N° Ordre : 3517

THÈSE Présentée DEVANT L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Pour obtenir Le grade de : DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie

PAR

Myriam BARAT

Equipe d’accueil : U.M.R. C.N.R.S 6553, Equipe Interaction Spéciation Adaptation (ISA) Ecole Doctorale : "Vie-Agro-Santé" Composante Universitaire : U.F.R. Sciences de la Vie et de l’Environnement

INTERACTIONS PLANTE -INSECTE , SPECIALISATION ET INVASION BIOLOGIQUE :

ECOLOGIE EVOLUTIVE DES AJONCS (GENRE ULEX )

ET DE LEURS CHARANÇONS SPECIFIQUES (GENRE EXAPION ) EN BRETAGNE .

SOUTENUE LE 9 mars 2007 devant la commission d’Examen

M. Jean-Claude GREGOIRE Professeur, Université Libre de Bruxelles, Belgique Rapporteur M. Marc GIBERNAU Chargé de Recherche CNRS, Université de Toulouse 3 Rapporteur Mme Anne-Marie CORTESERO Professeur, Université de Rennes 1 Examinatrice M. Jacques VAN ALPHEN Professeur, Institute of Biology, Leiden, Pays Bas Examinateur Mme Anne ATLAN Chargé de Recherche CNRS, Université de Rennes 1 Directrice Mme Michèle TARAYRE Maître de conférence, Université de Rennes 1 Co-directrice Résumé

Les trois espèces d'ajonc qui co-existent en Bretagne, sont toutes parasitées par des charançons prédateurs de graines. L'une d'entre elles, Ulex europaeus , est une plante envahissante qui constitue une nuisance pour l'agriculture et une menace pour la biodiversité. Le charançon Exapion ulicis a été introduit comme agent de lutte biologique depuis les années 1930, mais son efficacité est limitée par le fait qu'il ne pond qu'au printemps, alors que la plante peut produire des gousses dès l'automne. La première partie de cette thèse présente ma contribution à l'étude à long terme d' Ulex europaeus en Bretagne, dont le but est d'étudier les relations entre la phénologie de floraison et les stratégies de défense contre les phytophages (évitement dans le temps, satiété du prédateur). Cette étude a montré que la pression parasitaire a un impact important pour la plante, ce qui peut expliquer que dans les zones envahies, où les prédateurs spécifiques sont absents, elle puisse avoir des capacités compétitrices accrues. Dans la deuxième partie, j'ai élargi cette étude aux deux autres espèces d’ajonc présentes en Bretagne : U. gallii et U. minor . Ces espèces, qui sont souvent en sympatrie avec U. europaeus et ne fleurissent qu'en automne, sont parasitées par des charançons. J'ai identifié ces charançons à l'aide de caractères morphologiques et moléculaires. La caractérisation morphologique des charançons a permis d’identifier l’espèce qui pond en automne comme étant Exapion lemovicinum . La caractérisation moléculaire a permis de vérifier qu'une seule et même espèce parasitait U. gallii et U. minor, et que E. lemovicinum et E. ulicis constituaient bien deux espèces distinctes, incapables de s'hybrider. Des observations de terrain ont permis de décrire le cycle de vie de ces deux charançons et de montrer qu’il était intimement lié à la phénologie de leur plante-hôte. Enfin, une étude écophysiologique de cryobiologie a permis de montrer que les potentialités de résistance au froid de ces deux espèces avaient divergé avec leur cycle de vie. La spécialisation écologique des charançons, liée à la phénologie des ajoncs, est donc probablement à l’origine de leur différenciation, qui aurait pu s'effectuer par séparation dans le temps via le processus de spéciation sympatrique.

Abstract

Three gorse species co-exist in Brittany, all of them being parasitised by seed-eating weevils. One of the gorse species, Ulex europaeus , is an invasive plant that is a nuisance for agriculture and a threat to biodiversity. The weevil Exapion ulicis was introduced as a biological control agent from the 1930s, but its effectiveness is limited because it only lays eggs in spring, whereas the plant can produce pods from autumn onwards. The first part of this thesis is my contribution to a long-term study of Ulex europaeus in Brittany, aiming to examine the relations between the flowering phenology and defence strategies against phytophagous insects (avoidance in time, predator satiety). This study has shown that the parasite pressure has a major impact for the plant, which can explain the areas invaded; where specific grazers are absent, it can have an increased competitive advantage. In the second part, I have enlarged this study to two other gorse species that occur in Brittany: U. gallii and U. minor . These species, which are often sympatric with U. europaeus and only flower in the autumn, are also parasitised by weevils. I have identified these weevils by using morphological and molecular characters. The morphological identification of the weevils identified the species that lays in autumn as Exapion lemovicinum . The molecular identification confirmed that only a single species parasitised U. gallii and U. minor, and that E. lemovicinum and E. ulicis are two true distinct species, incapable of hybridising. Field observations have enabled the life cycle of these two weevils to be described and have demonstrated that they are intimately linked to the phenology of their host plant. Finally, a ecophysiological cryobiology study has shown that cold resistance of these two species has diverged with their life cycle. The ecological specialisation of the weevils, related to the gorse phenology, is therefore probably the origin of their differentiation, which could have taken place by temporal isolation by means of a process of sympatric speciation.

SOMMAIRE

Introduction générale 1 1. Les plantes envahissantes et les insectes phytophages 1 2. Evolution des associations plante-insecte phytophage 3 3. Plan de la thèse 6

Chapitre I. Synthèse bibliographique sur les relations plante-charançon 7 1. Spécificité d’hôte 9 2. Sélection de la plante-hôte 12 3. "Course à l’armement" entre plantes et charançons ? 15 4. Conclusion 18

Chapitre II. Présentation des espèces 20 1. Ulex europaeus , Ulex gallii et Ulex minor 20 2. Exapion ulicis et Exapion lemovicinum 24 3. Echantillonnage et élevage 27

Chapitre III. Impact de la pression parasitaire sur la phénologie d' U. europaeus 29 1. Diversité phénologie de floraison d’ U. europaeus en Bretagne 31 2. Variations temporelles de la phénologie et du parasitisme 34 3. Mise en évidence du déterminisme génétique des traits d’histoire de vie d’ U. 38 europaeus 4. Polymorphisme d’ U. europaeus dans les zones envahies 39

Chapitre IV. Cycles de vie des apions en relation avec la phénologie des ajoncs 42

IV. A. Rôle de la phénologie de floraison des ajoncs sur le cycle de vie des apions 46 (Article accepté dans Entomologia Experimentalis et Applicata )

IV. B. Observations préliminaires du comportement des apions 65 1. Observations qualitatives 65 2. Observations quantitatives 66 3. Bilan 68

Chapitre V. Différenciation génétique des apions 69

V. A. Différenciation génétique et spécialisation écologique des apions 70 (Article en préparation pour Ecography )

V. B. Recherche de marqueurs moléculaires polymorphes chez les apions 88 1. Marqueurs microsatellites 88 2. Marqueurs RAPD 91 3. Marqueurs ITS 91 Chapitre VI. La résistance au froid chez les apions et chez les ajoncs 92

VI. A. Quelques notions sur la résistance au froid 93 1. L’étude de la résistance au froid 93 2. Quelques définitions autour de l’eau 94

VI. B. La résistance au froid chez les apions et chez les ajoncs 95 (Projet d'article )

Discussion générale et perspectives 114

A. Impact de la pression parasitaire sur la phénologie d' U. europaeus 114

B. L'interaction ajonc-apion en Bretagne 115 1. Identification des deux espèces de charançon 115 2. Spécificité d'hôte 116 3. Spécialisation et spéciation sympatrique 119

Références bibliographiques 123

Annexes 1. Exemples d’impact d’ U. europaeus et d’ E. ulicis 138 2. Critères d’identification d’ Exapion ulicis et d’ E. lemovicinum 139 3. Tarayre et al. Evolutionary Ecology : in press 140 4. Atlan et al. soumis à Journal of Ecology 142 5. Premières observations des apions 165 6. Récapitulatif des principales données obtenues 166

Articles et colloques 167

Remerciements

Anne, Michèle, je tiens à vous remercier pour m’avoir toujours écoutée et respectée pendant ces années, en me laissant notamment le choix de travailler plus particulièrement sur ces incroyables et magnifiques (il faut le dire) charançons plutôt que sur ces ajoncs piquants ! Merci également pour votre générosité et votre disponibilité (surtout en fin de thèse !). Anne, heureusement que tu as un esprit synthétique, qui me manque tellement, mais que j’essaye toujours d’améliorer ! Merci aussi de m’avoir donné l’occasion de partir en Nouvelle-Zélande, et de découvrir un des plus beaux endroits au monde, Kaikoura…

Louis, je tiens à te remercier chaleureusement, pour m’avoir accompagnée sur le terrain et m’avoir aidée dès que j’en avais besoin. Merci pour tes discussions engagées, si il y avait d’avantage de Louis sur Terre, le monde serait très certainement meilleur !

Papa, Maman, Nathalie, je tiens à vous remercier pour votre soutien et la confiance que vous m’avez témoignée que ce soit pendant ces années de thèse ou avant. Sans vous, je ne serais probablement pas arrivée jusqu’ici.

Nico, merci de m’avoir soutenue toutes ces années, malgré le stress, nombreux sont ceux qui savent ce que cela représente et que ce n’était pas une tâche facile !

Je n’oublie pas non plus, toutes les personnes qui ont partagé mon stress et mes interrogations à l’Université : Sandrine, que dire, on se comprend parfaitement, tu pourrais être ma jumelle ! Alors merci pour ton soutien, ton écoute et courage, c’est bientôt fini pour toi aussi ! Nathalie, même du Canada, je sais que je peux compter sur toi, merci pour ta bonne humeur et ton optimisme. Pierre, merci d’avoir été là, bien que nous étions toujours démoralisés en même temps, du coup, il n’y en avait pas un pour remonter le moral de l’autre ! J’espère que la voie que tu as choisie te réussira. Philippe, mon compagnon de galère ! Merci pour toutes les conneries que tu as pu dire et tous les fous rires que tu as provoqué, merci pour ces moments de détente, notamment pendant les célèbres pauses thé et nos soirées munchkin, qu’elles ne se terminent jamais ! Aïcha, Florence, Aude, Annabelle, Nathalie, Houda, merci d’avoir été là, à mon écoute, merci de m’avoir soutenu, et merci d’avoir toujours répondu présentes pour le partage des gâteaux et chocolats pendant nos pauses (toutes des gourmandes, et pas de sous-entendus, ok ?).

Je tiens également à remercier tous les stagiaires et vacataires qui m’ont aidé au cours de cette thèse : Curmi, Paul, Aurélie, Camille, Soline, Marie…

Merci aussi à tous ceux qui ont collaboré à ma thèse ou qui m’ont aidé à un moment ou un autre, et ceci avec beaucoup de gentillesse, je pense à vous : Andy, Philippe, Armelle, David, Joan, Denis, Jean-Sébastien, Anne- Marie, Olivier, Yann, Jean-Christophe. Michelle, Michel, Jocelyne…

Merci aussi à Valérie, Maryvonne, Gwenola pour nous avoir accueillis et nous avoir aidé avec le sourire quand nous avons envahi temporairement votre étage ! Encore merci à Valérie pour ses recherches d’articles préhistoriques !

Enfin, un grand merci à l’équipe EGS, notamment Marie-Thérèse, pour tes conversations animées le midi et ta forme olympique qui nous laissera tous à terre ! Kader et Lily, merci pour votre gentillesse et votre disponibilité pour répondre à mes questions…

Dessin de Cicely Mary Barker.

Perhaps then zoologists might look at plants, and botanists look at animals, and we may find that evolution in some animals is like that in plants, and evolution in some plants like that in animals, particularly when their properties overlap.

A. D. Bradshaw (1972).

Introd uction

INTRODUCTION GENERALE

Les végétaux subissent la pression des insectes phytophages depuis leur apparition, c’est-à-dire depuis plus de 145 millions d’années. Cette phytophagie peut parfois induire des dommages importants, qui peuvent affecter le succès reproducteur d’une plante, ou la dynamique des populations végétales. Pour faire face à cette pression, les végétaux ont développé de nombreuses stratégies de défense. Cependant, à leur tour, les insectes phytophages ont aussi pu s’adapter à ces innovations, afin de pouvoir continuer à exploiter leur habitat. Les plantes et leurs insectes phytophages se livrent à une perpétuelle "course à l'armement" et sont donc dans un équilibre dynamique dont la rupture peut entraîner soit la prolifération des insectes, soit celle des plantes. Dans ce contexte, l’étude des interactions entre les plantes et les insectes phytophages peut notamment permettre de comprendre : (i) pourquoi une plante exotique peut devenir envahissante dans un nouvel environnement, qui ne contient pas ses prédateurs spécifiques et (ii) quel est le rôle de la phytophagie dans l'évolution des traits d'histoire de vie des plantes et la formidable diversité des insectes.

1. Les plantes envahissantes et les insectes phytophages

1.1 Conséquences du relâchement de la pression parasitaire L’introduction d’une plante exotique dans un nouvel environnement, peut parfois mener à une expansion importante de cette plante (Mack et al., 2000), au détriment des espèces végétales locales. En effet, les espèces envahissantes sont la deuxième cause de disparition d'espèces, juste derrière la destruction des habitats. Les plantes envahissantes présentent souvent une adaptation locale rapide (Reznick & Ghalambor, 2001) et peuvent même présenter de meilleures performances dans la zone envahie que dans la zone d'origine (Siemann & Rogers, 2001 ; Leger & Rice, 2003 ; Wolfe et al., 2004) . Pour de nombreux auteurs, les capacités d’invasion de ces végétaux seraient dues au relâchement de la pression de sélection exercée par les insectes phytophages. La résistance à l’herbivorie peut représenter un coût important pour les plantes et leur conférer un désavantage compétitif (Koricheva, 2002). Par conséquent, une espèce introduite peut être favorisée par l’absence de ses herbivores ou pathogènes spécifiques, ce qui constitue l’hypothèse ERH ou Enemy-Release Hypothesis de Keane & Crawley (2002). Une seconde hypothèse, l’EICA ou Evolution of

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Increased Competitive Ability (Blossey & Nötzold, 1995) prédit (i) qu’en absence de leurs herbivores spécifiques, les espèces végétales introduites perdent leur résistance contre ces ennemis et (ii) qu’en retour, les plantes évoluent en augmentant leur taille ou leur fécondité. Toutefois, les articles testant cette hypothèse n’ont vérifié qu’une de ces deux prédictions dans des populations envahissantes (e.g. Siemann & Rogers, 2003 ; Maron et al., 2004 ; Wolfe et al., 2004). Les relations plante-insecte peuvent donc permettre de mieux comprendre les potentialités d’invasion d’une plante exotique, via l’étude de l’influence de la pression parasitaire sur cette plante dans sa zone d'origine. Parallèlement, l’identification et l’étude de l’impact des insectes phytophages spécifiques à une plante envahissante peuvent permettre de trouver un agent de lutte biologique adéquat pour lutter contre cette plante.

1.2 Un exemple de plante envahissante : l’ajonc d’Europe Dans ce contexte, l’exemple de l’association entre les ajoncs et leurs charançons spécifiques illustre bien l’intérêt des études sur les relations plante-insecte. L’ajonc d’Europe, Ulex europaeus (Fabaceae, Genistae), est natif de la région ibérique et de l’ouest de l’Europe, mais est devenu une plante envahissante dans les pays où il a été introduit, notamment dans l’hémisphère sud. Cette plante a d’ailleurs été classée parmi les trente plantes les plus envahissantes dans le monde selon l’IUCN 1 (Lowe et al., 2000). A l'origine, l'ajonc a été introduit soit comme plante de haie, soit comme plante ornementale, soit comme plante fourragère ou encore de manière involontaire. Aujourd'hui, de nombreux pays ou états tels que l'Australie, la Californie, le Chili, Hawaï, La Réunion, la Nouvelle Zélande, l'Orégon ou la Tasmanie, cherchent à contrôler l’expansion de cette mauvaise herbe qui envahit les zones cultivées ainsi que les forêts posant à la fois des problèmes économiques et de conservation de la biodiversité (Julien, 1992). Pour limiter et contrôler l’invasion de l'ajonc, ces pays ont tout d'abord employé de nombreux moyens (mécaniques, chimiques, etc…) très coûteux, mais ces méthodes ne se sont pas révélées concluantes (par exemple, l'utilisation du feu a favorisé la germination des graines d'ajonc). En 1928, Davies constata que 92% des gousses qu'il examina en Angleterre étaient attaquées par Exapion ulicis (ou Apion ulicis , Apionidae, Exapion ) et le recommanda comme agent de contrôle d' U. europaeus . L’introduction de ce charançon s’est révélée être un succès, malgré le fait que l’ajonc d’Europe arrive encore à progresser. Ceci pourrait s’expliquer par un polymorphisme de floraison d’ U. europaeus . En

1 IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources.

2 Introd uction effet, la majorité des plantes produisent des gousses au printemps qui sont parasitées par E. ulicis , alors que d’autres plantes étalent leur production de gousses entre l’automne et l’hiver, ce qui pourrait leur permettre d’échapper en grande partie à la pression parasitaire (Hill et al., 1991). L'équipe ISA a étudié les relations entre la phénologie de floraison de l'ajonc et la prédation des graines par E. ulicis en Bretagne, dans sa zone d’origine. Elle a montré que le polymorphisme y était déjà présent, avec une floraison d'automne qui semble elle aussi échapper au parasitisme. Par ailleurs, nous avons constaté que les espèces Ulex minor et U. gallii sont elles-aussi attaquées par un charançon, alors qu'elles ne fleurissent qu'en automne. Il existe donc en Bretagne des charançons capables de pondre en automne. Il serait donc intéressant de connaître le cycle de vie et la spécificité du charançon qui attaque les espèces à floraion automnale, afin de voir s'il peut constituer un agent de lutte biologique contre U. europaeus . L’étude de l’interaction entre les ajoncs et les charançons en Bretagne apparaît donc être intéressante d’une part dans un contexte de lutte biologique, et d’autre part pour comprendre le polymorphisme de phénologie des plantes et leur rôle dans la diversification des insectes phytophages.

2. Evolution des associations plante-insecte phytophage

2.1 La spéciation sympatrique chez les insectes phytophages Les insectes phytophages représentent une grande diversité spécifique. Ils constituent plus d’un quart de toutes les espèces pluricellulaires (Strong et al., 1984). La diversification des insectes phytophages auraient suivi celle de leurs plantes-hôte, par le processus de spéciation sympatrique. Charles Darwin fut le premier à faire allusion au concept de spéciation sympatrique dans De l’origine des espèces en 1859, c’est-à-dire via la divergence d’une lignée évolutive en deux, en absence de barrière géographique. Soumise à de nombreuses controverses, face au modèle de spéciation allopatrique 2 il y a encore quelques années, la spéciation sympatrique est aujourd’hui un concept de plus en plus accepté (Jiggins & Mallet, 2000 ; Turelli et al., 2001) et l’association plante-insecte apparaît être le meilleur modèle pour évaluer l’importance de ce processus (Berlocher & Feder, 2002 ; Drès & Mallet, 2002). Deux processus évolutifs peuvent expliquer l’initiation de la spéciation sympatrique chez les insectes herbivores : la coévolution et le changement d’hôte.

2 Spéciation allopatrique : Divergence d’une lignée évolutive en deux, suite à la mise en place d’une barrière reproductive géographique.

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2.2 Coévolution La coévolution, au sens strict du mot, implique des influences réciproques entre espèces, et doit donc être distinguée de l’évolution séquentielle, dans laquelle l’évolution d’une espèce en influence une autre, sans que la réciproque soit vraie. En d’autres termes, elle implique que les adaptations et les contre adaptations évoluent en synchronie (Futuyma & Slatkin, 1983). Le terme de "coévolution" a été cité pour la première fois dans l’article de Ehrlich et Raven (1964), en tant qu’hypothèse évolutive pour expliquer la diversification des papillons et de leurs plantes-hôte. Pourtant, comme l’a fait remarqué Janzen (1980), ils n’ont pas démontré la coévolution, mais ont décrit une série successives d’adaptations radiatives. En effet, dans ce célèbre papier, Ehrlich et Raven suggèrent que les composés chimiques secondaires des plantes détermineraient l’utilisation des plantes-hôte par les papillons. En effet, deux plantes ayant des composés chimiques secondaires seraient susceptibles d’être attaquées par les mêmes espèces d’insecte. Ces substances chimiques auraient alors évolué en défenses chimiques contre ces insectes phytophages, qui à leur tour auraient développé de nouvelles adaptations, telle que la capacité de détoxification. Par conséquent, Ehrlich et Raven ont mis en évidence une coadaptation entre les papillons et leurs plantes-hôte, c’est-à- dire une interaction adaptative entre des organismes d’espèces différentes (Ridley, 1997), qui peut effectivement mener à la coévolution, mais n’en constitue pas une preuve. Ces dernières années, la phylogénie a permis de tester l’hypothèse de coévolution, qui a été démontrée dans des associations mutualistes (e.g. Wiebes, 1979 ; Michener & Grimaldi, 1988 ; Pellmyr, 2003), impliquant des parasitoïdes (e.g. Wiegman et al., 1993), et aussi dans certaines associations impliquant des insectes phytophages (e.g. Farrel, 1998 ; Becerra, 2003). Toutefois, dans les associations plante-insecte phytophage, la coévolution semble être un phénomène assez rare (synthèse in Bernays & Graham, 1988 ; Funk et al., 2002 ; Scriber, 2002). Pour Jermy (1984), l’évolution des plantes et des insectes est plutôt séquentielle. En effet, beaucoup d’insectes ne se nourrissent que d’un seul type de plante, alors que les plantes servent d’aliment à de nombreuses espèces d’insectes. Ainsi, lorsqu’une plante évolue, tous ses consommateurs sont obligés de suivre, alors que si une espèce d’insecte évolue, cette modification n’entraînerait sur la plante-hôte qu’une sélection limitée. Actuellement, un des mécanismes évolutifs les plus probants pour expliquer la spéciation chez les insectes phytophages serait la spéciation sympatrique via un transfert d’hôte.

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2.3 Changement d’hôte Benjamin Walsh 3 (1864) fut le premier à proposer que les insectes phytophages spécifiques à leur(s) plante(s)-hôte(s) résulteraient d’un transfert d’hôte suivi d’une spécialisation 4 au nouvel hôte. Sous ce scénario, la chimie de l’hôte joue un rôle prépondérant (Brues, 1920 ; Ehrlich & Raven, 1964). En effet, un insecte spécialiste serait préadapté pour coloniser un nouvel hôte, dont les composés chimiques secondaires (impliqués dans la résistance contre la phytophagie) sont similaires à l’hôte actuel (Ehrlich & Raven, 1964). La colonisation, puis la spécialisation du nouvel hôte conduirait alors à la formation de races d’hôte (Bush, 1969). Les races d’hôte sont des populations sympatriques de parasites, génétiquement différenciées, qui utilisent différents hôtes, et entre lesquels il y a un flux de gènes appréciable (Drès & Mallet, 2002). Le transfert d’hôte semble être un mécanisme commun chez les insectes phytophages (Dobler et Farrel, 1999). En effet, la majorité des insectes phytophages présentent un niveau élevé de spécificité à leur plante-hôte et la spécificité d’hôte est souvent combinée à de hauts niveaux de transfert d’hôte (Menken, 1996 ; Schoonhoven et al., 1998), lesquels sont souvent phylogénétiquement conservés (i.e. transfert entre plantes apparentées). De nombreux exemples de transfert d’hôte et donc de formation de races d’hôte ont été documentés chez les insectes herbivores (e.g. homoptère, Wood et al., 1999 ; lépidoptère, Nason et al, 2002 ; diptère, Scheffer & Wiegmann, 2000).

2.4 L’association ajonc-charançon : un modèle de spéciation sympatrique ? En Bretagne, trois espèces d’ajonc sont présentes, Ulex europaeus , U. gallii et U. minor . U. gallii et U. minor fleurissent en automne et se retrouvent souvent en sympatrie avec U. europaeus . Ulex europaeus , dont le pic de floraison est au printemps, est attaqué à cette même période par Exapion ulicis . Les graines des deux autres espèces d’ajonc sont attaquées en automne par un charançon morphologiquement très similaire à E. ulicis , mais dont les caractéristiques biologiques (période de reproduction, temps de développement, taux et intensité de parasitisme) sont très différentes. On s’attend donc à ce que les charançons parasitant U. gallii et U. minor correspondent à une espèce ou deux espèces-jumelles différentes de E. ulicis . Si tel est le cas, il est possible que E. ulicis et les charançons parasitant les espèces d’ajonc à floraison automnale, résultent d’une spéciation sympatrique, dans laquelle l’isolement reproductif se serait effectué suite à un isolement allochronique.

3 Benjamin Walsh (1808-1869) : Entomologiste américain. 4 Spécialisation : Adaptation évolutive à un mode de vie ou un habitat particulier (Bernays & Chapman, 1994).

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L’étude de l’association ajonc-charançon en Bretagne, peut donc apporter des connaissances sur l’influence de la pression parasitaire exercée par E. ulicis sur l’ajonc envahissant U. europaeus et donner des éléments de compréhension sur les facteurs de spécialisation et de spéciation chez les charançons.

3. Plan de la thèse

Dans le cadre de cette thèse, j’ai cherché à mieux comprendre les interactions plante- charançon, avec des objectifs à long terme aussi bien au niveau appliqué (lutte biologique) que fondamental (mécanismes de spéciation). Je présente d’abord une synthèse bibliographique rapportant les données connues sur les relations plante-charançon (chapitre I), puis brièvement les espèces étudiées dans le cadre de cette thèse (chapitre II). Ensuite, je présente une synthèse de travaux sur les relations entre la phénologie de floraison d’ U. europaeus , et les taux de parasitisme par un charançon spécifique Exapion ulicis (chapitre III). Bien que ces travaux ne constituent pas l'essentiel de ma thèse, il s'agit d’études à long terme auxquelles j'ai participé tout au long de mes trois années de thèse, et qui sont la base à partir de laquelle j'ai pu élargir l'étude à d'autres espèces . La majeure partie de ma thèse repose, en effet, sur l’étude des relations entre les différentes espèces d’ajonc et de leurs charançons granivores en Bretagne, dont l’objectif est de comprendre la mise en place des mécanismes de spéciation des charançons en relation avec leur plante-hôte. Ce travail se divise en trois parties. La première partie présente l’identification morphologique et le cycle de vie des charançons en Bretagne en relation avec la phénologie de fructification de leurs plantes-hôtes (chapitre IV). La seconde partie présente la caractérisation moléculaire des charançons, afin de vérifier la nature des différences taxonomiques entre ces espèces (chapitre V). La troisième partie présente une étude écophysiologique sur les potentialités de résistance au froid des charançons, ayant pour objectif de mieux comprendre les conséquences de la spécialisation des charançons au microhabitat constitué par leur plante-hôte (chapitre VI). Enfin, cette thèse se termine par une discussion générale de l’ensemble des données obtenues.

6 Chapitre I

Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES RELATIONS PLANTE -CHARANÇON

Au cours des siècles et jusqu’à aujourd’hui, les charançons (coleoptères appartenant à la superfamille des Curculionoidea) ont principalement été connus pour leur action destructrice sur les récoltes. En effet, quasiment toutes les plantes cultivées sont attaquées par des charançons : blé, luzerne, riz, coton, banane, choux, fraise, pomme de terre, etc. ; ces insectes ont donc affecté le

Photo 1. La larve du charançon rouge quotidien des hommes au cours de l’histoire. D’ailleurs, du palmier, Rhynchophorus ferrugineus , creuse des galeries à en 1545, les habitants du village de Saint-Julien l’intérieur du tronc. Ce charançon originaire de l’ouest de l’Asie intentaient auprès du juge épiscopal de Saint-Jean-de- commence à envahir l’Europe, où il a réussi en une a nnée à occasionner Maurienne (Savoie), un procès contre une colonie de des dommages irréversibles sur plus de 3000 palmiers en Espagne (Plant charançons qui avait envahi les vignobles et causaient des Research International, 2006). dégâts considérables. Les paysans supplièrent alors le révérend seigneur vicaire général de bien vouloir leur prescrire les mesures convenables pour apaiser la colère divine et de procéder dans les règles, "par voie d'excommunication ou toute autre censure appropriée", à l'expulsion des bestioles (Ménabréa, 1846). L’action ravageuse des charançons, aurait peut-être même retardé la découverte des lois fondamentales de l’hérédité, puisqu’en 1864, les plants de pois de Mendel avaient été détruits par une invasion de charançons ! L’étude des charançons a donc probablement été initiée dans un objectif d’éradication de ces insectes alors considérés uniquement comme nuisibles. Plus récemment, d’autres intérêts aussi bien au niveau appliqué que fondamental ont appuyé l’étude des charançons en relation avec leurs plante-hôtes.

Les charançons : une source de biodiversité Avec l’émergence des courants naturalistes au 19 e siècle, l’intérêt pour la superfamille des Curculionoidea du fait de sa formidable biodiversité n’a cessé d’augmenter. Parmi les insectes phytophages, les charançons constituent un des clades les plus diversifiés de coléoptère avec près de 48 000 espèces et 4 300 genres décrits (Kuschel, 1995). Beaucoup de charançons sont spécialisés à une plante-hôte, ou à plusieurs espèces d’un même genre,

7 Chapitre I apparaissant ainsi étroitement liés avec leur plante-hôte. De plus, l’utilisation du rostre (qui porte les pièces buccales) pour l’excavation du site d’oviposition, en relation avec les tissus des angiospermes, par certaines familles de Curculionoidea pourrait avoir jouer un rôle dans la diversification des charançons (Anderson, 1995). Cependant, peu d’études évolutives ont été réalisées sur les charançons, car leur identification est souvent complexe et leur biologie peu connue.

Charançon du coton

Charançon de Madagascar Charançon girafe

Photos 2. Quelques exemples représentatifs de la diversité morphologique des charançons.

Les charançons : des insectes nuisibles D’un point de vue appliqué, mieux connaître les associations plante-charançon peut permettre d’accéder à de nouvelles méthodes visant à supprimer les populations d’insectes phytophages nuisibles pour les récoltes agricoles. Par exemple, la connaissance des substances volatiles émises par les plantes et impliquées dans la localisation de la plante par l’insecte peut permettre de développer de nouvelles stratégies de protection des plantes en créant ou en sélectionnant des plantes pour une résistance endogène aux insectes nuisibles, ou en traitant les cultures avec des substances chimiques qui les rendent moins attractives (Agelopoulos, 1999). Des protocoles de pièges avec des phéromones 5 ont d’ailleurs été élaborés par Hallett et al. (1999) afin de réduire les populations du charançon asiatique du palmier, Rhynchophorus ferrugineus (Curculionidae), qui diminuent les quantités d’huile récoltées.

Les charançons : des agents de lutte biologique A l’inverse, face à des plantes envahissantes, posant à la fois des problèmes économiques et écologiques, l’utilisation d’insectes phytophages en lutte biologique a souvent

5 Phéromone : Substance ou mélange de substances intervenant dans la communication chimique, et qui est susceptible de modifier chez un congénère, son comportement ou sa physiologie. Il en existe cinq types principaux : phéromones sexuelles, phéromones grégaires, phéromones de piste, phéromones d'alarme et phéromones d'espacement.

8 Chapitre I

été mise en œuvre. En effet, certains insectes herbivores, présentant notamment une spécificité pour la plante envahissante et ayant un impact significatif sur son succès reproducteur peuvent représenter des agents biologiques adéquats pour lutter contre la plante ciblée dans les pays touchés, et ainsi éviter l’utilisation des procédés chimiques. Ainsi, du fait de leur gamme d’hôte restreinte (i.e. de leur spécificité), les charançons sont très utilisés en tant qu’agents de lutte biologique, comme cela a été le cas pour Apion ulicis (Apionidae) contre Ulex europaeus (Fabaceae) (Hill et al., 1991) ou Trichapion lativentre (Curculionidae) contre Sesbania punicea (Fabaceae) (Hoffmann et Moran, 1991). Néanmoins, le succès d’une action de lutte biologique repose entièrement sur la connaissance de la biologie des interactions entre la plante ciblée et l’insecte introduit. Par conséquent, connaître la spécificité d’hôte, et donc les mécanismes impliqués dans la sélection d’hôte et la spécialisation des insectes herbivores à leur plante-hôte est particulièrement important, notamment pour éviter qu’un insecte phytophage, introduit en tant qu’agent de lutte biologique, s’attaque à des plantes locales non ciblées. En résumé, l’étude des associations entre les charançons et leurs plantes-hôtes peut apporter des éléments de compréhension des processus évolutifs, mais aussi des solutions pour réduire des pertes économiques ou protéger la biodiversité. Toutefois, même si le nombre de publications sur les charançons augmente, aucune synthèse bibliographique n’a été réalisée sur ces insectes, sauf au niveau phylogénétique (Anderson, 2004). Je présente donc ici les connaissances actuelles sur les charançons en relation avec leurs plantes-hôtes, qui illustrent souvent ce qui est déjà connu chez les insectes phytophages, mais qui permet également de connaître les intérêts particuliers de ce groupe.

1. Spécificité d’hôte

1.1 Spécificité de plante-hôte La spécificité des insectes phytophages est définie comme le degré de restriction de la gamme de plante-hôte (Bernays & Chapman, 1994). Différents termes sont employés pour qualifier le degré de spécificité (Encadré 1).

9 Chapitre I

Encadré 1. Principaux termes utilisés pour définir la spécificité des insectes phytophages vis à vis de leurs plantes-hôtes.

Selon la plante-hôte choisie pour se nourrir, un insecte phytophage peut-être : - soit monophage : il se nourrit d’une espèce ou d’un genre de plante, - soit oligophage : il se nourrit d’un nombre restreint d’espèces de plante appartenant à une sous-famille ou à une famille de plantes, - soit polyphage : il se nourrit sur un large spectre de plantes provenant de différentes familles (Bernays & Chapman, 1994).

Selon la plante-hôte choisie pour pondre, un insecte phytophage peut-être : - soit spécialiste : il ne pond que sur une seule espèce de plante - soit généraliste : il pond sur différentes espèces de plante où les larves peuvent se développer (West & Cunningham, 2002).

Dans la nature, la majorité des insectes phytophages sont monophages ou oligophages (Bernays & Chapman, 1994) et les stratégies spécialistes sont largement plus nombreuses que les stratégies généralistes (Jermy, 1984). Les charançons suivent cette tendance, puisque la majorité d’entre eux présente un niveau d’association à leur(s) plante(s)-hôte(s) élevé et une gamme d’hôtes restreinte (Anderson, 2004). Cette étroite relation implique que les insectes soient spécialisés 6 à leur plante-hôte. Les stratégies généralistes représenteraient un coût énergétique plus important que les stratégies spécialistes. En effet, si les contraintes adaptatives sont importantes, alors la fitness de l’insecte sera sévèrement réduite sur une nouvelle espèce hôte (Timms & Read, 1999). Holmgren et Getz (2000) reportent dans leur article les principales raisons proposées dans la littérature pour expliquer pourquoi un insecte se spécialise à une plante-hôte. Ainsi, la théorie de défense chimique postule que la spécialisation est nécessaire pour surmonter les défenses chimiques d’une plante ou d’un groupe de plantes ("chemical defence theory", Swain, 1977). En effet, si un insecte herbivore arrive à surmonter ces défenses chimiques, alors la colonisation de ces plantes sera facilitée (Feeny, 1987). La spécialisation des insectes phytophages a également été expliquée du point de vue de l’écologie des populations. Ainsi, la prédation ou le désir d’optimisation des performances de recherche de nourriture pourraient influencer la sélection des stratégies spécialistes (Bernays & Graham, 1988 ; Bernays & Wcislo, 1994). Plus récemment, il a été suggéré que la spécialisation des insectes pourrait évoluer du fait des limitations du système sensoriel (Bernays & Wcislo, 1994 ; Janz & Nylin, 1997). En

6 Spécialisation : adaptation évolutive à un mode de vie ou un habitat particulier (Bernays & Chapman, 1994).

10 Chapitre I effet, dans un environnement complexe, les capacités d’un insecte à analyser un milieu sont restreintes car il a besoin de se focaliser sur un nombre limité de tâches d’identification.

1.2 Spécificité à une partie de la plante-hôte Non seulement la plupart des insectes phytophages tendent à se spécialiser à une espèce de plante-hôte, mais en plus, ils tendent également à être associés à certaines parties de la plante (Bernays & Chapman, 1994). En effet, chaque espèce de charançon peut être spécialiste d’une partie de la plante et collectivement l’ensemble des espèces de charançon sont capables de coloniser toutes les parties de la plante (Anderson, 2004). La figure 1 qui représentent les parties attaquées par les larves des espèces du genre Apion illustre très bien cette observation.

Figure 1. Diagramme présentant les différentes parties d’une plante attaquées par des larves de charançon appartenant au genre Apion . Les nombres montrent le nombre d’espèces de charançon dont les larves se nourrissent des parties indiquées. La figure inclue toutes les espèces britanniques. L’ensemble des parties d’une plante ne serait pas affecté chez une même espèce de plante. Les adultes se nourrissent généralement des feuilles (d’après Morris, 1990).

11 Chapitre I

2. Sélection de la plante-hôte

La spécificité des charançons implique qu’ils soient capables de localiser et de sélectionner leur plante-hôte. Les premières démonstrations de comportement de détection et de sélection de l’hôte chez les insectes sont assez récentes, les toutes premières étant chez les parasitoïdes, puis, plus tard chez les insectes phytophages (e.g. Kennedy, 1965). De manière générale, les insectes herbivores localisent leur plante-hôte à distance et l’accepte ou non une fois le contact établit. La chimie de l’hôte semble jouer un rôle prépondérant dans la localisation et la sélection de la plante-hôte.

2.1 Localisation de la plante-hôte Les insectes phytophages utilisent des repères visuels et/ou olfactifs pour localiser leur plante-hôte à distance.

2.1.1 Repères visuels Les charançons, comme les autres insectes phytophages, peuvent utiliser des repères visuels, tels que la couleur, la forme ou la structure de la plante-hôte pour la détecter (Propoky & Owens, 1983). Ainsi, le charançon du coton, Anthonomus grandis (Curculionidae), répond positivement à la couleur jaune comparativement à d’autres couleurs (Bernays & Chapman, 1994). D’autres facteurs peuvent également intervenir. Par exemple, les charançons de l’espèce Pissodes strobi (Curculionidae) trouvent leur hôte en utilisant une phototaxie 7 positive et une géotaxie 8 négative (Vandersar & Borden, 1977).

2.1.2 Repères olfactifs La chimie des plantes joue un rôle majeur dans la reconnaissance des plantes via la détection de substances chimiques volatiles, les allélochimiques 9, émises par les plantes (Bernays & Chapman, 1994). En effet, les allélochimiques peuvent être taxon spécifiques, et le système olfactif des insectes a souvent la capacité de distinguer ces odeurs parmi d’autres.

7 Phototaxie : Comportement par rapport à la lumière. On parle de phototaxie positive lorsque le mouvement va vers la lumière et d’orientation négative lorsque le mouvement fuit la lumière. 8 Géotaxie : Comportement par rapport au sol. On parle de géotaxie positive lorsque le mouvement va vers la terre et d’orientation négative lorsque le mouvement s’élève . 9 Allélochimiques : Substances chimiques qui agissent dans les interactions entre organismes d'espèces différentes. Si ces substances émises sont favorables au receveur elle sont nommées kairomones, si elles sont favorables à l'organisme émetteur elles sont nommées allomones, et si elles profitent aux deux organismes elles sont nommées synomones.

12 Chapitre I

Elles peuvent alors être interprétées comme attractives, non attractives, voire répulsives par les insectes phytophages (Dethier et al., 1960). La perception de ces odeurs se ferait via des neurones récepteurs olfactifs localisés sur les antennes des insectes (Hansson, 2002). Ces neurones ont été mis en évidence chez le charançon Ceutorhynchus assimilis (Curculionidae), pour lequel, les isothiocyanates émis par les plantes de la famille des Brassicacées sont des composants clés de la détection de l’hôte (Blight et al ., 1995). Deux hypothèses ont été proposées pour expliquer la reconnaissance des composés chimiques de l’hôte : (i) la reconnaissance d’une odeur spécifique à l’hôte et (ii) la reconnaissance d’un ratio spécifique de composés chimiques volatiles. La première hypothèse a rarement été soutenue, alors que les démonstrations soutenant la seconde hypothèse sont nombreuses, suggérant que la reconnaissance de l’hôte par l’insecte phytophage se fait via un ratio de composés chimiques de la plante (synthèse in Bruce et al., 2005). Chez les charançons, l’expérience de Roseland et al. (1997, Tableau 1), a d’ailleurs montré qu’un nombre important de charançons de l’espèce Smicronyx fulvus (Curculionidae) pouvait être piégé avec une mixture comprenant cinq composants chimiques en proportions caractéristiques de leur plante-hôte (Tableau 1). De même, Dormont et Roques (2001) ont confirmé cette hypothèse chez le charançon des cônes de pin, Pissodes validirostris (Curculionidae).

Tableau 1. Attraction du charançon du tournesol, Smicronyx fulvus , dans des pièges amorcés avec différents composés chimiques, en différentes proportions, de l’odeur du tournesol (d’après Roseland et al., 1997).

Mélange Nombre α-pinène β-pinène camphrène limonène Acétate de attrapés / bornyle piège (%) Témoin - - - - - 16 complet, ratio correct + + + + + 100 complet, ratio incorrect + + + + + 21 incomplet - + - + + 31 incomplet + - + + - 16 incomplet + + - - + 4

2.2 Sélection de la plante-hôte

2.2.1 Substances stimulant l’acceptation de l’hôte Les insectes phytophages sélectionnent leur hôte par des repères gustatifs (synthèse in Visser, 1986). Il a été montré que les charançons sont capables de tester les nutriments et les

13 Chapitre I composés chimiques dans les tissus végétaux et à la surface des plantes en utilisant des chimio-récepteurs situés sur les tarses et les pièces buccales (Dethier, 1982 ; Chapman, 1995). Les principaux phagostimulants sont des nutriments, notamment des sucres et parmi eux, les plus efficaces sont le sucrose et le fructose (Bernays & Chapman, 1994). Ces carbohydrates permettent aux insectes d’avoir un gain calorique important (Picaud et al., 2002). En étudiant le charançon foliovore, Exophthalmus jekelianus (Curculionidae), Wright et al. (2003) ont montré qu’il y avait une corrélation positive significative entre la durée du repas sur Cedrela odorata (Meliaceae) et la concentration de sucrose, et entre la durée du repas et la concentration en nitrogène. Cette corrélation avec la concentration en nitrogène s’explique par le fait que le nitrogène est une source importante en acides aminés, indispensable pour la synthèse des protéines, et donc pour la croissance et la survie des insectes (Mattson, 1980). D’ailleurs, les jeunes feuilles sont généralement préférées par les insectes herbivores, parce qu’elles contiennent notamment une concentration plus élevée en eau et en nitrogène que les feuilles matures.

2.2.2 Autres facteurs influençant la sélection de la plante-hôte La phénologie et la physiologie de la plante varient avec l’environnement et l’âge de la plante (Schoonhoven et al., 1998). Cette variation implique une variation de la disponibilité et de la qualité des ressources pour l’insecte phytophage, qui peut affecter ses performances ainsi que la dynamique des populations d’insecte. Le choix de l’hôte va, en effet, être déterminant pour les taux de croissance larvaire, la taille des adultes et leur fécondité (synthèse in Awmack & Leather, 2002). Dans ce contexte, Mannion et al. (2004) ont montré que la survie des larves du charançon Diaprepes Abbreviatus (Curculionidae) était supérieure sur le palétuvier gris et un sorgho fourrager que sur d’autres espèces de plantes locales testées. Le choix alimentaire pour certaines parties de la plante-hôte peut également jouer un rôle déterminant pour la fécondité et survie des larves. Parmi les charançons, les femelles de l’espèce Rhinoncomimus latipes (Curculionidae) se nourrissent plus que les mâles et préférentiellement sur le capitule (plus riche en protéine) de Polygononum perfoliatum (Polygonaceae) alors que les mâles se nourrissent de l’ochrea 10 et des feuilles (moins riches en protéines) (Colpetzer et al ., 2004). Les différences observées peuvent être notamment expliquées par l’anisogamie, c’est-à-dire le fait que la production d’ovaires soit plus coûteuse

10 Ochréa : Formation membraneuse plus ou moins translucide, de couleur blanchâtre qui entoure la tige d’une plante au niveau du nœud, chez les Polygonacées.

14 Chapitre I que la production de sperme (Alcock, 2001). De plus, la préférence des mâles pourrait être un mécanisme pour augmenter les opportunités de reproduction (Colpetzer et al., 2004). Enfin, la maturation des œufs et le comportement d’oviposition peuvent varier substantiellement selon la disponibilité et la qualité de l’hôte (Papaj, 2000). Les femelles du charançon Rhinoncominus latipes (Curculionidae) laissent plus d’œufs sur le capitule que sur les autres parties de leur plante-hôte, probablement parce que le contenu en nitrogène et donc la quantité de protéines est plus importante sur le capitule, ce qui favoriserait la survie larvaire (Colpetzer et al., 2004). D’autres facteurs, peuvent influencer le choix d’hôte, tel que l’arrangement spatial des plantes-hôtes (e.g. chez le charançon Apion onopordi (Apionidae), Moravie et al., 2006), la présence de prédateurs (Bernays, 1989), l’expérience de l’insecte (Courtney et Kibota, 1990) ou encore l’état motivationnel de la femelle qui varie selon son âge, la présence d’œufs de congénères (Bernays & Chapman, 1994), etc.

3. "Course à l’armement" entre plantes et charançons ?

3.1 Impact de l’herbivorie La plupart des espèces herbivores persistent à de faibles densités auxquelles elles provoquent peu de dommages à leur hôte (Lawton, 1979), probablement grâce à la présence d’ennemis naturels, aux conditions climatiques, et/ou à la dynamique des populations (Cappuccino, 2000). Pourtant, chaque année, environ 5 à 10% de la biomasse totale des plantes est consommée par les insectes phytophages, qui peuvent s’attaquer aux feuilles, aux tiges, aux racines, aux fleurs, aux fruits et aux graines. Il semble donc que la pression des phytophages ne soit pas si négligeable que cela pour les végétaux. Par exemple, le charançon Rhinoncomimus latipes (Curculionidae) réduit significativement la biomasse et la production de graines de Polygonum foliatum (Polygonaceae) (Colpetzer et al., 2004). De même, le charançon Oxyops vitiosa (Curculionidae), qui se nourrit exclusivement des repousses saisonnières de Melaleuca quiquenervia ( Myrtaceae), peut causer une diminution de 80% des structures reproductrices de la saison à venir. Les arbres endommagés ont alors 54% moins de fruits que les arbres non endommagés (Pratt et al., 2005). Les insectes phytophages peuvent aussi perturber la communauté des plantes. La compétition et l’herbivorie peuvent toutes les deux être considérées comme des facteurs clés

15 Chapitre I dans la détermination de la structure et la dynamique des communautés végétales (Crawley, 1983 ; Harper, 1977). Center et al. (2005) ont comparé l’effet de l’herbivorie de deux charançons spécialistes congénériques, Neochetina eichhornia et Neochetin bruchi (Curculionidae) sur la compétition entre leurs hôtes Eichhornia crassipes (Pontederiaceae) et Pistia stratiotes (Araceae). Ils ont montré que sans l’herbivorie, la compétition intraspécifique entre les plantes E. crassipes étaient 41 fois plus intense que la compétition interspécifique en terme de rendement en biomasse. L’ensemble de ces exemples suggère que l’impact de la phytophagie peut représenter une pression de sélection importante à laquelle vont répondre les plantes attaquées.

3.2 Réponses des plantes à l’herbivorie Les végétaux peuvent développer des stratégies de résistance contre leurs envahisseurs. En effet, les plantes possèdent un système de résistance efficace basé sur des caractères physiques, chimiques et développementaux. La résistance des plantes face aux insectes définit la capacité de celles-ci à éviter ou réduire les dommages causés par ces derniers (Kogan, 1975). En d’autres termes, elle repose sur des stratégies de tolérance et/ou d’évitement (Fig. 2).

Figure 2. Stratégies de résistance à l’herbivorie (d’après Belsky et al., 1993).

3.2.1 Stratégies de tolérance (ou de compensation) à la phytophagie Les végétaux peuvent compenser la perte de biomasse due à l’herbivorie en croissant plus vite grâce à des mécanismes encore peu connus (Trumble et al., 1993 ; Agrawal, 2000). Ils peuvent également augmenter leur rendement reproductif en réponse à l’herbivorie (Paige & Whitman, 1987 ; Paige, 1999). Par exemple, face à un prédateur spécifique de leurs fruits, certaines plantes produisent beaucoup de fruits à la fois pour réduire la proportion de fruits attaqués ("satiété du prédateur", Janzen, 1971 ; Kelly et al., 2000).

16 Chapitre I

3.2.2 Stratégies d’évitement de la phytophagie

a) Défenses physiques et chimiques Les plantes peuvent répondre à l’herbivorie en développant des stratégies d’évitement à l’herbivorie via des procédés physiques et chimiques. Ainsi, certaines plantes utilisent des défenses physiques telles que la formation de trichomes 11 , d’épines ou de textures de tissu particulière, telle qu’une épaisseur ou une coriacité des feuilles plus importante (Hochuli, 2001). Pour les petits insectes phytophages, une pubescence importante peut éviter que l’insecte pénètre l’épiderme végétal (Southwood, 1986). Van Duyn et al. (1972) ont, par exemple, observé que les coccinelles de l’espèce Epilachna varivestis , tombaient des glycines qui possédaient de longs trichomes. Les plantes répondent également à l’herbivorie en développant des défenses chimiques, qui constituent probablement les éléments les plus importants de la résistance des plantes contre les insectes phytophages (synthèses in Panda & Kush, 1995 ; Hilker et Meiners, 2002). Ainsi, en plus de leur rôle de défense physique, les épines et les trichomes, contiennent des composés anti-nutritifs ou anti-digestifs, qui produisent des toxines et donc réduisent la digestibilité. Par ailleurs, bien que de nombreux composés secondaires de la plante agissent comme phagostimulants, leur rôle est plutôt de repousser les herbivores. La concentration de ces composés est souvent plus élevée dans les feuilles matures que dans les jeunes feuilles (Bernays & Chapman, 1994). Dans ce contexte, les limonoïdes peuvent jouer un rôle pour repousser les herbivores. Wright et al. (2003) ont montré que le nombre de repas pris par des charançons de l’espèce Exophthalmus jekelianus (Curculionidae) était significativement plus faible lorsque les limonoïdes étaient présents dans les feuilles. Par conséquent, les limonoïdes pourraient être soit des phagodéterrents qui inhibent l’initiation du repas (Waladde et al ., 1989), soit des substances non attractives pour les insectes herbivores. Certaines plantes vont même plus loin. Par exemple, Cicer arietinum (Fabaceae) contient un inhibiteur de protéinase qui peut causer, à une concentration de 1,5%, de sévères retards de développement, des déformations et un taux de mortalité d’environ 45% chez le charançon Anthonomus grandis (Curculionidae) (Gómez-González et al., 2004). Ces réponses chimiques des plantes peuvent être induites par l’activité herbivore. Ainsi, l’activité phytophage du charançon Strophosoma melanogrammum (Curculionidae) augmente l’émission des monoterpènes de jeunes épicéas ( Picea abies ), alors que le charançon

11 Trichomes : Poils tapissant la surface d’un organe végétal.

17 Chapitre I

Otiorynchus sp. (Curculionidae) ne le faisait pas, probablement parce que son activité phytophage était moins importante (Priemé et al., 2000). Les principaux rôles des monoterpènes des conifères sont de repousser l’herbivorie ou l’oviposition des herbivores généralistes et d’agir en tant que toxines contre les champignons pathogènes (Snyder, 1992 ; Langenheim, 1994). Enfin, certaines défenses chimiques ont un rôle indirect, comme celui d’attirer des prédateurs antagonistes des formes herbivores (synthèse in Hilker & Meiners, 2002).

b) Echappement dans le temps et dans l’espace Certaines plantes choisissent d’échapper à leurs prédateurs dans le temps, en décalant, par exemple, leur période de floraison ou de fructification, par rapport à la période de parasitisme (e.g. Green & Palmbald, 1975 ; Carroll & Loye, 1987). Les végétaux peuvent également échapper à leurs parasites en dispersant leurs graines dans l’espace. Ainsi, en étant éparpillés dans la forêt, les arbres de la famille des Malvaceae, sont plus difficilement repérables par l’hétéroptère Dysdercus bimaculatus (Derr, 1980). En effet, si la recherche de l’hôte est trop coûteuse pour l’insecte phytophage, cela peut permettre à l’hôte d’échapper au parasitisme.

3.3 Adaptation des insectes aux défenses des plantes Afin d’exploiter les tissus végétaux contenant des métabolites secondaires répulsifs, les insectes ont développé des adaptations comportementales (Dussourd, 1993) ou des systèmes de détoxification efficaces (synthèse in Brattsten, 1992). Par exemple, le charançon de l’espèce Otiorhynchus sulcatus (Curculionidae), est le seul insecte connu qui préfère manger les parties vertes des plantes du genre Taxus , Rhododendron et Euonymus , qui sont très toxiques (Hanula, 1988).

4. Conclusion

En conclusion, les données bibliographiques actuelles suggèrent que les charançons, interagissent de la même manière avec leurs plantes-hôtes, que les autres insectes phytophages. Cependant, les données sur les charançons étant peu nombreuses, elles permettent surtout d’illustrer les données déjà connues sur les insectes phytophages, et ne doivent donc pas être prises pour des généralités. Il faut quand même souligner que parmi les insectes phytophages, les charançons, représentent une grande diversité spécifique et

18 Chapitre I présentent un degré élevé de spécificité à leur plante-hôte. De plus, les charançons sont souvent associés aux angiospermes, il est donc possible que leur diversification ait suivi la radiation de ces plantes, éventuellement aidée par la présence de leur rostre. Par conséquent, l’étude des charançons, pourrait constituer un bon modèle pour tester les hypothèses de coévolution et de changement d’hôte et comprendre une grande partie de la biodiversité terrestre.

19 Chapitre II

Chapitre II : PRESENTATION DES ESPECES

1. Ulex europaeus, Ulex gallii et Ulex minor

1.1 Présentation générale du genre Ulex Les ajoncs (Fabaceae, Genistae) sont des arbustes épineux à fleurs jaunes qui correspondent au genre Ulex . Toutes les espèces sont pérennes. Le genre Ulex compte une vingtaine d'espèces, dont le foyer évolutif se situe dans la péninsule ibérique (Feoli-Chiapella & Cristofolini, 1981). Une majorité des ajoncs se limite aux régions atlantiques et subatlantiques ou méditerranéennes du Portugal et de l'Espagne (Guinea & Webb, 1968 ; Cubas 1999), mais trois d'entre elles ont étendu leur aire de distribution jusqu'aux régions côtières de la Manche et de la Mer du Nord : U. europaeus, U. gallii et U. minor . Seul U. europaeus se trouve hors de l’Europe, car il a récemment envahi la plupart des continents. Dans le cadre de cette thèse, nous nous intéressons plus particulièrement à ces trois espèces caractéristiques du paysage breton.

1.2 Présentation d’ U. europaeus , U. gallii et U. minor

1.2.1 Taxonomie Phylum : Embryophyte Embranchement: Spermatophyte Sous-embranchement : Angiosperme Famille : Fabaceae Tribu : Genistae Genre : Ulex Espèce : europaeus gallii minor

1.2.2 Description et biologie des trois espèces d'ajoncs présentes en Bretagne (cf Fig. 4) Ulex europaeus est une espèce ubiquiste, dont la majorité des plantes présente un écotype érigé, avec des plantes atteignant jusqu’à quatre mètre de hauteur. Les autres plantes qui se rencontrent sur la côte, dans les lieux les plus exposés au vent, présentent un écotype prostré et ont une taille d’environ un mètre. Les plantes d’ U. europaeus sont caractérisées par de fleurs plus grandes que les autres espèces bretonnes. Cette espèce se développe sur un sol

20 Chapitre II acide, en milieu mésophile et peut se trouver en sympatrie soit avec U. gallii , soit avec U. minor , qui correspondent aux deux autres espèces d’ajonc présentes en Bretagne. Ulex europaeus est hexaploïde (Misset & Gourret, 1996) et peut donner des hybrides avec U. gallii (Benoit, 1962). Cette plante peut vivre une trentaine d'années (Lee et al., 1986) et les graines peuvent également vivre très longtemps dans le sol, au moins une vingtaine d'années (Zabkiewicz, 1976). Certaines plantes commencent à fleurir dès l’automne, mais le pic de floraison est au printemps (Des Abbayes, 1971). Les fleurs sont hermaphrodites et les étamines sont enfermées dans la carène, par conséquent, la pollinisation requiert l'intervention d'insectes. Seuls de grands insectes tels que les abeilles ou les bourdons sont capables d'ouvrir la carène et de libérer le pollen, qui sera leur seule récompense puisque les fleurs ne produisent pas de nectar. Chaque fleur contient 10 étamines et jusqu’à 12 ovules, le nombre de graines par gousse mûre varie de 4 à 6 (des Abbayes, 1971 ; Cubas, 1999). Au niveau européen, U. europaeus est présent sur toute l’Europe de l’Ouest et méditerranéenne jusqu’en Pologne (EUNIS, 2006). Au niveau mondial, cet ajonc a récemment colonisé de nombreuses régions de l’hémisphère sud (Fig. 3, Annexe 1).

Figure 3. Distribution d’ Ulex europaeus L. dans les régions où cette espèce est native (en bleu) et envahissante (en rouge). Adapté de Holm et al. (1997).

Ulex gallii a une taille d’environ un mètre et est caractérisé par l'étendard qui dépasse largement le calice. Cette espèce est associée à un climat océanique (Stockes et al., 2003). Elle se développe sur un sol pauvre, oligotrophique, acide et peut se trouver en sympatrie avec

21 Chapitre II

U. europaeus . Tout comme U. europaeus , U. gallii est hexaploïde (Misset & Gourret, 1996), ce qui explique pourquoi il peut donner des hybrides avec cette espèce. Ulex gallii fleurit en automne (Des Abbayes, 1971). Le nombre de graines par gousse mûre est 4-6 (Des Abbayes, 1971). Au niveau européen, U. gallii est également présent en Espagne, au Royaume-Uni et en Irlande (EUNIS, 2006).

Ulex minor est le plus petit des trois ajoncs bretons, avec une taille d’environ 50 cm, et ses fleurs sont plus petites que les deux autres espèces d’ajonc. On le rencontre plutôt en sous- bois. Il se développe sur un sol pauvre, oligotrophique, acide et peut se trouver en sympatrie avec U. europaeus . Ulex minor est diploïde (Misset & Gourret, 1996) et ne peut donc pas donner d’hybride pas avec U. europaeus . Ulex minor fleurit en automne (Des Abbayes, 1971). Le nombre de graines par gousse est 4 (Des Abbayes, 1971). Au niveau européen, U. minor est également présent en Espagne, au Portugal et au Royaume-Uni (EUNIS, 2006).

Le chapitre 4 présentera plus précisément les périodes de floraison et de fructification des trois espèces d’ajonc en Bretagne, ainsi que les quantités moyennes de gousses produites par plante et le nombre moyen de graines par plante.

22 Chapitre II

Ulex europaeus ssp. europaeus . a) rameau

fleuri ; b) fleur ; c) préfeuille ; d) étendard ; e)

aile ; f) carène g) pistil ; h) lèvre inférieure; i)

lèvre supérieure.

Ulex gallii . a) rameau fleuri ; b) fleur ; c) Ulex minor . a) rameau fleuri ; b) fleur ; c) préfeuille ; d) étendard ; e) aile ; f) carène ; g) étendard ; d) aile ; e) c arène ; f) pistil ; g) pistil ; h) préfeuille. gousse ; h) graine ; i) lèvre supérieure ; j) lèvre inférieure ; k) préfeuille

Figure 4. Planches de dessin représentant les trois espèces d'ajoncs présentes en Bretagne : Ulex europaeus , U. gallii et U. minor (D'après Vicioso, 1962).

23 Chapitre II

2. Exapion ulicis et Exapion lemovicinum

2.1 Présentation générale des charançon s Les charançons (Curculionoidea) sont des coléoptères holométaboles 12 . La caractéristique la plus distinctive de presque tous les charançons adultes est la présence d’un rostre qui correspond à un prolongement rigide de la tête et qui porte les pièces buccales à l’apex. Les stades immatures de la plupart des espèces et les détails d’histoire naturelle sont peu connus pour la plupart des espèces. La superfamille des Curculionoidea est composée de 13 familles (Anderson, 2004). Dans notre étude, nous nous intéresserons à deux espèces de charançon appartenant à la famille des Apionidae : Exapion ulicis et Exapion lemovicinum .

2.2 Présentation d’ Exapion ulicis et d’ E. lemovicinum

2.2.1 Taxonomie Phylum : Arthropode Classe : Insecte Ordre : Coleoptera Super-famille : Curculionoidea Famille : Apionidae Sous-famille : Apioninae Tribu : Exapiini Genre : Exapion Sous-genre : Ulapion Espèces : ulicis (Forster, 1771) lemovicinum (Hoffmann, 1929)

Les deux espèces de charançon étudiées font 2 à 3 mm de long. Ils appartiennent à la famille des Apionidés qui est caractérisée par des individus ayant un corps plus ou moins piriforme (d’où leur nom, du grec apios : poire) (Fig. 4). De part leur famille, ces charançons sont couramment appelés apions. Les membres du sous-genre Ulapion semblent inféodés au genre Ulex (Fabaceae, Genistae) (sauf au Sud de l’Espagne et au Nord de l’Afrique, où un genre proche Stauracanthus , semble aussi parasité).

12 Holométabole : Se dit des insectes chez qui le passage de l'état larvaire à l'état adulte se fait par l'intermédiaire d'un état nymphal. Les larves et les adultes de ces insectes ont, en général, une morphologie et des modes de vie très différents.

24 Chapitre II

Photos 3. Exapion ulicis (à gauche) et E. lemovicinum (à droite) sur des fleurs d’ajonc (Photos réalisées par Sonia Dourlot, Université de Rennes 1).

2.2.2 Identification morphologique Il existe à notre connaissance, trois clés d’identification basées sur des critères morphologiques des adultes, qui permettent d’identifier des apions : celles de Portevin (1935), d’Hoffmann (1958) et d’Ehret (1990). Cependant, ces critères sont difficilement utilisables pour une personne non spécialiste des charançons, d’autant plus que les charançons semblent présenter un important polymorphisme intraspécifique. A titre d’exemple, voici quelques éléments de description donnés par la clé d’identification la plus récente (Ehret, 1990) pour caractériser l’espèce E. ulicis : "insecte plus grand, pattes parfois entièrement noires, rarement entièrement rousses, tarses noires (sauf parfois les protarses) ". Du fait de leur grande richesse spécifique, les charançons sont un peu "la bête noire" des entomologistes et il existe à notre connaissance plus qu'un seul spécialiste dans le monde capables d’identifier avec certitude les espèces d'apions : Miguel A. Alonso-Zarazaga du Muséum National de Madrid (Espagne). De plus, nous désirions identifier des charançons dont nous connaissions la plante-hôte, donc récoltés dans les gousses, ce qui ne peut se faire qu’une seule fois dans l’année (au printemps). Enfin, il a fallu que je me familiarise aux techniques de montage d’insectes, qui ne sont pas facile à appliquer à des coléoptères ne dépassant pas les 5 mm de long. En juin 2005, nous avons donc envoyé 12 charançons adultes collectés dans les gousses d’ U. europaeus , 30 collectés dans les gousses d’ U. gallii et 7 collectés dans les gousses d’ U. minor , à Miguel A. Alonso-Zarazaga. Cet expert a identifié l’espèce E. ulicis pour tous les charançons provenant des gousses d’ U. europaeus et l’espèce E. lemovicinum pour tous les charançons provenant des gousses d’ U. gallii et d’U. minor . Il nous a transmis les critères morphologiques permettant de discriminer ces deux espèces (Annexe 2), que nous avons par la suite utilisé pour toutes nos identifications morphologiques.

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Afin, de vérifier, entre autres, l’absence d’espèces jumelles sur U. gallii et U. minor , nous avons également réalisé des identifications moléculaires, dont les méthodes et les résultats sont détaillés dans le chapitre 5.

2.2.3 Biologie générale des deux espèces de charançon étudiées Exapion ulicis . La plupart des observations de la biologie d’ E. ulicis ont été réalisées par Davies (1928) en Grande Bretagne, afin de savoir si cette espèce serait un agent de lutte biologique adéquat contre U. europaeus , ce qui a d’ailleurs été le cas (Annexe 1). L’accouplement de E. ulicis a lieu au printemps. Plus tard, la femelle creuse un trou dans une jeune gousse d’ U. europaeus , à l’aide de son rostre, puis y dépose ses œufs. Les adultes émergent en été lorsque les gousses mûres s’ouvrent sous l’effet de la chaleur. Les adultes libres se nourrissent des parties végétatives des fleurs des Ulex et hibernent sur les branches d’ajonc.

Figure 5. Larve (à gauche) et nymphe (à droite) d’ Exapion ulicis (d’après Davies, 1928).

Exapion lemovicinum . Les données biologiques concernant E. lemovicinum sont beaucoup plus rares. Les seules données reportées dans la littérature proviennent de la faune d’Hoffmann (1958). Il explique que les femelles de cette espèce déposent un œuf (rarement deux) dans les gousses d’ U. europaeus au printemps et qu’elle a un cycle de vie comparable à celui d’ E. ulicis .

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2.2.4 Distribution géographique Exapion ulicis . Cette espèce est native des régions ouest de l’Europe et de la Grande Bretagne. Elle est naturellement présente en Espagne, France, Grande Bretagne, Irlande, Italie, Pologne, Portugal et en République Tchèque (Fauna Europea). On retrouve également E. ulicis dans les régions où cette espèce a été introduite en tant qu’agent de lutte biologique contre U. europaeus : Amérique du Nord (Californie, Orégon), Hawaï, Nouvelle-Zélande, Tasmanie (Annexe 1). Exapion lemovicinum . Cette espèce a été observée sur U. europaeus et U. minor dans l’Ouest de la France (Portevin, 1935 ; Hoffmann, 1958 ; Ehret, 1990) et au Nord de l’Espagne (Miguel A. Alonso-Zarazaga, pers. comm.).

3. Echantillonnage et élevage

3.1 Echantillonnage Le suivi de la phénologie de floraison et de fructification des ajoncs ainsi que les observations des charançons in natura et les échantillonnages de gousses ou de charançons ont été réalisés sur des populations naturelles en Bretagne ou en jardin expérimental sur le campus de Beaulieu (Université de Rennes 1). Ces populations présentent généralement U. europaeus en sympatrie avec U. gallii ou U. minor . Les apions récoltés sur les rameaux ont été prélevés en tapant directement sur les plantes à l’aide d’un bâton, et en récupérant les apions tombés sur un tissu de coton blanc, placé sous la plante (Photos 4).

Photos 4. Récolte d’apions sur U. europaeus par Louis Parize et photos d’apions sur un tissu blanc.

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3.2 Elevage Afin d’obtenir un élevage de charançons, Anne Atlan et Michèle Tarayre ont commencé des cultures des différentes espèces d’ajonc en serre avant le début de ma thèse. Toutefois, les plantes n’ont pas survécu, peut-être entre autres, parce que les ajoncs ont besoin de bactéries fixatrices de nitrogène ( Rhizobium ) localisées au niveau des nodules de leurs racines pour croître (Zabkiewicz, 1976). Les ajoncs ont donc besoin de pousser avec leur terre d’origine, mais cela n’est pas encore suffisant, car ils ont un système racinaire vertical important et ont besoin de pousser en pleine terre, notamment pour U. europaeus qui peut atteindre une taille importante rapidement (trois mètres de hauteur au bout de quatre années). Cependant, même avec les conditions requises, les ajoncs mettent trois ans avant de fleurir, et donc à produire des gousses, il n’a donc pas été possible dans le cadre de ma thèse d’avoir des ajoncs pour réaliser des élevages d’apions. Par conséquent, la majorité des observations sur les charançons a été réalisée soit directement sur le terrain, soit avec des insectes collectés sur le terrain et étudiés au laboratoire. Nous pouvons effectivement conserver les apions pendant plusieurs semaines au laboratoire (dans des boites cylindriques en plastique ou dans des boites de pétri) en leur renouvelant régulièrement l’eau, les rameaux et/ou les fleurs d’ajonc dont ils se nourrissent.

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Chapitre III : IMPACT DE LA PRESSION PARASITAIRE SUR LA PHENOLOGIE D ’ U. EUROPAEUS

Ce chapitre présente les travaux qui ont permis de mieux connaître la biologie d' Ulex europaeus , plus particulièrement la relation entre la variabilité phénologique et la pression parasitaire, et ses conséquences sur les capacités envahissantes de cette espèce. Il s'agit le plus souvent de travaux à long terme, initiés avant ma thèse et poursuivis durant celle-ci. J'y ai donc participé tout au long de ma thèse; et bien que ce ne soit pas le cœur de mon sujet de recherche, ils constituent la base sur laquelle le projet a été élaboré.

L'équipe ISA a choisi d'étudier la phénologie de floraison d' U. europaeus car elle présente une variabilité très inhabituelle. En Europe, sa zone d’origine, son pic de floraison est au printemps (Des Abbayes et al. 1971; Cubas, 1999). Sous les tropiques, il peut pousser jusqu'à 2200 mètres d'altitude et sa floraison principale et en hiver; c'est le cas à Hawaï (Markin & Yoshioka, 1996) ou sur l'île de la Réunion (Océan indien) (Cadet, 1974). En Nouvelle-Zélande, il pousse du niveau de la mer à 1500 mètres d’altitude et fleurit en automne ou au printemps, suivant l'altitude des populations (Hill et al. 1991). Enfin, en Amérique Centrale, il peut pousser jusqu'à 4000 m d'altitude au Pérou, où sa floraison principale est en été (pers. com.). Cette capacité de déplacer sa période de floraison en fonction des conditions locales peut constituer l'une des raisons de ses capacités à envahir des milieux aussi différents. Cependant, on peut se demander si cette variabilité résulte de plasticité phénotypique ou de sélection sur une diversité génétique pré-existante, importée de la zone d’origine. Dans ce deuxième cas, la question du maintien de cette diversité dans la zone d'origine doit également être abordée. Pour répondre à ces questions, ce chapitre est divisé en quatre parties:

(i) La première partie correspond à un article dont je suis co-auteur (Annexe 3). Elle présente la diversité phénologique de floraison d’ U. europaeus dans sa zone d’origine (en Bretagne) et montre que cette plante présente un polymorphisme de floraison qui correspond à deux stratégies de défense contre la prédation des graines. Cet article présente des données recueillies avant le début de ma thèse, mais n'a été publié que récemment (sous presse dans la

29 Chapitre III

revue " Evolutionary Ecology "). J’ai contribué à compléter les résultats, à leur interprétation et à la rédaction de l’article.

(ii) La deuxième partie correspond à un suivi à long terme (de 2000 à 2005) de populations naturelles pour étudier la variabilité inter-annuelle de la phénologie et du parasitisme en Bretagne. L'article correspondant est en cours de rédaction. J’ai contribué à ce travail en participant au travail de terrain de 2003 à 2005 (suivi mensuel, voire bimensuel), et à l’interprétation des résultats.

(iii) La troisième partie correspond à un article dont je suis co-auteur (Annexe 4) Elle présente une étude du déterminisme génétique des traits d’histoire de vie d’ U. europaeus , à partir d’un jardin expérimental en Bretagne. Ce jardin a été planté avant le début de ma thèse, en 2002. Je n'ai pas donc pas participé à l'élaboration du protocole, mais j'ai participé aux mesures (faites en 2005/2006) et à la rédaction de l’article correspondant.

(iv) La quatrième partie présente le polymorphisme de floraison d’ U. europaeus dans deux zones envahies : La Réunion et la Nouvelle-Zélande. Ce travail est réalisé en collaboration avec des organismes présents dans les zones touchées. Je n’ai pas participé à l'étude faite à La Réunion, mais j'ai participé à la mission de trois semaines qui a permis d'observer le polymorphisme intra- et inter- population en Nouvelle-Zélande.

30 Chapitre III

1. Diversité phénologique de floraison d’ Ulex europaeus en Bretagne (cf article en Annexe 3)

1.1 Caractérisation de la diversité phénologique intra-population L'observation de la diversité phénologique d’ U. europaeus a été réalisée par le suivi de la floraison et de la fructification de populations naturelles en Bretagne, dans un rayon de 70 km autour de Rennes. Cinq populations ont été suivies de 2000 à 2005, et une étude plus approfondie de 16 populations a été réalisée en 2001/2002. Le résultat le plus marquant est l’existence d’une variabilité très importante des dates de début et de fin de floraison, et ce au sein même des populations (Fig. 6A). Au vu de la distribution des périodes de floraison, deux phénotypes principaux ont été définis, l'un correspond aux individus qui fleurissent de l'automne au printemps, qui ont été dénommés "plantes à floraison longue", et l'autre correspond aux individus qui fleurissent essentiellement au printemps, qui ont été dénommés "plantes à floraison courte" (Fig. 6B). La distribution bimodale des dates de début de floraison a permis de placer la limite entre ces deux phénotypes fin décembre.

Figure 6. Durée de floraison (A) et distribution des dates de début de floraison (B) de 60 plantes U. europaeus choisies aléatoirement dans cinq populations naturelles de Bretagne. La figure A présente les observations effectuées en 2001-2002 (chaque barre représente la durée de floraison d’un individu). La figure 2 compile les observations effectuées de 2000 à 2005. Ces résultats ont permis de définir deux phénotypes : les plantes à floraison (F.) longue et les plantes à floraison courte.

31 Chapitre III

1.2 Succès reproducteurs des plantes à floraison longue vs des plantes à floraison courte Afin d'analyser les différences entre ces deux types de plantes, Anne Atlan et Michèle Tarayre ont utilisé l’échantillonnage réalisé en 2001/2002 dans 16 populations naturelles, où elles ont choisi les plantes non pas au hasard mais de manière à avoir un nombre équilibré de plantes à floraison courte et longue dans chaque population. De manière surprenante, la production de fleurs et de gousses ne dépend pas de la saison, mais du type de plante. Les plantes à floraison longue produisent peu de fleurs, mais de manière constante tout au long de leur floraison, alors que les plantes à floraison courte produisent beaucoup de fleurs d'un seul coup. Les productions de gousses suivent le même schéma, indiquant que les fleurs produites en automne et en hiver peuvent être pollinisées. Les ajoncs sont attaqués par deux prédateurs de graines, le charançon E. ulicis (Curculionoidea, Apionidae) et la chenille de la teigne Cydia succedana (Lepidoptera, Tortricidae). Or, ces prédateurs de graines n'attaquent que la production de printemps ; par conséquent, la production d'automne/hiver des plantes à floraison longue échappe totalement au parasitisme, alors que toute la production des plantes à floraison courte y est soumise (Fig. 7). Au printemps, les plantes qui produisent le plus de gousses ont cependant une proportion de gousses parasitées plus faibles. Nous avons interprété ces deux types de floraison comme deux stratégies de défense contre le parasitisme : (i) une stratégie d’évitement : les plantes à floraison longue "fuient dans le temps", en produisant une partie de leurs gousses dans les périodes où le parasite est absent et (ii) une stratégie de compensation : les plantes à floraison courte utilisent la stratégie de "satiété du prédateur" (Janzen, 1971), en produisant leurs gousses de manière massive. Comment peut-on alors expliquer le maintien de ce polymorphisme de phénologie ?

32 Chapitre III

floraison longue

floraison courte

aou sep oct nov dec jan fev mar avr mai jun jul aou

période de stade attaqué par les apions ponte des apions

Figure 7. Phénologie de floraison et de fructification d’ U. europaeus et période de ponte des apions en Bretagne basée sur un suivi de cinq populations naturelles de 2000 à 2005. En haut, les périodes de floraison, en bas, les périodes de fructification correspondantes. Deux phénotypes sont représentés, mais il existe des phénotypes intermédiaires. Le stade de fructification représenté par un trait rouge est le seul à être attaqué par les apions.

1.3 Maintien du polymorphisme chez U. europaeus Notre première hypothèse serait que le polymorphisme est maintenu par une variation spatiale des pressions de sélection. Cependant, aucune corrélation entre le taux de parasitisme d'une population et la phénologie des individus n’a été trouvée. La seconde hypothèse est qu'il est maintenu par une fluctuation dans le temps des pressions de sélection . En effet, le succès relatif des deux types de plante dépend de la rigueur de l'hiver et du taux de parasitisme au printemps. En 2001/2002, la survie des gousses hivernales a été bonne et le taux de parasitisme élevé ; les plantes à floraison longue ont eu une meilleure production de graines que les plantes à floraison courte. Par contre, en 2003/2004 les gousses d'hiver ont gelé, et ce sont les plantes à floraison courte qui ont eu une meilleure production de graines. Enfin, en 2005/2006, nous avons observé sur notre terrain expérimental une production comparable pour les deux types de plantes. Les fluctuations temporelles des conditions environnementales ne permettent le maintien d'un polymorphisme que dans des conditions assez restrictives (Gillespie, 1991) car c'est le génotype qui a la plus grande moyenne géométrique qui envahit la population. Cependant, Haldane et Jayakar (1963) ont montré que ce polymorphisme peut être stable si la

33 Chapitre III variance des succès reproducteurs des deux phénotypes est différente, et si le phénotype le plus variable est récessif. Or les plantes à floraison longue sont souvent considérées comme partageant les risques suivant la stratégie appelée "bet-hedging" par Slatkin (1974). Pour l’ajonc, l'imprédictibilité réside dans la pression parasitaire au printemps et la rigueur du gel en hiver . En fleurissant à la fois aux deux saisons, les plantes à floraison longue diminuent la variance inter-annuelle de leur succès reproducteur. Par contre, les plantes qui ne fleurissent qu'au printemps ont un succès reproducteur directement lié aux conditions biotiques et abiotiques d’une seule saison, et de ce fait ont une amplitude de variation inter-annuelle plus grande. Une partie des conditions permettant le maintien de ce polymorphisme par fluctuations temporelles est donc réalisée. Il faut encore analyser l'ampleur de ces fluctuations temporelles.

2. Variations temporelles de la phénologie et du parasitisme

2.1 Variation entre les années et les populations Afin d'estimer la variabilité inter-annuelle des principaux traits d'histoire de vie de l’ajonc U. europaeus , cinq populations naturelles ont été suivies de 2000 à 2005. Douze individus par population ont été choisis au hasard et observés tous les mois (de septembre à février), ou tous les 15 jours (de mars à juillet). La phénologie de floraison et de fructification de ces plantes, ainsi que la production de graines par gousse et le taux de parasitisme ont été mesurés. Les productions annuelles de gousses et de fleurs par rameau n’ont pas été quantifiées, car ces mesures sont trop longues pour pouvoir être faites aussi souvent sur autant de plantes. En 2005, trois populations ont été détruites au printemps, ce qui fait que les données sur la production de graines et le parasitisme ne sont disponibles que sur les quatre premières années. Les dates de début de floraison se sont révélées très comparables d'une année à l'autre , avec des coefficients de corrélation inter-annuels variant de 0,66 à 0,86. Les coefficients les plus élevés ne sont pas forcément trouvés entre années consécutives, ce qui suggère que les conditions météorologiques , plus que l'âge des plantes, sont responsables des variations observées. L'amplitude des variations inter-annuelles dépend aussi des populations : quelques populations ont des phénologies très conservées d'une année sur l'autre, d'autres présentent des écarts plus importants (Fig. 8). Ces résultats montrent que les dates de début de floraison

34 Chapitre III sont bien une propriété répétable de la plante, mais qu'elles peuvent aussi dépendre d'une plasticité phénotypique plus ou moins importante suivant les populations et les individus.

2000/2001 300

250

200

R=0,41 150 R=0,81 R=0.88 100 R=0,84

50 R=0,42 R=0,67 0 0 50 100 150 200 250 300 2004/2005

Figure 8. Corrélation entre les dates de début de floraison observées entre la première et la dernière année de suivi. Chaque point représente une plante, et chaque symbole une population différente. La droite de régression compile les données des 5 populations. Les dates sont données en jours à partir du premier septembre.

Les valeurs des principaux traits étudiés sont significativement différentes suivant les populations et les années (Fig. 9). Les valeurs des traits mesurés qui dépendent de la plante (date de début de floraison et nombre de graines par gousse) varient peu au cours des années, et toutes les populations réagissent de la même manière (par exemple, elles ont toutes produit moins de graines par gousse durant la troisième année de l'étude). Par contre, la variabilité inter-annuelle des variables liées au parasitisme est très importante, et il y a une forte interaction entre les populations et les années. Suivant les années et les parasites considérés, ce n’est donc pas la même population qui a la pression parasitaire la plus forte, ce qui explique bien l'absence de corrélation observée en 2001/2002 entre le taux de parasitisme moyen d'une population et sa phénologie. Un tel résultat conforte le caractère imprédictible du parasitisme , et va donc bien dans le sens d'un polymorphisme maintenu par des fluctuations dans le temps. Pour que le parasitisme des graines impliquent de telles pressions de sélection, il faut vérifier que les dommages occasionnés soient importants.

35 Chapitre III

année 1 A. début de floraison B. gousses parasitées par apions (%) 250 année 2 70 année 3 200 60 année 4 50 150 40 100 30 20 50 10 0 0 CV LO LR PG PM CV LO LR PG PM C. graines par gousse D. gousses parasitées par des chenilles (%) 70 6 60 5 50 4 40 3 30 2 20

1 10

0 0 CV LO LR PG PM CV LO LR PG PM Figure 9. Evolution des moyennes (+ erreur-type) du début de floraison (A), du pourcentage de gousses parasitées (B) , du nombre de graines par gousse (C) et du pourcentage de gousses parasitées par des chenilles (D) chez Ulex europaeus pour les population bretonnes CV, LO, LR PG et PM, de 2000 à 2004.

2.2 Taux et intensité de prédation des gousses La figure 10 présente les variations mensuelles du taux de parasitisme d’ E. ulicis et de C. succedana ainsi que le nombre d’individus E. ulicis et le nombre de parasitoïdes d’apions par gousse parasitée. Quel que soit le parasite, le taux de parasitisme augmente du printemps à l’été. La présence de larves a été détectée à partir du mois d’avril pour E. ulicis et à partir du mois de mai pour C. succedana . Les larves de C. succedana sont capables d’attaquer en moyenne près du quart des gousses d’ U. europaeus et celles de E. ulicis plus du tiers. Le taux de parasitisme de ces deux prédateurs est donc particulièrement élevé. De plus, une seule chenille est capable de détruire tout le contenu d’une gousse. Par contre, chaque apion se développe en moyenne à partir d’une graine et nous avons considéré que chaque parasitoïde de l’apion correspondait initialement à la présence d’un charançon. Par conséquent, le nombre d’adultes émergeant par gousse parasitée est en moyenne de quatre. Etant donné que chaque gousse d’ U. europaeus contient en moyenne 4 graines, E.

36 Chapitre III ulicis est donc également capable de détruire tout le contenu d’une gousse. Par conséquent, l’intensité de parasitisme de ces deux prédateurs est également très élevée. Par ailleurs, malgré le succès reproducteur de E. ulicis , il est assez surprenant de constater qu’une proportion non négligeable de stades immatures sont encore présents lorsque les gousses matures s’ouvrent. Etant donné que les charançons doivent attendre l’ouverture des gousses matures en été pour pouvoir être libérés (contrairement aux chenilles qui peuvent faire un trou et sortir seules de la gousse), trois principales hypothèses peuvent expliquer cette observation. (i) Ces stades immatures résultent de pontes tardives, (ii) ils résultent d’un mauvais synchronisme entre la phénologie de la plante et le temps de développement du charançon ou (iii) le retard de développement de ces charançons est induit par le parasitoïdisme.

Nombre d'apions par gousse parasitée Taux de gousses parasitées parasitoïde par les chenilles apion (adulte) 0,6 par les apions 5 apion (larve) 0,5 4 0,4 3 0,3 2 0,2 1 0,1 0 0,0 mar-Avr mai juin1 juin2 juil1 mar-Avr mai juin1 juin2 juil1

Figure 10. Evolution temporelle du taux de parasitisme des gousses et du nombre de parasites par gousse parasitée de 60 plantes U. europaeus issues de 5 populations différentes. Ces données présentent les moyennes obtenues sur cinq périodes de 2000 à 2005 : mars-avril (n = 30), mai (n = 111), première quinzaine de Juin (n = 148), deuxième quinzaine de juin (n = 167) et première quinzaine de juillet (n = 126). Les plantes qui produisent des gousses mûres avant le mois de mars ou après le 15 juillet sont très rares (moins de 1%).

Le parasitisme exercé par E. ulicis est donc particulièrement important, et pourrait exercer une pression de sélection pouvant expliquer avec les conditions biotiques et abiotiques le maintien du polymorphisme des deux types de phénotypes floraux chez U. europaeus . De plus, l'absence de prédateurs de graines dans les zones envahies permet donc le relaâchement d'une pression de sélection très importante, ce qui pourrait expliquer le caractère envahissante de l'ajonc (hypothèse EICA). Pour vérifier ces hypothèses, il est primordial de s’assurer que le déterminisme de la diversité observée est au moins partiellement génétique.

37 Chapitre III

3. Mise en évidence du déterminisme génétique des traits d’histoire de vie d’ U. europaeus (cf article en Annexe 4)

Pour explorer le déterminisme génétique des phénologies de floraison et des taux de parasitisme, ainsi que les éventuelles corrélations génétiques entre ces traits, nous avons mis en route une étude de génétique quantitative en 2002, en cultivant des familles de demi-frères randomisées en jardin expérimental . Ce type d’étude est rarement effectué sur un ligneux, car la maturité sexuelle demande plusieurs années, et la taille des plantes adultes limite le nombre d’individus cultivables. L’ajonc commence à fleurir la troisième année mais n’atteint sa pleine maturité reproductive qu’à l’âge de quatre ans, âge où la plante peut avoir une largeur et une hauteur de plus de 2 mètres. Compte tenu de ces contraintes et des recommandations de Falconer and Mackay (1996), le protocole a consité à planter 20 familles de 10 plantes chacune. Ces plantes ont fleuri au printemps 2005, et en 2005/2006, elles ont fait l'objet d'un suivi régulier durant toute la saison de reproduction : nous avons estimé les stades de floraison et de fructification, quantifié les productions de gousses et de graines et mesuré la proportion de gousses infestées par des prédateurs de graines. Nous avons également mesuré la taille des plantes, car il existe souvent des trade-offs entre la reproduction sexuée et la croissance végétative. Le principal résultat de cette étude est le caractère hautement héritable et les forts effets familles retrouvés pour tous les traits liés à la phénologie, le parasitisme ou l'architecture des plantes , ce qui implique une forte composante génétique dans le déterminisme de ces caractères.

Les corrélations phénologiques ont été testées en calculant la corrélation entre individus, et les corrélations génétiques en calculant les corrélations entre moyenne par famille. Les traits phénologiques et architecturaux apparaissent indépendants, que ce soit au niveau phénologique ou génétique. Ils ne sont donc pas déterminées par les mêmes facteurs et ne répondent pas aux mêmes pressions de sélection. Par contre, les traits phénologiques sont fortement corrélés au taux de parasitisme au printemps , à la fois au niveau phénotypique et génétique. Il existe donc des trade-offs génétiques entre ces caractères : les familles qui fleurissent le plus tard sont celles qui sont les moins parasitées au printemps (N=20, R=-0.85, P<0.001). Cela suggère une évolution conjointe de ces deux caractères ayant conduit à deux stratégies différentes : des plantes très vulnérables à la prédation des graines et qui échappent

38 Chapitre III au parasitisme par évitement dans le temps (celles à floraison longue), et des plantes qui fleurissent massivement au printemps mais sont peu vulnérables à la prédation des graines (celles à floraison courte) . De plus une corrélation génétique significative et négative entre la taille des plantes et la résistance aux insectes (N=20, R=+0.51, P<0.05) suggère que cette résistance à un coût.

4. Polymorphisme d’ U. europaeus dans les zones envahies

4.1 Etude de la phénologie de floraison à La Réunion et en Nouvelle-Zélande Sur l'île de La Réunion, les ajoncs sont implantés depuis environs 200 ans. Ils ont été introduits accidentellement ou volontairement par des immigrants bretons, dans un but décoratif, pour faire des haies ou pour servir de fourrage. Cependant, ils ont rapidement eu un caractère envahissant, que ce soit dans les prairies pâturées ou dans des sites naturels. L'ajonc ne possède aucun parasite local; la lutte biologique par introduction d'apion n'y a pas été entreprise, et ceux-ci sont totalement absents de l'île. Au cours d'une première mission réalisée en décembre 2003, les grandes lignes d'un programme de recherche ont été définies, en collaboration avec l'ONF 13 , le CIRAD 14 et l'Université de Rennes 1. Une seconde mission réalisée en août 2004 a permis de mettre en place ce programme, qui s'est réalisé durant l'année 2005. Ce projet, financé par l'Europe et la Région Réunion, a permis la cartographie exhaustive des ajoncs réunionnais, la définition des zones sensibles, l'amélioration des stratégies de luttes, le suivi de la phénologie durant une année, et l'obtention des données génétiques en vue d'une analyse phylogéographique. La Nouvelle-Zélande est l'un des pays les plus touchés par l'invasion des ajoncs. Ils entraînent un coût important aussi bien pour les agriculteurs que pour les forestiers. Ce pays a été le premier à faire venir des apions pour la lutte biologique, dès les années 1930. Ces apions, issus de Grande Bretagne, se sont très bien implantés. Les apions utilisés pour la lutte biologique en Australie, en Tasmanie et au Chili sont issus des populations néo-zélandaises. Cependant, malgré l'utilisation de divers agents de lutte biologique et chimique, il n'a pas été possible de faire régresser ni même de limiter l'invasion. Une mission réalisée en janvier 2005 a permis de rencontrer les chercheurs travaillant sur la lutte biologique contre les ajoncs, et d’observer les populations. Malheureusement, le suivi prévu durant un stage de DEA n'a pu être réalisé, mais nos observations ponctuelles ont permis d'établir l'existence d'une forte

13 ONF : Office National des Forêts. 14 CIRAD : Centre de coopération International en Recherche Agronomique pour le Développement.

39 Chapitre III variabilité intra-populationnelle, dont il n'était pas fait mention dans les publications. Les discussions que nous avons eues avec des néozélandais ainsi que nos propres observations nous ont permis d'établir le profil phénologique des ajoncs néo-zélandais. La comparaison entre les phénologies de floraison en Bretagne, à La Réunion et en Nouvelle-Zélande est présentée figure 11.

Bretagne

La Réunion

Nouvelle-Zélande

automne hiver printemps été

fleurs gousses mûres croissance végétative Figure 11. Comparaison des périodes de production de fleurs, de gousses et de croissance végétative d' Ulex europaeus dans trois régions du monde sous trois types climatiques différents. En plein, les floraisons et fructifications abondantes, en hachuré, les floraisons et fructifications peu nombreuses.

En Bretagne, il n'y a qu'un seul pic de floraison au printemps, précédé par une période où une partie seulement des individus sont en fleurs. La proportion d'individus en fleurs avant le printemps dépend des populations. A la Réunion, la floraison est continue, mais il y a deux pics de floraison distincts. Suivant les populations, c'est le premier ou le deuxième pic qui est le plus productif. En Nouvelle-Zélande, la floraison est discontinue, avec un pic en automne et un pic au printemps. Suivant les populations, l'un des deux types est majoritaire. Une telle diversité est exceptionnelle, et correspond probablement à des adaptations aux conditions climatiques. Cependant, celles-ci ne peuvent être seules en cause, car la croissance végétative se fait à la même saison dans ces trois régions, et il est probable que d'autres facteurs biotiques, tels que la disponibilité en pollinisateurs, soient aussi impliqués. Nous sommes en train de cultiver en conditions contrôlées des plantes issues de ces trois régions pour les comparées en conditions homogènes, et espérons pouvoir continuer les observations in situ.

40 Chapitre III

Nous attendons d’avoir une autre année d’observations à La Réunion (effectuées ponctuellement lors des missions de Luc Gigord, Université de Lausanne) pour vérifier la stabilité dans le temps des phénotypes avant de rédiger l’article correspondant.

4.2 Conclusion L'ensemble de ces données suggère donc qu'il existe chez U. europaeus deux stratégies de floraison génétiquement déterminées, qui ont été sélectionnées en réponse à la pression parasitaire, et dont la coexistence est maintenue dans les populations de la zone d’origine par les fluctuations inter annuelles des conditions environnementales. Dans les zones récemment envahies, l’ajonc a été introduit sans ses prédateurs de graines. La pression de sélection due aux phytophages a donc été levée, et comme supposé dans l'hypothèse EICA (Blossey and Nötzold, 1995), toute la diversité génétique importée a pu être sélectionnée en réponse aux conditions locales, telle que température et la disponibilité en pollinisateurs aux différentes saison. Cela a sans doute facilité son adaptation à des conditions climatiques contrastées, et explique en partie pourquoi il constitue l'une des espèces exotiques les plus envahissantes dans de nombreuses régions (Lowe et al., 2000).

En essayant de comprendre les capacités d’adaptation d’une plante envahissante, ce troisième chapitre a permis de montrer que la pression parasitaire exercée notamment par le charançon E. ulicis pouvait fortement influencer la phénologie de floraison d’ U. europaeus . Réciproquement, en élargissant l’étude de l’association ajonc-charançon aux autres espèces d’ajonc et de charançon présente en Bretagne, nous verrons dans les trois chapitres qui suivent, et qui constituent la majeure partie de mon travail de thèse, que la phénologie de floraison, et plus particulièrement, la phénologie de fructification des ajoncs, peut également jouer un rôle important pour les charançons, en particulier dans la diversification des espèces.

41 Chapitre IV

Chapitre IV : CYCLES DE VIE DES APIONS EN RELATION AVEC LA PHENOLOGIE DES AJONCS

Afin de mieux comprendre les interactions entre les apions et leurs plantes-hôtes, j’ai élargie mon étude aux deux autres espèces d’ajonc présentes en Bretagne : U. gallii et U. minor . Ces deux espèces qui fleurissent en automne, se retrouvent très souvent en sympatrie avec U. europaeus . Or, leurs gousses sont également parasitées en automne par un apion morphologiquement très semblable à E. ulicis . Si ce charançon appartient à une autre espèce que E. ulicis , il serait donc possible que la divergence entre ces deux espèces d’apion se soit effectuée en sympatrie, et si c’est le cas, il serait intéressant de savoir par quel processus évolutif (coévolution ou transfert d’hôte). Avant de pouvoir se poser des questions sur un plan évolutif, différentes questions préliminaires concernant la spécificité de plante-hôte doivent être posées :

(i) L’apion parasitant les espèces d’ajonc automnales appartient-il à l’espèce E. ulicis ou à une autre espèce ?

(ii) Quelle est la spécificité d’hôte des apions parasitant les ajoncs en Bretagne ?

(iii) La phénologie de floraison et de fructification de la plante-hôte joue-t-elle un rôle important dans cette spécificité d’hôte ?

Afin de répondre à ces questions, ce chapitre présente dans une première partie, l’identification des apions et le rôle de la phénologie de floraison et de fructification des ajoncs sur le cycle de vie et le comportement des apions. Dans une seconde partie, je présente un travail complémentaire basé sur des observations de comportement, qui a été réalisé avant l’obtention des critères d’identification des charançons.

42 Chapitre IV

IV. A : R OLE DE LA PHENOLOGIE DE FLORAISON DES AJONCS

SUR LE CYCLE DE VIE DES APIONS

Article accepté dans Entomologia Experimentalis et Applicata

Myriam BARAT *, Michèle TARAYRE and Anne ATLAN

Plant phenology and seed predation:

interactions between gorses (Fabaceae: Genistae)

and weevils (Curculionoidea: Apionidae)

in Brittany (France)

Running title: Gorse-weevil interactions

UMR 6553 EcoBio, Université de Rennes 1,

Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex, France

*corresponding author.

Tel: 33 (0) 2 23 23 61 72, Fax: 33 (0) 2 23 23 50 47 e-mail: [email protected]

43 Chapitre IV

Résumé

Les deux charançons Exapion ulicis et E. lemovicinum (Curculionoidea, Apionidae) sont des prédateurs de graines des trois espèces d’ajoncs (Fabaceae, Genistae) présentes en Bretagne : Ulex europaeus , U. gallii et U. minor . La phénologie de floraison et de fructification des ajoncs joue un rôle majeur dans l’association apion-ajonc. En effet, les larves se développent à l’intérieur des gousses et les adultes doivent attendre leur ouverture pour pouvoir être libérés. Nous avons suivi la phénologie de floraison et de fructification des espèces d’ajonc, le comportement reproductif des apions dans six populations naturelles de la région native de ces espèces d’ajonc. Sur chaque site, U. europaeus , dont le pic de floraison est au printemps, était en sympatrie avec une des deux espèces à floraison automnale, U. gallii ou U. minor . Nous avons ainsi observé que E. ulicis déposait ses œufs dans les gousses d’ U. europaeus au printemps alors que E. lemovicinum déposait ses œufs dans les gousses d’ U. gallii ou d’ U. minor en automne. Par conséquent, la spécificité d’hôte dépend de la phénologie de l’ajonc et non pas de la proximité géographique. De plus, le contenu des gousses parasitées a montré que les femelles E. ulicis déposaient plusieurs œufs par gousse et choisissaient très probablement les gousses contenant le plus grand nombre de graines. Par contre, les femelles E. lemovicinum déposaient un œuf par gousse et ne montraient pas de préférence pour les gousses riches en graines. Enfin, nos résultats ont également montré que le taux de prédation exercé par E. ulicis était supérieur à celui de E. lemovicinum .

Summary

The two weevil species Exapion ulicis and Exapion lemovicinum (Curculionoidea, Apionidae) are seed predators of the three gorse species (Fabaceae, Genistae) occurring in Brittany (France): Ulex europaeus , Ulex gallii and Ulex minor . Host plant phenology plays a major role in the relationship between apionid weevils and their gorse species, because larvae develop within gorse pods and adults have to wait for pod dehiscence to be released. We monitored flowering and fruiting phenology of gorse species, weevil reproductive behaviour and egg laying patterns in six natural populations in the native area of these gorse species. At each site, U. europaeus , which flowers mainly in spring, was sympatric with one of two autumn flowering gorse species, U. gallii and U. minor . We noticed that E. ulicis laid eggs in spring and was restricted to U. europaeus whereas E. lemovicinum laid eggs in autumn and was restricted to the two autumn-flowering species U. gallii and U. minor . Therefore, host specificity depended on gorse phenology, and not on geographic proximity. In addition, the infested pod content showed that E. ulicis laid several eggs per pod and suggested that females chose pods with the highest numbers of seeds. By contrast, E. lemovicinum laid a single egg per pod and showed no preference for pods with many seeds. Finally, the impact of seed predation by E. ulicis was higher than that of E. lemovicinum .

44 Chapitre IV

Introduction

Most phytophagous insects have a high host specificity, using only one or a few closely related plants (Ehrlich & Murphy, 1988; Bernays & Chapman, 1994). Since the availability and quality of plant resources are variable with seasons, plant lifespan and the environment (Schoonhoven et al., 1998), host life history traits and especially plant phenology may strongly influence the life cycle and life history traits of phytophagous insects. This appears particularly true for seed predators, for which immature stages develop inside the ripening seeds. However, cases reporting influence of host phenology on life cycle of seed predators are rare, although they may be particularly interesting. For example, Ishihara (1998) has shown that growth rates of the bruchid Kytorhinus sharpianus varied in response to the changes in development of its host Sophora flavescens (Fabaceae). This result suggests that specialist seed predators are able to rapidly evolve new behavioural and physiological adaptations in response to variations of host phenology. Therefore, host phenological factors can allow or limit host use and may even lead to allochronic speciation of insects in which the initial segregation of sympatric populations is in time rather than space. Indeed, if an insect species adapts to a plant species which flowers during one restricted period, it will lead to temporal constraints on the use of other plant species with different flowering periods (Bernays & Chapman, 1994). Some cases of close relationship between insects and plants have resulted in temporal isolation between herbivore populations feeding on different host species (Pratt, 1994; Berlocher & Feder, 2002; Drès & Mallet, 2002). Reciprocally, insects may also influence the phenology of their host. Indeed, some plants escape predators in time by blooming before (Mahoro, 2002) or after predator activity (Green & Palmbald, 1975; Carroll & Loye, 1987). Others produce many seeds in a short period to surpass seed predator activity (“predator satiation”, Kelly et al., 2000). Therefore, the close relationship between phytophagous insects and their host plants may lead to co-evolutionary interactions. Interactions between apionid weevils and gorse species may represent a suitable model for investigating the reciprocal influence of host plant phenology with phytophagous insect. In Brittany (Western France), three species of gorse (Fabaceae, Genistae, Ulex ) are present and differ in their flowering period. In Ulex europaeus , flowering peaks in spring (but some plants may also flower in other seasons, Tarayre et al., 2007), whereas in U. gallii and U. minor the flowering peak is in autumn (Des Abbayes, 1971; Cubas, 1999). The seeds of all

45 Chapitre IV three gorse species are infested by several apionid weevils. Larvae develop within gorse pods until the adult stage, and the adults depend entirely on host plant phenology for their release as they are not able to escape from the pod before its dehiscence. In addition, apionid weevils are often specialist insects, and are therefore frequently used in biological control programs (Heard & Forno, 1996). Exapion ulicis , is currently used against U. europaeus , one of the thirty most invasive plant species in the world (Lowe et al., 2000). The weevils were collected in Great-Britain and introduced first in New Zealand (Hill et al., 2000), then in several invaded areas including Chile (Norambuena & Piper, 2000) and Hawaii (Markin & Yoshioka, 1998). Previous work done in Brittany suggested that U. europaeus phenology evolved in answer to parasitic pressure exercised by E. ulicis (Tarayre et al., 2007). Indeed, in this study, U. europaeus exhibited a polymorphism of flowering phenology: long-flowering plants start flowering in autumn or winter and continue through spring, whereas short-flowering plants only flower in spring. Short-flowering plants probably reduce the proportion of infested pods by predator satiation, since they produce mass fruiting in spring. Long-flowering plants partly escape parasitism in time, since their autumn and winter pods are never infested. Autumn pods of U. gallii and U. minor are infested by apionid weevils, but much less is known about the relationship between these two gorse species and their seed predators. This study documents gorse/weevil interaction between spring and autumn flowering species, which may help understanding the reciprocal influence of gorse phenology and weevil life history. We monitored natural populations of gorses in Brittany, where autumn and spring flowering species occur sympatrically, to answer the following questions: what were the flowering and fruiting phenologies of U. gallii and U. minor ? Which weevil species infest gorse pods in Brittany and what is the specificity of their association? What is the influence of gorse phenology on the life cycles and life history traits of weevils? What is the impact of weevils on natural populations of gorse species? The interaction between weevils and gorse species are discussed from a biological and evolutionary perspective.

46 Chapitre IV

Materials and methods

Study organisms

Gorse species Gorses are perennial spiny evergreen shrubs with yellow hermaphrodite flowers. The Ulex genus includes a dozen species whose native range is western Europe and North Africa. Three species also occur naturally in western France and Great-Britain: Ulex europaeus (subsp. europaeus ), U. gallii and U. minor . Ulex europaeus is about 2 meters high but its height can vary from 0.5 to 4 meters. In Brittany, it is widespread in both coastal and inland locations, and its flowering peak is in spring. Each plant produces several hundred pods. Ulex gallii and U. minor are smaller (from 0.5 to 1 meter) and flower in autumn (Des Abbayes, 1971; Cubas, 1999). They generally produce between 50-100 pods per individual. Ulex gallii is found in coastal areas and is often encountered in sympatry with U. europaeus. These two species may hybridize but their hybrids can be distinguished from the parent species (Benoit, 1962; Gloaguen, 1986) and were discarded from this study. Ulex minor is a woodland understorey species that sometimes occurs in sympatry with U. europaeus , but no hybrids have ever been reported. In Brittany, U. minor and U. gallii never occur sympatrically.

Weevil species The apionid weevil species observed in this study were identified as Exapion ulicis (Apion ulicis , Forster, 1771) and Exapion lemovicinum (Hoffmann, 1929). In order to determine host specificity, a sample of 49 adult weevils collected within pods from the three gorse species were identified by Miguel A. Alonso-Zarazaga (National Museum of Madrid, Spain), using morphological criteria based on Hoffmann's (1958) and Ehret's (1990) identification keys. We used the same criteria to identify all the other adult weevils collected in this study. Weevil larvae could not be identified, but ongoing molecular analyses of both adults and larvae have confirmed the presence of no more than two different species. Exapion ulicis is univoltine (Hoddle, 1991a). In its European native range, it has been recorded on U. europaeus and U. minor (Portevin, 1935; Hoffmann, 1958, Ehret, 1990). According to Hoffman (1958), it lays eggs in the pods of these two species. Most of the data about its life history in Europe comes from the observations of Davies (1928) on U. europaeus in Great Britain. Exapion ulicis mates and lays eggs in spring. Females dig a hole

47 Chapitre IV in young green pods with their rostrum and lay 6-8 eggs per pod. Weevil development lasts about two months. Adults emerge from the pod at dehiscence. Free adults feed on the vegetative parts and flowers of Ulex species, and hibernate on gorse branches. Much less is known about E. lemovicinum . It has been observed on U. europaeus and U. minor in western France (Portevin, 1935; Hoffmann, 1958; Ehret, 1990) and northern Spain (Miguel A. Alonso-Zarazaga, pers. comm.). The only data about its life history in France come from Hoffmann (1958). This author reported that females lay one egg (rarely two) within U. europaeus pods in spring and have a life cycle similar to that of E. ulicis .

Other insect species emerging from gorse pods Parasitoid wasps of weevil larvae were observed in the pods of the three gorse species. In Great Britain, Davies (1928) identified all weevil parasites within U. europaeus pods as Pteromalus sequester (Walker, 1935) (Hymenoptera, Pteromalidae), which is described as a solitary ectoparasite of the mature larvae and pupae of E. ulicis (Parnell, 1964). We sent two specimens collected in U. minor and U. gallii pods to Jose L. Nieves-Aldrey (National Museum of Madrid, Spain) who also identified them as P. sequester . Gorse pods may also contain Lepidoptera larvae, mainly the gorse pod moth Cydia succedana (Denis and Schiffermüller, 1775; Andy Sheppard, pers. comm.).

Population monitoring

Gorse phenology To distinguish species differences from population differences, we compared species in populations where they were sympatric. Seven gorse populations were monitored (Figure 1). Three (CF, IB and PL) were coastal populations where U. europaeus and U. gallii were sympatric. The four others (PA, RT, SJ, LO) were inland populations where U. europaeus and U. minor were sympatric. All populations were observed once in autumn 2004, once in winter 2004, and every month from April to July 2005. At each visit, presence of flowers and pods was recorded. The degree of maturation of gorse pods was determined from their colour and roughness: young immature pods are green and soft, whereas ripe pods are rough and brown. The general pattern of gorse phenology was confirmed by a long-term monitoring at IB and LO, that were observed every month from 2000 to 2005. However, the LO population was destroyed in February 2005 and could thus not be monitored after this month.

48 Chapitre IV

Figure 1. Location of the seven Ulex populations studied in Brittany (France). Ulex europaeus is sympatric with U. gallii in the three coastal populations, Cap Fréhel (CF), Ile Besnard (IB) and Ploumanach (PL) (black dots). U. europaeus is sympatric with U. minor in the four inland populations, Lande d’Ouée (LO), Paimpont (PA), Saint-Just (SJ) and Rochefort en Terre (RT) (white dots).

Weevil life cycles At each field visit for studying gorse phenology, the presence of apionid weevils was also recorded and their activity was divided into four categories: walking, courtship, copulation and egg laying. The relative proportions of each weevil species on gorse branches was estimated from weevils collected in February and July 2005 and identified in the laboratory under a stereo microscope. The relative abundance of weevils on branches of the three gorse species were compared in July 2005 by counting the number of weevils falling on a white sheet after striking the plants three times with a stick.

Variables estimated at pod maturation

Adult weevils were obtained from ripe pods. The pod contents were therefore observed at the peak of ripe pod production of each gorse species, when ten plants per species were randomly chosen in each population. For U. europaeus , 50 ripe pods per plant were collected in July 2005. For U. gallii and U. minor all ripe pods produced per plant (minimum = 50,

49 Chapitre IV maximum = 113) were collected in April and May 2005. Collected pods were opened in the laboratory, where the number of seeds and insects per pod were counted, and adult weevils were identified. To estimate seed production from uninfested pods, for each plant the mean number of seeds per uninfested pod was calculated. Rotten or flat seeds were not taken into account.

Seed predation by weevils was studied by estimating three variables for each plant: (i) The proportion of infested pods, calculated by dividing the number of pods infested by weevils by the total number of pods opened. (ii) The mean number of weevils per infested pod. When the pods contained parasitoid wasps, the total number of weevils was calculated by adding the number of wasps to the number of live weevils, since each wasp emerged from a weevil larva. (iii) The mean number of seeds per infested pod. Rotten and flat seeds were not taken into account.

To estimate the proportion of infested weevils, we divided the number of parasitoid wasps by the total number of weevils (wasps + live weevils). To estimate seed predation by lepidopterans, we divided the number of pods infested by lepidopterans by the total number of pods opened.

Statistical analyses

Statistical analyses were performed with SAS software (SAS, 2005) and based on a GLM (General Linear Model) procedure. Exapion species (exap) and population (pop) were treated as crossed factors and Ulex species (ulex) was nested within the Exapion factor. A nested design was the most appropriate because Ulex species of each flowering type were infested by a distinct weevil species. As a result, the model was:

µ = exap + ulex(exap) + pop + ε

where µ represents the average of the tested variable and ε represents the residual. Ulex species effects were compared on the basis of their least squares estimates (lsmeans) by the PDIFF option of SAS (giving a table of p-values for the three possible pairwise comparisons).

50 Chapitre IV

Data were arcsine transformed for analyses of proportions (Sokal & Rohlf, 2000). The normal distribution of residuals was checked for each parameter. The CORR procedure of SAS estimated the significance of the correlation between mean proportion of infested pods and mean seed numbers per uninfested pod. All results are given with the standard error of the mean (SEM).

Results

Population monitoring

Weevil species within gorse pods Among the 5622 weevils counted within ripe U. europaeus pods, 4% were in a larval or pupal stage, 38% were replaced by parasitoid wasps, and 57% were adults. All adults belonged to the species Exapion ulicis. Among the 546 weevils counted within U. gallii ripe pods, 35% were under immature stage, 31% were replaced by parasitoid wasps, and 34% were adults. Among the 242 weevils counted within ripe U. minor pods, 36% were in a larval or pupal, 58% were replaced by parasitoid wasps, and 5% were adults. All adult weevils found in U. gallii and U. minor pods belonged to the species E. lemovicinum . Since the identification of adults showed a total correlation between gorse and weevil species, we considered that whatever their stage, weevils within U. europaeus pods belonged to E. ulicis and weevils within U. gallii or U. minor pods belonged to E. lemovicinum .

Weevil species on gorse branches Weevils were abundant on U. europaeus branches (between 10 and 50 weevils fell after three strikes on a plant). The abundance was much lower on U. gallii (between 1 and 5 weevils) and U. minor (between 0 and 3 weevils). Adult weevils collected on U. europaeus branches and identified in the laboratory nearly always belonged to E. ulicis (99%) and only 1% to E. lemovicinum . ( n = 372). The result was exactly the reverse on U. gallii branches (99% E. lemovicinum, 1% E. ulicis, n = 125). Finally, U. minor branches yielded 92% E. ulicis and 8% E. lemovicinum (n = 167).

51 Chapitre IV

Weevil observations The high density of weevils on U. europaeus allowed data on life history of E. ulicis to be deduced from direct observations of weevil behaviour in the field. Walking and feeding weevils were observed when the outside temperature was higher than 10°C. Below this temperature, many immobile weevils could be collected by striking the branches. The mating period was deduced from the observations of dozens of courtship behaviours and copulations. The egg laying period was deduced from observations of females boring a hole through the pod (a process taking several hours and therefore easy to observe). The emergence period was deduced from observations of adult weevils within gorse pods. Observations on U. gallii and U. minor were more difficult because the abundance of weevils on gorse branches was very low. Therefore, their life cycle could not be deduced from direct behavioural observations in the field. The reproductive period was deduced from gorse phenology, and from observations of weevils collected after striking the branches. The egg laying period was considered to begin with the onset of pod productions, and to end when no moving adults could be collected after striking the branches (in winter, a few immobile adults could be collected from U. gallii branches, but no adults were collected from U. minor branches after November). The development time and emergence periods were deduced from observations of pod contents.

Gorse phenology and weevil life cycles Figure 2 shows the flowering and fruiting period of Ulex europaeus , U. gallii and U. minor in relation to parasitism by Exapion spp. in Brittany. Ulex europaeus produced flowers in both autumn and spring, but E. ulicis only infested U. europaeus pods resulting from spring flowers. It had a short development time and adults that emerged in early summer did not show any courtship or copulation behaviour before overwintering. By contrast, U. gallii and U. minor only produced flowers in autumn, and their pods were infested by E. lemovicinum . This species had a longer development time; individuals also emerged in spring but did not need to overwinter to show reproductive behaviour.

52 Chapitre IV

Figure 2. Flowering and fruiting periods of Ulex europaeus , U. gallii and U. minor in relation to parasitism by Exapion spp. in Brittany (France). Most U. europaeus individuals flower only in spring but some individuals flower both in autumn/winter and in spring. Exapion ulicis lays eggs only in pods resulting from spring flowers and emergence occurs late spring/early summer. All U. gallii and U. minor individuals flower in autumn. Pods from these flowers are infested by E. lemovicinum and emergence occurs the following spring.

Variables estimated at pod maturation

The population effects were included in the statistical model and appeared to be significant for all the variables studied. However, this study aimed to compare within sympatric populations and hence population differences are not discussed further.

Gorse seed production from uninfested pods Figure 3 shows the mean numbers of seeds per uninfested pod for each gorse species and for both coastal and inland U. europaeus populations. The mean numbers of seeds per uninfested pod depended on the gorse species (Table 2): U. europaeus produced significantly more seeds per uninfested pod than U. gallii (comparison between least square means, P < 0.001), but the difference between U. europaeus and U. minor in the same habitat was not significant (comparison between least square means, P = 0.54). The population effect was significant (Table 2) and showed that coastal populations of U. europaeus produced significantly more seeds per uninfested pods than inland populations. The numbers of seeds

53 Chapitre IV per uninfested pod varied from 0 to 10 for U. europaeus ( n = 769 pods), from 0 to 7 for U. gallii ( n = 1915) and from 0 to 4 for U. minor ( n = 1440).

Table 2. ANOVA table for the effects of weevil species (exap), gorse species (ulex) and gorse population (pop) on the content of infested and uninfested pods. DF represents degrees of freedom, MS: mean squares. Results with P < 0.05 were considered as statistically significant.

variable source DF MS F P

Seeds per unifested pod ulex 2 7.10 10.83 < 0.001

pop 5 5.01 7.04 < 0.001

error 107

R2 = 0.35 P < 0.001

Rate of infested pods exap 1 6.40 219.37 < 0.001

ulex(exap) 1 1.69 57.81 < 0.001

pop 5 0.52 17.70 < 0.001

error 107

R2 = 0.74 P < 0.001

Weevils per infested pod exap 1 66.97 134.88 < 0.001

ulex(exap) 1 9.03 18.19 < 0.001

pop 5 12.09 24.35 < 0.001

error 54

R2 = 0.84 P < 0.001

Seeds per infested pod exap 1 26.47 97.46 < 0.001

ulex(exap) 1 2.21 8.15 0.005

pop 5 1.16 4.29 0.001

error 105

R2 = 0.60 P < 0.001

Parasitoids per weevil exap 1 0.37 3.40 0.068

ulex(exap) 1 1.68 15.33 < 0.001

pop 5 0.33 3.02 0.014

error 105

R2 = 0.25 P < 0.001

54 Chapitre IV

Figure 3. Numbers of seeds per uninfested pod for Ulex europaeus (UE), U. gallii (UG) and U. minor (UM) in Brittany (France). “Seaside”: mean + SEM for the three coastal populations (CF, IB and PL). “Inland”: mean + SEM for three inland populations (PA, SJ and RT).

Seed predation by weevils

(i) Proportion of infested pods The proportions of infested pods depended both on weevil and gorse species (Figure 4). The proportion of U. europaeus pods infested by E. ulicis was significantly higher than by E. lemovicinum on U gallii or U. minor , and E. lemovicinum infested a significantly higher proportion of pods in U. gallii than in U. minor (Table 2). The population effect was also significant (Table 2) and showed that proportions of infested pods of inland U. europaeus populations were significantly higher than for coastal populations (Figure 4, Table 1). Depending on the plant, the percentage of infested pods varied from 20 to 98% for U. europaeus ( n = 55 plants), from 0 to 66% for U. gallii ( n = 30) and from 0 to 36% for U. minor ( n = 30).

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Table 1. Mean parasitism rates by apionid weevils in six gorse populations in Brittany (France).

Location Population Gorse species Plants sampled Pods collected Mean parasitism

rate by weevils

(± SE)

seaside Cap Fréhel Ulex europaeus 10 498 0.31 ± 0.06

Ulex gallii 10 1035 0.12 ± 0.03

Ile Besnard Ulex europaeus 10 491 0.33 ± 0.06

Ulex gallii 10 806 0.04 ± 0.01

Ploumanach Ulex europaeus 10 496 0.39 ± 0.04

Ulex gallii 10 554 0.37 ± 0.06

inland Paimpont Ulex europaeus 9 439 0.78 ± 0.04

Ulex minor 10 664 0.06 ± 0.02

Rochefort en Ulex europaeus 8 399 0.55 ± 0.04

Terre Ulex minor 10 797 0.10 ± 0.03

Saint-Just Ulex europaeus 8 396 0.66 ± 0.03

Ulex minor 10 756 0.06 ± 0.01

Figure 4. Parasitism rates of Exapion ulicis and E. lemovicinum on Ulex europaeus (UE), U. gallii (UG) and U. minor (UM) in Brittany (France). “Seaside”: mean + SEM for the three coastal populations (CF, IB and PL). “Inland”: mean + SEM for three inland populations (PA, SJ and RT).

56 Chapitre IV

The numbers of seeds per U. europaeus uninfested pod were negatively correlated with the proportions of pods infested by E. ulicis ( n = 53, R = -0.35, P = 0.01) (Figure 5). By contrast, the numbers of seeds per U. gallii or U. minor uninfested pods were not significantly correlated with the proportions of pods infested by E. lemovicinum ( n = 60, R = 0.1396, P = 0.30) (Figure 5).

Figure 5. Correlation between mean parasitism rates on U. europaeus by Exapion ulicis (black diamonds) or on U. gallii and U. minor by E. lemovicinum (white diamonds) and mean numbers of seeds per uninfested pod. (means ± SEM for each population).

(ii) Mean numbers of weevils per infested pod The mean number of weevils per infested pod was significantly higher for E. ulicis in U. europaeus than for E. lemovicinum in U. gallii or U. minor , and E. lemovicinum infested a significantly higher proportion of pods in U. gallii than in U. minor (Table 2). The population effect was also significant (Table 2), but no clear tendency was detected. The number of E. ulicis found in U. europaeus infested pods was about 4 (it varied from 1 to 16), whereas a U. gallii or a U. minor pod infested by E. lemovicinum almost always contained a single weevil: 1224 of the 1249 infested pods opened contained only one weevil, 20 contained two weevils, and only five contained three weevils.

(iii) Mean numbers of seeds per infested pod The mean number of seeds per infested pod depended both on weevil and gorse species (Figure 6). Ulex gallii and U. minor pods infested by E. lemovicinum contained significantly more seeds than U. europaeus pods infested by E. ulicis and the number of viable seeds in infested pods was significantly higher in U. gallii than in U. minor (Table 2). The population

57 Chapitre IV effect of individuals was also significant (Table 2), but no clear tendency was detected. Depending on the plant, the number of seeds per infested pod varied from 0 to 5 in U. europaeus ( n = 1333 pods), from 0 to 4 in U. gallii ( n = 407), and from 0 to 3 in U. minor (n = 155).

Figure 6. Numbers of seeds and numbers of Exapion ulicis and E. lemovicinum weevils per infested Ulex europaeus (UE), U. gallii (UG) or U. minor (UM) pod in Brittany (France). “Seaside”: mean + SEM for the three coastal populations (CF, IB and PL). “Inland”: mean for three inland populations (PA, SJ and RT).

Weevil parasitoidism and seed predation by Lepidoptera Parasitoid wasps were observed in pods of the three gorse species where they parasitized an average of 40% of weevils, and this rate did not vary significantly between the two weevil species (Table 2). By contrast Lepidoptera larvae were only observed within U. europaeus pods, where they infested 25% of pods. Such infested pods always harboured a single Lepidotera larva but no weevils.

Discussion

Weevil specificity and gorse phenologies

In Brittany, gorse pods are infested by two weevil species, Exapion ulicis and E. lemovicinum, which exhibit strong host specificity. All adults emerging from U. europaeus belonged to E. ulicis whereas all adults emerging from U. gallii and U. minor belonged to E. lemovicinum . The two weevil species have very different life cycles: E. ulicis only lays eggs in spring whereas E. lemovicinum only lays eggs in autumn. Indeed, E. ulicis is unable to infest autumn pods of U. europaeus since female ovaries are immature at this period (Davies,

58 Chapitre IV

1928) and U. europaeus autumnal pods are never infested by any weevil in Brittany (Tarayre et al., 2007). In contrast, E. lemovicinum did not infest spring pods since its host species only produces pods in autumn. Spring and autumn flowering gorses occur sympatrically, therefore host specificity depends on gorse phenology, and not on geographical proximity. However, phenology alone does not explain the strict host specificity for oviposition we observed, as there is an overlap of green pod production by the three gorse species in autumn and early spring. Indeed, in autumn, E. lemovicinum did not infest the green U. europaeus pods that were present. Reciprocally, in early spring, E. ulicis did not infest the small number of the green U. gallii and U. minor pods that were still present. This could be due to physical factors such as toughness of pods (Lucas et al., 2000); but also to chemical factors, such as oviposition deterrents (Karban & Baldwin, 1997) or toxic repellents (Panda & Kush, 1995) especially as Ulex species are rich in flavonoids (Máximo et al., 2000). The presence of E. ulicis within U. minor pods and that of E. lemovicinum within U. europaeus pods were reported in Hoffmann’s fauna (1958). Although we investigated sympatric populations of both Ulex species, we cannot confirm these earlier observations. Nevertheless, our results must be taken with caution: seed predation was much lower in U. gallii and U. minor than in U. europaeus . In addition, a lower proportion of weevils reached the adult stage in these two gorse species. As a result, many fewer adult weevils were identified within U. gallii and U. minor pods compared to U. europaeus . In addition, since morphological keys can only be applied to adults, some uncertainty remained on the status of immature larva, and we cannot exclude the possibility that E. ulicis individuals were present among the immature stages that we could not identify.

Habitat specificity was not as restricted as oviposition specificity, and did not depend on host phenology. In the field, E. ulicis was observed on the gorse species it emerged from, U. europaeus, but was also frequently observed on U. minor, and more rarely on U. gallii . This observation may be related to the distribution of gorse plants in the populations studied. Populations with U. europaeus and U. minor consisted of mixed small patches of both gorse species, whereas populations with U. europaeus and U. gallii only occurred in separate areas for each species. By contrast, E. lemovicinum was only observed on gorse species it emerged from, which is probably due to its low abundance.

59 Chapitre IV

Pod choice

Exapion ulicis and E. lemovicinum exhibited different pod choice strategies. Pod choice by female insects contributes to maximizing offspring performance (preference/performance theory, Thompson, 1988), which depend s on food quality and quantity, as well as on the presence of congeners or predators. Comparison between infested and uninfested pods of U. europaeus suggests that the behaviour of egg laying by females is influenced by the content of pods. Indeed, infested pods produced more weevils than uninfested pods produced seeds. As each weevil generally develops from one seed, this result indicates that infested pods contained about twice as many seeds as uninfested pods. In addition, the higher the proportion of pods infested by E. ulicis , the lower the mean seed numbers per remaining uninfested pods. Therefore, the most likely explanation to these patterns is that E. ulicis females preferentially laid eggs in pods with the highest number of seeds. This tendency was not found in E. lemovicinum . Indeed, the numbers of seeds per uninfested pod corresponded roughly to the numbers of weevils and seeds per infested pod, and the proportions of pods infested by E. lemovicinum were not correlated with the mean seed numbers per uninfested pod in U. gallii and U. minor . The tendency of E. ulicis to choose pods with a higher number of seeds can be compared to the tendency of other seed predators to select the largest or the most concentrated resources as oviposition sites (e.g. bean weevil, Callosobruchus maculatus , Cope & Fox, 2003; Bruchidius villosus, Redmon et al., 2000). Therefore, pod choice differences between E. ulicis and E. lemovicinum could be explained by the numbers of eggs laid per pod. Indeed, E. ulicis females lay 6-8 eggs at a time (Davies, 1928; our observations), which means that their fitness could be strongly reduced if they chose a pod at random, because more than half of U. europaeus pods contain 4 seeds or less. By contrast, E. lemovicinum females lay only one egg per pod (Hoffmann, 1958; our observations) and each U. gallii or U. minor pod contains at least one seed, consequently, E. lemovicinum females would not benefit from spending time and energy selecting only the largest pods. Exapion ulicis females were also able to discriminate a previously infested pod, as previously shown by Hoddle (1991b). This study provides indirect arguments suggesting that E. lemovicinum females also prefer uninfested pods. Indeed, the rarity of pods yielding more than one weevil, even in relatively highly infested populations, suggests that very few pods were attacked more than once. Avoidance of superparasitism is common among parasitoids (Lenteren, 1981; Alphen & Visser, 1990) but has rarely been reported among seed predators

60 Chapitre IV

(e.g. the apple maggot, Rhagoletis pomonella , Roitberg & Prokopy, 1983; the seed beetle, Stator limitatus , Fox et al., 1996). Laying eggs in uninfested pods avoids larval competition for food and thus increases the survival probabilities of each larva (Messina and Tinney, 1991). Whatever the oviposition strategy adopted by apionid weevils, offspring survival was altered by hymenopteran predation, mainly by Pteromalus sequester . Hymenopterans infested the two weevil species indifferently and they killed near 40% of the larvae.

Impact of seed predators on gorses

Exapion ulicis had a greater impact on U. europaeus seed production than E. lemovicinum on U. gallii or U. minor . Indeed, E. ulicis infested 49% U. europaeus pods, whereas E. lemovicinum infested 18% and 7% U. gallii and U. minor pods respectively. Moreover, E. ulicis destroyed 97% of the seeds in infested U. europaeus pods, whereas E. lemovicinum destroyed respectively 42% and 51% of the seeds in infested U. gallii and U. minor pods. Furthermore, the inland populations of U. europaeus studied here were more infested by weevils and produced fewer seeds per uninfested pod than coastal populations. This may be explained by the fact that U. europaeus was at its limit of ecological range in populations where it was sympatric with U. minor . Exapion ulicis adults were more abundant on gorse branches than E. lemovicinum adults, and therefore caused more foliage damage. Finally, gorse pod moths Cydia succedana were observed only in U. europaeus pods, they infested approximately a quarter of pods in which they ate almost all the seeds. The great impact of E. ulicis on the reproduction success of U. europaeus supports its use as biological agent in Hawaii (Markin & Yoshioka, 1998), New Zealand (Hill et al., 2000) and Chile (Norambuena & Piper, 2000). However, in these regions the high proportions of pods resulting from autumn flowering reduce the beneficial impact of this weevil (Hill et al., 1991). The introduction of an autumn laying weevil should be interesting. However, E. lemovicinum has a low impact on gorse pod production and, at least in situations where there is a choice, does not infest the autumn pods of U. europaeus in Brittany. It cannot therefore be considered as a potential biological control agent.

61 Chapitre IV

Conclusion, perspectives

Gorse phenology plays a major role in the life cycle, host choice and performance of apionid weevils in Brittany. The close relationship between weevil and gorse species might have involved mutual adaptations between insects and plants. The high seed predation exercised by weevils has probably led to the flowering shift of some U. europaeus plants towards autumn to escape parasitism in time (Tarayre et al., 2007). Host specificity by weevils depends on gorse phenology since the gorse species are sympatric. Divergence between E. ulicis and E. lemovicinum could thus have occurred through allochronic speciation. Studying gorse-weevil interactions with more species at a phylogenetic level would certainly provide interesting data for the understanding of speciation processes within these groups.

Acknowledgements

We are grateful to L. Parize and C. Antoine for help in the field and at the laboratory, Y. Rantier for drawing Figure 1, J-S. Pierre for help with the statistics. We thank J-S. Pierre, D. Poinsot, J. van Baaren and P. Vernon for comments on our paper, and R.H. Britton for English improvement.

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64 Chapitre IV

IV. B : O BSERVATIONS COMPLEMENTAIRES

DUCOMPORTEMENT DES APIONS

La première partie de ce chapitre a permis de montrer que la phénologie des ajoncs joue un rôle important dans le cycle de vie des charançons, notamment dans le choix de la plante- hôte. Dans cette deuxième partie, je présente des observations complémentaires où les charançons ont été placés en situation de choix de plante-hôte. Ces expériences constituent un travail préliminaire qui a été réalisé au tout début de ma thèse.

1. Observations qualitatives

Avant de commencer ma thèse (octobre 2003), Anne Atlan et Michèle Tarayre travaillaient majoritairement sur l’association entre U. europaeus et E. ulicis , mais elles avaient également observé que les deux autres espèces d’ajonc étaient parasitées par des apions qui présentaient une grande ressemblance morphologique avec E. ulicis . Etant donné que je n’avais pas encore les critères d’identification précis des charançons au début de ma thèse (cf chapitre 2) et que les apions sont très difficiles à observer in natura , du fait qu’ils se confondent avec les bourgeons des ajoncs, j’ai commencé par les observer dans des boites de pétri en laboratoire. Les apions choisis à la récolte correspondaient à ceux qui ressemblaient à l’espèce E. ulicis , car il existe d’autres espèces de charançons sur les ajoncs, mais qui ne s’attaquent pas à leurs graines. Mes principales observations effectuées en octobre 2003 sont reportées dans l’annexe 5. Ces observations suggèrent que quelle que soit la plante d’où ils proviennent, les apions sont capables de se nourrir des trois espèces d’ajonc breton, et semblent avoir des préférences selon la plante sur laquelle ils ont été récoltés. Par ailleurs, j’ai observé que les apions récoltés sur U. europaeus en automne tentaient de s’accoupler, bien que nous n’ayons jamais observé sur le terrain de gousses d’automne d’ U. europaeus parasitées. Par contre, les apions récoltés sur U. gallii sont capables de se reproduire en octobre, ce qui est cohérent avec le fait que les gousses de cette espèce soient présentes à cette période. Suite à ces premières observations préliminaires, qui m’ont permis de mieux connaître les espèces étudiées, j’ai réalisé des expériences de choix d’habitat préliminaires avec l’aide de Paul Page, étudiant en Master 2, à l’Université de Lausanne (Suisse).

65 Chapitre IV

2. Observations quantitatives

2.1 Matériel et méthodes Echantillonnage : Des expériences de choix ont été réalisées sur des apions prélevés sur des branches d’ajonc en septembre 2004. Nous avons récolté des apions sur U. europaeus dans trois sites, un où il n’était pas sympatrique avec d’autres espèces d’ajonc (CB), et dans deux sites, où il était sympatrique avec U. gallii (CF, IB). Sur ces deux sites, nous avons également récoltés des apions sur U. gallii . Méthode : Les apions récoltés sont placés dans des boites en plastique cylindriques aérées ( Ø : 18mm, hauteur : 80mm), à température ambiante dans le laboratoire. La première journée, les apions sont mis à jeûner. La deuxième journée, ils sont nourris avec des pelotes de pollen ("Regain") broyées et humidifiées. La troisième journée, ils sont soumis au test de choix. Les apions sont placés dans une boite en plastique rectangulaire (28 cm * 29 cm), où a été placé à chaque coin un rameaux d’ajonc d’une des trois espèces bretonnes ou un rameau de genêt à balais (Genistae, Cytisus scoparius ), à température ambiante, sous une lumière uniformément répartie. Les rameaux d’ajonc U. europaeus et de genêt ont été prélevés sur des plantes du campus de l’Université de Rennes 1, alors que les rameaux U. gallii et U. minor ont été prélevés sur des plantes jeunes cultivées en serre. Les rameaux ont été coupés juste avant le test et mesurés pour avoir la même longueur (10 cm). Les apions sont ensuite placés au centre de la boite où est placée l’eau. Leur emplacement est noté 24 heures plus tard. Analyses statistiques : Les analyses statistiques ont été réalisées manuellement avec un test de χ2, en ne prenant en compte que les individus qui ont effectué un choix de plante.

2.2 Résultats L’ensemble des résultats présentés dans la figure 12 montre que les apions ont une préférence pour les ajoncs par rapport au genêt. De plus, les apions récoltés sur U. europaeus, non sympatrique avec une autre espèce d’ajonc, ont une préférence significative pour U. europaeus pour un des deux échantillons testés (CB1, n = 22, χ2 = 18,3, 3ddl, P < 0,001) et proche de la significativité pour l’autre échantillon (CB2).

66 Apions récoltés sur U. europaeus U. europaeus Apions récoltés sur Chapitre IV non sympatrique sympatrique avec U. gallii 70 70

60 60 CB1 (n = 23) IB (n = 35) 50 CB2 (n = 36) 50 CF (n = 44) 40 40

30 30

20 fréquence relativefréquence (%) 20 fréquence relative (%)

10 10

0 0 UE UG UM genêt non choix UE UG UM genêt non choix

Apions récoltés sur U. gallii 70 sympatrique avec U. europaeus

60 IB (n = 19) 50 CF (n = 26) 40

30

20

fréquence(%) relative 10

0 UE UG UM genêt non choix

Figure 12. Répartition des charançons sur les rameaux d’ U. europeaus (UE), d’ U. gallii (UG),d’ U. minor (UM) et de genêt, selon la plante et la population où ils ont été récoltés.

67 Chapitre IV

Cette préférence pour U. europaeus subsiste pour les apions qui ont été récoltés sur U. europaeus sympatrique avec U. gallii , qui est significative au site IB (n = 27, χ2 = 19,7, 3ddl, P < 0,01), mais qui est beaucoup plus partagée au site CF, puisque les apions ont une préférence significative à la fois pour U. europaeus et U. gallii (n = 21, χ2 = 11,9, 3ddl, P < 0,01). Enfin, les apions récoltés sur U. gallii sympatrique avec U. europaeus , montrent une préférence pour U. gallii et semblent également apprécier U. europaeus (tests χ2 non réalisés, car les effectifs théoriques étaient inférieurs à 5).

2.3 Conclusion Ces premières observations suggèrent que (i) les apions sont spécifiques au genre Ulex , (ii) qu’ils présentent des différences dans leur choix de plante-hôte, probablement liées à leur plante-hôte d’origine et (iii) que la présence d’une autre espèce d’ajonc sympatrique à leur plante-hôte d’origine, peut élargir leur gamme d’hôte concernant le choix d’habitat.

3. Bilan

L’ensemble de ces résultats préliminaires suggèrent que les apions sont sélectifs et qu’il serait donc intéressant de poursuivre ces expériences de choix dans des conditions plus appropriées. A présent que nous pouvons identifier les charançons, il faudrait prendre des individus à l’émergence (qui n’auraient donc pas été influencés par une plante-hôte dont ils se sont nourris à l’âge adulte) et tester leur attraction vers les espèces d’ajonc avec un olfactomètre 15 . Par ailleurs, il serait également très intéressant de regarder les choix de ponte des femelles. Toutefois cette expérience est plus difficile à effectuer, car nous ne pouvons présenter aux femelles que des gousses prélevées sur le terrain, pour lesquelles il ne nous est pas possible de savoir si elles ont été parasitées préalablement.

15 Olfactomètre : Appareil qui permet d’analyser l’activité des insectes en envoyant différents courants d’air chargé de différentes substances odorantes.

68 Chapitre V

Chapitre V :

DIFFERENCIATION GENETIQUE DES APIONS

L’identification morphologique des apions adultes dans les gousses d’ajonc en Bretagne a permis d’identifier E. ulicis dans les gousses d’ U. europaeus et E. lemovicinum dans les gousses d’ U. gallii et d’ U. minor . Cependant, cette caractérisation ne permet pas de connaître le statut de ces deux taxons. Par ailleurs, les spécificités d’hôte décrites dans l'article précédent sont en inadéquation avec certaines observations des naturalistes (Portevin, 1935 ; Hoffmann, 1958, Ehret, 1990). Plusieurs questions se posent alors :

(i) Est-ce que E. ulicis et E. lemovicinum constituent bien deux espèces distinctes et non deux races d'hôte ? Est-il possible que E. lemovicinum soient constitué de deux espèces jumelles, l'une spécifique d’ U. g allii, l'autre spécifique d’ U. minor ?

(ii) La spécificité de E. ulicis et de E. lemovicinum est-elle totale? Quel est le degré de spécialisation de ces deux espèces sur leurs plantes-hôtes?

(iii) Quels sont les flux de gènes entre ces deux espèces ? Quel scénario évolutif peut on envisager pour expliquer la spéciation de E. ulicis et de E. lemovicinum ?

Ce chapitre présente dans une première partie la différenciation génétique des charançons parasitant les ajoncs en Bretagne, qui a été réalisée à partir de prélèvements de larves et d’adultes de charançon dans les gousses des trois espèces d’ajonc. Cette première partie est rédigée sous la forme d’un article. Dans une seconde partie, je présente une recherche de marqueurs polymorphes, qui n’a pu dans le cadre cette thèse aboutir, faute de temps, et qui a pour objectif d’étudier les flux de gènes des apions.

69 Chapitre V

V. A. D IFFERENCIATION GENETIQUE

ET SPECIALISATION ECOLOGIQUE DES APIONS

Article en preparation pour Ecography

Myriam BARAT *, Michèle TARAYRE and Anne ATLAN

Genetic differentiation and ecological specialization

of gorse ( Ulex sp) seed weevils ( Exapion sp)

UMR 6553 EcoBio, Université de Rennes 1,

Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex, France

*corresponding author.

Tel: 33 (0) 2 23 23 61 72, Fax: 33 (0) 2 23 23 50 47 e-mail: [email protected]

70 Chapitre V

Résumé

L’isolement reproductif de populations en sympatrie peut résulter d’une sélection divergente des populations dans différents environnements, et conduire à une spéciation écologique. En Bretagne, l’ajonc Ulex europaeus (Fabaceae, Genistae) se retrouve souvent en sympatrie avec une des deux autres espèces présentes : U. gallii and U. minor . Une étude récente basée sur l’identification morphologique des prédateurs de graines des ajoncs a montré que deux charançons (Curculionoidea, Apionidae) attaquent les gousses des ajoncs à différentes saisons et ne présentent pas les mêmes gammes d’hôte : Exapion ulicis s’attaque à U. europaeus au printemps alors qu’ E. lemovicinum s’attaque à U. gallii et U. minor en automne. L’identification morphologique des charançons est souvent difficile et certains caractères peuvent présenter des variations individuelles ou environmentales. Nous avons donc utilisé deux marqueurs moléculaires (COI et EF1-α) qui ont, dans un premier temps, mis en évidence une totale concordance entre l’identification morphologique et la caractérisation moléculaire des charançons. Ce résultat montre qu’ E. ulicis et E. lemovicinum constituent bien deux espèces distinctes et non des races d’hôte, et que les populations d’ E. lemovicinum présents sur U. gallii et U. minor ne semblent pas génétiquement différenciées. Dans un second temps, nous avons constaté qu’en fonction des années et des populations, E. ulicis est capable de parasiter U. gallii et U. minor au printemps, probablement selon la disponibilité des gousses au moment de la reproduction. Ce résultat suggère que E. ulicis est plus spécifique d’une phénologie de fructification que d’une espèce d’ajonc contrairement à E. lemovicinum qui ne s’attaque pas aux gousses d’automne d’ U. europaeus . La différenciation des populations d’ E. ulicis et d’ E. lemovicinum pourrait résulter de l’isolement temporel des périodes de reproduction des charançons suite à la spécialisation des insectes à la phénologie des plantes hôtes.

Summary

Reproductive isolation of sympatric populations may result from divergent selection of populations in different environments, and lead to ecological speciation. In Brittany (West France), the gorse Ulex europaeus (Fabaceae, Genistae) is often sympatric with one of the two other gorse species present: U. gallii and U. minor . A recent study based on morphological identification of seed predators of gorses has shown that two weevil species (Curculionoidea, Apionidae) infest gorse pods at different seasons and present different host ranges: Exapion ulicis infests U. europaeus in spring whereas E. lemovicinum infests U. gallii and U. minor in autumn. Morphological identification of weevils is often difficult and some characters may present individual or environmental variations. We thus used two molecular markers (COI et EF1-α) which have shown, in a first time, that morphological and molecular identifications were concordant. This result show that E. ulicis and E. lemovicinum are two true distinct species and not host races, and that populations of E. lemovicinum on U. gallii and U. minor are not genetically differentiated. In a second time, we observed that according to years and populations, E. ulicis was able to infest U. gallii and U. minor in spring, probably according to availability of pods present at its reproductive period. This result suggests that E. ulicis is more specific to an fructification phenology than to an Ulex species, contrarily to E. lemovicinum which does not infest autumnal U. europeaus pods. Differentiation of E. ulicis and E. lemovicinum may result from temporal isolation of reproductive periods of weevil populations which has followed specialization of insects to host phenology.

71 Chapitre V

Introduction The concept of ecological speciation (Schluter 2001) could help the understanding of population divergence in sympatry. It postulates that divergence and reproductive isolation evolve as a consequence of divergent selection in different environments. Phytophagous insects appear to be the best model for studying ecological speciation, since they have high fidelity to their host plant; which implies specific adaptations and specialization to this microhabitat. Indeed, in the last few years, numerous examples of host races have been demonstrated in phytophagous insects (e.g. Rhagoletis pomonella , Feder et al. 1988; agromyzid leaf miner, Scheffer and Wiegmann 2000 and the pea aphid, Via et al. 2000). Since host races are sympatric populations of parasites that use different hosts, are genetically differentiated and between which there is appreciable gene flow (Drès and Mallet 2002), their formation is often considered as a route to sympatric speciation (Feder et al. 1994; Berlocher and Feder 2002; Drès and Mallet 2002; Stireman et al. 2005). Among phytophagous insects, weevils (Coleoptera: Curculionoidea) are specially prone to the formation of host races as they generally exhibit very high host specificity. In addition, the use of rostrum (which carries the mouthparts) for excavation of the oviposition site by a subset of Curculionoidea coupled with the living tissues of angiosperms has probably contributed to their remarkable diversification (Anderson 1993). Indeed, they represent one of the richest groups, in terms of species number, with about 60,000 species (Thompson 1992; Kuschel 1995). The study of specialization and speciation in weevils is also interesting from an applied point of view, because weevils include numerous pest species, and also several biological agents used to control invasive plants (e.g. Trichapion lativentre against Sesbania punicea , Hoffmann and Moran 1991). However, most weevil species are poorly known because their identification is very difficult. In Brittany (Western France), two morphologically related weevils (Apionidae, Exapion spp.) infest the pods of the three gorse species (Fabaceae, Ulex spp.), and the specificity of weevils appears to depend on host flowering phenology rather than on host sympatry (Barat et al. in press). Indeed, Ulex europaeus, which flowers mainly in spring, is infested by Exapion ulicis whereas U. gallii and U. minor , which flower in autumn, are infested by E. lemovicinum . The two autumn-flowering species are often found in sympatry with U. europaeus , while they are never found in sympatry one with the other. It is therefore possible that E. ulicis and E. lemovicinum have diverged through allochronic sympatric speciation. However, previous observations in other European regions have suggested a less restrictive

72 Chapitre V specificity, since in the published identification keys, E. ulicis was reported to develop within U. minor pods and E. lemovicinum was reported to develop within U. europaeus pods (Hoffmann 1958). These divergences have to be clarified prior to further investigation of the speciation mechanism in the genus. They may result either from geographical differences in host specialization, or from incorrect species assignment through morphological identification keys. Indeed, morphological criteria used for weevil identification are often based on subtle descriptions of adult morphology and are very controversial. These morphological keys have been revised several times (Portevin 1935; Hoffmann 1958; Ehret 1990; Alonso-Zarazaga in prep. ), maybe because they are based on traits that may exhibit individual variability (e.g. the tibia color) or environmental plasticity (e.g. the length of the rostrum, Görür 2000). In order to make a clear assignment of species independently of possible morphological plasticity, we decided to use molecular markers. These tools have the advantage of being applicable to larval stages, and not only to adult morphology. Our goal was to answer the following questions: (i) Do E. ulicis and E. lemovicinum represent host races that still hybridize or are they true distinct species? (ii) Is there a genetic differentiation between E. lemovicinum individuals that reproduce on U. gallii and U. minor ? (iii) What is the level of weevil specificity? To answer to these questions we collected weevils at larval and adult stages within pods of the three gorse species from natural gorse populations of Brittany and characterized them molecularly. We used one mitochondrial and one nuclear marker, because comparison between the two can detect hybridization. The mitochondrial marker was the COI gene, which encodes for the first subunit of the cytochrome oxidase, and is one of the most frequently sequenced genes used in insect phylogeny (Caterino et al. 2000). As with any mitochondrial DNA material, it is assumed to be maternally inherited, single-copy and non- recombining (Lansman et al. 1983; Moritz et al. 1987). The nuclear marker was the EF1-α gene, which encodes for the alpha subunit of the first elongation factor, and has been a useful gene for studies of higher level phylogenetic relationships in insects, because of the conservative nature of the amino acid sequence (Hughes and Vogler 2004). The results will be discussed in the context of ecological speciation.

73 Chapitre V

Materials and Methods

Weevil species Exapion ulicis (named Apion ulicis by Forster 1771) and Exapion lemovicinum (Hoffmann 1929) are morphologically very similar, with a pear-shaped body 2-3 mm long. Females lay eggs in gorse pods and the larvae feed on seeds and develop until the adult stage within gorse pods. Adults and seeds have roughly the same size and each seed generally provides a single weevil. Weevils have to wait for pod dehiscence to be released; then they feed on vegetative parts and flowers of Ulex species (Portevin 1935; Hoffmann 1958; Ehret 1990). Exapion ulicis is reported to be univoltine (Hoddle 1991), but nothing is reported for E. lemovicinum . In Brittany, the life cycle of these two species was described in Barat et al. (in press). Females of E. ulicis lay eggs in early spring (April/May) within young green pods of U. europaeus . The mean percentage of infested pods is nearly 50%. Adults emerge in June/July, pass the winter in the adult form and reproduce next spring. Females of E. lemovicinum lay eggs in autumn (October/November) within young green pods of U. gallii or U. minor. The mean percentage of infested pods is 18% for U. gallii and 7% for U. minor . Adults emerge next spring (May/June). Individuals therefore pass the winter in the larval form within gorse pods (although some rare adults can also be encountered on gorse branches). Due to mismatching between pod ripening and weevil development time, several weevils are still in an immature stage at pod maturity, and die at pod dehiscence (25% in U. europaeus , 57% in U. gallii , 74% in U. minor ).

Sampling A first set of weevils was collected in spring 2002, 2003 and 2004 in Brittany (Western France) from ten locations containing one or two sympatric Ulex species (Fig. 1). For each location and each Ulex species, we opened ripe gorse pods, and collected one weevil per pod (either larva or adult) until we had a sample of ten weevils. These individuals were stored either in absolute ethanol at +4°C, or at –20°C, which made further morphological identification impossible. The 152 weevils of this first sampling were used for phylogenetic analysis: it includes 85 weevils from U. europaeus , 36 from U. gallii , and 31 from U. minor . After the establishment of the phylogeny we searched for diagnostic sites in the different clades obtained, and collected a second set of individuals to make comparisons of the proportion of each clade between years and populations. The 114 weevils in this second

74 Chapitre V sampling were collected in a similar way (one weevil per pod, either adults or larvae): it included 57 weevils from U. europaeus, 31 from U. gallii , and 26 from U. minor . We also sent specimens of each clade collected the same spring to a specialist in Curculionoidae systematics, Miguel A. Alonso-Zarazaga (National Museum of Madrid, Spain), for identification. In summer 2005, Miguel A. Alonso-Zarazaga provided us with morphological keys to identify the two weevil species. We then made a third sampling in autumn 2005 on gorse branches to assign molecular clades to morphological species. The 79 adult weevils of this last sampling included 31 weevils from U. europaeus , 19 from U. gallii and 29 from U. minor. They were identified both molecularly and morphologically, according to the morphological criteria of Miguel A. Alonso-Zarazaga (pers. comm.), which largely take into account the discriminative criteria of Hoffmann (1958) and Ehret (1990).

Figure 1. Location of Ulex populations sampled in Brittany (France). Three locations contained Ulex europaeus sympatric with U. gallii : Ile Besnard (IB), Cap Fréhel (CF) and Ploumanach (PL). Six locations presented U. europaeus sympatric with U. minor : Etang d’Ouée (EO), Lande d’Ouée (LO), Paimpont (PA), Rochefort en Terre (RT) and Saint-Just (SJ). Mont d’Arrée (MA) location mostly presented U. gallii gorse species. La Réauté (LR) and Pointe Meinga (PM) only had the U. europaeus gorse species.

75 Chapitre V

DNA extraction and sequencing Total DNA was extracted using the “salting out” method (Sunnucks et al. 1996). Gene amplification was done using the polymerase chain reaction (PCR), conducted in a Hybaid thermocycler with “pure TaqReady-To-Go PCR Beads” kits (Amersham Biosciences) in a final volume of 25 µL, with a concentration of 10 µM for primers. For the mitonchondrial gene cox1, we used the primers C1-J-2183 (5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’) and TL2-N-3014 (5’-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3’) (Simon et al. 1994) to amplify a fragment of 831 bp of the COI gene. The PCR conditions were as follows: denaturation at 94°C for 2 min, 35 cycles of 94°C for 20 s, 48°C for 20 s, 72°C for 30 s, and a last elongation at 72°C for 5 min. For the nuclear gene EF1-α we used the primers defined by Hughes and Vogler (2004) to amplify and sequence a region of the EF1-α gene. We then chose specific primers for apionid weevil with Oligo 4.0s software (www.oligo.net). We used these specific primers (5’-CTCTTCTGGCCTTCACTCTTG-3’) and EF1B (5’- GTCACCAGCTACATAACCACG-3’) to amplify a fragment of 724 bp of the EF1-α gene. The PCR conditions were as follows: denaturation at 94°C for 2 min, 35 cycles of 94°C for 1 min, 52°C for 1 min, 68°C for 2 min, and a last elongation at 68°C for 10 min. Purification and sequencing of COI and EF1-α fragments were performed by Macrogen Inc. (Seoul, Korea).

Phylogenetic analyses The sequences were compared with GenBank sequences on Blastn ( www.ncbi.nlm.nih.gov ) and multiple alignments were performed manually with SeqApp software (ftp.bio.indiana.edu ). The resulting matrix was imported onto McClade 3.08a software (Maddison and Maddison 1992) in order to optimise the data contained in indels according to Barriel's method (1994). Identical sequences within the same location and from the same gorse species were pooled prior to phylogenetic analysis. Phylogenetic analyses of mitochondrial and nuclear data were conducted using Rhinostomus barbirostris (Curculionoidea, Dryophthorinae) (GenBank accession AY131123 and AY131152, respectively) as outgroup. We analysed our data by maximum parsimony (MP, Farris 1970), maximum likelihood (ML, Felsenstein 1981) and neighbour joining (NJ, Saitou and Nei 1987) using PAUP 4.0b10 software (Swofford 2001). For the three methods, the default parameters of PAUP were used and only informative characters were retained. MP trees were conducted with heuristic searches based on the Catalán et al. (1997) strategy,

76 Chapitre V which uses 1000 random stepwise additions and the tree bisection-reconnection (TBR) algorithm. ML trees were constructed with heuristic searches using the TBR algorithm. The choice of model of sequence evolution was performed using Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998) and Modeltest WebServer ( http://darwin.uvigo.es ) with all options set to default. Modeltest returned the GTR+G+I model (GTR, Tavaré 1986) for COI data and the HKY+G model (HKY, Hasegawa et al. 1985) for EF1-α data as best-fit models for our data. NJ trees were constructed with Tamura and Nei (1993) distances. We estimated sequences divergence with DnaSP software (Rozas and Rozas 1999), which computes the average number of nucleotide substitutions per site between groups, D xy based on the Jukes and Cantor method (Nei 1987).

Results

Phylogenetic analyses After alignment of COI sequences, a matrix of 84 sequences of 586 bp was obtained. Sequences contained 72 variable sites and 58 phylogenetically informative sites. Mitochondrial data were composed by a total of 52 haplotypes (Genbank accession numbers in process). The maximum parsimony analysis resulted in 676 equally most-parsimonious trees of 120 steps (RI = 0.957), but the main nodes were supported by very high bootstrap values (see the strict consensus MP tree in Fig. 2). The other phylogenetic methods (ML and NJ) gave trees with the same topology, and the main nodes of the two optimal ML trees were supported by high bootstrap values (data not shown). After alignment of EF1-α sequences, a matrix of 39 sequences of 665 bp was obtained. Sequences contained 140 variable sites and 28 phylogenetically informative sites. Nuclear data were composed of a total of 19 haplotypes (Genbank accession numbers in process). The maximum parsimony resulted in one tree with step lengths of 58 (RI = 0.989), but the main nodes were supported by very high bootstrap values (see the strict consensus MP tree in Fig. 3). The other phylogenetic methods (ML and NJ) gave trees with the same topology, and the main nodes of the two optimal ML trees were supported by high bootstrap values (data not shown). Phylogenetic analyses from mitochondrial (COI) and nuclear (EF1-α) data both resulted in two distinct clades “A” and “B” (Fig. 2 and 3), and the same individuals were found in the same clade whatever the molecular material or the phylogenetic analysis. The clade “A”,

77 Chapitre V contained weevils collected within pods of all three gorse species; it was represented by 43 mitochondrial haplotypes (n = 107 sequences) and 10 nuclear haplotypes (n = 98 sequences). The clade “B” contained weevils collected within U. gallii and U. minor pods; it was represented by 9 mitochondrial haplotypes (n = 45 sequences) and 11 nuclear haplotypes (n = 40 sequences). Within-clade divergence did not exceed two percent either for mitochondrial or nuclear data, whereas mean molecular divergence between clade A and clade B was greater than six percent, whatever the DNA marker (Table 1). In the mitochondrial tree (but not in the nuclear tree), clade A was divided in two sub-groups A1 and A2, among which there was a clear geographical distribution: 85.5% of weevils collected at inland locations belonged to sub- group A1, whereas 87.5% of weevils collected at coastal locations belonged to sub-group A2 (Fig. 2).

Table 1: Sequence divergence between weevils found in Ulex pods in Brittany (France). Mitochondrial (mt) divergence was estimated from COI sequences and nuclear divergence was estimated from EF1-α sequences. The between clade comparison was made by pooling weevils from the three Ulex species and within clades comparisons were made between weevils from different Ulex species.

mt divergence (% ± nuclear divergence (% clade Comparison SD) ± SD) A and B Clade A vs clade B 7.9 ± 0.6 6.1 ± 0.4 A Subgroup A1 vs subgroup A2 2.0 ± 0.2 - U. europaeus vs U. gallii 1.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1 A U. europaeus vs U. minor 1.2 ± 0.2 0.2 ± 0.1 U. gallii vs U. minor 1.3 ± 0.3 0.2 ± 0.1 B U. gallii vs U. minor 0.2 ± 0.1 0.3 ± 0.1

78 Chapitre V

Figure 2. Maximum parsimony strict consensus tree of COI sequences of weevils collected within Ulex pods in Brittany (France). The number of changes is given above the branches and in parentheses, the bootstrap values. The populations sampled is given under the name of the Ulex species with the number of weevils in parentheses. Coastal populations are in bold.

79 Chapitre V

Figure 3. Maximum parsimony strict consensus tree of EF1-α sequences of weevils collected within Ulex pods in Brittany (France). The number of changes is given above the branches and in parentheses, the bootstrap values. The populations sampled is given under the name of the Ulex species with the number of weevils in parentheses. Coastal populations are in bold.

80 Chapitre V

Correspondence between molecular clades and morphological species In order to rapidly differentiate these two species from mitochondrial sequences, we searched for discriminating nucleotide sites. We retained seven sites that were monomorphic within species but different between species. Among the 79 individuals that were analysed using both mitochondrial diagnostic sites and morphological tools, all weevils that have been identified as E. ulicis species by morphological criteria (n = 53) belonged to clade A and all weevils that have been identified as E. lemovicinum species by morphological criteria (n = 26) belonged to clade B. Therefore, clade A corresponded to E. ulicis and clade B corresponded to E. lemovicinum (Table 2). These diagnostic sites were thus used to identify weevil species collected in gorse pods of U. minor and U. galli in spring 2005 (Table 3). In 2005, the proportion of each weevil species was significantly different between populations of both U. gallii ( χ² test: χ² = 21.8, n = 50, P < 0.001) and U. minor (Fisher’s exact test: n = 26, P<0.03,). The proportion of each weevil species in 2005 was compared to the proportion found in 2002 and 2004. The year effect was significant for the RT sampling site (n = 15 P<0.05), nearly significant for CF (n=29, P<0.06), and not significantly for the other populations.

Table 2: Mitochondrial diagnostic sites from COI gene used to differentiate E. ulicis and E. lemovicinum species.

Position 99 138 186 243 250 261 352 E. ulicis (genbank accession N° in process) T A T A T C C E. lemovicinum (genbank accession N° in process) C T C T A T T

Table 3: Proportion of weevil species found in pods of U. gallii, U. minor and U. europaeus in natural populations of Brittany. Identifications were based on mitochondrial phylogeny in 2002-2004, and on mitochondrial diagnostic sites in 2005.

U. gallii U. minor U. europaeus CF MA PL PA RT SJ all locations year weevil sp. E. ulicis 12 0 1 5 1 1 57 2005 E. lemovicinum 7 12 18 4 6 9 0

2004* E. ulicis 10 0 0 0 8 4 65 E. lemovicinum 0 10 8 7 0 4 0 * except CF and PA, that were collected in 2002.

81 Chapitre V

Discussion

Identification of weevils infesting gorse pods in Brittany (France) Mitochondrial and nuclear data show that weevils collected within pods of the three gorse species present in Brittany belonged to two distinct species. Indeed, weevils are distributed into two clades that diverge by more than five percent, a value generally associated with species differences (e.g. Erney et al. 1996). Furthermore, the correspondence between molecular clades and morphological identifications was total; showing that one clade corresponds to Exapion ulicis and the other to E. lemovicinum . The distribution of weevil clades seems to mostly rely on host choice by weevils. Indeed, E. lemovicinum only infested pods of the autumn flowering species Ulex gallii and U. minor , whereas E. ulicis was found in all three gorse species, but mainly infested the spring flowering species U. europaeus . However, no hybrid between E. ulicis and E. lemovicinum was detected, which confirms that the two clades correspond to true species. We did not find any evidence of host races. For both weevil species, nuclear diversity was not structured in differentiated subgroups, and the two mitochondrial subgroups observed within E. ulicis did not correspond to host species but to habitats (coastal or inland). Exapion ulicis appeared to have a wider host range than E. lemovicinum. In contrast to our previous observations which showed that E. ulicis only infested U. europaeus pods (Barat et al. in press), this weevil species appeared here to be able to infest the two other gorse species, but to a low degree. Part of this discrepancy may come from the fact that previous identifications were based on morphological criteria and did not include immature stages, which are the majority in U. gallii and U. minor pods. However, about one third of E. ulicis weevils found within U. gallii or U. minor pods did reach adulthood. The sampling effect may therefore explain the discrepancy, since the proportion of E. ulicis adults found in U. gallii and U. minor is very low, but the comparison between years suggests another explanation. Indeed, the relative proportion of E. ulicis and E. lemovicinum within U. gallii and U. minor varies between years and populations, and it is likely that the probability of detecting E. ulicis adults within these two species also depends on the year and populations studied. This may also explain the discrepancy observed in previous published work performed in other regions of Europe (Hoffman 1958).

82 Chapitre V

Weevil host choice and gorse phenology Weevil preference is clearly linked to host phenology: E. ulicis mainly infested the spring flowering species, while E. lemovicinum only infested the autumn flowering species. This is in agreement with behavioural observations that have shown that E. ulicis only lays eggs in spring, and E. lemovicinum only lays eggs in autumn (Barat et al. in press). The ability of E. ulicis to infest some pods of the two autumn flowering species may be explained by the length of gorse fruiting phenology. Indeed, when females E. ulicis are able to lay eggs, i.e. in early spring, most of the pods available belong to U. europaeus. However, some of the last pods produced by U. gallii or U. minor may still be immature enough to allow oviposition. As U. gallii produces pods later than U. minor , this hypothesis also explains why the proportion of E. ulicis weevils was higher within U. gallii pods than within U. minor pods. The ability of E. ulicis to oviposit on gorse species other than U. europaeus therefore relies on the availability of immature pods from autumnal gorse species, which in turn depends on environmental conditions that vary with locations and years. When E. ulicis was chosen for biological control, it was considered as being specific to U. europaeus by Davies (1928). Our study shows that the specificity of a seed predator may vary between years and locations, and emphasizes the need for studies at a large geographic scale and under varied environmental conditions to ensure the strict specificity of a biological agent. The host range of E. lemovicinum cannot be explained only by gorse phenology. Indeed, females of this species never laid eggs in U. europaeus , although immature pods of this gorse species are present in autumn every year in all study populations (Tarayre et al. in press), including during the egg-laying period of E. lemovicinum (September to November) Therefore, for this weevil species, host choice did not only depend on host phenology, but suggests that other physical and chemical factors are determinant: U. europaeus pods are bigger than those of autumnal species (Cubas 1999), and may also be too hard for E. lemovicinum females to pierce . Ulex europaeus may be repulsive, or simply not attractive for these females, or it is possible that E. lemovicinum is not able to detoxify the alkaloids contained in U. europaeus seeds (Máximo et al. 2000). However its specificity is not total, since it is able to infest U. gallii and U. minor to similar degrees . Further chemical and behavioural studies are therefore needed to understand the host choice of E. lemovicinum.

Scenario for the evolution of the gorse-weevil association The specificity of the weevil species may also be explained by the relatedness of their host plants. Indeed, plant relatedness often plays an important role in host selection (Odegaard

83 Chapitre V et al. 2005). Indeed, phytophagous insects tend to feed on more or less closely related host plants rather than on a random selection of plants (Strong et al. 1984). According to Aïnouche et al. (2003), the spring flowering species U. europaeus , and the autumn flowering species U. gallii and U. minor belong to two different genetic lines. In addition, U. gallii species is a hexaploid species, which probably results from the auto-polyploidization of the diploid species U. minor . Consequently, U. gallii and U. minor share similar genes and similar chemistry, which may explain why they share the same flowering periods and have the same attractiveness for E. lemovicinum . The ancestral flowering period of Genistea was very likely the spring, which is the main flowering period of these species (Cubas 1999). We can thus hypothesise that the ancestral laying period of the apionid weevils infesting gorse pods was also the spring. Since E. ulicis still lay eggs in spring and is able to infest U. gallii and U. minor pods when available at that period, it is thus possible that the ancestor of the species E. ulicis and E. lemovicinum was primarily infesting spring pods of U. europaeus . The ancestors of E. lemovicinum may have further specialized on the autumnal gorse species, and evolved a novel life history cycle that led them to lay eggs in autumn, to exploit this new resource at its peak. Indeed, according to Butlin (1990), genetic differences in host phenology might be all that is required initially to separate two genetically distinct forms. This specialization could in turn have led to reproductive isolation from the weevils reproducing in spring, the evolution of specialized traits (which may have included behavioural and physiological adaptations to the new life cycle), and the loss of the ability to infest U. europaeus pods. If such evolution occurred, it is likely that it happened in sympatry, since populations of the autumnal flowering species are almost always sympatric with populations of the spring flowering species. Such sympatric speciation resulting from different host phenology has already been suspected in the pine beetle (Langor 1989) and in Rhagoletis pomonella (Smith 1988). Speciation within the Exapion genera may thus be another good example of allochronic speciation. A dozen other gorse species with variable flowering seasons have been described (Cubas 1999), and most of them are infested by apionid weevils (pers. obs.), whose taxonomic status is unknown. Biological and phylogenetic studies including more Ulex and Exapion species will be needed to test the likelihood of allochronic sympatric speciation among the Exapion genera.

84 Chapitre V

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87 Chapitre V

V. B RECHERCHE DE MARQUEURS MOLECULAIRES POLYMORPHES

CHEZ LES APIONS

Les analyses génétiques précédentes ont permis de confirmer que les charançons parasitant les ajoncs en Bretagne appartenaient bien à deux espèces distinctes. Cependant, il est surprenant de retrouver la même espèce, E. lemovicinum, sur des plantes-hôtes qui ne sont jamais en sympatrie, alors que l'on trouve deux espèces différentes, E. ulicis et E. lemovicinum sur des plantes-hôtes qui se retrouvent fréquemment en sympatrie. Il serait donc intéressant d’identifier des marqueurs polymorphes des charançons pour étudier les flux de gènes intra-spécifique, et comprendre les mécanismes qui ont conduit aux événements de spéciation. Cette recherche de marqueurs moléculaires est actuellement au stade préliminaire (faute de temps) et demanderait à être poursuivie.

1. Marqueurs microsatellites

Les séquences microsatellites sont de petites séquences nucléotidiques courtes et répétées, qui constituent souvent des marqueurs codominants hautement polymorphes. Ces séquences pourraient donc représenter de bons marqueurs pour étudier la variation génétique intra-spécifique des charançons. La recherche de loci microsatellites polymorphes chez E. ulicis et E. lemovicinum a été réalisée en grande partie avec Curmi Llanque, étudiant en DEA Eco-Ethologie Evolutive en 2003/2004.

1.1 Matériel et Méthodes

Recherches de séquences microsatellites et construction d’amorces

L’extraction d’ADN total de quatre charançons récoltés dans des gousses d’ajonc aux environs de Rennes a été effectuée par Aude Vialatte (Bio3P, INRA Le Rheu) en 2003, avec la méthode de Sunnucks et al. (1996). Ces ADNs ont été transmis par Tatiana Giraud au génoscope d’Evry qui a réalisé une banque d’ADN enrichie en microsatellites selon une méthode adaptée par le laboratoire CIRAD-Biotrop. Dans la banque d’ADN, nous avons trouvé peu de séquences microsatellites, et très peu de séquences présentant un grand nombre

88 Chapitre V de répétitions (ainsi, nous n’avons détecté que quatre microsatellites avec un motif de deux nucléotides, présentant plus de 15 répétitions), ce qui peut parfois arriver chez les arthropodes (Fagerberg et al., 2001). Nous avons ensuite sélectionné six séquences microsatellites ayant au moins huit répétitions et défini des couples d'amorces pour chaque locus microsatellite à partir du logiciel Oligo 4.0s (www.oligo.net) (Tableau 1), qui ont été marqués avec un flurochrome (Fam ou Hex) afin que les locus amplifiés puissent être visualisés au séquenceur.

Amplification et séquençage des microsatellites

Echantillonnage La majorité des apions utilisés dans cette étude proviennent de l’échantillonnage effectué pour la première partie de ce chapitre sur les trois espèces d'ajonc dans un rayon de 150 km autour de Rennes. Ainsi, une partie de l’échantillonnage provient des récoltes dans les gousses d’ U. europaeus et d’ U. gallii de trois populations de la côte nord de Bretagne. Une autre partie provient des récoltes dans les gousses d’ U. europaeus et d’ U. minor de quatre populations dans le centre de la Bretagne. Enfin, d’autres proviennent de récoltes dans les gousses d’ U. europaeus de populations non sympatriques avec d’autres espèces d’ajonc. L’ensemble des charançons de cette étude a été récolté entre 2002 et 2005, avant que nous ayons la clé d’identification morphologique de Miguel A. Alonso-Zarazaga, mais nous savions que les gousses d’ U. europaeus étaient uniquement parasitées par le taxon E. ulicis et que celles de U. gallii et de U. minor étaient majoritairement parasitées par un taxon, qui s’est révélé être E. lemovicinum .

Extraction d’ADN, amplification et séquençage des microsatellites L'ADN des individus a été extrait par la méthode de Sunnucks et al. (1996). Les séquences microsatellites des individus analysés ont été amplifiées par PCR à l’aide d’un thermocycleur (Techne ou Hybaid). Les réactions de PCR ont été réalisées à l’aide de kits "puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads" (Amersham Biosciences) dans lesquels il a été rajouté 1µl d’ADN (extraction diluée au 1/10) et 0.5 µl de chaque amorce « sens » et « anti-sens » (10 pM). Le programme était constitué d’une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 35 cycles d'amplification comprenant chacun 20 secondes de dénaturation à 94°C, 20 secondes à la température d'hybridation des amorces (Tableau 1), et 30 secondes d'élongation à 72°C. Il s’est achevé par une élongation de 2 minutes à 72°C des brins néoformés. La séparation des fragments a été effectuée par migration électrophorétique sur

89 Chapitre V gel d'agarose à 2% sous 100V. La révélation des fragments a été réalisée par exposition aux UV du gel coloré au Bromure d’Ethidium. Les séquences amplifiées ont ensuite été analysées sur le séquenceur ABI PRISM 310 de Genopole Ouest. Ce séquenceur réalise des migrations électrophorétiques des échantillons permettant de déterminer la taille des allèles obtenus.

1.2 Résultats Parmi les 6 microsatellites analysés, trois se sont révélés monomorphes, y compris entre espèces de charançon, puisque le même génotype a été obtenu quelle que soit l’espèce d’ajonc sur laquelle ils ont été prélevés (21a , 21b et 23a), et trois se sont révélés faiblement polymorphes (21d, 21c, et 24a) (Tableau 2). Ces trois derniers locus présentaient en effet des génotypes différents pour des apions collectés sur une même espèce d’ajonc, mais les mêmes génotypes pour des individus prélevés sur différentes espèces d’ajonc, suggérant un polymorphisme commun aux deux espèces d’apion. Toutefois, pour chacun de ces trois marqueurs, seulement deux génotypes différents ont été obtenus (avec une bande commune aux deux génotypes, et une seule variable) dont un des deux qui est parfois très faiblement représenté (cas du locus 21d), ce qui semble trop faible pour pouvoir réaliser une analyse de la structure génétique intra-spécifique.

Tableau 2. Caractérisation de séquences microsatellites chez E. ulicis et E. lemovicinum . F correspond à l’amorce "sens" et R à l’amorce "antisens". Les locus polymorphes sont mis en évidence par des caractères gras. Les tailles des bandes trouvées pour chaque génotype sont données en paires de bases. N e, N g, N m représentent respectivement l'effectif de chaque génotype d’apion récolté dans U. europaeus , U. gallii ou U. minor .

Locus Séquence des amorces (5’-3’) Th Motif répété Génotypes Ne Ng Nm (°C) taille des bandes 21a F : GCACTTCGCCTCCTTTGACCG 63 (CA) 9 54, 78 52 16 8 R : TGATGATCGACGCGAGCTTGC

21b F : GATTCTCTTGCTTACGCGTGG 58 (GA) 10 G(GA) 7 54, 79 13 11 15 R : ATTACAAACACTCCCCCTCCC

23a F : TGATGATCGACGCGAGCTTGC 63 (GT) 8 63, 123 58 10 12 R : GTTGCCTTCGCACTTCGCCTC

21c F : TCGAGAGCGTATTCTTCTTGCACC 58 (GA) 16 68 5 2 - R : GATTCTCTTGCTTACGCGTGG 68, 72 9 9 15

21d F : GGCCCGTATAAACGATATGCC 58 (GT) 6(GAGT) 4 58, 126 41 15 9 R : ACATAGACACACGCGCGTAGG 63, 126 3 - 1

24a F : TTACTATGATTCTGCGGGCT 56 (CT) 15 59,122 4 - 4 R : CTACCAAGACATACACGTGCG 62, 122 5 - 6

90 Chapitre V

1.3 Discussion Les séquences microsatellites sont peu nombreuses chez ces charançons et semblent évoluer lentement, car elles peuvent être identiques chez deux espèces d’apion différentes. Par conséquent, ils ne semblent pas être de bons marqueurs pour étudier les flux de gènes. Nous avons donc décidé de chercher d’autres marqueurs.

2. Marqueurs RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

La technique RAPD est une technique PCR d'amplification de l'ADN. L'utilisation de plusieurs amorces permet de détecter un polymorphisme intraspécifique (Williams et al., 1990). J’avais commencé à analyser quelques profils d’ADN génomique de charançon obtenus avec des séquences RAPD de Kim & Sappington (2004), qui suggéraient des différences interspécifiques, mais non intra-spécifiques. Cependant, étant donné que cette technique est de plus en plus remise en cause, notamment du fait de problèmes de reproductibilité inter et intra-laboratoire (Penner et al., 1993 ; Pérez et al., 1998 ; Rajput et al., 2006), j'ai choisi de ne pas poursuivre mes recherches avec cette méthode.

3. Marqueurs ITS (Internal Transcribed Spacer region)

Les marqueurs ITS sont des régions nucléaires localisées sur le gène ribosomal 5.8S (White et al., 1990). Ces séquences évoluent rapidement, et peuvent donc être utilisées pour mettre en évidence les relations entre des taxons proches, et au niveau intra- et inter- spécifique. Ces séquences se sont révélées très utiles pour de nombreux groupes d’insectes (e.g. Kruger et al., 2000 ; Gallego & Galián, 2001 ; Peng et al, 2003) et pourraient peut-être apporter des solutions pour nos analyses génétiques. De plus, étant donné que Abdelkader Aïnouche travaille actuellement sur la phylogénie des ajoncs en se basant notamment sur des séquences ITS, il serait d’autant plus intéressant d’étudier ce marqueur. En effet, son utilisation permettrait (i) de réaliser des analyses génétiques intra-spécifiques pour comprendre les flux de gènes entre les populations de charançon et (ii) à une plus grande échelle, de confronter la phylogénie des charançons avec celle des ajoncs, ces deux études ayant pour objectif de comprendre les mécanismes de spéciation chez les charançons. Pour l’instant, cette étude n’est qu’au stade de mise au point de la technique à partir du marqueur ITS 1 décrit par White et al. (1990).

91 Chapitre VI

Chapitre VI : LA RESISTANCE AU FROID CHEZ LES APIONS ET CHEZ LES AJONCS

La dépendance des cycles de vie d’ Exapion ulicis et d’ E. lemovicinum à la phénologie de fructification de leurs plantes-hôtes, les a probablement amené à développer des adaptations spécifiques au microhabitat constitué par la plante-hôte qu’ils colonisent. Une particularité importante, est que E. ulicis passe l’hiver sous forme d’adulte et se reproduit au printemps qui suit, alors que E. lemovicinum semble passer majoritairement l’hiver sous forme de stade immature à l’intérieur des gousses d’ U. gallii ou d’ U. minor . Dans ce contexte, nous nous sommes posés plusieurs questions :

(i) Est-ce que ces deux espèces diffèrent dans la réponse au stress causé par le froid au cours de l’année ? Si oui, comment l’expliquer ? (ii) Le fait que E. lemovicinum ne ponde pas dans les gousses d’automne de E. ulicis pourrait-il être lié à la différence de résistance au froid des gousses des trois espèces d’ajonc ?

Quelques notions concernant la résistance au froid des organismes ectothermes 16 seront développées dans une première partie, avant de présenter l’étude de la résistance au froid d’ E. ulicis et d’ E. lemovicinum et de leurs plantes-hôtes dans une seconde partie.

16 Ectotherme : se dit des organismes dont la température corporelle est dépendante de la température de leur environnement.

92 Chapitre VI

VI. A. Q UELQUES NOTIONS SUR LA RESISTANCE AU FROID

La résistance au froid se réfère à la capacité d'un organisme à survivre à l'exposition à de basses températures, généralement inférieures à 0°C (Zachariassen 1985, Lee & Delinger, 1991).

1. L’étude de la résistance au froid

L'étude de la résistance au froid se base sur deux niveaux : la résistance aux basses températures et la résistance à la congélation.

1.1 La résistance aux basses températures La résistance aux basses températures concerne tous les processus comportementaux, physiologiques et biochimiques qui permettront à l'organisme de survivre à des températures inférieures à celles de son optimum métabolique, mais supérieures à sa température de surfusion. Parmi ces processus, les organismes peuvent migrer vers des sites où les conditions sont plus favorables, ou bien entrer en diapause.

1.2 La résistance à la congélation La résistance à la congélation proprement dite s'intéresse aux mécanismes développés par l'organisme placé dans des conditions où la température environnementale devient inférieure à sa température de surfusion. Les organismes peuvent mettre en place deux grands types de stratégies de résistance à la congélation. (i) Ils tolèrent la congélation : ils peuvent donc survivre à la formation de glace dans leurs tissus (ceci grâce à la présence de cryprotecteurs dans leur corps). (ii) Ils ne tolèrent pas la congélation : ils vont alors mettre en place différentes stratégies pour éviter la congélation.

Nous allons nous intéresser plus particulièrement à la résistance à la congélation chez les apions. Dans ce cas, l’absence d’eau sous forme liquide à des températures inférieures à 0°C devient alors vital.

93 Chapitre VI

2. Quelques définitions "autour de l'eau"…

L'eau pure a un point de congélation à l'équilibre qui est de 0°C, et les solutés présents dans les fluides corporels des organismes vivants diminuent la température de congélation à l'équilibre d'au plus quelques degrés. Quand un organisme est refroidi à une température en dessous du point d'équilibre de congélation des fluides de ses tissus, de la glace peut se former dans ses tissus, un événement qui est toujours létal au niveau intra-cellulaire (Zachariassen & Kristiansen 2000). Le point de fusion MP ("Melting Point") d'une solution correspond à la température à laquelle les derniers cristaux de glace disparaissent quand une solution congelée est lentement chauffée, en absence d'antigels. Le phénomène par lequel une solution aqueuse reste à l'état liquide quand elle est chauffée en dessous du MP est connu sous le terme de surfusion . La température à laquelle les fluides se congèlent spontanément est la température de surfusion (SCP :"Supercooling Point") ou température de cristallisation . La congélation spontanée s'accompagne de la libération de la chaleur latente de cristallisation (Fig. 13) La capacité de surfusion est la différence entre le point de fusion des fluides corporels et le SCP.

Figure 13. Effet du refroidissement d'un insecte à de faibles températures. La température du corps de l'insecte (ligne épaisse) en relation avec le point de congélation ("melting point") de l'hémolymphe, la surfusion des fluides corporels et la température à laquelle l'eau du corps est spontanément gelée, est appelé point de surfusion ou température de cristallisation (d'après Lee, 1989).

94 Chapitre VI

VI. B. LA RESISTANCE AU FROID CHEZ LES APIONS

ET CHEZ LES AJONCS

Projet d'article

Myriam BARAT *,a , Philippe VERNONb, Michèle TARAYRE a and Anne ATLAN a

Overwintering strategy and cold hardiness of two weevil species in Brittany (France).

a Equipe ISA (Interaction Spéciation Adaptation), UMR 6553 Ecobio, Université de Rennes 1, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex, France

b Equipe Impact des Changements Climatiques, UMR 6553 Ecobio, Université de Rennes 1, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes cedex, France

*corresponding author. Tél: 33 (0) 2 23 23 61 72, Fax: 33 (0) 2 23 23 50 47, e-mail: [email protected]

95 Chapitre VI

Résumé

En Bretagne, deux charançons (coléoptères, Curculionoidea) appartenant au genre Exapion diffèrent dans leur stratégie pour passer l’hiver et dans leur saison de reproduction. Exapion ulicis passe l’hiver sous forme d’adulte sur les ajoncs (Genistae, Ulex ) et se reproduit au printemps suivant sur Ulex europaeus . Une partie des individus chez Exapion lemovicinum passe également l’hiver sous forme adulte mais la majorité passe l’hiver sous forme larvaire à l’intérieur des gousses d’ U. gallii et d’ U. minor . Nous avons comparé les points de surfusion (SCP) des adultes de ces deux espèces à trois saisons (été, automne, hiver) et mesuré leurs températures minimales de survie (LLT) ainsi que leur survie plusieurs jours à –8°C en été. Ces deux espèces présentaient des SCP et des LLT très faibles (de l’ordre de –18°C) et étaient également capables de survivre plus d’une dizaine de jours à –8°C. Ces résultats montrent qu’ E. ulicis et E. lemovicinum sont intolérantes à la congélation et présentent de grandes capacités de résistance au froid. Ces deux espèces présentent des différences dans leurs réponses saisonnières au froid qui sont liées à leur période de reproduction. Exapion lemovicinum présentait un SCP très faible en automne, au moment de sa reproduction, alors que E. ulicis présentait un SCP très faible en hiver, ce qui lui permettait d’assurer sa reproduction au printemps. Nous avons également effectué des mesures de SCP des gousses des ajoncs qui ont montré que U. gallii et U. minor présentaient des SCPs plus faibles que U. europaeus . Cette observation suggèrent qu’ U. gallii et U. minor constituent une meilleure protection contre le gel qu’ U. europaeus , et expliquerait pourquoi E. lemovicinum ne parasite pas les gousses d’automne d’ U. europaeus . L’étude de la résistance dans les relations plante- insecte pourrait permettre de prédire la distribution géographique des plantes et donc de leurs parasites.

Summary

In Brittany (West France), two weevils (Coleoptera, Cuculionoidea) belonging to Exapion genera differ in their overwintering strategy and reproductive period. Exapion ulicis pass winter through adult form on gorses (Fabacea, Genistae) and reproduce the next spring on U. europaeus . A part of weevils from Exapion lemovicinum also pass winter under adult form, but most of them pass winter under larval form within U. gallii or U. minor pods. We compared supercooling point (SCP) of adults from the two weevil species at three seasons (summer, autumn, winter) and measured their lower lethal temperatures (LLT) as well as their survival several days at –8°C. Both species exhibited very low SCP and LLT (about –18°C) and were also able to survive more than ten days at –8°C. These results show that E. ulicis and E. lemovicinum are freezing intolerante and present high abilities to resist to coldness. Those species present differences in their seasonal variations to coldness which appear to be linked to their reproductive period. Exapion lemovicinum presented higher SCP in autumn, at its reproductive period, whereas E. ulicis presented higher SCP in winter, which allowed us to ensure its reproduction the next spring. We also realised SCP measures on gorse pods which have shown that U. gallii and U. minor had lower SCP than U. europaeus . This observation suggests that U. gallii and U. minor constitute a better protection against frost than U. europaeus and could explain why E. lemovicinum does not infest autumnal U. europaeus pods. The study of cold hardiness in plant-insect interactions could allow to predict the geographical distribution of plants and thus of the one of their parasites.

96 Chapitre VI

Introduction

Insects are ectotherm organisms (with a body temperature dependant to environmental temperature) that have to adapt, either on a behavioural or a physiological scale, to survive to seasonal variations. Cold exposure, in particular, may affect insects in many ways. To survive exposure to low temperatures below 0°C, ectotherm organisms use different physiological mechanisms and biochemical substances (Lee & Denlinger, 1991). In general, cold hardiness is based on the survival to ice formation in extracellular body tissues. Insects can be either freeze tolerant (they survive to ice formation in their tissues) or freeze intolerant (they do not survive to freezing in their body fluids) (Salt, 1961). Weevils (Coleoptera, Curculinoidea) are one of the most diverse groups of insects in terms of species richness (Kuschel, 1995) and their ability to adapt to variable environmental conditions probably contributed to their large expansion. In weevils, as well as in many insect species, three major strategies are employed to avoid hard winter conditions. The first strategy consists in migrating to habitats where temperature will be more favourable (Leather et al., 1993). For example, some apple blossum weevils, Anthonomus pomorum , reach forests adjacent to their host plants where they can find optimal hibernation sites (Toepfer et al., 2000). The second strategy consists in entering in quiescent state or in diapause, which is characterized by a decrease or a cessation of metabolism (Tauber et al., 1986) and an increase of resistance to stresses induced by cold hardiness (e.g. Curculio elephas , Menu & Desouhant, 2002; Exechesops Leucopis , Matsuo, 2006). In the third strategy, insects can remain active and employ more complex mechanisms to overcome cold and freezing. Thus, freezing intolerant insects predominate in temperate climates; freeze tolerant species are more abundant in continental regions where winter frosts can be extreme (Leather et al, 1993). To avoid freezing of their body fluids, freezing intolerant insects use a phenomenon called supercooling (Salt, 1936). Supercooling occurs when body tissues and fluids are maintained in the liquid state below their equilibrium freezing point. Some cases of weevils using supercooling to avoid freezing has already been reported (e.g. Hypera punctata , Watanabe & Tanaka, 1997; Palirhoeus eatoni , Merwe et al., 1997; Cylas formicarius , Kandori et al., 2006). In Brittany (Western France), two weevil species, morphologically related, Exapion ulicis and E. lemovicinum (Curculionoidae, Apionidae) are seed predators of the three gorse species (Fabaceae, Genistae) present: Ulex europaeus , U. gallii and U. minor . Those gorse species differ in their flowering period. Flowering peak of U. europaeus is in spring (but

97 Chapitre VI some plants also flower from autumn to spring, Tarayre et al., 2007) whereas U. gallii and U. minor only flower in autumn (Cubas, 1999). In addition, U. europaeus can be encountered in sympatry either with U. gallii or U. minor. The two weevil species have different life cycles relative to their host plant flowering and fruiting phenology (Barat et al., in press ). Females of E. ulicis lay eggs in early spring within young green pods of U. europaeus . Larvae feed on seeds and develop until adult stage within gorse pods. Adults have to wait for pod dehiscence in summer to be released. Then, they feed on vegetative parts and flowers of Ulex species. Adults are present in winter; they are immobile below 10°C, but begin to move and feed as soon as they are warmed above this temperature. This species is in reproductive diapause in autumn and winter (Davies, 1928) and has thus to wait until next spring to reproduce. It is described as univoltine by Hoddle (1991). Exapion ulicis infests near 50% of U. europaeus pods in Brittany and may occasionaly infest U. gallii or U. minor last green pods when they are present at its laying egg period (Barat et al, in press ). Females of E. lemovicinum lay eggs in autumn within young green pods of U. gallii or U. minor . Larvae feed on seeds and develop until adult stage within gorse pods. The development time is longer than for E. ulicis , as adults are released at pod dehiscence next spring. They feed on vegetative parts and flowers of U. gallii and U. minor species. After reproductive period in autumn, weevils pass winter mainly under larval form within gorse pods, even if some adults can also be encountered on gorse branches, but they are probably at the end of their life. Exapion lemovicinum infests on average, 18% for U. gallii pods and 7% for U. minor pods in Brittany. Therefore, E. ulicis and E. lemovicinum differ in their overwintering strategy. Exapion ulicis overwinters as adults, whereas E. lemovicinum overwinters as larvae. However, as (i) adults of E. lemovicinum may be encountered in winter and (ii) we do not know if E. lemovicinum is an univoltine species; it is possible that this last species has a mix strategy. In addition, the reproductive period of the two weevil species occur at different seasons (spring for E. ulicis and autumn for E. lemovicinum ). As temperature is the most important abiotic factors that may influence the reproduction of many insects (Anderwartha, 1952; Tauber et al., 1986), it is thus possible that overwintering strategy and period of reproduction of the two weevil species induce different physiological adaptations. The two species have approximatively the same body size and often live in sympatry; the association between weevils and gorses in Brittany thus offers the opportunity to compare cold hardiness of two similar insect species living in the same climatic conditions but in different microhabitats and using different way to pass winter. This article presents a

98 Chapitre VI comparative study of cold hardiness of these two weevil species in Brittany in regard to their ecology and life cycles. The main questions are (i) do the two Exapion species differ in their cold hardiness ? and (ii) can these differences be considered as adaptation to their life cycle and therefore to their host plant phenology ? To determine their cold hardiness, we measured the supercooling point of individuals of the two species at different seasons. To better understand supercooling abilities of weevils, we also measured their fresh mass and hydric coefficient. These measures are related to cold hardiness, but are not always directly related to survival, and do not take into account exposure duration to cold. We thus also measured lower lethal temperatures (here, the lowest temperature at which individuals survive after one hour of exposition) and survival at different time of exposure to a temperature below 0°C. To better understand constraints linked to overwintering as adults or larvae, we also measured supercooling point of pods of the three gorse species in winter, and survival to starvation of adults of the two weevil species.

Materials and Methods

Sampling

Six gorse populations were sampled, where the three gorse species are or not in sympatry (Fig. 1). Exapion ulicis weevils were collected on U. europaeus branches and E. lemovicinum weevils were collected on U. gallii branches. No weevils were sampled on U. minor , due to the low infestation rate of this species and the fact that its branches contained weevils of the two species (Barat et al., in press ). Weevil species were identified either with molecular markers (using diagnostic sites of the mitochondrial CO1 gene, as described in Barat et al., in prep ) and/or with the morphological key provided by Miguel A. Alonzo-Zarazaga after examination of sampled collected on the three gorse species (pers. com.). Morphological keys were obtained in June 2005 and were only used after this date. We verified that identifications obtained with molecular or morphological methods always gave congruent results (this study and Barat et al., in prep. ). For all measures, we homogenized samples in order to have an adult sex ratio of 1:1 for each population and gorse species. Supercooling point and mass parameters of weevils were measured on samples collected as following: for each population (except CB), at least 20 adult weevils were caught on U. europaeus and U. gallii branches at each studied season: autumn (November 2004), winter

99 Chapitre VI

(February 2005) and summer (July 2005). For comparison between adult weevils collected within gorse pods and on gorse branches, another sample of at least ten adult weevils were collected within U. europaeus pods in July 2005 from PA (July, 4 th ) and SJ (July, 4 th ) populations. Only one weevil was collected per pod to avoid family clusters. Supercooling point of gorse pods was measured on pods of comparable maturation stage collected in March 2005. About fifteen green to ripe pods were collected on U. europaeus from CB and SJ, U. gallii from MA and U. minor from SJ in March 2005. SCP was measured in the same conditions than for weevils, one day after sampling. Survival to low temperature and starvation of weevils have been realised from samples collected in July 2006, soon after pod dehiscence. Indeed, these measures required a high number of weevils, and finding E. lemovicinum adults in autumn and winter is particularly difficult, due to their low density on gorse branches. Adult of E. ulicis were collected on U. europaeus branches from CB population. Adult of E. lemovicinum were collected on U. gallii branches from population IB or MA. Collected weevils were placed in plastic boxes, in an air oven settled at +12°C with photoperiod of 16h light and 8h darkness.

100 Chapitre VI

Figure 1. Location of the six gorse populations from which adults of Exapion ulicis and E. lemovicinum have been collected (Brittany, France). Exapion ulicis weevils have been collected on U. europaeus branches from Campus Beaulieu (CB), Paimpont (PA), Saint-Just (SJ), Ile Besnard (IB) and Ploumanach (PL). Exapion lemovicinum weevils have been collected on U. gallii branches from Ile Besnard (IB), Ploumanach (PL) and Monts d’Arrée (MA).

Supercooling point (SCP) and related measures Weevils were kept three days without food and with water supply in glass vessel ( ∅: 90 mm, height: 10 mm) placed in an air oven settled at month average temperature and photoperiod of the tested season. The starvation avoids supercooling point (SCP) variations due to intestinal contain. In November 2004, the air oven was settled to a temperature of 12°C (light: darkness, 11h:13h). In February 2004, the air oven was settled to a temperature of 9°C (10h:14h). In July 2005, the air oven was settled to a temperature of 20°C (16h:8h). Fresh masses were measured just after the starvation period, on a microbalance (sartorius, sensitivity: 0.1 µg). Then SCP was measured with a cryostat (Polystat cc3, Huber) settled to decrease temperature from +5 to –30°C in 35 minutes (1°C/min). Each weevil was placed in a 0.5 ml eppendorf tube in contact with a thermal probe ( ∅: 2 mm). Thermocouples (HI 141 JH, Hanna Instruments) recorded weevil body temperature every two seconds. Then,

101 Chapitre VI data were reported on a computer via an infrared data transmitter and its specific software (HI 141000, Hanna Instruments). The software gave the curve of weevil temperature in function of time. SCP was detected as an exotherm caused by the release of the latent heat of crystallization (Lee, 1989). For each population and species, at least ten freezed weevils were kept for molecular analysis. When enough weevils were available (summer for the two species, and winter for E. ulicis ), an additional sample of ten weevils was placed 72 hours on an air oven at 50°C, for the measure of dried mass. Hydric coefficient was then calculated by dividing the quantity of body water (fresh mass – dried mass) by the dried mass.

Survival to low temperature and starvation

Lower lethal temperature (LLT) Collected weevils were placed one week in plastic boxes ( ∅: 100 mm, height: 55 mm) with gorse branches from the population sampled and water supply. Then, gorse branches were removed from boxes for three days. For each weevil species and tested temperature (T), a set of five males and five females was randomly chosen. After three days of starvation, each adult was placed in an 1.5 mL eppendorf tube within the cryostat (Polystat cc3, Huber). Tested temperatures were –14, -15, -16, -17 and –18°C. The cryostat was settled to decrease temperature from +5 to T (1°C/min), stay one hour at T, and increase from T to +5°C (1°C/min). After the experiment, each set of weevils tested at a given temperature was placed in a glass vessel ( ∅: 115 mm, height: 15 mm) with gorse branches from the sampled population, in the air oven settled at +12°C (16h:8h). Survival of weevils was observed twice: one and seven days after experiment. After the experiment, survival was checked when weevil was observed walking and eating. Death was checked when weevil was laying down, immobile, with no movement of antenna, and placement of antennas toward abdomen.

Lethal time to exposure at -8°C Collected weevils were placed one week in plastic boxes ( ∅: 100 mm, height: 55 mm) with gorse branches from the population sampled and water supply. For each weevil species and each exposure time tested, a set of ten males and ten females were randomly chosen and placed within one glass vessel ( ∅: 115 mm, height: 15 mm) in the air oven, without food and with water supply for three days. Then, all glass vessels were placed in an air oven settled at -8°C (16h:8h). Tested exposure times were 6, 8, 10, 12 and 14 days. In addition, for each

102 Chapitre VI species, there was one control for which the set of weevils stayed 16 days at +4°C, a temperature above 0°C, at which weevils are immobile, and which allows to test the influence of starvation in this experiment. After exposure time, each glass vessel was placed in the air oven settled at +12°C (16h:8h). Survival of weevils was observed twice: two and seven days after experiment. Survival was checked as above.

Survival to starvation For each species, fifteen males and fifteen females were placed in a glass vessel ( ∅: 115 mm, height: 15 mm) without food and water supply, in an air oven settled at 12°C (16h:8h), and the number of dead individuals and their sex was recorded every day.

Statistical analysis

For Supercooling point and mass parameters, statistical analyses were performed with SAS software (SAS, 2005) based on a GLM (General Linear Model) procedure. As all E. ulicis individuals were sampled on U. europaeus branches and all E. lemovicinum individuals were sampled on U gallii branches, weevil species and gorse species effects were confused. The following factors were crossed: season, population, weevil species and weevil sex. Normal distribution of residuals of each measured parameter has been checked. Values are given with standard error (SE). Significance of correlations between variables was tested with CORR procedure of SAS. For LLT, exposure time to low temperature, species effects were compared by a chi 2. For survival to starvation, we made a probit analyses of the survival curves with the software Minitab, and compared the half-life values at the 5% and 1% probability threshold.

Results

Supercooling point and mass parameters

Supercooling point (SSP) For both weevil species, relative frequency of SCP follows an unimodal distribution (Fig. 2).

103 Chapitre VI

40 40 E. ulicis (n = 301) E. lemovicinum (n = 121)

30 30

20 20

10 10 relative frequency (%) relative frequency (%)

0 0 -24 -22 -20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -24 -22 -20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 SCP (°C) SCP (°C)

Figure 2. Distribution of individual supercooling point (SCP) of Exapion ulicis and E. lemovicinum adults males (black) and females (white). Exapion ulicis individuals were collected on U. europaeus branches from four natural gorse populations of Brittany in 2004-2005. Exapion lemovicinum individuals were collected on U. gallii branches from three natural gorse populations of Brittany in 2004-2005.

The species effect was not significant but season effect and interaction between weevil species and season were highly significant (Table 1). Indeed, for E. ulicis species, SCP was significantly higher in summer than in autumn and winter (duncan test, P<5%). By contrast, for E. lemovicinum species, SCP was significantly lower in autumn than in summer and winter (duncan test, P<5%). Significant differences of SCP between the two weevil species, for each season, are presented in Figure 3. For both weevil species, there was no significant effect of weevil sex or the interaction between weevil species and weevil sex, but population effect and interaction between population and season were highly significant (Table 1). Finally, no significant difference was observed between weevils sampled within U. europaeus pods and weevils collected on gorse branches, neither in population PA (-15.17 ± 2.63°C, n = 11 vs –15.33 ± 0.70 n = 29, respectively, student-t test: t = 0.20, P>0.10), nor in population SJ (-18.51 ± 0.86°C, n = 15 vs –19.07 ± 0.40 n = 25, respectively, t = 1.08, P>0.10).

For gorse pods, SCP was significantly different between Ulex species (F 2,76 = 7.79, P < 0.001). Indeed, U. gallii and U. minor pods had a significant lower SCP (-11.17 ± 0.64°C, n = 25; -11.45 ± 0.94°C, n = 13, respectively) than U. europaeus pods (-8.81 ± 0.33°C, n = 38) (duncan test, P<5%).

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summer autumn winter -16 101 54 76 32 124 35

-17

-18

SCP(°C) -19

-20 * *

-21

Figure 3. Supercooling point (SCP) and hydric coefficient (HC) of Exapion ulicis (black) and E. lemovicinum (white) at different seasons. Data show mean value ± SE. The numbers within bars give the sample size. A star indicates significant differences with Duncan test (P<5%).

Fresh mass (FM) FM of weevils was not significantly different between E. ulicis and E. lemovicinum (Table 1). However, sex effect and interaction between species and sex were highly significant (Table 1). Indeed, mean FM of E. ulicis females (1.22 ± 0.02, n = 165) was not significantly different from that of E. lemovicinum (1.24 ± 0.02, n = 81) but mean FM of E. lemovicinum males (0.99 ± 0.02, n = 68) was significantly higher than that of E. ulicis (0.84 ± 0.01, n = 155). For both species, season effect and interaction between species and season were significant (Table 1). Indeed, for E. ulicis species, FM was significantly lower in summer (0.96 ± 0.02, n = 111) than in autumn (1.10 ± 0.03, n = 80) and winter (1.07 ± 0.02, n = 132) (duncan test, P<5%). By contrast, FM of E. lemovicinum species did not vary significantly between summer (1.10 ± 0.02, n = 74) and autumn (1.14 ± 0.04, n = 40) and between autumn and winter (1.18 ± 0.03, n = 38) (duncan test, P<5%). But mean FM was significantly different between the two species in summer and winter (duncan test, P<5%).

105 Chapitre VI

Hydric coefficient (HC) HC of weevils was not significantly different between E. ulicis and E. lemovicinum (Table 1). However, interaction between weevil species and weevil sex was highly significant even if weevil sex alone was not significant (Table 1). Indeed, in E. ulicis species, females had a significant higher hydric coefficient than males (1.26 ± 0.03, n = 75 vs 1.14 ± 0.03, n = 73; respectively) whereas it was the opposite in E. lemovicinum species (1.20 ± 0.04, n = 35 vs 1.31 ± 0.06, n = 35), which explains why weevil sex alone was not significant. For both species, HC was higher in summer (1.26 ± 0.03, n = 129) than in winter (1.16 ± 0.02, n = 89) but the effect of season and the interaction between weevil species and season were not significant (Table 1). Finally, population effect and interaction between weevil species and population were not significant (Table 1).

Table 1. ANOVA table of effects of weevil species, weevil sex, gorse population, season and interactions including weevil species on fresh mass, supercooling point and hydric coefficient of weevils. Degrees of freedom (DF) follow to the right of the variables for which they apply. F represents F values and significance of results are represent by asters: ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.

Fresh mass Supercooling point Hydric coefficient source DF F DF F DF F weevil species 1 0.39 1 1.54 1 0.14 weevil sex 1 347.08 *** 1 3.25 1 0.29 population 4 4.00 ** 4 7.41 *** 4 22.35 *** season 2 14.99 *** 2 13.46 *** 1 1.90 *** weevil species*weevil sex 1 13.79 *** 1 0.00 1 12.65 weevil species*population 1 1.82 1 12.25 *** 1 2.99 weevil species*season 2 4.58 * 2 6.96** 1 0.19 residuals 456 403 207

Correlation between FM, SCP and HC No significant correlation was observed, nor between fresh mass and SCP ( n = 419, P = 0.62), neither between fresh mass and hydric coefficient ( n = 218, P = 0.33) or between SCP and hydric coefficient ( n = 204, P = 0.21).

106 Chapitre VI

Survival to low temperature and starvation

Lower lethal temperature (LLT) The number of surviving weevils was not different between one day and seven days after experiment, so that table 3 only presents survival of weevils seven days after experiment. Whatever the species, more than half of weevils survived one hour at –14°C and there was at least one weevil alive after one hour at –18°C. The total number of alive and dead weevils was significantly different between E. ulicis and E. lemovicinum at –17°C and –18°C ( χ2 test: χ2 = 5.20, n = 40, P< 0.05), showing that E. lemovicinum had a better survival rate than E. ulicis . In addition, in E. ulicis species, males had a significantly better survival than females ( χ2 test: χ2 = 6.52, n = 50, P < 0.05). By contrast, no significant difference between males and females was observed in E. lemovicinum species ( χ2 test: χ2 = 1.26, n = 50).

Table 2. Survival of Exapion ulicis and E. lemovicinum exposed one hour at six different temperatures (T) below 0°C. For each tested temperature and each weevil sp ecies, five adult females and five adult males were exposed one hour at T. This table reports the number of weevils alive seven days after the experimentation.

E. ulicis E. lemovicinum T (°C) females males females males -14 2 4 2 5 -15 3 4 3 1 -16 1 4 2 1 -17 0 4 3 4 -18 1 0 1 4

Exposure time to low temperature The numbers of surviving weevils seven days after an exposure time at –8°C are presented in Table 4. The control at +4°C showed high values of survival, indicating that that starvation did not influence weevil survival in this experiment. For both weevil species, all weevils survived six days at –8°C and at least one weevil survived after 14 days at –8°C. The total number of alive and dead weevils was significantly different between E. ulicis and E. lemovicinum after 12 and 14 days of exposition at –8°C ( χ2test: χ2 = 22.4, n = 80, P< 0.001), showing that E. lemovicinum weevils survived longer at –8°C than E. ulicis weevils. Finally, there was no significant difference between survival of males and females nor for E. ulicis ( χ2 test: χ2 = 0.66, n = 100) neither for E. lemovicinum ( χ2 test: χ2 = 0.62, n = 100).

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Table 3. Survival of Exapion ulicis and E. lemovicinum exposed at five different exposure duration at –8°C. For each tested duration and each weevil species, ten adult females and ten adult males were exposed at –8°C. A control was realised for each species, in which weevils were placed at +4°C for 16 days. This table re ports the number of weevils alive seven days after the experiment.

E. ulicis E. lemovicinum number of days females males females males 6 10 10 10 10 8 8 10 10 9 10 5 10 7 9 12 4 1 6 8 14 1 1 7 7 control 9 10 8 9

Survival to starvation Figure 5 presents survival curves of females and males of E. ulicis and E. lemovicinum under starvation constraint. Both species are able to survive more than one month. In addition, individuals of E. lemovicinum survived longer than those of E. ulicis , but the difference was not significant when we compared half-lethal time values (LT 50 ) with probit analysis. In addition, no significant difference was observed between LT 50 of females and males of E. ulicis , but this difference was significant for E. lemovicinum (P < 1%).

E. ulicis E. lemovicinum

16 16 14 14 12 12 10 10 8 8 6 6 weevil weevil number weevilnumber 4 4 2 2 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 days days

Figure 4. Survival of E. ulicis and E. lemovicinum to starvation. For each weevil species, 15 males (black) and 15 females (white) have been collected on gorse branches in July 2005 have been tested.

108 Chapitre VI

Discussion

Values and seasonal variability of cold hardiness

Exapion ulicis and E. lemovicinum exhibited differences in all traits relied to cold hardiness and exhibited different sexual dimorphism for most of these characters. Both species were resistant to very low temperatures, but they exhibited different seasonal variability. Indeed, they both exhibited very low supercooling point (SCP), for which mean values were around -19°C. Such low SCP values are uncommon but have already been found in other weevil species, such as the beech weevil, Rhinchaenus fagi (Bale, 1980) for which SCPs were between –20 and –30°C. Besides, for both species, no significant difference was observed between weevils collected within pods and weevils collected on gorse branches, which suggests that supercooling abilities of apionid weevils are present since emergence. Lower lethal temperatures (LLT) were also very low and seemed to be equivalent to SCPs. This relation between SCP and LLT suggests that weevils die when they reach their SCP and that SCP is a good predictor of cold hardiness of weevils in this study. According to these data and recent views on classification of insect cold hardiness (Bale, 1987, 1993; Nedved, 2000), apionid weevils resisted to negative temperatures by avoiding freezing but not by freezing tolerance. In addition, not only weevils survived short exposure to temperature below -15°C, but they were also able to survive several days at –8°C, which reinforces their freezing intolerant status. This potential to survive very low temperatures is surprising since temperatures below -10°C are exceptional in Brittany (Météo France), but it may reflect the physiological state of weevils in regard to their cold hardiness potential face to their biological needs. Therefore, the comparison of SCP and LLT values of the two species gives indications on their physiological adaptation to coldness. SCP measures have shown that E. lemovicinum had a lowest SCP in autumn whereas E. ulicis had a lowest SCP in winter. These results suggest that these two species are physiologically adapted to have the best cold hardiness in relation to their reproductive period. Indeed, for E. lemovicinum , autumn corresponds to the reproductive period and it is thus important to optimise cold hardiness at this season. For E. ulicis , reproductive period is

109 Chapitre VI in spring, but adults have to pass winter before they reproduce, therefore, this species is selected to optimise its survival in winter. Besides, measures of LLT and survival to long exposure time at –8°C in summer have shown that E. lemovicinum survives better than E. ulicis . These observations may be related to the fact that its SCP in autumn was lowest than the SCP of E. ulicis . Therefore, it is possible that since summer, E. lemovicinum is preparing to autumn cold hardiness, by regulating body water or producing antifreeze proteins for example (Leather et al., 1993).

Traits linked with cold hardiness

Supercooling point is often linked to fresh mass and hydric coefficient. E. lemovicinum was significantly heavier than E. ulicis in summer and winter, but we did not find any significant correlation between supercooling point and fresh mass. Therefore, fresh mass does not influence cold hardiness of these weevils. Fresh mass analysis mostly allowed to show a sexual dimorphism, with females being heavier than males, a feature less marked in E. lemovicinum than in E. ulicis . However, there was no sexual dimorphism for SCP, and for LLT, sexual dimorphism was only observed for E. ulicis , which confirms the absence of correlation between cold hardiness and fresh mass. In the same way than for fresh mass, no significant correlation between supercooling point and hydric coefficient has been found, and seasonal variation of hydric coefficient was not significant. However, even if seasonal variation was not significant, mean hydric coefficient of both weevil species were lower in winter, suggesting that weevils decreased their water content (dehydratation) to resist to cold temperatures. Indeed, reducing water content may reduce the relative quantity of freezing water (Storey and Storey, 1997) or stimulate the production or the concentration of cryoprotective substances (Storey, 1990; Storey and Storey, 1992). Sexual dimorphism for hydric coefficient was highly significant for each species, but in an opposite direction. The influence of sex on insect cold hardiness has rarely been studied. A recent study on the tenebrionid beetle Alphitobius diaperinus has shown that males had a lower SCP than females (Salin et al., 2000). An other study has shown that females had a slightly higher survival than males in some species (Fields, 1992). Therefore, it is difficult to postulate if the absence of influence of sex on cold hardiness abilities of weevils is common or not among insects.

110 Chapitre VI

Other life history traits In addition to physiological traits linked to cold hardiness, other features may be relied to overwintering survival. For both species, adult survival to starvation may overtake one month. This ability may help weevils to survive cold temperatures. Indeed, starvation is probably one of the highest causes of mortality for insects overwintering as adults (Leather et al., 1993). Adults of E. ulicis and E. lemovicinum do not move (and thus are enable to eat) when temperatures are below 10°C, and thus may be submitted to long period of starvation. Therefore, their ability to survive long time to starvation help them to survive long exposure to coldness. Overwintering of larvae mainly depends on cold hardiness of the gorse pods they are in, because pod freezing lead to abortion. We have shown that gorse pods exhibited different cold hardiness depending on species: U. gallii and U. minor pods had a lower SCP than U. europaeus pods, which means that they freeze at a lower temperature. In addition, we observed in winter 2003/2004 that all pods of U. europaeus aborted but not pods of U. gallii and U. minor . U. europaeus pods are therefore less resistant to frost and thus represent a higher risk for the larvae survival. This may explain why E. lemovicinum did not lay eggs in U. europaeus pods although they are present at its reproductive period, but other physical (such as toughness of pods) or chemical components (Panda & Kusch, 1995) may be involved.

Conclusion

Our results show that host plant specificity plays an important role in insect ecophysiology. They suggest that apionid weevils adapt to their cold hardiness abilities to optimise their reproductive success, which period depends on host plant phenology. In addition, weevils exhibited high potential of cold hardiness and would be thus able to colonise regions colder than their present range. Indeed, E. ulicis is widespread in Europe, from Portugal until Poland, where its host plants are present. By contrast, E. lemovicinum , which has the same range order of cold hardiness than E. ulicis , is only present in West Europe, where U. gallii and U. minor are present. Therefore, it seems that the geographical distribution of apionid weevils is limited by the distribution of their host plant and not by their own cold hardiness.

111 Chapitre VI

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113 Discussion générale et perspectives

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

A. Impact de la pression parasitaire sur la phénologie d’ Ulex europaeus

En Bretagne, nous avons observé que les deux phénotypes floraux d’ Ulex europaeus (plantes à "floraison longue" et plantes à "floraison courte") étaient liés à des stratégies de défense contre deux prédateurs, Exapion ulicis (Coleoptera, Curculionoidea) et Cydia succedana (Lepidoptera, Tortricidae) qui s’attaquent à leurs graines au printemps (Fig. 14). De plus, nous avons montré que la résistance d’ U. europaeus aux insectes

Figure 14. Représentation des deux phénotypes phytophages était en partie génétiquement floraux d’ Ulex europaeus en Bretagne (photos prises en mars 2002). déterminée. Ainsi, les plantes à floraison longue évitent le parasitisme en produisant leurs gousses avant le printemps. Cette stratégie de défense a déjà été observée chez Astragalus utahensis (Fabaceae) qui fleurit également avant le pic d’abondance de son principal prédateur (Green & Palmbald, 1975) ou chez Sapinindus saponaria (Sapiondaceae) qui fleurit après le pic d’abondance de son prédateur (Carroll & Loye, 1987). Les plantes à floraison courte adoptent une stratégie de satiété du prédateur (Janzen, 1971), qui a déjà été observée, par exemple, chez des espèces du genre Chionochloa (Poaceae) (Kelly et al., 2000). La pression parasitaire peut donc représenter un coût énergétique important pour la plante, et expliquer qu’en son absence, une plante envahissante, telle que U. europaeus , puisse réinvestir cette énergie, dans d’autres fonctions (e.g. croissance, compétition interspécifique) lui permettant d’envahir les régions où elle a été introduite. Afin de tester cette supposition, qui constitue les bases de l’hypothèse EICA, ou Evolution of Increased Competitive Ability (Blossey & Nötzold, 1995), il faudrait vérifier si : (i) en absence de leurs herbivores spécifiques, les espèces végétales introduites perdent leur résistance contre leurs ennemis, et si (ii) en retour, les plantes évoluent en augmentant leur

114 Discussion générale et perspectives taille ou leur fécondité. Ces deux prédictions n’ont jamais été vérifiées ensemble. Or, à l’île de La Réunion, U. europaeus a été introduit, mais sans ses prédateurs granivores spécifiques, qui n’ont pas non plus été introduits, par la suite, dans un objectif de lutte biologique. De plus, aucun prédateur de graines local ne s’attaque aux gousses d’ U. europaeus . Par conséquent, U. europaeus constitue un bon modèle pour tester directement l’hypothèse EICA. Pour vérifier les deux prédictions de cette hypothèse, nous faisons actuellement pousser des plantes de La Réunion et des plantes de la zone d’origine d’ U. europaeus en jardin expérimental (pour limiter les effets environnementaux) afin d’évaluer leur sensibilité aux prédateurs de graines, ainsi que leur croissance et leur fécondité.

B. L’interaction ajonc-apion en Bretagne

La relation étroite entre U. europaeus et E. ulicis m’a amenée a élargir ce travail aux autres espèces d’ajonc présentes en Bretagne. Cependant, avant même de commencer, de nombreux aspects ont du être éclaircis afin de connaître la biologie des interactions ajonc- apion en Bretagne. En effet, le nombre d’espèces de charançon parasitant les graines des différentes espèces d’ajonc présentes en Bretagne n’était pas connu et il n’a pas été facile d’identifier ces insectes, comme nous l’avons déjà vu. Du fait de cette difficulté d’identification, la biologie et la spécificité des charançons étaient également peu connues. L’équipe ISA savait que E. ulicis parasitait U. europaeus , mais ne savait pas si cette espèce était capable de parasiter les autres espèces d’ajonc. De plus, elle avait remarqué que des charançons morphologiquement semblables à E. ulicis parasitaient U. gallii et U. minor en automne, mais ne savait pas à quelle(s) espèce(s) ils appartenaient. Or, l’identification d’un charançon prédateur des gousses d’automne d’ U. europaeus aurait pu être intéressante dans le cadre de la lutte biologique. D’ailleurs, le CSIRO 17 avait initié des campagnes de recherche de parasites d’automne d’ U. europaeus , mais ces recherches n’ont pas été fructueuses (Sheppard, 2003). Enfin, les conditions d’élevage, que ce soit en laboratoire ou sur les plantes, n’étaient pas non plus connues. Cette thèse a permis de répondre à la majorité de ces inconnues, dont la plupart des données sont rappelées dans l’annexe 6.

17 CSIRO : Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization.

115 Discussion générale et perspectives

1. Identification de deux espèces de charançon Au cours de cette thèse, deux espèces de charançon granivore s’attaquant aux ajoncs en Bretagne ont été identifiées sur la base de critères morphologiques et/ou moléculaires : Exapion ulicis et E. lemovicinum . Si la biologie d’ E. ulicis était bien connue, du fait de son histoire en tant qu’agent de lutte biologique contre U. europaeus , celle d’ E. lemovicinum , du fait, notamment, de sa faible répartition géographique en Europe et de son faible taux de parasitisme, était peu connue. Par ailleurs, l’identification moléculaire des charançons a permis de confirmer l’identification morphologique des espèces, mais également d’identifier des stades immatures dans les gousses d’ajonc et de vérifier l’absence d’espèce jumelles ou de races d’hôtes. L’utilisation de techniques moléculaires apparaît donc indispensable pour (i) bien caractériser les espèces étudiées et (ii) apporter des informations précieuses sur l’écologie des espèces, puisque dans ce travail de thèse, elle nous a permis de définir clairement les spécificités d’hôtes des deux espèces d’apion dans le genre Ulex.

2. Spécificité d’hôte

2.1 Spécificité d’hôte : de l’importance des données de terrain En Bretagne, E. ulicis et E. lemovicinum présentent des gammes d’hôtes différentes vis à vis du genre Ulex , qui sont liées à la phénologie de fructification de leurs plantes-hôtes. Au printemps, E. ulicis s’attaque majoritairement aux gousses d’ U. europaeus , mais peut également s’attaquer aux gousses d’ U. gallii et d’ U. minor . En automne, E. lemovicinum s’attaque aux gousses d’ U. gallii et d’ U. minor , mais ne s’attaque pas aux gousses d’ U. europaeus . Cette information montre que E. lemovicinum ne peut pas constituer un agent biologique contre U. europaeus , mais constitue une donnée intéressante puisque E. lemovicinum n’avait jamais été décrit sur U. gallii auparavant. Le fait que les spécificités d’hôtes dans le genre Ulex aient été décrites à partir de données obtenues in natura est important, car les spécificités observées sur le terrain et dans des conditions expérimentales peuvent parfois présenter des différences. Par exemple, dans son aire d’origine (Europe), la bruche Bruchidius villosus (Coleoptera, Bruchidae) ne se développe que sur le genêt à balais, Cytisus scorparius (Fabaceae, Genistae), qui est considéré comme une plante envahissante en Nouvelle-Zélande. Cette bruche a alors été soumise à des tests de choix de plante-hôte qui ont été réalisés dans des cages expérimentales, afin de vérifier si cet insecte pouvait constituer un bon agent biologique contre le genêt à balais (Haines et al., 2004). Dans ces tests, où les phénologies de floraison

116 Discussion générale et perspectives des taxons de plante testés ont été synchronisées, B. villosus déposait ses œufs uniquement dans les gousses de C. scorparius . Or une fois introduit en Nouvelle-Zélande, B. villosus s’est attaqué préférentiellement à C. proliferus probablement parce que la floraison de cette espèce s’amorce avant celle de C. scorparius (Sheppard et al., 2006). L’exemple de B. villosus montre bien combien les données de terrain sont importantes pour définir la gamme d’hôte d’une espèce, et suggère également que la phénologie de la plante-hôte joue un rôle important dans la sélection des plantes-hôtes par les insectes granivores.

2.2 Spécificité d’hôte et phénologie de la plante Nous avons observé que E. ulicis pouvait parasiter les dernières gousses d’ U. gallii et d’ U. minor présentes à sa période de reproduction. Par conséquent, la gamme d’hôte de cet apion dépend des disponibilités des gousses (i.e. de la phénologie) des différentes espèces d’ajonc, et donc de facteurs environnementaux qui varient en fonction des années et des populations. Le rôle de la phénologie d’une plante sur la spécificité de plante-hôte pour les insectes phytophages est peu documenté dans la littérature, car il est considéré comme évident. De ce fait, la majorité des études portant sur la phénologie de la plante-hôte s’interroge plutôt sur son influence sur les performances des insectes phytophages (e.g. Tikkanen & Lyytikaïnen-Saarenmaa, 2002 ; Chege, 2005 ; Poulin, 2006). Pourtant, la phénologie de la plante peut probablement fournir une approche alternative pour prédire l’activité des insectes, que ce soit pour les insectes nuisibles ou les insectes utilisés en tant qu’agent de lutte biologique. La définition de la gamme d’hôte d’un insecte phytophage n’est donc pas facile et demande de prendre de nombreuses précautions (cf encadré 2).

Encadré 2. Principales précautions à prendre pour définir la gamme d’hôte d’un insecte phytophage. - Bien définir les espèces étudiées (au cas où on serait en présence d’espèces jumelles, par exemple), - bien connaître la phénologie des plantes potentiellement attaquables dans la zone étudiée, - explorer de nombreux hôtes sur chaque site (notamment lorsqu’il s’agit d’étudier une espèce peu abondante), - faire les échantillonnages sur plusieurs populations et différentes années (sans lesquelles, nous n’aurions pas pu détecter le fait que E. ulicis pouvait également parasiter U. gallii et U. minor ).

117 Discussion générale et perspectives

2.3 Autres facteurs impliqués dans la spécificité d’hôte Si les données de terrain sont importantes pour connaître la gamme d’hôte d’une espèce, les expérimentations restent quand même indispensables pour comprendre les mécanismes de sélection d’une plante-hôte. En effet, les mécanismes de sélection et de spécialisation des insectes phytophages à leur(s) plante(s)-hôte(s) sont très complexes, et mettent en jeu de nombreux facteurs biologiques (cf chapitre 1). D’ailleurs, dans notre cas, la phénologie des plantes-hôtes ne permet pas d’expliquer les différences de spécificité entre E. ulicis et E. lemovicinum . En effet, E. ulicis est capable de s’attaquer aux trois espèces d’ajonc, alors que E. lemovicinum ne s’attaque qu’ U. gallii et U. minor , bien que des gousses d’ U. europaeus soient présentes à sa période de ponte (Fig. 15).

Figure 15. Périodes de production des gousses vertes d’ U. europaeus , d’ U. gallii et d’ U. minor (en vert) et périodes de ponte d’ E. lemovicinum (en bleu) et d’ E. ulicis (en rouge).

Le fait que E. lemovicinum ne s’attaque pas aux gousses d’ U. europaeus pourrait s’expliquer par de nombreuses raisons : physiques (longueur du rostre des femelles trop court pour pouvoir percer les gousses d’ U. europaeus ), chimiques (pas de composés attractifs dégagés par U. europaeus ), écologiques (faible dispersion de E. lemovicinum ), physiologiques (incapacité des larves à détoxifier les alcaloïdes des graines d’ U. europaeus ), etc… Dans ce cas, seules des expérimentations permettraient d’expliquer les mécanismes de sélection de plante-hôte des deux espèces d’apion. Il est possible que E. ulicis bénéficie d’une plus grande plasticité phénotypique que E. lemovicinum . Ainsi, le fait que les femelles E. ulicis ont un rostre plus long que celles d’ E. lemovicinum , pourrait leur conférer la capacité de pondre dans les gousses des trois espèces d’ajonc. De plus, E. ulicis semble également parasiter un genre proche des Ulex :

118 Discussion générale et perspectives

Stauracanthus (Miguel A. Alonso-Zarazaga, Museum National de Madrid, Espagne, pers. comm.). L’utilisation du rostre par les charançons pourrait d’ailleurs être un des facteurs clés à l’origine de leur diversification (Anderson, 2004). Le modèle ajonc-apion semble intéressant pour tester si les théories d’écologie comportementale concernant le choix de ponte des insectes, qui sont généralement basées sur des modèles parasitoïdes, peuvent s’appliquer au choix de ponte des insectes granivores. En effet, chez E. ulicis , nous avons remarqué que les femelles étaient très probablement capables de choisir les gousses U. europaeus avec le plus grand nombre de graines et également d’éviter les gousses déjà parasitées par leurs congénères (Hoddle, 1991b ; Barat et al., in press ). Plusieurs questions peuvent alors se poser : est-ce que les femelles apion sont capables de choisir les gousses les plus riches en graines ? Sont-elles capables d’ajuster leur taille de ponte au nombre de graines par gousse ? Est-ce que leur comportement de ponte varie selon leur expérience ?

3. Spécialisation et spéciation sympatrique

3.1 Spécialisation et isolement reproducteur La plasticité phénotypique des insectes phytophages dans des environnements fluctuants peut jouer un rôle important dans l’adaptation locale de populations d’insectes à un nouvel habitat (i.e. spécialisation), et donc dans la formation de nouvelles espèces (synthèse in Görür, 2000). L’importance du choix de l’habitat dans l’évolution des relations plante- insecte est connu depuis longtemps (Walsh, 1864). Pour E. ulicis et E. lemovicinum , le choix des plantes-hôtes, qui est majoritairement lié à leur phénologie, a sûrement entraîné (i) leur spécialisation et leur spécificité à leurs plantes-hôtes ainsi que (ii) leur isolement reproducteur. En effet, la phénologie des plantes-hôtes est une forte pression de sélection sur les insectes phytophages, et en particulier sur les insectes granivores, car leur cycle de vie doit être synchronisé avec la phénologie de la plante pour assurer la survie de leur descendance (synthèse in Mopper, 2005). Chez les apions, nous avons constaté que nombre de leurs traits d’histoire de vie sont liés à la phénologie de fructification des ajoncs, que ce soit : - au niveau du cycle de vie (période de reproduction, temps de développement, période d’émergence, etc…), - ou au niveau comportemental et physiologique (période de reproduction, forme de passage de l’hiver, nombre d’œufs déposés par gousse, etc…).

119 Discussion générale et perspectives

Enfin, la spécialisation des apions à la phénologie de fructification des ajoncs est probablement à l’origine de l’isolement reproducteur des deux espèces d’apion dans le temps : E. ulicis se reproduit au printemps alors que E. lemovicinum se reproduit en automne. Par ailleurs, en Bretagne, ces deux espèces se rencontrent en sympatrie. Il est donc possible que E. ulicis et E. lemovicinum se soient différenciés par spéciation sympatrique allochronique.

3.2 Spéciation sympatrique allochronique Si les exemples d’insectes phytophages présentant des périodes de reproduction séparées dans le temps relativement à la phénologie de leurs plantes-hôtes sont nombreux (e.g. Filchak et al., 2000 ; Groman & Pellmyr, 2000, Ueno et al., 2006), suggérant ainsi un mécanisme de spéciation allochronique, les démonstrations de ce mode de spéciation sont elles peu nombreuses (e.g. Wood & Kease, 1990 ; Marshal & Cooley, 2000 ; Simon et al., 2000). En effet, la mise en évidence de la spéciation sympatrique n’est pas aisée, car elle requiert une analyse combinée morphologique, écologique et moléculaire de différentes populations d’insectes indépendantes (Johannesson, 2001). Or, au cours de cette thèse, de nombreuses données ont été obtenues pour mieux connaître l’association ajonc-apion, qui peuvent permettre de mieux comprendre l’évolution de ce système. De plus, plusieurs conditions doivent être remplies pour pouvoir démontrer qu’il y a eu une spéciation sympatrique (selon Gavrilets, 2003) : - les espèces doivent être actuellement en sympatrie, - elles doivent être des espèces sœurs, - elles doivent être isolées reproductivement, - l’existence d’une précédente allopatrie entre ces espèces doit être hautement improbable. Le modèle ajonc-apion remplit bien les trois premières conditions et la dernière condition devrait être vérifiée, car il est peu probable qu’il y ait eu une précédente allopatrie entre les ajoncs et donc entre les apions car (i) dans la zone d’origine des ajoncs (péninsule ibérique), U. gallii et U. minor sont souvent en sympatrie avec U. europaeus (pers. obs.), et (ii) les évènements de spéciation dans le genre Ulex ont eu lieu via des évènements de polyploidie. L’étude de l’évolution des apions est également intéressante car il ne semble pas qu’il y ait de structuration génétique vis à vis des plantes-hôtes, mais plutôt vis à vis d’une phénologie de floraison et de fructification. Pour cela, il faudrait développer des marqueurs moléculaires suffisamment polymorphes pour faire de la structuration génétique des

120 Discussion générale et perspectives populations afin de connaître les flux de gènes intraspécifiques des deux espèces d’apion qui peuvent également nous donner des informations intéressantes sur l’évolution des espèces (e.g. sur le niveau de dispersion des espèces, pour savoir si les populations de E. lemovicinum résultent d’une dérive génétique, etc.).

3.3 Coévolution ou transfert d’hôte ? Il semble donc que E. ulicis et E. lemovicinum ait divergé par spéciation sympatrique allochronique. Il faudrait également déterminer si la spéciation a eu lieu via un phénomène de coévolution ou de transfert d’hôte (Fig. 16). D’après le chapitre 3 de cette thèse, nous avons vu que la pression exercée par les insectes phytophages au printemps était à l’origine du décalage de floraison des individus d’ U. europaeus vulnérables à cette prédation. Il est donc également possible que cette forte pression parasitaire ait conduit d’autres espèces d’ajonc (e.g. U. gallii et U. minor ) à ne fleurir qu’en automne et en hiver, malgré les risques biotiques (moins de pollinisateurs) et abiotiques (risque de gel) à cette période. En retour, l’adaptation des insectes à la phénologie des plantes-hôtes pourraient avoir créé de nouvelles espèces d’apion. Il est donc possible que les évènements de spéciation dans les interactions ajonc-apion se soient effectué suite à des adaptations coévolutives. Cependant, chez les insectes phytophages, la congruence entre la phylogénie des insectes et celle de leur plantes-hôtes a rarement été trouvée, et donc la cospéciation semble improbable dans les associations plante-insecte phytophage (Farrell & Mitter, 1990 ; Funk et al., 1995). De nombreux auteurs suggèrent plutôt que la spéciation des insectes phytopohages s’effectue le plus souvent par transfert d’hôte et spécialisation (Ronquist & Nylin, 1990 ; Funk et al., 1995, Janz et al., 2001). D’ailleurs Anderson (1995, 2004) qui a étudié les phylogénies de charançons (Curculionidae) avec celles de leurs plantes-hôtes pense que le transfert d’hôte est à l’origine de la majorité des évènements de spéciation chez les charançons.

121 Discussion générale et perspectives

Figure 16. Scénario évolutif pour expliquer la formation des espèces E. ulicis et E. lemovicinum . En noir, les hypothèses évolutives des évènements de spéciation chez les ajoncs (selon A. Aïnouche, pers. comm.). En couleurs, les hypothèses des évènements de spéciation des apions. En 1 : Les populations d’apions se seraient différenciées par spéciation sympatrique via un phénomène de coévolution ou de transfert d’hôte. En 2 : E. lemovicinum se serait spécialisé à U. gallii à partir d’ U. minor par un phénomène d’association par descendance.

Le modèle ajonc-apion constitue donc un bon modèle pour tester l’hypothèse de spéciation sympatrique allochronique. Pour cela, il faudrait aller échantillonner des ajoncs en Espagne et au Portugal, pouvoir les identifier avec certitude et collecter des charançons dans les gousses des différentes espèces d’ajonc qui fructifient à différents moments de l’année (ce qui demanderait donc plusieurs campagnes d’échantillonnage). Une fois cet échantillonnage effectué, il faudrait réaliser une phylogénie des apions, qui serait mise en parallèle avec celle des ajoncs (actuellement en cours de réalisation par Abdelkhader Aïnouche, UMR EcoBio, Université de Rennes 1), afin de voir si ces deux phylogénies témoignent d’évènements de co-spéciation ou si elles sont liées à la phénologie de fructification des plantes-hôtes.

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Les références bibliographiques suivantes reprennent l’intégralité des références citées dans le manuscript, à l’exception des références des articles placés en annexe.

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ANNEXE 1 : Exemples de régions envahies par Ulex europaeus et efficacité de prédation de Exapion ulicis en tant qu’agent de lutte biologique contre cette plante envahissante.

Régions Date d’introduction Surface touchée Date d’introduction Etudes d’impact de E. ulicis sur U. touchées par U. d’ U. europaeus d’ E. ulicis europaeus europaeus Océanie Australie début 19 e siècle Sud 1939 (Wilson, 1960) - Tasmanie début 19 e siècle - 1939 (Wilson, 1960) Impact faible (ISSG) Nouvelle début 19 e siècle 1 200 000 ha (Parsons 1931-1946 (Davies, Près de 92% des gousses attaquées Zélande (Bascand, 1973 ; & Cuthberston 1992) 1928) (Hill et al. 2000). Gaynor & MacCarter, 1981) Hawaii 1958 (Goeden, 15 000 ha (Markin & 1955-1956 (Pemberton, 84% gousses attaquées (Markin, 1978) Yoshioka 1998) 1957) 1984). Amérique du Sud Chili début 19 e siècle 100 000 ha de 1976 Jusqu'à 98% de gousses attaquées plantations avec des (Norambuena et al. 1986). espèces exotiques Diminution significative de la (Norambuena & production de graines et de la Piper, 2000) capacité de dispersion des graines (Norambuena & Piper, 2000). Amérique du Californie avant 1912 15 000 acres à Santa 1953 (Holloway & Succès partiel (Amme, 1983). Nord Cruz au Nord Huffaker, 1957) Orégon fin 19 e siècle 25 000 acres 1953 (Holloway & - (Hoshovsky,1989) Huffaker, 1957)

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ANNEXE 2 : Critères d’identification d’ Exapion ulicis et d’ E. lemovicinum

La clé qui suit permet d’identifier les deux espèces d’apions étudiés. Elle nous a été donnée par Miguel A. Alonso-Zarazaga, Muséum National de Madrid en Espagne.

E. ulicis : Le mâle possède un rostre un peu plus long que le pronotum 18 . La femelle possède un rostre une fois et demie aussi long que la tête et le pronotum ensemble. La dent mésorostrale dans les deux sexes est en angle aiguë, en profil parfait 19 , débordant le profil ventral du rostre. Les méso- et métafémurs des deux sexes sont très noircis, presque ou nettement jusqu’à l’apex, laissant plus ou moins 10% de la longueur du fémur éclaircie à l’apex. Les antennes, étirées en avant, n’arrivent pas à l’apex du rostre chez la femelle (distance de une demie à une massue de long), chez le mâle, l’antenne surpasse l’apex du rostre d’une massue de longueur ou plus. Les deux premiers protarsomères sont de même couleur que le tibia.

E. lemovicinum : Le mâle possède un rostre aussi long que la tête et le pronotum ensemble. La femelle possède un rostre au plus un peu plus long que la tête et le pronotum ensemble. La dent mésorostrale dans les deux sexes est en angle droit ou obtus, en profil parfait arrivant au plus à toucher le profil ventral du rostre. Les méso- et métafemur des deux sexes sont sombres seulement à la base (au plus jusqu’à moitié, mais il y a une proportion des mâles qui ont les fémurs très noircis, ne laissant qu’une tache ventrale claire dans la moitié apicale). Les antennes, étirées en avant, arrivent à ou surpassent de très peu (moitié d’une massue) l’apex du rostre dans la femelle, ou surpassent de moitié à une massue complète chez le mâle. Les deux premiers protarsomères sont obscurcis par rapport au tibia.

Morphologie d’un apion (d’après Ehret, 1983).

18 Pronotum : Partie supérieure du prothorax. 19 Les marges des deux yeux doivent coïncider exactement.

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ANNEXE 3 :

Flowering phenology of Ulex europaeus : ecological consequences of large variability

Michèle Tarayre, Gillianne Vergnerie, Agnès Schermann-Legionnet, Myriam Barat and Anne Atlan

Laboratoire "ECOBIO" - UMR 6553, Université de Rennes 1, Rennes, France.

ARTICLE SOUS PRESSE DANS EVOLUTIONARY ECOLOGY

Corresponding author: Anne Atlan Laboratoire "ECOBIO" - UMR 6553, Université de Rennes 1, Campus of Beaulieu, Bâtiment 14A, 35042 RENNES Cedex, France. Tel: (33)2 23 23 61 72, fax: (33)2 23 23 50 47 e-mail: [email protected]

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Résumé

La phénologie reproductive de l’ajonc Ulex europaeus (Fabaceae, Genistae, Ulex ) est inhabituelle dans le fait que le début et la durée de floraison varie beaucoup parmi les individus à l’intérieur même des populations : certaines plantes commencent à fleurir en automne ou en hiver et continuent à fleurir jusqu’au printemps, alors que d’autres fleurissent uniquement au printemps. Pour cmprendre l’origine de cette diversité et ses conséquences écologiques, nous avons suivi la phénologie de floraison d’individus choisis aléatoirement dans cinq populations naturelles différentes en Bretagne. Le succès reproductif a été évalué pour des individus présentant des schémas de floraison contrastés, provenant de seize populations naturelles. Nous avons estimé la production de fleurs, de gousses, de graines ainsi que la prédation des graines. Les plantes initiant leur floraison au printemps produisent plus de fleurs et de gousses sur une courte période que les plantes fleurissant de l’hiver au printemps, qui produisent peu de fleurs et de gousses à la fois mais sur une longue période. La production de gousses des plantes à floraison longue n’était pas significativement différente entre l’hiver et le printemps, mais leurs gousses étaient beaucoup plus attaquées par les prédateurs de graines au printemps qu’en hiver. Nous discutons nos résultats en relation avec des paramètres biotiques et abiotiques. Nous suggérons que les plantes à floraison longue peuvent être interprétées comme une stratégie de bet-hedging, prenant en compte les risques d’échec des gousses (avortement ou gel) en hiver et la prédation des graines au printemps.

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ANNEXE 4 :

Genetic variation of life history traits of the invasive plant Ulex europaeus (Fabaceae) within populations of its native range

Anne Atlan, Myriam Barat, Louis Parize and Michèle Tarayre

Laboratoire "ECOBIO" - UMR 6553, Université de Rennes 1, Rennes, France.

ARTICLE SOUMIS A JOURNAL OF ECOLOGY

Corresponding author: Anne Atlan Laboratoire "ECOBIO" - UMR 6553, Université de Rennes 1, Campus of Beaulieu, Bâtiment 14A, 35042 RENNES Cedex, France. Tel: (33)2 23 23 61 72, fax: (33)2 23 23 50 47 e-mail: [email protected]

Running headline: Genetics of life history traits in Ulex europaeus

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Résumé

1. Les plantes envahissantes ont la capacité de s’adapter rapidement à un nouvel environnement et se révèlent beaucoup plus vigoureuses dans leur zone d’introduction que dans leur zone d’origine. Parmi les hypothèses évoquées pour expliquer ces performances accrues, l’hypothèse EICA ou Evolution of Increased Competitive Ability , suggère que le relâchement de la pression de sélection exercée par les pathogènes spécifiques de la plante lui permet de sélectionner d’autres traits plus avantageux. Cependant, la sélection de ces traits ne peut s’effectuer que si il existait une variabilité génétique dans la zone d’origine permettant une diversité génétique dans la zone envahie. 2. L’objectif de notre étude était d’explorer la relation entre la variation génétique des traits d’histoire de vie d’une plante envahissante, Ulex europaeus (Fabaceae, Genistae), et la prédation des graines, dans des populations naturelles de son aire d’origine. 3. Pour cela, nous avons mis en place un plan de génétique quantitative en cultivant des familles de demi-frères dans un jardin experimental. Nous avons estimé l’héritabilité de la phénologie de floraison et de fructification, de la hauteur des plantes, de la résistance des prédateurs de graines, ainsi que les corrélations génétiques entre ces traits. 4. Nous avons montré que la variation de la phénologie de floraison et de fructification, la prédation des graines et la hauteur des plantes étaient génétiquement déterminées. 5. Nous avons mis en évidence une corrélation génétique entre la phénologie de floraison et de fructification et la résistance à la predation, ainsi qu’un coût de la résistance à la prédation en terme de croissance. Nous suggérons que le polymorphisme de ces traits peut être maintenu par les fluctuations annuelles des pressions de sélection biotiques et abiotiques. 6. Nos résultats contribuent à la compréhension du maintien des variations des traits d’histoire de vie chez U. europaeus . Ils sugèrent que l’hypothèse EICA peut bénéficier des fluctuations des pressions de sélection parasitaire dans la zone d’origine, et propose un mécanisme pour expliquer l’adaptation aux conditions climatiques d’une des plantes les plus envahissantes dans le monde.

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Summary

1 Invasive species adapt quickly to their new environment, and are frequently more vigorous in their invasive range than in their native range. Among the hypotheses invoked to explain such performance, the EICA or Evolution of Increased Competitive Ability hypothesis proposes that the release from the selection pressure exerted by specific pathogens allows for the selection for other advantageous traits. However, selection for advantageous traits can only operate on the basis of pre-existing genetic variability in the invaded areas, which assumes a great genetic diversity in the area of origin. 2 The aim of our study was to explore the genetic variation of life history traits linked to seed predation within natural populations of the native range of Ulex europaeus , an invasive plant species that has colonized many different habitats in most continents. 3 To do this, we set up a quantitative genetic design by raising families of half-sibs in a common garden. We estimated heritabilities of flowering and fruiting phenologies, plant height, resistance to seed predators, plus genetic correlations between these traits. 4 We showed a high genetically determined variation of flowering and fruiting phenologies, seed predation and plant height. 5 We evidenced a strong genetic correlation between the flowering and fruiting phenologies and the predation resistance, as well as a cost of predation resistance in terms of growth. We thus suggest that the polymorphism for these traits can be maintained by fluctuations between years in biotic and abiotic selective pressures. 6 Our results help explain the maintenance of a high variation of life-history traits in U. europaeus . They suggest that the EICA can benefit from the fluctuation of parasitic pressures within the native range, and propose a mechanism to explain the adaptation to contrasting climatic conditions of one of the most invasive plant species.

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Introduction

Invasive species are increasingly being studied, firstly because they are a major threat to biodiversity, and secondly because they are a model for rapid evolution that has enabled a coming together of the concepts of ecology and evolution (Callaway & Maron 2006). Although each case of invasion is unique, some life history traits seem to favour successful invaders. In plants, these traits include fast growth, great phenotypic plasticity, a high seed production and/or the ability to reproduce vegetatively (Barrett & Richardson 1986; Vogt- Anderson 1995). Furthermore, invasive plants are often able to adapt quickly to local conditions (Reznick & Ghalambor 2001). Because of this, recent studies have suggested that the capacity to respond to selection may be the main trait determining the invasion success of many species (Lee 2002). Not only can invasive species adapt quickly to their new environment, but they are also frequently more vigorous in the areas that they invade than in their native range (Willis & Blossey 1999; Leger & Rice, 2003; Jakobs et al . 2004). Among the hypotheses invoked to explain such enhanced performance, EICA or Evolution of Increased Competitive Ability (Blossey & Nötzold 1995) has received special attention in recent years and seems to have been confirmed for several species (e.g. Wolfe 2002; Joshi & Vrieling 2005; Rogers & Siemann 2005). This proposes that the release from the selection pressure exerted by specific pathogens allows for the selection for other advantageous traits, such as growth or reproduction. However, this selection can only operate on the basis of pre-existing genetic variability, which assumes both a great genetic diversity in the native range and the importation of this diversity to the invaded range. It is therefore necessary to study the genetics of invasive species to be able to understand their capacity to respond to selection in new environments (Barett 1992; Lee 2002). Ulex europaeus L. (Genisteae, Fabaceae) is good model for studying the local adaptation of a major life history trait: the flowering and fruiting phenologies. This spiny shrub, originating from Europe, is considered by the IUCN to be one of 30 most dangerous invasive plants (Lowe et al . 2000). In just a few centuries, U. europaeus has colonised most continents (Holm et al .1997). Its colonising properties make it a formidable invader, likely to adversely affect agricultural activities and reduce local biodiversity (Moss 1959; New 1984). Its flowering phenology varies greatly from one invaded region to another. In its native range, it grows at altitudes close to sea level and flowers mainly in early spring (Cubas 1999). In the

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tropics it can grow at altitudes of up to 2200 metres and flowers mainly in winter, as in Hawaii (Markin & Yoshioka 1996) or on Réunion Island (Indian Ocean) (Cadet 1974). In New Zealand, it grows from sea level to 1500 metres and flowers in autumn or spring, depending on the altitude (Hill et al . 1991). Finally, in South America, where it grows up to an altitude of 4000 m in Peru, and flowers in spring or early summer. This ability to shift its flowering period in relation to local conditions may be one of the reasons for its capacity to invade such a wide range of habitats. It is not however known whether this variability results from phenotypic plasticity or from selection on pre-existing genetic diversity, imported from the area of origin. In the second case, the question of how this diversity is maintained in the native range must also be posed. In order to understand the origin and ecological consequences of this diversity, a first stage consisted of observing the flowering of U. europaeus in natural populations in Brittany (France), in the area of origin. This study demonstrated the coexistence of two main phenotypes. (i) plants with a long flowering period that flower from autumn to spring, and (ii) plants with a short flowering period, that only flower in spring (Tarayre et al. 2006). The pods of U. europaeus are attacked by species-specific weevil, Exapion ulicis (Hoffmann) that can attack up to 95% of pods in its area of origin (Davies 1928), and in the countries where it has been introduced for biological control (Hill et al . 1991). However, it only lays in spring, which means that the autumn/winter flowering plants escape completely from seed predation (Tarayre et al . 2006; Hill et al . 1991). Consequently, the long-flowering plants escape predators in time by producing flowers in autumn and in winter, at a period when the young pods are sheltered from parasitism, but face the risk of frost damage in hard winters. In contrast, the spring-flowering plants produce all their pods at a time when seed predation is highest, but when the weather conditions are more favourable for pod survival. In Brittany, the phenotypes observed can be considered as strategies to reduce seed predation (Janzen 1971), and the maintenance of the polymorphism could therefore result from a temporal variability in abiotic and biotic conditions. In the invaded areas, where U. europaeus was initially introduced without its seed predators, the release from predation pressure would have allowed the flowering period to evolve to suit the vast range of climatic conditions. In order validate these hypotheses that involve selection mechanisms, it is essential to ensure that the diversity observed is genetically determined. Flowering phenology can be genetically determined (Putterill et al . 2004; Hendry & Day, 2005) in interaction with various environmental stimuli such as photoperiod and temperature (Rathcke & Lacey 1985; Nakagawa et al. , 2005). Observations on natural populations cannot distinguish between the

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role of genetic factors and phenotypic responses to environmental conditions, so we therefore conducted experiments under controlled conditions. The aim of this study was to explore the genetic determinism of flowering phenologies and resistance to seed predators. We also measured the size of plants, because there are often trade-offs between reproduction and growth (Stearns 1989; Roff 2002). To do this, we set up a quantitative genetic study by raising families of half-sibs in a common garden. This type of study is rarely conducted on shrubs because they take several years to reach sexual maturity and the size adult plants limits the number of individuals that can be cultivated. Ulex europaeus starts to flower in its third year but does not reach full reproductive maturity until the age of four years, when the plant can be more than 2 metres tall and wide. These constraints led us to limit the number of offspring studied to 200. Following the recommendations of Falconer and Mackay (1996), we chose to study 20 families each of 10 plants, and were able to show that the variations in phenology, seed predation and size were genetically determined. We also demonstrated a strong genetic correlation between the phenology and the predation resistance, and the cost of this resistance in terms of growth. These results help explain the maintenance of a high polymorphism in the area of origin, and support the idea of a genetic differentiation between the invaded areas.

Materials and methods

Study species Ulex europaeus is a spiny, perennial, hermaphrodite, hexaploid shrub. It lives for up to 20 to 30 years. Its adult height usually varies from 1 to 4 m. However, a "prostrate" ecotype that can be less than 50 cm high occurs in windswept coastal areas (Misset 1992). Each flower contains 4 stamens enclosed in a carina, and an ovary potentially bearing 12 ovules. Pollination can only be conducted by rather large insects such as honey-bees or bumble-bees (Herrera 1999 and pers. obs.). As in other Genisteae, the plants are self-compatible, but self- fertilisation produces very few seeds (Herrera 1999; unpublished results). Previous studies conducted in Brittany have shown that the distribution of flowering is bimodal and strongly correlated with the flowering duration (Tarayre et al. 2006), which has enabled us to define two distinct phenotypes. The long-flowering plants are those that start to flower before 31 December, and the short-flowering plants are those that start to flower after 1st January.

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The flowers and the pods are produced on the shoots of the previous year. The pods start to form immediately after the fertilisation of the flowers. The young pods are green and soft, but grow and harden throughout maturation, enabling their growth stages to be monitored. When the pods are ripe, they dehisce explosively and project the seeds and any seed predators contained in the pod (Norambuena & Piper 2000). Ulex europaeus pods are infested by a weevil, Exapion ulicis (Curculionoidae, Apion ulicis in Hoffmann 1958), and the larvae of the moth Cydia succedana (Tortricidae). The weevil itself can be attacked by a parasitoid ichneumon wasp Pteromalus sequester (Pteromalidae), whose presence in the pods means that the pod was initially infested by a weevil. The weevil cannot escape from the pod on its own and is released along with the seeds at the dehiscence of the pod (Hoffmann 1958; Ehret 1990). The moth caterpillar can escape from the pods before they become mature, but its presence is revealed by the droppings that it leaves in the pod and by the hole that it bores to escape. It is therefore always possible to know whether a weevil or a moth has infested a mature pod.

Design and measurements The breeding stock used to create the families was derived from natural populations occurring in a radius of 100 km around the city of Rennes (Brittany, France). These populations were regularly monitored from 2000 to 2005, and the flowering type of the plant was well known. We chose two inland populations, La Réauté (LR) and Château de Vaux (CV), and two coastal populations, la Pointe du Grouin (PG) and the Pointe du Meinga (PM). In each population, we collected seeds in the spring of 2001 from five mother-plants, by balancing the number of long- and short-flowering mother-plants (Table 1), which gave us ten families derived from short-flowering mothers and ten families derived from long-flowering mothers (a family consists of all the individuals derived from seeds collected from the same mother-plant). The seeds were stored at 4°C, then scarified using a scalpel and germinated in October 2002 at room temperature. The seedlings were grown in pots for one year. In November 2003, 10 seedlings per family were planted in a randomised pattern in a common garden, with minimum spacing of 1.20 m between each plant. The plants started to flower in spring 2005 and were studied in 2005/2006. Because of losses, we obtained between height and ten adult plants per family, i.e. a total of 190 individuals.

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Table 1. Populations of Ulex europaeus sampled in Brittany (France). Within pop Short flowering Long flowering Population (symbol) Location long-flowering mother mother Plants (%) sampled sampled

La Réauté (LR) hedge 29 2 3 Château de Vaux (CV) fallow 42 3 2 Pointe du Grouin (PG) seaside 7 3 2 Pointe du Meinga (PM) seaside 10 2 3

The plants were observed every month from September 2005 to May 2006, then every two weeks from June to mid-July 2006. At each visit, the presence of flower buds, flowers, and pods at various stages of maturation were recorded. The date of flowering onset corresponded to the appearance of the first flowers, associated with the presence of large- sized flower buds (>5 mm), ready to open. The date of fruiting onset corresponded to the appearance of the first mature pods, associated with the presence of many browning pods. The plant height was measured in June 2006. The mature pods were counted from April to July. To prevent counting the same pods twice, during the first count only the mature or browning pods were counted, then the shoots at different stages were marked in order to determine the time when the pods counted fell off and to conduct a new operation. This process was repeated up to the end of fruiting to enable us to estimate the number of pods produced at four dates (26 April, 14 May, 15 June and 4 July), and to estimate the total annual production by summing the results obtained for each of the periods. At each measurement, six shoots were chosen at random, and the number of flowers per shoot counted using the method in Tarayre et al . (2006). We then calculated the mean of these six measurements. To estimate pod content, between 20 and 30 mature pods were opened at each visit. When the pods were healthy, we counted the number of seeds and used the first ten measurements to calculate the mean numbers of seeds per pods. When the pods were infested, the numbers of seeds and seed predators recorded, and the mean numbers per pod were calculated for at least 10 infested pods. Flat, rotten or chewed seeds were excluded from the counts. The annual proportion of parasitism was obtained by dividing the annual total number of infested pods by the annual total number of pods opened. The annual number of seeds produced per shoot was obtained by summing the number of seeds per shoot in the infested pods and in the non- infested pods for each date.

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Results

Flowering and fruiting phenologies The dates of flowering onset of the 190 adult plants in the experimental plot ranged from September to May, with a peak in April (Fig. 1). The dates of end of flowering were much less variable and ranged from May to June, with an almost perfect correlation between the date of start of flowering and the flowering duration (N = 190, R² = 0.96, P<10 -4): the earlier a plant flowers, the longer it flowers. The effect of family on the date of flowering onset was significant in plants derived from long-flowering mothers (N = 95, F 6,3 = 6.96,

P>0.10), but not in plants derived from short-flowering mothers (N = 95, F 6,3 = 0.61, P = 0.72). The families derived from short-flowering mothers were therefore more uniform than the families derived from long-flowering mothers (Fig. 2).

50 45 short flowering mother 40 long flowering mother 35 30 individuals Numberof 25 20 15 10 5 0 Sep Oct Nov Dec Jan Feb Mar Apr May

Figure 1. Distribution of flowering onset of 190 plants of Ulex europaeus from natural populations of Brittany (France) grown in a common garden, as a function of the maternal flowering type.

150

7 long flowering mother 6 short flowering mother 5

4

3

2 Number families of

1

0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 Long flowering offspring (%)

Figure 2. Distribution of the percentage of long-flowering offspring within the 20 families grown in a common garden, as a function of the maternal flowering type.

The onset and duration of the fruiting period were less spread out over time, but followed the same pattern. Mature pods were produced between March and June for the long- flowering plants, and between May and early July for the short-flowering plants. The proportion of infested pods increased continuously from April to July, both for the weevils and the moths (Fig. 3A). However, the proportion of pods infested by weevils was always higher those infested by moths. Furthermore, whatever the date studied, the long-flowering plants were more infested than the short-flowering plants (Fig. 3B). As the measurement made at the end of June was conducted on the largest number of plants of both types, it was this measurement that was used for the calculations of heritability and genetic correlations.

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100 A 90

,, 80 moth 89 70 apion + moth 60 apion 50 161 40

infestedpods (%) 84 30 20 10 17 23 0 April May early June late June July

B 100 90 16 .. 80 long flowering plants 70 45 73 60 short flowering plants 50 40 48 infestedpods (%) 116 30 36 20 10 17 23 0 April May early June late June July

Figure 3. Temporal changes in parasitism in Ulex europaeus grown in the common garden. This figure presents the percentage of infested pods (+ SE) for each period as a function of the insect species (A) and in function of plant flowering type (B). Numbers above the bars indicate the sample size of fruiting plants available at each date.

Genetic differentiation and Heritability There was a very great variation between the traits studied, both between individuals and between families (Table 2). The results were analysed using an ANOVA (procedure GLM of SAS, 2005) in which the families were ranked into the populations of origin and the flowering type of the mother-plants (short- or long- flowering). The population of origin had a very strong influence on plant height, but a lower effect on the phenology and the parasitism rate. In a pair-wise comparison of the populations using a Duncan’s test, two groups were distinguished (Fig. 4): those individuals coming from inland populations (LR and CV) which flowered earlier were taller, produced fewer pods per shoot and were more infested than those coming from

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coastal populations (PG and PM). The maternal flowering type had a significant influence on the flowering and fruiting phenology, but not on any of the other variables studied (Table 3).

Table 2. Means, minimum and maximum values of the main quantitative traits.

Individual values Family means Traits Means (min - max) (min - max)

Flowering duration 81 19 - 252 34 - 135 (days)

Plant height 150.5 32 - 252 66.3 - 210.9 (cm)

Parasitism late June (% infested 32 0 - 100 2 - 80 pods)

Pods per shoot 45.4 13.8 - 131.2 17.8 - 67.3 (annual production)

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Flowering onset (days) Plant height (cm) 240 b b .. 210 a 250 180 a a 200 a 150 b 120 150 b

90 100 60 50 30 0 0

LR CV PG PM LR CV PG PM

Infested pods (% late june) Pods per shoot .. 70 80 60 b 70 50 60 b b 50 ab 40 a 40 a 30 c c 30

20 20 10 10 0 0 LR CV PG PM LR CV PG PM

Figure 4. Population differences of the main quantitative traits for Ulex europaeus plants grown in a common garden. Population means (+ SE) are given. Flowering onset is given in days after September 1st . Pods per shoot represent the annual production. LR and CV are inland populations; PG and PM are coastal populations. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05). N=48 for populations LR and PG, N= 47 for populations CV and PM.

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Table 3. Narrow sense heritability (h²) considering maternal progenies as half-sibs, and compilation of the results from analyses of variances of 10 quantitative traits of Ulex europaeus in Brittany (France).

Significance of tested effects

Family Population Maternal type Variables h² + SD (d.f.=15) (d.f.=3) (d.f.=1)

F P F P F P Phenology Flowering onset 0.66 + 0.20 4.32 <10 -4 2.92 0.07 12.81 <0.01 Flowering duration 0.65 + 0.20 3.70 <10 -4 1.12 0.37 11.89 <0.01 Fruiting onset 0.63 + 0.20 3.58 <10 -4 5.02 <0.05 4.78 <0.05 Fruiting duration 0.59 + 0.20 2.93 <10 -3 2.34 0.12 1.94 0.18

Plant height 0.85 + 0.21 7.16 <10 -4 9.65 <10 -3 1.61 0.22

Parasitism rate Late June 0.59 + 0.20 3.44 <10 -4 7.59 <0.01 3.32 0.10 Over year 0.69 + 0.21 3.28 <10 -4 1.96 0.16 0.24 0.63

Annual production Pods per shoot 0.23 + 0.17 1.63 0.07 4.88 <0.05 3.61 0.08 Seeds per pod 0.17 + 0.16 1.45 0.13 2.54 0.09 0.65 0.43 Seeds per shoot 0.17 + 0.16 1.44 0.13 2.75 0.08 0.73 0.41

The heritability values and standard deviations were calculated using the method given by Falconer and Mackay (1996), with individuals of the same family considered to be half- sibs: h²= 4 x inter family-variance / total phenotypic variance, where variance were estimated using the IML2 option of SAS. The heritabilities obtained for the phenological variables, the plant heights and the parasitism rates were high, and the family effects of these traits was highly significant. In contrast, the pod and seed productions had a low heritability and their family effects were not significant (Table 3). The short-flowering plants produced slightly fewer pods per shoot in the year than the long-flowering ones (48.1 versus 39.8), but this difference was not significant (N=190, F=0.05, P=0.82). The seed production per shoot was also slightly higher for the short-flowering plants than for the long-flowering plants (108.2 versus 90.5), but again the difference was not significant (N=190, F=0.01, P=0.92). The proportion of infested pods over the year was similar in both types of plants: it was 0.314 for

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the short-flowering plants and 0.306 for the long-flowering plants, which is not significant (N=190, F=0.13, P=0.72).

Correlations between traits The correlations were calculated with the population of origin being as a covariable, and the genetic correlations were estimated by performing correlations between the family means. The phenotypic correlations between the four phenological traits were very high and very significant (Table 4). We therefore only retained one of these variables (flowering onset) to correlate with the others. Table 5 shows that the most significant correlation in both phenotypic and genetic terms is that between the flowering onset and the parasitism rate at the end of June. The later a family flowers, the higher its parasitism rate at the end of June. A more detailed analysis showed that the genetic correlation was significant for parasitism by weevils (R= -0.87, P<10 -4, Fig. 5A) but not for parasitism by moths (R=-0.39, P=0.096, Fig. 5B). There was also a negative correlation between the resistance to parasitism and the plant height, this correlation being stronger genetically than phenotypically: the tallest plants were the most heavily parasitised.

Table 4. Phenotypic correlations within phenological traits. Analyses were performed with population effects as covariable. Pearson correlation coefficient and P values are reported. N=190.

Flowering Fruiting Fruiting duration onset duration

-0.98 +0.59 -0.45 Flowering onset P<10 -4 P<10 -4 P<10 -4

+0.40 -0.89 Fruiting duration P<10 -4 P<10 -4

-0.54 Fruiting onset P<10 -4

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Table 5 . Phenotypic and among-family correlations between the main quantitative traits. Analyses were performed with population effects as covariable. Pearson correlation coefficient and P values are reported. Significant correlations appear in bold.

Phenotypic correlations (N=190) Among-family correlations (N=20)

Plant Parasitism Pods Plant Parasitism Pods height late June per shoot height late June per shoot

-0.12 -0.62 +0.04 -0.19 -0.848 +0.47 Flowering onset P=0.11 P<10 -4 P=0.59 P=0.439 P<10 -4 P=0.041

+0.09 -0.04 0.419 -0.149 Pods per shoot P=0.20 0.56 P=0.07 P=0.54

+0.213 +0.511 Parasitism late June P=0.01 P=0.02

18 90 16 B 80 A 14 70 12 60 10 50 8 40 6 30 4 20

pods infested by moths (%) 2 10 pods infested by weevils (%) 0 0 60 90 120 150 180 210 240 270 60 90 120 150 180 210 240 270 flowering onset flowering onset

Figure 5. Relation between seed predation and flowering onset of Ulex europaeus plants grown in a common garden. The percentages of infested pods were measured late June. The flowering onsets are given in days, with September 1 st as day 1. Each plot represents a family mean (N=20).

Discussion

Heritability and variability of the traits studied The results obtained in the common garden show that the phenological variability and growth of U. europaeus and also its resistance to seed predators, are mainly determined by genetic factors. The heritability values obtained are greater than 0.59 but must be interpreted with care. The calculation assumes that the individuals from the same families were in fact half-sibs whose fathers were drawn at random from the population, which is not necessarily true, because there could be assortative mating for phenology (e.g. Weiss 2005) or plant

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height (e.g. Levin & Kerster 1972), which would lead to an overestimation of heritability (Lynch & Walsh 1998). However, very highly significant family effects were found each time that the heritability value was high. These family effects cannot be explained by maternal effects, which especially influence the young stages and annual plants (Roach & Wulff 1987), whereas we worked on 4-year old perennial plants. All of our results therefore show a strong involvement of genes in the determinism of the variation in these life history traits. Most studies on flowering phenology have shown that it is at least partly genetically determined (see reviews in Putterill et al . 2004; Hendry & Day 2005). Heritabilities have rarely been measured, but those values that have been obtained are generally much lower than in our study (Hendry & Day 2005). In U. europaeus , the range of the variation in flowering season is exceptional. Even under uniform conditions, the flowering duration varies from 3 weeks to 8 months depending on individuals, and from 1 to 5 months depending on the families! Architectural variables are also genetically determined in many species (see review in Housman et al . 2002), and U. europaeus is especially remarkable for the range of variation observed. The individual plant height varied 8-fold for individuals; and 3-fold for families. Finally, we showed a high heritability for the parasitism rate, which at the end of June could vary from 2 to 80%, depending on the families. This genetic variation for the resistance of plants of insects is generally assumed to exist, but has rarely be proven in natural populations (Kennedy & Barbour 1992). Recent studies undertaken to test the EICA hypotheses have however shown genetic differences in resistance to insects between the native ranges and invaded areas (e.g. Wolfe et al . 2004; Joshi & Vrieling 2005). Only the annual production of pods and seeds per shoot were not heritable. The genetic variability for fecundity cannot in fact be stable, because the most fecund genotypes invade the population.

Determinism of the flowering types Our results suggest that there is a major gene that determines the long and short- flowering phenotypes. Indeed, the distributions of the dates of flowering onset in the offspring from the two types of mother were very different: the offspring of long-flowering mothers had a multimodal distribution, whereas the offspring of short-flowering mothers had a unimodal distribution. Furtheremore, the short-flowering mothers always reproduced their own kind, and exhibited no significant differences between families. This suggests that they were all of the same homozygous genotype. The strict association between a phenotype and a homozygote genotype implies that this phenotype is recessive. In contrast, the long-flowering

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mothers produced different offspring from one another (highly significant differences between families). This suggests that they can bear homozygous or heterozygous genotypes, and that their phenotype is dominant. It therefore seems the long and short-flowering phenotypes are under the control of a major gene, and that despite the difficulty of establishing relations of dominance in a hexaploid, the "long-flowering" phenotype is probably dominant, and the "short-flowering" phenotype probably recessive. Other genes could be involved to explain the variability observed, especially within the offspring of long- flowering mothers. The determinism of flowering is often simple and coded by a small number of genes (Putterill et al . 2004). In Poa annua, which has a perennial variety that flowers continuously and an annual variety that flowers in spring, hybridisation studies have shown the spring- flowering type is recessive and the continuous flowering variety dominant (Johnson & White 1998). This model is therefore very similar to ours, except that in U. europaeus the flowering dimorphism cannot be explained by a perennial/annual dimorphism. The source of the maintenance of this variability must therefore lie elsewhere.

Effect of the population of origin The variability observed in natural populations was also found in our common garden. The difference between the coastal and inland populations was particularly pronounced for plant height; the plants derived from mothers living by the sea were smaller than those living inland. The difference in height between coastal and inland plants described by Misset (1992) is therefore partly genetic, and reflects different ecotypes. The inland populations also gave offspring that flowered earlier, were more susceptible to parasites and produced fewer pods per shoot than the coastal populations. The differences observed in the offspring cultivated in identical conditions revealed genetic differences between populations, which were not the main subject of this study but which reflect the existence of different selection pressures. A genetic correlation between the traits can therefore reflect a correlation between the selective factors occurring in different environments. By using the populations as covariable, we overcame this possible artefact, which enabled us to investigate the genetic relations intrinsic to the traits that were studied.

Reproductive strategies The flowering onset and duration were independent of the plant height, at all phenological or genetic levels. The phenological and growth traits are not therefore

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determined by the same factors and do not respond to the same selection pressures. In contrast, the phenological traits are strongly correlated, both phenotypically and genetically, with the parasitism rate at the end of June. There are therefore genetic trade-offs between these characters: the families that flower later are those that are the least infested in June, especially by weevils. This suggests that these characters have co-evolved, leading to two different strategies: plants very vulnerable to seed predation but which escape predation in time (the long-flowering flowering ones), and plants that flower mainly in spring but are not very vulnerable to seed predation (the short-flowering ones). However, this resistance has a cost, since there is a negative genetic correlation between the resistance to parasites and the plant size. However, in our common garden, the annual production per shoot of these two types of plants was similar. The reproductive success of short and long-flowering plants depends on the predation pressure and the severity of the winter (Tarayre et al. 2006). Fluctuations between years in fitness can allow polymorphism to be maintained, but only in rather restrictive conditions (Gillespie 1991). Haldane and Jayakar (1963) showed that polymorphism can be stable if the variance in the reproductive success of the two phenotypes differs, and if the most variable phenotype is recessive. The long-flowering plants are often thought to be spreading the risks in the face of an unpredictable environment, either biotic (e.g. pollination in Bolmgren & Eriksson 2003) or abiotic (e.g. rain fall in Wolfe & Burns 2001), according to the strategy called "bet-hedging" by Slatkin (1974). For U. europaeus , the unpredictability involves the parasite pressure in the spring and the severity of the frost in winter. By flowering in two seasons, the long-flowering plants decrease the variance in their reproductive success between years. In contrast, the plants that only flower in spring have a reproductive success that is directly related to the biotic and abiotic conditions of a single season, and therefore have a greater variability between years. The recessive phenotype is therefore the one that has the most variable fitness, in accordance with the prediction of Haldane and Jayakar (1963). The conditions therefore exist for the maintenance of a polymorphism by fluctuations between years in selective pressures.

Conclusion

All of our findings suggest that in its native range U. europaeus has two genetically determined flowering strategies, whose coexistence is maintained by fluctuations between

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years in the parasitism rate. In recently invaded areas, U. europaeus was introduced without its parasite. The selection pressure caused by seed predators was therefore removed with at least two consequences. Firstly, a loss of resistance could have occurred, thereby eliminating its associated cost in terms of growth. Furthermore, as suggested by the EICA hypothesis, all the genetic diversity imported could have been subjected to selection in response to local conditions, such as the temperature and the availability of pollinators at various seasons. This has undoubtedly facilitated its adaptation to contrasting climatic conditions, and partly explains why it is one of the most invasive of exotic species in many parts of the world.

Acknowledgements This work was supported by a CNRS (ATIP) grant. We thank Thierry Fontaine for technical assistance, and Henry Britton for English translation. We are grateful to Luc Gigord and Agnès Schermann for helpful comments.

References

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ANNEXE 5. Premières observations des apions récoltés dans différentes populations en Bretagne (octobre 2003). Les apions ont été récoltés sur des ajoncs de différentes espèces. Les individus ont été placés dans des boites de pétri (5 à 10 individus par boite) avec des rameaux et/ou des fleurs et/ou des gousses d’ajonc (provenant de populations naturelles), afin de réaliser des observations préliminaires.

Observations en - Les apions se nourrissent des épines, des bourgeons floraux, des fleurs, rarement des gousses, et préfèrent laboratoire communes apparemment les bourgeons et les fleurs. aux deux espèces de - Ils se dirigent vers la lumière. charançon - Ils sont sensibles au bruit (s’arrêtent de bouger quand il y a du bruit à proximité). - Leurs antennes semblent jouer un rôle tactile de reconnaissance. - Les femelles les plus courtisées, présentent une absence de poils au niveau de l’abdomen, corre spondant aux parties où les pattes des mâles s’agrippent, ces femelles sont plus noires. - Ils s’attaquent à une chenille (la mordent) quand elle arrive vers eux.

Comportement en Apions collectés sur U. europaeus - Ils peuvent se retrouver sur U. europaeus , U. gallii ou U. minor , et s’en laboratoire : nourrir. - Ils semblent avoir une préférence pour U. europaeus et U. minor . - Accouplement observé, mais suivi de ponte non effectué. Apions collectés sur U. gallii - Ils peuvent se retrouver sur U. europaeus , U. gallii et s’en nourrir. ( U. minor non testé). - Ils semblent avoir une préférence pour U. gallii . - Accouplement observé, mais suivi de ponte non effectué. Apions collectés sur U. minor - Ils peuvent se retrouver sur U. europaeus ou U. minor , et s’en nourrir ( U. gallii non testé). - Ils semblent avoir une préférence pour U. minor. - Accouplement non observé

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ANNEXE 6. Récapitulatif des principales données obtenues pour l’association ajonc-apion en Bretagne, au cours de cette thèse.

AJONCS APIONS U. europaeus U. gallii U. minor E. ulicis E. lemovicinum Répartition géographique ubiquiste, plutôt côtier en sous-bois Plante-hôte ( in natura ) U. europaeus U. gallii , U. minor parfois souvent très souvent (U. gallii, U. minor ) sympatrique sympatrique sympatrique avec U. gallii ou avec avec U. U. minor U.europaeus europaeus Floraison Période printemps automne (août- automne (août- Nutrition des Parties parties végétatives et florales des ajoncs (mars-mai) janvier) décembre) adultes ( in attaquées Automne natura ) Abondance U. europaeus : U. europaeus : (octobre-février) d’apions sur élevée quasi-nulle les rameaux U. gallii : quasi-nulle U. gallii : élevée U. minor : élevée U. minor : faible Fructification Période printemps-été automne- automne- Reproduction Période de printemps automne (mars-juillet) printemps printemps ponte (avril-mai) (septembre- Automne- (août-mai) (septembre-mai) novembre) printemps (octobre-mai) Gousses / plante 500-5000 40-200 20-100 Plante-hôte U. europaeus (U. U. gallii ou U. minor gallii, U. minor ) Nutrition larves Graines d’ajonc Graines / gousse 3-4 2-3 1-2 Temps de court long saine développement (2-3 mois) (7-8 mois) % gousses Apions 50% 17% 8% % 38 31 ( U. gallii ) parasitées parasitoïdisme 58 ( U. minor ) Chenilles 25% ? ? Emergence été printemps 4 adultes / gousse 1 adulte / gousse parasitée parasitée Résistance au Point de -8,8°C -11,2°C -11,5°C Résistance au Stade passant stade adulte surtout stades froid surfusion des froid l’hiver immatures dans les gousses gousses, quelques adultes sur rameaux Potentialités de optimales en hiver optimales en résistance au automne froid

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Publications

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