______ Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie Taxonomie a ekologie rodu Enterococcus
(Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie) Hana Bryndová Brno, Česká republika 2008 ______
1 Za cenné rady, ochotnou pomoc a čas, který mi věnoval při vzniku této práce, tímto děkuji RNDr. Pavlu Švecovi, PhD., pod jehož vedením jsem bakalářskou práci zpracovala na půdě České sbírky mikroorganismů.
2 Obsah
1. Úvod ...... 6
2. Cíl práce ...... 6
3. Taxonomie rodu Enterococcus ...... 7 3.1 Historie taxonomie rodu Enterococcus ...... 7 3.2 Současná taxonomie rodu Enterococcus ...... 7 3.3 Charakteristika rodu Enterococcus ...... 9 3.3.1 Fylogenetické zařazení rodu Enterococcus ...... 9 3.3.2 Základní charakteristika ...... 9 3.3.3 Metabolismus ...... 10 3.3.4 Buněčná stěna ...... 11 3.3.5 Antigenní vlastnosti ...... 11 3.3.6 Charakteristika genomu ...... 12 3.3.6.1 Transpozony ...... 13 3.3.6.2 Plasmidy ...... 13 3.4 Stručná charakteristika fylogeneticky příbuzných rodů ...... 14 3.4.1 Atopobacter ...... 14 3.4.2 Melissococcus ...... 15 3.4.3 Tetragenococcus ...... 15 3.4.4 Vagococcus ...... 15 3.4.5 Pilibacter ...... 16 3.4.6 Catellicoccus ...... 16
4. Izolace a identifikace ...... 17 4.1 Izolace enterokoků ...... 17 4.1.1 Média používaná k izolaci enterokoků ...... 17 4.1.2 Kultivační média ...... 18 4.2 Identifikace enterokoků ...... 19 4.2.1 Klasické testy používané při identifikaci enterokoků ...... 19 4.2.2 Metody fenotypové typizace ...... 20 4.2.3 Metody genotypizace ...... 20 4.2.3.1 Restrikční analýza chromozomální DNA ...... 20 4.2.3.2 Ribotypizace ...... 21 4.2.3.3 Metody založené na PCR ...... 21 4.2.3.4 Makrorestrikční analýza ...... 21 4.2.3.5 Sekvenační metody ...... 22
5. Ekologie rodu Enterococcus ...... 23 5.1 Charakteristika druhů rodu Enterococcus ...... 23 5.1.1 Enterococcus aquimarinus ...... 24 5.1.2 Enterococcus asini ...... 24 5.1.3 Enterococcus avium ...... 24 5.1.4 Enterococcus caccae ...... 24 5.1.5 Enterococcus camelliae ...... 24
3 5.1.6 Enterococcus canintestini ...... 25 5.1.7 Enterococcus canis ...... 25 5.1.8 Enterococcus casseliflavus ...... 25 5.1.9 Enterococcus cecorum ...... 25 5.1.10 Enterococcus columbae ...... 25 5.1.11 Enterococcus devriesei ...... 26 5.1.12 Enterococcus dispar ...... 26 5.1.13 Enterococcus durans ...... 26 5.1.14 Enterococcus faecalis ...... 26 5.1.15 Enterococcus faecium ...... 27 5.1.16 Enterococcus gallinarum ...... 27 5.1.17 Enterococcus gilvus ...... 27 5.1.18 Enterococcus haemoperoxidus ...... 27 5.1.19 Enterococcus hermanniensis ...... 27 5.1.20 Enterococcus hirae ...... 28 5.1.21 Enterococcus italicus ...... 28 5.1.22 Enterococcus malodoratus ...... 28 5.1.23 Enterococcus moraviensis ...... 28 5.1.24 Enterococcus mundtii ...... 29 5.1.25 Enterococcus pallens ...... 29 5.1.26 Enterococcus phoeniculicola ...... 29 5.1.27 Enterococcus pseudoavium ...... 29 5.1.28 Enterococcus raffinosus ...... 29 5.1.29 Enterococcus ratti ...... 30 5.1.30 Enterococcus saccharolyticus ...... 30 5.1.31 Enterococcus silesiacus ...... 30 5.1.32 Enterococcus sulfureus ...... 30 5.1.33 Enterococcus termitis ...... 31 5.1.34 Enterococcus villorum ...... 31 5.2 Fylogenetické členění rodu Enterococcus ...... 31 5.2.1 Skupina druhu Enterococcus faecalis ...... 31 5.2.2 Skupina druhu Enterococcus faecium ...... 32 5.2.3 Skupina druhu Enterococcus avium ...... 32 5.2.4 Skupina druhu Enterococcus gallinarum ...... 32 5.2.5 Skupina druhu Enterococcus cecorum ...... 32 5.2.6 Druhy tvořící samostatné fylogenetické větve ...... 32 5.3 Výskyt enterokoků ve vodě ...... 34 5.4 Výskyt enterokoků v půdě ...... 35 5.5 Výskyt enterokoků na rostlinách ...... 35 5.6 Výskyt enterokoků v živočiších ...... 36 5.7 Výskyt enterokoků v potravinách ...... 37 5.7.1 Výskyt enterokoků v mléčných výrobcích ...... 37 5.7.2 Výskyt enterokoků v masných výrobcích ...... 38 5.7.3 Enterokoky jako probiotika ...... 39 5.8 Klinický význam enterokoků ...... 39
6. Závěr ...... 42
4 7. Seznam literatury ...... 43
5 1. Úvod Enterokoky jsou zástupci domény Bacteria , které se vyskytují v celé škále prostředí. Najdeme je ve vodě, v půdě, na rostlinách, jsou přirozenou složkou střevní mikroflóry řady živočichů včetně člověka, využívají se také jako startovací kultury při výrobě mléčných i masných výrobků či jako probiotika. V centru zájmu vědeckých prací, týkajících se těchto bakterií, stojí na prvním místě jejich klinický význam. Enterokoky jsou infekčním agens mnoha onemocnění a nebezpečí pro člověka představují zejména jejich vysoce rezistentní kmeny způsobující nosokomiální infekce. Klinický význam enterokoků je tématem široce a podrobně zpracovaným, avšak jejich význam a výskyt v ostatních prostředích je opomíjen. Právě proto je pozornost v této práci zaměřena na výskyt enterokoků v prostředí, kde je jejich skladba ve srovnání s klinickým materiálem druhově bohatší a fenotypově variabilnější. 2. Cíl práce Cílem této bakalářské práce bylo nastudovat problematiku týkající se taxonomie enterokoků, jejich obecného významu a výskytu v různých prostředích. Práce by měla být kompilací dosud publikovaných studií a shrnovat základní poznatky o rodu Enterococcus z oblasti taxonomie a ekologie.
6 3. Taxonomie rodu Enterococcus
Historie taxonomie rodu Enterococcus Mikroorganismy, které dnes řadíme do rodu Enterococcus , byly poprvé popsány roku 1899, kdy francouzský vědec Thiercelin použil poprvé označení „entérocoque“ pro grampozitivní diplokoky fekálního původu (Murray a Weinstock 1999). Ve stejném roce publikovali MacCallum a Hastings práci, kde popsali mikroorganismus nalezený u pacienta s endokarditidou jako Micrococcus zymogenes . Jednalo se však pravděpodobně také o enterokoka. Označení Streptococcus faecalis , které se pro enterokoky užívalo až do roku 1984, poprvé publikovali roku 1906 Andrews a Horder (Murray a Weinstock 1999). Vyčlenění enterokoků ze skupiny streptokoků poprvé navrhl ve své práci roku 1937 Sherman, kde rozdělil streptokoky na pyogenní, viridující, mléčné a enterokoky. Jeho rozdělení odpovídalo serologickému rozdělení dle Lancefieldové, které publikovala ve 30. letech 20. století. Podle tohoto rozdělení byly enterokoky klasifikovány jako streptokoky skupiny D. Poprvé navrhl přesun druhů S. faecalis a S. faecium do rodu Enterococcus Kalina roku 1970 a to na základě fenotypových znaků a buněčného uspořádání (Facklam et al. 2002). Tento návrh však nebyl obecně akceptován. Rod Enterococcus byl proto validně popsán až v roce 1984, kdy uveřejnili Schleifer a Kilpper Bälz návrh přesunu druhů E. faecalis a E. faecium do rodu Enterococcus na základě výsledků DNA DNA a DNA rRNA hybridizace (Schleifer a Kilpper Bälz 1984). Tento nový rod byl akceptován a uveřejněn v následujícím vydání Bergey´s Manual (Mundt et al. 1986). Následně byly v roce 1984 do rodu Enterococcus přeřazeny také druhy S. avium , S. casseliflavus , S. durans , S. malodoratus a S. gallinarum (Collins et al. 1984). Současná taxonomie rodu Enterococcus Využití moderních metod molekulární biologie (zejména sekvencování 16S rDNA) při identifikaci izolovaných kmenů mikroorganismů přispělo v posledních dvaceti letech k významnému rozvoji taxonomie mikroorganismů. Nejinak tomu bylo i při studiu streptokoků a z nich vyčleněných enterokoků, jejichž taxonomie se významně rozvíjí dodnes.
7 V současnosti je validně popsáno 34 druhů rodu Enterococcus , které přehledně uvádí tabulka č.1. Tab.č. 1: V současnosti známé validně popsané druhy rodu Enterococcus. (upraveno podle www.bacterio.cict.fr/e/enterococcus.html)
Druh Validní popis Enterococcus aquimarinus Švec et al. 2005a Enterococcus asini de Vaux et al. 1998 Enterococcus avium Collins et al. 1984 Enterococcus caccae Carvalho et al. 2006 Enterococcus camelliae Sukontasing et al. 2007 Enterococcus canintestini Naser et al. 2005 Enterococcus canis De Graef et al. 2003 Enterococcus casseliflavus Collins et al. 1984 Enterococcus cecorum Williams et al. 1989 Enterococcus columbae Devriese et al. 1990 Enterococcus devriesei Švec et al. 2005b Enterococcus dispar Collins et al. 1991 Enterococcus durans Collins et al. 1984 Enterococcus faecalis Schleifer a Kilpper Bälz 1984 Enterococcus faecium Schleifer a Kilpper Bälz 1984 Enterococcus gallinarum Collins et al. 1984 Enterococcus gilvus Tyrrell et al. 2002 Enterococcus haemoperoxidus Švec et al. 2001 Enterococcus hermanniensis Koort et al. 2004 Enterococcus hirae Farrow a Collins 1985 Enterococcus italicus Fortina et al. 2004 Enterococcus malodoratus Collins et al. 1984 Enterococcus moraviensis Švec et al. 2001 Enterococcus mundtii Collins et al. 1986 Enterococcus pallens Tyrrell et al. 2002 Enterococcus phoeniculicola Law Brown a Meyers 2003 Enterococcus pseudoavium Collins et al. 1989 Enterococcus raffinosus Collins et al. 1989 Enterococcus ratti Teixeira et al. 2001 Enterococcus saccharolyticus Rodrigues a Collins 1990 Enterococcus silesiacus Švec et al. 2006 Enterococcus sulfureus Martinez Murcia a Collins 1991 Enterococcus termitis Švec et al. 2006 Enterococcus villorum Vancanneyt et al. 2001
8 Charakteristika rodu Enterococcus
Fylogenetické zařazení rodu Enterococcus doména: Bacteria kmen: Firmicutes třída: Bacilli řád: Lactobacillales čeleď: Enterococcaceae rod: Enterococcus příbuzné rody: Atopobacter, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Pilibacter, Catellicoccus Základní charakteristika Enterokoky jsou grampozitivní koky sférického nebo ovoidního tvaru, které se vyskytují jednotlivě, ve dvojicích, ve shlucích nebo v krátkých řetízcích (typický vzhled buněk enterokoků je vyobrazen na obr.č. 1 na následující straně) (Facklam et al. 1999). Jsou nesporulující, netvoří pouzdra a některé druhy mohou být pohyblivé. Enterokoky jsou fakultativně anaerobní, kataláza negativní, ale mohou vykazovat pseudokatalázovou aktivitu a dávat tak pozitivní výsledky, pokud katalázový test provádíme u kultur kultivovaných na médiu s obsahem krve. Enterokoky tvoří na krevním agaru šedé až mléčně zabarvené kolonie, které jsou hladké, lesklé, okrouhlé, mírně vypouklé s celistvým okrajem, o velikosti asi 1 mm. Některé druhy ( E. casseliflavus , E. sulfureus a E. mundtii ) tvoří žlutý pigment. Na krevním agaru mohou být nehemolytické nebo tvořit α či β hemolýzu, přičemž tvorba a typ hemolýzy závisí na taxonu a na typu krve přidané do média. Teplotní optimum je 35°C, většina druhů roste v rozmezí 10 45°C (Facklam et al. 1999). Většina druhů hydrolyzuje pyrrolidonyl ß naftylamid, výjimku tvoří druhy E. cecorum , E. columbae , E. pallens , E. saccharolyticus a E. termitis . Všechny druhy produkují leucin aminopeptidázu a tedy hydrolyzují leucin ß naftylamid, což se spolu s růstem při 10°C a 45°C a s růstem v médiu se 6,5% NaCl využívá při jejich odlišení od příbuzných rodů (Facklam et al. 2002). V 10°C nerostou druhy E. aquimarinus , E. camelliae , E. canintestini ,
9 E. canis , E. cecorum , v 45°C druhy E. devriesei , E. dispar , E. hermanniensis , E. malodoratus , E. silesiacus a E. sulfureus . V médiu s obsahem 6,5% NaCl nerostou E. asini , E. camelliae , E. cecorum , E. columbae , E. italicus a E. phoeniculicola . Většina druhů hydrolyzuje eskulin a jsou schopné růstu v médiu s 6,5% NaCl a 40% žluče (Facklam et al. 1999). Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí 35 45%. Obr.č. 1: Enterococcus faecalis –fotografie ze skenovacího elektronového mikroskopu (SEM). (upraveno podle www.ars.usda.gov/.../mar05/organism0305.html)
Metabolismus Enterokoky mají fermentativní typ metabolismu bez produkce plynu (Devriese et al. 1992). Jsou homofermentativní a hlavní metabolickou dráhou je Embden Meyerhof Parnasova cesta, kdy při pH<5 vzniká z glukózy L(+) enanciomer kyseliny mléčné. Při pH>7 je glukóza zkvašována na etanol, kyselinu mravenčí a kyselinu octovou. V aerobních podmínkách je glukóza metabolizována na kyselinu octovou, acetoin a CO 2. Enterokoky jsou schopné využívat rozmanitých cukerných substrátů jako jsou například D glukóza, D fruktóza, D manóza, ribóza, galaktóza, N acetylglukosamin, amygdalin, arbutin, salicin, celobióza, maltóza nebo laktóza (Huycke 2002). Významným substrátem je také v přírodě hojný glycerol, který se vyskytuje jako komponent lipidů. Široká
10 škála substrátů, které jsou enterokoky schopné utilizovat, jim umožňuje osídlení rozmanitých prostředí včetně těch, kde jsou zdroje živin limitované jako např. v gastrointestinálním traktu. Rozdíly ve schopnosti využití substrátů jsou důležitým znakem při druhové identifikaci enterokoků. Enterokoky mohou energii získávat také degradací některých aminokyselin (Devriese et al. 1992). E. faecalis například využívá arginin jako zdroj energie, přičemž prvním krokem jeho zpracování je deaminace na citrulin a konečným produktem je ornitin. Podobně může také využívat dekarboxylovaný derivát argininu agmatin, kde je konečným produktem reakce putrescin. Degradací jednoho molu argininu nebo agmatinu získávají enterokoky jeden mol ATP. Zdrojem energie může být pro E. faecalis také serin, který je deaminován na pyruvát. Ač jsou enterokoky charakterizovány jako mikroorganismy fakultativně anaerobní, některé druhy jsou schopné se s aerobním prostředím vypořádat velmi dobře. Kromě fermentace jsou schopné zpracovávat substráty také aerobní metabolickou cestou (Devriese et al. 1992). Buněčná stěna Enterokoky mají buněčnou stěnu grampozitivního typu, která je tvořena silnou vrstvou peptidoglykanu přiléhajícího na cytoplasmatickou membránu (Coyette a Hancock 2002). Buněčná stěna enterokoků je tvořena třemi hlavními složkami: peptidoglykanem, teichoovými kyselinami a polysacharidy. Mimo tyto složky obsahuje také povrchové i zanořené proteiny. Detailní složení buněčné stěny můžeme uvést na příkladu kmene E. hirae ATCC9790. Peptidoglykan zde tvoří 35 40% celkové hmoty stěny, kterou dále tvoří ramnózu obsahující polysacharid a ribitol obsahující teichoová kyselina. Procentuální zastoupení komponent buněčné stěny je druhově specifické, závisí na podmínkách kultivace a na použitém médiu. Antigenní vlastnosti Sérologické rozdělení streptokoků podle Lancefieldové je založeno na antigenních vlastnostech specifických polysacharidů buněčné stěny (Coyette a Hancock 2002). Pro skupinu A je charakteristický glukosamin a ramnóza, pro skupinu B ramnóza, galaktóza, N acetylglukosamin a fosfor, pro skupinu C vysoký obsah N acetylgalaktosaminu, dále glycerol, ramnóza, glukóza a N acetylglukosamin, pro skupinu D lipoteichoová kyselina, pro skupinu G vysoký obsah ramnózy, dále glukóza, N acetylglukosamin a N acetylgalaktosamin.
11 Enterokoky jsou řazeny do sérologické skupiny D, protože vystavují antigen D (Deibel 1964). Tento antigen je uložen mezi cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou, což znesnadňuje jeho extrakci z bakteriálních buněk. Tato extrakce se tradičně provádí za tepla působením kyseliny. Antigen D je tvořen polymerem lipoteichoové kyseliny (LTA) (Coyette a Hancock 2002). Teichoová kyselina je na glycerol fosfátovou kostru polymeru navázaná esterovou vazbou přes D alanin. Glukóza je na kostru navázána taktéž esterovou vazbou. Lipidovou složku LTA tvoří 1 kojibiosyl diglycerid. Při syntéze LTA se zpracovává glycerol 1 fosfát z lipidových substrátů a tato syntéza probíhá na vnější straně buněčné stěny. Mimo antigen typu D vystavují enterokoky také antigeny typu K a O popsané u E. faecalis (Deibel 1964). Antigen K je termolabilní, vyskytuje se na povrchu bakteriálních buněk a je považován za nevhodný pro sérologická stanovení kvůli variabilitě výskytu. Antigen typu O je termostabilní a je pevně zabudován do buněčné stěny. Jeho základní struktura je tvořena glukosaminem, ramnózou a glukózou. Charakteristika genomu Genom enterokoků se skládá z genů uložených na typickém prokaryotickém kružnicovém chromosomu a také z mnoha plasmidů (Devriese et al. 1992). Jedním z kompletně osekvencovaných genomů enterokoků je genom vankomycin rezistentního kmene E. faecalis V583 (Paulsen 2003). Jeho genom se skládá ze čtyř molekul DNA: jednoho chromosomu a třech plasmidů. Chromosom o velikosti 3 218 030 bp obsahuje okolo 3500 otevřených čtecích rámců (ORFs open reading frames) kódujících proteiny (McSahn a Shankar 2002). Plasmidy pTEF1 (66 320 bp), pTEF2 (17 963 bp) a pTEF3 (57 660 bp) nesou mimo jiné např. geny pro rezistenci k antibiotikům. Čtvrtina genomu je tvořena mobilními a získanými elementy DNA např. 38 inzerčními elementy (IS), konjugativními transpozony, složenými transpozony a integrovanými plasmidovými geny (Paulsen 2003). Definován byl také ostrov patogenity obsahující geny kódující syntézu cytolysinu, proteinů agregační substance a dalších faktorů virulence. Obsah C+G v DNA je 37.38% (1 255 997 bp).
12 Transpozony Důležitou roli při přenosu genů hrají v genomu enterokoků mobilní elementy transpozony (Weaver 2000). Existuje několik druhů transpozonů: složené transpozony, inzerční sekvence, transpozony typu Tn3 a konjugativní transpozony. Výskyt transpozonů byl popsán u různých bakteriálních druhů, není tedy specifický pouze pro enterokoky. Prvním popsaným a kompletně osekvencovaným konjugativním transpozonem grampozitivních bakterií byl Tn917 nalezený u E. faecalis (Devriese et al. 1992). Tn917 nese geny pro rezistenci k makrolidům, linkosamidům a streptograminu. Dále byl popsán transpozon Tn916, taktéž u druhu E. faecalis , který se přenáší jak mezi enterokoky mezi sebou, tak mezi nimi a dalšími druhy bakterií např. Streptococcus agalactiae , Streptococcus pyogenes , Lactococcus lactis , Bacillus thuringiensis , Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes či Mycoplasma hominis . Plasmidy Další mobilní elementy zodpovědné za vysokou rychlost, s níž enterokoky získávají a dále distribuují geny (např. pro rezistenci k antibiotikům) jsou plasmidy (Devriese et al. 1992). U druhu E. faecalis bylo popsáno 47 plasmidů, z nichž 29 je konjugativních. Právě konjugativní plasmidy jsou při přenosu genů velmi důležité. Přenos pomocí konjugace neprobíhá pouze v rámci rodu Enterococcus , ale i mezi enterokoky a dalšími bakteriálními druhy. Například byla popsána distribuce genů mezi enterokoky a streptokoky, laktobacily, pediokoky, listeriemi nebo klostridii. Byly popsány tři třídy plasmidů: RCR (rolling circle replicating) plasmidy, Inc18 plasmidy a feromonové (pheromone responsive) plasmidy (Weaver 2002). RCR a Inc18 plasmidy jsou schopné replikace v rámci široké škály grampozitivních bakterií, RCR plasmidy se vyskytují také u několika gramnegativních rodů domény Bacteria i některých rodů domény Archaea. Feromonové plasmidy jsou specifické pro skupinu enterokoků. RCR plasmidy jsou malé plasmidy, které se vyskytují v mnoha kopiích a replikují se mechanismem otáčivého kruhu (Weaver 2002). Poprvé byly tyto plasmidy objeveny u druhu Staphylococcus aureus a následně izolovány prakticky ze všech grampozitivních bakterií. Díky malé velikosti, možnosti nést geny pro rezistenci k antibiotikům a širokému rozpětí hostitelů, jsou RCR plasmidy využívány jako vektory při genetických studiích grampozitivních bakterií včetně enterokoků.
13 Pod pojmem Inc18 plasmidy rozumíme pIP501 plasmid izolovaný z druhu Streptococcus agalactiae , pSM19035 plasmid z druhu Streptococcus pyogenes a pAMβ1 plasmid z druhu Enterococcus faecalis (Weaver 2002). Tyto plasmidy se hojně vyskytují mezi grampozitivními bakteriemi s nízkým obsahem cytosinu a guaninu, tedy i mezi enterokoky. Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 25 30 kb a v buňkách se vyskytují v nízkém počtu kopií (méně než 10 v jedné buňce). Podobně jako RCR plasmidy se i Inc18 plasmidy využívají jako klonovací vektory, ale na rozdíl od nich jsou větší, stabilnější a nedochází u nich k častým delecím. Feromonové plasmidy se v buňkách vyskytují ve 2 4 kopiích a jejich velikost se pohybuje v rozmezí 37 91 kb (Weaver 2002). Tyto plasmidy jsou schopné konjugace a jejich přenos mezi buňkami je vyvolán feromony. Feromony mají podobu malých lineárních peptidů, které jsou kódované geny nesenými na bakteriálním chromozomu. Feromony jsou sekretovány buňkami, které neobsahují feromonový plasmid, a rozpoznávány buňkami, které naopak odpovídající feromonový plasmid obsahují (Devriese et al. 1992). Buňky obsahující plasmid vystupují jako donorové a v odpovědi na rozpoznání feromonů syntetizují agregační substanci umožňující spojení s recipientní buňkou. Po pevném spojení obou buněk dochází ke konjugaci a k přenosu feromonového plasmidu z donorové do recipientní buňky. Buňky jsou schopné exkretovat vždy pouze takové feromony, jejichž odpovídající plasmidy ještě neobsahují. Dokud tedy buňka neobsahuje všechny typy feromonových plasmidů, vystupuje jeko potenciální recipient, ale současně i jako donor všech feromonových plasmidů, které již obsahuje. Stručná charakteristika fylogeneticky příbuzných rodů Atopobacter Grampozitivní, kataláza negativní, fakultativně anaerobní bakterie tvaru tyček, které byly izolovány z tuleně obecného ( Phoca vitulina ) a identifikovány na základě molekulárně biologických metod (Lawson et al. 2000). V současné době obsahuje tento rod pouze jeden druh Atopobium phocae .
14 Melissococcus Grampozitivní ovoidní až kopinaté, někdy pleomorfní buňky, vyskytující se v řetízcích (Sedláček 2006). Jsou nepohyblivé, nesporulující, fakultativně anaerobní, vyžadují zvýšenou koncentraci CO 2. Jsou chemoorganotrofní, fermentující glukózu nebo fruktózu, vyžadují kultivaci na bohatých médiích s obsahem cysteinu nebo cystinu. Optimální růstová teplota je 35°C, reagují s antisérem D. Poprvé byly melisokoky izolovány z feces včely medonosné (Apis mellifera ) (Bailey a Collins, 1982). Jsou entomopatogenní. Tetragenococcus Grampozitivní sférické až ovoidní koky vyskytující se v tetrádách (Sedláček 2006). Jsou nepohyblivé, chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní, fermentující glukózu. Jsou halotolerantní, nepatogenní. V současnosti obsahuje rod čtyři validně popsané druhy. Prvním byl Tetragenococcus halophilus , který byl původně popsán jako Pediococcus halophilus (Collins et al. 1990). Tetragenococcus muriaticus byl izolován z tradičního japonského jídla omáčky z jater a olihní (Satomi et al. 1997). Podobně také Tetragenococcus koreensis byl izolován z tradičního korejského jídla kimchi, přičemž obě tyto potraviny vznikají procesem fermentace (Lee et al. 2005). Tetragenococcus solitarius byl izolován z humánního vzorku a původně řazen do rodu Enterococcus jako E. solitarius . Roku 2005 byl tento druh reklasifikován do rodu Tetragenococcus (Ennahar a Cai 2005). Vagococcus Grampozitivní kulaté až oválné koky (popř. krátké tyčky) vyskytující se jednotlivě, ve dvojicích nebo v krátkých řetízcích (Sedláček 2006). Jsou nesporulující, s peritrichálními bičíky. Jsou chemoorganotrofní, fermentující, fakultativně anaerobní s optimální růstovou teplotou 25 35°C. Některé druhy reagují s antisérem N dle Lancefieldové. Vyskytují se ve vodním prostředí a jejich patogenita je nevyjasněná.
15 Pilibacter Grampozitivní, anaerobní, heterofermentativní tyčky, které netvoří spory (Higashiguchi et al. 2006). Byly izolovány ze zadního střeva termita Coptotermes formosanus. V současnosti je validně popsán pouze jeden druh Pilibacter termitis . Catellicoccus Grampozitivní, kataláza negativní, fakultativně anaerobní bakterie kokoidního tvaru byly izolovány z mořských savců sviňuchy ( Phocoena spp.) a tuleně ( Phoca spp.) (Lawson et al. 2006). Rod v současnosti obsahuje pouze jeden druh Catellicoccus marimammalium .
16 4. Izolace a identifikace Izolace enterokoků Enterokoky jsou mikroorganismy chemoorganotrofní a jejich nutriční nároky jsou značné. Vyžadují kultivaci na médiích s obsahem vitamínů a aminokyselin, a proto je nelze jednoduše kultivovat na syntetických médiích (Domig et al. 2003). Existuje mnoho metod k jejich izolaci i kultivaci definovaných různými kombinacemi selektivních agens a podmínek inkubace. Dnes je známo více než šedesát různých selektivních médií, které však vedle enterokoků často umožňují růst také jiným bakteriím (Devriese et al. 1992). K jejich vzájemnému odlišení pak slouží další biochemické testy. Všechny druhy rodu Enterococcus můžeme kultivovat v 35 37°C a zvýšený obsah CO 2 může přispět k lepšímu růstu kolonií (Facklam et al. 1999). Média používaná k izolaci enterokoků K izolaci enterokoků se používá celá řada selektivních médií (Devriese et al. 1992).
První skupinou selektivních médií jsou média s obsahem azidu sodného (NaN 3), jako např. Slanetz Bartley agar. Azid sodný je nejpoužívanějším selektivním agens a většina médií jej obsahuje v koncentraci 0.2 – 0.5%. Hlavní funkcí azidu je inhibice enzymatických systémů elektronového transportu, např. katalázy nebo cytochromoxidázy c (Domig et al. 2003). Dalším příkladem selektivního média je žluč eskulinový agar využívající schopnost enterokoků růst ve 40% žluči a hydrolyzovat eskulin (Facklam et al. 1999). Příkladem takového komerčně dostupného média je Pfizer Selective Enterococcus agar (PSE). Na tomto médiu tvoří enterokoky po 24 hodinové inkubaci typické kolonie ohraničené černým kruhem, který je důkazem hydrolýzy eskulinu (Domig et al. 2003). Obdobně jako Slanetz Bartley a žluč eskulinový agar je i Kanamycin Aesculin Azid agar (KAA) hojně využívaným médiem při izolaci enterokoků jak z prostředí, potravin, vody, půdy, tak i z klinických vzorků (Domig et al. 2003). S rozvojem taxonomie enterokoků v současnosti jde ruku v ruce také vývoj nových selektivních médií. Příkladem takových médií jsou ty s obsahem chromogenních substrátů používané pro izolaci enterokoků z moči, nebo Cephalexin Aztreonam Arabinose agar (CAA)
17 používaný při izolaci E. faecium z vysoce kontaminovaných prostředí (Domig et al. 2003). CAA agar umožňuje odlišení E. faecium od E. faecalis a E. durans na základě schopnosti fermentace arabinózy, kterou E. faecalis a E. durans nevykazují. Kultivační média Ke kultivaci enterokoků se často používají bohatá média s obsahem krve (Facklam et al. 1999). Jsou to např. Tryptose Soy agar (TS) nebo Brain Heart Infusion (BHI) s 5% obsahem beraní krve. Vzhled kolonií na krevním agaru zobrazuje obr.č. 2 níže. Enterokoky mohou být α hemolytické, β hemolytické nebo nehemolytické, přičemž typ hemolýzy je ovlivněn taxonem a typem krve použité v médiu. Například některé kmeny E. faecalis vytváří na médiu s obsahem králičí, koňské nebo lidské krve β hemolýzu, ale na médiu s krví beraní ji nevytváří. Podobně také E. durans je schopen v závislosti na použitém druhu krve tvořit β hemolýzu. Ostatní druhy enterokoků jsou většinou α hemolytické nebo nehemolytické. Ke kultivaci enterokoků jsou velmi široce využívané také čistý BHI agar i BHI bujón, v nichž kolonie narostou po 24 hodinové kultivaci ve 35°C (Domig et al. 2003). Dále můžeme použít např. Trypton Glucose Extract agar, Tryptose Soy agar nebo bujón, Trypton Soy Yeast Extract agar, de Man Rogosa Sharp agar (MRS), Elliker bujón nebo Todd Hewitt bujón. Obr.č. 2: Kolonie E. faecalis na krevním agaru. (upraveno podle www.emlab.com/s/sampling/env report 02 2007.html)
18 Identifikace enterokoků Již od počátku minulého století byly enterokoky identifikovány, i když tehdy ještě jako fekální streptokoky, a sloužily jako indikátory fekální kontaminace vod. To vyplývá z jejich přirozeného výskytu ve střevech teplokrevných živočichů i hmyzu. Právě druhy, které najdeme v tělech těchto živočichů (zejména pak E. faecalis a E. faecium ), patří k nejlépe identifikovatelným druhům rodu. Identifikace izolátů z prostředí (z půdy, vody, rostlin, mléčných produktů) je problematičtější a vyžaduje využití molekulárně biologických metod. Klasické testy používané při identifikaci enterokoků V této krátké kapitole jsou uvedeny testy používané při odlišení enterokoků od jiných grampozitivních, kataláza negativních, fakultativně anaerobních bakterií. Je to pozitivní růst při 10°C a současně při 45°C, v bujónu s obsahem 6,5%NaCl a při pH 9,6, a také přítomnost antigenu sérologické skupiny D (Domig et al. 2003). U všech těchto vlastností však existují výjimky, kdy některé druhy enterokoků vykazují variabilní či negativní výsledky. Například E. devriesei , E. dispar , E. hermanniensis , E. malodoratus , E. silesiacus a E. sulfureus nerostou při 45°C, E. aquimarinus , E. camelliae , E. canintestini , E. canis , E. cecorum zase při 10°C (Domig et al. 2003). Druhy E. asini , E. camelliae , E. cecorum , E. columbae , E. italicus a E. phoeniculicola slabě rostou v médiu s obsahem 6.5% NaCl, ve kterém ostatní druhy rostou bez problémů. E. aquimarinus , E. canintestini , E. cecorum , E. columbae , E. dispar , E. gilvus , E. hermanniensis a E. saccharolyticus nereagují s antisérem skupiny D. Identifikaci dále komplikuje fakt, že pozitivní výsledky těchto testů neposkytují pouze enterokoky, ale i jiné bakterie ( Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Pediococcus, Leuconostoc ) (Devriese et al. 1993). Nutné jsou tedy i další testy jako například test produkce pyrolidonylarylamidázy (PYRázovou aktivitu nevykazují druhy E. cecorum , E. columbae a E. saccharolyticus) , hydrolýzy eskulinu nebo růst v médiu se 40% obsahem žluči. K běžné identifikaci v klinické praxi, kde převládají druhy E. faecalis a E. faecium , se používají selektivní média jako je například M enterococcus agar nebo KF streptococcus agar a k potvrzení identifikace pak kultivace na žluč eskulinovém agaru s obsahem azidu sodného (Manero a Blanch 1999).
19 Ač testy založené na fyziologických a biochemických vlastnostech nejsou tak přesné jako výsledky molekulárně biologických metod identifikace, stále jsou v laboratorní praxi pro rutinní identifikaci nejpoužívanější (Manero a Blanch 1999). Problém tohoto typu testů spočívá v tom, že schémata a klíče pro identifikaci neobsahují nově popsané druhy a také v materiálové, časové a finanční náročnosti některých testů. Metody fenotypové typizace V dnešní době známe celou škálu metod fenotypové typizace jako je například biotypizace, tedy detekce fermentace sacharidů a enzymatického aparátu ve formě konvenčních zkumavkových testů nebo komerčních kitů ( Api 20 Strep , Api 50 CH nebo Rapid ID32 Strep ) (Domig et al. 2003). Další metodou je analýza buněčných proteinů pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS PAGE). Tato metoda je přesná, rychlá a umožňuje zařazení neznámých izolátů do druhů i poddruhů. Kromě biotypizace a SDS PAGE se také často využívá serotypizace, analýza mastných kyselin s dlouhým řetězcem, multilokusová enzymová elektroforéza, testování antibiotické rezistence, analýza metylesterů mastných kyselin (fatty acid methyl esters analysis FAME) a další metody fenotypové typizace (Domig et al. 2003). Metody genotypizace Molekulárně biologické metody se při identifikaci enterokoků využívají kvůli přesným a jasným výsledkům, které poskytují, i kvůli rychlosti jejich provedení, která je důležitá zejména v klinické praxi (Domig et al. 2003). Z mnoha metod budou v následujících podkapitolách stručně charakterizovány pouze ty nejpoužívanější. Restrikční analýza chromozomální DNA Při restrikční endonukleázové analýze celkové chromosomální DNA (REA) je nejprve izolovaná DNA rozštěpena restrikčními enzymy a fragmenty jsou potom separovány pomocí gelové elektroforézy, čímž se získá specifický restrikční profil DNA (Domig et al. 2003).
20 Ribotypizace Ribotypizace je hybridizační metoda založená na selektivní hybridizaci a následné detekci restrikčních fragmentů nesoucích geny pro ribozomální RNA. Tato metoda umožňuje jak druhovou identifikaci, tak kmenovou typizaci enterokoků (Doming et al. 2003). Metody založené na PCR Metody identifikace založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) umožňují identifikaci na úrovni rodu i druhu. Mezi nejpoužívanější metody patří RAPD PCR, rep PCR a ITS PCR. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) PCR je metoda založená na amplifikaci DNA pomocí náhodných krátkých primerů o velikosti 7 10 párů bazí, které se vážou na nespecifické sekvence DNA řetězců a vznikají tak různě dlouhé PCR produkty (Domig et al. 2003). RAPD PCR se využívá při identifikaci izolátů z potravin i z klinického materiálu – např. při identifikaci vankomycin rezistentních enterokoků (VRE). Další metodou je rep PCR, která využívá existence krátkých repetitivních sekvencí DNA, které se vyskytují v bakteriálním genomu (Domig et al. 2003). Počet a poloha těchto repeticí je charakteristická pro jednotlivé druhy i kmeny bakterií. Amplifikací sekvencí, které se nachází mezi repeticemi, získáváme fragmenty DNA různé délky. Tyto fragmenty se poté separují pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, čímž získáváme specifický profil. Principem ITS (intergenic rRNA spacer regions amplification) PCR je amplifikace sekvencí, které se nacházejí mezi 16S a 23S rRNA (Domig et al. 2003). Získané fragmenty se separují pomocí elektroforézy na 6% akrylamid bisakrylamidovém gelu zabraňujícímu denaturaci DNA. Některé studované kmeny měly velmi podobné specifické profily získané pomocí ITS PCR ( E. avium, E. raffinosus, E. malodoratus, E. pseudoavium, E. faecalis, E. hirae ), jiné naopak vykazovaly charakteristické a vzájemně od sebe odlišitelné profily ( E. faecium , E. casseliflavus , E. mundtii a E. durans ). Této metody se využívá například také při typizaci kmenů enterokoků rezistentních ke glykopeptidům (GRE). Makrorestrikční analýza Makrorestrikční analýza pulzní gelovou elektroforézou (PFGE) slouží k separaci velkých molekul DNA, které není možné rozlišit pomocí konvenční gelové elektroforézy
21 (Domig et al. 2003). Makrorestrikční analýza je typizační metoda, která využívá vzácně štěpící restriktázy. Tato metoda umožňuje typizaci na úrovni kmenů, čehož se využívá zejména při epidemiologických studiích enterokoků způsobujících nosokomiální infekce. Sekvenační metody Sekvenace 16S rDNA pomocí PCR a následná analýza získaného PCR produktu je uznávána jako spolehlivá metoda vhodná k identifikaci a klasifikaci enterokoků (Domig et al. 2003). Nejčastěji jsou analyzovány oblasti V4 spolu s V9 nebo oblast V6 rDNA. Sekvenace 16S rDNA se široce využívá při identifikaci izolátů z prostředí, potravin i z klinického materiálu. Další sekvenační metodou je multilokusová sekvenční analýza (multilocus sequence typing MLST), která je založena na identifikaci fragmentů tzv. provozních (housekeeping) genů (Domig et al. 2003). Využívá se zejména při typizaci klinicky významných kmenů E. faecalis a nachází uplatnění také v taxonomických studiích při popisu nových druhů enterokoků (byla použita např. při popisu druhu E. canintestini ) (Naser et al. 2005).
22 5. Ekologie rodu Enterococcus
Enterokoky jsou bakterie, které se vyskytují přirozeně jako komensálové v trávicím traktu živočichů i člověka (Murray 1990). Zde byly poprvé nalezeny a na základě této skutečnosti charakterizovány jako mikroorganismy fekálního původu. Jejich výskyt je však běžný i v prostředí, kde se vyskytují jednak přirozeně, jednak jako kontaminace (např. odpadních vod nebo při fertilizaci půdy přírodními hnojivy). Enterokoky najdeme ve vodě, půdě, na rostlinách, v tělech bezobratlých živočichů i obratlovců. Vyskytují se také v potravinách živočišného původu jako jsou mléčné nebo masné výrobky. Enterokoky se využívají jako startovací kultury i jako probiotika. Díky vysoké schopnosti rezistence k vnějším podmínkám a produkci faktorů virulence jsou enterokoky etiologickým agens mnoha infekčních onemocnění (Jett et al. 1994). Enterokoky jsou dnes studovány z širšího hlediska, je zkoumán jejich výskyt a šíření v prostředí (Kühn et al. 2003). Hlavní výzkum souvisí se vzrůstající rezistencí enterokoků, která se přenáší mezi kmeny z prostředí a mezi kmeny způsobujícími vážné infekce. Vlastnosti (např. virulence, abundance či diverzita) populací z jednotlivých prostředí jsou srovnávány, hledají se jejich podobnosti i odlišnosti, což by mělo vést k pochopení vzniku a šíření nebezpečných rezistentních kmenů. V této kapitole budou nejprve charakterizovány validně popsané druhy rodu Enterococcus a následně přehledně popsán výskyt enterokoků v prostředí. V samotném závěru práce je zařazena kapitola pojednávající o významu rodu Enterococcus v humánní klinické mikrobiologii. Charakteristika druhů rodu Enterococcus V jednotlivých podkapitolách této části práce jsou uvedeny charakteristiky validně popsaných druhů rodu Enterococcus . Základní fenotypové a biochemické vlastnosti, které jsou pro všechny druhy shodné, jsou uvedeny v kapitole 3.3.2. Základní charakteristika. V následujících popisech jsou proto zdůrazněny pouze vlastnosti atypické či znaky využitelné pro odlišení jednotlivých druhů (např. tvorba pigmentu, typ hemolýzy či specifické růstové vlastnosti). Dále jsou zde uvedeny informace o původu izolátů analyzovaných při popisu druhů, případně informace o původu druhového jména. Při popisu druhů enterokoků se tradičně provádí sekvenční analýza 16S rDNA, DNA DNA hybridizace, analýza obsahu bazí
23 DNA, růstové a biochemické testy. Tyto základní metody bývají doplněny např. multilokusovou sekvenční analýzou (MLSA) provozního genu pheS , analýzou buněčných proteinů pomocí SDS PAGE nebo některou z metod založených na PCR (tDNA PCR, rep PCR nebo D11344 primed PCR). Enterococcus aquimarinus
Dva izoláty druhu Enterococcus aquimarinus byly izolovány z mořské vody (Švec et al. 2005a). Buňky rostou v rozmezí teplot 25 42°C, jsou viridující na krevním agaru a D antigen negativní. Obsah C+G v DNA je 38,7 mol%. Enterococcus asini Enterococcus asini byl izolován ze slepého střeva osla ( Equus asinus ) (de Vaux et al. 1998). Buňky tohoto druhu nerostou v médiu s obsahem 6,5% NaCl a slabě rostou při 10°C i 45°C. Obsah C+G v DNA je 39,4 mol%. Enterococcus avium Enterococcus avium byl izolován z těla ptáků (odtud původ jeho druhového jména, avis pták), ale také z feces jiných živočichů i člověka (Collins et al. 1984). Buňky E. avium jsou α hemolytické, produkují H 2S a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 39,0 40,0 mol%. Enterococcus caccae Enterococcus caccae byl izolován ze stolice člověka (Carvalho et al. 2006). Buňky jsou α hemolytické a obsah C+G v DNA je 32,5 mol%. Druhové jméno je odvozeno podobně jako u jiných druhů od původu izolace ( kakke feces). Enterococcus camelliae Enterococcus camelliae je v současnosti posledním validně popsaným druhem rodu Enterococcus , který byl izolován z fermentovaných lístků Camellia sinensis (odtud je
24 odvozeno jeho druhové jméno) (Sukontasing et al. 2007). Izoláty pocházejí ze severní části Thajska, z provincie Chiangmai. Buňky rostou v rozmezí 15 45ºC a v médiu s 2 6% NaCl. Obsah C+G v DNA je 37,8 mol%. Enterococcus canintestini Enterococcus canintestini byl izolován ze střev zdravých psů (Naser et al. 2005). Buňky tohoto druhu pomalu rostou při 25°C, optimálně v rozmezí 37 42°C, jsou D antigen negativní. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 36,0 37,0 mol%.
Enterococcus canis
Enterococcus canis byl izolován z análních výtěrů a vzorků odebraných při chronických otitidách psů (De Graef et al. 2003). Buňky jsou α hemolytické, rostou v rozmezí teplot 25 42°C a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 41,7 43,0 mol%. Enterococcus casseliflavus Enterococcus casseliflavus byl izolován z rostlinného materiálu, siláže i z půdy (Collins et al. 1984). Podle jasně žlutého pigmentu, který vytváří, získal tento druh své druhové jméno ( casseliflavus žlutě zbarvený). Buňky E. casseliflavus jsou pohyblivé a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 40,5 44,9 mol%. Enterococcus cecorum
Enterococcus cecorum byl izolován ze slepého střeva kuřat (odtud původ druhového jména, caecum slepé střevo) (Williams et al. 1989). Buňky E. cecorum nerostou v 10ºC ani v médiu s obsahem 6,5% NaCl a jsou D antigen negativní (Devriese et al. 1983). Enterococcus columbae
Enterococcus columbae byl izolován ze střev domestikovaných holubů (Devriese et al. 1990). Podle původu izolace získal tento druh své druhové jméno ( columba holub). Buňky
25 nerostou v médiu s obsahem 6,5% NaCl, jsou D antigen negativní a obsah C+G v DNA je 38,2 mol%. Enterococcus devriesei
Enterococcus devriese byl popsán na základě studia kmenů izolovaných ze skotu (Švec et al. 2005b). Buňky E. devriesei tvoří při kultivaci na krevním agaru s obsahem hovězí krve α hemolýzu, dobře rostou v rozmezí teplot 10 37°C, nerostou v teplotách vyšších než 42°C. Obsah C+G v DNA je 40,0 mol%. Tento druh byl pojmenován na počest belgického mikrobiologa Luc A. Devriese, který se významně zasloužil o vývoj taxonomie enterokoků. Enterococcus dispar
Dva izoláty Enterococcus dispar byly izolovány ze synoviální tekutiny a z feces člověka (Collins et al. 1991). Buňky nerostou v 45°C, jsou D antigen negativní a obsah C+G v DNA je 39,0 mol%. Druhové jméno dispar znamená rozdílný, nepodobný. Enterococcus durans
Enterococcus durans byl izolován z mléka a mléčných produktů (Collins et al. 1984). Druhové jméno durans znamená odolný, rezistentní. Buňky tohoto druhu mohou na krevním agaru vytvářet α i β hemolýzu (typ hemolýzy závisí na použitém druhu krve a liší se u jednotlivých kmenů) a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 38,0 40,0 mol%. Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis je typovým druhem rodu, který byl izolován z feces člověka a teplokrevných živočichů (odtud je odvozeno také druhové jméno) (Schleifer a Kilpper Bälz 1984). Buňky E. faecalis jsou většinou nehemolytické, ale vzácně tvoří β hemolýzu. Některé kmeny produkují při kultivaci na krevním agaru pseudokatalázu a poskytují pak pozitivní výsledek katalázového testu. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 37,0 40,0 mol%.
26 Enterococcus faecium
Enterococcus faecium byl podobně jako výše popsaný E. faecalis izolován z feces člověka a teplokrevných živočichů (Schleifer a Kilpper Bälz 1984). Některé kmeny E. faecium vytváří na krevním agaru α hemolýzu. Buňky rostou v rozmezí teplot 10 50ºC. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 37,0 40,0 mol%. Enterococcus gallinarum Enterococcus gallinarum byl izolován ze střev slepic a jiné domestikované drůbeže, z čehož bylo odvozeno také jeho druhové jméno (Collins et al. 1984). Buňky E. gallinarum jsou pohyblivé, na médiu s obsahem koňské krve tvoří β hemolýzu a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 39,0 40,0 mol%. Enterococcus gilvus
Enterococcus gilvus byl izolován ze žluči pacienta trpícího cholecystitidou (Tyrrell et al. 2002). Buňky vytváří jemně žlutý pigment, jsou D antigen negativní, dobře rostou v rozmezí teplot 10 35°C a při 45°C rostou pomalu. Enterococcus haemoperoxidus
Enterococcus haemoperoxidus byl izolován z povrchových vod (Švec et al. 2001). Buňky na krevním agaru poskytují pozitivní katalázovou reakci a mohou produkovat jemně nažloutlý pigment. Obsah C+G v DNA je 35,3 mol%. Enterococcus haemoperoxidus je pojmenován podle schopnosti rozkládat peroxid vodíku na kyslík a vodu při kultivaci na médiích s obsahem krve, což se projevuje jako pozitivní výsledek katalázového testu. Enterococcus hermanniensis
Enterococcus hermanniensis byl popsán na základě analýzy izolátů odebraných z tonsil psů a z marinovaného masa broilerů baleného v ochranné atmosféře (Koort et al. 2004). Buňky na médiu s obsahem hovězí krve vytváří α hemolýzu, dobře rostou v rozmezí teplot 10 37°C, nerostou při 45°C. Jsou D antigen negativní a obsah C+G v DNA se pohybuje
27 v rozmezí 36,6 37,1 mol%. Druhové jméno E. hermanniensis je odvozeno od názvu lokality izolace v Helsinkách zvané Hermanni. Enterococcus hirae
Enterococcus hirae byl izolován ze střevního traktu prasat a kuřat (odtud pochází druhové jméno hirae střevní) (Farrow a Collins 1985). Tento druh je etiologickým agens růstových onemocnění u kuřat. Charakteristika druhu odpovídá všeobecné charakteristice rodu Enterococcus a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 37,0 38,0 mol%.
Enterococcus italicus
Enterococcus italicus byl izolován v Piedmontu v Itálii (odtud druhové pojmenování E. italicus ) ze dvou druhů sýrů Toma a Robiola (Fortina et al. 2004). Buňky E. italicus slabě rostou ři teplotě 10°C, schopnost růstu při 45°C se u jednotlivých kmenů liší a růst je podporován obsahem 5% CO 2 v atmosféře. Nerostou v médiu s obsahem 6,5% NaCl a na krevním agaru tvoří α hemolýzu. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 39,9 41,1 mol%. Enterococcus malodoratus Enterococcus malodoratus byl izolován ze sýru Gouda (Collins et al. 1984). Buňky nerostou v teplotě 45ºC, produkují H 2S, některé kmeny produkují sliz. Své jméno druh získal podle specifického zápachu, který buňky vytvářejí. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí 40,0 41,0 mol%. Enterococcus moraviensis Enterococcus moraviensis byl podobně jako výše zmíněný Enterococcus haemoperoxidus izolován z povrchových vod. Kmeny byly izolovány z různých lokalit na území Moravy (odtud druhové pojmenování E. moraviensis ) (Švec et al. 2001). Vlastnosti druhu E. moraviensis odpovídají základní charakteristice rodu a obsah C+G v DNA je 36,3 mol%.
28 Enterococcus mundtii
Enterococcus mundtii byl izolován z rostlinného materiálu a také z půdy (Collins et al. 1986). Své druhové jméno nese E. mundtii podle amerického mikrobiologa J.O. Mundta, který se zabýval studiem tohoto rodu. Buňky produkují žlutý pigment a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí je 38,0 39,0 mol%. Enterococcus pallens
Enterococcus pallens byl izolován z klinických vzorků pacienta trpícího peritonitidou (Tyrrell et al. 2002). E. pallens produkuje světle žlutý pigment, díky kterému získal své druhové jméno pallens žlutavý. Enterococcus phoeniculicola
Enterococcus phoeniculicola nese své druhové jméno podle dudkovce stromového (Phoeniculus purpureus ), z jehož uropygiální žlázy byl poprvé izolován (Law Brown a Meyers 2003). Vzorky byly odebrány celkem šesti dospělým jedincům na území Morgan Bay v provincii Eastern Cape v Jižní Africe. Bylo dokázáno, že přítomnost těchto bakterií v sekretu uropygiální žlázy ovlivňuje jeho barvu, viskozitu i zápach. Buňky E. phoeniculicola nerostou v médiu s 6% obsahem NaCl ani 40% obsahem žluči, optimálně rostou v rozmezí teplot 30 37°C. Enterococcus pseudoavium Enterococcus pseudoavium byl izolován ze vzorků izolovaných z mastitid krav (Collins et al. 1989). Buňky E. pseudoavium jsou α hemolytické a obsah C+G v DNA je 40,0 mol%. Ostatní fyziologické i biochemické vlastnosti odpovídají obecné charakteristice rodu. Enterococcus raffinosus
Enterococcus raffinosus byl popsán na základě výsledků testů izolátů klinického původu (Collins et al. 1989). Druhové jméno E. raffinosus odkazuje na schopnost druhu
29 utilizovat rafinózu. Buňky slabě rostou v 10ºC a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí je 39,0 40,0 mol%. Enterococcus ratti
Enterococcus ratti byl izolován ze střev a feces krys s trávicími obtížemi (Teixeira et al. 2001). Buňky E. ratti jsou na agaru s beraní krví α hemolytické nebo nehemolytické. Dobře rostou v rozmezí teplot 10 45°C a s antisérem skupiny D reagují slabě. Enterococcus saccharolyticus Enterococcus saccharolyticus byl izolován z krav a slaměné podestýlky (Rodrigues a Collins 1990). Buňky E. saccharolyticus jsou D antigen negativní a druhové jméno je odvozeno od schopnosti druhu utilizovat sacharózu. Enterococcus silesiacus
Enterococcus silesiacus byl podobně jako E. moraviensis a E. haemoperoxidus izolován z povrchových vod (vzorky byly odebírány na území Slezska, odtud původ druhového jména E. silesiacus ) (Švec et al. 2006). Buňky E. silesiacus rostou při 10°C, ale ne při 45°C, slabě rostou také v médiu s 6,5% NaCl a při pH 9,6. Při kultivaci na krevním agaru poskytují pozitivní výsledky katalázového testu. Obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí je 35,6 36,7 mol%. Enterococcus sulfureus Enterococcus sulfureus byl izolován z rostlin (Martinez Murcia a Collins 1991). Buňky vytváří žlutý pigment, podle čehož byl také tento druh pojmenován ( sulphur síra a její žlutá barva). Nerostou v 45ºC a obsah C+G v DNA je 38,0 mol%.
30 Enterococcus termitis
Enterococcus termitis byl poprvé izolován ze střev termitů (odtud původ jeho druhového jména) (Švec et al. 2006). Buňky E. termitis rostou v rozmezí teplot 10 45°C a obsah C+G v DNA je 37,1 mol%. Enterococcus villorum Enterococcus villorum byl izolován ze střev selat pocházejících z Kanady, USA a Koreje, u nichž byl považován za možné etiologické agens průjmových onemocnění (Vancanneyt et al. 2001). Buňky jsou α hemolytické a obsah C+G v DNA se pohybuje v rozmezí je 35,1 35,3 mol%. Druhové jméno E. villorum je odvozeno od anatomického termínu villus označujícího vláskové struktury (klky) v tenkém střevě, na které tento druh adheruje. Fylogenetické členění rodu Enterococcus Druhy rodu Enterococcus můžeme na základě analýzy 16S rDNA rozdělit do několika fylogenetických skupin. V rámci jednotlivých skupin jsou řazeny druhy, které vykazují velkou podobnost 16S rRNA genu, a shodují se také v určitých fyziologických a růstových vlastnostech i biochemické aktivitě (Devriese et al. 1993). Na konci této kapitoly je zařazeno zobrazení fylogenetického stromu (obr.č. 3), který byl vytvořen na základě sekvencování 16S rDNA a publikován v rámci nejnovějšího validního popisu druhu E. camelliae roku 2007. V tomto zobrazení nejsou uvedeny pouze dva dosud popsané druhy: E. canis , který patří do skupiny E. faecium , a E. pallens tvořící samostatnou fylogenetickou větev. Skupina druhu Enterococcus faecalis Do této skupiny jsou řazeny druhy E. caccae , E. faecalis , E . haemoperoxidus , E. moraviensis , E. silesiacus a E. termitis (Sukontasing et al. 2007). Vlastnosti jednotlivých druhů této skupiny odpovídají obecným vlastnostem rodu Enterococcus .
31 Skupina druhu Enterococcus faecium
Do této skupiny patří E. canis , E. durans , E. faecium , E. hirae , E. mundtii , E. ratti a E. villorum (Devriese et al. 1993; Sukontasing et al. 2007). Tyto druhy rostou v rozmezí teplot 10 45ºC (E. canis pouze v rozmezí 25 42ºC), v médiu s obsahem 6,5% NaCl a pH 9,6. Jsou rezistentní k 0,04% azidu sodného. Skupina druhu Enterococcus avium Do této skupiny patří druhy E. avium , E. devriesei , E. gilvus , E. malodoratus , E. pseudoavium a E. raffinosus (Devriese et al. 1993; Sukontasing et al. 2007). Tyto druhy tvoří menší kolonie než ostatní druhy rodu Enterococcus . E. avium , E. devriesei a E. pseudoavium na krevním agaru vytvářejí výraznou viridaci. Skupina druhu Enterococcus gallinarum Do třetí skupiny patří druhy E. casseliflavus a E. gallinarum (Devriese et al. 1993). Oba tyto druhy jsou pohyblivé. Skupina druhu Enterococcus cecorum Do této skupiny patří druhy E. cecorum a E. columbae , které vykazují slabý růst selektivních médiích (Devriese et al. 1993). Buňky obou druhů nerostou v médiu s obsahem 6,5% NaCl a jsou D antigen negativní. Druhy tvořící samostatné fylogenetické větve Mimo výše uvedené skupiny jsou řazeny druhy E. aquimarinus E. asini , E. camelliae , E. canintestini , E. dispar , E. hermanniensis , E. italicus , E. pallens , E. phoeniculicola , E. saccharolyticus a E. sulfureus (Sukontasing et al. 2007).
32 Obr.č. 3: Fylogenetický strom sestavený podle výsledků sekvencování 16S rDNA znázorňující vztahy příbuznosti druhů rodu Enterococcus . (upraveno podle Sukontasing et al. 2007)
33 Výskyt enterokoků ve vodě Enterokoky byly již od počátku minulého století identifikované jako indikátory fekálního znečištění vod (Tandon et al. 2007). Jejich výskyt se testuje ve vodách pitných, užitkových, odpadních, ale i v rekreačních přírodních nádržích. Při určování kontaminace vod se tradičně používá metoda počítání kolonií tvořících jednotky (KTJ; CFU colony forming units), která se stanovuje v jednotkách KTJ.ml 1. Výskyt enterokoků ve vodě je úzce propojen s jejich výskytem v půdě, na rostlinách i v živočiších. Druhové zastoupení rodu Enterococcus ve vodním prostředí je rozmanité a původ izolovaných druhů je často nejasný. Indikátorem znečištění je druh E. faecalis , který se do vody dostává např. při fertilizaci půdy hnojivy přírodního původu nebo přímou kontaminací feces člověka nebo živočichů (Wheeler et al. 2002). Podobně se do vodního prostředí mohou dostat i jiné druhy např. E. faecium nebo E. hirae . V rámci jedné z mnoha studií, zabývajících se izolací enterokoků z vodního prostředí, byly izolovány z odpadních a z rekreačních vod druhy E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans a E. mundtii , přičemž poslední ze jmenovaných druhů není řazen mezi klasické indikátory fekálního znečištění (Junco et al. 2001). V jiné práci byly mezi izoláty z vody identifikovány mimo klasické druhy (E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans ) také druhy E. casseliflavus , E. gallinarum a E. raffinosus (Pinto et al. 1999). Enterokoky se vyskytují jak ve sladké, tak ve slané vodě (del Mar Lleò et al. 2005). Druhy primárně nalezené ve sladkovodním prostředí jsou E. haemoperoxidus , E. moraviensis a E. silesiacus (Švec et al. 2001; 2006). Z mořské vody byl izolován druh E. aquimarinus (Švec et al. 2005a). Kromě tohoto druhu však byly z mořské vody izolovány i jiné druhy enterokoků. V rámci studie provedené v Californii byl zkoumán výskyt enterokoků v mořské vodě, v sedimentech v hloubce 10 metrů, při pobřeží a také ve vodě i sedimentech sezónně zaplavovaných oblastí ústí řek (Ferguson et al. 2005). Zde se společně s koliformními bakteriemi vyskytovaly také druhy E. faecalis , E. faecium a E. hirae . Zajímavé jsou mechanismy přežití enterokoků v nepříznivých podmínkách znečištěných odpadních vod, kde tyto bakterie přežívají, ale ztrácejí schopnost se rozmnožovat (Pinto et al. 1999). V případech, kdy na ně působí jeden nepříznivý faktor (např. nedostatek utilizovatelných substrátů), buňky enterokoků hladoví, snižují metabolickou aktivitu na minimum, a tak přežívají dokud se podmínky nezlepší (del Mar Lleò et al. 2005). Jiným mechanismem je přechod buněk do tzv. nekultivovatelného stavu (viable but
34 nonculturable VBNC), který bakterie aktivují v případě působení více stresových faktorů. VBNC stav byl popsán např. u E. faecalis a je definován jako stav, kdy mikroorganismy ztrácejí schopnost kultivace, ale zachovávají faktory virulence. Po rozšíření do příznivých podmínek jsou schopné zpětně nastartovat metabolismus a znovu se začít rozmnožovat. Díky ztrátě schopnosti kultivace ve VBNC stavu jsou pro indikaci znečištění nepoužitelné kultivační metody stanovení KTJ. Proto se při indikaci znečištění využívají molekulárně biologické metody, které jsou aplikovatelné i u nekultivovatelných forem mikroorganismů. Výskyt enterokoků v půdě Půda patří s ohledem na výskyt enterokoků k nejméně prozkoumaným prostředím. Do půdy se tyto bakterie dostávají při fertilizaci přírodními hnojivy (zejména druhy E. faecalis a E. faecium ), kontaminací z vody, zvířat nebo z člověka (Facklam 2002). Přirozený výskyt enterokoků v půdě je úzce spjat s jejich výskytem na rostlinách (Mundt 1961). Z rostlin se enterokoky rozšiřují do půdního prostředí působením větru, deště, hmyzu i gravitace. Výskytem enterokoků na rostlinách a v půdě se zabýval J.O. Mundt, který izoloval enterokoky z rostlinných pupenů, květů a z půdy. Půda pocházela jak z obdělávaných polí, tak i z oblastí přírodních bez zásahu člověka. Ve dvanácti z celkových sedmnácti vzorků půdy izoloval enterokoky v počtu 10 100 KTJ na 1 g půdy. Izolací enterokoků z půdního prostředí se také zabývali Medrek a Litsky, kteří svůj výzkum prováděli v lokalitě Western Massachusetts (Medrek a Litsky 1960). V této oblasti nebyla v době izolace půda šedesát let obdělávaná člověkem a předpokládal se tedy minimální vliv zemědělství na složení půdní mikroflóry. Spolu s enterokoky byly ve vzorcích identifikovány také koliformní bakterie. Výskyt enterokoků na rostlinách Z rostlin bylo izolováno několik druhů rodu Enterococcus : E. camelliae (Sukontasing et al. 2007), E. casseliflavus (Collins et al. 1984), E. mundtii (Collins et al. 1986) a E. sulfureus (Martinez Murcia a Collins 1991). Výskyt enterokoků na rostlinách, podobně jako jejich výskyt v půdě, patří mezi nejméně prozkoumaná prostředí vůbec. Jednou z prací, které se výskytem enterokoků na rostlinách zabývají, je článek J.O. Mundta publikovaný roku 1962 (Mundt 1962a). Vzhledem
35 k tomu, že byl publikován mnoho let před validním popisem rodu Enterococcus , i druhy, které v rámci práce izoloval a identifikoval, neodpovídají dnešnímu taxonomickému zařazení. Mundt zkoumal izoláty z nižších rostlin a z květů vyšších krytosemenných rostlin v lokalitě Great Smoky Mountains National Park, USA. Vzorky sbíral v období od května do září a na základě získaných údajů uvedl, že výskyt enterokoků na rostlinách závisí na druhu rostlin, na teplotě (čím byly teloty vyšší, tím více izolátů enterokoků identifikoval), na slunečním záření v dané lokalitě (větší výskyt zaznamenal v prosluněných oblastech než v hlubokém lese) a na aktivitě hmyzu (nektar sající hmyz přenáší enterokoky vyskytující se na dužnatých šťavnatých orgánech rostlin). Výskyt enterokoků na rostlinách zkoumal také T. Müller, a to na polích nížinných oblastí na severo východě Německa (Müller et al. 2001). Vzorky byly sbírány v průběhu jara a léta roku 1998 na polích s vysetými pícninami, které však nebyly spásány, a tak byl zásah člověka v lokalitě eliminován na minimum. Izoláty byly zkoumány pomocí molekulárních metod sekvencování 16S a 23S rDNA a analýzy buněčných proteinů pomocí SDS PAGE. V rámci této práce byly identifikovány druhy E. faecalis , E. faecium , E. casseliflavus , E. mundtii a E. sulfureus , ale celou řadu izolátů se identifikovat nepodařilo. Výskyt enterokoků v živočiších Výskyt v tomto prostředí, jak již bylo v předchozích kapitolách práce uvedeno, je velmi dobře prozkoumaný. Enterokoky byly nalezeny v celé řadě živočišných druhů (např. koní, oslů, skotu, prasat, psů, drůbeže, divokých druhů ptáků i bezobratlých). Jedna z prvních prací, zabývající se výskytem enterokoků v různých živočišných druzích, byla práce J.O. Mundta (Mundt 1962b). Podobně jako rostlinné vzorky, tak i izoláty z feces savců, plazů a ptáků pocházely z lokality Great Smoky Mountains National Park, USA. Výskyt enterokoků popsal Mundt například u veverek ( Tamias siurus ), myší (Clethronomys gapperi ), netopýrů ( Myotus lucifugus ) a masožravých savců lišek ( Urocyon cineroargentius ), medvědů ( Euarctus americanus ), mývalů ( Procyon lotor ), skunků ( Mephitis sp.) nebo kanců ( Sus scrofa ). Přítomnost enterokoků se prokázala také u několika druhů plazů i ptáků. Ve své práci Mundt poukazuje na závislost výskytu enterokoků na typu stravy. Enterokoky se téměř nevyskytovaly u striktně býložravých živočichů nebo u živočichů žijících pod povrchem půdy. Naproti tomu byl jejich výskyt běžný v tělech větších všežravých živočichů.
36 Enterokoky najdeme mimo obratlovce také v tělech bezobratlých živočichů např. plžů (Charrier et al. 1998). Při studiu složení střevní mikroflóry měkkýšů byl jedním ze zkoumaných zástupců také plž Helix aspersa , z jehož střeva byl izolován Enterococcus casseliflavus , který zde zaujímal dominantní postavení. E. casseliflavus pravděpodobně přispívá k metabolické aktivitě Helix aspersa tím, že produkuje kyselinu mléčnou. Tyto domněnky však vyžadují další zkoumání. Výskyt enterokoků byl zkoumán také u zástupců hmyzu, kde se předpokládá úzká souvislost s rostlinnými druhy enterokoků, které se mezi rostlinami a hmyzem přenášejí při sání nektaru z dužnatých částí rostlin (Martin a Mundt 1972). Enterokoky byly izolovány ze zástupců hmyzu řádů Coleoptera , Hymenoptera a Lepidoptera , pocházejících z prostředí lesů a luk. Enterokoky se na rostlinách objevují až s příchodem jara a jejich vazba s nektar sajícím hmyzem je tedy zřejmá. Výskyt enterokoků v potravinách Nejvýznamnější roli hrají enterokoky v procesu fermentace mléčných a masných výrobků, ale byly také izolovány např. ze zeleniny, ryb nebo z černých oliv (Hugas et al. 2003). Výskyt enterokoků v mléčných výrobcích Enterokoky se v mléčných výrobcích vyskytují běžně (Garg a Mital 1991). Byly izolovány z různých druhů sýrů (zejména zrajících), z másla, zmrzliny, smetany, produktů s jogurtovou kulturou, ale především z čerstvého, pasterizovaného i sušeného mléka. Mléko a mléčné produkty kontaminují enterokoky např. díky znečištěné vodě nebo nástrojům ve výrobě, do čerstvého mléka se dostávají přímou cestou z dobytka, z hnoje nebo díky hmyzu. Mléko je pro růst enterokoků velmi vhodným prostředím (Garg a Mital 1991). Enterokoky jsou schopné dekarboxylovat tyrozin a histidin a následně produkovat vlastní aminy, rozkládají citrát a vyznačují se také proteolytickou a lipolytickou aktivitou (Foulquiè Moreno et al. 2006). Jejich metabolické aktivity se využívá při přípravě tradičních sýrů z ovčího, kozího a méně kravského mléka (Foulquiè Moreno et al. 2006). Tyto sýry jsou vyráběny pomocí procesu fermentace zejména v zemích jižní Evropy jako jsou Itálie, Řecko, Španělsko a státy
37 Balkánského poloostrova. Enterokoky jsou schopné utilizovat citrát, což vede k tomu, že konečným produktem kvašení není typicky kyselina mléčná, ale směs acetaldehydu, diacetylu, acetoinu a 2,3 butandiolu. Právě tyto látky, které enterokoky produkují, propůjčují sýrům typické aroma. Z proteolytických vlastností enterokoků je důležitá zejména degradace kaseinu, která ovlivňuje strukturu, aroma a chuť sýra (Foulquiè Moreno et al. 2006). Podobně také lipolytická aktivita těchto mikroorganismů ovlivňuje aroma a strukturu výrobků. Enterokoky jsou díky svým metabolickým drahám zdrojem mastných kyselin s krátkým řetězcem, které konvertují v aromatické ketony, a také jsou schopné oxidovat mastné kyseliny, což vede k tvorbě vysoce aromatických nenasycených aldehydů. Produkce aromatických sloučenin je specifická pro jednotlivé kmeny a je ovlivněna výrobními podmínkami. Přímo z mléka nebo mléčných výrobků byly primárně izolovány druhy E. durans , E. italicus a E. malodoratus (Collins et al. 1984; Fortina et al. 2004). Jako startovací kultury se však využívají zejména kmeny druhu E. faecalis (Hugas et al. 2003). Z mléčných produktů byly také izolovány kmeny E. faecalis a E. casseliflavus (Franz et al. 2003). Výskyt enterokoků v masných výrobcích Podobně jako mléko kolonizují enterokoky také čerstvé i upravené maso a masné výrobky (Giraffa 2002). Využívají se při výrobě tradičních fermentovaných masných výrobků jako jsou např. italské salámy nebo německé párky. Proces výroby těchto produktů je velmi podobný. Výrobek z čerstvého masa nejprve podléhá přirozené fermentaci za působení bakteriálních kultur, poté se zasolí nebo vyudí a následně konzumuje. V těchto tepelně neopracovaných výrobcích enterokoky nejen přežívají, ale jsou schopné se i rozmnožovat. Díky značné termotoleranci (např. E. faecium přežívá v teplotě 68ºC po dobu 30 minut) kontaminují enterokoky také tepelně upravené výrobky jako např. konzervované maso, kde působí jako původce kažení. Při procesu fermentace působí enterokoky společně s jinými bakteriemi (nejčastěji s laktobacily a koaguláza negativními stafylokoky) (Hugas et al. 2003). Enterokoky produkují bakteriociny, které mají antimikrobní účinky, a jsou tedy schopné potlačovat růst jiných, často patogenních, druhů (např. listerií, klostridií nebo laktobacilů produkujících sliz). Díky těmto vlastnostem můžeme enterokoky považovat také za ochranné činitele v tomto typu produktů.
38 Nejvíce se ve výrobě využívá kmenů E. faecium (např. kmen CTC492), ale z masa a masných výrobků izolujeme také např. druhy E. faecalis nebo E. hermanniensis (Koort et al. 2004; Hugas et al. 2003). Enterokoky jako probiotika Probiotika jsou potravinové doplňky obsahující živou bakteriální kulturu a příznivě ovlivňující hostitele tím, že vytvářejí a udržují rovnováhu mikroflóry v jeho těle (Fuller 1989). Probiotika jsou nejčastěji součástí mléčných výrobků (např. jogurtů, fermentovaných i nefermentovaných mlék), kojeneckých výživ a farmaceutických preparátů (např. komerčně dostupných potravinových doplňků) (Foulquiè Moreno et al. 2006). Nejčastěji používanými bakteriemi v probiotikách jsou zástupci rodů Lactobacillus a Bifidobacterium , ale také Leuconostoc, Streptococcus, Propionibacterium, Pediococcus, Sporolactobacillus, Escherichia, Bacillus a Enterococcus . Enterokoky jsou využívány jako součást probiotik určených nejen člověku, ale i zvířatům (zejména ve veterinární léčbě nebo v hospodářských chovech) (Foulquiè Moreno et al. 2006). Příkladem takového kmene je E. faecium SF 68, který se používá k prevenci výskytu střevních onemocnění asociovaných s dlouhodobým užíváním antibiotik, k léčbě průjmových onemocnění u dětí i jako doplněk stravy u psů. Používání a význam enterokoků jako probiotik je mírně kontroverzním tématem (Foulquiè Moreno et al. 2006). Výsledky některých studií jasně potvrzují fakt, že enterokoky mohou působit příznivě na hostitelský organismus. Na druhou stranu se velmi diskutuje o jejich rozsáhlé rezistenci k antibiotikům a jejím možném rozšíření např. do jiných druhů bakterií gastrointestinálního traktu, které představuje reálné nebezpečí především pro oslabené jedince. Klinický význam enterokoků
Jako jiné mikroorganismy, které tvoří součást mikroflóry zdravých lidí, jsou i enterokoky potenciálními patogeny a etiologickým agens široké škály infekčních onemocnění člověka (Jett et al. 1994). U většiny lidí se za normálních okolností nacházejí ve střevech v množství přibližně 10 8 KTJ v 1 g feces (Gilmore et al. 2002).
39 Nejčastěji způsobují infekce močopohlavního systému, bakteriémie, endokarditidy, peritonitidy, infekce měkkých tkání pánevní oblasti a pooperačních ran (Kayser 2003). Vzácně způsobují meningitidy u dospělých nebo infekce respiračního traktu. Vyskytují se také na kůži člověka (viz obr.č. 4 níže). Spolu s jinými bakteriemi často způsobují infekce polymikrobního charakteru (Jett et al. 1994). Nejčastějšími druhy způsobující infekce jsou E. faecalis (v 80 90% případů), E. faecium (v 10 15% případů) a dále např. E. durans , E. avium , E. gallinarum , E. hirae , E. mundtii nebo E. raffinosus . Enterokoky také způsobují vážné nosokomiální infekce (Murray 1990). Tyto infekce se vyskytují v nemocnicích nejčastěji u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů (např. u pacientů se zavedeným katetrem, u pacientů s oslabeným imunitním systémem, u pacientů ošetřovaných na jednotce intenzivní péče nebo u pacientů po transplantacích). Nebezpečí enterokoků spočívá v jejich schopnosti rezistence k nepříznivým podmínkám. Mohou přežívat např. na povrchu nástrojů nebo v prostředí nemocničních pokojů a odtud pak kolonizovat a infikovat pacienty. Patogenita enterokoků je dána rezistencí k širokému spektru antibiotik a dalšími faktory virulence (Foulquiè Moreno et al. 2006). Enterokoky jsou přirozeně rezistentní např. k vankomycinu ( E. gallinarum ), streptograminu ( E. faecalis ), dále k cefalosporinům, aminoglykosidům, linkosamidům, isoxazolylpenicilinům, monobactamům nebo polymyxinům (Foulquiè Moreno et al. 2006). Mezi získané rezistence patří např. rezistence k ampicilinu (hlavně u E. faecium ), tetracyklinům, chloraminifenikolu, aminoglykosidům, trimetoprim/sulfametoxazolu, makrolidům a streptograminům. Nejvýznamnější je však rezistence ke glykopeptidům a zejména potom k vankomycinu. Právě vankomycin rezistentní enterokoky (VRE) jsou hlavními původci nosokomiálních infekcí. Mezi významné faktory virulence enterokoků patří produkce bakteriocinů, cytolysinu, adhesinů a želatinázy (Foulquiè Moreno et al. 2006). Cytolysin lyzuje eukaryotické buňky, adhesiny usnadňují adherenci k různým typům buněk (např. k makrofágům nebo epiteliálním buňkám střeva) a želatináza hydrolyzuje želatinu, kolagen, hemoglobin i další látky bílkovinné povahy. Nebezpečí infekcí způsobovaných enterokoky v posledních desetiletích značně stoupá (Kayser 2003). To je způsobeno širokou škálou prostředí, v nichž se enterokoky vyskytují, a také jejich rezistencí k vnějším podmínkám. Tak je usnadněn proces jejich šíření např. z hnojiv přírodního charakteru do půdy, odtud do vody nebo k živočichům, do potravin a zpět k člověku. Výzkum se dnes zaměřuje zejména na přesný a důkladný výběr kmenů enterokoků,
40 které se mohou využívat jako probiotika nebo v potravinářském průmyslu. Takové kmeny nesmějí disponovat faktory virulence, které by jim umožnily permanentně kolonizovat střevní trakt a působit jako infekční agens. Obr.č. 4: E. faecium (červené bakteriální buňky) – fotografie výskytu enterokoků na epidermis člověka ze skenovacího elektronového mikroskopu (SEM). ( upraveno podle www.sflorg.com/sciencenews/scn052306_02.html)
41 6. Závěr
Tato bakalářská práce je kompilací dosud publikovaných článků a studií vztahujících se k tématu taxonomie, ekologie a významu rodu Enterococcus . Bylo publikováno mnoho prací zabývajících se klinickým významem enterokoků a nepoměrně méně těch, které se vyjadřují k jejich výskytu v prostředí, např. v půdě nebo na rostlinách. Vzhledem k vysoké rychlosti, s jakou se mezi kmeny enterokoků šíří rezistence k antibiotikům, má studium výskytu enterokoků v různých prostředích praktický význam. Zkoumání takových prostředí přispívá k poznání zákonitostí vzniku a šíření rezistencí k antibiotikům mezi environmentálními kmeny enterokoků, kmeny působícími jako patogeny a kmeny průmyslově využívanými. Enterokoky jsou bakterie se zajímavými vlastnostmi, které mohou být člověku prospěšné, přesto však především zůstávají v popředí zájmu klinické mikrobiologie jako mikroorganismy se značnou virulencí a potenciálem působit jako infekční agens. Tato bakalářská práce je proto věnována především významu a výskytu enterokoků v různých environmentálních zdrojích. První kapitola práce je věnována tématu taxonomie. Zde je nejprve zpracována historická i současná taxonomie rodu Enterococcus a v následujících kapitolách jsou uvedeny základní charakteristické vlastnosti enterokoků a příbuzných rodů z čeledi Enterococcaceae . Druhá kapitola pojednává o metodách izolace a identifikace enterokoků, jsou zde uvedeny základní izolační a kultivační média i typy biochemických testů a molekulárně biologických metod užívaných při identifikaci a typizaci izolátů enterokoků. Ve třetí velké kapitole jsou nejprve zpracovány charakteristiky jednotlivých druhů rodu Enterococcus a dále výskyt a význam enterokoků v jednotlivých prostředích ve vodě, v půdě, na rostlinách, v živočiších a v potravinách. Poslední krátká podkapitola v závěru práce shrnuje základní informace z oblasti klinické mikrobiologie.
42 7. Seznam literatury Bailey L., Collins M.D. (1982): Reclassification of ' Streptococcus pluton' (White) in a new genus Melissococcus , as Melissococcus pluton nom. rev.; comb. nov. J. Appl. Bacteriol. 53: 215 217. Carvalho M.S., Shewmaker P.L., Steigerwalt A.G., Morey R.E., Sampson A.J., Joyce K., Barrett T.J., Teixeira L.M., Facklam R.R. (2006): Enterococcus caccae sp. nov., isolated from human stools. Int. J. Syst. Bacteriol. 56: 1505 1508. Collins M.D., Facklam R.R., Farrow J.A.E., Williamson R. (1989): Enterococcus raffinosus sp. nov., Enterococcus solitarius sp. nov. and Enterococcus pseudoavium sp. nov. FEMS Microbiol. Lett. 57: 283 288. Collins M.D., Farrow J.A.E., Jones D. (1986): Enterococcus mundtii sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 8 12.
Collins M.D., Jones D., Farrow J.A.E., Kilpper Bälz R., Schleifer K.H. (1984): Enterococcus avium nom. rev., comb. nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb. nov.; E. durans nom. rev., comb. nov.; E. gallinarum comb. nov.; E. malodoratus sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 220 223.
Collins M.D., Rodrigues U.M., Pigott N.E., Facklam R.R. (1991): Enterococcus dispar sp. nov. a new Enterococcus species from human sources. Lett. Appl. Microbiol. 12: 95 98.
Collins M.D., Williams A.M., Wallbanks S. (1990): The phylogeny of Aerococcus and Pediococcus as determined by 16S rRNA sequence analysis: description of Tetragenococcus gen. nov. FEMS Microbiol. Lett. 70: 255 262. Coyette J., Hancock L.E. (2002): Enterococcal Cell Wall. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 177 218. ASM Press, Washington, D.C.
De Graef E.M., Devriese L.A., Vancanneyt M., Baele M., Collins M.D., Lefebre K., Swings J., Haesebrouck F. (2003): Description of Enterococcus canis sp. nov. from dogs and reclassification of Enterococcus porcinus Teixeira et al. 2001 as a junior synonym of Enterococcus villorum Vancanneyt et al. 2001. Int. J. Syst. Bacteriol. 53: 1069 1074. de Vaux A., Laguerre G., Diviès Ch., Prévost H. (1998): Enterococcus asini sp. nov. isolated from the caecum of donkeys ( Equus asinus ). Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 383 387.
Deibel R.H. (1964): The group D Streptococci. Bacteriol. Rev. 28: 330 366. del Mar Lleò M., Bonato B., Benedetti D., Canepari P. (2005): Survival of enterococcal species in aquatic environments. FEMS Microbiol. Ecol. 54: 189 196. Devriese L.A., Ceyssens K., Rodrigues U.M., Collins M.D. (1990): Enterococcus columbae , a species from pigeons intestines. FEMS Microbiol. Lett. 71: 247 252.
Devriese L.A., Collins M.D., Wirth R. (1992): The Genus Enterococcus . In: Balows A., Trüper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.H. (eds.), The Prokaryotes: a Handbook on
43 the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications, 1465 1481. Springer Verlag, New York.
Devriese L.A., Dutta G.N., Farrow J.A.E., Van de Kerckhove A., Phillips B.A. (1983): Streptococcus cecorum , a new species isolated from chickens. Int. J. Syst. Bacteriol. 33: 772 776.
Devriese L.A., Pot B., Collins M.D. (1993): Phenotypic identification of the genus Enterococcus and differentiation of phylogenetically distinct enterococcal species and species groups. J. Appl. Bacteriol. 75: 399 408.
Domig K.J., Mayer H.K., Kneifel W. (2003): Methods for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 2 3: 147 188.
Ennahar S., Cai Y. (2005): Biochemical and genetic evidence for the transfer of Enterococcus solitarius Collins et al. 1989 to the genus Tetragenococcus as Tetragenococcus solitarius comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 55: 589 592. Facklam R.R., Carvalho M.S., Teixeira L.M. (2002): History, Taxonomy, Biochemical Charakteristics, and Antibiotic Susceptibility Testing of Enterococci. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 1 54. ASM Press, Washington, D.C.
Facklam R.R., Sahm D.F., Teixeira L.M. (1999): Enterococcus . In: Murray P.R., Baron E. J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H. (eds.), Manual of Clinical Microbiology, 7: 297 305. ASM Press, Washington D.C. Farrow J.A., Collins M.D. (1985): Enterococcus hirae , a new species that includes amino acid assay strain NCDO 1258 and strains causing growth depression in young chickens. Int. J. Syst. Bacteriol. 35: 73 75. Ferguson D.M., Moore D.F., Getrich M.A., Zhowandai M.H. (2005): Enumeration and speciation of enterococci found in marine and interdial sediments and coastal water in southern California. J. Appl. Microbiol. 99: 598 608.
Fortina M.G., Ricci G., Mora D., Manachini P.L. (2004): Molecular analysis of artisanal Italian cheeses reveals Enterococcus italicus sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 54: 1717 1721. Foulquiè Moreno M.R., Sarantinopoulos P., Tsakalidou E., De Vuyst L. (2006): The role and application of enterococci in food and health. Int. J. Syst. Bacteriol. 106: 1 24. Franz Ch.M.A.P., Stiles M.E., Schleifer K.H., Holzapfel W.H. (2003): Enterococci in foods a conundrum for food safety. Int. J. Syst. Bacteriol. 88: 105 122. Fuller R. (1989): Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: 365 378. Garg S.K., Mital B.K. (1991): Enterococci in Milk and Milk Products. Crit. Rev. Microbiol. 18: 15 45.
44 Gilmore M.S., Coburn P.S., Nallapareddy S.R., Murray B.E. (2002): Enterococcal Virulence. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 301 354. ASM Press, Washington, D.C. Giraffa G. (2002): Enterococci from foods. FEMS Microbiol. Rev. 26: 163 171.
Higashiguchi D.T., Husseneder C., Grace J.K., Berestecky J.M. (2006): Pilibacter termitis gen. nov., sp. nov., a lactic acid bacterium from the hindgut of the Formosan subterranean termite ( Coptotermes formosanus ). Int. J. Syst. Bacteriol. 56: 15 20. Hugas M., Garriga M., Aymerich M.T. (2003): Functionality of enterococci in meat products. Int. J. Food Bacteriol. 88: 223 233. Huycke M.M. (2002): Physiology of Enterococci. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 133 175. ASM Press, Washington, D.C. Charrier M., Combet Blanc Y., Ollivier B. (1998): Bacterial flora in the gut of Helix aspersa (Gastropoda Pulmonata): evidence for a permanent population with a dominant homolactic intestinal bacterium, Enterococcus casseliflavus . Can. J. Microbiol. 44: 20 27. Jett B.D., Huycke M.M., Gilmore M.S. (1994): Virulence of enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 7: 462 478. Junco M.T.T., Martín M.G., Toledo M.L.P., Goméz P.L., Barrasa J.L.M. (2001): Identification and antibiotic resistance of faecal enterococci isolated from water samples. Int. J. Hg. Envin. Health. 203: 363 368. Kayser F.H. (2003): Safety aspects of enterococci from the medical point of view. Int. J. Food Bacteriol.88: 255 262.
Koort J., Coenye T., Vandamme P., Sukura A., Björkroth J. (2004): Enterococcus hermanniensis sp. nov., from modified atmosphere packaged broiler meat and canine tonsils. Int. J. Syst. Bacteriol. 54: 1823 1827.
Kühn I., Iversen A., Burman L.G., Olsson Liljequist B., Franklin A., Finn M., Aarestrup F., Seyfarth A.M., Blanch A.R., Vilanova X., Taylor H., Caplin J., Moreno M.A., Dominguez L., Herrero I.A., Möllby R. (2003): Comparison of enterococcal poulations in animals, humans, and the environment a European study. Int. J. Food Microbiol. 88: 133 145.
Law Brown J., Meyers P. (2003): Enterococcus phoeniculicola sp.nov., a novel member of the enterococci isolated from the uropygial gland of the Red billed Woodhoopoe, Phoeniculus purpureus . Int. J. Syst. Bacteriol. 53: 683 685.
Lawson P.A., Collins M.D., Falsen E., Foster G. (2006): Catellicoccus marimammalium gen. nov., sp. nov., a novel Gram positive, catalase negative, coccus shaped bacterium from porpoise and grey seal. Int. J. Syst. Bacteriol. 56: 429 432.
45 Lawson P.A., Foster G., Falsen E., Ohlen M., Collins M.D. (2000): Atopobacter phocae gen. nov., sp. nov., a novel bacterium isolated from common seal. Int. J. Syst. Bacteriol. 50: 1755 1760.
Lee M., Kim M.K., Vancanneyt M., Swings J., Kim S., Kang M.S., Lee S. (2005): Tetragenococcus koreensis sp. nov., a novel rhamnolipid producing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 55: 1409 1413.
Manero A., Blanch A.R. (1999): Identification of Enterococcus spp. with a biochemical key. Appl. Env. Microbiol. 65: 4425 4430. Martin J.D., Mundt J.O. (1972): Enterococci in insects. Appl. Microbiol. 24: 575 580. Martinez Murcia A.J., Collins M.D. (1991): Enterococcus sulfureus , a new yellow pigmented Enterococcus species. FEMS Microbiol. Lett. 80: 69 74. McSahn W.M., Shankar N. (2002): The Genom of Enterococcus faecalis V583: a Tool for Discovery. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 409 415. ASM Press, Washington, D.C. Medrek T.F., Litsky W. (1960): Comparative incidence of coliform bacteria and enterococci in undisturbed soil. Appl. Microbiol. 8: 60 63. Müller T., Ulrich A., Ott E. M., Müller M. (2001): Identification of plant associated enterococci. J. Appl. Microbiol. 91: 268 278. Mundt J.O. (1961): Occurence of enterococci: bud, blossom, and soil studies. Appl. Microbiol. 9: 541 544. Mundt J.O. (1962a): Occurence of enterococci on plants in a wild environment. Appl. Microbiol. 11: 141 144. Mundt J.O. (1962b): Occurence of enterococci in animals in a wild environment. Appl. Microbiol. 11: 136 140.
Mundt J.O. (1986): Enterococci. In: Sneath H.A.P., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1063 1065. Williams&Wilkins, Baltimore, USA. Murray B.E. (1990): The life and times of the Enterococcus . Clin. Microbiol. Rev. 3: 46 65.
Murray B.E., Weinstock G.M. (1999): Enterococci: new aspects of an old organism. Proc. Ass. Am. Phys. 111: 328 334.
Naser S.M., Vancanneyt M., De Graef E., Devriese L.A., Snauwaert C., Lefebre K., Hoste B., Švec P., Decostere A., Haesebrouck F., Swings J. (2005): Enterococcus canintestini sp. nov., from faecal samples of healthy dogs. Int. J. Syst. Bacteriol. 55: 2177 2182. Paulsen I.T., Banerjei L., Myers G.S.A., Nelson K.E., Seshardi R., Read T.D., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Heidelberg J.F., Tettelin H., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L.,
46 Beanan M., Daugherty S., DeBoy R.T., Durkin S., Kolonay J., Madupu R., Nelson W., Vamathevan J., Tran B., Upton J., Hansen T., Shetty J., Khouri H., Utterback T., Radune D., Ketchum K.A., Dougherty B.A., Fraser C.M. (2003): Role of mobile DNA in the evolution of vancomycin resistant Enterococcus faecalis . Science. 299: 2071 2074. Pinto B., Pierotti R., Canale G., Reali D. (1999): Characterization of ´faecal streptococci´ as indicators of faecal pollution and distribution in the environment. Lett. Appl. Microbiol. 29: 258 263. Rodrigues U., Collins M.D. (1990): Phylogenetic analysis of Streptococcus saccharolyticus based on 16S rRNA sequencing. FEMS Microbiol. Lett. 71: 231 234.
Satomi M., Kimura B., Mizoi M., Sato T., Fujii T. (1997): Tetragenococcus muriaticus sp. nov., a new moderately halophilic lactic acid bacterium isolated from fermented sqiud liver sauce. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 832 836.
Sedláček Ivo (2006): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno. 270 s.
Schleifer K.H., Kilpper Bälz R. (1984): Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 31 34. Sukontasing S., Tanasupawat S., Moonmangmee S., Lee J., Suzuki K. (2007): Enterococcus camelliae sp. nov., isolated from fermented tea leaves in Thailand. Int. J. Syst. Bacteriol. 57: 2151 2154.
Švec P., Devriese L.A., Sedláček I., Baele M., Vancanneyt M., Haesebrouck F., Swings J., Doškař J. (2001): Enterococcus haemoperoxidus sp. nov. and Enterococcus moraviensis sp. nov., isolated from water. Int. J. Syst. Bacteriol. 51: 1567 1574.
Švec P., Vancanneyt M., Devriese L.A., Naser S.M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2005a): Enterococcus aquimarinus sp. nov., isolated from sea water. Int. J. Syst. Bacteriol. 55: 2183 2187.
Švec P., Vancanneyt M., Koort J., Naser S.M., Hoste B., Vihavainen E., Vandamme P., Swings J., Björkroth J. (2005b): Enterococcus devriesei sp. nov., associated with animal sources. Int. J. Syst. Bacteriol. 55: 2479 2484.
Švec P., Vancanneyt M., Sedláček I., Naser S.M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2006): Enterococcus silesiacus sp. nov. and Enterococcus termitis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 56: 577 581.
Tandon P., Chhibber S., Reed R.H. (2007): Survival and detection of the fecal indicator bacterium Enterococcus faecalis in water stored in traditional vessels. Indian J. Med. Res. 125: 557 566.
Teixeira L.M., Carvalho M.S., Espinola M.M.B., Steigerwalt A.G., Douglas M.P., Brenner D.J., Facklam R.R. (2001): Enterococcus porcinus sp. nov. and Enterococcus ratti sp. nov., associated with enteric disorders in animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 51: 1737 1743.
47 Tyrrell G.J., Turnbull L., Teixeira L.M., Lefebvre J., Carvalho M.S., Facklam R.R., Lovgren M. (2002): Enterococcus gilvus sp. nov. and Enterococcus pallens sp. nov. isolated from human clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 40: 1140 1145.
Vancanneyt M., Snauwaert C., Cleenwerck I., Baele M., Descheemaeker P., Goossens H., Pot B., Vandamme P., Swings J., Haesebrouck F., Devriese L.A. (2001): Enterococcus villorum sp. nov., an enteroadherent bacterium associated with diarrhoea in piglets. Int. J. Syst. Bacteriol. 51: 393 400. Weaver K.E. (2000): Enterococcal Genetics. In: Fischetti V.A., Novick R.P., Ferretti J.J., Portnoy D.A., Rood J.I. (eds.), Gram Positive Pathogens, 259 271. ASM Press, Washington, D.C. Weaver K.E., Rice L.B., Churchward G. (2002): Plasmids and Transpozons. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 219 263. ASM Press, Washington, D.C. Wheeler A.L., Hartel P.G., Godfrey D.G., Hill J.L., Segars W.I. (2002): Potential of Enterococcus faecalis as a human source fecal indicator for microbial source tracking. J. Environ. Qual. 31: 1286 1293. Williams A.M., Farrow J.A.E., Collins M.D. (1989): Reverse transcriptase sequencing of 16S ribosomal RNA from Streptococcus cecorum . Lett. Appl. Microbiol. 8: 185 189. Elektronické zdroje www.bacterio.cict.fr/e/enterococcus.html www.ars.usda.gov/.../mar05/organism0305.html www.emlab.com/s/sampling/env report 02 2007.html www.sflorg.com/sciencenews/scn052306_02.html
48