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Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Microbiologia

DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS AOS CACTOS Melocactus ernestii e Opuntia humifusa PRESENTES EM ECOSSISTEMAS DO BRASIL E ESTADOS UNIDOS

Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em microbiologia.

ALICE FERREIRA DA SILVA HUGHES BELO HORIZONTE 2014

ALICE FERREIRA DA SILVA HUGHES

DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS AOS CACTOS Melocactus ernestii e Opuntia humifusa PRESENTES EM ECOSSISTEMAS DO BRASIL E ESTADOS UNIDOS

Orientador: Dr. Luiz Henrique Rosa Laboratório de Sistemática e Biomoléculas de Fungos – ICB/UFMG.

Co-orientadores: Dr. Carlos Augusto Rosa Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Leveduras ICB/UFMG.

Dr. David Wedge Dr. Charles L. Cantrell Natural Products Utilization Research Unit of the National Center for Natural Products Research University, United States Department of Agriculture (ARS/NPURU/USDA), Oxford, MS, USA.

Belo Horizonte, 2014

Dedico este trabalho a Frederic Mendes Hughes pelo apoio, força e amparo em todas as fases do doutorado.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Minas Gerais, ao Departamento de Microbiologia, ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia (PPGMICRO), pela oportunidade de realização do curso; Ao Professor Dr. Luiz Henrique Rosa pela orientação, ensinamentos e oportunidades engrandecedoras concedidas durante o curso; Ao Professor Dr. Carlos Augusto Rosa pela co-orientação, ensinamentos, críticas e valiosas sugestões, bem como pela participação na apresentação de projeto de doutorado e na qualificação; Ao grupo de pesquisa da USDA: Dr. David Wedge e Dr. Charles Cantrell pela oportunidade, co-orientação e ensinamentos. Aos técnicos Ramona Pace, Linda Robertson, Amber Callahan e Solomon Green III pela paciência, ensinamentos e supervisão no dia-a-dia; Ao querido marido, Frederic Hughes, pelo suporte nas coletas, identificação e herborização dos cactos e ensinamentos sobre análises estatísticas e filogenéticas; A bióloga Isis Galliza pelo suporte nos ensaios antimicrobianos; Ao técnico Jamil Silvano de Oliveira pelo suporte na utilização do liofilizador no laboratório multi-usuário da PPGMICRO da UFMG; A Rita Moraes e Victor Madoxx pelo suporte na coleta nos EUA; Aos queridos professores e ex-orientadores Angélica Lucchese e Flávio França pela confecção das cartas de recomendação, as quais me permitiram pleitear uma vaga no PPGMICRO da UFMG; A banca do projeto de doutorado, composta por Ary Correa Júnior, Maria Aparecida de Resende Stoianoff e Jovita Eugênia Gazzinelli Cruz Madeira, pelas considerações; A banca de qualificação, composta por Betania Cota e Susana Johann, pelas valiosas sugestões; A banca de doutorado, composta por Betânia Barros Cota, Daniel de Assis Santos, Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz e Susana Johann, pelas considerações e valiosas sugestões; Aos meus pais Adeilda Soares da Silva e Heribaldo Ferreira da Silva, bem como toda família pelo constante apoio sem os quais jamais teria atingido mais uma etapa; Às amigas do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras e do Laboratório de Sistemática e Biomoléculas de Fungos, em especial a Camila Gontijo, Camila Carvalho, Mariana Costa e Natália Maciel, pela amizade e pelo ambiente de agradável convívio;

Aos amigos de Oxford, em especial a homemate Camila Carvalho, Natália Corniani e Elza Correa, pela força, companhia e por tornar a estadia em Oxford prazerosa; À amiga Suikinai Nobre Santos pelo acompanhamento durante as etapas do doutorado e amizade; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela concessão da bolsa de doutorado (CNPq 141684/2010-0) e a CAPES pela bolsa de doutorado sanduíche (Capes/PSDE 1283/12-0).

“Se oriente, rapaz Pela constatação de que a aranha Vive do que tece Vê se não se esquece Pela simples razão de que tudo merece Consideração ... Determine, rapaz Onde vai ser seu curso de pós-graduação Se oriente, rapaz Pela rotação da Terra em torno do Sol Sorridente, rapaz Pela continuidade do sonho de Adão.” Gilberto Gil

SUMÁRIO

RESUMO xii ABSTRACT xiv LISTA DE FIGURAS xvi LISTA DE TABELAS xxi 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DA LITERATURA 04 2.1 FUNGOS ENDOFÍTICOS 04 2.2 DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 09 2.3 PROCESSOS BIOTECNOLOGICOS UTILIZANDO FUNGOS ENDOFÍTICOS 11 2.4 A FAMÍLIA CACTACEAE 15 2.4.1 Aspectos botânicos e distribuição geográfica 15 2.4.1.1 O gênero Melocactus (Link & Otto) 17 2.4.1.2 O gênero Opuntia (Opuntioideae; Stevens 2001–2008) 18 2.4.2 Utilização na medicinal tradicional da família Cactaceae 20 2.4.3 Propriedades terapêuticas da família Cactaceae 23 2.4.4 Fungos endofíticos associados à espécies da família Cactaceae 24 3 OBJETIVO GERAL 26 3.1 Objetivos Específicos 26 4 MATERIAL E MÉTODOS 27 4.1 COLETAS DO MATERIAL BOTÂNICO 27 4.2 ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 27 4.3 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS 28 4.3.1 Extração do DNA total 28 4.3.1.1 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Melocactus ernestii 28 4.3.1.2 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Opuntia humifusa 29 4.3.2 Obtenção dos amplicons 30

4.3.2.1 Amplificação utilizando o iniciador GTG5 30 4.3.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 30 4.3.2.3 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 31 4.3.2.4 Amplificação utilizando os iniciadores EF1-728F e EF1-986R 31

4.3.2.5 Amplificação utilizando os iniciadores β-butulina 31 4.3.3 Purificação dos amplicons 32 4.3.4 Sequenciamento 33 4.3.5 Análise computacional das sequências 33 4.4 ANÁLISES FILOGENÉTICAS 34 4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS POR TÉCNICAS DE MACRO E MICROCULTIVO 35 4.6 RIQUEZA, EQUABILIDADE E DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS 36 4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 37 4.7.1 Obtenção do extratos brutos 37 4.7.1.1 Extratos hidro-alcóolicos 37 4.7.1.2 Extratos diclorometânicos 37 4.7.2 Triagem da atividade antimicrobiana 38 4.7.3 Determinação da concentração inibitória mínima 40 4.7.4 Determinação da atividade antifúngica contra fungos fitopatôgenicos 40 4.7.4.1 Ensaio de bioautografia 40 4.7.4.2 Ensaio de microdiluição em placa 41 4.8 Seleção dos extratos para análise química 42 4.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear 42 4.10 Análise quantitativa e qualitativa de ácidos graxos 43 4.11 Cromatografia Gasosa – Análise com Detector por Ionização de Chama (GC-FID) 44 4.12 Fracionamento químico biomonitorado 44 4.13 Análises de Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) 45 4.14 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 45 4.15 Elucidação estrutural dos constituintes químicos 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 46 5.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii 46 5.1.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii 46 5.1.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii 55

5.2 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Opuntia humifusa 59 5.2.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa 59 5.2.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa 67 5.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS BIOATIVOS 69 5.3.1 Melocactus ernestii 69 5.3.2 Opuntia humifusa 77 5.4 ENSAIOS DE MICRODILUIÇÃO EM PLACA COM METABÓLITOS ISOLADOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa 83 6 DISCUSSÃO 93 6.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii E Opuntia humifusa 93 6.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E METABÓLITOS BIOATIVOS DE FUNGOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa 99 7 CONCLUSÕES 105 8 REFERÊNCIAS 107 9 APÊNDICES 148 10 ANEXOS 187

RESUMO

Para conhecer o potencial da micobiota endofítica associada a plantas da família Cactaceae, este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade da comunidade endofítica da raiz, cladódio e espinho de Melocactus ernestii Vaupel e do cladódio de Opuntia humifusa (Raf.) Raf., por meio de técnicas moleculares e morfológicas, bem como avaliar o potencial dos extratos e metabólitos de M. ernestii, O. humifusa e dos fungos endofíticos quanto a atividade antimicrobiana. Os fungos Aureobasidium pullulans e Mycoleptodiscus indicus, associados aos cladódios de M. ernestii, e Alternaria cf. arborescens, Alternaria sp. 4, Aureobasidium pullulans e Diaporthe sp., associados aos cladódios de O. humifusa, representaram os táxons dominantes. Apenas Diaporthe sp. UFMGCB 6350 (potencial nova espécie) foi compartilhado entre M. ernestii e O. humifusa. Preussia sp. 1 e Sphaerobolaceae sp. foram as espécies dominantes nos espinhos; por outro lado Cochliobolus eragrostidis, Fusarium oxysporum e F. solani foram as espécies dominantes nas raízes de M. ernestii. Dentre os fungos identificados 19 gêneros e 24 espécies de M. ernestii, bem como quatro gêneros e quatro espécies de O. humifusa foram reportadas pela primeira vez como fungos endofíticos associados a cactos. As sequências de 79 táxons endofíticos (10 de O. humifusa e 69 de M. ernestii) apresentaram baixa similaridade com sequências de fungos depositadas no GenBank e podem representar espécies novas. Os valores do índice de riqueza de Margalef encontrados para a comunidade endofíticas de O. humifusa (cladódios = 3,4) e M. ernestii (cladódios = 5,7, espinhos = 5,17 e raízes = 12,1) indicaram uma diversidade moderada e elevada, respectivamente. A diversidade β foi menor entre cladódio e espinho (0,65) quando comparada com os outros pares: raiz e cladódio (0,85) e raiz e espinho (0,84), sendo a comunidade de fungos endofíticos na raiz a mais diferenciada. Os extratos obtidos de M. ernestii (cladódios, raízes e espinhos) e O. humifusa (cladódios) não apresentaram atividade antimicrobiana; entretanto, cinco extratos dos fungos endofíticos de M. ernestii e seis de O. humifusa inibiram pelo menos um dos micro-organismos alvos. Foi detectada a presença majoritária do ácido graxo palmítico para os extratos Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, Bartalinia sp. UFMGCB 6347, Cladosporium funiculosum Ohu 17C1, Fusarium solanii UFMGCB 5865 e Paraconiothyrium sp. Ohu 17A e para as frações 8 e 9 do extrato Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1. O ácido linoleico foi majoritário nas frações 7 e 9 de Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B e na fração 7 de Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1. O fracionamento biomonitorado levou ao isolamento da citocalasina H (do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350), da especiferona A (do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409) e da (-)-5-metilmeléina (do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B) que apresentaram atividade antifúngica fraca ou moderada contra os micro-organismos alvos avaliados. As espécies do gênero Phomopsis foram as mais sensíveis, indicando que essas substâncias podem não ser as únicas responsáveis pela bio-atividade inicialmente observada no extrato bruto. Para o extrato de B. mediterranea Ohu 19B sugere-se efeito sinérgico da (-)- 5-metilmeléina e do ácido linoléico. Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo sobre substâncias bioativas produzidas por fungos endofíticos associados a cactos.

Palavras-chave: fungos endofíticos, diversidade, Cactaceae, ácidos graxos, citocalasina H, especiferona A, (-)-5-metilmeléina e atividade antimicrobiana.

xii

ABSTRACT

To understand the potential of the mycota endophytic associated to Cactaceae plants, this study aimed to characterize the diversity of the endophytic community of root, stem and spine from Melocactus ernestii Vaupel and stems from Opuntia humifusa (Raf.) Raf. by molecular biology and morphological techniques; and evaluate the potential of the crude extracts and metabolites of M. ernestii, O. humifusa and endophytic fungi on the antimicrobial potential. The taxa Aureobasidium pullulans e Mycoleptodiscus indicus associated with stems of M. ernestii e Alternaria cf. arborescens, Alternaria sp. 4 Aureobasidium pullulans and Diaporthe sp. associated with stems of O. humifusa were dominant; and only Diaporthe sp. UFMGCB 6350 (potential new species) was shared between M. ernestii and O. humifusa. Preussia sp. 1 and Sphaerobolaceae sp. were the dominant species on the spines while Cochliobolus eragrostidis, Fusarium oxysporum and F. solani were the dominant species in the roots of M. ernestii. Among the identified isolates, genera and 24 species of M. ernestii and four genera and four species of O. humifusa were first reported as endophytic fungi associated with cacti. A total of 79 endophyte taxa recovered (10 from the O. humifusa and 69 from the M. ernestii) showed low similarity with sequences of fungi deposited in the GenBank database and could represent new fungal species. The value on the Margalef index for the endophytic fungal of O. humifusa (stems = 3.4) e M. ernestii (stems = 5.7, spines = 5.17 and roots = 12.1) showed moderate and high diversity, respectively. The Beta diversity was lower among cladodes and spines (0.65) compared with the other pairs: root and stems (0.85) and root and spines (0.84), suggesting that endophytic community of root was the most differentiated. No antifungal activity was observed in the crude extracts from plants while five extracts of fungal endophytes from M. ernestii and six extracts of fungal endophytes from O. humifusa showed antimicrobial activity for at least one microorganism tested. The majority presence of the fatty acid palmitic was detected to the extracts Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, Bartalinia sp. UFMGCB 6347, Cladosporium funiculosum Ohu 17C1, Fusarium solanii UFMGCB 5865 and Paraconiothyrium sp. Ohu 17A and the fractions 8 and 9 of Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1. The linoleic acid was majority in the fractions 7 and 9 of Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B and in the fraction 7 of Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1. Using a bioassay-guided purification approach cytochalasin H were obtained from Diaporthe sp. UFMGCB 6350, spiciferone A were obtained from Phoma sp. UFMGCB 6409 and (-)-5-methylmellein were obtained from Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B, that showed weak or moderate antifungal activity against the target microorganisms tested, with the genus Phomopsis was the most sensitive; the results indicate that these substances can’t be the unique responsible for the bio-activity initially observed in the crude extract. To extract Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B suggest synergistic effect of (-)-5-methylmellein and linoleic acid. To our knowledge, this is the first report of bioactive substances produced by endophytic fungi associated with cacti.

Keywords: endophytic fungi, diversity, Cactaceae, fatty acids, cytochalasin H, spiciferone A, (-)-5-methylmellein and antimicrobial activity.

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema químico-ecológico: interpretação do custo-benefício entre Planta-Fungo, com ênfase em endofíticos. (A) demonstra a hipótese antagonismo balanceado; (B) doença causada por fungos patogênicos; (C) a reciprocidade endófito-patógeno. O ponto de interrogação (?) indica que este fenômeno pode não ser universal, e mais pesquisas são necessárias para confirmação; (D) produção de metabólitos secundários bioativos pela planta e fungos; (E) sinergia equilibrada. 07

Figura 2 Ação da camptotecina e seus derivados sobre o DNA. A tensão do DNA é causada pela replicação, transcrição e remodelagem da cromatina (a). Uma das fitas é quebrada pela TOP1 e favorece a formação do ponto de giro que habilita a rotação da fita intacta pela fita quebrada (b). Assim, é possível visualizar (c) a expansão do relaxamento do DNA pelo complexo de clivagem TOP1, que pode ser estabilizado por fármacos como as camptotecinas. 08 FIGURA 3 Metabólitos secundários isolados de fungos endofíticos: (1) paclitaxel, (2) camptotecina, (3) podofilotoxina, (4) vincristina e (5) hipericina. 14

Figura 4 Metabólito secundário enfumafungina, com propriedades antifúngicas, produzido pelo fungo endofítico Hormonema sp. 14

Figura 5 Melocactus ernestii sobre afloramento rochoso no município de Ipirá – Bahia. 18

Figura 6 Opuntia humifusa: com (a) e sem espinhos (b), gloquídeos (c) e flor (d). 20

Figura 7 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia da região transcrita interna de fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii: a) Aspergillus, b) Astrocystis, c) Bartalinia, d) Cladosporium e) Colletrotricum, f) Curvularia, g) Diaporthe, h) Fusarium, i) Microsphaeropsis, j) Penicillium, k) Phoma, l) Preussia, m) Rhizopycnis e Setosphaeria e n) Xylaria. 54

Figura 8 Curva de acumulação de espécies (linha cinza), intervalos de confiança de 95% (linhas em preto), baseado em 2.000 repetições de bootstrap. 55

xiv

Figura 9 Compartilhamento de espécies fungos endofíticos entre partes da planta Melocactus ernestii. Valores representam riqueza de espécies. Números nas interseções correspondem às espécies de fungos endofíticos que co-ocorrem entre as partes da planta. (U) representa o conjunto universo ou todas as espécies de fungos. Ver Tabela 3 para nomes dos táxons endofíticos. 56

Figura 10 Curvas de abundância das espécies detectadas nas partes da planta Melocactus ernestii: cladódio, espinho e raiz. Pontos representam as espécies de fungos endofíticos no eixo vertical. O eixo horizontal ordena as espécies em ordem hierárquica, da mais a menos comum. Ver tabela 3 para singletos e demais espécies de fungos endofíticos. 58

Figura 11 Dendrograma de similaridade baseado na matriz de abundância das comunidades endofíticas prospectadas em diferentes partes de Melocactus ernestii. A análise de agrupamento foi obtida pelo coeficiente de similaridade de Jaccard, método de ligação simples. Correlação cofenética = 0,999. Valor de bootstrap a partir de 5.000 repetições. 59

Figura 12 Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1: a) crescimento em meio Ágar batata dextrose (esquerda) e em meio Ágar extrato de malte (direita), b) conídeos sob objetiva 40x, c) conídeos sob objetiva 100x. 62

Figura 14 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia do gene do fator de alongamento de fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa: a) Alternaria e b) Cladosporium. 65

Figura 15 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia do gene da β-tubulina do fungo endofítico Biscogniauxia mediterranea associado à Opuntia humifusa. 65

Figura 16 Árvores filogenéticas a partir da análise (a) Máxima Parcimônia e (b) Bayesiana de sequências combinadas da região transcrita interna, do gene do fator de alongamento e da β-tubulina do fungo endofítico Diaporthe sp. associado à Opuntia humifusa. 66

Figura 17 Curva de acumulação de espécies da comunidade de fungos endofíticos associada à Opuntia humifusa (linha cinza), intervalos de confiança de 95% (linhas em preto), baseado em 2000 réplicas de bootstrap. 67

Figura 18 Curva de abundância das OTUs detectadas nos cladódios de Opuntia humifusa. Pontos representam as espécies (OTUs) de fungos endofíticos no eixo vertical. O eixo horizontal representa a abundância. 68

Figura 19 Metabólito citocalasina H (fórmula molercular C28H31NO7 e massa molecular de 493 g/mol) identificado a partir do fracionamento químico biomonitorado do extrato bruto do táxon Diaporthe sp. UFMGCB 6350. 75

Figura 20 Metabólito especiferona A (fórmula molercular C14H16O3 e massa molecular de 232,279 g/mol) identificado a partir do fracionamento químico biomonitorado do extrato bruto do táxon Phoma sp. UFMGCB 6409. 77

Figura 21 Metabólito (-)-5-metilmeleína (fórmula molercular C11H12O3 e massa molecular de 192 g/mol) identificado a partir do fracionamento químico biomonitorado do extrato bruto do táxon Biscogniauxia mediterranea. 83

Figura 22 Médias de inibição do crescimento (%) de Botrytis cinerea depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 84

xvi concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 85

Figura 24 Médias de inibição do crescimento (%) de Colletotrichum fragariae depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose- resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 86

Figura 25 Médias de inibição do crescimento (%) de Colletotrichum gloeosporioides depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 87

Figura 26 Médias de inibição do crescimento (%) de Fusarium oxysporum depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose- resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 88

Figura 27 Médias de inibição do crescimento (%) de Phomopsis obscurans depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose- resposta a 120 e 144 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 89

Figura 28 Médias de inibição do crescimento (%) de Phomopsis viticola depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 120 e 144 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 90

xvii

Figura 29 Médias de inibição do crescimento (%) de Candida krusei depois de expostos aos metabólitos citocalasina H e especiferona. Controle positivo: anfotericina B nas concentrações de 75, 150 e 300 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 91

Figura 30 Médias de inibição do crescimento (%) de Cladosporium sphaerospermum depois de expostos aos metabólitos citocalasina H e especiferona. Controle positivo: benomil nas concentrações de 75, 150 e 300 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 91

Figura 31 Médias de inibição do crescimento (%) de Escherichia coli depois de expostos aos metabólitos citocalasina H e especiferona. Controle positivo: cloranfenicol nas concentrações de 75, 150 e 300 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento. 92

xviii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Critério simbiótico proposto por Rodriguez et al. (2009) utilizado para caracterizar os grupos de fungos endofíticos. 04

Tabela 2 Utilização terapêutica das espécies da família Cactaceae no Brasil. 22

Tabela 4 Valores observados e valores esperados, baseados nos estimadores de riqueza Chao 2, Jackknife 1, Jackknife 2 e Bootstrap, para cladódios, espinhos e raízes de Melocactus ernestii. 56

Tabela 5 Comparação entre medidas de diversidade de Unidades Taxonômicas Operacionais de fungos endofíticos para os diferentes nichos (i.e. cladódio, espinho e raiz) da espécie Melocactus ernestii. 57

Tabela 7 Atividade antimicrobiana dos extratos dos fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii com inibição acima de 70%. 70

Tabela 8 Concentração inibitória mínima (μg/mL) e porcentagem de inibição dos extratos hidro-alcóolicos e diclorometânicos dos extratos bioativos de fungos associados à Melocactus ernestii. 71

Tabela 9 Atividade antifúngica de extratos dos fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii por meio do ensaio de bioautografia contra três espécies Colletotrichum. 72

xix

Tabela 10 Quantificação de ácidos graxos (%) produzidos por fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii. 73

Tabela 11 Atividade antifúngica de extratos dos fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa por meio do ensaio de bioautografia contra três espécies Colletotrichum. 78

Tabela 12 Quantificação de ácidos graxos (em porcentagem) produzidos por fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa.

1 INTRODUÇÃO

As espécies comumente encontradas como endofíticas pertencem ao filo Ascomycota (SCHULZ; BOYLE, 2005), mas também são encontrados representantes dos filos Zygomycota e Basidiomycota (PINRUAN et al., 2010; VIEIRA et al., 2012). Diferentes estudos relatam que vegetais são colonizados por dezenas de endofíticos, mostrando a sua importância na estimativa da diversidade fúngica, na descoberta de novos táxons e na distribuição geográfica das espécies (SAIKKONEM et al., 1998; ARNOLD et al., 2000; STONE et al., 2004). Alguns estudos têm demonstrado que fungos endofíticos hospedeiros de plantas medicinais são capazes de apresentar diferentes atividades biológicas (PHONGPAICHIT et al., 2006; HUANG et al., 2009; ROSA et al., 2010; VIEIRA et al., 2012) e em alguns casos sintetizar as mesmas substâncias produzidas pelos seus hospedeiros. O exemplo mais conhecido é o do paclitaxel (taxol), fármaco utilizado para o tratamento de câncer, o qual é produzido tanto na planta medicinal hospedeira Taxus brevifolia (Taxaceae), como no fungo endofítico associado Taxomyces andreanae (STIERLE et al., 1995). Outros táxons de fungos endofíticos, tais como Seimatoantlerium tepuiense, Seimatoantlerium nepalense (BASHYAL et al., 1999), Tubercularia sp. (WANG et al., 2000) e Metarhizium anisopliae (LIU et al., 2009) também foram relatados como produtores de paclitaxel. A camptotecina (inibidor de síntese de RNA), obtida do fungo endofítico Nothapodytes foetida (PURI et al., 2005a) e a podofilotoxina (antincancerígeno), produzida pelo endofítico Trametes hirsuta (PURI et al., 2005b), são exemplos de metabólitos vegetais também produzidos por endofíticos. Os fungos endofíticos também são produtores metabólitos secundários bioativos diferentes daqueles produzidos pelas plantas hospedeiras e com características estruturais únicas (LI et al., 2008; WIJERATNE et al., 2008; MARTÌNEZ-LUIS et al., 2008; WANG et al., 2010), os quais são de interesse para utilização na medicina e agricultura. De acordo com Aly et al. (2011), no período de 2008-2009 investigações com fungos endofíticos levaram à descoberta de mais de 100 novos produtos naturais, ao passo que quase o mesmo número de novos metabólitos foi relatado para o período de 7 anos entre 2000 a 2007. Estes dados ressaltam a importância dos fungos endofíticos em programas de bioprospecção nos últimos anos. Além disso, recentemente foram descobertos os seguintes antimicrobianos produzidos por fungos endofíticos: o pestaloteol C inibidor da replicação do vírus HIV-1LAI em células C8166 produzido por Pestalotiopsis theae (LI et al., 2008), o antifúngico enfumafungina

(glicosídeos triterpeno) produzido por Hormonema sp. (GARCIA-EFFRON et al., 2009) com atividade antifúngica contra Candida albicans e o metabólito (3S)-3,6,7-trihidroxi-α-tetralona isolado de Phoma sp., o qual mostrou atividade antifúngica contra os fitopatógenos Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani (WANG et al., 2012). A família Cactaceae, com aproximadamente 1.600 espécies, é nativa das Américas, mas ocorre em todo mundo (HUNT, 1999). Os cactos são importantes na manutenção de vários organismos vertebrados e invertebrados e também por serem amplamente utilizados na alimentação, paisagismo e medicina tradicional, como fonte de substâncias analgésicas, antibióticas, diuréticas, dentre outros (LIMA, 1996; HOLLIS; SHEINVAR, 1995; AGRA et al., 1996; ANDRADE et al., 2006a, 2006b; MAJURE, 2010). A espécie Melocactus ernestii (Vaupel) é endêmica do Brasil e só ocorre em afloramentos rochosos, com área de maior distribuição na Caatinga e em brejos de altitude (TAYLOR, 1991; ROCHA; AGRA, 2002; HUGHES et al., 2011). Melocactus ernestii também é conhecida como cabeça-de-frade e é utilizada na medicina popular principalmente no tratamento de gripe, pneumonia, doenças do intestino e cólicas (ANDRADE, 2002). Opuntia humifusa (Raf.). Raf., cacto termotolerante, é comumente conhecido como “figo-do-inferno” e/ou “língua do diabo” e, provavelmente, originou-se no sudoeste dos Estados Unidos e norte do México (NOBEL, 1996; LARGAY; SNEDDON, 2009; MAJURE et al., 2010). Opuntia humifusa é rica em polifenóis e flavonóides, minerais e é uma boa fonte de fibra na dieta alimentar (HAHM et al., 2011; KIM et al., 2012; CHA et al., 2013); além disso, apresenta várias atividades biológicas que incluem propriedades terapêuticas como efeitos anticancerígenos (YOON et al., 2009a, 2009b; HAHM et al., 2010; KIM et al., 2013; LEE et al., 2013), antibacteriana (LEE; KIM; LEE, 2004; YOUNG et al., 2007), antioxidante (CHA et al., 2013; JUN et al., 2013), anti-inflamatória (LEE et al., 2005; CHO et al., 2006) e atividade hipoglicemiante e hipolipidêmica (HAHM et al., 2011), bem como pode ser uma alternativa no tratamento da osteoporose pós-menopausa (PARK et al., 2011). A partir do exposto acima, parece possível que os tecidos de M. ernestii e O. humifusa possam ser colonizados por fungos endofíticos capazes de produzir metabólitos bioativos de interesse. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi investigar a diversidade e potencial anti-microbiano dos fungos endofíticos associados com M. ernestii e O. humifusa. Além disso, pelo nosso entendimento esse é o primeiro estudo sobre atividade antimicrobiana dos fungos endofíticos associados à plantas da família Cactaceae.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 FUNGOS ENDOFÍTICOS O termo endofítico foi mencionado pela primeira vez no início do século XIX, para definir os organismos que colonizam tecidos internos de plantas; mas foi De Bary, em 1866, quem primeiro delineou uma possível distinção entre endofíticos e patógenos de plantas (AZEVEDO, 1998). Carroll (1986) restringiu o uso do termo endofítico a organismos que causam infecções assintomáticas nos tecidos internos de plantas, excluindo os fungos patogênicos e mutualistas, tais como os micorrízicos. Entretanto, Petrini (1991) propôs a expansão da definição de Carroll, incluindo todos os organismos que habitam órgãos de plantas que, em algum período do seu ciclo de vida, colonizam tecidos internos de um vegetal, sem causar dano aparente a seu hospedeiro. De acordo com este autor, são também considerados endofíticos os micro-organismos que apresentam uma fase epifítica duradoura, bem como patógenos latentes que vivem assintomaticamente em seus hospedeiros por algum tempo em seu ciclo de vida. “Endofítico” é, portanto, a única associação conhecida até o momento de custo-benefício entre planta-micro-organismo definida por “localização” (não “funcional”) que é transitoriamente assintomática, discreta, e estabelecida inteiramente dentro dos tecidos da planta hospedeira (KUSARI; SPITELLER, 2012a). Historicamente, dois grupos de endofíticos têm sido classificados, os quais são baseados em sua filogenia e histórico de vida, como taxonomia, planta hospedeira e funções ecológicas. Estes grupos são classificados em endofíticos clavicipitaceos (EC), capazes de colonizar gramíneas (Grupo 1) e os endofíticos não clavicipitaceos (ENC), obtidos de tecidos assintomáticos de plantas não vasculares, pteridófitas, coníferas e angiospermas (CLAY; SCHARDL, 2002; ARNOLD, 2007a). Em 2009, Rodriguez e colaboradores demostraram que os ENC representam três grupos funcionais distintos (Grupos 2, 3 e 4) baseados em características de colonização do hospedeiro, mecanismos de transmissão entre gerações, níveis de biodiversidade e funções ecológicas (Tabela 1).

Tabela 1 Critério simbiótico proposto por Rodriguez et al. (2009) utilizado para caracterizar os grupos de fungos endofíticos. Clavicipitaceos (C) Não clavicipitaceos (NC) Critério Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Amplitude de hospedeiros restrita ampla ampla ampla parte aérea,raiz e Tecido(s) colonizados parte aérea e rizoma rizoma parte aérea raiz Colonização na planta extensa extensa limitada extensa Biodiversidade na planta baixa baixa alta não conhecida Transmissão vertical e horizontal vertical e horizontal horizontal horizontal Benefícios adaptativos* NAH NAH e AH NAH NAH *Não adaptado ao habitat (NAH): benefícios, tais como tolerância à seca e aumento do crescimento são comuns entre os endofíticos independentemente do habitat de origem. Adaptado ao habitat (AH): benefícios resultantes de pressões específicas ao habitat, tais como temperatura, pH e salinidade.

Os fungos endofíticos do Grupo NC 2 são capazes de proporcionar benefícios adaptativos a planta (NAH e AH) e são transmitidos horizontalmente (colonização não sistêmica) para as plantas hospedeiras por meio de esporos presentes no ar. Em contraste, alguns endofíticos também podem ser transmitidos verticalmente (colonização sistêmica) para a próxima geração de plantas via sementes (HARTLEY; GANGE, 2009). A associação entre o endofítico Curvularia protuberata e plantas de solos termais (Dichanthelium lonuginosum) é um exemplo desse grupo; em experimentos de in vitro no campo foram observados que nessa associação a planta o fungo conseguem sobreviver separadamente em solos com elevada temperatura, mas em associação ambos toleram altas temperaturas (REDMAN et al., 2002; MARQUEZ et al., 2007). Porém, quando a associação é submetida a outro tipo de e estresse, como, por exemplo, estresse salino ou ataque de patógenos, o fungo não protege a planta dos efeitos danosos do estresse (RODRIGUEZ et al., 2009). Os fungos do Grupo NC 3 são amplamente diversos e encontrados nas partes aéreas das plantas. Sua transmissão é exclusivamente horizontal e a sua função na planta hospedeira é pouco conhecida (RODRIGUEZ et al., 2009). Os fungos do Grupo NC 4 são conhecidos como DSE (dark septate endophytes) e colonizam exclusivamente as raízes das plantas; apresentam funções relacionadas à promoção de crescimento, proteção contra patógenos e distribuição de plantas em ambientes extremos (MANDYAM; JUNPPONEM, 2005), entretanto, sua função também é pouco compreendida. Os fungos endofíticos apresentam diferentes interações com suas plantas hospedeiras, incluindo mutualismo, comensalismo e antagonismo (STONE et al., 2000). A hipótese do ''antagonismo balanceado'' (SCHULZ et al., 1999; SCHULZ; BOYLE, 2005) foi inicialmente

4 proposta para tratar como um endófito evita ativar as defesas do hospedeiro, garante auto- resistência antes de ser incapacitado pelos metabólitos tóxicos do hospedeiro e se desenvolve dentro do seu hospedeiro, sem causar as manifestações visíveis da infecção ou doença (ARNOLD, 2005, 2007b, 2008; SCHULZ; BOYLE, 2006) (Figura 1A). Nesta hipótese a colonização assintomática de um tecido, ou órgão vegetal, por um endofítico é resultado de uma relação antagônica balanceada, onde ocorre um equilíbrio entre a virulência do micro- organismo e as respostas de defesa do hospedeiro. Desse modo, a variabilidade dessa interação dependeria não só da adaptação do micro-organismo a um determinado hospedeiro ou órgão em particular, mas também de fatores como a virulência inata do endofítico, a resposta de defesa da planta e as condições ambientais. De acordo com Kusare, Hertweck e Spiteller (2012), tanto os fungos endofíticos como os patógenos possuem vários fatores de virulência que são enfrentados pelos mecanismos de defesa da planta. Se a virulência do fungo endofítico e a defesa da planta são equilibradas, a associação continua aparentemente assintomática (Figura 1A). Esta fase é apenas um período de transição e pressões de fatores ambientais podem desestabilizar o equilíbrio dos antagonistas. Se os mecanismos de defesa da planta neutralizarem completamente os fatores de virulência do fungo, este morrerá; porém, se a planta sucumbir a virulência do fungo, um relacionamento planta-patógeno conduzirá a doença do vegetal (Figura 1B). Em alguns casos os fungos endofíticos podem tornar-se agentes patogênicos latentes (Figura 1C), na medida em que são influenciados por fatores intrínsecos ou ambientais, como por exemplo, estresse ou idade da planta (ARNOLD, 2008). A interação endofítico-planta pode não ser apenas o equilíbrio entre virulência e defesa, mas uma interação muito mais complexa e precisamente controlada (Figura 1D). Por exemplo, a planta Camptotheca acuminata produz o metabólito anticâncer camptotecina que inibe a DNA topoisomerase I (Figura 2), enzima que desempenha importante papel nos processos de replicação e empacotamento de DNA (KUSARI; SPITELLER, 2012b), enquanto Fusarium solani, fungo endofítico isolado dos tecidos da entrecasca de C. acuminata, ajuda na proteção da planta por ser também produtor de camptotecina e resistente a toxicidade da camptotecina produzida pelo hospedeiro, já que as plantas utilizam a camptotecina como um modo de defesa química contra ataques de insetos e patógenos (SIRIKANTARAMAS et al., 2009; KUSARI et al., 2011). Da mesma forma, a topoisomerase I codificada por outro endofítico isolado a partir do mesmo tecido, mas que não produz camptotecina também, contém as mesmas alterações para torná-lo resistente à ação de camptotecina. Isso sugere uma pré- adaptação evolutiva dos endofíticos que infectam a mesma planta, independentemente da sua

5 capacidade biossintética. Algumas plantas também demonstraram resistência à camptotecina exercidos por resíduos de aminoácidos específicos e nos domínios catalíticos da enzima topoisomerase I. A planta Ophiorrhiza japonica apresenta resistência parcial à camptotecina in vivo, apesar de não produzir este metabólito (SIRIKANTARAMAS et al., 2009). Em ambos os casos, parece que estes tipos de interações endofítico-planta devem ser específicos e fortemente selecionados para a convivência estável (hipótese da co-evolução planta-endófito).

Figura 2 Ação da camptotecina e seus derivados sobre o DNA. A tensão do DNA é causada pela replicação, transcrição e remodelagem da cromatina (a). Uma das fitas é quebrada pela TOP1 e favorece a formação do ponto de giro que habilita a rotação da fita intacta pela fita quebrada (b). Assim, é possível visualizar (c) a expansão do relaxamento do DNA pelo complexo de clivagem TOP1, que pode ser estabilizado por fármacos como as camptotecinas. Fonte: BRANDÃO et al. (2010), adaptado de POMMIER (2006).

Embora a base genética da comunicação simbiótica ainda não seja conhecida, existem isolados e/ou espécies de fungos endofíticos que abrangem a relação simbiótica, expressando estilos de vida (interações) que variam de mutualismo para comensalismo até o parasitismo, dependendo do genótipo do hospedeiro colonizado (RODRIGUEZ; REDMAN, 2008, UNTERSEHER; SCHNITTLER, 2010). Assim, pequenas diferenças genéticas nos genomas de ambos os parceiros podem controlar o resultado (positivo, negativo ou neutro) da simbiose (MORICCA; RAGAZZI, 2008). Por exemplo, a expressão do gene da proteína cinase SakA (stress-mitogen activated protein kinase) do endofítico Epichloe festucae mostra-se vital para a manutenção de sua associação mutualista com o

7 hospedeiro Lolium perenne e previni que esta associação se torne patogênica. Na associação mutante ΔsakA, foi observado um aumento dramático da regulação de hidrolases fúngicas e transportadores, mudança consistente de simbiose para patogenicidade, com crescimento proliferativo do fungo. A análise do transcriptoma da planta revelou mudanças dramáticas na expressão de genes do hospedeiro envolvidos na defesa do patógeno (biossíntese hormonal e resposta). Esta avaliação destaca como associações entre gramínea-endofíticos podem ser afetadas pelas vias de sinalização envolvidas na manutenção dessa simbiose e desencadear uma mudança da interação mutualista para patogênica (EATON et al., 2010, 2011). Dessa forma, a relação fungo-planta deve ser considerada como uma interação flexível cuja direção é determinada por pequenas diferenças na expressão genética do fungo, em resposta ao hospedeiro, ou, ao contrário, pelo reconhecimento do hospedeiro em resposta ao fungo. As interações mutualísticas entre fungos e planta hospedeira são entendidas como um equilíbrio, que está sob controles ambientais, fisiológicos e genéticos e resulta em benefícios adaptativos para ambos os parceiros (KOGEL et al., 2006).

2.2 DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS Os fungos endofíticos são encontrados em associações com algas (HAWKSWORTH, 1988), briófitas (SCHULZ et al., 1993), pteridófitas (FISHER, 1996), coníferas (BERNSTEIN; CARROL, 1977; LEGAULT; DESSUREAULT; LAFLAMME, 1989), gramíneas (CLAY, 1988; ROSA et al., 2009), palmeiras (RODRIGUEZ, 1994; FROHLICH; HYDE, 1999), ervas (ROCHA et al., 2009), arbustos (PETRINE; STONE; CARROL, 1982) e árvores em geral (FAETH; HAMMON, 1997; MORALES-RONDÓN; RODRÍGUEZ- GONZÁLEZ, 2006). Algumas espécies de endofíticos são mais frequentes em determinado tipo de vegetal, designadas dominantes, contraste com as consideradas mais raras, chamadas de secundárias ou singletos. Dentre as espécies comumente encontradas como endofíticas destacam-se principalmente espécies de Ascomycota (SCHULZ; BOYLE, 2005). Os habitats das plantas constituem um ambiente dinâmico no qual muitos fatores afetam a frequência e composição de espécies das comunidades microbianas associadas. As comunidades endofíticas variam espacialmente no vegetal havendo diferença e especificidade de microbiota entre os diversos tecidos vegetais tais como raízes, caules, folhas, flores e frutos (NALINI et al., 2005; TEJESVI et al., 2005; GOND et al., 2007). Além disso, os micro- organismos endofíticos também são dependentes da interação com outros micro-organismos patogênicos e epifitícos (OSONO, 2007; SANTAMARIA; BAYMAN, 2005), sofrem

8 influência do ambiente (PIMENTEL, 2006; UNTERSEHER et al., 2007) e da idade do tecido vegetal (PHOTITA et al., 2001; VUJANOVIC; BRISSON, 2002). A ocorrência de endofíticos parece variar de acordo com as condições climáticas. A maioria dos estudos descreve a microbiota de vegetais isolados de regiões de clima temperado, que se revela diferente das espécies encontradas em regiões tropicais, tanto em termos quantitativos quanto qualitativos (RODRIGUES; PETRINI, 1997). No entanto, existem espécies de endofíticos cosmopolitas que ocorrem em ambientes temperados e tropicais isolados de vários hospedeiros, os quais pertecem aos gêneros: Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Colletotrichum, Epicoccum, Fusarium, Guignardia, Phyllostica, Pestalotiopsis, Phomopsis, Phoma e Pleospora (SURYANARAYANAN; WITTLINGER; FAETH, 2005; PIMENTEL et al., 2006). Em ambientes áridos a colonização de endofíticos em plantas foi positivamente correlacionada com a umidade e precipitação (BILLS, 1996; FAETH; HAMMON, 1997). A precipitação de ambientes xerófilos pode ser sazonalmente abundante, prevendo períodos regulares em que as condições são favoráveis para a dispersão de esporos e, desta forma, ocorrência da infecção. Folhas de diversas plantas hospedeiras mesófilas têm demonstrado menor colonização de endofíticos na época da seca quando comparado com o período chuvoso (RODRIGUES, 1994, WILSON; CARROLL, 1994; SURYANARAYANAN; KUMARESAN; JOHNSON, 1998; SURYANARAYANAN; THENNARASAN, 2004). Segundo Suryanarayanan, Wittlinger e Faeth (2005) os resultados obtidos a partir da investigação dos fungos endofíticos associados a cactos do estado do Arizona (EUA), juntamente com os resultados do estudo preliminar de Fisher et al. (1994), sugerem que as plantas de zonas áridas são pobres em diversidade de fungos endofíticos e que alguns fungos cosmopolitas são presentes. Estes dados reforçam a hipótese de que a colonização de endofíticos pode depender mais da disponibilidade de inóculo das plantas em relação a localização geográfica das plantas hospedeiras (FISHER et al., 1994; SURYANARAYANAN; KUMARESAN, 2000). Além disso, a cutícula espessa e cerosa, a baixa frequência de estômatos e as adaptações para reduzir a transpiração e perda de água dos cactos podem representar barreiras adicionais que inibem a infecção por fungos parasitas, bem como a colonização de espécies de endofíticos resultando em menor diversidade (ZIMMERMANN; GRANATA, 2002; SURYANARAYANAN; WITTLINGER; FAETH, 2005).

A instalação de um micro-organismo endofítico no hospedeiro pode ocorrer de várias formas; ativamente pela produção de enzimas ou estruturas que facilitam a sua penetração ou por meio de aberturas naturais como estômatos, hidatódios, ferimentos (DOBEREINER et al., 1993) ou via raiz e sementes (HALLMANN et al., 1997). Além disso, névoas, chuvas e orvalho são importantes fontes de inóculos de esporos de fungos, os quais penetram os tecidos vegetais e colonizam as plantas como endofíticos nos estágios iniciais da planta (CARROL; CARROL, 1978; ARNOLD et al., 2003). A taxa de fungos endofíticos presentes no hospedeiro é maior quando maior for o regime de chuvas do local, maior isolamento do hospedeiro em relação a outras plantas e quanto mais velha forem as folhas (BERNSTEIN; CARROL, 1977, CARROL; CARROL, 1978, ARNOLD et al., 2003). No entanto, é importante ressaltar que as diferenças nos métodos de isolamento, incluindo a seleção de meios de cultivo, o tamanho dos fragmentos do tecido da planta hospedeiro, o tempo desde a colheita de tecido até o processamento das amostras, bem como as condições de cultura, podem influenciar nas conclusões sobre a frequência da infecção endofítica, bem como diversidade de fungos e composição de espécies (ARNOLD, 2007; SUN et al., 2011).

2.3 PROCESSOS BIOTECNOLOGICOS UTILIZANDO FUNGOS ENDOFÍTICOS Os fungos endofíticos são conhecidos a mais de um século, mas somente nas duas últimas décadas despertaram interesse em decorrência do seu potencial biotecnológico (ARAÚJO et al., 2002). O acúmulo de informações dessa interação planta-endofítico tem tido uma atenção especial, uma vez que, atribuem-se outras características importantes a estes organismos, como o aumento da resistência a condições de estresse, alteração em propriedades fisiológicas, produção de fitormônios, toxinas, fármacos, imunossupressores, antitumorais, bem como metabólitos de interesse biotecnológico como enzimas, proteínas e polissacarídeos (AZEVEDO, 1998; AZEVEDO et al., 2000; STAMFORD et al., 2001; STAMFORD et al., 2002; SUTO et al., 2002; STROBEL, 2003). Fungos endofíticos podem conferir resistência à planta contra herbivoria por meio de dois mecanismos principais: (i) estímulo direto do vigor da planta e (ii) produção de metabólitos que aumentam a resistência à herbivoria (CLAY; MARKS; CHEPLICK, 1993). Um levantamento feito por Azevedo et al. (2000) mostra a importância dos fungos endofíticos no controle de insetos que atacam plantas. Os fungos Acremonium lolli, Balansia cyper, Cladosporium sphaerosperum e Phomopsis oblonga são citados como produtores de

10 metabólitos capazes de proteger seu hospedeiro de ataques de insetos (AZEVEDO et al., 2000). Este fato se deve muitas vezes a produção de toxinas pelo endofítico, correlação feita pela primeira vez por Bacon et al. (1977), os quais estabeleceram uma ligação entre o endofítico Epicholoe typhi e a toxicidade do hospedeiro, o que confere proteção ao vegetal. Neotyphodium é outro exemplo, um endófitico de Festuca aerundinacea, que beneficia seu hospedeiro aumentando a tolerância à seca (WHITE JR. et al., 2002), crescimento da raiz, produção de sementes, germinação, captação de fósforo e resistência a nematóides e insetos (PANACCIONE et al., 2001). O crescimento do vegetal também pode ser afetado pela presença de endofíticos, o que se deve em parte a produção de fitormônios e/ou pelos endofíticos serem capazes de aumentar a absorção de nutrientes como nitrogênio e fósforo pela planta (TAN; ZOU, 2001; BANDARA et al., 2006). No entanto, a produção de enzimas pelas plantas em resposta à colonização do endofítico pode ter um papel fundamental na limitação de crescimento do endófito e/ou patógeno e na virulência dos mesmos. Alguns autores consideram ainda de grande importância a utilização de métodos e critérios que racionalizem a busca de fungos endofíticos em meio à miríade de espécies vegetais existentes no planeta (ARNOLD et al., 2000; TAN; ZOU, 2001; STROBEL, 2006). Neste sentido, algumas estratégias têm sido empregadas (STROBEL, 2003), tais como:

(1) a escolha de plantas de ambientes peculiares, especialmente aquelas que apresentam estratégias de sobrevivência pouco comuns; (2) plantas que apresentam histórico etnobotânico conhecido, ou seja, que vêm sendo tradicionalmente utilizadas como medicamento por tribos, grupos étnicos e pela população de um modo geral; (3) plantas endêmicas; (4) plantas cujo desenvolvimento se dá em regiões de grande biodiversidade, tais como em florestas temperadas e tropicais.

Entre estas estratégias, a busca por plantas que apresentam histórico etnobotânico constitui uma escolha empregada por pesquisadores em todo o mundo. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de fungos endofíticos obtidos de plantas medicinais, cujos metabólitos apresentaram atividade biológica. Neste contexto, é razoável supor que a atividade farmacológica atribuída a algumas espécies vegetais possa estar relacionada, de alguma forma, às substâncias produzidas por micro-organismos endofíticos (incluindo fungos) ou

11 pela planta em resposta a uma infecção (ARNOLD et al., 2000; FERRARA, 2006). Algumas vezes, os micro-organismos associados às plantas, são capazes de produzir substâncias com efeitos terapêuticos mais efetivos que as produzidas pelas plantas hospedeiras (STROBEL; LONG, 1998). Alguns exemplos de metabólitos secundários produzidos por endofíticos demonstraram que algumas linhagens são capazes de produzir os mesmos metabólitos produzidos pelas plantas hospedeiras. Um exemplo clássico disso consiste na obtenção do paclitaxel produzido por Taxomyces andreanae associado à planta Taxus brevifolia (STIERLE; STROBEL; STIERLE, 1993). O fungo Seimatoantlerium tapuiense obtido de uma Rubiaceae (Maguireothammus speciosus) também produz paclitaxel, além de outros fungos endofíticos (STROBEL, 2002). Estes resultados apontam para novas fontes potenciais para a obtenção de paclitaxel e sugerem que este seja um metabólito de ocorrência comum em endofíticos (MOMESSO, 2008). Outros exemplos recentes são a produção do inibidor de síntese de RNA, a camptotecina, obtida do fungo endofítico Nothapodytes foetida (PURI et al., 2005a), o antincancerígeno podofilotoxina, produzida pelos endofíticos Phialocephada fortinii e P. hexandrum (EYBERG et al., 2006), a vincristina (anticancerígeno) isolada a partir do fungo endofítico Mycelia sterilla associado a Catharanthus roseus (YANG et al., 2004), a produção de hipericina (KUSARI et al., 2008) com uma extensa variedade de atividades biológicas, por um fungo endofítico isolado de Hypericum perforatum (Figura 3). No entanto, os fungos endofíticos também são produtores de metabólitos secundários bioativos diferentes dos produzidos pelas plantas e com características estruturais únicas. Estes metabólitos são de interesse para utilização na medicina e agricultura. O fungo endofítico Pestalotiopsis theae (Amphisphaeriaceae), obtido a partir de ramos de uma planta não identificada na China, foi capaz de produzir quatro novos metabólitos nomeados como pestaloteol A-D, entre os quais o pestaloteol C inibiu a replicação do vírus HIV-1LAI em células C8166 com o valor de EC50 de 16, 1 μM (LI et al. 2008). O metabólito enfumafungina (glicosídeo triterpeno) produzido pelo fungo endofítico Hormonema sp., obtido de folhas de Juniperus communis é um inibidor específico da síntese de 1,3 β glucana em células fúngicas com EC50 de 0,07 μM sobre a proliferação de Candida albicans (ONISHI et al., 2000; PELÁEZ et al., 2000; SCHWARTZ et al., 2000; GARCIA-EFFRON et al., 2009). Modificações estruturais do metabolito enfumafungina (Figura 4) resultaram no desenvolvimento do MK- 3118, um metabólito semi-sintético de uso oral (inibidor da síntese de β-1,3-glucana) com atividade inibitória potente contra C. albicans (EC50 de 0,6 ng /mL) e Aspergillus fumigatus (1,7 ng/mL). O MK-3118 vem sendo submetido a ensaios clínicos na fase I como o

12 primeiro medicamento oral inibidor da síntese de glucana para uso na terapia de infecções fúngicas (MOTYL et al., 2010).

FIGURA 3 Metabólitos secundários isolados de fungos endofíticos: (1) paclitaxel, (2) camptotecina, (3) podofilotoxina, (4) vincristina e (5) hipericina. Fonte: MOMESSO, 2008.

Figura 4 Metabólito secundário enfumafungina, com propriedades antifúngicas, produzido pelo fungo endofítico Hormonema sp. Fonte: ALY et al. (2011).

Kumar e Kaushik (2012) mostraram em sua revisão vários metabólitos biofungicidas (alcalóides, terpenóides, esteróides, isocumarinas e cromonas, fenólicos e voláteis) isolados e 13 caracterizados de fungos endofíticos, tais como: (i) o novo metabólito tetralona [(3S)-3,6,7- trihidroxi-α -tetralona] isolado de Phoma sp., que tem atividade antimicrobiana contra os fitopatôgenos Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani (OLIVEIRA et al., 2009), (ii) os metabólitos bioativos 7-hidroximeleina e orcinol (isolados de Penicillium sp., endofítico de Alibertia macrophylla), que têm atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioides e Cl. sphaerospermum (OLIVEIRA et al, 2011) e (iii) os três metabólitos cladosporina, isocladosporina e 5′-hidroxiasperentina, isolados do fungo endofítico Cladosporium cladosporioides, com potencial como protótipo para o desenvolvimento de biopesticidas contra espécies de Colletotrichum e Phomopsis (WANG et al., 2013). Portanto, os fungos endófitos proporcionam uma fonte rica de muitos agentes agroquímicos, os quais podem ser utilizados como alternativa para substituir pesticidas sintéticos, considerando o aumento da incidência da resistência de fungos fitopatôgenicos, e toxicidades potenciais para o ambiente e os mamíferos (KUMAR; KAUSHIK, 2012; WANG et al., 2013).

2.4 A FAMÍLIA CACTACEAE

2.4.1 Aspectos botânicos e distribuição geográfica

As Cactáceas constituem um grupo extremamente diversificado, com um impressionante conjunto de estratégias adaptativas, evolutivas e ecológicas que lhes conferem uma grande capacidade de desenvolvimento nos diferentes habitat (ALVES et al., 2008). Segundo Rizzini (1982), as espécies de Cactaceae que ocorrem no Brasil podem ser classificadas em cinco grupos, de acordo com o seu hábitat:

i) silvícolas - que habitam florestas pluviais: amazônica e atlântica, com predominância de espécies epífitas; ii) savanícolas – ocorrem no cerrado; iii) campestres – ocorrem em campos rupestres de Minas Gerais; iv) litorâneas – ocorrem no litoral brasileiro; v) xerófilas – que ocorrem no bioma Caatinga, abrangendo o maior número de espécies.

As cactáceas encontram-se subdivididas em três subfamílias: Pereskioideae, Opuntioidae e Cactoideae (WALLACE, 1995). Recentemente foi proposta uma nova subfamília, Mahiuenioideae (SOUZA; LORENZI, 2005). Cronquist (1988) observou Cactaceae como uma das poucas grandes famílias das dicotiledôneas com claro significado ecogeográfico. A família é endêmica para o Novo Mundo distribuída desde o Canadá até a Patagônia, sendo mais freqüente nas zonas climáticas áridas entre 35°N e S de latitude, mas conspicuamente ausente da Região Amazônica (BARTHLOTT, 1979; BOYLE; ANDERSON, 2002; TAYLOR; ZAPPI, 2004), com exceção de três subespécies de Rhipsalis baccifera (Muell.): Rhipsalis baccifera subsp. mauritima, subsp. erythrocarpa e subsp. horrida, encontradas no Velho Mundo (MAXWELL, 1998, 1999). Três gêneros ocorrem nas Ilhas Galápagos no pacífico, e uma espécie endêmica de Cereus (Mill.) ocorre nos penhascos de rochas vulcânicas de Fernando de Noronha no Atlântico leste da costa nordeste do Brasil (BARTHLOTT, 1979). Dos três centros geográficos de diversidade e endemismo que são reconhecidos para Cactaceae, o primeiro compreende o México e sudoeste dos Estados Unidos, onde ocorrem 50 gêneros e 550 espécies (HUNT, 1999) e estima-se que 73% dos gêneros e 78% das espécies são endêmicas (HERNÁNDEZ; GODÍNEZ, 1994). Esta diversidade corresponde a ¼ dos gêneros descritos para Cactaceae (aceitos pela IOS – International Organization for Succulent Plant Research) e com ⅓ destas espécies endêmicas (HERNÁNDEZ; GINDÍNEZ, 1994; TAYLOR, 1997; BOYLE; ANDERSON, 2002), com relevante destaque para as 160 espécies do gênero Mammillaria (Haw.) para o México, das quais 94% são endêmicas (HERNÁNDEZ; GODÍNEZ, 1994). O segundo centro de concentração da diversidade de Cactaceae é localizado na porção central dos Andes na América do Sul (Peru, Bolívia, nordeste do Chile e da Argentina) e o terceiro centro está em grande parte restrita ao nordeste brasileiro e desta forma, aos domínios morfoclimáticos do bioma Caatinga, onde ocorrem aproximadamente 40 gêneros e 200 espécies, destas 76% são endêmicas (TAYLOR; ZAPPI, 2004; SOUZA; LORENZI, 2005).

2.4.1.1 O gênero Melocactus (Link & Otto) O gênero Melocactus tem como centro de diversidade proposto o estado da Bahia no nordeste do Brasil; entretanto, encontra-se distribuído desde as restingas litorâneas do estado do Rio de Janeiro, passando pelos estados do Nordeste do Brasil e chegando até o México e

15 lhas do Caribe (TAYLOR, 1991). Esta ampla distribuição e diversidade são marcadas por endemismos oriundos provavelmente por áreas vicariantes. Para o gênero Melocactus constituído de um total de 36 espécies (ANDERSON, 2001), 14 são encontradas na Bahia, das quais 11 são endêmicas (TAYLOR, 2000) e 12 subespécies apresentando algum grau de ameaça: M. conoideus, M. deinacanthus, M. glaucescens, M. paucispinus, M. pachyacanthus subsp. pachyacanthus, M. azureus subsp. ferreophilus, M. azureus subsp. azureus, M. violaceus subsp. margaritaceus, M. violaceus subsp. ritteri, M. violaceus subsp. violaceus, M. pachyacanthus subsp. viridis, M. lanssensianus (IUCN, 2012). Espécies de Melocactus apresentam um cefálio terminal como característica marcante do gênero. Para algumas espécies o cefálio pode determinar o fim do crescimento em altura das estruturas vegetativas, desta forma este tipo de cefálio é classificado como terminal (TAYLOR, 1991). Diferentemente das espécies de cactos colunares (como Ferocactus acanthodes e Carnegiea gigantea), onde o crescimento em altura vegetativa é determinante da idade da planta (JORDAN; NOBEL, 1982; NOBEL, 1988; PIERSON; TURNER, 1998), o gênero Melocactus apresenta a altura do cefálio como indicativo da idade da planta (TAYLOR, 1991) e estrutura etária populacional da fase adulta (TAYLOR, 1991; HUGHES, 2011). A espécie Melocactus ernestii Vaupel (Figura 5), endêmica do semi-árido brasileiro, compreende dentro do gênero a maior amplitude de distribuição geográfica, ocorrendo desde o NE de Minas Gerais até os Brejos de Altitude em Pernambuco e Paraíba, com disjunções em inselbergs gnáissicos e rochas cristalinas e areníticas. A amplitude de distribuição geográfica na qual a espécie M. ernestii se encontra é composta de nichos e gradientes ambientais distintos, mas com predomínio de ambientes com precipitação média anual de 1.000 mm (TAYLOR; ZAPPI, 2004).

Figura 5 Melocactus ernestii sobre afloramento rochoso no município de Ipirá - Bahia (Fotos: Frederic M. Hughes).

2.4.1.2 O gênero Opuntia (Opuntioideae; Stevens 2001–2008). O gênero Opuntia, incluído em Opuntioideae, é representado por cerca de 2300 espécies xerófitas e nativo das Américas ocorrendo desde o Canadá até o extremo sul da América do Sul, mas com maior diversidade no México (POWELL; WEEDIN, 2004; DE- FELICE, 2004). Essas espécies também conhecidas popularmente como opúntias, nopaleas ou palmas-forrageiras são perenes e possuem caules planos e podem ser prostradas ou eretas e 17 até mesmo formar pequenas árvores, geralmente, produzem muitos frutos com sementes abundantes e são facilmente propagados por fragmentos de caule. Muitas espécies se desarticulam facilmente nos nós, um mecanismo comum e eficiente de multiplicação clonal (BENSON, 1982; REBMAN; PINKAVA, 2001). A taxonomia do gênero Opuntia nunca foi bem resolvida, pelos seguintes motivos: (i) apresentam extrema plasticidade fenotípica, e são pobremente estudadas ecologicamente; (ii) são potencialmente capazes de formar híbridos com caracteres intermediários entre táxons bem definidos; (iii) e numerosos caracteres morfológicos, são difíceis de preservar em herbários (MAJURE; ERVIN, 2007). No entanto, as opúntias apresentam uma morfologia característica, como resultado de adaptações xerofíticas onde, geralmente, há a presença de cutículas e cera, que reduzem a quantidade de água perdida por transpiração; folhas modificadas em forma espinhos e gloquídeos que diminuem a área da superfície da planta, taxa de transpiração e os efeitos termoregulatórios; rápido crescimento das raizes e sistemas de raízes rasas que maximizam a absorção de água quando longos períodos de seca são quebradas pela chuva (LEWIS, 1977; NOBEL, 1978, 1983; POWELL; WEEDIN, 2004; MAUSETH, 2006; MAJURE et al., 2010). Dentre as espécies do gênero, a Opuntia humifusa (Raf.). Raf. (Figura 6) é um dos cactos mais tolerantes ao frio (até -24°C), provavelmente originado no sudoeste dos Estados Unidos e norte do México e então dispersado do leste para o sudoeste dos Estados Unidos (NOBEL, 1996; LARGAY; SNEDDON, 2009; MAJURE et al., 2010). É comumente conhecido como “figo-do-inferno” e “língua do diabo” e tem se destacado como uma das mais estudadas, utilizadas e difundida especialmente na América do Norte e Central e no Mediterrâneo, devido ao seu uso como planta ornamental, fonte de frutos e caules, forragem e medicinal (NOBEL, 1996; STINTZING; CARLE,

2005). Na Coréia O. humifusa é cultivada em larga escala por resistir ao inverno coreano, onde as temperaturas são abaixo de -20°C, enquanto a maioria das outras espécies de cactos cresce somente em regiões tropicais (GOLDSTEIN; NOBEL, 1994).

a) b)

c) d)

Figura 6 Opuntia humifusa: com (a) e sem espinhos (b), gloquídeos (c) e flor (d). Fonte: MAJURE; ERVIN, (2008).

2.4.2 Utilização na medicinal tradicional da família Cactaceae As cactáceas são vegetais amplamente utilizados na medicina tradicional por curandeiros e tribos indígenas no México, como analgésicos, antibióticos, diuréticos, para tratar problemas intestinais, tosses, afecções cardíacas e nervosas, úlceras e também são utilizadas para controlar diabetes e colesterol (HOLLIS; SHEINVAR, 1995). Os chineses curavam abscessos com a polpa da planta e os indianos usavam o fruto como alimentos e também xarope para tratar tosse e asma. Na Itália, as flores têm servido como um diurético. Um chá é preparado a partir das flores de cactos para tratar colite. Em Israel, pesquisadores descobriram que as flores secas podem ser utilizadas para tratar o aumento da próstata (NEFZAOUI; NAZARENO; MOURID, 2008). As opúntias têm sido amplamente utilizadas como medicinal em zonas áridas do mundo, tais como regiões do Brasil, México, Ásia Ocidental e África (INGLESE et al., 2002; NEFZAOUI; SALEM, 2002; MAJURE; ERVIN, 2008). Barbera et al. (1999) descreveram o uso medicinal do gênero Opuntia no México para tratamentos relacionados a diabetes, 19 diarreia, obesidade e inflamação. Além destes usos, a literatura também cita a raiz de O. fulgida no tratamento de diarreias, os cladódios de O. fuliginosa e O. streptacantha para o tratamento da gastrite, fadiga, dificuldade respiratória e lesão hepática após uso abusivo de álcool; já os cladódios de O. humifusa são utilizados no tratamento de feridas, verrugas e doenças pulmores (LEWIS, 1977; FOSTER; DUKE, 2000; SHAPIRO; GONG, 2002). No Brasil vários estudos citam a utilização de cactáceas com propriedades terapêuticas Agra et al. (1996), Mota (1997), Costa-Neto; Moraes (2000), Guerreiro et al. (2000), Tourinho (2000) e Andrade (2002) (Tabela 1). Andrade (2002) reuniu informações sobre a utilização de cactáceas com propriedades medicinais por meio de um levantamento em alguns municípios do semi-árido Baiano. Neste trabalho foram mencionados 21 problemas de saúde, que são tratáveis com cactos, dentre eles se destacam: inflamação na vaginal, uretra e no útero, infecção urinária, gripe, rendidura (reumatismo), engasgo, ressecamento e barriga inchada (constipação), coluna (doenças vertebrais), sífilis, distúrbios renais e digestivos, “estrepe” que é inflamação nos dedos das mãos ou dos pés por uma ponta de pau, cólica, doença do tempo (envelhecimento) e disenteria.

Tabela 2 Utilização terapêutica das espécies da família Cactaceae no Brasil. Espécie Parte da planta Uso terapêutico Referência Cereus jamacaru chá da raiz Inflamação na vagina, no útero e uretra, hemorroidas, gripe, sífilis, Agra et al. (1996, 2007), Tourinho (2000) distúrbios renais, digestivos, respiratórios e hepáticos, e doenças e Andrade (2002) vertebrais

Espinho Inflamação nos dedos das mãos ou dos pés por uma ponta de pau Andrade (2002) ("estrepe")

Caule Distúrbios renais, febre, no controle do colesterol alto, úlceras Correa (1969), Gomes (1972), Lima estomáquicas, sífilis, vermífugo, cicatrizante, antitumoral de origem (1996), Albuquerque e Andrade (2002), glandular, cardiotônico, anti-inflamatório, e doenças vertebrais Andrade et al. (2006a,b), Magalhães (2006), Agra et al. (2007). Cereus sp. chá do cladódio Febre Mota (1997) caule macerado Febre, problemas intestinais e constipação (intestino preso) Mota (1997) Opuntia ficus-indica mucilagem do cladódio Engasgo, inflamação, reumatismo (“rendidura”) e constipação Andrade (2002) (“ressecamento” e “barriga inchada”) chá do cladódio Dor gastro-intestinal Andrade (2002) chá da raiz Inflamação na vagina e no útero, infecção urinária e gripe Andrade (2002) Opuntia palmadora chá da raiz Inflamação na uretra Andrade (2002) Opuntia sp. mucilagem do cladódio Tumor Andrade (2002) Melocactus sp. chá do cladódio Cólicas e distúrbios no intestino Andrade (2002) xarope do cladódio Gripe e pneumonia Andrade (2002) Melocactus zehntneri xarope do cladódio Tosse e bronquite Agra et al. (1996) suco da polpa Debilidades físicas Agra et al. (1996) Harrisia adscendens chá da raiz Doenças vertebrais Guerreiro et al. (2000) Pilosocereus catingicola Cladódio Verme Guerreiro et al. (2000)

2.4.3 Propriedades terapêuticas da família Cactaceae

Opuntia tem sido o gênero mais estudado na área da farmacologia para Cactaceae. Alguns autores relacionam propriedades antimicrobianas, anti-inflamatória, antidiurética e antitumoral de extratos de frutos, flores e, principalmente, cladódios de Opuntia (AHMAD et al., 1996; BERGAOUI et al. 2007; PARK et al. 1998, 2001; GALATI et al. 2001, 2003; ZOU et al., 2005). Em O. streptacantha foi detectada a presença de propriedades antivirais contra os vírus de DNA, como herpes e vírus de RNA, tais como a gripe tipo A e vírus da imunodeficiência humana (HIV). O princípio ativo foi localizado no tecido exterior do cladódio e atribuído a uma proteína com mecanismos de ação desconhecido (AHMAD et al., 1996). Bergaoui et al. (2007) estudaram a composição química e atividade antifúngica de metabólitos voláteis obtidos das folhas, flores e frutos de O. lindheimeri var. linguiformis (L. Benson), folhas e flores de O. macrorhiza (Engelm) e folhas de O. microdasys (Lehmann) localizadas na Tunisía. Esses extratos voláteis foram testados contra os fungos Alternaria solani, Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium axysporum, Pythium ultiman e Rhizoctonia solani e um forte efeito inibitório dos extratos voláteis das três espécies foi observado contra A. solani (BERGAOUI et al., 2007). Lee, Kim e Lee (2004) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato etanólico e frações de O. humifusa e a fração com acetato de etila (700 ppm) exibiu forte inibição contra cinco bactérias: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium e Pseudomonas fluorescens. Yoon et al. (2009) demonstraram que a fração aquosa dos frutos de O. humifusa inibe a proliferação de células MCF-7, linhagem do câncer de mama em humanos. Hahm et al. (2010) demonstraram que extratos de O. humifusa inibiram a proliferação de células de glioblastoma humano (U87MG) por meio da detenção do ciclo celular na fase G1, enquanto Kim et al. (2013) mostraram que células do câncer de cólon (SW480) são susceptíveis aos metabólitos bioativos presentes no extrato de O. humifusa e que este extrato pode ter potencial na prevenção do câncer através da modulação de marcadores de apoptose e inibição de vias inflamatórias. Galati et al. (2003) constataram que o nível de colesterol (LDL) e triglicérides em ratos foram fortemente reduzidos após 30 dias de uma administração diária (1 g/kg) de cladódios de O. ficus-indica liofilizados. O trabalho de Ennouri et al. (2005) demonstrou que

22 o óleo de sementes de O. ficus-indica também diminui o colesterol plasmático LDL (colesterol VLDL) em ratos, sem qualquer efeito sobre concentrações de HDL-colesterol. Outra espécie estudada foi Cereus jamacaru, o extrato hidro-etanólico de C. jamacaru apresentou inibição tumoral evidente sobre tumores induzidos (Sarcoma 180) em camundongos (SOUZA et al., 2001). Silveira et al. (2006) verificaram que em concentrações de 25, 50 e 100 mg/kg do extrato etanólico de C. jamacaru não provocou nenhuma alteração hematológica quando administrado nos quatro primeiros dias da gestação das ratas Wistar.

2.4.4 Fungos endofíticos associados à espécies da família Cactaceae

Até o momento existem poucas informações sobre fungos endofíticos associados à Cactaceae. Apenas quatro trabalhos foram encontrados na literatura até o momento (FISHER et al., 1994; SURYANARAYANAN et al. 2005; BEZERRA et al., 2012, 2013). Fisher et al. (1994) realizaram um estudo preliminar relatando a ocorrência de endofíticos em Opuntia stricta coletada de regiões semi-áridas da Austrália. Estes endofíticos foram obtidos a partir do caule de quatro plantas em quatro locais distintos na Austrália e um total de 23 táxons foram obtidos pertencentes aos gêneros Alternaria, Ascochyta, Aureobasidium, Chaetomium, Coniella, Coniothyrium, Epicoccum, Fusarium, Geniculosporium, Leptosphaeria, Nigrospora, Nodulisporium, Penicillium, Phoma, Phomopsis e Sardaria. A maioria dos táxons inclue espécies cosmopolitas e apenas Coniothyrium opuntiae e Phomopsis cacti foram sugeridos como colonizadores específicos. Suryanarayanan et al. (2005) detectaram a presença de fungos endofíticos em 21 espécies de cactos representados pelos gêneros Carnegiea, Consolea, Cylindropuntia, Echinocereus, Mammillaria e Opuntia que ocorrem em várias localidades do Arizona, EUA. Os 900 isolados endofíticos obtidos representaram 22 espécies de fungos e Alternaria sp., Aureobasidium pullulans e Phoma spp. foram obtidos das cactáceas avaliadas. Neste estudo, a diversidade de endofíticos foi considerada baixa e não foi observada especificidade do hospedeiro entre os endofíticos; entretanto, as frequências de colonização das poucas espécies de endofíticos foram consideradas altas e comparáveis às descritas para os colonizadores de plantas tropicais. Espécies de Colletotrichum, Phomopsis, Phyllosticta comumente obtidos como endofíticos de plantas de habitats “moderadamente úmido" estiveram ausentes nos cactos estudados (SURYANARAYANAN et al., 2005).

Bezerra et al. (2012) estudaram a riqueza de fungos endofíticos associados à Opuntia ficus-indica na região semi-árida (Caatinga) do Brasil. Neste estudo foram isolados 44 endofíticos identificados como táxons gêneros Acremonium, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Monodictys, Nigrospora, Penicillium, Pestalotiopsis, Phoma, Phomopsis, Tetraploa e Xylaria. As espécies mais comumente encontradas foram Cladosporium cladosporioides (43%) e Cl. sphaerospermum (15,99%); Acremonium terricola, Monodictys castaneae, Penicillium glandicola, Phoma tropica e Tetraploa aristata foram relatadas pela primeira vez como fungos endofíticos para o Brasil. Bezerra et al. (2013) também exploraram riqueza e estimaram a frequência de espécies do cacto Cereus jamacaru também na região semi-árida (Caatinga) do Brasil. Foram identificados 59 táxons, sendo Cladosporium cladosporioides e Fusarium oxysporum as espécies mais frequentes, seguidas de Acremonium implicatum, Aureobasidium pullulans, Trichoderma viride, Chrysonilia sitophila e Aspergillus flavus. Quarenta e sete espécies foram relatadas pela primeira vez como endofíticos para Cactaceae e 18 como fungos endofíticos para o Brasil. Como reportado por Suryanarayanan et al. (2005) as espécies Colletotrichum e Phyllosticta comumente reportadas como fungos endofíticos não foram isoladas de Opuntia ficus-indica e Cereus jamacaru.

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar a diversidade de fungos endofíticos associados aos cactos Melocactus ernestii e Opuntia humifusa presentes em ecossistemas do Brasil e Estados Unidos, respectivamente, bem como estudar estes micro-organismos como fonte de metabólitos antimicrobianos.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Coletar e isolar fungos endofíticos presentes nas raízes, espinhos e cladódios de Melocactus ernestii e dos cladódios de Opuntia humifusa;  Depositar todos os isolados de M. ernestii na Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG para preservação ex situ da biodiversidade de fungos tropicais;  Identificar os fungos endofíticos por meio de técnicas morfológicas e moleculares;  Realizar análises de diversidade da comunidade de fungos endofíticos associados às plantas hospedeiras;  Preparar os extratos de todos os fungos endofíticos e de suas plantas hospedeiras;  Avaliar todos os extratos obtidos por meio de ensaios antimicrobianos;  Isolar e elucidar quimicamente os metabólitos antimicrobianos produzidos pelos fungos endofíticos selecionados.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 COLETAS DO MATERIAL BOTÂNICO Neste trabalho foram selecionadas duas espécies de cactos para isolamento dos fungos endofíticos. Melocactus ernestii foi coletada no Brasil e Opuntia humifusa nos Estados Unidos da América. As coletas referentes à espécie M. ernestii foram realizadas nos municípios de Pedra Azul, no dia 04 de julho de 2010, em Minas Gerais (15°59’29”S, 41°18’17,6”W) e Ipirá, no dia 25 de abril de 2011, na Bahia (12°11’04”S, 39°28’16”W). Em cada área foram coletadas raízes, espinhos e cladódios de 30 indivíduos aparentemente sadios. Uma exsicata representativa do material vegetal das duas localidadades (Pedra Azul e Ipirá) foi depositada no herbário BHCB da UFMG e registrados com os números 141490 e 154338, respectivamente. As coletas de O. humifusa foram realizadas em duas áreas: sítio 1 (N36.86140 W90.95036) e sítio 2 (N36.91370 W89.53330), no dia 6 de julho de 2012, ambos no estado do Missouri, neste caso, cladódios foram coletados de 18 indivíduos em cada sítio, totalizando 36 indivíduos. Todo o material foi estocado em sacos plásticos a 10ºC e processados em até 24 horas para o isolamento dos fungos endofíticos.

4.2 ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS Todo material coletado foi processado, lavado com água e detergente neutro, com auxilio de uma esponja para a remoção dos micro-organismos epifíticos e outros contaminantes. Em seguida, o material foi imerso em etanol 70% por 1 minuto, hipoclorito de sódio (NaOCl) a 2%, por 3 minutos, e por último em água destilada esterilizada por no mínimo 2 minutos. Após a desinfecção superficial, cinco fragmentos (aproximadamente 0,5 cm) da raiz, cladódio e espinho de cada indivíduo foram plaqueados em meio Ágar batata dextrose (BDA, 20% batata, 2% glicose, 2% ágar) e em meio Ágar extrato de malte (AEM, 2% extrato de malte e 2% ágar), ambos acrescidos de cloranfenicol (200 mg/mL), para tecidos de O. humifusa foi utilizado somente o meio de cultura BDA, e em seguida as placas foram incubadas a 28ºC. Como controle, após o processo de desinfestação, foi inoculado 0,1 mL da última água destilada esterilizada, em três placas de Petri com BDA. As placas permaneceram incubadas nas mesmas condições do isolamento. Diariamente as placas foram monitoradas quanto ao crescimento dos fungos, durante 60 dias de incubação. Os fungos filamentosos foram armazenados em triplicata, em água destilada esterilizada (CASTELLANI, 1967) e em glicerol 15% a - 80ºC. As leveduras foram purificadas utilizando o meio ágar Sabouraud (glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, peptona 26

1% e ágar 2%). Para a criopreservação, as culturas puras foram inoculadas em meio GYMP (glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1% e de fosfato de sódio 0,2%) a 28ºC, sob rotação (200 rpm), após o período de 24 horas foi acrescido de 15% glicerol e depositado no ultrafreezer a -80ºC. Os fungos preservados obtidos de M. ernestii foram depositados na coleção de Cultura do Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMGCB).

4.3 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS As leveduras foram agrupadas de acordo com as características macromorfológicas das colônias (cor, tamanho, borda, forma, aspecto e textura). As colônias dos fungos filamentosos foram fotografadas (frente e verso) e agrupadas de acordo com as seguintes características macromorfológicas: cor da colônia (frente e verso), textura da superfície (frente e verso) e aspecto da borda. Os grupos de isolados de leveduras e fungos filamentosos foram submetidos à análise molecular por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se o iniciador GTG5, de acordo com Lieckfeldt et al. (1993). Com base no perfil eletroforético dos produtos amplificados por PCR com o iniciador GTG5, um isolado dentre os que apresentaram um mesmo padrão de bandas foi selecionado para sequenciamento dos domínios D1/D2 da subunidade maior do DNA ribossomal utilizando os iniciadores NL1 e NL4, para as leveduras, e para sequenciamento para da região transcrita interna (ITS1-5.8S- ITS2) do DNA ribossomal, do gene do fator de alongamento (TEF1) e o gene da β-butulina para os fungos filamentosos.

4.3.1 Extração do DNA total

4.3.1.1 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Melocactus ernestii O DNA genômico dos isolados de leveduras foi extraído segundo Sambrook, Fritsch e Maniatis (1986), com modificações. Os isolados de leveduras foram crescidos em Agar Sabouraud por 24 horas a 25°C. Após crescimento, as colônias foram ressuspendidas em 100 μL Tampão de lise (Tris-HCl - trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA - ácido etilenodiamino tetraacético 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 10%), agitado em vórtex e aquecido a 65°C por 30 minutos. Após esta etapa, foi adicionado 200 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1 v/v) e homogeneizou-se por inversão. Em seguida, centrifugou-se a 13.200 r.p.m. por 10 minutos. Transferiu-se a fase superior para

27 novo tubo e para a precipitação do DNA foi utilizado foi adicionado 100 μL de isopropanol e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos. O DNA foi lavado com 200 μL de álcool 70% e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos. A amostra foi seca por aproximadamente 90 minutos a temperatura ambiente, dissolvido em 100 µl de TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM). A extração de DNA dos fungos filamentosos foi realizada conforme Rosa et al. (2009), sendo o DNA extraído a partir de micélio produzido em 5 mL de meio líquido (extrato de malte, 2%). Os micélios foram colocados em tubo de 1,5 mL acrescidos de 400 μL de tampão de lise (Tris-HCl 0,05 M, EDTA 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS 1%) e 3 esferas de aço inox (3,175 mm de diâmetro) e posteriormente submetidos a trituração no equipamento Bullet BlenderTM 24 (Uniscience). Os tubos foram acrescidos 5 μL de Proteinase K (50 μg/mL). Após homogeneização, o tubo foi colocado por 30 minutos a 60ºC em banho-maria. Após essa etapa, foram adicionados 162 μL de CTAB de Hoog (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização e incubação por 10 minutos a 65ºC. Em seguida, foram acrescentados 570 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1 v/v). Após homogeneização, o tubo será incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos e o líquido sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL, e acrescentado 10% do volume de uma solução de acetato de sódio 3 M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a 0ºC por 30 minutos e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, onde foi adicionado 50% do volume de isopropanol e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão. A seguir, foram adicionados 200 μL de etanol (Merck) 70% p/v e a suspensão foi cuidadosamente homogeneizada. Após este procedimento, a amostra foi centrifugada a 13.200 r.p.m. por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por inversão, seguido por homogeneização com etanol 70% p/v. A amostra foi seca por aproximadamente 15 minutos, 50 μL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M) foram adicionados e a mesma será incubada a 65ºC por 60 minutos para hidratação do DNA. Os produtos obtidos de leveduras e fungos filamentosos foram quantificados em espectrofotômetro a 260/280 nm (NanoDrop ND 1000 Thecnologies) e estocados a -20°C até sua utilização.

4.3.1.2 Leveduras e fungos filamentosos obtidos de Opuntia humifusa O DNA dos isolados foi extraído utilizando DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA), com modificações na lise das células (FREDLUND et al.; 2008). Os produtos

28 obtidos de leveduras e fungos filamentosos foram quantificados em espectrofotômetro a 260/280 nm (NanoDrop ND 1000 Thecnologies) e estocados a -20°C até sua utilização.

4.3.2 Obtenção dos amplicons

4.3.2.1 Amplificação utilizando o iniciador GTG5 As reações de amplificação foram feitas para volume final de 25 μL contendo 2,0 μL -1 de DNA (50-100 ng), 2,0 μL do inicidor GTG5 (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’) 10 μmol.L ,

2,5 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 1,0 μL de MgCl2 25 mM, 1,0 μL de dNTP 10 mM, 0,1 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água ultrapura estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycle proS (Eppendorf). O programa consistiu de desnaturação inicial a 94°C por cinco minutos, 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 45 segundos, anelamento a 50°C por um minuto e extensão a 72°C por um minuto, seguidos de extensão final a 72°C por seis minutos. Após as reações de amplificação, os produtos foram analisados por eletroforese em gel de agarose (Eurobio) a 1,5% em tampão Tris-Borato-EDTA 0,5% (TBE – 89 mM Tris, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA) a 80 V. As amostras foram coradas pela adição de GelRed (Biotium, USA) e visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas utilizando um sistema de foto-documentação (Vilber Lourmat, França).

4.3.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 Dentre as leveduras que apresentarem perfis moleculares distintos, um isolado foi selecionado para o sequenciamento da região D1/D2 da subunidade maior do rDNA utilizando os iniciadores NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) segundo Lachance et al. (1999). A reação de PCR será realizada em um volume final de 50 μL contendo: 2,0 μL de DNA (100 ng), 1,0 μL de cada iniciador NL1 e NL4 10 μmol.L-1, 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2,0 μL de

MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água ultrapura estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycle proS (Eppendorf), sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de: desnaturação a 95ºC por 15 segundos, anelamento a 54ºC por 25 segundos e extensão a 72ºC por 20 segundos, seguida por extensão final a 72ºC por 10 minutos.

4.3.2.3 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 Os iniciadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) foram utilizados para amplificação da região ITS do rDNA, conforme descrito por White et al. (1990) (Figura 5). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume final de 50 μL contendo 2,0 μL de DNA (100 ng), 1,0 μL de cada iniciador ITS1 e ITS4 10 μmol.L-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de

PCR 5X (Fermentas), 2,0 μL de MgCl2 25mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água ultrapura estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycle proS (Eppendorf). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de anelamento a 55ºC e 1 minuto de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 5 minutos a 72ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5 X, eluídos durante aproximadamente 1 hora a 120 V. As amostras foram coradas pela adição de GelRed (Biotium, USA) e visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas utilizando um sistema de foto-documentação (Vilber Lourmat, França).

4.3.2.4 Amplificação utilizando os iniciadores EF1-728F e EF1-986R Os iniciadores EF1-728F (5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’) e EF1-986R (5’- TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’) foram utilizados para amplificação do gene do fator de elongamento, conforme descrito por Carbone e Kohn (1999). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume final de 50 μL contendo 2,0 μL de DNA (100 ng), 1,0 μL de cada iniciador EF1-728F e EF1-986R 10 μmol.L-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água ultrapura estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycle proS (Eppendorf). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 96ºC por 2 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 30 segundos de anelamento a 56ºC e 30 segundos de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 7 minutos a 72ºC.

4.3.2.5 Amplificação utilizando os iniciadores β-butulina

Os iniciadores T1- BT2b, T1 (5´- AACATGCGTGAGATTGTAAGT - 3') e BT2b (5' – ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC - 3') foram utilizados para amplificação do gene da β-butulina, conforme descrito por Glass e Donaldson (1995). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume final de 50 μL contendo 2,0 μL de DNA (100 ng), 1,0 μL de cada iniciador EF1-728F e EF1-986R 10 μmol.L-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água ultrapura estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycle proS (Eppendorf). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de anelamento a 59ºC e 90 segundos de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 7 minutos a 72ºC. Todos os produtos de PCR (ITS1-ITS4, EF1-728F - EF1-986R e T1- BT2b) foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5 X, eluídos durante aproximadamente 1 hora a 120 V. As amostras foram coradas pela adição de GelRed (Biotium, USA) e visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas utilizando um sistema de foto-documentação (Vilber Lourmat, França).

4.3.3 Purificação dos amplicons Os amplicons oriundos de fungos endofíticos isolados de M. ernetii foram purificados utilizando Etanol-EDTA. Ao produto de PCR (45 μL) foi adicionado 11,25 µL de EDTA 125 mM e 135 µL de etanol absoluto, que foi homogeneizado e mantido à 25ºC por 15 minutos. O tubo foi centrifugado a 13.000 r.p.m. por 25 minutos e o sobrenadante foi retirado e descartado. A seguir, foram adicionados 120 μL de etanol 70% e o tubo foi centrifugado a 13.000 r.p.m. por 10 minutos e o etanol retirado. O tubo foi deixado à temperatura ambiente por 90 minutos para evaporação do resíduo de etanol. Foram adicionados 10 μL de água ultrapura. Em seguida, o tubo foi incubado em banho-maria a 37ºC por 40 minutos. O produto obtido foi quantificado em espectrofotômetro a 260/280 nm (NanoDrop ND 1000 Thecnologies) e ajustado para concentração de 100 ng/μL para ser utilizado nas reações de sequenciamento. Os produtos de PCR oriundos de fungos endofíticos isolados de O. humifusa foram purificados utilizando o Kit de purificação de PCR QIAquick® (Qiagen Inc., Valencia, CA). O produto obtido foi quantificado em espectrofotômetro a 260/280 nm (NanoDrop ND 1000 Thecnologies) e ajustado para concentração de 10 ng/μL para ser utilizado nas reações de

31 sequenciamento, o qual foi realizado em um aparelho modelo ABI 3730XL, Applied Biosystems (Foster City, CA).

4.3.4 Sequenciamento As reações de sequenciamento dos produtos obtidos após a purificação dos amplicons foram realizadas utilizando o kit Big Dye versão 3.1 (Applied Biosystems, EUA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado ABI 3730. A reação de sequenciamento foi realizada em microplacas de 96 poços (Applied Biosystems, EUA) preparada para um volume final de 10 µL, em que foram colocados: 1 µL do inciador a (5 μmol-1), 1 µL de tampão (presente no kit de sequenciamento), 1 µL de Big Dye, 1 a 5 µL de DNA (de modo que a reação final contenha entre 5 e 20 ng) e o restante de água para injeção esterilizada para completar o volume, se necessário. O programa de ciclagem utilizado consistiu de uma desnaturação inicial a 36°C por 1 minuto, 36 ciclos de anelamento a 96°C por 15 segundos, seguido por 15 segundos de extensão a 50ºC e 4 minutos de extensão final a 60ºC. Os produtos do sequenciamento foram submetidos ao processo de precipitação com o acréscimo de 1 µL de EDTA a 125 mM, 1 µL de acetato de amônio e 50 µL de etanol 96% (Merck), em cada poço. A placa foi submetida ao vortex brevemente e então incubada por 15 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Após incubação, as amostras foram centrifugadas por 45 minutos a 3.700 r.p.m à temperatura ambiente e o sobrenadante descartado por inversão. Em seguida, foram acrescentados 100 µL de etanol 70% (Merck) e as amostras novamente centrifugadas por 15 minutos a 3.700 r.p.m à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado por inversão e em cada poço foi acrescentado 10 µL de Formamida HI DI (Applied Biosystems, EUA). A placa foi armazenada a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado ABI 3730.

4.3.5 Análise computacional das sequências Os cromatogramas gerados para cada uma das sequencias senso e/ou antisenso de cada amostra foram submetidos ao aplicativo Phred online em HTTP://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/ para avaliação da qualidade das bases dos mesmos, sendo utilizadas apenas as posições com escore maior do que 20, ou seja, menos de um erro a cada 100 bases sequenciadas. A seguir, os cromatogramas foram conferidos

32 manualmente com o programa Chromas v. 2.23 (® 1998-2002 Technelysiumm Pty LTD) para a busca por erros de interpretação e discrepâncias entre cada uma das fitas sequenciadas. As sequências finais de DNA foram analisadas utilizando-se o programa BLASTn (Basic Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) desenvolvido pelo National Center For Biothecnology. De acordo com Gazis et al. (2011), sequências obtidas a partir da região ITS podem apresentar problemas na identificação de alguns táxons pertencentes ao filo Ascomycota. Por esta razão, os seguintes critérios foram utilizados para interpretação das sequências obtidas em comparação às sequências de fungos depositadas no GenBank: para as sequências com identidade ≥ a 99%, os isolados foram considerados como pertencentes à mesma espécie ou gênero. Já aqueles que apresentaram sequências com identidade de 98%, os isolados foram considerados como pertencentes à mesma espécie ou gênero, mas entre o gênero e o epíteto específico empregou-se c.f (c.f. é uma abreviação do termo latino “compare com”); e sequências com identidade entre 95 e 97%, somente o gênero foi aceito; para sequências com identidade <95% os isolados foram identificados como espécies desconhecidas ou identificados em família, classe ou ordem (GODINHO et al., 2013). Informações sobre os níveis taxonômicos dos fungos foram obtidas nos bancos de dados MycoBank (www.mycobank.org) e Index Fungorum (www.indexfungorum.org).

4.4 ANÁLISES FILOGENÉTICAS

O alinhamento das sequências foi realizado utilizando o método MUSCLE (EDGAR, 2004) com ajustes manuais para a melhoria visual, onde necessário, no programa Mega Versão 5.2 (TAMURA et al., 2011). O alinhamento para cada gênero estudado foi preparado incluindo sequências de linhagens tipo, de coleções de cultura e/ou publicada em jornais indexados obtidas do GenBank para aumentar a acurácia das identificações. Para cada região ITS1-5.8S-ITS2, TEF1, β-butulina e análise combinada do gênero Diaporthe, árvores filogenéticas foram construídas utilizando análises de Máxima Parcimônia pelo modo de busca heurística no PAUP* 4.0b10 (SWOFFORD, 2001) com adição de 100 replicas de sequências aleatórias e tree-bisection-reconnection (TBR) como algoritmo de rearranjo. Para limitar o esforço computacional, o número máximo de árvores salvas foi de 75.000. Todos os estados de caráter foram tratados como desordenados e com mesmo peso. Gaps foram tratados como quinta base. O suporte dos ramos foi avaliado como porcentagem de bootstrap (BP) a partir de 1.000 repetições de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985). Para análise 33 combinada do gênero Diaporthe também foram contruídas árvores por meio da inferência Bayesiana usando cadeias de Markov aliada a simulações de Monte Carlo (MCMC) realizada no programa MrBayes 3.1.2. (HUELSENBECK; RONQUIST, 2003). Quatro MCMC foram executadas simultâneamente, com mais de 2.000.000 gerações, usando aleatoriamente árvores de partida e os valores padrão a partir do modelo de evolução nucleotídica mais apropriado para condução das análises Bayesianas; dois critérios foram utilizados para estimar o modelo de evolução nucleotídica – MrModeltest 2.3 (NYLANDER, 2004): o modelo com melhor ajuste para o conjunto de dados por critério de informação Akaike e os testes de razão de verossimilhança implementado em MrModeltest 2.3. Árvores foram amostradas a cada 100 gerações, resultando em uma amostragem total de 20 001 árvores. As primeiras 5.000 árvores foram descartadas como “burnin”. A partir das árvores restantes, foi criada uma árvore de consenso usando o comando “sumt”, para determinar a probabilidade posterior dos clados. Comprimentos de ramo foram estimados como valores médios acima das árvores amostradas. A análise Bayesiana foi repetida quatro vezes, sempre utilizando árvores de partida aleatórias e valores iniciais aleatórios para os parâmetros do modelo de evolução nucleotídica para testar a independência dos resultados da repetição das topologias anteriores durante o avanço em cadeia (HUELSENBECK et al., 2002). Clados com probabilidade posterior (PP) > 0,95 foram considerados suportados.

4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS POR TÉCNICAS DE MACRO E MICROCULTIVO

Os fungos endofíticos bioativos selecionados para o fracionamento químico biomonitorado que apresentaram informações inconclusivas nas análises filogenéticas foram submetidos às técnicas de Macro e Microcultivos. No macrocultivo foi observado aspectos macroscópicos (aspecto, textura, medida de crescimento da cultura e pigmentação) dos fungos filamentosos nos meios BDA, AEM e Ágar Aveia (AA, aveia em flocos 10% e ágar 2%), incubados por 7 dias a 25ºC Para a técnica de Microcultivo em Lâmina (RIDDELL, 1950) foi recortado um pequeno quadrado de aproximadamente 2cm² do meio de cultura e colocado sobre uma lâmina histológica. O fungo foi então semeado nas quatro pontas do quadrado e colocado sobre a lâmina histológica e lamínula sobre a semeadura. Todo o conjunto foi colocado no interior de uma placa de Petri sobre um suporte de vidro e papel filtro embebido em água esterilizada. O microcultivo foi então encaminhado para estufa com temperatura de 25ºC Após 20 dias de crescimento fúngico foram retirados a lamínula e o meio de cultivo, e a lâmina foi corada com lactofenol para visualização em microscópio óptico. 34

4.6 RIQUEZA, EQUABILIDADE E DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS

Foram calculadas curvas de acúmulo de espécies, por meio do número de espécies de fungos endofíticos obtidos para cada planta. A proposta dessas curvas é que elas representem o número de espécies descobertas, plotadas em um gráfico que nos indique qual foi a quantidade de esforço empregado para se inventariar uma área, neste caso, a comunidade endofítica do hospedeiro. Quando a curva de acúmulo atinge uma assíntota (formato de uma curva que se estabiliza quando o valor do eixo y não muda, tornando a curva sempre paralela ao eixo x) é porque, virtualmente, todas as espécies de um hospedeiro já foram coletadas (COLWELL; CODDINGTON, 1994). Os estimadores de riqueza Bootstrap, Chao 1, Jackniffe 1 e Jackniffe 2 foram calculados a partir de 1000 reamostragens aleatórias das amostras com reposição (bootstrap), e suas médias e desvios-padrões foram relatados. Medidas de diversidade α são comumente utilizadas para descrever o quão diversa é uma comunidade e apresentam diferentes pressupostos, vantagens e limitações. Para a análise dos dados foram calculados: (i) o índice de riqueza de Margalef [(S-1)/ln(n)], valores inferiores a 2,0 são considerados como denotando áreas de baixa biodiversidade e valores superiores a 5,0 são considerados como indicador de grande biodiversidade, (ii) o inverso do índice de Simpson (D), que combinam os efeitos de riqueza e equabilidade de espécies. Simpson (ln S com transformação logarítmica) mede a chance de dois indivíduos, escolhidos ao acaso em uma mesma comunidade, pertencerem a mesma espécie, L = - Σ (pi²), onde 0 = todos os táxons estão presentes em iguais quantidades e 1 = um táxon domina completamente a comunidade, e (iii) o Índices de Simpson (1 – D) que mede a equitabilidade (“evenness”), onde 1 representa a máxima diversidade, ou seja, todas as espécies são igualmente abundantes e 0 representa mínima diversidade. Valores de índices de diversidade maximizam a perda de informação biológica sobre a comunidade endofítica (GUREVITCH et al., 2009). Considerando esta possibilidade de perda de informação nos índices, foi utilizada a curva de abundância para quantificar e comparar as comunidades. Curva de abundância é uma maneira de descrever hierarquias de abundâncias relativas. Comunidades com elevada dominância de uma única espécie e baixa riqueza de espécies terá um formato gráfico muito diferente daquela representando uma comunidade altamente diversa e sem forte dominância, com muitas espécies comuns e com um alto número total de espécies; sendo mais úteis para propósitos descritivos do que para comparações quantitativas.

Análises comparativas entre as partes da planta de M. ernestii foram conduzidas a partir das métricas dos índices de diversidade diferencial β. Estes índices refletem o quanto duas partes da planta diferem em função dos conjuntos de OTUs que abrigam (WHITTAKER, 1972; MAGURRAN, 2004). OTUs (Unidade Taxonômica Operacional) é um termo originalmente cunhado por Sneath e Sokal (1973) (proponentes da Taxonomia Numérica) para denominar as unidades (indivíduos, populações, espécies, gêneros, famílias, etc) em análise. As relações da composição de espécies entre dois ambientes (partes da planta: raiz, cladódio e espinho), como o número de espécies compartilhadas (a), o número de espécies perdidas (b), e o número de espécies ganhas (c) são considerados e ponderados. Para o estudo da diversidade β foi utilizado o índice βH1 [β H1 = (S /med) – 1] de Harrison et al.

(1992), em que S = total de espécies encontrado nas duas partes das plantas e med = média da riqueza das duas partes das plantas, que corresponde ao inverso do índice de diversidade de Whittaker, pertencente ao grupo de medida de continuidade de espécies (KOLEFF et al., 2003), em função da dependência aos valores de espécies compartilhadas (a), que sinalizam para uma semelhança na composição endofítica das partes das plantas, ou para a continuidade de nichos de uma área à outra. Análise de agrupamento foi conduzida a partir da matriz de distância de Manhatan com algoritmo single linkage de agrupamento. O critério de escolha da matriz de distância e algoritmo de agrupamento seguiu o parâmetro do coeficiente de correlação cofenética: medida que varia de 0 a 1, e indica a distorção entre a matriz de distância e a topologia encontrada pelo algoritmo de agrupamento; quanto mais próximo de 1 menor a distorção entre as matrizes e a topologia encontrada (LEGENDRE; LEGENDRE, 1998). Todas as análises de medidas de riqueza e diversidade foram conduzidas no software PAST v.2.12 (HAMMER et al., 2001).

4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

4.7.1 Obtenção do extratos brutos

4.7.1.1 Extratos hidro-alcóolicos Os fungos filamentosos e leveduras obtidas foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA a 28ºC com umidade de 70-80%. Após 15 dias de crescimento, o meio de cultura com o crescimento micelial foi transferido para tubos cônicos de 50 mL contendo

35 mL de etanol 60% PA (Vetec). Cladódios, espinhos e raízes de M. ernestii foram coletados de três indivíduos, escolhidos aleatoriamente, e colocados em tubos cônicos de 50 mL com contendo 35 mL de etanol 60% PA (Vetec). O conteúdo dos tubos foi macerado a 10ºC durante 48 horas, em seguida os extratos foram filtrados com papel de filtro e transferidos para frascos de vidro de 20 mL e para tubos de 1,5 mL. Todos os extratos brutos obtidos foram secos em centrífuga a vácuo “Speed Vac” (Savant) com temperatura de 35ºC, solubilizados em solução de DMSO (dimetilsulfóxido) a uma concentração de 100 mg/mL e depositados na Extratoteca Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Fungos (UFMG).

4.7.1.2 Extratos diclorometânicos Os extratos diclorometânicos foram produzidos após crescimento dos fungos endofíticos em placas de Petri (90 mm diâmetro) contendo 20 mL de BDA por 15 dias a 25°C ± 2°C (ROSA et al. 2013). Após este período os fungos em meio de cultura foram liofilizados para remoção de água por 48 horas, cortado em pequenos fragmentos e transferidos para frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 40 mL de diclorometano (DCM, Fisher, USA). Para os extratos vegetais de O. humifusa, os tecidos amostrados foram secos em liofilizador por 2 dias. Posteriormente, os tecidos foram individualmente macerados e transferidos para frascos de vidro tipo Erlenmeyer de 125 mL contendo 20 mL de DCM. Após 48 horas a temperatura ambiente, a fase orgânica de todos os extratos foi coletada e seca em centrífuga à vácuo com temperatura inferior a 40°C. As alíquotas dos extratos secos foram estocadas a -20°C para posterior utilização nos ensaios biológicos. Extração similar foi realizada utilizando meio de cultura BDA e o extrato utilizado como controle nos ensaios biológico

4.7.2 Triagem da atividade antimicrobiana A atividade antimicrobiana dos extratos brutos fúngicos e vegetais foi avaliada pelo método de microdiluição em placa de acordo com metodologia descrita nas normas do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS M7 – A6, vol. 23 n° 2) para bactérias; 7.1 Antifungal Susceptibility Testing Subcommittee of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (AFTS-EUCAST, 2002) para leveduras, com modificações e o “Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade à Terapia Antifúngica dos Fungos Filamentosos” (NCCLS M38 – A2, vol.22,

37 n° 16) para fungos filamentosos, com modificações. Os micro-organismos alvos utilizados nos ensaios foram: Escherichia coli ATCC 11775, Staphylococcus aureus ATCC 12600, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Candida albicans ATCC 60193, C. Krusei ATCC 6258 e Cladosporium sphaerospermum CCT 1740. Bactérias e leveduras foram previamente crescidas a 30 e 37°C nos meios Miller- Hinton (Difco) e Sabouraud (Himedia), respectivamente. Após 24 h de incubação, os inóculos foram preparados pela suspensão de duas a cinco colônias nos meios Mueller-Hinton e RPMI1640 (suplementado com 2% de glicose) para bactérias e leveduras, respectivamente. Cinquenta microlitros do inóculo foram adicionados em cada poço de uma placa de 96 poços, sendo que a densidade celular foi ajustada em espectrofotômetro para 1-2 x 108 células/mL para bactérias e 1 x 106 células/mL para leveduras. A absorbância foi medida em comprimentos de onda de 625 nm e 530 nm para bactérias e leveduras, respectivamente. Em cada poço usado para teste foram adicionados 25 μL de cada extrato dissolvido em DMSO, bem como 25 μL da solução com a droga nos poços de controle positivo, e 25 μL do meio. Ao final, o volume de cada poço foi de 100 μL, e as concentrações das drogas usadas como controles positivos para leveduras e bactérias, respectivamente, de 2 μg/mL (Anfotericina B – SIGMA/USA) e 32 μg/mL (Cloranfenicol – SIGMA/USA); e dos extratos de 250 μg/mL. Após o preparo das placas, as mesmas foram agitadas por cerca de 20 minutos a 200 r.p.m. e em seguida incubadas por 24 h a 37°C para leveduras e 30°C para bactérias. Após incubação, em cada poço foi acrescentado 10 μL de brometo tiazolil azul de tetrazólico (MTT/ AMRESCO - 5 mg/mL), o conteúdo homogeneizado e as placas novamente incubadas à mesma temperatura de crescimento dos respectivos inóculos por 4 horas. Nas mitocôndrias das células alvos, o MTT é metabolizado em formazan, revelando a presença de células metabolicamente ativas. Após o metabolismo do MTT, foram adicionados 100 μL/poço de SDS/isopropanol (5%), que rompe a membrana celular dos microrganismos alvos e disponibiliza no meio o formazan. A leitura foi realizada por meio do método colorimétrico do MTT em um leitor de microplaca VERSAmax (Molecular Devices) pelo programa Softmax® Pro 5 (Molecular Devices), com a absorbância de 570 nm. A absorbância dos poços testes foi comparada com a absorbância do poço controle contendo apenas o micro- organismo, sendo a porcentagem de inibição calculada pela seguinte fórmula: Porcentagem de Inibição = (Densidade óptica poço controle – DO poço tratado) X 100/ Densidade óptica do poço controle.

Para determinação da atividade antifúngica contra fungo filamentoso Cladosporium sphaerospermum CCT 1740, culturas puras de Cl. sphaerospermum foram previamente crescidas em meio ágar BDA, a 25ºC no escuro e ao atingir a maior fase de esporulação (7-10 dias), uma alçada dos esporos dos fungos foi transferida para cerca de 5 mL de salina e submetida à agitação em vórtex. A concentração do inóculo foi determinada em espectrofotômetro (ESPINEL-INGROFF et al., 1991; WEDGE et al.,1998) (absorbância de 625 nm) e as suspensões foram ajustadas até atingir a concentração final de 1.0 × 106 conídios/mL. Cinquenta microlitros do inóculo foram adicionados em cada poço da placa de 96 poços, juntamente com 25 μL dos extratos (concentração final no poço de 250 μg/ml) e 25 μL do meio RPMI. Após o preparo das placas, as mesmas foram agitadas por cerca de 20 minutos a 200 r.p.m. e em seguida incubadas por 48 h a 25°C. O crescimento fúngico foi avaliado pela medida da absorbância em cada poço em comprimento de onda de 620 nm. A droga fungicida benomil (Sigma/USA), na concentração de 1,16 μg/ml, foi usada como controle positivo. Todos os ensaios foram realizados em duplicata e foram considerados ativos os extratos com valor de inibição igual ou maior que 70%.

4.7.3 Determinação da concentração inibitória mínima Os extratos etanólicos e diclorometânicos dos isolados fúngicos selecionados foram submetidos ao ensaio de microdiluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima. Foram realizadas diluições seriadas dos extratos de 250 até 0,488 μg/mL. O meio de cultura, a padronização do inóculo, os controles positivos e negativos e a leitura dos resultados foram realizados conforme descrito acima, na triagem da atividade antimicrobiana, para os respectivos micro-organismos alvos.

4.7.4 Determinação da atividade antifúngica contra fungos fitopatôgenicos

4.7.4.1 Ensaio de bioautografia Os ensaios para determinação da atividade antifúngica foram realizados no Natural Products Utilization Research Unit pertencente ao National Center for Natural Products Research (ARS/NPURU/USDA) como parte do estágio de doutorado sanduíche. Utilizaram- se como micro-organismos alvos os seguintes fungos fitopatógenos: Colletotrichum acutatum, Co. fragariae e Co. gloesporioides obtidos do Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Poplarville, MS.

Os fitopatógenos alvos foram crescidos em BDA (Difco/EUA) em placas de Petri de 9 cm e incubados a 24 ± 2°C sob luz fluorescente branca (55 ± 5 μmol/m2/s) com 12 horas de fotoperíodo para estimulação da esporulação. Após 7–10 dias, 5 mL de água destilada esterilizada foram adicionados as placas de crescimento das colônias e, com o auxílio de uma alça de plástico em formato de “L”, os conídios dos fungos alvos foram liberados. A suspensão aquosa formada com os conídios foi filtrada por meio de Miracloth (Calbiochem- Novabiochem Corp., La Jolla, CA) para remoção do micélio. A concentração dos conídios foi determinada com auxílio de espectrofotômetro (WEDGE; KUHAJEK, 1998) com curva padrão baseada na absorbância de 625 nm, e as suspensões ajustadas com água destilada estéril a uma concentração de 1.0 x 106 conídios/mL. As concentrações conidiais padrão foram determinadas por meio da curva padrão de cada espécie fúngica. Curvas de turbidez padrão foram periodicamente validadas utilizando um contador de partículas (Bech- man/Coulter Z1) e contagem de hemocitômetro. Avaliação dos crescimentos micelial e conidial para experimentos de microdiluição em caldo foram avaliados utilizando leitor de microplaca (Packard –SpectraCount/ Packard Instru- ment Co., Meriden, CT). Os extratos brutos foram diluídos em diclorometano (DCM, Fisher, USA), aplicados 160 µg em uma placa de sílica gel (UNIPLATE™) e seca à temperatura ambiente. Posteriormente, cada placa foi borrifada com uma suspensão conidial (105 esporos/mL) da espécie alvo e incubadas em câmara úmida a 26°C com 12 horas de fotoperíodo durante quatro dias. Como controles positivos foram utilizados os antifúngicos pesticidas comerciais benomil (1,16 µg/ponto), ciprodinil (0,9 µg/ponto), azoxistrobina (1,61 µg/ponto) e captan (1,2 µg/ponto) (Chem Service, Inc. West Chester, PA). O diâmetro das zonas de inibição do crescimento fúngico foi avaliado após 4 – 5 dias de incubação. Zonas claras de inibição indicaram a presença de atividade antifúngica em cada extrato (WEDGE et al., 2009), e zonas não totalmente claras, consideradas difusas, indicaram atividade fungistática. Os extratos que apresentaram halos claros de inibição foram utilizados em novos testes de validação.

4.7.4.2 Ensaio de microdiluição em placa A avaliação dos compostos antifúngicos isolados contra a esporulação de fungos filamentosos foi realizada pelo método de microdiluição em placa, de acordo com metodologia descrita nas normas do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS M27-A) para leveduras, com modificações (WEDGE; KUHAJEK, 1998; WEDGE

40 et al., 2000). Neste ensaio foram utilizados os seguintes fitopatógenos como alvos: Colletotrichum acutatum, Co. fragariae, Co. gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Phomopsis obscurans e P. viticola. Os compostos puros foram testados de acordo com protocolo descrito por Wedge et al. (1998) frente as espécies fúngicas em três diferentes concentrações: 75, 150 e 300 μM. Como controles positivos foram utilizados os fungicidas azoxistrobina e captan, nas concentrações de 0.3, 3.0 e 30 µM. Todos os testes foram realizados em duplicata. O crescimento fúngico foi avaliado pela absorbância de cada poço a 620 nm após 0, 24, 48 e 72 horas, exceto para P. obscurans e P. viticola, que os dados foram obtidos após 120 e 144 horas. Os valores médios de absorbância e erros padrão foram determinados e representados graficamente, sendo que os gráficos foram utilizados para avaliar a inibição do crescimento fúngico. Diferenças na germinação dos esporos e no crescimento micelial em cada poço da placa de 96 poços demonstraram a sensibilidade a cada concentração dos compostos puros, e indicaram efeitos fungicidas ou fungistáticos.

4.8 Seleção dos extratos para análise química Após os ensaios realizados, os extratos ativos foram selecionados para os experimentos de desreplicação a fim de caracterizar os metabólitos presentes nos extratos brutos ou frações ativas. Tais experimentos foram realizados no Natural Products Utilization Research Unit pertencente ao National Center for Natural Products Research (ARS/NPURU/USDA).

4.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear A primeira parte dos experimentos de desreplicação consistiu na espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Os espectros de RMN de 1H e 13C foram obtidos em um aparelho Inova 600 MHz da fabricante Varian (Palo Alto, CA) ou em um aparelho Varian 400 MHz modelo EUR0020 (Palo Alto, CA). As amostras foram preparadas a aproximadamente 10 mg/mL em clorofórmio deuterado (CDCl3) e analisadas em tubos de RMN de 3 mm. Todos os espectros de RMN foram processados pelo programa MestReNova v8.1.2-11880 (Mestrelab Research, S. L., 2013). Todos os espectros de 13C foram registrados em experimentos de DEPT de 90 e 135°.

4.10 Análise quantitativa e qualitativa de ácidos graxos Os extratos brutos e frações com presença majoritária de ácidos graxos a partir dos espectros de RMN de 1H foram submetidos à análise quantitativa e qualitativa destas substâncias. Os tempos de retenção dos ésteres metílicos de ácidos graxos utilizados neste trabalho estão identificados em parêntese: ácido capróico (6:0), ácido caprílico (8:0), ácido cáprico (10:0), ácido undecanóico (11:0), ácido láurico (12:0), ácido tridecanóico (13:0), ácido mirístico (14:0), ácido miristoléico (14:1), ácido pentadecanóico (15:0), ácido cis-10- pentadecenóico (15:1), ácido palmítico (16:0), ácido palmitoléico (16:1), ácido heptadecanóico (17:0), ácido cis-10 heptadecenóico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido oléico (18:1n9c), ácido elaídico (18:1n9t), (LA) ácido linoléico (18:2n6c), ácido linolelaídico (18:2n6t), ácido gamma-linolênico (18:3n6), ácido pinolênico (18:3n6), ácido estearidônico (18:4n3), (ALA) ácido α-Linolênico (18:3n3), ácido nonadecanóico (19:0), ácido araquídico (20:0), ácido cis-11-eicosenóico (20:1), ácido cis-11-14-eicosadienóico (20:2), ácido heneicosanóico (21:0), ácido siadônico (20:3n6), ácido cis-8-11-14-eicosatrienóico (20:3n6), ácido arachidônico (20:4n6), (ETE) cis-11,14,17-ácido eicosatrienóico (20:3n3), (EPA) ácido eicosapentaenóico (20:5n3), ácido beénico (22:0), ácido erúcico (22:1n9), ácido cis-13,16- Docosadienóico (22:2), (DPA) ácido docosapentaenóico (22:5n3), (DHA) ácido docosahexaenóico (22:6n3), ácido tricosanóico (23:0) e ácido lignocérico (24:0). Os padrões de ácidos graxos foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ou Nu-Chek Prep, Inc. (Elysian, MN). Ésteres metílicos de ácidos graxos (do inglês FAME) utilizados na análise dos extratos brutos e frações ativas foram ou sintetizados a partir de um ácido graxo livre correspondente (reação de diazometano) ou analisados com uma mistura de padrões de referência da Supelco (St. Louis, MO), 18919. Os ácidos graxos livres foram convertidos ao seu éster metílico correspondente pela reação com diazometano e éter, sendo utilizado um Mini Diazald®, aparato da Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Resumidamente, 2,5 g de KOH foi dissolvido em 4 mL de água deionizada e a mistura mantida em um recipiente, sendo posteriormente adicionados 5 mL de etanol a mistura. Um funil de separação contendo 2,5 g de diazald dissolvido em 22,5 mL de éter foi acoplado ao recipiente, o qual foi aquecido a 65ºC em banho maria. Durante o aquecimento, por um período de 50 minutos, a solução de diazald foi gotejada na mistura em aquecimento. Após este período, o frasco foi resfriado utilizando um banho de acetona e gelo seco. O diazometano co-destilado (CH2N2) em solução de éter foi armazenado em frasco de vidro e mantido a -20ºC para posterior uso.

Para a análise, a cada amostra de extrato ou fração ativa foi adicionada 500 μL de éter dietil e 500 μL da solução de CH2N2. O frasco com a solução foi mantido aberto, a temperatura ambiente e overnight em uma capela de exaustão, a fim de completar a reação e permitir a evaporação do solvente e CH2N2. Após a reação o produto éster metílico foi dissolvido em 500 μL de éter dietil e analisado em GC-MS.

4.11 Cromatografia Gasosa – Análise com Detector por Ionização de Chama (GC-FID) As análises foram realizadas em um cromatógrafo a gás CP-3800 (Varian), o qual foi equipado com uma coluna capilar DB-23 Agilent Technologies (comprimento: 60 m; diâmetro interno: 0,25 mm; espessura do filme: 0,25 μm). Durante a operação utilizou-se a seguinte condição: temperatura de injeção, 270°C; temperatura da coluna, 130°C mantido por 1 minuto seguido por 130° a 170°C por 6,5°C/min seguido por 170 a 215°C por 2,8°C/min e mantido por 12 min seguido por 215 a 230°C por 40°C min e mantido por 3 minutos; volume de injeção de 1L (split 20:1); 3,0 ml/min fluxo constante; temperatura FID de 300°C. Ésteres metílicos de ácidos graxos foram identificados por injeção de padrões comercialmente disponíveis e pela comparação do tempo de retenção dos desconhecidos (presentes nos extratos ou frações ativas). Os ácidos graxos das amostras em estudo foram quantificados pelo cálculo da porcentagem da área baseado na combinação da área total: a área de cada pico obtido foi dividida pela área total de todos os picos do cromatograma e multiplicado por 100, a fim de obter a porcentagem.

4.12 Fracionamento químico biomonitorado Após a análise dos espectros de RMN de 1H, os extratos brutos selecionados foram submetidos ao fracionamento químico biomonitorado visando à purificação e identificação dos prováveis metabólitos responsáveis pela atividade biológica. Inicialmente, realizou-se a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do (s) extrato(s) bruto(s) a fim de selecionar os solventes para o fracionamento. As análises de CCD foram realizadas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária e um painel de misturas de solventes como fase móvel. As placas foram a princípio reveladas pela luz UV (254, 305 e 363 nm) e, também pelo calor, após aplicação de spray de Godin (Godin A, 5% de H2SO4 em etanol + Godin B 1 g de vanilina em 100 mL de etanol). A cromatografia em coluna do extrato foi realizada em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). As frações obtidas foram concentradas em rotaevaporador e avaliadas por

CCD. Baseado no perfil da CCD, as frações que continham mesmas distribuições de compostos foram reunidas.

4.13 Análises de Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) Após a realização dos ensaios antifúngicos com as frações obtidas, 1 mg de todas as frações ativas foram dissolvidas em DCM (1000 μL) e analisadas pela cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Utilizaram-se uma coluna DB-5 (coluna capilar de sílica fundida 30 m × 0,25 mm, 0,25 μm de espessura do filme) operado usando as seguintes condições: temperatura do injetor de 240°C; temperatura da coluna foi de 60-240°C a 3°C/min em seguida, mantida a 240°C por 5 minutos; gás de arraste, hélio; e volume de injeção de 5 μL (splitless).

4.14 Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS)

Foram utilizadas alíquotas dos compostos na concentração de 0,1 mg/mL (solubilizadas em metanol) e os espectros de massas em alta resolução foram obtidos usando Agilent 1100HPLC para JEOL AccuTOF (JMS-T100LC), (Peabody, MA).

4.15 Elucidação estrutural dos constituintes químicos A identificação das moléculas foi realizada sob supervisão do Dr Charles Cantrell, químico especialista em produtos naturais, a partir dos dados obtidos após os experimentos de RMN de 1H e 13C, CG-FID, CG-EM e LC-MS3 somado a pesquisas realizadas em banco de dados comerciais, como Dictionary of Natural Products e SciFinder Scholar.

5 RESULTADOS

5.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii

5.1.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii Ao final do processo de isolamento foram identificadas 99 espécies de fungos endofíticos (Tabela 3; Figura 7). Oito táxons de fungos filamentosos foram identificados em nível de espécie baseado na similaridade (99 e 100%) das sequências de ITS com sequências de isolados depositados em Coleções de Culturas internacionais. Apenas duas espécies de leveduras foram isoladas do cladódio de M. ernestii e foram identificadas como Aureobasidium pullulans UFMG CM-Y360 e Candida parapsilosis UFMG CM-Y361. As sequências TEF1 e β-butulina dos táxons Bartalinia sp. UFMGCB 6347 e Phoma sp. UFMGCB 6409 mostraram baixa similaridade quando comparadas com sequências depositadas no GenBank e foram identificados em nível de gênero. Enquanto a sequência TEF1 do táxon Fusarium solani UFMGCB 5685 mostrou alta similaridade (99% de identidade) com a sequência de referência Fusarium solani NRRL32789 [DQ247098], confirmando a identificação pela região ITS. As sequências TEF1 e β-butulina do táxon Diaporthe sp. UFMGCB 6350 mostrou alta similaridade (99% de identidade) com as sequências de Diaporthe sp. CBS119639 [343928 e 344170, respectivamente] e a identificação permaneceu em nível de gênero (Figura 21-a, b). Dentre os táxons dos fungos endofíticos pertencentes ao filo Ascomycota, apenas três táxons foram identificados como Ascomycota sp., os demais táxons foram incluídos no subfilo Pezizomycotina representado três classes: Sordariomycetes, Dothideomycetes, Eurotiomycetes e Pezizomycetes; e o subfilo Saccharomycotina representado pela classe Saccharomycetes.

Tabela 3 Identificação molecular dos fungos endofíticos associados aos cladódios, espinhos e raízes de Melocactus ernestii. A identificação foi conduzida usando BLASTn da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2). N° de bp Código N° de Parte da Resultado Top BLAST [n° de acesso no Cobertura Identidade Espécie ou grupo taxonômico proposto sequenciados UFMGCBa isolados planta GenBank] (%) (%) [n° de acesso GenBank]b e analisados 5694*c 29 C, E, R Preussia minima [AY510425] 99 99 463 Preussia sp. 1 [KJ471480] 5829*d 21 C, R Fusarium oxysporum [DQ790535] 100 99 521 Fusarium oxysporum [KJ471481] 5753*d 17 R Cochliobolus eragrostidis [JN943449] 100 99 518 Cochliobolus eragrostidis [KJ471482] 5656* 14 C Mycoleptodiscus indicus [GU980696] 100 100 470 Mycoleptodiscus indicus [KJ471483] 5890*d 11 R Fusarium solani [JQ625574] 100 100 454 Fusarium solani [KJ471484] 5765* 13 E, R Sphaerobolus stellatus [AY650264] 74 87 463 Sphaerobolaceae sp. [KJ471506] 6344 10 C, R Hypocrea peltata [AB742527] 99 91 442 Hypocreaceae sp. 1 [KJ471485] 6378* 9 R Sordariomycetes sp. [JQ761382] 100 98 498 Sordariomycetes sp. [KJ471552] CM-Y360 8 C Aureobasidium pullulans [KC433759] 100 100 449 Aureobasidium pullulans [KJ471577] 5841* 8 R Knufia perforans [JN040506] 100 90 491 Chaetothyriaceae sp. 1 [KJ471518] 6396* 8 R Dothideomycetes sp. [JQ760268] 75 93 603 Pezizomycotina sp. 2 [KJ471554] 5858 7 C, E, R Nigrospora oryzae [DQ219433] 99 98 405 Nigrospora sp. [KJ471524] 6364* 6 R Periconia macrospinosa [JN859363] 100 93 471 Halosphaeriaceae sp. [KJ471545] 5757 6 R Dothideomycetes sp. [JQ759888] 90 90 538 Pezizomycotina sp. 1 [KJ471504] 6371 5 R Cortinarius sp. [JX316774] 24 85 609 Agaricomycetidae sp. [KJ471550] 6741 5 E, R Penicillium sp. [AB734793] 100 99 424 Penicillium cf. griseofulvum [KJ471570] 6409*d 5 C, R Phoma sp. [GQ352490] 100 100 463 Phoma sp. 3 [KJ471522] 6368 5 R Camarographium koreanum [JQ044432] 82 86 471 Pleosporales sp. [KJ471547] 5758d 4 E, R Aspergillus calidoustus [KC253951] 100 100 488 Aspergillus calidoustus [KJ471505] 5665 4 R Ceratobasidium sp. [HQ630980] 100 95 586 Ceratobasidiaceae sp. 1 [KJ471490] 5878 4 R Knufia petricola [KC978745] 96 90 544 Chaetothyriaceae sp. 2 [KJ471528] 5693c 4 C, E Preussia africana [JQ031265] 100 99 445 Preussia minimoides [KJ471496] 5882 3 C Ascomycota sp. [HQ607933] 100 99 545 Ascomycota sp. 3 [KJ471531] 6427c 3 R Bartalinia pondoensis [JQ425386] 100 99 443 Bartalinia sp. [KJ471560] 6715 3 R Chaetomium cupreum [JQ676206] 99 96 481 Chaetomium sp. 2 [KJ471564] 6430c 3 C Cladosporium sphaerospermum [JX966576] 100 100 485 Cladosporium sp. [KJ471561] 6414* 3 R Neosartorya fischeri [FJ624264 ] 100 100 477 Neosartorya fischeri [KJ471558] 6420 3 R Peyronellaea prosopidis [KF777181] 100 99 423 Peyronellaea prosopidis [KJ471559] 5827*c 3 R Phoma sp. [KF177690] 100 100 443 Phoma sp. 2 [KJ471516]

Tabela 3 Continuação N° de bp Código N° de Parte da Resultado Top BLAST [n° de acesso no Cobertura Identidade Espécie ou grupo taxonômico proposto sequenciados UFMGCBa isolados planta GenBank] (%) (%) [n° de acesso GenBank]b e analisados 6362 2 R Ascomycota sp. [AM944355] 100 86 449 Ascomycota sp. 1 [KJ471544] 6369 2 R Ascomycota sp. [HQ607885] 99 90 482 Ascomycota sp. 2 [KJ471548] 5677 2 R Waitea circinata [HE964994] 99 90 525 Ceratobasidiaceae sp. 3 [KJ471491] 5687 2 R Ceratobasidium sp. [KC193238] 100 100 561 Ceratobasidium sp. [KJ471494] 5848 2 R Chaetomium gracile [GU966502] 99 99 481 Chaetomium gracile [KJ471520] 5745c 2 C Colletotrichum gloeosporioides [KF053200] 100 99 458 Colletotrichum sp. 1 [KJ471501] 6336d 2 R Curvularia brachyspora [AF212308] 100 99 530 Curvularia brachyspora [KJ471536] 6348 2 R Gelasinospora udagawae [NR077163] 100 99 473 Gelasinospora udagawae [KJ471540] 5682d 2 R Microsphaeropsis arundinis [HQ607976] 100 99 505 Microsphaeropsis arundinis [KJ471493] 6726 2 R Paraconiothyrium cyclothyrioides [JN021547] 73 86 491 Montagnulaceae sp. 2 [KJ471565] 6740d 2 R Penicillium citrinum [KF530863] 100 99 473 Penicillium citrinum [KJ471569] 6748d 2 R Penicillium griseofulvum [KF530869] 100 99 465 Penicillium cf. citrinum [KJ471573] 6737d 2 E Penicillium steckii [HM469415] 100 99 507 Penicillium steckii [KJ471568] 6339c 2 R Phoma proteae [JQ044433] 100 99 423 Phoma sp. 1 [KJ471537] 5887c 2 C, E Preussia persica [GQ292750] 100 98 469 Preussia sp. 2 [KJ471534] 6752 2 E Picoa juniperi [JN392151] 43 92 438 Pyronemataceae sp. [KJ471574] 5655d 2 R Rhizopycnis vagum [HQ610506] 100 100 426 Rhizopycnis vagum [KJ471488] 5699 2 R Setophoma terrestris [KF251247] 100 100 474 Setophoma terrestres [KJ471497] 6408d 2 R Setosphaeria rostrata [JX966631] 100 99 549 Setosphaeria rostrata [KJ471557] 5651 2 E Devriesia strelitziae [EU436763] 99 91 437 Teratosphaeriaceae sp. 1 [KJ471487] 5661d 2 E Xylaria sp. [FJ175176] 97 93 470 Xylariaceae sp. 4 [KJ471489] 6351c 1 R Aspergillus felis [KF558318] 100 99 488 Aspergillus cf. felis [KJ471542] 5881c 1 R Aspergillus malodoratus [AF033485] 98 95 459 Aspergillus malodoratus [KJ471530] 5884d 1 C Astrocystis sublimbata [GU322447] 100 99 432 Astrocystis sublimbata [KJ471532] CM-Y361 1 C Candida parapsilosis [JX441607] 100 100 447 Candida parapsilosis [KJ471578] 5688 1 R Thanatephorus cucumeris [AJ000202] 97 95 629 Ceratobasidiaceae sp. 2 [KJ471495] 6390 1 R Sphaerodes fimicola [JQ034510] 82 88 432 Ceratostomataceae sp. [KJ471553] 6401 1 R Chaetomium strumarium [JQ796877] 100 91 477 Chaetomiaceae sp. [KJ471556]

Tabela 3 Continuação. N° de bp Código N° de Parte da Resultado Top BLAST [n° de acesso no Cobertura Identidade Espécie ou grupo taxonômico proposto sequenciados UFMGCBa isolados planta GenBank] (%) (%) [n° de acesso GenBank]b e analisados 5790 1 C Chaetomium sp. [AB728554] 99 99 470 Chaetomium sp. 1 [KJ471509] 5811 1 C Chaetomium subglobosum [JX280852] 94 100 450 Chaetomium subglobosum [KJ471513] 6352 1 R Chaetomium succineum [JX280855] 100 99 412 Chaetomium succineum [KJ471543] 5800c 1 R Cochliobolus geniculatus [JN943416] 99 99 552 Cochliobolus sp. [KJ471511] 5775c 1 C Colletotrichum boninense [KF819619] 100 99 464 Colletotrichum sp. 2 [KJ471507] 5799 1 R Coniochaeta sp. [HM595555] 100 96 524 Coniochaetaceae sp. [KJ471510] 5888c 1 E Curvularia affinis [GQ352486] 100 100 504 Curvularia sp. [KJ471535] 5822 1 R Daldinia sp. [AY315403] 100 99 506 Daldinia sp. [KJ471515] 5678d 1 R Diaporthe raonikayaporum [KC343188] 100 99 424 Diaporthe raonikayaporum [KJ471492] 6340d 1 R Diaporthe phaseolorum [KC771507] 100 95 499 Diaporthe sp. 1 [KJ471538] 6350d 1 R Diaporthe sp. [KC343202] 100 99 550 Diaporthe sp. 2 [KF850394] 5821 1 E Epicoccum sp. [JN113038] 53 92 405 Dothideomycetes sp. [KJ471514] 5879 1 R Exophiala sp. [EU035421 ] 94 91 560 Herpotrichiellaceae sp. [KJ471529] 5867 1 R Trichoderma brevicompactum [KF294835] 89 95 474 Hypocreaceae sp. 2 [KJ471526] 5842 1 C Lecythophora sp. [JX624284] 100 99 485 Lecythophora sp. [KJ471519] 5749 1 R Magnaporthe grisea [JQ936264] 87 91 441 Magnaporthaceae sp. [KJ471503] 6370 2 R Paraconiothyrium sp. [JX868785 ] 78 99 571 Montagnulaceae sp. 1 [KJ471549] 5851 1 E Phaeothecoidea proteae [EU707898] 100 91 428 Mycosphaerellaceae sp. [KJ471521] 6345 1 R Neoscytalidium dimidiatum [KF531820] 100 99 497 Neoscytalidium dimidiatum [KJ471539] 5700 1 R Neurospora africana [GQ922531] 100 98 350 Neurospora sp. [KJ471498] 6400c 1 R Penicillium daleae [JQ776543] 100 99 510 Penicillium sp. 1 [KJ471555] 5868c 1 R Penicillium janthinellum [AY373921] 100 99 504 Penicillium sp. 2 [KJ471527] 6366 1 R Pestalotiopsis mangiferae [KF155295] 99 96 422 Pestalotiopsis sp. [KJ471546] 6706 1 C Dothideomycetes sp. [KF513534] 99 91 496 Pezizomycotina sp. 3 [KJ471563] 5787 1 R Phaeosphaeriopsis sp. [KC478551] 100 99 413 Phaeosphaeriopsis sp. [KJ471508] 6736d 1 E Phoma gardeniae [JX966640] 100 99 426 Phoma gardeniae [KJ471567] 5712d 1 E Preussia minimoides [KF557658] 100 99 465 Preussia minimoides [KJ471500] 5747 1 R Sclerostagonospora sp. [JX517283] 100 99 474 Sclerostagonospora sp. [KJ471502] 6703 1 R Monosporascus ibericus [JQ973832] 99 91 447 Sordariales sp. [KJ471562]

Tabela 3 Continuação. N° de bp Código N° de Parte da Resultado Top BLAST [n° de acesso no Cobertura Identidade Espécie ou grupo taxonômico proposto sequenciados UFMGCBa isolados planta GenBank] (%) (%) [n° de acesso GenBank]b e analisados 6734 1 C Westerdykella dispersa [AY943055] 100 96 435 Sporormiaceae sp. [KJ471566] 6376 1 R Thozetella sp. [GU973799] 100 99 420 Thozetella sp. [KJ471551] 5837 1 R Gymnopus melanopus [AY263442] 100 95 477 Tricholomataceae sp. [KJ471517] 6754 1 C Dermatocarpon dolomiticum [EF014212] 41 91 438 Verrucariaceae sp. 1 [KJ471575] 6755 1 R Endocarpon pallidulum [DQ826735] 40 87 427 Verrucariaceae sp. 2 [KJ471576] 6742c 1 E Xylaria laevis [GU324746] 100 99 466 Xylaria sp. 3 [KJ471571] 5709d 1 E Xylaria berteri [JQ936299] 100 98 419 Xylaria sp. 1 [KJ471499] 5643d 1 C Xylaria intracolorata [GU324741] 100 96 412 Xylaria sp. 2 [KJ471486] 5803d 1 E Anthostomella conorum [EU552099] 93 85 453 Xylariaceae sp. 1 [KJ471512] 5885d 1 C Anthostomella eucalyptorum [DQ890026] 74 94 406 Xylariaceae sp. 2 [KJ471533] 5857 1 E Xylaria sp. [HE585035] 48 97 560 Xylariaceae sp. 3 [KJ471523] 6747d 1 E Xylaria sp. [JX997749] 98 99 486 Xylariaceae sp. 5 [KJ471572] 5864d 1 C Xylaria sp. [DQ480352] 97 95 584 Xylariaceae sp. 6 [KJ471525] a Código da Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. bSequências de ITS depositadas no GenBanK. c Posição taxonômica sugerida por analises filogenéticas. d Posição taxonômica confirmada por analises filogenéticas. *Fungos endofíticos isolados de Pedra Azul (Minas Gerais) e Ipirá (Bahia). C = cladódio, E = espinho e R = raíz.

Aspergillus felis CBS130245 [KF558318]R a) 76 UFMGCB 6351 Neosartorya udagawae ATCC MYA4693 [HQ263363]R Neosartorya aureola NRRL20643 [EF669945]R 99 Neosartorya quadricincta CBS135.52 [KJ175469]R Neosartorya fischeri CBS832.88 [KJ175464]R R 79 Neosartorya stramenia NRRL4652 [EF669984] UFMGCB 6414 Aspergillus malodoratus NRRL5083 [AF033485]R 94 UFMGCB 5881 Aspergillus calidoustus NRRL26162 [EF652452]R 100 UFMGCB 5758 Talaromyces flavus NRRL2098 [EU021596]R

0.6 Astrocystis sublimbata [GU322447]P b) 93 UFMGCB 5884 72 Astrocystis mirabilis [GU322448]P 70 Astrocystis bambusae [GU322449]P Astrocystis cocoes [AY862571]P Biscogniauxia mediterranea CPC18217 [JF295129]R 0.4 c) Bartalinia robillardoide CBS122686 [EU552102]R 64 UFMGCB 6347 Xylaria hypoxylon CBS121680 [AM993138]R 0 Bartalinia pondoensis [GU291796]P Bartalinia laurina [AF405302]P 0.3

R d) Cladosporium bruhnei CPC5101 [AY251078] 99 Cladosporium uredinicola ATCC46649 [AY362001]R Cladosporium cladosporioides CBS 674.82 [HM148014]R Cladosporium sphaerospermum CBS 109.14 [DQ780350]R UFMGCB 6745 Neofusicoccum australe CBS115185 [FJ150696]R 0.3 P e) Colletotrichum fructicola [JX010181] Colletotrichum ignotum [KC790967]P 99 UFMGCB 5745 96 Colletotrichum gloeosporioides CBS119204 [JX010150]R Colletotrichum truncatum CBS711.70 [GU227892]R UFMGCB 5775 93 Colletotrichum karstii CBS106.91 [JQ005220]R Colletotrichum boninense CBS128526 [JQ005162]R 0.4

50 f) Cochliobolus geniculatus NBRC100368 [JN943416]R 84 UFMGCB 5800 Curvularia fallax [JQ360963]P Curvularia tuberculata CBS146.63 [JX256433]R 100 Cochliobolus tuberculatus CBS146.63 [JN192374]R Curvularia inaequalis CBS185.47 [AF120261]R 78 Curvularia protuberata CBS376.65 [HE861823]T Curvularia trifolii CPC2995 [JN712459]R 97 Curvularia borreriae CBS859.73 [HE861848]R Cochliobolus perotidis CBS350.90 [JN192385]R 89 Cochliobolus heteropogonis CBS284.91 [JN192379]R Curvularia brachyspora [AF212308]P 97 UFMGCB 6336 UFMGCB 5753 95 0 Cochliobolus eragrostidis NBRC32567 [JN943449]R Alternaria alternata CBS112018 [AY673074]R Curvularia pseudorobusta [AB453879]R Cochliobolus lunatus NBRC5997 [JN943422]R Cochliobolus australiensis CBS172.57 [JN601026]R Cochliobolus spicifer CBS274.52 [JN192387]R Cochliobolus ellisii CBS193.62 [JN192375]R Cochliobolus nisikadoi CBS192.29 [JN192373]R Curvularia affinis [GQ352486]P UFMGCB 5888 0.3 UFMGCB 6350 g) Diaporthe sp. CBS119639 [KC343202]R 57 Diaporthe sp. LGMF947 [KC343203]P Diaporthe cf. phaseolorum UFMGCB4602 [JN031056]R UFMGCB 5678 99 52 Diaporthe raonikayaporum CBS133182 [KC343188] UFMGCB 6340 Diaporthe megalospora CBS143.27 [KC343140]R 62 Diaporthe helianthi CBS344.94 [KC343114]R Diaporthe terebinthifolii CBS133180 [KC343216]R Diaporthe sojae CBS100.87 [KC343196]R Diaporthe phaseolorum CBS116019 [KC343175]R Diaporthe melonis CBS435.87 [KC343141]R Diaporthe lusitanicae CBS123212 [KC343136]R Diaporthe hordei CBS481.92 [KC343120]R Diaporthe endophytica CBS133811 [KC343065]R Diaporthe cuppatea CBS117499 [KC343057]R Diaporthe citri CBS199.39 [KC343051]R Diaporthe brasiliensis CBS133183 [KC343042]R Diaporthe batatas CBS122.21 [KC343040]R Diaporthella corylina CBS121124 [KC343004]R 0.4 R h) Fusarium oxysporum CBS129.24 [DQ453704] 94 UFMGCB 5872 100 Fusarium verticillioides CBS576.78 [AB587010]R 93 R 78 Fusarium subglutinans ATCC38016 [AY898251] Fusarium solani CBS124892 [JX435189]R 100 UFMGCB 6718 Fusarium dimerum CBS632.76 [AB586995]R Penicillium chrysogenum CBS906.70 [JX997117]R 0.5

R i) Microsphaeropsis proteae CPC1425 [JN712497] 99 Microsphaeropsis olivacea CBS432.71 [GU237863]R 100 Microsphaeropsis amaranthi [AF079774]P Microsphaeropsis arundinis [JQ814844]P 100 UFMGCB 5682 Coniothyrium multiporum CBS353.65 [JF740187]P 0.4

j) Penicillium janthinellum ATCC4845 [AY373921]R 97 UFMGCB 5868 Penicillium cremeogriseum CBS223.66 [GU981586]R 65 Penicillium daleae CBS211.28 [GU981583]R 60 55 UFMGCB 6400 82 Penicillium simplicissimum CBS372.48 [GU981588]R Penicillium griseofulvum CBS185.27 [JX997084]R 100 UFMGCB 6741 Penicillium citrinum CBS122452 [GU944576]R 99 UFMGCB 6740 UFMGCB 6748 Penicillium steckii CBS260.55 [GU944597]R 98 UFMGCB 6737 Penicillium waksmanii CBS230.28 [GU944602]R Talaromyces marneffei CBS388.87 [JN899344]R

0.6 Phoma gardeniae CBS626.68 [FJ427003]R 95 k) 78 UFMGCB 6736 UFMGCB 6409 57 Peyronellaea pomorum CBS286.76 [FJ427054]R Peyronellaea prosopidis CPC21704 [KF777181]R Phoma macrostoma CBS345.97 [DQ474079]R Phoma aliena CBS877.97 [GU237910]R 50 Peyronellaea glomerata CBS112448 [FJ427016]R Phoma proteae CBS114179 [JQ044433]R 53 UFMGCB 6339 UFMGCB 5827 Phoma herbarum CBS615.75 [FJ427022]R Phoma medicaginis CBS316.90 [AY831563]R Mycosphaerella punctiformis CBS113265 [AY490763]R

0.7

l) Preussia minimoides NRRL37629 [GU183123]R 97 UFMGCB 5712 UFMGCB 5693 82 Preussia africana [DQ865095]P Preussia intermedia UAMH7460 [DQ468020]R 72 Preussia isomera CBS318.65 [AY943058]R Preussia fleischhakii CBS565.63 [GQ203761]R 100 Preussia aemulans CBS28767 [DQ468017]R Preussia minima CBS52450 [DQ468026]R 66 UFMGCB 5694 72 Preussia pseudominima [AY510424]P 60 Preussia persica [GQ292750]P

99 UFMGCB 5887 Preussia australis ATCC22797 [AY943052]R 99 Preussia mediterranea [DQ468021]P Pleospora herbarum CBS191.86 [KC584239]R

0.6 m) Rhizopycnis vagum [AF022786]P 100 UFMGCB 5655 Setosphaeria rostrata [HE664034]P 100 UFMGCB 6408 Pleospora herbarum CBS191.86 [KC584239]R 0.3 Xylaria berteri [JQ327861]P n) 55 UFMGCB 5709 Xylaria longipes CBS148.73 [AF163038]R Xylaria laevis [GU324747]P Xylaria plebeja [GU324740]P UFMGCB 6747 Xylaria allantoidea [FJ884194]P 67 Xylaria curta [JF908804]P Xylaria enteroleuca CBS651.89 [AF163033]R Xylaria intracolorata [GU324741]P UFMGCB 5661 UFMGCB 6742 UFMGCB 5643 UFMGCB 5864 Xylaria cubensis CBS116.85 [AF163032]R Biscogniauxia mediterranea CPC18217 [JF295129]R

0.4

5.1.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Melocactus ernestii

A partir de 1.800 fragmentos, o total de 316 (cladódio = 55, espinho = 48 e raiz = 209) fungos endofíticos foi isolado de 58 das 60 plantas analisadas. Noventa e nove espécies de fungos foram obtidas dos tecidos de M. ernestii; 55 espécies da coleta realizada em Pedra Azul, sendo que 29 ocorreram com grupos com apenas um isolado (singletos) e 44 espécies da coleta realizada em Ipirá, com 20 singletos. A curva de acumulação de espécies das plantas (total de amostras), dos cladódios, dos espinhos e das raízes não estabilizaram, indicando que a amostragem não foi “representativa” (Figura 8); estes dados evidenciam que um maior esforço amostral poderia aumentar o número de espécies observado. Os estimadores Bootstrap, Jackniffe 1 e Jackniffe 2 indicaram estimativas de riquezas de espécies superiores às observadas, no entanto, Chao 1 indicou que praticamente todas as espécies foram coletadas nos cladódios, espinhos e raízes (Tabela 4).

) )

a 200 a 40

ç ç

n 180 n 36

a a

i i

f 160 f 32

n n

o o

c 140 c 28

e 120 e 24

d d

100 20

% %

5 5

9 80 9 16

( (

s 60 s 12

e e

i i

c 40 c 8

é é

p 20 p 4

s s

E 0 E 0 8 16 24 32 40 48 56 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Plantas Cladódios

) )

a 30 a 80

ç ç

n 27 n 72

a a

i i

f 24 f 64

n n

o o

c 21 c 56

e 18 e 48

d d

15 40

% %

5 5

9 12 9 32

( (

s 9 s 24

e e

i i

c 6 c 16

é é

p 3 p 8

s s

E 0 E 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Espinhos Raízes

Figura 8 Curva de acumulação de espécies (linha vermelha), intervalos de confiança de 95% (linhas em azul), baseado em 2000 réplicas de bootstrap.

Tabela 4 Valores observados e valores esperados, baseados nos estimadores de riqueza Chao 2, Jackknife 1, Jackknife 2 e Bootstrap, para cladódios, espinhos e raízes de Melocactus ernestii.

Melocactus Nº observado de Estimadores de riqueza ernestii espécies Chao 2 Jackknife 1 Jackknife 2 Bootstrap Cladódios 24 25,7 ± 11,1 25,4 ± 4,8 59,2 ± 8,1 32,3 ± 3,4 Espinhos 21 20,2 ± 6,2 21,8 ± 3,5 43,5 ± 6 26,8 ± 2,4 Raízes 65 64,3 ± 11,3 68,6 ± 7,1 120 ± 12,2 81,0 ± 4,9 Total 99 94 ± 14,9 99,4 ± 9,5 186,1 ± 16,2 119,2 ± 6,4

A riqueza-composição da comunidade endofítica foi distinta entre as partes de M. ernestii. Neste estudo foram identificadas 99 OTUs, as quais ocorreram em maior número na raiz, seguido pelo cladódio e espinho (Figura 9). Apenas duas OTUs co-ocorreram entre as três partes da planta (Nigrospora sp. e Preussia sp. 1). Duas OTUs co-ocorreram entre cladódio e espinho (Preussia sp. 2 e Preussia minimoides) e três entre raiz e espinho (Aspergillus calidoustus, Penicillium cf. griseofulvum e Sphaerobolaceae sp.). As comunidades endofíticas da raiz e cladódio compartilharam 3 OTUs: Fusarium oxysporum, Hypocreaceae sp. 1 e Phoma sp. 3 (Tabela 3; Figura 9).

U = 99 Raiz

3 3 2

17 14 2

Cladódio Espinho

A distribuição dos isolados no cladódio, espinho e raiz mostrou-se homogênea com baixa dominância, como demonstrado pelos valores do índice de Simpson e a equitabilidade (Tabela 5). Os valores do índice de Margalef (>5) indicaram alta diversidade para as comunidades de fungos endofíticos, sendo a raiz a comunidade com maior diversidade (Tabela 5). As curvas de abundância foram congruentes com os valores dos índices de diversidade α (Figura 10). A comunidade endofítica associada à raiz apresentou maior distribuição proporcional das OTUs. Cochliobolus eragrostidis (5,3%), Fusarium oxysporum (5,3%) e Fusarium solani (3,4%) apresentaram as maiores abundâncias e foram as OTUs dominantes na raiz de M. ernestii. Na comunidade de endofíticos associada aos cladódios, Mycoleptodiscus indicus (4,4%) e Aureobasidium pullulans (2,5%) foram as OTUs dominantes. Para a comunidade do espinho, Preussia sp. 1 (6%) e Sphaerobolaceae sp. (4,1%) foram as OTUs dominantes (Figura 10; Tabela 3).

Diversidade Partes da Planta Cladódio Espinho Raiz Riqueza 24 21 65 Isolados 55 48 209 Diversidade α Dominance_D 0,11 0,16 0,03 Simpson_1-D 0,89 0,84 0,97 Margalef 5,74 5,17 12,17 Diversidade β Cladódio 0 0,65 0,85 Espinho 0,65 0 0,84 Raiz 0,85 0,84 0

Os valores de diversidade β variaram entre 65 e 85% evidenciando que o cladódio, o espinho e a raiz apresentaram comunidades diferentes. Este resultado pode ser observado pelo número aproximado da riqueza de espécies entre cladódio e espinho, associado a um número proporcionalmente baixo de espécies compartilhadas entre as três partes da planta (Tabela 5).

Cladódio Espinho Raiz 18 18 18

16 16

)

) )

) 15

% %

14 % 14

(

i i

12 i 12 12

â â

10 â 10

d d

d 9

n n

8 n 8

b b 6 b 6

6 6 A

A A 4 4 3 2 2 0 0 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 3 6 9 12 15 18 21 0 8 16 24 32 40 48 56 64 Espécies Espécies Espécies Figura 10 Curvas de abundância das espécies detectadas nas partes da planta Melocactus ernestii: cladódio, espinho e raiz. Pontos representam as espécies de fungos endofíticos no eixo vertical. O eixo horizontal ordena as espécies em ordem hierárquica, da mais a menos comum. Ver tabela 3 para singletos e demais espécies de fungos endofíticos.

Os resultados da diversidade β puderam ser corroborados pela análise de agrupamento, onde foram verificados dois grupos: um grupo formado somente por raiz; e outro grupo formado pelas comunidades mais similares: cladódio e espinho (Figura 11). Dentre os isolados do filo Ascomycota e subfilo Pezizomycotina, a classe com maior abundância foi Sordariomycetes (37,3%) representada pelas ordens Xylariales (Amphisphaeriaceae e Xylariaceae), Sordariales (Chaetomiaceae e Sordariaceae), Hypocreales (Hypocreaceae e Nectriaceae), Diaporthales (Diaporthaceae), Coniochaetales (Coniochaetaceae), Chaetosphaeriales (Chaetosphaeriaceae), Glomerellales (Glomerellaceae), Microascales (Halosphaeriaceae) e Magnaporthales (Magnaporthaceae). A classe Dothideomycetes foi representada pelas ordens Pleosporales (Didymellaceae, Montagnulaceae, Phaeosphaeriaceae, Pleosporaceae, Sporormiaceae), Capnodiales (Cladosporiaceae, Mycosphaerellaceae, Teratosphaeriaceae), Botryosphaeriales (Botryosphaeriaceae), Dothideales (Dothioraceae) e a espécie Sclerostagonospora sp. e Rhizopycnis vagum com a família e ordem descritas como incertae sedis. Essa classe foi a segunda mais diversa (33,8%) em relação à composição das espécies. As ordens Eurotiales (Aspergillaceae), Chaetothyriales (Chaetothyriaceae e Herpotrichiellaceae) e Verrucariales (Verrucariaceae) representadas pela classe Eurotiomycetes (11,7%). E a classe com menor abundância foi Pezizomycetes (0,6%) representada pela ordem Pezizales (Pyronemataceae). O subfilo Saccharomycotina foi representado por um singleto da classe Saccharomycetes, ordem Saccharomycetales (Candida parapsilosis). O filo Basidiomycota foi representado somente pela classe Agaricomycetes com abudância de 9,1%, ordens Cantharellales (Ceratobasidiaceae), Agaricales (Agaricomycetidae e Tricholomataceae) e Geastrales (Sphaerobolaceae).

Raiz Espinho Cladódio 1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

a 0,5

S 0,4

0,3

0,2 99

0,1 100

0,0 Figura 11 Dendrograma de similaridade baseado na matriz de abundância das comunidades endofíticas prospectadas em diferentes partes de Melocactus ernestii. A análise de agrupamento foi obtida pelo coeficiente de similaridade de Jaccard, método de ligação simples. Correlação cofenética = 0,999. Valor de bootstrap a partir de 5.000 repetições.

5.2 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Opuntia humifusa

5.2.1 Identificação de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa

Ao final do processo de isolamento foram identificados 17 espécies de fungos endofíticos (Tabela 6; Figura 12,13, 14, 15 e 16). As análises de Máxima Parcimônia baseada na região ITS mostrou forte suporte (bootstrap ≥ 94%) para os clados contendo Biscogniauxia mediterranea, Curvularia protuberate e Epicoccum nigrum (Figura 13-b, d, e). Em contraste, as análises da região ITS para os gêneros Alternaria, Cladosporium, Paraconiothyrium, Pestalotiopsis e Phoma não receberam suporte (Figura 13-a, c, f, g e h) e as sequências TEF1 e/ou β-butulina desses táxons, exceto Cladosporium, mostraram baixa similaridade quando

58 comparadas com sequências depositadas no GenBank e foram identificados em nível de gênero. As sequências TEF1 dos isolados de Cladosporium foram analisadas e os táxons Cladosporium cf. asperulatum e Cladosporium funiculosum foram identificados (Figura 14- b). A amplificação do gene TEF1 falhou para os oito isolados de Cladosporium sp., portanto, a posição filogenética desse grupo, relativa a este gene, permaneceu em gênero. As árvores filogenéticas para o gênero Diaphorte geradas pelas análises de inferência Bayesiana e de Máxima Parcimônia apresentaram topologia muito similar (Figura 16-a, b). Os isolados do grupo Diaphorte sp. formaram um clado monofilético com alto suporte (probabilidade posterior e bootstrap ≥ 99%). O isolado bioativo de Alternaria sp. 3 Ohu 13A1, cujo extrato foi selecionado para o fracionamento químico biomonitorado, apresentou informações inconclusivas na análise filogenética da região ITS e TEF1 em comparação a sequências de espécies tipo, de coleções de cultura e/ou publicadas em jornais indexados, bem como apresentou baixa similaridade com sequências de fungos depositadas no GenBank. A amplificação do gene β-butulina falhou para esse isolado e, portanto a identificação permaneceu em nível de gênero. Para identificar esse fungo, técnicas de macro e microcultivo foram realizadas. As colônias de Alternaria sp. 3 Ohu 13A1 apresentaram colônias marrom-escuro acinzentadas, com diâmetros de até 6 cm, em sete dias, a 25 ± 2ºC nos meios BDA e AEM. Os conídios foram observados em cadeias (2-7), com 1-4 septos transversais e 1 septo longitudinal, com comprimento médio de 20 µm (15 - 24,7 µm) e largura média de 8,5 µm (5,6 - 11,5 µm). Baseado nestas características Alternaria sp. 3 Ohu 13A1 foi identificado como Alternaria cf. arborescens (Figura 17).

Tabela 6 Identificação molecular dos fungos endofíticos associados aos cladódios de Opuntia humifusa: identificação conduzida usando BLASTn da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2), do gene do fator de alongamento (TEF1) e o gene da β-tubulina. Código No. de pb No. de Resultado Top BLAST [n° de acesso do Cobertura Identidade Espécie ou grupo taxonômico proposto [n° de acesso do Ohu sequenciados isolados GenBank] (%) (%) GenBank] e analisados 5B1 29 Aureobasidium pullulans [FN824492] 100 100 526 Aureobasidium pullulans [KF850387]b 13A1e 18 Alternaria alternata [KF438091] 100 100 519 Alternaria sp. 3 [KJ471579]b [KR023652]c 8Ae 14 Diaporthe phaseolorum [EU301113] 100 99 519 Diaporthe sp. [KF850394]b [KR023657]c [KR023649]d 26Ae 10 Alternaria alternata [JQ070079] 100 100 540 Alternaria sp. 4 [KF850386]b [KR023651]c 7Ae 9 Alternaria alternata [KC959211] 100 100 516 Alternaria sp. 2 [KF850385]b 2Be 8 Cladosporium cladosporioides [JQ768318] 100 100 549 Cladosporium sp. [KF850389]b 2Ae 5 Cochliobolus sp. [JX960581] 100 100 570 Curvularia protuberata [KF850392]b 17C1e 4 Cladosporium cladosporioides [JX981454] 100 100 523 Cladosporium funiculosum [KF850391]b [KR023656]c 17Ae 2 Paraconiothyrium sporulosum [EU821483] 100 99 570 Paraconiothyrium sp. [KF850396]b 18B1e 2 Pestalotiopsis clavispora [KC537808] 100 100 461 Pestalotiopsis sp. [KF850397]b 4Be 1 Alternaria alternata [KC692221] 100 100 550 Alternaria sp. 1 [KF850384]b [KR023650]c 8B2e 1 Alternaria alternata [KF155521] 100 100 504 Alternaria sp. 5 [KJ471580]b [KR023653]c Biscogniauxia mediterranea [KF850388]b [KR023654]c 19Bf 1 Biscogniauxia mediterranea [EF026134] 100 100 530 [KR023648]d 2C1e 1 Cladosporium bruhnei [KC461496] 99 99 551 Cladosporium cf. asperulatum [KF850390]b [KR023655]c 7B 1 Cryptococcus flavescens [KC679297] 100 100 409 Cryptococcus flavescens [KF850393]b 23Af 1 Epicoccum nigrum [KC164754] 100 100 435 Epicoccum nigrum [KF850395]b 11Be 1 Phoma novae-verbascicola [KC411473] 100 100 515 Phoma sp. [ KF850398]b a Código dos fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa. bSequências da região transcrita interna depositadas no GenBanK. cSequências de do gene do fator de alongamento, depositadas no GenBanK. dSequências de β-tubulina, depositadas no GenBanK. ePosição taxonômica sugerida por analises filogenéticas. fPosição taxonômica confirmada por analises filogenéticas. 60

Alternaria gaisen CBS 632.93 [KC584658] R a) Alternaria alternate CBS 916.96 [KC584634] R Alternaria daucifolii CBS 118812 [KC584652] R Alternaria tenuissima CBS 918.96 [KC584693] R Alternaria longipes CBS 540.94 [KC584667] R 83 Alternaria arborescens CBS 102605 [KC584636] R Ohu4B Ohu8B2 Ohu13A1 Ohu26A Alternaria alternantherae CBS 124392 [KC584633] R Pleospora herbarum CBS 191.86 [KC584731]R 0.3 b) Epicoccum nigrum NRRL 37031 [GU183122]R 98 Epicoccum nigrum ATCC 62191 [FJ424241]R Ohu 23A Epicoccum sorghi CBS 986.95 [FJ427075]R 70 Epicoccum pimprinum CBS 246.60 [FJ427049]R Phaeosphaeria nodorum [AF250830]P 0.3 c) Cercospora beticola CPC 11557 [AY840527]R Cladosporium funiculosum CBS 122129 [HM148094] R Cladosporium asperulatum CBS 126340 [HM147998] R Cladosporium colombiae CBS 274.80B [FJ936159] R Cladosporium pini-ponderosae CBS 124456 [FJ936160] R Cladosporium cladosporioides CBS 112388 [HM148003] R 0 Cladosporium oxysporum CBS 126351 [HM148119] R Cladosporium uredinicola CPC 5390 [AY251071] R Cladosporium perangustum CBS 126364 [HM148122] R Ohu 17C1 Ohu 2B Ohu 2C1 0.11 Cochliobolus spicifer CBS 274.52 [JN192387]R d) 53 R 50 Cochliobolus ellisii CBS 193.62 [JN192375] R 77 Cochliobolus heteropogonis CBS 284.91 [JN192379] Cochliobolus australiensis CBS 172.57 [JN601026]R Curvularia protuberata UTHSC 08.2880 [HE861825]R 94 Curvularia protuberate CBS 376.65 [HE861823]T Ohu 2A R 84 Curvularia trifolii CPC 2995 [JN712459] 100 Curvularia borreriae CBS 859.73 [HE861848]R Curvularia inaequalis CBS 185.47 [AF120261]R Curvularia pseudorobusta [AB453879]P Cochliobolus lunatus NBRC 5997 [JN943422]R Cochliobolus tuberculatus CBS 146.63 [JN192374]R Alternaria alternata CBS 112018 [AY673074]R 0.6

Biscogniauxia mediterranea [EF026134]P e) 85 89 Ohu19B P 100 Biscogniauxia mediterranea [AJ390414] P 98 Biscogniauxia mediterranea CPC18217 [JF295129] P 67 Biscogniauxia atropunctata [AF201705] Biscogniauxia nummularia [AF201706]P 51 Biscogniauxia bartholomaei [AF201719]P Biscogniauxia marginata [AJ390417]P Biscogniauxia arima [EF026150]P Biscogniauxia repanda [AJ390418]P Xylaria bambusicola [EF026123]P 0.8 f) Pestalotiopsis microspora CBS364.54 [AF377292]R Pestalotiopsis foedans CGMCC3 9202 [JX398988]R Pestalotiopsis clavispora UFSM-P3 [JX628602]P 100 Pestalotiopsis longiseta MAFF 752008 [AB482206]R Pestalotiopsis mangiferae [JQ281542]P Ohu 18B1 Pestalotiopsis ellipsospora MFLUCC 12-0284 [JX398981]P Pestalotiopsis theae CGMCC 3.9188 [JN943624]R Bartalinia robillardoides CBS122686 [EU552102]R 0.3 g) Phoma novae-verbascicola CBS 114.93 [GU237753]R Phoma sylvatica CBS 874.97 [GU237907]R 93 Phoma poolensis CBS 116.93 [GU237755]R Ohu 11B R 68 Phoma valerianellae CBS 272.92 [GU128539] 66 Stagonosporopsis cucurbitacearum CBS 233.52 [EU167573]R Phoma insulana CBS 252.92 [GU237810]R Phoma herbarum CBS 567.63 [JF810528]R Peyronellaea pomorum var. pomorum CBS 539.66 [FJ427056]R Pyrenochaeta romeroi IP571.61 [DQ836802]P 0.4 Coniothyrium sporulosum CBS 218.68 [AJ293814]T h) 90 Paraconiothyrium sporulosum CBS 132.26 [AJ2938135]R Coniothyrium sporulosum CBS 358.75A [AJ293815]R Paraphaeosphaeria pilleata [AF250821]P 56 58 Paraphaeosphaeria michotii [AF250817]P Ohu 17A Coniothyrium minitans CBS 641.80 [AJ2938095]R Paraconiothyrium cyclothyrioides CBS 972.95 [AY642529]R 94 Paraconiothyrium estuarinum CBS 109850 [AY642530]R 100 Paraconiothyrium brasiliense CBS 100299 [AY642531]R Paraconiothyrium fungicola CBS 113269 [AY642532]R Paraconiothyrium fuckelii MUTITA 4319 [KC339222]R Corynespora smithii CABI5649b [FJ852597]P Saccharicola taiwanensis ATCC 38203 [AF439462]R 0.5

Figura 13 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia da região transcrita interna de fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa: a) Alternaria, b) Epicoccum, c) Cladosporium, d) Curvularia, e) Biscogniauxia, f) Pestalotiopsis, g) Phoma e h) Paraconiothyrium. R = sequências de isolados depositados em Coleções de Culturas internacionais; P = sequências de isolados publicadas em jornais indexados.

Alternaria gaisen CBS 632.93 [KC584658]R Alternaria alternate CBS 916.96 [KC584634]R a) Alternaria daucifolii CBS 118812 [KC584652]R Alternaria tenuissima CBS 918.96 [KC584693]R Alternaria longipes CBS 540.94 [KC584667]R 83 Alternaria arborescens CBS 102605 [KC584636]R Ohu 4B Ohu 8B2 Ohu 13A1 Ohu 26A Alternaria alternantherae CBS 124392 [KC584633]R Pleospora herbarum CBS 191.86 [KC584731]R 0.3 Cladosporium asperulatum CBS 126340 [HM148239]R 86 b) Cladosporium asperulatum CBS 126339 [HM148238]R 93 Ohu 2C1 Cladosporium asperulatum CBS 113744 [HM148237]R Cladosporium funiculosum CBS 122129 [HM148338]R 100 Cladosporium funiculosum CBS 122128 [HM148337]R Ohu 17C1 Cladosporium colombiae CBS 274.80B [FJ936163]R 99 R 90 Cladosporium pini-ponderosae CBS 124456 [FJ936164] Cladosporium cladosporioides CBS 674.82 [HM148255]R Cladosporium bruhnei CBS 115683 [EF679418]R Cladosporium oxysporum CBS 126351 [HM148363]R Cladosporium uredinicola CPC 5390 [HM148467]R Cladosporium perangustum CBS 126364 [HM148366]R Cercospora beticola CBS 124.31 [KF253246]R

0.5 Figura 14 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia do gene do fator de alongamento de fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa: a) Alternaria e b) Cladosporium. R = sequências de isolados depositados em Coleções de Culturas internacionais.

Biscogniauxia mediterranea [AY951684]P 82 Ohu19B 98 P 81 Biscogniauxia atropunctata [AY951673] Biscogniauxia arima [AY951672]P Biscogniauxia nummularia [GQ428324]P Xylaria bambusicola [GQ478223]P

0.5

Figura 15 Árvores filogenéticas a partir da análise Máxima Parcimônia do gene da β-tubulina do fungo endofítico Biscogniauxia mediterranea associado à Opuntia humifusa. P = sequências de isolados publicadas em jornais indexados.

Ohu 8A 93 UFMGCB 6350 a) 68 100 Diaporthe sp. CBS 119639 96 Diaporthe sp. LGMF 947 61 Diaporthe sojae CBS 100.87

70 Diaporthe citri CBS 199.39 Diaporthe endophytica CBS 133811 100 80 Diaporthe phaseolorum CBS 116019 Diaporthe batatas CBS 122.21 66 87 Diaporthe melonis CBS 435.87 Diaporthe helianthi CBS 344.94 75 96 Diaporthe hordei CBS 481.92 Diaporthe megalospora CBS 143.27 Diaporthe cuppatea CBS 117499 100 Diaporthe lusitanicae CBS 123212 Diaporthe brasiliensis CBS 133183 Diaporthella corylina CBS 121124

1.1 Diaporthe cuppatea CBS 117499 1 Diaporthe lusitanicae CBS 123212 b) 0.55 Diaporthe brasiliensis CBS 133183 0.9 Diaporthe helianthi CBS 344.94 0.52 Diaporthe hordei CBS 481.92 0.88 0.71 Diaporthe megalospora CBS 143.27 0.87 Diaporthe batatas CBS 122.21 0.83 Diaporthe melonis CBS 435.87 0.74 Diaporthe endophytica CBS 133811 1 Diaporthe phaseolorum CBS 116019 Diaporthe citri CBS 199.39 Ohu 8A 1 1 0.86 UFMGCB 6350 Diaporthe sp. CBS 119639 0.99 Diaporthe sp. LGMF 947 Diaporthe sojae CBS 100.87 Diaporthella corylina CBS 121124

0.08

5.2.2 Análise de diversidade de fungos endofíticos isolados de Opuntia humifusa

A partir de 180 fragmentos, o total de 108 fungos endofíticos foi isolado de 34 das 36 plantas analisadas (sítio 1 = 46 e sítio 2 = 62 isolados). Dezessete espécies de fungos associados foram obtidos dos tecidos de O. humifusa, com índice de Margalef = 3,4 indicando moderada diversidade dentro da comunidade de fungos endofíticos. A curva de acumulação de espécies ficou próxima da estabilização, os estimadores indicando que a amostragem não foi “representativa” (Figura 17). Os estimadores de riqueza Chao 1 (17 ± 3,94) e Jackniffe 1 (17,5 ± 2,46) indicaram que praticamente todas as espécies foram coletadas e, segundo o estimador Bootstrap (20,1 ± 1,7), cerca de três espécies poderiam ter sido coletadas a mais, enquanto Jackniffe 2 (31,3 ± 4,24) indicou estimativas de riquezas de espécies superiores às observadas, neste caso, estes dados evidenciam que um maior esforço amostral poderia aumentar o número de espécies nas

áreas amostradas.

) a

ç 28

a i

f 24

o c

e d

% 5

9 12

(

e 8

i c

é 4

p s

E 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Plantas Figura 17 Curva de acumulação de espécies da comunidade de fungos endofíticos associada à Opuntia humifusa (linha vermelha), intervalos de confiança de 95% (linhas em azul), baseado em 2000 réplicas de bootstrap.

A distribuição dos isolados entre as 17 OTUs mostrou-se homogênea com baixa dominância, como demonstrado pelo Índice de Simpson (0,14) e a equitabilidade (0,85). As curvas de abundância foram congruentes com os valores dos índices de diversidade α, onde a maioria das espécies apresentou abundância com valores intermediários ou baixos, quando comparados com as poucas espécies com altos valores de abundância (Figura 18).

30 27 24 21

n 18

d 15

b 12 A 9 6 3 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Espécies

No cladódio três espécies foram dominantes (Alternaria cf. arborescens, Aureobasidum pullulans e Diaporthe sp.), representando 61 (55%) do total de isolados. Em contraste, 11,76% das espécies (Paraconiothyrium sp. e Pestalotiopsis sp.) foram representadas por dois isolados, enquanto 47,05% das espécies (Alternaria sp. 1, Alternaria sp. 5, Biscogniauxia mediterranea, Cladosporium cf. asperulatum, Cryptococcus flavescens, Epicoccum nigrum e Phoma sp.) foram únicas (singletos), representadas por apenas um isolado. O sítio 1 foi mais diversificado e apresentou oito espécies exclusivas (Alternaria sp. 1, Alternaria sp. 5, Cladosporium funiculosum, Curvularia protuberata, Cryptococcus flavescens, Paraconiothyrium sp., Pestalotiopsis sp. e Phoma sp.), enquanto o síteo 2 com três espécies exclusivas (Alternaria sp 4., Biscogniauxia mediterranea, Epicoccum nigrum) contribuiu menos para a diversidade α. Seis espécies foram comuns a ambos os sítios (Alternaria cf. arborescens, Aureobasidum pullulans, Cladosporium sp., Cladosporium funiculosum e Diaporthe sp.). Dentre os isolados do filo Ascomycota, a classe com maior abundância foi Dothideomycetes (81,25%) representada pelas ordens Pleosporales (Alternaria, Epicoccum, Paraconiothyrium e Phoma), Capnodiales (Cladosporium) e Dothideales (Aureobasidium). A classe Sordariomycetes (18,75%), representada pelas ordens Xylariales (Biscogniauxia e Pestalotiopsis) e Diaporthales (Diaporthe), foi encontrada como componente minoritário nas comunidades fúngica. A espécie Cryptococcus flavescens foi única representante do filo Basidiomycota.

5.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS BIOATIVOS

5.3.1 Melocactus ernestii Os extratos obtidos a partir dos cladódios, raízes e espinhos de M. ernestii não apresentaram atividade antimicrobiana, enquanto cinco extratos dos fungos endofíticos inibiram pelo menos um dos micro-organismos alvos (Tabelas 6). Não foi detectada a inibição dos extratos fúngicos contra S. aureus e P. aeruginosa. Apenas o extrato de Diaporthe sp. UFMGCB 6350 apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli. Os isolados Fusarium solanii UFMGCB 5689 e 5865 demonstraram atividade antifúngica seletiva contra Cl. sphaerospermum, com inibição de 78,7 e 96,6%, respectivamente. Os extratos dos Bartalinia sp. UFMGCB 6347 e Phoma sp. UFMGCB 6409 apresentaram atividade antifúngica contra C. krusei (com inibição de 100 e 97%, respectivamente) e Cl. sphaerospermum (com inibição de 100 e 94,9%, respectivamente). Os cinco isolados bioativos foram re-cultivados e, posteriormente, produzidos seus extratos hidro-alcóolicos e diclorometânicos para determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Os extratos, hidro-alcóolico e diclorometânico, de Fusarium solanii UFMGCB 5689 perderam a atividade antimicrobiana após o re-cultivo. O extrato diclorometânico do isolado Phoma sp. UFMGCB 6409 apresentou porcentagem de inibição ≤70% a 250 μg/mL frente a Cl. sphaerospermum, enquanto o extrato hidro- alcóolico não apresentou atividade antimicrobiana após o re-cultivo (Tabela 8). Além disso, os extratos diclorometânicos dos isolados F. solanii UFMGCB 5685, Bartalinia sp. UFMGCB 6347 e Diaporthe sp. UFMGCB 6350 apresentaram os valores da CIM inferiores aos valores encontrados para os extratos hidro-alcóolicos (Tabela 8). Os quatro extratos diclorometânicos que apresentaram atividade antimicrobiana após o re-cultivo foram produzidos em larga escala e selecionados para estudos de desreplicação a fim de caracterizar e, posteriormente, isolar e identificar seus metabólitos bioativos. Estes experimentos foram realizados como parte do estágio de doutorado sanduíche no Natural Products Utilization Research Unit pertencente ao National Center for Natural Products Research (ARS/NPURU/USDA).

Tabela 7 Atividade antimicrobiana dos extratos dos fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii com inibição acima de 70%.

Inibição (%) 1UFMGCB Táxon Bactérias Leveduras Fungo Filamentoso E. coli S. aureus P. aeruginosa C. albicans C. krusei C. sphaerosperum 5685 Fusarium solanii - - - - - 78,7 ± 57 5689 Fusarium solanii - - - - - 96,6 ± 28 6347 Bartalinia sp. - - - - 100 ± 12 97 ± 51 6350 Diaporthe sp. 71,7 ± 0 - - - - - 6409 Phoma sp. - - - - 100 ± 2 94.9 ± 2 Controles Cloranfenicol 100± 0 - - - - - Benomil ------96 ± 1,9 Anfotericina B ------100 ± 1 100 ± 2 -- 1UFMGCB = Código da Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais; E. coli = Escherichia coli ATCC 11775; S. aureus = Staphylococcus aureus ATCC 12600; P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145; C. albicans = Candida albicans ATCC 60193, C. krusei = Candida krusei ATCC 6258; C. sphaerosperum = Cladosporium sphaerospermum CCT 1740; “-” = não ativo; "--" não testado; “*” isolado não identificado.

Tabela 8 Concentração inibitória mínima (μg/mL) e porcentagem de inibição dos extratos hidro-alcóolicos e diclorometânicos dos extratos bioativos de fungos associados à Melocactus ernestii.

Concentração (µg/mL)/Inibição (%) 1UFMGCB Táxon E. coli C. krusei C. sphaerosperum 2 3 2 3 2 3 H2O-EtOH DCM H2O-EtOH DCM H2O-EtOH DCM 5685 Fusarium solanii 1254 31,54 - - - - (97,6 ± 4,8)5 (91 ± 1,3)5 2504 2504 5689 Fusarium solanii - - - - (11 ± 0,2)5 (17,4 ± 0,5)5 2504 15,64 2504 62,54 6347 Bartalinia sp. - - (88,3 ± 1,9)5 (104,6 ± 1,7)5 (99,3 ± 1)5 (92,7 ± 15,5)5 2504 1254 6350 Diaporthe sp. (98,6 ± 3,7)5 (98,3 ± 5,6)5 - - - - 2504 2504 2504 2504 6409 Phoma sp. - - (0 ± 0,2)5 (0 ± 0,5)5 (39,3 ± 1)5 (70,4 ± 5,5)5 Controles Cloranfenicol 97 ± 0 ------Benomil ------95 ± 2 Anfotericina B -- -- 100 ± 2 -- -- 1 2 3 UFMGCB = Código da Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais; H2O-EtOH = extrato hidro-alcóolico; DCM = extrato diclorometânico; 4 = concentração inibitória mínima (μg/mL); 5 = porcentagem de inibição. E. coli = Escherichia coli ATCC 11775; S. aureus = Staphylococcus aureus ATCC 12600; P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145; C. albicans = Candida albicans ATCC 60193, C. krusei = Candida krusei ATCC 6258; C. sphaerosperum = Cladosporium sphaerospermum CCT 1740; “-” = não ativo; -- = não testado. .

Inicialmente os extratos Fusarium solanii UFMGCB 5865, Bartalinia sp. UFMGCB 6347, Diaporthe sp. UFMGCB 6350 e Phoma sp. UFMGCB 6409 foram submetidos à bioautografia para avaliação da atividade antifúngica contra fungos de interesse na agricultura. Estes extratos foram testados a 160 μg frente aos fitopatógenos Colletotrichum acutatum, Co. fragariae e Co. gloesporioides, agentes causais da antracnose em vegetais. O extrato de Phoma sp. UFMGCB 6409 apresentou zonas claras de inibição frente ao crescimento de todos os micro-organismos alvos de até 12 mm de diâmetro; os extratos de Fusarium solanii UFMGCB 5865 e Diaporthe sp. UFMGCB 6350 inibiram o crescimento de Co. fragariae e Co. gloesporioides (com halos de até 22 mm de diâmetro) e geraram zonas difusas para Co. acutatum; e o extrato do isolado Bartalinia sp. UFMGCB 6347 gerou zonas difusas para todos os micro- organismos alvos testados (Tabela 9).

Tabela 9 Atividade antifúngica de extratos dos fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii por meio do ensaio de bioautografia contra três espécies Colletotrichum. Média das zonas de inibição (mm) ± DP* Extratos (160 Táxon Colletotrichum Colletotrichum Colletotrichum µg) fragariae gloeosporioides acutatum 5685 Fusarium solanii 5 ± 0 5 ± 0 zona difusa 6347 Bartalinia sp. zona difusa zona difusa zona difusa 6350 Diaporthe sp. 6 ± 0,5 22 ± 1 zona difusa 6409 Phoma sp. 7 ± 0 12 ± 0 6 ± 0,7 Controles Benomil 18 ± 0 15 ± 0 0 ± 0 Ciprodinil zona difusa 20 ± 2 zona difusa Azoxistrobina zona difusa 22 ± 0 zona difusa Captan 22 ± 2 15± 0,5 16 ± 1,5

Análises dos espectros de RMN de 1H dos extratos bioativos foram realizadas e indicaram a presença majoritária de ácidos graxos nos extratos dos isolados Fusarium solanii UFMGCB 5865 e Bartalinia sp. UFMGCB 6347 (Apêndice A). Esses extratos foram submetidos à Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização em Chama (CG- FID) e foi confirmada a presença de misturas de ácidos graxos (Tabela 10). O ácido palmítico foi majoritário para os extratos analisados, seguido do ácido oléico e do ácido pentadecanóico para Bartalinia sp. UFMGCB 6347 e ácido linoléico e ácido oléico (Tabela 10). As análises dos espectros de RMN de 1H do extrato de Diaporthe sp. UFMGCB 6350 (Apêndice A) indicaram a presença de hidrogênios aromáticos e ausência de ácidos

graxos, e então selecionado para o fracionamento biomonitorado. O isolado Diaporthe sp. UFMGCB 6350 foi cultivado em larga escala em utilizadas 100 placas de Petri contendo o meio BDA, com rendimento de 800 mg de extrato diclorometânico. Nas análises de CCD, o extrato foi dissolvido a 1 mg/mL em DCM e conduzidas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Acetato de Etila/Hexano 80:20, Hexano/Éter 50:50, Hexano/Acetato de Etila 50:50 e Hexano/Acetato de Etila 80:20. Após a revelação em câmara de UV e com o revelador Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Acetato de Etila/ Hexano 80:20.

Tabela 10 Quantificação de ácidos graxos (%) produzidos por fungos endofíticos associados à Melocactus ernestii. Extratos brutos Ácidos graxos Bartalinia sp. Fusarium solani UFMGCB 6347 UFMGCB 5685 Caprílico (8:0) • 0,62

Cáprico (10:0) 0,15 •

Láurico (12:0) 0,33 •

Mirístico (14:0) 2,79 •

Miristoleico (14:1) 0,59 •

Pentadecanóico (15:0) 11,42 •

Palmítico (16:0) 40,87 40,54

Palmitoléico (16:1) • 0,49

Heptadecanóico (17:0) 3,11 •

Cis-10-Hepadecenóico (17:1) 7,54 •

Esteárico (18:0) 4,36 7,25

Elaídico (18:1n9t) 0.20 •

Oléico (18:1n9c) 19,74 14,5

Linolelaídico (18:2n6t) • 0,29

(LA) Linoléico (18:2n6c) 3,68 36,2

Pinolênico (18:3n6) 0,95 •

Araquídico (20:0) 1,23 •

Estearidônico (18:4n3) 0,22 • cis-8,11,14-Eicosatrienóico (20:3n6) 0,36 •

Eicosatrienóico (20:3n3) 1,83 •

Erúcico (22:1n9) 0,55 • “” = ausência de ácidos graxos.

As análises dos espectros de RMN de 1H do extrato de Diaporthe sp. UFMGCB 6350 (Apêndice A) indicaram a presença de hidrogênios aromáticos e ausência de

ácidos graxos, o qual foi então selecionado para o fracionamento biomonitorado. O isolado Diaporthe sp. UFMGCB 6350 foi cultivado em larga escala em utilizadas 100 placas de Petri contendo o meio BDA, com rendimento de 800 mg de extrato diclorometânico. Nas análises de CCD, o extrato foi dissolvido a 1 mg/mL em DCM e conduzidas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Acetato de Etila/Hexano 80:20, Hexano/Éter 50:50, Hexano/Acetato de Etila 50:50 e Hexano/Acetato de Etila 80:20. Após a revelação em câmara de UV e com o revelador Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Acetato de Etila/ Hexano 80:20. A cromatografia em coluna do extrato foi realizada em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). O processo teve início com 409,4 mg de extrato de Diaporthe sp. UFMGCB 6350 foi dissolvido em 2 mL de DCM e adsorvido a uma coluna cromatográfica de sílica gel (40- 63 μm, 60 Å, 40 x 150 mm). A eluição da coluna foi realizada em um Biotage XP-Sil, 100 g, SNAP cartridge correndo a 40 mL/min, com modo de detecção UV a 254nm e 365nm, com o gradiente Hexano/Acetato de Etila 20:100, utilizando 2300 mL dos solventes. Após o fracionamento foram coletadas porções individuais de 22 mL em tubos de ensaio (16 x 150 mm). Cada porção obtida foi submetida à CCD (Acetato de Etila/ Hexano 80:20), e de acordo com os perfis apresentados, as porções foram agrupadas em 6 frações [(1), 1-63, 17 mg; (2), 64-79, 178,7 mg; (3), 80-81, 1,5 mg; (4), 82-88, 45,1 mg; (5), 89-96, 12,8 mg; (6), 97-105, 2,6 mg, as quais foram concentradas em rota vapor e então submetidas ao ensaio antifúngico (bioautografia), sendo testadas sob as concentrações 10 e 100 µg. A fração 2 inibiu o crescimento de Co. fragarie, Co. gloerosporioides a 10 µg, com halos de 4 e 9 mm, respectivamente, e 100 µg, com halos de 6 e 11 mm, respectivamente. A fração 2 gerou zona difusa para Co. acutatum, enquanto as demais frações apresentaram zonas difusas para todos os micro-organismos alvos avaliados. Os sinais obtidos de RMN de 1H e 13C para a fração 2, juntamente com os dados obtidos a partir do LC-MS/MS, como fórmula molecular (m/z 494.22906 [M+H]+, calculado para - C28H32N1O7, 494.21788; m/z 492.20808 [M-H] , calculado para C28H30N1O7, 492.20223) permitiram identificar a molécula ativa como citocalasina H (Apêndice B). Os dados de RMN foram similares aos dados encontrados na literatura, descritos por Tao et al. (2008), corroborando a identificação da citocalasina H (Figura 19).

As análises dos espectros de RMN de 1H do extrato de Phoma sp. UFMGCB 6409 (Apêndice A) indicaram a presença de hidrogênios aromáticos, o qual também foi selecionado para o fracionamento biomonitorado. Phoma sp. UFMGCB 6409 foi cultivado em larga escala em 80 placas de Petri contendo o meio BDA, as quais renderam 470 mg de extrato diclorometânico. Nas análises de CCD, o extrato bruto foi dissolvido a 1 mg/mL em DCM e conduzidas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Hexano/Éter 50:50 e Hexano/Acetato de Etila 80:20. Após a revelação em UV e Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Hexano/Acetato de Etila 80:20. A cromatografia em coluna do extrato foi realizada em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). 470 mg de extrato bruto de Phoma sp. UFMGCB 6409 foi dissolvido em 2 mL de DCM e adsorvido a uma coluna cromatográfica de sílica gel (40-63 μm, 60 Å, 40 x 150 mm). A eluição da coluna foi realizada em um Biotage XP-Sil, 100 g, SNAP cartridge correndo a 40 mL/min, com modo de detecção UV a 280 nm e 300 nm, com o gradiente Hexano/Acetato de Etila, em 3 etapas: (1) 0:0 até 0:50 utilizando 2.300 mL, (2) 50:50 até 0:100 utilizando 775 mL, e (3) extensão de 0:100 utilizando 768 mL. Após o fracionamento foram coletadas porções individuais de 22 mL em tubos de ensaio (16 x 150 mm). Cada porção obtida foi submetida a CCD (Hexano/Acetato de Etila 8:2 e Hexano/Acetato de Etila 5:5), e de acordo com os perfis apresentados, as porções foram agrupadas em 13 frações [(1), 1-31, 4,9 mg; (2), 32-33, 5,3 mg; (3), 34- 36, 1,2 mg; (4), 37-44, 4,8 mg; (5), 45-49, 4,3 mg; (6), 50-51, 2,1 mg; (7), 52-58, 14,5 mg; (8), 59-60, 3,1 mg; (9), 61-62, 1,8 mg; (10), 63-65, 4,1 mg; (11) 66-72, 47,3; (12) 73-82, 67,7 mg; e (13) 83-163, 170,2 mg], as quais foram concentradas em rota vapor e

então submetidas ao ensaio antifúngico (bioautografia), sendo testadas sob as concentrações 10 e 100 µg. As frações 11 e 12 inibiram o crescimento de Co. fragarie a 10 µg, com halos de 4 mm de diâmetro; a 100 µg as frações 11 e 12 inibiram Co. fragarie com halos de 5 mm de diâmetro e Co. gloerosporioides com halos de 10 e 15 mm de diâmetro, respectivamente. As demais frações apresentaram zonas difusas frente a todos os alvos testados, exceto a fração 1 que não apresentou atividade. Com base no rendimento e na bioatividade, as frações 11 e 12 foram submetidas a RMN de 1H, os quais indicaram a presença de hidrogênios aromáticos. As frações 11 e 12 foram solubilizadas a 1 mg/mL em DCM e submetidas as CCD conduzidas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Hexano/Éter 50:50, Clororfórmio/Acetona 80:20, Hexano/Isopropanol 80:20, Hexano/Acetato de Etila 60:40, Hexano/Acetato de Etila 70:30 e Hexano/Acetato de Etila 80:20. Após a revelação em câmara de UV e revelador Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Hexano/Acetato de Etila 80:20. As frações 11 e 12 foram submetidas à cromatografia em coluna em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). 45 mg da fração 11 e 65 mg da fração 12 de extrato foram separadamente solubilizadas em 1 mL de DCM e individualmente adsorvidas a uma coluna cromatográfica de sílica gel (40-63 μm, 60 Å, 40 x 150 mm). A eluição da coluna foi realizada no Biotage XP-Sil, 100 g, SNAP cartridge correndo a 40 mL/min, com modo de detecção UV a 280 nm e 300 nm, com o gradiente Hexano/Acetato de Etila, em 3 etapas: (1) 0:0 até 0:15 utilizando 396 mL, (2) 0:15 até 0:50 utilizando 2700 mL, e (3) 0:50 até 0:100 utilizando 315 mL. Após o fracionamento foram coletadas porções individuais de 15 mL em tubos de ensaio (16 x 150 mm). Cada porção obtida foi submetida a CCD (Hexano/Acetato de Etila 8:2 e Hexano/Acetato de Etila 5:5), e de acordo com os perfis apresentados, as porções foram agrupadas em 7 sub-frações para a fração 11 [(11.1), 1-64, 4,2 mg; (11.2), 65-73, 19,8 mg; (11.3), 74-77, 16,8 mg; (11.4), 78-88, 31,4 mg; (11.5), 89-139, 4 mg; (11.6), 140-141, 8,3 mg; e (11.7), 142-207, 4 mg] e 16 sub-frações para a fração 12 [(12.1), 1-11, 3,6 mg; (12.2), 12-13, 2,3 mg; (12.3), 14-16, 2,5 mg; (12.4), 17-18, 2,1 mg; (12.5), 19-21, 2,1 mg; (12.6), 22-27, 2,2 mg; (12.7), 28-36, 2,8 mg; (12.8), 37-49, 3,4 mg; (12.9), 50-59, 2,9 mg; (12.10), 60-64, 2,1 mg; (12.11) 65-72, 2,7 mg; (12.12) 73-83, 36,9 mg; (12.13) 84-92, 9,7 mg; (12.14) 93-101, 4,4 mg; (12.15) 102-137, 5,3

mg, e (12.16) 138-207, 3 mg], as quais foram concentradas em rota vapor e então submetidas ao ensaio antifúngico (bioautografia), sendo testadas sob a concentração de 100 µg. As sub-frações 11.4 e 12.12 inibiram o crescimento de Co. fragarie e Co. gloerosporioides sob a concentração de 100 µg, com halos de 5 mm. As demais frações não inibiram os micro-organismos alvos testados. As sub-frações 11.4 e 12.12 foram selecionadas para análises de RMN de 1H e 13C e CG-MS, e após as análises foi verificado que as duas sub-frações se tratava da mesma substância (Apêndice C). Com os resultados do RMN de 1H e 13C, CG-MS e LC-MS/MS (m/z 233.08905 [M+H]+, calculado para C14H17O3, 233.11777) a molécula bioativa foi identificada como especiferona A (Apêndice C). Os dados de RMN foram similares aos dados encontrados na literatura, descritos por Nakajima et al. (1989), corroborando a identificação da Especiferona A (Figura 20).

5.3.2 Opuntia humifusa Os 36 extratos obtidos a partir dos cladódios de O. humifusa não apresentaram atividade antifúngica, enquanto seis extratos dos fungos endofíticos apresentaram atividade antifúngica com zonas de inibição de 4,5 até 11,2 mm de diâmetro nos ensaios de bioautografia (Tabela 11). Análises dos espectros de RMN de 1H dos extratos bioativos foram realizadas e indicaram a presença majoritária de ácidos graxos para os extratos dos fungos Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, Cladosporium funiculosum Ohu 17C1 e Paraconiothyrium sp. Ohu 17A (Apêndice D). Esses extratos foram submetidos à CG-FID e confirmada à presença de misturas de ácidos graxos (Tabela 12). O ácido palmítico foi majoritário para todos os extratos analisados, seguido de ácido oleico para Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, ácido linoleico

(30,9%) Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, ácido láurico (36,6%) para Cladosporium funiculosum Ohu 17C1 e (27,2%) Paraconiothyrium sp. Ohu 17A (Tabela 12).

Tabela 11 Atividade antifúngica de extratos dos fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa por meio do ensaio de bioautografia contra três espécies Colletotrichum. Média das zonas de inibição (mm) ± DP* Extratos brutos Táxon Colletotrichum Colletotrichum Colletotrichum (160 µg) fragariae gloeosporioides acutatum Ohu 8B2 Alternaria sp. 1 6 ± 2,82 6,5 ± 3,53 4,5 ± 0,7 Ohu 13A1 Alternaria cf. arborescens 8 ± 0 9 ± 0 8 ± 0 Ohu 30A Alternaria sp. 3 4,5 ± 0,7 4,5 ± 0,7 11± 9,8 Ohu 19B Biscogniauxia mediterranea 10 ± 0 zona difusa 9 ± 1,4 Ohu 17C1 Cladosporium funiculosum zona difusa zona difusa 4,5 ± 0,7 Ohu 17A Paraconiothyrium sp. 5,5 ± 0,7 5,5 ± 0,7 11,25 ± 7,4 Controles Benomil 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Ciprodinil 29,75 ± 0,35 25,25 ± 1,06 30,5 ± 4,9 Azoxistrobina 22 ± 2,82 30 ± 0 21 ± 4,24 Captan 12,25 ± 1,76 12,75 ± 0,35 13,5 ± 2,12 *Desvio padrão.

As análises dos espectros de RMN de 1H do extrato do fungo Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1 (Apêndice D) também indicaram a presença ácidos graxos, bem como a presença de hidrogênios aromáticos, sendo então selecionado para o fracionamento biomonitorado. O isolado Alternaria sp. 3 foi cultivado em larga escala sendo utilizadas 250 placas de Petri contendo BDA, as quais renderam 765 mg de extrato diclorometânico. Nas análises de CCD, o extrato bruto foi dissolvido a 1 mg/mL em DCM e conduzidas em sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Clorofórmio/Metanol 90:10, Clorofórmio/Metanol 80:20, Clorofórmio/Metanol 99:1, Clorofórmio/Acetona 95:5, Clorofórmio/Acetona 90:10 e Clorofórmio/Acetona 70:30. Após a revelação em UV e Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Clorofórmio/Acetona 95:5.

Tabela 12 Quantificação de ácidos graxos (em porcentagem) produzidos por fungos endofíticos associados à Opuntia humifusa. Ácidos graxos Extratos brutos Frações de Alternaria cf. Frações de Biscogniauxia arborescens mediterranea Ohu 13A1 Ohu 19B Alternaria Alternaria Cladosporium Paraconiothyrium F7 F8 F9 F7 F9 sp. 1 Ohu sp. 3 Ohu funiculosum sp. Ohu 17A 8B2 30ª Ohu 17C1 Caprílico (8:0) 0,85 0,32 • • • • • • • Cáprico (10:0) • • 2,22 • • • • • • Undecanóico (11:0) • • 2,89 • • • • • • Láurico (12:0) • • 36,68 • • 0,11 0,46 • • Mirístico (14:0) 0,64 0,52 • 0,82 0,19 0,68 1,39 0,16 0,17 Pentadecanóico (15:0) 1,29 1,57 • 0,59 • • • • • Palmítico (16:0) 47,83 32,74 42,75 45,99 24,9 36,3 43,84 8,61 2,80 Palmitoléico (16:1) 0,96 1,14 • 2,47 2,27 2,71 1,97 1,43 2,18 Heptadecanóico (17 :0) • • • • 0,51 0,1 0,66 • 1,58 Cis-10-Heptadecenóico (17 :1) • • • • 0,21 0,18 • • • Esteárico (18 :0) 16,51 11,14 15,43 4,04 5,37 5,22 5,05 0,07 • Oléico (18:1n9c) 26,01 20,36 • 17,19 20,92 17,53 9,7 4,28 0,79 (LA) Linoléico (18:2n6c) 4,48 30,96 • 27,27 42,88 34,66 17,04 81,86 75,79 Pinolênico (18:3n6) 0,58 0,37 • • • • • • • (ALA) α-Linolênico (18:3n3) • • • • 2,71 2,32 1,21 1,98 3,05 Nonadecanóico (19:0) • 0,4 • 1,38 • • • • 0,53 Araquídico (20:0) 0,8 0,41 • 0,21 • • 5,71 0,91 2,12 cis-11- eicosenóico (20:1) • • • • • 0,13 • • • Siadônico (20:3n6) • • • • • • • • 8,42 Arachidônico (20:4n6) • • • • • • 1,1 • •

Tabela 12 Continuação. Frações de Alternaria cf. Frações de Biscogniauxia Extratos brutos arborescens mediterranea Ohu 13A1 Ohu 19B Ácidos graxos Alternaria Alternaria Cladosporium Paraconiothyrium F7 F8 F9 F7 F9 sp. 1 Ohu sp. 3 Ohu funiculosum sp. Ohu 17A 8B2 30A Ohu 17C1 (EPA) eicosapentaenóico • • • • • • 1,63 • • (20:5n3) cis-13,16-Docosadienóico (22:2) • • • • • • 3,79 • • (DPA) docosapentaenóico • • • • • • 2,82 • • (22:5n3) Lignocérico (24:0) • • • • • • 3,57 0,49 2,54 “” = ausência de ácidos graxos.

A cromatografia em coluna do extrato do fungo Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1 foi realizada em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). 765 mg deste extrato bruto foi dissolvido em 2 mL de DCM e adsorvido a uma coluna cromatográfica de sílica gel (40- 63 μm, 60 Å, 40 x 150 mm). A eluição da coluna foi realizada em um Biotage XP-Sil, 100 g, SNAP cartridge correndo a 40 mL/min, com modo de detecção UV 254 e 360nm, com o gradiente Clorofórmio/Acetona, em 5 etapas: (1) 100:0 até 99:1 utilizando 600 mL, (2) 99:1 até 95:5 utilizando 800 mL, (3) 95:5 até 70:30 utilizando 800 mL, (4) 70:30 até 0:100 utilizando 800 mL, e (5) extensão de 0:100 utilizando 750 mL. Após o fracionamento foram coletadas porções individuais de 22 mL em tubos de ensaio (16 x 150 mm). Cada porção obtida foi submetida à CCD (Clorofórmio/Acetona 95:5), e de acordo com os perfis apresentados, as porções foram agrupadas em 10 frações [(1), 1-9, 30,2 mg; (2), 10-34, 444 mg; (3), 35-38, 24,4 mg; (4), 39-43, 156,7 mg; (5), 44-49, 32,1 mg; (6), 50-58, 15,3 mg; (7), 59-62, 38,5 mg; (8), 63-67, 60,6 mg; (9), 68-86, 56,4 mg; e (10), 87-169, 67,5 mg)], as quais foram concentradas em rota vapor e então submetidas ao ensaio antifúngico (bioautografia), sendo testadas sob as concentrações 10 e 100 µg. As frações a de 10 µg não apresentaram atividade. Porém quando testadas à 100 µg, a fração 7 inibiu o crescimento de Co. fragarie, Co. gloerosporioides e Co. acutatum com halos de 8, 4 e 5 mm de diâmetro, respectivamente. A fração 8 também inibiu o crescimento de Co. fragarie, Co. gloerosporioides e Co. acutatum com halos de 7, 4 e 4mm de diâmetro. A fração 9 inibiu o crescimento de Co. fragarie, com halo de 6,5 mm de diâmetro. As frações 7, 8 e 9 que apresentaram atividade antifúngica foram submetidas à RMN de 1H. Os espectros de RMN de 1H indicaram a presença predominante de ácidos graxos para as três frações bioativas, as quais foram posteriormente submetidas a análises de CG-FID e foi confirmada a presença de misturas de ácidos graxos (Tabela 12). As análises dos espectros de RMN de 1H indicaram a presença de hidrogênios aromáticos e ausência de ácidos graxos para os extratos de Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B, o qual foi selecionado para o fracionamento biomonitorado. Biscogniauxia mediterranea foi cultivada em larga escala sendo utilizadas 250 placas de Petri contendo o meio BDA, as quais renderam 3,2 g de extrato diclorometânico. Nas análises de CCD, o extrato bruto foi dissolvido a 1 mg/mL em DCM e conduzidas em

sílica gel (UNIPLATE™) como fase estacionária, com um painel de misturas de solventes como fase móvel: Hexano/Acetato de Etila 80:20, Hexano/Éter 50:50, Hexano/Acetato de Etila 50:50 e Acetato de Etila/Hexano 80:20. Após a revelação em UV e Godin a melhor condição foi obtida com a mistura Hexano/Acetato de Etila 80:20. A cromatografia em coluna do extrato do fungo Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B foi realizada em sistema automatizado de purificação utilizando o aparelho Biotage® Isolera™ One (Biotage, Uppsala, Suécia). Uma grama deste extrato foi dissolvido em 2 mL de DCM e adsorvido a uma coluna cromatográfica de sílica gel (40- 63 μm, 60 Å, 40 x 150 mm). A eluição da coluna foi realizada em um Biotage XP-Sil, 100 g, SNAP cartridge correndo a 40 mL/min, com modo de detecção UV 254 e 280 nm, com o gradiente hexano:acetato de etila, em 3 etapas: (1) 100:0 até 98:2 utilizando 396 mL, (2) 98:2 até 30:70 utilizando 1500 mL, e (3) 30:70 até 0:100 utilizando 600 mL. Após o fracionamento foram coletadas porções individuais de 22 mL em tubos de ensaio (16 x 150 mm). Cada porção obtida foi submetida a CCD (Hexano/Acetato de Etila 8:2), e de acordo com os perfis apresentados, as porções foram agrupadas em 10 frações [(1), 1-21, 3,8 mg; (2), 22-26, 353,6 mg; (3), 27-28, 9 mg; (4), 29-35, 91,34 mg; (5), 36-39, 26,8 mg; (6), 40-45, 25 mg; (7), 46-47, 10,8 mg; (8), 48-51, 9,9 mg; (9), 52- 58, 6,6 mg; e (10), 59-96, 22,8 mg)], as quais foram concentradas em rota vapor e então submetidas ao ensaio antifúngico (bioautografia), sendo testadas sob as concentrações 10 e 100 µg. As frações sob a concentração de 10 µg não apresentaram atividade. Porém quando testadas à 100 µg, a fração 4 inibiu o crescimento de Co. fragarie, Co. gloerosporioides e Co. acutatum com halos de 6,5, 5 e 6 mm de diâmetro, respectivamente. A fração 7 inibiu o crescimento de Co. fragarie e Co. acutatum (com halos de 10 e 9 mm de diâmetro, respectivamente) e a fração 9 inibiu o crescimento de Co. fragarie, com halo de 5 mm de diâmetro. As frações 4, 7 e 9 que apresentaram atividade antifúngica foram submetidas à RMN de 1H e 13C. Os sinais exibidos pelos espectros da fração 4, juntamente com os dados obtidos a partir do LC-MS/MS (m/z 193.09086 [M+H]+, calculado para - C11H13O3, 193.08647; m/z 191.05360 [M-H] , calculado para C11H11O3, 191.07082), permitiram identificar a molécula ativa como (-)-5-metilmeleína (Apêndice E, Figura 21). Os dados de RMN obtidos são similares aos dados encontrados na literatura, descritos por Carpenter et al. (1980). Os espectros de RMN de 1H das frações 7 e 9

indicaram a presença predominante de ácidos graxos, as quais foram posteriormente submetidas a análises de CG-FID e foi confirmada a presença de misturas de ácidos (-)(3R)-8-Hidroxi-6-metoxi-3,5- graxos (Tabela 12). (-)-5-Metilmeleína dimetil-3,4-dihidroisocumarina

MW: 222.24 g/moL MW: 192 g/moL C12H14O4 Figura 21 Metabólito (-)-5-metilmeleína (fórmulaC11H12O molercular3 C11H12O3 e massa molecular de 192 g/molDe Alvarenga) et al., 1978 Carpenter et al., 1980 identificado a partir do fracionamento químico biomonitorado do extrato bruto do táxon Biscogniauxia mediterranea. Fonte: CARPENTER et al. (1980).

5.4 ENSAIOS DE MICRODILUIÇÃO EM PLACA COM METABÓLITOS ISOLADOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa

As substâncias (-)-5-metilmeleína, citocalasina H e especiferona A isoladas dos fungos endofíticos associados à M. ernestii e O. humifusa foram submetidas ao ensaio de microdiluição em placa frente Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragarie, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Phomopsis obscurans e Phomopsis viticola. Os ensaios realizados com B. cinerea mostraram que as substâncias citocalasina H e (-)-5-metilmeleína estimularam o crescimento (6 até 34,4 %) sob as concentrações 75 e 150 μM em 72 horas e inibiram o crescimento do alvo (2,8 até 20,5%) sob a concentração de 300 μM em 48 e 72 horas. A especiferona A estimulou o crescimento de B. cinerea (1,4 até 21,6%) sob as concentrações testadas em 48 e 72 horas, exceto para a concentração 300 μM em 48 horas que mostou fraca inibição de 2,8 ± 6,6 % (Figura 22). A citocalasina H e (-)-5-metilmeleína estimularam o crescimento de Co. acutatum (6 até 34,4 %) sob as concentrações 75, 150 e 300 μM em 48 e 72 horas, exceto para a citocalasina H sob a concentração de 300 μM em 48 horas que mostou fraca inibição de 2,9 ± 4 %. A especiferona A também estimulou o crescimento deste alvo a 75 μM em 48 horas e inibiu fracamente o crescimento de Co. acutatum (0,6 ± 3,2

até 6 ± 2,8%) sob a concentração de 300 μM em 48 e 72 horas (Figura 23). Colletotrichum fragariae obteve o seu crescimento estimulado frente às substâncias puras nas concentrações de 75, 150 e 300 μM em 48 e 72 horas, exceto para a citocalasina H e (-)-5-metilmeleína sob a concentração de 300 μM em 48 horas que mostou fraca inibição, 16,2 ± 2,4 e 16,2 ± 4,2%, respectivamente (Figura 24). As substâncias (-)-5-metilmeleína e especiferona A estimularam o crescimento de Co. gloeosporioides (5,2 ± 2,2 até 36,6 ± 6,7%) nas concentrações 75, 150 e 300 μM em 48 e 72 horas, enquanto a citocalasina H na concentração de 150 e 300 μM em 48 horas inibiu de 50,1 ± 9,6 e 60 ± 10,3%, respectivamente, e após 72 horas estimulou o crescimento de Co. gloeosporioides (7,7 ± 12,4 até 40,9 ± 9%) nas três concentrações avaliadas (Figura 25). .

Figura 23 Médias de inibição do crescimento (%) de Colletotrichum acutatum depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento.

Para os ensaios com F. oxysporum, as substâncias (-)-5-metilmeleína e especiferona A foram ativas com inibição de 2,7 ± 3,5 até 23,8 ± 0,6%, nas concentrações de 75, 150 e 300 μM em 48 e 72 horas, enquanto a citocalasina H estimulou o crescimento de F. oxysporum em até 31,7 ± 4,7%, concentrações 75, 150 e 300 μM em 48 e 72 horas (Figura 26). As espécies mais sensíveis foram àquelas pertencentes ao gênero Phomopsis. As substâncias (-)-5-metilmeleína, citocalasina H e especiferona A inibiram o crescimento de P. obscurans e P. viticola nas concentrações 75, 150 e 300 μM em 120 e 144 horas, sendo as maiores porcentagens de inibição observadas à 300 μM. Entretanto, as

porcentagens de inibição observadas ainda foram menores que os valores de inbição dos controles utilizados (Figuras 27 e 28). Frente a P. obscurans as substâncias apresentaram maior inibição à 120 horas, exceto a citocalasina H, sob concentração de 300 μM, a qual apresentou maior inibição (72,7 ± 0,9%) às 144 horas. A (-)-5- metilmeleína também apresentou maior inibição às 144 horas (19,4 ± 7,1 até 49,3 ± 6,9%) quando testada contra 300 μM. Para as outras duas substâncias as inibições contra 300 μM quando comparadas às 120 e 144 horas foram variáveis (Figuras 27 e 28).

Figura 24 Médias de inibição do crescimento (%) de Colletotrichum fragariae depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento.

Figura 26 Médias de inibição do crescimento (%) de Fusarium oxysporum depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 48 e 72 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento.

Figura 27 Médias de inibição do crescimento (%) de Phomopsis obscurans depois de expostos aos metabólitos (-)-5-metilmeléina, citocalasina H e especiferona A utilizando dose-resposta a 120 e 144 horas, respectivamente. Controles positivo: azoxistrobilurina e captan nas concentrações de 0,3, 3 e 30 µM. As medias de porcentagem de inibição foram realizadas a partir de duas réplicas do experimento.

As substâncias citocalasina H e especiferona A isoladas dos fungos endofíticos Diaporthe sp. UFMGCB 6350 e Phoma sp. UFMGCB 6409, respectivamente, também foram submetidas ao ensaio de microdiluição em placa frente aos micro-organismos alvos E.coli, C. krusei e Cl. sphaerosperum, os quais foram susceptíveis aos extratos brutos de Diaporthe sp. UFMGCB 6350 e Phoma sp. UFMGCB 6409 (Tabela 8). As substâncias apresentaram fraca atividade antimicrobiana contra E.coli e C. krusei , enquanto inibiram o crescimento de Cl. sphaerosperum de 22 até 55,6%, entretando as porcentagens de inibição observadas ainda foram menores que os valores de inbição dos controle utilizado (Figura 29, 30 e 31).

6 DISCUSSÃO

6.1 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISES DE DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii E Opuntia humifusa

Estudos sobre fungos endofíticos de Cactaceae indicaram similaridade com nossos estudos. Fisher et al. (1994) estudaram 600 fragmentos dos cladódios de Opuntia stricta da Austrália e isolaram 617 fungos endofíticos pertencentes a 23 táxons (Ascomycota). Suryanarayan et al. (2005) utilizaram 1.050 fragmentos dos cladódios de 21 espécies de cactos do Arizona (EUA) e isolaram 900 fungos endofíticos pertencentes a 22 táxons (Ascomycota). Bezerra et al. (2012) utilizaram 45 fragmentos do cladódio de Opuntia ficus-indica no Brasil e obtiveram 44 fungos endofíticos pertencentes a 13 táxons (Ascomycota). Bezerra et al. (2013) utilizaram 1.215 fragmentos do cladódio de Cereus jamacaru no Brasil e isolaram 560 fungos endofíticos pertencentes a 59 táxons distribuídos em 30 gêneros: Ascomycotas (24), Basidiomycotas (4) e Zygomycotas (2). Endofíticos pertencentes ao filo Basidimycota não são frequentemente isolados (CHLEBICKI, 2009) e em cactos há registro de oito espécies (Rhodotorula foliorum, R. minuta, R. mucilaginosa, R. pilatii, R. sonckii, Sporobolomyces salmonicolor, Sterigmatomyces elviae e Tritirachium dependens) que foram isolas do cladódio de Cereus jamacaru (BEZERRA et al., 2013). Neste estudo foram detectados nove endofíticos pertencentes à Basidiomycota ainda não reportados como endofíticos para família Cactaceae. A maioria deles foi representada pela classe Agaricomycetes, ordens Cantharellales (Ceratobasidium sp., Ceratobasidiaceae sp. 1, Ceratobasidiaceae sp. 2, Ceratobasidiaceae sp. 3 e Ceratostomataceae sp.), Agaricales (Agaricomycetidae sp. e Tricholomataceae sp.) presentes na raiz de M. ernestii e Geastrales (Sphaerobolaceae sp.) presente na raiz e espinho de M. ernestii. E a classe Tremellomycetes foi representada pela espécie Cryptococcus flavescens, encontrada no cladódio de O. humifusa. A maioria das espécies da família Ceratobasidiaceae (complexo taxonômico comumente encontrado em solos) é sapróbia ou fitopatogênica, mas algumas são descritas como endofíticas (ANDERSEN, 1996; CURRAH; SHERBURNE, 1992). Gonzáles e Tello (2011), por exemplo, detectaram em Vitis vinifera duas espécies endofíticas de Ceratobasidium. Espécies da família Agaricomycetidae e Tricholomataceae são sapróbias, fitopatogênicas, micorrízicas e/ou endofíticas

(SCHULZ et al., 2006). Lana et al. (2011) isolaram o fungo endofítico Moniliophthora perniciosa (Tricholomataceae) do Theobroma caco e Toju et al. (2013) fungos endofíticos pertencentes ao gênero Cortinarius (Agaricomycetidae) da planta Quercus serrata. Espécies da família Sphaerobolaceae (humícola, sendo poucos táxons lignícolas e termitícolas) e espécies do gênero Cryptococcus (algumas espécies são capazes de causar doenças em humanos e animais) também têm sido descritas como fungos endofíticos. Além disso, foram isolados fungos endofíticos de Sphaerobolaceae associados à planta Bouteloua gracilis e Cryptococcus flavescens associado à Citrus sinensis (GAI et al. 2009; HERRERA et al., 2010). Grande parte dos fungos encontrada em O. humifusa e M. ernestii correspondeu a gêneros já reportados como endofíticos (VIEIRA et al., 2012; CARVALHO et al. 2012; ROSA et al., 2012a; VAZ et al., 2014). Os fungos Ascomycota estudados neste trabalho: Alternaria, Aspergillus/Neosartorya, Aureobasidium, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Cochliobolus/Curvularia, Fusarium, Nigrospora, Penicillium, Pestalotiopsis, Phoma e Xylaria já foram citados na literatura como fungos endofíticos de cactos. Dentre os isolados do filo Ascomycota identificados de M. ernestii, 18 gêneros e 24 espécies foram reportadas pela primeira vez como fungos endofíticos associados a cactos; os gêneros: Astrocystis, Bartalinia, Colletotrichum, Daldinia, Diaporthe, Gelasinospora, Lecythophora, Microsphaeropsis, Mycoleptodiscus, Neoscytalidium, Peyronellaea, Phaeosphaeriopsis, Preussia, Rhizopycnis, Sclerostagonospora, Setophoma, Setosphaeria e Thozetella, e as espécies: Astrocystis sublimbata, Aspergillus calidoustus, Aspergillus cf. felis, Aspergillus malodoratus, Candida parapsilosis, Chaetomium gracile, Chaetomium subglobosum, Chaetomium succineum, Cochliobolus eragrostidis, Diaporthe raonikayaporum, Fusarium solani, Gelasinospora udagawae, Microsphaeropsis arundinis, Mycoleptodiscus indicus, Neoscytalidium dimidiatum, Neosartorya fischeri, Penicillium citrinum, Penicillium steckii, Peyronellaea prosopidis, Phoma gardeniae, Preussia minimoides, Rhizopycnis vagum, Setophoma terrestres e Setosphaeria rostrata. Dentre os isolados do filo Ascomycota identificados de O. humifusa, quatro gêneros (Biscogniauxia, Cryptococcus, Diaporthe e Paraconiothyrium) e três espécies (Biscogniauxia mediterranea, Cladosporium cf. asperulatum e Curvularia protuberata) foram reportados pela primeira vez como fungos endofíticos associados à cactos.

Dos novos registros de fungos endofíticos encontrados neste trabalho para a família Cactaceae, somente o gênero Diaporthe foi compartilhado entre M. ernestii e O. humifusa. Os isolados do grupo Diaphorte sp. formaram um clado monofilético com alto nível de suporte (probabilidade posterior e bootstrap ≥99%) nas árvores com análises de Máxima Parcimônia e Bayesiana. De acordo com Gomes et al. (2013), os isolados Diaporthe sp. CBS 119639 e LGMF 947 (micélios estéreis) parecem representar uma nova espécie, portanto, nosso estudo claramente sugere que os isolados Diaphorte sp.UFMGCB 6350 e Diaphorte sp. Ohu 8A também podem ser representantes desta nova espécie. Diaporthe sp. CBS 119639 foi isolado de um abscesso de um homem na Alemanha e Diaporthe sp. LGMF 947foi isolado da semente de Glycine max (soja) no Brasil. Espécies do gênero Diaporthe que são comumente isoladas de soja também são reportadas como patógenos oportunistas em humanos (IRIART et al., 2011; GARCIA- REYNE et al., 2011). Em 1999, uma espécie de Phomopsis foi reportada como agente etiológico de uma infecção subcutânea no dedo de uma agricultora imunossuprimida e este género foi adicionado à lista de fungos capazes de causar doenças em humanos (SUTTON et al., 1999). O total de 79 táxons endofíticos (10 de O. humifusa e 69 de M. ernestii) mostraram baixa similaridade com sequências depositadas no GenBank nos níveis de gênero (Alternaria, Bartalinia, Ceratobasidium, Chaetomium, Cladosporium, Cochliobolus, Colletotrichum, Daldinia, Diaporthe, Lecythophora, Neurospora, Nigrospora, Paraconiothyrium, Pestalotiopsis, Phaeosphaeriopsis, Phoma, Preussia, Sclerostagonospora, Thozetella e Xylaria), família (Agaricomycetidae, Chaetomiaceae Chaetothyriaceae, Ceratobasidiaceae, Ceratostomataceae, Coniochaetaceae, Halosphaeriaceae, Hypocreaceae, Herpotrichiellaceae, Sphaerobolaceae, Sporormiaceae, Magnaporthaceae, Montagnulaceae, Mycosphaerellaceae, Pyronemataceae, Tricholomataceae, Verrucariaceae e Xylariaceae), ordem (Pleosporales e Sordariales), classe (Sordariomycetes e Dothideomycetes), sub-filo (Pezizomycotina) e filo (Ascomycota), que podem representar espécies novas. No entanto, a utilização da taxonomia polifásica (estudos filogenéticos de várias regiões, bem como técnicas morfológicas) deve ser realizada para identificar e/ou descrever estes fungos endofíticos em nível de espécie. O elevado número de novos registros de ocorrências para gêneros e espécies encontrados neste trabalho pode ser explicada por 72% dos gêneros terem sido

encontrados nas raízes e 70,83 e 16,6% das espécies terem sido encontradas nas raízes e espinhos, respectivamente, já que este é o primeiro trabalho que aborda a associação de fungos endofíticos a espinhos e raízes de cactos. Além disso, os trabalhos que tratam sobre fungos endofíticos associados a cactos identificaram os isolados somente por taxonomia morfológica, sendo que 1,78% dos fungos endofíticos isolados por Fisher et al. (1994), 6,44% dos fungos endofíticos isolados por Suryanarayanan et al. (2005), e 22,72% e 30,3% dos endofíticos isolados por Bezerra et al. (2012 e 2013), respectivamente, apresentaram micélios estéreis e não puderam ser identificados. Guo et al. (2000), Wang et al. (2005) e Suryanarayanan et al. (2011) mencionaram a importância da utilização de técnicas moleculares para a identificação de fungos com micélios estéreis. A diferença encontrada no número de isolados das comunidades cladódio, espinho e raiz pode ser devido às características de cada tecido vegetal amostrado. Sabe- se que a cutícula espessa e cerosa e a baixa frequência de estômatos no cladódio, que representam adaptações para reduzir a transpiração e perda de água dos cactos, podem representar barreiras adicionais que inibem a infecção por fungos parasitas, bem como a colonização de espécies de endofíticos resultando em menor diversidade quando comparado a outras espécies de planta (ZIMMERMANN; GRANATA, 2002; SURYANARAYANAN; WITTLINGER; FAETH, 2005, LUZ et al., 2006; SILVA et al., 2006). Além disso, existem outras características do tecido vegetal como, biomassa e substâncias secundárias, que podem justificar a baixa colonização no cladódio e espinhos (MAUSETH, 2004) em relação às raízes. Os fungos Aureobasidium pullulans e Mycoleptodiscus indicus associados aos cladódios de M. ernestii e Alternaria cf. arborescens, Alternaria sp. 4 Aureobasidium pullulans e Diaporthe sp. associados aos cladódios de O. humifusa foram isolados como espécies dominantes. Estes resultados foram similares aos encontrados por Suryanarayanan; Wittlinger; Faeth (2005) que isolaram os fungos endofíticos Alternaria sp. e Aureobasidium pullulans como espécies dominantes no deserto do Arizona (EUA). No entanto, o gênero Cladosporium foi os mais comumente encontrado nos cladódios dos cactos Opuntia stricta e O. ficus-indica (FISHER et al., 1994; BEZERRA et al., 2012); e Cladosporium e Fusarium foram os gêneros mais comumente encontrados nos cladódios de C. jamacaru (BEZERRA et al., 2013). Os isolados Preussia sp. 1 e Sphaerobolaceae sp. foram as espécies dominantes nos espinhos, enquanto Cochliobolus eragrostidis, Fusarium oxysporum e F. solani

foram as espécies dominantes nas raízes de M. ernestii. Os outros gêneros e espécies que mostram baixa abundância (um ou dois isolados) foram considerados como isolados raros. Estudos com cactos na África do Sul, Brasil e nos Estados Unidos apontam o gênero Alternaria como causador de necrose em cladódios de O. ficus-indica (FARR et al., 1989; SWART; KRIEL, 2002; SOUZA et al., 2010). Além dos cactos, o gênero Alternaria pode causar alternariose em sementes de sorgo, milho, soja, trigo e no tomateiro (LEMOS et al., 2001; BALBI-PEÑA et al., 2006). Mycoleptodiscus indicus, espécie tropical e subtropical, é descrito como sapróbio, decompositores do folhedo de Caesalpinia echinata, endofítico do hospedeiro Echinacea purpurea e Borreria verticillata, patogênicos em humanos e em animais causando feohifomicose subcutânea e fitopatogênicos, causador da crosta negra em folhas de baunilha (Vanilla fragans) (BEZERRA; RAM, 1986; GRANDI; SILVA, 2006; DEWAR; SIGLER, 2010; ROSA et al., 2012a; ANDRIOLI et al., 2014). Espécies do gênero Cochliobolus/Curvularia são comumente descritas como endofíticas, inclusive em cactos (BEZERRA et al., 2012; VIEIRA et al., 2012; CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013). Bezerra et al. (2013) relataram espécies de Cochliobolus como endofítico no cacto C. jamacaru, enquanto Freire (2009) reportou o isolamento de espécies deste gênero causando doença no mesmo cacto (C. jamacaru). Além de cactos, espécies do gênero Cochliobolus causam doenças em inhame (Alocasia spp., Colocasia spp., Dioscorea spp.), bananeira (Musa sp.) e em goiabeira (Psidium guajava) (MORAES et al., 2006; PEREIRA, 2010; FURTADO, 2011; JUNQUEIRA et al., 2001). Alterações no metabolismo da planta, causados por situações de estresse, pode gerar um desequilíbrio na comunidade endofítica e potencializando-os como fitopatógenos ou favorecendo a ação de fitopatógenos propriamente ditos. O fungo Biscogniauxia mediterranea, por exemplo, é bem conhecido como agente causal da doença "carvão do entrecasco" em várias espécies florestais, principalmente em espécies do gênero Quercus, mas também é documentado com endofítico (SANTOS, 2003). De acordo com Nugent et al. (2005) há evidências de que esta espécie ocorre em tecidos saudáveis de árvores como endofítico e torna-se fitopatogênica sob estresse hídrico. Membros do gênero Fusarium foram isolados de plantas e solos como patógenos, sapróbios e endofíticos, inclusive como endofítico do cacto C. jamacaru e

patógeno do gênero Opuntia causando a murcha dos cladódios (SOUZA et al., 2010; VIEIRA et al, 2012; ROSA et al., 2012b; BEZERRA et al. 2013; BOMFIM et al., 2013). Normalmente, F. oxysporum infecta os hospedeiros pela raiz obstruindo o sistema vascular e reduzindo o fluxo de água a partir das raízes para a parte superior da planta e consequentemente produzindo à murcha (LESLIE; SUMMERELL, 2011). No entanto, esse fungo foi assintomático em três tecidos de saudáveis de Equinacea purpurea e foram capazes de produzir extratos com atividade antifúngica, sugerindo um efeito protetor na planta. Nós também isolamos fungos pigmentados; Aureobasidium, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Epicoccum, Nigrospora e Phoma. Estudos sobre endofíticos sugerem que fungos pigmentados podem conferir ao hospedeiro tolerância a seca, aridez e/ou altas temperaturas (REDMAN et al., 2002; MANDYAM; JUMPPONEN, 2005; KHIDIR et al., 2010), e esses fungos associados com raízes estariam envolvidos na absorção de água (BARROW, 2003; MANDYAM; JUMPPONEN 2005; BARROW et al., 2008). Morsy et al. (2010) sugeriram que as relações endofítico-hospedeiro podem ser influenciada pelo envolvimento do pigmento da melanina e por proteínas termófilas, tal como observado em culturas de Curvularia protuberata. Os valores do índice de riqueza de Margalef encontrados para os fungos endofíticos de O. humifusa (cladódios = 3,4) e M. ernestii (cladódios = 5,7 e espinhos = 5,17) mostraram diversidade moderada e elevada, respectivamente. Esses valores foram inferiores aos encontrados para a comunidade endofítica do cladódio de C. jamacaru (9,72), enquanto o índice de Margalef para as raízes de M. ernestii (12,1) foi superior ao encontrado para os endofíticos associados às raízes de arroz (Oryza granulate), isso indica que a diversidade de fungos endofíticos em cactos do bioma Caatinga é alta (YUAN et al. 2010; BEZERRA et al., 2013). Os índices de diversidade β foram descritos com o objetivo de medir o quanto há de mudança na composição de espécies nos cladódios, espinhos e raízes de M. ernestii. A diversidade β foi menor entre cladódio e espinho (0,65) quando comparada com os outros pares: raiz e cladódio (0,85) e raiz e espinho (0,84), desse modo, a comunidade de fungos endofíticos na raiz foi a mais diferenciada, isso pode ser explicado pelo alto número de espécies exclusivas, associadas aos mais altos percentuais de singletos e doubletons. As espécies que ocorreram em todas as partes da planta (Nigrospora sp. e Preussia sp. 1) indicaram ser generalistas.

A baixa diversidade β indica uma elevada similaridade entre as áreas (FELFILI; FELFILI, 2001). Com isso, conclui-se que a comunidade de fungos endofíticos de M. ernestii pode ser dividida em dois grupos de acordo com a análise de agrupamento realizada: um grupo composto por raiz e outro grupo composto por cladódio e espinho. De acordo com Petrini et al. (1995), diferentes órgãos e tecidos das plantas podem representar um distinto microhabitat. Vieira et al. (2012), por exemplo, demonstraram que a composição da comunidade endofítica associada com Solanum cernuum pode variar entre folhas e caules. E Rosa et al. (2012a) observaram que fungos endofíticos se distribuíram de forma irregular entre folhas, caules, raízes e tubérculos de E. purpurea.

6.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E METABÓLITOS BIOATIVOS DE FUNGOS ASSOCIADOS À Melocactus ernestii e Opuntia humifusa

Os ácidos graxos são caracterizados pela presença de um grupo carboxila (- COOH) em uma extremidade e um grupo metil (-CH3) na outra, eles podem variar em tamanho (cadeia de quatro até vinte e oito carbonos) e grau de saturação podendo ser saturados (cadeia de carbono com ligações simples) ou insaturados (cadeia de carbono com duplas ligações) (LIU et al., 2008; SYLVAIN et al., 2009). Esses ácidos graxos têm sido reportados na literatura como compostos antifúngicos (KABARA et al., 1972; CARBALLEIRA, 2008; LIU et al., 2008; THIBANE et al., 2010; ROSA et al., 2013). Avis e Bélanger (2001) determinaram que o mecanismo geral dos ácidos graxos antifúngicos é na membrana celular, de modo que os ácidos graxos são capazes de se inserir na bicamada lipídica das membranas de fungos e perturbar fisicamente a membrana, o que resulta num aumento da fluidez da membrana e consequente desorganização generalizada da membrana celular que leva a alterações de conformação das proteínas de membrana, a libertação de componentes intracelulares, desordem citoplasmática e, eventualmente, a célula de desintegração. Além disso, os ácidos graxos também podem agir na inibição de enzimas envolvidas na síntese de lipideos, como a inibição da síntese triacilglicerol e esfingolipídeos, N- miristoil transferase, da β-oxidação e inibição da atividade da topoisomerase I em mamíferos (MCLAIN et al., 2000; SUZUKI et al., 2000; CARBALLEIRA; O’NEILL; PARANG, 2005, 2007; CARBALLEIRA, 2008). Em geral, a eficiência da atividade antifúngica dos ácidos graxos é maior com o aumento do comprimento da cadeia, no entanto, o aumento de hidrofobicidade com o

maior comprimento de cadeia pode reduzir a solubilidade em sistemas aquosos e os grupos hidrofóbicos podem ser impedidos de alcançar concentrações suficientes para interagir com os fosfolípideos da membrana (BRANEN; DAVIDSON; KATZ, 1980; WANG; JOHNSON, 1992; OUATTARA et al., 1997; SADO-KAMDEM; VANNINI; GUERZONI, 2009). O ácido láurico (ácido graxo saturado), identificado neste trabalho como um dos ácidos graxos majoritários para o extrato Cladosporium funiculosum Ohu 17C1, tem o melhor equilíbrio entre os grupos hidrofóbicos e hidrofílicos (BRANEN; DAVIDSON; KATZ, 1980); e tem atividade antifúngica descrita na literatura contra os fungos Aspergillus niger, Blumeria graminis, Candida albicans, Colletotrichum gloeosporioides, Cucumerinum lagenarium, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Myrothecium verrucaria, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani e Saccharomyces cerevisiae (KABARA et al., 1972; GERSHON; SHANKS, 1978; ŘIHÁKOVÁ; PLOCKOVÁ; FILIP, 2001; BERGSSON et al., 2001; MCDONOUGH; STUKEY; CAVANAGH, 2002; WALTERS; WALKER; WALKER, 2003; LIU et al., 2008; ALTIERI et al., 2007, 2009; MURZYN et al., 2010). O ácido palmítico (ácido graxo saturado), identificado neste trabalho como um dos ácidos graxos majoritários para os extratos Bartalinia sp. UFMGCB 6347, Fusarium solanii UFMGCB 5865, Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, Cladosporium funiculosum Ohu 17C1 e Paraconiothyrium sp. Ohu 17A, e para as frações 8 e 9 do extrato Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1, tem atividade antifúngica descrita na literatura contra os fungos Aternaria solani, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Cucumerinum lagenarium, Emericella nidulans e Fusarium oxysporum (LIU et al., 2008; ALTIERI et al., 2007). O ácido linoleico (ácido graxo poli-insaturado) majoritário nas frações 7 e 9 de Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B, nas frações 7 e 8 de Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1, bem como no extrato bruto de Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, já é conhecido por apresentar atividade antifúngica contra vários fungos fitopatogênicos, como Alternaria solani, Colletotrichum lagenarium e Fusarium oxysporum (LIU et al., 2008). O ácido oléico, também de cadeia insaturada, encontrado nos extratos Bartalinia sp. UFMGCB 6347, Fusarium solanii UFMGCB 5865, Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria cf. arborescens Ohu 30A, e Paraconiothyrium sp. Ohu 17A, e nas frações de Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1 é reportado na literatura como antifúngico para os fitopatôgenos Moniliophthora perniciosa e Pythium ultimum (WALTERS et al., 2004). De acordo com Liu et al. (2008), os ácidos graxos saturados, como por exemplo o ácido

palmítico, mostraram forte atividade antifúngica quando comparado com ácidos graxos insaturados, como por exemplo o ácido oleico, frente aos alvos Alternaria solani, Colletotrichum lagenarium e Fusarium oxysporum. Rosa et al. (2013) obtiveram resultados similares aos encontrados neste trabalho, foi observado uma mistura de ácidos graxos saturados e insaturados nas frações dos extratos do fungo endofítico Coniochaeta ligniaria e sua planta hospedeira Smallanthus sonchifolius, os quais apresentaram atividade antifúngica contra os fitopagênos Co. acutatum, Co. fragariae e Co. gloeosporioides. De acordo com Pohl et al. (2011), o uso dos ácidos graxos como agentes antifúngicos oferece várias vantagens, (i) os ácidos graxos podem ser utilizados juntamente com compostos antifúngicos que são propensos a resistência dos patógenos e que tenham ação na membrana, já que o sinergismo poderia proporcionar o uso prolongado; o ácido araquidônico, por exemplo, pode aumentar a susceptibilidade de biofilmes formado por Candida albicans a antifúngicos, e portanto resultar na diminuição da dose do antimicótico requerida para inibir a formação do biofilme (Ells et al., 2009); e (ii) pode ser usado como ingrediente ativo nas preparações de uso tópico, como o ácido 10-undecenoico que é utilizado com sucesso no tratamento de dermatomicoses causadas por Trichophyton rubrum, Epidermophyton inguinale e Microsporum audouini, onicomicoses causadas por Trichophyton rubrum, bem como a tinea pedis causada por Trichophyton mentagrophytes e Trichophyton rubrum (SHAPIRO; ROTHMAN, 1945; CHRETIEN et al., 1980; RHEDER; NGUYEN, 2008). No entanto, a utilização de ácidos graxos como fungicidas para controlar doenças em plantas pode não ser efetiva, pois são biodegradáveis e os mecanismos de ação ainda não são bem conhecidos (POHL et al., 2011). No presente trabalho, o fracionamento bioguiado do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350 levou ao isolamento da citocalasina H. A citocalasina H, isolada de fungos filamentosos pertencentes ao gênero Phomopsis/Diaporthe, inclusive endofíticos, e também dos fungos Helminthosporium sp., Phoma sp., Xylaria sp., Hypoxylon sp., Chalara sp. e Rhinocladiella sp., pertence ao grupo dos terpenos e estruturalmente são compostas de um anel isoindolona altamente substituído, com um grupo benzil na posição 3 e fundido com um anel macrocíclico de 11 a 14 membros. (WAGENAAR et al., 2000; STROBEL et al., 2004; SILVA et al., 2010; ZHAN et al. 2013).

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As citocalasinas exibem um amplo espectro de atividades como atividade antibiótica, antitumoral, inibidor de proteases de HIV e atividade fitotóxica (são capazes de inibir o crescimento das plantas). São utilizadas como sondas em ensaios biológicos, mas a aplicação terapêutica é limitada devido à toxicidade, já que são responsáveis por inibir o movimento do citosplasma em células de mamíferos (efeito atribuído á interação das citocalasinas com a actina), além disso, influenciam na retração de coágulos e agregação de plaquetas, transporte de glucose e alteram a secreção da tireóide (MCMILLAN et al., 1977; IZAWA et al., 1989; COLE et al., 1981; NATORI; YAHARA, 1991; WAGENAAR et al., 2000; JIAO et al., 2004; STROBEL et al., 2004; CIMMINO et al., 2008; CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2012). No ensaio de microdiluição em caldo a citocalasina H apresentou atividade antifúngica moderada, inibiu em 60 ± 10,3% o crescimento de Co. gloeosporioides e em 40% o crescimento de Cl. sphaerospermum na concentração 300 μM em 48 horas, bem como apresentaram as maiores porcentagens de inibição observadas à 300 μM (60- 72%) frente a P. obscurans e P. viticola. Esses resultados indicam que a citocalasina H pode não ser a única responsável pela bio-atividade inicialmente observada no extrato bruto. Resultados similares foram encontrados por Silva et al. (2010) que avaliaram a atividade antifúngica de seis citocalasinas (uma nova citocalasina, 19, 20- epoxicitocalasina D, C, N, Q e R) purificadas do extrato do fungo endofítico Xylaria sp. e obsevaram fraca inibição da 19, 20-epoxicitocalasina Q frente aos fungos fitopatôgenicos Cl. cladosporioides e Cl. sphaerospermum na concentração de 100 µg/mL, quando comparada com o padrão nistatina (1 µg/mL) e nenhuma inibição das demais citocalasinas. Do fungo Xylaria sp. isolado de Palicourea marcgravii foram isoladas as citocalasinas B e D que apresentaram atividade contra os fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum a uma concentração de 10 e 25 µg/mL, respectivamente. Fu et al. (2011) estudaram a atividade antimicrobiana dos compostos epoxicitocalasina H, citocalasina N, e citocalasina H isolados dos extratos de Phomopsis sp. By254, um fungo endofítico residente na raiz do Gossypium hirsutum, e observaram à ação antimicrobiana dos três compostos contra fungos patogênicos Sclerotinia sclerotiorum, Bipolaris maydis, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Bipolaris sorokiniana, Gaeumannomyces graminis var. tritici e Rhizoctonia cerealis, com um valor de IC50 0,1 a 50 µg/mL. Além disso, nenhuma inibição foi observada contra 101

bactérias fitopatogênicas (Acidovorax aveane, Curtobacterium luteum, C. flaccumfaciens, Clavibacter michiganensis, Rhodococcus fascians, Ralstonia solanacearum e Xanthomonas campestris). No nosso trabalho, a citocalasina H inibiu em 20% o crescimento de Botrytis cinerea na concentração de 300 µM e estimulou o crescimento de Fusarium oxysporum sob as concentrações de 75, 150 e 300 µM. O fracionamento bioguiado do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409 levou ao isolamento da especiferona A que pertence à classe das azafilonas. As azafilonas são policetídeos, pigmentos, produzidos por ascomicetos e foram encontradas em algumas espécies da família Nectriaceae, Pleosporaceae, Trichocomaceae e Xylariaceae (NAKAJIMA et al., 1992; EDRADA et al., 2000; OSMANOVA et al., 2010; QUANG et al., 2005a, STIERLE; STIERLE; KELLY, 2006; YANG et al., 2012). Esses metabólitos podem estar relacionados à defesa química contra insetos e outros organismos competidores, já que as azafilonas podem estar localizadas nos corpos frutíferos de espécies da família Xylariaceae em grânulos ou contidas em camadas de cera, sendo expostas para o meio somente se o estroma maduro sofrer alguma injúria (QUANG et al., 2006a). Além disso, esses compostos têm afinidade por amônia e reagem com aminas de proteínas, aminiácidos e ácidos nucleicos substituindo o oxigênio pirano por nitrogênio (OSMANOVA et al., 2010; QUANG et al., 2005a) e exibem ampla atividade biológica, incluindo inibição da enzima telomerase (TABATA et al., 1999), da acil-CoA: colesterol aciltransferase (ACAT) (QUANG et al., 2006b) e atividade antimicrobiana (QUANG et al., 2005b). A fitotoxina, especiferona A, já foi relatada como metabólito do fungo fitopatogênico Cochliobolus spicifer, responsável pelas lesões circulares em folhas de trigo, do endofítico Fusarium sp. LN-12, isolado de folhas de Melia azedarach, do fungo Drechslera hawaiiensis isolado de uma esponja marinha (Callyspongia aerizusa), e do extremófilo Penicillium sp. (NAKAJIMA et al., 1992; EDRADA et al., 2000; STIERLE; STIERLE; KELLY, 2006; YANG et al., 2012). Porém esta é a primeira vez como substâncias produzidas por um fungo do gênero Phoma. A atividade antifúngica da especiferona A contra fungos fitopatôgenos está sendo reportada pela primeira vez neste trabalho. Esta substância exibiu fraca atividade contra Fusarium oxysporum (inibição 23%) e moderadada atividade contra as espécies de Phomopsis vitícola e P. obscurans (cerca de 60% de inibição), e Cladosporium sphaerospermum (55% de inibição) sob a concentração de 300 µM.

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O fracionamento bioguiado do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B levou ao isolamento da substância (-)-5-metilmeléina, uma dihidroisocumarina. A substancia (-)-5-metilmeléina tem sido descrita como metabólito de diversos fungos como Biscogniauxia mediterranea, Hypoxylon agrillaceum, H. atropunctatum, H. chestersii, H. confluens, H. grenadense, H. illitum, H. jecarinum, H. mammatum, H. mediterraneum, H. microplacum, H. rubiginosum, H. rutilum, H. serpens, H. stigium, H. tinctor, H. truncatum, Nummularia broomiana, N. dennisii, N. discreta, Fusicoccum amygdale e Phomopsis sp. (ANDERSON et al., 1983; HASHIMOTO; ASAKAWA, 1998; EVIDENTE et al., 2005; AHMED et al., 2011). No ensaio de microdiluição em caldo a (-)-5-metilmeléina apresentou atividade antifúngica moderada frente a P. viticola e P. obscurans (inibição de 50 e 63%, respectivamente) e fraca atividade antifúngica (inibição até 20%) frente à Botrytis cinerea, Colletotrichum fragariae e Fusarium oxysporum, sob a concentração de 300 μM. Esses resultados indicam que a (-)-5-metilmeléina juntamente com os ácidos graxos majoritários encontratos nas frações 7 e 9 podem atuar em sinergismo e serem os responsáveis pela bio-atividade inicialmente observada no extrato bruto. Krohn et al. (1997) reportou fraca ou nenhuma bioatividade da (-)-5- metilmeléina frente a uma variedade de micro-organismos alvos (bactérias: Escherichia coli e Bacillus megaterium; fungos: Ustilago violacea, Mycotypha microspora, Eurotium repens e Fusarium oxysporum; e a alga Chlorella fusca). Ahmed et al. (2011) também observou a ausência de atividade biológica da (-)-5-metilmeléina para os seguintes alvos: as bactérias Escherichia coli e Bacillus megaterium; os fungos Microbotryum violaceum, Septoria tritici, Botrytis cinerea, Pyricularia oryzae e Phytophthora infestans (fungal-like); e a alga Chlorella fusca. No entanto, Kokubun et al. (2003) observaram a atividade antimicrobiana dessa substância contra Aspergillus niger e Cladosporium herbarum sob a concentração de 100 μg/mL e Bacillus subtilis sob a concentração de 200 μg/mL.

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7 CONCLUSÕES

 Novos relatos de gêneros e espécies de fungos endofíticos sugerem que Melocactus ernestii e Opuntia humifusa abrigam uma comunidade fúngica altamente diversificada como mensurado pelo índice de diversidade. No entanto, a curva de acumulação de espécies sugere que nosso estudo ainda subestima a diversidade de fungos endófiticos e que um maior esforço amostral poderia fornecer uma amostragem exaustiva.

 Os resultados demonstram elevada diversidade diferencial entre as partes de Melocactus ernestii sugerindo estratificação na comunidade fúngica endofítica;

 O estudo químico dos extratos bioativos permitiu a identificação de ácidos graxos e o isolamento de substâncias com atividade antifúngica. As substâncias citocalasina H, especiferona A e (-)-5-metilmeléina apresentaram atividade antifúngica fraca ou moderada contra os micro-organismos alvos testados, sendo as espécies do gênero Phomopsis as mais sensíveis; esses resultados indicam que essas substâncias podem não ser as únicas responsáveis pela bio-atividade inicialmente observada no extrato bruto. Para o extrato de Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B sugere-se efeito sinérgico da (-)-5-metilmeléina e do ácido linoléico.

 Os efeitos antifúngicos observado nos extratos e frações estudadas dão indícios de que os fungos endofíticos Fusarium solanii UFMGCB 5865, Bartalinia sp.UFMGCB 6347, Diaporthe sp. UFMGCB 6350 e Phoma sp. UFMGCB 6409 associados à Melocactus ernestii e Alternaria sp. 1 Ohu 8B2, Alternaria sp. 3 Ohu 30A, Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1, Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B, Cladosporium funiculosum Ohu 17C1 e Paraconiothyrium sp. Ohu 17A associados à Opuntia humifusa se encontram em uma relação de simbiose, produzindo substâncias antifúngicas contra possíveis fungos fitopatogênicos. No entanto, as fitotoxinas citocalasina H e especiferona A sugerem que os fungos endofíticos Diaporthe sp. e Phoma sp. sob condições de estresse podem atuar como fitopatogênicos e causar doença nos cactos.

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 Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo sobre substâncias bioativas como ácidos graxos, citocalasina H, especiferona A e (-)-5-metilmeléina produzidas por fungos endofíticos associados a cactos.

 Ao ampliar o conhecimento sobre a descoberta de novos táxons, distribuição geográfica das espécies e produção de substâncias bioativas por fungos endofíticos associados a cactos, muitas cactáceas que se encontram ameaçadas de extinção poderão ser consideradas em projetos que visem a conservação e manejo das espécies de cactos ameaçadas, bem como a bioprospecção de moléculas bioativas.

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146

9 APÊNDICES

147

APÊNDICE A

148

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Fusarium solani UFMGCB 5685.

149

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Bartalinia sp. UFMGCB 6347.

150

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350.

151

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

152

APÊNDICE B

153

154

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] da fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350.

155

1 Espectro de COSY da fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350, correlação entre H [600 MHz, CDCl3], utilizando como padrão para os dois campos 1H-RMN, sendo os pontos em intersecção os núcleos dos sinais correspondentes.

156

157

13 Espectro de RMN de C [600 MHz, CDCl3] da fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350.

158

Espectro de DEP 90º da fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350.

159

Espectro de DEP 135º da fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350.

160

Fração 2 do extrato Diaporthe sp. UFMGCB 6350. Análise de espectro de massa em LC/MS, com sinais do polo negativo.

161

APÊNDICE C

162

1 Espectro de RMN de H [400 MHz, CDCl3] da sub-fração 11.4 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

163

1 Espectro de RMN de H [400 MHz, CDCl3] da sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

164

Espectro COSY da sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

165

13 Espectro de RMN de C [400 MHz, CDCl3] da sub-fração 11.4 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

166

13 Espectro de RMN de C [400 MHz, CDCl3] da sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

167

Espectro DEP 90º da sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

168

Espectro DEP 135º da sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409.

169

Sub-fração 11.4

Sub-fração 12.12

Sub-fração 12.12 Sub-fração 11.4

Espectro de CG-MS da sub-fração 11.4 e da sub-fração 12.12.

170

Sub-fração 12.12 do extrato Phoma sp. UFMGCB 6409. Análise de espectro de massa em LC/MS, com sinais do polo positivo.

171

APÊNDICE D

172

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Alternaria sp. 1 Ohu 8B2.

173

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Alternaria cf. arborescens Ohu 13A1.

174

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Paraconiothyrium sp. Ohu 17A.

175

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Paraconiothyrium sp. Ohu 17C1.

176

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

177

1 Espectro de RMN de H [600 MHz, CDCl3] do extrato Alternaria cf. arborescens Ohu 30A.

178

APÊNDICE E

179

1 Espectro de RMN de H [400 MHz, CDCl3] da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

180

1 Espectro de COSY da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B, correlação entre H [400 MHz, CDCl3], utilizando como padrão para os dois campos 1H-RMN, sendo os pontos em intersecção os núcleos dos sinais correspondentes.

181

13 Espectro de RMN de C [400 MHz, CDCl3] da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

182

Espectro DEP 90º da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

183

Espectro DEP 90º da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

184

Fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B. Análise de espectro de massa em LC/MS, com sinais do polo positivo.

185

Fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B. Análise de espectro de massa em LC/MS, com sinais do polo negativo.

186

Espectro de CG-MS da fração 4 do extrato Biscogniauxia mediterranea Ohu 19B.

187

10 ANEXOS

PRODUÇÃO CIENTÍFICA

188

189

190

191

192

193

194

Artigo da tese publicado:

1) SILVA-HUGHES, ALICE F.; WEDGE, DAVID E.; CANTRELL, CHARLES L.; CARVALHO, CAMILA R.; PAN, ZHIQIANG; MORAES, RITA M.; MADOXX, VICTOR L.; ROSA, LUIZ H. Diversity and antifungal activity of the endophytic fungi associated with the native medicinal cactus Opuntia humifusa (Cactaceae) from the United States. Microbiological Research (Print), v. 175, p. 66-77, 2015. 2) CARVALHO, CAMILA R.; FERREIRA-D’SILVA, ALICE; WEDGE, DAVID E.; CANTRELL, CHARLES L.; ROSA, LUIZ H. Antifungal activities of cytochalasins produced by Diaporthe miriciae, an endophytic fungus associated with tropical medicinal. Canadian Journal of Microbiology, 2018, 64(11): 835- 843, https://doi.org/10.1139/cjm-2018-0131

Artigos da tese em submissão:

1) ALICE F. SILVA-HUGHES, FREDERIC M. HUGHES, DAVID E. WEDGE, CHARLES L. CANTRELL, CARLOS AUGUSTO ROSA, LUIZ H. ROSA. Diversity and antifungal activity of endophytic fungi associated with endemic cactus Melocactus ernestii (Cactaceae) in Brazil.

Artigos publicados como colaboradora:

1) VIEIRA, M. L. A.; HUGHES, A. F. S.; GIL, V. B.; VAZ, A. B. M.; ALVES, T. M. A.; ZANI, C. L.; ROSA, C. A.; ROSA, L. H. Diversity and antimicrobial activities of the fungal endophyte community associated with the traditional Brazilian medicinal plant Solanum cernuum Vell. (Solanaceae). Canadian Journal of Microbiology (Print), v. 58, p. 54/1-66, 2012.

2) ABRÃO, FLÁVIA OLIVEIRA; DUARTE, EDUARDO ROBSON; FREITAS, CLÁUDIO EDUARDO SILVA; VIEIRA, EDVALDO ALVES; GERASEEV, LUCIANA CASTRO; DA SILVA-HUGHES, ALICE FERREIRA; ROSA, CARLOS AUGUSTO; RODRIGUES, NORBERTO MARIO. Characterization of Fungi from Ruminal Fluid of Beef Cattle with Different Ages and Raised in Tropical Lignified Pastures. Current Microbiology (Print), v. 69, p. 649-659, 2014.

195