DIVERSIFICAÇÃO CITOGENÔMICA EM (), UM MODELO DE ESTASE CARIOTÍPICA: ASPECTOS EVOLUTIVOS E APLICADOS

KARLLA DANIELLE JORGE AMORIM ______Tese de Doutorado Natal/RN, março de 2020 KARLLA DANIELLE JORGE AMORIM

DIVERSIFICAÇÃO CITOGENÔMICA EM SERRANIDAE (PERCIFORMES), UM MODELO DE ESTASE CARIOTÍPICA: ASPECTOS EVOLUTIVOS E APLICADOS

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de doutora em Sistemática e Evolução.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

NATAL – RN 2020 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - •Centro de Biociências - CB

Amorim, Karlla Danielle Jorge. Diversificação citogenômica em serranidae (Perciformes), um modelo de estase cariotípica: aspectos evolutivos e aplicados / Karlla Danielle Jorge Amorim. - Natal, 2020. 120 f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.

1. Garoupas - Tese. 2. Evolução cariotípica - Tese. 3. Hibridização interespecífica - Tese. 4. DNA repetitivo - Tese. 5. Estase cariotípica - Tese. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSCB CDU 567

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351 KARLLA DANIELLE JORGE AMORIM

DIVERSIFICAÇÃO CITOGENÔMICA EM SERRANIDAE (PERCIFORMES), UM MODELO DE ESTASE CARIOTÍPICA: ASPECTOS EVOLUTIVOS E APLICADOS

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de doutora em Sistemática e Evolução.

______Dr. Clóvis Coutinho da Motta Neto (Serviço Geológico do Brasil)

______Dr. Luiz Antonio Carlos Bertollo (UFSCar)

______Dr. Marcelo de Bello Cioffi (UFSCar)

______Dr. Paulo Augusto de Lima Filho (IFRN)

______Dr. Wagner Franco Molina (Presidente da banca – UFRN)

Aos meus avós, Francisco e Terezinha com todo o meu amor AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família por todo apoio, por ser meu porto seguro, estender a mão quando tudo estava difícil, abrir mão de muitas coisas para que eu pudesse estudar e vibrar a cada degrau acadêmico que eu subo. Sem vocês o caminho teria sido mais difícil. Todas as minhas vitórias serão por e para vocês. Minha gratidão aos amigos que conquistei durante a vida e fizeram a diferença em momentos turbulentos. A vocês devo a minha sanidade e minha leve protuberância abdominal. Aos colegas que passaram ou estão no laboratório e contribuíram com minha formação e, adicionalmente, direta e/ou indiretamente para a realização deste trabalho: Allyson, Amanda, Aparecida, Cristiane, Clóvis, Dalvan, Divana, Éricka, Gideão, Glaicon, Inailson, Juliana, Josi, Leonardo Calado, Louise, Marcelo, Paulo, Rafael, Roberta, Rodrigo, Simião e Vanessa. Agradeço ao Professor Dr. Wagner Franco Molina por abrir as portas do laboratório para mim, pela orientação e por me fazer crescer pessoalmente e profissionalmente. Ao professor Marcelo de Belo Cioffi por disponibilizar as espécies coletadas na Tailândia e contribuir com o enriquecimento deste trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução e todo seu corpo docente pelo suporte oferecido durante o desenvolvimento deste trabalho. A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida.

Nobody said it was easy.

No one ever said it would be this hard.

Coldplay – The Scientist

RESUMO

A família Serranidae, cujos representantes são conhecidos como garoupas, constitui um dos mais diversos grupos de peixes em ambientes recifais. São predadores eficientes que podem ocupar desde poças de maré a recifes profundos. Algumas espécies podem alcançar porte considerável e, em geral, significativo valor econômico. Com distribuição circunglobal, o grupo é composto por 577 espécies, distribuídas em 75 gêneros, dos quais Epinephelus é o mais representativo. Apesar do crescente conjunto de informações genéticas, menos de 10% das espécies apresentam aspectos citogenéticos conhecidos. Abordagens citogenéticas para a família se mostram dissociadas quanto aos seus aspectos filogenéticos, geográficos e taxonômicos, limitando a compreensão de seus aspectos evolutivos e aplicados ao manejo. No presente trabalho, análises citogenéticas convencionais e mapeamento por hibridização in situ fluorescente das sequências DNAr 18S, DNAr 5S, elementos transponíveis Tol2 e Rex3, microssatélites (CA)15, (GA)15, (CAA)10 e (CGG)10, foram realizadas em 11 espécies de Serranidae. O primeiro capítulo pretende comparar a distribuição de sequências repetitivas dentro do cenário filogenético e em diferentes regiões biogeográficas. Em virtude das informações citogenéticas estarem concentradas no gênero Epinephelus, o segundo capítulo traz informações citogenômicas para outras três espécies da família dos gêneros Cephalopholis e Rypticus. No terceiro capítulo análises citogenômicas de três espécies de garoupas de interesse comercial foram realizadas para gerar informações sobre a organização dos cromossomos e o nível de divergência cromossômica entre as espécies, além de aspectos adaptativos e potencialidades aplicáveis à práticas de hibridização interespecífica. Todas as espécies apresentaram 2n=48, das quais apenas três possuem cariótipos não compostos exclusivamente por elementos acrocêntricos. O conservadorismo cariotípico, apenas perturbado por inversões pericêntricas, se estende à organização do DNA repetitivo onde as sequências repetitivas aqui analisadas refletem um baixo dinamismo evolutivo. A divergência citogenética e genômica entre espécies decorrente de ancestralidade comum ocorrida em períodos entre 15 a 11 M.a aparentemente proporciona reduzido nível de bloqueio reprodutivo pós-zigótico, com valiosas implicações para a hibridização induzida na aquicultura. Sob perspectiva biogeográfica e filogenética, os grupos mais basais do Atlântico apontam 2n=48a como o padrão ancestral para a família, indica que a especiação no grupo não foi seguida por modificações cariotípicas significantes e a despeito de uma relativa frequência de cariótipos divergentes, esse grupo de peixes se adequa a um padrão evolutivo de estase cariotípica.

Palavras-chave: Garoupas, evolução cariotípica, hibridização interespecífica, DNA repetitivo, estase cariotípica.

ABSTRACT

The Serranidae family, whose representatives are known as , is one of the most diverse groups of fish in reef environments. They are efficient predators that can occupy everywhere from tide pools to deep reefs. Some species can reach considerable size and, in general, significant economic value. With a circunglobal distribution, the group consists of 577 species, distributed in 75 genera, of which Epinephelus is the most representative. Despite the growing set of genetic information, less than 10% of species have known cytogenetic aspects. Cytogenetic approaches to the family are dissociated in terms of their phylogenetic, geographical and taxonomic aspects, limiting the understanding of their evolutionary aspects and applied to management. Conventional cytogenetic analyzes and fluorescent in situ hybridization mapping of the 18S rDNA, 5S rDNA sequences, transposable elements Tol2 and Rex3, microsatellites (CA)15, (GA)15, (CAA)10 and (CGG)10, were performed in 11 species of Serranidae. The first chapter aims to compare the distribution of repetitive sequences within the phylogenetic scenario and in different biogeographic regions. Because the cytogenetic information is concentrated in the genus Epinephelus, the second chapter provides cytogenomic information for three other species in the family of the genera Cephalopholis and Rypticus. In the third chapter, cytogenomic analyzes of three species of groupers of commercial interest were performed to generate information on the organization of chromosomes and the level of chromosomal divergence between species, in addition to adaptive aspects and potentialities applicable to interspecific hybridization practices. All species presented 2n = 48, of which only three have karyotypes not composed exclusively of acrocentric elements. Karyotype conservatism, only disturbed by pericentric inversions, extends to the organization of repetitive DNA where the repetitive sequences analyzed here reflect a low evolutionary dynamism. The cytogenetic and genomic divergence between species due to common ancestry that occurred in periods from 15 to 11 M.a apparently provides a reduced level of post-zygotic reproductive block, with valuable implications for the hybridization induced in aquaculture. From a biogeographic and phylogenetic perspective, the most basal groups in the Atlantic Ocean demonstrate 2n = 48a as the ancestral pattern for the family, indicating that speciation in the group was not followed by significant karyotype changes and despite a relative frequency of divergent karyotypes, this group of fish is adapted to an evolutionary pattern of karyotype stasis.

Keywords: Groupers, karyotype evolution, interspecific hybridization, repetitive DNA, karyotype stasis. LISTA DE FIGURAS

Introdução

Figura 1. Padrões crípticos de coloração em espécies de Epinephelus. Barra = 2 cm ...... 19

Figura 2. Série histórica de 10 anos da produção mundial de garoupas (FAO, 2019)...... 21

Figura 3. Diversificação da família Serranidae durante o Paleoceno. Em menor escala, a distribuição atual das espécies...... 28

Figura 4. Representantes da família Serranidae utilizados nas análises citogenômicas. Espécies provenientes do Atlântico: Epinephelus itajara (a), E. adscensionis (b), E. striatus (c), Cephalopholis fulva (d), Rypticus saponaceus (e). Indo-Pacífico: E. tauvina (f), E. coioides (g), E. sexfasciatus (h), E. erythrurus (i), E. caeruleopunctatus (j) C. formosa (k). Imagens das espécies são de arquivo pessoal, exceto E. striatus que apresenta veiculação livre. Barra = 2 cm...... 32

Capítulo I

Figura 5. Cariótipo das espécies Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus e E. erythrurus, sob coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs e sítios DNAr 18S e 5S. Barra = 5μm...... 43

Figura 6. Cariótipo das espécies E. sexfasciatus e E. itajara, sob coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs e sítios DNAr 18S e 5S. Barra = 5μm...... 43

Figura 7. Hibridização in situ com sondas microssatélites (CA15 e GA15), e elementos Tol2 e Rex3 em cromossomos das espécies

Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus, 45 E. sexfasciatus e E. itajara. Barra=5 μm......

Figura 8. Aspectos cariotípicos de espécies da família Serranidae, sob contexto filogenético (baseado em Ma et al., 2016) e biogeográfico. Círculos pretos indicam presença de sítios Ag- RONs simples, presentes ou não no par 24, enquanto círculos preto/cinza indicam sítios Ag-RONs múltiplos, incluindo o par 24 51

Figura 9. Variação na frequência do número de braços cromossômicos (NF) em cariótipos de clados da família Serranidae, sob perspectiva filogenética e temporal (adaptado de Ma et al., 2016)...... 52

Capítulo II

Figura 10. Mapa dos locais de coleta das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e Rypticus saponaceus...... 64

Figura 11. Cariótipos das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e Rypticus saponaceus sob coloração com Giemsa, técnica Ag- RONs (Caixas), bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Barra=5μm...... 67

Figura 12. Hibridização in situ com sondas microssatélites (CA)15 e (GA)15 e elementos Tol2 e Rex3 em cromossomos mitóticos das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e R. saponaceus. Barra=5 μm...... 68

Capítulo III

Figura 13. Mapa das áreas de distribuição e de cultivo comercial das espécies E. striatus (em verde) e E. coioides e E. tauvina (vermelho)...... 81

Figura 14. Cariótipos das espécies E. striatus, E. coioides e E. tauvina sob coloração Giemsa, bandamento-C e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas DNAr 18S e 5S. Em destaque os pares organizadores nucleolares e pares portadores de sítios DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). O par de cromossomos 24, de E. striatus, e 20, de E. tauvina, apresentaram arranjos 18S/5S DNAr colocalizados. Barra=5μm...... 84

Figura 15. Hibridização in situ fluorescente com sondas microssatélites di- e trinucleotídeos em metáfases mitóticas das espécies E. tauvina, E. striatus e E. coioides. Barra=5 μm ...... 86

Figura 16. Níveis de efeitos pós-zigóticos em híbridos de Serranidae em relação a divergência temporal dos parentais (adaptada de Ma et al., 2016) ...... 93

LISTA DE TABELAS

Introdução

Tabela 1. Dados citogenéticos de espécies da família Serranidae...... 24

Tabela 2. Espécies de Serranidae empregadas nas análises citogenéticas e respectivos locais de coleta ...... 31

Capítulo I

Tabela 3. Dados citogenéticos de espécies da família Serranidae...... 47

Capítulo III

Tabela 4. Cruzamentos interespecíficos em espécies da família Serranidae. Fórmula cariotípica, distâncias genéticas do DNAmt 16S, tempo de divergência estimada e características zootécnicas vantajosas (setas para cima) e desfavoráveis (setas para baixo) dos híbridos (Referências inclusas). F=Fertilização, E=Eclosão, C=Crescimento, S=Sobrevivência...... 87 LISTA DE ABREVIATURAS a – Acrocêntrico

AgNO3 – Nitrato de prata Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolos evidenciadas pela impregnação com nitrato de prata AIA - Arquipélago Indo-Australiano ASPSP – Arquipélago de São Pedro e São Paulo

Ba(OH)2.8H2O – Hidróxido de bário DAPI – 4’,6-diamidino-2-fenilindol DNAmt – DNA mitocondrial FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations FISH – Fluorescence in situ hybridization HCl – Ácido clorídrico IUCN – International Union for Conservation of Nature and Natural Resources KCl – Cloreto de potássio M.a – Milhões de anos NF – Número de braços cromossômicos (número fundamental) PCR – Reação em cadeia da polimerase RN – Rio Grande do Norte rpm – Rotações por minuto sm – Submetacêntrico SSC- Solução salina de citrato de sódio SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...... 13

2. OBJETIVOS...... 30

3. MATERIAL E MÉTODOS...... 31

3.1. Material...... 31 3.2. Métodos...... 33 3.2.1. Técnicas de estimulação mitótica...... 33 3.2.2. Técnicas de obtenção de cromossomos mitóticos...... 33 3.2.3. Preparação das lâminas...... 34 3.2.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)...... 34 3.2.5. Detecção de heterocromatina (Banda-C)...... 34 3.2.6. Hibridização in situ fluorescente – FISH...... 35 3.2.6. Hibridização cromossômica...... 36 3.2.8. Análise das sequências mitocondriais DNAr 16S...... 36

4. CAPÍTULO 1.

Homogeneidade citogenômica e hibridização interespecífica em Serranidae...... 38 4.1 CAPÍTULO 2.

Padrões citogenômicos em espécies dos gêneros Cephalopholis e Rypticus (Serranidae: Perciformes)...... 62 4.3. CAPÍTULO 3.

Estabilidade diploide e organização citogenômica de classes de DNA repetitivo em Serranidae. Padrões disruptivos em um cenário de estase cariotípica...... 78

5. CONCLUSÕES...... 105

6. REFERÊNCIAS GERAIS...... 107

7. ANEXO...... 119 Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 13

1. INTRODUÇÃO

Em 1982 foi assinada a Convenção das Nações Unidas sobre o Direito no Mar (CNUDM) onde acordou-se que o ambiente marinho é comum a toda a humanidade e nenhum Estado tem o direito de reivindicar domínio sobre ele, com exceção de uma zona estreita de mar ao longo da costa dos Estados (Kastrisios e Tsoulos, 2017). A Convenção define uma série de conceitos, como: - As águas internas: Parte do território do Estado que exerce total soberania nas águas interiores. - Mar territorial: Faixa de mar que se estende até o limite de 12 milhas náuticas, contadas a partir das linhas de referência na costa, sobre a qual o Estado costeiro exerce plena soberania, incluindo o espaço aéreo sobrejacente, bem como seu leito e subsolo. - Zona Contígua: Adjacente ao mar territorial e até o limite de 24 milhas náuticas da costa. - Zona Econômica Exclusiva (ZEE): faixa situada além do Mar Territorial e não pode ultrapassar 200 milhas náuticas. - Plataforma Continental: Compreende o leito e o subsolo das áreas marítimas que se estendem até o bordo exterior da margem continental, ou até uma distância limite de 200 milhas náuticas das linhas de referência na costa, nos casos em que o bordo exterior da margem continental não atinja essa distância. - O alto mar: Todas as partes do mar que não estão incluídas em nenhuma das zonas marítimas acima.

A ZEE brasileira tem uma área oceânica aproximada de 4,5 milhões de km², correspondendo a aproximadamente 52% da nossa área continental, de onde são prospectados aproximadamente 91% do nosso petróleo, 73% do nosso gás natural, bem como incalculáveis recursos naturais, sendo denominada “Amazônia Azul”. (Marinha do Brasil). As regiões oceânicas são permeadas por zonas oceânicas particulares que começam à beira-mar e atingem regiões que cobrem o fundo do oceano (Göltenboth et al., 2006). Basicamente são descritas como Zona entremarés, a região onde o fundo do oceano é exposto durante a maré baixa e coberto quando está na maré alta; como Zona nerítica, a que se estende desde a maré baixa até regiões da costa Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 14

que atingem profundidades de 200 metros, caracterizadas por abrigar a maioria da vida marinha e constituir as áreas de maior exploração da pesca comercial do mundo; a Zona pelágica, que é a maior e inclui a zona nerítica e a zona oceânica além de 200 metros de profundidade. Ela pode é dividida quanto à profundidade em Epipelágica, profundidade inferiores a 150 m; Mesopelágica entre 150 - 2000 m de profundidade; Batipelágica, entre 2000-4000 m de profundidade; Abissopelágica, são regiões oceânicas que se situam entre 4000-6000 m de profundidade e Hadopelágicos, regiões superiores à 6000 m de profundidade; a zona bentônica, que inclui todo o fundo do oceano, da zona entre marés à bacia oceânica profunda, abrigando grande variedade de peixes e invertebrados bentônicos que habitam o fundo e raramente nadam perto da superfície; a Zona fótica, representada pela camada superficial da coluna de água e iluminada pela luz solar. A incidência de luz nesta região promove o crescimento de algas e plantas, que fornecem uma fonte de alimento para animais marinhos, e a Zona afótica, camada mais profunda que não recebe luz. Esta região é caracterizada pela falta de organismos fotoautotróficos, uma vez que a luz solar não é capaz de penetrar tão longe. Em águas tropicais claras, a linha de 200m de profundidade marca a fronteira entre a zona fótica e a afótica. O ambiente marinho ocupa aproximadamente 71% da superfície da Terra (Lalli e Parsons, 1977) e apresenta profundidade média do oceano de 3.792m (Göltenboth et al., 2006), responsável por enorme biodiversidade, associada a serviços como turismo, transporte, indústrias extrativas e geração de energia (Atkins et al., 2010). O uso cada vez maior e diversificado do ambiente marinho tem levado a profundas mudanças na vida marinha, habitats e paisagens (Atkins et al., 2010). Nas últimas décadas os mares e oceanos vêm sofrendo intensamente com a poluição e já não conseguem mais se recuperar com tanta facilidade (Derraik, 2002; Cole et al., 2011). De fato, apesar de impulsionar o comércio global, o transporte marítimo pode ocasionar derramamentos acidentais de petróleo que causam poluição e mortalidade de espécies marinhas (Barry et al, 2018). Em 2019 um derramamento de petróleo foi identificado na costa brasileira e atingiu 4.334 km de costa em 11 estados do Nordeste e Sudeste, um dos maiores já registrados no mundo (Pena et al., 2020). A acidificação dos oceanos é outra consequência da poluição que causa o branqueamento dos corais que são fisiologicamente danificados e comprometidos Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 15

nutricionalmente, levando a morte se o clareamento for severo além de afetar a biodiversidade, a composição das espécies e a função do ecossistema (Hughes et al., 2018). Os recifes de coral são estruturas biogênicas que se distribuem em ambientes tropicais e subtropicais (Dikou, 2010), cobrem menos que 0,1% do fundo oceânico, mas concentram uma imensa biodiversidade, com destacada importância ecológica e econômica (Moberg e Folke, 1999; Bellwood et al., 2006; Bowen et al., 2013; Leão et al., 2016). Sua complexidade estrutural, cuja história evolutiva remonta há mais de 50 M.a, abriga um diversificado conjunto de organismos, dos quais cerca de 6.000 espécies de peixes são evolutivamente dependentes destes ecossistemas, particularmente as famílias Acanthuridae, Chaetodontidae, Gobiidae, Haemulidae, Labridae, Pomacentridae, Serranidae (Hixon, 2001; Bellwood e Wainwright, 2002; Cole et al., 2008; Graham e Nash, 2012; Bowen et al., 2013; Kulbicki et al., 2013; Nelson et al., 2016). A participação ativa dos peixes na evolução dos recifes de coral modernos resultou em padrões biogeográficos particulares, decorrentes de longas e complexas histórias evolutivas conjuntas (Bellwood, 1998; Bellwood e Wainwright, 2002). Aparentemente, os recifes de corais se destacaram como refúgios durante as flutuações climáticas do Quaternário e moldaram os atuais padrões de riqueza de peixes (Barber e Bellwood, 2005; Bellwood e Meyer, 2006; Pellissier et al., 2014). A região do Indo-Pacífico manteve extensos refúgios de recifes de corais e parecem ter atuado como centros de sobrevivência, enquanto no Atlântico apenas áreas muito limitadas eram adequadas para os ambientes recifais durante períodos frios, sugerindo que a biodiversidade atual dos peixes recifais pode ser explicada principalmente pela disponibilidade de habitats anteriores (Pellissier et al., 2014). No ambiente marinho os padrões de diversificação e especiação resultam da interação entre aspectos intrínsecos à espécie, como comportamento e ecologia, além de fatores climáticos, oceanográficos e tectônicos (Rocha & Bowen, 2008; Floeter et al., 2008; Toonen et al., 2016). Eventos geológicos, como a elevação do Istmo do Panamá e a glaciação do Pleistoceno, tiveram efeitos na circulação de espécies e influenciaram os padrões de distribuição marinha refletidos nas comunidades modernas (Snelgrove, 2008). A presença de barreiras biogeográficas determina a configuração das províncias biogeográficas (Rocha et al., 2005; Floeter et al., 2008; Luiz et al., 2011) e estabelece regiões com taxas de endemismos Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 16

significativos (Briggs, 1995; Snelgrove, 2008). No oceano Atlântico, a província brasileira é delimitada pelo delta dos rios Orinoco e Amazonas, toda a costa nordeste da América do Sul, incluindo ilhas oceânicas (Arquipélago de Fernando de Noronha, Atol de Rocas, Arquipélago de São Paulo e São Paulo e Ilha de Trinidade), até a costa de Santa Catarina, agregando uma ictiofauna diversificada (Briggs, 1995; Floeter et al., 2001; Galetti et al., 2006) cuja distribuição resulta de alterações nos níveis do mar, durante os períodos de glaciação (Leão et al., 1988; Briggs, 1995), e ações de barreiras biogeográficas (Floeter et al., 2008). Os ecossistemas recifais do Brasil abrigam um significativo conjunto de espécies endêmicas (Floeter et al., 2006; Leão et al., 2010). A diversificação de nichos e processos coevolucionários como a competição por espaço e outros recursos poderia explicar esse nível de diversificação dos peixes associados a recifes (Molina, 2000). As espécies de peixes da ilha de Trindade apresentam similaridade com peixes costeiros, provavelmente relacionada a uma conectividade entre a ilha e o continente por meio da cadeia submarina Vitória-Trindade (Gasparini e Floeter, 2000; Floeter et al., 2008; Krajewski e Floeter, 2011). O nível de endemismo (7%) dos peixes recifais na cadeia submarina Vitória-Trindade é elevado em comparação com outras localidades oceânicas do Atlântico (Floeter et al., 2008) e representa aproximadamente 11% do número total de peixes recifais endêmicos da província brasileira, sendo considerado um hotspot de biodiversidade (Pinheiro et al., 2015). A Província caribenha abriga a maior riqueza e endemismo de espécies de peixes do Atlântico (Floeter et al., 2008) e compreende recifes que se estendem desde as Bermudas e Flórida, até a região costeira do nordeste da América do Sul (Barreira Orinoco-Amazonas) (Briggs, 1995), compartilhando um conjunto de espécies com esta última região (Floeter e Gasparini, 2000; Rocha, 2003; Floeter et al., 2008). Tanto o Caribe, no Atlântico, como o Arquipélago Indo-Australiano (AIA), no Indo-Pacífico, se destacam como centros de especiação e dispersão de espécies (Lohman et al., 2011; Bowen et al., 2013). De fato, o AIA abriga mais de 2.300 espécies de peixes (Bellwood et al., 2012; Cowman e Bellwood, 2013; Kulbicki et al., 2013). Esta região conecta os Oceanos Índico e Pacífico e apresenta uma complexa história geológica que envolveu a movimentação de placas tectônicas entre o Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 17

Paleoceno e o Mioceno, onde eventos de vulcanismo, formação de ilhas, elevação de pontes de terra, mudanças nos padrões de correntes marinhas e redução dos níveis dos mares, moldaram altas taxas de endemismo (Lohman et al., 2011; Bowen et al., 2013). Historicamente, o fechamento do antigo Mar de Tethys e o sistema de Benguela - corrente de água fria que flui do sul da África do Sul em direção ao norte do Atlântico - tiveram papel importante na evolução dos padrões modernos de biodiversidade marinha tropical (Floeter et al., 2008; Cowman e Bellwood, 2011), pois promoveram o isolamento contemporâneo das faunas do Indo-Pacífico e Atlântico Ocidental (Bellwood e Wainwright, 2002). Entre os diversos grupos de peixes representativos dos ambientes recifais dos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico, com relevante importância ecológica e econômica, se destaca a família Serranidae (Nelson et al., 2016).

1.1 FAMÍLIA SERRANIDAE

Popularmente conhecidos como garoupas, espécies da família Serranidae são predadores demersais que se alimentam principalmente de invertebrados e peixes (Heemstra e Randall, 1993) e tendem a ser estrategistas k (Morris et al., 2000), seleção caracterizada pela utilização do esforço reprodutivo dos indivíduos que favorece uma maior eficiência na utilização dos recursos disponíveis e adaptações (Gadigil e Solbrig, 1972). Indivíduos classificados como k estrategistas são hábeis competidores, geralmente exploram habitats já colonizados, apresentam um tempo de vida mais longo e os pais demandam grande cuidado com a prole de forma a garantir a sobrevivência e longevidade (Stubbs, 1977). De fato, serranídeos apresentam lenta taxa de crescimento (entre 8 a 10 anos para atingir a primeira maturação sexual (Heemstra et al., 2002). Garoupas habitam águas costeiras rasas até profundidades moderadas, com menos de 200 metros (Heemstra e Randall, 1993; Nelson et al., 2016), em mares tropicais e subtropicais em todo mundo (Craig e Hastings, 2007). Com notável variação corporal, a menor espécie, Jeboehlkia gladifer, mede cerca de 5 cm de comprimento, enquanto a maior, Epinephelus lanceolatus, atinge 2,3 m e peso de 400 kg (Heemstra et al., 2002; Bright et al., 2016). Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 18

Pertencente a Série Eupercaria, Ordem Perciformes, Subordem Serranoidei (Betancur et al., 2017), a família Serranidae é composta por 577 espécies, e 75 gêneros agrupados em nas subfamílias Anthiadinae, Epinephelinae, Grammistinae e Liopropomatinae e (Craig et al., 2011; Fricke et al., 2019). O gênero Epinephelus, constituído por 87 espécies, é o mais representativo, seguido por Pseudanthias (64 spp.), Liopropoma (30 spp.) e Serranus (28 spp.). (Craig e Hastings, 2007; Craig et al., 2011; Nelson et al., 2016) cuja diversificação está associada a eventos simpátricos e alopátricos (Ma et al., 2016; Ma e Craig, 2018). Morfologicamente as espécies desta família apresentam boca de tamanho moderado a grande; mandíbula superior saliente; barbatana dorsal geralmente única, mas espinhosas com 2 a 11 espinhos; nadadeira anal com 3 espinhos (ausentes em Rypticus); nadadeira caudal bifurcada, lunada, emarginada, truncada ou arredondada, com 13 a 16 raios ramificados; nadadeira peitorais arredondadas, geralmente mais longas que as nadadeira pélvicas; nadadeira pélvica com 1 coluna e 5 raios; linha lateral presente (ausente em Jeboehlkia); 24 a 26 vértebras, com 10 ou 11 vértebras abdominais e 14 a 16 caudais (Heemstra et al., 2002; Nelson et al., 2016). A coloração das espécies pode variar durante o desenvolvimento, apresentando, em geral, padrões de manchas e listras claras ou escuras, e em alguns casos fases xânticas (todas amarelas) (Heemstra et al., 2002). Estes padrões de coloração podem ser suficientemente crípticos em alguns gêneros, como Epinephelus, dificultando a correta identificação das espécies (Figura 1) (Heemstra e Randall, 1993; Jawad, 2012; Miglan et al., 2014; Rahim et al., 2016). Os padrões sexuais dos peixes teleósteos são incrivelmente diversos em comparação com outros vertebrados (Mitcheson e Liu, 2008; Sunobe et al., 2017). Embora a maioria das linhagens de teleósteos exiba gonocorismo, o hermafroditismo ocorre em diversas famílias como Serranidae, Cirrhitidae, Gobiidae, Labridae, Pomacanthidae, Pomacentridae e Pseudochromidae e assume várias formas, incluindo hermafroditismo simultâneo, protoginia e protandria, bem como mudança de sexo bidirecional e androdioica (Mitcheson e Liu, 2008).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 19

Figura 1. Padrões crípticos de coloração em espécies de Epinephelus. Barra = 2 cm

Quatro padrões sexuais já foram documentados em Serranidae, gonocorismo, protoginia, hermafroditismo simultâneo, e androdioicia; apenas protandria e mudança bidirecional do sexo não foram relatadas, sendo que a maior das espécies é protogínica, padrão sexual considerado um ancestral (Mitcheson e Liu, 2008; Erisman et al., 2009; 2011). Garoupas produzem grandes quantidades de ovos, assim como a maioria dos peixes recifais (Sale, 1991) e suas larvas são planctônicas, que ficam à mercê de correntes oceânicas (Santos et al., 2019), com período pelágico larval (PPL) que varia entre 40 a 60 dias (Lindeman et al., 2000; Craig et al., 2006). Longos PPL podem influenciar fatores como fluxo gênico e a diferenciação genética das espécies, potencial para especiação, potencial adaptativo às questões ambientais e distribuição geográfica das espécies (Shulman e Bermingham, 1995). Esta condição em Serranidae pode ampliar sua dispersão no ambiente marinho, aumentando o fluxo gênico nas espécies do grupo, resultando em homogeneidade genética entre as espécies. A estrutura de acasalamento do grupo é diversa; algumas espécies desovam em pares, outras desovam em grupos ou apresentam os dois comportamentos (Erisman et al., 2009). Exceto durante agregações reprodutivas a maioria das garoupas é solitária e moderadamente sedentária (Heemstra e Randall, 1993; Ochieng et al., 2015; Nelson et al., 2016). A baixa mobilidade e lenta taxa de crescimento as tornam particularmente vulneráveis à superexploração (Sadovy, Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 20

2001; Heemstra et al., 2002; Dulvy et al., 2004; Wilson et al., 2010; Ochieng et al., 2015). Desde a década de 1960, a International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN) identifica, a nível global, espécies que podem estar em risco de extinção, com o objetivo de influenciar legislações e políticas nacionais e internacionais e fornecer informações para orientar as ações para conservar a diversidade biológica. Assim, as espécies podem ser classificadas quanto ao grau de informações ou ameaças em onze categorias, identificadas como extinta (EX), extinta na natureza (EW), regionalmente extinta (RE), criticamente em perigo (CR), em perigo (EN), vulnerável (VU), baixo risco (LR), quase ameaçada (NT), menor preocupação (LC), Dados insuficientes (DD) e não aplicável (NA). Baseado nesta classificação, em Serranidae, os gêneros Mycteroperca e Epinephelus se mostram os mais ameaçados (Morris et al., 2000). Estima-se que 12% das espécies tenham o status de ameaçadas (Mitcheson et al., 2013). No Pacífico, muitas espécies, como por exemplo, E. coeruleopunctatus, E. coioides, E. sexfasciatus, E. erythrurus e C. formosa apresentam dados insuficientes ou pouco preocupantes em relação a ameaças (IUCN, 2020). No Atlântico, algumas espécies têm merecido intensa atenção conservacionista, como Epinephelus striatus, considerada como criticamente em perigo; enquanto outras como E. adscensionis, Cephalopholis fulva, Rypticus saponaceus têm status de conservação pouco preocupante (IUCN, 2020). No Brasil, o Projeto Meros do Brasil e o Projeto Garoupa (http://www.merosdobrasil.org e http://www.institutoterraviva.org), realizam ações de conservação das espécies Epinephelus itajara e Epinephelus marginatus, incluídas na categoria de vulneráveis à extinção. Os serranídeos são considerados valiosos recursos alimentares sendo intensamente explorados pela pesca comercial (Kandula et al., 2015) e, em menor número, espécies também são usadas para o comércio de ornamentais marinhos (Craig et al., 2011), o que, sob o ritmo de sobrepesca atual, amplia em 25% o número de espécies ameaçadas (Heemstra e Randall, 1993; Mitcheson et al., 2013; Ochieng et al., 2015). Diante do quadro de exploração e diminuição de capturas, o cultivo comercial de garoupas representa um importante setor de produção em muitos países da Ásia, sobretudo China, Taiwan e Indonésia, que juntos respondem por 92% da produção mundial (Rimmer e Glamuzina, 2017). Um total de 646.804 toneladas de garoupas Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 21

foi produzido em 2017 (captura 72% e aquicultura 28%), representando um aumento de 44% em relação aos últimos dez anos, quando foram produzidas 359.505 toneladas (FAO, 2019; Figura 2). Dentre as espécies mais produzidas, destacaram- se Epinephelus fuscoguttatus, Epinephelus coioides e Epinephelus lanceolatus (Chu et al., 2016).

700.000

600.000

500.000

400.000

300.000 Captura e produção Toneladas 200.000

100.000

0

2007 2010 2013 2008 2009 2011 2012 2014 2015 2016 2017

Ano Figura 2. Série histórica de 10 anos da produção mundial de garoupas (FAO, 2019).

A demanda por peixes vem aumentando em todo o mundo e aparentemente é improvável que a crescente procura possa ser atendida através captura manual (Dunham et al., 2000; Lakra e Ayyappan, 2002). Neste contexto, a biotecnologia pode contribuir para melhorar a produtividade do cultivo por meio de técnicas de hibridização e manipulação cromossômica (Lakra e Ayyappan, 2002). A hibridização consiste na combinação de genomas distintos (Abbott et al., 2013; Shivaramu et al., 2019) e associada à técnicas de manipulação cromossômica podem induzir poliploidia e a herança cromossômica uniparental e tem sido aplicadas extensivamente em vários espécies cultivadas (Lakra e Ayyappan, 2002; Rahman et al., 2013; Rimmer & Glamuzina, 2017). Essas metodologias fornecem caminhos rápidos para a obtenção de produtos estéreis, controle sexual, melhoria da viabilidade híbrida (Lakra e Ayyappan, 2002), híbridos com altas taxas de crescimento, resistência a doenças e maior adaptabilidade ao cativeiro em relação às espécies parentais (Mitcheson et al., 2013; Chu et al., 2016; Rimmer e Glamuzina, 2017; Shivaramu et al., 2019; Wang et al., 2019). Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 22

Em peixes a hibridização ocorre com relativa frequência sob condições naturais (Allendorf e Waples, 1996; Rahman et al., 2013), motivados pela fertilização externa, distorção da razão sexual em uma das espécies parentais, sobreposição de áreas de reprodução, padrões cromossômicos homoploides, ausência de cromossomos sexuais (Campton, 1987; Molina et al., 2014b; Nagel et al., 2018), e lenta aquisição de bloqueios pós-zigóticos (Russell, 2003; Bolnick e Near, 2005; Stelkens et al., 2010). Na cultura de peixes marinhos os híbridos estéreis podem ser úteis frente a desafios ambientais da indústria como a reprodução indesejada em cativeiro ou escape para ambientes naturais que podem causar predação, competição por recursos ou outras dinâmicas comportamentais (Dunham et al., 2000; Muhammet et al., 2013). Adicionalmente, a maturação acelerada dos híbridos e a combinação de caracteres também podem ser relacionadas como usos aplicados da biotecnologia na aquicultura (Shivaramu et al., 2019; Wang et al., 2019). Desta forma, o conhecimento dos aspectos genéticos permite o desenvolvimento de marcadores moleculares para a validação de híbridos (Vicari et al., 2010; Motta-Neto et al., 2011) e o norteamento de protocolos de hibridização interespecífica (Rahman et al., 2013; Tseng e Shih, 2018) e. O lento desenvolvimento ontogenético das garoupas tem estimulado a produção de híbridos artificiais (Chu et al., 2016; Mitcheson et al., 2013). Além de híbridos naturais, 20 híbridos artificiais têm sido produzidos (Capítulo 2) (Tucker, 1994; Randall e Justine, 2008; Rimmer e Glamuzina, 2017), entre outros objetivos para incorporar taxa mais elevadas de crescimento nos produtos híbridos (Wang et al., 2019). Entre os cruzamentos realizados em garoupas tem sido relatada particular atenção para os híbridos entre Epinephelus lanceolatus e E. coioides, onde podem ser gerados híbrido diploide fértil, que cresce mais em relação as espécies parentais, e híbridos triploide infértil, com crescimento superior ao híbrido diploide e as espécies parentais (Huang et al., 2014). Diante do incremento ao cultivo proporcionado pela hibridização interespecífica, se intensifica o interesse em ampliar o conhecimento dos aspectos citogenômicos das espécies com vistas a subsidiar aplicações biotecnológicas, sobretudo relacionadas à produção de híbridos (Rahman et al., 2013; Tseng e Shih, 2018). Em última instância, o conhecimento dos padrões citogenéticos pode Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 23

contribuir tanto no conhecimento da composição e estrutura dos cromossomos, implementação de técnicas biotecnológicas voltadas à produção de espécies de valor comercial, caracterização da biodiversidade, bem como na reconstrução das relações filogenéticas (Cioffi e Bertollo, 2012; Molina et al., 2012; Molina e Jacobina, 2013; Minglan et al., 2014; Paim et al., 2018).

1.2 PADRÕES CITOGENÉTICOS NA FAMÍLIA SERRANIDAE

Estima-se que aproximadamente 72% das espécies pertencentes a Perciformes compartilham cariótipos com 2n=48 cromossomos acrocêntricos (Motta- Neto et al., 2019), com destaque para semelhanças entre cariótipos como quantidade reduzida de heterocromatina, baixas taxas de alterações no número e na estrutura dos cromossomos e ocorrência de sítios simples de regiões organizadoras nucleolares (Galetti et al., 2000; Molina, 2007). Este conservadorismo cariotípico sugere um baixo dinamismo no cariótipo das espécies, nos níveis de ploidia e na composição genômica durante a divergência filogenética caracterizando a estase cariotípica (Kahl, 2015). Apesar das aplicações práticas e evolutivas das informações citogenéticas, apenas 48 espécies da família Serranidae possuem algum aspecto de seus conjuntos de cromossomos conhecidos (Tabela 1), nas quais a maior parte dos dados citogenéticos refere-se à definição do valor diploide e morfologia dos cromossomos e revelam uma predominância de 48 cromossomos acrocêntricos (Arai, 2011; Paim et al., 2017; Wang et al., 2010; Pinthong et al., 2013; Minglan et al., 2014; Tseng e Shih, 2018). A variação no padrão de conservadorismo cromossômico observada em algumas espécies do grupo, evidenciando diversificação estrutural com manutenção do valor diploide deve-se a ocorrência de inversões pericêntricas. Estes rearranjos constituem as modificações detectáveis mais comuns em Eupercaria (Galetti et al., 2000; Galetti et al., 2006; Wang et al., 2010; Motta-Neto et al., 2019) e aparentemente se apresentam como mecanismos disruptivos na estabilidade cariotípica da família (Amorim et al., em preparação).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 24

Tabela 1. Dados citogenéticos de espécies da família Serranidae. Espécie 2n Fórmula NF Referência Alfestes afer 48 48a 48 Molina et al., 2002 Cephalopholis formosa 48 2m+46a 50 Pinthong et al., 2013 C. fulva 48 48a 48 Presente estudo Centropristis ocyurus 48 28m+20sm 96 Gonzalez e Figueras, 1990 C. striata 48 24m+22sm+2a 94 Merritt e Lacks, 1991 Cromileptes altivelis 48 2sm+ 46a 50 Takai e Ojima, 1995 Diplectrum eumelum 48 2m+4sm+42a 54 Aguilar e Galetti, 1997 D. formosum 48 2m+46a 50 Aguilar e Galetti, 1997 D. radiale 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 Epinephelus adscensionis 48 48a 48 Molina et al., 2002 E. akaara 48 48a 48 Wang et al., 2004 E. alexandrinus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. awoara 48 48a 48 Hong e Yang, 1988 E. bleekeri 48 48a 48 Noikotr et al., 2014 E. bruneus 48 2m+4sm+42a 54 Minglan et al., 2014 E. caninus 48 48a 48 Rodríguez-daga et al. 1993 E. coeruleopunctatus 48 2sm+ 46a 48 Presente estudo E. coioides 48 48a 48 Presente estudo E. diacanthus 48 2m+46a 50 Natarajan e Subrahmanyam, 1974 E. erythrurus 48 48a 48 Pinthong et al., 2015 E. fario 48 4m+6sm+4st+34a 62 Zheng; et al. 2005 E. fasciatomaculosus 48 48a 48 Li e Peng, 1994 E. fasciatus 48 48a 48 Li e Peng, 1994 E. faveatus 48 2sm+46a 50 Magtoon e Donsakul, 2008 E. flavocaeruleus 48 48a 48 Tseng e Shih, 2018 E. fuscoguttatus 48 2sm+46a 50 Tseng e Shih, 2018 E. guaza 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. guttatus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. itajara 48 6sm+42a 54 Presente estudo E. lanceolatus 48 6m+2st+40a 56 Jiun e Mei, 2009 E. malabaricus 48 48a 48 Zou et al., 2005 E. marginatus 48 48a 48 Sola et al., 2000 E. merra 48 4m+6sm+4st+34a 62 Zheng et al., 2005 E. moara 48 4sm+44a 52 Minglan et al., 2006 E. ongus 48 48a 48 Rishi e Haobam, 1984 E. polyphekadion 48 6sm+42a 54 Tseng e Shih, 2018 E. sexfasciatus 48 2sm+ 46a 50 Chen et al., 1990 E. striatus 48 48a 48 Presente estudo E. tauvina 48 8sm+40a 56 Presente estudo E. tukula 48 2sm+46t 50 Tseng; e Shih, 2018 Mycteroperca acutirostris 48 48a 48 Aguilar, 1993 M. rubra 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 Paracentropristis hepatus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 dewegeri 48 48a 48 Nirchio et al., 2014 P. nebulifer 48 48a 48 Martinez-brown et al., 2012 P. maculatofasciatus 48 48a 48 Martinez-brown et al., 2012 Plectropomus leopardus 48 48a 48 Pinthong et al., 2013 Rypticus saponaceus 48 48a 48 Presente estudo R. randalli 48 48a 48 Paim et al., 2017 Serranus cabrilla 48 48a 48 Martinez et al., 1989 S. flaviventris 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 S. scriba 48 48a 48 Martinez et al., 1989

Relações filogenéticas mais resolutivas para um maior número de espécies de Serranidae (Ma et al., 2016; Ma e Craig, 2018), tem propiciado um contexto Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 25

filogenético robusto para identificar os padrões evolutivos do cariótipo nesta família. Contudo, embora alguns estudos tenham analisado o conjunto de dados citogenéticos da família (Arai, 2011; Paim et al., 2017; Tseng e Shih, 2018; Motta- Neto et al., 2019), nenhum abrangeu e discriminou a diversificação cariotípica deste grupo sob um contexto biogeográfico e espectro filogenético suficientemente amplo voltado a estimar a evolução cariotípica dos seus diferentes gêneros. Aspectos gerais do cariótipo podem responder a várias questões evolutivas (Terencio et al., 2012). Alguns grupos apresentam cariótipos conservados entre suas espécies (Arai, 2011; Paim et al., 2017; Tseng e Shih, 2018; Motta-Neto et al., 2019). Em grupos que apresentam conservadorismo cromossômico, a análise da composição e organização de sequências de DNA repetitivo é aplicável para diferenciar espécies e estimar seus padrões carioevolutivos (Motta-Neto et al., 2011a, b; Vicari et al., 2010). DNAs repetitivos representam sequências que se repetem centenas ou milhares de cópias, em geral constituem a maior parte no genoma dos eucariotos, distribuindo-se em repetições dispersas pelo genoma ou localizadas em cromossomos específicos (Biscotti et al., 2015). Neste sentido, padrões de distribuição de regiões heterocromáticas, do DNA ribossômico 18S e 5S e outras sequências repetitivas possibilitam uma acurada interpretação de reorganizações cromossômicas, divergência ortóloga de cromossomos e mapeamento gênico (Ren et al., 1996; Gornung et al., 2001; Shapiro et al., 2005; Biémont e Vieira, 2006; Galetti et al., 2006; Ferreira et al., 2011; Artoni et al., 2015). Adicionalmente, os genes ribossomais 18S e 5S estão entre as famílias multigênicas mais conhecidas em peixes (Artoni et al., 2015), uma vez que dispersos nos cromossomos possibilitam estudos sobre evolução cromossômica e são eficientes marcadores citotaxonômicos em grupos com alto nível de conservadorismo cromossômico (Costa et al., 2015; Motta-Neto et al., 2019). Entre as sequências dispersas pelo genoma estão os elementos transponíveis de classe I (retrotransposons) e os de classe II (transposons) (Biscotti et al., 2015). Os retroelementos se propagam por meio de um intermediário de RNA que é posteriormente transcrito em DNA, enquanto os transposons são caracterizados pela falta de um intermediário de transposição de RNA (Warren et al., 2015). A mobilidade destes elementos pode afetar o comportamento e a evolução do genoma em vários níveis, como estrutura dos cromossomos e regulação da Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 26

expressão gênica, sendo capaz de modificar ou excluir genes, afetando o indivíduo em escalas individual, populacional ou na espécie (Herpin et al., 2010; Hua-Van et al., 2011; Darmon e Leach, 2014; Biscotti et al., 2015; Warren et al., 2015). Outra abundante parcela do DNA repetitivo é composta pelos microssatélites, curtas repetições de DNA in tandem com 6pb ou menos, altamente informativos sobre a divergência evolutiva e utilizados em estudos populacionais em peixes (Bagshaw, 2017; Landínez-García e Marquez, 2018; Vaini et al., 2019). Geralmente são encontrados em regiões heterocromáticas, mas também ocorrem em regiões eucromáticas (Xu et al., 2013), participando da organização da cromatina, replicação do DNA e da expressão gênica (Bagshaw, 2017). No ambiente marinho, a história evolutiva dos principais grupos de peixes recifais se estende por mais de uma região biogeográfica, com eventos regionais e históricos de especiação e expansão geográfica (Floeter et al., 2008; Cowman e Bellwood, 2013). Neste sentido, análises citogenéticas em espécies de diferentes oceanos ampliam as perspectivas de compreensão do contexto evolutivo de grupos extensamente distribuídos, entre os quais está a família Serranidae (Craig et al., 2001; Carlin et al., 2003; Pondella et al., 2003; García-Machado et al., 2004; Whiteman e Gage, 2007; Lautredou et al., 2013; Ma et al., 2016; Ma e Craig, 2018).

1.3 BIOGEOGRAFIA DA FAMÍLIA SERRANIDAE

A história geológica e sua influência através da tectônica de placas nos oceanos tem sido uma importante força motriz na evolução dos organismos marinhos (Crame e Rosen, 2002; Ma et al., 2016). Durante o Paleogeno (65-23 milhões de anos), os oceanos Atlântico e Pacífico estavam conectados pelo mar de Tethys, considerado centro global da biodiversidade marinha da época (Vermeij 2001; Renema 2008; Carpenter et al., 2011). No final do Eoceno, esse centro mudou para a Península Arábica, com a colisão inicial da África e Eurásia (Renema 2008; Harzhauser et al., 2007). Após o fechamento do mar de Tethys, o centro da biodiversidade foi alterado para o Indo-Pacífico (Carpenter et al., 2011). Até o início do Mioceno, por volta de 23 milhões de anos, a diversidade nos oceanos Índico e Pacífico era baixa (Wilson and Rosen 1998; Renema 2008). Quando os táxons que habitavam o mar de Tethys começaram a invadir o Indo- Pacífico, os processos tectônicos estavam produzindo diversificação de habitats na Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 27

região (Carpenter et al., 2011). Nessa época, quase coincidente com o fechamento do Mar de Tethys, a placa australiana começou a colidir com arcos insulares no Pacífico, na margem sudeste da placa eurasiana, alterando dramaticamente a circulação da superfície e definindo efetivamente as bacias modernas dos oceanos Índico e Pacífico (Hall, 2002). A associação entre processos geológicos e oceanográficos podem ter colaborado para tornar o Arquipélago Indo-Australiano (AIA) um centro de especiação que desempenhou um papel importante na origem da fauna do Indo-Pacífico (Mora et al., 2003; Briggs, 1999a, b) A divergência das garoupas coincide com uma drástica mudança paleoclimática de temperaturas muito quentes para geladas (Lear et al., 2008). A diminuição do nível de CO2 atmosférico e a formação de placas de gelo na Antártica resultaram em uma queda no nível do mar e levaram à extinção da fauna adaptada ao clima mais quente (Rohde e Muller, 2005). Os nichos vazios gerados devido a esse evento de extinção e a disponibilidade de novos habitats recifais, como o emergente (AIA), podem ter causado uma radiação adaptativa de garoupas em os oceanos mais frios (Ma et al., 2016). Além disso, o aumento da produtividade primária permitiu ao ecossistema marinho suportar mais predadores, possivelmente facilitando a radiação de garoupas carnívoras (Norris et al., 2013). A origem das garoupas remonta há ~60M.a (Ma et al., 2016). Posteriormente (~43M.a), as garoupas alcançaram o Atlântico Leste e colonizaram os Oceano Índico e Pacífico, provavelmente através do mar de Tethys (Figura 3) e, associado a eventos vicariantes, as semelhanças entre as faunas destas regiões diminuíram (Roman et al., 1989). A elevação do AIA provavelmente proporcionou oportunidades para a fauna recifal colonizar e diversificar nessa região (Cowman e Bellwood, 2011). O surgimento de várias linhagens de garoupas durante o início e meio do Mioceno, em um curto espaço de tempo, aparentemente está relacionado a tais mudanças ambientais, e não exclusivamente ao fechamento do mar de Tethys e a elevação do Arquipélago Indo-Australiano, eventos estes que coincidem com episódios de diversificação no grupo (Ma et al., 2016).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 28

Figura 3. Diversificação da família Serranidae durante o Paleoceno. Em menor escala, a distribuição atual das espécies.

Eventos vicariantes foram observados durante o Plioceno e o Pleistoceno onde quedas cíclicas do nível do mar geraram oportunidades para especiação alopátrica pelo isolamento de bacias oceânicas (Zachos et al., 2001; Miller et al., 2005). O isolamento entre o Pacífico Leste e o Atlântico provavelmente aumentou as oportunidades de vicariância nas garoupas do Atlântico Tropical e Pacífico Leste (Rocha et al., 2007) originando a diversidade contemporânea atualmente encontrada na família. A partir de relações estabelecidas através de características morfológicas (Randall e Bem-Tuvia, 1983; Randall e Heenstra, 1991; Heemstra e Randall, 1993), a história evolutiva de Serranidae vêm sendo consolidada pelo crescente aporte de abordagens moleculares e têm fornecido suporte para notáveis reinterpretações das suas relações filogenéticas. Desta maneira, as relações entre as espécies da família do grupo ainda se encontram em construção e são alvos de debates constantes (Craig e Hastings, 2007; Craig et al., 2011; Schoelinck et al., 2014; Ma et al., 2016; Betancur et al., 2017; Ma et al., 2018; Ma e Craig, 2018; Saad, 2019). Em um extenso estudo biogeográfico Ma et al. (2016) definiram aspectos da diversificação de alguns gêneros de Serranidae. Com a expansão de linhagens ancestrais, os gêneros Plectropomus, Saloptia, Gonioplectrus e Variola tiveram origem no Indo-Pacífico Central (~36M.a), e posteriormente Cephalopholis, Gracila, Aethaloperca e Paranthias no Indo-Pacífico Ocidental (~25M.a), onde eventos Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 29

vicariantes e o isolamento também contribuíram na diversificação de espécies. O ancestral comum mais recente de Dermatolepis, Alphestes e Hyporthodus provavelmente surgiu no Atlântico Oeste, mas a linhagem se expandiu e diversificou principalmente no Pacífico Leste (~18M.a). O gênero Mycteroperca e algumas espécies de Epinephelus originaram-se no Indo-Pacífico Ocidental (~16M.a) e posteriormente alcançaram para o Atlântico durante o Mioceno médio e, mais recentemente, para o Pacífico Leste durante o Plioceno. Cromileptes, Anyperodon e algumas espécies de Epinephelus tiveram origem no Indo-Pacífico Ocidental (~15 Ma). As demais diversificações em Epinephelus (~15 Ma) variaram, tendo pelo menos quatro diferentes centros regionais de diversificação: Pacífico Central, com posterior radiação para o Indo-Pacífico Central e Indo-Pacífico Ocidental; Atlântico Oeste (e provável dispersão no Pacífico); Indo-Pacífico Central e Pacífico Leste com diversificações posteriores no Indo-Pacífico Ocidental. Diante do interesse ecológico, econômico, taxonômico, filogenético e evolutivo envolvendo os serranídeos, a prospecção de informações citogenéticas mais resolutivas, aliando a aplicação de metodologias da citogenética clássica e o mapeamento de variada gama de sequências repetitivas de DNA nos cromossomos, têm contribuído no esclarecimento dos aspectos taxonômicos, carioevolutivos, inferências filogenéticas, e processos de mudanças nos cromossomos ao longo de sua diversificação e possibilitando alguns usos aplicados em biotecnologia.

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2. OBJETIVO GERAL

A família Serranidae, com sua grande diversidade e plasticidade fenotípica, apresenta uma significante importância ecológica e econômica, mas com algumas lacunas relacionadas a seus aspectos evolutivos, dentre os quais sua evolução cromossômica. Neste sentido, o presente trabalho visou analisar aspectos citogenômicos de um significativo número de espécies originárias de distintas regiões biogeográficas e centros de diversificação. O primeiro capítulo traz informações citogenéticas para as espécies E. sexfasciatus, E. erythrurus, E. coeruleopunctatus, E. adscensionis e E. itajara. No segundo capítulo são geradas informações citogenômicas para outras três espécies da família dos gêneros Cephalopholis e Rypticus (Cephalopholis formosa, C. fulva e Rypticus saponaceus). No terceiro capítulo foram realizadas análises citogenômicas de três espécies de garoupas de interesse comercial (Epinephelus coioides, E. tauvina e E. striatus).

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Realizar análises comparativas dos padrões macroestruturais dos cromossomos e da organização das sequências repetitivas DNAr 18S, DNAr

5S, Tol2, Rex3 e microssatélites (CA)15, (GA)15, em espécies da família Serranidae, considerando suas relações filogenéticas e biogeográficas a fim de averiguar suas tendências de diferenciação cariotípica e divergências citogenéticas entre linhagens;  Ampliar as informações citogenéticas para a família Serranidae através do mapeamento de DNA repetitivos DNAr 18S, DNAr 5S, Tol2, Rex3 e

microssatélites (CA)15, (GA)15 nos cromossomos de espécies dos gêneros Cephalopholis e Rypticus;  Analisar os padrões citogenéticos por meio de métodos citogenéticos convencionais e de hibridização in situ fluorescente (FISH) os cromossomos das espécies cultiváveis Epinephelus coioides, E. tauvina e E. striatus e estabelecer o nível de divergência cromossômica entre as espécies, aspectos adaptativos e potencialidades aplicáveis à práticas de hibridização interespecífica na piscicultura marinha. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 31

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

3.1.1 Coleta de espécimes

Análises citogenômicas foram realizadas em 11 espécies de Serranidae provenientes de regiões geográficas do Atlântico (n=5) e Indo-Pacífico (n=6), apresentadas detalhadamente na Tabela 2.

Tabela 2. Espécies de Serranidae utilizadas nas análises citogenômicas e seus respectivos locais de coleta. Região Coordenadas Espécie n Localidade oceânica geográficas

Epinephelus itajara 1 Canguaretama-RN Atlântico 6°19'23"S, 35°02'48"O

E. adscensionis 6 Extremoz-RN Atlântico 5°42’20”S, 35°11’38”O

E. striatus 10 Key Largo-EUA Atlântico 25°09'40"N, 80°45'83"O

E. tauvina 5 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

E. coioides 5 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

E. sexfasciatus 3 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

E. erythrurus 1 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

E. coeruleopunctatus 3 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

Cephalopholis fulva 5 Trindade-ES Atlântico 20°30'38"S, 29°19'22"O

C. formosa 4 Mar de Andaman Indo-Pacífico 11°04’00”N, 95°44’34”E

Rypticus saponaceus 4 Trindade-ES Atlântico 20°30'38"S, 29°19'22"O

As espécies de áreas marinhas do Brasil foram coletadas por meio de linha e anzol, mediante licença do ICMBio/SISBio (#19135-8, #60224-3 e #66021-1), e nos Estados Unidos da América, sob licença local (#02001.001902/06-82). Todos os procedimentos experimentais no manejo dos exemplares foram aprovados pelo Comitê de Ética para o uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (nº 044/2015).

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Figura 4. Exemplares das espécies de Serranidae utilizados nos estudos citogenômicos. Espécies provenientes do Atlântico: Epinephelus itajara (a), E. adscensionis (b), E. striatus (c), Cephalopholis fulva (d), Rypticus saponaceus (e). Indo-Pacífico: E. tauvina (f), E. coioides (g), E. sexfasciatus (h), E. erythrurus (i), E. caeruleopunctatus (j) C. formosa (k). Imagens das espécies são de arquivo pessoal, exceto E. striatus que apresenta veiculação livre. Barra = 2 cm.

3.2 Métodos

3.2.1 Técnicas de estimulação mitótica Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 33

Os exemplares coletados no Atlântico foram submetidos à estimulação mitótica com o uso de complexos de antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010). O procedimento consistiu na inoculação intramuscular do composto Broncho- Vaxom®, por um período de 24 a 48 horas. Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com Eugenol e sacrificados para extração do rim cefálico.

3.2.2 Técnicas de obtenção de cromossomos mitóticos

Os cromossomos mitóticos dos exemplares do Atlântico foram preparados a partir de suspensões celulares do tecido renal, de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Fragmentos da porção anterior do rim foram dissociados com ajuda de seringa de vidro e pinças em 10 ml de meio de cultura RPMI 1640. Em seguida foram adicionados 125 μl de colchicina 0,025% à suspensão celular, por 28 minutos, em temperatura ambiente. O material foi centrifugado por 10 minutos à 900 rpm, e o sobrenadante removido. Sobre o sedimento celular foram adicionados 10 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M), por 30 minutos em temperatura ambiente, ao término o material foi centrifugado por 10 minutos à 1.000 rpm. O material foi fixado em solução de metanol e ácido acético na proporção (3:1) respectivamente, em três ciclos de centrifugação de 10 minutos cada, e posteriormente transferido para tubos Eppendorf de 1,5 ml e mantidos à - 20ºC até a realização das análises citogenéticas. Nas espécies do Indo-Pacífico os cromossomos mitóticos foram preparados a partir de células do rim anterior após o tratamento com colchicina in vivo (0,025%) (Bertollo et al., 1978). Passados 60 minutos da aplicação da colchicina, os animais foram sacrificados e a porção anterior do rim foi removida e utilizada para obtenção de suspensão celular. Em seguida o material foi transferido para uma cubeta de vidro contendo 10 ml de solução de KCl (0,075M) e dissociado com ajuda com o auxílio de pinças. Posteriormente, a hipotonização celular foi realizada por meio da incubação do material em estufa à 37°C, por 20 minutos. Seguidamente, a suspensão foi centrifugada por 10 minutos à 1000 rpm. Após o sobrenadante ser removido, o material foi fixado em solução de metanol e ácido acético (3:1) em três ciclos de centrifugação de 10 minutos cada a 1000 rpm, sendo o material transferido Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 34

para tubos Eppendorf de 1,5 ml com tampa e mantidos à -20ºC até as análises citogenéticas.

3.2.3 Preparação das lâminas

Para análise das preparações cromossômicas, foram gotejados aproximadamente 3 gotas de suspensão celular sobre uma lâmina recoberta com uma lâmina d’água destilada aquecida à 60°C. Após seca ao ar, o material foi corado com solução Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8, por um período de 8 minutos, subsequentemente lavado com água destilada e seco ao ar.

3.2.4 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) foram visualizadas através da técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell e Black, 1980). As lâminas recém-preparadas foram cobertas com aproximadamente 175 μl de solução de gelatina (1g de gelatina incolor, diluída em 50 ml de água, acrescida de 0,5 ml de

ácido fórmico), 200 μl de nitrato de prata (AgNO3) à 50% e 75 μl de água destilada. A solução foi misturada sobre a lâmina, coberta com lamínula e colocada em estufa até atingir uma coloração âmbar (3 a 4 minutos). Em seguida a lamínula foi retirada, as lâminas foram lavadas com água destilada e secas ao ar.

3.2.5 Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)

As regiões heterocromáticas foram visualizadas através da técnica de bandamento C (Sumner, 1972). As lâminas foram envelhecidas em estufa à 37°C por três dias. Em seguida foram imersas em HCl 0,2N à temperatura ambiente, por 15 minutos, lavadas a posteriori em água destilada e secas ao ar. Após este procedimento, as lâminas foram imersas em solução de 2X SSC à 60ºC por 15 minutos, lavadas após este período de tempo em água destilada e secas ao ar. Em seguida, foram incubadas numa solução Ba(OH)2 8H2O à 5%, durante 1 a 2 minutos à 42ºC. Após incubação foram lavadas rapidamente em HCl 0,2N, enxaguadas com água destilada e incubadas em solução de 2X SSC à 60ºC, por 30 minutos. Por fim, foram coradas com solução Giemsa 10% diluído em solução de tampão fosfato, pH 6,8, por 6 minutos.

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3.2.6 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

3.2.6.1 Obtenção das sondas para hibridização cromossômica

As sondas DNAr 5S e 18S, contendo aproximadamente 200 pb e 1400 pb, respectivamente, foram obtidas por PCR, a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os iniciadores A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994), e NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’ (White et al., 1990), respectivamente. O DNAr 18S foi marcado com digoxigenina-dUTP-11, e a sonda de DNAr 5S, com biotina-14-dATP, através de nick translation, de acordo com as especificações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). Sondas de sequências Tol2 (200pb) foram amplificadas por PCR, a partir do DNA nuclear de E. itajara, utilizando o primer Tol2-5F 5′ -CTG TCA CTC TGA TGA AAC AG-3′ e Tol2-5R 5′ -CTT TGA CCT TAG GTT TGG GC-3′ (Kawakami; Shima, 1999). O produto de PCR amplificado com o primer Tol2-5 foi marcado com digoxigenina-11-dUTP, através de nick translation, seguindo as recomendações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). A amplificação da sonda do DNA retrotransponível Rex3, com aproximadamente 200 pb, foi obtida a partir do DNA genômico de E. itajara como uso dos primers Rex3-F5-YAA TGA CGG AGGGCCCGGCA-3′ e Rex3-5′ -TGG GTG GTG GGG CAG GT ACN-3′ (Valente et al., 2011). A região amplificada abrange os domínios de codificação 1, 2, 2A, A e B do gene da transcriptase reversa, projetados a partir dos genes de Xiphophorus (Volff et al., 1999; 2000). As sondas Rex3 foram marcadas por nick-translation com digoxigenina-11-dUTP, seguindo as recomendações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). A hibridização in situ com microssatélites foi realizada de acordo com Kubat et al. (2008), utilizando os oligonucleotídeos (CA)15, (GA)15, (CAA)10 e (CGG)10, marcados durante a síntese, na posição terminal 5’, com AlexaFluor 555 (InvitrogenTM).

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3.2.7 Hibridização cromossômica

A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20μg/ml em 2X SSC) por 1 hora a 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos, fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2X SSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2X SSC, 10% de sulfato dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/μl), em um volume final de 30 μl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2X SSC a 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1X SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4X SSC por 5 minutos à temperatura ambiente, posteriormente incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% NFDM/4X SSC e em seguida lavadas em Tween 20 0,5%/4×SSC por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche®, Mannheim, Alemanha) para o DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Roche®, Mannheim, Alemanha) para o DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml) (Roche®, Mannheim, Alemanha). As melhores metáfases foram fotografadas com um microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73 utilizando o software cellSens® (OlympusTM). Os cromossomos foram classificados em relação à posição do centrômero, em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964) e ordenados em tamanho decrescente para definição dos cariótipos.

3.2.8 Análises de sequências de DNAmt 16S

Sequências parciais do gene mitocondrial 16S de 21 espécies da família Serranidae, utilizadas em cruzamentos interespecíficos, foram obtidas no GenBank (Tabela SS1, Anexo) e alinhadas usando MUSCLE (Edgar, 2004), implementado pelo software MEGA 6 (Tamura et al., 2013). As taxas médias de divergência Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 37

genética (modelo Kimura-2p) foram obtidas através do software MEGA 6 (Tamura et al., 2013). A estimativa de divergência temporal das sequências considerou 0,42% de divergência genética por M.a, a partir de dados de Domingues et al. (2005).

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4.3 CAPÍTULO 1

Estabilidade diploide e organização citogenômica de classes de DNA repetitivo em Serranidae (Perciformes) - Padrões disruptivos em um cenário de estase cariotípica

RESUMO

Garoupas são peixes predadores, com importante papel ecológico nos ambientes recifais de todo o mundo. A maior diversidade de espécies está localizada no Indo- Pacífico, mas possuem significativo sucesso evolutivo em outras áreas oceânicas. Inferências sobre a evolução cariotípica da família sugerem uma dinâmica evolutiva conservativa, que basicamente era compatível com estase cariotípica. Entretanto, os dados citogenéticos disponíveis para o grupo se baseiam principalmente em análises convencionais, com algum viés filogenético e poucos dados citogenômicos. Análises citogenéticas envolvendo espécies de diferentes oceanos, utilizando mapeamento de sequências repetitivas possibilitam uma melhor compreensão da diversificação cariotípica frente às relações filogenéticas e biogeográficas das espécies do grupo. Diante disso, cinco espécies da família distribuídas nos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico foram analisadas com uso de protocolos citogenéticos convencionais e mapeamento de sequências repetitivas [DNAr 18S, DNAr 5S, Tol2, Rex3, (CA)15 e (GA)15]. Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus e E. sexfasciatus apresentaram um cariótipo com 48 cromossomos acrocêntricos (NF=48a), enquanto E. itajara exibiu 2n = 48 cromossomos, compostos por 6sm+42a (NF=54). Regiões heterocromáticas se apresentaram reduzidas e com localização centromérica. Sítios DNAr 18S e 5S ocorrem em pares cromossômicos distintos e demonstram regularidades filogenéticas entre as espécies. As sequências microssatélites (CA)15 e (GA)15 estão dispersas nos cromossomos, mas exibem acúmulos conspícuos nas regiões pericentroméricas. O elemento transponível Tol2 apresentou uma distribuição homogênea ao longo dos cromossomos, enquanto Rex3 mostrou discreto acúmulo nas regiões terminais dos cromossomos das espécies. Serranidae apresenta um notável conservadorismo do número diploide, no entanto, uma relativa variabilidade na macroestrutura dos cariótipos, diferenciados pela ocorrência de inversões pericêntricas, sobretudo em clados com diversificação mais recente (Indo-Pacífico). A maior parte das espécies apresenta uma estrutura cariotípica considerada basal para Eupercaria, contudo outras tantas apresentam variações deste padrão (NF>48), baixo dinamismo na distribuição das RONs e de sequências microssatélites. Os níveis de divergência cariotípica no grupo se mostram progressivamente maiores em espécies com origens mais recentes, presentes no Índico e Pacífico, aparentemente associados a biogeografia histórica da família.

Palavras-chave: Citogenética de peixes; evolução cariotípica; estase cariotípica; DNAr; microssatélites; garoupas.

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INTRODUÇÃO

Popularmente conhecidas como garoupas, a família Serranidae é composta por 577 espécies e 75 gêneros distribuídos nos recifes de corais de todo o mundo, onde são considerados recursos marinhos pesqueiros importantes (Craig e Hastings, 2007; Nelson et al., 2016; Fricke et al., 2019; Vaini et al., 2019). A maior parte de suas espécies são encontradas nas águas do Indo-Pacífico (Bawole et al., 2018), enquanto no Atlântico são reportadas 25 espécies (Craig et al., 2011). Serranídeos apresentam crescimento relativamente lento, maturação tardia, elevada longevidade, alcançando quase 40 anos (Santos et al., 2019), características que os colocam entre os grupos mais vulneráveis à pressão da pesca (Mitcheson et al., 2012). Estima-se que 12% das espécies de garoupas estejam ameaçadas de extinção (Mitcheson et al., 2013). Entre estas, algumas como a espécie Epinephelus itajara do Atlântico - altamente vulnerável a sobrepesca, tem respondido com sucesso aos diversos esforços conservacionistas (Giglio et al., 2014). Garoupas formam grandes aglomerações reprodutivas em locais específicos durante determinados períodos do ano (Craig et al., 2011; Mitcheson et al., 2013). Sua coloração é muito variável (Heemstra et al., 2002), embora a similaridade cromática de alguns grupos, como Epinephelus, possa ser bastante acentuada (Heemstra e Randall, 1993; Jawad, 2012; Rahim et al., 2016). Apesar da importância ecológica e econômica pouco se conhece sobre os aspectos carioevolutivos do grupo. De fato, apenas 8% das espécies de Serranidae dispõe de alguma informação citogenética, que perpassa 12 gêneros (16%), dos quais Epinephelus é o mais representado, com 31 espécies investigadas (Arai, 2011; Minglan et al., 2014; Tseng e Shih, 2018). A biogeografia evolutiva deste grupo de peixes tem compreensão complexa (Ma et al., 2016; Craig e Ma, 2018), que pode ser consolidada através de dados citogenéticos de um conjunto maior de espécies e gêneros de diferentes regiões oceânicas. Além disso, neste grupo com padrões cariotípicos menos variáveis, o mapeamento de sequências repetitivas nos cromossomos pode auxiliar na evidenciação de possíveis divergências cariotípicas. Diante disso, cinco espécies de garoupas provenientes dos oceanos Índico, Pacífico e Atlântico foram submetidas a análises citogenéticas convencionais e mapeamento de sequências repetitivas Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 40

[DNAr 18S, DNAr 5S, elementos transponíveis Tol2 e Rex3, e microssatélites (CA)15 e (GA)15], e seus dados foram associados aos disponíveis na literatura para traçar um panorama da evolução do cariótipo na família.

MATERIAIS E MÉTODOS

Exemplares de E. coeruleopunctatus (n=3) E. erythrurus (n=1) e Epinephelus sexfasciatus (n=3) foram provenientes do Mar de Andaman (11°04’00”N e 95°44’34”E), Tailândia. Exemplares da espécie E. adscensionis (n=6) e Epinephelus itajara (n=1) foram coletados, respectivamente, na costa do município de Extremoz (5°42’20”S e 35°11’38”O) e do município de Canguaretama (6°19'23,38"S, 35°02'48,84"O), no Estado do Rio Grande do Norte, região Nordeste do Brasil. Os exemplares das espécies E. adscensionis e Epinephelus itajara foram submetidos à estimulação mitótica intraperitoneal com complexos antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010), enquanto E. coeruleopunctatus E. erythrurus e Epinephelus sexfasciatus foram diretamente utilizados nas preparações cromossômicas. Os cromossomos mitóticos das espécies E. adscensionis e Epinephelus itajara foram preparados a partir de suspensão celular da porção anterior do rim, utilizado a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). As demais espécies foram preparadas a partir de suspensão celular da porção anterior do rim segundo a técnica in vivo proposta por Bertollo et al. (1978). Para determinação do número diploide e aspectos gerais do cariótipo, os cromossomos foram corados com solução de Giemsa diluída à 5%, em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C (Sumner, 1972) e as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) de acordo com a técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell e Black, 1980).

Obtenção das sondas para hibridização cromossômica

As sondas DNAr 5S (~200 pb) e 18S (~1400 pb) foram obtidas por PCR a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando respectivamente os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994) e NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’(White et al., 1990), respectivamente. As sondas de DNAr 5S e DNAr 18S e foram marcadas Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 41

respectivamente com biotina-14-dATP e digoxigenina-dUTP-11, por nick translation de acordo com as especificações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). Sondas de sequências Tol2 (200pb) foram amplificadas por PCR, a partir do DNA nuclear de E. itajara, utilizando o primer Tol2-5F 5′ -CTG TCA CTC TGA TGA AAC AG-3′ e Tol2-5R 5′ -CTT TGA CCT TAG GTT TGG GC-3′(Kawakami; Shima, 1999). O produto de PCR amplificado com o primer Tol2-5 foi marcado com digoxigenina-11-dUTP, através de nick translation, seguindo as recomendações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). As sondas do elemento retrotransponível Rex3 (~200 pb) foram obtidas a partir do DNA genômico de E. itajara, utilizando os primers Rex3-F5-YAA TGA CGG AGG GCC CGG CA-3′ e Rex3-5′-TGG GTG GTG GGG CAG GT ACN-3′ (Volff et al., 1999; 2000) e amplificado de acordo com Valente et al. (2011). As sondas Rex3 foram marcadas, através de nick translation, com digoxigenina-11-dUTP (Roche®, Mannheim, Alemanha). A hibridização in situ utilizando microssatélites foi realizada de acordo com Kubat et al. (2008), utilizando os oligonucleotídeos (CA)15 e (GA)15, marcados durante a síntese com AlexaFluor 555 na posição terminal 5’ (InvitrogenTM).

Hibridização cromossômica

Os experimentos de FISH foram realizados seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20µg/ml em 2X SSC) por 1 hora à 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C, por 10 minutos, fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2X SSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2X SSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2X SSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1X SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4X SSC por 5 minutos à temperatura ambiente, e posteriormente incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 42

NFDM/4X SSC, em seguida lavadas em Tween 20 0,5%/4X SSC por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Roche®, Mannheim, Alemanha).

Processamento das imagens

As melhores metáfases foram fotografadas em microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73, utilizando o software cellSens® (OlympusTM). Os cromossomos foram definidos em relação à posição do centrômero em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964).

RESULTADOS

Todas as espécies compartilharam um valor diploide de 2n=48 cromossomos. Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus e E. sexfasciatus apresentaram um cariótipo composto exclusivamente por cromossomos acrocêntricos (NF=48a), enquanto o cariótipo de E. itajara, com maior variação nos tipos cromossômicos, era composto por 6sm+42a (NF=54) (Figuras 5 e 6). O padrão de distribuição da heterocromatina para as espécies consistia de blocos heterocromáticos de tamanho reduzido, localizados principalmente nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos.

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 43

Figura 5. Cariótipo das espécies Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus e E. erythrurus, sob coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs e sítios DNAr 18S e 5S. Barra = 5μm.

Figura 6. Cariótipo das espécies E. sexfasciatus e E. itajara, sob coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs e sítios DNAr 18S e 5S. Barra = 5μm. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 44

O mapeamento do DNAr 18S identificou sítios simples em todas as espécies. Os sítios DNAr 18S e Ag-RONs foram coincidentes e localizados no braço curto do par 24, em Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus e E. sexfasciatus e par 1 (sm), em E. itajara (Figuras 5 e 6, em destaque). Por sua vez, as sequências de DNAr 5S ocorreram no braço curto do par 23, em Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus E. sexfasciatus e E. itajara (Figuras 5 e 6, em destaque).

O mapeamento dos microssatélites (CA)15 e (GA)15 evidenciou uma distribuição principalmente dispersa ao longo dos cromossomos, com acúmulos em regiões pericentroméricas e terminais de alguns pares cromossômicos das espécies, evidentes principalmente no menor par cromossômico de E. adscensionis (Figura 7). As sequências Tol2 apresentaram uma distribuição uniforme sobre os cromossomos das espécies, enquanto Rex3 mostrou discretos acúmulos nas regiões centroméricas (Figura 7).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 45

Figura 7. Hibridização in situ com sondas microssatélites (CA15 e GA15), e elementos Tol2 e Rex3 em cromossomos das espécies Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus, E. erythrurus, E. sexfasciatus e E. itajara. Barra=5 μm

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 46

DISCUSSÃO

Os padrões citogenômicos presentes nas cinco espécies do gênero Epinephelus, indicaram conservadorismo numérico dos cromossomos e da estrutura cariotípica para as espécies (2n=48), exceto E. itajara (2n=54). A variação no número fundamental (NF=48-96) para o grupo é elevada (Tabela 3), mas não reflete a condição mais frequente entre as espécies (NF=48), que se situa no padrão considerado basal para a família Serranidae (Wang et al., 2010; Arai, 2011; Pinthong et al., 2013; Minglan et al., 2014; Tseng e Shih, 2018). As cinco espécies analisadas compartilham um único par portador de regiões organizadoras nucleolares, em três delas, Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus e E. erythrurus, o 24º par. A ocorrência de sítios Ag-RONs no menor par cromossômico é uma característica frequente em Serranidae (Martinez et al., 1989; Rodríguez-Daga e Amores; Thode, 1993; Zou et al., 2005; Wang et al., 2010, 2012; Tseng e Shih, 2018), que sugere uma condição simplesiomórfica para o grupo. No entanto, variações na localização destes sítios, como observadas para E. itajara e E. sexfasciatus (pares 1 e 23, respectivamente), ou sítios Ag-RONs múltiplos, incluindo o 24º par têm sido descritas (Alvarez et al., 1983; Molina et al., 2002; Zou et al., 2005; Pinthong et al., 2013; Minglan et al., 2014). O conservadorismo das regiões Ag-RONs/DNAr 18S em mesmos pares cromossômicos de cariótipos similares (2n=48a), tornam esses sítios pouco resolutivos na diferenciação de espécies de Serranidae. Neste sentido, o mapeamento conjunto do DNAr 18S e 5S pode ampliar o nível de discriminação e detecção de divergência citogenética interespecífica (Minglan et al., 2014; Amorim et al., em preparação), embora ainda assim, o conservadorismo possa ser mantido em muitos casos como, Epinephelus adscensionis, E. coeruleopunctatus e E. erythrurus. Apesar dos arranjos alternativos de organização do DNAr, como sítios DNAr 18S múltiplos (Minglan et al., 2014) ou co-localização de sequências DNAr 18S e 5S sobre um mesmo par cromossômico (Amorim et al., Capítulo 3), as 5 espécies aqui analisadas e outras espécies da família (Sola et al., 2000; Wang et al., 2012; Paim et al., 2017; Amorim et al., em preparação) apresentam sítios DNAr 18S e 5S em cromossomos distintos, condição mais comum em teleósteos (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996; Gornung, 2013). A co-localização destes genes ou sua múltipla ocorrência no cariótipo, sugere que estas regiões possam ter alguma participação na Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 47

promoção de mudanças cariotípicas em Serranidae, como identificado em outros grupos de peixes (Molina e Galetti, 2002; Jacobina et al., 2013; Dulz et al., 2019).

Tabela 3. Dados citogenéticos das espécies da família Serranidae. Espécie 2n Fórmula NF Referência Alfestes afer 48 48a 48 Molina et al., 2002 Cephalopholis formosa 48 2m+46a 50 Pinthong et al., 2013 C. fulva 48 48a 48 Amorim et al., em preparação Centropristis ocyurus 48 28m+20sm 96 Gonzalez e Figueras, 1990 C. striata 48 24m+22sm+2a 94 Merritt e Lacks, 1991 Cromileptes altivelis 48 2sm+ 46a 50 Takai e Ojima, 1995 Diplectrum eumelum 48 2m+4sm+42a 54 Aguilar e Galetti, 1997 D. formosum 48 2m+46a 50 Aguilar e Galetti, 1997 D. radiale 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 Epinephelus adscensionis 48 48a 48 Molina et al., 2002 E. akaara 48 48a 48 Wang et al., 2004 E. alexandrinus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. awoara 48 48a 48 Hong e Yang, 1988 E. bleekeri 48 48a 48 Noikotr et al., 2014 E. bruneus 48 2m+4sm+42a 54 Minglan et al., 2014 E. caninus 48 48a 48 Rodríguez-daga et al. 1993 E. coeruleopunctatus 48 2sm+ 46a 48 Presente estudo E. coioides 48 48a 48 Amorim et al., em preparação E. diacanthus 48 2m+46a 50 Natarajan e Subrahmanyam, 1974 E. erythrurus 48 48a 48 Pinthong et al., 2015 E. fario 48 4m+6sm+4st+34a 62 Zheng; et al. 2005 E. fasciatomaculosus 48 48a 48 Li e Peng, 1994 E. fasciatus 48 48a 48 Li e Peng, 1994 E. faveatus 48 2sm+46a 50 Magtoon e Donsakul, 2008 E. flavocaeruleus 48 48a 48 Tseng e Shih, 2018 E. fuscoguttatus 48 2sm+46a 50 Tseng e Shih, 2018 E. guaza 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. guttatus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 E. itajara 48 6sm+42a 54 Presente estudo E. lanceolatus 48 6m+2st+40a 56 Jiun e Mei, 2009 E. malabaricus 48 48a 48 Zou et al., 2005 E. marginatus 48 48a 48 Sola et al., 2000 E. merra 48 4m+6sm+4st+34a 62 Zheng et al., 2005 E. moara 48 4sm+44a 52 Minglan et al., 2006 E. ongus 48 48a 48 Rishi e Haobam, 1984 E. polyphekadion 48 6sm+42a 54 Tseng e Shih, 2018 E. sexfasciatus 48 2sm+ 46a 50 Chen et al., 1990 E. striatus 48 48a 48 Amorim et al., em preparação E. tauvina 48 8sm+40a 56 Amorim et al., em preparação E. tukula 48 2sm+46t 50 Tseng; e Shih, 2018 Mycteroperca acutirostris 48 48a 48 Aguilar, 1993 M. rubra 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 Paracentropristis hepatus 48 48a 48 Martinez et al., 1989 Paralabrax dewegeri 48 48a 48 Nirchio et al., 2014 P. nebulifer 48 48a 48 Martinez-brown et al., 2012 P. maculatofasciatus 48 48a 48 Martinez-brown et al., 2012 Plectropomus leopardus 48 48a 48 Pinthong et al., 2013 Rypticus saponaceus 48 48a 48 Amorim et al., em preparação R. randalli 48 48a 48 Paim et al., 2017 Serranus cabrilla 48 48a 48 Martinez et al., 1989 S. flaviventris 48 48a 48 Aguilar e Galetti, 1997 S. scriba 48 48a 48 Martinez et al., 1989 Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 48

Um conteúdo heterocromático reduzido e homogêneo tem sido apontado como possível fator restritivo à dinâmica evolutiva dos cromossomos em peixes (Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2012; Costa et al., 2013). Estruturalmente a distribuição e composição da heterocromatina representam marcadores citotaxonômicos eficientes que revelam processos evolutivos do cariótipo em muitas famílias de peixes (Galetti et al., 2000). Em Serranidae, regiões heterocromáticas podem ocupar posição intersticial nos cromossomos (Minglan et al., 2014), mas em geral estão localizadas em posição centromérica/pericentromérica (Aguilar e Galetti, 1997; Sola et al., 2000), condição reportada para outros grupos da série Eupercaria (Molina et al., 2002; Motta-Neto et al., 2011 a, b; Noikotr et al., 2014; Motta-Neto et al., 2019). Dentre os componentes das regiões heterocromáticas nos cromossomos de peixes, se destacam sequências microssatélites (Cioffi e Bertollo 2012; Lima-Filho et al., 2015), contudo, em algumas espécies, podem se apresentar dispersas nas regiões eucromáticas (Cioffi et al., 2011; Supiwong et al., 2014; Costa et al., 2015).

Nas espécies analisadas, as sequências microssatélites dinucleotídicas (CA)15 e

(GA)15 estavam dispersas ao longo dos cromossomos, entretanto, discretos sinais de acúmulo ocorrem acessoriamente em heterocromatinas pericentroméricas dos cromossomos, sugerindo heterogeneidade heterocromática e uma organização mais complexa do DNA repetitivo, como identificado em alguns grupos de Percomorpha (Costa et al., 2015). Os elementos transponíveis Tol2 e Rex3 apresentaram organizações distintas, com sequências Tol2 distribuídas uniformemente sobre os cromossomos, enquanto Rex3 apresenta acúmulo em algumas regiões heterocromáticas das espécies. A dispersão do elemento transponível Tol2 em regiões eucromáticas em espécies da família pode ter causas diversas como relação com a evolução do genoma, algum papel na regulação das atividades gênicas (Fernández-Medina et al., 2012; Terencio et al., 2015), decorrer da recente invasão de Tol2 no genoma das espécies, ou apresentar elevados níveis de divergência que impeçam sua detecção (Koga et al., 2000). Por outro lado, o acúmulo de microssatélites dinucleotídicos

(CA)15 e (GA)15 e do elemento retrotransponível Rex3 nas regiões heterocromáticas das espécies, condição já identificada em outros grupos de peixes (Oliveira et al., 2006; Gouveia et al., 2017; Li et al., 2017), sugere uma associação evolutiva destas Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 49

classes de DNA repetitivo, que poderia estar relacionada a mudanças estruturais nos cariótipos de algumas espécies da família. As garoupas divergiram de sua linhagem irmã a aproximadamente 60 M.a (Craig e Ma et al., 2018). A manutenção do valor diploide em Serranidae remonta à origem do grupo. No Atlântico, centro de dispersão da família, 87% das espécies já analisadas compartilham um cariótipo composto por 2n=48a (Figura 8). Posteriormente (~43 M.a) migrando do Atlântico Leste, a família Serranidae colonizou os Oceanos Índico e Pacífico através do mar de Tethys (Ma et al., 2016) onde é possível verificar um incremento no número de cromossomos bi-braquiais no cariótipo coincidentes com os eventos históricos de diversificação na família com 56% das espécies do Pacífico apresentando cariótipo composto por cromossomos exclusivamente acrocêntricos, seguido pela região do Indo-Pacífico (55%) e Índico (33%) (Figura 8). Até o início do Mioceno, por volta de 23 milhões de anos, a diversidade nos Oceanos Índico e Pacífico era baixa (Wilson e Rosen 1998; Renema et al., 2008). Quando os táxons que habitavam o mar de Tethys começaram a invadir o Indo- Pacífico, os processos tectônicos geraram disponibilidade de novos habitats recifais e produziram diversificação na região (Rohde e Muller, 2005; Carpenter et al., 2011). Este fato pode explicar o maior número e espécies de Serranidae no Indo-Pacífico. Cariótipos estruturalmente divergentes do padrão basal ocorrem em 40% das espécies de Serranidae (Tabela 3). Nestes casos a manutenção do 2n com o aumento do NF indica a ocorrência de inversões pericêntricas como o principal rearranjo envolvido na diferenciação do cariótipo desta família (Galetti et al., 2006). Evolutivamente, inversões pericêntricas podem ser responsáveis por características adaptativas favoráveis a novas condições ambientais (Molina e Galetti, 2004; Hoffmann e Rieseberg, 2008), sugerindo influência evolutiva durante os processos históricos de colonização e especiação da família Serranidae. Este rearranjo tem também ativa participação na modelagem dos cariótipos de outros representativos grupos de peixes marinhos da série Eupercaria (Takai e Ojima, 1987; Galetti et al., 2000; Molina e Galetti, 2004). De fato, eventos simpátricos e alopátricos definiram a diversidade contemporânea das garoupas (Craig et al., 2001) e o surgimento de várias linhagens de garoupas em um curto espaço de tempo, durante o início e meio do Mioceno, aparentemente está relacionado às mudanças ambientais, e não exclusivamente Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 50

com o fechamento do mar de Tethys e a elevação do Arquipélago Indo-Australiano, eventos estes que coincidem com episódios de diversificação no grupo (Ma et al., 2016; Ma e Craig, 2018). A diversificação cariotípica evidenciada nas espécies do Indo-Pacífico pode ter relação com adaptações a novas condições ambientais. Apesar de serem encontradas nas regiões do Indo-Pacífico e Pacífico, as espécies Cephalopholis formosa, Plectropomus leopardus e Paralabrax nebulifer são próximas filogeneticamente das espécies do Atlântico (Figura 8). Espécies do gênero Cephalopholis e Paralabrax podem ser encontradas no Atlântico e Pacífico (Pondella et al., 2003; Coelho et al., 2012). Sete espécies pertencem ao gênero Plectropomus, todas distribuídas no Indo-Pacífico (Frisch et al., 2016). No entanto, a origem deste gênero remota a aproximadamente 36M.a, tempo adjacente a diversificação das espécies do ancestral da garoupa no nesta região (Ma et al., 2016), o que poderia explicar essa proximidade destes três gêneros com as espécies do Atlântico.

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 51

Figura 8. Aspectos cariotípicos de espécies da família Serranidae, sob contexto filogenético (baseado em Ma et al., 2016) e biogeográfico. Círculos pretos indicam presença de sítios Ag-RONs simples, presentes ou não no par 24, enquanto círculos preto/cinza indicam sítios Ag-RONs múltiplos, incluindo o par 24. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 52

Figura 9. Variação na frequência do número de braços cromossômicos (NF) em cariótipos de clados da família Serranidae, sob perspectiva filogenética e temporal (adaptado de Ma et al., 2016).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 53

No geral, os dados citogenéticos disponíveis para garoupas (52 spp; Tabela 3), revelam que aproximadamente 60% das espécies conservam o padrão cariotípico considerado basal para a família (2n=48 cromossomos acrocêntricos). Alguns gêneros de Serranidae, como Alphestes, Mycteroperca, Paralabrax, Paracentropristis, Plectropomus, Rypticus e Serranus apresentam apenas espécies com cariótipos exclusivamente formados por 2n=48a (Tabela 3; Figura 9). Entretanto, Cephalopholis e Diplectrum apresentam, respectivamente, 50% e 33% de espécies com NF=48 (Tabela 3). Na filogenia da Figura 17 é possível observar o gênero Epinephelus, que apresenta 54% de espécies com NF=48, presente em diferentes clados. O ramo com espécies dos gêneros Mycteroperca e Epinephelus originou-se no Indo-Pacífico Ocidental (~16M.a), enquanto o ramo com Cromileptes e Epinephelus teve origem no Indo-Pacífico Ocidental (~15 Ma) e as demais diversificações em Epinephelus (~15 Ma) variaram com pelo menos quatro centros regionais de diversificação diferentes: Pacífico Central com posterior radiação para o Indo-Pacífico Central e Indo-Pacífico Ocidental; Atlântico Oeste (e provável dispersão no Pacífico); Indo- Pacífico Central e Pacífico Leste com diversificações posteriores no Indo-Pacífico Ocidental (Ma et al., 2016). Outra característica que pode ser observada na figura 9 á a presença de sítios múltiplos de DNAr 18S no ramo com espécies dos gêneros Cromileptes e Epinephelus. Em E. bruneus estes sítios foram identificados em três pares de cromossomos enquanto em E. moara os sítios estavam localizados em dois pares (Minglan et al., 2014). Considerando-se que as demais espécies apresentam DNAr 18S e 5S em cromossomos distintos, condição mais comum em teleósteos (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996; Gornung, 2013), a ocorrência de sítios múltiplos nestas duas espécies pode sugerir uma autapomorfia para o grupo. Embora alguns destes grupos ainda disponham de informações citogenéticas limitadas, os resultados demonstram um conservadorismo cariotípico sobre a extensão filogenética e taxas diferenciais de mudanças cromossômicas entre os clados desta família. Adicionalmente às similaridades estruturais dos cariótipos, em largo espectro dos clados de Serranidae, persiste também um destacado conservadorismo em relação à organização de determinadas regiões repetitivas, como à frequência e distribuição das RONs, microssatélites e elementos de transposição. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 54

Diante destes achados, diversificações cariotípicas em alguns grupos ou espécies de Serranidae se mostram potencialmente atrelados a eventos de expansão e especiação no grupo, com lentas mudanças citogenômicas na família Serranidae, refletindo um cenário de estase cariotípica pontuado por episódios disruptivos dos seus padrões cromossômicos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pela assistência financeira (Processo nº 442664/2015-0), a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida a KDJA, ao Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis pela licença de coleta dos exemplares (Processo No. 19135-8) e a UFRN (Universidade Federal do Rio Grande do Norte), por fornecer os meios para a realização do estudo.

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4.2 CAPÍTULO 2

Padrões citogenômicos em espécies dos gêneros Cephalopholis e Rypticus (Serranidae: Perciformes)

RESUMO Serranidae (Perciformes) representa um grupo diverso, com extensa distribuição tropical e subtropical, composto por 75 gêneros. Seus padrões cromossômicos se mostram em geral conservados, com predominância de cariótipos com 48 cromossomos acrocêntricos. Contudo, a maioria das informações citogenéticas para a família está concentrada em espécies do gênero Epinephelus, enquanto em vários outros essas informações são ausentes ou incipientes. Com vistas a ampliar o espectro filogenético dos dados cromossômicos da família, para uma mais acurada representação da sua evolução cariotípica, foram realizadas análises citogenômicas em espécies dos gêneros Cephalopholis e Rypticus, ainda pouco representados. As espécies C. formosa (Índico), C. fulva e R. saponaceus (Atlântico) tiveram seus padrões cariotípicos investigados através de análises citogenéticas convencionais e mapeamento de sequências repetitivas [DNAr 18S, DNAr 5S, elementos transponíveis Tol2 e Rex3 e sequências microssatélites (CA)15 e (GA)15], por meio de hibridização in situ fluorescente. Todas as espécies apresentaram 2n=48 cromossomos, das quais C. fulva e R. saponaceus apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos (NF=48), e C. formosa 2n= 4sm+44a (NF=52). Os blocos heterocromáticos eram reduzidos e distribuídos nas regiões centroméricas. Os sítios Ag-RONs foram simples e concordantes com marcações do DNAr 18S. Sítios DNAr 18S e 5S foram localizados em diferentes cromossomos nas espécies analisadas. Os elementos Tol2 e Rex3 e microssatélites se mostraram dispersos ao longo dos cromossomos em C. formosa, enquanto em C. fulva e R. saponaceus exibem pequenos acúmulos em regiões heterocromáticas de alguns cromossomos. A ampliação dos dados citogenéticos para outros gêneros de Serranidae, incluindo o grupo basal Rypticus, apoia a ocorrência de conservadorismo citogenômico neste grupo.

Palavras-chave: Citogenética de peixes, garoupas, sequências repetitivas, estabilidade cariotípica.

INTRODUÇÃO

O ambiente recifal abriga diversos organismos, destacando-se por sua alta riqueza taxonômica e variedade de relações ecológicas, diversidade também encontrada na ictiofauna que habita estes ambientes (Bezerra e Silva, 2011). Entre os grupos de peixes que habitam esta região, estão as espécies da família Serranidae, grupo de peixes recifais diversificado, com destacada importância comercial (Heemstra et al., 2002; Rimmer e Glamuzina, 2017). Pertencente a Série Eupercaria, Ordem Perciformes, (Betancur et al., 2017) a família é composta por 75 Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 63

gêneros, alguns com representatividade no Atlântico e Pacífico, como Cephalopholis e Rypticus Nelson et al., 2016). O gênero Cephalopholis compreende 24 espécies distribuídas no Atlântico, Pacífico e na região do Indo-Pacífico encontradas em ambientes com fundos rochosos e coralinos, em profundidades que variam entre 1-40 m e difere de outros gêneros por possuir 9 espinhos de barbatana dorsal e barbatana caudal convexos a arredondados (Heemstra e Randall 1993; Bezerra e Silva, 2011; Nelson et al. 2016; Vella et al., 2016). As 10 espécies do gênero Rypticus são conhecidas como peixe-sabão devido a natureza escorregadia quando são capturadas, fenômeno causado pela grande quantidade de muco produzida pelo peixe em situação de estresse e com propriedades tóxicas de defesa (Maretzki e Castillo, 1967; Guimarães, 1996; Heemstra et al., 2002; Nelson et al., 2016). A coloração críptica de suas espécies, que estão distribuídas no Atlântico e Pacífico, tem sido responsável por constantes revisões taxonômicas no grupo (Guimarães, 1996; Baldwin e Weigt, 2012). As relações filogenéticas da família vêm sendo crescentemente esclarecidas (Minglan et al., 2014; Ma et al., 2016; Betancur et al., 2017; Ma e Craig, 2018; Tseng e Shih 2018). Contudo, as informações citogenéticas ainda são escassas, principalmente restritas às análises básicas do cariótipo (Pinthong et al., 2013), e centradas em grande parte em espécies do gênero Epinephelus (28 espécies) (Arai, 2011). De fato, outros gêneros representativos e importantes para ampliar as análises sobre a evolução cariotípica na família, como Cephalopholis e Rypticus têm informações cariotípicas reduzidas a uma única espécie (Pinthong et al., 2013; Paim et al., 2017). Em geral, Serranidae apresenta um cariótipo composto por 2n=48, com predominância de cromossomos acrocêntricos (Arai, 2011; Tseng e Shih 2018), contudo, dados citogenéticos de outros gêneros são necessários para estabelecer a aparente estabilidade da família (Motta-Neto et al., 2019). Em grupos com cariótipos conservados, análises da composição e organização de sequências de DNA repetitivo é aplicável para estimar seus padrões carioevolutivos (Vicari et al., 2010; Motta-Neto et al., 2011a, b), Neste sentido, padrões de distribuição do DNA ribossômico 18S e 5S e outras sequências repetitivas podem auxiliar na interpretação de reorganizações cromossômicas e Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 64

relações entre as espécies (Galetti et al., 2006; Ferreira et al., 2011; Artoni et al., 2015). Assim, aqui são ampliadas os dados citogenéticos para a família Serranidae, através de análises citogenômicas nas espécies Cephalopholis formosa, C. fulva e Rypticus saponaceus, com metodologias citogenéticas clássicas e mapeamento de sequências DNAr 18S, DNAr 5S, elementos de transposição Tol2 e Rex3 e sequências microssatélites (CA)15 e (GA)15.

MATERIAL E MÉTODOS

Exemplares de Cephalopholis formosa (n=4) foram obtidos na costa da Tailândia, no Mar de Andaman (11°04’00”N e 95°44’34”E). Exemplares das espécies C. fulva (n=5) e Rypticus saponaceus (n=4) foram coletadas na Ilha de Trindade, Atlântico Sul (20°30'38,84"S, 29°19'22,97"O).

Figura 10. Mapa dos locais de coleta das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e Rypticus saponaceus.

Os exemplares das espécies C. fulva e R. saponaceus foram submetidos à estimulação mitótica intraperitoneal com complexos antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010), enquanto Cephalopholis formosa foi diretamente utilizado nas preparações cromossômicas. Os cromossomos mitóticos das espécies C. fulva e Rypticus saponaceus foram preparados a partir de suspensão celular da porção anterior do rim, utilizando a técnica in vitro preconizada por Gold et al. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 65

(1990). A espécie Cephalopholis formosa foi preparada a partir de suspensão celular da porção anterior do rim segundo a técnica in vivo proposta por Bertollo et al. (1978). Para determinação do número diploide e aspectos gerais do cariótipo, os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5% diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C (Sumner, 1972) e as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) de acordo com a técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell e Black, 1980).

Obtenção das sondas para hibridização cromossômica

As sondas DNAr 5S (~200 pb) e 18S (~1400 pb) foram amplificadas por PCR, a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando respectivamente os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994) e NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’(White et al., 1990), respectivamente. As sondas de DNAr 5S e DNAr 18S foram marcadas respectivamente com biotina-14-dATP e digoxigenina-dUTP-11, por nick translation de acordo com as especificações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). Sondas de sequências Tol2 (200pb) foram amplificadas por PCR, a partir do DNA nuclear de E. itajara, utilizando o primer Tol2-5F 5′ -CTG TCA CTC TGA TGA AAC AG-3′ e Tol2-5R 5′ -CTT TGA CCT TAG GTT TGG GC-3′ (Kawakami; Shima, 1999) e marcadas com digoxigenina-11-dUTP, através de nick translation, seguindo as recomendações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha). As sondas do elemento retrotransponível Rex3 (~200 pb) foram obtidas por PCR a partir DNA genômico de E. itajara, utilizando os primers Rex3-F5-YAA TGA CGG AGG GCC CGG CA-3′ e Rex3-5′-TGG GTG GTG GGG CAG GT ACN-3′ (Volff et al., 1999; 2000), utilizando o protocolo de Valente et al. (2011) e marcadas, através de nick translation, com digoxigenina-11-dUTP (Roche®, Mannheim, Alemanha). A hibridização in situ utilizando microssatélites foi realizada de acordo com Kubat et al. (2008), utilizando os oligonucleotídeos (CA)15 e (GA)15, marcados durante a síntese com AlexaFluor 555, na posição terminal 5’ (InvitrogenTM).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 66

Hibridização cromossômica

Os experimentos de FISH foram realizados seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20µg/ml em 2X SSC) por 1 hora à 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C, por 10 minutos, fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2X SSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2X SSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2X SSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1X SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4X SSC por 5 minutos à temperatura ambiente e posteriormente incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% NFDM/4X SSC, seguidamente lavadas em Tween 20 0,5%/4X SSC por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Roche®, Mannheim, Alemanha).

Processamento das imagens

As melhores metáfases foram fotografadas em microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73, utilizando o software cellSens® (OlympusTM). Os cromossomos foram definidos em relação à posição do centrômero em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964).

RESULTADOS

A espécie C. formosa apresentou um cariótipo com 48 cromossomos, composto por 4sm+44a (NF=52), enquanto C. fulva e R. saponaceus apresentaram Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 67

48 cromossomos acrocêntricos (NF=48) (Figura 11). Blocos heterocromáticos reduzidos estavam distribuídos nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos das espécies. O mapeamento de sequências DNAr 18S e DNAr 5S identificou sítios simples em todas as espécies. Os sítios DNAr 18S e Ag-RONs foram coincidentes e localizados nos braços curtos do menor par de cromossomos (par 24) em C. fulva, primeiro par submetacêntrico (par 1) em C. formosa e em um par cromossômico de tamanho médio (par 20) em R. saponaceus (Figura 11, em destaque). As sequências de DNAr 5S em C. fulva e em C. formosa estavam localizadas no braço curto do par 23, em posição pericentromérica (Figura 8, em destaque) e na região terminal do braço curto do par 14, em R. saponaceus (Figura 11, em destaque).

Figura 11. Cariótipos das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e Rypticus saponaceus sob coloração com Giemsa, técnica Ag-RONs (Caixas), bandamento C e FISH, utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Barra=5μm.

Os microssatélites (CA)15, (GA)15 apresentaram organização dispersa ao longo dos cromossomos de C. formosa (Figura 12), enquanto em C. fulva e R. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 68

saponaceus esse padrão era permeado com a presença de clusters/sítios nas regiões pericentroméricas na maioria dos cromossomos. O mapeamento dos elementos Tol2 e Rex3 revelou distribuição uniformemente dispersa nos cromossomos de todas as espécies (Figura 12).

Figura 12. Hibridização in situ com sondas microssatélites (CA)15 e (GA)15 e elementos Tol2 e Rex3 em cromossomos mitóticos das espécies Cephalopholis fulva, C. formosa e R. saponaceus. Barra = 5 μm.

DISCUSSÃO

As espécies C. fulva, C. formosa e R. saponaceus compartilham um mesmo valor diploide (2n=48). Esta é uma condição recorrente na família, que mostra um completo conservadorismo quanto ao valor diploide (Arai, 2011; Minglan et al., 2014; Tseng e Shih, 2018; Motta-Neto et al., 2019). A estrutura do cariótipo da família, em geral é formada por 2n = 48 cromossomos acrocêntricos, presente em espécies de diferentes gêneros (Arai, 2011). Este padrão é mantido, mesmo entre grupos com variados períodos de divergência, como Serranus (~35 M.a) e Alfestes (~3 M.a) (Ma Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 69

et al., 2016). Entretanto, apesar do conservadorismo cromossômico, uma parcela das espécies da família exibe variação estrutural nos cariótipos (Motta-Neto et al., 2019). Os dois gêneros aqui analisados Cephalopholis e Rypticus, possuem origens distantes que remontam a ~25 M.a e 19 M.a (Ma et al., 2016). Cephalopholis apresentou uma maior diversificação cariotípica, com ocorrência de um padrão cariotípico conservado em C. fulva (2n=48a; NF=48), contrastando com uma maior diversificação cromossômica em C. formosa (2n=48; 4sm+44a; NF=52), enquanto que os dados citogenéticos para Rypticus saponaceus e R. randalli (Paim et al., 2017), indicam ausência de variação cromossômica numérica e estrutural em relação ao padrão cariotípico basal (2n=48a) da família (Arai, 2011; Minglan et al., 2014; Tseng e Shih, 2018). A presença de dois pares de cromossomos bi-braquiais em C. formosa indica a ocorrência de inversões pericêntricas como mecanismo de diversificação cariotípica. Estes rearranjos constituem as modificações detectáveis mais comuns em Eupercaria (Galetti et al., 2000; Galetti et al., 2006; Wang et al., 2010; Motta- Neto et al., 2019) e se apresentam como mecanismos disruptivos na estabilidade cariotípica da família (Capítulo 3). Discretos blocos de heterocromatina, geralmente centroméricas, presentes nas espécies de Cephalopholis e Rypticus, constitui uma condição presente em espécies de outros gêneros de Serranidae (Martinez et al., 1989; Sola et al., 2000; Molina et al., 2002; Wang et al., 2010, 2012; Minglan et al., 2014). Recorrentemente, largos conteúdos e diversidade de sequências repetitivas estão associados a variações cariotípicas observadas em diversos grupos de peixes Neotropicais (e.g. Cioffi e Bertollo, 2012). Assim como Serranidae, os ciclídeos neotropicais também apresentam diversidade de adaptações morfológicas sem grandes variações no número diploide (Feldberg et al., 2003). No entanto, as espécies dessa família exibem um genoma dinâmico com variações na estrutura, composição da heterocromatina e organização do cariótipo, demonstrado pelo mapeamento físico dos cromossomos de várias sequências repetitivas de DNA e podem reforçar a relação entre a heterogeneidade da heterocromatina e mudanças nos cariótipos (Poletto et al., 2010; Valente et al., 2011; Schneider et al., 2015). Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 70

O padrão conservativo da distribuição e composição da heterocromatina em Serranidae é em geral acompanhado por regiões Ag-RONs únicas localizadas em posição pericentromérica no menor par cromossômico (Rodríguez-Daga et al., 1993; Wang et al., 2012; Minglan et al., 2014; Pinthong et al., 2015; Tseng e Shih, 2018). No entanto, embora sítios Ag-RONs ocorram no par 24 de C. fulva, em C. formosa estes sítios se situem no par 1 (sm), e em R. saponaceus, se localizem no par 20, se mostrando eficientes marcadores citotaxonômicos em grupos de peixes com cariótipos que não apresentam variações no valor diploide e/ ou número fundamental (Costa et al., 2016). Nas espécies analisadas, os sítios Ag-RONs foram correspondentes aos sítios DNAr 18S e sua dinâmica fornece indicações adicionais sobre a evolução cromossômica de grupos com conservadorismo cariotípico, como a família Serranidae. O mapeamento do DNAr 5S indicou ausência de sintenia com o DNAr 18S, condição comum a maioria dos teleósteos (Sola et al., 2000; Wang et al., 2010) e prevalente em Serranidae (Minglan et al., 2014; Capítulo 3; presentes dados). Entretanto, apesar de raros o arranjo sintênico destes genes tem sido descritos em Epinephelus tauvina e E. striatus (Capítulo 1). DNAs repetitivos são componentes significativos do genoma de vários grupos de peixes e, em virtude de apresentar taxas aceleradas de mudança, estão associados à dinâmica evolutiva dos cromossomos (Molina, 2007; Cioffi e Bertollo, 2012; Costa et al., 2013; Cioffi et al., 2015; Terencio et al., 2015; Yuan et al., 2018). Essas sequências tendem a se acumular em regiões de baixa recombinação, como centrômeros e telômeros (Schneider et al., 2015) e cromossomos sexuais (Cioffi e Bertollo, 2012). Entre as diferentes classes de DNA repetitivos nos genomas eucariotos, os microssatélites podem apresentar grandes variações no conteúdo genômico (Milani e Cabral, 2014). Essas sequências constituem curtas repetições de DNA (~6pb), organizadas in tandem, geralmente encontrados em regiões heterocromáticas, e menos frequentemente também em regiões eucromáticas (Xu et al., 2013). Fora das regiões heterocromáticas podem desempenhar papel estrutural na organização da cromatina, bem como na replicação do DNA e expressão gênica (Fernández et al., 2012; Terencio et al., 2015; Bagshaw, 2017), como tem sido sugerido em modelos de vários grupos de organismos, como plantas, répteis e insetos (Chang et al., 2008; Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 71

Kubat et al., 2008; Teixeira et al., 2009; Cuadrado e Jouve, 2010; Pokorná et al., 2011; Valente et al., 2011; Kejnovský et al., 2013; Milani e Cabral, 2014).

Nas espécies analisadas, os microssatélites (CA)15 e (GA)15 exibiram padrões contrastantes nos cromossomos. Em C. fulva e R. saponaceus, esses microssatélites apresentam uma distribuição homogênea na maioria dos cromossomos, enquanto em outros estão acumulados nas regiões pericentroméricas de alguns pares cromossômicos. Em C. formosa essas sequências exibem uma distribuição inteiramente dispersa sobre regiões eu-heterocromáticas nos cromossomos. Em todas as espécies, os elementos Tol2 e Rex3 estavam homogeneamente distribuídos ao longo dos cromossomos, sem acúmulo em regiões específicas. As espécies C. fulva e R. saponaceus coletadas na Ilha de Trindade possuem mais semelhanças citogenômicas (cariótipos, padrões de microssatélites, Tol2 e Rex3) entre si do que qualquer uma delas com relação C. formosa, do Indo-Pacífico. Esse conservadorismo na macroestrutura dos cariótipos das garoupas pode estar associado a características comportamentais e biológicas, como hermafroditismo e agregações reprodutivas, restringindo alterações cromossômicas em consequência da manutenção do fluxo gênico (Molina et al., 2002; Molina, 2007; Molina et al., 2014). De fato, o elevado potencial dispersivo, grandes populações e especiação impulsionada principalmente por características ecológicas, podem contribuir para a estase cariotípica de alguns grupos, promovendo elevado número de espécies com cariótipos semelhantes (Rocha e Molina, 2008; Motta-Neto et al., 2019). Além disso, as características intrínsecas do genoma, como baixo e homogêneo conteúdo de DNA repetitivos (Molina, 2007; Costa et al., 2013), poderiam favorecer uma carioevolução conservada nessa família de peixes marinhos (Molina et al., 2002). A dispersão de microssatélites e os elementos transponíveis Tol2 e Rex3, a exemplo do que tem sido reportado em outros grupos de peixes (Pucci et al., 2016), pode representar uma organização dinâmica e coevolutiva, que contribui para a disseminação de microssatélites pelo cariótipo (Wilder e Hollocher, 2001; Li et al., 2002; Ellegren, 2004; Fischer et al., 2004; Costa et al., 2015). Informações adicionais sobre a distribuição de microssatélites e elementos transponíveis em cromossomos de garoupas (Amorim et al., em preparação), são similares as de C. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 72

formosa com distribuição destas sequências homogeneamente dispersas ao longo dos cromossomos. Os resultados obtidos ampliaram o espectro filogenético das informações citogenômicas para a família Serranidae e sugerem a ocorrência, no gênero Cephalopholis, de uma evolução cariotípica mais dinâmica relacionada à diversificação estrutural e quanto a organização de sequências microssatélites entre suas espécies.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pela assistência financeira (Processo nº 442664/2015-0), a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida a KDJA, ao Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis pela licença de coleta dos exemplares (Processo No. 19135-8) e a UFRN (Universidade Federal do Rio Grande do Norte), por fornecer os meios para a realização do estudo.

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Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 79

4 CAPÍTULO 3

Homogeneidade citogenômica e hibridização interespecífica em Serranidae (Perciformes)

Resumo

As garoupas (Serranidae) constituem um dos grupos de peixe com significativo valor econômico e crescente incremento da produção em cativeiro. Algumas de suas características biológicas como maturação sexual tardia e tamanho corporal podem ser restritivos à criação destas espécies, motivando cruzamentos interespecíficos cujos híbridos exibem características favoráveis quanto ao crescimento, resistência a doenças, adaptabilidade e sobrevivência. Os cerca de vinte híbridos reportados para a família exibem diferentes graus de bloqueios pós-zigóticos, desde a completa viabilidade e fertilidade, até a inviabilidade. Apesar do interesse econômico no processo de hibridização, o papel da divergência cromossômica, sobretudo baseado em análises mais resolutivas, tem sido negligenciado. Visando estimar o nível de divergência citogenética em espécies do gênero Epinephelus, cujo cultivo se encontra em expansão, foram realizadas análises citogenômicas nas espécies E. striatus (Caribe), E. coioides e E. tauvina (Indo-Pacífico). As análises citogenéticas utilizaram técnicas convencionais e mapeamento por hibridização fluorescente in situ

(FISH) de 6 classes de DNA repetitivos [DNAr 18S, DNAr 5S, microssatélites (CA)15, (GA)15, (CAA)10, (CGG)10. Adicionalmente, foram associados os níveis de bloqueios pós-zigóticos e sua relação com a divergência evolutiva das espécies parentais em híbridos. Todas as espécies possuem 2n=48 cromossomos, das quais Epinephelus coioides e E. striatus possuem um cariótipo composto apenas por elementos acrocêntricos (NF=48), enquanto E. tauvina apresenta um padrão mais diversificado formado por 8sm+40a (NF=56). Nestas espécies os blocos de heterocromatina são centroméricos e reduzidos, e os sítios Ag-RONs são simples. Sítios DNAr 18S e 5S apresentaram-se colocalizados em E. tauvina e E. striatus e não sintênicos em E. coioides. Repetições (CA)15, (GA)15, (CAA)10, e (CGG)10 mostraram-se dispersos ao longo dos cromossomos. A macroestrutura cariotípica formada, em grande parte, por elementos acrocêntricos e padrões similares de organização de sequências repetitivas reforçam a estabilidade cariotípica em Serranidae. Características adaptativas de híbridos de espécies com diferentes níveis de divergência evolutiva (43 a 3,5 M.a) indicam que as variações cromossômicas em escalas de tempo menores proporcionam bloqueios pós-zigóticos reduzidos. Os padrões citogenômicos obtidos fornecem informações relevantes sobre a organização dos cromossomos e podem nortear futuros experimentos de hibridização, estimativas da adaptabilidade híbrida e suas potencialidades na piscicultura marinha.

Palavras-chave: Estase cariotípica; garoupas; DNA repetitivo; híbridos; divergência genética.

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 80

INTRODUÇÃO

A hibridização interespecífica promove a combinação de genomas distintos, podendo resultar em híbridos com características adaptativas diferentes em relação às espécies parentais (Abbott et al., 2013; Shivaramu et al., 2019). Em peixes este processo ocorre com relativa frequência sob condições naturais (Allendorf e Waples, 1996; Rahman et al., 2013), motivados pela fertilização externa, fracos mecanismos de isolamento comportamental, abundância desigual entre as espécies parentais, perda de habitats, sobreposição de áreas de reprodução, baixa frequência de cromossomos sexuais (Campton, 1987; Molina et al., 2014b; Nagel et al., 2018), ou lenta aquisição de bloqueios pós-zigóticos (10 a 20 M.a.), que só se estabelecem muito depois da aquisição das barreiras pré-zigótica (Russell, 2003; Bolnick e Near, 2005; Stelkens et al., 2010). A combinação de caracteres desejáveis em híbridos em muitos casos apresenta considerável valor comercial, como o aumento da taxa de crescimento, da tolerância ambiental, resistência às condições de cultivo e produção de estoques monossexo (Rahman et al., 2013; Rimmer e Glamuzina, 2017; Shivaramu et al., 2019). De fato, características vantajosas em híbridos, sob condições de cultivo, têm sido identificadas em diversos grupos de peixes, como bagres (Dunham e Smitherman, 1983), trutas (Dorson et al., 1991; Dunham, 1995), percas (Smith, 1988; Hooe et al., 1994), carpas ( Reddy, 1999; Kalsoom et al., 2009), esturjões (Boscari et al., 2014), ciclídeos (Wohlfarth, 1994) e garoupas (James et al., 1999; Huang et al., 2016). Nos híbridos de garoupas a taxa de crescimento pode ser 50% superior a dos parentais (Dunham e Smitherman, 1983; Sugama et al., 2014). Alguns peixes híbridos podem apresentar gônadas completamente normais e férteis, formada por células germinativas em diferentes estágios de maturação (Moron et al., 2018), enquanto em outros, as gônadas são normais em tamanho e estrutura, mas produzem gametas morfologicamente e/ou cariotipicamente anormais, ou gametas fertilizáveis, porém inviáveis (Hooe et al., 1994). A inviabilidade em híbridos, pode advir em grande parte de pareamento cromossômico aberrantes durante a meiose, condição que pode ser suplantada pela compatibilidade numérica e sintênica dos cromossomos em híbridos homoploides (Molina et al., 2013; Yoshikawa et al., 2018). Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 81

As garoupas (Serranidae) constituem um dos grupos de peixes marinhos de elevado valor econômico devido à qualidade da sua carne (Mitcheson et al., 2013). Capturas e cultivo, este último envolvendo quase 50 espécies (Rimmer e Glamuzina, 2017), têm promovido um aumento exponencial da produção (FAO, 2019). Organismos diversos, tanto vegetais, como animais exibem hermafroditismo sequencial, estratégia reprodutiva onde os indivíduos começam a vida com um sexo, mudando algum tempo depois para outro (Warner, 1975; Munday et al., 2006; Vega- Frutis et al., 2014). Contudo, os peixes são os únicos vertebrados com hermafroditismo sequencial onde a mudança de sexo ocorre eventualmente durante o ciclo reprodutivo (Todd et al., 2016). Entre os teleósteos, 27 famílias apresentam um ou mais padrões de hermafroditismo sequencial, a protoginia (fêmea para macho), protandria (macho para fêmea) e mudança de sexo bidirecional (Mitcheson e Liu, 2008; Avise e Mank, 2009). Dentre essas famílias, as garoupas exibem os três padrões, embora a maioria das espécies tenha a estratégia reprodutiva associada à protoginia (Mitcheson e Liu, 2008). Esta condição favorece o cultivo e a formação de planteis nestes animais. Entre os gargalos do cultivo se destaca o lento desenvolvimento ontogenético, que tem estimulado a produção comercial de híbridos (Mitcheson et al., 2013; Chu et al., 2016). Desta forma, além de híbridos naturais (2), cerca de 20 híbridos artificiais têm sido produzidos (Tabela 1), alguns deles já utilizados regularmente em cultivos (Tucker, 1994; Randall e Justine, 2008; Rimmer e Glamuzina, 2017). Padrões genéticos associados às espécies parentais, incluindo aspectos citogenômicos, são valiosos para nortear experimentos de hibridização interespecífica (Rahman et al., 2013; Tseng e Shih, 2018). Apesar da significativa importância econômica dos serranídeos, informações citogenéticas para a família são reduzidas, principalmente restritas ao número de cromossomos e fórmula cariotípica, com poucas informações sobre a organização microestrutural dos cromossomos (Arai, 2011; Tang, 2011). Visando uma análise acurada dos padrões citogenéticos de espécies cultiváveis de Serranidae e possíveis extensões biotecnológicas para a produção de híbridos, foram realizados análises convencionais e mapeamento citogenômico através da hibridização in situ fluorescente de 9 classes de DNA repetitivos [DNAr 18S e 5S, microssatélites

(CA)15, (GA)15, (CAA)10 e (CGG)10 nas espécies Epinephelus coioides, E. striatus e E. tauvina, amplamente empregadas em cultivos comerciais. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 82

MATERIAL E MÉTODOS

Exemplares das espécies E. coioides, E. tauvina e E. striatus foram utilizados nas análises citogenômicas. Indivíduos de E. coioides e E. tauvina (n=5) foram coletados, respectivamente, no Mar de Andaman (11°04’00”N e 95°44’34”E) e E. striatus (n=10) obtidos de cultivo experimental, a partir de matrizes coletadas na costa da Flórida – EUA (25°09'40,07"N, 80°45'83,07"O). Os exemplares de E. striatus foram submetidos à estimulação mitótica com complexos de antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010), enquanto os de E. coioides, E. tauvina foram diretamente utilizados nas preparações cromossômicas. Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de suspensão celular da porção anterior do rim, utilizando a técnica in vitro (Gold et al., 1990), para os exemplares de E. striatus, e a preparação direta in vivo (Bertollo et al., 1978) para E. coioides, E. tauvina.

Figura 13. Mapa das áreas de distribuição (cores claras) e de cultivo comercial das espécies (cores sólidas) Epinephelus striatus (em verde) e (a) Epinephelus coioides e (b) Epinephelus tauvina (vermelho).

Para determinação do número diploide e aspectos gerais do cariótipo, os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5% diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 83

bandamento C (Sumner, 1972) e as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) de acordo com a técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell e Black, 1980).

Obtenção das sondas para hibridização cromossômica

As sondas DNAr 5S (~200 pb) e 18S (~1400 pb) foram obtidas por PCR a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando respectivamente os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994) e NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’ (White et al., 1990), respectivamente. As sondas de DNAr 5S e DNAr 18S foram marcadas respectivamente com biotina-14-dATP e digoxigenina-dUTP-11, por nick translation de acordo com as especificações do fabricante (Roche®, Mannheim, Alemanha).

Hibridização cromossômica

Os experimentos de FISH foram realizados seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20µg/ml em 2X SSC) por 1 hora à 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C, por 10 minutos, fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2X SSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em uma série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2X SSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2X SSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1X SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4X SSC por 5 minutos à temperatura ambiente e posteriormente incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% NFDM/4X SSC, seguidamente lavadas em Tween 20 0,5%/4X SSC por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Roche®, Mannheim, Alemanha) para a sonda DNAr Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 84

5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Roche®, Mannheim, Alemanha).

Processamento das imagens

As melhores metáfases foram fotografadas em microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73, utilizando o software cellSens® (OlympusTM). Os cromossomos foram definidos em relação à posição do centrômero em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964).

Análises de sequências de DNAmt 16S

Sequências parciais do gene mitocondrial 16S de 21 espécies da família Serranidae, utilizadas em cruzamentos interespecíficos, foram obtidas no GenBank (Tabela SS1, Anexo) e alinhadas usando MUSCLE (Edgar, 2004), implementado pelo software MEGA 6 (Tamura et al., 2013). As taxas médias de divergência genética (modelo Kimura-2p) foram obtidas através do software MEGA 6 (Tamura et al., 2013). A estimativa de divergência temporal das sequências considerou 0,42% de divergência genética por M.a, a partir de dados de Domingues et al. (2005).

RESULTADOS

As espécies de Epinephelus apresentam 2n=48 cromossomos, com algumas variações na fórmula cariotípica. Epinephelus striatus e E. coioides apresentam um cariótipo composto por cromossomos acrocêntricos (NF=48a), com pequena diferença de tamanho entre os pares, enquanto que E. tauvina é formado por 8sm+40a (NF=56) (Figura 14). Blocos heterocromáticos reduzidos estão distribuídos principalmente nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos das espécies. Em E. striatus e E. coioides os sítios Ag-RONs ocupam o braço curto do par 24, enquanto que em E. tauvina estes sítios estão localizados no braço curto de um par cromossômico maior, identificado como o par 20 (Figura 7, em destaque).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 85

Figura 14. Cariótipos das espécies E. striatus, E. coioides e E. tauvina sob coloração Giemsa, bandamento-C e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas DNAr 18S e 5S. Em destaque os pares organizadores nucleolares e pares portadores de sítios DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). O par de cromossomos 24, de E. striatus, e 20, de E. tauvina, apresentaram arranjos 18S/5S DNAr colocalizados. Barra=5μm.

O mapeamento de sequências DNAr 18S e 5S identificou sítios simples em todas as espécies. Em E. coioides os sítios DNAr 18S estão localizados no braço curto do par 24, enquanto os sítios DNAr 5S, ocupam o braço curto do par 23 (Figura 14, em destaque). Em E. striatus e E. tauvina os sítios DNAr 18S e DNAr 5S se mostram colocalizados, respectivamente, no braço curto dos pares 24 e 20, enquanto o mapeamento dos microssatélites (CA)15, (GA)15, (CAA)10 e (CGG)10 mostrou sinais de hibridização uniformemente dispersos ao longo dos cromossomos das espécies (Figura 15).

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 86

Figura 15. Hibridização in situ fluorescente com sondas microssatélites di- e trinucleotídeos em metáfases mitóticas das espécies E. tauvina, E. striatus e E. coioides. Barra=5 μm.

As divergência genética e estimativas de divergências temporal interespecíficas com base no gene 16S revelaram uma relação direta com níveis crescentes de bloqueios pós-zigóticos onde verificou-se que quanto maior a divergência, maior a inviabilidade híbrida.

Divergência citogenômica e efeitos funcionais em híbridos interespecíficos de Serranidae

Híbridos obtidos em Serranidae resultam de cruzamentos de espécies homoploides, com cariótipos similares ou apresentando variações estruturais nos cromossomos (Tabela 4). Com base nas sequências parciais do gene 16S, a divergência desses conjuntos parentais variaram de 1,4% entre Cephalopholis aurantia x C. spiloparaea, à 18% entre Epinephelus morio x Centropistes striata. As espécies parentais de híbridos com considerável produção comercial, como E. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 87

fuscoguttatus x E. lanceolatus e E. fuscoguttatus x E. polyphekadion apresentam distância genética de 4,8%, indicando um tempo de divergência de ~11 M.a (Tabela 4). Em geral, a maioria dos cruzamentos interespecíficos tem produzido híbridos com menor tempo de incubação e maior crescimento em relação às espécies parentais (Tabela 4). Híbridos férteis descritos nos cruzamentos entre E. coioides x E. lanceolatus (5,4% de divergência genética) e E. lanceolatus x E. fuscoguttatus (4,8%), apresentam ainda maior crescimento, sobrevivência e adaptabilidade ao cativeiro em relação aos parentais (Tabela 4). Inviabilidade híbrida, expressa pela letalidade larval de três dias após a fecundação, ocorre nos produtos híbridos entre E. morio e C. striata, cuja ancestralidade comum remonta a 43 M.a (Tabela 4).

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Tabela 4. Cruzamentos interespecíficos em espécies da família Serranidae. Cariótipos (Arai, 2011), distâncias genéticas do gene 16S, tempo de divergência e efeitos biológicos vantajosos (setas para cima) e desfavoráveis (setas para baixo) dos híbridos (Referências). F = Fertilização, E = Eclosão, C = Crescimento, S = Sobrevivência.

Efeitos Ref. Distância biológicos Cruzamentos genética M.a (%) F E C S

C. aurantia - x C. spiloparaea - 1,4 ~ 3,5 ↑ - - - 1 C. fulva 48a x P. furcifer - 4,6 ~ 11 ↑ - - - 2 C. fulva 48a x E.guttatus 48a 10 ~ 24 ↑ - - - 2 Cr. altivelis 2sm+46a x E. fuscoguttatus 2sm+46a 6,4 ~ 15 ↑ - - - 12 E. amblycephalum - x E. akaara 48a 5,8 ~ 14 ↑ ↓ ↑ ↑ 4

E. coioides 48a x E. fuscoguttatus 2sm+46a 4,6 ~ 11 ↑ ↓ ↑ 5

E. coioides 48a x E. lanceolatus 6sm+42a 5,4 ~ 12,5 ↑ ↓ ↑ ↑ 6, 7 E. coioides 48a x E. akaara 48a 3,8 ~9 ↑ - ↑ ↑ 8 E. costae 48a x E. marginatus 48a 1,6 ~ 4 ↓ - - - 9 E. fuscoguttatus 2sm+46a x E. coeruleopunctatus 2sm+46a 4,6 ~ 11 ↑ - - - 10

E. fuscoguttatus 2sm+46a x E. lanceolatus 6sm+42a 4,8 ~ 11 ↑ - ↑ ↑ 11, 12, 20 E. fuscoguttatus 2sm+46a x E. tukula 6sm+42a 4,6 ~ 11 ↑ - ↑ - 19 E. fuscoguttatus 2sm+46a x E. corallicola - 4,6 ~ 11 ↑ ↓ - - 3 E. fuscoguttatus 2sm+46a x E. polyphekadion 6sm+42a 4,8 ~ 11 ↓ ↓ ↑ ↑ 13; 14 E. lanceolatus 6sm+42a x E. polyphekadion 6sm+42a 5,2 ~ 12 ↑ - - - 3 E. lanceolatus 6sm+42a x Cr. altivelis 2sm+46a 6,0 ~ 14 ↑ - ↑ - 15 E. lanceolatus 6sm+42a x E. akaara 48a 6,6 ~ 16 ↑ - - - 16 E. lanceolatus 6sm+42a x E. moara 4sm+44a 4,2 ~ 10 ↓ - ↑ - 17 E. lanceolatus 6sm+42a x E. corallicola - 6,4 ~ 15 ↑ - - - 3 E. lanceolatus 6sm+42a x E. tukula 2sm+46a 4,2 ~ 10 ↑ - - - 10 E. marginatus 48a x E. aeneus - 7,0 ~ 17 ↑ - - - 18

E. morio - x Ce. striata 24m+22sm+2a 18 ~ 43 ↓ - ↓ ↓ 2

1) Randall e Justine, 2008; 2) Tucker, 1994; 3) Addin e Senoo, 2011; 4) Tseng e Poon, 1983; 5) Koh et al., 2008; 6) Chu et al., 2010; 7) Huang et al., 2001; 8) Liufu et al., 2007; 9) Glamuzina et al., 2001; 10) Rimmer e Glamuzina, 2017; 11) Senoo, 2006; 12) Ching et al., 2018; 13) James et al., 1999; 14) Ismi et al., 2013; 15) Chen et al., 2017; 16) Kim et al., 2018; 17) Chen et al., 2018; 18) Glamuzina et al., 1999; 19) Cheng et al., 2019; 20) Tan et al., 2018.

DISCUSSÃO As três espécies de Epinephelus analisadas reproduzem o perfil citogenético da família Serranidae caracterizado por padrões macro e microestruturais dos cromossomos embora mais variáveis que alguns grupos de peixes marinhos, ainda assim em grande parte conservados. De fato, E. striatus, E. coioides e E. tauvina e outras 44 espécies da família Serranidae (Wang et al., 2010; Arai, 2011; Pinthong et al., 2013; Minglan et al., 2014; Paim et al., 2017; Tseng e Shih, 2018) compartilham um mesmo valor 2n, em meio a variações estruturais dos cromossomos de parte das Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 89

espécies. Desta forma, um notável conservadorismo cariotípico está presente em 61% das espécies, que exibem um cariótipo com 2n=48 cromossomos acrocêntricos, enquanto as demais exibem variações no número de braços cromossômicos (NF= 48-96) (Motta-Neto et al., 2019). Os sítios Ag-RONs estão presentes em um único par de cromossomos das espécies, representado pelo menor elemento do cariótipo (par 24) em E. striatus, E. coioides e localizadas em um par de tamanho médio (par 20) em E. tauvina. A presença destes sítios no menor par de cromossomos em espécies de outros gêneros da família (Medrano et al., 1988; Martinez et al., 1989; Rodríguez-Daga et al., 1993; Zou et al., 2005; Wang et al., 2010, 2012; Tseng e Shih, 2018), indica uma condição simplesiomórfica e um provável conservadorismo sintênico deste par cromossômico. Similaridades nos padrões citogenômicos de alguns pares cromossômicos ressalta a estabilidade do cariótipo no grupo e indica que ao contrário de outros grupos (Jesus et al., 2003; Bellafronte et al., 2005), isoladamente os sítios Ag-RONs podem ser pouco discriminantes em Serranidae. Por outro lado, o mapeamento conjunto de sítios DNAr 18S e 5S, produzem padrões espécie-específicos capazes de discriminar espécies do gênero Epinephelus, no qual padrões morfológicos podem se mostrar crípticos (Park et al., 2016; Rimmer e Glamuzina, 2017). Sítios DNAr 45S e 5S, localizados em cromossomos distintos, representam a condição mais frequente em diversos grupos de vertebrados, dentre os quais os peixes teleósteos (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996; Gornung, 2013), incluindo espécies de Serranidae (Sola et al., 2000; Wang et al., 2012; Minglan et al., 2014; Paim et al., 2017). Entretanto, arranjos sintênicos DNAr 18S/5S, encontrados em E. striatus e E. tauvina, revelam uma condição pouco comum em peixes (Calado et al., 2014; Soares et al., 2017; Getlekha et al., 2018). A incomum disposição destes genes agrupados indica que apesar da relativa estabilidade na macroestrutura cariotípica, nestas espécies e em alguns grupos de peixes (Almeida et al., 2017; Dulz et al., 2019), mudanças microestruturais promovem modificações na organização interna dos cromossomos, contribuindo para uma relativa dinâmica evolutiva dos cromossomos. A análise da diversidade de sequências repetitivas e suas aceleradas taxas evolutivas nos cromossomos permitem uma maior aproximação da real dinâmica evolutiva dos cariótipos (Vicari et al., 2010; Cioffi e Bertollo, 2012). DNAs repetitivos Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 90

representam uma significativa parcela do genoma de vários grupos de peixes (Cioffi et al., 2015; Terencio et al., 2015; Yuan et al., 2018), enquanto outros, como alguns Percomorpha, exibem cromossomos com um pequeno conteúdo de heterocromatina e relativa homogeneidade constitutiva e funcional de sequências repetitivas (Pisano et al., 2007; Motta-Neto et al., 2012). Estas condições têm sido apontadas como restritiva à promoção de mudanças evolutivas dos cromossomos (Molina, 2007; Costa et al., 2013). Grande parte do DNA repetitivo é composta por sequências microssatélites (López e Garrido, 2012; Terencio et al., 2015; Hartley e O’neill, 2019). Em peixes, em geral, sequências microssatélites di- e trinucleotídicas se mostram preferencialmente acumuladas nas regiões heterocromáticas nos cromossomos, embora possam igualmente estar dispersas nas regiões eucromáticas em diversos grupos (Dover, 1986; Shimoda et al., 1999; Ugarković e Plohl, 2002; Cioffi et al., 2011; Xu et al., 2013; Supiwong et al., 2014; Costa et al., 2015). As três espécies do gênero Epinephelus apresentaram as repetições (CA)15, (GA)15, (CAA)10 e (CGG)10 indistintamente dispersas nas regiões eu- e heterocromáticas dos cromossomos. Embora um maior número de informações seja necessário, a estabilidade numérica e citogenômica nas espécies da família reflete a organização do DNA repetitivo no genoma das espécies de Serranidae. A dispersão de microssatélites sugere que os microssatélites podem seguir um caminho livre para espalhar e/ou agrupar (Piscor e Parise-Maltempi, 2016). Bloqueios pós-zigóticos podem decorrer da variação no número de cromossomos das espécies parentais (Cursino et al., 2014). Nesse sentido, as espécies homoploides da família Serranidae preenchem uma primeira condição para suplantar os bloqueios decorrentes de segregação imperfeita, durante a meiose dos híbridos (Buggs et al., 2011). Adicionalmente, a pequena divergência na organização de sequências repetitivas nos cromossomos das espécies aparentemente indica que o conservadorismo na macroestrutura cariotípica interespecífica é acompanhando por um limitado conjunto de mudanças na organização sintênica dos cromossomos (Molina, 2007; Costa et al., 2013). Esta última condição, aliada a ausência de cromossomos sexuais no grupo, possivelmente favorece o pareamento e segregação dos homólogos durante as divisões meióticas, ampliando as chances de produtos híbridos viáveis e férteis (Campton, 1987; Nagel et al., 2018). Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 91

No ambiente marinho, famílias de peixes que apresentam um padrão cariotípico conservado representam grupos com elevado índice de hibridização, entre as quais Chaetodontidae (Montanari et al., 2012), Haemulidae (Marceniuk et al., 2019), Lutjanidae (Batista et al., 2012) e Pomacanthidae (Pyle e Randall, 1994). O conservadorismo numérico e sintênico dos cromossomos destes grupos parecem minimizar bloqueios pós-zigóticos garantindo maior viabilidade dos híbridos em consequência da compatibilidade de gametas (Rahman et al., 2013; Molina et al., 2014a). Nas garoupas, os híbridos de espécies filogeneticamente próximas apresentam em geral maior crescimento e adaptabilidade em relação aos parentais (Senoo, 2006; Liufu et al., 2007; Huang et al., 2016). Esta condição pode ocorrer mesmo diante de algum nível de diversificação cromossômica, possivelmente suplantada por balanceamento gênico dos parentais (Birchler e Veitia, 2007). Uma correlação entre padrão cromossômico dos parentais e adaptabilidade pode ser assumida caso haja um desequilíbrio de genes sensíveis à dosagem, causado por ganho ou perda de segmentos cromossômicos envolvidos. O efeito da dosagem gênica em geral ocorre quando os rearranjos envolvem cópias adicionais de sequências (genes) abrangendo múltiplos genes com mudanças no seu número de cópias (Dulmage et al., 2018). Igualmente, rearranjos intracromossômicos envolvendo os cromossomos neo-homólogos (recombinação entre os homólogos) (Stapley et al., 2017), podem apresentar consequências adaptativas do excesso ou da deficiência de genes (Schmickl et al., 2017). Desta forma, a combinação da arquitetura genômica dos híbridos pode gerar grande plasticidade adaptativa, desde a heterose híbrida, aos níveis crescentes de bloqueios pós-zigóticos culminando com a inviabilidade dos produtos híbridos (Dagilis et al., 2019). Existem poucos dados sobre fertilidade dos híbridos de garoupas. O cruzamento entre E. lanceolatus x E. fuscoguttatus (distância genética de 4,8%) revela híbridos com menor tempo de incubação, alta taxa de fertilização e eclosão, maior crescimento, sobrevivência, adaptabilidade, resistência à doenças e fertilidade em relação às espécies (Ching et al., 2018). O tempo de divergência intensifica os bloqueios pós-zigóticos em peixes (Russel, 2003). Em geral, híbridos congenéricos evidenciam maior adaptabilidade que os intergenéricos (Senoo, 2006; Liufu et al., 2007), onde o nível de divergência evolutiva entre os gêneros é o fator determinante. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 92

Cruzamentos intergenéricos entre espécies de Cephalopholis e dos gêneros Paranthias e Epinephelus, que exibem 4,6% de divergência do gene 16S, produziram larvas viáveis (Tucker, 1994). Híbridos entre espécies de Cephalopholis e Epinephelus cujas sequências DNAmt 16S dos parentais divergem entre aproximadamente 6,4% e 6%, apresentam menor tempo de incubação e crescimento superior as espécies parentais (Ching et al., 2018). Por outro lado, cruzamentos entre E. morio × Centropristis striata, cujas espécies apresentam uma estimativa de divergência de 43 M.a e 18% de distância genética do gene 16S, sobrevivem por poucos dias após a eclosão (Tucker, 1994; Ma et al., 2016). Embora não se tenha informações sobre o cariótipo de E. morio, Centropristis striata apresenta uma estrutura cariotípica bastante diversificada e singular em relação à família Serranidae, sugerindo que grandes modificações estruturais na fórmula cariotípica, associadas ao largo tempo de divergência entre esses parentais atuaram em conjunto no impedimento reprodutivo destes dois táxons. Em peixes, bloqueios pós-zigóticos iniciam-se evolutivamente pela esterilidade em um ou nos dois sexos, até alcançar a inviabilidade híbrida entre espécies com períodos de divergência média de 11,6 milhões de anos (Russell, 2003). Esta condição possivelmente é decorrente de uma taxa evolutiva menor dos genes relacionados à viabilidade em relação aos genes relacionados ao sexo (Singh e Kulathinal, 2000; Russell, 2003). Grande parte da divergência das espécies de Serranidae ocorreu em períodos inferiores a 11 milhões de anos (Ma et al., 2016) (Figura 16), insuficientes à aquisição de bloqueios pós-zigóticos e cujo isolamento reprodutivo depende de alopatria e mecanismos de isolamento reprodutivo pré- zigóticos. O conhecimento sobre o processo de diferenciação sexual, muitas vezes complexo, tem aplicações práticas na aquicultura, propiciando um manejo adequado de reprodutores, bem como em ações de conservação onde diferentes classes de tamanho devem ser mantidas nas populações (Ferreira, 1993; Marques e Ferreira, 2008; Papadaki et al., 2018).

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Figura 16. Níveis de efeitos pós-zigóticos em híbridos de Serranidae, provenientes de espécies parentais com diferentes tempos de divergência temporal (adaptado de Ma et al., 2016).

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Entre as estratégias reprodutivas que podem minimizar divergências genômicas entre os sexos, destaca-se o hermafroditismo assincrônico, que impede a diferenciação de cromossomos sexuais uma vez que um mesmo genoma transita entre os dois sexos durante a história ontogenética de um indivíduo (Wright et al., 2016). Esta é uma condição favorável à hibridização em Serranidae, uma vez que a presença de cromossomos sexuais diferenciados em um ou ambos os parentais pode alterar o balanço gênico promovendo esterilidade ou inviabilidade do sexo heteromórfico (Russell, 2003). Nesta família divergências citogenéticas estabelecidas em períodos inferiores a 15 M.a resultam em geral em híbridos com diversas características favoráveis ao cultivo (Senoo, 2006; Liufu et al., 2007; Huang et al., 2016), indicando a fixação de limitado nível de bloqueio reprodutivo pós-zigótico neste período, mediado em parte por perfis citogenômicos pouco diversificados. Análises citogenômicas são ferramentas úteis para identificar graus de homologia cariotípica entre espécies, validação de produtos híbridos através da distinção dos conjuntos de cromossomos parentais, ou pares marcadores heterólogos em híbridos interespecíficos (Toledo-Filho et al., 1994; Molina e Jacobina, 2013). De fato, os resultados obtidos destacam a importância da caracterização citogenômica das espécies de Serranidae e seus híbridos, como ferramenta importante para a compreensão e aplicação dos processos de hibridização artificial na família e na rastreabilidade de híbridos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro (Processo nº 442664/2015-0), a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida e a UFRN (Universidade Federal do Rio Grande do Norte) por fornecer os meios para a realização do estudo.

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5. CONCLUSÕES

Serranidae representa um importante grupo de peixes marinhos que teve sua evolução diretamente atrelada à história dos recifes de corais. Análises citogenéticas no grupo auxiliam no entendimento da sua evolução e padrões de divergência cariotípica. Neste sentido, os resultados citogenômicos alcançados em espécies de diferentes grupos desta família possibilitaram concluir, que:

 A família Serranidae apresenta completo conservadorismo no número de cromossomos (2n=48), e elevada manutenção da estrutura cariotípica basal (2n=48a), que é mantida em 60% das espécies. Estruturas cariotípicas divergentes se devem, sobretudo, pela influência de eventos de inversões pericêntricas, possivelmente associados a adaptações frente novas condições ambientais, durante a expansão evolutiva do grupo.  O nível de bloqueio pós-zigótico entre espécies de Serranidae está relacionado ao tempo de divergência entre espécies, evidenciando-se como baixo ou ausente entre espécies com divergência entre 15 a 11 M.a e aparentemente suplantando pequenas divergências estruturais no cariótipo. Neste grupo, apesar das similaridades cariotípicas, dados citogenômicos demonstram potencialidades para rastrear produtos híbridos.  A organização de sequências repetitivas se mostra essencialmente conservativa nos cromossomos das espécies de Serranidae, seja quanto à distribuição das regiões heterocromáticas, microssatélites, elementos transponíveis ou das RONs, mantidos em pares cromossômicos homeólogos entre espécies, o que infere a manutenção de grandes trechos sintênicos no genoma das espécies.  A sintenia dos sítios DNAr 45S e 5S encontrados em E. striatus e E. tauvina indicam modificações na organização interna dos cromossomos e sugerem relativa dinâmica evolutiva de alguns cromossomos.  A ampliação do espectro filogenético com dados citogenéticos na família, com análises de espécies dos gêneros Cephalopholis e Rypticus, essencialmente retém os padrões cariotípicos e citogenômicos identificados para a família. Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 106

 O compartilhamento de regiões com acúmulo de sequências microssatélites

(CA)15 e Rex3 pode sugerir a participação dos elementos Rex3 na diversificação do cariótipo de espécies de Serranidae.  O conjunto de dados citogenéticos da família Serranidae indica que, apesar da ocorrência de diferenciações cromossômicas relacionadas à estrutura do cariótipo em uma parcela das espécies, ainda assim existe um extenso compartilhamento do padrão cariotípico basal e da organização do DNA repetitivo. Esta condição permite situar a evolução cariotípica dos Serranidae em uma condição limítrofe de estase cariotípica, cujas mudanças exibidas podem estar relacionadas à intensa diversificação do grupo frente a colonização histórica de novos ambientes.

Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 107

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Evolução cromossômica em Serranidae: comparações citogenômicas entre garoupas do Atlântico e Indo-Pacífico 119

7. ANEXO

Tabela SS1. Número de acesso das sequências de DNAmt 16S, obtidas no Genbank, das espécies da família Serranidae, com híbridos interespecíficos conhecidos.

Nº de acesso Espécies

KM656815.1 Cephalopholis aurantia AF297292.1 Cephalopholis fulva KM656820.1 Cephalopholis spiloparaea AY072667.1 Centropristis striata JX094001.1 Cromileptes altivelis KM077971.1 Epinephelus aeneus DQ067306.1 Epinephelus amblycephalus DQ154107.1 Epinephelus akaara KM077974.1 Epinephelus coeruleopunctatus KM077975.1 Epinephelus coioides JN637834.1 Epinephelus corallicola KM077988.1 Epinephelus costae KJ607972.1 Epinephelus fuscoguttatus AF297299.1 Epinephelus guttatus AY947588.1 Epinephelus lanceolatus HQ592229.1 Epinephelus marginatus JX094010.1 Epinephelus moara AY857954.2 Epinephelus morio KM077983.1 Epinephelus polyphekadion EF503631.1 Epinephelus tukula AY947584.1 Paranthias furcifer KM077993.1 Plectropomus leopardus