ΔΘΝΗΚΟ ΚΑΗ ΚΑΠΟΓΗ΢ΣΡΗΑΚΟ ΠΑΝΔΠΗ΢ΣΖΜΗΟ ΑΘΖΝΩΝ

΢ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΩΝ ΔΠΗ΢ΣΖΜΩΝ

ΣΜΖΜΑ ΥΖΜΔΗΑ΢

ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΢ΠΟΤΓΧΝ «ΚΑΣΑΛΤ΢Ζ ΚΑΗ ΔΦΑΡΜΟΓΔ΢ ΣΖ΢»

ΔΡΔΤΝΖΣΗΚΖ ΔΡΓΑ΢ΗΑ ΓΗΠΛΧΜΑΣΟ΢ ΔΗΓΗΚΔΤ΢Ζ΢

Ομεηδναλαγωγηθά έλδπκα ωο πξόηππα εθαξκνγήο ηεο κεζόδνπ QSAR (Quantitative Structure-Activity relations)

ΠΑΝΑΓΗΧΣΑ ΢. ΣΕΑΝΖ ΜΖΥΑΝΗΚΟ΢ ΣΔΥΝΟΛΟΓΗΑ΢ ΠΔΣΡΔΛΑΗΟΤ ΚΑΗ ΦΤ΢ΗΚΟΤ ΑΔΡΗΟΤ

ΑΘΖΝΑ

ΝΟΔΜΒΡΗΟ΢ 2011

ΔΡΔΤΝΖΣΗΚΖ ΔΡΓΑ΢ΗΑ ΓΗΠΛΧΜΑΣΟ΢ ΔΗΓΗΚΔΤ΢Ζ΢

Ομεηδναλαγσγηθά έλδπκα σο πξφηππα ηεο εθαξκνγήο ηεο κεζφδνπ QSAR (Quantitative Structrure-Activity relations)

ΠΑΝΑΓΗΧΣΑ ΢. ΣΕΑΝΖ

Α.Μ.: 281604

ΔΠΗΒΛΔΠΧΝ ΚΑΘΖΓΖΣΖ΢: Ι. ΜΑΡΚΟΠΟΤΛΟ΢ , Αλαπιεξσηήο Καζεγεηήο ΔΚΠΑ

ΣΡΗΜΔΛΖ΢ ΔΞΔΣΑ΢ΣΗΚΖ ΔΠΗΣΡΟΠΖ

Η. ΜΑΡΚΟΠΟΤΛΟ΢ Αλαπιεξωηεο θαζεγεηήο, Σκήκα Υεκείαο, ΔΚΠΑ

Γ. ΥΑΣΕΖΝΗΚΟΛΑΟΤ Δπίθνπξνο Καζεγεηήο, Σκήκα Βηνινγίαο, ΔΚΠΑ

Π. ΠΑΡΑ΢ΚΔΤΟΠΟΤΛΟΤ Λέθηνξαο, Σκήκα Υεκείαο, ΔΚΠΑ

ΗΜΔΡΟΜΗΝΙΑ ΔΞΔΣΑ΢Η΢ 25/11/2011

2 ΠΔΡΗΛΖΦΖ

΢ε απηή ηε δηαηξηβή αξρηθά παξνπζηάδνληαη νη γεληθνί κεραληζκνί ελδπκηθήο θαηάιπζεο νη νπνίνη ζηε ζπλέρεηα εμεηδηθεχνληαη ζηνπο αληίζηνηρνπο κεραληζκνχο ησλ νμεηδνλαγσγηθψλ ζπζηεκάησλ ησλ θαηαιαζψλ θαη ππεξνμεηδαζψλ.

Σν έλδπκν ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish peroxidase–HRP) απνηειεί ην θεληξηθφ έλδπκν αλαθνξάο ησλ αλσηέξσ κεραληζκψλ θαηάιπζεο ζηνπο νπνίνπο βαζίδεηαη θαη ε κειέηε ησλ ζρέζεσλ δνκήο-δξαζηηθφηεηαο ησλ ζπζηεκάησλ απησλ κέζσ ηεο κεζνδνινγίαο QSAR.

Η εξγαζία νινθιεξψλεηαη κε ηελ αλάιπζε ησλ πεηξακαηηθψλ δεδνκέλσλ ηεο βηβιηνγξαθίαο πνπ αθνξνχλ ζηελ πξφβιεςε ησλ ηηκψλ θαη ησλ θηλεηηθψλ παξακέηξσλ δξάζεο ηεο HRP κέζσ QSAR ελψ εμάγνληαη ζπκπεξάζκαηα ηα νπνία απνδεηθλχνπλ ηφζν ηελ εθαξκνζηκφηεηα φζν θαη ηε ρξεζηκφηεηα ηεο πξνηεηλφκελεο κεζνδνινγίαο ζηα ζπζηήκαηα καο.

ΘΔΜΑΣΗΚΖ ΠΔΡΗΟΥΖ: Δλδπκηθή θαηάιπζε

ΛΔΞΔΗ΢ ΚΛΔΗΓΗΑ: βηνθαηάιπζε, έλδπκα, θαηαιάζεο, ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (HRP), ζρέζεηο δνκήο-δξαζηηθφηεηαο (QSAR)

3 ABSTRACT

In this essay we present the concept of enzymatic catalysis and the general methods for the investigation of this phenomenon. We concentrated on the studies of oxidoreductases and especially in catalases and peroxidases. The application of the Quantitative Structure Activity Relationships (QSAR) methodology in enzymatic catalysis is also studied.

The target enzyme is the horseradish peroxidase (HRP) and as substrates fifteen phenolic derivatives are used. The methodology presented correlates the enzymatic parameters km and kcat with molecular descriptors that give us a possible explanation of the enzymatic action.

SUBJECT AREA: enzymatic catalysis

KEYWORDS: biocatalysis, enzymes, catalases, horseradish peroxidase, QSAR

4

Αθιεπώνεηαι ζηην οικογένεια μος.

5 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ

ΘΔΧΡΖΣΗΚΟ ΜΔΡΟ΢ ...... 13

1. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 1 ...... 14

1.1 Γεληθά ...... 14

1.2 Βηνθαηάιπζε ...... 15

2. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 2 ΈΝΕΤΜΑ ...... 16

2.1 Γεληθά ...... 16

2.2 Μεραληζκφο ηεο ελδπκαηηθήο θαηάιπζεο ...... 17

2.3 Κηλεηηθή ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ ...... 18

2.3.1 Τπφζεζε Michaelis–Menten ...... 21

2.3.2 Τπφζεζε Briggs–Haldane ...... 23

2.3.3 ΢εκαζία ηεο ζηαζεξάο Michaelis–Menten (km) ...... 25

2.3.4 Γξαθηθή παξάζηαζε ησλ θηλεηηθψλ δεδνκέλσλ ...... 25

2.3.5 ΢πκπεξάζκαηα αμηνιφγεζεο ηεο εμίζσζεο Michaelis-Menten ...... 27

2.4 Αλαζηνιή ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ ...... 28

2.4.1 Αληηζηξεπηή αλαζηνιή ...... 29

2.4.1.1 ΢πλαγσληζηηθή αλαζηνιή ...... 29

2.4.1.2 Με ζπλαγσληζηηθή αλαζηνιή ...... 31

2.4.2 Με αληηζηξεπηή αλαζηνιή ...... 33

3. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 3 ΚΑΣΑΛΑ΢Δ΢ ...... 34

3.1 Δηζαγσγή...... 34

3.2 Καηεγνξίεο ελδχκσλ «θαηαιάζεο» ...... 35

3.3 Ο ξφινο ηεο θαηαιάζεο ...... 36

3.4 Κηλεηηθέο ...... 37

3.4.1 Η θαηαιπηηθή δηάβαζε ...... 37

3.4.2 Η ππεξνμεηδηθή δξαζηηθφηεηα ησλ θαηαιαζψλ ...... 41

6 3.5 Έιεγρνο απφ NADPH : Η "πξφζζεηε" δηάβαζε ...... 43

3.6 Η θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα ησλ θαηαιάζσλ–ππεξνμεηδαζψλ ...... 46

3.7 Μεραληζκφο ηεο θαηαιπηηθήο αληίδξαζεο ...... 48

3.7.1 ΢ρεκαηηζκφο ηεο έλσζεο Ι ...... 48

3.7.2 Αλαγσγή ηεο έλσζεο Ι ...... 52

4. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 4 Τπεξνμεηδάζεο ...... 55

4.1 Δηζαγσγή...... 55

4.2 Καηαζηάζεηο νμείδσζεο ηεο νηθνγέλεηαο ηεο ππεξνμεηδάζεο ...... 58

4.3 Καηαιπηηθή πεξηνρή ηεο νηθνγέλεηαο ησλ ππεξνμεηδαζψλ ...... 59

4.4 Βάζε δεδνκέλσλ ππεξνμεηδαζψλ (PeroxiBase) ...... 61

5. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 5 ΤΠΔΡΟΞΔΗΓΑ΢Ζ ΑΓΡΗΟΡΑΠΑΝΟΤ (Horseradish Peroxidase) 64

5.1 Δηζαγσγή...... 64

5.2 Πεξηγξαθή ηνπ ελδχκνπ ...... 66

5.2.1 Γεληθά ραξαθηεξηζηηθά ...... 66

5.2.2 Σξηζδηάζηαηε δνκή ...... 70

5.2.3 HRP θαη ηεο ππεξνηθνγέλεηαο θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ ...... 71

5.3 Μεραληζκφο δξάζεο ...... 72

5.3.1 Λεηηνπξγηθφο ξφινο ...... 72

5.3.2 Καηαιπηηθφο κεραληζκφο ...... 73

5.4 Σν δήηεκα ηνπ ηζνέλδπκνπ, ηεο ππεξνεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ θαη νη Arabidopsis ππεξνμεηδάζεο ...... 75

5.4.1 Η νηθνγέλεηα ηνπ ηζνέλδπκνπ ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ ...... 75

ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΟ ΜΔΡΟ΢ ...... 77

6. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 6 Πνζνηηθή θαη πνηνηηθή πεξηγξαθή ηεο ζπζρέηηζεο ηωλ δνκηθώλ ραξαθηεξηζηηθώλ ηωλ κνξίωλ κε ηελ ππό κειέηε δξαζηηθόηεηα/ηδηόηεηα...... 78

6.1 Δηζαγσγή...... 78

6.2 Μέζνδνο ...... 79

7 6.2.1 ΢ηάδην 1. Αλάπηπμε κνληέινπ πνζνηηθήο ζπζρέηηζεο δνκήο– δξαζηηθφηεηαο/ηδηνηήησλ ...... 79

6.2.2 ΢ηάδην 2. ΢ρεδηαζκφο λέσλ κνξίσλ ...... 81

6.2.3 ΢ηάδην 3. ΢χλζεζε θαη αμηνιφγεζε–Αλαηξνθνδφηεζε ηεο βάζεο δεδνκέλσλ ...... 82

6.3 Δπίιπζε πξνβιεκάησλ ...... 83

6.4 Δθαξκνγέο ηνπ κνληέινπ ή αλάπηπμε κνληέινπ QSAR ζηελ ππεξνμεηδάζε αξγηνξάπαλνπ ...... 84

6.4.1 Δηζαγσγή ...... 84

6.4.2 QSAR ζε βηνινγηθά κφξηα π. ρ. έλδπκα ...... 84

6.4.2.1 Πξνζδηνξηζκφο ηνπ km θαη kCAT ...... 87

6.4.2.2 ΢ρέζεηο κεηαμχ ηεο ζηαζεξάο αλαινγίαο ηεο Αληίδξαζεο θαη ησλ κνξηαθψλ δνκψλ ηνπ Τπνζηξψκαηνο ...... 87

6.4.2.3 Πνζνηηθή απφθιηζε απφ ην κνληέιν kCAT/EHOMO: Μνξηαθφο φγθνο (VM)...... 89

6.4.2.4 Πνζνηηθή απφθιηζε απφ ηελ ηάζε kCAT/EHOMO: ΢ρεκαηηζκφο δεζκνχ ελδχκνπ-ππνζηξψκαηνο...... 90

6.5 ΢πκπεξάζκαηα ...... 94

6.6 Γεληθά ζπκπεξάζκαηα ...... 95

7. Παξάξηεκα Η ...... 96

8. Παξάξηεκα ΗΗ ...... 97

9. ΠΗΝΑΚΑ΢ ΟΡΟΛΟΓΗΑ΢ ...... 98

10. ΢ΤΝΣΜΖ΢ΔΗ΢ – ΑΡΚΣΗΚΟΛΔΞΑ – ΑΚΡΧΝΤΜΗΑ ...... 99

11. ΑΝΑΦΟΡΔ΢ ...... 100

8 ΚΑΣΑΛΟΓΟ΢ ΢ΥΖΜΑΣΧΝ

΢ρήκα 1 : Δλδπκηθή κεηαηξνπή ηνπ ππνζηξώκαηνο S ζε πξνϊόλ Ρ...... 19

΢ρήκα 2 : Δπίδξαζε δηαθόξωλ αξρηθώλ ζπγθεληξώζεωλ ππνζηξώκαηνο ζηελ αξρηθή ηαρύηεηα ηεο αληίδξαζεο...... 20

΢ρήκα 3 : Κακπύιε ηωλ Lineweaver–Burk ή δηπιώλ αληίζηξνθωλ...... 26

΢ρήκα 4 : Κακπύιε ηωλ Eadie–Hofstee...... 26

΢ρήκα 5 : Κακπύιε ηνπ Hanes...... 27

΢ρήκα 6 : Κακπύιεο Lineweaver–Burk, Hanes θαη Δadie–Hofstee γηα ηε ζπλαγωληζηηθή αλαζηνιή. ΢πλερήο γξακκή ρωξίο αλαζηνιή. Γηαθεθνκκέλε κε αλαζηνιή...... 31

΢ρήκα 7 : Κακπύιεο Lineweaver–Burk, Hanes θαη Δadie–Hofstee γηα ηε κε ζπλαγωληζηηθή αλαζηνιή...... 33

΢ρήκα 8 : Ο κεραληζκόο ηωλ Bonnichsen, Chance θαη Theorell γηα ηελ κεηαηξνπή ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγόλνπ από ηελ θαηαιάζε. (A) Ο απιόο κεραληζκόο ηηη αληηζθαίξηζεο (ping-pong) (B) Σν αληηζηξεπηό ES (Fe -H2Ο2) θαη ηεηξαεδξηθά

ζύκπινθα (έλωζε Η–Ζ2Ο2) πνπ πξνζηίζεληαη ζηνλ κεραληζκό Α...... 38

΢ρήκα 9 : Σαμηλόκεζε ηωλ δνηώλ πδξνγόλνπ ηωλ θαηαιαζώλ...... 42

΢ρήκα 10 : Ο θαηαιπηηθόο θύθινο πεξηιακβάλεη ηελ έλωζε ΗΗ’ θαη ην NADPH...... 44

΢ρεκα 11 : Καηαιπηηθέο θαη ππεξνμεηδηθέο αληηδξάζεηο ελδύκωλ ηύπνπ Β. Ζ έλωζε Η θαίλεηαη ζαλ [Fe5+=O] γηαηί αληηπξνζωπεύεη είηε κηα π-ξίδα θαηηόληνο είηε κηα ελαιιαθηηθή δνκή ξίδαο...... 48

΢ρήκα 12 : Μεραληζκνί ηνπ ζρεκαηηζκνύ ηεο έλωζεο Η ζηηο θαηαιάζεο ηύπνπ Β (A): θαηαιάζε ηύπνπ Α (B) θαη ριωξνϋπεξνμεηδάζεο (Γ)...... 50

΢ρήκα 13 : Μεραληζκνί αλαγωγήο ηεο έλωζεο Η ηωλ θαηαιαζώλ ηύπνπ Β (A) θαηαιάζεο ηύπνπ Α (B) θαη ριωξνϋπεξνμεηδάζεο (Γ) ...... 54

΢ρήκα 14. Σξηζδηάζηαηε αλαπαξάζηαζε ηεο θξπζηαιιηθήο δνκήο κε αθηίλεο Υ ηεο ππεξνμεηδάζεο ηεο γινπηαζεηόιεο...... 57

΢ρήκα 15. ΢ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεο θπινγελεηηθήο ζρέζεο κεηαμύ ηωλ δηαθόξωλ νηθνγελεηώλ πξωηεΐλεο πνπ βξίζθεηαη ζηελ Βάζε δεδνκέλωλ (PeroxiBase)...... 63

9 ΢ρήκα 16 : Σν θπηό θαη νη ξίδεο ηνπ αγξνξάπαλνπ (horseradish)...... 65

΢ρήκα 17 : Σξηζδηάζηαηε αλαπαξάζηαζε ηεο δνκήο θξπζηάιιωλ κε αθηίλεο Υ ηεο ππεξνμεηδάζεο αγξηνξάπαλνπ (horseradish) ηζνελδύκνπ C (Brookhaven ένηαξη Κωδικόρ 1H5A). Ζ νκάδα αίκεο (κε ην θόθθηλν ρξώκα) βξίζθεηαη κεηαμύ ηωλ πεξηθεξηθώλ θαη ηωλ εγγύο ηνκέωλ, πνπ θαζέλα πεξηέρεη έλα άηνκν αζβεζηίνπ (Δκθαλίδεηαη ωο κπιε ζθαίξεο). Α-ειηθνεηδήο θαη β-θύιιωλ πεξηνρέο ηνπ ελδύκνπ εκθαλίδνληαη κε κνβ ρξώκα θαη θίηξηλν, αληίζηνηρα. Οη F΄ θαη F΄΄ α-έιηθεο εκθαλίδνληαη ζην θάηω ηεηαξηεκόξην ζηα δεμηά ηνπ κνξίνπ...... 69

΢ρήκα 18 : Βαζηθά ακηλνμέα ζηελ πεξηνρή ηνπ δεζκνύ ηεο αίκεο ηεο HRP C. Ζ νκάδα ηεο αίκεο θαη ην άηνκν ζηδήξνπ ηεο αίκεο εκθαλίδνληαη κε θόθθηλν ρξώκα, παξακέλνπλ θαηάινηπα ζηα άηνκα κε άιια ρξώκαηα. His170, ην θαηάινηπν ηεο εγγύο ηζηηδίλεο, είλαη ζπκπιεγκέλν κε ην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ ηεο αίκεο, ελώ ε αληίζηνηρε πεξηθεξηθή ζέζε ζύκπιεμεο πάλω από ην επίπεδν ηεο αίκεο είλαη θελή...... 70

΢ρήκα 19. Καηαιπηηθόο θύθινο ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αξγηνξάπαλνπ (HRP C) κε θεξξνπιηθό νμύ ωο αλαγωγηθό κέζν ζην ππόζηξωκα...... 73

΢ρήκα 20 : Ζ πεξηνρή δέζκεπζεο ηνπ θεξξνπιηθνύ νμέωο κε ηελ ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish). Ζ παξάζηαζε απηή έρεη ιεθζεί από ηελ θξπζηαιιηθή δνκή αθηίλωλ Υ ηνπ ηεηξαεδξηθνύ ζπκπιόθνπ ηνπ θεξξνπιηθνύ νμέωο (FA) θαη δεζκώλ θπαληδίνπ ζηελ HRP C. Ζ νκάδα ηεο αίκεο εκθαλίδεηαη κε θόθθηλν ρξώκα θαη ην θεξξνπιηθό νμύ, ν θπάλν ππνθαηαζηάηεο θαη ηα Arg38, His42 θαη His170 είλαη ηα άηνκα κε ππόινηπα ρξώκαηα...... 76

΢ρήκα 21. ΢ηαζεξέο ηαρύηεηαο ζε ζπλάξηεζε ηνπ EHOMO γηα 15 θαηλνιηθέο ρεκηθέο νπζίεο, νη γξακκέο ζθάικαηνο αληηπξνζωπεύνπλ ±1 SE...... 88

΢ρήκα 22. ΢πζρεηίζεηο κεηαμύ ηωλ κεηξνύκελωλ θαη ηωλ πξνβιεπόκωλ ηηκώλ ηνπ ln(kCAT) ρξεζηκνπνηώληαο ηελ εμίζωζε 2 γηα ηελ έλωζε Η (επάλω) θαη ηελ εμίζωζε 3 γηα ηελ έλωζε II (θάηω)...... 91

΢ρήκα 23. Γηαλνκή θνξηίνπ ζηα επηιεγκέλα ππνζύλνια ηωλ ελώζεωλ Η (αξηζηεξά) θαη ΗΗ (δεμηά). Με θόθθηλν θαίλεηαη ε αίκε, κε θίξηηλν θαίλεηαη ε αίκε πνπ δεπκεύεηαη ζηα άηνκα ηνπ νμπγόλνπ, ην κπιέ είλαη ηα άηνκα ηνπ ζηδήξνπ πνπ δεζκέπνληαη ζηα θαηάινηνπα ηζηηδίλεο 170 ή θαη 42...... 96

10

ΚΑΣΑΛΟΓΟ΢ ΠΗΝΑΚΧΝ

Πίλαθαο 1. Αλζξψπηλε νηθνγέλεηα ππεξνμεηδάζεο: πξσηετληθά ραξαθηεξηζηηθά ...... 60

Πίλαθαο 2 : Η δηεζλήο έλσζε ηεο βηνρεκείαο θαηάηαμε ησλ ππεξνμεηδαζψλ ...... 62

Πίλαθαο 3. Αλαηνκία ηεο ππεξνμεηδάζεο. Οξηζκέλεο βαζηθά δηαξζξσηηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ ηζνελδχκνπ C ηεο ππεξνμεηδάζεο αγξηνξάπαλνπ (horseradish) (HRP C) ...... 67

Πίλαθαο 4 : Μεηξνχκελεο ηηκέο ln(kCAT) θαη KM γηα 15 Φαηλφιεο νηζηξνγφλσλ (΢ηήιεο 1- 3) θαη Πξνζνκνίσζε–Δθηηκψκελε απφζηαζε δεζκνχ (΢ηήιεο 4-7)a ...... 88

Πίλαθαο 5 : Παξάκεηξνη ηνπ ππνζηξψκαηνο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηηο QSAR ζρέζεηο,

ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηνπ κνξηαθνχ φγθνπ VM, ην αηνκηθφ θνξηίν ηνπ νμπγφλνπ ηεο

θαηλφιεο, ην ΔHOMO θαη ην ELUMO...... 97

Πίλαθαο 6 :Πίλαθαο νξνινγίαο κε ηηο αληηζηνηρίζεηο ησλ ειιεληθψλ θαη μελφγισζζσλ φξσλ ...... 98

11 ΠΡΟΛΟΓΟ΢

Η παξνχζα εξεπλεηηθή εξγαζία εθπνλήζεθε ζην εξγαζηήξην Αλφξγαλεο Υεκείαο ηνπ Δζληθνχ θαη Καπνδηζηξηαθνχ Παλεπηζηεκίνπ Αζελψλ θαζψο θαη ζην εξγαζηήξην Βνηαληθήο ηνπ ηκήκαηνο Βηνινγίαο ηνπ Δζληθνχ θαη Καπνδηζηξηαθνχ Παλεπηζηεκίνπ Αζελσλ. Γηα ηε δηεθπεξαίσζε ηεο παξνχζαο εξεπλεηηθήο εξγαζίαο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ:

Σνλ επηβιέπνληα, Αλαπιεξσηή Καζεγεηή θ. Ισάλλε Μαξθφπνπιν, γηα ηελ αλάζεζε ηνπ ζέκαηνο ηεο εξεπλεηηθήο εξγαζίαο, ηηο πνιχηηκεο γλψζεηο θαη ζπκβνπιέο πνπ κνπ κεηέδσζε.

Σνλ Δπίθνπξν Καζεγεηή ηνπ ηκήκαηνο Βηνινγίαο θ. Γεκήηξην Υαηδεληθνιάνπ, γηα ηελ ζπλεξγαζία, ηηο πνιχηηκεο γλψζεηο θαη ζπκβνπιέο ηνπ, θαζψο θαη γηα ηε ζπκβνιή ηνπ ζηε δηεθπεξαίσζε ηεο εξεπλεηηθήο εξγαζίαο.

Σε Λέθηνξα ηνπ ηκήκαηνο Υεκείαο θ. Παηξίλα Παξαζθεπνπνχινπ γηα ηηο ζεκαληηθέο παξαηεξήζεηο ηεο θαζψο θαη γηα ηελ παξνπζία ηεο ζηελ ηξηκειή εμεηαζηηθή επηηξνπή.

Σε Dr Γεσξγία Μειαγξάθε, γηα ηελ ακέξηζηε βνήζεηα πνπ κνπ πξφζθεξε. Υσξίο ηελ παξνπζία ηεο δελ ζα ήηαλ δπλαηή ε νινθιήξσζε ηεο εξεπλεηηθήο εξγαζίαο.

Όινπο ηνπο ζπλαδέιθνπο κεηαπηπρηαθνχο θαη δηδαθηνξηθνχο θνηηεηέο ηφζν γηα ηε βνήζεηά ηνπο ζε επηζηεκνληθά ζέκαηα, φζν θαη γηα ηηο φκνξθεο ζηηγκέο πνπ κνπ ράξηζαλ ζηα ρξφληα ηεο δηπισκαηηθήο εξγαζίαο ηελ Φσηεηλή Αγξαθηψηε θαη ηνλ Ισάλλε ΢ηακαηφπνπιν.

Γε ζα κπνξνχζα λα παξαιείςσ ηνπο θίινπο κνπ γηα ηε κεγάιε ππνκνλή θαη ζπκπαξάζηαζε πνπ επέδεημαλ.

Σέινο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηελ νηθνγέλεηα κνπ, γηα ηελ εζηθή ππνζηήξημε θαη αλνρή πνπ επέδεημαλ θαη εμαθνινπζνχλ λα επηδεηθλχνπλ.

12

ΘΔΧΡΖΣΗΚΟ ΜΔΡΟ΢

13 1. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 1 ΔΗ΢ΑΓΩΓΖ ΢ΣΖ ΚΑΣΑΛΤ΢Ζ

1.1 Γεληθά

Η θαηάιπζε είλαη ην θιεηδί ηεο απνδνηηθφηεηαο ησλ ρεκηθψλ βηνκεραληψλ θαη παίδεη θαζνξηζηηθφ ξφιν ζηελ αλάπηπμε λέσλ κεζφδσλ παξαγσγήο. Μεξηθά απφ ηα πξνηεξήκαηα ηεο ρξήζεο ησλ θαηαιπηηθψλ δηεξγαζηψλ:

 Δίλαη ζχκθσλε κε ηηο αξρέο ηηο πξάζηλεο–βηψζηκεο ρεκείαο.

 Δμνηθνλνκεί ελέξγεηα ιφγσ ηεο απμεκέλεο δξαζηηθφηεηαο ησλ ζχγρξνλσλ θαηαιπηηθψλ ζπζηεκάησλ πνπ ζπκβάινπλ ζηελ δηαηήξεζε ησλ απνζεκάησλ ελέξγεηαο.

 Βαζίδεηαη ζε ελαιιαθηηθέο πνξείεο απφ νηθνλνκηθφηεξεο βαζηθέο ρεκηθέο/πξψηεο χιεο.

 Έρεη απμεκέλε απφδνζε θαη ρακειφηεξν θφζηνο παξαγσγήο ζηα πξντφληα ηεο ρεκηθήο επεμεξγαζίαο ηνπ πεηξειαίνπ, ζηα ρεκηθά κεγάιεο θαη κεζαίαο παξαγσγήο πςειήο πξνζηηζέκελεο αμίαο, ζηα θαξκαθεπηηθά πιηθά θαη άιια εμεηδηθεπκέλα ρεκηθά πξντφληα.

 ΢ρεκαηίδεη ιηγφηεξα παξαπξντφληα ιφγσ ηεο απμεκέλεο ρεκηθήο-, ηνπν-, κνξθν-, θαη ζηέξεν–εθιεθηηθφηεηαο ησλ θαηαιπηψλ ζπλδπάδνληαο ζεκαληηθά νηθνλνκηθά θαη πεξηβαιινληηθά πιενλεθηήκαηα.

 ΢πρλά ρξεζηκνπνηεί έλα κηθξφηεξν αξηζκφ ζηαδίσλ νιηθήο ζχλζεζεο ζε ζχγθξηζε κε ζπκβαηηθέο ζηνηρεηνκεηξηθέο ζπλζεηηθέο πνξείεο.

 Παξάγεη ηειηθά πξντφληα κε πξνθαζνξηζκέλεο νπηηθέο, βηνινγηθέο, κεραληθέο θ.ι.η. ηδηφηεηεο ζηελ αζχκκεηξε θαηάιπζε.

 Μεηψλεη ή δελ παξάγεη θαζφινπ αλφξγαλα άιαηα.

 Απνθεχγεη ηελ ρξήζε ηνμηθψλ αληηδξαζηεξίσλ θαη δηαιπηψλ.

14 Η θαηάιπζε ρσξίδεηαη ζε ηξείο θαηεγνξίεο:

1. ΢ηελ νκνγελή θαηάιπζε πνπ ην θαηαιπηηθφ ζχζηεκα, ηα αληηδξαζηήξηα θαη ν δηαιχηεο βξίζθνληαη ζηελ ίδηα θάζε, ζπλήζσο ζηελ πγξή, ρσξίο λα απνθιείνληαη πεξηπηψζεηο φπνπ έλα ή θαη πεξηζζφηεξα αληηδξαζηήξηα λα βξίζθνληαη ζηελ αέξηα θάζε.

2. ΢ηελ εηεξνγελή θαηάιπζε έρνπκε πεξηζζφηεξεο απφ κία θάζεηο φπνπ ζπλήζσο ζηεξενί θαηαιχηεο θαη ηα αληηδξαζηήξηα βξίζθνληαη ζηελ πγξή, ζηελ αέξηα ή πγξή κε αέξηα θάζε.

3. ΢ηελ ελδπκηθή θαηάιπζε ηα έλδπκα πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη σο θαηαιχηεο κπνξεί λα είλαη ζε κία θάζε κε ηνλ δηαιχηε θαη ηηο αληηδξψζεο νπζίεο ή θαη ζε δηαθνξεηηθέο θάζεηο.

΢ήκεξα, ην 85% πεξίπνπ ηεο βηνκεραληθήο θαηάιπζεο ππνινγίδεηαη φηη ζπληειείηαη κε εηεξνγελή θαη ην 15% κε νκνγελή θαηαιπηηθά ζπζηήκαηα.1

1.2 Βηνθαηάιπζε

Βηνθαηάιπζε (biocatalysis) είλαη ε κεηαβνιηθή θαηαιπηηθή πνξεία κε ρξήζε ελδχκσλ θαη ζθνπφ ηε παξαζθεπή ελφο επηζπκεηνχ πξντφληνο.

Σα πιενλεθηήκαηα ηεο βηνθαηάιπζεο ζε ζρέζε κε ηε ρεκηθή είλαη φηη νη αληηδξάζεηο είλαη ζηεξενεθιεθηηθέο θαη κπνξνχλ λα πξαγκαηνπνηεζνχλ ζε πεξηβαιινληηθή ζεξκνθξαζία θαη αηκνζθαηξηθή πίεζε. Απηφ ειαρηζηνπνηεί ηα πξνβιήκαηα ηνπ ηζνκεξηζκνχ, ξαθεκνπνίεζεο, επηκεξηζκνχ θαη αλαδηνξγάλσζεο πνπ κπνξνχλ λα εκθαληζηνχλ θαηά ηε δηάξθεηα ησλ ρεκηθψλ δηαδηθαζηψλ. Οη βηνθαηαιπηηθέο δηαδηθαζίεο γεληθά πξαγκαηνπνηνχληαη ζε πδάηηλν δηάιπκα θαη έηζη εθαξκφδεηαη ε πξάζηλε ρεκεία. Δπηπιένλ, κηθξνβηαθά θχηηαξα ή έλδπκα παξαγφκελα απφ απηφ κπνξνχλ λα αθηλεηνπνηεζνχλ θαη λα επαλαρξεζηκνπνηεζνχλ γηα πνιινχο θχθινπο.2

15 2. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 2 ΈΝΕΤΜΑ

2.1 Γεληθά

Έλα απφ ηα κνλαδηθά ραξαθηεξηζηηθά γλσξίζκαηα ηνπ θπηηάξνπ είλαη ε ηθαλφηεηά ηνπ λα πξαγκαηνπνηεί κε ηαρχηεηα θαη αμηνζεκείσηε εμεηδίθεπζε πνιχπινθεο αληηδξάζεηο. Οη ππεχζπλνη παξάγνληεο γηα ηηο κεηαηξνπέο απηέο απνηεινχλ κηα νκάδα πξσηετλψλ πνπ νλνκάδνληαη έλδπκα, φπνπ θαζέλα είλαη πξννξηζκέλν λα θαηαιχεη κηα εηδηθή αληίδξαζε. Σν πξψην έλδπκν πνπ απνκνλψζεθε ζε θαζαξή θξπζηαιιηθή κνξθή ήηαλ ε νπξεάζε, ε νπνία θαηαιχεη ηελ πδξφιπζε ηεο νπξίαο ζε ακκσλία θαη δηνμείδην ηνπ άλζξαθα.

Κνηλφ γλψξηζκα φισλ ησλ ελδχκσλ, πνπ απνηειεί θαη ηε βαζηθή δηαθνξά ηνπο απφ ηηο άιιεο πξσηεΐλεο είλαη φηη απηά είλαη θαηαιχηεο.

΢ηηο αληηδξάζεηο πνπ θαηαιχνληαη απφ έλδπκα, ηα αληηδξψληα αλαθέξνληαη σο ππφζηξσκα (substrate). Σα έλδπκα θαη ην ππφζηξσκα ζπλδπάδνληαη γηα λα ζρεκαηίζνπλ έλα ελεξγνπνηεκέλν ζχκπινθν κε ην ραξαθηεξηζηηθφ φλνκα ζχκπινθν «έλδπκν–ππφζηξσκα» (ES). Σν ζχκπινθν απηφ πθίζηαηαη αθνινχζσο κηα ρεκηθή κεηαβνιή, κε απνηέιεζκα ηνλ ζρεκαηηζκφ ησλ πξντφλησλ (Ρ) θαη ηελ αλαγέλλεζε ηνπ ελδχκνπ.

Υαξαθηεξηζηηθέο ηδηφηεηεο ησλ ελδχκσλ είλαη ε ηεξάζηηα θαηαιπηηθή ηνπο δχλακε, ε ηθαλφηεηά ηνπο λα δηαθξίλνπλ κφξηα κε παξφκνηεο ηδηφηεηεο, λα θαηεπζχλνπλ εμεηδηθεπκέλεο αληηδξάζεηο, θαζψο επίζεο θαη ε δπλαηφηεηα ξπζκίζεσο ηεο δξάζεσο ηνπο.3

16 2.2 Μεραληζκόο ηεο ελδπκαηηθήο θαηάιπζεο

Ο ζρεκαηηζκφο ηνπ ζχκπινθνπ «έλδπκν–ππφζηξσκα», είλαη ην πξψην θαη πιένλ νπζηαζηηθφ βήκα ζηελ ελδπκαηηθή θαηάιπζε. Όια ηα έλδπκα νπζηαζηηθά είλαη ζθαηξνεηδείο πξσηεΐλεο, πνπ αθφκε θαη ηα πην απιά έρνπλ κνξηαθά βάξε πνπ θπκαίλνληαη απφ 12.000 έσο 40.000, πεξηιακβάλνπλ δειαδή 100 έσο 400 ακηλνμέα. Λφγσ ηνπ κεγάινπ κεγέζνπο ησλ ελδχκσλ ζε ζχγθξηζε κε ηα κφξηα ησλ αληηδξάζεσλ ηηο νπνίεο θαηαιχνπλ έρεη πξνηαζεί φηη ην ππφζηξσκα θαη ην έλδπκν αιιειεπηδξνχλ κφλν ζε κηα πεξηνξηζκέλε πεξηνρή ηεο επηθάλεηαο ηνπ ελδχκνπ, ε νπνία θαιείηαη ελεξγφο ζέζε (active site).

΢ήκεξα έλαο κεγάινο αξηζκφο ελδχκσλ έρεη απνκνλσζεί ζε θαζαξή θξπζηαιιηθή θαηάζηαζε θαη έρεη κειεηεζεί ε δνκή ηνπο κε θξπζηαιινγξαθία αθηηλψλ Υ. ΢ηηο πεξηπηψζεηο πνπ ε ηξηηνηαγήο δνκή ηνπ ελδχκνπ είλαη γλσζηή θαη νη αιιειεπηδξάζεηο ελδχκνπ–ππνζηξψκαηνο έρνπλ κειεηεζεί, ε ελεξγφο ζέζε είλαη κηα πεξηνξηζκέλε πεξηνρή ηεο επηθάλεηαο ηνπ ελδχκνπ κε κνλαδηθή ρσξνδηάηαμε ησλ παξάπιεπξσλ αιπζίδσλ ησλ ακηλνμέσλ.

Ο Emil Fisher παξνκνίαζε ηελ πξφζδεζε ελδχκνπ θαη ππνζηξψκαηνο κε ην πξφηππν θιεηδαξηάο θαη θιεηδηνχ, ζχκθσλα κε ην νπνίν ην ππφζηξσκα θαη ην έλδπκν έρνπλ ζπκπιεξσκαηηθά ζρήκαηα θαη εθαξκφδνπλ πιήξσο κεηαμχ ηνπο.

Οη νκάδεο ζηελ επηθάλεηα ηνπ ελδχκνπ, νη νπνίεο κεηέρνπλ ζηελ πξφζδεζε ελδχκνπ θαη ππνζηξψκαηνο γηα ην ζρεκαηηζκφ ηνπ ζπκπιφθνπ νλνκάδνληαη πξνζδέλνπζεο νκάδεο (binding groups).

Όηαλ έλα κφξην ηνπ ππνζηξψκαηνο έρεη αλαγλσξηζηεί θαη πξνζδεζεί ζηελ ελεξγφ ζέζε, νη νπνίεο ιακβάλνπλ κέξνο ζην ζρεκαηηζκφ θαη ζράζηκν ησλ ρεκηθψλ δεζκψλ, νλνκάδνληαη θαηαιπηηθέο νκάδεο (catalytic groups). Με απηή ηελ έλλνηα, ε ελεξγφο ζέζε ελφο ελδχκνπ απνηειεί έλαλ κνλαδηθφ ζπλδπαζκφ απφ πξνζδέλνπζεο θαη θαηαιπηηθέο νκάδεο.4

17 2.3 Κηλεηηθή ελδπκηθώλ αληηδξάζεωλ

Οη θηλεηηθέο κειέηεο ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ καο δίλνπλ πιεξνθνξίεο γηα ην είδνο ηεο αληίδξαζεο, ηελ εμεηδίθεπζε ηνπ ελδχκνπ θαη πνιιέο άιιεο παξακέηξνπο πνπ ραξαθηεξίδνπλ ηηο θπζηθέο ηδηφηεηεο ησλ ελδχκσλ. Οη πξαθηηθέο εθαξκνγέο απφ ηελ θηλεηηθή κειέηε ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ είλαη πάξα πνιιέο.

Γεληθά, φηαλ κηα αληίδξαζε γίλεηαη ρσξίο αιιαγή ηνπ φγθνπ ηνπ ζπζηήκαηνο, ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο ηζνχηαη κε ηε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ αληηδξψληνο ή ηνπ πξντφληνο ζε ζρέζε κε ηνλ ρξφλν.

Γηα αληίδξαζε π. ρ. ηνπ ηχπνπ:

Α + Β → 3C

u = - d[A]/dt= -1/2 d[B]/dt=1/3d[C]/dt

Οη αληηδξάζεηο πνπ γίλνληαη ζε έλα ζηάδην θαινχληαη ζηνηρεηψδεηο (elementary) θαη ε ηαρχηεηα εμαξηάηαη απφ ηε ζπγθέληξσζε ελφο ή πεξηζζνηέξσλ αληηδξψλησλ. Η ζρέζε κεηαμχ ηεο ηαρχηεηαο θαη ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ αληηδξψλησλ νξίδεη ηελ ηάμε ηεο αληίδξαζεο.

Όπσο είλαη γλσζηφ γηα ηελ αληίδξαζε ηχπνπ Α → Ρ ε ηαρχηεηα είλαη απεπζείαο αλάινγε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ Α θαη ε αληίδξαζε είλαη πξψηεο ηάμεο. Η ζηαζεξά αλαινγίαο είλαη γλσζηή ζαλ ζηαζεξά ηαρχηεηαο (rate constant k1):

u = k1[A]

Η παξαπάλσ εμίζσζε ζπζρεηίδεη ηελ ηαρχηεηα κηαο αληίδξαζεο κε ηε ζπγθέληξσζε ησλ αληηδξψλησλ. Ο ρξφλνο πνπ απαηηείηαη γηα λα αληηδξάζεη ε

κηζή πνζφηεηα Α είλαη γλσζηφο ζαλ ρξφλνο εκηδσήο t1/2.

18 Γηα αληηδξάζεηο πξψηεο ηάμεο t1/2 = 0,693/k1 θαη είλαη αλεμάξηεηνο ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ αληηδξψλησλ.

Γηα αληίδξαζε ηεο κνξθήο : A + B → P

ε ηαρχηεηα u, εμαξηάηαη απφ ηηο ζπγθεληξψζεηο ησλ Α θαη Β δίλεηαη απφ ηελ εμίζσζε:

1 1 u = k2[A] [B]

k2, ζηαζεξά ηαρχηεηαο αληίδξαζεο δεχηεξεο ηάμεο.

΢ην ζεκείν απηφ ζα πξέπεη λα ζπκίζνπκε θαη ηηο αληηδξάζεηο κεδεληθήο ηάμεο (zero order), γηα ηηο νπνίεο ε ηαρχηεηα είλαη αλεμάξηεηε ηεο ζπγθέληξσζεο

ησλ αληηδξψλησλ (u = k0).

Γεληθά αλ παξαθνινπζήζνπκε ηελ εκθάληζε ησλ πξντφλησλ ή ηελ εμαθάληζε ηνπ ππνζηξψκαηνο, ζε κηα ελδπκηθή αληίδξαζε κε ζηνηρεηνκεηξία 1:1, ζε ζπλάξηεζε κε ην ρξφλν, ζα πάξνπκε ηελ θακπχιε ηνπ παξαθάησ ζρήκαηνο.

΢ρήκα 1 : Δλδπκηθή κεηαηξνπή ηνπ ππνζηξώκαηνο S ζε πξνϊόλ Ρ.

Σν απνηέιεζκα ηεο επίδξαζεο δηαθφξσλ αξρηθψλ ζπγθεληξψζεσλ ηνπ ππνζηξψκαηνο ζηελ αξρηθή ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο πξννξίδεηαη αλ δηεμάγνπκε κηα ζεηξά πεηξακάησλ θαη θάζε θνξά θάλνπκε γξαθηθέο παξαζηάζεηο φπσο εθείλε ηνπ πξνεγνχκελνπ ζρήκαηνο. ΢ηε ζπλέρεηα αλ θάλνπκε γξαθηθή παξάζηαζε ηεο u ζπλαξηήζεη ηεο ζπγθέληξσζεο [S] ζα πάξνπκε ηελ θακπχιε ηνπ αθφινπζνπ ζρήκαηνο.

19

΢ρήκα 2 : Δπίδξαζε δηαθόξωλ αξρηθώλ ζπγθεληξώζεωλ ππνζηξώκαηνο ζηελ αξρηθή ηαρύηεηα ηεο αληίδξαζεο.

Απφ ηελ θακπχιε ηνπ ζρήκαηνο 2, θαίλεηαη φηη, γηα αληηδξάζεηο φπνπ νη αξρηθέο ζπγθεληξψζεηο ηνπ ππνζηξψκαηνο είλαη κηθξέο, ε ηαρχηεηα είλαη απ’ επζείαο αλάινγε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ ππνζηξψκαηνο. Η αληίδξαζε είλαη πξψηεο ηάμεο. Όζν, φκσο, απμάλεη ε ζπγθέληξσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο γίλεηαη αλεμάξηεηε ηεο ζπγθέληξσζεο, δειαδή κεδεληθήο ηάμεο.

Σν 1902 ν Henri γηα λα εμεγήζεη ηελ παξαπάλσ πεηξακαηηθή θακπχιε

πξφηεηλε ηελ εμίζσζε: u = umax [S]/km + [S]

Όπνπ umax, km είλαη θηλεηηθέο παξάκεηξνη πνπ έπξεπε λα πξνζδηνξηζηνχλ πεηξακαηηθά.

Σελ ίδηα ρξνληά ν Brown δέρηεθε ην ζρεκαηηζκφ ζπκπιφθνπ ελδχκνπ– ππνζηξψκαηνο. Ο κεραληζκφο πνπ πξνηάζεθε γηα κηα ελδπκηθή αληίδξαζε κε έλα ππφζηξσκα θαη έλα έλδπκν είλαη ν αθφινπζνο:

To 1913 νη Michaelis–Menten γηα λα εμεγήζνπλ ηελ παξαπάλσ εμίζσζε θαη λα ηελ παξάγνπλ έθαλαλ ηελ αθφινπζε παξαδνρή. Σα Δ, S θαη ES έξρνληαη

20 γξήγνξα ζε ηζνξξνπία, ε δε ηαρχηεηα ζρεκαηηζκνχ ηνπ ES είλαη κεγαιχηεξε απφ φηη ε δηάζπαζε ηνπ ζε πξντφληα (αξρή ηεο γξήγνξεο δηάζπαζεο).

Σν βξαδχ ζηάδην είλαη απηφ πνπ θαζνξίδεη ηε ηαρχηεηα ηεο

αληίδξαζεο, ελψ k2 είλαη ε ζηαζεξά θαηάιπζεο.

Απηή ε παξαδνρή ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο ζηελ εηεξνγελή θαηάιπζε, γηα ηελ εχξεζε ησλ θηλεηηθψλ παξακέηξσλ.

Σέινο, ην 1925 νη Brings θαη Haldane έθαλαλ ηελ παξαδνρή φηη ε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ ES ζε ζρέζε κε ην ρξφλν είλαη ακειεηέα, d[ES]/dt = 0.

Απηή είλαη γλσζηή ζαλ ππφζεζε ςεπδνζηάζηκεο θαηάζηαζεο θαη ρξεζηκνπνηείηαη επίζεο γηα ηελ εχξεζε ηεο ηαρχηεηαο αληηδξάζεσλ ζηελ εηεξνγελή θαηάιπζε.5

2.3.1 Τπόζεζε Michaelis–Menten 5

΢χκθσλα κε ηε παξαδνρή πνπ έθαλαλ νη Michaelis–Menten , γηα κηα ελδπκηθή αληίδξαζε:

ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο ζε φινπο ηνπο ρξφλνπο ζα είλαη:

u = k2[ES] (1)

φπνπ k1, k-1, k2 νη ζηαζεξέο ηαρχηεηαο ησλ αληίζηνηρσλ αληηδξάζεσλ. Ο ιφγνο k-1/k1 = Κs (Ks, ζηαζεξά δηάζπαζεο ηνπ ζπκπιφθνπ ES). Η ζηαζεξά k2 ιέγεηαη θαη ζηαζεξά θαηάιπζεο. Δπηπιένλ

21 [Δ]νι = [Δ] + [ES] (2)

Απφ ηηο (1) θαη (2) κε δηαίξεζε παίξλνπκε:

Δπεηδή έρνπκε δερηεί ηζνξξνπία κεηαμχ Δ, S θαη ES ε ζπγθέληξσζε ηνπ ES κπνξεί λα εθθξαζηεί ζπλαξηήζεη ησλ Δ θαη S :

Αλ ζηελ εμίζσζε (3) αληηθαηαζηήζνπκε ην [ES] κε ηελ (5) πξνθχπηεη:

Αθνχ ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο δίδεηαη απφ ηελ u=k2[ES], ηφηε k2[E]oι=umax δειαδή πεηπραίλνπκε κέγηζηε ηαρχηεηα φηαλ φιν ην έλδπκν βξίζθεηαη κε ηε κνξθή ζπκπιφθνπ ES νπφηε :

22 2.3.2 Τπόζεζε Briggs–Haldane 5

Αλ ε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ ζπκπιφθνπ ES ζε ζρέζε κε ην ρξφλν είλαη κεδέλ ηφηε ε ζπγθέληξσζε ES είλαη ζηαζεξή.

Γηα ηελ ηαρχηεηα ζρεκαηηζκνχ ηνπ ζπκπιφθνπ ES έρνπκε:

uf = k1[S]{[E] – [ES]} (9)

Όπνπ ε [Δ]–[ES] ε ζπγθέληξσζε ηνπ ελδχκνπ πνπ είλαη ειεχζεξν. Όπσο θαίλεηαη απφ ηελ παξαπάλσ εμίζσζε, ε ηαρχηεηα ζρεκαηηζκνχ ηνπ ζπκπιφθνπ είλαη αλάινγε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ηνπ αδέζκεπηνπ ελδχκνπ.

Η ηαρχηεηα δηάζπαζεο ή εμαθάληζεο ηνπ ζπκπιφθνπ ES δίλεηαη απφ ηε ζρέζε

ud = k-1[ES] + k2[ES] (10)

Γειαδή ην ζχκπινθν ES κπνξεί λα εμαθαληζηεί γηα λα δψζεη ηα αληηδξψληα

(k-1) ή λα δψζεη ηα πξντφληα (k2).

Αθνχ ζεσξήζνπκε φηη ε ζπγθέληξσζε ηνπ ES είλαη ζηαζεξή πξέπεη ε ηαρχηεηα ζρεκαηηζκνχ ηνπ λα είλαη ίζε κε ηελ ηαρχηεηα εμαθάληζεο ηνπ. Οπφηε απφ ηηο (10) θαη (11) έρνπκε:

k1[S]{[E] – [ES]} = k-1[ES] + k2[ES] (11)

Καη ηξνπνπνηψληαο ηελ (11) :

23

Δπεηδή δελ είλαη δπλαηφλ λα κεηξήζνπκε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ ζπκπιφθνπ ES,

γηα λα πξνζδηνξίζνπκε ηελ km ζα πξέπεη λα παξάγνπκε κηα εμίζσζε πνπ λα

ζπζρεηίδεη ηελ km κε ηηο ζπγθεληξψζεηο ησλ Δ θαη S πνπ κεηξψληαη εχθνια.

Γλσξίδνληαο φηη ε ηαρχηεηα ηεο ελδπκηθήο αληίδξαζεο ζε φιε ηε ρξνληθή

δηάξθεηα είλαη u=k2[ES] θαη ιακβάλνληαο ππφςε φηη γηα πνιχ κεγάιεο ζπγθεληξψζεηο ππνζηξψκαηνο ζε ζρέζε κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ ελδχκνπ, φιν ην έλδπκν είλαη κε ηε κνξθή ηνπ ES, ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο ζα είλαη:

umax=k2[E]

Απφ ηηο (1) θαη (13) πξνθχπηεη:

Αλ ζηελ εμίζσζε (13) αληηθαηαζηήζνπκε ην [ES] κε απηφ ηεο εμίζσζεο (14) πξνθχπηεη ε εμίζσζε (15) ε γλσζηή θαη σο εμίζσζε Michaelis–Menten :

24 2.3.3 ΢εκαζία ηεο ζηαζεξάο Michaelis–Menten (km)

Αλ ζηελ εμίζσζε Michaelis–Menten ζέζνπκε u=umax/2, πξνθχπηεη [S]=km θαη ε ζηαζεξά Michaelis–Menten νξίδεηαη ζαλ ε ζπγθέληξσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο

φηαλ ε ηαρχηεηα είλαη ε κηζή ηεο κέγηζηεο. Δπηπιένλ φηαλ [S]=km, ην έλδπκν

είλαη κηζφ θνξεζκέλν. Η km είλαη κηα ζπνπδαία θηλεηηθή παξάκεηξνο πνπ ε ηηκή ηεο ραξαθηεξίδεη ηελ εμεηδίθεπζε ηνπ ελδχκνπ γηα έλα δεδνκέλν

ππφζηξσκα. Μεγάιε ηηκή ηνπ km δειψλεη κηθξφ βαζκφ ζπγγέλεηαο ηνπ ελδχκνπ γηα ην δεδνκέλν ππφζηξσκα θαη αληίζηξνθα. 5

2.3.4 Γξαθηθή παξάζηαζε ηωλ θηλεηηθώλ δεδνκέλωλ

Απφ ην 1913 θαη κεηά έγηλαλ πνιιέο πξνζπάζεηεο γηα λα παξαζηαζεί γξαθηθά ε εμίζσζε Michaelis–Menten.

΢ήκεξα ρξεζηκνπνηνχληαη ηξεηο θπξίσο γξακκηθνί κεηαζρεκαηηζκνί απηήο, ησλ α) Lineweaver–Burk, β) Eadie–Hofstee θαη ηνπ γ) Hanes. Η θακπχιε ησλ Lineweaver–Burk ή δηπιψλ αληίζηξνθσλ ιακβάλεηαη αλ πάξνπκε ηελ αληίζηξνθε εμίζσζε Michaelis–Menten :

θαη κε αλαζρεκαηηζκφ :

Η εμίζσζε (17) είλαη ηνπ ηχπνπ y = ax + b. Γξαθηθή αλαπαξάζηαζε ηνπ 1/u

έλαληη ηνπ 1/[S] δίλεη επζεία γξακκή κε θιίζε km/umax.

25 Η εμίζσζε ησλ Lineweaver–Burk έρεη ην κεηνλέθηεκα φηη ην παξακηθξφ πεηξακαηηθφ ζθάικα κπνξεί λα νδεγήζεη θαηά ην γξαθηθφ πξνζδηνξηζκφ ζε

πνιχ εζθαικέλε ηηκή ησλ km θαη umax αληίζηνηρα.

΢ρήκα 3 : Κακπύιε ηωλ Lineweaver–Burk ή δηπιώλ αληίζηξνθωλ.

Η γξαθηθή παξάζηαζε πνπ ρξεζηκνπνηείηαη θπξίσο είλαη ησλ Eadie–Hofstee (ζρήκα 4) θαη δίλεηαη απφ ηελ εμίζσζε:

΢ρήκα 4 : Κακπύιε ηωλ Eadie–Hofstee.

26 Η γξαθηθή παξάζηαζε ηνπ Hanes, [S]/u ζπλαξηήζεη ηνπ [S], εθφζνλ ζηηο πεξηπηψζεηο πνπ ε εμίζσζε Michaelis–Menten εθαξκφδεηαη, ζα δψζεη επζεία γξακκή (ζρήκα 5)5

΢ρήκα 5 : Κακπύιε ηνπ Hanes.

2.3.5 ΢πκπεξάζκαηα αμηνιόγεζεο ηεο εμίζωζεο Michaelis-Menten

Οη ηηκέο ησλ θηλεηηθψλ παξακέηξσλ ηεο εμίζσζεο Michaelis–Menten, km κπνξνχλ λα πξνζδηνξηζηνχλ:

1. Απφ κηα ζεηξά πεηξακάησλ (αζπλερψλ) πνπ ζα γίλνπλ κε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ππνζηξψκαηνο, κε ζηαζεξή ζπγθέληξσζε ελδχκσλ, ζηαζεξή ζεξκνθξαζία θαη pH θαη λα κεηξήζνπκε ηηο ζπγθεληξψζεηο είηε ηνπ ππνζηξψκαηνο είηε ησλ πξντφλησλ ζε ζρέζε κε ην ρξφλν.

2. Aπφ ηηο γξαθηθέο παξαζηάζεηο ηνπ [S] ή ηνπ [Ρ] ζπλαξηήζεη ηνπ ρξφλνπ γηα δηαθνξεηηθέο αξρηθέο ζπγθεληξψζεηο ππνζηξψκαηνο θαη

3. Απφ ηα δηαγξάκκαηα Lineweaver–Burk, Eadie–Hofstee θαη Hanes.5

27 2.4 Αλαζηνιή ελδπκηθώλ αληηδξάζεωλ

Η αλαζηνιή ησλ ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ ελδηαθέξεη πάξα πνιχ ηελ ελδπκνινγία. Η κειέηε ησλ ελδπκηθψλ αλαζηνιέσλ, καο βνεζά λα θαηαλνήζνπκε πψο δνπιεχνπλ ηα έλδπκα. Σξνπνπνηψληαο π.ρ. ηε δνκή ηνπ ππνζηξψκαηνο S κπνξεί λα εμάγνπκε πιεξνθνξίεο γηα ην ελεξγφ θέληξν ηνπ ελδχκνπ. Γλσξίδνληαο ηε ρεκεία ηνπ ελεξγνχ θέληξνπ κπνξεί λα ζπλζέζνπκε αλαζηνιείο κε ζεξαπεπηηθή αμία.

Οη ελδπκηθέο αληηδξάζεηο, φπσο ηηο γλσξίδνπκε, είλαη πνιχ εμεηδηθεπκέλεο αληηδξάζεηο φπνπ έλα ζπγθεθξηκέλν ππφζηξσκα (S) ε αληίδξαζε, θαηαιχεηαη απφ έλα πνιχ εμεηδηθεπκέλν γη’ απηφ ελδπκηθφ θαηαιχηε (Δ) πξνο πξντφλ (P). Όζνλ αθνξά ζηνλ κεραληζκφ, ε αληίδξαζε πξνρσξεί φπσο έρνπκε αλαιχζεη κέζσ ζρεκαηηζκνχ ζπκπιφθνπ ελδχκνπ–ππνζηξψκαηνο (ES) θαη ε θηλεηηθή ηεο αληίδξαζεο είλαη απηή πνπ κειεηήζακε πξηλ :

Έρεη βξεζεί φκσο φηη πνιιά έλδπκα θαηαιχνπλ φρη κφλν έλα αιιά πεξηζζφηεξα ππνζηξψκαηα (πνιιαπιά ππνζηξψκαηα). ΢ηελ πεξίπησζε απηή φια είλαη ην ίδην γηα φια ηα ππνζηξψκαηα.

΢ην ζεκείν απηφ ζα πξέπεη λα ηνλίζνπκε φηη εθηφο απφ ηα ππνζηξψκαηα θαη άιιεο νπζίεο είλαη δπλαηφλ λα επηδξάζνπλ ζην έλδπκν ηαπηφρξνλα κε ην ππφζηξσκα θαη λα αιιάμνπλ έηζη ηελ θαηαιπηηθή ηνπ δξαζηηθφηεηα. Οη νπζίεο απηέο ιέγνληαη ξπζκηζηέο ή ηξνπνπνηεηέο θαη κπνξνχλ λα είλαη θπζηθά ζπζηαηηθά ηνπ θπηηάξνπ. ΢ηηο ελψζεηο απηέο ππάγνληαη νη γλσζηνί καο αλαζηνιείο ελδχκσλ θαη νη ελεξγνπνηεηέο ελδχκσλ.6

28 2.4.1 Αληηζηξεπηή αλαζηνιή

2.4.1.1 ΢πλαγωληζηηθή αλαζηνιή

Έλαο αλαζηνιέαο ελδπκηθήο αληίδξαζεο είλαη ζπλαγσληζηηθφο φηαλ έρεη δνκηθή νκνηφηεηα κε ην ππφζηξσκα. Έηζη ν αλαζηνιέαο θαη ην ππφζηξσκα, ζπλαγσλίδνληαη γηα ην ελεξγφ θέληξν ηνπ ελδχκνπ. Ο ζρεκαηηζκφο ζπκπιφθνπ ελδχκνπ–αλαζηνιέα ειαηηψλεη, φπσο είλαη θπζηθφ, ηελ πξνζθεξφκελε γηα ζχλδεζε κε ην ππφζηξσκα, πνζφηεηα ηνπ ελδχκνπ, κε απνηέιεζκα ε ηαρχηεηα ηεο ελδπκηθήο αληίδξαζεο λα κεηψλεηαη. Η ζπλαγσληζηηθή αλαζηνιή είλαη αληηζηξεπηή, πνπ ζεκαίλεη φηη ε αλαζηνιή κπνξεί λα ειαρηζηνπνηεζεί κε αχμεζε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ ππνζηξψκαηνο, εθηφο θαη αλ ε ζπγθέληξσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο είλαη κεγαιχηεξε απφ εθείλε φπνπ ην ππφζηξσκα θαζ΄απηφ δξα σο αλαζηνιέαο.

Οη αληηδξάζεηο ζπλαγσληζηηθήο αλαζηνιήο είλαη:

Αλ ην θαζνξίδνλ ηελ ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο ζηάδην είλαη ν ζρεκαηηζκφο ησλ πξντφλησλ θαη ε ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο ζπκθσλεί κε ηελ παξαδνρή Michaelis–Menten, ε ηαρχηεηα κπνξεί λα εθθξαζηεί κε βάζε ηε ζρέζε (1) θαη γηα ην έλδπκν έρνπκε:

Γηα ηηο δχν αληηδξάζεηο ζε ηζνξξνπία έρνπκε:

29

Όπνπ Κs θαη Κ1 είλαη νη ζηαζεξέο δηάζηαζεο ησλ ΔS θαη ΔΙ πνπ είλαη ηα αληίζηνηρα ησλ ζηαζεξψλ ηζνξξνπίαο. Με ζπλδπαζκφ ησλ παξαπάλσ αληηδξάζεσλ έρνπκε:

Απηφ δείρλεη φηη ε KmI αλαζηνιήο είλαη κεγαιχηεξε απφ ηελ Ks θαη ε umax κηθξφηεξε, ζχκθσλα κε ηηο ηειεπηαίεο δχν εμηζψζεηο. ΢ην ζρήκα πνπ αθνινπζεί δίλνληαη νη γξαθηθέο παξαζηάζεηο γηα ηε ζπλαγσληζηηθή αλαζηνιή ησλ Lineweaver–Burk, Hanes θαη Δadie–Hofstee.6

Κακπχιε Hanes Κακπχιε Lineweaver–Burk

30

Κακπχιε Δadie–Hofstee

΢ρήκα 6 : Κακπύιεο Lineweaver–Burk, Hanes θαη Δadie–Hofstee γηα ηε ζπλαγωληζηηθή αλαζηνιή. ΢πλερήο γξακκή ρωξίο αλαζηνιή. Γηαθεθνκκέλε κε αλαζηνιή.

2.4.1.2 Με ζπλαγωληζηηθή αλαζηνιή

Οη κε ζπλαγσληζηηθνί αλαζηνιείο αληηδξνχλ κε ην έλδπκν, ζηελ πεξηνρή ηνπ ελεξγνχ θέληξνπ αληηζηξεπηά ή ζε θάπoηα άιιε πεξηνρή κε αληηζηξεπηά. Καη ζηηο δχν πεξηπηψζεηο ην ζρεκαηηδφκελν ζχκπινθν είλαη αλελεξγφ:

31

Αθνχ ην ππφζηξσκα θαη ν αλαζηνιέαο δελ ζπλαγσλίδνληαη γηα ηελ ίδηα πεξηνρή ηνπ έλδπκνπ γηα λα ζρεκαηίζνπλ ην αληίζηνηρν ζχκπινθν, κπνξνχκε λα δερηνχκε φηη ε ζηαζεξά δηαζηάζεσο γηα ηηο ηξεηο πξψηεο αληηδξάζεηο ζε ηζνξξνπία είλαη ίδηεο:

Παξνκνίσο θαη γηα ηηο άιιεο δχν

Η ηαρχηεηα ηεο αληίδξαζεο κπνξεί λα παξαρζεί απφ ηελ αληίζηνηρε εμίζσζε Michaelis–Menten.

Κακπχιε Hanes Κακπχιε Lineweaver–Burk

32

Κακπχιε Δadie–Hofstee

΢ρήκα 7 : Κακπύιεο Lineweaver–Burk, Hanes θαη Δadie–Hofstee γηα ηε κε ζπλαγωληζηηθή αλαζηνιή.

Δπνκέλσο ε umaxI ηεο αληίδξαζεο παξνπζία κε ζπλαγσληζηηθνχ αλαζηνιέα 6 κεηψλεηαη ελψ ε km δελ επεξεάδεηαη απφ ηνλ αλαζηνιέα.

2.4.2 Με αληηζηξεπηή αλαζηνιή

Κάλνληαο ρξήζε ηεο ζρέζεο Michaelis–Menten θαίλεηαη φηη ζηε ζπλαγσληζηηθή θαη κε ζπλαγσληζηηθή αληηζηξεπηή αλαζηνιή, ν ζπλδπαζκφο ελδχκνπ–αλαζηνιέα είλαη αληηζηξεπηφο. Όηαλ ν αλαζηνιέαο ελψλεηαη κε αληηζηξεπηά κε ην έλδπκν (νκνηνπνινθνί δεζκνί) δελ κπνξνχκε λα

ρξεζηκνπνηήζνπκε ηε ζρέζε Michaelis–Menten γηα ηνλ ππνινγηζκφ km θαη umax.

Με αληηζηξεπηή αλαζηνιή πξνθαιείηαη απφ δηάθνξεο νπζίεο φπσο π. ρ. αιθπιησηηθά αληηδξαζηήξηα.6

33 3. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 3 ΚΑΣΑΛΑ΢Δ΢

3.1 Δηζαγωγή

Οη θαηαιάζεο είλαη έλδπκα πνπ έρνπλ ηελ ηδηφηεηα λα παξάγνπλ κνξηαθφ 7 νμπγφλν απφ ηε δηάζπαζε ηνπ H2O2. Οη θαηαιάζεο παξαηεξνχληαη θαη κειεηψληαη πάλσ απφ 100 έηε, κε ηελ πξψηε κειέηε λα εκθαλίδεηαη γχξσ ζην 1900. 7 Η θαηαιάζε είλαη έλα έλδπκν, παξφλ ζρεδφλ ζε φια ηα θχηηαξα δψσλ θαη θπηψλ ηα νπνία θαηαιχνπλ ηελ αθφινπζε αληίδξαζε:

2H2O2 →2H2O +O2 (1)

Τπάξρνπλ δχν ζηάδηα ζηελ αληίδξαζε. Σν πξψην ζηάδην πεξηιακβάλεη ηελ νμείδσζε ηνπ ζηδήξνπ ηεο αίκεο ρξεζηκνπνηψληαο ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ σο ππφζηξσκα γηα λα ζρεκαηηζηεί ε έλσζε Ι, έλα είδνο νμπζηδήξνπ (oxyferryl) κε κηα νμείδσζε ηνπ ηζνδχλακνπ ζηδήξνπ θαη κηα δεχηεξε αληίδξαζε ζε έλα ηζνδχλακν θαηηνληηθήο ξίδαο αίκεο (αληίδξαζε 2). Σν δεχηεξν ζηάδην, ε αλαγσγή ηεο έλσζεο Ι, ρξεζηκνπνηεί έλα δεχηεξν κφξην ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ σο δφηε ειεθηξνλίσλ πνπ ηνπ παξέρεη δχν νμεηδσηηθά ηζνδχλακα (αληίδξαζε 3).

III + IV (Por–Fe ) + H2O2 → (Por -Fe =O) + H2O (2)

Έλδπκν Έλσζε Ι

+ IV III (Por -Fe =O) + H2O2 → (Por–Fe ) + H2O + O2 (3)

Έλσζε Ι Έλδπκν

Η έλσζε Ι κπνξεί επίζεο λα ππνζηεί αλαγσγή ελφο ειεθηξνλίνπ κε ή ρσξίο πξσηφλην κε ζπλέπεηα ηνλ ζρεκαηηζκφ κηαο αλελεξγήο έλσζεο ΙΙ (αληίδξαζε (4) ή (4α))

34 (Por+-FeIV=O) +e-→ (Por+-FeIV=O) (4)

Έλσζε Ι Έλσζε II (Por+-FeIV=O) +e- + H+ → (Por+-FeIV-OH+) (4α)

Έλσζε Ι Έλσζε II

Οη θαηαιάζεο κπνξνχλ λα ελεξγήζνπλ θαη σο ππεξνμεηδάζεο (θαηαιχνληαο κηα παξφκνηα αληίδξαζε) ζηελ νπνία νη δφηεο ειεθηξνλίσλ είλαη νμεηδσκέλνη κέζσ κεηαθνξάο ελφο ειεθηξνλίνπ (αληηδξάζεηο (5) θαη (5α))

+ IV IV (Por -Fe =O) +ΑΗ2 → (Por-Fe -OH) + ΑΗ (5)

Έλσζε Ι Έλσζε II

IV IV (Por-Fe -OH) + ΑΗ2 → (Por–Fe ) + ΑΗ (5α)

Έλσζε II Έλδπκν

Γεληθά, ε ππεξνμεηδηθή αληίδξαζε ησλ αιεζηλψλ θαηαιαζψλ είλαη αζζελήο ζε ζχγθξηζε κε ηηο πξαγκαηηθέο ππεξνμεηδάζεο, αιιά κπνξεί λα είλαη κηα ζεκαληηθή αληίδξαζε ζηελ θαηεγνξία, γλσζηή σο θαηαιάζεο–ππεξνμεηδάζεο.

3.2 Καηεγνξίεο ελδύκωλ «θαηαιάζεο»

Τπάξρεη πνηθηινκνξθία ζηηο θαηαιάζεο θαη αθνξά ζηελ πνηθηιία ησλ κεγεζψλ ησλ ππνκνλάδσλ, ηνλ αξηζκφ ησλ ηεηαξηνηαγψλ δνκψλ, ηε δηαθνξά ζηηο πξνζζεηηθέο νκάδεο αίκεο θαη ηε πνηθηιία ηεο αιιεινπρίαο ησλ νκάδσλ. ΢αλ απνηέιεζκα έρνπκε ηελ θαηεγνξηνπνίεζε ησλ θαηαιαζψλ ζε ηέζζεξηο θχξηεο νκάδεο: ηα "θιαζηθά" κνλνιεηηνπξγηθά έλδπκα (ηχπνο Α)8, ηηο θαηαιάζεο- ππεξνμεηδάζεο (ηχπνο Β)9,10, ηηο θαηαιάζεο πνπ δελ πεξηέρνπλ αίκε (ηχπνο C)11,12,13,14 θαη ηηο δηάθνξεο πξσηεΐλεο κε δεπηεξεχνπζεο θαηαιπηηθέο δξαζηηθφηεηεο (ηχπνο D)15.

35 3.3 Ο ξόινο ηεο θαηαιάζεο

Πνηνο είλαη ν ξφινο ηεο θαηαιάζεο ζηνπο νξγαληζκνχο; Σν πξνθαλέο είλαη φηη πξνζηαηεχεη ηνλ νξγαληζκφ έλαληη ησλ ελψζεσλ ηνπ νμπγφλνπ, ηδηαίηεξα εθείλσλ πνπ πξνέξρνληαη απφ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ. Η χπαξμε ηφζσλ πνιιψλ πξνθαξπσηηθψλ θαηαιαζψλ, θαζψο επίζεο θαη ε πεξηζηαζηαθή έθθξαζή ηνπο ππνδειψλεη ην πιενλέθηεκα λα ρξεζηκνπνηείηαη ε θαηαιάζε πεξηνδηθά φηαλ νπνηνζδήπνηε νξγαληζκφο εθηίζεηαη ζε αηθλίδηεο απμήζεηο ηνπ επηπέδνπ ηνπ ππεξνμεηδίνπ, πεξηβαιινληηθά ή εζσηεξηθά. Οη Μa θαη Eaton16 ππέδεημαλ έλαλ πξνζηαηεπηηθφ ξφιν γηα ηε θαηαιάζε (HPII ή HPI) ζηηο θαιιηέξγεηεο ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Ε. coli. Απηφο ν πξνζηαηεπηηθφο ξφινο είλαη εκθαλήο πην πνιχ ζηηο ππθλέο απφ φ,ηη ζηηο αξαηέο βαθηεξηαθέο θαιιηέξγεηεο. Σν κεκνλσκέλν θχηηαξν, αθφκε θαη κεηαμχ ησλ πξνθαξπσηηθψλ, είλαη πηζαλφηεξν λα δηαηξέμεη θίλδπλν απφ εζσηεξηθά παξαγφκελν παξά απφ

εμσηεξηθά παξαγφκελν Η2Ο2. Σν εζσηεξηθφ Η2Ο2 κπνξεί λα απνκαθξπλζεί είηε κε θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα, είηε κε δηάρπζε ζην θχηηαξν. Σν πνζφ ηεο θαηαιάζεο πνπ εκθαλίδεηαη ζηα θχηηαξα θάησ απφ ηηο πεξηζζφηεξεο ζπλζήθεο είλαη ην ειάρηζην πνπ απαηηείηαη γηα λα δηαηεξήζεη ηε κέγηζηε ζπγθέληξσζε ππεξνμεηδίνπ θαηά ηε δηάξθεηα κηαο παξαγσγήο θάησ απφ 0,1 ή 0,2 κΜ17,18. ΢ε άιινπο κηθξννξγαληζκνχο απαηηνχληαη πςειφηεξα επίπεδα θαηαιαζψλ γηα λα ζπληεξήζνπλ ην ρακειφ επίπεδν ππεξνμεηδίνπ θάησ απφ φιεο ηηο ζπλζήθεο. Ο κηθξννξγαληζκφο Rhodobacter spheroides κπνξεί λα ζπλζέζεη πάλσ απφ 25% ηεο πξσηεΐλεο ηνπ ππφ κνξθή θαηαιάζεο.19

΢ηελ πεξίπησζε ησλ επθαξπσηηθψλ θπηηάξσλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ αλζξψπηλσλ, νη Nicholls θαη Schonbaum20 πξφηεηλαλ φηη ε θαηαιάζε είλαη έλα "απνιηζσκέλν έλδπκν," ρσξίο ιεηηνπξγηθφ ξφιν. Οη κειέηεο γηα απηή ηε ζεσξία δελ ζπλερίζηεθαλ.

Σα έλδπκα κε έλαλ κε δηαθξηηφ ξφιν απνδείρηεθαλ ζεκαληηθφηεξα απφ φηη ήηαλ γλσζηφ. Απηφ πξψηα ππνγξακκίζηεθε απφ ηνπο Deisseroth θαη Dounce ζηε κειέηε ηνπο γηα ηηο θαηαιάζεο ην 197021. Οη Deisseroth θαη Dounce επηζήκαλαλ επίζεο ηελ πηζαλφηεηα ε ζπγθεθξηκέλε ζέζε ηεο επθαξπσηηθήο θαηαιάζεο ζηα ππεξνμπζψκαηα λα είλαη κηα ιεηηνπξγηθή απάληεζε ζηελ

36 αλάγθε λα δηαζπαζηεί ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ πνπ παξάγεηαη παξνπζία αεξφβησλ νμεηδαζψλ, ζηα ίδηα νξγαλίδηα, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ πδξνμπ-φμηλσλ νμεηδαζψλ θαη ησλ δ–ακηλν-φμηλσλ νμεηδαζψλ.

3.4 Κηλεηηθέο

3.4.1 Ζ θαηαιπηηθή δηάβαζε

Η θηλεηηθή ζπκπεξηθνξά ησλ θιαζζηθψλ θαηαιαζψλ δελ είλαη πιήξσο

θαηαλνεηή. Οη ηηκέο km θαη kcat/km γηα ηηο θαηαιάζεο δελ έρνπλ ηελ ίδηα έλλνηα κε ην ηππνπνηεκέλν έλδπκν ησλ Michaelis-Menten, παξά ην γεγνλφο φηη ην απηφ ζέκα δηεπθξηλίζηεθε απνηειεζκαηηθά απφ ηνπο Bonnichsen, Chance θαη Theorell.22 Όπσο πεξηγξάθεηαη ήδε, νη θαηαιάζεο αληηδξνχλ κε ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ ζε κηα δηαδηθαζία δχν ζηαδίσλ. ΢ηελ αληίδξαζε (2), ην έλδπκν ηνπ ζηδήξνπ αληηδξά κε ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ θαη παξαγάγεη χδσξ θαη ηελ έλσζε Ι. Σν ελδηάκεζν έλδπκνπ–ππνζηξψκαηνο (ES) θαη ε ζηαζεξά ξπζκνχ δξάζεο γηα απηήλ ηελ αληίδξαζε θαζνξίδεηαη απφ ηελ k1. Η αληίζηξνθε αληίδξαζε κε κηα ζηαζεξά ξπζκνχ δξάζεο k-1 είλαη ακειεηέα. ΢ηελ αληίδξαζε (3), ε έλσζε Ι ζπλδπάδεηαη κε έλα δεχηεξν κφξην ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ γηα λα αλαπαξαγάγεη ην έλδπκν ηνπ ζηδήξνπ, ην κνξηαθφ νμπγφλν θαη ην χδσξ. Η ζηαζεξά ξπζκνχ δξάζεο γηα απηήλ ηελ

αληίδξαζε είλαη ε k2, θαη γηα ηελ αληίζηξνθε αληίδξαζε, ε νπνία είλαη επίζεο

ακειεηέα, ε k-2. Οη αληηδξάζεηο ζπλνςίδνληαη ζην ζρήκα 8A. Γεδνκέλνπ φηη θαη νη δχν αληηδξάζεηο εμαξηψληαη απφ ην ππεξνμείδην, νη Bonnichsen, Chance θαη Theorell22, πξνβιέπνπλ φηη ην έλδπκν δελ είλαη πνηέ θνξεζκέλν κε ην ππφζηξσκά ηνπ θαη φηη ε επαλάιεςε ηνπ θαηαιπηηθνχ θχθινπ ηνπ ππνζηξψκαηνο απμάλεηαη απεξηφξηζηα θαζψο απμάλεηαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ ππεξνμεηδίνπ (BCT κεραληζκφο).

Οη ηαρχηεηεο ησλ αληηδξάζεσλ (2) θαη (3), u1 θαη u2, κπνξνχλ λα εθθξαζηνχλ απν ηε ζπλνιηθή ελδπκηθή ζπγθέληξσζε (ή ηηο ζπλνιηθέο νκάδεο ηεο αίκεο) [E] θαη ηε ζπγθέληξσζε ηνπ ζπκπιφθνπ ελδχκνπ–ππνζηξψκαηνο [ES], σο εμήο:

37 u1 = kl [H2Ο2] ([E]-[ES]) (6)

θαη

u2 = k2 [H2Ο2] [ES]) (7)

΢ηε ζηάζηκε θαηάζηαζε νη δχν ηαρχηεηεο είλαη ίζεο θαη ηζρχεη

kl [H2Ο2] ([E]-[ES]) = k2 [H2Ο2] [ES]) (8)

ε φπνηα κπνξεί λα απινπνηεζεί σο

kl([E]-[ES]) = k2[ES] (9)

΢ρήκα 8 : Ο κεραληζκόο ηωλ Bonnichsen, Chance θαη Theorell γηα ηελ κεηαηξνπή ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγόλνπ από ηελ θαηαιάζε. (A) Ο απιόο κεραληζκόο ηηη αληηζθαίξηζεο (ping-pong) (B) Σν αληηζηξεπηό ES (Fe -H2Ο2) θαη ηεηξαεδξηθά

ζύκπινθα (έλωζε Η–Ζ2Ο2) πνπ πξνζηίζεληαη ζηνλ κεραληζκό Α.

Η επίιπζε γηα [ES] δίλεη :

[ES] = [E]k1/(k2 + k1) (10)

38 Απφ φπνπ πξνθχπηεη φηη ε αλαινγία [ES]/[|E] είλαη κηα ζηαζεξά:

[ES]/[|E] = k1/(k2 + k1) = a (11)

Ωο εθ ηνχηνπ ε ζπγθέληξσζε ηνπ ζχκπινθνπ ES ζηε ζηάζηκε θαηάζηαζε

είλαη αλεμάξηεηε ηνπ [H2Ο2]. Η αληίδξαζε 2 ή ε απνζχλζεζε ηεο έλσζεο Ι είλαη ην ελδηάκεζν ζηάδην ηεο ζπλνιηθήο δξάζεο κε ζπλέπεηα ε γεληθή ηαρχηεηα λα πεξηγξάθεηαη απφ

V = 2k1k2[H2O2] [E]/(k2 + k1 ) (12)

φπνπ ν ζπληειεζηήο 2 είλαη παξψλ επεηδή θάζε πιήξεο θχθινο πεξηιακβάλεη ηελ απψιεηα δχν κνξίσλ ππεξνμεηδίνπ. Η εμίζσζε (12) δείρλεη φηη ην πνζνζηφ απνζχλζεζεο ηνπ ππεξνμεηδίνπ είλαη αλάινγν πξνο κηα ζηαζεξά

k’ = 2k1k2/(k2 + k1) (13)

πνιιαπιαζηαζκέλε κε ηηο ζπγθεληξψζεηο είηε ηνπ πξντφληνο,είηε ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ηεο ελεξγήο πεξηνρήο ηνπ ελδχκνπ.

Η κέηξεζε ηεο ζπλνιηθήο ζηαζεξάο ξπζκνχ δξάζεο, καδί κε ηε κέηξεζε ηνπ πνζνζηνχ ηνπ ελδχκνπ πνπ βξίζθεηαη ζε ζηαζεξή θαηάζηαζε, φπνπ είλαη ε έλσζε Ι, επηηξέπεη ηνλ ππνινγηζκφ ησλ ηηκψλ ησλ δχν εγγελψλ ζηαζεξψλ ξπζκνχ δξάζεο ζχκθσλα κε :

k2 = k’/2a (14)

θαη

k1 = k’/2(1-a) (15)

39 Η ηηκή ηεο k1 κπνξεί λα θαζνξηζηεί άκεζα εάλ κηα έλσζε «παγίδα» είλαη δηαζέζηκε λα αληηδξάζεη κε αληηζηξεπηά θαη πην γξήγνξα κε ηελ έλσζε Ι απφ

φηη κε ην δεχηεξν H2Ο2.

Οη ρακειέο ηηκέο ηνπ km ζηα έλδπκα ησλ ζειαζηηθψλ ζεσξήζεθαλ σο απνηέιεζκα ηεο ελδπκηθήο αδξαλνπνίεζεο απφ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ, φηαλ πξαγκαηνπνηήζεθαλ κεηξήζεηο ζε πεξίζζεηα ππεξνμεηδίνπ 10 mM γηα ρξνληθφ δηάζηεκα 10 ιεπηψλ ή πεξηζζφηεξν. Η γξήγνξε κέζνδνο δεηγκαηνιεςίαο/πξνζδηνξηζκνχ ηνπ Bonnichsen έιπζε ην πξφβιεκα ηεο αδξαλνπνίεζεο θαη επέηξεςε έλαλ ηθαλνπνηεηηθφ ζπζρεηηζκφ ησλ γεληθψλ θαηαιπηηθψλ κεηξήζεσλ θαη ησλ παξαηεξήζεσλ ηνπ Chance ζην ελδηάκεζν ζχκπινθν (έλσζε I).

Πξνθαλψο, πξέπεη λα ππάξμεη έλα φξην ζηελ επαλάιεςε ηνπ θαηαιπηηθνχ θχθινπ νπνηνπδήπνηε ελδχκνπ. Η ηαρχηεηα ηεο δξάζεο, ζεσξεηηθά, απμάλεηαη απεξηφξηζηα κε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο. ΢ηελ πεξίπησζε ησλ θαηαιαζψλ ησλ ζειαζηηθψλ, ηα φξηα είλαη κεηαμχ 2 x 106 s-1θαη 1 x 107 s-1.20 Γειαδή θάζε ελεξγή πεξηνρή ηεο αίκεο κπνξεί ζεσξεηηθά λα απνζπλζέζεη

απφ 2 έσο 10 εθαηνκκχξηα κφξηα H2O2 αλά δεπηεξφιεπην. Όηαλ δχν κφξηα απνζπληίζεηαη αλά επαλάιεςε ηνπ θαηαιπηηθνχ θχθινπ, ζεκαίλεη φηη ε δηάξθεηα δσήο ηνπ ελεξγνχ ζπκπιφθνπ Michaelis-Menten ή ε έλσζε Ι, είλαη κεηαμχ 0,2 θαη 1 ms.

Σν πην ζχλζεην ζρήκα 8B απαηηείηαη εάλ ρξεζηκνπνηεζεί έλα αιεζηλφ km. Τπάξρνπλ δχν πηζαλά ζηάδηα πνπ ζα κπνξνχζαλ λα πεξηιακβάλνπλ ην

πεξηνξηζκφ ησλ κε κνξηαθψλ δηαδηθαζηψλ, πνπ δηέπνληαη απφ ηα kΑ θαη kΒ. Σα βήκαηα απηά πεξηιακβάλνληαη ζην ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι θαη ηελ απνζχλζεζε ηνπ ηεηξαεδξηθνχ ζπκπιφθνπ, αληίζηνηρα. Οη Nicholls θαη Schonbaum20 έδσζαλ ηνπο ιφγνπο πνπ πξνηηκάηαη ε απνζχλζεζε ηνπ ηεηξαεδξηθνχ ζπκπιφθνπ γηα ηελ θαηαιάζε ησλ ζειαζηηθψλ.

Γηάθνξεο θαηαιάζεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ θηαιαζψλ-ππεξνμεηδαζψλ ηχπνπ Β, θαίλνληαη λα παξνπζηάδνπλ έλα πξαγκαηηθφ θνξεζκφ ππνζηξψκαηνο ζε πνιχ ρακειφηεξα επίπεδα ππεξνμεηδίνπ απφ φηη ζηηο αξρηθέο παξαηεξήζεηο γηα ηα έλδπκα πνπ ππάξρνπλ ζηα ζειαζηηθψλ (κεξηθά millimolar). Απηφ ζεκαίλεη φηη ε πεξηνξηζηηθή κέγηζηε επαλάιεςε ηνπ

40 θαηαιπηηθνχ θχθινπ είλαη κηθξφηεξε θαη ε δηάξθεηα δσήο ηνπ ππνζεηηθνχ ελδηάκεζνπ Michaelis-Menten είλαη πνιχ κεγάιε. Σν ζρήκα 8Β πεξηγξάθεη ην θαηλφκελν απηφ.

3.4.2 Ζ ππεξνμεηδηθή δξαζηηθόηεηα ηωλ θαηαιαζώλ

Δθηφο απφ ηελ θαηαιπηηθή (δηάζπαζε ππεξνμείδηνπ) δξαζηηθφηεηα ηνπο, νη θαηαιάζεο ρξεζηκνπνηνχλ επίζεο ηα ππεξνμείδηα γηα λα νμεηδψζνπλ ηα δεπηεξνηαγή πδξνγφλα θαη ηα κφξηα δνηψλ ειεθηξνλίσλ. Τπάξρνπλ δχν ζεκαληηθέο θαηεγνξίεο πηζαλψλ δνηψλ πδξνγφλνπ: δφηεο δχν ειεθηξνλίσλ φπσο νη αιθνφιεο θαη δφηεο ελφο ειεθηξνλίνπ φπσο νη θαηλφιεο. Οη δχν ηξφπνη νμεηδναλαγσγηθήο ζπκπεξηθνξάο είλαη αξθεηά ζαθείο. Οη Keilin θαη Nicholls24 πεξηέγξαςαλ έμη ηχπνπο δνηψλ, πνπ ηαμηλνκήζεθαλ ζχκθσλα κε ηελ ηθαλφηεηά ηνπο λα αληηδξνχλ άκεζα κε ηηο δχν ελψζεηο ησλ θαηαιαζψλ ηνπ ππεξνμεηδίνπ. Σν ζρήκα 9Α παξνπζηάδεη ηε βάζε γηα απηήλ ηελ ηαμηλφκεζε. Ση έρεη ζπκβεί θαηά ηε δηάξθεηα ησλ ηειεπηαίσλ 40 εηψλ έηζη ψζηε λα ηξνπνπνηεζεί απηφ ην ζρέδην; Αξρηθά, ν αξηζκφο ησλ γλσζηψλ θαηαιαζψλ έρεη απμεζεί πάξα πνιχ, αλ θαη ππάξρνπλ ζεκαληηθέο πνζνηηθέο δηαθνξέο ζηα πνζνζηά αληίδξαζεο κε ζπγθεθξηκέλνπο ηχπνπο δνηψλ, κέιε ηεο θαηεγνξίαο ηχπνπ Α ησλ θαηαιαζψλ, πνπ πεξηιακβάλεη ηελ θαηαιάζε ηνπ ήπαηνο ηνπ βφεηνπ θξέαηνο (BLC) θαη ηε HPIΙ, πνπ έρνπλ πνιιά θνηλά ραξαθηεξηζηηθά, φπσο ε ηδηνκνξθία ζηνπο δφηεο. Γεχηεξνλ, κηα ζεκαληηθή αλαθάιπςε είλαη απηή ηνπ εηδηθνχ ξφινπ ηνπ δφηε NADPH. Σξίηνλ, έρεη δηαπηζησζεί φηη κεξηθά έλδπκα ηχπνπ Α, φπσο ην έλδπκν απφ ηνπο κηθξννξγαληζκνχο Αspergillus θαη Ε. coli HPII, δε ζρεκαηίδνπλ θαζφινπ ηελ έλσζε ΙΙ. Μηα ηέηαξηε ηξνπνπνίεζε ηνπ θιαζζηθνχ ζρεδίνπ πεξηιακβάλεη ηελ παξαηήξεζε φηη νξηζκέλνη ηχπνη ππεξνμεηδίσλ, φπσο ην t-βνπηπιηθφ πδξνυπεξνμείδην θαη ην ππεξνμπληηξψδεο νμχ, κπνξνχλ λα δηακνξθψζνπλ ηελ έλσζε ΙΙ άκεζα κε νκνιπηηθή δηάζπαζε δεζκνχ Ο-Ο, κε ηελ επαθφινπζε · · απειεπζέξσζε κηαο ξίδαο ππεξνμεηδίνπ ζην κέζν (t–BuΟ ή NO 2).

41

ρήκα 9 : Σαμηλόκεζε ηωλ δνηώλ πδξνγόλνπ ηωλ θαηαιαζώλ.

42 3.5 Έιεγρνο από NADPH : Ζ "πξόζζεηε" δηάβαζε

Οη Kirkman θαη Gaetani25 αλαθάιπςαλ ηνλ έβδνκν ηχπν δνηψλ θαηαιαζψλ, D7, άγλσζην ζηνπο Keilin θαη Nicholls24. ΢ηνπο ππνινγηζκνχο in vivν ν Nicholls26 είρε ζθεθηεί ήδε γηα ηελ πηζαλφηεηα θάπνηαο αζπλήζηζηεο δξάζεο γηα ηελ θαηαιάζε ηνπ αίκαηνο, αιιά είρε επηκείλεη ζηνλ ξφιν ηνπ γινπηαζείνπ, αθνινπζψληαο ηηο αξρηθέο ηνπ κειέηεο γηα ηελ θπζηείλε θαη ηηο αιιειεπηδξάζεηο ηνπ γινπηαζείνπ κε ηελ θαηαιάζε24. Αθνινπζψληαο ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηνπ ηζρπξνχ δεζκνχ NADP+/NADPH κε ηηο ζπκβαηηθέο κεζφδνπο ρξσκαηνγξαθίαο, νη Fita θαη Rossmann27 δηαπίζησζαλ φηη έλα θνκκάηη απφ απηφ πνπ πξνεγνχκελα είραλ ζθεθηεί ήηαλ έλα δηαθνξνπνηεκέλν πεπηίδην πνπ πηζαλψο κνηάδεη κε ην NADPH.

Οη Kirkman θαη Gaetnni25 απέδεημαλ φηη φρη κφλν νη ηζρπξνί δεζκνί ησλ NADP+ ή NADPH ήηαλ παξφληεο ζηηο θαηαιάζεο ησλ ζειαζηηθψλ αιιά θαη φηη ε παξνπζία ηνπ αλαγνκέλνπ λνπθιενηηδίνπ κείσζε ην ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο ΙΙ. Οη θηλεηηθέο, εληνχηνηο, ήηαλ αλψκαιεο. Απφ ηηο αξρηθέο θαηεγνξίεο δνηψλ, δχν ηχπνη ζα κπνξνχζαλ λα κεηψζνπλ ηε ζπζζψξεπζε ηεο έλσζεο ΙΙ: ε θαηεγνξία D3 ησλ δχν ειεθηξνλίσλ, ε νπνία απνκαθξχλεη ηελ έλσζε Ι πξηλ ηελ έλσζε ΙΙ πνπ κπνξεί λα δηακνξθσζεί απζφξκεηα, θαη ε θαηεγνξία ελφο ειεθηξνλίνπ (D2), ζηελ νπνία αλάγεηαη ε έλσζε ΙΙ. Σν NADPH δελ εκπίπηεη ζε θακία θαηεγνξία ελψ, αλ θαη απνηξέπεη ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο ΙΙ απφ ηελ έλσζε Ι, δελ αλάγεη ηελ έλσζε Ι άκεζα ζε ειεχζεξν έλδπκν (δειαδή δελ είλαη ζπκβαηφο δφηεο δχν ειεθηξνλίσλ), αλ θαη απνηξέπεη ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο ΙΙ, δελ αλάγεη ηελ έλσζε ΙΙ ζε έλδπκν ηνπ ζηδήξνπ άιινηε παξάγεη ην πξνεγνχκελν είδνο απνπζία ηνπ. Δπίζεο δελ κπνξεί λα δξάζεη σο δφηεο ελφο ειεθηξνλίνπ. Παξνπζηάδεηαη έλα πξνθαλέο παξάδνμν. Οη Hillar θαη Nicholls25 πξνζπαζνχλ λα επηιχζνπλ ην παξάδνμν απηφ κε ην λα ζέζνπλ έλα ελδηάκεζν κεηαμχ ηεο έλσζεο Ι θαη ηεο θαηάζηαζεο ηεο έλσζεο ΙΙ πνπ θαηέρεη κηα κνλαδηθή δξαζηηθφηεηα κε ην δεζκφ ηνπ NADPH, φπσο θαίλεηαη ζην ζρήκα 10. Σν αξρηθφ (αξγφ) βήκα ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ απφ ηελ έλσζε Ι ελαπφθεηηαη ζηε κεηαλάζηεπζε ελφο νμεηδσηηθνχ ηζνδχλακνπ ζε έλα δηπιαλφ θαηάινηπν πξσηεΐλεο Ρ (φπσο εκθαλίδεηαη γξήγνξα θαη ζηαζεξά, παξαδείγκαηνο ράξηλ, ζηελ ππεξνμεηδάζε ηνπ θπηνρξώκαηνο c). ΢ε έλα

43 δεχηεξν (θαη ζρεηηθά γξήγνξν) γεγνλφο, ηα "ελδνγελή" θέληξα δνηψλ ζην κφξην (απνκαθξπζκέλεο ηπξνζηλάζεο, θ.ιπ.) αλάγνπλ ηε ξίδα Ρ· πίζσ ζηε ζηαζεξή θαηάζηαζε PH.

΢ρήκα 10 : Ο θαηαιπηηθόο θύθινο πεξηιακβάλεη ηελ έλωζε ΗΗ’ θαη ην NADPH.

Ση είλαη ην PH/P·; Αθελφο κπνξεί λα είλαη ε θεληξηθή ηπξνζηλάζε, πνπ νμεηδψλεηαη ζηε δηακφξθσζε tyrO· κε κεηαθνξά ησλ π–ειεθηξνλίσλ ηεο ξίδαο. Αθεηέξνπ κπνξεί είλαη λα είλαη κία απφ ηηο άιιεο θνληηλέο ηπξνζηλάζεο φπσο ε Y235 ή ε Y214. Μηα ηξίηε πηζαλφηεηα, πνπ πξνηείλεηαη απφ ηνλ Bicout θαη ηελ νκάδα ηνπ29, είλαη φηη ε ζπληεξεκέλε ζεξίλε S196 κπνξεί επίζεο λα ελεξγήζεη σο ξίδα. Λίγα είλαη γλσζηά γηα ηηο ξίδεο ζεξίλεο ζε άιια έλδπκα, θαη επνκέλσο ε ζεξκνδπλακηθή είλαη αδχλαηνλ λα ππνινγηζηεί.

Ιζρχνπλ δχν ελαιιαθηηθέο απφςεηο σο πξνο ηνλ ηξφπν κε ηνλ νπνίν ην καθξηλά ζπλδεδεκέλν NADPH κπνξεί λα ιεηηνπξγήζεη. Η πξψηε δξάζε ηνπ πεξηιακβάλεη δχν επηηπρείο νμεηδψζεηο ελφο ειεθηξνλίνπ.30,31 Η απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ NADPΗ ζηελ παξεκπφδηζε ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ νθείιεηαη ζηελ πςειή αληηδξαζηηθφηεηα ηεο ελδηάκεζεο ξίδαο NADP·, σο αλαγσγηθφ ηεο έλσζεο ΙΙ, πνπ παξάγεηαη ζην βήκα ελφο ειεθηξνλίνπ. Σν άιιν πξφηππν28 ζεσξεί ην NADPH σο δφηε πδξηδίσλ ππεχζπλν γηα ηε ζρεδφλ ηαπηφρξνλε αλαγσγή ηνπ ζηδήξνπ ζε ζίδεξν(ferryl) θαη ησλ εηδψλ πξσηετληθήο ξίδαο.

Οη Kirkman θαη Gaetani32 έρνπλ επαλεμεηάζεη ηηο θηλεηηθέο νμείδσζεο ηνπ NADPH θαη ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο ΙΙ απφ ηε θαηαιάζε ησλ ζειαζηηθψλ. Κάησ απφ πεηξακαηηθέο ζπλζήθεο ην πνζνζηφ νμείδσζεο ηνπ NADPH είλαη νπζηαζηηθά πςειφηεξν απφ ην πνζνζηφ ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ ρσξίο NADPH. Απηφ κπνξεί λα πξνζαξκνζηεί ζε έλα ζρέδην φπσο απηφ ηνπ ζρήκαηνο 10, εάλ ην πνζνζηφ ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ΄ είλαη κεγαιχηεξν

44 απφ ην πνζνζηφ ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ. Απηφ κπνξεί λα πξνθχςεη είηε εάλ ππάξρνπλ πεξηζζφηεξεο απφ κηα δηαδξνκέο γηα ηελ απνζχλζεζε ηεο έλσζεο ΙΙ΄, απφ ηηο νπνίεο κφλν ε κηα πξνρσξά κέζσ ηεο έλσζεο ΙΙ, είηε εάλ ν ζρεκαηηζκφο ηεο έλσζεο ΙΙ΄ απφ ηελ έλσζε Ι είλαη αληηζηξεπηφο, φπσο θαίλεηαη ζην ζρήκα 10. Σέηνηα αληηζηξεςηκφηεηα είλαη πηζαλή ιακβάλνληαο ππφςε ηα νμεηδναλαγσγηθά δπλακηθά ησλ ζρεηηθψλ εηδψλ. Αλ θαη νη άκεζεο κεηξήζεηο δελ έρνπλ πξαγκαηνπνηεζεί ζηηο θαηαιάζεο, νη αληίζηνηρεο ελψζεηο ππεξνμεηδίνπ ησλ metmyoglobin ππεξνμεηδαζψλ θαη ησλ ππεξνμεηδαζψλ ηνπ 33,34 άγξηνπ ξαπαλνχ (horseradish) έρνπλ δπλακηθά (ηηκέο Δ΄0) πεξίπνπ +880 mV (horseradish ππεξνμεηδάζε ή HRP έλσζε I), +900 mV (HRP έλσζε II) θαη · +890 mV (ferrylmetmyoglobin). Οη αληίζηνηρεο ηηκέο E'0 γηα ην trpH/trp θαη ηα δεχγε tyrOH/tyrO· είλαη +1050 θαη +940 mV.35 Αλ θαη απηά ηα δπλακηθά πνηθίινπλ ζηηο δηάθνξεο πξσηεΐλεο, θαίλεηαη φηη ην νμεηδναλαγσγηθφ θελφ κεηαμχ ηεο έλσζεο Ι θαη ηεο έλσζεο ΙΙ΄(ζρήκα 10) είλαη πεξίπνπ 60 mV ππέξ ηεο έλσζεο Ι. Κάησ απφ απηέο ηηο ζπλζήθεο πνπ πεξηγξάθνληαη απφ ηνπο Kirkman θαη Gaetani32, ην πνζνζηφ ζρεκαηηζκνχ ηεο έλσζεο ΙΙ είλαη πεξίπνπ 25% ηνπ πνζνζηνχ νμείδσζεο ηνπ NADPH. ΢χκθσλα κε ηνλ πξνηεηλφκελν κεραληζκφ ε έλσζε Ι θαη ε έλσζε ΙΙ΄ βξίζθνληαη ζε ηζνξξνπία.

Ο ξφινο ηνπ NADPH σο "πξνζηαηεπηηθφο" δφηεο36,37 ζπζρεηίδεηαη κε ηηο δηαθνξεηηθέο ηάζεηο ησλ δηάθνξσλ θαηεγνξηψλ θαηαιαζψλ γηα ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο αλελεξγνχ έλσζεο ΙΙ. Μφλν νη θιαζζηθέο θαηαιάζεο παξνπζηάδνπλ δεζκνχο NADP+ θαη NADPH. Σν ζρέδην πνπ παξνπζηάδεηαη ζην ζρήκα 9B ζπλνςίδεη ηηο ειάρηζηεο αλαζεσξήζεηο ηνπ αξρηθνχ ζρήκαηνο (ζρήκα 9Α) πνπ απαηηνχληαη γηα λα πξνζαξκνζηνχλ ηα λεψηεξα ζπκπεξάζκαηα.

45 3.6 Ζ θαηαιπηηθή δξαζηηθόηεηα ηωλ θαηαιάζωλ–ππεξνμεηδαζώλ

Σα κέιε ηεο θαηεγνξίαο θαηαιάζεο–ππεξνμεηδάζεο είραλ αλαθαιπθζεί μερσξηζηά ζε δηαθνξεηηθνχο κηθξννξγαληζκνχο απφ δηάθνξεο νκάδεο εξεπλεηψλ πξνο ην ηέινο ηεο δεθαεηίαο ηνπ '70 θαη αξρέο δεθαεηίαο ηνπ '8038,39,40. ΢ηα ρξφληα πνπ αθνινχζεζαλ έγηλε γλσζηφ φηη απηά ηα έλδπκα είλαη νκφινγα κε ηνλ επθαξπσηηθφ ηχπν Α θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ ηνπ Welinder41. Αλ θαη απηά ηα έλδπκα παξνπζηάδνπλ θαηαιπηηθή θαη ππεξνμεηδηθή δξαζηηθφηεηα (γηα απηφ ην ιφγν νλνκάζηεθαλ θαηαιάζεο–ππεξνμεηδάζεο (CatPx)) δελ είλαη ζαθέο εάλ ε ππεξνμεηδηθή δξαζηηθφηεηα ηνπο είλαη αλαινγηθά κεγαιχηεξε απφ ηελ δξαζηηθφηεηα πνπ παξνπζηάδεηαη αληίζηνηρα ζηα θιαζζηθά έλδπκα (ηχπνπ Α)42. Δίλαη ζαθέο φηη ε θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα εκθαλίδεη πνιιά κνλαδηθά ραξαθηεξηζηηθά. Οη Hochman θαη Shernesh40 έδεημαλ φηη ην έλδπκν απφ ην κηθξννξγαληζκφ Rhodopseudomonas capsulata

ραξαθηεξίδεηαη απφ αζηάζεηα παξνπζία ππνζηξψκαηνο H2Ο2, θηλεηηθφ

θνξεζκφ (km≈4 mM) γηα ηελ θαηαιπηηθή αληίδξαζε, θαη κηα ζρεηηθή κε επαηζζεζία ζην αδίδην θαη ζηελ πδξνμπιακίλε.

Σα πεηξάκαηα πνπ έγηλαλ ζηελ ζπλέρεηα κε ην παξφκνην έλδπκν ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Klebsiella pneumonia44,45 έδεημαλ φηη ηα ζρεδηαγξάκκαηα ηνπ pH γηα ηελ CatPx είλαη αξθεηά δηαθνξεηηθά απφ εθείλα ησλ θιαζζηθψλ θαηαιαζψλ. Οη ηειεπηαίεο θαηαιπηηθέο δξαζηηθφηεηεο είλαη νπζηαζηηθά αλεμάξηεηεο απφ ην pH, γηα ηηο ηηκέο ηνπ pH απφ 5 έσο 1046. Η CatPx ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Κlebsiella παξνπζίαζε κηα βέιηηζηε θνξπθή pH κεηαμχ ησλ ηηκψλ 6 θαη 744. Μηα παξφκνηα επθαξησηηθή κπθεηηαθή CatPx47 ραξαθηεξίζηεθε

απφ κηα νμεία επαηζζεζία ζην pH θαη ζην θηλεηηθφ θνξεζκφ (km≈3,4 mM) φπσο θαη ζηα βαθηεξηαθά έλδπκα, ήηαλ επαίζζεηε ζηελ επψαζε κε ππεξνμείδην αιιά φρη ζην θιαζζηθφ αλαζηνιέα θαηαιάζεο αδηδίνπ θαη ακηλνηξηαδφιεο.

Οη ρακειέο ππεξνμεηδηθέο δξαζηηθφηεηεο ήηαλ ιηγφηεξν επαίζζεηεο ζην pΗ απφ φηη ε θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα.

Πξφζθαηα, ε κειέηε ησλ θαηαιαζψλ–ππεξνμεηδαζψλ έρεη επεθηαζεί ζηα θπαλνβαθηήξηα, ηα νπνία, αληίζεηα απφ ηα επβαθηήξηα, ραξαθηεξίδνληαη ζπρλά απφ ηελ χπαξμε κφλν κηαο CatPx (ηχπνο Β) θαη θακία θαηαιάζε ηχπνπ

46 Α. Ο Obinger θαη ε νκάδα ηνπ48 έδεημαλ φηη ην έλδπκν ηνπ κηθξννξγαληζκνχ

Anacystis nidulans είρε km=4,3 mM ζην H2Ο2 θαη κηα κέγηζηε επαλάιεςε θαηαιπηηθνχ θχθινπ πάλσ απφ 7000 s-1. ΢ε ρακειά επίπεδα ππεξνμεηδίνπ ε δξαζηηθφηεηα ήηαλ πεξίπνπ 20% ηνπ ελδχκνπ ηνπ ήπαηνο ηνπ βφεηνπ θξέαηνο. Σν ππεξφμπ νμηθφ νμχ παξήγαγε έλα ραξαθηεξηζηηθφ είδνο έλσζεο Ι. Έλα αλάινγν έλδπκν βξίζθεηαη ζηνλ κηθξννξγαληζκφ Synechocystis 6803.48,49 Απηφ ην έλδπκν, φπσο ζηα παξαδείγκαηα ησλ επβαθηεξίσλ, παξνπζηάδεη βέιηηζην pH κεηαμχ ησλ πεξηνρψλ pΗ 6 θαη 750 γηα ηηκέο pΚ θνληά ζην 7, κεηαμχ 5,5 θαη 6,0. Σα ζρεδηαγξάκκαηα pH γηα ηελ ππεξνμεηδαηηθή δξαζηηθφηεηα ήηαλ δηαθνξεηηθά απφ ηα αληίζηνηρα ηεο θαηαιπηηθήο δξαζηηθφηεηαο. Σν ππεξφμπ νμηθφ νμχ επίζεο παξάγεη κηα ραξαθηεξηζηηθή έλσζε Ι. Ωζηφζν, ε αληίδξαζε ηεο έλσζεο Ι κε αλαγσγή ελφο ειεθηξνλίνπ παξάγεη έλα ελδηάκεζν πςεινχ ζπηλ δηαθνξεηηθφ απφ ηελ ραξαθηεξηζηηθή έλσζε ΙΙ. Ο Regelsberger θαη ε νκάδα ηνπ49 δηαπίζησζαλ φηη ην πξντφλ πνπ πξνθχπηεη κε αλαγσγή ελφο ειεθηξνλίνπ ιακβάλεηαη κε ηελ πξνζζήθε αζθνξβηθνχ ζηελ έλσζε Ι, είλαη έλα είδνο πςεινχ ζπηλ κε κία ηαηλία Soret, πνπ εκθαλίδεη κεγάιε νκνηφηεηα κε απηφ ηνπ ειεχζεξνπ ελδχκνπ θαη ηνπ νξαηνχ θάζκαηνο κε κηα θνξπθή ζηα 626 nm ζπγθξηηηθά κε ηε θνξπθή ηνπ ελδχκνπ ηνπ ζηδήξνπ ζηα 631 nm.

Δπηπιένλ, ην θάζκα ζηε ζηαζεξή θαηάζηαζε παξνπζία ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ δελ έδεημε θαλέλα ζεκάδη παξνπζίαο ηεο έλσζεο Ι (πνπ πξνζδηνξίδεηαη απφ ην θάζκα ππεξφμπ νμηθφ νμχ), θαη ε παξαγσγή ηεο έλσζε Ι απφ ην ππεξφμπ νμηθφ νμχ ήηαλ απξφζβιεηε απφ ηελ πξνζζήθε ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ. Ο Regelsberger θαη ε νκάδα ηνπ49 θαη ν Jakopitsch ε νκάδα ηνπ50 εξκήλεπζαλ ηα απνηειέζκαηά ηνπο απφ ηελ άπνςε ηνπ θιαζζηθνχ θχθινπ "BCT" (ζρήκα 8), πνπ απνδίδεη ηηο δηαθνξέο ζηηο νπζηψδεηο δηαθνξέο ησλ θηλεηηθψλ ζηαζεξψλ γηα ην ζρεκαηηζκφ θαη ηελ

απνζχλζεζε ηεο έλσζεο Ι, k1 θαη k2 (εμηζψζεηο (4) θαη (5)). Μηα δηαθνξεηηθή αλάιπζε παξνπζηάδεηαη ζην ζρήκα 11. Μφλν ε ππεξνμεηδηθή δξαζηηθφηεηα ησλ ελδχκσλ ηχπνπ Β κπνξεί λα πξνρσξήζεη κέζσ ηεο θαηηνληηθήο ξίδαο πνξθπξίλεο ηεο έλσζεο Ι. Η δηακφξθσζε ηεο αίκεο, αλάινγε κε απηή ηνπ θπηνρξωκάηνο c ππεξνμεηδάζεο ηεο δχκεο, κπνξεί λα επηηξέςεη κία ελαιιαθηηθή δηπιή θαηάζηαζε νμείδσζεο πνπ πεξηιακβάλεη κία πξσηετληθή

47 ξίδα. Δπηπιένλ, ην αζπλήζηζην θάζκα ηεο έλσζεο ΙΙ απηνχ ηνπ ελδχκνπ κπνξεί επίζεο λα δείμεη κηα πην ζηαζεξή πξσηετληθή ξηδηθή θαηάζηαζε απφ φηη ζηε ζπλεζηζκέλε ζηδεξηθή (ferryl) θαηάζηαζε, αθφκε θαη γηα ην ελδηάκεζν.

΢ρεκα 11 : Καηαιπηηθέο θαη ππεξνμεηδηθέο αληηδξάζεηο ελδύκωλ ηύπνπ Β. Ζ έλωζε Η θαίλεηαη ζαλ [Fe5+=O] γηαηί αληηπξνζωπεύεη είηε κηα π-ξίδα θαηηόληνο είηε κηα ελαιιαθηηθή δνκή ξίδαο.

3.7 Μεραληζκόο ηεο θαηαιπηηθήο αληίδξαζεο

3.7.1 ΢ρεκαηηζκόο ηεο έλωζεο Η

Ο πξψηνο κεραληζκφο γηα ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι είηε απφ ππεξνμεηδάζε ή απφ θαηαιάζε πξνηάζεθε ην 1980 απφ ηνπο Poulos θαη Kraut51. Απηνί βαζίζηεθαλ ζηελ ηφηε πξφζθαηε δνκή ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ θπηνρξώκαηνο c. Απηή ε κειέηε έρεη επαλεμεηαζηεί πξφζθαηα.52,53 Παξακέλεη ν ιεηηνπξγηθφο κεραληζκφο γηα ηηο ππεξνμεηδάζεο κε παξφκνηεο ελεξγέο πεξηνρέο θαη έρεη πξνζαξκνζηεί ψζηε λα εμεγήζεη ηελ θαηαιπηηθή αληίδξαζε. Σα CCP, Arg48 θαη His52 ζηελ αθξαία πιεπξά ηεο αίκεο πξνζδηνξίζηεθαλ σο θαηαιπηηθνί θαζνξηζηηθνί παξάγνληεο πνπ δεζκεχνπλ θαη πνιψλνπλ ην κφξην

ηνπ Η2Ο2 ζε ζπληνληζκφ κε ηελ αίκε ηνπ ζηδήξνπ. Ο δαθηχιηνο ηκηδαδφιεο His52, ν νπνίνο είλαη πξνζαλαηνιηζκέλνο θάζεηα ζην επίπεδν, πεξίπνπ 6Å επάλσ απφ ηελ αίκε, ιεηηνπξγεί σο απνδέθηεο πξσηνλίσλ απφ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ, ελψ ε πιεπξηθή αιπζίδα Arg, πνπ είλαη

48 ηνπνζεηεκέλε απέλαληη απφ ηελ αίκε ηνπ δαθηπιίνπ ηεο ηκηδαδφιεο, ζηαζεξνπνηεί ηα θνξηία ησλ ελδηάκεζσλ. Η πξνθχπηνπζα έλσζε Ι νμπζηδήξνπ (oxyferryl) νμεηδψλεη ην ζίδεξν ζε FeΙV θαη νμεηδψλεη έλα δεχηεξν ηζνδχλακν γηα λα ζρεκαηίζεη πξσηετληθή ξίδα πνπ ηνπνζεηείηαη ζηελ εγγχηεξε Trpl91, αλ θαη ζε κεξηθέο ππεξνμεηδάζεο φπσο ε HRP, ε νμείδσζε ηνπ δεπηέξνπ ηζνδχλακνπ βξίζθεηαη σο θαηηνληηθή ξίδα πνξθπξίλεο. Η δνκή ηεο ελεξγνχ πεξηνρήο ησλ θαηαιαζψλ–ππεξνμεηδαζψλ ηχπνπ Β βαζίδεηαη αλάινγα κε ηελ ελεξγφ πεξηνρή ησλ ππεξνμεηδαζψλ. ΢πλεπψο, νπνηνζδήπνηε κεραληζκφο πξνηείλεηαη γηα ην ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι, ζα είλαη παξφκνηνο κε ην κεραληζκφ πνπ πξνηείλεηαη γηα ην CCP. Γειαδή ηα θαηάινηπα His θαη Arg, 106 θαη 102, αληίζηνηρα, ζηε HPI, ζπκκεηέρνπλ ζηελ πφισζε ηνπ δεζκνχ Ο-Ο θαη ζηε κεηαθνξά πξσηνλίσλ γηα λα παξαγάγνπλ ηελ έλσζε Ι (ζρήκα 12Α). ΢ηελ θαηαιπηηθή κνξθή, ε HPI δελ παξνπζηάδεη θακία ζεκαληηθή θαζκαηηθή αιιαγή, γεγνλφο πνπ ππνδειψλεη φηη ε έλσζε Ι έρεη έλα νμεηδσκέλν ηζνδχλακν ππφ ηε κνξθή πξσηετληθήο ξίδαο παξά πνξθπξηθήο ξίδαο. Αθ' εηέξνπ, ε παξαιιαγή W105F ηεο HPI, ε νπνία ιεηηνπξγεί κφλν κε ππεξνμεηδηθφ ηξφπν, έρεη κηα πνξθπξηθή ξίδα πνπ παξνπζηάδεηαη θαζαξά ζηα θάζκαηα απνξξφθεζεο θαη ζην EPR.54

Ο κεραληζκφο γηα ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι ζηηο θαηαιάζεο είλαη παξφκνηνο κε απηφλ πνπ πεξηγξάθεθε γηα ηηο ππεξνμεηδάζεο. Η ελεξγφο πεξηνρή ησλ θαηαιαζψλ ηχπνπ Α επίζεο έρεη ηζηηδίλε, πνπ είλαη ζεκαληηθή γηα ηελ θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα θαη αζπαξαγίλε, ε νπνία, αλ θαη δελ είλαη ζεκαληηθή, βειηηψλεη ηε θαηάιπζε55. Παξά ηνπο πξνζαλαηνιηζκνχο ησλ ελεξγψλ πεξηνρψλ θαηάινηπσλ θαηαιάζεο, ηδηαίηεξα ε ηζηηδίλε, δηαθέξεη ζεκαληηθά απφ ηνπο πξνζαλαηνιηζκνχο ησλ ηζνδχλακσλ θαηάινηπσλ ππεξνμεηδάζεο, έρεη παξφκνην ξφιν θαη ζηα δχν έλδπκα ελψ ε αζπαξαγίλε ηεο θαηαιάζεο παίδεη παξφκνην ξφιν κε απηφλ ηεο αξγηλίλεο ηεο ππεξνμεηδάζεο (ζρήκα 12B). ΢ε αληίζεζε κε ην πξνζαλαηνιηζκφ ησλ ππεξνμεηδαζψλ, ν δαθηχιηνο ηεο ηκηδαδφιεο ηεο βαζηθήο ηζηηδίλεο ζηηο θαηαιάζεο είλαη ζην ίδην επίπεδν κε ηελ αίκε, πνπ ζπζζσξεχεηαη απνηειεζκαηηθά, πεξίπνπ 3,5 Å επάλσ απφ ηνλ δαθηχιην ΙΙΙ ηεο αίκεο b ζην BLC ή ζην δαθηχιην IV ηεο αίκεο d ζηε HPII. Όπσο ε αξγηλίλε ζηελ ππεξνμεηδάζε, ην θαηάινηπν ηεο αζπαξαγίλεο είλαη ηνπνζεηεκέλν απέλαληη

49 απφ ηελ αίκε ηεο ηζηηδίλεο ζε κηα ζέζε φπνπ ην πδξνγφλν κπνξεί λα δεζκεχζεη ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο θαηάιπζεο. Η παξνπζία παξφκνησλ θαηάινηπσλ επέηξεςε λα δηακνξθσζεί ν θαηαιπηηθφο κεραληζκφο ζχκθσλα κε ηνλ ππεξνμεηδηθφ κεραληζκφ.27

΢ρήκα 12 : Μεραληζκνί ηνπ ζρεκαηηζκνύ ηεο έλωζεο Η ζηηο θαηαιάζεο ηύπνπ Β (A): θαηαιάζε ηύπνπ Α (B) θαη ριωξνϋπεξνμεηδάζεο (Γ).

Η αιιειεπίδξαζε ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ θαη κε ηελ αίκε ηνπ FeIII θαη κε ηνλ ηκηδαδνιηθφ δαθηχιην ηεο ηζηηδίλεο απνδπλακψλεη θαη ραιαξψλεη ην δεζκφ O-H, επηηξέπνληαο ζην δεχηεξν νμπγφλν ηνπ ππεξνμεηδίνπ λα δηακνξθψζεη ηαπηφρξνλα δεζκφ πδξνγφλνπ κε ηελ ηκηδαδφιε. Σν πξσηφλην ζην Ο αιιειεπηδξά κε ην Fe θαη κεηαθέξεηαη, κέζσ ηκηδαδφιεο, ζην δεχηεξν νμπγφλν, παξάγνληαο χδσξ θαη ηελ έλσζε Ι. Σν θαηάινηπν ηεο αζπαξαγίλεο ζπκκεηέρεη κέζσ ηνπ δεζκνχ ηνπ πδξνγφλνπ κε ην ππεξνμείδην θαη ζηαζεξνπνηεί ηα πνισκέλα ελδηάκεζα.

Γηα ηελ ρισξνυπεξνμεηδάζε, κηα θαηαιάζε ηχπνπ D, ν κεραληζκφο γηα ηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι δηαθέξεη ζεκαληηθά απφ εθείλνλ πνπ πεξηγξάθεθε επεηδή ην κφλν θαηάινηπν ηεο ελεξγήο πεξηνρήο πνπ είλαη αξθεηά θνληά ζην ζίδεξν ηεο αίκεο θαη κπνξεί λα ζπκκεηέρεη άκεζα ζηελ αληίδξαζε είλαη ε γινπηακίλε183. Η γινπηακίλε είλαη πδξνγφλν πνπ ζπλδέεηαη κε ηε His105,

50 αιιά ε ηειεπηαία είλαη πνιχ καθξηά γηα λα ζπκκεηέρεη άκεζα ζηελ αληίδξαζε

κε ην Η2Ο2. Δπνκέλσο, ην Η2Ο2 αξρηθά πξέπεη λα ζπλδεζεί κε ηελ ελεξγφ πεξηνρή ηεο αίκεο ηνπ FeΙΙΙ θαη κε ηελ γινπηακηληθή πιεπξηθή αιπζίδα. Καζψο ε αληίδξαζε πξνρσξά, έλαο δεχηεξνο δεζκφο πδξνγφλνπ κπνξεί λα δηακνξθσζεί ζηελ πςειά ειεθηξναξλεηηθή γινπηαληκηθή πιεπξηθή αιπζίδα, ψζηε λα δηεπθνιχλεηαη ε κεηαθνξά πξσηνλίσλ απφ ην Fe–O-H ζην δεχηεξν O, παξάγνληαο χδσξ θαη ηελ έλσζε Ι (ζρήκα 12Γ). Λακβάλνληαο ππφςε ηηο πηζαλέο δηαθνξέο πνπ πξνθχπηνπλ απφ ηηο δνθηκέο ζε δηαθνξεηηθά εξγαζηήξηα, ε θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα ηεο ρισξνυπεξνμεηδάζεο δελ είλαη πεξηζζφηεξν απφ 2% απφ ηε δξαζηηθφηεηα ησλ θαηαιαζψλ ηχπνπ Α ή Β, πξνηείλεηαη φηη ε ελεξγφο πεξηνρή ηεο ρισξνυπεξνμεηδάζεο δελ βειηηζηνπνηείηαη γηα ηε θαηαιπηηθή αληίδξαζε, ζχκθσλα κε ην φηη είλαη κηα πιεπξηθή αληίδξαζε.

Ο πξνζαλαηνιηζκφο ησλ θαηαινίπσλ ζηελ αθξαία πιεπξά ηεο αίκεο δελ βειηηζηνπνηείηαη γηα ηε θαηαιπηηθή αληίδξαζε κέρξη ην ζεκείν πνπ ππάξρεη έλαο έθηνο ππνθαηαζηάηεο ηεο αίκεο, κηα ηζηηδίλε, ε νπνία ζα απέθιεηε κηα ζηελή έλσζε ηεο αίκεο κε ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ ρσξίο κηα ζεκαληηθή κεηαθίλεζε ηεο πιεπξηθήο αιπζίδαο. Απηφ γίλεηαη κφλν κεηά απφ εθηεηακέλε

ζεξαπεία κε H2Ο2 θαη γίλεηαη εκθαλήο ε νμείδσζε ηνπ Fe ζε κηα ρακειή θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα.

51 3.7.2 Αλαγωγή ηεο έλωζεο Η

Ο κεραληζκφο γηα ηελ αλαγσγή ηεο έλσζεο Ι απφ ηηο θαηαιάζεο πξέπεη λα δηαθέξεη ζεκαληηθά απφ ην κεραληζκφ ησλ ππεξνμεηδαζψλ ιφγσ ηεο ζπκκεηνρήο ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ σο δφηε δχν ειεθηξνλίσλ παξά ηα δηαδνρηθά νξγαληθά ππνζηξψκαηα πνπ ελεξγνχλ σο δφηεο ελφο ειεθηξνλίνπ. Βαζηζκέλνη πάιη ζηελ ππεξνμεηδηθή αληίδξαζε, νη θαηαιάζεο– ππεξνμεηδάζεο ή θαηαιάζεο ηχπνπ Β ζεσξήζεθαλ αξρηθά φηη πξνζιακβάλνπλ ηηο Arg102 θαη His1u6 (HPII) σο θαηαιπηηθά θαηάινηπα ζην ζηάδην ηεο αλαγσγήο. Δληνχηνηο, λεφηεξα ζηνηρεία πξνηείλνπλ φηη ε ελεξγή πεξηνρή ηεο ηξππηνθάλεο, Trp105 ζε HPI, παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν. Η απφζπαζε ηεο Trp105, δελ έρεη επηπηψζεηο ζηνλ ζρεκαηηζκφ ηεο έλσζεο Ι κέρξη ην ζεκείν φπνπ ε έλσζε Ι λα κπνξεί λα πξνζδηνξηζηεί κε θαζκαηνκεηξία EPR, εκπνδίδνληαο ζεκαληηθά ηελ αλαγσγή ηνπ ππνζηξψκαηνο απφ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ.56 Δπεηδή δελ είλαη δπλαηφλ ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ λα δεζκεπηεί ηαπηφρξνλα θαη ζηα ηξία His106, Trp105, θαη Arg102, έλα ηξνπνπνηεκέλν δεχηεξν ζηάδην πξνηείλεηαη ζην νπνίν ν δαθηχιηνο ηεο ηλδφιεο Trp105 έρεη έλαλ ξφιν αλάινγν κε απηφλ ηεο ελεξγνχ πεξηνρήο ηεο Asn ζηηο θαηαιάζεο ηχπνπ Α. Μαδί κε ηελ ηκηδαδφιε ηεο His106, δεζκεχεη ην δεχηεξν ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ θαη δηεπθνιχλεη ηε κεηαθνξά πδξνγφλνπ ζην νμπγφλν νμπζηδήξνπ (oxyferryl) θαη ζηνλ ηκηδαδνιηθφ δαθηχιην His106. Η ηειηθή κεηαθνξά ηνπ δεχηεξνπ ηζνδχλακνπ πνπ αλάγεηαη, απφ ηελ ηκηδαδφιε ηνπ His106 ζε Fe–O–H, νινθιεξψλεη ηνλ θχθιν, παξάγνληαο χδσξ θαη ην εγγελέο έλδπκν (ζρήκα 13A). Απηφο ν κεραληζκφο είλαη αλεμάξηεηνο απφ ηε πξσηετληθή θαη ηε δνκή πνξθπξίλεο ηεο ξίδαο ηεο έλσζεο Ι.

΢ηηο θαηαιάζεο ηχπνπ Α, ππάξρνπλ κφλν δχν θαηάινηπα ελεξγψλ πεξηνρψλ ζε ζέζεηο φπνπ κπνξνχλ λα επεξεάζνπλ ηελ αληίδξαζε, ε ηζηηδίλε θαη ε αζπαξαγίλε. Έλαο κεραληζκφο γηα ηελ αλαγσγή ηεο έλσζεο Ι ζηηο θαηαιάζεο πξνηάζεθε απφ ηνπο Fita θαη Rossmann27 ζε BLC πεξηιακβάλνληαο απηά ηα

δχν θαηάινηπα. Σν Η2Ο2 δεζκεχεη ηελ έλσζε Ι, ζρεκαηίδνληαο δεζκνχο πδξνγφλνπ κε ην νμπγφλν ηνπ νμπζηδήξνπ (oxyferryl), ηε Ηis ηκηδαδφιε θαη ηε πιεπξηθή αιπζίδα Asn. Απηή ε δνκή επηηξέπεη ηε κεηαθνξά ελφο πδξνγφλνπ ζην νμπγφλν ηνπ νμπζηδήξνπ (oxyferryl) θαη κεηά ζηελ ηκηδαδφιε, κε ζπλέπεηα

52 ην ζρεκαηηζκφ ηνπ νμπγφλνπ. Σν πδξνγφλν θαη ην δεχηεξν ηζνδχλακν πνπ αλάγεηαη ζε ηκηδαδνιηθφ δαθηχιην ζα κπνξνχζε λα κεηαθεξζεί ζην FeΙV-OH γηα λα παξάγεη χδσξ θαη λα αλαπαξαγάγεη ην έλδπκν ζηελ εγγελή θαηάζηαζε ηνπ (ζρήκα 13B). Ο ξφινο ηεο Asn ζε απηφ ην ζηάδην είλαη λα ζηαζεξνπνηεί ην αλαγελλεκέλν νμπγφλν θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αληίδξαζεο.55

Η αλαγσγή ηεο έλσζεο Ι ζε ρισξνυπεξνμεηδάζε δηαθέξεη θαη απφ απηή ησλ κεραληζκψλ ησλ θαηαιαζψλ ηχπνπ Α θαη Β επεηδή απφ απηά έρνπκε έλα εληαίν θαηάινηπν γινπηακηληθνχ νμένο γηα λα θαηαιχζεη ηελ αληίδξαζε. Σν

Η2Ο2πνπ αλάγεηαη πξέπεη αξρηθά λα δεζκεπηεί κε ηε γινπηακηληθή πιεπξηθή αιπζίδα θαη ην νμπγφλν ηνπ νμπζηδήξνπ (oxyferryl). Η πςειή ειεθηξαξλεηηθή γινπηακίλε εμαγάγεη εχθνια έλα πξσηφλην απφ ην ππεξνμείδην, αιιά είλαη δπζθνιφηεξν λα ζπιιάβεη έλα πδξνγφλν ή λα αλάγεη ην ηζνδχλακν πνπ κεηαθέξεηαη ζε απηφ. Καη νη δχν επηινγέο εμεηάδνληαη παξαθάησ. ΢ηελ πξψηε,

ην Η2Ο2 είλαη ηζρπξά πνισκέλν απφ ηε γινπηακίλε, κε ζπλέπεηα κεηαθνξά πδξηδίσλ ζην νμπγφλν νμπζηδήξνπ (oxyferryl) θαη ηε ηαπηφρξνλε κεηαθνξά πξσηνλίσλ ζηε γινπηακίλε. Σν πξσηφλην ηεο γινπηακίλεο κεηαθέξεηαη ζην FeΙI-O-H γηα λα παξαγάγεη χδσξ θαη ην εγγελέο έλδπκν. ΢ηε δεχηεξε επηινγή, ην ηζνδχλακν πνπ αλάγεηαη, έλα πδξνγφλν, κεηαθέξνληαη ζην νμπγφλν ηνπ νμπζηδήξνπ (oxyferryl). Σν δεχηεξν ηζνδχλακν πνπ αλάγεηαη θαη ην πξσηφλην κεηαθέξνληαη ζηε γινπηακίλε θαη απεληνπίδεηαη ζηε πεξίπινθε έλσζε πνπ πεξηέρεη Glu183, His105, πξσηνληνκέλεο αιπζίδεο, θαη έλα θαηηφλ ηνπ ΜnΙΙ. Απηφ ην ηζνδχλακν κεηαθέξεηαη πίζσ ζην FeIV–O-H γηα λα νινθιεξψζεη ηελ αληίδξαζε (ζρήκα 13Γ). Πξνθαλψο, ε παξνπζία γινπηακίλεο κφλν ζηελ αθξαία πιεπξά δελ εκθαλίδεη ηε βέιηηζηε θαηαιπηηθή πεξηνρή γηα ηελ αληίδξαζε κε ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ, εμεγψληαο ηελ ρακειή δξαζηηθφηεηα.

53

΢ρήκα 13 : Μεραληζκνί αλαγωγήο ηεο έλωζεο Η ηωλ θαηαιαζώλ ηύπνπ Β (A) θαηαιάζεο ηύπνπ Α (B) θαη ριωξνϋπεξνμεηδάζεο (Γ)

54 4. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 4 Τπεξνμεηδάζεο

4.1 Δηζαγωγή

Οη ππεξνμεηδάζεο είλαη έλδπκα πνπ πεξηέρνπλ αίκε θαη νμεηδψλνπλ πνηθηιία μελνβηνηηθψλ νπζηψλ κε ππεξνμεηδίν ηνπ πδξνγφλνπ.56 Σν εγγελέο έλδπκν πεξηέρεη κία αίκε, ζπλήζσο ζηδεξηθή πξσηνπνξθπξίλε, κε ηέζζεξηο δεζκνχο ππξνιίνπ-αδψηνπ ζην Fe(ΙΙΙ). Η πέκπηε ζέζε ζχκπιεμεο ζηελ θεληξηθή πιεπξά ηεο αίκεο είλαη ζπλήζσο ε πιάγηα αιπζίδα ηνπ ηκηδαδνιηθνχ δαθηπιίνπ ηνπ θαηάινηπνπ ηζηηδίλεο. Η έθηε ζέζε ζχκπιεμεο είλαη θελή ζην θεληξηθφ έλδπκν ζηελ αθξαία πιεπξά ηεο αίκεο. Ο αθφινπζνο θχθινο ησλ αληηδξάζεσλ πεξηιακβάλεη ηελ νμείδσζε ησλ μελνβηνηηθψλ (X):

Τπεξνμεηδάζε + ROOH → έλσζε Ι + ROH

Έλσζε Ι + XOH → έλσζε ΙΙ + XO∙

∙ Έλσζε ΙΙ + XOH → ππεξνμεηδάζε + XO + H2Ο

Οη ππεξνμεηδάζεο ηωλ θπηώλ, π.ρ. ε ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish) θαη νη κπθεηηαθέο ππεξνμεηδάζεο, π.ρ. ε ππεξνμεηδάζε ηεο δχκεο ζην θπηόρξωκα c, απνηεινχληαη πεξίπνπ απφ 300 ακηλνμέα θαη δεζκνχο αίκεο, ελψ νη ππεξνμεηδάζεο ησλ ζειαζηηθψλ είλαη κεγαιχηεξεο (576-738 ακηλνμέα) θαη ν δεζκφο ηεο αίκεο είλαη νκνηνπνιηθφο. Βάζεη ηεο αθνινπζίαο νκφινγσλ ακηλνμέσλ, έρνπλ πξνηαζεί ηξεηο νηθνγέλεηεο θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ: θαηεγνξία Ι, πξνθαξπωηηθέο ππεξνμεηδάζεο, π.ρ. ππεξνμεηδάζεο θπηνρξώκαηνο c δύκεο θαη θπηηθέο αζθνξβηθέο ππεξνμεηδάζεο (κηθξφηεξε ππεξνμεηδάζε κε 251 ακηλνμέα) θαηεγνξία ΙΙ, εθθξηηηθή κπθεηηαθή

55 ππεξνμεηδάζε θαη θαηεγνξία ΙΙΙ, εθθξηηηθή θπηηθή ππεξνμεηδάζε (ER– ζηνρεπφκελα), π.ρ. ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (Horseradish peroxidase) ηζνέλδπκα ππεξνμεηδάζεο C. Η θαηεγνξία III ησλ ππεξνμεηδαζψλ πεξηέρεη δνκηθφ Ca2+, γέθπξεο δηζνπιθίδησλ θαη ζηνρεχεη ζηελ εθθξηηηθή δηάβαζε κέζσ ηνπ ελδνπιαζκαηηθνχ δηθηχνπ. Έρνπλ πξνζδηνξηζηεί πεξηζζφηεξα απφ 40 γνλίδηα ππεξνμεηδαζψλ ζηνλ κηθξννξγαληζκφ Arabidopsis, ν νπνίνο έρεη πέληε ρξσκνζψκαηα θαη ην κηθξφηεξν κέγεζνο γνληδηψκαηνο (~100 Μb) απφ ηα πςειφηεξα θπηά κε ιίγα θαη κηθξά εζψληα θαη επαλαιακβαλφκελν DNA. Απηέο νη θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο παίδνπλ ξφιν ζην κεηαβνιηζκφ ηεο απμίλεο, πνπ είλαη κηα νξκφλε γηα ηελ αλάπηπμε. Δπίζεο ρξεζηκεχνπλ ζηελ εμσθπηηαξηθή ππεξάζπηζε έλαληη ησλ παζνγφλσλ θαη ηεο πίεζεο, ηεο βηνζχλζεζεο θαη ηεο ππνβάζκηζεο ηεο ιηγλίλεο, ζηελ ελδνθπηηαξηθή αθαίξεζε ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ θαη ζηελ νμείδσζε ησλ ηνμηθψλ αλαγσγψλ. Οη θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο πξνθαινχληαη απφ ηελ πίεζε, π.ρ. επίζεζε παζνγφλσλ, ηξαπκαηηζκφ, ζεξκφηεηα, θξχν, UV αθηηλνβνιία. Οη κπθεηηαθέο/θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο πηζαλφλ πξνέθπςαλ απφ ην δηπιαζηαζκφ ησλ γνληδίσλ απφ έλα πξφγνλν γνλίδην πνπ θσδηθνπνίεζε πέληε έιηθεο, έλαλ ππνθαηαζηάηε αίκεο His, έλαλ ππνθαηαζηάηε Αsp ή Asn κε δεζκφ πδξνγφλνπ ζην His θαη κηα Ca2+ δεζκηθή πεξηνρή.57 Οη ππεξνμεηδάζεο ησλ ζειαζηηθψλ πηζαλά πξνέθπςαλ απφ έλα δηαθνξεηηθφ πξφγνλν γνλίδην απφ φηη νη θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο θαη παίδνπλ ξφιν ζηε ζχλζεζε ηνπ ζπξενεηδή ή ηελ ππεξάζπηζε ησλ νξκνλψλ έλαληη ζηα παζνγφλα.

Δλψ ν αθξηβήο κεραληζκφο δελ έρεη αθφκα δηεπθξηληζηεί, νη ππεξνμεηδάζεο είλαη γλσζηφ φηη παίδνπλ ξφιν ζηελ κείσζε νξηζκέλσλ παζνγελεηψλ ησλ θπηψλ.58 Οη ππεξνμεηδάζεο ρξεζηκνπνηνχληαη ζαλ ηζηνξηθνί δείθηεο. Η ππεξνμεηδάζε θπηνρξώκαηνο c ρξεζηκνπνηείηαη ζαλ θαζνξηζκέλν πξφηππν γηα ηελ νμεηδάζε ηνπ θπηνρξώκαηνο c. Η νηθνγέλεηα ησλ ππεξνμεηδαζψλ γινπηαζεηόιεο ρξεζηκνπνηεί ηε γινπηαζεηφιε ζαλ δφηε ειεθηξνλίσλ θαη είλαη ελεξγή κε ην Η2Ο2 θαη κε ηελ νξγαληθή πδξνυπεξνμεηδάζε ζαλ ππφζηξσκα. Σα Gpx1, Gpx2, Gpx3 θαη Gpx4 ππάξρνπλ ζηα έλδπκα πνπ πεξηέρνπλ ζειήλην. Οη amyloid beta, φηαλ δεζκεπηεί κε ηελ αίκε, έρνπλ ππεξνμεηδαηηθή δξαζηηθφηεηα.59 Μηα ηππηθή νκάδα ππεξνμεηδαζψλ είλαη θαη νη haloperoxidase. Η νκάδα απηή κπνξεί λα ζρεκαηίζεη ελεξγά είδε αινγφλνπ

56 θαη ζαλ απνηέιεζκα, νπδέηεξα ππνζηξψκαηα νξγαληθψλ αινγφλσλ. Η πιεηνςεθία ησλ αθφινπζσλ πξσηετληθψλ ππεξνμεηδαζψλ κπνξνχλ λα αλαδεηεζνχλ ζηε βάζε δεδνκέλσλ γηα ηηο ππεξνμεηδάζεο (peroxibase).

Οη ππεξνμεηδάζεο βξίζθνπλ δηάθνξεο εθαξκνγέο. Μπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ σο ζεξαπεία γηα ηα απφβιεηα. Γηα παξάδεηγκα, νη θαηλφιεο, νη νπνίεο είλαη ζεκαληηθφο ξχπνο, κπνξνχλ λα απνκαθξπλζνχλ κε ελδπκηθή θαηάιπζε πνιπκεξηζκνχ ρξεζηκνπνηψληαο ζαλ ππφζηξσκα HPR. Έηζη νη θαηλφιεο νμεηδψλνληαη ζε θαηλφμπ ξίδεο, νη νπνίεο θαηά θχξην ιφγν ρξεζηκνπνηνχληαη ζε αληηδξάζεηο πνπ παξάγνπλ πνιπκεξή θαη νιηγνκεξή πνπ είλαη ιηγφηεξν ηνμηθά απφ φηη νη θαηλφιεο.

Δπηπιένλ ε ππεξνμεηδάζε κπνξεί λα είλαη κηα ελαιιαθηηθή ιχζε γηα ηα έληνλα ρεκηθά, αξρίδνληαο απφ ηηο έληνλεο ζπλζήθεο αληίδξαζεο. Τπάξρνπλ πνιιέο κειέηεο γηα ηελ ρξήζε ησλ ππεξνμεηδαζψλ φπσο ζε θφιιεο, ζηα ηζηπ ησλ ππνινγηζηψλ, ζηα αληαιιαθηηθά απηνθηλήησλ θαη ζηα κεηαιιηθά θνπηηά.

΢ρήκα 14. Σξηζδηάζηαηε αλαπαξάζηαζε ηεο θξπζηαιιηθήο δνκήο κε αθηίλεο Υ ηεο ππεξνμεηδάζεο ηεο γινπηαζεηόιεο.

57 4.2 Καηαζηάζεηο νμείδωζεο ηεο νηθνγέλεηαο ηεο ππεξνμεηδάζεο

Οη ππεξνμεηδάζεο δελ ρξεζηκνπνηνχληαη κφλν γηα ηελ αλάγσγή δχν ειεθηξνλίσλ ζηα πδξνυπεξνμείδηα γηα λα ζρεκαηίζνπλ ηελ αληίζηνηρε αιθνφιε θαη γηα κηα θαζκαηνζθνπηθά αληρλεχζηκε πςειφηεξε θαηάζηαζε νμείδσζεο πνπ απνθαιείηαη έλσζε Ι, αιιά θαη γηα λα νμεηδψζνπλ ηνλ θπζηθφ δφηε ή ηηο μελνβησηηθέο νπζίεο κε πνιπάξηζκεο θπςεινεηδείο ιεηηνπξγίεο ή απνηειέζκαηα. Απφ ηε θαζκαηνζθνπηθή κειέηε (ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηνπ παξακαγλεηηθνχ ζπληνληζκνχ (EPR)) πξνηείλεηαη φηη έλαο δεζκφο Fe=O ζρεκαηίδεηαη ζηελ έλσζε Ι, πηζαλψο κε κεηαθνξά ελφο ειεθηξνλίνπ απφ ηνλ δαθηχιην πνξθπξίλεο ζηνλ ζίδεξν ζηελ πεξίπησζε ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αξγηνξάπαλνπ (horseradish peroxidase). Απηφ ζπκθσλεί κε ηελ έλσζε Ι ζαλ νκάδα δεζκνχ ζηδήξνπ FeIV=Ο (πνξθπξπθή π–ξίδα θαηηφλησλ κε ην ηεηξαζρηδή ππνθαηαζηάηε Por·+FeIV=Ο). Ωζηφζν, νη κειέηεο κεηαιιαμηνγέλεζεο εηδηθήο πεξηνρήο πξνηείλνπλ φηη ζηελ ππεξνμεηδάζε ησλ ζειαζηηθψλ, π.ρ. ζηελ PGHS-1, ην ειεθηξφλην κεηαθέξεηαη απφ ηελ ηπξνζηλάζε (Tyr) 38560 έηζη ψζηε ε έλσζε Ι λα είλαη πηζαλψο ε Tyr·+FeIV=O. Η ηζνδχλακε κνξθή ηεο έλσζεο Ι ηεο αηκνγινβίλεο ή κπνγινβίλεο πεξηιακβάλεη ηνλ πξψην ζρεκαηηζκφ ξίδαο απφ Tyr103 θαη έπεηηα ηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ην Tyr151 θαη έλα θαηάινηπν ηξππηνθάλεο.61,62 Απφ ηελ άιιε κεξηά ε ιαθηνυπεξνμεηδάζε θαη ε ππεξνμεηδάζε ηνπ ζπξενεηδνύο, αληηδξνχλ μαλά κε

H2Ο2 γηα λα δψζνπλ κηα αζηαζή νμνζηδεξηθή ξίδα πνξθπξίλεο π-θαηηφλησλ πνπ αληηδξά κε ηελ πξσηετληθή ηπξνζίλε ή ηξππηνθάλε θαη ηζνκεξηψλεη ηηο πξσηετληθέο ξίδεο νμνζηδήξνπ. Η πνξθπξηθή θαηηνληηθή π-ξίδα Ι θαηαιχεη ηελ νμείδσζε δχν ειεθηξνλίσλ ηνπ ησδίνπ ζε ππντσδηψδεο, ην νπνίν ησδηψλεη ηελ ηπξηζίλε ηεο ζπξενζθαηξίλεο ζε δητσδνηπξνζπλάζε. Η θαηηνληηθή ξίδα Ι έπεηηα θαηαιχεη ηελ νμείδσζε ελφο ειεθηξνλίνπ ηεο ζπξενζθαηξίλεο δητσδνηπξνζπλάζεο γηα λα ζρεκαηίζεη θαηλφμπ ξίδεο πνπ ππνβάιινληαη ζε ζχδεπμε γηα λα ζρεκαηίζνπλ ηελ ζπξημίλε ζπξενζθαηξίλεο.63 Ο ζρεκαηηζκφο ηεο έλσζεο Ι απφ ην θπηόρξωκα c ζηελ ππεξνμεηδάζεο ηεο δχκεο πεξηιακβάλεη ηε κεηαθνξά ελφο ειεθηξνλίνπ απφ ηε Trp191 ζην δαθηχιην πνξθπξίλεο, ζπλεπψο, απηή ε ππεξνμεηδάζε θαηαιχεη ην δηκεξηζκφ ηεο ηπξνζίλεο φρη ηελ ησδίσζε.

58 Η δξαζηηθφηεηα ηεο θπθιννμπγνλάζεο ηεο PGHS-1 θαηαιχεη ηελ νμπγφλσζε ηνπ αξαρηδνληθνχ νμένο γηα λα δηακνξθψζεη ην πδξνυπεξνμείδην ηεο ελδνυπεξνμεηδάζεο, PGG2. Οη μελνβηνηηθέο νπζίεο κπνξνχλ επίζεο λα ελεξγήζνπλ σο δφηεο ειεθηξνλίσλ θαη νμεηδψλνληαη μαλά γηα λα ζρεκαηίζνπλ ξίδεο πνπ ζηε ζπλέρεηα νμεηδψλνληαη πάιη ζε δηάθνξνπο θπζηθνχο δφηεο ειεθηξνλίσλ, π.ρ. πξσηεΐλεο, λνπθιετληθά νμέα θαη ιηπίδηα.

4.3 Καηαιπηηθή πεξηνρή ηεο νηθνγέλεηαο ηωλ ππεξνμεηδαζώλ

Σα ραξαθηεξηζηηθά ηεο νηθνγέλεηαο ηεο αλζξψπηλεο ππεξνμεηδάζεο ζπλνςίδνληαη ζηνλ πίλαθα 1 θαη πεξηιακβάλνπλ ηελ ηαπηφηεηα ησλ αθξαίσλ θαη θεληξηθψλ ακηλνμέσλ ηεο θαηαιπηηθήο πεξηνρήο. Όπσο έρεη πξνηαζεί γηα ηελ αίκε ηεο ππεξνμεηδάζεο ηεο δχκεο θπηνρξώκαηνο c ππεξνμεηδάζεο ε αθξαία ηζηηδίλε ησλ ππεξνμεηδαζψλ ησλ ζειαζηηθψλ ιεηηνπξγεί ζαλ φμηλν/βαζηθφο θαηαιχηεο πνπ βνεζά ην πδξνυπεξνμείδην λα απνπξσηνλησζεί θαη ζηελ πξσηνλίσζε ηνπ κνξίνπ ηνπ χδαηνο κεηά απφ ην ζπάζηκν ηνπ δεζκνχ Ο-Ο. Η θαηεπζπλφκελε πεξηνρή κεηαιιαμηνγέλεζεο PGHS-1 θαη ε έθθξαζε απηψλ ησλ κεηαιιάμεσλ ζηα θχηηαξα ηνπ COS έρνπλ δείμεη φηη νη δξαζηηθφηεηεο ησλ ππεξνμεηδαζψλ θαη ησλ θπθιννμπγελάζεσλ θαηαξγνχληαη απφ ηε κεηάιιαμε ηεο θεληξηθήο His388 ή ηεο αθξαίαο His207.64 Η θξπζηαιινγξαθία αθηηλψλ X65 θαη ε θαηεπζπλφκελε πεξηνρή κεηαιιαμηγέλεζεο66 έρνπλ δείμεη φηη ε θεληξηθή ηζηηδίλε (His336) ηεο κπεινυπεξνμεηδάζεο δηεπθνιχλεηαη απφ έλα δεζκφ πδξνγφλνπ κε Asp235 φηαλ ζπλδέεηαη νκνηνπνιηθά ζην ζίδεξν ηεο αίκεο. Δπηπιένλ, ε αθξαία ηζηηδίλε (His15) θαη ε εγγχο αξγηλίλε (Arg239) ηνπνζεηνχληαη ζην ππεξνμείδην ηνπ δεζκνχ ηζέπεο πνπ ζπκκεηέρεη πηζαλψο ζην ζπάζηκν ηνπ δεζκνχ ηνπ ππεξνμεηδίνπ Ο-Ο, κε ηελ ηζηηδίλε λα ελεξγεί σο γεληθφο φμηλν/βαζηθφο θαηαιχηεο. Οη θξπζηαιιηθέο δνκέο ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ ζπξενεηδνχο, ηεο ιαθηνυπεξνμεηδάζεο, θαη ηεο εσζηλφθηιεο ππεξνμεηδάζεο δελ είλαη δηαζέζηκεο. Δληνχηνηο, ππάξρεη κηα αθνινπζία ακηλνμέσλ ηαπηφζεκε κε ηηο εσζηλφθηιεο, ιαθηνυπεξνμεηδάζε, ππεξνμεηδάζε ηνπ ζπξενεηδή 70, 61, θαη 47%, αληίζηνηρα, ηεο κπεινυπεξνμεηδάζεο. Η παξάηαμε ζηε ζεηξά απηψλ ησλ

59 ζπληεξεκέλσλ αιιεινπρηψλ ακηλνμέσλ ζεσξείηαη ζεκαληηθή ζην ζρεκαηηζκφ ππεξνμεηδαζψλ έλσζεο Ι πξνηείλνληαο φηη νη His494 θαη His239 ππεξνμεηδάζεο ηνπ ζπξενεηδή αληηζηνηρνχλ ζηελ θεληξηθή θαη ζηελ αθξαία ηζηηδίλε ηεο κπεινυπεξνμεηδάζεο. Η δξάζε ηεο His494 δηεπθνιχλεηαη πηζαλψο απφ ηε Asn579.67 Απηή ε νκνηφηεηα ζηηο ζπληεξεκέλεο αιιεινπρίεο ακηλνμέσλ πνπ δεζκεχνπλ κε ην ζρεκαηηζκφ ππεξνμεηδάζεο έλσζεο Ι πξνηείλεη φηη φιεο νη ππεξνμεηδάζεο αλήθνπλ ζηελ ππεξνηθνγέλεηα ησλ ππεξνμεηδαζψλ. Δληνχηνηο, ζηηο δσηθέο ππεξνμεηδάζεο, ην πδξνγφλν ζηελ θεληξηθή ηζηηδίλε ζπλδέεηαη κε ηελ αζπαξαγίλε, ελψ ε θεληξηθή ηζηηδίλε ζηηο κπθεηηαθέο/βαθηεξηδηαθέο/θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο δεζκεχεη πδξνγφλν κε ην αζπαξηηθφ νμχ. Απηφ πξνηείλεη φηη νη ππεξνμεηδάζεο ησλ ζειαζηηθψλ αλήθνπλ ζε κηα δηαθνξεηηθή νηθνγέλεηα γνληδίσλ απφ ηηο κε–δσηθέο ππεξνμεηδάζεο.

Πίλαθαο 1. Αλζξώπηλε νηθνγέλεηα ππεξνμεηδάζεο: πξωηεϊληθά ραξαθηεξηζηηθά

Μνξηαθό Τπνθπηηαξηθή Οκόινγα Άλω Δγγύο Τπεξνμεηδάζεο Κύηηαξα βάξνο Τπνκνλάδεο Ακηλνμέα ζέζε κε ΜPO ακηλνμύ ακηλνμύ (kDa) Neutrophils, MPO Lysosomes 75 x 2 57, 14 580 x 2 100% His95 His336 leukocytes EPO Eosinophils Lysosomes 70 57, 11 576 70% His388? Mammary, ductalepithe lial cell, Extracellular, LPO Secretory milk, saliva, 75 712 61% His383? cells of tears exocrine glands Thryrocyte (thyroid Roygh e.r., Golgi fallicular TPO apical 105 738 47% His239 His494 cells), membrane perinuclear membrane Plateles, PGHS-1 Seminal 70 x 2 70 600 x 2 His207 His338 vesicles Inflammator PGHS-2 57,11 70 x 2 70 604 x 2 y cells Oxidase p138 NADPH 1210 (TOX) oxidase

60 4.4 Βάζε δεδνκέλωλ ππεξνμεηδαζώλ (PeroxiBase)

Οη ππεξνμεηδάζεο (ΔC 1.11.1.x), πνπ θσδηθνπνηνχληαη απφ κηθξέο ή κεγάιεο πνιπγνληδηαθέο νηθνγέλεηεο, εκπιέθνληαη ζε αξθεηέο ζεκαληηθέο θπζηνινγηθέο θαη αλαπηπμηαθέο δηαδηθαζίεο. Αλαιχνληαο ηελ εμέιημε θαη ηελ θαηαλνκή ηνπο κεηαμχ ησλ δηαθφξσλ phyla ζα κπνξνχζε λα θσηηζηεί ην κπζηήξην ηεο εμαηξεηηθά εθηεηακέλεο θαη δηαθνξνπνηεκέλεο παξνπζίαο ηνπο ζε ζρεδφλ φινπο ηνπο δσληαλνχο νξγαληζκνχο. Η Βάζε δεδνκέλσλ (PeroxiBase) δεκηνπξγήζεθε αξρηθά γηα ηελ εμαληιεηηθή ζπιινγή ηεο θαηεγνξίαο αιιεινπρηψλ ππεξνμεηδάζεο ΙΙΙ απφ ηα θπηά.68 Η επέθηαζε ηεο βάζεο δεδνκέλσλ ηεο ππεξνμεηδάζεο ηεο θαηεγνξίαο ΙΙΙ ζε φιεο ηηο πξσηεΐλεο πνπ κπνξνχλ λα αλάγνπλ κφξηα ππεξνμεηδίνπ είλαη αλάγθαία. Η βάζε δεδνκέλσλ καο πεξηέρεη αηκηθνχ θαη κε αηκηθνχ ραξαθηήξα αιιεινπρίεο ππεξνμεηδαζψλ πνπ πξνήιζαλ απφ ζρνιηαζκέλε ή φρη ζσζηά ζρνιηαζκέλε αιιεινπρία, θαη θαηαηίζεληαη θπξίσο ζηηο GenBank ή UniProt KnowledgeBase. Απηή ε λέα βάζε δεδνκέλσλ ζα επηηξέςεη λα επηηεπρζεί γεληθή επηζθφπεζε ηεο εμέιημεο ησλ νηθνγελεηψλ ησλ πξσηετλψλ. ΢ε απηφ ην ηαρχηαηα αλαπηπζζφκελν πεδίν, ππάξρεη αλάγθε γηα ζπλερή ελεκέξσζε θαη δηνξζψζεηο ησλ αιιεινπρηψλ πξσηετληθψλ ππεξνμεηδαζψλ. Μεηά ηελ έιιεηςε ελνπνηεκέλεο νλνκαηνινγίαο, εηζήρζε επίζεο κηα κνλαδηθή ζχληκεζε γηα θάζε δηαθνξεηηθή νηθνγέλεηα ππεξνμεηδαζψλ. Απηφ απνζθνπεί ζην λα αλαθέξεηαη ε εμέιημε ηεο βάζεο δεδνκέλσλ PeroxiBase, πνπ είλαη ειεχζεξα πξνζβάζηκε κέζσ ελφο δηαθνκηζηή (http://peroxibase.isb-sib.ch). Δπηπιένλ, λέεο θαηεγνξίεο ππεξνμεηδαζψλ, λέα εηδηθά εξγαιεία έρνπλ δεκηνπξγεζεί γηα λα δηεπθνιπλζεί ε αλαδήηεζε, ε ηαμηλφκεζε θαη ππνβνιή ησλ αιιεινπρηψλ ππεξνμεηδαζψλ.

61 Πίλαθαο 2 : Ζ δηεζλήο έλωζε ηεο βηνρεκείαο θαηάηαμε ηωλ ππεξνμεηδαζώλ

EC Απιθμόρ Πποηεινόμενο όνομα Σςνηομογπαθία ζηην peroxibase

EC 1.11.1.1 NADH peroxidase NadPrx

EC 1.11.1.2 NADPH peroxidase

EC 1.11.1.3 Fatty acid peroxidase

EC 1.13.11.11 Tryptophan 2,3-dioxygenase Γελ ζεσξείηαη πιένλ ππεξνμεηδάζε

ΔC 1.11.1.5 Cytochrome-c peroxidase CcP, DiHCcP

EC 1.11.1.6 Catalase Kat, CP

EC 1.11.1.7 Peroxidase Haem peroxidase

EC 1.11.1.8 Iodide peroxidase TPO

EC 1.11.1.9 Glutathione peroxidase GPx

EC 1.11.1.10 Chloride peroxidase HalPrx, HalNPrx, HalVPrx

EC 1.11.1.11 L-ascorbate peroxidase Apx

Phospholipid-hydroperoxidase EC 1.11.1.12 GPx glutathione peroxidase

EC 1.11.1.13 Magnanese peroxidase MnP

EC 1.11.1.14 Lignin peroxidase LiP

EC 1.11.1.15 Peroxiredoxin 1CysPrx,2CysPrx,PrxII/V/PrxGrx,PrxQ/BCP

EC 1.11.1.16 Versatile peroxidase VP

EC 1.13.1.44 Linaleate diol synthase LDS

Prostaglandin-endoperoxidase EC 1. 14.99.1 DuOx synthase

4-Carboxymuconolactone AhpD,CMD,CMDn,HCMD, HCMDn, EC 4.1.1.44 decarboxylase DCMD,DCMDn,AlkylPrx,AlkyPrxn

΢ηαζεξέο πιάγησλ ηηκψλ γηα ΔC αξηζκνχο πνπ δελ έρνπλ αιιεινπρία (ΔC 1.11.1.2 θαη ΔC 1.11.1.3) ή απνθιείνληαη (ΔC 1.11.1.4) απφ ηελ θαηάηαμε ηεο ππεξνμεηδάζεο. Pxd, Pxt, AnPOX, NAnPrx, DypPrx, APx-CcP θαη CII δελ δηαζέηνπλ αξηζκφ ΔC. Οη δχν αλεμάξηεηνη αξηζκνί ΔC (1.11.1.9 θαη 1.11.1.12) θαη νη δχν αληηζηνηρνχλ ζε GPx θαη βαζίδνληαη ζηνπο δέθηεο ειεθηξνλίσλ (ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ ή ιηπίδην ππεξνμεηδίνπ αληίζηνηρα)

62

΢ρήκα 15. ΢ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεο θπινγελεηηθήο ζρέζεο κεηαμύ ηωλ δηαθόξωλ νηθνγελεηώλ πξωηεΐλεο πνπ βξίζθεηαη ζηελ Βάζε δεδνκέλωλ (PeroxiBase).

63 5. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 5 ΤΠΔΡΟΞΔΗΓΑ΢Ζ ΑΓΡΗΟΡΑΠΑΝΟΤ (Horseradish Peroxidase)

5.1 Δηζαγωγή

Η ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (Horseradish peroxidase) είλαη έλα ζεκαληηθφ έλδπκν πνπ πεξηέρεη αίκε θαη είλαη αληηθείκελν κειέηεο παξαπάλσ απφ έλαλ αηψλα. Σα ηειεπηαία ρξφληα έρνπλ γίλεη γλσζηά λέα ζηνηρεία γηα ηελ ηξηζδηάζηαηε δνκή ηνπ ελδχκνπ, ηα θαηαιπηηθά ελδηάκεζα, ηνπο κεραληζκνχο ηεο θαηάιπζεο θαη ηε ιεηηνπξγία ησλ ζπγθεθξηκέλσλ ακηλνμέσλ.

Σν αγξηνξαπάλη (horseradish) είλαη έλα βφηαλν αλζεθηηθφ ζην ρξφλν, θαιιηεξγείηαη ζε εχθξαηεο πεξηνρέο, θπξίσο γηα ηελ γαζηξνλνκηθή αμία ηεο ξίδαο ηνπ (΢ρήκα 16). ΢χκθσλα κε ηνλ Gerard ε ξίδα ηνπ είλαη καθξηά θαη παρηά, έρεη ιεπθφ ρξψκα θαη θαπηεξή γεχζε. Απηέο νη ηδηφηεηεο νθείινληαη ζηνπο πηεηηθνχο εζηέξεο ηνπ ηζνζεηνθπαληθνχ νμένο πνπ απειεπζεξψλνληαη κε ηελ πδξφιπζε ηνπ ζπζηαηηθνχ γιπθνδηλφιε, φηαλ ζπλζιίβνληαη νη ξίδεο, κηα αληίδξαζε πνπ θαηαιχεηαη απφ myrosinase. Δπίζεο ε ξίδα ηνπ είλαη κηα πινχζηα πεγή ππεξνμεηδάζεο, έλα έλδπκν πνπ πεξηέρεη αίκε θαη ρξεζηκνπνηεί

ην Η2Ο2 γηα νμείδσζε ζε επξεία πνηθηιία νξγαληθψλ θαη αλφξγαλσλ ελψζεσλ. Η παξαγσγή ππεξνμεηδάζεο απφ ηε ξίδα ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish) εκθαλίδεηαη ζε ζρεηηθά κεγάιε θιίκαθα ιφγσ ησλ εκπνξηθψλ ρξήζεσλ ηνπ ελδχκνπ, γηα παξάδεηγκα, γηα ηηο αλνζνινγηθέο δνθηκαζίεο. Αλ θαη ν φξνο ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish) είλαη γεληθφο, ε ξίδα ηνπ θπηνχ πεξηέρεη κηα ζεηξά εηδηθψλ ηζνέλδπκσλ ππεξνμεηδάζεο ηεο νπνίαο ην ηζνέλδπκν C (HRP C) είλαη άθζνλν. ΢εκαληηθή πξφνδνο ζηελ θαηαλφεζε ηεο δνκήο θαη ηεο ιεηηνπξγίαο ηεο HRP C έρεη επηηεπρζεί ζρεηηθά πξφζθαηα, θαη μεθίλεζαλ κε ηελ επηηπρεκέλε παξαγσγή ηνπ αλαζπλδπαζκέλνπ ελδχκνπ.69 Απφ ηελ εξγαζία απηή ήξζε ε ηξηζδηάζηαηε δνκήο ηε HRP κε θξπζηαιινγξαθία αθηηλψλ Υ θαη, πην πξφζθαηα, κηα πςειή πεξηγξαθή ησλ ελδηάκεζσλ ζην θαηαιπηηθφ θχθιν ηνπ ελδχκνπ.70,71 Πνιινί θπζηνινγηθνί ξφινη απνδίδνληαη ζην ηζνέλδπκν ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ

64 ζπκπεξηιακβαλνκέλεο ηεο ηλδφιεο-3-νμηθνχ νμένο ζην κεηαβνιηζκφ, ζηε παξαγσγή ιηγλίλεο, ζην ζρεκαηηζκφ δεζκψλ απφ πνιπκεξή ηνπ θπηηαξηθνχ ηνηρψκαηνο, ζην ζρεκαηηζκφ ζνπβεξίλεο θαη ζηελ αληίζηαζε ζηηο ινηκψμεηο. Πξνθαιεί έθπιεμε ην γεγνλφο φηη ιίγα είλαη γλσζηά γηα ηηο εηδηθέο ιεηηνπξγίεο ηνπ θπηνχ. Νέεο ηδέεο ζε απηφ ην πξφβιεκα κπνξεί λα πξνθχςνπλ απφ ηε ζπγθξηηηθή κειέηε ησλ ππεξνμεηδαζψλ ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., ε νπνία είλαη επίζεο κέινο ησλ Cruciferae. Γχν νκάδεο πνπ πεξηγξάθνληαη ζηελ νηθνγέλεηα ησλ γνληδίσλ ππεξνμεηδάζεο ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Α. thaliana, ε νπνία πεξηιακβάλεη ιηγφηεξν απφ 73 γνλίδηα πιήξνπο κήθνπο, ε πιεηνςεθία εθ ησλ νπνίσλ πξνβιέπεηαη λα θσδηθνπνηήζεη ηα ζηαζεξά έλδπκα.72,73 Φαίλεηαη σο εθ ηνχηνπ, φηη θάζε είδνπο θπηφ πεξηέρεη κηα «αιιεινπρία» ηνπ ηζνέλδπκνπ ππεξνμεηδάζεο κε ηε δπλαηφηεηα λα πξαγκαηνπνηήζεη έλα επξχ θάζκα δηαθνξεηηθψλ ιεηηνπξγηψλ.

΢ρήκα 16 : Σν θπηό θαη νη ξίδεο ηνπ αγξνξάπαλνπ (horseradish).

65 5.2 Πεξηγξαθή ηνπ ελδύκνπ

5.2.1 Γεληθά ραξαθηεξηζηηθά

Σν ηζνέλδπκν C ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αξγηνξάπαλνπ (horseradish) πεξηιακβάλεη έλα πνιππεπηίδην 308 ακηλνμέσλ, ε αιιεινπρία ηνπ νπνίνπ θαζνξίδεηαη απφ ηνλ Welinder74. Σν N–άθξν ηνπ θαηάινηπνπ κπινθάξεηαη απφ ππξνγινπηακίλε θαη ην C–άθξν είλαη εηεξνγελέο, κε θάπνηα θαηάινηπα κφξηα ζαλ ην αθξαίν θαηάινηπν, Ser308. Τπάξρνπλ 4 δηζεηνχρεο γέθπξεο κεηαμχ ησλ θαηάινηπσλ θπζηεΐλεο 11-91, 44-49, 97-301 θαη 177-209, θαζψο θαη κηα θεθακέλε γέθπξα άιαηνο κεηαμχ ησλ Asp99 θαη Arg123. Δλλέα πηζαλέο ηνπνζεζίεο ηεο Ν-γιπθνδπιίσζεο κπνξεί λα αλαγλσξίδνληαη ζηελ πξσηνγελή αιιεινπρία απφ ην κνηίβν Asn-X-Ser/Thr (φπνπ «Υ» αληηπξνζσπεχεη έλα ακηλνμχ) απφ ηηο νπνίεο νη νθηψ είλαη θαηεηιεκκέλεο. Μηα δηαθιαδηζκέλε επηαζαθραξίλε αληηπξνζσπεχεη ην 75 έσο 80% απφ ηηο γιπθάλεο (Πίλαθαο 3), αιιά ε πεξηεθηηθφηεηα ζε πδαηάλζξαθεο ηεο HRP C είλαη εηεξνγελή, επίζεο έρνπλ ραξαθηεξηζηεί πνιιέο κηθξφηεξεο γιπθάλεο.75 Απηά πεξηέρνπλ δχν ηεξκαηηθά GlcNAc θαη πνιιά θαηάινηπα καλλφδεο. Μηα πεξαηηέξσ επηπινθή είλαη ε δηαθχκαλζε ηνπ ηχπνπ ηεο γιπθάλεο παξνχζαο ζε θάζε ζέζε γιπθνδπιίσζεο. Η ζπλνιηθή πεξηεθηηθφηεηα ζε πδαηάλζξαθεο ηεο HRP C εμαξηάηαη απφ ηελ πεγή ηνπ ελδχκνπ θαη νη ηηκέο κεηαμχ 18 θαη 22% είλαη ηππηθέο.

66 Πίλαθαο 3. Αλαηνκία ηεο ππεξνμεηδάζεο. Οξηζκέλεο βαζηθά δηαξζξσηηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ ηζνελδχκνπ C ηεο ππεξνμεηδάζεο αγξηνξάπαλνπ (horseradish) (HRP C)

Αίκε

(i) Η Ηis170 ζπκκεηέρεη ζην ζπληνληζκφ ηνπ δεζκνχ πνπ ζρεκαηίδεηαη κε ην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ ηεο αίκεο.

(ii) Σν θαξβνμπιηθφ ηκήκα ηεο Asp247 ηεο αιπζίδαο βνεζάεη ζηνλ έιεγρν ηνπ ηκηδαδνιηθνχ ραξαθηήξα ηνπ δαθηπιίνπ ηεο His170.

(iii) Η κεηαιιαγκέλε πξσηεΐλε His170Ala πθίζηαηαη απνηθνδφκεζε ηεο νκάδαο ηεο αίκεο παξνπζία 1 -1 -1 H2O2 θαη φηαλ δελ αληρλεχνληαη νη ελψζεηο I θαη II, k1 = 1.6x10 M s . Ικηδαδφιεο κπνξνχλ λα πξνζδεζνχλ ζην ζίδεξν ηεο αίκεο ζηελ θνηιφηεηα πνπ έρεη ζρεκαηηζηεί ηερλεηά, κε ηελ θαηαιπηηθή δξαζηηθφηεηα φκσο λα κελ απνθαζίζηαηαη επεηδή ην ζχκπινθν His170Ala-ηκηδαδφιεο δελ δηαηεξεί ζηε ζθαίξα ζχληαμήο ηνπ 5 ζέζεηο πξφζδεζεο ( ε His42 πξνδέλεηαη επίζεο ζην Fe).

(iv) Σα αξσκαηηθά ππνζηξψκαηα νμεηδψλνληαη ζην εθηεζηκέλν ηκήκα ηεο αίκεο, αιιά δελ πξνζδέλνληαη ζην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ ηεο αίκεο.

Αζβέζηην

Άλσ δφηεο Ο2 Δγγχο δφηεο Ο2

Asp43, Asp50, Ser52 Thr171, Asp222, Thr225, Asp230

(πιεπξηθή αιπζίδα) (πιεπξηθή αιπζίδα)

Asp43, Val46, Gly48 (θαξβνλχιην) Thr171, Thr225, Ile228 (θαξβνλχιην)

1 δνκηθφ κφξην λεξνχ

(i) Σα άπσ θαη ηα εγγχο ηφληα Ca2+ είλαη ζηελ έβδνκε ζέζε ζηε ζθαίξα ζχληαμεο.

(ii) ΢ε έιιεηςε ζηδήξνπ ε ελδπκηθή δξαζηηθφηεηα κεηψλεηαη θαηα 40%.

(iii) Σν δνκηθφ κφξην λεξνχ ηεο πιεπξάο ηνπ άπσ Ca ζρεκαηίδεη δεζκφ πδξνγφλνπ κε ηε Glu64 ε νπνία κε ηε ζεηξά ηεο ζρεκαηίδεη δεζκφ πδξνγφλνπ κε ηελ Asn70 θαη έηζη ζπλδέεηαη άλσ ηζέπε ηεο αίκεο.

Τδαηάλζξαθαο

(i) Οη ζέζεηο ηεο γιπθνδπιίσζεο είλαη ζε πεξηνρέο ζειηάο ηεο δνκήο, ζηηο Asn13, Asn57, Asn158, Asn156, Asn186, Asn198, Asn214, Asn255 θαη Asn268.

67 (ii) Η θχξηα γιπθάλε παξνπζηάδεηαη εθεη, εθεί επίζεο είλαη νη κηθξφηεξεο γιπθάλεο ηεο κνξθήο ManmGlcNAc2 (m απν 4

ζην 7) θαη (Xyl)xManm (Fuc)f GlcNAc2 (m= 2,4,5,6 f = 0 ή 1, x = 0 ή 1)

Καηάινηπα ακηλνμέσλ

4 - Arg38 Οπζηαζηηθφο ξφινο ζην (i) ν ζρεκαηηζκφο θαη ε Μεηάιαμε ηνπ Arg38Leu, k1=1.1 x 10 M ζηαζεξνπνίεζε ηεο έλσζεο Ι, (ii) δέζκεπεη θαη 1 s-1

ζηαζεξνπνηεί ηνπο ππνθαηαζηάηεο θαη ηα

αξσκαηηθά ππνζηξψκαηα. Οη κεηαιάμεηο ησλ Phe41Ala/Leu/Thr Phe41 Απνηξέπεη ηελ είζνδν ζην ππφζηξσκα ζην παξνπζηάδνπλ βειηησκέλα πνζνζηά ηεο ζηδηξηθφ νμπγφλν ηεο έλσζεο. νμείδσζεο ηεο ζηαληζφιεο.

Γηαηεξεί νπζηαζηηθά ηελ πιεπξηθή αιπζίδα ηεο 5 -1 -1 Αsn70 Asn70Val κεηάιιαμε, k1=6 x 10 M s Ηis42 κέζσ ηνπ δεπγαξηνχ Αsn70- His42

Οπζηαζηηθφο ξφινο ζην (i) ζρεκαηηζκφο ηεο His42 2 -1 - έλσζεο Ι (δέρεηαη πξσηφληα απν ην H2O2), ii) His42 Leu κεηάιιαμε, k1=1.4 x 10 M s 1 Kd (BHA) 2.9 ±0.5 κΜ. δέζκεπεη θαη ζηαζεξνπνηεί ηνπο ππνθαηαζηάηεο θαη ηα αξσκαηηθά ππνζηξψκαηα.

Μέξε ηνπ δνκηθνχ κνηίβνπ –Pro-X-Pro- (Pro139- Σα θξπζηαιινγξαθηθά δεδνκέλα

Ala140-Pro141 ζηελ HRP C), φπνπ δηαηεξείηαη δείρλνπλ φηη ε Pro139 παίδεη θάπνηνλ ζηηο ππεξνμεηδάζεο ησλ θπηψλ. Pro139 ξφιν ζηελ νμείδσζε ηνπ ππνζηξψκαηνο

θαη ζηελ δέζκεπζε.

Η HRP C πεξηέρεη δχν δηαθνξεηηθά είδε κεηαιιηθψλ θέληξσλ, ζηδήξνπ(ΙΙΙ) πξσηνπνξθπξίλε IX (ζπλήζσο αλαθέξεηαη σο «Οκάδα αίκεο») θαη δχν άηνκα αζβεζηίνπ (΢ρήκα 17 θαη Πίλαθα 3). Καη ηα δχν είλαη απαξαίηεηα γηα ηε δνκηθή θαη ιεηηνπξγηθή αθεξαηφηεηα ηνπ ελδχκνπ. Η νκάδα ηεο αίκεο ζπλδέεηαη κε ην έλδπκν ζην His170 κε ηνλ δεζκφ ζχκπιεμεο κεηαμχ ηεο ηζηηδίλεο ηεο πιεπξηθήο αιπζίδαο ζην άηνκν Nε2 θαη ηελ αίκε ηνπ αηφκνπ ηνπ ζηδήξνπ. Η δεχηεξε αμνληθή πεξηνρή ζχκπιεμεο είλαη θελή ζε θαηάζηαζε εξεκίαο ηνπ έλδπκνπ, αιιά είλαη ζηε δηάζεζε ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο επαλάιεςεο ηνπ θαηαιπηηθνχ θχθινπ ηνπ ελδχκνπ (΢ρήκα 16). Μηθξά κφξηα φπσο ην κνλνμείδην ηνπ άλζξαθα, ην θπάλην, ην θζφξην θαη ν δεζκφο ζην αδίδην ηεο αίκεο ζην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ ζε απηφ ην αθξαίν ζεκείν δίλνπλ έμη ζχκπινθα ππεξνμεηδάζεο. Μεξηθά δεζκεχνπλ κφλν ηηο πξσηνλησκέλεο κνξθέο, νη νπνίεο ζηαζεξνπνηνχληαη κέζσ δεζκνχ πδξνγφλνπ κε ηηο αιιειεπηδξάζεηο κε ηελ αθξαία ηζέπε αίκεο ζην ακηλνμχ ηεο

68 πιεπξηθήο αιπζίδαο ηεο Arg38 (άπσ αξγηλίλε) θαη ηεο His42 (αθξαία ηζηηδίλε) (΢ρήκα 16).

΢ρήκα 17 : Σξηζδηάζηαηε αλαπαξάζηαζε ηεο δνκήο θξπζηάιιωλ κε αθηίλεο Υ ηεο ππεξνμεηδάζεο αγξηνξάπαλνπ (horseradish) ηζνελδύκνπ C (Brookhaven ένηαξη Κωδικόρ 1H5A). Ζ νκάδα αίκεο (κε ην θόθθηλν ρξώκα) βξίζθεηαη κεηαμύ ηωλ πεξηθεξηθώλ θαη ηωλ εγγύο ηνκέωλ, πνπ θαζέλα πεξηέρεη έλα άηνκν αζβεζηίνπ (Δκθαλίδεηαη ωο κπιε ζθαίξεο). Α-ειηθνεηδήο θαη β-θύιιωλ πεξηνρέο ηνπ ελδύκνπ εκθαλίδνληαη κε κνβ ρξώκα θαη θίηξηλν, αληίζηνηρα. Οη F΄ θαη F΄΄ α-έιηθεο εκθαλίδνληαη ζην θάηω ηεηαξηεκόξην ζηα δεμηά ηνπ κνξίνπ.

Σα δχν αζβέζηηα έρνπλ δεζκνχο ζε ζέζεηο πνπ βξίζθνληαη πεξηθεξηαθά θαη εγγχηεξα ζην επίπεδν ηεο αίκεο θαη ζπλδένληαη νκφινγα κε ηελ πεξηνρή ηνπ δεζκνχ ηεο αίκεο ζε έλα δίθηπν πδξνγφλνπ. Κάζε ζέζε αζβεζηίνπ είλαη επηά- ζπκπιεγκέλε κε έλαλ δφηε νμπγφλνπ ζαλ ππφζηξσκα πνπ παξέρεηαη απφ έλα ζπλδπαζκφ ακηλνμέσλ πιεπξηθήο αιπζίδαο θαξβνμπιίσλ (Asp), νκάδεο πδξνμπιίνπ (Ser, Thr), θαξβνλχιηα πνπ παξέρνπλ νπηζζνζχλδεζε θαη έλα δνκηθφ κφξην λεξνχ (ζηε πεξηθεξηθή ζέζε) (πίλαθαο 3). Απψιεηα ηνπ αζβεζηίνπ νδεγεί ζε κείσζε ηφζν ηεο ελδπκηθήο δξαζηηθφηεηαο φζν θαη ηεο ζεξκηθήο ζηαζεξφηεηαο76 θαη ζε ιεπηέο αιιαγέο ζην πεξηβάιινλ ηεο αίκεο πνπ κπνξεί λα αληρλεπηνχλ θαζκαηνζθνπηθά.77

69 5.2.2 Σξηζδηάζηαηε δνκή

Η πξψηε αλάιπζε ηεο ηξηζδηάζηαηεο δνκήο ηεο HRP C κε θξπζηαιινγξαθία αθηίλσλ Υ εκθαλίζηεθε ζηελ βηβιηνγξαθία ζρεηηθά πξφζθαηα70. Σν αλαζπλδπαζκέλν έλδπκν ρξεζηκνπνηείηαη σο πεγή ησλ θξπζηάιισλ θαη ηα παξάγνγα βαξέσλ αηφκσλ παξήρζεζαλ απφ ηνλ κηθξννξγαληζκφ Escherichia coli,69 ζε κε γιπθνδπιησκέλε κνξθή. Πξνεγνχκελεο πξνζπάζεηεο γηα λα απνθηεζνχλ θξχζηαιια θαηάιιεια γηα πεξίζιαζε καηαηψζεθαλ ελ κέξεη απφ ηελ εηεξνγέλεηα ησλ θπηψλ ηεο HRP C πνπ απνηειείηαη απφ πνιιαπιέο γιχθν-δηακνκνξθψζεηο. Η δνκή ηνπ ελδχκνπ είλαη ζε κεγάιν βαζκφ είλαη α- ειηθνεηδήο αλ θαη ππάξρεη επίζεο κηα κηθξή πεξηνρή β-θχιισλ (΢ρήκα 18). Τπάξρνπλ δχν ηνκείο, ν πεξηθεξηθφο θαη ν εγγχο, κεηαμχ ησλ νπνίσλ βξίζθεηαη ε νκάδα ηεο αίκεο. Απηνί νη ηνκείο πηζαλψλ πξνήιζαλ σο απνηέιεζκα ηνπ δηπιαζηαζκνχ ησλ γνληδίσλ, ε πξφηαζε απηή ππνζηεξίδεηαη απφ ηηο θνηλέο ζέζεηο ησλ δεζκψλ ηνπ αζβεζηίνπ θαη άιισλ δνκηθψλ ζηνηρείσλ.78

΢ρήκα 18 : Βαζηθά ακηλνμέα ζηελ πεξηνρή ηνπ δεζκνύ ηεο αίκεο ηεο HRP C. Ζ νκάδα ηεο αίκεο θαη ην άηνκν ζηδήξνπ ηεο αίκεο εκθαλίδνληαη κε θόθθηλν ρξώκα, παξακέλνπλ θαηάινηπα ζηα άηνκα κε άιια ρξώκαηα. His170, ην θαηάινηπν ηεο εγγύο ηζηηδίλεο, είλαη ζπκπιεγκέλν κε ην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ ηεο αίκεο, ελώ ε αληίζηνηρε πεξηθεξηθή ζέζε ζύκπιεμεο πάλω από ην επίπεδν ηεο αίκεο είλαη θελή.

70 5.2.3 HRP θαη ηεο ππεξνηθνγέλεηαο θπηηθώλ ππεξνμεηδαζώλ

Σα ηζνέλδπκα ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ αλήθνπλ ζηελ θαηεγνξία ΙΙΙ («θιαζηθά» εθθξηηηθά θπηά ππεξνμεηδαζψλ) ηεο ππεξνηθνγέλεηαο θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ, ε νπνία πεξηιακβάλεη ππεξνμεηδάζεο βαθηεξηαθήο, κπθεηηαθήο θαη θπηηθήο πξνέιεπζεο.79 Οη ππφινηπεο δχν ηάμεηο πεξηιακβάλνπλ ηελ ππεξνμεηδάζε ηεο καγηάο ηνπ θπηνρξώκαηνο c, ηελ ππεξνμεηδάζε γνληδίνπ-δηπιήο βαθηεξηαθήο θαη ηελ αζθνξβηθή ππεξνμεηδάζε (θιάζε I) θαη ηελ κπθεηηαθή ππεξνμεηδάζε (Καηεγνξία ΙΙ). Η θαηάηαμε απηή βαζίδεηαη αξρηθά ζε ζπγθξίζεηο ηεο αιιεινπρίαο ησλ ακηλνμέσλ, αιιά ππνζηεξίδεηαη απφ ηα πην πξφζθαηα ηξηζδηάζηαηα δνκηθά δεδνκέλα πνπ ιακβάλνληαη γηα ηα έλδπκα γηα θαζεκία απφ ηηο θαηεγνξίεο. Πνιιά απφ ηα δνκηθά ζηνηρεία δηαηεξνχληαη κεηαμχ ησλ ηξηψλ θαηεγνξηψλ ππεξνμεηδαζψλ θαη νδεγνχλ ζηνλ νξηζκφ ελφο «ππξήλα» ππεξνμεηδάζεο. Οη δνκέο ηεο HRP C θαη ηεο θαηεγνξηαο III θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ πεξηιακβάλεη ηξεηο α-έιηθεο πνπ είλαη πξφζζεηεο ζηνλ ππξήλα ππεξνμεηδάζεο70. Γχν απφ απηέο (έιηθεο F΄ θαη F΄΄), βξίζθνληαη ζε κηα καθξά εηζαγσγή θαη παξνπζηάδνπλ κεγάιε δηαθχκαλζε ζηηο αιιεινπρίεο θαη ζηνλ αξηζκφ ησλ θαηαινίπσλ (΢ρήκα 17). Η ζπλνιηθή αθεξαηφηεηα ηεο δνκήο ζηελ πεξηνρή απηή δηαηεξείηαη κε δηζεηνχρν δεζκφ απφ ηε Cys177 ζηε Cys209. Ιδηαίηεξν ελδηαθέξνλ ζηελ πεξίπησζε ηεο HRP C είλαη ε ζέζε ησλ θαηάινηπσλ ζηνλ F΄ έιηθα πνπ εκπιέθεηαη ζηελ αξρή ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ην δεζκφ. Μεξηθνί εξεπλεηέο ιέλε φηη απηή ε δνκηθή πεξηνρή είλαη ζεκαληηθή γηα ηε ζηαζεξνπνίεζε ή ε δηαηήξεζε ησλ ξηδψλ πνπ παξάγνληαη ζε αληηδξάζεηο πνπ θαηαιχνληαη απφ θπηηθέο ππεξνμεηδάζεο.69

71 5.3 Μεραληζκόο δξάζεο

5.3.1 Λεηηνπξγηθόο ξόινο

Οη πεξηζζφηεξεο αληηδξάζεηο πνπ θαηαιχνληαη απφ ηελ HRP C θαη άιια ηζνέλδπκα ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ κπνξεί λα εθθξαζηνχλ απφ · ηελ αθφινπζε εμίζσζε, ζηελ νπνία ηα AH2 θαη AH αληηπξνζσπεχνπλ ηελ αλαγσγή ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ηεο ξίδαο, αληίζηνηρα. Σππηθά ππνζηξψκαηα αλαγσγήο είλαη νη αξσκαηηθέο θαηλφιεο, θαηλνιηθά νμέα, ηλδφιεο, ακίλεο θαη ζνπιθνληθά.

· H2O2 + 2AH2 → 2H2O + 2AH (1)

Η κεηαηξνπή ηνπ ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ ζε λεξφ δελ είλαη ε πξσηαξρηθή ιεηηνπξγία ηεο θαηεγνξίαο III ησλ θπηηθψλ ππεξνμεηδαζψλ φπσο ε HRP C. Άιια έλδπκα, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηεο αζθνξβηθήο ππεξνμεηδάζεο (Καηεγνξία I), ρξεζηκνπνηνχληαη απφ ηα θπηά θαη ξπζκίδνπλ 80,81 ηα επίπεδα ηνπ ελδνθπηηάξηνπ Η2Ο2.

Ο ζρεκαηηζκφο ξηδψλ ζηε HRP φηαλ θαηαιχεη αληηδξάζεηο δίλεη κηα έλδεημε κεξηθψλ in vivo ιεηηνπξγηψλ ζην θπηφ. Οη ππεξνμεηδάζεο πνπ θαηαιχνπλ αληηδξάζεηο δηθηχσζεο κπνξεί λα είλαη απάληεζε ζε εμσγελείο παξάγνληεο, φπσο ζηνλ ηξαπκαηηζκφ ησλ ηζηψλ. Η απψιεηα λεξνχ θαη ε εηζβνιή παζνγφλσλ κηθξννξγαληζκψλ κπνξεί λα πεξηνξίδεηαη απφ ηνλ ζρεκαηηζκφ ελφο πξνζηαηεπηηθνχ θξάγκαηνο πνιπκεξνχο φπσο ε ζνπβεξίλε. Παξ’ φιν πνπ ν in vivo ξφινο γηα ηα ηζνέλδπκα HRP δελ έρεη αθφκε θαζνξηζηεί, είλαη γλσζηφ φηη ε δξάζε ηεο ππεξνμεηδάζεο πξνθαιείηαη φηαλ ηξαπκαηηζηνχλ ηα θχιια ηνπ αγξηνξάπαλνπ.82

72 5.3.2 Καηαιπηηθόο κεραληζκόο

Ο θαηαιπηηθφο κεραληζκφο ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αξγηνξάπαλνπ (horseradish) θαη εηδηθφηεξα, ην ηζνέλδπκν C, έρεη εξεπλεζεί εθηελψο.83,84 Μεξηθά ζεκαληηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ θαηαιπηηθνχ θχθινπ απεηθνλίδνληαη ζην ζρήκα 19 φπνπ ζαλ αλαγσγηθφ κέζν ζην ππφζηξσκα είλαη ην θεξξνπιηθφ νμχ. Η παξαγσγή πνιιψλ εηδψλ ξηδψλ ζηηο αλαγσγέο ελφο ειεθηξνλίνπ κπνξεί λα νδεγήζεη ζε πνιχπινθν πξνθίι ησλ πξντφλησλ αληίδξαζεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ δηκεξψλ, ηξηκεξψλ θαη πςειφηεξσλ νιηγνκεξψλ πνπ ελεξγνχλ σο αλαγσγηθά κέζα ζηα ππνζηξψκαηα γηα ηνπο επφκελνπο ζπλερήο θαηαιπηηθνχο θχθινπο.

΢ρήκα 19. Καηαιπηηθόο θύθινο ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αξγηνξάπαλνπ (HRP C) κε θεξξνπιηθό νμύ ωο αλαγωγηθό κέζν ζην ππόζηξωκα.

Σν πξψην βήκα ζηνλ θαηαιπηηθφ θχθιν είλαη ε αληίδξαζε ηνπ Η2Ο2 θαη ηνπ Fe(ΙΙΙ) ζε θαηάζηαζε εξεκίαο ηνπ έλδπκνπ γηα ηελ παξαγσγή ηεο έλσζεο Ι, ζε κηα πςειή θαηάζηαζε νμείδσζεο, ην ελδηάκεζν πεξηιακβάλεη έλα Fe(IV) νμπζηδεξηθφ (oxoferryl) θέληξν θαη κηα πνξθπξίλε κε βάζε ηελ θαηηνληηθή ξίδα. Έλα παξνδηθφ ελδηάκεζν πνπ ζρεκαηίζηεθε πξηλ απφ ηελ έλσζε Ι έρεη

αληρλεπηεί ζηηο αληηδξάζεηο κεηαμχ HRP C θαη H2O2 ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο

73 θαη πεξηγξάθεηαη σο έλα ζχκπινθν Fe(III)-πδξνυπεξνμεηδίνπ. Πξνζνκνηψζεηο κνξηαθνχ δπλακηθνχ ησλ ελ ιφγσ ππεξνμεηδίσλ θάλνπλ δεζκνχο κε ελψζεηο πνπ έρνπλ πξαγκαηνπνηεζεί.85 Απφ ηππηθήο πιεπξάο, ε έλσζε Ι έρεη δχν νμεηδσκέλα ηζνδχλακα ζε θαηάζηαζε εξεκίαο. Σν πξψην βήκα γηα ηελ αλαγσγή ελφο ειεθηξνλίνπ απαηηεί ηε ζπκκεηνρή ηεο αλαγσγήο ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη νδεγεί ζηελ παξαγσγή ηεο έλσζεο ΙΙ, έλα Fe(IV) ζσκαηίδην νμπζηδήξνπ (oxoferryl) πνπ είλαη έλα νμεηδσκέλν ηζνδχλακν ζε θαηάζηαζε εξεκίαο. Καη νη δχν ελψζεηο Ι θαη ΙΙ, είλαη ηζρπξά νμεηδσηηθέο, κε νμεηδναλαγσγηθέο ηθαλφηεηεο θνληά ζην +1 V.

Η δεχηεξε αλαγσγή ελφο ειεθηξφληνπ επηζηξέθεη ηελ έλσζε ΙΙ ζε θαηάζηαζε εξεκίαο ηνπ ελδχκνπ. Η αληίδξαζε κε πεξίζζεηα ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ ζε θαηάζηαζε εξεκίαο ηνπ έλδπκνπ δίλεη ηελ έλσζε ΙΙΙ, ε νπνία κπνξεί επίζεο λα παξαζθεπαζηεί θαη κε άιινπο ηξφπνπο.86 Απηφ ην ελδηάκεζν είλαη θαιχηεξα λα πεξηγξαθεί σο έλα πβξίδην ζχκπιεμεο ησλ ζπκπιφθσλ ηνπ ζηδήξνπ(ΙΙΙ)-ζνππεξνμεηδίνπ θαη ζηδήξνπ (ΙΙ)-δηνμπγφλνπ. Μηα πςειήο αλάιπζεο θξπζηαιιηθή δνκή ηεο έλσζεο ΙΙΙ θαζαξφηεηαο 95% δείρλεη φηη ην δηνμπγφλν θάλεη δεζκφ κε ηελ αίκε ηνπ ζηδήξνπ κε κηα δηακφξθσζε ηεο κε θιίζε.70 Μνληέια γηα ηελ ακεηάθιεηε αδξαλνπνίεζε ηεο HRP C κε ππεξνμείδηα έρνπλ αλαπηπρζεί ζε κειέηεο κε m-chloroperoxybenzoic νμχ.87

Τςειήο αλάιπζεο θξπζηαιιηθέο δνκέο ηνπ νμεηδσκέλνπ ελδηάκεζνπ ηεο HRP C επηβεβαηψλνπλ ηε ζεκαζία ησλ Arg38 θαη His42 ζηελ θαηάιπζε ηνπ ππεξνμεηδίνπ.71

74 5.4 Σν δήηεκα ηνπ ηζνέλδπκνπ, ηεο ππεξνεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ θαη νη Arabidopsis ππεξνμεηδάζεο

5.4.1 Ζ νηθνγέλεηα ηνπ ηζνέλδπκνπ ηεο ππεξνμεηδάζεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ

Γεθαπέληε ηζνέλδπκα ππεξνμεηδάζεο έρνπλ απνκνλσζεί απφ ηε ξίδα ηνπ αγξηνξάπαλνπ κε ηε ρξήζε θιαζηθψλ κεζφδσλ θαζαξηζκνχ ησλ πξσηετλψλ θαη κε ηα θσδηθφλνηα πνπ βαζίδνληαη ζηελ ηηκή ηνπ ηζνειεθηξηθνχ ζεκείνπ ηνπο φπσο ε HRP Α1-Α3 («φμηλν»), Β1-Β3 θαη C1-C2 («νπδέηεξν» ή «νπδέηεξν-βαζηθφ») θαη D θαη Δ1-Δ6 («βαζηθφ»). Πεξηζζφηεξεο «ηζνκνξθέο» ππεξνμεηδάζεο κπνξνχλ λα αληρλεπζνχλ κε ηζνειεθηξηθή εζηίαζε αιιά ε ηαπηφηεηά ηνπο είλαη ακθηιεγφκελε, ελψ κεξηθέο κπνξεί λα παξάγνληαη θαηά ηελ απνακηδίσζε, κε αληηδξάζεηο δηθηχσζεο ή κε άιιεο δηεξγαζίεο. Σν γεγνλφο φηη ζηηο αιιεινπρίεο ακηλνμέσλ ζηελ HRP Α2 θαη E5 έρνπλ ηαπηφηεηα ζε πνζνζηφ 54 θαη 70%, αληίζηνηρα, ζηελ HRP C. Απηφ είλαη έλα απνδεηθηηθφ ζηνηρείν γηα ηελ χπαξμε δηαθξηηψλ ηζνελδχκσλ ππεξνμεηδάζεο ζηηο ξίδεο ηνπ αγξηνξάπαλνπ88.

Σέζζεξα γνλίδηα DNA θσδηθνπνηνχλ νπδέηεξνπο θιψλνπο θαη έρνπλ νπδέηεξα-βαζηθά ηζνέλδπκα HRP πνπ έρνπλ απνκνλσζεί θαη ραξαθηεξηζηεί απφ θαιιηεξγεκέλα θχηηαξα ηνπ κηθξννξγαληζκνχ Armoracia rusticana.89,90 Γχν απφ απηά ηα γνλίδηα ππεξνμεηδάζεο (prxC1a θαη prxC1b) ππάξρνπλ ζε ζηειέρε θαη ξίδεο θαη δχν θπξίσο (prxC2 θαη prxC3) ζηηο ξίδεο. Όια απνηεινχληαη απφ ηέζζεξα εμφληα θαη ηξία ηληξφληα θαη έρνπλ ηηο ίδηεο ζέζεηο ζηε ζέζε ζπξξαθήο, πνπ είλαη έλα θνηλφ ραξαθηεξηζηηθφ ησλ άιισλ θπηψλ ζηα γνλίδηα ππεξνμεηδάζεο. Σξία πςειά νκφινγα cDNAs (prxC1a, prxC1b θαη prxC1c) έρνπλ επίζεο απνκνλσζεί κε ηε ρξήζε ελφο θαζεηήξα νιηγνλνπθιενηηδίσλ αληίζηνηρα κε ηελ πξσηνγελή πεξηνρή ζηελ αιιεινπρία απφ His40 ζε Ala51 ηεο HRP C.91 Η αιιεινπρία ησλ ακηλνμέσλ ζπλάγεηαη απφ prxC1a πνπ είλαη παλνκνηφηππν κε εθείλν ηεο HRP C, αιιά πεξηέρεη επίζεο έλα πδξφθνβν νδεγφ αιιεινπρίαο, θαζψο θαη κηα επέθηαζε C- ηεξκαηηθνύ πνπ είλαη ππεχζπλε γηα ηελ ζηφρεπζε ζηα ρπκνηφπηα.

75

΢ρήκα 20 : Ζ πεξηνρή δέζκεπζεο ηνπ θεξξνπιηθνύ νμέωο κε ηελ ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξάπαλνπ (horseradish). Ζ παξάζηαζε απηή έρεη ιεθζεί από ηελ θξπζηαιιηθή δνκή αθηίλωλ Υ ηνπ ηεηξαεδξηθνύ ζπκπιόθνπ ηνπ θεξξνπιηθνύ νμέωο (FA) θαη δεζκώλ θπαληδίνπ ζηελ HRP C. Ζ νκάδα ηεο αίκεο εκθαλίδεηαη κε θόθθηλν ρξώκα θαη ην θεξξνπιηθό νμύ, ν θπάλν ππνθαηαζηάηεο θαη ηα Arg38, His42 θαη His170 είλαη ηα άηνκα κε ππόινηπα ρξώκαηα.

76

ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΟ ΜΔΡΟ΢

77 6. ΚΔΦΑΛΑΗΟ 6 Πνζνηηθή θαη πνηνηηθή πεξηγξαθή ηεο ζπζρέηηζεο ηωλ δνκηθώλ ραξαθηεξηζηηθώλ ηωλ κνξίωλ κε ηελ ππό κειέηε δξαζηηθόηεηα/ηδηόηεηα.

6.1 Δηζαγωγή

Ο πξνζδηνξηζκφο ησλ ηδηνηήησλ ησλ ελψζεσλ απφ ην δνκηθφ ζθειεηφ ηνπο θαη ρσξίο λα είλαη απαξαίηεηε ε πεηξακαηηθή ηνπο ζχλζεζε, ππήξμε αλέθαζελ κηα πξφθιεζε γηα ηελ ππνινγηζηηθή ρεκεία.91 Οη ηηκέο ησλ ηδηνηήησλ είλαη ρξήζηκεο γηα ην ζρεδηαζκφ, ηνλ έιεγρν θαη ηελ θαηαλφεζε ησλ ρεκηθψλ αληηδξάζεσλ, ηελ πξφβιεςε ηεο ηνμηθφηεηαο θαη ησλ επηπηψζεσλ ηνπο ηφζν ζηνλ αλζξψπηλν νξγαληζκφ, φζν θαη ζην πεξηβάιινλ. Τπάξρεη ινηπφλ αλάγθε γηα αμηφπηζηεο κεζφδνπο πξφβιεςεο ηεο ζρέζεο πνπ ζπλδέεη ηα δνκηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ κνξίνπ κε ηηο ηδηφηεηέο ηνπ θαη ηνλ ζρεδηαζκφ λέσλ κνξηαθψλ δνκψλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά.92 ΢ηε βηβιηνγξαθία δελ ππάξρνπλ δηαζέζηκεο νη ηηκέο ησλ ηδηνηήησλ γηα φιεο ηηο ρεκηθέο ελψζεηο, ελψ ν πεηξακαηηθφο πξνζδηνξηζκφο ηνπο ηηο πεξηζζφηεξεο θνξέο απαηηεί πςειφ θφζηνο θαη αξθεηφ ρξφλν. Απηφ ζεκαίλεη πσο είλαη επηηαθηηθή ε αλάγθε γηα θαηεπζπλφκελε ζχλζεζε πξνο ζπγθεθξηκέλα κφξηα πνπ έρνπλ ζεκαληηθή πηζαλφηεηα λα παξνπζηάζνπλ αμηφινγεο ηηκέο ηδηνηήησλ.

Μειεηψληαο ηε δξαζηηθφηεηα θάπνησλ νπζηψλ ζε ζπλάξηεζε κε ηα δνκηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπο, κπνξνχκε λα παξαηεξήζνπκε πσο ελψζεηο κε παξφκνηα δνκή εκθαλίδνπλ γεληθά θαη παξφκνηεο ηηκέο δξαζηηθφηεηαο/ηδηνηήησλ.93 Οη δηαθνξέο πνπ πξνθαινχληαη ζηηο ηδηφηεηεο, φηαλ θάπνηα δνκηθά ραξαθηεξηζηηθά κεηαβάιινληαη, κπνξνχλ λα ζπζρεηηζηνχλ ζεσξεηηθά κε θάπνηεο πνηνηηθέο ζρέζεηο δνκήο–δξαζηηθφηεηαο. Σέηνηνπ είδνπο ζρέζεηο κπνξνχλ λα εμαρζνχλ κειεηψληαο ην βαζηθφ ζθειεηφ ελφο κνξίνπ, ηε δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηεο ηνπ θαη ηηο κεηαβνιέο ζε απηήλ, πνπ κπνξεί λα πξνθιεζνχλ κε ηε κεηαβνιή θάπνησλ δνκηθψλ ραξαθηεξηζηηθψλ, π.ρ. κε ηελ εηζαγσγή ζην κφξην δηαθνξεηηθψλ ππνθαηαζηαηψλ. Μηα ηέηνηα κειέηε ζα κπνξνχζε λα πξνζδηνξηζεί, γηα παξάδεηγκα, πνηνο ππνθαηαζηάηεο ή πνηνο ζπλδπαζκφο ππνθαηαζηαηψλ είλαη ππεχζπλνο γηα ηελ αχμεζε ή θαη ηε

78 κείσζε ηεο δξαζηηθφηεηαο θαη ζε ηη βαζκφ. Μηα ηέηνηα πιεξνθνξία ζα ήηαλ ηδηαίηεξα ρξήζηκε ζηνλ ζρεδηαζκφ ελφο λένπ θαξκάθνπ, αθνχ κε θαηάιιειν ζρεδηαζκφ ηεο δνκήο ζα ήηαλ δπλαηφ λα επηηεπζρεί ζπλδπαζκφο κεγηζηνπνίεζεο ηεο δξαζηηθφηεηαο θαη ειαρηζηνπνίεζεο ησλ αλεπηζχκεησλ ελεξγεηψλ.

Η πξνζπάζεηα γηα καζεκαηηθή έθθξαζε θαη εξκελεία ησλ ζπζρεηίζεσλ απηψλ είλαη ελδεδεηγκέλε, θαζψο ε επεμεξγαζία ησλ δηαζέζηκσλ δεδνκέλσλ ζα κπνξνχζε λα νδεγήζεη ζε κηα πην ζπζηεκαηηθή αμηνπνίεζε ησλ απνηειεζκάησλ. Μηα πξνζέγγηζε πξνο ηελ θαηεχζπλζε απηή απνηειεί θαη ε κεζνδνινγία ε νπνία αλαπηχζζεηαη αθνινχζσο.

6.2 Μέζνδνο

Η κέζνδνο πνπ αλαπηχρζεθε94,95 θαη νδεγεί ζην ζρεδηαζκφ κνξίσλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά (δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηεο) απνηειείηαη απφ ηηο αθφινπζεο θάζεηο, νη νπνίεο απνηεινχλ ζπλδπαζκφ ζχλζεζεο, αμηνιφγεζεο θαη ππνινγηζηηθήο αμηνπνίεζεο ησλ δεδνκέλσλ:

6.2.1 ΢ηάδην 1. Αλάπηπμε κνληέινπ πνζνηηθήο ζπζρέηηζεο δνκήο– δξαζηηθόηεηαο/ηδηνηήηωλ

Γηα ηελ αλάπηπμε ηεο πνζνηηθήο ζπζρέηηζεο δνκήο/δξαζηηθφηεηαο (QSAR– quantitative structure–activity relationship) πξαγκαηνπνηνχληαη ηα αθφινπζα βήκαηα:

 Δπηινγή ελψζεσλ. Αξρηθά επηιέγνληαη κφξηα γηα ηα νπνία είλαη ήδε γλσζηή ε δξαζηηθφηεηα ή ε ηδηφηεηα ε νπνία ζα απνηειέζεη ην αληηθείκελν ηεο κειέηεο. Απφ ηα κφξηα απηά δεκηνπξγείηαη ε αξρηθή βάζε δεδνκέλσλ. Δίλαη επηζπκεηφ ε βάζε απηή λα πεξηιακβάλεη φζν ην δπλαηφλ πεξηζζφηεξεο πιεξνθνξίεο γηα ηελ επίδξαζε ησλ δνκηθψλ κεηαβνιψλ ζηελ ππφ κειέηε δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηα.

79  Τπνινγηζκφο–επηινγή δεηθηψλ. Γηα θαζέλα απφ ηα κφξηα ηεο βάζεο δεδνκέλσλ ππνινγίδνληαη δείθηεο (ν φξνο απνδίδεηαη ζε νπνηαδήπνηε πνζφηεηα κπνξεί λα ραξαθηεξίζεη ηε δνκή θαη ηηο ηδηφηεηεο θάζε έλσζεο) κε ρξήζε θαηάιιεινπ ινγηζκηθνχ. Οη δείθηεο πνπ ππνινγίδνληαη κπνξεί λα είλαη: ηνπνινγηθνί (π.ρ. δείθηεο ζπλεθηηθφηεηαο), θπζηθνρεκηθνί (π.ρ. logP),

θβαληηθνί δείθηεο (π.ρ. ΔLUMO, EHOMO), ζηεξενρεκηθνί θ.ι.π. Απφ ηνπο δείθηεο πνπ ππνινγίδνληαη γίλεηαη επηινγή εθείλσλ νη νπνίνη είλαη νη πεξηζζφηεξν ζεκαληηθνί γηα ηελ πεξηγξαθή ηεο ππφ κειέηεο δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο.96 Η επηινγή απηή γίλεηαη ζπλήζσο βάζεη κηαο απηνκαηνπνηεκέλεο δηαδηθαζίαο.

 Σερληθέο κνληεινπνίεζεο. Η επηινγή ησλ δεηθηψλ ζπλδπάδεηαη κε δηαθνξεηηθέο ηερληθέο κνληεινπνίεζεο (Πνιιαπιή Γξακκηθή Παιηλδξφκηζε, Μέζνδνο Διαρίζησλ Σεηξαγψλσλ, Νεπξσληθά δίθηπα, Μεραλέο Γηαλπζκάησλ ΢ηήξημεο) κε ζθνπφ ηελ αλάπηπμε γξακκηθψλ ή/θαη κε γξακκηθψλ κνληέισλ. Με απηέο ηηο δηαδηθαζίεο αλαπηχζζνληαη ζηε ζπλέρεηα πνιιά ελαιιαθηηθά κνληέια πνπ ρξεζηκνπνηνχλ δηαθνξεηηθέο νκάδεο δεηθηψλ θαη πνπ βαζίδνληαη ζε δηαθνξεηηθνχο δηακεξηζκνχο ηεο αξρηθήο βάζεο δεδνκέλσλ ζε δεδνκέλα εθπαίδεπζεο θαη αμηνιφγεζεο.

 Αμηνιφγεζε κνληέινπ. Μεηά ηελ αλάπηπμε ελφο κνληέινπ QSAR αθνινπζεί ε δηεξεχλεζε ηεο αμηνπηζηίαο θαη ηεο δπλαηφηεηαο πξφβιεςεο απηνχ.96 Γηα ηελ αμηνιφγεζε ηνπ κνληέινπ ρξεζηκνπνηνχληαη νη ηηκέο ησλ R2, RMS θαη άιισλ ζηαηηζηηθψλ κεγεζψλ, φπσο επίζεο θαη νη ηερληθέο cross–validation θαη Τ–randomization. Απαξαίηεηνο είλαη επίζεο ν ππνινγηζκφο ηνπ ρψξνπ ηζρχνο ηνπ (domain of applicability). Όηαλ έλα κνληέιν ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ πξφβιεςε ηδηνηήησλ/δξαζηηθφηεηαο γηα ελψζεηο νη νπνίεο δελ ζπκπεξηιήθζεζαλ ζηε δηαδηθαζία δηακφξθσζεο ηνπ, ζα πξέπεη νη ελψζεηο απηέο λα βξίζθνληαη ζην ρψξν ηζρχνο ηνπ, πξνθεηκέλνπ ε πξφβιεςε λα ζεσξεζεί αμηφπηζηε.

80 6.2.2 ΢ηάδην 2. ΢ρεδηαζκόο λέωλ κνξίωλ

΢ηφρνο ζην ζηάδην απηφ είλαη ε εχξεζε κνξίσλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά (δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηα), ηα νπνία δελ ζπκπεξηιακβάλνληαη ζηελ αξρηθή βάζε δεδνκέλσλ. Γηα ην ζθνπφ απηφ είλαη δπλαηφ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ πνηθίιεο ηερληθέο, κεηαμχ ησλ νπνίσλ ν εηθνληθφο έιεγρνο θαη νη κειέηεο πξφζδεζεο, (docking) ε εμφξπμε δεδνκέλσλ θαη ε επίιπζε ηνπ αληίζηξνθνπ πξνβιήκαηνο αξηζηνπνίεζεο.

 Α. Δηθνληθφο έιεγρνο (virtual screening). Η επίδξαζε ησλ επηιερζέλησλ δεηθηψλ, απφ ην πξνεγνχκελν ζηάδην, ζηε δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηα ζε ζπλάξηεζε κε ηα δνκηθά ραξαθηεξηζηηθά ησλ κνξίσλ απνηεινχλ θξηηήξην γηα ηελ αλεχξεζε λέσλ δνκψλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά. ΢ηφρνο είλαη ν ζρεδηαζκφο λέσλ παξαγσγψλ κε ρεκηθή ηξνπνπνίεζε ηεο δνκήο ησλ αξρηθψλ, ηα νπνία ζχκθσλα κε ηνλ εηθνληθφ έιεγρν ζα εκθαλίδνπλ επηζπκεηή ηηκή δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο. ΢ηελ πεξίπησζε κειέηεο βηνινγηθήο δξάζεο ζεκαληηθφ εξγαιείν απνηειεί θαη ε κειέηε πξφζδεζεο ησλ κνξίσλ (docking) ζηελ πξσηεΐλε–ππνδνρέα.

 Β. Δμφξπμε δεδνκέλσλ. Αθνξά ζηελ αλαδήηεζε ζε κηα βάζε δεδνκέλσλ (data mining) λέσλ κνξίσλ κε επηζπκεηή ηηκή ηεο δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο. Οη αξρέο ζηηο νπνίεο ζηεξίδεηαη ε ζηξαηεγηθή ηεο αλεχξεζεο ησλ λέσλ απηψλ ελψζεσλ είλαη :

1) ε νκνηφηεηα πνπ παξνπζηάδεη κηα ηπραία έλσζε ηεο βάζεο δεδνκέλσλ κε έλσζε πνπ έρεη απνδεδεηγκέλα ζεκαληηθή δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηα,

2) ε πξφβιεςε ηεο δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο ησλ ελψζεσλ ηεο βάζεο δεδνκέλσλ κε βάζε ην κνληέιν QSAR πνπ αλαπηχρζεθε ζην πξνεγνχκελν βήκα. Γηα θάζε έλσζε ηεο βάζεο δεδνκέλσλ ππνινγίδεηαη ε επθιείδεηα απφζηαζε ησλ δεηθηψλ ηεο απφ ηνπο αληίζηνηρνπο δείθηεο κηαο απνδεδεηγκέλα δξαζηηθήο νπζίαο. Οη ελψζεηο ηαμηλνκνχληαη κε βάζε ηελ απφζηαζε θαη γηα πεξαηηέξσ κειέηε επηιέγνληαη απηέο πνπ εκθαλίδνπλ ηε κηθξφηεξε απφζηαζε.

81  Γ. Δπίιπζε αληηζηξφθνπ πξνβιήκαηνο αξηζηνπνίεζεο. Αθνξά ζηελ αλαδήηεζε ησλ θαηάιιεισλ ππνθαηαζηαηψλ κε ζηφρν λα πξνθχςνπλ λέεο δνκέο νη νπνίεο ζα βειηηζηνπνηήζνπλ ηελ αληηθεηκεληθή ζπλάξηεζε αξηζηνπνίεζεο, δειαδή ην απνηέιεζκα ηεο εμίζσζεο QSAR. Δπηιέγεηαη ην πιήζνο θαη ην είδνο βαζηθψλ νκάδσλ αηφκσλ, νη νπνίεο ζπλδπάδνληαη κε ρεκηθά επηηξεπηνχο ζπλδπαζκνχο δίλνληαο ππνθαηαζηάηεο, νη νπνίνη νδεγνχλ ζε βειηηζηνπνηεζε ηεο δξάζεο. Ο ρψξνο αλαδήηεζεο ηνπ ζπλδπαζκνχ ησλ νκάδσλ πεξηνξίδεηαη απφ παξακέηξνπο πνπ νθείινληαη αθελφο ζηε κνξηαθή ζπλεθηηθφηεηα θαη αθεηέξνπ είλαη ρεκηθψο απνδεθηνί.

6.2.3 ΢ηάδην 3. ΢ύλζεζε θαη αμηνιόγεζε–Αλαηξνθνδόηεζε ηεο βάζεο δεδνκέλωλ

Αθνχ εμαληιεζνχλ φια ηα πεξηζψξηα ηεο ππνινγηζηηθήο (in silico) έξεπλαο93, ηα παξάγσγα πνπ πξνηείλνληαη απφ ηα πξνεγνχκελα ζηάδηα ζπλζέηνληαη θαη αμηνινγνχληαη σο πξνο ηελ ηηκή ηεο ππφ κειέηε δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο. Απφ ηα απνηειέζκαηα πνπ πξνθχπηνπλ αλαηξνθνδνηείηαη θαη ζπγρξφλσο αμηνινγείηαη ην αξρηθφ κνληέιν QSAR, κε ζηφρν ηνλ επαλαπξνζδηνξηζκφ ηνπ θαη ηε δεκηνπξγία λένπ κε βειηησκέλε ηθαλφηεηα πξφβιεςεο. Η αλαηξνθνδφηεζε απηή είλαη ηδηαίηεξα ζεκαληηθή γηα ηνλ έιεγρν ησλ απνηειεζκάησλ θαζψο θαη ηελ αχμεζε ηεο αμηνπηζηίαο ηνπ. Με ηνλ εκπινπηηζκφ ινηπφλ ηνπ κνληέινπ απμάλεη θαη ν ρψξνο ησλ αμηφπηζησλ πξνβιέςεσλ ηνπ (domain of applicability).

82 6.3 Δπίιπζε πξνβιεκάηωλ

Η πξναλαθεξζείζα κεζνδνινγία βξίζθεη εθαξκνγή ζε κηα πιεζψξα πξνβιεκάησλ ζηνρεπκέλνπ ζρεδηαζκνχ βηνινγηθά δξαζηηθψλ κνξίσλ αιιά θαη ζρεδηαζκνχ πιηθψλ κε επηζπκεηέο ηδηφηεηεο. ΢ηα πιαίζηα απηνχ ηνπ ζηνρεπκέλνπ ζρεδηαζκνχ κε ηε ρξήζε ειεθηξνληθψλ ππνινγηζηψλ (CAMD, Computer Aided Molecular Design), αλαπηχρζεθαλ πξνεγκέλεο καζεκαηηθέο ηερληθέο, αιγφξηζκνη θαη εξγαιεία πεξηγξαθήο, πξφβιεςεο θαη εηθνληθνχ ειέγρνπ ηεο δξαζηηθφηεηαο θαη ησλ ηδηνηήησλ ησλ κνξηαθψλ δνκψλ. Σα πξνβιήκαηα πνπ επηιχζεθαλ αθνξνχλ ζηελ πνηνηηθή θαη πνζνηηθή πεξηγξαθή ηεο ζρέζεο κνξηαθήο δνκήο/δξαζηηθφηεηαο/ηδηνηήησλ (QSAR/QSPR), ζηελ πξφβιεςε ηεο δξαζηηθφηεηαο/ηδηφηεηαο βηνινγηθά δξαζηηθψλ κνξίσλ θαη πνιπκεξψλ (LCST, intrinsic viscosity, glass transition)97, ζηνλ ζρεδηαζκφ λέσλ κνξηαθψλ δνκψλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά (επηζπκεηή βηνινγηθή δξαζηηθφηεηα, κεησκέλε ηνμηθφηεηα, επηζπκεηέο θαξκαθνινγηθέο ή άιιεο ηδηφηεηεο) θαη ζηνλ εηθνληθά βηνινγηθφ έιεγρν (HCV, HIV, MCH1, CCR5).93,95,98

83 6.4 Δθαξκνγέο ηνπ κνληέινπ ή αλάπηπμε κνληέινπ QSAR ζηελ ππεξνμεηδάζε ηνπ αξγηνξάπαλνπ

6.4.1 Δηζαγωγή

΢ε κηα πξφζθαηε κειέηε πνπ δεκνζηεπηεθε απν ηελ νκάδα ησλ Lisa M. Colosi, Qingguo Huang θαη Walter J. Weber, Jr. ζην πεξηνδηθφ JACS99, εμεηάζηεθαλ ηα αξρηθά πνζνζηά αληίδξαζεο κίγκαηνο 15 θαηλφισλ κέζσ HRP ζηελ πδαηηθή θάζε. Η ζπλνιηθή ηαρχηεηα αληίδξαζεο ζε ζπλζήθεο θνξεζκνχ ηνπ ππνζηξψκαηνο, θαη φρη ν ξπζκφο γηα θάζε ελδηάκεζν βήκα ηεο αληίδξαζεο, κεηξήζεθε γηα λα αληηθαηνπηξίδεη ηελ ελδπκηθή δξαζηηθφηεηα γηα θάζε ρεκηθή νπζία πνπ αλακέλεηαη ζε εθαξκνγέο επεμεξγαζίαο λεξνχ. Σα

απνηειέζκαηα δείρλνπλ φηη ε ηαρχηεηα θαηάιπζεο ηνπ έλδπκνπ (kcat) θαη

εηδηθφηεξα ην km δηαθέξνπλ ζεκαληηθά ζηα θαηλνιηθά ππνζηξψκαηα πνπ κειεηήζεθαλ. Απηφ νδήγεζε ζηελ πεξαηηέξσ δηεξεχλπζε ησλ πνζνηηθψλ ζρέζεσλ δνκήο-δξαζηηθφηεηαο (QSAR), ψζηε λα κειεηεζνχλ νη παξάγνληεο νη νπνίνη πξνθαινχλ ζεκαληηθέο κεηαβνιέο ζηε δξαζηηθφηεηα.

6.4.2 QSAR ζε βηνινγηθά κόξηα π. ρ. έλδπκα

Αξρηθέο QSAR κειέηεο γηα ηηο αληηδξάζεηο κέζσ HRP επηθεληξψλνληαη ζε ζπζρεηηζκνχο κεηαμχ ηεο κνξηαθήο δνκήο ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ησλ πνζνζηψλ αληίδξαζήο ηνπο, είηε γηα κεκνλσκέλα ελδηάκεζα ή γηα ην ζπλνιηθφ θχθιν ησλ αληηδξάζεσλ. Λφγσ ηεο θχζεο ηεο νμεηδναλαγσγηθήο αληίδξαζεο, ηέζζεξεηο δείθηεο ρξεζηκνπνηεζεθαλ: ε ελέξγεηα απφ ην πςειφηεξν

θαηεηιεκκέλν κνξηαθφ ηξνρηαθφ (EHOMO), ε ελέξγεηα απφ ην ρακειφηεξν

θαηεηιεκκέλν κνξηαθφ ηξνρηαθφ (ELUMO), ην αηνκηθφ θνξηίν θαη ε ζηαζεξά ηνπ Hammet (ζ). Η εληζρπκέλε ππνινγηζηηθή δχλακε έρεη νδεγήζεη ζηελ αχμεζε

ηεο αθξίβεηαο ησλ ab initio θαη εκηεκεπεηξηθψλ εθηηκήζεσλ ηνπ EHOMO θαη o δείθηεο έρεη ρξεζηκνπνηεζεί ζε πνιπάξηζκεο έξεπλεο ζε δηαθνξεηηθά ππνζηξψκαηα. Οη ζπληειεζηέο ζπζρέηηζεο ,r, πνπ αλαθέξεηαη ζε απηέο

84 100-107 θπκαίλεηαη κεηαμχ 0.560 έσο 0.998. Ο βαζκφο ζπζρέηηζεο κε ην ELUMO πνηθίιεη. Οη Sakurada θαη Brewster εκθάληζαλ αξθεηά ηζρπξή ζπζρέηηζε

(r=0,86, 0,89) κεηαμχ ηεο δξαζηηθφηεηαο ηεο ελψζεο ΙΙ θαη ηνπ ELUMO ζε κηα ζεηξά απφ ππνθαηεζηεκέλεο θαηλφιεο, ελψ ν Hosoya αλέθεξε φηη δελ ππάξρεη ζεκαληηθή ζπζρέηηζε ζε κηα ζεηξά κε παξφκνηα ππνζηξσκάηα.102,101,107 Οη Bordeleau θαη Bartha εκθάληζαλ ζπζρέηηζε κεηαμχ ηεο δξαζηηθφηεηαο ηεο έλσζεο ΙΙ θαη ηνπ αηνκηθνχ θνξηίνπ ζην θαηλνιηθφ νμπγφλν ηνπ ππνζηξψκαηνο, ελψ νη Hosoya θαη Sakurada δελ ήηαλ ζε ζέζε λα επηβεβαηψζνπλ ζεκαληηθή ζπζρέηηζε.102,107,108 Οη Job, Dunford, Sakurada θαη Gilabert έρνπλ αλαθέξεη ζεκαληηθέο ζπζρεηίζεηο κεηαμχ ηεο ζηαζεξάο ηνπ Hammet ζ ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ησλ πνζνζηψλ αληίδξαζεο θαη κε ηηο ελψζεηο I θαη ΙΙ.100,102,106,110

΢ηηο κειέηεο πνπ πεξηγξάθνληαη αλσηέξσ, έρνπκε κηα παξαδνζηαθή QSAR πξνζέγγηζε, εζηηάδνληαο ζηε ζπζρέηηζε ηεο δξαζηηθφηεηαο κε ηε κνξηαθή ή ηελ ειεθηξνληθή δνκή ησλ ππνζηξσκάησλ αγλνψληαο ηηο αιιειεπηδξάζεηο ζην δεζκφ ελδχκνπ–ππνζηξψκαηνο. Μηα ππφζεζε ζηελ νπνία ζηεξίδεηαη ε πξνζέγγηζε είλαη φηη φια ηα ππν κειέηε ππνζηξψκαηα έρνπλ παξφκνηα δηακφξθσζε ζηελ κεηαβαηηθή θαηάζηαζε (ζχκπινθν έλδπκνπ- ππνζηξψκαηνο), ψζηε ε ελέξγεηα ελεξγνπνίεζεο λα ζπζρεηίδεηαη γξακκηθά κε ηελ θαηάζηαζε ηνπ ππνζηξψκαηνο. Απηή ε ππφζεζε, πξνθαλψο, δελ ζα ηζρχεη ζηηο ελδπκαηηθέο αληηδξάζεηο ζηηο νπνίεο ηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ είλαη πεξίπινθα θαη επέιηθηα, θαη σο εθ ηνχηνπ, ην QSAR γηα ηηο ελδπκηθέο αληηδξάζεηο ζπρλά ηζρχεη κφλν κέζα ζε έλα πεξηνξηζκέλν ζχλνιν ππνζηξσκάησλ κε κηθξέο κφλν δνκηθέο κεηαβνιέο. Η ελζσκάησζε βαζηθψλ δεηθηψλ ζηα ραξαθηεξηζηηθά ηνπ δεζκνχ ελδχκνπ-ππνζηξψκαηνο ελδέρεηαη λα θάλεη ην QSAR έλα ηζρπξφ εξγαιείν γηα ηε δηεξεχλεζε ησλ ελδπκηθψλ αληηδξάζεσλ.104,110 Οη van Haandel θαη de Riso έρνπλ πξνζπαζήζεη λα ζπζρεηίζνπλ πνζνζηά αληηδξάζεσλ κε HRP κε ηηο NMR απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ πξσηνλίσλ ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ηεο αίκεο ηνπ ζηδήξνπ.

Η HRP, φπσο θαη άιιεο ππεξνμεηδαζεο αίκεο, πεξηέρεη ζην θαηαιπηηθφ ηεο θέληξν κηα πνξθπξίλε ζηδήξνπ κε δξαζηηθφηεηα πνπ δηακνξθψλεηαη απφ ηα πεξηβάιινληα ακηλνμέα πνπ απνηεινχλ ηελ θαηαιπηηθή ηζέπε. Έλαο επξέσο απνδεθηφο κεραληζκφο αληίδξαζεο δηαηππψζεθε απφ ηνπο Poulos θαη Kraut,

85 επηβεβαηψλεηαη απφ ηηο κεηξήζεηο κε ηε βνήζεηα ππξεληθνχ καγλεηηθνχ ζπληνληζκνχ θαη ηεο θαζκαηνθσηνκεηξίαο ηαρείαο ζάξσζεο, δείρλεη φηη ε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ην ππφζηξσκα ζηελ αίκε δελ ιακβάλεη ρψξα ζην άηνκν ηνπ ζηδήξνπ αιιά ζην δN ηνπ δαθηπιίνπ ηεο ηκηδαδφιεο HIS42.111 Πεξηθεξεηαθά θαηάινηπα ARG38 ιεηηνπξγνχλ παξάιιεια κε ηελ HIS42, παξέρνληαο ζεκαληηθφ θνξηίν ζηαζεξνπνίεζεο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο κεηαθνξάο ειεθηξνλίσλ θαη ηε δηεπθφιπλζε ηφζν ηεο νμείδσζεο φζν θαη ηεο ηαπηφρξνλεο κεηαηφπηζεο ηνπ ειεθηξνλίνπ ζην δαθηχιην ηεο πνξθπξίλεο.112, 113

΢ηελ παξνχζα κειέηε, βξέζεθαλ δηαθνξεηηθέο δξαζηηθφηεηεο απφ ηηο 15 θαηλφιεο, πνιιέο απφ απηέο ηεθκεξηψζεθαλ ή ζεσξήζεθαλ νηζηξνγφλα θαη δελ κπνξεί λα ζπζρεηηζηνχλ απνθιεηζηηθά κε ηηο δνκηθέο κεηαβνιέο ζην ππφζηξσκα. Τπνινγίζηεθαλ νη δηακνξθψζεηο ηνπ δεζκνχ ελδχκνπ- ππνζηξψκαηνο θαη δηαπηζηψζεθε φηη ε απφζηαζε κεηαμχ ηνπ πξσηνλίνπ ηνπ θαηλνιηθνχ ππνζηξψκαηνο θαη ηνπ δN δαθηπιίνπ ηκηδαδνιεο HIS42 δηαδξακαηίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηε δηακφξθσζε ηεο δξαζηηθφηεηαο ηνπ ππνζηξψκαηνο. Με ηελ ελζσκάησζε απηήο ηεο παξακέηξνπ γηα ηε δηακφξθσζε ηνπ δεζκνχ, νη QSAR εμηζψζεηο είραλ πεξηγξάςεη κε αθξίβεηα ηε κεηαβνιή ηεο δξαζηηθφηεηαο ζε δηαθνξεηηθά ππνζηξψκαηα πνπ δνθηκάζηεθαλ. Απηή ε κειέηε QSAR δίλεη πιεξνθνξίεο γηα ην πψο ν δεζκφο ελδχκνπ/ππνζηξψκαηνο έρεη επηπηψζεηο ζηε δξαζηηθφηεηα ηεο HRP. Ωο εθ ηνχηνπ, ηα απνηειέζκαηα ρξεζηκεχνπλ σο βάζε γηα ην ζρεδηαζκφ θαη ηνλ έιεγρν ησλ δπλεηηθψλ πξσηναηκηθψλ ηξνπνπνηήζεσλ ηεο HRP γηα ηελ ελίζρπζε ηεο δξαζηηθφηεηαο έλαληη επηιεγκέλσλ πξνζκίμεσλ.

86 6.4.2.1 Πξνζδηνξηζκόο ηνπ km θαη kCAT

Οη κεηξνχκελεο ηηκέο ηνπ km θαη kCAT παξνπζηάδνληαη ζηνλ Πίλαθα 4 καδί κε ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο γηα ην ηππηθφ ζθάικα ηεο παιηλδξφκεζεο (SE). Οη ελψζεηο ηνπ Πίλαθα 4 θαηαηάζζνληαη αλάινγα κε ηνλ απμαλφκελν κνξηαθφ

φγθν, VM. Η ζεκαληηθή δηαθχκαλζε ησλ ηηκψλ κέηξεζεο, εθηείλεηαη ζε 3 ηάμεηο κεγέζνπο, έδσζε ψζεζε ζηελ νκάδα λα δηεξεπλήζεί ηε κνξηαθή βάζε γηα ηηο δηαθνξέο ζηε δξαζηηθφηεηα ηεο HRP.

6.4.2.2 ΢ρέζεηο κεηαμύ ηεο ζηαζεξάο αλαινγίαο ηεο Αληίδξαζεο θαη ηωλ κνξηαθώλ δνκώλ ηνπ Τπνζηξώκαηνο

Δπεηδή ζηηο αληηδξάζεηο κέζσ HRP ζπλεπάγεηαη κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ απφ ην ππφζηξσκα ζηελ αίκε κε ηαπηφρξνλε κεηαθνξά πξσηνλίσλ ζηελ HIS42, νη ειεθηξνληθέο δνκέο ησλ κνξίσλ ηνπ ππνζηξψκαηνο έρνπλ ηελ ηάζε λα δηαδξακαηίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν γηα λα επεξεάδνπλ ηελ δξαζηηθφηεηα.113,106

Έρεη γίλεη κηα πξνζπάζεηα λα ζπζρεηηζζνχλ νη κεηξνχκελεο ηηκέο kCAT κε ηξεηο

ειεθηξνρεκηθέο παξακέηξνπο ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ EHOMO, ELUMO θαη ηνπ αηνκηθνχ θνξηίνπ ηνπ νμπγφλνπ ηεο θαηλφιεο. Γελ απνηειεί έθπιεμε, πνπ

δελ πξνθχπηεη ζπζρέηηζε κεηαμχ ηεο kCAT θαη ηνπ ELUMO ή ηνπ αηνκηθνχ θνξηίνπ ηνπ νμπγφλνπ ηεο θαηλφιεο. Αληίζεηα, κηα πνιχ ελδηαθέξνπζα ζρέζε

δηαπηζηψζεθε φηη ππάξρεη κεηαμχ ηεο kCAT θαη ηνπ EHOMO. Γηα 8 απφ ηηο 15

ρεκηθέο νπζίεο πνπ κειεηήζεθαλ, ε kCAT παξνπζίαζε κηα ηζρπξή γξακκηθή 2 ζπζρέηηζε κε ην EHOMO (R =0.90). Ωζηφζν, νη ηηκέο ηεο kCAT γηα ηηο ππφινηπεο επηά ρεκηθέο νπζίεο απνθιίλνπλ απφ ηελ ηάζε κε έλα αξλεηηθφ ππφινηπν θαηά ηξφπνλ ψζηε θάζε ηηκή λα είλαη κηθξφηεξε απφ ηελ αλακελφκελε κε βάζε ηελ ηάζε.

Σν ζρήκα 21 απεηθνλίδεη ηνπο ξπζκνχο κεηαβνιήο ηνπ ππνζηξψκαηνο ζε

ζπλάξηεζε ησλ ηηκψλ EHOMO. Γηα λα δηεπθνιπλζεί ε εξκελεία, ηα δεδνκέλα έρνπλ ρσξηζηεί ζε δχν νκάδεο κε δηαθνξεηηθά ρξσκαηηζηά ζχκβνια: ζθνχξα ηεηξάγσλα δείρλνπλ ελψζεηο πνπ ηαηξηάδνπλ κε ηελ ηάζε θαη αλνηρηά ηεηξάγσλα δείρλνπλ ελψζεηο πνπ απνθιίλνπλ απφ απηήλ.

87 Πίλαθαο 4 : Μεηξνύκελεο ηηκέο ln(kCAT) θαη KM γηα 15 Φαηλόιεο νηζηξνγόλωλ (΢ηήιεο 1-3) θαη Πξνζνκνίωζε–Δθηηκώκελε απόζηαζε δεζκνύ (΢ηήιεο 4-7)a

Μεηξνύκελεο παξάκεηξνη Πξνζνκνηωκέλεο-εθηηκώκελεο απνζηάζεηο (Δ) Έλωζε Η Έλωζε Η Έλωζε ΗI Έλωζε ΗI Έλωζε k (κΜ) Ln(k ) (S-1 ) Ln(SE K ) (S-1 ) m CAT CAT H-HemeO H-HIS42 H-HemeO H- HIS42 Φαηλόιε 614.0 6.71 1.79 5.01 6.61 4.82 7.40 1,4-βελδνδηόιεb,d 91.8 8.19 -0.04 5.63 7.98 4.52 8.63 1,2,3-βελδνηξηόιε 59.1 7.94 0.14 6.13 6.99 5.89 7.50 4-ριωξνθαηλόιεc 120.3 7.63 1.49 5.62 6.90 4.29 7.22 4-ληηξνθαηλόιεb,d 73.7 6.46 0.14 5.22 7.80 4.51 8.54 4-κεζνμπθαηλόιεd 307.9 9.59 0.65 5.27 6.43 5.40 7.35 4-αηζπινθαηλόιε 273.1 9.09 0.14 3.54 6.22 7.12 7.52 4-αηζνμπθαηλόιεc 204.4 9.73 0.92 6.23 5.81 6.16 7.46 2,6-δηκεζνμπθαηλόιε 1188.0 9.51 0.65 5.71 6.80 4.69 7.73 4-tert-βνπηπινθαηλόιεb,c 157.6 9.68 -1.66 6.48 8.10 9.62 9.05 4-θαηλπινθαηλόιεb,c 25.8 7.21 -0.26 4.25 9.22 5.39 10.15 Γηζθαηλόιε Αc 3.5 9.99 0.30 5.84 5.72 9.07 7.71 4-νθηπινθαηλόιεb,c 6.0 5.18 1.75 5.01 9.90 8.85 10.78 17β-νηζηξαδηόιε 12.9 5.22 -1.66 5.94 10.78 11.93 12.40 17α-αηζπληινηζηξαδηόιε 2.6 6.24 1.44 13.74 10.40 9.02 10.61 aΑπνζηάζεηο κεηαμχ ηνπ ππνζηξψκαηνο θαηλνιηθψλ πξσηνλίσλ είηε κε ηνλ δεζκφ ηεο αίκεο κε ην νμπγφλν (H-HemeO) ή ην δΝ ηνπ HIS42 ηερλεηνχ ηκηδαδνιίνπ δαθηπιίνπ (H-HIS42) ιακβάλνληαη κέζσ κνξηαθψλ πξνζνκνηψζεσλ ησλ ζπκπιφθσλ ελδχκνπ/ππνζηξψκαηνο πνπ απνηειείηαη απφ δχν νπζίεο, έλσζε Ι (ζηήιεο 4 θαη 5) ή έλσζε ΙΙ (ζηήιεο 6 θαη 7).

b Δλψζεηο δφηεο πνπ παξεθθιίλνπλ απφ ηελ EHOMO/ln(kCAT) ηάζε

c Δλψζεηο δφηεο πνπ παξνπζηάδνπλ ηεθκεξησκέλα νηζηξνγφλα

d Δλψζεηο δφηεο πνπ θέξνπλ χπνπηα νηζηξνγφλα

12

R2 = 0,9522 10

8

6

4

2

0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

΢ρήκα 21. ΢ηαζεξέο ηαρύηεηαο ζε ζπλάξηεζε ηνπ EHOMO γηα 15 θαηλνιηθέο ρεκηθέο νπζίεο, νη γξακκέο ζθάικαηνο αληηπξνζωπεύνπλ ±1 SE.

88 Γεδνκέλα πνπ αληηζηνηρνχλ ζηηο απνθιίλνπζεο ελψζεηο επηζεκαίλνληαη κε κηα ζχληκεζε γηα ην ππφζηξσκα ζην νπνίν αληηζηνηρνχλ: 4-νθηπιθαηλφιε (4OP), 17β-νηζηξαδηφιε (17β), 17Rethynylestradiol (17R), 4-ληηξνθαηλφιεο (4NP), 1,4-benzenediol (1,4BD), 4-tert-βνπηπινθαηλφιεο (4TBP), θαη 4- θαηλπινθαηλφιε (4PP). Σνπιάρηζηνλ ηξεηο ελδηαθέξνπζεο παξαηεξήζεηο

κπνξνχλ λα γίλνπλ φζνλ αθνξά ην ΢ρήκα 21. Πξψηνλ, ην ln(kCAT) απμάλεηαη

κε ηελ αχμεζε ηνπ EHOMO. Απηφ ζπλάδεη κε πξνεγνχκελεο κειέηεο QSAR γηα αληηδξάζεηο κέζσ HRP άιισλ θαηλνιψλ.100-107 Απηή ε παξαηήξεζε είλαη

επίζεο εχθνιν λα αηηηνινγεζεί απφ ην γεγνλφο φηη νη πςειφηεξεο ηηκέο EHOMO είλαη ελδεηθηηθέο ηεο πην επλντθήο απφζπαζεο θαη κεηαθνξάο ησλ ειεθηξνλίσλ.102,104 Γεχηεξνλ, κφλν έλα κέξνο ησλ δεδνκέλσλ ηαηξηάδεη ζηελ

ηάζε κεηαμχ EHOMO θαη kCAT. Αληί λα είλαη ηπραία δηαζθνξπηζκέλα ζηελ γξακκή, ηα ζεκεία πνπ απνθιίλνπλ απφ ηελ ηάζε πάληνηε παξνπζηάδνπλ αξλεηηθφ ππφινηπν. Με άιια ιφγηα, θάζε έλσζε πνπ απνθιίλεη απφ ηελ ηάζε

ηεο ηηκήο kCAT έρεη ηηκή ρακειφηεξε απφ απηή πνπ πξνβιέπεηαη απφ ηε

ζπζρέηηζε κε βάζε ηελ ηηκή ηνπ EHOMO. Σξίηνλ, ην ζρήκα 21 δείρλεη φηη ην κνξηαθφ κέγεζνο, ηείλεη λα είλαη έλαο παξάγνληαο δηαθνξνπνίεζεο κεηαμχ απηψλ ησλ ελψζεσλ πνπ βξίζθνληαη πάλσ θαη εθηφο ηεο γξακκήο, έηζη ψζηε ε HRP θαίλεηαη λα είλαη πεξηζζφηεξν ζε ζέζε λα πξνθαιεί ηελ απνδφκεζε ησλ κηθξφηεξσλ ρεκηθψλ νπζηψλ.

6.4.2.3 Πνζνηηθή απόθιηζε από ην κνληέιν kCAT/EHOMO: Μνξηαθόο όγθνο (VM).

Γηα ηα 15 ππνζηξψκαηα πνπ κεηξήζεθαλ, ν κέζνο κνξηαθφο φγθνο (VM) γηα ηηο ελψζεηο ζην κνληέιν ήηαλ πεξίπνπ 25% κηθξφηεξνο απφ ην κέζν φξν ησλ ελψζεσλ εθηφο ηνπ κνληέινπ. Η ζηαηηζηηθή ζεκαληηθή δηαθνξά (α=0.10) κέζσλ κνξηαθψλ φγθσλ νδεγεί ζηελ εμήο ππφζεζε: Ο πηζαλφο ξπζκφο κε ηνλ νπνίν κηα έλσζε κπνξεί λα απνδνκεζεί απφ ηελ HRP θαζνξίδεηαη απφ ηελ

ηηκή ηνπ EHOMO. Ωζηφζν, γηα κηα έλσζε πνπ είλαη πνιχ κεγάιε ή ζηεξενρεκηθά παξεκπνδηζκέλε γηα λα δηεπθνιπλζεί ν βέιηηζηνο δεζκφο κε ην έλδπκν, ν ξπζκφο ηεο αληίδξαζεο ζα θαηαζηεί κηθξφηεξνο ζε ζρέζε κε ηελ κέγηζηε πηζαλή ηηκή.

89 Μηα πξψηε πξνζπάζεηα λα αμηνινγεζεί ε παξαπάλσ ππφζεζε, απνηειεί ε παξαθάησ εμίζσζε δχν παξακέηξσλ ζπζρέηηζεο γξακκηθήο παιηλδξφκεζεο

ρξεζηκνπνηψληαο ηα EHOMO θαη VM σο αλεμάξηεηεο κεηαβιεηέο θαη ηε ζηαζεξά αλαινγίαο σο εμαξηεκέλε κεηαβιεηή (εμίζσζε 1).

ln kCAT=19.95 + 1.25 x EHOMO - 0.006 x VΜ

R2 = 0.583 (1)

κεηαμχ ησλ κεηξνχκελσλ θαη ησλ πξνβιεπφκελσλ ln(kCAT) ηηκψλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηελ εμίζσζε 1. ΢ε ζχγθξηζε κε ην ζρήκα 21, ε πξνζζήθε

ηνπ VM σο δεχηεξε κεηαβιεηή βειηίσζε ην κνληέιν. Παξφια απηά, ν ρακειφο

ζπληειεζηήο ζπζρέηηζεο ππνδειψλεη φηη ν VM, πνπ ππνδειψλεη ηνλ φγθν ηνπ ππνζηξψκαηνο, είλαη αλεπαξθήο γηα λα εμεγήζεη ηελ απφθιηζε απφ ηελ ηάζε kCAT/EHOMO. Γηαηππψλεηαη έηζη ε άπνςε φηη ην ππφζηξσκα VΜ, έζησ θαη έκκεζα κε ηελ αιιειεπίδξαζε ηνπ δεζκνχ ελδχκνπ/ππνζηξψκαηνο, δελ ζπιιακβάλεη εληειψο ζηνλ ηξφπν κε ηνλ νπνίν ν δεζκφο ελδχκνπ/ππνζηξψκαηνο δηεπθνιχλεη ηε βέιηηζηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ.

6.4.2.4 Πνζνηηθή απόθιηζε από ηελ ηάζε kCAT/EHOMO: ΢ρεκαηηζκόο δεζκνύ ελδύκνπ-ππνζηξώκαηνο.

Όπσο πεξηγξάθεθε λσξίηεξα, πξνεγνχκελεο κειέηεο ζρεηηθά κε ηνλ δεζκφ HRP/ππνζηξψκαηνο δείρλνπλ φηη ην κέγεζνο ησλ δχν απνζηάζεσλ ησλ δεζκψλ κπνξεί λα δηαδξακαηίζεη έλαλ θξίζηκν ξφιν ζηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ, γηα παξάδεηγκα, νη απνζηάζεηο απφ ην θαηλνιηθφ πξσηφλην ηνπ ππνζηξψκαηνο ζην δεζκφ ηεο αίκεο κε ην νμπγφλν104,115 ή ζην δN ηνπ ηκηδαδνιίνπ δαθηπιίνπ ηνπ HIS42101-114. Υξεζηκνπνηψληαο ππνινγηζηηθέο πξνζνκνηψζεηο, έρεη επηηεπρζεί ν ππνινγηζκφο κηαο ελεξγεηαθά κέζεο ζηαζκηζκέλεο ηηκήο γηα ηελ θάζε κία απφ ηηο δχν απνζηάζεηο δεζκψλ πνπ πεξηγξάθνληαη αλσηέξσ θαη ζηηο δχν ελψζεηο Ι θαη II, νη νπνίεο αλαγξάθνληαη ζηηο ζηήιεο 4-7 ηνπ πίλαθα 4. Σα ππνζηξψκαηα ζηνλ Πίλαθα 4 θαηαηάζζνληαη

90 ζχκθσλα κε αχμεζε ηνπ κνξηαθνχ φγθνπ, θαη ν εθζέηεο b ππνδειψλεη ηηο

επηά ελψζεηο πνπ απνθιίλνπλ απφ ηελ ηάζε ηνπ EHOMO/kCAT.

12

10 R2 = 0,9363

8

6

4

2

0 0 2 4 6 8 10 12

12

R2 = 0,956 10

8

6

4

2

0 0 2 4 6 8 10 12

΢ρήκα 22. ΢πζρεηίζεηο κεηαμύ ηωλ κεηξνύκελωλ θαη ηωλ πξνβιεπόκωλ ηηκώλ ηνπ ln(kCAT) ρξεζηκνπνηώληαο ηελ εμίζωζε 2 γηα ηελ έλωζε Η (επάλω) θαη ηελ εμίζωζε 3 γηα ηελ έλωζε II (θάηω).

Καηέζηε ακέζσο πξνθαλέο φηη δελ ππάξρεη ζεκαληηθή ζπζρέηηζε κεηαμχ ηνπ

θαηάινηπνπ απφ ηελ ηάζε EHOMO/kCAT θαη ηεο απφζηαζεο Η-HemeO είηε γηα ηελ έλσζε Ι (R2=0.12) ή ηελ έλσζε ΙΙ (R2=0.42). Αληίζεηα, ε απφθιηζε απφ

ηελ ηάζε EHOMO/kCAT ζπζρεηίδεηαη έληνλα κε ηελ απφζηαζε H-HIS42 θαη ζηηο δχν έλσζεηο, Ι (R2=0.92) θαη ΙΙ (R2=0.96). Σέηνηα ζεκαληηθή ζπζρέηηζε, ζε ζπλδπαζκφ κε ηελ αζζελή ζπζρέηηζε κε ηελ απφζηαζε H-HemeO,

91 ηεθκεξηψλεη φηη ε HIS42 δηαδξακαηίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηε δηαδηθαζία κεηαθνξάο ειεθηξνλίσλ. Η HIS42 κπνξεί λα ρξεζηκεχζεη σο ζεκείν επαθήο γηα ηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ ή κπνξεί λα δηεπθνιχλεη ηε κεηαθνξά ειεθηξνλίσλ κεηαμχ ηνπ ππνζηξψκαηνο θαη ηεο αίκεο κέζσ απνπξσηνλίσζεο ηνπ ππνζηξψκαηνο. Πεξαηηέξσ, θαη νη δχν ζπζρεηίζεηο είλαη αξλεηηθέο, ππνδεηθλχνληαο φηη ε απμεκέλε απφζηαζε δεζκψλ ζρεηίδεηαη κε απμεκέλε θαζπζηέξεζε ζην ξπζκφ ζε ζρέζε κε ηε ηηκή πνπ θαζνξίδεηαη κε ηε ηηκή

EHOMO ηνπ ππνζηξψκαηνο. Με ηε ρξήζε ησλ απνζηάζεσλ Η-HIS42 ζηελ Ι ΙΙ έλσζε Ι (κ H – ΗIS) ή ηελ έλσζε ΙΙ (κ H – ΗIS) θαη ηνπ EHOMO σο αλεμάξηεησλ κεηαβιεηψλ, αλαπηχρζεθε γξακκηθή εμίζσζε παιηλδξφκεζεο δχν

παξακέηξσλ γηα ηελ ln(kCAT), φπσο θαίλεηαη ζηηο εμηζψζεηο 2 θαη 3. Σν ζρήκα 21 απεηθνλίδεη ζπζρεηίζεηο κεηαμχ ησλ κεηξνχκελσλ θαη ησλ πξνβιεπφκελσλ

ηηκψλ ln(kCAT) ρξεζηκνπνηψληαο ηηο εμηζψζεηο 2 θαη 3.

Ι ln kCAT = 25.39 + 1.43 x EHOMO - 0.91 x κ H–ΗIS

R2 = 0.936 (2)

ΙΙ ln kCAT = 30.86 + 1.94 x EHOMO - 1.00 x κ H–ΗIS

R2 = 0.956 (3)

Όπσο αλαθέξζεθε πξνεγνπκέλσο, ε αληίδξαζε κέζσ ηεο έλσζεο ΙΙ είλαη πνιχ πην αξγή απφ φηη κε ηε κέζσ ηεο έλσζεο I θαη σο εθ ηνχηνπ θαζνξίδεη ηα ζπλνιηθά πνζνζηά ηεο HRP ζηνλ θαηαιπηηθφ θχθιν (βι. ΢ρήκα 19). ΢χκθσλα κε απηά, ζπλάγεηαη ην ζπκπέξαζκα φηη ηα ζπλνιηθά πνζνζηά αληίδξαζεο πνπ κεηξνχληαη ζε απηή ηε κειέηε ζα έπξεπε θπξίαξρα λα επεξεάδνληαη απφ ην δεζκφ ηνπ ππνζηξψκαηνο ζηελ έλσζε II. Σν γεγνλφο φηη ν ξπζκφο ζπζρεηίδεηαη θαη κε ην δεζκφ ηνπ ππνζηξψκαηνο κε ηελ έλσζε Ι κπνξεί λα ζεκαίλεη πσο ππάξρεη ζπζρέηηζε θαη κεηαμχ δεζκνχ έλδπκνπ/ππνζηξψκαηνο κε ηελ έλσζε I θαη ηελ έλσζε II, ηνπιάρηζηνλ σο πξνο ηελ ραξαθηεξηζηηθή απφζηαζε H-HIS42. Απηφ είλαη εχινγν εθφζνλ νη ελψζεηο Ι θαη ΙΙ έρνπλ παξεκθεξή δηακνξθψζεηο ακηλνμέσλ ζε άκεζε γεηηλίαζε κε ην ελεξγφ θέληξν θαη δηαθέξνπλ κφλν ειαθξψο ζηε θαηαλνκή ηνπ θνξηίνπ ηεο αίκεο ηνπ ζηδήξνπ θαη ζην δεζκφ ηνπ ζηδήξνπ κε ηα άηνκα ηνπ νμπγφλνπ. Μηα

92 ελδηαθέξνπζα παξαηήξεζε πνπ κπνξεί λα γίλεη, κεηά ηελ εμέηαζε ηνπ Πίλαθα 4 ζρεηίδεηαη κε ηελ απφζηαζε ησλ δεζκψλ γηα ηα ππνζηξψκαηα πνπ

αθνινπζνχλ ηελ ηάζε κεηαμχ EHOMO/kCAT: ζηηο ελψζεηο I θαη II, φιεο νη επηθάλεηεο πνπ αθνινπζνχλ ηελ ηάζε έρνπλ παξφκνηεο απνζηάζεηο κε ηνπ I δεζκνχ H-HIS42. Γηα ηελ έλσζε Ι, ε κέζε απφζηαζε ηνπ δεζκνχ Η-HIS (κ H- HIS) είλαη 6,44 ± 0,17 Å (SE). Αληίζεηα, ε κέζε απφζηαζή ηνπ Η-HIS γηα ηελ IΙ έλσζε ΙΙ (κ H-HIS) είλαη ειαθξψο κεγαιχηεξε απφ 7,49 ± 0,06 Å (SE). Γηα απηά ηα παξάγσγα πνπ απνθιίλνπλ ζεκαληηθά απφ ην κνληέιν, ε απνζηάζε H-HIS42 είλαη γεληθά κεγαιχηεξε γηα ηελ έλσζε ΙΙ ζε ζχγθξηζε κε απηήλ ηεο IΙ έλσζεο Ι. Έλα t-test έγηλε κε ηε ρξήζε ησλ απνζηάζεσλ ησλ δεζκψλ κ H-HIS I θαη κ H-HIS γηα ην δεδνκέλν ππφζηξσκα. Σν απνηέιεζκα δείρλεη φηη ε κέζε IΙ I δηαθνξά κεηαμχ ησλ απνζηάζεσλ ησλ δεζκψλ (κ H-HIS-κ H-HIS) είλαη ζηαηηζηηθά ζεκαληηθή (p ηηκή <0,001) θαη κε ηηκή 0,96 ± 0,13 Å (SE). Η αχμεζε απηή ησλ απνζηάζεσλ ησλ δεζκψλ απφ ηελ έλσζε Ι ζηελ έλσζε II κπνξεί λα ζπλεηζθέξεη ζην γεληθά βξαδχηεξν ξπζκφ αληίδξαζεο κέζσ ηεο έλσζεο ΙΙ ζρεηηθά κε ηελ έλσζε Ι.

Η ζχγθξηζε ησλ εμηζψζεσλ 1, 2 θαη 3 δείρλεη φηη ε απφζηαζε H-HIS42 έρεη

πνιχ κεγαιχηεξε ηθαλφηεηα πξφβιεςεο ζε ζρέζε κε ην VM ζηελ πνζνηηθνπνίεζε ηεο επίδξαζεο ηεο δηακφξθσζεο ηνπ δεζκνχ ελδχκνπ/ππνζηξψκαηνο ζηνλ εκθαλή ξπζκφ αληίδξαζεο. Η δηαθνξνπνίεζε κεηαμχ ηνπ κνξηαθνχ φγθνπ θαη ηεο απφζηαζεο ηνπ δεζκνχ επηβεβαηψλεηαη απφ ηελ εμέηαζε ηνπ δεζκνχ ηεο δηζθαηλφιεο Α. Αλ θαη απηή ε έλσζε έρεη ηνλ ηέηαξην κεγαιχηεξν κνξηαθφ φγθν κεηαμχ ησλ 15 ελψζεσλ πνπ έρνπλ

κειεηεζεί, ε ηαρχηεηα αληίδξαζεο αθνινπζεί ηελ ηάζε κεηαμχ ησλ EHOMO/kCAT αξθεηά θαιά (ππφινηπν =0,20). Αληίζεηα, ε 4-θαηλπινθαηλφιε, κηα ρεκηθή νπζία κε αληίζηνηρα κεγάιν κνξηαθφ φγθν, έρεη κηα ζηαζεξά αληίδξαζεο πνιχ κηθξφηεξε απφ εθείλε πνπ πξνβιέπεηαη απφ ηελ ηάζε (ππφινηπν=-2,33). Οη πξνζνκνηψζεηο καο δείρλνπλ φηη ε απφζηαζε H-HIS42 γηα ηελ δηζθαηλφιε Α ζηηο ελψζεηο Ι θαη ΙΙ είλαη 5,72 θαη 7,71 Å, αληίζηνηρα. Οη απνζηάζεηο απηέο είλαη πξάγκαηη πνιχ κηθξφηεξεο απφ εθείλεο ηεο 4-θαηλπινθαηλφιεο (9,22 θαη 10,15 ζηηο ελψζεηο Ι θαη ΙΙ, αληίζηνηρα). ΢ηελ δηζθαηλφιε Α νη ραξαθηεξηζηηθέο απνζηάζεηο ησλ δεζκψλ είλαη παξφκνηεο κε εθείλε ησλ άιισλ ρεκηθψλ

νπζηψλ πνπ αθνινπζνχλ ηελ ηάζε EHOMO/kCAT. Η ηθαλφηεηα ηεο δηζθαηλφιεο Α

93 γηα ζηελφηεξε επαθή κε ηελ HIS42 ελδέρεηαη λα πξνθχςεη απφ παξάγνληεο φπσο ε δηκεξήο ζπκκεηξία θαη ε γξακκηθφηεηα ηνπ ζρήκαηνο. Δπεηδή απηά ηα κνξηαθά ραξαθηεξηζηηθά δελ είλαη αθξηβψο ελζσκαησκέλα ζηε κέηξεζε ηνπ

κνξηαθνχ φγθνπ, ην VM έρεη κηθξφηεξε ηθαλφηεηα πξφβιεςεο ηνπ πνζνζηνχ απνηθνδφκεζεο ζε ζχγθξηζε κε ηε δηακφξθσζε ηνπ δεζκνχ.

6.5 ΢πκπεξάζκαηα

΢ηφρνο ησλ κεζνδνινγηψλ θαη ηεο εθαξκνγήο, πνπ αλαπηχρζεθαλ αλαιπηηθά είλαη ζε πξψην ζηάδην, ε πνηνηηθή θαη πνζνηηθή πεξηγξαθή ηεο ζπζρέηηζεο ησλ δνκηθψλ ραξαθηεξηζηηθψλ ησλ κνξίσλ κε ηελ ππφ κειέηε δξαζηηθφηεηα/ηδηφηεηα θαη, ζε επφκελν ζηάδην, ν ζρεδηαζκφο λέσλ δξαζηηθψλ κνξίσλ κε επηζπκεηά ραξαθηεξηζηηθά κέζσ κηαο δηαδηθαζίαο εηθνληθνχ βηνινγηθνχ ειέγρνπ, αξηζηνπνίεζεο ή εμφξπμεο δεδνκέλσλ. Οη κεζνδνινγίεο απηέο κπνξνχλ λα αληηθαηαζηήζνπλ ηηο εκηεκπεηξηθέο εμηζψζεηο κε πεξηνξηζκέλεο δπλαηφηεηεο θαη λα πεξηνξίζνπλ ζεκαληηθά ηα ρξνλνβφξα θαη πςεινχ θφζηνπο πεηξάκαηα πνπ απαηνχληαη γηα ηελ πξφβιεςε δξαζηηθφηεηαο/ηδηνηήησλ θαη ην ζρεδηαζκφ λέσλ κνξίσλ κε βειηησκέλα ραξαθηεξηζηηθά.

94 6.6 Γεληθά ζπκπεξάζκαηα

΢ηελ παξνχζα δηπισκαηηθή εξγαζία παξνπζηάζηεθαλ ηφζν ζηνηρεία ελδπκηθήο θαηάιπζεο, κε έκθαζε ζην έλδπκν ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξαπαληνχ (HRP), φζν θαη ζηνηρεία ππνινγηζηηθήο ρεκείαο, κε έκθαζε ζηελ εθαξκνγή ππνινγηζηηθψλ κεζφδσλ γηα ηελ πξφβιεςε ησλ ηηκψλ θηλεηηθψλ παξακέηξσλ ηεο δξάζεο ηεο HRP κέζσ κεζνδνινγηψλ αλάπηπμεο πνζνηηθψλ ζρέζεσλ δνκήο–δξαζηηθφηεηαο (QSAR). Αξρηθά παξνπζηάζηεθαλ γεληθά ζηνηρεία βηνρεκείαο γηα ηα έλδπκα, ηηο θαηαιάζεο, ηηο ππεξνμεηδάζεο θαη εηδηθφηεξα ηελ ππεξνμεηδάζε ηνπ αγξηνξαπαληνχ, ελψ αθνινχζσο έγηλε πεξηγξαθή ησλ βαζηθψλ κεζνδνινγηψλ κνληεινπνίεζεο ηεο ζπζρέηηζεο δνκήο–δξαζηηθφηεηαο κε ηδηαίηεξε αλαθνξά ζε κηα πνιχ ελδηαθέξνπζα

εθαξκνγή γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ θηλεηηθψλ παξακέηξσλ km θαη ΚCAT. Η

ππνινγηζηηθή δηεξεχλεζε ησλ θξίζηκσλ παξακέηξσλ πνπ επεξεάδνπλ ηα km

θαη ΚCAT ζε δηαθνξεηηθά ζπζηήκαηα θαηλνιψλ θαη HRP θαη ε αθφινπζε πξφβιεςε ησλ παξακέηξσλ απηψλ κε αθξίβεηα κέζσ ηνπ κνληέινπ πνπ αλαπηχζζεηαη, απνηειεί έλα πεδίν έξεπλαο κε ηδηαίηεξν ελδηαθέξνλ. Η επέθηαζε ηεο κεζνδνινγίαο θαη ζε άιια ζπζηήκαηα κε δηαθνξεηηθνχο ζπλδπαζκνχο κνξίσλ θαη ελδχκνπ θαη γηα δηαθνξεηηθά ππνζχλνια κνξηαθψλ δεηθηψλ, παξνπζηάδεη επίζεο ηδηαίηεξν ελδηαθέξνλ θαη αμίδεη λα δηεξεπλεζεί.

95 7. Παξάξηεκα Η

΢ρήκα 23. Γηαλνκή θνξηίνπ ζηα επηιεγκέλα ππνζύλνια ηωλ ελώζεωλ Η (αξηζηεξά) θαη ΗΗ (δεμηά). Με θόθθηλν θαίλεηαη ε αίκε, κε θίξηηλν θαίλεηαη ε αίκε πνπ δεπκεύεηαη ζηα άηνκα ηνπ νμπγόλνπ, ην κπιέ είλαη ηα άηνκα ηνπ ζηδήξνπ πνπ δεζκέπνληαη ζηα θαηάινηνπα ηζηηδίλεο 170 ή θαη 42.

96 8. Παξάξηεκα ΗΗ

Πίλαθαο 5 : Παξάκεηξνη ηνπ ππνζηξώκαηνο πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη ζηηο QSAR

ζρέζεηο, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηνπ κνξηαθνύ όγθνπ VM, ην αηνκηθό θνξηίν ηνπ

νμπγόλνπ ηεο θαηλόιεο, ην ΔHOMO θαη ην ELUMO.

3 § ♯ Έλωζε vM(Å ) Φνξηίν Ο EHOMO (eV ) ELUMO (eV ) Σάζε θαηάινηπνπ Φαηλόιε 356 -0.35 -8.66 7.86 0.00 1,4-βελδνδηόιε* 375 -0.34 -7.20 7.56 -1.16 1,2,3-βελδνηξηόιε 389 -0.32 -7.65 7.78 -0.59 4-ριωξνθαηλόιε 396 -0.34 -8.31 6.94 0.29 4-ληηξνθαηλόιε* 426 -0.34 -8.18 7.43 -1.11 4-κεζνμπθαηλόιε 426 -0.35 -7.09 7.62 0.05 4-αηζπινθαηλόιε 453 -0.34 -7.35 7.94 0.02 4-αηζνμπθαηλόιε 484 -0.35 -6.98 7.69 -0.01 2,6-δηκεζνμπθαηλόιε 487 -0.34 -7.13 7.77 0.04 4-tert-βνπηπινθαηλόιε* 536 -0.35 -7.27 7.97 -2.23 4-θαηλπινθαηλόιε* 565 -0.34 -7.09 6.90 -2.33 Γηζθαηλόιε Α 708 -0.35 -6.95 7.79 0.20 4-νθηπινθαηλόιε* 767 -0.35 -7.34 7.95 -3.93 17β-νηζηξαδηόιε* 797 -0.35 -6.98 7.88 -4.52 17α-αηζπληινηζηξαδηόιε* 853 -0.35 -7.12 7.76 -3.24 § Γηα ρεκηθέο ελψζεηο κε πνιιαπιέο θαηλνιηθέο νκάδεο, αλαθέξεηαη θαηά κέζνλ φξν ην θνξηίν ηνπ νμπγφλνπ

# Καηάινηπα ηνπ ln(KCAT) απφ ηελ ηάζε πνπ νξίδεηαη απφ ηε γξακκηθή ζρέζε ηεο εμίζσζεο 3.

* Γείρλεη ηηο επηά ελψζεηο πνπ απνθιίλνπλ απφ ηε γξακκηθή ζρέζε ΚCAT-EHOMO πνπ νξίδεηαη απφ ηελ εμίζσζε 3.

Δμηζψζεηο 1 θαη 2: Βέιηηζηε γξακκηθή ζρέζε γηα ηα απνηειέζκαηα κνξηαθψλ πξνβιέςεσλ κε θαθέο ζπζρεηίζεηο.

2 ln(KCAT) = 19.36 + 33.8 * Φνξηίνθαηλφιεο-Ο R =0.03 (1)

2 ln(KCAT) = 9.15 - 0.19 * ELUMO R =0.00 (2)

Eμίζσζε 3: Bέιηηζηε γξακκηθή ζρέζε γηα ηηο νθηψ ρεκηθέο νπζίεο πνπ

πεξηιακβάλνπλ ηελ ηάζε ΚCAT-EHOMO (απηέο πνπ δελ ζεκεηψλνληαη ζηνλ πίλαθα 5 κε *)

2 ln(KCAT) = 22.315 - 1.80 * EHOMO R =0.95 (3)

97 9. ΠΗΝΑΚΑ΢ ΟΡΟΛΟΓΗΑ΢

Πίλαθαο 6 :Πίλαθαο νξνινγίαο κε ηηο αληηζηνηρίζεηο ηωλ ειιεληθώλ θαη μελόγιωζζωλ όξωλ

Ξελόγιωζζνο όξνο Διιεληθόο Όξνο

Horseradish peroxidase Τπεξνμεηδάζε ηνπ αγξηoξάπαλνπ

Quantitative Structure-Activity Πνζνηηθέο/Πνηνηηθέο ζρέζεηο δνκήο- Relationships δξαζηηθφηεηαο

98 10. ΢ΤΝΣΜΖ΢ΔΗ΢ – ΑΡΚΣΗΚΟΛΔΞΑ – ΑΚΡΧΝΤΜΗΑ

Αθξωλύκηα θαη αλάπηπμή ηνπο

HPR Horseradish peroxidase Arg Αξγηλίλε Tpr Tξππηνθάλε Asp Αζπαξαγίλε Tyr Σπξνζίλε Ser ΢εξίλε QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

99 11. ΑΝΑΦΟΡΔ΢

1. Γ. Παπαδνγηαλλάθεο, Δηζαγσγή ζηελ θαηάιπζε, Γ. Παπαδνγηαλλάθεο Αζήλα 2008 (΢εκεηψζεηο καζήκαηνο)

2. K.Faber, R. Patel, A happy marriage between chemistry and biotechnology: asymmetric synthesis via green chemistry, Current Opinion in Biotechnology, 2000, 11, 517-519

3. Ι. Μ. Μαξθφπνπινο Αξρέο Βαζηθήο Βηνθαηάιπζεο Αζήλα 2004

4. Enzymes Biochemistry Biotechnology, Clinical Chemistry, 2nd edition, Trevor Palmier, Philip Bonover, Horwood Publishing, Thiehester 2007

5. Enzyme structure and mechanism, Han Fersht, W.H. Freeman and company,1977

6. Kinetic at Chemical and Enzyme catalysed reactivity, Dennis Piszkiewicz, Oxforf university Press N.Y. , 1977

7. Loew O., Physiological studies of Connenticut leaf tobacco, U.S. Dept of Agri. Repts.1900,65,5-57

8. Klotz M., G. Klassen, G. R. Loewen P. C., Phylogenetic relationships among prokaryotic and eukaryotic catalases, Mol. Biol. Evol.1997,14,951-958

9. Welinder K., Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases, Curr.Opin.Struc.Biol.1992,2,388-393

10. Loewen P. C., Scandalios, J. G.,In ‘Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defences’, ed. Pp. 273-308. Cold Spring Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 1997

11. Kono Y., Fridovich I., Isolation and characterization of the pseudocatalase of Lactobacillus plantarum, J. Biol. Chem.1983,258,10,6015-6019

100 12. Allgood G., S. Perry, Characterization of a manganese-containing catalase from the obligate thermophile Thermoleophilum album, J.J.J. Bacteriol.1986,168,2,563-567

13. Waldo G. S., Fronko R. M., Penner-Hahn J. E., Inactivation and reactivation of manganese catalase: Oxidation-state assignments using X-ray absorption spectroscopy, Biochemistry, 1991, 30, 10486

14. Whittaken M.M, Barynin V.V, Antonyuk S.V, Whittaken J.W., The oxidized (3,3) state of manganese catalase. Comparison of enzymes from Thermus thermophilus and Lactobacillus plantarum, Biochemistry,1999, 38,28,9126-9136

15. Thomas J., A. Morris, D. R. Hager L. P., Chloroperoxidase. VII. Classical peroxidatic, catalatic, and halogenating forms of the enzyme, J. Biol. Chem.1970,245,12,3129-3134

16. Ma M., Eaton J. W., Multicellular oxidant defense in unicellular organisms, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992,89,17,7924-7928

17. Nicholls P., Activity of catalase in the red cell, Biochim. Biophys. Acta.1965,99,286-296

18. Nicholls P., Contributions of catalase and glutathionine peroxidase to red cell peroxidase removal, Biochim. Biophys. Acta.1972,279,306-309

19. Clayton R. K., Permeability barriers and the assay of catalase in intact cell, Biochim. Biophys. Acta.1959,36,35-39

20. Nicholls, P. Schonbaum, G. R. In ‘The Enzymes’ P. Boyer, H. Lardy, K. Myrback, eds., Vol. VIII,2nd ed.,pp.147-225, Academic Press: New York, 1963

21. Deisseroth A., Dounce A. L., Catalase: Physical and chemical properties, mechanism of catalysis, and physiological role, Physiol. Rev.1970,50,3,319-375

22. Bonnichsen R. K., Chance, B. Theorell H., Catalase activity, , Acte Chem. Scand.1947,1,685-709

101 23. Ogura Y., Catalase activity at high concentration of hydrogen

peroxidase, Arch. Biochem. Biophys. 1955, 57, 288-300

24. Keilin D., Nicholls P., Reaction of catalase with hydrogen peroxidase and hydrogen donors, Biochim. Biophys. Acta.,1958, 29,302-307

25. Kirkman H. N., Gaetani, G. F., Catalase: a tertameric enzyme with four tighty bound molecular of NADPH, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 1984,81,14,4343-4347

26. Nicholls P., The formation and catalytic role of catalase peroxidase compound II, Biochem. J.1964,90,331

27. Fitta I., Rossmann M. G., The actine center of catalase NADPH binding site on beef catalase, J. Mol.Biol., 1985, 185,21-37

28. Hillar A., Nicholls P., A mechanism for NADPH inhibition of catalase compound II formation” FEBS Lett.1992,314,2,179-182

29. Bicout D.J.,Field M. J., Gouet P., Jouve H.-M., Simulations of electron transfer in the NADPH-bound catalase from Proteus mirabolis PR, , Biochim. Biophys. Acta. 1995,1252,172-176

30. Olson L. P., Bruice T.C., Electron tunneling and ab initio calculations related to thwe one-electron oxidation of NAD(P)H bounb to catalase, Biochemistry 1995,34,7335-7347

31. Almarsson O., Sinha A., Gopinath E., Bruise T.C, Mechanism of one- electron oxidation of NAD(P)H and function of NADPH bound to catalase, J. Amer. Chem. Soc. 1993,115,7093-7102

32. Kirkman H. N., Rolfo M., Ferraris A. M., Gaetani G. F., Mechanisms of protection of catalase by NAPDH KINETICS AND STOICHIOMETRY*, Biol. Chem. 1999,274,13908-13914

33. Hayashi Y., Yamazaki I.,The oxidation-reduction potentials of compound I/compound II and compound II/ferric couples of horseradish peroxidases A2 and C, J. Biol. Chem. 1979,254,18,9101-9106

34. He B., Sinclair R., Copeland B. R., Makino R., Powers L. S., Yamazaki I, The Structure-Function Relationship and Reduction Potentials of High

102 Oxidation States of Myoglobin and Peroxidase, Biochemistry 1996,35,2413-2420

35. DeFelippis M. R., Murthy C. P., Faraggi M., Klapper M. H., Pulse radiolytic measurements of redox potentials:The Tyrosin and Tryptophan radicals, Biochemistry 1989,28, 4847-4853

36. Hillar A., Nicholls P., Switala J., Loewen P. C., NADPH binding and control of catalase compound II formation: Comparison of bovine, yeast, and Escherichia coli enzymes, Biochem. J. 1994,300,531-539

37. Jouve H. M., Pelmont J., Gaillard J., Interaction between Pyridine Adenine Dinucleotides and Bovine liver catalase: A chromatographic and spectral study, Arch. Biochem. Biochys.1986,248,1,71-79

38. Claiborne A., Malinowski D. P., Fridovich I., Purification and characterization of hydroperoxidase II of Escherichia coli B, J. Biol. Chem.1979, 254, 22,11664-11668

39. Hochman A., Shemesh A., Purification and characterization of a catalase-peroxidase from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulate, J. Biol. Chem. 1987,262,14,6871-6876

40. Loewen P. C., Stauffer G. V., Nucleotide sequence of KatG of Salmonella typhimurium LT2 and characterization of its product, hydroperoxidase I, Mol. Gen. Genet. 1990,224,1,147-151

41. Welinder K., Bacterial catalase-peroxidases are gene duplicated members of the plant peroxidase superfamily, Biochim. Biophys. Acta. 1991,1080,3,215-220

42. Percy M.E., Can J., Catalase: an old enzyme with a new role? , Biochem. Cell. Biol.1984,62,10,1006-1014

43. Hochman A., Shemesh A., Purification and characterization og catalase- peroxidase from the Photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulate, J. Biol. Chem. 1987, 262, 6871

44. Goldberg I., Hochman A., Purification and characterization of a novel type of catalase from the bacterium Klebsiella pneumoniae, Biochim. Biophys. Acta.1989,991,330-336

103 45. Hochman A., Goldberg I., Purification and characterization of a catalase- peroxidase and a typical catalase from the bacterium Klebsiella pneumoniae, Biochim. Biophys. Acta. 1991, 1077, 299-307

46. Goldberg I., Hochman A., Three Different Types of Catalases in Klebsiek pneumonia, Arch. Biochem. Biochys. 1989,268,124-128

47. Levy E., Eyal Z., Hochman A., Purification and characterization of a catalase-peroxidase from Fungus Septoria tritici, Arch. Biochem. Biochys.1992,296,1,321-327

48. Obinger C., Regelseberger G., Strasser G., Burner U., Peschek G.A., Purification and characterization of a homodimeric catalase-peroxidase from Cyanobacrerium Anacystis nidulans, Biochem. Biochys. Res. Commun. 1997,235,545-552

49. Regelsberger G., Jakopitsch C., Engleder M., Ruker F., Peaschek G.A., Obinger C., Spectral and Kinetic Studies of the Oxidation of Monosubstituted Phenols and Anilines by Recombinant Synechocystis Catalase-Peroxidase Compound I, Biochemistry 1999,38,10480-10488

50. Jakopitsch C., Ruker F., Regelsberger G., Tockal M., Peaschek G.A., Obinger C. Catalase-peroxidase from the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803: Cloning, overexpression in Escherichia coli, and kinetics characterization, Biol. Chem. 1999,380, 1807-1096

51. Poulos T. L., Kraut J., The stereochemistry of peroxidase catalysis, J. Biol Clem.1980,255,17,8199-8205

52. English A. M., Tsaprailidis G., Catalytic Structure-function relationships in heme peroxidases, Adv. Inorg. Chem.1995,43,79-125

53. Dunford H. B., In ‘Heme Peroxidases’ J. Wiley & Sons: New York,1999

54. Hillar A., Ph.D.Thesis,1999, University of Manitoba, Winnipeg, MG, Canada

55. Loewen P. C., Switala J., von Ossowski I., Hillar A., Chriestie A., Tattrie B., Nicholls P., Catalase HPII of Escherichia coli catalyzes the conversion of protoheme to cis-Heme d, Biochemistry 1993,32,10159- 10164

104 56. B.C. Saunders, Peroxidases and catalases, in: G.L. Eichhorn (Ed.), Inorganic Biochemistry, Elsevier, Amsterdam, 1973, pp. 988–1021

57. K.G. Welinder, M. Gajhede, Structure and evolution of peroxidases, in: K.G. Welinder, S.K. Rasmussen, C. Penel, H. Greppin (Eds.), Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology, University of Geneva, Geneva, 1993, pp. 35–42

58. Karthikeyan M et al, Induction of resistance in host against the infection of leaf blight pathogen (Alternaria palandui) in onion (Allium cepa var aggregatum), Indian J Biochem Biophys, 2005,42 (6): 371–7

59. Hani Atamna, Kathleen Boyle, Amyloid-{beta} peptide binds with heme to form a peroxidase: Relationship to thecytopathologies of Alzheimer's disease, Proceedings of the National Academy of Science, 2006,103 (9): 3381–3386

60. W.L. Smith, E.T. Eling, R.J. Kulmacz, L.J. Marnett, A.L. Tsai, Tyrosyl radicals and their role in hydroperoxide-dependent activation and inactivation of prostaglandin endoperoxidase synthase, Biochemistry 31 (1992) 3–7

61. M.R. Gunther, R.A. Tschirret-Guth, H.E. Witkowska, Y.C. Fann, D.P. Barr, P. Ortiz de Montellano, R.P. Mason, Site-specific spin trapping of tyrosine radicals in the oxidation of metmyoglobin by hydrogen peroxide, Biochem. J. 330 (1998) 1293–1299.

62. C. Giulivi, E. Cadenas, Heme protein radicals: formation, fate and biological consequences, Free Radic. Biol. Med. 24 (1998) 269–279.

63. A. Taurog, M.L. Dorris, D.R. Doerge, Mechanisms of simultaneous iodination and coupling catalyzed by thyroid peroxidase, Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 24–32

64. L.M. Landino, B.C. Creus, J.K. Gierse, S.D. Hauser, L.J. Marnett, Mutational analysis of the role of the distal histidine and glutamate residues of prostaglandin- endoperoxide synthase-2 in peroxidase catalysis, hydroperoxide reduction and cyclooxygenase activation, J. Biol. Chem. 272 (1997) 21565–21574

105 65. J. Zeng, R.E. Fenna, X-ray crystal structure of canine myeloperoxidase at 3 A, resolution, J. Mol. Biol. 226 (1992) 185–207

66. A. Jacquet, L. Garcia-Quintana, V. Deleersnyder, R. Fenna, A. Bollen, N. Moguilevsky, Site-directed mutagenesis of human myeloperoxidase, Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 73–81

67. A. Taurog, Molecular evolution of thyroid peroxidase, Biochimie 81 (1999) 557–562

68. Bakalovic, N., Passardi, F., et al., 2006. PeroxiBase: a class III plant peroxidase database, Phytochemistry 67, 534–539

69. Smith, A.T., Santama, N., Dacey, S., Edwards, M., Bray, R.C., Thorneley, R.N.F., Burke, J.F., 1990. Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase C in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with Ca2+ and heme. J. Biol. Chem. 265, 13335–13343

70. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T., Poulos, T.L., 1997. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 angstrom resolution. Nature Struct. Biol. 4, 1032–1038

71. Berglund, G.I., Carlsson, G.H., Smith, A.T., Szo¨ ke, H., Henriksen, A., Hajdu, J., 2002. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. Nature 417, 463–468

72. Tognolli, M., Penel, C., Greppin, H., Simon, P., 2002. Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana. Gene 288, 129–138

73. Welinder K.G., Justesen A.F., Kjδrsgard I.V.H., Jensen R.B., Rasmussen S.K., Jespersen H.M., Duroux L., 2002, Structural diversity and transcription of class III peroxidases from Arabidopsis thaliana. Eur. J. Biochem. 269, 6063–6081

74. Welinder K.G., 1973, Current structure of the glycoprotein horseradish peroxidase, FEBS Lett.,72,19-23

75. Yang B.Y., Gray J.S.S., Montgomery R., 1996, The glycans of horseradish peroxidase, Carbohydrate Res., 287, 203–212

106 76. Haschke R.H., Friedhoff J.M., 1978, Calcium-related properties of horseradish peroxidase, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80,1039– 1042

77. Howes B.D., Feis A., Raimondi L., Indiani C., Smulevich G., 2001, The critical role of the proximal calcium ion in the structural properties of horseradish peroxidase, J. Biol. Chem. 276, 40704–40711

78. Welinder K.G., Gajhede M., 1993, Structure and evolution of peroxidases, In: Welinder, K.G., Rasmussen S.K., Penel C., Greppin H., (Eds.), Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology, University of Geneva, Geneva, pp. 35–42

79. Welinder K.G., 1992a. Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases, Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 388–393

80. Mittler R., 2002, Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance, Trends Plant Sci. 7, 405–410

81. Shigeoka S., Ishikawa T., Tamoi M., Miyagawa Y., Takeda T., Yabuta Y., Yoshimura K., 2002, Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes, J. Exp. Biol., 53, 1305–1319

82. Kawaoka A., Kawamoto T., Ohta H., Sekine M., Takano M., Shinmyo A., 1994, Wound-induced expression of horseradish peroxidase, Plant Cell Rep.,13, 149–154

83. Dunford H.B., 1991, Horseradish peroxidase: Structure and kinetic properties, In: Everse, J., Everse, K.E., Grisham, M.B. (Eds.), Peroxidases in chemistry and biology, Vol. 2. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 1–24

84. Veitch N.C., Smith A.T., 2001, Horseradish peroxidase. Adv. Inorg.Chem. 51, 107–162

85. Filizola M., Loew G.H., 2000, Role of protein environment in horseradish peroxidase compound I formation: molecular dynamics simulations of horseradish peroxidase–HOOH complex, J. Am. Chem. Soc., 122, 18– 25

86. Dunford H.B., 1999, Heme peroxidases, Wiley–VCH, New York

107 87. Rodriguez-Lopez J.N., Hernandez-Ruiz J., Garcia-Ca΄novas F., Thorneley R.N.F., Acosta M., Arnao M.B., 1997, The inactivation and catalytic pathways of horseradish peroxidase with mchloroperoxybenzoic acid, J. Biol. Chem., 272, 5469–5476

88. Welinder K. G., 1992b, Plant peroxidases: structure-function relationships In: Penel C., Gaspar T., Greppin H., (Ends), Plant Peroxidases 1980-1990, Topics and Detailed Literature on Molecular, Biochemical, and Physiological Aspects. University of Geneva, Geneva pp. 1–24

89. Fujiyama K., Takemura H., Shibayama S., Kobayashi K., Choi J.-K., Shinmyo A., Takano M., Yamada Y., Okada H., 1988, Structure of the horseradish peroxidase isozyme C genes, Eur. J. Biochem. 173, 681– 687.

90. Fujiyama K., Takemura H., Shinmyo A., Okada H., Takano M., 1990, Genomic DNA structure of two new horseradish-peroxidase encoding genes, Gene 89, 163–169

91. Hansch C., Leo A., Exploring QSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, ACS, Washington DC (1995)

92. Gasteiger J., Engel T., Chemoinformatics: A textbook, Wiley-VCH, Weinheim (2003)

93. Opera T.I. Chemoinformatics in drug discovery. Wiley-VCH, Weinheim, 2055

94. Afantitis A., Melegraki G., Sarimveis H., Koutentis P.A., Markopoulos J. & Iglessi-Markopoulou O., Investigations of Substituent Effect of 1(3.3- Diphenylpropyl)-Piperidinyl Phenylacetamides Amides on CCR5 Binding Affinity using QSAR and Virtual Screening Techniques. Journal of Computer-Aided Molecular Design Vol.20, No2 (2006a)83-95

95. Melegraki G., Afantitis A., Sarimveis H., Koutentis P.A., Markopoulos J.& Iglessi-Markopoulou O., Identification of a series of novel derivatives as potent HCV inhibitors by a ligand-based virtual screening optimized procedure. Vol. 15,No23 (2007a)7237-7247

108 96. Todeschini R., Consonni V., Handbook of Molecular Descriptors. Methods and Principles in Medical Chemistry, in Series of Methods and Principles of Medical Chemistry,ed. Mannhold R., Kubinyi H. & Timmerman H. Wiley-VCH, Weinheim (200) Vol.11

97. Afantitis A., Melegraki G., Sarimveis H., Koutentis P.A., Markopoulos J.& Iglessi-Markopoulou O., Prediction of Instrinsic Viscosity in Polymer- Solvent Combinations using a QSAR madel. Polymer Vol.47,No 9 (2006b)3240-3248

98. Melegraki G., Afantitis A., Sarimveis H., Koutentis P.A., Markopoulos J.& Iglessi-Markopoulou O., Optimazion of Biaryl Piperidine and 4-Amino-2- biarylurea MCH1 Receptor Antagonists using QSAR Modeling, Classification Techniques and Virtual Screening. Journal of Computer- Aided Molecular Design, Vol.20,No 21 (2007b)83-95

99. Colosi L.M., Huang Q., Walter J., Weber Jr., Quantative Structure- Activity Relationship based quantification of the impacts of enzyme- substrate binding on rates of peroxidase-mediated of estrogenic phenolic chemicals,J.AM.CHEM.SOC.2006,128,4041-4047

100. Job D., Dunford H. B., Substituent Effect on the Oxidation of Phenols and Aromatic Amines by Horseradish Peroxidase Compound I, Eur. J. Biochem. 1976, 66, 607

101. Sakurada J., Alda M., Nagata C., Hosoya T., Molecular orbital studies of the action of thyroid hormone analongs:Effects on oxygen consuption of mytochondria and horseradish peroxidase-catalysed NADH oxidation, J. Biol. Phys. 1988, 16, 17

102. Sakurada J., Sekiguchi R., Sato K., Hosoya T., Kinetic and molecular orbital studies of monosubstituted phenols and anilines by horseradish peroxidase compound II, Biochemistry 1990, 29, 4093

103. Brewster M. E., Doerge D. R., Huang M. J., Kaminski, J. J., Pop E., Bodor N., Application of semiempirical molecular orbital techniques to the study of peroxidase-mediated oxidation of phenols, anilines, sulfides and thiobenzamides, Tetrahedron 1991, 47, 7525

109 104. Van Haandel M. J. H., Rietjens I. M. C. M., Soffers A. E. M. F., Veeger C., Vervoort J., Modi S., Mondal M. S., Patel P. K., Behere, D. V., Computer calculations based quantative stracturd-activity relationships for the oxidation of phenol derivatives horseradish peroxidase compound II, J. Biol. Inorg. Chem. 1996, 1, 460

105. Van Haandel M. J. H., Claassens M. M. J., Van der Hout N., Boersma M. G., Vervoort J., Rietjens I. M. C. M., Differential substrate behavior of phenols and aniline derivatives during convertion by horseradish peroxidase, Biochim. Biophys. Acta 1999, 1435, 22

106. Gilabert M. A., Hiner A. N. P., Garcia-Ruiz, P. A., Tudela, J., Garcia- Molina, F., Acosta, M., Garcia-Canovas F., Rodriguez-Lopez J. N., Differential substrate behavior of phenols and aniline derivatives during oxidation by horseradish peroxidase: kinetic evidence for a two-steps mechanism, Biochim. Biophys. Acta 2004, 1699, 235

107. Hosoya T., Fuji T., Ogawa S., A molecular orbital study on the oxidation of hydrogen donor molecules by peroxidase compound II, J. Theor. Biol. 1983, 100, 283

108. Bordeleau L. M., Bartha R., Biochemical transformations of herdicide- derived anilines:requirements of molecular configuration, Can. J. Microbiol. 1972, 18, 1873

109. Dunford H. B., Adeniran A., Hammett ζ corelation for reactions of horseradish peroxidase compound II with phenols, J. Arch. Biochem. Biophys. 1986, 251, 536

110. De Riso, A., Gullotti M., Casella L., Monzani E., Profumo A., Gianelli L., De Gioia L., Gaiji N., Colonna S., Selectivity in the peroxidase catalyzed oxidation of phenolic sulfides, J. Mol. Catal. A 2003, 204, 391

111. Poulos T. L. Kraut, J. The stereochemistry of peroxidase catalysis, J. Biol. Chem. 1980, 255, 8199

112. Rodriguez-Lopez J. N., Smith A. T., Thorneley R. N. F., Role of Agrinine 38 in Horseradish peroxidase A critical residue for substrate binding and catalysis, J. Biol. Chem. 1996, 271, 4023

110 113. Rodriguez-Lopez J. N., Lowe D. J., Hernandez-Ruiz J., Hiner A. N. P., Garcia-Canovas F., Thorneley R. N. F., Mechanism of reaction of horseradish peroxidase: Intentification of intermediates in the catalytic cycle, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11838

114. Dunford H. B., Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties. In Peroxidases in Chemistry and Biology, Everse J.E., Everse K. E.,Grisham M. B., Eds., CRC Press: Ann Arbor, MI, 1991;Vol. II, pp 1-24

115. Sakurada J., Takahashi S., Hosoya T., Increased collagen biosynthesis and increased expression of type I and type III procallagen genes in tight skin (TSK) mouse fibroblasts, J. Biol. Chem. 1986, 261, 0657.

111