Untersuchungen an Zootieren: Einsatz Von Raubwanzen Als „Lebende Spritzen “Und Einflüsse Verschiedener Faktoren Auf Die Parasitierung

Untersuchungen an Zootieren:

Einsatz von Raubwanzen als

„lebende Spritzen“ und Einflüsse verschiedener

Faktoren auf die Parasitierung

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Biologie an der Universität Duisburg-Essen

vorgelegt von

André Stadler

aus Wuppertal

Mai 2019 Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden in elf europäischen Ländern in 44 zoologischen Institutionen sowie drei privaten Haltungen und in der Veterinärmedizinischen Universität Wien und kommerziellen Laboren durchgeführt. Die konventionelle Blutabnahme erfolgte ausschließlich durch Veterinärmediziner der jeweiligen Institutionen.

1. GUTACHTER:

Prof. Dr. H. Burda, Universität Duisburg-Essen

2. GUTACHTER:

Prof. Dr. G. A. Schaub, Ruhr-Universität Bochum

VORSITZENDER DES PRÜFUNGSAUSSCHUSSES:

Prof. Dr. Daniel Hering, Universität Duisburg-Essen

Diese Dissertation wird über DuEPublico, dem Dokumenten- und Publikationsserver der Universität Duisburg-Essen, zur Verfügung gestellt und liegt auch als Print-Version vor.

DOI: 10.17185/duepublico/70119 URN: urn:nbn:de:hbz:464-20190524-070207-5

Tag der Dispu tation: 03.05.2019 Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, Nr. 6 der Promotionsordnung der Math.-Nat.- Fachbereiche zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient habe.

Essen, den

- André Stadler -

Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, Nr. 8 der Promotionsordnung der Math.-Nat.- Fachbereiche zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw. Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe und dass diese Arbeit von keiner anderen Fakultät abgelehnt worden ist.

Essen, den

- André Stadler -

Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, Nr. 7 der Promotionsordnung der Math.-Nat.- Fachbereiche zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich das Arbeitsgebiet, dem das Thema „Einsatz von Raubwanzen als „lebende Spritzen“ in Zoologischen Gärten“ zuzuordnen ist, in Forschung und Lehre vertrete und den Antrag von André Stadler befürworte.

Essen, den

- Hynek Burda - Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1 1.1 Einsatz von Raubwanzen zur minimal-invasiven Blutentnahme 1 1.2 „Lebende Spritzen“: Auswahlkriterien und Methoden 9 1.3 Einsatzgebiete der „lebenden Spritzen“ 15 1.4 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Parasitierung 19 1.5 Hypothese und Ziel 24

2. Material und Methoden 25 2.1 Herkunft, Haltung und Zucht der Raubwanzen 25 2.2 Untersuchungszeitraum und Datenerhebung 25 2.3 Untersuchte Arten 27 2.4 Konventionelle Blutabnahme 27 2.5 Methodik der Blutentnahme mit Raubwanzen 28 2.6 Molekulartaxonomische Untersuchungen 34 2.7 Untersuchungen auf Tierseuchen 36 2.8 Klassische Hämatologie 38 2.9 Trächtigkeits-Hormonmetabolitbestimmung 40 2.10 Stresshormonanalysen 41 2.11 Kotprobengewinnung 42 2.12 Bestimmung von Parasitierungen im Kot 43 2.13 Ethologische Beobachtungsmethoden 44 2.14 Datenauswertung 45

3. Ergebnisse 46 3.1 Blutentnahme mit Raubwanzen mit verschiedenen Varianten 46 3.2 Blutaufnahme bei unterschiedlichen Körpertemperaturen der Wirte 46 3.3 DNA-Unterarten der Erdferkel 47 3.4 Tierseuchen 48 3.5 Klassische Hämatologie 49 3.5.1 Anteile der Leukozyten 49 3.5.2 Reproduzierbarkeit 49 3.5.3 Blutparameter nach konventioneller Abnahme bzw. der Wanzenbeprobung 50 3.5.4 Kalium-Konzentrationen 52 3.5.5 Glukose-Konzentrationen 54 3.5.6 Verschiedene Blutparameter aus dem Zooalltag 54 Inhaltsverzeichnis

3.6 Hormon-Konzentrationen 56 3.6.1 Genauigkeit des Testverfahrens für Progesteronkonzentrationen 56 3.6.2 Progesteron und Kortisoltiter bei Ratten 57 3.6.3 Progesteron und Kortisoltiter bei verschiedenen Wildtierarten 58 3.7 Einfluss psychoneuroimmunologischer Faktoren auf die Parasitierung 63 3.7.1 Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Parasitierung 63 3.7.2 Parasitierungen in Abhängigkeit vom Alter 68 3.7.3 Parasitierungen in Abhängigkeit vom Sozialrang 69 3.7.3.1 Soziogramm der Erdmännchengruppen 70 3.7.3.2 Korrelationen des Sozialranges der Erdmännchen mit der Parasitierung 74 3.7.3.3 Korrelation des Sozialranges der Weißlippenhirsche mit der Parasitierung 80 3.7.4 Parasitierung von Vögeln während der Brutperiode 81

4. Diskussion 89 4.1 Methodische Probleme 89 4.2 Unterartbestimmungen 92 4.3 Diagnostik auf Tierseuchen 94 4.4 Klassische Hämatologie 94 4.5 Konzentration des Progesteronspiegels 99 4.6 Stresshormontiter 103 4.7 Parasitierung und Auswirkungen verschiedener Faktoren 104 4.8 Ausblick 111

5. Zusammenfassung/Summary 112 5.1 Zusammenfassung 112 5.2 Summary 114

6. Literaturverzeichnis 116

7. Anhang 147

8. Abkürzungsverzeichnis 170

9. Danksagung 172

10. Lebenslauf 173 Einleitung 1

1. Einleitung Blutproben liefern Veterinärmedizinern und Wissenschaftlern wichtige Rück- schlüsse auf den Gesundheitszustand der Tiere und stellen die Grundlage für genetische Aussagen oder Verwandtschaftsverhältnisse dar (Knickel et al. 1997). Eine Blutproben- entnahme bei Wildtieren und/oder kleineren Tierarten ist im Gegensatz zu Haustieren für das Tier oft sehr stressig, da viele Tiere für die Entnahme fixiert werden müssen (Baer & McLean 1972). Größere Wildtiere müssen sogar anästhesiert werden, ein Ein- griff, der sowohl für die Pfleger/Tierärzte als auch für das Tier hohe Risiken birgt (Fair et al. 2010). Hierbei verletzen sich die Tiere zum Teil wegen der individuell variierenden Dosierung der Narkose oder gefährden das versorgende Personal. Das Hauptziel ist, auch aus Tierschutzgründen, das zu beprobende Tier nicht unnötig zu beeinträchtigen.

1.1 Einsatz von Raubwanzen zur minimal-invasiven Blutentnahme Der erste Einsatz blutsaugender Arthropoden für die Gewinnung von Blut bei Wildtieren wurde von Prof. Dr. W. Frank in Stuttgart–Hohenheim vorgeschlagen. Reptilien wurde mit Zecken und Raubwanzen Blut abgenommen, und das Blutbild bzw. die Blutproteine wurden gegenüber Proben verglichen, die mit einer Amputation von Teilen des Schwanzes gewonnen wurden (Will 1971; 1975; 1977). Unabhängig davon induzierte Dr. J. Núñez aus Argentinien den Einsatz von Raubwanzen in der Fleder- mausforschung für Energie- und Hormonanalysen, vermutlich aufbauend auf der Xeno- diagnose, ein in Lateinamerika seit 1914 gängiger Nachweis des Krankheitserregers Trypanosoma cruzi (von Helversen & Reyer 1984; von Helversen et al. 1986; Meiser & Schaub 2011) (s. 1.2). Problematisch ist diese Art des Einsatzes der Raubwanzen in Häusern oder im Freiland in (sub-)tropischen Regionen. Dort besteht beim Entkommen der Insekten die Gefahr, dass sich die Raubwanzen vermehren, was zur Etablierung von Neozoen in der lokalen Fauna unbedingt zu vermeiden ist. Eine Sterilisation der Triatominen wäre möglich, ist aber momentan noch nicht standardisiert und aufwendig (Stadler et al. 2011). Einige Länder verbieten aus diesem Grund die Einfuhr bzw. den Einsatz der Triatominen im Freiland (Habicher 2009). Deshalb werden in Südafrika als Alternative schon einheimische Tsetse Fliegen bei Erdmännchen (Suricata suricatta) eingesetzt, wobei die Stiche schmerzhaft für den Wirt sind (Fünfstück et al. 1989; Habicher et al. 2013). Einleitung 2

In den letzten Jahren ist ein verstärkter Einsatz von Triatominen zu beobachten, speziell wenn Stress für das Wirtstier vermieden werden soll (Voigt et al. 2004; Stadler 2006). Dabei wurden drei Raubwanzen-Arten – Rhodnius prolixus, Triatoma infestans und Dipetalogaster maxima – als „lebende Spritzen“ für diese minimal-invasive Methode für die Blutgewinnung vorgeschlagen und werden meistens eingesetzt (von Helversen et al. 1986; Thomsen & Voigt 2006; Stadler 2007; Stadler et al. 2007; 2008 a, b, 2009; Kruszewicz et al. 2009). Alle drei Arten gehören zur Unterfamilie Triatominae aus der Familie Reduviidae mit momentan 140 beschriebenen Arten (Galvão et al. 2003; Schofield & Galvão 2009). Diese hemimetabolen Insekten durchlaufen fünf Nymphenstadien (N1-N5; Schaub 2008). Die Hauptverbreitung von Triatominen liegt zwischen den Großen Seen im Norden der USA bis nach Südargentinien. Alle Arten des monophyletischen Stammes der Rhodniini, zu dem R. prolixus gehört, bevorzugen Bäume mit Vogelnestern. Sie kleben ihre Eier an Federn der Vögel oder Palmblätter. Wenn die Blätter als Dächer für Häuser der Menschen benutzt werden, wird R. prolixus somit direkt ins Haus transportiert. Diese Art hat sich in Brasilien und Mexiko bereits komplett an das Leben in Wohnhäusern adaptiert und entwickelt zum Teil bis zu zwei Generationen pro Jahr (Zeledón & Rabinovich 1981). R. prolixus ist dabei eine der kleineren Arten der Triatominae; Imagines sind zwischen 20 und 22 mm groß (Lent & Wygodzinsky 1979). Die fünf Nymphenstadien wachsen in der Länge von 3 über 4,5; 8,5; 10 und 15 mm heran (Schaub et al. 2012). Die Art ist einfach im Labor zu züchten. Eine komplette Generation kann innerhalb von drei Monaten herangezogen werden, wenn die Nymphen immer vier Tage nach der jeweiligen Häutung gefüttert werden (Schaub 1988). Als Futterspezialist ist diese Art eines der häufigen Insekten im Labor und der erste Vertreter der Triatominae, dessen Genom entschlüsselt wurde (Wigglesworth 1972; Huebner 2007). Ein gegenüber R. prolixus noch bedeutenderer Vektor von Trypanosoma cruzi ist T. infestans. Diese Art kommt ursprünglich aus dem Gran Chaco, den Dornbusch- savannen von Bolivien bis Argentinien. Hauptwirte von T. infestans sind dort Nagetiere wie z.B. Meerschweinchen. Durch die Domestikation der Meerschweinchen zur Fleischgewinnung begann die Haltung der Tiere in den Wohnhäusern der Menschen. Auch T. infestans ist an das Leben in den Wohnhäusern sehr gut angepasst und verbrei- tete sich durch den Handel in alle südlichen Staaten Lateinamerikas. Der Einsatz von Insektiziden in den Wohnhäusern hat T. infestans, welches sich mit einer Generation pro Einleitung 3

Jahr in den Häusern fortpflanzt, wieder in die ursprünglichen Lebensräume, den Gran Chaco, zurückgedrängt (Dias & Schofield 1999; Schofield et al. 2006). Diese Art ist größer als R. prolixus; Männchen und Weibchen werden 26-29 mm groß (Lent & Wygodzinsky 1979), die fünf Nymphenstadien 4; 6; 9; 12 und 19 mm (Schaub et al. 2012). Die Nachzucht dauert unter optimalen Bedingungen etwas länger als bei R. prolixus, mindestens vier Monate (Schaub 1988). Die dritte und gleichzeitig die größte Art der Triatominae ist Dipetalogaster maxima. Diese kommt nur in der Nebelwüste auf der mexikanischen Halbinsel Baja California Sur vor (Ryckman & Ryckman 1963; Lent & Wygodzinsky 1979). Hauptwirte sind kleinere Reptilien, Säugetiere und bodenlebende Vögel. Ursprünglich als D. maximus beschrieben, wird heutzutage von führenden Triatominae-Taxonomen der Name D. maxima empfohlen, was auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzt wird (Marsden 1986; Schofield & Galvão 2009; Justi et al. 2014). Imagines dieser univoltinen Art sind meist zwischen Juni und Juli in der freien Wildbahn zu finden, mit Größen von bis 35 mm bei Männchen und bei Weibchen sogar von bis zu 42 mm (Lent & Wygodzinsky 1979). Die Nymphe wächst über 8; 11,5; 15; 20; und 27 mm heran (Stadler et al. 2011). Die Nachzucht bis zur Imago dauert im Labor 5-6 Monate (Schaub & Breger 1988). Wegen den lebensfeindlichen Bedingungen in den Nebelwüsten der Baja California Sur ist diese Art sehr aggressiv und sticht im Vergleich zu allen anderen Arten sehr schnell. Des Weiteren ist die Art im Gegensatz zu den beiden anderen Arten tag- und nachtaktiv (Ryckman & Ryckman 1963; 1967; Lent & Wygodzinsky 1979). Aufgrund eines strikten Exportverbots stammen alle heutigen Laborzuchten von D. maxima außerhalb Mexikos aus Ursprungskolonien von zwei Exkursionen (Ryckman & Ryckman 1963; Marsden et al. 1979). Die gesamte Unterfamilie der Triatominae wird zu den blutsaugenden Insekten gerechnet, obwohl einzelne Arten, wie z.B. T. klugi, oft Hämolymphe anderer Insekten saugen. Die Wanzen besitzen Anpassungen an die Hämatophagie (Carvalho-Pinto et al. 2000). Im Gegensatz zu anderen blutsaugenden Insekten, wie z.B. Mücken, saugen bei den Triatominen alle Nymphenstadien und beide Geschlechter Blut (Schaub 2008). Die Raubwanzen finden ihre Wirte über verschiedene Reize. In warmen Nächten fliegen sehr hungrige Imagines zu Lichtquellen und überwinden dabei auch große Distanzen. Des Weiteren lockt der Kot vollgesogener anderer Raubwanzen die Tiere zu potentiellen Futterquellen. Das ausgeatmete Kohlenstoffdioxid der Wirte oder die Infrarotdetektion bzw. eine Thermosensitivität der Raubwanzen sind weitere Stimuli, die den Triatominae Einleitung 4 helfen, die Wirte zu finden. Die Infrarotdetektion ist in der Klasse der Insekten nur bei der Familie der Reduviidae und wenigen Käfern zu finden. Sehr wahrscheinlich ist dieser Prozess ähnlich dem der Thermosensitivität der Säugetiere über TRPV (transient receptor potential vanilliod) Kanäle geregelt (Schofield 1979; Lorenzo Figueras et al. 1994; Schmitz et al. 2000; Guerenstein & Guerin 2001; Barrozo et al. 2004; Barrozo & Lazzari 2004; 2006; Ferreira et al. 2007; Ortiz & Molina 2010; Zermoglio et al. 2015). Die Rezeptoren für alle diese Stimuli liegen hauptsächlich auf den Antennen und Mundwerkzeugen (Guerenstein & Guerin 2001). Die Mundwerkzeuge der Raubwanzen bestehen aus Labrum, Labium, Mandibeln und Maxillen. In der Ruheposition werden sie unter den Thorax gelegt. Labrum und Labium bilden die Proboscis, welche die innen liegenden Mandibeln schützt und die wiederum die Maxillen. Die linke und rechte Maxille sind gegeneinander in der Körperlängsachse beweglich. Dazwischen liegen Speichel- und Futterkanal (Geigy & Kraus 1952; Wirtz 1987; Wenk et al. 2010). Mit diesen Mundwerkzeugen wird das Blut ähnlich wie bei Bettwanzen oder Mücken direkt aus den Blutgefäßen aufgenommen. Dieses steht im Unterschied zu z.B. Tsetse Fliegen oder Bremsen, die Kapillaren anschneiden und das Blut aus der Wunde aufnehmen (Lavoipierre 1965). Nach dem Hautkontakt wird mit einer ruckartigen Bewegung die Haut punktiert, und die vorderen Enden der Mandibeln eröffnen dabei die oberen Hautschichten des Wirtes und verankern sich dort. Die Maxillen werden tiefer in die Haut eingeführt und suchen nach Blutgefäßen. Es entstehen manchmal kleinste Hämatome, aber bei dieser minimalen Invasivität ist die Gefahr größerer Hämatome ausgeschlossen. Bei der konventionellen Blutabnahme dagegen ist die Gefahr, dass es zu größeren Hämatomen beim Wirt führt, viel größer, speziell bei Vögeln (Bähnisch 2011). Während der Probierphase werden die Mundwerkzeuge mehrfach eingeführt, aber noch kein Blut aufgenommen. Ist ein passendes Gefäß gefunden, wird die linke Maxille in der Blutgefäßwand veran- kert, und die rechte Maxille penetriert daraufhin das Gefäß (Lavoipierre et al, 1959; Wirtz 1987; Ferreira et al. 2007; Vos et al. 2010). Die Probieranstiche dauern mehrere Sekunden oder sogar einige Minuten. Wird kein passendes Gefäß gefunden, bewegt sich die Wanze an einen anderen Ort und versucht es dort erneut (Lavoipierre et al. 1959; Sant’Anna et al. 2001). Die Dauer des Saugvorgangs liegt bei durchschnittlich 5-20 (max. 50) Minuten und hängt vom Wirt, dem Nymphenstadium und der Art der Raubwanze ab (Soares et al. 2000; Martí et al. 2008). Der Durchmesser des angestochenen Gefäßes wird von der Einleitung 5

Wanze sowohl durch den Rhythmus bei der Aufnahme des Blutes als auch durch die Injektion von Speichelkomponenten vergrößert (Lavoipierre et al. 1959; Wirtz 1987; Soares et al. 2006). Die endgültig aufgenommene Blutmenge variiert nach Art und Stadium; Nymphen nehmen das 3-23-fache ihres eigenen Körpergewichtes auf, Imagines bis zum dreifachen Körpergewicht. Raubwanzen sind im Vergleich aller hämatophagen Insekten die Tiere mit der größten Menge an aufgenommenem Blut (Meiser 2009). Das größte Volumen saugen dabei D. maxima Weibchen mit bis zu 4.3 ml Blut (Barreto et al. 1981). Jedes Nymphenstadium nimmt entweder mehrere kleinere oder eine maximale Blutmenge auf, bevor es späterzur Ecdysis kommt. Das Einsetzen der Häutung hängt dann von den klimatischen Bedingungen, dem Nymphenstadium und von der Art ab. Bei 26 ± 1 °C und 50-60% relativer Luftfeuchte brauchen die fünf Nymphenstadien von R. prolixus nach der Fütterung 9; 9; 10; 13 bzw. 14 Tage bevor die Häutung beginnt. Bei T. infestans sind es 10; 10; 12; 17 bzw. 28 Tage und bei D. maxima 14; 14; 16; 21 bzw. 51 Tage (Schaub 1988; Schaub & Breger 1988). Verschiedene Komponenten der Raubwanzen interagieren mit dem Wirt. Blut ist ein energiereiches Futter, aber eine strikte Spezialisierung darauf bedeutet für die Ektoparasiten auch Probleme. Die Blutgefäße müssen gefunden werden, und das Blut muss zugänglich gemacht werden, ohne dabei den Wirt auf sich aufmerksam zu machen und seine mechanischen Abwehrreaktionen zu induzieren. Der Stich der meisten Raubwanzenarten ist für den Wirt schmerzlos, mit Ausnahme von Triatoma rubrofasciata. Vermutet wird eine Injektion eines Lokalanästhestikums (Hase 1932; Ryckman & Bentley 1979). Überraschenderweise ist bis jetzt nur bei T. infestans ein Protein im Speichel nachgewiesen worden, welches die Na+-Kanäle beeinflusst, somit wie ein Lokalanästhestikum wirkt und so die Reizweiterleitung verhindert. Bei allen anderen Arten ist der genaue Mechanismus noch unbekannt (Dan et al. 1999). In der Anfangsphase der Blutaufnahme sind es Speichelkomponenten, von denen mehrere hundert verschiedene bekannt sind, und später Komponenten im Magen der Tiere, die relevant sind, um diese Ernährungsweise zu ermöglichen (Ribeiro et al. 2004; Santos et al. 2007; Assumpςão et al. 2008; Meiser et al. 2010b). Im Speichel von R. prolixus wurden NO-Radikale nachgewiesen, die eine Erweiterung der Blutgefäße und damit eine schnellere Blutaufnahme bewirken (Kaneko et al. 1999; Weichsel et al. 2000; Martí et al. 2008). Weiterhin ist der blutsaugende Ektoparasit mit weiteren Abwehrmechanismen konfrontiert, dem Komplementsystem und der Agglutination des Blutes (Andrade et al. 2005). So interagiert der Speichel der Triatominen mit der Einleitung 6 klassischen bzw. alternativen Komplementkaskade (Cavalcante et al. 2003; Barros et al. 2009). Apyrasen und weitere Proteine im Speichel der Raubwanzen verhindern zusätzlich die Hämostase des Blutes bzw. das Verklumpen der Blutplättchen, z.B. durch eine direkte Inhibierung der Koagulation (Ribeiro & Garcia 1981 a, b; Sarkis et al. 1986; Noeske-Jungblut et al. 1995; Ribeiro et al. 1998). Entzündungshemmende Proteine, Sialidasen, wurden zusätzlich gefunden (Amino et al. 1998; 2002). Ein 39-kDa Protein mit der gleichen Funktion verhindert in einer „Nebenwirkung“ auch das Verklumpen der Blutplättchen (Ribeiro & Garcia 1981 b, Ribeiro 1982; Ribeiro & Walker 1994). Neben den Proteinen im Speichel, welche mit dem Blut vermischt werden, sind die Komponenten im Verdauungstrakt der Wanzen für einen Einsatz als „lebende Spritzen“ von Bedeutung. Der Verdauungstrakt der Triatominen besteht aus einer einfachen Röhre ohne weitere seitliche Divertikel. Der Trakt ist in drei Teile unterteilbar, Vorder-, Mittel- und Enddarm, wobei für die Anwendung der Raubwanzen als „lebende Spritzen“ vor allem der Mitteldarm von Bedeutung ist. Dieser wird wiederum unterteilt in einen vorderen Teil, mit der Cardia und dem dehnbaren Magen, sowie den hinteren Teil, den Dünndarm, zur Verdauung des Blutes (Kollien & Schaub 2000). Nach einer Blutmahlzeit ist das Abdomen der Tiere fast komplett angeschwollen und oft rund, so dass Nymphen oft schlecht bewegungsfähig sind. Zur Lösung des Problems besitzen Triatominen das effektivste Exkretionssystem im Tierreich (Maddrell 1969; Maddrell et al. 1991). Schon während der Blutaufnahme wird mit der Exkretion einzelner Komponenten begonnen, z.B. bei R. prolixus schon nach drei Minuten (Maddrell 1963). Nach dieser kurzen Zeit werden durch die Magenwand Ionen in die Hämolymphe transportiert und damit verbunden auch Wasser, welches in die Malpighischen Gefäßen diffundiert, die am Ende des Mitteldarms enden. Direkt nach der Blutaufnahme steigern die Malpighischen Gefäße ihre Sekretionsrate um bis zu 3 μl min-1 mm-1 bei R. prolixus und T. infestans (Maddrell 1969; Schnitker et al. 1988). Dadurch verliert R. prolixus ~45 % des Gewichtes der aufgenommenen Blutmenge innerhalb der ersten vier Stunden und T. infestans 60 % in den ersten 24 h (Wigglesworth 1931; Maddrell 1969; Eichler & Schaub 1998). Außer einer gesteigerten Aktivität der Glykosidasen und Lipasen, die eine Lyse der Erythrozyten und einige weitere Modifikationen verursacht, wird in den folgenden Tagen das Blut im Magen aber nicht weiter verändert (Bauer 1981; Azambuja et al. 1983; Ribeiro & Pereira 1984; Canavoso et al. 2004; Schaub 2009; Garcia et al. 2010; Schaub et al. 2011). Abhängig Einleitung 7 von der Wirtsart kristallisiert das Blut dann; normalerweise nimmt es aber eine geleeartige Konsistenz an (Bauer 1981; Lehane 2005; Oliveira et al. 2007). Die Exkretion der wässrigen Komponenten erhöht somit erst langsam den Hämatokritwert des Mageninhaltes. Die Einflüsse der Speichel-komponenten auf das Komplementsystem oder die Koagulation werden von Proteinen im Magen z.T. noch verstärkt. Die stärksten Antikoagulantien, die dabei direkt auf Thrombin oder die Serinprotease einwirken, finden sich im Magen der Triatominen (Barros et al. 2009; Meiser et al. 2010 a). Die Nachzucht und Haltung von Triatominen ist nicht sehr schwer, aber es gibt einige Besonderheiten, die zu berücksichtigen sind. In endemischen Regionen besteht die Möglichkeit Wanzen unter normalen Laborbedingungen ohne klimatische Kontrolle zu halten (Dias 1955; Wood 1964). Trotzdem sind regulierte klimatisierte Bedingungen notwendig, wenn man Auswirkungen auf die Entwicklung aufgrund von Umwelteinflüssen einschränken möchte. Genaue Haltungs- und Zuchtempfehlungen für einzelne Arten sind für R. prolixus, T. infestans und D. maxima verfügbar (Gómez- Núñez 1964; Neghme et al. 1967; Gardiner & Maddrell 1972; Barreto et al. 1981). Für die meisten Arten werden gute Nachzuchtergebnisse bei einer Temperatur von 26-28 °C erzielt (Ryckman & Ryckman 1966; Garcia et al. 1984; Núñez & Segura 1987). Die relative Luftfeuchte ist zudem entscheidend. Unter 50 % rH müssen die Raubwanzen zu viel Energie darauf verwenden, nicht zu viel Wasser zu verlieren und sterben meist während der Häutung. Bei über 90 % rH treten dagegen häufig schädliche Pilzkulturen auf dem Kot der Raubwanzen auf (Ryckman & Ryckman 1966). Zusätzlich ist ein Tag/ Nacht Rhythmus zu empfehlen. Eine längere Tagesphase ist dabei vorteilhafter als zu lange Dunkelheit (Gomez-Núñez 1964; Ryckman & Ryckman 1966). Zur Haltung von Triatominen werden spezielle Gefäße empfohlen (Dias 1938; Deane 1948; Corrêa 1954; Ryckman & Ryckman 1966). An der Ruhr-Universität Bochum werden allerdings aus Kostengründen und zur Arbeitserleichterung handels- übliche 2-l Plastikbecher benutzt, die genauso effektiv und gut einsetzbar sind. Diese werden mit Nylongaze verschlossen (Stadler et al. 2011). Pappkreuze sind unbedingt in den Gläsern zu platzieren, um die Oberfläche zu vergrößern und die Eiablage zu erleichtern (Schaub 1988). Filterpapier am Boden des Gefäßes saugt den Urin und Kot der Tiere auf. Wenn nach einer Fütterung große Menge Urin abgesetzt werden, könnten ansonsten junge Nymphen ertrinken (Wood 1964). Ein häufiges Handling der Tiere z.B. zum Zählen sollte vermieden werden, da Handlingstress die Raubwanzen schädigt Einleitung 8

(Schaub 1988; Schaub & Breger 1988). In Kolonien an der Ruhr-Universität Bochum werden ca. 100-200 Nymphen angesetzt, deren Becher nicht geöffnet werden, bis sie sich zu Imagines gehäutet haben. Der Kot und Urin wird nicht entfernt, um eine Auf- nahme der Symbionten über Koprophagie zu ermöglichen (Stadler et al. 2011). Auch die Exuvien verbleiben im Gefäß (Schaub 1988; Schaub & Breger 1988). Einen weiteren Einfluss auf die Haltung der Triatominen nimmt die Populationsgröße ein, da sich ein “Crowdingeffekt“, also eine Überbevölkerung, negativ auf das Saugverhalten und die Entwicklung auswirkt (Gomez-Núñez 1964; Schaub 1990b). Als Richtwert werden bei T. infestans bis zu 40 Nymphen in einem 1-l Becher und bis zu 200 Indi- viduen in einem 2-l Plastikbecher mit einem Pappkreuz gehalten, ohne dass Probleme auftreten (Schaub 1988; 1989). Zur Fütterung im Labor wird meistens ein Wirt auf einem Holzbock fixiert, und die Gefäße mit den Wanzen werden pro Becher für 1-2 Stunden angesetzt (Ryckman & Ryckman 1966). Wirte sind z.B. Hühner (Gallus gallus dom.). Da viele Arten däm- merungs- bzw. nachtaktiv sind, mit der Haupt-Aktivitätsphase am Abend, wird eine Fütterung in Dunkelräumen empfohlen (Neghme et al. 1967; Núñez 1987). Eine Fütterung der tagaktiven D. maxima ist ohne Probleme während des Tages bzw. bei Licht möglich (Marsden et al. 1979; Martínez-Ibarra et al. 2003). Die Wirtsauswahl ist für eine gute Entwicklung entscheidend. Mäuse und Hühner scheinen optimal zu sein, während bei Kaninchen (Oryctulagus cuniculus dom.) Probleme bei der Aufzucht von Rhodnius neivai aufraten (Cabello et al. 1987). Eine in-vitro Fütterung unter einer künstlichen Membran ist ebenfalls möglich, scheint aber einen Einfluss auf die Langzeitentwicklung zu haben, und eine potentiell letale Kontamination mit Bakterien aus der Luft ist schwierig auszuschließen (Gomez- Núñez 1964; Garcia et al. 1984; Schaub 1990 a). Die Gefahr einer Erkrankung der Raubwanzen durch Bakterien, Viren, Pilzen oder Parasiten wird dabei durch drei zel- luläre Immunabwehrreaktionen – Phagozytose, Verklumpung und Einkapselung – reduziert (Flores-Villegas et al. 2015 a, b). Antibakterielle Proteine im Speichel der Triatominen sind u.a. bei T. infestans beschrieben, z.B. das 30-kDa Trialysin. Dieses Protein sowie Komponenten der humoralen Immunabwehr könnten der Grund für seltene Erkrankungen der Rauwanze sein (Flores-Villegas et al. 2015 a). Um das Blut bei einer in-vitro Fütterung am Verklumpen zu hindern, muss zudem das Blut mit Antikoagulantien versetzt oder defibriniert werden. Dieses wiederum führte bei Fütter- rungen von R. prolixus mit definibrierten Schafs- oder Rinderblut zu einer erhöhten Einleitung 9

Mortalitäts und reduzierten Reproduktionsrate der Wanzen (Gardiner & Maddrell 1972; Langley & Pimley 1978). Entscheidend für die Entwicklung der Raubwanzen ist die Versorgung mit Symbionten. Ohne diese versterben nahezu alle Tiere spätestens als N4 oder N5 und entwickeln sich nicht zur Imago. Bisher gehören alle diese Symbionten zur Bakterien- ordnung Actinomycetales und werden über Koprophagie aufgenommen (Schaub et al. 1989; Vallejo et al. 2009). Einige weitere Bakterien sind sowohl in Freiland- als auch in Laborzuchten beschrieben, aber alle sind für Menschen nicht pathogen, was beim Einsatz als „lebende Spritzen“ von Nachteil wäre. Auch bei der schon seit 1914 sehr häufig eingesetzten Xenodiagnose wurde noch in keinem Fall ein pathogenes Bakterium übertragen (Vallejo et al. 2009). Wenn neue Kolonien mit N1-Stadien begonnen werden, sollten erwachsene Männchen oder ältere Larven als Symbiontenspender hinzugefügt werden, wobei erwachsene Männchen den Vorteil bieten, dass die Populationsdichte im Becher nicht durch Nachkommen von Weibchen erhöht wird (Schaub 1989; Jensen & Schaub 1991). Ein Verfüttern von in-vitro Kulturen der Actinomyceten an die Kolonien ist möglich (Kollien & Schaub 1998). Wenn Blut im Kot der Raubwanzen auftritt, ist dies ein Indiz dafür, dass sich die Tiere mit anderen Pathogenen infiziert haben, z.B. von anderen Insekten. Deswegen ist eine gemeinsame Haltung verschiedener Insekten nicht zu empfehlen und vor Übernahme von Freilandfängen von Triatominen in die Zuchträume eine Quarantäne einzuhalten (Schaub unveröffentlicht).

1.2 „Lebende Spritzen“: Auswahlkriterien und Methoden Der Einsatz von Raubwanzen als eine Möglichkeit zur Gewinnung von Blutproben, basiert auf Erfahrungen in der Humanmedizin. Raubwanzen sind Vektoren des Erregers der Chagas-Krankheit, dem Protozoon Trypanosoma cruzi, das sich neben den Menschen in verschiedenen Säugetierarten entwickelt (Botto-Mahan et al. 2009; 2010; 2012; Coura & Vinas 2010). Die Anzahl der Infektionen von Menschen mit dem Erreger der Chagas Krankheit haben in den letzten Jahren in Lateinamerika durch eine intensive Bekämpfung der Überträger stark abgenommen, nehmen aber in den letzten Jahren regional zu, z.B. in Texas (Wozniak et al. 2015; Schaub et al. 2016). In der Humanmedizin werden seit 1914 Raubwanzen der Unterfamilie Triatominae in der Xenodiagnose eingesetzt, um Infektionen mit T. cruzi nachzuweisen (Brumpt 1914; Meiser & Schaub 2011). Diese Art der Diagnose ermöglicht einen direkten Nachweis, Einleitung 10 wenn die Konzentration des Erregers im Blut des Menschen zu gering ist, um im Mikroskop erkannt zu werden. In der Raubwanze dagegen vermehrt sich der Parasit, so dass der Nachweis gelingt. Dazu werden im Labor gezüchtete Raubwanzen in einem Plastikgefäß an den Patienten gebracht, um zum Beispiel am Arm Blut zu saugen. Alternativ wird auch abgenommenes Blut des Patienten über eine Membran verfüttert, um Allergien gegen die Raubwanzen zu vermeiden (Meiser & Schaub 2011). Detektionen von anderen Blutparasiten sind bisher nicht erforscht, obwohl die Methode der Xenodiagnose seit über 100 Jahren angewendet wird. Grundsätzlich sind fast alle Arten der Triatominen zum Einsatz als „lebende Spritzen“ geeignet. Da bei der Raubwanze Panstrongylus megistus, Rhodococcus equi als Symbiont identifiziert wurde, der Nokardiose hervorruft (Schaal 1992), sollte diese Art nicht als „lebende Spritze“ verwendet werden. Bis jetzt sind fast ausschließlich T. infestans, R. prolixus und D. maxima als „lebende Spritzen“ eingesetzt worden (Stadler et al. 2011). Wichtige Punkte bei der Auswahl der Art als „lebende Spritze“ sind die Aufzuchtzeit, die Saugmenge, mögliche Allergien und die Aggressivität der einzelnen Tiere. Die Generationsdauer, also die Zeit, die benötigt wird, um sich vom Nymphenstadium 1 bis zur Imago zu entwickeln. ist bei D. maxima am längsten, während R. prolixus dagegen die kürzeste Aufzuchtzeit hat und T. infestans dazwischen liegt (s. 1.1). Problematisch gestaltet sich bei R. prolixus das Absammeln der Eier, da diese an allen Oberflächen festgeklebt werden. Bei den beiden anderen Arten werden die Eier einfach auf dem Boden abgelegt (Tab. 1.1). Außerdem sind die Imagines von R. prolixus durch Haftpolster an den Tarsen sehr mobil, was eine spezielle Art der Haltung erfordert (Lent & Wygodzinsky 1979). Eine Bestimmung des optimalen Nymphenstadiums ist im Vorfeld möglich, wenn die erforderliche Zielmenge bekannt ist. Blutprobenmengen von bis zu 70 µl wurden mit N4 und N5 von R. prolixus und T. infestans gewonnen, mit N3 von D. maxima sogar bis zu 200 µl. Beim Einsatz von N4 von T. infestans und N3 von D. maxima saugen die Wanzen innerhalb von 2–12 min durchschnittlich 100 µl Blut, von denen 70–80 µl aus den Mägen der Tiere gewinnbar sind. Mit der Größe der Nymphen steigt die aufgenommene Blutmenge. Bei D. maxima nehmen N1-N5 jeweils 0,1; 0,2; 0,6; 1.2 und 2,5 ml Blut auf (Stadler et al. 2011, Tab. 1.1). Somit fällt die lange Generationsdauer nicht ins Gewicht, da auch kleine Nymphen schon vergleichsweise große Mengen an Blut zu sich nehmen. Einleitung 11

Tab. 1.1 Vergleich der Vor- und Nachteile von R. prolixus, T. infestans und D. maxima beim Einsatz als „lebende Spritzen“

Triatominenart R. prolixus T. infestans D. maxima Generationsdauer Kurz Mittel Lang

Sammeln der Eier Schwierig Einfach Einfach

Blutmenge Am geringsten Mittel Am höchsten

Allergiereaktionen Hoch Mittel Wenig

Aggressivität Hoch Wenig Mittel* * nur gering weniger als R. prolixus

Allergische Reaktionen auf den Speichel der Triatominen sind nur bei Menschen bekannt und treten nur bei Wirten auf, an denen Triatominen wiederholt gesogen haben (Tab. 1.1). R. prolixus induzierte kleinere Hautreaktionen, wobei diese deutlich weniger intensiv bei T. infestans waren und D. maxima die geringsten Hautreaktionen verur- sachte (Lapierre & Lariviere 1954; Marsden 1986; Hoffman 1987; Meiser & Schaub 2011). Auch bei der Flussseeschwalbe (Sterna hirundo) wurden N2 und N3 von D. maxima zur Probenentnahme eingesetzt und verursachten dabei keine allergischen Reaktionen (Becker et al. 2005). Wirtsspezifische Antikörperreaktionen auf den Speichel von T. infestans, T. brasiliensis, T. sordida, R. prolixus und Panstrongylus megistus sind bei Meerschweinchen und Haushühnern nachgewiesen, führen aber nicht zu anaphylaktischen Reaktionen (Schwarz et al. 2009; 2010; 2014; Dorňáková et al. 2014). Neben der Größe spielt die Aggressivität eine bedeutende Rolle, da bei der Probenentnahme bei Wildtieren Zeitreduktion immer bedeutend ist. Beim Vergleich der Aggressivität der Arten ist R. prolixus am aggressivsten, gefolgt von D. maxima und T. infestans (Tab. 1.1) (Marsden 1986; Schaub et al. 2012). Die Aggressivität hängt dabei von mehreren Faktoren ab, vor allem vom Hunger der Tiere. Kurz nach der Ecdysis verweigern die Nymphen eine Blutaufnahme, eventuell weil die Mundwerkzeuge noch nicht ausgehärtet sind. In der Regel werden Nymphen ab ca. einer Woche nach der Häutung gefüttert, wobei die Empfehlung zu mindestens zwei Wochen geht, um die Aggressivität zu steigern. Mit zunehmender Zeit seit der letzten Häutung nimmt die Sauglust und Aggressivität zu. Wenn die optimale Fütterungsphase aber überschritten ist, fällt diese wieder ab, und die Wanzen reduzieren bzw. verweigern die Einleitung 12

Nahrungsaufnahme. Dieser optimale Zeitraum unterscheidet sich zwischen den einzelnen Arten und Nymphenstadien (Schaub & Lösch 1989) und muss beim Einsatz als „lebende Spritze“ bedacht werden. Nach Abwägung aller Vor- und Nachteile wird der Einsatz von D. maxima empfohlen (Stadler et al. 2011). Beim Einsatz „lebender Spritzen“ muss bei der Methodik sowohl die Biologie der Vektoren als auch die der Wirte beachtet werden. Dabei unterscheidet sich der Ein- satz in der freien Wildbahn von dem bei Wildtieren in Menschenhand. Triatominen wurden erfolgreich in verschiedenen Feldstudien eingesetzt. Auch wenn hierbei die Wirtstiere allerdings zuerst gefangen werden mussten, boten die „lebenden Spritzen“ Vorteile, da es sich oft um kleinere Arten handelte, bei denen eine konventionelle Blut- abnahme Erfahrung und Training brauchte (Baer 1966; Baer & McLean 1972; von Helversen & Reyer 1984). Ein Vorteil der Methode mit den Raubwanzen ist, dass der invasive Einstich handelsüblicher Kanülen größer ist, als N5 von R. prolixus, T. infestans oder D. maxima (Voigt et al. 2004; 2006). Je nach Körpergröße der Wirte wurden die Wanzen z.B. freilaufend auf das Tier gesetzt. Dieses waren bei Freilandstudien zum Energie- und Wasserhaushalt von Fledermäusen die Innenseiten der Flügel (von Helversen & Reyer 1984; von Helversen et al. 1986; Voigt et al. 2003). Vergleichsproben wurden aus Venen entnommen und die Konzentrationen der Isotope verglichen mit Werten im Blut, welches mit der Hilfe von Wanzen gewonnen wurde (Voigt et al. 2003). Diese ersten Feldstudien benutzten die „lebenden Spritzen“ für „doubly-labelled water experiments“, um die Nektaraufnahme und den Energieaufwand zu erfassen. Dieser lag bei den Nektar-trinkenden Fledermäusen vergleichbar zu anderen Fledermausarten, kleineren Säugetieren oder Vögeln (von Helversen & Reyer 1984; von Helversen et al. 1986). Für diese „doubly-labelled water experiments“ wurden mindestens zwei Blutproben benötigt, was im Freiland zu Schwierigkeiten führte. Habituierten Erdmännchen wurde diese Probenanzahl ohne Probleme mit Raubwanzen abgenommen (Habicher 2009). Die Werte der Isotope waren in mit Wanzen gewonnenem Blut jedoch signifikant höher. In anderen Studien lieferten die Vergleichsproben allerdings vergleichbare Resultate. Diskutiert wird, ob in der Analyse der Proben für die Wasserisotope eine Verdünnung mit der Hämolymphe der Wanzen stattgefunden hat. Da die konventionelle Blutentnahme einen hohen Stress für die Tiere mit schlimmstenfalls sogar Gewichtsverlust des Tieres birgt, wird für diese Analysen trotzdem die Wanzenmethode empfohlen (Voigt et al. 2003; 2005). Zum Teil aufbauend auf der vorliegenden Studie werden nicht fixierte Raubwanzen auch bei verschiedenen Einleitung 13

Zootieren eingesetzt, um nicht für eine Blutprobenentnahme narkotisiert werden zu müssen. Dies gelang z.B. bei Giraffen (Giraffa camelopardalis) (Kruszewicz et al. 2009). Als weitere Variante wird ein mit Metallgaze verschlossener Becher – ähnlich der Xenodiagnose – bei Tieren eingesetzt, die den Umgang mit Menschen gewöhnt sind, z.B. während der Fütterung. Durch die Fütterung wird der ca. 15-20 Minuten dauernde Saugvorgang überbrückt. Diese Becher sind entweder sehr klein und schmal für einzelne Wanzen oder aber geräumiger und bieten Platz für mehrere Wanzen. Bei Letzteren ist wieder ein Pappkreuz eingefügt, um den Wanzen den Punktions- und Saugvorgang zu erleichtern (Hoffmann et al. 2005; Thomsen & Voigt 2006; 2008; Stadler 2007; Stadler et al. 2007; 2008b, 2009; Kruszewicz et al. 2009). In speziellen patentierten Bechern werden einzelne Wanzen sogar mit einem beweglichen Schieber an das Wirtstier gepresst (Hoffmann et al. 2005; Thomsen & Voigt 2008). Dies ermöglicht ein leichteres Handling der Wanzen, birgt aber die Gefahr der Verletzung der Wanze. Eine weitere Variation wird bei Erdmännchen eingesetzt, die mit Hilfe eines Halsbandes von R. prolixus und D. maxima beprobt werden (Habicher 2009). Diese Habituierung der Erdmännchen erfordert aber deutlich mehr Aufwand, da die Wirte zuerst durch positive Verstärkung an das Halsbandanlegen und auch an das Abnehmen mittels einer Belohnung gewöhnt werden müssen. Zielsetzung dieser Studie sind analog zu den Fledermausstudien Fragen zum Hormon- und Energiehaushalt (Habicher 2009). Diese Untersuchungen zeigen einen Nachteil der Methodik, da unter 20 °C die Raubwanzen meistens den Saugvorgang verweigern. Unter 6-8 °C kommt es sogar zu einer totalen Verweigerung. Demgegenüber töten hohe Temperaturen oder direkte Sonneneinstrahlung die Wanzen ab (Schaub, persönl. Mitteilung). Eine weitere Variation ist für Tiere in Zoos anzuwenden, die in Höhlen oder Boxen ruhen bzw. schlafen. In diesen Fällen wird ein zweiter Boden installiert, der über eine Metallgaze den Anstich erlaubt. Unter diesem Boden sind dann die Raubwanzen eingebracht, die so vom Wirtstier unbemerkt eine Blutprobe entnehmen. Erfolgreich wird dies z.B. bei Lemurenarten eingesetzt (Thomsen & Voigt 2006). Für die Untersuchungen an Vögeln eignen sich künstliche Eier, in denen die Wanzen versteckt sind, um den Stress für die Wirts-Tiere zu vermeiden (Bauch et al. 2010; 2013; 2014). Die künstlichen Eier für zu beprobende Flussseeschwalben enthalten, analog der Technik mit dem zweiten Boden, mit Gaze verschlossene Löcher, um das Saugen der Wanze zu ermöglichen und ein Entkommen zu verhindern (Becker Einleitung 14 et al. 2005; Arnold et al. 2008). Mit N3 von D. maxima wurden bis zu 190 µl Blut gewonnen. Die Erfolgsquote der Beprobung lag bei bis zu 86 % (Becker et al. 2005; Bauch et al. 2010). Auch in weiteren ornithologischen Studien wurden Raubwanzen eingesetzt (Janowski 2010; Bähnisch 2011; Janowski et al. 2014). Bei allen Studien mussten im Gegensatz zu früheren Studien ohne Raubwanzen die Tiere nicht mehr gefangen werden. Die „lebenden Spritzen“ sind also optimal, um die Grundwerte der Stresshormone als Indikatoren für Fitness, Rang, Gesundheit oder Störungen zu erfassen und wurden dabei bei Kaninchen bereits erfolgreich eingesetzt (Arnold et al. 2008; Voigt et al. 2003; 2004; 2005; Bähnisch 2011). Bei künstlichen Eiern war die Akzeptanz durch die Brutvögel ein Problem (Janowski 2010; Janowski et al. 2014). Waren künstliche Eier in entsprechender Größe nicht verfügbar, so führten bei Kohlmeisen (Parus major) Stoffsäcke nicht zum Erfolg, da sie die Meisen nach spätestens zehn Minuten aus dem Nest warfen (Bähnisch 2011). Bei Wiesenweihen (Circus pygargus) entfernten vier von 48 Vögeln die künstlichen Eier aus dem Nest, und sieben Vögel platzierten das Kunstei so, dass die Wanzen nicht saugen konnten. Verankerungen des künstliches Eis im Nest schafften Abhilfe. Für Mauersegler (Apus apus) und kleinere Singvögel wurden spezielle künstliche Eier entwickelt, um diese mit Raubwanzen zu beproben (Bauch et al. 2013). Wenn die Entnahme erfolgt war, musste das Blut aus dem Magen der Wanze entnommen werden. In anfänglichen Studien wurden dazu die Wanzen dekapitiert und das Abdomen mit einer Mikrokapillare angestochen (von Helversen et al. 1986). Eine Fixierung der Wanze entweder mit einer Federstahlpinzette oder mit den Fingern und ein direktes Absaugen des Blutes aus dem Magen mit einer handelsüblichen Spritze und Kanüle erwies sich als praktikabler (Voigt et al. 2004). Die Wanzen überleben den Prozess, sollten aber trotzdem abgetötet und nicht erneut verwendet werden, um eine Infektion in der Leibeshöhle der Raubwanzen und eine Verunreinigung folgender Pro- ben zu verhindern. Wenn das Blut nicht direkt abgenommen wird, sollten die Wanzen gekühlt werden, um den Metabolismus der Wanze herunterzufahren und eine weitere Verdauung und dadurch eine Konzentrierung des Blutes zu verhindern (Stadler et al. 2011). Dies ist möglich, weil die Exkretionsrate temperaturabhängig ist (Madrell 1963). Einleitung 15

1.3 Einsatzgebiete der „lebenden Spritzen“ Neben den bereits erwähnten Analysen wurde der Einsatz im Rahmen von Vor- studien bzw. in dieser hier vorliegenden Arbeit intensiv auf die Einsatzmöglichkeiten im Zooalltag gelegt. Spezielles Interesse galt dabei taxonomischen Fragestellungen, Test- möglichkeiten auf Tierseuchen, der klassischen Hämatologie sowie endokrinologischen Untersuchungen. In vorherigen Studien standen die taxonomische Fragestellungen im Vordergrund. Bei dreizehn verschiedenen Fledermausarten wurde mit Hilfe von Raubwanzen Blut entnommen und über Lymphozytenkulturen eine karylologische Analyse erstellt (von Helversen et al. 1986). In 50 Versuchen wurden ebenfalls für genetische Untersuchungen 25 Blutproben bei Wiesenweihen gewonnen (Janowski 2010). Für Tierarten, die sich in der freien Wildbahn nur bedingt oder sehr schwer erforschen lassen, stellen Zoos eine wichtige Ressource an Informationen dar (Frankham 2008). Zoos bieten durch ihre Erhaltungszuchten eine ausreichende Probenmenge für die Forschung. Bei den Erhaltungszuchten, die teilweise weltweit koordiniert sind, spielt die Erhaltung der genetischen Vielfalt in den Populationen eine zentrale Rolle (Hale & Briskie 2007). Generell nimmt die Genetik einen immer wichtigeren Platz ein, was wiederum auch Auswirkungen auf die Erhaltungszucht hat (Frankham 2008; Fallon et al. 2006; Fernando et al. 2003). Des Weiteren rückt auch die Frage nach der Validitat von Unterarten in den Fokus taxonomischer Studien, wie etwa beim Jaguar (Panthera onca), bei dem acht Unterarten anerkannt wurden (Seymor 1989; Philimore & Owens 2005). Genetische Analysen bekommen dadurch auch in der Zoowelt eine immer größere Bedeutung für Zoozuchtprogramme, um für die Analyse die benötigte Grundlage zu bieten (Wang et al. 2010; 2012; Schmidt et al. 2015). Die dabei eingesetzte Methode ist vor allem das DNA Fingerprinting. Dabei wird aufgrund der repetetiven DNA Sequenzen ein molekularer Fingerabdruck erstellt. Diese Abschnitte stammen aus einer bestimmten Gruppe des Genoms, den so genannten Minisatelliten. Dies sind beim Menschen jeweils 10 bis 15 Basenpaare lange Sequenzen. Mit dem Restriktions-Fragment-längen-Polymorphismus wird dann eine Vielzahl unterschiedlicher Minisatelliten gleichzeitig nachgewiesen und so ein charakteristischer genetischer Fingerabdruck erstellt (Roewer & Nürnberg 1992; Lubjuhn & Sauer 1999). Interessant sind hierbei z.B. die Erdferkel (Orycteropus afer), von denen es 18 valide Unterarten gibt (Shoshani et al. 1988; Lehmann 2009). Diese lassen sich anhand morphologischer Unterschiede und genetischer Muster bestimmen. Es gibt unter den Einleitung 16 rezenten Erdferkelpopulationen zwei verschiedene Ökomorphotypen, einen Wald- und einen Savannentypen. Untersuchte Tierseuchen waren im Rahmen der vorliegenden Studien Brucellose, Tuberkulose, Blauzungenkrankheit und Vogelmalaria, bedeutende Tier- seuchen in der Zoowelt. Dabei handelt es sich bei der Brucellose und bei der Tuberkulose um infektiöse Bakterien, bei der Malaria um einen Einzeller-Parasiten und bei der Blauzungenkrankheit um einen Virus. Diese Tierseuchen haben z.T. bedeutende Auswirkungen auf die Zootierpopulationen, und es muss jedes Mal im Einzelfall ent- schieden werden, ob und wie eine Therapie bedeutender Tierbestände möglich oder ob eine Euthanasie notwendig ist. Die Bakterien der Gattung Brucella sind Gram-negativ, sehr kurze unbewegliche Bakterien, die Zucker nicht verstoffwechseln können. Die Arten befallen unterschiedliche Gattungen von Wirten, und das Wachstum erfolgt in einem breiten Wirtspektrum intrazellulär. Bekannte Erreger sind z.B. Brucella abortus oder B. suis (Heizmann et al. 1999). Bei Wildtieren besteht die Gefahr, dass die Bakterien lethal wirken oder zu Aborten führen (Heizmann et al. 1999). Wirte sind vor allem Paarhufer, wie Schafe oder Ziegen, aber auch andere Tiergruppen zeigen zum Teil hohe Anti- körper-Spiegel gegen die Bakterien, z.B. Großbären (Wedlich 1982; Heizmann et al. 1999). Um eine Einschleppung der Erreger in die Tierbestände der Zoologischen Gärten zu verhindern, sind Antikörpernachweise über Agglutination oder ELISA-Tests in der Routinediagnostik von Bedeutung, speziell bei Tier Im- und Exporten. Brucellose gilt zudem als Anthropozoonose, ist also für den Menschen von Bedeutung. Die bedeutendsten Erreger der Tuberkulose aus der Gattung Mycobacterium sind Gram-positive Bakterien, die sich von anderen Bakterien durch ihren besonderen Zell- wandaufbau unterscheiden (Heizmann et al. 1999). Bei Wildtieren endete die früher relativ häufige Tuberkulose bei manchen Tiergruppen stets tödlich und gilt auch heute noch als meldepflichtig. Bei einigen Tierarten wird eine Euthanasie empfohlen (Kuntze 1995; Brack et al. 1995). Zum Tuberkulosekomplex gehören z.B. M. tuberculosis, M. bovis und M. avium. Einige weitere Erreger wie M. pinnipedi sind für die Wildtier- haltung von Bedeutung (Heizmann et al. 1999; Conraths et al. 2004; Jurczynski et al. 2007; Moser 2012). Während der Mensch primär mit M. tuberculosis befallen wird, infiziert M. bovis Rinder, M. avium Vögel und M. pinnipedi Meeressäuger. Nachweise erfolgen über Röntgentests, post mortem, eine Ziehl-Neelsen Färbung der säurefesten Stäbchen Bakterien, Serotests (ELISA und SAFA-Test) oder einen Tuberkulintest bzw. Einleitung 17

Multi-Antigen-Print-Immuno-Assays (MAPIA) (Haagsma & Eger 1990; Corcoran & Thoen 1991; Heizmann et al. 1999; Duncan et al. 2009). Allerdings sprechen die Nachweistests unter Umständen auch auf die anderen Erreger an und erzeugen falsch positive Ergebnisse, z.B. bei M. avium (Brack et al. 1995). Bei Vögeln in Zoologischen Gärten spielt als einzige Protozoenerkrankung die Vogelmalaria eine bedeutende Rolle (Eulenberger 1995). Erstmals wurde 1884 in einem Blutausstrich eines Wildvogels ein Malariaerreger entdeckt (Haberkorn 1978). Die Vogelmalaria ist fast auf der ganzen Welt verbreitet; nur in Australien tritt sie selten auf (Seed & Manwell 1977; Bennett et al. 1993; Krone et al. 2001; Schrenzel et al. 2003). Die Vögel werden von verschiedenen Mückenarten gestochen und so mit Vogelmalaria infiziert (Beaudoin et al. 1971). Als Überträger fungieren Mücken der Aedes-, Anopheles- oder Culiseta-Gattungen. Betroffen sind vor allem Jungvögel. Zu den Erregern der Vogelmalaria gehören Arten der Gattungen Leukozytozoon, Plasmodium und Haemoproteus (Hellgren et al. 2004). Die Parasitämie bei Plasmodium spp. schwankt jahreszeitlich aufgrund des Biotops oder des Alters der Tiere (Haberkorn 1968; 1984; Bennett et al. 1982 a; Bernhard & Bair 1986; Deviche et al. 2001; Shurulinkov & Golemansky 2003; Hasselquist et al. 2007). Die Intensität des Parasiten- befalls variiert auch zwischen den Individuen und Arten (Bennett & Cameron 1974). Bei Pinguinen in Zoos wird die Vogelmalaria vor allem durch die Erreger Plasmodium relictum und P. elongatum verursacht. Erkrankungen mit Haemoproteus sind nicht bekannt. Pinguine haben unter natürlichen Bedingungen keinen Kontakt mit Malariaerregern (Lindt & Hörning 1966; Kronberger & Schüppel 1977; Stoskopf & Beier 1979; Mehlhorn et al. 1986e, Eulenberger 1995). Die Todesrate liegt bei 50 % bei ausgewachsenen Pinguinen und bei Jungvögeln sogar noch höher (Beier et al. 1980; Cranfield et al. 1990; 1994; Redrobe 2000). Ein weiteres Problem ist, dass Pinguine, die keine erythrozytären Entwicklungsstadien aufweisen, Rezidive erleiden und wieder infektiös für Vektoren werden und so andere Tiere infizieren (Haberkorn 1968; Waldenström et al. 2004). Für eine Frühdiagnose werden verschiedene Verfahren angewendet, z.B. das ELISA-Testverfahren des Blutes oder eine Aufstellung von serologischen Referenzwerten oder der Nachweis in Blutausstrichen (Graczyk et al. 1993; 1994; 1995). In einigen Zoos werden die Tiere, meist allerdings nur die Jungvögel, im Sommer im Rahmen der Malariaprophylaxe mit Chloroquin oder Paraquin behandelt (Cranfield et al. 1994). Einleitung 18

Die Blauzungenkrankheit oder blue tongue disease ist v.a. eine Schafs- und Rindererkrankung, die durch Gnitzen übertragen wird. Gelegentlich tritt ein Befall anderer Huftiere auf, wie z.B. bei Ziegen, Kamelen oder Wildtierarten wie Gabelböcken (Antilocapra americana), Spießböcken (Oryx gazella) oder Weißwedelhirschen (Odocoileus virginianus) (Ramsey et al. 1985; Vestweber et al. 1991; Jarofke 1995; Bender et al. 2003; Baltus & Potgieter 2009). Auch in Zootieren wurden Antikörper gegen den Erreger nachgewiesen (Hoff & Hoff 1976). Der Erreger gehört zu den Reoviviren und ist auf allen Kontinenten verbreitet (Baltus & Potgieter 2009). Zur Diagnose dienen neben klinischen Anzeichen wie starkem Temperaturanstieg und einer Hyperämie der Schleimhäute und Zunge – namensgebend für diesen Virus – Antikörper und spezielle serotypische Assays bzw. Genomtests auf das Virus (Jarofke 1995; Mertans et al 2009). Zur Auswertung des Blutes müssen die verschiedenen Typen von Zellen identifiziert werden. Zur klassischen Hämatologie gehört die chemische Untersuchung, also die Bestimmung der Konzentrationen von Stoffwechselprodukten (z.B. Bilirubin, Glukose, Harnstoff, Kreatinin), Enzymen (z.B. Amylase, Glutamat-Oxalacetat Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT)), Elektrolyten (z.B. Natrium, Kalium, Chlorid) und von Hämoglobin. In anderen Studien mit Raubwanzen als „lebende Spritzen“ standen endokrinologische Studien im Vordergrund. Sie fanden erstmals an Kaninchen statt. Vergleichsproben der konventionellen Methode und aus N5 von D. maxima zeigten keine signifikanten Unterschiede bei den Konzentrationen von Progesteron und Testosteron (Voigt et al. 2004). Beim Progesteron trat allerdings ein Anstieg nach 8 bzw. 24h auf, wenn man das Blut im Magen der Wanze beließ, wahrscheinlich aufgrund des Wasserentzugs der Probe (Voigt et al. 2004). Konsequenterweise wurden R. prolixus und D. maxima auch in folgenden Studien am Pardelluchs (Lynx pardinus) erfolgreich eingesetzt, wobei das Blut direkt nach Aufnahme aus der Wanze abgenommen wurde (Vargas 2008; Braun et al. 2009). Prolaktin löst bei beiden Geschlechtern das Brutverhalten aus, während Kortikosteron das Stresshormon darstellt. Beide sind positiv miteinander korreliert (Schmidt et al. 2011). Brut, Prädation und Hunger führten zur signifikanten Erhöhung der Konzentration. Für eine erfolgreiche, kontrollierte Nachzucht von Zootieren, wie dem Afrikanischen Elefanten (Loxodonta africana), ist eine Bestimmung des Reproduktionszyklus notwendig. Dieses findet bei Elefanten sowohl durch Messung des Progesteronspiegels im Blutserum als auch durch Einleitung 19

Urinanalysen auf den Progesteronmetaboliten Pregnantriol statt (Mainka & Lothrop 1990; Olsen et al. 1994; Oerke et al. 2001; Czekala et al. 2003). Auch die Trächtigkeit wird auf diese Weise überwacht (McNeilly et al. 1983). Bei weiblichen Afrikanischen Elefanten ist der Progesterongehalt im Vergleich zu den meisten anderen Säugetierarten ziemlich gering. Dieses und der Wunsch nach einer kontrollierten Zucht macht eine zuverlässige Methode zur Progesteronanalyse während der etwa 22 Monate andauernden Trächtigkeit notwendig (Schwarzenberger et al. 1997). Dabei sind die Progesteron-Konzentrationen von trächtigen Afrikanischen Elefanten mit durchschnittlich 1,414 ± 0,092 ng/ml signifikant höher als die von nicht trächtigen Tieren (McNeilly 1983). Probleme ergaben sich in ersten Studien an Elenantilopen (Taurotragus oryx) (Hubmer et al. 2010). In dieser Studie an der Universität Wien wurden sowohl Kotproben als auch mittels Raubwanzen gewonnene Blutroben auf Progesteron, Östradiol und Glukortikoid mittels eines Enzyme-Immuno-Assays mit radioaktiven Isotopen untersucht. Dabei waren Konzentrationen in Proben, welche mit Hilfe von Triatominen gewonnen wurden, um das sechs- bis zehnfache erhöht (Hubmer et al. 2010).

1.4 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Parasitierung In Zoologischen Gärten sind Blutuntersuchungen und Diagnosen auf Parasiten nicht nur Teil der allgemeinen Krankheitsprophylaxe, sondern dienen auch der Überwachung des Tierbestandes. Dazu zählen turnusmäßige Blut- und parasitologische Untersuchungen die mit Hilfe von Raubwanzen erledigt werden können (Elze & Eulenberger 2000; Stadler et al. 2007). Hierbei können verschiedene Faktoren Einfluss auf die Parasitierung nehmen. Die Parasitenfauna ist sehr divers und z.T. artspezifisch. Neben parasitischen „Protozoen“ (z.B. Kokzidien) siedeln sich im Darm auch Plattwürmer, Plathelminthes an; im Blut dagegen finden sich mehrere Krankheitserreger die u.a. zu Malaria führen (Lucius & Loos-Frank 2008). Die Häufigkeit und Intensität parasitärer Infektionen hängt von vielen Faktoren ab, u.a. der Präsenz und der Populationsdichte der Vektoren (Jones & Shellam 1999). Hat der Wirt aber eine starke Beeinträchtigung und z.B. eine Immunsuppression durch weitere Erkrankungen, Mangelernährung oder Stress, führt dies zu einer starken, explosionsartigen Vermehrung des Parasiten im Wirt (Mehlhorn 2002 a). Der Körper reagiert über eine Ausschüttung der Stresshormone aus der Neben- nierenrinde, vor allem von dem Mineralkortikoid Aldosteron sowie den Glukokor- Einleitung 20 tikoiden Kortison, Kortisol und Kortikosteron (Faber & Haid 1995; Greenberg et al. 2002). Diese regulieren die Reaktionsbereitschaft des Organismus gegenüber Stresssituationen und versetzen den Körper in einen Zustand, der für Kampf- und Fluchtsituationen von Vorteil ist. Die Skelettmuskulatur wird dabei optimal versorgt und die Magen-Darm-Tätigkeit gehemmt (Faber & Haid 1995). Dieser Prozess erfolgt sekundenschnell. Dabei werden zuerst die Glukokortikoide und die Katecholamine freigesetzt. Eine zusätzliche Freisetzung von Acetylcholin führt dann zur Ausschüttung von Adrenalin und damit zur gesteigerten Aufmerksamkeit. Die Anteile der einzelnen Hormone an den Gesamt-Glukokortikoid-Konzentrationen sind artspezifisch und variabel (Keller 1995; Palme et al. 2005). Die Glukokortikoid-Konzentration ist ein Indikator für die Intensität des auslösenden Stresses und wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Dazu gehören der circadiane Rhythmus, das Alter, die Fort- pflanzung und der emotionale Status (Aschoff 1978; Widowski et al. 1989). Die Futterbeschaffung und die dadurch erfolgende Exposition für Prädatoren sind weitere natürliche Stressfaktoren, die zusammen mit dem sozialen Stress den individuellen Glukokortikoid-Hormonstatus beeinflussen. Auerhühner, die z.B. unter ständigem Stress stehen, zeigen einen höheren Grundlevel von Kortikosteron als ungestörte Tiere (Clinchy et al. 2004; Thiel et al. 2005). Es liegen Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Parasitierung vor. Neben dem Geschlecht und dem Alter des Wirtes wirken psychoneuroimmunologische Faktoren auf die Immunabwehr (Schuster & Schaub 2001 a, b; Stadler 2005). Diese Faktoren resultieren aus dem sozialen Umfeld, dem Stress und dem Status der Tiere. Das Geschlecht führt zu unterschiedlichen Auswirkungen des Parasitenbefalls auf das Individuum. Weibliche Tiere scheinen weniger empfänglich als männliche Tiere zu sein (Roberts et al. 1996). Dies liegt an Unterschieden im Immunsystem der Männchen und Weibchen. Außerdem beeinflussen die Geschlechtshormone das Zusammenspiel zwischen Parasit und Wirt (Araneo et al. 1991; Roberts et al. 2001). Dieser geschlechtsabhängige Unterschied ist sowohl bei Infektionen mit Protozoen (Plasmodium chabaudi, Trypanosoma cruzi, Babesia microti, Isospora sp.) als auch anderen Parasiten (Trichinella spiralis, andere Nematoden, usw.) erfasst worden (Barnard et al. 1993; 1996 a, b; Klein et al. 1999; Lourenço et al. 1999; Schuster & Schaub 2001 b; Krücken et al. 2005 a, b; Bähnisch 2006, 2011; Stadler 2006; Wunderlich et al. 2005). Die Geschlechtshormone wirken dabei einerseits auf die Makrophagen und andererseits auf die T-Zellen (Benten et al. 1999 a, b). Einleitung 21

Auch das Alter beeinflusst den Parasitenbefall. Oft haben juvenile Tiere einen stärkeren Befall als Adulte. Nachgewiesen ist dies bisher vor allem bei Vögeln. Nestlinge von Trauerschnäppern (Ficedula hypoleuca) und Buntfalken (Falco sparverius) bzw. subadulte Vögel besitzen eine deutlich höhere Prävalenz als die adulten Tiere (Merino & Potti 1995; Dawson & Bortolotti 1999). Keine altersbedingten Unterschiede finden sich bei Drosselrohrsängern (Acrocephalus arundinaceus), die mit Hämosporidien infiziert sind (Hasselquist 2007). Bei Kohlmeisen haben die adulten Tiere sogar eine signifikant höhere Prävalenz als die juvenilen (Bähnisch 2011). Auch bei Vögeln ist die Lebensweise mit der Prävalenz der Parasiten verbunden. Solitär oder in Paaren lebende Vögel sind signifikant weniger mit Kokzidien infiziert als in Gruppen lebende (McQuistion et al. 2000). Ein Zusammenhang zwischen dem Gewicht der Tiere und der Intensität der Parasitierung ist nicht nachgewiesen, wohl aber eine Auswirkung der Ernährung. Frugivore Arten haben weniger Protozoen als insektivore (Bennett et al. 1988; McQuistion et al. 2000). Psychoneuroimmunologische Faktoren wirken neben den Parasiten, dem Geschlecht und dem Alter auf das Immunsystem der Wirte ein (Schuster & Schaub 2001 a, b; Stadler 2005, Bähnisch 2011). Bedeutung hat dabei die „Immunkompetenz- Handikap“-Hypothese. Bei vielen Tieren findet in jeder Fortpflanzungsperiode eine neue Paarbindung statt. Diese wird ggf. neu erkämpft und muss anschließend weiter gefestigt werden. Dominante Tiere sind hierbei im Vorteil gegenüber zu sozial Schwächeren. Parasitenstatus und Immunkompetenz korrelieren dabei positiv, wobei die dominanten Tiere einen höheren Testosteronspiegel aufweisen (Ros et al. 1997; Braude et al. 1998; Deviche & Cortez 2005). Testosteronkonzentrationen im Kot von Schimpansen (Pan troglodytes) waren direkt mit dem sozialen Rang und dem Parasi- tenbefall korrelierbar. Ranghohe Tiere hatten einen höheren Befall mit „Helminthen“ und höhere Testosteron-Konzentration als umgekehrt (Mühlenbein & Watts 2010). Auswirkungen von Stress auf den Parasitenbefall sind besonders bei Tieren erkennbar, welche mit einer Rangordnung leben, z.B. bei Gruppen von männlichen mit Trypanosoma cruzi infizierten Labormäusen. Die dominanten Tiere zeigen die niedrigsten Parasitämien (Schuster & Schaub 2001b; Pravousudov et al. 2003). In rein weiblichen Mäusegruppen war die Parasitierung ähnlich. Setzte man in diese Gruppen Männchen hinzu, so stiegen die vorher niedrigen Östrogen- und Parasitenwerte der Tiere. In diesen Versuchen stiegen bei beiden Geschlechtern die Werte an, wobei die Weibchen mit dem höchsten Kortikosteron- und Progesteron-Level den niedrigsten Einleitung 22

Parasitenbefall behielten (Schuster & Schaub 2001 a). Bei Mäuse-Weibchen, die ohne Kontakt mit (Geruch von) Männchen gehalten werden, weisen die Tiere immer höhere Parasitämien von Trypanosoma cruzi auf als Tiere in einer normalen sozialen Haltung (Schuster & Schaub 2001 a). Bei Gruppen von drei männlichen Labormäusen besitzen die dominanten Tiere mit den wahrscheinlich höchsten Testosteron-Konzentrationen die niedrigsten Parasitämien mit Trypanosoma cruzi. Einzeln gehaltene Männchen weisen zudem niedrigere Parasitämien auf als die in Gruppen gehaltenen Tiere (Schuster & Schaub 2001 b). Jedoch zeigen die dominantesten Tiere eine erhöhte Para- sitämie von Babesia microti, wenn es bei Männchengruppen von Mäusen haltungsbedingt zu Kämpfen zwischen den Tieren kommt (Bernard et al. 1993, 1996 a, b). Auch der Haltungs-Stress erhöht die Höhe der Parasitämien (Barnard et al. 1993, 1996 a, b). Paarweise gehaltene Hamster (Unterfamilie Cricetinae) haben einen höheren Parasitenbefall mit „Helminthen“ als solitär gehaltene Hamster (Rashed et al. 1996). Die Jungtieraufzucht ist eine weitere, wenn nicht die stressigste Phase im Jahresverlauf von Tieren und tritt in verschiedenen Intensitäten auf. Sie reicht von kurzen Brutperioden mit starkem Stress bis zum maximales Stress durch Todesfälle vom Partner, falls der bei der Brut benötigt wird. Alle diese Phasen führen zu unterschiedlich hohen Stressantworten (Wingfield & Sapolsky 2003). Stress kann auch das Immunsystem negativ beeinflussen und so zu einer Immunsuppression führen. Während der Brutzeit führt diese stressbedingte Reduktion der Immunkompetenz zu einer erhöhten Anfälligkeit der Elterntiere gegenüber Parasiten. Die Anzahl der Parasiten der an der Brut beteiligten Vögel steigt bei Fliegenschnäppern und Kohl- meisen signifikant an (Siikamäki et al. 1997; Bähnisch 2011). Ein hoher Testosteron- Spiegel führt allerdings zu einer Reduzierung der Brutfürsorge und Erhöhung der eigenen Überlebenschance und ist damit der Gegenspieler (Dufty 1989; Wingfield et al. 1990; Gustafsson et al.; 1994; Moss et al. 1994; Saino et al. 1995; Ketterson et al. 1996; Allander 1997; Stjernman et al. 2004). Eine hohe Anzahl an Parasiten während der Reproduktionsphase findet sich bei vielen verschiedenen Arten der Vögel und Säugetiere. Dies scheint eine Konsequenz der Reduktion der eigenen immunologischen Verteidigungsmechanismen gegen Parasiten zu sein (Gustafsson et al. 1994; Allander 1997; Stjernman et al. 2004). Der Stress wirkt sich sogar so negativ auf die Fitness der Elterntiere aus, dass die eigene Lebenserwartung sowie der Reproduktionserfolg reduziert werden (Trivers 1972; Johnsen & Zuk 1998; Sanz & Tinbergen 1999; Jenni- Einleitung 23

Eiermann et al. 2005). Längere Belastungen durch Nachzuchtphasen führen zu einer generell erhöhten Produktion und Ausschüttung von Glukokortikosteroiden. Diese Glukokortikoidsekretion wird durch physiologischen Stress noch weiter erhöht, z.B. durch Hitze, Kälte, Hunger, Durst, Infektionen und Verletzungen (van Duyse et al. 2000, 2004). Der Grundlevel der Glukokortikoid-Konzentration differiert bei einigen Arten stark geschlechtsabhängig. Bei Labormäusen enthält das Serum der Männchen immer höhere Konzentrationen als das der Weibchen. Bei anderen Mäusestämmen und weiteren sozial lebenden Tieren, wie Laborratten und Wölfen (Canis lupus), liegt zwischen beiden Geschlechtern allerdings kein Unterschied vor (Touma et al. 2003; Sands & Creel 2004; Palme et al. 2005). Auch Nestlinge von Blaufußtölpeln (Sula nebouxii) weisen schon unterschiedliche Stresshormon-Konzentrationen auf (Nuñez-de la Mora 1996; Martinez-Padilla et al. 2004). Weibliche Jungtiere bekommen mehr Futter von den Eltern als die männlichen Tiere. Dadurch entsteht eine Ressourcenkonkurrenz zu Ungunsten der Männchen. Die Stresshormon-Konzentration liegt bei weiblichen Nestlingen von Moorschneehühnern (Lagopus lagopus) nur dann höher, wenn das größte Tier ein Weibchen ist, im Vergleich zu Bruten, bei denen das größte Jungtier ein Männchen ist (Martinez-Padilla et al. 2004). Dominante Tiere beider Geschlechter bei Mäusen ohne kooperative Reproduktion besitzen niedrige Konzentrationen (Schuhr 1987). Zu beachten ist für die Bestimmung des Glukokortikoidtiters im Blutplasma der Tiere und deren Interpretation, dass die Blutabnahme bei Tieren schon zu einer Stress- situation führt. Der Stresshormontiter kann sich deshalb innerhalb von Minuten, um das 10-fache erhöhen (Palme et al. 2005). Bei Labortieren wird dieser Effekt durch rasches Arbeiten vermieden, was bei Wildtieren nicht immer möglich ist (Schuster 2001 a). Ein erhöhter Glukokortikoidgehalt wird dabei nicht länger als 90 Minuten im Blut aufrechterhalten. Es kommt zu einem schnellen Abbau der Hormone und der raschen Ausscheidung über Kot, Urin und Speichel. Eine nicht-invasive Methode ist deshalb der Nachweis der Glukokortikoide z.B. im Kot oder in der Kloakenflüssigkeit, was zur Validierung der Werte der Blutproben genutzt wird (Hiebert et al. 2000; Eriksson et al. 2004; Touma et al. 2004; Queyras & Carosi 2004; Brousset Hernandez- Jauregui et al. 2005; Goymann & Jenni-Eiermann 2005; Palme et al. 2005; Thiel et al. 2005; Touma & Palme 2005). Dabei variiert die Konzentration der Glukokortikoid- metabolite im Kot der verschiedenen Arten spezifisch. Ebenso ändert sich die Zeit- Einleitung 24 dauer der Nachweisbarkeit, die wiederum von der Länge des Darms und der Dauer des Stresses abhängt (Queyras & Carosi 2004; Scheiber et al. 2005). Die klimatischen Faktoren Temperatur und relative Feuchte beeinflussen ebenfalls die Konzentration der Glukokortikoidmetabolite im Kot (Touma et al. 2004; Millspaught & Washburn 2004). Blutkonzentrationen von Progesteron und Hydrokortisonen, die mit Hilfe blutsaugender Wanzen gewonnen wurden, zeigten keinerlei Veränderungen durch die Wanze. Auch bei Erdmännchen wurden Raubwanzen erfolgreich eingesetzt, um stressfrei Blutproben zu erhalten (Voigt et al. 2004, Stadler 2006).

1.5 Hypothese und Ziel In der vorliegenden Arbeit soll die Hypothese untersucht werden, ob sich Raubwanzen der Art Dipetalogaster maxima dazu eignen, als eine minimal-invasive Alternativmethode zur Blutprobengewinnung bei Wildtieren in Zoologischen Gärten eingesetzt zu werden. Hierzu sollen verschiedene Teilgebiete erfasst werden. Das sind im einzelnen Variationen der Methodik für die Anwendung im Zooalltag. Bei den Genanalysen diente das Erdferkel als Model. Untersuchte Tierseuchen waren die Brucellose, Tuberkulose, Malaria und Blauzungenvirose. Besonders wichtig ist der Vergleich gewonnener Proben in Bezug auf klinische Blutparameter sowie die Nutzung für Hormonanalysen. Die endokrinologischen Untersuchungen sollten an mindestens drei verschiedenen Vogelarten und 60 Arten von Säugetieren stattfinden. Für die Hormonanalysen wurden exemplarisch Kortisol und Progesteron bei Elenantilopen (Taurotragus oryx) und Elefanten ausgewählt, da sie in den Zoos von Bedeutung sind. Des Weiteren sollen ethologische Studien mit koprologischen Untersuchungen auf Parasiten und Blutanalysen nach Entnahme durch Raubwanzen verknüpft werden, um einen weiteren Einblick in den Einfluss der psychoneuroimmunologischen Einflüsse bei Parasitämien liefern. Der Einsatz der Raubwanzen wurde bei mehreren Tiergruppen untersucht, Haushühnern (Gallus gallus f. dom.), Brillenpinguinen (Spheniscus demersus), Diamanttäubchen (Geopelia cuneata), Weißlippenhirschen (Cervus albirostris) und Erdmännchen (Suricata suricatta). Material und Methoden 25

2. Material und Methoden

2.1 Herkunft, Haltung und Zucht der Raubwanzen In der vorliegenden Arbeit wurde nach Abwägung aller Vor- und Nachteile fast ausschließlich Dipetalogaster maxima eingesetzt. Einzig bei der Beprobung der Afrikanischen Elefanten wurde auch Rhodnius prolixus benutzt. Alle Wanzen stammten aus der Zucht an der Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr- Universität Bochum und gehören taxonomisch zu der Unterfamilie Triatominae aus der Familie Reduviidae. Bei der Zucht herrschten standardisierte Laborbedingungen mit 26 ± 1 °C und 70-80 % relativer Luftfeuchte (relative Humidität, RH). Es gab einen 16/8h Tag/Nacht-Rhythmus, und als Wirte für die Laborzucht wurden Haushühner eingesetzt (Schaub 1989). Verwendet wurden in der vorliegenden Studie Nymphenstadien N2-N5, welche vor einer Beprobung der Zootiere mindestens drei und maximal fünf bis zehn Wochen gehungert hatten. Im Zoologischen Garten Wuppertal wurden die Wanzen bis zur Nutzung im Terrarium gehalten, saisonabhängig bei 23-30 °C und 67-86 % RH. Für die Fütterung der Wanzen wurden auch Latex-Membranen eingesetzt. Diese wurden vor dem ersten Gebrauch abgewaschen und abgekocht, um das Talkum- Puder und den Weichmacher zu entfernen. Für die Fütterung wurden die autoklavierten Membranen (1 bar für 45 min) flach auf einer sterilen gerillten Glasplatte ausgebreitet, welche durch eine Heizplatte bei einer Temperatur von 36-38 °C gehalten wurde (Schaub 1990a). Eine Erwärmung der Blutproben war notwendig, da diese Temperatur die Raubwanzen zur Nahrungsaufnahme animierte (Lazzari & Núnez 1989; Schofield 1979). Bei jeder Fütterung wurden je 3-4 ml Blut auf die Glasplatte gebracht. Auf die Membran wurden mit Gaze verschlossene Gefäße mit jeweils fünf Nymphen (N5) gesetzt. Diese Gefäße wurden während der Fütterung mit einem Tuch abgedunkelt. Nach jeder Fütterung wurden die Membranen mit kaltem Wasser abgewaschen und erneut autoklaviert.

2.2 Untersuchungszeitraum und Datenerhebung Eigene Voruntersuchungen im Zoo Wuppertal und in einigen europäischen Institutionen fanden vom Juni 2006 bis Ende 2009 statt. In dieser Zeit wurden vor allem die Kontakte zu anderen europäischen Instituten intensiviert, und die Methodik wurde erarbeitet. Von 2010 bis Mitte 2015 wurde die Anzahl der Stichproben erhöht und die Methodik in der Zoowelt etabliert. Weiterhin wurden einzelne Fragestellungen Material und Methoden 26 durch die Betreuung von studentischen Praktika-, Bachelor-, Diplom-, Master- und Doktorarbeiten weiter bearbeitet (Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007; Skodras pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2011; Heller 2011; Hubmer 2011; Dobrzinski 2012; Jezyschek 2012; Schepsky 2012; Hübner 2013; Hermsen 2014; Müser 2014). Die Untersuchungen waren von Anfang an multinational geplant und fanden in insgesamt zwölf europäischen Länder und 44 Institutionen und drei privaten Haltungen statt (Tab 2.1, 2.2, Abb. 2.1).

Tab 2.1: Beteiligte Institutionen in Deutschland Land Institution Deutschland Allwetterzoo Münster, Auffangstation für Reptilien München, Hannover Zoo,

Kölner Zoo, Opelzoo Kronberg, Private Ställe in Hagen, Wülfrath und Wuppertal, Serengetipark Hodenhagen, Tiergarten

Nürnberg, Tierpark Hagenbeck, Tierpark Hellabrunn, Zoo Dortmund, Zoo Duisburg, Zoo Frankfurt, Zoo Heidelberg, Zoo Krefeld, Zoo Leipzig, Zoo Magdeburg, Zoo Saarbrücken, Zoom Erlebniswelt Gelsenkirchen, Zoo Wuppertal

Tab 2.2: Beteiligte Institutionen in Europa (nach Ländern sortiert) Land Institution Dänemark Reepark Safari Ebeltoft England Chester Zoo, Colchester Zoo, London Zoo, Whipsnade Zoo, Port Lympne Wild Animal Park, Twycross Zoo Frankreich African Safari, Le Pal Zoo, Marineland, Mulhouse Zoo Irland Dublin Zoo Lettland Riga Zoo Niederlande Amersfoort Zoo, Artis Zoo Amsterdam, Burgers Zoo Arnheim, Dierenpark Emmen Österreich Tiergarten Schönbrunn, Zoo Salzburg Schottland Edinburgh Zoo Schweiz Basel Zoo, Zoo Zürich Spanien Bioparc Valencia, Faunia Madrid Tschechische Republik Lány Gehege

Material und Methoden 27

Abb. 2.1 Europakarte mit Angabe der am Projekt beteiligten Institutionen

2.3 Untersuchte Arten Die im Rahmen der vorliegenden Studie untersuchten und mit Raubwanzen erfolgreich beprobten Arten sind im Anhang in Tabelle A7.2 aufgeführt. Insgesamt waren es vier Arten aus der Klasse der Reptilien, drei verschiedene Vogelarten und 60 Arten von Säugetieren, welche alle in zoologischen oder privaten Einrichtungen mit entsprechenden Haltungsgenehmigungen gehalten wurden. Zusätzlich wurden ethologische und koproskopische Untersuchungen an Königspinguinen und Sibirischen Steinböcken durchgeführt. Konventionelle Blutproben wurden bei Haussperlingen, Mähnenrobben, Schwarzkopfschafen, Afrikanischen Zwergeseln, Afrikanischen Zwergziegen, Hausrindern, Afrikanischen und Asiatischen Elefanten genommen.

2.4 Konventionelle Blutabnahme Da die konventionelle Blutprobenentnahme in den entsprechenden Institutionen ausschließlich Veterinärmediziner vornahmen und dies nicht im Rahmen von extra angelegten Tierversuchen, sondern aus einem aktuellen Anlass wie z.B. bei geplanten Narkosen oder Transporten, lagen alle erforderlichen Genehmigungen nach § 8a Abs. Material und Methoden 28

1+2, § 9 Abs. 2 Nr. 7 Tierschutzgesetz vor. Es wurde bei den Wirtstieren an Tierart- spezifischen Körperstellen venöses Blut entnommen. Dies geschah z.B. aus der Vena jugularis oder anderen großen Blutgefäßen. Ein Großteil der Tiere musste dafür anästhesiert werden oder zumindest gefangen und fixiert werden. Die Narkosen wurden mit Tierart-spezifischen Narkotika durchgeführt und dauerten je nach Anlass zwischen 10 und 120 Minuten. Für die Blutabnahmen wurden handelsübliche Kanülen unterschiedlicher Größen und Spritzen unterschiedlicher Volumina benutzt.

2.5 Methodik der Blutentnahme mit Raubwanzen Die Beprobung mit Hilfe der Raubwanzen erfolgte entweder selber vor Ort oder durch die Veterinärmediziner bzw. Tierpfleger in den entsprechenden Zoos. Die Thermometrie bei der Blutabnahme bei den 13 Reptilienarten in der Reptilien Auffangstation München wurden nach Anleitung mit dem Infrarot-Thermometer ScanTemp 485 durchgeführt. Zur Beprobung von Wirten mittels Raubwanzen wurden sechs verschiedene Varianten entwickelt und angewandt. Dies waren im einzelnen die freilaufende Wanzen , freilaufende mit Faden markierte Wanzen sowie Wanzen im Becher, im Rucksack/Kunstei und unter dem doppelten Boden. Bei den freilaufenden Wanzen wurden die Raubwanzen zuerst in einem Becher separiert. Kurz vor der Beprobung wurde mehrfach in den Becher geatmet, um durch das CO 2 die Saugbereitschaft der Raubwanzen zu erhöhen. Danach wurde eine einzelne Raubwanze mit Hilfe einer Federstahlpinzette oder mit dem Finger dem Becher entnommen und auf dem Tier platziert (Abb. 2.2). Dieses geschah oft beim kurzzeitigen Berühren des Wirtstieres.

Material und Methoden 29

Abb. 2.2 Freilaufende Wanze auf Schabrackentapir (Foto: Dr. Mägdefrau, Nürnberg) Unter Umständen musste das Tier gar nicht berührt werden, sondern die Wanzen wurden auf das Tier geworfen (Abb. 2.3). Nicht fixierte Raubwanzen lieferten im Rahmen der vorliegenden Studie den Vorteil, dass z.B. Raubtiere nicht für eine Blutprobenentnahme narkotisiert werden mussten.

Abb. 2.3 Beobachtung einer Giraffe, um eine Wanze durch Wurf zu platzieren (Foto: Dr. Grothmann, Magdeburg) Dabei wurden die Wanzen während des Saugvorganges stets beobachtet, um ein Entkommen der Wanzen zu verhindern, da diese nach vollständiger Blutaufnahme den Wirt verlassen und vom Wirt abwandern. In diesen Fällen wurden die Zootiere aus dem Gehege gesperrt und die Wanzen dann eingesammelt. Freilaufende Wanzen bieten den enormen Vorteil, dass der Wirt nur kurz durch den Pfleger gestört wird und ansonsten Material und Methoden 30 die Methodik komplett minimal-invasiv ablaufen kann. Das Risiko eines Entkommens einzelner Wanzen ist gering, und im Falle eines Entkommen sind die Wanzen durch Insektizide leicht abzutöten ohne das entkommene Tier suchen zu müssen. Um das Auffinden der Raubwanzen in zum Teil großen Gehegen zu erleichtern, wurde einzelnen Individuen ein Bindfaden um das Abdomen geknotet. Allerdings reagierten die Wanzen auf diesen Handlingstress mit verminderter Sauglust, so dass dieses nur in Notfällen benutzt wurde. Teilweise wurden an diesen Faden auch noch rote Fähnchen gehängt, um das Auffinden der abgefallenen Wanzen zu erleichtern (Abb. 2.4). Bei Erdmännchen wurde den Wanzen zwischen dem ersten und zweiten Laufbeinpaar ein Nähgarn umgebunden. Wenn ein Erdmännchen sich als Wächter am Gitter des Geheges exponierte, wurde die Wanze vorsichtig angesetzt. Über das Garn wurde die Wanze schnell aus dem Gehege gezogen, wenn das Erdmännchen diese entdeckte. Zur Beprobung der Weißlippenhirsche wurden die Wanzen auch mit Nähgarn festgebunden. Um in die Nähe der Hirsche zu kommen, wurden sie mit Erdnüssen ans Gitter des Außengeheges gelockt. Es erwies sich als hilfreich, die Wanzen an Schrammen im Fell des entsprechenden Tieres zu platzieren, da das Fell recht grob und borstig ist und die Wanzen so deutlich einfacher eine optimale Anstichstelle fanden.

Abb. 2.4 Mit Bindfaden markierte Raubwanze der Art D. maxima auf einem Okapi

Bei scheuen Tieren, wie z.B. Okapis ( Okapia johnstoni ), die nur kurzzeitig, aber nicht für eine gesamte Saugdauer, angelockt werden können, wurden Becher mit Wanzen an das Tier gebracht. Vorteilhaft war auch hier, wenn vor dem Ansetzen mehrfach in den Becher geatmet wurde, um die Wanzen zu stimulieren. Zusätzlich Material und Methoden 31 verringerte dies die Saugzeit. Nachdem die ersten Wanzen am Wirt waren, wurde dann der Becher entfernt. Danach konnten die Wanzen am Wirt beobachtet werden, was den Stress für den Wirt weiter verringerte, da die Zeit mit direktem Kontakt weiter reduziert wurde (Stadler et al . 2007; 2008b, 2009). Wenn die zu beprobenden Tiere ein geringes Handling durch die versorgenden Personen gewohnt waren, konnten auch umgebaute Präparatebecher, in denen sich die Raubwanzen befanden, an das Wirtstier gehalten werden (Abb. 2.5). Diese Becher hatten einen Durchmesser von 6 cm und eine Tiefe von 5,3 cm. Der Becher enthielt zusätzlich ein Pappkreuz, um den Wanzen Versteckmöglichkeiten zu geben sowie das Klettern im Gefäß und das Anstechen des Wirtes zu erleichtern. Wenn die Chancen einer erfolgreichen Beprobung erhöht werden sollten, wurde der Verschlussdeckel bei der Beprobung weggelassen. Dieser ist normalerweise mit einer Stoffgaze verschlossen, um so das Saugen der Raubwanzen zu ermöglichen. Vor der Anwendung wurde wie bei den frei laufenden Wanzen mehrfach in den Becher geatmet, um die Sauglust zu erhöhen (Abb. 2.6).

Abb. 2.5 Mit Raubwanzen gefüllter Becher an einem Asiatischen Elefanten Material und Methoden 32

Abb. 2.6 Stimulation der Raubwanzen durch Atmung (Foto: Dr. Lawrenz, Wuppertal)

Da einige der zu beprobenden Vögel nicht lange genug ruhig blieben, wurde eine Art Rucksack zur Beprobung entwickelt (Abb. 2.7). Dieser bestand aus Hosen- bundgummibändern, an denen ein Becher mit Raubwanzen befestigt war. Der Becher war nicht verschlossen, die Raubwanzen konnten innerhalb des Bechers frei an die Wirtstiere gelangen. Der Rucksack wurde über Kreuz, über und unter dem Flügel gebunden, um so den Vögeln weiterhin eine freie Bewegung zu ermöglichen. Diese Methode wurde nur bei Brillenpinguinen ( Spheniscus demersus ) eingesetzt. Bei den brütenden Diamanttäubchen (Stictopeleia cuneata ) wurde zunächst die Raubwanze in einem kleinen Stoffsäckchen verborgen, durch dessen Gewebe die Wanze in der Lage war anzustechen. Als nächstes wurden kleine Pappschachteln mit Gaze-überzogenen Fenstern eingesetzt, um zu vermeiden, dass die Wanze gequetscht wird, wenn sich eine der beiden Tauben in das Nest setzt. Kommerzielle Kunstoffeier wurden ebenfalls verwendet. Zuletzt fand ein künstliches Ei Verwendung, welches mit der Knetmasse Fimo im Backofen ausgehärtet wurde. Das Ei war nach oben hin offen und wurde, nach dem Einsetzen der Wanze mit Metall-Gaze und einem Klebestreifen verschlossen. Das Ei wurde mit der von Gaze bedeckten Öffnung nach oben im Nest platziert, so dass die Wanze die entsprechende Taube, die sich zum Nisten daraufsetzte, anstechen konnte.

Material und Methoden 33

Abb. 2.7 Brillenpinguin mit Wanzenrucksack (Foto: Silja Heller) Bei der Beprobung von Tierarten, die in Boxen schlafen, wurde ein doppelter Boden unter den Schlafkisten der Tiere angebracht. Dieser hatte eine Höhe von 8 cm und war an einigen Stellen mit Metallgaze verschlossen. Bevor die Wirtstiere die Box auf- suchten, wurden Raubwanzen in der unteren Etage entweder freilaufend oder in kleinen Plastikbechern eingebracht. Ungefähr eine Stunde, nachdem sich die Tiere zum Schlafen in den Boxen eingefunden hatten, wurde die Raubwanzen wieder entfernt und überprüft, ob sie sich vollgesogen hatten. Die einzige Störung des Wirtstieres bestand im erneuten Weckvorgang, um die Raubwanzen zu entnehmen (Abb. 2.8).

Abb. 2.8 Sandkatze während einer Blutabnahme durch Raubwanzen durch den doppelten Boden

Material und Methoden 34

Nach erfolgreicher Blutaufnahme durch die Raubwanzen wurde das Blut analog zu vorherigen Studien (z. B. von Helversen 1986) mit einer handelsüblichen 12 oder 21G-Einmalkanüle und einer Einmalspritze aus dem Magen der Raubwanzen aufgenommen. Die Kanüle wurde dazu in einem ca. 45° Winkel ins Abdomen eingeführt und das Blut umgehend bis zur späteren Analyse in ein Lithium-Heparin- oder EDTA- Gefäß überführt.

2.6 Molekulartaxonomische Untersuchungen Eine Unterartbestimmung von Erdferkeln wurde im Rahmen einer von mir mitbetreuten Diplomarbeit angefertigt (Schepsky 2012). Die Proben stammten aus den Zoos Arnheim, Frankfurt, Prag, Saarbücken sowie aus den Museen Berlin, Frankfurt, München, Stockholm und Tervuren, wobei letztere Proben von Tieren stammten, die in Afrika genommen wurden (A7.3, Anhang). Zehn Blutproben wurden mit Hilfe von N5 von D. maxima an Erdferkeln (Orycteropus afer ) entnommen und für reproduzierbare Ergebnisse der DNA-Unterart Bestimmungen genutzt. Alle diese Proben wurden mit frei auf den zu beprobenden Erdferkeln laufenden Wanzen gewonnen. Außerdem wurden Haare und Speichel eingesetzt sowie konventionell entnommene Blutproben. Die anschließende Isolierung der DNA aus den Proben erfolgte gemäß des Protokolls des benutzten DNeasy ® Blood & Tissue Kits von Qiagen. Die aus den Wanzen gewonnenen 500 μl bis 1,5 ml Erdferkelblut wurden bis zur Analyse in Ethanol aufbewahrt. DNA Messungen nach der Isolierung ergaben ein sehr unterschiedliches Gesamt DNA-Volumen. Die Messung mit dem Qubit-Verfahren gab keine Referenz bezüglich der Qualität der Proben, da bei der Methode sämtliche Nukleinsäuren durch Fluoreszenz erfasst werden, also auch kleinste Nukleotid- Fragmente und denaturierte DNA, die später in der Analyse kein Ergebnis bei der Sequenzierung bringen konnte. Beim Qubit-Verfahren war es weniger wichtig, absolute Mengen an DNA zu bestimmen als vielmehr einen Erfolg bei der Isolierung nachzuweisen und eine Mengenreferenz zu bekommen. Für die folgende Polymerase-Kettrenreaktion (PCR) und die hierfür benötigte Aufreinigung wurde das PCR Kit von Roche ® verwendet. Für die Unterartbestimmung wurde die 16SrDNA amplifiziert. Hierbei handelt es sich um ein nicht proteincodierendes Gen, das am Aufbau der Ribosomen beteiligt ist. Die Standardprimer 16SAL und 16SBH amplifizierten ein jeweils 554 Basenpaare (bp) umfassendes Fragment des Gens. Die bekannten Primer wurden durch neu entworfene Material und Methoden 35 ergänzt (430f, 430r und 180f; Wandeler et al . 2007). Die neuen Kombinationen der Primer waren L2513 und H2714 für ein Fragment von je ca. 200 bp sowie 180f und 430r für ein Fragment von ca. 250 bp und 430f zusammen mit 16SBH, die eine

Fragmentgröße von ca. 150 bp lieferten (Kitano et al . 2007) (Tab. 2.3).

Tab. 2.3 Sequenzen der verwendeten Primer mit entsprechender Annealing-Temperatur Primer Sequenz Annealing-Temperatur 16SAL CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT 54 °C 16SBH CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T 54 °C L2513 CGC CTG TTT ATC AAA AAC ATC AC 57 °C H2714 AAG ACG AGA AGA CCC TAT GGA G 61 °C 430f CGG AAC AAG TTA CCC TAG GG 57 °C 430r CCC TAG GGA TAA C AG C GC AAT 59 °C 180f CCT TCC CGT GAA GAG GCG GG 63 °C

Die PCR wurde anschließend mit dem Mastermix 5Prime (50 μl Endvolumen) gemäß Protokoll durchgeführt (Tab. 2.4; 2.5). Durch Gradienten-PCRs mit abweichenden Annealing-Temperaturen wurde die optimale Temperatur für die Primerkombinationen bestimmt. Grundsätzlich wurden immer 1,5 μl von der 1:10 verdünnten DNA und 1,5 μl original DNA eingesetzt.

Tab. 2.4 PCR ‐Mastermix und Protokoll (hier für die Primer 16SAL und 16SBH) Menge [ μl] Reagenz

26 H2O 20 Ma stermix 5Prime je 1,3 Primer (Vorwärts - und Rückwärtsprimer) 1,5 Probe

Tab. 2.5 Dauer der Inkubierung Temperatur Dauer 94° 2 min 94° 30 sec 54° 1 min 30 sec 33 Zyklen 65° 1 min 30 sec 65° 3 min

Eine Kontrolle der Ergebnisse der PCR und der folgenden Aufreinigung wurden mittels Gelelektrophorese durchgeführt. Nach der standardmäßigen Aufreinigung folgte die Sequenzierreaktion nach Sanger (Sanger et al . 1977). Die Reaktion wurde mit dem Mastermix nach Sanger (10 μl Endvolumen) nach Protokoll für alle Primer durchgeführt (Tab. 2.6; 2.7).

Material und Methoden 36

Tab. 2.6. PCR ‐Mastermix und Protokoll (hier für die Primer 16SAL und 16SBH) Menge [ μl] Reagenz 5 H2O 2 Sanger -Reagenz 1 Primer 2 aufgereinigte Probe

Tab. 2.7 Dauer der Inkubierung Temperatur Dauer 95° 20sec 50° 15sec 25 Zyklen 60° 60sec

Das Alignment wurde mit Hilfe der Gensequenz der 16SrDNA von einem Erdferkel aus der Genbank erstellt (Accession Number Y18475; Arnason et al. 1999). Für die Außengruppen der phylogenetischen Analysen wurden Mensch und Rothirsch (Cervus elaphus ) gewählt, um mögliche Kontaminationen zu erkennen, der Rothirsch wegen der häufigen Verwendung von Proben im Labor der Universität Trier. Zudem wurden noch Sequenzen von Rüsselspringer ( Elephantulus sp.) und Kleinen Igeltenreks (Echinops telfairi ) als Außengruppe gewählt, da sie Verwandte des Erdferkels sind. Die erzielten Sequenzen wurden mit dem Computerprogramm Chromas 1.5 ausgelesen und in ein Microsoft Office Dokument übertragen. Es wurde für jedes Individuum eine eigene Sequenz angelegt, bei der jeder Sequenzbereich des Gens eines Individuums immer direkt unter dem gleichen Sequenzbereich eines anderen Individuums lag, also ortholog zueinander. Das erstellte Alignment wurde mit den Computer-Programmen MrBayes 3.1.1., das einen Konsensbaum erstellt, und TCS 1.21, welches ein Haplotypennetzwerk der gegebenen Daten entwirft, ausgewertet. Ein Parsimonienetzwerk der Haplotypen wurde anschließend unter Anwendung der Standardregeln und Verwendung von TCS 1.21 berechnet (Tempelton et al . 1987; Clement et al . 2000).

2.7 Untersuchungen auf Tierseuchen Die Untersuchungen auf Tierseuchen erfolgten mit Ausnahme der Malariadiagnostik ausschließlich in zertifizierten Diagnostiklaboren. Das Blut wurde sowohl mit Raubwanzen als auch konventionell entnommen. Die Tests auf Brucellose wurden mit dem Rose-Bengal-Test angefertigt, bei denen nach einer Agglutinationsreaktion der Probe gesucht wird. Die Diagnostik auf die relevanten Tuberkulosebakterien ( Mycobacterium tuberculosis , M. bovis oder M. avium ) erfolgte Material und Methoden 37 entweder über den Rapid Test (ElephantTB STAT-PAK) in den einzelnen Instituten oder per Mapia (Multi-Antigen-Print-Immuno-Assay) bzw. ELISA Test in Diagnosereferenzlaboren. Der Rapid Test benötigte 30 μl Blutvolumen und zeigte in einem Schnell-Assay an, ob Antikörper mit der Testfläche kreuzreagieren. Auch der Mapia bzw. ELISA sind Antikörpertests. Zur Bestimmung der Parasiten im Blut der Brillenpinguine dienten Blutausstriche. Hierzu wurde ein Bluttropfen mit einem Objektträger auf einem sauberen Objektträger ausgezogen und an der Luft getrocknet (Mehlhorn et al . 1986a). Eine anschließende Anfärbung erfolgte mit der Diff-Quick-Schnellfärbung. Bei einer 1000-fachen Vergrößerung waren anschließend im Mikroskop die Strukturen der Blutzellen und die der Malariaerreger gut sichtbar und unterscheidbar. Im Blutausstrich wurde von jeweils 2.000 Erythrozyten die Parasitierung mit Malariaerregern erfasst (Godfrey et al . 1987). Eine Verifizierung erfolgte durch die Herren Prof. Dr. A. Haberkorn, Wuppertal, und Prof. Dr. H. Mehlhorn, Düsseldorf. Auf weitere Verifizierungen der Ausstriche und die Bestimmung der Parasiten mit Hilfe der PCR wurde aus zeitlichen und finanziellen Gründen verzichtet. Eine zweite Methode zur Überprüfung der Ergebnisse war der dicke Tropfen (Mehlhorn et al . 1986a). Bei diesem wird ein Bluttropfen auf einem Objektträger auf etwa 1,5 cm² mit einem Zahnstocher verrührt, um das Fibrin zu entfernen und die Koagulation zu verhindern. Nach der Lufttrocknung wird der Objektträger ohne weitere Fixierung in Wasser gelegt (Mehlhorn et al . 1986a). Dann erst erfolgt die Anfärbung mit der Diff-Quick-Lösung. Der Vorteil des dicken Tropfens ist der Nachweis von Parasiten auch bei einer geringen Parasitendichte. Die schwierige Blauzungenvirus (BTV)-Diagnostik erfolgte bei den Proben des Zoologischen Gartens Wuppertal im Chemischen und Veterinärmedizinischen Untersuchungsamt, Münster. Andere europäische Einrichtungen nutzten äquivalente zugelassene Einrichtungen ihrer entsprechenden Länder. Die eingesandten Blutproben wurden dazu serologisch auf Antikörper gegen BTV über einen kompetitiven Antikörper-ELISA untersucht. Die virologische Untersuchung erfolgte mittels pan- BTV-S5 real time RT-PCR gemäß dem Protokoll des Friedrich Löffler Instituts von Herrn Dr. Bernd Hoffmann. Die Anzahl der insgesamt getesteten Arten waren: vier für die Brucellosediagnostik, sieben Arten für die Untersuchungen auf Tuberkulose, insgesamt drei Arten – 14 männchliche und 26 weibliche Hühner, 10 Haussperlinge und 12 Material und Methoden 38

Brillenpinguine – für die Malariadiagnostik und sechs Arten bei der Blauzungenkrankheit. Insgesamt wurden 9 Proben für die Brucellose, 37 Proben für Tuberkulose, 52 Proben für Malaria und 26 für die Blauzungenkrankheit bei insgesamt 12 verschiedenen Wildtierarten getestet. Bei acht Tierarten gab es direkte Vergleichsproben zwischen der konventionellen Blutabnahme und der Abnahme mit Raubwanzen.

2.8 Klassische Hämatologie Blutproben wurden entweder mit einem Vetscan VS2 oder VetScan I-STAT 1 Analysegerät auf bis zu 47 klinisch relevante Parameter foto- und potentiometrisch analysiert. Die einzelnen Blutparameter und ihre veterinärmedizinische Relevanz sind der Tabelle 2.8 zu entnehmen. Abweichungen der Werte vom Referenzbereich können Hinweise auf Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme und auch Aufschluss über das Vorliegen eines infektiösen Krankheitsgeschehens geben. Dazu reichte ein einziger Tropfen auf das Analyseset aus. Alternativ dazu wurden Blutproben von den entsprechenden zoologischen Einrichtungen zur Analyse per Kurier an Diagnostiklabore geschickt, z.B. Laboklin, Bad Kissingen. Die hierzu benötigte Blutmenge betrug zwischen 0,3 und 0,5 ml. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen wurde bei einem Tropfen Blut in einer Neubauer Zählkammer direkt vor Ort selber ausgezählt. Dazu wurden durch manuelle Zellzählung alle Zählfelder unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung analysiert. Die Differenzierung der weißen Blutkörperchen erfolgte an einem Blutausstrich. Die Glukosebestimmung erfolgte sowohl mit einem Blutzuckermessgerät Accu-Check als auch mit dem VetScan I-STAT 1, um die Proben zu validieren. Es reichte jeweils ein Tropfen Blut aus, um amperometrisch, also mittels einer Glukose- Oxidase Reaktion und Messung eines Stromstärkenverlaufs die Konzentration zu bestimmen. Neun Raubwanzen wurden an einem Hausrind gefüttert, um die Reproduzierbarkeit zu erfassen, d.h. mögliche Auswirkungen der Raubwanzen vor allem auf die Anzahl der verschiedenen Blutzellen zu erfassen.

Material und Methoden 39

Tab 2.8: Untersuchte Blutparameter und ihre veterinärmedizinische Bedeutung (nach Campbell 2012; bei den Parametern ist die hauptsächliche Bedeutung angegeben; Elektrolyte sind allgemein wichtig für den Wasserhaushalt bzw. viele Stoffwechselvorgänge im Körper. Die Zuordnung auf eine Eigenschaft ist exemplarisch) Veterinärmedizi- Veterinärmedizi- Gruppierung Blutparameter Gruppierung Blutparameter nische Bedeutung nische Bedeutung Blutzellen Hämatokrit Anzahl zellulärer Stoffkonzen- Gesamteiweiß Gesamtkonz. der (l/l oder %) Bestandteile trationen (g/dl) Proteine Rote Blutkörperchen Sauerstofftransport Kreatinin (µmol/l Nierenwert (T/l) + mg/ dl) Hämoglobin Blutfarbstoff der Harnstoff-BUN Harnstoffwert im (mmol/l) Erythro zyten (mg/dl) Blut ctHb Gesamthämoglo- Bilirubin direkt Abbau der Erythro- (mmol/l) binkonzentration (µmol/l) zyten in Leber Weiße Immunabwehr Bilirubin total Abbau der Erythro- Blutkörperchen (G/l) (µmol/l) zyten in Leb er Neutrophile Identifizierung und Enzyme Urease Enzym zur Spaltung Granulozyten Zerstörung von (mmol/l) von Harnstoff (%) Erregern Amylase (U/l) Zuckerstoffwech Lymphozyten Adaptives Immun- selenzym (%) system ALP/AP (U/l) Alkalische Monozyten Makrophagen der Phosphatase (%) Immunabwehr GLDH (U/l) Glutamatdehydro - Eosinophile Zelluläre Immun- genase Granulozyten (%) abwehr LDH (U/l) Laktat -Dehydroge Basophile Unspezifische nase Granulozyten (%) Immunabwehr ALT (U/l) Alanin - Thrombozyten Blutgerinnung Aminotransferase (G/l) gGT (U/l) Gamma -Glutamyl - Stoffkonzen- Laktat Abbauprodukt der Transferase trationen (mmol/l) Glukose im Muskel AST/ GOT Aspartat- Glukose Blutzucker (U/l) Aminotransferase (mmol/l) Triglyceride Blutf ette pH (T)c pH Wert des Blutes (mmol/l) Partial CO 2 (T c/e) Konzentration des Elektrolyte Kalzium ionisiert Kalziumhaushalt (mmHg) CO2 (mmol/l) Bikarbonat-HCO 3- Hydrogencarb- Phosphat Molekülbaustein (P)c (mmol/l) onatpartialdruck (mmol/l) von ATP oder DNA Gesamt CO 2 Gesamtkonzen- Kalium Signalweiterleitung (mmol/l) tration des Gases (mmol/l) Sauerstoff Gesamtkonzen- Natrium Flüssigkeits- (%) tration des Gases (mmol/l) haushalt ABE Basenüberschuss Chlorid (nmol/l & Flüssigkeits- (mmol/l) mmol/l ) haushalt BEecf Basenabweichung Magnesium Enzymreaktionen (mmol/l) (mmol/l) AnGap Anionenlücke Spuren- Eisen Bildung von (mmol/l) elemente (umol/l) Hämoglobin Bilrubin-BIL Gallenfarbstoff Selen Stimulation des (mg/dl) (ug/l) Immunsystems Albumin Aufrechterhaltung Zink (umol/l) Wundheilung (g/dl) des kolloidosmo- tischen Drucks Globulin An Immunabwehr (g/dl) beteiligt

Material und Methoden 40

2.9 Trächtigkeits-Hormonmetabolitbestimmung Um die Variationen durch Raubwanzen besser vergleichen zu können, wurden in einer mitbetreuten Bachelorarbeit Membranfütterungen von Raubwanzen mit Elefantenblut durchgeführt (Dobrzinski 2012). Die Membranfütterungen vergrößerten das aufgenommene Blutvolumen durch die Wanzen, da diese vorher z.T. Probleme hatten, mit dem Stechrüssel durch die Haut der Elefanten zu den Blutgefäßen zu gelangen und so nicht genug Blut aufnahmen. Der Tierarzt entnahm dafür mehrmals pro Woche zwei Blutproben zur selben Uhrzeit. Diese Blutproben wurden direkt in Lithium- Heparinröhrchen überführt, um eine Blutgerinnung zu vermeiden. Eine Probe wurde für die Membranfütterung verwendet, während die zweite Probe als Kontrolle bei ca. 2000 G zentrifugiert wurde. Das Kontrollplasma wurde in 600 Z-Multivetten bei -20° C bis zur Analyse aufbewahrt. Progesteronwerte wurden bei vier verschiedenen Tierarten im Rahmen von mitbetreuten Bachelor- und Masterbeiten sowie eigenen Untersuchungen analysiert (Dobrzinski 2012, Müser 2014). Insgesamt wurden ein Flachlandtapir (1 Weibchen) vom Zoo Salzburg, je eine Kuh von Asiatischen Elefanten vom Dubliner und Leipziger Zoo sowie drei Kühe Afrikanischer Elefanten vom Wuppertaler Zoo und Laborratten (2 Männchen, 4 Weibchen) vom Zoo Wuppertal untersucht. Zudem wurden Versuche an zehn weiblichen Elenantilopen aus Gehege Lány, Tschechien, in Zusammenarbeit mit der Veterinärmedizinischen Universität Wien durchgeführt (Hubmer et al . 2010, Hubmer 2011). Die Analysen der Blutproben auf Progesteron bei Elefanten beider Gattungen erfolgten sowohl im Labor Stein und Kollegen in Velbert als auch im Labor des Leipziger Zoos mit dem selben immunologischen Test. Mit einer Mindestmenge von 500-600 μl Vollblut oder respektive ~300 μl Plasma wurde mit Hilfe eines ECLIA (Elektro-Chemie-Lumineszens-Immuno-Assay bzw. Elecsysy Progesterone II) Tests ohne radioaktive Isotope der Progesterongehalt bestimmt. Für diese Analyse wurden 30 μl Plasma zur Freisetzung des gesuchten Progesterons mit Danazol in Gegenwart eines spezifischen biotinylierten Antikörpers inkubiert. Zusätzlich war ein mit Ruthenium- Komplex markiertes Progesteronderivat notwenig. Das Derivat und das Progesteron standen dabei in Konkurrenz um die Anbindungsstellen des Antikörpers. Um die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung auszunutzen, wurden bei einer zweiten Inkubation mit Streptavidin beschichtete Mikropartikel hinzugefügt. Diese bildeten den Komplex für die Markierung des Progesteronderivates an die Festphase. Der Anteil des Progesteronderivates war umgekehrt proportional zum Progesterongehalt in der Probe. Material und Methoden 41

Durch Anlegen einer Spannung in einer Messzelle wurden alle Mikropartikel auf der Oberfläche fixiert und die ungebundenen Substanzen entfernt. Die ausgelöste Chemilumineszenzemission wurde photometrisch gemessen, um über eine Kalibrationskurve den Progesterongehalt zwischen 0,03-0,60 ng/ml zu ermitteln. Alle diese Analysen erfolgten nach Anleitung des Herstellers. Die Analysen der ACTH Hormonmetabolite im Blut und im Kot der Elenantilopen erfolgten im Biochemischen Institut der Veterinärmedizinischen Universität Wien mittels eines Enzym-Immuno-Assays (Palme & Möstl 1997). Der Enzym-Immuno-Assay nutzte dabei gruppenspezifische Antikörper, welche eine simultane Erfassung ermöglichten (Palme et al . 2005).

2.10 Stresshormonanalysen Kortisolwerte wurden bei Erdmännchen ( Suricata suricatta ) und Weißlippenhirschen ( Cervus albifrons ) im Rahmen der von mir mitbetreuten Bachelor- und Masterarbeiten sowie eigenen Untersuchungen analysiert (Dobrzinski 2012, Müser 2014). Zudem wurden Elenantilopen in Zusammenarbeit mit der Veterinärmedizinischen Universität Wien untersucht (Hubmer et al . 2010, Hubmer 2011). Da der Stresshormontiter zur Validierung der ethologischen Beobachtungen dienen sollte, wurde versucht, den Tieren das Blut möglichst stressfrei abzunehmen. Die konventionelle Methode über eine handelsübliche Spritze erfordert ein rasches Fangen und Fixieren des Tieres. Deshalb sollte die Blutentnahme mittels Raubwanzen erfolgen, eine Methode, die schonender ist. Der Raubwanze wurde anschließend das Blut aus dem Magen mit einer Kanüle oder Spritze über Punktion des Abdomens entnommen, in ein Heparin-Röhrchen überführt und bei -20 °C aufbewahrt. Die Konzentrationen der Stresshormonmetabolite wurden im Biochemischen Institut der Veterinärmedizinischen Universität Wien mittels eines Enzym-Immuno- Assays bestimmt (Palme & Möstl 1997). Dieser nutzte gruppenspezifische Antikörper, welche eine simultane Erfassung aller Metabolite ermöglichte (Palme et al . 2005). Die Detektion der Metabolite erfolgte mit beschichteten Mikrotiterplatten über die Anti- körper und Steroiden als Label zum Nachweis der Kortikosterone. Aufgrund der Kreuzreaktionen erfasste dieser Assay alle Metabolite mit einer 3,11 Dioxy-Struktur (Rettenbacher et al . 2004). Maximal 0,5 ml Probe wurden in 5 ml 60 % Methanol verdünnt. Die Analyse der Aliquots erfolgte mit einer 1:20.000 Verdünnung. Kortikosteron, mit einer Material und Methoden 42

Bandbreite von 2-500 pg, wurde als Standard gesetzt, wobei der 50 % Wert bei 60 pg lag. Dabei ergab sich eine Nachweisgrenze von 0,01 pg. Bei 4 °C wurden ~ 50 μl Probe mit jeweils 100 μl Antikörper und Steroiden inkubiert. Anschließend wurden die Mikrotiterplatten mit 0,02 % Tween 20 Lösung gewaschen und getrocknet, bevor 250 μl Streptavidin-Meerrettich-Peroxidasen-Konjugat (4,2 mU) aufgetragen wurden. Nach weiteren 45 min bei 4 °C in der Dunkelkammer und einem zusätzlichen Waschschritt mit Tweed wurden die Platten abschließend mit Tetramethylbenzin bestrichen und bei 4 °C inkubiert. Nach 45 min wurde diese Reaktion mit 50 μl 2 M Sulfatsäure gestoppt. Die Absorption wurde in einem ELISA-reader bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzfilter 620 nm) gemessen (Rettenbacher et al . 2004, Rettenbacher & Palme 2009). Bei Weißlippenhirschen (3 Männchen, 4 Weibchen) wurden Proben analysiert.

2.11 Kotprobengewinnung Koproskopische Untersuchungen zur Detektion von Parasiten fanden im Rahmen von betreuten Praktika-, Bachelor-, Master-, und Diplomarbeiten an Sibirischen Steinböcken, Erdmännchen, Weißlippenhirschen, Diamanttäubchen und Königspinguinen sowie in eigenen Untersuchungen statt (Stadler 2005; Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007; Skodras pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2011; Dobrzinski 2012; Jezyschek 2012; Hübner 2013; Hermsen 2014; Müser 2014).. Zusätzlich wurde bei einer mitbetreuten Bachelorarbeit Blutproben von Brillen- pinguinen, Haushühnern und Haussperlingen auf Vogelmalaria getestet (Heller 2011). Zur Verknüpfung der Ergebnisse der parasitologischen Untersuchungen mit ethologischen Untersuchungen fanden bei Königspinguinen, Diamanttäubchen, Erdmännchen und Weißlippenhirschen ~380 Stunden ethologischer Untersuchungen statt (Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007; Dobrozinski 2012; Jezyschek 2012; Hübner 2013; Hermsen 2014; Müser 2014). Die Kotproben wurden im Rahmen der einzelnen Arbeiten manuell eingesammelt und entweder in ein Rollrandglas oder für spätere Analysen in Gefrierbeutel überführt. Die untersuchten Arten waren Erdmännchen, Steinböcke, Weißlippenhirsche, Königspinguine und Diamanttäubchen, also alles Arten, die in Gruppen vorkommen und gehalten wurden. Wenn möglich wurde der Kot unmittelbar nach Defäkation durch einen Studierenden oder durch den Tierpfleger eingesammelt und umgehend in den Tiefkühlräumen des Zoos Wuppertal bei –20 °C gefroren gelagert. Wenn ein direktes Betreten der Anlage aus Sicherheitsgründen nicht möglich war, wurde der Defäkationsort notiert und der Kot Material und Methoden 43 schnellstmöglich eingesammelt. So konnten sowohl eine individuelle Zuordnung als auch eine möglichst schnelle Kühlkette gewährleistet werden. Die Sammlung aller individuellen Kotproben erstreckte sich bei den Erdmännchen über vier bis sechs Stunden pro Tag. Bei den anderen Arten gelang dieses meist schneller, wobei bei den Vogelarten die Zuordnung des Kotes oft nur nach Zuordnung z.B. mit einem Lot möglich war. Insgesamt wurden 7 männliche und 8 weibliche Diamanttäubchen, je 1 männlicher und weiblicher sowie 12 unbestimmte Königspinguine, Sibirische Steinböcke (7 Männchen, 4 Weibchen), Weißlippenhirsche (3 Männchen, 4 Weibchen) sowie 5 männliche, 3 weibliche und 10 unbestimmte Erdmännchen in drei verschiedenen Gruppen untersucht.

2.12 Bestimmung von Parasitierungen im Kot Für die Quantifizierung von Parasiten im Kot der Tiere mussten die Parasitenstadien, wie z.B. Oozysten, aus dem Kot isoliert werden. Dazu wurde die Flotationsmethode mit Natrium/Zinkchlorid genutzt (Davis 1973, Mehlhorn et al . 1986a). Hierfür wurde eine gesättigte Natrium/Zinkchlorid-Lösung angesetzt. Sie bestand aus 310 g NaCl und 220 g ZnCl 2 in 800ml Reinstwasser, die über Nacht gelöst wurden. Die Kotproben wurden abgewogen und danach mit 50 ml der gesättigten NaCl-

/ZnCl 2-Lösung mit einem Mörser verrührt, bis eine homogene Suspension vorlag. Diese wurde über ein Kaffeesieb (Maschenweite 250-300 μm) von groben Schwebteilchen befreit, in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und anschließend bei 1200-1250 g für sieben Minuten zentrifugiert. Aufgrund der relativen Dichte der Lösung und der geringeren Dichte der Überdauerungsstadien befanden sich diese nach der Zentrifugation an der Oberfläche der Lösung. Sie wurden anschließend entweder mit einer Drahtöse abgeimpft oder nach Auflegen eines Deckgläschens auf die Oberfläche der Lösung entnommen (Mehlhorn et al . 1986a, Stadler 2006). Die Parasiten- Überdauerungsstadien wurden über Adhäsionskräfte an die Fläche des Deckgläschens gebunden. Nach ≥30 Minuten wurde das Deckgläschen auf einen Objektträger überführt, und die Parasiten wurden bei 400facher Vergrößerung ausgezählt. Bei der Quantifizierung der Stadien wurden diese auf die Anzahl an Stadien pro Gramm Kot bzw. Kotballen bei den Diamanttäubchen umgerechnet (Waldenstedt et al . 2000). Beim Auszählen beim Fäzes von Diamanttäubchen hat sich analog zu Sperlingsvögeln die Einheit Parasiten pro Kotballen durchgesetzt, da die Anzahl an im Kot enthaltenen Oozysten in chronisch erkrankten Vögeln konstant bleibt und die Kotballengröße Material und Methoden 44 proportional zur Körpergröße des Vogels ist (Dolnik 2006; Jezyschek 2012). Die Parasiten wurden unter dem Mikroskop (400x Vergrößerung) fotografiert und mit Hilfe von Bestimmungsschlüsseln und Abbildungen aus der Literatur bestimmt (Mehlhorn et al . 1986b, c, d; Levine 1985). Eine weitere Absicherung erfolgte durch die Bestimmung isolierter Parasiten der Erdmännchen und Weißlippenhirsche im Zentralen Institut des Sanitätsdienstes der Bundeswehr in Koblenz durch Oberstleutnant PD Dr. Patrick L. Scheid, Dr. Nora Medrano-Mercado von der Universidad Mayor de San Simon, Bolivien sowie von Dipl.-Biol. Charles Soukou, Ruhr-Universität Bochum.

2.13 Ethologische Beobachtungsmethoden Für die Verifizierung der psychoneuroimmunulogischen Faktoren waren zum Teil ethologische Beobachtungen notwendig. Bei der Scan Sampling-Beobachtung wurde das Verhalten einer ganzen Gruppe von Tieren in fest definierten, meist halbstündigen Intervallen erfasst. Mit dieser Methode ließ sich das Ethogramm erstellen. Bei der Fokus-Tier-Beobachtung wurde ein einzelnes Individuum über einen definierten Zeitraum beobachtet und das gesamte Verhaltensspektrum erfasst. Dabei wurden alle sozialen Interaktionen innerhalb der Gruppe protokolliert, inklusive Adressat und Empfänger. Der Rest der Gruppe wurde nicht mit in Betracht gezogen. Hierüber konnte dann das Soziogramm und eine Verfeinerung des Ethogramms erstellt werden. Die Fokus-Tier- und die Scan-Sampling-Methode waren auch kombinierbar. Diese Behavioural Sampling-Methode wurde bei ganzen Tiergruppen über einen nicht vorher bestimmten Zeitraum eingesetzt. Dabei konnten alle vorher festgelegten und für die Untersuchung bedeutenden Verhaltensweisen protokolliert werden und belegten über das Ethogramm und Soziogramm die Rangfolge unter den Tieren. Diese Beobachtungen dauerten meist zwischen 30 und 90 Minuten (je 3-5 Wiederholungen) und fanden bei den für die Kotuntersuchungen eingesetzten Diamanttäubchen, Königspinguinen, Sibirischen Steinböcken, Weißlippenhirschen und Erdmännchen (drei verschiedene Gruppen) statt.

Material und Methoden 45

2.14 Datenauswertung Der Stichprobenumfang, der verwendete statistische Test und die ermittelten Signifikanzniveaus sind an den betreffenden Stellen angegeben. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte in Tabellen, Balken-, Linien- oder Box- und Whiskerplots. Im Fall von Box- und Whiskerplots ist der Median als Querstrich in der Box dargestellt. Darunter werden das 25 % und darüber das 75 % Perzentil dargestellt. Die Linien ober- und unterhalb der Box erstrecken sich bis zu den Minimum- bzw. Maximum-Werten. Die Signifikanz der Ergebnisse wurde entweder über den Paired t-Test (non-parametric Wilcoxon signed rank test bzw. Student) oder über generalisierte lineare Modelle überprüft (Vogt 1994). Für alle Analysen wurde das Signifikanzniveau auf mindestens p <0,5 gesetzt. Die Berechnungen erfolgten mit Hilfe des Computerprogramms R (Korner-Nievergelt & Hüppop 2010). Die molekulartaxonomische Untersuchung der Erdferkel wurde mit der Bayesianischen Statistik auf Signifikanz überprüft. Diese befasst sich mit der a posteriori-Wahrscheinlichkeit (Knoop 2009) und stellt die am häufigsten verwendete Methode zur Phylogenie-Rekonstruktion dar (Stümpel 2012). Die Bayesianische Inferenz bewertet die Phylogenie Bäume nach ihrer „Posterior“-Wahrscheinlichkeit unter gegebenem Modell, den „Priors“ und dem Alignment. Anders als Maximum Likelihood sucht die Bayesianische Statistik nicht nach einem einzigen optimalen Baum, sondern berechnet alle Bäume mit dem Markov-Chain-Monte-Carlo-Sampler. Zur Berechnung werden 1.000.000 Generationen bei der Markov Chain errechnet, bei der jeder 1.000 Baum gespeichert wird. Für ein genaueres Ergebnis werden die ersten 250 Bäume, die mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit eine ungenaue Likelihood besitzen, aus der Analyse gelöscht. 3. Ergebnisse 46

3. Ergebnisse 3.1 Blutentnahme mit Raubwanzen mit verschiedenen Varianten Freilaufende Triatominen wurden auf dem Tier platziert bei: Hausratte, Capybara, Brillenlangur, Ansell-Graumull, Kleinem Igeltenrek, Kurzohr- Rüsselspringer, Braunborsten Gürteltier, Großem Ameisenbär, Erdferkel, Schabrakenhyäne, Seehund, Mähnenrobbe, Kalifornischem Seelöwen, Südafrikanischem Seebär, Somali Wildesel, Flusspferd, Bongo, Gelbrückenducker, Banteng und Zwergziege sowie Flachland-, Schabracken- und Bairdstapir. Auf das Tier geworfen wurden sie bei Giraffen, Sibirischen Steinböcken, Mishmi-Takinen, Elenantilopen, Asiatischen Löwen und zudem auch bei Schwarzen Panthern, Geparden, Nebelpardern, Nashörnern und bei Kanadischen Wölfen. Raubwanzen mit Bindfaden bzw. Fähnchen dienten beim Südlichen Tamandua, Trampeltieren oder Böhmzebras zur Beprobung. Eine erfolgreiche Blutaufnahme bei den scheuen Okapis ermöglichte ein Ansetzen des Insekts im Becher, der nach Beginn der Blutaufnahme entfernt wurde. Mit Stoffgaze verschlossene Becher wurden zudem bei Schwarzen Klammeraffen, Mandrills, Elefanten, Hauspferden, Afrikanischen Zwergeseln, Hirschebern, Halsbandpekaris, Pinselohrschweinen, Schwarzkopfschafen, Hausrindern, Nashörnern, Zwergzebus, Milus, Weißlippenhirschen, Elchen oder Dromedaren verwendet. Bei Brillenpinguinen wurde der Becher mit Gummibändern auf dem Rücken fixiert. Diamanttäubchen waren über künstliche Eier bepropbar. doppelte Böden erlaubten die Blutentnahme von Goldkopflöwenäffchen, Rothandtamarinen, Schwarzfußkatzen, Sandkatzen, Salzkatzen und Erdmännchen.

3.2 Blutaufnahme bei unterschiedlichen Körpertemperaturen der Wirte Bei 13 verschiedenen Reptilienarten wurden innerhalb von 5-20 Minuten Saugdauer mit N3 und N4 bis zu 1.7 ml Blut gewonnen. Hierbei trat eine deutliche Temperaturabhängigkeit auf. Bei Reptilien mit Oberflächentemperaturen von 27,2 °C bis 37,3 °C saugte D. maxima nur bei den Tieren mit >36,2 °C (Tab. 3.1).

3. Ergebnisse 47

Tab. 3.1 Abhängigkeit der Blutaufnahme bei verschiedenen Reptilienarten von ihrer Körperobertemperatur [°C] Deutscher Artname Wissenschaftlicher Artname Temperatur Ergebnis Dornschwanzagame Uromastyx geyri 37,3 + Kuba -Leguan Cyclura nubila nubila 37,1 - Griech. Landschildkröte Testudo hermanni boettgeri 36,9 + Schöne Bambusotter Cryptelyt rops venustus 36,8 + Königspython Python regius 36,2 + Steppenschildkröte Testudo (Agrionemys) horsfieldii 34,2 - Steppenschildkröte Testudo (Agrionemys) horsfieldii 33,6 - Griech. Landschildkröte Testudo hermanni boettgeri 31,8 - Teppi chpython Mor elia spilota variegata 31,5 - Bairds Kletternatter Elaphe bairdi 30,9 - Indische Schmucknatter Coelognathus (Elaphe) helena 30,1 - Grüner Leguan Iguana iguana iguana 30,1 - Grüner Leguan Iguana iguana rhinolopha 29,4 - Abgottschlange Boa c onstrictor 29,1 - Abgottschlange Boa constrictor 28,7 - Steppenwaran Varanus exanthematicus 28,7 - Abgottschlange Boa constrictor 28,6 - Dunkler Tigerpython Python (molurus) bivittatus 28,5 - Abgottschlange Boa constrictor 27,9 - Schnappschildkröte Chelydra serp entina serpentina 27,9 - Abgottschlange Boa constrictor 27,2 - +: Blutaufnahme d. Raubwanze erfolgreich; - Blutaufnahme d. Raubwanze nicht erfolgt

3.3 DNA-Unterarten der Erdferkel In der von mir mitbetreuten Diplomarbeit führten die PCRs bei den meisten Proben zu Amplifikaten (Schepsky 2012). Proben Nr. 54 bis 63 basierten auf Haarproben und Proben Nr. 64 bis 75 auf Blutproben, wobei Proben Nr. 69, 70 und 71 Kanülenblut waren und die restlichen durch die Wanzenmethode erhalten. Die letzten Proben (Nr. 97 – 108) waren Speichelproben. Proben Nr. 104, 105 und 106 waren Proben, die in Ethanol aufbewahrt wurden; die restlichen Proben wurden trocken in einem Eppendorf Tube gelagert. Bei den Proben von Haaren und Blut wurde ein konsequent gutes Ergebnis in der Analyse im Labor erzielt. Bei den Speichelproben gab es vereinzelte gute Ergebnisse, aber auch Ausfälle bei den PCRs oder nur schwache Banden im Agarosegel (Abb. 3.1). Ein Alignment der DNA Sequenzen war nicht bei allen Proben möglich (Tab. A7.4, Anhang). Insgesamt wurden 80 Proben untersucht, wobei nur bei 31 Proben genug Fragmente sequenziert werden konnten, die genügend

3. Ergebnisse 48

Aligment lieferten um phylogenetisch analysiert zu werden und mehrere Proben einzelner Tiere wurden nicht analyisert (Tab. A7.4, Anhang).

Abb. 3.1 21 PCR-Amplifikate beim Einsatz der Primer 180f und 430r (aus Schepsky 2012)

3.4 Tierseuchen Bei keiner Probe und keiner Tierseuche kam es zu falsch positiven oder negativen Proben durch die Entnahme des Blutes mit Raubwanzen (Tab. 3.2). Arten, die sowohl bei konventionell als auch über Raubwanzen gewonnenem Blut Infektionen aufwiesen, waren bei der Tuberkulose Mähnenrobben, Schabracken- und Flachlandtapire; bei der Malaria Brillenpinguine und Haussperlinge und bei der Blauzungenkrankheit Schwarzkopfschafe, Dromedare, Steppengiraffe und Banteng. Bei konventionell gewonnenen Proben fanden sich außerdem zwei Infektionen mit der Blauzungenkrankheit. 9 Proben bei 4 Arten zeigten keinen Nachweis für Brucellose.

3. Ergebnisse 49

Tab. 3.2 Resultate der auf Tierseuchen getesteten Proben

Brucellose Tuberkulose Malaria Blauzungenkrankheit Positiv Negativ Positiv Negativ Positiv Negativ Positiv Negativ Arten 0 4 3 7 2 3 4 6 W-Proben # 0 8 4 22 12 31 0 4 k--Proben * 0 1 4 7 2 7 2 20 Gesamt 0 9 8 29 14 38 2 24 #mit Raubwanzen entnommene Proben; * konventionell entnommene Proben;

3.5 Klassische Hämatologie Für die Untersuchungen zur klassischen Hämatologie wurden insgesamt 629 Proben in 46 der insgesamt 47 Institute gewonnen. Diese wurden insgesamt auf 48 verschiedene Blutparameter untersucht und im Vergleich zur konventionellen Blutabnahme für unterschiedliche Fragestellungen eingesetzt wie der Leukozytenanzahl, der Reproduzierbarkeit, sowie den Kalium- und Glukosekonzentrationen.

3.5.1 Anteile der Leukozyten Bei sieben Tierarten wurden bei eigenen Untersuchungen die Leukozyten in einer Neubauerkammer ausgezählt. Dabei unterschieden sich die Ergebnisse meistens gar nicht bzw. kaum, aber um maximal 34,6 % beim Afrik. Zwergesel (Tab. 3.3).

Tab. 3.3 Anzahl der Leukozyten im konventionell bzw. mit Raubwanzen gewonnenen Blut (Neubauer Zählkammer) Tierart Konventionelle Methode Raubwanzen Differenz (%) 1,0 Böhmzebra 6.750 – 6.850 6.350 – 6.500 -3,7 -7,3 0,1 Halsbandpekari 9. 050 – 9.200 9.600 – 9.900 +4,3 -9,4 0,1 Kanadischer Wolf 14.000 – 15.000 12.50 0 –15.500 -3,3 -16,6 0,1 Afrikanischer Zwergesel 7.300 – 7.800 5.100 – 5.750 -21,2 -34,6 1,0 Afrikanische Zwergziege 12.000 – 12.250 9.850 –10.250 +14,6 -19,6 1,0 Baird’s Tapir 13.225 13.100 -15.100 + 0,9 - 14,1 0,1 Schwarze r Panther 14.000 -15.000 13.000 -15.000 -0-13,3

3.5.2 Reproduzierbarkeit Bei einem ca. 2,5 Jahre alten Hausrind wurde die Vergleichbarkeit der Messwerte der Proben aus einzelnen Wanzen untereinander getestet (gewonnenes Volumen 800 µl). Alle neun Nymphen brauchten ungefähr eine Minute bis zum Anstich und sogen 15 Minuten. Dabei zeigten in einem nicht-parametrischen Wilcoxon Rank Test alle Blutparameter mit Ausnahme eines Lymphozytenwertes (p=0,7) keine signifikanten Unterschiede (p≤0,5) untereinander. Die Abweichungen lagen alle im Bereich der Messungenauigkeiten der Messgeräte (Tab. 3.4).

3. Ergebnisse 50

Tab. 3.4 Blutparameter bei neun mit Wanzen gewonnenen Proben von einem Hausrind

Wanze Wanze Wanze Wanze Wanze Wanze Wanze Mittel- SD p 1 2 3 4 5 6 7-91 wert Erythrozyten (T/l) 6,39 6,65 6,70 6,58 6,59 6,70 6,50 6,59 0,1 0,1-0,5 Hämoglobin (mmol/l) 7,50 7,80 7,80 7,70 7,80 7,80 7,60 7,71 0,1 0,1-0,5 Hämatokrit (l/l) 0,38 0,40 0,40 0,39 0,39 0,40 0,39 0,39 0 0,1-0,5 Hämatokrit (%) 37,80 Leukozyten (G/l) 2,72 3,54 3,18 2,92 3,27 2,88 3,09 3,09 0,3 0,1-0,5 Neutrophile (%) 28,90 26,10 29,10 25,70 27,80 29,00 15,60 26,03 4,8 0,1-0,5 0,1-0,5 Lymphozyten (%)* 40,50 45,30 43,60 48,71 45,90 39,80 56,10 45,70 5,5 (-0,71) Monozyten (%) 24,70 25,10 23,60 22,8 24,1 28,70 18,20 23,89 3,1 0,1-0,5 Eosinophile (%) 0,70 0,70 0,10 0,70 0,30 0,50 8,60 1,66 3,1 0,1-0,5 Basophile (%) 5,20 2,90 3,50 2,20 1,80 2,10 1,50 2,74 1,3 0,1-0,5 Thrombozyten (G/l) 334 358 339 332 312 318 282 325 24,1 0,1-0,5 AST/ GOT (U/l) 234 238 225 232 6,7 0,1-0,5 Kalzium ionisiert (mmol/l) 1710 1710 1690 1703 0,1-0,5 1Wanzenblut gepoolt; *= Signifikanter Unterschied zwischen den Werten, p=statistische Signifikanz, AST/ GOT = Asparat-Aminotransferase

3.5.3 Blutparameter nach konventioneller Abnahme bzw. der Wanzenbeprobung Beim Blut von sieben Geparden für den Vergleich der Methoden waren folgende Konzentrationen bei dem über Raubwanzen gewonnenem Blut signifikant erhöht: Gesamteiweiß (Total Protein) (p=0.045), ALT (Alanin-Aminotransferase) (p=0.018), Total Bilirubin ( p=0.028), Phosphat (p=0.043), Kalium ( p=0.026) und Magnesium (p=0.044). Bei Natrium ( p=0.019) und Chlorid ( p=0.020) fanden sich signifikant niedrigere Werte und bei Plasma Albumin, Urease, Kreatinin und Kalzium keine Unterschiede (Tab. 3.5).

Tab. 3.5 Blutwerte von 7 Geparden beim Vergleich der Methoden (Mittelwerte ± Standardabw.) Parameter Spritze Wanze* p# Albumin (g/dl) 4,1 ± 0,1 4, 9 ± 3,3 0.547 Gesamteiweiß (g/dl) 6,9 ± 0,1 9,6 ± 2,8 0.045 Urea (mmol/l) 15,1 ± 1,9 14,7 ± 1,7 0.313 Kreatinin (µmol/l) 170 ± 19 167 ± 13 0.704 Bilirubin total (µmol/l) 2 ± 0,2 23 ± 24 0.028 Bilirubin direkt (µmol/l) < 1,7 2,6 ± 3,3 / ALT (U/l) 80 ± 48 572 ± 81,2 0.018 gGT (U/l) < 3 3,9 ± 3,9 / Kalzium (mmol/l) 2,6 ± 0,1 2,5 ± 0,3 0.272 Phosphat (mmol/l) 2 ± 0,3 3,8 ± 2,1 0.043 Kalium (mmol/l) 4,2 ± 0,1 6,3 ± 1,9 0.026 Natrium (mmol/l) 15 8 ± 2 145 ± 11 0.019 Chlorid (mmol/l) 122 ± 2 109 ± 12 0. 020 Magnesium (mmol/l) 1,1 ± 0 1,5 ± 0,5 0.044 ALT= Alanin-Aminotransferase, gGT=Gamma-Glutamyl-Tranferase; *Proben von zwei Wanzen /Gepard gepoolt; p=statistische Signifikanz, # lt. nicht-parametrischem Wilcoxon Rank Test

3. Ergebnisse 51

Das Blut von elf Hausrindern wies beim Vergleich von 28 hämatologischen Parametern bei drei Parametern (Neutrophile Zellen ( p<0,02), Basophile Zellen (p<0,01) und Urease ( p<0,04)) einen signifikanten Unterschied auf (nicht- parametrischer Wilcoxon Rank Test). Der Anteil der Neutrophilen Zellen und die Konzentration der Urease waren signifikant niedriger, der Anteil der Basophilen signifikant höher. Bei allen anderen Parametern lagen keine signifikanten Unterschiede vor (Tab. 3.6).

Tab. 3.6 Blutwerte bei 11 Hausrindern im Vergleich der Methoden

Parameter Spritze Wanze p# Rote Blutkörperchen (T/l) 6,66 ± 0,91 6,66 ± 0,76 0,83 Hämoglobin (mmol/l) 6,93 ± 1,02 7,27 ± 0,88 0,22 Hämatokrit (l/l) 0,36 ± 0,05 0,38 ± 0,04 0,38 Hämatokrit (%) 34,38 ± 4,40 32,87 ± 4,46 0,81 Weiße Blutkörperchen (G/l) 5,35 ± 1,71 4,81 ± 2,04 0,39 Neutrophile (%) * 44,90 ±8,19 36,22 ±11,98 0,02 Lymphozyten (%) 36,92 ±8,54 41,49 ± 9,56 0,13 Monozyten (%) 9,60 ± 5,97 14,54 ± 8,46 0,05 Eosinophile (%) 8,04 ± 5,24 6,31 ± 6,83 0,33 Basophile (%) * 0,54 ± 0,63 1,43 ± 1,40 0,01 Thrombozyten (G/l) 357,85 ± 136,69 374,88 ± 99,49 0,53 AST/ GOT (U/l) 90,29 ± 79,01 111,06 ± 92,24 0,81 Kalzium ionisiert (mmol/l) 1,18 ± 0,07 1,20 ± 0,07 0,63 Laktat (mmol/l) 0,54 ± 0,22 0,63 ± 0,21 0,37 Glukose (mmol/l) 3,92 ± 0,39 3,48 ± 0,38 0,45 Urease (mmol/l) * 23,45 ± 43,36 4,53 ± 1,04 0,04 Kreatinin (µmol/l) 111,73 ± 19,69 105,95 ± 9,03 0,98 PH (T)c 7,43 ± 0,03 7,43 ± 0,03 0,76

Partial CO 2 (T)c (mmHg) 40,44 ± 3,96 38,28 ± 3,71 0,41

Partial CO 2(T)e (mmHg) 65,78 ± 35,01 97,23 ± 48, 76 0,08 ABEc (mmol/l) 2,58 ± 2,28 1,56 ± 2,39 0,73

HCO 3-(P)c (mmol/l) 26,44 ± 2,39 25,24 ± 2,42 0,61 Glukose (mmol/l) 4,08 ± 0,51 3,71 ± 0,39 0,38 ctHb (mmol/l) 6,92 ± 0,92 6,64 ± 0,90 0,81 Sau erstoff (%) 84,34 ± 14,66 90,33 ± 9,94 0,13 Natrium (mmol /l) 142,20 ± 2,77 142,64 ± 2,53 0,93 Kalium (mmol/l) 3,82 ± 0,54 4,51 ± 0,63 0,24 Kalzium (mmol/l) 1,22 ± 0,06 1,25 ± 0,06 0,60 *Signifikanter Unterschied zwischen den beiden Methoden, AST/ GOT=Asparat- Aminotransferase, ABE=Basenabweichung, HCO 3-(P)c= Hydrogencarbonat- Partialdruck, ctHb=Gesamthämoglobinkonzentration; p=statistische Signifikanz # lt. nicht-parametrischem Wilcoxon Rank Test

3. Ergebnisse 52

3.5.4 Kalium-Konzentrationen In einigen mit Raubwanzen gewonnenen Proben fand sich ein erhöhter Kaliumwert (siehe Kap. 3.4.3.). Dieser wich im Vergleich zur konventionellen Methode um bis zu 136% ab, trat aber nur bei Raubwanzen auf, die länger als 20 Minuten für den Saugakt gebraucht hatten und bei denen eine Hämolyse vorlag (Tab. 3.7). Bei diesen Proben zeigten auch die anderen Blutparameter höhere Werte. Die Differenzen lagen beim Halsbandpekari bei bis zu 79 % beim Partial CO2, beim Brillenlangur und beim Kanadischen Wolf bei 333 % bzw. 133% bei der Basenabweichung sowie beim Afrikanischen Zwergesel bei 146 % bei der Glutamat-Pyruvat-Transaminase. Bei Kaliumwerten, die maximal um 56 % abwichen, wurden keine so starken Abweichungen bei den anderen Parametern gemessen (Tab. 3.7). Dieses war u.a. der Fall beim Schwarzen Panther, Böhmzebra und Weißlippenhirsch. Auch schienen nicht alle Werte bei einem hohen Kaliumwert erhöht zu sein. Natrium, Kalzium, Urease, pH, Alkalische Phosphatase, Harnstoff, Hydrogencarbonat-partialdruck, Phosphat, Kreatinin, Glukose, Gesamteiweiß waren maximal um 32 % erhöht (Tab. 3.7; 3.8 und 3.9).

Tab. 3.7 Erhöhte Kaliumwerte und die Korrelation mit der Blutchemie (Auswahl)

Art Methode Natrium Kalium Chlorid Ges.CO 2 Urease Glukose Hämato pH Part. CO 2 HCO 3 BEecf AnGap Hämoglo

(mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mg/dl) (mg/dl) krit (%) (mmHg) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) bin (g/dl) Spritze 142 3,4 105 32 10 117 28 7,5 37,3 30,9 8 10 9,5 0,1 Halsband- Wanze (40 min) 134 6,6 102 36 10 103 36 7,3 66,9 33,9 8 5 12,2 pekari Differenz 5,6 -94,1 2,9 -12,5 0,0 12,0 -28,6 2,8 -79,4 -9,7 0,0 50,0 -28,4 [%]

Spritze 147 3,8 110 24 35 113 49 7,3 41,8 22,5 -3 19 16,7 1,0 Wanze (37 min) 136 > 9,0 111 35 44 98 41 7,3 64,2 32,7 7 **** 13,9 Brillenlangur Differenz 7,5 >136 -0,9 -45,8 -25,7 13,3 16,3 0,3 -53,6 -45,3 333,3 16,8 [%]

Spritze 144 3,9 116 21 80 120 51 7,3 35,9 19,8 -6 12 17,3 0,1 Kanadischer Wanze (27 min) 135 7,3 113 14 103 65 74 7,2 28,9 13,3 -14 16 25,2 Wolf Differenz 6,3 -87,2 2,6 33,3 -28,8 45,8 -45,1 1,0 19,5 32,8 -133,3 -33,3 -45,7 [%]

Spritze 137 4,1 108 0,1 Esel Wanze (35 min) **** HEM 128

Wanze (33 min) **** 9,6 128

1,0=Männchen, 0,1=Weibchen, ****=Nicht messbar, HEM=Hämolytisch, HCO 3-(P)c=Hydrogencarbonatpartialdruck, BEecf=Basenabweichung, min.:Dauer der Blutaufnahme der Wanzen

3. Ergebnisse 53

Tab. 3.8 Erhöhte Kaliumwerte und die Korrelation mit der Blutchemie bei einem weiblichen Esel (Auswahl) fortgesetzt

Methode Albu- ALP ALT Amy- BIL Harn- Kalzium Phosphat Kreatinin Glukose Gesamt- Globulin min stoff eiweiß U/l U/l lase U/l mg/dl mg/dl mg/dl mg/dl mg/dl g/dl (g/dl) mg/dl g/dl Spritze 3,2 139 15 11 0,4 12 13,3 2,7 0,8 108 6,9 3,7 Wanze (35 Min) HEM HEM 37 0 HEM 11 14,4 2,9 HEM 128 8,5 ****

Wanze (33 Min) 0 119 37 0 0,0 11 14,4 2,9 0,7 128 8,5 **** - Differenz [%] 100,0 14,4 100,0 100,0 8,3 -8,3 -7,4 12,5 -18,5 100,0 146,7 0,1=Weibchen, ***=Nicht messbar, HEM=Hämolytisch, ALP=Alkalische Phosphatase, ALT= Glutamat-Pyruvat- Transminase, BIL=Bilrubin, AnGAP=Anionenlücke, GLDH=Glutamatdehydrogenase, min.:Dauer der Blutaufnahme der Wanzen

Tab. 3.9 Geringe Kaliumwerte und die Korrelation mit der Blutchemie (Auswahl)

Art Methode Natrium Kalium Chlorid Ges. CO 2 Urease Glukose Hämato- pH Part. CO 2 HCO 3 BEecf AnGap Hämoglo- (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mg/dl) (mg/dl) krit (%) (mmHg) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) bin (g/dl) Spritze 150 4,2 123 19 58 72 50 7,132 53,5 17,9 15 0,1 Schwarzer Wanze (12 147 5,6 117 18 60 89 44 7,278 35,7 16,7 17 Panther min) Wanze (17 min) 141 6,5 120 20 63 89 60 7,134 53,8 18 20,4 Mittelwert 144 6,05 118,5 19 61,5 89 52 7,206 44,75 17,35 18,7 SD 4,2 0,6 2,1 1,4 2,1 0,0 11,3 0,1 12,8 0,9 2,4 Differenz 4,0 -44,0 3,7 0,0 -6,0 -23,6 -4,0 -1,0 16,4 3,1 -24,7 [%]

1,0 Böhmzebra Spritze 135 3,2 99 30 24 175 35 7,441 42,0 28,6 4 11 11,9 Wanze (13 118 3,08 104 34 32 155 49 7,413 50,5 32,3 8 **** 16,7 min) Differenz 12,6 3,8 -5,1 -13,3 -33,3 11,4 -40,0 0,4 -20,2 -12,9 -100,0 -40,3 [%]

Spritze 138 3,7 97 35 41 82 24 7,412 52,8 33,7 9 11 8,2 1,0 Wanze (1) 137 7,1 99 35 34 24 < 10 7,430 51,0 33,8 9 12 **** Weißlippenhirsch (18 min) Wanze (2) 139 4,5 97 33 39 85 < 10 7,342 57,0 30,9 5 15 **** (9 min) Mittelwert 138 5,8 98 34 36,5 54,5 10 7,386 54 32,35 7 13,5 SD 1,4 1,8 1,4 1,4 3,5 43,1 0 0,1 4,2 2,1 2,8 2,1 Differenz 0,0 -56,8 -1,0 2,9 11,0 33,5 58,3 0,4 -2,3 4,0 22,2 -22,7 [%] 1,0=Männchen, 0,1=Weibchen, ***=Nicht messbar, ALP=Alkalische Phosphatase, ALT= Glutamat-Pyruvat-Transminase, AnGAP=Anionenlücke, BEecf=Basenabweichung, HCO3-(P)c=Hydrogencarbonatpartialdruck, min.:Dauer der Blutaufnahme der Wanzen

3. Ergebnisse 54

3.5.5 Glukose-Konzentrationen Die Glukose-Konzentration wurde im Rahmen eines von mir betreuten Praktikums von Theodoras Skodras evaluiert und nahm sowohl in der Kontrolle als auch in dem aus den Wanzen entnommenen Blut im Wasserbad stetig mit geringen Differenzen der 196 Werte ab. Die Differenz der Glukosekonzentration zwischen der Ausgangsglukosekonzentration lag in den ersten 30 Minuten bei 6-10 % und nach 60- 120 min. bei 27-38 %. Die größten Abweichungen ergaben sich bei den Messungen nach 180 und 240 min.; hier differierten die Werte um ca. 51-57 % (Abb. 3.2).

Abb. 3.2 a) Humanes Blut im Wasserbad (n=16) (37 °C); b) Humanes Blut nach Verfütterung und Entnahme aus den Wanzen (n=16) (verändert nach Skodras, pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2011)

3.5.6 Verschiedene Blutparameter aus dem Zooalltag Als bei neun Individuen von neun Arten hämatologische Blutparameter mit Hilfe von Raubwanzen der Art D. maxima bestimmt wurden, konnten alle Parameter erfasst werden bis auf einen Kaliumwert beim Tamandua (in der Faunia, Madrid) der aufgrund der Hämolyse der Probe nicht bestimmbar war (Tab. 3.10).

3. Ergebnisse 55

Tabelle 3.10 Auswahl einiger Blutparameter bei Blut aus Raubwanzen

Geschlecht 1,0 0,1 1,0 1,0 0,1 1,0 0,1 1,0 0,1 Spitzmaul- Spitzmaul- Tamandua Weißlippen- Bonobo Flachland- Flachland- Asiatischer Zwerg- Art nashorn nashorn hirsch tapir tapir Löwe zebu Zoo Krefeld Krefeld Faunia Wuppertal Wuppertal Salzburg Salzburg Twycross Twycross Albumin (g/l) 24,9 12 17 40 ALP/AP (U/l) 42 64 106 155 19,4 24,9 ALT (U/l) 75 20 46 101 61 Amylase (U/l) 43 58 17 AnGAP (mmol/l) 11 9 AST (GOT) U/l) 58,6 BEecf (mmol/l) -7 4 Bikarbonat -HCO 3

(mmol/l) 17,9 28 Bilrubin (µmol/l) 1,5 1,7 1,7 0,4 0,4 Chlorid (mmol/l) 2,1 Kalzium (mg/dl) 8,1 11,0 9,1 Kreatin-Kinase (U/l) 97,5 Chlorid (mmol/l) 3,4 3,8 126 100 Eisen (µmol/l) 0,8 Erythrozyten/ µl gGT (U/l) 12,8 22,9 Gesamt CO 2

(mmol/l) 19 29 Gesamteiweiß (g/l) 88,2 95,8 55 75 67 GLDH (U/l) 4,1 4,2 4,7 3,6 2,9 1 Globolin (g/l) 63,3 4,3 Glukose (mg/dl) 127 144 45 140 78 81 89 Harnstoff -BUN 14 (mg/dl) 26 10 Hämoglobin (g/dl) 11,6 10,2 Hämatokrit (%) 34 30 Kalium (mmol/l) 6,6 *** 3,9 4,5 4,5 4,6 Kreatinin(mg/dl) 0,5 0,8 0,2 1,4 0,6 1,6 1,2 LDH (U/l) 75,3 Leukozyten (G/l) 6,0 Magnesium 1,1 (mmol/l) Natrium (mmol/l) 135 136 136 141 150 142 Partial CO 3

(mmH g) 28,1 39,4 pH 7,4 7,5 Phosphat (mmol/l) 1,0 1,3 2,7 2,0 1,9 Selen (µg/l) 165,3 Triglyceride 0,17 (mmol/l) Urease (mmol/l) 4,7 4,3 1,5 1,7 5,5 3,6 Zink (µmol/l) 19,4 * Einheiten bei Bil, Chol, Crea, Glu, Mg,Urea & Phos teilweise umgerechnet. ALP=Alkalische Phosphatase, ALT= Glutamat-Pyruvat-Transminase, AnGAP=Anionenlücke, AST/ GOT=Asparat-Aminotransferase, ABE=Basenabweichung, BEecf=Basenabweichung, gGT=Gamma-Glutamyl- Tranferase, GLDH=Glutamatdehydrogenase, HCO 3-(P)c=Hydrogencarbonatpartialdruck, LDH= Laktat- Dehydrogenase

3. Ergebnisse 56

3.6 Hormon-Konzentrationen 3.6.1 Genauigkeit des Testverfahrens für Progesteronkonzentrationen Um die Genauigkeit zu überprüfen, wurden im Rahmen einer von mir betreuten Bachelorarbeit je eine Blutprobe einer Afrikanischen Elefantenkuh konventionell mit der Spritze entnommen, diese Proben auf drei Röhrchen verteilt und einzeln ausgewertet und die Ergebnisse verglichen (Dobrzinski 2012). Die mit dem „ECLIA-Test“ ermittelten Progesteron-Konzentrationen der beiden Proben der Elefantkuh „Sabie“ lagen bei 0,24-0,32 ng/ml Plasma (1,27 ± 0,12 ng/ml), die der Elefantenkuh „Sweni“ bei 1,15- 1,43 ng/ml (0,28 ± 0,04 ng/ml). Die prozentualen Abweichungen vom Mittelwert betrugen 9,4 % bzw. 12,9 %. Alliquots der Blutproben wurden unter Membranen an N3 von D. maxima verfüttert. Die Progesteronwerte bei den Proben der Membranfütterung lagen mit 1,26 ± 0,51 und 1,71 ± 0,77 ng/ml Plasma sowohl bei „Sabie“ als auch bei „Sweni“ durchschnittlich niedriger als bei den konventionell gewonnenen Kontrollproben (Tab. 3.11). Dabei unterschied sich die Progesteron-Konzentration der Proben von „Sweni“ signifikant von den Kontrollproben (p=0,01), während die von „Sabie“ eine nicht signifikante Abweichung aufwiesen (p=0,22). Die durchschnittliche Abweichung des Progesterongehalts der Membranproben von den Kontrollwerten lag ohne Berück- sichtigung der stark abweichenden Werte bei „Sabie“ bei 0,81 ng/ml und bei „Sweni“ bei 1,0 ng/ml (Tab. 3.11). Lediglich bei vier Messungen waren die Progesteron- Konzentrationen der Membranproben 0,06-1,1 ng/ml höher als die der Kontrollwerte. Je höher die Progesteron-Konzentration der Kontrollprobe war, desto größer waren auch die Abweichungen der Werte nach der Membranfütterung. Die Konzentrationen der Elefantenproben lagen damit in der Regel unterhalb jener der Kontrollproben, so dass diese verdünnt werden mussten (Dobrzinski 2012). Tab. 3.11 Abweichungen der Progesteron-Konzentrationen (ng/ml Plasma) zwischen Membranfütterung und Spritze (verändert n. Dobrzinski 2012); *ohne die abweichenden Werte vom 14.06 und 27.06.2012 Datum "Sabie" "Sweni" 14.06.2012 -5,37 -6,15 26.06.2012 -1,37 -2,33 27.06.2012 -0,68 -6,92

28.06.2012 -2,90 -3,70 05.07.2012 -0,31 -0,60 06.07.2012 -0,18 -0,82 09 .07.2012 +0,06 -1,09

11.07.2012 -0,02 -0,37 12.07.2012 0,94 -0,84 16.07.2012 +1,10 +0,62 Median* 0,81 1,00 Mittelwert* 1,29 2,34

3. Ergebnisse 57

3.6.2 Progesteron und Kortisoltiter bei Laborratten Die Progesterontiter der trächtigen Ratte 2 nahmen in den ersten zwei Wochen um 39,57 ng/ml zu und fielen in der dritten Woche um 36,69 ng/ml ab. Die Standardisierungsprobe vom 01.12.2014, welche der Schwanzvene entnommen wurde, ergab einen Progesterontiter von 18,58 ng/ml. Bei Ratte 5 ergaben Proben, welche mit Raubwanzen genommen wurden, in der ersten Trächtigkeitswoche einen Progesterontiter von 51 ng/ml und 59,3 ng/ml zu Beginn der zweiten Trächtigkeitswoche. In der ersten Trächtigkeitswoche wurde zudem zeitgleich Blut aus der Schwanzvene entnommen, welches einen Progesterontiter von 46,2 ng/ml aufwies. Zu Beginn der zweiten Trächtigkeitswoche wurde das Blut mit Hilfe von Wanzen einen Tag eher als die Standardisierungsprobe abgenommen und der Progesterontiter lag beim Wanzenblut bei 59,3 ng/ml im Gegensatz zu 11,16 ng/ml. Bei Ratte 8 trat zwei Tage vor Beginn der Trächtigkeit ein Progesterontiter von 8,65 ng/ml auf. Am Ende der zweiten Woche war er auf 61,4 ng/ml angestiegen, was eine Differenz von 52,75 ng/ml ausmacht. Die Probe der dritten Woche konnte aufgrund einer zu geringen Menge nicht ausgewertet werden (Tab. 3.12). Kortisoltiter trächtiger und nicht trächtiger Laborratten lagen bei Beprobung mit Raubwanzen zwischen 0 ng/dl und 20,2 ng/dl, während bei der Blutabnahme an der Schwanzvene die Kortisolwerte zwischen 51 und 124 ng/dl und somit deutlich höher lagen. Eine Statistik konnte aufgrund geringer Probenmengen nicht erstellt werden (Tab. 3.12). Die Konzentrationen der Proben lagen z.T. oberhalb des Messbereiches > 60ng/ml, so dass diese verdünnt werden mussten (Dobrzinski 2012).

3. Ergebnisse 58

Tab. 3.12 Kortisol- und Progesterontiter im Blut von Laborratten während der Trächtigkeit nach Entnahme des Blutes mit Hilfe von Raubwanzen bzw. aus der Schwanzvene (S) (aus Müser 2014).

Ratte 1 Trächtigkeit Progesteron ng/ml Kortisol ng/dl 27.10.2014 - 16,50 03.11.2014 - 37,74 14,70 18.11.2014 3,25 0,00 11.12.2014 (S) - 12,40 Ratte 2 27.10.2014 19,09 - 03.11.2014 08.11. -29.11.2014 42,63 13,20 23.11.2014 82,20 14,90 28.11.2014 45,51 17,80 01.12.2014 (S) 18,58 73 ,30 Ratte 3 28.10.2014 24.10. -07.11.2014 - 15,40 01.12.2014 (S) - 51,00 Ratte 5 06.12.2014 51,00 10,70 06.12.2014 (S) 46,20 38,40 09.12.2014 30.11. -21.12.2014 59,30 0,00 10.12.2014 (S) 11,26 68,10 15.12.2014 7,30 13,60 Ratte 8 26.10.2014 8,65 0,00 14.11.2014 28.10. -18.11.2014 61,40 14,20 24.11.2014 x 0,00 Ratte 10 23.10.2014 - 0,00 01.11.2014 - - 19,50 23.11.2014 - 20,20 01.12.20 14 (S) - 91,80 x: zu wenig Probenmaterial

3.6.3 Progesteron und Kortisoltiter bei verschiedenen Wildtierarten Es wurden je eine Probe vom Flachlandtapir bzw. sechs Einzelproben von Asiatischen Elefanten zur Bestimmung der Progesterontiter und dadurch zur Detektion einer möglichen Trächtigkeit in zwei verschiedenen Zoos (Dublin und Salzburg) genommen. Während sich die vermutete Trächtigkeit beim Flachlandtapir nicht bestätigte (Probe vom 16.04.2015; Progesteron 1,9 ng/ml), war die Asiatische Elefantenkuh „Yasmine“ tragend und die Progesteronwerte wurden eine Woche lang bestimmt. Der Mittelwert lag bei 5,1 ± 0,71 ng/ml, ein zu diesem Zeitpunkt der Trächtigkeit (Geburt am 17.02.2008) hoher aber normaler Wert (Tab. 3.13).

3. Ergebnisse 59

Tab. 3.13 Progesterontiter im Blut der Elefantenkuh „Yasmine“ (Zoo Dublin) zur Detektion einer Trächtigkeit nach Entnahme des Blutes mit Hilfe von Raubwanzen

Datum Progesteron ng/ml 02.12.2007 5,1 04.12.2007 4,2 05.12.2007 6,4

06.12.2007 4,8 07.12.2007 5,1 09.12.2 007 5,0 Mittelwert

inkl. SD 5,1 ± 0,71

Ausgehend von diesen ersten Ergebnissen wurden bei Trächtigkeiten von Asiatischen und Afrikanischen Elefanten 133 Proben entnommen. Bei insgesamt 52 der 74 der im Zoo Wuppertal bei Afrikanischen Elefanten entnommenen Blutproben reichte das Volumen für eine Analyse aus (Abb. 3.4, 3.5). Sieben Wanzenproben ergaben nach der Zentrifugation zu wenig Blutplasma und weitere 17 Proben waren nicht auswertbar. Bei der Asiatischen Elefantenkuh „Hoa“ im Leipziger Zoo konnten insgesamt 59 Blutproben gewonnen werden. Dabei zeigte der Verlauf der Progesteron- Konzentrationen der konventionell entnommenen Blutproben eine überwiegend abfallende Tendenz von einem Anfangswert bei 4,71 ng/ml Progesteron am 03.11.11 auf 0,53 ng/ml am 03.04.12. In den letzten Tagen vor der Geburt am 09.04.12 fiel die Konzentration vom 30.03. auf den 03.04.12 stark um 2,57 ng/ml ab. Die Konzentrationen der Wanzenproben nahmen ebenfalls von 5,32 ng/ml auf 0,81 ng/ml Progesteron ab (Abb. 3.3). Sie lagen allerdings durchschnittlich bei 3,33 ± 1,48 ng/ml und somit oberhalb der Konzentration der konventionell gewonnenen Proben, welche im Median bei 2,40 ± 0,84 ng/ml lagen. Bei einem deutlich höheren Wert der Probe, welche mit einer Wanze gewonnen wurde (14.02.), fand sich mit 8,76 ng/ml sogar eine 2,5-fach höhere Progesteron-Konzentration als durchschnittlich bei den durch Spritzen entnommenen Proben. Diesen stark erhöhten Wert ausgenommen, ergab sich beim Median eine positive Abweichung von 0,60 ng/ml zwischen den Wanzenproben und der venösen Blutentnahme. Die Progesteron-Konzentrationen der durch Wanzen aufgenommenen Proben unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollproben (p=0,09) (Abb. 3.3). Beim zeitlichen Verlauf der Progesteron-Konzentration bei den Afrikanischen Elefantenkühen zeigte sich bei der konventionellen Blutabnahme (n=24) eine abfallende Tendenz mit zwischenzeitlichen Anstiegen (Abb. 3.4). Bei der Elefantenkuh „Sabie“ lagen die Progesteron-Konzentrationen zwischen 0,71 und 7,64 ng/ml und bei

3. Ergebnisse 60

der anderen Kuh bei 1,67-6,89 ng/ml. Der Progesterontiter bewegte sich bei „Sabie“ und „Sweni“ um einen Mittelwert von 2,02 ± 1,89 bzw. 3,69 ± 1,99 ng Progesteron/ml Plasma (Abb. 3.4, 3.5).

10 9 Spritze Wanze 8 7 6 5 4 3 Progesterontiter (ng/ml) 2 1 0 03.11.2011 08.11.2011 13.11.2011 18.11.2011 23.11.2011 28.11.2011 03.12.2011 08.12.2011 13.12.2011 18.12.2011 23.12.2011 28.12.2011 02.01.2012 07.01.2012 12.01.2012 17.01.2012 22.01.2012 27.01.2012 01.02.2012 06.02.2012 11.02.2012 16.02.2012 21.02.2012 26.02.2012 02.03.2012 07.03.2012 12.03.2012 17.03.2012 22.03.2012 27.03.2012 01.04.2012 06.04.2012 11.04.2012 16.04.2012 Datum

Abb. 3.3 Progesteron-Konzentrationen der Elefantenkuh „Hoa“ im Zoo Leipzig (verändert nach Dobrzinski 2012)

9 8 7 6 5 4 3 2 Progesteronkonzentration (ng/ml) 1 0 05.06.2012 14.06.2012 26.06.2012 27.06.2012 28.06.2012 05.07.2012 06.07.2012 09.07.2012 11.07.2012 12.07.2012 16.07.2012 19.07.2012 Datum Membranfütterung Spritze Direktprobe Wanze

Abb. 3.4 Progesteron-Konzentrationen der Elefantenkuh „Sabie“ (verändert nach Dobrzinski 2012)

3. Ergebnisse 61

9 8 7 6 5 4 3 2 1

Progesteronkonzentration (ng/ml) 0 05.06.2012 14.06.2012 26.06.2012 27.06.2012 28.06.2012 05.07.2012 06.07.2012 09.07.2012 11.07.2012 12.07.2012 16.07.2012 19.07.2012 Datum Membranfütterung Spritze Direktprobe Wanze

Abb. 3.5 Progesteron-Konzentrationen der Elefantenkuh „Sweni“ (verändert nach Dobrzinski 2012)

Der Vergleich der Ergebnisse zwischen den beiden Gattungen zeigte, dass d ie Progesteron-Konzentration der konventionell entnommenen Proben von Loxodonta africana (Zoo Wuppertal) bei 2,98 ± 2,11 ng/ml (n=2) und von Elephas maximus (Zoo Leipzig) bei 2,4 ± 0,84 ng/ml (n=1) lagen. Im Zoo Wuppertal wurde immer am selben Tag sowohl Blut mit Raubwanzen als auch mit der Spritze entnommen wurde, während im Zoo Leipzig beide Methoden abwechselnd angewandt wurden. Im Zoo Leipzig lag der Progesterontiter der Wanzenproben von „Hoa“ im Mittel 0,6 ng/ml oberhalb der Kontrollwerte. Im Zoo Wuppertal hingegen lag die Konzentration des Progesterons meist unterhalb der Werte der Kontrollproben. Die durchschnittlichen Abweichungen des Progesterontiters der Wuppertaler Membranproben von den Kontrollwerten waren bei „Sabie“ 0,81 ng/ml und bei „Sweni“ 1,0 ng/ml. Die Wanzenproben der beiden Afrikanischen Elefanten wiesen mit 0,71 ng/ml eine etwas höhere Abweichung von den Kontrollproben auf als bei der Asiatischen Elefantenkuh. Allerdings lagen die Werte zweier Wanzenproben aus Wuppertal im Gegensatz zu denen aus Leipzig etwas niedriger als die der Kontrollproben. Im Rahmen einer von mir mitbetreuten Dissertation wurden bei der Plasma- Progesteron- und Kortikosteronbestimmung von sechs der zehn trächtigen Elenantilopen in Lány in der Nähe von Prag die höchsten Werte im letzten Drittel der Trächtigkeit erreicht (Hubmer et al . 2010; Hubmer 2011). Interessanterweise waren die Werte der Steroid Hormone im Plasma der Proben, welche mittels Wanzen (n=154) abgenommen wurden, in 78 % aller Proben signifikant um den Faktor sechs erhöht, im

3. Ergebnisse 62

Vergleich zu den Proben, die über Spritzen (n=211) gewonnen wurden (7,37±1,94 ng/ml und 1,23±0,23 ng/ml, GLM Modell). Plasma-Kortikosteron Werte wiesen in 93 % aller Proben sogar einen signifikant zehnfach höheren Wert beim Vergleich der Proben zwischen den beiden Methoden auf (13,01± 2,24 ng/ml und 1,35±0,28 ng/ml). Die Kortisolkonzentrationen waren vergleichbarer; in 54 % aller Proben (über Spritzen gewonnen), waren die Werte im Vergleich der Proben erhöht, wiesen aber keinen signifikanten Unterschied auf (1,30±0,28 ng/ml und 1,07±0,19 ng/ml) (Abb. 3.6; Tab. A7.5, Anhang).

Wanze

Spritze 3.7 Parasiten Diamantäubchen Männchen höhere Parasitierung als Weibchen Brut oder Streit um Nistplätze erhöhten die Parasitenanzahl (Hübner, n=3)

Geschlecht (ng/ml)Plasmahormone

Progesteron Kortikosteron Kortisol

Abb. 3.6 Progesteron-Kortikosteron- und Kortisolkonzentrationen im Blut von sechs Elenantilopen (verändert nach Hubmer 2011 )

3. Ergebnisse 63

3.7 Einfluss psychoneuroimmunologischer Faktoren auf die Parasitierung 3.7.1 Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Parasitierung Von insgesamt 40 Haushühnern wiesen acht Vogelmalariaerreger auf, je vier Weibchen (15,4 % aller Hennen) und vier Männchen (28,7 % aller Hähne). Die Anzahl infizierter männlicher Tiere war fast doppelt so groß wie bei den weiblichen Tieren, allerdings aufgrund der Stichprobenmenge nicht statistisch signifikant. Bei den zehn Haussperlingen fanden sich bei einem Männchen und einen Weibchen Vogelmalariaparasiten im Blut. Das entspricht einer Infektionsrate von 33,3 % bei den männlichen und 14,3 % bei den weiblichen Haussperlingen. Insgesamt waren 20 % der Tiere befallen (Tab. 3.14). Insgesamt wurden in vier von zehn Brillenpinguinen Vogelmalariaerreger in den Blutausstrichen nachgewiesen (Tab. 3.14). Bei dieser 40 % Infektionsrate trat allerdings jeweils nur je ein Erreger pro 2.000 Erythrozyten auf, d.h. nur 0,05 % aller Erythrozyten waren befallen. Da die Geschlechter der Brillenpinguine zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht bekannt waren, kann der Unterschied zwischen männlichen und weiblichen infizierten Pinguinen nicht dargestellt werden und auch hier keine Statistik anwendbar.

Tab. 3.14 Infektion verschiedener Vögel mit Vogelmalaria

Haushuhn Haussperling Brillenpinguin Männchen Weibchen Männchen Weibchen Gesamt 40 14 26 10 3 7 10 Infiziert 8 4 4 2 1 1 4

In zwei mitbetreuten Abschlussarbeiten an Königspinguinen fanden weitere Untersuchungen zur Parasitierung im Zusammenhang mit dem Geschlecht statt (Dobr- zinski 2012; Müser 2014). Es wurden in drei erfolglosen Brutperioden in den Jahren 2012-2014 sowohl bei den nicht brütenden Kontrolltieren als auch bei den Individuen der Brutpaare in vereinzelten Proben Kokzidien festgestellt (maximale Befallsrate einzelner Individuen 33 % aller 87 Proben). Beim Männchen des Brutpaares von 2012 waren dies maximal 2 Oozysten/Deckglas und beim beteiligten Weibchen bis zu 8 O/D. Dabei wiesen die Kotproben des weiblichen Brutvogels mit durchschnittlich 7,1x10 5±5,85x10 5 Kokzidien pro Gramm Kot signifikant mehr Parasiten auf als die des Männchens mit 4,81x10 5±4,7x10 5 Kokzidien/g ( t-Test p<0,01; Tab. 3.18). 2013 waren allerdings in den Proben der Weibchen keine Oozysten gefunden worden, während die Probe des Männchens maximal 2 Oozysten aufwies. Auch 2014 fand sich bei einer der insgesamt acht Proben bei dem weiblichen Brutvogel mit 8 O/D eine höhere Anzahl als beim Männchen (1-2 O/D) und der Kontrollgruppe (1-3 O/D) (Tab. 3.15).

3. Ergebnisse 64

Tab. 3.15 Kokzidienbefall pro Gramm Kot bei Königspinguinen (verändert n. Dobrzinski 2012) Zuchtpaar Kontrollgruppe Anzahl der Gewicht der Anzahl der Gewicht der Anzahl der Gewicht der Kokzidien x 10 4/g Probe (g) Kokzidien x 10 4/g Probe (g) Kokzidien x 10 4/g Probe (g) Datum Männchen Weibchen 17.10.2011 0 0,2 - - 0 0,5 20.10.2011 0 0,3 - - - - 24.10.2011 4,91 1,8 - - 17,9 0,8 27.10.2011 - - 0 1,6 0 1,7 31.10.2011 0 0,8 - - - - 03.11.2011 - - 19 ,1 1,5 0 0,8 06.11.2011 - - 113 0,3 0 1,0 09.11.2011 - - - - 0 1,0 12.11.2011 11,3 1,0 - - - - 14.11.2011 83 0,4 - - - - 23.11.2011 - - 78,3 0, 3 0 0,6 30.11.2011 84,8 0,4 - - 36,8 1,0 03.12.2011 - - - - 0 0,6 07.12.2011 - - - - 9,6 0,5 10.12.2011 174 0,2 - - 0 0,7 25.01.2011 53,6 1,6 40,7 0,8 0 0,8 01.02.2012 50,3 1,4 - - 64,9 1,2 08.02.2012 - - - - 26,3 2,4 30.03.2012 - - 40,3 1,0 0 1,8 13.04.2012 - - - - 9,32 3,5 09.05.2012 19,3 1 66,1 1,2 27 0,6 16. 05.2012 18,5 0,5 210 0,8 - - 18.05.2012 - - - - 14,7 0,5 24.05.2012 15,8 1,1 - - - - 06.06.2012 13,8 0,6 - - - -

In zwei weiteren Bachelorarbeiten und einer Diplomarbeit wurde der Befall mit Kokzidien bei den Geschlechtern der Diamanttäubchen untersucht (Jezyschek 2012; Hübner 2013; Hermsen 2014). Dazu wurden insgesamt Bruten aus drei Jahren analysiert. Da die Gewichte der Kotproben teilweise hohe Differenzen aufwiesen, wurde die Oozystenzahl pro Gramm Kot errechnet, um die Proben direkt miteinander vergleichen zu können. An Tagen, an denen mehrere Proben gesammelt und untersucht wurden, wurde ein Mittelwert der Proben errechnet. In den Untersuchungen 2012 wiesen die 16 Proben vom Männchen eine durchgehend niedrigere Parasitierung mit Kokzidien auf als die des Weibchens, wobei die mittlere Anzahl beim Männchen mit 926 ±416 Oozysten/g Kot signifikant niedriger (p<0,05) als die des Weibchens mit 1.575 ±527 Oozysten/g Kot war. Es lässt sich hervorheben, dass 2013 die Vögel nicht so hoch parasitiert waren wie bei der Brut 2012. Die Parasitierung der Weibchen lag aber immer unter der des Männchens ( t-Test p<0,01; Tab. A7.6, Anhang). Bei den 2014 untersuchten Diamanttäubchen zeigte das Weibchen einen deutlich höheren und

3. Ergebnisse 65 häufigeren aber nicht signifikanten Parasitenverlauf als das Männchen ( t-Test p>0,05). Allerdings blieb die Oozystenzahl stets sehr niedrig mit maximal 36 O/D beim Weibchen und 28 O/D beim Männchen (Tab. A7.6, Anhang). Bei den Sibirischen Steinböcken lag bis auf wenige Ausnahmen bei den Männchen immer ein Parasitenbefall mit Kokzidien vor (aufgrund der Größe als Isospora sp. oder Eimeria sp. identifiziert), während die Weibchen regelmäßig negative Proben aufwiesen. Alle Prävalenzen waren allerdings immer niedrig (Tab. 3.16).

Tab. 3.16 Kokzidienbefall pro Gramm Kot bei Sibirischen Steinböcken (verändert nach Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007)

Tier/Datum 09.10. 10.10. 11.10. 13.10. 14.10. 17.10. 18.10. 19.10. 20.10. 21.10. Frang 0,6 0,7 0,2 0,1 0,1 0,1 0,3 0,6 0,9 0,9 Trahe 0,6 0,4 0,4 2,4 0,4 0,9 0,5 0,2 1,5 0,7 Barbatus 0,1 0,2 0 0,7 0,1 2,5 0,3 0,3 0,9 1,4 Lucidus 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,5 0,1 0,4 1 0,1 Atapex - 0,2 0,1 0,2 1,2 0,7 1,1 1,2 0,5 0,7 Brevis 0,5 0,5 0,4 0,1 0,1 0,5 0,1 0,6 0,2 0,4 Subdo 0,9 0,8 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0 0 0,2 Maxima - 0 0,3 0 0 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 Quitas 0,4 0,7 0 0 0 0,2 0,1 0,3 0,9 0,3 Macu 0,1 0 0 0,1 0,1 0,5 0,7 0,1 0,1 0,7 Infans 0 0,1 0,7 0,5 0 1 0 0,9 0,7 1,6

Bei den Erdmännchen wurden insgesamt viermal die Gruppen untersucht (Stadler 2005, Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007, Jezyschek 2012, Müser 2014). Beim Vergleich der geschlechtspezifischen Unterschiede wiesen bei den 2005 untersuchten Tiere beim statistischen Vergleich der Varianzen der mittleren Befallsintensitäten der Tiere bis auf zwei Ausnahmen die Werte einen signifikanten Unterschied im Befall mit Isospora sp. auf ( t-Test p mindestens <0,01). Dabei ergab sich bei der Berücksichtigung der mittleren Befallsdichte mit 9 Kokzidien pro Gramm Kot (K/G) bei einem Weibchen der höchste Wert. Statistisch nicht signifikant (t-Test p≥0,05), aber mit der gleichen Tendenz fand sich dasselbe Ergebnis in der 2007 angefertigten Untersuchung, bei dem erneut die Weibchen die höchste Parasitierung aufzeigten. In den Jahren 2011 und 2012 trat beim Vergleich der individuellen Parasitierung zwischen den Geschlechtern ebenfalls einen Trend zu einer erhöhten Intensität mit Parasiten beim Weibchen auf, im Jahr 2012 allerdings umgekehrt mit der erhöhten Parasitierung beim Männchen, wobei diese Unterschiede in den Parasitierungen nicht statistisch signifikant waren ( t-Test p ≥0,05). 2014 wurden 16 Proben von sechs Tieren untersucht; auch hierbei wiesen die beiden weiblichen Tiere

3. Ergebnisse 66 einen Befall mit Kokzidien auf. Der stärkste Befall wurde allerdings bei einem Männchen nachgewiesen, wobei aber zwei der vier Männchen gar keinen Befall hatten (Tab. 3.17, Tab. A7.7/8 Anhang).

Tab. 3.17 Anzahl der Parasiten pro Gramm Kot in den einzelnen Untersuchungsjahren bei den Erdmännchen im Wuppertaler Zoo 0,1 Durbie 1,0 Zorro 1,0 Stummel 1,0 Spitze 1,0 Kalla 0,1 Garfield 1,0 Sekou 1,0 Uli 0,1 Tinchen 2005 71,2 592,4 1729,9 5808,4 98,4 6678,8 168,3 648,5 28,8 ±133,1 ±439,1 ±1875,3 ±2703 ±115,6 ±8250 ±223,9 ±546,6 ±36 1,0 Sekou 0,1 Durby 1,0 Luco 1,0 Scar 1,0 Vulno 1,0 Brevis 2007 0,01 0,02 0,02 0,01 0,01 0,02 ±0,03 ±0,06 ±0,06 ±0,03 ±0,02 ±0,08 1,0 Valens 1,0 Maco 1,0 Schwalbe 1,0 Fuchs 1,0 Piet 2007 0,1 0,06 0,34 0,02 0,01 ±0,1 ±0,07 ±0,61 ±0,04 ±0,32 2011 0,1 Angie 1,0 Power 1, 0 Lenny 0,1 Carla 3472 35258 16550 74286 ±3256 ±76810 ±20853 ±75200 2012 821 669 3531 1901 ±496 ±222 ±2260 ±191 2014 1,0 E1 1,0 E2 1,0 E3 0,1 E4 0,1 E5 1,0 E6 0 0 53 8 2 49 ±0 ±0 ±38,1 ±0 ±1,4 ±0 0,1=Weibchen; 1,0 =Männchen; 2005 wurde 1,0 Mickerling aufgrund des frühen Todes ausgeschlossen; 2014 wurden nicht Parasiten pro Gramm Kot, sondern Oozyten pro Deckglas ausgezählt

Um zu überprüfen, ob die Parasitierung der einzelnen Individuen bei den Weißlippenhirschen mit dem Geschlecht korrelierte, wurden 2011 zunächst insgesamt 78 Kotproben der Weißlippenhirschgruppe im Zoo Wuppertal quantitativ auf Isospora sp. untersucht. Dabei wiesen alle vier Hirschkühe eine höhere mittlere Parasitierung auf als der junge Bock und die beiden Jungtiere. Beim jungen Bock „Mirko“ waren im Mittel mit 492 weniger K/G im Kot als bei den vier Hirschkühen, jedoch mehr als bei den beiden Jungtieren (Tab. 3.18). Statistische Signifikanz nach dem t-Test zwischen den Parasitierungen lag jeweils zwischen den vier Hirschkühen und „Jungtier 2“ sowie zwischen „Kerbe“ und „Mirko“ und zwischen „Kerbe“ und „Jungtier 2“ vor (Abb. 3.7, Tab 3.18). Bei den 14 Kotproben von 2012 lag gegenüber 2011 nach wie vor der Trend vor, dass die adulten Hirschkühe eine höhere mittlere Parasitierung aufwiesen, als der junge Bock und das verbliebene Jungtier. Die Tiere „Wuppi“ und „Jungtier 2“ lebten zu diesem Zeitpunkt nicht mehr. Dabei unterschieden sich die Parasitierungen zwischen jeweils allen Tieren und dem verbliebenen Jungtier sowie zwischen „Rotterdamerin“

3. Ergebnisse 67 und „Mirko“ und „Kerbe“ und „Rotterdamerin“ signifikant bis höchst signifikant (Tab. 3.18, Abb. 3.7). Im Winter 2011/2012 schienen mit Ausnahme von „Rotterdamerin“, bei der ein Anstieg der mittleren Parasitierung im Vergleich zum Vorjahr vorlag, die Parasitierungen im Mittel bei allen Weißlippenhirschen von 2011 zu 2012 zurückgegangen zu sein. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Parasitierungen beider Jahre lag bei keinem Tier vor (Tab. 3.18).

Tab. 3.18 p-Werte beim Vergleich der mittleren Parasitierungen der Weißlippenhirsche 2011 und 2012 über den t-Test (nach Student). Signifikante p-Werte sind fett gedruckt. Kursiv : Weibchen (verändert nach Jezyschek 2012)

2011 Kerbe Wuppi Rotterdamerin Mirko Jungtier 1 Jungtier 2 Berlinerin 0,3360 0,8800 0,9109 0,1731 0,2051 0,0042 Kerbe 0,3540 0,5758 0,0354 0,0422 0,0010 Wuppi 0,8273 0,3105 0,3559 0,0239 Rotterdamerin 0,2853 0,3206 0,0447 Mirko 0,8938 0,0868 Jungtier 1 0,0565 2012 Kerbe Wuppi Rotterdamerin Mirko Jungtier 1 Jungtier 2 Berlinerin 0,269 ------0,141 0,092 0,017 ------Kerbe ------0,023 0,332 0,011 ------Rotterdamerin ------0,009 0,005 ------Mirko ------0,025 ------2000

1800

1600

1400

1200

1000

800 Oocysten/g Kot 600

400

200

2 pi rbe rin erin up irko Ke tier 1 tier rlin W ame M g e d ung B Jun J Rotter Abb. 3.7 Mittlere Parasitierungen der Mitglieder der Weißlippenhirschgruppe mit Isospora sp. im Februar/März 2011. weiß: Männchen; hellgrau: Weibchen; dunkelgrau: Jungtier (verändert nach Jezyschek 2012)

3. Ergebnisse 68

3.7.2 Parasitierung in Abhängigkeit vom Alter Ein Vergleich der Parasitierungen bei den Weißlippenhirschen in Abhängigkeit vom Alter wurde zwischen den adulten Hirschkühen und dem jungen Bock sowie zwischen den adulten Hirschkühen und den Jungtieren für 2011 vorgenommen, da deutlich mehr Proben vorlagen, mehr Tiere lebten und der Beprobungszeitraum über einen längeren Zeitraum andauerte als 2012. Am deutlichsten war der Unterschied der mittleren Parasitierungen zwischen den Jungtieren und den adulten Hirschkühen. Die Parasitierungen unterschieden sich hier höchst signifikant (p<0,001). Die Parasitierungen des jungen Bocks und der Adulten schienen sich zwar deutlich zu unterscheiden, waren jedoch nicht statistisch signifikant unterschiedlich (Abb. 3.8, Tab. 3.19).

1800 1600 1400 1200

1000 800

600

400 200 0 Adulte Weibchen junger Bock Jungtiere

Abb. 3.8 Mittlere Parasitierungen sowie Standardabweichungen der adulten Hirschkühe, dem jungen Bock und der Jungtiere. Ohne Schraffur: Männchen; schraffiert: Weibchen; kariert: Jungtier (verändert nach Jezyschek 2012)

3. Ergebnisse 69

Tab. 3.19: Anzahl an Oozysten der Weißlippenhirschgruppe 2011+2012. Kursiv : Weibchen (aus Jezyschek 2012)

Berlinerin Wuppi Kerbe Rotterdamerin Mirko Jungtier 1 Jungtier 2 22.11.2011 533 2038 287 162 571 23.11.2011 378 1381 99 168 305 24.11.2011 637 768 25.11.2011 1735 563 702 94 28.02.2011 671 1224 462 1735 196 230 02.03.2011 984 302 232 03.03.2011 890 183 736 108 342 101 04.03.2011 1846 2132 2103 334 829 1726 256 09.03.2011 800 519 297 1832 240 384 14. 03.2011 549 973 166 478 167 71 18.03.2011 611 2348 477 226 300 154 174 21.03.2011 292 765 1607 176 22.03.2011 3223 1105 99 23.03.2011 916 24.03.2011 418 26.03.2011 428 389 320 806 240 168 33 Mittelwert 829,4 1071,9 785,5 868,5 49 1,7 522,5 174,9 ± 546,0 652,7 758,2 938,4 546,5 496,4 115,1 17.01.2012 820 283 ------1663 470 106 ------18.01.2012 785 564 ------839 454 128 ------20.01.2012 815 645 ------1241 134 ------Mittelwert 807 497 ------1248 353 117 ------± 19 190 ------412 190 16 ------

3.7.3 Parasitierung in Abhängigkeit vom Sozialrang Um zu überprüfen, ob die Parasitierung der Individuen mit der Ranghöhe zusammenhängt, wurden bei den Erdmännchen im Wuppertaler Zoo in den Jahren 2005, 2007, 2011, 2012 und 2014 insgesamt 833 Kotproben über die Flotationsmethode analysiert und die Anzahl der gefundenen Kokzidien quantifiziert. Zusätzlich wurden in der Regel über ethologische Beobachtungen und Erstellung von Soziogrammen die Ranghöhen innerhalb der sozialen Gruppen der Tiere bestimmt. Dabei spiegelt die Dicke der Pfeile des Soziogramms die Intensität des Bezuges zwischen den Tieren wider (Abb. 3.9., Abb. 3.10, Abb. 3.11, Abb. 3.12).

3. Ergebnisse 70

3.7.3.1 Soziogramm der Erdmännchengruppen Im Jahr 2005 ist die starke Interaktion aller Tiere mit dem ranghöchsten Männchen „Kalla“ deutlich zu erkennen (Abb. 3.9). Einzig das rangniedrigste Weibchen („Garfield“) zeigte eine starke Interaktion mit dem ranghohen Weibchen „Durbie“, was vor allem am Dominanzverhalten „Durbies“ gegenüber „Garfield“ lag. Der Bezug zwischen den beiden ranghohen Tieren bestand aus freundlichem Verhalten, während die Verhaltensweisen der beiden Tiere gegenüber den tiefer stehenden Gruppenmitgliedern vor allem aggressives Verhalten beinhaltete. Das Männchen „Zorro“, das zweitniedrigste Tier der Gruppe zeigte keine aggressiven Verhaltensweisen sondern ein stärkeres Komfortverhalten, sowohl zum rangniederen Weibchen „Garfield“ als auch zum δ-Männchen „Spitze“ (Abb. 3.10). 2007 wurden die Ergebnisse nicht in einem klassischen Soziogramm dargestellt, sondern das freundliche und dominante Verhalten für jedes Gruppenmitglied getrennt aufgenommen und daraus die Hierarchie abgeleitet. Über 60% des notierten freundlichen Verhaltens von „Sekou“ fiel dabei auf das einzige Weibchen „Durby“. Der Rest entfällt etwa zu gleichen Teilen auf die anderen zehn Gruppenmitglieder. Das dominante Verhalten zeigte eine vermehrte Aggression gegen Piet, aber auch gegen „Brevis“ und „Durby“ (Abb. 3.10; Abb. 3.11). Über die Häufigkeiten der ausgeführten und hingenommenen und für die Rangordnung relevanten Verhaltensweisen ergab sich 2011-2012 folgende Rangordnung innerhalb der Erdmännchengruppe: Angie > Power > Klumpi > Lenny > Carla > Dumbo (kursiv=Weibchen; Abb. 3.12). Dies basierte vor allem auf den Dominanzgesten. Hierbei drohte „Angie“ hinter „Power“ am häufigsten. Außerdem markierte sie am häufigsten. „Angie“ empfing dabei die wenigsten Drohgesten und wurde zusammen mit „Power“ am wenigsten weggeschoben. Des Weiteren korrelierte die Rangordnung mit den körperlichen Eigenschaften der Tiere. So war „Angie“ deutlich größer als das andere Weibchen „Carla“ und körperlich unversehrter. „Power“ war deutlich das kräftigste Erdmännchen und ebenfalls körperlich unversehrt. Bei den Untersuchungen 2014 wurde aufgrund der kurzen Beobachtungsdauer auf die Erstellung eines Soziogrammes verzichtet, die Rangfolge lautete aufgrund der beobachteten Dominanzgesten: E1>E5>E2=E4>E3=E6.

3. Ergebnisse 71

Abb. 3.9 Soziogramm der Erdmännchen im Wuppertaler Zoo 2005

3. Ergebnisse 72

freundliches Verhalten von Sekou freundliches Verhalten von Luco freundliches Verhalten von Scar

Luco Scar Vulno Sekou Sekou Scar Luco Zobre Vulno Vulno Brevis Zobre Zobre Valens Brevis Brevis Durby Valens Valens Maco Durby Durby Maco Maco Schwalbe Schwalbe Schwalbe Fuchs Fuchs Fuchs Piet Piet Piet

freundliches Verhalten von Valens freundliches Verhalten von Vulno freundliches Verhalten von Maco

Sekou Sekou Sekou Luco Luco Luco Scar Scar Scar Vulno Zobre Vulno Zobre Brevis Zobre Brevis Valens Brevis Durby Durby Valens Maco Maco Durby Schwalbe Schwalbe Schwalbe Fuchs Fuchs Fuchs Piet Piet Piet

freundliches Verhalten von Brevis freundliches Verhalten von Zobre freundliches Verhalten von Durby

Sekou Sekou Sekou Luco Luco Luco Scar Scar Scar Vulno Vulno Vulno Zobre Brevis Zobre Valens Valens Brevis Durby Durby Valens Maco Maco Maco Schwalbe Schwalbe Schwalbe Fuchs Fuchs Fuchs Piet Piet Piet

freundliches Verhalten von Schwalbe freundliches Verhalten von Fuchs freundliches Verhalten von Piet

Sekou Sekou Sekou Luco Luco Luco Scar Scar Scar Vulno Vulno Vulno Zobre Zobre Zobre Brevis Brevis Brevis Valens Valens Durby Valens Durby M aco Durby Maco Fuchs Maco Schwalbe Piet Schwalbe Fuchs Piet

Abb. 3.10 Kreisdiagramme d. freundlichen Verhaltens der Tiere 2007 gegenüber anderen Mitgl. der Gruppe (Greins pers. Mitteil., Praktikums Protokoll 2007)

3. Ergebnisse 73

dominantes Verhalten von Sekou dominantes Verhalten von Luco dominantes Verhalten von Scar

Luco Sekou Sekou Scar Scar Luco Vulno Vulno Vulno Zobre Zobre Zobre Brevis Brevis Brevis Valens Valens Valens Durby Durby Durby Maco Maco Maco Schwalbe Schwalbe Schwalbe Fuchs Fuchs Fuchs Piet Piet Piet

dominantes Verhalten von Valens dominantes Verhalten von Vulno dominantes Verhalten von Maco

dominantes Verhalten von Brevis dominantes Verhalten von Zobre dominantes Verhalten von Durby

Sekou Sekou Sekou Luco Luco Luco Scar Scar Scar Vulno Vulno Vulno Zobre Brevis Zobre Valens Valens Brevis Durby Durby Valens Maco Maco Maco Schwalbe Schwalbe Schwalb Fuchs Fuchs Fuchs Piet Piet Piet

dominantes Verhalten von Schwalbe dominantes Verhalten von Fuchs dominantes Verhalten von Piet

Sekou Sekou Sekou Luco Luco Luco Scar Scar Scar Vulno Vulno Vulno Zobre Zobre Zobre Brevis Brevis Brevis Valens Valens Valens Durby Durby Durby Maco Maco Maco Schwalbe Schwalbe Fuchs Piet Fuchs Piet

Abb. 3.11 Kreisdiagramme des dominanten Verhaltens der Erdmännchen 2007 gegenüber anderen Mitgliedern der Gruppe (aus Greins pers. Mitteilung, Praktikums Protokoll 2007)

3. Ergebnisse 74

Abb. 3.12 Soziogramm der Erdmännchen im Wuppertaler Zoo 2011-2012 (aus Jezyschek 2012)

3.7.3.2 Korrelationen des Sozialranges der Erdmännchen mit der Parasitierung

In allen Untersuchungen wiesen immer die rangniedrigsten Individuen die höchste Parasitierung auf und der Befall korrelierte negativ mit der Ranghöhe. Im Einzelnen stellten sich die Ergebnisse wie folgt dar. Im Jahr 2005 zeigte das mit „Uli“ zusammen gehaltene dominante Weibchen „Tinchen“ den geringsten Befall, gefolgt von „Durbie“, dem ranghohen Weibchen der großen Gruppe, dem einzeln gehaltenen „Sekou“ und dem ranghohen Männchen „Kalla“ (Tab. 3.20, Tab. 3.21). Alle diese Tiere hatten einen mittleren Befall von <100 O/G, und an einzelnen Tagen war gar kein Befall nachweisbar. Danach folgten aus der großen Gruppe „Zorro“ und „Stummel“ sowie aus der Pärchenhaltung „Uli“ mit mittleren Befallsintensitäten von bis zu 3.500 O/G. Beim statistischen Vergleich der Mittelwerte der Befallsintensitäten unterschieden sich alle Tiere der jeweiligen Gruppe signifikant in ihrem Befall (P mindestens <0,01). 2007 war auffallend, dass es eine hohe Anzahl negativer Proben gab. In nur 40 von insgesamt 151 Kotproben konnte ein Kokzidienbefall festgestellt werden. Der Befall der einzelnen Individuen lag minimal bei 7 % aller Proben („Brevis“; ranghoch) und maximal bei 62% aller Proben („Valens“; rangniedrig). Die durchschnittlichen Befallsintensitäten korrelierten ebenfalls negativ mit der Rangordnung. So hatte „Durby“ einen höheren durchschnittlichen Kokzidienbefall als die rangniedrigeren Individuen. Die auf Stufe zwei eingeordneten Erdmännchen hatten eine deutlich geringere Kokzidienanzahl im

3. Ergebnisse 75

Kot aufzuweisen als die in Stufe 3 eingeordneten Erdmännchen. Nur bei Stufe 4, der letzten Stufe, zeigte sich keine weitere Steigerung der Befallsintensität. (Tab. 3.17). 2011 war ebenfalls die mittlere Parasitierung mit Kokzidien der einzelnen Individuen beim ranghöchsten Tier „Angie“ mit 3.388 O/G Kot am niedrigsten und beim rangniedersten Tier „Dumbo“ mit 117.612 O/G Kot mit großem Abstand am höchsten. Mit abnehmendem Rang der Tiere stieg die individuelle mittlere Parasitierung der Tiere. Der statistische Vergleich mittels eines t-Test der einzelnen Gruppenmitglieder zeigte aber – mit Ausnahme des Vergleiches von „Angie“ und „Lenny“ (p=0,037) – keine signifikanten Unterschiede, und sehr hohe Standardabweichungen entstanden durch sehr hohe Schwankungen der Parasitierung der einzelnen Tiere (Tab. A7.8, Anhang). Bei einer erneuten Untersuchung der gleichen Gruppe im Jahr 2012 war die mittlere Parasitierung der Gruppenmitglieder – ohne Einbeziehung stressreicher Ereignisse – tendenziell beim Alphapaar am geringsten. So lag bei „Power“ mit 669 O/G Kot die geringste Parasitierung vor, dahinter lag „Angie“. Dann folgte „Carla“, die entgegen der Rangordnung mit 1901 O/G Kot die niedrigste Parasitierung hinter dem Alphapaar aufwies. Dabei lag allerdings nie eine statistische Signifikanz beim t-Test zwischen den mittleren Parasitierungen von „Angie“ und „Carla“ (p=0,029), „Power“ und „Klumpi“ (p=0,042) und „Power“ und „Carla“ (p=0,002) vor. Das rangniedere Tier „Dumbo“ wies innerhalb der Gruppe mit 19.665 O/G Kot erneut die höchste mittlere Parasitierung mit Isospora sp. auf (Tab. A7.8, Anhang). Auch 2014 wurde trotz des kurzen Beprobungszeitraumes und der geringen Probenmenge eine negative Korrelation zwischen dem Befall und dem Rang festgestellt. In den 16 Proben von sechs Tieren waren in mehreren Proben des dominanten Erdmännchens 1 keine Parasiten vorhanden. Bei Erdmännchen 2 konnte ebenfalls kein Befall nachgewiesen werden, allerdings beim Erdmännchen 3, welches noch rangniedriger war als E2, mit bis zu 80 O/D. Bei Erdmännchen 4 traten in zwei Proben jeweils 8 O/D auf. Das weibliche Tier stand im Rang auf der Stufe von Erdmännchen 2. In zwei Proben von Erdmännchen 5 fanden sich keine bzw. 2 O/D auf. Das Tier war weiblich und dominant, jedoch nicht das Alpha-Weibchen. Bei Erdmännchen 6, dessen Kot bis zu 49 O/D, aufwies gab es auch negative Proben. Erdmännchen 6 war männlich und stand auf der Ranghöhe von Erdmännchen 3. Bei den rangniederen Tieren E3 und E6 lag der stärkste Befall mit Kokzidien vor (Tab. 3.17). Da auch der Stresshormontiter bestimmt werden sollte, musste den Tieren das Blut möglichst stressfrei abgenommen werden. Die konventionelle Methode über eine

3. Ergebnisse 76 handelsübliche Spritze erfordert ein rasches Fangen und Fixieren des Tieres. Deshalb wurde versucht, Blutproben mittels Raubwanzen zu bekommen. 72 Proben der Erdmännchen wurden mit Raubwanzen gewonnen. Die Parasitisierungen wurden mit den ethologisch beobachteten Stressfaktoren in Verbindung gebracht (Kap. 3.7.3.1). Bei den 2005 untersuchten Erdmännchen kam es nach der Neuzusammen- stellung der Gruppen am 24.05.05 zu Änderungen im Befall. In der Gruppe stieg der durchschnittliche Befall des Weibchens „Tinchen“ von 10 auf 30 O/G Kot, hingegen fielen bei den beiden Männchen „Spitze“ und „Uli“ die Mittelwerte von 7350 auf 4920 bzw. von 1523 auf 580 (Tab. 3.20, Tab. 3.21). In der Männergruppe 2 fand sich beim ranghohen Tier „Kalla“ eine starke Senkung des Mittelwertes von 150 auf 60, und beim β-Männchen „Zorro“ eine moderate Senkung von 690 auf 460 und beim γ-Männchen Stummel eine Erhöhung von 840 auf 3460. Innerhalb der neu entstandenen Gruppe 3 verzeichnete das vorher solitär lebende Männchen „Sekou“ eine Verzehnfachung der mittleren Parasitendichte von 26 auf 260. Der Mittelwert der weiterhin dominanten „Durbie“ vervierfachte sich von 20 auf 100. Während der O/G Kot-Befall des vorher rangniedrigsten Weibchens „Garfield“ von 14020 auf 2940 fiel, wiesen jeweils die ranghöchsten Tiere die niedrigsten Befallsintensitäten auf, die zweithöchsten Tiere eine mittlere Befallsintensität und die rangniedersten Tiere den höchsten Befall (Tab. 3.18). Zudem variierte bei der Erdmännchengruppe die Befallsintensität im zeitlichen Verlauf (Tab. 3.20, Tab. 3.21). Die Befallsintensität von „Sekou“ zeigte z.B. um den 26.04.2005 und einen Tag vor der Neugruppierung deutlich erhöhte Befallsintensitäten. „Garfields“ Befallsintensität fiel vom einem sehr hohen Grundlevel mit zwei deutlichen Peaks am 15.03.2005 und 14.04.2005 ab Ende April wieder ab, so dass vor der Neugruppierung eine Befallsintensität von ca. 3000 O/G vorlag. Deutliche Peaks, welche sich vom Grundbefall deutlich unterschieden, traten auch bei „Kalla“ in der letzten Märzwoche auf, bei „Spitze“ am 13.05.05, bei „Durbie“ am 22.04.05, bei „Zorro“ in der letzten Märzwoche und bei „Sekou“ am 11.05.05. Eine gleichmäßig niedrige Parasitierung wiesen die Tiere „Stummel“, „Uli“, „Tinchen“ auf (Tab. 3.20, Tab. 3.21). Bei den 2011 und 2012 untersuchten Tieren traten sehr hohe Standardab- weichungen durch sehr hohe Schwankungen der Parasitierung der einzelnen Tiere auf. So wies beispielsweise „Dumbo“ eine minimale bzw. maximale Parasitierung von 8.526 bzw. 412.460 O/G Kot auf. Mehr oder minder starke Schwankungen der individuellen Parasitierung im Laufe des Beprobungszeitraums fanden sich bei allen Erdmännchen (Abb. 3.13).

3. Ergebnisse 77

Abb. 3.13 Verlauf der individuellen Parasitierungen der Erdmännchen „Lenny“, „Carla“ und „Dumbo“

Tab. 3.20 Anzahl der Parasiten pro Gramm Kot an den einzelnen Untersuchungstagen beim jeweiligen Erdmännchen* im Wuppertaler Zoo. Durbie Zorro Stummel Spitze Kalla Garfield Mickerling Sekou Uli Tinchen 03.02.2005 # 808,0 29085,7 10.02.2005 41,2 15796,8 12.02.2005 1093,5 83,6 02.03.2005 33,9 572,1 10894,6 109,6 3.3 verstorben 0,0 10.03.2005 349 ,6 7985,0 15.03.2005 0,0 630,0 240,3 10380,0 182,9 27459,1 28,6 17.03.2005 21,8 649,0 1136,5 11030,5 313,1 12652,3 0,0 20.03.2005 1307,8 691,0 28.03.2005 1810,7 1406,4 487,8 0,0 06.04.2005 53,6 1412,2 149,9 4552,9 294,6 14232,9 12.04.2005 47,7 310,9 4682,7 66,4 9681,4 20,0 14.04.2005 0,0 206,0 336,9 4417,9 134,5 32605,1 18.04.2005 0,0 283,1 425,9 48,8 19.04.2005 4,8 401,4 992,0 3289,4 181,7 15476,8 22.04.2005 118,8 1316,4 25.04.2005 952,1 22,1 29.04.2005 3,2 146,9 0,0 1228,3 40,6 02.05.2005 8,9 28,6 0,0 1816,6 2,5 04.05.2005 0,0 172,6 312,2 20,2 79,4 0,0 11.05.2005 118,9 13.05.2005 9575,1 0,0 0,0 17.05.2005 13,6 38,2 0,0 19.05.2005 0,0 212,5 1662,9 0,0 20.05.2005 8,8 171,5 1460,3 207,3 *Namen der Weibchen werden durch Kursivdruck angezeigt #Wenn Angaben fehlen, konnte an diesem Tag keine Probe gewonnen werden. konnte.

3. Ergebnisse 78

Tab. 3.21 Anzahl der Parasiten pro Gramm Kot an den einzelnen Untersuchungstagen beim jeweiligen Erdmännchen* im Wuppertaler Zoo nach der Neuzusammensetzung. Durbie Zorro Stummel Spitze Kalla Garfield Mickerling Sekou Uli Tinchen 24.05.2005 0,0 3069,9 0,0 0,0 409,6 6,7 25.05.2005 0,0 511 ,9 2434,1 18,3 1060,8 314,3 256,8 42,3 26.05.2005 0,0 408,0 31.05.2005 28,0 354,6 5412,1 7,8 597,4 117,1 445,6 117,6 08.06.2005 62,5 836,9 6827,4 4905,3 100,0 5536,2 399,6 308,6 09.06.2005 25,6 270,2 2269,0 0,0 232,6 57,5 13.06.2005 21,5 7840,1 1021,9 0,0 7790,9 1238,2 59,5 15.06.2005 16,5 759,3 146,3 790,0 117,2 4,9 16.06.2005 0,0 482,2 8119,0 0,0 708,0 190,1 1606,5 0 20.06.2005 25,2 472,7 3804,1 3300,9 21,1 1684,2 196,4 241,0 0,0 23.06.2005 25,9 641,2 2078,0 6720,5 13, 3 487,5 272,0 43,8 29.06.2005 86,5 1638,3 6031,7 14,3 5628,5 360,4 30.06.2005 253,4 284,8 1462,4 7292,6 107,8 64,5 636,1 0,0 03.07.2005 4,0 11,2 1705,9 6100,1 13,0 846,3 96,9 07.07.2005 8,9 04.07 verst. 796,0 110,9 1779,3 365,3 7,5 11.07 .2005 600,2 1117,1 4488,1 231,1 203,3 12.07.2005 458,1 736,5 6281,7 11,6 1742,5 189,4 548,7 19.07.2005 73,4 0,0 1871,6 156,9 39,6 21.07.2005 406,6 408,4 3799,4 0,0 9807,3 1023,2 164,1 27.07.2005 68,9 151,2 5366,0 670,3 28.07.2005 11,3 72,5 377,3 31.07.2005 74,0 3180,6 49,6 217,8 02.08.2005 70,8 4958,9 1384,8 04.08.2005 113,8 0,0 *Namen der Weibchen werden durch Kursivdruck angezeigt #Wenn Angaben fehlen, konnte an diesem Tag keine Probe gewonnen werden. konnte.

Am 28.02.2012 fand in der Erdmännchengruppe ein stressreiches Ereignis statt. In der Mittagszeit fingen „Angie“ und „Carla“ an zu kämpfen. Dies kommt gelegentlich im Rahmen von Hierarchiekämpfen vor, ist aber in der Regel schnell wieder vorbei. „Carla“ biss sich jedoch im Laufe des Kampfes in den Halsbereich von „Angie“ fest. Es griffen dann noch „Klumpi“ und „Dumbo“ in den Kampf ein und bissen ebenfalls immer wieder in die Halsgegend von „Angie“. Dieser Kampf dauerte etwa zehn Mi- nuten und hätte vermutlich ohne Eingreifen des Tierpflegepersonals tödlich für „Angie“ geendet. „Angie“ lag nach dem Kampf blutend am Boden, erholte sich nach tier- ärztlicher Behandlung und Separation zusammen mit „Power“ vom Rest der Gruppe jedoch schnell wieder. Bei allen Individuen der Erdmännchengruppe, mit Ausnahme von „Dumbo“, waren nach dem Kampf zwischen „Angie“ und „Carla“ die mittleren Parasitierungen angestiegen (Abb. 3.14). Besonders bei „Angie“ schien die Parasitierung nach dem Kampf und der anschließenden Trennung stärker zu sein, wobei sich beide Intensitäten statistisch nicht signifikant unterschieden (Abb. 3.14). Bei „Angie“ stieg die Anzahl an

3. Ergebnisse 79

Parasiten von 821 auf 58.807 O/G Kot an. Bei der anderen Hauptprotagonistin des Kampfes, „Carla“, lag nach dem Kampf ein deutlicher Anstieg der individuellen mittleren Parasitierung von 1.832 auf 9.898 O/G Kot vor, die sich statistisch signifikant von der Parasitierung vor dem Kampf unterschied (p=0,039). Bei anderen Tieren mit einem offensichtlich deutlichen Anstieg der individuellen mittleren Parasitierung nach dem Kampf lag keine statistische Signifikanz der Differenz vor (Abb. 3.14). Am 14.03.2012 fand das nächste stressreiche Ereignis statt. Es verlief ähnlich wie der Kampf zwischen „Angie“ und „Carla“, nur waren diesmal „Klumpi“ und „Lenny“ die Kontrahenten. Hierbei wurde kein Tier nennenswert verletzt, da ein weiteres Mal rechtzeitig durch das Tierpflegepersonal eingegriffen wurde. Daraufhin wurde „Lenny“ vom Rest der Gruppe separiert. Es lagen nun eine Gruppe mit „Klumpi“, „Carla“ und „Dumbo“ vor sowie eine mit den zuvor separierten „Angie“ und „Power“ und eine dritte Gruppe mit „Lenny“ und bei zwei weiteren Erdmännchen. Nach diesem Kampf schien die mittlere Parasitierung bei „Klumpi“ und „Lenny“ stär- ker zu sein und bei den anderen Erdmännchen geringer (Abb. 3.14). Die Parasitierungen vor dem ersten Kampf von „Angie“ und „Carla“ und nach dem zweiten Kampf von „Klumpi“ und „Lenny“ unterschieden sich aber nicht statistisch signifikant (Abb. 3.14).

Abb. 3.14 Mittlere Parasitierung aller Proben der Erdmännchengruppe vor (blau) und nach den Kämpfen: „Angie“ gegen „Carla“ (lila) und „Klumpi“ gegen „Lenny“ (türkis). Ohne Schraffur: Männchen; schraffiert: Weibchen; kariert: Jungtier (aus Jezyschek 2012)

3. Ergebnisse 80

3.7.3.3 Korrelation des Sozialranges der Weißlippenhirsche mit der Parasitierung Um zu überprüfen, ob die Parasitierung der einzelnen Individuen bei den Weißlippenhirsche mit der Rangordnung korrelierte, wurden die 78 Proben aus 2011 auf Isospora sp. untersucht und mit ethologische Beobachtungen eine Rangfolge der Individuen erstellt. Besonders die Häufigkeit empfangener und ausgeführter aggressiver Verhaltensweisen erlaubte hierbei eine Auflistung der Hirsche in einer Rangordnung. Leider konnten nur 37 Proben der Weißlippenhirsche mit Raubwanzen zur Korrelation gewonnen werden. Die vier Hirschkühe unterschieden sich in ihrem Rang nur wenig und die Zuordnung erfolgte deshalb per separatem Vergleich ihres Verhaltens (Abb. 3.15). Demnach war „Kerbe“ das Alpha-Tier ( α), „Berlinerin“ das Beta-Tier ( β), „Rotterdamerin“ das Gamma-Tier ( γ) und „Wuppi“ das Delta-Tier ( δ). Die beiden Jungtiere lagen in der Rangordnung hinter den vier Kühen sehr nah beieinander und vor dem jungen Bock. Sie wurden deutlich weniger dominiert und öfter gegroomt. Da „Jungtier 1“ einmal „Jungtier 2“ dominierte, wurden sie als Epsilon-Tier ( ε) bzw. Zeta- Tier( ζ) klassifiziert. Der junge Bock lag in der Rangordnung hinter allen anderen Tieren. So wurde „Mirko“ meistens dominiert und niemals gegroomt. Keine seiner aggressiven Verhaltensweisen war gegen eine der Hirschkühe gerichtet. Er war somit das Eta-Tier ( η). Als Rangordnung ergab sich: „Kerbe“ > „Berlinerin“ > „Rotterdamerin“ > „Wuppi“ > „Jungtier 1“ > „Jungtier 2“ > „Mirko“

Abb. 3.15 Soziogramm der Weißlippenhirschgruppe im Zoologischen Garten Wuppertal (aus Jezyschek 2012)

3. Ergebnisse 81

Innerhalb der vier Kühe waren bei „Wuppi“ mit 1.072 die meisten O/G Kot, gefolgt von „Rotterdamerin“ mit mehr Parasiten als „Berlinerin“ und „Kerbe“, die mit 786 O/G Kot die wenigsten Isospora -Oozysten im Kot enthielt. Beim jungen Bock „Mirko“ waren im Mittel mit 492 weniger O/G im Kot als bei den vier Kühen, jedoch mehr als bei den beiden Jungtieren. Unter den Jungtieren lag wiederum beim jüngeren Tier mit 175 O/G Kot eine geringere Isospora -Oozysten-Dichte in den Kotproben vor. Besonders prägnant unterschieden sich die Parasitierungen der Hirschkühe zu denen der Jungtieren und zum jungen Bock. Zwischen den adulten Hirschkühen fielen die Unterschiede in der mittleren Parasitierung wiederum nicht so deutlich aus. Statistische Signifikanzen zwischen den Parasitierungen lagen jeweils nach dem t-Test (p<0,05) zwischen den vier Hirschkühen und „Jungtier 2“ sowie zwischen „Kerbe“ und „Mirko“ und zwischen „Kerbe“ und „Jungtier 2“ vor (Abb. 3.15, Tab. 3.19). Bei den 14 Kotproben von 2012 war bei den Hirschkühen die mittlere Para- sitierung bei der „Rotterdamerin“ mit 1.248 O/G Kot am höchsten und bei „Kerbe“ mit 497 O/G Kot am niedrigsten. „Berlinerin“ lag dazwischen. Der Bock „Mirko“ hatte erneut eine niedrigere mittlere Parasitierung als die drei Hirschkühe, jedoch eine höhere als das verbliebene „Jungtier 1“ mit 117 Oozysten/g Kot. Dabei unterschieden sich die Parasitierungen zwischen jeweils allen Tieren und dem Jungtier sowie zwischen „Rotterdamerin“ und „Mirko“ und „Kerbe“ und „Rotterdamerin“ signifikant bis höchst signifikant (Tab. 3.19).

3.7.4 Parasitierung von Vögeln während der Brutperiode Bei zwei Vogelarten, Königspinguinen und Diamanttäubchen, wurde der Einfluss der Brutperiode auf die Parasitierung untersucht. Während einer erfolgreichen Brut 2011/2012 bei Königspinguinen wurden insgesamt 40 Kotproben ausgewertet, 14 vom beteiligten Männchen, 8 vom Weibchen sowie 18 Kontrollproben. Bei den Elterntieren wurden im Vergleich zu den Kontrollproben auffällig viele Kokzidien gefunden, respektive bei dem Männchen des Brutpaars in 79% und beim Weibchen des Brutpaars in 88% aller untersuchten Proben. Die Kontrollproben wiesen nur in 44% aller Proben eine Infektion mit Kokzidien auf. Die Fäzes der Brutvögel wiesen mit durchschnittlich 7,1x10 5±5,85x10 5 O/G Kot respektive 4,81x10 5±4,7x10 5 O/G Kot mehr Parasiten auf als die Fäzes der Kontrollgruppe mit einem Befall im Durchschnitt von nur 2,84x10 5±1,73x10 5 O/G Kot. Damit unterschied sich der Befall des Zuchtpaares signifikant von dem der Kontrolltiere ( t-Test p<0,01; Tab. A7.9, Anhang).

3. Ergebnisse 82

Bei den weiteren Untersuchungen zur Parasitierung während der Brut an Königspinguinen wurde in drei erfolglosen Brutperioden in den Jahren 2013/2014 sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den Individuen der Brutpaare in vereinzelten Proben Kokzidien festgestellt (maximale Befallsrate einzelner Individuen 33% aller untersuchten 87 Proben). Bei den Männchen des Brutpaares waren dieses maximal 2 Oozysten pro Deckglas (O/D) und beim beteiligten Weibchen bis zu 8 O/D. Die Untersuchung der Kontrolltiere ergab als höchsten Befall 15-17 O/D (Tab. A7.8, Anhang). Die Anzahl der Kokzidien im Verlauf, inklusive einer erfolgreichen Aufzucht eines Kükens, stieg beim Männchen des Brutpaares der Königspinguine beinahe kontinuierlich von 4,91x10 4 am 24.10.2011 auf das Maximum von 1,74x10 6 O/G Kot am 10.12.2011 an und fiel danach wieder auf 1,38x105 O/G Kot am 06.06.12 ab. Beim Weibchen des Brutpaares nahm die Konzentration nach Beginn der Aufzucht eines Kükens auf ein erstes Maximum bei 1,13x10 6 O/G am 06.11.2011 zu, fiel bis 30.03.2012 ab und stieg danach erneut bis zu einem zweiten Maximum am 16.05.2012 mit 2,10x10 6 O/G Kot. Die acht infizierten Proben der Kontrollgruppe wiesen, verglichen mit jenen der Elterntiere, im zeitlichen Verlauf meistens niedrigere Werte auf (Abb. 3.16).

250

200

150

100

Anzahl der Kokzidien x104/g 0

17.10.2011 31.10.2011 14.11.2011 28.11.2011 12.12.2011 26.12.2011 09.01.2012 23.01.2012 06.02.2012 20.02.2012 05.03.2012 19.03.2012 02.04.2012 16.04.2012 30.04.2012 14.05.2012 28.05.2012 Datum Zuchtmännchen Zuchtweibchen Kontrollgruppe

Abb. 3.16 Jahreszeitlicher Verlauf der Anzahl der Kokzidien bei einem Zuchtpaar Königspinguine

Bei den Diamanttäubchen fanden die Untersuchungen 2012-2014 statt. Leider nahmen die Raubwanzen kein Blut auf, so dass Korrelationsproben fehlen. Als Vergleich zu dem brütenden Pärchen wurden 2012 je ein Weibchen und ein Männchen isoliert. Dabei wies dieses Weibchen im individuellen Verlauf der Parasitierung (Tab.

3. Ergebnisse 83

A7.6, Anhang, Abb. 3.17) sowie im Mittel mit 975 ± 151 O/G Kot eine statistisch signifikant ( t-Test p<0,05) höhere Parasitierung mit Kokzidien auf als das isolierte Männchen mit 706 ± 17 O/G Kot. Im Vergleich zu den isolierten Tieren besaßen die brütenden Diamanttäubchen eine höhere mittlere Parasitierung mit Isospora sp. (Tab. A7.6, Anhang, Abb. 3.17). Außerdem war die Anzahl an O/G Kot bei den brütenden Männchen der Diamanttäubchen stets geringer als bei den Weibchen (Tab. A7.6, Anhang, Abb. 3.17). Dabei unterschieden sich jeweils die Parasitierungen zwischen den Geschlechtern bei den brütenden und den isolierten Tieren signifikant ( t-Test p<0,05).

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 Anzahl Oozysten/G Kot 400 200 0 Männchen Weibchen

Abb. 3.17: Mittlere Parasitierungen und Standardabweichungen der isolierten (schraffiert) und brütenden Männchen und Weibchen (n= 16; verändert nach Jezyschek 2012)

Im Jahr 2013 hatte bei den drei erfassten Pärchen das weißberingte Pärchen zu Beginn der Beobachtungsphase ein Jungtier zu versorgen und ein Ei zu bebrüten. Zwei Tage später wurde das Küken jedoch aus dem Nest gedrängt und verstarb. Tags darauf verschwand das Ei. Das Weibchen blieb zwar in der Nähe des Nestes, kehrte jedoch nicht wieder zurück. Am fünften Versuchstag wurden von dem weiß beringten Pärchen erneut zwei Eier abgelegt (Tab. A7.6, Anhang). Beide Partner brüteten abwechselnd, wobei der Wechsel von Männchen und Weibchen kein festes Muster aufwies und es nicht zum Schlupf eines Kükens kam. Um den 35. Versuchstag fand ein erneuter Nestwechsel statt. Nach einer Kopulation am 43. Versuchstag wurden sieben Tage später zwei neue Eier gelegt. Es wurde dann weiter gebrütet, wobei der Brutwechsel von Männchen zum Weibchen meist gegen 15 Uhr erfolgte. Bei allen drei Brutversuchen entwickelten sich keine Jungvögel. Die Eier wurden fünf Tage nach dem dritten Versuch am 55. Versuchstag von den ebenfalls in der Voliere gehaltenen Gouldamadinen oder Zebrafinken aus dem Nest geworfen und am Boden zerstört und

3. Ergebnisse 84 gefressen. Danach kamen die Vögel zwar weiterhin zum Nest, eine erneute Eiablage erfolgte jedoch nicht. Nach weiteren acht Tagen kehrten beide nicht mehr zum Nest zurück. Gegen Ende der Versuchsphase um den 93. Tag kam es vermehrt zu Aggressionen unter den in der Voliere befindlichen Männchen. Alle drei beprobten Männchen waren häufig (bis zu dreimal täglich in der Beobachtungszeit) in leichte Kämpfe verwickelt oder jagten sich durch die Voliere. Die Anzahl der Oozysten pro Kotprobe stieg gleich zu Beginn beim weiß- beringten Weibchen von null auf 22. Danach sank die Anzahl wieder auf null. Am 38. Tag nach Versuchsbeginn war die Anzahl der Oozysten wieder auf 13 angestiegen. Es erfolgte jedoch wieder eine rasche Abnahme bis zum 55. Tag, an dem ein leichter Anstieg auf 6 Oozysten auftrat. Auch hier fiel die Anzahl schnell wieder auf null. Am 83. und 99. Tag wurde erneut ein Anstieg der Anzahl der Oozysten auf 15 bzw. 17 festgestellt. Beim weiß-beringten Männchen fand sich zunächst ein geringer Anstieg der Anzahl der Oozysten pro Kotprobe von null auf zwölf. Nach einem kurzen Absinken der Anzahl stieg sie am 7. Tag erneut wieder auf 11 Oozysten an. Danach blieb sie konstant hoch, bis sie am 35. Versuchstag ihr Maximum von 43 Oozysten erreichte. Anschließend sank die Anzahl der Oozysten rapide ab, bevor sie am 55. Versuchstag erneut stark auf 35 Oozysten anstieg. Nachdem die Anzahl der Oozysten wieder auf null gefallen war, lag sie am 65. und 83. Versuchstag wieder bei fünf bzw. drei und fiel erst wieder am 85. Versuchstag auf null. Der letzte Anstieg erfolgte am 99. Tag auf 10 Oozysten pro Kotprobe (Tab. A7.6, Anhang). Während des Anstiegs am 2. und 3. Versuchstags erfolgte die Eiablage des Weibchens. Bei ihr stieg die Anzahl der Oozysten schneller und auch höher an als beim Männchen. Auch der Anstieg am 35. bzw. 38. Versuchstag ließ sich eindeutig einer Stresssituation zuordnen, die beide Vögel betraf, den Wechsel zu Nest C. Um den 55. Versuchstag gab es erneut einen rapiden Anstieg beim Männchen und beim Weibchen, der mit der erneuten Eiablage des Weibchens korrelierte. Beim Verlassen des Nestes um den 63. Versuchstag lag die Anzahl der Oozysten beim Männchen hoch (acht Oozysten pro Kotprobe), die des Weibchens nicht. Der Anstieg der Anzahl der Oozysten beim Männchen und Weibchen auf 10 bzw. 17 zum Ende der Beobachtung erfolgte während der Phase der Kämpfe zwischen den drei Männchen. Insgesamt reagierte das weißberingte Männchen vor allem beim vierten und sechsten Ereignis mit einem deutlicheren Anstieg der Anzahl der Oozysten als das Weibchen. Die Parasitierung blieb trotz der verschiedener Stresssituationen (Eiverlust, Nestwechsel, Tod des

3. Ergebnisse 85

Jungtieres) konstant niedrig, jedoch erfolgte ein Anstieg der Parasitierung bei den jeweiligen Stresssituationen (Tab. A7.6, Anhang). Beim schwarz-beringten Männchen legte das Weibchen am Tag vor Versuchs- beginn zwei Eier und innerhalb der nächsten 11 Tage weitere drei Eier. Leider beendete das Pärchen die Brutphase kurzzeitig. In der Zeit der Brutunterbrechung kopulierte das Männchens am 43. Versuchstag mit dem orange-beringten Kontrollweibchen, das ab dem 63. Versuchstag zwei Eier im Nest des schwarzen Pärchens bebrütete. Das Nest wurde jedoch auch vermutlich vom Weibchen des schwarz-beringten Männchens be- sucht. Es kam zu Auseinandersetzungen und leichten Kämpfen zwischen den beiden Weibchen. Zwei Tage nach Brutbeginn wurde das orange-beringte Weibchen nicht mehr im Nest gesehen. Das vermutlich ursprüngliche Weibchen des schwarz-beringten Männchens bebrütete die Eier noch einige Tage, bis diese aus dem Nest verschwanden. Die Parasitierung verlief bis zum 34. Versuchstag ohne Befund. Erst dann zeigte sich mit 385 Oozysten pro Kotprobe eine recht hohe Parasitierung (Tab. A7.9, Anhang). Am 35. Tag sank die Anzahl auf 190, am 36. auf 11 und schließlich am 38. Versuchstag auf null ab. Am 49. Versuchstag stieg die Anzahl leicht auf sieben Oozysten an, war aber wieder schnell rückläufig. Am 65. Tag lag ein Anstieg auf 27 Oozysten vor. Der zweite hohe Peak trat am 85. Versuchstag auf, wobei die Anzahl der Oozysten auf 135 angestiegen war. 12 der 17 Kotproben des schwarz-beringten Männchens enthielten keine Parasiten. Nur 34 bzw. 85 Tage nach Versuchsbeginn lagen mit 385 und 135 Oozysten pro Kotprobe viele Parasiten vor. Der erste große Peak trat zu Beginn der Brutunterbrechung auf (Tab. A7.6, Anhang). Die darauffolgende Verpaarung mit der orange-beringten Taube induzierte keine Erhöhung der Parasitierung. Beim leichten zweiten Anstieg wurden keine konkreten Stresssituationen beobachtet, hingegen korreliert der Anstieg am 65. Tag mit dem Kampf beider Weibchen und der am 85. Tag mit den Kämpfen aller Männchen. Die Parasitierung bei den Kontrolltieren (orange-beringtes Weibchen und pink- beringtes Männchen) zeigten lediglich zum Ende der Versuchsphase einen Anstieg der Parasitenanzahl. Das männliche Kontrolltier wies bis zum bis zum 85. Versuchstag keine Oozysten im Kot auf (Tab. A7.6, Anhang). Am 87. Tag stieg die Oozystenanzahl pro Kotprobe auf vier und am 93. Versuchstag erhöhte sie sich auf fünf. Danach sank sie wieder auf null ab. Der Anstieg der Oozysten korrelierte mit den Kämpfen der drei Männchen. Die Anzahl der Oozysten des Kontrollweibchens war am Anfang sehr gering und stieg am 7.Versuchstag nur auf 10 Oozysten pro Kotprobe an, danach fiel sie

3. Ergebnisse 86 sofort wieder auf null (Tab. A7.5, Anhang). Am 38. Versuchstag stieg die Anzahl der Oozysten auf sieben an und fiel erst auf fünf (43. Tag) und anschließend wieder auf null. Der erste Peak am 83. Versuchstag lag mit 300 Oozysten deutlich über den vorherigen Werten. Trotz des hohen Wertes sank die Anzahl direkt danach wieder auf null (85. Versuchstag). Der letzte Anstieg auf 400 Oozysten pro Kotprobe am 99. Versuchstag war auch zugleich der höchste. Der Kot des orange-beringten Weibchens enthielt bei 10 von 16 Proben keine, bei 4 von 16 nur sehr wenige und bei 2 von 16 Proben viele Parasiten. Die sehr geringen Anstiege auf 10 Oozysten bzw. sieben Oozysten waren keiner Stresssituation zuzuordnen. Der hohe Anstieg der Oozyten auf 300 fiel mit dem Kampf mit dem Weibchens des schwarz-beringten Männchens um das Nest und den zwei Eiern zusammen. Der erneute Anstieg der Oozysten auf 400 korrelierte mit keiner auffälligen Stresssituation (Tab. A7.5, Anhang). Im Jahr 2014 wurden erneut die Brutphasen des weiß-beringten Pärchen analysiert. Zu Beginn des Versuches bebrütete das weiß-beringte Pärchen im Nest ein Ei. Die Jungen aus der letzten Brut besuchten das Nest noch häufig. Allerdings verließ das Pärchen das Nest früh, da das Ei von Zebrafinken oder Gouldamadinen aus dem Nest geworfen wurde. Von da an konnte ein häufiges Balzverhalten beobachtet werden, bis schließlich die Kopulation erfolgte. Sechs Tage vor Beprobungsbeginn baute sich das Paar ein neues Nest. Die Partner wechselten sich mit den Brutzeiten ab. In der Regel brütete der Täuber von morgens bis nachmittags und danach die Täubin. Ab dem 8. Versuchstag verließen das Paar das neu gebaute Nest und das Ei. Nach einer Versuchspause von drei Wochen befand sich das Pärchen am 43. Versuchstag in einer neuen Brutvorbereitungsphase in dem zuvor gebauten Nest (Tab. A7.5, Anhang). Diese Brutphase musste erneut unterbrochen werden, da das Pärchen am 47. Versuchstag umgesiedelt wurde. Danach folgte eine Brutpause von 17 Tagen. Am 65. Versuchstag fing der Täuber an zu balzen und das künstliche Nest mit Kokosfasern auszubauen. Die erste Eiablage fand am 67. Tag statt. Ab da erfolgte wieder eine abwechselnde Bebrütung. Insgesamt wurden zwei Eier gelegt, und bis zum 84. Versuchstag befand sich das Pärchen in der Brutphase. Das Männchen entwich am 84. Tag aus der Voliere, sodass das Weibchen am 85. Versuchstag das Nest verließ (Tab. A7.5, Anhang). Beim Weibchen war schon am zweiten Tag ein Anstieg von 0 auf 8 O/D zu sehen Zu diesem Zeitpunkt legte sie das erste Ei dieser Brutphase. Danach sank die Oozystenzahl wieder auf null, bis sie am 9. Versuchstag auf 9 O/D anstieg. Am 54. Tag erreichte ihre Parasitierung den Maximalwert von 28 O/D. Danach sank die Zahl auf 5

3. Ergebnisse 87

Oozysten ab und stieg am 57. Tag wieder an. Der Parasitenbefall fiel bei der Täubin am 72. und 73. auf null und stieg erst am 74. wieder leicht an. Die in der Nacht vom 77. zum 78. Tag gesammelte Probe enthielt 25 Oozysten, also einen deutlichen Anstieg der Parasitierung. Am Ende des Versuchs stieg die Oozystenzahl der Täubin noch einmal an. Beim weiß-beringten Männchen nahm die Oozystenzahl erst am 5. Tag von 0 auf 6 zu und fiel danach wieder direkt auf null. Erst am 43. Tag stieg die Parasitierung leicht auf 5 O/D an und erreichte dann am 54. Tag ihr Maximum. Einen Tag später sank die Zahl auf 15 bzw. 0 O/D. Nur noch vereinzelt erhöhte sich die Oozystenanzahl an den restlichen Versuchstagen bis maximal 12 O/D Kot an (Tab. A7.6, Anhang). Bei der Brutphase des rot-beringten Pärchen saß das Männchen tagsüber im Nest und verließ es selten bis kaum. Die Täubin ließ sich tagsüber nicht in der Nähe des Nestes sichten. Die Täubin saß danach tagsüber im Nest und der Täuber flog hin und wieder zu ihr. Sie bebrüteten zwei Eier. Zu beobachten war auch, dass der Täuber, trotz Brutphase anderen Weibchen seinen Balztanz vorführte. Zur Kopulation mit einer anderen Täubin kam es aber nicht. Drei Tage später befand sich in dem Nest des Pärchens nur noch ein Ei. Die Wahrscheinlichkeit war sehr hoch, dass ein anderer Vogel (Zebra- finken oder Gouldamadinen) das andere Ei zerstört und den Embryo gefressen hatte. Ab dem 8. Versuchstag brütete der Täuber wieder tagsüber. Einen Tag später saß das Weibchen mehrere Stunden an derselben Stelle im rechten Volierengehölz. Ein fremdes Männchen flog immer wieder zu ihr und brachte Kokosfasern, welches als Nistmaterial diente. Es ist eher selten, dass Diamanttäubchen ihren Partner wechseln, da sie eine monogame Beziehung führen. Dies bestätigte sich jedoch am 16. Versuchstag, da das rot-beringte Weibchen mit einem fremden Täuber vorne rechts im Bambus ein Nest gebaut hatte. Dort saß sie tagsüber und der Täuber brachte ihr weiterhin Nistmaterial. Es befand sich noch kein Ei im Nest. Das rot-beringte Männchen brütete weiterhin im selben Nest mit einer neuen Partnerin. Nach dreiwöchiger Versuchspause befand sich das rot-beringte Weibchen am 54. Versuchstag nicht in einer Brutphase, wohingegen das rot-beringte Männchen in seinem Nest brütete. Das rot-beringte Pärchen wurde ab dem 54. Versuchstag in einer neuen Um- gebung isoliert gehalten. Da es sich erst einmal an die neue Situation gewöhnen musste, fand ungefähr bis zum 60. Versuchstag eine Brutpause statt. Ab diesem Tag sammelte das rot-beringte Männchen Kokosfasern und brachte es der im künstlichen Nest sitzenden rot-beringten Täubin. Es befand sich ein Ei im Nest. Das zweite Ei wurde am 65. Versuchstag gelegt. Das Pärchen saß ab diesem Zeitpunkt häufig zu zweit im Nest,

3. Ergebnisse 88 wobei die Täubin primär brütete. Der Täuber verließ das Nest nur zur Nahrungs- aufnahme oder zur Defäkation. Das Pärchen zeigte in der neuen Umgebung einen stär- keren Zusammenhalt als in der Voliere. Am 78. Versuchstag schlüpften die Küken und verließen am 85. Versuchstag schon für kurze Zeit das Nest. Bei Einbeziehung des Parasitierungsverlaufs des rot-beringten Pärchens war die Oozysten Anzahl des rot-beringten Täubers schon am ersten Tag leicht erhöht und stieg am zweiten Tag auf 10 O/D an (Tab. A7.6, Anhang). Danach sank die Intensität leicht ab, fiel aber nicht auf null. Bei der Täubin zeigte sich am zweiten Versuchstag eine erhöhte Intensität der Parasitierung, die ab dem 8. Versuchstag auf 0 sank und ab dem 54. Versuchstag (Tag des Umzugs) wieder deutlich anstieg. Die Oozystenzahl des Täubers stieg deutlich auf 14 O/D an. Bei der Täubin sogar von 0 auf 20 O/D. Am 54. Tag (vier Tage vor dem Umzug in die neue Voliere) lagen die Werte der Täubin leicht höher als die des Täubers. Der Maximum-Wert des Täubers am 69. Versuchstag mit 111 O/D zeigte hier die Ausnahme, die Täubin hate ihren Maximalwert am 77./78. Tag mit 31 O/D. Die Anzahl der Oozysten war beim Täuber an diesem Tag ebenfalls erhöht (Tab. A7.5, Anhang). Wie schon bei dem weiß-beringten Pärchen blieb auch bei diesem Paar die O/D Kot recht niedrig, mit Ausnahme des Maximums vom Täuber. Zu Beginn des Versuches saß der Täuber hauptsächlich im Nest, sodass nicht viele Proben gesammelt werden konnten. Dies funktionierte besser, weil das Paar ab dem 54. Versuchstag separat gehalten wurde. Im Wesentlichen zeigte die Täubin kontinuierlich mehr Oozysten, als der Täuber.

Diskussion 89

4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich die Raubwanze Dipetalogaster maxima (Familie Triatominae) als eine minimal-invasive Methode zur Blutprobengewinnung bei Wildtieren in Zoologischen Gärten eignet. Die Triatominae wurden in verschiedenen Teilgebieten eingesetzt, ohne dass man die zu beprobenden Tiere fangen oder narkotisieren musste. Auch bei kleineren Arten, die aufgrund ihrer Körpergröße über kleinere Blutgefässe verfügen, wurden die Raubwanzen erfolgreich eingesetzt, da die Technik stressfrei ist und eine Anästhesie der Wirte unnötig macht (Voigt et al . 2006).

4.1 Methodische Probleme Beim Einsatz von blutsaugenden Insekten haben Raubwanzen einen großen Vorteil gegenüber anderen blutsaugenden Invertebraten, da alle Nymphenstadien und beide Geschlechter Blut saugen. Dies unterscheidet sie z.B. von Stechmücken oder anderen Mückenarten (Schaub 2016). Mehrere Faktoren wie die Hungerphase der Raubwanzen, Besonderheiten der Raubwanzen-Arten und Stadien, potentielle Allergien, die Anzahl der Wirts-Individuen und -Arten sowie die Körpertemperatur der Wirte und Besonderheiten der Blutabnahme beeinflussen den Einsatz der Wanzen als „lebende Spritzen“. So war die vorherige Hungerphase zu beachten. Hungrige Raubwanzen der Art Rhodnius prolixus stachen in Laborversuchen signifikant öfter als nicht hungrige Artgenossen (Reisenman et al . 2013; Reisenman 2014). Bei N5 von Dipetalogaster maxima sogen nach einer fünfwöchigen Hungerphase nur 60 % an Kaninchen (Markvardsen et al . 2012). Lag die letzte Fütterung der Wanzen in der vorliegenden Arbeit entweder zu lang oder zu kurz vor Probenentnahme wurde ebenfalls eine geringere Aggressivität beobachtet (Schaub pers. Mitteilung). Diese äußerte sich durch verstärktes Herumwandern der Wanzen und seltenem oder gar keinem Einstechen des Saugrüssels. Dieses war ein wichtiger Punkt, wenn die Blutprobe im Zooalltag oder zu Forschungsprojekten eingesetzt werden sollte. In den meisten Fällen gab es eine aktuelle Fragestellung, die nicht auf Aufschub warten konnte. Dieses Problem wurde, analog zu anderen Studien, in der vorliegenden Studie durch eine höhere Individuenzahl an Wanzen gelöst. Es wurden in der Regel fünf Raubwanzen gleichzeitig eingesetzt, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge Blut gewonnen werden konnte. Damit konnten die geringen Erfolgsquoten der anderen Studien verhindert werden (Vos et al . 2010; Markvardsen et al . 2012). Es wurde zudem darauf geachtet, dass die

Diskussion 90

Hungerphasen der Wanzen in der vorliegenden Arbeit nie länger als zehn Wochen betrugen. Die Erfolgsquoten waren deshalb sehr zufriedenstellend. Hungerphasen wirken sich bei den einzelnen Raubwanzen-Arten und -Stadien unterschiedlich aus. Obwohl R. prolixus eine höhere Aggressivität zeigte (Stadler et al . 2011), wurde trotzdem im Rahmen der vorliegenden Arbeit D. maxima eingesetzt. Diese Art ist nicht nur nacht- sondern auch tagaktiv (Lent & Wygodzinsky 1979), was beim Einsatz in Zoologischen Gärten natürlich einen immensen Vorteil brachte. Auch die Aggressivität war nur wenig geringer als bei R. prolixus und die Entnahme der Eier aus den Zuchtbechern deutlich einfacher. Zum anderen saugten selbst kleine Nymphen schon relativ große Mengen an Blut. In den fünf Nymphenstadien saugen die Tiere 0,1 mg Blut im ersten, 0,2 mg im zweiten, 0,6 mg im dritten, 1,2 mg im vierten und 2,5 mg im fünften Nymphenstadium (Schaub et al . 2012). Problematisch stellte sich trotzdem für manche Analysen die Saugmenge dar. Wenn junge Nymphenstadien eingesetzt wurden, waren die gewonnenen Blutproben meist zu gering. So kam es bei der Probeneinsendung zu kommerziellen Laboren zu Problemen, da diese die geringen Probenmengen teilweise bemängelten. In der Regel arbeiten diese Labore mit mindestens 2 mg Blut. Speziell in der Pharmakologie, wo große Blutmengen und zeitlich genaue Entnahmen notwendig waren, stellten die Wanzen einen hohen Unsicherheitsfaktor dar (Markvardsen et al . 2012). Einen weiteren limitierenden Faktor können Allergien auf die Speichelantigene der Wanze darstellen. Diese können unerwünschte Immunreaktionen auslösen (Vos et al . 2010). Wirtsspezifische Antikörperreaktionen auf den Speichel von Raubwanzen wurden bei Meerschweinchen und Haushühnern nachgewiesen (Schwarz et al . 2009, 2010, 2014; Dor ňáková et al . 2014). Alle beprobten Tiere der vorliegenden Studie zeigten allerdings keine Hautreaktionen oder ähnliches nach der Beprobung. Dies deckt sich mit vorherigen Untersuchungen, z.B. an Flussseeschwalben (Becker 2015). Allergische Hautreaktionen können bei Wildtieren wie beim Menschen nur durch wiederholten Einsatz ausgelöst zu werden (Meiser & Schaub 2011) . Die Anzahl der zu beprobenden Individuen wurde im Rahmen der vorliegenden Studie nicht primär aus einem wissenschaftlichen Ansatz herausgewählt. Das tagesaktuelle Geschehen in den Zoologischen Gärten diente als maßgebender Faktor. Dadurch entstanden bei einzelnen Fragestellungen die kleinen Stichprobenmengen bzw. die Ungleichverteilung zwischen den Geschlechtern. Anstehende Untersuchungen für

Diskussion 91

Tiertransporte zwischen verschiedenen Zoos oder Erkrankungen gaben Anlass für diese Studie. Beides sind Faktoren, die nicht planbar waren. Ein letzter wichtiger Faktor beim Einsatz von Raubwanzen zur Gewinnung von Blutproben ist die Körpertemperatur des Wirtes . Raubwanzen finden ihre Wirte über die Körpertemperatur des Wirtes und/oder durch das ausgeatmete CO 2. Da durch Letzteres die Wanzen Menschen bevorzugt in der Mundregion anstechen, bekamen sie in der englischen Sprache auch den Trivialnamen „kissing bugs“ (Schofield 1979). Weiterhin werden Raubwanzen durch den Kot anderer Raubwanzen angelockt, da der Kotabsatz kurz nach einer Blutaufnahme geschieht (Schofield 1979). In der vorliegenden Studie an verschiedenen Reptilienarten waren von 21 Proben bei 13 verschiedenen Reptilienarten nur vier Versuche erfolgreich. Es gelang nur bei Mindestkörpertemperaturen von 36,2 °C. Damit zeigte sich eine stärkere Temperaturabhängigkeit beim Auffinden des Wirtes, da die untersuchten Reptilien nicht sehr stark atmen und es unwahrscheinlich ist, dass der Wirt über eine CO 2- Detektion gefunden wurde. Auch Kot anderer Wanzen war nicht vorhanden, so dass auch diese Möglichkeit nicht in Betracht kam. Bei der Probengewinnung an den Weißlippenhirschen, die sich meist auf dem Außengelände aufhielten, war die Probengewinnung durch die Außentemperatur eingeschränkt und die ersten Bemühungen im Frühjahr 2012 wegen der niedrigen Temperaturen erfolglos. Dieses würde aber für alle Insekten gelten, die man zur minimal invasiven Blutprobengewinnung einsetzen möchte, da alle Insekten ektotherm sind (Hoffmann & Krüll 1979). Es stellt damit aber eine natürliche Grenze der Einsetzbarkeit der Raubwanzen im Winter in Außengehegen von Zoologischen Gärten dar. Die bei den Erdmännchen eingesetzte Methodik des doppelten Bodens erwies sich als schwierig und zu langwierig für eine regelmäßige Probengewinnung (Stadler 2006). So mussten die zu beprobenden Tiere erst einmal an den Studierenden habituiert werden, um ein entspanntes Verhalten der Tiere zu ermöglichen. In den ersten Wochen kam es oft zu Warnlauten und die Boxen mit dem doppelten Boden wurden kaum oder nur kurz aufgesucht. Dabei kam es zu keiner Blutaufnahme durch die Wanzen. Nach einer Gewöhnungsphase von zum Teil mehreren Wochen hielten sich aber zum Teil so viele Tiere in der Box auf, dass eine Probenzuordung zu einem bestimmten Individuum nicht möglich war. Bei den Weißlippenhirschen war die Beprobung mittels Raubwanzen deutlich einfacher: die Tiere wurden mit Erdnüssen ans Gitter gelockt, um

Diskussion 92 ihnen unbemerkt eine Raubwanze aufzusetzen. Dabei erwiesen sich besonders Schrammen im Fell als hilfreich, da die Raubwanze hier leichten Zugang zur Haut des Tieres hatte. Künstliche Eier zur Blutprobengewinnung bei ornithologischen Studien wurden bei Flussseeschwalben und Kohlmeisen eingesetzt (Arnold et al . 2008; Bähnisch 2011). Bei den Kohlmeisen führte der Einsatz von N3 und N4 von D. maxima zu keinem Erfolg (Bähnisch 2011). Eine mögliche Ursache könnte die zu große Distanz vom Ei zur Haut des Vogels gewesen sein. Eventuell bieten N5 eine bessere Möglichkeit, wobei die Kunsteier bei den kleinen Diamanttäubchen relativ zu groß sind. Bei der Auswahl der Tierarten bzw. Individuen für die parasitologischen Untersuchungen gab die primäre Fragestellung (Einfluss der sozialen Stellung auf die Immunität und damit den Parasitenbefall) den Ausschlag für die Auswahl. Bei allen Tieren wurde weiterhin eine Gewöhnungszeit der Tiere an die Studierenden, die die Tiere im Rahmen ihrer Projekte beobachtet haben, berücksichtigt, da viele Wildtiere schreckhaft auf fremde Personen reagieren und dies sowohl die individuelle Kotprobengewinnung als auch die unverfälschten Verhaltensbeobachtungen beeinflussen kann (Rasa 1984). Auch die Studenten benötigten diese Eingewöhnungszeit, um die Tiere fehlerfrei individuell erkennen zu erlernen. In der Regel waren dies ca. vier Wochen, und dadurch stellte die Kotprobengewinnung zumindest bei den Erdmännchen kein Problem dar. Bei den Weißlippenhirschen war die Kotprobengewinnung etwas komplizierter. Das Einsammeln der Proben war nicht unmittelbar nach der Kotablage möglich, da Männchen sich beim Betreten des Geheges aggressiv verhielten. Deshalb wurden die Positionen des Kotes der einzelnen Tiere vermerkt und zu einem späteren Zeitpunkt eingesammelt. Bei den Diamanttäubchen war die Kotprobengewinnung schwieriger, da auf dem mit Vogelkot übersäten Boden die richtige Probe schwierig zu finden war. Hier erwies sich ein Lot als hilfreich, das an die Position des Vogels bei der Kotabgabe gehalten wurde (Jezyschek 2012).

4.2 Unterartbestimmungen Die Phylogenie spielt für die Einschätzung des Gefährdungsgrades einer Art eine wichtige Rolle, da sich die Erhaltungskonzepte auf den taxonomischen Status einer Art beziehen (Palsboll et al . 2006). Häufig haben taxonomische Neubeschreibungen oder Änderungen Einfluss auf den Gefährdungsstatus in der Roten Liste der IUCN (Weltnaturschutzorganisation) (Palsboll et al . 2006). Viele Arten lassen sich nur schwer in der freien Wildbahn erforschen. Hier stellen Museen und Zoos eine wichtige

Diskussion 93

Ressource an Informationen dar (Frankham 2008). Gerade bei den Erhaltungszuchtprogrammen spielt die Erhaltung der genetischen Vielfalt in den Populationen eine zentrale Rolle (Hale & Briskie 2007). Hierbei nimmt die Analyse des Genoms einen immer wichtigeren Platz ein (Frankham 2008; Fernando et al . 2003). Ziel der Zuchtprogramme ist es, 90% der Gene für mindestens 100 Jahre in den Zoos zu erhalten (Tudge 1993). Des Weiteren rückt auch die Frage nach der Validität von Unterarten in den Fokus taxonomischer Studien (Philimore & Owens 2005). Die hier präsentierten Untersuchungen der taxonomischen Variabilität des Erdferkels stellen ein erstmaliges Screening zum Unterartstatus einer Tierart in einer kompletten europäischen Zoopopulation dar und geben dadurch weitere Möglichkeiten, das Zuchtprogramm noch weiter zu optimieren. Auf diesem Wege können auch ggf. Fehler aus der Vergangenheit in der Verwendung von Tieren mit unterschiedlichem taxonomischen Status für die Zucht ausgemerzt werden. Dieses hat in der Vergangenheit zum Bespiel zu Problemen bei der Zucht von unterartreinen Tigern geführt (Müller 2009). Die über Wanzen gewonnenen Blutproben enthielten eine ausreichende Menge Blut für die Analysen. Darüber hinaus war die Qualität und Menge der DNA sehr gut verwendbar, da eine Kontamination durch Wanzen-DNA durch die spezifischen Primer ausgeschlossen wurde. Auch die Blutentnahme am Individuum konnte problemlos durchgeführt werden, da Erdferkel in Warmhäusern gehalten werden und es so zu keinem Temperaturproblem kam. Die Wanzen waren in diesem Fall die beste Wahl für die Probentnahme, da sie komplett stressfrei für die Wirte ablief. Alle Proben lieferten anschließend gute DNA-Konzentrationen, die eine gute Amplifikation in der PCR erlaubten, wobei die Anzahl der Basenpaare relativ gering war. Morphometrische, taxonomisch relevante Unterschiede der Erdferkel, wie z.B. Ohr- oder Schwanzlänge ließen sich genetisch nicht bestätigen. Im nördlichen Osten Afrikas scheint sich eine genetisch veränderte Gruppe zu befinden. Die Hypothese, dass es 18 valide rezente Unterarten des Erdferkels gibt, ließ sich anhand der untersuchten genetischen Merkmale nicht bestätigen. Nach der Sequenzierung und den Alignments ließ sich bei den Erdferkeln kein genetisches Muster finden, das Unterarten nachgewiesen hätte. Auch ein Muster, das eine Trennung in eine Wald- und eine Savannenform unterstützt, wurde vorerst nicht bestätigt. Allerdings belegen die Proben genetische Unterschiede, der in folgenden Studien weitere Beachtung geschenkt werden muss. Diese hochvariable Stelle in der

Diskussion 94

Sequenz könnte von Bedeutung für weitere Untersuchungen bezüglich der Phylogenie des Erdferkels sein. Dies ist ein erster Hinweis auf eine genetische Untergruppierung.

4.3 Diagnostik auf Tierseuchen Die Überprüfung des Tierbestandes auf Tierseuchen ist ein weiterer wichtiger Aspekt in Zoologischen Gärten, u.a. auf Tuberkulose, Brucellose, Malaria und die Blauzungenkrankheit. Für die Tuberkulose wurden dazu entweder der ELISA Test oder der Rapid Test benutzt. Für die Analysen reichte schon ein Tropfen Blut. Vergleichsproben bei Mähnenrobben, Schwarzkopfschafen und Schabrakentapiren wurden venös entnommen. In allen 43 Vergleichsproben waren die positiven und negativen Ergebnisse identisch. In sieben von 29 auf Tuberkulose getesteten Proben waren keine Antikörper nachweisbar. Bei der Überprüfung einer von neun Proben bei verschiedenen Arten auf Brucellose enthielt sie keine Antikörper. Dies gilt ebenfalls für sieben Proben bei der Malariadagnostik und bei 20 Proben bei der Blauzungendiagnostik. Falsch positive oder negative Proben lagen beim Vergleich mit konventionell entnommenen Proben nicht vor. Eine Netzgiraffe im Kölner Zoo wies nach einer Beprobung durch D. maxima ebenfalls Antikörper gegen die Blauzungenkrankheit auf (Habicher 2009). Gerade bei der Diagnostik auf Tierseuchen stellt die Beprobung mittels Raubwanzen einen großen Vorteil dar, da aufgrund der geringen benötigten Blutmenge Narkosen bei Zootieren unterbleiben können. Aufgrund der immensen Vorteile gibt es mittlerweile schon in den Husbandry Guidelines für den Schabrakentapir des Europäischen Erhaltungszuchtprogrammes (EEP) der EAZA (Europäische Vereinigung der Zoos und Aquarien) eine Empfehlung, Raubwanzen zur Probengewinnung zu nutzen (Dr. Helmut Mägdefrau pers. Mitteillung).

4.4 Klassische Hämatologie Blutparameteranalysen liefern Informationen über den Gesundheitszustand der Tiere und über ggf. vorliegende Krankheiten. Einige Tierarten wie Primaten können durch die konventionelle Blutabnahme sehr gestresst werden, und eine regelmäßige Blutabnahme ist nicht möglich. Das fünfte Nymphenstadium von D. maxima wurde bei Grauen Mausmakis ( Microcebus murinus ) und bei Orang-Utans bzw. Bonobos ( Pongo abelii, Pan paniscus ) als minimal-invasive Blutentnahmemethode eingesetzt. Nach 6–62 min Saugzeit wurden 0,01-2,4 ml Blut in 11 von 12 Versuchen gewonnen (Thomsen & Voigt 2006).

Diskussion 95

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Parameter der klassischen Hämatologie untersucht. Im Vergleich zu Proben der konventionellen Blutabnahme waren dies u.a. die Anzahl der Blutzellen und die Konzentrationen von Enzymen, Kalium und Glukose. Bei der Erythrozytenzählung in einer Zählkammer tritt immer ein methodisch bedingter Fehler auf, dessen Größe mit steigender Erythrozytenzahl im Zählnetz zunimmt. Dieser wird durch eine Übereinanderlagerung von Zellen verursacht (Stobbe 1991). Dieses Problem lag auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit beim Auszählen der weißen Blutzellen vor. Das Zählen war gut machbar, aber etwas erschwert, da die Blutzellen leicht verformt waren. Auch beim Auszählen der Erythrozyten und bei den neutrophilen und basophilen Zellen sowie den Lymphozyten wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit niedrigere Werte als bei anderen Laborstudien an Kaninchen und Mäusen erzielt (Soares et al . 2014). Die Differenz in der Anzahl der weißen Blutkörperchen lag in der vorliegenden Studie in sieben Proben aus den Wanzen gegenüber konventionell gewonnenen Blutproben 3,7- 34,6 % niedriger. Ebenfalls war die Anzahl der Leukozyten im Mikroskop niedriger, wobei diese komprimiert erschienen. Diese Komprimierung der Leukozyten wird dabei schon im Wirtskörper in venösen Blutgefäßen durch die Raubwanze ausgelöst (Soares et al . 2014). Personen, die regelmäßig Zellen in Blutproben auszählen, kompensieren diese Erscheinung allerdings ohne Probleme. Beim Vergleich der Reproduzierbarkeit der Methode zeigten sich bei neun über N4 gewonnenen Proben bei allen Blutparameter mit Ausnahme eines Lymphozytenwertes (p<0,5) keine signifikanten Unterschiede (p>0,5, non-parametric Wilcoxon signed rank Test). Die Abweichungen lagen alle im Bereich der Messungenauigkeiten der Messgeräte. Ein Unterschied zwischen den vorherigen Studien und den hier vorliegenden war die Saugdauer der Wanzen. Bei den eigenen Untersuchungen durften die Raubwanzen immer maximal 15 Minuten saugen, und es wurden fast immer 800 µl aus jeder Wanze (N4) gewonnen. Diese Beschränkung der Saugdauer reduzierte Veränderungen des aufgenommenen Blutes. Es resultierten aber Unterschiede im Volumen des aufgenommenen Blutes. Bei nicht vollständiger Blutaufnahme durch die Wanze kann es beim Entnehmen der Probe zur Verunreinigung der Probe kommen, z.B. durch Hämolymphe. Diese wiederum kann zu Kreuzreaktionen mit den Analysemethoden führen und so Abweichungen erklären. Ein weiterer untersuchter Aspekt der vorliegenden Arbeit war die Vergleichbarkeit der konventionellen Abnahme mit der Wanzenbeprobung. Dazu

Diskussion 96 sind Unterschiede der Tierarten einzubeziehen, die bei der Bestimmung der Blutparameter im Zooalltag und auch im Generellen entscheidend sind. Alle in Tabelle 2.3 aufgeführten Parameter variieren je nach Art, Alter und teilweise sogar geschlechtsspezifisch (Campbell 2012). Deswegen können keine direkten Vergleiche zu Literaturwerten gezogen werden. In vorherigen Laborversuchen an Kaninchen wurden 29 Blutparameter zwischen der herkömmlichen Methode und einer Blutabnahme mittels Wanzen verglichen. Dabei unterschieden sich 16 Blutparameter signifikant (Markvardsen et al . 2012). Niedrigere Konzentrationen in der Probe, welche mittels Wanzen gewonnen wurde, gab es bei Lipase, Kalzium, Phosphat, Natrium und Gamma-Glutamyl-Transferase. Die Cholesterinwerte von Flussseeschwalben und Silbermöwen sowie die Konzentrationen der Harnsäure und Tryglizeride unterschieden sich bei Silbermöwen nicht, bei den Flussseeschwalben allerdings signifikant gegenüber denen von herkömmlich gewonnenen venösen Vergleichsproben (Bauch et al . 2010). Zur Beurteilung des Einflusses der Wanzenbeprobung wurden in der vorliegenden Studie mit N3 und N4 von D. maxima 14 klinisch relevante Blutparameter bei Geparden und 28 Parameter bei Hausrindern bestimmt. Bei den über Wanzen gewonnenen Proben der sieben Geparde waren folgende Konzentrationen gegenüber konventionell gewonnenen Proben signifikant erhöht: Gesamteiweiß, Alanin- Aminotransferase, Total Bilirubin, Phosphat, Kalium und Magnesium (Tab. 3.4; Tab. 3.5). Bei Natrium und Chlorid fanden sich signifikant niedrigere Werte und beim Plasma Albumin, Urease, Kreatinin und Kalzium keine Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den „Wanzenproben“ und den „konventionellen Blutproben“ bei den Geparden können hier durch individuelle Besonderheiten bedingt sein, da zumindest eines der Tiere zum Zeitpunkt der Entnahme Infektionen aufwies und ein weiteres tragend war. Diese Faktoren hatten beim Zusammenfassen der Werte eventuell einen Einfluss. Das Blut der elf Hausrinder wies beim Vergleich dagegen nur bei drei Parametern (neutrophile und basophile Zellen und Urease einen signifikanten Unterschied auf (p<0,5, nicht-parametrischer Wilcoxon Rank Test). Der Anteil der neutrophilen Zellen und die Konzentration der Urease waren signifikant niedriger, der Anteil der Basophilen signifikant höher. Bei allen anderen Parametern lagen keine signifikanten Unterschiede vor. Somit konnten 25 Parameter ohne signifikante

Diskussion 97

Unterschiede zwischen herkömmlicher Methode und Wanzenbeprobung einbezogen werden. Neben dem Metabolismus der Wanzen und dem des Wirtes könnte aber noch ein weiterer Faktor entscheidend für Unterschiede zwischen den beiden Entnahmemethoden sein. Die konventionelle Entnahme mittels einer Spritze und Kanüle resultiert in der Regel immer in venösem Blut, während Raubwanzen fast ausschließlich Kapillargefässe anstechen. Dieses kann entscheidend sein, da sich bei Haushunden zwischen venösem und arteriellen Blut signifikante Unterschiede in der Anzahl der roten und weißen Blutzellen und Lymphozyten sowie der Konzentration von Hämoglobin und Hämatokrit finden (Lue et al . 2007). Die Herkunft des Blutes aus der Wanze ist nicht sicher zu bestimmen. Allerdings nimmt R. prolixus zu 63% venöses Blut auf (Soares et al . 2014). In wie weit dies auf andere Arten zu übertragen ist, müssen weitere Forschungen zeigen, aber eine geringere Wahrscheinlichkeit arterielles Blut zu erfassen, darf bei der Interpretation der Ergebnisse nicht unterschätzt werden. Zusammengefasst ist zu betonen, dass einzelne Parameter von der Wanze beeinflusst werden können, aber alle Parameter grundsätzlich mittels dieser Alternativmethode mess- und nutzbar sind. Die Vorteile überwiegen hierbei sicherlich. Da zwischen beiden Entnahmemethoden vereinzelt die Werte bei Kalium und Glukose deutlich differierten, wurden sie detaillierter untersucht. Abweichungen im Vergleich zur konventionellen Methode um bis zu 136% traten aber nur bei Proben von Raubwanzen auf, die deutlicher länger als 20 Minuten für den Saugakt gebraucht hatten und bei denen eine Hämolyse vorlag. Die Hämolyse kann im Magen der Wanze auftreten und/oder wenn das Blut zu schnell aus dem Magen in die Spritze aufgesogen wird. Dies dürfte die Blutwerte verändert haben, da bei Wanzen unabhängig vom Nymphenstadium bei einem Saugvorgang von <30 Minuten die Blutparameter sich nicht signifikant von den Proben klassischer Entnahme unterschieden. Der Kalium-Wert ist ein guter Richtwert, um zu entscheiden, wie weit die Hämolyse fortgeschritten ist, und um zu beurteilen, wie aussagekräftig die gewonnenen Werte sind. Sind die Kalium- Werte erhöht, so ist die Hämolyse fortgeschritten. Bei den Proben nach längerer Saugzeit zeigten auch die anderen Blutparameter höhere Werte. Die Differenzen lagen beim Halsbandpekari bei bis zu 79 % beim Partial

CO 2, beim Brillenlangur und beim Kanadischen Wolf bei 333 % bzw. 133 % bei der Basenabweichung sowie beim Afrikanischen Zwergesel bei 146 % bei der Glutamat- Pyruvat-Transaminase. Bei Kaliumwerten, die maximal um 56 % abwichen, wurden

Diskussion 98 keine so starken Abweichungen bei den anderen Parametern gemessen. Dieses war u.a. der Fall beim Schwarzen Panther, Böhmzebra und Weißlippenhirsch. Auch scheinen nicht alle Werte bei einem erhöhten Kaliumwert so stark erhöht zu sein. Natrium, Kalzium, Urease, pH, Alkalische Phosphatase, Harnstoff, Hydrogencarbonat, Phosphat, Kreatinin, Glukose und Gesamteiweiß waren um maximal 32 % erhöht. Ein weiterer Einfluss durch die Wanzen resultiert aus dem raschen Entzug des Wassers aus dem Blut im Magen der Raubwanzen. Dieser bei R. prolixus gut untersuchte Entzug geschieht mittels eines Ionentransports durch Na +/K + Kanäle in der Membran des Mitteldarms der Wanzen (Farmer et al . 1981). Bei D. maxima ist dies zwar noch nicht untersucht, sollte aber ähnlich bzw. identisch ablaufen. Als Ursache für die Unterschiede bei den Parametern Natrium und Kalium wird dieser Ionenaustausch angesehen (Markvardsen et al . 2012). In den Blutproben der Zootiere stiegen die Kalium-Werte nach über 20 Minuten Saugdauer. Neben Kalium wurde die Glukose über einen längeren Zeitraum nach Blutaufnahme detaillierter untersucht. Da bis auf die Lyse der Erythrozyten und einige weitere Modifikationen in den ersten drei bis vier Tagen nach Blutaufnahme das Blut im Magen der Raubwanze nicht bzw. nur gering verändert wird (Bauer 1981; Azambuja et al . 1983; Ribeiro & Pereira 1984; Canavoso et al. 2004; Schaub 2009; Garcia et al . 2010; Schaub et al . 2011), war zunächst davon ausgegangen worden, dass sich die Glukose-Konzentrationen im Magen kaum ändern. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurde aber erstmalig eine stetige Abnahme der Glukosekonzentration in dem aus den Wanzen entnommenen Blut nachgewiesen. Die Differenz der Glukosekonzentration in den im Wasserbad gelagerten Proben lag gegenüber der Ausgangskonzentration nach 30 Minuten signifikant um 6-10 % niedriger (t-test p<0,05) und nach 60-120 min. um 27-38 %. Die größte signifikante Abweichung ergab sich bei den Messungen nach 180 und 240 Minuten; hier lagen die Werte ca. 51-57 % niedriger (t-test p<0,05). Der Abbau der Glukose im Magen der Raubwanzen wurde bisher durch Verdauungsenzyme im Magen erklärt (Azambuja et al . 1983). Durch den weiter verlaufenden Stoffwechsel der Erythrozyten nach Probenentnahme ist der Abbau der Glukose in den Kontrollproben zu erklären. Wegen der stetigen Abnahme der Konzentration der Glukose im Magen der Raubwanzen sollte eine Auswertung der Glukose in den Proben innerhalb der ersten 30 Minuten erfolgen. Etwaige Temperaturdifferenzen wurden nicht beachtet.

Diskussion 99

Bei neun Individuen von neun verschiedenen Tierarten wurden das klassische Blutbild und alle wichtigen hämatologischen Blutparameter aus dem mit Hilfe der Raubwanze D. maxima gewonnenen Blut erfolgreich bestimmt. Nur beim Tamandua war ein Kaliumwert aufgrund der Hämolyse der Probe nicht erfassbar. Das Gesamtbilirubin war bei früheren Laborstudien in 12 von 13 Proben nicht messbar (Markvardsen et al . 2012). Hierbei unterschieden sich diese Literaturwerte und die Ergebnisse der vorliegenden Studie nicht, da bei vier Arten im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenfalls kein Bilirubin detektiert wurde. Dies könnte ein Indiz dafür sein, dass der Metabolismus der Wanzen einen Einfluss auf diesen Faktor hat und muss in zukünftiger Forschung noch verifiziert werden. Bei allen weiteren 37 untersuchten Parametern war die Detektion erfolgreich. Als Regel für den Zooalltag etablierte sich im Laufe der Studie, dass die Raubwanzen komplett vollgesogen sein müssen und die Blutaufnahme möglichst schnell (<20 Minuten) erfolgen soll. Ansonsten ist mit höheren Abweichungen zu rechnen. Der Kalium-Wert erlaubt dabei eine gute Beurteilung. Wenn dieser erhöht oder nicht messbar ist, ist die Vergleichbarkeit eingeschränkt v.a. bei den Leber- und Nierenwerten. Generell überwiegen aber auch bei diesem Teilaspekt die Vorteile der minimal-invasiven Methode, da v.a. bei Tieren, welche nicht ohne Fang oder Narkose beprobt werden können, einzelne abweichende Parameter nicht so stark ins Gewicht fallen.

4.5 Konzentration des Progesteronspiegels Der Erfolg von Zuchtprogrammen speziell bei beiden Elefantenarten ist u.a. von der Bestimmung des Reproduktionszyklus abhängig. Seit ungefähr zwanzig Jahren kann der Zyklus von Weibchen durch regelmäßige Messungen von Progesteron im Blutserum überprüft werden (Olsen et al . 1994). Auch eine Trächtigkeit lässt sich über die Progesteron-Konzentration nachweisen (Mc Neilly 1983). Zunächst wurden bei Kaninchen die Konzentrationen der Steroidhormone Progesteron, Testosteron und Kortisol in mit N5 D. maxima gesogenem Blut ermittelt (Voigt et al . 2004). Die durchschnittliche Progesteron-Konzentration der konventionell entnommenen Proben lag bei 0,51±0,33 ng/ml. Die durch die Raubwanzenmethode gewonnenen Blutproben enthielten 0,75±0,53 ng Progesteron/ml Plasma, erschienen also erhöht, wichen aber nicht signifikant von den Kontrollproben ab (Voigt et al . 2004).

Diskussion 100

Da bei weiblichen Afrikanischen Elefanten der Progesterongehalt im Vergleich zu vielen anderen Säugetierarten geringer ist, bietet die Methode zur Progesteronanalyse während der Trächtigkeit ein hilfreiches Werkzeug (Schwarzenberger et al . 1997). Progesteron-Konzentrationen von trächtigen Afrikanischen Elefanten sind mit durchschnittlich 1,414 ± 0,092 ng/ml signifikant höher als die von nicht trächtigen Kühen mit 0,707 ± 0,077 ng/ml (Mc Neilly 1983). Bisherige Hormonanalysen mit Proben, die über Raubwanzen gewonnen wurden, fanden bei Fledermäusen, Erdmännchen und Pardelluchsen erfolgreich statt (Voigt et al . 2004; Vargas 2008; Habicher 2009). Allerdings erhöhten sich Progesteronwerte bei zunehmender Verweildauer im Magen der Wanze (Voigt et al . 2004). Auch im Rahmen der vorliegenden Studie wurde Progesteronkonzentration erfolgreich bei Proben bestimmt, z.B. bei Asiatischen Elefanten in den Zoos Dublin bzw. Leipzig und bei Afrikanischen Elefanten im Zoo Wuppertal. Bei trächtigen Afrikanischen Elefanten ist die Progesteron-Konzentration signifikant höher als bei nicht trächtigen Kühen, mit maximalen Werten während dem 9.-12. Monat der Trächtigkeit (McNeilly et al . 1983). Die Konzentration des Progesterons variiert dabei zwischen 0,38-3,74 ng/ml, wobei trächtige Elefanten mit durchschnittlich 1,41±0,92 ng/ml in der Regel einen höheren Progesterongehalt aufweisen als nicht trächtige Kühe mit 0,71±0,77 ng/ml. Bei den Afrikanischen Elefanten aus dem Zoo Wuppertal wurde die Genauigkeit des Testverfahrens überprüft. Hierbei gab einen Wechsel zur Membranfütterung, die sich aber als problematisch herausstellte. Die Progesteron-Konzentration dieser Blutproben lag deutlich unterhalb der Werte der Proben, die direkt von Raubwanzen stammten. Bei beiden Elefantenkühen führte eine Lagerung des Blutes unter einer Membran zu einer bis zu 76,8 % niedrigeren Progesteron-Konzentration als bei den Kontrollproben. Die Blutentnahme durch die Raubwanzen wurde durch die Vergleichsproben als Ursache für die Verringerung der Hormonkonzentration ausgeschlossen. Höchst wahrscheinlich waren die Latex-Membranen die Ursache für den Progesteronverlust in den Blutproben. Vermutlich wurde das Progesteron durch Adhäsion an die Membranoberfläche gebunden und nur im geringerem Maße von den Raubwanzen aufgenommen. Demnach eignet sich die Membranfütterung nicht bei Progesteronnachweisen. Bei der Asiatischen Elefantkuh „Yasmine“ wurden im Rahmen der vorliegenden Studie im Zoo Dublin in sechs Proben Progesteronwerte von 4,2 bis 6,4 ng/ml bestimmt. Kontrollproben konnten nicht gewonnen werden, so dass nur der Vergleich mit der

Diskussion 101

Literatur eine Trächtigkeit bestätigt, wenn auch mit einem erhöhten Wert. Die Elefantenkuh gebar im folgenden Jahr ein gesundes Kalb. Bei den beiden trächtigen Afrikanischen Elefanten „Sabie“ und „Sweni“ aus dem Zoo Wuppertal enthielten die auf konventionelle Weise gewonnenen Blutproben durchschnittlich 2,02±1,89 und 3,69±1,99 ng/ml Progesteron im Plasma. Diese im Vergleich zu früheren Trächtigkeiten relativ hohen Werte waren wahrscheinlich durch den Beprobungszeitraum bedingt, da die Kühe sich zu Beginn der Messung im 13. und 15. Monat befanden, d.h. in der Mitte der ca. 22 monatigen Trächtigkeit (Mc Neilly et al . 1983; Magunna 1995; Meyer et al . 2004). Bei der ebenfalls beprobten Asiatischen Elefantenkuh „Hoa“ aus dem Zoo Leipzig lag die Progesteron-Konzentration im letzten Schwangerschaftsdrittel bei durchschnittlich 2,4 ± 0,84 ng/ml. Die Abweichung dieses Wertes zu dem gemittelten Progesteronwert der Afrikanerkühe begründet sich möglicherweise in der unterschiedlichen Gattungszugehörigkeit. Darauf deutet ein Vergleich zwischen der Progestagen-Konzentration im Serum von 19 Asiatischen und acht Afrikanischen Elefanten während ihrer jeweiligen Trächtigkeit hin (Meyer et al . 2004). Wie bei Kaninchen wichen die hier vorliegenden Ergebnisse bei den Elefanten nicht signifikant von den Kontrollproben ab. In der vorliegenden Studie fand beim „ECLIA“-Test demnach keine Kreuzreaktion statt. Die negativen Abweichungen von zwei direkten Wanzenproben der Afrikanischen Elefanten lassen sich möglicherweise durch eine unterschiedliche Progesteron-Konzentration in verschiedenen Körperregionen erklären. Das Blut der konventionellen Proben wurde aus den großen Blutgefäßen an den Ohren der Elefanten entnommen. In diesen Gefäßen war der Progesterongehalt evtl. höher als in den peripheren Blutgefäßen des Vorderlaufs, an dem die Wanzen Blut aufnahmen. Die Anzahl der Wanzenproben im Zoo Wuppertal war allerdings zu niedrig und im Zoo Leipzig waren keine Kontrollproben zu den Wanzenproben am gleichen Tag vorhanden. Für verlässlichere Aussagen über die Abweichung des Progesterontiters der über Raubwanzen gewonnenen Blutproben sollte der Probenumfang erheblich vergrößert werden, und es sollten stets Kontrollproben zur Validierung genommen werden. So lange bleibt die Überwachung des Progesterontiters durch konventionelle Blutentnahme vorerst die bessere Methode, obwohl die Alternative über „lebende Spritzen“ die stressfreiere Alternative darstellt. Der Trend Elefanten in größeren Gruppen und ohne Training („Hands off“) zu halten wird die konventionelle Blutentnahme erschweren.

Diskussion 102

Bei trächtigen Laborratten fanden sich bei der Untersuchung des Blutes auf das Progesteron höhere Maximalwerte als bei den nicht trächtigen Weibchen. Bei drei trächtigen Ratten lagen die maximalen Progesteronwerte zwischen 59,3 ng/dl und 82,2 ng/dl (Abb. 3.3), bei zwei nichtträchtigen Ratten bei 37,5 ng/dl und 38,8 ng/dl. Die höheren Progesteronwerte bei den trächtigen Tieren und deren Verlauf während der Tragzeit entsprachen tendenziell den Ergebnissen vorheriger Arbeiten bzw. den eigenen Studien an Elefanten (Grota & Kristen 1967; Dobrzinski 2012). Bei einer Laborratte (Nr. 5) kam es in der zweiten Graviditätsswoche zu einem starken Abfall der Progesteronwerte von 59,3 ng/dl auf 7,2 ng/dl. Die Progesteronwerte und die äußere Erscheinung des Tieres sprachen für eine Trächtigkeit, welche wohl abgebrochen wurde. Die durchschnittliche Progesteron-Konzentration unterschied sich mit 37,9±32,2 ng/ml signifikant von jener, die in der vorliegenden Studie bei den beiden Elefantenarten ermittelt wurde, was auf die unterschiedliche Familienzugehörigkeit zurückzuführen ist. In einer früheren Studie fiel die Progesteron-Konzentration im Plasma von Ratten nach dem Wurf der Jungtiere signifikant von 114 ng/ml auf 10 ng/ml ab (Grota & Kristen 1967). Dies deckt sich in etwa mit den höchsten und niedrigsten Werten in der vorliegenden Studie mit 101,3 ng/ml während der Trächtigkeit und 4,5 ng/ml nach dem Wurf. Um das Artenspektrum zu erweitern, fanden auch Untersuchungen an Elenantilopen statt. Allerdings traten bei der Validierung der Methode zur Bestimmung der Hormonkonzentrationen sechsfach höhere Werte bei Adrenocorticotropin- Metaboliten gegenüber der konventionellen Abnahme und der Analyse im Kot der Tiere bei 78 % der Proben auf, die mittels Wanzen gewonnen wurden. Bei der Analyse des Progesterons in den Blutproben der Elenantilopen wurden aber gruppenspezifische Enzym-Immunoessays eingesetzt. Da bei Elefanten und Rattenproben Chemolumineszenz-Immunoassays erfolgten, stellt sich die Frage, ob Metabolite der Raubwanzen mit einer Komponente der Analysemethode dieser Studie kreuzreagiert hatten. Zukünftige Studien müssen zeigen, welchen Einfluss die Analysemethode auf die Ergebnisse hat. Komponenten aus dem Magen, dem Speichel oder der Hämolymphe scheinen zumindest bei den Elenantilopen bzw. auch teilweise bei den Elefanten kreuzreagiert zu haben.

Diskussion 103

4.6 Stresshormontiter Für die Analyse des Gesundheitszustandes eines Tieres werden standardmäßig Blutproben genommen und analysiert. Die Abnahme ist für die Tiere meist mit großem Stress verbunden und wird durch meist heftige Abwehrreaktionen erschwert. Schlimmstenfalls können sowohl das Tier als auch der Mensch zu Schaden kommen. Vor allem kleine Säuger, Vögel und Reptilien können sich bei Blutentnahmen schwer verletzen oder sogar sterben (Baer & McLean 1972). Stress beeinflusst das Wohlbefinden und die Gesundheit von Tieren (Stadler 2006) und äußert sich z. B. in einer Unterdrückung der Fortpflanzung oder einer Reduktion der Immunabwehr (Charmandari et al . 2005). Eine herkömmliche Blutentnahme ist für das entsprechende Individuum sehr stressreich und wirkt direkt auf die Stresshormonkonzentration (Young et al . 2004). Deshalb wird auch eine quantitative Bestimmung der Stresshormone über den Kot durchgeführt. Während die Stresshormonkonzentration im Blut den Stress zum Zeitpunkt der Beprobung widerspiegelt, stellen die Werte der Abbauprodukte der Stresshormone im Kot eine Langzeitbelastung dar (Touma et al. 2004; Young et al . 2004). Insbesondere bei Wildtieren, ist der Einsatz von blutsaugenden Insekten eine gute alternative Methodik zur Blutentnahme und bietet Vorteile für Mensch und Tier (von Helversen et al . 1986; Stadler et al . 2007; Jezyschek 2012). So können außerdem Auswirkungen von Stressfaktoren erfasst werden. Eine zusätzliche Blutproben- gewinnung parallel zur Kotbeprobung sollte Aufschluss über eine Korrelation von Stresshormonen im Blut und deren Metabolite im Kot bieten (von Helversen et al . 1986; Voigt 2003). Dadurch sollte ein Zusammenhang von akutem Stress, wie z. B. Rangkämpfen, und den daraus resultierenden Stresshormonen bzw. deren Abbauprodukten untersucht werden. Die ursprünglich geplanten Stresshormonanalysen aus dem Kot konnten aus Kostengründen oder erfolgloser Probenentnahme nicht angefertigt werden. Dies sollte in zukünftigen Studien umgesetzt werden, um so weitere Rückschlüsse auf das komplexe Zusammenspiel psychoneuroimmunologischer Faktoren auf die Parasitierung zu bekommen. Für die Analysen auf das Stresshormon Kortisol wurden im Rahmen der vorliegenden Studie die Raubwanzen eingesetzt. Problematisch war die Wanzenbeprobung an sehr mobilen Mäusen. Bei ihnen wurde nicht das Maximum an Proben gewonnen, wie man sie über eine Fixierung bekommen hätte. Aber zugunsten der minimal-Invasivität wurde darauf verzichtet. Bei sieben Laborratten wurde auf eine

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Fixierung der Tiere verzichtet, um die Ergebnisse durch die Entnahme nicht zu verfälschen. Während der dreiwöchigen Trächtigkeit der Ratten nahmen die Kortisolkonzentrationen nicht zu. Nur bei einer Abnahme von Blut aus der Schwanzvene zum Validieren der Ergebnisse waren die Kortisolwerte um das vier- bis siebenfache erhöht. Dies deckt sich mit früheren Studien zum Einfluss von Blutabnahmen auf die Stresshormonkonzentrationen (Maurer 2005; Voigt et al . 2013). Bei Stresshormonanalysen bei Flussseeschwalben unterschieden sich beide Entnahmemethoden nicht signifikant (Arnold et al . 2008). Da die Entnahme mit den Wanzen keinen Fangstress darstellt, eignet sie sich zur Erfassung der Basiswerte der Tiere, während bei der konventionellen Methode Proben rasch entnommen werden müssen, da die Werte drei bis vier Minuten nach Fang ansteigen. Dies ist ein weiterer Beweis für die Minimal-Invasivität der Raubwanzenmethodik. Die Prolaktin- und Kortikosteronanalysen wurden deswegen ohne Validierung der Methoden durchgeführt (Arnold et al . 2008; Riechert et al . 2014b).

4.7 Parasitierung und Auswirkungen verschiedener Faktoren Das Wohlbefinden von Tieren hat eine immens große Bedeutung für alle, die beruflich mit Tieren zu tun haben, und die Meidung von chronischem Stress ist eine der Voraussetzungen hierfür (Möstl & Palme 2002). Wohlbefinden ist allerdings schwer zu definieren, so dass noch kein genereller Konsens vorliegt (Wieblebnowski 2003). Eine wichtige Störung des Wohlbefindens stellt ein Parasitenbefall dar. „Parasiten sind Lebewesen, die andauernd oder vorübergehend auf oder in einem andersartigen Organismus, dem Wirt, leben und diesen schädigen, ihn aber höchstens zu einem späteren Zeitpunkt töten“ (Wülker & Schaub 2002). Unter natürlichen Bedingungen besteht zwischen Parasit und Wirt ein Gleichgewicht, wodurch die Parasiten ihre Wirte langfristig ausnutzen und permanent nur geringfügig schädigen (Kaltz & Shykoff 1998; Mehlhorn 2002b). Dieses gilt jedoch nur solange, wie der Wirt keine starke Beeinträchtigung erleidet. Beeinträchtigungen können vom Parasiten selbst ausgelöst werden, indem er z.B. eine Immunsuppression des Wirtes induziert. Andere Beeinträchtigungen, die ebenfalls zu Immunsuppressionen führen, sind z.B. weitere Erkrankungen, Mangelernährung oder auch Stress. In allen Fällen resultiert dies in einer starken Vermehrung des Parasiten. Eine höhere Parasitendichte wiederum ist oftmals direkt korreliert mit der Intensität der parasitogenen pathologischen Effekte (Mehlhorn 2002 a).

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Stresshormone, Glucokortikoide, wirken ummunsuppressiv (Peng et al . 1989; Ader et al . 1990). Stresshormontiter werden wiederum von psychoneuroimmunologischen Faktoren beeinflusst, wie dem Geschlecht, dem Alter der Tiere und dem sozialen Rang sowie der Aufzucht der Jungen bzw. dem Brüten. Stress wirkt bidirektional. Akuter Stress führt zu einer kurzfristig verbesserten Immunantwort, längerer Stress zum Gegenteil (Dhabar & McEwen 1997). Neben der Dauer ist auch die Art und Quantität des Stresses relevant. Die Immunsuppression steigt proportional zur Stressintensität (Dhabar & McEwen 1996, Dhabar et al . 1996, Dhabar 1998; Braude et al . 1999; Keller et al . 1981). Bei Schwächung des Immunsystems können Parasiten ihren Wirt überschwemmen, da sich das Gleichgewicht zwischen Wirt und Parasit zu Gunsten des Parasiten verschiebt (Mehlhorn & Piekarski 2002 a). Die Überschwemmung des Wirtes durch Parasiten wird v. a. durch eine ungeschlechtliche Vermehrungsphase ermöglicht, z. B. die Schizogonie bei Kokzidien (Mehlhorn & Piekarski 2002 a). Auswirkung des Geschlechts auf die Parasitenpathogenität bzw. -prävalenz variiert bei den einzelnen Arten. Bei einem Vergleich der beiden Geschlechter scheinen weibliche Tiere weniger empfindlich zu sein als männliche Tiere (Roberts et al . 1996). Hierbei wirken sich das unterschiedlich ausgeprägte Immunsystem und die Geschlechtshormone aus (Araneo et al . 1991; Roberts et al . 2001). Dieses Phänomen ist in mehreren Studien detailliert erfasst (Barnard et al . 1996; Lourenço et al . 1999; Schuster & Schaub 2001 a). Die Höhe der Testosteronkonzentration steht im direkten Zusammenhang mit dem Parasitenbefall. Je höher die Testosteronkonzentration, desto stärker ist auch ein Parasitenbefall (Morales-Montor et al . 2004). Auch die Prävalenz und Intensität einer Infektion mit „Protozoen“, Cestoden und Arthropoden sind beim Männchen durchwegs höher als beim Weibchen (Klein 2004). Männliche Mäuse sind anfälliger für eine Infektion mit dem Malariaerreger als Weibchen und weisen auch ein höheres Risiko auf, an der Infektion zu sterben (Zhang et al . 2000; Krücken 2005 a, 2005b; Cernetich et al . 2006). Auch beim Menschen treten Infektionen mit Leishmania donovani häufiger bei Männern als bei Frauen auf (Grevelink & Lerner 1996). Die Resistenz gegen eine Infektion mit Toxoplasma gondii ist bei weiblichen Mäusen höher als bei männlichen (Walker et al. 1997). Eine Infektion mit dem Bandwurm Echinococcus granulosus führt bei männlichen Mäusen nach 21 Tagen zu einer höheren Anzahl von Zysten (Frayha et al. 1971), und bei Infektionen mit anderen „Helminthen“ besitzen Männchen mehr „Helminthen“ als Weibchen (Poulin 1996). Bei Berggorillas

Diskussion 106

(Gorilla gorilla beringei ) lagen dagegen keine Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen bei der Anzahl der Parasiten vor (Sleeman et al. 2000). Umgekehrte Ergebnisse traten nach einer Infektion mit Schistosoma mansoni auf, die bei männlichen Mäusen zu weniger Würmern führten als bei Weibchen (Nakazawa et al . 1997). In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen bei insgesamt sieben verschiedenen Arten durchgeführt. Dabei fanden sich starke aber aufgrund der Stichprobengröße statistisch nicht signifikante Unterschiede des Vogelmalariabefalls zwischen männlichen und weiblichen Haushühnern. Bei 28,7% der männlichen und 15,4% der weiblichen Haushühner wurden Parasiten nachgewiesen, bei den Männchen also fast doppelt so oft wie bei den Weibchen. Bei Haussperlingen war der Unterschied noch größer. 33,3% aller männlichen und 14,3% aller weiblichen Haussperlinge hatten einen Malariaparasitenbefall. Allerdings war die Anzahl der untersuchten Tiere relativ gering. Auch bei den Sibirischen Steinböcken lag bis auf wenige Ausnahmen bei den Männchen immer ein höherer Parasitenbefall mit Kokzidien als bei den Weibchen vor. Bei den Erdmännchen trat in den Jahren 2005-2014 eine signifikante höhere Parasitierung in Abhängigkeit vom Geschlecht nicht immer auf. Während 2005 noch die Weibchen die signifikant höhere Befallsdichte aufwiesen, war diese 2011 und 2014 nicht mehr signifikant (aber mit dem Trend zu höheren Befallsprävalenzen bei den Weibchen). 2012 wiesen sogar die Männchen die höchste Parasitierung auf. Auch bei der Weißlippenhirschgruppe wiesen alle weiblichen Tiere eine höhere mittlere Parasitierung auf als das Männchen. Demgegenüber fanden sich bei den Diamanttäubchen im Kot der Männchen in den Jahren 2012-2013 (brütend und Einzelhaltung) signifikant weniger Kokzidien als im Kot der Weibchen. Hierbei lag also eine erhöhte Parasitierung beim weiblichen Geschlecht vor. Im Jahr 2014 zeigte das untersuchte Weibchen eine deutlich aber nicht signifikant höhere Parasitämie. Auch bei den Königspinguinen wiesen die Weibchen die höheren Befallsraten auf. Demnach waren bei drei untersuchten Tierarten (Haushühner, Haussperlinge und Steinböcke) die Männchen nicht signifikant höher parasitiert und bei vier anderen Arten (Erdmännchen, Weißlippenhirsche, Diamanttäubchen, Königspinguine) die Weibchen signifikant höher. Weitere Studien sollten angefertigt werden, um diesen spannenden Aspekt weiter zu beleuchten. Weitere immunsuppressive Auswirkungen der psychoneuroimmunologischen Faktoren, die zu einer stärkeren Parasitierung führen, hängen vom Alter ab. Bei Schafen

Diskussion 107 enthalten vier Monate alte Lämmer mehr Eier gastrointestinaler Nematoden im Kot als 28 Monate alte Tiere (Douch & Morum 1993). Auch bei Hunden und Katzen sind jüngere Tiere anfälliger für Endoparasiten (Gates & Nolan 2009). In der vorliegenden Arbeit zeigten die Jungtiere der Erdmännchen 2011 im Kot durchgehend mehr Isospora - Oocysten als die adulten Tiere. Diese Parasitierung nahm im darauf folgenden Jahr deutlich ab. Somit lag eine deutlich höhere Parasitierung der Jungtiere vor. Am deutlichsten (p<0,001) war der Unterschied bei dem Vergleich der Parasitierung in Abhängigkeit von Alter zwischen den Jungtieren und den adulten Weislippenhirschkühen. Die Parasitierungen unterschieden sich hier. Allerdings lag die Anzahl der Kokzidien im Kot der Jungtiere immer höchst signifikant (p<0,001) unter dem Befall der adulten Tiere. Die Rangordnung spiegelt sich oftmals in den Stresshormontitern wider . Bei gesunden Mäusen unterscheiden sich die Kortikosterontiter von dominanten und rangniederen Tieren nicht (Gourbal et al . 2002). Bei verschiedenen in sozialen Gruppen lebenden Arten differieren aber die Auswirkungen des sozialen Status auf die Hormontiter. Bei Afrikanischen Wildhunden ( Lycaon pictus ) und Wölfen treten bei ranghöheren Tieren immer höhere Konzentrationen an Glucokortikoiden auf als bei rangniederen Tieren (Sands & Creel 2004). Auch bei freilebenden Erdmännchen weisen dominante Männchen und Weibchen höhere Kortisol-Konzentrationen auf (Carlson et al . 2004). Umgekehrt verhält es sich hingegen bei den Nacktmullen ( Heterocephalus glaber ), bei denen sich bei rangniederen Tiere ein höherer Titer an Glucokortikoiden findet (Creel 2005). Bei Rhesusaffen ( Macaca mulatta ) besitzen ebenfalls dominante Tiere einen geringeren Titer (Sassenrath 1970). Bei einigen Tierarten wird die Parasitendichte z.T. vom sozialen Stress verstärkt. Der soziale Rang, bei dem augenscheinlich der meiste Stress vorliegt, sollte die meisten Krankheiten fördern (Sapolsky 2005). Die Wahrscheinlichkeit für Infektionen bei niedrigem sozialen Status sollte deutlich höher sein (Cohen et al . 1997). Bei Javaneraffen ( Macaca fascicularis ) korreliert der niedrige soziale Status mit einer erhöhten Anfälligkeit für Atemwegsinfektionen (Cohen et al . 1997). Die Immunabwehr auf eine Infektion mit Nematoden ist schwächer bei ranghöheren Labormäusen. Die verringerte Antwortfähigkeit auf die Infektion ist dabei mit einer erhöhten Kortikosteron-Konzentration im Blutserum verknüpft (Barnard et al . 1998). Diese Abhängigkeit vom sozialen Stress tritt u.a. auch bei Babesia microti- bzw. Trypanosoma

Diskussion 108 cruzi-infizierten Mäusen sowie bei Schistosoma -infizierten Goldhamster ( Mesocricetus auratus ) auf (Barnard et al. 1993; 1996 a; Rashed et al . 1996). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Abhängigkeit mehrfach für die Erdmännchen bestätigt, zum Beispiel bei den 2005 und 2012 untersuchten Erdmännchengruppen. Das rangniederste Tier zeigte in allen untersuchten Gruppen immer den höchsten Befall mit Kokzidien, während die ranghöchsten Tiere immer sehr niedrig oder gar nicht befallen waren. Es bestand eine klare Korrelation des Parasitenbefalls mit der Ranghöhe! Die Bedeutung des sozialen Stresses zeigte sich auch bei der Neuzusammensetzung der Erdmännchen-Gruppen. Auch bei den vier Hirschkühen der Weißlippenhirsche nahm die Parasitierung mit abnehmendem Rang zu. Zusammenfassend lässt sich hervorheben, dass die verschiedenen untersuchten Tiergruppen erste Einblicke in die Abhängigkeit des Parasitenbefalls vom Geschlecht und den Stress-Faktoren wir Rangordnung, Fortpflanzung oder Alter erlaubten. In sozialen Gruppen steigt der Stress in der Fortpflanzungszeit. Bei der Brunft von männlichen Rentieren ( Rangifer t. tarandus ) ist dann die Glucokortikoid- konzentration erhöht (Klein & Nelson 1999). Deswegen wurde versucht, bei den Weißlippenhirschen, deren Beprobung ausschließlich im Winter 2011/2012 stattfand, eine Korrelation mit dem Parasitenverlauf zu detektieren. Mit Ausnahme eines Weibchens, bei dem ein Anstieg der mittleren Parasitierung im Vergleich zum Vorjahr vorlag, schien die Parasitierung im Mittel bei allen Weißlippenhirschen von 2011 zu 2012 zurückgegangen zu sein. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Parasitierung beider Jahre lag bei keinem Tier vor, allerdings wäre eine höhere Stichprobenmenge erforderlich. Auswirkung der Aufzucht der Jungtiere auf die Parasitierung wurde bei diesen Hirschen bisher nicht erfasst. Bei Vögeln wirken sich ähnliche Faktoren, wie zum Beispiel Nestsuche , Brut und Jungenaufzucht aus (Poulin & Vickery 1993). Das Hormon Prolaktin wird während der Brut und Aufzucht vermehrt synthetisiert und stimuliert die Immunabwehr (Angelier & Chastel 2009). Der Befall mit Parasiten wird durch Brut und Aufzucht beeinflusst, wobei die Parasitämie dadurch gefördert wird. Ein Plasmodium -Befall steigert sich z.B. mit der Fütterungsrate der Jungtiere und der Brutgröße (Richner et al . 1995). Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen ergaben sich bei den Diamanttäubchen unterschiedliche Ergebnisse des Parasitierungsgrads der untersuchten Tiere im Zusammenhang mit der Brut. In allen Brutphasen gab es bei einem Pärchen bei dem Männchen eine leichte Erhöhung der Anzahl der ausgeschiedenen Oozysten.

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Demnach dürfte sein Immunsystem auf Grund von anhaltendem Stress während der Brut geschwächt sein und als Folge die Stärke des Parasitenbefalls zugenommen haben. Der Parasitenbefall des zugehörigen Weibchens stieg vor allem in besonderen Stresssituationen, z.B. beim Nestwechsel oder beim Legen eines Eis. Demgegenüber wurden bei einem anderen Pärchen geringere Parasitierungen während der Brut nachgewiesen. Nur beim Schlupf des Kükens trat ein Anstieg der Anzahl der Oozysten bei beiden Elterntieren auf, wobei dieser beim Männchen geringer war. Eventuell lag bei diesem Pärchen eine höhere reproduktive Fitness vor und wirkte dem negativen Einfluss der Stresshormone auf das Immunsystem entgegen. Bei dieser Interpretation war das eine Pärchen nicht so fit wie das andere Pärchen, allerdings nicht signifikant nachgewiesen aufgrund der geringen Stichprobenmenge. Zur gastrointestinalen Parasitierung von antarktischen Vögeln sind nur wenige Studien vorhanden (Vidal et al . 2012). Im Kot von freilebenden Pinguinen dreier Arten (Pygoscelis antarctica , P. papua, P. adeliae ) auf Livingston und King George Island in der Antarktis wurden Oocysten der Kokzidiengattungen Eimeria und Isospora entdeckt (Golemansky 2011). Parasitäre Infektionen hängen bei ihnen von vielen Faktoren ab, u.a. der Präsenz eines für den Parasiten kompatiblen Zwischenwirtes bzw. Vektors meist unterschiedliche Nagetierarten, dessen Nahrungspräferenzen und dem allgemeinen Nahrungsangebot sowie der Populationsdichte des Vektors (Jones & Shellam 1999). Bei Königspinguinen ist über Endoparasiten und deren Auswirkung in Verbindung mit Stress bisher nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch in den Proben der Königspinguine im Zoo Wuppertal Kokzidien gefunden. Eine genaue Artbestimmung war im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Beim Männchen des Brutpaares der Königspinguine stieg die Anzahl der Kokzidien im Jahresverlauf beinahe kontinuierlich an. Dieser Zeitraum lag in einer Phase einer erfolgreichen Aufzucht eines Kükens und spiegelte wohl den Einfluss der Brut auf die Parasitierung von Vögeln während der Brut wider. Die Intensitäten der Parasitierung bei dem an der Brut beteiligten Weibchen und dem zugehörigen Männchen waren über einen längeren Zeitraum im Vergleich zur Gruppe durchschnittlich deutlich höher. Dies ist wohl ebenfalls auf den erhöhten Stress durch die Aufzucht zurückzuführen. Dabei konnte nicht zwischen Pinguin-spezifischen Kokzidien oder Pinguinen als Fehlwirt unterschieden werden. Hierfür wären weiterführende PCR Analysen der Kokzidien notwendig und wären ein sicherlich spannendes Feld für zukünftige Untersuchungen.

Diskussion 110

In Freilandpopulationen fehlen Nachweise für einen Einfluss der Parasitierung auf die Gesundheit oder Populationsdynamik, aber bei Pinguinen in Menschenhand wirken sich parasitäre Infektionen negativ auf ihre Gesundheit aus (Jones & Shellam 1999, Barbosa & Palacios 2009). Die adrenokortikale Antwort von brütenden Pinguinen auf Aufzuchtstress beeinflusst u.a. Körpermasse und Gesundheitszustand (Hood et al . 1998). Erhöhter Stress kann zur Verringerung des Reproduktionserfolgs führen, z.B. sogar zum Verlassen der Brut (Boersma et al . 1990; Yorio & Boersma 1994). Dies lag in der vorliegenden Untersuchung wohl im November 2011 bei dem an der Brut beteiligten Weibchen vor. Ihre Fürsorge für das Jungtier reduzierte sich auffallend, wahrscheinlich aufgrund einer zusätzlichen Belastung durch eine Fuß-Entzündung. Das an der Brut beteiligte Männchen und zwei weitere Tiere übernahmen ihre Rolle bei der Aufzucht. Diese Entlastung spiegelte sich in auch in einem leichten Abfall des Befalls beim Weibchen wider. Danach erhöhte sich ihre Parasitierung allerdings wieder, obwohl die Betreuung des Jungtieres nicht wiederaufgenommen wurde. Der Verlauf der Parasitierung bei dem an der Brut beteiligten Weibchen mit dem deutlichen Anstieg kurz vor dem Tod deutet aber eher auf eine Beeinflussung der Parasitenanzahl durch den schlechten Gesundheitszustand hin als auf einen Einfluss durch die Parasiten. Unterschiede in der Stärke des Parasitenbefalls wurden bisher auf das Geschlecht, das Alter, den Rang und die Aufzucht zurückgeführt. Aber auch weitere Stressfaktoren sind möglich. Bei der Erdmännchengruppe variierte 2005 die Befallsintensität im zeitlichen Verlauf bei einzelnen IndividuenBei den 2011 und 2012 untersuchten Erdmännchen führten sehr hohe Schwankungen der Parasitierung der einzelnen Tiere zu sehr hohen Standardabweichungen. Mehr oder minder starke Schwankungen der individuellen Parasitierung im Laufe des Beprobungszeitraums traten bei allen Erdmännchen auf und wurden wohl durch Umsetzungen innerhalb der Gruppen oder durch Kämpfe verursacht. Bei Betrachtung aller psychoneuroimmunologischer Faktoren und der Parasitenprävalenz ist nicht die Prävalenzrate in Populationen entscheidend, sondern die Intensität der Parasitierung als Indikator der Pathogenität. Sehr häufig finden sich gleiche oder ähnliche Infektionsraten bei Männchen oder Weibchen einer Population, z.B. bei Primaten (Sleeman et al., 2000; Lisboa et al. , 2000). Bei andauerndem Stress und einem dadurch geschwächten Immunsystem ist die Wahrscheinlichkeit der kontinuierlichen Vermehrung eines Parasiten hoch (Mehlhorn 2002).

Diskussion 111

4.8 Ausblick Die Etablierung der Methode der Raubwanzen als „lebende Spritzen“ in der täglichen Arbeit der Zooveterinäre als alternative Methode zur konventionellen Blutentnahme ist erfolgreich. Dies zeigen die verschiedenen positiven Erfahrungen der letzten Jahre und die vorliegende Arbeit. Der immense Vorteil der „lebenden Spritzen“ ist, dass die Methodik sehr gut nutzbar und umsetzbar ist, da sie minimal-invasiv für den wertvollen Tierbestand ist. Nun könnte die Methode noch bei der Erstellung von generellen Blutbildern bei bisher nicht erfassten Arten helfen, z.B. bei Sandgräbern (Bathyergidae). Die DNA-Unterartbestimmung dürfte bei entsprechender Finanzierung für die Zoos von immer größerer Bedeutung werden. Die bereits existierenden Zuchtprogramme könnten so weiter optimiert werden. Auch die Untersuchung von Verwandtschaftsgraden wäre mit Hilfe der „lebenden Spritzen“ weiter voran zu treiben. Bei der Diagnostik auf Tierseuchen sollte eine Stichprobenerhöhung einhergehend mit dem Testen von mehr positiven Tieren erfolgen. Dies ist glücklicherweise in der Vergangenheit aufgrund der Seltenheit der Erkrankungen in Zoologischen Gärten noch nicht möglich gewesen. Die endokrinologischen Untersuchungen sind aufgrund der widersprüchlichen Ergebnisse bei den Trächtigkeitsbestimmungen wahrscheinlich noch der schwierigste Teil für zukünftige Untersuchungen. Die dringend benötigten Stresshormonanalysen bei den Studien zum Einfluss der psychoneuroiummunologischen Faktoren auf die Parasitenprävalenz werden sicherlich abschließende Einblicke liefern. Hierbei sollte in zukünftigen Untersuchungen z.B. bei den Erdmännchen durch Einbeziehung verschiedener Zoologischer Gärten auch die Auswirkungen der Haltungsdichte verglichen werden. Das „crowding“ bei Tiergruppen ist ein noch größtenteils unerforschtes Feld. Bei Hirschgruppen sollte zudem eine größere Gruppe mit mehreren adulten Hirschen einbezogen werden. Auch eine weitere Untersuchung zur Parasitierung bei den Diamanttäubchen sollte erfolgen, da die Ergebnisse widersprüchlich waren. Aspekte wir die individuelle Fitness oder der Einfluss der Brut sollten dabei im Mittelpunkt stehen. Des Weiteren ließen sich bei ihnen Anstiege in der Parasitierung aufgrund stressreicher Ereignisse gut nachvollziehen.

Zusammenfassung/ Summary 112

5 Zusammenfassung/ Summary 5.1 Zusammenfassung Triatominen bieten eine gute Alternative zur konventionellen Blutab- nahmemethode. Dabei überwiegt vor allem der Vorteil der minimalen Invasivität für den Wirt. Ein etwaiges Fixieren der Tiere oder sogar eine Anästhesie können entfallen. Wenn die Entnahmemethode mit den Raubwanzen den entsprechenden Wirtsarten wie Reptilien, Vögeln oder Säugetieren angepasst wurde, führten die „lebenden Spritzen“ in der vorliegenden Arbeit zum Erfolg. In insgesamt zwölf europäischen Ländern wurde in 47 Institutionen bei 72 verschiedenen Arten erfolgreich Blut abgenommen. Dazu gehörten neben vier Reptilien- auch drei Vogelarten und 65 Arten von Säugetieren. Eingesetzt wurde ausschließlich die Triatomine Dipalogaster maxima als „lebende Spritze“, da diese Art die höchste Aggressivität zeigte und die größte Blutmenge aufnahm. Bei der methodischen Anwendung im Zooalltag, um über gewonnene Blutproben die klassische Hämatologie zu untersuchen, erwiesen sich die Raubwanzen als sehr gut einsetzbar. Dabei war der Kaliumwert ein guter Richtwert, um die ggf. einsetzende Hämolyse der Probe beurteilen zu können. Auch der erstmalig nachgewiesene Glukoseabbau innerhalb des Wanzenmagens betont die Notwendigkeit des raschen Arbeitens. Bei der genetischen Unterartbestimmung der Erdferkel fand sich zwar kein genetisches Muster, aber es bestätigte sich die Hypothese, dass die „lebenden Spritzen“ gut zur Probengewinnung eingesetzt werden können. Die Analyse auf verschiedene Tierseuchen – Brucellose, Tuberkulose, Malaria und Blauzungen- krankheit – war erfolgreich und lieferte keine falschpositiven oder falschnegativen Nachweise. Die Stresshormon-Untersuchungen bestätigten die Vorteile der minimal invasiven Blutentnahme über Raubwanzen. Bei Ratten und Elenantilopen ist die Blutentnahme mittels Raubwanzen empfehlenswert, da sie relativ stressfrei ist. Problematischer waren bei den endokrinologischen Analysen die Progesteronanalysen, bei denen zwar die Konzentrationen erfolgreich bestimmt wurden, aber die Genauigkeit des Testverfahrens verstärkt mit konventionell entnommenen Blut verglichen werden muss, da bei Elenantilopen in 78% der mit Raubwanzen gewonnenen Proben eine sechsfach höhere Konzentration vorlag. Parasit-Wirt-Systeme werden von verschiedenen psychoneuroimmunologischen Faktoren beeinflusst. Diese Faktoren können das Gleichgewicht zu Gunsten oder Ungunsten des Wirtes bzw. Parasiten verschieben. Solche Faktoren sind vor allem Zusammenfassung/ Summary 113

Geschlecht, Alter, Rangordnung und Fortpflanzung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Auswirkungen der entsprechenden Faktoren auf die Parasitierungen mit intestinalen Protozoen bei Haushühnern, Haussperlingen, Diamanttäubchen, Königspinguinen, Sibirischen Steinböcken, Erdmännchen und Weißlippenhirschen untersucht. Bei drei Tierarten (Haushühner, Haussperling und Sibirischer Steinbock) besaßen die Männchen wohl die höheren Parasitämien und bei den vier anderen Arten die Weibchen. Allerdings sind statistisch signifikante Aussagen erst nach weiteren Studien möglich. Ein Einfluss des Alters auf das Immunsystem lag bei den Erdmännchen vor, bei denen die Jungtiere deutlich stärker parasitiert war als die Adulten. Bei den Weißlippenhirschen waren es aber die jüngeren Tiere, die einen geringeren Befall mit intestinalen Protozoen aufwiesen als die Adulten. Die Rangordnung als psychoneuroimmunologischer Faktor spiegelte sich besonders gut bei den Erdmännchen wider, bei denen eine zunehmende Parasitierung intestinaler Protozoen der Tiere negativ mit der Ranghöhe korrelierte, meist sogar signifikant. Ein ähnlicher Trend war ebenfalls bei den adulten Weißlippenhirschkühen zu beobachten. Ebenso wie bei den Erdmännchen nahm die Parasitierung mit abnehmendem Rang zu. Den Einfluss der Fortpflanzung belegten die Untersuchungen der Vögel. Die Diamanttäubchen besaßen in der Brutzeit eine stärkere Parasitierung als außerhalb dieser Phase und als nicht brütende Tiere. Im Kot des Brutpaares der Königspinguine wurde im Vergleich zu den Individuen ohne Nachwuchs eine stark erhöhte Anzahl von Kokzidien gefunden. Die erhöhte Anzahl der Parasiten in den Elterntieren korrelierte mit dem erhöhten Stress durch die Aufzucht. Über den Einsatz der Raubwanzen beim Nachweis des Einflusses psychoneuroimmunologischer Faktoren sollte in Zukunft das Stresshormon erfasst werden. Zusammenfassung/ Summary 114

5.2 Summary Triatomines can be used as an alternative means for obtaining blood samples from vertebrates instead of the conventional method via syringe and needle. As greatest advantage preponderates the minimal invasiveness for the host. Capture or anaesthesia are not applicable. If the method with blood-sucking bugs was modified to the different host species like reptiles, birds or mammals, the „living syringes“ were successfully used in twelve European countries and 47 institutions and 72 different species. These were in total four different reptile, three bird and 65 mammal species. Exclusively the triatomine Dipetalogaster maxima was used in the present study because of the highest aggression and biggest blood volume which could be obtained. The concentration of potassium was useful as approximate value for the beginning of the hemolysis. The present study verified the reduction of glucose in the stomach of the blood-sucking bugs was verified for the first time. The genetic subspecies determination of aardvarks did not result in a clear classification, but the hypothesis that blood sucking bugs can be used for the blood sample collection was confirmed. Also the screening for epizootic diseases like brucellosis, tuberculosis, malaria and blue-tongue disease were successful. All results were identical in both collection methods. No false-positive and false- negative results were found. The stress hormone analysis proved again the advantage of the minimal invasive method via blood-sucking bugs. More problems occurred at the endocrinological analysis for Progesterone. Progesterone levels were 6 fold higher in 78% of the samples of Eland antilopes in comparison to the conventional method. Although progesterone concentrations could be detected in the samples, the accuracy of the method should be examined if this method is only suitable for the specific methodology in the measurement of progesterone concentrations; for house rats this method can be recommended. Parasite-host-systems are affected by different psychoneuroimmunological factors. These factors can affect the balance to the advantage or disadvantage of the host or the parasite. Such factors are the gender, age, social rank and reproduction. In the present study the impact of the appropiate factors of intestinal parasites on suricates, white-lipped deer, Siberian ibex, king penguins, chicken, house sparrow and diamond doves were examined. In three species (chicken, house sparrow and Siberian ibex) the males had the higher parasitemia and respectively the females of the four other species. Not all results were significantly different and further studies Zusammenfassung/ Summary 115 are planned. An influence of the age on the immune system was also verified, e.g. the offspring of suricates possessed the highest parasite burden. Also the younger white-lipped deers had the higher numbers of parasites. The social hierarchy as psychoneuroimmunological factor was well presented in the study at the suricates with an increasing parasitaemia with decreasing rank in the hierarchy. Highest parasitaemia were found (in most cases highly significant) in the subordinate individuals. Similar results were detected in the white-lipped deers. The influence of the reproduction could be detected in the examined bird species. The breeding diamond doves for example had a higher parasitamia in comparison to the non breeding birds. The breeding pair of king penguins had a higher parasite burden in comparison to the other individuals. The higher parasite amount of the breeding birds correlated to the observed increased stress in that case. Also in future studies the use of the blood-sucking bugs for determinations of stress hormone levels will hopefully deliver much more insights for the interesting aspects of the influence of psychoneuroimmunological factors on the host-vector interactions of parasites. Literaturverzeichnis 116

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7. Anhang

Tab. A6.1 Chemikalien, Lösungsmittel, Geräte und weitere Materialien 12 bzw. 21G-Einmalkanüle Henry Schein, Hamburg Analysenwaage P1200 Mettler, Gießen Blutzuckermessgerät Accu check Roche, Basel, Schweiz BTV Antikörper ELISA Labordiagnostik, Leipzig Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig Diff-Quick Medion Diagnostics, Düddingen, Schweiz DNA Sanger Mastermix Life Technologies, Darmstadt DNeasy ® Blood & Tissue Kit Qiagen, Hilden ECLIA Testlösungen Roche, Basel, Schweiz EDTA-Röhrchen Sarstedt, Kleinstadt Einmal-Injektionskanüle Henry Schein, Hamburg Einmalspritzen, 1ml Henry Schein, Hamburg ElephantTB STAT-PAK Chembio, Medford, USA Entellan Merck, Darmstadt Enzymimmunoassay Univ. Vet. Med., Dept. of Natural Sciences (11-oxoetiocholanolon) Biochemistry, Wien, Österreich Eppendorfgefäß, 2ml Eppendorf, Hamburg Erlenmeyerkolben, 1 Liter Simax, Selb Ethanol, 70% (v/v) J.T. Baker, Center Valley, USA Federstahlpinzette Windaus, Clausthal-Zellerfeld Fimo Staedler, Nürnberg Fotomikroskop mit Kamera Olympus BX 40 mit Altra 20 Tokio, Japan Gefrierbeutel, 3l Alio, Stuttgart Handzählgerät Handy Telly Upgreen Counters Taiwan, Taiwan Heizplatte Medax 15800 Medax Nagel, Kiel Hosenbundgummiband Gründl, Ingolstadt Infrarot-Thermometer TFA Dostmann, Wertheim ScanTemp 485 Kunsteier Raiffeisen, Telgte Latexmembran C/144 Microtec, Sao Paulo, Brasilien Lithium-Heparinröhrchen Henry Schein, Hamburg Mikroskop SM-LUX Carl Zeiss, Jena Anhang 148

Multivette 600 Z Sarstedt, Kleinstadt Methanol 60 % Applied Biosystems, Darmstadt Mikrotiterplatte ELISA-READER Molecular Devices, Downington, USA Mörser und Pistill Haldenwagner, Waldkraiburg Natriumchlorid J.T. Baker, Center Valley, USA Natriumhydrogencarbonat J.T. Baker, Center Valley, USA Neubauer-Zählkammer Henry Schein, Hamburg Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig Pasteurpipette Brand, Wertheim PCR Kit Roche, Basel, Schweiz Präparatebecher, 100ml Henry Schein, Hamburg Reinstwasser SG-Reinstwassersystem, Barsbüttel Rollrandgläser Carl Roth, Karlsruhe Stereomikroskop SM-LUX Leitz, Stuttgart Streptavidin-Meerrettich- Boehringer, Mannheim Peroxidasekonjugat (4.2 mU) Sulfatsäure (2 M) Sigma, Deisenhofen Tetramethylbenzin Sigma, Deisenhofen Trichter VIT-LAB, Grossostheim Tween 20 Lösung Roche Diagnostics, Grenzach Vetscan VS2 Abaxis, Griesheim VetScan I-STAT 1 Abaxis , Griesheim Zentrifuge Universal 30 RF Hettich, Tuttlingen Zentrifugenröhrchen, 50 ml Omnilab, Bremen Zinkchlorid J.T. Baker, Center Valley, USA

Anhang 149

Tab. A6.2: Übersicht aller erfolgreich beprobten Arten (systematisch sortiert) Deutscher Name Wissenschaftlicher Name Einsatzort Griechische Landschildkröten Testudo hermanni (2 spp) Reptilien Auffangstation Schöne Bambusotter Cryptelytrops venustus Reptilien Auffangstation Königspython Python regius Reptilien Auffangstation Geyrs Dornschwanzagame Uromastyx geyri Reptilien Auffangstation Haushuhn Gallus gallus dom. Zoo Wuppertal, privater Stall Wülfrath Brillenpinguin Spheniscus demersus Zoo Wuppertal Diamanttäubchen Geopelia cuneata Zoo Wuppertal Bennetts-Känguru Macropus rufogriseus Faunia, Zoo Wuppertal Bonobo Pan paniscus Zoo Wuppertal Westl. Flachlandgorilla Gorilla gorilla Zoo Wuppertal Brillenlangur Presbytis obscura Zoo Wuppertal Schwarzer Klammeraffe Ateles fusciceps robustus Zoo Wuppertal Mandrill Mandrillus sphinx Chester Zoo Goldkopflöwenäffchen Leontopithecus chrysomelas Zoo Wuppertal Rothandtamarin Saguinus midas Magdeburger Zoo Hausratten Rattus rattus Ruhr –Universität Bochum Sambischer Kleingraumull Cryptomys ansellii Zoo Wuppertal Kleiner Igeltenrek Echinops telfairi Zoo Frankfurt Kurzohr-Rüsselspringer Macroscelides proboscideus Zoo Wuppertal Greifstachler Coendou prehensilis Zoo Frankfurt Erdferkel Orycteropus afer Faunia, Zoo Frankfurt, Zoo Saarbrücken Capybara Hydrochoerus hydrochaeris Zoo Riga Großer Ameisenbär Myrmecophaga tridactyla Zoo Dortmund Braunborsten-Gürteltier Chaetophractus villosus Zoo Frankfurt Kanadischer Wolf Canis lupus ssp. Zoo Wuppertal Erdmännchen Suricata suricatta Zoo Wuppertal Erdwolf Proteles cristatus Twycross Zoo Schabrackenhyäne Hyaena brunnea Amersfoort Schwarzfußkatze Felis nigripes Zoo Wuppertal Sandkatze Felis margarita Zoo Wuppertal Salzkatze Oncifelis geoffroyi Zoo Wuppertal Nebelparder Neofelis nebulosa Zoo Wuppertal Gepard Acinonyx jubatus Reepark, Whipsnade Zoo Schwarzer Panther Panthera pardus Zoo Wuppertal Asiatischer Löwe Panthera leo persicus Twycross Zoo Seehund Phoca vitulina Le Pal, Nürnberg Anhang 150

Deutscher Name Wissenschaftlicher Name Einsatzort Mähnenrobbe Otaria flavescens Emmen Zoo, Heidelberg, Hellabrunn, Le Pal, Marineland, Mulhouse Kalifornischer Seelöwe Zalophus californianus Bioparc Valencia, Faunia, Zoo Wuppertal Südafrikanischer Seebär Arctocephalus pusillus African Safari, Marineland Afrikanischer Elefant Loxodonta africana Zoo Wuppertal, Seren- getipark Hodenhagen Asiatischer Elefant Elephas maximus Dublin Zoo, Port Lympne Tiergarten Nürnberg, Twycross Zoo, Whipsnade, Zoo Leipzig Südlicher Tamandua Tamandua tetradactyla Faunia, Zoo Frankfurt Baird´s Tapir Tapirus bairdii Zoo Wuppertal Schabrackentapir Tapirus indicus Artis, Chester Zoo, Dortmund Zoo, Edinburgh Zoo, London Zoo, Heidelberg Zoo, Tiergarten Nürnberg, Twycross Zoo Flachlandtapir Tapirus terrestris Dublin Zoo, Hagenbeck Tierpark, Riga Zoo, Tiergarten Schönbrunn, Twycross Zoo, Zoo Duisburg Breitmaulnashorn Ceratotherium simum Salzburg Zoo, Whipsnade Zoo Spitzmaulnashorn Diceros bicornis Chester Zoo, Zoo Krefeld, Panzernashorn Rhinoceros unicornis Basel Zoo, Edinburgh Zoo, Tiergarten Nürnberg Afrikanischer Zwergesel Equus asinus, dom. Zoo Wuppertal Hauspferd Equus ferus caballus Privater Stall, Hagen Böhmzebra Equus quagga boehmi Zoo Dortmund, Zoo Wuppertal Somali Wildesel Equus africanus somalicus Basel Zoo, Zoo Zürich, Halsbandpekari Tayassu tajacu Zoo Wuppertal Hirscheber Babyrousa babyrussa Whipsnade Zoo, Zoo Wuppertal Anhang 151

Deutscher Name Wissenschaftlicher Name Einsatzort Pinselohrschwein Potamochoerus porcus Allwetterzoo Münster, Tierpark Hellabrunn, Zoo Wuppertal Milu Elaphurus davidianus Zoo Wuppertal Weißlippenhirsch Cervus albirostris Zoo Wuppertal Elch Alces alces Zoom Erlebniswelt Schwarzkopfschaf Ovis aries dom. Privater Stall, Wuppertal Sibirischer Steinbock Capra ibex sibirica Zoo Wuppertal Mishmi-Takin Budorcas taxicolor Zoo Wuppertal Okapi Okapia johnstoni London Zoo, Zoo Wuppertal Steppengiraffe Giraffa camelopardalis (3 spp + Ammersfoort, Colchester Hybriden) Zoo, Kölner Zoo, Magdeburger Zoo, Serengetipark Hodenhagen, Tierpark Hellabrunn, Tiergarten Schönbrunn, Whipsnade Zoo, Zoom Erlebniswelt, Zoo Dortmund Elenantilopen Taurotragus oryx Hannover Zoo, Lány Zoo Wuppertal Bongo Taurotragus euryceros Zoo Duisburg Zoo Wuppertal Gelbrückenducker Cephalophus silvicultor Zoo Wuppertal Hausrind Bos taurus, dom. Opel Zoo Zwergzebu Bos taurus, dom. Twycross Zoo Banteng Bos javanicus Riga Zoo Trampeltier Camelus bactrianus Riga Zoo Dromedar Camelus dromedarius Zoo Wuppertal Flußpferd Hippopotamus amphibius Whipsnade Zoo, Zoom Erlebniswelt Afrikanische Zwergziege Capra hircus, dom. Zoo Wuppertal

Anhang 152

Tab. A6.3: Übersicht aller Erdferkelproben (verändert nach Schepsky 2012 ) Material Probe Museum/Zoo Skelett/Haut 76,77,78,88 Zoologische Staatsammlung München Nabelschnur/Frischgewebe 3,9,4 Senckenbergmuseum Frankfurt Gewebe 5 Senckenbergmuseum Frankfurt Haut 19 Senckenbergmuseum Frankfurt Haut 79 Senckenbergmuseum Frankfurt Haut 20 Senckenbergmuseum Frankfurt Haut 6,11 Senckenbergmuseum Frankfurt Gewebe 21 Senckenbergmuseum Frankfurt Ligamente 7,12,14,22 Museum für Naturkunde Berlin Ligamente 8,13,15,23 Museum für Naturkunde Berlin Ligamente 16,24 Museum für Naturkunde Berlin Ligamente 17,25 Museum für Naturkunde Berlin Ligamente 18,26 Museum für Naturkunde Berlin Haut/Ligamente/Skelett 33 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 38 Royal Museum for Central Africa Tervuren Ligamente 40 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 45,85 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut/Ligamente/Skelett 30,52,28,89 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 31,53,84 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 32,48 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut/Skelett 34,51,91 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut/Ligamente 36,49,29 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 39,86 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 41 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 35,83 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut/Skelett 42,90 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 43,80 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 44,87 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 37,46,82 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haut 47,81 Royal Museum for Central Africa Tervuren Haar/Blut/Speichel 54,64,103 Burgers Zoo Arnheim Haar/Blut/Speichel 55,65,102 Burgers Zoo Arnheim Haar/Blut/Speichel 56,66,100 Burgers Zoo Arnheim Haar/Blut/Speichel 57,67,99 Burgers Zoo Arnheim Haar/Blut/Speichel 58,68,101 Burgers Zoo Arnheim Haar/Blut/Speichel 59,69,104 Zoo Praha Haar/Blut/Speichel 60,70,106 Zoo Praha Haar/Blut/Speichel 61,71,105 Zoo Praha Anhang 153

Haar/Blut/Speichel 62,72,97 Zoo Saarbrücken Haar/Blut/Speichel 63,73,98 Zoo Saarbrücken Haar/Blut/Speichel 74,108 Zoo Frankfurt Haar/Blut/Speichel 75,107 Zoo Frankfurt Haar/Blut/Speichel 141 Zoo Frankfurt Frischgewebe 5,6 Senckenbergmuseum Frankfurt Knochenpulver 93 Naturhistorika Riksmuseet Stockholm Knochenpulver 94 Naturhistorika Riksmuseet Stockholm Knochenpulver 95 Naturhistorika Riksmuseet Stockholm Knochenpulver 96 Naturhistorika Riksmuseet Stockholm Haut 109-140 Museum für Naturkunde Berlin

Anhang 154

Tab. A6.4 Alignment (aus Schepsky 2012) #Y18475 CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #5_O_af_NA CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #139_O_af_NA ?????????????????????????????????????????????????? #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA ????????????????????????????????????????GTGACACACG #74_O_af_ZNA ???????????????TAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #72_O_af_ZNA ??????TAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #71_O_af_ZNA ??????TAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #58_O_af_ZNA ??????TAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #59_O_af_ZNA CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #70_O_af_ZNA CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #64_O_af_ZNA CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #65_O_af_ZNA ???????????????TAGTATTAGAGGCAC?GCCTGCCCAGTGACACACG #66_O_af_ZNA CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #67_O_af_ZNA CACCT-TAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #75_O_af_ZTZ ????????????????????????AGGCACTG?CTGCCCAGTGACACACG #141_O_af_ZTZ ?????????CATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #117_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #7_O_af_SU CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #23_O_af_SU ??????TAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #94_O_af_AE ?????????????????????????????????????????????????? #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU ???????????????????????????????????????AGTGACACACG #31_O_af_CO ????????????????AGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #30_O_af_CO ????????????????????????????????????CCCAGTGACACACG #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO ?????????????????????????????????????????TGACACACG #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO ?????????????ACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #81_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO CACCTCTAGCATGACTAGTATTAGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACACACG #90_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #95_O_af_KE ?????????????????????????????????????????????????? #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #126_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 CACCTCCAGCATAACTAGTATTGGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACAACCG #H_s_JX306646 CACCTCTAGCATCACCAGTATTAGAGGCACCGCCTGCCCAGTGACACATG #Y18475 TT AAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #5_O_af_NA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #139_O_af_NA ?????????????????????????????????????????????????? #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #74_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #72_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #71_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #58_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #59_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT Anhang 155

#70_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #64_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #65_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #66_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #67_O_af_ZNA TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #75_O_af_ZTZ TTA?ACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #141_O_af_ZTZ TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #117_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #7_O_af_SU TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #23_O_af_SU TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #94_O_af_AE ?????????????????????????????????????????????????? #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #31_O_af_CO TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #30_O_af_CO TTA?ACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO TTAAACG?CCGCG?TACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #81_O_af_CO ?TAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO TTAAACGGCCGCGGTACTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTT #90_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #95_O_af_KE ?????????????????????????????????????????????????? #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #126_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 TTAAACGGCCGCGGTATCCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTT #H_s_JX306646 TTTAACGGCCGCGGTACCCTAACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTT #Y18475 CTCT AAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #5_O_af_NA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #139_O_af_NA ?????????????????????????????????????????????????? #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #74_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #72_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #71_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #58_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #59_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #70_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #64_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #65_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #66_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #67_O_af_ZNA CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #75_O_af_ZTZ CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #141_O_af_ZTZ CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #117_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT Anhang 156

#7_O_af_SU CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #23_O_af_SU CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #94_O_af_AE ?????????????????????????????????????????????????? #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #31_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCC??????GAATTCAACTGTCTCT #30_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #81_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO CTCTAAATAAGGACTTGCATGAATGGCCACACGAGAATTCAACTGTCTCT #90_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #95_O_af_KE ?????????????????????????????????????????????????? #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #126_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 CTCTAAATAGGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGTTTTACTGTCTCT #H_s_JX306646 CCTTAAATAGGGACCTGTATGAATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCT #Y18475 TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #5_O_af_NA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #139_O_af_NA ?????????????????????????????????????????????????? #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGG???GCAA? #74_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #72_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #71_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #58_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #59_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #70_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #64_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGTAAC #65_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #66_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #67_O_af_ZNA TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #75_O_af_ZTZ TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #141_O_af_ZTZ TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #117_O_af_TZ ??????????????????????????????????????????TATGCAAC #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGTAAC #7_O_af_SU TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATG?AAC #23_O_af_SU TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #94_O_af_AE ??????????????????????????????????????????TATGCAAC #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #31_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #30_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? Anhang 157

#36_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAAT??????????????????????????????? #81_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #83_O_af_CO ??????????????????????????CCCGTGAAGAGGCGGGTATGCAAC #51_O_af_CO TGCTTTTTATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGTAAC #90_O_af_CO ??????????????????????????????????????????TATGCAAC #95_O_af_KE ?????????????????????????????????????????????????? #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #126_O_af_XX ??????????????????????????????????????????TATGCAAC #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 TACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATATATT #H_s_JX306646 TACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATAACAC #Y18475 TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #5_O_af_NA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #139_O_af_NA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA ??TAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #74_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #72_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #71_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #58_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #59_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #70_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #64_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #65_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #66_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #67_O_af_ZNA TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #75_O_af_ZTZ TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAATAACTC #141_O_af_ZTZ TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #117_O_af_TZ TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #7_O_af_SU TAT????????????????????????????TTAATTAATTCAACAACTC #23_O_af_SU TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTT?AATTA?TTAATTCAACAACTC #94_O_af_AE TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #31_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATGGA?????????????????????????? #30_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATG???????????????????????????? #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #81_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCT??????????????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #90_O_af_CO TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAACAACTC #95_O_af_KE ?????????????????????????????????????AATTCAACAACTC #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? Anhang 158

#126_O_af_XX TATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAATTAATTAATTCAATAACTC #130_O_af_XX ??????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 ATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTACTTAGCCCAAAAGAAA #H_s_JX306646 AGCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTTATTAATGCAAACAGTA #Y18475 AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #5_O_af_NA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #139_O_af_NA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #19_O_af_SA ????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #74_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #72_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #71_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #58_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #59_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #70_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #64_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #65_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #66_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #67_O_af_ZNA AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #75_O_af_ZTZ AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #141_O_af_ZTZ AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #117_O_af_TZ AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ AAATT??TAAGTG?TAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #7_O_af_SU AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #23_O_af_SU AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE AAATTACTAAGTGCTA?TAGCACGTATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #94_O_af_AE AAATTACTAAGTGCTAATAGCACGTATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #31_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #30_O_af_CO AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #81_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #90_O_af_CO AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #95_O_af_KE AAATTACTAAGTGCTAATAGCACGTATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #126_O_af_XX AAATTACTAAGTGCTAATAGCATATATCTCTAGTTTCATGAATTAACAAT #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 CAAATTTCA-TTGCTAAGGAAACAACAACACTCTTT-ATGGGCTAACAGC #H_s_JX306646 ----CCTAACAAACCCACAGGTCCTAAACTACCAAACCTGCATTAAAAAT #Y18475 TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #5_O_af_NA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #139_O_af_NA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #19_O_af_SA ?????????????????????????????????????????????????? #21_O_af_SA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #74_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #72_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #71_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG Anhang 159

#58_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #59_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #70_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #64_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #65_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #66_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #67_O_af_ZNA TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #75_O_af_ZTZ TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #141_O_af_ZTZ TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #117_O_af_TZ TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #128_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #138_O_af_TZ TTAGGTTGGGGTGAC?TCGG??CATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #7_O_af_SU TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #23_O_af_SU TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #93_O_af_SU ?????????????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #94_O_af_AE TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #31_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #30_O_af_CO TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #45_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #43_O_af_CO TT?GGTTGGGGTGACCTCGGAGCA?AAAAAACCCTCCGAATGAT?????? #32_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #36_O_af_CO TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #44_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #46_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #81_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #90_O_af_CO TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #95_O_af_KE TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #121_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????????????????????????????? #125_O_af_SWA ?????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX TTAGGTTGGGGTGAC???GGAG??TA??AAACCCTCCGAATGATATTATG #126_O_af_XX TTAGGTTGGGGTGACCTCGGAGCATAAAAAACCCTCCGAATGATATTATG #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 TTTGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAAGAAATCCTCCGAGCGATTTTAAA #H_s_JX306646 TTCGGTTGGGGCGACCTCGGAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAGTA-CATG #Y18475 TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #5_O_af_NA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #139_O_af_NA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #19_O_af_SA ?????????????????????????--???-?????????????????????? #21_O_af_SA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #74_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #72_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #71_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #58_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #59_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #70_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #64_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #65_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #66_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #67_O_af_ZNA TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #75_O_af_ZTZ TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #141_O_af_ZTZ TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #117_O_af_TZ TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #128_O_af_TZ ?????????????????????????--???-?????????????????????? #138_O_af_TZ TT?????TC??CCAGTCTAAA?TTC--TAC-ATCACCAATTGATCC??????? Anhang 160

#140_O_af_TZ ????????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #7_O_af_SU TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #23_O_af_SU TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #93_O_af_SU ?????????????????????????--???-?????????????????????? #16_O_af_AE TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #94_O_af_AE TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #40_O_af_RU ?????????????????????????--???-?????????????????????? #50_O_af_RU TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #31_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #30_O_af_CO TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #45_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #43_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #32_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #36_O_af_CO TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #44_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #46_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #81_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????--???-?????????????????????? #51_O_af_CO TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #90_O_af_CO TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #95_O_af_KE TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #121_O_af_OA ?????????????????????????--???-?????????????????????? #127_O_af_OA ?????????????????????????--???-?????????????????????? #125_O_af_SWA ????????????????????????????????????????????????????? #109_O_af_XX ?????????????????????????--???-?????????????????????? #126_O_af_XX TTAAGACTCAACCAGTCTAAACTTC--TAC-ATCACCAATTGATCCATATACT #130_O_af_XX ????????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 GACTAGACCTACAAGTC-GAATCA---ACAATCGTTTATTGATCCAAAAAAT #H_s_JX306646 CTAAGACTTCACCAGTCAAGCGAACTACTATACTCAATTGATCCAATAACT #Y18475 TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #5_O_af_NA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #139_O_af_NA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #19_O_af_SA ????????????????????????????????????????CCTATTCTAG #21_O_af_SA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #74_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #72_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #71_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #58_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #59_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #70_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #64_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #65_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #66_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #67_O_af_ZNA TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #75_O_af_ZTZ TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #141_O_af_ZTZ TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #117_O_af_TZ TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #128_O_af_TZ ????????????????????????????????????????CCTATTCTAG #138_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #140_O_af_TZ ?????????????????????????????????????????????????? #76_O_af_AN TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #7_O_af_SU TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #23_O_af_SU TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #93_O_af_SU ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #16_O_af_AE TGATCAACGGAACAAGTTA??????????????????????????????? #94_O_af_AE TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAAT?????????? #40_O_af_RU ?????????????????????????????????????????????????? #50_O_af_RU TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #31_O_af_CO ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #30_O_af_CO TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #45_O_af_CO ????????GGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG Anhang 161

#43_O_af_CO ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #32_O_af_CO ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #36_O_af_CO TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #44_O_af_CO ???????????????????????????ATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #46_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #81_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #83_O_af_CO ?????????????????????????????????????????????????? #51_O_af_CO TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #90_O_af_CO TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATT?TAG #95_O_af_KE TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #121_O_af_OA ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #127_O_af_OA ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #125_O_af_SWA ???????CGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #109_O_af_XX ??????ACG???CAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #126_O_af_XX TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #130_O_af_XX ?????????????????????????????????????????????????? #C_e_DQ318377 TGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTGTTCAAG #H_s_JX306646 TGACCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAG #Y18475 AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #5_O_af_NA AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #139_O_af_NA AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #19_O_af_SA AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #21_O_af_SA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #74_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #72_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #71_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #58_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #59_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #70_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #64_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #65_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #66_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #67_O_af_ZNA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #75_O_af_ZTZ AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #141_O_af_ZTZ AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #117_O_af_TZ AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #128_O_af_TZ AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #138_O_af_TZ ?????????????????GGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #140_O_af_TZ ?????????????????GGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #76_O_af_AN AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #7_O_af_SU AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #23_O_af_SU AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #93_O_af_SU AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #16_O_af_AE ????????TCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #94_O_af_AE ???????ATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #40_O_af_RU ?????????????????GGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #50_O_af_RU AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #31_O_af_CO AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #30_O_af_CO AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #45_O_af_CO AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #43_O_af_CO AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #32_O_af_CO AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #36_O_af_CO AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #44_O_af_CO AGTCC?TATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #46_O_af_CO AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #81_O_af_CO ???????????????TAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #83_O_af_CO ????????????????????????????????????TGGATCAGGACATC #51_O_af_CO AGTCCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #90_O_af_CO AGTCC?TATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #95_O_af_KE AGTCCTTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAG?????? #121_O_af_OA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #127_O_af_OA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC Anhang 162

#125_O_af_SWA AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #109_O_af_XX AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #126_O_af_XX AGTCCCTATCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #130_O_af_XX ????????TCGACGATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #C_e_DQ318377 AGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #H_s_JX306646 AGTCCATATCAACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATC #Y18475 CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #5_O_af_NA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #139_O_af_NA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #19_O_af_SA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #21_O_af_SA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #74_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #72_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #71_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGG?????????????????????????? #58_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTT???????????????????????? #59_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAA???????????????????????????? #70_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #64_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTC??????????????????????? #65_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCA????????????????????????????????????? #66_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGT????????????????????? #67_O_af_ZNA CCAATGGTGTAGCA????????????????????????????????????? #75_O_af_ZTZ CCAATGGTGT????????????????????????????????????????? #141_O_af_ZTZ CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTC??????????????????????? #117_O_af_TZ CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #138_O_af_TZ CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #140_O_af_TZ CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #76_O_af_AN CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTT??????????????????? #7_O_af_SU CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGT????????????????????????? #23_O_af_SU CCAATGGTGTAGCAG???????????????????????????????????? #93_O_af_SU CCAATGGT??????????????????????????????????????????? #16_O_af_AE CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGT?CAACGATTAAAGTCCT #94_O_af_AE CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #40_O_af_RU CCAATGGTGT??????TATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #50_O_af_RU CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #31_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #30_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #45_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #43_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #32_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGT????????????????????? #36_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #44_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #46_O_af_CO CCAATGGTG???????TAT????GG?TCGTTTG?????????????????? #81_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #83_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #51_O_af_CO CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #90_O_af_CO CCAATGGTGTAGC?GCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #95_O_af_KE ??????????????????????????????????????????????????? #121_O_af_OA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #127_O_af_OA CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAA????? #125_O_af_SWA CAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #109_O_af_XX CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #126_O_af_XX CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #130_O_af_XX CCAATGGTGTAGCAGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT #C_e_DQ318377 CCGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAG???? #H_s_JX306646 CCGATGGTGCAGCCGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCT

Anhang 163

Tab. A6.5 Blutsteroide [ng/ml] der zehn trächtigen Elenantilopen in Lany (verändert nach Hübner 2011) Name:DAK P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 09.10.2008 3,71 36,10 0,34 11.11.2008 1,40 1,27 1,23 16.12.2008 0,60 0,64 1,04 06.02.2009 0,34 0,27 0,47 28.02.2009 0,85 0,66 0,81 18.03.2009 1,05 1,10 0,95 23.04.2009 3,41 1,23 1,64 25.06.2009 0,27 0,78 Name:Glory P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 09.10.2008 6,18 18,10 8,22 12.11.2008 2,20 2,57 3,40 16.12.2008 1,42 0,67 1,21 06.02.2009 1,68 0,86 0,96 28.0 2.2009 1,79 3,02 3,31 18.03.2009 2,12 1,65 1,72 23.04.2009 3,13 2,47 14,40 6,40 3,07 4,37 30.05.2009 41,70 3,13 45,40 0,97 1,06 0,95 25.06.2009 5,90 0,10 13,30 0,50 1,41 0,64 29.07.2009 6,53 1,79 36,30 0,45 0,70 0,79 20.08.2009 1,27 1,55 1,24 2,94 0,69 3,72 20.08.2009 30,50 22,80 1,12 01.10.2009 9,85 1,36 17,90 4,78 5,22 6,31 Name:KAT P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 09.10.2008 12,70 38,30 2,64 12.11.20 08 3,83 5,73 3,45 16.12.200 8 0,97 0,91 1,53 06.02.2009 1,54 0,73 0,85 28.02.2009 2,08 2,98 2,05 18.03.2009 1,92 1,53 1,51 22.04.2009 3,61 3,84 6,49 1,24 1,34 0,48 30.05.2009 6,40 0,13 23,20 3,53 0,93 2,76 25.06.2009 0,37 0,47 2,84 0,77 1,37 1,44 29.07.2009 0,80 7,51 0,72 20.08.2009 19,40 0,88 18,80 0,40 2,05 1,01 01.10.2009 1,36 1,29 1,73 0,67 0,60 0,70 Name:Lindi P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 02.08.2008 1,98 9,62 2,20 08.10.2008 5,02 4,32 0,96 11.11.2008 1,76 4,50 3,07 16.12.2008 0,38 0,28 0,37 06.02.2009 0,87 1,04 1,26 28.02.2009 0,23 3,45 0,38 18.03.2009 0,51 1,51 1,01 22.04.2009 1,70 0,69 7,00 0,86 0,42 0,52 30.05.2009 30,00 52,50 1,1 3 25.06.2009 12,70 10,20 1, 12 20.08.2009 8,90 15,70 1,41 Anhang 164

Name:NAS P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 08.10.2008 5,00 46,90 2,08 09.10.2008 18,70 8,59 1,16 06.02.2009 0,92 0,94 1,78 28.02.2009 3,86 4,94 0,95 30. 05.2009 0,10 0,10 0,10 25.06.2009 0,27 0,10 0,70 Name:NIA P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 08.10.2008 2,40 20,30 0,55 11.11.2008 3,40 6,48 1,85 16.12.2008 0,86 1,98 1,31 06.02.2009 1,0 0 0,37 0,96 28.02.2009 2,45 3,00 0,22 18.03.2009 0,99 3,20 0,66 22.04.2009 5,31 3,64 8,54 1,32 0,67 0,54 30.05.2009 0,11 1,08 0,53 25.06.2009 4,92 1,08 9,15 0,44 0,41 0,58 29.07.2009 0,22 0,01 2,10 0,72 1,7 8 1,58 20.08.2009 3,21 0,44 8,50 0,50 0,64 0,55 20.08.2009 8,30 10,00 0,55 01.10.2009 0,07 0,20 0,75 0,93 0,73 0,82 Name:STA P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 11.11.2008 0,80 1,04 1,25 16.12.2008 0,38 0,37 0,79 06.02.2009 0,0 5 0,22 0,78 28.02.2009 0,13 3,22 2,62 18.03.2009 0,06 2,02 1,72 22.04.2009 0,22 0,33 3,52 0,30 1,11 0,35 30.05.2009 16,30 0,56 37,50 0,08 0,25 0,21 25.06.2009 0,32 0,47 0,51 29.07.2009 1,37 0,83 12,00 0,76 0,48 0,53 20.08.2009 2,22 0,77 2,74 0,30 0,29 0,37 01.10.2009 2,47 0,40 4,16 1,17 1,04 0,75 01.10.2009 3,43 10,60 0,43 Name:LIA P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 02.08.2008 31,80 92,00 1,28 08.10 .2008 5,10 12,40 0,48 11.11 .2008 0,93 0,94 2,55 16.12.2008 0,83 0,39 0,58 Name:LIB P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 02.08.2008 5,85 70,70 1,26 08.10.2008 4,33 13,60 0,64 12.11.2008 0,63 0,23 0,51 16.12.2008 0,32 0,35 0,56 22.04.2009 2,30 39,20 0,36

Anhang 165

Name:LDE P4 P4 KK KK Kortisol Kortisol Datum Wanze Spritze Wanze Spritze Wanze Spritze 08.10.2008 18,80 31,30 0,68 11.11.2008 2,02 0,77 0,78 16.12.2008 1,09 0,33 0,67 06.02.2009 0,72 0,38 0,60 28.02.2009 1,59 1,35 1,14 18.03.2009 2,15 1,00 0,79 22.04.2009 3,82 4,27 25,50 1,84 0,06 0,30 30.05.2009 0,09 0,51 0,22 25.06.2009 0,73 0,35 1,71 1,08 1,03 0,62 29.07.2009 5,70 4,76 0,44 20.08.2009 1,45 2,57 0,43 01.10.2009 20,50 0,38 16,20 0,23 0,56 0,38 P4= Progesteron; KK=Kortikosteron

Tab. A6.6 Anzahl der Oozysten pro Gramm Kot bei den Diamanttäubchen im Wuppertaler Zoo (verändert nach Hermes 2014) Tag ♂ ♀ Iso ♂ Iso ♀ Ereignis 26.01.2012 690 1034 30.01.2012 208 984 723 803 Küken geschlüpft 31.01.2012 636 1552 01.02.2012 1148 1640 Küken tot 02.02.2012 1204 2576 706 1088 03.02.2012 1292 1804 06.02.2012 1188 1556 neues Ei 07.02.2012 1236 1700 13.02.2012 492 856 Mittelwert 926 1584 706 975 ± 416 527 17 151 2013/Tag ♂ Weiß ♀ Weiß ♂ Schwarz ♀ Orange ♂ Pink 0 - - - - - 2 - 22 - - - 3 12 12 - - - 7 - - 0 10 - 9 11 0 0 0 - 15 9 0 0 0 - 34 7 0 385 4 - 35 43 0 190 0 - 36 - 0 11 - - 38 0 13 0 7 - 43 0 0 0 5 - 49 - 0 7 - 0 52 0 - 0 0 0 55 35 6 0 0 0 57 0 - 0 - 0 63 - - 0 0 0 65 5 0 27 0 0 83 3 15 0 300 0 85 0 - 135 0 - 87 0 0 - 0 4 93 1 0 - 0 5 99 10 17 0 400 - Anhang 166

2014/Tag ♂ Weiß ♀ Weiß Ereignis ♂ Rot ♀ Rot Ereignis 1 0 0 Brutphase; 1 Ei gelegt 3 Brutphase 2 0 8 Brutphase 10 12 Brutphase 5 6 - Nest verlassen 6 - 1 Ei geklaut 8 0 0 Brutabbruch - - Brutabbruch 9 0 9 Brutpause - 0 Partnertausch Getrennte 10 0 7 Brutpause - 0 Paarung 16 - 0 ♂ sammelt Nistmaterial 4 - Brutbeginn ♀ Rot 17 0 5 Neu es Nest - - 43 5 - Brutphase - 0 Brutphase ♂ Rot 45 - 0 Brutphase - 0 Brutphase ♂ Rot 54 36 28 Umzug 14 20 Umzug 56 15 5 Brutpause 8 19 Brutpause 57 0 11 Brutpause 0 6 Br utpause 57 -58 - - Brutpause 8 22 Brutpause 58 0 - Brutpause - - Brutpause Brutphase 2 Eier 65 0 0 Brutvorbereitung 0 0 gelegt 66 4 0 1 Ei gelegt 8 0 Brutphase 67 0 1 Brutphase 3 - Brutphase 68 - 0 Brutphase - 5 Brutphase 69 0 11 Brutphase 111 0 Brutphase 72 0 0 Brutphase 0 0 Brutphase 72 -73 0 0 Brutphase 0 0 Brutphase 74 0 4 Brutphase 0 1 Brutphase 75 12 0 Brutphase - - Brutphase 77 -78 0 25 Brutphase 9 31 Küken geschlüpft 78 0 2 Brutphase 0 1 Aufzucht 79 -82 7 4 Brutphase 3 7 Aufzucht 83 - - Brutphase - 2 Aufzucht 84 1 11 Versuch Blutabnahme - 4 Aufzucht 85 - 6 Versuch Blutabnahme - - Aufzucht

Tab. A6.7 Parasitierungen, Mittelwerte und Standardabweichungen der Erdmännchengruppe im Wuppertaler Zoo 2011. Kursiv: Weibchen (aus Jezyschek 2012) Angie Power Klumpi Lenny Carla Dumbo 18.01.2011 1477 952 385 170 4 316 53047 19.01.2011 1013 20.01.2011 55119 21.01.2011 54 16038 1837 59218 222552 22.01.2011 2265 29160 23.01.2011 1509 196902 236837 412460 24.01.2011 25.01.2011 22904 16732 26.01.2011 10096 27.01.2011 5456 85 26 28.01.2011 1547 1268 147709 29.01.2011 3765 222 7401 24984 12223 30.01.2011 191561 43922 11022 101854 Mittelwert 3388 35258 42119 16550 72225 127169 ± 3558 70117 70 851 19036 80981 137468

Anhang 167

Tab. A6.8 Parasitierungen, Mittelwerte und Standardabweichungen der Erdmännchengruppe im Wuppertaler Zoo 2012. Kursiv: Weibchen (aus Jezyschek 2012) Angie Power Klumpi Lenny Carla Dumbo Ereignis Folge 17.01.2012 989 440 1501 1635 2036 25327 18.01.2012 1211 685 4069 6032 1766 14603 19. 01.2012 263 883 3955 2925 20.01.2012 * * * * * 28.02.2012 * Kampf: Carla P+A separiert gegen Angie 29.02.2012 3993 1939 10496 6537 17215 8736 01.03.2012 11 5365 38092 13568 26428 7921 23102 02.03.2012 108073 * * * * * 05.03.2012 * * * * 1071 * Versuch der ohne Erfolg Reintegration 07.03.2012 7798 6332 21346 26696 7358 3955 08.03.2012 * * * * * 09.03.2012 * * * * * 12.03.2012 * 1825 * 13.03.2012 * 8518 * 14.03.2012 18576 * Kampf: Klumpy L separiert gegen Lenny 15.03.2012 11808 9205 14519 6223 16.03.2012 11767 9083 * 15949 * 6674 17.03.2012 13754 519 * 59984 8648 6544 19.03.2012 7073 21.03.2012 43772 32192 * * Mittelwert# 821 669 3175 3531 1901 19965 ± 405 181 1185 1845 135 5362 Mittelwert 27502 7570 14645 17025 6530 12706 ± 42393 10786 12138 17203 4925 7907 #=Ohne stressreiche Ereignisse; * Probe nicht ausgewertet

Anhang 168

Tab. A6.9 Anzahl der Oozysten pro Deckglas in den einzelnen Untersuchungsjahren bei den Königspinguinen im Wuppertaler Zoo (verändert nach Dobrzinski 2012) Bruttiere Kontrolltiere Brutpaar Brutpaar Bruttier Datum M W W P1 P2 P3 P4 P5 P6 13.07.2013 1 ------14.07.2013 2 - 0 14 - - - - - 20.07.2013 - - 0 ------24.07.2013 0 - 0 ------27.07.2013 - - 0 ------31.07. 2013 - - 0 ------03.08.2014 0 ------04.08.201 4 ------0 - 07.08.2013 0 0 ------14.08.2013 2 - 1 - - - - 0 - 21.08.2013 - - 0 ------24.08.2013 - - 0 ------27.08.2013 - 0 - - - - 0 - - 28.08.2013 - - 0 ------31. 08.2013 - 0 0 ------15.09.2013 - - 0 ------18.09.2013 - - - - - 0 6 - - 21.09.2013 ------0 - - 22.09.2013 ------0 - 25.09.2013 - - - 0 0 - - - - 29.09.2013 ------0 - 0 Bruttiere Kontrolltiere P4 Brutpaar Datum M W P1 P2 P3 P5 P6 02.10.2013 0 0 - - 0 - - 05.10.2013 0 ------06.10.2013 - - - - 0 - - 09.10.2013 - - - 17 - - - 16.10.2013 - 0 - - 0 - - 20.10.2013 - 0 - - - - - 23.10.2013 - - - - - 0 - 27.10.2013 - - 0 - - - - 30.10.2013 - 1 - - - - 1 02.11.2013 - 3 - - - 0 - 06.11.2013 0 0 - - - - - 09.11.2013 - 0 - - - 0 - 13.11.2013 - 1 - - 0 - - 16.11.2013 - - - - 15 - - 17.11.2013 - 0 - - - - - 21.11.2013 - 0 - 0 - - - 27.11.2013 - - - - - 0 - 29. 11.2013 - 0 - - - - - 04.12.2013 - 0 - - - - 0 08.12.2013 0 ------11.12.2013 - - - 0 - 0 - 14.12.2013 - - 0 - - - -

Anhang 169

Bruttiere Kontrolltiere P4 Brutpaar Datum M W P2 P3 P6 23.07.2014 - - - - 1 29.07.2014 2 - 0 - - 06.08.2014 1 0 1 - - 16.08.2014 - - - 0 3 27.08.2014 0 0 - 1 - 06.09.2014 0 - - - - 08.09.2014 - 0 - - - 18.09.2014 - 0 - - - 19.09.2014 - 8 - - - 25.09.2014 0 0 - - - 05.10 .2014 - 0 - - - 06.10.2014 0 - - - - 11.10.2014 - 0 - - -

Abkürzungsverzeichnis 170

8. Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ABE Basenabweichung ALP Alkalische Phosphatase ALT Alanin-Aminotransferase AnGAP Anionenlücke AST/ GOT Asparat-Aminotransferase BEecf Basenabweichung BIL Bilrubin BTV Blauzungenvirus bzw. beziehungsweise ca. circa ctHb Gesamthämoglobinkonzentration dest. destilliert DNA Desoxyribonukleinsäure dom. domesticus ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FLI Friedrich Löffler Institut fortg. fortgesetzt g Gramm g Zentrifugalbeschleunigung ggf. gegebenenfalls gGT Gamma-Glutamyl-Tranferase GLDH Glutamatdehydrogenase

HCO 3-(P)c Hydrogencarbonat-Partialdruck HEM Hämolytisch l Liter LDH Laktat-Dehydrogenase NaCl Natriumchlorid max Maximum min Minuten ml Mililiter p Signifikanzwert pg Picogramm Abkürzungsverzeichnis 171

PCR Polymerasekettenreaktion RH relative Luftfeuchte sp. Spezies ssp. Unterart Tab. Tabelle u.a. unter anderem μl Mikro-Liter z.B. zum Beispiel

ZnCl 2 Zinkchlorid z.T. zum Teil

Danksagung 172

9. Danksagung

Herrn Prof. Dr. Hynek Burda danke ich die Überlassung des Themas und für die gute Betreuung, welche sich nicht allein auf die Diskussions- und Hilfsbereitschaft beschränkte, sondern auch auf die Vermittlung eines guten und persönlichen Arbeitsklimas. Bei Herrn Prof. Gero Hilken bedanke ich mich für die Übernahme des Korreferats sowie den Mitgliedern der Arbeitsgruppe für das gute Arbeitsverhältnis.

Ein großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Günter A. Schaub, Ruhr-Universität Bochum, für die großartige Unterstützung und Wissensvermittlung und Betreuung meiner Arbeit sowie die Übernahme des Korreferats und die Abgabe der Raubwanzen. Bei Herrn Prof. Dr. Franz Schwarzenberger, Universität Wien, Frau Dr. Kummrow und Katrin Gries vom Wuppertaler Zoo und den Damen Silja Heller und Lara Hermsen von der Universität Düsseldorf, Ines Hubmer von der Universität Wien, Pauline Schepsky von der Universität Trier sowie bei Anja Greins, Vivienne Dobrzinski, Lisa Hübner, Maike Müser, Theodoros Skodras und Mirko Jezyschek von der Ruhr-Universität Bochum bedanke ich mich für die sehr schnelle und gute Zusammenarbeit.

Ein weiterer Dank gilt den Herren Dr. Ulrich Schürer und Dr. Arne Lawrenz für die Erlaubnis und die Unterstützung der Arbeit im Wuppertaler Zoo. Weiterhin bedanke ich mich bei allen Pflegern und den folgenden Institutionen und deren Mitarbeitern für ihre Teilnahme und ihren Beitrag zu meiner Arbeit: African Safari (F), Allwetterzoo Münster (D), Artis (NL), Auffangstation für Reptilien München (D), Bioparc Valencia (E), Chester Zoo (UK), Colchester Zoo (UK), Dierenpark Emmen (NL), Dublin Zoo (UK), Edinburgh Zoo (UK), Faunia (E), Frankfurt Zoo (D), Hannover Zoo (D), Kölner Zoo (D), Lány (CZ), London Zoo (UK), Le Pal Zoo (F), Marineland (F), Mulhouse Zoo (F), Opelzoo Kronberg (D), Port Lympne (UK), Reepark Safari Ebeltoft (DK), Serengetipark Hodenhagen (D), Tiergarten Nürnberg (D), Tiergarten Schönbrunn (A), Tierpark Hagenbeck (D), Tierpark Hellabrunn (D), Twycross Zoo (UK), Whipsnade Zoo (UK), Zoo Amersfoort (NL), Zoo Basel (CH), Zoo Dortmund (D), Zoo Duisburg (D), Zoo Heidelberg (D), Zoo Krefeld (D), Zoo Leipzig (D), Zoo Magdeburg (D), Zoo Riga (LET), Zoo Salzburg (A), Zoom Erlebniswelt (D), Zoo Zürich (CH).

Ein großer Dank gilt Frau Dr. Eva Bähnisch, dass sie während der Anfertigung der Arbeit bei Fragen und bei Diskussionsbedarf immer für mich da war und mich großartig unterstützt hat. Ein weiterer großer Dank gilt auch meiner Mutter.

Lebenslauf 173

10. Lebenslauf

„Aus datenschutzrechtlichen Gründen ist der Lebenslauf in der elektronischen Version nicht enthalten“

Lebenslauf 174

Lebenslauf 175