Enzymatische Alkinfunktionalisierung Zur Markierung Und Identifizierung
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Enzymatische Alkinfunktionalisierung zur Markierung und Identifizierung von Protein-Methyltransferase-Substraten Von der Fakultat¨ f¨ur Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Gymnasiallehrerin Sophie Willnow aus Hattingen Berichter: Universitatsprofessor¨ Dr. Elmar Weinhold Universitatsprofessor¨ Dr. Bernhard L¨uscher Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 06. Juli 2012 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verf¨ugbar. Diese Arbeit wurde im Zeitraum von September 2008 bis Oktober 2011 am Institut f¨ur Orga- nische Chemie der Rheinisch-Westf¨alischen Technischen Hochschule Aachen (RWTH Aachen University) unter Anleitung von Prof. Dr. Elmar Weinhold und am Institut f¨ur Biochemie und Molekularbiologie des Universit¨atsklinikums Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. Bernhard L¨uscher angefertigt. Mein Dank gilt an erster Stelle Prof. Dr. Elmar Weinhold f¨ur die interessante interdisziplin¨are Themenstellung zwischen Chemie und Biologie, f¨ur das entgegengebrachte Vertrauen, auch eigene Ideen umsetzen zu k¨onnen, und f¨ur die vielen konstruktiven Diskussionen. Ich bedanke mich außerdem herzlich bei Prof. Dr. Bernhard L¨uscher f¨ur die vielen hilfreichen Anmerkungen und Einsch¨atzungen. Teile dieser Arbeit wurden bereits ver¨offentlicht: 1. W. Peters, S. Willnow, M. Duisgen, H. Kleine, T. Macherey, K. E. Duncan, D. W. Litch- field, B. L¨uscher, E. Weinhold. Enzymatic Site-Specific Functionalization of Protein Me- thyltransferase Substrates with Alkynes for Click Labeling. Angew. Chem. 2010, 122, 5296–5299; Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 5170–5173. 2. Y. Motorin, J. Burhenne, R. Teimer, K. Koynov, S. Willnow, E. Weinhold, M. Helm. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 2011, 39, 1943–1952. 3. S. Willnow, M. Martin, B. L¨uscher, E. Weinhold. A selenium-based click AdoMet analog for versatile substrate labeling with various protein methyltransferases. ChemBioChem 2012, 13, 1167–1173. Inhaltsverzeichnis Abk¨urzungsverzeichnis . .... V Drei- und Einbuchstaben-Code f¨ur Aminos¨auren . ........... VIII 1 Einleitung 1 1.1 PosttranslationaleModifikationanProteinen . ........... 1 1.1.1 Ubersicht¨ ¨uber posttranslationale Modifikationen . ...... 2 1.1.2 DieHistoncode-Hypothese. 3 1.2 MethylierungvonHistonenundanderen Proteinen . ......... 5 1.2.1 EnzymatischeMethylierung . 6 1.2.2 Lysinmethylierung ............................ 7 1.2.3 Argininmethylierung . 10 1.2.4 Demethylierungen ............................ 12 1.2.5 MethylierungvonNicht-Histonproteinen . ...... 14 1.3 S-Adenosyl-L-methioninundAnaloga . 16 1.3.1 Eigenschaften von S-Adenosyl-L-methionin. .. .. .. .. 16 1.3.2 SynthetischeAdoMet-Analoga. .. 17 1.4 BioorthogonaleMarkierungvonBiomolek¨ulen . ......... 22 1.4.1 ClickchemieundbioorthogonaleReaktionen . ...... 23 1.4.2 Die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC). 24 1.4.3 Anwendung bioorthogonaler Reaktionen in der Biologie........ 26 1.5 Methoden zum Auffinden von MTasen und ihren Substraten . ........ 27 2 Zielsetzung 29 3 Ergebnisse und Diskussion 30 3.1 DieModifikationsreaktion . ... 31 3.1.1 Uberpr¨ufung¨ der enzymatischen Ubertragung¨ . 32 3.1.2 Analyse von Cofaktoranaloga mit Selenonium-Zentrum ........ 34 3.2 Die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition (CuAAC) .......... 39 3.2.1 Synthese von TAMRA-Azid 34 ..................... 40 3.2.2 Bestimmung der optimalen Natriumascorbatkonzentration ....... 41 3.2.3 EinflussderAlkinkomponente . 43 I Inhaltsverzeichnis 3.2.4 VergleichverschiedenerLiganden . .... 44 3.2.5 Untersuchung zum Cu/THPTA (25)-Verh¨altnis . 47 3.2.6 InhibitiondurchThiole. 48 3.2.7 InhibitiondurchProteinlysat . .... 49 3.2.8 Analyse der CuAAC mit TAMRA-Alkin 50 ............... 51 3.3 DaszweistufigeMarkierungsverfahren . ....... 54 3.3.1 Dim-5................................... 55 3.3.1.1 SeAdoPropin (16) und SeAdoPropylazid (33) ........ 55 3.3.1.2 Analyse der Methylierung mit Hilfe von AdoEnIn (12) ... 56 3.3.1.3 Analyse der Sequenzspezifit¨at durch Methylierung ...... 56 3.3.1.4 Analyse der Sequenzspezifit¨at mit Histon H3-Varianten ... 58 3.3.2 Clr4.................................... 60 3.3.2.1 AdoEnIn(12) und SeAdoPropin (16)............. 60 3.3.2.2 MALDI-MS-Messungen der Modifikation von Histon H3 . 61 3.3.2.3 SeAdoPropin (16) und AdoPropin (11)............ 62 3.3.2.4 SeAdoPropin (16) und SeAdoPropylazid (33) ........ 64 3.3.2.5 Sequenzspezifit¨at von Clr4 mit SeAdoPropin (16) ...... 64 3.3.3 DieCuAACamalkinyliertenProtein . .. 67 3.3.3.1 AnalysederCuAACamalkinyliertenProtein . 67 3.3.3.2 DieCuAACinSDS-Probenpuffer. 68 3.3.3.3 DieCuAACinProteinlysat . 69 3.4 Zweistufige Substratmarkierung mit weiteren Methyltransferasen. 70 3.4.1 G9a.................................... 71 3.4.2 Set7/9................................... 71 3.4.2.1 AdoEnIn(12) und SeAdoPropin (16)............. 71 3.4.2.2 DasSubstratTAF10 . 72 3.4.2.3 OptimierungderMarkierungsreaktion . 72 3.4.2.4 Sequenzspezifit¨atvonSet7/9 . 74 3.4.3 PRMT1.................................. 75 3.4.3.1 DieSubstrateHistonH4undhnRNPK . 75 3.4.3.2 Sequenzspezifit¨atvonPRMT1 . 76 3.4.4 PrmC ................................... 77 3.5 Verkn¨upfung des Markierungsverfahrens mit Methoden der Proteomforschung . 79 3.5.1 Substratanalyseim2D-Gel. 80 3.5.2 Substratanalyse mit Isolierung durch Magnetpartikel.......... 83 3.5.2.1 IsolierenvonaufgereinigtemSubstratRF1 . ... 83 3.5.2.2 IsolierenvonRF1ausLysat . 84 3.5.2.3 Massenspektrometrische Analyse isolierter Proteine ..... 88 II Inhaltsverzeichnis 3.5.3 SubstratanalysemiteinemProteinarray . ...... 91 3.5.3.1 MarkierungsreaktionaufTestarrays . .. 92 3.5.3.2 MarkierungsreaktionaufdemProteinarray . ... 94 4 Zusammenfassung 98 4.1 AnalysederenzymatischenModifikation . ...... 99 4.2 AnalysederCuAAC ............................... 99 4.3 Analyse des zweistufigen Markierungsverfahrens . .......... 99 4.4 Substrat-MarkierungmitweiterenMTasen . ........ 100 4.5 Verkn¨upfung des Markierungsverfahrens mit Methoden der Proteomforschung . 101 5 Ausblick 102 6 Experimenteller Teil 104 6.1 VerwendeteMaterialien. 104 6.1.1 Chemikalien ............................... 104 6.1.2 S-Adenosyl-L-methioninundsynthetischeAnaloga . 106 6.1.3 Restriktionsendonucleasen(REasen) . ...... 106 6.1.4 Marker .................................. 106 6.1.5 Plasmide ................................. 106 6.1.6 Bakterienst¨amme (Escherichia coli)................... 108 6.1.7 NachweisreagenzienundKits . 109 6.1.8 SonstigeVerbrauchsmaterialien . .. 109 6.2 InstrumentelleMethoden . 109 6.2.1 VerwendeteGer¨ate . .. .. .. .. .. .. .. .. 109 6.2.2 FPLC(Fast protein liquid chromatography)............... 111 6.2.3 rp-HPLC (Reversed-phase high performance liquid chromatography) . 111 6.2.4 NMR-Spektroskopie . 113 6.2.5 Massenspektrometrie. 113 6.3 ChemischeMethoden............................... 113 6.3.1 D¨unnschichtchromatographie(DC) . .. 113 6.3.2 S¨aulenchromatographie. 113 6.3.3 Arbeiten unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss . .......... 113 6.4 ChemischeSynthesen. .. .. .. .. .. .. .. .. 114 6.4.1 TAMRA-Azid 34 ............................. 114 6.4.2 BODIPY-FL-Azid 56 ........................... 115 6.4.3 TAMRA-Alkin 50 ............................ 115 6.5 MolekularbiologischeMethoden . ..... 120 6.5.1 AnzuchtderBakterien . 120 III Inhaltsverzeichnis 6.5.2 Herstellung kompetenter E.coli-ZellenzurElektroporation. 120 6.5.3 Transformation elektrokompetenter E.coli-Zellen. 121 6.5.4 AmplifikationundReinigungvonPlasmid-DNA . .. 121 6.5.5 Agarose-Gelelektrophorese. 121 6.5.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) . ......... 121 6.5.7 F¨arbemethodenf¨urSDS-PAGE-Gele . 123 6.5.8 Analyse biotinylierter Proteine mittels Western Blot .......... 123 6.5.9 Aufnahme fluoreszierender Proteine im SDS-PAGE-Gel . ....... 124 6.5.10 KonzentrationsbestimmungvonProteinen . ....... 124 6.5.11 F¨allungvonProteinen . 124 6.5.12 DialysevonProteinen . 124 6.5.13 Herstellung von E.coli-Lysaten ..................... 125 6.6 ProteinexpressionundIsolierung . ....... 126 6.6.1 Dim-5................................... 126 6.6.2 H3-Varianten ............................... 126 6.6.3 Clr4.................................... 127 6.6.4 Set7/9................................... 128 6.6.5 TAF-10 .................................. 128 6.6.6 PrmC,RF1undRF2 ........................... 129 6.7 BiochemischeMethoden . 130 6.7.1 Analyseder enzymatischenPeptidmodifikation . ....... 130 6.7.2 Analyse der CuAAC durch rp-HPLC .................. 130 6.7.3 Zweistufiges Markierungsverfahren von Proteinen . ........ 132 6.7.4 AnalysederSequenzspezifit¨at derMarkierung . ....... 133 6.7.5 MTase-Substratanalyseim2D-Gel . 134 6.7.6 MTase-Substratanalyse mit Isolierung durch Magnetpartikel . 134 6.7.7 MTase-Substratanalyse auf einem Proteinarray . ........ 136 A Anhang 138 A.1 Massenspektren der neu synthetisierten Verbindungen . ............. 138 A.2 GelederProteinaufreinigung . ..... 141 A.3 DatendesProteinarrays. 145 Literaturverzeichnis 149 Danksagung 166 Lebenslauf 167 IV Abk ¨urzungsverzeichnis Abb. Abbildung AdoHcy S-Adenosyl-L-homocystein AdoMet S-Adenosyl-L-methionin ADP Adenosindiphosphat Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat Aq.¨ Aquivalent(e)¨ ATP Adenosintriphosphat BCCP Biotin carboxyl carrier protein, biotinyliertes Protein aus E. coli Bis-Tris bis-(2-Hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan bp Basenpaar(e) BSA