Inpa Universidade Federal Do Amazonas – Ufam Programa Integrado De Pós-Graduação Em Biologia Tropical E Recursos Naturais

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS

ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PEIXE ORNAMENTAL Carnegiella strigata (CHARACIFORMES, GASTEROPELECIDAE) DE TRÊS RIOS DE ÁGUA PRETA DA AMAZÔNIA CENTRAL

Carlos Henrique Schneider

MANAUS – AM Abril, 2007 CARLOS HENRIQUE SCHNEIDER

ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PEIXE ORNAMENTAL Carnegiella strigata (CHARACIFORMES, GASTEROPELECIDAE) DE TRÊS RIOS DE ÁGUA PRETA DA AMAZÔNIA CENTRAL

Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto, Dr.

Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

MANAUS – AM Abril, 2007

FICHA CATALOGRÁFICA

S358 Schneider, Carlos Henrique

Análise da variabilidade genética do peixe ornamental Carnegiella strigata (Characiformes, Gasteropelecidae) de três rios de água preta da Amazônia Central / Carlos Henrique Schneider .--- Manaus : [s.n.], 2007.xvi, 72 f. : il.

Dissertação (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2007 Orientador : Jorge Ivan Rebelo Porto Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Sinopse:

Espécimes do peixe ornamental Carnegiella strigata provenientes da bacia dos rios Negro, Urubu e Uatumã foram estudados mediante análise de seqüências do gene da ATPase 8/6. As análises filogenéticas e populacionais sugerem a presença de duas unidades evolutivas e também evidência de uma possível conexão antiga entre a bacia do rio Negro e Uatumã.

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Dedico esta dissertação aos meus pais João e Edite, à minhas irmãs Marielle e Silvia e à minha esposa Maria Claudia.

“Cada grande passo na ciência foi precedido por uma nova audácia da imaginação” John Dewey

Agradecimentos Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade Federal do Amazonas (UFAM), curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Ao Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM) do INPA, Coordenação de Pesquisas (COPE), onde foi desenvolvida a maior parte deste trabalho. Pelo financiamento dos Projetos de Pesquisas Institucionais, do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Universal Proc. 47.2345/2004-4), Projeto Mariuá (Pronex/FINEP 46.6098/2001-4) e Projeto Navegabilidade, hidrologia, qualidade de água e biodiversidade do rio Negro (FINEP/CNPq 3724/04). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) que concedeu a bolsa de estudo durante a realização deste trabalho. Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou indiretamente, possibilitaram a realização deste trabalho. Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto, que me ensinou como é interessante a biologia molecular. Por ter acreditado e confiado no meu trabalho, pelos estímulos, atenção, pelas dúvidas plantadas na minha cabeça (e que não foram poucas), pela amizade, conselhos, compreensão e pela força em momentos difíceis, o que facilitou muito a execução deste trabalho. À Dra. Eliana Feldberg, que além de ser uma mãe para todos os seus alunos, ainda o é para os alunos do Jorge. Obrigado pelos conselhos e incentivo. Além do mais, sem o seu auxílio e o do Jorge eu não poderia ter vindo para Manaus. Um obrigado especial por todo o apoio na minha vida pessoal, nos momentos mais complicados. Ao Dr. Jansen Zuanon e à Dra. Vera Scarpassa, pelas valiosas críticas e sugestões no meu trabalho. À MSc. Lucélia Nobre de Carvalho, pelo auxílio com as coletas na bacia do rio Urubu.

Às amigas do Projeto Pirada (Jacqueline, Kyara, Naiara, Tatiana, Fabíola, Giselle, Rosa, Luci, Andréa, Iamilli) pelo auxílio no laboratório, bem como nas soluções dos problemas encontrados. E também pelo bom humor sem o qual o dia a dia de trabalho ficaria mais cansativo. Às amigas do LTBM Renata Frederico e Renata Schmitt. Valeu pela força e pela ajuda sempre que precisei. E à MSc Renata Schmitt, pelo tempo “gasto” no auxílio das análises do Paup. Às minhas irmãs científicas Alexandra, Audrey, Rebecca, Maria José e Ana Fabíola, pela força no laboratório. Aos amigos do Laboratório de Genética Animal do INPA: Claudia, Aldaléia, Leandra, Eduardo, Denise, Jota, Cacá, Marco e Thiago. Obrigado pelas sugestões, bem como pelas festas no laboratório. Aos amigos do mestrado do GCBEV-2005, em especial ao Eduardo (Belugão), Fátima, Luciano, Walfran e Raimundo pelos momentos de descontração sem os quais o caminho seria mais difícil. À Hercilia e Alessandra, super secretárias do GCBEV. Sem elas os alunos iriam sofrer muito. Ao Sr. Ribeiro pelo auxílio na coleta em Barcelos. Ao Robertão, Mara, Marcelo, Ernani, Miguel e demais colegas do Laboratório de Citogenética Animal da Universidade Estadual de Ponta Grossa, pelo auxílio e por me iniciarem na vida científica. Aos casais de amigos Leandra e Igor, Waleska e Daniel e Eduardo e Tahisa pelos ótimos momentos de diversão, bem como pelo apoio nas horas que mais precisei. Ao Lineu Gross e Marilda Delfrate Gross, que além de terem me dado a Claudinha, são mais que sogros e sempre foram grandes amigos. É bom fazer parte da vida de vocês. À MSc. Maria Claudia Gross, pelo exemplo profissional, por ser a primeira revisora de tudo que faço, pelo apoio, pelas críticas e sugestões deste trabalho. E à minha esposa Maria Claudia, obrigado pelo companheirismo e amizade nas

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horas alegres e tristes, sempre com seu amor e carinho me incentivou a seguir adiante. É maravilhoso ter você ao meu lado. À Dra. Marielle Cristina Schneider, pelo exemplo de como age um excelente profissional. E à minha irmã Marielle, pelo incentivo e por mostrar como é maravilhosa a Biologia e a Genética. À minha irmã Silvia, a única da família que desertou a biologia e resolveu escrever a sua própria História. Obrigado pelo apoio e incentivo. E é ótimo ser irmão e amigo de vocês. Aos meus pais João Carlos Schneider e Edite Maria Schneider, que são meus exemplos de vida. Pai, obrigado por você ter feito parte da minha vida, os altos papos dentro do “Fiatão” jamais serão esquecidos, tudo valeu a pena. Mãe, obrigado por ter me incentivado a voltar a estudar, você tinha razão, como sempre. Sem o apoio e incentivo de vocês eu não teria crescido pessoal e profissionalmente. Amo vocês.

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RESUMO Os peixes ornamentais do gênero Carnegiella são conhecidos vulgarmente como peixe-borboleta, sendo que Carnegiella strigata é conhecido como peixe- borboleta rajado. Esta espécie pode ser encontrada na Guiana, Suriname, Colômbia, Bolívia, Peru e Brasil (bacia Amazônica) e aparentemente tem sua distribuição limitada a rios de água preta. Este trabalho apresenta preliminarmente a variabilidade genética de C. strigata, provenientes de três rios de água preta da Amazônia central. Foram genotipados 69 indivíduos de C. strigata utililizando seqüencias nucleotídicas dos genes ATPase 8/6 do DNA mitocondrial (646 pb) sendo que os espécimes foram coletados na bacia do rio Negro (cinco localidades), na bacia do rio Urubu (uma localidade) e bacia do Uatumã (duas localidades). Os dados mitocondriais evidenciaram altos níveis de variação genética que sugerem a presença de mais de uma unidade evolutiva. Um grupo foi formado por espécimens provenientes de Mauá, Urubaxi, Pixirituba e Tarumã (bacia do rio Negro) e Urubu (bacia do rio Urubu) e o outro grupo foi formado por espécimes provenientes do rio Uatumã e Barretinho (bacia do rio Uatumã) e Cajarizinho (bacia do rio Negro). As árvores gênicas mitocondriais (máxima parcimônia, máxima verossimilhança e distância genética) e análises de genética populacional (polimorfismo de DNA, AMOVA, Teste de Mantel) permitiram a identificação de 13 haplótipos agrupados em dois grupos monofiléticos segregantes. Cada uma das unidades evolutivas de C. strigata apresentou uma variação da distância genética distinta uma da outra, sendo que a distância genética entre as duas unidades evolutivas foi de 11,50%. Ambas unidades diferiram em 19,70% em relação à espécie irmã, C. marthae. Com base nos dados moleculares sugere-se uma antiga conexão entre as cabeceiras de alguns tributários do rio Negro e do rio Uatumã. Se assumirmos que cada uma das unidades evolutivas encontrada em C. strigata corresponde a uma espécie então muito provavelmente C. strigata engloba um complexo de espécies. Por outro lado, se assumirmos que cada uma das unidades evolutivas corresponda a uma população ou um grupo de populações divergentes geneticamente e eventualmente isolada reprodutivamente de outras unidades populacionais

relacionadas, então se deve aplicar o conceito de Unidades Evolutivas Significativas (ESU – Evolutionary Significat Units).

ABSTRACT Ornamental fish species of the genus Carnegiella are commonly known as hatchetfish and in particular, Carnegiella strigata is known as the marbled hatchetfish. It is found in Guiana, Suriname, Colombia, Bolivia, Peru and Brazil (Amazon basin) and apparently is limited to black waters rivers. The present study is a preliminary assessment of the genetic variability of C. strigata from three black waters rivers in the Central Amazon. Sixty-nine specimens from five localities in the Negro river basin, one locality in the Urubu river basin and two localities in the Uatumã river basin were genotyped using the nucleotide sequence of mitochondrial ATPase 6/8 genes (646 bp). The mtDNA data resulted in unexpected high levels of variation that suggest the presence of more than only one evolutionary unit. Specimens from Mauá, Urubaxi, Pixirituba, Tarumã (Negro basin) and Urubu (Urubu basin) formed one evolutionary unit, and specimens from Barretinho and Uatumã (Uatumã basin) and Cajarizinho (Negro basin) formed another unit. Analyses of mitochondrial gene trees (maximum parsimony, maximum likelihood and genetic distance) and population genetics (DNA polymorphism, AMOVA, Mantel Test) allowed the identification of 13 haplotypes assembled in two monophyletic groups, with genetic segregation between them. The range of the genetic distance found in each evolutionary unit of the so-called C. strigata were distinct, and the average genetic distance between the evolutionary units was 11.50%. When compared to C. marthae, the sister species of C. strigata, both units showed an average genetic distance of 19.70%. Based on molecular data we suggest a past connection between the headwaters of some tributaries from the Negro and the Uatumã river basins. If we assume that each evolutionary unit detected corresponds to a valid species, then today, what is known as C. strigata in fact corresponds to a widespread species complex. If we assume that each evolutionary unit corresponds to a group of specimens which are genetically divergent and reproductively isolated from other groups of the same species, then the concept of an evolutionary significant unit (ESU) must be evoked.

SUMÁRIO

1. Introdução ...... 1

1.1 Carnegiella strigata como objeto de estudo genético ...... 1 1.2 DNA mitocondrial como ferramenta para estudos genéticos ...... 3 1.3 Considerações sobre as bacias dos rios Negro, Urubu e Uatumã ...... 6 1.4 Objetivos Gerais ...... 8 1.4.1 Objetivos Específicos ...... 8 1.5 Hipóteses ...... 8

2. Material e Métodos ...... 9

2.1 Locais de coleta e amostragem ...... 9 2.2 Análises Moleculares ...... 12 2.2.1 Extração de DNA ...... 12 2.3 Análise dos Dados ...... 14 2.3.1 Edição e Alinhamento das Seqüências ...... 14 2.3.2 Inferências Evolutivas ...... 15 2.3.3 Análises Populacionais ...... 16

3. Resultados ...... 18

3.1 Seqüência de DNA ...... 18 3.2 Análise e distribuição dos haplótipos ...... 20 3.3 Inferências evolutivas ...... 21 3.3.1 Máxima Parcimônia (MP) ...... 21 3.3.2 Máxima Verossimilhança (MV) ...... 21 3.3.3 Agrupamento de vizinhos (NJ) ...... 22 3.4 Análises populacionais ...... 27 3.4.1 Análises de polimorfismo de DNA ...... 27 3.4.2 Análise de Variância Molecular (AMOVA) e estrutura genética ...... 28 3.4.3 Teste de Mantel ...... 30 3.4.4 Árvore de haplótipos ...... 31

4. Discussão ...... 33

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5. Conclusão ...... 43

6. Referências bibliográficas ...... 44

7. Anexos ...... 53

Anexo 1...... 53 Anexo 2...... 54 Anexo 3...... 55

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Imagens ilustrativas de C. strigata morfotipos strigata (A), forma intermediária (B) e fasciata (C)...... 9 Figura 2 – Exemplares de C. strigata dos diferentes pontos de amostragem...... 10 Figura 3 - Localização da área de estudo. Os pontos marcados são referentes às áreas de amostragem de C. strigata. M=igarapé Mauá, U=rio Urubaxi, Pi= igarapé Pixirituba, Caj=igarapé Cajarizinho, T=rio Tarumã, Uru=rio Urubu, Uat=bacia do rio Uatumã e Bar=igarapé Barretinho...... 11 Figura 4 – Esquema da localização dos primers utilizados para amplificação e seqüenciamento do gene da ATPase 8/6 de C. strigata...... 13 Figura 5 – Número de substituições (TS-transição, TV-transversão) contra distância genética HKY+G, para o gene da ATPase...... 19 Figura 6 – Consenso estrito entre 3 árvores de MP (L = 188; CI = 0,952; RI = 0,972; RC = 0,926) considerando matriz de peso TS1/TV1. Os números acima dos ramos são valores de bootstrap para 1000 réplicas. No interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades...... 23 Figura 7 – Árvore de MV (Ln = 1630,94823) com os 13 haplótipos de C.strigata. No interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades. Os valores entre os ramos indicam a distância genética entre os grupos...... 24 Figura 8 – Árvore de distância genética com os 13 haplótipos de C. strigata, obtida pelo agrupamento de vizinhos, usando o modelo de HKY+G. No interior dos quadrados coloridos os números de indivíduos de cada localidade que apresenta o haplótipo. As cores representam as localidades. Os valores entre os ramos indicam a distância genética entre os grupos...... 25 Figura 9 – Árvore de haplótipos evidenciando as conexões entre os 13 haplótipos evidenciados em C. strigata. Os círculos pequenos significam haplótipos inferidos, mas não detectados, *69 número de passos adicionais necessários para conectar as sub-árvores. Os haplótipos estão distribuidos da seguinte forma: Unidade

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evolutiva 1: h1=Urubaxi, Mauá e Pixirituba; h2=Urubaxi; h3=Pixirituba; h4 a h7=Tarumã, h8=Urubu; e Unidade evolutiva 2: h9 a h12=Cajarizinho e h13=bacia do rio Uatumã...... 32 Figura 10 – Imagem evidenciando os locais de coleta com sobreposição da árvore de máxima parcimônia...... 39 Figura 11 – Imagem orbital (radar SRTM) mostrando a região da cabeceira do rio Uatumã e do rio Apuaú, afluente do rio Negro. Em evidência a região onde poderia ter ocorrido o contato da bacia do rio Uatumã com a bacia do rio Negro. Fonte SigLab-INPA, com modificações...... 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Identificação dos locais de coleta de C. strigata ...... 11 Tabela 2 – Frequência dos haplótipos de C. strigata encontrados entre os 69 indivíduos, evidenciando as localidades onde U=Urubaxi; M=Mauá; Pi=Pixirituba; Caj=Cajarizinho; T=Tarumã; Uru=Urubu e Uat=bacia do Uatumã...... 20 Tabela 3 – Distância genética entre os haplótipos (em porcentagem) obtida pela distância p não corrigida. Haplótipos h1 a h8 correspondem à unidade evolutiva 1 e haplótipos h9 a h13 à unidade evolutiva 2...... 26 Tabela 4 – Resultados da análise de polimorfismo de DNA, entre os indivíduos de C. strigata das cinco localidades. Onde: N=número de indivíduos; H=número de haplótipos; HU=haplótipos únicos; S=sítios polimórficos; ETA=número de mutações; HD=diversidade haplotípica; PI=diversidade nucleotídica; K=média das diferenças nucleotídicas par a par...... 27 Tabela 5 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 1, entre e dentro dos grupos de populações. Unidade evolutiva 1 corresponde a indivíduos das localidades Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã. Fst : 0,91345...... 28 Tabela 6 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 2, entre e dentro dos grupos de populações. Unidade evolutiva 2 corresponde a indivíduos das localidades Cajarizinho e Uatumã/Barretinho. Fst : 0,88377...... 29 Tabela 7 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 1. ns= não significativo...... 29 Tabela 8 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 2...... 29 Tabela 9 – Matriz de distância em quilômetros, considerando o leito do rio...... 30 Tabela 10 – Valores obtidos no teste de Mantel...... 30

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1. Introdução

1.1 Carnegiella strigata como objeto de estudo genético

O gênero Carnegiella pertence à família Gasteropelecidae na qual existem dois outros gêneros: Gasteropelecus e Thorachocarax. O gênero Carnegiella possui quatro espécies: C. marthae; C. myersi; C. schereri e C. strigata (Weitzman & Palmer, 2003). Segundo Weitzman (1960) as espécies do gênero Carnegiella são formas neotênicas derivadas de Gasteropelecus, seu grupo irmão. O gênero Carnegiella distingue-se dos demais gêneros da família pela ausência de nadadeira adiposa e também pelo seu tamanho relativamente menor em relação aos outros gasteropelecídeos e a exemplo dos demais representantes da família as espécies de Carnegiella também possuem a região peitoral fortemente pronunciada e as nadadeiras peitorais alongadas e posicionadas para o alto (Weitzman & Palmer, 2003). As modificações nas nadadeiras e região peitoral permitem a estes peixes dar pequenos saltos acima da lâmina d’água durante a fuga de predadores e na busca de alimento (Wiest, 1995; Weitzman & Palmer, 1996). Por esta razão são conhecidas vulgarmente como peixe-borboleta. Uma das espécies de Gasteropelecidae de maior apelo comercial, dado o bonito padrão morfológico, é Carnegiella strigata (Günther). Este peixe é comumente conhecido como peixe-borboleta rajado e é intensamente explorado comercialmente como peixe ornamental, estando entre as 15 espécies de maior destaque no ramo da aquariofilia amazônica. Somente entre os anos de 1998 e 1999 foram exportados aproximadamente 600.000 indivíduos (Chao, 1998, 2001). Dados mais recentes indicam que de todos os peixes ornamentais destinados à exportação, 2,4% correspondem ao gênero Carnegiella, incluindo C. strigata (Anjos, no prelo). Carnegiella strigata pode ser encontrada na Guiana, Suriname, Colômbia, Bolívia, Peru e Brasil (bacia Amazônica). Seu habitat está associado a áreas sombreadas de áreas alagadas e de pequenos igarapés. Essa espécie vive em

cardumes e sua alimentação é basicamente insetívora, mas com estratégias alimentares generalistas, baseadas no consumo oportunista de itens alimentares disponíveis no ambiente, normalmente na superfície da água. O formato da boca só permite que ele coma alimentos na superfície. Seu tamanho médio quando adulto é de 4 a 5 cm. Seu corpo é de cor prateada, às vezes castanho dourado, com quatro listras marrons escuras, que lhe dão um aspecto marmóreo. A parte dorsal é num tom mais escuro e uma faixa amarela em sentido longitudinal se prolonga das brânquias até o começo da cauda. As nadadeiras pélvicas são tão pequenas que quase não são notadas. Seu corpo curto e achatado lateralmente apresenta a região anterior em formato de quilha de navio, de onde partem suas desenvolvidas nadadeiras peitorais que são largas e em forma de asas e que medem quase a metade de seu corpo (Weitzman, 1954; Géry, 1973; Weitzman & Palmer, 2003; Géry, 1977; Nelson, 1994; Santos, 2005). Desde que Carnegiela strigata foi descrita por Günther (1864), a partir de dois exemplares de origem desconhecida, a delimitação taxonômica dessa espécie tem suscitado debates. Atualmente ela é considerada sinônima sênior de pelo menos sete espécies nominais e por várias vezes foi dividida em subespécies (Géry, 1973; Weitzman & Palmer, 2003). Géry (1973) realizou uma análise nomenclatural bem como uma análise dos tipos morfológicos de C. strigata provenientes de diversos rios. Ele separou C. strigata em dois morfotipos: strigata e fasciata. De acordo com Géry (1973), C. strigata morfotipo strigata ocorre na Guiana (alto rio Suriname), no Suriname (rio Maroni, rio Cottica), Peru (rio Tigre e quebrada Yanayacu) e provavelmente no Brasil (rio Purus, Codajás e Lago Saracá na boca do rio Urubu). Já C. strigata morfotipo fasciata ocorre predominantemente no Brasil (de Tabatinga a Belém), no Peru (Iquitos, Yurimaga e Pevas), na Colômbia (rio Caqueta). Desta maneira é possível que entre Manapuru e Lago Saracá os morfotipos strigata e fasciata sejam simpátricos. Géry (1973) descreve C. strigata tipo strigata com um corpo alongado, possuindo de 25 a 30 raios na nadadeira anal, apresentando a terceira listra corporal dividida a

partir da borda do tórax. Já C. strigata tipo fasciata apresenta um corpo mais alto, com 26 a 32 raios na nadadeira anal, e com a terceira listra corporal não dividida antes da base da nadadeira peitoral (Figura 1). Este mesmo autor chama atenção para algumas amostras que ele chamou de intermediárias, e que ocorrem no alto rio Meta (bacia do Orinoco), rio Xeruini (médio rio Negro) e no rio Negro (perto de Manaus). Em tais exemplares o espaço entre os dois ramos da listra 3 não é apagada, assemelhando-se portanto a listra 3 do tipo morfológico fasciata porém mais larga. Weitzman & Palmer (2003) na obra Check list of the freshwater fishes of South and Central America apresenta de maneira sintética uma revisão sobre a nomenclatura dos gasteropelecídeos. Porém, estes autores não reconhecem a divisão de C. strigata em subespécies. Considerando a importância econômica de C. strigata para a economia do Amazonas, a provável existência de diferentes morfotipos explotados sob uma mesma denominação taxonômica, e o fato dos morfotipos habitarem rios de águas pretas normalmente separados por rios de água branca, observa-se que o estudo genético molecular propiciando conhecimentos sobre a estrutura da população e delimitação taxonômica pode ser de capital importância para o estabelecimento de estratégias de uso e conservação deste recurso pesqueiro. Os estudos genéticos em C. strigata estão restritos a descrição do cariótipo (Terencio et al., no prelo) onde foi observado que a espécie possui 50 cromossomos autossômicos (4 metacêntricos, 4 submetacêntricos, 2 subtelocêntricos e 40 acrocêntricos).

1.2 DNA mitocondrial como ferramenta para estudos genéticos

A genética de peixes na região amazônica teve seu início no final da década de 70, sendo empregadas técnicas de citogenética e isoenzimas. Mais recentemente, seqüências de DNA têm sido usadas para entender relações evolutivas em alguns grupos de peixes (Alves-Gomes et al., 1995; Farias et al., 1999). Porém, tratando-se de

peixes ornamentais, dados sobre filogeografia, estrutura genética de populações e capacidade de sustentação são pobremente conhecidos (Porto et al., 2001). Na última década tornou-se comum a utilização de marcadores mitocondriais em estudos genéticos de animais, uma vez que essa organela possui genoma próprio (DNAmt) e geralmente pequeno (15 a 20 kb), com grande número de variação nucleotídica e estrutura simples de organização, além de apresentar herança uniparental materna e ausência de recombinação. Estas características fazem com que um haplótipo mitocondrial possa servir para traçar uma genealogia ou até mesmo uma filogenia materna, o que muitas vezes pode ajudar a entender o modo de dispersão de muitos organismos (Avise, 1994, 2000; Ballard & Whitlock, 2004). O DNA mitocondrial possui 37 genes. Desses 13 codificam proteínas, dois RNAs ribossomais (12 S e 16 S), 22 RNAs transportadores e uma região não codificante chamada de região controle (Boore, 1999). Dentre estes genes, destaca-se o da ATPase, o qual tem sido utilizado para inferências sobre aspectos evolutivos, populacionais e filogeográficos de espécies de peixes (Bermingham & Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Perdices et al., 2002; Hughes & Hillyer, 2006; Reeves & Bermingham, 2006). A ATPase constitui uma família de enzimas que catalisam a hidrólise do ATP (adenosina trifosfato) para originar ADP (adenosina difosfato) e fosfato inorgânico, com liberação de energia. Estas enzimas são processadas a partir de duas subunidades gênicas, ATPase 8/6 (Alberts et al., 2002). De acordo com Zardoya & Meyer (1996) o gene da ATPase se enquadra na categoria dos pobremente apropriado para estudos filogenéticos, mas um dos mais recomendados para estudos filogeográficos e de diversidade genética (Bermingham & Martin, 1998; Martin & Bermingham, 2000; Reeves & Bermigham, 2006). Com base em uma análise no banco de dados do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) as seqüências disponíveis de ATPase de Characiformes restringem-se a 37 de Roeboides, 21 de Prochilodus, 2 de Semaprochilodus, 37 de Bryconamericus, 54 de Brycon, 2 de Astyanax, 1 de Chalceus e 1 de Phenacogrammus. Dos casos acima, duas espécies relacionam-se a estudos com mitogenomas (Saitoh et

al., 2003) e as demais com filogeografia ou com sistemática molecular (Bermingham & Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Machordom & Doadrio, 2001a; Reeves & Bermingham, 2006). De acordo com os dois mitogenomas de Characiformes já publicados, Chalceus macrolepidotus e Phenacogrammus interruptus (Saitoh et al., 2003), a subunidade 8 da ATPase possui 168 nucleotídeos que, quando traduzidos, codificam 56 aminoácidos; e a subunidade 6 da ATPase possui 228 nucleotídeos que codificam 76 aminoácidos. Convém destacar que, a exemplo de outros dois pares de genes mitocondriais, as ATPases 8/6 se sobrepõem em dez nucleotídeos. Considerando-se a diversidade ictiofaunística da região amazônica, estudos abordando a diversidade genética de peixes limitam-se aos seguintes gêneros: Prochilodus (família Prochilodontidae); Potamorrhaphis, Belonion e Pseudotylosurus (família Belonidae); Paracheirodon (família Characidae); Hypopygus (família Rhamphycthyidae); Brachyplatystoma (família Pimelodidae) Mylesinus (família Serrasalmidae); Arapaima (família Arapaimidae) (Porto, 1999; Lovejoy & de Araújo, 2000; Harris & Petry, 2001; Sivasundar et al., 2001; Batista & Alves-Gomes, 2006; Formiga-Aquino, 2004; Turner et al., 2004; Hrbek et al., 2005; Schmitt, 2005). Na maioria destes estudos verificou-se uma forte relação entre a estrutura genética das populações e os locais de amostragem, excetuando os grandes migradores, sendo a vicariância o principal evento responsável por essa diversificação. A região amazônica é a mais rica em espécies de peixes de todo o mundo, contudo informações sobre sua diversidade e os processos evolutivos que a geraram são pobremente conhecidos. Descrever os padrões e entender os processos que produziram esta imensa diversidade é importante, ainda mais pelo fato de poder-se analisar a variabilidade genética de uma espécie de peixe ornamental altamente explorada, como é o caso de Carnegiella strigata, oriunda de bacias de drenagem de água preta próximas de Manaus (centro exportador), como a bacia do rio Negro, do Uatumã e do Urubu.

1.3 Considerações sobre as bacias dos rios Negro, Urubu e Uatumã

Os rios amazônicos podem ser classificados em: rios de águas brancas, com coloração barrenta, possuindo muitos sedimentos em suspensão; rios de águas claras que têm suas cabeceiras nos Escudos do Brasil Central e das Guianas e que drenam áreas onde existe pouca erosão; e rios de águas pretas (Sioli, 1990; Santos & Ferreira, 1999). Os rios de águas pretas têm sua origem no platô das Guianas, que consiste numa área de formação geológica muito antiga e erodida, datando do período Pré- Cambriano. Estes rios não transportam material em suspensão em grande quantidade. Porém, encontram-se na sua área de captação enormes florestas inundáveis (igapós) e o material orgânico produzido pela floresta, tais como folhas e galhos, caem na água e decompõe-se parcialmente. Vários produtos de decomposição são solúveis e de coloração marrom, provocando a coloração escura da água (Junk, 1983). Muitas destas substâncias possuem características ácidas (ácidos húmicos e fúlvicos), contribuindo para baixar o pH da água, que pode atingir valores ao redor de quatro. Este tipo de água é extremamente pobre em sais minerais (Junk, 1983; Goulding et al.,1988). Nas proximidades de Manaus, destacam-se três bacias de drenagens de água preta: o rio Negro, rio Urubu e rio Uatumã. Os padrões ecológicos desses sistemas de águas pretas podem ser caracterizados como acentuada oligotrofia, baixa produtividade de biomassa vegetal e animal, recursos pesqueiros concentrados nas suas florestas inundadas e diversidade biológica alta. O rio Negro é o maior tributário do rio Amazonas, com 1700 km de extensão. Este rio drena três principais formações geológicas: o escudo das Guianas, a região dos sedimentos terciários e a região sedimentar quaternária da bacia Amazônica, totalizando cerca de 750.000 km2. Corredeiras são encontradas apenas na região mais alta do seu curso. O nível da água é amplamente influenciado pelo regime de chuvas na Amazônia como um todo, sendo que no período de cheia alguns tributários podem conectar-se formando uma planície de inundação (Junk, 1983; Goulding et al., 1988;

Santos & Ferreira, 1999). O rio Urubu e o rio Uatumã drenam regiões geológicas dos períodos terciário e quaternário. As atividades neotectônicas, durante este último período, originaram inúmeras corredeiras e cachoeiras no leito de seus tributários (Nogueira & Sarges, 2001; Ibanez, 2006). Devido a este relevo acidentado, no rio Uatumã está localizada a hidrelétrica de Balbina, a qual iniciou seu funcionamento no final da década de 80. Os rios Negro, Urubu e Uatumã são paralelos entre si e são afluentes da margem esquerda do rio Amazonas, cujas águas são brancas e ricas em sedimentos. Como C. strigata, aparentemente tem sua distribuição limitada a rios de água preta, a realização de uma amostragem nestes rios, associado ao um estudo genético, pode ser uma real contribuição para uma melhor compreensão da história evolutiva de C. strigata nessas bacias fluviais.

1.4 Objetivos Gerais

Analisar a variabilidade genética do peixe ornamental Carnegiella strigata em três rios de água preta da Amazônia central.

1.4.1 Objetivos Específicos

• Estimar a variabilidade genética em populações de Carnegiella strigata; • Testar a presença de fluxo gênico entre as localidades das bacias dos rios Negro, Urubu e Uatumã; • Inferir o grau de diferenciação entre as populações das diferentes bacias de drenagem; • Relacionar os agrupamentos encontrados com a distribuição geográfica das populações amostradas.

1.5 Hipóteses

H01 - Não existe divergência genética entre as populações de Carnegiella strigata de diferentes rios de água preta na Amazônia central.

H02 - Fluxo gênico entre as populações não é influenciado pela distância geográfica.

H03 - Não há diferenças quanto ao grau de variabilidade genética entre as amostras.

2. Material e Métodos

2.1 Locais de coleta e amostragem

Para a identificação dos morfotipos strigata, fasciata e intermediário utilizou-se o trabalho de Géry (1973), observando-se o padrão da listra 3 localizada no meio do corpo que se origina na base do coracóide e que se prolonga até a listra abaixo da dorsal (Figura 1). Exemplares de Carnegiella strigata (Figura 2) foram coletados, com auxílio de puçás, redinhas e rapichés, em tributários da bacia do rio Negro, próximo às cidades de Santa Isabel do rio Negro (na margem direita: rio Urubaxi – U e na margem esquerda: igarapé Mauá – M), Barcelos (na margem direita: o igarapé Cajarizinho – Caj e na margem esquerda: o igarapé Pixirituba - Pi) e Manaus (na margem esquerda: o rio Tarumã). Na bacia do rio Urubu no igarapé Ajuricaba – Uru. Na bacia do rio Uatumã, o igarapé Barretinho – Bar, à jusante do lago de Balbina e em um igarapé no rio Uatumã – Uat, à montante do lago de Balbina. (Figura 2). Os oito pontos amostrados foram georeferenciados com auxílio de um GPS e espécimes testemunhos encontram-se depositados no Laboratório de Genética da Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática do INPA (Tabela 1).

Figura 1 - Imagens ilustrativas de C. strigata morfotipos strigata (A), forma intermediária (B) e fasciata (C).

Figura 2 – Exemplares de C. strigata dos diferentes pontos de amostragem.

Figura 3 - Localização da área de estudo. Os pontos marcados são referentes às áreas de amostragem de C. strigata. M=igarapé Mauá, U=rio Urubaxi, Pi= igarapé Pixirituba, Caj=igarapé Cajarizinho, T=rio Tarumã, Uru=rio Urubu, Uat=bacia do rio Uatumã e Bar=igarapé Barretinho.

Tabela 1 – Identificação dos locais de coleta de C. strigata

Bacia Local de coleta Número amostral Coord. S-N Coord. W-E rio Urubaxi (U) 7 0°34'15" S 64°49'55" W igarapé Mauá (M) 6 0°21'21" S 65°09'33" W rio Negro igarapé Cajarizinho (Caj) 14 1°04'25" S 62°58'16" W igarapé Pixirituba (Pi) 15 0°53'52"S 62°41'11"W rio Tarumã (T) 15 2°42'36"S 60°02'57,50"W igarapé Barretinho (Bar) 6 1°58'19" S 59°29'48" W rio Uatumã Uatumã (Uat) 4 1°28'23"S 60°16'11"W rio Urubu igarapé Ajuricaba (Uru) 2 2°06'58,8" S 59°56'7,8" W

2.2 Análises Moleculares

2.2.1 Extração de DNA

Para extração do DNA foram descartadas as vísceras e as escamas, utilizando-se somente o tecido muscular. Este foi obtido da região peitoral do peixe, por meio de um pequeno corte com material esterilizado. O protocolo de extração de DNA utilizado foi o descrito por Sambrook & Russell (2001), com algumas modificações. Foi utilizado o tampão de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente foram acrescentados: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente digerido. A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol clorofórmio, álcool isoamílico e clorofórmio hidratado (500 μL de cada um destes reagentes). Após a lise, o DNA foi separado das proteínas por precipitação salina juntamente com centrifugação a 14000 rpm. O sobrenadante foi então precipitado com um volume de isopropanol 100%, também com o auxílio de centrifugação. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo do tamanho do pellet (DNA precipitado) formado. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com brometo de etídio (EtBr – 0,5 g/mL). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Eagle Eye (Stragene), o qual possui acoplado um transluminador de ultravioleta (260 nM).

2.2.2 Amplificação do DNA

O gene mitocondrial da ATPase 8/6 foi amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Saiki et al., 1988), utilizando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores (primers): ATP8.2-L8331 5’-AAAGCRTYRGCCTTTTAAGC-3’ e CO3.2- H9236 5’-GTTAGTGGTCAKGGGCTTGGRTC-3’, descritos por Lovette et al. (1998) (Figura 4). As reações de PCR foram feitas em um termociclador Ependorff - Mastercycler Gradient, para volume final de 25 μL (~100 ng de DNA genômico; Tampão 1X; 0,5 unidades de Taq DNA Polimerase; 0,2 mM de cada dNTP – dATP, dCTP, dTTP, dGTP; 0,2 μM de cada primer; 2,0 mM de cloreto de magnésio e água mili-Q para completar o volume) em 30 ciclos sendo: desnaturação a 93°C por 1 minuto, anelamento a 60°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos. Após os 30 ciclos uma extensão final a 72°C por 5 minutos. Depois de amplificado, os produtos de PCR foram verificados em eletroforese em gel de agarose 1,0% corado com EtBr (0,5 μg/mL). As visualizações e documentações dos géis de agarose foram realizadas no fotodocumentador Eagle Eye (Stragene). A purificação dos produtos de PCR foi realizada com uso do kit GFX PCR DNA Kit (GE HealthCare), seguindo o protocolo sugerido pelos fabricantes.

Figura 4 – Esquema da localização dos primers utilizados para amplificação e seqüenciamento do gene da ATPase 8/6 de C. strigata.

2.2.3 Seqüenciamento do DNA

O seqüenciamento do DNA foi realizado pelo método de Sanger et al. (1977), com terminadores marcados com fluorescência. Para a realização das reações de seqüenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare), no qual cada dideoxinucleotídeo (terminador) é marcado com fluoresceína (responsável pela ativação do segundo elemento) e um dos quatro tipos de rodamina, cuja fluorescência é captada pelo seqüenciador automático de DNA. As reações de seqüenciamento foram realizadas em placas de 96 poços, utilizando-se entre 150 e 300 ng do produto de PCR purificado; 5pmol de cada primer em reações separadas; 4 μL do premix (kit) e água mili-Q para completar o volume de 10 μL. Essas reações foram feitas em um termociclador Ependorff - Mastercycler Gradient, em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento a 50°C por 15 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no seqüenciamento foram os mesmos utilizados para o PCR. Depois de seqüenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de precipitação para a eliminação de produto não incorporado durante a reação de seqüenciamento. Logo após foi realizada a leitura automática do fragmento no seqüenciador automático de DNA MegaBACE 1000 (GE HealthCare), nas condições de injeção e corrida recomendadas pelo fabricante.

2.3 Análise dos Dados

2.3.1 Edição e Alinhamento das Seqüências

As amostras seqüenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do seqüenciador para outro computador. As seqüências geradas foram comparadas com seqüências depositadas no banco de dados público na Internet, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), através de uma procura realizada com o programa BLAST. Este procedimento foi realizado para determinar se o fragmento seqüenciado 14

realmente correspondia ao gene de interesse. Depois de conferidas, todas as seqüências foram alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que está incluso no BioEdit v. 5,0,6 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente conferido e editado no mesmo programa.

2.3.2 Inferências Evolutivas

As relações evolutivas entre as populações de C. strigata foram estimadas através dos métodos de Máxima Parcimônia (Hennig, 1966), Máxima Verossimilhança (Felsenstein, 1981), e Agrupamento de Vizinhos (Saitou & Nei, 1987) com o emprego do modelo evolutivo adequado. A busca do modelo foi realizada com o programa ModelTest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). Estas análises foram realizadas no programa PAUP* 4.0 (Swofford, 1999). A espécie Carnegiella marthae foi utilizada para enraizar as árvores encontradas. A Máxima Parcimônia (MP) utiliza um algorítimo que realiza uma busca entre todas as topologias mais prováveis de conter a árvore mais parcimoniosa, ou seja, determina a topologia que apresenta o menor número de passos e, conseqüentemente, o cladograma de menor tamanho para explicar as diferenças observadas nos terminais. Foram estimados o comprimento em número de passos (L=Lenght), o índice de consistência (CI=Consistence Index) e o índice de retenção (RI=Retention Index). Visto que três árvores foram igualmente parcimoniosas, foi realizado o consenso estrito e a regra de maioria entre todas as árvores. A robustez de cada nó interno foi implementada através da análise de bootstrap, realizada com 1000 replicatas. O método de Máxima Verossimilhança MV (Felsenstein, 1981) considera a árvore mais verossímil aquela que apresenta a maior probabilidade de explicar a natureza dos dados observados através de um dado modelo evolutivo. Este modelo foi o HKY+G, escolhido pelo ModelTest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). A procura pela árvore mais verossímil foi realizada pela busca heurística com adição randômica de táxons com 1000 réplicas.

O método de Agrupamento de Vizinhos (Neighbour Joining = NJ) tem como princípio encontrar pares de unidades taxonômicas operacionais (OTUs = vizinhos) que minimizam o comprimento total dos ramos em cada estágio do agrupamento com base na em dados de distância evolutiva (Saitou & Nei, 1987). Utilizando este método foi gerada uma árvore de distância corrigida pelo modelo HKY+G e outra pela distância p. Para ser possível a comparação com outros trabalhos que utilizam a ATPase como marcador, uma matriz de distância genética para estimativa da divergência entre as unidades evolutivas foi obtida pela distância p não corrigida considerando os 13 haplótipos de C. strigata.

2.3.3 Análises Populacionais

As análises populacionais foram realizadas posteriormente às inferências evolutivas em C. strigata. Cada local de coleta (igarapé) foi considerado como uma população, exceto as localidades de Urubaxi e Mauá que foram agrupadas como uma só, bem como as do Uatumã e Barretinho. Considerando a baixa amostragem no rio Urubu, esta localidade foi excluída das análises populacionais. As estimativas de variabilidade e diferenciação genética calculadas foram: (1) H - número de haplótipos; (2) HU - haplótipos únicos; (3) ETA - número de mutações; (4) K - média das diferenças nucleotídicas par a par; (5) HD – diversidade gênica (haplotípica), que é definida como a probabilidade de dois alelos escolhidos ao acaso em uma população serem diferentes – calculada pelo método Nei (1987); (6) PI − diversidade nucleotídica, a média de diferenças nucleotídicas por sítio amostrados aleatoriamente entre duas seqüências de DNA (Li & Graur, 1991); (7) S – número de sítios polimórficos; (8) Nm – número de migrantes entre populações; (9) Fst – índice de fixação.

Estas análises de variabilidade foram realizadas nos programas ARLEQUIN 3.1 (Schneider et al., 2006) e DnaSP 4.0 (Rozas et al., 2003). A Análise de Variância Molecular - AMOVA (Excoffier et al., 1992), inclusa no programa ARLEQUIN 3.1 (Schneider et al., 2006), foi utilizada para testar a significância da variabilidade encontrada dentro e entre as populações amostradas. Esta análise utiliza as informações de uma matriz de distância entre as seqüências para medir dois componentes da variância total que são: (1) o número de mutações entre as diferentes populações; (2) o número de mutações entre os diferentes haplótipos de cada população. Estes componentes foram utilizados para o cálculo dos índices de fixação. Por se tratar de uma análise hierárquica, foi possível agrupar os indivíduos dentro de populações e as populações dentro de grupos, determinando, dessa maneira, a estrutura a ser testada (Schneider et al., 2006). Foram testadas as diferenças dentro e entre cada local de coleta. O Teste de Mantel é um método estatístico que testa a significância da relação entre duas matrizes de similaridade, utilizando o valor de Fst. Neste trabalho foi utilizado para estimar a significância da relação entre a distância genética e distância geográfica que foi calculada com base na distância pelo leito dos rios. Esta análise foi realizada no programa ARLEQUIN 3.1 (Schneider et al., 2006). A árvore de haplótipos foi obtida a partir do programa TCS 1.21 (Clement et al., 2000), um software que agrupa seqüências dentro de haplótipos, calcula a freqüência destes nas populações amostradas e estima relações genealógicas entre elas. Este programa foi utilizado para estimar cladogramas não enraizados de haplótipos com o critério da máxima parcimônia (95%).

3. Resultados

3.1 Seqüência de DNA

A amplificação com os primers para a ATPase 8/6, resultou em um fragmento de 646 pb em Carnegiella strigata. Estas seqüências foram comparadas com outras disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e o segmento correspondia à ATPase de Characiformes. Ao todo foram seqüenciados 69 indivíduos de C.strigata, sendo que 561 sítios foram constantes e 85 variáveis. A média da composição nucleotídica calculada foi de 32,11% para Adenina, 23,44% para Citosina, 10,27% para Guanina e 34,18% para Timina. A taxa de transição/transversão foi de 4,3, sendo que dos 646 pb foram observadas 86 substituições nucleotídicas, 85 sítios polimórficos, dos quais 70 eram transições e 16 transversões. Não foi visualizada saturação para transições ou transversões quando a distância genética HKY+G foi plotada contra os dois tipos de mutação (Figura 5).

Gráfico de saturação

TS 40 TV

30 Número de substituições Número 20

% % % % % % % 0 5 0 5 0 5 0 1 1 2 2 3 Distância genética

Figura 5 – Número de substituições (TS-transição, TV-transversão) contra distância genética HKY+G, para o gene da ATPase.

3.2 Análise e distribuição dos haplótipos

No total foram obtidas 69 seqüências completas da ATPase, correspondentes a sete no rio Urubaxi, seis no igarapé Mauá, 15 no Pixirituba, 14 no igarapé Cajarizinho, 15 no rio Tarumã, dois no rio Urubu e 10 no rio Uatumã. Estas apresentaram 13 haplótipos diferentes, sendo dois no Urubaxi (h1 e h2), um no Mauá (h1), dois no Pixirituba (h1 e h3), quatro no Tarumã (h4, h5, h6 e h7), um no Urubu (h8), quatro no Cajarizinho (h9, h10, h11 e h12) e um para as duas localidades da bacia do rio Uatumã (h13), havendo compartilhamento de haplótipos entre as localidades de Urubaxi (cinco indivíduos), Mauá (seis indivíduos) e Pixirituba (14 indivíduos) (Tabela 2).

Tabela 2 – Frequência dos haplótipos de C. strigata encontrados entre os 69 indivíduos, evidenciando as localidades onde U=Urubaxi; M=Mauá; Pi=Pixirituba; Caj=Cajarizinho; T=Tarumã; Uru=Urubu e Uat=bacia do Uatumã. rio Negro rio Urubu rio Uatumã Haplótipos Total U M Caj Pi T Uru Uat h1 5 6 - 14 - - - 25 h2 2 ------2 h3 - - - 1 - - - 1 h4 - - - - 9 - - 9 h5 - - - - 2 - - 2 h6 - - - - 3 - - 3 h7 - - - - 1 - - 1 h8 - - - - - 2 - 2 h9 - - 9 - - - - 9 h10 - - 2 - - - - 2 h11 - - 1 - - - - 1 h12 - - 2 - - - - 2 h13 ------10 10 Total 7 6 14 15 15 2 10 69

3.3 Inferências evolutivas

3.3.1 Máxima Parcimônia (MP)

A análise de máxima parcimônia (MP), considerando-se pesos iguais entre transição e transversão (TS/TV) gerou três árvores igualmente parcimoniosas. Ao total foram 85 sítios variáveis e destes 82 foram informativos para a parcimônia. Para a visualização de apenas uma árvore foram feitos o consenso estrito e a regra da maioria (≥ 50%). Os resultados dessas topologias foram semelhantes separando C. strigata em duas unidades evolutivas, suportada cada uma por um bootstrap de 100. A primeira, englobas as localidades do Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu, sendo que esta unidade evolutiva é separada em dois grupos irmãos: um agrupando as localidades do médio rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos de h1 a h3) e outro englobando as localidades do baixo rio Negro (Tarumã – haplótipos de h4 a h7) e bacia do rio Urubu (haplótipo h8). A segunda unidade evolutiva agrupa a localidade de Cajarizinho (bacia do rio Negro – haplótipos h9 a h12) como grupo irmão de Uatumã (bacia do rio Uatumã – haplótipo h13). A árvore que melhor representa os dados é mostrada na figura 6.

3.3.2 Máxima Verossimilhança (MV)

Dentre os 56 modelos evolutivos testados, o que melhor se adequou às seqüências foi o modelo de HKY+G, a partir do teste de verossimilhança implementado no ModelTest, sendo que o programa indicou parâmetro Gamma =0,2220, taxa de ts/tv = 7,3621 e freqüência de bases nucleotídicas A= 0,3211, C= 0,2344, G = 0,1027 e T=0,3418. A partir destes parâmetros foi obtida uma árvore de máxima verossimilhança com Ln= 1630,94823. Da mesma forma como a árvore de MP, houve a separação de C. strigata em duas unidades evolutivas. A diferença entre as árvores de MP e MV foi

na unidade evolutiva 1 onde o grupo formado por indivíduos das localidades do médio rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos h1 a h3) estariam mais relacionados com alguns indivíduos da localidade do baixo rio Negro (Tarumã – haplótipos h4 e h5) (Figura 7).

3.3.3 Agrupamento de vizinhos (NJ)

As árvores de distância geradas pelo o método do agrupamento de vizinhos segundo o modelo de HKY+G e distância p, foram semelhantes. As duas unidades evolutivas evidenciadas pela MP e MV também foram demonstradas pelo método de agrupamento de vizinhos. Novamente a diferença entre as árvores resultantes dos diferentes métodos (MP, MV e NJ) encontra-se na unidade evolutiva 1, onde o grupo formado pelos indivíduos do médio rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos h1 a h3) manteve-se constante, porém indíviduos do baixo rio Negro (Tarumã – haplótipo h6) foram considerados basais para esta unidade (Figura 8). A matriz de distância genética par a par foi determinada pela distância p não corrigida (Tabela 3). A distância p entre Carnegiella strigata e Carnegiella marthae (grupo externo) variou de 17,80 a 19,70%, enquanto que a distância genética entre os haplótipos de C. strigata variou de 0,20 a 11,50%. Evidenciou-se uma variação genética separando C. strigata em duas unidades evolutivas com uma elevada distância genética entre elas, variando de 10,80 a 11,50%, aproximadamente a metade encontrada para o grupo externo. Com relação à distância genética encontrada dentro das unidades, esta variou de 0,20 a 2,00% para unidade evolutiva 1 (haplótipos h1 a h8) e de 0,20 a 0,60% para a unidade evolutiva 2 (haplótipos h9 a h13). A tabela 3 apresenta as distâncias encontradas entre os haplótipos de C. strigata.

Figura 6 – Consenso estrito entre 3 árvores de MP (L = 188; CI = 0,952; RI = 0,972; RC = 0,926) considerando matriz de peso TS1/TV1. Os números acima dos ramos são valores de bootstrap para 1000 réplicas. No interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades.

Figura 7 – Árvore de MV (Ln = 1630,94823) com os 13 haplótipos de C.strigata. No interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades. Os valores entre os ramos indicam a distância genética entre os grupos.

Figura 8 – Árvore de distância genética com os 13 haplótipos de C. strigata, obtida pelo agrupamento de vizinhos, usando o modelo de HKY+G. No interior dos quadrados coloridos os números de indivíduos de cada localidade que apresenta o haplótipo. As cores representam as localidades. Os valores entre os ramos indicam a distância genética entre os grupos.

Tabela 3 – Distância genética entre os haplótipos (em porcentagem) obtida pela distância p não corrigida. Haplótipos h1 a h8 correspondem à unidade evolutiva 1 e haplótipos h9 a h13 à unidade evolutiva 2.

h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 h10 h11 h12 h13 Cm h1 h2 0,20% h3 0,20% 0,30% h4 1,10% 1,20% 1,20% h5 1,20% 1,40% 1,40% 0,20% h6 1,20% 1,40% 1,40% 0,20%0,30% h7 1,50% 1,70% 1,70% 0,50%0,60% 0,30% h8 1,90% 2,00% 2,00% 0,80%0,90% 0,60% 0,90% h9 11,10% 11,30% 11,00% 11,10%11,00% 11,00% 11,30% 11,30% h10 11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20% h11 11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20% 0,30% h12 11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20% 0,30% 0,30% h13 11,00% 11,10% 10,80% 11,00% 10,80% 10,80% 11,10% 11,10% 0,50% 0,60% 0,60% 0,60% Cm 19,50% 19,70% 19,30% 18,70% 18,90% 18,60% 18,60% 19,00% 18,00% 18,00% 18,10% 17,80% 18,10% cm = Carnegiella marthae

3.4 Análises populacionais

3.4.1 Análises de polimorfismo de DNA

Para a unidade evolutiva 1 (Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã) a maior diversidade haplotípica foi evidenciada na população de Tarumã (baixo rio Negro), e a menor em Pixirituba (médio rio Negro). A diversidade nucleotídica e a média das diferenças nucleotídicas par a par, seguiu este mesmo padrão. Na unidade evolutiva 2 (Cajarizinho e Uatumã/Barretinho) a população de Cajarizinho apresentou as maiores diversidade haplotípica, diversidade nucleotídica e média de diferenças par a par. Quando analiza-se os índices de polimorfismo de DNA totais, comparando as duas unidades evolutivas, a segunda apresenta maiores valores de diversidade nucleotídica, enquanto a unidade evolutiva 1 possui valores mais elevados para diversidade nucleotídica e média das diferenças nucleotídicas par a par. Todos os valores encontram-se na Tabela 4.

Tabela 4 – Resultados da análise de polimorfismo de DNA, entre os indivíduos de C. strigata das cinco localidades. Onde: N=número de indivíduos; H=número de haplótipos; HU=haplótipos únicos; S=sítios polimórficos; ETA=número de mutações; HD=diversidade haplotípica; PI=diversidade nucleotídica; K=média das diferenças nucleotídicas par a par.

Rios Localidades N HHU S ETA HD PI K Urubaxi/Mauá 13 2 0 1 1 0,2821+/- 0,1417 0,0004 +/- 0,0005 0,2820 +/- 0,3215 Pixirituba 15 2 1 1 1 0,1333 +/- 0,1123 0,0002 +/- 0,0003 0,1333+/- 0,2098 rio Negro Tarumã 15 4 1 4 4 0,6190 +/- 0,1196 0,0014 +/- 0,0011 0,9333+/- 0,6789 Cajarizinho 14 3 1 3 3 0,5906 +/- 0,1185 0,0010 +/- 0,0009 0,6900 +/- 0,5473 rio Uatumã Uatumã/Barretinho 10 1 0 0 0 0,0000 +/- 0,0000 0,0000 +/- 0,0000 0,0000 +/- 0,0000 Total Unidade Evolutiva 1 43 7 0 13 13 0,6224 +/- 0,0709 0,0058 +/- 0,0033 3,7497 +/- 1,9288 Total Unidade Evolutiva 2 24 5 0 6 6 0,6993 +/- 0,0599 0,0029 +/- 0,0019 1,9239 +/- 1,1331

3.4.2 Análise de Variância Molecular (AMOVA) e estrutura genética

Por meio da Análise de Variância Molecular verificou-se que 91,35% da variância total foi observada entre as populações e 8,65% distribuídas dentro delas (Fst = 0,91345, P=0.01) para unidade evolutiva 1 (Tabela 5). Este mesmo padrão ocorre ao analisar-se a unidade evolutiva 2, sendo que a variâcia total observada entre populações foi de 88,38% enquanto 11,62% foi verificado dentro delas (Fst= 0,8377, P=0.01) (Tabela 6). Com relação a valores do índice de fixação (Fst), a unidade evolutiva 1 apresentou valores significativos apenas entre a população do baixo rio Negro (Tarumã) com as do médio rio Negro (Urubaxi/Mauá e Pixirituba). O fluxo gênico estimado à partir do número de migrantes por geração (Nm) foi elevado entre Urubaxi/Mauá e Pixirituba (7,41864 migrantes por geração), enquanto entre estas populações e Tarumã o fluxo gênico é extremamente restrito (Tabela 7). Para unidade evolutiva 2 o Fst foi significativo entre Cajarizinho e Uatumã/Barretinho, que também apresentaram número de migrantes extremamente baixo (Tabela 8).

Tabela 5 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 1, entre e dentro dos grupos de populações. Unidade evolutiva 1 corresponde a indivíduos das localidades Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã. Fst : 0,91345.

Fonte da variância Componentes Porcentagem de variação da variância Entre populações 2,41664 91,35% Dentro da população 0,22897 8,65% Total 2,64562 100,00%

Tabela 6 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 2, entre e dentro dos grupos de populações. Unidade evolutiva 2 corresponde a indivíduos das localidades Cajarizinho e Uatumã/Barretinho. Fst : 0,88377.

Componentes Fonte da variância Porcentagem de variação da variância Entre populações 1,50598 88,38% Dentro da população 0,19805 11,62% Total 1,70404 100,00%

Tabela 7 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 1. ns= não significativo.

Urubaxi/Mauá Pixirituba Tarumã Urubaxi/Mauá 0,06314ns 0,91792 Pixirituba 7,41864 0,92982 Tarumã 0,04471 0,03774

Tabela 8 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 2.

Cajarizinho Uatumã/Barretinho Cajarizinho 0,88377 Uatumã/Barretinho 0,06576

3.4.3 Teste de Mantel

A correlação entre distância geográfica (Tabela 9) e distância genética, obtida pelo teste de Mantel, não foi significativa tanto para a unidade evolutiva 1 (Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã) como para a unidade evolutiva 2 (Uatumã/Barretinho e Cajarizinho), indicando assim que a distância genética encontrada entre as populações de cada unidade evolutiva não está relacionada com a distância geográfica (Tabela 10).

Tabela 9 – Matriz de distância em quilômetros, considerando o leito do rio.

Urubaxi/Mauá Pixirituba Tarumã Cajarizinho Uatumã/Barretinho Urubaxi/Mauá 0,00 Pixirituba 284,39 0,00 Tarumã 744,14 47,05 0,00 Cajarizinho 557,88 285,79 505,88 0,00 Uatumã/Barretinho 1349,06 1076,97 2701,08 1110,80 0,00

Tabela 10 – Valores obtidos no teste de Mantel.

Unidade Evolutiva 1 Unidade Evolutiva 2 r 0,8014 0,9916 p 0,3351ns 0,3415ns r = coeficiente de correlação; ns = valores não significativos

3.4.4 Árvore de haplótipos

Para a construção do cladograma foi utilizado o princípio de máxima parcimônia, de forma que os haplótipos tivessem probabilidade maior ou igual a 95% de se conectar parcimoniosamente, obtendo-se assim duas sub-árvores, sendo estas correspondentes às unidades evolutivas. Para que houvesse a conexão entre as sub-árvores foram necessários 69 passos mutacionais (Figura 9).

h12

h13 h9 h11

h10 * 69

h2 h1

h5 h4

h7 h6 h8

Figura 9 – Árvore de haplótipos evidenciando as conexões entre os 13 haplótipos evidenciados em C. strigata. Os círculos pequenos significam haplótipos inferidos, mas não detectados, *69 número de passos adicionais necessários para conectar as sub- árvores. Os haplótipos estão distribuidos da seguinte forma: Unidade evolutiva 1: h1=Urubaxi, Mauá e Pixirituba; h2=Urubaxi; h3=Pixirituba; h4 a h7=Tarumã, h8=Urubu; e Unidade evolutiva 2: h9 a h12=Cajarizinho e h13=bacia do rio Uatumã.

4. Discussão

Aproximadamente 70% dos estudos genéticos utilizam o DNA mitocondrial como ferramenta de análise (Avise, 2000) e os estudos realizados na Amazônia seguem este mesmo padrão, sendo que a caracterização da estrutura genética e da história evolutiva por meio de técnicas moleculares é uma importante informação na genética da conservação. Porém, na bacia Amazônica os trabalhos sobre genética de peixes ósseos e cartilaginosos ainda são escassos, mas estão em franca expansão podendo- se destacar os trabalhos com: Mylesinus (Porto, 1999), Potamorrhaphis, Belonion, Pseudotylosurus (Lovejoy & de Araújo, 2000), Prochilodus (Sivasundar et al., 2001; Turner et al., 2004), Paracheirodon (Harris & Petry, 2001), Hypostomus (Montoya- Burgos, 2003) Brachyplatystoma (Formiga-Aquino, 2004; Batista & Alves-Gomes, 2006), Arapaima (Hrbek et al., 2005), Hypopygus (Schmitt, 2005), Paratrygon (Frederico, 2006), Cichla (Andrade et al., 2001, Renno et al., 2006), Symphysodon (Ready et al., 2006) e Colossoma (Santos et al., 2007).

Os fragmentos de C. strigata seqüenciados neste trabalho iniciaram-se na posição 8.064 de Chalceus macrolepidotus, de acordo com seqüência disponível no GenBank, mais precisamente no 100º nucleotídeo da ATPase 8, o qual traduz para o aminoácido treonina, e finalizaram-se na posição 8713, confirmando assim a homologia dos fragmentos.

A composição nucleotídica das seqüências de ATPase 8/6 de C. strigata foi de 32,11%, 10,27%, 23,44% e 34,18% para adenina, guanina, citosina e timina, respectivamente. De acordo com Meyer (1993), animais pecilotérmicos apresentam menores quantidades de guanina e citosina que animais endotérmicos. Este fato também pode ser verificado ao se analisar a composição nucleotídica da ATPase de outros Characiformes, disponíveis no GenBank, como ocorre em Astyanax, o qual apresenta 29,22% de adenina, 24,82% de citosina, 12,95% de guanina e 33,02% de timina (Machordom & Doadrio, 2001b). As 86 substituições nucleotídicas observadas nas seqüências de ATPase 8/6 de C. strigata resultaram na presença de 55 aminoácidos variáveis, distribuídas nos 13

haplótipos (anexo 1). Deste total 13 foram sinônimas e as demais não sinônimas, sendo que as diferenças entre os aminoácidos podem ser percebidas entre as populações (anexo 2). Um resultado semelhante foi encontrado por Cohen (2002) ao analisar molecularmente o complexo de histocompatibilidade (MHc) de diferentes populações do peixe Fundulus heteroclitus (Ciprinodontidae), provenientes de estuários de Massachusetts (EUA), onde foi verificado que os aminoácidos eram habitat-específicos e correspondiam a diferentes pressões ambientais. De acordo com Yang & Bielawski (2000), a média das trocas dos aminoácidos somente é maior que as mutações sinônimas quando estas oferecem uma vantagem seletiva, sendo então fixadas nas populações. Provavelmente isto possa estar ocorrendo com as populações de peixe-borboleta analisadas neste trabalho, uma vez que as mutações não sinônimas prevaleceram. Com base no fragmento da ATPase 8/6, as análises filogenéticas utilizando os princípios metodológicos da máxima parcimônia (Figura 6) e da máxima verossimilhança (Figura 7) indicam a existência de dois grupos monofiléticos para C. strigata. O primeiro engloba as populações de Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã (todos da bacia do rio Negro) e Urubu (bacia do Urubu), enquanto o segundo as populações de Cajarizinho (bacia do rio Negro) e da bacia do Uatumã. A variação entre as duas árvores (MP e MV) é dada pela mudança na posição dos haplótipos h4, h5, h6, h7 e h8. Na árvore de máxima parcimônia todos estes haplótipos formavam um grupo monofilético irmão dos haplótipos h1, h2 e h3. Porém, na árvore de máxima verossimilhança este grupo não se manteve. Nesta árvore os haplótipos h1, h2 e h3 formam um grupo monofilético irmão dos haplótipos h4 e h5, e este um grupo irmão de h6, h7 e h8. Embora a topologia das árvores não seja exatamente igual, isto não modifica a inferência principal de que existe uma segregação genética entre os dois grandes grupos, corroborado por um alto valor de bootstrap e também pela distância genética (Figura 8). Porto (1999), utilizando a região controle do DNAmt de Mylesinus paraschomburgkii dos rios Uatumã, Trombetas e Jarí, sugeriu que a segregação

genética dá-se em função da bacia de drenagem, sendo isto observado nas árvores de máxima parcimônia e distância genética. Para C. strigata isto não foi observado, uma vez que os indivíduos do Cajarizinho (bacia do rio Negro) são mais relacionados aos da bacia do Uatumã. Da mesma forma, que os do rio Tarumã (bacia do rio Negro), são mais próximos geneticamente dos exemplares do rio Urubu (bacia do rio Urubu), do que de outros da mesma bacia a qual eles pertencem. Um resultado similar ao encontrado para C. strigata foi evidenciado em Potamorrhaphis, utilizando o Citocromo b como ferramenta (Lovejoy & de Araújo, 2000). Esta espécie de peixe, que também apresenta pequeno porte e não é migradora, apresentou maior similaridade entre diferentes bacias de drenagem (bacia do Orinoco e bacia do rio Negro), que dentro delas. Os autores sugeriram que durante o final do Mioceno poderia ter havido uma ligação entre as duas bacias, por meio de uma região alagada que estaria próxima ao alto rio Branco. A distância genética encontrada entre os haplótipos de C. strigata variou de 0,20 a 2,00% entre indivíduos das localidades de Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu (unidade evolutiva 1), e de 0,20 a 0,6% entre espécimes de Cajarizinho e Uatumã (unidade evolutiva 2). Porém, a distância genética entre as duas unidades evolutivas variou de 10,80 a 11,50%. Com relação ao grupo externo esta distância varia de 17,80 a 19,70%. Sivasundar et al. (2001), analisando espécies de Prochilodus de diferentes bacias de drenagem, entre elas bacia do rio Negro, Orinoco e Amazonas, por meio de seqüências da ATPase 8/6, encontraram uma variação na distância genética p não corrigida de 0 a 5% entre quatro diferentes espécies do gênero. Quando estes foram comparados a um grupo externo (Semaprochilodus) esta variou de 12,5 a 16%. Considerando estes dados e analisando as seqüências publicadas de ATPase 8/6 de Characiformes, as quais estão disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), a distância genética p variou de 0 a 9,8% entre espécies e de 12 a 27% entre gêneros (Bermingham & Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Machordom & Doadrio, 2001a, b; Reeves & Bermingham, 2006). Até o momento nenhum trabalho descreveu para Characiformes uma distância genética tão elevada dentro da mesma espécie como a

encontrada em C. strigata. Os dados aqui encontrados sugerem a existência de dois grupos distintos, corroborando as árvores filogenéticas obtidas, os quais devem no mínimo ser considerados como duas unidades evolutivas, que devem ser mais bem investigadas morfológica e sistematicamente para verificar se C. strigata seria um complexo de espécies. De acordo com Waples (1998), a análise da estrutura populacional das espécies e a identificação de unidades evolutivas são extremamente importantes para a identificação de unidades de conservação, prevenindo não apenas a extinção dos organismos, mas também a perda irreversível do material genético. Paralelamente ao padrão encontrado nas árvores filogenéticas, também foram observadas na rede haplotípica duas sub-árvores correspondentes à unidade evolutiva 1 (populações das bacias do rio Negro, exceto Cajarizinho, e rio Urubu) e à unidade evolutiva 2 (populações de Cajarizinho e da bacia do Uatumã). Para forçar a conexão entre as sub-árvores foram necessários 69 passos mutacionais, tamanha a distância genética entre elas. Apesar do peixe-borboleta ser um peixe de pequeno porte e apresentar características migratórias restritas, ou seja, migrações laterais e reprodutivas, esta espécie apresentou uma estruturação populacional. Na unidade evolutiva 1 foram evidenciados altos valores de Fst (Tabela 7) entre as populações do médio rio Negro (Urubaxi/Mauá e Pixirituba) e a população do baixo rio Negro (Tarumã), enquanto na unidade evolutiva 2 foram evidenciados altos valores de Fst (Tabela 8) entre a população da bacia do rio Uatumã (Uatumã/Barretinho) e a população do médio rio Negro (Cajarizinho). Assunção (2006), ao utilizar marcadores microssatélites para estudar o cardinal (Paracheirodon axelrodi) um peixe ornamental altamente explorado, não verificou uma estruturação populacional, sendo que o rio Negro não foi uma barreira para a dispersão deste peixe, que apresentou de 1 a 9 migrantes por geração. Além disso, foi evidenciado um grande fluxo de migrantes entre igarapés de uma mesma margem, provavelmente ocasionados durante a época da cheia quando estes extravasam e conectam-se com igarapés vizinhos.

Analisando-se o número de migrantes dentro de cada unidade evolutiva de C. strigata é possível constatar que, para a unidade evolutiva 1, o rio Negro em sua porção média, não constituiu uma barreira ao fluxo gênico entre indivíduos de margens opostas ou da mesma margem (Urubaxi/Mauá e Pixirituba), pois mesmo estando distantes entre si em vários quilômetros (284 km) o número de migrantes é elevado (7,41864 migrantes por geração). Segundo Frankham et al. (2002), localidades que apresentem valores de número de migrantes superior a dois por geração podem ser consideradas como uma mesma população. Porém o fluxo gênico entre populações do médio rio Negro com a população do baixo rio Negro (Tarumã) é restrito (< 0,05 migrantes por geração). Na unidade evolutiva 2 o rio Amazonas constituiu uma barreira ao fluxo gênico entre populações distantes entre si em vários quilômetros (Uatumã/Barretinho e Cajarizinho) visto o baixo número de migrantes entre as localidades. A variância molecular evidênciada em C. strigata foi maior entre do que dentro das populações amostradas (Tabela 5 e 6), para ambas unidades evolutivas, mostrando novamente que, exceto as populações de Urubaxi/Mauá e Pixirituba (unidade evolutiva 1), C. strigata apresenta populações estruturadas do ponto de vista genético. A correlação entre a distância genética e geográfica não foi significativa para nenhuma das unidades evolutivas de C. strigata (Tabela 10). Dessa forma, a distância geográfica parece não ser o fator potencial para explicar a distância genética encontrada, não podendo assim ser rejeitada a hipótese nula. Frederico (2006), estudando a ATPase 8/6 de Paratrygon aireba (raias de água doce), dos rios Negro, Tapajós, Xingu, Araguaia e Tocantins, evidenciou uma variabilidade genética entre 0,5 a 1%, observando também que não existe correlação entre as distâncias genéticas e geográficas. Outra espécie que apresentou ampla variabilidade na bacia do rio Negro foi Hypopygus lepturus (Schmitt, 2005). Estes pequenos peixes elétricos foram coletados em vários tributários entre São Gabriel da Cachoeira e Barcelos, tendo sido observado que os haplótipos encontrados (utilizando a região controle do DNA mitocondrial) estão agrupados em clados cujos indivíduos podem estar formando um complexo de espécies, tamanha é a diferença encontrada entre eles (7% em média).

De acordo com Lundberg et al. (1998) a maioria da diversidade dos peixes de água doce é produto de mudanças paleohidrológicas que promoveram a dispersão seguida de divergência alopátrica, sendo proposto que as maiores alterações ocorreram no final do Período Terciário e durante o Quaternário, hipóteses estas que ainda estão sendo revistas. Estas mudanças também influenciaram de alguma forma a distribuição de outros táxons, como insetos (Hall & Harvey, 2002), plantas (Pennington et al., 2004), pássaros (Nores, 1999), anfíbios (Noonan & Wray, 2006), entre outros. Contudo, é notório que a região Neotropical exibe um complexo padrão biogeográfico, não associado apenas a estas alterações climáticas (Hubert & Renno, 2006). Porém, sabendo-se que a bacia do rio Negro respondeu significativamente a trocas ambientais por meio de alterações do seu leito e sentido de seu curso durante o final do Pleistoceno e Holoceno, principalmente associados com as últimas glaciações e eventos de neotectônica (Costa et al., 2001; Latrubesse & Franzinellli, 2005) e verificando este intrigante padrão genético encontrado em C. strigata, ao se sobrepor a árvore de máxima parcimônia ao mapa das localidades de coleta de C. strigata (Figura 10) uma questão vem à tona: Por que a população de Cajarizinho é mais próxima geneticamente das populações da bacia do rio Uatumã, do que de populações pertencentes à própria bacia do rio Negro?

Figura 10 – Imagem evidenciando os locais de coleta com sobreposição da árvore de máxima parcimônia.

A relação que existe entre os haplótipos do rio Tarumã e do rio Urubu poderia ser explicada pela maior proximidade geográfica, apesar de tratar-se de duas bacias diferentes. Mas como explicar a relação mais próxima de Cajarizinho do rio Uatumã que atualmente distam mais de 1000km? Existiu em algum momento uma conexão entre as cabeceiras de tributários do rio Uatumã e as cabeceiras de tributários do rio Negro abaixo do rio Branco? Estudos recentes têm indicado que a paisagem Amazônica é composta por blocos estruturais que apresentam uma segmentação orientada alternadamente nas direções NW-SE e NE-SW, sendo estes blocos separados por extensos sistemas de falhas. Estes blocos se moviam independentemente no passado e continuam se ajustando lentamente, alterando feições da paisagem e curso de alguns rios da Amazônia Central (Forsberg et al., 2000; Nogueira & Sarges, 2001; Costa et al., 2001; Almeida-Filho et al., 2005).

A conexão entre a cabeceira do rio Uatumã e afluentes da margem esquerda do rio Negro (abaixo do rio Branco), pode ter acontecido na região de depressão periférica à noroeste da bacia do rio Uatumã (Figura 11), durante o final do terciário e no quaternário, época que também ocorreu o surgimento das cachoeiras e corredeiras no leito do rio Uatumã (Nogueira & Sarges, 2001; Müller & Carvalho, 2005; Ibanez, 2006; Arnaldo Carneiro, comunicação pessoal 2007). Além disso, Costa (2002) sugere que um sistema de falhas com direção NW-SE foi responsável pelo alinhamento dos rios Negro, Preto da Eva e Urubu, bem como pelo deslocamento do leito de outros rios ao longo do rio Amazonas, o que reforça as evidências da instabilidade tectônica desta região.

Figura 11 – Imagem orbital (radar SRTM) mostrando a região da cabeceira do rio Uatumã e do rio Apuaú, afluente do rio Negro. Em evidência a região onde poderia ter ocorrido o contato da bacia do rio Uatumã com a bacia do rio Negro. Fonte SigLab- INPA, com modificações. Uma alternativa para comprovar tal hipótese seria analisar indivíduos de C. strigata da região abaixo do rio Branco ao rio Tarumã, para verificar se os indivíduos

provenientes desta região realmente seriam mais próximos geneticamente aos do Uatumã e do Cajarizinho. Outra hipótese possível é que C. strigata constitua um complexo de espécies. Géry (1973), analisando a morfologia externa evidenciou duas formas para C. strigata, tendo como característica marcante o padrão de bandas: C. strigata tipo strigata (tipo S) e C. strigata tipo fasciata (tipo F). A distribuição geográfica do tipo S seria na Guiana, Suriname e algumas localidades da calha amazônica. Enquanto a do tipo F estaria dominando a bacia Amazônica, de Iquitos (Peru) a Belém (Brasil) incluindo ainda o rio Caquetá (Colômbia). Segundo o autor, as duas formas seriam simpátricas entre Manacapuru e o rio Urubu. Adicionalmente no rio Negro e rio Orinoco, haveria um tipo morfológico intermediário que o autor chamou de tipo SF. Observando-se o padrão de bandas nos indivíduos analisados no presente trabalho (Figura 2), pode-se perceber que os indivíduos da unidade evolutiva 2 seriam mais relacionados com o tipo morfológico S (localidades de Cajarizinho e bacia do rio Uatumã), enquanto os unidade evolutiva 1 com a forma intermediária SF (localidades de Pixirituba, Mauá, Urubaxi, Tarumã e rio Urubu). Dessa forma é necessário obter seqüências do tipo morfológico F bem como realizar uma revisão taxonômica em C. strigata para comprovar se o número de espécies está subestimado. Vale destacar que Weitzman & Palmer 2003 colocaram em sinônimia todas as espécies e subspécies em uma única espécie válida, C. strigata. Visto que duas unidades evolutivas foram evidenciadas no presente trabalho e apesar de não ter sido utilizado relógio molecular nas inferências, a separação das duas grandes unidades evolutivas pode ter ocorrido em torno de 5 milhões de anos (final do Terciário), enquanto que a separação de Carnegiella marthae (grupo externo) e Carnegiella strigata provavelmente ocorreu em torno de 9 milhões de anos, considerando-se que a taxa de evolução do gene mitocondrial da ATPase é descrita na literatura como sendo de, em média, 2% por milhão de anos (Machordom & Doadrio, 2001b). Assim sendo, políticas de conservação e manejo para Carnegiella strigata não devem considerá-la como sendo um único estoque pesqueiro. Este dado é

extremamente importante, ainda mais porque esta espécie é amplamente explorada como peixe ornamental no rio Negro, o principal centro exportador de peixes ornamentais do Brasil. Se um único plano de manejo for proposto para a espécie, certamente implicará na perda de diversidade genética, mesmo que a extinção da espécie esteja sendo evitada.

5. Conclusão Os resultados obtidos para C. strigata, por meio da análise do gene da ATPase 8/6, permitiu chegar as seguintes conclusões:

1) Duas unidade evolutivas foram evidenciadas, uma composta pelas localidades de Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu, e a outra por Cajarizinho, Uatumã e Barretinho.

2) Houve uma correspondência entre as unidades evolutivas e o padrão morfológico descrito por Géry (1973), sendo que a unidade evolutiva 1 é composta por indivíduos da forma intermediária e a unidade evolutiva 2 por indivíduos da forma strigata.

4) A distância genética evidenciada entre as duas unidades evolutivas de C. strigata foi elevada quando comparada com outras espécies de Characiformes, podendo corresponder a espécies distintas.

5) Detectou-se uma estruturação populacional, com baixos índices de fluxo gênico entre as localidades, exceto entre Urubaxi/Mauá e Pixirituba (bacia do rio Negro).

6) O rio Negro não constitui uma barreira para as populações de sua porção média na unidade evolutiva 1 e o rio Amazonas atua como barreira ao fluxo gênico entre as populações da unidade evolutiva 2.

7) Na unidade evolutiva 1 maior diversidade genética foi encontrada na população de Tarumã baixo rio Negro e na unidade evolutiva 2 Cajarizinho apresentou os maiores indíces de diversidade.

8) C. strigata não pode ser tratada para fins de manejo como um único estoque, nem mesmo na bacia do rio Negro, tendo em vista o elevado grau de diferença entre as unidades evolutivas.

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7. Anexos

Anexo 1

Sítios variáveis nas seqüências da ATPase 8/6 de Carnegiella strigata

1111111111111111122222222222233333333333333333444444444455555555555 1111222333440023334445567888912455566778800012223445577899012344678912333345669 80269018456161923470692578689581212769561403670692474918035105237768428035602036 #H1 GCCTATCGTCCTCCTACTCTCCTTTGAGGTACTAAAACACTTCACAAATTGCTCTATAACATGTCGCTCTCAATGTCTAT #H2 ...... A...... #H3 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC.. #H4 A.TCTCAACTTCTTC.TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC.. #H5 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTCG. #H6 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCGCT.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC.. #H7 ...... A...... #H8 ...... T...... A....G..G.G...T...... C #H9 ...... T...... A....G..G.G...T...... C #H10 ...... T...... T...... A....G..G.G...T...... C #H11 ...... T....T...... C...... A....G..G.G...T...... C #H12 A.TCTCAACTTCTT..TCTA..CCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.TCTGG.ACTC.. #H13 .T...... T...... G...... A..T.G..G.G...T..C...... C

66666 02233 30902 #H1 TTTCG #H2 ..... #H3 CCCTA #H4 CCCTA #H5 CCCTA #H6 CCCTA #H7 ..... #H8 ..... #H9 ....A #H10 ..... #H11 ....A #H12 .CCTA #H13 ....A

Anexo 2

Aminoácidos variáveis nas seqüências da ATPase 8/6 de Carnegiella strigata

111111111111111111111111111222222222 3334444467778888889001112222244444455667788999011223444 6790357970890234593674792357802348937050519268412012034 #H1 SLSIESIPTFLSLSSFLVVNSLQDEPYLLDYLMRPPVFQELICSLSLECLDLLLC #H2 ...... S...... #H3 ...... Y...... #H4 ...... F...... Q....RG...... P... #H5 ...... F...... L...... Q....RG...... P... #H6 ...... F...... Q....RG...... P..Y #H7 ...... F...... P...... Q....RG...... P..Y #H8 .F...... F...... C...... Q.L..RG....S...... P..Y #H9 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYP..PPY #H10 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYPG.PPY #H11 N.PSKLTSILSFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYP..PPY #H12 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLAS.VPTYF.L.GYP..PPY #H13 N.PSKLTSI.SFH..SPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.LSGYP..PPY

Anexo 3 Seqüências do gene da ATPase 8/6 de 69 indivíduos de Carnegiella strigata 1111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890 #Cs1U ------A #Cs2U ------. #Cs3U ------. #Cs4U ------. #Cs5U ------. #Cs6U ------. #Cs9U ------. #Cs1M ------. #Cs6M ------. #Cs8M ------. #Cs10M ------. #Cs17M ------. #Cs23M ------. #Cs1Caj ------. #Cs3Caj ------. #Cs4Caj ------. #Cs5Caj ------. #Cs6Caj ------. #Cs7Caj ------. #Cs8Caj ------. #Cs9Caj ------. #Cs10Caj ------. #Cs11Caj ------. #Cs12Caj ------. #Cs13Caj ------. #Cs14Caj ------. #Cs17Caj ------. #Cs4Pi ------. #Cs5Pi ------. #Cs7Pi ------. #Cs15Pi ------. #Cs16Pi ------. #Cs17Pi ------.

1111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890 #Cs22Pi ------. #Cs25Pi ------. #Cs23Pi ------. #Cs26Pi ------. #Cs27Pi ------. #Cs34Pi ------. #Cs35Pi ------. #Cs7225Pi ------. #Cs7240Pi ------. #Cs1T ------. #Cs2T ------. #Cs3T ------. #Cs4T ------. #Cs6T ------. #Cs7T ------. #Cs9T ------. #Cs6957T ------. #Cs6959T ------. #Cs6960T ------. #Cs6963T ------. #Cs6964T ------. #Cs6965T ------. #Cs6966T ------. #Cs6967T ------. #Cs2Bar ------. #Cs3Bar ------. #Cs4Bar ------. #Cs6Bar ------. #Cs7Bar ------. #Cs8Bar ------. #Cs6502Bar ------. #Cs6503Bar ------. #Cs6504Bar ------. #Cs6505Bar ------. #Cs1Uru ------. #Cs2Uru ------. #ge ------. #Chalceus ATGCCCCAATTAAATCCCGCCCCATGATTTGCCATCCTAGTATTTTCTTGACTAATCTTCCTGACAATCGTCCCATCCAAAGTACTTAAACATACTTTT.

ATPase 8

ATPase 6

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