CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA RIBOSOMAL 16S
DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. Colombia AGOSTO DE 2007.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA RIBOSOMAL 16S
DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTAR EL TITULO DE
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
DIRECTOR: JOSE SALVADOR MONTAÑA CO-DIRECTORA: MARIA MERCEDES MARTINEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D. C. Colombia AGOSTO DE 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos omitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la justicia”
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA RIBOSOMAL 16S
DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA
APROBADO
José Salvador Montaña Msc. María Mercedes Martínez Msc. Director Codirectora
María del Pilar Márquez Msc. Jurado 1 Andrea Juliana Mantilla Microbióloga Industrial Jurado 2
Bogotá. D. C. Colombia AGOSTO DE 2007.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA RIBOSOMAL 16S
DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA
APROBADO
Ángela Umaña MPhil. David Gómez Msc. Decana Académico Director de Carrera
Bogotá. D. C. Colombia AGOSTO DE 2007
DEDICATORIA
A mis padres por todo su amor, su esfuerzo constante durante mi carrera, su comprensión, su ayuda y apoyo incondicional y único, y por creer en mí cada momento en esta gran etapa de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
A mis directores José Salvador Montaña y María Mercedes Martínez, por su apoyo incondicional, por compartir sus invaluables enseñanzas y conocimientos conmigo y por acompañarme en este valioso paso en mi vida.
A todas las personas del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana, por su colaboración y por haber permitido el desarrollo de esta investigación.
A los investigadores de las Unidades de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) y Biotecnología Vegetal (UBV) por su colaboración y asesoría.
Al Ingeniero agrónomo Andrés Siabato por su colaboración y asesoría en el muestreo.
A mis hermanos Julis, Caro y Chepe, por su apoyo y cariño en toda mi carrera.
A mi linis por amarme tanto, por su compañía, por su comprensión y por ser un apoyo incondicional.
A todas las personas de mi familia que me apoyaron y creyeron en mí día a día.
A mis amigos de la Universidad y de Sogamoso por ser personas importantes y únicas.
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción...... 1 2. Marco teórico...... 3 2.1. Importancia y problemática del nitrógeno en la agricultura...... 3 2.2. La rizosfera...... 3 2.3. Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazótrofos)...... 5 2.3.1. Fijación biológica de nitrógeno (FBN)...... 5 2.3.2. Microorganismos diazotróficos simbióticos...... 7 2.3.3. Microorganismos diazotróficos asimbióticos...... 9 2.5. Familia Azotobacteraceae...... 11 2.6. Generalidades del género Azotobacter spp...... 12 2.6.1. Azotobacter chroococcum...... 16 2.6.2. Azotobacter vinelandii...... 17 2.7. Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias diazotrófas...... 18 2.7.1. Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y taxonomía...... 19 2.7.2. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)...... 21 2.7.3. Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y otras bacterias diazótrofas mediante el análisis de restricción del RNA ribosomal 16S (ARDRA)...... 21 3. Formulación del problema y justificación...... 25 4. Objetivos...... 27 4.1. Objetivo general...... 27 4.2. Objetivos específicos...... 27 5. Metodología...... 28 5.1. Lugar de muestreo...... 28 5.2. Muestreo del suelo...... 28 5.3. Procesamiento de muestras...... 29 5.3.1. Medición de pH de las muestras de suelo...... 29 5.3.2. Aislamiento primario...... 29 5.4. Aislamiento secundario...... 30 5.4.1. Conservación de cepas mediante la técnica de criopreservación en 30
glicerol al 50% (v/v)...... 5.4.2. Pigmentación de los aislamientos...... 30 5.4.3. Identificación Bioquímica…...... 31 5.4.4. Cepa control...... 31 5.5. Extracción de DNA...... 32 5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3...... 33 5.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)...... 34 5.7.1. Perfil electroforético para el ARDRA...... 34 5.7.2. Análisis filogenético...... 35 5.8. Restricción virtual...... 35 6. Resultados...... 36 6.1. Medición de pH de los cultivos muestreados...... 36 6.2. Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas.. 36 6.3. Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas...... 37 6.3.1. Morfología de las colonias...... 37 6.3.2. Morfología de las células...... 37 6.3.3. Pigmentación...... 38 6.4. Identificación bioquímica...... 39 6.5. Extracción de DNA...... 41 6.6. Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3...... 42 6.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA)...... 43 6.7.1. Análisis con la enzima AluI...... 43 6.7.2. Análisis con la enzima HpaII...... 44 6.7.3. Análisis con la enzima RsaI...... 46 6.8. Cladograma generado del análisis con las tres enzimas...... 48 6.9. Restricción virtual...... 48 6.9.1. Análisis virtual con la enzima AluI...... 50 6.9.2. Análisis virtual con la enzima HpaII...... 52 6.8.3. Análisis virtual con la enzima RsaI...... 53 7. Discusión de resultados...... 56 8. Conclusiones...... 67 9. Recomendaciones...... 69 10. Referencias...... 70 11. Anexos...... 86
INDICE DE FIGURAS
Figura. 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la nitrogenasa para la reducción del N2...... 6 Figura. 2. Quistes de Azotobacter spp...... 12 Figura. 3. Pigmentación de cepas de Azotobacter...... 13 Figura. 4. Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno y morfología celular de Azotobacter spp...... 14 Figura. 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis de las tres nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de nitrógeno...... 18 Figura. 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá...... 28 Figura. 7. Recolección de las muestras de suelo...... 29 Figura 8. Aislamiento primario...... 30 Figura. 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato...... 31 Figura. 10. Baterías bioquímicas de azucares...... 31 Figura. 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas...... 37 Figura. 12. Morfología celular de los aislamientos...... 38 Figura. 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato...... 38 Figura. 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos...... 41 Figura. 15. Amplificación del DNAr 16S...... 42 Figura. 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima AluI...... 43 Figura. 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos...... 44 Figura. 18. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima HpaII...... 45 Figura. 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos...... 46 Figura. 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima RsaI...... 46 Figura. 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos...... 47 Figura. 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI, HpaII y RsaI para los aislamientos...... 48 Figura. 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en el análisis de restricción virtual...... 49
Figura. 24. Restricción virtual con la enzima AluI...... 51 Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para las secuencias obtenidas del Genbank...... 51 Figura. 26. Restricción virtual con la enzima HpaII...... 52 Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias obtenidas del Genbank...... 53 Figura. 28. Restricción virtual con la enzima RsaI...... 54 Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias obtenidas del Genbank...... 55
INDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno...... 7
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del género Azotobacter...... 13 Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas para la caracterización del género Azotobacter spp...... 15 Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas...... 33 Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA...... 34 Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo...... 36 Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de recuperación por cultivo...... 36 Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada cultivo...... 37 Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas encontradas en cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá...... 39 Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo (ATCC 12518) y la cepa CCT...... 40 Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos...... 41 Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI...... 43 Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII...... 45 Tabla 13. Morfotipos obtenidos con la enzima RsaI...... 47 Tabla 14. Secuencias obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción virtual...... 49 Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima AluI en las secuencias obtenidas del Genbank...... 50 Tabla 16. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank...... 52 Tabla 17. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank...... 54
RESUMEN
Con el fin de aislar y caracterizar bacterias diazotrófas del genero Azotobacter se realizó un muestreo de suelo en cultivos de hortalizas ubicados en el departamento de Boyacá, el aislamiento se realizó en medio Ashby-Sacarosa libre de nitrógeno. El pH de los suelos se encontró cercano a la neutralidad y el porcentaje de recuperación obtenido fue alrededor de 40%, los aislamientos fueron clasificados e identificados fenotípica y bioquímicamente, encontrando bacterias de las especies A. vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A. paspali. La caracterización molecular se realizó utilizando un análisis de restricción del DNAr 16s amplificado (ARDRA), para esto se realizó una extracción de DNA por medio de la utilización de solventes orgánicos (Fenol), el gen fue amplificado con iniciadores universales utilizados para bacterias diazótrofas (Y1-Y3) que amplifican 1487pb del gen. Las enzimas utilizadas en el ARDRA fueron AluI, HpaII y RsaI las cuales presentaron porcentajes de polimorfismo alrededor de 16%. Los aislamientos se distribuyeron en tres grupos que presentaron morfotipos similares para las tres enzimas.
Se realizó una comparación de los morfotipos generados en los aislamientos frente a los generados en una restricción virtual con las mismas enzimas, utilizando secuencias parciales del gen DNAr 16s de bacterias diazótrofas obtenidas del Genbank. Los aislamientos presentaron cierta homología con bandas generadas con la restricción virtual, sin embargo, algunas identificaciones no fueron precisas ya que el patrón de bandas coincidía con otras especies de Azotobacter o con otros géneros como en el caso de los aislamientos C1BR y C5BR. Por otro lado, el aislamiento C5T presentó el mismo morfotipo con A. chroococcum para las tres enzimas, indicando que su similitud genética es evidente con esta especie, además corroborando su identificación preliminar y su pigmentación en medio benzoato. Demostrando que las técnicas moleculares junto con las convencionales y la bioinformática son herramientas fundamentales para la caracterización de bacterias diazótrofas importantes en la agricultura, además de su importancia en estudios de biodiversidad, bioprospección y biotecnología.
ABSTRACT
With the aim to isolate and characterized nitrogen fixing bacteria from Azotobacter genera, a soil sample was made in vegetable cultures located at the department of Boyacá, the isolation was made in the Ashby-Sucrose medium free of nitrogen. The PH of soils was found near neutrality, and the porcentage of recovery obtained was around the 40%, the isolations were classified and identified phenotypical and biochemiclally, finding bacterias of the species A. vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A. paspali. The molecular characterization was made using an amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), for this an extraction of the DNA was made by using organic solvents (phenol), the gen was amplified with universal primers used for nitrogen fixing bacterias (Y1-Y3) that amplifies 1487pb of the gen. The enzymes used in the ARDRA were AluI, HpaII y RsaI which presented polymorphism percentages around 16%. The isolations were distributed in three groups that presented similar morphotypes for the three enzymes.
A comparison betweeen the morphotypes generated by isolations and the ones generated in a virtual restriction with the same enzymes, using partial secuencies of the gen DNAr 16s from nitrogen fixing bacterias obtained from the Genbank. The isolations presented certain similarities with bands generated wtih the virtual restriction; nevertheless some identifications were not precised due that the pattern of bands matched with other species of Azotobacter or with other genders kile in the case of isolation C1BR y C5BR. In the other hand, the isolation C5T presented the same morphotype with A. chroococcum for the three enzymes indicating that the genetic similarity is evident with this specie, besides corroborating its preliminar identification and pigmentation on a bezoatum medium. Showing that the molecular techniques with the conventional ones and the bioinformatic are fundamental tools for the nitrogen fixing bacterias characterization important in the agriculture, besides its importance in biodiversity, bioprospection and biotechnology studies.
1. INTRODUCCIÓN.
Actualmente la gran mayoría de cultivos agrícolas Colombianos dependen de los fertilizantes químicos sintetizados, los cuales proporcionan nutrientes asimilables por las plantas, buscando optimizar los procesos de producción. El uso indiscriminado de fertilizantes químicos, ocasiona contaminación de cuerpos de agua y suelos, sumado al incremento de los costos de producción y el impacto negativo en la salud animal y humana. Por esto, el uso de agricultura orgánica, tecnologías limpias y seguras, han hecho que los biofertilizantes se conviertan en una gran alternativa para disminuir estos inconvenientes. Los biofertilizantes son preparaciones de células vivas o latentes que cumplen funciones específicas en los cultivos, como, la fijación biológica de nitrógeno, la solubilización del fósforo, la producción de hormonas promotoras de crecimiento, la producción de antibióticos y la generación de agentes quelantes de hierro.
Las bacterias fijadoras de nitrógeno (diazótrofas) fueron las primeras en producirse comercialmente con fines de biofertilización pero posteriormente las bacterias diazótrofas asimbióticas cobraron importancia en la agricultura. De este grupo, las más utilizadas como biofertilizantes corresponden al género Azotobacter, compuesto por 7 especies (Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. paspali, A. armeniacus, A. nigricans y A. salinestris), siendo A. chroococcum y A. vinelandii las que se encuentran en gran proporción en la rizosfera de suelos tropicales que se caracterizan por poseer altos contenidos de materia orgánica, fosfatos y valores de pH cercanos a la neutralidad. Las bacterias del género Azotobacter son fijadores de nitrógeno de vida libre, solubilizadores de fósforo, productores de sustancias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) y degradadoras de plaguicidas. Por estas razones se consideran indicadores de salud en cultivos agrícolas.
Los métodos de cultivo más utilizados para aislar bacterias del género Azotobacter incluyen aislamiento en medio libre de nitrógeno; enriquecimiento en solución de Winogradsky y posterior siembra en medio libre de nitrógeno; y siembra de gránulos individuales de suelo en medio libre de nitrógeno. Para su identificación se emplean pruebas como fermentación de ramnosa, manitol, inositol, malonato, benzoato y sucrosa; además de test de oxidasa y catalasa, producción de pigmentos, crecimiento en diferentes valores de pH, crecimiento
en diferentes concentraciones de NaCl y de oxigeno. La identificación también se realiza mediante observación de la morfología celular, de colonias y la formación de estructuras de resistencia. Sin embargo, estos métodos generan ambiguedad en el momento de diferenciar especies dentro del género Azotobacter u otros géneros diazótrofos como Beijerinckia y Derxia. Por esta razón su utilización es insuficiente para la identificación y caracterización de bacterias diazotrófas, además de ser útiles solo para bacterias cultivables. Debido a esto, se han desarrollado técnicas de huella genética como DGGE, RFLP, RAPD, ARDRA y secuenciación que permiten una identificación y caracterización mas precisa.
El DNA ribosomal 16S es utilizado en estudios de filogenia y taxonomía ya que su estructura y función han permanecido constantes a través del tiempo de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan cambios aleatorios, su transmisión es principalmente vertical ya que no está sujeto a transferencia génica horizontal entre microorganismos. La técnica molecular de amplificación del DNA ribosomal 16S es utilizada constantemente en microbiología, ya que por sus características precisas permite identificar y caracterizar bacterias no cultivables, bacterias cuyas características bioquímicas no se adaptan a las de ningún género o especie reconocido; bacterias con elevados requerimientos nutricionales; cuya caracterización fenotípica no es suficiente o aquellas con crecimiento muy lento.
En este estudio se pretende obtener un acercamiento a la identificación, caracterización molecular y filogenia de cepas nativas Colombianas del género Azotobacter mediante el análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA), y con esto lograr una aproximación al conocimiento de la diversidad genética de bacterias diazotrófas asimbióticas aerobias en cultivos agrícolas colombianos, a través de la estandarización de un protocolo para la extracción del DNA total, amplificación y restricción del DNA ribosomal 16S y el análisis conjunto con la información de secuencias de bacterias diazótrofas obtenidas del Genebank. En un corto plazo se busca realizar la validación de esta técnica e incluirla en el portafolio de servicios del laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana para el control de calidad de bioinsumos agrícolas.
2. MARCO TEORICO
2.1 Importancia y problemática del nitrógeno en la Agricultura Debido a que el nitrógeno es el elemento más limitante para el crecimiento de las plantas en suelos tropicales (Franco & Dobereiner, 1994), se ha incrementado el uso de productos de síntesis, con el ánimo de aumentar la producción agrícola. Existen reportes de 77 x 106 toneladas de nitrógeno aplicados mundialmente como fertilizante en diversos cultivos de gran importancia agronómica, como hortalizas, caña, sorgo, maíz, arroz, flores y ornamentales entre otros. Lo anterior ha provocado efectos negativos en los recursos naturales, tales como acumulación de nitratos en las aguas freáticas, toxicidad en las plantas por la presencia de altos niveles de NO2 en los suelos, contribuyendo con la muerte de la biota del suelo, ocasionando desequilibrios en los procesos naturales biogeoquímicos que se traducen en un alto costo económico, social y ecológico. (Marín et al., 2003).
2.2 La rizósfera El termino rizósfera se refiere a la zona del suelo influenciada por el desarrollo de raíces, en donde se activa la proliferación de microorganismos (Hiltner, 1904); este efecto rizosférico se debe al suministro de exudados radicales que contienen azúcares, aminoácidos, vitaminas y enzimas, además de señales que modulan la interacción microbio-planta (Kennedy & Smith, 1995; Bowen & Rovira, 1999). Las propiedades físicas, químicas y biológicas de la rizósfera son muy diferentes a las del suelo no rizosférico particularmente, la población microbiana desciende entre 10 a 100 veces al alejarse pocos milímetros de la superficie radical (Collados, 2006).
Las poblaciones rizosféricas están compuestas por bacterias, hongos, algas, nemátodos, protozoos y virus pero la mayor parte de las investigaciones se centran en hongos y bacterias (Bowen & Rovira, 1999; Gryndler, 2000). Se estima que existen unas 30.000 especies de bacterias y 1.500.000 especies de hongos de los cuales solo un 1% y 8% respectivamente han sido identificadas (Kennedy & Smith, 1995; Barea, 2000). En este contexto hay que referir que la utilización de técnicas basadas en el análisis de moléculas de DNA ha puesto de manifiesto que entre el 90% y 99% de los microorganismos del suelo son viables
pero no cultivables (Barea et al., 2005), por lo que dichas técnicas permiten caracterizar los microorganismos y establecer sus relaciones filogenéticas.
Análisis pioneros de la complejidad microbiana en suelos, realizados por Torsvik et al., (1990), utilizando técnicas de reasociación de DNA, pusieron en evidencia la gran diversidad genética bacteriana presente. Así el número de genomas bacterianos diferentes estimados en una muestra de suelo forestal fue de unos 4.000, en claro contraste con la diversidad genética de las bacterias aisladas en cultivo a partir de la misma muestra (200 veces menor). En otras muestras de suelo de la amazonia brasilera la diversidad genómica fue incluso superior (8.000-10.000 genomas diferentes) (Torsvik et al., 1998).
Los microorganismos en la rizosfera desempeñan funciones de gran importancia en relación con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos como el carbono, el nitrógeno, oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de las plantas y protección frente a patógenos; degradación de compuestos xenobióticos y producción de fitohormonas (Nogales, 2005).
Dentro de la microflora de la rizosfera se encuentran especies pertenecientes a los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacteria, Hafnia, Klebsiela, Serratia Xanthomonas, Azotobacter, Azospirillum, Clostridium, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia y Bacillus (Kloepper et al., 1989; Bashan & Levanony, 1990; Tang, 1994; Barea et al., 2004). Otras bacterias importantes en la microflora del suelo y en la agricultura son las fosfato solubizadoras, como las aisladas por Useche et al., (2004), en un estudio de la diversidad en diferentes suelos de la Amazonía, Pseudomonas spp., P. cepacia, P. gladioli, Xanthomonas spp., X. maltophilia, Enterobacter agglomerans, Chromobacterium sp., X. maltophilia, y Chromobacterium sp.; constituyeron nuevos reportes de bacterias solubilizadoras de fósforo en Colombia.
Observaciones de secciones ultrafinas de suelo mediante microscopía electrónica, tomografía, análisis geoestadístico y la elaboración de modelos, especialmente basados en fractales, han demostrado que la distribución de las bacterias edáficas está altamente estructurada, y que esta estructuración es
importante para la funcionalidad y estructura del suelo. Las bacterias se organizan en microcolonias compuestas de pocas células que pueden pertenecer a diferentes morfotipos (Nunan et al., 2003).
2.3 Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazotrófos) La fijación biológica de nitrógeno molecular la llevan a cabo diversos géneros de bacterias de vida libre, algunas de estas se encuentran en la rizósfera en vida libre, y otros géneros bacterianos forman asociaciones mutualistas con plantas (Saribay, 2003). Las bacterias fijadoras de nitrógeno presentan una amplia diversidad taxonómica, con diferentes estilos de vida y de asociación con los vegetales. Sin embargo, sólo una pequeña proporción de especies es capaz de hacerlo; 87 especies en dos géneros de arqueobacterias, 38 de bacterias, y 20 géneros de cianobacterias se han identificado como diazótrofas (Hussein, 1999).
En la rizósfera la fijación del nitrógeno se realiza aparentemente sólo por ciertos tipos de bacterias y por algunos miembros del taxón Archea; estos diazotrófos incluyen algunas especies de Bacillus spp., Clostridium spp. y Klebsiella spp., miembros de la familia Azotobacteraceae (A. vinelandii y A. chroococcum), Rhizobiaceae y del orden Rhodospirillales (Singleton, 2004). Además de estos, se han descrito géneros en diferentes hábitats con la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, entre estos están: Beijerinckia, Chromatium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Chlorobium, Azospirillum, Desulfovibrio, Desulfotomaculum y Pseudomonas (Atlas & Bartha 2002).
2.3.1 Fijación biológica de nitrógeno (FBN) La fijación biológica de nitrógeno esta catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa. El complejo de la enzima tiene dos coproteínas, la proteína I contiene hierro y molibdeno y la proteína II contiene solamente hierro, aunque se han encontrado una enzima alterna de Azotobacter vinelandii que contiene vanadio (Drummond et al., 1995; Eady et al., 1988). La proteína I es un tetrámero de alrededor de 220.000 Da, formado por dos tipos de subunidades α2 β2, de masa molecular semejante, y producto de los genes nifDK (Telisa et al., 1999). La proteína II es un dímero de alrededor de 68.000 Da, el gen responsable de la síntesis de esta proteína es nifH, esta proteína tiene la función de transportar los electrones del donador fisiológico de electrones (ferrodoxina o flavodoxina), hacia la proteína I para llevar a cabo la reducción de la molécula de
N2, (Figura 1) (Baca et al., 2000). Se han descrito alrededor de 20 genes involucrados en la fijación biológica de nitrógeno, cuya secuencia y funciones han sido ya determinadas. Igualmente se conoce que los genes estructurales de la nitrogenasa están sumamente conservados, así como un cierto número de otros genes cuyos productos juegan un papel en la maduración de la enzima, la síntesis del cofactor, el transporte de molibdeno y la regulación (Elmerich, 1993; Lee et al., 2000; Desnoues et al., 2003). Las proteínas NifL y NifA son las encargadas de la regulación y el control de la expresión de los genes nif en la fijación biológica del nitrógeno, en Azotobacter vinelandii estas dos proteínas están codificadas por el operon nifLA (Martínez et al., 2005).
Figura 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la nitrogenasa para la reducción del N2. Fuente: Baca et al., (2000).
La reducción de nitrógeno requiere mucha energía, alrededor de 12 a 16 moléculas de ATP por cada molécula de nitrógeno fijada (Ecuación 1) (Betancurt, 2002; Singleton, 2004; Baca et al., 2000). Para la fijación bacteriana de nitrógeno molecular se necesita un aporte importante de energía (150 kcal/mol) en forma de ATP y coenzimas reducidas; la energía puede obtenerse a través de la conversión de la energía lumínica que realizan los organismos fotoautótrofos, como las cianobacterias, o a través de la respiración de los heterótrofos como Azotobacter (Atlas & Bartha, 2002). Ya que la fijación de nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso que demanda gran cantidad de energía, requiere una eficiente fosforilación oxidativa. La enzima nitrogenasa es altamente sensible al oxígeno y muchos diazotrófos fijan nitrógeno anaeróbicamente o microaeróbicamente y en algunas cianobacterias
el proceso se realiza en estructuras de resistencia como los heterocistes. (Singleton, 2004).
Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno. Fuente: Baca et al., (2000) N2 + 8H+ + 8e- + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP +16Pi
La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O2, la proteína (Fe) es mucho más sensible que la proteína (Mo-Fe) con una vida media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente
(Robson & Postgate, 1980). El efecto de O2 sobre la nitrogenasa restringe la fijación de N2 en la mayoría de las especies de eubacterias a condiciones anaeróbicas o de microaerobiosis. Azotobacter y Beijerinckia pueden fijar nitrógeno a la presión normal de oxígeno, ya que protegen su nitrogenasa de la inactivación oxidativa por una combinación de compartimentación y de complejos mecanismos bioquímicos entre los que se encuentran, la protección conformacional o switching off (Moshiri et al., 1994); la expresión de la citocromo oxidasa cytbd; la autoprotección, la cual consiste en reducir por medio de la nitrogenasa reductasa el oxigeno a peróxido de hidrogeno y posiblemente a agua y por lo tanto, reduciría el oxigeno en la vecindad de la nitrogenasa (Thorneley & Ashby, 1989). Además de esto, el uso de nitrogenasas alternativas y la producción de polímeros como alginato y los PHBs (Polihidroxibutiratos) son alternativas eficientes para proteger el complejo (Atlas & Bartha, 2002; Espin, 2002
2.3.2 Microorganismos diazotróficos simbióticos. Las bacterias diazotróficas simbióticas son aquellas que son capaces de fijar nitrógeno atmosférico en simbiosis con las raíces de plantas leguminosas (guisantes, judías, tréboles, alfalfa, entre otras). Estas raíces poseen pequeños engrosamientos llamados nódulos que contienen bacteroides o rizobios, en esta alianza, la planta suministra nutrientes y protección, mientras que el rizobio proporciona a la planta nitrógeno fijado de la atmósfera (Espín, 2002
caulinodans en las raíces de la oleaginosas (Brassica napus); los nódulos de las raíces de aliso (Alnus) contienen bacterias del género Frankia, mientras que el pequeño helecho flotante Azolla contiene Anabaena azollae dentro de cavidades especializadas. Así mismo, se han detectado cepas pertenecientes a la cianobacteria Nostoc en las raíces de corraloides de cícadas (Cycas, Encephalatos, Zamia) de un jardín botánico mediante métodos basados en PCR. Pisa, (2002), realizó una análisis filogenético amplificando el DNAr 16S con primers especificos para diazótrofas de cepas simbióticas capaces de nodular cultivos de frijol (Phaseolus vulgaris) en Brasil, encontrando un 42% de bacterias del genero Rhizobium, 17% de Ralstonia y 6% de Burkholderia.
Una de las simbiosis más efectivas es la que se establece entre Bradyrhizobium japonicum-Soya, donde un 70% de la fijación de nitrógeno por la bacteria es asimilada por la planta. En Brasil se ha empleado con éxito la fertilización biológica de soya con B. japonicum y 0% de aporte de nitrógeno como fertilizante químico, ello ha conducido a que este país sea el segundo productor de soya a nivel mundial (Baldani et al., 1997). En Colombia se han evaluado biofertilizantes a base de Rhizobium en cultivos de maní, frijol y soya con resultados positivos en la producción y en la disminución de costos (Torres, 2000
Asi mismo, la utilización de plantas fijadoras de nitrógeno como el trébol y la alfalfa, pueden incluirse dentro de los esquemas de rotación de las cosechas; plantas como la Azolla se utiliza como abono orgánico, una práctica común en el sudeste de Asia, mientras que en los arrozales la fertilidad puede incrementarse potenciando el crecimiento de cianobacterias autónomas fijadoras de nitrógeno (Singleton, 2004). Por otro lado, Santillana et al., (2005), comprobaron la capacidad de Rhizobium para promover el crecimiento de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum Miller), evidenciando la producción de sustancias promotoras de crecimiento de tipo citoquininas, ácido indol acético y ácido giberélico.
La simbiosis Rhizobium-Leguminosas es el resultado de una interacción muy específica entre la bacteria y la planta (Singleton, 2004). La formación del nódulo es un proceso inducido por un intercambio de señales entre los dos participantes de la interacción; sustancias con efecto mitógeno (factores de nodulación) son
sintetizadas por los genes de nodulación del microsimbionte (genes nod), en respuesta a la excreción por la planta de sustancias de tipo flavonoide (Baca et al., 2000). Se han reportado que existen alrededor de 26 genes nod expresados en el proceso de nodulación y 26 genes nif expresados en la fijación de nitrógeno, los cuales codifican para 416 proteínas involucradas en estos dos sistemas (Freiberg et al., 1997). Sin embargo, Kaneko et al., (2000), identificaron 39 genes cromosomales involucrados en el proceso de nodulación y 46 en la fijación de nitrógeno.
2.3.3 Microorganismos diazótrofos asimbióticos. Las bacterias diazótrofas asimbióticas son aquellas que pueden fijar nitrógeno atmosférico sin la necesidad de formar una simbiosis con plantas, ya que estas poseen diferentes estrategias para proteger el complejo nitrogenesa. Estas bacterias se encuentran prácticamente en todos los hábitats: suelo, mar, fuentes de agua dulce y sedimentos. Entre los principales géneros bacterianos que se hallan en vida libre o endófitos asociados a la rizosfera se encuentran: Azotobacter spp., Azotococcus spp., Azospirillum spp., Beijerinckia spp., Azotomonas spp., Bacillus spp., Citrobacter spp., Clostridium spp., Chromatium spp., Chlorobium spp., Desulfovibrio spp., Desulfomonas spp., Gluconacetobacter spp., Herbaspirillum spp., Klebsiella spp. (Rodríguez et al., 2003).
Magalãhes et al., (2001), aislaron y caracterizaron molecularmente 38 cepas fijadoras de nitrógeno de la rizosfera, hojas y tallos de cultivos de piña y banano en Rio de Janeiro (Brasil); caracterizaron cepas de Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y Burkholderia tropicalis, mostrando la gran diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno asimbioticas en suelos tropicales. Torres et al., (2000), aislaron 18 cepas del género Azotobacter de 20 cultivos de arroz en el Tolima (Colombia), las cuales producían importantes concentraciones de de acido indol acético (AIA), incluyendo A. vinelandi con 32.22 ppm y A. chroococcum con 30.07 ppm de AIA.
Por otro lado, Aquilanti et al., (a) (2004), aislaron bacterias diazotróficas asimbióticas de la rizósfera de cultivos de maíz, trigo y hortalizas en Italia, los géneros encontrados fueron de la familia Azotobactereaceae, al igual que
miembros del géneros Beijerinckia, Azomonas y Agrobacterium. Tejera et al., (2005), aislaron cepas de A. chroococcum y Azospirillum spp. de la rizósfera de cultivos de caña de azúcar en Granada España, utilizando medio libre de nitrógeno (Burk`s) (Martínez et al., 1985) para su aislamiento, las cepas fueron identificadas y caracterizadas por medio de métodos convencionales (motilidad, producción de pigmentos, fermentación de azúcares, producción de PHBs y morfología de la colonia y celular) y moleculares (Rep- PCR y ARDRA).
Entre las bacterias diazótrofas asimbióticas utilizadas como biofertilizantes una de las más importantes es Azotobacter spp, la importancia agronómica de esta radica especialmente en la capacidad de producir antibióticos, sustancias estimulantes del crecimiento vegetal (SPCV) del tipo auxinas, giberelinas y citoquininas (Pandey & Kumar, 1990); además de la fijación de nitrógeno, producción de vitaminas, pigmentos, (Pandey et al., 1998) aminoácidos y otras moléculas con actividad biológica de interés industrial y comercial como polisacáridos (Sabra et al., 2001; Cuesta et al., 2006.). CORPOICA produce biofertilizantes a base de A. chroococcum (Monibac), su forma de presentación es líquida, su concentración es de 107 UFC/g y ha sido utilizado en cultivos de algodón, tomate y ají (CORPOICA, 2007
El control de calidad y la vigilancia de estos productos en Colombia esta a cargo del ICA, en general un bioinoculante debe cumplir con adecuada concentración bacteriana, especificidad para la estimulación del crecimiento vegetal y para su formulación comercial deben presentar lote y fecha de vencimiento además de cumplir con las condiciones de almacenamiento adecuadas (Bashan, 1998). Para bioinoculantes a base de Azotobacter el
inóculo debe presentar una concentración de 1x105 UFC/ml, sin embargo, estas concentraciones varían de acuerdo al cultivo a manejar. En Colombia existen diversas empresas encargadas en la producción e importación de estos bioinoculantes, entre las empresas registradas por el ICA se encuentra Agrotecnia LTDA, Biocultivos S.A, Eco Organics LTDA, Microagro LTDA, Safer Agrobiologicos, Fingifert Oriente Colombiano LTDA entre otras (ICA, 2007
Neeru et al., (1991), utilizaron A. chroococcum como bioinoculante en la India para una variedad de cereales, oleaginosas y vegetales obteniendo resultados favorables en el peso seco de la planta y la producción de grano. Igualmente Galindo et al., (2006), inocularon bacterias diazotrófas (A. vinelandii) y solubilizadores de fosfato en plántulas de mangle y plantas de Citrullus vulgaris en la isla de San Andrés (Colombia) incrementando la altura de las plantas, el número de hojas y de nodos. Los bioinoculantes en Colombia también se han utilizado en cultivos de crisantemo (Santana et al., 2002), pompón y clavel (FUNDASES, 2007
García et al., (2005), mediante la inoculación de Azotobacter beijerinckii y Azospirillum spp. lograron aumentar la absorción de urea y la trasformación de los exudados radicales en SPCV, incrementando el peso fresco y seco del trigo inoculado. Estudios realizados en la India indican que los beneficios obtenidos en la inoculación de semillas con Azotobacter son marginales en suelos con pobre contenido de materia orgánica, pero muy favorables en suelos con mucha carga orgánica (Stevenson et al., 2000). Está documentado que bacterias del género Azotobacter y Azospirillum han utilizadas en sistemas de acuacultura y en producción de vermicompost para aumentar el contenido de nitrógeno y fósforo del producto (Garg et al., 2001; Kumar & Singh, 2001).
2.5 Familia Azotobacteraceae. La familia Azotobacteraceae pertenece a la subclase gamma de las proteobacterias (Tchan, 1984), esta compuesta por bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre que comúnmente habitan en suelo, agua y sedimentos. Estudios de DNA ribosomal 16s (DNAr 16S) han identificado dos géneros en esta familia, Azotobacter y Azomonas El género Azotobacter se diferencia de Azomonas por la presencia de quistes pero no se puede diferenciar
morfológicamente de muchas otros géneros de bacterias diazotrófas como Azospirillum y Beijerinckia; comprende siete especies: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. paspali (Doberienener & Day, 1975), A. armeniacus, A. nigricans (Tchan & New, 1984(a)) y A. salinestris (Page & Shivprasad, 1991). El género Azomonas comprende tres especies: A. macrocytogenes, A. agilis, y A. insignis (Tchan & New, 1984(b)).
Los miembros de esta familia Azotobacteraceae tienen la capacidad de sintetizar antibióticos y generar sustancias promotoras del crecimiento vegetal, (Pandey & Kumar, 1990) además de fijar nitrógeno no simbióticamente, especies como A. chroococcum y A. vinelandii son utilizadas como bioinoculantes en suelos tropicales y alcalinos. Igualmente muchos miembros de la familia Azotobacteraceae son utilizados para producción de compuestos de interés comercial como polisacáridos, (Sabra et al., 2001) vitaminas y pigmentos (Pandey et al., 1998).
2.6 Generalidades del género Azotobacter spp. Los microorganismos de este género comprenden bacterias con forma bacilar, reaccionan a la tinción de Gram como Gram negativos y en cultivos viejos como Gram variables, las células son ovoides y miden aproximadamente de 2µm a 4µm de diámetro, siendo las de mayor tamaño las de A. chroococcum que llegan a medir hasta 6µm, puede llegar a formar cadenas de tamaños variables, la forma de resistencia es el quiste (Figura 2), son aerobios pero algunos pueden vivir en tensiones bajas de oxígeno y su movilidad se debe a flagelos perítricos (Tabla 2), además, producen pigmentos solubles en agua en medios específicos (Tabla 1) (Figura 3) (Saribay, 2003).
Figura 2. Quistes de Azotobacter spp. Fuente: Autor.
En medio libre de nitrógeno con glucosa como única fuente de carbono, las células jóvenes de diferentes especies presentan una forma bacilar con extremos redondeados (Figura 4B). Las células de cultivos viejos tienden a ser elipsoidales y en ciertos casos es común observar gránulos sudanofílicos y metacromáticos (PHBs) (Tejera et al., 2005; Segura & Espín, 1998). Las colonias jóvenes de estos microorganismos son generalmente lisas, opacas poco convexas y viscosas (Figura 4A).
Figura 3. Colonias de diferentes especies de Azotobacter spp. en medio diferencial LG. A) Azotobacter vinelandii DSM2289. B) Azotobacter armeniacus DSM2284 C) Azotobacter paspali DSM2283. Fuente: Aquilanti et al., (a) (2004). Pigmentación de diferentes especies en medio Ashby con benzoato. D) Pigmentación café característica de A. armeniacus, A. chroococcum y A. nigricans. E) Pigmentación negra-café característica de A. nigricans y A. chroococcum. F) Pigmentación verde-amarillo característica de A. vinelandii y A. paspali. Fuente: Autor.
Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del género Azotobacter. Fuente: Holt, 2000
A. A. A. A. A. A. Pigmento vinelandii beijerinckii paspali armeniacus nigricans chroococcum
Amarillo-Verde + - + - - - fluorescente Verde D - - - - - Café-Negro - - - - D D
Café-Negro a - - - + + - Violeta-Rojo Rojos-Violetas D - + + D - D: 11% – 89% de las cepas son positivas a producir pigmento. +: 90% o más de las cepas son positivas a producir pigmento. - : 90% o más de las cepas son negativas a producir pigmento.
Figura 4. A) Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno. B) Morfología de las células de Azotobacter spp. Fuente: Autor.
Bioquímicamente son catalasa y oxidasa positivo, reducen el nitrato, producen el sulfuro de hidrógeno e hidrolizan almidón, producen promotores de crecimiento (giberelinas, auxinas y citoquininas) (Santana et al., 2002), las bacterias de este género fijan asimbióticamente nitrógeno y son solubizadoras de fosfato, además, realizan procesos de biodegradación de plaguicidas como el endosulfan (Castillo et al., 2005). Son quimioorganotróficas, utilizan para su crecimiento azúcares, alcoholes y sales inorgánicas. Son fijadores de nitrógeno en vida libre, fijan al menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido (Holt, 2000).
Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede ser parcialmente reemplazado por vanadio. Al igual que los demás fijadores de nitrógeno Azotobacter sp. es quimioheteròtrofo, utiliza como fuente de carbono y energía una gran variedad de ácidos orgánicos, azúcares o sus derivados alcohólicos como el manitol que es el sustrato más empleado para aislarlos y cultivarlos, dentro las sustancias que utilizan como fuente de carbono y energía se encuentra la fructosa, glucosa, sucrosa, acetato, fumarato, piruvato, succinato, acetilmetilcarbinol y α-oxoglutarato (Tabla 2) (Holt, 2000).
Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas para la caracterización del género Azotobacter spp. Fuente: Holt, 2000
Características y A. A. A. A. A. A. Test/Especie vinelandii beijerinckii paspali armeniacus nigricans chroococcum Movilidad + - + + - -
Filamentos en - b - b + - b - b - b cultivos jóvenes
Oxidasa + D - D D D Peroxidasa + + + D + + Nitrato-Nitrito + + + - + + Meso-inositol + D - D - - Fructosa + + + + + + Glucosa + + + + + + Sucrosa + + + + + + Malonato + + - - D D Benzoato D + - - - + Caproato + - - - - + Caprilato + - - + - - Maltosa + D - + D + Rafinosa D D - D D + Glicerol + D - - - D Sorbitol + D - + D + Manitol + D - + D + Ramnosa + ------b: Estas especies podrían producir esporádicamente filamentos de diferente longitud D: 11% - 89% de las cepas son positivas +: 90% o más de las cepas son positivas - : 90% o más de las cepas son negativas
Respecto a la fuente de nitrógeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y aminoácidos, pero ellos pueden además fijar el nitrógeno del ambiente (Garzón et al., 2001), sin embargo, la adición de nitrato de potasio mejora la producción de biomasa (Santana et al., 2002). Adicionalmente necesita fuente de magnesio, potasio, calcio, hierro y fósforo para realizar la fijación de nitrógeno. Su crecimiento es normal cuando se encuentra a pH de 7.0 - 7.5, requieren una temperatura óptima de 30ºC, susceptibles a pH ácido, (Balandreau, 1986) altas concentraciones de NaCl y temperaturas mayores a 35ºC (Saribay, 2003).
2.6.1 Azotobacter chroococcum. En medios libres de nitrógeno A. chroococcum produce un pigmento café-negro no difusible, estos se producen en presencia de benzoato. También produce pigmentos grises-cafés en medios adicionados con 0.2% de gluconato. Sobre medios libres de nitrógeno esta bacteria forma colonias mucilaginosas pardas las cuales aparecen a las 48 horas a 30ºC. A. chroococcum presenta colonias mucosas opacas, inicialmente el color del pigmento es claro y brillante, pero a medida que la colonia se desarrolla se torna de color café oscuro, la fuente principal de carbono es el manitol (Santana et al., 2002). A. chroococcum puede llegar a crecer en un pH alrededor de 5.5 (Saribay, 2003).
A. chroococcum puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico como amonio, nitrato, nitrito o dinitrógeno, este microorganismo realiza la asimilación de nitrógeno en tres pasos: transporte del nitrato dentro de la célula, reducción del nitrato a nitrito (Nitrato reductasa) y la reducción de nitrito a amonio (Nitrito reductasa), sin embargo, estos pasos requieren de dos condiciones nutricionales, la ausencia de amonio (represor) y la presencia de nitrato o nitrito (inductores). Se ha reportado la presencia de dos polipéptidos con masas moleculares de 22kDa (P22) y 35kDa (P35), la expresión de estos genes es regulada por las fuentes de nitrógeno. La P22 esta asociada a la membrana citoplasmática y es fosforilada en respuesta al nitrato, este polipéptido es una proteína sensorial para la asimilación de nitrato en A. chroococcum (Muñoz et al., 1996).
Además de la fijación de nitrógeno y excreción de amonio al medio, esta especie tiene la propiedad y la capacidad de biodegradar compuestos tóxicos y contaminantes; tener efecto antagónico con patógenos (Hongos y Nematodos), en cultivos agrícolas, solubilizar fosfato tricalcico y producir fitohormonas. Es una bacteria que metaboliza compuestos fenólicos como, ácidos p-hidroxibenzoico, vanilinico, p-cumarico, ferulico y 4-hidroxifenilacetico, compuestos que se encuentran en aguas residuales procedentes de la extracción de aceite de oliva, estos ácidos tienen un efecto antibacterial, fitotóxico y generan coloración a las aguas residuales, debido a esto, son compuestos con alta carga contaminante para el ambiente (Sarybay, 2003; Juárez et al., 2004). Además de esto, tiene la capacidad de degradar plaguicidas cloroaromáticos contaminantes como el
endosulfán por medio de enzimas deshalogenasas, dioxigenasas e hidroxilasas (Castillo et al., 2005). Por otro lado, Sudhir et al.,(1983), reportaron que A. chroococcum tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de Rhizoctonia solani en cultivos de papa a temperaturas de 15°C. Bansal et al., (1999) determinaron el efecto de bacterias rizosféricas en cultivos de maíz infestados con el nematodo patógeno Heterodera avenae, reportando que la máxima reducción de infección la produjo A. chroococcum con un 48% seguido por Pseudomonas con 11% y Azospirillum con 4%.
2.6.2 Azotobacter vinelandii. Azotobacter vinelandii es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de su cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El número de copias varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la fase de crecimiento. Es de tamaño muy grande de 2 a 5 µm de diámetro es decir de 5 a10 veces el volumen de E. coli, se ha asociado el tamaño con la poliploidía (Nagpal et al., 1989).
La capacidad metabólica y genética por las que A. vinelandii ha sido y es objeto de estudio en biofertilización y biotecnología incluyen la fijación de nitrógeno en presencia de oxígeno por tres sistemas diferentes de nitrogenasa; presencia de mecanismos de protección de la nitrogenasa ; alta capacidad respiratoria que en condiciones diazotróficas o de fijación de nitrógeno es hasta 10 veces más alta que la de E. coli ; la formación de estructuras de resistencia frente al estrés ambiental (quistes) y la producción de polímeros de uso industrial como el alginato y el polihidroxibutirato (Espin, 2002). A. vinelandii fija nitrógeno en aerobiosis gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección respiratoria, autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas (Manchal et al., 2000).
A. vinelandii posee tres tipos de nitrogenasas diferentes para la fijación de nitrógeno; la nitrogenasa 1 codificada por el gen nifHDK, la nitrogenasa 2 es dependiente de vanadio y los genes que codifican para las dos proteínas están designados con el nombre de vnf y se encuentran en los operones vnfHorfFd y vnfDGK y la nitrogenasa 3 la cual es fabricada en condiciones deficientes de
molibdeno y vanadio esta codificada por el gen anfHDK (Figura 5) (Betancourt, 2002). La comparación de las secuencias entre estos genes indican que el porcentaje de identidad entre los genes nifH y vnfH es del 88.5%, sugiriendo que provienen de un gen ancestral. Por otro lado, el porcentaje de similitud entre las secuencias de los genes nifH y anfH se encuentra alrededor del 70%. Los genes vnfDK y anfDK muestran una mayor similitud en su secuencia al compararlos con lo genes nifDK, reportando un porcentaje de similitud de 65.8% entre los genes vnfK y anfK y una similitud de 65.8% entre los genes vnfD y anfD (Joerger et al., 1989; Joerger et al., 1990)
Figura 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis de las tres nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de nitrógeno. Fuente: Betancourt, 2002
2.7 Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias diazotrófas Diversos estudios se han realizado en la caracterización, identificación y taxonomía de la diversidad biológica de bacterias diazotrófas. Las técnicas moleculares mas utilizadas a nivel mundial son DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) y la secuenciación. Estas técnicas permiten conocer la diversidad genética de forma precisa en ambientes complejos como la rizosfera en donde pueden habitar las bacterias fijadoras nitrógeno. Los genes nif y el gen DNAr 16S han sido reportados para la caracterización de diferentes géneros diazótrofos, ya que son muy conservados y se encuentran en todos microorganismos fijadores de nitrógeno. Lovell et al., (2000), realizaron un
DGGE para evaluar la diversidad de bacterias diazótrofas en cultivos de Spartina alternifora y realizaron una PCR de genes nifH, logrando identificar bacterias diazótrofas de la subdivisión beta de las proteobacterias. Yeager et al., (2004), realizaron un T-RFLP del gen nifH utilizando la enzima RsaI para caracterizar la comunidad diazótrofa en un bosque australiano el cual había sufrido un incendio forestal, reportando cepas diazótrofas del genero Clostridium y Paenibacillus
R`sch et al., (2002) utilizaron la secuenciación de los genes nifH, nosZ, nirS y nirK para realizar un estudio de diversidad de bacterias diazótrofas y desnitrificantes en bosques de suelos ácidos en Alemania. Igualmente Roesch et al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas asociadas a cultivos de maíz, amplificando el gen nifH del DNA extraído directamente del suelo con iniciadores nifHFor y nifHRev, y realizaron un análisis RFLP con enzimas de restricción TaqI y HaeIII, reportando bacterias del género Herbaspirillum, Azoarcus, Burkholderia y Azospirillum. Además de esto, Soares et al., (2003), realizaron una comparación entre RFLP, RAPD y secuenciación parcial del gen DNAr 16S en cepas de Herbaspirillum en Curitiba (Brasil). Muchos estudios han dado por manifiesto la importancia de las nuevas técnicas moleculares en la caracterización de bacterias diazótrofas, sin embargo, estos estudios son una pequeña muestra de la gran cantidad de investigaciones y de herramientas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias diazótrofas.
2.7.1 Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y taxonomía El DNAr 16S es un polirribunucleotido codificado por el gen rrs también denominado RNA ribosomal 16S, apartir de cuya secuenciación genética se puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el DNAr 16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla (Neffs et al.,1990). En eucariotas el DNAr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que los DNAr 16S y 18S proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo DNAr SSU (del inglés, Small Subunit) se utiliza para ambos (Rodicio & Mendoza, 2004). Los DNAr SSU son altamente conservados, presentando regiones
comunes a todos los organismos, pero contienen variaciones que se concentran en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los DNAr 16S de distintos grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia práctica: La presencia de una o más secuencias características que se denominan oligonucleótidos firma, se trata de secuencias específicas cortas que aparecen en todos (o en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo filogenético, y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos, incluidos los más próximos. Por ello, los oligonucleótidos firma pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo (Rodicio & Mendoza., 2004; Heyndrickx et al., 1996).
La comparación de las secuencias del DNAr 16S es una herramienta poderosa para deducir la filogenia, la evolución y la relación entre bacterias, arqueobacterias y organismos eucariotas. Estas secuencias han sido derivadas previamente de métodos como catalogación de oligonucleotidos, secuenciación de clones, secuenciación directa de DNA usando trascriptasa reversa y secuenciación de material amplificado por reacción de cadena de polimerasa (PCR) (Weisburg et al., 1991). Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al DNAr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarlo.
Este marcador molecular presenta una serie de ventajas: 1) está presente en todos los organismos y tiene la misma función en todos ellos; 2) debido a restricciones estructurales, diferentes regiones de la molécula presentan distinto grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolución; 3) su transmisión es principalmente vertical ya que se considera que no está sujeto a transferencia génica horizontal entre microorganismos; 4) la longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado como para proporcionar suficiente información, con un coste asumible, y 5) el análisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los microorganismos. (Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005).
La identificación basada en la secuenciación del gen que codifica el DNAr 16S en los laboratorios microbiológicos se centra en cepas cuya identificación por métodos fenotípicos resulta imposible, es el caso de bacterias no cultivables, hecho que en ocasiones ha conducido al descubrimiento de nuevos microorganismos; bacterias cuyas características bioquímicas no se adaptan a
las de ningún género o especie reconocido, esta situación puede presentarse cuando se trata de nuevas especies; cepas de especies comunes que exhiben un perfil bioquímico ambiguo; bacterias para las cuales la caracterización fenotípica sea sustancialmente deficiente; bacterias fastidiosas, a consecuencia de sus requerimientos nutricionales complejos y bacterias de crecimiento lento, que retrasa considerablemente la identificación convencional. (Rodicio & Mendoza, 2004)
2.7.2 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA) Una alternativa para buscar la información filogenética y taxonómica que encierra el DNAr 16S es el análisis del patrón electroforético obtenido después de la digestión del gen con enzimas de restricción. La relación matemática entre el número de los sitios compartidos por la enzima de restricción o de los fragmentos compartidos del DNA es lo que entra en discusión para identificar la divergencia genética. Los modelos matemáticos para hallar la similaridad de los patrones de corte se basan en el uso de matrices binarias utilizando coeficientes de similitud como el de Dice, Jaccard, Nei & Li, entre otros. Estos coeficientes permiten agrupar a los morfotipos en clústers que identifican la distancia genética mediante el uso de métodos de análisis de agrupamiento tales como el Neigboring-Joing y UPGMA. En los últimos años, la amplificación del DNAr 16S y el análisis de restricción se ha realizado en diferentes géneros como: Clostridium, Streptocooccus, Mycobacteria, Moraxella, Leptospira Rhizobia, Brevibacterium, Acinetobacter, entre otros (Heyndrickx et al., 1996).
2.7.3 Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y otras bacterias diazótrofas mediante ARDRA El análisis de restricción de DNAr 16S ha sido reportado por muchos autores para realizar caracterización filogenética de baterías diazótrofas, sin embargo, un punto critico de este análisis es la correcta identificación de las enzimas para una caracterización adecuada. Debido a que las endonucleasas reconocen solo ciertas secuencias de nucleótidos, el uso de estas debe generar una diferenciación clara, es decir, deben reconocer sitios de corte en el gen DNAr 16S de diazótrofas y generar morfotipos diferentes para obtener porcentajes de polimorfismo altos, con el fin de diferenciar las secuencias amplificadas. Las herramientas de bioinformáticas han sido fundamentales para los análisis de
restricción ya que permiten simular los cortes de una enzima en determinada secuencia, y de esta forma distinguir las enzimas que pueden proporcionar una mayor información. Existen diferentes programas en internet para realizar restricciones virtuales, entre los que se encuentran el FastPCR, CLC Gen Worbech 2.2.4 y el Webcutter 2.0, además, existen diferentes enzimas de restricción reportadas para la caracterización de diazótrofas. Aquilanti et al., (a) (2004), compararon diferentes métodos de aislamiento preliminar y tomaron muestras de suelo en el centro de Italia para realizar un análisis ARDRA, utilizando los iniciadores universales 27f y1495r, que amplificaban el DNAr 16S completo (1500 bp) para posteriormente realizar una digestión con las enzimas de restricción RsaI y HhaI, identificando miembros de la familia Azotobactereaceae, además especies del género Azomonas, Beijerinckia, Azospirillum y Agrobacterium, reportando que la enzima Rsa I genera un patrón de 5 bandas en la electroforesis para las especies del género Azotobacter.
De la misma forma, Magalãhes et al., (2001), realizaron una caracterización de diazótrofas mediante ARDRA en aislamientos de muestras de suelo obtenidas en cultivos de piña y banano utilizando los iniciadores universales Y1 y Y3 que amplifican aproximadamente 1500 pb, utilizando enzimas de restricción AluI, HaeII, HinfI y RsaI identificando bacterias diazotróficas: Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y Burkholderia tropicalis. Tejera et al., (2005), amplificaron el DNAr 16S utilizando los iniciadores universales 41f y 1488r para especies de Azotobacter y utilizaron las enzimas TaqI, NdeII y MspI para el análisis de restricción, reportando la presencia de A. chroococcum y Azospirillum brasilense en cultivos de caña de azúcar.
Perin et al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas del género Burkholderia aisladas de cultivos de maíz y caña de azúcar en México y Brasil amplificando el DNAr 16S con los iniciadores universales para el dominio bacteria fD1 y rD1 utilizando las enzimas AluI, DdeI, HaeIII, HhaI, HinfI, MspI, y RsaI. Junior et al., (2004), realizaron una identificación de cepas de Azospirillum asociados a Brachiaria spp. utilizando los iniciadores Y1 y Y3 para amplificar el gen DNAr 16S y utilizaron las enzimas HaeIII, AluI, RsaI y CfoI, los patrones de restricción fueron comparados utilizando el coeficiente de Jaccard (Rohlf, 2000) y
los aislados fueron agrupados por el método de medias distancias y representados gráficamente por un dendrograma con el software NTSYS 2.0.
Aquilanti et al., (b) (2004), realizaron un análisis de restricción del DNAr 16S para la caracterización de la familia Azotobactereaceae, utilizando iniciadores universales 27f y 1495r amplificando 1500 bp y posteriormente utilizando unos iniciadores internos Y1 y Y2 amplificando 300 bp en el extremo 5', para después realizar la secuenciación del gen, utilizaron las enzimas RsaI, HhaI, HpaII, FnuDII y AluI e identificaron las diferentes especies del genero Azotobacter, seleccionaron las enzimas con ayuda de una restricción virtual del gen DNAr 16S de secuencias de Azotobacter sp. y Azomonas sp. tomadas del Genbank, utilizaron el programa Genetool software (Version 2.0) (Wishart et al., 2000), los datos los organizaron en una matriz binaria de presencia (0) ausencia (1) de bandas en los patrones de corte. Los diferentes patrones de corte de cada cepa caracterizada con cada enzima fueron diferenciando y definiendo los haplotipos y la combinación de los haplotipos obtenidos con las 5 enzimas fueron agrupados generando los filotipos (Tiedje et al., 1999).
Asi mismo, Aquilanti et al., (b) (2004), hallaron la diversidad de los haplotipos, la cual fue estimada usando el coeficiente de Shannon–Weaver: H= - £pi lnpi, donde pi es la frecuencia de cada haplotipo (Shannon & Weaver, 1949). La distancia genética entre los filotipos fue calculada utilizando el coeficiente de Nei y Li (Nei & Li, 1979), y el resultado de la distancia en la matriz fue usado para el análisis UPGMA y el análisis Neighbor-joining mid-point. La secuencia del gen 16S en todos los aislamientos estudiados fue comparada empleando el programa Basic BLAST y los alineamientos usando el programa CLUSTALW (Higgins et al., 1992) disponible en http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Los autores reportaron el porcentaje de polimorfismo de cada enzima (RsaI 16%, HhaII 24%, AluI 23%, HpaII 22%, FnuDII 15%) y concluyeron que la enzima RsaI posee un bajo porcentaje diversidad 1.79, comparado con las enzimas HpaII y AluI
El análisis de restricción del DNA ribosomal 16S se ha utilizado para filogenia de bacterias fototróficas de Rhizobium (Young et al., 1991), identificación de especies de Micobacterias (Kurabachew et al., 2003), identificación de especies de Actinomyces en aislados de muestras clínicas (Hall et al., 2001), identificación
para delinear las especies del bacterioplancton marino (Hagstrom et al., 2002) y la identificación de diferentes bacterias importantes en biotecnología. Esto demuestra que las técnicas moleculares como el ARDRA son muy útiles en la identificación y caracterización de diferentes grupos de microorganismos y que genera una identificación precisa de bacterias diazótrofas en suelos. Así mismo, se constituye en una herramienta importante en estudios de filogenia, taxonomía y ecología microbiana.
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Los procedimientos convencionales para la caracterización e identificación de microorganismos diazótrofos empleando características fenotípicas, (forma bacteriana, presencia de flagelos y test de Gram) bioquímicas (asimilación de azucares, crecimiento en medios libres de nitrógeno, pruebas de oxidasa y catalasa) y fisiológicas (crecimiento a diferentes temperaturas, condiciones atmosféricas, concentración de sal y valores de pH) son métodos que permiten identificar solamente algunos géneros de bacterias cultivables presentes en un agroecosistema, además, son métodos que manifiestan un mayor grado de ambigüedad entre especies y por esto la identificación y caracterización se hace mas difícil.
Los microorganismos diazótrofos, descritos desde el siglo pasado, han sido objeto no solo de estudio en microbiología de suelos, sino también en el desarrollo de productos biológicos comerciales, especialmente en Cuba, México y Estados Unidos. En este momento en Colombia, donde se han aislado numerosas cepas asociadas a cultivos de importancia agrícola (arroz, caña, maíz, hortalizas, algodón, banano, flores, etc.,), se cuenta con productos comerciales registrados que contienen bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre o simbiótica, con miras a ser utilizados para reducir o complementar la fertilización química nitrogenada. Sin embargo, el control de calidad de estos productos y la caracterización de los aislamientos se dificultan por la similitud macro y microscópica de los mismos, haciendo que los análisis moleculares sean la única herramienta realmente precisa.
El análisis del DNA ribosomal 16S suministra información importante sobre la identidad de bacterias diazótrofas del género Azotobacter, y permite establer las relaciones filogenéticas entre individuos del mismo agroecosistema. El análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado a partir de muestras de suelo de un agroecosistema proporciona un panorama claro de la diversidad presente y lo convierte en una herramienta útil para la caracterización de microorganismos no cultivables, de crecimiento lento o de aquellos con necesidades nutricionales complejas.
La ejecución de esta propuesta pretende caracterizar cepas nativas colombianas de la familia Azotobacteraceae, de la cual muchas especies se utilizan en la industria agrícola como biofertilizantes. Además se procura establecer protocolos de extracción y amplificación de ADN con el fin de validar esta metodología para el control de calidad de bioproductos que contengan bacterias diazótrofas e incluirla en el portafolio de servicios del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general.
9 Caracterizar molecularmente cepas nativas Colombianas de Azotobacter spp. aisladas de cultivos de hortalizas mediante el Análisis de Restricción del DNA Ribosomal 16S Amplificado (ARDRA)
4.2 Objetivos específicos.
9 Aislar cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. en suelos de cultivos de hortalizas ubicados en el departamento de Boyacá
9 Identificar fenotípica y bioquímicamente cepas de Azotobacter spp. aisladas de suelos de cultivos de hortalizas ubicados en el departamento de Boyacá.
9 Estandarizar un protocolo para extraer DNA total y amplificar el DNA ribosomal 16S de cepas nativas de Azotobacter spp.
9 Analizar y comparar los patrones de corte generados por las enzimas de restricción (AluI, HpaII y RsaI) sobre el DNA ribosomal 16S amplificado a partir de cada uno de aislamientos.
9 Realizar un análisis filogenético de las diferentes cepas nativas aisladas.
5. METODOLOGIA 5.1 Lugar de muestreo El muestreo de suelo se realizó en los municipios de Sogamoso y Tibasosa en el departamento de Boyacá. Se muestrearon 6 cultivos de hortalizas (brócoli, calabacín, coliflor, espinaca, tomate y zanahoria).
Se obtuvieron muestras de suelos de cultivos de calabacín (Cucurbita pepo), espinaca (Spinacia oleracea) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en la granja agroindustrial de Cementos Paz del Rio en el municipio de Sogamoso ubicado a 170 Km de la ciudad de Bogotá, la cual cuenta con una ubicación geográfica de 5°43’41’’de latitud norte y 72°55’13’’ longitud oeste, con una temperatura promedio de 17°C y una altura de 2500 msnm. Las muestras de suelos de los cultivos de brócoli (Brassica oleracea itálica); coliflor (B. oleracea botrytis) y zanahoria (Daucus carota var. Sativus) fueron colectadas en una finca particular productora de hortalizas del municipio de Tibasosa, ubicado geográficamente a 5°44’00’’ latitud norte y 73°00’04’’ longitud oeste, cuenta con una temperatura promedio de 15°C y una altura de 2748 msnm. (Figura 6)
Figura 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá.
5.2 Muestreo del suelo De cada cultivo de hortalizas se tomaron cinco muestras de 500g (Figura 7A) a una profundidad de 10 a 15 cm (Martyniuk & Martyniuk 2003; Tejera et al., 2005), el muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo (Torres et
al., 2000). Las muestra se empacaron en bolsas de papel que se colocaron dentro de bolsas de plástico herméticas y posteriormente fueron trasportadas en neveras de icopor a temperatura ambiente al laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana (Figura 7B).
Figura 7. Recolección de las muestras de suelo. A) Muestras de 500 gramos; B) Trasporte de las muestras en bolsas herméticas y neveras de icopor. Fuente: Autor.
5.3 Procesamiento de muestras Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo fueron tamizadas en un tamiz estándar de 4.75 mm (Aquilanti et al., 2004 (a)), con el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el aislamiento primario.
5.3.1 Medición de pH de las muestras de suelo La medición del pH se realizó siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop, 1981; se colocó en un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión se dejó precipitar durante 5 min y se tomó el valor de pH del sobrenadante con un potenciómetro OAKTON®. Los valores de pH fueron promediados a partir de cuatro mediciones en cada cultivo.
5.3.2 Aislamiento primario A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realizó el aislamiento primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; que consiste en colocar 20 gránulos en cajas de Agar Ashby-Sacarosa a una distancia aproximada de 1 cm (Figura 8A) (Anexo 1) (Aquilanti et al., 2004 (a); Pochon, 1975). Las cajas se incubaron a 28°C por 7 días hasta observar alrededor de los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas (Figura 8B). Se realizó el recuento de gránulos con colonias, con el fin de obtener el porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas para cada cultivo
(% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de gránulos sembrados X 100) y se realizó coloración de Gram.
Figura 8. Aislamiento primario. A) Siembra de gránulos en agar Ashby-Manitol; B) gránulos mucilaginosos después de la incubación. Fuente: Autor.
5.4 Aislamiento secundario El aislamiento secundario se realizó mediante siembra por agotamiento en cajas con Agar Ashby-Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas fueron incubadas por 7 días a 28°C, posteriormente se observó el crecimiento en el medio selectivo Ashby-Sacarosa, la morfología de la colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. (Tejera et al., 2005). Las cepas aisladas que presentaron crecimiento en el segundo aislamiento se codificaron de acuerdo al cultivo de donde fueron aisladas.
5.4.1 Conservación de los aislamientos mediante la técnica de criopreservación en glicerol al 50% (v/v) A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizaron cultivos en erlenmeyer de 100ml con 50ml de caldo nutritivo (Anexo 2), el cual se incubó a 28°C por 24 horas con agitación de 150 rpm. El cultivo fue depositado en 10 viales eppendorf de 1.5ml con 50% v/v de glicerol puro y estéril. Los tubos eppendorf se almacenaron en bolsas ziploc a - 80°C (Aquilanti et al., 2004 (a) Poutou et al., 1994).
5.4.2 Pigmentación de los aislamientos Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada aislamiento se realizó una siembra en agar diferencial Ashby con 5g/l de Benzoato (Anexo 1) (Torres et al., 2000) remplazando la fuente de carbono (Sacarosa) en cajas de petri pequeñas para observar la pigmentación en las colonias. La siembra se realizó tomando una colonia de cada aislamiento y
realizando una estría en toda la caja, se incubo a 28°C por 7 días y se observó pigmentación (Figura 9). (Martyniuk & Martyniuk 2002)
.
Figura 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato. Fuente: Autor.
5.4.3 Identificación Bioquímica A cada aislamiento se le realizó una caracterización con base en el comportamiento bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol y ramnosa (Anexo 3) también se realizó una prueba de asimilación y crecimiento en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación en caldo nitrato (Holt, 2000; Tejera et al., 2005). La batería de azúcares fue sembrada con una colonia de cada cepa, se llevó a incubar a 28°C por 24 horas. Posteriormente se verificó la acidificación del medio como indicativo de la fermentación de azúcares y benzoato (Figura 10). Finalmente se realizó la prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa y oxidasa a partir de las colonias. (Anexo 4). Todas las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado.
Figura 10. Baterías bioquímicas de azucares sin sembrar. A) Baterías bioquímicas servidas en placas de 24 pozos; B) Baterías bioquímicas servidas en tubos de 13X100. Fuente: Autor.
5.4.4 Cepa control Para la identificación bioquímica y la caracterización molecular se utilizó una cepa A. vinelandii ATCC No. 12518 como control positivo, además se realizó la caracterización a una cepa de Azotobacter aislada por Toro, (2006) en un cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) en el municipio de Tierra Negra (Boyacá).
5.5 Extracción de DNA Inicialmente la extracción de DNA se realizó siguiendo el protocolo descrito por Aquilanti et al., (a) (2004) Para esto, se tomaron tres colonias y se suspendieron en 500µl de agua destilada estéril. Se llevaron a centrifugar a 5000 rpm por 5 min, el “pellet” obtenido se resuspendió en 100µl de agua estéril más 100µl de Tris-HCL 10mM a pH 8.2. Finalmente se adicionó 0.65µl de proteinasa K (20mg/ml), se llevó a incubar a 55°C por 2 horas, posteriormente se centrifugó a 5000 rpm por 5 min y se tomó 2µl del sobrenadante para la reacción de amplificación (PCR).
Considerando que la extracción a partir de colonias no fue exitosa se procedió a realizar la extracción de DNA a partir de medio de cultivo liquido, siguiendo el protocolo propuesto por Maloy (1989) (http://www.research.umbc.edu), que utiliza solventes orgánicos como Fenol Cloroformo alcohol Isoamílico (FCI) y Cloroformo alcohol Isoamílico (CI) para la remoción de proteína. Este protocolo ha sido utilizado con éxito por investigadores del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (SINCHI) para la extracción de DNA de bacterias diazótrofas. El procedimiento consistió en realizar una suspensión a partir de una colonia de Azotobacter en 5ml de caldo nutritivo en tubo falcón de 15ml la cual se llevó a incubar de forma inclinada 48 horas a temperatura ambiente a 150 rpm. Posteriormente el cultivo se colocó en 2 tubos eppendorf de 1.5ml (c/u con 1.5ml del cultivo); se centrifugaron a 13000 rpm por 2 min y se desechó el sobrenadante.
Las células se resuspendieron en 50µl de TE 1X (Anexo 5) y se reunieron las fracciones en un solo tubo eppendorf de 1.5ml; se agregó 1ml TE de 1X y se lavó suavemente, agitando los tubos; se centrifugó a 13000 rpm/2 min y se descartó el sobrenadante; se resuspendieron las células en 350µl de TE 1X y se adicionó 5µl lisozima (50mg/ml) y 2µl RNAsa A (10mg/ml), se llevó a incubar 10 min a 37ºC; posteriormente se adicionó 3µl proteinasa K (20mg/ml) y 30 µl SDS 10% y se volvió a incubar a 15 min a 65ºC hasta observar una suspensión translúcida que indicará la lisis bacteriana. Una vez lisadas las células, se adicionó 350µl de la mezcla fenol cloroformo alcohol isoamílico (FCI) 25:24:1 (Anexo 6) y se mezcló por inversión 5 veces; se centrifugó el tubo 13000 rpm por 7 min; posteriormente, el sobrenadante se recuperó en un tubo eppendorf de
1.5ml, teniendo cuidado de no tomar la interface ni la fase orgánica (fenol); se adicionó 350µl de una mezcla de cloroformo alcohol isoamílico (CI) 24:1 y se mezcló por inversión 5 veces para volver a centrifugar a 13000 rpm por 7 min;
El sobrenadante obtenido fue transferido a un tubo de vidrio de 13X100 que contenía 1ml de etanol absoluto (98%); se mezcló suavemente hasta observar el DNA suspendido; posteriormente, con ayuda de una pipeta pasteur estéril se tomó el DNA y se colocó en un tubo eppendorf que contenía 500µl de etanol al 70%, posteriormente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min. El pellet de DNA obtenido se dejó secar durante 20 minutos a temperatura ambiente y finalmente fue resuspendido en 50µl de agua destilada estéril para ser utilizado en la reacción de amplificación (PCR).
5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3 Para lograr la amplificación del gen DNAr 16S se utilizaron los iniciadores universales Y1 y Y3 que amplifican una región del DNAr 16S de la posición 20 a la 1507 (1487 pb) de bacterias diazótrofas. (Magalãhes et al., 2001) (Tabla 3). La amplificación se llevó a cabo en un volumen de 100µl que contiene: Buffer 1X;
2mM de MgCl2; 50µM de dNTPs; 0.2µM de iniciador Y1 y 0.2µM de iniciador Y3; 4U de Taq DNA polimerasa recombinante marca Biolase®; en un ensayo preliminar de amplificación con cuatro volúmenes de DNA (1, 2, 3 y 4µl) se determinó que el volumen del molde adecuado para una amplificación exitosa era de 3µl (50ng aproximadamente) (Junior et al., 2004).
La reacción de amplificación (PCR) se llevó a cabó en un termociclador (My cycler de Biorad® con un paso inicial de denaturación de 93ºC por 2 min; 35 ciclos con un programa de temperatura que consiste en: denaturación a 93ºC por 45 seg; anillamiento a 62ºC por 45 seg y elongación a 72ºC por 2 min; y un paso final de extensión de 72ºC por 5 min (Junior et al., 2004).
Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas.
INICIADORES SECUENCIA PARES DE BASES (pb) Y1 Forward 5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3' 24 Y3 Reverse 5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3' 26
Para observar los productos de la amplificación del DNAr 16S se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % (p/v) en TBE 1X (Anexo 7), con 0.5µg/ml de bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm por 1 hora. Se colocaron en cada pozo 15µl del producto de amplificación con 3µl de buffer de carga 6X; se utilizó el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). La visualización de las bandas se realizó en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron fotografiados en el equipo Gel Documentation de Biorad®
5.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA) Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción: AluI, (Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (b)) HpaII (Aquilanti et al., 2004 (b)) y RsaI (Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (a) (b)).
La digestiones se llevaron a cabo por separado con cada enzima en un volumen final de 40µl que contenian: 2.5U de cada una de las enzimas AluI, HpaII y RsaI (Promega®); Buffer 1X; 0.1mg/µl de albumina de suero bovina (BSA); 25µl de producto de amplificación. Todas las digestiones fueron incubadas en baño de agua a 37°C por 3 horas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las enzimas utilizadas y su correspondiente sitio de corte se encuentran en la tabla 4.
Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA.
ENZIMA SITIO DE RESTRICCION AluI (5'- AG / CT - 3') (3'- TC / GA -5') HpaII (5'- C / CG G- 3') (3'- G GC / C-5') RsaI (5'- GT / AC- 3') (3'-CA / TG-5')
5.7.1 Perfil electroforético para el ARDRA Para observar y separar los productos de restricción del DNAr 16S se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 2.5% (p/v) en TBE 1X (0.09M de Tris-base, 0.09M de borato de sodio y 2.4 mM de EDTA, pH 8.3), con 0.5µg/ml de bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara de electroforesis Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm durante 3 horas; Se colocaron en cada pozo 25µl del producto de amplificación con 5µl de buffer de carga 6X; se utilizó el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). Las bandas se
visualizaron en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron fotografiados en el equipo Gel Documentation de Biorad®
5.7.2 Análisis filogenético Las imágenes digitalizadas de los geles producto del ARDRA fueron analizadas con el software Quantity One de Biorad®. Se establecieron los patrones de bandas en cada cepa aislada mediante una matriz básica de presencia y ausencia (1 y 0); los pesos moleculares de cada banda se determinaron mediante un análisis de regresión lineal, teniendo como referencia los pesos moleculares del marcador de 100 pb (Promega®). Posteriormente, se construyó la matriz de similaridad genética utilizando el índice de Dice a partir del cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA y el correspondiente cladograma para cada enzima. Adicionalmente utilizando el programa NTSYS versión 2.0 se realizó un análisis de agrupamiento UPGMA con las tres enzimas empleando el coeficiente de Dice.
5.8 Restricción virtual Con el fin de verificar el nivel de polimorfismo generado por las enzimas(AluI, HpaII y RsaI) se realizó una restricción virtual utilizando el programa CLC Gene Workbench 2.2.4®, Para eso se obtuvieron del Genebank, secuencias parciales del DNAr 16S amplificadas de bacterias diazótrofas de las especies Azotobacter vinelandii (AY336565); A. chroococcum (AY353708); A. paspali (AJ308318); A. salinestris (AB175656); A. armeniacus (AB175655); A. beijerinckii (EF100152); A. nigricans (AB175651); Azospirillum spp. (AF112477); Azomonas macrocytogenes (AB175654); Beijerinckia derxi (AJ563934); Burkholderia tropica (AF164045); Derxia gummosa (AB089482); Herbaspirillum seropedicae (AY191275); Rhizobium leguminosarum (AY509900) y Escherichia coli (AB305017).
Estas secuencias fueron alineadas empleando el programa CLC Gene Workbench 2.3.4. Finalmente, con los patrones electroforéticos obtenidos se realizó el correspondiente agrupamiento (UPGMA) como se describe en 5.7.2 y se generó el cladograma que permitió establecer una comparación de los morfotipos obtenidos con cada enzima en los diferentes aislamientos.
6. RESULTADOS
6.1 Medición de pH de los cultivos muestreados El valor de pH registrado en los suelos muestreados se encuentra cercano a la neutralidad. Para el caso del cultivo de zanahoria se obtuvo un valor de 6.25, mientras que para el cultivo de tomate se registró un valor de 7.44. Estos valores se encuentran en el rango óptimo reportado para el crecimiento de bacterias del género Azotobacter (Tabla 6).
Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo. Fuente: Autor.
Cultivo pH (Promedio) * Brócoli 7.06 Calabacín 6.82 Coliflor 7.12 Espinaca 6.79 Tomate 7.44 Zanahoria 6.25 * Promedio de cuatro mediciones
6.2 Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas Los porcentajes de recuperación se realizaron para cada cultivo, obteniendo un mayor porcentaje en los cultivos de espinaca, tomate y brócoli, sin embargo, en el cultivo de zanahoria se obtuvo el porcentaje de recuperación mas bajo (31.33%). En la tabla 7 se muestran los promedios de gránulos con colonias mucilaginosas y el porcentaje de recuperación en cada cultivo.
Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de recuperación por cultivo. Fuente: Autor.
Promedio* gránulos con colonias Porcentaje de Cultivo mucilaginosas recuperación Brócoli 7.26 36.33 Calabacín 7.00 35.00 Coliflor 6.73 33.66 Espinaca 9.00 45.00 Tomate 7.53 37.66 Zanahoria 6.26 31.33 *Promedio de gránulos con colonia mucilaginosas en las 5 muestras de cada cultivo realizado por triplicado
6.3 Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas En el aislamiento secundario en medio Ashby-Sacarosa se logró obtener un total de 24 aislamientos de bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno asimbióticas (Tabla 7).
Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada cultivo Cultivo Número de cepas aisladas Brócoli 5 Calabacín 4 Coliflor 3 Espinaca 5 Tomate 5 Zanahoria 2
6.3.1 Morfología de las colonias En el total de aislamientos se evidenciaron dos morfologías diferentes de colonias (Figura 11). Las colonias en la mayoría de aislamientos fueron de color crema, medianas, irregulares y brillantes muy similares a la reportadas para el género Azotobacter, sin embargo, se presentaron aislamientos con colonias pequeñas traslucidas y brillantes como en el caso de algunos aislamientos del cultivo de brócoli. En la tabla 8 se muestran los resultados de la morfología de las colonias de todos los aislamientos.
Figura 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas. A) Cepa C5E, colonias color crema, medianas, irregulares y brillantes; B) Cepa C3BR, colonias pequeñas traslucidas y brillantes. Fuente: Autor
6.3.2 Morfología de las células Se logró identificar tres morfologías celulares, se evidenció formación de quistes en algunas cepas, al igual que bacilos Gram negativos, grandes y cortos, estas dos morfologías son similares a las reportadas para el género Azotobacter. Sin
embargo, en algunas cepas se presentaron bacilos Gram negativos, cortos y pequeños (Figura 12). En la tabla 8 se muestran los resultados obtenidos para la morfología celular de todos los aislamientos
Figura 12. Morfología celular de los aislamientos. A) C5CA, quistes; B) CCT, bacilos Gram negativos ovalados y grandes; C) C1BR, bacilos Gram negativos pequeños. Fuente autor
6.3.3 Pigmentación La mayoría de las cepas aisladas no presentaron pigmentación, sin embargo, algunos aislamientos pigmentaron de un color café claro, otros presentaron una pigmentación café-negra y uno solo presento pigmentación verde (Figura 13 y Tabla 8) esta característica de algunas bacterias de género Azotobacter ha sido reportadas por Martyniuk & Martyniuk, 2003; Torres, 2000. Las pigmentaciones de color café o negro son características de las especies de A. armenicus A. nigricans y A. chroorococcum, mientras que la pigmentación amarillo verdosa es característica de las especies de A. vinelandii y A. paspali (Holt, 2000), sin embargo, estas se presentan dependiendo del medio diferencial donde se encuentren o la presencia de un determinado sustrato, tal como lo han reportado Aquilanti et al., (a) (2004); Holt, (2000).
Figura 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato. A) C1T, pigmentación café. B) C5T; pigmentación negra-café; C) C5CA; pigmentación amarillo-verde. Fuente: Autor
Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas encontradas en cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá. Fuente: Autor
Morfología de Morfología Cepa Muestra Lugar Pigmentación la colonia celular ATCC - - A Y Sin pigmentación 12518 CCT Papa Tierra negra A Y Sin pigmentación
C1BR Brócoli Tibasosa A X Sin pigmentación
C2BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación
C3BR Brócoli Tibasosa B Y Sin pigmentación
C4BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación
C5BR Brócoli Tibasosa A Y Sin pigmentación Calabacín C1CA Sogamoso A Y Sin pigmentación
Calabacín C3CA Sogamoso A X Café-Amarillo
Calabacín C4CA Sogamoso A X Café claro
Calabacín C5CA Sogamoso A Z Amarillo-verde
C1CO Coliflor Tibasosa A Y Negra
C4CO Coliflor Tibasosa A Y Sin pigmentación
C5CO Coliflor Tibasosa B Y Sin pigmentación
C1E Espinaca Sogamoso B Y Sin pigmentación
C2E Espinaca Sogamoso A Y Sin pigmentación
C3E Espinaca Sogamoso A Y Café
C4E Espinaca Sogamoso A X Café
C5E Espinaca Sogamoso A Y Café-negro
C1T Tomate Sogamoso A Y Café claro
C2T Tomate Sogamoso A X Sin pigmentación
C3T Tomate Sogamoso B Y Café-Negro
C4T Tomate Sogamoso A Y Café
C5T Tomate Sogamoso A Y Café-Negra
C1Z Zanahoria Tibasosa A Z Sin pigmentación
C2Z Zanahoria Tibasosa B X Sin pigmentación A: Colonias color crema, medianas, irregulares y brillantes. B: Colonias pequeñas traslucidas y brillantes. X: Bacilos Gram negativos pequeños. Y: Bacilos Gram negativos grandes. Z: Quistes (Estructuras de resistencia).
6.4 Identificación Bioquímica La identificación bioquímica se realizó utilizando las técnicas convencionales para la identificación del género Azotobacter, las pruebas empleadas se basan
en la utilización de cuatro azúcares como fuente de carbono, prueba de oxidasa, prueba de catalasa y desnitrificación de nitratos (Figura 14). En la tabla 9 se muestran los resultados de la caracterización bioquímica de todas las cepas aisladas.
Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo (ATCC 12518) y la cepa CCT. Fuente: Autor.
Cepa/Test GLU MAL MAN RAM BNZ OXI CAT NITRATO
ATCC 12518 + + + + D + + NITRITO CCT + + + + + + + NITRITO C1BR - - - - D + + NITRITO C2BR - + + D - - + AMONIO C3BR + D + - - + + NITRITO C4BR ------+ AMONIO C5BR D + + + - + + NITRITO C1CA + + D + + + + AMONIO C3CA - - D - D + + AMONIO C4CA D - - - - + + AMONIO C5CA + + + + + + + NITRITO C1CO D + + - D D + NITRITO C4CO D - - - D + + NITRITO C5CO + - - D - + + AMONIO C1E D - - - - + + AMONIO C2E + + + + + + + NITRITO C3E + + + + + + + NITRITO C4E - - - - D + + AMONIO C5E + D + - D D + AMONIO C1T + - - - - + + AMONIO C2T - D - - - - + NITRITO C3T - - - - - + + AMONIO C4T + + + + + + + NITRITO C5T D + + - D D + AMONIO C1Z + - - - - - + NITRITO C2Z - - - - - + - NITRITO +: Prueba positiva. - : Prueba negativa. D: Bioquímica dudosa.
Figura 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos. A) Acidificación del medio en la asimilación de azúcares; prueba positiva. B) Prueba de oxidasa positiva; C) Prueba de catalasa positiva; D) Prueba de desnitrificación positiva. Fuente: Autor.
De todas las cepas aisladas 10 fueron positivas para glucosa y 6 mostraron un resultado dudoso para este azúcar, estas cepas fueron identificadas como bacterias del género Azotobacter. Adicionalmente, la identidad de la cepa control de A. vinelandii ATCC 12518 fue confirmada mediante las mismas pruebas.
Debido a que los resultados bioquímicos pueden ser ambiguos para diferentes especies de Azotobacter y pueden ocasionar problemas en la identificación y hacerla poco exacta, se tuvieron en cuenta las observaciones macro y microscópicas (morfología de colonia y celular) así como la pigmentación producida en medio Ashby-Benzoato para la identificación preliminar (Tabla 10).
Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos. Fuente: Autor Cepas Aisladas Identificación Preliminar CCT; C5BR; C1CA; C5CA; C2E; C3E; C4T Azotobacter vinelandii C1CO; C5E; C5T Azotobacter chroococcum/ A. nigricans C3BR; C4CA; C4CO; C5CO; C1E; C1T; Azotobacter nigricans C1Z Azotobacter paspali
En la identificación preliminar se evidenció que las cepas C1CO, C5E y C5T presentaron resultados ambiguos para las especies de A. chroococcum y A. nigricans, además de presentar pigmentación café-negra en el medio diferencial Ashby-Benzoato.
6.5 Extracción de DNA Para la extracción de DNA se utilizaron los protocolos descritos por Aquilanti et al., (b) (2004) y Maloy, (1989). En el primer caso la extracción se realizó a partir de colonias crecidas en medio Ashby-Sacarosa. Sin embargo este protocolo no resultó ser exitoso pues a pesar de obtener una cantidad adecuada de DNA, al realizar la amplificación con los iniciadores universales (Y1–Y3) para el gen
DNAr 16S no se obtuvo ninguna banda de amplificación. Debido a esto se decidió utilizar el protocolo propuesto por Maloy, (1989)., que utiliza solventes orgánicos para una eficiente remoción de proteínas y polisacáridos, permitiendo obtener un DNA con mayor pureza y alto peso molecular, lo que garantiza el éxito de la reacción de amplificación. Una vez obtenido el DNA de alto peso molecular (Figura 15 carril 1) se procedió ha realizar la amplificación con los primers Y1 y Y3 y se obtuvo el fragmento de 1487 pb acorde con lo reportado por Magalhães et al, (2001); Junior et al., (2004). Utilizando el protocolo de extracción propuesto por Maloy, (1989) se logró obtener ADN de 14 aislamientos así como del control positivo (cepa de A vinelandii ATCC 12518) y la cepa CCT. Los aislamientos que presentaron extracción de DNA exitosa fueron: C1BR, C3BR, C5BR, C1CA, C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z, estos fueron caracterizados molecularmente por medio del análisis de restricción. El único aislamiento que no se identificó preliminarmente como bacteria del género Azotobacter fue C1BR.
6.6 Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3 Se realizó un ensayo preliminar con dos aislamientos para conocer la cantidad adecuada de molde para la amplificación del DNAr 16S, los resultados evidenciaron que con todos los volúmenes utilizados (1, 2, 3 y 4µl) se obtuvo una banda de amplificación clara de aproximadamente 1490 pb (Figura 15), sin embargo, considerando que la cantidad de DNA en todos los casos no es la misma se decidió utilizar un volumen de 3µl en todas las reacciones. La amplificación del DNAr 16S se realizó para los 14 aislamientos de los cuales se obtuvo DNA, para la cepa control ATCC 12518 y para la cepa CCT.
Figura 15. Amplificación del DNAr 16S de dos cepas aisladas, variando el volumen de molde. 1 y 2) DNA de alto peso molecular de los aislamientos C3E y C5T. 3 y 7) 1µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 4 y 8) 2µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 5 y 9) 3µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 6 y 10) 4µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 11) Agua destilada estéril 12) MPM (100pb). Fuente: Autor.
6.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA) Para el análisis de restricción con la enzimas AluI, HpaII y RsaI se utilizó el gen DNAr 16s amplificado con los primers Y1 y Y3, la visualización de las bandas se realizó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2.0% a 3.2V/cm por 3 horas. (Figura 16, 18 y 20).
6.7.1 Análisis con la enzima AluI Esta enzima generó 8 patrones de restricción o morfotipos diferentes, en donde el morfotipo VIII fue el que generó mayor cantidad de bandas con un total de 12 y los morfotipos I y VI generaron el menor número de bandas con 3 bandas cada uno (Tabla 11).
Figura 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%, digestión con la enzima AluI. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Agua destilada estéril. 10) MPM (100pb). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor.
Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI. Fuente: Autor.
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases I ATCC 12518; CCT; C5CA; C3E 3 558-370-203 II C1BR 4 845-591-217-172 III C3BR; C5CO; C1E; C1T 6 845-591-449-370-217-172 IV C5BR 2 845-591 V C1CA; C2E; C4T 4 591-558-370-203 VI C5E 3 591-370-203 370-300-250-203-172-147-133-116- VII C5T 9 108 845-591-449-370-300-250-203-172- VIII C1Z 12 147-133-116-108
La restricción con esta enzima generó un total de 78 bandas para todas las cepas evaluadas de las cuales 13 bandas fueron polimórficas obteniendo un
porcentaje de polimorfismo de 16.6%. A partir de los diferentes morfotipos de restricción se construyó una matriz de presencia y ausencia (1 y 0) y se realizó el agrupamiento respectivo con el método UPGMA utilizando el coeficiente de similitud de DICE (Anexo 8), este agrupamiento generó un cladograma en el cual se evidencia que todas las cepas evaluadas forman tres grupos (I, II y III). Se observó de manera general que el coeficiente de similitud para las cepas del grupo III (C3E, CCT, C5CA, ATCC 12518, C4T, C2E Y C1CA) fue aproximadamente de 0.80, y presentan un coeficiente de similitud muy bajo aproximadamente 0.30 con respecto a las cepas C1Z y C5T que hacen parte del grupo II. (Figura 17).
Figura 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos. Fuente Autor.
6.7.2. Análisis con la enzima HpaII La restricción con la enzima HpaII generó 12 morfotipos de los cuales el que generó el mayor número de bandas fue el morfotipo IV con 9 bandas, por otro lado, los morfotipos I, VI, IX, X y XI presentaron 6 bandas. El mayor número de cepas se encontró formando parte del morfotipo I que incluye las cepas ATCC 12518, CCT, C2E y C3E (Tabla 12).
Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima HpaII. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo. 10) MPM (100 pb Promega). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor.
Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII. Fuente: Autor.
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases I ATCC 12518; CCT; C2E; C3E 6 511-272-172-144-123-113 II C1BR; C5BR 4 951-636-411-220 III C3BR 8 951-638-411-334-256-239-220-113 IV C1CA 9 951-511-461-411-272-172-144-123-113 V C5CA 7 951-511-272-172-144-123-113 VI C5CO 6 951-411-334-256-239-123 VII C1E 7 951-638-461-411-334-456-239 VIII C5E 4 411-334-256-239 IX C1T 6 951-638-411-220-144-123 X C4T 6 461-272-172-144-123-113 XI C5T 6 677-411-367-272-220-123 XII C1Z 5 677-411-334-256-239
Por otro lado, la restricción con esta enzima generó un total de 92 bandas para las 16 cepas analizadas, de todas las bandas 16 fueron polimórficas, pero ninguna de ellas fue única, esta enzima tiene un porcentaje de polimorfismo de 17.3%. Los resultados del agrupamiento utilizando el coeficiente de Dice (Anexo 9) muestran que las cepas analizadas con esta enzima generan dos grupos diferentes (Figura 19). Las cepas C1CA, C4T, C5CA, C3E, C2E, CCT y ATCC 12518 se agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente de 0.60 (grupo I), encontrándose el mayor coeficiente de similitud (0.95) entre la cepa ATCC 12518 y el aislamiento CCT. De otra parte en el grupo (II), los aislamientos C1T y C5T se agrupan con un coeficiente de similitud de 0.20 con respecto al resto de aislamientos de este grupo.
Figura 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos. Fuente: Autor.
6.7.3. Análisis con la enzima RsaI
La enzima RsaI generó el menor número de morfotipos (solo 7) observándose el menor número de bandas en el morfotipo IV (3 bandas). El morfotipo que incluyó mayor cantidad de aislamientos corresponde al morfotipo I, con el que se obtuvo un patrón de 5 bandas (Tabla 13)
Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima RsaI. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo. 10) MPM (100 pb Promega®), 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor.
Tabla 13. Morfotipos hallados con la enzima RsaI. Fuente: Autor
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de Bases ATCC 12518; CCT; I 5 968-507-457-405-108 C1CA; C5CA; C2E; C4T. II C1BR, C5BR 4 479-405-350-139 III C3BR; C5CO; C1E 6 479-426-405-350-139-108 IV C3E; C5T 3 892-507-108 V C5E 6 640*-426-405-374-350-139 VI C1T 7 479-426-405-374-350-139-108 VII C1Z 7 892-507-426-405-350-139-108 *Banda única.
Esta enzima generó un total de 82 bandas entre los 7 morfotipos de las cuales 13 bandas fueron polimórficas y una de ellas fue única y se encuentra en el morfotipo V generando un porcentaje de polimorfismo de 15.8% y un porcentaje de bandas únicas de 1.2%. En forma general el agrupamiento utilizando el coeficiente de Dice (Anexo 10) y el método UPGMA generó 2 grupos (I y II) en donde las cepas que conforman el grupo (I) tienen un coeficiente de similitud aproximadamente de 0.65, mientras que en el otro grupo (II) las cepas ATCC 12518, CCT, C1CA, C4T y C5CA presentaron un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.85 (Figura 21).
Figura 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos. Fuente: Autor.
6.8 Cladograma generado del análisis con las tres enzimas Para reunir los datos obtenidos de los tres análisis se realizó agrupamiento UPGMA con el coeficiente de Dice utilizando del programa NTSYS 2.0. Los resultados obtenidos muestran que todos los aislamientos junto con la cepa ATCC 12518 forman tres grupos (I, II y III). El grupo I se formó con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.75. En este grupo la cepa ATCC 12518 y el aislamiento CCT presentaron el mayor coeficiente de similitud (1.0) y un coeficiente de similitud de 0.97 con respecto al aislamiento C5CA. El grupo II presentó un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.69 e incluye todos los aislamientos de brócoli. Por otro lado, en el grupo III los aislamientos C5T y C1Z se forma con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.65, además mostraron los morfotipos más disímiles (Figura 22).
Figura 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI, HpaII y RsaI para los aislamientos. Fuente: Autor.
6.9 Restricción virtual. Para la restricción virtual se utilizaron secuencias parciales del gen DNAr 16s de bacterias diazótrofas y de Escherichia coli como control negativo, obtenidas del Genbank (Tabla 14). Los alineamientos, la comparación de las secuencias y el agrupamiento (UPGMA) se realizaron en el software CLC Gen Workbench 2.2.4,
De manera general las secuencias se agruparon en cuatro grupos, en donde en el clúster II se encuentran la mayoría de las especies del género Azotobacter excepto A. chroococcum que se encuentra en el grupo I. Por otro lado, en el grupo III solamente se encuentra la bacteria no fijadora de nitrógeno (E. coli), y en el ultimo grupo se encuentra H. seropedicae, D. gummosa y B. tropica. (Figura 22).
Tabla 14. Secuencias del DNAr 16S obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción virtual.
Microorganismo Accession Secuencia (pb) Iniciadores Publicación A. vinelandii AY336565 1398 27f- 1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b) A. chroococcum AY353708 1383 27f-1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b) A. paspali AJ308318 1384 - Hilario et al., 2004 A. salinestris AB175656 1477 - No publicado A. armeniacus AB175655 1481 - No publicado A. beijerinckii EF100152 1372 - No publicado A. nigricans AB175651 1475 - No publicado Azospirillum spp. AF112477 1457 - Oh et al., 1999 A. macrocytogenes AB175654 1442 - No publicado B. derxi AJ563934 1429 28f-1481r Dedysh et al., B. tropica AF164045 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001 D. gummosa AB089482 1449 8f-1527r Xie & Yokota et al., 2004 H. seropedicae AY191275 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001 R. leguminosarum AY509900 1475 - No publicado E. coli AB305017 1464 - No publicado
Figura 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en el análisis de restricción virtual. Fuente: Autor.
El alineamiento y la comparación de las secuencias mostraron que el mayor porcentaje de similitud se presentó entre las secuencias de A. salinestris y A. armenicus con un 98.58%. Por otro lado, la similitud de las secuencias en las especies del género Azotobacter se encuentra en un rango de 71.92% a
98.58%, siendo A. chroococcum la mas disímil de este grupo. Además, se evidenció que las secuencias de Azospirillum spp. y A. macrocytogenes fueron las mas similares con respecto a las del género Azotobacter. Finalmente se observó que la similitud de las secuencias de E. coli, H. seropedicae, B. tropica y D. gummosa, con respecto a las del género Azotobacter esta en un rango de 74.68% a 83.34%. (Anexo 11).
6.9.1 Análisis virtual con la enzima AluI La restricción virtual realizada con esta enzima mostró que cada secuencia pertenece a un morfotipo distinto, se evidenció que las secuencias del género Azotobacter generan 3 bandas mayores a 100pb, excepto la secuencia de A. chroococcum que produce 6 bandas. Por otro lado las secuencias de B. derxi, B. tropica y R. leguminosarum generaron 5 bandas (Tabla 15). Esta enzima generó un total de 64 bandas de las cuales 30 fueron polimórficas obteniendo un porcentaje de polimorfismo de 48.3% (Figura 24).
Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima AluI en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente Autor.
Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 6 239-208-184-159-144-126 A. vinelandii 4 600-208*-207*-175-162 A. nigricans 4 602-241-208*-207*-162 A. paspali 4 601-370-207-117 A. armeniacus 4 601-370-225-207 A. salinestris 4 601-221-208*-207*-162 A. beijerinckii 4 601-209*-207*-162-108 A. macrocytogenes 4 572-208*-207*-192-162 Azospirillum spp. 3 600-209*-207*-162*-162* B. derxi 5 430-382-231-200-144 D. gummosa 4 571-396-209-152 B. tropica 5 571-396-209-200-147 H. seropedicae 4 427-209-205*-202*-144 R. leguminosarum 5 402-208-207*-207*-184-144 E. coli 4 377-361-221-207 *Pesos moleculares que generan la misma banda en la electroforesis virtual
Figura 24. Restricción virtual con la enzima AluI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor.
Los patrones de corte obtenidos con esta enzima fueron agrupados a por medio del análisis UPGMA (Figura 24) y se determinó su similaridad por medio del coeficiente de Dice (Anexo 12). Los resultados de este análisis mostraron 6 grupos ubicándose la mayoría de las especies de Azotobacter en el grupo IV, sin embargo A. chroococcum, A. paspali y A. armeniacus se encuentran formando parte de otros grupos. (Figura 24). Se logró observar que la similitud entre los patrones de corte generados por las secuencias de A. negricans, A. vinelandii, A. salinestri, Azospirillum spp. y A. beijerinckii fue de aproximadamente 0.85, por otro lado, A. armenicus y A. paspali generaron una similitud aproximada de 0.78 entre ellos y una similitud de 0.60 frente al grupo anteriormente mencionado.
Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
6.8.2 Análisis virtual con la enzima HpaII Con esta enzima cada secuencia formó un morfotipo diferente excepto las secuencias de A. vinelandii y A. negricans, que mostraron un patrón de bandas idéntico en la electroforesis virtual, sin embargo, dos de sus bandas se diferencian por tan solo una base. Las secuencias de A. chroococcum y A. salinestris generaron 5 y 4 bandas respectivamente, mientras que las demás secuencias del género Azotobacter formaron 4 bandas, siendo las secuencias de B. derxi y E. coli las que generaron el mayor número de bandas (Tabla 16). Esta enzima generó un total de 73 bandas y un porcentaje de polimorfismo de 42.4%. (Figura 25).
Tabla 16. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 3 654-271-220 A. vinelandii 4 545-406-128-108 A. nigricans 4 546-406-128-109 A. paspali 4 546-373-129*-128*-108 A. armeniacus 4 656-406-128-118 A. salinestris 5 406*-405*-139-128-118-108 A. beijerinckii 4 547-364-128*-125*-108 A. macrocytogenes 5 546-404-128-112-108 Azospirillum spp. 5 548-449-128-124-108 B. derxi 6 417-287-220-153-142-114 D. gummosa 5 487-423-128-116-108 B. tropica 4 541-277-128-108*-107* H. seropedicae 5 456-423-128-116-108 R. leguminosarum 5 494-402-220-157-121 E. coli 6 476-278-160-135-108-106*-104* *Pesos moleculares que generan la misma banda en la electroforesis virtual
Figura 26. Restricción virtual con la enzima HpaII. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor.
Los patrones de corte fueron agrupados utilizando el análisis UPGMA (Figura 26), el cual fue determinado mediante una matriz de similitud utilizando el coeficiente de Dice (Anexo 13). Este agrupamiento mostró de forma general que las secuencias forman 5 grupos, las secuencias de A. vinelandi y A. macrocytogenes tiene una similitud mayor a 0.85 en el grupo V, las secuencias de A. salinestris y A. armeniacus forman un solo grupo (III), mientras que la secuencia de A. chroococcum forma parte del grupo I.
Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
6.8.3 Análisis virtual con la enzima RsaI Con esta enzima se obtuvieron 14 morfotipos diferentes y un total de 62 bandas que generaron un porcentaje de polimorfismo de 50% (Figura 27). Se encontró que A. armeniacus y A. salinestris, corresponden a un mismo morfotipo con un total de 5 bandas. En el caso de A. chroococcum se obtuvo un patrón de dos bandas, siendo el morfotipo que menor número de bandas presentó (Tabla 17). (Figura 28) (Anexo 14).
Tabla 17. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 2 789-505 A. vinelandii 4 585-356-233-146 A. nigricans 4 652-356-234-146 A. paspali 5 527-356-234-146-121 A. armeniacus 5 635-356-234-146-110 A. salinestris 5 631-356-235-146-110 A. beijerinckii 5 518-357-234-146-117 A. macrocytogenes 5 591-356-234-146-104 Azospirillum spp. 4 838-357-146-116 B. derxi 4 422*-414*-262-142-106 D. gummosa 4 470-404-352-146 B. tropica 4 439-404-390-108 H. seropedicae 4 439-404-348-150 R. leguminosarum 3 825-501-149 E. coli 3 502-457-407 *Pesos moleculares que generan la misma banda en la electroforesis virtual
Figura 28. Restricción virtual con la enzima RsaI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor.
Los morfotipos obtenidos de la restricción virtual formaron 4 grupos. En el grupo IV se encuentran la mayoría de las especies de Azotobacter excepto A. chroococcum, que se encuentra formando parte del grupo III, junto a R. legominosarum y E. coli. La mayoría de especies del género Azotobacter se agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.70 (grupo IV) en este grupo se incluyen las especies A. salinestris y A. armeniacus que presentan el coeficiente máximo de similitud de 1.00.
Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los cultivos de hortalizas son de gran importancia agrícola en nuestro país, ya que son fuente de materias primas para el comercio y la alimentación. Los suelos de estos cultivos poseen bacterias diazótrofas del género Azotobacter que cumplen diferentes roles benéficos como, la fijación del nitrógeno molecular, la producción de fitohormonas (Pandey & Kumar, 1990), la depuración de compuestos tóxicos (Juárez et al., 2004) y mantienen el equilibrio ambiental y ecológico en el agroecosistema. Estas bacterias son utilizadas como biofertilizantes para disminuir el uso de compuestos nitrogenados sintéticos, con el fin darle un valor agregado ecológico al producto, además generar mayor rentabilidad desde el punto de vista económico (Torres, 2000
Para el aislamiento y caracterización molecular de bacterias diazótrofas del género Azotobacter fueron muestreados suelos de diferentes cultivos de hortalizas ubicados en dos municipios en el departamento de Boyacá (Figura 6). Estos suelos fueron tomados en cuenta para el muestreo ya que pertenecen a cultivos de hortalizas fertilizados con gran cantidad de materia orgánica y fosfatos, lo que beneficia la proliferación de bacterias diazótrofas tal como lo reporta Jensen, (1965); Gordon, (1981); Tsain et al., (1979), además de no utilizar, en su esquema de rotación, fertilizantes nitrogenados en exceso que puedan inhibir las bacterias diazótrofas, se evidencio un color oscuro en el suelo lo que hace suponer gran cantidad de materia orgánica presente (Figura 8), además se obtuvo información del manejo de fertilizantes en estos cultivos, suministrada por el Ingeniero agrónomo a cargo de estas plantaciones.
El muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo a una profundidad de 10 a 15cm, con el fin de obtener un buen porcentaje de recuperación bacteriano (Torres et al., 2000; Aquilanti et al., 2004 (a)), aunque los 5 muestreos realizados por cultivo no fueron cuantificados estadísticamente fueron suficientes para el aislamiento. Por otro lado, los cultivos evaluados no eran de gran extensión y las 5 muestras fueron representativas para la recuperación de bacterias diazótrofas asimbióticas aerobias.
Se observó que los suelos de todos los cultivos poseen un pH cercano a la neutralidad (Tabla 5), lo que favorece el aislamiento de bacterias del género Azotobacter, siendo el suelo del cultivo de zanahoria el que presentó un menor valor pH (6.25) lo que posiblemente afectó la recuperación y el crecimiento de bacterias de este género. Aunque se han reportado especies que pueden crecer desde pH alrededor de 5.5 como A. chroococcum y A. vinelandii (Sarybay, 2003), sin embargo, el rango optimo para el crecimiento cuando realizan la fijación de nitrógeno se encuentra entre 7.0 y 7.5 (Balandreau, 1986).
El aislamiento y recuperación se realizó en medio Ashby-Sacarosa, este es un medio diferencial libre de nitrógeno que permite el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno. Debido a que todas las especies de Azotobacter son capaces de utilizar la sacarosa como fuente de carbono (Holt, 2000), el medio fue preparado con 5g/L de sacarosa. Sin embargo se ha reportado que para el aislamiento de A. chroococcum se puede utilizar medio con manitol o benzoato, (Torres et al., 2000), además posee microelementos importantes para la fijación de nitrógeno como el FeSO4 y algunos utilizan Molibdeno como en el caso del medio Jensen`s (Kumar & Narula, 1999).
Los porcentajes de recuperación se presentaron en un rango de 31.3 a 45.0% (Tabla 6), sin embargo, el cultivo de menor porcentaje fue el de zanahoria, lo cual se pudo presentar debido al pH bajo del suelo, así mismo, en este cultivo solamente se logró obtener dos aislamientos (C1Z y C2Z), para los demás cultivos el porcentaje de recuperación se presentó en un rango de 35 a 45%, aunque fueron porcentajes relativamente bajos se lograron aislar 22 cepas fijadoras de nitrógeno aerobias asimbióticas, en donde el mayor número de cepas aisladas se presentó en los cultivos de tomate, espinaca y brócoli (5 aislamientos). Las colonias mucilaginosas obtenidas en los gránulos en el aislamiento primario presentaron quistes formados, esto se debe a que las bacterias de el género Azotobacter cuando provienen del suelo se encuentran en un estado de resistencia a las condiciones ambientales (desecación) (Vela, 1974).
Los 24 aislamientos presentaron dos morfologías de colonias (Figura 11), una de ellas se caracterizó por presentar colonias color crema, medianas, irregulares y
brillantes, morfología reportada para bacterias del género Azotobacter (Aquilanti et al., (a) 2004), sin embargo, algunas presentaron colonias pequeñas traslucidas y brillantes, las cuales pueden ser muy similares a las anteriormente nombradas y presentarse en otros géneros fijadores de nitrógeno asimbióticos como Beijerinckia (Holt, 2000) lo que dificulta la identificación. Los aislamientos que presentaron este tipo de colonia fueron C2BR, C3BR, C4BR, C5CO, C1E, C3T y C2Z; los demás aislamientos presentaron colonias similares a las reportadas por el género Azotobacter (Tabla 8).
La identificación mediante la morfología celular generó tres diferentes formas celulares. En los aislamientos C1Z y C5CA se observaron quistes (Figura 12), estos pueden formarse después de la fase de crecimiento exponencial, cuando las condiciones son adversas por falta de nutrientes o nutrientes complejos como el β-Hidroxibutirato o bien cuando se degradan los PHBs (Hitchins & Sadoff, 1973), también por la acción de iones calcio en el medio (Hitchins & Sadoff, 1970); por otro lado, estas estructuras de resistencia no son formadas exclusivamente por especies del género Azotobacter, sino que también son características de especies del género Beijerinckia, aunque existen diferencias en el número de quistes agrupados, ya que Azotobacter forma pares y Beijerinckia no los agrupa, para el caso de estos dos aislamientos los quistes se agruparon en pares.
Los aislamientos C1BR, C3BR, C4BR, C3CA, C4CA, C4E, C2T Y C2Z presentaron bacilos Gram negativos pequeños, muy similares a los formados por Azospirillum spp., Beijerinckia spp., Herbaspirillum spp. y Derxia spp., el resto de los aislamientos presentaron bacilos Gram negativos grandes como los reportados por Azotobacter spp. (Holt, 2000) (Tabla 8), sin embargo, los aislamientos que presentaron esta morfología posiblemente pudieron germinar y pasar a su forma vegetativa, proceso que ocurre cuando las bacterias crecen con medios libres de nitrógeno y una fuente de azúcar fácil de metabolizar como el manitol o la sacarosa (Hitchins & Sadoff, 1970). En general, esta identificación y caracterización morfológica es muy relevante a la hora de identificar un género bacteriano fijador de nitrógeno y al mismo tiempo ofrece una serie de ventajas para distinguir fenotipos diferentes al manifestado por bacterias del género Azotobacter, tal es el caso de los aislamientos C2BR, C4BR y C2Z, los cuales no
presentaron ninguna homología con las características morfológicas de Azotobacter, pero presentaron una clara fijación de nitrógeno asimbiótica, lo cual sugiere que pueden ser fijadoras de nitrógeno mas no ser del género Azotobacter.
Con respecto a la caracterización fisiológica o a la producción de pigmentos, se evidenciaron tres pigmentaciones diferentes, café claro, café-negro y amarillo verdoso. Según se ha reportado, el género Azotobacter tiene la capacidad de producir pigmentos solubles (Pandey et al., 1998; Holt, 2000 Saribay, 2003), lo que puede ser útil a la hora de caracterizar diferentes especies, sin embargo, de acuerdo con la composición del medio, otras especies como Bejerinckia derxi tiene la capacidad de presentar pigmentaciones solubles de color verde (Holt, 2000). En este caso se observó la pigmentación en un medio Ashby con 5g/L de benzoato, utilizado para diferenciar especies de A. chroococcum y A. negricans, las cuales forman pigmentos oscuros (negros o cafés) (Torres et al., 2000; Martyniuk & Martyniuk 2002).
Los resultados muestran que los aislamientos C1CO, C5E, C1T, C3T, C5T, presentaron características fenotípicas y de pigmentación similares a las presentadas por A. chroococcum y A. nigricans, (Tabla 8), este tipo de pigmentación se debe a que el benzoato es tomado como fuente de carbono y metabolizado por medio de la vía β-cetoadipato, que genera succinato que es introducido a la cadena respiratoria mediante el sistema dependiente de flavina, el cual esta relacionado con la pigmentación del medio. (Castillo, 2005).
Por otro lado, se observó que los aislamientos C3CA y C4E evidenciaron una pigmentación café-amarilla, con bacilos Gram negativos pequeños, diferentes a los de Azotobacter y una identificación bioquímica preliminar negativa para este género; esto indica que pueden ser fijadoras de nitrógeno que pigmentan pero que no son del género Azotobacter o que su identificación bioquímica no fue lo suficientemente clara. Por el contrario los aislamientos C4CA y C3E también pigmentaron café pero a diferencia del resto, el primer aislamiento presentó bacilos Gram negativos pequeños y el segundo fue identificado bioquímicamente como A. vinelandii. Esto demuestra la gran dificultad de caracterizar estos microorganismos por métodos convencionales (Aquilanti et al., (a) 2004).
La identificación bioquímica preliminar se llevó a cabo con base en la utilización de cuatro azúcares y benzoato como fuente de carbono, pruebas de oxidasa y catalasa y desnitrificación de nitrato, estas bioquímicas se utilizaron ya que permiten diferenciar el género Azotobacter, de otras bacteria fijadoras de nitrógeno asimbióticas (Tejera et al., 2005) y así mismo ayuda a diferenciar cada especie, un ejemplo claro de esto es que A. vinelandii es la única especie del género capaz de asimilar la ramnosa y utilizarla como fuente de carbono (Holt, 2000), además todas las especies de este género tiene la capacidad de producir oxidasas para la protección de su nitrogenasa (Thorneley & Ashby, 1989). Los resultados de la identificación bioquímica preliminar muestran que de los 24 aislamientos 16 presentaron un resultado positivo o dudoso para la fermentación de glucosa, sin embargo fueron considerados bacterias del género Azotobacter (Tabla 9), los resultados dudosos se presentaron debido a que en las tres replicas una de ellas generó un resultado diferente, esto pudo ocurrir por la alcalinización del medio después de de la utilización y fermentación del azúcar, o bien por factores externos de contaminación.
La identificación preliminar evaluando los aislamientos mediante la morfología celular y de colonia, la pigmentación y las bioquímicas generó 4 grupos (Tabla 10), el primero conformado por los aislamientos C5BR, C1CA, C5CA, C2E, C3E, C4T los cuales fueron identificados como bacterias de la especie A. vinelandii, el segundo grupo presentó ambigüedad entre las especies de A. chroococcum y A. nigricans, esto ocurrió ya que muchos de sus resultados de las pruebas bioquímicas fueron dudosos pero coinciden con el perfil para estas especies En el tercer grupo se presentaron los aislamientos C3BR, C4CA, C4CO, C5CO, C1E, C1T los cuales se identificaron como A. negricans y en el ultimo grupo una sola cepa del cultivo de zanahoria (C1Z) fue identificada como A. paspali. La cepa control (ATCC12518) presentó un resultado que confirmó su ubicación taxonómica como A. vinelandii, este resultado coincide con el obtenido para la cepa CCT; en ambos casos se presentaron colonias con la morfología típica reportada para el género Azotobacter (Aquilanti et al., 2004 (a)) con la diferencia de no presentarse pigmentación en el medio Ashby-Benzoato, ya que esta especie no es capaz de catabolizar el benzoato (Holt, 2000).
De otra parte, trabajo realizado por Mantilla, 2007 aportó información tendiente a establecer la identidad de la cepa ATCC 12518 con base en la gran producción de ácido indol acético (AIA) característica de las bacterias de este género.
Una vez caracterizados los aislamientos fenotípica y bioquímicamente se procedió a realizar la caracterización molecular. En esta etapa se utilizaron dos protocolos de extracción de DNA, el primero propuesto por Aquilanti et al., 2004 (b), el cual no fue exitoso, ya que al realizar la amplificación con los iniciadores Y1 y Y3 no se obtuvo la banda esperada de 1487pb (Magalãhes et al., 2001), los interferentes de esta extracción pudieron ser de tipo metodológico o externo, ya que se ha reportado que la impureza o baja calidad del DNA puede inhibir el proceso de amplificación (PCR) (White, 1993). Fue por esto que se utilizó el protocolo de extracción reportado por Maloy, 1989, el cual utiliza solventes orgánicos para la remoción de proteínas y polisacáridos, agentes que pueden inhibir la reacción de PCR. Con los aislamientos C1BR, C3BR, C5BR, C1CA, C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z que presentaron una extracción de DNA exitosa, se realizó la amplificación del DNAr 16S y posterior análisis de restricción. La cepa CCT (aislada en otro trabajo y catalogada como Azotobacter) y el control ATCC12518 también fueron evaluadas mediante este análisis molecular.
Los iniciadores universales Y1 y Y3, han sido utilizados en la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001; Junior et al., 2004), sin embargo, no son específicos para bacterias del género Azotobacter, pero ya que en este estudio se realizó una identificación preliminar no fue necesario utilizar iniciadores únicos para el género. La caracterización de bacterias diazótrofas se puede realizar a partir de diversos genes presentes en estos microorganismos que codifiquen para determinadas funciones, como los nif para la nitrogenasa (Roesch et al., 2006), pero debido a las características del gen DNAr 16S y a su trasmisión únicamente vertical, se ha convertido en el cronometro molecular por excelencia. Este gen codifica para el RNAr 16S que hace parte del la subunidad pequeña del ribosoma (SSU) (Weisburg et al., 1991; Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005).
El ARDRA se realizó con tres enzimas de restricción (AluI, RsaI, HpaII), los morfotipos generados con estas enzimas en los aislamientos fueron comparados con los morfotipos generados por las mismas enzimas en secuencias parciales del DNAr 16S de diferentes géneros fijadores de nitrógeno obtenidas del Genbank. De manera general, estas enzimas presentaron porcentajes de polimorfismos altos en el análisis de restricción de los aislamientos, ya que para la enzima AluI el porcentaje fue de 16.6%, para la HpaII fue de 17.3% y para RsaI fue de 15.8%, estos son muy similares a los reportados por Aquilanti et al., (a y b) (2004), por el grado de polimorfismo que son utilizadas en caracterización de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001), ya que permiten una clara diferenciación inter e intraespecífica de bacterias diazótrofas. Se evidenció una relación directamente proporcional entre el porcentaje de polimorfismo y los morfotipos generados, ya que en la enzima RsaI donde se presentó el menor porcentaje de polimorfismo también se obtuvieron menos morfotipos, este resultado es consistente con lo reportado por Aquilanti et al., (b) (2004).
El porcentaje de polimorfismo obtenido en este trabajo fue menor comparado con el generado por la restricción virtual para las tres enzimas. Esto se debió, posiblemente, a que para el análisis virtual, se utilizaron secuencias de diferentes microorganismos (diazotrófos asimbióticos, simbióticos, endófitos y una bacteria no fijadora de nitrógeno), lo que aumentó el grado de polimorfismo y el número de morfotipos, sin embargo, se pudo evidenciar que estas enzimas permiten obtener una clara diferenciación inter e intraespecífica.
Los resultados del análisis UPGMA conjunto para las tres enzimas formo tres grupos (Figura 22). Se evidenció que las cepas C3E, CCT, ATCC 12518, C5CA, C4T, C2E muestran un agrupamiento único en para las tres enzimas, grupo (I). Por otro lado, las cepas C5BR, C1BR, C1E, C3BR, C1T, C5CO se agrupan igualmente con las tres enzimas en otro grupo (II). Caso especial fueron las cepas C5E, C5T y C1Z, que se agruparon en el grupo (III), esto indica que las cepas C5E, C5T y C1Z no generaron un morfotipo similar a ninguno de los demás aislamientos, algo evidente, ya que las cepas C5T y C1Z siempre presentaron morfotipos irregulares para cada enzima y la cepa C5E presentó una banda única con la enzima RsaI; estas bandas únicas son muy especiales,
ya que pueden ser útiles en el diseño de iniciadores específicos para la amplificación mediante la reacción de la polimerasa (PCR).
Se observó que las cepas del grupo (II) incluyen aislamientos encontrados solamente en los cultivos ubicados en el municipio de Sogamoso, mientras que para el grupo (II) y (III) las cepas pertenecen a los cultivos muestreados en los dos municipios. Esto indica que posiblemente los aislamientos generan grupos filogenéticos diferentes de acuerdo a las características del suelo o al tipo cultivo. Por otro lado, no se observó una relación entre los diferentes grupos con respecto al pH del suelo, sin embargo en el grupo II, la mayoría de la cepas fueron aisladas de suelos con valores de pH en un rango entre 7.06 a 7.44.
Al comparar los morfotipos generados del análisis ARDRA en este trabajo y los generados a partir de la restricción virtual de las secuencias obtenidas del Genebank, se observó en algunos casos una gran consistencia entre el número de bandas y sus correspondientes pesos moleculares, sin embargo en otros casos esta consistencia se presenta solo para una o dos de las enzimas. Esto puede deberse a que los iniciadores utilizados (Y1-Y3) no son los mismos que los utilizados para la amplificación de las secuencias reportadas en el Genebank (Tabla 14) y por esto los pesos moleculares de las bandas generadas con las enzimas pueden diferir en unos cuantos pares de bases especialmente en los fragmentos de las regiones flanqueantes del gen, se consideraron bandas similares en la comparación cuando diferían entre 15 a 25pb. Por otro lado, en algunos aislamientos se observó la presencia de bandas de mayor peso molecular después de la digestión con algunas enzimas, hecho que no se presenta en las digestiones virtuales lo que indica que algunas copias del gen no fueron digeridas completamente.
Con respecto al grupo (I) se logró observar que con las tres enzimas todas las cepas mostraron similitud en las bandas generadas con respecto a los patrones de corte de las especies del género Azotobacter utilizadas en la restricción virtual. Sin embargo los patrones de corte no fueron suficientemente claros y se decidió hacer un análisis minucioso de las bandas generadas en cada morfotipo para evidenciar homología. Un ejemplo de esta similitud se generó con la cepa C1CA, la cual presentó para la enzima AluI una similitud de dos bandas con
respecto a la secuencia de A. vinelandii y 4 bandas similares con la enzima HpaII para el mismo microorganismo, sin embargo, con la enzima RsaI no se logró ubicar esta cepa en ningún grupo. Con respecto a la cepa utilizada como control (ATCC 12518) generó una similitud de 2 bandas con la enzima AluI y HpaII, pero al igual que la anterior el morfotipo generado con la enzima RsaI no permitió compararla con ninguna secuencia virtual. Debido a éstos resultados aunque los morfotipos generados no sean completamente exactos el patrón de bandas permite diferenciar de manera parcial cada aislamiento y considerarlo muy similar a bacterias del género Azotobacter.
Con respecto al grupo (II) se logró observar que estas cepas poseen varias bandas similares con las tres enzimas para bacterias del género Azotobacter, sin embargo se encontró una relación muy cercana entre estas y las restricciones virtuales de B. derxi, A. macrocytogenes y Azospirillum spp., un ejemplo claro de esta situación se presento con la cepa C1BR, la cual presentó una similitud de tres bandas con la enzima AluI frente a Azospirillum spp. y de tres bandas frente a A. macrocytogenes pero con las enzimas HpaII y RsaI se presentaron dos bandas similares a B. derxi, además con la enzima RsaI mostró similaridad de cuatro bandas frente a D. gummosa. Posiblemente esta cepa es diferente a las del género Azotobacter ya que su identificación preliminar fue negativa para especies de este género, además su morfología corresponde a bacilos Gram negativos pequeños similares a los de Azospirillum spp. y B. derxi. (Holt, 2000), además siempre se ubicó junto con C5BR en un clúster alejado de los demás aislamientos (Figuras 17, 19 y 21).
Por otro lado, en este mismo grupo, se evidenció que la cepa C5CO tiene una similitud con A. negricans, ya que comparte algunas bandas en sus diferentes morfotipos para las tres enzimas, aunque también comparte algunas bandas con A. vinelandii. Sin embargo la caracterización bioquímica y fenotípica mostró un perfil que se ajusta a la especie A. negricans por lo que se puede concluir que las características bioquímicas, fenotípicas y moleculares permiten ubicarla taxonómicamente como A. negricans.
Con respecto al grupo (III) se observó de manera especial que la cepa C5T generó morfotipos idénticos en las tres enzimas con respecto A. chroococcum,
con diferencias en unas pocas bases, pero con el mismo perfil de corte. Lo que significa que este aislamiento tiene una gran similaridad de secuencia con la utilizada en la restricción virtual para A. chroococcum, se puede concluir que genéticamente este aislamiento puede ser considerado como A. chroococcum, además su identificación bioquímica lo respalda (Tabla 10), así como la pigmentación producida en medio con benzoato (Figura 13 B).
Por otro lado, se logró verificar que el aislamiento C5T aunque presentó unos morfotipos atípicos en todas las enzimas pertenece al género Azotobacter, sin embargo, la secuencia de esta especie es diferente a las demás de este género, esto se observó también en la restricción virtual y en la comparación de los alineamientos de las secuencias obtenidas en el Genbank (Figura 22) ya que formo siempre morfotipos y grupos diferentes a las demás especies de Azotobacter, tal como lo reporta Aquilanti et al., (b) (2004). Las cepas C5E y C1Z las cuales son muy similares a la cepa C5T, mostraron en la comparación con las restricciones virtuales que comparten varias bandas en las tres enzimas con el género A. chroococcum, sin embargo, la cepa C5E es la mas similar, aunque no compartió los mismos sitios de corte con cada enzima, pero observando su pigmentación (Tabla 9) posiblemente se trate de la misma especie. De otra parte la cepa C1Z mostró similitud con otras especies de Azotobacter, por lo que su identificación como A. paspali de acuerdo con las pruebas bioquímicas preliminares, no pudo ser confirmada.
En conclusión, de los 16 aislamientos 14 presentaron similitud genética con respecto a especies del género Azotobacter. De estos, el aislamiento C5T presentó un morfotipo para las tres enzimas idéntico al presentado por la secuencia de A. chroococcum, mientras que los aislamientos C1BR y C5BR presentaron similitud con otros géneros fijadores de nitrógeno como B, derxi, A. macrocytogenes, Azospirillum spp. y D. gummosa. Aunque el análisis molecular es confiable, lo recomendable en estos casos es trabajar con cepas certificadas para tener una comparación clara frente a los aislamientos.
Para finalizar es preciso anotar que las caracterizaciones moleculares mediante ARDRA (Magalãhes et al., 2001; Tejera et al., 2005) DGGE (Lovell et al., 2000), RFLPs (Yeager et al., 2004) y otras técnicas permiten tener una mayor certeza
en la identificación de géneros diazotrófos, sin embargo las técnicas convencionales son de gran ayuda en estas identificaciones. El ARDRA es una de las herramientas mas utilizadas en la caracterización molecular de organismos, ya que permite obtener relaciones filogenéticas entre individuos, además de conocer un poco mas de su estructura genética (Heyndrickx et al., 1996). Las enzimas utilizadas en este tipo de análisis deben generar un alto grado de polimorfismo, que permitan observar diferencias significativas inter o intraespecíficas. Para esto las ayudas bioinformaticas son fundamentales ya permiten clasificar enzimas que generen polimorfismo para grupos específicos y así evitar altos costos en análisis inútiles además de ser indispensables en estudios de biodiversidad, bioprospección y biotecnología.
8. CONCLUSIONES
El suelo muestreado en cultivos de hortalizas en dos municipios del departamento de Boyacá presentó valores de pH adecuados y determinantes para la recuperación de bacterias diazótrofas del género Azotobacter.
La caracterización fenotípica y bioquímica permitió identificar 17 aislamientos presuntivos como especies del género Azotobacter, sin embargo, se presentaron resultados ambiguos y dudosos.
Utilizando el protocolo de Maloy, (1989), se logró extraer DNA bacteriano con una pureza y calidad adecuadas para amplificar el gen DNAr 16S de bacterias diazótrofas, utilizando los iniciadores universales Y1-Y3.
El análisis de restricción del DNA ribosomal amplificado (ARDRA) con las enzimas AluI, HpaII, y RsaI género porcentajes de polimorfismo de aproximadamente 16%, obteniéndose el mayor valor con la enzima HpaII. Esto permitió agrupar los aislamientos de bacterias del género Azotobacter en tres grupos de similaridad, El grupo I el cual se formó con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.8 incluye los aislamientos mas similares genéticamente a las especies del género Azotobacter.
El aislamiento CCT proveniente de un cultivo de papa presentó el máximo valor de similitud (1.0) con respecto a la cepa de Azotobacter vinelandii ATCC 12518, lo que sugiere que puede tratarse de esta especie. En el caso del aislamiento C1CA se presentó un coeficiente de similitud de 0.95 con respecto a las anteriormente mencionadas, indicando que también puede tratarse de A. vinelandii. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos para la restricción virtual y las pruebas bioquímicas preliminares.
El análisis de restricción virtual con secuencias obtenidas del Genbank permitió establecer comparaciones útiles para aclarar la ubicación taxonómica e identificación de algunos aislamientos de bacterias diazótrofas provenientes de cultivos de hortalizas. Esto demuestra la importancia de las herramientas bioinformaticas como apoyo en estudios de diversidad.
Mediante la combinación de métodos convencionales y moleculares se logró caracterizar de manera precisa como A. chroococcum un aislamiento proveniente de un cultivo de tomate del municipio de Sogamoso y con una alta similaridad como A. vinelandii los aislamientos C5CA y CCT, provenientes de cultivos de calabacín y papa respectivamente.
9. RECOMENDACIONES
Utilizar diferentes medios y sustratos para verificar la pigmentación de otras especies del género Azotobacter y verificar el comportamiento bioquímico frente a una mayor cantidad de sustratos.
Realizar pruebas fisicoquímicas del suelo muestreado, con el fin de obtener mayor información del agroecosistema y de esta forma conocer la función de las bacterias aisladas en estos cultivos.
Realizar pruebas de AIA para identificar la producción de esta fitohormona y pruebas de reducción de acetileno.
Con el fin de amplificar DNAr 16s de bacterias del género Azotobacter se debe trabajar en el diseño de primers específicos y de esta forma tener mayor exactitud en la caracterización.
Utilizar un mayor número de enzimas de restricción, con el fin de obtener más información de las secuencias del gen DNAr 16s de bacterias del género Azotobacter.
Se sugiere utilizar en estos casos cepas certificadas para obtener una comparación realmente clara de los aislamientos en las restricciones virtuales, además con el fin de identificarlos plenamente se debe secuenciar el gen completa o parcialmente (Y1-Y2).
Realizar caracterización con genes nif y comparar los resultados con las realizadas en base al DNAr 16S
9. REFERENCIAS.
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11. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIO AGAR ASHBY COMPOSICION g/l Sacarosa/Manitol o Benzoato 5
KH2PO4 1
MgSO4.7H2O 0.2
FeSO4. 7H2O 0.005 NaCl 0.2
CaCl2. 2H2O 0.2 Agar 15 pH 7.0 (+/- 0.2). Fuente: Martínez, 2003
ANEXO 2. CALDO NUTRITIVO Scharlau chemie® COMPOSICION g/l Extracto de carne 3.0 Extracto de peptona 5.0
ANEXO 3. PREPARACION DE AZUCARES Merck® COMPOSICION g/l Base rojo de fenol (caldo) 15 Azúcar (Maltosa; Manitol; Glucosa; Ramnosa)* 1 *Para la preparación con el benzoato se agrega igualmente un gramo por litro de medio.
ANEXO 4. PRUEBA DE OXIDASA Y CATALASA. Fuente: Escobar, 2002.
Prueba de oxidasa: Coloque sobre una tira de papel filtro, puesta sobre una lamina, varias gotas del reactivo recién preparado de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua destilada estéril. Con un palillo tome una colonia del microorganismo y frótela sobre el papel humedecido. La prueba de oxidasa indica la presencia de enzimas oxidativas, denominadas citocromos, que son porfirinas, que contiene hierro y se encuentran en la cadena respiratoria, pues participan en el trasporte de electrones. Una prueba positiva de oxidasa se
determina por el cambio de color de azul a púrpura después de diez segundos de poner al microorganismo con el reactivo
Prueba de catalasa: Esta se leva a cabo con el fin de comprobar la presencia de la enzima catalasa. Con un asa de siembra se recogió el centro de una colonia pura de 18 a 24 h de incubación en TSA y se extendió sobre un portaobjetos, luego con un gotero se agrego una gota de HO2 al 3%. La formación de burbujas indica la liberación de O2 característico de un resultado positivo.
ANEXO 5. PREPARACION DE TE 1X COMPOSICIÓN CANTIDAD/ 100ml Tris 10mM 1ml EDTA 1mM 0.08ml Agua destilada 39.52ml
ANEXO 6. PREPARACION DE FCI (25:24:1) y FC (24:1)* COMPOSICIÓN CANTIDAD/ 100ml Fenol 50ml Cloroformo 48ml Alcohol Isoamílico 2ml *Para la preparación del FC no se utiliza el fenol
ANEXO 7 PREPARACION DE TBE 5X* COMPOSICIÓN CANTIDAD/ 200ml Tris 10.8 g Acido bórico 5.5g EDTA 4ml *Para la preparación del TBE 1X se diluye con agua destilada. Fuente: Sambrook. 1989.
ANEXO 8. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA AluI ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1Z ATCC 100.0 93.9 0.0 26.5 0.0 86.6 97.3 13.7 19.5 85.7 83.4 50.0 11.3 90.7 35.2 32.6 CCT 93.9 100.0 0.0 24.6 0.0 90.5 92.5 14.2 20.2 89.0 83.1 52.3 11.8 88.0 36.1 34.2 C1BR 0.0 0.0 100.0 72.4 49.7 15.9 0.0 76.9 60.7 15.5 0.0 29.8 85.2 14.7 16.5 36.0 C3BR 26.5 24.6 72.4 100.0 42.2 36.0 27.0 86.8 83.4 36.3 29.6 42.7 82.2 36.4 27.3 52.9 C5BR 0.0 0.0 49.7 42.2 100.0 19.8 0.0 38.7 53.7 19.3 0.0 32.3 39.3 18.2 0.0 21.2 C1CA 86.6 90.5 15.9 36.0 19.8 100.0 85.2 26.2 31.3 98.1 76.9 65.1 25.2 95.6 34.2 40.8 C5CA 97.3 92.5 0.0 27.0 0.0 85.2 100.0 14.0 19.9 84.2 86.0 51.5 11.6 90.0 35.8 31.2 C5CO 13.7 14.2 76.9 86.8 38.7 26.2 14.0 100.0 83.8 26.0 15.5 46.2 87.3 25.1 23.7 52.9 C1E 19.5 20.2 60.7 83.4 53.7 31.3 19.9 83.8 100.0 31.1 21.9 46.5 72.0 30.2 21.3 49.8 C2E 85.7 89.0 15.5 36.3 19.3 98.1 84.2 26.0 31.1 100.0 78.9 65.4 25.0 94.8 34.5 40.8 C3E 83.4 83.1 0.0 29.6 0.0 76.9 86.0 15.5 21.9 78.9 100.0 52.5 13.0 78.2 31.2 26.8 C5E 50.0 52.3 29.8 42.7 32.3 65.1 51.5 46.2 46.5 65.4 52.5 100.0 37.5 63.1 30.5 41.7 C1T 11.3 11.8 85.2 82.2 39.3 25.2 11.6 87.3 72.0 25.0 13.0 37.5 100.0 24.0 22.8 43.8 C4T 90.7 88.0 14.7 36.4 18.2 95.6 90.0 25.1 30.2 94.8 78.2 63.1 24.0 100.0 34.0 38.9 C5T 35.2 36.1 16.5 27.3 0.0 34.2 35.8 23.7 21.3 34.5 31.2 30.5 22.8 34.0 100.0 76.5 C1Z 32.6 34.2 36.0 52.9 21.2 40.8 31.2 52.9 49.8 40.8 26.8 41.7 43.8 38.9 76.5 100.0
ANEXO 9. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA HpaII ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1Z ATCC 100.0 94.0 0.0 17.4 0.0 62.7 70.8 8.4 0.0 84.0 81.3 0.0 19.1 64.3 24.4 0.0 CCT 94.0 100.0 0.0 17.3 0.0 59.5 70.5 13.8 0.0 83.2 83.2 0.0 24.5 64.8 26.8 0.0 C1BR 0.0 0.0 100.0 51.8 81.7 24.4 17.7 40.3 66.7 0.0 0.0 15.3 43.4 0.0 20.0 17.1 C3BR 17.4 17.3 51.8 100.0 50.1 25.3 14.5 48.9 63.6 15.4 9.9 45.2 39.4 11.1 15.2 54.8 C5BR 0.0 0.0 81.7 50.1 100.0 16.4 16.4 37.8 55.4 0.0 0.0 13.9 53.0 0.0 25.1 9.3 C1CA 62.7 59.5 24.4 25.3 16.4 100.0 60.1 18.6 24.2 56.8 65.6 9.8 35.8 58.3 24.5 13.6 C5CA 70.8 70.5 17.7 14.5 16.4 60.1 100.0 18.8 14.0 77.2 62.9 0.0 25.6 61.4 24.4 0.0 C5CO 8.4 13.8 40.3 48.9 37.8 18.6 18.8 100.0 61.4 5.7 17.3 31.4 26.8 10.2 19.2 39.0 C1E 0.0 0.0 66.7 63.6 55.4 24.2 14.0 61.4 100.0 0.0 0.0 49.0 29.8 4.0 9.6 46.1 C2E 84.0 83.2 0.0 15.4 0.0 56.8 77.2 5.7 0.0 100.0 72.0 0.0 17.2 67.6 24.6 0.0 C3E 81.3 83.2 0.0 9.9 0.0 65.6 62.9 17.3 0.0 72.0 100.0 0.0 17.1 60.5 28.4 0.0 C5E 0.0 0.0 15.3 45.2 13.9 9.8 0.0 31.4 49.0 0.0 0.0 100.0 10.5 0.0 10.8 60.7 C1T 19.1 24.5 43.4 39.4 53.0 35.8 25.6 26.8 29.8 17.2 17.1 10.5 100.0 19.5 48.4 15.1 C4T 64.3 64.8 0.0 11.1 0.0 58.3 61.4 10.2 4.0 67.6 60.5 0.0 19.5 100.0 27.8 0.0 C5T 24.4 26.8 20.0 15.2 25.1 24.5 24.4 19.2 9.6 24.6 28.4 10.8 48.4 27.8 100.0 32.3 C1Z 0.0 0.0 17.1 54.8 9.3 13.6 0.0 39.0 46.1 0.0 0.0 60.7 15.1 0.0 32.3 100.0
ANEXO 10. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA RsaI ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1Z ATCC 100.0 84.1 18.6 38.5 18.7 82.0 83.0 42.5 29.7 71.3 48.8 17.7 35.4 86.9 43.3 45.0 CCT 84.1 100.0 22.6 34.0 18.8 87.4 91.8 37.3 28.8 63.1 54.0 15.8 35.2 87.9 41.6 40.5 C1BR 18.6 22.6 100.0 71.8 92.8 25.6 24.4 69.1 77.6 14.2 0.0 61.2 77.7 25.5 0.0 45.8 C3BR 38.5 34.0 71.8 100.0 76.3 30.4 32.4 92.8 92.6 22.4 23.7 66.0 89.1 33.6 17.7 65.6 C5BR 18.7 18.8 92.8 76.3 100.0 21.4 20.3 71.5 83.1 14.3 0.0 63.1 79.3 21.2 0.0 45.8 C1CA 82.0 87.4 25.6 30.4 21.4 100.0 94.2 34.0 32.1 66.5 43.5 17.9 32.0 93.2 46.2 44.8 C5CA 83.0 91.8 24.4 32.4 20.3 94.2 100.0 36.0 30.8 64.1 44.6 17.1 33.8 94.3 45.6 43.4 C5CO 42.5 37.3 69.1 92.8 71.5 34.0 36.0 100.0 86.8 23.1 24.5 62.7 85.9 37.3 18.3 65.4 C1E 29.7 28.8 77.6 92.6 83.1 32.1 30.8 86.8 100.0 22.3 14.7 67.4 87.8 31.9 15.7 64.9 C2E 71.3 63.1 14.2 22.4 14.3 66.5 64.1 23.1 22.3 100.0 31.0 13.5 21.0 68.8 34.0 35.2 C3E 48.8 54.0 0.0 23.7 0.0 43.5 44.6 24.5 14.7 31.0 100.0 0.0 21.4 41.0 87.6 55.6 C5E 17.7 15.8 61.2 66.0 63.1 17.9 17.1 62.7 67.4 13.5 0.0 100.0 59.1 17.8 0.0 57.9 C1T 35.4 35.2 77.7 89.1 79.3 32.0 33.8 85.9 87.8 21.0 21.4 59.1 100.0 34.9 16.6 58.3 C4T 86.9 87.9 25.5 33.6 21.2 93.2 94.3 37.3 31.9 68.8 41.0 17.8 34.9 100.0 41.9 44.3 C5T 43.3 41.6 0.0 17.7 0.0 46.2 45.6 18.3 15.7 34.0 87.6 0.0 16.6 41.9 100.0 61.8 C1Z 45.0 40.5 45.8 65.6 45.8 44.8 43.4 65.4 64.9 35.2 55.6 57.9 58.3 44.3 61.8 100.0
ANEXO 11. PORCENTAJE DE SIMILITUD DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS DEL GENBANK
ANEXO 12. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA AluI A. chroococcum A. vinelandii A. nigricans A. paspali A. armeniacus A. salinestris A. beijerinckii A. macrocytogenes Azospirilllum spp. B. derxi D. gummosa B. tropica H. seropedicae R. leguminosarum E. coli A. chroococcum 100.0 22.6 36.4 20.0 20.0 22.6 23.4 22.6 24.3 18.1 19.9 17.9 36.4 25.4 20.0 A. vinelandii 22.6 100.0 78.4 47.1 47.1 78.5 75.5 57.2 84.0 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1 A. nigricans 36.4 78.4 100.0 47.3 47.2 78.5 75.4 57.1 83.9 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1 A. paspali 20.0 47.1 47.3 100.0 75.0 47.2 46.3 29.4 48.6 0.0 24.9 21.9 22.0 0.0 24.9 A. armeniacus 20.0 47.1 47.2 75.0 100.0 47.1 46.2 29.4 48.5 0.0 24.8 21.9 22.0 0.0 24.9 A. salinestris 22.6 78.5 78.5 47.2 47.1 100.0 75.5 57.2 84.1 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.2 A. beijerinckii 23.4 75.5 75.4 46.3 46.2 75.5 100.0 56.6 85.0 0.0 30.4 26.1 26.3 0.0 30.5 A. macrocytogenes 22.6 57.2 57.1 29.4 29.4 57.2 56.6 100.0 64.0 0.0 46.9 40.7 25.3 0.0 29.2 Azospirilllum spp. 24.3 84.0 83.9 48.6 48.5 84.1 85.0 64.0 100.0 0.0 31.9 27.2 27.4 0.0 32.0 B. derxi 18.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 19.9 20.2 14.6 0.0 D. gummosa 19.9 29.1 29.1 24.9 24.8 29.1 30.4 46.9 31.9 0.0 100.0 44.0 22.0 0.0 24.8 B. tropica 17.9 25.1 25.1 21.9 21.9 25.1 26.1 40.7 27.2 19.9 44.0 100.0 19.8 0.0 21.9 H. seropedicae 36.4 25.3 25.3 22.0 22.0 25.3 26.3 25.3 27.4 20.2 22.0 19.8 100.0 14.6 22.0 R. leguminosarum 25.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 14.6 0.0 0.0 14.6 100.0 30.2 E. coli 20.0 29.1 29.1 24.9 24.9 29.2 30.5 29.2 32.0 0.0 24.8 21.9 22.0 30.2 100.0
ANEXO 13. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA HpaII A. chroococcum A. vinelandii A. nigricans A. paspali A. armeniacus A. salinestris A. beijerinckii A. macrocytogenes Azospirilllum spp. B. derxi D. gummosa B. tropica H. seropedicae R. leguminosarum E. coli A. chroococcum 100.0 0.0 0.0 0.0 28.5 0.0 0.0 0.0 0.0 22.2 0.0 0.0 0.0 24.8 0.0 A. vinelandii 0.0 100.0 75.1 65.0 50.1 60.0 59.3 88.8 64.9 0.0 44.4 64.2 44.4 21.9 16.5 A. nigricans 0.0 75.1 100.0 47.4 50.2 43.5 36.7 66.9 42.8 0.0 22.5 35.2 22.5 21.9 0.0 A. paspali 0.0 65.0 47.4 100.0 29.5 39.0 48.0 56.9 54.7 0.0 41.3 63.9 41.2 0.0 13.3 A. armeniacus 28.5 50.1 50.2 29.5 100.0 60.2 14.1 44.6 20.8 0.0 22.4 17.7 22.4 21.8 0.0 A. salinestris 0.0 60.0 43.5 39.0 60.2 100.0 29.9 53.0 29.4 0.0 29.6 38.7 29.6 23.0 12.8 A. beijerinckii 0.0 59.3 36.7 48.0 14.1 29.9 100.0 53.4 70.2 0.0 32.9 57.8 32.9 0.0 15.3 A. macrocytogenes 0.0 88.8 66.9 56.9 44.6 53.0 53.4 100.0 58.4 0.0 40.1 56.3 40.1 19.8 15.1 Azospirilllum spp. 0.0 64.9 42.8 54.7 20.8 29.4 70.2 58.4 100.0 0.0 38.5 55.7 38.5 0.0 15.0 B. derxi 22.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 18.0 0.0 D. gummosa 0.0 44.4 22.5 41.3 22.4 29.6 32.9 40.1 38.5 0.0 100.0 40.9 80.0 19.9 15.1 B. tropica 0.0 64.2 35.2 63.9 17.7 38.7 57.8 56.3 55.7 0.0 40.9 100.0 40.8 0.0 31.9 H. seropedicae 0.0 44.4 22.5 41.2 22.4 29.6 32.9 40.1 38.5 0.0 80.0 40.8 100.0 0.0 15.1 R. leguminosarum 24.8 21.9 21.9 0.0 21.8 23.0 0.0 19.8 0.0 18.0 19.9 0.0 0.0 100.0 0.0 E. coli 0.0 16.5 0.0 13.3 0.0 12.8 15.3 15.1 15.0 0.0 15.1 31.9 15.1 0.0 100.0
ANEXO 14. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA RsaI A. chroococcum A. vinelandii A. nigricans A. paspali A. armeniacus A. salinestris A. beijerinckii A. macrocytogenes Azospirilllum spp. B. derxi D. gummosa B. tropica H. seropedicae R. leguminosarum E. coli A. chroococcum 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 39.8 40.0 A. vinelandii 0.0 100.0 74.9 66.6 66.5 66.6 66.5 88.7 49.8 0.0 24.8 0.0 0.0 0.0 0.0 A. nigricans 0.0 74.9 100.0 66.8 66.7 66.7 66.6 66.9 49.7 0.0 24.8 0.0 0.0 0.0 0.0 A. paspali 0.0 66.6 66.8 100.0 60.0 60.1 60.0 60.2 44.2 0.0 22.1 0.0 0.0 0.0 0.0 A. armeniacus 0.0 66.5 66.7 60.0 100.0 99.9 59.9 60.1 44.1 0.0 22.0 0.0 0.0 0.0 0.0 A. salinestris 0.0 66.6 66.7 60.1 99.9 100.0 59.9 60.2 44.2 0.0 22.1 0.0 0.0 0.0 0.0 A. beijerinckii 0.0 66.5 66.6 60.0 59.9 59.9 100.0 60.0 44.3 0.0 22.0 0.0 0.0 0.0 0.0 A. macrocytogenes 0.0 88.7 66.9 60.2 60.1 60.2 60.0 100.0 44.3 0.0 22.1 0.0 0.0 0.0 0.0 Azospirilllum spp. 0.0 49.8 49.7 44.2 44.1 44.2 44.3 44.3 100.0 0.0 24.8 0.0 0.0 0.0 0.0 B. derxi 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 D. gummosa 0.0 24.8 24.8 22.1 22.0 22.1 22.0 22.1 24.8 0.0 100.0 25.0 25.2 0.0 28.7 B. tropica 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.0 100.0 50.0 0.0 28.4 H. seropedicae 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.2 50.0 100.0 0.0 28.6 R. leguminosarum 39.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 33.2 E. coli 40.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 28.7 28.4 28.6 33.2 100.0