Ana Camila DOS SANTOS DIAS
Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade de Docteur de l'Université de Nantes sous le sceau de l’Université Bretagne Loire
École doctorale : VENAM
Discipline : Science de la Vie et de la Santé - Sciences Pharmaceutique (CNU 85-86-87) Spécialité : Substances Naturelles Bioactives d'Origine Marine Unité de recherche : EA 2160 - MMS - UFR Sciences Biologiques et Pharmaceutiques
Soutenue le 28 avril 2017
Champignons marins : Lipidomique et lipides d'intérêt en santé et nutrition
JURY
Rapporteurs : Arlette BAILLET-GUFFROY , Professeur, Université Paris Sud François-Hugues POREE , Maitre de conférences, HDR, Université Paris Descartes
Examinateurs : Joel BOUSTIE , Professeur, Université de Rennes I Joel FLEURENCE , Professeur, Université de Nantes
Invité(s) : Samuel BERTRAND , Maitre de conférences, Université de Nantes Nicolas RUIZ , Maitre de conférences, Université de Nantes
Directeur de Thèse : Gaetane WIELGOSZ-COLLIN , Maitre de conférences, HDR, Université de Nantes
Co -directeur de Thèse : Aurélie COUZINET-MOSSION , Maitre de conférences, Université de Nantes Nicolas RUIZ , Maitre de conférences, Université de Nantes
Remerciements
Eu gostaria de primeiramente agradecer a minha familia, meu suporte, minha benção, sempre esteve ao meu lado, independente da distancia, das brigas e desse oceano que nos separa nunca deixou de me apoiar e de me amar. Ao meu pai, que tanto se esforçou para nos dar uma boa educação. A minha mãe, mulher de garra e força! Aos meus irmãos e irmã, meu muito obrigada. Essa tese também é de vocês. Essa é a nêga do pai!
Je voudrais remercier ma directrice de thèse, Gaëtane Wielgosz-Collin, pour sa confiance et son encadrement tout aux long de ces années de thèse, et surtout pour sa patience à l'égard d'une "non-chimiste". Merci de m'avoir épaulée dans les moments difficiles d'énervement et de stress aux détours des petits thés et de rires partagés.
Merci à mes deux encadrants officiels, Aurélie Couzinet-Mossion et Nicolas Ruiz, qui me suivent depuis mon M2. C'est grâce à vous que j'ai découvert, de façon passionnante, la Recherche dans le monde "des champignons". Merci, Aurélie, pour tes conseils avisés, pour ton partage d'expérience, notamment lors des cours de TPs, et pour ta compagnie ; toujours agréable. Merci, Nico, pour tout! Je n’ai pas de mot pour exprimer mon admiration et mon respect. Même si de temps en temps, nous ne partagions pas forcément les mêmes avis, particulièrement sur le comté et le café.
Merci à mon encadrant officieux, Samuel Bertrand, et pour tout le temps que tu m'as consacré, malgré l'encadrement non officiel. Merci pour tout ce que tu m'as apporté avec ton regard sur l'approche lipidomique.
Je souhaiterais remercier les rapporteurs que sont Mme Arlette Baillet-Guffroy et M. François- Hugues Porée ainsi que les membres du jury Joel Boustie et Joel Fleurence, qui ont gentiment accepté d'évaluer mon travail.
Je remercie également la bourse d'études de la " Fundação CAPES - Ministério da Educação ", du gouvernement brésilien, qui a financé cette thèse et sans laquelle ce travail n'aurait pas eu lieu. Obrigada Lula, obrigada Dilma!
Je voudrais remercier notre directeur de laboratoire, Yves François Pouchus, pour m'avoir accueillie au sein de son équipe depuis toutes ces années.
Je voudrais remercier également les membres de mon comité de suivi de thèse, Olivier Goncalves et Edouard Kraffe, pour les discussions importantes qui ont permis de faire avancer ma recherche ainsi que pour leur regard extérieur qui m'a énormément aidé.
Merci à l'équipe de chimie de la Faculté de Pharmacie de Nantes qui m'a donné la possibilité d'enseigner et de beaucoup apprendre. Qui m'a accompagné pendant la préparation des EDs et des TPs : Christine Herrenknecht, Isabelle Ourliac et Marjorie Albassier. Merci pour les fous rires Isabelle!! Tu me dois encore des kitkat au thé vert...
Je voudrais remercier du fond du cœur ma petite Vony Rabesaotra, mon bras droit! A l'Isomer ou pendant les TPs en pharma, tu m'as toujours aidé, depuis le début, tu m'as énormément appris, tu as énormément donné de ta personne pour que cette thèse avance, je t'en serai éternellement reconnaissante. Et désolée pour les bourdes de temps en temps...
Je souhaiterais remercier également Marie-Claude Boumard, Thibault Robiou Du Pont et Christophe Tomasoni (merci beaucoup Toto!), pour leur soutient technique qui m'a été indispensable depuis le début. Sois rassurée Marie-Claude, je ne piquerai plus ton petit chauffage (hahaha!).
Merci à Chantal Simonato et à Nathalie Calvi pour m'avoir sauvé la vie plusieurs fois sur tout ce qui concerne papier au niveau administratif au secrétariat. Merci pour votre gentillesse et patience. Je sais que parfois je ne suis pas facile...
Merci à Catherine Roullier, à Oliver Grovel et à Emanuel Gentil pour vos interventions, et l'apport de vos connaissances pour l'avancé de ma thèse. Catherine, ton rire est une bouffée d'air frais! Je l'adore!
Merci également à Hassan Nazih et à son équipe pour leur disponibilité, leur gentillesse et leur aide avec les tests au sein de leur laboratoire.
A ma chère Karina Petit, cette personne pétillante, toujours prête à m'aider et qui a beaucoup contribué à mon adaptation au laboratoire. Merci d'avoir apporté la joie de tes petits dans ma vie. Merci également de partager ton expérience et ton travail avec moi lors des séances de TP. I'm the bad cop!
Merci à mes amis qui ont partagé le bureau des doctorants avec moi, aux anciens (Marie, Elodie, Mickael et Anne-Isaline) et aux nouvelles (Thuy et Lucie). Merci pour les apéros (hehe!), pour l'atelier nem, pour les fromages de chèvre, pour la bonne humeur, pour la joie de vivre tout au long de ce chemin et surtout et principalement pour supporter mon humeur exécrable!!
Je remercie également tous les stagiaires que j'ai pu encadrer au long de cette thèse (y en a eu presque une dizaine!) qui m'ont également beaucoup appris et à qui j'ai pu transmettre un peu de mes connaissances. C'est toujours un plaisir de partager ces moments. C'est aussi grâce à eux que j'ai pu réaliser ce travail.
Merci à ma famille en France : Celine Boché (Hector et Tess), Jailson et Frank, Rafaela et Yvonnick (et sa famille!), Larissa et Régis, Leonardo et Poliana, Carla, François et Matthieu Dupuis et Aurélie Pouchus. Mes amis, mes amours, qui m'accompagnent, pour la plus part, depuis bientôt 9 ans dans ce pays qui m'a adoptée, mais dans lequel je suis arrivée seule. C'est grâce à vous que j'ai tenu le coup... Parce que les amis, c'est la famille qu'on choisit!
A mes amis du CrossFit, ce sport qui m'a montré que nous pouvons être des meilleurs athlètes, des meilleures personnes et que nous pouvons toujours évoluer. Ce sport qui m'a apporté tant de belles choses...et de magnifiques personnes...
A mon Lucas Bryk, merci d'être mon support, mon rocher. Merci pour ton soutien quotidien, ton écoute, tes paroles pour me calmer. Merci de faire de moi une meilleure personne chaque jour, d'exercer ta patience avec moi et d'apporter un nouveau regard dans la relecture et corrections de mes publications. Merci également à ta famille pour son soutien. Mon rayon de soleil, Kocham cię kochanie .
Sommaire
Remerciements ...... i Liste des travaux et publications ...... iv Liste des abréviations ...... vi Liste des figures ...... viii Liste des tableaux ...... xi Introduction générale ...... 1 Chapitre I. Étude bibliographique ...... 3
1. LES CHAMPIGNONS : DÉFINITION ET CLASSIFICATION 4
2. L' IMPORTANCE DES FUNGI 7 2.1. Métabolites d'origine fongique 9 2.2. Nouvelles sources de molécules fongiques 11
3. LES LIPIDES DES CHAMPIGNONS MARINS 19 3.1. Les lipides : Définition générale 19 3.2. Les principales classes lipidiques étudiées 21 3.3. Métabolisme lipidique 29
4. ACTIVITÉS BIOLOGIQUES DES LIPIDES DES CHAMPIGNONS MARINS 30
5. VALORISATION DES LIPIDES DE CHAMPIGNONS 35 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit ...... 37
1. LIPIDOMIQUE 38
2. DÉRÉPLICATION 40
3. CRIBLAGE DES PROFILS LIPIDIQUES PAR APPROCHE OSMAC 41
4. CONCLUSION 44 Chapitre III. Matériel et méthodes ...... 46
1. LES CULTURES FONGIQUES 47
i
1.1. Le matériel biologique 47 1.2. Les milieux de culture 49 1.3. Cultures fongiques pour l’étude OSMAC sur les lipides totaux 49 1.4. Culture s fongiques pour l’étude OSMAC sur les glycolipides 50 1.5. Cultures fongiques pour le criblage 51
2. ARRÊT DES CULTURES 51
3. EXTRACTION ET ANALYSE LIPIDIQUE 52 3.1. Extraction classique par macération 52 3.2. Séparation en classes lipidiques 53 3.3. Chromatographie sur couche mince (CCM) 53
4. ISOLEMENT ET PURIFICATION DES GLYCOLIPIDES 54
5. ISOLEMENT ET PURIFICATION DES STÉROLS 55
6. SAPONIFICATION 55 6.1. Acétylation des composés lipidiques 56 6.2. Esters méthyliques d'acides gras (EMAG) 57 6.3. N-Acyl pyrrolidides (NAP) 57
7. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE COUPLÉE À LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE (CPG-SM) 57 7.1. Analyse des EMAG et des NAP 58 7.2. Analyse des stérols et des acétates de stérol 58
8. SPECTROMÉTRIE DE MASSE BASSE ET HAUTE RÉSOLUTION 58
9. ANALYSES RMN 59
10. MÉTHODE D 'ANALYSE DES LIPIDES PAR CLHP-SM 59 10.1. Méthode chromatographique 59 10.2. Analyse des données 60 10.3. Déréplication 61
11. ÉVALUATION D 'ACTIVITÉ BIOLOGIQUE 61 11.1. Test MTT – Viabilité cellulaire 61 11.2. Activité antibactérienne 65
ii
Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines ...... 67
1. MYCOTHÈQUE MMS – SOUCHES CRIBLÉES 68
2. PRODUCTION LIPIDIQUE ET ANALYSE DES PROFILS LIPIDIQUES 70 2.1. Teneur en lipides totaux des souches criblées 70 2.2. Composition en acides gras des souches criblées 73 2.3. Conclusion 79
3. PROFILAGE DES EXTRAITS BRUTS PAR APPROCHE LIPIDOMIQUE (CLHP-SM) 81 3.1. Résultats 81 3.2. Conclusion 88
4. CRIBLAGE SELON LES ACTIVITÉS BIOLOGIQUES DES FRACTIONS ENRICHIES EN GLYCOLIPIDES 89 4.1. Résultats 89 4.2. Conclusion 91
5. CONCLUSION : SOUCHES RETENUES SUITE AU CRIBLAGE 92 Chapitre V. Étude lipidique de Clonostachys rosea MMS1090 ...... 94
1. ÉTUDE DE L ’ACIDE GRAS CONJUGUÉ 4-ME-6,8-16:2 95
2. ÉTUDE DES GLYCOLIPIDES 118 2.1. Effet du sucre sur la production des glycolipides bioactifs 120 2.2. Activités biologiques du Glycosphingolipide majoritaire 135
3. ÉTUDE DES STÉROLS 139
4. CONCLUSION 159 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540 ...... 160
1. PRÉSENTATION DE LA PUBLICATION 162
2. CONCLUSION 188 Conclusion Générale et Perspectives ...... 189 Références bibliographiques ...... 193
iii
Liste des travaux et publications
PUBLICATIONS
2014 - Publication : Abstract - 4-Me-6E,8E-hexadecadienoic acid isolated from a marine- derived strain of Clonostachys rosea reduces viability of MCF-7 breast cancer cells and gene expression of lipogenic enzymes. Ana Camila Dos Santos Dias , Nicolas Ruiz, Aurélie Couzinet-Mossion, Vony Rabesaotra, Jean-Michel Huvelin, Chloé Chaillou, Olivier Grovel, Muriel Duflos, Yves-François Pouchus, Gilles Barnathan, Hassan Nazih, Gaetane Wielgosz-Collin. Planta Medica , book of abstracts . DOI: 10.1055/s-0034- 1394499. 2015 - Publication : The marine-derived fungus Clonostachys rosea , source of a rare conjugated 4-Me-6E,8E-hexadecadienoic acid reducing viability of MCF-7 breast cancer cells and gene expression of lipogenic enzymes. Dos Santos Dias, A. C. ; Ruiz, N., Couzinet-Mossion, A., Bertrand, S., Duflos, M., Pouchus, Y.-F., Barnathan, G., Nazih, H., Wielgosz-Collin, G. Marine Drugs , 13, 4934-4948. DOI : 10.3390/md13084934. 2016 - Publication : Sugar induced glycolipid production in Acremonium sp. revealed by LC- MS lipidomic approach - Current Advances in Fungal Biotechnology. Dos Santos Dias A.C., Couzinet-Mossion A., Ruiz. N., Le Bellec M., Gentil E., Wielgosz-Collin, G., Bertrand S., Current Biotechnology , 5, 1-11 . DOI : 10.2174/2211550105666160922130029.
COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES
2014 - Communication orale : 4-Me-6E,8E-hexadecadienoic acid isolated from a marine- derived strain of Clonostachys rosea reduces viability of MCF-7 breast cancer cells and gene expression of lipogenic enzymes. Ana Camila Dos Santos Dias , Nicolas Ruiz, Aurélie Couzinet-Mossion, Vony Rabesaotra, Jean-Michel Huvelin, Chloé Chaillou, Olivier Grovel, Muriel Duflos, Yves-François Pouchus, Gilles Barnathan, nd Hassan Nazih, Gaetane Wielgosz-Collin. 62 International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research - GA. August 31 st – September 4 th , Guimarães, Portugal. 2014 - Poster : Champignons marins : Production de lipides et valorisation en santé, nutrition et bioénergie. Ana Camila Dos Santos Dias , Aurélie Couzinet-Mossion, Nicolas Ruiz, Samuel Bertrand, Gaetane Wielgozs-Collin. Les doctoriales - 2 au 7 novembre 2014, Rio Grande do Sul, Brésil. 2015 - Communication orale : Lipids from marine-derived fungi as source of bioactive compounds. Ana Camila Dos Santos Dias , Nicolas Ruiz, Aurélie Couzinet-Mossion, Matthieu Le Bellec, Yves- François Pouchus, Gilles Barnathan, Hassan Nazih, Samuel Bertrand, Gaetane Wielgosz-Collin .
iv
1st Conference of the Marine Fungal Natural Products Consortium - 22 nd to 24 th July 2015, Nantes - France. 2016 - Communication orale : Lipidomic approach to explore chemodiversity in Acremonium marine-derived strains. Ana Camila Dos Santos Dias , Aurélie Couzinet-Mossion, Nicolas Ruiz, Matthieu Le Bellec, Emmanuel Gentil, Gaëtane Wielgosz-Collin, Samuel Bertrand . OCEANEXT – Interdisciplinary Conference – 9th June 2016, Nantes - France. 2016 - Short communication - Poster : Glycolipids from marine-derived fungus Clonostachys rosea MMS1090 . Ana Camila Dos Santos Dias , Nicolas Ruiz, Aurélie Couzinet-Mossion, Samuel Bertrand, Muriel Duflos, Yves François Pouchus, Gaetane Wielgosz-Collin . August 29 th to september 2 nd , Cumbuco beach, Ceara, Brasil.
v
Liste des abréviations
AG : Acide gras AGE : Acide gras essentiel AGPI : Acide gras poly-insaturé AGS : Acide gras saturé AGL : Acide gras libre CCM : Chromatographie sur couche mince
CI50 : Concentration inhibitrice médiane CLHP-SM (HR) : Chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (haute résolution) CPG : Chromatographie en phase gazeuse CPG-SM : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse Da : Daltons DG : Diacylglycérol DGTS : Diacylglyceryltrimethylhomoserine DMSO : Diméthyl sulfoxyde EBL : Extrait brut lipidique EMAG : Ester méthylique d'acides gras ESI : Electrospray ionization (ionisation par éléctronébulisation) FB : Formule brute GL : Glycolipides GlcCer : Glycosylcéramide HR-ESI-MS: High resolution electrospray ionization mass spectrometry (Spectrométrie de masse haute résolution par ionisation par éléctronébulisation) IPA : Isopropanol (Propan-2-ol) LN : Lipides neutres
vi
MeOH : Méthanol m/z : Rapport masse sur charge NAP : N-Acyl pyrrolidide OSMAC : One strain many compounds PC : Glycerophosphocholine PE : Glycerophosphoethanolamine PE-Cer : Ceramidephosphoethanolamine PI : Glycerophosphoinositol PL : Phospholipides ppm : Parties par million RMN : Résonance magnétique nucléaire SM n : Fragmentation multiple en spectrométrie de masse TG : Triacylglycérol TI : Trappe ionique tR : Temps de rétention v/v : Volume sur volume
vii
Liste des figures
Figure 1. : Phyla préférentiellement étudiés par la communauté scientifique sur les produits naturels marins sur une période de 50 ans à partir de 1963. Extrait de Blunt et al . (2015). 1 Figure I.1 : Tree of life - La nouvelle classification fait mention des "Oomycetes" comme des "fungi- like " et les attribue à un au tre groupe distinct, d’après Lee et al . (2012). 5 Figure I.2 : Arbre évolutif simplifié des Phyla traditionnels : Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota, Zygomycota et Chytridiomycota. d'après Bruns (2006), Hibbett (2007), Moore et al . (2011) et McLaughlin et al . (2015). 6 Figure I.3 : Nombre de publications par année (Scopus) qui comprennent l'association des mots « champignon dérivé de milieu marin » ou « champignon isolé d’une éponge » dans le titre, le résumé ou les mots clés. La ligne de tendance exponentielle a été appliquée aux points de données réels (R 2 = 0,95 si 2014 est exclu). D’après Overy et al . (2014). 13 Figure I.4 : Distribution des métabolites de champignons d’origine marine en fonction de l’habitat. Les habitats présentant des faibles pourcentages ne sont pas représentés, d’après Bugni & Ireland (2004). 15 Figure I.5 : Nouveaux composés répertoriés entre 2014 et 2016 provenant de champignons marins en fonction des habitats, d’après Jin et al . (2016). 16 Figure I.6 : Nouveaux composés de champignons marins par classes chimiques, d’après Jin et al . (2016). 19 Figure I.7 : Mécanismes de la biosynthèse des lipides. La biosynthèse des lipides contenant des cétoacides et des isoprènes se fait soit par l’intermédiaire d’un carbanion soit par extension de la chaîne avec le carbocation. Figure extraite de Fahy et al . (2011). 20 Figure I.8 : Représentation des esters d'acides gras : schéma de substitution des hydroxylations du
glycérol par des chaînes d'acides gras (R; R 1; R 2; R 3). 23 Figure I.9 : Structures des principaux glycérophospholipides. Adapté de Christie & Han (2010). 25 Figure I.10 : Métabolisme des sphingolipides. Les enzymes impliquées dans le métabolisme des sphingolipides sont la céramidase (CASE), la céramide kinase (CK), la céramide-1-phophosphate phosphatase (CPP), la céramide synthase (CS), la dihydrocéramide désaturase (DD), la galactosylcéramide synthase (GalCS), la glucosylcéramide synthase (GCS), la glucosylcéramidase (Gcase), la sphingomyélinase (SMase) et la sphingomyéline synthase (SMS). Extrait de Huang et Freter (2015). 26
viii
Figure I.11 : Exemple de structures de sphingolipides simples et plus complexes. Source : Lipid Library (“Sphingolipids - AOCS Lipid Library,” n.d.) . 27 Figure I.12. Structure générale d'un stéroïde. 28 Figure I.13 : Structure des quatre cérébrosides, Flavicérébrosides A (1), B (2) C (4) et D (3), isolés d’une souche marine d’ A. flavipes . Extrait de Jiang et al . (2004). 30 Figure I.14 : Structures chimiques des composés isolés : 1 : Asperamide A ; 2 : Asperamide B. Extrait de Zang et al . (2007). 31 Figure I.15. Structures chimiques des composés isolés : 1 : Pénicilloside A ; 2 : Pénicilloside B. Extrait de Murshid et al . (2016). 32 Figure I.16. Structure chimique des composés isolés : Ergosta-8 (14), 22-diene-3,5,6,7-tetraol (3, 5, 6, 7, 22E) (1), ergosta-8(9), 22-diene-3,5,6,7-tetraol (3, 5, 6, 7, 22E) (2), 5,8-epidioxy-24(S)- methylcholesta-6, 22-diene-3-ol (3), 5,8-epidioxy-24(S)-methylcholesta-6,9(11), 22-triene-3-ol (4), 3,5,9-trihydroxyergosta-7,22-diene-6-one (5). Extrait de Sun et al . (2006). 33 Figure I.17. St ructure chimique des composés isolés : 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien- 7,15-dione (1), 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8,14,22-tetraen-7-one (2), 3β,15β -Dihydroxyl- (22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-one (3), 3β,15α -Dihydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22- trien-7-one (4), 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7,15-dione (5), 5α,8α -Epidioxy- 23,24(R)-dimethylcholesta-6,9(11),22-trien-3β -ol (6), 3β -hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22- trien-7-one (7), 5α,8α -epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,22-dien-3β -ol (8), 5α,8α -epidioxy- 23,24(R)-dimethylcholesta-6,22-dien-3β -ol (9), and 5α,8α -epidioxy-24(R)-methylcholesta- 6,9(11),22-trien-3β -ol (10). Extrait de Wang et al . (2008). 34 Figure III.1 : Culture en boite de Petri Acremonium sp. MMS884 (A), Trichoderma citrinoviride MMS19 (B) et Clonosachys rosea MMS1090 (C). Prélèvement de C. rosea de la gélose (D). 52 Figure III.2 : Schéma de l'équation de la réaction de saponification d’un triglycéride. 55 Figure IV.1 : Répartition des souches conservées dans la mycothèque du laboratoire par genre. 69 Figure IV.2 : Rendements des extraits bruts lipidiques (% m/m) obtenus pour les différentes souches étudiées. 70 Figure IV.3 : Chromatogrammes CLHP-SM des 3 fractions lipidiques obtenues après séparation sur colonne ouverte de gel de silice d’un EBL obtenu par le mélange des EBL de Penicillium ligerum MMS388 , Aspergillus terreus MMS815 , Clonostachys rosea MMS1090, Acremonium sp. MMS1120 et Trichoderma longibrachiatum MMS151. 81
ix
Figure IV.4 : Profil CLHP-SM de 5 souches et représentation des classes lipidiques mises en évidence. Axe Y : Intensité des pics (0 à 1 500 000); Axe X : Temps de rétention (0 à 50 min). 82 Figure IV.5 : Proportions lipidiques des souches analysées. L'axe horizontal correspond au pourcentage des souches présentant des lipides en commun. L'axe vertical au pourcentage total des pics identifiés. 83 Figure IV.6 : Chromatogrammes des EBL pour les différentes souches et la classification selon la quantité de pics détectés (+ < 8 pics). 85 Figure IV.7 : Chromatogrammes des fractions glycolipidiques pour les différentes souches et la classification selon la quantité de pics détectés (+ < 11 pics). 87 Figure V.1 : Représentation de l'acide gras lié à la 10-Phenyl-[11]-cytochalasine isolée du champignon Microporellus subsessilis . Extrait de Kurnia et al . (2007) 96 Figure V.2 : Structures du D-glucose et du D-galactose 118 Figure V.3 : Représentation de la voie de Leloir du métabolisme du galactose. Les différentes enzymes qui catalysent les réactions chez la levure sont discriminées. Extrait de Sellick et al . (2008). 119 Figure V.4 : Observation macroscopique des cultures de C. rosea MMS1090 sur milieu DCA à base de glucose (A) et de galactose (B), après 7 jours de culture (27 °C). 120 Figure V.5 : Volcano-plot des pics détectés en CLHP-SM dans les EBL obtenus des cultures sur milieux DCA et GCA (A), PDA et PGA (B), MEA et MEGA (C), ( p-value < 0,05). 122 Figure V.6 : Activité antiproliférative sur cellules KB des fractions enrichies en glycolipides obtenues à partir de la souche C. rosea MMS1090. 128 Figure V.7 : Schéma des étapes de purification des glycolipides bioactifs 129 Figure V.8 : Spectre de masse haute résolution (HR-ESI-MS) de la fraction A4-7-9 peracétylée de C. rosea MM1090 130 Figure V.9 : Structure proposée pour le composé majoritaire analysé par HR-ESI-MS. 131 Figure V.10 : Spectre de masse du dérivé EMAG pour la partie AG du glycosphingolipide isolé de C. rosea MMS1090. 132 Figure V.11: Formule développée du glucosylcéramide isolé de C. rosea MMS1090. 134
x
Liste des tableaux
Tableau I.1. Exemples de métabolites d’origine fongique commercialisés (Khan et al. , 2014). 10 Tableau I.2. Structures et noms systématiques, triviaux et abrégés de certains acides gras communs, d’après Gunstone et al. (2012). 22 Tableau III.1. Classification phylogénétique actuelle pour les genres des souches fongiques étudiées, d’après Hibbett et al. (2007) et McLaughlin et al. (2015). 47 Tableau III.2. Tableau général des souches sélectionnées et citées dans les différents chapitres. 48 Tableau III.3. Composition des 7 milieux de cultures utilisés pour l'étude lipidique par approche OSMAC. 50 Tableau III.4. Composition des milieux de culture utilisés pour l'approche OSMAC pour la production des glycolipides. 51 Tableau III.5. Phases mobiles, témoins et révélateurs utilisés en CCM 54 Tableau III.6. Qualité des solvants utilisés pour l'obtention des profils lipidiques. 60 Tableau IV.1: Profilage des acides gras majoritaires (> 2 %) obtenus après saponification et estérification de l'extrait brut pour les souches étudiées, cultivées sur milieu DCA. Profils obtenus en CPG-SM 74 Tableau IV.2. Analyse générale du profil CLHP-SM des EBL des souches étudiées 84 Tableau IV.3. Analyse générale du profil CLHP-SM des fractions enrichies en glycolipides des souches étudiées. 86 Tableau IV.4. Activité antiproliférative sur cellules KB des fractions enrichies en glycolipides des souches analysées, masse des extraits bruts lipidiques (g) et des fractions glycolipidiques en pourcentage de l'extrait brut total 90 Tableau V.1 : Production lipidique totale et rendement glycolipidique de C. rosea sur les différents milieux étudiés glucosés ou galactosés. 120 Tableau V.2 : Ions d'intérêt liés à l'EBL selon le SUS-plot généré par les deux modèles OPLS-DA (normalisation par UV) comparant les milieux de culture DCA/GCA et PDA/PGA. ↑ indique que l'ion est surexprimé en milieu glucosé. ↓ indique l'ion surexprimé en milieu galactosé. * Valeur p ≤ 0,05; ** valeur p ≤ 0,01; *** valeur p ≤ 0,001. 124 Tableau V.3 : Ions d'intérêt des fractions glycolipidiques selon le SUS-plot généré par les deux modèles OPLS-DA (normalisation par UV) comparant les milieux de culture DCA/GCA, MEA/MEGA et PDA/PGA. ↑ indique que l'ion est surexprimé en milieu contenant du glucose. ↓
xi
indique l'ion surexprimé e n milieu contenant du galactose. * Valeur p ≤ 0,05; ** valeur p ≤ 0,01; *** valeur p ≤ 0,001. 126 Tableau V.4 : 1H, 13 C et corrélation COSY obtenus à partir des spectres RMN pour le glycosphingolipide isolé. 133 Tableau V.5 : Zone d'inhibition (mm) pour l'activité antibactérienne du glycosphingolipide isolé à partir des fractions de C. rosea MMS1090 contre 7 bactéries pathogènes de l'homme. Streptomycine (traitement standard antibactérien). Doses testées : 50 et 100 µg/mL (n = 3). 137
xii
Introduction générale
Au cours des 50 dernières années, les Phyla majoritairement étudiés pour la recherche de métabolites bioactifs dans le milieu marin ont été parmi les invertébrés marins, les éponges et les cnidaires (Figure 1). Le nombre de publications concernant ces deux Phyla reste constant alors que le nombre de publications concernant les champignons et plus particulièrement les Ascomycètes est en augmentation depuis environ une dizaine d'années.
Figure 1: Les Phyla préférentiellement étudiés par la communauté scientifique sur les produits naturels marins sur une période de 50 ans à partir de 1963. Extrait de Blunt et al . (2015a).
Parmi ces Ascomycètes, le genre Aspergillus a été plus largement étudié. Malgré leur diversité chimique due aux adaptations constantes, les champignons en milieu marin restent encore peu étudiés lorsqu'ils sont comparés aux terrestres.
Le laboratoire Mer Molécules Santé (MMS) de l'Université de Nantes est pionnier dans la constitution d'une mycothèque d'origine marine, avec la conservation d'environ 800 souches de champignons provenant de l'estuaire de la Loire. Cette collection constitue ainsi une ressource
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importante pour la recherche de métabolites d'intérêt. Parmi ces métabolites, les lipides fongiques marins ont été peu étudiés.
Le laboratoire, possédant une expertise dans l’analyse des lipides marins bioactifs issus d'autres organismes (invertébrés et macroalgues), a initié des recherches sur les lipides de champignons marins (Ruiz et al. , 2007). Ces travaux préliminaires s'étaient focalisés sur les procédés de fermentation pour la production de lipides et n'avaient concernés que l'étude des acides gras. Toutefois, des lipides d'intérêt avaient pu être mis en évidence comme des acides gras conjugués originaux.
Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit donc dans la poursuite de ces études précédentes, en ayant une approche plus globale des différentes classes lipidiques (glycolipides, acides gras et stérols). Cette thèse s'inscrit dans le cadre d’ un des projets majeurs du laboratoire qui vise à mettre en place une approche lipidomique permettant de cribler le potentiel lipidique des champignons marins constituants la mycothèque du laboratoire.
Après une étude bibliographique sur les lipides de champignons marins, et l’analyse lipidique à haut débit, les différentes méthodes utilisées lors de ce travail seront exposées. Une première partie des résultats a concerné le criblage des souches marines qui a permis de sélectionner deux souches, Clonostachys rosea MMS 1090 et Acremonium sp. MMS540. La première souche, C. rosea , a fait l’objet d’une étude lipidique approfon die sur trois classes de lipides (acides gras, glycolipides et stérols) en couplant des méthodes classiques de chimie des produits naturels et de bioguidage mais également des approches "omiques" et déréplicatives. Cette approche lipidomique couplée à la déréplication a été également effectuée pour l'étude des lipides produits par Acremonium sp. MMS540 et fait l'objet du dernier chapitre.
Ce travail a été en partie financé par la fondation CAPES du ministère de l’éducation du Brésil en attribuant une bourse de thèse.
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Chapitre I. Étude bibliographique
3 Chapitre I. Étude bibliographique
1. Les champignons : définition et classification
Le terme "champignon" est classiquement employé pour parler d'un groupe d'organismes très varié. Les champignons sont classés dans un règne séparé des plantes, des animaux et des bactéries. Les champignons sont caractérisés par leur mode d’alimentation exclusivement basé sur l’absorption des nutriments. Une autre caractéristique des champignons est la présence de chitine dans les parois cellulaires, ce qui les rapproche des animaux et au contraire les éloigne des végétaux, qui contiennent de la cellulose.
Les progrès de la génétique moléculaire ont ouvert la voie à l'inclusion de l'analyse de l'ADN dans la taxonomie, qui a parfois contesté les classifications antérieures basées principalement sur des critères morphologiques. Ainsi, les études phylogénétiques publiées au cours de la dernière décennie ont contribué à modifier la classification du règne des Fungi (Moore & Nova Frazer, 2002).
La classification actuelle des champignons a été effectuée à partir d'un travail collaboratif remarquable et de l'union de plusieurs chercheurs autour du projet " Tree Of Life " et l'application d'une approche évolutive reliée à la biologie moléculaire pour décrire le lien entre les organismes (Figure I.1).
4 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.1 : Tree of life - La nouvelle classification fait mention des "Oomycetes" comme des "fungi-like " et les attribue à un autre groupe distinct, d’après Lee et al . (2012).
Cette nouvelle classification englobe tous les organismes fongiques dans un groupe appelé "Eumycota" (les champignons vrais ou Eumycètes) qui partagent un ancêtre commun (un groupe monophylétique). Les plus connus sont les levures, les cèpes, les morilles et les moisissures, mais de nombreux champignons moins connus du grand public en font aussi partie telles que les trémelles et les rouilles. Dans les années 1990, près de 70 000 espèces ont été recensées (Hawksworth, 1991; Hawksworth et al. , 1996).
Plus récemment, plus de 130 000 espèces de champignons ont été répertoriées par le projet "Catalogue Of Life ". Néanmoins, les dernières estimations prévoient que ces chiffres puissent atteindre un nombre supérieur à 5 millions d'espèces (Blackwell, 2011). Les principales branches de la nouvelle classification du Règne des Fungi sont dérivées de l'analyse de données génomiques et métabolomiques (James et al. , 2006).
Au sein des Eumycetes, les Ascomycota et Basidiomycota sont unis dans un sous-règne appelé Dikarya, regroupant les champignons dans lesquels au moins une partie du cycle de vie est caractérisée par des cellules avec des noyaux appariés, ou dicaryons. Les parents les plus proches de ces deux groupes sœurs sont les Glomeromycota ( Figure I.2). Ni les Zygomycota ni les
5 Chapitre I. Étude bibliographique
Chytridiomycota ne sont des groupes monophylétiques, ils ont des représentants dans différents clades ou branches de l'arbre qui sont groupés dans ces Phyla par leurs morphologies primitives partagées (ces groupes sont appelés paraphylétiques) (Bruns, 2006; Hibbett et al. , 2007; McLaughlin et al. , 2015; Moore et al. , 2011). Les branches de Microsporidia et de Rozella apparaissent comme basales à tous les autres champignons dans cette analyse.
Figure I.2 : Arbre évolutif simplifié des Phyla traditionnels : Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota, Zygomycota et Chytridiomycota. d'après Bruns (2006), Hibbett (2007), Moore et al . (2011) et McLaughlin et al . (2015).
La plupart des biologistes ont pu observer en laboratoire des colonies de champignons filamenteux denses se développant sur des boîtes de gélose nutritive, mais dans la nature, les filaments peuvent être beaucoup plus longs et les colonies moins denses. Lorsque l'un des filaments entre en contact avec des nutriments, l'ensemble de la colonie mobilise et réaffecte les ressources pour exploiter cette nouvelle ressource nutritive. Si tous les nutriments s’épuisent, la sporulation est déclenchée. Bien que les filaments fongiques et les spores soient microscopiques, la colonie peut être très grande avec des individus de certaines espèces rivalisant avec la masse des plus grands animaux ou plantes (Moore et al. , 2011).
En tant que groupe sœurs des animaux qui est apparu il y a environ un milliard d'années, les champignons constituent un groupe indépendant de rang égal à celui des plantes et des animaux (Hibbett et al. , 2007; McLaughlin et al. , 2015). Ils partagent avec les animaux la capacité d'exporter des enzymes hydrolytiques qui décomposent les bio polymères, qui peuvent être ensuite absorbés pour la nutrition (Moore & Nova Frazer, 2002; Moore et al. , 2011). Plutôt que d'avoir un estomac pour accomplir la digestion, les champignons vivent dans leur propre substrat
6 Chapitre I. Étude bibliographique nutritif en le digérant en même temps que leur environnement local s’appauvrit en éléments nutritifs.
Les champignons survivent dans un large éventail d'habitats, comme dans l'eau, le sol, l'air, mais aussi sur les animaux et les plantes (Cox, 2007; Moore & Nova Frazer, 2002). En effet, les métabolites microbiens servent d'interface chimique entre le monde microbien et le reste de la nature. Ces molécules leur permettent de communiquer et de créer des interactions avec les autres organismes vivants et l'environnement. Ces composés sont, en général, des agents de signalisation inter microbiens. L'implication de leur rôle contribue à mieux comprendre la véritable fonction écologique des microorganismes fongiques dans la biosphère (Greenberg, 2010).
La majorité des champignons jusqu’à présent décrits, sont terrestres et vivent dans le sol ou survivent sur des cadavres d'organismes multicellulaires, y compris les plantes et les animaux, et contribuent au recyclage naturel des composés organiques. En outre, de nombreux champignons terrestres sont pathogènes pour les animaux et les plantes et peuvent causer des maladies parfois difficile à traiter. Parmi ces champignons, nous pouvons mentionner deux champignons pathogènes majeurs des plantes. Puccinia coronata qui provoque la rouille de l'avoine et Magnaporthe grisea , responsable de la pyriculariose du riz, Aspergillus fumigatus , le plus important champignon pathogène chez l'homme et Cryptococcus neoformans sont tous les deux particulièrement pathogènes chez les individus immunodéprimés (Cox, 2007; Moore & Nova Frazer, 2002).
2. L'importance des Fungi
La mycologie est la discipline de la biologie consacrée à l'étude des champignons. Elle a été souvent considérée comme une branche de la botanique, même si les études phylogénétiques ont démontré que les champignons sont plus étroitement liés aux animaux qu’aux plantes. Ubiquistes, la plupart des champignons sont peu visibles en raison de la taille microscopique de leurs structures. Leurs modes de vie (saprophytes, décomposeurs de la matière morte; symbiotes ou parasites de plantes, d'animaux et d'autres champignons) ainsi que leur habitat lié aux conditions environnementales parfois extrêmes montrent leur indéniable capacité d'adaptation (Ainsworth, 2008; Blackwell, 2011; Celio et al. , 2006; Griffin, 1995).
7 Chapitre I. Étude bibliographique
Les champignons sont depuis longtemps utilisés comme une source d'alimentation, comme les cèpes et les truffes, ou les levures pour la fermentation de produits divers tels que le vin, la bière, le pain, les produits laitiers ou la sauce soja (Cole, 2012; Zelinski & Hauer, 2002).
Depuis le début du XXème siècle et avec la découverte de la pénicilline par Sir Alexander Fleming, les champignons ont été utilisés pour la production d'antibiotiques (Broadbent, 1968; Bérdy, 2012). Diverses enzymes, principalement des xylanases et des α-amylases sont produites à l’échelle industrielle (Couto & Sanromán, 2006; Jayani et al. , 2005; Kirk et al. , 2002; Polizeli et al. , 2005; Souza & Magalhães, 2010). Les champignons sont également utilisés en contrôle biologique comme agents biologiques pour la protection des plantes ou la lutte contre les phytopathogènes (Ahmed et al. , 2014; Mondy & Corio-Costet, 2000; Zhang et al. , 2014).
De nombreuses espèces de champignons produisent des mycotoxines telles que la patuline et l’ochratoxine, molécules toxiques pour les animaux et les êtres humains (Pitt and Wild, 2012; Marroquín-Cardona et al. , 2014).
Plus récemment, une simple prospection sur les principaux moteurs de recherche pour la bibliographie scientifique tels que " Scifinder ", " Science Direct " ou " Google Scholar " nous donnent des centaines de milliers de résultats, pouvant dépasser le million de références bibliographiques répertoriées, avec les mots clé " Compounds from Fungi ". En réalisant un tri rapide de quelques pages de ces résultats, la majorité des publications d'intérêt se partage selon l’origine des organismes : terrestre (principalement endophytes), marine (symbionte ou pas) et extrêmophiles.
Une autre observation effectuée lors de cette recherche est basée sur les principales classes de molécules produites et leurs activités biologiques associées. Les champignons peuvent produire une gamme très large de molécules telles que des terpènes, des alcaloïdes, des lactones, des peptides, des quinones, des polycétides, des lipides, mais aussi des dérivés azotés et sulfurés de ces classes. L es molécules d’origine naturelle, en général, contiennent relativement plus de carbone, d’oxygène et d’hydrogène, avec une architecture plus complexe et plusieurs centres stéréochimiques que les molécules de synthèse ce qui leur permet d’agir avec plus de puissance et de spécificité auprès des récepteurs de protéines (Clardy & Walsh, 2004).
8 Chapitre I. Étude bibliographique
2.1. Métabolites d'origine fongique
La chimie des champignons est un peu plus complexe et ils sont structurellement différents des plantes et des animaux. Cependant, il existe également des ressemblances entre eux. Ils peuvent suivre les mêmes voies biosynthétiques pour la synthèse de métabolites secondaires comme les terpènes et les polycétides en utilisant des monomères de départ (Griffin, 1995; Moore et al. , 2011). Les champignons peuvent également être utilisés comme modèle expérimental car ils peuvent être cultivés facilement dans les conditions de laboratoire (Goffeau et al. , 1996; Mewes et al. , 1997).
La majorité des métabolites secondaires produits par des champignons ont une masse environnant les 400 Daltons (Da) (Bérdy, 2012). Ces molécules proviennent de voies conditionnelles qui sont activées dans un contexte ou une situation particulière et qui reflètent à leur tour des stratégies d’assemblage alternatives. Différents types de métabolites fongique s peuvent posséder une caractéristique essentielle qui justifie leur production et leur existence dans la nature (Cragg & Newman, 2013; Griffin, 1995; Jiang & An, 2000; Miles & Chang, 2004; Moore et al. , 2011). Ces métabolites peuvent également exprimer un certain type d'activité biologique non découverte.
De nombreuses données reflètent les machines biosynthétiques très diverses, compliquées, et parfois inconnues, en particulier dans le cas des espèces incultivables (Bérdy, 2012). Il s'agit notamment des métabolites produits lors d'une situation de carence de nutriments disponibles dans l'environnement, pendant la croissance, la différenciation cellulaire, la signalisation, par exemple (Walsh, 2003).
Au cours des 70 dernières années, les efforts consacrés à la découverte de nouveaux métabolites provenant de différentes sources fongiques ont continuellement augmenté. Parmi les 500 000 produits naturels listés depuis les années 1940, 70 000 sont d’origine microbienne, et quasiment 16 000 spécifiquement d’origine fongique (Bérdy, 2012). Une autre étude bibliographique couvrant plus de 23 000 produits microbiens bioactifs : antifongiques, antibactériens, antiviraux, cytotoxiques et immunosuppresseurs ; montre que la majorité des métabolites produits proviennent principalement du règne fongique (environ 42 %) (Brakhage & Schroeckh, 2011).
Les ressources naturelles, en particulier les champignons, sont une usine connue pour leur capacité métabolique à produire une grande diversité de composés bioactifs. En effet, parmi les
9 Chapitre I. Étude bibliographique métabolites fongiques, près de 10 000 (66 %) présentent des activités biologiques autres qu'antibiotiques, principalement cytotoxiques ou antivirales, mais également liées à la régulation de la croissance des plantes. Plus de 50 % des métabolites fongiques présentent aussi des activités phytopathogènes ou pesticides (Bérdy, 2012).
Certains métabolites sont des produits à haute valeur avec des applications pharmaceutiques telles que les pénicillines, antibiotiques de la classe des β-lactamines, produites initialement par Penicillium chrysogenum (Sykes, 2001).
D’autres antibiotiques non β-lactamines sont également produits par des champignons tels que la griséofulvine isolée de Penicillium griseofulvum qui a été utilisée pendant plusieurs années pour traiter des dermatoses de la peau, des ongles et des cheveux (Artis et al. , 1981). Certains métabolites secondaires communs d'origine fongique sont listés dans le Tableau I.1.
Tableau I.1. Exemples de métabolites d’origine fongique commercialisés (Khan et al. , 2014).
Métabolites Classe Espèce Application Structure chimique
Céphalosporines Peptides NR (1) Acremonium chrysogenum Antibactérien
Peptides Ciclosporines Tolypocladium spp. Immunosuppresseur cycliques NR (1)
Acide fusidique Stéroïde Fusidium coccineum Antibactérien
Gibbérellines Terpènes Gibberella fujikuroi Hormone végétale
Griséofulvine Polycétide Penicillium griseofulvum Antifongique
Pénicillines Peptides NR (1) Penicillium chrysogenum Antibactérien
Hormone de croissance Zéaralénones Polycétide Gibberella zeae pour le bétail
NR : non ribosomal
10 Chapitre I. Étude bibliographique
À la fin des années 1960, une étude a été menée sur les activités "non antibiotiques" des antibiotiques, plus spécifiquement sur leurs activités d’inhibition enzymatiqu e (Umezawa, 2009). Des années plus tard, plusieurs centaines de types d'activités autres qu’antibiotiques de métabolites fongiques ont été découvertes tels que pesticides, insecticides et cytotoxiques (Aly et al. , 2011; Attaway & Zaborsky, 2013; Bladt et al. , 2013; Lorenzen & Anke, 1998; Stamets, 2002; Zjawiony, 2004).
Actuellement, les composés bioactifs d'origine fongique ont prouvé leur potentiel en tant qu'importante source de nouveaux produits pharmaceutiques antimicrobiens mais aussi anti- inflammatoire, immunosuppresseur, hypocholestérolémiant, et présentant une action anti tumorale (Evidente et al. , 2014; Greve et al. , 2010; Lull et al. , 2005).
Néanmoins, plusieurs antibiotiques connus peuvent présenter d'autres activités biologiques comme par exemple la céphalosporine qui lorsque combinée à un anticorps monoclonal présente une activité anti tumorale contre l'adénocarcinome du poumon (Vrudhula et al. , 1993).
L'importance des champignons comme producteurs de métabolites bioactifs a connu une grande croissance durant les années 1980-1990, en raison de l'intérêt fascinant des champignons endophytes et marins (Imhoff, 2016). L'inventaire des molécules naturelles reste incomplet et les découvertes de nouvelles structures et de nouvelles fonctions se poursuivront au fur et à mesure que des sources de produits naturels sous-explorées seront évaluées.
2.2. Nouvelles sources de molécules fongiques
Lorsque les chercheurs accèdent à de nouveaux environnements avec une diversité biologique nouvelle ils sont confrontés à des produits naturels originaux. D’ailleurs, l'exploration de l'environnement marin a eu un effet profond sur la chimie des produits naturels et a conduit à des nouveaux projets de recherche, aussi bien dans les laboratoires privés que dans les laboratoires universitaires.
2.2.1. Les champignons marins
Pendant longtemps, les champignons ont été considérés comme une forme de vie fondamentalement terrestre. Au cours des dernières décennies, ce concept a commencé à être
11 Chapitre I. Étude bibliographique révisé en fonction des preuves émergentes que ces microorganismes sont également répandus dans l'habitat marin. De nouvelles espèces isolées à partir de substrats marins ont été signalées à plusieurs reprises (Jones & Pang, 2012). L'attention des chercheurs sur le terrain tend souvent à être axée sur les espèces marines obligatoires, définies pour leur capacité à se développer et à sporuler exclusivement dans un habitat marin (Kohlmeyer & Kohlmeyer, 2013). Néanmoins, il est vrai que de nombreuses espèces trouvées en mer sont déjà connues en milieu terrestre, ce qui rend leur placement dans une catégorie « marine facultative » plus appropriée (Overy et al. , 2014).
Le terme de « champignon dérivé du milieu marin » remonte aux années 1990 (Christophersen et al. , 1998; Wang et al. , 1997). En principe, le terme « dérivé de la mer » ou « d’origine marine » indiquent simplement l'emplacement dans le milieu marin. Malheureusement, dans certains cas, le mot « marin » semble avoir été rattaché aux souches isolées pour justifier que la recherche avait accompli un objectif marin ou que l'organisme producteur pourrait être différent de l'équivalent terrestre génotypiquement apparenté (Overy et al. , 2014).
Il est évident que le simple isolement d'une souche à partir d'un substrat marin n'implique pas une véritable adaptation d'un champignon à se développer dans ces conditions particulières. En revanche, cet aspect devient secondaire lorsque l'on considère la découverte et l'exploitation de composés bioactifs et, en vue de cet objectif, la polyvalence écologique des champignons marins "facultatifs" les introduit parmi les ressources naturelles les plus précieuses, méritant d'être mieux caractérisées génétiquement et biochimiquement (König et al. , 2006; Nicoletti & Trincone, 2016).
Bien que ces souches marines soient mises en avant comme une source nouvelle et inexplorée chimiquement, il existe peu de données comparatives pour tester l'hypothèse selon laquelle la recherche d'autres champignons, principalement les Ascomycètes ou Basidiomycètes, donnerait autant des nouveaux produits que les espèces des groupes terrestres associés génétiquement (Majik et al. , 2016).
Au cours des 15 dernières années, le nombre de publications décrivant des métabolites provenant de champignons isolés du milieu marin (animaux, algues, sédiments des estuaires et d'habitats de
12 Chapitre I. Étude bibliographique transition terrestres-marins, comme les mangroves par exemple) ne cesse de progresser (Overy et al. , 2014; Pang et al. , 2016) (Figure I.3).
Figure I.3 : Nombre de publications par année (Scopus) qui comprennent l'association des mots « champignon dérivé de milieu marin » ou « champignon isolé d’une éponge » dans le titre, le résumé ou les mots clés. La ligne de tendance exponentielle a été appliquée aux points de données réels (R 2 = 0,95 si 2014 est exclu). D’ap rès Overy et al . (2014).
Néanmoins, rarement dans ces rapports, les auteurs se demandent si les organismes producteurs de métabolites dépendent réellement de l'environnement marin ou si des souches apparentées génétiquement de la même espèce provenant d'un habitat terrestre pourraient produire les mêmes composés dans des conditions de fermentation identiques.
Toutefois, dans une étude récente portant sur l’ analyse des métabolites produits par 150 souches de Penicillium et Talaromyces provenant de sources marines, la moitié des composés décrits étaient isolés et caractérisés pour la première fois, en comparaison avec des souches terrestres. Les métabolites présentaient des activités biologiques, principalement liées à la cytotoxicité et leur action antiproliférative contre des cellules cancéreuses de mammifères (Nicoletti & Trincone, 2016).
Cette remarque indique non seulement une fois de plus que l’environnement marin est un mi lieu propice à la découverte de nouveaux composés, mais introduit également le fait que les relations écologiques établies avec des organismes marins par des espèces qui sont habituellement signalées à partir d’environnements terrestres pourraient activer les voies biochimiques vers la synthèse de composés nouveaux.
13 Chapitre I. Étude bibliographique
La distribution géographique des champignons marins s'est montrée, avec l'avancée des études, être la plus diversifiée, démontrant la grande capacité d'adaptation de ces organismes aux différents habitats. Plusieurs travaux, notamment ceux des époux Kohlmeyer, pionniers dans le domaine, ont décrit la présence très répandue de ces microorganismes dans les différents habitats tels que les mangroves des côtes Africaine, Sud-Américaine, d’ Amérique Centrale et les océans Pacifique et Atlantique (Kohlmeyer, 1968, 1969, 1984, Kohlmeyer & Kohlmeyer, 1971, 1983, 2013).
D'autres travaux ont également été entrepris pour cataloguer la distribution des champignons marins en fonction de la source à partir de laquelle ils ont été isolés. Ce type d'analyse permet de révéler des zones qui n'ont pas fait l'objet de recherches, comme les eaux profondes, ou les pôles, et qui représentent des ressources précieuses pour les habitats fongiques sous-explorés et la découverte de nouveaux produits naturels (Bugni & Ireland, 2004).
Au début des années 2000, une étude a mis en évidence les principales origines des champignons marins (Bugni & Ireland, 2004). La distribution des champignons a été synthétisée graphiquement en fonction du nombre de genres distincts décrits à partir d'une source marine dans la littérature (Figure I.4).
14 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.4 : Distribution des métabolites de champignons d’origine marine en fonction de l’habitat . Les habitats présentant des faibles pourcentages ne sont pas représentés , d’après Bugni & Ireland (2004).
D'après le graphique, il est évident que les éponges et les algues représentent la plus grande diversité taxonomique. Aujourd’hui, plusieurs publications rapportent l’isolement et la caractérisation de champignons vivant associés aux tissus des invertébrés marins en général (Chen et al. , 2015a; Li & Wang, 2009; Liu et al. , 2016).
Les invertébrés marins et principalement les éponges, continuent d'être l'une des sources les plus importantes de souches fongiques par rapport aux algues ou aux sédiments (Rateb & Ebel, 2011). Il est suggéré que les champignons associés aux éponges pourraient jouer un rôle dans la biosynthèse des molécules bioactives utilisées comme défense chimique par leurs hôtes, comme des signaux chimiques pour la communication, ou comme inhibiteurs de la croissance d'autres organismes concurrents (Haygood et al. , 1999). Il est vrai que du fait que ces organismes vivent dans des écosystèmes complexes où ils rivalisent et communiquent avec d'autres organismes ils deviennent attrayants comme sources prometteuses de nouveaux métabolites bioactifs (Kohlmeyer & Kohlmeyer, 2013).
Il y a peu d'évolution sur l'origine des champignons pour lesquels des molécules ont été décrites. En effet, actuellement, encore environ 50 % des nouveaux composés décrits proviennent de
15 Chapitre I. Étude bibliographique champignons isolés d’organismes marins ( animaux et plantes) tandis que les autres composés proviennent de champignons isolés de sources non vivantes (Figure I.5). Cependant, l'étude des mangroves et des profondeurs des océans est plus récente (Jin et al. , 2016).
Figure I.5 : Nouveaux composés répertoriés entre 2014 et 2016 provenant de champignons marins en fonction des habitats, d’après Jin et al . (2016).
Les champignons marins ont été explorés plus intensément ces dernières années pour obtenir des composés nouveaux et biologiquement actifs, mais ils restent encore moins étudiés que les organismes terrestres. Néanmoins, parmi les champignons marins plusieurs cas sont également connus.
La céphalosporine C, qui a été initialement isolée pour la première fois d'une souche de Cephalosporium acremonium à partir d'une sortie d'égout au large des côtes de Sardaigne a joué un rôle clé dans la réduction des maladies infectieuses et la souffrance des personnes dans le monde depuis les cinq dernières décennies (Demain, 1999). Cependant, il s'agissait d'une découverte accidentelle et il a fallu encore 30 ans pour que les champignons dérivés du milieu marin fassent l'objet d'une étude plus systématique (Ebel, 2010).
Diverses études décrivent des composés produits par des champignons isolés du milieu marin tels que la néo-échinuline B et ses analogues, produits par une souche d’ Eurotium rubrum isolé à partir de sédiments d'eaux profondes au sud de l'océan Atlantique, et agissant en tant qu'inhibiteurs puissants d'un panel de virus grippaux comprenant des souches résistantes (Chen et al. , 2015b), ou encore le lunatin, un dérivé d'anthraquinone produit par une souche de Curvularia lunata isolée d'une éponge, qui possède une activité antimicrobienne contre Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus et Escherichia coli (Jadulco et al. , 2002).
16 Chapitre I. Étude bibliographique
Bien que de nombreux produits naturels bioactifs aient été identifiés durant ces dernières décennies (Christophersen et al. , 1998; Ebel, 2010; Karuppiah et al. , 2015; Kiran et al. , 2009; Kiuru et al. , 2014; König et al. , 2006; Majik et al. , 2016), il est évident que de nombreuses molécules attendent encore d'être découvertes. Cette hypothèse repose non seulement sur le fait que seul un petit nombre de souches aient été découvertes et cultivées, mais aussi sur de récents projets de séquençage du génomiques afin d'activer de nouvelles voies de biosynthèse normalement endormies dans certaines conditions de culture (Brakhage & Schroeckh, 2011).
La culture réussie d'une nouvelle souche fongique est souvent suffisante pour identifier de nouveaux produits naturels. Nous pouvons citer comme exemple l'isolement des arugosines G et H du champignon marin Emericella nidulans var. acristata (Kralj et al. , 2006). La culture de ce champignon a permis de décrire ces deux nouveaux composés, ainsi que des métabolites déjà connus dérivés de la benzophénone, liés biosynthétiquement aux xanthones. Ces arugosines ont montré une activité cytotoxique modérée face à des lignées de cellules tumorales.
Un autre exemple est la pestalone, un antibiotique puissant contre une souche de Staphylococcus aureus résistante à la méthicilline et contre Enterococcus faecium résistant à la vancomycine. La pestalone a été isolée lors d'une co-culture du champignon marin Pestalotia sp. (isolé de la surface d'une algue brune) avec une α-protéobactérie marine, encore inconnue (souche CNJ-328) (Cueto et al. , 2001). La molécule a aussi présenté une cytotoxicité in vitro modérée pendant un screening sur 60 lignées de cellules tumorales humaines à l’Institut National du Cancer aux États-Unis d’Amérique .
Enfin, un dernier exemple concerne les analogues de la gliotoxine isolés à partir d'une souche de Penicillium sp. (JMF034) dérivée du milieu marin où les composés contenant une liaison disulfure présentaient des propriétés inhibitrices puissantes d'une histone méthyltransférase (HMT) (Sun et al. , 2012). D'autres études rapportent également l'activité inhibitrice et antiproliférative de la gliotoxine contre une lignée de cellules HUVEC avec une CI 50 de 40 ng/mL (Evidente et al. , 2014).
Ces dernières années, la recherche sur la chimie des champignons marins a connu un réel essor en raison de la nécessité de rechercher des composés possédant une activité biologique avec des applications pharmaceutiques possibles ou d'autres propriétés utiles économiquement tel que la
17 Chapitre I. Étude bibliographique cosmétique en tant qu'inhibiteur de la production de mélanine (Imhoff, 2016; Jadulco et al. , 2002; Kim, 2011; Sun et al. , 2012).
Indépendamment de l'approche adoptée, l'objectif de toute recherche de molécules bioactives est la découverte d'une nouvelle entité chimique ou, la variante, d'une molécule possédant une activité biologique précédemment non rapportée.
Idéalement, la nouvelle molécule devrait appartenir à une nouvelle classe chimique, avec un mécanisme d'action différent de celui des composés structurellement liés ou qu'elle ne soit pas structurellement liée aux molécules agissant sur la même cible. La molécule doit représenter une variante améliorée au sein d'une classe connue, c'est-à-dire qu'elle présente certains avantages (puissance, stabilité, aptitude à l'hémi-synthèse, etc...) par rapport à des composés structurellement similaires (Monciardini et al. , 2014).
Au cours des dernières années, un nombre significatif de nouveaux métabolites ayant un potentiel pharmacologique ont été découverts à partir des champignons marins, tels que des polycétides, des alcaloïdes, des peptides, des protéines, des terpènes, des lipides et des hybrides qui présentent des activités biologiques importantes en tant qu'anticancéreux, anti tumoral, antiprolifératif, cytotoxique, photo protecteur, ainsi que des propriétés antibiotiques et anti-fouling (Rateb & Ebel, 2011).
Les champignons marins ont fourni une variété de métabolites pharmacologiques potentiels et représentent donc une ressource précieuse de nouveaux candidats à médicaments (Jin et al. , 2016).
Plusieurs revues ont été publiées pour répertorier les molécules à activité biologique potentielle. Une première publication datant du début des années 2000 a recensé 272 nouvelles structures jusqu'en 2002, ensuite, jusqu'en 2009 plus de 200 molécules ont été recensées et en 2012 et 2013, respectivement 288 et 302 molécules (Blunt et al. , 2015b; Faulkner, 2001; Saleem et al. , 2007; W. Blunt et al. , 2014).
D’après une étude récente (Jin et al. , 2016) prenant en compte les nouvelles molécules décrites depuis 2014, sur les 153 composés, les alcaloïdes et les polycétides sont les plus largement représentés (50 % environ), suivis des peptides, terpènes, lactones et stéroïdes (Figure I.6).
18 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.6 : Nouveaux composés de champignons marins par classes chimiques, d’après Jin et al . (2016).
Il est à noter qu'il existe une probabilité plus élevée de découvrir une variante d'une molécule au sein des classes chimiques qui ont été peu explorées par criblage, hémi-synthèse et/ou synthèse totale. En revanche, en général dans les classes très explorées de produits microbiens, cette probabilité est faible, à moins qu'un grand nombre de molécules puissent être rapidement évalué (Monciardini et al. , 2014).
Dans ce contexte, les lipides des champignons marins restent des molécules peu étudiées et pourraient donc constituer une nouvelle source de composés à activité biologique.
3. Les lipides des champignons marins 3.1. Les lipides : Définition générale
Le terme "lipide" bien qu'il ait une tendance à avoir une compréhension généralisée, n’ a pas de définition largement acceptée par la communauté scientifique. Généralement, les ouvrages décrivent les lipides comme étant un groupe de composés naturels, qui ont en commun une solubilité dans les solvants organiques tels que les hydrocarbures, le chloroforme, le benzène, les éthers et les alcools et sont peu solubles dans l'eau (Christie & Han, 2010). Mais cette définition est trop restrictive car beaucoup de substances qui sont maintenant largement considérées comme des lipides peuvent être presque aussi solubles dans l'eau que dans les solvants organiques (Christie, 2013). Au début des années 2000, les lipides ont été définis de manière plus large comme étant des substances biologiques qui sont généralement hydrophobes et, dans de nombreux cas, solubles dans des solvants organiques (Smith, 2000). Des définitions plus précises sont possibles lorsque les lipides sont considérés d'un point de vue structurel et/ou
19 Chapitre I. Étude bibliographique biosynthétique. Ainsi, Christie propose de conserver la définition qu’il a proposé à la fin des années 1980 (Christie, 1987) définissant les lipides comme étant “les acides gras et leurs dérivé s, et les substances reliées biosynthétiquement ou fonctionnellement à ses composés ». En 2005, le "International Lipid Classification and Nomenclature Committee " a proposé une nouvelle définition basée sur les voies métaboliques qui décrit les lipides comme de « petites molécules hydrophobes ou amphipathiques qui peuvent provenir entièrement ou en partie de condensations à base de carbanion de thioesters de cétoacyle (acides gras, polycétides, etc.) et / ou par des condensations à base de carbocation d'unités d'isoprène (prénols, stérols, etc) (Fahy et al. , 2005, 2011) (Figure I.7).
Figure I.7 : Mécanismes de la biosynthèse des lipides. La biosynthèse des lipides contenant des cétoacides et des isoprènes se fait soit par l’intermédiaire d’un carbanion soit par extension de la chaîne avec le carbocation. Figure extraite de Fahy et al . (2011).
Les lipides incluent donc une gamme diversifiée de composés, acides gras, caroténoïdes, triglycérides ou triacylglycérols, terpènes, stéroïdes, sphingolipides, phospholipides, avec une aussi grande diversité de solubilité selon leur polarité ce qui les distinguent des autres groupes majeurs de molécules biologiques, à savoir les acides nucléiques, les acides aminés et les glucides.
20 Chapitre I. Étude bibliographique
Les lipides peuvent être subdivisés en groupes plus petits appelés "classes lipidiques", dont chacune comprend des composés qui ont en commun certains aspects de leur structure moléculaire et qui possèdent des propriétés chimiques et physiques similaires (Weete, 2012). Par exemple, ils peuvent être subdivisés en groupes «simples» et «complexes». Les lipides simples sont ceux qui produisent au plus deux types de produits par hydrolyse (par exemple, les acides gras, les stérols et les acylglycérols) et les lipides complexes donnent trois produits ou plus (par exemple glycérophospholipides et glycosphingolipides).
Ils peuvent également être séparés en lipides saponifiables (glycérides, phospholipides,..) et non saponifiables (stéroïdes) (“IUPAC Gold Book,” 2016) .
La classification issue de la définition de l’ International Lipid Classification and Nomenclature Committee divise les lipides en huit classes : acyle gras, glycérolipides, glycérophospholipides, sphingolipides, stérols, prénols, saccharolipides et polycétides (Fahy et al. , 2011; Huang & Freter, 2015); contenant encore des classes et sous-classes distinctes de molécules. Ce schéma de classification qui organise les lipides en catégories bien définies couvrant les sources eucaryotes et procaryotes est également applicable aux lipides synthétiques (artificiels) (Fahy et al. , 2005).
Dans le cadre de cette thèse nous allons nous intéresser plus particulièrement à quelques-unes de ces classes lipidiques décrites ci-après : les acyles gras contenant les acides gras; les glycérophospholipides, les stérols, les glycérolipides incluant les glycosyldiacylglycérols et les glycosphingolipides. Ces-derniers, glycosyldiacylglycérols et glycosphingolipides seront communément appelés « glycolipides » dans la suite de ce manuscrit.
3.2. Les principales classes lipidiques étudiées
Il est important de rappeler que la classification adoptée actuellement par les organismes internationaux met en avant non seulement le caractère polaire ou apolaire des molécules décrites mais également les voies de biosynthèses communes pour ces composés.
3.2.1. Les acyles gras
Les acyles gras sont un groupe diversifié de molécules synthétisées par élongation d'une série répétitive de groupes méthylène (association de l'acétyl-CoA avec des groupes malonyl-CoA, ou méthylmalonyl-CoA) qui confèrent un caractère hydrophobe à ces molécules. La présence de
21 Chapitre I. Étude bibliographique groupements cycliques et des hétéroatomes (l'oxygène, l'azote et le soufre, par exemple) contribuent à la diversité de cette classe ou la première sous-classe comprend les acides gras, mais elle contient également des alcools, des aldéhydes, des amines et des esters. La chaîne des acides gras représente le principal bloc de construction lipidique de lipides complexes (“LIPID MAPS Lipidomics Gateway,” n.d.; Voelker, 2008; Fahy et al. , 2011).
Dans le cadre de cette thèse nous allons nous intéresser particulièrement à une sous-classe de cette catégorie : les acides gras.
Les acides gras sont des acides mono carboxyliques aliphatiques, habituellement à chaîne linéaire. La définition la plus large inclut toutes les longueurs de chaîne, mais la plupart des acides gras naturels ont des longueurs de chaîne entre C4 et C22, le C18 étant le plus commun (Gunstone et al. , 2012; Sul & Smith, 2008) (Tableau I.2). Les structures d'acides gras naturels reflètent leur biosynthèse commune (la chaîne est construite par blocs de deux carbones) et ils peuvent présenter des insaturations.
Tableau I.2. Structures et noms systématiques, triviaux et abrégés de certains acides gras communs, d’après Gunstone et al. (2012).
Les acides gras représentent une importante forme de stockage de l'énergie : la dégradation des acides gras par la β-oxydation conduit à la libération d'énergie (de grandes quantités d'ATP) générant en plus du CO 2 et de corps cétoniques (Schulz, 2008; Sul & Smith, 2008; Tvrzicka et
22 Chapitre I. Étude bibliographique al. , 2011). Ils constituent également des composants structuraux essentiels des membranes, ils sont utilisés pour modifier et réguler les propriétés de nombreuses protéines, et ils jouent un rôle important en tant que molécules de signalisation dans la régulation métabolique (Sul & Smith, 2008).
Les acides gras sont également des éléments de base pour les glycérolipides, les glycérophospholipides et autres lipides.
Plus de 1 000 acides gras sont connus avec différentes longueurs de chaîne, positions, configurations et nombres d'insaturations, et une gamme de substituants supplémentaires au long de la chaîne aliphatique (Harlapur & Shimbo, 2013). Cependant, quelques acides gras sont majoritaires dans la nature, parmi eux l’acide palmitique, l'acide oléique et l ’acide linoléique représentent environ 80 % des huiles et des graisses les plus utilisées (Sul & Smith, 2008; Weete, 2012).
3.2.2. Les glycérolipides
La classe des glycérolipides comprend les molécules qui ont un squelette basé sur la molécule de glycérol.
Les acides gras sont liés par une liaison ester au glycérol et remplace ainsi les hydroxyles de l'alcool. Ces remplacements peuvent occuper une, deux ou trois positions de la molécule de glycérol en les substituant par des chaînes grasses (Figure I.8).
Figure I.8 : Représentation des esters d'acides gras : schéma de substitution des hydroxylations du glycérol par des chaînes d'acides gras (R; R 1; R 2; R 3).
23 Chapitre I. Étude bibliographique
Pour la plupart des cellules, les molécules dans ce groupe sont la source de carburants métaboliques qui conduisent toutes les réactions biochimiques essentielles nécessaires pour le fonctionnement normal des cellules.
Il est intéressant de souligner que de nombreuses molécules lipidiques bioactives différentes, telles que les diacylglycérols (ou diglycérides), régulent différentes voies de signalisation dans les cellules (Kasimova et al. , 2014). Les diacylglycérols sont non seulement liés au développement des organismes, plus précisément en rapport avec la croissance cellulaire, quand cette molécule rentre dans la composition des membranes cellulaires mais elle agit également en tant que second messager (Carrasco & Mérida, 2007).
Quand les trois substitutions sont effectuées, ces molécules reçoivent le nom de triacylglycérols, la principale forme de stockage d'énergie dans les organismes (Berg et al. , 2002; Sul & Smith, 2008).
Les triacylglycérols sont assez répandus dans les microorganismes eucaryotes tels que les levures et les moisissures (Feofilova et al. , 2015; Weete, 2012; Yoon & Rhee, 1983). Ils se présentent sous forme d'inclusions cytoplasmiques ou de gouttelettes lipidiques dans les organismes. Comme chez les autres organismes eucaryotes, les triacylglycérols semblent fonctionner comme une réserve d'acides gras (Stahl & Klug, 1996).
3.2.3. Les glycérophospholipides
Les glycérophospholipides, communément appelés « phospholipides », sont le composant principal des membranes biologiques agissant comme une barrière pour l'entrée des composés dans les cellules (Voelker, 2008) et leur métabolisme est très complexe (Fahy et al. , 2011).
Le groupe de tête forme une région hydrophile et détermine le type de glycérophospholipide (Figure I.9). Ce groupe de tête attachée au groupement phosphate peut être la choline, l'éthanolamine, la serine, l'inositol ou le glycérol, par exemple (Vance & Vance, 2008).
24 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.9 : Structures des principaux glycérophospholipides. Adapté de Christie & Han (2010).
Les chaînes latérales d'acide gras donnent un caractère hydrophobe (diacylglycérol) contrairement à la tête qui porte des charges. Cette propriété amphipathique des glycérophospholipides est à la base de la compartimentation cellulaire.
25 Chapitre I. Étude bibliographique
La taille, la forme, la charge et la composition chimique des différentes classes de glycérophospholipides jouent un rôle dans la formation et le maintien de la bicouche membranaire des cellules, ainsi que des membranes entourant des organelles et des vésicules subcellulaires (Brügger, 2014; Vance & Vance, 2008). La biosynthèse (voie CDP-DAG et voie de Kennedy) et la dégradation (différentes phospholipases) des glycérophospholipides sont régulées par différentes voies de signalisation (Huang & Freter, 2015). Les glycérophospholipides seront appelés phospholipides dans la suite du manuscrit, par souci de simplicité
3.2.4. Les sphingolipides
Les sphingolipides sont une famille complexe de composés qui partagent un squelette de base sphingoïde synthétisé de novo à partir de la sérine et d'un acyl-CoA lié à une chaîne grasse (“LIPID MAPS Lipidomics Gateway,” n.d.) . Depuis cette base, ils peuvent être ainsi convertis en céramides, puis en glycosphingolipides et autres espèces (Figure I.10). Cette caractéristique structurelle commune se retrouve chez tous les animaux, les plantes et les champignons, chez certains organismes procaryotes et les virus (Weete, 2012).
Figure I.10 : Métabolisme des sphingolipides. Les enzymes impliquées dans le métabolisme des sphingolipides sont la céramidase (CASE), la céramide kinase (CK), la céramide-1-phophosphate phosphatase (CPP), la céramide synthase (CS), la dihydrocéramide désaturase (DD), la galactosylcéramide synthase (GalCS), la glucosylcéramide synthase (GCS), la glucosylcéramidase (Gcase), la sphingomyélinase (SMase) et la sphingomyéline synthase (SMS). Extrait de Huang et Freter (2015).
26 Chapitre I. Étude bibliographique
En plus de jouer un rôle de lipides de structure de la membrane cellulaire, les produits du métabolisme des sphingolipides tels que les céramides, les céramide-1-phosphates, les sphingosines, les sphingosine-1-phosphates et les glycosylcéramides agissent comme des molécules lipidiques bioactives dans la signalisation apoptotique et pharmaco-résistante (Merrill Jr., 2008).
Ces molécules peuvent être divisées en plusieurs classes principales : les bases sphingoïdes et leurs dérivés simples (comme le 1-phosphate), les bases sphingoïdes avec un acide gras à liaison amide (par exemple, les céramides) et les sphingolipides plus complexes avec des groupes attachés via des liaisons phosphodiester (les phosphosphingolipides), via des liaisons glycosidiques (les glycosphingolipides simples et complexes tels que les cérébrosides et les gangliosides) et d'autres groupes (tels que les phosphono- et arséno-sphingolipides) (“LIPID MAPS Lipidomics Gateway,” n.d.; Merrill, 2011; Merrill Jr., 2008) . Quelques sphingolipides sont représentés dans la Figure I.11.
Figure I.11 : Exemple de structures de sphingolipides simples et plus complexes. Source : Lipid Library (“Sphingolipids - AOCS Lipid Library,” n.d.) .
27 Chapitre I. Étude bibliographique
Les sphingolipides ont tendance à s'associer entre eux, ainsi qu'avec le cholestérol et certaines catégories de protéines, telles que celles fixées à la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'un glycosylphosphatidylinositol (Merrill Jr., 2008).
3.2.5. Les stérols
Les stérols sont produits par la voie du mévalonate qui donne naissance à une large gamme de produits tels que les ubiquinones, les caroténoïdes (précurseurs de la vitamine A), les hormones stéroïdiennes (précurseurs de la vitamine D) et les vitamine E et K par exemple (Buhaescu & Izzedine, 2007; Summons et al. , 2006).
Les stérols sont des molécules qui se retrouvent dans pratiquement tous les grands groupes d'organismes, des bactéries aux humains. Ces molécules, tels que le cholestérol chez l'homme et ses dérivés, sont une composante importante des lipides membranaires avec principalement les glycérophospholipides (Yaoita et al. , 2015).
Les stéroïdes, qui contiennent également la même structure à quatre noyaux stérane à cycles fusionnés, ont des rôles biologiques différents comme des hormones et des molécules de signalisation (“LIPID MAPS Lipidomics Gateway,” n.d.) (Figure I.12).
Figure I.12. Structure générale d'un stéroïde.
Excepté certains groupes importants d'organismes comme les insectes et les nématodes parasites qui ne peuvent pas produire ces molécules, les stérols sont largement distribués dans la nature, puisqu'ils sont nécessaires à la croissance et/ou la reproduction de pratiquement tous les organismes eucaryotes (Weete, 1980). Les stérols ont tendance à être produits en tant que
28 Chapitre I. Étude bibliographique molécules finales, comme par exemple chez les champignons sous forme d'ergosterol (Dupont et al. , 2012).
Bien que largement étudiée en ce qui concerne la synthèse du cholestérol et ses implications dans les maladies cardiovasculaires, ces dernières années, la voie du mévalonate est devenue un sujet stimulant puisqu'un grand nombre d'études expérimentales et cliniques suggèrent qu'elle pourrait avoir un intérêt pour d'autres pathologies humaines (Buhaescu & Izzedine, 2007). Ainsi, ces molécules essentielles à la croissance cellulaire et à la différenciation semblent être des cibles thérapeutiques potentiellement intéressantes pour de nombreux domaines de recherche en cours comme l'oncologie, les troubles auto-immuns, l'athérosclérose et la maladie d'Alzheimer (Hernández-Perera et al. , 1998; Cannon et al. , 2004; Sparks et al. , 2006).
3.3. Métabolisme lipidique
Les principales fonctions biologiques des lipides incluent leur rôle central dans le stockage d'énergie, en tant que composants structurels des membranes cellulaires, et en tant qu'importantes molécules de signalisation (Gunstone et al. , 2012). Le métabolisme lipidique est régulé par de multiples voies de signalisation, et génère une variété de molécules lipidiques bioactives. Ces molécules tel que des acides gras, des céramides, des sphingolipides, et des stérols sont impliquées dans l'activation ou la régulation de différentes voies de signalisation (Currie et al. , 2013; Gorin et al. , 2012; Hannun & Obeid, 2008). Ces molécules participent à la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la croissance cellulaire, la prolifération, la différenciation, la survie, l'apoptose, l'inflammation, la motilité, l'homéostasie membranaire, la réponse chimio thérapeutique et la résistance aux médicaments, par exemple (Krycer et al. , 2010; Zechner et al. , 2012). Des molécules lipidiques bioactives peuvent favoriser l'apoptose modulant la perméabilité de la membrane mitochondriale et en activant différentes enzymes (Muñoz- Pinedo, 2012).
29 Chapitre I. Étude bibliographique
4. Activités biologiques des lipides des champignons marins
Actuellement, bien qu'aucun médicament à base de molécules isolées d'un champignon marin ne soit actuellement commercialisé, des activités cytotoxiques, neuro-actives, antibactériennes, antivirales et antifongiques prometteuses ont été trouvées à partir de lipides de champignons marins (Ebel, 2010; Jiang et al. , 2004; Jin et al. , 2016; Wang et al. , 2008a).
Deux nouveaux analogues de cérébrosides, les flavicérébrosides A et B (Figure I.13), ont été isolés à partir du mycélium d'une souche d’ Aspergillus flavipes , isolée de l'anémone de mer Anthopleura xanthogrammica , ainsi que deux cérébrosides D et C déjà connus. Les quatre composés ont montré une activité cytotoxique contre la lignée cellulaire KB allant de 16,7 µM à 26,6 µM (Jiang et al. , 2004).
Figure I.13 : Structure des quatre cérébrosides, Flavicérébrosides A (1), B (2) C (4) et D (3), isolés d’une souche marine d’ A. flavipes. Extrait de Jiang et al . (2004).
En 2010, les asperamides A et B (Figure I.14) ont été isolées d'une souche endophyte d’ Aspergillus niger associée à une algue brune récoltée sur la côte chinoise. Les molécules ont été isolées en même temps que deux intermédiaires de l'aflatoxine. L'asperamide A a présenté une activité antifongique modérée (Ø 12 mm à 100 µg/mL) contre une lignée de Candida albicans (Zhang et al. , 2007). En 2013, une nouvelle étude a rapporté l'activité
30 Chapitre I. Étude bibliographique stimulante de l'asperamide B contre les cellules Natural Killer T-cell (NKT) (Chaudhary et al. , 2013).
Figure I.14 : Structures chimiques des composés isolés : 1 : Asperamide A ; 2 : Asperamide B. Extrait de Zang et al . (2007).
Au cours de la recherche des composés bioactifs provenant des champignons isolés de la mer Rouge, des souches de Penicillium ont été isolées, une en particulier à partir d'un tunicier. L'étude de cette souche de Penicillium a permis l'isolement et la caractérisation de deux nouveaux cérébrosides, les pénicillosides A et B (Figure I.15) (Murshid et al. , 2016). Le pénicilloside A a révélé une activité antifongique vis-à-vis du parasite C. albicans (Ø 23 mm à 100 µg/mL). De plus, le pénicilloside B présentait une activité antibactérienne contre S. aureus et E. coli (Ø 19 mm, et 20 mm à 100 µg/mL, respectivement). Les deux composés ont montré par ailleurs une faible activité contre des cellules HeLa (cancer du col de l'utérus) avec des CI 50 supérieures ou égales à 70 μM.
31 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.15. Structures chimiques des composés isolés : 1 : Pénicilloside A ; 2 : Pénicilloside B. Extrait de Murshid et al . (2016).
En ce qui concerne les composés stéroïdiens, une étude de 2006 a rapporté l'isolement de 5 stérols (Figure I.16), dont un nouveau, à partir d'une souche marine de Penicillium . Les cinq composés ont été évalués pour leur cytotoxicité contre les cellules cancéreuses du foie humain
(Hep G), et la plupart d'entre eux ont présenté une activité importante avec des CI 50 comprises entre 23 µM et 48 µM. Le nouveau composé (1), l'ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7- tetraol(3β, 5α, 6β, 7α, 22E), a présenté la plus forte cytotoxicité parmi les composés évalués avec une CI 50 de 23 µM (Sun et al. , 2006).
32 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.16. Structure chimique des composés isolés : Ergosta-8 (14), 22-diene-3,5,6,7-tetraol (3, 5, 6, 7, 22E) (1), ergosta-8(9), 22-diene-3,5,6,7-tetraol (3, 5, 6, 7, 22E) (2), 5,8-epidioxy-24(S)- methylcholesta-6, 22-diene-3-ol (3), 5,8-epidioxy-24(S)-methylcholesta-6,9(11), 22-triene-3-ol (4), 3,5,9-trihydroxyergosta-7,22-diene-6-one (5). Extrait de Sun et al . (2006).
Une autre étude sur les stérols des champignons marins a démontré que six nouveaux dérivés de l'ergostérol ont été identifiés ainsi que quatre autres déjà connus (Figure I.17) dans une souche de Rhizopus sp. isolée du bryozoaire Bugula sp. recueilli dans la baie de Jiaozhou en Chine. Les composés ont été évalués pour leurs activités cytotoxiques sur plusieurs lignées cellulaires P388,
A549, HL-60 et BEL-7420. Le composé 4 a présenté les plus fortes CI 50 sur les 4 lignées testées, 1,4 µM; 4,9 µM; 0,3 µM; 5,2 µM, respectivement (Wang et al. , 2008a).
33 Chapitre I. Étude bibliographique
Figure I.17. Structure chimique des composés isolés : 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7,15-dione (1), 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8,14,22-tetraen-7-one (2), 3β,15β -Dihydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22- trien-7-one (3), 3β,15α -Dihydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-one (4), 3β -Hydroxyl-(22E, 24R)-ergosta- 5,8(14),22-trien-7,15-dione (5), 5α,8α -Epidioxy-23,24(R)-dimethylcholesta-6,9(11),22-trien-3β -ol (6), 3β -hydroxyl- (22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one (7), 5α,8α -epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,22-dien-3β -ol (8), 5α,8α - epidioxy-23,24(R)-dimethylcholesta-6,22-dien-3β -ol (9), and 5α,8α -epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,9(11),22-trien- 3β -ol (10). Extrait de Wang et al . (2008).
Plus récemment, en 2014, une étude pionnière a été conduite dans le domaine du Quorum Sensing (QS), processus de communication cellule-cellule entre les bactéries. Soixante-quinze souches appartenant à 21 genres fongiques différents ont été isolées à partir de récifs, de lacs salins et de la rhizosphère de la mangrove. L'activité inhibitrice de ces souches sur le QS a été évaluée sur Chromobacterium violaceum CVO26. Quatre d’entre elles ont présenté une activité à des concentrations allant de 500 à 50 μg/mL ( Sarocladium LAEE06; Fusarium LAEE13; Epicoccum LAEE14 et Khuskia LAEE21). Les résultats suggèrent qu'une combinaison de métabolites secondaires fongiques et d'acides gras pourrait être responsable des activités observées (Martín-Rodríguez et al. , 2014).
34 Chapitre I. Étude bibliographique
5. Valorisation des lipides de champignons
Initialement, un intérêt croissant est apparu pour rechercher des microorganismes d'origine fongique cultivables potentiellement producteurs d'AGE à l’échelle industrielle et cela dès les années 1980. Certaines espèces cultivées, pour lesquelles les lipides peuvent dépasser 25 % en poids de la biomasse, sont considérées comme des organismes oléagineux (Murphy, 1990).
Cette recherche a débuté sur les champignons terrestres où des nombreuses espèces ont ainsi été explorées, balayant la totalité du règne fongique. Les travaux de référence de Brennan et al . (1975) et de Lösel (1988) puis de Stahl & Klug (1996), ont permis de montrer que, comme les autres organismes vivants, les champignons sont constitués, de façon générale, majoritairement par les acides palmitique (16:0), palmitoléique (16:1), stéarique (18:0), oléique (18:1) et linoléique (18:2). Par ailleurs, la plupart des champignons inférieurs sont caractérisés par la présence importante d’A GPI (Acide Gras Polyinsaturés) contrairement aux champignons supérieurs pour lesquels, seules certaines espèces contiennent l’acide alpha -linoléique, précurseur biosynthétique de la voie des AGPI « oméga-3 ». Néanmoins des études montrent que certaines esp èces d’Ascomycètes peuvent produire des AGE, en fonction de la source de carbone utilisée dans le milieu de culture (Pohl et al. , 1997).
La majorité de ces études fondamentales ont été réalisées sur des souches terrestres. Ainsi, d'une certaine manière, il n'est pas surprenant que le nombre de composés bioactifs augmente constamment lorsqu'un contexte jusqu'i ci insuffisamment exploré, telle que l’origine marine, a fait l'objet d'investigations systématiques. De tels composés sont biosynthétisés pour s'adapter à des habitats marins spécifiques. Une des conséquences d'une telle adaptation peut être le changement (qualitatif et/ou quantitatif) dans la composition de lipides produits par des souches de champignons marins.
Pourtant, depuis les travaux des Kohlmeyers (1968, 1977, 1984; 1971) et l’avènement de la mycologie marine, le nombre des publications relatives à l’étude des champignons marins n’a cessé d’augmenter. D’une part, de nombreuses publications ont concerné l’étude des communautés fongiques marines de diverses régions et habitats afin de mieux comprendre leur rôle dans les écosystèmes marins (Kohlmeyer & Kohlmeyer, 1983, 2013) . D’autre part, des publications concernent le fort potentiel de production de métabolites secondaires originaux avec
35 Chapitre I. Étude bibliographique un nombre croissant de structures nouvellement décrites ces dernières décennies (Blunt et al. , 2015b; Bugni & Ireland, 2004).
À l’inverse, les études sur les lipides et les acides gras des champignons marins sont encore insuffisantes. Nous pouvons toutefois mentionner les travaux de Cooney (1993), de Devi et al . (2006) et de Khudyakova (2009) concernant une série d’Ascomycètes ou encore les travaux d'Oleinikova (2013b, 2013a, 2015) sur des souches diverses de champignons marins filamenteux. Bien que les compositions en acides gras observées dans ces travaux soient proches de celles des champignons terrestres, ces travaux ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’étudier les champignons marins comme source d’acides gras d’intérêt, tels que les AG PI et les acides gras conjugués. Il s’agit là des principales publications qui ont porté sur l’étude des acides gras de champignons marins et ce domaine de recherche est appelé à un approfondissement dans l’avenir.
Suivant cet objectif, les champignons d'origine marine étant peu explorés ils pourraient s’av érer représenter une source intéressante de lipides originaux pouvant constituer une source d'acides gras valorisables en santé et nutrition.
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Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
37 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
Contexte de l'étude
Les lipides présentent une immense diversité combinatoire et structurelle. Cette vaste gamme d'entités chimiques uniques encode pour des fonctions distinctes au sein des systèmes biologiques où ils jouent un rôle essentiel dans la structure cellulaire et l'organisation, les événements de signalisation, le trafic et le tri des macromolécules (Gunstone et al. , 2012). Avec tant de rôles, il n'est pas étonnant que les lipides constituent la moitié du cerveau humain en poids sec (Piomelli et al. , 2007).
Les lipides sont produits, transportés et reconnus par de nombreuses enzymes, protéines de liaison et récepteurs. Une analyse complète des molécules lipidiques est prépondérante pour comprendre la physiologie cellulaire et les pathologies (Watson, 2006). Par conséquent, la biologie des lipides est devenue une cible de recherche majeure de la révolution post- génomique et de la biologie des systèmes (Fahy et al. , 2011).
Cependant, l'étude du rôle des lipides est compliquée compte tenu de cette diversité structurelle et par les défis techniques considérables associés à la distinction des espèces lipidiques dans des échantillons d’extraits complexes . Néanmoins, «l'analyse à grande échelle des profils lipidiques dans les cellules et les tissus» (Piomelli et al. , 2007) a été rendue possible grâce au développement des approches de la "lipidomique" (Spener et al. , 2003).
1. Lipidomique
Le mariage réussi entre la chimie et la haute technologie a débuté à l'ère encore jeune des "omics" qui se concentrent sur des analyses efficaces de macromolécules. Le mot «lipidome» est utilisé pour décrire le profil lipidique complet dans une cellule, un tissu ou un organisme et est un sous-ensemble du «métabolome» qui comprend également les trois autres classes principales de molécules biologiques: les acides aminés, les sucres et les acides nucléiques (Wenk, 2005).
Il existe cependant des nouveaux «omics» comme la métabolomique et la glycomique qui traitent respectivement des flux métaboliques et de la structure des glucides, à l'aide de la
38 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et de la spectrométrie de masse (Spener et al. , 2003).
La lipidomique est un domaine de recherche relativement récent qui a bénéficié grandement des derniers développements technologiques en spectrométrie de masse et en bioinformatique (Bou Khalil et al. , 2010). Malgré toutes les approches et les techniques développées et mises en place pour l'étude d'autres molécules biologiques, les lipides demeurent encore peu explorés.
Ces méthodes analytiques couplées à la reconnaissance du rôle des lipides dans de nombreuses maladies métaboliques comme l'obésité, l'athérosclérose, l'AVC, l'hypertension et le diabète (Fahy et al. , 2011) s'est traduit par la création de ce champ en pleine expansion qui vient compléter les énormes progrès réalisés en génomique et en protéomique.
L'objectif de la lipidomique est donc, de comprendre comment ces molécules sont produites, et comment elles travaillent ensemble. Ces avancées dans les applications de la lipidomique pourraient permettre d'analyser la production, la variabilité, le métabolisme des lipides, leur participation dans la physiologie cellulaire mais également leurs fonctions dans les processus d'infection liés aux pathologies (Watson, 2006; Zheng et al. , 2006).
Afin de faciliter la communication internationale sur les lipides, une classification complète des lipides ainsi qu’une plate-forme commune, appelée LipidMaps , compatible avec les exigences informatiques ont été développées pour traiter les quantités massives de données générées (Sud et al. , 2007).
Ce système de classification moderne et robuste ouvre la voie à la création d'une infrastructure bioinformatique complète comprenant des bases de données de lipides et de gènes associés aux lipides (Fahy et al. , 2007).
39 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
2. Déréplication
La création d'outils pour représenter les structures lipidiques et d'interfaces pour analyser des données expérimentales et des méthodologies d'étude des lipides a permis d’appliquer le concept de "déréplication" (Corley & Durley, 1994) à la lipidomique.
Les études de déréplication par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectroscopie de masse haute résolution (LC-HRMS) et par résonance magnétique nucléaire (RMN) pe rmettent d’ établir le profil chimique des extraits bruts qu’ils soient d’origine microbienne, mais également obtenus à partir de matrices végétales ou animales (Tawfike et al. , 2013).
La déréplication, déjà utilisée en métabolomique est donc appliquée dans ce contexte afin de relever des défis informatiques et jouer un rôle dans l'établissement de la lipidomique comme domaine important dans cette nouvelle façon de faire de la recherche.
En plus de LipidMaps , d'autres bases de données telles que LipidBank , LipidBlast , KEGG , AntiMarin , AntiBase , mais également Dictionary of Natural Products , et plus spécifiquement pour le milieu marin MarinLit répertorient des milliers de molécules déjà connues ce qui permettrait la pré-identification des métabolites à un stade précoce facilitant l'isolement de molécules bioactives non décrites dans la littérature.
Suite à l'acquisition des données, des logiciels tels que MZmine, sont utilisés pour effectuer le traitement et l'analyse de ces données pour trouver des caractéristiques significatives exprimées et pour permettre d'observer et de mettre en évidence les complexités et les variations des paramètres. Les molécules sont identifiées à l'aide d'enregistrements de masse à haute résolution et comparées aux différentes bases de données en ligne ou internes (Pluskal et al. , 2010).
Le profilage lipidique a trouvé son application dans le criblage d'extraits de microorganismes ainsi que dans l'isolement et dans la culture de souches microbiennes afin de chercher de produits naturels bioactifs pour ensuite tester leurs activités pharmacologiques.
40 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
3. Criblage des profils lipidiques par approche OSMAC
Quand la quantité d'échantillons à étudier est importante des méthodes de criblages sont mises en place afin de diminuer le temps passé sur chaque exemplaire. Il existe plusieurs méthodes, des plus simples au plus sophistiquées, pour cribler des extraits bruts obtenus à partir des organismes et d'évaluer les différentes activités biologiques.
Parmi les méthodes classiques non basées sur la spectrométrie de masse, la séparation et l'analyse des lipides ont été traditionnellement effectuées sur des gels ou du papier, en électrophorèse unidimensionnelle ou bidimensionnelle. D'autres méthodes courantes d'analyse des lipides incluent la chromatographie en couche mince (CCM), la chromatographie en phase gazeuse (CPG), la chromatographie liquide haute performance (CLHP), la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les techniques de spectrométrie de masse (Bou Khalil et al. , 2010).
L'analyse des lipides pose un défi constant en raison de leur grand nombre et de leur diversité structurelle. En 2008, quelques études ont estimé que le nombre théorique d'isoformes lipidiques distinctes était proche de 200 000 (Oresic et al. , 2008; Yetukuri et al. , 2008). Bien qu'il ne soit pas encore possible d'analyser tous ces lipides à la fois, de nouvelles innovations technologiques basées sur la spectrométrie de masse élargissent le nombre et les types de lipides qui peuvent être analysés (Han & Gross, 2003; Guan & Wenk, 2006; Gross & Han, 2009). La spectrométrie de masse offre sensibilité et résolution élevées pour la caractérisation des profils lipidiques globaux et les méthodes basées sur l'analyse des spectres de masse peuvent être couplées à plusieurs des différentes méthodes mentionnées auparavant, CPG ou CLHP, par exemple.
L'approche lipidomique permettant de cribler le potentiel des molécules lipidiques originaires des champignons marins et la création d'une méthode d’analyse automatisée des extraits lipidiques par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CLHP-SMHR) est fondamentale pour sélectionner les souches aux
41 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
profils atypiques, qui pourraient représenter une source de molécules originales en poursuivant l’app roche déréplicative mettant en avant leurs activités biologiques.
Les informations obtenues à partir d'un ensemble de données lipidomiques peuvent efficacement établir des procédés de culture et de production à petite échelle qui seront finalement étendus à un système à grande échelle, tout en maintenant ou en améliorant la synthèse des composés souhaités.
Approche OSMAC
Le défi majeur étant celui d'accéder à la fois aux voies biosynthétiques codées dans les génomes des microorganismes non cultivables, ainsi que celles des microorganismes cultivables qui ne sont pas exprimées dans des conditions de culture standard (Challinor & Bode, 2015). La modification systématique des conditions de croissance, par exemple le milieu de culture, la température, le pH ou les conditions physiques de croissance (fermenteur, milieux solide ou semi-solide), par l'approche OSMAC (One Strain Many Compounds ), peut induire la production de nouveaux métabolites (Bode et al. , 2002).
L'approche OSMAC est basée sur l'emploi d'un milieux de culture dans lequel il faut changer une variable, la source de carbone ou d'azote par exemple, créant des changements significatifs dans la production des métabolites (Bode et al. , 2002). Les résultats obtenus sont ensuite comparés aux chiffres connus, des milieux de culture traditionnels/standards originaux, en termes d'efficacité de croissance et de profil lipidique ce qui permettrait par conséquent de choisir les meilleures conditions de culture afin de passer à la culture en grande échelle.
La teneur en lipides des microorganismes peut varier selon les conditions de mise en culture comme par exemple la modification du pH, la température, la proportion entre le carbone et l'azote disponible dans le milieu, la concentration en oxygène et en éléments nutritifs (Li & Wang, 1997).
En conditions de stress azoté, la production lipidique intracellulaire d'une levure peut augmenter significativement selon les souches (Hassan et al. , 1996), ce qui optimise le
42 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
rendement. Zavala-Moreno et al . (2014) ont également démontré qu'il existe une relation entre la source d'azote, sa quantité disponible dans le milieu de culture et la production glycolipidique dans le basidiomycète Ustilago maydis . Le milieu sans source d'azote a présenté une plus forte production lipidique totale ainsi qu'une capacité émulsifiante plus importante.
L'obtention d'un "profil lipidique" à partir de l'analyse d'un extrait brut lipidique et de son chromatogramme permet d'étudier la composition et l'abondance des lipides qu'il contient, ce qui peut être utilisé pour comparer les changements dans le temps et en réponse aux différentes conditions de culture.
Néanmoins, ces améliorations dans les conditions de culture sont difficiles à prédire, car les variations des profils obtenus et les changements diverses (morphologique ou autres) doivent être faciles à observer. Aujourd'hui, il est évident, avec l'avancée des recherches, que de nombreux micro-organismes ont besoin de signaux environnementaux diverses pour leur croissance et la production de métabolites, ce qui rend la recherche parfois un peu plus complexe (Bode et al. , 2002; Challinor & Bode, 2015).
43 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
4. Conclusion
La nouvelle classification des champignons est le fruit du progrès de la génétique moléculaire et de l'ouverture des voies à l'inclusion de l'analyse de l'ADN dans la taxonomie, ce qui a permis aux chercheurs d'accéder aux études phylogénétiques pour enfin contribuer à la modification de la classification du règne des Fungi .
Les organismes fongiques sont depuis longtemps utilisés comme une source d'alimentation mais sont aussi une source de composés bioactifs, que ce soit de façon empirique ou prouvé scientifiquement. La médecine chinoise compte parmi son panel de "remèdes naturels", plusieurs extraits de champignons. Ces composés bioactifs à potentiel pharmacologique appartiennent à différentes classes chimiques : terpènes, alcaloïdes, lactones, peptides, quinones, polycétides, lipides, mais aussi des dérivés azotés et sulfurés de ces classes. Ces molécules peuvent présenter des activités liées à des actions antifongiques, antibactériennes, antivirales, cytotoxiques et immunosuppressives mais aussi dans le domaine agricole avec des activités phytotoxiques, herbicides ou pesticides.
L'importance des champignons comme producteurs de métabolites bioactifs a connu un grand essor pendant les années 1980-1990, en raison de l'intérêt croissant pour les champignons endophytes et marins. D’ailleurs, l'exploration de l'environnement marin a eu un effet profond sur la chimie des produits naturels et a conduit à de nouveaux projets de recherche. Bien que les bioactivités des métabolites des champignons marins révèlent des niveaux intéressants pour un certain nombre de cibles cliniques pertinentes, elles ne sont pas bien représentées dans les pipelines de médicaments et aucune d'entre elles n'est actuellement en étude clinique.
Il est important de souligner que la probabilité de découvrir des nouvelles molécules est plus élevée au sein de classes chimiques qui ont été peu explorées jusqu'à présent. Dans ce contexte, les lipides des champignons marins constituent une source potentielle non négligeable de nouveaux composés.
44 Chapitre II. Analyse lipidique à haut débit
Les méthodes analytiques ont fortement progressées dû aux avancées technologiques dans les applications de la spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse a été couplée avec succès à plusieurs méthodes déjà existantes telle que les chromatographies en phase gazeuse et liquide ce qui permet l'identification partielle ou totale des espèces lipidiques mais également leur quantification.
L'intégration de l'analyse statistique des données acquises ont également été facilitées par les progrès effectués en bioinformatique. Il est donc important de coupler ces nouvelles technologies aux recherches de composés bioactifs afin une vision globale du profil lipidique des souches étudiées. Il est important également d'intégrer le profilage lipidique et les évaluations pharmacologiques proposées qui apporteront des réponses quant à la cytotoxicité des extraits obtenus pour les différentes souches évaluées.
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Chapitre III. Matériel et méthodes
46 Chapitre III. Matériel et méthodes
Plusieurs matériels et méthodes communs aux différents chapitres du manuscrit sont abordés ci-dessous tel que la liste des souches et leur entretien, les consommables, les méthodes d'extraction et de purification, ainsi que les méthodes analytiques et les protocoles des tests biologiques.
1. Les cultures fongiques 1.1. Le matériel biologique
Les souches utilisées ont été sélectionnées au sein de la mycothèque du laboratoire Mer Molécule Santé (MMS) et ont été référencées par un code interne (MMS + numéro de la souche). L'identification du matériel biologique a été effectuée principalement par l'analyse morphologique macroscopique et microscopique. La classification générale des souches étudiées est présentée dans le tableau suivant (Tableau III.1).
Tableau III.1. Classification phylogénétique actuelle pour les genres des souches fongiques étudiées, d’après Hibbett et al. (2007) et McLaughlin et al. (2015).
Classification phylogénétique actuelle Règne Fungi Division Ascomycota Sous-division Pezizomycotina Classe Sordariomycetes Eurotiomycetes Ordre Hypocreales Eurotiales Famille Hypocreaceae Incertae sedis Bionectriaceae Trichocomaceae Genre Trichoderma Acremonium Clonostachys Aspergillus Penicillium
Pour certaines souches, l'identification a été complétée par une étude moléculaire par l'amplification des zones des espaceurs transcrits internes (ITS) suivie de leur séquençage. Les séquences de l'ADN ribosomal correspondant aux zones codant pour les sous-unités 5,8S, 18S et 28S ont ensuite été alignées et comparées aux séquences déjà répertoriées dans la base de données GenBank. Le Tableau III.2 liste toutes les souches étudiées avec leur code correspondant pour la mycothèque MMS ainsi que l'indication de l'endroit de collecte et le
47 Chapitre III. Matériel et méthodes
type de prélèvement (bivalves, sédiments). La référence GenBank est mentionnée, le cas échéant.
Tableau III.2. Tableau général des souches sélectionnées et citées dans les différents chapitres.
Type de Référence Souche Espèce Origine géographique prélèvements GenBank MMS815 Aspergillus terreus Port Giraud Sédiments (5cm) non MMS13 Trichoderma harzianum Le Croisic Coques JQ653065 MMS19 Trichoderma citrinoviride Le Croisic Coques JQ608473 MMS58 Trichoderma longibrachiatum La Tara Moules JQ653055 MMS151 Trichoderma longibrachiatum Tharon Moules JQ653057 MMS510 Trichoderma reesei La Couplasse Sédiments (5cm) GU947793 MMS639 Trichoderma atroviride La Couplasse Eau de mer JQ653056 MMS755 Trichoderma capilare Port du Collet Sédiments de surface JQ653068 MMS852 Trichoderma capilare Port Giraud Sédiments de surface JQ653070 MMS912 Trichoderma sp. La Tara Sédiments de surface JQ653073 MMS975 Trichoderma ghanense Le Croisic Sédiments de surface GU947792 MMS1541 Trichoderma pleuroticola Bonne Anse Coques JQ653064 MMS42 Penicillium expansum Le Croisic Sédiments (5cm) JN794527 MMS330 Penicillium ubiquetum Port Giraud Moules non MMS388 Penicillium ligerum La Prée Moules non MMS404 Penicillium brevicompactum Le Croisic Coques non MMS460 Penicillium canescens Le Croisic Sédiments de surface non MMS646 Penicillium sp. La Couplasse Sédiments de surface non MMS540 Acremonium sp. La Louippe Sédiments de surface non MMS594 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments de surface non MMS621 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments (5cm) non MMS700 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments de surface non MMS713 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments (5cm) non MMS714 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments de surface non MMS862 Acremonium sp. Port Giraud Sédiments de surface non MMS868 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments de surface non MMS884 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments (5cm) non MMS887 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments de surface non MMS889 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments de surface non MMS895 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments (5cm) non MMS901 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments (5cm) non MMS950 Acremonium sp. La Couplasse Sédiments de surface non MMS1120 Acremonium sp. Port du Bec Sédiments (5cm) non MMS1090 Clonostachys rosea Port du Bec Sédiments de surface KR011118
48 Chapitre III. Matériel et méthodes
Les souches sélectionnées sont représentatives des principaux genres de la mycothèque MMS et ont été isolées a u cours de différentes campagnes de collecte et d’identification de la microfaune de l’estuaire de la Loire (Ruiz, 2007; Sallenave-Namont, 1999). Les souches ont été conservées dans des tubes inclinés sur milieu DCA (Tableau III.3) et incubés à l'étuve à 27 °C jusqu'à recouvrement de leur superficie par les champignons. Plusieurs séries de tubes ont été ensemencées afin de constituer un stock suffisant de culture.
1.2. Les milieux de culture
Différents milieux de culture ont été utilisés afin de comparer la production et les profils lipidiques pour les différentes souches. Ce sont des milieux classiques semi-empiriques couramment utilisés pour la culture de champignons. Tous les milieux ont été stérilisés à la chaleur humide (autoclave, 121 °C, 20 min) et la distribution dans les boîtes de Petri a été faite en condition d'asepsie totale sous hotte à flux laminaire.
1.3. Cultures fongiques pour l’étude OSMAC sur les lipides totaux
Une suspension obtenue après le lavage des conidies avec l'eau distillée stérile a été concentrée à 1 × 10 6 spores/mL. Cette suspension de spores a été ensuite utilisée pour inoculer des boites de Petri de 10 cm de diamètre (0,5 mL par boite) pour 7 milieux solides préparés à base d'eau de mer (Tableau III.3). Les expérimentations ont été effectuées en triplicatas. Tous les milieux ont été stérilisés à la chaleur humide (autoclave, 121 °C, 20 min) et la distribution dans les boîtes de Petri a été faite sous hotte à flux laminaire.
49 Chapitre III. Matériel et méthodes
Tableau III.3. Composition des 7 milieux de cultures utilisés pour l'étude lipidique par approche OSMAC.
Composition (g/L) CYA DCA KMS MEA PDA YES MES
CuSO 4, 5H 2O 0,005 - - 0,005 0,005 0,005 0,005
FeSO 4, 7H 2O 0,01 ------
MgSO 4, 7H 2O 0,5 - 2,4 - - 0.5 0.5
ZnSO 4, 7H 2O 0,01 - - 0,01 0,01 0,01 0,01 KCl 0,5 ------
K2HPO 4 1 ------
NaNO 3 3 ------
NH 4NO 3 - - 2,4 - - - -
Tris buffer (R-NH 2) - - 1,21 - - - - Peptone - - - 1 - - - Digestion enzymatique de - 10 - - - - - caséine Extrait de levure 5 - - - - 20 - Extrait de malt - - - 20 - - - Extrait de moule ------20 Extrait de pomme de terre - - - - 4 - - Glucose - 40 5 20 20 - - Saccharose 30 - - - - 150 150 Agar 15 15 20 20 15 20 20 Eau de mer (L) 1 1 1 1 1 1 1
1.4. Cultures fongiques pour l’étude OSMAC sur les glycolipides
Les souches ont été cultivées sur trois milieux de culture standards (DCA, PDA et MEA) qui ont été modifiés en fonction du type de sucre additionné dans sa composition. Traditionnellement, le type de sucre utilisé dans la composition des milieux de culture est le glucose ou le saccharose. Un changement a été opéré dans la composition de ces 3 milieux de culture standards donnant ainsi les milieux GCA, MEGA, PGA (Tableau III.4).
50 Chapitre III. Matériel et méthodes
Tableau III.4. Composition des milieux de culture utilisés pour l'approche OSMAC pour la production des glycolipides.
Composition (g/L) DCA GCA MEA MEGA PDA PGA
CuSO 4, 5H 2O - - 0,005 0,005 0,005 0,005
ZnSO 4, 7H 2O - - 0,01 0,01 0,01 0,01 Peptone - - 1 1 - - Digestion enzymatique de 10 10 - - - - caséine Extrait de malt - - 20 20 - - Extrait de pomme - - - - 4 4 de terre Glucose 40 - 20 - 20 - Galactose - 40 - 20 - 20 Agar 15 15 20 20 15 15 Eau de mer (L) 1 1 1 1 1 1
1.5. Cultures fongiques pour le criblage
Les souches ont été ensemencées dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre contenant du milieu DCA (Dextrose-Caséine-Agar), composé d’eau de mer synthétique à 36 g/L et de milieu de culture DCA à 65 g/L. Après ensemencement par contact, les cultures ont été incubées à l'étuve à 27 °C, pendant 10 jours, jusqu'à recouvrement de leur superficie par le champignon.
2. Arrêt des cultures
Le prélèvement de la biomasse fongique a été réalisé à l'aide d'un scalpel pour les cultures en milieu gélosé (Figure III.1). Les biomasses fongiques ont été pesées à température ambiante. L’équivalent de 50 % du volume de méthanol (MeOH) total pour la première extraction a été immédiatement ajouté afin d’éviter de possibles dégradations des lipides par les enzymes fongiques.
51 Chapitre III. Matériel et méthodes
Figure III.1 : Culture en boite de Petri Acremonium sp. MMS884 (A), Trichoderma citrinoviride MMS19 (B) et Clonosachys rosea MMS1090 (C). Prélèvement de C. rosea de la gélose (D).
3. Extraction et analyse lipidique 3.1. Extraction classique par macération
L'extrait brut lipidique est obtenu par double macération de la biomasse fraîche selon le protocole suivant :
Un ratio de 6 mL de solvant, l'équivalent de 4 mL de MeOH et 2 mL de dichlorométhane
(CH2Cl 2) ont été rajoutés par gramme de biomasse. Le contenu a été mis à macérer sur agitateur (Bioblock Scientific 74403) à 100 rpm pendant 2h. Suite à la première macération, la biomasse récupérée a été à nouveau mise en contact avec 4 mL de CH 2Cl 2 et 2 mL de MeOH dans les mêmes conditions. Le rapport final pour ce mélange de solvants (CH 2Cl 2:MeOH) est de 1:1. Après l'étape de filtration, les deux phases organiques sont transvasées ensemble dans une ampoule à décanter et 40 % du volume final en eau (0,08 % KCl) sont ajoutés pour le partage liquide/liquide. La phase organique est récupérée, séchée et pesée. La phase aqueuse a
été rincée deux fois avec 50 % du volume final en CH 2Cl 2. Les phases organiques ont été regroupées, séchées à l'évaporateur rotatif à 40 °C et pesées, permettant ainsi, l’obtention de l’extrait brut lipidique (EBL). La biomasse fongique délipidifiée séchée a été ensuite pesée. Les valeurs des extraits bruts lipidiques obtenus pour chaque milieu de culture ont été rapportées à la biomasse délipidifiée et exprimées en pourcentage (masse/masse). Les extraits secs sont conservés à –20 °C.
52 Chapitre III. Matériel et méthodes
3.2. Séparation en classes lipidiques
Les extraits bruts lipidiques (EBL) sont séparés en classes selon leur polarité et affinité avec le solvant. Cette procédure chromatographique basée sur les travaux de Kates (1986), est réalisée sur une colonne ouverte de gel de silice (phase normale, Kieselgel, porosité 60Å, granulométrie 0,063 - 0,2 mm). Le gel de silice est préparé avec 20 mg de silice par mg d’extrait dans du CH 2Cl 2. L'échantillon est dissous dans un minimum de CH 2Cl 2 et déposé en tête de colonne. Trois solvants de polarité croissante sont utilisés pour éluer les différents lipides. Un ratio a été mis au point entre les solvants et la masse pour chaque milligramme d’EBL : 2,5 mL de CH 2Cl 2 pour éluer les lipides neutres (LN) ; 2 mL d’acétone pour les glycolipides (GL) et 2 mL de MeOH pour les phospholipides (PL).
3.3. Chromatographie sur couche mince (CCM)
L'analyse des EBL ainsi que celle des classes lipidiques ont été réalisées par CCM. Des plaques de gel de silice (20 cm 20 cm) de 200 µm d’épaisseur sur support aluminium ont été utilisées (60 F254 SDS). Les échantillons ont été déposés à la même concentration (1 mg/mL) à l'aide d'un capillaire de 10 μL. Les phases mobiles utilisées étaient choisies en fonction des classes lipidiques analysées (Tableau III.5). Les témoins utilisés sont l’huile de sésame, le cholestérol et l’acétate de cholestérol pour les EBL et les LN ; l’extrait d’épinard (contenant des glycéroglycolipides) et un galactocérébroside pour les GL.
Après pulvérisation à la vanilline sulfurique (1 %) ou à l’orcinol, les plaques sont placées 5 min à l'étuve à 110 °C pour la révélation.
53 Chapitre III. Matériel et méthodes
Tableau III.5. Phases mobiles, témoins et révélateurs utilisés en CCM
Fractions Phases mobiles Témoins Révélateurs analysées
Hexane/éther diéthylique/acide acétique Cholestérol 1 Vanilline LN (50:50:1 ou 60:15:0,75) Acétate de chole stérol 1 sulfurique (v/v/v) Huile de sésame
CH Cl /MeOH 2 2 Galactocérébroside 1 Orcinol et GL (90:10 ou 85:15 ou 80:20) MGDG/DGDG/SQDG 2 Vaniline (v/v) 1 : Fournisseur SIGMA ; 2 : extrait d’épinards ; MGDG/DGDG/SQDG : mono- et digalactosyldiacylglycérol et sulfoquonovosyldiacylglycérol
4. Isolement et purification des glycolipides
Après fractionnement de l’EBL sur colonne ouverte (c f. Chapitre III.3.2). La fraction acétonique, enrichie en GL, a été ensuite purifiée par plusieurs étapes chromatographiques. Une seconde colonne ouverte sur gel de silice est réalisée. L'élution est effectuée par un gradient discontinu d'un mélange de CH 2Cl 2/MeOH variant de 100:0 à 80:20 (CH2Cl 2/MeOH, v/v).
Le choix du solvant et les proportions des différentes phases mobiles ont été déterminés par des optimisations préalables montrant que la majorité des cérébrosides était éluée dans les fractions allant de 90:10 à 80:20 (v/v) avec ce même mélange de solvant en se basant sur les protocoles de Farokhi et al . (2013, 2010). Une troisième colonne ouverte sur gel de silice est réalisée. L'élution est effectuée par un gradient discontinu d'un mélange de CH 2Cl 2/MeOH variant de 95:5 à 80:20 (CH 2Cl 2/MeOH, v/v).
Le suivi du fractionnement est réalisé par chromatographie sur couche mince (CCM) (cf . Chapitre III.3.3) ainsi que par des analyses en spectrométrie de masse basse résolution (spectromètre de masse LCQ TM ). Les fractions présentant des profils similaires ont été regroupées pour ensuite être ré-fractionnées selon le même procédé jusqu'à l'obtention d'un produit pur.
54 Chapitre III. Matériel et méthodes
5. Isolement et purification des stérols
Pour la production de stérols, des cultures fongiques ont été réalisées sur le milieu de culture YES. Des boîtes de Petri (20 cm de diamètre, contenant 125 mL de milieu) ont été incubées à 27 °C sous lumière naturelle pendant 10 jours. Après extraction de la biomasse, les lipides totaux ont été séparés comme décrit précédemment ( cf . Chapitre III.3.2). La fraction contenant le stérol d'intérêt a été purifiée sur colonne ouverte en gel de silice en utilisant du CH 2Cl 2 comme phase mobile. Le fractionnement est effectué tous les 5 mL jusqu’à épuisement de l’échantillon. La fr action d'intérêt a été ensuite purifiée par CCM préparative (hexane / éther diéthylique / acide acétique : 50/50/0.75/v/v/v) sur des plaques F254 de gel de silice (cf . Chapitre III.3.3). La bande correspondante au stérol a été prélevée et remise en suspension sur plaque chauffante à 40 °C dans un mélange CH 2Cl 2/MeOH (80/20, v/v). La pureté des fractions a été contrôlée par CCM et par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM). La structure a été ensuite déterminée et confirmée par analyse des spectres HR-ESI-MS et RMN.
6. Saponification
La saponification est une réaction chimique qui permet de rompre les liaisons esters d’une molécule. Les corps gras sont hydrolysés en milieu basique par l'hydroxyde de potassium (KOH) à une température comprise entre 80 °C et 100 °C. La température élevée sert à accélérer la réaction de saponification car c'est un facteur cinétique. La saponification des corps gras produit du glycérol et un mélange de carboxylate de potassium qui constitue le savon (Figure III.2).
Figure III.2 : Schéma de l'équation de la réaction de saponification d’un triglycéride .
55 Chapitre III. Matériel et méthodes
Une partie des extraits bruts obtenus après l’extraction est transvasé dans un tube avec 1,5 mL de solution de KOH éthanolique à 2 mol/L et chauffée à reflux à 80 °C pendant 1 h 30. Après refroidissement de la solution, 1 mL d’eau et 2,5 mL d’hexane sont ajoutés. Le tout est centrifugé 5 min à 1236 g pour obtenir deux phases, une phase organique qui servira pour l’acétylation des stérols et une phase aqueuse contenant les acides gras qui peuvent être convertis en esters méthyliques d’acides gras et en N-Acyl pyrrolidides pour analyse.
La phase organique est ensuite séchée en ajoutant deux pointes de spatules de Na 2SO 4 anhydre, puis centrifugée 5 min à 1236 g. Le surnageant est prélevé et transvasé dans un tube préalablement taré. Le solvant est évaporé et la fraction insaponifiable obtenue est pesée. Après ajout de dichlorométhane, 500 µL sont p rélevés et placés dans un vial pour l’analyse des stérols libres en CPG-SM ; le reste est évaporé à sec à 45 °C sous azote pour l’acétylation.
6.1. Acétylation des composés lipidiques
L’acétylation est une réaction chimique qui permet l’ajout d’un groupement fo nctionnel acétyle dans un composé organique.
Pour l’acétylation des composés lipidiques (stérols et GL), 500 µL d’anhydride acétique et 2 gouttes de pyridine sont ajoutés sur les échantillons à sec puis chauffés à reflux à 80 °C pendant 1 h 30.
Cinq cent microlitres d’eau distillée sont ajoutés afin de solubiliser l’anhydride acétique et la pyridine, puis 3 mL de CH 2Cl 2 sont ajoutés pour extraire les composés acétylés. Le mélange est centrifugé et la phase aqueuse est enlevée. Deux millilitres d’ HCl 2 mol/L sont ajoutés, le mélange est agité, dégazé puis centrifugé à nouveau.
Après avoir enlevé la nouvelle phase aqueuse, 2 mL de solution saturée de NaHCO 3 sont ajoutés. Le mélange est agité, dégazé puis centrifugé. La phase aqueuse est enlevée et la phase organique est séchée par ajout de deux pointes de spatules de Na 2SO 4 anhydre. Après centrifugation, le surnageant est prélevé , séché et pesé. L’extrait est solubilisé dans du CH 2Cl 2 à concentration de 1 mg/mL et placé dans un vial pour l’analyse en CPG-SM.
56 Chapitre III. Matériel et méthodes
6.2. Esters méthyliques d'acides gras (EMAG)
Cinq cent microlitres d’HCl 2mol/L sont ajoutés afin d’obtenir les AGL à partir des sels d’ acides gras (AG) issus de la saponification. Puis ils sont extraits par deux fois 3 mL de
CH 2Cl 2. La phase organique contenant les AGL est récupérée et évaporée.
Les AGL sont solubilisés dans 2 mL de MeOH chlorhydrique (6 %). Les tubes fermés sont chauffés au bain à sec à 90 °C pendant 1 h. Après refroidissement à température ambiante,
1 mL d'eau distillée et 2 mL de CH 2Cl 2 sont ajoutés. Après mélange, la solution est centrifugée à 1236 g pendant 5 minutes. La phase organique est récupérée et transvasée dans un tube taré. La phase aqueuse est rincée deux fois à l’aide de 2 mL de CH 2Cl 2. Les phases organiques sont regroupées, évaporées sous azote à 40 °C puis pesées, permettant d’obtenir les esters méthyliques d’acides gras (EMAG).
6.3. N-Acyl pyrrolidides (NAP)
Une partie des EMAG obtenus précédemment est transférée dans un tube en verre et évaporée à sec pour quantifier la masse de départ, ensuite 3 00 μL de pyrrolidine et 50 μL d'acide acétique sont ajoutés. Le tube fermé est chauffé à 85 °C pendant 1 h. Après refroidissement à température ambiante, 500 μL d'eau distillée et 4 mL de CH 2Cl 2 sont ajoutés et le tube est centrifugé (1236 g, 5 min). La phase organique est récupérée, évaporée sous azote puis pesée avant analyse en CPG-SM).
7. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM)
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) est utilisée pour analyser les molécules qui sont volatilisées sous l’effet de la chaleur. L’échantillon est chauffé, volatilisé et les molécules sont séparées par chromatographie et ionisés par un flux d’électron qui a pour effet de fragmenter la molécule avant d’être analysée par le spectromètre de masse. Le résultat de l’analyse est exploité et peut être comparé à une base de données afin de déterminer la composition du produit.
57 Chapitre III. Matériel et méthodes
Les dérivés lipidiques ont été analysés à l'aide d'un appareil de CPG-SM (Hewlett Packard HP 6890 - GC System / HP 6890 – 70 eV) équipé d'une colonne SLB-5TM (60 m 0,25 mm 0,25 μm). Les températures de l'injecteur et du détecteur sont respectivement 250 °C et 280 °C. Le gaz vecteur était l'hélium à un débit de 1 mL/min et le solvant delay est de 9 minutes.
7.1. Analyse des EMAG et des NAP
Cette méthode d’analyse permet de connaî tre la longueur et le type de la chaîne (présence d’insaturations, de méthylations, d’hydroxylations) des AG. Pour l'analyse des EMAG, le gradient de température de la colonne débute par un palier à 170 °C pendant 4 min, puis d’une augmentation de la température de 3°C/min jusqu'à 300 °C (cycle = 58,33 min). Pour les NAP, après un palier à 200 °C pendant 4 min, la température augmente de 3 °C/min jusqu'à 310 °C durant 20 min (cycle = 50,67 min). Pour les deux types d’analyse, le volume injecté est de 1 μL en mode splitless .
7.2. Analyse des stérols et des acétates de stérol
Suite à la saponification, l’analyse de la fraction insaponifiable, composée principalement de stérols, permet d’estimer la formule brute de ces composés et de proposer la position des ins aturations quand elles sont présentes. L’acétylation des stérols et l’analyse de leur fragmentation et du pic moléculaire permet de déceler principalement une insaturation en position D5, ce qui permet de confirmer l’identification des stérols. Les paramèt res utilisés sont les mêmes pour l’analyse des stérols libres et des acétates de stérols.
La température initiale du four est 200 °C puis elle est augmentée de 3 °C/min jusqu’à 310 °C, température maintenue pendant 5 min. La durée d’une analyse est 41,67 m in.
8. Spectrométrie de masse basse et haute résolution
Afin d'analyser les molécules obtenues suite aux purifications, deux méthodes spectrométriques ont été utilisées en basse résolution (LCQTM, Thermo Fisher Scientific) et haute résolution (Micromass Zab Spec Tof - Shimadzu).
58 Chapitre III. Matériel et méthodes
En ce qui concerne la masse basse résolution, l'appareil est équipé d'une source d'ionisation à éléctronébulisation (ou electrospray, ESI) couplée à un analyseur de masse à trappe d'ions quadripôle (IT). La température du capillaire est de 160 °C.
Les spectres de masse haute résolution sont obtenu après ionisation par éléctronébulisation (HR-ESI-MS) (température de source ionique 200 °C).
Les deux méthodes d'analyse ont utilisé un mode d'ionisation positif, et l'accélération de la source ionique est de 4,5 kV. Les échantillons sont préparés dans du méthanol pour HPLC. Ce solvant présente une faible conductivité, ainsi qu'une faible tension de surface.
9. Analyses RMN
Les spectres RMN 1H et 13 C ainsi que les spectres 2D-RMN ont été obtenus sur un spectromètre RMN Bruker Avance-400 avec une triple prolifération TBI multi nucléaire dans
CDCl 3 à 400,13 MHz et 100,62 MHz respectivement, en référence à un étalon interne de tétraméthylsilane. Les déplacements chimiques et les constantes de couplage ont été exprimés en δ (ppm) et Hz respectivement. Les multiplicités sont indiquées comme singulet (s), doublet (d), doublet de doublets (dd), doublet de triplet (dt), triplet (t), multiplet (m).
10. Méthode d'analyse des lipides par CLHP-SM 10.1. Méthode chromatographique
En vue de mettre en place le protocole de profilage des extraits lipidiques par CLHP-SM, une méthode de profilage générique par chromatographie en phase inverse (Knittelfelder et al. , 2014) a été adapté à l’appareillage utilisé (UFLC -IT-TOFMS, Ultra Fast Liquid Chromatography coupled to Ion Trap Time of Flight Mass Spectrometry, Shimadzu) et aux besoins de profilage des phospho- et glycolipides, ainsi qu’aux LN et AG libres. Les extraits bruts une fois séchés et pesés sont solubilisés dans de l’isopropanol (IPA) à une concentration de 1 mg/mL pour ensuite être injectés en CLHP-SM.
59 Chapitre III. Matériel et méthodes
La séparation des constituants de l’extrait est effectuée par HPLC (UFLC Shimadzu) couplé à un analyseur hybride de type trappe ionique et spectromètre de masse à temps de vol (LC-IT- TOFMS Shimadzu) équipée d’une colonne Kinetex C18, 150 2,1 mm, 2,6 µm (Phenomenex). Le protocole consiste en un gradient d’élution composé d’eau (A), de méthanol (B) et d’isopropanol (C), chaque solvant modifié par 0,1 % d’acide formique et 10 mM de formiate d’ammonium. Les solvants A et B étaient continuellement en proportions équivalentes tout le long du gradient. Le gradient d’élution déb utait avec 25 % d’IPA pendant 5 min. De 5 à 13 min, la proportion d’IPA augmentait jusqu’à 45 %. De la 13ème à la 45ème minute, la proportion du solvant C augmentait pour atteindre 75,27 % ; puis une phase de nettoyage de la colonne commençait avec 100 % d’IPA pendant 7 minutes et enfin les 7 dernières minutes consistaient en un rééquilibrage de la colonne avec 25 % d’IPA. Le spectromètre de masse à temps de vol ( ToF ) va permettre de détecter les molécules ayant un m/z compris entre 100 et 1200 Daltons (Da) . Le temps d’acquisition est de 10 msec et l’analyse dure en tout 59 min. Le débit est de 0,4 mL/min, la température de 60° C et le volume injecté de 2 µL à 1 mg/mL.
Pour l'analyse des extraits et des fractions lipidiques par CLHP-SM les solvants utilisés sont présentés dans le Tableau III.6.
Tableau III.6. Qualité des solvants utilisés pour l'obtention des profils lipidiques.
Solvant Qualité Marque Méthanol ULC/MS Acide formique (99 %) - Formiate d'ammonium - Biosolve Isopropanol LC/MS Eau ULC/MS
10.2. Analyse des données
Les fichiers de données brutes CLHP-SM ont été convertis en netCDF en utilisant le logiciel d’analyse fourni avec l’appareil (version 3.60 - Shimadzu). La détection automatique des pics
60 Chapitre III. Matériel et méthodes
a été réalisée en utilisant les paramètres sélectionnés selon l'analyseur HPLC-IT-TOFMS pour un « run » entre 0,7 et 40 min avec le logiciel MZmine 2 (Pluskal et al. , 2010). Des pics avec une largeur d'au moins 0,03 s et d’une intensité largement supérieure au bruit de fond institué à 35 000 points ont été pris en compte avec une tolérance de 15 à 30 ppm en m/z. Les pics détectés ont été déconvolués. Le filtrage des isotopes a été appliqué en utilisant le module "isotopic peaks grouper" avec des paramètres de tolérance ajustés à 0,1 s et 15 à 30 ppm. L'alignement des pics et le remplissage des espaces ( gap filling ) ont été réalisés avec une tolérance m/z de 15 ppm et une tolérance de temps de rétention (tR) de 0,1 min. Les pics détectés à partir d'échantillons blancs (solvant) et d'échantillons d'agar non inoculés ont été éliminés de la matrice générée.
Une analyse de données multivariée a été effectuée en utilisant SimcaP 13 (UMETRICS). Les pics d'intérêt ont été sélectionnés en fonction de leur importance variable en valeur de projection (VIP). L'analyse uni-variée des données a été effectuée sur Excel (Microsoft). Les caractéristiques d'intérêt ont été sélectionnées en fonction de leur taux de variabilité supérieur à 2 et inférieur à 0,5 avec une p-value inférieure à 0,01. Les pics d'intérêt mis en évidence par les deux approches ont été ensuite vérifiés dans les données brutes CLHP-SM.
10.3. Déréplication
L’identification des composés est faite grâce aux bas es de données LIPIDMAPS (Sud et al. , 2007) et LipidBlast (Kind et al. , 2013). La recherche de correspondance se fait sur le logiciel MZMine 2 pour les pics détectés ainsi que pour les isotopes. La prédiction de formules brutes (FB) a été effectuée sur les pics détectés avec un seuil de tolérance de 15 à 30 ppm.
11. Évaluation d'activité biologique 11.1. Test MTT – Viabilité cellulaire
Le test MTT est largement utilisé comme une méthode rapide et sensible pour le dépistage des médicaments anticancéreux ainsi que pour l'évaluation de la cytotoxicité de nouvelles molécules. Les principaux avantages du test MTT sont sa simplicité, sa rapidité et la lecture automatique des résultats avec un spectrophotomètre à microplaque. Le réactif utilisé de
61 Chapitre III. Matériel et méthodes
couleur jaune est le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tétrazolium, réf Sigma M5655-16) qui est réduit, par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan, un précipité de couleur violette. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes (mais également à l'activité métabolique de chaque cellule). Ces cristaux de formazan sont ensuite dissous dans de l’isopropanol pour les cellules pulmonaires et KB et dans du DMSO pour les cellules du cancer du sein.
11.1.1. Ligné du carcinome épidermoïde de rhinopharynx
La lignée cellulaire KB (ATCC CCL 17) est maintenant connue pour être une sous-lignée ubiquiste kératinisée de la lignée cellulaire tumorale HeLa (carcinome cervical de Henrietta Lacks). À l'origine, les scientifiques ont pensé qu'elle était dérivé d'un carcinome épidermique de la bouche, mais a été par la suite trouvé, basé sur l'analyse des isoenzymes, par des marqueurs des chromosomes HeLa, et par l'empreinte d'ADN, que cette lignée semble s'être établie par contamination de la lignée cellulaire HeLa (“KB cell origins,” n.d.) . Les cellules ont également été rapportées comme contenant des séquences de papillomavirus humain 18 (HPV-18).
Les cellules KB sont cultivées en milieu Eagle's Basal Medium supplémenté en SVF (5 %, v/v), glutamine (200 mM, 1 %, v/v) et streptomycine/pénicilline (10 mg/mL, 1 %, v/v). Les cellules sont mises en suspension dans du BME à une concentration de 200 000 cellules/mL et 50 µL de la suspension déposées dans chaque puits de la microplaque (96 puits) et la période d'incubation dure 48 h (étuve à 37°C, 5 % CO 2) afin de permettre aux cellules d'adhérer au fond créant un tapis cellulaire homogène. Les échantillons sont ajoutés dans chaque puits et après 72 h le MMT est ajouté et les cristaux de formazan dissous dans de l'isopropanol. Les absorbances son lues à 570 nm et les résultats comparés aux témoins, non traités.
11.1.2. Lignées du cancer du poumon
Deux lignées cellulaires ont été utilisées lors des différents tests effectués avec les molécules isolées. Une première lignée, la NSCLC-N6-L16 classée comme T2N0M0, propre au
62 Chapitre III. Matériel et méthodes
Département de Recherche en Cancérologie - IICIMED, issu e d’une tumeur primaire de cancer du poumon non à petites cellules. La lignée NSCLC-N6-L16 a été isolée à partir d’une biopsie sur un patient atteint d’un cancer broncho -pulmonaire de type épidermoïde, avant qu’il reçoive tout traitement. Pour l’obtenir, u n fragment de la tumeur primaire, préalablement mis en suspension dans du liquide physiologique auquel est ajouté un antibiotique et du sérum, a été injecté en sous-cutané chez la souris nude. Ce transfert in vivo, a permis de stabiliser la lignée avant la mise en culture in vitro, évitant ainsi une mort cellulaire massive par apoptose s’il avait été effectué directement. La lignée est conservée depuis sa création en cryotube à - 180 °C (Roussakis et al. , 1991).
La seconde lignée est la lignée commerciale A549 utilisée en tant que référence pour l’étude de ce type de cancer du poumon. Elle est conservée dans la banque de lignées du National Cancer Institut (NCI) sous la référence Collection ATCC n°CCL-185. Elle est issue d’un adénocarcinome pulmonaire prélevé chez un patient de 58 ans (Giard et al. , 1973) est communément utilisée dans les laboratoires de recherche qui étudient le cancer du poumon non à petites cellules (Foster et al. , 1998). Les cellules A549 présentent une morphologie de type épithélial et se développent en monocouche. La lignée est tumorigène chez la souris nude et possède un gène TP53 de type sauvage (Bai et al. , 1998).
Les deux lignées cellulaires sont cultivées en petites flasques à bouchon filtrant (Falcon ?) dans un milieu de culture constitué de Rosewal Park Memorial Institute (RPMI 1640, GIBCOTM), de 5 % de sérum de veau fœtal (SVF, GIBCO TM), de 1 % de glutamine (2mM, GIBCOTM) et de 1 % d’antibiotiques : pénicilline (100 UI) et streptomycine (100 μg/mL), GIBCOTM; et conservées à 37 °C dans une atmosphère contrôlée à 5 % de dioxyde de carbone (CO 2).
Les cellules NSCLC-N6-L16 sont ensemencées à une densité de 40 000 cellules par puits, et la lignée A549 à une densité de 200 000 cellules par puits avec un volume 200 µL de milieu RPMI enrichie, comme décrit auparavant, dans une plaque à 96 puits. Une fois les cellules adhérées pendant la nuit, les différents traitements préparés dans un milieu RPMI + 0,1 %
63 Chapitre III. Matériel et méthodes
BSA ( Bovin Serum Albumines ) ont été ajoutés. À la fin de la période d’incubation (72 h), 10 µL de MTT sont ajoutés dans chaque puits. Après 4 h à 37 °C, 50 µL d'IPA sont ajoutés afin de solubiliser les cristaux. La lecture se fait à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra MAX 190, Molecular Devices . La viabilité cellulaire des cellules traitées est exprimée en pourcentage par rapport à celles des cellules sans traitement (contrôle).
11.1.3. Lignées du cancer du sein
La lignée cellulaire MCF-7 a été initialement isolée à partir du tissu mammaire d'une femme de race blanche. En plus de conserver leur sensibilité aux œstrogènes, les cellules MCF -7 sont également sensibles à la cytokératine. La lignée cellulaire de cancer du sein MDA a été isolée d'une femme caucasienne à l'institut M. D. Anderson Cancer . Provenant d'une métastase, elle a été isolée du tissu mammaire contenant des cellules multi nucléées. Avec une morphologie épithéliale, les cellules apparaissent phénotypiquement en forme de fuseau. In vitro, la lignée cellulaire MDA présente un phénotype invasif. Alors que les cellules MCF-7 constituent une lignée œstrogène -positive, la lignée MDA est œstrogène -négative, donc, non œstrogène - dépendante.
Les cellules MCF-7 et MDA sont ensemencées à une densité de 10 000 cellules par puits, avec un volume 200 µL de milieu DMEM ( Dulbecco Modified Eagle's Medium ) + 10 % SVF dans une plaque 96 puits. Une fois les cellules adhérées pendant la nuit, les milieux sont remplacés par 200 µL des différents traitements préparés dans un milieu DMEM + 0,1 % BSA. Passée la période d’incubation du traitement de 24, 48 h et/ou 72 h, 100 µL de milieu sont retirés, puis 50 µL de MTT (2,5 mg/mL) sont ajoutés dans chaque puits. Après une période d’incubation de 4 h à 37 °C, les puits sont vidés et 200 µL de DMSO (Sigma, réf D8418) sont ajoutés dans chaque puits afin de solubiliser les cristaux. La lecture se fait à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra MAX 190, Molecular Devices . La viabilité cellulaire des cellules traitées est exprimée en pourcentage par rapport à celles des cellules sans traitements (contrôle).
64 Chapitre III. Matériel et méthodes
11.2. Activité antibactérienne
La technique utilisée pour l'évaluation de l'activité antibactérienne de nos extraits est celle de la diffusion en milieu gélosé, en utilisant des disques de cellulose de 6 mm de diamètre, selon la technique décrite par Bauer et al. (1966).
11.2.1. Microorganismes
Les souches utilisées pour évaluer l'activité antimicrobienne ont été obtenues de la collection de l'Institut Pasteur (CIP) et de l' American Type Culture Collection (ATCC). Les bactéries Gram-positif sont Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus sp. (CIP 104717), B. cereus (ATCC 33019), et Listeria ivanovii (ATCC 19119). Les bactéries Gram-négatif sont Escherichia coli (ATCC 10536), Citrobacter freundii (ATCC 8090) et Salmonella spp.
11.2.2. Test d’activité antibactérienne
Les tests ont été effectués à l'Université Chouaib Doukkali, au Laboratoire de Biotechnologie Marine et de l'Environnement, à El Jadida au Maroc.
L'extrait à tester est dissout dans un volume minimal de solvant et déposé sur un disque de cellulose à différentes concentrations (50 et 100 µg/mL). Après évaporation du solvant, le disque est placé à la surface d'une boîte de Pétri préalablement ensemencée par inondation. Pour cela, une colonie représentative, prélevée pour la réalisation du test antimicrobien est mise en suspension dans 10 mL d'eau physiologique stérile (NaCl, 9 ‰). Une culture d'une nuit a abouti à une suspension de 10 6 bactéries par mL (évaluée par la valeur d'absorbance de 0,5 à 620 nm). Cette solution est diluée 100 fois et la densité bactérienne est ensuite ajustée à 0,2 × 10 4. Après agitation, 5 mL de la suspension servent à l'inondation d'une boîte de Pétri contenant la gélose de Mueller Hinton, après un temps de contact de quelques minutes, l’excès de l'inoculum est éliminé. Après stabilisation de la température à 4 °C, les boîtes sont incubées à 37 °C pendant 24 h. L'inhibition se traduit par l'apparition autour des disques d'une zone d'inhibition due à la diffusion des molécules antibactériennes dans la gélose.
65 Chapitre III. Matériel et méthodes
Des disques imprégnés d'antibiotiques standards (streptomycine) sont utilisés comme référence à 50 ou 100 µg/mL. En outre, tous les tests ont été effectués en triplicatas. Les zones d’inhibition représentatives sont celles présentant un diamè tre supérieur à 10 mm (Lima-Filho et al. , 2002).
L'activité antibactérienne dans les différents extraits a été testée vis-à-vis de différentes souches bactériennes. L'efficacité antibactérienne d'extraits a été évaluée selon le barème suivant :
o Ø ≤ 8mm: Activité antimicrobienne non significative
o 8 <Ø ≤ 12 mm: Activité antimicrobienne modérée
o 12 <Ø ≤ 14 mm: Activité antimicrobienne significative
o Ø> 14 mm: Activité antimicrobienne très importante
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Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
67 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Contexte de l'étude
Malgré leur diversité chimique due aux adaptations constantes, les champignons en milieu marin restent peu étudiés et constituent donc un potentiel pour de nouvelles molécules à intérêt pharmaceutique (Bugni & Ireland, 2004; Christophersen et al. , 1998; Jones, 2011; Jones & Pang, 2012; Karuppiah et al. , 2015; Kiuru et al. , 2014; Kohlmeyer & Kohlmeyer, 2013; Xu et al. , 2015).
Depuis quelques années, l'intérêt porté surtout aux champignons producteurs de lipides (champignons oléagineux) est grandissant. Les champignons marins représentent un réel intérêt compte tenu du fait qu'ils peuvent produire des fractions lipidiques bioactives (Wang et al. , 2008a; Zhang et al. , 2007; Zhu et al. , 2007). Ils peuvent ainsi constituer une source de lipides d’ intérêt pour la recherche de nouveaux composés biologiquement actifs et une potentielle valorisation en santé et nutrition (Ebel, 2010; Ruiz et al. , 2007). De plus, les champignons marins peuvent également représenter une source importante de lipides à visée nutritionnelle, comme par exemple les AGE ou des lipides à visée pharmacologique comme les stérols et les GL.
Cette thématique de recherche attachée aux champignons marins et à leur production lipidique a débuté au sein du laboratoire Mer Molécule Santé (MMS) il y a une dizaine d’année dans l e cadre de précédents travaux de thèse (Ruiz, 2007). Sur la base de ces travaux, il était donc intéressant de poursuivre l’investigation du lipidome des champignons de la collection fongique marine du laboratoire afin de rechercher des lipides d’intérêt valorisables en santé et nutrition. La première étape de ce travail a consisté à mettre en place un criblage lipidique des souches.
1. Mycothèque MMS – souches criblées
La mycothèque marine du laboratoire MMS comprend presque mille souches isolées des zones conchylicoles de l’estuaire de la Loire, et constitue une bio -ressource réelle, originale et unique pour l’étude des lipides. Cette mycothèque est constituée principalement de souches
68 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
d’Ascomycètes appartenant aux genres Penicillium , Trichoderma , Aspergillus , Cladosporium et Acremonium (Figure IV.1).
Fusarium Drechslera Verticillium < 1% 1.8 1.7 1.9 6.1 Scopulariopsis Penicillium 2.3 41.0 Acremonium 4.7 Cladosporium 4.8
Aspergillus 12.7
Trichoderma 23.2
Figure IV.1 : Répartition des souches conservées dans la mycothèque du laboratoire par genre.
Trente-quatre souches, appartenant à 4 des 5 genres principaux de champignons présents dans la collection du laboratoire, à savoir Aspergillus , Trichoderma , Penicillium et Acremonium , ont été sélectionnées pour rechercher celles potentiellement productrices de lipides d’intérêt (Tableau III.2). Cette liste a été complétée par la souche Clonostachys rosea MMS1090 déjà étudiée au laboratoire et connue pour présenter une forte teneur lipidique et une composition originale en AG (Ruiz, 2007).
Les extraits bruts lipidiques (EBL) des souches sélectionnées pour ce criblage ont ensuite été obtenus à partir de cultures fongiques réalisées sur milieu DCA, en adoptant une stratégie de miniaturisation des cultures fongiques afin d'économiser du temps et de produire rapidement de petites quantités d'extraits pour le criblage. À partir de ces extraits, les données de teneur en lipides, de composition en AG, de profils chromatographiques et d’activités biologiques ont ensuite été comparées afin de sélectionner parmi ces 34 souches, les plus intéressantes à étudier pour la production de lipides bioactifs. Les résultats obtenus sont présentés ci-après.
69 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
2. Production lipidique et analyse des profils lipidiques 2.1. Teneur en lipides totaux des souches criblées
Les résultats de la teneur totale en lipides obtenus pour toutes les souches étudiées cultivées sur milieu DCA sont présentés dans la figure suivante (Figure IV.2) :
Teneur en lipides (m/m) 0 10 20 30 40 50 60 Aspergillus A. terreus MMS815 Trichoderma T. harzianum MMS13 T. citrinoviride MMS19 T. longibrachiatum MMS58 T. longibrachiatum MMS151 T. reesei MMS510 T. atroviride MMS639 T. capilare MMS755 T. capilare MMS852 Trichoderma sp. MMS912 T. atroviride MMS927 T. ghanense MMS975 T. pleuroticola MMS1541 Penicillium P. expansum MMS42 P. ubiquetum MMS330 P. ligerum MMS388 P. brevicompactum MMS404 P. canescens MMS460 Penicillium sp. MMS646 Acremonium Acremonium sp. MMS540 Acremonium sp. MMS594 Acremonium sp. MMS621 Acremonium sp. MMS700 Acremonium sp. MMS713 Acremonium sp. MMS714 Acremonium sp. MMS862 Acremonium sp. MMS868 Acremonium sp. MMS884 Acremonium sp. MMS887 Acremonium sp. MMS889 Acremonium sp. MMS895 Acremonium sp. MMS901 Acremonium sp. MMS950 Acremonium sp. MMS1120 Clonostachys C. rosea MMS1090 0 10 20 30 40 50 60 Teneur en lipides (m/m)
Figure IV.2 : Rendements des extraits bruts lipidiques (% m/m) obtenus pour les différentes souches étudiées.
70 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Les teneurs en lipides des différentes souches étudiées s’échelonnent entre 2 % (T. pleuroticola MMS1541) et 51 % (Acremonium sp. MMS889) et varient en fonction des souches et des genres étudiés.
La souche A. terreus MMS815 présente une teneur en lipides égale à 14 %. Quelques travaux rapportent la variabilité des rendements lipidiques dans différentes souches du genre Aspergillus inferieurs à 20 % (Abraham & Srinivasan, 1984; Hui et al. , 2010; Papanikolaou et al. , 2011; Suutari, 1995). Plus récemment, des travaux mentionnent la forte productivité lipidique (31 %) d'une souche d ’A. awamori dans les conditions optimales développées au cours de l'étude (Venkata Subhash & Venkata Mohan, 2014). Le rendement lipidique relevé sur la souche d ’A. terreus MMS815 se retrouve dans la moyenne de ceux décrits dans la littérature.
En ce qui concerne les souches du genre Trichoderma , les productions lipidiques sont très variables. La plus faible production a été observée pour la souche T. pleuroticola MMS1541 (2 %). Le rendement le plus important (21 %) a été obtenu pour la souche T. ghanense MMS975. Les souches T. citrinoviride MMS19, les souches T. longibrachiatum MMS58 et MMS151, T. reesei MMS510, T. capilare MMS755 et Trichoderma sp. MMS912 ont présenté des rendements inférieurs ou égaux à 10 %. Les souches T. harzanium MMS13, T. atroviride MMS639 et T. capilare MMS852 ont présenté des rendements se situant entre 10 % et 20 %. Plusieurs espèces appartenant au genre Trichoderma ont déjà fait l'objet d’études sur leur composition lipidique, notamment T. reesei pour laquelle les rendements lipidiques rapportés à la biomasse (% m/m) varient de 0,03 % à 12 % selon les conditions de culture comme par exemple le type de milieu (Brown et al. , 1990). Une autre étude a également fait mention de souches cultivées dans différentes conditions de culture (changement de température et pH) telles que T. harzianum et T. viride pour lesquelles la teneur en lipide pouvait atteindre 17 % et 32 %, respectivement (Serrano-Carreon et al. , 1992).
Plus récemment, une étude du laboratoire réalisée sur T. longibrachiatum MMS151 mise en culture sur milieu solide ou liquide a démontré que dans les deux modes de fermentation, la
71 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
production lipidique était similaire, correspondant environ à 10 % de la biomasse (% m/m) après extraction (Ruiz et al. , 2007). Les valeurs observées des rendements lipidiques pour les souches de Trichoderma étudiées sont en accord avec celles décrites dans les travaux cités.
Les souches du genre Penicillium ont présenté des valeurs de rendement inférieures à 10 %, à l'exception de la souche Penicillium sp. MMS646 qui a présenté un rendement égal à 34 %. Une autre étude menée par Abraham et Srinivasan (1984) a démontré chez une souche de P. frequentans que la production lipidique pouvait dépasser les 10 % (% m/m) et que les LN étaient majoritaires. Une étude plus récente a également démontré que le rendement lipidique pour une souche de P. roqueforti était inférieur à 10 % (Feofilova et al. , 2015).
Les souches du genre Acremonium ont présenté les plus importants rendements parmi toutes les souches étudiées, et même des valeurs supérieures à 50 %. En effet, la souche Acremonium sp. MMS889 a présenté un rendement de 51 % en relation à sa masse délipidifiée. Excepté les souches MMS540, MMS713, MMS714, MMS862, MMS868 et MMS884 présentant des valeurs de rendements inférieurs ou égaux à 11 %, toutes les autres souches d’ Acremonium ont montré des rendements supérieurs ou égaux à 16 %. Peu de travaux répertorient la production lipidique des souches du genre Acremonium . À la fin des années 1980, une souche thermophile d’A. alabamensis a été étudiée quant à sa production lipidique durant la culture avec un pic de production à neuf jours (environ 3 %) (Satyanarayana et al. , 1987). Une autre étude dans les années 1990, rapporte le rendement lipidique, supérieur à 5 %, d'une souche d ’Acremonium , anciennement appelée Cephalosporium acremonium pendant la production de la céphalosporine C (Sohn et al. , 1994). Les rendements obtenus pour les souches étudiées dans ce criblage sont donc supérieurs à ceux décrits dans la littérature. Une autre étude mentionne également que pendant la production de la céphalosporine C par une souche d ’A. chrysogenum , les fragments des hyphes accumulent des lipides à des fortes concentrations (Queener & Ellis, 1975).
C. rosea MMS1090 a déjà fait l’objet d’étude au laboratoire pour sa production lipidique (Ruiz, 2007) supérieure à 20 % de la biomasse sèche. Une autre étude récente rapporte la
72 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
production lipidique (18 %) d'une souche C. rosea isolée à partir de l'arbre Torreya grandis (Yang et al. , 2015). Les résultats observés lors de la présente étude confirment les résultats antérieurs qui indiquent que C. rosea est une souche intéressante dans la production de lipides.
Les souches du genre Acremonium ont présenté, en général, une plus forte production lipidique quand elles sont comparées aux autres souches étudiées.
La teneur en lipides des microorganismes peut varier selon les conditions de mise en culture comme par exemple la température, le pH ou encore la proportion entre le carbone et l'azote disponibles dans le milieu (Li et al. , 2008).
En conditions de stress azoté, la production lipidique intracellulaire d'une levure peut augmenter significativement selon les souches (Hassan et al. , 1996), ce qui optimise le rendement. Zavala-Moreno (2014) a aussi démontré qu'il existe une relation entre la source d'azote, sa quantité disponible dans le milieu de culture et la production lipidique. Ainsi, augmenter le rapport C/N semble également augmenter la production lipidique des différentes souches mentionnées dans les études. Une discussion plus approfondie à propos de ce ratio C/N sera menée au Chapitre V.1.
Depuis plusieurs années, des études ont été menées dans le but de comprendre la composition lipidique (TG, stérols, cérébrosides, AG, PL etc.) des champignons afin de les valoriser dans les différents domaines industriels. Il est donc important de mettre en évidence le comportement de différentes souches cultivées dans le même type de milieu de culture afin de sélectionner les plus intéressantes pour les différentes classes lipidiques.
2.2. Composition en acides gras des souches criblées
Les compositions en acide gras (AG) présentés dans le Tableau IV.1 répertorient pour chacune des souches étudiées, le profil des AG majoritaires détectés lors des analyses par CPG-SM. Ces résultats seront comparés, dans leur globalité, à des études menées sur des souches terrestres. Dès que les comparaisons entre les données de notre étude et celles de la littérature avec des souches d'origine marine pourront être effectuées ceci sera spécifié.
73 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Tableau IV.1: Profilage des acides gras majoritaires (> 2 %) obtenus après saponification et estérification de l'extrait brut pour les souches étudiées, cultivées sur milieu DCA. Profils obtenus en CPG-SM
Composition en AG (% AG totaux)
Souche MMS C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 Autres (≥ 1 %) Aspergillus
A. terreus 815 16 1 8 34 37 Trichoderma
T. harzianum 13 23 2 2 20 48 C15:0 (1 %); C17:1 (1 %) T. citrinoviride 19 20 1 2 21 50 C15:0 (1,5 %) T. longibrachiatum 58 22 2 4 28 40 C15:0 (1 %); C17:1 (1 %) T. longibrachiatum 151 20 1 13 31 30
T. reesei 510 21 2 8 25 32 C15:0 (2 %); C17:0 (1 %); C24:0 (1 %) C15:0 (1 %); C17:0 (1 %); C17:1 (1 %); C18:2 T. atroviride 639 21 1 4 17 53 cj (1 %) T. capilare 755 22 1 8 28 39 C15:0 (1 %); C16:1 (1 %) T. capilare 852 5 2 16 34 38 C15:0 (1,5 %); C16:2 (1,5 %); C24:0 (1 %) C15:0 (1 %); C17:0 (1 %); C17:1 (1 %); C18:2 Trichoderma sp. 912 17 1 1 18 57 cj (2 %) T. ghanense 975 23 2 4 21 49 C15:0 (1 %) T. pleuroticola 1541 24 1 4 19 49 C15:0 (1 %); C16:2 (1 %) Penicillium
P. expansum 42 16 1 4 14 60 C15:0 (2 %); C17:0 (1 %) P. ubiquetum 330 17 1 8 35 35 C17:0 (1 %); C24:0 (1 %) P. ligerum 388 20 1 7 12 45 C17:0 (1 %); C17:2 (1 %) P. brevicompactum 404 12 1 5 38 40 C18:2 cj (2 %) P. canescens 460 17 1 7 16 52 C15:0 (1 %); C17:0 (2 %); C17:1 (1 %) Penicillium sp . 646 13 1 3 20 59 C15:0 (1 %); C18:2 cj (2 %) Acremonium
Acremonium sp . 540 23 2 3 30 33 C20:2 (1 %); C20:1 (1 %); C17:0 (1 %) Acremonium sp. 594 20 1 2 36 38
Acremonium sp . 621 24 2 7 53 13
Acremonium sp . 700 17 1 3 48 30
Acremonium sp . 713 19 1 4 37 36
Acremonium sp . 714 23 - 11 - 65
Acremonium sp . 862 16 1 7 20 51
Acremonium sp . 868 21 2 3 28 43
Acremonium sp . 884 33 1 6 31 27
Acremonium sp . 887 19 1 4 23 51
Acremonium sp . 889 25 1 3 32 34
Acremonium sp . 895 19 1 6 35 38
Acremonium sp . 901 18 1 4 33 42
Acremonium sp . 950 20 - 9 44 27
Acremonium sp . 1120 22 2 2 27 39 Clonostachys 4-Me-C16:2 isomère C (23 %) C.rosea 1090 16 1 4 17 33 4-Me-C16:2 isomères A et B (2 %) ** Les AG avec des teneurs inferieures à 1 % ne sont pas mentionnés ; cj : conjugué
74 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
L'acide palmitoléique (Δ9 16:1) a été présent à teneur constante entre 1 % et 2 % sur toutes les souches et est donc, représenté dans le tableau. Seulement deux souches, appartenant au genre Acremonium (MMS714 et MMS950), ne présentent pas cet acide gras dans leur composition.
Les AG majoritaires pour la souche A. terreus sont l'acide linoléique ( Δ9,12 18:2) et l'acide oléique ( Δ9 18:1), 37 % et 34 %, respectivement. Le troisième acide gras majoritaire observé a été l ’acide palmitique (16:0) présent à 16 %, suivi par l'acide stéarique (18:0) présent à 8 %. Quelques études répertorient la production lipidique et la composition des AG chez les souches du genre Aspergillus . Nemec et al . (1997) ont étudié le profil des AG de six souches du genre Aspergillus et ont démontré également que les AG majoritaires sont les mêmes que dans la présente étude. Ils ont également démontré que l'acide linolénique (18:3) produit par ces souches pourrait être utilisé en tant que marqueur dû à son profil variable (entre 5 % et 18 %). Dans le cas de cette souche du genre Aspergillus l'acide linolénique n'a pas été observé. Suutari (1995) a étudié l'effet du changement de la température sur le profil des AG sur plusieurs souches de différents genres, parmi elles une souche de A. niger . Il a été démontré que la production en acide gras passait de 25 % à environ 2 % du poids sec avec une augmentation significative de la température passant de 10 °C à 35 °C, et que les AG majoritaires étaient en accord avec ceux présentés dans notre étude.
Plus récemment les travaux de Oleinikova et al. (2013b) sur le profil des AG sur plusieurs souches du genre Aspergillus isolées du milieu marin. Les AG majoritaires présents également dans les cinq souches étudiées sont en accord avec ceux de notre étude. Cependant, deux des souches, A. carneus MM4638 et A. versicolor MM4640, présentaient des valeurs plus élevées de l'acide palmitique, environ 37 % et 30 %, respectivement, tandis que l'acide linoléique était présent à hauteur d'environ 33 % et 22 %, respectivement, des AG totaux.
Les souches du genre Trichoderma ont toutes présenté une forte production de l'acide linoléique ( ≥ à 30 %), acide gras majoritaire pour ces souches, jusqu'à 57 % pour la souche MMS912 à l’exception de l a souche MMS151, pour laquelle l'acide oléique est l’acide gras majoritaire à 31 %, dépassant légèrement l'acide linoléique (30 %). L'acide oléique était
75 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
présent également en concentrations supérieures à 17 % de la composition des AG totaux. Néanmoins, l'acide palmitique a été observé égal ement en forte concentration (≥ 17 %) à l'exception de MMS852 où il a été faiblement produit (5 %). Toutefois, des différences ont été observées également sur la production de l'acide stéarique fortement produit sur MMS852 et MMS151, 16 % et 13 %, respectivement, tandis que pour les autres souches sa production a été inférieure à 10 %.
Des études rapportent l'analyse du profil des AG sur plusieurs souches terrestres du genre Trichoderma . Parmi ces études nous pouvons citer celle de Serrano-Carreon et al. (1992) qui a étudié la production lipidique et le profil des AG pour des espèces de Trichoderma et a rapporté que la teneur en acide linoléique était supérieure à la teneur en acide oléique dans T. harzianum (48 % et 28 %, respectivement), tandis que l'inverse était observé chez T. viride (33 % et 50 %, respectivement), alors que la quantité d'acide palmitique dans les deux champignons était supérieur à 13 % et 20 %, respectivement.
Brown et al. (1990) ont également étudié le profil lipidique de souches du genre Trichoderma en réponse aux changements de température et il a été démontré que le changement de pH et de température augmentait anormalement les proportions des acides palmitique (jusqu'à 88 %) et stéarique (jusqu'à 71 %) au détriment de l'acide linoléique (jusqu'à 49 %) et oléique (jusqu'à 60 %).
Ruiz et al. (2007) ont également observé des changements dans le profil des AG de T. longibraquiatum MMS151 en fonction du type de fermentation, en milieu solide ou liquide. Les AG prédominants présents ont été les mêmes que pour les travaux mentionnés précédemment, c’est -à-dire les acides palmitique, oléique et linoléique comme principaux AG des extraits étudiés. La biomasse produite sur milieu solide a été 10 fois supérieure à celle produite en milieu liquide. Néanmoins des teneurs similaires en lipides ont été obtenues pour les deux processus (environ 10 % m/m).
Les souches du genre Penicillium ont présenté l'acide linoléique comme l'acide gras majoritaire allant de 35 % à 60 % pour MMS330 et MMS42, respectivement. L'acide oléique
76 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
est présent majoritairement chez les souches MMS330, MMS404 et MMS646 à 35 %, 38 % et 20 %, respectivement, contre 17 %, 12 % et 13 % pour l'acide palmitique, respectivement. À contrario, pour les souches MMS42, MMS388 et MMS460, l'acide palmitique est présent à hauteur de 16 %, 20 % et 17 %, respectivement, alors que l'acide oléique est présent à 14 %, 12 % et 16 %, respectivement.
Suutari et al. (1995) ont étudié la variation de la production lipidique et la composition des AG de quatre souches de champignons, parmi elles, une de P. chrysogenum , et leur réponse aux changements de température lors des cultures. L'augmentation de la température a stimulé la production lipidique et la croissance du champignon. Cependant, la teneur en AG a diminué et beaucoup varié concernant les AG à 18 carbones. Parmi les AG majoritaires, la composition était similaire à celle classiquement retrouvée chez les autres champignons. L'acide linoléique a été présent majoritairement dans toutes les conditions de culture ( jusqu’à 50 % à 26 °C), suivi par l'acide oléique ( jusqu’à 28 % à 30 °C). L'acide palmitique a présenté une faible variabilité, entre 13 % et 14 %, selon les températures testées. L'acide oléique a présenté une plus forte production à 10 °C (9 %) et une plus faible à partir de 20 °C (5 %), suivi de faibles proportions de l'acide palmitoléique entre 1 % et 2 % selon les conditions de cultures. Il a été également démontré la présence de l'acide linolénique entre 3 % et 13 %.
Lomascolo et al. (1994) ont également étudié la production et l'accumulation lipidique pour deux souches de P. roqueforti et une souche de P. camemberti . Ces souches étant couramment utilisées dans l'industrie fromagère, il était important de caractériser leurs acides gras. Pour les trois souches, les principaux AG observés étaient les acides linoléique, oléique et palmitique, correspondant à 80% des AG totaux. Une fois de plus, l'acide gras majoritaire présent était l'acide linoléique, supérieur à 40 % des AG totaux.
Plusieurs travaux sur des souches marines du genre Penicillium ont été accomplis au cours des dernières décennies. Il est important de mentionner plus récemment les travaux d'Oleinikova (2013b, 2013a, 2015) sur la caractérisation des extraits apolaires de plusieurs souches de Penicillium isolées à partir d’échantillons d’algues, de coraux et de sédiments. Ces travaux
77 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
relatent que toutes les souches ont également produits les AG majoritairement présents chez les champignons en général (16:0; 18:2; 18:1; 18:0). Dans certains cas comme pour P. glabrum , P. inaequalis , et deux souches de P. citrinum , la proportion de l'acide palmitique a atteint une forte production (77 %, 74 %, 53 % et 45 %, respectivement), tandis que les AG à 18 carbones ont été produits plus faiblement. À contrario, pour les autres souches, les acides linoléique et oléique ont présenté des valeurs plus élevées que celles habituellement retrouvées chez les autres champignons.
Toutes les souches du genre Acremonium ont présenté le profil observé classiquement chez les champignons et déjà décrit dans les paragraphes précédents. Les AG insaturés constitués d'une chaîne à 18 carbones (linoléique et oléique) ont été les acides majoritaires dans la constitution du profil de toutes les souches et aucune observation concernant des différences sur le profil des AG n’a pu être relevée . Cependant, la souche MMS540 a présenté dans sa constitution d'autres AG en plus de ceux classiquement observés tels que les AG 20:2 (1%); 20:1 (1%); 17:0 (1%). Peu de travaux rapportent l’ étude du profil des AG de souches du genre Acremonium .
Dans les années 90, Sohn et al. (1994) ont étudié les modifications dans la composition des AG d’ une souche du genre Acremonium au cours de la production de céphalosporine C. Les principaux AG produits une fois de plus ont été ceux classiquement retrouvés dans la majorité des souches de champignons et déjà mentionnés auparavant. Dans cette étude, l'acide oléique était présent majoritairement (environ 62 %) suivi par l'acide linoléique (supérieur à 24 %).
Un des travaux récents d'Oleinikova (2013a) répertorie également la composition des AG sur des souches marines d ’A. roseum où l'acide oléique est majoritairement présent (supérieur à 53 %) suivi par l'acide palmitique (environ 32 %).
Comme nous l’avons mentionné précédemment, C. rosea MMS1090, contrairement aux 34 autres souches est caractérisée par la présence, en plus des AG classiques, de l'acide 4-Me-6,8- 16:2, un acide gras rarement observé composé de 17 carbones, présentant une méthylation en C-4 et un système conjugué en position C-6/C-8.
78 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
L'acide oléique apparait en proportion plus importante, supérieur à 38 %, suivi par l'acide 4- Me-6,8-16:2 à 19 %, l'acide palmitique représente 18 %, alors que l'acide linoléique est présent à hauteur de 16 %. L'acide stéarique est également présent à 5 %. Les AG minoritaires (< 1 %) représentent moins de 6 % des AG totaux. L'acide gras conjugué 4-Me-6,8-16:2 selon les conditions de culture peut atteindre plus de 20 % des AG totaux lorsque la souche est cultivée sur milieu DCA (Dos Santos Dias et al. , 2015).
Dans ce cadre, des études supplémentaires sur cet AG ont été réalisées et seront abordées dans le Chapitre V.
2.3. Conclusion
Pour conclure, après l'analyse des résultats par CPG-SM, nous pouvons observer que la composition des AG principaux pour les différentes souches étudiées reste similaire, avec des variations dans leur pourcentage. En général, bien que certains champignons synthétisent des AG hautement spécifiques, comme l'acide γ-linolénique (18:3) par Mortierella isabellina (Yokochi et al. , 1995), par exemple, habituellement les AG prédominants observés sont les acides palmitique (16:0), stéarique (18:0), oléique ( Δ9 18:1), linoléique ( Δ9,12 18:2) associés éventuellement à l'acide γ-linolénique (18:3) et l’acide palmitoléique (Δ9 16:1) en quantités moindres (Jabaji-Hare, 1988; Khudyakova et al. , 2009; Lösel, D.M., 1988; Olsson & Johansen, 2000; Ratledge, 2002, 2004).
L'acide linoléique est un AG essentiel nécessaire à la biosynthèse des eicosanoïdes et il ne peut pas être synthétisé par le corps humain (Harlapur & Shimbo, 2013). Des études ont démontré que le remplacement des graisses saturées par l'acide linoléique et par des AGPI réduit les concentrations de cholestérol dans le sang et le risque de maladie coronarienne (Farvid et al. , 2014).
De plus, la composition des AG cellulaires et extracellulaires des champignons marins pourrait modifier la viscosité des membranes en les distribuant dans la bicouche lipidique ou en incorporant dans la partie grasse des PL membranaires et pourrait également constituer un
79 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
facteur d'adaptation (Dowhan et al. , 2008; Peretó et al. , 2004; Vance & Vance, 2008; Voelker, 2008).
Ce travail a permis d'enrichir la connaissance sur le profilage lipidique des souches de champignons marins. Les résultats obtenus mettent en évidence la variabilité intra- et inter- spécifique des souches des différents genres et apportent des informations supplémentaires sur la composition des AG. La constitution des AG majoritaires est semblable à celles observées dans des souches terrestres ou marines déjà répertoriées. Néanmoins, nous pouvons observer que les pourcentages de ces AG changent. Il est important également de mentionner la présence des AG conjugués dans quelques souches à des faibles concentrations, à l'exception de la souche C. rosea MMS1090 qui présente un AG conjugué parmi les majoritaires. Les travaux mentionnés dans l'analyse des données ne rapportent pas la présence de ce genre d'AG dans les compositions générales décrites des différentes souches de C. rosea (Viccini et al. , 2007; Yang et al. , 2015; Zhai et al. , 2016; Chatterjee et al. , 2016).
L'analyse des AG pourrait être également utilisée comme un marqueur chimio-taxonomique, ce qui est déjà largement étudié pour la caractérisation des bactéries et des levures (Bertone et al. , 1996; Brondz & Olsen, 1990). L'inclusion des AG conjugués ou d'autres molécules dans les études sur les acides gras, comme les stérols par exemple, pourrait améliorer et élargir la possibilité de faire la distinction entre les organismes examinés.
La souche Acremonium sp. MMS540 est la seule de son genre qui a présenté également un profil atypique dans la composition des AG totaux. Néanmoins, d'autres souches des autres genres étudiées (MMS404, MMS912, MMS639 et MMS646) ont également présenté des faibles pourcentages de différents AG, en particulier les AG conjugués.
En conclusion, ces études ont été importantes pour le criblage et ont démontré que sur la base de l’analyse des AG, seule C. rosea MMS1090 semble intéressante d’un point de vue diversité de la composition. Des études plus ciblés devront être effectuées pour confirmer ces analyses. Les AG et leur importance pour les différents domaines seront discutés plus particulièrement dans le Chapitre V.1.
80 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
3. Profilage des extraits bruts par approche lipidomique (CLHP-SM) Contexte de l'étude
Une méthode d’analyse de différents types d’extraits lipidiques par CLHP-SM a été appliquée aux extraits bruts et fractions enrichies issus des souches sélectionnées. Pour cette étude, une approche lipidomique permettant de cribler le potentiel lipidique (GL bioactifs, AG conjugués) des champignons marins a été utilisée.
3.1. Résultats
Une fois le fractionnement effectué sur colonne de gel de silice et les fractions obtenues, elles ont été ensuite analysées par CLHP-SM. Les chromatogrammes obtenus lors de l’analyse d es trois fractions lipidiques d'un mélange fongique (standard interne) sont présentés Figure IV.3.
7,E+06
dichlorométhane 6,E+06 acétone
5,E+06 méthanol
4,E+06
Intensité 3,E+06
2,E+06
1,E+06
0,E+00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Temps de rétention Figure IV.3 : Chromatogrammes CLHP-SM des 3 fractions lipidiques obtenues après séparation sur colonne ouverte de gel de silice d’un EBL obtenu par le mélange des EBL de Penicillium ligerum MMS388 , Aspergillus terreus MMS815 , Clonostachys rosea MMS1090, Acremonium sp. MMS1120 et Trichoderma longibrachiatum MMS151.
Le chromatogramme en bleu représente la fraction lipidique éluée par le dichlorométhane (LN), en rouge la fraction éluée par l'acétone (GL) et en vert, la fraction éluée par le méthanol (PL). Les fractions ont été éluées par polarité décroissante, à l'exception des AG libres (AGL) élués au début du gradient entre 5 et 14 minutes. Les PL sont élués entre 17 et 22 minutes, les GL entre 23 et 29 minutes et enfin les LN entre 39 et 47 minutes. Les PL et les GL ont une
81 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
partie de leur plage d’élution commune du fait de leur polarité proche. Les EBL des 34 souches ont ensuite été analysés suivant cette méthode.
Cette méthode a ainsi permis de cribler le potentiel, qualitatif, des souches les plus productrices de certains types de lipides, mettant en évidence la complexité de leur profil selon l'analyse des chromatogrammes (Figure IV.5).
Métabolites secondaires Acides gras Phospholipides Glycolipides Lipides neutres
1500000
1000000 T. longibrachiatum MMS151 500000 Intensité 0 1500000 C. rosea 1000000 MMS1090 500000 Intensité 0
1500000 Acremonium sp. 1000000 MMS1120 500000 Intensité 0
1500000 P. ligerum 1000000 MMS388 500000 Intensité 0 A. terreus 1500000 MMS815 1000000 500000 Intensité 0 0 10 20 30 40 50 Temps de rétention Figure IV.4 : Profil CLHP-SM de 5 souches et représentation des classes lipidiques mises en évidence. Axe Y : Intensité des pics (0 à 1 500 000); Axe X : Temps de rétention (0 à 50 min).
En complément des profilages CLHP-SM, d'autres analyses ont également été effectuées pour les souches criblées, telle que la proportion totale des lipides produits. Ces analyses sont présentées Figure IV.5. La figure représente la proportion des principales classes lipidiques mises en évidence par cette méthode. Ces classes lipidiques ont été analysées en fonction de leur répartition parmi les espèces fongiques.
82 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines Chimiodiversité
Biodiversité Figure IV.5 : Proportions lipidiques des souches analysées. L'axe horizontal correspond au pourcentage des souches présentant des lipides en commun. L'axe vertical au pourcentage total des pics identifiés.
L'axe appelé "biodiversité" représente la quantité de souches analysées, différents genres et espèces. L'axe de la "chimiodiversité" représente la quantité de pics détectés dans l'analyse de ces souches. La majorité des souches présentent des proportions très faibles de lipides communs entre elles. En effet, entre 80 à 100 % des souches présentent seulement 4,7 % de la chimiodiversité (pics détectés), entre 60 à 80 % des souches partagent 3,5 % des pics en commun et entre 40 à 60 % des souches, 6,9 % des pics en commun. Entre 20 et 40 % des souches présentent environ 15 % des pics totaux, surtout caractérisés par les LN. L'analyse de ce graphique nous permet d'affirmer qu'il est important de s’intéresser aux lipides les moins communs, ceux qui sont présents chez peu de souches, entre 1 et 20 %, pour permettre de rechercher des molécules nouvelles.
Le profilage lipidique basé sur les analyses chromatographiques en HPLC-MS a été effectué sur les EBL des 34 souches étudiées (Tableau IV.2).
83 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Tableau IV.2. Analyse générale du profil CLHP-SM des EBL des souches étudiées
Complexité du profil Souche MMS chromatographique Aspergillus
Aspergillus terreus 815 + Trichoderma
T. harzianum 13 + + T. citrinoviride 19 + + T. longibrachiatum 58 + T. longibrachiatum 151 + T. reesei 510 + T. atroviride 639 + + + T. capilare 755 + + T. capilare 852 + Trichoderma sp . 912 + + T. ghanense 975 + + T. pleuroticola 1541 + + Penicillium
P. expansum 42 + P. ubiquetum 330 + + P. ligerum 388 + P. brevicompactum 404 + P. canescens 460 + + Penicillium sp . 646 + Acremonium
Acremonium sp . 540 + + + + Acremonium sp. 594 + + + + + Acremonium sp . 621 + + + + Acremonium sp . 700 + + + + Acremonium sp . 713 + + + + + Acremonium sp . 714 + + Acremonium sp . 862 + + Acremonium sp . 868 + + + + + Acremonium sp . 884 + + + Acremonium sp . 887 + + + Acremonium sp . 889 + + + + Acremonium sp . 895 + + + + + Acremonium sp . 901 + + Acremonium sp . 950 + + Acremonium sp . 1120 + + + + Clonostachys
Clonostachys rosea 1090 + + + : environ 8 pics détectés
84 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Ces données résultent de l'analyse générale du profil lipidique obtenu et de la quantité de pics observés pour toutes les souches étudiées. Nous avons observé que la zone de plus grande variabilité correspondait à celle des lipides chargés, plus spécialement la zone des GL. La complexité des chromatogrammes a été évaluée sur la base de la quantité de pics chromatographiques observés dans la zone d’élution des GL. Le niveau de complexité est représenté de + à +++++ pour les chromatogrammes peu complexes (moins de 8 pics) à très complexes (plus de 24 pics) dans l'EBL (Figure IV.6).
MMS388 (+)
MMS460 (++)
MMS887 (+++)
MMS540 (++++)
MMS713 (+++++)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 RT (min)
Figure IV.6 : Chromatogrammes des EBL pour les différentes souches et la classification selon la quantité de pics détectés (+ < 8 pics).
Ainsi, d’après ces analyses, les souches d’Acremonium sp. semblent les plus intéressantes avec au moins 11 souches sur 15 présentant des profils lipidiques complexes (au moins +++). Au
85 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
contraire, la totalité des souches de Penicillium sp. présente des chromatogrammes peu complexes (++). Les souches de Trichoderma sont caractérisées globalement par des profils également peu complexes (++), à l'exception de T. atroviride MMS639 (+++). Afin d’affiner cette étude, nous nous sommes donc focalisés sur les GL plus spécifiquement en analysant directement les fractions enrichies en GL selon la méthode CLHP-SM développée. Ainsi, pour les souches pour lesquelles environ 15 mg d’EBL avai ent été obtenus, au moins 10 mg d’extrait ont été séparés en classe de lipides sur colonne ouverte de gel de silice ( cf . Chapitre III.3.2 – p. 53). Les fractions enrichies en GL, ainsi obtenues, ont été analysées de la même façon que pour les EBL, en évaluant leur complexité. Les résultats obtenus sont présentés Tableau IV.3.
Tableau IV.3. Analyse générale du profil CLHP-SM des fractions enrichies en glycolipides des souches étudiées.
Teneur en GL (% Complexité du profil Souche MMS EBL) chromatographique T. harzianum 13 13 + + + T. citrinoviride 19 29 + T. longibrachiatum 58 21 + + T. reesei 510 12 + T. atroviride 639 16 + + + + T. capilare 852 2 + + + + Trichoderma sp. 912 14 + + + T. pleurotica 1541 4 + Penicillium sp. 646 13 + Acremonium sp. 540 21 + Acremonium sp. 594 36 + + + Acremonium sp. 621 14 + + + + Acremonium sp. 700 32 + Acremonium sp. 713 16 + + Acremonium sp. 714 28 + + + Acremonium sp. 862 23 + + Acremonium sp. 868 22 + + Acremonium sp. 884 50 + + + + Acremonium sp. 887 20 + + Acremonium sp. 889 35 + + + + + Acremonium sp. 895 4 + + Acremonium sp. 901 13 + + + Acremonium sp. 950 15 + + C. rosea 1090 4 + + + + : environ 11 pics détectés
86 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Les résultats obtenus sur les fractions enrichies en GL corroborent ceux obtenus sur les EBL. En effet, environ la moitié des souches du genre Acremonium présentent également, par rapport aux autres souches, les chromatogrammes les plus complexes laissant suggérer des profils lipidiques plus riches, n otamment dans la zone d’élution correspondant aux GL (Figure IV.7).
MMS646 (+)
MMS950 (++)
MMS1090 (+++)
MMS639 (++++)
MMS889 (+++++)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 RT (min)
Figure IV.7 : Chromatogrammes des fractions glycolipidiques pour les différentes souches et la classification selon la quantité de pics détectés (+ < 11 pics).
Néanmoins, les souches de Trichoderma qui présentaient des chromatogrammes d’EBL moyennement complexes se sont révélées plus intéressantes lors des analyses de leurs fractions enrichies en GL avec 4 souches sur 8 présentant des profils complexes (+++). La
87 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
souche de Penicillium analysée (MMS646) reste caractérisée par un profil chromatographique peu complexe de sa fraction enrichie en GL.
3.2. Conclusion
Les analyses HPLC-HRMS ont permis d'étudier les extraits lipidiques des différentes souches de champignons d'origine marine de manière automatisée en les séparant par classes selon leur charge et leur temps de rétention. La méthode utilisée a permis d ’obtenir une bonne séparation et une bonne détection (en termes de quantité de pics) de l’ensemble des lipides.
Les profils chromatographiques des EBL obtenus ont démontré en terme de quantité de pics détectés (+ : 8 pics) moins de complexité quand comparé aux profils chromatographiques des fractions glycolipidiques (+ : 11 pics). Le fractionnement semble mettre en évidence certaines molécules restées non-détectées auparavant dans les profils plus généraux, probablement par une superposition ou que d'intensité était trop faible pour être détectée.
Des profils lipidiques différents ont été observés entre les espèces de champignons et une importante variabilité se retrouve au sein de chaque genre étudié. Il est important de souligner que la variabilité interspécifique reste la plus importante.
Parmi les résultats obtenus, certains lipides ont été observés dans la majorité des souches alors que d’autres n’ont été détectés que chez certaines. Afin de confirmer la condition de "nouveauté", les molécules doivent passer par une étape de déréplication qui peut également être optimisée. Il est également important de mentionner que l'ajout de techniques supplémentaires comme la fragmentation (SM n) devrait permettre d ’apporter plus d’information sur les structures des molécules lipidiques (Hsu & Turk, 2009; Knittelfelder et al., 2014). Il nous parait évident que cette méthode en complément de la CPG-SM permettrait également de confirmer l’identification des AG présents dans les espèces lipidiques (TG, GL, PL).
88 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
La combinaison de toutes ces techniques permettra ainsi d’aider à l’identification des composés et ainsi de valoriser au mieux les champignons de la mycothèque marine dans les domaines de la santé, de la cosmétique, de la nutrition ou de l’énergie.
Pour conclure, ce criblage qui consiste en l’analyse de la composition lip idique a permis de mettre en évidence que les souches du genre Acremonium possédaient les profils les plus atypiques et pourraient donc représenter une source de molécules originales.
4. Criblage selon les activités biologiques des fractions enrichies en glycolipides Contexte de d'étude
Certains travaux décrivent le caractère original des GL produits par des champignons (Batrakov et al. , 2002, 2004, 2001, 2003) comme les ascomycètes (Duarte et al. , 1998; Park et al. , 2005; Toledo et al. , 1999). Cependant, peu de travaux décrivent l'isolement de GL de champignons d'origine marine (Keusgen et al. , 1996).
Dans ce contexte, les nouvelles stratégies de criblage des souches nous mènent non seulement à l'analyse des profils obtenus par CPG-SM et CLHP-SM, mais également à des tests biologiques des fractions enrichies en GL. Pour cela, les extraits enrichis en GL obtenus précédemment ont été évalués pour leur activité antiproliférative sur la lignée cellulaire cancéreuse KB, lignée couramment utilisée au laboratoire pour le criblage biologique d’extraits fongiques .
La séparation en classes lipidiques, et notamment l'obtention des fractions enrichies en GL, n'ont été possible que sur les souches produisant 15 mg ou plus d'EBL par culture (cf . Tableau IV.3, p-86).
4.1. Résultats
Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur la plupart des souches dont les fractions enrichies en GL ont été analysées précédemment en CLHP-SM (cf . Tableau IV.3). Toutefois, pour certaines d’entre -elles (MMS510, MMS639, MMS852, MMS862 et MMS868), les faibles
89 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
quantités de fractions enrichies en GL obtenues après la séparation des lipides en classe n’ont pas permis de réaliser les tests biologiques. Le Tableau IV.4 regroupe l'ensemble de l'évaluation de l'activité cytotoxique réalisé sur les fractions enrichies en GL des différentes souches testées.
Tableau IV.4. Activité antiproliférative sur cellules KB des fractions enrichies en glycolipides des souches analysées, masse des extraits bruts lipidiques (g) et des fractions glycolipidiques en pourcentage de l'extrait brut total
GL Souche EB (g) CI (µg/mL) (% du total) 50 T. harzianum MMS13 0,032 12,6 15,7 ± 5,2 T. citrinoviride MMS19 0,021 29,0 > 100 T. longibrachiatum MMS58 0,019 21,0 15,6 ± 3,8 Trichoderma sp. MMS912 0,014 3,6 21,1 ± 3,0 T. pleuroticola MMS1541 0,028 3,8 > 100 Penicillium sp . MMS646 0,215 13,0 > 100 Acremonium sp. MMS540 0,026 20,6 10,6 ± 1,34 Acremonium sp. MMS594 0,054 36,0 20,6 ± 5,8 Acremonium sp. MMS621 0,067 29,1 > 100 Acremonium sp. MMS700 0,030 32,4 14,6 ± 0,6 Acremonium sp. MMS713 0,045 16,0 23,6 ± 1,7 Acremonium sp. MMS714 0,084 28,3 21,1 ± 8,1 Acremonium sp. MMS884 0,029 50,0 51,6 ± 13,7 Acremonium sp. MMS887 0,026 19,8 20,2 ± 2,6 Acremonium sp. MMS889 0,039 34,6 17,2 ± 1,1 Acremonium sp. MMS895 0,040 3,7 11,8 ± 5,9 Acremonium sp. MMS901 0,088 12,6 15 ± 9,0 Acremonium sp. MMS950 0,029 14,7 23,4 ± 2,3 C. rosea MMS1090 0,055 4,0 4,7 ± 0,6
Parmi les cinq souches du genre Trichoderma étudiées, trois ont présenté des CI 50 inferieures à 25 µg/mL (MMS13, MMS58 et MMS912). Les deux autres souches, MMS19 et MMS1541, n'ont pas présenté de CI 50 dans la gamme évaluée (> 100 µg/mL).
Le genre Acremonium a présenté la plus grande variabilité d’activité des extraits enrichis en
GL avec des CI 50 comprises entre 10 et 52 µg/mL. Toutefois, parmi les 12 souches évaluées,
90 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
10 extraits présentaient des valeurs de CI 50 inférieures à 25 µg/mL. En ce qui concerne la souche MMS621, la CI 50 était supérieure à 100 µg/mL et pour la souche MMS884 la CI 50 était égale à 51,6 µg/mL. Il est important de rappeler que parmi ces souches, certaines étaient également productrices des profils lipidiques les plus complexes observés en CLHP-SM.
Pour la seule souche du genre Penicillium évaluée (MMS646), les résultats obtenus ont démontré qu'elle ne présentait pas de cytotoxicité à la plus forte dose testée (> 100 µg/mL). Néanmoins, cette souche étant caractérisée par une forte teneur lipidique (Figure IV.2), elle pourrait être valorisée dans d'autres domaines. Ainsi, ces souches non cytotoxiques pourraient être testées sur des cellules saines afin d'évaluer leur possible valeur nutritionnelle mais également cosmétique (Martins et al. , 2014). Les lipides augmentent l'hydratation de la peau en réduisant l'évaporation et présentent des propriétés de soin de la peau et des cheveux (Inès & Dhouha, 2015).
4.2. Conclusion
Au vu de ces résultats Acremonium sp MMS540 et C. rosea MMS1090 ont présenté les meilleures inhibitions de la prolifération des cellules KB (CI 50 10,6 µg/mL et 4,7 µg/mL, respectivement) comparées aux autres souches. En ce qui concerne MMS540, sa proportion en GL représentait 20,6 % de la production lipidique totale contre seulement 4 % pour la souche MMS1090.
91 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
5. Conclusion : Souches retenues suite au criblage
Les souches sélectionnées au départ de cette étude ont été comparées sur la base de leur production lipidique, de la composition en AG, de la complexité des extraits bruts lipidiques/fractions glycolipidiques et des activités cytotoxiques in vitro .
L'évaluation de la production lipidique a révélé que les souches du genre Acremonium présentaient globalement une plus forte teneur en lipides que celles des autres genres étudiés avec en moyenne des teneurs en lipides représentant 18 % de la biomasse. Les souches du genre Trichoderma se positionnaient juste derrière avec des teneurs en lipides moyennes de 10 %.
L'étude du profil des AG n'a pas permis globalement de discriminer une souche ou un genre présentant des caractéristiques atypiques parmi ceux analysés, à l'exception de la souche C. rosea MMS1090 caractérisée par la présence de l’ acide gras conjugué original 4-Me-6,8- 16:2. Nous pouvons noter tout de même, que la souche Acremonium sp. MMS540 a été la seule parmi le genre Acremonium à présenter un profil plus complexe avec la présence des AG 20:2, 20:1 et 17:0.
En ce qui concerne les analyses de la complexité des extraits lipidiques par CLHP-SM, en général, ce sont les souches du genre Acremonium qui se sont révélées les plus intéressantes. En effet, sur la base de la comparaison des chromatogrammes, les souches du genre Acremonium ont présenté une plus forte complexité des profils lipidiques totaux mais également des fractions enrichies en GL dans les zones d’élution correspondantes des chromatogrammes.
Enfin, l'évaluation de la cytotoxicité sur cellules KB a permis de montrer que les souches potentiellement intéressantes à étudier étaient des celles des genres Acremonium et
Trichoderma ainsi que la souche Clonostachys rosea MMS1090, avec des valeurs de CI 50 inférieures à 20 µg/mL.
92 Chapitre IV. Criblage lipidique des souches marines
Ainsi, après l'analyse globale de toutes les informations concernant la production lipidique, le profilage des AG, les profils obtenus par CLHP-SM et les cytotoxicités les plus intéressantes pour chacune des souches, le choix s’est porté sur deux souc hes, C. rosea MMS1090 et Acremonium sp. MMS540.
Clonostachys rosea MMS1090 a été retenu sur la base de sa production lipidique (22 %), supérieure à la production lipidique moyenne de toutes les souches étudiées (18 %), sa composition originale en AG et l’a ctivité cytotoxique de sa fraction enrichie en GL.
Acremonium sp. MMS540 a, quant à elle, été retenue principalement sur la base de la complexité de ses profils chromatographiques et des valeurs de CI 50 observées (10,6 µg/mL).
Afin d’évaluer de manière optimale la variation du lipidome de ces deux souches, différentes approches OSMAC ont été entreprises pour les cultures fongiques. Les principaux résultats des études lipidiques menées sur C. rosea MMS1090 et Acremonium sp. MMS540 sont présentés dans les chapitres V et VI, respectivement.
93
Chapitre V. Étude lipidique de Clonostachys rosea MMS1090
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Contexte général
Comme nous l’avons mentionné dans le Chapitre IV, Clonostachys rosea MMS1090 est l’une des deux souches sélectionnées lors du cri blage pour poursuivre l’étude lipidique et rechercher des lipides d’intérêt bioactifs. En effet, il était intéressant d’une part de poursuivre l’étude de l’acide gras conjugué original 4 -Me-6,8-16:2 et d’évaluer ses activités biologiques. D’autre part, le criblage biologique a également montré l’intérêt de se focaliser sur les GL produits par cette souche qui semblaient prometteurs en termes d’activité biologique. Ce chapitre présente ainsi les principaux résultats obtenus pour ces deux séries de lipides d’ intérêt et aborde également, dans une troisième partie, l’étude d’une autre série de lipides d’intérêt que représentent les stérols.
1. Étude de l’acide gras conjugué 4 -Me-6,8-16:2 Contexte de l'étude
Les levures et les champignons filamenteux sont capables d'accumuler une quantité significative de lipides. Ces micro-organismes sont connus sous le nom de Single Cell Oil (SCO) (Papanikolaou et al. , 2004; Peng & Chen, 2008; Chatzifragkou et al. , 2011; Economou et al. , 2011). Parmi ces lipides, les acides gras conjugués (AGC) peuvent être considérés comme des lipides d’intérêt compte tenu des a ctivités biologiques qui leurs sont associées. Les AGC sont en effet décrits pour présenter des activités anti-cancérogènes, immuno- modulatrices, antidiabétiques, anti-obésité, anti thrombotiques et antiathérogènes (Nagao & Yanagita, 2005; El Roz et al. , 2013) et pourraient représenter un intérêt majeur pour la santé et la nutrition humaine (Ruiz et al. , 2007; Kishino et al. , 2009). Les principales sources naturelles des AGC correspondent au lait de ruminants, aux algues et aux huiles de graines de plusieurs plantes (Ogawa et al. , 2005), mais les champignons ont été également largement reconnus pour leur production d'AGC (Kishino et al. , 2009). Ces micro-organismes constituent une voie alternative pour la recherche et la production des acides gras.
Lors d’une précédente étude, C. rosea MMS1090 avait retenu l’attention pour sa production lipidique (Ruiz, 2007). E n effet, il s’était avéré que cette souche était caractérisée par une production importante de TG (+ de 80 % de l’EBL) mais également par la présence en
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quantité non négligeable (+ de 10 % des AG des triglycérides) d’ un acide gras conjugué original, l’acid e 4-Me-6,8-16:2. Des étapes de purification de cet AG avaient été entreprises afin de poursuivre son identification structurale (configuration de la double liaison conjuguée) mais également de débuter son évaluation pharmacologique. Toutefois, compte tenu des quantités obtenues, ce travail était resté en suspens. Or, les AGC, selon la configuration de leur système conjugué ( trans /trans , cis /trans , trans /cis ou cis /cis ) peuvent présenter des activités différentes comme cela a déjà été décrit largement pour les différents isomères de l’acide linoléique conjugué (9,11 -18:2 ; 10,12-18:2 et 11,13-18:2) (Nagao & Yanagita, 2005; Degen et al. , 2011).
L’acide 4 -Me-6,8-16:2 a fait l’objet d’une seule étude, pub liée en 2007, dans laquelle il a été décrit pour la première fois à partir d'une cytochalasine (Figure V.1) isolée d'un champignon terrestre ( Microporellus subsessilis ) (Kurnia et al. , 2007).
Figure V.1 : Représentation de l'acide gras lié à la 10-Phenyl-[11]-cytochalasine isolée du champignon Microporellus subsessilis. Extrait de Kurnia et al . (2007)
Les analyses structurales réalisées avaient permis de confirmer la configuration trans /trans du système conjugué. Pour autant, aucune évaluation pharmacologique n'avait été effectuée pour cet acide gras. Pourtant, la structure originale de cet AG, avec un système conjugué et une ramification par un groupement méthyle laisse suggérer des activités biologiques potentielles (Shultz et al. , 1992; Wongtangtintharn et al. , 2004; Stachowska, E., 2007; Wang et al. , 2008b; Yuan et al. , 2014).
Ainsi, au cours de ce travail, nous nous sommes donc intéressés à optimiser les rendements de
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production de l'acide 4-Me-6,8-16 en se basant sur une approche OSMAC, les objectifs étant d’en purifier des quantités suffisantes pour parfaire son élucidation structurale et évaluer ses effets sur des lignées cellulaires cancéreuses . Ce travail a fait l’objet d’une publication dans la revue "Marine Drugs", présentée ci-après.
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Mar. Drugs 2015, 13 , 4934-4948; doi:10.3390/md13084934 OPEN ACCESS marine drugs ISSN 1660-3397 www.mdpi.com/journal/marinedrugs Article
The Marine-Derived Fungus Clonostachys rosea, Source of a Rare Conjugated 4-Me-6E,8E-hexadecadienoic Acid Reducing Viability of MCF- 7 Breast Cancer Cells and Gene Expression of Lipogenic Enzymes
Ana Camila Dos Santos Dias 1, Nicolas Ruiz 1, Aurélie Couzinet-Mossion 1, Samuel Bertrand 1, Muriel Duflos 2, Yves-François Pouchus 1, Gilles Barnathan 1, Hassan Nazih 1, * and Gaetane Wielgosz-Collin 1, *
1 Faculty of Pharmacy, University of Nantes, MMS; 9, Rue Bias, 44000 Nantes, France; E- Mails: [email protected] (A.C.D.S.D.); [email protected] (N.R.); [email protected] (A.C.-M.); [email protected] (S.B.); [email protected] (Y.-F.P.); [email protected] (G.B.) 2 Faculty of Pharmacy, University of Nantes, IICiMed, 9 Rue Bias, 44000 Nantes, France; E- Mail: [email protected]
* Authors to whom correspondence should be addressed; E-Mails: [email protected] (H.N.); [email protected] (G.W.-C.); Tel.: +33-272-641-154 (H.N.); +33-276-645-081 (G.W.-C.).
Academic Editor: Alejandro M. Mayer
Received: 3 June 2015 / Accepted: 29 July 2015 / Published: 4 August 2015
Abstract: A marine-derived strain of Clonostachys rosea isolated from sediments of the river Loire estuary (France) was investigated for its high lipid production. The fungal strain was grown on six different culture media to explore lipid production changes. An original branched conjugated fatty acid, mainly present in triglycerides and mostly
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produced when grown on DCA (23% of total fatty acid composition). It was identified as 4-Me-6E,8 E-hexadecadienoic on the basis of spectroscopic analyses. This fatty acid reduced viability of MCF-7 breast cancer cells in a dose dependent manner (up to 63%) at physiological free fatty acid human plasma concentration (100 μM). Reduction of gene expression of two lipogenic enzymes, the acetyl CoA carboxylase (ACC) and the fatty acid synthase (FAS) was evaluated to explore the mechanisms of action of 4-Me- 6E,8 E-16:2 acid. At 50 μM, 50% and 35% of mRNA gene expression inhibition were observed for ACC and FAS, respectively. Keywords: Clonostachys rosea ; fatty acids; conjugated fatty acid; lipids; cancer; anti-carcinogenic; MCF-7; lipogenesis; acetyl-CoA carboxylase; fatty acid synthase
1. Introduction
Various oleaginous yeasts and filamentous fungi have been recognized for their production of lipids. In fact, they grow quickly on different media, have a short life cycle, require less maintenance and produce significant amounts of oil [1]. The lipid content of these microorganisms may vary depending on the conditions of cultivation such as pH, temperature, ratio between carbon and nitrogen available in the medium [2]. For instance, under conditions of nitrogen stress, intracellular lipid production of yeast can increase significantly depending on the strain [3]. Over the years, the fatty acid (FA) profiles present in oleaginous microorganisms were explored. FA composition of a several fungi belonging to Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, and Basidiomycetes have been studied. It has been demonstrated that they are a source of various FA, however their general composition stay constant but with different proportions. The most common and abundant FA are palmitic acid (16:0), stearic acid (18:0), oleic acid (9-18:1), and linoleic acid (9,12-18:2) [4 –6]. Furthermore, some studies also showed that most lower fungi (Chytridiomycetes, Oomycetes, and Zygomycetes) are characterized by the significant presence of polyunsaturated fatty acids (PUFA) unlike some species of higher fungi (Ascomycetes and Basidiomycetes) which produce only α-linolenic acid (9,12,15-18:3), the precursor of the biosynthetic pathway of ω3 FA, known as essential FA. Higher fungi can also produce essential PUFA such as arachidonic acid (20:4 ω6) or docosahexaenoic acid (22:6 ω3) but in lower proportions [4 –6]. Some studies have demonstrated that certain species of Ascomycetes (yeasts and molds) could produce essential FA such as γ-linoleic acid (GLA) and ω6 [7], produced by the unsaturation of linoleic acid. This production is highly dependent on the source of carbon used in the culture medium.
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Studies focusing on FA from marine-derived fungi are still rare [8 –11]. Therefore, these marine microorganisms represent an alternative FA production approach for a use in human health and nutrition. In a previous study, we have shown that fungal lipid production by Agar surface fermentation is an easy to operate process and could be used for further screening of marine-derived fungi [8]. In this context, our attention focuses on a marine-derived strain of Clonostachys rosea (MMS1090), a filamentous fungus isolated from marine sediments of the river Loire estuary (France), which was detected as a high lipid producer. C. rosea (Ascomycete, syn. Gliocladium roseum : Teleomorph Bionectria ochroleuca ) [12], is known for its high lipid production [13]. In addition, it was also reported to produce volatile compounds, major components of biodiesel [14]. To optimize the lipid production a “One Strain Many Compounds” (OSMAC) approach was performed on six culture media [15] and FA composition was determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). An unusual conjugated fatty acid (CFA) was purified and identified based on spectroscopic data. Because some CFA (such as conjugated E9, E11-octadecadienoic acid) have already shown inhibitory effects on mammary cancerous cell (MCF-7) proliferation [16] this unusual CFA was evaluated for its anti- proliferative activity on MCF-7 breast cancer cells. In addition, as aberrant lipogenesis in cancer cells is mediated by increased expression and activity of acetyl CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) [17], the mechanism of action of this rare CFA was further explored on these two lipogenic enzymes.
2. Results and Discussion
Lipids from microorganisms have a real importance in human health, once the FA composition studied, they can be tested against several diseases. However, the lipid composition of Clonostachys rosea (C. rosea ) was not yet investigated in different culture media. It could be of interest in the pharmacological field, including research of new molecules.
2.1. Lipid and Fatty Acid Composition of C. rosea —OSMAC Approach
To optimize the lipid production of the marine-derived strain of C. rosea MMS1090, an OSMAC approach was performed on six culture media. FA profiling was determined by GC- MS on the six extracts (Table 1). Changes of lipid production by the strain were observed and media composition compared according to the amount of supplemented sugar (see
100
Experimental Section for the amount of supplemented sugar). An unusual CFA was observed.
Table 1. Total lipid content (TL % dw) and major fatty acid composition (% total FA) of C. rosea on six different culture media. Fatty Acids (Mean ± SD) (% Total FA) Culture Lipid Content Medium (%, dw) 16:0 4-Me-6,8-16:2 18:2 and 18:1 18:0 Others FA *
PDA 12.9 ± 0.3 16.1 ± 0.9 8.0 ± 3.0 55.0 ± 4.0 10.0 ± 2.0 12.0 ± 7.0 MES 29.7 ± 0.4 20.0 ± 5.0 9.0 ± 2.0 52.5 ± 13.5 8.0 ± 3.0 10.0 ± 5.0 CYA 8.7 ± 0.8 15.7 ± 0.5 14.0 ± 1.0 60.0 ± 17.0 6.0 ± 0.1 4.0 ± 3.0 YES 30.7 ± 0.4 14.0 ± 2.0 11.0 ± 1.0 64.0 ± 6.0 6.0 ± 1.0 4.0 ± 2.0 DCA 14.3 ± 0.4 16.0 ± 1.0 23.0 ± 0.8 44.6 ± 4.7 5.0 ± 1.0 10.0 ± 6.0 MEA 14.9 ± 0.2 17.5 ± 0.4 8.0 ± 2.0 57.0 ± 2.0 9.0 ± 0.5 9.0 ± 6.0 * % of total fatty acid content ≤3%.
FA compositions observed indicated the ability of this strain to use the different available nutrients provided in the culture media leading to some differences in FA production. The highest lipid contents were obtained on YES and MES media, 30.7% and 29.7%, respectively. These high values could be explained by the high sucrose content of these culture media (150 g sucrose/L) which would engage the lipid cells accumulation. In fact, under suitable culture conditions, some microorganisms may convert the carbon sources from several substrates into storage lipid [18,19]. The stocking rate for fungi could reach 70% of the cell biomass [20,21]. Regarding the other culture media, the values for the production of lipid are almost two times lower. Each extract was saponified and the total FA composition was determined by GC-MS analysis. Finally, all FA were identified by MS EI spectra investigation and the five major FA are presented in Table 1. Analysis of fatty acid methyl esters (FAME) by GC-MS is used to define the length of the carbon chain, to classify FA by their number of double bonds or ramifications, and estimate their relative proportion. Analysis of N-Acyl pyrrolidide derivatives (NAP) allows positioning the double bonds on the unsaturated FA. Therefore, they become complementary to analyze FA composition. All the extracts contained these five major FA representing between 88% and 96% of total FA. However, a total of 31 FA were identified in this strain, corresponding to 14 to 24 carbon FA. Four of them, 16:0, 18:0, 9-18:1 and 9,12-18:2 are the most common FA described in oleaginous microorganisms [4,8 –10]. Among the different cultures analyzed, a rare FA was observed mainly when grown on DCA medium (23% of total lipid). Providing some amount of amino acids in the culture medium seems to promote its production. Indeed, DCA medium contains 10 g/L of hydrolysed casein
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and CYA and YES media provide yeast extract which are rich in amino acids. These three culture media of C. rosea lead to the production of 23%, 14% and 11% of this particular FA, respectively. In order to know the repartition of observed FA in the different lipid classes, DCA extract was partitioned on an open silica gel column leading to fractions corresponding to the different lipid classes. After saponification and esterification, FA composition was analyzed by GC-MS for each fraction (Table 2). This C. rosea oleaginous strain extract contained a high triglyceride (TG) content (84%) composed mainly of unsaturated FA (58%). Few studies on the separation of lipid classes were made on fungi; usually neutral lipids are the major ones when fungi are cultivated on solid medium [8]. Their proportion varies according to the lipid class and certain FA are present in only a specific class, such as hydroxylated FA observed only in the phospholipids.
Table 2. Fatty acid composition to different lipid classes for C. rosea on DCA culture medium.
Lipid production Main FA Composition (% total FA) Lipid Classes % of Total Lipids Saturated FA* Unsaturated FA* 4-Me-6,8-16:2 Triglycerides 84 ± 7 28 ± 2 58 ± 7 20 ± 4 Glycolipids 4 ± 2 46 ± 3 44 ± 2 5 ± 1 Phospholipids 12 ± 6 29 ± 3 64 ± 6 3 ± 1 Also identified (≤3%): 14:0, 15:0, 9 -16:1, 4-Me-6-16:1, 6,8-16:2, 17:0, 4-Me-6,8-16:2 (isomer A), 4-Me-6,8-16:2 (isomer B), cj-17:2, 9,11-18:2, 10,12-18:2, cj-18:3, 19:2, cj-19:2, 10,14-20:2, 10-20:1, 11-20:1, 20:0, 21:0, 12- 22:1, 22:0, 23:0, 2-OH-22:0**, 24:1, 24:0, 2-OH-24:0**. cj, conjugated; * only major FA for saturated (16:0 and 18:0) and unsaturated (4-Me-6,8-16:2 ; 18:1 and 18:2); ** only presents in phospholipids.
Three isomers (A, B, and C) of the unusual CFA, the 4-Me-6,8-16:2 acid, have been identified based on their chromatographic behavior, the analysis of their FAME and their NAP spectra. Figure 1 shows the NAP spectrum of the isomer C. A molecular ion peak at m/z 319 [M] + confirmed the heptadecadienoic structure. A diminished peak corresponding to the fragment at m/z 140 [M-179]+ flanked by an elevated peak corresponding to the fragment at m/z 154 [M- 165]+ indicated a methyl bran ch at the fourth carbon. The conjugated diene system (Δ6,8) was located at C6-C7, and C8-C9 where a difference of 12 in m/z ratios was observed between each couple of those carbons. Isomers A and B of 4-Me-6,8-16:2 acid were present in low amounts, less than 2% of total FA. The third-one was present in higher amount in TG (20%), which implies that it could be a storage FA [22].
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Figure 1. NAP spectrum of the 4-Me-6,8-16:2 acid (isomer C) produced by Clonostachys rosea .
The presence of the unusual 6,8-16:2 acid was also detected in low amount (1.3% of total FA). This CFA differs from the three previous isomers of 4-Me-6,8-16:2 acid by the lack of methyl branch on C-4. A possible biosynthetic link could be suggested between these CFA. Nevertheless, the biosynthetic pathway involving the production of the three 4-Me-6,8-16:2 isomers remain unknown. Biosynthesis of CFA is well documented in bacteria from rumen origin in relation to the production of conjugated linoleic acids (CLA). CLA are produced by isomerization of linoleic acid or by Δ9-desaturation of trans -11-octadecenoic acid ( trans - vaccenic acid) [23,24]. In fungi, CLA are mainly related to the Δ9-desaturation of trans - vaccenic acid [24]. A possible way of biosynthesis of the 4-Me-6,8-16:2 acid could be a desaturation of the 4-Me-6-16:1 which was also detected in low amounts (less than 1% of TFA). In addition, it could be suggested that these methyl-branched CFA arise from a mixed isoprenoid/acetate biogenesis. The presence of branched and conjugated FA in a fungus is therefore unexpected and remains rare.
2.2. Characterization of 4-Me-6-8-Hexadecadienoic Acid Structure (Isomer C)
For structure identification of the isomer C of 4-Me-6,8-16:2 acid, its isolation was necessary. For that purpose, cultures of C. rosea MMS1090 were performed on nine DCA-containing Petri dishes to produce sufficient amount. After fungal biomass extraction, the crude lipid
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extract (4.4 g) was saponified leading to free total FA (3.5 g). Enrichment and purification of the 4-Me-6,8-16:2 was performed by urea fractionation followed by consecutive silver ion column chromatography and silver ion HPLC. The final fraction (100 mg) contained the 4- Me-6,8-16:2 methyl ester with a purity of 98% (according to GC-MS). Proton NMR analysis confirmed the structure of the CFA (Table 3), the spectrum being consistent with data previously described in the literature [25]. The 13 C NMR spectra (Table 3) showed the signals for 18 carbons and the DEPT 135 spectra distinguished a switch between C-4 and C-10 signals in comparison to previously reported spectra [25]. Starting from the proton of C-5 or C-10, all the 1H and 13 C NMR signals of the conjugated double bonds were assigned by using the homonuclear correlation spectroscopy (COSY), and heteronuclear single quantum correlation (HSQC).
Table 3. 1H and 13 C NMR spectroscopic data for FAME of 4-Me-6,8-16:2 (structure and atom number in Scheme 1).
Positions δC δH (Integral, Mult., J = Hz) 1 174.4 - - 1.33 (1H, m) 2 31.9 2.33 (1H, m) 1.33 (1H, m) 3 31.8 2.33 (1H, m) 4 32.9 1.48 (1H, m) 1.99 (1H, dt, 7.2, 6.8) 5 39.8 2.05 (1H, dt, 7.2, 6.8) 6 129.8 5.54 (1H, m) 7 130.1 5.99 (1H, m) 8 132.03 5.99 (1H, m) 9 132.9 5.54 (1H, m) 10 32.6 2.05 (2H, m) 11 29.2 1.44 (2H, m) 1.33 (1H, m) 12 31.4 1.70 (1H, m) 13 29.4 1.33 (2H, m) 14 29.1 1.33 (2H, m) 15 22.6 1.33 (2H, m) 16 14.1 0.86 (3H, t, 6.8) 17 19.1 0.88 (3H, d, 6.4)
–OCH 3 51.5 3.66 (3H, s) 1 13 Taken in CDCl 3 at 400 MHz for H and at 100 MHz for C.
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Scheme 1. Chemical structure of 4-Me-6E,8 E-16:2 methyl ester.
Infrared spectroscopy analysis was performed to determine the configuration of the diene system. A characteristic band of strong intensity is observed at 987 cm −1 , corresponding to the stretching vibration of CH trans. In addition, no absorbance at 700 –750 cm −1 corresponding to a cis stretching vibration was observed . Therefore, the structure of this unusual CFA is 4-Me- 6E,8 E-16:2. To our knowledge conjugated 4-Me-16:2 acids were rarely described in literature. For instance, there is only one description of the 4-Me-6,8-16:2 acid, identified in a cytochalasan derivative and corresponding to the trans Δ6,8 isomer [25]. This FA was described from the mushroom Microporellus subsessilis , a Polyporaceae (Basidiomycota) collected in Indonesia, taxonomically distant of C. rosea . Moreover, it is the first report of the production of such CFA from a filamentous fungi belonging to the Ascomycota and isolated from the marine environment. The fact that this CFA is rare and not universal in microorganisms makes it interesting as a taxonomic biomarker. Due to the presence of conjugated diene system, CFA have attracted particular attention as active compounds due to their remarkable biological activities. They were reported to possess anti-carcinogenic, immune modulator, anti-diabetic, anti-obesity, antithrombotic, and anti- atherogenic activities [16,26 –30] but also antimicrobial ones [31]. The main natural sources of CFA correspond to ruminant milk, algae, and seed oils of several plants [23,26]. On the past ten years, numerous investigators have extensively studied the beneficial role of CLA and ω3 FA against tumor growth as well as tumor types both in vitro and in vivo . The protective effect of CLA against tumors is well documented [16]. In addition, some nutritional trials showed that CLA supplemented diet lead to their incorporation in the mammary gland in a group of women [32,33]. This can easily suggest that CFA could be used as oil supplements, in pill or liquid form, to prevent or reduce mammary cancer. However, despite the considerable investigation on CLA, no study is available on the role of other CFA such as the 4-Me-6E,8 E- 16:2. Fungi like C. rosea seem to represent an alternative renewable source of those remarkable compounds.
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2.3. 4-Me-6E,8E-Hexadecadienoic Acid Reduces Viability of Human MCF-7 Breast Cancer Cells
The original structure of this rare FA, with a conjugated diene system and a methyl branch, suggest potential biological activity [16,29,34,35]. To evaluate its anti-proliferative activity, viability of MCF-7 breast cancer cell line after treatment with 4-Me-6E,8 E-16:2 acid was assessed using MTT assays. The dose level used, ranging from 0 to 100 μM, was consistent with previous studies with PUFA and CLA and closed to the physiological range concentration normally observed in human plasma (10 –80 μM) [16,36 –39]. The 4-Me-6E,8 E- 16:2 acid reduced the viability in a dose dependent manner (Figure 2). After 48 h, significant growth inhibitions of 43% and 63% ( p < 0.05) were observed at 50 μM and 100 μM, respectively.
100
80 * ** 60 * 40 Cell viabilityCell(%) 20
0 0 25 50 100 4-Me-6E,8 E-16:2 acid (µM)
Figure 2. Effect of 4-Me-6E,8 E-16:2 acid on proliferation of MCF-7 cancer cell line. MCF-7 cells were treated with 4-Me-6E,8 E-16:2 acid at 25 μM, 50 μM and 100 μM for 48 h ( n = 3 experiments in triplicates). * p < 0.001 vs. control; ** p < 0.01 vs. control ( t-test).
2.4. 4-Me-6E,8E-Hexadecadienoic Acid Reduces Gene Expression of Lipogenic Enzymes
Numerous studies have demonstrated that cancer cell proliferation is associated with hyperactivity of lipogenesis [40 –44] manifested by high expression of the lipogenic enzymes. The alteration of the activity of the key lipogenic enzymes (ACC and FAS) is critical for the development of the malignant phenotypes [41,45]. Furthermore, overexpression of FAS correlates with poor prognosis in several types of human malignancies [46]. In addition, the
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hyperactivity and over expression of FAS have been described in aggressive breast carcinomas [47]. Because FAS is the key enzyme involved in the FA synthesis, many studies have evaluated the effect of different FA ( ω3 PUFA, CLA) on FAS activity by different nutritional or pharmacological approaches. For example docosahexaenoic acid (DHA) showed FAS inhibitory activity but to a lower level than CLA. Even closely related isomers may exert different inhibitory activity on FAS as exemplified by the difference between Z9, E11 and E10,Z12 isomers of the CLA [48]. Accordingly and because of the original source and structure of 4-Me-6E,8 E-16:2 acid, it was further investigated whether this FA affects proliferation of mammary cancerous cells and mRNA expression of ACC and FAS. The effects of treatment with this CFA on expression of these two lipogenic enzymes on MCF-7 were evaluated by real time quantitative PCR. The concentration of 4-Me-6E,8 E-16:2 acid used (50 μM, close to 50% of growth inhibition after 48 h), was in agreement with previous studies concerning CLA [16,49,50]. At 50 μM and after 24 h, gene expression was reduced for both enzymes (ACC, 50%, and FAS, 35%) (Figure 3).
1.21,2 a 1,21.2 b b
1.0 1 1.01
0.80,8 0,80.8 * * 0.60,6 0,60.6
0.40,4 0,40.4
0.20,2 0,20.2 Relative mRNA RelativemRNA Expression RelativemRNA Expression
00 00 0 50 0 50 4-Me-6E,8 E-16:2 acid (µM) 4-Me-6E,8 E-16:2 acid (µM)
Figure 3. Effect of 4-Me-6E,8 E-16:2 acid on gene expression of ACC ( a) and FAS ( b) of MCF-7 cancer cell line. MCF-7 cells were treated with 4-Me-6E,8 E-16:2 acid at 50 μM for 24 h (n = 3 experiments in triplicates). * p < 0.05 vs. control ( t-test).
The major observation of this study was that 4-Me-6E,8 E-16:2 acid reduces ACC and FAS expression and inhibits their proliferation. However, its mechanism of action is not known. Some studies have reported that FAS inhibition in human breast cancer cells leads to accumulation of malonyl-CoA, which is an inhibitor of FA oxidation because it down- regulates CPT-1 (carnitine-palmitoyl transferase-1); an enzyme involved in mitochondrial FA uptake [51]. In addition, in breast and prostate cancers, similar changes have been found in the expression of ACC (high expression). This enzyme catalyzes the condensation of malonyl- CoA using acetyl-CoA and is considered as a rate-limiting enzyme of lipogenesis [52].
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Silencing of ACC gene resulted in the inhibition of LNCaP prostate cancer cell line proliferation similarly to FAS suppression by RNAi technology. Overall, these data indicates the effect of 4-Me-6E,8 E-16:2 acid on cancerous cell proliferation is mediated through its impact on lipid metabolism by down-regulating lipogenic enzymes ACC and FAS. More investigations are needed to clarify its role in the modulation of lipid metabolism.
3. Experimental Section
3.1. Clonostachys rosea Strain MMS1090
The fungal strain was isolated from sediments at Port du Bec, France, in 2002 and identified as Clonostachys rosea (Link: Fries) Schroers on the basis of molecular method by sequencing the internal transcribed spacers ITS1 and 2 and the 5.8S regions. The strain is conserved in the fungal collection of the laboratory MMS under the reference number MMS1090. Sequences of ITS1, ITS2 and 5.8S were deposited in GenBank under accession number KR011118 (National Center for Biotechnology Information, 2015).
3.2. Culture Media for OSMAC Approach
Petri dishes (10 cm diameter) were inoculated with conidia suspension (1 × 10 6 cells/mL) in six marine-like solid media prepared with artificial sea water (Reef Crystals 36 g/L): DCA (Dextrose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L, Difco); MEA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1 g/L, glucose 20 g/L, Agar 20 g/L; PDA (Potato extract 4 g/L, Dextrose 20 g/L, ZnSO 4, 7H 2O 0.01 g/L, CuSO 4, 5H 2O 0.005 g/L, Agar 15 g/L; YES (Yeast Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L plus salts); MES (Mussel Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L plus salts); CYA (Czapek concentrate 10 mL, Yeast extract 5 g/L, K 2HPO 4 1 g/L, trace metal solution 1 mL, sucrose 30 g/L, Agar 15 g/L). Cultures were incubated in natural light during 10 days at 27 °C.
3.3. Lipid Extraction and Separation of Lipid Classes
For each culture media, biomass was removed with a scalpel and allowed to dry in an oven at 65 °C and weighing until a stable weight. Total lipids were extracted from the dried biomass during 2 h at room temperature by two-step CH 2Cl 2/MeOH extraction 2:1 then 1:2 ( v/v). The resulting extracts were filtered, pooled and washed with distilled water (40% of total volume). Organic phase was then evaporated to dryness under vacuum providing crude total lipids (TL). TL are expressed in percentage of the total extracted dry biomass. Crude lipids were
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chromatographed on an open silica gel column with dichloromethane (triglycerides), acetone (glycolipids) and methanol (phospholipids) as successive eluents.
3.4. Preparation of Fatty Acid Methyl Esters and N-Acyl Pyrrolidides
FAME were prepared by saponification of crude lipids or lipid classes (1.5 h at 80 °C under reflux with KOH/EtOH 2 moL/L) followed by methylation of the free FA (40 min at 80 °C under reflux with 6% methanolic hydrogen chloride). NAP were prepared by direct treatment of the FAME with pyrrolidine/acetic acid (5:1 v/v) for 60 min at 85 °C under reflux.
3.5. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis
FAME and NAP were analyzed using a GC-MS instrument (Hewlett Packard HP 6890 —GC System, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) linked to a mass detector (HP 6890— E.I. 70 eV) equipped with a SLB-5™ column (60 m × 0.25 mm × 0.25 μm). The carrier gas was helium at a flow rate of 1 mL/min. The temperatures of the injector and detector were respectively set at 250 °C and 280 °C. One microliter was injected in splitless mode. For FAME analysis, the column temperature was held at 170 °C for 4 min and programmed to 300 °C at 3 °C/min; for NAP, a bearing at 200 °C for 4 min, then 3 °C/min up to 310 °C and held for 20 min. The solvent delay was 9 min.
3.6. Production, Purification and Structural Elucidation of 4-Me-6,8-16:2 Fatty Acid
For production of 4-Me-6,8-16:2 FA, fungal cultures of C. rosea MMS 1090 were performed on DCA-containing Petri dishes (20 cm diameter, 125 mL) and incubated at 27 °C in natural light. After biomass extraction, total lipids were saponified, as described previously. Total FA were subjected to a urea inclusion step in order to obtain a fraction enriched in PUFA. Urea inclusion was prepared by heating FA mixtures and urea in MeOH under reflux for 2 h (1:2:0.01, w/w/v). After urea crystallization at room temperature, the urea-complex fraction enriched in saturated FA was removed and the filtrate enriched in PUFA and containing the 4- Me-6,8-16:2 acid was extracted with hexane and evaporated. The enriched fraction of 4-Me- 6,8-16:2 FA was esterified under reflux (1 h) in MeOH/HCl 2% (10:1 w/v) and the 4-Me-6,8- 16:2 methyl ester was then purified by a three-step silver ion chromatography method using two open columns followed by HPLC. Fraction purity was monitored by GC-MS analyses. Briefly, the enriched fraction of 4-Me-6,8-16:2 methyl ester was eluted from a first open column of silica gel impregnated with silver nitrate (Chromagel, 300 × 20 mm, 60Å, 40 –
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63 μm, SDS, Peypin, France) using Hexane/Ethyl acetate 100:0 to 90:10 ( v/v) as eluent. 4-Me- 6,8-16:2 methyl ester was eluted with Hexane/Ethyl acetate 90:10 ( v/v). This fraction was further subjected to a second open column (300 × 20 mm) using Cyclohexane/Ethyl acetate 98:2 to 90:10 ( v/v) and eluted with Cyclohexane/Ethyl acetate 96.5:3.5 ( v/v). Finally, the 4- Me-6,8-16:2 methyl ester was purified by an Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) on silver ion column (Varian Chrompack ChromSpher Lipids 250 × 4.6 mm, 5 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ) with a mobile phase of Hexane/Acetonitrile 99.85:0.15 ( v/v) at a constant flow rate of 1 mL/min. Detection was performed by UV at 215 nm. All data were acquired by HP ChemStation for LC. Structural analysis was performed by infrared spectroscopy and 1H-NMR spectroscopy with
CDCl 3 to determine the configuration of the double bond. IR spectra were recorded on a PerkinElmer Spectrum 100 Series FT-IR spectrometer. 1H, 13 C NMR spectra were recorded on a Bruker DXP 300 spectrometer at 300, 75 MHz, respectively and a Bruker AVANCE 400 MHz high resolution NMR spectrometer at 400, 100 MHz, respectively. Multiplicities are reported as singlet (s), doublet (d), doublet of doublets (dd), doublet of triplet (dt), triplet (t), multiplet (m).
3.7. Cell Viability Assay
Before pharmacological evaluation, 4-Me-6,8-16:2 acid was prepared by saponification of the purified FAME (1.5 h at 80 °C under reflux with KOH/EtOH 2 M). Human breast cancer MCF-7 cells were purchased from the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), were purchased from Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) was obtained from BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Uptilight US Blot HRP substrate was from Interchim (Montlucon, France). All other reagents were purchased from Sigma Aldrich. MCF-
7 cells were cultured at 37 °C in a humidified incubator with 5% CO 2 in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% glutamine and 1% penicillin- streptomycin. Viability of MCF-7 was tested in 96-well plate at density 10 4 cells per well in 200 μL of culture medium and allowed to adhere overnight. Then the seeding medium was removed and cells were treated with 4-Me-6,8-16:2 acid at 25 μM, 50 μM and 100 μM diluted in 0.1% BSA containing medium for 48 h. For MTT assay, 50 μL MTT (at 2.5 mg/mL) was added to each well at a final concentration of 833 μg/mL. The mixture was further incubated for 4 h, and the liquid in the wells was removed thereafter. Dimethyl sulfoxide (DMSO 200 μL) was then added to each well to solubilize the formazan product and the absorbance was
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read at 570 nm. The relative cell viability was expressed as a percentage of the control that was not treated with 4-Me-6,8-16:2 acid.
3.8. Gene Expression of Lipogenic Enzymes
MCF-7 cells were plated at a density of 5 × 10 5 in a 6-well plate in 2 mL of culture medium and allowed to adhere overnight. Then the seeding medium was removed and cells were treated with 50 μM of 4-Me-6,8-16:2 acid diluted in 0.1% BSA-containing medium for 24 h at 37 °C. Total RNA was isolated by the TriZol Reagent (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) following the manufacturer’s instructions. The mRNA (1 μg) was then reverse-transcribed into cDNA using Super-ScriptIII Reverse Transcriptase (Invitrogen, Waltham, MA, USA). An initial denaturation step for 5 min at 70 °C was followed by an elongation phase of 45 min at 50 °C. Quantitative-PCR was performed on a MyiQ2 Real-Time PCR Detection System (Bio- Rad, Marnes-la-Coquette, France) using SYBR Green Supermix. The PCR was carried out for 45 cycles of 95 °C for 30 s and 60 °C for 30 s. The fluorescence was read during the reaction, allowing continuous monitoring of the amount of PCR product. The results were normalized with the values observed for the gene expression of untreated cells.
4. Conclusions
This study of the marine-derived Clonostachys rosea MMS1090 confirm that this strain could be considered as oleaginous. This high lipid production is particularly obtained using high- sucrose-content culture media that lead to a high amount of TG (84% of total FA). The lipids are recognized to possess potent biotechnological interest. Moreover this strain produces lipids composed of a rare CFA in high amounts (up to 23% of total FA) when grown on DCA medium. This unusual FA was identified as 4-Me-6E,8 E-16:2 acid and is present mainly in the TG. To our knowledge this is the first study which refers to a branched CFA isolated from a marine-derived strain. In addition the two other isomers of this particular lipid were also detected. This rare CFA reduces proliferation of mammary cancerous cells (MCF-7) at normal human plasma free FA concentration. This could be related to the down-regulation of lipogenic enzymes ACC and FAS. This preliminary in vitro study should be completed by in vivo studies to confirm the impact of this rare CFA in relation to regular dietary intake.
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Acknowledgments The authors acknowledge the CAPES Foundation, Ministry of Education of Brazil, Brasília — DF 70040-020, Brazil for the Ph. D. fellowship and the technical platform ThalassOMICS of Biogenouest for the SM analyses. Thanks are also due to E. Montassier , J. M. Huvelin , C. Chaillou , V. Rabesaotra and T. Robiou du Pont for their technical participation and L. Bryk for English revisions.
Author Contributions
A.C.D.S.D. as Ph. D. student was implied at all experimental stages. A.C.M., N.R. and S.B. participated in data analyses, results exploitation and revised the article critically for intellectual content. H.N. supervised the biological part of this study. M.D. participated in RMN and IR data analyses. Y.F.P. supervised the choice of the strain and the fungal collection. G.W.C. and G.B. initiated and conducted the research project. G.W.C. has been supervisor of the thesis work of A.C.D.S.D. and was responsible for writing arranging and checking the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
Conflicts of Interest
The authors declare no conflict of interest.
Abbreviations
CFA Conjugated fatty acid FA Fatty acid FAME Fatty acid methyl ester GC-MS Gas chromatography coupled to mass spectrometry NAP N-Acyl pyrrolidide OSMAC One strain many compounds PUFA Polyunsaturated fatty acid TL Total lipids TG Triglycerides ACC Acetyl CoA carboxylase FAS Fatty acid synthase
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© 2015 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
116
L’un des questionnements de cette étude éta it de savoir si cet acide gras, très peu décrit jusqu’à présent, pouvait correspondre à un bio -marqueur de l’espèce C. rosea . Pour cela, une étude complémentaire a été réalisée sur quatre autres souches terrestres provenant du laboratoire "Mycology and Biotechnology Group - Institute for Plant Production Sciences IPS - Agroscope", en Suisse, mais aussi sur deux souches marines (MMS 528 et 863) appartenant au genre Gliocladium , taxonomiquement proche. De manière surprenante, seule une souche terrestre de C. rosea produisait également cet acide gras en proportions inferieures (5 % des AG totaux). Ces résultats préliminaires sont très intéressants et pourraient suggérer l’existence, au sein de l’espèce C. rosea de deux « chimiotypes ».
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2. Étude des glycolipides Contexte de l'étude
Plusieurs monosaccharides existent dans la nature, cependant seul un nombre réduit intervient comme intermédiaire de biosynthèse ou comme composant structural des GL (Sellick et al. , 2008). Le glucose, qui est le glucide le plus utilisé dans les préparations des milieux de culture fongique, en fait partie (Chatzifragkou et al. , 2010; Diamantopoulou et al. , 2013). Toutefois, d'autres hexoses, tel que le galactose, peuvent également être assimilés et peuvent contribuer de manière importante au métabolisme énergétique (McCourtie & Douglas, 1981; Sellick et al. , 2008; Slot & Rokas, 2010). Enfin, d'autres glucides sous forme plus complexes, comme les disaccharides, peuvent également être absorbés une fois la digestion par les machines enzymatiques entamée (Farag et al. , 1983; Fakas et al. , 2009; Liang et al. , 2012).
Ces différents types de glucides ne possèdent pas exactement les mêmes voies métaboliques. Parmi eux, le glucose et le galactose (Figure V.2) sont assimilés différemment par les cellules.
Figure V.2 : Structures du D-glucose et du D-galactose
Les enzymes de la voie de Leloir catalysent la conversion du galactose en une version métaboliquement plus facile d'être assimilée, le glucose-6-phosphate (Sellick et al. , 2008). Cette voie est nécessaire car le galactose lui-même ne peut pas être utilisé directement pour la glycolyse (Figure V.3).
118
Figure V.3 : Représentation de la voie de Leloir du métabolisme du galactose. Les différentes enzymes qui catalysent les réactions chez la levure sont discriminées. Extrait de Sellick et al. (2008).
Cependant, bien que plus difficilement assimilable que le glucose, le galactose, une fois transformé en UDP-galactose, peut être assimilé et transféré pour la glycosylation des protéines et des lipides (Timson, 2007). Le galactose, ainsi incorporé dans les GL, les rendrait plus bioactifs que le glucose (Bergter & Villas Boas, 1995; Barreto-Bergter et al. , 2004, 2011). À partir de ce constat, nous nous sommes donc intéressés à étudier l’effet de la nature du sucre utilisé dans les milieux de culture sur l'induction de métabolites bioactifs dans les fractions glycolipidiques produits par C. rosea . L’objectif final était d’orienter le métabolisme lipidique de C. rosea MMS1090 en favorisant la production de GL bioactifs. Pour cela, nous avons utilisé une approche OSMAC basée sur des milieux de culture glucosés ou galactosés afin de sélectionner le milieu le plus propice à la production de GL bioactifs. Les résultats obtenus sont présentés dans cette deuxième partie.
119
2.1. Effet du sucre sur la production des glycolipides bioactifs
2.1.1. Croissance fongique et rendement lipidique
C. rosea MMS1090 a été cultivé sur les milieux de culture DCA, PDA et MEA réalisés à base de glucose et de galactose. La souche cultivée sur les milieux avec du galactose a présenté une croissance réduite principalement sur milieu DCA et PDA (Figure V.4). Cela pourrait être expliqué par la difficulté d'assimiler le galactose par C. rosea MMS1090.
AB
Figure V.4 : Observation macroscopique des cultures de C. rosea MMS1090 sur milieu DCA à base de glucose (A) et de galactose (B), après 7 jours de culture (27 °C).
En revanche, sur MEA, la nature du sucre n’a pas influencé la croissance fongique. De la même manière, la production lipidique a été impactée lorsque C. rosea a été cultivée sur milieux DCA et PDA galactosés avec des quantités totales d’extraits obtenus plus faibles (Tableau V.1).
Tableau V.1 : Production lipidique totale et rendement glycolipidique de C. rosea sur les différents milieux étudiés glucosés ou galactosés.
C. rosea MMS1090
DCA PDA MEA
EBL (g) 1,33 0,491 0,687 Glucose GL (%) 3,8 ± 0,2 5,1 ± 0,3 6,8 ± 0,3 EBL (g) 0,206 0,128 1,058 Galactose GL (%) 10,7 ± 0,3 22,6 ± 3,4 4,6 ± 0,3 EBL (g) = Σ des triplicat as
120
Cependant, sur milieu MEA galactosé, la souche a produit quasiment deux fois plus d'extrait. En ce qui concerne la production en GL, les rendements obtenus sont globalement trois fois supérieurs sur milieu DCA galactosé et plus de quatre fois supérieurs sur milieu PDA galactosé. A l’inverse, sur milieu MEA galactosé la quantité de GL a diminué de plus de 30 %.
Ces premiers résultats montrent que la nature du sucre utilisé influe à la fois sur la croissance fongique mais également sur les rendements lipidiques et la biosynthèse des GL. Du point de vue de la production en GL, le galactose semble favoriser leur biosynthèse pour deux des trois milieux testés.
2.1.2. Comparaison des profils lipidiques
Afin de poursuivre l’évaluation de l’ef fet de la nature du sucre sur la production lipidique, une étude lipidomique globale a été réalisée sur les extraits bruts lipidiques et les fractions enrichies en GL.
Dans un premier temps, les extraits bruts obtenus à partir des différents milieux glucosés et galactosés ont été analysés par CLHP-SM afin de mettre en évidence la variabilité des profils lipidiques de C. rosea MMS1090 en lien avec la production de GL (Chapitre III.10, p-59).
Les résultats sont présentés et comparés pour chaque milieu glucosé (DCA, MEA et PDA) et galactosé (GCA, MEGA et PGA). Les ions sont indiqués en fonction de leur présence dans les extraits obtenus à partir des cultures sur les différents milieux. Les "volcano-plot" présentés dans la Figure V.5 représentent l'évolution des pics détectés en CLHP-SM les plus intensément produits par la souche, dans chaque milieu de culture.
121
Intensément produit × Intensément produit A en milieu glucosé DCA GCA en milieu galactosé 0.0000
0.0000 -value p
0.0000
0.0001
0.0010
0.0100
0.1000
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 1.0000 Fold-change
PDA × PGA B 0.00 -value 0.00 p
0.00
0.00
0.01
0.10
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 1.00 Fold-change
MEA × MEGA C 0.00 -value
0.00 p
0.00
0.00
0.01
0.10
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 1.00 Fold-change
Figure V.5 : Volcano-plot des pics détectés en CLHP-SM dans les EBL obtenus des cultures sur milieux DCA et GCA (A), PDA et PGA (B), MEA et MEGA (C), (p-value < 0,05).
122
Le facteur de changement (fold change ) décrit les changements dans l'intensité des ions détectés dans les profils obtenus. Les zones mises en évidence correspondent aux ions qui ont été induits plus fortement sur les différents milieux de culture à base de glucose ou de galactose. La comparaison des ions détectés met clairement en évidence la modification dans la production de lipides.
Sur milieux DCA glucosé ou galactosé, le changement de sucre semble induire la production de différentes molécules, de part et d’autre de la zone de base du "volcano -plot". Cette induction est présente non seulement dans les zone s d’élution correspondant aux GL mais également sur la totalité du chromatogramme.
En ce qui concerne l'analyse des extraits lipidiques de la souche MMS1090 obtenus sur milieu PDA, nous pouvons constater des différences provoquées par le changement de sucre. Une induction dans la production de certaines molécules différentes sur milieu glucosé ou galactosé peut être observée avec plusieurs métabolites intensément produits en milieu glucosé et galactosé.
Sur milieu MEA, le changement de sucre ne semble pas apporter de différences significatives dans l'induction de molécules, la majorité des pics observés sont communs aux deux milieux, dans la zone de base du "volcano-plot". Il est intéressant de noter que le changement de sucre pour ce milieu n’interférait pa s sur la croissance de C. rosea ni sur les activités biologiques des extraits obtenus. Un élément de réponse à ces observations pourrait résider dans la composition de l’extrait de malt. En effet, ce dernier contient du maltose , un disaccharide de glucose. Il est donc fort probable que la souche, en présence d’extrait de malt, oriente sa machinerie enzymatique pour métaboliser préférentiellement le maltose afin d’assimiler directement le glucose plutôt que le galactose. Il est important d'indiquer que seulement six ions ont démontré un changement dans l'induction de leur production, 4 ions ont été surexprimés sur milieu MEA ( m/z 377,1660 ; 746,5877 ; 764,6363 et 859,6741) et deux ions sur milieux MEGA (738,6193 et 683,5977).
123
Les ions induits dans la totalité du chromatogramme sont répertoriées dans le Tableau V.2 pour chaque condition de culture.
Tableau V.2 : Ions d'intérêt liés à l'EBL selon le SUS-plot généré par les deux modèles OPLS-DA (normalisation par UV) comparant les milieux de culture DCA/GCA et PDA/PGA. ↑ indique que l'ion est surexprimé en milieu glucosé. ↓ indique l'ion surexprimé en milieu galactosé. * Valeur p ≤ 0,05; ** valeur p ≤ 0,01; *** valeur p ≤ 0,001.
t Ions révélés par Ions révélés par R m/z (min) l'analyse multi variée l'analyse uni variée Identification potentielle DCA/GCA PDA/PGA DCA/GCA PDA/PGA
0,98 626,4184 ↓ ↓* NID
0,98 648,4014 ↓ ↓* NID
1,24 757,1180 ↓ ↓* NID
4,45 520,2962 NID
12,62 377,1660 ↓ ↓* NID
18,98 780,5499 ↓ ↓* PC(16:0/18:2) [M+Na] +
19,40 756,5489 ↓ ↓* PC(16:0/16:0) [M+Na] +
19,55 744,5727 ↑ ↑ ↑* ↑*** PC(P-16:0/18:1) [M+H] + 19,85 758,5881 ↓ ↑ ↓* ↑** DGTS(16:0/18:2) [M+Na] + 20,09 782,5642 ↓ ↓** PC(16:0/18:1) [M+Na] +
20,09 784,5693 ↓ PC(16:0/18:) [M+Na] +
20,44 740,5171 ↓ ↓** PE(16:0/18:1) [M+Na] +
20,62 734,5895 ↓ ↑ ↓* ↑* DGTS(16:0/16:0) [M+Na] + + 20,68 746,5877 ↑ ↑ ↑*** ↑*** PE-Cer((2OH)18:2/20:1) [M+NH 4] 20,85 758,5647 ↓ ↓* PA(22:1/17:2) [M+NH ]+ 4 20,99 760,6037 ↓ ↑ ↓* ↑** PE(P-18:0/20:0) [M+H] + 21,17 716,5186 ↓ ↓* PE(16:1/18:1) [M+H] +
21,37 784,5803 ↓ ↓* PC(16:0/18:0) [M+Na]+
21,74 736,6030 ↓ ↑ ↑** DGTS(16:0/18:2) [M+H] + + 22,23 762,6203 ↓ ↑ ↓* ↑*** PE-Cer((2OH)18:2/21:0) [M+NH 4] 22,97 738,6193 ↑ ↑* NID
23,72 764,6363 ↓ ↑ ↓* NID
24,15 625,4771 ↑ ↑*** DG(17:2/18:2/0:0) [M+Na] +
24,50 639,4932 ↑ DG(18:2/18:2/0:0) [M+Na] +
25,42 627,4935 ↑ ↓ ↑*** DG(17:2/18:1/0:0) [M+Na] +
26,49 617,5083 ↓* DG(18:1/16:0/0:0) [M+Na] +
26,97 643,5246 ↑ ↓ ↓* DG(18:1/18:1/0:0) [M+Na] +
28,34 645,5393 ↓ ↓** DG(18:1/18:0/0:0) [M+Na] +
31,07 647,4559 ↓ ↑ DG(18:0/18:0/0:0) [M+Na] +
34,79 683,5977 ↓ NID
35,51 854,7189 ↑ ↑ TG(16:1/17:2/18:3) [M+NH ]+ 4 35,51 859,6741 ↑ ↑ ↑** ↑*** TG(18:2/16:2/17:2) [M+Na] + + 35,78 868,7343 ↑ ↑ ↑** ↑** TG(16:2/18:2/18:2) [M+NH 4] 35,78 873,6890 ↑ ↑** TG(17:2/17:2/18:1) [M+Na] + + 36,06 882,7487 ↑ ↑ ↑** TG(17:2/18:2/18:2) [M+NH 4] + 36,27 844,7357 ↑ ↑ ↑*** ↑*** TG(16:0/16:2/18:2) [M+NH 4] 36,35 896,7644 ↓ ↓* TG(18:2/18:2/18:2) [M+NH ]+ 4 36,36 901,7215 ↓ ↓ ↓* TG(18:2/18:2/18:2) [M+Na] + + 36,53 870,7489 ↑ ↑*** TG(16:1/18:2/18:2) [M+NH 4] + 36,56 858,7493 ↑ ↑ ↑*** ↑** TG(16:1/17:2/18:2) [M+NH 4] 36,83 575,5020 ↓ NID
36,80 884,7637 ↑ ↑*** TG(16:1/17:2/18:2) [M+NH ]+ 4
124
t Ions révélés par Ions révélés par R m/z Identification potentielle (min) l'analyse multi variée l'analyse uni variée 36,84 877,7204 ↓ ↑ ↓* TG(16:1/18:2/18:1) [M+Na] +
36,86 872,7656 ↓ ↓** TG(17:0/17:2/18:2) [M+NH ]+ 4 37,09 898,7802 ↓ TG(18:1/18:2/18:2) [M+NH ]+ 4 37,24 577,5167 ↓ NID
37,30 860,7655 ↑ ↑*** TG(16:0/18:2/17:2) [M+NH ]+ 4 37,32 848,7655 ↓ ↓** TG(16:0/16:0/18:2) [M+NH ]+ 4 37,54 886,7803 ↑ ↓ ↑*** TG(17:2/18:1/18:1) [M+NH ]+ 4 37,57 874,7803 ↓ ↓ ↓** TG(16:0/18:2/18:1) [M+NH ]+ 4 37,80 900,7957 ↓ TG(18:0/18:2/18:2) [M+NH ]+ 4 38,25 876,7962 ↓ TG(16:0/18:1/18:1) [M+NH ]+ 4 38,33 888,7948 ↑ ↑*** TG(17:2/18:0/18:1) [M+NH ]+ 4 38,48 603,5322 ↓ ↓*** DG(O-16:1/18:1) [M+Na] +
38,51 902,8107 ↓ ↓*** TG(18:0/18:2/18:1) [M+NH ]+ 4 39,01 878,8114 ↓ TG(16:0/18:0/18:1) [M+NH ]+ 4 39,22 605,5477 ↑ ↓ DG(O-16:0/18:1) [M+Na] + + 39,22 904,8269 ↓ ↓*** TG(18:0/18:1/18:1) [M+NH 4] + 39,92 906,8435 ↓ ↓** TG(18:0/18:0/18:1) [M+NH 4] NID : Non Identifié
En se concentrant sur les deux milieux de culture couplés (DCA/GCA et PDA/PGA) il a été possible de mettre en évidence les ions ayant un comportement modifié par le remplacement du sucre. Dans cette liste constituée dans le Tableau V.2 seuls neuf ions (en gras) ont été significativement modifiés dans les deux modèles.
L'identification des lipides listés a été réalisée par des stratégies de déréplication (Chapitre II.2, p-40). La formule moléculaire et les structures lipidiques présumées ont été déduites en fonction de la précision exacte de la masse et de la concordance des modèles recherchés dans Lipid Maps . En outre, les chaînes d’ AG ont été sélectionnées principalement en fonction des AG identifiés dans C. rosea MMS1090 (Chapitre V). Cette stratégie a conduit à l'identification potentielle de la plupart des ions.
Sur la base des annotations proposées, il est intéressant d'observer que tous les types de lipides (GL, PL et LN) ont été altérés par le remplacement du glucose par le galactose, tels que des DGTS, des TG et des DG (par exemple). De plus, une surexpression des lipides de membrane, en général, a été observée principalement en milieu GCA. Tandis que les TG (lipides de réserve) ont diminué. En effet, C. rosea MMS1090 est une souche fortement productrice de LN (Chapitre IV.2.1, p-70). Néanmoins, en conditions de stress cette souche semble orienter
125
son métabolisme vers les lipides de structure au détriment des lipides de réserve. Le comportement des TG est inversé sur milieu PGA et une induction de la production des LN a été observée. En effet, sur milieux PDA/PGA, constitué en partie par l'amidon un glucide complexe contenu dans l'extrait de pomme de terre, la souche semble utiliser également du glucose mais avec plus de difficulté que sur milieu MEA/MEGA.
Après la séparation des lipides en classes, une analyse a également été effectuée pour les fractions enrichies en GL afin de mettre en évidence des possibles modifications dans la diversité chimique liée au changement du sucre sur les milieux étudiés (Tableau V.3).
Tableau V.3 : Ions d'intérêt des fractions glycolipidiques selon le SUS-plot généré par les deux modèles OPLS- DA (normalisation par UV) comparant les milieux de culture DCA/GCA , MEA/MEGA et PDA/PGA. ↑ indique que l'ion est surexprimé en milieu contenant du glucose. ↓ indique l'ion surexprimé en milieu contenant du galactose. * Valeur p ≤ 0,05; ** valeur p ≤ 0,01; *** valeur p ≤ 0,001.
t Ions révélés par l'analyse Ions révélés par l'analyse R m/z (min) multi variée uni variée Identification potentielle DCA/GCA MEA/MEGA PDA/PGA DCA/GCA MEA/MEGA PDA/PGA
1,25 757,1197 ↓ ↑ ↓** ↑* NID
GlcCer (16:2/(OH)18:0) 4,90 731 ,5785 ↓ ↑ + [M+NH 4] 5,20 799,4706 ↓ NID
5,55 841,4731 ↑ ↑ ↓ ↑* PI (16:0/17:2) [M+Na] +
7,53 481,1961 ↑ NID
9,01 469,3260 ↑ ↑* NID
9,54 713,5700 ↓ NID
10,21 465,1746 ↑ ↑* NID
18,72 643,4941 ↑ NID
19,06 657,5108 ↓ NID
19,82 633,5115 ↑ ↓ NID
20,18 776,5584 ↑ ↑* NID
20,18 736,5725 ↑ ↑* DGTS(16:0/18:2) [M+H] +
GlcCer (14:2/18:0) 20,35 659 ,5240 ↑ ↓ + [M+NH 4] GlcCer ((OH)18:0/19:2) 20,90 778 ,5742 ↑ ↑ ↑* ↑* [M+Na] + 23,72 611,4646 ↑ DG (18:3/16:1) [M+Na] +
24,06 625,4801 ↑ ↓ ↑* DGTS (17:2/18:2) [M+Na] +
24,42 639,4992 ↑ ↓ ↑ ↓** ↑* DG (18:2/18:2) [M+Na] +
25,19 615,5001 ↑ ↓ ↑ ↑* DG (18:2/16:0) [M+Na] +
25,58 575,5033 ↑ ↓ ↑ ↓** NID
25,70 627,4989 ↑ ↑* DG (17:2/18:1) [M+Na] +
25,71 641,5153 ↑ ↑ ↑* ↑* DG (18:1/18:2) [M+Na] +
26,80 577,5191 ↑ ↓ ↑ ↑** NID
26,80 617,5138 ↑ ↓ ↑ ↑* ↑* DG (18:1/16:0) [M+Na] +
27,29 643,5314 ↑* ↓** ↑** DG (18:1/18:1) [M+Na] +
28,63 645,5466 ↑* ↓* DG (18:1/18:0) [M+Na] + NID : Non Identifié
126
Comme nous l’avons expliqué précédemment, pour chaque ion d'intérêt énuméré, une analyse déréplicative a été entreprise afin de proposer une hypothèse de structure. Cette stratégie a conduit à l'annotation de la plupart des ions ci-dessus.
Selon les résultats obtenus, il est intéressant de noter que pour les fractions enrichies en GL, le changement dans la production des métabolites ne semble pas être lié à une grande variété de familles lipidiques. Néanmoins, il est important de remarquer la présence de plusieurs molécules non identifiées, cela pourrait correspondre à des composés potentiellement nouveaux, lorsqu'aucune correspondance avec des composés décrits n'a été établie suite à l'interrogation de la base de données.
L'identification potentielle de LN de la famille des diacylglycérols (DG), comme par exemple le composé m/z 611,4646 (t R 23,72), dans la fraction enrichie en GL peut poser des questions. En effet, ces composés sont normalement élués dans la fraction dichlorométhane avec les autres LN. Pourtant, suite à la déréplication, il y a une correspondance parfaite entre la formule brut proposée et celle identifiée sur la base de l’ion [M+Na] +. Seule la purification et l'identification structurale réelle de ces molécules pourraient apporter, avec certitude, une réponse sur l’annotation proposée. Ceci permettrait de savoir si de telles observations seraient dues soit à une mauvaise assignation lors de la déréplication soit à une voie préférentielle créée au cours de la séparation chromatographiques des lipides par exemple.
2.1.1. Activités biologiques des fractions enrichies en glycolipides
Les fractions enrichies en GL ont été testées sur la lignée KB (Figure V.6). L’effet d'inhibition le plus important est observé pour les fractions obtenues à partir des cultures sur milieu DCA galactosé avec une valeur de CI 50 de 0,7 µg/mL, alors que pour les fractions enrichies en GL obtenues sur milieu DCA glucosé, les CI 50 sont quasiment 10 fois supérieures (env. 6 µg/mL).
127
70
60
50 Glucose Galactose 40 µg/mL
50 30 CI
20
10
0 DCA PDA MEA
Figure V.6 : Activité antiproliférative sur cellules KB des fractions enrichies en glycolipides obtenues à partir de la souche C. rosea MMS1090.
Les extraits enrichis en GL de la souche MMS1090 obtenus sur milieux MEA, quelle que soit la nature du sucre, ont présenté un taux d'inhibition de la prolifération cellulaire sur KB similaire (environ 6 µg/mL) et très légèrement inférieur à celui obtenu sur DCA glucosé. Le galactose ne semble pas influencer l’activité biologique des fractions obtenues pour le milieu MEA.
En ce qui concerne le milieu PDA, nous pouvons constater une perte importante de l’activité des fractions obtenues à partir des cultures sur milieu galactosé. En effet la CI 50 atteint quasiment 60 µg/mL contre moins de 10 µg/mL pour les fractions obtenues à partir des cultures sur milieu glucosé.
En conclusion, le remplacement du glucose par le galactose dans le cas du milieu DCA permet d'observer d'importantes variations dans la production lipidique et entraîne des variations importantes au niveau du profil métabolique. De plus, la fraction acétonique obtenue sur milieu GCA a démontré l’activité biologique la plus forte. Ce milieu a donc été choisi pour poursuivre l’étude des GL de C. rosea MMS1090. Pour cela, des cultures à grande échelle ont
128
été mises en œuvre afin de produire suffisamment d'extrait lipidique destiné à la purification des GL potentiellement actifs.
2.1.2. Cultures, production lipidique et purification des glycolipides
Pour la culture en grande échelle, C. rosea MMS1090 a été cultivée sur 128 boîtes de Petri (10 cm de diamètre ) de milieu GCA. Après une période d’incubation de 10 jours, la biomasse a été récupérée à la surface de la gélose puis extraite (Arrêt des cultures - Chapitre III.2, p-51). Après extraction et évaporation, 9,4 g d’extrait brut ont été obtenus et fractionnés par chromatographie liquide (Séparation en classes lipidiques - Chapitre III.3, p-52). Cinq fractions acétoniques (A1-A5) ont été obtenues. Après suivi CCM et bio guidage sur cellules KB, les fractions actives A4 (111 mg) et A5 (91 mg) ont été regroupées afin de poursuivre les étapes de purification. Deux chromatographies liquides successives sur colonne ouverte de gel de silice ont été réalisées avec un gradient discontinu (Isolement et purification des glycolipides - Chapitre III.4, p-54 ) permettant d’obtenir la frac tion glycolipidique A4-7-9 (135 mg). Le bilan des différentes étapes de purification est présenté Figure V.7.
C. rosea MMS1090
Dichlorométhane Acétone Méthanol
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 A1 A2 A3 A4 A5 M1 M2 M3 M4 M5
CH 2CL 2/MeOH
A4-1 A4-2 A4-3 A4-4 A4-5 A4-6A4 -6 A4-7A4 -7 A4-8A4 -8 A4-9 …A4 -19
CH 2CL 2/MeOH
A4-7-1 A4-7-2 A4-7-3 A4-7-4 A4-7-5 A4-7-6 A4-7-7 A4-7-8 A4-7-9 …A4 -7-19
Figure V.7 : Schéma des étapes de purification des glycolipides bioactifs
129
2.1.3. Analyse structurale du glycolipide majoritaire
Suite au fractionnement, une partie de la fraction A4-7-9 (12 mg) a été peracétylée et analysée en spectrométrie de masse haute résolution. Le spectre de masse obtenu est présenté Figure V.8.
[M+Na]+
Figure V.8 : Spectre de masse haute résolution (HR-ESI-MS) de la fraction A4-7-9 peracétylée de C. rosea MM1090
Le composé majoritaire est observé sous forme d’un adduit sodium monochargé [M+Na] + m/z 1028,6272. La formule brute la plus probable pour ce composé est C 55 H91 NO 15 pour un m/z théorique à 1028,6281, considérant que les seuls éléments présents sont C, H, N et O et que la molécule comporte un nombre impair d’azote.
D’autres ions sont aussi observés mais moins intensément. L’ion m/z 968,6062 ([M+Na- + CH 3CO 2H] ) pourrait correspondre à la même molécule avec une peracétylation en moins, donc une hydroxylation en moins sur la molécule native, non-acétylée . L’ion à m/z 1000,5962
130
+ ([M+Na-C2H4] ) pourrait correspondre à la molécule majoritaire avec deux CH 2 en moins et + l’ion à m/z 1014,6123 ([M+Na-CH 2] ) à celle avec un CH 2 en moins. De même, les pics à m/z
1042,6054 et m/z 1056,6576 pourraient correspondre à un et deux CH 2 en plus, respectivement. L'ion observé à m/z 986,6168 pourrait être lié à la perte d'une partie de la + peracétylation [M+Na-H2C=CO] sur le même composé majoritaire.
La fragmentation MS 2 de l’ion moléculaire [M+N a] + m/z 1028,6272 a permis d’ observer la perte de 6 CH 3COOH (-60), quatre provenant du sucre et deux des chaines carbonées (acide + gras et base sphingoïde). La présence de l’ion m/z 371 [C 14 H20 O10 Na] valide la partie monosaccharide peracétylée et permet de déduire la formule brute de la partie restante soit
C41 H72 NO 5. En considérant la structure imaginée au départ cela nous conduit à la présence de 3 insaturations dans la partie céramide réparties entre la base sphingoïde et l’AG. Une première hypothèse de structure incomplète du GL majoritaire de la fraction A-4-7-9 est proposée Figure V.9.
Acide gras
-60 Sucre C14 H19 O9 -60 C H NO -60 41 72 6
-60 -60 -60 Base sphingoïde m/z 371 + [C 14 H20 O10 Na]
Figure V.9 : Structure proposée pour le composé majoritaire analysé par HR-ESI-MS.
Après saponif ication d’une partie de la fraction (10 mg), l’AG a été analysé par CPG-SM. Nous avons observé qu’il s’agissait d’un AG à 18 carbones sans insaturation avec une
131
hydroxylation en position C2 mise en évidence par l’analyse des dérivés EMAG (Figure V.10) et NAP.
2-OH-18:0 (EMAG)
Mac Lafferty
+ [M-COOCH 3] M+
Figure V.10 : Spectre de masse du dérivé EMAG pour la partie AG du glycosphingolipide isolé de C. rosea MMS1090.
Les trois insaturations de la molécule devraient, donc, se trouver sur la chaîne sphingoïde.
Les résultats de l'analyse RMN sont présentés dans le Tableau V.4.
132
Tableau V.4 : 1H, 13 C et corrélation COSY obtenus à partir des spectres RMN pour le glycosphingolipide isolé.
COSY Position δ ppm, mult., J en Hz δc H corrélation NH 6.28, d, J=9.2 -
1a 3.96, dd, J=10.3,/3.9 67.1 2, 1b 1b 3.61, dd, J=10.3/4.6 67.1 2, 1a 2 4.30, m 50.8 1a, 1b, 3, NH 3 4.27, t, J= 4.8 72.6 4, 2 4 5.3, t, J = 7,2 124.4 3, 5 5 5.39, dd, J = 7,2/15,2 122.9 4 6 1.95, m 32.3 5, 7 7 2.09, m 31.9 6, 8 8 5.82, m 136.8 7 9 -- 136.7 -- 10 5.48, dd, J = 7.2/15.6 122.9 11 11 5.89, m 138.0 10, 12 12 2.09, m 32.5 11 19 1.57, s 15.9 7, 8 CH 1.25, m 22.6-29.7 2 terminal CH 0.83, t, J=6.8 14.1 3 CH acetate 1.93-2.1, s 20.5-21.0 3 C=O acetates 168.3/169.2/169.3/169.4/169.7/170.1
1' 4.48, d, J= 8.1 100.5 2' 2' 4.96, dd, J= 8.1/9.6 71.1 1', 3' 3' 5.20, t, J= 9.6 74.4 2', 4' 4' 5.10, t, J= 9.6 68.2 3', 5' 5' 3.7, ddd, J= 2.4/4.8/9.6 71.9 4', 6'a, 6'b 6'a 4.13, dd, J= 2.4/12.4 61.8 5', 6'b 6'b 4.24, dd, J= 4.8/12.4 61.8 5, 6'a 1" -- 170.6
2" 5.51, m 73.2
3" 2.0, m 39.7
4" 1.37, m 29.7 terminal CH 3 0.88, t, J = 7.2 14.1
Cette analyse a permis de confirmer la nature du sucre dans le GL majoritaire. La valeur de la constante de couplage du proton anomérique confirme la présence d'un β-glycopyranoside (4,48, d, J = 8,1 Hz). Ce proton est corrélé avec le carbone anomérique situé à δ = 100,5 ppm sur le spectre HSQC. A partir de ce proton tous les signaux des 1H et 13 C du sucre ont été
133
attribués grâce au spectre COSY, HSQC et HMBC. Les valeurs des constates de couplage ( J1,2
= 8,1 Hz, J2,3 , J3,4 et J4,5 = 9,6 Hz) indiquent la présence d'un glucose. Le sucre incorporé dans le GL était du glucose et non le galactose comme éventuellement attendu. Il semblerait que C. rosea MMS1090 oriente son métabolisme en transformant le galactose présent dans le milieu de culture en glucose avant de l’incorporer aux GL bio synthétisés (Barreto-Bergter et al. , 2011; Sellick et al. , 2008), tel que mentionné précédemment (Figure V.3, p-119)
En ce qui concerne la base sphingoïde, la présence d'un signal pour 5 protons éthyléniques et d'un singulet δ = 1,57 ppm indique que nous avons un groupement méthyle branché sur un des carbones d'une des doubles liaisons. Ce carbone à δ = 136,22 ppm observé sur le spectre du 13 C classique n'est plus présent dans le spectre DEPT. L'insaturation en Δ4 de la sphingosine est visible sur le spectre du 1H par un signal doublet dédoublé (dd) à δ = 5,39 ppm pour le C5, avec une configuration trans (J = 15,2 Hz). De même , il est observé un doublet dédoublé (dd) à δ = 5,48 ppm ( J = 15,6 Hz) pour l'insaturation en Δ10 trans . Les corrélations observées entre les différents protons a permis de déterminer la position des doubles liaisons (Figure V.11).
n=13
Figure V.11: Formule développée du glucosylcéramide isolé de C. rosea MMS1090.
La molécule isolée de la souche C. rosea MMS1090 est donc identifiée comme un glucosylcéramide avec une formule brute de C 43 H79 NO 9 ((β-D-glucopyranosyl)-3-hydroxy-2- [2-hydroxyoctadecanoyl]-amino-9-méthyl-4E,8 E,10 E-octadecatriene). La stéréochimie de ce glycosphingolipide est pour l'instant supposée en accord avec celles classiquement observées dans les produits naturels mais il conviendra réaliser une analyse complète pour la déterminer avec certitude.
134
Les GL de champignons présentent traditionnellement une base sphingoïde avec deux insaturations en Δ4,8 et une méthylation en C9 (Barreto-Bergter et al. , 2004, 2011; Barreto- Bergter & Figueiredo, 2014; Del Poeta et al. , 2014; Rollin-Pinheiro et al. , 2014; Calixto et al. , 2016; McCloskey et al. , 2017). En effet, les bases sphingoïdes avec ce système de 3 insaturations sont caractéristiques des invertébrés marins (Durán et al. , 1998; Maier et al. , 1998; Park et al. , 2011). Ces résultats démontrent que pour la première fois ce glucosylcéramide (GlcCer) a été isolé d'un champignon.
De plus, l'ion m/z 776,5584 (t R 20,18 min) détecté, lors de l'approche lipidomique, dans tous les extraits glycolipidiques de C. rosea et non identifié lors des comparaisons avec les bases de + données (Tableau V.3, p-126), semble correspondre à ce GlcCer ([C 43 H79 NO 9+Na] ) et être présent dans les six fractions enrichies en GL analysées. Il est intéressant de souligner que cet ion est uniquement surexprimé dans la fraction obtenue sur milieu PDA par rapport à celle obtenue sur milieu PGA. Cette-dernière présentait l’activité la pl us faible contre les cellules KB (Figure V.6, p-128). Pour les autres fractions issues des milieux DCA/GCA et MEA/MEGA, aucune variation de cet ion n’a été mise en évidence. En conséquence, il est difficile de corréler la présence de cet ion ( m/z 776,5584) et la variation d’activité biologique observée pour les fractions issues des milieux DCA/GCA.
Bien que déjà décrit dans la littérature, le GlcCer isolé au cours de cette étude n’a jamais fait l’objet d’investigations quant à son activité biologique.
2.2. Activités biologiques du Glycosphingolipide majoritaire
Suite à la purification de la molécule, l'évaluation du potentiel de l'activité biologique a été effectuée sur deux lignées cellulaires du cancer du sein ainsi que son activité antimicrobienne contre 7 souches de bactéries pathogènes de l'homme.
2.2.1. Activité antiproliferative contre lignées cancéreuses
Les tests in vitro réalisés avec le GL isolé de la souche MMS1090 ont montré une activité intéressante sur les cellules MCF-7 (CI 50 à 2,6 mM) et une plus faible activité sur la lignée
135
MDA (CI 50 30 µM), deux lignées de cancer du sein, après 72 h d'exposition au traitement. Différents travaux décrivent l’analyse de glycosphingolipides, originaux isolés de cham pignons marins mais pour certains, aucune activité biologique n’a été rapportée (Keusgen et al. , 1996; Ouyang et al. , 2005).
En 2009, des glycosphingolipides isolés d'un champignon halotolérant originaire des sédiments recueillis dans le champ de sel de la mer de Hongdao , en Chine, n’ont démontré aucune activité (CI 50 > 100 µM) lorsque testés contre quatre lignées cellulaires (P388, HL60, A549, et BEL-7402) (Wang et al. , 2009). Plus récemment, les penicillosides A et B ont présenté une faible cytotoxicité (CI 50 > 70 µM et 90 µM, respectivement) sur la lignée HeLa (Murshid et al. , 2016) (Figure I.15, p-32). Ces glycosphingolipides ne possèdent quant à eux qu’une seule insaturation en Δ7 sur la base sphingoïde et une à deux autres insaturations sur la chaîne de l’AG. Par ailleurs , Jiang et al . (2004) ont isolé quatre cérébrosides, les flavidérébrosides A-D, présentant des CI 50 allant de 18 µM à 27 µM contre des cellules KB (Figure I.13, p-30). Les auteurs ont également établi, pour les molécules décrites, une relation entre la présence d'une insaturation sur la chaîne de l'AG et l'augmentation de l'activité biologique. Par rapport à ces données, l’activité du composé isolé (CI 50 – 2,6 µM) contre les cellules MCF-7 est plus intéressante. Il serait également intéressant de comparer l’activité du GlcCer isolé sur cellules KB.
2.2.2. Activité antibactérienne
L'activité antimicrobienne du glycosphingolipide a été testée contre un large spectre de bactéries pathogènes humaines et l'efficacité a été évaluée selon la moyenne du diamètre d'inhibition de trois répétitions (Tableau V.5) : Ø ≤ 8mm: Pas d'activité antimicrobienne significative; 8 < Ø ≤ 12 mm: Activité antimicrobienne modérée; 12 < Ø ≤ 14 mm: Activité antimicrobienne significative; Ø > 14 mm: activité antimicrobienne élevée.
136
Tableau V.5 : Zone d'inhibition (mm) pour l'activité antibactérienne du glycosphingolipide isolé à partir des fractions de C. rosea MMS1090 contre 7 bactéries pathogènes de l'homme. Streptomycine (traitement standard antibactérien). Doses testées : 50 et 100 µg/mL (n = 3).
Streptomycine B. cereus Bacillus sp. L. ivanovii S. aureus C. freundii E. coli Salmonella spp.
50 µg/mL 12 ± 2 7 ± 0 9 ± 1 8 ± 1 10 ± 0 9 ± 1 10 ± 1 10 ± 1 100 µg/mL 15 ± 2 19 ± 1 7 ± 1 10 ± 1 21 ± 3 20 ± 4 16 ± 1 26 ± 4
Une activité antibactérienne nulle à modérée du glycosphingolipide a été observée contre L. ivanovii et Bacillus sp., dont les zones d'inhibition sont inférieures à celles du témoin pour les deux concentrations testées. Sur E. coli , le taux d'inhibition est légèrement supérieur (16 mm), mais reste dans le même ordre de grandeur que celui du standard streptomycine (15 mm) pour la concentration de 100 µg/mL. Concernant la concentration la plus faible (50 µg/mL) le taux d'inhibition est inférieur (10 mm) à celui du témoin (12 mm).
Le glycosphingolipide a présenté une zone d'inhibition de 19 mm sur B. cereus à 100 µg/mL supérieure au standard à la même concentration. Tandis que la zone d'inhibition pour la concentration à 50 µg/mL (7 mm) est 40 % inférieure à celle du témoin (12 mm).
Une forte activité antibactérienne avec une inhibition importante a été observée sur les souches C. freundii et S. aureus (20 mm et 21 mm, respectivement) pour la concentration de 100 µg/mL. Néanmoins, les activités observées pour la concentration de 50 µg/mL ont été inférieures à celles du témoin sur les deux souches.
La zone d'inhibition la plus élevée (26 mm) pour le glycosphingolipide a été observée à 100 μg/ mL sur Salmonella spp.. Ce résultat est plus de 70 % supérieur à la zone d'inhibition observée sur le témoin streptomycine pour la même concentration. Néanmoins, les résultats obtenus pour cette même souche à la concentration de 50 µg/mL est équivalent à celui observé pour le témoin streptomycine.
Quelques travaux font mention de l'activité antibactérienne des glycosphingolipides isolés de champignons marins. Wang et al. (2009) ont isolé des cérébrosides d'un champignon
137
halotolérant et les ont testés contre E. coli , B. subtilis , cependant, ces composés ont démontré une très faible activité antibactérienne (> 70 µg/mL). L'activité antibactérienne des penicillosides A et B a également été testée et seul le composé B a présenté une zone d'inhibition importante contre E. coli (20 mm), mais également contre S. aureus (19 mm) (Murshid et al. , 2016).
Le GL isolé de C. rosea MMS1090 a présenté des zones d'inhibition importantes qui semblent être en accord avec celles rapportées dans la littérature concernant les mêmes bactéries, voire des zones d'inhibition supérieures, notamment contre B. cereus , S. aureus , C. freundii et Salmonella sp..
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3. Étude des stérols
Contexte de l'étude
Les stérols, lipides essentiels de la plupart des cellules eucaryotes, assurent des fonctions structurales et de signalisation importantes. Ces molécules présentent un noyau stérane dont le carbone 3 est porteur d’un gro upement hydroxyle. Le stérol le plus commun et répandu chez les champignons e st l’ergostérol (Dupont et al. , 2012). Cette molécule est une composante membranaire spécifique aux champignons qui peut être utilisée pour estimer la biomasse fongique (Charcosset & Chauvet, 2001). Néanmoins, un travail récent a également montré que certaines espèces de champignons moins évolués ne synthétisent pas l'ergostérol mais le cholestérol (Weete et al. , 2010). Ainsi, la voie de biosynthèse de l'ergostérol pourrait avoir accompagné l'évolution des champignons.
Depuis plusieurs années, des travaux répertorient l'importance et l'intérêt grandissant des stérols fongiques comme précurseurs de molécules bioactives, telle que la cortisone (Appleton et al. , 1955), ou comme composé actifs directement utilisés en tant qu'anti-inflammatoire ou anticancéreux (Akihisa & Yasukawa, 2001).
Afin d'étudier la variabilité dans la composition des LN et plus spécialement les stérols de la souche C. rosea MMS1090, une approche OSMAC a été effectuée. Les principaux résultats obtenus font l’objet d’une publication prochainement soumise dans la revue "Steroid", présentée ci-après.
139
Marine-derived fungal strains and steroidal composition: Eburicol with antiproliferative and antimicrobial activities
Ana Camila dos Santos Dias 1, Aurélie Couzinet-Mossion 1, Nicolas Ruiz 1, Fatima Lakhdar 2, Samira Etahiri 2, Samuel Bertrand 1, Christos Roussakis 3, Yves-François Pouchus 1, Hassan Nazih 1, Gaetane Wielgosz-Collin 1,*
1 University of Nantes, Faculty of Pharmacy, MMS; 9, Rue Bias, 44000, Nantes, France 2 University Chouaib Doukkali, Faculty of Science, Laboratory of Marine Biotechnology and Environment, BP 20, El Jadida, Morocco 3 University of Nantes, Faculty of Pharmacy, IICiMed, 9, Rue Bias, 44000, Nantes, France
* Authors to whom correspondence should be addressed; E-Mail: gaetane.wielgosz- [email protected]; Tel.: +33-276-645-081
Abstract: Sterol lipids play an important role in metabolic reactions and are actively involved in membrane dynamic and cell organization. Ergosterol is the most common sterol in Fungi and had frequently been investigated in human pathogenic fungal strains. Others sterols from fungal strains have also demonstrated cytotoxicity against cancer cell lines and antimicrobial activities. Until now, several studies have been done on the cytotoxicity of sterols, especially ergosterol and its derivatives. Marine fungi can produce high amounts of bioactive compounds like sterols. A screening was performed to study sterol composition in nineteen marine fungal strains. One strain, C. rosea MMS1090, was selected and an OSMAC approach was performed to optimize culture conditions and produce high amounts of sterol. Isolated compound was assessed against four cancer cell lines as well as seven human pathogenic bacteria, Gram positive and negative. This study confirms that marine C. rosea MMS1090 strain can produce high amounts of lipids and isolated sterol had strong biological activity.
Keywords: Clonostachys rosea , marine fungi, lipids, sterol, eburicol, cytotoxicity, antimicrobial activity.
Abbreviations
TLC: thin layer chromatography; TL: total lipid; GC-MS: gas chromatography coupled to mass spectrometry; NMR: nuclear magnetic resonance; OSMAC: one strain many compounds;
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1 . Introduction
Lipids are essential molecules for the survival of organisms, whether unicellular or multicellular. Lipids are a highly chemo-diversified family of molecules containing weakly polar compounds such as sterols, triglycerides and fatty acids, but also highly polar ones like glycolipids and phospholipids. These molecules are actively involved in metabolic reactions like cell recognition, trans-membrane signaling, apoptosis, and growth or cell differentiation [1]. Sterols are essential for organization and functioning of eukaryotic organisms. They are an integral component of cell membranes and determine the permeability, the rigidity or the fluidity of the membrane, playing a crucial role in this dynamic [2 –4]. The presence of sterols in every eukaryotic organism, highlights the importance of these molecules in biological evolution [5,6]. However, the origin of three distinct pathways after a common beginning is an interesting fact which is still poorly understood. Fungi present ergosterol as main sterol in their plasma membrane unlike animals which present cholesterol [7,8]. Biosynthetic pathways of those two sterols are distinguish, but have squalene as common precursor. Squalene is converted to lanosterol then converted to ergosterol in fungi and cholesterol in animals [8 –10]. Fungi production of ergosterol instead of cholesterol is still not understood since this pathway consumes more energy [11]. Numerous studies have described sterols as bioactive compounds with antimicrobial activities, against human cancer cells and with anti-inflammatory activities [12 –20]. Concerning steroid compounds produced by marine fungi, some molecules have demonstrated bioactivities as cytotoxicity against cancer cell lines [21,14,22]. The exploration of microorganisms as sources of therapeutically useful compounds has a much shorter and less well-known history than the use of plants and plant extracts in human medicine. However, the large number and variety of chemotherapeutic agents isolated from microbial natural products and used to treat human diseases have greatly contributed to the improvement of human health during the past century among which lipid components. Moreover, marine fungi are known to produce secondary metabolites with excellent biomedical applications [23]. These marine microorganisms produce bioactive compounds that could be used as a promising source against human diseases. This present investigation was undertaken to study sterol composition in nineteen marine fungal strains using a screening program and then to assess pharmacological activities such as antimicrobial and cytotoxic activities of sterol other than ergosterol.
2. Experimental Section
2.1. MMS Marine Fungal Collection Strains
Fungal strains were isolated from French Atlantic west coast and identified on the basis of molecular method by sequencing the internal transcribed spacers ITS1 and 2 and the 5.8S regions. The strains are conserved in the fungal collection of the MMS laboratory under the reference MMS + number. Nineteen strains from four genera were selected: Trichoderma harzanium MMS13 ; T. citrinoviride MMS19 ; T. reesei MMS510 ; T. atroviride
141
MMS639 ; T. capilare MMS755 ; T. capilare MMS852 ; T. pleuroticola MMS1541 ; Acremonium sp. MMS540 ; Acremonium sp. MMS594 ; Acremonium sp. MMS 700 ; Acremonium sp. MMS713 . Acremonium sp. MMS862 ; Acremonium sp. MMS887 ; Acremonium sp. MMS889 ; Penicillium expansum MMS42 ; P. ubiquetum MMS330 ; P. canescens MMS460 ; Penicillium sp. MMS646 ; Clonostachys rosea MMS1090.
2.2. Culture Media Conditions
Petri dishes (10 cm) were inoculated with conidia suspension (1 10 6 cells/mL) to 6 marine- like solid media prepared with artificial sea water (Reef Crystals 36 g/L): DCA (Dextrose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L, Difco); MEA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1g/L, glucose 20g/L, Agar 20 g/L); PDA (Potato extract 4 g/L, Dextrose 20 g/L,
ZnSO 4, 7 H 2O 0.01 g/L, CuSO 4, 5 H 2O 0.005 g/L, Agar 15 g/L); YES (Yeast Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L plus salts); MES (Mussel Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar
20 g/L plus salts); CYA (Czapek concentrate 10 mL, Yeast extract 5 g/L, K 2HPO 4 1 g/L, trace metal solution 1 mL, sucrose 30 g/L, Agar 15 g/L). Cultures were incubated in natural light during 10 days at 27 °C.
2.3. Lipid Extraction and Saponification
For each culture media, biomass on Petri dishes was removed using a scalpel and allowed to dry in an oven at 65 °C and weighed until a stable weight. Total lipids were extracted from the dried biomass during 2 h at room temperature by two-step CH 2Cl 2/MeOH extraction 2:1 then 1:2 (v/v). The resulting extracts were filtered, pooled and washed with water (0.08 % KCl, 40% of total volume). Organic phase was then evaporated to dryness under vacuum providing total lipid crude extracts (TL). TL is expressed as a percentage of the total extracted dry biomass. TL were then saponified with ethanolic KOH (2 M) at 80 °C under reflux for 1h30. After cooling, water and hexane were added, 1:2 (v/v), and organic phase, containing sterols
(unsaponifiable), was dried with anhydrous Na 2SO 4 and the solvent was evaporated. Unsaponifiable fraction was analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS).
2.4. General Spectrometry Analysis
Sterols were analyzed using a GC-MS instrument (Hewlett Packard HP 6890 - GC System) linked to a mass detector (HP 6890- E.I. 70 eV) equipped with a SLB-5TM column (60 m 0.25 mm 0.25 µm). The carrier gas was helium at a flow rate of 1 mL/min. The temperatures of the injector and detector were respectively set at 250 °C and 280 °C. One microliter was
142
injected in splitless mode. The initial temperature of the GC-oven was 200 °C with a subsequent increase (3 °C/min) up to 310 °C. The solvent delay was 9 min. High resolution electrospray ionization mass spectrometry (HR-ESI-MS, positive mode, ion- source acceleration 4.5 kV, ion-source temperature 200 °C, methanol as solvent) mass spectra were recorded with a Micromass Zab Spec Tof spectrometer. 1H- and 13 C-NMR spectra were obtained on a NMR Bruker Avance III 400 spectrometer with triple Probe TBI multinuclear in
CDCl 3 with tetramethylsilane as reference to an internal standard. Chemical shifts and coupling constants were expressed in δ (ppm) and Hz respectively.
2.5. Production, Purification and Structural Elucidation of Sterol
For production of sterols, cultures of C. rosea MMS 1090 were performed on YES culture medium. Petri dishes (20 cm diameter, 125 mL) were incubated at 27 °C in natural light for 10 days. After biomass extraction, TL were separated as described previously [24]. Briefly, TL were separated in lipid classes on an open silica gel column (Kieselgel - 60 Å - 0.063-0.2 mm - ASTM). The crude extract from MMS1090 was separated in 20 fractions according to the eluents: D1 to D8 for dichloromethane fractions; A1 to A5 for acetone fractions; M1 to M7 for methanol fractions. Lipid fractions composition was controlled by thin layer chromatography (TLC) performed on precoated silica gel F254 plates. After development, the dried plates were sprayed with 50%
H2SO 4-vanillin and orcinol reagents. Sterols were eluted from D3 to D8. D3 fraction corresponding to the sterol one was then purified by preparative TLC (hexane/diethyl ether/acetic acid: 50/50/0.75: v/v/v) in silica gel F254 plates. White amorphous powder (melting point ~ 155 °C) was obtained. Fraction purity was monitored by GC-MS analysis. 1 Eburicol RMN H (400.13 MHz, CDCl 3) : 0.70 (s, 3H, 18-CH 3), 0.82 (s, 3H, 29-CH 3), 0.89 (s;
3H, 31-CH 3), 0.93 (d, 3H, 21-CH 3, J = 6.4 Hz), 0.99 ( s, 3H, 19-CH 3), 1.01 ( s, 3H, 30-CH 3),
1.03 (d, 3H, J = 6.9 Hz; 27-CH 3), 1.04 (d, 3H, 26-CH 3, J = 6.9 Hz), 2.24 ( m, 1H, 25-CH),
1.35-2.34 (m, 23H, rest of the 10 × CH 2 and 3 × CH), 3.24 ( dd , 1H, 3-CH, J = 4.7 and
11.5 Hz), 4.67-4.72 (d and s, 2H, 28-CH 2, ethylene, J = 1.2 Hz), 5.35 (d, 1H, OH, J = 13 4.7 Hz). C (100.61 MHz, CDCl 3) : δ 15.4 (C29), 15.7 (C18), 18.2 (C6), 18.7 (C19), 19.1 (C21), 21.0 (C11), 21.9 (C27), 22.0 (C28), 24.3 (C31), 26.5 (C12), 27.8 (C2), 27.9 (C30), 28.2 (C7), 30.8 (C23), 31.0 (C16), 31.3 (C15), 33.8 (C26), 35.0 (C22), 35.6 (C1), 36.5 (C20), 37.0 (C10), 38.6 (C4), 44.5 (C13), 49.8 (C14), 50.4 (C5), 50.4 (C17), 79.0 (C3), 105.9 (C25), 134.4 + (C8), 134.4 (C9), 156.9 (C24), HR-ESI-MS m/z [M+Na] : 463.3908 (calculated for C 31 H52 O [M+Na] +: 463.3910).
143
2.6. Cell Viability Assay
Human breast cancer MCF-7 and MDA cells were purchased from the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). Human lung cancer NSCLC-N6-L16 cells came from IICiMED – Cancérologie (Nantes, France) and A549 cell line was obtained from ATCC collection reference CCL-185 from National Cancer Institute bank lines (NCI). Cells were cultured at 37 °C in a humidified incubator with 5% CO 2 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% glutamine and 1% penicillin –streptomycin. Cells were treated with different concentrations of the purified sterol for 72 h and cell growth was estimated by a colorimetric assay based on the conservation of tetrazolium dye (MTT) to a blue formazan product by live mitochondria (Sigma Aldrich - Saint Quentin Fallavier, France). Optical density corresponding to solubilized formazan was read at 570 nm. The relative cell viability was expressed as a percentage of the control that was not treated with sterol.
2.7. Antibacterial Activity Against Human Pathogens
The strains used to evaluate the antimicrobial activity were obtained from the collection of the Pasteur Institut (CIP) and the American Type Culture Collection (ATCC). Gram-positive bacteria were Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus sp. (CIP 104717), Bacillus cereus (ATCC 33019), and Listeria ivanovii (ATCC 19119). Gram-negative bacteria were Escherichia coli (ATCC 10536), Citrobacter freundii (ATCC 8090) and Salmonella spp. Purified sterol was assessed to observe antibacterial activity using agar diffusion with cellulose disks of 6 mm of diameter, dissolved in a minimum volume of solvent (dichloromethane) and cellulose disks were imbibed with different concentrations. After solvent evaporation, the disks were placed on the surface of a Petri dish previously seeded with 5 mL of a bacteria suspension (0.2 × 10 4 bacteria/mL) and placed at 37 °C for 24 h. Two different concentrations 50 and 100 μg/mL were tested. Disks with the standard Streptomycin at same concentrations were used as control. The results were obtained by measuring the diameter of inhibition zone for each disk and expressed in millimeter.
3. Results and discussion
3.1. Marine Fungal Strains Screening
To explore diversity on marine strains, a screening was performed on DCA culture media with nineteen marine fungal strains. They were selected in the fungal collection of the laboratory and are representative of the major genera. TL content in Trichoderma strains varied from 2.2 % (MMS1541) to 17.3% (MMS852) (Table 1). These values are in agreement with previous studies on lipid production but lipid
144
content can be improved by the optimization of cultures conditions as culture media composition, the pH and temperature [25 –28]. Lipid content from Acremonium species were generally higher than in Trichoderma and Penicillium species and varied from 7.3 % (MMS540) to 50.7 % (MMS889). As well as for Trichoderma strains, some studies have also demonstrated that changes in growth conditions such as carbon source to Acremonium strains can improve their lipid production [29,30]. The same variability for TL content in strains from Penicillium genus were observed with values ranging from 2.7 % (MMS460) to 33.5 % (MMS646). Penicillium strains have been most intensively studied regarding the production of bioactive compounds. For example, a new sterol, ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7- tetraol(3 β, 5 α, 6 β, 7 α, 22 E), isolated from a marine strain of Penicillium , had presented cytotoxicity with IC 50 values at 23 mM against human liver cancer cell (Hep G) [14]. Concerning C. rosea MMS1090, TL content was 21.4 %.
Table 1: Lipid content and unsaponifiable composition of different strains. Relative amounts of individual mainly sterols identified in several species cultivated under the same conditions determined with GC/MS analysis after TL saponification (n=1) and putative identification.
Unsaponifiable composition (%) Putative identification Ergosterol Lipid content Ergostapentaene Ergostatetraenol Neoergosterol Eburicol Strain m/z 396 (% w/w) m/z 376 [M] + m/z 394 [M] + m/z 380 [M] + m/z 440 [M] + [M] + MMS13 13 4.8 4.5 77.2 2.4 ND Trichoderma MMS19 9 7.9 10.2 43.5 2.5 Tr
MMS510 5.8 4.3 4.8 66.8 3.1 ND MMS639 12.9 5.1 5.5 63.8 3.5 0.7 MMS755 8.8 5.1 10.7 50.8 3.9 0.8
MMS852 17.3 6.5 3.1 79.2 4.3 ND MMS1541 2.2 6.0 12.8 22.8 4.9 1.5 MMS540 7.3 11.3 11.5 30.8 3.9 ND Acremonium MMS594 18.1 5.4 9.3 44.7 3.5 2.1
MMS700 11.4 3.2 2.2 65.5 3.8 0.6 MMS713 9.2 3.3 6.5 66.3 3.5 0.5 MMS862 8 5.1 8.8 59.9 4.1 2.4
MMS887 20.1 7.4 8.9 56.1 3.2 5.4 MMS889 50.7 5.0 7.3 73.3 4.1 ND MMS42 5.7 4.0 5.5 60.3 3.1 0.6 MMS330 2.9 6.1 7.6 49.3 3.4 0.7 Penicillium MMS460 2.7 5.8 7.0 48.1 2.8 0.8 MMS646 33.5 5.1 8.3 26.5 2.8 ND Clonostachys MMS1090 21.4 6.6 5.5 66.2 ND 9.4 Tr : traces < 0.5% ; N.D. : Not Detected
145
After fungal biomass extraction, TL were saponified and sterol were identified by GC-MS. The relative amounts were calculated using the percentage of peak area on chromatograms. GC-MS profile analysis revealed low complexity of the sterols produced by these strains and three major peaks were observed. In all chromatograms, a compound with m/z 376 [M] + was observed in relatively high amounts, with the highest value at 11.3 % in Acremonium sp. MMS540 and the lowest value at 3.2 % in Acremonium sp. MMS700. This same molecular mass was observed in other fungal sterol study [20,31]. Comparing mass fragmentation, spectral data results are consistent with literature to ergostapentaene (ergost-3,5,7,9(11),22- pentaene). Ergostatetraenol ( m/z 394 [M] +) was present in higher concentration in Trichoderma MMS1541 almost at 13 %. Lowest concentration was observed in Acremonium MMS700 at 2.2 %. This compound is directly linked on ergosterol pathway and the possibility that ergostatetraenol (ergosta-5,7,22,24(28)-tetraen-3β-ol) was a metabolite of ergosterol and not a precursor was refuted in the 1970s [32]. The strain Trichoderma MMS1541 has presented also the highest value (4.9 %) of neoergosterol ( m/z 380 [M] +). In addition, another Trichoderma strain, MMS13, has presented lowest value (2.4 %) of neoergosterol (19- Norergosta-5,7,9,22-tetraen-3β-ol). Nevertheless, in C. rosea MMS1090, this molecule was not detected. Studies have reported that neoergosterol have a metabolic origin from ergosterol [33,34]. Concerning ergosterol ( m/z 396 [M] +) values, they were ranged from 26.5 % to 77.2 %, in MMS646 and MMS13, respectively, which represents a high variability. Ergosterol is traditionally the most abundant sterol in fungi present as main sterol in their plasma membrane [7]. The highest values reported in this study to an C31:2 compound, probably eburicol, m/z 440 [M] +, were 9.4 %, 5.4 %, 2.4 %, 2.1 % and 1.5 %, in C. rosea MMS1090, Acremonium sp. MMS887, Acremonium sp. MMS862, Acremonium sp. MMS594, and Trichoderma strain MMS1541, respectively. Lowest values to eburicol (< 1 %) were observed in MMS460 (0.8 %), MMS755 (0.8 %), MMS639 (0.7 %), MMS330 (0.7 %), MMS700 (0.6 %), MMS42 (0.6 %) and MMS713 (0.5 %) strains. T. citrinoviride MMS19 strain has presented traces of this sterol (< 0.5 %).
Table 2: Mean of lipid content and unsaponifiable composition of different strains by genus and relative amounts of individual mainly sterols identified.
Lipid content Ergostapentaene Ergostatetraenol Ergosterol m/z Neoergosterol Eburicol
(% w/w) m/z 376 [M] + m/z 394 [M] + 396 [M] + m/z 380 [M] + m/z 440 [M] +
Tricho derma 9.9 5.7 7.4 54.2 3.5 0.5 Acremonium 17.8 5.8 7.8 56.7 3.7 1.6 Penicillium 11.2 5.3 7.1 46.1 3.0 0.5 Clonostachys 21.4 6.6 5.5 66.2 ND 9.4
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C. rosea MMS1090 strain had presented high amounts of TL (21.4 %) and also produced high amounts of eburicol (9.4 %) when compared with results of others strains. All the strains were cultivated in normal conditions and no antifungal compounds were added in culture media. It seems certain that in many filamentous fungi the metabolic steps from lanosterol to ergosterol differ and research into sterol composition is important to understand ergosterol pathways. Nevertheless, eburicol content is mostly studied in pathogenic strains and instead of ergosterol few biological evaluation have been reported. C. rosea MMS1090 was selected to purify and thus assess biological potential effects of eburicol.
3.2. OSMAC Approach: Eburicol Production
An OSMAC approach [35] was performed on seven culture media to observe differences in eburicol production and optimize culture conditions. Unsaponifiable fraction compositions were determined by GC-MS analysis (Table 1). Changes in unsaponifiable fraction compositions were observed (Table 3). A previous study has reported variations on lipids from C. rosea in OSMAC conditions, and the highest lipid production was obtained on YES culture conditions [24].
Table 3: Content of unsaponifiable (%) and composition of TL from MMS 1090 based on the seven culture media (n = 3).
DCA CYA YES GCA KMS PDA MEA
Sterol content (% w/w of 8.8 ± 1.4 10.6 ± 2.4 12.5 ± 2.1 9.5 ± 1.1 7.5 ± 3.5 7.5 ± 1.8 10.0 ± 2.5 unsaponifiable) Putative identification Main unsaponifiable composition (% of unsaponifiable)
Ergostapentaen e 5.9 0.6 5.1 1.2 3.8 0.5 4.7 0.9 4.7 0.9 3.3 ± 0.5 3.4 ± 0.3
9-dehydroergosterol 5.0 0.5 5.5 0.8 3.1 0.7 5.3 1.1 5.9 0.7 1.7 ± 0.3 3.6 ± 0.4
Ergostatrienol 1.9 0.2 1.4 0.5 1.1 0.1 3.1 0.4 2.8 0.1 0.9 ± 0.1 1.3 ± 0.2
Ergosterol 63.2 3.3 65.1 3.8 61.8 3.4 68.2 6.3 61.5 3.8 80.9 ± 1.3 72.4 ± 4.1
Ergostadienol 4.7 0.6 8.9 1.3 4.2 0.5 2.8 0.3 3.6 0.8 5.4 ± 0.5 2.9 ± 0.4
Neoergosterol 2.2 0.2 1.8 0.5 2.0.21 2.5 0.4 2.6 0.7 2. 0.02 2.0 ± 0.5
Fungisterol 0.8 0.2 1.7 0.1 0.8 0.3 tr. (1) 1.3 1.1 0.6 ± 0.3 0.8 ± 0
Lanosterol tr ND 0.8 0.3 0.3 0.2 tr ND Tr
Eburicol 8.0 1.3 5.6 0.5 11.7 2.4 2.7 0.8 3.8 0 2.3 ± 0.6 7.5 ± 0.8 Others 8.2 ± 1.1 4.9 ± 1.2 10.6 ± 1.2 13.7 ± 2.0 12.7 ± 1.2 2.9 ± 0.4 6.1 ± 1.3
tr : traces < 0.5% ; ND : Not Detected
147
Results obtained indicate the ability of MMS1090 strain to use the different available nutrients provided in the culture media leading to some differences in sterol production. The highest sterol content was obtained from cultures on YES medium (12.5%). This high value could be explained by the high sucrose content of these culture media (150 g sucrose/L) which would engage the lipid cells accumulation. In fact, under suitable culture conditions, some microorganisms may convert the carbon sources from several substrates into storage lipid which neutral lipids represent about 90% of total cumulated lipids in some cases [36,29,37]. Cultures conditions such as pH, temperature, carbon source and C/N ratio may change lipid production and lipid composition in fungal strains [26,28,30,38,39]. Neutral lipids mainly contain triglycerides, free fatty acids and sterols. The proportion between these molecules varies depending on culture conditions. Some studies have also reported changes particularly in sterols composition [40 –42]. These molecules have a real importance in fungal growth and their content depends on the physiological state of the fungal culture. Ergosterol remains the most important sterol produced by C. rosea MMS1090 in all culture conditions. The highest ergosterol contents were obtained on PDA and MEA media, 80.9% and 72.4%, respectively, and the lowest values were observed on KMS and YES culture media, 61.5% and 61.8%, respectively. The highest eburicol content was observed in extracts from C. rosea MMS1090 on YES culture medium, 11.7 % of the total unsaponifiable. Lowest value was observed in extracts obtained from cultures on PDA and GCA media, 2.3 % and 2.7 %, respectively. Thus, YES culture medium was used to produce and purify high amounts of eburicol from C. rosea MMS1090 as described in material and methods (2.5).
3.2. Eburicol confirmation
Two isomers are reported in the literature, Eburicol and Euphorbol. Identification and confirmation of structure to C31:2 sterol ( m/z 440) was achieved by analysis of spectral data (GC-MS, HR-ESI-MS and 1H and 13 C NMR) and compared with literature. After purification, compound was observed as a white powder (mp ~ 155 °C) and GC-MS analysis demonstrated the base peak at m/z 425 represents the [M-15 ]+ ion, which could be characteristic for the presence of a 14 α-methyl group in a Δ8-sterol (Figure 1).
148
[M - 15 - side chain - 42 ]+ [M - 15 ]+
[M]+
Fig. 1: C31:2 free sterol GC-MS spectrum from C. rosea MMS1090.
+ The ion at m/z 259 [M-15 -side chain -42 ] corresponded to a 24-methylene side chain and was in agreement with a C 9H17 and a loss of the 14 a-methyl group (Figure 2). The HR-EIMS showed a molecular ion peak at m/z 441.4075 [M+H]+, consistent with a + molecular formula C 31 H53 O and fragmentation resulted to a m/z 423.3986 [M-OH ] . Concerning NMR analysis, the singlet methyl signal at δ0.89 corresponds to methyl group (31-CH 3) branched in C-14. A doublet signal at δ4.67 (J = 1,2 Hz) and the broad singlet at δ4.72 indicate the two C-28 protons, characteristic of a geminal coupling. Doublets were also observed at δ0.93 (J = 6.4 Hz), δ1.04 (J = 6.9 Hz) and δ1.03 (J = 6.9 Hz) for the C-21, C-26 and C-27 methyl groups. The 1H NMR signals are diagnostic for sterols with a 14 α-methyl and 8(9)- and 24(28)-diene structure [43]. Analysis of the 13 C NMR spectral data for the C31:2 isolated sterol showed signals in agreement with those for a 24-methylenelanost-8-en-3β-ol and were in agreement with shifts reported for eburicol in the literature [43 –45]. Melting point (mp ~ 155 °C) was important to confirm isomer eburicol structure [43]. Euphorbol isomer have mp at around 123-126 °C [46].
3.4. Biological Activities of Eburicol
In anti-fungal drugs, specially azole compounds, ergosterol biosynthetic pathway is frequently referred in order to prevent the proliferation of pathogenic fungi [47 –51]. Several studies reported the presence of high amounts of eburicol as the first sterol accumulating once the ergosterol biosynthetic pathway is blocked. Moreover, eburicol is the principal substrate to CYP51, an enzyme which promotes 14 α-demethylation in sterols and constitute an important target to control pathogenic fungi diseases. As a result of enzyme inhibition, ergosterol decrease and nonfunctional sterols accumulation such as eburicol are observed. Eburicol
149
accumulation and depletion of ergosterol therefore disrupt membrane organization and prevents further fungal growth [48,50,52 –55]. Until now, several studies have been done on the cytotoxicity of sterols, especially ergosterol and its derivatives [20,21,56]. Eburicol was assessed against breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA) and lung cancer cell lines (NSCLC-N6-L16 and A549) to assess antiproliferative activity. Antimicrobial activity of eburicol was also evaluated against B. cereus , Bacillus sp., L. ivanovii , S. aureus (Gram- positive bacteria) and C. freundii , E. coli , Salmonella spp. (Gram-negative bacteria).
3.4.1. Antiproliferative Activity of Eburicol Against Human Cancer Cells
To evaluate antitumor activity after treatment with eburicol, cellular viability was evaluated using MTT assays. Results showed potent activity against breast cancer cell lines with IC 50 at 2 µM and 15.7 µM to MCF-7 and MDA, respectively, and smaller activity against lung cancer cell lines IC 50 at 24.5 µM and 38.0 µM to NSCLC-N6-L16 and A549, respectively. Numerous studies have reported sterols and sterol derivatives activities against cancer cell lines from fungal sources. Huang et al . [57] have demonstrated that sterol compounds presented cytotoxicity against several cancer cell lines (Huh-7, MCF-7, A-2058, HSC-3, B16F10 and
SKOV3), specially against B16F10 (IC 50 < 30µM). Cytotoxicity was also observed to steroid compounds against four cancer cell lines and ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one had presented most important inhibition against Neuro-2a and Saos-2 cell lines (53 µM and 71 µM, respectively) and weakest activity against MCF7 and LNCaP-C42 (146 µM and 88 µM, respectively) [20]. Another study has isolated six new steroid compounds and evaluated their cytotoxicity against several human tumor cell lines (P388, HL-60, A549, BEL-7402). All compounds have demonstrated higher activity against 2 cancer cell lines (P388: 1.4 µM to 9.3 µM and HL-60: 0.3 µM to 7.1 µM) [21]. However, in the best of our knowledge, only one study has investigated cytotoxicity of eburicol against KB cell and multi-drug resistant strain KB-VINcells but no growth inhibition were observed in a tested dose at 20µM for both strains [17]. It was isolated from the fruiting body of a terrestrial fungi ( Taiwanofungus camphoratus ) largely used in Chinese medicine.
3.4.2. Antimicrobial Activity of Eburicol Against Human Pathogenic Bacteria
Antimicrobial activity of eburicol was tested against a wide spectrum of human pathogenic bacteria and efficacy was evaluated according to mean of the inhibition diameter of three replicates: Ø ≤ 8mm: No significant antimicrobial activity; 8 < Ø ≤ 12 mm: Moderate antimicrobial activity; 12 < Ø ≤ 14 mm: Significant antimicrobial activity; Ø > 14 mm: High antimicrobial activity (Table 4). Generally, a moderate antimicrobial activity was observed against all bacteria. The highest inhibition zone (24 mm) for eburicol was observed at 100 µg/mL on S. aureus and was the only treatment highest than streptomycin standard
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antibacterial compound. This result represent an increase of 60 % in inhibition zone when compared with a standard treatment. Inhibition zone was increased in a dose depend manner on Bacillus sp. and C. freundii from 8 to 12 mm and from 8 to 11 mm, respectively. No inhibition zone increasing was observed on B. cereus , L. ivanovii or Salmonella spp.. The minimum inhibition zone with no differences was being observed on Salmonella spp. around 9 mm. To E. coli at 50 µg/mL an inhibitory zone of 10 mm was observed, which indicates a moderate activity, but no differences were found to 100 µg/mL.
Table 4. Inhibition zone (mm) for antimicrobial activity of Eburicol from C. rosea MMS1090 against seven human pathogenic bacteria at 50 and 100 µg/mL and streptomycin (standard antibacterial treatment) n = 3.
Streptomycin B. cereus Bacillus sp. L. ivanovii S. aureus C. freundii E. coli Salmonella spp.
50 µg/mL 12 ± 2 10 ± 1 8 ± 0 10 ± 1 7 ± 0 8 ± 1 10 ± 1 9 ± 1 100 µg/mL 15 ± 2 11 ± 1 12 ± 1 9 ± 1 24 ± 4 11 ± 2 ND 8 ± 2
Bacterial infections remain a significant threat to human health. Due to the emergence of widespread antibiotic resistance, development of novel antibiotics is required in order to ensure that effective treatment remains available. Ergosterol isolated from another C. rosea strain and assessed to antibacterial activity was not active at 100 µg/mL on six Gram-positive and Gram-negative bacteria, including a methicilin-resistant S. aureus (MRSA) [19]. Lanostane triterpenes isolated from Fomitopsis rosea demonstrated weak antibacterial activity against a S. aureus strain, at 400 µg/mL, inhibition zone from 14 to 25 mm [58]. This study demonstrated the antibacterial activity of eburicol from Clonostachys rosea MMS1090 and supports its potential for being investigated further for novel antibacterial compound, especially against S. aureus a bacteria very often involved in nosocomial infections for years [59].
4. Conclusion
This present investigation was undertaken to compare differences in sterol production on nineteen marine fugal strains. C. rosea MMS1090 produced, on DCA culture medium, when compared with others strains high amounts of lipids (21.4 %), had presented the richest eburicol production (9.4 %). To optimize culture conditions and produce high amounts of eburicol an OSMAC approach was performed. One study has evaluated eburicol biological activities. The present results showed that eburicol had an important antimicrobial activity, specially, against S. aureus (24 mm at 100 µg/mL) and moderate antimicrobial activity on all the tested bacteria, and proved a significant cytotoxic effect against two breast human cancer cell lines, in particular against MCF-7 at 2 µM (IC 50 ) and two lung human cancer cell lines. To
151
conclude, this study of sterols isolated from the marine Clonostachys rosea MMS1090 confirms that this strain produce bio-active lipids.
Acknowledgments
The authors acknowledge the CAPES Foundation, Ministry of Education of Brazil, Brasília - DF 70040-020, Brazil for the Ph.D. fellowship and the technical platform CRMPO from University of Rennes 1 to NMR and HR-ESI-MS analyses. Thanks are also due to F. Moirand and M. Raheri , for their help as trainees and V. Rabesaotra and C. Tomasoni for their technical participation. The authors thank L. Bryk for English revisions of the manuscript.
Conflicts of Interest
The authors declare no conflict of interest.
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4. Conclusion
En conclusion, ce travail sur Clonostachys rosea MMS1090 a permis de montrer l’ intérêt biotechnologique de cette souche pour sa production importante de TG mais aussi d’un acide gras conjugué rare, l’acide 4 -Me-6E,8 E-16:2. Il a été mis en évidence que cet AGC inhibait la prolifération de cellules cancéreuses mammaires (MCF-7) et réduisait l'expression génique des enzymes responsables pour la lipogenèse.
La méthode CLHP-SM a permis d'analyser de manière automatisée par déréplication la composition extraits bruts lipidiques mais également des fractions enrichies en GL obtenus à partir des cultures effectuées suivant l'approche OSMAC. Le changement de sucre dans le milieu de culture semble induire des variations du métabolisme lipidique. Les plus importants changements ont été observés sur les milieux DCA/GCA et PDA/PGA, notamment pour les LN détectés. Par contre, il a été plus difficile de mettre en évidence des variations au niveau de la classe des GL.
Toutefois, sur la base des activités biologiques réalisées sur les fractions enrichies en GL, le milieu de culture GCA semblait être intéressant à utiliser pour rechercher des GL bioactifs. Suite à une culture en grande échelle, un glucosylcéramide a été isolé et identifié. Cette molécule n'a jamais été décrite chez les champignons du fait de la présence de trois insaturations sur la base sphingoïde ( Δ4,8,10). Ce GlcCer présente une activité antiproliferative intéressante principalement contre la lignée MCF-7, mais également une forte inhibition de la croissance de bactéries pathogènes humaines, spécialement contre B. cereus , S. aureus , C. freundii et Salmonella spp.
Dans le cadre de l'étude de la chimiodiversité lipidique de C. rosea MMS1090, nous nous sommes également focalisés sur la production de stérols en utilisant une approche OSMAC. Cette étude a permis de mettre en évidence la production d'eburicol, intermédiaire de biosynthèse de l'ergosterol, dans des proportions non négligeables (~10 %) sur milieu YES. L'eburicol a présenté une activité antiproliférative principalement contre MCF-7). Cette molécule a également présenté des activités antimicrobiennes, en particulier contre S. aureus .
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Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
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Contexte de l'étude
Acremonium sp. MMS540 est la deuxième souche sélectionnée suite au criblage présenté dans le chapitre IV, pour poursuivre l’étude lipidique e n se focalisant sur les GL. La même démarche que celle mise en place pour C. rosea MMS1090 a été utilisée ici, à savoir une approche OSMAC basée sur des milieux glucosé et galactosé. Ce chapitre présente ainsi de manière globale les variations lipidiques observées en fonction des milieux de cultures utilisés en termes de rendement lipidique, de composition en AGT et de profil lipidique/glycolipidique.
Ces premiers résultats ont fait l’objet d’une publication dans la revue "Current Biotechnology" présentée ci-après et ont été complétés par l’analyse des activités biologiques des fractions enrichies en GL.
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1. Présentation de la publication
Current Biotechnology, 2017 , Vol. 5 Dos Santos Dias et al.
Sugar Induced Modification in Glycolipid Production in Acremonium sp. Revealed by LC-MS Lipidomic Approach.
Ana Camila Dos Santos Dias,1 Aurélie Couzinet-Mossion, 1 Nicolas Ruiz, 1 Matthieu Le Bellec, 1 Emmanuel Gentil, 1,2 Gaetane Wielgosz-Collin, 1 Samuel Bertrand *1,2
1 Mer-Molécules-Santé (MMS) – EA2160, FR CNRS 3473 IUML, University of Nantes, France; 2 ThalassOMICS metabolomics facility, Plateforme Corsaire, Biogenouest, 44035 Nantes, France
*Address correspondence to this author at the UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, University of Nantes, 9 rue bias BP 53508, 44035 Nantes cedex 1, France; Tel: +33(0)2 51 12 56 89; E-mails: [email protected]
Abstract : Background : Marine-derived fungi are an underexploited source of lipids for health and nutrition. Little is known about the impact of sugar type on the lipid diversity produced by a marine-derived fungi. Objective : Traditionally glucose is used as the main sugar source for fungal growth. Thus, this study aimed to reveal the glycolipid alteration induced by glucose replacement by galactose. Methods : The marine-derived Acremonium sp. MMS540 fungal strain was cultivated on three different media with for each the use of glucose or galactose as sugar source, using an OSMAC (One Strain Many Compounds) strategy. For the six different culture conditions, the total lipid and lipid class content of the fungal extracts were evaluated. Fatty acids composition was determined by GC-MS. Finally a LC-MS lipidomic approach was used to evaluate glycolipid modification induced by this sugar replacement. Results : The replacement of glucose by galactose did not alter drastically the total lipid production. However, their GC-MS profiling reveal major modification in the main Δ Δ Δ detected fatty acid ratio ( 916:1, 16:0, 9-12 18:2, 918:1, 18:0) with a decrease of the minor fatty acids diversity. Complementarily, the LC-MS profiles revealed that in the case of Acremonium sp. MMS540, this culture medium modification alter lipid and glycolipid chemical diversity. Conclusion : This study revealed the link between the sugar uptake in fungi and the
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associated glycolipid production. This emphasis that very minor changes may drastically alter not only the secondary natural products in fungi but also its lipid related production.
Keywords: Acremonium , fatty acid, glycolipid, lipid, lipidomic, oleaginous fungus, OSMAC approach .
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1. INTRODUCTION
Marine organisms are an important source of new bioactive compounds [1, 2]. Since the discovery of α-galactosylceramides isolated from a marine sponge, exhibiting anti- tumoral activity [3], marine organisms were largely investigated as a source of glycolipids (GL) [4]. The α-galactosylceramides consist of a galactose attached via a bond of the α type with a ceramide (Cer), varying in length, hydroxylation, and saturation of both the sphingosine and fatty acid moieties. This class of lipids is of particular interest since GL are known to participate in cell recognition mechanisms, growth, transmembrane signalling, and in the cell differentiation process [5].
Interest in oleaginous microorganisms (yeasts, bacteria, algae and fungi) is currently increasing because they are considered as a renewable source of lipids through fermentation process. Various GL were described from terrestrial fungi, for example some cerebrosides were isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae [6]. Some studies describe the original character of GL produced by Zygomycetes [7-10] and Ascomycetes [11-14]. Among these organisms, marine-derived fungi represent an undeniable, however yet underexploited, source of lipids for health and nutrition [15]. Thus, their production of GL is still under-documented and only a few studies describe the isolation of cerebrosides and steroid glycosides [16-19]. However, some of the reported GL have already demonstrated cytotoxic activity against cancer cells [17]. Therefore a large variety of active GL may also be expected from marine fungi.
In natural product drug discovery, recent studies have demonstrated the importance of the “hidden” metabolites, which are not produced under standard laboratory conditions [20]. Therefore, to improve observed chemical diversity, various culture-based strategies were developed such as the OSMAC (One Strain Many Compound) [21], epigenetic modifier [22] and co-culture approaches [23]. The most widely exploited approach remains the OSMAC strategy. Even if recent studies have already demonstrated that modification of the culture medium yielded modification in fungal lipid composition [24, 25], only a few studies have shown the impact of carbon sources on their lipid production [26-29]. Moreover, the main used sugar carbon source was glucose.
164 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
The study presented here focusses on the alteration of sugar source present in the culture medium, through an OSMAC approach. To explore lipid diversity the Ascomycete Acremonium sp. MMS540 was cultivated on different culture media using glucose or galactose as the main sugar carbon source (inversion of chiral carbon at position 4). Total lipid composition was evaluated by lipid class and fatty acids (FA) analyses. In addition, GL-enriched fractions were profiled by liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS) to highlight the chemical differences generated by this particular sugar modification through a lipidomic approach [30, 31].
2. MATERIALS AND METHOD
2.1. Culture media preparation
Solid media were prepared as followed with artificial sea water (Reef Crystals 36 g/L): DCA (Dextrose/glucose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L, Difco); GCA (Galactose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L); PDA
(Potato extract 4 g/L, Dextrose/glucose 20 g/L, ZnSO 4, 7H 2O 0.01 g/L, CuSO 4, 5H 2O
0.005 g/L, Agar 15 g/L); PGA (Potato extract 4 g/L, Galactose 20 g/L, ZnSO 4, 7H 2O
0.01 g/L, CuSO 4, 5H 2O 0.005 g/L, Agar 15 g/L); MEA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1 g/L, glucose 20 g/L, Agar 20 g/L); MEGA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1 g/L, galactose 20 g/L, Agar 20 g/L).
2.2 Acremonium sp. MMS540
The Acremonium strain was isolated from sediments of Bourgneuf bay (La Louippe) in French west coast and stored in the fungal collection of the laboratory MMS under the reference number MMS540. The strain isolation was described by Sallenave-Namont et al. [32]. Sub –cultures were stored in tubes under a paraffin oil layer, on DCA medium. Every sample of sediments was diluted (1 g of sediment with 49 mL of sterilized sea water) and 4 ml of supernatant were inoculated on 18 cm Petri dishes with DCA medium. Fungal cultures were grown at 27°C. Strains were counted and transferred to a 10-cm Petri dishes containing DCA medium. Isolated strains were then morphologically identified. On DCA medium, mycelium of MMS540 is of white colour which may become slightly yellow or orange in case of old cultures (longer than 1 month).
165 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
2.3. Fungal growth
Petri dishes (10 cm diameter) were inoculated with conidia suspension (1 10 6 cells/mL) in 6 marine-like solid media and incubated in natural light for 10 days at 27 °C.
2.4. Lipid Extraction and Separation of Lipid Classes
For each culture media (triplicates), biomass was removed with a scalpel from the agar culture media and allowed to dry in an oven at 65 °C and weighing until it reached a stable weight. Total lipids were extracted from the dried biomass during 2 h at room temperature by two-step CH 2Cl 2/MeOH extraction 2:1 then 1:2 (v/v). The resulting extracts were filtered, pooled and washed with distilled water (40% of total volume). Organic phase was then evaporated to dryness under vacuum providing crude total lipid content (TL). TL are expressed in percentage of the total extracted dry biomass.
Lipid class separation (triplicates) was performed using a classical protocol [24]. Briefly, TL were chromatographed on an open silica gel column (amount of silica corresponding to 20 times the amount of extract separated) with dichloromethane (neutral lipids), acetone (GL) and methanol (phospholipids) as successive eluents until complete depletion.
2.5. Preparation of Fatty Acid Methyl Esters and N-Acyl Pyrrolidides
Fatty acid methyl esters (FAME) and N-Acyl pyrrolidides (NAP) were prepared using classical procedure [24]. Briefly, they were prepared by saponification of crude lipids or lipid classes (1.5 h at 80 °C under reflux with KOH/EtOH 2 mol/L) followed by methylation of the free FA (40 min at 80 °C under reflux with 6% methanolic hydrogen chloride). NAP were prepared by direct treatment of the FAME with pyrrolidine/acetic acid (5:1 v/v) for 60 min at 85 °C under reflux.
2.6. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis
FAME and NAP were analysed using a GC-MS instrument (Hewlett Packard HP 6890 – GC System) linked to a mass detector (HP 6890 MSD – E.I. 70 eV, m/z 40-700 Da) fitted with a SUPELCO SLB-5MS column (60 m 0.25 mm, 0.25 µm). The carrier gas was helium at a flow rate of 1 mL/min. The temperatures of the injector and detector
166 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
were respectively set at 250 °C and 280 °C. From solution prepared at 1 mg/mL in CH2Cl2, 1 µL was injected in splitless mode. For FAME analysis, the column temperature was held at 170 °C for 4 min and programmed to 300 °C at 3 °C/min; for NAP, the initial temperature of 200 °C was held 4 min, then increased by 3 °C/min up to 310 °C and maintained for 20 min. The solvent delay was 9 min.
2.7. High Performance Liquid Chromatography Coupled to High-Resolution Mass Spectrometry
GL enriched fractions (triplicates) were analysed by high performance liquid chromatography linked with a electrospray ionization ion trap time-of-flight multistage mass spectrometer (LCMS-IT-TOFMS) using the protocol described by Kendel et al . [33] on a Shimadzu LCMS-IT-TOFMS instrument composed of two LC-20ADxr pumps, a SIL-20ACxr autosampler, a CTO-20AC column oven, a SPD-M20A DAD detector, a CBM-20A system controller, an ESI ion source, and an IT-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). Briefly, LC-MS profiles were recorded using a 150 × 2.1 mm, 2.6 µm Kinetex C18 column (Phenomenex) in gradient mode at a flow rate of 0.4 mL/min at the temperature of 60 °C. A solvent system composed of (A) water/MeOH 1:1 (ULC-MS grade, Biosolve) and (B) isopropanol (HPLC grade, Biosolve); both eluents (A and B) being modified with 0.1% v/v formic acid (LC-MS grade, Biosolve) and 10 mM of ammonium formate (ULC-MS grade, Biosolve). The gradient consisted of 5 min at 25% B, followed by an increase to 45% B from 5 min to 13 min, followed by an increase to 75.27% B from 13 min to 45 min. The injection consisted of 2 µL of solution at 1 mg/mL in isopropanol. The conditions of the ESI-IT- TOFMS analyses are listed below: (1) detection mode: positive ion; (2) mass range: MS, m/z 100 –1200 Da; (3) heat block: 250 °C and curved desolvation line temperature: 230 °C; nebulizing nitrogen gas flow: 1.5 L/min; interface voltage: 4.0 kV; detector voltage of the TOFMS analyser: 1.61 kV; for MS the ion accumulation time: 20 ms. Samples were analysed along with blank and quality control (QC) samples.
2.8. Data Analysis
Native Shimadzu LC-MS data files were converted into netCDF (common data format) using LCMS solution (version 3.60 – Shimadzu). Automatic feature detection was
167 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
performed between 0.7 and 40 min with MZmine 2 software [34] using parameters selected according to the HPLC-IT-TOFMS analyser. Peaks with a width of at least 0.03 s and an intensity greater than 35000 counts were picked with a 15 ppm m/z tolerance and the generated peak lists were deconvoluted. Deisotope filtering was applied using the “isotopic peaks grouper” module with toleranc e parameters adjusted to 0.1 s and 15 ppm. Feature alignment and gap filling were achieved with a m/z tolerance of 15 ppm and a RT tolerance of 0.1 min. The features detected from blank samples and non-inoculated agar samples were removed from the generated matrix.
Multivariate data analysis was performed using SimcaP 13 (UMETRICS). Features of interest were selected based on their variable importance in projection (VIP) value. Univariate data analysis was performed on Excel (Microsoft). Features of interest were selected according to fold-change over 2 and bellow 0.5 with p-value below 0.01. Features of interest highlighted by both approaches were carefully checked in the raw LC-MS data.
3. RESULTS AND DISCUSSIONS
To explore the lipid diversity production induced by sugar modification, a strain of Acremonium sp. MMS540 was chosen because it was previously identified as an interesting GL producer based on a preliminary LC-HRMS screening of marine-derived fungal strains (data not shown). This filamentous fungus was cultivated under different conditions based on DCA, PDA and MEA culture media. The only modification consisted in replacing the sugar source from glucose to galactose, leading to six different culture media used for OSMAC approach [21]. Those media were chosen because they were traditionally used for fungal growth [24]. In the case of DCA and PDA the glucose to galactose modification drastically modify the carbon source present. In the case of MEA, the carbon source is composed of glucose and maltose (a dimer of glucose) coming from the malt extract. Therefore observed differences between both media containing maltose might be related to differences between glucose and galactose intake in comparison to maltose.
168 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
Acremonium sp. MMS540 was able to grow on the different culture media and no growth speed differences were observed. After growth the mycelium was extracted using classical Bligh and Dyer extraction protocol [35]. The extracts were then evaluated to highlight the lipid differences generated by a simple sugar replacement.
3.1. OSMAC Induced Modification in Extract and Class Lipid Content
The comparison of the lipid content between each culture media clearly shows differences induced by replacement of glucose by galactose (Table 1). However this modification did not always induce or reduce the lipid production. In fact, in the case of DCA, the modification significantly reduced the lipid production from approximately 13.1% to 8.7%. Contrarily, the same modification applied to PDA and MEA media significantly increased the lipid content of the mycelium. The highest lipid production was obtained with PGA medium (~ 20%) which used galactose as major carbon source. In comparison in the PDA medium, the fungal strain produced two times less lipids (~ 11%). Lipid production using MEGA culture medium was approximately 16% and is slightly higher than the production obtained using MEA medium (~ 13%).
Table. (1). Total lipid content (TL) and lipid classes of Acremonium sp. MMS540 on six culture media (n=3).
Lipid classes (Mean ± SD) (% TL) Cultu re TL Sugar medium (% dw) Neutral lipids Glycolipids Phospholipids (%) (%) (%) DCA Glucose 13.1 ± 1.0 53.6 ± 2.2 9.7 ± 1.1 36.7 ± 1.3 GCA Galactose 8.7 ± 1.3 30.2 ± 4.9 32.8 ± 1.4 37.0 ± 3.5 PDA Glucose 10.9 ± 0.5 72.0 ± 2.9 9.4 ± 1.4 18.6 ± 4.1 PGA Galactose 19.8 ± 1.9 68.4 ± 1.7 10.1 ± 0.8 21.5 ± 0.9 MEA Glucose 13.0 ± 0.3 67.1 ± 0.6 7.2 ± 0.4 25.7 ± 0.9 MEGA Galactose 16.1 ± 2.9 65.2 ± 2.2 8.3 ± 3.0 26.5 ± 4.3
Such difference in TL content induced by glucose replacement by galactose between PDA/MEA and DCA may be explained by the presence of peptone (as a source of peptides and amino acids or polymeric glucose in the culture medium. On one hand, the peptone content is 10, 1 and 0 g/L in DCA/GCA, MEA/MEGA and PDA/PGA, respectively. The highest induction of TL content was observed in PDA/PGA, in which no peptone was present. In MEA/MEGA, where only a limited amount of peptone was
169 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
added, the TL content was slightly induced by glucose to galactose replacement. In contrast, in the case of DCA/GCA, where a large amount of peptone was added, this modification yielded the decrease of the TL amount. On the other hand, MEA/MEGA and PDA/PGA media contain a potential glucose source; maltose in the first case and starch in a low amount in the second case. Therefore the presence of glucose source even in low amount may help to initiate the cell energy cycle necessary for improved lipid production by the addition of galactose.
These alterations of total lipid content were further explored after partitioning by open silica gel column. This led to fractions of the different lipid classes (Table 1). Changes of lipid production were observed and media composition compared according to the type of supplemented sugar. As expected, Acremonium sp. MMS540 extracts exhibited high neutral lipids (NL) content (up to 72.0%) and the TL content varies from 8.7% to 19.8% of the mycelium dry weight. Some studies on Acremonium strains have already reported that the production of total lipid content is below 7% of the mycelium dry weight under liquid culture [36]. For example, NL fractions from Acremonium alabamensis , a thermophilic mould, increased during growth while GL and PL classes decreased.
Only few studies report lipid class separation on fungi. Usually fungal extracts are mostly composed of NL when cultivated on a solid medium [24, 37]. This content could reach up to 70% of the total cell biomass [38, 39] which is in agreement with observed NL in Acremonium sp. MMS540. In fact, under some specific culture conditions, numerous microorganisms may convert the carbon sources from several substrates into storage lipids [40-42]. In addition, the temperature and the culture medium pH and C/N ratio may modify their lipid content [43, 44]. For example, when cultivating yeasts in nitrogen-stress conditions, the intracellular lipid content can significantly increase depending on the strain and species [45]. In the case of fungi, several carbon sources have already been tested, like corncob, sweet potato or olive oil, and variation of the lipid production was observed [46-49].
The analysis of the lipid class content (Table 1) revealed that, except for the GCA medium, their proportion did not drastically change when comparing all used culture
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media. NL, GL and phospholipids (PL) corresponded approximately to respectively 65%, 10% and 25% of the total extracted lipid. In the cases where Acremonium was grown using GCA, the three lipid classes are equally represented in the total lipid extract. It corresponded to a decrease of NL content to 30.2% and an increase of GL content to 32.8%. Therefore in that particular case the change in the sugar source drastically altered lipid biosynthesis without modifying the PL content (36.7% in DCA to 37.0% in GCA).
Focusing on GL content, no significant changes were observed between PGA and PDA culture media (10.1% and 9.4%, respectively). Similarly no clear differences were observed between MEGA and MEA culture media (8.3% and 7.2%, respectively).
3.2. GC-MS Analysis of lipids of total lipid content
To further explore the modification of composition of the total lipid content induced by sugar replacement, the extracts were saponified and esterified. Then the total FA composition was determined by GC-MS analysis. Finally, all FA were identified by a careful investigation analysis of their MSEI spectra (FAME and NAP derivatives). Analysis of FAME is used to define the length of the carbon chain, to classify FA by their number of double bonds or ramifications, and estimate their relative proportion. Analysis of NAP allows positioning the double bonds on the unsaturated FA. The major FA are presented in Table 2.
Table. (2). Composition in major fatty acids (% total FA) produced by Acremonium sp. MMS540 on six different culture media obtained by GC-MS profiling.
Fatty acids (% of total FA) Culture medium Sugar ∆916:1 16:0 ∆9,12 18:2 ∆918:1 18:0 Others FA* DCA Glucose 1.9 23.9 30.6 28.6 2.8 12.2 GCA Galactose 1.7 25.7 31.2 35.4 4.1 1.9 PDA Glucose 2.1 21.9 34.2 35.0 3.9 2.9 PGA Galactose 1.0 29.7 16.4 42.3 9.2 1.4 MEA Glucose 1.5 24.5 45.5 20.6 4.2 3.7 MEGA Galactose 1.5 24.2 40.7 26.0 4.4 3.2 *Also identified (< 1%) : 14:0, 15:0, 17:0, 17:2, 2-OH-18:0, cj18:2, 19:1, 19:2, 20:0, 20:1, 20:2, 21:0, 22:0, 22:1, *22:2, 23:0, 24:0; cj (conjugated)
171 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
Δ Δ Δ All the extracts contained five major FA ( 916:1, 16:0, 9,12 18:2, 918:1 and 18:0) representing 88% to 98% of total FA (Table 2). Three FA are clearly overrepresented Δ Δ (16:0, 9,12 18:2, 918:1) with content around 30% each. Four of the major observed FA Δ Δ (16:0, 18:0, 918:1 and 9,12 18:2) are the most common FA described in oleaginous microorganisms [24, 37, 50-53]. In addition 17 other FA were produced by this strain in trace amount (< 1%) corresponding to 14 to 24 carbon FA. Others FA were also observed and identified, they represent less than 4% of the TL content except when Acremonium sp. was grown in DCA where they represent 12%.
Table 2 indicated that some changes could be observed due to the use of galactose instead of glucose as a carbon source. In the case of the MEA/MEGA media no drastic Δ changes could be observed. A 5% decrease in 9,12 18:2 combined with a 5% increase of Δ Δ 918:1 could be observed when galactose was used. The other FA ( 916:1, 16:0 and 18:0) content was not modified.
The modification of the sugar in the DCA medium induced clear modification in the FA Δ Δ profile. The 918:1 and 18:0 FA clearly increase from 28.6% to 35.4% for 918:1 and from 2.8% to 4.1% for 18:0. This 9% increase in 18-carbon-FA is combined by a 10% decrease of the minor FA. Thus this leads to a decrease in FA chemical diversity, focusing the FA production by Acremonium sp. MMS540 on its major FA.
Interestingly the comparison of the PDA and PGA culture media leads to more drastic alteration of the FA profiles. All the major FA production were modified. The Δ Δ biosynthesis of 916:1 and 9,12 18:2 FA by Acremonium sp. clearly decreased with the replacement of glucose by galactose, both being twice less produced (2.1% to 1.0% for 16:1 and 34.2% to 16.4% for Δ9,1218:2). Contrarily, 16:0, Δ918:1 and 18:0 FA production increased in the same conditions. Particularly the 18:0 FA was induced more than 2 times; it corresponded to 3.9% and 9.2% of total lipid extract in PDA and PGA, respectively.
Other alterations were also observed on minor FA. When grown on DCA, MEA and MEGA culture media a 2-OH-18:0 FA was observed at low concentration (0.13%, 0.03% and 0.10%, respectively). FA hydroxylated in the second carbon can be easily
172 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
detected as FAME derivative by the presence of characteristic fragment ions peaks from Mac Lafferty rearrangement (m/z = 90 and m/z = 103). Hydroxylated FA usually occur in fungal GL, and sometimes in PL, from various organisms such as marine sponges[8, 54].
Those observations clearly indicate that minor changes (glucose to galactose) in the culture medium conditions could lead to major FA profiles alteration. It is interesting to note that a global culture media modification from DCA to PDA or MEA lead also to drastic alteration. This pointed out that glucose and galactose assimilation by the fungi are related to two different biosynthetic pathway [55].
3.3. Untargeted LC-MS Analysis on TL Extract
To evaluate TL composition modification related to the sugar modification, the TL extracts were profiled by high performance liquid chromatography coupled to high- resolution mass spectrometry (LC-HRMS). This allowed to get a general overview of their TL content using a classical lipidomic approach [30]. This procedure takes advantage of the high-resolution (HR) detection offered by a TOFMS detector [31]. The LC-MS profiles generated 2D ion maps, in which all of the features (retention time – RT – × m/z ) are associated with the fungal lipids resolved in both the LC and MS dimensions. All of the features (RT × m/z × peak area) detected in the lipid profiles of each extract were deconvoluted using an automated peak-picking procedure that was optimized for the retrieval of only the relevant chromatographic ion traces [34].
As a preliminary step, an unsupervised multivariate data analysis using principal component analysis (PCA – UV scaling) was performed on these 18 samples (Figure 1). This PCA shows a clustering according to the culture media used. The first axis (PC1, 21%) separated the samples according to the culture medium without differences according to the sugar source. The second axes (PC2, 18%) clustered the samples according to the sugar source of each culture media. This indicated that the dataset contained information allowing the discrimination of culture media. This clearly indicated that the culture medium influence the lipid production in Acremonium sp.
173 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
Fig. (1). Unsupervised multivariate data analysis using principal component analysis (UV scaling) of total lipid profiles showing differences related to the culture media used for Acremonium sp. MMS540 growth.
In the case of DCA/GCA and PDA/PGA a clear separation could be observed in the PCA. This indicated that, in those two cases, major lipid modification are present in the extract depending on the sugar used in the culture medium. Contrarily, samples obtained on MEA and MEGA culture media were not clustered separately in the PCA. Therefore their lipid content stays similar (as observed in the raw LC-HRMS base peak chromatograms – data not shown). This similarity can be explained by the presence of maltose in the culture media, which is constituted by two linked molecules of glucose. Thus, Acremonium sp. MMS540 seems to be able to hydrolyse a disaccharide, maltose,
174 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
to afford glucose, and use it as primary carbon source as reported for Acremonium spp. [56] and others fungal strains [25] and it was preferred to direct galactose intake. This could explain the lack of major differences on lipid, lipid classes and FA content observed between MEA and MEGA.
Focusing on the two coupled media (DCA/GCA and PDA/PGA), two orthogonal projections of latent structure with discriminant analysis (OPLS-DA) models were developed [57]. Their use lead to the selection of the features modified by the sugar replacement. To explore in combination the two models, a share and unique structure (SUS) plot approach was used (Fig 2) [58]. The generated plot represented each feature in a two dimensional manner where the first and second axes correspond to importance in the DCA/GCA and PDA/PGA models, respectively. In addition to the selection feature responsible to sample grouping, this approach highlights also features highly present in both glucose media (DCA and PDA) or in both galactose media (GCA and PGA). The features of interest are listed in Table 3. Only two features were significantly altered in both models. Complementarily, the data were also explored univariatly [59]. However, no new features were highlighted (Table 3).
175 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
Fig. (2). Share and unique structure (SUS) plot based on two OPLS-DA models (DCA/GCA and PDA/PGA) showing over-produced features related to total lipids according to each culture media. Features close to 1 in the x-axis are over-produced in PGA in comparison to PDA. Contrarily, features close to -1 in the x-axis are over-produced in PDA in comparison to PGA. Similarly, on the y-axis over- produced features in DCA or GCA are close to value -1 and 1, respectively.
The data analysis performed on the LC-MS features detected in each medium revealed a clear reduced TL diversity when glucose is replaced by galactose. However, TL cellular content (Table 1) was higher under galactose condition for MEGA and PGA media, but not to GCA medium. Therefore in the case of Acremonium sp. MMS540, the replacement lead to a more focused lipid production on a few compounds.
176 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
3.4. Putative Identification of TL related to Glucose/Galactose modification
The identification of the lipids listed in Table 3 was performed through dereplication strategies [31]. Molecular formula and putative lipid structures were deduced based on exact mass accuracy, isotopic pattern matching [60], heuristic filtering [61] and searches in Lipid Maps [62]. In addition, FA chains were selected according to the main observed in Acremonium sp. MMS540 (Table 2). This strategy leads to the putative identification (level 3 according to Metabolomics Standards Initiative [63]) of most highlighted features from Table 3.
Based on the proposed annotations, it is interesting to note that all kind of lipids (GL, PL and NL) were altered by glucose to galactose replacement (Table 3), such as PG (ex. down-regulation of PG(14:1)), fatty amino-acids (ex. down-regulation of N- docosahexaenoyl phenylalanine), PE (ex. down-regulation of PE(P-19:1/0:0)), PC (ex. up-regulation of PC(16:0/18:2)), PE-Cer (ex. down-regulation of PE- Cer(d17:1/18:0(2OH))), inositol-phosphoceramide (IP-Cer) (ex. up-regulation of IP- Cer(18:0/16:0)), DG (ex. up-regulation of DG (16:1/18:2/0:0)) or TG (ex. down- regulation of TG(18:1/18:1/18:2)). However, NL remains the less impacted by the culture medium modification.
3.5. Untargeted LC-MS Analysis on GL Fraction
GL represent an important source of bioactive compounds [5, 64, 65]. Therefore the GL-enriched fractions (acetone fraction) were further explored to evaluate the chemical diversity modification related to the sugar modification. These fractions were similarly profiled by LC- HRMS [30]. Composition modification related to the culture medium modification were explored by data analysis, yielding features of interest.
First, PCA (UV scaling) was performed on these 18 samples (Figure 3). This score plot shows a different clustering in comparison to TL clustering (Figure 1) with the first two components representing 59% of the total explained variance (PC1: 38.6% and PC2: 20.0%). As expected clustering is related to culture medium composition. However, compared to TL content, the GL enriched fractions profiles are much more altered by the glucose to galactose replacement. This was expected because various different sugar
177 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
moieties may be present in GL [4, 66]. It is interesting to note that, as for TL clustering, the glucose to galactose replacement is also observed in the PCA according to the second axes (PC2) with approximately the same explained variance (20%). At contrary the first axes (PC1) does not corresponded to a culture medium effect as it was the case for the TL.
Table. (3). Features of interest related to total lipids according to the SUS-plot generated by the two OPLS-DA models (UV scaling) comparing DCA/GCA and PDA/PGA culture media. ↑ indicates that the feature is over-produced in glucose containing media. ↓ indicates that the feature is over-produced in galactose containing media. * p-value ≤ 0.01; ** p-value ≤ 0.001. RT m/z Features revealed by Feature revealed by Putative identification (min) multivariate data univariate data analysis analysis (OPLS-DA) DCA/GC PDA/PGA DCA/GCA PDA/PGA A 3.67 518.2862 ↑ ↑* Unidentified
4.01 472.2530 ↑ ↑* PG (14:1) [M+NH ]+ 4 4.19 496.2886 ↑ ↑** Unidentified
4.42 520.2953 ↑ ↑** Unidentified
4.60 472.2530 ↑ ↑** PG (14:1) [M+NH ]+ 4 5.04 520.2999 ↑ ↑** Unidentified
N-docosahexaenoyl phenylalanine 5.10 498.3063 ↑ ↑ ↑** [M+Na] + N-docosahexaenoyl phenylalanine 5.83 498.3070 ↑ ↑** [M+Na] + 5.86 520.3145 ↑ Unidentified
7.33 522.3248 ↑ ↑* Unidentified
7.37 500.3256 ↑ ↑* PE(P-19:1/0:0) [M+Na] +
8.17 500.3254 ↑ ↑** PE(P-19:1/0:0) [M+Na] +
8.17 522.3343 ↑ ↑** Unidentified
8.27 377.1110 ↑ ↑* Unidentified
8.77 377.1111 ↑ ↑* ↑* Unidentified
10.30 379.1235 ↑ ↑* Unidentified
10.71 379.1232 ↑ ↑** Unidentified
12.62 451.1730 ↑ Unidentified
18.70 756.5754 ↑ PE(P-20:0/18:2) [M+H] +
18.92 780.5494 ↓ ↓** PC(16:0/18:2) [M+Na] +
PE-Cer(d17:1/18:0(2OH)) 19.73 708.5757 ↑ + [M+NH 4] 19.82 758.5879 ↑ DGTS(16:0/18:2) [M+Na] +
inositol-phosphoceramide 20.03 782.5643 ↓ ↓** (18:0/16:0) [M+H] + inositol-phosphoceramide 20.14 782.5647 ↓ (18:0/16:0) [M+H] + PE-Cer(d19:2/18:0(2OH)) 20.61 734.5891 ↑ ↑* + [M+NH 4] 20.78 758.5649 ↓ ↓ ↓** PE-NMe(18:1/18:1) [M+H] + 20.95 760.6026 ↑ PC(16:0/18:1) [M+H] +
21.02 710.5924 ↑ Unidentified
21.14 716.5204 ↓ PE(16:0/18:2) [M+H] +
PE-Cer(d19:1/18:0(2OH)) 21.73 736.6041 ↑ [M+NH4] + 22.22 762.6211 ↑ PE(O-20:0/18:0) [M+H] +
22.96 738.6197 ↑ ↑* Unidentified
23.70 764.6364 ↑ PA(O-18:0/22:0) [M+NH ]+ 4 24.10 613.4781 ↓ ↓** DG(16:1/18:2/0:0)[iso2] [M+Na] +
178 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
35.75 379.1779 ↓ Unidentified
TG(18:1/18:1/18:2)[iso3] 37.78 900.7961 ↑ ↑* + [M+NH 4] 38.46 603.5327 ↑ DG(O-16:0/18:1) [M+Na] +
Table. (4). Features of interest related to total glycolipids according to the SUS-plot generated by the two OPLS-DA models (UV scaling) comparing DCA/GCA and PDA/PGA culture media. ↑ indicates that the feature is over-produced in glucose conta ining media. ↓ indicates that the feature is over-produced in galactose containing media. * p-value ≤ 0.01; ** p-value ≤ 0.001. RT m/z Features revealed by multivariate Feature revealed by univariate Putative (min) data analysis (OPLS-DA) data analysis identification DCA/GCA PDA/PGA MEA/MEGA DCA/GCA PDA/PGA MEA/MEGA 1.65 481.2894 ↑ ↓ ↑* ↓** PA(10:0/10:0) [M+H] +
3.02 468.2713 ↑ ↓* ↑* PE(8:0/8:0) [M+H] +
3-O-(ß-D-glucopyranosyl- 3.03 513.2652 ↓ ↓* (1->6)-ß-D- glucopyranosyl)ethyl -3- hydroxyoctanoate [M+H] + 4.05 467.3105 ↑ ↓ ↑* ↓* PA(20:0/0:0) [M+H] +
4.07 467.1937 ↓** ↑* ↑* Unidentified
6.41 465.1736 ↓* ↑* Unidentified
6.70 375.0949 ↓* ↑** Unidentified
6.71 375.2505 ↑* ↑* ↓* Digitoxigenin [M+H] +
6.91 467.1924 ↓** ↑* Unidentified
6.95 467.3087 ↑ ↑ ↓ ↑* ↓** PA(20:0/0:0) [M+H] +
7.31 481.1959 ↓* Unidentified
7.91 467.3109 ↓* Ergocalciferol [M+Na] +
8.20 465.1726 ↓* Unidentified
8.54 377.2683 ↑ ↑ ↑** ↑* MG(18:2) [M+Na] +
8.88 467.1931 ↑* Unidentified
9.86 347.2574 ↑ ↓ ↑* Auricolic acid [M+Na] +
9.88 427.1326 ↑* Unidentified
9.92 465.1731 ↑* Unidentified
10.06 443.1525 ↑** Unidentified
10.27 451.3179 ↑ ↑ ↑ ↑* ↓* PA(P-20:0/0:0) [M+H] +
10.52 429.1491 ↓* Unidentified
10.70 357.3005 ↑ ↑* Unidentified
N-arachidonoyl glutamine 10.93 433.3042 ↑ ↓ ↑* ↓** + [M+H] N-oleoyl glutamine 10.94 411.3237 ↑ ↑ ↓ ↑* ↑* ↓* + [M+H] N-arachidonoyl glutamic 11.85 451.3145 ↓ ↑* ↓** + acid [M+NH 4] 20.17 754.5794 ↑ ↑* Unidentified
GlcCer(d15:0/20:1) 20.18 736.5711 ↑ + [M+Na] 20.18 574.5188 ↑ ↑ ↑* Cer(d18:1/17:0) [M+Na] +
20.18 776.5580 ↑ ↑* Unidentified
20.89 778.5748 ↑ ↑ ↑* GlcCer(d19:2/18:0(OH)) [M+Na] + 21.98 602.5131 ↓ ↓* Cer(d14:1/22:1(OH)) [M+Na] + 23.49 637.4825 ↑ ↑* Unidentified
24.71 590.5451 ↑ ↑* Cer(d18:0/18:0) [M+Na] +
Cer(t20:0/22:0(2OH)) 27.73 706.632 ↑* + [M+Na]
179 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
Fig. (3). Unsupervised multivariate data analysis using principal component analysis (UV scaling) of glycolipid profiles showing differences related to the culture media used for Acremonium sp. MMS540 growth.
A detail exploration of the PCA of the LC-MS GL profiles (Figure 3) showed that PDA and PGA cluster nicely together. This indicated that only minor changes in GL composition occur due to either culture media. Alternatively, DCA/GCA and MEA/MEGA clustered separately indicating more significant differences in the GL- enriched fractions. It is interesting to note that, as represented by the very close clusters of the MEGA and DCA enriched fractions, the glucose replacement by galactose in the MEA medium leaded to a composition close to DCA GL-enriched fraction. Therefore, this clearly indicated that the culture medium influence the GL production in Acremonium sp.
180 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
To explore further the induced diversity, supervised OPLS-DA models were developed [57] focused on the impact of sugar replacement from glucose to galactose. The features of interest are listed in Table 4.
3.6. Putative Identification of GL related to Glucose/Galactose modification
As previously explained, the features of interest listed in Table 4 were putatively identified. This strategy leads to the annotation of most features from Table 3.
Based on the proposed annotations, it is interesting to note that within the GL enriched extract, the altered metabolite production was not related to a large variety of families. Only ceramide (mostly down-regulation), glycosylceramides (down-regulation), fatty amino-acids and polar sterols were altered by the glucose to galactose alteration (Table 3).
It is interesting to note that the IP-Cer glycolipid class was not present in the GL- enriched fraction due to the presence of the P atoms. Such structures types were previously identified in other Acremonium strains [67, 68] as well as in other fungi [67, 69, 70], but substituted by sugars on the inositol. Nevertheless, they remain most widely studied in plants. In fungi, these molecules play an important role in organisms in intercellular processes [67, 69, 70]; the ceramide moiety serving as anchor for membrane proteins. In PDA, both putatively identified inositol-phosphoceramides (IP- Cer 18:1/16:0 and IP-Cer 18:0/16:0) were produced in higher amount compared to PGA. Similarly, in DCA medium, only IP-Cer 18:0/16:0 was observed to be overproduced in presence of glucose.
4. CONCLUSION
This present study explored the potential of minor changes in the culture medium on the GL production of the filamentous fungus Acremonium sp. MMS540. Three culture media composition (DCA, PDA and MEA) were altered and glucose was replaced by galactose (inversion of chiral carbon at position 4). Differences were observed in the total lipid production with an increase content in the case of PGA in comparison to PDA and a slight decrease for GCA compared to DCA.
181 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
FA composition of the total lipid extracts was analysed revealing that, as expected for Δ Δ fungi, the three main FA were 16:0, 9,12 18:2, 918:1. Major ratio modifications were observed between PGA and PDA, and between GCA and DCA. Those observations clearly indicate that these minor changes in the culture medium conditions lead to major FA profiles alteration, in comparison to global medium modification (shown by the comparison of DCA, PDA and MEA GC-MS profiles). The proposed alteration however, tends to reduce minor FA diversity.
The TL and GL (lipids with high pharmacological potential) were profiled by a LC-MS lipidomic approach. In the case of Acremonium sp. MMS540, the comparison of the detected features clearly highlights modification in lipid production by the studied medium modification. This study highlights for the first time the link between the sugar uptake in fungi and the associated GL production. This emphasis that very minor changes [21] may drastically alter not only the secondary natural products in fungi but also the lipid related production. Therefore, for screening purposes it is also important to modify sugar sources to improve lipid and secondary metabolite diversity.
LIST OF ABBREVIATIONS
C/N: Carbon-Nitrogen ratio, DCA: Dextrose casein agar, EI: Electronic impact ionization, ESI: Electrospray ionization, FA: Fatty acids, GCA: Galactose casein agar, GC-MS: Gas chromatography coupled to mass spectrometry, GL: Glycolipids, FAME: Fatty acid methyl esters, HPLC: High-performance liquid chromatography, HRMS: High-resolution mass spectrometry, IP-Cer: inositol-phosphoceramides, IT: Ion trap, LC: Liquid chromatography, MEA: Malt extract agar, MEGA: Malt extract galactose agar, MS: Mass spectrometry, NAP: N-Acyl pyrrolidides, NL: neutral lipids, OPLS- DA: Orthogonal projections of talent structure with discriminant analysis, OSMAC: One Strain Many Compound, PCA: Principal component analysis, PDA: Potato dextrose agar, PGA: Potato galactose agar, PL: Phospholipids, RT: Retention time, SUS: Share and unique structure, TL: Total lipids, TOFMS: Time-of-flight mass spectrometry, VIP: Variable Importance in Projection.
182 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare no conflict of interest.
ACKNOWLEDGEMENTS
A.C.D.S.D. as Ph. D. student was implied at all experimental stages. In addition, N.R. was involved in fungal culture, E.G., M.L.B., S.B. in LC-MS method development and extract analysis. A.C.M., G.W.C., N.R., S.B. participated in data analyses, results exploitation and revised the article critically for intellectual content. S.B. was responsible for writing arranging and checking the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
The authors acknowledge the CAPES Foundation, Ministry of Education of Brazil, Brasília - DF 70040-020, Brazil for the Ph. D. fellowship, the Region des Pays de la Loire for funding of this study through the CHIMIMAR program and the ThalassOMICS metabolomics facility, (Plateforme Corsaire, Biogenouest) for the MS analyses. The authors thank Lucas Bryk for English revisions of the manuscript.
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Received: November 12, 2015 Revised: September 8, 2016 Accepted: September 9, 2016 DOI : 10.2174/2211550105666160922130029
187 Chapitre VI. Étude lipidique de la souche Acremonium sp. MMS540
2. Conclusion
Comme pour C. rosea MMS1090, le remplacement du glucose par du galactose dans le milieu de culture induit une modification du profil lipidique. Par contre, il semble intéressant de noter que les lipides impactés pour Acremonium sp. MMS540 dans les extraits bruts semblent être principalement des PL alors que pour C. rosea , il s’agissait principalement de LN (DG, TG).
De plus, contrairement à C. rosea , sur la base des identifications proposées suite à la déréplication, les variations de métabolites observées dans les fractions acétoniques semblent concerner des GL mais aussi leurs intermédiaires de biosynthèse, les céramides (Figure I.10, p-26). Pour approfondir, il serait intéressant de tester différentes activités biologiques de ces fractions et d’essayer de les corréler aux variations des profils lipidiques observées.
Il est important de remarquer la présence de l'ion m/z 776,5580 (t R 20,18 min) détecté dans l'extrait glycolipidique d' Acremonium sp.. En effet, cette molécule pourrait correspondre au GlcCer isolé de C. rosea . Néanmoins, d'autres molécules ayant une masse moléculaire identique ont été isolées d'un Aspergillus flavipes (Jiang et al ., 2004). Il est intéressant de noter que ces composés diffèrent en possédant un glucose ou un galactose pour la partie glycosylée, et l'une des trois insaturations est localisée sur l'acide gras. Il serait nécessaire d'isoler et d'élucider la structure exacte du composé présent dans les extraits d' Acremonium sp. MMS540 et d'évaluer son activité biologique.
188
Conclusion Générale et Perspectives
189
Le travail présenté ici avait pour principal objectif d'évaluer le potentiel des champignons marins en termes de production et de chimiodiversité lipidique pour la recherche de lipides bioactifs.
Pour cela, une première partie a consisté en un criblage sur plus d'une trentaine de souches en étudiant différents critères : production lipidique globale, composition en acides gras, complexité des profils lipidiques, mais également les activités biologiques. Différentes techniques ont été utilisées telles que la CPG-SM, la CLHP-SM et les tests MTT. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner deux souches C. rosea MMS1090 et Acremonium sp. MMS540. Lors de ce criblage, d’autres souches présentant des activités biologiques moins importantes n’ont pas été retenues mais elles pourraient être valorisées dans d’autres domaines tels que la cosmétique et la nutrition du fait de leur forte productivité lipidique. De plus, il serait intéressant de poursuivre le criblage au sein de la mycothèque de MMS avec les genres peu ou pas étudiés dans le cadre de ce travail.
La première souche retenue C. rosea avait déjà fait l’objet d’une étude lipidique permettant de mettre en évidence la forte production de TG ainsi que celle d’un AG rare conjugué, le 4-Me-6,8-16:2. Le présent travail a permis de poursuivre l’élucidation structurale de l’AG (IR, RMN) notamment la configuration des doubles liaisons conjuguées (4-Me-6E,8 E-16:2) suite à une optimisation des conditions de culture par approche OSMAC permettant sa purification en quantité suffisante. Cet acide gras a démontré une activité antiproliférative contre la lignée MCF-7 et une inhibition importante de l'expression des gènes de la lipogenèse responsables de la production des enzymes Fatty Acid Synthase (FAS) et Acetyl CoA-carboxylase (ACC). Cet AGC pourrait présenter un intérêt dans la prévention, voire la réduction de cancers mammaires, notamment en tant que complément alimentaire. Pour cela il faudra poursuivre les investigations en réalisant des études nutritionnelles in vivo afin de confirmer son effet bénéfique potentiel, notamment lors de prises régulières dans le cadre d'un régime alimentaire.
Le criblage selon l’activité biologique a montré l’intérêt d’étudier les fractions enrichies en GL aussi bien chez C. rosea que chez Acremonium sp. MMS540. Pour les deux
190
souches, une approche originale initiée dans le cadre de ce travail a consisté à évaluer l’effet de la nature du sucre contenu dans le milieu de culture (glucose vs. galactose) sur leur métabolisme lipidique. Les outils de lipidomique ainsi mis en place et couplés à la déréplication ont permis de mettre en évidence des modifications du métabolisme lipidique pour les deux souches étudiées. Concernant C. rosea MMS1090, les lipides principalement impactés étaient les LN, lipides majoritairement produits par cette souche alors que pour Acremonium sp. MMS540, il s’agissait des lipides polaires (PL, GL).
En parallèle, des variations d’activités biologiques des différentes fractions enrichies en GL chez C. rosea ont également été observées en fonction de la nature du sucre. À partir de ces constats, le milieu de culture galactosé GCA a été choisi pour produire des GL bioactifs. Cette étape a permis de purifier un glycosphingolipide majoritaire caractérisé par la présence d’une molécule de glucos e et d'une base sphingoïde méthylée possédant 3 insaturations. Cette molécule a déjà été décrite chez des invertébrés marins mais il s’agit de la première observation chez un champignon. De plus, ce travail montre pour la première fois que cette molécule présente des activités antiprolifératives (MCF- 7) et antimicrobiennes ( B. cereus , S. aureus , C. freundii et Salmonella sp.). Il pourrait être intéressant de rechercher si cette molécule est présente chez d’autres souches de la mycothèque puisque sa présence est supposée chez Acremonium sp. MMS540.
Un criblage basé sur la production d'un autre groupe de lipides d'intérêt, les stérols, a été mené afin d'isoler et de tester l'activité biologique de ces composés. Suite à cette étude, l'eburicol, un intermédiair e de biosynthèse de l’ergostérol présent majoritairement chez les champignons pathogènes pour l'homme, a été plus fortement observé chez C. rosea . Après optimisation des conditions de culture par approche OSMAC et purification, l’eburicol a été testé quant à son activité biologique jusqu'alors peu étudiée. Il a montré une activité antimicrobienne importante, en particulier contre S. aureus et un effet cytotoxique sur une lignée cellulaire de cancer (MCF-7).
En conclusion, ce travail a permis d’isoler trois lipides d’intérêt : un acide gras conjugué, un glycosphingolipide et un stérol, après avoir optimisé les conditions de culture permettant leur production par C. rosea MMS1090. Ces trois composés bien que
191
déjà décrits n’avait pas ou peu fait l’objet d’étude concernant leurs activités biologiques. Les résultats obtenus incitent à poursuivre leur évaluation pharmacologique notamment sur d’autres lignées cellulaires, cancéreuses ou saines, mais également d’élargir à d’autres pathologies (parasitoses).
De plus, cette étude couplant la lipidomique par CLHP-SMHR et l’approche OSMAC, novatrice dans le domaine des lipides fongiques, devra être étendue à l’ensemble des souches présentes dans la mycothèque du laboratoire.
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Ana Camila DOS SANTOS DIAS
Champignons marins : Lipidomique et lipides d'intérêt en santé et nutrition
Marine fungi : Lipidomic and interesting lipids in health and nutrition
Résumé Abstract
Les champignons marins, malgré leur diversité chimique Marine fungi, despite their chemical diversity due to their due aux adaptations constantes, restent encore peu constant adaptations, remain poorly investigated for étudiés pour leur diversité lipidique et constituent donc their lipid diversity and therefore represent a potential un potentiel pour des lipides d'intérêt valorisables en source of lipids of interest in health and nutrition. In this santé et nutrition. Dans ce cadre, après un criblage context, after a screening of more than thirty strains of réalisé sur plus d’une trentaine de souches de la the MMS lab marine fungal collection, mycothèque marine du laboratoire, les souches Clonostachys rosea MMS1090 and Clonostachys rosea MMS1090 et Acremonium sp. Acremonium sp. MMS540 were selected based on their MMS540 ont été retenues sur la base de leur production lipid production, their fatty acid composition and their lipidique, de leur composition en acides gras, du lipid profiling using lipidomic approach but also for the profilage lipidique par approche lipidomique mais potential bioactivities of their lipid fractions. également du potentiel cytotoxique de leur fractions For both studied strains, a more comprehensive study lipidiques. using OSMAC approach (One Strain Many Compounds) Les deux souches ont ensuite fait l'objet d'une étude was then performed in order to observe lipid profiling lipidique plus complète en adoptant une approche differences in terms of lipid diversity and production and OSMAC ( One Strain Many Compounds ) afin d’évaluer to assess their potential to produce bioactive plus largement leur potentiel en termes de diversité compounds. lipidique et de production de lipides d’intérêt. Methodology used, crossing lipidomic approaches, Les méthodologies ainsi utilisées, croisant des dereplication as well as conventional lipid purification approches lipidomiques, des techniques de techniques have been applied and permitted for déréplication ainsi que des techniques classiques de C. rosea MMS1090 to isolate, identify and evaluate the purification de lipides ont permis pour C. rosea MMS biological potential of the conjugated fatty acid 4-Me- 1090 d’isoler, d’identifier et d’évaluer biologiquement 6,8 -16: 2, a glycosphingolipid and a sterol, the eburicol. l’acide gras conjugué 4-Me-6,8-16:2 , un These molecules exhibited bioactivities against cancer glycosphingol ipide et un stérol, l’eburicol. cells lines, in particular ag ainst MCF-7 breast cancer Ces molécules ont démontré une importante activité sur cell line, as well as Gram -positive and negative bacterial les différents lignées cancéreuses testées, notamment strains. In the same way, for Acremonium sp. MMS 540 sur MCF -7, ainsi que sur des souches bactériennes it was also demonstrated the presence of bioactive Gram positif et négatif. D’autre part il a été mis en glycolipid fractions. These first reports show the évidence sur Acremonium sp. MMS 540 la prés ence de importance of further research in this area for the fractions glycolipidiques également bioactives. Ces investigation of bioactive lipids. premiers travaux montrent ainsi toute l’importance de poursuivre les investigations dans ce domaine pour la recherche de lipides bioactifs.
Mots clés Key Words
champignons marins, OSMAC, approche marine fungi, OSMAC, Lipidomic approach, fatty lipidomique, acides gras, stérols, glycolipides, acids, sterols, glycolipids, biological activities, activités biologiques, déréplication dereplication
L’Université Bretagne Loire