FILOGENIA DE LOS TAXONES DEL SUBGÉNERO Parides (LEPIDOPTERA: PAPILIONIDAE) PRESENTES EN COLOMBIA, BASADA EN SECUENCIAS DEL GEN MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASA I
INGRID MARCELA GUTIÉRREZ ROJAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C., 11 DE JULIO DE 2007 FILOGENIA DE LOS TAXONES DEL SUBGÉNERO Parides (LEPIDOPTERA: PAPILIONIDAE) PRESENTES EN COLOMBIA, BASADA EN SECUENCIAS DEL GEN MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASA I
INGRID MARCELA GUTIÉRREZ ROJAS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de:
BIOLOGA
GIOVANNY FAGUA M.Sc. DIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C., 11 DE JULIO DE 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946.
FILOGENIA DE LOS TAXONES DEL SUBGÉNERO Parides (LEPIDOPTERA: PAPILIONIDAE) PRESENTES EN COLOMBIA, BASADA EN SECUENCIAS DEL GEN MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASA I
INGRID MARCELA GUTIÉRREZ ROJAS
APROBADO
______GIOVANNY FAGUA GONZALEZ, M.Sc. Director
______MANUEL RUIZ, Ph.D. ANDRES ACOSTA, M.Sc. Jurado Jurado
FILOGENIA DE LOS TAXONES DEL SUBGÉNERO Parides (LEPIDOPTERA: PAPILIONIDAE) PRESENTES EN COLOMBIA, BASADA EN SECUENCIAS DEL GEN MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASA I
INGRID MARCELA GUTIÉRREZ ROJAS
APROBADO
______Dra. ANGELA UMAÑA, M. Phil ANDREA FORERO Decano Académico Facultad de Ciencias Director Carrera de Biología
RESUMEN DEL CONTENIDO:
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 4
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 24
4. OBJETIVOS 26
5. MATERIALES Y MÉTODOS 27
6. RESULTADOS 36
7. DISCUSIÓN 69
8. CONCLUSIONES 85
9. RECOMENDACIONES 88
10. REFERENCIAS 89
11. ANEXOS 99
Dedico este trabajo a mis padres y hermana quienes me han amado y apoyado a lo largo de mi vida.
A ti mami, por tu amor, por enseñarme a que debemos tener la fortaleza de continuar hacia adelante sin importar las circunstancias que la vida nos presenta y porque sin tu apoyo no estaría donde estoy.
AGRADECIMIENTOS
A Giovanny Fagua por su apoyo y confianza en mí, y por su excelente dirección.
A la Sociedad Colombiana de Entomología SOCOLEN por la financiación del proyecto.
A la Pontificia Universidad Javeriana.
A Mónica Higuera M.Sc. por su asesoría y orientación durante la realización del proyecto.
Al laboratorio de Genética de Poblaciones-Biología Evolutiva. Manuel Ruiz, Maria Martínez, Diana Álvarez Maria Eugenia Varela, Catalina Vásquez, Carolina Almansa.
A todo el grupo de trabajo del laboratorio de Entomología (Grupo Élitros).
Gracias a Dios por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente, por las bendiciones y regalos que recibo día tras día y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante toda mi vida.
A mi mami ¡Gracias por ser una madre excepcional! Te adoro y admiro. Eres el regalo más valioso que Dios podía haberme dado.
A mi familia, que me ha apoyado y ha confiado en mí. En especial gracias a mis padres y a mi hermanita.
A ハビエル por aparecer, por existir, muchas gracias por ocupar un lugar muy importante en mi vida. Gracias de corazón.
A Alexandra, Gracias por escucharme, apoyarme, por infundirme tus ánimos y compartir conmigo tus conocimientos.
Y a todas las personas que me brindan su cariño y confianza en todo momento, pero sobre todo por estar, cada uno a su manera, respaldándome para alcanzar mis objetivos.
TABLA DE CONTENIDOS
12. INTRODUCCIÓN 1
13. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 4
2.1 Familia Papilionidae 4
2.2 Sistemática de Papilionidae 4
2.3 El subgénero Parides Hübner, 1819 7
2.3.1 Distribución geográfica de las especies y subespecies de Parides empleadas en este estudio. 8
2.3.1.1 Parides aeneas bolivar (Hewitson, 1850) 8
2.3.1.2 Parides anchises (Linné, 1758) 8
2.3.1.2.1 Parides anchises serapis (Boisduval, 1836) 8
2.3.1.2.2 Parides anchises alyattes (Felder& Felder, 1861) 8
2.3.1.3 Parides bunichus (Hübner, 1821) 9
2.3.1.4 Parides chabrias chabrias (Hewitson, 1852) 9
2.3.1.5 Parides childrenae childrenae (Gray, 1832) 9
2.3.1.6 Parides eurimedes arriphus (Boisduval, 1836) 9
2.3.1.7 Parides erithalion yaminahua (Pischedda & Racheli, 1987) 9
2.3.1.8 Parides iphidamas (Fabricius, 1793) 10
2.3.1.9 Parides lycimenes erythrus (Rotshchild & Jordan 1906) 10
2.3.1.10 Parides lysander (Cramer, 1775) 10
2.3.1.10.1 Parides lysander lysander (Cramer, 1776) 10
2.3.1.10.2 Parides lysander brissonius (Hübner, 1819) 10
2.3.1.11 Parides neophilus (Geyer, 1837) 11 2.3.1.12 Parides panthonus jaguarae (Foetterle, 1902) 11
2.3.1.13 Parides phosphorus gratianus (Bates, 1861) 11
2.3.1.14 Parides sesostris tarquinus (Boisduval, 1836) 11
2.3.1.15 Parides vertumnus bogotanus Felder (1864) 12
2.4 Historia sistemática del subgénero Parides Hübner, 1819 12
2.5 Sistemática Molecular en Lepidoptera 14
2.5.1 ADN mitocondrial (ADNmt) en Lepidoptera 15
2.6 Sistemática Molecular en Papilionidae 18
2.7 Estudio sistemático 18
2.7.1 Inferencias Filogenéticas 19
14. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 24
3.1 Pregunta de Investigación 24
3.2 Justificación de la Investigación 24
15. OBJETIVOS 26
4.1 Objetivo General 26
4.2 Objetivos Específicos 26
16. MATERIALES Y MÉTODOS 27
5.1 Diseño de la Investigación 27
5.1.1 Análisis de los Especímenes 27
5.1.2 Taxones 27
5.1.3 Distribución Geográfica 28
5.1.4 Variables de Estudio 29
5.2 Métodos 29
5.2.1 Obtención de ADN 29
5.2.2 Extracción y Almacenamiento del ADN 30
5.2.3 Amplificación de ADN mitocondrial por PCR 31
5.2.4 Electroforesis de ADN 31
5.2.5 Secuenciación de ADNmt 32
5.3. Recolección de la Información 32
5.4 Análisis de la Información 33
5.4.1 Alineamiento de ADN 33
5.4.2. Análisis Filogenético 33
5.4.2.1 Análisis de Máxima Parsimonia 34
5.4.2.2 Análisis Bayesianos 35
17. RESULTADOS 36
6.1 Revisión y análisis molecular de los especimenes 36
6.2 Análisis Filogenético 37
6.2.1 Máxima Parsimonia 39
6.2.1.1 Árbol de consenso del subgénero Parides 39
6.2.2 Análisis Bayesianos 48
6.3 Determinación de los taxones de especie y subespecie de Parides en Colombia. 52
6.3.1 Parides aeneas bolivar (Hewitson, 1850) 54
6.3.2 Parides anchises (Linné, 1758) 55
6.3.2.1 Parides anchises serapis (Boisduval, 1836) 55
6.3.2.2 Parides anchises alyattes (Felder& Felder, 1861) 55
6.3.3 Parides chabrias chabrias (Hewitson, 1852) 57
6.3.4 Parides childrenae childrenae (Gray, 1832) 58
6.3.5 Parides eurimedes arriphus (Boisduval, 1836) 59
6.3.6 Parides erithalion yaminahua (Pischedda & Racheli, 1987) 60
6.3.7 Parides iphidamas (Fabricius, 1793) 61
6.3.8 Parides lycimenes erythrus (Rotshchild & Jordan 1906) 61
6.3.9 Parides lysander (Cramer, 1775) 64
6.3.9.1 Parides lysander lysander (Cramer, 1776) 64
6.3.9.2 Parides lysander brissonius (Hübner, 1819) 64
6.3.10 Parides phophorus gratianus (Bates, 1861) 66
6.3.11 Parides sesostris tarquinius (Boisduval, 1836) 67
6.3.12 Parides verumnus bogotanus Felder (1864) 68
18. DISCUSIÓN 69
7.1 Análisis Filogenético 69
7.2 Determinación de los taxones de especie y subespecie de Parides en Colombia. 83
19. CONCLUSIONES 85
20. RECOMENDACIONES 88
21. REFERENCIAS 89
22. ANEXOS 99
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tasa de sustitución nucleotídica de las secuencias analizadas de 38 COI. Figura 2. Árbol filogenético 1 según análisis de Máxima Parsimonia. 40 Figura 3. Árbol filogenético 2 según análisis de Máxima Parsimonia. 41 Figura 4. Árbol filogenético de consenso según análisis de Máxima 42 Parsimonia, utilizando secuencias nucleótidicas de COI. Figura 5. Anidamiento de los taxones del Grupo 1 según análisis de 44 Máxima Parsimonia. Figura 6. Anidamiento de los taxones del subgrupo A, según análisis de 45 Máxima Parsimonia. Figura 7. Anidamiento de los taxones del subgrupo B, según análisis de 45 Máxima Parsimonia. Figura 8. Anidamiento de los taxones del subgrupo C, según análisis de 46 Máxima Parsimonia. Figura 9. Anidamiento de los taxones del subgrupo D, según análisis de 46 Máxima Parsimonia. Figura 10. Árbol filogenético según análisis Bayesiano. 50 Figura 11. Taxones analizados del subgénero Parides y su localidad 53 geográfica en Colombia. Figura 12. Distribución de Parides aeneas bolivar en Colombia. 54 Figura 13. Distribución de las subespecies de Parides anchises en 56 Colombia. Figura 14. Distribución de Parides chabrias chabrias en Colombia. 57 Figura 15. Distribución de las subespecies de Parides childrenae en 58 Colombia. Figura 16. Distribución de las subespecies de Parides eurimedes en 59 Colombia.
Figura 17. Distribución de las subespecies de Parides erithalion en 60 Colombia. Figura 18. Distribución de las subespecies de Parides iphidamas en 62 Colombia. Figura 19. Distribución de las subespecies de Parides lycimenes en 63 Colombia. Figura 20. Distribución de las subespecies de Parides lysander en 65 Colombia. Figura 21. Distribución de Parides phosphorus gratianus en Colombia. 66 Figura 22. Distribución de las subespecies de Parides sesostris en 67 Colombia. Figura 23. Distribución de las subespecies de Parides vertumnus en 68 Colombia.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Primers utilizados para secuenciar el gen mitocondrial 31 Citocromo Oxidasa I (COI). Tabla 2. Estimaciones nucleotídicas de las secuencias analizadas del gen 38 COI. Tabla 3. Tasa de sustitución nucleotídica de las secuencias analizadas de 38 COI.
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. El subgénero Parides. Figura 1. Características del subgénero Parides. 99 Figura 2. Distribución geográfica y centros de endemismo de Parides 100 en Colombia según Fagua (1997). Figura 3. Distribución geográfica de Parides en Colombia según 101 Le Crom et al. (2002).
ANEXO 2. Taxones del subgénero Parides seleccionados para el análisis filogenético. Figura 1. Patrón de coloración alar de los taxones del grupo interno y 102 externo seleccionados para el análisis filogenético. Tabla 1. Taxones del grupo interno y externo seleccionados para el 107 análisis filogenético. Tabla 2. Taxones del subgénero Parides seleccionados para el 108 análisis filogenético, representados en tres colecciones entomológicas.
ANEXO 3. Listado preliminar de los taxones del subgénero Parides de 110 los años 1996-2006, seleccionados para el análisis molecular representado en tres colecciones entomológicas.
RESUMEN
El género Parides Hübner (Lepidoptera: Papilionidae), es un grupo de mariposas diversificado en el trópico y subtrópico, son modelos de complejos miméticos batesianos y mullerianos. Varias de las especies son generalmente simpátricas e involucran poblaciones con variaciones intraespecíficas de los patrones de coloración, lo que genera confusiones en la definición del estatus taxonómico, especialmente en Colombia, punto de convergencia de las biotas de Norte y Suramérica. Este trabajo establece una definición más robusta de los taxones de especie y subespecie de Parides y genera una aproximación a la filogenia de este grupo de mariposas. Para ello se analizaron 17 taxones (especie y subespecie) dentro del grupo interno, utilizando como grupo externo especies de los géneros Pachliopta y Atrophaneura cuyas secuencias se obtuvieron del GenBank. Para la extracción del ADN se utilizó el protocolo de Pascual et al. (1997) y DNeasy Kit. Mediante PCR se amplificó un fragmento del gen Citocromo Oxidasa I (COI) de 476 pb. Se realizaron análisis de Máxima Parsimonia y se evaluó el soporte de cada nodo mediante Jackknife y soporte absoluto de Bremer. Para los datos moleculares se realizó un análisis Bayesiano. La hipótesis filogenética generada propone al subgénero Parides como grupo Parafilético. Según Máxima Parsimonia Parides se divide en tres grupos principales y cuatro subgrupos coincidentes con los grupos Lysander y Aeneas de Rothschild & Jordan (1906) apara las especies de Parides. Se obtuvieron agrupaciones con valores altos de soporte de Bremer y Jackknife. Según análisis Bayesiano, la topología del árbol de Máxima Parsimonia presentó pocos cambios al incluir un modelo de evolución GTR+G. Aceptando los grupos monofiléticos y la congruencia con su areal geográfico, se definió el estatus taxonómico de una especie sin subespecies y cinco subespecies de Parides presentes en Colombia. Se encontró coincidencia entre el análisis morfológico desarrollado por otros autores y el análisis molecular de este trabajo en relación a la designación de especie y subespecie para el subgénero Parides presentes en Colombia. 1. INTRODUCCIÓN
Las mariposas del género Parides Hübner, 1819 (Lepidoptera: Papilionidae), presentan generalmente colores negros en sus alas, un cuerpo negro con manchas rojas, uñas tarsales asimétricas y sexos dimorficos; se alimentan durante sus estados larvarios de plantas de la familia Aristolochiaceae (DeVries 1987). Según Fagua (1997) las hembras se caracterizan por presentar un ducto de la bursae corto y ancho, correspondiente con el edeagus corto grueso de los machos. Además, las hembras son muy similares y forman parte de un importante complejo mimético Mülleriano asociado a otro complejo mimético Batesiano (DeVries 1987). Fagua & Ruiz (1993), describen a Parides como un grupo de interés debido a la preferencia de un determinado tipo de hábitat, a que son huéspedes de una o pocas especies estrechamente relacionadas de plantas hospedero, a la presencia de complejos miméticos anteriormente mencionados y por su distribución geográfica restringida a alturas inferiores a los 2000 m, reflejando cambios orográficos, características que las hacen especies ideales como modelos de estudio en biogeografía, coevolución, competencia, depredación y especiación.
El género Parides es un grupo de mariposas diversificado en el trópico y principalmente en el subtrópico. Este género se encuentra distribuido en tres subgéneros (sensu Miller 1987): Panosmia y Atrophaneura del viejo mundo (zona tropical asiática, los Himalayas, el sureste de China y sur de Japón) registrándose 26 especies; y en el Neotrópico se encuentra el subgénero Parides, con 34 especies y 107 subespecies (Tyler et al. 1994). Fagua (1997) registró para Colombia 17 especies, aceptando 28 subespecies y catalogando como fenotipos 20 subespecies propuestas por otros autores. Posteriormente, Le Crom et al. (2002), proponen que este género en Colombia presenta 16 especies y 38 subespecies diversificado en su mayor parte en los boques húmedos de la Cuenca Amazónica, la Costa Pacífica y el Magdalena Medio.
1 En consecuencia existe una gran diferencia en cuanto a la mayoría de los taxones subespecificos del subgénero Parides propuestos según caracteres morfológicos; esto debido a que las especies y subespecies son generalmente simpátricas e involucran poblaciones con variaciones intraespecíficas de los patrones de coloración, por lo que se han generado confusiones en la definición del estatus taxonómico, especialmente en Colombia, punto de convergencia de las biotas de Norte y Suramérica (Fagua 1997). De acuerdo con el concepto de subespecie propuesto por Fox (1955), quien la define como una población fenotípicamente diferenciable cuyo rango de distribución no se solapa con el de otras subespecies, corresponde a una definición que podría no ajustarse a condiciones tropicales donde las barreras reproductivas geográficas pueden no ser tan drásticas como en zonas temperadas; además, la amplia capacidad de desplazamiento de papiliónidos como Parides permite reconocer híbridos y denominarlos como tales, así como el mantener algunas formas con categoría de subespecie (Fagua 1997).
Por ello se hizo necesario el análisis de caracteres moleculares, los cuales establecieron una definición más robusta del estatus taxonómico de los taxones del subgénero Parides a partir de diferencias de secuencias de ADN mitocondrial y por primera vez se generó una hipótesis filogenética de este grupo de mariposas presentes en Colombia.
Por consiguiente, se empleo el análisis de secuencias amplificadas de una región del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI) como marcador molecular; el utilizar ADN mitocondrial en estudios de filogenia entre especies ha permitido la realización de filogenias robustas, delimitación de especies objetivo y proporción del flujo de genes a este nivel (Moritz et al. 1987, Harrison 1989, Hillis 1996). En Lepidoptera los estudios a nivel de ADNmt especialmente las regiones de los genes COI y COII han sido bien estudiadas y existe una base de datos importante de secuencias en Lepidoptera; COI se considera que está evolucionando relativamente rápido a nivel nucleotídico (Caterino et al. 2001), por lo que se asume que el gen COI es una
2 excelente herramienta de trabajo para resolver relaciones a nivel de especies y grupos de especies entre Papilionidae (Caterino & Sperling 1999).
A partir de los datos moleculares las inferencias filogenéticas correspondieron a análisis de Máxima Parsimonia a través del programa TNT 1.0 (Goloboff et al. 2003); obteniendo el índice de consistencia (CI) y de retención (RI) mediante Winclada 1.00.08 (Nixon 1999-2002). De la misma forma, se realizaron análisis Bayesianos con MrBayes 3.1 (Ronquist et al. 2005); el hacer análisis Bayesiano fue para mayor soporte e investigar los efectos en los resultados bajo la suposición más restrictiva del análisis de datos. Los análisis Bayesianos se ejecutaron con la matriz de datos completa, la cual fue analizada mediante PAUP 4.0q (Swofford 1999); por medio del programa MODELTESTS 3.06 (Posada & Crandall 1998) se determinó el modelo de evolución que mejor se ajusta al gen, la proporción de transición/transversión y los parámetros del modelo de sustitución que mejor se ajustan a los datos obtenidos.
3 2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Familia Papilionidae
Papilionidae es una de las familias de mariposas mejor conocidas sistemática y biológicamente, se encuentran en casi todos los tipos de hábitat a través del mundo donde se incluyen 600 especies, siendo la mayor parte de origen tropical (DeVries 1987, Le Crom et al. 2002). La familia presenta una monofilia que es sustentada por cuatro caracteres específicos: presencia de un osmaterio bifurcado en la larva; reducción pretarsal de aerolio y el pulvinulo en el adulto; la vena 2A se extiende libre hasta al margen alar y la aorta mesotorácica carece de cámara horizontal (Ehrlich 1958, Tyler et al. 1994). Además la laterocervicalia está fusionada ventromedialmente; finalmente la presencia de epífisis tibial en las patas protorácicas (Wilson 1961, Kristensen 1976, Scoble 1995).
Estas mariposas presentan un cuerpo robusto, con tres pares de patas bien desarrolladas, antenas largas y recurvadas hacia arriba, ojos compuestos grandes con o sin extensiones caudales (Le Crom et al. 2002); todas las especies son de tamaño mediano a grande presentando colores conspicuos (DeVries 1987). El comportamiento de los papiliónidos los hace distintos de las otras mariposas por el hábito de agitar las alas cuando liban néctar de las flores (Le Crom et al. 2002).
2.2 Sistemática de Papilionidae
Para definir la taxonomía de la familia Papilionidae se han realizado varios trabajos; fueron Scopoli (1777), Felder & Felder (1864) quienes iniciaron el trabajo en el grupo. Rothschild (1895) y Rothschild & Jordan (1906) realizaron los primeros trabajos sistemáticos detallados, definiendo especies y estableciendo listados de sinónimos con base en análisis de caracteres morfológicos, de genitalia y de la
4 estructura del órgano escente; ellos dividen a los actuales Papilionidae neotropicales en tres secciones: Aristolochia-Swallowtails (las larvas se alimentan de Aristolochia) actualmente corresponde a Parides y Battus (Scopoli, 1777); Fluted Swallowtails (Papilios acanalados) corresponden a Papilio L. y Kite-Swallowtail (parecen una cometa de papel) para Eurytides Hübner (1821). Seguido a este trabajo se presenta el de Ford (1944, citado por Miller 1987), quien realiza un sistema de agrupación basado en la química de los pigmentos alares. Munroe & Ehrlich (1960) dividen a Papilionidae en Baroniinae, Parnassinae y Papilioninae por medio de los caracteres de venación de los tubérculos larvales y de las plantas hospedero. Hancock (1983) realiza el primer análisis cladístico apoyado en los caracteres de venación y morfología de la genitalia del macho, resultado que difiere bastante en las aproximaciones realizadas en Papilionini; Igarashi (1984, citado por Miller 1987) apoya su clasificación en las características morfológicas de las orugas. Miller (1987) propone una clasificación basada en un detallado análisis cladístico, obteniendo como resultado varias divergencias respecto a clasificaciones anteriores.
Ford (1944, citado por Miller 1987), divide a los papiliónidos en las tribus Cressidini y Troidini. Ehrlich (1958), establece dos tribus Troidini con Battus y Ornithoptera Boisduval y Cressidini conteniendo al resto de los papilios de las aristoloquias. Munroe & Ehrlich (1960) plantean para Troidini dos subtribus Battiti con Battus y Troiditi con Atrophanuera y Troides. Munroe (1961) ubica a Battus, Cressida, Euryades, Parides, Pachliopta Reakirt, Troides y Ornithoptera dentro de Troidini. Hancock (1983) propone una sola tribu de herbívoros de Aristolochia dentro de Papilioninae, con las subtribus propuestas por Munroe y Ehrlich (1960). Igarashi (1984, citado por Miller 1987) reconoce el género Pharmacophagus Haase, con Papilio antenor (Drury). Miller (1987), acepta las tribus propuestas por Munroe y Ehrlich (1960), aunque no reconoce a Troides y Ornithoptera como géneros independientes, reconoce a Phamacophagus, Battus, Cressida, Euryades, Pachliopta y Parides.
5 Finalmente, los papiliónidos son divididos en tres subfamilias: Baroniinae, monotípica que ocurren en México con Baronia brevicornis (Caterino et al. 2001, Tyler et al. 1994), Parnassiinae, con distribución Holartica, y Papilioninae cosmopolitas (Scriber 1995, citado por Silva-Brandão et al. 2005). Según Haüser et al. (2002), la subfamilia Papilioninae presenta 485 especies, dividida en tres tribus: Papilionini, Graphiini y Troidini. La tribu Troidini es predominantemente tropical, con la mayoría de especies concentradas en los bosques de tierras bajas de Centro y Sur América y la región IndoAustraliana (Weintraub 1995 citado por Silva-Brandão et al. 2005). Esta tribu es reconocida como un grupo natural porque las larvas y las pupas presentan una marcada homogeneidad; además esta tribu ha sido sujeto de varios estudios de sistemática, por lo cual su clasificación ha sido inestable (Miller 1987). Troidini presenta 130 especies en 12 géneros de los cuales tres corresponden al Neotropico: Battus (11 especies), Euryades (2 especies) y Parides (34 especies) Tyler et al. (1994). A pesar de las diferencias de clasificación que se presenta en Papilionidae, Parides del neotrópico siempre es incorporada dentro de la tribu Troidini, grupo restringido a la alimentación y ovoposición sobre Aristolochia (Magnoliophyta: Aristolochiales).
Para Colombia los primeros trabajos en Papilionidae fueron realizados por Apolinar María (1924,1924 a, 1924 b, 1924 c; 1925, 1925 a, 1925 b; 1939; 1940, 1940a), registrando para el país varias especies del género; aunque la mayor parte de los trabajos abarcaron buena parte del país, sus esfuerzos se concentraron en la zona del piedemonte llanero del Departamento del Meta (Fagua 1997). Posteriormente, durante los años del 60-90 se han realizados varios trabajos a nivel faunistico y estudios específicos de Papiliónidos (Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
6 2.3 El subgénero Parides Hübner, 1819
Las mariposas del subgénero Parides presentan colores negros en sus alas, un cuerpo negro con manchas rojas, uñas tarsales asimétricas, antenas largas, de masa elongada, ranuras sensoriales largas y bien definidas y último segmento antenal cónico. Presentan sexos dimórficos, donde los machos usualmente muestran un gran parche verde en las alas anteriores y siempre presentan un distintivo parche androconial en el margen anal de las alas posteriores y con escamas blancas lanosas dentro del pliegue; ambos sexos tienen un parche rojo característico en las alas posteriores, en el cual algunas especies tienen un recubrimiento de escamas violeta iridiscente (DeVries 1987). Las hembras son muy similares y forman parte de un importante complejo mimético Mülleriano asociado a otro complejo mimético Batesiano (DeVries 1987); además se caracterizan por presentar un ducto de la bursae corto y ancho, correspondiente con el edeagus corto y grueso de los machos (Fagua 1997) (Anexo1: Figura 1).
Las especies de Parides se alimentan durante sus estados larvarios de plantas de la familia Aristolochiaceae, esta familia presenta compuestos químicos tóxicos como los ácidos aristolóquicos, los cuales son incorporados por estas mariposas en sus tejidos (DeVries 1987, Le Crom et al. 2002), proporcionándoles mal sabor y toxicidad para depredadores vertebrados (Miller 1987a). Las larvas se caracterizan por ser de hábito solitario, presentan tubérculos carnosos en el dorso de color rojo, morado, negro o blanco. Las posturas son colocadas en retoños tiernos de manera individual en el envés de las hojas (DeVries 1987, Le Crom et al. 2002).
Fagua & Ruiz (1993), describen a Parides como un grupo de interés debido a la preferencia de un determinado tipo de hábitat, a que son huéspedes de una o pocas especies estrechamente relacionadas de plantas hospedero, a la presencia de complejos miméticos anteriormente mencionados y por su distribución geográfica restringida a alturas inferiores a los 2000 m, reflejando cambios orográficos,
7 características que las hacen especies ideales como modelos de estudio en biogeografía, coevolución, competencia, depredación y especiación.
2.3.1 Distribución geográfica de las especies y subespecies de Parides empleadas en este estudio.
2.3.1.1 Parides aeneas bolivar (Hewitson, 1850)
Parides aeneas bolivar es una subespecie rara y local, ocurre en zonas de bosque húmedo en buen estado de conservación; se registra en la Amazonía, Mitad sur de la Orinoquía y Piedemonte cordillerando en altitudes inferiores a los 500m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.2 Parides anchises (Linné, 1758)
2.3.1.2.1 Parides anchises serapis (Boisduval, 1836)
Esta subespecie es distintiva y poco variable; es endémica de la planicie caribeña seca de Colombia. Península de la Guajira, Sierra Nevada de Santa Marta, Departamento del Atlántico, Serranía de Perijá y los Motilones, Occidente de Maracaibo y sector aledaño al litoral de los departamentos de Magdalena, Bolivar, Cesar y Sucre. Presente en zonas de bosque seco tropical entre 100 y 1200m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.2.2 Parides anchises alyattes (Felder& Felder, 1861)
Esta subespecie presenta una distribución en el centro de la Región Andina, Valle del Magdalena; se encuentra en zonas de bosque seco tropical, entre 100 y 1200m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
8 2.3.1.3 Parides bunichus (Hübner, 1821)
Esta especie se encuentra en habitats abiertos; presenta una distribución disyuntiva, restringida al Norte y Centroamérica, Ecuador, centro y sur del Brasil y al sur de Argentina (Rothschild & Jordan 1906, Tyler et al. 1994, Silva-Brandão et al. 2005).
2.3.1.4 Parides chabrias chabrias (Hewitson, 1852)
Subespecie muy rara y local; se registra en el sur del Piedemonte Cordillerano, alta Orinoquía y Amazonía. Presente en bosque húmedo tropical en buen estado de conservación (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.5 Parides childrenae childrenae (Gray, 1832)
Esta subespecie es rara y local; abundante en zonas de bosque pluvial, muy húmedo tropical y en buen estado de conservación. Se registra para el Chocó Biogeográfico hasta la zona del Bajo Calima, Valle medio del Río Cauca (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.6 Parides eurimedes arriphus (Boisduval, 1836)
Subespecie endémica de la región biogeográfica del Magdalena-Nechí. Región Atlántica, Pacífica y Andina; Piedemonte cordillerano, sector biogeográfico del refugio de Villavicencio (Brown, 1982). Presente en zonas de bosque húmedo tropical (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.7 Parides erithalion yaminahua (Pischedda & Racheli, 1987)
Esta subespecie se encuentra en el sur de Perú, en bajas elevaciones de la mitad de Madre de Diós (Tyler et al. 1994).
9 2.3.1.8 Parides iphidamas (Fabricius, 1793)
Subespecie presente en bosques Transandinos; se registra en el sur de México a sector occidental del Ecuador (Tyler et al. 1994, Fagua 1997).
2.3.1.9 Parides lycimenes erythrus (Rotshchild & Jordan 1906)
Subespecie endémica de Colombia occidental y central. Se encuentra en Urabá, sur y centro de la Región Atlántica, Valles del Magdalena y Cauca, Región Pacífica y Piedemonte Cordillerano en el sector aledaño a Villavicencio (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.10 Parides lysander (Cramer, 1775)
2.3.1.10.1 Parides lysander lysander (Cramer, 1776)
Esta subespecie se distribuye en el centro y sur del Piedemonte cordillerano, Amazonía, sector suroccidental de la Orinoquía y riveras del Orinoco (Tyler et al. 1994, Fagua 1997).
2.3.1.10.2 Parides lysander brissonius (Hübner, 1819)
Subespecie con distribución en el centro y sur del Piedemonte cordillerano, Amazonía, sector suroccidental de la Orinoquía y riveras del Orinoco. Subespecie común y abundante en sotobosque, se encuentra entre los 100 y 1200m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
10 2.3.1.11 Parides neophilus (Geyer, 1837)
Esta especie es común encontrarla cerca a los cursos de agua; presenta una distribución en el litoral sur venezolano, Amazonía a norte de Bolivia y sur de Brasil (Tyler et al. 1994, Fagua 1997).
2.3.1.12 Parides panthonus jaguarae (Foetterle, 1902)
Subespecie con distribución al centro de Brasil (Tyler et al. 1994).
2.3.1.13 Parides phosphorus gratianus (Bates, 1861)
Subespecie muy rara; endémica de la vertiente de la cordillera oriental de Colombia. Parte sur del piedemonte cordillerano en Cundinamarca, meta, Caquetá y Putumayo. Se encuentra en zonas de bosque húmedo tropical entre 500 y 1200m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.3.1.14 Parides sesostris tarquinius (Boisduval, 1836)
Esta subespecie presenta una distribución del Sur de México a la región Amazónica, centro de Brasil y norte de Venezuela. En Colombia es común en zonas de bosque pluvial y muy húmedo tropical en toda la costa pacífica y en zonas de bosque húmedo tropical en el Magdalena medio, en la Serranía de Santa Marta, Serranía de Perijá y las selvas del Catatumbo; se encuentra entre los 0 y 1000m (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
11 2.3.1.15 Parides vertumnus bogotanus Felder (1864)
Subespecie poco frecuente; con distribución en el sector del refugio de Villavicencio, Serranía de la Macarena y Amazonía; presente en zonas de bosque húmedo tropical (Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002).
2.4 Historia sistemática del subgénero Parides Hübner, 1819
Respecto a la historia Sistemática de Parides, primero fueron ubicados por Rothschild & Jordan (1906) dentro de Papilio, en la subsección A de Aristolochia- Swallowtail (Colas de Golondrina), reconociendo 45 especies y 71 subespecies dividiéndolas en los grupos Ascanius, Aeneas y Lysander. Esta clasificación fue seguida por Jordan (1907, in Seitz 1924). Por su parte, Munroe (1961) divide en dos subgéneros: Parides, neotropical y Atrophaneura, del viejo mundo; además no plantea ninguna autopomorfía para las especies de este género. D’Almeida (1966) trabaja a Parides como un subgénero de Battus con 48 especies y 80 subespecies. Hancok (1983) eleva a género a las especies Neotropicales de Parides y reconoce tres grupos de especies: El grupo ascanius reteniendo un gran número de caracteres primitivos y una disyunción peculiar en los modelos de distribución. Los grupos aeneas y lysander, presentan pérdida de series submarginales de manchas rojas en el ala posterior.
Miller (1987) propone dentro de Parides tres subgéneros: Parides (45 spp) neotropical, Panosmia Wood-Mason & de Niceville y Atrophaneura (12 spp) del viejo mundo; argumenta la monofilia del género en la presencia de tres caracteres autoapomórficos de la genitalia de las hembras: una gran invaginación dorsal esclerotizada en la apertura del ducto de la bursae, ducto de la bursae amplio y corto y vesica grande. Dado su amplio apoyo morfológico y filogenético, es el arreglo
12 taxonómico adoptado por este trabajo: Género Parides. Subgénero Parides (sensu Miller 1987).
Tyler et al. (1994), a nivel infragenérico, dan el estatus específico a 34 taxones y subespecífico a 107, elevando en 22 las subespecies; igualmente trabajan y apoyan el estudio de patrones de coloración, morfología de estados inmaduros y las relaciones de estos con sus plantas hospedero. Por su parte proponen para Colombia 18 especies y 32 subespecies, algunas de las cuales son endémicas de nuestro país. Fagua (1997) registró para Colombia 17 especies, aceptando 28 subespecies y catalogando como fenotipos (patrón de coloración estable y rango de distribución definido) 20 subespecies propuestas por otros autores. Por su parte, Le Crom et al. (2002), proponen que este género en Colombia presenta 16 especies y 38 subespecies.
Han sido pocos los estudios enfocados en las relaciones internas del género Parides, por consiguiente Silva-Brandão et al. (2005), considerando la diversidad e importancia ecológica de este grupo de mariposas del Neotrópico, plantearon el primer análisis filogenético del género Parides dentro de su análisis general de Troidini neotropical, en el cual incluyeron 17 de las 34 especies reconocidas, representados por todos los grupos subgenéricos reconocidos por Tyler et al. (1994). Identificaron cuatro grupos dentro del género: El grupo 1 corresponde a la posición basal dentro del género compuesto por Parides bunichus y Parides ascanius siendo esta la especie más basal dentro el género. El grupo 2 compuesto por Parides proneus y Parides agavus; el grupo 1 y 2 forman un clado basal de todas las remanentes Parides, en el cual se podrian incluir Parides phalaecus, Parides montezuma, Parides gundlachianus y Parides alopius conforme con Tyler et al. (1994). El grupo 3 incluye a las especies Parides chabrias, Parides childrenae, Parides photinus, Parides sesostris, Parides vertumnus, Parides anchises y el Grupo 4 con las especies Parides aeneas, Parides tros, Parides lysander, Parides panthonus, Parides eurimedes, Parides zacynthus y Parides neophilus.
13 Asimismo, a nivel del Neotrópico, Parides presenta diferentes trabajos respecto a su ecología, evolución, morfología y conservación (p.e. Fagua & Ruiz 1993, Fagua & Ruiz 1996 y Silva-Brandão et al. 2005). Estudios sobre la distribución geográfica del subgénero Parides en Colombia se encuentra los realizados por: Fagua (1997), el cual plantea que las subespecies se segregan en dos grupos de especies: las andinas y las amazónicas. En el grupo andino se identifica un subgrupo de la zona de influencia de la Sierra Nevada de Santa Marta (refugio Santa Marta), parte media y baja de los Valles Interandinos (refugios Cauca y Magdalena), que tienen gran influencia sobre el Chocó Biogeográfico. En el grupo amazónico se presenta que la similaridad va disminuyendo a medida que aumenta la distancia geográfica del núcleo amazónico (sector aledaño a los ríos Amazonas y Putumayo). Además propone tres centros de endemismos de subespecies de Parides en Colombia: Sierra Nevada de Santa Marta, parte media y baja de los valles Interandinos y el Piedemonte Amazónico. Por su parte, Le Crom et al. (2002), plantean que el subgénero Parides en Colombia esta principalmente diversificado en los bosques húmedos de la Cuenca Amazónica, la Costa Pacífica y el Magdalena medio (Anexo1: Figura 2 y 3).
2.5 Sistemática Molecular en Lepidoptera
Reconstruir filogenias permite tener un armazón histórico para entender la evolución de las características de los individuos a través de análisis comparativos; por ello la expansión de datos moleculares ha reforzado la reconstrucción de filogenias (Hillis 1996, Caterino et al. 2001), estos datos ayudan a dar valor a los datos morfológicos y ecológicos, haciendo contribuciones substanciales en los conceptos de biología evolutiva; además una de las ventajas que presentan es la inherente semejanza que generan a partir de diferentes estudios (Caterino et al. 2000). Sperling (2003), plantea como una de las mayores ventajas en sistemática molecular, el generar numerosos datos de caracteres para secuencias de ADN, lo que permite reconstruir filogenias en
14 las cuales pocas especies son analizadas y los efectos son enfocados en maximizar la cantidad de secuencias disponibles para cada especie.
Los análisis de secuencias del ADN han presentado avances en los recientes años, estos análisis permiten estudios filogenéticos a nivel de diferentes jerarquías taxonómicas (Caterino & Sperling 1999). Por esta razón, los avances en sistemática molecular en Lepidoptera integran técnicas con secuencias de ADN, lo que permite la reconstrucción de filogenias robustas y la delimitación de especies objetivo (Hillis 1996); asimismo han concedido avanzar las investigaciones sistemáticas en relación al flujo de genes entre poblaciones intraespecificas, que ayudan a examinar divergencias filogenéticas (Brower 1994, Sperling & Harrison 1994).
2.5.1 ADN mitocondrial (ADNmt) en Lepidoptera
Dentro de los marcadores moleculares están las secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt). El ADNmt como marcador en estudios de filogenia entre especies, determina modelos históricos y proporción del flujo de genes a este nivel (Harrison 1989). Algunos estudios asumen que el ADNmt está actuando como un marcador estrictamente neutral, lo que permite emplearlo en estimar parámetros evolutivos y ecológicos de interés, tales como tiempos de divergencia y modelos filogeográficos (Ballard & Rand 2005). El ADNmt puede tener diferentes historias evolutivas; no obstante, los modelos de variación del ADNmt dentro de y entre las especies proporcionan discernimiento en la historia de por lo menos una parte del genoma de las especies y puede proporcionar pruebas de hipótesis evolutivas basadas en otros caracteres (Sperling & Harrison 1994).
El ADNmt como marcador filogenético presenta múltiples ventajas de las cuales se encuentran: 1) Presenta herencia materna, lo que favorece su uso como buen marcador para establecer límites entre las especies (Moritz et al. 1987, Harrison 1989, Sperling 2003), además favorece la presencia de menos polimorfismos (Sperling
15 2003). 2) El ADNmt carece de recombinación (Ballard & Rand 2005). 3) La molécula de ADNmt es robusta y puede ser amplificada a partir de material en seco obteniendo una gran cantidad de kilobases (Sperling 2003). 4) El ADNmt no presenta regiones no codificantes (intrones) (Harrison 1989). 5) La tasa de divergencia de la tercera posición del codón es alta, siendo un excelente recurso para obtener información dentro de especies y entre grupos de especies (Sperling 2003). 6) El ADNmt puede obtenerse fácilmente gracias a la existencia de un mayor número de copias (cientos de mitocondrias por célula, cada una con decenas de copias de ADNmt), permitiendo una fácil amplificación, una mayor estabilidad del ADN (Luque & Herráez 2001) y puede detectarse más fácil en muestras antiguas (Loxdale & Lushai 1998). 7) A nivel universal el ADNmt presenta una gran cantidad de primers que han sido elaborados de regiones conservadas, siendo de interés en filogenia/evolutiva y estudios poblacionales (Simon et al. 1994).
No obstante, el ADNmt presenta desventajas como: 1) Saturación de secuencias de los genes que codifican para proteínas, por ende hay perdida de información (Sperling 2003). 2) El ADN mitocondrial experimenta mayor proporción de mutaciones que el nuclear, debido a la exposición de especies reactivas al oxigeno resultantes del metabolismo oxidativo mitocondrial, a carecer de histonas y a la menor eficiencia de los sistemas de reparación mitocondrial; de esas mutaciones, aquellas que afectan a regiones codificantes más del 93% de la molécula de ADNmt suelen tener consecuencias perjudiciales para la funcionalidad de las proteínas que codifican para la vida de la célula (Luque & Herráez 2001). 3) El ADNmt puede presentar altos niveles de homoplasia al ser analizado por varios métodos filogenéticos estándar, porque en la posición del tercer nucleótido se encuentra Adenina o Timina (Harrison 1989). 4) La alta tasa de sustitución puede ser una desventaja para resolver filogenias de más de 5-10 millones de años (Lin & Danforth 2004), una solución a este problema es maximizar el número de taxones examinados en el estudio (Hillis 1998, Sperling 2003), lo cual ayuda a resolver nodos internos (Graybeal 1998) y hacer más informativas las reconstrucciones de los nodos ancestrales (Yang 1998).
16 En Lepidoptera los estudios a nivel de ADNmt son más frecuentes que los realizados en cualquier gen nuclear; estos estudios han analizado varias regiones las cuales han sido utilizadas para establecer filogenias al nivel de especies, géneros, subfamilias y familias (Caterino et al. 2000, Sperling 2003). En mariposas, la mayoría de análisis moleculares se han enfocado en las regiones de ADNmt correspondientes a los genes COI y COII; principalmente en investigaciones del género Papilio (Papilionidae) Sperling (2003).
Respecto al gen Citocromo Oxidasa I COI (1,5 kb-1500pb), el estudio de sus secuencias han generado un gran grupo de datos, los cuales han sido aplicados en resolver problemas filogenéticos de un amplio nivel taxonómico en los insectos, como entre especies estrechamente relacionadas (Beckenbach et al. 1993, Sperling & Hickey 1994, Brower 1996, Caterino & Sperling 1999) hasta género y subfamilia (Frati et al. 1997), familias (Howland & Hewitt 1995), e incluso órdenes (Liu & Beckenbach 1992).
Hay dos razones que permiten escoger al gen mitocondrial COI: 1) Existe una base de datos sustancial de secuencias en Lepidoptera, estos datos son un recurso valioso en estudios de evolución del gen COI, así como en la perspectiva de una filogenia global en Lepidoptera (Caterino et al. 2001). 2) COI se considera que está evolucionando relativamente rápido a nivel nucleotídico, por consiguiente puede contener importantes homoplasias (Caterino et al. 2001), pero es el gen que evoluciona más lento de los genes que codifican proteínas mitocondriales (Simon et al. 1994). 3) El gen COI muestra un excelente historial en resolver relaciones a nivel de especies y grupos de especie en Papilionidae (Caterino & Sperling 1999, Reed & Sperling 1999, Caterino et al. 2001, Zakharov et al. 2004).
17 2.6 Sistemática Molecular en Papilionidae
Recientemente, se han realizado varios estudios moleculares sobre las relaciones filogenéticas en la familia Papilionidae, destacándose los trabajos de Aubert et al. (1999), Caterino et al. (2001), Kondo & Shinkawa (2003), Morinaka et al. (1999) y Silva-Brandão et al. (2005). Por su parte, Caterino & Sperling (1999), Reed & Sperling (1999) y Zakharov et al. (2004), estudiaron la filogenía del género Papilio a partir de secuencias de genes mitocondriales COI y COII y el gen nuclear EF-1α. Dentro de los estudios a nivel molecular en Parides está el desarrollado por Yoshiomi & Takashi (2004), quienes plantearon la filogenia de Parides (Byasa) alcinous de varias localidades del Japón, las islas Ryukyu y parte del este del Continente de Eurasia, por análisis de secuencias de ADN mitocondrial que codifican para la subunidad 5 de NADH desidrogenasa (ND5). Silva-Brandão et al. (2005), estudiaron las relaciones filogenéticas de la tribu Troidini del Nuevo Mundo obtenidas con secuencias de dos genes mitocondriales (COI, COII) y un gen nuclear (EF-1α); especialmente infirieron las relaciones filogenéticas de Parides, género monofilético y dividido en cuatro grupos según análisis de Máxima Parsimonia.
De lo anterior se desprende que en el subgénero Parides para Colombia no existen estudios moleculares, por lo cual el análisis de una secuencia del gen COI será útil en la definición del estatus taxonómico, las relaciones filogenéticas y la distribución geográfica de este grupo de mariposas en Colombia.
2.7 Estudio sistemático
La sistemática filogenética o cladística trabaja la diversidad orgánica por medio del conocimiento de las relaciones genealógicas de los organismos, las que se deben ver reflejadas en la clasificación natural de los mismos (Wiley et al. 1991). En consecuencia, durante los últimos años las reconstrucciones filogenéticas han
18 involucrado nuevas técnicas, entre ellas está la filogenia molecular, la cual emplea el genoma de los organismos, siendo importante para inferir el ancestro común, para entender relaciones ancestro-descendiente y transferencia de genes entre especies (McInerney 2006).
2.7.1 Inferencias Filogenéticas
Para inferir filogenias de especies a nivel molecular se emplean varios métodos, entre ellos se encuentran los Métodos de Parsimonia, Máxima Probabilidad, Máxima Verosimilitud y Análisis Bayesianos. Los Métodos de Parsimonia son hipotético- deductivo los cuales generan suposiciones no explicitas; la idea central de este método es que el árbol evolutivo seleccionado exige el mínimo número de substituciones/cambios evolutivos que expliquen las diferencias observadas entre los taxones de estudio (Felsenstein 2003). La búsqueda del árbol más parsimonioso es con el fin de formular los modelos de relaciones entre organismos, a través de los que se pueden distinguir caracteres compartidos debido a un ancestro común, de aquellos que convergen posiblemente debido a presiones ambientales (Meyer 1996).
Los Métodos de Parsimonia involucran diferentes modalidades que influyen en la topología y la longitud final del árbol filogenético; los cambios de estado dentro de una filogenia requieren del uso de algunos algoritmos; generalmente para los caracteres moleculares se emplea el Algoritmo de Fitch, este cuenta el número de cambios en las ramas del árbol a partir de datos de secuencias nucleotídicas, en el cual una de cualquiera de las cuatro bases (A, C, G, T) puede cambiar por cualquier otra (Felsenstein 2003).
Dentro de los Algoritmos empleados en buscar el árbol más parsimonioso, se encuentran los Algoritmos Exactos y Algoritmos Heurísticos. Los Algoritmos
19 Exactos garantizan la obtención de todos los árboles más parsimoniosos correspondientes a una matriz de datos dada y son ejecutados por medio de un análisis exhaustivo, en el cual se revisan todos los árboles posibles, permitiendo examinar la distribución de secuencias de las longitudes de los árboles con el fin de determinar cuál es el más cortó. Otro método es por medio de Branch and bound (ramificar y atar) el cual permite una búsqueda exhaustiva de un árbol determinado dentro de los árboles que probablemente son más cortos, este puede ser elegido al azar o calculado a partir de un algoritmo heurístico; estos métodos permiten analizar hasta 30 taxones terminales (López y Pérez 1999, Morrone 2000).
Por otra parte, los Algoritmos Heurísticos son empleados cuando se excede el número de taxones terminales, entre los métodos heurísticos se encuentra Stepwise addition (adición paso a paso), su resultado se ve influenciado por el orden en que son introducidos los taxones y los posteriores reordenamientos de las ramas, los cuales buscan mejorar la resolución inicial mediante el desplazamiento de las ramas, con el fin de encontrar topologías más parsimoniosas. Este procedimiento no hace todos los posibles arreglos, por lo cual necesita métodos de reordenación como: Búsquedas por permutación de ramas, con este método se tiene la alternativa de realizar una permutación local y global de ramas. En el primer caso se emplea Nearest-neighbor interchanges (NNI), se cambian las ramas adyacentes a una rama interna. Para el segundo caso se siguen dos estrategias Subtree pruning and regrafting (SPR), se separa el cladograma original en dos o más subcladogramas, para reubicarlos en otras posiciones y se evalúan todas la combinaciones posibles y Tree bisection and reconnection (TBR), es el método más elaborado, consiste en separar un subcladograma y se enraiza antes de reubicarlo en las distintas ramas, probando todos los enraizamientos y reconexiones posibles (Arnedo 1999, Morrone 2000, Felsenstein 2003).
20 El método de Máxima Probabilidad (Maximun Likelihood) es acreditado a Fisher, quien lo describe en 1922 y es el primero en investigar sus propiedades; el método de máxima probabilidad depende completamente de los datos y un modelo de probabilidad para describir los datos. Este método proporciona el mejor armazón en la estimación de filogenias, en la comprobación y comparación de modelos alternativos; además permite entender la mayoría de los procesos de evolución y su reconstrucción. La parte de exigencia del método de máxima probabilidad es su robusta base matemática como estadística y la habilidad de emplear todos los datos disponibles (Kuhner & Felsenstein 1994, Huelsenbeck 1995).
Los Análisis Bayesianos proporcionan un armazón ideal para investigar y caracterizar modelos de sustitución con base en datos moleculares (Huelsenbeck et al. 2001, 2002); una ventaja que presentan estos análisis es que emplean menos recursos computacionales, además la estimación del soporte de la ramas se obtiene con la estimación del árbol, por lo que se elimina el uso del bootstrap no paramétrico (Zakharov et al. 2004). Los Análisis Bayesianos están estrechamente relacionados con los métodos de Máxima Verosimilitud, sólo difieren en el uso a priori de la probabilidad de la distribución de los parámetros (observaciones) para determinar una probabilidad de distribución posterior (Felsenstein 2003, Ronquist 2004); además, las inferencias Bayesianas son un modelo estadístico en el cual sus parámetros son considerados como variables al azar (Ronquist 2004).
Los análisis Bayesianos se basan en que “El valor de la probabilidad posterior es proporcional a la probabilidad anterior multiplicada por la máxima probabilidad”, lo anterior es conocido como el teorema de Bayes. En la inferencia Bayesiana, la distribución posterior tiene un denominador que es difícil de calcular, porque involucra la suma de todas la posibles hipótesis; para resolver este problema se utiliza la Cadena de Markov Monte Carlo (MCMC), la cual permite conocer la distribución posterior sin conocer el denominador. La MCMC es una técnica de simulación
21 estocástica para generar una muestra a partir de una distribución compleja, la que se conoce hasta obtener una condición estacionaria (Ronquist 2004).
Por otro lado, para algunos autores es importante determinar la confianza de los análisis filogenéticos, para ello se realizan pruebas estadísticas que permiten generar un grupo de datos (Bremer 1994, Siddall 1995, Felsenstein 2003). Uno de los mayores análisis se presenta a nivel de la construcción de los árboles filogenéticos, es importante que estos análisis permitan determinar cuál es el grado de soporte o la estabilidad de los diferentes clados presentes en un árbol; para lo que se emplean métodos de remuestreo que por medio de un muestreo repetido de los datos originales se obtiene un conjunto de pseudoréplicas y a partir de esas se elabora la distribución de interés (Arnedo 1999).
Las principales técnicas para obtener aleatoriamente pseudoréplicas son: 1) Jackknife, técnica que consiste en eliminar al azar uno o un número determinado de caracteres y taxones (originales), se busca el árbol más parsimonioso entre cada pseudoréplica y se calcula la frecuencia con que cada uno de los clados del árbol original aparece en los árboles del remuestreo, con el fin de determinar que tan estables son los clados presentes en el árbol más parsimonioso (Siddall 1995). 2) Bootstrapping las pseudoréplicas se obtienen eliminando al azar la mitad de los caracteres de una matriz de datos, se duplican (para obtener una matriz del mismo tamaño) y se analiza la nueva matriz para obtener el o los árboles más parimoniosos entre las pseudoréplicas, este proceso se repite 100 veces y el soporte de las ramas es el porcentaje de veces que aparece cada nodo interno en el conjunto de árboles de las pseudoréplicas (proporción de bootstraps) (Arnedo 1999, Morrone 2000, Felsenstein 2003). 3) Permutaciones, permite reordenar los datos, rompiendo de esta forma cualquier tipo de covariación que pueda existir entre ellos; consiste en cambiar al azar los estados de los caracteres dentro de la matriz de datos y luego analizar la nueva matriz, con el fin de obtener el o los árboles más parsimoniosos. Si la matriz original produce un árbol
22 más corto que el 5% de los árboles obtenidos de las matrices aleatorizadas, se puede asegurar con un 95% de confianza, que los datos originales tienen estructura jerárquica y no por azar como se esperaría (Morrone 2000).
Dentro de la técnica de permutaciones se encuentra el Soporte absoluto de Bremer (índice de deterioro, índice de soporte o soporte de ramas), en el que el grado de soporte de las ramas se considera como una función del número de pasos extras necesarios para colapsar un clado en el árbol de consenso en el conjunto de árboles de las pseudoréplicas; por lo que el soporte de un clado es la diferencia entre el número de pasos del árbol más parsimonioso y el árbol más parsimonioso bajo la restricción de que dicho clado no aparezca (Arnedo 1999, Morrone 2000). Una rama bien soportada perdurará en un mayor número de series, mientras que una rama pobremente soportada habrá de colapsarse antes (Morrone 2000). Este índice permite ser aplicado a matrices de datos morfológicos y moleculares, además, la ventaja de este método es que establece el soporte de los distintos clados basándose en datos reales y no en perturbaciones de los mismos (Arnedo 1999).
23 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Pregunta de Investigación
¿Cuál es el estatus taxonómico y la filogenia de especies y subespecies del subgénero Parides Hübner, 1819 (Lepidoptera: Papilionidae) presentes en Colombia, basada en secuencias del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I?
3.2 Justificación de la Investigación
El género Parides, es un grupo de mariposas diversificado en el trópico y subtrópico. Este género se encuentra distribuido en tres subgéneros (sensu Miller 1987): Panosmia y Atrophaneura del viejo mundo y en el Neotrópico el subgénero Parides con 34 especies (Tyler et al. 1994). Fagua (1997) realizó una revisión taxonómica del género para Colombia, basado en la morfología y patrones de coloración; donde se registraron 17 especies, aceptando 28 subespecies y catalogando como fenotipos 20 subespecies propuestas por otros autores. Por su parte Le Crom et al. (2002), proponen que este género en Colombia presenta 16 especies y 38 subespecies diversificado en su mayor parte en los boques húmedos de la Cuenca Amazónica, la Costa Pacífica y el Magdalena Medio.
Dentro de las especies y subespecies del subgénero Parides, varias son generalmente simpátricas e involucran poblaciones con variaciones intraespecíficas de los patrones de coloración, por lo cual se han generado confusiones en la definición del estatus taxonómico, especialmente en Colombia, punto de convergencia de las biotas de Norte y Suramérica (Fagua 1997). De acuerdo con el concepto de subespecie propuesto por Fox (1955), quien la define como una población fenotípicamente diferenciable cuyo rango de distribución no se solapa con el de otras subespecies; corresponde a una definición que podría no ajustarse a condiciones tropicales donde las barreras reproductivas geográficas pueden no ser tan drástica como en zonas
24 temperadas; además, la amplia capacidad de desplazamiento de papiliónidos como Parides permite reconocer híbridos y denominarlos como tales, así como el mantener algunas formas con categoría de subespecie (Fagua 1997).
Es por ello que se hace necesario el análisis de caracteres moleculares en estas mariposas, los cuales permitan evidenciar la existencia de diferencias genéticas que presentan las especies y subespecies de Parides; que posteriormente puedan ser útiles en la definición de estos taxones y por ende propogan las relaciones filogenéticas de este grupo de mariposas.
25 4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Definir el estatus taxonómico y las relaciones filogenéticas de taxones del subgénero Parides presentes en Colombia, basados en secuencias del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Definir protocolos moleculares de extracción y amplificación del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I para el subgénero Parides.
II. Plantear una propuesta filogenética del subgénero Parides presentes en Colombia, basada en diferencias de secuencias del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I.
III. Confirmar la validez de taxones (especie y subespecie) descritos del subgénero Parides presentes en Colombia, mediante la confrontación de secuencias del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I y el areal geográfico propuesto por Tyler et al. (1994) y Fagua (1997).
26 5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Diseño de la Investigación
• Tipo de Investigación: Descriptiva. • Unidad de Muestreo: Cada espécimen (mariposa).
5.1.1 Análisis de los Especímenes
Los especímenes de Parides que fueron examinados corresponden a los depositados en tres colecciones entomológicas nacionales cuyos nombres y siglas se presentan a continuación.
IAvH Instituto Alexander von Humboldt, Bogotá.
MPUJ Museo Javeriano de Historia Natural, Bogotá.
CP Le Crom Colección Personal de Jean Francois Le Crom, Bogotá.
De los especímenes examinados se realizó su determinación taxonómica mediante las claves e ilustraciones de Rothschild & Jordan (1906); Tyler et al. (1994); Fagua (1997) y Le Crom et al. (2002), con el fin de identificar a nivel morfológico especies y subespecies del subgénero de Parides, para posteriormente confrontar con secuencias del gen mitoconrial Citocromo Oxidasa I. Además de cada espécimen se obtuvo material fotográfico y en los casos en los que se permitió las patas, tórax y abdomen de algunos de estos.
5.1.2 Taxones
Se realizó un análisis molecular de 25 especímenes correspondientes a 13 subespecies y 1 especie del subgénero Parides presentes en Colombia; se obtuvieron secuencias de estudios previos de una especie de Pachliopta
27 neptunus, Atrophaneura alcinous, Parides bunichus, Parides neophilus y Parides panthonus jaguarae, para un total de 30 especímenes (Anexo 2: Figura 1, Tabla 1 y 2).
Grupo Externo
Los especímenes utilizados como grupo externo lo integraron Pachliopta neptunus (Guérin-Méneville, 1840) y como parte del grupo hermano de Parides (sensu Miller 1987) a Atrophaneura alcinous (Klug, 1758), lo anterior con el fin de polarizar los estados de los caracteres apomórficos y plesiomórficos (Nixon & Carpenter 1993).
Grupo Interno
El grupo interno lo conformaron 28 taxones del subgénero Parides, correspondiendo a 1 especie y 13 subespecies (25 especímenes) de Colombia y 3 taxones de Brasil (Parides bunichus, Parides neophilus y Parides panthonus jaguarae), con el fin de poder establecer los grupos principales de Parides de acuerdo a la clasificación de Rothschild & Jordan (1906).
5.1.3 Distribución Geográfica
En esta fase se tomaron los areales de las especies y subespecies con base en la información suministrada en las etiquetas de los especímenes depositados en colecciones, además se colocaron las localidades según referencias bibliográficas de Tyler et al. (1994); Fagua (1997) y Le Crom et al. (2002).
28 5.1.4 Variables del Estudio
Variables independientes: Secuencias nucleotídicas de un fragmento de 476pb del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I y distribución geográfica de cada espécimen.
Variables dependientes: Coincidencia de secuencias nucleotídicas de un fragmento de 476pb del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I y distribución geográfica de cada espécimen.
5.2 Métodos
5.2.1 Obtención de ADN
Para la realización de esta fase el ADN fue extraído de ejemplares adultos (macho y hembra) extendidos y depositados en las colecciones entomológicas del Instituto Alexander von Humboldt (IAvH), la colección del Museo Javeriano de Historia Natural (MPUJ) y la colección personal de Jean Francois Le Crom (CP Le Crom); de cada ejemplar se tomaron las patas, tórax o abdomen (en los casos que fue permitido), las patas son la primera opción debido a que no se deteriora de forma sustancial a los especímenes, el tórax o abdomen se utilizó cuando el espécimen carecía de las patas o presentaba alguna dificultad para la obtención del ADN.
Por medio de pinzas de disección de punta fina y estériles se extrajo una pro, meso y metapata de cada espécimen, si no las presentaban se tomaba cualquier pata(s); para el tórax y abdomen primero se retiraron las alas, estas fueron depositadas en sobres de celofán transparentes, una vez retiradas las alas se tomó la mitad del tórax y abdomen. Posteriormente las patas, tórax o abdomen
29 extraídos fueron depositados en tubos eppendorff estériles de 1.5 µl debidamente marcados; estos se colocaron en cajas para su almacenamiento a -20°C.
5.2.2 Extracción y Almacenamiento del ADN
Para la extracción de ADN total de los ejemplares mayor de un año de colectado, se utilizó el protocolo de DNeassy Tissue Kit (Qiagen QIAamp), en donde las muestras fueron lisadas durante tres horas y recuperadas con 150 µl de buffer T.E.. Para los ejemplares menor a un año de colectado, se utilizó el protocolo de extracción de ADN de Pascual et al. (1997) modificado para Parides; cada muestra se maceró con Nitrógeno líquido en un tubo eppendorff estéril de 1.5 µl con una punta para micropipeta sellada por medio de calor; luego se adicionaron 160 µl de solución de buffer de lisis (Tris 10mM, NaCl 60mM, sacarosa 54%, EDTA 10ml pH 7.8) y 200µl de una segunda solución (Tris 300mM, SDS 1.25%, sacarosa 5%, EDTA 10mM pH 8.0). Se incubó a 65°C durante 50 minutos. Se adicionaron 60µl de Acetato de Potasio 3M y se incubó por 20 minutos a -20°C. Luego se centrífugo a 13000 r.p.m, durante 15 minutos. Se adicionaron 400µl de isopropanol al sobrenadante y se mantuvo a temperatura ambiente por 5 minutos. Cada muestra se centrifugó nuevamente durante 15 minutos a 13000 r.p.m. y se desechó el sobrenadante, se lavó con 500 µl de etanol al 70% y se desechó el sobrenadante. Se dejó secar el pelet durante 20 minutos a temperatura ambiente, se resuspendió el ADN en 100 µl de T.E. y finalmente se incubó a 56°C durante 30 minutos. Después de extraer el ADN de cada espécimen este fue almacenado a -20°C.
30 5.2.3 Amplificación de ADN mitocondrial por PCR
Se utilizaron dos primers para la amplificación de una secuencia de alrededor de 476pb de longitud del ADN producto de las extracciones (Tabla 1). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador, empleando calor de arranque; comenzó con una denaturación a 95°C por 5 minutos; seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 47°C, 1 minuto 30 segundos a 72°C y una extensión final 10 minutos a 72°C.
Todas las muestras fueron amplificadas en un volumen final de 35 µl que
contiene: 20.3 µl de H2O destilada y estéril, 3.5 µl de MgCl2 (25µM), 3.5 µl de Buffer (5X) de la Taq polimerasa, 0.7 µl de dNTPs (1mM), 1.75 µl (10mM) de primer inicial, 1.75 µl (10mM) de primer final, 1.75 µl (10ng/µl) de ADN y 1.75 µl de Taq polimerasa. Finalmente, los productos de la PCR se almacenaron a -4°C.
Tabla 1. Primers utilizados para secuenciar el gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI).
Nombre a F/R Sitio b (final 3´) Secuencia (5´ 3´) Jerry F 2183 CAACATTTATTTTGATTTTTTGG Mila R 2659 GCTAATCCAGTGAATAATGG a Primers obtenidos de Caterino & Sperling 1999, Caterino et al. 2001. b Posición relativa a Drosophila yakuba (Clary & Wolstenholme 1985) para los primers COI.
5.2.4 Electroforesis de ADN
Se verificaron 5 µl del producto de extracción ó de PCR, con 3 µl de buffer de carga, en geles de agarosa al 2% (Hartwell et al. 2000) y en una cámara de electroforesis horizontal, en la cual se adicionaron 8 µl de Bromuro de etidio (1 mg/ml). Los productos de extracción y de PCR se corrieron durante 50
31 minutos a 100 voltios. Para identificar el tamaño o rango de pares de bases (476pb) de los productos de PCR, se utilizó un marcador DNA Ladder (100pb) (fragmentos de ADN de tamaño conocido).
5.2.5 Secuenciación de ADNmt
Una vez obtenidos los productos de PCR correspondientes a las muestras de ADNmt, fueron purificados y secuenciados por MACROGEN Ltda.; estos productos se secuenciaron directamente en ambos sentidos de la doble cadena.
5.3 Recolección de la información
Las muestras fueron ordenadas por especie y subespecie de acuerdo a su clasificación morfológica (clasificación taxonomica tradicional). Se transfirió la muestra de cada espécimen a un tubo eppendorff de 1.5 µl debidamente marcado. Posteriormente se realizó la extracción de ADN por espécimen, con el protocolo DNeassy Tissue Kit (Qiagen QIAamp) y Salting-Out, anteriormente descritos. Una vez obtenido el ADN de los especimenes, este se preservó a -20°C, para luego realizar las amplificaciones de ADN por PCR.
La estandarización del contenido para PCR se realizó por medio de diferentes pruebas, se realizó verificación en geles de agarosa al 2% y se registró el ADN amplificado por medio de una foto o un gráfico. Si una de las muestras producto de PCR presentaba una banda de ADN, esta era positiva, posterior a esto se realizaban otros ciclos de amplificación de 8 a 12 muestras, repitiendo el mismo proceso hasta continuar con la amplificación para todas las muestras de ADN. Si las muestras eran negativas se probaban diferentes condiciones de reacción hasta que fueran positivas. Una vez amplificadas todas las muestras, fueron almacenadas a -4°C, hasta su
32 posterior traslado a la fase de secuenciación. Obtenidas las secuencias de las muestras, estas se alinearon para realizar los análisis de datos respectivos.
5.4 Análisis de la información
5.4.1 Alineamiento de ADN
Las secuencias nucleotídicas fueron alineadas manualmente con el programa BioEdit versión 7.0.5 (Hall 2005), utilizando la secuencia de COI de Drosophila yakuba (Clary & Wolstenholme 1985); se compararon ambos sentidos de la doble cadena para cada muestra (espécimen) y todas las secuencias se analizaron por medio de POY 3.0.11 (Wheeler et al. 2003). Para optimizar el alineamiento los gaps no se observaron como entidades, se tomaron como indels (eventos de inserción/deleción), siendo un proceso para crear secuencias de igual longitud y poder reconstruir hipotéticamente las secuencias ancestrales (Wheeler 1996).
5.4.2 Análisis Filogenético
Para estimar estos análisis primero se analizó la matriz de datos completa mediante PAUP 4.0q (Swofford 1999). Por medio del programa MODELTESTS 3.06 (Posada & Crandall 1998), se determinó el modelo de evolución que mejor se ajusta al gen, la proporción de transición/transversión y los parámetros del modelo de sustitución que mejor se ajustan a los datos obtenidos.
33 5.4.2.1 Análisis de Máxima Parsimonia
Para determinar Máxima Parsimonia (MP) se utilizaron 695 caracteres moleculares, los cuales fueron organizados en una matriz utilizando el programa POY 3.0.11 (Wheeler et al. 2003). Los análisis de MP se ejecutaron por medio de TNT 1.0 (Goloboff et al. 2003) empleando los siguientes parámetros: búsqueda heurística, TBR branch-swapping para obtener los árboles más parsimoniosos, adición de 500 réplicas y un ratchet de 200 iteraciones que generaron una hipótesis nula, caracteres multiestado tratados como polimorfismos y todos con pesos diferentes, los gaps fueron contados como datos faltantes. El índice de consistencia (CI) y el índice de retención (RI) fueron calculados por Winclada 1.00.08 (Nixon 1999-2002).
De igual manera, con TNT 1.0 (Goloboff et al. 2003) se determinó el grado de soporte o la robustez de las ramas empleando: Análisis de Jackknife (Felsenstein 2003), con 1000 réplicas, bajo el criterio de mínima evolución; y el soporte absoluto de Bremer (Felsenstein 2003), cuyo análisis fue calculado con la adición de 1000 taxones al azar como réplicas, TBR branch-swapping y reteniendo en cada réplica 100 árboles. Los valores del soporte de Bremer se definieron como: “soporte débil” valores de Bremer de 1-6 (correspondiendo a valores de Jackknife 3-40%), “soporte moderado” con valores entre 7-16 (valores de Jackknife 41-70%), “soporte bueno” con valores entre 17-22 (valores de Jackknife 71-88%) y “soporte fuerte” con valores >22 (valores de Jackknife 89-100%).
Por medio de PAUP 4.0q (Swofford 1999), se determinó el número de sitios constantes, sitios variables no informativos y el número de sitios informativos de parsimonia.
34 5.4.2.2 Análisis Bayesianos
Los análisis Bayesianos se realizaron con MrBayes 3.1 (Ronquist et al. 2005), el cual emplea un modelo de las Cadenas de Markov-Monte Carlo (MCMC). Se corrieron simulaciones de seis cadenas simultáneas para 10.000.000 de generaciones, el muestreo de los árboles se realizó sobre 250 ciclos. La estabilidad del proceso se alcanzó cuando los valores de la probabilidad se aproximaron al equilibrio, esto se determinó en un diagrama de líneas de Ln de probabilidad contra tiempo de generación (Lin & Danforth, 2004). Se descartaron los primeros 1000 árboles como “calientes” (árboles y parámetros estimados obtenidos antes del equilibrio). Los valores de Probabilidad Posterior (PP) se definieron como: “débil” valores entre 53-61%, “bueno” con valores entre 65-95% y “fuerte” con valores >97%.
35 6. RESULTADOS
6.1 Revisión y análisis molecular de los especímenes
De las colecciones visitadas se revisaron 403 ejemplares del subgénero Parides, para la extracción de ADN se seleccionaron 137 pertenecientes a los años 1996-2006 (Anexo 3), de estos se logró obtener el ADN de 130 y 80 de ellos se obtuvo amplificación del fragmento de estudio de COI. Una vez alineadas las 80 muestras se realizó el análisis de filogenia y distribución geográfica de 25 de ellas, debido a que las muestras restantes presentaron en el alineamiento un bajo porcentaje de coincidencia nucleótidica (<80%) respecto a la secuencia de COI para Drosophila yakuba (Clary & Wolstenholme 1985).
Por otra parte, en relación a los métodos de extracción de ADN, el método de Pascual et al. (1997) se modificó para Parides en cuanto al proceso de maceración de los tejidos con el buffer de lisis, el cual presentaba cristalización de los tejidos y no permitía la rotura total de ellos; por esta razón este proceso se efectuó con Nitrógeno líquido con el fin de obtener rotura total de los tejidos y por ende mayor cantidad de ADN de las mariposas.
Con este método se obtuvo alta o baja cantidad de ADN (alta corresponde a la presencia de una banda fuerte de ADN evidenciada en el gel de agarosa y baja a una banda débil). Igualmente, la extracción con el protocolo de DNeassy Tissue Kit (Qiagen QIAamp), proporcionó alta o baja cantidad de ADN, aunque para algunas muestras se evidenció la presencia del ADN degradado correspondiente a las muestras entre los años 1997 y 2004.
En relación a la fase de amplificación, se evidenció que el fragmento amplifica dependiendo la especie; es decir se presentaron especies con una alta cantidad de ADN, en donde el marcador molecular funcionó perfectamente y en otros casos a
36 pesar de realizar diferentes estandarizaciones de amplificación como cambios en la temperatura de anillamiento y en el volumen del buffer de la polimerasa, el cloruro de magnesio, la concentración de la polimerasa y el volumen final de la reacción, la muestra no amplifico (p.e Parides neophilus), o en otros casos las señales de amplificación fueron bajas (p.e P. sesostris, P. childrenae y P. eurimedes); lo anterior puede corresponder a que el ADN de algunas especies de Parides podría presentar una mutación en la zona de complementariedad con los primers (alelo-específicos), ocasionando una disminución o perdida de especificidad de los primers hacia la secuencia complementaria.
Respecto al alineamiento, las secuencias presentaron un alto número de indels, posiblemente debido a que este se realizó a ojo con la ayuda del programa BioEdit versión 7.0.5 (Hall 2005), además en algunas regiones de las secuencias analizadas de COI el alineamiento fue un poco ambiguo, con respecto a la secuencia de Drosophila yakuba; asimismo, las secuencias presentaron ambigüedad en el codon de iniciación, lo que confirma estudios de Lunt et al. (1996) y Mitchell et al. (1993), en secuencias de COI para insectos.
6.2 Análisis Filogenético
Se analizaron las bases y posiciones de 695 pb del gen COI (695 caracteres), incluyendo nucleótidos y gaps; 161 caracteres fueron constantes, 56 caracteres variables no informativos de parsimonia y 478 caracteres informativos de parsimonia. Los análisis filogenéticos se determinaron bajo el modelo de evolución simple de Jukes-Cantor, GTR + G [General Time-Reversible model (Rodríguez et al. 1990), con distribución gamma y sin proporción de sitios invariables]. Acorde al análisis de los datos el promedio de A+T fue de 56.16% (26.10% A, 30.06% T) mayor que el promedio de G+C de 43.83% (19.89% G, 23.94% C) (Tabla 2).
37 Tabla 2. Estimaciones nucleotídicas de las secuencias analizadas del gen COI.
FRECUENCIA DE LAS BASES A G C T I G 0.2610 0.1989 0.2394 0.3006 0 8.3947 I = proporción de sitios invariables. G = Distribución gamma.
La proporción de transición/transversión fue de 0.816, lo que corresponde a una saturación de transición en las secuencias analizadas (Tabla 3, Figura 1); en donde se observa que la proporción de sustitución de C-T fue sustancialmente alta que otro tipo de sustitución.
Tabla 3. Tasa de sustitución nucleotídica de las secuencias analizadas de COI.
TASA DE SUSTITUCIÓN A-C A-G A-T C-G C-T G-T 1.1869 1.5471 1.7861 1.2152 2.6934 1.0000
Tasa de Sustitución Nucleotidica en COI
3 2,5 2 1,5
1
0,5
0 A-C A-G A-T C-G C-T G-T
Figura 1. Tasa de sustitución nucleotídica de las secuencias analizadas de COI.
38 6.2.1 Máxima Parsimonia
De acuerdo con los análisis de Máxima Parsimonia se obtuvo como resultado dos árboles igualmente parsimoniosos con una longitud de 3236, con índices de consistencia (IC) de 0.5 e índices de retención (IR) de 0.31 (Figuras 2 y 3), a partir de los cuales se realizó un consenso estricto dando como resultado un árbol parsimonioso con una longitud de 3240 y los mismos índices de consistencia y de retención (Figura 4). En los dos árboles completamente resueltos como en el árbol de consenso estricto se encontró una baja homoplasia (IC= 0.5) y la parafilia del subgénero Parides.
6.2.1.1 Árbol de consenso del subgénero Parides
El árbol de consenso estrito mostró menor resolución por colapsar el clado que varia en los dos árboles anteriores, en donde se encuentran las subespecies P. anchises alyattes, P. anchises serapis y P. erithalion yaminahua, mostrando relaciones inciertas entre estas subespecies. Asimismo, el árbol reveló que los nodos de las ramas básales están pobremente resueltos presentando valores de Jackknife débil y moderado (3-47%) y soporte de Bremen débil (1-6), por el contrario los nodos de las ramas terminales estuvieron bien soportados por valores de Jackknife (71%-100%) y de Bremen (17-32) buenos y fuertes.
39
Figura 2. Árbol filogenético 1 según análisis de Máxima Parsimonia, utilizando secuencias nucleotídicas de COI. Longitud 3236. IC=0.5. IR=0.31.
40
Figura 3. Árbol filogenético 2 según análisis de Máxima Parsimonia, utilizando secuencias nucleotídicas de COI. Longitud 3236. IC=0.5. IR=0.31.
41
Figura 4. Árbol filogenético de consenso según análisis de Máxima Parsimonia, utilizando secuencias nucleotídicas de COI. Longitud 3240. IC=0.5. IR=0.31. Los números de las ramas indican: porcentajes de Jackknife con 1000 replicas (encima del nodo) y valores del soporte de Bremen (debajo del nodo). Los triángulos indican el sexo del espécimen: azul macho, rojo hembra.
42 En el análisis de Máxima Parsimonia (MP) (Figura 4), las relaciones de Parides con el grupo externo Pachliopta neptunus y Atrophaneura alcinous, no fueron claramente resueltas, dado que Pachliopta neptunus grupo hermano de todos los taxones de Troidini neotropicales, se asocio con P. lysander lysander taxón del grupo interno (con valor de Jackknife moderado y soporte de Bremer débil); sin embargo, Atrophaneura alcinous si apareció como grupo externo de Parides (Miller 1987) y asociado con P. bunichus, especie basal de los taxones de Parides. Dentro de todos los arreglos que se hicieron para la elaboración del árbol filogenético, fue interesante observar que al colocar en la matriz de datos a Atrophaneura alcinous como primera especie y a Pachliopta neptunus como segunda, Pachliopta siempre se agrupó dentro del clado de Parides; por el contrario, si Pachliopta se colocaba como primera especie en la matriz de datos y Atrophaneura como segunda, esta se relacionaba con P. bunichus y Pachliopta quedaba como grupo externo.
Por su parte, P. bunichus con un valor de Jackknife fuerte y soporte de Bremer incierto, se encontró como especie basal de los taxones de Parides correspondiendo al grupo Ascanius, grupo basal de las especies de Parides según Rothschild & Jordan (1906) y Silva- Brandão et al. (2005). P. neophilus se encontró como especie basal de Parides, lo que no es coherente con estudios previos; además su soporte de Bremer débil, indica relaciones poco robustas con el clado de Parides. Es importante observar que las secuencias de los taxones obtenidas del GenBank se separaron de los taxones cuyas secuencias se obtuvieron del trabajo de laboratorio, lo anterior puede deberse a los indels introducidos en las secuencias durante el alineamiento; sin embargo P. panthonus jaguarae a pesar que su secuencia se obtuvo del GenBank, se agrupó en el clado que incluye a las Parides pero con valores de Bremer y Jackknife débiles, lo que indica relaciones poco sólidas de esta especie con las restantes Parides.
Por su parte, los taxones remanentes de Parides se dividieron en tres grupos y cuatro subgrupos. Los grupos se conformaron por: Grupo 1: (Pachliopta neptunus + (P. lysander lysander 1 + P. lysander lysander 2)) con valores de Jackknife moderado y
43 soporte de Bremer débil, este grupo incluye a las especies más básales dentro de las Parides analizadas (Figura 5). Grupo 2: (((P. chabrias chabrias + P. lysander brissonius) + (P. vertumnus bogotanus 2 + (P. eurimedes arriphus 1 + P. eurimedes arriphus 2))) + ((P. phosphorus gratianus + P. lycimenes erythrus 2) + (P. childrenae childrenae 1 + (P. childrene childrenae 2 + (P. vertumnus bogotanus 1 + P. eurimedes arriphus 3))))), valores de Jackknife débil y soporte de Bremer fuerte. Grupo 3: (P. panthonus jaguarae (P. anchises serapis 2 + (P. erithalion yaminahua + P. anchises serapis 1) + (P. anchises alyattes 1 + P. anchises alyattes 2)) + ((P. lycimenes erythrus 1 + P. lycimenes eruthrus 3) + ((P. iphidamas 1 + P. iphidamas 2) + (P. aeneas bolivar + (P. sesostris tarquinius 1 +P. sesostris tarquinius 2))))) valores Jackknife y de Bremer débiles.
47 6 Parides lysander lysander (1) 100 36 Parides lysander lysander (2)
Figura 5. Anidamiento de los taxones del Grupo 1 según análisis de Máxima Parsimonia.
Los subgrupos fueron integrados por: A: ((P. chabrias chabrias + P. lysander brissonius) + (P. vertumnus bogotanus 2 + (P. eurimedes arriphus 1 + P. eurimedes arriphus 2)) con valor de Jackknife fuerte y soporte de Bremer bueno (Figura 6). B: ((P. phosphorus gratianus + P. lycimenes erythrus 2) + (P. childrenae childrenae 1 + (P. childrene childrenae 2 + (P. vertumnus bogotanus 1 + P. eurimedes arriphus 3)))) con valor de Jackknife y soporte de Bremer moderado (Figura 7). C: (P. anchises serapis 2 + (P. erithalion yaminahua + P. anchises serapis 1) + (P. anchises alyattes 1 + P. anchises alyattes 2)) con valor de Jackknife bueno y soporte de Bremer
44 moderado (Figura 8). D: ((P. lycimenes erythrus 1 + P. lycimenes eruthrus 3) + ((P. iphidamas 1 + P. iphidamas 2) + (P. aeneas bolivar + (P. sesostris tarquinius 1 + P. sesostris tarquinius 2)))) con valor de Jackknife bueno y soporte de Bremer moderado (Figura 9).
100 18 Parides lysander brissonius 100 17 100 17 100 Parides eurimedes arriphus (1) 17 Parides eurimedes arriphus (2)
Figura 6. Anidamiento de los taxones del subgrupo A, según análisis de Máxima Parsimonia.
100 Parides phosphorus gratianus 23 Parides lycmenes erythrus (2) 52 7 Parides childrenae childrenae (1) 100 23 Parides childrenae childrenae (1) 100 21 100 Parides vertumnus bogotanus (1) 32
Figura 7. Anidamiento de los taxones del subgrupo B, según análisis de Máxima Parsimonia.
45 76 95 10 5 Parides anchises alyattes (1) 99 26 Parides anchises alyattes (2)
Figura 8. Anidamiento de los taxones del subgrupo C, según análisis de Máxima Parsimonia.
100 Parides lycimenes erythrus (1) 30 Parides lycimenes erythrus (3) 80 Parides iphidamas (1) 13 Parides iphidamas (2) 89 17 Parides aeneas bolivar 100 16 100 Parides sesostris tarquinius (1) 22 Parides sesostris tarquinius (2)
Figura 9. Anidamiento de los taxones del subgrupo D, según análisis de Máxima Parsimonia.
Con base en este estudio el grupo 1 y el subgrupo A incluyen a las especies de Parides con manchas marginales rosadas en el ala posterior y los subgrupos B, C y D a las especies que presentan manchas marginales blancas en el ala posterior; de acuerdo a la clasificación propuesta por Rothschild & Jordan (1906) para las especies de Parides, los taxones del grupo 1 y del subgrupo A harían parte del grupo Lysander
46 y los taxones de los subgrupos B, C y D del grupo Aeneas. Sin embargo, P. chabrias chabrias y P. vertumnus bogotanus 2 del grupo Lysander; P. eurimedes arriphus 3 del grupo Aeneas no coincidieron con el grupo establecido según Rothschild & Jordan (1906); en donde P. eurimedes arriphus 3 correspondería al grupo Lysander y P. chabrias chabrias y P. vertumnus bogotanus 2 al grupo Aeneas.
La subespecie P. sesostris tarquinius (valor de Jackknife y soporte de Bremer fuerte) y la especie P. iphidamas (valor de Jackknife fuerte y soporte de Bremer moderado) conformaron grupos monofiléticos. Las subespecies restantes con más de un espécimen en el análisis presentaron grupos: Parafiléticos como P. childrenae childrenae que incluye a P. vertumnus bogotanus 1 y P. eurimedes arriphus 3 (valor de Jackknife y soporte de Bremer fuerte). Polifiléticos tal es el caso de P. lysander (P. lysander lysander y P. lysander brissonius), P. vertumnus bogotanus, P. eurimedes arriphus y P. lycimenes erythrus.
Adicionalmente, como grupos hermanos se encontró a P. lysander lysander (valor de Jackknife y soporte de Bremer fuerte), P. eurimedes arriphus (valor de Jackknife fuerte y soporte de Bremer bueno), P. lycimenes erythrus (valor de Jackknife y soporte de Bremer fuerte) y P. anchises alyattes (valor de Jackknife y soporte de Bremer fuerte).
Finalmente, la resolución de la mayoría de las ramas terminales de los taxones de Parides, se encontraron bien soportadas por valores de Jackknife y de Bremer buenos y fuertes; aunque para el clado de P. anchises serapis 1 y P. erithalion yaminahua el soporte de Bremer fue débil (5), lo que puede estar relacionado con que la rama que soporta a este clado se colapso. Además, los nodos de las ramas de los grupos 1, 2 y 3 presentaron valores de Jackknife y de Bremer débiles, y los nodos de las ramas de los cuatro subgrupos valores de Bremer débil moderado, por lo que las relaciones entre los grupos o subgrupos no son robustas.
47 6.2.2 Análisis Bayesiano
De acuerdo con los análisis Bayesiano, se obtuvo un árbol de consenso estricto (Figura 10), de 43.228 árboles restantes; la topología del árbol al incorporar el modelo de evolución GTR+G con distribución gamma fue heterogénea a lo obtenido según análisis de Máxima Parsimonia (MP). El promedio de Probabilidad Posterior (PP) para la inferencia filogenética fue de 87%. El árbol Bayesiano presentó 10 ramas colapsadas con una PP del 90%. Ocho (de 22) nodos del grupo interno presentaron una PP de 1.0, 14 nodos estuvieron soportados con un nivel de significancia >0.9 (7 nodos) y >0.5 (7 nodos).
Las relaciones del clado Parides con el grupo externo en los dos análisis presentó coincidencia con una PP fuerte (100%) para Atrophaneura alcinous y una PP moderada (61%) con respecto a Pachliopta neptunus. Las especies P. bunichus y P. neophilus al igual que MP presentaron la misma ubicación en el árbol, a diferencia que en análisis Bayesiano, la rama de P. bunichus se colapsó y P. neophilus presentó una PP fuerte (100%), comparado con el soporte de Bremer débil (7) de MP; por lo que la asignación de este taxón en el árbol puede ser precisa. Por su parte, P. panthonus jaguarae presentó colapso de su rama con una PP indeterminada, indicando relaciones confusas con los restantes taxones de Parides.
Por otro lado, los tres grupos establecidos en MP, se encontraron claramente definidos en este análisis, sin embargo los subgrupos presentaron colapso en algunas de sus ramas, diferente distribución de los clados y de los taxones, por lo que las relaciones entre los taxones terminales variaron. Grupo 1: No varió presentando una PP débil (61%). Subgrupos: A: Su rama interna se colapsó con una PP fuerte; las relaciones entre los dos clados de este subgrupo no variaron con respecto a MP, por lo que las relaciones entre los taxones terminales permanecieron constantes con PP fuertes. B: Las relaciones entre los clados presentes en MP variaron, debido a que el clado (P. phosphorus gratianus + P. lycimenes erythrus 2) con una PP fuerte presentó
48 colapso de su rama, al igual que el clado (P. childrenae childrenae 1 + (P. childrene childrenae 2 + (P. vertumnus bogotanus 1 + P. eurimedes arriphus 3) con una PP fuerte, lo que permite proponer que estos dos clados no conforman un grupo monofilético, como se encontró en MP. En relación a los taxones que conformaron cada clado presentaron PP fuertes (99-100%) y coincidencia con MP.
C: Las relaciones entre sus taxones variaron enormemente; P. erithalion yaminahua, agrupado en el clado de P. anchises para MP, se encontró fuera de este clado y su rama se colapsó. Además, todas las P. anchises conformaron un grupo monofilético con una PP moderada y se estableció como grupo hermano de P. lycimenes erythrus, conflictuando con las relaciones establecidas en MP para este taxón. D: Las relaciones entre los clados presentes en MP variaron considerablemente en donde las ramas de los clados (P. iphidamas 1 + P. iphidamas 2) y (P. aeneas bolivar + (P. sesostris tarquinius 1 + P. sesostris tarquinius 2) se colapsaron con una PP fuerte (100 y 97%); el clado de P. lycimenes erythrus se encontró como grupo hermano de P. anchises con una PP buena (0.65%), conflictuando con las relaciones de P. lycimenes erythrus + P. iphidamas + P. aeneas bolivar + P. sesostris tarquinius según análisis de MP. Tanto en análisis Bayesiano como de MP los clados de P. iphidamas, P. sesostris tarquinius y P. lycimenes erythrus se mantuvieron como grupos monofiléticos (100% de PP y 100 Jackknife). Además se mantuvo la relación de P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius.
En efecto, los clados que se modificaron en análisis Bayesiano con respecto a MP, correspondieron a los clados con soportes de Bremer débil a moderado; asimismo los nodos de las ramas básales del árbol de MP que presentaron valores de Jackknife y de Bremer débiles, pertenecen en análisis Bayesiano a las ramas con PP débil (53-56%) y a las ramas que se colapsaron. Por su parte, el análisis Bayesiano al igual que el de MP, estableció claramente los dos grupos principales de Parides grupo Lysander y Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), debido a que las relaciones de los taxones
49 terminales en gran parte no se modificaron, siendo consecuente con los buenos valores de Jackknife, Bremer y PP que los soportan.
Atrophaneura alcinous
Parides bunichus Grupo Ascanius Parides neophilus Pachliopta neptunus
0.61 Parides lysander lysander (1) Grupo 1 0.99 Parides lysander lysander (2) 100 Parides panthonus jaguarae Parides phosphorus gratianus 0.99 Parides lycimenes erythrus (2)
0.53 Parides childrenae childrenae (2) B 0.99 Parides childrenae childrenae (1) 1.00 Parides vertumnus bogotanus (1) 1.00 Parides eurimedes arriphus (3) Grupo 2 Parides chabrias chabrias 0.95 Parides lysander brissonius 0.56 0.97 Parides vertumnus bogotanus (2) A 1.00 Parides eurimedes arriphus (1) 0.99 Parides eurimedes arriphus (2) Parides erithalion yaminahua Parides iphidamas (1) 1.00 Parides iphidamas (2) Parides aeneas bolivar D (1) 0.69 0.97 Parides sesostris tarquinius 1.00 Parides sesostris tarquinius (2) Parides lycimenes erythrus (1) Grupo 3 1.00 Parides lycimenes erythrus (3)
0.65 Parides anchises serapis (1) Parides anchises serapis (2) 0.65 C 0.61 Parides anchises alyattes (1) 1.00 Parides anchises alyattes (2)
Figura 10. Árbol filogenético según análisis Bayesiano. Los valores de las ramas indican la probabilidad posterior Bayesiana.
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51 6.3 Determinación de los taxones de especie y subespecie de Parides en Colombia.
Se analizaron 12 especies y 13 subespecies de Parides presentes en Colombia (Anexo 2: Tabla 1), las que mostraron correspondencia respecto a la designación especifica y subespecífica a nivel morfológico, propuesta en principio por Rothschild & Jordan (1906) y posteriormente por Tyler et al. (1994), Fagua (1997) y Le Crom et al. (2002); y el análisis de distribución geográfica de Parides en Colombia propuesta por Tyler et al. (1994) y Fagua (1997), quienes plantean a las subespecies de acuerdo a sus distribuciones alopátricas y simpátricas respectivamente (Figura 11).
Lo anterior fue un factor importante en la validación de los taxones analizados a nivel de especie y subespecie de Parides; además, esta delimitación fue coherente con el concepto de especie filogenético de Nixon & Wheeler (1990), quienes la definen como una detectable pequeña unidad de población monofilética, por lo que la monofília que presentaron varios de los taxones con más de un individuo en el análisis de MP, permitió hacer valido a una especie y cinco subespecies de Parides, tal fue el caso de P. iphidamas, P. anchises alyattes, P. eurimedes arriphus, P. lycimenes erythrus, P. lysander lysander y P. sesostris tarquinius.
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Figura 11. Taxones analizados del subgénero Parides y su localidad geográfica en Colombia.
53 6.3.1 Parides aeneas bolivar (Hewitson, 1850)
Comentario: La hembra que se estudio presentó coincidencia en cuanto a la distribución geográfica de su localidad y a las manchas blancas del margen distal en el Ala Anterior (AA) reconocibles para esta subespecie (Figura 12).
Figura 12. Distribución de Parides aeneas bolivar en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidad del espécimen analizado.
54 6.3.2 Parides anchises (Linné, 1758)
6.3.2.1 Parides anchises serapis (Boisduval, 1836)
Comentario: Se estudiaron dos machos los cuales presentaron areales cercanos y el fenotipo y la localidad geográfica coincidieron con lo propuesto para esta subespecie (Figura 13); sin embargo las relaciones filogenéticas imprecisas con P. erithalion yaminahua en análisis de MP no permiten hacer valido a esta subespecie.
6.3.2.2 Parides anchises alyattes (Felder& Felder, 1861)
Comentario: Se acepta valido la designación de esta subespecie debido a que los patrones de coloración y areal geográfico de los especímenes analizados (macho y hembra), corresponden a lo descrito para esta subespecie (Figura 13); además el análisis de MP los agrupó como un grupo hermano.
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Figura 13. Distribución de las subespecies de Parides anchises en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados de Parides anchises serapis. Parides anchises alyattes.
56 6.3.3 Parides chabrias chabrias (Hewitson, 1852)
Comentario: El patrón de coloración y la localidad geográfica que presentó el espécimen estudiado (hembra), corresponde a lo propuesto para esta subespecie (Figura 14).
Figura 14. Distribución de Parides chabrias chabrias en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidad del espécimen analizado.
57 6.3.4 Parides childrenae childrenae (Gray, 1832)
Comentario: El material estudiado corresponde a dos machos, los que presentaron iguales patrones de coloración y areales, siendo equivalente con lo designado para esta subespecie (Figura 15); sin embargo en análisis de MP conformaron un grupo parafilético con P. vertumnus bogotanus y P. eurimedes arriphus, por lo que no se hace valido la designación de esta subespecie.
Figura 15. Distribución de las subespecies de Parides childrenae en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
58 6.3.5 Parides eurimedes arriphus (Boisduval, 1836)
Coementario: Los especímenes analizados (dos machos y una hembra) presentaron correspondencia frente al fenotipo y a la localidad geográfica propuesta para esta subespecie (Figura 16). De acuerdo al análisis de MP esta subespecie conformó un grupo polifilético, en donde dos especímenes (macho y hembra) establecieron un grupo monofilético siendo consecuente con la alta coincidencia nucleotídica que presentaron los dos, comparándola con la del espécimen (macho) que no se asocio en este clado. Sin embargo, se aceptaría la designación de esta subespecie.
Figura 16. Distribución de las subespecies de Parides eurimedes en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
59 6.3.6 Parides erithalion yaminahua (Pischedda & Racheli, 1987)
Comentario: Es una subespecie rara para Colombia, según Tyler et al. (1994) es una subespecie con distribución para Perú, por lo que probablemente se trata de una forma intermedia de una especie de Parides erithalion presente en Colombia; de tal manera que se necesita incorporar en el análisis molecular otras especies de Parides erithalion y de esta subespecie, con el fin de aceptar la validez de esta subespecie para Colombia (Figura 17).
Figura 17. Distribución de las subespecies de Parides erithalion en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidad del espécimen analizado.
60 6.3.7 Parides iphidamas (Fabricius, 1793)
Comentario: La designación de esta subespecie a los especímenes analizados (dos hembras) puede justificarse en la coincidencia fenotípica, en los areales geográficos propuestos para esta especie (Figura 18) y en el análisis de MP, el cual agrupó a los dos especímenes como grupo monofilético a pesar que son dos formas distintas de hembras dentro de esta especie. Por su parte, la aceptación de este taxón se mantuvo a nivel de especie para los especímenes analizados, debido a que no presentaron semejanza morfológica con los fenotipos descritos para las subespecies propuestas en este taxón. En este sentido, la asignación que ahí de subespecies simpátricas de esta especie no tendría validez.
6.3.8 Parides lycimenes erythrus (Rotshchild & Jordan 1906)
Comentario: A partir de los especímenes analizados (tres hembras), se reconoce como valido la designación de este taxón, debido a la coincidencia fenotípica y a las localidades propuestas según patrones de distribución geográfica para esta subespecie (Figura 19). Además, el análisis de MP agrupó a dos de los especímenes como un grupo hermano, a pesar de presentar areales distantes y dos formas distintas de hembras de esta subespecie. Un tercer espécimen fue separado de este clado, probablemente porque la hembra analizada puede corresponder a una forma geográfica no coincidente o la designación taxonómica dentro de las hembras de esta subespecie es incorrecta, característica que presentan algunas de las hembras de Parides (Fagua 1997).
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Figura 18. Distribución de las subespecies de Parides iphidamas en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
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Figura 19. Distribución de las subespecies de Parides lycimenes en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
63 6.3.9 Parides lysander (Cramer, 1775)
6.3.9.1 Parides lysander lysander (Cramer, 1776)
Comentario: Se aceptaría valido la designación de este taxón, de acuerdo a la coincidencia fenotípica y la localidad geográfica de los especímenes analizados (macho y hembra) respecto a estudios previos (Figura 20); asimismo, el análisis de MP agrupó a los dos especímenes como un grupo hermano separándolo de Parides lysander brissonius.
6.3.9.2 Parides lysander brissonius (Hübner, 1819)
Comentario: En principio la aceptación de este taxón se hizo válida, debido a que el fenotipo y la localidad geográfica del material examinado (macho), coincidió con lo descrito para esta subespecie (Figura 20); además, el análisis de MP separo a este taxón de Parides lysander lysander. Sin embargo, el encontrar a estas dos subespecies en la misma localidad, se permite demostrar la no validez de este taxón y por lo tanto debe ser un fenotipo (sinónimo) de Parides lysander lysander.
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Figura 20. Distribución de las subespecies de Parides lysander en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados de Parides lysander brissonius. Parides lysander lysander.
65 6.3.10 Parides phosphorus gratianus (Bates, 1861)
Comentario: El espécimen analizado (macho), presentó coincidencia fenotípica y la localidad geográfica propuesta para esta subespecie (Figura 21).
Figura 21. Distribución de Parides phosphorus gratianus en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidad del espécimen analizado.
66 6.3.11 Parides sesostris tarquinius (Boisduval, 1836)
Comentario: Los especímenes analizados conservaron fidelidad en cuanto al areal de distribución geográfica propuesto para esta subespecie, además la coincidencia fenotípica (Figura 22) y el estar agrupado como un grupo hermano según análisis de MP permiten hacer valido la designación de este taxón.
Figura 22. Distribución de las subespecies de Parides sesostris en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
67 6.3.12 Parides vertumnus bogotanus Felder (1864)
Comentario: Los especímenes analizados (macho y hembra), presentaron correspondencia frente al fenotipo y frente a la localidad geográfica propuesta para esta subespecie (Rothschild & Jordan 1906 y Fagua 1997) (Figura 23). Sin embargo, en el árbol filogenético conformaron un grupo polifilético, lo que puede deberse a que la hembra analizada puede corresponder a una forma geográfica no coincidente o la designación taxonómica dentro de las hembras de esta subespecie es incorrecta, característica que presentan algunas de las hembras de Parides (Fagua 1997).
Figura 23. Distribución de las subespecies de Parides vertumnus en Colombia. En sombreado la distribución propuesta por Tyler et al. (1994), los símbolos negros la propuesta por Fagua (1997). Localidades de los especímenes analizados.
68 DISCUSIÓN
7.1 Análisis Filogenético
Este análisis corresponde a la primera propuesta filogenética del subgénero Parides que incluye el mayor número de taxones del grupo Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), del cual se analizaron 12 especies y 13 subespecies reconocidas para Colombia por Tyler et al. (1994), Fagua (1997) y Le Crom et al. (2002). Con base en los resultados de Máxima Parsimonia (MP) y análisis Bayesiano el subgénero Parides comprende un grupo parafilético, siendo no consecuente con los arreglos filogenéticos de Hancock (1983) y Miller (1987), quienes proponen a Parides como un grupo monofilético.
Según análisis de Máxima Parsimonia Atrophaneura alcinous quedo como grupo externo del subgénero Parides, evento que apoyaría el planteamiento propuesto por Munroe (1961) y seguido por Miller (1987), en dividir a Parides en las especies del Viejo Mundo (Atrophaneura) y las del Neotrópico (Parides). Por su parte, Parides se dividió en tres grupos (Figura 4), que coinciden en buena parte con los grupos Lysander y Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), quienes las ubicaron en la subsección A “Aristolochia-Swallowtail” equivalente a los Troidini Americanos. Estos grupos corresponderían a mariposas que presentan menos series submarginales de manchas rojas en el ala posterior y son más especializadas (Hancock 1983). Dentro de las Parides (Parides) analizadas, la ubicación de P. bunichus en la posición más basal, coincide con lo propuesto por Rothschild & Jordan (1906) y Silva- Brandão et al. (2005), en ubicar a esta especie en el grupo Ascanius, grupo que retiene gran número de caracteres primitivos y tiene una distribución disyuntiva, restringida al Norte y Centroamérica, Ecuador y Centro y Sur del Brasil; por lo tanto, este trabajo se corroboraría en buena parte la división de Parides según Rothschild & Jordan (1906), hecha con base en análisis morfológicos.
69 La topología general obtenida del subgénero Parides, fue diferente según análisis de MP y Bayesiano, excepto para la ubicación de P. neophilus que se mantuvo estable en los dos análisis como grupo hermano de las restantes Parides, aunque la ubicación estuvo débilmente soportada (soporte de Bremer débil), lo que hace indefinida la relación de estos taxones con el subgénero Parides, a pesar de presentar valores de Jackknife y PP fuertes (Figura 4 y 10); además el ejemplar analizado correspondió a un espécimen de Brasil, lo que posiblemente hace imprecisa la relación de este taxón respecto a las Parides de Colombia.
De acuerdo con las restantes Parides, el análisis de MP permitió dividir a los ejemplares analizados en tres grupos: 1, 2, 3, coincidentes en buena parte con los grupos Lysander y Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), que a su vez se dividen en cuatro subgrupos. Coincidentes con el grupo Lysander, se relacionaron los ejemplares de P. lysander lysander, P. lysander brissonius, P. chabrias chabrias, P. vertumnus bogotanus y P. eurimedes arriphus, comprendiendo a mariposas con manchas marginales rosadas en el ala posterior, a excepción de P. chabrias chabrias y P. vertumnus bogotanus 2, las cuales corresponden al grupo Aeneas de Rothschild & Jordan (1906). La ubicación de: P. chabrias chabrias dentro de este grupo posiblemente se deba a que de este grupo de especies, que incluye a Parides haneli, P. quadratus, P. pizarro, P. vercingetorix y P. klagesiesi, solo fue posible obtener el amplificado de un espécimen, lo que estaría relegando su vinculación a cualquier rama. Respecto de P. vertumnus bogotanus 2, su ubicación puede ser explicada por porque la hembra analizada puede corresponder a una forma geográfica no coincidente o la designación taxonómica dentro de las hembras de esta subespecie es incorrecta, característica que presentan algunas de las hembras de Parides (Fagua 1997); por lo que es importante realizar un análisis de caracteres morfológicos, para evaluar la fiabilidad de la información generada a partir de este estudio y poder dar una definición más robusta respecto a la designación de esta subespecie.
70 En la posición más basal de Parides se encontró el grupo 1 con los ejemplares de Pachliopta neptunus y P. lysander lysander (Figura 5), ubicación que se mantuvo estable en los análisis de MP y Bayesiano; sin embargo los valores de Bremer y de PP de las ramas internas de este clado fueron débiles, por lo que la asignación como rama de divergencia basal de Parides debe tomarse como poco precisa. De igual manera, la ubicación de Pachliopta neptunus dentro de este grupo, puede ser una relación indefinida, debido a la no inclusión en el presente análisis de Cressida y Euryades taxones hermanos de Pachliopta (sensu Miller 1987); esta ubicación concuerda con el moderado valor de Jackknife, soporte de Bremer y de PP débil, lo que permite establecer como no confiable la relación de este taxón con Parides. Por su parte, las relaciones entre los dos ejemplares de P. lysander lysander, se encontraron fuertemente soportados, siendo consecuente con que, a nivel morfológico, corresponderían a la misma subespecie; además, macho y hembra conformaron un grupo monofilético, lo que validaría la designación subespecifica.
Según Silva-Brandão et al. (2005), P. lysander se localiza dentro del grupo 4, correspondiendo al grupo de mariposas más evolucionadas, lo cual no coincidió con lo propuesto en este estudio. Sin embargo, si se encontró una correspondencia con lo planteado en los trabajos de Rothschild & Jordan (1906), D’Almeida (1966) y Fagua (1997), en relación de no aceptar el estatus subespecífico de brissonius y designarlo como sinónimo de lysander, debido a que los dos fenos fueron colectados en la misma localidad. Para soportar lo anterior es importante aumentar el muestreo de especimenes de P. lysander en la localidad donde fueron colectados los especímenes de este análisis, esto con el fin de evidenciar niveles apropiados de variación, además que permitirían determinar con mayor exactitud el estatus de las subespecies de P. lysander (Zwickl & Hillis 2002).
El Grupo 2 presentó valor de Jackknife débil en su rama basal, lo que indica que las relaciones entre los subgrupos que lo integran (A y B) son poco robustas, evento evidenciado en análisis Bayesiano, en donde las ramas que soportan cada subgrupo se
71 colapsaron con PP fuertes. Referente al subgrupo A, sus ramas internas estuvieron bien soportadas y presentaron valores de Jackknife y PP fuerte; este grupo incluyó dos clados (P. chabrias chabrias + P. lysander brissonius) y (P. vertumnus bogotanus 2+ (P. eurimedes arriphus 1 + P. eurimedes arriphus 2)) (Figura 6).
Las relaciones de P. chabrias en este análisis no fueron coincidente con lo propuesto por Silva-Brandão et al. (2005), en donde ubican a P. chabrias chabrias como el taxón más basal del grupo G3, donde se encuentran P. childrenae, P. photinus, P. sesostris, P. vertumnus cutora y P. anchises; esto puede deberse al planteamiento formulado anteriormente.
La relación de P. vertumnus bogotanus 2 y P. eurimedes arriphus (1,2) dentro del subgrupo A presentó un soporte de Bremer bueno y valores de Jackknife y PP fuertes; sin embargo esta relación puede ser imprecisa, debido a lo mencionado anteriormente para P. vertumnus bogotanus 2. Por lo cual, es preciso analizar un mayor número de estos especímenes, con el fin de asegurar las relaciones de este taxón con P. eurimedes arriphus y con los restantes taxones del grupo Lysander.
Respecto a P. eurimedes arriphus, su ubicación en este grupo presentó valores de Jackknife y PP fuertes y soporte de Bremer bueno, lo anterior es consecuente con que los dos especímenes de esta subespecie (macho y hembra) conformaron un clado a pesar de presentar distribuciones geográficas distantes. Silva-Brandão et al. (2005), incluyen a P. eurimedes dentro del grupo más divergente de Parides; según estos autores las relaciones del clado en el cual se encuentra esta especie son difíciles de resolver debido a la distribución geográfica que presentan las especies que lo conforman: P. neophilus con una amplia distribución y dos especies restringidas P. zacinthus en bosques de la Mata Atlántica y P. eurimedes con distribución Transandina. De tal manera que la ubicación filogenética propuesta para P. eurimedes en este trabajo diferente de la de Silva-Brandão et al. (2005), posiblemente correspondería a la propuesta de que es una especie muy variable, en donde los
72 especimenes de Colombia se encuentran en área de cruzamiento de las poblaciones de Centro y Suramérica, coincidiendo con el planteamiento de Fagua (1997).
El otro ejemplar de eurimedes arriphus del chocó, se asoció a un espécimen del subgrupo B (Figura 7); por lo que el estatus de la subespecie arriphus podría no ser valido. Lo anterior apoyaría el planteamiento propuesto por Fagua (1997), respecto al aumentar el análisis de un mayor número de especímenes de P. eurimedes arriphus, debido a que es una subespecie variable en Colombia que presenta zonas de hibridación con P. eurimedes mycale y P. eurimedes antheas; con el fin de dar una validación más certera de la designación subespecifica de los taxones de P. eurimedes.
Los taxones que integran los subgrupos B, C y D correspondieron en su mayoría al grupo Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), el cual sería el grupo más divergente de Parides según análisis de MP e inferencia Bayesiana; además coinciden en que este grupo presenta a las mariposas con manchas marginales blancas en el ala posterior. Las únicas excepciones de lo anterior fueron P. eurimedes arriphus 3 y P. panthonus jaguarae pertenecientes al grupo Lysander de Rothschild & Jordan (1906). La inclusión de P. eurimedes arriphus 3 en este grupo probablemente se deba a la baja coincidencia nucleotídica que presentó respecto a la secuencia de COI de Drosophila yakuba. Por otra parte, las relaciones de P. panthonus jaguarae con los taxones de Parides de Colombia son imprecisas, posiblemente porque corresponde a un espécimen del Brasil, siendo consecuente con que en análisis de MP que presentó valores de Jackknife y Bremer débiles y en el análisis Bayesiano la rama que lo contiene se colapsó. De acuerdo con lo propuesto por Silva-Brandão et al. (2005), que designan a P. panthonus jaguarae taxón hermano de P. lysander y relacionado con P. eurimedes, P. zacynthus y P. neophilus; no se encontró correspondencia con los resultados de este trabajo según MP.
73 El subgrupo B está integrado por las subespecies P. phosphorus gratianus, P. lycimenes erythrus 2, P. childrenae childrenae, P. vertumnus bogotanus 1 y P. eurimedes arriphus 3; este subgrupo presentó diferente topología en los análisis de MP e inferencia Bayesiana, por lo que las relaciones de sus taxones terminales pueden ser ambiguas. Lo anterior se asume porque la rama interna que soporta a este subgrupo mostró un valor de Jackknife y de Bremer moderado; además, en análisis Bayesiano los clados (P. phosphorus gratianus + P. lycimenes erythrus 2) y (P. childrenae childrenae 1 + (P. childrene childrenae 2 + (P. vertumnus bogotanus + P. eurimedes mycale))) se encontraron separados debido a que sus ramas se colapsaron con una PP de 99%.
P. phosphorus gratinaus se encontró como taxón basal de este subgrupo, dentro de un clado con P. lycimenes erythrus 2, presentando valores de Jackknife, Bremer y PP fuertes. Rothschild & Jordan (1906), al encontrar registros de esta especie de una hembra en Colombia y dos machos en Perú, plantearon la posibilidad que el material analizado pertenecía a dos razas o a una. Sin embargo, en este estudio el espécimen analizado corresponde a un macho el cual coincide absolutamente con los patrones de coloración de P. phosphorus gratianus; por lo que se desvirtuaría el planteamiento propuesto por Rothschild & Jordan (1906).
Fagua (1997), cuestiona la validez de P. phosphorus, debido a la dispersión de sus subespecies, la baja frecuencia y la estrecha relación que guarda con P. erithalion y P. vertumnus, por lo que plantea que esta sería resultado de la hibridización entre P. erithalion y P. vertumnus, o que las tres conforman una sola especie. De acuerdo, con los resultados de este estudio, se propone que P. phosphorus es un taxón independiente de P. erithalion y P. vertumnus, debido a que los tres se encontraron en clados separados; además, la coincidencia que presentó el espécimen analizado en relación a sus patrones de coloración y distribución geográfica propuestos para esta especie en estudios previos (Rothschild & Jordan 1906, Tyler et al. 1994, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002), permiten dar certeza de la validación de este taxón.
74 Es importante analizar un mayor número de especímenes de esta subespecie, a nivel molecular y frente a sus patrones de distribución geográfica, con el fin de evidenciar la designación subespecifica y las relaciones filogenéticas de este taxón. Lo anterior es muy importante debido a que esta subespecie se encuentra amenazada de extinción al menos de manera local, debido a la especificidad que tiene por bosques primarios intervenidos, a la baja abundancia relativa que presenta y al acelerado proceso de destrucción al que se enfrentan sus ecosistemas (Fagua 1997).
Por otra parte, la relación que presentó P. phosphorus gratianus con su taxón hermano P. lycimenes erythrus 2, estuvo fuertemente soportada según valores de Jackknife, Bremer y PP; aunque, a nivel morfológico (patrones de coloración), son muy diferentes. A pesar de que el análisis se realizó con un macho de P. phosphorus gratianus y una hembra de P. lycimenes erythrus, cabe anotar que en Colombia P. phosphorus gratianus es la única especie en la que la hembra conserva los patrones de coloración del macho (Fagua 1997), por lo que las diferencias morfológicas en estas subespecies si se presentan. Posiblemente, esta relación filogenética se debe a que la hembra de P. lycimenes erythrus 2, esté taxonomicamente mal definida debido a que las hembras en Parides son variables dentro de las especies y subespecies, o es una forma geográfica no coincidente, lo anterior se plantea por el hecho de encontrar a este espécimen separado de los restantes de P. lycimenes erythrus.
P. childrenae childrenae, se presentó en un grupo parafilético que incluyó a P. vertumnus bogotanus 1 y P. eurimedes arriphus 3. La rama interna de este clado presentó un soporte de Bremer débil según MP y colapso de su rama con una PP de 99% en análisis Bayesiano, por lo que su ubicación dentro del árbol fue poco robusta. Sin embargo, los soportes que sostienen a los taxones terminales fueron fuertes, al igual que los valores de Jackknife y de PP, por ello las relaciones entre los taxones se plantean como posiblemente válidas.
75 La no inclusión de P. childrenae childrenae dentro de un grupo monofilético puede ser consecuente con la coincidencia nucleotídica del primer taxón, fue más baja que el segundo, respecto a la secuencia de COI de Drosophila yakuba, o puede relacionarse con lo propuesto por Brown (1982), quien menciona que P. childrenae childrenae tiene una pequeña zona de hibridación en el sector norte del Chocó, zona donde fueron colectados los especimenes analizados (dos machos); las diferencias nucleotídicas entre los especímenes podrían ser el resultado de la hibridización en alguno de estos, aunque haría falta comparar más especimenes de la zona y contrastarlos con ejemplares andinos y centroamericanos.
Silva-Brandão et al. (2005) incluyen a P. childrenae dentro del grupo 3, con P. chabrias, P. photius, P. sesostris, P. vertumnus cutora y P. anchises; comparado con los resultados de este trabajo, coinciden exclusivamente en la relación que presenta P. childrenae con P. vertumnus; además, los dos presentaron a P. childrenae como taxón basal entre estas dos especies; lo anterior esta fuertemente soportado (valores de Jackknife, Bremer y PP fuertes). En contraste, la relación que incluye a P. vertumnus bogotanus 1 y P. eurimedes arriphus 3 sería imprecisa, a pesar de tener valores de Jackknife, Bremer y PP fuertes; esto porque P. eurimedes arriphus 3 definitivamente debe pertenecer al grupo Lysander de Rothschild & Jordan (1906); además la morfología de estos taxones es muy diferente (Fagua 1997). Es importante mencionar que en los subgrupos A y B, se encontró una relación filogenética entre P. vertumnus y P. eurimedes, en ambos casos con valores de Jackknife, Bremer y PP fuertes; por ello, se permite proponer que estas dos especies presentan una afinidad válida, para lo que es importante aumentar el número de especímenes a analizar, los cuales expliquen la verdadera relación filogenética que se presenta en estas dos especies. Sin embargo, en el trabajo de Silva-Brandão et al. (2005), P. vertumnus y P. eurimedes, se encontraron en grupos distintos, mostrando una fuerte separación filogenética.
76 En el grupo 3, donde se ubicaron los subgrupos C y D, se incluyeron los taxones P. anchises alyattes, P. anchises serapis, P. erithalion yaminahua, P. lycimenes erythrus, P. iphidamas, P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius. Según MP este grupo presentó un soporte de Bremer débil y en análisis Bayesiano cuatro de sus ramas se colapsaron, por lo que las relaciones filogenéticas de la mayor parte de los taxones variaron, lo que demuestra confusas las relaciones entre sus taxones. Vale destacar que los taxones de los subgrupos B y C fueron muy difíciles de identificar a nivel morfológico, debido a la pequeña apariencia del exterior (Rothschild & Jordan 1906); lo que se pudo evidenciar en los taxones: P. phosphorus gratianus, P. vertumnus bogotanus 2, P. anchises alyattes, P. anchises serapis y P. erithalion yaminahua.
El grupo C incluyó a los ejemplares de P. anchises alyattes, P. anchises serapis, P. erithalion yaminahua. Las relaciones filogenéticas de P. anchises serapis y P. erithalion yaminahua, no se encontraron totalmente resueltas, por lo que en el análisis de MP las ramas que soportan a estas subespecies se colapsaron; posiblemente la relación entre estas subespecies puede estar relacionada con que la secuencia de ADNmt de P. erithalion yaminahua presentó un alto porcentaje de coincidencia nucleotídica con las secuencias de P. anchises serapis, lo que puede mostrar una afinidad genética entre estas subespecies; a pesar de que a nivel de patrones de genitalia, coloración y morfología son diferentes (Fagua 1997). No obstante, hay que destacar que solo se analizó un espécimen de P. erithalion yaminahua y que esta subespecie presenta distribución en Perú (Tyler et al. 1994), por lo que puede corresponder a una forma o aberración de alguna especie de P. erithalion presente en Colombia; lo anterior debe ser ratificado mediante el análisis de más material de esta subespecie.
Referente a los dos especímenes analizados (dos machos) de P. anchises serapis, a pesar de provenir de localidades distantes, mostraron igual fenotipo y una fuerte relación filogenética al ubicarse en el árbol dentro de un mismo clado, lo que podría
77 corroborar lo planteado por Fagua (1997), quien la define como una subespecie muy distintiva y poco variable.
En los dos análisis filogenéticos P. anchises alyattes conformó un grupo monofilético con valores de Jackknife y PP fuertes; además la inclusión de un macho y una hembra en el análisis, apoyan la designación de este taxón; no obstante, Fagua (1997), cuestiona su validez, porque varios especímenes analizados presentaron el patrón de serapis dentro del área de distribución de esta subespecie; por lo que, para refutar lo anterior, es necesario ampliar el muestreo de especímenes en la zona andina, donde ocurren varias subespecies de P. anchises.
Silva-Brandão et al. (2005) establecen relaciones cercanas de P. anchises con P. vertumnus y P. sesostris incluyéndolos dentro de un mismo grupo (G3). Sin embargo, a nivel morfológico (genitalia del macho y patrones de coloración), son especies muy diferentes (Fagua 1997), lo que apoyaría la separación de estos taxones en el árbol filogenético que el presente trabajo propone (Figura 8).
El subgrupo D, incluyó a los ejemplares de P. lycimenes erythrus, P. iphidamas, P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius; las relaciones entre los taxones de este subgrupo no son claras respecto a que la rama que las soporta presento un valor de Bremer moderado en análisis de MP y en análisis Bayesiano tres clados se colapsaron. Los dos especímenes de P. lycimenes erythrus constituyeron un grupo hermano dentro del subgrupo D, según análisis de MP, lo que permitiría dar validez a este taxón. Además, P. lycimenes erythrus se encontró como grupo hermano de P. iphidamas, P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius según MP y en análisis Bayesiano conformó un grupo monofilético con P. anchises con una PP débil; por lo que, sus relaciones filogenéticas dentro del subgrupo D fueron imprecisas.
La ubicación de P. lycimenes erythrus (1 y 3) en el árbol de MP y Bayesiano, coincide con Rothschild & Jordan (1906), quienes proponen que en Colombia esta
78 subespecie se confunde con formas de P. iphidamas y P. anchises; y es concordante con Fagua (2007), quien opina que varias de las formas de hembras de Parides están taxonomicamente mal definidas y que existen formas geográficas no coincidentes; de ahí la relación que presentaría P. lycimenes erythrus con estos dos taxones. De acuerdo a lo anterior, se requiere analizar un mayor número de especímenes de P. lycimenes erythrus.
Otro grupo monofilético dentro del subgrupo D, correspondió a P. iphidamas, taxón hermano de P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius en análisis de MP, aunque en Bayesiano la rama que soporta a esta subespecie se colapso con una PP fuerte. De igual forma, es preciso resaltar que la ubicación de P. iphidamas en los dos árboles no concuerda con las relaciones propuestas para esta especie, en donde P. iphidamas estaría relacionada morfológicamente con P. anchises y posiblemente pueden conformar una sola especie (Rothschild & Jordan 1906 y Fagua 1997).
La relación de P. iphidamas con P. aeneas bolivar y P. sesostris tarquinius (soporte de Bremer bueno), permitiría evidenciar una afinidad genética entre estas especies; no obstante, resulta paradójica esta relación debido a que a nivel de patrones de genitalias y coloración P. iphidamas es diferente (Fagua 1997), por lo que su ubicación puede ser ambigua. Los dos especimenes de P. iphidamas analizados conformaron un grupo hermano, es decir que son especies que comparten una fuerte afinidad genética, a pesar de corresponder morfológicamente a dos formas de hembras distintas de P. iphidamas.
La rama de P. aeneas bolivar y las P. sesostris tarquinius se mantuvo estable en análisis de MP y Bayesiano. Esta agrupación puede estar relacionada con la similaridad que presentan las dos subespecies referente a los patrones de genitalias y coloración (Fagua 1997); en esta relación P. aeneas bolivar se encontró como subespecie basal. Silva-Brandão et al. (2005), colocan a P. aeneas y P. sesostris en dos grupos diferentes, relacionados lejanamente; además relacionan a P. aeneas con
79 P. panthonus, P. eurimedes. P. zacynthus y P. neophilus, taxones del grupo Lysander de Rothschild & Jordan (1906); planteamiento opuesto a lo encontrado en este trabajo.
Referente a P. sesostris tarquinius los dos especímenes analizados conformaron un grupo hermano en análisis de MP e inferencia Bayesiana; asimismo se analizó un macho y una hembra, que presentaron coincidencia referente al patrón de coloración y rango geográfico propuesto para esta subespecie, lo que permitiría hacer valida la designación de este taxón. Silva-Brandão et al. (2005), agrupan a P. sesostris, con P. chabrias, P. childrenae, P. photinus, P. vertumnus y P. anchises; relaciones que no son coincidentes con los resultados de este estudio.
Finalmente, el análisis de MP reveló que el grupo Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), es el grupo más derivado de Parides; que los grupos Lysander y Aeneas, presentan perdida o disminución de varios caracteres morfológicos que ocurren en los taxones ancestrales de este subgénero (grupo Ascanius), como pérdida o reducción de colas en las alas posteriores (aunque algunas especies del grupo de Aeneas las presentan, no perteneciendo a las especies de Colombia) y perdida de series submarginales de manchas rojas en las alas posteriores (Hancock 1983). Sin embargo, varios de los resultados de este trabajo están débilmente soportados, debido al pequeño número de especimenes incluidos en el análisis filogenético y a que las secuencias analizadas corresponden a una pequeña región mitocondrial.
En el mismo sentido y como se menciono anteriormente, el grupo Aeneas correspondió al grupo más evolucionado de Parides para Colombia; lo que puede corroborarse con el hecho que varias de las especies incluidas dentro de este grupo, son especies que han presentado una alta especificidad sobre especies de Aristolochia (Rothschild & Jordan 1906, Tyler et al. 1994, Fagua & Ruiz 1996, Fagua 1997, Le Crom et al. 2002, Silva-Brandão et al. 2005), más aún incluye a especies que muestran una tendencia hacia la especialización por su planta hospedero, lo que
80 puede ser resultado de la distribución geográfica de estas especies (procesos biogeográficos) (Fagua & Ruiz 1996, Silva-Brandão et al. 2005). Además, concuerda con que la mayoría de los hospederos de Parides tiene areales restringidos a zonas boscosas, y que algunos grupos de aristoloquias tienen mayor diversificación en estas zonas (Fagua & Ruiz 1996), lo que permite la colonización y por ende la diversificación de las especies de Parides.
En resumen, se encontró coincidencia entre el análisis morfológico de Rothschild & Jordan (1906), Tyler et al. (1994) y Fagua (1997) y el análisis molecular de este trabajo, en relación a la designación de los taxones de Parides. El alto número de caracteres informativos que presentaron las secuencias, permiten entender porque los dos análisis filogenéticos mostraron topologías similares frente a la filogenia de Parides. Por consiguiente, se plantea que la hipótesis filogenética obtenida para Parides, es moderadamente robusta, además los altos valores de Jackknife, Bremer y PP que presentaron sus taxones terminales fueron buen soporte; aunque es importante aumentar el número de caracteres a analizar, los que permitirían incrementar la exactitud (Hillis 1998) y el soporte (Felsenstein 2003, Sanderson et al. 2003) de la hipótesis filogenética generada.
El grado de saturación encontrado en COI, correspondió a 0.816, siendo un valor alto, lo que puede deberse a que la gran mayoría de caracteres informativos presentaron cambios rápidos (sinónimos) en la tercera posición de un codon. El resultado de esta saturación se evidenció en las altas probabilidades que se obtuvieron en el análisis Bayesiano, estos modelos altos de probabilidad pueden ser el mejor ajuste de estos caracteres para generar una topología (Monteiro & Pierce 2000).
Adicional a este parámetro, el mejor modelo de evolución del ADN correspondió a GTR+G, que contiene cuatro clases de transversiones y dos para transición; corresponde a un promedio de proporción para transversiónes y uno para transiciones, este correspondería con los pocos cambios que ocurrieron del análisis de MP
81 empleando el promedio de proporción Ti/Tv. Sin embargo, Yang & Poder (1999), resaltan que estimar la máxima probabilidad de la proporción de Ti/Tv, con el parámetro de distribución gamma, es altamente sensitivo al muestreo de taxones; por lo que es necesario aumentar este muestreo con el fin de no encontrar discrepancias entre varios análisis para un número determinado de taxones.
Varios autores han argumentado que tanto el número de caracteres como el número de taxones en ser muestreados son importantes en la buena estimación de los árboles filogenéticos (Swofford 1999). En análisis de datos moleculares adicionar taxones a un grupo de genes puede a veces mejorar las inferencias del árbol filogenético, sobre todo en los casos donde el interés es el largo de las ramas (Hillis 1996); además incrementar los taxones puede mejorar la reconstrucción del estado ancestral de los caracteres, estimar la proporción y los modelos de evolución de las secuencias, y generalmente proporcionar un resumen de la historia evolutiva de un clado (Sanderson et al.2003). Además, los resultados sugieren el análisis de modelos evolutivos, que permitan evidenciar las diferencias entre las topologías generadas; asimismo estos modelos generan un bagaje de datos heterogéneos, importantes para analizar en detalle dinámicas evolutivas de procesos de división de poblaciones filogenéticas.
82 7.2. Determinación de los taxones de especie y subespecie de Parides en Colombia.
De los 25 especímenes analizados de Parides en este estudio y comparado con un mayor número de individuos analizados en los trabajos de Tyler et al. (1994), Le Crom et al. (2002) y especialmente el de Fagua (1997), ratifica que la validación de los taxones de Parides es poco robusta, a pesar de la coincidencia con estudios previos. Lo anterior se complementaría con el análisis genético de un mayor número de especímenes, primordialmente para la definición de subespecie, ya que la mayoría de las subespecies de Parides descritas son simpátricas e involucran poblaciones en las cuales se han reconocidos híbridos (Fagua 1997).
Asimismo, el análisis molecular mostró que en la validación de las especies y subespecies de Parides es útil emplear machos y hembras, debido a que los dos conforman grupos monofilético dentro del árbol filogenético según análisis de MP e inferencia Bayesiana, como ocurre con los taxones de P. lysander lysander, P. eurimedes arriphus, P. anchises alyattes y P. sesostris tarquinius. Sin embargo, también es útil emplear en esta validación solo hembras, tal es el caso de P. iphidamas y P. lycimenes erytrus, a pesar que en P. lycimenes erythrus una hembra se separo del grupo monofilético, lo que puede estar relacionado con lo propuesto por Fagua (1997), quien propone que varias de las hembras de las subespecies de Parides se encuentran taxonomicamente mal asignadas o pueden corresponder a formas geográficas no coincidentes; por lo que es necesario emplear un análisis morfológico con el fin de establecer su correcta taxonomía. Según Fagua (1997), los caracteres morfológicos como: pubescencia del primer par de tibias, distribución de los patrones de venación, color de los palpos, forma y tipo de escamas androconiales y morfología de la genitalia del macho, son indispensables en la taxonomía e identificación de los taxones de Parides.
83 De igual manera, Burns (1997) expresa que gran parte de la variación individual en mariposas se presenta a nivel de genitalia, la que debe ser estudiada, comparada y entendía para su correcta interpretación; esta variación individual puede ser causante de las relaciones inciertas de P. lycimenes erytrus y P. vertumnus bogotanus, lo que puede estar sesgando los resultados al hacer las similitudes o diferencias como individuos y no como entidades taxonómicas (Galindo 2005).
Por otra parte, el análisis filogenético del presente trabajo, no valida el planteamiento de Rothschild & Jordan (1906) y Fagua (1997), que P. erithalion, P. vertumnus, P. lycimenes y P. iphidamas, P. anchises, conforman dos especies con base en caracteres morfológicos y en la poca coincidencia entre los patrones de distribución de estas especies; dado que la mayor parte de estas especies se encontraron en clados independientes según análisis de MP e inferencia Bayesiana.
Por su parte, se encontró coincidencia entre el análisis morfológico desarrollado por otros autores y el análisis molecular de este trabajo en relación a la designación de especie y subespecie para el subgénero Parides; lo que permite establecer que los dos análisis se complementan, ampliado con la distribución geográfica permiten hacer valido los estatus taxonómico de especie y subespecie para varios de los taxones de Parides presentes en Colombia. Lo anterior plantea la necesidad de realizar un análisis de datos morfológicos y moleculares (análisis de evidencia total) para los taxones de Parides, el cual permita dar mayor congruencia y veracidad de los resultados.
84 8. CONCLUSIONES
• La hipótesis filogenética plantea al subgénero Parides como un grupo parafilético, del que en Colombia se presentan registros de 17 especies, 28 subespecies y fenotipos de 20 subespecies (Fagua 1997), de las que a nivel molecular se hicieron validos una especie y cinco subespecies.
• El subgénero Parides para Colombia se divide en tres grupos principales coincidentes con los grupos Lysander (grupo 1) y Aeneas (grupos 2 y 3) de Rothschild & Jordan (1906).
• Las especies y subespecies del grupo 1 y subgrupo A, coincidieron con el grupo Lysander de Rothschild & Jordan (1906), resultaron el grupo basal de Parides, comprendiendo a mariposas con manchas marginales rosadas en el ala posterior.
• Los subgrupos de especies y subespecies B, C y D, grupo Aeneas de Rothschild & Jordan (1906), correspondió al grupo más derivado, cuya característica es la presencia de manchas marginales blancas en el ala posterior.
• De los 13 taxones de Parides analizados, P. sesostris tarquinius y P. iphidamas conformaron grupos monofiléticos. Los taxones restantes con más de un espécimen en el análisis presentaron grupos: Parafiléticos como P. childrenae childrenae y P. eurimedes arriphus y Polifiléticos tal es el caso de P. lysander, P. vertumnus bogotanus, P. eurimedes arriphus y P. lycimenes erythrus.
85 • Los taxones de Parides, aceptados como válidos corresponden a P. anchises alyattes, P. eurimedes arriphus, P. iphidamas, P. lycimenes erythrus, P. lysander lysander y P. sesostris tarquinus.
• Se considera a P. lysander brissonius como un fenotipo de P. lysander lysander.
• Las relaciones filogenéticas imprecisas de P. anchises serapis con P. erithalion yaminahua pueden corresponder a que en el análisis de filogenia solo se incluyo un espécimen de P. erithalion.
• Varias de las relaciones que se encontraron imprecisas dentro del árbol filogenético de MP y Bayesiano, posiblemente se debe al bajo número de especímenes analizados dentro de cada taxón.
• Varias ubicaciones de los clados del árbol obtenido según análisis de MP no concuerdan con las del árbol de análisis Bayesiano, siendo coherente con los clados que en sus ramas internas presentaron soportes de Bremer débil a moderado en MP.
• Las relaciones filogenéticas de P. eurimedes arriphus descrita como una incongruencia, posiblemente se debió a la baja coincidencia nucleotídica que presentó un espécimen respecto a la secuencia de COI de Drosophila yakuba.
• La gran coincidencia que se encontró frente a análisis morfológico de otros autores y el desarrollado en este trabajo en relación a la designación de taxones de especie y subespecie para el subgénero Parides, permite establecer que los dos análisis se complementan, lo que integrado con la distribución geográfica, permite validar los estatus taxonómico de especie y subespecie para este subgénero en Colombia.
86 • Los análisis moleculares apoyan localidades dentro de la distribución geográfica que presentan los taxones de Parides en Colombia según Fagua (1997), las cuales se segregan en dos grupos: 1). Las andinas, con un subgrupo que tiene su influencia en la Sierra Nevada de Santa Marta y otro en los valles interandinos, con influencia sobre el Chocó Biogeográfico. 2). Las amazónicas, presentando disminución en la similaridad a medida que aumenta la distancia geográfica del núcleo amazónico (Sector aledaño a los ríos Amazonas y Putumayo).
87 9. RECOMENDACIONES
• Ampliar la cantidad de especies y de especímenes por especie para obtener más datos y definir con certeza los taxones (especie y subespecie) y la distribución geográfica del subgénero Parides para Colombia.
• Incluir el análisis de otra(s) región(es) del gen COI, al igual que el análisis de los genes COII y EF1α (gen nuclear), para apoyar con mayor solidez los resultados presentados en este estudio.
• Incluir un análisis genético-poblacional para dar firmeza a la definición de los taxones (especie y subespecie) y los patrones de distribución geográfica de Parides para Colombia.
• Recolectar muestras recientes con el fin de garantizar obtención de una mayor cantidad y buena calidad de ADN de las mariposas, lo que permite la amplificación del fragmento de estudio y buena coincidencia nucleotídica entre las secuencias de estudio.
• En la realización del protocolo de extracción de ADN por Salting-Out (Pascual et al. 1997), en la primera fase macerar los tejidos con Nitrógeno líquido, con el fin de obtener rotura total de los tejidos y por ende mayor cantidad de ADN de las mariposas, lo que puede facilitar la amplificación de la secuencia de estudio.
88 10. REFERENCIAS
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98 11. ANEXOS
ANEXO 1. El subgenéro Parides.
A B
D
F E
Figura 1. Características del subgénero Parides. A. Macho de Parides childrenae childrenae; B. Hembra de Parides sesostris tarquinius. C. edeagus del macho. D. bursae de la hembra. E. Larva de Parides erithalion. F. Larva de Parides vertumnus.
99 A
C B
D
Figura 2. Distribución geográfica y centros de endemismo de Parides en Colombia según Fagua (1997). A. Sierra Nevada de Santa Marta. B. Parte media y baja de los Valles Interandinos. C. Chocó Biogeográfico. D. Piedemonte Amazónico.
100 C B
A
Figura 3. Distribución geográfica de Parides en Colombia según Le Crom et al. (2002). A. Bosques húmedos de la cuenca Amazónica. B. Costa Pacífica. C. Magdalena Medio.
101 ANEXO 2. Taxones del subgénero Parides seleccionados para el análisis filogenético.
Figura 1: Patrón de coloración alar de los taxones del grupo interno y externo seleccionados para el análisis filogenético.
102
Continuación Figura 1.
103
Continuación Figura 1.
104
Continuación Figura 1.
105
Continuación Figura 1.
106 Tabla 1. Taxones del grupo interno y externo seleccionados para el análisis filogenético.
No. Taxones Localidad GenBank
Atrophaneura alcinous (Klug, 1836) Okura, Japón AF170876 Pachliopta neptunus (Guérin-Méneville, 1840) Malasia AF044023 Parides bunichus (Hübner, 1821) Santa Maria, RS, Brasil AY804366 Parides neophilus (Geyer, 1837) Campinas, SP, Brasil AY804373 Parides panthonus jaguarae (Foetterle, 1902) Belo Horizonte, MG, Brasil AY804376
107 Tabla 2. Taxones del subgénero Parides seleccionados para el análisis filogenético, representados en las colecciones entomológicas: Instituto Alexander von Humboldt (IAvH), Museo Javeriano de Historia Natural (MPUJ), Colección Personal de Jean Francois Le Crom (CP Le Crom).
Ubicación Geográfica Dia Mes Año Altitud Sexo Colector
Parides aeneas bolivar (Hewitson, 1850) Colombia. Meta. San Martín. Finca Tocancipa. Bosque de Galería 4 2006 hembra G. Fagua
Parides anchises serapis (Boisduval, 1836) Colombia. Atlántico. Piojo. Cerro La Vieja. Sección 3 (espécimen 1) 29 11 2003 150m macho J. de las Casas Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque (espécimen 2) 16 7 2006 macho G. Fagua Parides anchises alyattes (Felder& Felder, 1861) Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana (espécimen 1) 8 7 2006 hembra J. Gutiérrez Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana (espécimen 2) 8 7 2006 macho J. Gutiérrez
Parides chabrias chabrias (Hewitson, 1852) Colombia. Amazonas. Leticia. 5 2003 hembra G. Fagua
Parides childrenae childrenae (Gray, 1832) Colombia. Chocó (espécimen 1) 2006 macho S. Tavera Colombia. Chocó (espécimen 2) 2006 macho S. Tavera
Parides eurimedes arriphus (Boisduval, 1836) Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda El Salitre. Finca Brisas del Llano. Cultivo (espécimen 1) 3 12 2005 380m hembra R. Botero Colombia. Chocó (espécimen 2) 2006 macho S. Tavera Colombia. Chocó (espécimen 3) 2006 macho S. Tavera
Parides erithalion yaminahua (Pischedda & Racheli, 1987) Colombia. Caquetá. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. En rastrojo 3 12 1997 1400m macho G. Fagua
108
Continuación Tabla 2.
Parides iphidamas (Fabricius, 1793) Colombia. Santander. Barichara. Cuenca Cabrera (espécimen 1) 18 5 2002 1200m hembra Espitia H. Leg Colombia. Guajira. Maicao. Zona Comercial (espécimen 2) 5 1 2006 hembra C. Cotes
Parides lycimenes erythrus (Rotshchild & Jordan 1906) Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia (espécimen 1) 30 5 2004 1568m hembra G. A. Pérez Colombia. Chocó (espécimen 2) 2006 hembra S. Tavera Colombia. Chocó (espécimen 3) 2006 hembra S. Tavera
Parides lysander lysander (Cramer, 1776) Colombia. Vichada. PNN Tuparro. Mata de monte. Trampa pitfall de dosel (espécimen 1) 11 11 2004 macho I. Quintero Colombia. Meta. San Martín. Finca Tocancipa. Bosque de Galería. Tarde (espécimen 2) 25 4 2006 hembra G. Fagua Parides lysander brissonius (Hübner, 1819) Colombia. Meta. San Martín. Finca Tocancipa. Bosque de Galería. Tarde 25 4 2006 macho G. Fagua
Parides phosphorus gratianus (Bates, 1861) Colombia. Caquetá. San Vicente del Caguan. PNN Picachus. Borde de Bosque 3 12 1997 1400m macho G. Fagua
Parides sesostris tarquinius (Boisduval, 1836) Colombia. Chocó (espécimen 1) 2006 macho S. Tavera Colombia. Chocó (espécimen 2) 2006 hembra S. Tavera
Parides vertumnus bogotanus Felder (1864) Colombia. Cundinamarca. Municipio La Vega. Laguna del Tabacal. En rastrojo (espécimen 1) 8 5 1999 macho Zúñiga Colombia. Amazonas. Leticia. Comunidad Indígena. Zaragoza (espécimen 2) 17 9 2002 70m hembra Caro Ríos
109
ANEXO 3. Listado preliminar de los taxones del subgénero Parides de los años 1996-2006, seleccionados para el análisis molecular representado en las colecciones entomológicas: Instituto Alexander von Humboldt (IAvH), Museo Javeriano de Historia Natural (MPUJ), Colección Personal de Jean Francois Le Crom (CP Le Crom).
Ubicación Geográfica Dia Mes Año Taxón Altitud Sexo
Parides aeneas
Colombia. Amazonas. Leticia. Monilla Amena. BTF 21 3 2004 Parides aeneas bolivar 70 macho Colombia. Amazonas. Leticia. Monilla Amena. BTF 23 4 2003 Parides aeneas bolivar 70 macho Colombia. Meta. San Martin. Finca Tocancipa. Bosque de Galeria 4 2006 Parides aeneas bolivar hembra
Parides anchises
Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda el Salitre. Finca Brisas del Llano 20 9 2005 Parides anchises 310 macho Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 10 6 2006 Parides anchises hembra Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 10 6 2006 Parides anchises hembra Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 16 7 2006 Parides anchises macho Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 16 7 2006 Parides anchises macho Colombia. Bolivar. Cartagena. Isla Barú. Camino 13 10 2006 Parides anchises macho Colombia. Cundinamarca. Nito. Rastrojo. Larva en Aristolochia maxima 5 2006 Parides anchises macho Colombia. Chocó 2006 Parides anchises macho Colombia. Chocó 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Chocó 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Chocó 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 6 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 8 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 8 7 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 6 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 6 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Tolima. Armero Guayabal. Vereda Santo Domingo. Buenavista. Mañana 6 7 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque Costa 16 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque Costa 16 7 2006 Parides anchises alyattes hembra
110
Continuación ANEXO 3
Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque Costa 16 7 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Chocó 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Chocó 2006 Parides anchises alyattes macho Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 10 6 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 10 6 2006 Parides anchises alyattes hembra Colombia. Putumayo Parides anchises drucei macho Colombia. Caqueta. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. En rastrojo 2 12 1997 Parides anchises koenigi macho Parides anchises osyris hembra Colombia. Bolivar. Cartagena. Isla Barú. Camino 17 10 2006 Parides anchises serapis macho Colombia. Atlántico. Barranquilla. Nisperal. Bosque 16 7 2006 Parides anchases serapis macho Colombia. Atlántico. Piojo. Cerro La Vieja. Sección 3 29 11 2003 Parides anchises serapis 150 macho Colombia. Atlántico. Piojo. Cerro La Vieja. Sección 8 3 9 2003 Parides anchises serapis 400 macho
Parides eurimedes
Colombia.Tolima. Ibague. Jardín Botánico San Jorge 18 5 2001 Parides eurimedes 1300 hembra Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda el Salitre. Finca Brisas del Llano 21 9 2005 Parides eurimedes 300 hembra Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda El Salitre. Finca Brisas del Llano 11 12 2005 Parides eurimedes 375 hembra Colombia. Meta. Villavicencio 2006 Parides eurimedes macho Colombia. Meta. Villavicencio 2006 Parides eurimedes macho Colombia. Tolima. Ibague. Vereda Cay 18 8 2006 Parides eurimedes macho Colombia. Tolima. Ibague. Vereda Cay 18 8 2006 Parides eurimedes macho Colombia. Tolima. Municipio Cunday. Vereda El Eden 13 3 1999 Parides eurimedes antheas 500 hembra Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laguna del Tabacal. Rastrojo 13 10 1999 Parides eurimedes antheas 1230 macho Colombia. Tolima. Ibague. Jardín Botánico San Jorge 19 3 2001 Parides eurimedes arriphus 1300 hembra Colombia. Tolima. Ibague. Jardín Botánico San Jorge 19 5 2001 Parides eurimedes arriphus 1300 hembra Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda El Salitre. Finca Brisas del Llano 3 12 2005 Parides eurimedes arriphus 380 hembra Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes arriphus macho Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes arriphus macho Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale hembra Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale hembra Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale macho
111
Continuación ANEXO 3
Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale macho Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale hembra Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale macho Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale macho Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale hembra Colombia. Chocó 2006 Parides eurimedes mycale hembra Colombia. Sierra Nevada de Santa Marta. Quebrada Valencia. 1 12 2006 Parides eurimedes mycale macho
Parides chabrias
Colombia. Amazonas. Leticia. 5 2003 Parides chabrias chabrias hembra
Parides childrenae
Colombia. Chocó 2006 Parides childrenae childrenae macho Colombia. Chocó 2006 Parides childrenae childrenae hembra Colombia. Chocó 2006 Parides childrenae childrenae macho Colombia. Chocó 2006 Parides childrenae childrenae macho Colombia. Chocó 2006 Parides childrenae childrenae macho Colombia. Boyaca. Otanche 8 1996 Parides childrenae latisfasciata macho
Parides erithalion
Colombia. Valle del Cauca. Tulua. Vereda Mataguadua. Jardin Botanico 1998 Parides erithalion Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 24 4 2004 Parides erithalion 1506 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 8 8 2004 Parides erithalion 568 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 30 5 2004 Parides erithalion 1506 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 20 3 2004 Parides erithalion 1506 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 21 9 2003 Parides erithalion 1500 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 18 10 2003 Parides erithalion 1568 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 27 6 2004 Parides erithalion 1506 macho Parides erithalion hembra
112
Continuación ANEXO 3
Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 5 10 2004 Parides erithalion erithalion 1568 hembra Parides erithalion lacydes macho Colombia. Caqueta. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. En rastrojo 3 12 1997 Parides erithalion lacydes macho Colombia. Caqueta. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. En rastrojo 3 12 1997 Parides erithalion lacydes 1400 macho Parides erithalion xanthias macho Colombia. Cundinamarca. Medina Parides erithalion xanthias 1000 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 24 6 2004 Parides erithalion yaminahua 1506 macho Colombia. Caqueta. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. En rastrojo 3 12 1997 Parides erithalion yaminahua 1400 macho Colombia. Tolima. Armero 6 7 2006 Parides erithalion zeuxis macho
Parides iphidamas
Colombia. Tolima. Ibague. Jardin Botanico San Jorge 19 5 2001 Parides iphidamas 1300 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 24 4 2004 Parides iphidamas 1506 hembra Parides iphidamas hembra Colombia. Santander. Barichara. Cuenca Cabrera 18 5 2002 Parides iphidamas 1200 hembra Colombia. Bolivar. Cartagena. Isla Barú. Rastrojo 12 10 2006 Parides iphidamas 40 macho Colombia. Guajira. Maicao. Zona Comercial 5 1 2006 Parides iphidamas hembra Colombia. Atlantico. Barranquilla Km 6 Via Puerto Colon. Sección 6 5 11 2003 Parides iphidamas iphidamas hembra Colombia. Atlantico. Tubari. Sección 2 La Cucamba 6 6 2003 Parides iphidamas iphidamas 100 hembra Colombia. Atlantico. Piojo. Cerro La Vieja. Sección 7 3 9 Parides iphidamas iphidamas 350 hembra Colombia. Cundinamarca. La Vega. P Urbano. Bogotá-La Vega. Rio Ilá. 2 1 1999 Parides iphidamas phalias 1300 hembra
Parides lycimenes
Colombia. Cundinamarca. La Vega. P Urbano. Condominio La Reserva 4 2 2001 Parides lycimenes 1300 macho Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 30 5 2004 Parides lycimenes 1506 macho Colombia. Casanare. Aguazul. Vereda El Salitre. Finca Brisas del Llano. Pastizal 5 2 2005 Parides lycimenes 380 hembra Colombia. Cundinamarca. La Vega. Laureles. Parque Ecológico Vegaterapia 30 5 2004 Parides lycimenes erythrus 1568 hembra Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus macho Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus macho Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus macho
113
Continuación ANEXO 3
Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus macho Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus macho Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus hembra Colombia. Chocó 2006 Parides lycimenes erythrus hembra Colombia. Cundinamarca. La Vega. P Urbano. Bogotá-La Vega. Rio Ilá. 25 6 2000 Parides lycimenes racheli 1300 hembra Colombia. Tolima. Municipio Cunday. Rastrojo 20 3 Parides lycimenes racheli 430 hembra
Parides lysander
Colombia. Vichada. PNN Tuparro. BTF Trocha de Observación 17 2 2004 Parides lysander macho Colombia. Vichada. PNN Tuparro. Trampa coprofagos 11 11 2004 Parides lysander macho Colombia. Meta. San Martin. Finca Tocancipa. Bosque de Galeria. Tarde 25 4 2006 Parides lysander brissonius macho Colombia. Vichada. PNN Tuparro. Mata de monte. Trampa pitfall de dosel 11 11 2004 Parides lysander lysander macho Colombia. Meta. San Martin. Finca Tocancipa. Bosque de Galeria. Tarde 25 4 2006 Parides lysander lysander hembra Colombia. Caquetá. Región de Araracuara. Comunidad de Peña 22 7 2000 Parides lysander lysander 200 macho
Parides neophilus
Colombia. Guaviare. San José del Guaviare. Vereda Agua Bonita. El Refugio 22 6 2002 Parides neophilus consus hembra Colombia. Guaviare. San José del Guaviare. Puerto Tolima Parides neophilus consus hembra Parides neophilus olivencius hembra Colombia. Guaviare. El Retorno. Vereda El Trueno. Granja El Trueno 18 4 2002 Parides neophilus parianus macho Colombia. Guaviare. San José del Guaviare. Vereda Agua Bonita. El Refugio 22 6 2002 Parides neophilus parianus macho Colombia. Guaviare. El Retorno. Vereda El Trueno. Granja El Trueno 25 12 2002 Parides neophilus parianus macho 2002 Parides neophilus parianus macho Parides neophilus parianus macho Colombia. Guaviare. El Retorno. Vereda El Trueno. Granja El Trueno 23 12 2002 Parides neophilus parianus macho
Parides phosphorus
Colombia. Caqueta. San Vicente del Caguan. PNN Picachos. Bore de Bosque 3 12 1997 Parides phosphorus gratianus 1400 macho
114
Continuación ANEXO 3
Parides sesostris
Colombia. Guaviare. San José del Gaviaré. Vereda la Pizarra. Indio 23 9 2002 Parides sesostris sesostris macho Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris sesostris macho Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris sesostris hembra Parides sesostris sesostris macho Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris tarquinius macho Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris tarquinius macho Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris tarquinius hembra Colombia. Chocó 2006 Parides sesostris tarquinius hembra Colombia. Guaviare Parides sesostris zichkai macho Casa el. Piedemonte 24 5 Parides sesostris hembra
Parides vertumnus
Colombia. Amazonas. Leticia. Comunidad Indigena. Zaragosa 17 9 2002 Parides vertumnus 70 hembra Parides vertumnus hembra Parides vertumnus macho Colombia. Cundinamarca. Municipio La Vega. Laguna del Tabacal. En rastrojo 8 5 1999 Parides vertumnus bogotanus macho Colombia. Guaviare. El Retorno. Vereda El Trueno. Granja El Trueno 10 11 2002 Parides vertumnus vertumnus macho Colombia. Guaviare. San Jose del Guaviare. Puerto Tolima 4 7 2002 Parides vertumnus vertumnus hembra
115