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Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Microbiologia DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS AOS CACTOS Melocactus ernestii e Opuntia humifusa PRESENTES EM ECOSSISTEMAS DO BRASIL E ESTADOS UNIDOS Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em microbiologia. ALICE FERREIRA DA SILVA HUGHES BELO HORIZONTE 2014 ALICE FERREIRA DA SILVA HUGHES DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS AOS CACTOS Melocactus ernestii e Opuntia humifusa PRESENTES EM ECOSSISTEMAS DO BRASIL E ESTADOS UNIDOS Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em microbiologia. Orientador: Dr. Luiz Henrique Rosa Laboratório de Sistemática e Biomoléculas de Fungos – ICB/UFMG. Co-orientadores: Dr. Carlos Augusto Rosa Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Leveduras ICB/UFMG. Dr. David Wedge Dr. Charles L. Cantrell Natural Products Utilization Research Unit of the National Center for Natural Products Research University, United States Department of Agriculture (ARS/NPURU/USDA), Oxford, MS, USA. Belo Horizonte, 2014 Dedico este trabalho a Frederic Mendes Hughes pelo apoio, força e amparo em todas as fases do doutorado. AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de Minas Gerais, ao Departamento de Microbiologia, ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia (PPGMICRO), pela oportunidade de realização do curso; Ao Professor Dr. Luiz Henrique Rosa pela orientação, ensinamentos e oportunidades engrandecedoras concedidas durante o curso; Ao Professor Dr. Carlos Augusto Rosa pela co-orientação, ensinamentos, críticas e valiosas sugestões, bem como pela participação na apresentação de projeto de doutorado e na qualificação; Ao grupo de pesquisa da USDA: Dr. David Wedge e Dr. Charles Cantrell pela oportunidade, co-orientação e ensinamentos. Aos técnicos Ramona Pace, Linda Robertson, Amber Callahan e Solomon Green III pela paciência, ensinamentos e supervisão no dia-a-dia; Ao querido marido, Frederic Hughes, pelo suporte nas coletas, identificação e herborização dos cactos e ensinamentos sobre análises estatísticas e filogenéticas; A bióloga Isis Galliza pelo suporte nos ensaios antimicrobianos; Ao técnico Jamil Silvano de Oliveira pelo suporte na utilização do liofilizador no laboratório multi-usuário da PPGMICRO da UFMG; A Rita Moraes e Victor Madoxx pelo suporte na coleta nos EUA; Aos queridos professores e ex-orientadores Angélica Lucchese e Flávio França pela confecção das cartas de recomendação, as quais me permitiram pleitear uma vaga no PPGMICRO da UFMG; A banca do projeto de doutorado, composta por Ary Correa Júnior, Maria Aparecida de Resende Stoianoff e Jovita Eugênia Gazzinelli Cruz Madeira, pelas considerações; A banca de qualificação, composta por Betania Cota e Susana Johann, pelas valiosas sugestões; A banca de doutorado, composta por Betânia Barros Cota, Daniel de Assis Santos, Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz e Susana Johann, pelas considerações e valiosas sugestões; Aos meus pais Adeilda Soares da Silva e Heribaldo Ferreira da Silva, bem como toda família pelo constante apoio sem os quais jamais teria atingido mais uma etapa; Às amigas do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras e do Laboratório de Sistemática e Biomoléculas de Fungos, em especial a Camila Gontijo, Camila Carvalho, Mariana Costa e Natália Maciel, pela amizade e pelo ambiente de agradável convívio; Aos amigos de Oxford, em especial a homemate Camila Carvalho, Natália Corniani e Elza Correa, pela força, companhia e por tornar a estadia em Oxford prazerosa; À amiga Suikinai Nobre Santos pelo acompanhamento durante as etapas do doutorado e amizade; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela concessão da bolsa de doutorado (CNPq 141684/2010-0) e a CAPES pela bolsa de doutorado sanduíche (Capes/PSDE 1283/12-0). “Se oriente, rapaz Pela constatação de que a aranha Vive do que tece Vê se não se esquece Pela simples razão de que tudo merece Consideração ... Determine, rapaz Onde vai ser seu curso de pós-graduação Se oriente, rapaz Pela rotação da Terra em torno do Sol Sorridente, rapaz Pela continuidade do sonho de Adão.” Gilberto Gil SUMÁRIO RESUMO xii ABSTRACT xiv LISTA DE FIGURAS xvi LISTA DE TABELAS xxi 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DA LITERATURA 04 2.1 FUNGOS ENDOFÍTICOS 04 2.2 DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 09 2.3 PROCESSOS BIOTECNOLOGICOS UTILIZANDO FUNGOS ENDOFÍTICOS 11 2.4 A FAMÍLIA CACTACEAE 15 2.4.1 Aspectos botânicos e distribuição geográfica 15 2.4.1.1 O gênero Melocactus (Link & Otto) 17 2.4.1.2 O gênero Opuntia (Opuntioideae; Stevens 2001–2008) 18 2.4.2 Utilização na medicinal tradicional da família Cactaceae 20 2.4.3 Propriedades terapêuticas da família Cactaceae 23 2.4.4 Fungos endofíticos associados à espécies da família Cactaceae 24 3 OBJETIVO GERAL 26 3.1 Objetivos Específicos 26 4 MATERIAL E MÉTODOS 27 4.1 COLETAS DO MATERIAL BOTÂNICO 27 4.2 ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 27 4.3 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS 28 4.3.1 Extração do DNA total 28 4.3.1.1 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Melocactus ernestii 28 4.3.1.2 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Opuntia humifusa 29 4.3.2 Obtenção dos amplicons 30 4.3.2.1 Amplificação utilizando o iniciador GTG5 30 4.3.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 30 4.3.2.3 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 31 4.3.2.4 Amplificação utilizando os iniciadores EF1-728F e EF1-986R 31 ix 4.3.2.5 Amplificação utilizando os iniciadores β-butulina 31 4.3.3 Purificação dos amplicons 32 4.3.4 Sequenciamento 33 4.3.5 Análise computacional das sequências 33 4.4 ANÁLISES FILOGENÉTICAS 34 4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS POR TÉCNICAS DE MACRO E MICROCULTIVO 35 4.6 RIQUEZA, EQUABILIDADE E DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 36 4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 37 4.7.1 Obtenção do extratos brutos 37 4.7.1.1 Extratos hidro-alcóolicos 37 4.7.1.2 Extratos diclorometânicos 37 4.7.2 Triagem da atividade antimicrobiana 38 4.7.3 Determinação da concentração inibitória mínima 40 4.7.4 Determinação da atividade antifúngica contra fungos fitopatôgenicos 40 4.7.4.1 Ensaio de bioautografia 40 4.7.4.2 Ensaio de microdiluição em placa 41 4.8 Seleção dos extratos para análise química 42 4.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear 42 4.10 Análise quantitativa e qualitativa de ácidos graxos 43 4.11 Cromatografia Gasosa – Análise com Detector por Ionização de Chama (GC-FID) 44 4.12 Fracionamento químico biomonitorado 44 4.13 Análises de Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) 45 4.14 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 45 4.15 Elucidação estrutural dos constituintes químicos 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 46 5.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii 46 5.1.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii 46 5.1.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii 55 x 5.2 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Opuntia humifusa 59 5.2.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa 59 5.2.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa 67 5.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS BIOATIVOS 69 5.3.1 Melocactus ernestii 69 5.3.2 Opuntia humifusa 77 5.4 ENSAIOS DE MICRODILUIÇÃO EM PLACA COM METABÓLITOS ISOLADOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa 83 6 DISCUSSÃO 93 6.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii E Opuntia humifusa 93 6.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E METABÓLITOS BIOATIVOS DE FUNGOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa 99 7 CONCLUSÕES 105 8 REFERÊNCIAS 107 9 APÊNDICES 148 10 ANEXOS 187 xi RESUMO Para conhecer o potencial da micobiota endofítica associada a plantas da família Cactaceae, este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade da comunidade endofítica da raiz, cladódio e espinho de Melocactus ernestii Vaupel e do cladódio de Opuntia humifusa (Raf.) Raf., por meio de técnicas moleculares e morfológicas, bem como avaliar o potencial dos extratos e metabólitos de M. ernestii, O. humifusa e dos fungos endofíticos quanto a atividade antimicrobiana. Os fungos Aureobasidium pullulans e Mycoleptodiscus indicus, associados aos cladódios de M. ernestii, e Alternaria cf. arborescens, Alternaria sp. 4, Aureobasidium pullulans e Diaporthe sp., associados aos cladódios de O. humifusa, representaram os táxons dominantes. Apenas Diaporthe sp. UFMGCB 6350 (potencial nova espécie) foi compartilhado entre M. ernestii e O. humifusa. Preussia sp. 1 e Sphaerobolaceae sp. foram as espécies dominantes nos espinhos; por outro lado Cochliobolus eragrostidis, Fusarium oxysporum e F. solani foram as espécies dominantes nas raízes de M. ernestii. Dentre os fungos identificados 19 gêneros e 24 espécies de M. ernestii, bem como quatro gêneros e quatro espécies de O. humifusa foram reportadas pela primeira vez como fungos endofíticos associados a cactos. As sequências de 79 táxons endofíticos (10 de O. humifusa e 69 de M. ernestii) apresentaram baixa similaridade com sequências de fungos depositadas no GenBank e podem representar espécies novas. Os valores do índice de riqueza de Margalef encontrados para a comunidade endofíticas de O. humifusa (cladódios = 3,4) e M. ernestii (cladódios = 5,7, espinhos = 5,17 e raízes = 12,1) indicaram uma diversidade moderada e elevada, respectivamente. A diversidade β foi menor entre cladódio e espinho (0,65) quando comparada com os outros pares: raiz e cladódio (0,85) e raiz e espinho (0,84), sendo a comunidade de fungos endofíticos na raiz a mais diferenciada. Os extratos obtidos de M.