Untersuchung Von Transkriptionsunterschieden in Retina Und Gehirn Des Ccdc66-Defizienten Mausmodells

Aus der Abteilung für Humangenetik an der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen

Untersuchung von Transkriptionsunterschieden in Retina und Gehirn des Ccdc66-defizienten Mausmodells

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Elke Porrmann-Kelterbaum aus Gelsenkirchen 2017

Dekan: Prof. Dr. med. Albrecht Bufe Referent: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Eiben

Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2018

Meinen Kindern Meike, Sarah, Kristina und Tim

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...... 9

1.1 Retinitis pigmentosa ...... 9

1.2 Die Retina der Wirbeltiere ...... 11

1.2.1 Aufbau der Retina ...... 11

1.2.2 Photorezeptorzellen ...... 14

1.2.3 Retinale Gliazellen ...... 15

1.3 Die Retina der Maus als Modellsystem für retinale Erkrankungen ...... 17

1.3.1 Histologische Merkmale ...... 17

1.3.2 Prä- und postnatale Entwicklung der Retina ...... 18

1.4 Das Ccdc66-/--Mausmodell für retinale Degeneration ...... 20

1.4.1 Die Ccdc66-defiziente Maus ...... 20

1.4.2 Ccdc66-Genexpression in Retina und Gehirn ...... 21

1.5 Transkriptionsunterschiede in Retina und Gehirn der Ccdc66-/--Maus ...... 23

1.5.1 Genexpression in Retina und Gehirn der Ccdc66-/--Maus ...... 23

1.5.2 Kandidatengene für weitere Untersuchungen ...... 25

2 Aufgabenstellung und Zielsetzung ...... 26

3 Material und Methoden ...... 28

3.1 Versuchstiere ...... 28

3.2 Material ...... 28

3.2.1 Enzyme ...... 28

3.2.2 Größenstandards ...... 28

3.2.3 Oligonukleotide ...... 29

3.2.4 Antikörper ...... 29

3.2.5 Reaktionskits ...... 30

3.2.6 Geräte ...... 30

3.2.7 Chemikalien und Lösungen ...... 30

3.2.8 Software ...... 32

3.2.9 Datenbanken ...... 32

3.3 Methoden ...... 32

3.3.1 Genotypisierung ...... 32

3.3.1.1 DNA-Isolation ...... 32

3.3.1.2 DNA-Amplifikation mittels PCR ...... 33

3.3.1.3 Agarosegel-Elektrophorese ...... 34

3.3.2 Gewebepräparation ...... 36

3.3.3 Anfertigung der Gefrierschnitte ...... 36

3.3.4 Herstellung der RNA-Sonden ...... 36

3.3.4.1 RNA-Isolation ...... 37

3.3.4.2 Herstellung von cDNA mittels reverser Transkription ...... 37

3.3.4.3 Amplifikation der Sondenvorlagen mittels PCR ...... 38

3.3.4.4 Elektrophoretische Auftrennung der Sondenvorlagen ...... 40

3.3.4.5 Aufreinigung der Sondenvorlagen ...... 41

3.3.4.6 Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden ...... 42

3.3.5 In-situ-Hybridisierung ...... 46

4 Ergebnisse ...... 49

4.1 RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 49

4.1.1 Serpina3n-RNA-Expression in der Maus-Retina...... 49

4.1.2 Gm12541-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 50

4.1.3 Antxr2-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 52

4.1.4 Pcolce-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 53

4.1.5 Gadd45b-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 54

4.1.6 Edn2-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 55

4.1.7 Optc-RNA-Expression in Retina und Ziliarkörper der Maus ...... 56

4.1.8 Rpe65-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 64

4.1.9 Rho-RNA-Expression in der Maus-Retina ...... 65

4.1.10 Zusammenfassung der Ergebnisse (Retina) ...... 66

4.2 Zerebrale RNA-Expression der untersuchten Gene in der Maus ...... 68

4.2.1 Optc-RNA-Expression im Gehirn der Maus ...... 68

4.2.2 Pcolce-, Antxr2- und Gm12541-Expression im Gehirn der Maus ...... 70

4.2.3 Serpina3n-, Edn2- und Gadd45b-Expression im Gehirn der Maus ...... 70

4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse (Gehirn) ...... 73

5 Diskussion ...... 75

5.1 Gene der zellulären Stressantwort ...... 76 2

5.2 Gadd45b im Kontext der Neuroprotektion ...... 79

5.3 Gene der extrazellulären Matrix ...... 80

5.3.1 Auswirkung erhöhter retinaler Optc-Expression ...... 81

5.3.2 Antxr2- und Pcolce-Expression und Umbauprozesse der Extrazellularmatrix ... 85

5.4 Optc-, Edn2- und Serpina3n-Expression im Gehirn ...... 88

5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ...... 89

6 Zusammenfassung ...... 93

7 Literaturverzeichnis ...... 96

Abkürzungsverzeichnis *

Antxr2 anthrax toxin receptor 2 AP alkalische Phosphatase ATP Adenosintriphosphat BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat βgeo β-Galaktosidase/Neomycin-Fusionsgen BMP-1 bone morphogenetic protein 1 bp Basenpaare BSA bovines Serumalbumin Ca Calcium Ccdc66 coiled coil domain containing 66 CA Cornu Ammonis Ccdc66-/- coiled coil domain containing 66-defizienter Mausstamm Ccdc66+/+ coiled coil domain containing 66-Wildtyp cDNA complementary (komplementäre) DNA Cmg2 capillary morphogenesis gene-2 CUB complement C1r/C1s, UEGF, BMP-1 CTP Cytidintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbamid DG Gyrus dendatus DIG Digoxigenin DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat dT Desoxythymin E embryonaler Tag Edn2 endothelin 2 EDTA Ethylendiamintretraessigsäure EPL external plexiform layer (externe plexiforme Schicht) FGF-2 fibroblast growth factor 2 Fgf2os fibroblast growth factor 2 opposite strand Fwd forward Gadd45b growth arrest and DNA-damage inducible, beta GAG Glykosaminoglykan GCL ganglion cell layer (Ganglienzellschicht) GDP Guanosindiphosphat GL glomerular layer (glomeruläre Schicht) gPRA generalisierte progressive Retinaatrophie Grl granule layer (Körnerzellschicht) h Stunde HCl Salzsäure Ig Immunglobulin ILM inner limiting membrane (innere Grenzschicht) INL inner nuclear layer (innere Körnerschicht) IPL inner plexiform layer (innere plexiforme Schicht) IRBP retinol binding proteins IS inner segments (Innensegmente) ISH in-situ-Hybridisierung K Kalium kDa Kilodalton M molar mg Milligramm µg Mikrogramm MgCl2 Magnesiumchlorid min Minuten 4

ML mitral layer (Mitralzellschicht) ml Milliliter µl Mikroliter mM millimolar µM mikromolar mRNA messenger RNA MT1-MMP membrane-type 1 matrix metalloproteinase mTOR mechanistic target of rapamycin Na Natrium Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxid NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid NCBI National Center for Biotechnology Information NFL nerve fiber layer (Nervenfaserschicht) ng Nanogramm NO Stickstoffmonoxid NTR Netrin OlfNL olfactory nerve layer (Schicht der Riechnervenfasern) OML outer limiting membrane (äußere Grenzschicht) ONL outer nuclear layer (äußere Körnerschicht) OPL outer plexiform layer (äußere plexiforme Schicht) Optc opticin OS outer segments (Außensegmente) P postnataler Tag PBS phosphate buffered saline PBST phosphate buffered saline with tween Pcolce procollagen C-proteinase enhancer Pcpe procollagen C-proteinase enhancer PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) Pde6b phosphodiesterase subunit beta PFA Paraformaldehyd PL polymorphic layer (polymorphe Schicht) PRA progressive retinale Atrophie rd retinal degeneration RdCVF rod-derived cone viability factor Rev reverse RNA Ribonukleinsäure ROS reactive oxygen species RP Retinitis pigmentosa RPE retinal pigment epithelium (Pigmentepithelschicht) Rpe65 retinal pigment epithelium 65 gene rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT reverse Transkriptase sec Sekunde Serpina3n serine peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3N SLRP small leucine-rich repeat protein SRY sex determing region of Y SSC saline-sodium citrate ssRNA single strand RNA TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TEA Triethanolamin

tRNA transfer RNA U unit UCSC University of California, Santa Cruz UEGF embryonic sea urchin protein UTP Uridintriphosphat V Volt vWA von Willebrandfaktor Typ A WT Wildtyp

* Gennamen in kursiven Schriftzeichen, Proteinnamen in regulären Schriftzeichen

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Schematischer Aufbau des menschlichen Auges ...... 11 Abb. 1.2: Lichtmikroskopische und schematische Darstellung der Retinaschichten ...... 12 Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Stäbchen- und Zapfenzellen ...... 14 Abb. 1.4: Schematische Darstellung retinaler Gliazellen und neuronaler Zellen ...... 16 Abb. 1.5: Zeitlicher Verlauf der Neurogenese in der Mausretina ...... 18 Abb. 1.6: Die „Genfalle“ des Ccdc66-Gens ...... 20 Abb. 1.7: Ccdc66-Expression in der Retina der Maus (P17) ...... 22 Abb. 3.1: Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese ...... 36 Abb. 3.2: Überprüfung der Länge der Sondenvorlagen mittels Agarose-Gelelektrophorese .... 41 Abb. 3.3: Überprüfung der Länge der RNA-Sonden mittels Agarose-Gelelektrophorese ...... 44 Abb. 3.4: Dot blots zur Überprüfung der Markierungseffizienz der RNA-Sonden ...... 45 Abb. 4.1: Serpina3n-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 50 Abb. 4.2: Gm12541-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 51 Abb. 4.3: Antxr2-RNA Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 52 Abb. 4.4: Pcolce-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 53 Abb. 4.5: Gadd45b-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 54 Abb. 4.6: Edn2-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 56 Abb. 4.7: Optc-RNA-Expression am Ziliarkörper der Maus (P10) ...... 57 Abb. 4.8: Optc-RNA-Expression am Ziliarkörper der Maus (P28) ...... 57 Abb. 4.9: Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P10) ...... 59 Abb. 4.10: In-situ-Hybridisierung der Optc-Sense-Sonde in der Maus-Retina (P10) ...... 60 Abb. 4.11: Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 61 Abb. 4.12: Optc-RNA-Expression in der Ccdc66-defizienten Maus-Retina (P4, P10, P17) ...... 62 Abb. 4.13: Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P4) ...... 63 Abb. 4.14: Rpe65-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 64 Abb. 4.15: Rho-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) ...... 65 Abb. 4.16: Optc- Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) ...... 69 Abb. 4.17: Optc-Expression in der Hippocampusformation der Maus (P28) ...... 70 Abb. 4.18: Serpina3n-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) ...... 71 Abb. 4.19: Edn2-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) ...... 72 Abb. 4.20: Gadd45b-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) ...... 73

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1: Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene in Retina und Gehirn ...... 24 Tab. 1.2: Kandidatengene für weitere Untersuchungen ...... 25 Tab. 3.1: Enzyme ...... 28 Tab. 3.2: Größenstandards ...... 28 Tab. 3.3: Oligonukleotide ...... 29 Tab. 3.4: Antikörper ...... 29 Tab. 3.5: Reaktionskits ...... 30 Tab. 3.6: Geräte ...... 30 Tab. 3.7: Chemikalien und Lösungen ...... 30 Tab. 3.8: Software ...... 32 Tab. 3.9: Datenbanken ...... 32 Tab. 3.10: PCR-Ansätze für die Genotypisierung und Geschlechtsbestimmung ...... 34 Tab. 3.11: PCR-Bedingungen zur Genotypierung und Geschlechtsbestimmung ...... 34 Tab. 3.12: Lösungen für die elektrophoretische Auftrennung der Amplifikate ...... 35 Tab. 3.13: Reaktionsansätze für die cDNA-Synthese ...... 38 Tab. 3.14: PCR-Ansätze der Sondenvorlagen-Amplifikation ...... 39 Tab. 3.15: PCR-Programm Optc, Serpina3n, Gm12541, Rho, Rpe65 ...... 39 Tab. 3.16: PCR-Programm Edn2, Pcolce, Antxr2, Gadd45b ...... 40 Tab. 3.17: Längen der Sondenvorlagen ...... 40 Tab. 3.18: Lösungen für die gelelektrophoretische Auftrennung der Sondenvorlagen ...... 41 Tab. 3.19: Reaktionsansatz zur Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden ...... 42 Tab. 3.20: Lösungen für die gelelektrophoretische Auftrennung der markierten RNA-Sonden . 43 Tab. 3.21: Lösungen für den Dot blot...... 45 Tab. 3.22: Lösungen für die in-situ-Hybridisierung ...... 48 Tab. 4.1: Zusammenfassung der retinalen RNA-Expression...... 66 Tab. 4.2: Zusammenfassung der RNA-Expression im Bulbus olfactorius (P28) ...... 74

1 Einleitung Die Retinitis pigmentosa des Menschen gehört zu den erblichen degenerativen Erkrankungen der Retina, die durch eine Mutation in einem von zur Zeit über 200 bekannten Genen verursacht werden (Genes and Loci Causing Retinal Diseases, verfügbar unter Retinal Information Network, RetNet). Die generalisierte progressive Retinaatrophie (gPRA) stellt das canine Äquivalent zur Reti- nitis pigmentosa des Menschen dar. In der Rasse der Schapendoes-Hunde wurde eine Mutation des Gens CCDC66 (coiled coil domain containing 66) als Ursache einer autosomal-rezessiven Form der gPRA nachgewiesen (Dekomien et al., 2010). Homozygote Ccdc66-defiziente Mäuse, bei denen durch Einsatz einer „Gen- falle“ die Expression des Ccdc66-Gens und des CCDC66-Proteins unterbunden wird, zeigen bereits im Alter von 13 Tagen initiale Degeneration der Photo- rezeptorzellen, auf die eine langsam progrediente retinale Degeneration folgt (Gerding et al., 2011). Daher eignet sich das Ccdc66-/--Mausmodell zur Unter- suchung von retinalen Degenerationsprozessen, deren Mechanismen mög- licherweise auch am Krankheitsbild der Retinitis pigmentosa des Menschen grundlegend beteiligt sind.

1.1 Retinitis pigmentosa Die Retinitis pigmentosa des Menschen umfasst eine Gruppe von erblichen Retinopathien, die durch den Verlust von Photorezeptorzellen und durch retinale Pigmentablagerungen gekennzeichnet sind (Hamel, 2006). In der Mehr- zahl der Fälle tritt primär eine Degeneration der Stäbchenphotorezeptorzellen auf, der eine sekundäre Degeneration der Zapfenphotorezeptorzellen folgt. In einigen Fällen wird eine gleichzeitige Degeneration beider Photorezeptorzell- typen beobachtet. Seltener beginnt die Zapfendegeneration vor der Stäbchen- degeneration (Hartong et al., 2006). Die Hauptsymptome der Retinitis pigmentosa sind initiale Nachtblindheit aufgrund der Degeneration der Stäbchenrezeptorzellen und progredienter Verlust des peripheren Gesichtsfeldes bei Tageslicht („Tunnelblick“) bis zur vollständi- gen Erblindung. Der Augenhintergrund der betroffenen Patienten zeigt intrareti- 9

nale Melaninablagerungen in Form von Knochenbälkchen, den zunehmenden Pigmentverlust des retinalen Pigmentepithels und eine Verengung der retinalen Arteriolen, die eine sekundäre Veränderung und keine Ursache der Erkrankung zu sein scheint (Fahim et al., 2013). Der Vererbungsmodus der Retinitis pigmentosa kann autosomal-dominant, autosomal-rezessiv oder X-chromosomal sein. Die autosomal-dominanten For- men zeigen einen milderen Verlauf. Bei den autosomal-rezessiven und X-chro- mosomalen Vererbungsmodi beginnen die Retinaveränderungen bereits wäh- rend der ersten zehn Lebensjahre. Außerdem ist eine digenische Form bekannt, bei der eine Kombination von Mutationen in zwei Genen im heterozygo- ten Zustand vorliegt. In einigen wenigen Fällen von Retinitis pigmentosa wurde eine Mutation mitochondrialer DNA nachgewiesen (Hamel, 2006). Die Komple- xität der Retinitis pigmentosa zeigt sich in ihrer genetischen Heterogenität mit mehr als 60 verschiedenen Genen und in ihrer allelischen Heterogenität mit an- nähernd 3100 Mutationen in den betroffenen Genen (Daiger et al., 2013). Die Produkte der mit der Retinitis pigmentosa assoziierten Gene sind in den Stäbchenphotorezeptorzellen an unterschiedlichen Prozessen beteiligt. Unter ihnen sind Proteine, die an Prozessen der Phototransduktion, an Auf- und Um- bauprozessen des Zytoskeletts, an intrazellulären Stofftransporten, an der Zell- differenzierung und an mRNA-Spleißvorgängen teilhaben. Andere Genprodukte sind am Lipid-, Nukleotid- und Vitamin A-Stoffwechsel, an interzellulären Signal- wegen und an synaptischen Interaktionen beteiligt (Hamel, 2006). Die Retinitis pigmentosa wird auch durch Mutationen in Genen verursacht, die im retinalen Pigmentepithel und in der Choriokapillaris exprimiert werden. Die Produkte dieser Gene sind an der Regulierung des pH-Wertes, an dem Retinol-Metabo- lismus und an der Phagozytose der Außensegmente beteiligt (Hamel, 2006; Hartong et al., 2006). Trotz der genetischen Heterogenität zeigt die Retinitis pigmentosa zumeist einen relativ homogenen Phänotyp, der sich in der primären Degeneration der Stäbchenzellen äußert. Photorezeptorzellen benötigen eine Homöostase des Extra- und Intrazellularraums, deren Veränderung zu Apopto- se und Degeneration führt (Hamel, 2006). Stäbchenrezeptorzellen produzieren Faktoren, die für das Überleben der Zap- fenrezeptorzellen notwendig sind. Die Degeneration der Zapfenrezeptorzellen, die ein mutiertes Gen nicht exprimieren, kann daher eine Folge der fehlenden

Produktion trophischer Faktoren wie z.B. RdCVF (rod-derived cone viability factor) aufgrund der Stäbchendegeneration sein (Koenekoop, 2009). Die Beob- achtung, dass in Mausmodellen für Retinitis pigmentosa Zapfenrezeptorzellen aufgrund nutritiver Defekte und Autophagie unter Vermittlung des Insu- lin/mTOR-Signalwegs degenerieren, lässt eine Beteiligung von Stäbchenrezep- torzellen an der Glucose-Versorgung der Zapfenrezeptorzellen vermuten (Pun- zo et al., 2009).

1.2 Die Retina der Wirbeltiere

1.2.1 Aufbau der Retina In der Retina, die als innere Schicht den Augapfel auskleidet, erfolgt nach Ab- sorption von Photonen die Übersetzung in elektrochemische Signale und die neuronale Informationsverarbeitung.

Abb. 1.1: Schematischer Aufbau des menschlichen Auges N: nasal, T: temporal (aus Lüllmann-Rauch, 2009)

Die Retina besteht aus Photorezeptorzellen (Zapfen und Stäbchen), die als erstes Neuron der Sehbahn fungieren, aus Bipolarzellen, die als zweites Neu- 11

ron die Signale der Photorezeptorzellen an die Ganglienzellen (drittes Neuron) weiterleiten, aus Horizontalzellen und amakrinen Zellen, die als Interneurone laterale Verbindungen herstellen, und aus Gliazellen (Lüllmann-Rauch, 2009). Aufgrund der Anordnung dieser Zellen sind lichtmikroskopisch unterschiedliche Schichten zu erkennen: die Pigmentepithelschicht (RPE, retinal pigment epithelium), die Schicht der Photorezeptorfortsätze (OS, outer segments; IS, inner segments), die äußere Körnerschicht (ONL, outer nuclear layer), die äußere plexiforme Schicht (OPL, outer plexiform layer), die innere Körnerschicht (INL, inner nuclear layer), die innere plexiforme Schicht (IPL, inner plexiform layer), die Ganglienzellschicht (GCL, ganglion cell layer) und die Nervenfaserschicht (NFL, nerve fiber layer).

Abb. 1.2: Lichtmikroskopische und schematische Darstellung der Retinaschichten links: Mausretina (Richardson-Färbung) (modifiziert nach Treuting, 2012) rechts: schematische Darstellung der Retinazellen (modifiziert nach Dyer und Cepko, 2001) S Sklera, CP Choroidea, PE Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, ONL äußere Körnerschicht, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere Körnerschicht, IPL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzellschicht, NF Nervenfaserschicht

Die Zellen des Pigmentepithels (RPE) enthalten Melanosomen, deren Pigment (Melanin) Lichtreflexionen verhindert, und Phagosomen für den Abbau von Membranen der Photorezeptoraußensegmente. Über seine basolaterale Mem- bran ist das RPE mit der Bruch-Membran verbunden, einer 2 µm dicken Schicht aus elastischen Fasern und Kollagenfibrillen. Sie stellt eine enge Verbindung 12

der Retina mit der Choriokapillaris her, die ein Netz aus Kapillaren enthält, das für die Versorgung der äußeren Retinaschichten wichtig ist (Lüllmann-Rauch, 2009). Beim Stoffaustausch zwischen der Choriokapillaris und den Photorezep- toren bilden die Tight junctions zwischen den Epithelzellen des RPE einen wich- tigen funktionellen Teil der Blut-Retina-Schranke. Die apikale Seite der Pig- mentepithelzellen grenzt an den subretinalen Raum, dessen Extrazellularmatrix die Interaktionen zwischen dem RPE und den Außensegmenten der Photore- zeptorzellen unterstützt. Eine weitere Funktion des RPE ist die Regeneration des Sehpigments Retinal (Strauss, 2011). An das RPE grenzt die Schicht der Photorezeptorfortsätze. Die Außen- und In- nensegmente der Zapfen- und Stäbchenphotorezeptorzellen erstrecken sich in den subretinalen Raum, wo sie von den apikalen Fortsätzen der Pigmentepi- thelzellen umschlossen werden. Die Innen- und Außensegmente sind durch ein Zilium, bestehend aus neun Mikrotubuli-Dubletten ohne zentrale Mikrotubuli, verbunden (Kolb, 2005a). Der subretinale Raum wird von der eigentlichen neuronalen Retina durch die äußere Grenzschicht abgegrenzt. Diese wird durch Zonulae adhaerentes zwischen den nach außen gerichteten Zellfortsätzen der Müllerzellen und den inneren Segmenten der Photorezeptoren gebildet (Kolb, 2005b). In der äußeren Körnerschicht liegen die Perikaryen der Photorezeptorzellen. Die Zellkörper der Stäbchen befinden sich unterhalb der Zapfenzellkörper. Die synaptische Verbindung der Axone der Photorezeptorzellen (1. Neuron) mit den vertikal verlaufenden Fortsätzen der Bipolarzellen (2. Neuron) sowie den horizontal verlaufenden Fortsätzen der Horizontalzellen erfolgt in der äußeren plexiformen Schicht. Die Perikaryen der Bipolarzellen bilden zusammen mit denen der Horizontalzellen, der amakrinen Zellen und der Müllerzellen die innere Kör- nerschicht. Die Synapsen zwischen den Axonen der Bipolarzellen und den Den- driten der Ganglienzellen (3. Neuron) liegen in der inneren plexiformen Schicht. Interaktionen mit den horizontal und vertikal verlaufenden Fortsätzen von amakrinen Zellen modifizieren die Erregungsweiterleitung (Lüllmann-Rauch, 2009). In der Ganglienzellschicht liegen die Perikaryen der Opticusganglienzellen (3. Neuron) sowie die Zellkörper von amakrinen Zellen, die nach innen verlagert sind. Die marklosen Axone der Ganglienzellen ziehen in der Nervenfaserschicht zur Sehnervpapille, wo sie sich zum Nervus opticus vereinen.

Die neuronale Retina wird gegen den Glaskörper des Auges durch die innere Grenzmembran abgegrenzt. Diese wird von den Endfüßen der Müllerzellen- fortsätze und der assoziierten Basalmembran gebildet und fungiert als Diffu- sionsbarriere (Kolb, 2005b).

1.2.2 Photorezeptorzellen Die Photorezeptorzellen sind die lichtempfindlichen Zellen der Retina, in denen das Licht, nachdem es die inneren Schichten der Retina durchquert hat, in ein Rezeptorpotential umgewandelt wird. Aufgrund der unterschiedlichen Form ihrer Fortsätze (Innen- und Außensegment) werden sie als Stäbchen- und Zap- fenzellen bezeichnet.

Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Stäbchen- und Zapfenzellen Die Außensegmente enthalten Stapel von Membranscheiben, in die das Sehpigment eingelagert ist. In den Innensegmenten befinden sich Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat (modifiziert nach Veleri et al., 2015).

Die Außensegmente sind mit Membranstapeln angefüllt, die das Sehpigment, bestehend aus Opsin und einem Chromatophor, und andere an der Phototrans-

duktion beteiligte Komponenten enthalten. In den Stäbchenaußensegmenten liegen die Membranscheiben vollständig intrazellulär. Bei den Zapfenaußenseg- menten werden sie durch Einstülpungen der Plasmamembran gebildet (Fu, 2010). Die Innensegmente enthalten das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Apparat und zahlreiche Mitochondrien, um den hohen Energiebedarf der Phototransduktion zu decken. Die Proteine, die an der Phototransduktion beteiligt sind, werden in den Innensegmenten synthetisiert und durch das verbinden- de Zilium transportiert (Deretic et al., 1995). Die Außensegmente der Zapfen- und Stäbchenzellen werden kontinuierlich erneuert. Proximal gebildete Mem- branen ersetzen die an den apikalen Spitzen abgestoßenen Membranscheiben, die von den Zellen des Pigmentepithels Integrin-vermittelt aufgenommen und phagozytiert werden (Lüllmann-Rauch, 2009). In der Wirbeltier-Retina gibt es verschiedene Typen von Zapfenzellen, die durch das Opsin der Außensegmente und dessen maximale spektrale Sensitivität un- terschieden werden. Sie ermöglichen photopisches Sehen. Die menschliche Retina besitzt drei und die Mausretina zwei verschiedene Zapfentypen (Veleri et al., 2015). Bei den Stäbchenphotorezeptorzellen, die skotopisches Sehen vermitteln, gibt es nur einen einzigen Typ. Die Außensegmente enthalten als Sehpigment Rhodopsin, bestehend aus Opsin und dem Chromatophor 11-cis- Retinal, das kovalent an ein Lysin des Opsin bindet und das von dem Pigment- epithel mittels Carriermoleküle (IRBP, retinol binding proteins) zu den Außen- segmenten gelangt (Chader, 1989).

1.2.3 Retinale Gliazellen In der Retina gibt es drei Arten von Gliazellen: Müllerzellen, Astrozyten und Mikrogliazellen. Die Ausläufer der Müllerzellen, deren Zellkörper in der inneren Körnerschicht liegen, sind an der Bildung der inneren und äußeren Grenz- schicht beteiligt, und sie umschließen die Zellkörper der Neurone in den Körner- schichten sowie die neuronalen Fortsätze in den plexiformen Schichten. Müller- zellen unterstützen die metabolischen Prozesse in den Neuronen, indem sie diese mit Substraten des Energiestoffwechsels und mit Vorstufen der Neuro- transmitter versorgen (Vecino et al., 2015). Sie regulieren die Ionen-Konzen- tration des Extrazellularraumes, indem sie extrzelluläre K+-Ionen aufnehmen und an das Blut oder den Glaskörper abgeben (Kolb, 2001). 15

Abb. 1.4: Schematische Darstellung retinaler Gliazellen und neuronaler Zellen BV Blutgefäß, A amakrine Zellen, As Astrozyten, B Bipolarzellen, C Zapfenzellen, G Ganglien- zellen, H Horizontalzellen, M Müllerzellen, Mi Mikrogliazellen, R Stäbchenzellen, Ch Choroidea, PE Pigmentepithel, OS Außensegmente, ONL äußere Körnerschicht, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzellschicht, NF Nervenfaserschicht, ON Nervus opticus (aus Vecino et al., 2015)

Außerdem üben die Müllerzellen in der invertiert aufgebauten Retina die Funk- tion eines Lichtleiters aus. Die Gesamtheit der Müllerzellen bildet eine lichtlei- tende Struktur, mit deren Hilfe die Streuung des Lichts, das alle Retinaschichten durchqueren muss, um zu den Photorezeptoren zu gelangen, auf ein Minimum beschränkt wird (Franze et al., 2007). Während Müllerzellen alle Retinaschichten durchziehen, sind die Zellkörper der Astrozyten und ihre Ausläufer hauptsächlich in der Nervenfaserschicht zu finden (Watanabe und Raff, 1988). Sie überziehen die Oberfläche der gebün- delten Ganglienzellaxone und sind mit Blutgefäßen in dieser Schicht und in der inneren Körnerschicht assoziiert. Die Astrozyten haben neurotrophische Funk- tionen, sorgen für die mechanische Unterstützung degenerierter Axone und sind an der Bildung der Blut-Retina-Schranke beteiligt (Vecino et al., 2015).

Mikrogliazellen sind in der äußeren und in der inneren plexiformen Schicht zu finden. Sie haben wichtige Funktionen bei der Abwehr von Mikroorganismen, bei der Kontrolle von Immunreaktionen und bei Reparaturvorgängen des Gewe- bes. Sie überwachen die Schichten der Retina mit ihren beweglichen Zellaus- läufern. Wenn sie durch insultbedingte Veränderungen im RPE oder in der Retina aktiviert werden, entwickeln sie sich zu amöboiden Phagozyten und migrieren in die betroffenen Regionen (Karlstetter et al., 2010). Bei degenerativen neuronalen Prozessen sind Mikrogliazellen an der Phagozytose von Zell- trümmern und an Regenerationsprozessen beteiligt (Chen et al., 2002). Mikro- gliazellen besitzen Rezeptorsysteme für chemische Signale benachbarter oder weiter entfernter Zellen. Sie sezernieren unterschiedliche Moleküle in Abhängig- keit ihres Funktionszustandes, unter anderem Cytokine und Chemokine, ROS (reaktive Sauerstoffspezies), NO (Stickstoffmonoxid) und FGF-2 (fibroblast growth factor 2) (Vecino et al., 2015).

1.3 Die Retina der Maus als Modellsystem für retinale Erkrankungen

1.3.1 Histologische Merkmale Die Retina des Menschen besitzt etwa 120 Millionen Stäbchenzellen und etwa 6 Millionen Zapfenzelllen, die ein unterschiedliches Verteilungsmuster zeigen. In der Macula lutea (Durchmesser ca. 3 mm) herrschen die Zapfenzellen vor, die in der Fovea centralis, der Stelle der höchsten Sehschärfe, ihre größte Dich- te erreichen (Lüllmann-Rauch, 2009). Außerhalb der Macula lutea nimmt die Häufigkeit der Zapfenzellen ab, und in den peripheren Bereichen dominieren die Stäbchenzellen (Kolb, 2005b). In der Retina der Maus überwiegen die Stäbchenzellen mit einem Anteil von 97%. Abweichend von der menschlichen Retina besitzt die Retina der Maus keine Fovea und zeigt überall eine Dominanz der Stäbchenzellen. In der Nähe der Austrittsstelle des Sehnervs erreichen beide Photorezeptorzelltypen ihre höchste Dichte, die nach peripher abnimmt (Jeon et al., 1998). Im Gegensatz zum trichromatischen Sehen des Menschen ermöglichen die zwei Typen von Zapfenzellen bei der Maus nur dichromatisches Sehen (Veleri et al., 2015). 17

1.3.2 Prä- und postnatale Entwicklung der Retina Die Zellen der neuronalen Retina, sowohl die Neuronen als auch die Müllerzel- len, entwickeln sich sequentiell aus den gleichen retinalen Progenitorzellen. Die postmitotischen Zellen, deren „Geburt“ durch den Zeitpunkt ihrer letzten S-Pha- se gekennzeichnet ist, ordnen sich in spezifischen Schichten an, differenzieren sich, und die Neuronen bilden Synapsen mit anderen retinalen Neuronen aus. Bei der Maus gehen die retinalen Zellen zwischen dem 11. embryonalen Tag (E11) und dem 10. postnatalen Tag (P10) in definierten, überlappenden Zeit- intervallen in den postmitotischen Zustand über (Cepko et al., 1996).

Abb. 1.5: Zeitlicher Verlauf der Neurogenese in der Mausretina Die Entstehung und Differenzierung der Zellen der neuronalen Retina beginnt vor der Geburt und dauert bis zum 11. postnatalen Tag (modifiziert nach Zhang et al., 2011).

Retinale Ganglienzellen, Zapfenphotorezeptorzellen, amakrine Zellen und Hori- zontalzellen differenzieren zu relativ frühen Zeitpunkten, hauptsächlich vor der Geburt der Maus. Ihre Differenzierung ist kurz nach der Geburt abgeschlossen. Die Differenzierung der Bipolar- und Müllerzellen beginnt kurz vor der Geburt und dauert ein bis zwei Wochen postnatal an (Xu und Tian, 2004). Den längsten prä- und postnatalen Entstehungszeitraum haben die Stäbchenphoto-

rezeptorzellen. Ihre Entstehungsrate zeigt ein Maximum bei der Geburt der Maus (Blackshaw et al., 2004). Im Gegensatz zur Retinogenese der Maus ist beim Menschen die Differenzie- rung der Zapfen vor der Geburt abgeschlossen. Die Entstehung der Stäbchen erstreckt sich beim Menschen wie bei der Maus in die frühe postnatale Periode (Swaroop et al., 2010). Die Differenzierung der Photorezeptorzellen umfasst außer der Bildung der photorezeptorspezifischen Proteine auch das distale Wachstum der Axone und die Bildung von Synapsen in der äußeren plexiformen Schicht, die zwischen dem fünften (P5) und dem siebten (P7) postnatalen Tag histologisch erkennbar wird (Sharma et al., 2003). Gleichzeitig mit dem Abschluss der neuronalen Differenzierung und der Gefäßentwicklung beginnt bei der Maus nach Öffnung der Augen (P11 bis P14) die visuelle Wahrnehmung (Dorrell et al., 2004), mit welcher die Entwicklung der physiologischen Funktion der Retina weiter fortschreitet. Der Sehvorgang des Wirbeltierauges ist mit einem hohen Energiebedarf verbunden. Die Retina zählt zu den Geweben mit dem höchsten relativen Sauer- stoffbedarf (Schmidt et al., 2003). Die Blutversorgung der Retina erfolgt beim Menschen und bei der Maus über zwei Gefäßsysteme. Die Arteria centralis retinae, die über den Sehnerv in die Retina eintritt, versorgt mit ihren Aufzwei- gungen die inneren zwei Drittel der Retina über Kapillaren, die von der Nerven- faserschicht bis zur äußeren plexiformen Schicht verlaufen. Die Versorgung der äußeren Retinaschichten erfolgt über das Pigmentepithel aus den Gefäßen der Choriokapillaris (Kolb, 2005b). Die äußere Körnerschicht, die die Perikaryen der Photorezeptorzellen enthält, wird nicht direkt über Kapillaren mit Sauerstoff versorgt, sondern durch Diffusion. Im Gegensatz zur Retina des Menschen, deren Angiogenese in einem Gesta- tionsalter von 16 Wochen beginnt und nach 40 Schwangerschaftswochen bei der Geburt abgeschlossen ist, zeigt die Retina der Maus bei der Geburt eine unreife Vaskularisierung und persistierende hyaloide Gefäße. Postnatal findet parallel zu der Regression der A. hyaloidea die Entwicklung der intraretinalen Gefäße in einem streng regulierten zeitlichen und räumlichen Muster statt (Stahl et al., 2010).

1.4 Das Ccdc66-/--Mausmodell für retinale Degeneration

1.4.1 Die Ccdc66-defiziente Maus Tiermodelle sind ein hilfreiches Instrument bei der Erforschung von Gendys- funktionen, die ursächlich an der Erkrankung des Menschen beteiligt sind. Um die Funktion des Ccdc66-Gens und des CCDC66-Proteins bei retinalen Dege- nerationsprozessen zu untersuchen, wurde ein Mausmodell erzeugt, bei dem die Expression des Ccdc66-Gens (accession no. NM_177111) durch Einsatz einer „Genfalle“ in 5‘-Richtung von Exon 4 unterbunden wird.

Abb. 1.6: Die „Genfalle“ des Ccdc66-Gens Der schematische Überblick zeigt die codierende Region des Ccdc66-Gens. G-14 und T-20 kennzeichnen die genomischen Sequenzen der antikörperbindenden Regionen des CCDC66- Proteins. 5‘ von Exon 4 wurde eine „Genfalle“ eingesetzt, die aus einem Spleiß-Akzeptor (SA), einem β-Galaktosidase/Neomycin-Fusionsgen (βgeo) und einer Polyadenylierungssequenz (pA) besteht. Die Initiation der Transkription durch den endogenen Promotor führt zu einer mRNA, die aus Exon 1 bis 3 und der Genkassette besteht. SD Spleiß-Donor (modifiziert nach Gerding et al., 2011)

Die Transkripte, die durch den endogenen Promotor des Ccdc66-Gens initiiert werden, werden zwischen dem Spleiß-Donor des endogenen Exons 3 und dem Spleiß-Akzeptor der eingefügten Genkassette gespleißt. Der 5‘-Anteil des Ccdc66-Gens und das in der Genkassette enthaltene β-Galaktosidase/Neomy- cin-Fusionsgen werden exprimiert, und das endogene Transkript wird vorzeitig durch die Polyadenylierungssequenz der Genkassette beendet (Gerding et al., 2011). 20

Charakteristisch für die homozygote Ccdc66-defiziente Maus (129P2;B6N- Ccdc66Gt(bgeo); Ccdc66-/-) ist die fehlende Expression der retinalen Ccdc66-RNA. Stattdessen wird ein verkürztes Fusionstranskript gebildet, das aus den ersten drei Exons des Ccdc66-Gens und aus dem lacZ-Reportergen, welches in vivo natürlicherweise nicht vorhanden ist, besteht (Gerding et al., 2011). Dieses kann bei histologischen Untersuchungen dazu benutzt werden, die Expression des Transgens nachzuweisen, da das lacZ-Reportergen für β-Galaktosidase codiert. Bei der Transkription wird β-Galaktosidase exprimiert und bildet bei Zugabe von X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid) ein blaues Präzipitat. Die fehlende Expression des Ccdc66-Gens führt bei der Ccdc66-/--Maus zur retinalen Degeneration, die sich am 13. postnatalen Tag (P13), zum Zeitpunkt des Öffnens der Augen, in einer Deformierung der Außen- und Innensegmente der Photorezeptoren zeigt und langsam fortschreitet. Im Alter von drei Monaten ist die äußere Körnerschicht auf fünf bis sechs Reihen von Photorezeptorzell- kernen reduziert. Im Alter von sieben Monaten zeigt die Retina der Ccdc66-/-- Maus eine sehr dünne äußere Körnerschicht mit verkürzten Außen- und Innen- segmenten. Auch die Dicke der inneren nukleären und der inneren plexiformen Schicht ist im Vergleich zur Retina der Wildtyp-Maus (C57BL/6J; Ccdc66+/+) deutlich verringert (Gerding et al., 2011). Setzt man die Lebenserwartung der Maus von bis zu zwei Jahren in Relation zu der des Menschen, spiegelt die in der Ccdc66-defizienten Maus gezeigte langsam progrediente Degeneration der Retina den typischen Verlauf der Retinitis pigmentosa beim Menschen wider (Gerding et al., 2011).

1.4.2 Ccdc66-Genexpression in Retina und Gehirn Das evolutionär konservierte Gen Ccdc66 liegt bei der Maus auf Chromo- som 14. Mit einer Länge von 26 056 bp umfasst es 18 Exons (UCSC Genome Browser on Mouse Dec. 2011 (GRCm38/mm10) Assembly). Das Spleißmuster der Ccdc66-mRNA ist mit mehreren möglichen mRNAs sehr komplex (Dekomien et al., 2010). In der Retina und im Gehirn der Wildtyp-Maus wurden zwei Isoformen des CCDC66-Proteins, eine lange Isoform mit ~100–140 kDa und eine kurze Isoform mit ~37 kDa, nachgewiesen. Die kurze Isoform ist auch bei der Ccdc66-defizienten Maus vorhanden. Sie ist möglicherweise das 21

Produkt einer alternativ gespleißten Ccdc66-mRNA, deren Expression nicht durch die „Genfalle“ inhibiert wird (Schreiber, 2015). Das CCDC66-Protein wurde beim Menschen, beim Hund und bei der Maus immunhistochemisch in den Photorezeptoren während der postnatalen Diffe- renzierung nachgewiesen (Dekomien et al., 2010). Mittels Immunogold-Elektro- nenmikroskopie wurde das CCDC66-Protein in den Außen- und Innensegmen- ten, in dem diese beiden Segmente verbindenden Zilium und in dem Basalkör- perchen lokalisiert (Gerding et al., 2011).

Abb. 1.7: Ccdc66-Expression in der Retina der Maus (P17) A: Reportergen-Expression bei der Ccdc66-/--Maus B: Nachweis der Ccdc66-mRNA bei der Ccdc66+/+-Maus mittels in-situ-Hybridisierung Überlappende Signale (schwarze und weiße Pfeilspitzen) sind in den Innensegmenten (IS) der Photorezeptoren, in der inneren Körnerschicht (INL), in der inneren plexiformen Schicht (IPL) (weißer Pfeil) und in der Ganglienzellschicht (GCL) (schwarzer Pfeil) zu erkennen. Bei der X- Gal-Färbung zeigt sich auch eine Ccdc66-Expression in der äußeren plexiformen Schicht (OPL) (graue Pfeilspitze). RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, ONL äußere Körnerschicht Der Maßstabsbalken entspricht 50 µm (aus Schreiber, 2015).

Mittels Darstellung der Ccdc66-mRNA durch in-situ-Hybridisierung mit Digoxi- genin-markierten Sonden und durch den Nachweis des Ccdc66-Reportergens über die Expression der β-Galaktosidase wurde die Expression des Ccdc66- Gens in den Innensegmenten der Photorezeptoren, in der inneren Körner- schicht, hauptsächlich in den Grenzzonen zu den plexiformen Schichten, in der

inneren plexiformen Schicht, in der äußeren plexiformen Schicht und in der Ganglienzellschicht lokalisiert (Schreiber, 2015). Dabei zeigten im zeitlichen Verlauf bei P17 alle genannten Schichten die höchs- te Ccdc66-Expression, die im weiteren Verlauf abnahm. In den plexiformen Schichten wurde von der Geburt der Maus bis zu P17 eine kontinuierliche Zu- nahme der Ccdc66-Expression beobachtet. Die Ccdc66-Expression in den plexiformen Schichten deutet daraufhin, dass das CCDC66-Protein nicht nur eine Rolle in den Außen- und Innensegmenten der Photorezeptoren spielt, sondern dass die Expression des Ccdc66-Gens wahrscheinlich auch mit der Bildung von synaptischen Kontakten assoziiert ist (Schreiber, 2015). Im Gehirn der Maus konnte eine starke Ccdc66-Expression in allen Schichten des Bulbus olfactorius nachgewiesen werden. In der Hippocampusformation zeigten das Stratum pyramidale der Felder CA1-3 (Cornu Ammonis), das Stra- tum radiatum des Feldes CA1 sowie die Körnerzellschicht, die polymorphe Schicht und das Stratum moleculare des Gyrus dendatus deutliche Expression des Ccdc66-Gens (Schreiber, 2015).

1.5 Transkriptionsunterschiede in Retina und Gehirn der Ccdc66-/--Maus Microarray-Analysen können durch den Vergleich retinaler Transkriptome von Mäusen, die eine Defizienz eines bestimmten Gens aufweisen, mit denen von Wildtyp-Mäusen dazu beitragen, Gemeinsamkeiten der genomischen Antwort auf unterschiedliche Prozesse aufzudecken, die zu einer retinalen Degeneration führen. Des Weiteren können sie Hinweise auf die molekularen Mechanismen geben, die der progressiven Degeneration zugrunde liegen (Swiderski et al., 2007).

1.5.1 Genexpression in Retina und Gehirn der Ccdc66-/--Maus In der Arbeit von Roberz (2014) wurden die retinalen und zerebralen Tran- skriptomprofile von Ccdc66-defizienten Mäusen (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo); Ccdc66-/-) und von Wildtyp-Mäusen (C57BL/6J; Ccdc66+/+) zu verschiedenen Zeitpunkten (10., 17. und 28. postnataler Tag; P10, P17, P28) analysiert und miteinander verglichen. Dadurch werden die regulatorischen Auswirkungen der 23

Ccdc66-Defizienz auf die Expression anderer Gene charakterisiert, und es wird ein Vergleich der unterschiedlichen Zeitpunkte ermöglicht. Die Ergebnisse der Expressionsanalysen können durch die Berechnung des „Fold-Change“ als Maß für die Expressionsänderung quantifiziert werden (Roberz, 2014). Die ermittelten Signalstärken, die als Logarithmen zur Basis 2 angegeben sind, werden in die Form log2(Signalstärke-/-) bzw. log2(Signalstärke+/+) gesetzt. Der | log (Signalstärke-/-) - log (Signalstärke+/+)| „Fold-Change“ wird mit 2 2 2 berechnet und gibt den n-fachen Expressionsunterschied an. Wenn die Signalstärke der Ccdc66-defizienten Probe höher ist als die der Wildtyp-Probe, resultiert aus der Berechnung des „Fold-Change“ ein positiver Wert. Wenn die Signalstärke der Ccdc66-/-- Proben niedriger ist, wird dem berechneten „Fold-Change“ der entsprechende negative Wert zugeordnet.

Tab. 1.1: Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene in Retina und Gehirn * in der Literatur erwähnte Gene, ** vorhergesagte Gene und Gene, deren Expressionsprodukte in der Literatur nicht erwähnt sind

erhöhte erniedrigte noch nicht „Fold- bekannte Anzahl Expression bei Expression bei bekannte Change“ Gene* Ccdc66-/- Ccdc66-/- Gene** Retina >2 12 9 3 4 8 P10 1,7-2 17 4 13 14 3

Retina >2 0 - - - - P17 1,7-2 6 4 2 4 2

Retina >2 55 43 12 31 24 P28 1,7-2 30 20 10 23 7

Gehirn >2 0 - - - - P10 1,7-2 3 1 2 2 1

Gehirn >2 25 25 - 10 15 P28 1,7-2 15 11 4 9 6

Die in der Arbeit von Roberz durchgeführte Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) zeigte nach Ausschluss von Genen, die wie das Gen Ccdc66 auf dem Chromosom 14 liegen und deren Expressionsunterschiede möglicherweise durch Kopplung auf demselben Chromosom bedingt sind, bei einem Grenzwert des „Fold-Change“ von größer als 1,7 und kleiner als -1,7 in den Retina-Proben 24

der Ccdc66-defizienten Maus erhöhte Expression bei 80 Genen und erniedrigte Expression bei 40 Genen. In den Gehirn-Proben waren bei der Ccdc66-/--Maus 37 Gene stärker exprimiert und sechs Gene geringer exprimiert als in den entsprechenden Proben des Wildtyps. Die größte Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene wurde in den retinalen P28-Proben nachgewiesen (Roberz, 2014).

1.5.2 Kandidatengene für weitere Untersuchungen Um mittels in-situ-Hybridisierung Expressionsunterschiede bei der Ccdc66-/-- Maus (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo)) und der Ccdc66+/+-Maus (C57BL/6J) nachzuweisen und die exprimierten Gene bestimmten Zellschichten zuzuordnen, wurden für diese Arbeit basierend auf den Ergebnissen der Arbeit von Roberz (2014) aus den beschriebenen Genen mit veränderter Expression Kandidaten- gene ausgewählt, deren „Fold-Change“ bei Werten größer als 2 und kleiner als -2 liegt.

Tab. 1.2: Kandidatengene für weitere Untersuchungen

Gensymbol „Fold-Change“ Chromosom Genomische Position Serpina3n 11,54 12 104406708 - 104414329 Gm12541 8,75 3 37335332 - 37349740 Antxr2 5,02 5 97884688 - 98030962 Pcolce 3,28 5 137605103 - 137611487 Gadd45b 3,2 10 80930091 - 80932204 Edn2 3,02 4 120161206 - 120167360 Optc 2,18 1 133897193 - 133907999 Rpe65 -3,89 3 159599181 - 159625321

Von den Genen der Retina-Analyse, die diese Bedingung erfüllen, wurden Ser- pina3n (serine peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3N), Gm12541 (Fgf2os, fibroblast growth factor 2 opposite strand), Antxr2 (anthrax toxin receptor 2), auch bekannt als Cmg2 (capillary morphogenesis gene-2), Pcolce (Pcpe-1, procollagen C-proteinase enhancer-1), Gadd45b (growth arrest and DNA-damage inducible, beta), Edn2 (endothelin 2), Rpe65 (retinal pigment epithelium 65) und Optc (opticin) ausgewählt. 25

2 Aufgabenstellung und Zielsetzung Die funktionelle Charakterisierung der Ccdc66-Genexpression und des Proteins CCDC66 in der Retina und in extraretinalen Geweben zeigte deren Bedeutung vor allem für die Entwicklung und die Funktion der Retina und lieferte erste Hin- weise auf eine mögliche Rolle des Ccdc66-Gens in der Entstehung retinaler De- generationsprozesse (Gerding et al., 2011). Neben der Expression in der Retina konnte auch eine Expression von Ccdc66 im Gehirn nachgewiesen werden, die besonders in den Regionen des Bulbus olfactorius und des Hippocampus relativ hoch ist (Schreiber, 2015). Der Vergleich des retinalen und des zerebralen Transkriptomprofils von Ccdc66-/--Mäusen (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo)) mit dem von Wildtyp-Mäusen (C57BL/6J) zeigte zudem einen Einfluss der Ccdc66-Defi- zienz auf die Expression weiterer Gene (Roberz, 2014). Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die nähere Charakterisierung der in der Arbeit von Roberz (2014) nachgewiesenen Genexpressionsunterschiede in der Retina und im Gehirn mittels in-situ-Hybridisierung mit RNA-Sonden. Dabei sollen folgende Fragen beantwortet werden:

 Können signifikante Genexpressionsunterschiede zwischen der Ccdc66- defizienten (Ccdc66-/-) und der Wildtyp-Retina (Ccdc66+/+) dargestellt werden?  In welchen retinalen Schichten werden die Gene exprimiert, die eine unterschiedliche Expression in der Transkriptomanalyse zeigen?  Kann eine schichtspezifisch unterschiedlich ausgeprägte Expression dieser Gene nachgewiesen werden?  Zeigen die unterschiedlich exprimierten Gene bei verschiedenen Alters- stufen unterschiedliche Expressionsmuster in den retinalen Schichten?  Beeinflusst die Ccdc66-Defizienz auch in den Gehirnarealen mit starker Ccdc66-Expression (Bulbus olfactorius und Hippocampus) die Expres- sion der untersuchten Gene oder liegen diese Genexpressionsunter- schiede spezifisch in der Retina vor?

Die Ergebnisse der in-situ-Hybridisierung sollen dazu beitragen, die gewebe- spezifische Lokalisation der Genexpressionsprodukte und damit die beim Ccdc66-defizienten Mausmodell vorliegenden Degenerationprozesse zu identifi- 26

zieren. Insgesamt könnte somit die Charakterisierung der Prozesse generell zum Verständnis der retinalen und zentralen Degenerationsmechanismen im Mausmodell beitragen und gegebenenfalls auch wichtige Hinweise auf ähnliche Prozesse bei anderen Säugern liefern.

3 Material und Methoden

3.1 Versuchstiere In den Versuchen wurden zur Darstellung des Wildtyp-Genotyps Mäuse des C57BL/6J-Stammes (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) eingesetzt. Sie wurden an der Ruhr-Universität Bochum gezüchtet, in einem Hell-Dunkel- Zyklus von 12h/12h gehalten, und sie hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Ccdc66-defiziente Mäuse wurden durch Rückkreuzung von Tieren, die mit einer „Genfalle“ in dem Ccdc66-Gen versehen wurden (129P2;B6N- Ccdc66Gt(bgeo), German Gene Trap Consortium), an der Ruhr-Universität Bo- chum gezüchtet (Gerding et al., 2011). Dabei erfolgte die Rückkreuzung mit dem Wildtyp des C57BL/6J-Stammes mindestens bis zur Generation F6, um einen möglichst homogenen genetischen Hintergrund zu erhalten. Die Mäuse wurden unter den gleichen Bedingungen wie die C57BL/6J-Mäuse gehalten (Tierversuchsgenehmigung inklusive Zuchtgenehmigung nach § 33 Tierschutz- Versuchstierverordnung AZ 84-02.04.2015.A250).

3.2 Material

3.2.1 Enzyme Tab. 3.1: Enzyme Enzym Hersteller DNase I Thermo Scientific HotStarTaq DNA Polymerase Qiagen Proteinase K Peqlab RNase Serva Electrophoresis

3.2.2 Größenstandards Tab. 3.2: Größenstandards Größenstandard Hersteller GeneRuler 100bp DNA Ladder Thermo Scientific pUC19 DNA/MspI Thermo Scientific ssRNA Ladder N0362S New England BioLabs

3.2.3 Oligonukleotide Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma metabion international hergestellt.

Tab. 3.3: Oligonukleotide Primer-Sequenz (5‘ – 3‘) Amplifikats- Gen SP6 (fwd) / T7 (rev) Promotor Länge (bp) Antxr2 Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGTGATGGTCCCTGAAGAAGAGAT 1014 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTCCTGTTGAATTAACGC Edn2 Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGCTGGCCTGAAGCTGTGGT 654 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGATAGGGGCCAGCCATGAT Gadd45b Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGGGAAGGCCTCCGACACTT 907 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCTTGCCTGAGGTGC Gm12541 Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGATGCTTCTTTCTCCACTTCTGC 692 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCCGTAACTGTGAAGAGC Optc Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGCACTGCTCTTCTCTTCCCAGAT 540 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGAGTCAGAAAGACCAGGCTTCAG Pcolce Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGGTCCTTCCGAGTCTTCGATATG 661 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGTCAGGGCTGACTCCTTCTCTAC Rho Fwd Primer GATTTAGGTGACACTATAGACCCAGGCCTTCAGGCCTGTGC 666 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGCACCACTGCCACCAAGTGTA Rpe65 Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGGCTTATGTTCGAGCAATGACTG 714 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGGGAAGAGATTGAAAGGGGAAGT Serpina3n Fwd Primer ATTTAGGTGACACTATAGCATCTAGGACTACTTGGTGCCC 286 Rev Primer TAATACGACTCACTATAGGGGTGGTGTTCCTCTTTTGTGTGA Ccdc66 Fwd Primer AACAGCCTCTTATGGTTGTCG 271 Rev Primer AAAGGACATTTTGCAATTTTGA Ccdc66- Fwd Primer GCTAGCTTGCCAAACCTACAGGTGG 194 Rev Primer AAAGGACATTTTGCAATTTTGA SRY Fwd Primer TTGTCTAGAGAGCATGGAGGGCCATGTCAA 273 Rev Primer CCACTCCTCTGTGACACTTTAGCCCTCCGA

3.2.4 Antikörper Tab. 3.4: Antikörper Antikörper Hersteller Anti-DIG alkaline phosphate conjugated antibody ROCHE

3.2.5 Reaktionskits Tab. 3.5: Reaktionskits Reaktionskit Hersteller DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Roche HighPrep PCR Kit Magbio HotStarTaq Master Mix Kit Qiagen QIAamp DNA Mini Kit Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen Sensiscript RT Kit Qiagen

3.2.6 Geräte Tab. 3.6: Geräte Gerät Hersteller Axio Imager Z2 Zeiss Biofuge pico Heraeus Biometra T professional gradient Thermocycler Biometra Centrifuge 5415 R Eppendorf Cryostat CM3050 S Leica Fusion SL Peqlab MagnaRack Thermo Scientific Nanodrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific Perkin Elmer PE 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems SuperFrostPlus Adhäsionsobjektträger Thermo Scientific Ultra Turrax T5 FU IKA UV-Tisch Fusion SL Peqlab

3.2.7 Chemikalien und Lösungen Tab. 3.7: Chemikalien und Lösungen Chemikalie / Lösung Hersteller Acetic-Acid-Anhydride Acros Organics Agarose Invitrogen Ammoniumacetat J. T. Baker ATL-Puffer Qiagen BCIP Applichem Borsäure Applichem Bromphenolblau Merck KGaA BSA RNase-frei New England Biolabs

Chloroform Roth Desoxyribonukleid-Triphosphat Fermentas Dextransulfat Roth Diethylpyrocarbamid (DEPC) Applichem Dimethylformamid Roth EDTA Merck KGaA Essigsäure VWR Ethanol Sigma-Aldrich Ficoll Typ 400 Sigma-Aldrich Formaldehyd Roth Formamid VWR Glycerin Roth Harnstoff J. T. Baker HCl Roth HICO-Mic Hirtz & Co KG Isopentan VWR Jung Tissue Freezing Medium Leica Magnesiumchlorid (50 mM) BioTherm Magnesiumchlorid J. T. Baker Natriumchlorid (NaCl) Fisher Scientific Natriumcitrat Sigma-Aldrich

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) J. T. Baker

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) J. T. Baker Natriumhydroxid (NaOH) J. T. Baker NBT Applichem Normal Goat Serum PAN-Biotech Paraformaldehyd Riedel-de Haen PCR Puffer 10x Qiagen peqGOLD TriFast Peqlab Polyvinylpyrolidin Roth

RNase-freies H2O Qiagen RNase-Inhibitor New England Biolabs SERVA DNA Stain G Serva Electrophoresis Tris Sigma-Aldrich Triethanolamin Acros Organics tRNA ROCHE Tween Applichem Xylencyanoblau Fluka

3.2.8 Software Tab. 3.8: Software Software Hersteller / Anbieter Fusion capture advance software Peqlab Microsoft Office Microsoft Primer3web (Version 4.0.0) http://primer3.ut.ee Vslide software MetaSystems

3.2.9 Datenbanken Tab. 3.9: Datenbanken Datenbank Web Adresse Allen Brain Atlas http:/www.brain-map.org/ Genecards http://www.genecards.org/ NCBI Gene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene RetNet (Retinal Information Network) https://sph.uth.edu/retnet/ UCSC-(University of California, Santa Cruz) http://genome.ucsc.edu/ Genome Browser

3.3 Methoden

3.3.1 Genotypisierung Bei den Mäusen, deren Gewebe in den Versuchen eingesetzt wurde, wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) eine Genotypisierung bezüglich des Vorhandenseins der Ccdc66-„Genfalle“ (Ccdc66-/-, Ccdc66+/+, Ccdc66+/-) sowie bei sehr jungen Tieren bezüglich der Geschlechtsbestimmung durchgeführt.

3.3.1.1 DNA-Isolation Die für die Genotypisierung und Geschlechtsbestimmung benötigte DNA wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit aus den Schwanzspitzen der Mäuse isoliert. Die Schwanzspitzen wurden in 180 µl ATL-Puffer, dem 30 µl Proteinase K (300 µg)) zugefügt wurden, über Nacht bei 56 °C (Wasserbad) inkubiert. Nach kurzer Zentrifugation wurden zum Überstand 200 µl AL-Puffer gegeben und nach 10- minütiger Inkubation bei 70 °C (Wasserbad) wurden 200 µl Ethanol (99,8 %) zugefügt. Die Lösung wurde nach gründlichem Durchmischen auf eine Silica- säule aufgetragen. Die Säule wurde 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert und in ein 32

neues Sammelgefäß transferiert. Dann wurde sie zunächst mit 500 µl AW1- Puffer (1 min Zentrifugation bei 8000 rpm) und danach mit 500 µl AW2-Puffer (3 min Zentrifugation bei 13000 rpm) gewaschen. Die DNA wurde mit 40 µl TE- Puffer eluiert (5 min Inkubation bei Raumtemperatur und 1 min Zentrifugation bei 8000 rpm). Die Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der DNA erfolgte mittels eines Nanodrop-Spektrometers.

3.3.1.2 DNA-Amplifikation mittels PCR Bei der Polymerasekettenreaktion können unter Einsatz spezifisch bindender Primer bestimmte DNA-Sequenzen vervielfältigt werden. In mehreren Zyklen, die aus der Denaturierung der doppelsträngigen DNA, der Anlagerung der Primer an die entsprechenden Abschnitte der DNA und der Elongation der Primer zu einem komplementären DNA-Strang bestehen, werden Amplifikate mit einer bestimmten Länge erzeugt, deren Menge je nach Anzahl der Zyklen exponentiell ansteigt. Bei der Genotypisierungs-PCR wurde die HotStarTaq-Polymerase benutzt, die durch initiales Erhitzen auf 95 °C aktiviert wird. Die verwendeten Primer-Se- quenzen (Ccdc66 und Ccdc66-) sind in Tabelle 3.3 aufgelistet. Der Ccdc66- Vorwärts-Primer bindet zwischen Exon 3 und Exon 4 des Ccdc66-Gens und der Ccdc66--Vorwärts-Primer lagert sich innerhalb der „Genfalle“ an. Der Rück- wärts-Primer bindet in Exon 4 (Gerding et al., 2011). Es enstehen abhängig vom Genotyp unterschiedlich lange Amplifikate, 271 bp bei der Wildtyp-Maus (Ccdc66+/+) und 194 bp bei der Ccdc66-defizienten Maus (Ccdc66-/-). Neben zwei Ansätzen, die jeweils den entsprechenden Vorwärts-Primer und den Rück- wärts-Primer enthielten, wurde ein dritter Ansatz mit beiden Vorwärts-Primern und dem Rückwärts-Primer verwendet. Für die Geschlechtsbestimmung wurden Primer (SRY-Vorwärts-Primer und SRY-Rückwärts-Primer, Tabelle 1) verwendet, die komplementär zu Sequenzen des SRY-Gens (Sex determining region of Y-gene) auf dem kurzen Arm des Y-Chromosoms sind und bei Vor- handensein eines Y-Chromosoms zur Amplifikation eines 273 bp-langen PCR- Produkts führen. Die Sequenzen dieser Primer wurden von Mouse Genetics Core der Washington University übernommen (http://mgc.wustl.edu/Proto-

cols/PCRGenotypingPrimerPairs/tabid/154/Default.aspx.). Die Geschlechtsbe- stimmung erfolgte mit zwei Ansätzen.

Tab. 3.10: PCR-Ansätze für die Genotypisierung und Geschlechtsbestimmung Substanz Endkonzentration Volumen HotStarTaq Master Mix 10 µl HotStarTaq Polymerase 1 Unit

MgCl2 1,5 mM dNTP je 200 µM Vorwärts-Primer 1 µM 2 µl Rückwärts-Primer 1 µM 2 µl

MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 0,6 µl

H2O 4,4 µl DNA (100 ng/µl) 1 µl

Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen mit dem Biometra T professional gradient Thermocycler durchgeführt:

Tab. 3.11: PCR-Bedingungen zur Genotypierung und Geschlechtsbestimmung Temperatur Dauer Aktivierung der Polymerase 95 °C 15 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 68 °C 1 min Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 65 °C 1 min Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 62 °C 1 min 30x Elongation 72 °C 1 min Finale Elongation 72 °C 10 min Abkühlen 8 °C 10 min

3.3.1.3 Agarosegel-Elektrophorese Die Größe der mittels PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurde durch elektrophoretische Auftrennung in einem TBE-Agarosegel (2,5 %) ermittelt. Nuklein- 34

säuren wandern aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen beim Anle- gen eines elektrischen Feldes zur positiv geladenen Anode. Dabei kommt es zu einer größenspezifischen Auftrennung der DNA-Fragmente, da größere Frag- mente durch die Matrix des Gels stärker zurückgehalten werden als kleinere Fragmente. Zur Herstellung des Gels wurde die Agarose in der Mikrowelle aufgekocht. Zur Visualisierung der DNA wurde dem Agarosegel SERVA DNA Stain Clear G (5 µl/100 ml Agaroselösung) zugefügt. Nach dem Gießen und dem Erstarren des Gels wurden je 10 µl DNA-Amplifikat mit 2 µl XX-Ladepuffer aufgetragen. Als Größenstandard wurden 2 µl pUC19 DNA/MspI in 2 µl BX-Ladepuffer verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte für ungefähr 60 min bei 200 V.

Tab. 3.12: Lösungen für die elektrophoretische Auftrennung der Amplifikate Lösung Zusammensetzung Agarosegel 2,5 % 2,5 g Agarose in 100 ml 1x TBE-Puffer 1x TBE-Puffer 89 mM Tris 89 mM Borsäure 2 mM EDTA XX-Ladepuffer 0,25 % Xylencyanoblau 15 % Ficoll-Typ 400 BX-Ladepuffer 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanoblau 15 % Ficoll-Typ 400

Die Dokumentation wurde mittels der fluoreszierenden Eigenschaften des in die DNA interkalierenden Farbstoffs in UV-Licht bei einer Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe des FUSION–FX7 Advance-Dokumentationssystems und der fusion capture advance-Software erstellt.

Abb. 3.1: Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese Die Auftrennung der PCR-Produkte in einem 2,5 % Agarosegel zeigt die für den jeweiligen Genotyp typischen Banden. WT Wildtyp +/+ 271 bp, KO Knockout -/- 194 bp, SRY Sex determing region of Y 273 bp, co An- satz mit beiden Vorwärts-Primern, bp Basenpaare

3.3.2 Gewebepräparation Die Organentnahme, die unter Berücksichtigung des Tierschutzgesetzes (§ 7 Abs.1 TierSchG) erfolgte, und die Gewebepräparation wurde mit verschiedenen

Mitarbeitern der Arbeitsgruppe durchgeführt. Die Mäuse wurden mit CO2 anäs- thesiert und dekapitiert. Die für die RNA-Isolation entnommenen Retinae wurden sofort auf Trockeneis eingefroren. Die Organe für die in-situ-Hybridisierung (Augen und Gehirn) wurden zunächst in gekühltes Isopentan gegeben und dann auf Trockeneis eingefroren. Die Lagerung erfolgte jeweils bei -80 °C.

3.3.3 Anfertigung der Gefrierschnitte Die Gewebe (Retinae und Gehirne) wurden in Tissue Tek eingebettet. Für die in-situ-Hybridisierung wurden vertikale (Retina) bzw. coronale (Gehirn) Schnitte von 20 µm (Retina) bzw. 18 µm (Gehirn) Dicke angefertigt. Es wurden Gruppen von je vier Gewebeschnitten, je zwei von Ccdc66-/--Mäusen (129P2;B6N- Ccdc66Gt(bgeo) und von Wildtyp-Mäusen (C57BL/6J; Ccdc66+/+), auf SuperFrost- Plus Adhäsionsobjektträgern aufgenommen. Die Gewebeschnitte wurden an- schließend für 2 h bei Raumtemperatur getrocknet.

3.3.4 Herstellung der RNA-Sonden Für die Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden wurde zunächst aus den Retinae der Ccdc66-/--Mäuse und der Wildtyp-Mäuse RNA isoliert und in cDNA transkribiert. Mittels sequenzspezifischer Primer-Paare wurden PCR- Produkte amplifiziert, die nach Aufreinigung als Vorlagen für die Herstellung

Digoxigenin-markierter RNA-Sonden dienten. Die Durchführung im Detail findet sich unten.

3.3.4.1 RNA-Isolation Für die Isolierung der RNA unter Einsatz des RNeasy mini Kits wurden Retinae von Ccdc66-/--Mäusen und von Ccdc66+/+-Mäusen verwendet (Gewebepräpa- ration siehe 3.3.2). Die Retinae wurden in 1 ml peqGOLD TriFast gegeben, mit dem Ultra Turrax T5 FU homogenisiert und für 5 min bei 60 °C im Wasserbad inkubiert. Das Ho- mogenisat wurde mit 200 µl Chloroform versetzt, 15 sec gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugieren bei 4 °C und 12000 rpm führte zur Trennung der wässrigen Phase von der Phenolphase. Die wässrige Phase wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, mit dem gleichen Volumen 70 % Etha- nol vorsichtig mit der Pipette gemischt, auf eine Säule des RNeasy mini Kits gegeben (500 µl) und bei 10000 rpm 15 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die restliche Lösung wurde ebenfalls auf die Säule gegeben und zentrifugiert. Zum Waschen der Silicasäule wurden zunächst 700 µl RW1 Puffer (RNeasy mini Kit) auf die Säule zugefügt. Diese wurde 15 sec bei 10000 prm zentrifugiert und in ein neues Sammelröhrchen überführt. Nach Zugabe von 500 µl RPE-Puffer wurde die Säule zunächst 15 sec und nach weiterer Zugabe von 500 µl RPE-Puffer für 2 min bei 10000 rpm zentrifuglert. Die Eluation der RNA erfolgte zuerst mit 30 µl und danach mit 20 µl RNase-freiem Wasser und Zentrifugation bei 8000 rpm (1 min). Die quantitative und qualitative Messung der RNA wurde mit Hillfe eines Nano- drop-Spektrometers durchgeführt. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -80 °C.

3.3.4.2 Herstellung von cDNA mittels reverser Transkription Aus der isolierten RNA wurde mittels reverser Transkription cDNA umgeschrie- ben. Dabei wurde das Sensiscript RT Kit und ein oligo(dT) Primer (reverse 5‘- TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3‘; Metabion), der komplementär zum Poly-A- Schwanz der mRNA ist, eingesetzt.

Tab. 3.13: Reaktionsansätze für die cDNA-Synthese Substanz Endkonzentration Volumen

RNA (50 ng) + H2O (RNase-frei) 13,25 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 0,5 U/µl 0,25 µl 10x Puffer RT 2,0 µl dNTP je 200 µM 2,0 µl oligo(dT) Primer 1 µM 2,0 µl Sensiscript RT 0,5 µl

Die reverse Transkription erfolgte im Perkin Elmer PE 9700 Thermal Cycler bei 37 °C für 90 min.

3.3.4.3 Amplifikation der Sondenvorlagen mittels PCR Um die Sondenvorlagen bereitzustellen, wurde eine PCR unter Einsatz spezifischer Primer-Paare durchgeführt. Die Sequenzen für die Vorwärts- und Rück- wärts-Primer (Tab. 3.3) wurden von den entsprechenden Sonden des ALLEN Mouse Brain Atlas (http:/www.brain-map.org/) übernommen. Die Lage der Primer wurde mit Hilfe der UCSC Genome Browser website verifiziert und die Genspezifität mittels in-silico-PCR bestimmt. Die Primer für Rhodopsin (inklu- dierte Region: N1985-2611 ENSMUST00000032471) wurden mit Primer3 ent- worfen. Um aus den Sondenvorlagen Antisense-RNA-Sonden zu generieren, die komplementär zur Ziel-mRNA sind, wurden die Rückwärts-Primer am 5‘-En- de mit einer T7-Promotorsequenz (TAATACGACTCACTATAGGG) versehen. Zur Herstellung von Sense-RNA-Sonden, die die gleiche Basenfolge wie die Ziel-mRNA besitzen und als Negativ-Kontrolle eingesetzt werden, wurde an die Vorwärts-Primer eine SP6-Promotorsequenz (ATTTAGGTGACACTATAG) am 5‘-Ende angefügt. Diese Promotorsequenzen basieren auf dem Plasmid pSPT18 (http://www.addgene.org/browse/sequence vdb/4207/). Die PCR wurde im Biometra T professional gradient Thermocycler mit den in Tab. 3.14 aufge- führten Ansätzen und unter den in Tab. 3.15 und Tab. 3.16 angegebenen Be- dingungen durchgeführt.

Tab. 3.14: PCR-Ansätze der Sondenvorlagen-Amplifikation Gen Substanz Endkonzentration Volumen

Serpina3n,Rho, H2O 13,6 µl Gm12541 10x PCR Puffer 1x 2,0 µl Vorwärts-Primer 0,25 µM 0,5 µl Rückwärts-Primer 0,25 µM 0,5 µl dNTP je 200 µM 2,0 µl

MgCl2 (50 mM) 1,5 mM 0,3 µl HotStar Taq DNA Polymerase 0,1 µl cDNA 1,0 µl

Optc, Rpe65, Edn2, H2O 13,3 µl Pcolce, Antxr2, 10x PCR Puffer 1x 2,0 µl Gadd45b Vorwärts-Primer 0,25 µM 0,5 µl Rückwärts-Primer 0,25 µM 0,5 µl dNTP je 200 µM 2,0 µl

MgCl2 (50 mM) 3 mM 0,6 µl HotStar Taq DNA Polymerase 0,1 µl cDNA 1,0 µl

Tab. 3.15: PCR-Programm Optc, Serpina3n, Gm12541, Rho, Rpe65 Temperatur Dauer Aktivierung der Polymerase 95 °C 5 min und Denaturierung Anlagerung 61 °C 30 sec Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 58 °C 30 sec Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 55 °C 30 sec 35x Elongation 72 °C 1 min Finale Elongation 72 °C 5 min Abkühlen 8 °C 10 min

Tab. 3.16: PCR-Programm Edn2, Pcolce, Antxr2, Gadd45b Temperatur Dauer Aktivierung der Polymerase 95 °C 5 min und Denaturierung Anlagerung 63 °C 30 sec Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 60 °C 30 sec Elongation 72 °C 1 min Denaturierung 95 °C 30 sec Anlagerung 57 °C 30 sec 35x Elongation 72 °C 1 min Finale Elongation 72 °C 5 min Abkühlen 8 °C 10 min

Tab. 3.17: Längen der Sondenvorlagen Länge der Sondenvorlage Länge der Sondenvorlage Gen ohne Promotorsequenz mit Promotorsequenz Serpina3n 248 bp 286 bp Gm12541 654 bp 692 bp Antxr2 976 bp 1014 bp Pcolce 623 bp 661 bp Gadd45b 869 bp 907 bp Edn2 616 bp 654 bp Optc 502 bp 540 bp Rpe65 676 bp 714 bp Rho 627 bp 666 bp

3.3.4.4 Elektrophoretische Auftrennung der Sondenvorlagen Um die Länge der durch die PCR amplifizierten Sondenvorlagen zu überprüfen, wurden diese in einem Agarosegel (1 % in 1x TBE), das SERVA DNA Stain G zur Visualisierung der DNA enthielt, aufgetrennt (siehe Kap. 3.3.1.3). Dazu wurden von jeder Sondenvorlage 5 µl zusammen mit 2 µl Bromphenolblau- Ladepuffer und zur Überprüfung der Länge 2 µl einer 100 bp DNA-Leiter auf das Gel aufgetragen. Die Dokumentation erfolgte mit Hilfe des Fusion-FX7 Advance-Dokumentationssystems und der fusion capture advance-Software.

Tab. 3.18: Lösungen für die gelelektrophoretische Auftrennung der Sondenvorlagen Lösung Zusammensetzung Agarosegel 1 % 1 g Agarose in 100 ml 1x TBE-Puffer 1x TBE-Puffer 89 mM Tris 89 mM Borsäure 2 mM EDTA BX-Ladepuffer 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanoblau 15 % Ficoll-Typ 400 B-Ladepuffer 0,25 % Bromphenolblau 34,5 % Glycerin

Abb. 3.2: Überprüfung der Länge der Sondenvorlagen mittels Agarose-Gelelektrophorese Die amplifizierten Sondenvorlagen wurden auf ein 1 % Agarosegel aufgetragen und 30 min bei 200 V aufgetrennt. Bei den Amplifikaten ist jeweils nur eine Bande sichtbar, die der erwarteten Fragmentlänge entspricht. bp Basenpaare

3.3.4.5 Aufreinigung der Sondenvorlagen Die PCR-Amplifikate der Sondenvorlagen wurden mit Hilfe des HighPrep PCR reagent aufgereinigt. Durch selektive Bindung von DNA-Fragmenten, die länger als 100 bp sind, an magnetische Kügelchen werden Salze, Primer, Primer- Dimere und dNTPs entfernt. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit dem 1,8-fachen Volumen an HighPrep PCR reagent gemischt und bei Raumtempe- ratur 5 min inkubiert. Das Reaktionsgefäß wurde in eine Vorrichtung, die eine magnetische Auftrennung erlaubt (MagnaRack), gesteckt. Nach 2-3 min hatten sich die magnetischen Kügelchen an der Wand des Reaktionsgefäßes gesam- melt und der Überstand wurde abpipettiert. Das Reaktionsgefäß wurde in dem Ständer belassen, die Kügelchen wurden zweimal mit je 200 µl 75 % Ethanol

gewaschen und 10 min getrocknet. Nach Entfernen aus dem Magnetfeld wurden die Kügelchen mit 50 µl Wasser gemischt und nach einer Inkubationszeit von 5 min wurde das Reaktionsgefäß zurück in den Magnetständer gestellt. Das Eluat mit den gereinigten Sondenvorlagen wurde entnommen. Die DNA- Konzentration wurde mit Hilfe eines Nanodrop-Spektrometers bestimmt. Die La- gerung der aufgereinigten Sonden erfolgte bei -20 °C.

3.3.4.6 Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden Die Herstellung der Digoxigenin-markierten RNA-Sonden erfolgte unter Einsatz der in Kap. 3.3.4.3 beschriebenen Sondenvorlagen mit Hilfe des DIG RNA Labeling Kits (SP6/T7). Dabei dient der an den Vorwärts-Primer gekoppelte SP6-Promotor zur Herstellung der Sense-Sonde und der an den Rückwärts- Primer gekoppelte T7-Promotor zur Erzeugung der Antisense-Sonde, deren Basensequenz komplementär zu der nachzuweisenden mRNA ist. An jeder 20.- 25.Position des Transkripts erfolgt die Markierung der Sonden durch Einbau von Uridinnukleotiden, deren C-5-Position über ein Zwischenstück aus elf Koh- lenstoffatomen mit einem Digoxigenin-Molekül verbunden ist. Die Digoxigenin- Markierung ermöglicht unter Einsatz eines Antikörper-Konjugats die Detektion der Sonden.

Tab. 3.19: Reaktionsansatz zur Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden Substanz Endkonzentration Volumen

DNA (200 ng) + H2O (RNase-frei) 13,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 1 U/µl 0,5 µl 10x Transkriptionspuffer 2,0 µl 10x NTP labeling mixture 1 mM ATP, 1 mM CTP, 2,0 µl 1 mM GTP, 0,65 mM UTP, 0,35 mM DIG-11-UTP RNA Polymerase SP6 2 U/µl 2,0 µl oder RNA Polymerase T7

Die in Tab. 3.19 aufgeführten Ansätze wurden im Perkin Elmer 9700 Thermal Cycler 2 h bei 37 °C inkubiert. Um die Vorlagen-DNA zu entfernen, wurden den Ansätzen 5 µl DNase I (5 U) zugefügt. Nach einer weiteren Inkubation bei 37 °C

für 15 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 µl 0,2 M EDTA gestoppt. Die Digoxigenin-markierten RNA-Sonden wurden anschließend gefällt, indem zu 20 µl Sonden-Ansatz 20 µl Ammoniumacetat und 100 µl Ethanol (99,5 %) zuge- fügt wurden. Nach 20-minütiger Inkubation bei -20 °C und Zentrifugation bei 4 °C während 30 min (16000g) wurde der Überstand abgenommen. Das RNA- Pellet wurde nach 10-minütigem Trocknen in 20 µl RNase-freiem Wasser re- suspendiert. Die Länge der markierten Sonden wurde in einer Agarosegel-Elektrophorese

überprüft. Das 1 % Agarosegel wurde mit 1x TBE, das mit DEPC H2O ange- setzt wurde, hergestellt (siehe Kap.3.3.1.3). Um die RNA-Sonden für die Auf- trennung in einen denaturierten Zustand zu überführen, wurden je 2 µl der Son- den mit 3 µl RNase-freiem Wasser und 5 µl 2x RNA-Leiter-Ladepuffer gemischt, 5 min bei 60 °C erhitzt, kurz auf Eis gelagert und auf das Gel aufgetragen. Zur Überprüfung der Sondenlänge wurden 2 µl einer ssRNA-Leiter wie die RNA- Sonden bei 60 °C denaturiert und auf das Gel aufgetragen. Nach der Auftren- nung (200 V, 80 min) erfolgte die Dokumentation mit dem FUSION-FX 7 Ad- vance-Dokumentationssystem und der fusion capture advance-Software.

Tab. 3.20: Lösungen für die gelelektrophoretische Auftrennung der markierten RNA-Sonden Lösung Zusammensetzung Agarosegel 1 % 1 g Agarose in 100 ml 1x TBE-Puffer 1x TBE-Puffer pH 8,3 89 mM Tris 89 mM Borsäure 2 mM EDTA

in DEPC H2O 2x ssRNA-Leiter-Ladepuffer 2x TBE 13 % Ficoll-Typ 400 0,01 %Bromphenolblau 7 M Harnstoff

DEPC H2O H2O 0,02 % DEPC

Abb. 3.3: Überprüfung der Länge der RNA-Sonden mittels Agarose-Gelelektrophorese Die Abbildung zeigt am Beispiel von drei Digoxigenin-markierten Antisense- und Sense-Sonden die Auftrennung in einem 1 % Agarosegel. Die RNA-Sonden wurden vor dem Auftragen denaturiert. Doppelbanden kommen dadurch zustande, dass die RNA-Sonden nicht vollständig einzel- strängig vorlagen. Die Digoxigenin-Markierung erhöht die Größe der amplifizierten Sonden, so dass sowohl bei den amplifizierten Sonden als auch bei der Kontroll-RNA eine Verschiebung zu größeren Produkten als der berechneten Basenpaar(bp)-Länge vorlag. AS Antisense-Sonde, S Sense-Sonde

Um die Effizienz der Sondenmarkierung zu überprüfen, wurde ein Dot blot mit einer Verdünnungsreihe der Digoxigenin-markierten Antisense- und Sense- Sonden durchgeführt. Als Referenzkonzentration diente die im DIG RNA Labeling Kit enthaltene DIG-labeled Antisense Neo RNA (760 Basen) mit einer Konzentration von 100 ng/µl. Von den jeweiligen RNA-Sonden wurden Verdün- nungen mit Konzentrationen von 10 ng/µl, 1 ng/µl, 100 pg/µl und 1 pg/µl hergestellt. Es wurde ein RNA-Verdünnungspuffer verwendet, um die Stabilität der RNA zu gewährleisten. Von den Verdünnungen wurde je 1 µl auf eine positiv geladene Nylonmembran aufgetragen. Die Membran wurde 2 h bei 80 °C getrocknet, um die aufgetragenen Nukleinsäuren zu fixieren. Dann wurde die Membran zweimal für 2 min mit PBST gewaschen. Es folgte eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in PBST mit 3 % Normal Goat Serum zum Blockie- ren unspezifischer Bindungsstellen und für weitere 30 min in Antikörperlösung (PBST mit 3 % Normal Goat Serum und Anti-DIG alkaline phosphatase conjugated antibody in einer Konzentration von 1:5000). Die Membran wurde an- schließend viermal für 5 min in PBST gewaschen, 2 min in AP-Reaktionspuffer äquilibriert und in NBT/BCIP (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid/5-Brom-4-chlor-3- indoxylphosphat)-Färbelösung im Dunkeln inkubiert. Nach einer Färbedauer

von 15-30 min wurde der Dot blot zweimal für 5 min in DEPC H2O gespült und anschließend getrocknet.

Tab. 3.21: Lösungen für den Dot blot Lösung Zusammensetzung

RNA-Verdünnungspuffer DEPC H2O 50 %, 20x SSC 30 %, Formaldehyd 20 %

DEPC H2O H2O mit 0,02 % DEPC

20x SSC pH 7,0 DEPC H2O, 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat

PBS pH 7,4 10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2HPO4, 140 mM NaCl PBST PBS mit 0,1 % Tween

AP-Reaktionspuffer pH 9,0 DEPC H2O, 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2

NBT-Stammlösung 75 mg/ml in 70 % Dimethylformamid, 30 % DEPC H2O BCIP-Stammlösung 50 mg/ml in Dimethylformamid NBT/BCIP-Färbelösung 45 µl NBT-Stammlösung, 35 µl BCIP-Stammlösung, 10 ml AP-Reaktionspuffer

Abb. 3.4: Dot blots zur Überprüfung der Markierungseffizienz der RNA-Sonden Durch den Vergleich der Verdünnungsreihen der Antisense- und Sense-Sonden mit der bekannten Verdünnung der Kontroll-RNA kann die Konzentration der Sonden abgeschätzt werden. LW Leerwert

Mit Hilfe der getropften Verdünnungen der Antisense- und Sense-Sonden sowie der bekannten Verdünnung der im Kit enthaltenen Digoxigenin-markierten Kon- troll-RNA können die Konzentrationen der Antisense- und Sense-Sonden visuell abgeschätzt werden, um die für die in-situ-Hybridisierung erforderliche Menge der Sonden zu ermitteln. Der Vergleich der Konzentrationen der Antisense-Son- den mit denen der korrespondierenden Sense-Sonden dient dazu, die einge- setzte Menge der Sonden entsprechend ihrer Markierungsstärke anzugleichen, um falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse im Vergleich zu den als Negativ-Kontrolle dienenden Sense-Sonden zu vermeiden.

3.3.5 In-situ-Hybridisierung

Alle Lösungen wurden mit RNase-freiem DEPC H2O hergestellt. Die Gefäße wurden bei 200 °C für 4 h erhitzt und Plastikteile wurden über Nacht mit 0,2 M NaOH behandelt. Die Gewebeschnitte wurden wie in Kap. 3.3.3 beschrieben angefertigt und 2 h bei Raumtemperatur getrocknet. Es folgte eine Fixierung in 4 % PFA (Paraformaldehyd in PBS) für 20 min bei Raumtemperatur und in Ethanol, dem Essigsäure zugefügt wurde (95 % Ethanol, 5 % Essigsäure), bei - 20 °C für 10 min. Die Gewebeschnitte wurden bei Raumtemperatur zweimal für je 5 min in PBS gewaschen, für 5 min bei 37 °C in Proteinase K-Verdauungs- puffer äquilibriert und mit Proteinase K (1 µg/ml) für 20 min bei 37 °C verdaut, um durch Deproteinisierung das Gewebe durchlässiger für die Sonden zu machen. Danach wurden die Schnitte erneut in 4 % PFA fixiert (5 min, Raum- temperatur), um die Proteinase K-Reaktion zu beenden, und in DEPC H2O gewaschen (2 x 2 min). Nach der Äquilibrierung in TEA-Puffer (15 min, Raum- temperatur) wurden die Gewebeschnitte in TEA/Essigsäureanhydrid inkubiert (10 min, Raumtemperatur). Hierbei soll durch Acetylierung positiv geladener Aminogruppen der Gewebeproteine die unspezifische Bindung der negativ geladenen RNA-Sonden und damit die Hintergrundfärbung vermindert werden.

Die Gewebeschnitte wurden in DEPC H2O gewaschen (2 x 2 min), in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 2 x 100 %) entwässert und kurz getrocknet. Nach der Vorhybridisierung mit Hybridisierungslösung für 1 h bei 58 °C erfolgte über Nacht die Inkubation mit Hybridisierungslösung, die die jeweilige Antisense- und Sense-Sonde in einer Konzentration von 400 ng/ml enthielt. Die Sonden waren zuvor 5 min bei 80 °C erhitzt worden, um Sekundär- 46

strukturen zu lösen. Die Hybridisierung der Gewebeschnitte erfolgte in einer feuchten Kammer, die zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit und der Osmola- rität 5x SSC mit 50 % Formaldehyd enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Gewebeschnitte in 2x SSC bei Raumtemperatur gewaschen (3 x 15 min, 1 x 5 min), für 5 min bei 37 °C in RNase-Verdauungspuffer äquilibriert und in RNase-Verdauungspuffer mit RNase A (20 µg/ml) für 45 min bei 37 °C inkubiert, um einzelsträngige RNA, die nicht an die komplementäre mRNA gebunden hatte, zu beseitigen. Es folgten mehrere Waschschritte, und zwar bei 58 °C dreimal 15 min in 2x SSC, bei Raumtemperatur einmal 15 min in 0,5x SSC und einmal 5 min in 0,1x SSC. Nach Äquilibrieren in PBS für 5 min folgte für 45 min bei Raumtemperatur die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit PBST, das 5 % Normal Goat Serum enthielt. Danach wurden die Gewebeschnitte in PBST mit 2 % Normal Goat Serum und Anti-DIG alkaline phosphate conjugated antibody (1:500) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Objektträger wurden viermal in PBS gewaschen (jeweils 10 min), für 2 min in AP-Reaktionspuffer äquilibriert und in NBT/BCIP-Färbelösung im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die enzymatische Spaltung von BCIP durch die Alkalische Phosphatase entsteht 5-Brom-4-chlor-indolyl, das vom Luftsauerstoff zum blauen Farbstoff 5,5‘-Dibrom-4,4‘-dichlor-indigo oxidiert wird. Durch Reduktion des NBT, das als Oxidationsmittel für das BCIP dient, entsteht ein roter Mono-Formazanfarbstoff. Die Bildung des purpurnen Farbstoffs, der spezifisch für die DIG-markierten Sonden ist, wurde durch optische Kontrolle überprüft. Die Gewebeschnitte wurden in DEPC H2O gewaschen (3 x 3 min), in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 2 x 100 %) dehydriert, kurz getrocknet und in Einbett- medium (HICO-Mic) eingeschlossen. Die Färbung der Gewebeschnitte wurde mit dem Axio Imager Z.2 und der Vslide Software dokumentiert.

Tab. 3.22: Lösungen für die in-situ-Hybridisierung Lösung Zusammensetzung

DEPC H2O H2O mit 0,02 % DEPC 4% PFA pH 6,9 PBS mit 4 % Paraformaldehyd

PBS pH 7,4 10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl Proteinase K-Verdauungspuffer pH 8,0 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA

Proteinase K-Stammlösung 200 µg/ml DEPC H2O TEA Puffer pH 8,0 0,1 M Triethanolamin TEA/Essigsäureanhydrid 125 µl Essigsäureanhydrid in 50 ml TEA Puffer Hybridisierungslösung 50 % Formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1x Denhardt’s, 10 % Dextransulfat, 500 µg/ml tRNA 25x Denhardt‘s 5 mg/ml Ficoll 400, 5 mg/ml Polyvinylpyrolidon, 10 mg/ml BSA, RNase-frei

RNase-Stammlösung 10 mg/ml in DEPC H2O, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl PBST PBS mit 0,1 % Tween NBT-Stammlösung 75 mg/ml in 70 % Dimethylformamid,

30 % DEPC H2O BCIP-Stammlösung 50 mg/ml in Dimethylformamid NBT/BCIP-Färbelösung 45 µl NBT-Stammlösung und 35 µl BCIP- Stammlösung in 10 ml AP-Reaktionspuffer

4 Ergebnisse Die Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit basieren auf den in einer Transkrip- tomanalyse (Roberz, 2014) gezeigten Expressionsunterschieden der Gene Ser- pina3n, Gm12541, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2, Rpe65 und Optc bei der Ccdc66-defizienten Maus (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo), Ccdc66-/-) im Vergleich zu der Wildtyp-Maus (C57Bl/6J, Ccdc66+/+). Mittels in-situ-Hybridisierung wurde genspezifische mRNA in der Retina, im Bulbus olfactorius und im Hippocampus der Altersstufe P28 untersucht. Durch ihre Lokalisation in bestimmten Gewebe- schichten können die das Gen exprimierenden Zellen näher charakterisiert werden. Von den Augen und Gehirnen beider Genotypen wurden je zwei Schnitte auf einen Objektträger aufgebracht, um durch gleiche Hybridisierungs- und De- tektionsbedingungen einen Vergleich der Signalintensitäten der hybridisierten Sonden zu ermöglichen. Um den möglichen Einfluss einer bei der Ccdc66-defizienten Maus erhöhten retinalen Optc-Expression auf angiogenetische Pro- zesse zu untersuchen, wurden in-situ-Hybridisierungen bei verschiedenen Al- tersstufen (P4, P10, P17, P28) durchgeführt.

4.1 RNA-Expression in der Maus-Retina Zur Untersuchung der Expression der Gene Serpina3n, Gm12541, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2, Rpe65 und Optc wurden in-situ-Hybridisierungen (siehe Kap. 3.3.5) mit den entsprechenden Antisense-Sonden der Gene zum Nachweis der genspezifischen mRNA an den Retinae von je drei 28 Tage alten (P28) Ccdc66-/-- und Ccdc66+/+-Mäusen durchgeführt. Die Expression des Gens Optc wurde zusätzlich an Retinae der Altersstufe P4 (n=2), P10 (n=2) und P17 (n=1) untersucht. Die Applikation der entsprechenden Sense-Sonden diente als Negativ-Kontrolle. Als Positiv-Kontrolle wurde die mRNA des Gens Rhodopsin nachgewiesen.

4.1.1 Serpina3n-RNA-Expression in der Maus-Retina Das vom Serpina3n (serine peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin) member 3N) Gen kodierte Protein ist ein Plasmaprotease-Inhibitor, der an Prozessen der Akute-Phase-Reaktion, der Entzündungsreaktion und der Proteolyseregulation beteiligt ist (Vicuña et al., 2015). In der Retina der 28 Tage 49

alten Ccdc66-/--Maus war die in der Arbeit von Roberz (2014) gezeigte erhöhte Expression des Gens Serpina3n („Fold-Change“ 11,54) mittels in-situ-Hybridi- sierung auf Zellniveau nicht nachweisbar.

Abb. 4.1: Serpina3n-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die gleiche Expressionsstärke des Serpina3n-Transkripts in der äußeren und der inneren Körnerschicht (ONL, INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) bei beiden Genotypen (A, B). Durch die Sense-Sonden entsteht eine leichte Hintergrundfärbung (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 32 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Die Signalstärke der hybridisierten Antisense-Sonden lag bei den Ccdc66-/-- Mäusen (n=3) nicht über der Signalstärke, die bei den Wildtyp-Mäusen (n=3) beobachtet wurde. Die Hybridisierung der Antisense-Sonden war bei beiden Genotypen in der äußeren Körnerschicht, in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht zu beobachten (Abb. 4.1). Die Sense-Sonden erzeugten bei den Retinae der untersuchten Tiere eine leichte Hintergrundfärbung.

4.1.2 Gm12541-RNA-Expression in der Maus-Retina Das Genprodukt des Gm12541 (Fgf2os, fibroblast growth factor 2 opposite strand) Gens, dessen Expression in der Ccdc66-defizienten Retina bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) um den Faktor 8,75 er- höht war, ist ein Antisense-Transkript, das als Fgf-Antisense-RNA möglicher- 50

weise bei der post-transkriptionalen Regulation des Fgf2-Gens eine Rolle spielt (Li und Murphy, 2000). Die Retinae (P28) der Ccdc66-/--Mäuse (n=3) und der Ccdc66+/+-Mäuse (n=3) zeigten in der in-situ-Hybridisierung die Expression des Gm12541-Transkripts in der äußeren und inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht. Die Signalstärke der hybridisierten Antisense-Sonden war bei der Ccdc66- defizienten Maus in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht höher als bei der Wildtyp-Maus. In der äußeren Körnerschicht war bei beiden Genotypen das Signal gleich stark (Abb. 4.2).

Abb. 4.2: Gm12541-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Expression der Gm12541-RNA in der äußeren und inneren Körnerschicht (ONL, INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) bei beiden Genotypen (A, B). Bei der Ccdc66-/--Maus ist die Expression in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzell- schicht stärker als bei der Ccdc66+/+-Maus. Die Sense-Sonde hybridisiert mit der 3‘ nicht- translatierten Region des Fgf2-Transkripts und erzeugt eine Hintergrundfärbung, die bei der Ccdc66-/--Maus stärker ausgeprägt ist (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 30 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, (+) schwache Expression, + deutliche Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Die Sense-Sonde erzeugte eine bei den Genotypen unterschiedlich ausgepräg- te Hintergrundfärbung. Das durch die Sense-Sonde vermittelte Signal war in den gleichen Schichten wie die Markierung der Antisense-Sonde lokalisiert. Bei der Ccdc66-/--Retina war das Signal in allen exprimierenden Schichten stärker 51

als bei der Wildtyp-Retina, mit einer besonders hohen Intensität in der inneren Körnerschicht.

4.1.3 Antxr2-RNA-Expression in der Maus-Retina Das Gen Antxr2 (anthrax toxin receptor 2), auch bekannt als Cmg2 (capillary morphogenesis gene 2), bei dem die Transkriptomanalyse in der Arbeit von Ro- berz (2014) eine 5-fach stärkere Expression in der Retina der Ccdc66-defizienten Maus ergab, kodiert für ein Transmembranprotein, das an Laminin und Kol- lagen IV bindet. Es ist an Prozessen der Zelladhäsion und der Motilität ver- schiedener Zelltypen beteiligt (Ye et al., 2014). Die in-situ-Hybridisierung der Antxr2-Antisense-Sonde zeigte bei den Retinae (P28) der Ccdc66-/--Mäuse (n=3) eine starke Expression des Antxr2-Transkripts in der äußeren und inneren Körnerschicht und eine schwächere Expression in der Ganglienzellschicht. Bei den Retinae der Ccdc66+/+-Mäuse (n=3) war das nachgewiesene Signal in der äußeren und inneren Körnerschicht schwächer und es fehlte in der Ganglienzellschicht (Abb. 4.3).

Abb. 4.3: Antxr2-RNA Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Lokalisation der Antxr2-RNA in der äußeren Körnerschicht (ONL), in der inneren Körnerschicht (INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) bei der Ccdc66-/- -Maus (A). Bei der Ccdc66+/+-Maus ist die Expression in der äußeren und inneren Körnerschicht schwächer und sie fehlt in der Ganglienzellschicht (B). Die Sense-Sonde erzeugt bei beiden Genotypen eine starke Hintergrundfärbung (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 21 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Die Anwendung der Sense-Sonden erzeugte eine Hintergrundfärbung, die bei der Ccdc66-defizienten Maus die gleiche Intensität wie die Antisense-Sonde zeigte und bei der Wildtyp-Maus die Signalintensität der Antisense-Sonde über- traf.

4.1.4 Pcolce-RNA-Expression in der Maus-Retina Das Gen Pcolce (Pcpe-1, procollagen C-endopeptidase enhancer-1) kodiert für ein Glykoprotein der Extrazellularmatrix, das an Prozessen der Kollagenbiosyn- these und dem Abbau der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Das PCOLCE- Protein bindet an das C-terminale Propeptid des Prokollagen und kann dadurch die Aktivität der Procollagen C-Proteinase um den Faktor 20 steigern (Ricard- Blum et al., 2002). Bei der retinalen Expression der Pcolce-RNA (P28) konnte mittels in-situ-Hybri- disierung der Unterschied zwischen den Ccdc66-/--Mäusen und den Ccdc66+/+- Mäusen (jeweils n=3), dessen „Fold-Change“ bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) 3,28 betrug, nicht nachgewiesen werden.

Abb. 4.4: Pcolce-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt bei beiden Genotypen eine gleich starke Pcolce-RNA-Expres- sion in der äußeren und inneren Körnerschicht (ONL, INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) (A, B). Die Sense-Sonde erzeugt eine vergleichsweise starke schichtspezifische Hintergrundfär- bung (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 21 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht 53

Bei beiden Genotypen waren die Pcolce-Transkripte mit gleicher Signalstärke in der äußeren und inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht lokalisiert (Abb. 4.4). Die Hybridisierung der Sense-Sonde erzeugte vergleichsweise ein ähnlich starkes Signal. Die Intensität dieser Hintergrundfärbung zeigte bei den Retinae der untersuchten Tiere schichtspezifische Schwankungen. Bei den Retinae der Ccdc66-defizienten Mäuse war die Hintergrundfärbung insgesamt stärker als bei den Retinae der Wildtyp-Mäuse, insbesondere in der Ganglien- zellschicht.

4.1.5 Gadd45b-RNA-Expression in der Maus-Retina Gadd45b (growth arrest and DNA-damage inducible, beta) gehört zu einer Gruppe von Genen, die bei stressbedingtem Zellwachstumsstillstand oder infolge DNA-Schädigungen vermehrt exprimiert werden. Die Produkte dieser Gene sind an der Regulierung von Zellwachstum und Apoptose beteiligt (Liu et al., 2009).

Abb. 4.5: Gadd45b-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Lokalisation der Gadd45b-RNA in der äußeren (ONL) und in der inneren Körnerschicht (INL) sowie in der Ganglienzellschicht (GCL). Bei der Ccdc66-/--Maus (A) ist die Expression in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht stärker als bei der Ccdc66+/+-Maus (B). Die Applikation der Sense-Sonden zeigt bei beiden Genotypen eine leichte Hintergrundfärbung (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 21 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Der in der Arbeit von Roberz (2014) ermittelte Expressionsunterschied des Gens Gadd45b („Fold-Change“ 3,2) konnte mittels in-situ-Hybridisierung bei den Retinae der 28 Tage alten Ccdc66-/-- und Ccdc66+/+-Mäuse (jeweils n=3) bestätigt werden. Bei der Ccdc66-defizienten Maus und bei der Wildtyp-Maus wurde die Expression der Gadd45b-RNA in der äußeren und inneren Körner- schicht und in der Ganglienzellschicht dargestellt (Abb. 4.5). Bei der Retina der Ccdc66-/--Maus war in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht eine stärkere Expression als bei der Ccdc66+/+-Maus zu beobachten. Eine leichte Hintergrundfärbung war bei beiden Genotypen nachweisbar.

4.1.6 Edn2-RNA-Expression in der Maus-Retina Das Gen Edn2 (endothelin 2) gehört zu den Genen, die bei einer Stressantwort der retinalen Zellen erhöht exprimiert werden (Swiderski et al., 2007; Rattner und Nathans, 2005). Die in-situ-Hybridisierung der P28-Retinae der Ccdc66-/-- Mäuse (n=3) und der Ccdc66+/+-Mäuse (n=3) mit der Edn2-Antisense-Sonde zeigte bei der Ccdc66-defizienten Maus erhöhte Expression des Edn2-Tran- skripts verglichen mit der Wildtyp-Maus. Der bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) ermittelte Expressionsunterschied („Fold-Change“ 3,02) konnte duch die in-situ-Hybridisierung bestätigt werden. Edn2-RNA wurde bei beiden Genotypen in der äußeren Körnerschicht, in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht nachgewiesen (Abb. 4.6). Während in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht die durch die Hybridisierung erzeugten Signale bei der Ccdc66-/--Maus und bei der Ccdc66+/+-Maus etwa gleich stark waren, zeigte die äußere Körnerschicht der Retina der Ccdc66-defizienten Maus ein intensiveres Signal als die entsprechende Schicht der Ccdc66+/+-Retina. Die Sense-Sonde erzeugte bei beiden Genotypen eine leichte Hintergrundfärbung.

Abb. 4.6: Edn2-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt bei der Ccdc66-/--Retina (A) und bei der Ccdc66+/+-Retina (B) eine Akkumulation des Edn2-Transkripts in der äußeren und inneren Körnerschicht (ONL, INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) mit einem intensiven Signal in der äußeren Körnerschicht der Ccdc66-/--Maus (A). Die Sense-Sonden erzeugten bei beiden Genotypen eine schwache Hintergrundfärbung (C, D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 32 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

4.1.7 Optc-RNA-Expression in Retina und Ziliarkörper der Maus Das Gen Optc (opticin) kodiert für ein Protein der Extrazellularmatrix, das zu der Familie der small leucine-rich repeat proteins (SLRP) gehört. Es ist bem Men- schen in signifikanten Mengen im Glaskörper, in der Cornea, in der Iris, im Ziliarkörper, in der Choroidea und in der Retina nachweisbar (Friedman et al., 2002). Opticin besitzt eine anti-angiogene Aktivität. Indem es an Kollagenfibril- len bindet, vermindert es die Integrin-vermittelte Adhäsion zwischen Endothel- zellen und der umgebenden Extrazellularmatrix (Le Goff et al., 2012b). Die in-situ-Hybridisierung mit der Optc-Antisense-Sonde zeigte sowohl bei den Ccdc66-/--Mäusen (P10 n=2, P28 n=3) als auch bei den Ccdc66+/+-Mäusen (P10 n=2, P28 n=3) gleich starke Expression der Optc-RNA im nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers (Abb. 4.7, Abb. 4.8).

Abb. 4.7: Optc-RNA-Expression am Ziliarkörper der Maus (P10) Die in-situ-Hybridisierung zeigt, dass bei beiden Genotypen das Optc-Transkript mit gleicher Signalintensität im nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers exprimiert wird (Pfeile in A und B). Die Sense-Sonde bewirkt kein Signal (Pfeil in C und D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 2 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte.

Abb. 4.8: Optc-RNA-Expression am Ziliarkörper der Maus (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt, dass bei beiden Genotypen das Optc-Transkript mit gleicher Signalintensität in dem nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers exprimiert wird (Pfeil in A und B). Die Sense-Sonde bewirkt kein Signal (Pfeil in C und D). 20 µm vertikale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 2 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte.

In der Retina wurde das Optc-Transkript bei beiden Genotypen in der äußeren Körnerschicht, in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht durch die Optc-Antisense-Sonde nachgewiesen (Abb. 4.9, Abb. 4.11). Die Ap- plikation der Sense-Sonde erzeugte in den exprimierenden Strukturen kein Sig- nal (Abb. 4.10, Abb. 4.11). Der Expressionsunterschied, der bei den zehn Tage alten Mäusen (P10) bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) einen „Fold-Change“ von 2,18 zeigte, war bei der P10-Retina mittels in-situ-Hybridisierung ebenfalls nachweisbar. Bei drei unabhängig voneinander durchgeführten in-situ-Hybri- disierungen waren die Intensität der Markierungssignale und der dargestellte Expressionsunterschied zwischen den beiden Genotypen unterschiedlich aus- geprägt und innerhalb der einzelnen Versuche abhängig von der Inkubations- dauer in der NBT/BCIP (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid/5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)-Färbelösung (Abb. 4.9). Die Retina der Ccdc66-defizienten Maus zeigte sowohl in der äußeren Körner- schicht als auch in der inneren Körnerschicht stärkere Optc-RNA-Expression als die Retina der Wildtyp-Maus (Abb. 4.9 A-D), die bei einer längeren In- kubationsdauer in der NBT/BCIP-Färbelösung deutlicher ausgeprägt war. Bei noch längeren NBT/BCIP-Inkubationen waren die Expressionsunterschiede entweder nur in der inneren Körnerschicht (Abb. 4.9 E, F) oder in der äußeren Körnerschicht (Abb. 4.9 K, L) zu erkennen.

Abb. 4.9: Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P10) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Expression der Optc-RNA bei beiden Genotypen in der äußeren Körnerschicht (ONL), in der inneren Körnerschicht (INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL). Die Intensität der Markierungssignale und der dargestellte Expressionsunterschied zwischen den beiden Genotypen ist bei den durchgeführten in-situ-Hybridisierungen unterschiedlich ausgeprägt und abhängig von der Inkubationsdauer in der NBT/BCIP-Färbelösung. Inkubationszeit: A und B 1,5 h, C und D 3 h, E und F 70 min, G und H 100 min, I und J 1 h, K und L 2 h. 20 µm vertikale Gefrierschnitte; der Maßstabsbalken entspricht 100 µm und gilt für alle hier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabellen links und rechts zeigen schematisch die Signalloka- lisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, (+) schwache Expression, + deutliche Expression, +(+) intermediäre Expression, ++ starke Expression, ++(+) starke bis sehr starke Expression, +++ sehr starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Abb. 4.10: In-situ-Hybridisierung der Optc-Sense- Sonde in der Maus-Retina (P10) Die Hybridisierung der Sense-Sonde erzeugt bei beiden Genotypen kein Signal. 20 µm vertikale Gefrierschnitte; der Maßstabsbalken entspricht 100 µm und gilt für beide abgebildeten Ausschnitte. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, ONL äußere Körnerschicht, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere Körnerschicht, IPL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzell- schicht

Obwohl die Transkriptomanalyse in der vorhergehenden Arbeit von Roberz (2014) nur bei den P10-Retinae und nicht bei den P28-Retinae einen Expressionsunterschied des Optc-Gens ergab, zeigte die in-situ-Hybridierung bei der Altersstufe P28 ebenfalls stärkere Markierungssignale in der Retina der Ccdc66-/--Maus im Vergleich zur Retina der Wildtyp-Maus. Bei den Retinae der 28 Tage alten Ccdc66-/--Mäuse waren wie bei der P10-Retina die äußere und die innere Körnerschicht intensiver angefärbt als die entsprechenden Schichten der Ccdc66+/+-Retina (Abb. 4.11). Auch hier zeigte sich der Einfluss der Inku- bationszeit in der NBT/BCIP-Färbelösung auf die Ausprägung der Signalunterschiede, die bei zweistündiger Färbedauer am deutlichsten waren (Abb. 4.11 E, F). Bei vierstündiger Färbedauer zeigten die Signale in allen Optc- exprimierenden Schichten wahrscheinlich aufgrund von Sättigung eine gleich stark ausgeprägte Färbungsintensität, die keine differenzierte Beurteilung der Expression ermöglichte (Abb. 4.11 I, J).

Abb. 4.11 : Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Lokalisation der Optc-RNA bei beiden Genotypen in der äußeren Körnerschicht (ONL), in der inneren Körnerschicht (INL) und in der Ganglienzellschicht (GCL). Die Intensität der Markierungssignale und der dargestellte Expressionsunterschied zwischen den beiden Genotypen sind abhängig von der Inkubations- dauer in der NBT/BCIP-Färbelösung. Inkubationszeit: A-D 1,75 h, E-F 2 h, I-L 4 h. 20 µm vertikale Gefrierschnitte; der Maßstabsbalken entspricht 50 µm und gilt für alle abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signal lokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, +(+) inter- mediäre Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Abb. 4.12: Optc-RNA-Expression in der Ccdc66-defizienten Maus-Retina (P4, P10, P17) Die in-situ-Hybridisierung zeigt bei allen Altersstufen Optc-RNA-Expression in der äußeren Kör- nerschicht (ONL) bzw. in der äußeren neuroblastischen Schicht (ONBL), in der inneren Körner- schicht (INL) bzw. in der inneren neuroblastischen Schicht (INBL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) mit zunehmender Signalintensität abhängig von der Inkubationszeit in der NBT/BCIP- Färbelösung. 20 µm vertikale Gefrierschnitte; der Maßstabsbalken in O entspricht 50 µm und gilt für alle abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle rechts zeigt schematisch die Signallokalisation der Anti- sense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expres- sion, ++(+) starke bis sehr starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OPL äußere plexiforme Schicht, IPL innere plexiforme Schicht

Um eine bei den Genotypen unterschiedlich ausgeprägte Optc-RNA-Expres- sion, die an der Angiogenese der postnatalen Retina und an den degenerativen Prozessen der Ccdc66-defizienten Retina beteiligt sein könnte, näher zu charakterisieren, wurden in-situ-Hybridisierungen an Retinae der Altersstufen P4

(n=2), P10 (n=2) und P17 (n=1) durchgeführt (Abb. 4.12). Die Expression der Optc-RNA konnte bei den untersuchten Altersstufen in allen kernhaltigen Re- tinaschichten (äußere Körnerschicht bzw. äußere neuroblastische Schicht, innere Körnerschicht bzw. innere neuroblastische Schicht und Ganglien- zellschicht) nachgewiesen werden. Die Anwendung der Sense-Sonden bewirkte keine Hintergrundfärbung. Bei der Altersstufe P4 wurden in der äußeren neuroblastischen Schicht, in der die Differenzierung der Photorezeptorzellen noch nicht abgeschlossen ist, stär- kere Antisense-Sondensignale beobachtet als in den äußeren Körnerschichten der P10- und P17-Retinae. Bei allen drei Altersstufen zeigte die Hybridisierung der Optc-Antisense-Sonde in der inneren Körnerschicht eine höhere Optc-RNA- Expression als in der Schicht der Photorezeptoren an. Die Sondensignale in der Ganglienzellschicht waren bei der P4-Retina im Vergleich zu der P10- und P17- Retina am stärksten ausgeprägt (Abb. 4.12 E).

Abb. 4.13: Optc-RNA-Expression in der Maus-Retina (P4) Die in-situ-Hybridisierung zeigt bei beiden Genotypen Optc-RNA-Expression in der äußeren neuroblastischen Schicht (ONBL), in der inneren neuroblastischen Schicht (INBL) und in der Ganglienzellschicht (GCL) mit einer etwas stärkeren Signalintensität bei der Ccdc66-/--Retina in den neuroblastischen Schichten (A). Inkubationszeit in der NBT/BCIP-Färbelösung 1 h. 20 µm vertikale Gefrierschnitte; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Anti- sense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, +(+) intermediäre Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, IPL innere plexiforme Schicht

Der Vergleich der Ccdc66-/--Retina mit der Wildtyp-Retina wies auch bei der Altersstufe P4 auf einen Unterschied bei der Optc-RNA-Expression hin, der bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) nicht untersucht worden war. Bei der Retina der Ccdc66-defizienten Maus zeigten beide neuroblastischen Schichten ein etwas intensiveres Sondensignal als die entsprechenden Schichten der Ccdc66+/+-Retina (Abb 4.13).

4.1.8 Rpe65-RNA-Expression in der Maus-Retina Das Transkriptionsprodukt des Gens Rpe65 (retinal pigment epithelium 65) ist ein Protein, das im retinalen Pigmentepithel lokalisiert ist. Aufgrund seiner Iso- merase-Aktivität hat es eine wichtige Funktion bei der Regeneration der licht- sensitiven Komponente des Rhodopsins. Es isomerisiert das bei der Photo- transduktion entstehende all-trans-Retinol zu 11-cis-Retinal (van Soest et al., 1999).

Abb. 4.14: Rpe65-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Mittels in-situ-Hybridisierung kann keine Rpe65-Expression in den Retinaschichten nachgewiesen werden (A, B). Die Sense-Sonde erzeugt bei beiden Genotypen eine leichte Hintergrundfär- bung (C, D). 20 µm sagittale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 1 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebideten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, OPL äußere Körner- schicht, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere Körnerschicht, IPL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzellschicht

Die Expression des Rpe65-Transkripts konnte mittels in-situ-Hybridisierung bei den Ccdc66-/-- und Ccdc66+/+-Mäusen (P28) (jeweils n=3) nicht nachgewiesen werden (Abb. 4.14). In keiner der Retinaschichten war eine Hybridisierung mit der Antisense-Sonde darstellbar. Die Sense-Sonde bewirkte bei beiden Geno- typen eine leichte Hintergrundfärbung.

4.1.9 Rho-RNA-Expression in der Maus-Retina Bei den in-situ-Hybridisierungen diente der Nachweis der Rhodopsin-RNA als Positiv-Kontrolle. Die Applikation der Rho-Antisense-Sonde zeigte bei den Retinae der Ccdc66-defizienten Mäuse (n=3) und der Wildtyp-Mäuse (n=3) eine intensive Färbung der Photorezeptorinnensegmente, in denen die Rhodopsin- RNA translatiert wird, und eine schwächere Färbung der äußeren Körner- schicht. Die applizierte Sense-Sonde erzeugte auf den Retinaschnitten kein Signal (Abb. 4.15).

Abb. 4.15: Rho-RNA-Expression in der Maus-Retina (P28) Bei beiden Genotypen zeigt sich bei der in-situ-Hybridisierung eine starke Färbung der Photo- rezeptorinnensegmente (IS) und eine etwas schwächere Färbung der äußeren Körnerschicht (ONL) (A, B). Die Sense-Sonde erzeugt kein Signal (C, D). 20 µm sagittale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 2 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 50 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. RPE retinales Pigmentepithel, OS Außensegmente, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere Körnerschicht, IPL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzellschicht

4.1.10 Zusammenfassung der Ergebnisse (Retina) Die in-situ-Hybridisierungen wiesen bei den Genen Serpina3n, Gm12541, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2 und Optc variable Expression in allen Schich- ten nach, die Zellkerne enthalten (äußere Körnerschicht, innere Körnerschicht, Ganglienzellschicht). Im retinalen Prigmentepithel (RPE) war keine Analyse möglich, da aufgrund der dunklen Pigmentierung dieser Retinaschicht RNA- Expression nicht visualisiert werden konnte.

Tab. 4.1: Zusammenfassung der retinalen RNA-Expression Die Signalintensitäten der verschiedenen untersuchten Gene erlauben einen Vergleich der Genexpression der Ccdc66-/--Retina und der Ccdc66+/+-Retina, aber keinen Vergleich der Gene untereinander, da jede in-situ-Hybridisierung verschiedene Inkubationszeiten erforderte und zu unterschiedlichen Färbungsintensitäten führte. Abk.: FC „Fold-Change“ zum Vergleich der Array-Expressionsdaten, RPE retinales Pigment- epithel, OS Außensegmente, IS Innensegmente, ONL äußere Körnerschicht, OPL äußere plexiforme Schicht, INL innere Körnerschicht, IPL innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzell- schicht, - keine nachweisbare Expression, (+) schwache Expression, + deutliche Expression, +(+) intermediäre Expression, ++ starke Expression.

Serpina3n Gm12541 Antxr2 Pcolce Gadd45b Edn2 Optc Rpe65 P28 P28 P28 P28 P28 P28 P10 P28

FC 11,54 FC 8,75 FC 5,02 FC 3,28 FC 3,2 FC 3.02 FC 2,18 FC -3,89

------

/ / / / / / / /

------

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66 Ccdc66

RPE OS ------IS ------ONL + + + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + +(+) + - - OPL ------INL + + + (+) ++ + + + ++ + + + +(+) + - - IPL ------

GCL + + + (+) + - + + ++ + + + + + - -

In der Ccdc66-/--Retina zeigten die Gene Antxr2, Pcolce, Edn2 und Optc eine schichtspezifisch unterschiedlich ausgeprägte Expression. Bei den Genen Antxr2 und Optc war die Expression in der äußeren (ONL) und in der inneren Körnerschicht (INL) stärker als in der Ganglienzellschicht (GCL). Die Expres- sion der Gene Edn2 und Pcolce war in der äußeren Körnerschicht (ONL) am stärksten. 66

Bei den Genen Gm12541, Antxr2, Gadd45b, Edn2 und Optc konnten Expres- sionsunterschiede gezeigt werden. Beim Gen Antxr2 war die genotypabhängige unterschiedliche Expression in allen kernhaltigen Retinaschichten nachweisbar (ONL, INL, GCL). Bei den Genen Gadd45b und Gm12541 zeigten die innere Körnerschicht (INL) und die Ganglienzellschicht (GCL) der Ccdc66-/--Retina stärkere Expression als die entsprechenden Schichten der Ccdc66+/+-Retina. Das Gen Optc wurde in der Ccdc66-/--Retina in der äußeren und inneren Kör- nerschicht stärker exprimiert als in der Ccdc66+/+-Retina. Der Expressions- unterschied des Gens Edn2 war in der äußeren Körnerschicht nachweisbar. Bei den Genen Serpina3n, Pcolce und Rpe65 war kein Expressionsunterschied objektivierbar. Drei der untersuchten Gene, Antrxr2, Edn2 und Optc, zeigten bei der Ccdc66-/-- Maus in der äußeren Körnerschicht, der Schicht der Photorezeptorzellkörper, erhöhte Expression im Vergleich zu der Ccdc66+/+-Maus. Eine Lokalisation des Expressionsunterschieds zwischen der Ccdc66-defizienten und der Wildtyp- Retina in der inneren Körnerschicht, die die Perikaryen der Müllerzellen, der amakrinen Zellen sowie der Bipolar- und Horizontalzellen enthält, wurde durch die in-situ-Hybridisierung bei den Genen Gm12541, Antxr2, Gadd45b und Optc nachgewiesen. Eine erhöhte RNA-Expression in der Ganglienzellschicht zeigte sich in der Ccdc66-defizienten Retina bei den Genen Gm12541, Antxr2 und Gadd45b. Beim Optc-Gen wurde sowohl bei P10 als auch bei P28 ein genotypspezifischer Expressionsunterschied in der äußeren und inneren Körnerschicht nachgewiesen. Im zeitlichen Verlauf (P4, P10, P17, P28) zeigte sich bei der Retina der Ccdc66-/--Maus eine Optc-Expression in allen kernhaltigen Schichten (äußere Körnerschicht bzw. äußere neuroblastische Schicht, innere Körnerschicht bzw. innere neuroblastische Schicht und Ganglienzellschicht) mit der stärksten schichtspezifischen Expression in der inneren Körnerschicht. Während bei den Genen Serpina 3n, Gadd45b, Edn2 und Optc die Hintergrund- färbung fehte oder nur schwach ausgeprägt war, zeigte sich bei den Genen Antxr2, Pcolce und Gm12541 eine intensivere Hintergrundfärbung.

4.2 Zerebrale RNA-Expression der untersuchten Gene in der Maus Da das Gen Ccdc66 außer in der Retina auch im Bulbus olfactorius und im Hippocampus exprimiert wird, wurden in diesen zerebralen Strukturen in-situ- Hybridisierungen mit den Sonden der Gene durchgeführt, deren Expression in der Retina untersucht wurde. Die Anfertigung der Gehirnschnitte erfolgte wie in Kap. 3.3.3 beschrieben. Es wurden die Gehirne von je drei 28 Tage alten (P28) Ccdc66-/--Mäusen und Ccdc66+/+-Mäusen untersucht. Die in-situ-Hybridisierungen mit den Antisense-Sonden der Gene Serpina3n, Gm12541, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2 und Optc wurden wie in Kap. 3.3.5 beschrieben durchgeführt. Die korrespondierenden Sense-Sonden dienten als Negativ-Kontrollen.

4.2.1 Optc-RNA-Expression im Gehirn der Maus Optc-RNA konnte bei den Ccdc66-/-- und bei den Ccdc66+/+-Mäusen der Alters- stufe P28 im Bulbus olfactorius in der Körnerzellschicht, in der internen und externen plexiformen Schicht, in der Mitralzellschicht, in der glomerulären Schicht und in der Schicht der Riechnervenfasern nachgewiesen werden (Abb. 4.16). Die Sense-Sonden erzeugten eine sehr schwache Hintergrundfärbung. Die Lokalisation des Optc-Transkripts korreliert mit der Expression der Ccdc66- RNA, die ebenfalls in den oben genannten Schichten nachgewiesen wurde (siehe Kap. 1.4.2). Unterschiede in der Expressionsstärke zwischen den beiden Genotypen konnten nicht objektiviert werden.

Abb. 4.16: Optc- Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) In-situ-Hybridisierung zeigt bei beiden Genotypen eine gleich starke Expression der Optc-RNA in der Körnerzellschicht (GrL), der internen und externen plexiformen Schicht (IPL, EPL), der Mitralzellschicht (ML), der glomerulären Schicht (GL) und der Schicht der Riechnervenfasern (OlfNL) (A, B). Die Sense-Sonde erzeugt bei beiden Genotypen eine leichte Hintergrundfärbung (C, D). 18 µm coronale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 2 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 100 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; + deutliche Expresssion, ++ starke Ex- pression.

In der Hippocampusformation zeigte die in-situ-Hybridisierung bei beiden Geno- typen eine gleich starke Optc-Expression in dem Stratum pyramidale der Regio- nen CA1bis CA3 (Cornu Ammonis) sowie in der Körnerzellschicht und der polymorphen Schicht des Gyrus dendatus. Auch in den angrenzenden cortikalen und thalamischen Regionen wurde die Expression des Optc-Transkripts durch die Optc-Antisense-Sonde nachgewiesen (Abb. 4.17). Die Applikation der Sense-Sonde erzeugte keine Markierungssignale. In der Hippocampusforma- tion korreliert die Lokalisation der Optc-Expression ebenfalls mit der der Ccdc66-Expression (siehe Kap.1.4.2).

Abb. 4.17: Optc-Expression in der Hippocampusformation der Maus (P28) Mittels in-situ-Hybridisierung wurde die Optc-Expression bei beiden Genotypen in dem Stratum pyramidale der Regionen CA1-3 (Cornu Ammonis), in der Körnerzellschicht und in der polymorphen Schicht des Gyrus dendatus (DG) sowie in den angrenzenden cortikalen (CTX) und thalamischen (TH) Arealen nachgewiesen (A, B). Die Sense-Sonde erzeugte keine Signale (C, D). 18 µm coronale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 2 h; der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

4.2.2 Pcolce-, Antxr2- und Gm12541-Expression im Gehirn der Maus Bei der Hybridisierungen der Pcolce-, Antxr2- und Gm12541-Sonden ließ die intensive Hintergrundfärbung der Sense-Sonden, die teilweise die Signalstärke der Antisense-Sonden übertraf, keine eindeutige Lokalisation der Transkripte in den Schichten des Bulbus olfactorius zu. In der Hippocampusformation konnte mittels in-situ-Hybridisierung keine Expression der Gene Pcolce, Antxr2 und Gadd45b nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

4.2.3 Serpina3n-, Edn2- und Gadd45b-Expression im Gehirn der Maus Im Bulbus olfactorius führte die in-situ-Hybridisierung mit den Serpina3n-, Edn2- und Gadd45b-Antisense-Sonden zum Nachweis der entsprechenden mRNA. Die Hybridisierung mit der Serpina3n-Antisense-Sonde stellte Serpina3n-Tran- skripte bei beiden Genotypen in der Körnerzellschicht, in der Mitralzellschicht und in der glomerulären Schicht dar. In allen diesen Schichten war die Ser-

pina3n-Expression bei der Ccdc66-/--Maus stärker als bei der Ccdc66+/+-Maus bei fehlender Hintergrundfärbung durch die Sense-Sonde (Abb. 4.18).

Abb. 4.18: Serpina3n-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt die Expression der Serpina3n-RNA in der Körnerzellschicht (Grl), der Mitralzellschicht (ML) und der glomerulären Schicht (GL). Die Expression ist bei der Ccdc66-/--Maus (A) stärker ausgeprägt als bei der Ccdc66+/+-Maus (B). Die Sense-Sonde erzeugt keine Signale. (C, D). 18 µm coronale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 33 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 100 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, (+) schwache Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. IPL interne plexiforme Schicht, EPL externe plexiforme Schicht, OlfNL Schicht der Riechnervenfasern

Die Lokalisation des Edn2-Transkripts wurde bei beiden Genotypen in der Kör- nerzellschicht, der Mitralzellschicht und der glomerulären Schicht nachgewiesen. Die Expression war bei der Ccdc66-/--Maus in den genannten Schichten stärker als bei der Ccdc66+/+-Maus (Abb. 4.19). Allerdings erzeugte die Sense- Sonde eine Hintergrundfärbung, die nur wenig schwächer war als die Signale der Antisense-Sonden.

Abb. 4.19: Edn2-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) Edn2-Expression wurde mittels in-situ-Hybridisierung in der Körnerzellschicht (Grl), der Mitral- zellschicht (ML) und der glomerulären Schicht (GL) nachgewiesen. Die Expression ist bei der Ccdc66-/--Maus (A) stärker ausgeprägt als bei der Ccdc66+/+-Maus (B). Die von der Sense-Son- de erzeugte Hintergrundfärbung ist bei den Genotypen unterschiedlich ausgeprägt (C, D). 18 µm coronale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 33 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 100 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression. IPL interne plexiforme Schicht, EPL externe plexiforme Schicht, OlfNL Schicht der Riechnerven- fasern

Bei der Hybridisierung mit der Gadd45b-Antisense-Sonde war das erzeugte Markierungssignal bei beiden Genotypen mit gleicher Intensität in der Körner- zellschicht, in der Mitralzellschicht und in der glomerulären Schicht zu beobachten (Abb 4.20). Die Sense-Sonde erzeugte eine schichtspezifische Hintergrund- färbung unterschiedlicher Intensität. In der Hippocampusformation konnte mittels in-situ-Hybridisierung keine Ex- pression der Gene Serpina3n, Edn2 und Gadd45b nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.20: Gadd45b-Expression im Bulbus olfactorius der Maus (P28) Die in-situ-Hybridisierung zeigt eine gleich starke Expression der Gadd45b-RNA bei beiden Genotypen in der Körnerzellschicht (GrL), in der Mitralzellschicht (ML) und in der glomerulären Schicht (GL) (A, B). Die Sense-Sonde erzeugt eine unterschiedlich starke Hintergrundfärbung (C, D). 18 µm coronale Gefrierschnitte, Inkubation in NBT/BCIP-Lösung für 17 h; der Maßstabsbalken in D entspricht 100 µm und gilt für alle vier abgebildeten Ausschnitte. Die Tabelle links zeigt schematisch die Signallokalisation der Antisense-Sonden; - keine nachweisbare Expression, + deutliche Expression. IPL interne plexiforme Schicht, EPL externe plexiforme Schicht, OlfNL Schicht der Riechnerven- fasern

4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse (Gehirn) Im Hippocampus wurde eine bei beiden Genotypen gleich starke Optc-Expres- sion im Stratum pyramidale der Regionen CA1bis CA3 (Cornu Ammonis), in der Körnerzellschicht und der polymorphen Schicht des Gyrus dendatus sowie in den angrenzenden cortikalen und thalamischen Regionen nachgewiesen. Die Expression der Gene Serpina3n, Gadd45b, Edn2, Pclolce, Antxr2 und Gm12541 war im Hippocampus nicht objektivierbar. Im Bulbus olfactorius wurde die Expression der Gene Serpina3n, Edn2, Gadd45b und Optc dargestellt. Die Gene Serpina3n und Edn2 zeigten bei der Ccdc66-/--Maus im Vergleich mit der Ccdc66+/+-Maus eine stärkere Expression in allen drei exprimierenden Schichten (Körnerzellschicht, Mitralzellschicht und glomeruläre Schicht). Beim Gadd45b-Gen und beim Optc-Gen, das außer in der Körnerzellschicht, der Mitralzellschicht und der glomerulären Schicht auch 73

in der internen und externen plexiformen Schicht sowie in der Schicht der Riechnervenfasern exprimiert wird, wurde kein genotypspezifischer Unterschied nachgewiesen.

Tab. 4.2: Zusammenfassung der RNA-Expression im Bulbus olfactorius (P28) Die Signalintensitäten der verschiedenen untersuchten Gene erlauben einen Vergleich der Genexpression der Ccdc66-/--Retina und der Ccdc66+/+-Retina, aber keinen Vergleich der Gene untereinander, da jede in-situ-Hybridisierung verschiedene Inkubationszeiten erforderte und zu unterschiedlichen Färbungsintensitäten führte. Abk.: GrL Körnerzellschicht, IPL interne plexiforme Schicht, ML Mitralzellschicht, EPL externe plexiforme Schicht, GL glomeruläre Schicht, OlfNL Schicht der Riechnervenfasern, - keine nachweisbare Expression, (+) schwache Expression, + deutliche Expression, ++ starke Expression

Serpina3n Gadd45b Edn2 Optc Ccdc66-/- Ccdc66+/+ Ccdc66-/- Ccdc66+/+ Ccdc66-/- Ccdc66+/+ Ccdc66-/- Ccdc66+/+ GrL ++ + + + ++ + ++ ++ IPL ------+ + ML ++ + + + ++ + ++ ++ EPL ------+ + GL + (+) + + ++ + ++ ++ OlfNL ------+ +

5 Diskussion Die Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit Geweben (Re- tina und Gehirn) von Ccdc66-defizienten Mäusen (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo); Ccdc66-/-) und Wildtyp-Mäusen (C57BL/6J; Ccdc66+/+) durchgeführt wurden, sollten Genexpressionsunterschiede, die in der Arbeit von Roberz (2014) mittels „Exon array“-Techologie dargestellter Transkriptomprofile bestimmt worden waren, näher charakterisieren. Der Nachweis der Gen-Transkripte (mRNA) in der Retina, im Bulbus olfactorius und im Hippocampus erfolgte dabei mittels in- situ-Hybridisierung. Die Signale der hybridisierten Sonden zeigten in der Retina die Lokalisation der RNA-Transkripte der Gene Serpina3n, Gm12514, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2 und Optc jeweils in der äußeren Körnerschicht mit den Perikaryen der Photorezeptorzellen, in der inneren Körnerschicht mit den Perikaryen der Mül- lerzellen, Bipolarzellen, Horizontalzellen und amakrinen Zellen sowie in der Ganglienzellschicht, also in Schichten, die Zellkerne enthalten. Die mRNA der untersuchten Gene war demnach erwartungsgemäß in der Nähe der Zellkerne lokalisiert. Bei den Genen Antxr2, Pcolce, Edn2 und Optc konnte schichtspezifisch unterschiedlich ausgeprägte Expression nachgewiesen werden. In den exprimierenden Schichten (ONL, INL, GCL) war die Expression der Gene Antxr2 und Optc in der äußeren und inneren Körnerschicht stärker als in der Ganglienzellschicht. Von den Schichten, die die Gene Edn2 und Pcolce exprimierten (ONL, INL, GCL), zeigte die äußere Körnerschicht die stärksten Hybridisierungssignale. Die in der Arbeit von Roberz (2014) ermittelten Transkriptionsunterschiede in der Ccdc66-/--Retina im Vergleich mit der Ccdc66+/+-Retina konnten durch die in-situ-Hybridisierungen dieser Arbeit bei den Genen Gm12514, Antxr2, Gadd45b, Edn2 und Optc bestätigt werden. Bei den Genen Serpina3n, Pcolce und Rpe65 wurde kein signifikanter Expressionsunterschied objektiviert. Die Zuordnung der Genexpressionen zu unterschiedlichen Schichten der Retina und damit zu spezifischen Zellgruppen, die schichtspezifischen Expressions- unterschiede zwischen den beiden Ccdc66-Genotypen, das zeitliche Expres- sionsmuster des Gens Optc bei unterschiedlichen Altersstufen und der genotypspezifische Expressionsunterschied der Gene Serpina3n und Edn2 im Bulbus olfactorius erlaubten Rückschlüsse bezüglich möglicher Auswirkungen 75

der veränderten Genexpression auf Prozesse, die mit der Degeneration der Photorezeptoren assoziiert sind.

5.1 Gene der zellulären Stressantwort Die in der Ccdc66-/--Retina erhöhte Expression des Gens Edn2 (endothelin 2), die in der Arbeit von Roberz (2014) bei der Transkriptomanalyse der Altersstufe P28 einen „Fold-Change“ von 3,02 ergab, konnte mittels in-situ-Hybridisierung bestätigt werden. Das Edn2-Transkript wurde in der äußeren Körnerschicht, in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht nachgewiesen. Die stärkste Signalintensität wurde in der Schicht der Photorezeptoren der Ccdc66- defizienten Retina beobachtet. Edn2 gehört zu einer relativ kleinen Gruppe von Genen, die bei Photorezeptor- schädigungen vermehrt exprimiert werden, wie verschiedene Studien über hereditäre Retinadegenerationen sowie über Verletzungen der Retina durch Lichtschäden und Netzhautablösungen zeigten (Rattner und Nathans, 2005; Bramall et al., 2013; Swiderski et al., 2007). Unter den durch die Photorezeptor- degeneration induzierten Transkripten waren die Edn2-Transkripte, die in den Photorezeptorzellen nachgewiesen wurden, in allen getesteten Modellen vermehrt exprimiert (Rattner und Nathans, 2005). Eine Schädigung der Photorezeptoren führt unabhängig von der auslösenden Ursache zur Aktivierung von Müllerzellen, den Hauptgliazellen der Retina (Bringmann und Reichenbach, 2001). Bei diesem Prozess wird dem von den Photorezeptoren stammenden EDN2-Protein die Funktion eines Stresssignals zugeschrieben (Rattner und Nathans, 2005). EDN2 bindet an den Endo- thelinrezeptor B (EDNRB) auf den Müllerzellen und kommuniziert auf diesem Weg mit den Müllerzellen, die dadurch über den Funktionsstatus der Photo- rezeptoren informiert werden (Rattner und Nathans, 2005). EDN2 ist ein Peptid, das an zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (EDNRA und EDNRB) bindet. EDNRB wird in Müllerzellen und Horizontalzellen exprimiert, EDNRA in Bipolarzellen. Beide Rezeptoren befinden sich auch in choroidalen und retinalen Gefäßen (Bramall et al., 2013). EDN2 wird aus einem Präpropeptid durch sequentielle Kürzungen zum maturen EDN2 prozessiert. Endothelin-Converting-Enzym 1(ECE-1), das an diesem Prozess beteiligt ist,

wird in den Müllerzellen exprimiert. Es wird vermutet, dass EDN2-Protein von den degenerierenden Photorezeptoren produziert und in den extrazellulären Raum abgegeben wird. Hier kann es durch die extrazelluläre funktionelle Gruppe des ECE-1, das auf den die Photorezeptoren umschließenden radialen Ausläufern der Müllerzellen lokalisiert ist, zum maturen EDN2 umgewandelt werden und an den EDNRB der radialen Müllerzellen-Ausläufer binden (Bramall et al., 2013). In Mausmodellen für hereditäre Retina-Degeneration (Pde6brd1/rd1 (Bramall et al., 2013); rd10 (Samardzija et al., 2012)) stellt die erhöhte Edn2-Expression eine protektive Antwort auf die durch eine Mutation verursachte Schädigung der Photorezeptoren dar, um die retinale Degeneration aufzuhalten. In degenerier- ten Retinae wurde erhöhte Expression von Fgf2 mRNA und FGF2-Protein nachgewiesen (Bramall et al., 2013; Samardzija et al., 2012). FGF2 ist ein neurotropher Faktor, der das Überleben von Zellen fördert. Der in den Maus- modellen beobachtete protektive Effekt der erhöhten Edn2-Expression könnte zumindest teilweise durch die Edn2-abhängige Expressionserhöhung von Fgf2 bedingt sein (Bramall et al., 2013). In den Retinae der Ccdc66-/--Maus wurde bei der Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) ebenfalls eine erhöhte Fgf2-Expression gesehen („Fold-Change“ 2,54), die bei der in-situ-Hybridisierung durch die Signale der Gm12541-Sense-Sonde bestätigt wurde. Da das Gen Gm12541 sich auf dem Gegenstrang des Fgf2-Gens befindet, wurde bei der in-situ-Hybridisierung durch die Gm12541-Antisense-Sonde das Gm12541-Transkript und durch die Gm12541-Sense-Sonde, die komplementär zu Sequenzen der 3‘ untranslatier- ten Region des Fgf2-Transkripts ist (Li und Murphy, 2000), die Expression des Fgf2-Gens nachgewiesen. Die Fgf2-RNA wurde in der äußeren Körnerschicht, in der Ganglienzellschicht und besonders stark in der inneren Körnerschicht exprimiert. Auch die von dem Fgf2-Gegenstrang transkribierte Gm12541-RNA, die eine mögliche Funktion als Fgf2-regulatorisches Antisense-Transkript hat (Bramall et al., 2013), war in den Retinae der Ccdc66-/--Mäuse stärker exprimiert als in den Retinae der Ccdc66+/+-Mäuse. Im zeitlichen Verlauf ergab die in der Arbeit von Roberz (2014) durchgeführte Transkriptomanalyse bei den Retinae der Altersstufe P10 und P17 keine erhöh- te Edn2-, Fgf2- und Gm12541-Expression. Die erhöhte Expression dieser Gene

trat bei der Ccdc66-/--Maus erst nach fortgeschrittener retinaler Degeneration ein, die bei den Retinae 13 Tage alter Mäuse in der Deformierung der Außen- und Innensegmente der Photorezeptorfortsätze und bei 28 Tage alten Mäusen als leicht reduzierte Schicht der Photorezeptoren sichtbar wird (Gerding et al., 2011). Der stressbedingte Expressionsanstieg des Gens Serpina3n, der in der Tran- skriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) den höchsten „Fold-Change“ (11,54) ergab, konnte mittels in-situ-Hybridisierung in der hier vorgelegten Ar- beit nicht bestätigt werden. Serpina3n (serine peptidase inhibitor, clade A, member 3N) ist ein Akute-Phase-Protein, das mit Entzündungsreaktionen assoziiert ist und das bei retinaler Degeneration mit einer erhöhten Expression nachgewiesen wurde (Swiderski et al., 2007; Rattner und Nathans, 2005). Serpina3n scheint eine bedeutende Rolle bei der Verhinderung inflammatorisch vermittelter neurodegenerativer Krankheiten zu spielen (Haile et al., 2015). Inflam- matorische Prozesse, die durch aktivierte retinale Mikrogliazellen vermittelt werden, spielen bei der retinalen Degeneration eine wichtige Rolle, wie Studien an rd10 Mausmodellen zeigen (Zhao et al., 2015). Mikrogliazellen sind phago- zytierende Wächterzellen im zentralen Nervensystem und in der Retina, die für die neuronale Homöostase und die angeborene Immunabwehr benötigt werden. Während der Entwicklung der Retina besteht ihre Aufgabe darin, über einen Umbau von Komponenten der Extrazellularmatrix die Bildung des Neuronen- Glia-Netzwerks zu unterstützen und durch Phagozytose Zelltrümmer apopto- tischer Neurone in der Ganglienzellschicht und in der inneren Körnerschicht zu eliminieren (Langmann, 2007). In Studien zur retinalen Degeneration wird eine frühe Infiltration von Mikro- gliazellen in die Schicht der Photorezeptoren und eine Hochregulierung von Molekülen, die an der Phagozytose beteiligt sind, beschrieben (Zhao et al., 2015). Diese aktivierte infiltrierende Mikroglia kann die Apoptose der Photo- rezeptoren und dadurch die retinale Degeneration über proinflammatorische Mechanismen weiter beschleunigen. Die frühe Mikrogliaaktivierung ist eine generelle Reaktion auf unterschiedliche Schädigungen der Retina, wie Auto- immunmechanismen, neuronale Verletzungen, Ischämie sowie metabolische und hereditäre Retinopathien. Diese sind auch mit progressiver Neurodege- neration verbunden (Langmann, 2007).

Die im Ccdc66-defizienten Mausmodell bei der Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) gezeigte erhöhte Expression von Serpina3n kann als protektive Reaktion auf die Aktivierung der Mikrogliazellen gedeutet werden. Der spezifische Nach- weis des Serpina3n-Transkripts in der hier vorgelegten Arbeit mittels in-situ- Hybridisierung wurde dadurch erschwert, dass das Serpina3n-Gen zu einem Cluster von Genen gehört, deren 14 Mitglieder eine Sequenzähnlichkeit von 65- 80 % besitzen (Pelissier et al., 2008). Obwohl als Hybridisierungsposition der Antisense-Sonde mit dem Serpina3n-Transkript eine relativ kurze Sequenz von 248 Basenpaaren am 3‘-Ende des proteinkodierenden Transkriptsbereiches ausgewählt wurde und die Datenbank-Analyse der Sondensequenz keine Homologien zu anderen Sequenzen zeigte, scheint die Spezifität der Sonde nicht ausreichend zu sein. Der Nachweis eines Expressionsunterschieds mittels in-situ-Hybridisierung könnte mit anderen Sonden möglich sein. Des Weiteren wurde die Ausprägung der Sondensignale stark von der NBT/BCIP-Färbedauer beeinflusst und zeigte bei wiederholten in-situ-Hybridisierungen mit gleichen Färbezeiträumen Schwankungen in der Signalintensität. Deshalb war die Inku- bationsdauer, bei der ein Expressionsunterschied optimal erkannt werden kann, nicht sicher vorherzusagen. Es wurden daher drei unterschiedliche Inkubations- zeiten getestet. Weitere Tests waren im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Gegebenenfalls könnten optimale Bedingungen zu einem Nachweis des Ex- pressionsunterschieds beitragen oder es könnten monoklonale Antikörper, so- fern verfügbar, eingesetzt werden.

5.2 Gadd45b im Kontext der Neuroprotektion Mittels in-situ-Hybridisierung konnte in den Retinae der Ccdc66-/--Mäuse im Ver- gleich zu den Ccdc66+/+-Mäusen eine erhöhte Gadd45b-Expression nachgewiesen werden. Der größte Expressionsunterschied zwischen den beiden Geno- typen wurde in der Ganglienzellschicht beobachtet, und auch in der inneren Körnerschicht war die Signalintensität bei der Ccdc66-/--Retina stärker als bei der Ccdc66+/+-Retina. Das Produkt des Gens Gadd45b (growth arrest and DNA-damage inducible, beta), wird in retinalen Ganglienzellen als Antwort auf oxidativen Stress, Alte- rungsprozesse und erhöhten intraokulären Druck vermehrt exprimiert und för-

dert das Zellüberleben (Liu et al., 2009). GADD45B ist ein Mitglied der GADD45-Familie von kleinen (18 kDa), evolutionär konservierten Proteinen. In nicht-neuronalen Zellen interagiert es mit Regulationsfaktoren und Signalwe- gen, die das Zellüberleben bzw. die Apoptose kontrollieren (Liu et al., 2009). In neuronalen Zellen wird die Gadd45b-Expression durch die induzierte Aktivie- rung des NFκB-Signalweges durch TGF-β hochreguliert, dessen Signalwirkung fördernd für das neuronale Überleben unter pathologischen Bedingungen ist (Liu et al., 2009). Die bei der Ccdc66-/--Retina erhöhte Expression des Gadd45b-Transkripts in den Ganglienzellen kann daher als neuroprotektive Funktion gedeutet werden, die das Überleben der neuronalen Zellen fördern soll.

5.3 Gene der extrazellulären Matrix Die Gene Optc, Antxr2 und Pcolce, deren erhöhte Expression bei der Ccdc66-/-- Maus in der vorangegangenen Arbeit mittels Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) nachgewiesen wurde, sind mit biochemischen und strukturellen Prozes- sen der extrazellulären Matrix assoziiert. Bei den Genen Optc und Antxr2 konnte der Expressionsunterschied durch die in-situ-Hybridisierungen der hier vorgelegten Arbeit bestätigt werden. Bei dem Gen Pcolce war keine genotypspezi- fisch unterschiedliche Expression offensichtlich. Die extrazelluläre Matrix, die als dynamisches Maschenwerk aus Proteinen und Polysacchariden die nicht-zelluläre Komponente aller Gewebe und Organe dar- stellt, sorgt für die strukturelle Unterstützung der zellulären Bestandteile und vermittelt wichtige biochemische Prozesse der Morphogenese, Differenzierung und Homöostase der Gewebe (Ishikawa et al., 2015). Der Verlust von Photorezeptorzellen bei degenerativen Erkrankungen wird von „Remodeling“-Prozessen der extrazellulären Matrix begleitet, die zu morphologischen und funktionellen Veränderungen führen und Neurone, Gliazellen und Blutgefäße beteiligen (Strettoi, 2015; Reinhard et al., 2015). Die erhöhte Ex- pression der Gene Optc, Antxr2 und Pcolce lässt über eine Beteiligung ihrer Genprodukte an Umbauprozessen der extrazellulären Matrix vermuten, dass diesen „Remodeling“-Prozessen auch im Ccdc66-defizienten Mausmodell beim

Fortschreiten oder sogar auch bei der Entstehung der retinalen Degeneration eine wichtige Rolle zukommt.

5.3.1 Auswirkung erhöhter retinaler Optc-Expression Beim Gen Optc (opticin) wurde in der Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) bereits bei der zehn Tage alten Ccdc66-/--Maus erhöhte Expression im Ver- gleich zu der Ccdc66+/+-Maus ermittelt. Dieser Zeitpunkt liegt vor dem Auftreten von ersten sichtbaren Zeichen der retinalen Degeneration (P13) (Gerding et al., 2011). Die in-situ-Hybridisierungen in der hier vorgelegten Arbeit wiesen einen genotypspezifischen Unterschied der Optc-Expression in der äußeren und inneren Körnerschicht in der Retina von zehn Tagen und 28 Tagen alten Mäusen (P10, P28) nach. Der Expressionsunterschied war bereits in der Retina vier Tage alter Mäuse (P4) in der äußeren und der inneren neuroblastischen Schicht sichtbar. Die Lokalisation der Optc-Expression zeigte im zeitlichen Verlauf teilweise Übereinstimmungen mit der Ccdc66-Expression, die in der Arbeit von Schreiber (2015) untersucht wurde. Beide Gen-Transkripte zeigten bei P17 und bei P28 eine gemeinsame Lokalisation in der inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht. Das von dem Gen Optc kodierte Protein OPTICIN gehört zur SLRP-Familie (small leucine-rich repeat protein), deren Mitglieder eine Region mit unterschiedlicher Anzahl an Leucin-reichen Wiederholungsmotiven besitzen (Le Goff und Bishop, 2007). Die meisten SLRPs sind Proteoglykane, die aus einem zentralen Proteinfilament bestehen, an das kovalent eine oder mehrere Glykosaminoglykan (GAG)-Ketten gebunden sind. OPTICIN ist anstelle von GAGs mit syalylierten Oligosacchariden glykosiliert (Takanosu et al., 2001). Beim Menschen ist es eng assoziiert mit den Kollagenfibrillen des Glaskörpers und trägt so zur Stabilisierung der Glaskörpergelstruktur bei. Dadurch dass es mit Heparan- und Chondroitinsulfat-Glykanen interagiert, kann es Glaskörper- kollagenfibrillen mit der inneren Grenzmembran verbinden und dient so der Auf- rechterhaltung der Glaskörper-Retina-Adhäsion (Le Goff und Bishop, 2007). Die in-situ-Hybridisierung mit der Optc-Antisense-Sonde wies neben der Optc- Expression in allen kernhaltigen Retinaschichten auch die-Expression am Ziliar-

körper nach. Im nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers wurde das Optc- Gen bei beiden Ccdc66-Genotypen etwa gleich stark exprimiert. Reardon (Reardon et al., 2000) und Le Goff (Le Goff et al., 2012b) zeigten, dass OPTICIN anti-angiogene Aktivität besitzt. Es bindet an Kollagen Typ I und Typ II und inhibiert kompetitiv die Integrin-vermittelte endotheliale Zelladhäsion an der umgebenden extrazellulären Matrix (Le Goff et al., 2012b). Kollagen sti- muliert die Angiogenese durch „outside-in-signaling“ über α1β1- und α2β1-Inte- grine, die auf endothelialen Zellen exprimiert werden. Die Signalübertragung führt zur Ausbildung von Fokaladhäsionskomplexen und von Actin-Stressfa- sern. Dieser initialen Kontraktilitäts- und Formänderung der Endothelzellen folgt die Anlagerung und Verbindung zu präkapillären Strukturen (Le Goff et al., 2012b). Durch seine Bindung an Kollagen Typ II, das Hauptkollagen des Glas- körpers, fungiert OPTICIN als endogener Inhibitor der Angiogenese im Glas- körper und der präretinalen Neovaskularisierung (Le Goff et al., 2012a). Die erhöhte Optc-Expression in der Ccdc66-/--Retina kann möglicherweise angiogene Vorgänge verändern, die bei der Maus in den ersten drei postnatalen Wochen zur Ausbildung eines retinalen Gefäßsystems führen. Die Retina der C57BL6-Maus zeigt bei der Geburt noch unreife Vaskularisierung und persistierende hyaloide Gefäße (Stahl et al., 2010). In der ersten postnatalen Woche (P0–P8) wandern Gefäße vom Sehnerv her ein und bilden ein ober- flächliches Gefäßnetz, indem sie radiär zur Retinaperipherie hin auswachsen (Stahl et al., 2010). Durch vertikale Aussprossung beginnt ab P7 die Bildung eines tiefen Gefäßplexus in der äußeren plexiformen Schicht, der ungefähr bei P12 die Retinaperipherie erreicht. Die Bildung eines intermediären Gefäßplexus in der inneren plexiformen Schicht erfolgt zwischen P12 und P15. Am Ende der dritten postnatalen Woche sind alle vaskulären Gefäßnetze ausgereift (Stahl et al., 2010). Die in der Ccdc66-/--Retina erhöhte Optc-Expression könnte durch eine Hem- mung proangiogener Signalwege zur Beeinträchtigung der sich ausbreitenden Gefäßplexus führen. Die starke Optc-Expression in der inneren Körnerschicht zum Zeitpunkt P10, die sowohl mittels in-situ-Hybridisierung in dieser Arbeit als auch durch die Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) gezeigt wurde, korreliert mit der Ausbreitung des tiefen Gefäßplexus in der äußeren plexiformen Schicht und mit der fehlenden Ccdc66-Expression, die in der Arbeit von Schreiber

(2015) mittels Reportergenexpression mit einer postnatal bis P17 zunehmenden Intensität in der äußeren plexiformen Schicht nachgewiesen wurde. Auch die Ausbreitung des oberflächlichen Gefäßnetzes während der ersten acht Le- benstage der Maus und die Bildung des intermediären Gefäßplexus in der inneren plexiformen Schicht, beginnend am 12. postnatalen Tag, könnten durch die gesteigerte Optc-Expression in der Ccdc66-/--Retina beeinträchtigt werden. Photorezeptorzellen haben einen hohen Bedarf an Sauerstoff und Nährstoffen, der nicht direkt über Kapillaren sondern durch Diffusion aus den angrenzenden Gefäßsystemen gedeckt wird. Eine Störung der Gefäßentwicklung und damit eine Ischämie der inneren zwei Drittel der Retina hätte negative Auswirkungen auf die Versorgung der Photorezeptorzellen in der äußeren Körnerschicht. Die Versorgung der äußeren Retinaschichten erfolgt zusätzlich mittels Diffusion über das retinale Pigmentepithel aus den Gefäßen der Choriokapillaris (Kolb, 2005b). Auch dieses Gefäßsystem könnte durch erhöhte Optc-Expression in seiner Struktur beeinträchtigt sein, so dass eine Minderversorgung der Photo- rezeptorzellen mit Sauerstoff und Nährstoffen den Degenerationsprozess ver- stärkt oder möglicherweise sogar initiiert. Die weitere Abklärung der Vaskulari- sierung der Retina bei der Ccdc66-/--Maus und der Wildtyp-Maus zu unterschiedlichen Zeitpunkten der postnatalen Entwicklung könnte Hinweise darauf geben, welche Rolle die Angiogenese bei der retinalen Degeneration spielt. Eine weitere Bedeutung kommt der erhöhten Optc-Expression durch die Bin- dung des Proteins OPTICIN an Laminin zu, wodurch Integrin-vermittelte Zell- Matrix-Interaktionen unterbrochen werden (Le Goff et al., 2012a). Laminin ist eine Schlüsselkomponente retinaler Basalmembranen und spielt eine wichtige Rolle bei der Zelldifferenzierung (Reinhard et al., 2015). Es hat eine besondere Bedeutung bei den Vorgängen der Proliferation und Differenzierung retinaler Progenitorzellen aufgrund symmetrischer und asymmetrischer Teilungen, bei der Organisation der komplexen retinalen Struktur, die auf der exakten Positio- nierung der Retinazellen beruht, und bei der dendritisch-axonalen Entwicklung (Varshney et al., 2015). Außerdem tragen Laminine, dadurch dass sie die Pola- rität der Müllerzellen aufrechterhalten, zur retinalen Homöostase bei. Der Ver- lust von Laminin-vermittelten Signalen in der Retina resultiert in retinaler Dys- plasie (Varshney et al., 2015).

Die erhöhte Optc-Expression, die in den Retinae vier Tage alter Ccdc66-/--Mäu- se in der inneren neuroblastischen Schicht am stärksten ausgeprägt war, kann durch die Unterbrechung Integrin-vermittelter Interaktionen zwischen der extra- zellulären Matrix und der Zelloberfläche der Müllerzellen die Entwicklung der Müllerzellen, die zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen ist (Xu und Tian, 2004), beeinflussen. Die bei der Ccdc66-/--Maus erhöhte Optc-RNA-Expression in der inneren nukle- ären Schicht (P10, P17 und P28) führt möglicherweise durch eine vermehrte Ansammlung des OPTICIN-Proteins in dieser Retinaschicht über eine Störung der Polarität und der Kompartimentierung der Müllerzellen, für deren Aufrecht- erhaltung Laminine notwendig sind, zu einer Beeinträchtigung der retinalen Homöostase. Müllerzellen üben aufgrund ihrer hoch polarisierten Morphologie multiple Funktionen aus, wie die Regulierung der extrazellulären Ionenkon- zentration, Neurotransmitterrecycling und Freisetzung neurotropher Substanzen (Varshney et al., 2015). Eine gestörte Funktion der Müllerzellen kann den durch die Mutation des Ccdc66-Gens initiierten Degenerationsprozess der Photo- rezeptoren weiter verstärken. Keenan et al. (2012) wiesen in menschlichen Retinae OPTICIN immunhistochemisch in allen Retinaschichten nach, einschließlich des retinalen Pigment- epithels, der Bruch-Membran und des choroidalen Stromas. Eine erhöhte Optc- Expression in dieser Region beeinträchtigt möglicherweise über eine Inhibition Integrin-vermittelter Signalwege die Zellen des Pigmentepithels in ihren Funktio- nen im subretinalen Raum. Diese über die Interphotorezeptormatrix vermittelten Interaktionen beeinhalten Prozesse wie Adhäsion, Phagozytose, Außenseg- mentstabilität, Nährstoffaustausch und Retinoid-Transport (Ishikawa et al., 2015). Ein Hinweis auf die Störung dieser Funktionen des retinalen Pigment- epithels könnte die in der Arbeit von Roberz (2014) gezeigte erniedrigte Rpe65- Expression in der Retina der Ccdc66-/--Maus sein. Bei der Ccdc66-/--Maus konnte mittels in-situ-Hybridisierung die Expression der Gene Optc und Rpe65 in den Zellen des retinalen Pigmentepithels aufgrund der Pigmentierung dieser retinalen Schicht nicht dargestellt werden. Für die Untersuchung der Gen- expression in dieser Schicht kann als weiterer Ansatz die Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung in Erwägung gezogen werden.

5.3.2 Antxr2- und Pcolce-Expression und Umbauprozesse der Extrazellularmatrix Das Protein-Produkt des Gens Antxr2 (anthrax toxin receptor 2), auch bekannt als Cmg2 (capillary morphogenesis gene 2), ist ebenfalls an der Homöostase der Extrazellularmatrix beteiligt. Es ist ein Typ I Transmembran-Protein, das Ähnlichkeiten mit Integrinen besitzt. Es enthält eine von Willebrandfaktor Typ A (vWA)-Domäne, gefolgt von einer Ig-like Domäne in dem extrazellulären Anteil des Moleküls, eine einzelne 23 Aminosäuren lange Transmembran-Helix und einen 148 Aminosäuren langen zytoplasmatischen Anteil. Über seine vWA-Do- mäne bindet es an Laminin und an Kollagen Typ IV (Deuquet et al., 2012). Es wurde gezeigt, dass Antxr2-Expression für angiogene Prozesse wie endotheliale Proliferation und kapillarähnliche Netzwerkbildung benötigt wird und dass ANTXR2 an Matrix-Zell-Interaktionen beteiligt ist, indem es auf die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen einwirkt (Reeves et al., 2013). Weiterhin ist ANTXR2-Protein durch Assoziation mit MT1-MMP (membrane type 1 matrix metalloproteinase) am einem MMP-2 (matrix metalloproteinase- 2)-Aktivierungskomplex beteiligt, der proMMP-2 aus der extrazellulären Matrix durch proteolytische Spaltung aktiviert (Reeves et al., 2013). MMP-2 gehört zu einer Gruppe von Zink enthaltenden Endoproteasen, die Komponenten der Extrazellularmatrix abbauen. Die in der Retina der Ccdc66-defizienten Mäuse der Altersstufe P28 erhöhte Antxr2-Expression, die mittels Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) und in der hier vorgelegten Arbeit mittels in-situ-Hybridisierung gezeigt wurde, könnte als Versuch retinaler Zellen, angiogene Prozesse zu beeinflussen, angesehen werden. Die Antxr2-Expression wurde in der äußeren und inneren Körner- schicht und in der Ganglienzellschicht lokalisiert, was darauf schließen lässt, dass Antxr2 von mehreren retinalen Zelltypen wie neuronale Zellen und Glia- zellen exprimiert wird. Der Verlust von Photorezeptorzellen wird von einem Gewebe-„Remodeling“ begleitet, einem Prozess, der auch Anpassungsvorgänge von Blutgefäßen ein- schließt. Da Antxr2 die endotheliale Proliferation und Morphogenese während angiogener Prozesse fördert (Reeves et al., 2013), kann möglicherweise über eine veränderte Antxr2-Expression das retinale Gefäßsystem moduliert werden.

Die in der Ccdc66-/--Retina erhöhte Antxr2-Expression ist potentiell über eine Förderung der MT1-MMP-Aktivität an weiteren „Remodeling“-Prozessen der Extrazellularmatrix in der degenerierenden Retina der Ccdc66-defizienten Maus beteiligt. Erhöhte Expression des ANTXR2-Proteins führt möglicherweise durch eine Aktivierung der Matrix-Metalloproteinasen der Interphotorezeptormatrix zu einem vermehrten Abbau von Matrix-Komponenten und damit zu einer Störung der Prozesse des subretinalen Raums, wodurch die Degeneration der Photo- rezeptorzellen weiter fortschreitet. Das von dem Gen Pcolce (Pcpe-1, procollagen C-endopeptidase enhancer-1) kodierte Protein ist ebenfalls mit Prozessen der extrazellulären Matrix assoziiert. Die in-situ-Hybridisierung mit der Pcolce-Antisense-Sonde zeigte bei beiden Genotypen eine Lokalisation der mRNA in der Ganglienzellschicht, in der inneren Körnerschicht und vor allem in der äußeren Körnerschicht der P28- Retina. Die bei der Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) nachgewiesene erhöh- te Pcolce-Expression in der Ccdc66-defizienten Retina („Fold-Change“ 3,28) konnte mittels in-situ-Hybridisierung nicht bestätigt werden. Dies kann dadurch bedingt sein, dass durch eine zu kurze Inkubationszeit in der NBT/BCIP-Färbe- lösung unterschiedlich starke Sondensignale noch nicht deutlich sichtbar waren oder durch eine zu lange Inkubationszeit aufgrund einer Sättigung nicht mehr zu differenzieren waren. Beim Gen Pcolce wie auch bei dem oben beschriebenen Gen Antxr2 bewirkte die Hybridisierung mit der Sense-Sonde eine unterschiedlich ausgeprägte Hintergrundfärbung, die wahrscheinlich auf eine unspezifische Bindung hin- deutet. Durch den Einsatz anderer Antisense/Sense-Sondenkombinationen oder durch Veränderung der Hybridisierungstemperatur kann möglicherweise die Hintergrundfärbung reduziert werden. Die teilweise stark ausgeprägte Hintergrundfärbung könnte auch dadurch bedingt sein, dass von einer großen Anzahl von Genen bei verschiedenen Spezies, einschließlich beim Menschen und bei der Maus, Antisense-RNAs vom gegenüberliegenden Strang eines proteinkodierenden Strangs transkribiert werden. Diese „natural ribonucleic acids“ sind Transkripte, die komplementär zu endogenen RNAs, einschließlich mRNAs, sind und dadurch zu einer Hybri- disierung mit den Digoxigenin-markierten Sense-Sonden führen (Chiba, 2015). Die Antisense-Transkription spielt eine Rolle bei der Genregulation über Degra-

dation des korrespondierenden Sense-Transkripts (RNA „interference“) oder über Gen-Abschalten auf der Chromatinebene (Katayama et al., 2005). Globale Transkriptomanalysen zeigten, dass bei einem großen Anteil des Genoms Transkripte von beiden Strängen produziert werden (Katayama et al., 2005). Die Störung der Antisense-RNA kann die Expression der Sense-mRNA verän- dern, was darauf hinweist, dass die Antisense-Transkription dazu beiträgt, die Genexpression zu kontrollieren (Katayama et al., 2005). Das Transkriptionsprodukt des Gens Pcolce (Pcpe-1) ist ein Glykoprotein der Extrazellularmatrix, das die Bearbeitung des Prokollagens durch Prokollagen C- Proteinasen wie BMP-1 (bone morphogenetic protein-1) stimulieren kann. Die proteolytische Entfernung des Prokollagen C-Peptids ist ein wichtiger Schritt, der die Bildungsrate limitiert (Bourhis et al., 2013). Fibrilläre Prokollagen-Vor- läufer besitzen N- und C-terminale Extensionen an beiden Enden ihrer pro-α- Ketten. Die Propeptide werden von Prokollagen C-Proteinasen abgespalten, wodurch ein spontaner Zusammenbau der Kollagenfibrillen ermöglicht wird (Weiss et al., 2010). PCOLCE besteht aus zwei CUB-Domänen (complement C1r/C1s, embryonic sea urchin protein Uegf, BMP-1), die an das Prokollagen C-Propeptid binden, und aus einer Netrin-like (NTR)-Domäne, die an BMP-1 bindet (Weiss et al., 2014). Über die NTR-Domäne bindet PCOLCE auch an Zellmembran-Hepa- ransulfat-Proteoglykanen (Syndecan-1, -2 und -4). Durch eine solche Bindung könnte PCOLCE die Anordnung von Kollagenfibrillen an der Zelloberfläche kontrollieren und damit als spezifischer positiver Regulator der Kollagenanlagerung fungieren (Weiss et al., 2014). Syndecane spielen eine zentrale Rolle bei Zell-Matrix-Interaktionen. Sie sind in Prozesse der Zelladhäsion, der Migration, der Zytoskelettorganisation und der Differenzierung involviert. PCOLCE hat keine Funktion als Signal-Glykoprotein, sondern es scheint als eine Komponente eines multimolekularen Komplexes zu fungieren, bei dem die Heparansulfatketten der Syndecane und andere Extra- zellularmatrix-Komponenten als ein Gerüst dienen, das BMP-1, PCOLCE und Prokollagenmoleküle in dem Gebiet der Kollagenfibrillengenese zusammen- bringt (Weiss et al., 2014). Die in-situ-Hybridisierung zeigte die Expression der Pcolce-mRNA in der inneren Körnerschicht und besonders in der äußeren Körnerschicht der P28-Retina.

Eine genaue Regulierung der Anlagerung und Anordnung der Kollagenfibrillen bei Prozessen der Reparatur, die als „Remodeling“ bei Retina-Degenerationen zu beobachten sind, ist grundlegend für die Homöostase des retinalen Ge- webes. PCOLCE interagiert außer mit Prokollagen auch mit Laminin-111, Kol- lagen IV und Kollagen VI (Salza et al., 2014). Verstärkte Anlagerung von Kollagen und die damit verbundene Veränderung der Zell-Matrix-Interaktionen tragen wie die anderen „Remodeling“ -Prozesse zu einem Fortschreiten der degenerativen Prozesse der Retina bei, deren Endstadium durch den Zelltod weiterer Zelltypen und durch die Disorganisation der Retinaschichten gekennzeichnet ist (Strettoi, 2015).

5.4 Optc-, Edn2- und Serpina3n-Expression im Gehirn Die Transkriptomanalyse (Roberz, 2014) der Gehirne der Ccdc66-/-- und der Ccdc66+/+-Mäuse ergab keine Expressionsunterschiede der Gene, die in der Ccdc66-defizienten Retina im Vergleich zur Wildtyp-Retina unterschiedlich exprimiert wurden. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels in-situ-Hybridisie- rung in den Strukturen des Bulbus olfactorius bei der Ccdc66-/--Maus eine stär- kere Expression der Gene Edn2 und Serpina3n als bei der Wildtyp-Maus gezeigt werden. Der fehlende Nachweis der erhöhten Expression dieser Gene mittels Transkriptomanalyse ist sehr wahrscheinlich darin begründet, dass bei der Transkriptomanalyse nicht einzelne Gehirnareale, sondern Proben des Gesamtgehirns eingesetzt wurden. Die im Bulbus olfactorius mittels in-situ-Hybridisierung gezeigte erhöhte Serpina3n-Expression der Ccdc66-defizienten Maus konnte in der Retina nicht nachgewiesen werden. Die Spezifität der Sonde war möglicherweise aufgrund retinaspezifischer alternativer Spleißvorgänge des Serpina3n-Transkripts nicht ausreichend. Die Expressionsstärke des Gens Optc, dessen Expressionsorte im Bulbus olfactorius und im Hippocampus mit denen des Ccdc66-Gens korreliert, zeigte keine genotypspezifischen Unterschiede. Wie im in-situ-Hybridisierungsprojekt des adulten Mausgehirns gezeigt wurde (Lein et al., 2007) gehört Optc zu den nahezu ubiquitär exprimierten Genen des Gehirns.

Die erhöhte Expression des Gens Edn2, das in Prozesse der zellulären Stress- antwort bei der retinalen Degeneration involviert ist, und des Gens Serpina3n, das mit inflammatorischen Prozessen assoziiert ist, könnte, wie in der Retina, auch im Bulbus olfactorius zu den Degenerationsprozessen beitragen, die bei Ccdc66-defizienten Mäusen im Alter von elf Monaten elektronenmikroskopisch nachgewiesen wurden (Schreiber, 2015). Der Bulbus olfactorius elf Monate alter Ccdc66-defizienter Mäuse zeigte an den synaptischen olfaktorischen Ner- venendigungen in den Glomeruli charakteristische Degenerationszeichen in Form vergrößerter axonaler Endigungen mit kondensierten Zellorganellen (Schreiber, 2015). In der glomerulären Schicht des Bulbus olfactorius wurde bei der Ccdc66-defizienten Maus der Altersstufe P28 erhöhte Edn2- und Ser- pina3n-Expression mittels in-situ-Hybridisierung gezeigt. Die Hippocampus- Formation, in der keine Edn2- und Serpina3n-Expression beobachtet wurde, zeigte bei den elf Monate alten Ccdc66-defizienten Mäusen keine degenerativen Veränderungen (Schreiber, 2015), so dass eine Beteiligung dieser beiden Gene an den degenerativen Prozessen des Bulbus olfactorius wahrscheinlich ist.

5.5 Schlussfolgerung und Ausblick Die Zuordnung der mittels in-situ-Hybridisierung untersuchten Expression der Gene Serpina3n, Gm12514, Antxr2, Pcolce, Gadd45b, Edn2 und Optc zu bestimmten Retinaschichten, die schichtspezifischen Expressionsunterschiede dieser Gene und die in der Ccdc66-defizienten Retina nachgewiesene erhöhte Expression der Gene Gm12514, Antxr2, Gadd45b, Edn2 und Optc trugen dazu bei, die exprimierenden Zellgruppen einzugrenzen, einige der mit der Dege- neration verbundenen Signalwege und Prozesse zu plausibilisieren und die Funktion der beteiligten Gene und Proteine näher zu charakterisieren. Von den bei der Ccdc66-defizienten Maus und der Wildtyp-Maus unterschiedlich exprimierten Genen könnte das Gen Optc an frühen Entwicklungsprozes- sen beteiligt sein, welche die durch die Ccdc66-Mutation bedingte Degeneration der Photorezeptorzellen initiieren oder verstärken, da es bereits bei der Alters- stufe P4 in der Ccdc66-defizienten Retina verstärkte Expression zeigte, die auch bei späteren Alterstufen P10 und P28 bestehen blieb. Über seine anti-

angiogene Wirkung durch Inhibition Integrin-vermittelter endothelialer Zellad- häsionen in der umgebenden extrazellulären Matrix (Le Goff et al., 2012b) kann das Protein OPTICIN die Bildung der Gefäßplexus in der postnatalen Retina beeinträchtigen und damit zur Ischämie führen, die möglicherweise zu den frühen degenerativen Veränderungen der Photorezeptorzellen beiträgt. Des Weiteren kann OPTICIN durch Störung Laminin-Integrin-vermittelter Zell-Matrix- Interaktionen Zelldifferenzierungsprozesse negativ beeinflussen (Reinhard et al., 2015) und dadurch die Entwicklung der Müllerzellen beeinträchtigen, deren Differenzierung während der ersten beiden Lebenswochen der Maus andauert (Zhang et al., 2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass der retinalen Degeneration des Ccdc66-defizienten Mausmodells „Remodeling“-Prozesse der extrazellulären Matrix als Degenerationsmechanismen zugrunde liegen, die über morphologische, funktionelle und molekulare Umgestaltung retinaler Kom- ponenten zunächst einen protektiven Charakter haben, aber zur Inhibition neuronaler Regeneration und durch toxische Effekte zum Tod weiterer Zelltypen der Retina führen (Strettoi, 2015; Bringmann und Wiedemann, 2012). Die untersuchten Gene Edn2, Antxr2, Gadd45b, Gm12541, Pcolce und Ser- pina3n sind in Umbauprozesse involviert, die auch bei anderen hereditären Retina-Degenerationen den Verlust der Photorezeptoren begleiten. Die mittels in-situ-Hybridisierung gezeigte erhöhte Expression von Edn2 und Gadd45b kann als protektive Antwort auf die beginnende Degeneration der Photorezep- toren gedeutet werden. Edn2 kann dabei als Stresssignal an der reaktiven Gliosis der Müllerzellen beteiligt sein (Rattner und Nathans, 2005). Die erhöhte Gadd45b-Expression soll in retinalen Ganglienzellen das Zellüberleben fördern (Liu et al., 2009). Serpina3n, dessen erhöhte Expression in der Transkriptom- analyse (Roberz, 2014), jedoch nicht mittels in-situ-Hybridisierung gezeigt wurde, scheint an protektiven Reaktionen auf die Aktivierung von Mikrogliazellen beteiligt zu sein (Haile et al., 2015). Die Gene Antxr2 (erhöhte Expression bei Transkriptomanalyse und in-situ-Hybridisierung) und Pcolce (erhöhte Expres- sion bei Transkriptomanalyse) tragen möglicherweise zu Umbauvorgängen der extrazellulären Matrix und der Blutgefäße bei (Reeves et al., 2013; Weiss et al., 2010).

Die Expressionsunterschiede der Gene Edn2 und Serpina3n, die mittels in-situ- Hybridisierung im Bulbus olfactorius, einem Gehirnareal mit starker Ccdc66- Expression, nachgewiesen wurden, könnten neben ihrer Beteiligung an der zellulären Stressantwort und an inflammatorischen Prozessen in der Retina auch im Bulbus olfactorius an den bei älteren Ccdc66-defizienten Mäusen nachgewiesenen Degenerationserscheinungen (Schreiber, 2015) beteiligt sein. Sie sind ein Hinweis darauf, dass die unterschiedliche Genexpression nicht ausschließlich retinaspezifisch ist. Die Folgen der fehlenden Ccdc66-Expres- sion im Gehirn sind möglicherweise ein Grund dafür, dass bisher keine Mutation in diesem Gen als Ursache für die Retinitis pigmentosa des Menschen nachgewiesen wurde. Da die phänotypischen Krankheitserscheinungen im Mausmodell oft weniger stark ausgeprägt sind als beim Menschen, ist es möglich, dass die zerebralen Auswirkungen einer gestörten Ccdc66-Expression beim Menschen so gravierend sind, dass das Lebensalter, in dem die retinale Degeneration als Krankheitsbild der Retinitis pigmentosa auftritt, nicht erreicht wird oder dass die zerebralen Symptome einen größeren Stellenwert einnehmen als die retinale Degenerationen. Zur weiteren Charakterisierung der Prozesse, die die retinale Degeneration begleiten und verstärken, könnte die Untersuchung anderer Gene beitragen, die mit „Remodeling“-Prozessen assoziiert sind und deren Expressionsunterschied bei der Transkriptomanalyse möglicherweise aufgrund von Veränderungen der Zellzahlrelation zwischen den beiden Genotypen nicht festgestellt werden konnte. Der Nachweis der Beteiligung von Genen, die mit der Aktivierung von Mikro- gliazellen assoziiert sind, wäre geeignet, um die Rolle dieser Zellen bei der retinalen Degeneration näher zu beschreiben. Um eine zellspezifische Zuord- nung der Gen-Expression zu ermöglichen, könnten die in-situ-Hybridisierungen gleichzeitig mit zelltypspezischen Sonden bzw. Antikörpern durchgeführt werden. Da bei vielen Genen der Wirkungsort des Translationsproduktes räumlich von dem Ort der mRNA-Expression getrennt ist, erlauben immunhistochemi- sche Proteinnachweise möglicherweise weitere Rückschlüsse auf die zelluläre Lokalisation und auf die beteiligten Prozesse. Die Untersuchung weiterer an angiogenen Vorgängen beteiligter Gene und die Darstellung des Gefäßsystems der Ccdc66-defizienten Retina zu verschiedenen postnatalen Entwicklungszeitpunkten könnte die Bedeutung angiogener

Prozesse bei der Initiierung oder Verstärkung der degenerativen Veränderun- gen im Ccdc66-defizienten Mausmodell näher charakterisieren. Veränderungen des Gefäßsystems spielen auch bei anderen retinalen degenerativen Erkran- kungen, wie bei der vaskulären altersabhängigen Makuladegeneration des Menschen (Al Gwairi et al., 2016; Wang und Hartnett, 2016), eine wichtige Rolle. Die Untersuchungen des Ccdc66-defizienten Mausmodells zeigen, dass Gen- Mutationen, die zu degenerativen Veränderungen der Retina führen, über eine Expressionsänderung anderer Gene Prozesse initiieren können, die unabhän- gig von der zellulären Lokalisation der Mutation zur Progression der Degenera- tion beitragen. Obwohl beim Menschen eine CCDC66-Mutation als Ursache der Retinitis pigmentosa bisher nicht nachgewiesen wurde (Genes and Loci Cau- sing Retinal Diseases, verfügbar unter Retinal Information Network, RetNet), wird eine weitere Charakterisierung der Umbauprozesse der Extrazellularmatrix möglicherweise zum Verständnis der retinalen Degenerationsmechanismen auch beim Menschen beitragen.

6 Zusammenfassung Um die Mechanismen der erblichen retinalen Degeneration, die beim Menschen zum Krankheitsbild der Retinitis pigmentosa führt, näher zu untersuchen, wurde ein Mausmodell erzeugt, bei dem die Expression des Ccdc66-Gens durch Ein- satz einer „Genfalle“ unterbrochen wird. Die Retina der Ccdc66-defizienten Maus (129P2;B6N-Ccdc66Gt(bgeo)) zeigt bereits während der frühen postnatalen Entwicklung zum Zeitpunkt P13 morphologische Zeichen der Degeneration (Gerding et al., 2011). Vorausgehende Arbeiten lieferten durch Charakterisie- rung der Ccdc66-Expression in der Retina und im Gehirn (Bulbus olfactorius und Hippocampus) erste Hinweise auf die mögliche Rolle des Ccdc66-Gens bei der Entstehung retinaler Degenerationsprozesse (Schreiber, 2015) und zeigten durch den Vergleich des retinalen und zerebralen Transkriptomprofils von Ccdc66-defizienten Mäusen mit dem von Wildtyp-Mäusen den Einfluss der Ccdc66-Defizienz auf die Expression weiterer Gene (Roberz, 2014). Für die Untersuchungen dieser Arbeit wurden anhand der Expressionsunter- schiede, die durch Transkriptomanalyse in der Arbeit von Roberz (2014) ermittelt worden waren, die Gene Serpina3n, Gm12541, Antxr2, Edn2, Pcolce, Gadd45b, Optc und Rpe65, deren Expressionsunterschied mehr als das Zwei- fache betrug, ausgewählt. Der Nachweis der Expression dieser Gene in Retina, Bulbus olfactorius und Hippocampus erfolgte mittels in-situ-Hybridisierung mit Digoxigenin-markierten RNA-Sonden, die über eine Antikörperfärbung und die daran gebundene alkalische Phosphatase mit Hilfe eines NBT/BCIP-Farbstoff- umsatzes im Gewebe detektiert wurden. Die Zuordnung der Genexpression zu bestimmten Retinaschichten, der Nach- weis schichtspezifischer Unterschiede, die Darstellung des Expressionsmusters bei verschiedenen Altersstufen sowie die Bestätigung genotypspezifischer Gen- expressionsunterschiede sollten dazu beitragen, die Mechanismen, die den retinalen Degenerationsprozessen zugrunde liegen, zu identifizieren und näher zu charakterisieren. Während in der Arbeit von Roberz (2014) mittels Transkriptomanalyse die Gen- expressionsunterschiede des Gesamtgehirns ermittelt worden waren, wurden in dieser Arbeit gezielt Hirnareale mit einer erhöhten Ccdc66-Expression (Bulbus olfactorius und Hippocampus) untersucht. Durch den Einsatz der Sonden von Genen, die in der Retina einen Expressionsunterschied zeigten, sollte unter- 93

sucht werden, ob auch in selektiven Gehirnarealen unterschiedliche Expres- sionsmuster zwischen der Ccdc66-defizienten Maus und der Wildtyp-Maus vorliegen. Die in-situ-Hybridisierungen der Retinae von Ccdc66-defizienten Mäusen und von Wildtyp-Mäusen zeigten die Lokalisation der RNA-Transkripte der Gene Serpina3n, Gm12541, Antxr2, Edn2, Pcolce, Gadd45b und Optc in der äußeren und inneren Körnerschicht und in der Ganglienzellschicht. Die Gene Antxr2 und Optc wurden in der äußeren und inneren Körnerschicht stärker exprimiert als in der Ganglienzellschicht. Bei den Genen Edn2 und Pcolce war die Expression in der äußeren Körnerschicht am deutlichsten. Der vormals gezeigte Expressions- unterschied (Roberz, 2014) konnte bei der Altersstufe P28 bei den Genen Gm12541, Antxr2, Gadd45b, Edn2 und bei bei der Altersstufe P10 bei Optc bestätigt werden. Beim Gen Optc konnte zusätzlich ein Expressionsunterschied bei P4 und P28 nachgewiesen werden. Bei den Genen Serpina3n und Pcolce konnte methodisch bedingt und bei dem Gen Rpe65 aufgrund der Lokalisation im pigmentierten Epithel kein Expressionsunterschied gezeigt werden. Im Ge- hirn zeigte die Optc-Expression im Bulbus olfactorius und im Hippocampus keinen Genotyp-Unterschied. Von den im Bulbus olfactorius jedoch nicht im Hippocampus exprimierten Genen Serpina3n, Edn2 und Gadd45b zeigten Ser- pina3n und Edn2 bei der Ccdc66-/--Maus gesteigerte Expression. Die Gene Optc und Antxr2, deren verstärkte Expression in den Untersuchungen dieser Arbeit gezeigt werden konnte, sind an „Remodeling“-Prozessen der extrazellulären Matrix beteiligt, die retinale Degeneration begleiten (Reinhard et al., 2015) und die zu einer morphologischen und funktionellen Umgestaltung retinaler Komponenten führen (Strettoi, 2015). Auf die Bedeutung dieser Umbau- prozesse bei der retinalen Degeneration im Ccdc66-defizienten Mausmodell wiesen bereits die Ergebnisse der Transkriptonanalyse (Roberz, 2014) hin. Durch seine anti-angiogene Aktivität (Le Goff et al., 2012b) ist das Gen Optc möglicherweise über eine Beeinflussung der postnatalen Entwicklung der Gefäßplexus an frühen Prozessen der retinalen Entwicklung beteiligt, welche die durch die Ccdc66-Mutation bedingte Degeneration der Photorezeptorzellen initiieren oder verstärken; bereits bei der Altersstufe P4 zeigte sich in der Ccdc66-defizienten Retina verstärkte Expression. Die erhöhte Expression des

Gens Antxr2 könnte über vermehrten Abbau von Matrixkomponenten an der Modulation des retinalen Gefäßsystems (Reeves et al., 2013) beteiligt sein. Dem in der äußeren Körnerschicht der Ccdc66-/--Retina erhöht exprimierten Gen Edn2 kann die Funktion eines Stresssignals zwischen den Photorezeptor- zellen und den Müllerzellen zugeordnet werden (Rattner und Nathans, 2005). Auch das Gen Gm12541, das in der inneren Körnerschicht und der Ganglien- zellschicht verstärkt exprimiert wird, könnte mit diesem Signalweg assoziiert sein. Die gesteigerte Expression des Gens Gadd45b in der Ganglienzellschicht hat neuroprotektive Funktion (Liu et al., 2009). Die genotypspezifischen Expressionsunterschiede der Gene Edn2 und Ser- pina3n im Bulbus olfactorius könnten neben ihrer Beteiligung an retinalen Prozessen auch an zerebralen Degenerationsprozessen älterer Ccdc66-defizienter Mäuse (Schreiber, 2015) beteiligt sein. Sie sind ein Hinweis darauf, dass die Genexpressionsunterschiede, die mit der Ccdc66-Defizienz assoziiert sind, nicht nur gewebespezifisch in der Retina vorliegen. Die hier durchgeführten Untersuchungen am Ccdc66-/--Mausmodell zeigten, dass die Defizienz des Gens Ccdc66 mit Expressionsunterschieden von Genen unterschiedlicher Funktion, wie Umgestaltung der extrazellulären Matrix, Stress- antwort und Neuroprotektion, assoziiert ist und dass multiple Prozesse trotz eines relativ milden und langsam progredienten Verlaufs der retinalen Degene- ration bereits zu einem sehr frühen Entwicklungszeitpunkt eine Rolle spielen. Obwohl beim Menschen eine Ccdc66-Mutation als Ursache der Retinitis pigmentosa bis heute noch nicht nachgewiesen wurde, wird dieses degenerative Krankheitsbild, das schließlich zur Erblindung führt, möglicherweise ebenfalls von diesen im Mausmodell gezeigten Prozessen begleitet. Die weitere Charak- terisierung unterschiedlich exprimierter Gene und die detaillierte Untersuchung der beteiligten Signalwege könnten zum Verständnis pathologischer Retina- veränderungen auch beim Menschen beitragen.

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Danksagung

Als erstes möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen dafür danken, dass er es mir ermöglicht hat, meine Dissertation über dieses interessante Thema anzufertigen, sowie für seine ermutigende und kompetente Unterstützung. Frau Wanda Gerding PhD Neurosci. danke ich für ihre sachkundige Beratung und Betreuung sowie für ihre konstruktiven und kritischen Anmerkungen während der Anfertigung meiner Arbeit. Bei Frau Sabrina Schreiber PhD Neurosci. möchte ich mich für ihre freundliche und hilfsbereite Unterstützung bei der Durchführung der experimentellen Arbeiten bedanken und dafür, dass sie sich stets Zeit für die Beantwortung meiner Fragen genommen hat. Auch möchte ich allen Mitarbeitern der Abteilung für Humangenetik für das freundschaftliche und angenehme Arbeitsklima danken, das viel zu dem Gelin- gen meiner Arbeit beigetragen hat.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Elke Porrmann-Kelterbaum Geburtsdatum 20.12.1957 Geburtsort Gelsenkirchen Familienstand verheiratet, 4 Kinder

Studium seit März 2015 Doktorandin in der Abteilung für Humangenetik an der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

September 2014 Abschluss Bachelor of Science Medizinische Biologie, Bachelorarbeit: durchgeführt in der HNO-Forschungs- abteilung des Universitätsklinikums Essen, „Interaktion von Tumorzellen, Stromazellen und neutrophilen Granu- lozyten als in vitro Modell für die Tumormikroumgebung“

10/2011 - 9/2014 Studium B.Sc. Medizinische Biologie an der Universität Duisburg-Essen

11/1983 Ärztliche Prüfung und Approbation

10/1976 - 11/1983 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum und am Universitätsklinikum Essen

Schulbildung

1976 Abitur

1967 - 1976 Ricarda-Huch-Gymnasium Gelsenkirchen

1964 - 1967 Volksschule Gelsenkirchen-Ückendorf