Fundamentos Y Metodologías Innovadoras Para El Mejoramiento Genético De Maíz

Fundamentos y Metodologías Innovadoras para el Mejoramiento Genético de Maíz

Dr. Axel Tiessen Favier ii

Fundamentos y Metodologías Innovadoras para el Mejoramiento Genético de Maíz

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Fundamentos y Metodologías Innovadoras para el Mejoramiento Genético de Maíz

PRIMERA EDICIÓN Versión 1.36 19 de Julio del 2009 Editorial Fundación Ciencia Activa ISBN: 978-970-95522-3-2 1. Plantas – Maíz 2. Fitomejoramiento – Cultivos 3. Biotecnología – Ingeniería Genética 4. Genómica – Marcadores moleculares 5. Estadística – Bioinformática 6. Fisiología vegetal – Bioquímica 7. Tolerancia a Sequía – Calidad Nutricional

Editor

Dr. Axel Tiessen Favier Profesor-Investigador del Departamento de Ingeniería Genética CINVESTAV Irapuato México

Nota de Copyright: Este documento puede ser reproducido libremente para fines educativos sin ánimos de lucro siempre y cuando se cite a todos los autores.

Autores Contribuyentes

Autor Contribución Capítulos Dr. Axel Tiessen Favier 7.8 MB 1-19 CINVESTAV Irapuato Dr. Fernando Gómez 900kB 6 Merino Colegio de Posgraduados Dra. Libia Iris Trejo 800kB 6 Téllez Colegio de Posgraduados Biol. Alejandro López 200kB 18-19 Fabre CINVESTAV Irapuato Mtro. Daniel Padilla 100kB 9 Facultad de Química UNAM Mtra. Erandi Vargas 250kB 8-10 CINVESTAV Irapuato Dr. Pedro Rocha 1kB 4 Salvarrieta Colombia Dr. Misael Lopez 1kB 17 Lozano Universidad Juarez del Estado de Durango Dra. Natalia Palacios 1kB 8 Rojas CIMMYT Dra. Esperanza Torres 1kB 11 Universidad Nacional de Colombia Dr. Silverio Garcia 1kB 12-15 Lara Tecnológico de Monterrey

Indice Página

1. Prólogo 10 2. Introducción 22 3. Herramientas Moleculares 80 4. Detección de polimorfismos genéticos 103 5. Genómica y regulación 130 6. Factores de Transcripción 152 7. Herramientas Bioinformáticas 189 8. Herramientas Estadísticas 206 9. Biología de sistemas 257 10. Herramientas Bioquímicas 263 11. Fisiología vegetal 307 12. Crecimiento, desarrollo y reproducción 375 13. Transferencia Genética 406 14. Genética de Poblaciones 428 15. Genética cuantitativa 442 16. Mapas genéticos 447 17. Metodologías de Mejoramiento 463 18. Mejoramiento Genético de Maíz 503 19. Anexos 509

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Tabla de Contenido

1. Prólogo 10 1.1. Presentación y enfoque ...... 10 1.2. Distribución abierta ...... 11 1.3. Lenguaje científico ...... 12 1.4. Grupos de usuarios...... 13 1.5. Motivación para estudiantes ...... 14 1.6. Patrocinadores...... 16 1.7. Agradecimientos ...... 17 1.8. Sobre los autores...... 17 1.9. Formato para las citas ...... 19 1.10. Guía general ...... 19 2. Introducción 22 2.1. Conceptos básicos...... 22 2.1.1. Ambiente y genética 22 2.1.2. Del genotipo al fenotipo 25 2.1.3. Biodiversidad 29 2.2. Origen de la variabilidad genética...... 36 2.2.1. Mutaciones 36 2.2.2. Recombinación 37 2.2.3. Transferencia horizontal 40 2.2.4. Selección 42 2.2.5. El azar 44 2.3. Evolución...... 46 2.3.1. Evolución biológica 46 2.3.2. Evolución dirigida 51 2.3.3. Mejoramiento: evolución en acción 53 2.3.4. Mejoramiento: ciencia, ingeniería y filosofía 61 2.4. El DNA ...... 62 2.4.1. Nociones básicas de los ácidos nucleicos 62 2.4.2. Nociones avanzadas 74 2.4.3. Genética Forward y Genética Reversa 79 3. Herramientas Moleculares 80 3.1. PCR...... 80 3.1.1. Historia y Principios 80 3.1.2. Técnicas y Aplicaciones 83 3.2. Modificadores del DNA ...... 83 3.2.1. Enzimas de restricción 83 3.2.2. Ligasas 84 3.2.3. Recombinasas 85 3.3. Métodos de secuenciación ...... 88 3.3.1. Sanger 88 3.3.2. Pirosecuenciación 89 3.3.3. Método de apareamiento y ligación 92 3.3.4. Método de síntesis con fluoróforos 102 4. Detección de polimorfismos genéticos 103 4.1. Marcadores ...... 103 4.1.1. Características de los marcadores 103 4.1.2. Tipos de marcadores genéticos 103 4.1.3. Ejemplos de marcadores 105 4.1.4. Estrategias de genotipaje 112

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4.2. Técnicas de comparación genómica ...... 120 4.2.1. Differential Display (DD) 120 4.2.2. Representational Diference Analysis (RDA) 121 4.2.3. Genome Missmatch Scanning (GMS) 123 4.3. Ejemplos de aplicaciones ...... 124 4.3.1. Demostración de Pedigrí 124 4.4. Haplotipos ...... 125 4.4.1. Desequilibrio por ligamiento 125 4.4.2. Proyecto HapMap 125 4.5. Pros y contras de las herramientas moleculares...... 126 4.5.1. Ventajas de las herramientas moleculares 126 4.5.2. Limitaciones de las herramientas moleculares 126 5. Genómica y regulación 130 5.1. Antecedentes de la genómica...... 130 5.2. Estrategias de ensamblaje genómico...... 131 5.3. Ejemplos de proyectos de genómica...... 134 5.3.1. Genomas vegetales 135 5.3.2. Genomas animales 140 5.3.3. DNA extranuclear 145 5.3.4. Genomas comparativos 151 6. Factores de Transcripción 152 6.1. ¿Qué son? ...... 152 6.2. Factores de transcripción basales ...... 153 6.3. Factores de transcripción regulatorios...... 157 6.4. Bases de datos sobre factores de transcripción en maíz...... 161 6.5. Descripción de algunas familias ...... 162 6.6. Resumen...... 185 7. Herramientas Bioinformáticas 189 7.1. ¿Qué es la bioinformática? ...... 189 7.2. Análisis de secuencias...... 191 7.2.1. BLAST 191 7.3. Bases de datos ...... 195 7.3.1. Genbank y el NCBI 195 7.3.2. Maize GDB 197 7.3.3. Maize Gene Index 198 7.3.4. CIMMYT 199 7.3.5. IRRI 200 7.4. Paquetes de Software...... 201 7.4.1. Fieldbook para maíz 201 7.4.2. Alternativas gratuitas de software 202 8. Herramientas Estadísticas 206 8.1. Conceptos básicos de estadística ...... 206 8.1.1. ¿Para que sirve la estadística? 206 8.1.2. Medidas centrales 206 8.1.3. Desviación estándar y distribución normal 207 8.1.4. Tipos de errores 209 8.1.5. Diseño experimental 209 8.2. Análisis estadísticos...... 211 8.2.1. Ejemplo de análisis usando pruebas de T 211 8.2.2. Ejemplo de análisis usando ANOVA 216 8.2.3. Ejemplo: varianza, heredabilidad y repetibilidad 221 8.2.4. Ejemplo de gráfica 228 8.2.5. Ejemplo de análisis de bloques incompletos 228 8.2.6. Ejemplo de análisis espacial 228

8.2.7. Ejemplo de análisis con modelos lineales 228 8.2.8. Otros ejemplos 229 8.3. Software para estadística ...... 229 8.3.1. Uso de Excel 229 8.3.2. R para estadística 231 9. Biología de sistemas 257 9.1. Introducción...... 257 9.2. Genómica...... 258 9.3. Transcriptómica...... 259 9.4. Proteómica...... 259 9.5. Metabolómica...... 260 10. Herramientas Bioquímicas 263 10.1. Fundamentos de enzimología...... 263 10.1.1. ¿Qué es una reacción química? 263 10.1.2. ¿Qué es un catalizador? 264 10.1.3. ¿Qué es una enzima? 265 10.1.4. Características generales de una reacción enzimática 265 10.1.5. ¿Cómo funcionan las enzimas? 266 10.1.6. Nomenclatura de las enzimas 267 10.1.7. Regulación de la actividad enzimática 269 10.1.8. Modelo cinético de Michaelis-Menten 271 10.2. Fundamentos de Espectrofotometría ...... 278 10.2.1. La radiación electromagnética 278 10.2.2. Cromóforos 279 10.2.3. Los auxocromos 279 10.2.4. Espectro de compuestos biológicos 280 10.2.5. La ley de Beer-Lambert 281 10.2.6. Métodos enzimáticos. 283 10.3. Análisis de macromoléculas ...... 288 10.3.1. Electroforesis 288 10.3.2. Cromatografía 289 10.4. Metodologías y Equipos...... 291 10.4.1. Cromatografía de líquidos (HPLC) 291 10.4.2. Cromatografía de gases (GC) 296 10.4.3. Ejemplos de metodologías usadas para el mejoramiento de maíz 299 11. Fisiología vegetal 307 11.1. Introducción...... 307 11.2. Asimilación de carbono...... 307 11.2.1. La fotosíntesis 307 11.2.2. Plantas C3, C4 y CAM 322 11.2.3. Descripción de las distintas rutas fotosintéticas 323 11.3. Tejidos vegetales ...... 332 11.3.1. Monocotiledóneas y dicotiledóneas 332 11.3.2. Semillas 333 11.3.3. Hojas 334 11.3.4. Raíces 336 11.3.5. Tallos 339 11.3.6. Tejido Vascular 341 11.3.7. Transporte vascular 345 11.3.8. Movimientos de agua 358 11.4. Asimilación de nutrientes ...... 360 11.4.1. Nitrógeno 360 11.4.2. Azufre 364 11.4.3. Fósforo 366

11.4.4. Otros minerales 367 11.4.5. Resumen de minerales esenciales 370 11.4.6. El suelo y la nutrición 372 12. Crecimiento, desarrollo y reproducción 375 12.1. Fundamentos del desarrollo vegetal...... 375 12.1.1. El ciclo celular 375 12.1.2. La mitosis 375 12.1.3. La meiosis 378 12.1.4. Ciclo de vida y reproducción sexual 383 12.1.5. Desarrollo de flores y semillas 383 12.2. Crecimiento y desarrollo vegetativo...... 387 12.2.1. Regulación del crecimiento 387 12.2.2. Tropismos y su relación con hormonas 387 12.2.3. Geotropismo 388 12.2.4. Fotoperiodicidad 388 12.2.5. Fitocromo 391 12.2.6. Ritmos circadianos y relojes biológicos 392 12.3. Hormonas vegetales ...... 393 12.3.1. Auxinas 394 12.3.2. Citocininas 397 12.3.3. Giberelinas 398 12.3.4. Etileno 401 12.3.5. Acido Abcísico 402 12.3.6. Resumen de hormonas como reguladoras del desarrollo vegetal 402 12.4. Desarrollo reproductivo de maíz...... 405 13. Transferencia Genética 406 13.1. Transferencia sexual...... 406 13.1.1. Cruzas entre individuos de la misma especie 407 13.1.2. Cruzas entre especies diferentes 410 13.1.3. Poliploidia en el reino vegetal 413 13.2. Organismos Genéticamente Modificados...... 414 13.2.1. Transferencia por Agrobacterium 414 13.2.2. Transferencia por Biobalística 415 13.2.3. Vectores virales para expresión transiente 415 13.2.4. Legislación sobre los OGM en Latinoamérica 415 • Ventajas y desventajas de los OGM 416 13.3. Divergénicos ...... 416 13.3.1. Definiciones 416 13.3.2. Ejemplos 419 13.4. Ejercicios de Discusión ...... 423 14. Genética de Poblaciones 428 14.1. Las leyes de Mendel ...... 428 14.2. La genética de poblaciones clásica ...... 429 14.3. Ley de equilibrio Hardy-Weinberg...... 429 14.3.1. Ejemplos de aplicaciones de la Ley de Hardy-Weinberg 431 14.4. Heredabilidad...... 439 14.5. Parámetros matemáticos de variabilidad genética...... 440 15. Genética cuantitativa 442 15.1. Carácteres de distribución discontinua...... 442 15.2. Carácteres de distribución continua...... 442 16. Mapas genéticos 447 16.1. Tipos de mapas...... 447 16.1.1. Mapas de ligamiento 447 16.1.2. Características de la recombinación 451

16.1.3. Mapas físicos 453 16.1.4. Mapas cromosómicos o citogénicos: 454 16.2. Aplicaciones de los mapas genéticos...... 456 16.2.1. Mapa genético de maíz 458 16.2.2. Metodologías para identificar genes 459 17. Metodologías de Mejoramiento 463 17.1. Metodologías clásicas...... 463 17.1.1. Introducción 463 17.1.2. Importancia del ambiente 463 17.1.3. Importancia de los modos de reproducción 464 17.1.4. Autopolinización o polinización libre 464 17.1.5. Selección Masal 465 17.1.6. Esquemas de selección 471 17.1.7. Mejoramiento por pedigrí 475 17.1.8. Selección recurrente 477 17.1.9. Metas de mejoramiento 477 17.2. Metodologías innovadoras...... 482 17.2.1. Retrospectiva histórica del mejoramiento molecular de plantas 482 17.2.2. Modernización de viejas herramientas 492 17.2.3. Aprovechamiento de la información molecular disponible 496 17.2.4. Selección asistida por marcadores 496 17.2.5. Nuevos esquemas de mejoramiento 498 17.3. Retos para el futuro ...... 501 18. Mejoramiento Genético de Maíz 503 18.1. Introducción...... 503 18.1.1. Características distintivas del Maíz 503 18.2. Origen y razas del Maíz ...... 505 18.3. Heterosis...... 506 18.3.1. Magnitud del vigor híbrido en maíz 506 18.3.2. Teorías y Explicaciones 507 18.3.3. Grupos heteróticos 507 18.3.4. Aprovechamiento de heterosis en maíz 508 18.4. Manejo de Cultivo y Fitotecnia...... 508 19. Anexos 509 19.1. Fundamentos varios ...... 509 19.2. Cronología de algunas teorías genéticas ...... 509 19.3. Catálogo de preguntas interesantes...... 510 19.4. Catálogo de respuestas a las tareas ...... 518

1. Prólogo 1.1. Presentación y enfoque

La mayoría de los libros sobre mejoramiento genético tienen un enfoque tradicional que incluye sólo de manera tangencial los desarrollos científicos modernos. Si bien existe un gran número de referencias bibliográficas en inglés, los libros de texto actualizados sobre mejoramiento genético en español son pocos y muy limitados. Se decidió entonces escribir un texto didáctico para los estudiantes de los países latinoamericanos.

El punto de partida de este libro es la recapitulación de los fundamentos y conceptos que son necesarios hoy en día para el mejoramiento genético moderno. Se elaboró un texto con la intención de incluir algunos conocimientos de frontera y mostrar su posible aplicación. Con este fin, se escogió al maíz como planta modelo por su importancia cultural, social y económica. También se quiso poner énfasis en las características distintivas de este cultivo, en particular la relacionada con el fenómeno de heterosis. El vigor híbrido del maíz es algo fascinante, tanto desde el punto de vista teórico, como práctico. La heterosis del maíz es un enigma científico sin resolver, y además, le da sustento económico a muchas empresas que comercializan semilla certificada de híbridos con altos rendimientos.

¿En qué se diferencia el mejoramiento clásico del moderno? Básicamente en las herramientas, pues los principios y objetivos son los mismos. Algunas metodologías permiten aproximarse a los fenómenos desde diferentes niveles de observación y escalas de eficiencia, convirtiéndose de esta manera en herramientas complementarias. El fitomejoramiento tradicional y moderno no son estrategias excluyentes. De manera simplificada, se puede decir que el mejoramiento moderno no es otra cosa que el refinamiento del mejoramiento clásico. Esto se logra incorporando algunas herramientas moleculares adicionales. ¿Cuáles son estas? ¿Qué se necesita saber de ellas para sacar el mayor provecho? Algunos de los mejoradores más experimentados son personas que estudiaron en una época en donde no se sabía mucho del DNA o no se había inventado el PCR. Se formaron en un ambiente que no podía predecir las implicaciones de la ingeniería genética ni tampoco prever los alcances de la genómica y la bioinformática. El punto de partida de muchos libros de texto que abordan el tema del fitomejoramiento son las clásicas leyes de herencia de Mendel y las teorías estadísticas de la genética de poblaciones. Podría considerarse que el libro más avanzado sobre mejoramiento clásico es el tratado de Hallauer sobre genética cuantitativa. Sus teorías y propuestas son una excelente referencia para todos los mejoradores. Los que dominen los conceptos de Hallauer ya son expertos en el área.

Para ser exitosos en el mejoramiento no se necesita entender la estructura del DNA ni ninguna de las implicaciones de la genómica o metabolómica. Sin embargo, en un mundo competitivo en donde la rapidez, la eficiencia y la economía son cada vez más importantes, es crucial incorporar todas las herramientas que se han desarrollado en los últimos años para facilitar el trabajo y obtener mejores resultados. Es por ello que en este libro se decidió partir de los ácidos nucleicos y de los fundamentos moleculares de la herencia. Usando esas bases, pretendemos acercarnos a los diferentes temas de la genética, bioquímica, y la fisiología vegetal, que son relevantes para incrementar el rendimiento o la calidad de un cultivo.

1.2. Distribución abierta

Para promover la difusión de los conocimientos incluidos en este documento –con fines académicos y no lucrativos– se ha decidido usar un formato digital así como un modelo de distribución basado en la filosofía de código abierto. La libertad de copyright significa que los usuarios tienen el derecho a imprimir y distribuir tantas copias quieran de esté documento en formato digital o impreso sin tener que pagar regalías ni estar limitados por restricciones legales de impresión o de fotocopiado. Lo único que se requiere es que siempre se cite la fuente original, y que se de crédito a los autores originales del texto.

El concepto de código abierto significa que cualquier investigador que desee enriquecer este documento, puede hacerlo como potencial autor contribuyente. Para ello, deberá contactar al editor quien le informará de los procedimientos a seguir. En términos generales, a los interesados se les enviará la versión más actualizada del archivo Word para que puedan editarla con la opción de control de cambios activada. Regresarán su versión mejorada al editor principal. El revisará la pertinencia de las correcciones y la calidad científica y didáctica del material adicionado. En caso de que la contribución lo amerite, el editor incluirá los cambios y se le dará el crédito correspondiente al autor contribuyente para después distribuir la nueva versión del documento a toda la comunidad. Las nuevas versiones se distribuirán cada seis meses. Hacemos una invitación a todos los investigadores de Latinoamérica a participar en este proyecto de código abierto y autoría conjunta para que con su contribución mejoren este libro.

Para la distribución masiva usaremos el formato digital pdf para una re-edición más rápida y flexible. La distribución de esta información por medio de CDs y la Web nos permite ofrecerla de manera gratuita y masiva. Más que cubrir los gastos de edición y producción por medio de la venta de ejemplares impresos con copyright restringido, trataremos de hacer sustentable este proyecto educativo por medio de un modelo de patrocinios y donaciones de parte de entidades públicas y privadas.

Alentamos a todos los maestros y profesores de universidades a usar este material informativo para sus respectivas clases sobre mejoramiento genético y biotecnología. Estos apuntes pueden ayudar a complementar y enriquecer sus cursos. La libertad de copyright les permite distribuir este documento gratuitamente a todos sus alumnos para que ellos puedan aprender de manera autodidacta. De esta forma, los estudiantes pueden prepararse antes o después de la clase, y así el profesor tendrá mayor libertad de usar su tiempo frente al grupo para aclarar dudas y resolver problemas. Nosotros favorecemos un modelo educativo basado en la reflexión, la experimentación y el descubrimiento. Quisiéramos fomentar el talento científico de los jóvenes, y no restringirlos con un aprendizaje de memoria que no permite el desarrollo de la creatividad. Más bien queremos fomentarles su capacidad de razonamiento lógico, y ayudarles a tener la mente siempre abierta para aplicar los criterios científicos de análisis neutral y juicio crítico.

Si en la actividad académica o durante las clases surge alguna idea de cómo mejorar la preparación científica de los estudiantes, no duden en contactar al editor para que le envíen sus sugerencias concretas de como enriquecer este proyecto. La filosofía de coautoría abierta solamente funciona con la participación proactiva y entusiasta de todos los usuarios.

1.3. Lenguaje científico

En este documento usamos el castellano como idioma principal y el inglés como idioma complementario. La mayor parte de este documento está en español. Esto con el fin de facilitar el entendimiento de algunos conceptos básicos para los estudiantes de habla hispana. También incluimos algunas secciones completas en inglés para motivar a los estudiantes a practicar el idioma internacional de la ciencia. Un estudiante que no domine la lectura en inglés, nunca podrá hacer ciencia de calidad internacional. El manejo del inglés, tanto escrito como oral, es fundamental. Entre más rápido se pueda familiarizar con el inglés, mucho mejor será su preparación académica.

Estamos concientes de que en este documento no usamos el castellano con la pureza que exige la Real Academia de la Lengua Española. Usamos algunas expresiones regionales, en su mayor parte términos mexicanos, pero también muchos anglicismos y palabras extranjeras. No quisimos traducir todos los términos técnicos científicos al español, ya que en algunos casos se desvirtúan demasiado. Es por ello que preferimos hablar de primers que de cebadores. Hablamos de tejidos sink o source y de genética forward y reverse. Para evitar conflictos con puristas lingüísticos, usamos letra itálica para todos los términos extranjeros.

Preferimos usar las abreviaciones en inglés que las homologas españolas. Es por ello que usamos PCR (Polymerase Chain Reaction) en lugar de RCP, decimos QTLs (Quantitative Trait Loci) en lugar de LCQ, hablamos de maíz QPM (Quality Protein Maize) en lugar de maíz ACP. También usamos los términos de MAS (marker assisted selection) en lugar de SAM, o bien ANOVA (Analisis Of Variance) en lugar de ADV. En el caso de los ácidos nucleicos, usamos las abreviaciones de DNA y RNA. En los modelos lineales usamos las letras de E (Environment), G (Genetic) y R (residual Randomness). También hablamos de interacciones GxE en lugar de interacciones GxA.

La inclusión de términos científicos extranjeros a veces crea una polémica entre colegas. Si bien podría ser tema de una larga discusión lingüística, los debates se resolvieron de manera práctica para este libro de texto. Se dejaron las variantes que el editor consideró más atractivas. Tenemos la convicción de que el idioma no es algo estático sino que debe evolucionar con el tiempo. La mejor forma de escribir un libro sobre mejoramiento genético moderno es incluyendo um cierto progresismo en el seno de su estructura y lenguaje. Nadie habla hoy en día el español del Quijote de Cervantes. Algunas abreviaturas y términos extranjeros con el tiempo se adoptan de forma natural. En Latinoamérica no decimos ordenador sino computadora. Hablamos de trocas, trailers y clutch. Decimos ok y bye. Son pocos los que usan los nombres completos de abreviaturas como: LASER, RAM, CPU, DVD, USB, DOLBI, etc.

Actualmente no es raro escuchar a estudiantes decir: voy a blastear el cDNA para diseñar los primers correctos para mí RT-PCR. El verbo blastear para algunos es una aberración lingüística, mientras que para otros es de lo más normal. Es natural decir láser en lugar de su nombre completo (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation). De igual forma, nadie se sorprende cuando dicen que un memory stick (memoria USB) tiene un MB de RAM. Nuestros abuelitos tal vez si se queden con los ojos cuadrados. Sin embargo, este libro no es para viejitos. Este libro esta escrito para los jóvenes modernos que no tienen problema de entender y adoptar diversas palabras del inglés.

1.4. Grupos de usuarios

Este texto surge de la inquietud de combinar conocimiento actualizado sobre fisiología, bioquímica, biología molecular, genómica, metabolómica y bioinformática, para aplicarlo en algo muy concreto: el mejoramiento genético de una especie vegetal como el maíz. Actualmente, los docentes de diversas universidades, de programas de biología, agronomía y fitotecnia, entre otros, no enfatizan los conceptos anteriormente mencionados. En Cinvestav Irapuato recibimos a estudiantes con un interés muy alto en la biotecnología aplicada y el mejoramiento genético. Muchos vienen con muy buenas aptitudes y habilidades en los temas agrícolas, pero muy pocos pasan el examen de admisión por falta de conocimientos científicos básicos sobre biología molecular, química, bioquímica, matemáticas o inglés. Si bien este libro no pretende remediar todas esas deficiencias, por lo menos si trata de facilitar algunos de tales conocimientos. Nuestra intención es que los estudiantes, desde una etapa temprana, fortalezcan su entendimiento y profundicen en el análisis de los temas que se manejan en un posgrado sobre biotecnología vegetal. Se busca apoyar la formación de personas que sean observadoras, analíticas, críticas y creativas, para que se conviertan en científicos profesionales y se embarquen en una aventura constante para experimentar, comprobar, preguntarse y responderse.

El presente documento está enfocado a los siguientes grupos de usuarios:

• Estudiantes avanzados de las licenciaturas de las áreas biológicas y agrícolas. • Tesistas con interés de realizar un posgrado en biotecnología, o ingeniería genética de plantas. • Docentes de universidades y profesores que imparten cursos sobre biotecnología o mejoramiento genético moderno. • Investigadores de los departamentos de fitotecnia y biología. • Ingenieros agrónomos y técnicos de compañías de semillas. • Fitomejoradores con inquietud de aprender más sobre biología molecular y herramientas biotecnológicas.

1.5. Motivación para estudiantes

There is no purifier in this world like knowledge; he that perfects his practice in selfless action finds that knowledge in himself in due time.

Se invita, a aquellas personas que se sientan motivados por este documento, a considerar la opción de continuar sus estudios académicos mas allá de la licenciatura, por ejemplo, haciendo un posgrado sobre biotecnología de plantas. Una muy buena opción es hacerlo en Cinvestav Irapuato, o bien, en el Colegio de Posgraduados (Colpos) en Texcoco. Para tomar una decisión es muy relevante conocer el perfil de egreso de los estudiantes de maestría y doctorado. A continuación mostramos información de los programas de posgrado de las instituciones de más alto nivel para la biotecnología de plantas en México.

Cinvestav Irapuato:

Maestría en Ciencias con Especialidad en Biotecnología de Plantas Los egresados de esta Maestría tendrán conocimientos científicos amplios, sólidos y actualizados, tanto en la teoría como en la práctica, en las disciplinas afines a las ciencias biológicas y sus aplicaciones biotecnológicas. Formados en un ambiente que valora la responsabilidad ética y social como componente esencial de la práctica científica, las aptitudes adquiridas le permitirán incorporarse directamente al mercado de trabajo, en actividades docentes en la educación superior, como técnicos o auxiliares de investigación en la industria privada y el sector público.

Doctorado en Ciencias con Especialidad en Biotecnología de Plantas Los egresados de este Doctorado serán científicos con conocimientos amplios, sólidos y actualizados, tanto en la teoría como en la práctica. Tendrán la capacidad de abordar problemas y de plantear y responder preguntas científicas y de desarrollo tecnológico, de manera rigurosa, creativa y multidisciplinaria, en áreas afines a las ciencias biológicas. Habrán desarrollado habilidades para la comunicación, divulgación del conocimiento y para la docencia. Su preparación les permitirá integrarse de manera competitiva, a nivel nacional e internacional, en instituciones académicas y de investigación científica de prestigio. Podrán conformar áreas propias de liderazgo e innovación en el sector público y privado y participar con responsabilidad ética y social en la generación y ejecución de proyectos y políticas públicas relacionadas con la investigación y desarrollo científico y tecnológico.

¿Que esperamos de un doctor en ciencias en Cinvestav? El Doctor en Biotecnología de Plantas puede hacer investigación. Esto significa que tiene la capacidad para generar ideas, estructurar propuestas, obtener financiamiento, formular protocolos de investigación, diseñar experimentos, realizarlos, analizar e interpretar los resultados, y darlos a conocer mediante la publicación de artículos en revistas científicas de impacto, y la participación en congresos y otros foros. Realiza investigación de calidad, y actúa con ética. Por la excelencia de su formación y su dominio del idioma inglés, es competitivo en el ámbito científico nacional e internacional. Es exigente consigo mismo. Siempre busca la excelencia. Es independiente en la generación de sus ideas y auto-dirigido en su trabajo, no-obstante su capacidad para trabajar en equipo. Sabe resolver problemas. Como investigador, empuja la ciencia constantemente hacia nuevas fronteras a través del cuestionamiento.

Para mas detalles consultar la página: http://www.ira.cinvestav.mx

Colegio de Posgraduados: Es una institución mexicana de enseñanza, investigación y servicio en ciencias agrícolas, que en 1979, por decreto presidencial, se convirtió en organismo público descentralizado del gobierno federal. Ofrece programas académicos sobre casi todas las disciplinas del conocimiento agronómico y afines. Su función es formar líderes talentosos para el sector rural.

La dirección del Campus Montecillo es: Km. 36.5 Carretera Mex-Texcoco. Texcoco Edo. de México C.P. 56230. http://www.colpos.mx

Misión El Colegio de Postgraduados es una institución educativa que genera, difunde y aplica conocimiento para el manejo sustentable de los recursos naturales, la producción de alimentos nutritivos e inocuos, y el mejoramiento de la calidad de vida de la sociedad.

Visión El Colegio de Postgraduados es una comunidad comprometida con la sociedad que fomenta el desarrollo personal, la creatividad académica y la generación de conocimiento colectivo para trascender al existente a las ideologías y a la estructura disciplinaria. Reafirma los valores de la sociedad cultivando y enriqueciendo la mente y el espíritu de los individuos. Sus modelos educativos y organizacionales están actualizados y en superación permanente.

Objetivos El Colegio de Postgraduados es una institución pública cuyas actividades sustantivas son educación, investigación y vinculación. En función de esas tres actividades y de la necesidad de contar con una administración que permita realizarlas de manera eficaz, se definieron los objetivos estratégicos siguientes: • Educar y formar personas creativas, innovadoras y con sentido humanista que atiendan las necesidades agroalimentarias de la sociedad en un contexto de desarrollo sustentable. • Realizar investigación generadora de conocimiento pertinente para el manejo sustentable de los recursos naturales y la producción de alimentos nutritivos e inocuos y de otros bienes y servicios. • Mejorar la calidad de vida de la sociedad y retroalimentar las actividades académicas a través de la vinculación • Contar con procesos administrativos certificados que apoyen en forma eficaz y eficiente a las actividades sustantivas de la institución.

Perfiles de los aspirantes que deseen ingresar al Colpos: Maestría: Doctorado: Son aspirantes a realizar estudios de maestría Para realizar estudios de doctorado en en ciencias, los egresados de las escuelas ciencias se exige del aspirante una sólida profesionales de agricultura, universidades e preparación en ciencias básicas y aplicadas en instituciones afines con estudios equivalentes el campo de su especialidad, experiencia en la a la carrera agronómica; también se aceptan transmisión de conocimientos y sentido social egresados de instituciones de enseñanza de sus actividades. Además es necesario superior cuyo curricula les dé opción de haber obtenido el grado de maestría en estudios de postgrado en el CP. ciencias o su equivalente.

1.6. Patrocinadores

Los siguientes organismos e instituciones han contribuido generosamente para la elaboración del presente documento, ya sea en términos financieros, logísticos o intelectuales.

Colegio de Posgraduados Unidad Irapuato

Red de Agricultura, Alimentos y Biotecnología

1.7. Agradecimientos Los autores contribuyentes quisieramos agradecer a muchas personas que nos han acompañado durante la realización de este proyecto. Los comentarios y sugerencias de muchos estudiantes y colaboradores nos han permitido hacer de este proyecto algo mucho más valioso de lo que imaginamos cuando iniciamos. En la primavera del 2008, este documento empezó como unos apuntes de clases con menos de una docena de páginas. Ahora se ha convertido en un libro con más de 500 páginas, en el cual se incluyen temas muy diversos y variados. Muchas gracias a todas esas personas que de forma anómima han hecho diversas correcciones y contribuciones que han sido sumamente valiosas. 1.8. Sobre los autores

Dr. Axel Tiessen Favier Laboratorio de Metabolómica y Fisiología Molecular Departamento de Ingeniería Genética CINVESTAV Unidad Irapuato Km. 9.6 Libramiento Norte Irapuato, CP 36821 Guanajuato, México [email protected] http://www.ira.cinvestav.mx

El editor y los coautores de este libro se complementan mutuamente en su formación académica. El Dr. Axel Tiessen Favier estudió Biología en la Universidad de Heidelberg en Alemania. Tambien estudio un semestre en Inglaterra e hizo sus prácticas de laboratorio en el Instituto John Innes. Llevó a cabo su doctorado en Bioquímica de Plantas en el Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas. Después de 12 años en Europa regresó a México para trabajar en un proyecto sobre tolerancia a sequía en el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (Cimmyt). Posteriormente se incorporó como investigador del Departamento de Ingeniería Genética de la Unidad Irapuato del Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav). Actualmente, establece diversas líneas de investigación sobre biotecnología vegetal, todas ellas enfocadas a aprovechar las plantas como reactor bioquímico y fotosintético que usa la energía solar para generar biomasa en forma de alimentos, vitaminas y otros productos de valor agregado para el ser humano y la industria.

Dr. Fernando C. Gómez Merino Profesor Investigador Colegio de Posgraduados Carretera México-Texcoco km 36.5 Montecillo. C.P. 56230 Estado de México, México [email protected] http://www.colpos.mx

El Dr. Fernando Carlos Gómez Merino obtuvo el título de Ingeniero Agrónomo de la Universidad Veracruzana en 1995. En 1997 inició sus estudios de postgrado en el Instituto de

Recursos Genéticos y Productividad del Colegio de Postgraduados, de donde obtuvo el grado de Maestro en Ciencias en 1998. De 2001 a 2004 realizó sus estudios doctorales en el Instituto de Biología y Bioquímica de la Universidad de Potsdam, en colaboración con el Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, en Golm, Alemania. Desde 2005 es Profesor Investigador del Colegio de Postgraduados, en donde estudia los mecanismos fisiológicos y moleculares de las respuestas de las plantas al estrés ambiental, con especial énfasis en sequía y estrés nutrimental que ocasionan algunos elementos del suelo en las plantas.

Dra. Libia Iris Trejo Téllez Profesora Investigadora Colegio de Posgraduados Carretera México-Texcoco km 36.5 Montecillo. C.P. 56230 Estado de México, México [email protected] http://www.colpos.mx

La Dra. Libia Iris Trejo Téllez realizó sus estudios de licenciatura en la Universidad Autónoma Chapingo, de donde 1995 obtuvo el título de Ingeniero Agrónomo Especialista en Suelos. En 2000 se graduó como Maestra en Ciencias de la Especialidad de Edafología del Colegio Postgraduados y en 2004 obtuvo el grado de Doctor en Ciencias Naturales por Universidad Libre de Berlín, en Alemania. A partir de 2005 se desempeña como Profesora Investigadora del Colegio de Postgraduados, donde imparte las cátedras de Mecanismos celulares de homeóstasis de metales en plantas y Funciones de los nutrimentos en plantas. Su línea de investigación se centra el estudio del efecto de los elementos benéficos en las plantas y la biología celular y molecular de la nutrición de cultivos.

Dr. Misael López Lozano Departamento de Fitotecnia Facultad de Agricultura y Zootecnia Universidad Juárez del Estado de Durango Dom. Conocido Venecia, CP 35000 Durango, México [email protected] http://www.ujed.mx

Dr. Misael López Lozano (BREVE SINPOSIS)

Dra. Natalia Palacios Rojas (BREVE SINPOSIS)

Mtro. Daniel Padilla (BREVE SINPOSIS)

Mtra. Erandi Vargas (BREVE SINPOSIS)

1.9. Formato para las citas

Los autores de este documento invirtieron mucho esfuerzo y tiempo para elaborar los diversos capítulos de manera didáctica y profesional. Como es común de los trabajos científicos que son publicados en revistas o en libros, una forma de evaluar su impacto es a través de las citas que hacen referencia a ellos. Es por ello que pedimos que los docentes que usen los textos o figuras contenidas en el presente libro, le den crédito completo a los autores involucrados. Para facilitar la inclusión de las citas a este documento, a continuación mostramos algunos ejemplos.

El libro en su conjunto se debe citar de la siguiente manera:

Tiessen, A., Gómez-Merino, F., Trejo-Téllez, L., López-Fabre, A., Padilla-Chacón, D., Vargas-Ortis, E., y Palacios-Rojas, N. (2009). Fundamentos y Metodologías Innovadoras para el Mejoramiento Genético de Maíz. Edición Primera, versión 1.36 (Bogotá, Colombia: Fundación Ciencia Activa). pp 550. ISBN: 978-970-95522-3-2

Para una cita específica a una sección del libro, consulte la página iv para revisar que autores contribuyeron a que capítulo. Por ejemplo el capítulo 6 se debería citar así:

Gómez-Merino, F., Trejo-Téllez, L., y Tiessen, A. (2009). Cap 6. Factores de Transcripción. p 127-163. En: Fundamentos y Metodologías Innovadoras para el Mejoramiento Genético de Maíz, A. Tiessen, ed. Edición 1 versión 1.36 (Bogotá, Colombia: Fundación Ciencia Activa), ISBN: 978- 970-95522-3-2

1.10. Guía general

El mejoramiento genético es un arte y a la vez una ciencia. Se deriva de un conjunto de técnicas complementarias de diferentes áreas como la genética, la agronomía, la patología y la estadística, entre otras. Es una tarea multidisciplinaria que requiere de un enfoque interdisciplinario. Y más aun el mejoramiento moderno que trata de incorporar los últimos avances de la biología, bioquímica, fisiología molecular y bioinformática. El presente libro refleja esa necesidad de incluir los fundamentos de muy diversas disciplinas para que el estudiante los pueda dominar de una manera integral. Solo así podrá aplicar sus conocimientos para generar un beneficio para el campo. Nuestra meta es formar personas que puedan trabajar en el laboratorio de una manera competitiva a nivel internacional, pero que a la vez sepan hacer trabajo de campo para atender las necesidades reales de los agricultores y los consumidores.

El presente libro de texto está dirigido a esa nueva generación de jóvenes que quieran dedicar sus esfuerzos al mejoramiento moderno, de maíz o de cualquier otro cultivo. El documento está organizado en diferentes capítulos que son independientes y a la vez complementarios. Los lectores tendrán la libertad de leer el texto secuencialmente, o bien seleccionar los capítulos que consideren más relevantes, para iniciar su lectura en cualquiera de ellos. Los estudiantes

20 avanzados podrán brincarse los capítulos sobre los temas que ya dominan y concentrarse en aquellos para los cuales necesiten saber más.

En el capítulo introductorio (capítulo dos), se mencionan algunos conceptos básicos sobre genética, evolución, y ácidos nucleicos. En el capítulo tres se explican algunas de las herramientas moleculares como la PCR y los métodos de secuenciación. En el capítulo cuatro se habla de los polimorfismos genéticos y las técnicas de detección. El capítulo cinco trata sobre genómica y regulación. Ahí se mencionan algunos de los proyectos genómicos tanto de plantas como de animales. En el capítulo seis se explican los factores de transcripción y su relevancia para el fenotipo de una planta. En el capítulo siete se enumeran las herramientas bioinformáticas que hay disponibles hoy en día, como las bases de datos del NCBI y el análisis de secuencias con BLAST. También se explican algunos de los conceptos básicos de estadística como las medidas centrales, varianza y tipos de error. El capítulo ocho trata sobre la biología de sistemas que incluye las áreas de la genómica, transcriptomica, proteómica y metabolómica. En el capítulo nueve se mencionan diferentes herramientas bioquímicas que pueden ser usadas para el mejoramiento. Ahí se explican las bases de las reacciones químicas, catálisis y regulación enzimática, así como los fundamentos de algunas metodologías como HPLC y espectrofotometría. El capítulo diez trata sobre fisiología vegetal. Ahí se mencionan los tipos de fotosíntesis C3 y C4, así como la fuerza motriz del transporte vascular y las relaciones fuente- demanda, que son importantes para el rendimiento de grano. El capítulo once habla sobre reproducción y desarrollo, incluyendo la mitosis y la meiosis como base de la reproducción sexual. En el capítulo doce se explican las bases de la transformación de plantas. También se habla de los organismos genéticamente modificados en un contexto más amplio de su impacto tanto en el ambiente como para la economía globalizada. En el capítulo trece se habla de la genética clásica, incluyendo los fundamentos estadísticos de la genética de poblaciones, como la ley de equilibrio de Hardy-Weinberg. El capítulo catorce trata sobre genética cuantitativa. Ahí se habla sobre los métodos para la detección de QTLs. En el siguiente capitulo se refuerzan los conocimientos sobre los mapas genéticos y su uso para el mejoramiento. En el capítulo dieciséis se mencionan las diferentes metodologías de mejoramiento. Tanto las clásicas, como las estrategias más modernas. El capítulo diecisiete se enfoca espeficicamente al Mejoramiento Genético de Maíz. Finalmente los capítulos dieciocho y diecinueve incluyen los anexos e información adicional. Ahí podrá consultar algunos catálogos de preguntas y temas interesantes, así como documentación adicional. Se incluye un glosario de conceptos importantes, un índice con términos clave, y una lista de referencias y bibliografía para consulta adicional.

En términos generales, el libro tiene una estructura conceptual que se podría resumir de la siguiente forma:

Introducción: Biología Ambiente Diversidad Evolución

Fundamentos: Biología Genética Estadística Bioquímica Fisiología molecular vegetal Ácidos Leyes Azar, Macromoléculas, Fotosíntesis, Nucleicos, mendelianas, distribución Proteínas, Desarrollo, estructura de genética de normal, Enzimas, regulación genes, poblaciones, promedio, Metabolitos, etc. del expresión, etc. errores, prueba metabolismo, proteínas, T, ANOVA, etc. etc.

21 etc.

Herramientas: Herramientas Herramientas Herramientas Herramientas Herramientas moleculares bioinformáticas estadísticas bioquímicas fisiológicas Hibridación, Bases de datos, Análisis Electroforesis, Medición de PCR, BLAST, análisis estadísticos, cromatografía, fotosíntesis, secuenciación, de secuencias. componentes de espectrometría transpiración, marcadores, Programas: varianza, HPLC, clorofila, transformación, SMS, EMBOSS, heredabilidad, ensayos nitrógeno, etc. etc. etc. Programas: enzimáticos, estrategias de Excel, etc. fenotipeo, Fieldbook, R, etc. etc.

Metodologías de mejoramiento: Metodologías Metodologías Metodologías Metodologías empíricas clásicas modernas innovadoras Selección y Hibridización, Marcadores Estrategias de serendipia. recombinación, moleculares, fenotipo, selección por fisiología, dobles pedigrí. bioquímica. haploides, MARS, transformación, etc.

Unidad de selección: Metodologías Metodologías clásicas innovadoras

Fenotipo Genotipo Haplotipo Poblaciones. Plantas. Líneas Combinación Selección en individuales. de alelos base a grupos Selección en individuales. de individuos. base al genotipo Selección en Pools de de un solo base a genes. individuo. haplotipos.

2. Introducción 2.1. Conceptos básicos 2.1.1. Ambiente y genética

La genética es una disciplina de las ciencias biológicas, por medio de la cual se generan nuevos conocimientos sobre el funcionamiento molecular de las células vivas. El ácido desoxiribonucleico (DNA por sus siglas en inglés de desoxiribonucleic acid) es muy importante en este contexto. La genética nos ayuda a revelar la importancia del DNA como la molécula portadora de la información biológica. Más que ser una ciencia meramente básica, la genética también tiene un componente muy aplicado de ingeniería. Esto ha permitido desarrollar un conjunto de metodologías para manipular el DNA de una especie. Uno de los objetivos de la biotecnología y de la ingeniería genética es proporcionar herramientas moleculares para modificar los carácteres productivos de las especies biológicas. Con ello se pretende lograr que algunos genes sean más útiles y aprovechables para el ser humano.

En especial, la ingeniería genética vegetal está enfocada a mejorar la productividad de las plantas y los microorganismos benéficos. Pero, ¿cómo lograrlo de manera concreta? ¿Cómo se puede incrementar el rendimiento de un cultivo como el maíz? La tarea no es fácil. Requiere de técnicas diversas, dedicación, tiempo y esfuerzo. Para llegar a ser expertos en el tema hay que profundizar nuestros conocimientos sobre las bases del mejoramiento genético. Primero hay que entender todos los fundamentos científicos sobre el tema. ¿Qué factores influyen en el rendimiento? La producción agrícola en términos de cantidad y calidad dependen de dos grandes conjuntos de factores:

Factores externos Factores internos

abióticos + bióticos genéticos + epigenéticos

El ambiente incluye factores físicos y La genética incluye una serie de factores químicos, denominados factores internos sobre la herencia del DNA, abióticos, como son: la disponibilidad de como; genes, alelos, heterosis, agua, nutrientes, luz, temperatura, etc. El poliploidia, epistasis, etc. Los factores ambiente externo también incluye genéticos incluyen la información factores biológicos de interacciones codificada en la secuencia nucleotídica ecológicas entre diferentes especies, del DNA. Tambien existe una serie de como por ejemplo, microorganismos factores que no dependen de la simbióticos, insectos polinizadores, virus secuencia primaria del DNA (factores y diversos patogenos. Estos factores se epigenéticos) pero que si se heredan y denominan factores bióticos. también influyen en la forma que se expresa y se manifiesta el fenotipo.

La producción agrícola se puede incrementar al optimizar todas las variables de estos dos grandes conjuntos de factores (variables externas e internas). Es muy importante considerar los dos conjuntos de factores de forma integral, ya que el rendimiento depende del factor que es más limitante en ese momento.

Por ejemplo, si la limitante es la cantidad de agua que se le aplica a un cultivo, entonces no tiene caso incrementar la fertilización de nitrógeno más allá de un cierto límite. ¿De qué sirve hacer mejoramiento genético de una forma sofisticada si las prácticas agrícolas no son adecuadas para las variedades que se están desarrollando? Por otro lado, no tiene caso implementar la más alta tecnología agrícola si lo que se pretende es utilizar variedades criollas que no han sido mejoradas para esas condiciones óptimas. Es decir, el mejoramiento genético tiene que ir de la mano con el manejo agronómico. El mejorador tiene que hacer un trabajo multidisciplinario. Tiene que saber tanto de genética como de agronomía, patología, fisiología, biología molecular y bioquímica. Y no solo debe dominar las ciencias naturales, sino que a veces también es muy importante saber algo de economía, sociología, psicología y de política para tener un mayor impacto. En la práctica, muy pocos científicos dominan todas las disciplinas necesarias, por lo que el mejoramiento es una labor que debe realizarse en equipo. Se requiere un grupo de expertos con un enfoque interdisciplinario. No es la simple adición de personas de múltiples disciplinas, sino la sinergía de diversas metodologías la que conduce al éxito.

¿Cómo podemos optimizar las variables externas? El ambiente se puede acondicionar a través del manejo agrícola. Esto se logra, por ejemplo, por medio de la fertilización, el riego, el control integral de plagas, el uso de invernaderos, etc.

La agricultura protegida, es decir, el cultivo de plantas dentro de invernaderos, es una de las técnicas más eficientes para incrementar los rendimientos agrícolas. Por ejemplo, en los invernaderos se optimiza la humedad relativa, se riega y fertiliza adecuadamente, se regula la temperatura, se incrementa el CO2 y se protegen los cultivos de lluvias, heladas, plagas y patógenos. Si por ejemplo a campo abierto se cosechan 200 toneladas de tomate por hectárea por año, en un invernadero se llegan a producir hasta 600 toneladas por año. En algunos invernaderos de Holanda ya se está rompiendo el record de mil toneladas por hectárea por año.

¿Cómo se optimizan las variables internas de la genética? El potencial genético de una especie se puede incrementar al combinar genes y acumular alelos favorables. Esto se logra a través del mejoramiento genético por medio de selección y recombinación. Este es un proceso que debe de ser constante y continuo, con ciclos iterativos.

Muchas veces, la influencia del ambiente es mucho más fuerte que el factor genético. De hecho, la mayor limitante para la productividad de los cultivos vegetales es la disponibilidad de agua y nitrógeno. En promedio, los agricultores solo obtienen del 5 al 20% del máximo potencial genético de un cultivo.

Por ejemplo, el maíz puede producir hasta 16 toneladas de grano por hectárea, mientras que el rendimiento promedio en México es de 2.4 ton/ha. Esto se debe a que la mayoría de los agricultores siembran en tierras y localidades donde no hay suficiente nitrógeno ni agua. Algunos agricultores no obtienen los máximos rendimientos por falta de recursos o conocimientos para implementar buenas prácticas agrícolas. Si bien es cierto que se puede incrementar el rendimiento a traves de su potencial genético, en el caso de países con baja tecnificación agrícola como México, los factores ambientales son mucho más limitantes para la productividad de maíz a nivel nacional.

Para incrementar la producción de grano en México y Latinoamérica en general, se necesita optimizar el manejo agrícola para obtener mayores rendimientos. Sin embargo, los fertilizantes son costosos, el agua es escasa y las plagas atacan los cultivos. Es por eso que la genética si es importante, sobre todo, si dos agricultores con el mismo suelo, insumos y manejo agrícola, comparan sus rendimientos.

El uso de semilla no-mejorada o si-mejorada puede marcar la diferencia entre una agricultura rentable o no rentable. Puede significar el sustento o la ruina para un campesino y su familia. La genética de los cultivos puede derivar en hambre o calidad de vida para pueblos enteros. El mejoramiento genético del maíz es un trabajo muy importante. Muchas personas dependen de ese cultivo para su alimentación y sustento. El mejoramiento de especies vegetales es

24 particularmente atractivo en países megadiversos como los nuestros en Latinoamérica. El territorio mexicano cuenta con una amplia diversidad de climas, ecosistemas y suelos, lo que ha dado origen a una gran riqueza de especies, tanto animales como vegetales. Es una gran ventaja contar con un enorme acervo genético, y debemos de cuidarlo como un patrimonio de toda la humanidad. Pero también es cierto que debemos de sacarle provecho a esa ventaja competitiva que nos ha dado la naturaleza. ¿De qué nos sirve tener mucha diversidad biológica, si las condiciones de vida de una mayoría son de pobreza y marginación? La biotecnología vegetal nos puede ayudar a encontrar los mecanismos para que la diversidad biológica y la riqueza natural sea una fuente de bienestar para toda nuestra sociedad.

Figura 2-1. Biotecnología y diversidad biológica.

2.1.2. Del genotipo al fenotipo

2.1.2.1. Modelos genéticos En el siglo pasado se debatió mucho acerca de la influencia del ambiente y los genes. Esta discusión no se limitaba a características de las especies vegetales, sino también al ser humano. Algunos decían que nuestra vida estaba determinada por el ambiente, otros opinaban que los genes lo predeterminaban todo. Hoy en día, los expertos todavía no se han puesto de acuerdo acerca de algunas de nuestras habilidades. ¿Cómo están determinadas?, ¿Es el talento innato que adquirimos por medio de la herencia, o es lo que aprendemos por medio de la experiencia y la educación? Lo mismo ocurre con las plantas, ¿qué es lo que determina la apariencia y el fenotipo de una planta? Para discutir estas cuestiones es muy importante contar con definiciones muy claras de los diferentes conceptos que vamos a utilizar.

Fenotipo (F): El fenotipo es el conjunto de caracteres que se manifiestan visiblemente a nivel del individuo o población. Esto pueden ser parámetros agronómicos cualitativos o cuantitativos (color, rendimiento, etc.). El fenotipo es lo que podemos observar, medir, cuantificar o cosechar. El fenotipo puede ser algo muy simple como el color del grano, pero también puede ser una característica tan compleja, como la inteligencia o el comportamiento sexual en los seres humanos.

Ambiente (E del inglés Environment): El ambiente es el conjunto de variables externas que influyen sobre el desarrollo y las funciones de un organismo. Muchas veces el ambiente controla la expresión de los genes o las proteínas. Por ejemplo, la temperatura afecta la función de la célula, promueve la actividad de algunas enzimas o cambia el patrón de acumulación de metabolitos. El ambiente incluye todos los factores abióticos (parámetros químicos y físicos) y también factores bióticos de interacciones biológicas y ecológicas. Algunas variables ambientales se pueden medir, pero muchas veces no se pueden controlar en el campo.

Genotipo (G): El genotipo es la suma de los genes y combinación de alelos que tiene un determinado individuo o variedad. En términos moleculares es la información genética codificada en el DNA que está presente en el núcleo, los plástidos y mitocondrias. A nivel de especie se habla del genoma, que incluye todos los genes y su potencial de expresión. A nivel de población de habla del pool genético, mientras que a nivel individual se habla de la combinación de alelos que están presente en determinado genotipo.

Hoy en día, uno de los temas más importantes de las ciencias biológicas es determinar la relación que existe entre los genes y sus funciones específicas. Es decir, entender cómo se llega del genotipo al fenotipo y viceversa. De la genómica estructural, se está pasando cada vez más a la genómica funcional. La secuenciación de genomas completos es solo el principio de una tarea más amplia dentro de la biología de sistemas. A lo largo de la historia se han postulado varios modelos que tratan de explicar los factores que influencian el fenotipo de un individuo.

Fenotipo = E Modelo ambientalista reduccionista Fenotipo = G Modelo genetista reduccionista Fenotipo = E + G Modelo aditivo simple

El modelo aditivo asume que el factor genético y el factor ambiental son totalmente independientes y actúan de forma lineal. Sin embargo, éste no siempre es el caso. Algunas veces, el factor genético puede tener una interacción no-lineal con el ambiente. Un mismo alelo puede tener un efecto fenotípico diferente, dependiendo del ambiente en que se exprese. A esta interacción que no necesariamente es aditiva ni lineal se le llama interacción genotipo-ambiente GxE. (Genotype x Environment) Gen A Gen B

Ambiente

Figura 2-2. Un modelo de la determinación fenotípica que demuestra cómo los genes y el ambiente actuan en el desarrollo interactivo para producir un fenotipo. El ambiente es como un prisma que puede cambiar la forma en que un gen se expresa a nivel de fenotipo. El mismo gen puede tener un efecto diferente dependiendo del ambiente. La combinación de genes y la interaccion con el ambiente pueden dar lugar a fenotipos complejos. Esta complejidad significa que el fenotipo es más que la simple suma de los efectos individuales de los genes.

De cierta forma, la interacción genética no-lineal contradice la noción que generalmente nos enseñan sobre los genes, derivada de los experimentos con chícharos de Gregor Mendel y las mosquitas de la fruta de Thomas Morgan. Por lo regular, un alelo que determina el color rojo o blanco de los ojos de una mosquita, va a funcionar de la misma forma, independientemente del medio en que se desarrolle el individuo. Sin embargo éste parece ser solo el caso para los caracteres bioquímicos simples. Esta relación simple es mucho más común para las bacterias que para los organismos superiores. Para los caracteres fenotípicos con mayor complejidad, como el rendimiento de grano en maíz, existen muchos ejemplos de que los genes no siempre actúan de la misma forma, y que existe un tipo de herencia que es más complicada de lo que generalmente se menciona en los libros de genética clásica. Los investigadores que tienen experiencia en mejoramiento genético están concientes de que es un fenómeno de expresión complejo, y por eso hacen sus evaluaciones de rendimiento en diferentes localidades y en diferentes años. De esta forma, pueden hacer un análisis estadístico que permite calcular los efectos de G, E y GxE para tratar de identificar aquellos alelos que tienen un efecto genético positivo y una baja interacción con el ambiente. A esto se refieren los mejoradores cuando hablan de “potencial” de rendimiento y “estabilidad” de rendimiento.

Los libros de biología molecular muchas veces explican el concepto de la información genética, simplificándolo. Por ejemplo diciendo que a partir de un gen se forma una sola proteína, que siempre es la misma, y que tiene una determinada y única función. Es por eso que muchos biólogos moleculares piensan que al determinar la secuencia del DNA ya saben que proteína se va a formar y por ende pueden saber la función y el fenotipo. Recientemente se ha encontrado que a traves del mecanismo de splicing diferencial, un solo gen puede dar lugar a varias proteínas diferentes. Si ya estamos convencidos de que un solo gen da origen a varias proteínas, no estamos lejos de comprender porque un solo gen puede tener diferentes funciones, o que una sola proteína pueda tener diferentes efectos dependiendo, del ambiente o de las demás proteínas con las que se encuentre asociada.

En términos prácticos, la interacción GxE puede significar que un alelo puede ser favorable para condiciones de riego normal, pero detrimental bajo condiciones de sequía.

Por ejemplo, un gen que incremente el número de aperturas estomáticass en las hojas verdes puede ayudar a que la planta tenga una mayor asimilación de dióxido de carbono. Esto será

benéfico para la tasa fotosintética y el rendimiento de grano en condiciones de alta humedad; sin embargo, esta misma característica puede ser perjudicial si la planta se expone a una baja humedad relativa y condiciones limitantes de agua. El efecto de un gen depende del ambiente, de forma que un mismo alelo puede ser benéfico o detrimental según las condiciones particulares en que se exprese.

Para explicar esta diferencia de una respuesta genética simple se debe de incluir el factor GxE en la ecuación. En resumen se puede establecer un modelo más completo como:

Fenotipo = E + G + GxE

Este es el modelo que en la actualidad se aplica con mayor frecuencia para el análisis de varianzas y detección de QTLs (del inglés Quantitative Trait Locus). Sin embargo, hay que tomar en cuenta que este modelo todavía es un poco reduccionista. Un factor que siempre está presente en todos los experimentos es el azar, y por lo tanto, se debe incluir un término de variabilidad residual que llamaremos R (del inglés randomness). Sin embargo, el factor R es un tanto intangible y para muchos muy molesto. Por lo regular se asume que es constante, pequeño y tiene una media de cero y una distribución normal, por lo que en forma común se ignora (a veces injustificadamente) y se elimina de las ecuaciones. Otro factor que también influye en el fenotipo, es la interacción no lineal entre genes (interacción GxG). Esta interacción se expresa en forma de epistasis, heterosis y factores epigenéticos.

Por ejemplo, un gen puede ser benéfico en cierto fondo genético, mientras que en otro puede ser detrimental. Un alelo puede funcionar si está presente en estado homocigótico, pero tener un efecto diferente en estado heterocigótico y viceversa. En el caso del maíz, el efecto de heterosis es tan marcado (>200%), que casi todos los parámetros agronómicos importantes se tienen que evaluar en híbridos, y no en líneas homocigóticas. Esté fenómeno se refiere a la interacción de gen con gen y se le puede incluir en la ecuación como interacción GxG.

En el presente libro enfocado a los mejoradores modernos, usaremos un modelo más completo como:

Fenotipo = E + G + GxE + GxG + R

En el capitulo 8.2 explicaremos con mayor detalle como distinguir entre las diferentes variables. Daremos ejemplos de que experimentos y cálculos que se deben de hacer para estimar la contribución de cada parámetro.

2.1.2.2. Control de variabilidad La variabilidad fenotípica es uno de los obstáculos más grandes para el mejoramiento genético convencional. En los ensayos de campo siempre hay mucha variabilidad. La influencia predominante del ambiente representa un problema, ya que genotipos iguales en ambientes diferentes pueden tener fenotipos muy diferentes, mientras que genotipos diferentes en un mismo ambiente pueden tener fenotipos muy parecidos. Es decir, el factor del ambiente puede ocultar a los demás factores genéticos (cuando E es mucho mas grande que G).

Los mejoradores de maíz tienen que identificar diferencias genéticas entre variedades de menos de 1 ton/ha. Sin embargo, la variabilidad de campo muchas veces es mayor a 2 ton/ha, mientras que las diferencias entre una condición (riego normal) y otra condición (sequía) causa variaciones de mas de 8 ton/ha ¿Cómo detectar diferencias sutiles con un ruido de fondo altísimo? Bajo condiciones de altísima variabilidad no-genética, es muy difícil identificar los alelos de las variedades superiores.

Para detectar mejor las diferencias genéticas, tenemos que disminuir la influencia de los demás factores que afectan el fenotipo. Interesa que el ambiente sea lo más uniforme posible (E ≈

28 constante) para que la relación fenotipo/genotipo sea lo menos complejo posible (F ≈ E). Esta uniformidad del ambiente ayuda a identificar mejor a los genes favorables, y así realizar las mejoras genéticas deseadas, ya que la selección por lo general se hace sobre el fenotipo (selección convencional). Una de las ventajas de los marcadores moleculares es que usan la información del DNA y permiten así una selección genotípica directa. A esto se le llama selección asistida por marcadores moleculares (o MAS por sus siglas en inglés de Marker Assisted Selection).

Para saber si G tiene importancia y es cuantitativo para un caracter determinado en una población, primero tenemos que minimizar los efectos de E y de GxE. Si el ambiente tiene la influencia mínima posible, el fenotipo dependerá básicamente del genotipo. En esas condiciones podremos determinar si el fenotipo tiene cierta variabilidad y si tiene una cierta distribución estadística (puede ser una distribución binomial o normal). Las distribuciones binomiales se derivan de carácteres monogénicos con efectos muy marcados, mientras que las distribuciones polinomiales y distribuciones normales se explican por un gran número de genes involucrados (poligénicos), cada uno con efecto menor y aditivo (carácteres cuantitativos).

2.1.2.3. Matriz de parentescos Para determinar si G tiene una influencia importante sobre el fenotipo podemos comparar el carácter de interés en individuos que comparten genes (padres-hijos, hermanos completos, medios hermanos, etc.). Hay que establecer una matriz de parentescos (ver Figura 2-3) y relacionarlo con el fenotipo. En función del parentesco es posible saber el porcentaje de alelos que comparten los individuos por probabilidad.

Progenitor 1 Progenitor 2 Progenitor 3 P % de Homogocidad = a % de Homogocidad = b % de Homogocidad = c

X X 50% cruza cruza

a*25% +b* 25% +50% b*25% +c* 25% F1 Hijo 1 100% Hijo 2 50% Hijo 3 Progenitor 4 Hermanos Medios completos Hermanos

100% autofecundación

F2 Nieto 1 25% Nieto 2

Figura 2-3. Matriz de parentescos.

Pogrenitor-Descendiente = En caso de una cruza simple, entonces los hijos (F1) compartirán 50% de los alelos con cada uno Si el progenitor es heterocigótico, aunque sea de sus padres. En caso de una autofecundación, sólo se compartirán 50% de autofecundación con un solo progenitor los alelos.

homocigótico, se compartirán 100% de los alelos.

Hermanos completos (misma madre y Si los dos progenitores son heterocigóticos, es padre). En caso de que los padres sean decir, cada uno tienen dos alelos diferentes homocigóticos, la generación F1 tendrá 100% para un total de cuatro alelos, entonces los de alelos compartidos (primera ley genética hermanos completos compartirán 50% de sus de Mendel). Ésta es la razón por la que los alelos, pero sólo compartirán el 25% de las híbridos son genéticamente homogéneos. En combinaciones alelicas diploides. la siguiente generación F2 habrá segregación (por ejemplo del tipo 3:1 o 1:2:1).

Medios hermanos (misma madre, pero Si los progenitores son heterocigóticos (la diferente padre) = 50% alelos compartidos. madre tiene dos alelos y los diferentes padres también tienen alelos diferentes), entonces los medios hermanos compartirán 50% de sus alelos.

El parecido entre ellos que tienen hermanos completos, en comparación con el que tienen los hijos (F1) con sus padres (F0), es un indicador de la heterocigoticidad de los padres, y de la herencia de un carácter.

Ejemplo-Maíz: Si sembramos las semillas de una mazorca autofecundada (hermanos completos de un mismo padre y madre), vemos que las plantas varían mucho y el carácter que nos interesa tiene una distribución aleatoria (curva normal) entonces, podemos decir que en este caso el factor R es grande, y el factor G influye poco (asumiendo que el factor E y GxE son constantes para todos, ya que las plantas se sembraron en el mismo surco, al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones). En cambio, si comparamos las mazorcas de dos plantas diferentes, y vemos que los dos grupos de plantas se distinguen claramente, entonces eso nos dice que los genes si son importantes. Estudiando la distribución de los hijos es como podremos detectar cual progenitor es mejor genéticamente. Para saber la importancia de los genes es necesario una matriz de parentivos y un estudio de los fenotipos (que permitirá ver qué progenitor tiene mejores genes). Si hay coherencia entre el parentesco y el fenotipo, se puede decir que la genética si tiene un peso importante en el carácter.

2.1.3. Biodiversidad Ningún individuo es exactamente igual a otro; incluso dentro de una misma familia se encuentra una fuerte variación. Se calcula que actualmente existen unas 450 mil especies vegetales y más de dos millones de especies animales. Entendemos por diversidad biológica o biodiversidad la variedad de formas de vida que habitan la tierra. A este conjunto se la llama la biosfera. La diversidad se compone no sólo de un elemento, sino de la variación y la abundancia relativa de especies de modo que las medidas de diversidad así consideran estos dos factores: riqueza de especies, que es el número de especies; y uniformidad, esto es, en qué medida son abundantes las poblaciones de cada especie. Se pueden clasificar según los niveles de organización en:

Diversidad genética: Cada individuo de una especie posee una composición genética fruto de la evolución de millones de años. En el genoma está escrito el potencial de cada individuo, provocando la gran diversidad existente incluso dentro de una misma especie.

Diversidad ambiental: La misma composición genética puede expresarse de diferente manera según el ambiente y la historia del individuo, generando así plasticidad y diversidad fenotípica. Esta es la razón por la que los gemelos, aunque tengan los mismos genes, a veces sean diferentes y se comporten cada uno en su forma particular.

Diversidad epigenética: Una de los mecanismos por medio del cual esas diferencias ambientales pueden heredarse a las siguientes generaciones es por medio de cambios epigenéticos en el genoma. Esto se refiere principalmente a los patrones de metilación del DNA. Los cambios epigenéticos también se refieren a la acetilación de las histonas y los modificadores de la cromatina.

Diversidad de especies: A la diversidad global del planeta contribuyen por una parte las especies ubicuitas (especies universales) y las especies endémicas. Existen muchas especies que se encuentran muy extendidas y que en cada zona aparecen como una raza o subespecie, pero siempre dentro de la misma especie. Las especies endémicas son aquellas cuya distribución geográfica se limita a un área muy localizada.

Diversidad de ecosistemas: Viene dada por la multitud de ecosistemas que integran la tierra. En este nivel de diversidad existe cierta imprecisión por la ambigüedad del concepto de ecosistema y la dificultad de delinear un ecosistema de otro vecino.

Un ecosistema es un sistema natural vivo que está formado por un conjunto de organismos vivos (biocenosis) y el medio físico en donde se relacionan, biotopo. Un ecosistema es una unidad compuesta de organismos interdependientes que comparten el mismo hábitat. Los ecosistemas suelen formar una serie de cadenas tróficas que muestran la interdependencia de los organismos dentro del sistema. El concepto de ecosistema tiene en cuenta las complejas interacciones entre los organismos (por ejemplo plantas, animales, bacterias, algas, protistas y hongos, entre otros) que forman la comunidad (biocenosis) y los flujos de energía y materiales que la atraviesan.

Un concepto similar al de ecosistema es el de bioma, que es, climática y geográficamente, una zona definida ecológicamente en que se dan similares condiciones climáticas y similares comunidades de plantas, animales y organismos del suelo, a menudo referidas como ecosistemas. Los biomas se definen basándose en factores tales como las estructuras de las plantas (árboles, arbustos y hierbas), los tipos de hojas (como maleza de hoja ancha o delgada), la distancia (bosque, floresta, sabana) y el clima. A diferencia de las ecozonas, los biomas no se definen por genética, taxonomía o semejanzas históricas y se identifican con frecuencia con patrones especiales de sucesión ecológica y vegetación clímax.

Los biomas también pueden considerarse como mega-ambientes pare el cultivo de una especie agrícola. Actualmente se distinguen diversos mega-ambientes principales para el mejoramiento de maíz:

• Regiones templadas o Templado de ciclo corto (Iowa, Illinois, Kansas, Alemania, Inglaterra) o Templado de ciclo más largo (Florida, Francia, España) • Regiones subtropicales o Valles altos (>2000 mts de altura. Etiopía, Nepal, Edo de México, Hidalgo) o Subtropico (800-2000 mts de altura. India, Kenia, Jalisco, Guanajuato) o Tropico (<800mts de altura. Colombia, Brazil, Veracruz, Yucatan)

Figura 2-4. Mapa de biomas terrestres.

2.1.3.1. Diversidad biológica

Figura 2-5. Diversidad de organismos eucarióticos y animales.

Figura 2-6. Diversidad de hortalizas y frutas

Figura 2-7. Diversidad de especies vegetales.

Tarea 2-1 Averigüe el nombre común y científico de algunas de las especies que se muestran en las figuras anteriores.

Tarea 2-2 Refuerce sus conocimientos de botánica. Haga una lista de todas las familias de especies vegetales que conozca.

Tarea 2-3 Haga un esquema de la estructura floral de las siguientes familias de plantas: poacea, brassicacea y fabacea. ¿Cuantos sépalos, pétalos, estambres y carpelos tienen las flores de esas familias?

Tarea 2-4 ¿Cual es la diferencia botánica entre flor e inflorescencia? ¿Identifique y distinga la inflorescencia y las flores individuales del maíz?

Tarea 2-5 ¿Cual es la diferencia botánica entre hoja simple y hoja compleja?

Tarea 2-6 ¿Cuál es la diferencia botánica entre las espinas que se derivan de una hoja, de un tallo o de una raíz? ¿A que se refieren los biólogos cuando hablan de órganos homólogos?

Tarea 2-7

¿Qué especies de gramíneas tienen ahuates, espinas o tricomas? ¿Para que sirven? Los tricomas del maíz ¿como se producen?

Figura 2-8. Diversidad de formas y funciones de hojas vegetales.

Tarea 2-8 ¿A qué se refieren los científicos cuando dicen que México es un país megadiverso? Investigue el origen de algunas especies agrícolas de consumo diario. Averigüe en su biblioteca o por internet cuales fueron los centros de domesticación de las siguientes plantas: maíz, trigo, arroz, fríjol, chile, caña de azúcar, jitomate, arroz, aguacate, cacao, nopal, papa y tabaco.

Tarea 2-9 Muchas plantas de origen mesoamericano se cultivan hoy en día en todo el mundo. Sin embargo, los animales domesticados como el perro, el gato, el cerdo, el caballo, la gallina, la vaca, la cabra, la oveja y muchos animales son originarios de otros continentes. Solo el pavo (el guajolote) es de origen mesoamericano y se ha vuelto importante a nivel mundial. Es decir, de México proceden muchas plantas, pero muy pocos animales con importancia económica. Postule una hipótesis de porque ésto fue así, y haga una recopilación de información que le ayude a sustentarla.

2.1.3.2. Diversidad taxonómica

Figura 2-9. Árbol de la vida a partir de ancestros comunes

Figura 2-10. Algunos ejemplos de especies de los tres dominios.

2.1.3.3. Diversidad agrícola En la agricultura mundial, se emplean menos de 300 especies de las 400 mil disponibles. Más del 80% de la alimentación mundial depende de tan solo de 3 especies (maíz, trigo y arroz). Muchos científicos están muy preocupados por la conservación de la diversidad biológica y genética de las especies silvestres. Algunas de las especies que todavía no han sido domesticadas podrían proporcionar genes muy valiosos. Podría ser un tesoro insustituible para el desarrollo sostenible de la humanidad durante los próximos milenios. Algunos de los genes que se podrían incorporar en variedades futuras son aquellos que son responsables de resistencias a enfermedades y tolerancia a factores abióticos adversos. También están aquellos genes que podrían generar nuevos colores, sabores y olores, hasta ahora inimaginados. Es por ello que la conservación debe de ser una estrategia sistemática de almacenamiento, clasificación, caracterización, unida con bioprospección e introgresión. Pero no se trata solo de conservar y de almacenar. Un banco de germoplasma no tiene ninguna utilidad si no se usa también para caracterización y mejoramiento genético.

2.1.3.4. Diversidad del maíz

Figura 2-11. Colores y formas de mazorcas de variedades criollas.

El maíz es una de las especies biológicas con mayor diversidad. Esta diversidad tan alta puede tener varios orígenes. Por un lado, el genoma de maíz es de los más plásticos y dinámicos. Esto se debe a la cantidad tan grande de transposones que contiene, y además a la alta taza de mutación y recombinación. No fue una coincidencia de que los elementos genéticos movibles fueran descubiertos primero en maíz.

Tarea 2-10 Averigüe quien fue Bárbara McClintock. ¿Qué fue lo que ella descubrió? ¿Qué es un elemento genético movible? ¿Por cuáles meritos científicos le otorgaron el Premio Nobel?

Tarea 2-11 Visite el sito de la Fundacion Nobel en Estocolmo y averigüe las contribuciones que han hecho los científicos más famosos en las áreas de química y de medicina. http://nobelprize.org/ Escoja 5 premios Nobel y haga un resumen de los logros científicos con sus propias palabras.

Fue hasta después de los años 70´s que en otras especies también se descubrieron los transposones. Otra razón de que sea un cultivo tan diverso, es que el maíz depende 100% del ser humano para la diseminación de su semilla y su desarrollo. Los pueblos indígenas mesoamericanos generaron una gran cantidad de razas. Estas por lo regular se distinguen por el tipo y color de grano, y no tanto por el aspecto de la planta.

2.2. Origen de la variabilidad genética 2.2.1. Mutaciones Una parte de la diversidad genética se genera por mutaciones puntuales durante la replicación o el ciclo celular. Por lo regular, el DNA se replica dentro del núcleo generando copias idénticas. 2 copias idénticas Gen 1 Gen 1 Replicación Gen 1

Ciclo celular Fase G1 Fase S Fase G2 Mitosis División Celular

Figura 2-12. Replicación de los genes durante el ciclo celular.

Por efecto del azar y fluctuaciones cuánticas se pueden cometer errores al copiar el DNA. Una de las proteínas responsables se llama polimerasa. Es una enzima que tiene una fidelidad de copiado mayor a 99% pero menor que 100%. Al cometerse un error de copiado, se genera una nueva variante del gen como se observa en la Figura 2-13. A esto se le llama un polimorfismo. Esta mutación puntual puede generar un nuevo alelo. Este alelo puede tener una mejor o peor eficiencia que el original. Estas mutaciones se van acumulando durante sucesivas generaciones, de forma que con el tiempo, el alelo puede adquirir una función diferente. Polimorfismo

Alelo 1 Mutación Alelo 2

Figura 2-13. Las mutaciones dan origen a nuevas variantes de genes.

Si el proceso mutagénico se combina con una duplicación de ese gen (por ejemplo, un alelo en el cromosoma 1 se puede copiar e insertar en el cromosoma 4, obteniéndose dos copias del mismo alelo en distintos loci del genoma). Por medio de mutaciones acumulativas las diferentes variantes se diversifican cada vez más. Los alelos evolucionan de manera independiente. Con el transcurso del tiempo se obtienen genes que pertenecen a una misma familia, pero que han adquirido funciones diferentes. A estas variantes duplicadas ya no se les llama alelos sino familias de genes. Ver Figura 2-14. Alelo 1a Mutaciones Gen 1 Alelo 1 Duplicación Alelo 1b Mutaciones Gen 2

Figura 2-14. La duplicación y mutación divergente genera familias de genes.

El proceso de duplicación de genes es muy común en los organismos superiores. Cuando se secuenció el genoma completo de Arabidopsis thaliana en el año 2000, se advirtió que existían muchos bloques de genes repetidos en diferentes partes del genoma. La Figura 2-15 muestra los 5 cromosomas de Arabidopsis (líneas horizontales blancas). Las líneas verticales de colores muestran los grupos de genes que están repetidos en diferentes cromosomas. Se puede observar que no son pocos, sino miles de genes que están duplicados en esta planta.

Figura 2-15. Duplicaciones segmentales del genoma de Arabidopsis.

Si bien antes se pensaba que el genoma de un organismo era estático y fijo, hoy en día se sabe que existe muchísima plasticidad durante la evolución genómica. Por ejemplo, en maíz se han secuenciado segmentos de cromosomas de diferentes variedades. Al comparar los segmentos supuestamente homólogos se han encontrado que puede haber diferencias muy grandes, por ejemplo, que hasta 30% de los genes pueden faltar o sobrar en alguna de las variedades. En la Figura 2-16 se muestra el DNA de dos variedades que comparten tres genes, mientras que el gen 3 y 5 sólo están presentes en una de las variedades, en la otra variedad tiene genes únicos.

Gen 1 Gen 2 Gen 3 Gen 5 Gen 7 Variedad 1

Gen 1 Gen 2 Gen 4 Gen 6 Gen 7 Variedad 2

Figura 2-16. Algunas líneas homocigóticas de maíz tienen diferentes genes en regiones homologas de sus cromosomas.

Tarea 2-12 Busque artículos sobre algunos genes de maíz. Ponga las referencias y haga un mapa conceptual con respecto la posible función de esos genes, tanto a nivel molecular como agronómico. 2.2.2. Recombinación Además de las mutaciones, otro mecanismo que contribuye de manera muy significativa a la formación de nuevos alelos y genes es la recombinación. Durante la meiosis los dos alelos de un padre diploide se aparean y pueden intercambiar segmentos (crossing over), formándose así dos nuevos alelos, como se muestra en la Figura 2-17. Alelo 1 Alelo 3 X Recombinación + Alelo 2 Alelo 4

Figura 2-17. La recombinación genética crea nuevos alelos.

Un atributo de este mecanismo es que permite generar variantes con mayor probabilidad de ser ventajosas. Una mutación al azar tiene una gran probabilidad de ser letal, mientras que la recombinación puede generar una variante que combine las ventajas del 5 prima (5’) de un alelo, con las características superiores de la región 3 prima (3’) de otro alelo. De esta forma se puede generar un alelo recombinante mejorado (un superalelo). De hecho, parece ser que la organización de los genes en intrones y exones, facilita este tipo de recombinaciones entre diferentes alelos. De esta forma se pueden combinar y piramidizar módulos de diferentes proteínas, y así, generar genes con funciones novedosas. A este concepto evolutivo se le llama Exon-Shuffling (Figura 2-18). Gen 1 Promotor Exon 1 Exon 2 Exon 3

Gen 2 Promotor Exon 1 Exon 2 Exon 3

Exon Shuffling

Gen 3 Promotor Exon 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3 Figura 2-18. Exon shuffling por recombinación.

Es curioso notar que el genoma de las bacterias se caracteriza por la ausencia de exones e intrones, mientras que los genomas de organismos superiores, como el maíz o el ser humano, están repletos de ellos. Si analizamos la historia evolutiva, podríamos constatar que el genoma de Zea mays ha evolucionado mucho más rápido que el genoma de una bacteria como Escherichia coli. ¿A qué se debe esto?

Figura 2-19. Comparación del genoma de E. coli, S. cerevisiae, humano y maíz. Se muestran las diferencias en la densidad génica y secuencias repetitivas.

Nadie lo sabe a ciencia cierta. Tal vez sea que los intrones y el “DNA basura” de los organismos superiores facilita la recombinación de exones y de esta forma se facilita la innovación genética. Otros procesos que podrían contribuir a este fenómeno, es la ploidía y los procesos de transferencia genética por vía sexual. La sexualidad incrementa la tasa de recombinación mucho más allá de lo que las bacterias pueden lograr por medio de la conjugación bacteriana. Todo esto combinado, es lo que ha permitido que algunos organismos evolucionen más rápido que otros, aún cuando los ciclos generativos sean mucho más largos. Por ejemplo, un ciclo generativo de E. coli dura menos de 1 h mientras que un ciclo de maíz dura más de 3 meses. Y sin embargo, pareciera que el maíz ha evolucionado más que la bacteria coli en los últimos cien años. Esta es una noción evolutiva relevante para el mejoramiento genético, ya que cualquier mecanismo que nos ayude a acelerar la innovación genética facilita nuestra tarea de

40 mejoramiento, ya sea, incrementando nuestra probabilidad de que la variante sea ventajosa o ayudándonos a lograrlo de manera más rápida o eficiente. 2.2.3. Transferencia horizontal En la sección anterior vimos que un gen se puede duplicar dentro de una misma especie. El gen duplicado puede quedarse cerca del gen original o transferirse entre los diferentes cromosomas (ver Figura 2-15). ¿Podríamos entonces pensar que este proceso de duplicación y transferencia genética también se lleva a cabo entre los genomas de diferentes especies? No es difícil imaginar que sí puede suceder. A esté fenómeno se le llama transferencia genética horizontal (Figura 2-20) para distinguirlo de la transferencia genética vertical (Figura 2-21) que se refiere al proceso en donde los progenitores transfieren una parte de sus genes a sus hijos de manera sexual (fenómeno de herencia). Organismo A

Gen 1

Gen 2

Gen 3 Gen 1 Transferencia Gen 2 horizontal Gen 2 Gen 1 Gen 3 Gen 3 Gen 2 Nuevo organismo con genes adicionales Gen 3 Organismo B

Figura 2-20. Transferencia genética horizontal.

Progenitor P1 Progenitor P2

Alelo 1a Alelo 1b

Alelo 2a Alelo 2b

Alelo 3a Alelo 3b

Transferencia vertical (Herencia)

Alelo 1b

Alelo 2a

Alelo 3b Descendiente F1

Figura 2-21. Transferencia genética vertical.

La transferencia genética horizontal es un proceso muy común en las bacterias y los microorganismos que comparten un mismo hábitat. Esto se debe, a que las bacterias tienen mecanismos especiales para transferir el DNA entre diferentes células. A esto de le llama conjugación bacteriana y se lleva a cabo por medio de estructuras llamadas sex pilli. Sin embargo, las bacterias también pueden adquirir DNA de fuera de la célula. A este proceso se le llama transformación genética y es uno de los pilares metodológicos con mayor importancia de la biología molecular.

Tarea 2-13 Averigüe por internet cuales son los protocolos de transformación de bacterias mas usados en la actualidad por los laboratorios de investigación. Haga un comparativo entre el protocolo de choque térmico (heat shock) y el protocolo de electroporación. ¿Cuál es más fácil? ¿Cuál es más eficiente? ¿Qué equipo requiere cada protocolo?

Tarea 2-14 ¿Cuál de los siguientes organismos tiene un genoma plastídico: la diatomea, la víbora, la seta, el maíz, la bacteria Escherichia Coli, la garrapata, el tripanosoma? Si no conoce todas las especies, consulte un libro de taxonomía.

Tarea 2-15 Si la especie A tiene más DNA por núcleo que la especie B, ¿tienen A necesariamente más genes que B? Explique. ¿Qué factores determinan la cantidad de genes o de DNA de una especie?

Tarea 2-16 Imagine que tiene cuatro variedades de maíz. Los números 1, 2 y 3 son de color azul, y el número 4 es blanco. Las cruzas siguientes fueron hechas y la progenie obtenida fue evaluada:

1 x 2 todo azul 1 x 3 ¾ azul y ¼ blanco 1 x 4 ½ azul y ½ blanco

¿Qué fenotipo es dominante, el azul o el blanco? Ahora ponga los genotipos de los cuatro maíces progenitores en una lista. Use la siguiente nomenclatura: A para azul y a para blanco. Prediga los tipos de progenie y proporciones de la cruzas 2x3, 2x4 y 3x4.

Tarea 2-17 Dibuje el ciclo de vida de una planta con flores. Explique el fenómeno de la doble fecundación.

Tarea 2-18 Defina la palabra dimorfismo sexual ¿Está relacionado con el término polimorfismo genético? ¿Cuál es la importancia del dimorfismo en la evolución?

Tarea 2-19 ¿Cuáles son las diferencias entre individuos, familias, poblaciones y comunidades? Si no lo sabe, postule una hipótesis y defiéndala con argumentos.

Tarea 2-20 Para hacer entre profesor y alumnos. Escoja una población de plantas y animales que conozca cerca de donde usted vive. Enliste las diferencias morfológicas entre individuos, y encuentre los dimorfismos si es que los hay.

2.2.4. Selección La selección natural afecta de gran manera la cantidad y la calidad de la variabilidad genética. En realidad no es un proceso por el cual se produzcan nuevas variantes, sino todo lo contrario. Por medio de la selección se reduce y se restringe enormemente la diversidad genética. Casi el 99% de la diversidad de especies que han existido en nuestro planeta se han extinguido a causa de la selección natural. Es decir, la selección es una fuerza que elimina, y de esta a forma moldea la diversidad genética que sobrevive y puede multiplicarse y reproducirse. Podemos decir entonces que las mutaciones son parte de una fuerza creativa, mientras que la selección es una fuerza destructiva, y que la evolución se da por el balance entre estas dos grandes fuerzas que en cierto sentido son opuestas (ver Figura 2-22).

Gen 6 Gen 1 Gen 5 X M uta Gen 4 ci ión Gen 2 one ecc s Sel X Gen 1 Creación de variantes Eliminación de variantes Gen 2 Gen 2

Gen 3 Gen 3

Gen 1 Gen17 Gen 2 Generación de nuevas variantes Recombinación

Figura 2-22. Fuerzas evolutivas de mutación, recombinación y selección.

La selección natural puede dividirse en varias categorías:

• La sexual, ocurre cuando los organismos son más atractivos para el sexo opuesto debido a sus características. Los alelos favorables se reproducen más y aumentan la frecuencia de estas características en el patrimonio genético común.

• La ecológica, ocurre en el resto de las circunstancias (habilidad para obtener o procesar alimento, capacidad de esconderse, huir o de defensa, capacidad para resistir fluctuaciones ambientales, etc.)

La selección en muchos casos implica una muerte antes de llegar a la etapa reproductiva. Cabe recalcar que la muerte del individuo después de la etapa reproductiva no se puede considerar como selección natural. Cuando un individuo ya ha procreado, sus alelos ya se han transferido a la siguiente generación. La muerte de individuos sin capacidad de reproducción (por ejemplo abejas y hormigas trabajadoras) tampoco se considera selección natural.

El papel central de la selección natural en la teoría de la evolución ha dado origen a una fuerte conexión entre ese campo y el estudio de la ecología. Las interacciones ecológicas entre diferentes organismos son uno de los factores determinantes para el fitness y el éxito evolutivo. Esto es lo que Darwin llamo struggle for life y Haeckel después describió como survival of the fittest. La selección natural altera las frecuencias de los alelos de diferentes formas:

• La selección negativa elimina las mutaciones perniciosas de una población. A este fenómeno también se le ha llamado selección purificadora, porque sólo permite que sobrevivan un número limitado de variantes. • La selección positiva aumenta la frecuencia de variantes benéficas. Esto se debe a que los organismos portadores tienen más éxito y producen más descendencia, que a su vez sobrevive y puede reproducirse, y por consiguiente, esa ventaja selectiva de generación en generación causa un cambio en las frecuencias génicas de la población. • La selección de balanceo mantiene ciertas variaciones dentro de una población. Esto se debe, a que los alelos, en algunos casos tienen un efecto de fitness positivo y en

otros casos un efecto de fitness negativo. La selección de balanceo se da a través de mecanismos tales como: • La sobredominancia o vigor híbrido. Este fenómeno se debe a que un alelo en estado heterocigoto puede ser ventajoso, pero cuando se encuentra en estado homocigoto puede ser desfavorable. • La selección dependiente de la frecuencia. Esto se puede deber a que el efecto de un alelo puede ser ventajoso cuando solo está presente con muy baja frecuencia, pero cuando está presente con mayor frecuencia en la población, ese alelo ya no confiere una ventaja de fitness.

Las mutaciones que no se ven afectadas por la selección natural, son llamadas mutaciones neutras. Su frecuencia en la población está dictada por su tasa de mutación, por la deriva genética y el flujo genético. Se entiende que la secuencia de DNA de un organismo, en ausencia de selección, sufre una acumulación de mutaciones neutras. El efecto probable de las mutaciones es la diversificación. Un gen que no está bajo selección será destruido por las mutaciones acumuladas. Éste es un aspecto de lo que se pudiera llamar “degradación genómica”. 2.2.5. El azar

2.2.5.1. Un fenómeno universal El azar tiene muchos nombres y muchas caras. En nuestras vidas nos confrontamos diariamente con fenómenos de incertidumbre. ¿Va a llover hoy? ¿Y si me deja el autobús? ¿Llegaré tarde al trabajo por un accidente de tránsito? Existe un dicho alemán que establece que en nuestras vidas no podemos tener certeza de nada; sólo la muerte es cierta, necesaria e inevitable. En la naturaleza, ¿qué tanto se da por azar y qué tanto se da por necesidad? En un sentido científico, podemos decir que el azar es el fenómeno que se interpone a las leyes mecanísticas de la naturaleza. El azar es el error que interfiere con la repetibilidad. El azar es la incertidumbre que rompe con la regularidad de los resultados. Por ejemplo, si partimos exactamente de las mismas condiciones y repetimos un experimento con las mismas variables, nuestra expectativa es que el resultado sea exactamente el mismo. Las mismas premisas bajo las mismas reglas deben de dar las mismas conclusiones. Es como en las matemáticas: uno más uno siempre da dos. El azar es ese fenómeno observable de la vida real que rompe con esa regularidad. El azar es como la excepción a la teoría de las matemáticas. Si no fuera por el azar, todo sería mucho más fácil de pronosticar. El azar es algo inesperado e impredecible, generando variantes en los resultados, de forma que un día, uno más uno dan dos, mientras que en otra ocasión, uno más uno dan tres. Por lo regular decimos que esa variación del resultado se da de forma espontánea. Pero ¿a qué se debe esa espontaneidad? ¿Cuál es la causa? ¿Es un capricho de la naturaleza? ¿Es algo mágico? Si analizamos los fenómenos de espontaneidad con cuidado, podemos concluir que son igual de misteriosos que el azar. Tal vez sea solo otra palabra para el mismo fenómeno ¿Podríamos decir que las fluctuaciones se dan por una fuerza real que no entendemos del todo, pero que llamamos azar? No suena tan descabellado. El azar ¿Es la causa inicial? Sí, tal vez si la sea. Es una fuerza que rompe con la inercia de los resultados siempre iguales. Es una fuerza inicial, que a su vez ¿no tiene fin, motivo o razón? Podríamos decir de forma trascendental, que es una causa inicial sin causa, o podríamos simplemente decir, que es azar.

2.2.5.2. Fuerza innovadora y fuente de diversidad En la física, el concepto de fuerza está definido como la capacidad de alterar el estado de un objeto. Por ejemplo, si un automóvil se encuentra en reposo (velocidad cero) una fuerza aplicada a lo largo de una distancia (una cantidad de energía), es capaz de cambiar el estado de

45 reposo, generando así una variación en la velocidad del automóvil. La aceleración del automóvil será directamente proporcional a la fuerza que se aplique, e inversamente proporcional a la masa inerte del automóvil. En la física, el concepto de inercia refleja esa noción de que todo permanece igual hasta que se aplica una fuerza que logra un cambio.

Usando los mismos conceptos de inercia y fuerza, podemos entonces aplicarlos al fenómeno molecular del azar. Un átomo radioactivo no va a cambiar su estado, hasta que la fuerza del azar causa un efecto cuántico inesperado e impredecible. Ese cambio azaroso hace que el átomo se descomponga emitiendo una partícula radioactiva y transformándolo en otro elemento. Es así como un átomo de carbono 14 se puede convertir en un átomo de nitrógeno 14 al emitir una partícula radioactiva beta. ¿Podemos entonces decir que el azar es la fuerza que rompe con la inercia del átomo? Es la fuerza que genera un cambio de estado. Sin el azar no habría los decaimientos radioactivos. Si no fuera por esa fuerza misteriosa, el átomo de carbono 14 seguiría siendo un átomo de carbono 14 por toda la eternidad. Si no fuera por el azar, todo se quedaría en el mismo estado inerte. Sin una fuerza externa, no puede haber cambios de inercia. Es por ello que en la física, el azar debe considerarse como una fuerza.

¿Que se puede decir del azar en el contexto químico y biológico? ¿Es el azar la fuente de diversidad? ¿Podríamos decir que el azar es una fuerza diversificadora de los elementos químicos en el universo? Tal vez si. Por ejemplo, el azar evita que todos los átomos del universo sean solo de helio o de carbono, sino que constantemente se estén generando átomos de diferentes elementos y no siempre los mismos. Si hubiera una ley universal sobre la formación de los elementos, entonces todas las partes del universo deberían tener la misma composición química. Pero las observaciones que se han hecho es que si hay grandes diferencias entre los elementos que están presentes en una región u otra del espacio. ¿Porque la Tierra tiene una composición química tan diferente de Venus o de Marte? Si continuamos analizando otros ejemplos de la cosmología o de la física cuántica, nos sorprenderíamos de la multitud de fenómenos que tienen que ver con el azar y la incertidumbre.

En la biología, el azar también tiene un papel predominante. Un alelo va a seguir siendo el mismo alelo, hasta que un agente causante, es decir una fuerza mutagénica haga que ese alelo cambie. Es decir, si la ley de la complementariedad de los nucleótidos del DNA debe de generar copias idénticas de los genes durante la replicación, el azar es esa fuerza, que interrumpe esa regularidad y genera variantes diferentes a las esperadas. El azar es la fuerza que altera la inercia de un gen a no cambiar. Actualmente la visión que predomina en la comunidad científica es que todas las mutaciones biológicas se dan por el azar. Esas mutaciones son las que generan polimorfismos genéticos que se van acumulando con el tiempo, y de esa forma van incrementando la diversidad. Es decir, si analizamos el origen de la diversidad biológica, llegaremos tarde o temprano a la conclusión de que el azar es una fuerza innovadora que genera cambios continuos e impredecibles.

¿Cómo surgió la vida en nuestro planeta? Tal vez sí fue un evento químico y biológico bastante improbable. ¿Se dio de manera espontánea? ¿Se dio por necesidad a causa de una ley universal? Hasta ahora no hay evidencias científicas de que el inicio de la vida sea repetible. En el famoso experimento de Miller se generaron diversas moléculas orgánicas, pero ni una sola molécula de DNA y mucho menos una célula viva. ¿Fue un milagro el inicio de la vida en la Tierra primitiva? ¿Pudo haber sido por un capricho del azar? Tal vez no podamos contestar todas esas preguntas de manera científica, pero si podemos formular una hipótesis bastante tangible: el azar es el origen de la diversidad en el universo. Podemos darle muchas vueltas al asunto como filósofos, pero lo que nos correspondería como científicos, es hacer experimentos para comprobar o descartar esa hipótesis.

Tarea 2-21 Para realizar entre profesor y alumnos, se sugiere trabajo en equipos y discusión plenaria. ¿Se le ocurre algún experimento que se pueda hacer para comprobar esa hipótesis? Piense en algún sistema modelo, diseñe un experimento, escriba el protocolo y hágalo. Si no puede hacer el experimento en la vida real, concíbalo en su imaginación. Discuta sus ideas con otros compañeros; estudiantes y maestros.

2.3. Evolución 2.3.1. Evolución biológica Generalmente se denomina evolución a cualquier proceso de cambio en el tiempo. La palabra evolución se usa en el ámbito social, económico y biológico. Esto no implica que sea un cambio para bien o para mal, ni para mejor o peor. Es simplemente cambio. Es por ello que la evolución no debe tener ninguna connotación hacia una dirección fija o específica. Una de las mejores formas de representar el camino impredecible de la evolución es por medio de una famosa caricatura sobre la evolución del hombre.

Figura 2-23. Caricatura de la evolución que representa un cambio de apariencia a lo largo del tiempo. La evolución puede ser hacia una dirección como hacia otra.

En el contexto de las ciencias de la vida, la evolución es un cambio, que puede llevar a la aparición de nuevas especies, a la adaptación a distintos ambientes o a la aparición de novedades morfológicas. La evolución biológica es el proceso continuo de transformación de las especies a través de cambios producidos en sucesivas generaciones, y que se ve reflejado en el cambio de las frecuencias alélicas de una población. Es decir, es un cambio en el perfil genético de una población de individuos.

A menudo existe cierta confusión entre hecho evolutivo y teoría de la evolución. Se denomina hecho evolutivo a un suceso que está sustentando por abundante evidencia. Se refiere a hechos observables, comprobables, independientes y complementarios. Por ejemplo, el hecho de que los seres vivos están emparentados entre sí y han ido transformándose a lo largo del tiempo. Esto por lo tanto se le llama hecho científico. La teoría de la evolución es el modelo científico que describe la transformación evolutiva y explica sus causas. La evolución como teoría puede tener algunas imperfecciones, pero la evolución como hecho es bastante obvia e irrefutable. Por ejemplo, puede ser que las teorías evolutivas actuales todavía le asignen pesos diferentes a las diferentes causas de la evolución, es decir, que le asignen una importancia diferente a las diversas fuerzas motrices, como selección natural, selección artificial, selección

47 sexual, migración, mutación, deriva genética, azar, etc. Pero por otro lado, es un hecho evolutivo que los perros y los lobos tuvieron un ancestro en común. Hay suficiente evidencia para sustentarlo y se puede comprobar de manera experimental.

Casi nada en la biología tiene sentido, si no se mira desde la perspectiva de que los organismos se originaron unos de otros, y que las especies se transforman con el tiempo. Si no se tiene esa noción de que cada generación hereda ciertas características de sus progenitores, pero que están acompañadas de algunos cambios, no tendría sentido intentar hacer mejoramiento genético. Las personas que dicen tener dudas sobre la teoría de la evolución, no es que no crean en la evolución, sino más bien que tienen dudas sobre los procesos causales y las razones finales. Por ejemplo, la evolución ¿tiene un fin? ¿Existe una razón superior? ¿Hay diseño en la naturaleza? ¿Podemos hablar de un propósito? ¿Es el azar o una voluntad misteriosa? ¿Puede haber una inteligencia divina dirigiendo la evolución?

Tarea 2-22 Para realizar entre profesor y alumnos. ¿Conoce algunos ejemplos de evolución de algún organismo? Haga una búsqueda bibliográfica y presente algunos indicios de evolución. Discuta la evidencia de manera crítica con otros compañeros, estudiantes y maestros.

Tarea 2-23 Busque información sobre alguna teoría científica sobre el origen de la vida. Puede empezar por la propuesta por Oparin y Haldane. ¿Qué es lo que propusieron?, ¿En qué se basaron para hacer sus afirmaciones? ¿Con qué experimentos se podría confirmar esta teoría?

Tarea 2-24 ¿Qué aportaciones hizo Stanley L Miller y Harold Urey al conocimiento sobre el origen de la vida? Investigue los detalles sobre su famoso experimento.

Tarea 2-25 ¿Qué obras ha escrito el biólogo mexicano Antonio Lazcano Araujo sobre el origen de la vida? Investigue más sobre sus artículos y compártalo con sus compañeros.

2.3.1.1. Teorías originales El Creacionismo, es la visión de que en un grado u otro, los seres vivos tienen un creador personal, consciente y divino (léase Dios). El Creacionismo original asume que las especies son inmutables, es decir, que no cambian con el paso de las generaciones. En algún momento se dió un solo acto de creación que generó a todas las especies que conocemos actualmente. Es una posición religiosa o filosófica que no puede probarse experimentalmente, y por tanto no es una teoría científica. No obstante, en el marco de la cultura popular anglosajona, algunos se esfuerzan por presentarla como tal. Pero la comunidad científica en su conjunto considera tales intentos como una forma de propaganda religiosa de carácter medieval en pleno siglo XXI. Una vertiente mas avanzada del Creacionismo, parte de múltiples actos de intervención divina, a partir de cuales se van creando nuevas especies de forma continua, a la par de que otras especies van desapareciendo por medio de selección y catástrofes.

El Lamarkismo es la suposición de que el fenotipo de un organismo puede dirigir de alguna forma el cambio del genotipo en sus descendientes. Es una posición teórica ya casi indefendible, en la medida en que es incompatible con lo que sabemos sobre la herencia; y también porque todos los intentos por hallar pruebas de observación o experimentales, han fracasado. Sin embargo, a nivel molecular, todavía existen algunas dudas sobre la capacidad de las células de alterar su información genética para adaptarse al medio. Como ejemplos se pueden mencionar la inducción de mutaciones en las bacterias expuestas a condiciones ambientales adversas, o el

48 sistema inmunológico de los humanos, en donde se inducen ciertos cambios en las regiones hipervariables para la formación de anticuerpos más selectivos después de la exposición previa con un antígeno patógeno. Todavía no se puede contestar con certeza si existe o no algún fenómeno de adaptación en la naturaleza, es decir, que se dé una modificación de los genes en dependencia del medio o la experiencia previa del organismo.

Robert Chambers fue el primer científico en postular una hipótesis que contradecía la noción generalizada de su época. La visión que predominaba era que el universo, y en lo particular las especies biológicas eran inmutables. Esta hipótesis de cambios continuos la postuló en su libro “Vestiges of the natural history of creation” que fue publicado en Londres en 1844, mucho antes que el libro famoso de Darwin. Este libro fue un bestseller de la época. Contenía ideas tan radicales para ese entonces, que su autor decidió publicarlo de manera anónima, para no ser víctima de una inquisición del tipo religiosa. El problema más grave de las teorías de este tipo era que ponían en peligro la justificación divina del orden establecido; de ahí que, en general, los conservadores se opusieran con uñas y dientes a ellas. Fue sólo hasta después de su muerte que se supo quien había sido el autor original de esa obra.

Charles Darwin y Alfred Russel Wallace propusieron la selección natural como principal mecanismo de la evolución. El más famoso libro de Darwin “On the Origins of species by means of Natural Selection”, fue publicado en 1859, mucho después de que Darwin hubiera publicado sus memorias del viaje a Suramérica en los barcos de su majestad inglesa durante los años 1826-1836 (Voyages of the Adventure and Beagle. Darwin 1839). Hoy en día se ha generado el mito de que Darwin inventó la teoría de la evolución durante su estancia en las islas Galápagos. Si uno lee las memorias de su viaje en el Beagle publicadas en 1839, son pocas las alusiones a su posterior teoría. Es probable que Darwin haya sido mucho mas inspirado por los mejoradores y los criadores de pichones de la época. Darwin también fue apresurado por la carta de otro naturalista que trabajo en lo que hoy en día es Nueva Guinea, Java, Borneo e Indonesia. Es notable que el joven Wallace se le adelantara a Darwin en la publicación de sus ideas. En 1855 Wallace publicó un artículo titulado "On the law which has regulated the introduction of new species" donde defendía el hecho de la evolución, aunque sin atribuirle una causa. Tres años más tarde, un nuevo artículo "On the tendency of varieties to depart indefinitely from the original type" proponía la selección natural como el mecanismo explicativo de la transmutación de las especies. Wallace remitió el artículo a Darwin para su revisión. Cuando éste lo leyó, se encontró con lo que calificó como el mejor resumen imaginable de las ideas que él mismo llevaba gestando trabajosamente desde hacía más de veinte años. Tras consultar con Charles Lyell, Darwin realizó una presentación pública de su manuscrito ante la Sociedad linneana de Londres el 1 de julio de 1858, acreditando a Wallace como codescubridor.

Cita completa del trabajo original: Darwin, C. R. and A. R. Wallace. 1858. On the tendency of species to form varieties; and on the perpetuation of varieties and species by natural means of selection. [Read 1 July] Journal of the Proceedings of the Linnean Society of London. Zoology 3 (20 August): 46-50. Communicated by Sir CHARLES LYELL, F.R.S., F.L.S., and J. D. HOOKER, Esq., M.D., V.P.R.S., F.L.S

Es interesante notar que el término de evolución originalmente se usaba para referirse a la historia humana en un contexto social. El término que se usaba para el cambio de las especies biológicas a lo largo del tiempo era transmutación. En esa época el concepto de mutación se refería al cambio en la geología, y no como se usa actualmente en contexto biológico. Hoy en día nadie habla ya de transmutación, aunque en esencia, las mutaciones son las verdaderas causantes de que se formen nuevas especies, y no la selección natural como postuló Darwin originalmente. La selección natural solo se limita a eliminar individuos que no sobreviven en la lucha por la vida (struggle for life), y por consiguiente, no se puede eliminar algo que no se ha creado anteriormente. En otras palabras: sin previa mutación que genera diversidad, no puede haber selección.

En la época de Darwin, los científicos no conocían cómo se heredaban las características. No se sabía nada de los genes ni del DNA. Darwin tampoco conocía la fuente de las variaciones en los organismos individuales, pero sí observó que siempre estaban presentes, y además, que parecían ocurrir aleatoriamente. En trabajos muy posteriores otros científicos atribuyeron la mayor parte de estas variaciones a las mutaciones en los genes. Es por ello que hoy en día, un título mas adecuado para un libro de evolución sería algo como: On the origins of species by means of transmutation, and the mecanism of adaptation by means of natural selection.

La Teoría de la Evolución de Darwin ha sido enriquecida desde su formulación en el siglo XIX, por avances en otras disciplinas relacionadas, como la biología molecular, la genética del desarrollo, embriología o la paleontología. Wallace y Darwin fueron los primeros en postular un mecanismo evolutivo por medio de la selección natural. La teoría más popular hoy en día es la síntesis de las ideas de muchos científicos.

En la actualidad sabemos que en algunos aspectos Darwin se equivocó. Darwin fue un pionero del pensamiento para su época, aunque en realidad Robert Chambers fue mucho más adelantado con su libro de Vestiges. Hoy en día sabemos que las ideas en el libro Chambers tuvieron muchas fallas. De igual forma sería erróneo e impreciso decir que Darwin tuvo razón en todo. De hecho, más que los biólogos, son los sociólogos e historiadores que entienden como algunos de los grandes científicos tuvieron razón en parte, pero que sus teorías originales mostraron algunos errores que poco a poco se han ido modificando y refinado. ¿Cómo iba a saber Darwin algo sobre las mutaciones del DNA, si ni siquiera se conocía nada de los genes en su época? Es importante tener presente que los grandes descubridores, pensadores o sabios, fueron y son humanos, capaces de equivocarse, y con frecuencia lo hacen. Nos podemos dar cuenta de ello si después de varios siglos estudiamos todos los aspectos de sus teorías con máximo detalle. Lo mismo que Lineus o Darwin en la biología podemos decir de Kepler, Copernico o Newton en la física. Eso no significa que las teorías originales sean erróneas, simplemente que estuvieron incompletas y que algunos hechos hoy en día se pueden interpretar mucho mejor.

Tarea 2-26 Consiga el libro o en su caso por internet el texto original de Charles Darwin (On the origins of species by means of natural selection). Puede encontrarlo en la página web del proyecto Gutenberg (www.gutenberg.org). Otro sitio donde puede encontrar todas las obras originales de Darwin es: http://darwin-online.org.uk Lea cuidadosamente la introducción de Origins y el resumen y trate de ver si encuentra algunas diferencias con respecto a la teoría actual. ¿Cuál es el verdadero papel de la selección natural? ¿Es una fuerza creadora que genera nuevas especies o es una fuerza destructiva que elimina variantes? ¿A qué se refiere Darwin cuando habla de mutación? ¿A quién le daría más crédito científico: a Chambers, a Darwin o a Wallace? ¿Por qué?

Es interesante notar que gran parte de la argumentación del texto de Darwin no proviene de las islas Galápagos como generalmente se cree, sino principalmente de la domesticación de animales y del mejoramiento genético. Es decir, Darwin usó el concepto de selección artificial que ya se conocía en su época y postuló que un mecanismo similar funcionaba en la naturaleza. Eso, fue a lo que le llamo selección natural. Lo revolucionario de su texto no fue el concepto de selección per se, sino que que dijo que existía una selección sin la supervisión del ser humano (selección natural). Para muchas personas de la época esto era inconcebible, ya que el concepto de selección implicaba que alguna inteligencia superior debía estar supervisando este proceso, así como los mejoradores escogían sus pichones favoritos y tomaban decisiones de cómo debían hacer las cruzas entre individuos. Históricamente, el ser humano tiene mayor experiencia empírica sobre el mejoramiento artificial que sobre la evolución natural. Esto está documentado, puesto que Darwin dedicó varios libros y capítulos a la crianza de palomas, ovejas, etc.

Tarea 2-27 Consulte la página http://darwin-online.org.uk y haga una lista de los trabajos originales de Darwin que tuvieron como tema la domesticación y el mejoramiento de las especies.

2.3.1.2. Teoría actual (síntesis moderna) Actualmente, la teoría de la evolución combina las propuestas de Darwin y Wallace, las interpretaciones de Huxley, con las leyes de Mendel y otros avances genéticos posteriores; por eso es llamada Síntesis Moderna o Teoría Sintética de la Evolución. Los principales contribuyentes a esta síntesis fueron Thomas Hunt Morgan, R. A. Fisher, Theodosius Dobzhansky, J.B.S. Haldane, Sewall Wright, William Donald Hamilton, Cyril Darlington, Julian Huxley, Ernst Mayr, George Gaylord Simpson, y G. Ledyard Stebbins.

Tarea 2-28 Consiga y lea algunas de las publicaciones que definieron la sintesís moderna de la evolución: ¿Qué aportaciones hizo cada uno? • Fisher, R. (1930) The Genetical Theory of Natural Selection ISBN 0-19-850440-3. • Haldane, J. B. S. The Causes of Evolution, Longman, Green and Co., 1932; Princeton University Press reprint, ISBN 0-691-02442-1 • Huxley, J. S. Evolution: The Modern Synthesis, Allen and Unwin, 1942 ISBN 0-02- 846800-7

En el seno de esta teoría, la evolución se define como un cambio en la frecuencia de los alelos en una población a lo largo de las generaciones. Este cambio puede ser causado por uno o varios mecanismos diferentes: selección natural, deriva genética, mutación, migración (flujo genético).

La evolución biológica es un fenómeno natural, real, observable y comprobable empíricamente. La Síntesis Evolutiva Moderna es una teoría robusta y ampliamente aceptada por la comunidad científica. Aunque algunos detalles son cuestionados por algunos investigadores. Actualmente proporciona explicaciones y modelos matemáticos sobre los mecanismos generales de la evolución o los fenómenos evolutivos, como la adaptación o la especiación. Como cualquier teoría científica, sus hipótesis están sujetas a constante crítica y comprobación experimental.

Dobzhansky, uno de los fundadores de la síntesis evolutiva moderna, la definió del siguiente modo: "La evolución es un cambio en la composición genética de las poblaciones. El estudio de los mecanismos evolutivos corresponde a la genética poblacional."

La síntesis moderna de la evolución se basa en tres aspectos fundamentales: • La ascendencia común de todos los organismos a partir de un único ancestro. • El origen de nuevos caracteres en un linaje evolutivo. • Los mecanismos por los que algunos caracteres persisten mientras que otros desaparecen.

Las mutaciones introducen nuevas variaciones genéticas, siendo la principal fuente de diversificación y de evolución. En la teoría sintética, la mutación tiene el papel de generar diversidad genética sobre la cual actúa la selección natural, y también la deriva génica. Las mutaciones que afectan a la eficacia biológica del portador, y por tanto son objeto de la selección natural, pueden ser deletéreas (negativas), beneficiosas (positivas), o bien neutras. Las mutaciones beneficiosas son las menos frecuentes, aunque se conocen muchos ejemplos que afectan a rasgos específicos, como la resistencia a enfermedades o a estrés, la longevidad, el tamaño, la capacidad para metabolizar nuevas sustancias, etc. La mayor parte de las

51 mutaciones son neutras; no afectan las oportunidades de supervivencia y reproducción de los organismos, y se acumulan con el tiempo a una velocidad más o menos constante. Algunas mutaciones son deletereas, por ejemplo, cuando se interrumpe un gen que es importante para mantener a una celula viva. En esos casos se dice que la mutacion es letal, y por consiguiente, desaparace rápidamente del fondo genético de la población por la presión selectiva tan alta.

La mayoría de los biólogos creen que la adaptación ocurre fundamentalmente por selección natural en etapas, mediante la acumulación de variaciones genéticas ventajosas con efectos relativamente pequeños. Las macromutaciones, por el contrario, producen efectos drásticos, fuera del intervalo de variación normal de la especie. Se ha propuesto que quizá hayan sido responsables de ciertos rasgos adaptativos o de la aparición de novedades evolutivas, aunque, dado que algunas mutaciones suelen tener efectos muy nocivos o letales, esta vía se considera actualmente poco frecuente, pero no por eso menos importante.

La duplicaciones génicas ocurren cuando las familias multigénicas están presentes en muchos genomas; por ejemplo en las globinas. Pueden surgir por duplicación de todo el genoma, o pequeños bloques o genes. Los mecanismos de duplicación incluyen: entrecruzamiento desigual, errores de replicación, transposición, poliploidía, etc. Por ejemplo, el 45% del genoma humano está compuesto de transposones. En maíz, se cree que el genoma se duplicó antes de ser domesticado, por lo que se dice que es una especie autotetraploide.

La selección natural también consiste en la reproducción diferencial de los individuos, según su dotación genética, y generalmente como resultado del ambiente. Existe selección natural cuando hay diferencias en eficacia biológica entre los individuos de una población, es decir, cuando su contribución en descendientes es desigual. La eficacia biológica puede desglosarse en componentes como: la supervivencia (la mortalidad diferencial es la tasa de supervivencia de individuos hasta la edad de reproducción), la fertilidad, la fecundidad, etc.

2.3.2. Evolución dirigida Algunas personas tienen una visión progresista de la evolución. Por ejemplo, de que el destino de las bacterias primitivas es la de evolucionar hacia convertirse en organismos multicelulares complejos. Es decir, de que la evolución consiste en progresar de lo simple como una bacteria a lo complejo como un ser humano. Algunos consideran a la especie humana como la cúspide de la evolución, y muchas veces esto está tan arraigado dentro de nosotros que lo reflejamos en nuestra religión y cultura.

Figura 2-24. Caricatura de la evolución progresiva de Darwin.

Sin embargo, otros piensan que esto es un punto de vista antropocéntrico, más que científico. La evidencia científica actual no es suficiente para sacar una conclusión definitiva. Sin embargo, la evolución natural no parece tener una dirección específica, ni un camino predeterminado. No sabemos si la evolucion tiene una dirección, pero si es que la tiene, entonces no tiene un rumbo fijo predeterminado. Es decir, no es un rumbo definido para siempre, sino que el rumbo puede cambiar con el tiempo y según las circunstancias. La historia evolutiva esta llena de accidentes, cataclismos y sorpresas. No se puede decir que exista una presión selectiva universal. Hay organismos que con el tiempo se han hecho más complejos o grandes, pero también hay muchos casos contrarios de organismos que se han hecho menos complejos o pequeños. Lo que si se puede constatar es que existe una fuerza continua de innovación que genera siempre nueva diversidad genética. Esta diversidad biológica tiende a ocupar todos los nichos ecológicos libres (Figura 2-25). Hace 3 mil Evolución Hoy millones de años Sin tendencia evolutiva Evolución por difusión B Bacterias

A Organismos Complejidad superiores

Con tendencia evolutiva Complejidad Evolución con dirección Nivel mínimo C

Complejidad

Figura 2-25. Curvas de distribución según diferentes tendencias evolutivas. El panel A muestra la situación original hace mas de mil millones de años. El panel B muestra un ejemplo de evolución sin una tendencia fija, es decir, evolución por difusión. En este caso el promedio no cambia. El panel C muestra un ejemplo de cómo se comportaría la distribución, si existiera una tendencia evolutiva que hiciera que todas las especies se vuelvan cada vez más complejas. En este caso, el promedio si cambia. Idea basada en los argumentos de Stephen Jay Gould (Full House: The spread of excellence from Plato to Darwin).

Many people wrongly believe that the process of evolution has a preferred direction—a tendency to make organisms more complex and more sophisticated as time goes by. Those who believe in evolution's drive towards progress often demonstrate it with a series of organisms that appeared in different eons, with increasing complexity, e.g., "bacteria, fern, dinosaurs, dog, man". Gould explains how these increasingly complex organisms are just one

hand of the complexity distribution, and why looking only at them misses the entire picture—the "full house". He explains that by any measure, the most common organisms have always been, and still are, the bacteria. The complexity distribution is bounded at one side (a living organism cannot be much simpler than bacteria), so an unbiased random walk by evolution, sometimes going in the complexity direction and sometimes going towards simplicity (without having an intrinsic preference to either), will create a distribution with a small, but longer and longer tail at the high complexity end.

Tarea 2-29 Trate de recabar información biológica que le permita distinguir si la curva de distribución de las especies se comporta más como el recuadro de arriba o el de abajo en la Figura 2-25. Es decir, trate de responder por si mismo si existe alguna tendencia evolutiva universal que aplique para todos los seres vivos.

Si existiera una tendencia evolutiva universal, entonces uno debería ver que todos los organismos se han desarrollado en esa dirección, y es por eso que el promedio también debería de cambiar con el tiempo. Es decir, la evolución con dirección se debe observar por medio de la comparación de los promedios y no de los extremos. Mediante la evolución “por difusión” el promedio general no cambia. Simplemente es que la curva de distribución se hace más amplia. La evolución por difusión se debe observar a través de la comparación de los límites de los extremos. Si antes no había organismos tan complejos, con el tiempo han surgido algunos cuantos por el simple hecho de que están tratando de ocupar nuevos nichos ecológicos que antes estaban libres. La curva de distribución se amplia hacia la derecha, mientras que no puede ensancharse para la izquierda porque existe un mínimo de complejidad más abajo del cual un organismo biológico no puede reproducirse (barrera de mínima complejidad). Esta barrera mínima posiblemente esté representada por algunas bacterias o micoplasmas, que son las células más simples que se conocen.

Un nicho ecológico que todavía está libre, es el de un organismo tolerante que sepa desarrollarse de manera sustentable y no se autodestruya. La especie humana puede acabar extinguiéndose como los dinosaurios o transformarse para seguir ocupando un nicho ecológico privilegiado, en nuestro limitado planeta. 2.3.3. Mejoramiento: evolución en acción La meta de un mejorador es obtener plantas o cultivos diferentes. El mejorador quiere lograr un cambio, de preferencia, benéfico. Por lo regular se trata de obtener una mayor producción en términos de cantidad y calidad. La evolución biológica es un cambio a lo largo de millones de años, sin embargo, es un cambio que se da al azar y no tiene dirección. A diferencia, el mejorador quiere lograr un cambio independientemente del azar, y además, sí quiere darle una dirección específica, y por si fuera poco, no quiere esperar miles de años para lograrlo. Es por eso que podemos decir, que el mejoramiento genético es un proceso de evolución dirigida, en donde la eficiencia y la rapidez son parámetros importantes.

Es interesante recalcar que el mismo Darwin cuando exhibió su famoso libro sobre el "Origen de las Especies", basó gran parte de sus argumentos en la selección artificial de los mejoradores genéticos de la época. En sus libros dedicó varios capítulos a la selección artificial y la domesticación de animales y plantas por la mano del hombre. Hay que recordar que la idea novedosa que postuló Darwin, es que también existía un proceso de selección en la naturaleza, y que ese proceso -al que llamó selección natural- era responsable de que los organismos silvestres pudieran cambiar tan drásticamente a lo largo del tiempo.

El mejoramiento genético es un proceso iterativo, con ciclos repetitivos de mutación, recombinación y selección. Es por eso que en realidad el mejoramiento no es otra cosa más que evolución en acción. La evidencia histórica indica que se ha logrado un gran avance, ya que a partir de la revolución verde en los años 50, la producción de trigo y de maíz en países desarrollados se ha incrementado a un ritmo promedio de alrededor del 10% por década (ver Figura 2-26).

Figura 2-26. Rendimiento de maíz en Estados Unidos. Se indican los periodos dominados por variedades de polinización libre (OPVs), híbridos dobles e híbridos simples junto con los coeficientes de regresión. Crow, J. F. (1998) Genetics: 148 p923-928. Existen diferentes tipos de bushels en Estados Unidos (los hay de 60, 56 y de 48 libras), pero posiblemente en esta figura se refieren a los bushels de 60 libras. 1 Bushel por Acre equivale aproximadamente a 0.067 toneladas por hectárea.

En 2008 el rendimiento promedio de maíz en México fue de 2.4 ton/ha lo que equivale a 36 bushels per acre. Estos bajos rendimientos se deben a las pobres prácticas agronómicas y también a que en México actualmente predominan los materiales criollos más que los materiales híbridos. Para incrementar el rendimiento en México, es necesario hacer más trabajos científicos y desarrollos tecnológicos. Sin embargo es importante resaltar, que cuando una tecnología se importa, sin adecuarla a las condiciones del lugar, puede traer graves consecuencias desfavorables, como ocurrió con la revolución verde en la mayoría de los países de África. Es por ello que la transferencia de tecnología se debe hacer con criterios científicos, ecológicos, económicos y sociales.

En términos globales, se puede decir que el mejoramiento ha sido todo un éxito por el incremento en la productividad. Durante los últimos 50 años ha habido un aumento continuo y constante de los rendimientos por hectárea. Los datos los podemos consultar en las bases de datos de la FAO (ver siguientes figuras). El impacto que esto ha generado en la alimentación mundial es innegable.

Yield Maize World 6 Rice World y = 0.063x - 121.7 Wheat World R2 = 0.9598

4 y = 0.0524x - 100.87 R2 = 0.9838

y = 0.0404x - 78.03 Mg/ha 2 2 R = 0.9716

0 1960 1970 1980 1990 2000 2010 year FAOSTAT 2009

Figura 2-27. Rendimiento promedio global de los 3 cereales más importantes del mundo: maíz, arroz y trigo. Se puede ver que la productividad ha aumentado de forma lineal desde hace más de 40 años. Fuente de datos: Faostat 2009.

Este logro se debe al trabajo combinado de los mejoradores y los agrónomos. La curva de regresión muestra que los incrementos para cada cereal han sido diferentes. El maíz tiene la tasa más alta con una ganancia promedio de 63 kg/ha*año, seguido por el arroz con un incremento de 52 kg/ha*año y el trigo con 40 kg/ha*año. El mayor rendimiento de grano se obtiene con maíz (>4 ton/ha), debido a su fotosíntesis más eficiente. El maíz es C4, mientras que el arroz y el trigo tienen fotosíntesis tipo C3.

World Cereal Production

800

750 Maize World 700 Rice World 650 Wheat World Millones 600 ton 550

500

450 1989 1994 1999 2004 2009 year FAOSTAT 2009

Figura 2-28. Producción global de los 3 cereales más importantes del mundo: maíz, arroz y trigo. Se puede ver que en 1989 el cereal más producido en el planeta era el trigo, seguido por el arroz y por último el maíz. A partir del año 2000 hubo una inversión en la jerarquía. Hoy en día (2003- 2009), el cereal más importante del mundo es el maíz, seguido por el arroz y en tercer lugar por el trigo.

El hecho de que el maíz haya rebasado a los 2 otros cereales en los últimos 20 años se debe al éxito en el mejoramiento genético del maíz, principalmente por el aprovechamiento del fenómeno de la heterosis en esta especie. Sin embargo, los incrementos en la productividad han sido variables en diferentes países. En algunos países, el rendimiento ha incrementado más rápido que en otros. Los valores los podemos consultar en la base de datos de la FAO (ver siguientes figuras).

Yields in USA Maize 10 y = 0.1154x - 222.25 Rice R2 = 0.8716 Sorghum 8 Wheat

y = 0.0735x - 140.01 2 6 R = 0.9154 y = 0.0268x - 49.558 R2 = 0.443 Mg/ha 4

2 y = 0.0243x - 45.899 R2 = 0.7979 0 1960 1970 1980 1990 2000 2010 year FAOSTAT 2009

Figura 2-29. Rendimiento de cereales en Estados Unidos. La pendiente indica la tasa de incremento en los rendimientos por hectárea. Se puede ver que en Estados Unidos, la pendiente para maíz es mucho mas pronunciada que la de trigo.

Yields in China Maize 10 Rice Sorghum 8 y = 0.0967x - 187.04 Wheat R2 = 0.9454

6 y = 0.0972x - 189.45 R2 = 0.9598

Mg/ha 4 y = 0.0784x - 152.74 R2 = 0.903 2 y = 0.0882x - 172.51 R2 = 0.9744 0 1960 1970 1980 1990 2000 2010 year FAOSTAT 2009

Figura 2-30. Rendimiento de cereales en China. Se puede ver que en China, la pendiente es muy similar para todos los cereales. Esto refleja el enorme esfuerzo de mejoramiento genético para todos los cereales.

Yields in Mexico 10 Maize Rice 8 Sorghum Wheat 6 y = 0.0595x - 114.28 R2 = 0.8495 y = 0.0617x - 118.92 R2 = 0.9139 Mg/ha 4 y = 0.0226x - 41.884 R2 = 0.5111 y = 0.0438x - 85.026 2 R2 = 0.9438

0 1960 1970 1980 1990 2000 2010 year FAOSTAT 2009

Figura 2-31. Rendimiento de cereales en México. Se puede ver que en Mexico los rendimientos y las tasas de incremento son mas bajas que en los otros países, sobre todo, para maíz y sorgo. A diferencia de Estados Unidos y China, en México el maíz no es el primer cereal en rendimiento, sino el último.

Por lo regular el maíz es de los cereales más productivos del mundo. Sin embargo, en México se da un fenómeno muy particular. México es relativamente competitivo en la producción de trigo, sorgo y arroz. Por ejemplo, los rendimientos por hectárea de trigo que se obtienen en México (>4 ton/ha), están por arriba de lo que se obtiene en promedio en Estados Unidos (<3 ton/ha). En sorgo y arroz, México tampoco esta tan mal. En el caso de maíz, México si esta muy por debajo de muchos países del mundo. En Estados Unidos se cosechan en promedio 9 ton/ha, en China se obtienen 5 ton/ha, mientras que en México se producen menos de 3 ton/ha. ¿Por qué? Para entenderlo mejor, debemos verlo desde una perspectiva evolutiva, considerando algunos trends históricos. A continuación se muestra una tabla que indica las tasas de incremento de los rendimientos.

Kg/ha*año México Estados China Unidos Maíz 43.8 115.4 97.2 Arroz 61.7 73.5 94.5 Sorgo 22.6 26.8 78.4 Trigo 59.5 24.3 88.2 Tabla 2-1. Incremento por año de los rendimientos en kilogramos por hectárea. Los datos corresponden a la pendiente de las líneas de regresión de las figuras anteriores. El valor corresponde a la pendiente promedio (en kg/ha*año) durante los últimos 40 años.

En Estados Unidos se le ha dado mucho énfasis al mejoramiento de maíz. Durante las últimas 4 décadas se ha logrado un incremento promedio de 115 kg por año. China es líder en arroz, pero también ha logrado incrementar los rendimientos de todos los cereales a un ritmo acelerado. Sin embargo, en México, no solo el rendimiento promedio es bajo ( < 3 ton/ha ), sino que además el

59 incremento en la productividad del maíz por año es mas bajo que el promedio mundial. El progreso que se obtiene en México (43.8 kg/ha*año) es menos de la mitad de lo que se obtiene en China ¿Por qué? ¿Cuál es la causa de que en México se de una velocidad de incremento menor para el maíz, a pesar de que es el país con el mayor recurso genético para esta especie? Les podemos echar la culpa a los políticos, a los mejoradores, o a los agricultores. Pero tal vez haya razones aun más enigmáticas que los propios diputados. Algunos científicos han observado que los centros de origen biológicos están positivamente correlacionados con la diversidad de alelos, genes y variedades, sin embargo, también han notado que esos centros están negativamente correlacionados con la productividad.

Los rendimientos más altos se obtienen fuera de los centros de origen. Por ejemplo, la máxima productividad del maíz se da en otros países fuera de México. Una baja productividad de maíz se obtiene en el centro y sur de México, donde hay una gran diversidad de razas y variedades de maíz. En trigo, la máxima productividad se da fuera de Medio Oriente. En Irak e Irán –el centro de origen– los rendimientos de trigo son relativamente bajos comparados con el promedio mundial. En papa, la máxima productividad se da fuera de Perú. Se cosechan más tubérculos por hectárea en los valles de los Alpes (Europa) que en los valles de los Andes (América), de donde se originó la papa y donde todavía hay mucha diversidad de solanáceas. Y como esos hay muchos otros ejemplos de especies vegetales y animales que sugieren que, el origen de la diversidad, y la máxima productividad, son como polos opuestos. ¿Podría ser un fenómeno universal? Tal vez no sea coincidencia que en la especie humana, que tiene sus raíces en el continente Africano, el máximo desarrollo social, cultural, científico y económico también se ha dado fuera del centro de origen.

Se podría postular la hipótesis de que la diversidad genética es como un lastre que impide que se alcancen los más altos niveles de rendimiento. Es como si la diversidad y la productividad fueran fenómenos opuestos. ¿A qué se puede deber esto? Por un lado, las mutaciones por el azar generan diversidad, y por otro lado, la selección limita las variantes que sobreviven. Es un equilibrio dinámico que siempre esta en transición y movimiento. La biología no es un fenómeno estático. La evolución se da por un balance de fuerzas opuestas. El mejoramiento consiste en la selección de los mejores alelos, genotipos y variedades. Para ello se deben descartar variedades que no son tan productivas bajo las mismas condiciones. Para obtener el máximo rendimiento solo se debe sembrar la variedad que es más rendidora. La productividad se “compra” a costa de la pérdida de un cierto porcentaje de diversidad. La disminución de la diversidad solo se puede compensar por medio de cruzas y recombinaciones que generan nuevas variantes de alelos. Sin embargo, un mejorador que no esta dispuesto a descartar genotipos, nunca logrará obtener los más altos rendimientos. Es el precio que se debe pagar para hacer mejoramiento.

Los centros de origen se pueden considerar como incubadoras de diversidad genética. En esas regiones, la presión selectiva debe de ser relativamente baja, para que la tasa de mutación y recombinación puedan ser altas, lo que permite un alto grado de innovación y creatividad genética. Una vez incubados en los centros de diversidad, los genotipos pueden ser exportados a otras regiones del mundo donde son expuestos a condiciones selectivas más exigentes. Solo los genotipos más rendidores tendrán éxito en un ambiente competitivo. En esos ambientes exigentes habrá una baja diversidad (muy pocos genotipos exitosos), pero con muy alta productividad.

El origen de los rendimientos tan altos en China y Estados Unidos se fundamenta en cierta medida en aquellos genes que alguna vez fueron preincubados en el centro de diversidad del maíz, en México. Cuando los españoles conquistaron y colonizaron América, nunca hubieran imaginado que las pocas semillas de maíz que se llevaron en sus barcos, iban a ser mucho más valiosas que todos los lingotes de oro y plata que se llevaron a Europa. El valor comercial del maíz que se produce fuera de México es tan cuantioso que alcanzaría a financiar el sistema educativo y científico de todo un país. El trabajo de incubación genética por los indígenas mesoamericanos durante cientos de años dio a lugar un sinnúmero de razas y variedades de maíz, que hoy en día representan un acervo

60 biológico para toda la humanidad. Esa diversidad genética es la razón por la que hoy en día, el maíz se haya convertido en el cereal más importante de todo el planeta (ver Figura 2-28).

De ahí radica la importancia y la perdurabilidad del mejoramiento genético:

He who can make one ear of grain grow where none grew before renders an endurable service to whole humankind

Las anteriores evidencias evolutivas nos inspiran a hacer una reflexión más extensa en torno a la diversidad y la productividad. Para ello usaremos algunas analogías. Una región de origen biológico puede ser considerada como un centro de incubación genética. Es como un vivero. Se debe fomentar la creatividad y la imaginación para permitir así la generación de nuevas variantes y alelos.

Los centros de incubacion son como las escuelas a las que enviamos nuestros hijos para que aprendan y puedan ser creativos. Debemos permitir que descubran y que hagan sus propias experiencias. Debe ser un ambiente óptimo de baja presión. Debemos ser tolerantes con los errores de los jóvenes, ya que solo a través de la experimentación aprenderán a desarrollar sus habilidades. Una vez que fueron incubados, los jóvenes deberán salir al mundo exterior para demostrar sus aptitudes. Así se pondrán a prueba. Una persona que nunca sale al exterior, difícilmente alcanzará su máxima productividad. Por otro lado, un joven que nunca se preincubó en ese ambiente creativo y libre de presiones, nunca logrará lo mismo que una persona que haya disfrutado de ese privilegio.

El fomento la diversidad, es un privilegio, que si tiene un costo para los demás. En las familias, los padres son los que trabajan para pagar la formación académica de sus hijos. En las empresas, el departamento de ventas es el que financia las operaciones del departamento de innovación y desarrollo. Más que un costo, es una inversión a largo plazo. Sin innovación no habrá nuevos productos, y sin ellos, tarde o temprano no habrá más ventas.

Seria ridículo pedirle a un bebé, que apenas camina, que trabaje para comprar su leche y sus pañales. Seria absurdo exigirles a los maestros que financíen el sistema escolar. No se puede pedir que los científicos paguen los experimentos que deben hacer para generar nuevos conocimientos. La innovación y el desarrollo tecnológico debe ser un esfuerzo de toda la sociedad. Todos debemos poner nuestro granito de arena. Los empresarios que ganan más deben apoyar (financiar) a los investigadores que quieren hacer ciencia de alto nivel. La historia de la evolución nos ensaña el valor que tiene la diversidad. El costo de la ignorancia es trivial comparado con el gasto en educación e investigación. La diversidad del conocimiento es la única forma de reducir el peligro de fracasar a largo plazo.

Lo que debemos preguntarnos en México es: ¿Qué valor le damos a la diversidad? ¿Qué tan cretivos queremos ser? ¿Cómo podemos incrementar la productividad agrícola para ser autosuficientes en la producción de maíz, con el mínimo costo posible de diversidad genética? ¿Quién debe pagar las investigaciones que se requieren en maíz? ¿Cómo podemos evolucionar para progresar? ¿Qué es lo que se requiere hacer?

Lo que mas necesita México, y Latinoamérica, son mejores políticos y mejores estudiantes. Este libro sobre Fundamentos de Mejoramiento Genético solo pretende remediar una de muchas necesidades. Un buen gobierno es aquel que tiene la suficiente visión a largo plazo para estar convencido de que la ciencia y la investigación no es un gasto sino una inversión. Un buen estudiante es aquel que le dedica suficiente tiempo y esmero al aprendizaje, porque sabe que el conocimiento es una buena inversión para su futuro. Un buen libro es aquel que transmite conocimientos pero también permite incrementar la creatividad de los jóvenes para fomentar la diversidad de sus propios pensamientos.

Por un lado, el razonamiento lógico debe ayudarles a analizar críticamente los datos. Deben descartar muchas ideas que no fueron confirmadas por la evidencia científica. La ciencia avanza

61 por la falsificación de hipótesis. Esto significa que hay que descartar ciertos pensamientos. Esto disminuirá la diversidad. Pero por otro lado, la creatividad y la imaginación deben ayudarles a unir pensamientos aislados, para generar conclusiones y desarrollar soluciones novedosas que permitan incrementar la eficiencia de nuestra tecnología y economía. La combinación de dos ideas seleccionadas puede dar lugar a decenas de otras ideas recombinadas. El mejoramiento genético no solo es evolución en acción, sino que también es un conjunto de diversas disciplinas que requieren el desarrollo de habilidades de muy diversa índole. Los mejoradores no solo deben seleccionar y recombinar genes, sino también deben recombinar y seleccionar ideas y teorías, y no solo eso, sino también deben aplicar y desarollar nuevas metodologías y estrategias.

2.3.4. Mejoramiento: ciencia, ingeniería y filosofía Es imprescindible que el fitomejorador sepa escoger las herramientas para incrementar la diversidad. Debe tener la capacidad de medir los parámetros que usará para seleccionar. Debe ser eficiente para hacer mucho con pocos recursos. Un buen fitomejorador tiene una mano prodigiosa para dirigir la evolución, en la dirección adecuada y por el camino más viable. Ese es un talento que, muy pocos tienen de manera innata, pero que muchos pueden adquirir por medio del aprendizaje y la dedicación. El mejoramiento moderno es tanto un arte como una ciencia, es ingeniería y práctica, pero también incluye teoría y filosofía (Figura 2-32).

preguntas Científico Filósofo experimentos

Mejorador

resultados

Ingeniero

Figura 2-32. Áreas de interés intelectual para los fitomejoradores. El mejorador tiene que ser científico, ingeniero y filósofo al mismo tiempo.

2.4. El DNA 2.4.1. Nociones básicas de los ácidos nucleicos

2.4.1.1. Analogía de la biblioteca Empezaremos con una analogía para explicar el concepto de información genética y la relación que existe entre cromosomas, genes y proteínas. Podemos imaginar la forma en que trabajamos en la cocina. Analicemos el flujo de información y los procesos que utilizamos para preparar un pastel. Ahora comparémoslo con los procesos que usa la célula para obtener una proteína. La Figura 2-33 muestra este ejercicio al que llamaremos: la analogía de la biblioteca y el pastel:

Figura 2-33. Analogía de la biblioteca y el pastel. Se muestra la correspondencia de la información que está en un núcleo, cromosoma, gen o proteína.

Esta forma de imaginarlo, es un excelente inicio para adentrarse en el mundo de los ácidos nucleicos y así, entender mejor las bases del mejoramiento genético.

Tarea 2-30 Explique con esta analogía lo que sucedería si usted arrancara una página de la biblioteca de un restaurante chino y se la agregara a un libro de un taller mecánico alemán. ¿Qué tan importante es el hecho de que los mecánicos y los cocineros hablen el mismo idioma? Si el texto estuviera en chino y usted solo hablara alemán, ¿de qué sabor le saldría el pastel? Escriba un cuento sobre ello. Muéstrele el cuento a un familiar y después discútalo con sus demás compañeros de clases. ¿Qué tanto sirvió su cuento para que una persona común entienda mejor la ingeniería genética?

Tarea 2-31 Explique la relevancia científica y tecnológica de que el código genético sea universal. ¿Podría haber ingeniería genética si el lenguaje genético fuera diferente para cada especie? Postule una hipótesis de por qué el lenguaje humano ha cambiado tanto en pocos miles de años, mientras que el lenguaje genético no ha cambiado nada en miles de millones de años.

2.4.1.2. Nucleótidos Existen cuatro nucleótidos básicos del Acido DesoxiriboNucleico (ADN, DNA): la adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). La diferencia entre los ribonucleótidos y los

63 desoxirribonucleótidos es que la pentosa puede tener o no un grupo hidroxilo en el carbono 2. Una diferencia entre el DNA y el Acido RiboNucleico (ARN, RNA) es que por lo regular el DNA casi siempre se presenta como una doble cadena, mientras que el RNA por lo regular es de cadena sencilla. Otra diferencia importante entre los nucleótidos que forman al DNA y el RNA es que la timina (T) se substituye por uracilo (U) (químicamente, la timina es un uracilo metilado en el carbono 5). A la base nitrogenada con la pentosa se le llama nucleósido, y dependiendo del número de grupos fosfatos esterificados en el carbono 5 del azúcar se le puede llamar mono-, di- o tri- fosfatos. La regla de apareamiento por cuestiones de tamaño es que las purinas (la A y la G con dos anillos cíclicos) se pueden aparear con las pirimidinas (la C, T o U con un solo anillo) (ver Figura 2-34.).

Figura 2-34. Nucleótidos

Figura 2-35. Estructura de dATP

Tarea 2-32 En la figura anterior se muestra una molécula de dATP, dibuje ahora una molécula de ATP. Use también las fórmulas que se muestran en esa figura para dibujar una molécula completa de GTP. ¿Puede aprender a dibujar las cuatro bases de memoria? Explique las diferencias de reactividad química entre el ATP y el dATP. ¿Qué consecuencias tiene la funcionalidad hidroxilo para la estructura y estabilidad de las moléculas de RNA y de DNA? Dé ejemplos de los usos que tienen esas dos nucleótidos dentro de la célula. Si no hubiera CTP, pero si hubiera dCTP, ¿Se podría replicar el DNA? ¿Se podría transcribir el RNA? Justifique sus respuestas.

2.4.1.3. Doble hélice El DNA es una cadena lineal que tiene dos hebras enrolladas en forma de doble hélice. Nos podríamos preguntar: ¿cada una de las hebras tiene la misma información? En realidad no es exactamente la misma, sino información complementaria. La complementariedad está dada por la forma en que los cuatro nucleótidos se aparean, la A con la T, y la G con la C. Entre las bases se forman puentes de hidrógeno que estabilizan el apareamiento complementario. El par de AT está formado de dos puentes de hidrógeno, mientras que el par GC forma tres (Figura 2-36). El número de puentes de hidrógeno tiene repercusiones sobre la temperatura a la que la doble hebra se separa. Por ejemplo la temperatura de empareamiento (Tm) para la PCR

(Reacción en Cadena de la Polimerasa, por sus siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction) depende del porcentaje de GCs. Entre mayor proporción de GCs mayor será la Tm.

Figura 2-36. Complementariedad de las bases del DNA.

La convención establece que la secuencia de DNA siempre se debe de escribir del 5 prima al 3 prima (5’ y 3’, respectivamente). De cualquier forma, es una buena práctica siempre incluir el número prima cuando se escribe una secuencia dada. Sobre todo cuando uno la escribe en orden inverso.

Tarea 2-33 Si en un genoma bacteriano tenemos 15% de timina, ¿qué porcentaje de citosina tendremos? Diga si existe alguna regla que sea universal. Averigüe si en todos los virus esta regla de proporcionalidad entre diferentes bases también aplica. Averigüe que familias de virus tienen DNA de cadena sencilla. Explique las excepciones a esas reglas.

Respuesta: si hay 15% de timina en una cadena de DNA doble, entonces habrá 15% de adenina, y por consiguiente habrá 35% de citosina de 35% de guanina.

Tarea 2-34 Para discutir entre profesor y alumnos ¿Que hubiera pasado si Watson y Crick hubieran considerado la proporción variable de A, T, G y C en ciertos organismos? Considere esta hipótesis: La postulación de la doble hélice del DNA sólo fue posible al ignorar los resultados sobre la proporción variable de A, T, G y C en los virus de una sola cadena. Haga una tabla en defensa y en contra de la práctica científica de darle más peso a ciertos resultados e ignorar otros resultados.

Tarea 2-35 Una secuencia escrita en la nomenclatura estándar: ATGTCTGCGAT Indique ahora cuales moléculas de las siguientes siete opciones si corresponden o no a esa misma doble cadena de DNA: Secuencia corresponde: Si No 3´-ATGTCTGCGAT-5´ O O 5´-ATGTCTGCGAT-3´ O O 3´-ATCGCAGACAT-5´ O O 5´-ATCGCAGACAT-3´ O O 5´-TAGCGTCTGTA-3´ O O 3´-TAGCGTCTGTA-5´ O O 3´-TACAGACGCTA-5´ O O

Respuesta: Esta pregunta parece fácil, pero nuestra experiencia, es que menos del 20% de los estudiantes pueden contestar a todas las opciones correctamente. Tómese el tiempo necesario para responderla y entenderla bien. Para resolver este problema, lo mejor es escribir la doble cadena de la secuencia en cuestión, y también de cada una de las 7 opciones. Hecho esto ahora vea cuales son iguales o diferentes considerando la orientación y la hebra. Lea las secuencias siempre del cinco prima al tres prima. La segunda, la cuarta, la penúltima y la última si corresponden a la misma doble cadena que la secuencia en cuestión. Las demás no. Si no pudo responder esta pregunta o se equivocó en alguna opción, debe estudiar más sobre el DNA y sobre todo, entender los conceptos de la orientación, y también de lo que es reverse complement (complemento inverso).

2.4.1.4. Replicación La información que está contenida en el DNA se copia por medio de un mecanismo que se llama replicación semiconservativa. Esto se refiere a que el DNA se duplica formándose dos copias, en las cuales cada una contiene una hebra molde (cadena templado) y una hebra nueva (Figura 2-37).

Cadena templado A 3’ 5’ T G C C A G T A C G G T C A 3’ 5’ Cadena A Nueva cadena B 5’ 3’ T C C T G A G Cadenas Hijas A C G G T C A 3’ 5’ Cadena B Nueva cadena A 5’ 3’ Cadena Parental T G C C A G T A C G G T C A 3’ 5’ Cadena templado B Figura 2-37. Replicación semiconservativa de DNA. La hebra de color naranja representa la hebra parental, mientras que la de color rojo es una nueva hebra que se forma durante la replicación.

Cuando usamos una fotocopiadora para copiar un documento, lo que hacemos es transferir la información de una hoja vieja a una hoja nueva. Al final obtenemos dos hojas con la misma información, pero una de las hojas es nueva, y la otra es la “vieja original”. A esta forma de copiar se le llama “conservativa”. Para generar dos hojas de papel de manera “semiconservativa” lo que tendríamos que hacer es partir la hoja original en dos, después fotocopiar cada una de ellas en una mitad de hoja, y después volver a pegarlas de forma que obtengamos dos hojas con información idéntica, pero que cada una de las copias tengan tanto papel nuevo, como papel viejo.

Tarea 2-36 Supongamos que quisiera averiguar si el DNA se copia de manera conservativa (como una fotocopiadora normal) o de manera semiconservativa (mitad nueva y mitad original). Reflexione sobre esto y diseñe el experimento que debería hacer para demostrar la forma en que se replica el DNA. Como herramientas puede usar nucleótidos con una masa molecular mayor a lo normal y de esta forma distinguir las hebras de DNA viejas y nuevas que se generan in vitro con una polimerasa. Diseñe el protocolo del experimento y dibuje el resultado que esperaría. ¿Qué gráficas usaría para convencer a una audiencia científica de sus resultados? Haga las gráficas o figuras y presente sus conclusiones a su maestro de clases. Realice una búsqueda bibliográfica

66 y averigüe la forma en que los científicos de los años 50 hicieron los experimentos para contestar esta pregunta (Experimento de Meselson y Stahl)

2.4.1.5. Síntesis direccional Un concepto importante del DNA es que la síntesis de los ácidos nucleicos se lleva a cabo de manera direccional, del 5 prima al 3 prima. Esto tiene como consecuencia, que una de las hebras se puede copiar de manera continua, pero la otra se copia de manera discontinua en forma de pequeños tramos. Estos pequeños tramos se llaman fragmentos Okazaki (Figura 2-38). La replicación inicia en un zona del DNA con secuencias regulatorias, que en el caso de los plásmidos de bacterias se llama ori (del inglés origin of replication). A partir del ori se forma una burbuja de replicación que se va extendiendo hasta que se ha copiado la totalidad del DNA.

Leading strang 5’ Fragmentos de Okazaki 3’ 5’ 3’ Burbuja de Replicación 3’ Fragmentos de 3’ 5’ Okazaki 5’ Lagging strang

Inicio de Replicación

Figura 2-38. Burbuja de replicación con el leading y el lagging strand.

2.4.1.6. El gen El concepto de gen surgió durante la época de Gregor Mendel, mucho antes de que se supiera del DNA. Hoy en día, decimos que un gen es un segmento lineal de DNA que puede contener información funcionalmente revelante, codificada por la secuencia de los nucleótidos. Se dice que el gen es la unidad básica de la herencia, ya que es responsable de un cierto carácter fenotípico unitario. Sin embargo, así como el átomo resultó ser divisible, el gen también está formado de elementos de menor tamaño. La Figura 2-39 muestra un gen típico de una bacteria. Gen bacteriano Promotor Operador Terminador DNA Transcripción

5´ ORF 1 ORF 2 ORF 3 3´ mRNA

Shine Stop Start StopStart Stop Dalgarno +ATG Start Traducción

NH3 Proteína 3 COOH NH3 Proteína 1 COOH Proteínas NH COOH 3 Proteína 2 Figura 2-39. Estructura y expresión de un gen bacteriano.

Por lo regular, se dice que un gen es un segmento de DNA que codifica para una proteína. En ese caso, algunos genes bacterianos pueden codificar para varias proteínas, ya que el RNA

67 tiene varios marcos de lectura abiertos (ORF por sus siglas en inglés: open reading frame). A diferencia de los genes bacterianos, los genes de las células eucarióticas son un poco más grandes y complejos. Además, se requiere de una edición del RNA mediante un proceso de splicing y maduración que es necesario para que el RNA mensajero (mRNA) pueda ser exportado del núcleo al citoplasma donde se da la traducción (ver Figura 2-40). Gen eucariótico Silencer Enhancer Promotor Exon 1 Intron 1Exon 2 Intron 2 Exon 3 Terminador DNA Transcripción

5´ Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 3´ Edición

GCap 5´ UTR Exon 1 Exon 2 Exon 3 3´ UTR AAAAAA 3´

ATG Start Stop Traducción Proteína NH COOH 3 Proteína 1 Figura 2-40. Estructura y expresión de un gen eucariótico

Tarea 2-37 Realice un dispositivo o una fórmula que relacione el tamaño del mRNA con el tamaño del gen, el número de intrones, el tamaño medio de intrones, y el tamaño de la región reguladora.

2.4.1.7. Dogma central Uno de los primeros conceptos que se postularon en la biología molecular fue el hecho de que el flujo de información era en una sola dirección a partir del DNA, pasando al RNA y después a las proteínas. Digamos que, aunque en la replicación sí hay un flujo de información bidireccional, la trascripción y la traducción es un flujo unidireccional (ver Figura 2-41.). Replicación de DNA DNA

5’ T G C C A G T T G C C A G T A C G G T C A A C G G T C A 3’

Síntesis de RNA (Transcripción) RNA

5’ U G C C A G U U G C C A G U

Síntesis de Proteína (Traducción) Proteína H2N C Q L P V COOH

Aminoácidos

Figura 2-41. Flujo unidireccional de información: Dogma central de la biología molecular.

Para explicar eso a manera de una analogía, diríamos que el DNA es una molécula dictadora que no escucha ni tiene en cuenta la información que puedan adquirir sus moléculas súbditas como el RNA y las proteínas. Otra forma de verlo, es parecida al debate entre la visión Lamarkista y la visión Darwinista de la evolución. Lamark decía, que la experiencia y las características aprendidas durante la vida de un organismo eran heredables. Hoy en día, sabemos que la educación que tuvieron nuestros padres no la heredamos en forma de genes, y es por eso que todos los niños y jóvenes tenemos que aprender muchas cosas desde cero.

Tarea 2-38 Para discutir entre profesor y alumnos. Trate de reflexionar un poco más sobre las consecuencias más amplias del dogma central de la biología molecular. Tratemos de hacerlo con una analogía sobre el aprendisaje. Por ejemplo, el canto de los pájaros, ¿que tanto depende de los genes que heredan y de lo que aprenden durante jóvenes? Elabore una tabla en donde mencione las ventajas y desventajas de aprender algunos conocimientos desde el inicio. ¿Qué tipo de habilidades es ventajosa heredarlas de manera innata y que otras son mejores adquirirlas durante nuestro desarrollo? ¿Por qué a veces no escuchamos a nuestros papás o maestros? Algunas cosas tenemos que aprenderlas por

69 nuestras propias experiencias, ya que no solemos aprender mucho de los errores de nuestros antecesores. Discuta esto con sus compañeros de clases. Presenten sus conclusiones a su maestro de curso.

El postulado central de la biología molecular se hizo cuando todavía no se tenía información experimental suficiente que pudiera sustentar o refutar esta hipótesis de manera universal, y es por eso que se le llamó dogma. Actualmente sabemos que el dogma no es tan estricto como se postuló al inicio. Existe una enzima llamada transcriptasa reversa que a partir RNA sí puede formar DNA. Entonces, a ese DNA se le llama cDNA (del inglés copied DNA). De hecho, esta enzima es la base de muchísimas aplicaciones de la ingeniería genética. Hoy en día todavía nos falta aprender mucho sobre las proteínas, pero ya hay indicios de que algunas proteínas pueden hacer cambios substanciales a la información del DNA y del RNA, ya sea en forma de edición de RNA, splicing diferencial, exon shuffling, metilación, mutación inducida, etc.

Tarea 2-39 En su cuaderno de trabajo prepare un glosario en donde defina lo que es: hipótesis, objetivo, teoría, ley, dogma, fe, evidencia, resultados, datos, análisis, síntesis, información. Ponga especial énfasis en las similitudes y diferencias entre estas palabras y los conceptos a los que se refieren. Use ejemplos de las ciencias biológicas para explicar de manera concreta estos términos.

2.4.1.8. Síntesis de proteínas usando el código genético universal La síntesis de las proteínas a partir de un RNA mensajero se llama traducción. El RNA se lee de 5 prima al 3 prima, y la proteína naciente se va formando del término amino, al término carboxilo (ver Figura 2-42.).

Figura 2-42. Ribosoma.

Este proceso se lleva a cabo en el ribosoma con ayuda de los RNA de transferencia (tRNA), que asignan un aminoácido a cada una de las 64 combinaciones posibles de tres bases. La información de los ácidos nucleicos se lee en forma de tripletes (grupo de tres bases contiguas). Ese código de tripletes se ha encontrado casi inalterado en todos los organismos vivos y es por eso que se le ha llamado código genético universal (ver Figura 2-43).

Figura 2-43. Código genético universal.

Una de las evidencias más contundentes de que todos los seres vivientes actuales compartimos a un sólo ancestro común, se deriva de la forma en que se lee el DNA. Ese código es el idioma genético que habló la célula primogénita de la cual se derivaron todos los organismos y especies que sobrevivieron después de miles de millones de años de selección y evolución. Una de las premisas más importantes para la ingeniería genética es precisamente esa, la universalidad del código genético. Si el DNA no se leyera de la misma forma en diferentes organismos, entonces no tendría ningún sentido aislar un gen de una bacteria y tratar de meterlo en el genoma de una planta. Si usamos una analogía diríamos que es como si todos los seres humanos hablaran el mismo idioma y de esta forma fuera más fácil intercambiar información entre personas de diferentes culturas. Por ejemplo, podríamos usar los mismos libros que los griegos, estadounidenses y los chinos y no tendríamos tanto trabajo de hacer traducciones entre los diferentes libros de texto.

Tarea 2-40 Elabore una presentación explicando que son los tripletes y como se lee el código genético universal.

2.4.1.9. Abreviaturas de los aminoácidos Los estudiantes que pretendan trabajar con genes y proteínas, tarde o temprano tendrán que aprender las abreviaturas de una letra de los diferentes aminoácidos que conforman las proteínas. Los que deseen ser expertos, adicionalmente tendrán que tener una buena noción de los grupos químicos funcionales que están presentes en cada uno de los aminoácidos.

Abreviación Nombre Triplete Molécula 1 letra 3 letras completo típico

Ácido HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH D Asp aspártico GAT

Ácido HOOC-(CH2)2-CH(NH2)- E Glu glutámico GAG COOH

CH3-CH(NH2)-COOH A Ala Alanina GCT

HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- R Arg Arginina CGT CH(NH2)-COOH

H2N-CO-CH2-CH(NH2)- N Asn Asparagina AAC COOH

HS-CH2-CH(NH2)-COOH C Cys Cisteina TGC

Ph-CH2-CH(NH2)-COOH F Phe Fenilalanina TTT

NH2-CH2-COOH G Gly Glicina GGG

H2N-CO-(CH2)2-CH(NH2)- Q Gln Glutamina GAG COOH

NH-CH=N-CH=C-CH2- H His Histidina CAT CH(NH2)-COOH

CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)- I Ile Isoleucina ATA COOH

(CH3)2-CH-CH2-CH(NH2)- L Leu Leucina CTC COOH

H2N-(CH2)4-CH(NH2)-COOH K Lys Lisina AAG

CH3-S-(CH2)2-CH(NH2)- M Met Metionina ATG COOH

NH-(CH2)3-CH-COOH P Pro Prolina CCC

HO-CH2-CH(NH2)-COOH S Ser Serina AGT

HO-p-Ph-CH2-CH(NH2)- Y Tyr Tirosina TAC COOH

CH3-CH(OH)-CH(NH2)- T Thr Treonina ACG COOH

Ph-NH-CH=C-CH2-CH(NH2)- W Trp Triptófano TGG COOH

(CH3)2-CH-CH(NH2)-COOH V Val Valina GTT

Tarea 2-41 Traduzca al idioma de las proteínas la siguiente secuencia nucleotídica. Use la abreviatura de una letra de los aminoácidos. atggtgaaggccgtggtggtgggcgcggcg gtcgtggcgtgcgcggcggtgggggtggcg ______gcggtgctggtgcaccgccggcgcaggcgc gacgccgcgctcctggggtccgcggaggcg ______gagaggaggcggcgcgcggccgccgtgatc gaggaggtggagcgcagcctcgccacgccc ______acggcgctgctgcggggcatcgcggacgcc atggtcgccgagatggagcgcggcctgcgc ______ggggacatccacgcgcagctcaagatgctc attagctacgtcgacaacctccccaccgga ______gatgaacatgggctgttttatgcactggat cttggagggaccaacttccgtgtgctgcga ______

Tarea 2-42 ¿Qué significa que el código genético esté degenerado? Usando el código genético (Figura 2-43) Traduzca la siguiente secuencia proteíca a su respectiva secuencia nucleotídica:

______M D F E S L N P G E Q I Y E K M I S G M ______Y L G E I V R R I L L K L A H D A S L F ______G D V V P T K L E Q P F I L R T P D M S

______A M H H D S S H D L K T L G S K L K D I ______V G V A D T S L E V R Y I T R H I C D L ______V A E R G A R L A A A G I Y S I L K K I

Tarea 2-43 Considere el siguiente fragmento de DNA: 5´ GCTTCCCAAGGT 3´ 3´ CGAAGGGTTCCA 5´ Si la cadena superior es la cadena de la plantilla usada por la polimerasa de RNA. a) Dibuje el RNA transcrito. b) Etiquete sus terminos 5´and 3´. c) Escriba las tres posibles cadenas correspondientes de aminoácidos. d) Etiquete sus extremos amino y carboxilos. e) Repita los pasos a-d asumiendo que la cadena inferior es la cadena de la plantilla. En caso que tenga dificultades o quiera profundizar más, responda los problemas del capítulo 2 y 3 de Griffiths et al, modern genetic analysis.

Tarea 2-44 Aprenda más sobre genética. Consulte la página: http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/

Tarea 2-45 Aprenda más sobre genética. Consulte la página: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mga.TOC&depth=10 Introdusza una palabra clave en la ventana de búsqueda de esa página. Despues saldrán los links a los capítulos en donde viene explicado ese término.

Tarea 2-46 Consulte los diversos libros electrónicos que estan disponibles en la página del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=books

Libros recomendados para consulta: • Griffiths AJF, Gelbart WM, Miller JH, Lewontin RC. Modern Genetic Analysis. WH Freeman & Company. • Watson, J.D., Caudy, A. A., Myers, R.M. and Witkowski, J.A.; Recombinant DNA: Genes and Genomes — A Short Course; Third Edition; Cold Spring Harbor Lab. Press; CSH New York; 2007. • Baum, S. J., Scott-Ennis, R. J., and Hill, J W; Chemistry and Life: An Introduction to General, Organic and Biological Chemistry; Prentice Hall; 1999. • Crothers, D. M., Kill, J., Tinoco, I., Hearst, J. E., Wemmer, D. E., and Bloomfield, V. A.; Nucleic Acids: Structures, Properties, and Functions; University Science Books; 2000. • Gait, M. G., and Blackburn, G. M.; Nucleic Acids in Chemistry and Biology; Oxford University Press Inc.; 1995. • Van Holde, K.E., Johnson, W.C., and Ho, P.S.; Principles of Physical Biochemistry; Prentice Hall Inc.; 1998 • Creighton, T. E.; Proteins: Structures and Molecular Properties; W.H. Freeman & Co., 1992.

2.4.2. Nociones avanzadas

2.4.2.1. Conformaciones del DNA La doble hélice del DNA puede estar en diferentes conformaciones. La que más se conoce es la conformación B, que es la que primero se descubrió por Watson, Crick y Wilkins. Sin embargo, existen otras conformaciones como la Z y la A, que también se presentan in vivo dentro de las células. Todavía no se sabe la relevancia de este fenómeno, pero se intuye que tiene importancia para la forma en que las proteínas se pueden unir al DNA, y así, influyen en la forma en que se expresan los genes en una determinada región. Aunque todavía no se sabe si la conformación es heredable, la conformación A, B, Z del DNA puede ser considerado un factor epigenético, ya que puede afectar la expresión de los genes, pero no es directamente atribuible a la secuencia de los nucleótidos per se. (Figura 2-44).

Figura 2-44 Diferentes Conformaciones de DNA.

Cromosoma

Clusters de Genes Centrómero Telómero

Gen Gen Gen

Doble hélice de DNA

Promotor Exones Intrones RNA inmaduro Transcripción 5’ 3’

Splicing y Edición de RNA mRNA CAP AAAAAAA

Traducción Proteína

H2N COOH

Figura 2-45 Estructura de cromosomas y genes. Se muestra trambién el proceso de maduración del RNA y la conversión final en una proteína.

Tarea 2-47 ¿Qué es un gen? ¿Cómo se expresa una proteína? Elabore un ensayo explicando con detalle todos los pasos moleculares que se llevan a cabo, desde el DNA con su estructura de promotor y exones, pasando del RNA inmaduro, al RNA maduro, hasta la proteína. Use la Figura 2-40 y la Figura 2-45 como guía y explique todos los procesos que están involucrados. Indique también en que compartimento celular se lleva a cabo cada proceso, ya sea núcleo, citoplasma o retículo endoplasmático.

2.4.2.2. Complejo de replicación Complejo Replisoma Hebra Líder

Proteínas SSB Topoisomerasa 5’ DNA Polimerasa 3’ Complejo Primosoma Primasa

3’ 5’ Helicasa

Hebra retrasada Replicación Ligasa

Figura 2-46 Complejo de replicación. Una serie de diversas proteínas y enzimas se agrupan en grandes complejos proteícos que permiten así la replicación del DNA.

Tarea 2-48 Explique la función de las diferentes enzimas que participan en la replicación del DNA. ¿Que hace la polimerasa? ¿Cuál es la función de la helicasa? ¿Qué hace la topoisomerasa? ¿Para que sirven las proteínas SSB? ¿En qué momento actúa la ligasa? ¿Por qué la replicación es diferente para cada hebra del DNA? En la Figura 2-46 ¿cuál es el leading strand y cuál es el lagging strand?

Tarea 2-49 Aprenda más sobre la replicación. Consulte la página: http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

2.4.2.3. Intrones y exones

Gen

ATG AGGU AGG AGGU AGG TGA DNA Start Stop

Región Regiones NO Región codificante codificantes promotora (Exon) (Intrones)

Figura 2-47. Promotor, intrones y exones.

Tarea 2-50 ¿Cuál es la diferencia entre un exon y un intron? ¿Qué repercusiones genéticas, moleculares y evolutivas puede haber?

Tarea 2-51 Averigüe más sobre las secuencias cortas para las señales de: start, stop, sílice-start, splice-end. ¿De que sirve esto para las predicciones de genes por metodos bioinformáticos?

2.4.2.4. Mecanismo de splicing Exón Intrón Exón A 3’ 5’ A G G U AG G

A A G 5’ A G G U G 3’

Estructura “Lazo”

U G A

A G 3’ 5’ A G G 3’

+ 5’ A G G 3’ U G A A

G 3’

Figura 2-48. Formación de un lazo de splicing.

2.4.2.5. Splicing diferencial Gen de α tropomiosina

DNA

splicing diferencial

mRNA 1 variante en músculo estriado

mRNA 2 variante en músculo liso

mRNA 3 variante en fibroblastos

mRNA 4 variante en células cerebrales

Figura 2-49. Ejemplo de splicing diferencial. Gen humano de tropomiosina. Denz et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 320(4):1291-7

2.4.2.6. Mecanismo de recombinación La recombinación comienza como dos moléculas de DNA que se unen para formar una sinapsis de recombinación. Uno de cada hebra duplex se une a la enzima recombinasa, el 3’ terminal de cada uno de las hebras desenrolladas, está vinculada a un residuo de tirosina (Y) de la enzima recombinasa. Unos nuevos fosfodiester se agregan, y se forman. Cuando un 5’ es cortada de otra hebra en el complejo. De estos ataques tirosina-aductos de DNA. Después de isomerización, estos pasos se repiten para formar el producto de la recombinación (Figura 2-50).

Figura 2-50. Mecanismo de recombinación.

2.4.3. Genética Forward y Genética Reversa Históricamente, la genética forward es la metodología más antigua. Por lo regular, primero se observaba un fenotipo, y si era muy interesante se buscaba entonces el gen o los genes que eran responsables de esa característica. Esto se lograba por medio de mapeo hasta encontrar el locus genético, para después determinar la secuencia del gen responsable. A esa forma de proceder se le llama genética forward (de dirección hacia delante, en inglés) (Figura 2-51). Cuando los costos de secuenciación bajaron, porqué se usó cotidianamente por su mayor rapidez, exactitud y se empezó a producir mucha información nucleotídica, entonces se identificaron muchos más genes que fenotipos. Así inicia la genética reverse. Ésta parte de un gen determinado con una función desconocida, y trata de ver cual es el efecto de ese gen cuando se interrumpe o se cambia su patrón de expresión. Una forma de alterar el gen es a través de mutagénesis química, con metilsulfonato (EMS) o transgénesis insercional (transposones o T-DNA), o también por medio de la sobreexpressión con un promotor diferente. Algunos científicos usan los conceptos de genética directa y genética reversa. Sin embargo, los términos en inglés son mucho más comunes en los artículos científicos. Más alla del idioma, lo importante es entender las diferencias entre las metodologías que se utilizan para cada una de esas dos estrategias genéticas.

Mutant screens, Variabilidad QTLs, chromosome Secuenciación natural walking

Fenotipo Genética Forward Genotipo atggctagctagcgatc gatttgagctggatatta ccctgagatggggcgc Genética Reversa gtggtagaagggaata gcagatagcatgctga Mutagénesis EMS, T-DNA

Figura 2-51. Genética forward y genética reverse.

3. Herramientas Moleculares 3.1. PCR 3.1.1. Historia y Principios La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica para obtener un gran número de copias de un fragmento de DNA en particular. Fue descrita en 1986 por Kary Mullis. Una de las primeras referencias fue:

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491

Para realizar la técnica de PCR se necesitan:

• DNA polimerasa que sea estable a temperaturas altas. La más común es la Taq polimerasa que resiste los 100ºC. • Mezcla de cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), que son los sustratos para polimerizar el nuevo DNA. (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) • DNA molde (DNA template) con la región que se va a amplificar. • Dos primers (oligos, iniciadores o cebadores) complementarios al DNA molde. Son secuencias cortas, normalmente de 20 a 25 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa para iniciar la reacción de elongación. Deben estar orientados correctamente (antiparalelos mostrándose uno hacia el otro) para que puedan amplificar exponencialmente. • Iones divalentes como el magnesio (Mg2+). El magnesio se une a los nucleótidos estabilizando los enlaces diésteres de fosfato. Actúa como cofactor de la polimerasa. • Iones monovalentes, como el potasio. • Una solución amortiguadora que mantiene el pH 8-9. • Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. Hoy en día los nuevos termocicladores tienen todos una tapa caliente para evitar la evaporación-condensación del líquido, pero de todos modos en algunos casos se suele se agregar una gota de aceite para evitar la evaporación.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 20-50 µl en pequeños microtubos de polipropileno estériles que se colocan en el termociclador. Por lo regular se hace un master mix de la reacción de PCR (agua, amortiguador, dNTPs y Taq agregados en ese orden). Ese master mix se reparte en varios tubos a los que posteriormente se les agrega ya sea 1 µl de templado de DNA y el par de primers específicos. Por lo regular se usa Tris como buffer y cloruro de magnesio (MgCl2) y cloruro de potasio (KCl) como sales.

Ciclo de amplificación El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir de dos a tres pasos de temperaturas diferentes. Las temperaturas usadas y el tiempo

81 aplicado en cada ciclo dependen de una gran variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de DNA, la concentración de iones divalentes, la cantidad y proporción de dNTPs en la reacción, y la temperatura de unión de los primers.

Inicialización Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 95ºC, que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto es necesario para las DNA polimerasas (hot start) que requieren activación por calor. Esté paso también es útil cuando se esta usando DNA genómico que requiere de más tiempo para desnaturalizarse completamente. Sin embargo, solamente es necesario agregar este paso de inicialización antes del primer ciclo.

Desnaturalización Este paso se realiza también por medio de calentamiento a 95ºC. La alta temperatura (energía cinética molecular) rompe los enlaces de hidrógeno y hace que las dos hebras se separen (el DNA se desnaturaliza).

Unión del primer A continuación se producirá la hibridación del primer. Este se une a su secuencia complementaria en el DNA molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC (según el valor Tm de los primers) durante 20-40 segundos permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de DNA (unión DNA-DNA) sólo se forman cuando la secuencia del primer es muy similar a la secuencia del DNA molde. La polimerasa une al pedazo de doble cadena formado por el primer y el DNA molde, y empieza a sintetizar DNA. Los primers definirán los límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Extensión/Elongación de la cadena En esta fase, la DNA polimerasa se une al fragmento de doble cadena que forma el DNA molde y el primer e inicia la síntesis. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de DNA complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de DNA creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la DNA polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad es de 72°C. Como regla general se le da 1 min por cada mil bases de fragmento que se piensa amplificar.

Elongación final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 72°C entre 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante es totalmente ampliado. También se le da tiempo a la Taq-polimerasa para que agregue un nucleótido terminal de A que puede servir después para clonar el fragmento en vectores con overhang T (Vectores tipo TOPO como pGEM)

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de DNA previsto, se emplea electroforesis para separar los fragmentos de PCR de acuerdo a su tamaño. Típicamente se emplean geles de agarosa horizontales para fragmentos grandes; y geles de acrilamida verticales para los más pequeños. El tamaño de los productos de la PCR se compara con marcador de peso molecular conocido, que se corren en una de las líneas del gel (1) (Figura 3-1). Es una buena práctica poner un control positivo y un control negativo para todos los PCRs que uno realiza en el laboratorio. Uno debe anotar las condiciones exactas del ciclo de temperaturas, así como los volúmenes de reactivos y las muestras que se usaron para cada experimento.

Figura 3-1. Productos de PCR después de diferente número de ciclos

Tarea 3-1 Un estudiante pipeteó los siguientes componentes: 10 µL 10x PCR buffer solution (500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, 30 mM DTT, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA) 10 µL 10x dNTP stock (2mM of each dNTP in TE buffer) 1 µL Oligo primer 5' stock (50 µM) 1 µL Oligo primer 3' stock (50 µM) 76 µL sterile H2O 1 µL Template DNA Cuando corrió el PCR se dio cuenta que no amplifico nada. ¿Podría decir por qué no funciono? ¿Qué le hizo falta?

Tarea 3-2 Otro estudiante programó el termociclador de la siguiente manera: Step Temperature Time (seconds) 1 95 °C 300s 2 55°C 30s 3 72°C 60s 4 Go to step 1 for 30 cycles 5 4°C Hold

Cuando dejó corriendo su reacción de PCR se dio cuenta de que la máquina tardó mucho en terminar todo el programa. Sin embargo, el equipo era un poco viejo y por eso pensó que era lento. Cuando corrió su gel, la amplificación no fue muy buena. ¿Podría usted postular una hipótesis de porque la maquina tardo tanto, y al final se dio tan mala amplificación?

Respuesta a tarea 1: se le olvido agregar 1 µL Taq polymerase (2.5 units/mL) Respuesta a tarea 2: el paso 1 de desnaturalización a 95°C por 300s solo se debe de hacer la primera vez por tanto tiempo. Ya después en los ciclos repetitivos es suficiente hacerlo por solo 30s. La Taq polimerasa pierde actividad a altas temperaturas prolongadas y además se corre el riesgo de que los nucleótidos se degraden y la muestra se evapore. Mejor seria realizar un programa como: Step Temperature Time (seconds) 1 95°C 270s 2 95°C 30s 3 55°C 30s 4 72°C 60s 5 Go to step 2 for 30 cycles 6 4°C Hold

3.1.2. Técnicas y Aplicaciones La PCR es hoy en día una de las técnicas más importantes para un laboratorio de biología molecular. Se usa tanto para las amplificaciones de genes y las clonaciones, como para la detección de los niveles de expresión (PCR en tiempo real por sus siglas en inglés RT-PCR), como para la secuenciación de genes (Método Sanger). La PCR es la técnica que primero debe dominar cualquier estudiante que pretenda hacer algo de biología molecular. Existen muchos libros y manuales que explican los trucos y los secretos del PCR. También existen muchos sitios web en donde podrás encontrar mayor información. Sin embargo, únicamente con la práctica en el mismo laboratorio se puede hacer al maestro. Hacer una PCR puede ser muy fácil, pero también puede ser un dolor de cabeza. No es fácil optimizar las variables para una buena amplificación (obtener suficiente DNA, pero sin que salgan otras bandas inespecíficas).

Tarea 3-3 Busque algunas aplicaciones de PCR. Haga un resumen de dos posibles aplicaciones para el mejoramiento genético. Para más información, consulte el siguiente link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.580

Tarea 3-4: Haga una busqueda en Genebank para encontrar el gen de la hexocinasa de maíz y diseñe unos primers para amplificar un fragmento de 100 pares de bases. La información de cómo usar esta base de datos se encuentra en el capitulo 7. Ponga los dos primers, el forward y el reverse, en su orientación estándar del 5 prima al 3 prima.

3.2. Modificadores del DNA Para poder hacer cambios dirigidos en el material genético de una especia se necesitan herramientas que puedan modificar el DNA de una manera predecible. Por ejemplo, para cortar un gen de un cromosoma y después insertarlo en algún otro sitio en el genoma de otra especie. Para ello se necesita un cierto tipo de enzimas que cortan y pegan la cadena de ácidos nucleicos en sitios específicos. Podemos decir que para hacer ingeniería genética primero necesitamos tener, a nivel molecular, unas tijeras y también un pegamento. A continuación se describen con más detalle algunas de esas enzimas que hacen ese trabajo. 3.2.1. Enzimas de restricción Las enzimas de restricción cortan el DNA en regiones específicas. Por lo regular son secuencias correspondientes a palíndromos invertidos de 4 ó 6 bases. El corte puede resultar en una doble cadena con terminación simple (blunt, o extremos romos) o resultar en una terminación de cadena sencilla complementaria (sticky end, o extremos cohesivos). Esto tiene enorme relevancia para la clonación de genes en sitios específicos y en una orientación determinada.

Sitio de corte Enzima de restricción Blunt cut

Hae III 5’ 3’ N N C C N G G N N C C G G N N N G G N + C C N N G G C C N 3’ 5’

Sitio de corte

3’

Sticky end cut A A T T C G A A T T C EcoR I G C T T A A G 5’ + G 5’

C T T A A Sitio de corte 3’

Figura 3-2. Ejemplos de cortes de restricción. Arriba se muestra la enzima HaeIII que hace un corte tipo blunt, mientras que abajo la enzima EcoRI hace un corte tipo sticky end.

3.2.2. Ligasas Si las enzimas de restricción son las tijeras microscópicas, entonces las ligasas son el pegamento molecular. El uso combinado de estos dos tipos de enzimas permite hacer el cut & paste de la ingeniería genética. Esto se usa para reemplazar genes o para generar nuevas variantes quiméricas de ellos. Las ligasas usan ATP para fosforilar los extremos 5´ de la cadena de DNA, y de esta forma se puede unir dos pedazos de DNA que antes estaban separados. Las DNA ligasas catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre el 5' de un fosfato y el 3' de un nucleótido. Se usan para unir covalentemente cadenas de DNA. Por ejemplo, un fragmento dentro de otro. La DNA ligasa usada más habitualmente es la T4 DNA ligasa, que requiere ATP como cofactor. La ligación de moléculas de DNA puede realizarse de múltiples maneras (Figura 3-3).

Ligación Ligación intermolecular intramolecular

T4 DNA Ligasa T4 DNA Ligasa + ATP + ATP

DNA DNA lineal circular

Figura 3-3. Ligación intermolecular: entre dos cadenas distintas de DNA. Ligación intramolecular: entre los dos extremos de la misma cadena de DNA.

La ligación en principio se producirá o bien entre extremos romos o bien entre extremos de DNAs digeridos con la misma enzima de restricción (Eco RI) y que, por tanto, pueden aparearse. Sin embargo, en ocasiones, también pueden producirse entre moléculas digeridos con enzimas diferentes si los extremos que generan son compatibles (BamHI, BglII, Bcl, XhoII).

3.2.3. Recombinasas La enzima recombinasa cataliza la recombinación homóloga basada en unas secuencias de reconocimiento attB1 y attB2. En los laboratorios de biología molecular mas avanzados, la BP clonasa y la LR clonasa están sustituyendo cada vez mása las enzimas de restricción y a las ligasas, para la clonación de genes y construcción de vectores (Figura 3-4).

Figura 3-4. Estrategia de clonación por recombinación.

Tarea 3-5: En internet haga una búsqueda sobre la Recombinasa y la Tecnología Gateway de Invitrogen. Averigüe que es un Vector Gateway, y cuáles son los que más se usan hoy en día. Visite la página de Invitrogen para averiguarlo: http://www.invitrogen.com

Tarea 3-6: Descargue el manual pdf de CloneMiners de Invitrogen. Averigüe ¿para qué sirve la técnica, cómo funciona, cuales son los pasos a seguir? Prepare una presentación para que lo explique en un seminario a sus compañeros de clases: http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/710-02224-Tb%20CloneMiner%20.pdf

Figura 3-5. Tecnología Gateway para subclonación entre diferentes vectores.

3.3. Métodos de secuenciación Hoy en día existe una gama muy amplia de métodos para determinar la secuencia nucleotídica de los genes. En los últimos 5 años ha habido una gran explosión de plataformas tecnológicas de secuenciación. Estas permiten secuenciar genomas completos en una sola corrida. A continuación presentamos algunos de los métodos clásicos y explicamos los principios en que se basan las tecnologías modernas.

3.3.1. Sanger El método Sanger moderno se basa en la separación por electroforesis capilar de una sola reacción de PCR con nucleótidos dideox marcados con fluoróforos. Antes se usaba radioactividad, y además se usaban cuatro reacciones separadas en donde se le agregaba solo un nucleótido dideox, el cual terminaba la amplificación y no dejaba que se extendiera al final la cadena con ese nucleótido en específico. Cada una de estas cuatro reacciones se cargaba en un carril por separado y después se corría en geles de acrilamida. Con el tiempo se mejoró la técnica al usar nucleótidos marcados con cuatro fluoróforos diferentes que pueden ser distinguidos por el uso de laser con diferentes longitudes de excitación y la detección con varios filtros de emisión. De esta forma, se puede correr la reacción en un solo tubo capilar, mejorando mucho la resolución y la economía del método (Figura 3-6).

Figura 3-6. Secuenciación por Sanger con nucleótidos fluorescentes.

3.3.2. Pirosecuenciación Secuenciación en tiempo real más rápido, eficiente y masivo que el método Sanger. El método de pirosecuenciación se basa en la liberación de PPi por cada nucleótido incorporado por la polimerasa durante el proceso normal de la síntesis de DNA. La enzima Sulfurilasa usa el PPi y un análogo de ADP (adenosina 5´- fosfosulfato o APS) para formar ATP. Este ATP después es usado por la luciferasa para producir fotones. La luz producida es la señal que se detecta con una cámara CCD.

A la pirosecuenciación también se le llama método basado en síntesis en tiempo real, porque la síntesis de DNA y la detección de los nucleótidos se hacen al mismo tiempo (no como en Sanger que los dos procesos están temporalmente separados). La especificidad en Sanger se basa en el marcaje fluorescente específico de cada nucleótido. Esto permite agregar todos los dNTPs al mismo tiempo durante el PCR. En la Pirosecuenciación, el PPi liberado no permite distinguir los nucleótidos, y es por eso que cada dNTP se tiene que agregar por separado (sistema de microfluidos para agregar secuencialmente los nucleótidos. Ciclo repetitivo: dATP, lavado, dGTP, lavado, dCTP, lavado, dTTP, lavado, etc.) .

La pirosecuenciación se lleva a cabo en varios pasos que a continuación vamos a describir en inglés. Esto nos ayudará a practicar éste idioma.

Step 1 A sequencing primer is hybridized to a single stranded, PCR ampliﬁed, DNA template, and incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase and apyrase, and the substrates, adenosine 5´ phosphosulfate (APS) and luciferin.

Step 2 The ﬁrst of four deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP) is added to the reaction. DNA polymerase catalyzes the incorporation of the deoxyribo-nucleotide triphosphate into the DNA strand, if it is complementary to the base in the template strand. Each incorporation event is accompanied by release of pyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to the amount of incorporated nucleotide.

Step 3 ATP sulfurylase quantitatively converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5´ phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase mediated conversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional to the amount of ATP. The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a charge coupled device (CCD) camera and seen as a peak in a Pyrogram. The height of each peak (light signal) is proportional to the number of nucleotides incorporated.

Step 4 Apyrase, a nucleotide degrading enzyme, continuously degrades ATP and unincorporated dNTPs. This switches off the light and regenerates the reaction solution. The next dNTP is then added.

Step 5 Addition of dNTPs is performed one at a time. It should be noted that deoxyadenosine alfa- thio triphosphate (dATPaS) is used as a substitute for the natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it is efﬁciently used by the DNA polymerase, but not recognized by the luciferase. As the process continues, the complementary DNA strand is built up and the nucleotide sequence is determined from the signal peaks in the Pyrogram.

Fig A Fig B

Fig C Fig D Figura 3-7. Etapas de la Pirosecuenciación.

Tarea 3-7: Asigne las figuras a las explicaciones anteriores en inglés. De cada panel de figura, ¿a qué paso (step) corresponde?

Figura Step A B C D

Preguntas: 1) ¿Para qué se usa la enzima apirasa? 2) ¿Qué reacción cataliza la sulfurilasa? 3) ¿Qué reacción cataliza la luciferasa? 4) ¿Qué químicos y enzimas se necesitan para la pirosecuenciación? 5) La luciferasa usa ATP como substrato principal, pero también puede usar dATP como substrato alternativo. Para secuenciar los nucleótidos G, T y C no hay problema ya que estos trinucleotidos no interfieren con la reacción de la luciferasa. Pero si se agrega dATP, la luciferasa generaría una señal de luz muy alta, que no sería proporcional a la cantidad de PPi que liberó la polimerasa. ¿Explique cómo se solucionó este problema de interferencia para que la técnica de secuenciación funcionara sin problemas?

Respuestas: A2, B4, C3, D5 1) La apirasa degrada los deoxinucleotidos que no se han incorporado y acelera el proceso de lavado entre cada ciclo de diferentes nucleótidos. 2) La sulfurilasa usa el PPi para convertir el APS en ATP. 3) La luciferasa usa el ATP para emitir luz. La cantidad de luz emitida refleja la cantidad de ATP presente, y esto es proporcional a la cantidad de PPi que había antes, que a su vez es proporcional a la cantidad de nucleótido que la polimerasa incorporo. 4) Necesitamos 4 enzimas: DNA Polimerasa, ATP Sulfurilasa, Luciferasa y Apirasa. Se necesitan los sustratos APS y Luciferina. también se deben de agregar los dNTPs que a su vez liberaran el PPi que necesita la sulfurilasa. 5) Se escogió entonces un substrato análogo al dATP que la polimerasa si pudiera usar para liberar PPi, pero que la luciferasa no pudiera usar para generar luz. La luciferasa no puede usar deoxyadenosine alfa- thio triphosphate (dATPaS), pero la polimerasa afortunadamente si.

Figura 3-8. Pirograma mostrando el efecto de un SNP en la intensidad de los picos de fluorescencia en los ciclos secuenciales de la pirosecuenciación.

Pirosecuenciación masiva “Genome sequencer GS20”: La técnica de Pirosecuenciación aprovecha los avances de la nanotecnología, al utilizar esferas atrapadas en una placa que contiene 1,600,000 microceldas de 44μm de diámetro, como se explica arriba, de tal suerte que al ingresar una esfera por cada celdilla, permite realizar una reacción de secuenciación individual, basada en la síntesis complementaria de un DNA de cadena sencilla, el cual ha sido amplificado por una reacción de PCR y alineado a cada esfera. La incorporación de cada nucleótido durante la polimerización de DNA, libera una molécula de pirofosfato (PPi), que al interaccionar con algunas enzimas presentes en el medio (luciferasa, entre otras) produce una señal quimioluminiscente que es capturada por una cámara de detección de fotones y que con el soporte de un poderoso programa de computo, es traducida como la adición de un nucleótido determinado, generando una secuencia individual por cada celda

Es una tecnología que ahora distribuye la compañía Roche. En lugar de secuenciar hebras individuales, el método de luminiscencia permite detectar más de trescientas mil reacciones de secuenciación al mismo tiempo. Esto se hace en nanoesferas dentro de una nanorejilla hexagonal. El punto crítico es que se hace PCR de un trozo pequeño de DNA dentro de una pequeña gota. A esto se le llama PCR de emulsión o ePCR por sus siglas en inglés. Previamente se debe romper el DNA en trozos pequeños (técnica de nebulización), ligarlo a adaptadores, desnaturalizarlo y unirlo a nanoesferas, de forma que una bola se encuentre con un fragmento.

¿Para qué sirve la emulsión PCR? Las microgotas de emulsión capturan la bola junto con la mezcla de enzimas necesarias para hacer PCR, entonces el DNA de las bolas se amplificará. Cada nanoesfera tiene solo una secuencia de DNA. Es decir, en cada microgota hay una sola molécula molde, por lo que la amplificación creará muchas copias de esa molécula solamente. Decimos entonces que es una amplificación clonal. Seguidamente se distribuye las nanoesferas en los pozos de una nanoplaca. Dentro del tubo estarán los reactivos de pirosecuenciación y se añaden los nucleótidos. En 5 horas podemos leer 200 mil secuencias de 100-250 nt. En una corrida de pirosecuenciación obtendremos información de 20-50 millones de nucleótidos. Estas secuencias cortas se tendrán que ensamblar. Para ello se requiere de una supercomputadora con una capacidad muy grande de memoria. Por lo regular se usan clusters computacionales de varias docenas de nodos, cada uno con un procesador independiente. El cluster reparte el trabajo a los diferentes nodos de forma paralela, y así se reduce el tiempo requerido para hacer los cómputos de ensamblaje. La tecnología de pirosecuenciación fue desarrollada por la empresa 454 Life Sciences, la cual comercializó el primer equipo de secuenciación masiva (Secuenciador GS 20), con una capacidad para descifrar 20 millones de bases por corrida (4 hrs), en secuencias individuales de 100 bases. Tan solo 3 años después la capacidad de secuenciación se ha ampliado para fragmentos de 400 bases.

En CINVESTAV Irapuato estamos explorando el potencial de esta nueva tecnología, al utilizarla con genomas mucho más complejos que el de las bacterias, y así poder implementar herramientas poderosas para proyectos genómicos de mayor envergadura. En el LANGEBIO se tiene montada la técnica de pirosecuenciación. Ya se ha descifrado un genoma bacteriano ancestral, perteneciente al género Bacillus, el cual fue aislado de una de las fosas de Cuatro Ciénegas. Con seis corridas (Secuenciador GS 20), se descifraron 129.6 Mb se secuencia, que corresponden a una cobertura mayor a 20x de su genoma. También se trabaja en la pirosecuenciación de maíz palomero conico toluqueño, usando bancos genómicos de DNA total y bancos genómicos de DNA enriquecido en regiones codificantes. A estas regiones se les llama MAGIs (Maize Assembled Gene Islands). Para ello se utilizan estrategias para el enriquecimiento de regiones de DNA no metiladas. Los procesos de ensamblado y de anotación se tratan de llevar acabo de manera paralela, pero estas representan el cuello de botella, ya que tardan mucho más tiempo que las propias corridas de secuenciación.

Tarea 3-8 Revise estas referencias bibliográficas y haga un resumen de su contenido. Schaefer, B. 1995. Revolutions in Rapid Amplification of cDNA Ends: New Strategies for Polymerase Chain Reaction Cloning of Full-Length cDNA Ends. Anal Biochem. 227, 255-273. Jordan, B.; DNA Microarrays: Gene Expression Applications; Springer-Verlag; 2001 y Schena, M.; Microarray Biochip Technology; Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division; 2000.

3.3.3. Método de apareamiento y ligación En esta sección explicaremos el sistema de secuenciación usando la plataforma SOLiD de Applied Biosystems. El sistema de SOLiD es un equipo de secuenciación masiva de última generación. Es aún más avanzado que el método de pirosecuenciación descrito en la sección

93 anterior. La Figura 3-9 muestra el equipo que está instalado dentro del CINVESTAV Campus Guanajuato. A diferencia de los demás métodos de secuenciación, el sistema SOLiD puede generar muchos millones de secuencias. La limitante es que son secuencias muy cortas de sólo 50 bases.

Tabla comparativa de métodos de secuenciación: Longitud de Número de Cantidad de Método lectura de cada secuencias información secuencia por cada nucleotídica corrida por corrida Sanger 800-1500 bases 1-384 576 kb Pirosecuenciación 454 100-500 bases 250 mil 20 Mb SOLiD 50 bases 30 millones 4 Gb

Figura 3-9 Equipo de SOLiD de Applied Biosystem

Los procesos necesarios de la metodología SOLiD se dividen en varias etapas (Ver Figura 3-10.): • La preparación de la muestra es dependiente de la aplicación. Se puede iniciar a partir de DNA o de RNA. • La librería puede hacerse ya sea de fragmentos cortos (fragment library), o de fragmentos largos con términos apareados (mate-paired library). Ver Figura 3-11.. • La librería se tiene que amplificar en microesferas usando PCR en emulsión. • Las clonas de cada microesfera se depositan de manera aleatoria sobre la superficie de una laminilla de vidrio. Ahí se inmovilizan por medio de enlaces covalentes. La laminilla de vidrio se inserta en la máquina donde se procesa por un sistema robótico de microfluidos (ver Figura 3-9). • Las clonas se secuencian por la técnica de ligación. Ver Figura 3-13. Esto consiste en múltiples ciclos de apareamiento, ligación, lavado, detección, corte y lavado. • Con eso se obtienen los datos primarios que tienen que ser interpretados para obtener la secuencia. Para ello se usa una codificación de cuatro colores para cada dos bases (dibases) (ver Figura 3-14.). El análisis de datos posterior esespecífico para cada tipo de

aplicación. Existen diversos programas bioinformáticos propios de la empresa y también algunos de uso libre. Para mas detalles visite la página: http://solid.appliedbiosystems.com

Figura 3-10. Etapas secuenciales de la plataforma SOLiD. Tanto la preparacion inicial de la muestra como el análisis de datos son específicos para cada tipo de aplicación. En cambio, la parte central del proceso (enmarcada en amarillo) es común y universal para todas las aplicaciones.

Se pueden hacer dos tipos de librerías de fragmentos de DNA. Cada tipo de librería se puede usar de manera óptima para diversas aplicaciones.

Figura 3-11. Tipos de librerías que pueden ser secuenciadas por el sistema SOLiD

Principio de secuenciación por ligación: La secuenciacion se lleva a cabo en ciclos repetitivos cada uno de varias etapas: 0. Adición de primer universal de secuenciación. 1. Adición de sondas fluorescentes y enzima ligasa. Empareamiento de sondas. Formación de union covalente por ligación. Lavado de sondas no unidas. 2. Detección del fluoróforo con excitación laser. 3. Desfosforilación de hebras no extendidas por el primer. 4. Corte del fluoróforo. Se quitan tres nucleótidos z unidos al fluorocromo dejando tres nucleótidos n con un fosfato libre en el 5 prima. Lavado de agente cortante. 5. Repetición de etapas 1-4 para extender la secuencia. La extensión se hace de cinco en cinco bases (2 bases detectoras y 3 bases n). 6. Reseteo de primer de secuenciación. Desnaturalización y lavado. 7. Repetición de etapas 1-5 con el nuevo primer que esta desplazado por una base. 8. Se hacen en total 5 rondas de secuenciación (etapas 0-6) con los respectivos primers de inicio universales n, n-1, n-2, n-3 y n-4.

Figura 3-12. Principio de secuenciación por ligación. Etapas cíclicas dentro del sistema robótico.

Figura 3-13. Principio de secuenciación usando la enzima ligasa y detección con el sistema SOLiD.

Figura 3-14. Principio de codificación de cuatro colores para cada dos bases (dibase).

Existen 16 posibles combinaciones de dibases nucleotídicas. Si sólo se usan 4 fluoróforos diferentes entonces sólo se pueden reconocer 4 grupos de dibases. Por ejemplo, el color rojo puede ser para las dibases AT, CG, GC o TA. No podemos decir para cual de esas 4 dibases corresponde el color rojo. Esto significa que una secuencia de 4 colores no es suficiente para dedicir cual es la secuencia exacta de nucleótidos. Habra cuatro opciones de secuencias posibles con esos colores. Se necesita información adicional para distinguir entre las cuatro versiones posibles. La siguiente figura muestra un ejemplo de una secuencia de color y sus cuatro posibles versiones nucleotídicas:

Secuencia color dibases AT AAGA AT ACAC GA AA Opción 1 Secuencias CG CCTC CG CACA TC CC Opción 2 nucleotídicas GC GGAG GC GTGT AG GG Opción 3 TA TTCT TA TGTG CT TT Opción 4

Figura 3-15. Secuencia en código de colores, y sus posibles versiones nucleótidicas.

Por ejemplo, si de la secuencia de color mostrada en la Figura 3-15 se sabe que la primera base es A, entonces eso nos indica que el rojo es para la dibase AT y no para las otras opciones. Por consiguiente, la siguiente dibase que es azul, sólo puede ser para AA, y la siguiente que es amarilla, es para GA y así sucesivamente (opción 1). Es decir, con la secuencia de colores y el conocimiento de al menos una base de esa secuencia, podemos traducir el código de colores (sistema de dibase) al código nucleótidico (sistema de monobase). Así es como el sistema SOLiD convierte un código de 16 opciones a un código de cuatro opciones. En la práctica, lo que se hace es alinear la secuencia de colores con una secuencia referencia, de forma que la secuencia referencia nos ayuda a definir las opciones nucleotídicas posibles. Una vez alineada con una referencia dada, se puede distinguir muy bien si hay algunas mutaciones como deleciones, inserciones o SNPs con respecto a la referencia. Esto se logra con una altísima precisión, ya que el sistema de dibase puede distinguir entre mutaciones reales y errores técnicos de secuenciación (ver Figura 3-16). Está precisión se da por la característica de que cada base está representada por dos colores contiguos, de forma que para que un SNP sea real debe de haber un cambio en dos colores contiguos. Si en cambio, sólo se detecta un solo cambio de color, esto indica que fue un error de secuencación.

Figura 3-16. Opciones de detección de errores falsos o de confirmación de cambios reales, por ejemplo SNPs, deleciones o inserciones de una base.

Es por ello que el sistema de SOLiD es ideal para resecuenciar genomas ya conocidos en busqueda de polimorfismos. Para lo que es menos indicado, es para secuenciar de novo cuando

99 no existe suficiente informacion de referencia. La dificultad radica en que las secuencias cortas (<50 bases), que además tienen ambigüedad por sus colores dibases (para cada secuencia de color existen 4 secuencias nucleotídicas posibles). Todo esto hace mucho mas difícil el ensamblado de novo de un genoma eucariótico desconocido. Toda esta traducción complicada entre diferentes códigos se podria evitar si se pudieran usar 16 fluoróforos diferentes para las 16 dibases posibles. Sin embargo, actualmente no existen tantas moléculas fluoróforas que tengan un espectro de absorción y de emisión lo suficientemente diferente para distinguir 16 colores diferentes. Tal vez, en un futuro próximo si las haya, y de esta forma, se pueda mejorar aún más los sistemas tipo SOLiD.

Tarea 3-9: Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Qué combinación de características son las que permiten la alta confiabilidad de los datos generados con este sistema?

Ligase enzymology provides significantly higher selectivity than polymerase-based approaches and dramatically reduces errors associated with mis-incorporated bases. Two base encoding interrogates each base twice during sequencing allowing for rare SNP detection with extremely high confidence. The built-in primer reset function automatically caps system noise at given intervals to yield lower background and error rates compared to polymerase-based chemistries. A mate-paired technology that allows for a tight distribution across a range of insert sizes enables the accurate analysis and assembly of complex genomes. It is ideal to utilize larger insert sizes for detection and fine resolution of de novo genomic aberrations, such as inversions, translocations and duplications. Smaller insert sizes do not allow the same level of resolution as larger insert sizes.

Tarea 3-10: Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Cuáles son las ventajas del sistema SOLiD? El sistema de SOLiD ¿para qué etapa de secuenciación es adecuado de manera única? ¿Cuánta información genera cada corrida? ¿Qué tan confiables son los datos generados con este sistema?

De novo sequence analysis has traditionally been conducted by shotgun approaches using automated capillary electrophoresis (CE) systems. When the initial sequence scaffold for a particular genome is available, it is then possible to perform deep sequencing to fill in the gaps or to identify polymorphisms, mutations, and structural variations between organisms. Large scale resequencing projects require a highly parallel system to provide the depth of coverage required for variation detection. A highly accurate system is also critical to reduce false positive rates and provide the sensitivity necessary to detect mutations in heterogeneous samples. With increased sensitivity, the SOLiD System enables pooling of samples, as well as the detection of minor alleles. Automated CE sequencing remains the gold standard for de novo analysis in which long read lengths are desired, and for smaller targeted resequencing experiments. The Applied Biosystems SOLiD™ System for next generation sequencing is uniquely suited for finishing or large scale resequencing projects. The system generates up to 4 gigabases of mappable data in a single run (dual slide), providing the coverage and statistical resolving power required to correctly identify low frequency SNPs and structural variations across a large number of amplicons. The combination of 2-base encoding, high fidelity ligase, and primer reset functionality result in an overall accuracy of 99.94%, and a consensus accuracy at 15x coverage of 99.9999%.

Tarea 3-11. Lea el siguiente texto en inglés y después, decriba con sus propias palabras en español para qué aplicaciones se puede usar el sistema SOLiD.

Targeted Resequencing The high accuracy inherent in the SOLiD System is required for targeted resequencing. The SOLiD System technology is amenable to region-specific pullout methods and barcoding, that when coupled with alignment against a known reference sequence, will yield a very flexible format for region-specifi c resequencing.

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Gene Expression The massive amount of sequence tags generated in a single run can be used to identify and quantify exon sequences associated with alternative splicing and promoter usage. Simple tag counting allows for digital readout of expression levels and the ability to detect lowly expressed genes with greater sensitivity. MicroRNA Discovery MicroRNAs (miRNAs) are highly conserved, small, RNA molecules encoded in the genomes of plants and animals. The SOLiD System technology will enable the identification and quantification of large numbers of small RNAs from diverse species. Chromatin Immuno-precipitation (ChIP) The vast number of sequencing reads generated by the system coupled with high accuracy and matepaired technology enable a whole new way to study ChIP with unmatched specifi city and accuracy. Whole Genome Sequencing The SOLiD System enables a new level of whole genome sequencing with massive throughput and mate-paired technology. The system’s throughput allows for high coverage levels and the ability to sequence multiple genomes in a single run. These and other features dramatically reduce the time and cost required by other technologies.

Tarea 3-12 Lea las siguientes explicaciones en inglés, y elabore su propio diagrama de flujo con sus respectivas explicaciones en español.

A. LIBRARY PREPARATION The SOLiD System can use two types of libraries—fragment or mate-paired. The type of library used depends on the application and information needed.

B. Emulsion PCR/Bead Enrichment Clonal bead populations are prepared in microreactors containing template, PCR reaction components, beads and primers. After PCR, the templates are denatured and bead enrichment is performed to separate beads with extended templates from undesired beads. The template on the selected beads undergoes a 3’ modification to allow covalent bonding to the slide.

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C. Bead DEPOSITION 3’ modified beads are deposited onto a glass slide. Deposition chambers offer the ability to segment a slide into one, four or eight chambers during the bead loading process. A key advantage of the system is the ability to accommodate increasing densities of beads per slide, which will result in a higher level of throughput from the same system.

D. Sequencing by Ligation /DATA ANALYSIS Primers hybridize to the P1 adapter sequence within the library template. A set of four color dye- labeled probes compete for ligation to the sequencing primer. Specificity of probe ligation is achieved by interrogating every 4th and 5th base during the ligation series. Five to seven rounds of ligation, detection and cleavage record the color at every 5th position with the number of rounds determined by the type of library used. Following each round of ligation, a new complimentary primer offset by one base in the 5’ direction is laid down for another series of ligations. Primer reset and ligation rounds (5–7 ligation cycles per round) are repeated sequentially five times to generate 25–35 base pairs of sequence for a single tag. With mate- paired sequencing, this process is repeated for the second tag. The use of color space for two base encoding makes it easy for the system to quickly and accurately discriminate between system errors and true polymorphisms.

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3.3.4. Método de síntesis con fluoróforos Tarea 3-13. Consulte las paginas web de Ilumina para aprender mas sobre la tecnología que implementa esa compañía. Trate de explicar el sistema de secuenciación Solexa con sus propias palabras. http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=203 http://www.illumina.com/downloads/SS_DNAsequencing.pdf

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4. Detección de polimorfismos genéticos 4.1. Marcadores 4.1.1. Características de los marcadores A los polimorfismos genéticos también se les llama marcadores moleculares por la posibilidad de distinguir una variante de DNA de otras. Un buen marcador molecular tiene las siguientes características ideales: • Inferencia no destructiva: Permite analizar al individuo sin perder su integridad o descendencia. El DNA se puede extraer de una muestra o de un tejido sin matar al organismo. • Ser frecuente. El tipo de marcador tiene que ser abundante en el genoma para tener suficientes marcadores a lo largo de todos los cromosomas sin permitir muchos huecos. • Ser polimórfico: Debe tener como mínimo 2 variantes. No nos da información analizar un marcador que es igual en toda la población. • Presenta herencia mendeliana. Está basado en una secuencia de DNA específica y se hereda por medio de los cromosomas del núcleo. • Ser de carácter codominante: Para distinguir entre el homocigoto y el heterocigoto. Los marcadores moleculares puramente dominantes no permiten identificar a los heterocigotos. Esta es una de las desventajas de los marcadores fenotípicos que tampoco detectan a los heterocigotos. • Requerir poca cantidad de DNA: Esto es importante, sobretodo cuando las muestras son pequeñas (por ejemplo a partir de semillas). La cantidad de DNA de buena calidad es muy limitante para los RFLPs. Los microsatélites requieren de muchos menos DNA para funcionar. • Fácilmente analizables, interpretables e intercambiables entre laboratorios: Para evitar resultados diferentes. Una electroforesis con errores de 5 pb puede dar resultados poco reproducibles y erróneos. Además se pueden sumar errores de la PCR, sobretodo si se usan muchos ciclos. Al copiar fragmentos repetitivos la polimerasa Taq puede tener problemas. Es necesario hacer intercambios entre laboratorios y muestras control con el fin de validar los resultados de microsatélites. • Automatizables: Los RFLPs, AFLPs y microsatélites requieren de nuestra interpretación manual, ya que todavía no existe un software que haga la evaluación computarizada. Los SNPs sí son automatizables, sobre todo si se usan microarreglos (por ejemplo, la tecnología de Illumina).

4.1.2. Tipos de marcadores genéticos Marcadores Tipo I (basados en caracteres expresados) Antes se usaban sólo estos porque se pueden detectar fácilmente (color de semilla, forma, tamaño, etc.). Por lo general se trataba de marcadores monogénicos dominante-recesivos para características fenotípicas muy simples, por ejemplo, el color y forma de los chícharos de Gregor Méndel o el color de los ojos y la forma de las alas de las mosquitas de Thomas Morgan.

• Marcadores fenotípicos: forma de la hoja, color de la flor, semilla, presencia de lígulas, tricomas, etc.

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• Marcadores bioquímicos: carotenos, antocianinas, clorofila, almidón tipo waxy, etc.

Marcadores Tipo II (basados en proteínas) Patrón de Proteínas Se puede hacer extractos y hacer electroforesis de las proteínas. Con ello se pueden detectar diferencias entre genotipos (polimorfismos). No es tan eficaz ya que en los geles SDS de una dimensión sólo se pueden diferenciar relativamente pocas proteínas por tamaño y abundancia. Los extractos totales de proteínas no permiten detectar muchos cambios. Solamente los cambios mayores del tipo ausencia-presencia o modificación sustancial en el peso molecular. Se ha propuesto el uso de MALDI-TOF para detectar cambios en patrones proteínas, pero en la práctica se usado poco para mejoramiento genético.

Isoenzimas Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la secuencia de aminoácidos, pero que catalizan la misma reacción química. Estas enzimas suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos (i.e. diferentes valores de Km), o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. Pueden encontrarse diferentes isoenzimas en los diversos compartimientos intracelulares. Muchas proteínas, y no sólo las que tienen actividad catalítica, pueden presentarse en formas múltiples en las células. En bioquímica, las isoenzimas son isoformas (variantes estrechamente relacionadas) de las enzimas. En muchos casos, son codificadas por genes homólogos que han divergido con el tiempo. Aunque de forma estricta, las aloenzimas representan enzimas de diferentes alelos de un mismo gen y las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes cuyos productos catalizan la misma reacción, los dos términos se suelen usar indistintamente. Las isoenzimas permiten una detección fácil y muy especifica por medio de la actividad enzimática que se visualiza en un gel nativo. Al realizarse en condiciones no desnaturalizantes, es posible detectar variantes con ligeros cambios en la secuencia y la carga neta de la proteína. Muchas veces las isoenzimas no tienen cambios drásticos de la masa total. La ventaja es que es un método muy sensible. Las enzimas amplifican la señal que es detectada en geles de actividad. En algunos casos las enzimas también tienen algo que ver con alguna función molecular, por lo que pueden estar muy ligados con característica fenotípica deseada. Hoy en día, muy pocos laboratorios miden isoenzimas, aunque en el pasado se usaron mucho en la investigación de la base molecular de la diferenciación celular y de la morfogénesis.

Marcadores Tipo III (basados en secuencias de DNA) Tipo IIIa Marcadores no-neutrales (Genes estructurales que codifican para algo): Son secuencias de DNA que sí codifican para alguna proteína, y por lo tanto, los polimorfismos que observamos si están sujetos a una presión directa por selección natural o artificial.

Tipo IIIb Marcadores neutrales: (DNA que no codifica para nada): Son polimorfismos de DNA que no están sujetas a una selección directa. Por lo regular son secuencias anónimas que se encuentran en regiones intergénicas. Estos marcadores son útiles cuando están ligados cercanamente a los genes de interés (menos de 5 cM).

En el transcurso de la historia, se ha pasado de marcadores polimórficos del tipo fenotípico, a los de tipo bioquímico y de isoenzimas, hasta los basados en DNA directamente, que son los que más se usan hoy en día.

Tarea 4-1. Observe el video en la página web http://www.slideshare.net/lautorresm/pcr-marcadores- moleculares, y después explíquelo con sus palabras. Consulte los siguientes sitios para mayor

105 información: http://www.angelfire.com/magic2/bioquimica/enzimas9.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Marcador_gen

4.1.3. Ejemplos de marcadores

4.1.3.1. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Los Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) se originan de las mutaciones puntuales. Los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) son variaciones de secuencia del ADN que ocurren por un cambio en solo nucleótido (A, T, C, o G) de la secuencia. La mayoría de SNP, (dos de cada tres SNP), se originan de la sustitución de la citosina (C) con timina (T). Esta mutación se da a raíz de la metilación de las citocinas. Los SNPs son evolutivamente estables ya que no cambian mucho de una generación a otra, lo que facilita algunos estudios de poblaciones. Los SNPs también tienen elevada facilidad de análisis porque admiten diferentes tipos de genotipaje. Existe un amplio abanico de técnicas para analizarlos. Algunas de estas pueden ser automatizadas y usadas en masa a gran escala. Un ejemplo es la plataforma de Illumina que se explica mas adelante. Una ventaja de los SNPs es que son muy abundantes en el genoma. Las estimaciones actuales es que hay aproximadamente un SNP por cada 100-300 bases en el genoma humano. En algunas plantas el promedio es de uno cada mil bases. Esto implica por ejemplo, que en todo el genoma humano hay aproximadamente 10 a 30 millones de potenciales SNPs. Más de 4 millones de SNPs se han identificado y la información se ha puesto a disposición del público en internet.

Tarea 4-2 Revise las siguientes páginas web y haga un resumen de lo que tenga que ver con los marcadores moleculares: www.intl-pag.org/10/abstracts/ www.terralia.com/revista12/pagina43.htm http://www.bioline.org.br/request?la05005 http://bcs.whfreeman.com/mga2e/bioinformatics/ch01/index.htm

Problemas de los SNP’s: Los SNP’s ofrecen menos información que los microsatélites. El punto débil es la capacidad de discriminación; un SNP puede tener solo 4 alelos (4 bases diferentes) pero en la práctica sólo hay 2 (bialélicos). Los cambios más frecuentes de los SNPs son los cambios de C a T, o de G a A. Un microsatélite puede tener muchos más alelos que sólo 4. En algunos casos hay hasta 20 diferentes variantes. Es por ello que es necesario utilizar más marcadores SNPs a comparación de los microsatélites.

Ejercicio: Algunos investigadores han determinado empíricamente que la cantidad de información que pueden dar 4 SNP’s es similar a la de un microsatélite. ¿Cuántos SNP’s necesitamos para una prueba de paternidad, por ejemplo? Teniendo en cuenta que hacían falta ocho microsatélites para pruebas de paternidad, entonces si usamos SNPs necesitaríamos analizar al menos 32 SNPs para poder decir con mayor certeza si el individuo es o no es el padre.

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Figura 4-1. Gráfico-SNP’s dada una N para que todos los individuos puedan ser discriminados.

Ejemplo: Según vemos en la gráfica hacen falta más SNP’s para distinguir dos individuos consanguíneos que para los no consanguíneos. Si tuviéramos la certeza de que en nuestro set de SNP’s los alelos, como mínimo estuvieran en una frecuencia (F≈0.2), entonces con un set de 30-40 SNPs sería suficiente y significativo. Pero, ¿cuál es el problema de está aproximación? Garantizar que todos los SNP’s se encuentran con una frecuencia (0.2). Esto no es tan fácil. Lo ideal sería diferenciar a estos dos individuos entre el intervalo de 106 a 109 individuos. Pero para obtener estos valores es preciso disponer de un rango entre 50-100 SNP’s. Se analizaron 40 SNP’s para ver si cumplían el requisito de 0.2 usando como ejemplo cuatro poblaciones. Existen SNP’s donde no hay polimorfismo. Es decir, su frecuencia era F = 1. Por consiguiente su poder de discriminación era cero. Otros SNP’s se vio que en alguna de las poblaciones no cumplían F > 0.2. De los 40 SNP’s, en el mejor de los casos, hay 20 que sirven. Conclusión: Para una población en particular es relativamente fácil conseguir un set de 40 SNP’s. Pero si es necesario que éstos se puedan utilizar para diversas poblaciones, entonces uno necesita analizar un mínimo de 90 SNP’s por lo que de éstos tenemos la esperanza de que 35-40 cumplan con la regla F = 0.2.

¿Cuántos SNP’s necesitamos si el alelo más raro tiene una A = 8,0 a = 2,0 frecuencia de 0.2? Lo ideal es que cada alelo fuera 0.5 = p = q AA aaAa dándonos así la máxima información. Pero en la práctica, para un P 2 = 2 28,0 QPQ 2 = 2,0 2 mismo SNP las frecuencias son diferentes entre diferentes 1424444 434444 2 poblaciones. Averigüe más sobre la función de Hardy-Weinberg ∑ ()QP =+= 1 para resolver la pregunta. ¿Cuanta más información puede dar un alelo con frecuencia 0.5 en comparación con un alelo de frecuencia 0.2?

Técnicas de genotipaje económico y fiable con SNP’s: En la década de los ochentas estos análisis se realizaban por Southern Blot ya que no existían secuenciadores. Cuando se pudo secuenciar DNA, tras la aparición de la PCR (1989), surgen los arrays o chips que permiten realizar análisis masivos:

• Métodos basados en hibridación: Ensayos de genotipaje para discriminar y genotipar. Diagnóstico de variabilidad por polimerización: Primer + Polimerasa que hace crecer la cadena. • Discriminación por ligación: De variantes alélicas en función de si 2 oligos son combinables (OLA, RCA, LCR, DOL). • Discriminación por corte: Se discrimina en función de si se rompe o no el DNA. Se usa una enzima de restricción y depuse se tiene que analizar el tamaño del fragmento. • Secuenciación de DNA: Al margen de estas cuatro técnicas hay mucha gente que prefiere más secuenciar el trocito de DNA; si ven dos picos será heterocigoto y si se ve un pico, será homocigoto. Esto antes era impensable porque los kits de secuenciación eran muy caros. La secuencia se hace con el método dideóxido en secuenciadores

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automáticos basados en electroforesis capilar. Podemos secuenciar DNA pero además genotipar.

Tarea 4-3. Lea el siguiente texto en inglés y comente con sus compañeros lo que comprendió.

The discovery of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions, which are the basis of most differences between alleles, has been simplified by recent developments in sequencing technology. SNP discovery in many crop species, such as corn and soybean, is relatively straightforward because of their high level of intraspecific nucleotide diversity, and the availability of many gene and expressed sequence tag (EST) sequences. For these species, direct readout of SNP haplotypes is possible. Haplotype-based analysis is more informative than analysis based on individual SNPs, and has more power in analyzing association with phenotypes. The elite germplasm of some crops may have been subjected to bottlenecks relatively recently, increasing the amount of linkage disequilibrium (LD) present and facilitating the association of SNP haplotypes at candidate gene loci with phenotypes. Whole-genome scans may help identify genome regions that are associated with interesting phenotypes if sufficient LD is present. Technological improvements make the use of SNP and indel markers attractive for high-throughput use in marker-assisted breeding, EST mapping and the integration of genetic and physical maps.

4.1.3.2. Microsatélites Los satélites son regiones del genoma repetidas en tándem, que no transcriben y están ampliamente distribuidos en los diferentes cromosomas. Cuando se fragmenta y se desnaturaliza el DNA, la mayor parte del DNA se convierte a monocadena. Sin embargo, también se observa un porcentaje de DNA que queda separado del resto. Este corresponde a DNA repetitivo y renaturalizado (doble cadena) que en ese entonces se le llamo DNA satélite. Es en las regiones teloméricas y centroméricas donde se concentra la mayor parte de los satélites. Los satélites son de 500-1000 bases, mientras que los microsatélites son secuencias repetidas más cortas (2-10 bases). Los microsatélites típicos son nucleótidos AT repetidos en tándem de cinco a veinte veces. A los microsatélites también se les llama SSRs (Simple Sequence Repeats). Su polimorfismo viene dado por el número de veces que se repite su matriz. Se pueden diseñar primers que amplifiquen estas regiones para discriminar las diferentes variantes alélicas. Se efectúa entonces un PCR y después se corre una electroforesis de agarosa o acrilamida para separar las variantes por su tamaño. En el genoma de maíz, la abundancia de los microsatélites es elevada, sus polimorfismos son múltiples y su distribución es más o menos uniforme a lo largo de los cromosomas. Son marcadores codominantes, lo que permite distinguir heterocigotos de homocigotos. Normalmente se encuentran en regiones no codificantes, son marcadores neutros. (Figura 4-2).

Figura 4-2. Ejemplo de microsatélites Los marcadores SW240, SO357 y SO101 (verdes) y el SW 26 y SO005 (azules) presentan dos picos separados. El SO386 (negro) es el único homocigótico ya que presenta un solo pico. Si en este rango no hay ningún otro marcador significa que no hay heterocigosis. Cuanto más repeticiones en tándem, más separados estarán los alelos.

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¿Cómo se generan los polimorfismos de microsatélites? La polimerasa va replicando el DNA, al trabajar con tándems puede ser que se forme un “loop” (vuelta) con lo que al unirse con la cadena complementaria habrá un número elevado de repeticiones. Si este loop se forma en la cadena molde sucedería que el fragmento que se generaría tendría una repetición menos. A esto se le llama un deslizamiento “slippage” de la replicación (Figura 4-3).

Figura 4-3. Modelo de slippage de la polimerasa

Aplicaciones de los microsatélites: Gracias a su polimorfismo y su rápida evolución (dan lugar a muchos alelos), existen muchos en el genoma. Muchos son de locus único y neutros (no codificantes). Además, se encuentran en el genoma de casi todos los organismos.

Pruebas de paternidad: Normalmente se evalúan unos 15 microsatélites. Si dos o más no coinciden se puede descartar la paternidad. Pero también sirve para encontrar altos grados de parentesco o bien saber de quién proviene un cierto material genético. La técnica se basa en la amplificación de los microsatélites mediante PCR (utilizando cebadores específicos para cada uno de los 15 microsatélites utilizados). Al ser secuencias nucleares, cada individuo posee dos copias de cada marcador, una de origen paterno y otra de origen materno, que pueden ser iguales o diferentes entre si. Los 15 marcadores poseen de 5 a 22 variantes cada uno (es prácticamente imposible encontrar 2 individuos iguales). La identificación es inequívoca y es independiente del tipo de muestra que se utilice. Accede directamente al genotipo de los individuos y, por tanto, no se ve afectado por las relaciones de dominancia ni por las variaciones de penetrancia o expresividad ya que estos marcadores se heredan de forma codominante permitiendo así, determinar también el genotipo (Figura 4-4).

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Figura 4-4. Prueba de paternidad con marcadores

Estudio del origen de poblaciones (migraciones humanas): Se analizan diferentes poblaciones y se intenta encontrar caminos lógicos para explicar cómo han pasado de un lugar a otro. ¿Cuánta diversidad hay en una población determinada? ¿Qué individuos pertenecen a una subespecie o a otra? Los marcadores moleculares pueden dar respuestas a este tipo de preguntas.

Problemática de los microsatélites: Son relativamente difíciles de encontrar en una especie nueva. Las colecciones que se tienen ahora ha sido una labor de muchos años. Antes se hacían en geles de agarosa, pero era muy difícil diferenciar entre 5 pb. Hoy muchos se hacen en geles de acrilamida. Algunos SSRs son complicados de interpretar por lo que aparecen otras bandas inespecíficas. Muchas veces no es posible automatizar por lo que se necesita anotación manual.

4.1.3.3. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Se diseñan primers cortos (10-16 bases) con una secuencia aleatoria. Con cada par de primers escogidos al azar se hace un PCR con DNA genómico a una temperatura de alineamiento (Tm) bastante baja (35-40º C) y después se corre en un gel de agarosa. Los RAPDs son útiles cuando no hay información previa del genoma ni de los genes. Como los primers son pequeños habrá cientos de sitios en el genoma donde hibridarán. Con suerte puede ser que los primers se unan a regiones del genoma no muy lejanas. Si se unen en una orientación complementaria habrá amplificación. Si la orientación no es correcta, entonces no habrá amplificación exponencial. La metodología se ha aplicado más a DNA de plantas, que de animales. Por lo regular los RAPDs dan a lugar de 5 a 20 bandas que muchas veces no son muy específicas, es decir, que varían bastante según las condiciones de cada experimento. Bajo condiciones ideales, se usa un par de primers con DNA de muchas variedades diferentes y se obtienen bandas de diferente tamaño para cada variedad. Muchas veces son las mismas bandas en las muestras, pero a veces en una sí se amplifica y en la otra no.

Ventajas: Para diseñar los primers no hace falta tener información previa del genoma del organismo. De hecho, se pueden usar los mismos primers para diferentes especies. Problema: Al hacerlo a menor temperatura hay problemas de repetibilidad en PCR. Por ejemplo, la amplificación varía mucho en función de la cantidad de DNA genómico. En los RAPDS a veces aparecen o desaparecen bandas, y muchas veces esto no tiene que ver con la secuencia del DNA. Es una técnica poco robusta. Por eso, en el momento en el que se encuentre 1 banda consistente se diseñarán unos primers más específicos y se hará una PCR normal.

Tarea 4-4: Calcule cuántas variantes posibles existen para un primer de 10 bases. Asumiendo un tamaño de genoma como el del arroz (450Mb), ¿cuántas veces en promedio se pegará un primer aleatorio de 10 bases?

Respuesta: Existen 410=1048576 variantes diferentes de un primer de 10 bases.

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Para calcular las veces que se pega asumimos que el primer se puede unir a cualquiera de las dos hebras del ADN. Es decir, tenemos dos formas de escanear el genoma (2*450Mb=900Mb) En promedio, un primer de 10 bases se pegara (900’000’000/1’048’576) = 858 veces

4.1.3.4. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) A finales de los años 80, los marcadores moleculares más usados fueron los RFLPs. El procedimiento es el siguiente: Se extrae el DNA genómico y se hace una digestión con enzimas de restricción. Después se hace una electroforesis y se transfiere el DNA a un filtro de nylon. Se hace un marcaje e hibridación del DNA digerido con una sonda radiactiva. Se observan diferentes patrones de bandas entre individuos. Los polimorfismos de DNA tenían ventajas sobre los polimorfismos bioquímicos porque permitían descubrir muchas más diferencias; el nivel de variabilidad de polimorfismo aumentó mucho. Individuos que se veían muy parecidos a nivel del fenotipo, podían ser muy bien distinguidos con marcadores de DNA. Se acuñó entonces el término de “fingerprinting”. Dos individuos diferentes no comparten el mismo patrón de bandas (Figura 4-5.).

Figura 4-5. Pasos para realizar una prueba de RFLP

4.1.3.5. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Los AFLPs tratan de superar las limitaciones prácticas de otras técnicas. De la falta de robustez y repetitividad de los RAPDs por un lado, y de la cantidad de DNA necesario para los RFLPs por otro lado. Son parecidos a los RFLPs, pero en lugar de usar enzimas de restricción se usa amplificación por PCR. Se hacen dos rondas de PCR con primers anidados. En la primera ronda de PCR se usan primers universales, y en la segunda se usan primers con extensiones específicas. La ventaja de los AFLPs es que se requieren de mucho menos DNA de buena calidad para empezar. Primero se usan enzimas de restricción para digerir DNA. Por ejemplo EcoRI (reconoce 6 bases) y M (reconoce 4 bases). Una de las enzimas lleva la etiqueta de corte frecuente y la otra de corte menos frecuente. Este es un punto crítico de la técnica, porque E y M dejan extremos cohesivos, de forma que hecha la digestión, usaremos adaptadores (fragmentos de DNA de doble cadena que serán cohesivos en los extremos generales para E y M, de forma que en 3’ y 5’ tendrán secuencias que conocemos).

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Con esto conseguimos millones de fragmentos de los que conocemos secuencias de los extremos 3’ y 5’ y que tienen tamaños variables. Gracias a esto podemos amplificar diseñando primers específicos de M y E. Si hacemos PCR con estos primers será un fracaso porque habrá demasiados fragmentos. Por esto aún metiendo primer E + M tampoco podríamos ver nada. Todos los fragmentos digeridos quedan unidos por los extremos a los adaptadores. Se conoce su secuencia porque la ha diseñado el investigador. Obtenemos un conjunto de fragmentos con secuencias de los extremos conocidos. Podremos hacer un PCR específico. Los primers de este PCR serán complementarios a la secuencia de los diferentes adaptadores. No sólo amplificaremos los fragmentos que tienen los dos tipos de adaptadores diferentes sino amplificaremos mucho y en el PCR veremos un barrido de bandas.

Tarea 4-5. The gene for the autosomal dominant disease shown in this pedigree is thought to be on chromosome 4, so five RFLPs (1-5) mapped on chromosome 4 were tested in all family members. The results are also shown in the diagram; the superscripts represent different alleles of the RFLP loci.

(a) Explain how this experiment was carried out. (b) Decide which RFLP locus is closest to the disease gene (explain your logic). (c) How would you use this information to clone the disease gene?

Método: Se hace un PCR pero diseñando cuatro primers E de la misma secuencia excepto por el nucleótido en 3’ que en un caso será A, en otro T, C y G. Se hace lo mismo con los primers de M. Se hacen 4 alícuotas de primer E y cuatro de los primers M. En total se hacen 16 PCR diferentes con las combinaciones de primers. Así en cada PCR se logra amplificar un subconjunto de fragmentos. Al hacerlo, comenzarán a intuirse bandas pero seguirán habiendo demasiados fragmentos. Fue la PCR pre-selectiva donde habríamos enriquecido un subconjunto de moléculas del DNA genómico del que habíamos partido. Entonces se diseña un nuevo subconjunto de primers que además de tener secuencia complementaría a E y la A, dos nucleótidos más adicionales, más la secuencia complementaria a los adaptadores, igual con los otros 3 primers de E. Así, se tendrán 16 combinaciones, 16 primers dEA, 16 de EC, 16 de ET y 16 de EG logrando 64 PCR’s diferentes en total. Por tanto 64 primers MSEI. Estamos ante la

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PCR selectiva. Ahora sí que el número de bandas era discreto (100-200 bandas) y hacía falta usar gel acrilamida o bien marcar primers fluorescentemente.

Ventajas: A diferencia de RAPD, obtenemos 10-20 veces más bandas y es una técnica muy robusta y muy repetitiva ya que usa oligos largos y el Tm es más alto y especifico. Da mucha información. Tampoco es necesario conocer el genoma, incluso se puede hacer fingerprinting de un DNA desconocido. Buena técnica para obtener marcadores. Problema: Es obligatorio hacer las dos PCR’s porque sino habrá demasiada amplificación. Veremos banda tanto para homocigoto dominante y hetero. Todavía no hay ningún software que permita automatizar las lecturas. Pruebas de paternidad: El hijo debe tener una banda del padre o de la madre, si no tiene ninguna banda de los dos no es hijo suyo. El problema es que se tardaba más tiempo comparando el gen del hijo con el de los padres. Si hubiera softwares mejores los AFLP se harían más. Si el DNA está degradado o de mala calidad generará problemas en la técnica, ya que el 1er paso de la técnica es hacer la digestión del DNA genómico, si este ya viene cortado o está en muy mal estado, no funcionará bien, no será tan robusta ni repetitiva.

4.1.4. Estrategias de genotipaje

4.1.4.1. Técnica de extensión de primers Unas de las más usadas son las que utilizan un secuenciador. Usa el primer que queremos extender. Diseñamos un primer que en 3’ tenga el nucleótido adyacente a la posición de la mutación del DNA. Dejamos hibridar, colocamos la DNA polimerasa y 4 dideoxido nucleótidos con fluorescencias diferentes.

Figura 4-6

Heterocigoto: 2 picos. La DNA polimerasa pondrá ddG y a otros ddA. Pero cabe recordar que al ser dideox, sólo podrá añadir 1 nucleótido dd más a continuación del “primer”. Se pueden detectar diferencias de migración debido a las marcas fluorescentes.

Se puede usar una extracción rápida de DNA (15-20’) en condiciones alcalinas para degradar el RNA. Seguidamente PCR (1:30’) y tratamiento con fosfatasa y exon (ExoSAP = cóctel de las dos enzimas). Tan sólo 30 minutos de digestión. Ponemos el cóctel con los dideox (1:20’) inactivadas previamente las otras enzimas. El paso CIP es para cuando analizamos muchos SNP’s (elimina los dideox no hibridados). Si nos lo saltamos, no sólo veremos el primer del pico, sino también otras señales que son los dideox. La eficiencia con la que la DNA polimerasa incorpora un dideox, no es la misma de que los picos tengan la misma altura. Las diferencias de migración en las gráficas son debido a las fluorescencias. Todo este proceso tarda unas 12 horas/placa (384 muestras/placa).

Ventajas: Técnica muy rápida. Problema: Es necesario purificar primers: Si no, al ponerlos con los dideox éstos igualmente se alargarían por lo que veríamos muchos picos con muchas

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fluorescencias. Eliminación química: Enzimas exonucleasas para eliminar los primers y fosfatasa alcalina para eliminar los nucleótidos. La ventaja es que podemos hacerlo “in situ” pero después será necesario inactivar estas enzimas para que se pueda realizar la siguiente reacción. Eliminación física: Columna donde quedará retenido el DNA y se eluirán primers y nucleótidos.

4.1.4.2. PCR en tiempo real con sondas TaqMan Este método requiere del monitoreo de la cantidad de producto en cada ciclo del PCR. La fluorescencia se puede detectar: Por método óptico normal con un solo filtro tipo highpass: Se estimula con una lámpara a varias longitudes de onda simultáneamente a una molécula marcada fluorescentemente y se detecta la fluorescencia total. Esta técnica no permite detectar varios tipos de fluorescencia a la vez, y es por eso que solo se puede ver una sola marca por carril. Por secuenciadores automáticos: Se usan diferentes láser con diferentes longitudes de onda de excitación. Esto permite leer varias fluorescencias dentro del tubo de forma continua y simultanea. Además, el láser de fluorescencia permite ser lo suficientemente sensible para trabajar con volúmenes muy pequeños dentro de tubos de vidrio capilares. Fluorescencia absorbida

Sonda Taq Man OligoFw Taq R Q Pol

OligoRv

Figura 4-7. Fluorescencia absorbida son una sonda Taq Man

Sondas Taqman: La polimerasa Taq, además de extender, elimina, pues la sonda está marcada en 5’ por un fluorocromo y en 3’ por otro. Cuando la Taq extienda el primer se acabará encontrando con la Taqman que tendrá activo exon y la separará (los fluorocromos quedarán separados no anulándose entre si). La cantidad de fluorescencia que se detecta es directamente proporcional al número de moléculas molde que se están extendiendo. Es una técnica cuantitativa. También se utiliza para genotipar en tiempo real (Figura 4-7).

Método para genotipar: Añadimos dos sondas TaqMan diferentes en el PCR y deben contener el nt que estoy genotipando y cada una será complementaria a uno de los dos alelos, además, cada uno tendrá una fluorescencia diferente, por tanto, en esta reacción tendremos 4 primers; 2 primers R y Q y 2 sondas TaqMan. Al final del PCR sólo queremos saber qué fluorescencia será mayoritaria. Este método lo podemos hacer con PCR normal y después PCR cuantitativa para que lea la fluorescencia.

Homocigoto: Hibridará una de las dos sondas porque será totalmente complementaria. 90/10 fluorescencia. Heterocigoto: Habrá un 50% de eficiencia de hibridación para cada sonda. 50/50 fluorescencia.

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Ventajas: No se requiere purificación. En esta se hace todo en un tubo sin purificar. Es eficiente y rápida. Problema: No se genotipan mas de 1 SNP. Sería difícil que la hibridación sea correcta si se usan más. Es necesario comprar 2 sondas TaqMan con 2 fluorocromos diferentes. Esto resulta muy caro. Sólo vale la pena si se tiene que genotipar muchas muestras con el mismo marcador. Las sondas deben llevar modificación química (MGB) en el segundo fluorocromo por lo que aumenta la Tm (gana especifícidad). Muy importante con las sondas TaqMan porque son muy pequeñas y es mejor aumentar su especifícidad a la hora de hibridar. No tiene sentido aplicarla si tenemos poca muestra o muchos SNP’s.

4.1.4.3. PCR en tiempo real con sondas FRET Las sondas FRET emiten fluorescencia cuando dos fluorocromos están juntos. Se diseñan dos primers adyacentes a la posición de los SNP’s a genotipar, si los dos primers ligan y se enganchan emitirán fluorescencia. Aquí volvemos a tener 4 primers, los dos de la PCR y los dos que discriminarán un alelo de otro. El extremo 3’ de la sonda reportero está bloqueado y no se extiende. También podemos hacer RT-PCR a tiempo real mediante cinética de desnaturalización del producto amplificado. Un solo nucleótido cambiado hace suficiente diferencia entre la Tm como para que la cinética cambie.

Figura 4-8. Ejemplo de una sonda FRET

Ventajas: No es necesaria la degradación porque se emite fluorescencia. Tan sólo es necesaria hibridación.

4.1.4.4. PCR alelo-específica Sistema de PCR que permite la amplificación de uno alelo específico individual y no del resto de alelos posibles. Esto debido a que el primer forward es complementario solo a uno de los dos alelos del gen. Con fluoróforos intercalantes (SYBR Green) la calidad de la detección depende de la especificidad de los primers, de la interacción entre primers. La fluorescencia se emite cuando se intercala en el surco menor del DNA de doble cadena (dsDNA). Por lo que hay que diseñar un primer “forward” que en 3’ acabe con el nucleótido que se está evaluando. Sabemos que si esta última base del primer no se complementa la PCR bajará mucho su eficiencia.

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SYBR Green Molécula intercalante

Figura 4-9. SYBR Green II es una molécula que fluórese cuando se une a DNA de doble cadena.

Homocigoto: Habrá amplificación y sólo fluorescencia en un tubo, de lo contrario será heterocigoto y con fluorescencia en ambos tubos. Podría ser homocigoto mutante. Para comprobarlo se tiene que hacer un segundo PCR con un nuevo primer.

Figura 4-10. Se muestra una molécula verde intercaladora que se une a la doble hélice del DNA

SYBR Green I emite fluorescencia cuando se une al DNA de doble cadena. Es decir, no reacciona con el DNA de cadena sencilla. Si hacemos PCR en un medio donde hay SYBR esté se podrá unir al DNA en los momentos que esta presente como doble cadena, y así podemos ver la amplificación del DNA dándonos una señal fluorescente en tiempo real.

Ventajas: Se puede hacer con solo 2 primers: Ya que SYBR sirve para todos los SNP’s ya que se intercala inespecíficamente en cualquier secuencia de DNA de doble cadena, por lo que sirve para cualquier genotipado. Permite ahorrarse el marcaje fluorescente de los primer Taqman o FERT, que

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son sondas específicas muy caras. Problema: Es difícil poner a punto las 2 PCR’s.

Métodos de genotipaje: Comentario [ATF1]: No Sabiendo la secuencia flanqueante al SNP queremos genotipar un polimorfismo A-G; entiendo este párrafo Homocigoto: Para A esperaríamos un pico el doble de alto. Heterocigoto: Esperamos un pico bajo porque sólo se elonga una de las dos cadenas. Después de interrogar (A) lo hago con (G) por lo que lanzo (C), si vemos un pico equivalente a 1 incorporación nos indica que se alarga la cadena y que por tanto es heterocigoto. Segundamente interrogamos (C) (tendremos (G)); por lo tanto esperaremos pico doble ya que este nucleótido está en ambas dos cadenas.

Podremos elaborar un pictograma teórico porque conocemos la secuencia flanqueante. Si en el alelo 2, en vez de (G) fuese (C), al añadir (G) veríamos un pico que sería el triple de (A) por lo que se incorporarían 3(G).

Secuenciar cadena simple: Puedo analizar haplotipos (si encontramos 2 SNP’s muy cercanos entre sí con el dideox no podríamos saber que el individuo es doble heterocigoto ya que no distinguiría. En los 2 casos existe doble heterocigoto pero no podemos decir en qué orden y qué fase está el haplotipo. Con esta técnica sí podremos saberlo: C G C C ó Pedigrí a T C T G través de probabilística en la población: Con las frecuencias alélicas de los marcadores. Pueden influir los haplotipos siempre y cuando las 2 posiciones de los SNP’s estén más lejos de 100 pb (ya que la muestra no puede ser más larga). Mezcla de muestras de DNA e interrogamos SNP: Si vemos una altura muy diferente entre el grupo control y el grupo enfermo podemos inferir que esa mutación está en la enfermedad. Patrones de metilación diferencial en el DNA: Las C’s pueden estar metiladas y estos patrones de metilación son importantes para determinar el “inprinting”. El gene inprinting se refiere cuando individuos para un gen determinado, sólo expresa uno de los dos alelos, ya sea el paterno o el materno. Pero, ¿cómo se estudia el patrón de metilación? Se hace una reacción con bisulfito que transfiere la C metilada en un análogo de base, después se hace pyrosequencing y en función del patrón y se determina si aquella C estará o no metilada.

Ventajas: Puede discriminar mezclas de 400 muestras (patologías, expresión) pero el DNA mezclado debe estar bien cuantificado. Se supone que hay la misma cantidad de cada muestra. Si no es así, el genotipaje de la cual añadamos más cantidad estará más representado. Problema: Longitud de información baja comparada con “dideox”. Como máximo evalúa 100pb y en el otro 600-700 pb. Pero ha ofrecido una alternativa al dideox para análisis masivo de DNA.

4.1.4.5. SNPlex Para genotipar simultáneamente 48 SNP’s en una muestra de DNA. En realidad no estamos obligados a hacer un PCR para cada par de primers. Para cada SNP diseño 3 primers; uno en 5’ que comenzará en la posición 3’ del SNP complementario al molde, pero su extremo 3’ será universal. Los otros dos primers tendrán el último nucleótido en 3’; esto es, que uno será complementario al primer alelo, y el otro al segundo.

La discriminación de los dos alelos de un SNP se realiza mediante una ligación específica del alelo (OLA), en la que se utilizan dos oligos con el nucleótido del SNP en el extremo 3’ y un oligonucleotido común que se une a la región adyacente al SNP. Los productos de la ligación se

117 amplifican mediante una reacción de PCR múltiplex, que utiliza como primers las secuencias universales presentes en los oligonucleótidos. Tras la reacción de PCR, los amplicones se hibridan a una mezcla de sondas fluorescentes (sondas ZipChute), complementarias a las secuencias ZipCode (también presentes en los oligonucleótidos, y que muestran movilidades únicas y pre-optimizadas en una electroforesis capilar). La identificación de las sondas ZipCute que han hibridado se realiza en un analizador de DNA y los resultados se analizan con el software GeneMapper. Todas las reacciones se realizan en placas de 384 pozos, genotipándose hasta 48 SNPs simultáneamente en una muestra. Si hacemos esto en 48 muestras, todas tendrán en común las 2 regiones universales, los Zips serán diferentes para los 48 SNP’s.

Homocigoto para C: Los 2 primers se podrán enganchar pero el de A no al último. La ligasa no lo permitirá. Con el PCR se amplificarán las señales de los primers ligados. Pero deberemos saber para cada uno de los 48 qué nt se ha ligado, si “A” o el primer “G”. Ahora sólo será necesario observar las diferentes fluorescencias pero no hay 48 parejas de fluorescencias si no que se combinan con la movilidad electroforética. Veríamos 48 puntitos. Heterocigoto para los 48 SNP’s: Veremos 96 puntitos.

Ventajas: Las 48 sondas utilizadas servirán para cualquier tipo de muestra, humana, animal, etc. Actualmente la plataforma puede producir unos 200,000 genotipos a la semana. Problema: Como hacemos (OLA, ligación) necesitamos grandes cantidades de DNA genómico pero es económico porque podemos genotipar muchas muestras a la vez. Además, las reacciones de ligación entre dos regiones del genoma pueden ser muy discordantes, por ello un 5%, al hacer la reacción de ligación e hibridación, serán SNP’s que no son compatibles entre si.

4.1.4.6. Sistema de Illumina Explicar más sobre las plataformas de ILLUMINA Una alternativa con mucho rendimiento, es la tecnología de Illumina. Esta permite genotipificar muchos SNP’s simultáneamente de la misma muestra. Es una técnica de microarreglo (microesferas unidas a primers de secuencia artificial). Estas microésferas con diversos primers unidos (todos ellos de la misma clase para una bola) se colocan en unos tubos con filtros. Si tenemos 1536 bolas diferentes y en la superficie del arreglo hay unos 30 filtros, los filtros se unen entre si formando fibras más grandes. Cada arreglo engloba 50,000 fibras ópticas por lo que tendremos 90,000 arreglos/mm2.

Figura 4-11. Microarreglos, microbolas que se enganchan los oligos.

Método de genotipaje: Para cada SNP se diseñan tres oligos (dos serán idénticos excepto en el último nucleótido que será complementario 1 a cada variante), una parte de estos primers “forward” será una secuencia universal. El primer que situaremos al 3’ del SNP tiene una región completamentaria

118 al DNA, seguida de una secuencia complementaria a la secuencia de la microesfera bola y una 3ª región que será universal. Con el genómico y el trío de 1,500 oligoelementos haremos PCR, (sólo harán falta los 2 primers hibridados) gracias a las 2 secuencia universales de los P1 y P2. Con una fluorescencia distinta cada uno y un tercer primer que será complementario a la universal de reverso.

Figura 4-12.

Homocigoto: Sólo se amplificará a partir de un primer (una única fluorescencia). ¿Cómo se verá? Hay que pasar el producto amplificado por los filtros con esferas, en función de la secuencia. El que lleve el primer se unirá con unas esferas u otras (será necesario no perder de vista en aquel arreglo en qué la fluorescencia es mayoritaria y el software nos indica el genotipo). Heterocigoto: Veremos dos fluorescencias.

Las Fases: Extensión del alelo específica por PCR. Esto se puede sofisticar en una misma esfera donde se pueden colocar diferentes secuencias, aumentando así el número de SNP’s que se puede genotipificar. Ilumina igual que SNPlex tiene dopantes, es decir, algunos SNP’s que no hibridan correctamente. Utilizando esté aparato se pueden hacer un millón de SNP’s al día. Más recientemente, ha salido un chip de Illumina donde las esferas se colocan de forma distinta.

Ventajas: Es barato ya que salen a unos 0,05-0,10 USD/ SNP que genotipamos y 400 USD por array, pero el equipo es caro. Se considera como técnica muy potente. Problema: Si hay mutaciones alrededor de los SNP’s. Los primers no hibridarán bien y por eso hay algunos que no funcionan.

Comentario [ATF2]: Esta 4.1.4.7. SNP Chips muy difícil de entender Los chips más conocidos los maneja Affimetrix, aunque también existen de otros proveedores. Se colocan oligos de 15 nucleótidos sintetizados en un punto determinado por fotolitografía. Gracias a un láser se pueden colocar muchos oligos por unidad de superficie. Así, se pueden hacer arreglos con decenas de miles de oligos. Son servicios comerciales. Los científicos en los laboratorios sólo deben aislar mRNA, pasar a cDNA, marcar con fluorescencia y dejar hibridar, para ver cuáles de aquellos genes se expresan más o menos.

La técnica no está limitada por el número de oligos, no consiste en una sola hibridación y sólo hace falta una PCR (con primers universales). Método de genotipaje: Se pueden colocar 2 oligos que únicamente varíen por el SNP, pero hay que tener en cuenta que los oligos son cortos y la hibridación podría ser muy sutil. Otra manera, es que, por cada SNP se diseñe un conjunto de oligos diferente, en el que haya 0 missmatch, 1, 2, 3, asegurando así, que en aquel oligo no haya tan sólo una diferencia de un SNP. Entonces, se puede obtener un patrón de intensidad de hibridación dependiente del genotipo de la muestra. La máquina interpretará este patrón (gracias a que en esta técnica no hay limitación de espacio) y nos dirá cuál es el genotipo. Actualmente se cuenta con un GeneChip para 100,000 SNP.

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Figura. 4-13. SNP-Chip-Based Genome-Wide Analysis www.hematology.org/publications/hematologist http://www.mun.ca/biology/scarr/DNA_Chips.html

Es necesario fraccionar el DNA genómico (a partir de 250 ng de buena calidad) y unir adaptadores en cada extremo. Se hace un PCR universal y se rescata la región de interés; después estos se vuelven a fragmentar y se marcarán con fluorescencia. Al hacer PCR, sólo los fragmentos pequeños amplificarán bien (reducción de complejidad). Para prevenir esto, se pueden prever los tamaños de la restricción, haciendo esta, in silico, es decir, en programas especializados. De esta manera, se asegura que el SNP quede en un fragmento de longitud adecuada Ya han salido al mercado chips que genotipifican todas las mutaciones conocidas por ciertos genes en específico, por ejemplo, el gen CYP2C19 y CYP2D6 en los humanos. Estos genes están relacionados con el metabolismo de fármacos y su estudio ha permitido reducir en un 20% los efectos adversos.

Método MIP (Universal): por cada SNP se diseña una sonda (oligo muy largo, en 5’ y 3’ con regiones complementarias a las regiones flanqueantes del SNP a genotipificar). Cuando la sonda híbrida forma un semicírculo, dejando un espacio libre (SNP a analizar), el cual se rellena con nucleótidos (todos con fluorescencias distintas). Se usa la enzima exonucleasa. La secuencia semicírculo tiene dianas. Las secuencias adyacentes son conocidas y entonces, se puede diseñar el primer, abrir el círculo y amplificar por PCR. Con el producto diseñamos un chip donde introduciremos la secuencia del oligo. El producto de la PCR hibridará y se podrá observar la fluorescencia. En estas sondas del chip no serán complementarias al SNP, sino a la secuencia bioinformática generada (diferente para cada sonda MIP, color verde). Si diseñamos 12,000 sondas con 12,000 secuencias bioinformáticas, en función del SNP que queramos analizar le añadiremos una región roja a otra, así que el chip no tan sólo valdrá para humanos sino para cualquier especie. Tenemos cuatro tubos (cada uno con un círculo no cerrado). En el primero añadimos (A), en el segundo (C) no marcados. Entonces amplificaremos por PCR.

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Homocigoto: Sólo habrá amplificación en un tubo si es homocigoto, en dos si es heterocigoto. Para discriminar esto, en función de qué fluorescencia se esté amplificando. Como nosotros ya sabemos si el SNP está entre A y C, sólo se usan 2 fluorescencias. Dispondremos del mismo primer marcado con fluorescencias diferentes que se unirá, y en el chip las sondas serán complementarias a estos primers.

Ventajas: Podemos diseñar sondas diferentes que tan solo difieran de la región flanqueante por el SNP pero manteniendo el mismo blanco de ER y secuencia flanqueante a la diana. Los arreglos no poseen oligos específicos de los SNPs. Problema: Se vio que marcar cada nucleótido con una fluorescencia no era eficiente. Ahora las sondas que se añaden para hacer PCR tienen marcaje fluorescente.

4.1.4.8. Espectrometría de masas (MALDI-TOF) Se coloca una microgota con DNA en un chip. Por lo regular se usa una solución de algún compuesto que absorba la energía láser como el acido fórmico (matriz). El chip se expone al vacío y con la energía de un rayo láser se volatiliza y se ionizan las moléculas. De ahí el nombre de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI). Las moléculas con cargas eléctricas positivas o negativas puedan ser aceleradas hacia al detector de masas. Ahí son clasificadas en un espectrómetro de masas por su tiempo de vuelo, Time of Flight (MS-TOF). Con el mismo campo eléctrico aplicado a moléculas con diferente masa, se generan diferentes aceleraciones o velocidades, y esto se mide por el tiempo que tardan en recorrer la longitud del detector. Los dos trozos de DNA de igual longitud pero con un nucleótido diferente, tendrán una masa diferente, y por tanto, diferente tiempo de vuelo.

Ventajas: Analiza fragmentos amplificados por PCR Problema: El equipo de MALDI-TOF es costoso, y además no todos los modelos de MALDI- TOF se pueden manejar de manera automática, ya que muchos necesitan la interacción manual del usuario para apuntar el láser en el punto correcto.

4.2. Técnicas de comparación genómica 4.2.1. Differential Display (DD)

Por medio de esta técnica se comparan genes de expresión diferencial. Es parecida a los AFLPs, pero en lugar de partir de DNA genómico, se inicia con RNA, que se transcribe a cDNA usando un oligodT con nucleótidos específicos adicionales. Se buscan bandas de marcadores que distingan a las variedades. Con esta técnica se encuentran genes con expresión diferencial entre dos muestras.

Tarea 4-6 Lea el siguiente texto en ingles. Con base en ese texto, explique ahora con sus propias palabras en español como funciona la técnica de diferential display.

Differential Display allows rapid, accurate and sensitive detection of altered gene expression (Liang, P. and A.B. Pardee. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction, Science 257, 967-971). The mRNA Differential Display technology works by systematic amplification of the 3' terminal portions of mRNAs and resolution of those fragments on a DNA sequencing gel. Using anchored primers designed to bind to the 5' boundary of the poly-A tails for the reverse transcription, followed by PCR amplification with additional upstream primers of arbitrary sequences, mRNA sub-populations are visualized by denaturing polyacrylamide electrophoresis (See schematic illustration of differential display). This allows direct side-by-side comparison of most of the mRNAs between

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or among related cells. The differential display method is thus far unique in its potential to visualize all the expressed genes in a eukaryotic cell in a systematic and sequence-dependent manner by using multiple primer combinations. More importantly, the new method enables the recovery of sequence information and the development of probes to isolate their cDNA and genomic DNA for further molecular and functional characterizations. Because of its simplicity, sensitivity, and reproducibility, the mRNA Differential Display method is finding wide-ranging and rapid applications in developmental biology, cancer research, neuroscience, pathology, endocrinology, plant physiology, and many other fields.

Ejemplo: Se parte de una extracción de mRNA que se pasa a cDNA vía RT-PCR. Para ello se usan primers aleatorios de secuencia corta (decámeros) junto con un primer de oligodT12MN, y se le agrega la transcriptasa reversa. De cada muestra se hacen cuatro alícuotas, y como primer se usa un oligodT12 con dos nucleótidos extras como la G. Sólo las moléculas que tengan dos C (complementarias de las dos G) antes de la cola poliA serán eficientemente transcritas. En la primera alícuota estará pasando de los RNAs a cDNA que antes tengan C, en las otras alícuotas se usan otros primers con un nucleótido adicional G, A o T. Todo esto se hace con las dos muestras en paralelo.

Las moléculas de RNA que estén en A y B se transcribirán en los 2 tubos. Una vez hecho esto, para cada una de las tres parejas de tubos se hace una amplificación y se usa un oligo de secuencia aleatoria de 10 nucleótidos. Se hacen geles y se analizan bandas que estén en A y no en B o viceversa. Esto se repite con más primers aleatorios y con todas las alícuotas. Se recomienda usar geles de poliacrilamida para poder ver bien las bandas. La separación eficiente de fragmentos es necesaria para distinguir las bandas de interés. También cabe decir, que está técnica nos puede indicar, no tan sólo genes que se expresan en uno y en el otro, sino también genes que se expresan más en A que en B o a la inversa. Toda banda candidata se puede recortar del gen y ser verificada usando técnicas convencionales como northern, RT-PCR. Es una técnica de arreglos para pobres, porque un chip de expresión es muy caro.

Ventajas: Permite comparación múltiple de las muestras y permite partir de pequeñas cantidades de RNA que vendrán limitadas por las alícuotas necesarias. También permite identificar fragmentos génicos aumentando o disminuyendo la regulación. Esta técnica puede dar pistas sobre genes que están expresados diferencialmente entre muestras mediante la intensidad de la banda (técnica cualitativa). Problema: Falsos positivos, por lo que se recomienda hacerlo por duplicado.

4.2.2. Representational Diference Analysis (RDA)

La técnica de RDA, permite comparar muestras de dos genomas e identificar regiones que presentan diferencias entre ellas. Se llama así, porque se usa exclusivamente una fracción del DNA (representativo). Antes de hacer el PCR, se hace una substracción por hibridación con un DNA tester. Esto permite amplificar la fracción del DNA que tiene los adaptadores correctos. Se ha usado para comparar DNA de tejido tumoral con DNA del mismo paciente de tejido sano.

Lisitsyn N, Lisitsyn N, Wigler M. (1993), cloning the differences between two complex genomes. Science, 259, 946-951

Metodológicamente, la técnica se basa en hibridación substractiva de ácidos nucleicos. Se tienen 2 DNA’s, uno es el DNA prueba o tester (en el que se pretende identificar las diferencias), el otro es el driver (o DNA de referencia). Inicialmente, ambos DNA son digeridos y ligados a adaptadores. Los adaptadores del tester tienen que ser diferentes a los del driver (aunque los 2 DNAs hayan sido preparados con la misma enzima de restricción). Así pues, en el tester habrá algún fragmento que no se encuentre en el driver, o al revés. Por esto se recomienda hacerlo en

122 paralelo y que en uno, el primer caso el tester sea tester y en el otro el tester pase a ser el driver. Como digerimos con la misma enzima de restricción, la mayoría de fragmentos tienen una longitud promedio similar. No es recomendable usar enzimas que corten con frecuencias diferentes. Representational Difference Analysis RDA Tester Driver (exceso) Extracción de ADN

Restricción

PCR (selección del tamaño del fragmento 150- 1500bp)

Adaptadores Hibridación sustractiva * ** * + * * Desnaturalización Alineación * * * * * PCR * * * * Crecimiento* Crecimiento Sin producto exponencial lineal Figura 4-14. Representational Diffrerence analysis (RDA).

Si el DNA viene del mismo individuo no habrá polimorfismos de restricción, pero si los driver y tester son de individuos diferentes, sí que podremos obtener fragmentos de diferente tamaño, porque puede haber polimorfismos de restricción. No solamente habrá deleciones e inserciones que nos podemos encontrar si son del mismo individuo. Después de poner adaptadores, se tiene el driver en exceso, por lo que habrá hibridación entre la cadena sencilla del driver y la cadena sencilla del tester. Si el fragmento está en las dos muestras, es más probable que hibride el driver con el tester que el tester con él mismo, porque el driver está en exceso. Como resultado, los fragmentos que solo están en el tester no encontrarán ninguna cadena driver complementaria, y por tanto volverán a hibridar con su cadena complementaria. Esto implica que aquellos fragmentos de tester-tester son los que no están presentes en el driver.

Se hace un PCR con primers complementarios a los adaptadores del tester, de tal manera que sólo estos amplifican de manera exponencial. Cabe decir que puede ser que un fragmento que esté en los dos se haya colado porque haya vuelto a hibridarse con tester en lugar de driver. Por eso es que la hibridación substractiva y el PCR se tienen que repetir varias veces. Después se corren las bandas en geles, se recortan y se mandan secuenciar. Seguro que habrá una fracción del genoma que no será amplificable por PCR debido a que los fragmentos son más grandes de la cuenta, por lo que se recomienda digerir el DNA con diferentes enzimas.

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Ventajas: Es una técnica potente. Problema: Muchos falsos positivos, pero se pueden disminuir haciendo alícuotas del producto de PCR y hibridarla otra vez con un exceso de DNA driver, porque así descartamos las posibles moléculas que han hibridado y que también están presentes en el DNA driver.

SSH Es equivalente a la RDA, pero a diferencia de este, se parte de RNA y no sobre DNA genómico. También se habla de tester y driver. En esta técnica se tienen 2 alícuotas diferentes de tester, cada una con adaptadores de secuencias diferentes. Al driver no se le liga ningún adaptador. Se desnaturalizan las muestras y se hibrida el tester A y B con exceso de driver en diferentes tubos. Después se juntan ambos tubos, se desnaturalizan y se vuelven a hibridar. De todas las moléculas que se formen, interesarán aquellas que contengan una cadena de tester A con 1 cadena de tester B. Si ahora se hace PCR, en estos dos tubos, aquellos tester que no estén presentes en los drivers, no hibridarán con ellos y quedarán en forma de cadena sencilla, de tal manera, que si juntamos los dos tubos e hibridamos de nuevo, el tester de los dos tubos que no habían hibridado, hibridarán entre ellos y los que estaban hibridados. Finalmente se hace PCR con un primer complementario al adaptador A y otro al B, para que sólo se amplifique el tester A+B.

Ventajas: Resultados normalizados, se amplifica cDNA expuesto diferenciado, pequeñas cantidades de RNA. Problema: Expresión diferencial no cuantitativa.

4.2.3. Genome Missmatch Scanning (GMS) A veces interesa encontrar fragmentos de DNA comparables para dos muestras, y que los hayan heredado de los antecesores. El objetivo de esta técnica es encontrar secuencias idénticas de DNA.

Se debe analizar el pedigrí y cuatro o cinco generaciones atrás encontará al individuo afectado. Probablemente pensemos que han recibido del antepasado ese fragmento de DNA. Así que se necesita una técnica que permita identificar los fragmentos de DNA que estos dos hijos tengan en común (fragmentos iguales,) candidatos de la enfermedad y que por lo tanto, habrán Comentario [ATF3]: No hay heredado. Además este fragmento compartido no tendrá que tener SNP’s porque tan sólo han contexto pasado tres o cuatro generaciones, lo que se considera poco para que surjan SNP’s. Se Quiere una colección de fragmentos de identidad por descendiente, identity by descent (IBD) que no presenten cambios nucleotídicos. El GMS descarta secuencias con nucleótidos diferentes y se queda con las secuencias iguales (Griffiths, et al. 2004)

Se parte de dos DNA genómicos (A y B), de los cuales, uno sera metilado y el otro no (tan solo tendrá dos moléculas de DNA genómico metiladas las regiones normales). Enseguida, se utilizan enzimas de restricción como PstI (que puede corta tanto secuencias hipermetiladas como no) se Mezclan las 2 digestiones, se desnaturaliza y se renaturaliza, del tal manera que se hibride el DNA A con DNA B. Puesto que nos interesan los DNA mixtos (pero moléculas de igual secuencia), se debe descartar los homohíbridos. ¿Cómo lo hacemos? Aprovechando el mismo grado de metilación que tienen los homohíbridos. Se digiere con DpnI (reconoce cuatro nucleótidos y sólo corta cuando las dos cadenas están metiladas) y MboI (reconoce la misma secuencia que DnpI y corta las dos cadenas cuando no hay metilación). Usando estas dos enzimas digeriremos homohíbridos (las enzimas de restricción no se usan, porque son de mayor frecuencia de corte). Los heterohíbridos que no presenten ningún cambio de nucleótidos no se cortarán eficientemente, ni por una enzima ni por la otra y quedarán en un tamaño mayor, por lo que serán moléculas candidatas a ser responsables de esa característica fenotípica. Ahora se

124 compara cuales no presentan missmatch de estas moléculas grandes (missmatch = no IBD)1. ¿Cómo haremos está discriminación? Si se incuba los heterohíbridos con enzimas de reparación estos buscarán missmatch, si lo encuentran harán nicks en la molécula, y por tanto, si después de hacer esto quedan fragmentos largos, estos serán candidatos a ser el heterohíbrido sin missmatch. Después hará falta recuperar estas moléculas de doble cadena grandes que serán candidatas a ser IBD.

4.3. Ejemplos de aplicaciones 4.3.1. Demostración de Pedigrí Anteriormente, las pruebas de descendencia (entre ellas las de paternidad) se hacían con marcadores microsatélites, pero ahora se está utilizando más los SNP’s. Los microsatélites tienen un grado de polimorfismo mas elevado que los SNPs. Con 8 microsatélites es suficiente para discriminar un individuo en las pruebas de paternidad. Se necesitan más de 40 SNPs para lograr una discriminación con el mismo grado de confiabilidad.

Pruebas de paternidad con microsatélites: Algunos laboratorios recomiendan usar un par concreto de marcadores, para que todo el mundo los haga igual. Suelen ser paneles de 12 marcadores. Cuando se hace la prueba de paternidad y se compara el par padre-hijo, no se puede hacer la exclusión de paternidad solo por un microsatélite que no coincida, como mínimo hacen falta 2. Si medimos 12 microsatélites y sólo sale 1 diferente, ampliaremos la batería de marcadores a comparar hasta 16. La pregunta es: si realmente el individuo es del padre ¿Cómo puede ser que el microsatélite no coincida? Porque hubo mutación en la línea germinal (P= 10-4). Hay microsatélites en donde la tasa de mutación es más elevada que las ordinarias. Cuando la DNA polimerasa se encuentra con repeticiones puede haber un deslizamiento en la replicación, lo que no será reconocido por los sistemas de reparación. Los sistemas de reparación de la célula si reconocen una mutación de SNP y en la mayoría de los casos la reparan. Por eso hay una tasa de mutación más elevada en los microsatélites que en los SNPs.

Criterios de selección de microsatélites: Cuando elegimos marcadores para hacer pruebas de paternidad, se escogen estos de algunas listas estándares. Por ejemplo, para animales se usa la de la Internacional Society of Animal Genetics (ISAG). Esta tiene unos 32. Los criterios que se siguen para la selección de marcadores de DNA son: • Que no den problemas de lectura. • Puedan amplificar en múltiplex. • Evitar aquellos que tengan alelos nulos. Estos son individuos que tienen mutación justo donde se empareja el primer, que no tiene nada que ver con el microsatélite. Si el individuo es Aa y pasa esto, uno de los 2 alelos no amplifica y el otro sí: pensaremos que es (AA) y en realidad es (Aa). • Evitar utilizar marcadores demasiado cercanos en un mismo cromosoma. • Tratar de que tengan segregación independiente.

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4.4. Haplotipos 4.4.1. Desequilibrio por ligamiento Un haplotipo es un conjunto de alelos ligados por su proximidad en un cromosoma. Los genes que están en loci cercanos (menos de 5 centimorgans) se heredan en bloque ya que son pocas las recombinaciones que se realizan entre ellos. A mayor distancia física entre los genes, mayor tasa de recombinación. El término de haplotipo se emplea para referirse a ese bloque de polimorfismos ligados. Por ejemplo, si los abuelos paternos tienen el haplotipo ABCDEF mientras que los abuelos maternos tienen el haplotipo abcdef, los nietos tendrán uno de esos dos haplotipos. Serán muy pocas las veces en que los nietos tengan un haplotipo combinado tipo abcDEF o ABCdef. Solo cuando las distancias entre los genes son mayores a 10 centimorgans es cuando se da un desligamiento entre genes. En inglés a esto se le llama linkage disequilibrium. Al estudiar un trozo de DNA, secuenciarlo y alinearlo con una secuencia referencia encontramos varias posiciones polimórficas. Cada una de estas combinaciones de polimorfismos ligados recibe el nombre de haplotipo. En una escala de tiempo evolutiva, los haplotipos se rompen en los alelos individuales que los conforman, por lo que decimos que se heredan de forma independiente e individual. Sin embargo, en escalas de tiempo cortas (menos de 20 generaciones) los polimorfismos se agrupan en haplotipos.

Tarea 4-7 Un mejorador hizo una cruza entre dos padres, después autofecundo la F1 y la F2 para generar una población segregante de familias F3. Usando esa población genotipeo las diferentes líneas para 3 genes de interés. Los alelos que detecto eran: Gen 1: A y a. Gen 2: B y b, Gen 3: C y c. Obtuvo los siguientes resultados: a b c a B C A b c A b c A b c A b c A B C a b c a B C A b c A b c A b c A b c A B C A B C a B C a B C a b c A b c A b c A B c A b c a b c A B C A B C a b c A b c A B C

En la tabla anterior cada celda representa el genotipo de un individuo de esa población. Un padre tenía el genotipo ABC y el otro padre el genotipo abc. Calcule las distancias genéticas entre los diferentes genes A, B y C en unidades centimorgan.

4.4.2. Proyecto HapMap El proyecto HapMap fue Iniciado en 2002 con el objetivo de describir las variaciones en la secuencia de DNA de la población humana. Debido a que estas variaciones se dan en bloques, la meta entonces es definir los diferentes haplotipos del genoma humano y de esta forma facilitar el estudio de algunas enfermedades.

Al secuenciar cromosomas de diferentes personas se encontró que en ciertas regiones de genoma humano había combinaciones de SNP’s que son más frecuentes que otras. Esto se debe al ligamiento de secuencias de DNA que están muy cercanas y que casi siempre se heredan en grupo. Es decir, los genes no se segregan cada uno independientemente, sino que en bloques. Un haplotipo es un conjunto de polimorfismos que se conservan juntos aún después de muchas generaciones. Por lo regular, un haplotipo abarca de 10 a 1000 genes.

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¿Cuántos SNP’s son suficientes para darnos información de los diferentes haplotipos? No hace falta genotipar todos los polimorfismos: analizando tan sólo 3 SNP’s podremos determinar cuál de los haplotipos tenemos.

4.5. Pros y contras de las herramientas moleculares 4.5.1. Ventajas de las herramientas moleculares

4.5.1.1. Rapidez El uso de marcadores moleculares se traduce en una rapidez mucho mayor en comparación con los métodos convencionales. Por ejemplo, con marcadores moleculares se pueden lograr la introgresión por retrocruza de un gen en tan solo 3 ó 4 generaciones, mientras que con el método sin marcadores esto mismo llevaría hasta 6 ú 8 generaciones. Esta rapidez en muy importante para las compañías de semillas, y es por eso que no es de sorprender que las empresas privadas como Monsanto o Pioneer usen los marcadores moleculares muchísimo más que las instituciones de investigación pública como el INIFAP o la Universidad Antonio Narro. Mismo en una institución internacional de mejoramiento como el CIMMYT los marcadores moleculares sólo se usan en casos especiales y de manera esporádica, muy lejos de la rutina masiva que usan las compañías semilleras de maíz. Time is money. Muchas veces los investigadores no tienen mucho dinero de fuentes de financiamiento generosas, y es por que eso que suelen tardarse un poco más para lograr las mismas metas de mejoramiento en comparación con sus colegas en las empresas.

4.5.1.2. Alta heredabilidad Los marcadores moleculares ofrecen la oportunidad de obtener información de manera más precisa que al medir el fenotipo. El fenotipo es muy variable, ya que depende del ambiente y del estado de desarrollo. Si decimos que el genotipo es una información digital con valores discretos (A, T, G o C), el fenotipo es información análoga con valores continuos que dependen de muchos otros factores y circunstancias. Un marcador molecular por consiguiente, tiene un valor de heredabilidad máximo (cercano a 100%), ya que toda la varianza se debe al polimorfismo y no hay influencia del ambiente. En cambio, el fenotipo puede tener una heredabilidad mucho más baja, por ejemplo el rendimiento de grano bajo sequía suele tener una heredabilidad de menos de 30%.

La heredabilidad es un término que se usa para describir la proporción de la varianza que puede atribuirse a los genotipos, en relación con la varianza fenotípica total, que incluye la varianza ambiental, y el error residual. La heredabilidad puede también entenderse como “repetibilidad” de la medición del carácter de interés, en nuestro caso, el rendimiento de grano bajo sequía. 4.5.2. Limitaciones de las herramientas moleculares

4.5.2.1. Costos Un argumento muy válido en contra de los marcadores moleculares es que actualmente los costos son demasiado altos. Muchas veces, su uso no se justifica por simples razones económicas. Las herramientas moleculares pueden requerir una inversión inicial muy elevada y un costo de operación muy alta, lo que impide su uso de manera general para todos los cultivos y todas las características. La inversión inicial implica la compra de equipos sofisticados de secuenciación o de genotipaje, que en la mayoría de los casos cuestan más de dos cientos mil

127 dólares. También se requiere de personal calificado y entrenado, ya que las metodologías no son tan fáciles y no siempre funcionan a la primera. El costo por datapoint de los marcadores moleculares puede ser de 3 a 10 dólares, lo que es mucho más caro que sembrar varios genotipos en el campo para evaluarlos. Muy pocas instituciones públicas aplican rutinariamente los marcadores moleculares para el mejoramiento genético. El uso de los marcadores moleculares únicamente se justifica en algunos casos en que las metodologías tradicionales no han funcionado muy bien, o cuando la velocidad es lo mas crítico y el costo no importa tanto (p. ej. empresas de semillas transnacionales). Uno de los retos más grandes para el futuro es desarrollar metodologías que sean mucho más económicas y eficientes. Para que valgan la pena, los costos tendrían que bajar entre dos a tres órdenes de magnitud.

4.5.2.2. Escepticismo de los mejoradores clásicos Algunos genetistas clásicos piensan que no es necesario utilizar las herramientas moleculares modernas. Su justificación es que con sus técnicas clásicas han conseguido incrementar la producción sin ninguna necesidad de secuenciar el DNA o usar la información genómica. El éxito histórico del mejoramiento clásico, así como los resultados contundentes que obtienen de forma continua les da la razón. En promedio, el avance genético que se ha obtenido en el mejoramiento de maíz es de 10% por década aproximadamente. Sin embargo, se debe tener en cuenta que no en todos los caracteres se ha conseguido lo mismo, y que en algunos casos, el progreso genético se podría acelerar al usar la información molecular. Es decir, hoy en día no solo importa el resultado, sino también la velocidad y la eficiencia. Todavía no existen muchos casos documentados que demuestren que con marcadores moleculares se logró un progreso genético mas rápido y mas eficiente que sin los marcadores. La eficiencia hay que medirla en términos de una relación de costo-beneficio. Pocos fitomejoradores han dicho que ahorraron dinero por usar marcadores. Por otro lado, si hay varios que han invertido bastante dinero en marcadores sin realmente tener muchos beneficios en términos genéticos. Actualmente se están realizando estudios comparativos para demostrar la superioridad de los marcadores, pero todavía no hay mucha evidencia publicada. Hay que recordar que los marcadores moleculares se propusieron hace mas de dos décadas, y sin embargo, hasta la fecha no han dado tan buenos resultados como muchos investigadores prometieron desde el inicio.

Algunos piensan que todavía es cuestión de tiempo demostrar que los marcadores funcionan eficientemente en la práctica de un fitomejorador de campo. Otros piensan que todo lo molecular suena muy bonito e interesante en teoría, pero que ya en la práctica es muy diferente. Algunos han llegado a pensar que los marcadores son una promesa que se quedará en los laboratorios pero que nunca llegará realmente a tener impacto en el campo. Las opiniones varían según las experiencias de los grupos y la participación de las instituciones.

Una de las limitantes más grandes de la aplicación de los marcadores es la brecha tan grande que existe entre los científicos y los diferentes usuarios. Por lo regular los fitomejoradores trabajan solo en el campo, mientras que los investigadores lo hacen en el laboratorio. Existen muy pocos investigadores que realmente sepan hacer bien las dos cosas: hacer ensayos de campo con evaluaciones fenotípicas por un lado, y por otro lado hacer experimentos de laboratorio y análisis bioquímicos o moleculares. Son actividades que requieren de diferentes destrezas. Hay muy pocas personas con vocación y talento en las dos áreas.

Muchas veces, los dos grupos se echan mutuamente la culpa. Es típico escuchar de algunos investigadores que dicen que los fitomejoradores no hacen caso de los descubrimientos que ellos han publicado en las revistas. Por otro lado, algunos fitomejoradores dicen que los agricultores no se van a comer el papel de las publicaciones. Otros piensan que los moleculares viven encerrados en sus laboratorios y que no saben realmente de que están hablando cuando se trata de los problemas del campo. Es muy fácil hacer promesas en teoría, pero no es tan sencillo cumplirlas en la realidad. Algunos dicen que a partir de un genoma

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secuenciado ya automáticamente se pueden generar mejores variedades. Otros piensan que el desarrollo de toda la tecnología de secuenciación de los últimos 20 años fue una tarea relativamente sencilla, comparado con el grandísimo reto de generar variedades mejoradas a partir de la información de una secuencia.

“Es un camino mucho más largo y sinuoso… la del gen a la semilla, de la semilla al campo, y del campo al plato, que del modelo de la doble hélice de Crick al genoma secuenciado de Watson” Cita anónima

Nunca sabremos quien tiene más razón, ni se trata de eso. Lo que si es verdad es que se necesitan más personas calificadas en los dos temas, agrícolas y moleculares, para que un ejército de estudiantes jóvenes, motivados y capacitados se conviertan en verdaderos puentes de unión, para que lleven los logros de la ciencia de vanguardia a todos los rincones del medio rural. Sin esos jóvenes y sin esa educación de calidad, todos los sueños de la biotecnología agrícola se quedarán solo en papel.

4.5.2.3. El vínculo entre el laboratorio y el campo Hay muchos científicos que saben hacer PCR. Hay otros que saben tomar datos agronómicos. Sin embargo, no existen muchos científicos que quieran hacer las dos cosas, aislar un gen y calificar mazorcas. Hay muchos estudiantes que prefieren ponerse la bata y los guantes, y muchos mas los que deciden ponerse las botas y el sombrero para trabajar bajo el sol. Hay muy pocos que saber hacer las dos cosas. Y mucho menos los que realmente son buenos en las dos áreas. Necesitamos más científicos que puedan publicar en las más altas revistas científicas, y a su vez estén generando semilla mejorada de alguna variedad vegetal.

Pareciera que existie una barrera psicológica entre los científicos y los mejoradores que evita que los dos se complementen de una manera eficiente. Por un lado los científicos reclaman: “es que los mejoradores no aplican nuestros conocimientos sobre el ADN”. Por otro lado los agrónomos contestan: “es que los científicos investigan lo que les interesa a ellos. Después de graduar y publicar, ya no se esfuerzan en aterrizar las cosas”. A su vez los científicos responden “yo publico en revistas para que los demás lean mis artículos y apliquen el conocimiento”. El problema es que a veces no hay gente capacitada para hacerlo, y otras veces, los resultados que se generaron son demasiado costosos para una aplicación de campo. Los científicos se guían por el interés y se motivan por la curiosidad de responder preguntas, mientras que los mejoradores se guían por la necesidad y la urgencia de resolver problemas. Un científico busca contestar las preguntas de una manera novedosa, mientras que un mejorador trata de resolver un problema de la manera más rápida y con el menor costo posible. Si un científico no responde la pregunta inicial, no importa porque habrá aprendido mucho, y tal vez haya contestado muchas otras preguntas muy interesantes. Si un mejorador no logra su objetivo de incrementar el rendimiento, o la calidad, entonces ha fracasado. Es decir, la eficacia y la eficiencia son parámetros primordiales para el mejorador, mientras que para el científico no tanto. Un ejemplo muy característico son los marcadores moleculares. Se pueden realizar estudios sofisticados sobre la función de los genes para identificar QTLs y generar marcadores moleculares. Eso se puede publicar muy bien. Sin embargo, muy pocas veces resulta útil esa información para el mejoramiento en términos prácticos, debido a que los QTLs son específicos de las poblaciones experimentales que se utilizaron, y por lo regular no aplican para las generaciones mas avanzadas de los materiales elite de los mejoradores. La complejidad de algunas características, como el rendimiento de grano bajo sequía, es tal que resulta muy poco eficaz utilizar marcadores para un gen que solo contribuye con menos del 1% de la variabilidad genética. Además, todo se complica aun más, con los fenómenos de heterosis, epistasis, interacción genotipo-ambiente, etc. Bajo esas circunstancias resulta mucho más rápido, barato y eficaz confiar en un buen fenotipeo y un análisis bioquímico, que gastar demasiados recursos en el genotipeo y selección por marcadores. En teoría, los marcadores suenan muy bien, pero ya en la práctica resultan más costosos y menos confiables para lograr los objetivos de mejoramiento deseados. En teoría, la secuenciación de un genoma es una noticia fabulosa, pero en la práctica, no se necesita tanto esa información. Más serviría desarrollar protocolos

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de fenotipeo más eficientes, confiables y baratos. Sin embargo, no hay suficiente dinero, ni apoyo para esos trabajos, ni tampoco hay recursos humanos capacitados.

Hoy en día es muy fácil secuenciar miles de genes. Lo que es difícil es encontrar la forma de aprovechar la información nucleotídica para generar una variedad mejorada. Lo que se necesita es una oleada de estudiantes inteligentes y motivados para que se pongan a trabajar en esos temas para que resuelvan los problemas que están pendientes. Lo que se requiere es formar un ejército de futuros fitomejoradores para que trabajen con los diversos cultivos, y se enfoquen en desarrollar variedades adaptadas para los diferentes suelos, climas y ambientes. Sólo así se lograrán avances significativos para satisfacer las necesidades de los agricultores y los consumidores.

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5. Genómica y regulación 5.1. Antecedentes de la genómica La genómica surgió en 1990 con el proyecto del genoma humano (HUGO). El objetivo era caracterizar todos los genes de la especie humana. Se sabía que algunas mutaciones en determinados genes eran responsables de algunas enfermedades o padecimientos. Debido a que los genes solo representan una pequeña parte del genoma, secuenciar todo el DNA, incluyendo los fragmentos repetitivos, implicaba un gran esfuerzo de tiempo y dinero. El interés de curar y diagnosticar algunas de estas enfermedades fue lo que finalmente movilizó los recursos financieros para lograrlo. El objetivo era obtener tanto el mapa genético, como el mapa físico y la secuencia de DNA. Se redujeron los costos y aumentó la velocidad de secuenciación.

Después de HUGO se trataron de incluir a muchas más especies diferentes. Se introdujo el concepto de especies modelo. El primer genoma bacteriano secuenciado fue el de Haemophilus influenzae. En 1996 se secuenció la levadura Saccharamyces cerevisiea. Este fue el primer eucariota secuenciado con 6,000 genes. En el 1998 se secuenció un nemátodo (Caenorhabditis elegans) que ya posee diferenciación celular. En el 2001 se publicó el genoma de Arabidopsis con 23 mil genes. Entre los genomas secuenciados figuran los cloroplastos, las mitocondrias de mamíferos, diferentes organismos de laboratorio como levaduras, nematodos, la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster la planta Arabidopsis thaliana, el ratón, Mus musculus. También se han secuenciado una gran variedad de patógenos, como las bacterias causantes del cólera, la tuberculosis, la sífilis, la gonorrea, la enfermedad de Lyme, el virus de la viruela y el del mal de Epstein-Barr. Con la conclusión de estos y muchos otros proyectos genomas se espera lograr una mejor comprensión sobre el mecanismo de acción de los organismos patógenos, para disminuir su virulencia, o lograr erradicarlos.

Los proyectos genómicos se pueden dividir en tres fases: • Genómica estructural: Es una caracterización física. Por ejemplo ¿qué tamaño?, ¿cuántos cromosomas?, ¿cuántos genes?, ¿cuántas secuencias repetitivas? Se desarrollan mapas genéticos, mapas físicos, BACs, marcadores, se averigua como están organizados los genes en clusters, centrómeros, telómeros, bandeo, etc. • Secuenciación: Es la determinación del orden de las letras del DNA. Esto incluye la secuenciación (ya sea por Sanger, Pirosecuenciación, Solid o Solexa), el ensamblado bioinformático en contigs y almacenaje de las secuencias en bases de datos. La secuenciación se puede hacer en fragmentos por azar (método shot-gun) o de manera organizada por YACs, BACs o contigs (método tradicional). • Genómica funcional: Ya una vez que se tiene la secuencia, se tienen que identificar los genes (exones e intrones), y después anotar las proteínas con sus respectivas secuencias regulatorias. Después se debe de determinar la función de cada gen por medio de mutantes, transgénicos, expresión heteróloga, etc. Finalmente se pretende entender la función de cada uno de los elementos del genoma (promotor, gen, etc.).

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Figuras 5-1. Yeast Artificial Chromosomes. PYAC con DNA blanco 5.2. Estrategias de ensamblaje genómico Para la secuenciación de un genoma de manera tradicional, primero se tienen que obtener clonas que estén ordenadas dentro de un mapa físico. Primero necesitamos tener el genoma clonado en forma redundante en cromosomas artificiales. Después, necesitamos obtener un mapa físico preferentemente de traslape mínimo, “minimum tilling” y finalmente, necesitamos obtener la secuencia de cada uno de los clones elegidos. Otra forma es buscando los pasos apropiados “chromosome walking”. Comenzando con un clon, se clona solamente un extremo y se busca en la biblioteca otro(s) que traslapen. Este proceso se repite, avanzando “pasos” en el cromosoma.

Los mapas de restricción de los vectores son una alternativa al “Chromosome walking”. Se pueden hacer mapas de restricción de los vectores para identificar secciones parcialmente traslapadas. Con ello se puede ordenar la biblioteca de manera que se obtengan grupos traslapados que pertenezcan al mismo cromosoma.

Los vectores son plásmidos, microcromosomas bacterianos. Sus principales características es que tienen un origen de replicación y son estables, es decir deben poseer secuencias que permitan su propagación dentro de una célula bacteriana. Los vectores tienen sitios específicos para insertar el DNA a clonar y sitios con secuencias únicas para varias enzimas de restricción. Los vectores también deben tener marcadores de selección; que confieren propiedades fenotípicas que permiten seleccionar a los portadores. Se tiene varios tipos de vectores clonados, tales como: a) Plásmidos; cuyo límite de clonación es de 0.1 a 10 kb. b) Fagos; derivados del bacteriófago lambda, de 8 a 20 kb. c) Cósmidos; combinación de fago I y plásmido, de 35 a 50 kb d) BAC: por sus siglas en inglés Bacterial Artificial Chromosome, derivado de plásmido F (plásmidos de fertilidad) de E. coli, que interviene en el control de la replicación. El sitio de clonación en el gen LacZ (selección azul/blanca). Su transformación es por electroporación. De 75 a 300kb. e) Vectores derivados de bacteriofago P1; de 100 kb. f) YAC; por las siglas en inglés, Yeast Artificial Chromosome. Cromosoma artificial de levadura, Hablaremos un poco más de los YACs. Son segmentos largos (más de 100 kb), se ligan con los dos brazos, y cada brazo termina con un telómero de hongo, de manera que el producto puede ser estabilizado en la célula fúngica. Los YACs más largos son también más estables. Los

132 brazos tiene una secuencia de replicación autónoma (ARS), un centrómero (CEN) y un marcador de selección ( trp1), el otro brazo tiene otro marcador de selección (ura3) esto asegura que la célula ha recibido un cromosoma artificial con ambos telómeros, dada la complementariedad de los mutantes, y el cromosoma artificial el ADN insertado. Los problemas con los YACs: El más importante es que de 40 al 60% de ellos sufren rearreglos, el 40% de los YACs se pierden, tienen baja eficiencia de transformación y son extremadamente difíciles de de manipular

Figura 5-1 Esquema del vector YAC en Escherichia coli.

Figuras 5-2. Secuenciación basada en mapas y secuenciación por Shotgun.

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Figuras 5-3. Método de Shotgun. Figura tomada de los artículos de Craig Venter sobre shotgun (Nature 1996)

Figura 4 2: Historia de los mapas genéticos y secuenciación genómica.

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5.3. Ejemplos de proyectos de genómica Son proyectos de caracterización global de los genes de una especie. Se trata de determinar la secuencia, el número de genes, la posición de los mismos dentro de los cromosomas, la estructura intrón-exón, las secuencias regulatorias, promotores, la función de los genes, su patrón de expresión en diferentes tejidos, estados de desarrollo e influencia de los factores ambientales. Los organismos modelo que se han escogido para los proyectos de genómica suelen ser aquellos con un genoma relativamente pequeño, ya que entre menos nucleótidos, mas barato resulta secuenciarlos.

Figura 5-2 Tamaño del genoma haploide de varias especies

Figura 5-3 Número de genomas completos en las bases de datos de Genbank

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Tarea 5-1: Usando los datos de las figuras anteriores conteste las siguientes preguntas: ¿Qué son los dominios taxonómicos?, ¿Por qué en la actualidad se usan más que los 5 reinos?, ¿Cuáles son estos? y ¿cuáles son las características de cada uno? ¿En qué tipo de organismos existen más genomas completos? ¿Puede usted postular algunas razones de ello? 5.3.1. Genomas vegetales

5.3.1.1. Arabidopsis Tarea 5-2: Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Por qué se escogió Arabidopsis como modelo genómico? ¿Cuántos genes nuevos se agregaron en la versión TAIR8?

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Arabidopsis thaliana is a small flowering plant of mustard family, brassicaceae. It was selected as a model organism for genome sequencing in plants based on the fact that it has (1) a small genome of ~120 Mb with a simple structure having few repeated sequences and high gene density (2) short generation time of six weeks from seed germination to seed set (3) produces large number of seeds, and (4) is easy to transform. The sequencing was done by an international collaboration, collectively termed the Arabidopsis Genome Initiative (AGI). It consisted of research groups in the U.S., Europe and Japan. The project was initiated in 1996 and completed in 2000 (Nature, 408:796-815). The Arabidopsis Information Resource (TAIR) has announced the release of the latest version of the Arabidopsis genome annotation (TAIR8) at TAIR and NCBI. The latest release builds upon the gene structures of the previous TAIR7 release. The TAIR8 release contains 27,235 protein coding genes, 4759 pseudogenes or transposable elements and 1288 ncRNAs (33,282 genes in all, 38,963 gene models). A total of 1291 new genes and 2009 new gene models were added. Thirteen percent (4330) of Arabidopsis genes now have annotated splice variants. Updates were made to 3811 gene structures of which 625 gene models had CDS updates; a total of 4007 exons were modified and 683 new exons incorporated. There were 33 gene splits and 41 gene merges. Overall 23% of all existing TAIR7 genes (7380 genes) were updated (includes split, merged and deleted genes as well as locus type changes, structural updates and sequence updates) for TAIR8. Changes to chromosome sequences include removal of vector/Ecoli contamination and 1425 single nucleotide substitutions. Additional details can be viewed at the TAIR website.

Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=3702

5.3.1.2. Arroz Tarea 5-3 Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Cuántas veces más grande es el genoma de arroz comparado con el de Arabidopsis? ¿Cuántos proyectos genómicos de arroz existen actualmente?

Rice is one of the most important food crops in the world and feeds more people than any other crop. The international community decided to use rice as the model monocot plant to study cereal genomics for two reasons: 1) the small genome size, ~450 Mb, and 2) the understanding that many of the commercially important cereals have genomes that are very syntenic with rice. There have been commercially funded efforts as well as publicly funded efforts to determine the nucleotide sequence of rice. The first commercial effort, by Monsanto, resulted in a database of genomic sequence and SSR objects. The genomic sequence has been shared with the International Rice Genome Sequencing Project members. The second commercial effort, a collaboration between Myriad Genetics and Syngenta, used the whole-genome shotgun method. Despite a press release in January 2001 noting the completion of the "rice genome map", little if any genomic sequence from this project has been deposited into the public domain. A response to the impediments and shortcomings of this is available. The two publicly funded rice genomic sequence projects have each produced draft genome sequence. The International Rice Genome Sequencing Project is a collaboration of publicly funded investigators. The project began at the 1997 meeting of the International Symposium on Plant Molecular Biology in Singapore and is described. All of the PAC and BAC libraries for the effort have been produced from DNA prepared from seeds from a single plant of Oryza sativa ssp. japonica c.v. Nipponbare. The work has been apportioned among the various collaborators. The current status of sequence acquisition by the contributors to the sequence acquisition is routinely updated at the coordination organization, IRGSP. As the Monsanto sequence is brought to phase 2 qualities by IRGSP members, this material is published in public databases. The nucleotide sequence for twelve chromosome assemblies has been deposited in DDBJ by IRGSP. Various groupings of subsets of the IRGSP have deposited in GenBank the nucleotide sequence for four alternative assemblies. The other publicly funded project, directed by the Chinese Academy of Sciences, Beijing, China, is to sequence the genome of O. sativa ssp. indica and O. sativa ssp. japonica by the whole genome shotgun (WGS) method. This project began in April 2000, as a WGS project to sequence the Oryza sativa L. ssp. indica genome. The first peer-reviewed report was in the April 5, 2002 issue of Science. This has been deposited at GenBank/EMBL/DDBJ under the project accession AAAA00000000. The revision history for this data is available. Sequence data are retrievable through Entrez. The collection of contigs is available as a BLAST database for public query. This project has expanded to include the WGS sequencing of the Oryza sativa L. ssp. japonica genome. This has been deposited at GenBank/EMBL/DDBJ under the project

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accession AACV00000000. The revision history for this data is available. Sequence data are retrievable through Entrez. The collection of contigs is available as a BLAST database for public query.

Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=39947

5.3.1.3. Maíz El maíz no solo es una especie económicamente importante, sino que también puede ser un buen modelo para los estudios de evolución genómica. Existe mucha información sobre esta especie debido a que muchos genetistas clásicos y moleculares han trabajado con esta especie desde hace más de un siglo. Si bien su secuencia completa no ha sido aun publicada, ya se han identificado gran parte de los genes. No fue secuenciado con anterioridad debido al gran tamaño de su genoma. El maíz tiene 10 cromosomas (2n=20).

Tarea 5-4: Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Cuáles es el tamaño mínimo del genoma de maíz? ¿Cuántos mapas genéticos de maíz están públicamente disponibles actualmente?

The maize nuclear genome is thought to be amphidiploid - a fusion of two diploid genomes (Helentjaris T, Weber D, Wright S. Genetics 1988 118:185-188) - or allopolyploid - (Wilson et al. 1999) with knob heterochromatin. The knob heterochromatin has been characterized as a duplication of a 185-bp element (Peacock et al. Proc Natl Acad Sci, USA 1981; 78:4490-4494) and a 350-bp element (Ananiev et al. 1998) with the amount of duplication varying up to 3 to 4 orders of magnitude between different races of corn. This leads to a wide range of genome sizes among corn. The minimum size is estimated to be 2400 Mbp with a high proportion of repetitive DNA. At a NSF sponsored workshop it was decided that sequencing maize genes and placing them on a cross-referenced physical-genetic map is important to improving the agronomic characteristics of the plant. The effort to deterimine the nucleotide sequence of the Zea mays subspecies mays (maize) has begun. Currently there are seven genetic maps available. The data for six maps were provided by MaizeDB. The data are currently available from MaizeGDB. These six are 1) the IBM interim genetic map of 2000, 2) version 2 of the IBM genetic map from 2002, 3) the Emerson genetic map, 1935, and the 4) UMC-98 map with the two maps with map coordinates dependent upon the UMC-98 map, 5) QTL map and 6) bin-mapped loci. Gardiner J et al. (1993) described the UMC-98 map and the use of loci on the map to create a framework to localize non-Mendelian loci or incompletely positioned Mendelian loci. The IBM map was presented in Sharpova N et al. (2001). The initial data for the 1999 Wilson maize map [Wilson WA et al. (1999)] was provided by RiceGenes with input from MaizeDB/MaizeGDB used to complete the display. As data for other maps are requested or new map data are made available, these maps will be displayed.

Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=4577

Un pariente del maíz, el sorgo, tiene un contenido mucho menor de DNA (800Mb). Gaut y Doebley (1997), utilizando 14 pares de genes que se encuentran duplicados en el maíz, lograron fechar la duplicación hace entre 16,5 y 11,4 millones de años. Sin embargo, esta poliploidización no explica totalmente el incremento del genoma del maíz.

En el maíz son muy abundantes los elementos móviles (McClintock, 1946; Fedoroff, 2000). Estos elementos móviles contribuyen al gran tamaño del genoma del maíz. Por ejemplo, Hake y Walbot (1980) estimaron que entre 60 y 80% del total del genoma del maíz se encuentra constituido por elementos móviles, alrededor del 20% está formado por elementos altamente repetitivos con hasta 80,0000 copias, y 40% está dado por elementos moderadamente repetitivos, con más de 1000 copias.

Un estudio detallado de la dinámica de los elementos móviles fue realizado por San Miguel et al. (1998) en el cual analizaron una región de 240kb que incluye al gen Adh1. Alrededor del 62% del total de esta sección está formado por transposones y 6% por repeticiones de bajo número. En

138 está sección del genoma encontraron 23 retrotransposones pertenecientes a 10 familias distintas. De estos 23 elementos, 10 se encontraban a su vez insertos dentro de otro elemento. La edad del elemento móvil más antiguo en esta región, según aproximaciones de reloj molecular, sería de hace unos 5.2 millones de años, aunque el promedio es de alrededor de 3 millones de años. Dado que esta región en el sorgo carece de retrotransposones, se considera que la proliferación de éstos en el maíz ha sido reciente y posterior al evento de tetraploidización. Los datos con que se cuenta indican que la situación de la región de la Adh1 es representativa de la mayor parte del genoma del maíz. Así estimaron que el 50% del total del genoma del maíz está constituido por las familias de retrotransposones que se encuentran en esta región, y que su distribución a lo largo de los diferentes cromosomas es bastante uniforme. De hecho, tres de estas familias representaría algo así como el 25% del total del genoma de esta planta {Aldridge, 2009 #176}.

Gaut et al. (2000) y Tenaillon et al. (2001) realizaron experimentos para explorar a fondo la variación genética a nivel de secuencias en el maíz. Como ya se mencionó, los niveles de variación genética son muy altos en esta especie. Así, en el cromosoma 1 en 25 colectas, encontraron una q =0.0144 para 4 genes cerca del centrómero y una q =0.0170 para 11 genes más alejado del centrómero. q es un estimado de 4Neµ que depende del total de sitios polimórficos y del largo de la secuencia, y si la evolución del gen es neutra, debe de ser igual a p y se interpreta de manera parecida, (Cummings y Clegg, 1998).

Otro patrón interesante en el maíz y sus parientes silvestres cercanos del mismo género y conocidos como teosintles, es la falta de congruencia entre las filogenias obtenidas para diferentes genes. Por ejemplo, las secuencias derivadas de plantas de diferentes localidades pertenecientes al teosintle Zea luxurians forma un grupo muy bien definido con los genes glb1 y adh1. Estos genes se encuentran cercanos en el cromosoma 1, pero las mismas plantas presentan secuencias más parecidas a las de otros taxa del género Zea para la adh2 (del cromosoma 4) y para c1 (del cromosoma 9), sugiriendo una historia evolutiva compleja mediada por diferentes tipos de selección natural y patrones de flujo génico, que posiblemente sean comunes en la mayor parte de las angiospermas con polinización cruzada.

5.3.1.4. Tomate Tarea 5-5: Lea el siguiente texto en inglés y conteste las siguientes preguntas: ¿Ya se secuenció totalmente el genoma de tomate? ¿Qué países están participando? ¿Entre que especies de tomate se hicieron cruzas para determinar QTLs y para hacer mapas genéticos?

The genus Solanum includes the cultivated tomato, S. lycopersicum, together with its wild relatives. Tomato has long been used as a model system for plant genetics. It has been used for a number of firsts in molecular genetics of plants. The use of RFLP (restriction fragment length polymorphism) to generate a linkage map of a complete plant genome was done with tomato (Bernatzky and Tanksley. Genetics 1986; 112:887-898). Tomato was the organism where quantitative traits were resolved into Mendelian factors (Paterson et al.). The use of allelic variation of RAPD (random amplification of polymorphic DNA) to facilitate map-based walking to agronomically pertinent loci was first done in tomato (Wing et al. and Martin et al.). The creation of a high-density molecular linkage map and the use for comparative genomics were done with tomato and potato (Tanksley et al.). There is an NSF-funded effort to create an ordered collection of BACs that is to be superimposed upon the tomato genetic map. This resource will more rapidly allow access to the underlying genetic and functional basis of the extensive collection of alleles of already known loci affecting fruit development and ripening, interactions between plants and pathogens, and other biological processes of plants. International consortiums of researchers as part of the Solanaceae Genomics Project are in the process of sequencing the gene rich regions of all 12 chromosomes on a BAC-by-BAC basis and annotate it. In US, majority of the research is funded by NSF and USDA-NRI Plant Genome program. It will be sequencing chromosomes 1, 10, and 11. Other participating

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member countries are Korea (chromosome 2), China (chromosome 3), UK (chromosome 4), India (chromosome 5), The Netherlands (chromosome 6), France (chromosome 7), and Japan (chromosome 9). Map Viewer Data There are four maps currently available. The gene genetic map is from the data presented by Tanksley et al. The other three are maps built with loci where the allelic state is determined by examining the nucleic acid of the genes. These maps are built using backcross populations from an interspecific cross between Solanum lycopersicum and Solanum pennellii. For all the maps the data either are publicly available or have been published in a peer-reviewed journal. The 1986 map data are from Bernatzky and Tanksley (Genetics 1986; 112:887-898). The 2000 map data are entirely from the Solanaceae Genome Network.

Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=4081

Tarea 5-6: El nombre científico del tomate era Lycopersicum esculentum, mientras que hoy en día se le trata de llamar Solanum lycopersicum. Haga una busqueda bibliografica y averigue más sobre el tema, y dé una razón de este cambio. ¿Qué experimento haría usted para demostrar que la papa (Solanum tuberosum) es un pariente muy cercano del tomate? Es decir, porque no se justifica tener un género separado para el tomate (Lycopersicum) y para las diferentes especies de papa (Solanum). Haga un árbol taxonómico para explicarlo.

Tabla 5-1. Lista de especies y el número de genes tentativos consenso y secuencias unicas (singletons). Datos sacados el 14 de enero 2009 de la página http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/tc_count.pl?category=plant

Species TCs Singletons TC + Singletons Malus x domestica 28,148 26,317 Aquilegia 13,556 7,389 Arabidopsis thaliana 34,155 47,671 Hordeum vulgare 41,206 39,517 Beta vulgaris 4,784 12,367 Brassica napus 47,634 42,693 Chlamydomonas reinhardtii 11,139 20,469 Citrus clementina 10,269 29,614 Theobroma cacao 843 1,972 Coffea canephora 7,420 10,212 Phaseolus vulgaris 5,351 8,738 Gossypium 49,233 65,161 Gossypium raimondii 9,508 15,383 Vitis vinifera 33,638 45,338 Mesembryanthemum 3,627 6,772 crystallinum Euphorbia esula 10,727 15,769 Lactuca sativa 12,505 17,380 Lotus japonicus 15,472 18,793 Zea mays 85,624 151,387

Medicago truncatula 29,273 38,190 Ipomoea nil 11,754 9,760

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Physcomitrella patens 28,254 35,527 Nicotiana benthamiana 5,861 10,266 Allium cepa 4,063 8,182 Citrus sinensis 26,081 72,817 Prunus persica 8,439 15,690 Capsicum annuum 4,661 9,588 Petunia hybrida 2,230 6,499 Pinus 34,181 27,683 Populus 49,638 50,013 Solanum tuberosum 31,567 29,805 Lactuca serriola 8,047 13,958 Oryza sativa 77,158 104,638 Secale cereale 1,471 4,116 Sorghum bicolor 23,442 22,583 Glycine max 42,647 40,856 Picea 42,051 38,443 Saccharum officinarum 40,016 76,572 Helianthus annuus 12,347 24,616 Festuca arundinacea 6,686 13,251 Nicotiana tabacum 26,151 56,932 Solanum lycopersicum 25,764 21,085 Triphysaria 17,442 17,043 Triphysaria versicolor 7,165 5,647 Triticum aestivum 91,464 124,988

5.3.2. Genomas animales

5.3.2.1. Genoma Humano El proyecto HUGO inició en 1990 con el objetivo de obtener el mapa genético completo del genoma humano, que no se consiguió hasta el 1996 con 5264 marcadores y 1,6 cM de distancia. En 1998 se consiguió el mapa físico con 30.075 STS localizados en contig maps. En el 2000 se anunció el primer borrador de la secuencia completa del genoma humano y en 2001 se publicó este borrador con el 90% de la secuencia. En 2003 se dio por acabada la secuencia del genoma humano. Paralelamente a los esfuerzos públicos de HUGO, una compañía privada (Celera Genomics de Craig Venter) secuenció el genoma de varios humanos (mujeres y hombres de diferentes razas) en un tiempo récord. Esto se debió a que el grupo de Venter escogió una estrategia de secuenciación masiva a partir de fragmentos de DNA aleatorios. La secuenciación tipo shot gun no necesita generar mapas genéticos previos. Sin embargo si necesitaba un software muy poderoso de ensamblado. Hoy en día se han desarrollado programas muy sofisticados de ensamblado que pueden usar fragmentos tan cortos de 100 bases para generar contigs de millones de bases.

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Figura 5-4. Menos del 2% de los 3400 millones de bases del genoma humano codifican para proteínas.

Tabla 5-2: Tabla de estadísticas sobre el Genoma Humano Topic Statistic Total size of the genome: approximately 3,200,000,000 bp Percentage of adenine (A) in the genome: 54% Percentage of cytosine (C) in the genome: 38% Percentage of bases not yet determined: 9% Highest gene-dense chromosome: chromosome 19 with 23 genes per 1,000,000 bp Least gene-dense chromosomes: chromosome 13 and Y with 5 genes per 1,000,000 bp Percentage of DNA spanned by genes: between 25% and 38% Percentage of exons: 1.1 to 1.4% Percentage of introns: 24% to 37% Percentage of intergenic DNA: 74% to 64% The average size of a gene: 27,000 bp The longest gene: dystrophin (a muscle protein) with 2,400,000 bp Average length of an intron: 3,300 bp Most common length of an intron: 87 bp Occurrence rate of SNPs: roughly 1 per 1,500 bp Occurrence rate of genes: about 12 per 1,000,000 bp

Tarea 5-7 Usando los datos del genoma humano mostrados en la tabla anterior, conteste las siguientes preguntas: ¿Cuál es el porcentaje de bases de guaninas (G) en el genoma humano? Dedúzcalo. La longitud promedio de los intrones es de 3300 bp pero la longitud más común es de tan sólo 87 pb. Explique ¿por qué? Para ello dibuje una grafica tipo histograma con la distribución de la longitud de los intrones.

Tarea 5-8 Observe el video de las siguientes páginas web para que comprenda mejor los datos anteriores. http://www.elmundo.es/especiales/2001/02/ciencia/genoma/grafico http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000088/lecciones/Foros/Genoma/GenomaHuman http://es.wikipedia.org/wiki/Proyecto_Genoma_Humano

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Tarea 5-9 ¿Cuántos cromosomas hay en una célula humana diploide? ¿Hay diferencias entre el sexo masculino y femenino? Investigue en otros seres vivos (mínimo 10), haga un cuadro comparativo y explíquelo.

Tarea 5-10 ¿Cómo se explica que en la mitocondria tengamos material genético? ¿Postule una hipótesis de porque se ha podido acumular DNA que no tiene función aparente?

El genoma haploide humano tiene 23 cromosomas con 3200 millones de pares de bases. La cantidad de información en el núcleo es muy elevada: si punteáramos cada nucleótido de una célula abarcaríamos una longitud de Norteamérica a Londres. Dentro de la mitocondria tenemos un genoma muy pequeño (16 kb en mamíferos) que sólo codifica para el rRNA y tRNA propios de la mitocondria y para unos pocos genes más. Se podría dividir en sus componentes: Genes y secuencias relacionadas y DNA intergénico (64%). Los genes representan el 1.4% del genoma (regiones codificadas), y el resto son intrones, transposones, etc. El DNA intergénico engloba elementos repetidos, copias dispersas, etc. El genoma es muy grande, pero las regiones codificantes son muy pequeñas. Al parecer hemos acumulando DNA que no tiene una función aparente. Por eso se ha querido caracterizar una parte muy pequeña del genoma: los genes. Dentro del conjunto de los genes, a los mejoradores les interesan principalmente aquellos con una repercusión en el fenotipo. Hace falta un mapa para no perderse, así nació el concepto de mapa genético: es una descripción de la posición y la distancia relativa de los genes y otros marcadores en los cromosomas de una especie. También se introdujo el concepto de Haplotipo {Aldridge, 2009 #176; Gallais, 2009 #175}.

5.3.2.2. Genoma del perro Algunas especies domésticas se han secuenciado gracias al proyecto Tree of Live (http://www.tigr.org/tol/). Este proyecto pretende secuenciar los genomas de diferentes especies que pertenezcan a diferentes ramas del árbol evolutivo de la vida. Cuando es muy costoso obtener la secuencia completa se plantea obtener secuencias con una cobertura de tan solo 2X. Esto es suficiente para hacer un análisis comparativo del genoma. La empresa Celera Genomics secuenció el genoma del perro y lo publicó como un borrador en el 2003, pero con una redundancia 1.5X (78% del genoma). Pese a esto fue útil para comparar tamaño, genes ortólogos y ver que el 5% del genoma está conservado entre el perro y el ratón. Se vio pues que un 2-3% eran genes y 2-3% no lo eran, pero estaban igualmente conservados. En el proyecto público se adelantaron y en el 2004 depositaron los datos en las bases públicas. Desde que el perro, un descendiente de los lobos asiáticos, se convirtió (hace al menos 15.000 años) en un animal doméstico, los criadores han desarrollado varios cientos de razas. El que fuera cazador, guardián o ayudante del ser humano se convirtió cada vez más en un perro faldero. Hoy existen en el mundo cerca de 400 millones de perros de compañía. El perro fue el primer genoma de especie doméstica en estar secuenciado: hay una gran variabilidad en las razas de perros. Aproximadamente hay 300 razas con características morfológicas y de comportamiento diferentes. Muchas de estas razas derivan de unos pocos fundadores provocando aumento de la consanguinidad y por tanto son muy similares entre sí, pero muchas diferencias con las otras especies (hay homogeneidad dentro de la raza). En perros se han descrito 360 enfermedades hereditarias muy similares a las humanas. Los simpáticos y ladradores mejores amigos del hombre, como hemos dicho, presentan variaciones de tamaños de 50 a 1, 100 a 1 o incluso más. Era necesario averiguar por qué. El responsable de averiguar la causa de este extraordinario fenómeno fue Nate Sutter, un genetista del Instituto Nacional de Investigación del Genoma en Bethseda, Maryland.

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Comenzó tomando radiografías de los huesos de 500 perros de aguas portugueses y haciendo prolijas mediciones de 91 partes críticas de sus esqueletos. Hecho esto, caracterizó a cada ejemplar como pequeño o grande con respecto al promedio de su propia raza. Por último, quedaba solamente averiguar en qué difería el ADN de un perro de aguas grande del de uno pequeño. Este trabajo era fácil: el mismo Sutter es uno del los responsables del mapeo completo del genoma de Tasha, así que no tuvo que esforzarse mucho. La diferencia entre un perro pequeño y uno grande consistía en... ¡un solo gen! El gen en cuestión, previsiblemente, ocupaba una posición en las zonas del genoma que presentan muchas variaciones entre ejemplares de la misma especie (Figura 5-5).

Cuando se descubrió que el hígado era un órgano productor de hormonas, se identificaron tres sustancias secretadas por él: una de ellas era el Factor de Crecimiento Similar a la Insulina (IGF- 1, según su sigla más usual). El descubrimiento del IGF-1 demostró que la hormona de crecimiento o somatotrofina, secretada por la hipófisis, no activaba el crecimiento corporal por sí misma. En realidad, la somatotrofina disparaba la secreción de IGF-1, responsable, en última instancia, del crecimiento y regeneración de los tejidos. El nombre de la hormona proviene de la enorme similitud estructural de su molécula con la de la hormona insulina, secretada por el páncreas.

Figura 5-5. Evolución genética del perro a partir del Lobo www.clarin.com/diario/

5.3.2.3. Genoma de la gallina La revista "Nature" presentó en 2004 la secuencia del genoma de la gallina, el primero decodificado de un ave y de un animal de granja. Este logro de científicos de una docena de países. El DNA analizado fue el de un ejemplar "red jungle fowl" (Gallus gallus), especie salvaje asiática de la que derivan todas las variantes de gallinas domésticas. El animal fue criado en la Universidad de Michigan y se trata de una hembra. Estas tienen los dos tipos de cromosomas sexuales, mientras que los machos sólo tienen uno. "Esta investigación ha revelado que gallinas

144 y humanos comparten más de la mitad de sus genes. La secuenciación de este genoma nos ayudará a descubrir los genes que aumentan la resistencia a enfermedades en las aves", asegura Jerry Dodgson, genetista que ha trabajado en el proyecto durante los últimos 17 años.

"Somos más parecidos a los pájaros de lo que creíamos. Alrededor del 60% de los genes que codifican proteínas en la gallina tienen su equivalente en el hombre", afirma Peer Bork, del Laboratorio Europeo de Biología Molecular, una de las 49 instituciones que han participado en el proyecto. La gallina es un importante modelo de investigación biomédica porque es fácil de mantener, se reproduce rápidamente y es fácil determinar sus linajes por las características físicas.

Es un animal ideal para investigar el desarrollo embrionario -mucho de lo que se sabe del desarrollo de nuestras extremidades se debe al estudio de gallinas dentro del huevo-, y se han creado estirpes que sufren patologías genéticas propias de humanos, como la distrofia muscular. Además, como gallinas y mamíferos tienen respuestas inmunitarias muy parecidas, el genoma de está ave ayudará a luchar contra enfermedades que saltan entre especies, como la gripe aviar.

Los investigadores dicen que la secuenciación permitirá a los productores saber por qué algunas gallinas ponen más huevos y la carne de ciertos pollos asados contiene menos grasa. "Si sabemos los genes que influyen en esas características, podremos seleccionar las gallinas que mejor cubran las demandas de los consumidores y que lo hagan de una manera más sana", dice Dodgson (Figura 5-6).

El último ancestro común del hombre y la gallina vivió hace unos 310 millones de años. Desde ese momento, los antepasados de ambas especies emprendieron caminos separados en la evolución. "El genoma de la gallina llena un hueco crucial del conocimiento científico. Localizada entre los mamíferos y los peces en el árbol de la vida, la gallina está bien colocada para proporcionarnos nuevas perspectivas de la evolución del genoma y la biología humana", señala Francis Collins, del Instituto Nacional para la Investigación del Genoma Humano.

Figura 5-6.El genoma del pollo aportará datos de enorme valor para mejorar la productividad, aunque no de inmediato.

El genoma de la gallina está compuesto por 1,000 millones de pares de bases -un tercio de los del hombre- que se reparten en 39 pares de cromosomas, uno de los cuales determina el sexo: los machos tienen dos cromosomas Z, mientras que en las hembras ese par está formado por uno Z y uno W. Esta ave de corral tiene entre 20,000 y 23,000 genes, cuyos primeros estudios ya han dado algunas sorpresas. Así, se ha descubierto que la gallina presenta un importante número de receptores olfativos en su ADN, cuando hasta ahora se creía que su sentido del olfato era muy pobre. En cambio, apenas tiene sentido del gusto. El genoma de la gallina se obtuvo con una redundancia de 6,63X. En China hubo un proyecto con gallina que permitió determinar 2, 000,000 de SNP’s. Una conclusión preliminar del genoma de la gallina es que aunque es tres3 veces más pequeño que el humano (tiene unas 1000 Mb)

145 no es menos complejo: es más compacto porque hay menos secuencias repetitivas, menos intrones. 5.3.3. DNA extranuclear

5.3.3.1. Genoma Mitocondrial El DNA mitocondrial esta presente como estructura circular de 17,000 pb. Se dice que es DNA citoplasmático o extracromosómico, es decir, no esta en los cromosomas del núcleo. La comparación de secuencias y detección de cambios en determinadas posiciones del genoma mitocondrial es útil para estudios evolutivos sobre DNA antiguo debido a su tamaño, estabilidad y grado de conservación. Además, el DNA mitocondrial es abundante ya que hay alrededor de 1,000 mitocondrias por célula. Una característica adicional es que se transmite por vía materna dando información sobre la dispersión de linajes maternos antiguos.

• DNA pequeño y circular: mayor estabilidad frente degradación. • Regiones muy conservadas: Ejemplo de 16s de RNA ya que los cambios no son muy tolerantes evolutivamente aunque suelen producirse ciertos cambios útiles para comparar poblaciones. • Origen materno. Permite establecer el linaje materno. Todos los humanos compartimos un solo ancestro femenino. La Eva mitocondrial. (Contraparte masculina: El Adán del cromosoma Y) • No recombina. El DNA de una mitocondria paterna no se mezcla con el de las mitocondrias maternas. • La tasa mutagénica es diferente. El mecanismo de reparación del DNA es diferente a los nucleares. Con menos mutaciones se dan menos polimorfismos. • Ediciones especiales. En la mitocondria en algunos genes se dan procesos frecuentes de edición de RNA antes de ser traducidos a una proteína, y además, en algunos casos también se presentan variantes al código genético universal. • Regiones hipervariables: Su replicación es en forma de “D-Loop” (replica una cadena antes que la otra), la región cercana a este inicio de replicación (D-Loop) acostumbra a ser muy variable (muy útil). • Poco DNA: Es el único marcador que se puede utilizar con poquísimo DNA (cadáveres antiguos...)

Aplicaciones del DNA mitocondrial:

Inferir relaciones entre poblaciones y especies: Para el conocimiento del origen de razas animales domésticas. Se usan regiones del Citocromo B del DNA mitocondrial para estudiar por ejemplo el origen de razas animales:

Ejemplo - Distinción de razas de cerdos: Queremos saber si tres especies de cerdo; Ibérico, canario y mallorquín están relacionados. Para ello, obtenemos muestras biológicas de un grupo de individuos, extremos DNA, amplificamos con PCR y lo secuenciamos. Al comparar los polimorfismos nos damos cuenta que el cerdo ibérico y el mallorquín sólo tiene haplotipos europeos, mientras que la raza canario posee haplotipos tanto europeos como asiáticos. De esta forma podemos inferir de dónde vienen estas poblaciones porcinas.

Ejemplo – Lugar de domesticación del cerdo: La domesticación del cerdo se pudo dar independientemente en Europa, Asia y otros lugares al mismo tiempo. El estudio del DNA mitocondrial permitió confirmar la existencia de múltiples centros de domesticación y que ha habido poca migración de estos cerdos domesticados hacia otros lugares. Esto se comprobó gracias a que el DNA mitocondrial del cerdo asiático

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domesticado se parecía más al del cerdo asiático salvaje, mientras que el cerdo europeo se parecía mas al cerdo europeo salvaje.

Tarea 5-11 Busca otros ejemplos de especies animales como de plantas en donde se haya usado el DNA mitocondrial para conocer sus ascendencia. ¿Cómo se explica la evolución del Hombre?, ¿Dónde se supone que se origino y por qué?

Comparación de especies y subespecies: También permite realizar estudios de filogenética y taxonomía. Se estudia una región no codificante en la que las mutaciones se pueden considerar neutras (no intervienen en la selección). Esto permite calcular las tasas de divergencia entre especies. Para cada gen se estima una tasa de mutación por unidad de tiempo. Esté análisis también puede ser respaldado por fósiles, para realizar una calibración molecular de la tasa evolutiva. Las evidencias de un grupo de genes se pueden contrastar comparándolas con otras secuencias independientes.

Modelo Árbol: Relación entre diferentes haplotipos. Cuanta más diferencias polimórficas mayor será la distancia evolutiva, y esto se representa con una “rama” más larga. Son árboles de parsimonia que intentan agrupar las muestras de par en par de la mejor manera. Tanto un árbol de parsimonia y uno de distancias (ME) para el mismo set de datos produce Topologías y longitudes de ramas idénticas. La diferencia radica en que el árbol de parsimonia identifica qué sitio del alineamiento contribuye cada paso mutacional en la longitud de cada rama. Como criterio de optimización de se usa la (máxima) parsimonia. Esto involucra la identificación de la(s) topología(s) con la menor longitud total del árbol, es decir, que requiere(n) el menor número de cambios evolutivos (transformaciones en estados de base) Comentario [ATF4]: No sé si para explicar las diferencias observadas entre OTUs. El modelo de máxima parsimonia se sea adecuado cambiar justifica en filogenética dado que: 1) se asume que los cambios de estado de base carácter por base (sustituciones) son poco frecuentes y 2) no se puede conocer con exactitud el camino evolutivo de dichos cambios, por lo que se busca maximizar la similitud evolutiva que se puede explicar como homóloga (por ancestría compartida). De esta manera se busca de minimizar la homoplasia (similitud no heredada directamente del ancestro), ya que las hipótesis de homoplasia (convergencia, evolución paralela...) pueden ser juzgadas como intentos ad hoc de explicar por qué determinados datos no encajan en una hipótesis evolutiva (árbol filogenético) particular.

. Figura 5-7.

Tarea 5-12. En la página de Internet www2.uah.es/biologia_animal/EFyC2008/Practica%205.pdf realiza la práctica para la construcción de un árbol de parsimonia.

Mapas de migración: Estudio del origen de poblaciones (por ej. migraciones bovinas). Se intentan encontrar caminos lógicos para explicar cómo han pasado de un lugar a otro. Las alturas de las barras nos indican la diversidad nucleotídica. En los lugares donde hay mayor diversidad se cree que son los centros de origen, y de ahí es dónde provienen las migraciones. Por ejemplo, los

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bovinos europeos entraron desde Turquía y no África, que además coincide con las migraciones humanas. En el mapa de rutas cada color indica una especie diferente. Vemos un foco amarillo importante con ciertas rutas de migración bovina. El rojo y negro representan orígenes de domesticación independientes.

Figura 5-8. Mapas de migración bovina.

5.3.3.2. Genoma plastídico Los cloroplastos son un tipo de plastos, orgánulos exclusivos de las células vegetales. Tienen una forma alargada y presentan una organización similar a la de las mitocondrias. Su importancia se debe a que son los orgánulos donde se realiza la fotosíntesis. Estructura Presentan tres sistemas de membranas, dos de los cuales forman la envoltura externa. Estas membranas son: • La membrana externa, que contiene porinas que le proporcionan una gran permeabilidad. • La membrana interna, menos permeable. Junto con la membrana anterior forma la envoltura externa. • La membrana tilacoidal, se localiza en el interior del cloroplasto y está altamente plegada para formar los tilacoides. Estos se apilan unos sobre otros para formar grana. En esta membrana se localizan los fotosistemas, responsables de la captación de la energía solar, los componentes de una cadena de transporte electrónico y una ATP sintasa. Esta membrana es muy fluida debido a que contiene una elevada proporción de ácidos grasos.

Figura 5-9. A) El cloroplasto presenta tres compartimentos diferentes: un espacio intermembranoso, un espacio interno, ocupado por el estroma o matriz del cloroplasto, y un espacio tilacoidal.

El espacio intermembranoso se localiza entre las dos membranas que constituyen la envoltura externa del cloroplasto, y posee una composición semejante a la del citosol. El estroma está situado entre la membrana interna y la membrana tilacoidal. En él se encuentran ribosomas, enzimas, varias moléculas de ADN, distintos tipos de ARN, gránulos de almidón y gotas de

148 lípidos. B) El espacio tilacoidal corresponde al espacio interno de los tilacoides que, al estar interconectados, delimitan un único compartimento común. Las mitocondrias y los cloroplastos son orgánulos celulares autónomos, ambos poseen ADN que es capaz de replicarse, transcribirse y traducirse independientemente del nuclear. A la vista de este hecho, podríamos pensar, si esos genes contenidos en el cromosoma de mitocondrias y cloroplastos, tuvieran o no influencia en el fenotipo de un individuo. De ser así, su herencia no sería de tipo mendeliana. Los genes nucleares segregan en meiosis, pero los genes de estos orgánulos segregaran en mitosis, cuando se produce la distribución al azar de los orgánulos celulares. En la fecundación la aportación citoplásmica del gameto masculino es muy pequeña, sí no nula, por lo tanto hemos de pensar que los individuos reciben sólo aportación de mitocondrias y cloroplastos vía materna, es decir sólo recibe los genes extranucleares de la madre. Un último aspecto a considerar es que si el individuo empieza su desarrollo en el citoplasma del óvulo, ¿tendrán influencia las proteínas (productos génicos de genes nucleares maternos) allí presentes sobre el fenotipo del individuo? Es un genoma circular, filogenéticamente muy cercano al genoma de las cianobacterias, como demuestra gran cantidad de estudios de evolución molecular. En plantas con flores el cloroplasto se hereda de manera casi exclusiva por vía materna, y por lo tanto, es un genoma haploide (cada organismo solo tiene una copia de este genoma). Es interesante notar que en coníferas (Gimnospermas) usualmente los cloroplastos se heredan por vía paterna así, mientras que en las angiospermas el cloroplasto describe la historia evolutiva por parte de la función femenina (patrones de dispersión de las semillas), en coníferas se relaciona con la función masculina (patrones de dispersión del polen).

Existen varias secuencias completas del genoma del cloroplasto en plantas con flores, incluyendo especies monocotiledóneas como el arroz (O. sativa) y el maíz (Zea mays), y varias dicotiledóneas, como el tabaco (Nicotiana tabacum), la espinaca (Spinacia oleracea), la especie experimental de la familia de la mostaza Arabidopsis thaliana y la planta parásita no fotosintética Epifagus virginiana.

El cloroplasto en las plantas con flores tiene una estructura muy conservada. Generalmente mide entre 120 y 217kb (miles de pares de bases de DNA), aunque en E. virginiana mide tan solo 70kb. Esta planta, al ser parásita, no necesita de la maquinaria fotosintética y ha perdido muchos de los genes involucrados en este mecanismo. El número de genes presente en el cloroplasto es también muy conservado, entre 110 a 113 (Tabla 5-3), aunque E. virginiana sólo tiene 42 genes. Así, el número de genes del cloroplasto es menos del 25% del que presentan los genomas bacterianos más pequeños, posiblemente debido a la pérdida de una elevada cantidad de los genes que tenían inicialmente las bacterias que dieron origen a los actuales cloroplastos Por ejemplo, la bacteria con genoma "mínimo" M. genitalium, tiene 470 genes que codifican para proteínas.

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Tabla 5-3. Comparación de genomas terminados de cloroplastos * http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid

Los cloroplastos eucarióticos derivan evolutivamente de las cianobacterias, su DNA es una molécula circular, bicatenaria y que contiene entre 120 y 160 kbp. Este contenido en DNA es inferior al que presentan las algas verdes, por lo que se supone que a lo largo de la evolución se ha reducido el tamaño del mismo, bien por pérdida de material o bien por integración de genes dentro del genoma eucariótico. El número de moléculas de DNA por cloroplasto es muy variable. En plantas este número oscila entre 20 y 60 moléculas por cloroplasto, mientras que en algas superiores el número es mayor. La organización es muy sencilla ya que apenas posee secuencias repetidas, aunque en la mayoría de las especies vegetales se ha demostrado la presencia de una duplicación invertida que incluye genes de tRNA. La secuenciación del DNA de los cloroplastos ha revelado que existen alrededor de 150 genes. Además de los tRNA y los rRNA hay unos 90 genes que están implicados en la fisiología de los cloroplastos, principalmente en la fijación fotosintética del carbono. Estos genes suelen agruparse en pequeños nichos cuya organización se ha mantenido a lo largo de la evolución. El orden de estos genes dentro del genoma del cloroplasto, no se ha mantenido constante en todas las especies estudiadas, lo cual indica que en el proceso evolutivo han existido variaciones cromosómicas estructurales.

El cloroplasto, es el asiento de la fotosíntesis en una célula, contiene su propio genoma conocido como plastome. El plastome incluye los genes que cifran para el RNA ribosomal, el RNA de transferencia y varias proteínas que alternadamente controlan fotosíntesis así como otros rasgos. Un desarrollo reciente en la manipulación de los genes del plástido es la introducción de genes extraños en los cloroplastos y esta técnica se conoce como ingeniería del Plastome. La transformación de plastome primero fue divulgada por Boynton y sus colegas en 1988 en Chlamydomonas reinhardtii. Esto fue logrado, bombardeando las células con las partículas de

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tungsteno cubiertas con el DNA. Ahora, las líneas transplastómicas (ésas que tienen un transgen) se han sintetizado ya en el tabaco, la soja, la colza, la espinaca, la patata dulce, etc.

El conocimiento del plastome completo puede ser útil para entender los procesos fundamentales de la biología del plástido y de la interacción del plastome con genoma nuclear y del proceso fotosintético. La diversidad genética de los cloroplastos de varias cosechas (en los niveles intervarietal, interespecíficos o intergenérico) puede ser revelada realizando el análisis de las secuencias. Los genes fotosintéticos codificados por el plastome se pueden manipular para lograr el nivel deseable de la eficacia fotosintética, así como la productividad. Puesto que los genes del plástido maternal se heredan los genes nuevamente incorporados no conseguirán transmitidos a los parientes o a las malas hierbas salvajes a través del polen. Esto es especialmente atractivo para los genes de tolerancia a herbicidas, puesto que el desarrollo de “malas hierbas estupendas” (las malas hierbas tolerantes a los herbicidas) se evita. Una vez que introduzcamos un gene nuevo en un solo plastome de una célula, consigue amplificarla varias veces durante la división y la multiplicación de plástidos.

Los genes para producir las proteínas útiles se pueden transferir en los cloroplastos para las expresiones múltiples y su producción enorme. Las líneas transplastómicas pueden ser desarrolladas para fines farmacéuticos.

5.3.3.3. DNA nuclear Vs. DNA citoplásmico Ventajas del DNA nuclear frente al DNA mitocondrial: El DNA nuclear por lo regular pose dos alelos; Esto permite hacer pruebas de paternidad. La variabilidad del DNA nuclear es más alta que la del DNA mitocondrial (mitDNA) y dan mayor capacidad de discriminación: En una población muy parecida es difícil la discriminación, con suerte dos a tres haplotipos diferentes. Con el DNA nuclear se pueden hacer dibujos más “finos” ya que si analizamos un número elevado de microsatélites tendremos una fuerza de discriminación muy alta. Esto nos sirve cuando por ejemplo queremos averiguar cuán diferentes son dos poblaciones, una salvaje y otra domesticada.

Figura 5-10. Diversificación entre el perro y lobo

Ejemplo de lobos y perros: Se quiere ver las poblaciones de perros en lugares donde también hay lobos. Se analizaron 74 muestras (lobos del zoo europeo; azul, Lobos en cautividad; amarillo, Perros; rojo). La pregunta que nos hacemos es si los lobos en cautiverio son de amplia diversificación y si solo representan un grupo genético muy reducido. Las manchas amarillas están bastante distribuidas (muestras representativas de la diversidad genética ya que además éstas están intercaladas con lobos salvajes; verdes). En general vemos clara diferenciación genética entre perro y lobo (entre azul y rojo).

Elevado margen de confianza con pocos marcadores: Si utilizamos microsatélites ¿cuántos debemos utilizar? Queremos tener un nivel de confianza elevada de que los individuos no salgan iguales. Estamos entonces frente a cifras de 3 a 20 marcadores. Además, tenemos que tener en cuenta el grado de consangueneidad. Para estimar divergencias genéticas entre individuos muy cercanos es difícil tener capacidad de discriminación con DNA mitocondrial. Los marcadores

151 buenos son aquellos con suficientes número de alelos por Locus. Sin embargo, algunos marcadores son un poco delicados por las diferencias que pueden aparecer entre laboratorios. 5.3.4. Genomas comparativos Cuando se habla de genómica comparativa se puede decir que se tiene un cromosoma (por ejemplo arroz) donde se ha identificado ciertos genes. Si estos genes se han encontrado también en maíz y trigo podríamos preguntarnos en qué cromosomas están repartidos esos genes. ¿Puede ser que algunos genes estén agrupados similarmente en especies cercanas? Al establecimiento de correspondencias entre genomas se le llama análisis de sintenia. Si el cromosoma nueve del arroz es homólogo a parte del cromosoma ocho del maíz es debido a que estas especies tuvieron un ancestro común en donde los genes estaban organizados de esa forma, pero con la evolución se han reorganizado en las diferentes especies. Podemos notar que esta reorganización es mayor en algunos géneros que en otros. La comparación entre especies de cereales puede ser buena, mientras que la comparación entre maíz y fríjol puede ser no tan buena. A los genes que supuestamente tienen la misma función en dos especies se les llama ortólogos. Cuando hablamos de comparar genomas queremos buscar similitudes o diferencias en el orden de los genes ortólogos. La sintenia es la similitud en la distribución de genes ortólogos a lo largo de cromosomas de especies diferentes.

Cuando hablamos de secuencias, es mucho más exacto hablar de similitudes que de homologías. Homología es un término que se usa en la evolución con una connotación muy específica. Las manos de los humanos y las alas de los murciélagos son órganos homólogos. Pero las alas de los pájaros y las alas de los insectos son órganos análogos y no homólogos. Los genes ortólogos, son genes que no solo son similares a nivel de secuencia, sino que además, cumplen todavía la misma función enzimática o estructural.

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6. Factores de Transcripción 6.1. ¿Qué son? Las células necesitan adaptarse constantemente a cambios ambientales, modificando los patrones de la expresión génica. Los mismos genes están presentes en todas las células de una especie, pero no todos están activos al mismo tiempo. En la modulación de la expresión génica es necesaria la presencia de secuencia reguladoras y proteínas capaces de direccionar la expresión de los genes. La regulación de la expresión génica es uno de los eventos más importantes en el control del desarrollo y de las respuestas a cambios ambientales. Las proteínas maestras en la regulación de la expresión génica son conocidas como factores de transcripción. {Carpita, 2008 #625; Casati, 2008 #628}

Los factores de transcripción son proteínas que se unen al DNA para controlar los genes. Estas proteínas regulatorias, estimulan o reprimen la tasa transcripcional de sus genes blanco al unirse a regiones promotoras específicas (i.e. elementos cis). Esto activa o desactiva cascadas de señalización de genes. Los factores de transcripción tienen funciones fundamentales en casi todos los procesos biológicos (desarrollo, crecimiento y respuestas a factores ambientales) y se asume que tienen un papel preponderante en la evolución de las especies. En plantas, los factores de transcripción han sido empleados para manipular varias rutas metabólicas, de crecimiento y desarrollo, y de respuestas al estrés. La comparación entre especies y la identificación de módulos regulatorios relacionados con los factores de transcripción, permitirán diseñar plantas con mayor producción de biomasa o más tolerantes a diversos factores adversos del medio como la sequía, o incluso manipular rutas de biosíntesis de metabolitos. Por ejemplo, en maíz, las inserciones de los transposones Mutador y Spm modifican la expresión del gen a1, el cuál codifica la enzima deshidroflavonol reductasa (involucrada en la formación de los pigmentos flobafeno rojo y antocianina púrpura) y es indistintamente regulado por los factores de transcripción C1 y P de la familia MYB, determinando así la coloración del maíz (ver Figura 6-1) {Chuck, 2008 #627}.

Figura 6-1 Inserciones de transposones en el promotor del gen a1 afectan diferencialmente la transcripción mediada por los factores de transcripción P y C1 de la familia Myb (MaizeGDB)

Existen dos tipos de factores de transcripción: los basales o generales, y los regulatorios o específicos.

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6.2. Factores de transcripción basales Los factores de transcripción basales o generales pertenecen a un conjunto mínimo de proteínas requeridas para la iniciación de la transcripción (proteínas de unión a la caja TATA). Junto con la RNA polimerasa II, estas proteínas forman el aparato transcripcional básico, representando el núcleo de cada proceso transcripcional en plantas.

Para iniciar la transcripción del gen codificador de cualquier proteína, los factores de transcripción basales se unen a la RNA polimerasa II. Estos factores de transcripción son llamados TFIIA, TFIIB, y así sucesivamente. El promotor del gen a transcribir contiene una secuencia de DNA llamada caja TATA, la cual está localizada 25 nucleótidos corriente arriba del punto de iniciación de la transcripción. La caja TATA es reconocida y ligada al factor de transcripción TFIID, el cuál permite la unión al factor TFIIB. El resto de los factores generales de transcripción, así como la RNA polimerasa se ensamblan al promotor. El factor TFIIH usa ATP para separar la doble hélice en el punto de inicio de la transcripción, lo que da lugar al comienzo del proceso. El factor TFIIH también fosforila a la RNA polimerasa II, liberándola del complejo y con ello puede iniciar la elongación de la transcripción.

También se requiere de otros factores (proteínas) que activen o desactiven este proceso. En eucariontes, el aparato molecular que controla la transcripción está integrado por cuatro componentes. Los factores de transcripción basales o generales son esenciales para la transcripción, pero no pueden por si mismos incrementar o disminuir la tasa de transcripción. Esto lo llevan a cabo moléculas regulatorias conocidas como activadores y represores. Los activadores, y posiblemente los represores, se comunican con los factores basales a través de proteínas co-activadoras que están asociadas en un complejo a las proteínas que se unen a la caja TATA.

El reclutamiento de la RNA polimerasa al sitio de inicio de la transcripción es controlada por la región promotora localizada al lado 5´ del sitio de inicio de la transcripción, la cual contiene el promotor basal. Esta secuencia es contigua al sitio de inicio de la transcripción y se une a un número de factores generales de transcripción que forman el complejo de iniciación de la transcripción necesario para el reclutamiento de RNA polimerasa y el inicio de la síntesis de mRNA. Además de la región promotora basal que contiene la caja TATA y que está localizada a 30 o 40 pares de bases corriente arriba, existe la región promotora proximal, entre los 40 y los 200 nucleótidos corriente arriba, y la región promotora distal, más allá de los 200 pares de bases corriente arriba, que puede estar separada hasta por miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Estas regiones promotoras incluyen las secuencias de los potenciadores y de los silenciadores. Los potenciadores se unen a factores de transcripción que regulan la expresión de uno o varios genes. Los factores que se unen a los potenciadores median su respuesta interactuando directamente con el complejo de pre-iniciación de la transcripción en la región promotora del gen, o través de proteínas intermediarias llamadas co-activadores para iniciar la transcripción (Figura 6-16). ({Zhang, 2008 #629})

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Figura 6-2 Complejo RNA polimerasa II-factores generales de transcripción. Este complejo es suficiente para realizar transcripción específicamente en regiones que contienen un promotor en genes que codifican proteínas (Alberts et al., 2004).

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Figura 6-3. Aparato molecular que controla la transcripción en eucariontes {Hatzis, 2002 #115}.

En el modelo se explica la manera en que un complejo activador se forma a partir de la unión de varios factores de transcripción al potenciador y hacen contacto directo con el promotor gracias a la flexibilidad de la cadena de DNA, que permite el acercamiento físico de los tres tipos de secuencias promotoras (basal, proximal y distal). Las secuencias de los potenciadores localizadas en cis respecto a la región codificadora del gen se unen a factores de transcripción que conforman el complejo activador (Figura 6-2) {Griffiths, 2003 #109}. Este complejo entonces interacciona con factores de transcripción basales ensamblados al promotor al plegarse y entrar en contacto con las secuencias que intervienen en el proceso. Esta interacción puede ocurrir directamente o a través de un complejo de co-activadores que transmiten la señal desde uno o más complejos activadores a la maquinaria de transcripción basal para iniciar la transcripción (Figura 6-3).

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Figura 6-4. Plegamiento y flexibilidad del DNA que permite el inicio de la transcripción en eucariontes.

En 2006, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Roger Kornberg por sus aportaciones en torno a las bases moleculares de la transcripción en eucariontes. Con sus contribuciones en el estudio de la cromatina y el descubrimiento del mediador, un complejo de alrededor de 20 proteínas, cuya función es transmitir señales positivas o negativas desde los factores de transcripción regulatorios específicos de ciertos genes hasta la RNA polimerasa II y los factores de transcripción generales, se pudo establecer un nuevo modelo que incluye tres componentes esenciales de la regulación genética y transcripcional en eucariontes: los factores de transcripción generales, el mediador y la RNA polimerasa (Figura 6-4).

En bacterias, los activadores y represores de la transcripción interaccionan directamente con la RNA polimerasa y afectan su unión al promotor. En eucariontes, la cromatina y el mediador

157 constituyen nuevas etapas en la regulación entre factores de transcripción regulatorios de genes específicos y la RNA polimerasa II, lo que conduce a una mayor complejidad en la regulación {Liu, 2008 #626}.

Figura 6-5. Complejo de iniciación de la transcripción en eucariontes que incluye una secuencia de DNA, los factores de transcripción generales TBP, TFIIB, E, F y H, el mediador, la RNA polimerasa II y un factor de transcripción regulatorio unido a un potenciador.

Tarea 6-1. Consigue la perspectiva de Roger Kornberg (Kornberg 2007, PNAS vol 104, no.32) y haz un ejercicio reflexivo de cómo se fue dando el desarrollo del actual modelo de la transcripción en eucariontes. ¿Cuál fue el inicio del concepto? ¿Cómo se fue avanzando conforme transcurrieron los años? ¿Cuáles fueron los descubrimientos más notables que han permitido llegar al modelo actual? ¿Qué es lo que falta por hacer?

6.3. Factores de transcripción regulatorios

En contraste con los factores de transcripción generales o basales, los factores de transcripción regulatorios o específicos se unen de manera proximal y distal (corriente arriba o corriente abajo) al aparato de transcripción basal y actúan, ya sea como factores constitutivos o inducibles. Estas proteínas afectan la iniciación de la transcripción al entrar en contacto con componentes del aparato basal de la transcripción. Los factores de transcripción regulatorios ejercen funciones específicas hacia genes o tejidos y modulan la tasa transcripcional de sus genes blanco en respuesta a diferentes estímulos. En este capítulo el concepto factor de transcripción se refiere únicamente a los regulatorios (Figura 6-5).

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Figura 6-6. Los factores de transcripción pueden activar la transcripción a partir de su interacción con los promotores de múltiples genes, cada uno de los cuales puede estar involucrado en diferentes respuestas (A). De manera coordinada, los factores de transcripción regulan la expresión de múltiples genes involucrados en una ruta metabólica (B) (basado en Yanagisawa et al., 2004).

La gran diversidad de factores de transcripción y de elementos cis a los que se unen es la fuente de una enorme complejidad de combinaciones que permite el control de la expresión específica de genes y produce un gran espectro de fenotipos fisiológicos y del desarrollo. Por lo tanto, no es sorprendente que la manipulación de la expresión de los factores de transcripción con frecuencia resulte en cambios fenotípicos drásticos en el organismo, lo cual les hace muy interesantes candidatos para enfoques biotecnológicos (Figura 6-7).

Figura 6-7. Resistencia al ataque de larvas del insecto Bradysia impatiens en plantas de Arabidopsis sobreexpresan el gen que codifica el factor de transcripción HAHB4. A la derecha se presentan hojas de tres líneas transgénicas que sobreexpresan el factor de transcripción, mientras que a la izquierda se muestran hojas de tres líneas transformadas solo con el vector Las fotografías fueron tomadas un día después del ataque de las larvas. (Basado en Manavella et al., 2008). Se sabe que la evolución de las redes regulatorias es un importante actor en el desarrollo de innovaciones evolutivas y en consecuencia en la constitución de la diversidad biológica.

El registro y análisis de los factores de transcripción en eucariontes inició hace más de una década. Hoy en día, las secuencias de los genomas de varios cientos de organismos se encuentran disponibles y la secuenciación de otros tantos está en proceso. Actualmente se dispone de un análisis completo de cinco especies de plantas: arroz (Oryza sativa), arabidopsis (Arabidopsis thaliana), olmo (Populus trichocarpa), el musgo (Physcomitrella patens) y las algas (Ostreococcus tauri y Chlamydomonas reinhardtii), y de 18 especies más cuya secuenciación de

159 sus genomas va avanzando rápidamente. Los factores de transcripción pueden ser agrupados en diferentes familias de acuerdo a la estructura primaria o tridimensional de sus dominios de unión a DNA o de multimerización. En la Tabla 6-1 se indica el número de factores de transcripción encontrados hasta ahora en los genomas de las especies citadas y el número de familias en las que se agrupan.

Tabla 6-1. Factores de transcripción encontrados en los genomas secuenciados de plantas.

-Especie No. total Factores de Familias de % de factores de Transcripción factores de de Proteínas transcripción transcripción Ostreococcus tauri 8236 174 (173) 33 2.1 Chlarrydomonas 15256 229 (228) 38 1.5 reinhardtii Oriza sativa 30690 2516 (2352) 66 4.0 Arabidopsis thaliana 45555 2304 (2147) 68 7.5 Populus trichocarpa 62827 2723 (2697) 66 6.0 Physcomitrella patens > 20000 1274 (1264) 59 6.3 Zea mays - 764 55 - Triticum aestivum - 1127 57 - Hordeum vulgare - 618 55 - Sorghum bicolor - 397 54 - Saccharum - 1177 54 - officinarum Gosspium hirsutum - 1567 54 - Nicotiana tabacum - 2513 64 - Solanum tuberosum - 1341 61 - Lycopersycon - 998 62 - esculentum Vitis vinifera - 867 59 - Malus domestica - 1025 62 - Citrus sinensis - 599 60 - Lotus japonicus - 467 55 - Glycine max - 1891 53 - Medicago truncatula - 1022 60 - Helianthus agnus - 53 53 - Pinus taeda - 950 58 - Pinus glauca - 440 50 - Los números en paréntesis indican secuencias únicas de proteínas (basado en Riaño-Pachón et al., 2007 y {Guo, 2008 #110}.

Existen grandes familias de genes que codifican factores de transcripción, las que a su vez y en ocasiones están compuestas por subfamilias. En plantas se han identificado 68 familias de factores de transcripción, siendo las más numerosas las siguientes: MYB-(R1), R2R3, AP2/EREBP, bHLH, NAC, C2H2 (Zn), HB, MADS, bZIP, WRKY (Zn), GARP, Dof (Zn), CO-like (Zn), y GATA (Zn). Tomando el genoma de Arabidopsis thaliana como referencia, en el siguiente esquema se ilustran algunas de estas familias

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Figura 6-8. Relaciones y cambios de dominios en las principales familias de factores de transcripción en plantas. Las familias de genes están representadas por círculos, cuyo tamaño es proporcional al número de miembros de la familia. Los dominios que han sido cambiados y que conectan diferentes grupos de factores de transcripción están indicados con rectángulos, cuyo tamaño es proporcional a la longitud del dominio. Los dominios de unión a DNA están coloreados; otros dominios (usualmente dominios de interacciones proteína-proteína) se indican en cuadros achurados. Las líneas punteadas indican que un dominio dado es característico de Comentario [EVO5]: Cuáles una familia o subfamilia con la cual se conecta. Los nombres de los genes están escrito en ? cursiva {Riechmann, 2000 #181}.

Tarea 6-2. Consigue los artículos originales de Riaño-Pachón et al. (2007) y (2008) y de Guo et al. (2008) sobre bases de datos y análisis de factores de transcripción. Discute los métodos de análisis de dichos factores y analiza las diferencias que reportan los autores. ¿Qué hay sobre la evolución de los factores de transcripción desde las algas hasta las plantas superiores? ¿Existen todas las familias en los genomas secuenciados de las seis especies reportadas? ¿Cuál es la mayor diferencia en número de genes que codifican factores de transcripción entre angiospermas y gimnospermas? ¿Y entre monocotiledóneas y dicotiledóneas?

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6.4. Bases de datos sobre factores de transcripción en maíz

La base de datos de los factores de transcripción predichos en maíz se encuentra disponible en la dirección electrónica: http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/web/index.php?sp=zm Esta base de datos establece que en el genoma de maíz se han identificado hasta el momento 764 factores de transcripción, distribuidos en 55 familias diferentes de la manera siguiente:

Esta predicción se basa en la comparación de las secuencias descritas recientemente por Riaño- Pachón et al. (2007), y la función biológica de los mismos está siendo descifrada.

Se puede apreciar que las familias más numerosas predichas en maíz son C3H, MYB-related, bHLH, MADS, NAC, AP2-EREBP, AUX-IAA y bZIP. En adelante se hace una descripción de estas familias de genes, incluyendo los avances en los estudios de las funciones en la biología de la planta. En algunos casos se ilustra el efecto de la actividad de algún gen en la fisiología y el fenotipo de la planta.

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Tarea 6-3 Analiza y compara las familias de factores de transcripción que se han identificado en el genoma del maíz con los reportados en arabidopsis y en arroz. ¿Cuáles son los más numerosos en arroz? ¿Existe alguna similitud con lo que se tiene en maíz? ¿A qué crees que se deba?

6.5. Descripción de algunas familias

6.5.1.1. Factores AB13/VP1 En el genoma del maíz se han predicho 18 genes que codifican factores de transcripción ABI3- VP1. Las proteínas ABI3/VP1 son miembros de un gran grupo de factores de transcripción que actúan como intermediarios en la regulación de genes inducidos por la hormona ácido abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla. Alteraciones en las secuencias de estos genes afectan etapas posteriores en el desarrollo de la semilla y tienen efectos adversos en muchos procesos importantes tales como almacenamiento de reservas, dormancia y tolerancia de la semilla a la desecación. El factor ABI3 actúa en coordinación con varios factores de transcripción como LEC1, LEC2 and FUS3 en el control de la maduración de semillas; estas interacciones evitan que los genes asociados a la germinación y el crecimiento se activen con antelación. El factor de transcripción del maíz Viviparous1 (VP1) y el de Arabidopsis ABI3 son ortólogos. El factor ABI3/VP1 es una proteína que contiene varios dominios, que funciona tanto como activador como represor, dependiendo del contexto que haya en el promotor. Los dominios básicos B1, B2, y B3, se encuentran muy conservados entre los factores ABI3/VP1 de varias especies de plantas. El dominio B3 en el extremo carboxilo terminal (C-Terminal) del factor VP1 se une específicamente al elemento Sph en el promotor C1 del maíz, mientras que los dominios B1 y B2 localizados en el extremo amino terminal (N-Terminal) están implicados en la localización nuclear y la interacción con otras proteínas. El dominio localizado en el N -terminal, que funciona como activador y como represor es necesario y suficiente para activar o reprimir la expresión de VP1/ABI3 dependiente de ABA, en tanto que el dominio B3 localizado en el C- terminal es requerido para activar al gen blanco (Figura 6-9) {Lazarova, 2002 #146; Chen, 2007 #84}.

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Figura 6-9. Embriones del mutante vp1 (viviparous 1). Los embriones vp1 germinan antes de la maduración. Las semillas mutantes no tienen coloración (derecha), a menos que la cubierta de la mazorca sea removida (izquierda) para permitir la entrada de luz del sol (cortesía de S. McCormick y MaizeGDB).

El factor de transcripción IDEF1 del arroz, se une específicamente a IDE1, un elemento en cis que responde a deficiencia de hierro. IDEF1 pertenece a la familia de factores de transcripción ABI3/VP1. Plantas transgénicas de arroz que sobreexpresan el gen IDEF1 exhiben mayor tolerancia a deficiencia de hierro tanto en hidroponía como en suelos calcáreos.

Figura 6-10. Tolerancia a la deficiencia de hierro conferida por la expresión inducida del gen IDEF1 en arroz. A, fenotipos de plantas transgénicas tolerantes a deficiencia de hierro transformantes (líneas I2p-IDEF1 9 y 13) después de 5 días de tratamiento. B, Fenotipos de

164 plantas tranegénicas (líneas I2p-IDEF1 9, 12, y 13) 17 después de la siembra (Kobayashi et al., 2007).

6.5.1.2. Factores Alfin La secuencia rica en cisteínas Cys-X2-Cys-X11-Cys-Cys-X2-Cys-X4-His-X2-Cys-X9-His-X5-Cys- X2-Cys- codificada por el gen Alfin1 contiene un dedo de zinc y una estructura His/Cys y forma parte de un factor de transcripción asociado con tolerancia a NaCl en alfalfa (Medicago sativa L.). La proteína Alfin1 se une de manera específica al promotor del gen MsPRP2, el cual es inducible por NaCl. Los callos de alfalfa que sobreexpresan el gen Alfin1 muestran mayor resistencia a la inhibición del crecimiento que ejerce la concentración de 171 mM NaCl y crecen más, en comparación con callos testigo transformados con el vector vacío. Los callos que portan la construcción del gen Alfin1 en antisentido muestran más sensibilidad a NaCl y crecen menos. La proteína Alfin1 actúa como un regulador transcripcional en plantas y media la expresión del gen MsPRP2 en alfalfa en condiciones de estrés por salinidad. En maíz se encuentran 20 genes que potencialmente codifican factores de transcripción de esta familia.

6.5.1.3. Factores AP2/EREBP Esta familia de factores de transcripción es única en plantas. Las proteínas prototipo de esta familia son AP2 (APETALA2) y EREBPs (ethylene-responsive element binding proteins). Su característica distintiva es que contienen denominado dominio AP2 de unión a DNA. Algunas proteínas que contienen una copia del dominio AP2 incluyen EREBPs/ERFs (ethylene response factor), réplica-C/proteínas de unión a elementos que responden a la deshidratación (C-repeat/dehydration response element binding proteins o CBFs/DREBs), ABI4 y TINY. Otras proteínas contienen dos copias del dominio AP2, como AP2, ANT y los productos de la actividad de los genes spikelet1 (ids1) y Glossy15 (Gl15) en maíz. Los genes AP2/EREBP conforman una familia muy extensa y tienen papeles importantes a través del ciclo de vida de la planta, desde ser reguladores clave de numerosos procesos del desarrollo como la determinación de la identidad de órganos florales o el control de la identidad celular en la epidermis de la hija, hasta formar parte de los mecanismos usados por las plantas para responder a varios tipos de estrés tanto biótico como abiótico. En maíz, el gen branched silkless1 (bd1, el cual codifica un facto de transcripción tipo ERF) controla la identidad del meristemo de la espiga {Fujita, 2005 #107; Hirota, 2007 #117}.

Figura 6-11. Jilotes de plantas tipo silvestre y mutantes bd1-N. (A): Mazorca tipo silvestre con iniciación del primordio del pistilo. La mazorca no está ramificada. (B) Mazorca del mutante bd1 mostrando el desarrollo de múltiples ramas {Chuck, 2002 #88}.

El genoma del maíz contiene 33 genes que potencialmente codifican factores AP2/EREBP.

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6.5.1.4. Factores ARF Los factores de transcripción ARF (auxin-response factors) se unen con especificidad a elementos que responden a auxinas con secuencias TGTCTC, los cuales son encontrados en los promotores de genes que responden a auxinas. Las proteínas ARF1 contienen un dominio de unión a DNA en el extremo N-terminal (DNA-binding domain o DBD), el cual tiene cierta similitud con el dominio B3 del extremo C-terminal del factor de transcripción VIVIPAROUS 1 (VP1) de maíz. El factor ARF1 contiene un dominio en el extremo C-terminal(carboxyl-terminal domain o CTD) relacionado con los motivos III y IV encontrado en los CTD de proteínas inducidas por auxinas y citocininas (Aux/IAA proteins). Los CTDs en ARF1 y proteínas Aux/IAA facilitan la dimerización entre miembros tanto de ARF como de proteínas Aux/IAA. Algunas ARF contienen regiones intermedias (que separan los dominios DBD de los CTD) que funcionan como motivos de activación transcripcional y la potencian. En arabidopsis, miembros de la familia de genes KANADI regulan la identidad abaxial y el crecimiento laminar de órganos laterales. Mutaciones en el gen ETTIN (ETT; también conocido como Auxin Response Factor3 o ARF3) potencian la sobreexpresión de KANADI. Mutantes dobles de los genes ett y ARF4 muestran transformaciones de los tejidos abaxiales a adaxiales en toda la parte aérea, con fenotipos muy parecidos a mutantes KANADI. En maíz existen 16 genes ARF.

6.5.1.5. Factores ARID Las proteínas ARID constituyen una familia de dominios de unión a DNA homólogos. Debido a que las primeras proteínas ARID caracterizadas interactúan con secuencias específicas ricas en AT, el motivo fue denominado dominio de interacción rico en AT o ARID (del inglés AT-rich interaction domain). Los dominios ARID ocurren en una amplia variedad de especies, desde plantas hasta levaduras, nematodos, insectos y mamíferos. Todas las proteínas ARID caracterizadas muestran actividad de unión al DNA, pero no muestran ninguna similitud con otros motivos de unión a DNA previamente caracterizados. Los genes que codifican estas proteínas están implicados una gran variedad de procesos biológicos, incluyendo desarrollo embrionario, regulación genética del linaje celular, y control del ciclo celular. Estas proteínas regulan tanto positiva como negativamente la transcripción, y participan en la modificación de la estructura de la cromatina. En leguminosas, la señal del factor Nod del rizobio es percibido por receptores tipo cinasa como SymRK. El gen NIN (Nodule Inception) en Lotus japonicus es requerido para permitir la entrada del rizobio en las células de la raíz y para la organogénesis del nódulo. El factor de transcripción SIP1 interactúa con la proteína SymRK y contiene un dominio ARID. La proteína SIP1 se une específicamente al promotor del gen NIN y reconoce dos de tres dominios ricos en AT en el promotor del gen NIN. Este factor de transcripción es requerido para activar la expresión del gen NIN y está involucrada en las etapas iniciales de comunicación entre el rizobio y la célula huésped de la raíz. El genoma del maíz contiene solo un gen ARID. ({Kortschak, 2000 #137})

6.5.1.6. Factores AS2/LOB El gen ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) de arabidopsis está involucrado en el establecimiento del sistema de nervaduras en la hoja, el cual incluye la nervadura central y el desarrollo de una lamina uniforme. El factor de transcripción codificado por este gen es una proteína con réplicas de cisteína (llamadas motivo-C) y una secuencia tipo-cierre de leucina en el extremo N-terminal. El genoma de arabidopsis contiene 42 genes putativos que potencialmente codifican proteínas que conservan el motivo-C y los cierres de leucina y constituyen así, la familia AS2. Una variante de esta familia es la ASL (AS2-like proteins). Transcritos del gen AS2 se encuentran en los dominios adaxiales de primordios cotiledonales. La sobreexpresión del cDNA del gen AS2 en plantas transgénicas de arabidopsis ocasiona enchinamiento hacia arriba en las hojas, muy diferente al que ocasiona la represión de la expresión del gen, con fenotipos con hojas enchinadas hacia abajo. En maíz solo dos genes codifican este tipo de proteínas, relacionadas

166 con embriogénesis. El desarrollo del saco embrionario en angiospermas da inicio con una fase de división libre del núcleo, seguida por celularización y diferenciación celular. El gen indeterminate gametophyte1 (ig1) de maíz restringe la fase proliferativa del desarrollo del gametofito femenino. La mutante ig1 muestra una fase prolongada de división libre del núcleo conducente a una variedad de anormalidades del saco embrionario, incluyendo un número excesivo de células huevo, núcleos polares y sinérgicas que dan origen a semillas deformes Comentario [ATF6]: Esto (Figura 6-12). El gen ig1 codifica una proteína LOB (LATERAL ORGAN BOUNDARIES) con alta está bien? afinidad al gen ASYMMETRIC LEAVES2 de arabidopsis, ambos miembros de la familia de genes AS2/LOB.

Figura 6-12. Fenotipos de mutantes ig1. A, mazorca de planta tipo silvestre; B, mazorca del mutante ig1-O/ig1-O; C, mazorca del mutante ig1-mum/ig1-mum ({Evan, 2007 #104})

6.5.1.7. Factores AUX/IAA Los genes Aux/IAA representan una de las familias más grandes de factores de transcripción en maíz, con 32 miembros. Estos genes muestran una rápida inducción en respuesta a la auxina ácido indolacético o IAA). Este tipo de genes parecen ser únicos en el reino de las plantas, encontrándoseles tanto en monocotiledóneas (maíz y arroz) como en dicotiledóneas (chícharo, soya, Medicago truncatula, arabidopsis, tomate, tabaco y algodón) y en ginmospermas (pináceas). Las proteínas Aux/IAA canónicas comparten cuatro motivos de aminoácidos conservados llamados dominios I, II, III y IV. El dominio II se encuentra bien conservado y las mutaciones que ocurren en él incrementan la actividad de las proteínas correspondientes, estabilizándolas. Los dominios III y IV pueden mediar homo- y heterodimerización entre proteínas Aux/IAA y proteínas ARF (las cuales comparten estos dominios). En Arabidopsis thaliana, mutaciones en el gen AXR3 ocasiona cambios en diversas respuestas a auxinas. Tanto el crecimiento de la parte aérea como de la raíz son afectados por estas mutaciones (arx3-1, arx3-2 y arx3-3). La importancia funcional de este y otros genes de la familia AUX/IAA demuestran que las proteínas AUX/IAA intervienen de manera determinante en la señalización por auxinas en plantas. En maíz, la proteína ABP (auxin-binding protein, también conocida como AUX y AXR) actúa como receptor de auxinas. Mutaciones en los genes Abp1 y Ahp4 no ocasionan aberraciones fenotípicas, lo que sugiere redundancia funcional de esta familia de genes en maíz {Leyser, 1996 #149; Rouse, 1998 #185}.

6.5.1.8. Factores BBR-BPC Las proteínas BBR-BPC se unen a genes que contienen motivos (GA)8 o (GA/TC)8 en sus regiones promotoras. BPC1 deriva de BASIC PENTACYSTEINE1, un factor regulador de la expresión del gen homeótico SEEDSTICK (STK), el cual controla la identidad de los óvulos en arabidopsis. Por su parte, BBR deriva de barley b recombinant (BBR), proteína que se une de manera específica a secuencias (GA/TC)8 y activan los genes respectivos. La sobreexpresión de este gen en tabaco conduce a una modificación muy pronunciada de la morfología de la hoja. En arabidopsis, el motivo (GA/TC)8 ocurre entre las 1500 bp corriente arriba a partir del codón de

167 inicio de algunos genes homeóticos. Solo tres genes BBR-BPC son predichos en el genoma del maíz {Kooiker, 2005 #135}.

6.5.1.9. Factores BES1 Los brasinoesteroides (BR) señalizan a través de receptores de cinasa localizados a nivel membrana plasmática para regular el crecimiento y desarrollo en plantas. La proteína BES1 (BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1), se acumula en el núcleo en respuesta a BR, donde tiene una función en la expresión de genes regulados por BR. BES1 es un factor de transcripción que se une a las regiones promotoras de genes regulados por BR y los activa. BES1 interacciona con una proteína básica hélice-bucle-hélice, la BIM1, para unirse sinérgicamente a la caja E (consenso CANNTG) presente en muchos promotores inducidos por BR. La sobreexpresión y la represión del gen BIM1 y los miembros cercanos de esta familia muestran fenotipos que responden a BR. En el genoma del maíz existe sólo un gen predicho que codifica potencialmente un factor de transcripción de tipo BES.

6.5.1.10. Factores bHLH Las proteínas bHLH (basic/helix-loop-helix) constituyen una superfamilia de factores de transcripción con funciones regulatorias que controlan diversos procesos biológicos, desde la proliferación celular hasta el establecimiento del linaje celular. El dominio bHLH contiene 60 aminoácidos con dos regiones funcionales distintas. La región básica, localizada en el extremo N-Terminal del dominio está involucrada la unión al DNA y contiene 15 aminoácidos con un número considerable de residuos básicos. La región HLH, localizada en el extremo C-Terminal, funciona como dominio de dimerización y está constituida principalmente por residuos hidrofóbicos que forman dos hélices alifáticas separadas por una región que forma un bucle de longitud y constitución variada. Fuera del dominio conservado, estas proteínas muestran amplia divergencia. En plantas, la organogénesis es controlada por el transporte polar de auxinas. En maíz, el gen barren inflorescence2 (bif2) codifica un co-ortólogo de la serina/treonina proteína cinasa PINOID (PID), el cual regula el transporte de auxinas en arabidopsis. El factor de transcripción BARREN STALK1 (BA1), un miembro de la familia bHLH, es el blanco de BIF2 (Tanto bif2 como ba1 son requeridos para la iniciación de meristemos axilares durante el desarrollo de la inflorescencia en maíz. La cinasa BIF2 fosforila al factor BA1 in vitro. Mutantes del gen ba1 muestran deformación en el desarrollo de inflorescencias y mazorcas {Li, 2006 #151}.

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Figura 6-13. Fenotipo del mutante ba1 (baf1) que muestra deformaciones en el desarrollo de la mazorca debido a alteraciones en la secuencia de nucleótidos del factor de transcripción BARREN STALK1 (MaizeGDB). En el genoma del maíz se predicen 34 genes bHLH

6.5.1.11. Factores bZIP Los factores de transcripción bZIP (basic leucine zipper) contienen una estructura bipartida de unión a DNA, la cual es rica en aminoácidos básicos adyacentes a un cierre de leucina. La región básica es la que entra en contacto con el DNA, en tanto que el cierre de leucina media la homodimerización y heterodimerización de monómeros protéicos. La familia de factores bZlP de arabidopsis que se unen a cajas-G (GBF1, GBF2, y GBF3) interaccionan con el motivo palindrómico de la caja-G (secuencia CCACGTGG) encontrado en numerosos promotores en plantas. La especificidad de unión a DNA del factor es afectada por la naturaleza de los nucleótidos que flanquean la secuencia central ACGT. Existe una conexión entre la señalización por los factores bZIP y el ácido salicílico (SA). Los factores bZIP se unen a elementos tipo-secuencia de activación as-1 (activating sequence-1) que son elementos en cis que responden a SA, encontrados en promotores de genes inducibles por SA. TGA2.2 constituye el principal componente del factor-1 de unión a as-1 (as-1-binding factor-1 o ASF-1) en tabaco. TGA2.1, constituye una fracción menor del complejo. Ambas proteínas interactúan con NPR1, una proteína esencial para la inducción de genes por SA. La reducción en la actividad de las proteínas TGA2.2 y TGA2.1 se correlaciona con un decremento significativo en la actividad de ASF-1 y con una inducibilidad reducida de genes que responden a SA. En contraste, la sola reducción de TGA2.1 no tiene efecto en la expresión de de los genes blanco. La expresión de la mutante TGA2.2 incapaz de formar heterodímeros con el reservorio endógeno de factores TGA conlleva a una inducibilidad reducida mediada por SA en el gen Nt103, lo que indica que el cierre de leucina nativo es importante para que la proteína actúe positivamente en la transcripción. Plantas con una expresión reducida de TGA2.1 desarrollaron

169 estambres tipo pétalo, lo que indica que esta proteína ejerce un papel regulatorio sobre la definición de la identidad de órganos en flores de tabaco. En maíz, las zeinas son codificadas por una familia de genes expresados de manera coordinada en el endospermo de la semilla durante su desarrollo. La acumulación de zeinas es regulada a nivel transcripcional por reguladores transcripcionales del tipo bZip, entre ellos Opaque-2 (O2). La proteína O2 intreracciona directamente con el promotor de genes de zeina, y esta interacción es mediada por su dominio bZIP de unión al DNA. En el genoma del maíz existen 65 factores de transcripción bZIP predichos.

Figura 6-14. Fenotipos de mazorca de maíz con mutación en el gen op-2 que codifica un factor de transcripción tipo bZIP (MaizeGDB)

6.5.1.12. Factores tipo C2C2-CO Los genes CO (CONSTANS) actúan entre los relojes circadianos y los genes que controlan la identidad meristemática. En arabidopsis, los factores de transcripción CO contienen dos dominios conservados. El primero es un dedo de zinc localizado cerca del C-Terminal, que asemeja una caja-B y el cual regula interacciones proteína-proteína. El segundo es una región de 43 aminoácidos cercana a la Terminal-C llamada dominio CCT (CO, CO-like, TOC1). Estos factores constituyen de manera importante a la regulación de la floración, conectando los relojes circadianos y las señales de luz con el tiempo para florecer. El gen CONSTANS-LIKE 9 (COL9) es un miembro de esta familia que codifica un factor de transcripción de localización nuclear. La expresión den gen COL9 está regulada por relojes circadianos en la ruta fotoperiódica. La sobreexpresión de este gen en plantas transgénicas de arabidopsis ocasiona retardo en la floración, en tanto que la co-supresión y la inserción de T-DNA produce floración temprana en condiciones de días largos. En comparación con plantas tipo silvestre, la abundancia de transcritos de genes CO y FLOWERING LOCUS T (FT) es reducido en plantas transgénicas que sobreexpresan el gen COL9, lo que indica que dicho gen está involucrado en la regulación de la floración al reprimir la expresión de otros genes CO, y en consecuencia la del gen FT, retardando con ello la floración. La floración en el maíz moderno no es afectada por el fotoperiodo. Sin embargo, el gen conz1 y otros dos genes homólogos a genes fotoperiódicos exhiben expresión diurna muy similar a la de CONSTANS (CO) en arabidopsis lo que sugiere que el maíz es capaz de discernir entre variaciones en fotoperíodo y responder con expresión diferencial del gen conz1, el cuál muestra gran homología a los genes fotoperíodocos CO de arabidopsis y Heading date1 (Hd1) de arroz, último con el cual también muestra sintenia. En el genoma de maíz se predicen 12 genes que codifican factores tipo C2C2-CO {Cheng, 2005 #85}.

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6.5.1.13. Factores C2C2-Dof La familia de proteínas Dof (DNA binding with one finger), una clase particular de factores de transcripción con dedos de zinc, caracterizada por una región conservada de 50 aminoácidos con una estructura de dedo C2-C2 asociada a la región básica, se une específicamente a secuencias de DNA con un consenso 5'-T/AAAAG-3'. Las proteínas Dof participan en la regulación de la expresión de genes en procesos como la síntesis de proteínas de almacenamiento en el endospermo en desarrollo en semillas, genes regulados por la luz involucrados en el metabolismo de carbohidratos, mecanismos de defensa en plantas, germinación de semillas, respuestas a gibberelinas en la aleurona después de la germinación, respuestas a auxinas y regulación genética en las células guarda de los estomas. En maíz, el factor de transcripción Dof1 (MNB1) se expresa me manera constitutiva en hojas, tallos y raíces, mientras que el Dof2 es expresado principalmente en tallos y raíces (ref). El factor Dof1 actúa como activador transcripcional, en tanto que Dof2 lo hace como represor de la transcripción. Otro factor de transcripción tipo Dof de maíz, la proteína PBF activa la transcripción del gen γ-zein durante el desarrollo de la semilla (ref). Tres genes en maíz potencialmente codifican proteínas C2C2-Dof.

6.5.1.14. Factores C2C2-GATA Los factores de transcripción de unión a secuencias GATA comprenden una familia de proteínas cuyos miembros contienen ya sea uno o dos dominios de unión a DNA tipo dedos de zinc bien conservados. En arabidopsis, estas proteínas están implicadas en la regulación de la transcripción en respuesta a estímulos de luz y medían la expresión de genes homeóticos florales. La especificación de la identidad de pétalos y sépalos está determinada por la acción de dos proteínas: APETALA3 (AP3) y PISTILLATA (PI). La inducción de la actividad del gen AP3 altera la expresión del gen GNC (GATA, nitrate-inducible, carbon-metabolism-involved), el cual codifica una proteína GATA implicada en la regulación de la biosíntesis de clorofila y en el metabolismo del Carbono (C) y del Nitrógeno (N). El parólogo de GNC, el gen GNL (GNC-like), también es regulado negativamente por las proteínas AP3 y PI. Análisis de mutantes simples y dobles gnc y gnl indican que estos dos genes comparten roles redundantes en la promoción de la biosíntesis de clorofila y actúan para regular cascadas transcripcionales necesarias para integrar la energía necesaria que requieren los procesos de desarrollo y respuestas a estímulos ambientales para promover una diferenciación apropiada de órganos florales. En el genoma del maíz se predice solamente un gen C2C2-GATA {Shikata, 2004 #194}.

6.5.1.15. Factores C2C2-YABBY Los factores de transcripción C2C2-YABBY contienen dos dominios conservados: un dominio C2C2 tipo-dedo de zinc en el extremo N-terminal y una secuencia hélice-bucle-hélice o dominio YABBY en el extremo C-terminal, el cual es similar a las primeras dos hélices de la caja HMG. Los genes YABBY están expresados de una manera polarizada en todos los órganos laterales generados por los meristemos florales y apicales. La pérdida de la expresión de estos genes resulta en ausencia de diferenciación polar en células tipo en órganos laterales, en tanto que la sobreexpresión de los mismos ocasiona que los órganos laterales se hagan abaxiales. La expresión de estos genes está correlacionada con el destino abaxial de los órganos. Los miembros de esta familia de genes actúan de manera redundante para especificar la identidad abaxial en órganos laterales producidos por meristemos apicales y florales. En maíz se predicen 10 genes que potencialmente codifican factores de transcripción C2C2-YABBY{Dai, 2007 #614; Siegfried, 1999 #193}.

6.5.1.16. Factores C2H2-ZPT2 Numerosos factores de transcripción con dominios C2H2 tipo dedos han sido caracterizados en plantas. La secuencia ZF (zinc finger) canónica (CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H) contiene dos

171 cisteinas y dos histidinas que coordinan un átomo de zinc, creando un dominio de unión DNA. Estos factores de transcripción tienen funciones cruciales en el desarrollo de plantas y otros eucariontes. En arabidopsis, cuatro genes C2H2-ZPT2 codifican las proteínas AZF1, AZF2, AZF3, y STZ). Las proteínas AZFs y STZ se unen a secuencias A (G/C) T que se encuentran entre la secuencia EP2 conocida como secuencia blanco de algunas proteínas ZPT2 de petunia (Petunia hybrida). Las cuatro proteínas ZPT2 actúan como represores transcripcionales que reducen la expresión de otros factores de transcripción. La expresión de los genes AZF2 y STZ es inducida fuertemente por deshidratación, alta salinidad y frío, así como por la aplicación externa de ABA. Plantas transgénicas de arabidopsis que sobreexpresan el gen STZ muestran crecimiento retardado y tolerancia a estrés por sequía. Por lo tanto, las proteínas AZF2 y STZ funcionan como represores transcripcionales, que incrementan la tolerancia al estrés retardando el crecimiento. En maíz se predicen 14 genes que potencialmente codifican factores de transcripción C2H2-ZPT2 {Li, 1998 #154; Chrispeels, 2000 #91}.

6.5.1.17. Factores C3H/CCCH Los genes de la familia C3H/CCCH codifican proteínas con dedos de zinc que contienen un motivo con tres cisteínas y una histidina. Tienen importantes funciones en el procesamiento del RNA como proteínas de unión al RNA en animales. En arroz y arabidopsiss e han identificado más de 65 genes de este tipo en cada especie, expresados de manera diversa en tejidos y en respuesta al estrés biótico y abiótico (ABA, salinidad, frío, manitol, hipoxia y estrés osmótico), lo que sugiere que pueden tener funciones importantes en la tolerancia al estrés. Estos genes fueron aislados primeramente de embriones en arabidopsis. El gen PEI, codifica una proteína que contiene un dominio de dedo de zinc tipo Cys3His y es expresado en el embrión desde la fase globular hasta la madurez del cotiledón. Estos genes están presentes en arabidopsis, arroz, algodón, maíz, olmo y pináceas y tienen funciones regulatorias. En el genoma de maíz se predicen 57 genes que pueden codificar proteínas C3H/CCCH.

6.5.1.18. Factores CCAAT (CBT, CP, Dr1, HAP, NY-F) El motivo CCAAT es un elemento ubicuo encontrado en los promotores de genes eucariontes. El factor nuclear Y (Nuclear Factor Y o NF-Y) es un complejo trimérico que se une al motivo CCAAT. En mamíferos y levadura, las tres subunidades del complejo NF-Y (NF-YA, NF-YB y NF- YC) están representadas por genes simples. En plantas, numerosos genes codifican cada subunidad. El genoma del trigo contiene 37 genes NF-Y y Dr1 (10 genes NF-YA, 11 NF-YB, 14 NF-YC y 2 Dr1) expresados de manera predominante en el endospermo de la semilla. Tres de estos genes son inducidos por la sequía. En el genoma de arroz se encuentran 10 genes HAP2, 11 HAP3 y siete HAP5. Estos factores de transcripción de la familia CCAAT también son conocidos como CBF, CP, Dr1, HAP o NF-Y indistintamente dependiendo de la especie, y controlan varios aspectos del crecimiento y el desarrollo en arroz. También se encuentran representados en maíz, arabidopsis, Medicago truncatula y Brassica napus. Los homólogos en arabidopsis regulan la floración en condiciones de fotoperiodos largos y responden al estrés osmótico. La expresión del factor de transcripción nuclear tipo Y (NF-Y), AtNF-YB1, confiere mejora la respuesta de plantas de Arabidopsis sometidas a sequía. El gen ZmNF-YB2, un ortólogo del AtNF-YB1 encontrado en maíz, también confiere mayor tolerancia a sequía en plantas transgénicas de maíz (Figura 6-15). En total se predicen cuatro genes CCAAT en maíz {Cai, 2007 #80; Gusmaroli, 2002 #113; Li, 1992 #153}.

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Figura 6-15. Plantas tipo silvestre y transgénicas de maíz en invernadero y en campo. Las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen ZmNF-YB2 muestran evidencias visuales de mayor tolerancia a la sequía. En ambas fotografías las plantas tipo silvestre se encuentran a la izquierda (Nelson et al., 2007).

6.5.1.19. Factores CPP Los genes CPP codifican una pequeña familia de proteínas que presenta dos dominios conservados denominados CXC, los cuales son ricos en cisteína. Estás proteínas están restringidas exclusivamente a plantas, en donde participan en procesos de desarrollo de tejidos reproductivos y control de la división celular. En soya, los genes Nodulin se expresan específicamente en los nódulos que fijan nitrógeno en la raíz. El factor de transcripción CPP1 interactúa con la región promotora del gen Gmlbc3 (Glycyne max leghemoglobin). El dominio de unión a DNA del factor CPP1 contiene dos motivos ricos en cisteína con 9 y 10 residuos de este aminoácido, respectivamente. Genes similares han sido identificados en Arabidopsis thaliana. El gen cpp1 es inducido en etapas tardías del desarrollo del nódulo. El factor CPP1 está involucrado en la regulación de genes leghemoglobin en el nódulo simbiótico de raíces de leguminosas. En el genoma del maíz se predicen 10 genes que codifican factores CPP {Cvitanich, 2000 #94}.

6.5.1.20. Factores E2F-DP La familia E2F-DP (E2 promoter-binding protein-dimerization partner) de factores de transcripción tiene un papel determinante en el control del ciclo celular al regular la transcripción de genes involucrados en el desarrollo de la fase G1 a la fase S. En tabaco existen genes que contienen sitios de unión a factores E2F, los cuales funcionan como elementos en cis, esenciales para la expresión de genes que regulados por el ciclo celular. Nueve genes E2F-DP son los que se predice existen en el genoma de maíz {De Jager, 2001 #97}.

6.5.1.21. Factores EIN/EIL El etileno es un regulador del crecimiento vegetal que controla diversas etapas del crecimiento y respuestas a estrés. Los factores de transcripción de la familia EIN (ETHYLENE INSENSITIVE) están involucrados en la regulación de las respuestas de la planta a este regulador del crecimiento. EIN3 un factor de transcripción clave que media la expresión de genes regulados por etileno. Los genes de Vigna radiata VR-EIL1 y VR-EIL2 (Vigna radiata EIN-like) codifican proteínas tipo-EIN3. En presencia de etileno, se incrementan los niveles de la proteína EIN3. En ausencia de etileno, la proteína EIN3 es rápidamente degradada a través de una ruta ubiquitina/proteosoma mediada por dos proteínas caja-F, EBF1 y EBF2. Otra proteína, la EIN5, antagoniza la regulación negativa de EIN3, al promover la reducción del la tasa de transcripción

173 de EBF1 y EBF2, lo que permite la acumulación de la proteína EIN3, que regula la respuesta a etileno. En maíz, el endospermo de la semilla sufre de muerte celular programada al final de su desarrollo, de manera que, a excepción de la aleurona, el tejido está muerto al final de la etapa de maduración. Dos miembros de esta familia de factores de transcripción, EIN2 y EIL, intervienen en la recepción y transducción de señales de etileno que medían la muerte celular programada. En total se predicen seis genes EIL en el genoma del maíz {Lee, 2003 #147}.

6.5.1.22. Factores FHA El dominio forkhead (FH) es una región de unión a DNA bien conservada que consta de 110 aminoácidos, que se encuentra en los factores de transcripción FHA. Estas proteínas están involucradas en el procesamiento de rRNA y en la regulación del ciclo celular y el crecimiento. Además del dominio forkhead, algunos factores de transcripción forkhead también poseen un dominio forkhead asociado (forkhead-associated,domain FHA). En Arabidopsis, un gen FHA denominado DDL regula múltiples aspectos del desarrollo de la planta. Líneas transgénicas donde se reprime la expresión del gen por inserciones de T-DNA muestran retardo en el crecimiento, emisión de raíces, flores y tallos defectuosos, y menor producción de semillas que las plantas tipo silvestre. En el genoma del maíz se predicen 10 genes FHA.

6.5.1.23. Factores GARP-ARR-B El genoma de arabidopsis codifica 22 reguladores de respuestas (ARR), 12 de los cuales contienen un domino de unión a DNA tipo-MYB llamados ARRM (tipo B). El resto (tipo A) poseen solo un dominio de recepción de señales que contiene dos aspartatos y una lisina (DDK) en una posición fija, y sus genes son inducidos por citocininas sin que tenga lugar una síntesis de proteínas de novo. Los miembros del tipo B llamados ARR1 y ARR2 se unen al DNA de manera específica y trabajan como activadores transcripcionales. La proteína ARR1 media señales de citocininas a través de un dominio receptor de señales de citocininas localizado en el extremo N- terminal Un regulador de respuestas parálogo, ARR2, muestra funciones muy similares a ARR1,indicando redundancia. Las respuestas reducidas a citocininas observadas en la mutante arr1-1 pueden ser provistas por la actividad de ARR2. Además de ARR6, otros miembros del tipo A, incluyendo ARR4, ARR5, ARR7, ARR8, y ARR9, también fueron activados por DEX, lo que sugiere que todos los genes que responden a citocininas de manera inmediata y que pertenecen a este grupo son directamente activados por ARR1. En maíz se predicen sólo tres genes de esta familia.

6.5.1.24. Factores GARP-G2 Las proteínas GLK son miembros de de superfamilia GARP de factores de transcripción, que incluye a G2 en maíz; las proteínas ARR-B de arabidopsis (RESPONSE REGULATOR-B) y la proteína PSR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1) de Chlamydomonas. La proteína G2 es capaz de transactivar la expresión de genes reporteros y puede homodimerizar o heterodimerizar con ZmGLK1. En arroz y arabidopsis, los factores GLK están expresados en tejidos fotosintéticos. Es posible que estas proteínas funcionen como reguladores en el desarrollo de cloroplastos. En el genoma de maíz, se predicen tres genes GARP.

6.5.1.25. Factores GeBP Los tricomas en arabidopsis son pelos de una sola célula que surgen de la epidermis. La iniciación de tricomas requiere de la activación del gen GLABROUS1 (GL1), cuya expresión en células de la epidermis y de los tricomas depende de la presencia de un elemento regulatorio 3'- cis y la proteína GeBP (GL1 enhancer binding protein) se une a este elemento regulatorio. GeBP y sus tres homólogos en arabidopsis comparten dos regiones: una región central sin motivos conocidos y una región en el xtremo C-terminal, con un motivo tipo cierre de leucina. La proteína KNAT1, producto de un gen KNOX, es un activador transcripcional de GeBP, lo cual indica que

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GeBP actúa como un represor del destino morfológico de células en la hoja. No se han identificado proteínas homólogas fuera del reino de las plantas. En maíz se predice la existencia de dos genes GeBP {Chevalier, 2008 #86}.

6.5.1.26. Factores GIF Las proteínas GRF o factores reguladores del crecimiento (growth-regulating factor) modulan el crecimiento y desarrollo en hojas y cotiledones en arabidopsis. La región C- terminal de las proteínas GRF presenta actividad de transactivación. Otra familia de proteínas, los factores que interactúan con GRF (GRF-interacting factor o GIF), comprende tres miembros. La región N- terminal de la proteína GIF1 interacciona con GRF1. Al igual que los mutantes grf, el mutante gif1 y las plantas transgénicas desarrollaron hojas y pétalos más pequeños que las plantas tipo silvestre. Las proteínas GRF1 y GIF1 actúan como activador y coactivador transcripcionales, respectivamente, y son parte de un complejo involucrado en la regulación del crecimiento y la forma de hojas y pétalos, a través de la promoción o el mantenimiento de la proliferación celular en los primordios foliares o florales. En maíz se predice únicamente un gen que codifica potencialmente un factor de transcripción GIF.

6.5.1.27. Factores GRAS Mutaciones en el locus SCARECROW (SCR) en Arabidopsis ocasiona aberraciones en el patrón de distribución radial de raíces y tallos. La proteína que codifica este locus es un factor de transcripción denominada SCARECROW-LIKE (SCL) y conforma una familia de proteínas junto con otros factores similares, entre los que se encuentran la GAI (GIBBERELLIN-INSENSITIVE) y la RGA (REPRESSOR of ga1-3). De estas tres primeras proteínas estudiadas (GAI, RGA, SCR) es que se ha derivado el nombre de GRAS para toda la familia. El gen Zea mays SCARECROW (ZmSCR) de maíz es el ortólogo de SCR y es capaz de complementar el fenotipo de la mutante scr de arabidopsis, lo que sugiere, que las funciones entre mono y dicotiledóneas se han conservado {Pysh, 1999 #179}.

6.5.1.28. Factores GRF El gen GROWTH-REGULATING FACTOR1 de arroz (OsGRF1) codifica un factor de transcripción que desempeña una función regulatoria en la elongación del tallo en arroz. En arabidopsis, las proteínas AtGRP están compuestas de nueve miembros, los cuales contienen dos regiones características, una QLQ (Gln, Leu, Gln) y otra WRC (Trp, Arg, Cys). La mayoría de los genes AtGRF son expresados fuertemente en tejidos en crecimiento activo. La sobreexpresión y la mutación de los genes AtGRF1 y ATGR2 ocasionan alteraciones en el crecimiento de la raíz, como resultado de un incremento o decremento del tamaño de las células, respectivamente, lo que indica que las proteínas AtGRF presentan un papel en la regulación de la expansión celular en hojas. En el genoma del maíz se predicen 50 proteínas GRAS, mientras Comentario [EVO7]: Estas que en arroz este número asciende a 52. no son las del apartado anterior? 6.5.1.29. Factores HB El dominio homeobox es una secuencia consenso de 180 pb presente en un número de genes involucrados en procesos de desarrollo. De acuerdo a la conservación de secuencias, los genes que codifican dominios HB pueden ser subdivididos en diferentes familias, cada una con un número considerable de miembros. Estudios evolutivos indican que las diferentes subfamilias muestran divergencia anterior a la separación de animales, plantas y hongos. De acuerdo con ello, miembros de diferentes subfamilias muestran propiedades estructurales y funcionales muy características y que les diferencian de los demás. Por ejemplo, los genes tipo-kn1 están involucrados en diferentes aspectos del control de la determinación del destino de la célula en meristemos apicales; los genes HD-Zip, que codifican proteínas que contienen motivos de cierre de leucina adyacentes a dominio HB, operan en etapas tardías del desarrollo; y los genes tipo-

175 gl2 están involucrados en diferenciación celular de la epidermis. En el genoma de arabidopsis existen 89 genes HB, los cuales pueden ser clasificados en diferentes grupos de acuerdo a la presencia de dominios conservados. De ese total, 48 codifican proteínas HD-Zip (homeodomain- leucine zipper). Otras subfamilias son HD-PHD, Tale-HD y tipo-WUS. En maíz, el gen Knox7, un miembro de la familia de la clase 2 de genes HB, es expresado en los embriones de la semilla durante la germinación. En el mismo tejido, la expresión de este gen es estimulada por ABA, pero inhibida por ácido giberélico (GA), dos hormonas que controlan el proceso de germinación. En el genoma del maíz se predicen 16 genes que codifican proteínas HB {Manavella, 2008 #158}.

6.5.1.30. Factores HMG Las proteínas del grupo de alta movilidad (High mobility group proteins (HMG) constituyen una familia de componentes de bajo peso asociadas a la cromatina. En plantas, estas proteínas se presentan en dos subfamilias denominadas HMGA y HMGB. Las proteínas HMGA (Figura 6-16) se caracterizan por la presencia de cuatro motivos AT-hook de unión a DNA, mientras que las proteínas HMGB (Figura 6-17) contienen un dominio de unión a DNA de tipo caja HMG. Las proteínas HMG están involucradas en la regulación de la transcripción y otros procesos dependientes del DNA. En maíz se ha identificado la interacción de la proteína recombinante HMGA y cinco proteínas HMGB con mononucleosomas purificados a partir de cromatina de la semilla. En maíz se predice la existencia de un total de 23 genes que potencialmente codifican proteínas HMG {Launholt, 2006 #142; Launholt, 2007 #141; Lichota, 2003 #155}.

Figura 6-16. Estructura de factores de transcripción HMGA

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Figura 6-17. Estructura del Dominio HMG

6.5.1.31. Factores HSF Durante las fases iniciales del estrés por calor, los factores de transcripción HSF (heat shock transcription factor) son las primeras moléculas en transmitir las señales de estrés al aparato transcripcional. Con base en el análisis de sus dominios de unión a DNA (DBD) y la comparación de sus dominios de oligomerización (OD), se ha determinado la existencia de dos clases principales de factores HSF: la clase A y la B. Estos dos grupos de HSF parecen ser únicos en plantas y no tienen relación con otros encontrados en eucariontes. En arroz, los HSF participan en la regulación de la expresión de las proteínas HSP (heat shock proteins), las cuales son críticas en la protección del daño por estrés y muchos otros procesos biológicos. La respuesta al choque térmico (heat shock response o HSR) es un mecanismo conservado por el cuAl los transcritos de los genes que codifican proteínas de choque térmico (hsp) se acumulan como consecuencia de la movilización de factores de transcripción de choque térmico (HSF) en respuesta a estrés térmico. Se ha identificado una proteína de unión al factor HSF1 (heat shock factor-binding protein1 o HSBP1) que interacciona con el factor HSF1 durante la atenuación de choque térmico. La proteína HSBP1 funciona como un regulador negativo de HRS. En maíz existen dos HSBP parólogos: EMP2 y HSBP2, los cuales exhiben acumulación diferencial durante eventos de HSR y del desarrollo de la planta. Lal mutante recesiva letal para el embrión emp2, demuestra que EMP2 es requerida para la des-regulación de la transcripción de hsp durante la embriogénesis, mientras que la acumulación de HSBP2 es inducida en plántulas como consecuencia de choque térmico. En maíz se reportan entre 11 y 22 isoformas de genes HSF, las cuales componen una de las tres clases estructurales: HSF-A, HSF-B y HSF-C. Las interacciones entre residuos hidrofóbicos de las proteínas son requeridas para la unión HSF: HSBP2 durante el desarrollo de la planta. El factor de transcripción HSF en maíz es activado por calcio, en tanto que la proteína CaM regula la unión del factor de transcripción al DNA. En maíz se predice un total de 11 genes que codifican factores de transcripción HSF. ({Fu, 2006 #106})

6.5.1.32. Factores JUMONJI Las proteínas JUMONJI (JMJ) conforman una familia de factores de transcripción de localización nuclear, algunos relacionados con la regulación de la floración. En el genoma de maíz se predice

177 la existencia de siete genes que codifican factores de transcripción JMJ. En arabidopsis, la floración es controlada por múltiples rutas, incluyendo la fotoperiódica y la ruta FLC (FLOWERING LOCUS C). Los factores de transcripción tipo-JMJ, ELF6 (EARLY FLOWERING 6) y REF6 (RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6), desempeñan diferentes funciones en el control de la floración. El factor ELF6 actúa como represor durante la ruta fotoperiódica, mientras que REF6, reprime la expresión de FLC. La actividad regulatoria de la transcripción que desempeñan estos factores incluye la remodelación de la proteína y la modulación de la expresión de genes regulados por brasinoesteroides. ({Kim, 2003 #131})

6.5.1.33. Factores LIM En eucariontes, las proteínas LIM actúan como reguladores del desarrollo en procesos celulares básicos tales como la transcripción o la organización del citoesqueleto. La familia de proteínas LIM en plantas ha sido estudiada en girasol y en tabaco, en las cuales muchos miembros de esta familia exhiben patrones de expresión específicos en polen. En el genoma del olmo (Populus trichocarpa) existen 12 genes LIM predichos, mientras que en arabidopsis y en arroz existen seis en cada especie. Estas proteínas contienen muchos motivos conservados involucrados en sus funciones. En maíz existen 10 genes LIM. La lignina es un polímero fenólico complejo que es esencial como soporte mecánico, defensa y transporte de agua en plantas superiores. El motivo caja-Pal, rico en AC, es un elemento en cis importante para la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de fenilpropanoides. El gen Ntlim1 codifica una proteína que se una a la caja-Pal, con secuencia muy similar a los miembros de la familia LIM que contienen un dedo de zinc. Además, la proteína Ntlim1 tiene una habilidad específica para unirse al DNA y activar de manera temporal la transcripción del gen beta- glucuronidasa regulada por la caja-Pal en protoplastos de tabaco. La represión del gen Ntlim1 ocasiona menores niveles en la transcripción de genes relacionados con la ruta de fenilpropanoides, tales como fenilalanina aminio-liasa, hidroxicinamato CoA ligasa y cinamil alcohol deshidrogenasa. Además, se observa un 27 % de reducción en el contenido de lignina en células de plantas transgénicas de tabaco con el antisentido del gen Ntlim1 {Arnaud D, 2007 #1; Arnaud D, 2007 #76; Kawaoka, 2000 #125}.

6.5.1.34. Factores LUG La regulación de la expresión de genes homeóticos (causantes de cambios inusuales en el desarrollo de un órgano o tejido) es crucial para lograr patrones de desarrollo apropiados tanto en animales como en plantas. El gen LEUNIG (LUG) es un regulador clave del gen homeótico floral AGAMOUS en arabidopsis. Mutaciones en LEUNIG causan sobreexpresión del mRNA del gen AGAMOUS, provocando transformaciones homeóticas del órgano floral y pérdida de los órganos florales. El descubrimiento de la importancia fisiológica de este gen tanto en plantas como en animales sugiere que los organismos eucariontes usan proteínas represoras similares para regular procesos críticos del desarrollo. El gen LUG conecta las interacciones entre factores de transcripción y reguladores de cromatina. La proteína LUG es reclutada por ciertos factores de transcripción con dominios MADS hacia las regiones promotoras del gen homeótico AGAMOUS (AG) y reprime la expresión del gen AG. TOPLESS (TPL), una proteína poco similar a LUG, desempeña una función primordial en al patrón de desarrollo de embriones en arabidopsis. Mutaciones negativas dominantes en el gen TPL inactivan a los cinco miembros de la familia TPL en arabidopsis y convierten el polo apical en polo basal, lo que conduce a un fenotipo con doble raíz. En el genoma de arabidopsis existe un homólogo de LUG, el gen LEUNIG_HOMOLOG (LUH), y ambos codifican dos proteínas co- represoras altamente homólogas. Mutantes simples luh producen flores normales, pero los dobles mutantes luh producen embriones infértiles. Además, al recuperar la función en mutantes luh/+ se potencia y mejora el fenotipo floral de lug, lo que revela un papel menor de LUH en el desarrollo de la flor. La diversificación funcional entre los genes LUH y LUG se hace evidente debido a la incapacidad de la sobreexpresión de la construcción 35S LUH para recuperar el fenotipo en los mutantes lug y por las tendencias opuestas en la expresión de LUG y LUH en

178 respuesta a condiciones adversas de estrés biótico y abiótico. En maíz se han identificado sólo dos genes LUG.

6.5.1.35. Factores MADS La caja-MADS (MADS-box en inglés) es un dominio de 58 aminoácidos que se une a secuencias de DNA en secuencias consenso de reconocimiento conocidas como cajas CArG [CC(A/T) 6GG]. Los factores de transcripción caja-MADS están involucrados en la regulación de la identidad de órganos florales. El modelo ABC de mutantes florales homeóticos explica cómo la combinación de funciones de tres clases de genes (A, B, y C) determina la función de los cuatro órganos florales. Arabidopsis tiene dos genes de la clase-A (AP1 y AP2), dos de la clase-B, (PI y AP3), y uno de la clase-C (AG). La actividad transcripcional de los genes de las clases B y C que controlan el desarrollo de pétalos, estambre y carpelo, depende de tres genes caja-MADS: SEP1, SEP2 y SEP3. Sólo cuando los alelos de los tres genes se combinan en un mutante triple sep1 sep2 sep3 se observa la pérdida de la identidad de pétalos, estambres y carpelo, lo que resulta en una flor que solo contiene sépalos, lo cual es indicio de la redundancia funcional de estos genes. Los genes SHP ofrecen otro ejemplo de redundancia de los genes caja-MADS. Los mutantes shp1 y shp2 no exhiben ningún efecto fenotípico por sí solos, pero cuando son dobles mutantes se observa una alteración en el desarrollo de la zona dehiscente del fruto, lo que ocasiona incapacidad para liberar semillas. En plantas, animales y hongos existen por lo menos dos tipos de genes que codifican factores de transcripción caja- MADS: tipo-I y tipo-II. En plantas, la mayoría de los genes son tipo-II, los cuales tienen tres dominios más que los tipo-I: el dominio de intervención (intervening domain o I de ~ 30 residuos); el dominio tipo queratina (keratin-like coiled-coil domain o K de ~70 residuos); y el dominio del C- terminal (C-terminal domain o C, de longitud variada). Estos genes son denominados tipo-MIKC y son específicos en plantas. En maíz se han identificado 47 genes MADS.

6.5.1.36. Factores MBF1 El factor de unión a multiptoteínas 1 MBF1 (multiprotein bridging factor 1) es un co-activador transcripcional que conecta la interacción entre un activador y una proteína de unión a la caja- TATA o TBP (TATA-box binding protein). Mutaciones en los genes MBF1 de arabidopsis (AtMBF1a, AtMBF1b y AtMBF1c) reduce parcialmente el tamaño de los mutantes, lo cual indica que todos ellos funcionan como coactivadores. Cada uno de estos genes muestra un patrón de expresión diferencial de acuerdo al tejido y en respuesta a fitohormonas, lo que sugiere que no hay redundancia entre ellos. La expresión constitutiva del gen ATMBF1c en arabidopsis mejora la respuesta de plantas transgénicas a infecciones bacterianas, calor y estrés osmótico. Además, la mayor tolerancia al estrés osmótico y al calor, se mantuvo aún cuando ambos factores se combinaron, lo cual estuvo mediado por una alteración en la ruta de transducción de señales de etileno. En el genoma del maíz se han identificado 19 genes MBF1.

6.5.1.37. Factores MYB Los factores MYB contienen el dominio MYB de unión a DNA, identificado por primera vez en la proteína codificada por el oncogen v-Myb aislado del virus aviar de la mieloblastosis (avian myeloblastosis virus). La comparación de secuencias revela que el oncogen v-Myb pudo haberse originado a partir de un gen de vertebrados, el cual mutó una vez en el virus. Genes similares han sido identificados en vertebrados, insectos, plantas superiores, hongos y musgos. Las proteínas codificadas son cruciales para el control de la proliferación y la diferenciación de células y conservan el dominio MYB de unión a DNA. Este dominio contiene hasta tres réplicas imperfectas, todas ellas formando una estructura hélice-vuelta-hélice de cerca de 53 aminoácidos, con tres residuos regulatorios de triptofano espaciados, referidos como R1, R2 y

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R3. Las réplicas en otras proteínas MYB son categorizadas de acuerdo a su similitud con sus residuos regulatorios R1, R2 o R3. Las proteínas MYB pueden ser clasificadas dentro de tres subfamilias dependiendo del número de réplicas adyacentes en el dominio MYB una, dos o tres). Así, las proteínas MYB con una replica son referidas como MYB1R, las que contienen dos como MYBR2 y las que contienen tres como MYB3R. En el genoma de maíz se han predicho 18 genes MYB {Stracke, 2001 #200}.

6.5.1.38. Factores MYB-related Hasta ahora, los genes Myb caracterizados en plantas, codifican factores de transcripción involucrados en diversos procesos y son regulados por señales múltiples. El control de la biosíntesis de pigmentos flavoniodes está controlado por genes Myb. Uno de los genes mejor caracterizados es el gen C1 del maíz, el cual es activado tanto por ácido abscísico como por luz. En total se han predicho 52 genes MYB-related en el genoma de maíz. En maíz se sintetizan dos grandes clases de flavoniodes: antocianinas rojas y púrpuras y flobafenos rojos. La biosíntesis de flobafenos está controlada por el gen p1, el cual codifica un factor de transcripción tipo- Myb. En maíz, el gen p1 (pericarp color1) regula la síntesis de flobafeno, el pigmento flavonoide rojo de órganos florales como el pericarpio de la semilla. El gen p1 codifica un factor de transcripción R2R3 tipo-Myb que regula la expresión de los genes estructurales involucrados en la biosíntesis de flavonoides, incluyendo el gen c2 (chalcone synthase), chi (chalcone flavonone isomerase), y a1 (por dihydroflavonol reductase. Más de 100 alelos del gen 100 han sido descritos, cada uno de los cuales especifica un patrón de pigmentación específico y distinto a los demás. Los alelos que confieren distinta expresión de pigmentación incluyen: P1-rr (red pericarp/red cob), P1-wr (white pericarp/red cob), P1-rw (red pericarp/white cob), p1-ww (white pericarp/white cob) (Figura 6-18) {Zhang, 2005 #223}.

Figura 6-18. Distintos patrones de pigmentación de flobafeno como productos de la actividad de diferentes alelos del gen p1 que codifica un factor de transcripción tipo-Myb. A, Patrones de pigmentación de la mazorca madura especificados por los alelos P1-rr4B2, P1-wr, P1-rw1077, and p1-ww1112 del gen p1 (de izquierda a derecha). B, Patrones de pigmentación de los alelos P1-rr4B2 y P1-rw1077 a los 16 y 28 días después de la polinización {Zhang, 2005 #223}.

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6.5.1.39. Factores NAC Los factores de transcripción NAC de la petunia y ATAF1 y CUC2 de arabidopsis contienen el denominado dominio NAC (NAM-ATAF1-CUC2). El dominio NAC está ampliamente distribuido en plantas, pero no en otros eucariontes. El dominio de unión a DNA (DNA-binding domain o DBD) está contenido en una región de 60 aminoácidos. El genoma de arabidopsis contiene más de 90 genes que contienen el dominio NAC. Estos factores regulan los mecanismos de defensa contra patógenos y atenúan las señales de ABA. También regulan la formación de paredes secundarias en los márgenes de los frutos de arabidopsis, después del establecimiento de la identidad del tejido. En arroz, la expresión del gen OsNAC6 es inducida por diferentes factores de estrés biótico y abiótico incluyendo ataques por hongos e insectos, frío, sequía y alta salinidad. La sobreexpresión de este gen origina mayor tolerancia de las plantas a la sequía (Figura 6-19).

Figura 6-19. Respuestas fenotípicas de plantas de arroz tipo Silvestre (control) y plantas transgénicas que sobreexpresan el gen OsNAC6. Las plantas tenían 14 días de edad cuando fueron tratadas con 250 mm NaCl en la solución nutritiva por tres días. Las plantas a la derecha de la barra negra sobrevivieron, mientras que se encuentran a la izquierda murieron {Nakashima, 2007 #169}.

En el genoma del maíz se han identificado un total de 30 genes que codifican factores de transcripción NAC.

6.5.1.40. Factores tipo -Nin El inicio de la formación de un nódulo depende en principio de la competencia celular en una zona de infección muy restringida, localizada justo abajo del punto de crecimiento de la raíz. Los nódulos maduros regulan el número de nuevos nódulos en el sistema radical suprimiendo el desarrollo de primordios de nódulos. La proteína Nin (nodule inception) es requerida para la formación de la infección y el inicio del primordio. Contiene un motivo conservado en proteínas de plantas cuyo crecimiento está controlado por el nitrógeno. Este motivo está involucrado en la regulación de genes controlados por la disponibilidad de nitrógeno y en el genoma de maíz se han predicho dos genes que codifican factores tipo-Nin.

6.5.1.41. Factores PcG Las proteínas PcG (polycomb group) mantienen silenciamiento en loci blancos pero también participan en la activación de ciertos loci homeóticos. Mutantes PcG muestran transformaciones fenotípicas causadas por la des-represión de loci homeóticos. Además, las proteínas PcG también regulan blancos no homeóticos. Por otra parte, proteínas trxG (trithorax group) son requeridas para el mantenimiento pero no la iniciación de la activación de loci homeóticos. Los productos de los genes trxG suprimen el fenotipo de los mutantes PcG, deduciendo que las proteínas trxG actúan de manera antagonista a las proteínas PcG. El análisis estructural de los elementos de respuesta en los genes PcG y trxG muestra que las secuencias requeridas para la activación dependiente de trxG y la represión dependientes de PcG están separadas pero dentro de las 30 a 40 pb una de la otra. Estás proteínas participan en

181 la modificación de y la condensación de la cromatina, que ocurre antes de la mitosis. En maíz se han identificado 16 genes PcG.

6.5.1.42. Factores PHD El homeodominio de plantas (Plant HomeoDomain o PHD), un dedo de zinc Cys4–His–Cys3, es encontrado en muchas proteínas relacionadas con la regulación transcripcional mediada por cromatina. En plantas, el desarrollo reproductivo requiere de un proceso normal de meiosis, con eventos bien coordinados, incluyendo mecanismos de control y verificación transcripcional. El progreso del ciclo celular en la meiosis es una parte esencial del programa de desarrollo de la esporogénesis en plantas. La actividad del gen DUET (que codifica un factor de transcripción con un motivo PHD) es determinante para la organización cromosómica durante la meiosis masculina y su desarrollo. El mutante duet de arabidopsis es un macho estéril que carece de polen y presenta de un proceso meiótico aberrante. En arroz, el gen HAZ1 codifica una proteína PHD, similar a las proteínas PHD Zmhox1a (52% de identitidad) y a Zmhox1b (50% de identidad) encontradas en maíz. HAZ1 está involucrada en la morfogénesis de embriones en arroz. En maíz, la sobreexpresión de las proteínas ZmHox1a or ZmHox1b causan alteraciones pleiotrópicas en el desarrollo de órganos vegetativos y reproductivos. Además de estos genes, en maíz se han identificado otros 15 genes pertenecientes a esta familia.

6.5.1.43. Factores PLATZ El factor PLATZ1 (plant AT-rich sequence- and zinc-binding protein 1), contiene motivos específicos de cisteina e histidina que no varían, así como dos regiones distanciadas, una con la secuencia consenso C-x(2)-H-x(11)-C-x(2)-C-x((4-5))-C-x(2)-C-x((3-7))-H-x(2)-H y otra con la secuencia C-x(2)-C-x((10-11))-C-x(3)-C. La proteína PLATZ1 se une de manera no específica a secuencias ricas en A/T, incluyendo la región corriente arriba de los genes pra2 de la GTPasa en chícharo y petE de la plastocianina. En el genoma del maíz se han identificado solo tres genes PLATZ {Carbajosa, 1997 #82}.

6.5.1.44. Factores SIF Los factores de transcripción S1F (spinach leaf nuclear factor) regulan algunas respuestas a la luz y al crecimiento en plantas. El gen nuclear rps1 que codifica la proteína ribosomal del plastidio de espinaca CS1 (spinach plastid ribosomal protein CS1) exhibe un patrón de expresión tanto constitutivo como específico en hoja. En hoja, la inducción del gen rps1 depende de la luz. El factor de transcripción S1F (spinach leaf nuclear factor 1) interactúa con el promotor del gen rps1 y regula su transcripción. De hecho, el sitio de unión a S1F en el gen rps1 es un elemento negativo que reprime la actividad del promotor de rps1. En maíz se han predicho seis genes S1F.

6.5.1.45. Factores SPL Los factores de transcripción SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE) constituyen una familia de proteínas estructuralmente diversas que se encuentran solo en plantas. En el genoma de maíz se han identificado cuatro genes SPL. La característica distintiva de los factores SPL es la caja-SBP que representa un dominio conservado de 76 aminoácidos, el dominio SBP, responsable de la interacción con el DNA. Estos genes muestran actividad en el control del desarrollo de las plantas, como se observa en las mutantes del gen Liguleless1 de maíz, que presentan aberraciones en un gen SBP. El tomate, un gen SBP es determinante para el amarre de frutos, el desarrollo de la planta y la generación de variación natural. En arroz, el área entre la parte más elevada de la vaina y la parte más baja de la lámina foliar contiene varios órganos tales como la aurícula y la lígula. El mutante del gen OsLIGULELESS1 (OsLG1) que codifica el factor de transcripción tipo SBP es altamente homólogo al gen LIGULELESS1 (LG1) de maíz y es expresado en regiones en desarrollo del punto de unión de la

182 lámina con la vaina foliar, así como en las regiones meristemáticas, en las que desempeña un papel preponderante en la formación de lígula y aurícula {Cardon, 1999 #83; Chuck, 2002 #88}.

Figura 6-20. Fenotipo de plantas de arroz tipo silvestre y transgénicas con expresión diferencial del factor de transcripción oslg1. A, comparación de las hojas en el lado abaxial; B, comparación de las hojas en el lado axial (plántulas de 10 días de edad). li, lígula; au, aurícula; lj, unión de la lámina; bl, lámina foliar; sh, vaina foliar. Barra, 100 μm ({Lee, 2007 #148}).

6.5.1.46. Factores TCP Los genes cycloidea (cyc) y teosinte branched 1 (tb1) codifican para proteínas estructuralmente relacionadas implicadas en la evolución de caracteres morfológicos clave en plantas. En total se ha identificado solo un gen TCP en maíz. Las proteínas TCP mantienen conservado un dominio hélice-bucle-hélice no canónico (a non-canonical basic-Helix-Loop-Helix o bHLP). Este dominio también se encuentra en dos proteínas que se unen a DNA, la PCF1 y la PCF2. Esta familia de factores de transcripción que conserva el dominio bHLP ha sido denominada TCP (por las proteínas TB1, CYC y PCFs que fueron primeramente identificadas). Dos de estas proteínas se encuentran expresadas en los primordios florales en crecimiento, con actividad en el control de la división celular y en la evolución de las plantas para generar nuevos caracteres morfológicos. El gen PTC-1 de Beta palonga es un homólogo del gen TFL1/CEN en arabidopsis. Este gen regula la identidad meristemática y el desarrollo floral en Beta palonga. En el maíz, la mutante tb1 muestra deformación de la mazorca y excesivos hijuelos o retoños.

Figura 6-21. Fenotipo del mutante tb1, que muestra el excesivo número de hijuelos en la fotografía de la izquierda y deformaciones de la mazorca en la figura de la derecha (cortesía de M. Johri y MaizeGDB).

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6.5.1.47. Factores TLP Los factores de transcripción TLP (Tubby-like proteins) están presentes en un amplio número de organismos multicelulares. En mamíferos, la mutación en estos genes causa una o más de las siguientes enfermedades: obesidad (de la cual se deriva el nombre de tubby), degeneración de la retina y pérdida auditiva. En plantas, las proteínas TLP poseen un dominio tubby y una caja-F. El dominio tubby contiene de 16 a 17 aminoácidos y está localizado en la C-terminal. Por su parte, la caja-F es un dominio de 40 a 50 aminoácidos en la N-terminal, encontrado por primera vez en la proteína ciclina F, y de ahí su nombre.En arabidopsis se encuentran 11 genes TLP, 14 en arroz, y 11 en olmo. En arroz, la mayoría de los genes OsTLP contienen un dominio tubby en su terminal carboxilo y una caja-F en el dominio amino terminal. La expresión de los 14 genes es inducida por Xanthomonas oryzae pv. oryzae, causante de una de las principales enfermedades de esta gramínea. Ocho de los 14 genes TLP también responden a daños por heridas físicas y todos ellos muestran expresión diferencial en tejidos y etapas de desarrollo de la planta. En el genoma del maíz se han predicho 14 genes TLP {Lai, 2004 #140}.

6.5.1.48. Factores Trihelix/GT Los factores de transcripción Trihelix o GT están involucrados en las respuestas de las plantas a la luz y a su programa de desarrollo. El mutante PETAL LOSS (PTL) del gen GT-2 muestra fenotipos pleiotrópicos incluyendo enanismo, enrrollamiento de las hojas, crecimiento retardado y esterilidad masculina. La expresión constitutiva y ectópica de PTL no pudo restablecer el fenotipo del mutante ptl-D, y fue letal para algunas plantas transgénicas en la etapa de desarrollo del cotiledón, sugiriendo que la expresión precisa del gen PTL, tanto en tiempo como en espacio, es esencial para su propia implementación funcional durante el desarrollo de la planta. La mutante ptl-D también tiene defectos en los mecanismos de acción de auxinas, lo que da lugar al enrrollamiento de las hojas. También se presenta degeneración de anteras que causan la esterilidad masculina de la flor. En maíz se ha identificado solo un gen Trihelix {Brewer, 2004 #78}.

6.5.1.49. Factores VOZ Los factores de transcripción VOZ (Vascular Plant Transcription Factors with a One-Zinc Finger) están involucrados en el desarrollo del polen en arabidopsis. En maíz se han identificado dos genes VOZ. Un elemento en cis específico del polen de 38 pb que se encuentra en el promotor del gen AVP1 (arabidopsis vacuolar-type H+-pumping pyrophosphatase (V-PPase) 1) está involucrado en la expresión de la V-PPasa en arabidopsis, y dicho gen AVP1 es activado por la unión de los factores AtVOZ1 y ATVOZ2 al elemento en cis mencionado. El gen AtVOZ1 es expresado específicamente en el tejido del floema, en tanto que AtVOZ2 se expresa fuertemente en raíz. El gen AtVOZ2 codifica una proteína que se une a un dímero con secuencia palindrómica específica GCGTNx7ACGC.

6.5.1.50. Factores Whirly La activación del gen PR-10a (pathogenesis-related) de inducida por un evocador que requiere de una secuencia de 30 pb en el promotor denominada ERE (elicitor response element) que es unida por el factor nuclear PBF-2 (PR-10a binding factor 2). El factor PBF-2 es almacenado en el núcleo y se hace disponible para unirse al elemento ERE cuando ocurre el estímulo. Esta familia de factores de transcripción es llamada tipo-PBF-2 o Whirly. La proteína StWhy1 de la papa actúa como activador transcripcional de genes que contienen el elemento del promotor de genes PB que se une al factor PBF2. El gen AtWhy1, el ortólogo de StWhy1, es inducido por ácido salicílico (SA) y es necesario tanto para desarrollar resistencia a patógenos en una vía dependiente de SA como para la expresión de un gen que responde a SA y que es inducida por la fitohormona. La proteína NPR1, factor de transcripción asociado a la respuesta, también es requerida para activar genes que responden a SA. El gen AtWhy1 es un componente crucial de

184 las respuestas de resistencia a las enfermedades en las plantas en una ruta dependiente de SA. Tres genes Whirly se han identificado a la fecha en el genoma de maíz {Desveaux, 2004 #99}.

6.5.1.51. Factores WRKY La familia de factores de transcripción WRKY contienen un dominio conservado definido por dos secuencias de aminoácidos: el motivo WRKYGQK (de unión a DNA) junto con un dedo de zinc en su extremo N-terminal. Estos factores de transcripción están involucrados en la regulación de varios procesos fisiológicos únicos en plantas, incluyendo mecanismos de defensa contra patógeno, senescencia y desarrollo de tricomas. En Arabidopsis, el gen WRKY25 codifica una proteína que funciona como represor de los mecanismos de defensa mediados por ácido salicílico; la sobreexpresión de este gen ocasiona mayor susceptibilidad de la planta a la bacteria Pseudomonas syringae, mientras que las mutantes con inserciones de T-DNA aumentan la tolerancia al patógeno. En arroz, 103 genes codifican factores de transcripción WRKY. De entre ello, la mayoría (77.7%) fueron localizados en regiones duplicadas. Bajo condiciones normales, 65 genes WRKY se expresan diferencialmente en cuanto a abundancia de transcritos o en su patrón de expresión. En condiciones de estrés abiótico, (frío, sequía y salinidad), o en tratamientos con fitohormonas, 54 genes WRKY mostraron expresión diferencial en cuanto a abundancia de transcritos y de ellos sólo tres se expresaron exclusivamente en condiciones de estrés, mientras que 13 de ellos se expresaron sólo en respuesta a aplicaciones de fitohormonas. El resto (28 genes) es regulado por ambos factores estrés y fitohormonas), lo que sugiere que existe una interacción entre la señalización del estrés abiótico y de hormonas. En maíz se predice la existencia de 13 genes WRKY {Eulgem, 2000 #90; Eulgem, 2000 #103}.

6.5.1.52. Factores ZIM/TIFY Recientemente reclasificada como TIFY, la familia de factores ZIM (Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem) está involucrada en el desarrollo de la planta. El gen ZIM de Arabidopsis codifica un factor de transcripción que contiene dedo de zinc tipo-GATA con una secuencia espaciadora entre sus dos juegos de cisteinas conservadas (C-X2-C-X20-C-X2-C). La sobreexpresión del gen ZIM causa mayor elongación de hipocotilos y peciolos en cualquier longitud de onda y aun en presencia de inhibidores de la síntesis de brasinoesteroides y de giberelinas. En el genoma de maíz se han identificado 23 genes ZIM.

Recientemente se ha reportado el desarrollo de una plataforma basada en RT-PCR cuantitativo para analizar el perfil de expresión de gran escala en el genoma del arroz ({Caldana, 2007 #81}). Con esta plataforma ha sido posible analizar la expresión de los cerca de 2500 genes que codifican factores de transcripción en esta especie. Esta tecnología facilitará el análisis de estos genes en otras especies, como maíz, una vez que se tengan los genomas completamente secuenciados.

Tarea 6-4 Lea el siguiente resumen en ingles y describa cuáles son las principales similitudes y las principales diferencias entre los genes SCARECROW de maíz y los de arabidopsis. Discuta ¿cuál es la importancia fisiológica de los genes estudiados?

Plant Molecular Biology (2005) 59:619–630 Conservation and diversification of SCARECROW in maize. Jun Lim,*, Jee W. Jung, Chae Eun Lim2, Mi-Hyun Lee, Bong Jun Kim Miran Kim, Wesley B. Bruce and Philip N. Benfey

Abstract: The SCARECROW (SCR) gene in Arabidopsis is required for asymmetric cell divisions responsible for ground tissue formation in the root and shoots. Previously, we reported that a Zea may SCARECROW (ZmSCR) is the likely maize ortholog of SCR. Here we describe

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conserved and divergent aspects of ZmSCR. Its ability to complement the Arabidopsis scr mutant phenotype suggests conservation of function, yet its expression pattern during embryogenesis and in the shoot system indicates divergence. ZmSCR expression was detected early during embryogenesis and localized to the endodermal lineage in the root, showing a gradual regionalization of expression. Expression of ZmSCR appeared to be analogous to that of SCR during leaf formation. However, its absence from the maize shoot meristem and its early expresión pattern during embryogenesis suggest a diversification of ZmSCR in the patterning processes in maize. To further investigate the evolutionary relationship of SCR and ZmSCR, we performed a phylogenetic analysis using Arabidopsis, rice and maize SCARECROW-LIKE genes (SCLs). We found SCL23 to be the most closely related to SCR in both eudicots and monocots, suggesting that a gene duplication resulting in SCR and SCL23 predates the divergence of dicots and monocots.

Tareas 6-1. Lea el siguiente artículo y haga un resumen de la metodología empleada para medir la expresión de genes que codifican factores de transcripción en arroz. Reflexione sobre la posibilidad de utilizar esta metodología para maíz.

Plant Methods (2007), 3:7doi:10.1186/1746-4811-3-7 A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors. Camila Caldana, Wolf-Rüdiger Scheible, Bernd Mueller-Roeber and Slobodan Ruzicic The electronic version of this article can be found online at: http://www.plantmethods.com/content/3/1/7

Abstract Quantitative reverse transcription – polymerase chain reaction (qRT-PCR) has been demonstrated to be particularly suitable for the analysis of weakly expressed genes, such as those encoding transcription factors. Rice (Oryza sativa L.) is an important crop and the most advanced model for monocotyledonous species; its nuclear genome has been sequenced and molecular tools are being developed for functional analyses. However, high-throughput methods for rice research are still limited and a large-scale qRT-PCR platform for gene expression analyses has not been reported

6.6. Resumen

Tarea 6-5 De todos los factores que se estudiaron en este capítulo, en una tabla resumen, indique las funciones principales y los procesos que están relacionados. Indique también genes blanco y dominios típicos que presentan. Haga búsquedas bibliográficas por su cuenta para actualizar la información. Ponga también las referencias principales para cada familia.

Ejemplo: Comentario [ATF8]: Ayuden me a completar y a corregir la TABLA RESUMEN tabla FAMILIAS DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN Dominios que Factor Relacionados con procesos como: Algunos genes blanco: presentan TFIIA, Factores de trascripción basales. Todos los genes requieren TFIIB, Necesarios para cualquier proceso estos factores para su TFIIH, de transcripción en el núcleo. Se expresión. TFIID unen a la RNA Polimerasa II. AB13 / VP1 Desarrollo de la semilla Genes inducidos por ABA B1, B2, B3 Dedo de zinc Alfin Estrés salino (Tolerancia salinidad) MsPRP2, inducido por NaCl (ZF) AP2/ Identidad celular Genes de respuesta a AP2

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EREBP Estrés biótico y abiótico deshidratación, entre otros Identidad abaxial DBD (N Genes que responden a ARF crecimiento laminar de órganos Terminal) auxinas laterales CTD Desarrollo embrionario Dominio de Regulación genética del linaje interacción ARID celular rico en AT Control del ciclo celular (ARID)

Establecimiento del sistema de Cierre de AS2 / LOB nervaduras (A. thaliana). leucina Embriogénesis (maíz) Crecimiento de parte aérea y raíz Genes de respuesta a Dominios I, II, AUX / IAA (A. thaliana) auxinas III, IV genes con motivos (GA)8 y BBR-BCP (GA/TC)8 Genes regulados por BES1 brasinoesteroides Proliferación celular bHLH bHLH Establecimiento del linaje celular Señalización por ácido salicílico Genes inducibles por SA (SA) bZIP Identidad de órganos florales Genes de zeína (maíz) (tabaco) Reloj circadiano Genes relacionados con la ZF y dominio C2C2-CO Tiempo de la floración floración CCT Actividad meristemática Genes de fotoperíodo (arabidopsis) Genes de metabolismo de Mecanismos de defensa carbohidratos regulados por C2C2-Dof germinación de semillas luz ZF Genes de respuesta a auxinas C2C2- Respuesta a estímulos de luz ZF GATA (Arabidopsis) C2C2- ZF y dominio Desarrollo de órganos laterales YABBY YABBY genes de otros factores de C2H2-ZPT2 Tolerancia al estrés ZF transcripción Procesamiento de RNA (animales) C3H /CCCH Estrés biótico y abiótico ZF (Arabidopsis y arroz) CCAAT Estrés abiótico (sequía) CXC División celular CPP Desarrollo de tejidos reproductivos E2F-DP ciclo celular genes del ciclo celular Crecimiento Genes que responden a EIN / EIL Respuesta a estrés etileno Ciclo celular FH (cabeza de FHA crecimiento tenedor) procesamiento de rRNA FHA GARP- Genes que responden a Myb ARR-B citocininas GARP-G2 Desarrollo de cloroplastos?

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GeBP Desarrollo de tricomas Gen GLABROUS1 Desarrollo y crecimiento de hojas GIF (arabidopsis) GRAS Distribución radial de raíces y tallos Crecimiento activo de algunos GRF tejidos Destino celular HB HB Desarrollo HMG Regulación de la transcripción Caja HMG Factor Relacionados con procesos como: Algunos Genes Blanco son Dominios que presentan HSF Estrés térmico Genes de proteínas de DBD choque térmico (hsp) OD JUMONJI Regulación de la floración genes regulados por brasinoesteroides LIM Transcripción Organización del citoesqueleto LUG Genes homeóticos MADS Identidad de órganos florales MADS De intervención (I) De queratina (K) C- Terminal (C) MBF1 Coactivadores MYB Control de proliferación y MYB diferenciación celular MYB- Biosíntesis de flavonoides genes involucrados en la related síntesis de flavonoides NAC Estrés biótico y abiótico NAC Defensa contra patógenos DBD Nin Formación de nódulos genes controlados por disponibilidad de nitrógeno PcG Silenciamiento de los genes blanco Genes homeóticos PHD Control durante el proceso de ZF Cys4–His– meiosis Cys3 Desarrollo de órganos reproductivos y sexuales PlATZ pra2 (GTPasa, petE (plastocianina) SIF Respuestas a la luz gen rps1 (inducido por luz) Crecimiento SPL Desarrollo Caja SBP TCP Evolución de caracteres bHLP morfológicos División celular TLP Respuesta estrés biótico Tubby Caja F Trihelix/GT Respuestas a la luz Desarrollo VOZ Desarrollo de polen (arabidopsis) Whirly Resistencia a patógenos Genes de defensa

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WRKY Defensa a patógenos Genes de respuesta a SA WRKYGQK senescencia desarrollo de tricomas ZIM / TIFY Desarrollo de la planta ZF

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7. Herramientas Bioinformáticas 7.1. ¿Qué es la bioinformática? Tal vez no se pueda dar una sola definición de bioinformática, ya que la percepción de ella depende mucho de los tipos de usuarios. Por un lado están los biólogos que usan la bioinformática solo como algo accesorio, es decir, como un conjunto de herramientas para contestar preguntas biológicas. Mientras que por otro lado están los informáticos, programadores y estadistas para los cuales la bioinformática per se, es el tema central de su trabajo. Para algunos, la bioinformática es solo un medio, más no un fin, mientras que para otros, la bioinformática se justifica como una disciplina científica emergente con una meta propia.

Algunos consideran que la bioinformática utiliza la tecnología de la información para organizar, analizar y distribuir información biológica con la finalidad de responder preguntas complejas en biología. Esto incluye la colección, organización, almacenamiento y recuperación de información en bases de datos. Otros consideran que la bioinformática es un área propia de investigación multidisciplinaria, la cual puede ser ampliamente definida como la interfase entre dos ciencias: Biología y Computación. Involucra la solución de problemas complejos usando herramientas de sistemas y computación.

Según la definición del NCBI (2001); la bioinformática es un campo de la ciencia en el cual confluyen varias disciplinas tales como: biología, computación y tecnología de la información. El fin último de este campo es facilitar el descubrimiento de nuevas ideas biológicas, así como crear perspectivas globales a partir de las cuales se puedan discernir principios unificadores en biología.

Aparte de las definiciones formales de organismos o instituciones de referencia, los manuales de esta materia aportan sus propias definiciones operativas, lógicamente vinculadas en mayor o menor medida con las ya mencionadas. En otras palabras, cada quien define los términos según su propio interés o su área de trabajo. Dentro de este libro de texto, vamos a definir algunos términos de la siguiente forma:

• Bioinformática: Es un término difuso que enmarca de manera global todas las actividades, en donde la realización del experimento no es el elemento central, sino más bien, el análisis de datos y la interpretación de la información de origen biológico. • Los bioinformáticos: Hacen investigación, desarrollo o aplicación de herramientas computacionales y aproximaciones para la expansión del uso de datos biológicos, genómicos, bioquímicos, agronómicos, médicos o de salud, incluyendo aquellas herramientas que sirvan para adquirir, almacenar, organizar, analizar o visualizar tales datos. • Biología computacional: Es el desarrollo y aplicación de métodos teóricos y de análisis de datos, modelado matemático, estadística y técnicas de simulación computacional al estudio de sistemas biológicos, bioquímicos, agronómicos, conductuales y sociales. • Biocomputación: Es la construcción y uso de computadores que contienen componentes biológicos o funcionan como organismos vivos. Esto incluye a las redes neuronales, los sistemas cibernéticos y la inteligencia artificial. • La bioestadística: Es una serie de herramientas matemáticas que sirven para entender, interpretar y resumir mejor los datos a pesar de la grandísima influencia del azar en los sistemas biológicos. Las pruebas de bioestadística nos

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dan una idea cuantitativa de la probabilidad de que el azar es la causa principal de nuestros resultados. La bioestadística también tiene la finalidad de ahorrarle recursos a los experimentadores para obtener más datos confiables con menos repeticiones y experimentos.

Bajo estas definiciones, la bioinformática tiene más que ver con la información, mientras que la biología computacional lo haría con las hipótesis, y la bioestadística con el azar. Por otra parte, el término biocomputación suele enmarcarse en las actuales investigaciones con biocomputadores, es decir los dispositivos cibernéticos que usan principios biológicos u orgánicos para almacenar o procesar información.

Durante los inicios de la genómica el concepto de bioinformática se refería sólo a la creación y mantenimiento de bases de datos donde se almacenaba secuencias de nucleótidos y aminoácidos. El desarrollo de este tipo de base de datos no solamente significaba el diseño de las mismas, sino también el desarrollo de interfaces complejas donde los investigadores pudieran acceder los datos existentes, y suministrar o revisar datos por medio de la web.

Toda esa información debe ser combinada para formar una idea lógica y razonable, de tal manera, que los investigadores pudieran estudiar cómo estas actividades se veían alteradas en estados de una enfermedad o en dependencia de un factor ambiental. De allí viene el surgimiento de nuevos campos de la bioinformática. El desarrollo de nuevos algoritmos (fórmulas matemáticas) y estadísticos, con los cuales se pueda relacionar partes de un conjunto enorme de datos, como por ejemplo, métodos heurísticos para localizar un gen dentro de una secuencia, predecir estructura o función de proteínas, y poder agrupar secuencias de proteínas en familias relacionadas. Por ahora el campo más popular es el análisis e interpretación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, dominios de proteínas y estructuras de proteínas. Los principales esfuerzos de investigación en estos campos incluyen el alineamiento de secuencias, la predicción de genes, montaje del genoma, alineamiento estructural de proteínas, predicción de estructura de proteínas, predicción de la expresión génica, interacciones proteína-proteína, y modelado de la evolución.

Los términos bioinformática, biología computacional y biocomputación son utilizados en muchas ocasiones como sinónimos. En realidad hacen referencia a campos de estudios interdisciplinarios muy vinculados, que requieren el uso o el desarrollo de diferentes técnicas que incluyen informática, matemática aplicada, estadística, ciencias de la computación, inteligencia artificial, química y bioquímica, para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos, todos ellos de índole biológica, y usualmente (pero no de forma exclusiva) en el nivel molecular. El meollo principal de estas técnicas se encuentra en la utilización de recursos computacionales para solucionar o investigar problemas sobre escalas de tal magnitud que sobrepasan el discernimiento humano. La investigación en biología computacional se solapa a menudo con la biología de sistemas.

Una constante en proyectos de bioinformática y biología computacional es el uso de herramientas matemáticas para extraer información útil de datos producidos por técnicas biológicas de alta productividad, como la secuenciación del genoma. Un problema común en bioinformática es el montaje o ensamblado de secuencias genómicas de alta calidad desde fragmentos mas o menos cortos obtenidos tras la secuenciación del DNA a gran escala. Otros problemas comunes incluyen el estudio de la regulación génica para interpretar patrones de expresión génica utilizando datos de microarreglos de cDNA o de oligonucleótidos.

Principales áreas de investigación: • Análisis de secuencias • Anotación automática de genomas • Genómica comparativa y ortología

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• Biología evolutiva computacional • Medición de la biodiversidad • Análisis de la expresión génica • Análisis de la regulación • Análisis de la expresión de proteínas • Análisis de la interacción entre proteínas • Determinación de la estructura de las proteínas • Predicción del plegamiento de proteínas • Acoplamiento proteína-proteína • Análisis de mutaciones en el cáncer • Modelado de sistemas biológicos • Simulación de rutas y redes metabólicas • Análisis de imagen de alto rendimiento • Herramientas de software • Análisis estadístico de datos

7.2. Análisis de secuencias 7.2.1. BLAST El Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) es un programa informático de alineamiento basado en similitudes de tipo local. Las secuencias alineadas pueden ser de DNA o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (comúnmente llamada query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en diversas bases de datos. El algoritmo encuentra las secuencias que tienen mayor parecido a la secuencia query y las alinea. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurístico, por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solución correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular una probabilidad de error de que el alineamiento se deba meramente al azar. Por lo que el E value (valor E), es un parámetro estadístico que nos permite juzgar el grado de significancia de los resultados que se obtienen. El E value depende del número de identidades de nuestro query (hits perfectos) pero también del número de secuencias en las bases de datos analizadas.

Normalmente el BLAST es usado para encontrar genes que tengan similitudes con nuestra secuencia en cuestión. Por lo general, cuando una nueva secuencia es obtenida, se usa el BLAST para compararla con otras secuencias que han sido previamente caracterizadas, para así poder inferir su función. La predicción de función en base a similitud es el paradigma central de la bioinformática, y por consiguiente, el BLAST es uno de los pilares de la genómica. El BLAST es la herramienta más usada para la anotación y predicción funcional de genes o secuencias proteicas.

BLAST fue desarrollado por los Institutos Nacionales de Salud del gobierno de EE. UU., por lo que es de dominio público y puede usarse gratuitamente a través de un servidor del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI).

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

El programa BLAST también puede ser instalado en una computadora personal para buscar secuencias en bases de datos de manera local. Algunas ventajas de usar el servidor del NCBI son que el usuario no tiene que mantener ni actualizar las bases de datos y que la búsqueda se hace en un cluster de computadoras, lo que otorga rapidez. Las desventajas son: no se permite hacer búsquedas masivas dado que es un recurso compartido, no se puede personalizar las

192 bases de datos contra la que busca el programa y las secuencias son enviadas al servidor del NCBI sin ningún tipo de cifrado, lo que puede ser un problema para quienes quieran mantener sus secuencias privadas. La aplicación local de BLAST tiene la ventaja de que permite manejar varios parámetros que en las búsquedas de NCBI están estandarizados, por lo que provee una mayor flexibilidad para los usuarios avanzados.

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Consideraciones al usar BLAST:

• A pesar de que BLAST es un programa muy poderoso y casi siempre podemos confiar en sus resultados, se debe recordar que el programa es heurístico, y por lo tanto puede que no encuentre la solución óptima. En la actualidad, el abuso y la pobre interpretación de los resultados de BLAST ha llevado a múltiples errores de anotación. Una cosa a tener en cuenta al usar BLAST es que, cuanta más evidencia externa se pueda obtener para corroborar un alineamiento (fisiológica, filogenética, genética, etc.) es mejor.

• El programa de BLAST NO garantiza que las secuencias que alinea son homólogas y mucho menos que tengan la misma función (en el caso que sean proteínas), simplemente provee posibles candidatos. Se necesitan más análisis para anotar correctamente una secuencia.

• La puntuación BLAST depende del largo de la secuencia, una secuencia muy corta tendrá una puntuación menor que una grande, simplemente por la cantidad de bases que tiene. Así que siempre se debe interpretar la puntuación con respecto al largo de la secuencia.

• El e-value depende del tamaño de la base de datos. Para bases de datos muy pequeñas, e-values altos son menos significativos que para bases de datos muy grandes. Para la base de datos NCBI por lo general e-values de 0.01 o menos son considerados como significativos, pero esto puede depender de la secuencia que se esté analizando.

• Se debe tener cuidado con los errores de anotación, es común que alguna secuencia que se anotó mal (ya sea porque se hizo automática o por error humano) sea utilizada como referencia para anotar otras secuencias similares, por lo que los errores de anotación se pueden propagar rápidamente. Siempre debemos especificar que la

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función de nuestra secuencia es posible o probable si fue asignada usando identidad con otras secuencias. Asimismo debemos tener en cuenta que la gran mayoría de las funciones asignadas en la actualidad son putativas y que pueden no ser una buena referencia para una asignación funcional.

• A pesar de lo que comúnmente se piensa, las secuencias con la mejor puntuación o el mejor e-value NO necesariamente es la mejor opción para la anotación funcional de un gen. Es importante analizar todos los alineamientos que encuentra el programa y sacar conclusiones en base al resultado global.

• BLAST tiene varios parámetros por defecto que en general funcionan bien para la mayoría de los casos, pero habrá situaciones en las que es necesario cambiarlos para obtener mejores resultados. No hay forma de saber exactamente qué parámetro es el óptimo, se tienen que realizar múltiples pruebas hasta encontrar las mejores condiciones.

Tarea 7-17-1 Haga una búsqueda en la base de datos del NCBI y averigüe mediante la herramienta BLAST, a que proteína corresponde la siguiente secuencia: GRDKVPSSGSKMPRTVIALDGGLYEHYKKFSSCVEATLT Obtenga la secuencia completa de esa proteína. Tradúzcala a su secuencia nucleotídica.

Respuesta: Para responder primero debes saber a que base de datos se refiere. La podrás encontrar en la página: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez.Una vez ahí busca en la barra de la izquierda la herramienta BLAST y ábrela. Como la secuencia que tienes es de aminoácidos usa la herramienta protein blast. Cuando la abras te pedirá que introduzcas la secuencia que quieres buscar y te la pide en formato FASTA. Este formato es un formato de fichero informático basado en texto, utilizado para representar secuencias bien de ácidos nucleicos, bien de péptido, y en el que los pares de base o los aminoácidos se representan usando códigos de una única letra. El formato también permite incluir nombres de secuencias y comentarios que preceden a las secuencias en si. Esto significa que metas la secuencia de aminoácidos sin espacios y sin puntos y comas, solo letras. Una manera es copiar del problema la secuencia y pegarla en la ventana. Una vez que hayas hecho esto oprime la instrucción BLAST, casi al final de esta ventana. Los resultados aparecerán en unos segundos, dependiendo de la red. Obtendrás una tabla con las secuencias que tienen un alineamiento significativo, es decir secuencias que se parecen a la que acabas de meter, y están ordenadas de las más parecidas a las que menos se parecen. El primer resultado es la hexocinasa de maíz

Hexocinasa de maíz (zea mays) Secuencia completa: 1 mvkavvvgaa vvacaavgva avlvhrrrrr daallgsaea errrraaavi eeverslatp 61 tallrgiada mvaemerglr gdihaqlkml isyvdnlptg dehglfyald lggtnfrvlr 121 vqlggrekrv vkqqyeevsi pphlmvgtsm elfdfiaaal akfvgteged fqlpegrqre 181 lgftfsfpvn qtsissgtli kwtkgfsing tvgedvvsel sramerqgld mkatalvndt 241 vgtlaggrym dtdvvaavil gtgtnaayve hanaipkwtg llpksgkmvi ntewgsfksn 301 klplseydka mdfeslnpge qiyekmisgm ylgeivrril lklahdaslf gdvvptkleq 361 pfilrtpdms amhhdsshdl ktlgsklkdi vgvadtslev ryitrhicdl vaergarlaa 421 agiysilkki grdkvpssgs kmprtviald gglyehykkf sscveatltd llgeeasssv 481 vaklandgsg igaallaash sqygasd

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7.3. Bases de datos 7.3.1. Genbank y el NCBI El National Center for Biotechnology Information (NCBI) es parte de la National Library of Medicine (NLM), una rama de los National Institutes of Health (NIH). Está localizado en Bethesda, Maryland, en Estados Unidos. Fue fundado el 4 de noviembre de 1988 con la misión de ser una importante fuente de información en biología molecular. Almacena y constantemente actualiza la información referente a secuencias genómicas en GenBank. En PubMed se maneja un índice de artículos científicos referentes a biomedicina, biotecnología, bioquímica, genética y genómica, una recopilación de enfermedades genéticas humanas, además de otros datos biotecnológicos de relevancia. Todas las bases de datos del NCBI están disponibles en línea de manera gratuita.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

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Figura 7-1. Página principal del NCBI

El NCBI ofrece además, algunas herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN, ARN y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas. GenBank se coordina con otras bases de datos como la del instituto europeo de bioinformática (http://www.ebi.ac.uk) y la base de datos de DNA de Japón (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome.html.en). Otra instituto importante que alberga varias bases de datos nucleotídicas es el instituto de investigación genómica (The Institute for Genomic Research o TIGR) que ahora ha sido absorbido por un consorcio liderado por Craig Venter.

197

http://www.tigr.org

Figura 7-2. Página principal de TIGR 7.3.2. Maize GDB La página de Maize GDB es la base de datos más completa y más útil para los investigadores con un interés en fitomejoramiento. En MaizeGDB se pueden encontrar los resultados de proyectos de mapeo, QTLs e información genotípica y fenotípica sobre diversas poblaciones de maíz. Actualmente existen varios mapas genéticos disponibles para maíz, entre ellos La línea B73 es una línea progenitora de varios híbridos que tuvieron bastante distribución agrícola y comercial en Estados Unidos. El hibrido B73xMo17 dio a lugar un set de líneas recombinantes (Recombinant Inbred Lines o RILs) que se conocen en el medio científico como población IBM (intermated B73xMo RIL population) y se usa mucho para proyectos de mapeo genético. Con referencia a las bases de datos de maíz, se puede recomendar el siguiente link:

http://www.maizegdb.org

198

Figura 7-3. Página inicial de MaizeGDB

7.3.3. Maize Gene Index Actualmente se han secuenciado de manera masiva dos genotipos de maíz. En las bases de datos públicas de USA y Europa se usa el genotipo B73, que es una línea homocigótica para climas templados. Por otro lado, en CINVESTAV Irapuato se secuenciaron las islas de genes (regiones hipometiladas) de una mezcla de DNA de varios individuos de una población criolla de maíz mexicano (el maíz palomero cónico toluqueño, un genotipo del CIMMYT llamado Mexi-5). Sin embargo, el genoma de maíz palomero todavía no se ha ensamblado ni anotado totalmente, por lo que por el momento existe mucho más información pública para el maíz B73. Por ejemplo, ya se conocen casi la totalidad de los genes de B73, que son como 56 mil secuencias consenso tentativas.

199

Con referencia al genotipo maíz B73, las bases de datos con más información nucleotídica, incluyendo una lista casi completa de los genes de maíz (Maize Gene Index) se pueden consultar en los siguientes links:

http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=maize

http://www.maizegenome.org

http://maize.tigr.org

Figura 7-4. Página inicial de TIGR maíz. 7.3.4. CIMMYT Una de las instituciones líderes de mejoramiento de maíz es el CIMMYT. A diferencia de las compañías comerciales, el CIMMYT trabaja para el ámbito público y se enfoca más bien a los

200 agricultores de los lugares más marginados. Su página web contiene información sobre los diversos proyectos que se desarrollan tanto en México como en África y otras partes del mundo. En los vínculos también se puede encontrar un formulario para pedir semilla del banco de germoplasma del CIMMYT. http://www.cimmyt.org

7.3.5. IRRI La institución líder para el mejoramiento de arroz es el IRRI, que esta en las Filipinas.

http://www.irri.org

Un sitio con información interesante sobre mejoramiento genético es el Cereal Knowledgebank, que es una base de datos conjunta entre el CIMMYT y el IRRI. Incluye información sobre los 3 cereales más importantes del mundo: maíz, trigo y arroz.

201

Tarea 7-2 Visite la siguiente página y averigüe más sobre las metodologías de mejoramiento que se usan en diferentes cereales. http://www.knowledgebank.irri.org/

7.4. Paquetes de Software 7.4.1. Fieldbook para maíz Fieldbook, es un programa que desarrollaron los investigadores del CIMMYT para el manejo de inventarios, ensayos y viveros de maíz. En esencia, es una serie de archivos y documentos maestros de Excel que se manipulan con algunos macros escritos en visual basic. Se definen archivos maestros de Excel (templates) que se usan; para la preparación de la semilla (SeedPrep), la impresión de los sobres, y para la preparación de los libros de campo (trials or nurseries). También se pueden hacer resúmenes de ciclos (SeasonSummary), así como envíos de semillas (SeedShipment). En los archivos Excel se introducen los datos fenotípicos, tanto de los ensayos como de los viveros. Con ayuda del programa se pueden hacer los cálculos de rendimiento y los análisis estadísticos para compensar la variabilidad de campo. Para ello se exportan los datos para ser analizados por un programa estadístico llamado REML que a su vez regresa los resultados en el mismo formato de Excel. En resumen, es un paquete de macros y archivos de Excel, que le ayudan a un investigador a tener un programa de fitomejoramiento organizado y coherente. El programa puede ser descargado gratuitamente en los siguientes dos sitios: http://www.cimmyt.org/dtma/mFinder/fb8.4.7.zip

202 ftp://ftp.cgiar.org/cimmyt/FIELDBOOK/FIELDBOOK

7.4.2. Alternativas gratuitas de software Muchos estudiantes no tienen recursos para comprar software comercial, o no quieren usarlos para ello, y es por eso que recurren al copiado ilegal de programas. Las personas honestas, respetuosas y comprometidas con la innovación científica no deberían desacreditar el valor de la propiedad intelectual. Las empresas invierten mucho dinero en investigación y desarrollo merecen una retribución económica por ello. Piratear programas de software con copyright restringido es como robarle patentes a otras empresas, o copiarle la tesis a un compañero. ¿Por qué hacerlo si no hay necesidad? Hoy en día existen alternativas muy atractivas de software gratuito bajo un esquema de licenciamiento GPL.

7.4.2.1. Sistema operativo Ubuntu Uno de los sistemas operativos con más crecimiento en los últimos años es Ubuntu. Además de que es gratuito y de código libre, corre mucho más rápido que Windows Vista, y por si fuera poco, no tiene problemas de virus o de spyware. Instale Ubuntu en su computadora y pruébelo. El sistema Ubuntu se puede descargar del siguiente sitio: http://www.ubuntu.com/

Cuando aprenda más de los nuevos sistemas Linux, verá que existe un sinnúmero de programas disponibles y que puede hacer todo lo que hacía antes en Windows, con programas gratuitos, flexibles y poderosos. Hay más herramientas bioinformáticas disponibles en Linux que en los otros sistemas operativos (Windows y Mac). Si quiere incursionar más a fondo en la bioinformática y el cómputo biológico avanzado, no hay mejor forma que aprendiendo a manejar Ubuntu y usar los programas tipo Linux.

7.4.2.2. Open Office ¿Cuanto cuesta la licencia para tener instalado de manera legal el paquete de Microsoft Office en su computadora? Los que no tienen dinero para pagarla, en lugar de usar una copia pirata, pueden probar una alternativa diferente. Una de las mejores es el OpenOffice. Tanto en Ubuntu como en Windows el paquete de Open Office puede ser usado para manejar archivos Word, Excel y PowerPoint. Descargue el Open Office de forma gratuita del siguiente link:

http://es.openoffice.org/

203

Figura 7-5. Ventanas de programas de OpenOffice

7.4.2.3. Emboss EMBOSS is "The European Molecular Biology Open Software Suite". EMBOSS is a free Open Source software analysis package specially developed for the needs of the molecular biology user community. The software automatically copes with data in a variety of formats and even allows transparent retrieval of sequence data from the web. Extensive libraries are provided with the package. It is a platform that allows other scientists to develop and release software in true open source spirit. EMBOSS also integrates a range of sequence analysis tools into a seamless whole. EMBOSS breaks the historical trend towards commercial software packages. http://emboss.sourceforge.net/

7.4.2.4. Sequence Manipulation Suite El Sequence Manipulation Suite (SMS) es una colección de programas de JavaScript para generar, formatear y analizar secuencias de DNA y proteínas. Es un paquete gratuito basado en una serie de páginas web que puede correr de manera local en cualquier buscador (navegador) como Explorer o Firefox. Para probar y descargar el SMS consulte la página oficial: http://www.bioinformatics.org/sms2/

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El SMS tiene una serie de funciones. La siguiente lista muestra algunos ejemplos de las funciones de este paquete que es gratuito y fácil de usar.

Format Conversion: • GenBank to FASTA - accepts one or more GenBank files as input and returns the entire DNA sequence from each in FASTA format. Use this program when you wish to quickly remove all of the non-DNA sequence information from a GenBank file. • One to Three - converts single letter translations to three letter translations. • Reverse Complement - converts a DNA sequence into its reverse, complement, or reverse-complement counterpart. The entire IUPAC DNA alphabet is supported, and the case of each input sequence character is maintained. You may want to work with the reverse-complement of a sequence if it contains an ORF on the reverse strand.

Sequence Analysis: • Codon Plot - accepts a DNA sequence and generates a graphical plot consisting of a horizontal bar for each codon. The length of the bar is proportional to the frequency of the codon in the codon frequency table you enter. Use Codon Plot to find portions of DNA sequence that may be poorly expressed, or to view a graphic representation of a codon usage table (by using a DNA sequence consisting of one of each codon type). • DNA Molecular Weight - accepts one or more DNA sequences and calculates molecular weight. Sequences can be treated as double-stranded or single-stranded, and as linear or circular. Use DNA Molecular Weight when calculating molecule copy number. • DNA Pattern Find - accepts one or more sequences along with a search pattern and returns the number and positions of sites that match the pattern. The search pattern is written as a JavaScript regular expression, which resembles the regular expressions written in other programming languages, such as Perl. • DNA Stats - returns the number of occurrences of each residue in the sequence you enter. Percentage totals are also given for each residue, and for certain groups of residues, allowing you to quickly compare the results obtained for different sequences. • Fuzzy Search DNA - accepts a DNA sequence along with a query sequence and returns sites that are identical or similar to the query. You can use this program, for example, to find sequences that can be easily mutated into a useful restriction site.

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• Mutate for Digest - accepts a DNA sequence as input and searches for regions that can easily be mutated to create a restriction site of interest. The program also reports protein translations so that you can see which reading frames are altered by the proposed mutations. Use Mutate for Digest to find sequences that can be converted to a useful restriction site using PCR or site-directed mutagenesis. • Multi Rev Trans - accepts a protein alignment and uses a codon usage table to generate a degenerate DNA coding sequence. The program also returns a graph that can be used to find regions of minimal degeneracy at the nucleotide level. Use Multi Rev Trans when designing PCR primers to anneal to an unsequenced coding sequence from a related species. • ORF Finder - searches for open reading frames (ORFs) in the DNA sequence you enter. The program returns the range of each ORF, along with its protein translation. ORF Finder supports the entire IUPAC alphabet and several genetic codes. Use ORF Finder to search newly sequenced DNA for potential protein encoding segments. • Pairwise Align DNA - accepts two DNA sequences and determines the optimal global alignment. Use Pairwise Align DNA to look for conserved sequence regions. • PCR Primer Stats - accepts a list of PCR primer sequences and returns a report describing the properties of each primer, including melting temperature, percent GC content, and PCR suitability. Use PCR Primer Stats to evaluate potential PCR primers. • PCR Products - accepts one or more DNA sequence templates and two primer sequences. The program searches for perfectly matching primer annealing sites that can generate a PCR product. Any resulting products are sorted by size, and they are given a title specifying their length, their position in the original sequence, and the primers that produced them. You can use linear or circular molecules as the template. Use PCR Products to determine the product sizes you can expect to see when you perform PCR in the lab. • Protein GRAVY - Protein GRAVY returns the GRAVY (grand average of hydropathy) value for the protein sequences you enter. The GRAVY value is calculated by adding the hydropathy value for each residue and dividing by the length of the sequence (Kyte and Doolittle; 1982). • Protein Isoelectric Point - calculates the theoretical pI (isoelectric point) for the protein sequence you enter. Use Protein Isoelectric Point when you want to know approximately where on a 2-D gel a particular protein will be found. • Protein Molecular Weight - accepts one or more protein sequences and calculates molecular weight. You can append copies of commonly used epitopes and fusion proteins using the supplied list. Use Protein Molecular Weight when you wish to predict the location of a protein of interest on a gel in relation to a set of protein standards. • Protein Stats - returns the number of occurrences of each residue in the sequence you enter. Percentage totals are also given for each residue, and for certain groups of residues, allowing you to quickly compare the results obtained for different sequences. • Restriction Digest - cleaves a DNA sequence in a virtual restriction digest, with one, two, or three restriction enzymes. The resulting fragments are sorted by size, and they are given a title specifying their length, their position in the original sequence, and the enzyme sites that produced them. You can digest linear or circular molecules, and even a mixture of molecules (by entering more than one sequence in FASTA format). Use Restriction Digest to determine the fragment sizes you will see when you perform a digest in the lab. • Restriction Summary - accepts a DNA sequence and returns the number and positions of commonly used restriction endonuclease cut sites. Use this program if you wish to quickly determine whether or not an enzyme cuts a particular segment of DNA. • Reverse Translate - accepts a protein sequence as input and uses a codon usage table to generate a DNA sequence representing the most likely non-degenerate coding sequence. A consensus sequence derived from all the possible codons for each amino acid is also returned. Use Reverse Translate when designing PCR primers to anneal to an unsequenced coding sequence from a related species. • Translate - accepts a DNA sequence and converts it into a protein in the reading frame you specify. Translate supports the entire IUPAC alphabet and several genetic codes.

206

8. Herramientas Estadísticas 8.1. Conceptos básicos de estadística 8.1.1. ¿Para que sirve la estadística? Para poder calcular algo en estadística, lo más importante es tener suficientes repeticiones. El mantra de los experimentos biológicos es: siempre incluir repeticiones y controles. De preferencia, hacer las más repeticiones posibles. El principal problema de los experimentos agronómicos para mejoramiento genético, es que no se hacen suficientes repeticiones para tener mayor certeza de los resultados. En un mundo ideal para un fitomejorador, sería deseable tener 5 repeticiones de un mismo genotipo sembradas en 50 diferentes localidades. En el mundo real muchas veces no se pueden hacer tantas repeticiones por cuestiones de espacio, costo, esfuerzo o de tiempo. Por ejemplo, a veces solo se hacen 2 repeticiones por localidad, y muchas veces solo se siembran menos de 5 localidades diferentes. Algunas veces no se tiene suficiente semilla para evaluarla en tantos ensayos, otras veces simplemente no se tienen las facilidades o el dinero. La estadística se puede usar para resolver este problema de limitación de recursos. Se podría decir que es un conjunto de herramientas matemáticas que permiten sacar el mayor provecho con el menor esfuerzo experimental posible. Es decir, la bioestadística permite llegar a una conclusión lo más robusta posible, con el número limitado de repeticiones que tiene uno disponibles. La ventaja de la estadística es que calcula un resultado y al mismo tiempo da un valor sobre la confiabilidad de ese resultado en términos probabilísticos. A esto se le llama niveles de confianza, y se les clasifica en errores del tipo alfa (α) y beta (β). Para entender más a fondo la estadística, es necesario repasar algunos de sus fundamentos y conceptos básicos. 8.1.2. Medidas centrales Con una serie de datos relativamente grande uno puede calcular las medidas centrales como el promedio, la mediana y la moda. En un conjunto de valores, por lo regular, el valor promedio es el más importante. Al promedio también se le llama media aritmética. Esta medida no se debe confundir con la mediana que es el valor central de un conjunto de números. La mediana es el número que se encuentra en medio, es decir, la mitad de los números es mayor que la mediana y la otra mitad es menor. La moda es el valor que se repite con mayor frecuencia. Ninguna de estas medidas de tendencia central tomada individualmente proporciona una imagen completa de los datos. Supongamos que los datos están agrupados en tres áreas, en una hay un valor bajo que se repite mucho; en la otra, hay muchos valores promedios y en el otro tercio hay valores más extremos, pero cada vez menos frecuentes. Tanto PROMEDIO como MEDIANA devolverán un valor situado en una zona central, y MODA devolverá el valor bajo dominante. (Ver Figura 8-1) Lo que hay que recordar es que cuando la distribución de los datos es compleja, los valores de media, mediana y moda darán valores muy diferentes (ver Figura 8-1), mientras que con una distribución normal, los valores serán muy parecidos (ver Figura 8-2).

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Histograma de Datos Moda: 0.2 Mediana: 0.80 12 Promedio: 0.96

Frecuencia 4

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 Categoría

Figura 8-1. Ejemplo de histograma de datos con una distribución compleja. Se puede ver, que los valores del promedio, la mediana y la moda son diferentes uno del otro.

Histograma de Datos Moda: 1.51 60 Mediana: 1.510 50 Promedio: 1.514 40

Frecuencia 20

0 1.44 1.46 1.48 1.5 1.52 1.54 1.56 1.58 1.6 1.62 Categoría

Figura 8-2. Ejemplo de histograma de datos con una distribución seminormal. En este caso los valores del promedio, la mediana y la moda son muy parecidos. 8.1.3. Desviación estándar y distribución normal Cuando se tiene una serie de datos con sus respectivas repeticiones, primero se calcula el promedio. Esto se hace con la simple formula de sumar todos los valores y dividirlo entre el número de mediciones. Sin embargo, el promedio no dice nada sobre la repetibilidad y por eso es necesario hacer más cálculos para reducir la variabilidad de los datos. La desviación estándar (SD) es una medida de dispersión para variables numéricas (variables de intervalo). El concepto es de gran utilidad en la estadística descriptiva. La desviación estándar (símbolo sigma, σ) informa sobre el promedio de las distancias que tienen los datos respecto de su media

208 aritmética, expresada en las mismas unidades que la variable. El término desviación estándar fue incorporado a la estadística por Karl Pearson en 1894.

Figura 8-3. Distribución normal mostrando el porcentaje de valores que hay dentro de cada rango.

La distribución normal es una curva estandarizada que está basada en la fórmula de Gauss.

Para conocer con detalle un conjunto de datos, no basta con conocer las medidas de tendencia central, sino que necesitamos conocer también la desviación que representan los datos en su distribución respecto de la media aritmética de dicha distribución. El objetivo es tener una visión de los mismos más acorde con la realidad a la hora de describirlos e interpretarlos para la toma de decisiones. A esto se le llama prueba de hipótesis.

La varianza representa la media aritmética de las desviaciones con respecto a la media, elevadas al cuadrado. Si atendemos a la colección completa de datos (la población en su totalidad) podemos obtener la varianza poblacional; y si por el contrario prestamos atención sólo a una muestra de la población, obtenemos en su lugar la varianza muestral. En la rutina de los investigadores casi siempre se usan las medias y varianzas muestrales, casi nunca las poblacionales. La varianza y la desviación estándar están estrechamente relacionadas. La desviación estándar es la raíz cuadrada positiva de la varianza.

Expresión de la varianza muestral:

Expresión de la desviación estándar muestral:

209

8.1.4. Tipos de errores En las mediciones experimentales podemos distinguir entre dos tipos de errores. El error aleatorio debido al azar, y el error sistemático debido a algún desperfecto del instrumento, o problemas con la referencia o la curva de calibración. Por lo regular se trata de obtener la mejor precisión posible, con el más alto grado de repetibilidad (Figura 8-4).

Precisión Error sistemático

buena mala

buena

Repetibilidad

mala

Error aleatorio Figura 8-4. Tipos de errores y su relación con precisión y repetibilidad. 8.1.5. Diseño experimental Los pasos para la realización de un experimento son:

1) Estudio del arte previo. Antes de hacer un experimento se debe tener un panorama de lo que ya se sabe (dominio del conocimiento general) y las interrelaciones con otras ramas científicas y del conocimiento. Después de eso se debe hacer la pregunta: ¿Qué es lo que todavía no se sabe? Solamente así se pueden plantear preguntas novedosas que contribuyan al avance de nuestro conocimiento.

2) Planteamiento del problema de investigación. Esto incluye la definición de una pregunta concreta y relevante. En base a esa pregunta específica se define una respuesta teórica que llamamos hipótesis. Una hipótesis es la respuesta favorita a una pregunta biológica pero que todavía no tenemos datos suficientes para sustentarla de manera rigurosa. Cuando se trata de una pregunta estadística, por ejemplo, el efecto de un factor sobre un resultado, se define una hipótesis nula (Ho) y una hipótesis alterna:

La hipótesis nula: Por lo regular predice que el azar es la causa principal del resultado que obtuvimos. Solo cuando tenemos evidencia experimental (suficiente repetibilidad) de que los resultados no se dieron por azar, es cuando rechazamos la hipótesis nula y decimos con cierto grado de certeza (nivel de significancia) que la hipótesis alterna es válida. En estadística, una hipótesis nula es una hipótesis construida para anular o refutar. La hipótesis nula se presume verdadera hasta que los datos (prueba de hipótesis) indiquen lo contrario.

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Ejemplo de Hipótesis nula para Chi cuadrado: "Si este material genético segrega en proporciones mendelianas, no habrá diferencias entre las frecuencias observadas (O) y las frecuencias esperadas (E)" Ejemplo de hipótesis nula para student: "Si la humedad relativa no influye sobre el número de huevos por desove, no habrá diferencias entre las medias de esta variable entre las regiónes húmedas o secas."

3) Modelo y metodología: En base a la pregunta planteada, se busca el mejor método para contestarla. Por ejemplo, si queremos saber cuál de todos las variedades de maíz es mejor, lo que debemos hacer es un ensayo de campo para ver cuál tiene mayor rendimiento de grano. El diseño experimental incluye la elección de los genotipos, los controles, el procedimiento a seguir, es decir: el diseño, las repeticiones, las localidades, el o los tratamientos a aplicar, las variables consideradas: variables independientes, variables dependientes, variables codependientes, variables extrañas, etc.

Tipos de variables: * Variables independientes: Son las variables que el experimentador puede controlar y define a priori en el experimento. Por ejemplo, los genotipos, la irrigación, los tratamientos, etc. Se supone que estas variables determinan los resultados del experimento. * Variables dependientes: Son características de la realidad que se ven determinadas ya sea por el azar o por los factores que se definieron o controlaron en el experimento. La clasificación “dependiente” indica conocimiento a priori de que esta variable es efecto y no causa. Es decir, depende del tratamiento y no al revés. El valor de la variable dependiente puede ser resultado del azar (hipótesis nula), o ser efecto directo o indirecto de otros fenómenos o variables desconocidas. Sólo cuando existe suficiente asociación con la variable independiente se dice que aceptamos la hipótesis alterna. *Variable continua: Se presenta cuando el fenómeno que se mide puede tomar valores cuantitativos, por ejemplo el rendimiento, ya que esta variable puede asumir valores de rango continuo: 1, 2, 3, o 15 toneladas por hectárea. * Variables discretas: Son aquellas que establecen categorías en términos no cuantitativos. Por ejemplo cuando se clasifican las localidades o los ambientes en: normal, sequía, bajo en nitrógeno, etc., o cuando se clasifica el germoplasma por color: blanco, amarillo, azul, etc.

El número de variables que se incluyan en un experimento, depende del investigador y del fenómeno que estudie. Mientras más variables independientes se agreguen, quizá obtenga una mayor explicación de los cambios en su variable dependiente. Por ejemplo: si quiere explicar el rendimiento de grano puede controlar variables como el genotipo, los alelos, los QTLs, la localidad, los riegos, la fertilidad del suelo, etc. También se pueden incluir variables independientes, pero que no son controlables a campo abierto, como intensidad de luz, temperatura, vientos, lluvias, etc. Además de la variable dependiente principal que es el rendimiento de grano, también se pueden analizar variables codependientes como: el número de mazorcas, el tamaño de grano, días de floración, el intervalo de floración femenina-masculina (ASI), la senescencia, la altura de planta, etc. Si sólo se utiliza una variable, será difícil creer que el rendimiento depende sólo de un factor. La relación causa- efecto no siempre es tan evidente como quiere el investigador. Entre más variables se incluyan en el análisis mayor será la certeza de detectar efectos significativos y confiables.

4) Resultados: los datos obtenidos se deben organizar de manera sistemática y congruente. Usando estos datos se hace un análisis estadístico para describir cuáles fueron las relaciones observadas entre las variables. Se debe contestar si la o las variables independientes realmente influyeron significativamente sobre los valores de las variables dependientes. También se debe analizar si hubo tantas variables conocidas o extrañas como se pensaba, o si surgieron otras. Los resultados por lo general se presentan a manera de tablas o graficas (de barras, de pastel, etc.). Todas las formas de representación de resultados deben incluir indicadores de variabilidad experimental con grados de confiabilidad (desviación estándar, barras de error, repetibilidad, resultados de pruebas de T, etc.)

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5) Conclusiones: En la investigación y la experimentación, las conclusiones son determinaciones hechas mediante el estudio meticuloso de los resultados del trabajo precedente dentro de una cierta metodología. Las conclusiones toman a menudo la forma de teorías (explicación general fenomenológica). La conclusión es típicamente el resultado de una discusión de los datos considerando las premisas. Sin una discusión de las premisas, no hay conclusión, si son sólo aseveraciones sin evidencia, es una alegación. Naturalmente, la precisión de una conclusión dada, es dependiente de la verdad de la conclusión elegida.

6) Difusión y divulgación. A partir de las conclusiones ya es posible pensar en la elaboración de un informe que puede ser oral o escrito, y tiene la finalidad de comunicar los resultados a la sociedad y a la comunidad científica. La publicación del experimento y sus conclusiones se puede presentar en un congreso en forma de una charla, o hacerse a través de un artículo en una revista nacional o internacional.

Como muchas cosas en la ciencia, el proceso experimental es cíclico e iterativo, de forma que una pregunta o experimento genera una serie de datos cuya interpretación da origen a muchas preguntas más, que a su vez pueden ser contestadas al repetir los experimentos variando las condiciones, eligiendo nuevos componentes o alterando las premisas (Figura 8-5).

Estado del Arte Publicación Creatividad

Difusión Pregunta

Proceso Científico Símbolos, teorías Hipótesis Iterativo Conclusiones Metodología

Experimento Análisis Datos Variables

Figura 8-5. Proceso iterativo científico. 8.2. Análisis estadísticos 8.2.1. Ejemplo de análisis usando pruebas de T Ahora que hemos repasado un poco las bases de la estadística descriptiva, trataremos de profundizar más con algunos ejemplos. Trataremos de ver como la estadística cuantitativa permite generar conclusiones con relevancia biológica (inferencia estadística). Supongamos que queremos saber si dos productos (un agroquímico y un fertilizante orgánico) incrementan el rendimiento de maíz. Para ello se diseña un experimento en el cual se usan los productos solos o de manera combinada. Producto Fertilizante Tratamiento XA Tratamiento XB Fertilizante: 0 kg Fertilizante: 0 kg

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Químico Químico: 0 lt Químico: 1 lt Tratamiento YA Tratamiento YB Fertilizante: 2 kg Fertilizante: 2 kg Químico: 0 lt Químico: 1 lt

El tratamiento XA corresponde al control (sin químico y sin fertilizante), mientras que el tratamiento YB incluye los dos productos de manera combinada (con químico y con fertilizante). Para cada condición (nivel de tratamiento) se hacen 10 repeticiones que se manejan dentro de un campo experimental. En total se siembran 40 parcelas al azar. A continuación se muestra una tabla con los datos que se obtuvieron del experimento.

Rendimiento de maíz en kilos por parcela Tratamientos XA XB YA YB rep1 6 9 13 8 rep2 7 12 12 9 rep3 5 12 12 8 rep4 4 12 12 11 rep5 6 11 11 12 rep6 7 13 11 10 rep7 8 11 11 12 rep8 6 10 10 14 rep9 9 10 10 12 rep10 9 9 14 11

La tarea ahora consiste en hacer el análisis estadístico para saber si los diferentes tratamientos tienen un efecto significativo sobre el rendimiento de maíz. Explicaremos con estos datos algunos tipos de análisis estadísticos, por ejemplo, la prueba T y el análisis de varianza (ANOVA). Usaremos las funciones de Excel (o Spreadsheet de OpenOffice) para hacerlo. Lo primero que se debe calcular es el número de observaciones, la suma, el promedio, la desviación estándar y el error estándar para cada tratamiento por separado. (Si no sabe usar Excel consulte primero la sección 8.3.1 de este capítulo)

XA XB YA YB NumObs 10 10 10 10 =CONTAR(B4:B15) Suma 67 109 116 107 =SUMA(B4:B15) Promedio 6.70 10.90 11.60 10.70 =PROMEDIO(B4:B15) SD 1.636 1.370 1.265 1.947 =DESVEST(B4:B15) SE 0.517 0.433 0.400 0.616 =B19/RAIZ(B16)

Podemos ver que los promedios tienen valores diferentes para cada tratamiento. La pregunta ahora es saber si las diferencias son significativas. La hipótesis nula en este caso sería: las diferencias entre los tratamientos se deben al azar y no a los productos químicos que se aplicaron. Para visualizar mejor los resultados hacemos una grafica en Excel usando los valores promedio incluyendo barras de error.

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Rendimiento por plot Rendimiento por plot 14 14

12 12

10 10

8 8

6 6 kg/plot kg/plot 4 4

2 2

0 0 XA XB YA YB XA XB YA YB

Figura 8-6. Resultados del experimento de rendimiento. En la gráfica de la izquierda se uso el valor SD para las barras de error y en la derecha el valor SE.

Las barras de error son mas pequeñas si se usa el valor SE (standard error, error estándar) que el valor SD (standard deviation, desviación estándar). La gráfica de la derecha se ve más bonita por tener errores más pequeños. Eso podría ser razón suficiente para poner siempre el valor SE en cualquiera de las graficas que hagamos. Afortunadamente, no solo hay argumentos estéticos sino también técnicos para usar los valores SE en nuestras graficas. Las barras de error son más informativas si se usa el error estándar (SE) que si se usa la desviación estándar (SD), debido a que el valor SE incluye una información importante, como es el número de repeticiones hechas (valor n) que no esta reflejada en el valor SD pero si en el valor SE.

SD SE = n

Con el valor SE uno puede ver intuitivamente que tratamientos fueron diferentes de otros. Una regla empírica dice que si las barras de error (SE) se tocan, entonces las diferencias no son significativas ya que el valor P será mayor a 5% (P>0.05). Sólo cuando las barras de error no se tocan es cuando las diferencias podrían ser significativas (P<0.05). En realidad siempre es necesario hacer pruebas para obtener un valor de P exacto. Solo con un análisis de varianza se puede tener certeza estadística.

Una de las pruebas más usadas es la prueba T. En este caso, usamos la función de Excel PRUEBA.T con la siguiente sintaxis (matriz, matriz, 1, 3) que significa una comparación entre dos matrices de datos, con la opción de análisis de una cola con muestras de varianza distinta. La prueba T permite comparar sólo dos grupos entre si, por lo que tenemos que hacer varias de ellas. Para ello hacemos una matriz de valores P en donde comparamos todos los tratamientos contra todos.

Valor de P de significancia estadística XB 4.11E-06 =PRUEBA.T(C4:C13,D4:D13,1,3) YA 4.53E-07 0.125 =PRUEBA.T(C4:C13,E4:E13,1,3) YB 5.34E-05 0.397 0.119 =PRUEBA.T(C4:C13,F4:F13,1,3)

214

Prueba.T XA XB YA

Como podemos ver, sí hay algunas diferencias significativas entre los tratamientos, tanto de los valores promedio como los valores P. El par significativamente más diferente, es la comparación entre el tratamiento XA con el YA. Por otro lado, el tratamiento XB no es significativamente diferente del tratamiento YA, ni del YB tampoco (P>0.05). Tomando esto en cuenta, podemos poner estrellitas en nuestra grafica para indicar los valores que son significativamente diferentes del control XA.

Rendimiento por plot 14 *** 12 *** *** 10

6 kg/plot 4

0 XA XB YA YB

Figura 8-7. Gráfica con significancia estadística. Las estrellitas indican los valores P en la comparación con el tratamiento control XA. Una estrellita significa P<0.05, Dos estrellitas indican P<0.01, mientras que tres estrellitas indican P<0.001.

La interpretación del anterior resultado es que ambos productos si incrementan significativamente el rendimiento. Tanto el fertilizante como el químico tienen un efecto positivo. Sin embargo, el efecto de los productos no es aditivo, ya que cuando se usan de manera combinada, el rendimiento no incrementa más. Si el efecto fuera aditivo, lo que se esperaría, es que el tratamiento YB tuviera un rendimiento más alto que XB o YA.

La razón T. Antes, cuando no había los programas como Excel, los estadistas calculaban todo a mano y con lápiz. De hecho, al principio ni siquiera se tenían calculadoras de bolsillo. Para obtener sus resultados, se usaban formulas matemáticas y se consultaban tablas de estadística en donde se indicaban los valores de las proporciones T y F para un determinado valor P y grados de libertad (df). Si bien hoy en día tenemos disponibles las computadoras con programas como Excel y R, no esta de más repasar la manera en que se obtienen algunos valores estadísticos.

X1 xi-X (xi-X)2 X2 xi-X (xi-X)2 18 3.53 12.48 13 2.67 7.11 17 2.53 6.42 12 1.67 2.78 16 1.53 2.35 12 1.67 2.78 16 1.53 2.35 12 1.67 2.78 16 1.53 2.35 11 0.67 0.44 15 0.53 0.28 11 0.67 0.44 15 0.53 0.28 11 0.67 0.44

215

15 0.53 0.28 10 -0.33 0.11 15 0.53 0.28 10 -0.33 0.11 14 -0.47 0.22 10 -0.33 0.11 14 -0.47 0.22 10 -0.33 0.11 13 -1.47 2.15 9 -1.33 1.78 12 -2.47 6.08 9 -1.33 1.78 11 -3.47 12.02 8 -2.33 5.44 10 -4.47 19.95 7 -3.33 11.11

NumObser (n) 15 15 Suma Σ 217 0 67.73 155 0.00 37.33 Promedio (X) 14.47 10.33

2 i − Xx )( SD df=n-1 Varianza = ∑ SD= Varianza SE= n − )1( n Teniendo la suma de las diferencias cuadradas y los grados de libertad (df = 14) Entonces podemos calcular la varianza, la desviación estándar y el error como se muestra a continuación: X1 X2 Varianza 4.838 =67.73/14 2.667 =37.33/14 SD 2.200 =√4.838 1.633 =√2.667 SE 0.568 =2.2 / √15 0.422 =1.63 / √15

Ahora, si comparamos los valores de 14.47 y 10.33 vemos que hay una diferencia de 4.13 entre los promedios de los dos grupos de variables X1 y X2. ¿Es significativa esta diferencia? Para responder esta pregunta, hay que calcular la razón T. Primero hay que calcular el error estándar de la diferencia entre dos medias usando la siguiente formula:

2 2 ∑∑1 + xx 2 ⎛ 2 ⎞ Sx1-x2= *⎜ ⎟ 21 −+ 2 ⎝ nnn ⎠

Se procede a sustituir las variables de la fórmula con los valores: + 33.3773.67 ⎛ 2 ⎞ 06.105 ⎛ 2 ⎞ Sx1-x2 = *⎜ ⎟ = *⎜ ⎟ = 50286.0 = 0.7091 −+ 21515 ⎝15 ⎠ 28 ⎝15 ⎠

− XX 21 13.4 A continuación de calcula la razón T = = = 5.82 7091.0 7091.0

El valor 0.7091 es la diferencia esperada entre dos grupos si se extraen aleatoriamente de una población común con la varianza calculada para X1 y X2. El valor de la razón T indica cuantas veces mayor es la diferencia de lo que se esperaría si la hipótesis cero fuera cierta. La diferencia observada es 5.82 veces mayor que la esperada según la hipótesis de nulidad. ¿Es lo suficientemente grande para rechazar la hipótesis cero con un nivel de confianza de 0.05? Para contestar necesitamos consultar una tabla t con los grados de libertad indicados (df=N-2=28). En este caso, el valor de 5.82 sí es mayor al valor crítico, y por consiguiente, rechazamos la

216 hipótesis cero. Concluimos que las diferencias de los promedios sí son significativas. Es decir, la diferencia de los dos grupos no se debe al azar, sino a algún factor externo que hace que sus distribuciones no sean de una misma población.

Sería un desperdicio de tiempo hacer que los estudiantes de postgrado calculen siempre sus estadísticas a mano como en el ejemplo anterior. Si las computadoras pueden hacer el trabajo, ¿para que desperdiciar el potencial intelectual de los jóvenes con una tarea tan de rutina? Lo que se requiere de los estudiantes es que piensen. Esto implica que diseñen experimentos, hagan las pruebas, y que interpreten los resultados y presenten sus conclusiones a una audiencia científica. Los cálculos aburridos los puede hacer la computadora. Sin embargo, es necesario saber como funcionan las fórmulas. El presente libro tiene el titulo de “Fundamentos”, y es por ello que incluimos muchas de estas nociones básicas para el mejoramiento genético. Ahora que hemos aprendido como lo hacían los estadistas de antaño, y cuando ya entendamos como lo hacen las computadoras modernas, los estudiantes de ahora ─que serán científicos del futuro─ nos podemos enfocar a la interpretación de los resultados.

8.2.2. Ejemplo de análisis usando ANOVA Ahora haremos un análisis de varianza (analysis of variance, ANOVA) con los mismos datos de la sección anterior. Al igual que la prueba T, la ANOVA se utiliza para determinar una razón de las diferencias observadas –nivel/margen de error– para comprobar hipótesis. Esta razón denominada como razón F, determina la varianza de las medias de los grupos como una medida de las diferencias observadas entre ellos. La razón T sólo se utiliza para comprobar la diferencia entre dos medias. Es por ello que tuvimos que hacer varias pruebas T dentro de una matriz para comparar todos los tratamientos. La ANOVA nos permite verificar la diferencia entre dos o más medias. Lo particular de ANOVA es que la misma considera la varianza total de todos los sujetos en una muestra incluyendo la varianza entre los grupos y la varianza dentro de los grupos. Se puede usar para analizar experimentos más complejos que incluyen combinaciones de tratamientos. Por lo tanto, es una técnica más amplia y de mayor uso que la razón T. Una prueba T es equivalente a una ANOVA de un solo factor, mientras que para comparaciones entre dos o más factores ya no se debe usar la prueba T, sino que es mejor usar una ANOVA.

Grados de libertad: Con la expresión de grados de libertad se designa un número de observaciones que pueden variar alrededor de un parámetro constante. Por ejemplo: si se le pide que escoja cinco números y usted elige los que quiera, entonces tiene cinco grados de libertad. Sin embargo, si se le pide que escoja cinco números cuya media de 20 (la suma de 100), entonces puede escoger cuatro números libremente, pero para el quinto tendrá que restringirse a un número especifico para poder llegar a 100. Solo así obtendrá un promedio de 20. Si suma 20 + 30 + 29 + 11... el quinto número tiene que ser 10. Por lo tanto tiene sólo cuatro grados de libertad. Usualmente, para determinar los grados de libertad (df), se resta uno del total de la muestra (df=N – 1). Cuando se hace un análisis de correlación entre dos variables (regresión lineal) entonces se le restan dos al numero total de observaciones (df=N- 2).

Suma de los cuadrados: En ANOVA se calcula la suma de las diferencias cuadradas. ¿Porque es tan importante esta suma de cuadrados? La suma de los cuadrados dividido entre los grados de libertad (df) equivale a la varianza (var). Por su parte, la raíz cuadrada de la varianza equivale a la desviación estándar (SD). El error estándar (SE), se calcula a partir del SD dividido entre la raíz cuadrada del numero de observaciones (n). Como se puede ver, la suma de los cuadrados esta directamente relacionado con un gran número de parámetros relevantes para la estadística. Cuando se habla de la suma de los cuadrados, la diferencia se refiere a la diferencia entre el valor x y el valor promedio de todo el ensayo. Es decir, no se refiere a los valores promedio dentro de los grupos. En el ejemplo de los datos que hemos usado, el promedio global es 9.975, mientras que el promedio de los grupos individuales es: 6.7, 10.9, 11.6, 10.7 para los tratamientos XA, XB, YA, YB respectivamente.

217

Para hacer una ANOVA, es necesario organizar los datos de acuerdo al programa que se va a usar para el análisis. La diferencia entre el formato requerido para Excel y el formato para el programa R radica en la forma en que se acomodan los grupos y los tratamientos. en Excel se especifican dos columnas de resultados según la primer variable (Grupo de fertilizante X o Y), mientras que la segunda variable de tratamiento se especifica hacia abajo (grupo de químico A o B).

Formato de datos para Excel Formato de datos para R Grupo X Grupo Y Variable1 Variable2 Resultado A 75 58 X A 75 68 56 X A 68 71 61 X A 71 B 75 60 X B 75 66 62 X B 66 70 60 X B 70 Y A 58 Y A 56 Y A 61 Y B 60 Y B 62 Y B 60

En cambio, en R, los tratamientos se especifican con columnas extras que indican los factores (variables dependientes por tipo de químico o fertilizante) y los niveles de tratamiento por cada factor. El resultado de rendimiento se pone en una sola columna (Resultado). La ventaja del formato de R es que permite agregar más columnas de resultados hacia la derecha, mientras que en Excel se tiene que hacer una tabla aparte para cada resultado (parámetro) que se quiera analizar. Tomando todo esto en cuenta, usaremos nuestros datos como ejemplo. En Excel debemos acomodar los tratamientos y los datos así: Quim RendX RendY A 6 13 A 7 12 A 5 12 A 4 12 A 6 11 A 7 11 A 8 11 A 6 10 A 9 10 A 9 14 B 9 8 B 12 9 B 12 8 B 12 11 B 11 12 B 13 10 B 11 12 B 10 14 B 10 12

218

B 9 11

Para el análisis ANOVA en Excel, debemos seleccionar todo el rango de celdas -que se muestran arriba- como rango de entrada. En el menú herramientas de Excel seleccionar “análisis de datos” y después escoger: “análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo”. En la ventana de dialogo de especificar el valor de filas por muestra (el número de repeticiones, en nuestro caso son 10 por tratamiento).

Para hacer el análisis ANOVA con el programa R, es mejor acomodar los datos de esta forma: Fert Quim Rend X A 6 X A 7 X A 5 X A 4 X A 6 X A 7 X A 8 X A 6 X A 9 X A 9 X B 9 X B 12 X B 12 X B 12 X B 11 X B 13 X B 11 X B 10 X B 10 X B 9 Y A 13 Y A 12 Y A 12 Y A 12 Y A 11 Y A 11 Y A 11 Y A 10 Y A 10 Y A 14 Y B 8 Y B 9 Y B 8 Y B 11 Y B 12 Y B 10 Y B 12 Y B 14 Y B 12 Y B 11

219

Para hacer el análisis ANOVA en R, copiar las celdas arriba en el clipboard (portapapeles) y escribir en la consola de R los siguientes 3 comandos en azul: data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") attach(data1) summary(aov(Rend~Quim*Fert))

El resultado que obtendremos será el siguiente:

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Quim 1 27.225 27.225 10.951 0.002132 ** Fert 1 55.225 55.225 22.213 3.598e-05 *** Quim:Fert 1 65.025 65.025 26.155 1.059e-05 *** Residuals 36 89.500 2.486 --- Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Ahora trataremos de interpretar el resultado. Primero comparemos las tablas ANOVA que nos dio Excel o R. El resultado ANOVA que obtendremos en Excel se vera así: Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo

RESUMEN RendX RendY Total A Cuenta 10 10 20 Suma 67 116 183 Promedio 6.7 11.6 9.15 Varianza2.681.608.34

B Cuenta 10 10 20 Suma 109 107 216 Promedio 10.9 10.7 10.8 Varianza1.883.792.69

Total Cuenta 20 20 Suma 176 223 Promedio 8.8 11.15 Varianza 6.8 2.77

ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Promedio de las Suma de Grados de los Valor crítico variaciones cuadrados libertad cuadrados F Probabilidad para F Quimico 27.23 1 27.23 10.95 0.002132 4.11 Fertilizante 55.23 1 55.23 22.21 0.000036 4.11 Interacción 65.02 1 65.02 26.16 0.000011 4.11 Dentro del gru 89.50 36 2.49

Total 236.98 39

Vallamos paso por paso. Las primeras dos tablas se refieren a los datos de los tratamientos A o B por separado. En las columnas se muestran los tratamientos X o Y. En esas tablas se muestran algunos valores que ya habíamos calculado antes, como el número de observaciones por tratamiento, la suma, el promedio y la varianza, que corresponde al cuadrado de la desviación estándar. El verdadero resultado ANOVA se muestra en la última tabla. Es casi el mismo resultado que nos arrojo R. En la primera columna se muestran los nombres de los tratamientos como origen de la varianza. La segunda columna muestra la suma de los cuadrados, separada por tratamiento, así como la suma total de las diferencias cuadradas del experimento. En la segunda columna se puede ver que el tratamiento con fertilizante genera más suma de cuadrados que el tratamiento

220 con el químico. La tercera columna muestra los grados de libertad para cada tratamiento. Más adelante explicaremos con más detalle la suma de los cuadrados y los grados de libertad. La cuarta columna muestra los promedios de las sumas de los cuadrados. Equivale a la suma de los cuadrados dividido entre los grados de libertad (df). La quinta columna muestra la razón F para cada variable del tratamiento (Químico, Fertilizante e interacción entre los dos). La razón F se calcula al dividir el valor de los tratamientos (promedio de la suma de los cuadrados) entre el valor del residual (varianza dentro de los grupos=2.49)

27.23/2.49 = 10.95 55.23/2.49 = 22.21 65.02/2.49 = 26.16

En otras palabras, la razón F se refiere a la variación de los datos ─por efecto de los tratamientos─ que tantas veces más grande es en comparación con la varianza dentro de los grupos. La varianza entre los grupos es la varianza residual no explicada por los tratamientos. Entre mayor sea el valor F, menor será la probabilidad de que esos efectos se deban solo al azar (error tipo I). La sexta columna muestra precisamente ese valor P (probabilidad de un error tipo alfa). Si no tenemos Excel, en las tablas de estadística podemos consultar la probabilidad P, para determinado valor F, tomando en cuenta los grados de libertad (df). En nuestro caso, todos los tratamientos, así como la interacción entre ellos fue significativa a un nivel P<0.001. Cuando la hipótesis de nulidad se rechaza una vez llevado a cabo el análisis de varianza, lo único que puede afirmarse es que los resultados obtenidos de los grupos difieren y que las diferencias son mayores de lo que cabría suponer en función de la mera casualidad. Nos dice que el efecto del fertilizante o del químico fue significativo. El tercer renglón se refiere a la interacción entre los dos tratamientos. El resultado nos dice que la interacción fertilizante: químico es significativamente diferente de lo que se podría esperar de un efecto aditivo simple (suma de los efectos de cada tratamiento).

Una razón F alta no quiere decir que todos los grupos dentro de los tratamientos difieran significativamente de los demás. En nuestro caso solo tenemos dos niveles por tipo de tratamiento (fertilizante 0kg y fertilizante 2kg). En nuestro caso el resultado ANOVA nos dice que esos dos tratamientos sí difieren entre si. Sin embargo, podríamos hacer un experimento con varios niveles de tratamiento, por ejemplo, cinco niveles de fertilizante: 0kg, 1kg, 2kg, 3kg. En ese caso, el resultado de ANOVA, aunque sea significativo, no nos va a decir cual nivel difiere de otro. Una razón F significativa puede ser el resultado que solo un subgrupo difiera de los otros subgrupos. Por ejemplo, que el tratamiento 0kg fuera significativamente distinto de los tratamientos con 1kg y 2kg. Pero un valor P significativo de ANOVA no dice si el tratamiento 2kg y el de 3kg son significativamente diferentes. Para contestar esto, se deben hacer pruebas de comparación múltiple adicionales. Una de ellas es la prueba de Tukey. En la sección X se explica como hacer esas pruebas adicionales usando el programa R. Si no sabe usar el programa R, consulte la sección X de este libro. En resumen se puede decir que primero se debe crear un objeto aov( ) en R, para después hacer las pruebas de comparación con TukeyHSD.

Tarea 8-1. De la siguiente lista de datos calcule todos los parámetros estadísticos: n, suma, promedio, suma de los cuadrados, varianza, SD, SE y df. Hágalo con MS Excel, o con el programa spreadsheet de OpenOffice.

X1 X2 18 13 17 12 16 12 16 12

221

16 11 15 11 15 11 15 10 15 10 14 10 14 10 13 9 12 9 11 8 10 7

8.2.3. Ejemplo: varianza, heredabilidad y repetibilidad Una de las tareas más importantes de los mejoradores es distinguir entre los efectos debidos al genotipo y los debidos al ambiente y el azar. Esto es importante en todos los ensayos agronómicos, sobre todo los de mejoramiento, tanto los viveros de líneas como los ensayos de variedades. Las diferencias genotípicas entre líneas en un vivero o ensayo, son la señal que el mejorador está intentando detectar. Sin embargo, la señal no es pura. Hay gradientes de campo que pueden causar grandes variaciones. Los efectos de las unidades experimentales (parcelas, plots) están llenas de ruido. La heredabilidad (repetibilidad) es la proporción de señal:ruido (signal to noise ratio). A continuación vamos a repasar algunas formulas estadísticas para discriminar la señal del ruido. También haremos un ejercicio sobre el cálculo de los componentes de varianza y repetibilidad.

Medición Fenotípica Gradiente de Campo 7 4

6 3 5

4 2 3

2 1 1

0 0

Señal Genotípica Ruido 4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

Figura 8-8. Ejemplo de mediciones fenotípicas y su descomposición en sus componentes de señal, gradiente de campo y ruido residual. Esta figura nos ayuda a imaginarnos mejor la

222 magnitud del ruido en comparación con la señal. La descomposición en sus diversos componentes se hace por medio de un análisis de varianza.

Medición Fenotípica Rep1 Medición Fenotípica Rep2 4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

Medición Fenotípica Rep3 Medición Fenotípica Rep4

4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

Medición Fenotípica Rep5 Promedio de las 5 repeticiones 4 4

3 3

2 2

1 1

0 0

Figura 8-9. Mediciones fenotípicas con varias repeticiones. Entre más repeticiones se hacen, el ruido por azar cada mes tiene un menor efecto. El promedio de las 5 repeticiones tiene menos ruido que las repeticiones individuales, y por consiguiente, la señal genotípica es más clara y confiable.

Los objetivos de esta sección son: • Repasar los modelos lineales para mediciones en las parcelas en ensayos de variedad y viveros, así como los análisis estadísticos derivados de estas. • Entender el propósito de la replicación en programas de mejoramiento. • Repasar el concepto de repetibilidad experimental (Heredabilidad H).

223

• Modelar la relación entre replicas, error estándar del promedio de un cultivar (SEM), la diferencia mínima significativa (LSD) entre los promedios de dos cultivares y la repetibilidad.

El modelo lineal para mediciones en parcelas Los efectos genotípicos, ambientales y el ruido son parte del valor fenotípico. Estos valores se obtienen de las mediciones en las parcelas. Pueden ser valores como altura de planta, número de mazorcas o rendimiento de grano. Los efectos del genotipo y del ambiente se incorporan en los modelos lineales. Estos modelos son los mas utilizados para analizar resultados de ensayos agronómicos. Primero se requiere estar familiarizado con estos modelos, para después discutir mas a fondo sobre como incrementar la precisión de los ensayos, maximizar la respuesta de selección y utilizar eficientemente los recursos limitados de los mejoradores. Así que ahora, vamos a examinar el efecto de la variabilidad del campo, así como la repetibilidad en la precisión con la que los efectos de los genotipos son estimados.

Las mediciones de la parcela son analizadas utilizando un modelo lineal que permite la separación de los efectos genotípicos, del efecto ambiental y el error debido al azar. Una parte del ruido se debe a las diferencias en la calidad el suelo, disponibilidad de agua y nutrientes en las parcelas, y también a la variabilidad inherente de los organismos vivos. En un diseño completamente al azar (completely randomized desing, CRD) o en un diseño sin bloques, la medición de una parcela (P) en un vivero o ensayo de variedad, puede ser descompuesta en los siguientes componentes:

Pij = µ + Gi + ej Ecuación 8-1

Donde: Pii = valor fenotípico de una parcela que se obtuvo por una medición cuantitativa µ = promedio de todas las parcelas Gi = efecto en el enésimo genotipo, expresado como una desviación del promedio de todas las parcelas ej = el efecto “residual” de la enésima parcela, expresado como la desviación del promedio de todas las parcelas

En un vivero sin réplicas, las mediciones de parcelas sencillas se mezclan completamente, los efectos genotípicos y los de la parcela. En este caso, no se puede separar entre los diferentes efectos. En ensayos con réplicas, el promedio de la variedad j sobre la parcela (∑Yi./r), tiene el valor esperado μ + Gi. En la práctica el promedio de una variedad estimada de un ensayo es:

Yi. = µ + Gi + Σej/r Ecuación 8-2

Dónde: Σej = es la suma de los errores de ese genotipo en las diferentes repeticiones. r = es el número de réplicas.

Como todos los agrónomos saben, algunas áreas en el campo son más productivas que otras. Si asignamos un genotipo al azar, en varias parcelas diferentes (Por ejemplo, si tenemos varias réplicas), los efectos positivos y negativos de la parcela tienden a cancelarse entre ellos y Σej tiende a cero. Sin embargo, cuando tenemos pocas réplicas (r<3), los residuos (Σej/r) pueden hacer que el promedio que estimamos de las parcelas, difiera de manera importante del verdadero promedio del genotipo, μ + Gi..

224

La razón por la que hacemos réplicas de los ensayos de mejoramiento, es para minimizar el efecto de los errores residuales de la parcela en el estimado del promedio del genotipo. Las réplicas no se hacen principalmente para generar un término de error para probar si las diferencias entre genotipos son significativas (y tampoco es para compensar por parcelas pérdidas).

La varianza del promedio de un genotipo es:

2 2 σ Y = σ e /r Ecuación 8-3

2 El error estándar de un promedio (standard error of mean, SEM) es la raíz cuadrada de σ Y.

Los mejoradotes seguido están interesados en la varianza de la diferencia entre dos variedades. La diferencia (D) debe ser expresada como sigue:

−= YYD 21 Ecuación 8-4

Para dos variables independientes y no correlacionadas, la varianza de la suma es igual al a 2 2 2 suma de las dos varianzas. Nota que si Y = c X, donde c es una constante, entonces σ Y = c σ X, por lo tanto,

2 2 2 2 σ D = σ Y1 + (-1) σ Y2 2 2 = σ e /r + σ e /r 2 =2 σ e /r Ecuación 8-5

El error estándar de la diferencia entre dos promedios (Standard error of a difference 2 between 2 means, SED) es la raíz cuadrada de σ D.

La mínima diferencia significativa (least significant difference, LSD) es el valor crítico de la prueba de t (t-test) de la diferencia entre dos promedios. Esta se calcula como sigue:

LSD = tα/2,edf x SED 2 = tα/2,edf x √(2 σ e /r) Ecuación 8-6

Donde t.α/2,edf es el valor t para un nivel de significancia de α/2, y el número de grados libertad en el término de error (edf) del análisis de varianza del ensayo para α/2, t.α/2,edf es siempre aproximadamente 2. Como una aproximación,

LSD.05 ≈ 3 SEM Ecuación 8-7

Es importante que el concepto de LSD quede claro: El valor LSD0.05 es la diferencia entre estimados de los promedios de dos líneas con el mismo valor genotípico, que se espera que sea excedido por mero azar con un 5% de las repeticiones de un ensayo de variedad.

225

Visto de otra manera, suponga que toma dos muestras de semilla de una variedad cultivada en la misma parcela. Cada submuestra las pone en diferente sobre, dándole diferente nombre. Después, toma estas dos muestras y las compara en un ensayo con réplicas en diferentes sectores de la parcela. Por puro azar, la diferencia en el promedio del rendimiento entre las muestras de material idéntico podría exceder el valor LSD0.05 solo el 5% de las ocasiones.

Los valores de SEM, SED y LSD son mediciones importantes de la precisión de un ensayo de variedad, o de la habilidad de este para detectar diferencias.

Varianza genotípica y fenotípica

La varianza genética en un ensayo, es la varianza de los efectos del cultivar, el valor Gi’s en la 2 ecuación 5.1, y se denota como σ G. La varianza fenotípica en un ensayo de cultivar, es la varianza de los promedios del cultivar a 2 través de las réplicas del ensayo. Se denota como σ P. Ya que los promedios están basados en 2 las mediciones de la parcela, las cuales contienen tanto a Gi’s como a ej’s, σ P contiene la varianza genética y una porción de la varianza residual.

2 2 2 σ P = σ G + σ e/r Ecuación 8-8

2 Donde σ e es la varianza de parcela residual o de error del ANOVA, y r es el número de réplicas. 2 2 σ G y σ e son estimadas del ANOVA como sigue: Fuente de variación Grados Promedio de la suma Valor correspondiente a libertad de cuadrados (Df) (Mean square)

Réplicas r-1 2 2 Genotipos g-1 MSG rσ G + σ e 2 Residual (r-1)(g-1) MSE σ e

2 Entonces para estimar σ G:

2 σ G = (MSG –MSE)/r Ecuación 8-9

2 σ e se estima directamente como la varianza del error residual del experimento.

La repetibilidad en los ensayos La repetibilidad en un ensayo de variedades es la proporción de la variación dentro de los promedios de una línea, que es debida a la variación en los efectos genotípicos. También se le llama heredabilidad en sentido amplio (broad-sence heritability, H) y es calculada de la siguiente forma:

2 2 2 2 2 H = σ G/ σ p = σ G /[σ G + σ e/r] Ecuación 8-10

H es una medida importante de la precisión (fiabilidad) de un experimento. Es un estimado de la correlación esperada entre diferentes repeticiones o corridas del mismo experimento. Es decir, es la correlación que esperaríamos entre promedios estimados de la misma serie de cultivares, estimado dos veces en diferentes parcelas del mismo campo de cultivo. Los valores que toma H se encuentran entre 0 y 1. Si observamos la ecuación 5.10, nos daremos cuenta de que H no es

226 una constante. Mientras mayor sea el número de réplicas (r), o menor sea el error residual 2 (σ e=0), H se aproxima más a 1. Entonces puede “comprar” Hs mayores para un experimento, invirtiendo en más réplicas.

Note que el valor de H pertenece sólo al ensayo donde fue estimado. Los valores de H estimados para ensayos con menos de 30 variedades son menos confiables que los ensayos de 100 variedades. También tenga en cuenta que H no nos dice nada acerca de la transmisión mendeliana de una característica de padres a hijos. H es solamente una medida estadística de la repetibilidad de una característica en un experimento en particular. Esto a menudo causa confusión, debido a que en biología molecular, la heredabilidad tiene una connotación de herencia y de transmisión de ácidos nucleicos (genes). El termino heredabilidad se acuño cuando todavía no se sabia nada del DNA, de la época clásica de Hallauer en los años 30 cuando se fundaron los principios de la genética cuantitativa. La mayoría de los términos que se usan en el mejoramiento están basados en estadística y no tanto en el DNA. Hoy en día convendría cambiar el término de heredabilidad por el de repetibilidad para no crear confusión entre los biólogos moleculares y los mejoradores. Sin embargo, ahora que sabemos los alcances de esos términos, eso nos ayudara a ampliar los canales de comunicación entre científicos de diferentes disciplinas.

Modelar el efecto de la replicación en la precisión y repetibilidad de los ensayos de variedades Todos sabemos que hacer muchas réplicas es caro y laborioso. Podemos usar la Ecuación 8-6 y Ecuación 8-10 para modelar el efecto al cambiar el número de réplicas en un ensayo. Por lo tanto, estas ecuaciones son útiles para aquellos mejoradores que estén planeando o estructurando sus ensayos. Es importante saber si los ensayos están sub o sobre-replicados, para saber si los recursos económicos están siendo bien invertidos para lograr una avance genético deseado.

Ejercicio de modelación: En la siguiente tabla se presenta el análisis de varianza para el rendimiento de grano de un ensayo de variedad con arroz de temporal de tierras bajas, llevado a cabo en Champassak Laos, durante la temporada de lluvias del 2004.

Fuente de variación Grados Promedio de la suma Valor correspondiente a libertad (Df) de cuadrados (Mean square)

Réplicas 3 688426 2 2 Genotipos 21 759729 rσ G + σ e 2 Residual 66 159692 σ e

Ahora, con esos datos: 2 2 a) Estime σ G y σ e b) Calcule el valor predicho de SEM, SED, LSD0.05 y H para ensayos con 1-8 réplicas. El valor apropiado de t es 1.997

2 2 σ G σ e SEM SED LSD0.05 Reducción en H Número LSD debido ala de adición de réplicas réplicas 1 2 3

227

4 5 6

c) Si dos ensayos de variedad con 3 réplicas como el descrito anteriormente fueran llevados a cabo uno a lado del otro en el mismo campo y en la misma temporada, ¿cuál sería la correlación esperada en los promedios de las variedades entre los dos ensayos? d) ¿Cuáles son las dos maneras posibles de incrementar la precisión y repetibilidad de un ensayo de variedad?

Resumen • En ensayos de campo y viveros, los efectos del genotipo y de la parcela siempre se confunden. Los efectos de la parcela son “ruido” que enturbian el estimado del valor genotípico en los experimentos de mejoramiento. • En los programas de mejoramiento, el propósito de la replicación, es separar los efectos genotípicos de los debidos a la parcela, reduciendo la confusión, mejorando la precisión de los ensayos e incrementando nuestra habilidad de identificar genotipos superiores. • La varianzas genotípicas o de error estimadas de los análisis de varianza pueden ser usadas para estimar el LSD y la repetibilidad o heredabilidad en sentido amplio, H • Incrementar el número de replicas reducirá el LSD e incrementará H así como la precisión y repetibilidad del ensayo. • Los beneficios obtenidos en la precisión disminuyen rápidamente con cada réplica adicional. Raramente es económicamente efectivo utilizar más de 4 réplicas. • Las ecuaciones de LSD y H pueden ser utilizadas para modelar el efecto de incrementar o disminuir el número de réplicas en la precisión y repetibilidad del ensayo.

228

8.2.4. Ejemplo de gráfica

Figura 8-10. Scatterplot xy con histogramas y boxplots marginales. 8.2.5. Ejemplo de análisis de bloques incompletos Input estadista CIMMYT? 8.2.6. Ejemplo de análisis espacial Input estadista CIMMYT? 8.2.7. Ejemplo de análisis con modelos lineales Usar el programa R. Aprender a usar la función lm

229

8.2.8. Otros ejemplos Input estadista CIMMYT?

8.3. Software para estadística

8.3.1. Uso de Excel Excel es uno de los programas que más usan los fitomejoradores y los bioquímicos analíticos. Las hojas de Excel se pueden usar tanto para almacenar y organizar datos, como para hacer cálculos, gráficas y análisis estadísticos. En el capítulo 7.4.1 (ver página 201) se menciona el paquete de Fieldbook basado en macros de Excel que los mejoradores de maíz usan para manejar sus ensayos de rendimiento. Excel tiene una amplia gama de funciones integradas para estadística. Entre las más simples se pueden mencionar el promedio, la media, moda, máxima, mínima, desviación estándar y número de valores de un determinado rango. También hay funciones para calcular la pendiente (slope), la intersección (intercept) con el eje-y y el coeficiente de correlación a partir de una serie de datos xy. Algo muy conveniente del programa Excel son las funciones de búsqueda vertical, horizontal y las tablas dinámicas (pivot tables). Entre las funciones de análisis se pueden mencionar los histogramas, las tablas de correlación y el análisis de varianza. Una de las funciones más avanzadas de Excel es el solver. Se puede usar para resolver problemas lineales y no lineales. También cuenta con algunas funciones para hacer análisis estadísticos con modelos lineales simples. Según la versión de Excel que se tenga instalada, las funciones pueden estar en ingles o en español. A continuación se muestran algunos ejemplos de funciones sencillas.

Tabla 8-1. Formulas y funciones de Excel Función Versión Versión española Formula inglesa Promedio =AVERAGE(x) =PROMEDIO(x) x ∑ n Mediana =MEDIAN(x) =MEDIANA(x) Moda =MODE(x) =MODA(x) Mínima =MIN(x) =MIN(x) Máxima =MAX(x) =MAX(x) Numero de =COUNT(x) =CONTAR(x) n mediciones (n) Grados de =COUNT(x)-1 =CONTAR(x)-1 n −1 libertad (DF) Desviación =STD(x) =DESVEST(x) estándar (SD)

Error Estándar =STD(x)/SQR(n =DESVEST(x)/RAIZ(n) SD (SE) ) SE = n Pendiente =SLOPE(y, x) =PENDIENTE(y, x) (valor m)

Intersección =INTERCEPT(y, =INTERSECCION.EJE( (valor t) x) y, x)

230

Coeficiente de =CORREL(y, x) =PEARSON(y, x) correlación R

Coeficiente de =RSQ(y, x) =COEFICIENTE.R2(y, correlación R2 x)

Las fórmulas de la tabla anterior parecen un poco complicadas. Sin embargo, al inspeccionarlas con calma, nos podemos dar cuenta que sus componentes se basan en simples manipulaciones algebraicas de los datos primarios. Se basan en algunas sumas simples y cuadradas. La Figura 8-11 muestra un ejemplo de los cálculos que se hacen para una regresión lineal.

Figura 8-11. Ejemplo de cálculos de regresión lineal en Excel. A partir de los datos x,y se calculan las sumas de las multiplicaciones y de los cuadrados, para despues calcular los valores m, b y R.

El valor R2 por si solo no es suficiente para decir si una correlación es significativa o no. Por ejemplo, un valor de R2=0.9 no es significativo si solo se tienen 3 puntos. Mientras que un valor de R2=0.5 es altamente significativo si se tienen cientos de datos. Es necesario tomar en cuenta los grados de libertad para una determinada comparación. En el caso de las correlaciones entre dos variables, los grados de libertad son (n-2). La Figura 8-12 muestra la forma de calcular el valor P para un grupo de datos xy.

231

Figura 8-12. Ejemplo de funciones en Excel. Para calcular el valor P se usa el valor R2 corregido con los grados de libertad usando la función de distribución F. Un valor de R2=0.38 con una lista de 19 observaciones si es significativo ya que el valor P=0.0049.

8.3.2. R para estadística El R es un programa para analizar datos. El programa puede hacer diversos tipos de análisis estadísticos, así como producir muchos tipos de gráficas. La ventaja de R, en comparación de otros como SAS y SPSS, es que R es un programa gratuito y de código abierto.

R is a software package especially suitable for matrix data analysis and graphical representation. R can be used as a statistical tool but also as a programming language itself, making it very flexible and highly customizable. Excellent graphical tools make R an ideal environment for exploratory data analysis and for preparing publication ready graphs (exportable as .ps or .jpg files). All work is done in command style text functions and therefore it is different from other windows style programs (like SPSS) that use menus with select and click options for predefined statistical procedures. It takes considerable time to learn to use R, but once you have passed the first burden, it is quite convenient to handle. As a programming language it is not for beginners, but rather for advanced users for whom the statistical functions of Microsoft Excel are no longer enough (for example if you want to do Principal Component Analysis). In comparison to SAS and SPSS which are very expensive commercial programs for doing statistics, R is free software distributed under the GNU and GPL license terms.

Descargue R de la página oficial:

http://cran.r-project.org/

Revise y descargue estos otros programas complementarios: Editor de texto para editar scripts de R: http://www.sciviews.org/Tinn-R/ Análisis de datos de microarreglos: http://bioconductor.org/

Después de instalar R en su computadora de manera local, el programa inicia con la ventana de la consola:

232

Figura 8-13. Ventana inicial de la consola de R

Tabla 8-2: Consola de R

Introducción a R (Uso básico) El programa R utiliza objetos y funciones. Los objetos contienen datos, mientras las funciones utilizan los datos dentro de los objetos, para llevar a cabo cálculos y obtener soluciones. Si quieres ver todas las funciones de R, escribe: help() # Abrirá una ventana con información general (enlista todas las funciones)

Para obtener ayuda específica sobre una función dada, escribe su nombre dentro del paréntesis: help(var) # Ayuda especifica sobre la función varianza (variance) help(sd) # Ayuda especifica sobre la función desviación estándar (standard deviation) ?sd #Alternativa para abrir ayuda sobre la función desviación estándar

En muchas de las funciones de R se necesita abrir y cerrar paréntesis para introducir variables o atributos de la función respectiva. Aunque también en algunas ocasiones, los paréntesis se dejan vacíos.

R distingue mayúsculas de minúsculas en todo lo que se escribe. Como en los comandos unix, en R puedes volver a llamar los comandos previamente escritos, utilizando las teclas de las flechas hacia arriba o hacia abajo.

Definiendo y editando objetos

Para trabajar en R, nenecitas definir objetos. Un objeto puede ser una variable, un vector o una matriz, dependiendo de la cantidad de datos y su estructura. Escoge un nombre para el objeto, que no sea el nombre de una función. Algunos nombres posibles son a, b, c, x, y, z, data1, data2, matrix1, model1, etc.

233

La siguiente sección serán en inglés para practicar un poco más esté idioma. Para hacer un posgrado en biotecnología vegetal, es muy importante poder entender instrucciones técnicas en inglés. Las palabras en azul se refieren a los comandos que se usan en la consola de R. Haga copy de esos comandos y péguelos en la consola para que vea el resultado en R, y de esta forma aprenda a usar este programa para hacer análisis estadísticos (Tabla 8-2).

#The # sign denotes comments that are not interpreted by the console. I use them here to explain some features of the functions or commands. #To work with R you need first to define variables, vectors or matrix objects. This is done either manually or by importing data from external files. First I will explain the manual entry of data directly from the console. This can be done with the combine function: x = c(1,3,2,7,9) #create a vector x with 5 components y = c(a=1,a=3,b=2,c=7,c=9,d=2,d=3) #define y with variable names and values z=matrix(c(10,20,30,40,50,60),ncol=2) #define matrix with 2 columns. Values are equally distributed into the two columns. The first column is filled first and downwards. x; y; z #show the contents of objects x, y and z

#The definition of the variables can be done with =, but also with the simbols of <- or also -> depending on the side in which you put the variable. x = c(1,3,2,7,9) #my preferred option to create a vector x with 5 components x <- c(1,3,2,7,9) #alternative option to create a vector x with 5 components c(1,3,2,7,9) -> x #alternative option to create a vector x with 5 components

#To show the contents of any object simply type its name x # list contents of object x x=edit(x) # edit contents of object x in a data.frame window

#Now that you have defined an object x, you can do things like: summary(x) # shows a summary of x (min, max, mean, median, quartiles) sd(x) # gives the standard deviation of data in x sd(x)/sqrt(length(x)) #gives the standard error of data in x

#The object x and the results of those functions are stored in the RAM memory of R. When using R no file is writen to the harddisk unless you save it specifically. When you quit R program you can save the workspace so that all objects created during the current session are available next time you work with R. #If you need to do further calculations with the results of a given function, you need to define a new object to store the output. For example: a=length(x) # stores the results of length(x) in new object a ls() #to list all objects stored in the current workspace

#Remember that everything you type in R is case sensitive. As in unix command line, in R you can recall previously typed commands using the up and down arrow keys. #A convenient way to enter matrix data manually into R is by using the command edit(data.frame()) data1 = edit(data.frame()) # opens a window to define data1 manually

234

# Tabla 8-3. Editor de datos de R.

Después de que hayas introducido los datos y cerrado la ventana del editor, tus datos se guardaran como el objeto data1. Dando un “click” en las marcas de las columnas, puedes definir si los valores serán numéricos o categóricos. Puedes nombrar tus variables, o dejar los nombres predeterminados (var1, var2, var3, etc.). Si cambias los nombres de las variables, utiliza uno corto y fácil de recordar, de tal manera que tengas fácil acceso a él (función attach). No utilices espacios o caracteres extraños para el nombre de las variables. Para ver que esta guardado en una matriz determinada, simplemente escribe el nombre del objeto. Aquí yo utilice “data1”, pero tú puedes definirlo con otro nombre similar

(Tabla 8-3). data1 # to list the content of the data1 object in the console window data1=edit(data1) # to re-edit the contents of object data1 and saving it edit(data1) # It prints editions on screen but it does not save changes in memory attach(data1) #to make the variables defined in data1 accesible to the console var1 # to show the contents of var1 (defined inside attached data1) detach(data1) #to detach the variables defined in data1 data1$var1 # to show the contents of var1 from data1 without the attach function

La primera barrera para usar R es introducir una gran cantidad de datos en un objeto. La entrada manual de datos descrita anteriormente, no es práctica ni conveniente en determinadas ocaciones. Hay mejores opciones para introducir datos a R, desde otros archivos. Se pueden importar datos desde el portapapeles de Windows. Esto es apropiado para conjuntos de datos pequeños y medianos. Para conjuntos de datos muy grandes, puedes importar los datos desde archivos de texto externos.

Subiendo datos desde el portapapeles

Mas que escribir manualmente los datos con la función edit data frame, es preferible importar los datos desde Excel o Word, vía el portapapeles de Windows. Para hacer esto, sólo abre tul archivo de Excel o Word, y copia la tabla de datos, incluyendo o no, los nombres de las filas y los títulos de las columnas. Después ve al programa R y escribe el comando:

235 data1=read.table(file="clipboard", sep="\t") #Para importar sin nombres de filas y títulos de columnas.

Las variables de las columnas serán nombradas como V1, V2, V3, consecutivamente. Si la primera celda esta vacía, se podrá reconocer de manera automática los nombres y títulos de las filas. Este comando crea el objeto “data1”con el contenido del portapapeles de Windows. Transfiere los datos desde la memoria del portapapeles hacia la memoria de R. Lo anterior funciona bien para Excel, Word, Power Point y otros programas de Windows. Para mi, esta es la forma más conveniente de importar datos a R, pues no necesito crear archivos de texto, carpetas o definir directorios de trabajo.

data1=read.table(file="clipboard") #for importing without row names and column headings. Column variables will be named V1, V2, V3, consecutively. If the first cell is empty then this allows automatic recognition of row names and headings. data1=read.table(file="clipboard", header=T) #for forcing import with row names and column headings. This option works even if the first cell is not empty. data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t", na.strings="")

Breve nota sobre importar datos Algunos tutoriales te recomiendan exportar los datos de hojas de Excel a archivos de texto, y desde estos archivos importarlas a R. Esto es totalmente innecesario, puesto que se puede utilizar directamente el portapapeles para importar los datos. Sin embargo, algunas veces se tiene una gran cantidad de datos que no cabe en el portapapeles. Por ejemplo, cuando se hacen microarreglos de diez mil genes. En estos casos, debes de usar la función read table, para importar tus archivos de texto como se describe a continuación.

Subiendo datos desde archivos de texto

El programa R necesita definir una carpeta para subir y guardar archivos. Para cambiar el directorio en el cual quieres trabajar, ve al menú ->file->. Cambia el directorio y selecciona una carpeta del directorio que elegiste. También lo puedes hacer manualmente en la consola: setwd("C:/Axel StatisticsR") # sets the working directory manually getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory

Para importar datos desde un archivo de texto (tab delimited), tienes varias opciones: data1=read.table("file.txt", header=T) data1=read.table("file.txt", header=T, sep="\t") data1=read.table("file.txt", header=T, sep="\t", row.names = 1)

La opción sep=”\t” te permite definir el símbolo de separación entre valores, en la mayoría de los casos, estos están separados por un tabulador. La opción sep=”/t” no funciona para formatos csy (valores separados por comas). En este caso es preciso usar la opción sep=”,”. La opción row names, te permite especificar el nombre de las filas.

236

El archivo de texto debe estar en el directorio predeterminado de R. Utiliza setwd para definir el directorio correcto. Una manera más conveniente de subir archivos, es usando el comando file.choose().Con esta función no es necesario recordar o escribir el nombre del archivo manualmente. También puedes navegar la carpeta con ventanas (browse the folder with windows). Para importar datos desde un archivo de texto delimitado por tabulaciones estándar, utiliza el comando: data1=read.table(file.choose(),header=T) # selecciona el archivo con una ventana emergente

Si tu archivo de datos no tiene el nombre de las variables en la primera columna, entonces utiliza la opción header=F. Recuerda que en todo lo que escribes, R reconoce mayúsculas de minúsculas y que puedes llamar los comandos previos para corregir cualquier error, utilizando las teclas de flechas hacia arriba o hacia abajo.

Análisis de objetos

Si tienes definido un objeto x, puedes hacer cosas simples como: x # shows data stored in the object x on screen sort(x) # list data increasing order length(x) # number of items in x

Con objetos de datos guardados en el espacio de trabajo, se pueden realizar muchas funciones individuales como: sum(x), max(x), min(x), median(x), mean(x), pero es mejor utilizar la función summary, que integra las funciones anteriores: summary(data1) # shows a summary of x (min, max, mean, median, quartiles) sd(data1) #standard deviation of elements in data1 sd(data1)/sqrt(length(data1)) #gives the standard error of data in data1 var(data1) #variance value, or covariance matrix of elements in data1.

Breve nota de la función var(). Si se da un objeto vectorial de una dimensión, el resultado es la varianza total del conjunto de datos de dicho objeto. Si el objeto es una matriz con más de una dimensión, entonces la función var() calcula una matriz de covarianza, equivalente a la función cov(). En una matriz de covarianza, los elementos en diagonal, son varianzas dentro de la variable dada, y los otros elementos son covarianzas entre diferentes variables. La covarianza es una medida de la manera en que las variables se relacionan, es decir que tan independientes o que tan correlacionadas están. Una matriz de covarianza, se puede escalar a una matriz de correlación con la función cov2cor(). plot(data1) #matrix correlation plots with all elements in data1. cor(data1, use = "pairwise.complete.obs") #correlation coefficient matrix of all elements in data1 round(cor(data1, use = "pairwise.complete.obs"),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals round(cor(data.frame(data1$var1, data1$var2, data1$var3)),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals with some selected variables only

237

Definiendo nuevos objetos

Las funciones escritas como tal, solo mostrarán los resultados en la pantalla. Si necesitas hacer cálculos con los resultados de una función dada, necesitas usar el comando object= para definir un nuevo objeto que guardará los resultados de dicha función en la memoria de trabajo. Por ejemplo:

Matrix1=var(data1) # stores the covariance matrix in new object called Matrix1 Matrix2=cor(data1) # store the correlation coefficient matrix of elements in data1 Matrix1; Matrix2 #shows the contents of the two newly created objects. The semicolon allows separating two functions given in the same line

Todos los objetos se guardan en la memoria RAM de R. Cuando se utiliza R ningún archivo se escribe en el disco duro, a menos que se guarde específicamente. Cuando cierras el programa R, puedes guardar el espacio de trabajo, de tal manera, que todos los objetos que se crearon en la sesión, estén disponibles la siguiente vez que se trabaje con R. ls() #to list all objects stored in the current workspace Matrix1 # to list the content of the Matrix1 object in the console window edit(data1) # It lets you print editions on screen but it does not save changes in the object memory.

Para editar y guardar los cambios, utiliza el siguiente comando: data1=edit(data1) # to re-edit the contents of object data1 and saving it rm(x) #to remove object x from workspace

Trabajando con matrices

Realiza algunas manipulaciones con matrices como: data3=2*data1 # define a new matrix with scalar matrix multiplication by factor 2 data4=data1+data3 # matrix addition data5=solve(data1) # define a new matrix using the inverse matrix of data1 data2=t(data1) # define a new matrix using the transposed matrix from data1 data6=data.frame(data1,data3) # use data.frame for adding elements to objects

Extraer un componente de una matriz involucra uno o dos indices [Fila,columna] data1[2,3] #element of data1 at the second row, third column z=data1[2,3] #define new object with a selected data entry of data1

#conditional recoding of values within an object

238 data1= x = rnorm(1000) #create a set of 1000 random values x[x > 1.2] = NA # to recode all values of x > 1.2 to NA data1= data.frame(a = rnorm(1000), b= rnorm(1000) , d=rnorm(1000), entry=c(1:10)) data1$a[data1$b > 1] = 5 # to recode all values of b > 1 to 5

La función attach se utiliza para tener acceso a varias variables dentro del objeto. Utiliza detach para eliminar el acceso a esas variables. attach(data1) # allows direct access to the variables defined inside an object hist(var1) # plots an histogram of variable var1 inside attached object data1 detach(data1) # detaches variables hist(data1$var1) # plots an histogram of var1 from data1 without attaching

Valores propios y vectores propios (eigenvalues, eigenvectors, respectivamente) de una matriz se manejan con la función eigen(): m2=matrix(c(10,20,30,40),ncol=2) eigen(m2)

239

Creando gráficos Hay muchas maneras sencillas para graficar utilizando los datos en los objetos. plot(data1) #Salida gráfica de los arreglos de gráficas con los elementos en data1.

Esta característica de gráficos es particularmente notable, pues grafica todas las variables en la matriz, contra todas las variables. Con ella, puedes hacer análisis exploratorios y descubrir algunas correlaciones escondidas. Si deseas hacer esto en Excel, te tomará mucho más tiempo.

58 62 66 180 220 0.40 0.50

GYF 68 12

AD 58 62 66

ASI -3 -1 1 3

PH 180 220

EH 70 90 120

EPO 0.40 0.50

EPP 0.8 1.1 1.4

68 12 -3 -1 1 3 70 90 120 0.8 1.1 1.4 boxplot(data1) #graphical output with boxplots of all elements in data1 attach(data1) #to make the variables defined in data1 accesible to the console var1 # to show the contents of var1 (defined inside attached data1) boxplot(var1, var2) #produces a boxplot of only the variables 1, 2 plot(data.frame(var1, var2, var3)) #plot arrays of some selected elements only. detach(data1) #to detach the variables defined in data1 data1$var1 # to show the contents of var1 from data1 without the attach function

240

Si quieres obtener algunas estadísticas involucradas en los diagramas de caja, utiliza los siguientes comandos: b=boxplot(data1); b$stats # gives the value of the lower end of the whisker, the first quartile (25th percentile), second quartile (median=50th percentile), third quartile (75th percentile), and the upper end of the whisker. # plot() is a general graphic command with numerous options. plot(x) # plots the data x plot(var1, var2) # plots var1 in dependence of var2 abline(line(var1,var2)) # add a regression line plot(y,z, main="Enter Title Here") # scatterplot with variables y and z fit=lm(y~z) #A fitted straight line is shown in the plot by executing two more commands abline(fit)

Exportando gráficas

Hacer click derecho en cualquier lugar de la ventana activa de la gráfica, mostrará un menú sensible al contexto, que te permite guardar la gráfica como metafile(EMF) o con formato postscript (PS).Las opciones Copy as metafile o Copy as bitmap (BMP) coloca la gráfica en el portapapeles. Inmediatamente necesitas pegarla en alguna aplicación como MS Word. Hay mas formatos de gráficos disponibles en el menú principal. Mientras que la ventana de la gráfica este activa, selecciona el menú File y luego en Save As. Esto enlistará seis formatos de archivo (metafile, postscript, PDF, PNG, BMP y JPG en tres niveles de calidad), así que tienes muchas opciones.

¿Cuál es la mejor opción de formato de gráficas? En general el formato metafile, conserva la calidad de la gráfica, aún cuando se redimensiona en la aplicación que se utilice después. Por

241 otro lado, JPG es la elección popular el tamaño del archive es mucho menor y compatible con internet. Excepto por muy raras circunstancias, yo no recomendaría el mapa de bits (bitmap), puesto que es muy grande y tiene muy poca calidad de imagen cuando se redimensiona. El formato de archivos postscript es útil cuando se incluye el archivo del gráfico en otro archivo del mismo formato, o cuando la impresora es compatible. La calidad de la imagen no se deteriora cuando se redimensiona.

Utiliza el formato metafile para aplicaciones de MS office (por ejemplo Word, Powerpoint). Dentro de la ventana del gráfico haz click derecho y selecciona copy as metafile. Esto transferirá la figura al portapapeles de windows. Ve a Powerpoint y pégalo como metafile. Para publicaciones, guarda los gráficos con formato jpg.

Exportando datos write.table(x, file = "dataOut.txt", append = FALSE, col.names = NA, sep = " ") # with the above commands a textfile will be created in in the working directory. To change the working directory use the following getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory setwd("C:/Axel StatisticsR") # sets the working directory manually # open the text files in excel using the text import wizard.

Manejo de los paquetes de R

Hay varias páginas en internet dedicadas a temas estadísticos específicos Por ejemplo, para el análisis de los datos de un microarreglo utilizando R, puedes consultar: http://bioconductor.org/

Descarga los paquetes de R desde diversos sitios de Internet y guárdalos en carpetas como archivos zip. Dentro del programa R, usa la opción install from local zip files. Instala los paquetes directamente desde R, utilizando los siguientes comandos: install.packages("corrgram") install.packages("agricolae") install.packages("gplots") install.packages("UsingR") install.packages("lattice") install.packages(“maanova") # Once you have downloaded the packages, activate them with the library function. Then you can use the extended functions in those packages.

# Example (agricolae) data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(agricolae) #load and activate library model1=aov(Yield~Gen) #define a model and change variables df=df.residual(model1) MSerror=deviance(model1)/df comparison = HSD.test(Yield,Gen,df,MSerror, group=TRUE) bar.err(comparison,std=TRUE) #for plotting a graph

#Make an additional LSD test with:

242 comparison = LSD.test(Yield,Gen,df,MSerror, p.adj="bonferroni", group=FALSE) bar.err(comparison,std=TRUE) #for plotting a graph #For adjusting the graph you can modify some options like: bar.err(comparison,std=TRUE,ylim=c(0,45),density=4,border="blue")

#AMMIS biplots: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, graph="biplot",number=FALSE) #For adjusting the graph you can modify some options like: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, xlim=c(-4,4),ylim=c(-4,4), graph="biplot",number=FALSE)

# Example (Pairwise.T.test) data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console pairwise.t.test(Var1, Var2) # make t.tests of Var1 grouped by category Var2

# if you want to export the data you need to use following commands: x=pairwise.t.test(Var1, Var2) # create an object x for exporting write.table(x$p.value, file = "dataOutPairwise.txt", append = FALSE, col.names = NA, sep = " ") # a textfile will be created in in the working directory. getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory # open the text file in excel using the text import wizard.

# Another option to make multiple comparisons. model1=aov(var1~var2) TukeyHSD(model1, "var1")

#Example PCA analysis (bioconductor) #first you need to define the source to download the package source("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("pcaMethods") #downloading needs only to be done the first time library(pcaMethods) #load the library. Necessary to do it every time you run R

# For importing data you have 3 options ## 1) load the matrix with data. Considering that row names are present data=read.table(file.choose(), header=T, sep="\t", row.names=1)

## or 2) not considereing the ID of metabolites or genes data=read.table(file.choose(), header=T, sep="\t")

## or 3) importing data from clipboard data=read.table("clipboard", header=T, sep="\t")

# depends on the type of data, you can use: ## 1) variables in the rows and samples in the columns md = prep(t(data), scale = "none", center = TRUE) ## or 2) variables in the columns and samples in the rows md = prep((data), scale = "none", center = TRUE)

## then do the analysis. In this case for the first 5 principal components. resPPCA = pca(md, method = "ppca", center = FALSE, nPcs = 5)

243 slplot(resPPCA) # to plot the results resPPCA@scores # to see all the principal components (treatment) resPPCA@loadings # to see all the loadings

#Example PCA analysis (native R) data=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") #importing data from clipboard

# depends on the dataframe you have: ## 1) variables in the rows and samples in the columns md = prep(t(data), scale = "none", center = TRUE) ## or 2) variables in the columns and samples in the rows md = prep((data), scale = "none", center = TRUE) md=data.frame(md[,2],md[,3],md[,4],md[,5],md[,6],md[,7])

## Analysis for 2 principal components. pc=princomp(md, scale=TRUE) loadings(pc) biplot(pc) pc summary(pc)

#Example PCA analysis (agricolaeAMMIS) Rep Plot Entry Env Yield 1 1 A E1 36.3 2 4 A E1 37.9 1 2 B E1 49.9 2 5 B E1 50.3 1 3 C E1 80.1 2 6 C E1 82.3 1 1 A E2 44.4 2 4 A E2 46.3 1 2 B E2 22.3 2 5 B E2 20.8 1 3 C E2 85.4 2 6 C E2 86.7 1 1 A E3 82.4 2 4 A E3 86.3 1 2 B E3 92.3 2 5 B E3 92.8 1 3 C E3 90.3 2 6 C E3 94.6 data5=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data5) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(agricolae) #load and activate library model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, graph="biplot",number=FALSE)

244

PC % A 1 85.1 2 14.9

E3 E2 PC 2 -1 0 1 2 3

B C

-4 -2 0 2 4

PC 1

#For changing the range of the axes use xlim and ylim: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, xlim=c(-3,3),ylim=c(-4,4), graph="biplot",number=FALSE)

#Example: Conditional Averaging # use the same datatable as above (data5) data5=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data data5$avRep=ave(data5$Yield,data5$Rep) # create new column with averages among Reps data5$avEntry=ave(data5$Yield,data5$Entry) # create new column with average among Entries

#Making special graphics

# Example (gplots) data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(gplots) #load extended plot library plotmeans(var1~var2) #plot means with error bars

245 CONOC 40 50 60 n=19 n=21 n=7 n=12 n=12 n=8

BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB

CARRERA2

# Example (lattice) x=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(x) #make variables accessible library(lattice) #load library xyplot(var1~ var2)

50 CONOC 40

BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB CARRERA2 dotplot(var1~ var2) barchart(var1~ var2) stripplot(var1~ var2) bwplot(var1~ var2)

50 CONOC 40

20 BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB

# Example (Simple) install.packages("UsingR") require(UsingR) data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t")

246 attach(data1) simple.violinplot(var1 ~ var2, col=8) 20 40 60 80

BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB

par(new=TRUE) #for adding to an existing graph. Next function will add. plot(var1 ~ var2, add = TRUE) # so that a new plot is not started

# Example (ellipse) data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") library(ellipse) plotcorr(cor(data1, use = "pairwise.complete.obs")) S BIOQ BIOL INGLE PROBA QUIM

BIOQ BIOL INGLES PROBAB QUIM

library(corrgram) corrgram(data1)

#Trellis graphs #In order to produce Trellis plots you must load the “Lattice" library and start a “trellis aware" device. library(lattice) trellis.device()

#Make conditional plots with the coplot function coplot(var1 ~ var2 | var3) # plot var1 against var2, subdivided in categories var3

247

Given : SEXO

NO SI CONOC 30 40 50 60 70 80

NO SI

PROPED # It is possible to use two conditional variables in the form of var3*var4 coplot(var1 ~ var2 | var3*var4) # plot var1 against var2, subdivided in categories var3 and var4

248

Given : SEXO

M F

NO SI QFB 30 50 70 OTRO 30 50 70 INGAGR 30 50 70 CONOC ING 30 50 70 Given : CARRERA2 : Given IBQ 30 50 70 BIOL 30 50 70

NO SI

PROPED

#Options for the coplot function: coplot(formula, data, given.values, panel = points, rows, columns, show.given = TRUE, col = par("fg"), pch = par("pch"), xlab = paste("Given :", a.name), ylab = paste("Given :", b.name), number = 6, overlap = 0.5, ...) co.intervals(x, number = 6, overlap = 0.5) # formula

# Add a trendline #Use the functions lm() and abline() to add a trendline to an existing plot. data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") attach(data1) plot(var1, var2) model1=lm(var1~var2) abline(model1,lwd=2) #The lwd specifies the line width model1 #To show the slope and intercept of the trendline

# To add text to a graphic text (x, ...) text.default (x, y = NULL, labels = seq(along = x), adj = NULL, pos = NULL, offset = 0.5, vfont = NULL, cex = 1, col = NULL, font = NULL, xpd = NULL) mtext(text, side = 3, line = 0, outer = FALSE, at = NULL, adj = NA, cex = NA, col = NA, font = NA, vfont = NULL) title(main="Name")

# Multiple plots per page #You can combine multiple plots into one overall graph, using either the

249 par( ) or layout( ) function. With the par( ) function, the option mfrow=c(nrows, ncols) creates a matrix of nrows x ncols plots that are filled in by row. mfcol=c(nrows, ncols) fills in the matrix by columns. par(mfrow=c(2,2)) plot(var1,var2, main="Title plot1") plot(var1,var3, main="Title plot2") hist(var1, main="Title Histogram") boxplot(var1, main="Title Boxplot", xlab="label1", ylab="label2")

# The layout( ) function has the form layout(mat) where mat is a matrix object specifying the location of the N figures to plot. # Example of one figure in row 1 and two figures in row 2 layout(matrix(c(1,1,2,3), 2, 2, byrow = TRUE)) hist(wt) hist(mpg) hist(disp)

# 3D Perspective Plot

0.841 0.746 0.678 0.628 0.587 0.554 0.526 0.502 0.909 0.789 0.710 0.652 0.606 0.570 0.540 0.514 0.141 0.141 0.140 0.140 0.139 0.139 0.138 0.138 -0.757 -0.687 -0.634 -0.592 -0.558 -0.530 -0.505 -0.484 -0.959 -0.819 -0.730 -0.667 -0.619 -0.580 -0.548 -0.521 -0.279 -0.276 -0.272 -0.269 -0.266 -0.263 -0.260 -0.257 0.657 0.611 0.573 0.543 0.516 0.494 0.474 0.456 0.989 0.836 0.742 0.676 0.625 0.585 0.553 0.525 0.412 0.401 0.390 0.380 0.371 0.363 0.355 0.347 -0.544 -0.518 -0.495 -0.475 -0.457 -0.441 -0.427 -0.414 data3=read.table(file="clipboard", header=F, sep="\t") # import data without header data3=data.matrix(data3) # convert table to a data matrix x=c(1:10) # define x variable. In this case 10 values y=c(1:8) # define y variable. In this case 8 values par(mfrow=c(2,2)) # for plotting 4 graphs in one page contour(x, y, data3, col="blue") # plot contour image(x, y, data3) # plot image persp(x, y, data3, col="blue", theta = -20, phi = 15, scale = FALSE, axes = TRUE)

250

# Firsts Exercises # Example of Graph: p <- c(0:1000)/1000 x <- 6*(p^2)*((1-p)^2) plot(p,x,col="red",type="l") title(main="Likelyhood function", ylab="Likelyhood: L(p)") grid()

Likelyhood function Likelyhood: L(p) Likelyhood: 0.0 0.1 0.2 0.3

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

# Example of data import and analysis: To perform statistical tests, first copy the data into the clipboard and then use the following commands in R: data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") summary(data1) #lists a summary of the data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console t.test(var1,var2) #T.test between data contained in two variables. Use the names of the variables inside the object. In my case they were named as var1, and var2. t.test(var1~var2) #T.test within data of variable1 grouped by categories specified in variable 2. Grouping factor of var2 must have exactly 2 levels.

# Note the important difference between the t.test(var1,var2) and t.test(var1~var2) since in the first case you are comparing all values of var1 against all values of var2. In the second case, you make subgroups of the values contained in var1 depending in the grouping

251 levels defined in var2. If you have more than 2 grouping levels in var2, then it is better to use the pairwise.t.test function. pairwise.t.test(var1, var2) # make t.tests of var1 grouped by categories var2. The result is a pairwise comparison matrix. Note the comma in (var1, var2) ave(var1, var2) # make averages of var1 grouped by factor categories var2. The result is a vector of the same length as var1.

#To make an analysis of variance: a=aov(var1~var2) #defines a new object a with the results of the analysis of variance a #lists the content of the previously created object a summary(a) #lists the summary of the statistical results of object a attributes(a) #lists all attributes of new object

#To make a linear model: model1=lm(var1 ~var2+var3+var4) summary(model1) # show summary of the linear model attributes(model1) # shows all attributes of the new object

#Examples & Exercises Make Cylinder Weight Mileage Type Volkswagen V4 2330 26 Small Ford V4 2345 33 Small Eagle V4 2560 33 Small Acura V6 3265 20 Medium Buick V6 3325 23 Large Chrysler V6 3450 22 Medium

#Copy the above table from word and then import data using the command read.table(file="clipboard" header=T) in the R console as following:

CarData=read.table(file="clipboard", header=T)

# Boxplots are very useful when comparing grouped data. For example, side-by-side boxplots of weights grouped by vehicle types are shown below: attach(CarData) boxplot(Weight ~Type) # create boxplot of Weight grouped by Type title("Weight by Vehicle Types") # put title to the graph boxplot(Mileage ~Cylinder) title("Mileage by Cylinder") plot(Mileage, Weight) # create a x,y scatterplot title("Mileage by weight") # put title to the graph

252

#Example of grain yield trial data

REP BLK PLOT ENTRY RANGE LONGROW GYF AD ASI PH EH EPO EPP 1 1 1 6 1 1 11.00 60.0 -2.0 185.0 96.0 0.52 1.35 1 1 2 5 1 2 8.60 58.0 1.0 194.0 99.0 0.51 0.96 1 1 3 2 1 3 7.46 60.0 0.0 165.0 70.0 0.42 1.00 1 1 4 28 1 4 10.99 63.0 1.0 192.0 109.0 0.57 1.08 1 1 5 11 1 5 11.23 63.0 -2.0 224.0 120.0 0.54 1.04 1 2 6 12 1 6 11.32 64.0 1.0 205.0 109.0 0.53 1.00 1 2 7 1 1 7 8.20 60.0 0.0 210.0 109.0 0.52 0.91 1 2 8 19 1 8 10.01 61.0 3.0 215.0 113.0 0.53 0.96 1 2 9 27 1 9 12.46 63.0 1.0 217.0 109.0 0.50 1.00 1 2 10 26 1 10 13.19 64.0 0.0 215.0 113.0 0.53 1.24 1 3 11 25 1 11 10.23 64.0 -2.0 233.0 108.0 0.46 1.00 1 3 12 9 1 12 11.64 63.0 -3.0 180.0 85.0 0.47 1.13 1 3 13 4 1 13 7.08 60.0 1.0 205.0 82.0 0.40 1.40 1 3 14 18 1 14 5.32 66.0 0.0 208.0 92.0 0.44 1.07 1 3 15 13 1 15 8.96 65.0 0.0 213.0 103.0 0.48 1.00 1 4 16 3 1 16 9.61 60.0 1.0 215.0 113.0 0.53 1.04 1 4 17 14 1 17 11.20 60.0 1.0 203.0 92.0 0.45 1.00 1 4 18 30 1 18 11.98 65.0 0.0 209.0 102.0 0.49 0.91 1 4 19 20 1 19 5.98 64.0 1.0 203.0 109.0 0.54 0.85 1 4 20 7 1 20 6.53 64.0 1.0 174.0 90.0 0.52 0.94 1 5 21 23 2 20 7.55 64.0 1.0 195.0 88.0 0.45 1.12 1 5 22 10 2 19 11.30 64.0 1.0 213.0 106.0 0.50 0.96 1 5 23 17 2 18 9.00 63.0 1.0 218.0 106.0 0.49 1.00 1 5 24 8 2 17 8.41 66.0 0.0 204.0 93.0 0.46 0.96 1 5 25 24 2 16 10.06 66.0 0.0 230.0 115.0 0.50 1.00 1 6 26 29 2 15 11.52 65.0 1.0 210.0 118.0 0.56 1.09 1 6 27 21 2 14 6.82 61.0 1.0 208.0 104.0 0.50 0.76 1 6 28 16 2 13 12.93 60.0 1.0 203.0 105.0 0.52 0.96 1 6 29 15 2 12 7.36 61.0 1.0 212.0 113.0 0.53 0.87 1 6 30 22 2 11 9.66 60.0 1.0 208.0 107.0 0.51 0.92 2 1 31 28 2 10 12.25 60.0 1.0 239.0 130.0 0.54 1.16 2 1 32 25 2 9 9.88 61.0 1.0 220.0 121.0 0.55 0.96 2 1 33 15 2 8 7.91 62.0 4.0 230.0 123.0 0.53 0.92 2 1 34 14 2 7 10.53 57.0 0.0 211.0 108.0 0.51 1.05 2 1 35 1 2 6 6.80 57.0 -1.0 210.0 95.0 0.45 0.95 2 2 36 6 2 5 10.36 58.0 0.0 220.0 117.0 0.53 1.04 2 2 37 27 2 4 10.96 60.0 1.0 223.0 121.0 0.54 1.00 2 2 38 13 2 3 13.86 61.0 1.0 209.0 113.0 0.54 0.96 2 2 39 10 2 2 12.55 60.0 1.0 217.0 102.0 0.47 0.92 2 2 40 21 2 1 9.82 61.0 -2.0 207.0 92.0 0.44 1.05 2 3 41 18 3 1 12.29 61.0 1.0 217.0 102.0 0.47 1.17 2 3 42 22 3 2 9.26 62.0 0.0 218.0 124.0 0.57 1.06 2 3 43 11 3 3 13.22 60.0 -2.0 219.0 104.0 0.47 1.19 2 3 44 3 3 4 6.90 60.0 -1.0 219.0 108.0 0.49 0.83

253

2 3 45 8 3 5 9.48 60.0 1.0 225.0 123.0 0.55 1.00 2 4 46 12 3 6 12.37 60.0 0.0 200.0 103.0 0.52 1.04 2 4 47 20 3 7 8.72 59.0 -1.0 224.0 103.0 0.46 1.00 2 4 48 2 3 8 7.30 60.0 1.0 190.0 97.0 0.51 0.81 2 4 49 17 3 9 7.64 60.0 1.0 217.0 83.0 0.38 1.00 2 4 50 29 3 10 11.82 65.0 0.0 205.0 97.0 0.47 1.05 2 5 51 9 3 11 10.23 61.0 0.0 204.0 115.0 0.56 1.14 2 5 52 19 3 12 8.46 61.0 1.0 209.0 101.0 0.48 1.05 2 5 53 7 3 13 8.10 60.0 1.0 171.0 74.0 0.43 1.05 2 5 54 5 3 14 6.43 58.0 0.0 183.0 76.0 0.42 1.00 2 5 55 23 3 15 7.53 60.0 1.0 195.0 90.0 0.46 1.43 2 6 56 30 3 16 10.49 66.0 0.0 189.0 86.0 0.46 1.20 2 6 57 4 3 17 7.32 60.0 1.0 194.0 96.0 0.49 1.10 2 6 58 24 3 18 5.60 63.0 2.0 191.0 88.0 0.46 0.93 2 6 59 26 3 19 10.92 60.0 1.0 227.0 107.0 0.47 1.30 2 6 60 16 3 20 10.96 60.0 1.0 197.0 96.0 0.49 1.05

#Copy the above table and then type the command in the R Console: TrialData=read.table(file="clipboard", header=T) attach(TrialData) #make variables accessible boxplot(GYF ~ENTRY) # create boxplot of GYF grouped by category ENTRY boxplot(GYF ~ENTRY, notch=T) # Same as above but with notch option set to TRUE. If the notches of two plots do not overlap this is ‘strong evidence’ that the two medians differ boxplot(GYF ~REP) # create boxplot of GYF grouped by category REP a=aov(GYF ~ENTRY) # make anova of GYF grouped by category ENTRY summary(a) # show summary of anova pairwise.t.test(GYF, BLK) # make t.tests of GYF grouped by category BLK

#The pairwise.t.test function is quite useful since it makes T-tests with all possible two groups and provides a matrix of P values. This allows identifying groups that are significantly different from each other. Unfortunately, it seems that R can only handle about less than 20 groups.

#Linear models let you find causal relationships of the dependent variables. A breeder, for example, would be interested in modeling grain yield in dependence of other trial parameters and secondary traits. Copy the table with grain yield data and then enter following command in R for modeling. TrialData=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") attach(TrialData) #make variables accesible model1=lm(GYF ~REP+BLK+PLOT+ENTRY+AD+ASI+PH+EH+EPO+EPP) summary(model1) # show summary of the linear model

# the lm coefficients let you know how much is the dependence from the other variable, whereas the p values indicate if the relationships are significant or not. #Construct a new variable called SELINDEX taking into account the coefficient of those variables which were significant in the linear model. In this case use GYF, EPP and ASI

TrialData$SELINDEX=GYF+EPP*3.5-ASI*0.4 #Define a new variable called SELINDEX based on a linear combination of other variables GYF, EPP and ASI. The coefficients given by the linear model were used as weighting factors for this selection index. boxplot(GYF ~ENTRY)

254 6 8 10 12 14

# 1 3 5 7 9 11131517192123252729 GYF #From the above boxplot, decide which is the highest yielding entry? Is it entry 10,11,12, 13 or 26? Are the differences significant? We can plot the selection index to find an answer. boxplot(SELINDEX ~ENTRY) 10 12 14 16

# 1 3 5 7 9 11131517192123252729 SELINDEX title(main="Selection Index") # to put a title to the graph #From the above boxplot it can be seen that entry 11 is significantly better than entry 10, 12, 13 and 26. This was not significant if only looking at GYF parameter (previous boxplot). This highlights the usefulness of including secondary traits into the analysis.

255

# Some interesting codes #To add an extra column containing the rank to a ragged array indexed by more than one grouping factors: rank.lists <-with( data1, tapply( yield, list( site=site, year=year ), rank ) )

#To add an additional column ``rank'' containing the rank of the ``yield'' of the different varieties in relation to the indices ``year'' and ``site'' to the data1 object. I achieved to calculate the ranks but I do not manage to merge this result to the original dataframe. model1 <- lme(math ~ grade, mathdata, random=~grade|studentid)

#Ejemplo en español data1 = read.table(file="data1.txt", header=T) #El objeto "data1" contiene ahora los datos del archivo data1.txt. Utilice help() para aprender mas de las funciones que va a utilizar para analizar sus datos. Mas que poner el nombre del archivo, es mejor usar la función file.choose() para escoger cualquier archivo de texto en cualquier directorio. data1 = read.table(file.choose(), header=T) summary(data1) # Le da un resumen de las estadísticas básicas attributes(data1) # Le da los "atributos" attributes(data1)$names # Le da los nombres de las variables attach(data1) # Anexa los datos de manera que R sepa de la existencia de esas variables sin necesidad de referirnos al objeto. summary(long) # Nos da el resumen de la variable "long" summary(data1$long) # tambien da el resumen de la variable "long" # para acceder una variable sin el commando attach ponga el nombre del objeto seguid del simbolo de pesos $ plot(longitud,c) # Obteniendo una gráfica (scatter plot o diagrama de disperción) de longitud x c

#Glosary of frequent R functions

? name #does the same as help(name) a=aov(var1~var2) #defines a new object a with the results of the analysis of variance attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console attach(object) #makes the elements of object available to be called directly attributes(data1) #lists the atributes of data1: variable and row names boxplot(data1) #boxplot data1=edit(data.frame()) # opens a window to define data1 manually data1=read.table(file.choose(),header=T) # select file with a popup window data1=read.table(file="clipboard") #import data from clipboard. Works only if there are no empty cells data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") #import data from clipboard. Works even if empty cells are present

256 data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t", na.strings="") #import data from clipboard. Works even if empty cells are present. Fills empty cells with NA. detach(data1) #to detach the variables defined in data1 help (name) #provides help about "name" hist(data1) #simple histogram ls() #shows the variables in the workspace names(table) #what are the variables inside the table pairs(data1) #splom plot pairwise.t.test(var1, var2) # make t.tests of var1 grouped by categories var2. The result is a pairwise comparison matrix. plot(data1) #simple scatter plots rm(list = ls()) #removes all variables from the work space rm(variable) #removes that variable or object round(cor(data1),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals summary (lm(var1~0+var2*var3)) #summary of the results of a linear model with interactions summary (lm(var1~var2)) #summary of the results of a linear model summary(a) #summary of the contents of object a summary(aov(var1~var2)) #summary of the analysis of variance summary(data1) #lists a summary of the data t.test(var1,var2) #T.test between two variables. Use the names of the variables inside the object. In my case they were named as var1, and var2. t.test(var1~var2) #T.test within data of variable1 grouped by categories specified in variable 2. Grouping factor of var2 must have exactly 2 levels.

257

9. Biología de sistemas

9.1. Introducción La biología de sistemas, también llamada biología integral, incluye la genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, todas ellas unidas por las herramientas bioinformáticas. Se trata de entender las funciones moleculares de un organismo en términos globales. Para lograrlo, primero hay que aprender el idioma del DNA y entender el lenguaje de las proteínas. La expresión de un gen, o la aparición de un fenotipo se pueden entender como una cadena de información. El flujo de información en algunos casos es monodireccional, mientras que en otros es bidireccional. Al principio de la cadena está el DNA y los genes, que representan el potencial de lo que una planta puede hacer; después están el ARN y los transcritos que es lo que la planta planea hacer para adaptarse al ambiente durante su desarrollo; posteriormente llegan las proteínas que definen lo que la célula esta realizando en determinado momento; al final están los metabolitos, que es lo que la planta produce y nos interesa cosechar. Por ejemplo; en el caso del maíz, nos interesa el almidón, las proteínas y los lípidos que obtenemos de los granos.

Genoma: Totalidad de genes que tiene un organismo. Se puede definir como el DNA que esta dentro del núcleo y organelos de las células. Hay que recordar que algunos organelos tienen su propio genoma (cloroplastos y mitocondrias). Epigenoma: Conjunto de modificaciones que no alteran la secuencia de nucleótidos, pero que sí afectan la expresión de los genes, y además son heredables (metilaciones, etc.). Transcriptoma: Conjunto de RNAs que están presentes en un determinado momento en un tejido específico. Por lo regular se refiere a los mRNAs que codifican para proteínas. Proteoma: Conjunto de proteínas que están presentes en un tejido. Se refiere tanto a la acumulación de proteínas estructurales, así como enzimas funcionales y factores regulatorios. Metaboloma: Conjunto de metabolitos de un tejido (moléculas que participan en el metabolismo). Muchas veces, los metabolitos es lo que finalmente nos importa, porque es lo que cosechamos y tiene importancia económica.

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9.2. Genómica Se denomina genómica al conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, la evolución y el origen de los genomas. El genoma es la suma de todos los genes de un determinado organismo, es decir es toda la información que está codificada en el DNA de una célula. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. Muchas veces, la genómica es usada como sinónimo de otras áreas de estudio relacionadas, por ejemplo, la proteómica o la transcriptómica.

Las ciencias genómicas han tenido un importante auge en los últimos años, sobre todo gracias a las nuevas técnicas de secuenciación de DNA, a los avances en bioinformática, y a las técnicas cada vez más sofisticadas. La genética clásica parte de un fenotipo, generalmente mutante, y busca el o los genes responsables de dicho fenotipo. A diferencia, la genómica su estrategia es en la dirección opuesta. Tiene como objetivo predecir la función de los genes a partir de la determinación previa de todas las secuencias.

La genómica (principalmente potenciada con la conclusión del proyecto del genoma humano) es un campo nuevo de investigación con un potencial de gran impacto. La aplicación de tecnologías a la medicina genómica, así como la secuenciación del DNA, la bioinformática, la proteómica, y otras, consideradas en la actualidad como tecnologías exóticas han tenido aplicación reciente en las naciones desarrolladas.

Roderick en 1986 introdujo el término genómica para discernir la secuencia de bases o moléculas que constituyen el genoma de los organismos, en lo particular los objetivos principales de la genómica son:conocer la totalidad de los genes de un ser vivo y la expresión de sus transcritos, en relación con sus procesos metabólicos, sus características estructurales y sus características funcionales; así como relacionar y aplicar dicha información con losprocesos de enfermedad del organismo en estudio.

En este sentido, se calcula que la diferencia genética entre dos individuos es del 0.1% del genoma con aproximadamente tres millones de pares de bases. Dentro de estas variaciones se encuentran el polimorfismo del nucleótido simple (SNP’s), la forma más común de variación del DNA en muchas especies. El estudio de los SNP’s es de gran utilidad para entender la susceptibilidad o resistencia genética a una enfermedad en particular, y conocer la predisposición a determinadas patologías y variaciones genéticas del metabolismo.

En humanos, la investigación genómica acorta el camino en la investigación médica hacia sus aplicaciones en la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades transmisibles, genéticas, cardiovasculares, cáncer, diabetes, psicosis mental grave entre otras. La medicina genómica está en sus inicios en los países desarrollados y en corto plazo servirá de base para el diseño de nuevos mecanismos de atención a la salud.

La pregunta a plantear es ¿cómo las naciones en vías de desarrollo pueden tener acceso a los beneficios de la genómica? Muchos de los conocimientos actuales de la genómica ya han sido publicados, pueden considerarse como conocimientos del público en general, aunque existen compañías que hacen uso de esta información para desarrollar productos y servicios de carácter privado.

Tarea 9-1: Con sus palabras describa las diferencias entre: genoma, epigenoma, transcriptoma, proteoma y metaboloma. De también un ejemplo de que tipos de equipos de laboratorio se usan para cada una.

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9.3. Transcriptómica Con el aumento de secuencias de genes en las bases de datos, se ha producido una explosión en la aplicación de herramientas a gran escala para analizar perfiles de expresión en los sistemas biológicos. La capacidad de analizar cualitativa y cuantitativamente poblaciones de mRNA (transcriptómica) y proteínas (proteómica) suscitan la tentadora posibilidad de descifrar las rutas reguladoras y funcionales que representan el puente entre el genotipo y el fenotipo.

En términos prácticos, el perfil transcripcional de un organismo se puede determinar usando microarreglos de cDNA u oligonucleótidos. Las tecnologías de miniaturización y automatización han permitido masificar el estudio de todo el transcriptoma y no sólo de unos pocos genes. Los macroarreglos y microareglos ha avanzado tanto en los últimos años que es una realidad rutinaria en muchos laboratorios de biología vegetal, como lo prueba el que aparezcan cada vez más artículos científicos que recogen este tipo de enfoque experimental. La perspectiva transcriptómica es particularmente atractiva ya que el RNA es químicamente más homogéneo que las proteínas. El mRNA se puede extraer, manipular in vitro, amplificar y secuenciar. Esto permite analizar cuantitativamente distintas situaciones fisiológicas, de desarrollo o en distinta localización tisular de muchos miles de productos génicos distintos de forma simultánea, lo que representa un estudio amplio del transcriptoma.

Tarea 9-2 Averigüe por internet cuales son las metodologías que actualmente más se usan para detectar ácidos nucleicos (DNA o RNA), proteínas y metabolitos.

9.4. Proteómica Un eslabón en la cadena de información entre el genotipo y el fenotipo es el proteoma. El término proteómica se está convirtiendo en algo ambiguo que engloba casi cualquier aspecto de la expresión de proteínas, el estudio de su estructura o su función. Sin embargo, en términos generales, debería definirse como el estudio del perfil del conjunto de proteínas de una célula o un tejido en un determinado momento. Sería análogo al perfil de transcritos en una situación dada. A diferencia de los estudios de transcriptómica en los que el RNA se extrae y manipula con facilidad, los estudios con proteínas presentan múltiples desafíos. Primero esta la heterogeneidad fisicoquímica y complejidad estructural de las proteínas, lo que complica su extracción, solubilización, manejo, separación e identificación. Además, no existe ningún tipo de tecnología similar a la PCR que permita amplificar aquellas proteínas que son poco abundantes. Algunos de estos problemas son particularmente críticos cuando se trabaja con tejidos vegetales. Hay ya algunas bases de datos disponibles que contienen datos sobre perfiles de proteínas. La segunda categoría en el análisis de proteómica es la llamada proteómica comparativa, donde el objetivo no es identificar todas las proteínas presentes en una situación concreta, sino caracterizar las diferencias entre distintas poblaciones de proteínas en dos situaciones biológicas diferentes. Este tipo de enfoque es en cierta medida análogo a los perfiles comparativos de genes con librerías de cDNA substractivas.

Gran parte del esfuerzo en proteómica se ha realizado para desarrollar métodos de alta resolución para separar e identificar proteínas. Uno de los pasos críticos es la extracción y preparación de muestras. Los tejidos vegetales son usualmente más complicados a la hora de preparar extractos de proteínas que otras fuentes biológicas. Tienen menor contenido de proteínas, usualmente contienen más proteasas y otros compuestos que interfieren en la estabilidad de las proteínas (polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos), además de toda una colección de metabolitos secundarios que pueden interferir no sólo en el proceso de extracción, sino también en el fraccionamiento y posterior análisis.

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A pesar de los grandes progresos que se han realizado en proteómica de plantas, hay que tener en cuenta una serie de limitaciones teóricas y prácticas. Los costos y los materiales necesarios para llevar a cabo este tipo de estudio son muy altos. Hay mucha esperanza de que en un futuro próximo será posible obtener datos de proteínas a gran escala. Sin embargo, comparativamente, la cantidad y calidad de datos que se puede esperar de la proteómica es mucho menor que la de otras tecnologías, como la transcriptómica o la genómica.

9.5. Metabolómica La metabolómica aparece como una nueva herramienta funcional de la genómica que contribuye a nuestra comprensión de las complejas interacciones moleculares en los sistemas vivos. Al ser una de las últimas «ómicas» aparecida, presenta todavía muchos campos metodológicos que se pueden y se deben mejorar antes de que aparezcan bases de datos que nos permitan integrar las concentraciones de metabolitos con el resto de recursos de la genómica. La metabolómica representa la progresión lógica desde los estudios a gran escala de micromatrices de cDNA y proteómica hasta el tratamiento en conjunto de un sistema biológico completo (biología de sistemas).

Los metabolitos de las plantas son importantes para muchas de las respuestas de resistencia al ataque de patógenos, en condiciones de estrés y contribuyen al color, sabor y olor de flores y frutos. El fenotipo bioquímico de una planta es el resultado de la interacción entre el genotipo y el entorno. Por tanto, se necesita identificar y cuantificar los metabolitos para estudiar la dinámica del metaboloma y analizar los flujos metabólicos. El reto de la metabolómica reside en encontrar cambios en las cantidades de metabolitos que se puedan correlacionar con el estado fisiológico y de desarrollo de una célula, de un tejido o de un organismo.

La enorme diversidad bioquímica que existe en las plantas hace que los metabolitos distintos que pueden encontrarse en plantas se estime que sean más de 200,000. Esto hace que una aproximación en gran escala al estudio de los metabolitos presentes en las plantas sea un tremendo reto. La necesidad de utilizar tecnologías diversas para caracterizar los metabolitos presentes en plantas refleja el grado de complejidad para abordar este tipo de estudio. La deducción de cómo es el contexto biológico de una planta dada a partir de datos obtenidos por la medida de las concentraciones de metabolitos requiere, por tanto, que la identificación y cuantificación de los mismos se realice con gran fiabilidad. El puente necesario que debe existir entre la metabolómica y las otras aproximaciones de la genética funcional: transcriptómica y proteómica, permitirá el desarrollo de bases de datos que almacenen, integren, relacionen y permitan establecer relaciones causales entre genes, transcritos, proteínas y metabolitos.

Para obtener un conocimiento global de cómo funciona un sistema biológico es esencial saber cómo responden los tres niveles de expresión. Sólo así será posible deducir asociaciones relevantes entre macromoléculas, identificar correlaciones funcionales con fenotipos y construir modelos que describan de forma cuantitativa la dinámica de un sistema biológico. Estos análisis fenotípicos a gran escala permitirán en un futuro predecir como será el comportamiento de una planta dada en un determinado contexto medioambiental.

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La metabolómica es el análisis del metabolismo desde una perspectiva global. Es como ver un mapa de metro desde arriba.

Figura 9-1. Ciudad de Berlín, Alemania, con sus líneas de metro

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Figura 9-2. Ejemplo de rutas metabólicas en hígado.

La metabolómica trata de medir todos los metabolitos que están presentes en un tejido, y de está forma hacer inferencias simples sobre las propiedades complejas de un sistema de redes entrelazadas. Por ejemplo, de cómo están reguladas las distintas rutas metabólicas. La metabolómica estructural se concentra en elucidar todas las rutas metabólicas existentes, tomando en cuenta todos los pasos químicos, los procesos enzimáticos y los genes que están involucrados. La metabolómica funcional trata de entender como están coordinadas las diversas rutas bioquímicas por medio de la regulación individual de enzimas clave. Para hacer metabolómica, es muy importante entender todas las técnicas analíticas que se usan en los laboratorios para medir metabolitos cuantitativamente. En los siguientes capítulos se explican algunas metodologías y principios de manera ilustrativa y breve.

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10. Herramientas Bioquímicas 10.1. Fundamentos de enzimología 10.1.1. ¿Qué es una reacción química? Una reacción química es todo proceso molecular en el que unas o más sustancias (reactantes) sufren transformaciones para convertirse en otras moléculas (productos). Las reacciones químicas por lo regular consisten en un reacomodo de enlaces covalentes entre diferentes átomos. Es decir, se trata de un rearreglo de los orbitales electrónicos. Por ejemplo, en la reacción 2H2 + O2 -> 2 H2O se forman dos moléculas de agua a partir de dos moléculas de hidrogeno y una molécula de oxígeno. En este reacción se rompen enlaces y de distribuyen los electrones de una forma diferente. A las representaciones simbólicas de las reacciones se les llama ecuaciones químicas. Una ecuación química indica la forma y los pasos en que se puede llevar a cabo una posible transformación de las moléculas. Las reacciones se dan bajo ciertas premisas y leyes que pueden ser cualitativas o cuantitativas.

Tarea 10-1 Para entender las reacciones químicas es importante definir muy bien ciertos conceptos básicos. Investigue en un libro avanzado de química los siguientes conceptos y haga un breve resumen. • La conservación de las masas • La conservación de las cargas eléctricas • El concepto de molaridad de Avogadro • El concepto de equilibrio químico de Le Chatelier • La reversibilidad de una reacción • La entropía y la entalpía de una reacción

Tarea 10-2 ¿Cómo aplican los conceptos anteriores para la biología vegetal? De ejemplos usando las reacciones de la fotosíntesis en las hojas de las plantas.

Las ecuaciones químicas se pueden clasificar en distintas categorías: • Reacción de síntesis: Elementos o compuestos sencillos se unen para formar un compuesto más complejo. A+B → AB • Reacción de descomposición; Un compuesto se fragmenta en elementos o compuestos más sencillos. AB → A+B • Reacción de desplazamiento simple o sustitución simple: Un elemento reemplaza a otro en un compuesto. A + BC → AC + B. En su explicación sencilla, es cuando alguien le roba la pareja a otro. • Reacción de doble desplazamiento o doble sustitución: Los iones en un compuesto cambian lugares con los iones de otro compuesto para formar dos sustancias diferentes. AB + CD → AD + CB. Para un entendimiento práctico es el intercambio de parejas.

Los dos tipos fundamentales de reacciones químicas son: las reacciones del tipo ácido-base (neutralización y disociación) y las reacciones del tipo redox (oxidación o reducción). Reacciones ácido-base Reacciones redox Se dan cuando se intercambian protones, sin Se dan cuando hay cambios en los estados de cambios en los estados de oxidación en las oxidación de los átomos. Por ejemplo en la reacción + moléculas. Por ejemplo la reacción H2O -> H + 2H2 + O2 -> 2 H2O el hidrogeno pierde un electrón OH- consiste en un reacomodo de los protones, sin (se oxida) mientras que los átomos de oxígeno

264 alterar el estado de oxidación de cada átomo. La ganan dos electrones (se reducen). Otro ejemplo de reacción HCl + NaOH -> NaCl +H2O es otro una reacción redox es la formación de óxido de ejemplo, y en este caso se llama reacción de hierro producida al reaccionar el oxígeno del aire neutralización. Las reacciones acido-base pueden con el hierro. Las reacciones más comunes de estar acompañadas por cambios en el pH, pero no oxidorreducción dentro de una célula viva son las necesariamente siempre es así. Por ejemplo, la que involucran los cofactores NADH o NADPH. formación de un enlace peptídico, o la hidrólisis de un enlace glicosídico son reacciones del tipo ácido- base en las que no cambia el pH.

Desde un punto de vista general se pueden postular solamente esos dos grandes modelos para las reacciones químicas, que corresponden a un reacomodo ya sea de electrones o de protones. Bajo el concepto de Lewis, las reacciones de ácido-base involucra el reacomodo de orbitales ocupados y libres (orbitales con y sin electrones). Mientras que la reacciones redox involucran el movimiento de uno o más electrones entre orbitales de diferentes átomos. Las transformaciones químicas como la combustión, deshidratación, hidrólisis, neutralización, pueden ser clasificadas ya sea en reacciones acido-base, reacciones redox o una combinación de ambas. Los procesos de solubilización, precipitación, evaporación, condensación más que ser reacciones químicas son procesos físicos.

Tarea 10-3 Clasifique las siguientes reacciones químicas: 2HCl + CaCO3 -> CaCl2 + CO2 + H2O 2Na + 2H2O -> H2 + 2NaOH

Tarea 10-4 Dentro de una célula vegetal suceden algunas de las siguientes reacciones bioquímicas. Clasifíquelas según el tipo de reacción química: Glucosa + ATP -> Glucosa-6-P + ADP ATP + H2O -> ADP + Pi Etanal + NADH + H+ -> Etanol + NAD+ Fructosa,1,6-bis-P -> GAP + DHAP Sacarosa + H2O -> Glucosa + Fructosa Glucosa-6-P + NADP+ -> Gluconato-6-P + NADPH + H+ 10.1.2. ¿Qué es un catalizador? Para que una reacción química se lleve a cabo, las moléculas necesitan pasar de un estado electrónico a otro. Este paso a veces requiere de un estado transitorio de más alta energía. Los catalizadores por definición son aquellas sustancias que de alguna manera intervienen en la formación de este estado transitorio. Los catalizadores son aquellas sustancias que estabilizan este estado transitorio, y de esta forma aumentan la velocidad de reacción.

La estabilización del estado transitorio significa que se requiere menos energía de activación para llegar a ese estado. El modelo probabilístico de química (Bolzmann) dice que las moléculas tienen una amplia distribución de su energía cinética, por lo que a una determinada temperatura siempre hay un número de moléculas que tienen mas o menos energía que el promedio. El promedio global de las moléculas depende directamente de la temperatura (constante de Bolzmann multiplicada por la temperatura = kT). Con una reducción en la energía de activación se logra que un gran número de moléculas tenga más energía que ese nivel mínimo. Esta es la razón por la que las reacciones se aceleran con un catalizador, ya que hay más moléculas de la población global que pueden reaccionar.

Los catalizadores se pueden clasificar en dos grandes grupos:

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• Catalizadores Inorgánicos: Son metales como el Níquel, el Platino, etc. Se usan industrialmente y trabajan en condiciones como presión o temperatura extremas. • Catalizadores Biológicos: son las enzimas formadas generalmente por proteínas. Son biomoléculas complejas que tienen diversos grupos funcionales y que están acomodados en una conformación tridimensional definida.

10.1.3. ¿Qué es una enzima? Los catalizadores biológicos por excelencia son las proteínas con sus grupos funcionales. Las enzimas están hechas de 20 diferentes aminoácidos, mientras que las ribozimas son catalizadores hechos de ácidos ribonucleicos. Las principales características de las enzimas biológicas son: • Disminuyen la energía de activación • Se unen y modifican la estructura del sustrato • Se requieren en pequeñas cantidades • Son altamente específicas • Son regulables. Es decir, son susceptibles de ser activadas o inhibidas • Intercambian diferentes formas de energía (cinética, química, vibracional, etc) • Se desnaturalizan bajo condiciones extremas como una temperatura de 60oC o un pH de 1.

Las enzimas pueden formar complejos con otras proteínas o factores. A esos complejos funcionales (enzima–cofactor) se les llama holoenzimas. Algunos de los principales componentes de las holoenzimas son: • Coenzimas: Son moléculas orgánicas tales como CoA, NAD, NADP, ATP y ADP. • Grupos prostéticos: son cofactores complejos que pueden unir metales como: Fe, Cu, Mg, Ca, Zn y Mo.

10.1.4. Características generales de una reacción enzimática Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación de una reacción y acelera sustancialmente la velocidad de la conversión química. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reacción (ΔG), pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Ver Figura 10-1.

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Figura 10-1. En la imagen de la izquierda se muestra como varia la energía libre en una reacción química cuando se pasa de reactantes a productos. En la imagen de la derecha se muestra la comparación de una reacción llevada a cabo por una enzima donde la diferencia de energía libre es menor, debido a que las enzimas disminuyen la energía de activación.

Una reacción que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente reacción no catalizada. Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) para dar H2O y O2 puede ocurrir sin catalizador, con un catalizador inorgánico (platino), o con un enzima específico (catalasa). Las respectivas energías de activación (Ea) para cada proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20,000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370,000 veces. Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las reacciones que ellas catalizan, ni alteran su equilibrio químico. Sin embargo, las enzimas difieren de otros catalizadores por ser más específicas. Las enzimas pueden catalizar alrededor de 4,000 reacciones bioquímicas distintas. No todos los catalizadores bioquímicos son proteínas, pues algunas moléculas de RNA son capaces de catalizar reacciones. A estas se les llama ribozimas, como por ejemplo el fragmento 16S de los ribosomas en el que reside la actividad peptidil transferasa.

10.1.5. ¿Cómo funcionan las enzimas? Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. Llevan a cabo reacciones específicas y casi siempre actúan sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. El mecanismo catalítico de una enzima comienza cuando el sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están directamente implicados en el mecanismo de la reacción estando en contacto directo el sustrato y un sitio catalítico. Es decir, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y una orientación adecuadas. La actuación del enzima permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca. La unión al centro activo modifica las propiedades químicas del sustrato, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos.

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Figura 10-2. Ejemplo de la transformación del sustrato en el sitio activo de una enzima hacia la formación de producto. La enzima no permanece estática, sino que se mueve al unirse al primer sustrato. En el caso de la hexocinasa, la unión a glucosa hace que la enzima se cierre como una tijera, lo que crea un nuevo sitio para unión del ATP.

Los productos obtenidos a partir de ciertos tipos de reactivos dependen de las condiciones bajo las que se da la reacción química. No obstante, tras un estudio cuidadoso se comprueba que, aunque los productos pueden variar según cambien las condiciones, determinadas cantidades permanecen constantes en cualquier reacción química. Estás cantidades constantes, las magnitudes conservadas, incluyen el número de átomos presentes, la carga eléctrica y la masa total.

La cantidad de producto que se suele obtener de una reacción química de forma práctica, es menor que la cantidad teórica. El rendimiento de una reacción depende de varios factores, como la pureza del reactivo, las reacciones secundarias que puedan tener lugar, etc. Cuando uno de los reactivos esté en exceso, el rendimiento deberá calcularse respecto al reactivo limitante. En este contexto es importante recordar el concepto de equilibrio químico de Le Chatelier.

Tarea 10-5. Considere la reacción AB + C <-> AC + B Usando el principio de Le Chatelier, ¿que debe agregar o quitar para desplazar la reacción hacia la derecha? ¿Que debe hacer para maximizar la cantidad de producto AC? Compare sus respuestas con otros compañeros y discútalo con su maestro de clases.

Para que una reacción ocurra tiene que existir un choque efectivo entre las moléculas. Los choques efectivos dependerán de la naturaleza de los reactivos, de su concentración y de la orientación de las moléculas cuando ocurre el encuentro.

Tarea 10-6. Entre en Internet a http://reacciones.colegiosandiego.com/ejercicios.html, y realice los ejercicios, prácticas y juegos marcados ahí. Compare sus resultados con los compañeros. Corrija sus errores con la literatura especializada

10.1.6. Nomenclatura de las enzimas Hay varias formas de asignarle un nombre a un enzima: nombres particulares, nombre sistemático, código de la comisión enzimática (enzyme comisión o EC). Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. También se les daba un nombre según su origen, por ejemplo, la papaina es una enzima que se extrae de la papaya. Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

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El nombre sistemático de un enzima consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente, el tipo de reacción realizada terminación "asa”. La mayoría de las enzimas se clasifican dependiendo la actividad que realicen sobre el sustrato.

Tipo de reacción Ejemplos Hidrolasa Lipasa, Proteasa, Amilasa Liasa Aldolasa, Phenylamonia liasa Oxido-reductasa Alcohol deshidrogenasa Transferasa Hexocinasa Isomerasa G-6-P-isomerasa Ligasa Citrato sintasa

Muchos enzimas catalizan reacciones reversibles. No hay una manera única para fijar cual de los dos sentidos se utiliza para nombrar al enzima. La glucosa fosfato isomerasa cataliza la isomerización de la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Así, la glucosa-6-fosfato isomerasa también podría llamarse fructosa-6-fosfato isomerasa. Cuando la acción típica del enzima es la hidrólisis del sustrato, el segundo componente del nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa. Además de los nombres sistemáticos, aún persisten otros consagrados por el uso. Así, la glucosa-ATP fosforiltransferasa se llama habitualmente glucocinasa.

El nombre de cada enzima puede ser identificado por un código numérico, encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro números separados por puntos. El primer número indica a cual de las seis clases pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción. Así, la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucocinasa) se define como EC 2.7.1.2. El número 2 indica que es una transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y el último 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.

En función de su acción catalítica específica, las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases: Clase 1: OXIDORREDUCTASAS Clase 2: TRANSFERASAS Clase 3: HIDROLASAS Clase 4: LIASAS Clase 5: ISOMERASAS Clase 6: LIGASAS

Como se menciona anteriormente, una de las características de las enzimas es la cantidad de enzima, por ello es importante cuantificarla. La cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato en un minuto se llama Unidad de enzima. La actividad enzimática también se puede medir en catales, que es la cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato en un segundo. (Stryer, Enzymes: Basic Concepts and kinetics. Chapter 8. 2007).

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Figura 10-3. Cambio conformacional de la enzima debido a la unión de la glucosa a la hexocinasa. 10.1.7. Regulación de la actividad enzimática Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por: cambios en el pH, cambios en la temperatura, presencia de cofactores las concentraciones del sustrato y de los productos finales, presencia de inhibidores, modulación alostérica, modificación covalente, activación o inactivación por proteolisis. A continuación se explican algunos ejemplos de los tipos de regulación enzimática.

10.1.7.1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; aminos -NH2; tioles -SH; imidazol, fenol, etc.). Estos representan algunos de los grupos funcionales de las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. Es decir, la mayoría de las enzimas son sensibles a la concentración de protones en la solución, por lo que desviaciones por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar su actividad. La influencia del pH se da por un lado por la estructura terciaria de la proteína, y por otro lado por el mecanismo de reacción que a veces requiere protones como catalizadores. La mayoría de las enzimas celulares funcionan en un rango de pH de 6 a 8. Sin embargo, existen enzimas como la pepsina estomacal que tienen un pH óptimo de 2. Un pH extremo puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno.

Figura 10-4. Gráfica del efecto del pH sobre la estructura de las proteínas. En los tres ejemplos se observa que el máximo de actividad enzimática (pH óptimo) se encuentra a diferentes valores de pH que representa que en el sitio activo participan diferentes aminoácidos con grupos ionizables distintos.

10.1.7.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas. La regla clásica de bioquímica dice que por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La

270 temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por ejemplo, las enzimas humanas se encuentran generalmente entre los 35 y los 40ºC, siendo 37ºC la temperatura media de las células humanas. La mayoría de las enzimas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a partir de los 40ºC. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. En cambio, las enzimas de las arqueas termófilas, que se encuentran en manantiales calientes, son estables hasta a 100ºC. Sin embargo, la idea de una temperatura "óptima" para una reacción enzimática puede ser engañosa, ya que la velocidad observada es el producto de la velocidad de la reacción química y la concentración de la enzima activa sin desnaturalizarse. La Figura 10-5 muestra que por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

Figura 10-5. Gráfica que explica del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. La velocidad aumenta a medida de que se incrementa la temperatura hasta alcanzar la temperatura óptima. Si la temperatura aumenta por encima de este punto, la enzima pierde su actividad debido al daño en la estructura tridimensional.

Tarea 10-7 Los cultivos vegetales no se dan igual de bien en todos los climas. Hay unos que crecen bien a ciertas temperaturas pero no a otras. El maíz no se crece óptimamente a las mismas temperaturas a las que se cultiva generalmente la papa. Haga una lista con más ejemplos. Postule algunas hipótesis de por que esto es así. Relacione los efectos fisiológicos conocidos a nivel de la productividad de las plantas, con los efectos que ha aprendido a nivel molecular de las células vegetales.

10.1.7.3. Efecto de los cofactores en la actividad enzimática A veces, una enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como el Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, etc. Casi un tercio de las enzimas conocidas requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima. Muchos de estos apoenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la Figura 10-6 podemos observar una molécula de mioglobina (proteína que transporta oxígeno al tejido muscular) y su coenzima (el grupo hemo, representado en color verde). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa, es decir, la enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de una holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima. Ver Figura 10-6

Figura 10-6. Imagen de la estructura cuaternaria de una enzima mostrando los cambios estructurales al unirse un cofactor y el sustrato en el sitio activo de pasar de holoenzima a apoenzima.

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10.1.7.4. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato. Si aumenta la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Sin embargo, un grado extremo de saturación también puede limitar la velocidad máxima y hasta inhibirla. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo. A partir del punto de saturación la reacción no puede acelerarse mediante adición de sustrato, sea cual sea la cantidad añadida. En un gráfico la velocidad de reacción habría alcanzado una meseta.

[S4]

[S3]

[S2] Producto

[S1]

Tiempo

Figura 10-7. Gráfica de curso de reacción de una enzima a cuatro diferentes concentraciones de sustrato. Tanto la velocidad inicial, como el valor absoluto del producto final son distintos.

10.1.7.5. Efecto de la fuerza osmótica sobre la actividad enzimática La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones de sodio interfieren con los enlaces débiles iónicos de las proteínas. Las enzimas típicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de organismos halófilos. Sin embargo, en la mayoría de las enzimas al encontrarse a una concentración alta de sal se debilitan las fuerzas básicas que estabilizan a la estructura y por lo tanto su función se pierde. Por lo regular los iones de sodio (Na+) son más dañinos para las enzimas citosólicas que los iones de potasio (K+).

Tarea 10-8 Investigue porque los cultivos como el maíz no pueden ser regados con agua salina de mar, mientras que las palmeras de coco aguantan muy bien ese tratamiento. Haga un comparativo entre los efectos de los iones de cloruro, sodio, potasio, magnesio, fósforo y sulfato. Relacione los efectos fisiológicos a nivel de la planta, con algunos efectos a nivel molecular de las células vegetales.

10.1.8. Modelo cinético de Michaelis-Menten

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten (ver Figura 10-8) desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad, que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

272

Figura 10-8. Imágenes de de Leonor Michaelis (Izquierda) y Maud Menten (derecha).

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (Vo) y la concentración inicial de sustrato ([S]o) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre.

Sustrato Complejo + Enzima Sustrato Productos Enzima

E + S ES E + P

Figura 10-9. Representación de la unión del sustrato con la enzima y la formación de producto.

E + S <-> ES <-> EP <-> E + P

En las reacciones bioquímicas hay pasos intermedios que se llaman ES y EP que se refieren al complejo de enzima unido al substrato o al producto. Las flechas en las dos direcciones indican que la reacción es reversible en todos sus pasos. Es importante tener en cuenta que la enzima no se degrada, sino que se recicla durante la catálisis. Es decir, la suma de E + ES + EP se mantiene siempre constante. Lo que sí cambia después del tiempo, es la cantidad de E y de P, como en cualquier reacción en la que un substrato se transforma en un producto. Sin embargo, la proporción de E y de P que finalmente se obtendrá depende el equilibrio químico y de las constantes de energía y no de la enzima. La enzima sólo determina la velocidad de la reacción y acelera el establecimiento del equilibrio químico.

La afinidad que existe entre la enzima y el sustrato, se caracteriza por su constante de Michaelis, Km. El valor de Km se refiere al valor de la concentración de S cuando la cantidad de enzima unida al substrato (ES) o producto (EP) es igual a la cantidad de enzima libre (E). Es decir cuando E=ES+EP. La Km es la concentración de sustrato con la que la enzima alcanza la mitad de su Vmax, sus unidades se expresan en moles por litro. Por su parte, la Vmax es la velocidad máxima que puede alcanzar una enzima en su punto de saturación. Es decir cuando todas las enzimas están unidas a un substrato (ES>>E) y casi no hay enzima libre (E=0). Las unidades de Vmax se miden en μmoles/min.

Es importante saberse de memoria la ecuación de Michelis y Menten, ya que esta explica la grafica de saturación mostrada en la Figura 10-7. . VS max*][ v = + SKm ][

273

La ecuación de Michelis-Menten explica la aparición de productos, el recambio del complejo enzima sustrato, la velocidad (v) y la afinidad de una enzima (Km). La siguiente figura muestra la forma en que se deriva esta ecuación (ver Figura 10-10).

Figura 10-10. Forma de derivar la ecuación de Michelis y Menten. Se puede distinguir entre enzima libre [E] y enzima unido al sustrato [ES], de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es: [ET] = [E] + [ES]. Como [E] = [ET] – [ES], resulta que: v1= k1 [S] [ET] – k1 [S] [ES] Este modelo cinético La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten que se comporta como una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

La derivación de Michaelis-Menten está descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de la siguiente manera: Se supone que la reacción enzimática es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima después de la reacción.

274

Siguiendo la aproximación del estado estacionario, que señala que la concentración del complejo enzima-sustrato (ES) es pequeña y se mantiene casi constante a lo largo de la reacción enzimática:

Se define:

Entonces:

(1)

La velocidad de reacción es: (2) La concentración total de la enzima:

[E0] = [E] + [ES] Por lo tanto: [E] = [E0] − [ES] (3)

Sustituyendo (3) en(1) da:

Reordenando: Km [ES] + [S][ES] = [E0][S]

(4)

Sustituyendo (4) en (2):

Representado gráficamente se obtiene una hipérbola que representa el cambio en la velocidad a medida que aumenta la concentración de sustrato como se ve en la siguiente Figura.

Figura 10-11. Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

Esta ecuación puede ser analizada experimentalmente con un diagrama de Lineweaver-Burke o un diagrama de Eadie-Hofstee. Para determinar gráficamente por medio Lineweaver-Burke de los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/ [S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cuál: • La pendiente es KM/Vmax .

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• La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/Km. • La ordenada en el origen (1/ [S]0 = 0) es 1/Vmax. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Figura 10-12. Gráfica de Lineweaver-Burke o de doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, así como el gradiente de velocidad.

10.1.8.1. Actividad enzimática Se define la unidad de actividad enzimática (U), como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 μmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot), o por mililitro de disolución (U/ml), o por gramo de peso freso (U/gFW).

10.1.8.2. Efectos alostéricos Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricas, cuya gráfica de la velocidad frente a la concentración de sustrato [S] no es una hipérbola, sino una sigmoidea. En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Figura 10-13. Ejemplificación de cómo se realiza la inhibición alostérica. A la izquierda. Curva de saturación de una enzima alostérica, donde se puede apreciar una cinética sigmoidea.

10.1.8.3. Tipos de inhibición de la actividad enzimática Las enzimas catalizan, virtualmente, todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos y agroquímicos más importantes. Los herbicidas mas potentes como los gliofosatos, triazinas o fosfonotricinas, son agentes químicos que inhiben la actividad enzimática de ciertas proteínas clave para la sobrevivencia de la célula vegetal.

Tarea 10-9 Investigue cuales son los agentes activos de algunos de los herbicidas comerciales como Basta, Roundup, Sanson, etc. Averigüe cuales son las rutas metabólicas que inhiben estos compuestos. Dibuje las formulas químicas de estos herbicidas, y cómo estas moléculas se pueden unir al sitio

276 activo de una enzima para inhibirla. Postule una hipótesis de porque algunos herbicidas son selectivos para hierbas de hoja ancha (plantas dicotiledóneas) y otros son mas efectivos para pastos (plantas monocotiledóneas). Use los conocimientos que aprendió sobre inhibición enzimática para explicarlo.

Un aspecto muy importante sobre la actividad de las enzimas, es su capacidad de activación o inhibición selectiva por otras moléculas o proteínas. Esta se de da por la formación de metabolitos que inhiben la actividad enzimática, ya sea contaminantes inespecíficos o inhibidores específicos. También se lleva a cabo por medio de proteínas que modifican las enzimas, por ejemplo por fosforilación de grupos hidroxilo o por modificaciones en los enlaces disulfuro entre diferentes residuos de cisteína (regulación redox). Está regulación permite a las enzimas regular el flujo metabólico en una determinada vía.

Los inhibidores se pueden clasificar en varios grupos, entre ellos los del tipo reversible y los que causan una inhibición irreversible. Un tipo de inhibición reversible es la denominada competitiva. Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo del enzima, pero la reacción normalmente no tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato. Debido a que el inhibidor se une de manera reversible, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del sustrato simplemente añadiendo más sustrato.

Se distinguen 3 tipos de inhibiciones: • Competitiva: El inhibidor compite por el sitio activo de la enzima. • No competitivo: El inhibidor se une con la enzima libre en otro sitio diferente al catalítico, afectando su velocidad de reacción. • Acompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato, más no a la enzima libre.

A continuación se muestran los diferentes tipos de inhibición y como se pueden diferenciar de manera gráfica.

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a) Sin Inhibición b) Inhibición Competitiva

Inhibida ⎛ [I]⎞ km 1 m ⎜1+= ⎟ 1 ⎝ kI ⎠Vmax V V [I]

1 km 1 Vmax m= Vmax −1 Vmax km No inhibida 1 Intersección −1 1 S [] ⎛ + []I1 ⎞ []S km⎜ ⎟ ⎝ kI ⎠

c) Inhibición No Competitiva d) Inhibición Acompetitiva

Inhibida Inhibida ⎛ []I ⎞ km m ⎜1+= ⎟ km 1 ⎜ ⎟ m = kI Vmax 1 ⎝ ⎠ Vmax V [I] V [I]

Intersecciones No inhibida [I] No inhibida 1+ −1 1 ⎛ []I ⎞ kI 1 ⎛ [I]⎞ ⎜1+ ⎟ − ⎜1+ ⎟ Intersecciones ⎜ kV ⎟ ⎜ ⎟ km max ⎝ I ⎠ km Intersecciones max ⎝ kV I ⎠ 1 1 []S []S

Figura 10-14. Gráfica comparativas de los inversos del sustrato y la velocidad para los 3 tipos de inhibición; a). Enzima no inhibida; b) inhibición competitiva; c) inhibición no competitiva y d) inhibición acompetitiva.

En la imagen de abajo se muestra en forma tridimensional una cinasa que es inhibida por ATP. Figura 10-15

Figura 10-15. Ejemplificación de un complejo catalítico en tres dimensiones de la proteína kinasa con un inhibidor, el ATP está adyacente al sitio activo.( Stryer)

Tarea 10-10 Observa las gráficas, e indica cuáles son las diferencias significativas

278 a) En cada gráfica que indica cada una de las rectas. ¿Qué ocurre con la Vmax y con la Km? b) compara cada tipo de inhibición, qué ocurre con la Vmax y con la Km, ¿En cuáles se modifica y en cuáles no?

Tarea 10-11 Investigue, ¿qué es la inhibición alostérica? Observe y explique la figura de arriba.

10.2. Fundamentos de Espectrofotometría 10.2.1. La radiación electromagnética La espectrofotometría se refiere a la medición de la cantidad de luz absorbida por una muestra en función de la longitud de onda. El sufijo de metría indica que es una metodología cuantitativa y no sólo cualitativa. Es una metodología rápida, precisa, versátil, fácil de usar y eficiente en costo. Es uno de los métodos más usados en la bioquímica analítica. Para explicar los usos prácticos de la espectrofotometría, primero debemos repasar algunos fundamentos teóricos sobre la luz y los cromóforos.

La luz tiene una naturaleza corpuscular y ondulatoria. La cantidad mínima de luz (paquete cuántico) se llama fotón. Los fotones son partículas, y ondas a la vez, según dice el principio de incertidumbre de Heisenberg. No tienen masa, pero si energía, la cual esta definida, no por su velocidad que es constante en un determinado medio, sino por su frecuencia v (seg-1) o longitud de onda (λ).

×= vhE λ ×= vc Ecuación 11 Ecuación 12 En donde:

E = energía de la molécula h = constante de Planck v = frecuencia de la onda λ = longitud de onda c= constante de la velocidad de la luz en medio vacío (~3 *108 m/s) I = intensidad de la luz. Se refiere al número de fotones, o al equivalente de watts de potencia

Figura 10-16. Representación de una onda senoidal con su amplitud o intensidad I y su longitud lambda.

Se denomina espectro electromagnético a la distribución energética del conjunto de las ondas electromagnéticas. Referido a un objeto se denomina espectro electromagnético o simplemente espectro a la radiación electromagnética que emite (espectro de emisión) o absorbe (espectro de absorción) una sustancia. Dicha radiación sirve para identificar la sustancia de manera análoga a una huella dactilar. Los espectros se pueden observar mediante espectroscopios que, además

279 de permitir observar el espectro, permiten realizar medidas sobre este, como la longitud de onda, la frecuencia y la intensidad de la radiación.

Figura 10-17. Espectro de absorción visible.

Tarea 10-12. Para evaluar el contenido de nitrógeno de las plantas, a veces se usa un dispositivo que mide el contenido de clorofila de las hojas. Esto se hace con un espectrofotómetro portátil que se usa mucho en las evaluaciones de campo, por ejemplo, para el mejoramiento de maíz. Averigüe a que longitudes de onda trabajan estos equipos y haga una relación de los fundamentos de espectrofotometría que necesita saber para entender el funcionamiento de este aparato. Investigue también a nivel bioquímico que tiene que ver la concentración de clorofila con el contenido de nitrógeno y el tipo de fertilizante que se aplica en el suelo.

10.2.2. Cromóforos Las moléculas que pueden absorber fotones se llaman cromóforos. Originalmente solo se refería a la captura de fotones del rango visible, pero ahora también se incluyen los rangos mas amplios desde el ultravioleta (UV), hasta el rojo lejano (FR). La absorción de energía en el rango UV-VIS se debe a que estas moléculas tienen electrones que pueden ser excitados de un nivel basal a un nivel energético más alto. Debido a que estos niveles energéticos tienen valores discretos, únicamente los fotones de una determinada longitud de onda pueden excitar esos electrones. La energía de la luz incidente (hv) tiene que ser igual a la variación de energía entre dos estados electrónicos (fundamental Eo y excitado E*) de los orbitales moleculares del cromóforo. Los cromóforos típicos encontrados en proteínas y ácidos nucleicos absorben luz únicamente por debajo de 300 nm, aunque las proteínas pueden contener otros grupos asociados que absorban a longitudes de onda mayores. Está absorción espectroscópica en la región del ultravioleta de las proteínas y ácidos nucleícos contiene información importante de la composición de estas moléculas complejas y de su conformación o estructura tridimensional en solución.

Figura 10-18. La Intensidad y posición de las bandas del espectro de absorción 10.2.3. Los auxocromos Los auxocromos son grupos funcionales unidos a un cromóforo que modifican su absorbancia en dependencia del estado de ionización del auxocromo. Estos grupos inonizables son por ejemplo grupos carboxilo, hidroxilo o amino: -COOH, -OH, - NH2. Si estos grupos están en conjugación directa con el sistema pi (π) del cromóforo, estos modifican la longitud de onda a la que la luz es absorbida, y como resultado, cambian el espectro de absorción del cromóforo. Una característica de los auxocromos es la presencia de al menos un par libre de electrones que extienden el sistema conjugado por resonancia (Figura 10-19). Los ejemplos más comunes de moléculas con propiedades auxocromicas son los indicadores de pH, como la fenoftaleína, que cambian su color dependiendo de la concentración de protones en el medio. El cambio de color de los indicadores de pH se debe a un cambio en los niveles energéticos de los orbitales, y esto se ve reflejado en el espectro de absorción en el rango de la luz visible.

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Figura 10-19. Ejemplos de Cromóforos y auxocromos. Modificado de Hesse et al, 1997

10.2.4. Espectro de compuestos biológicos Muchos de los compuestos biológicos de interés, como los ácidos nucleicos y las proteínas, son cadenas de monómeros. Para comprender sus espectros de UV-VIS debemos examinar varias contribuciones al espectro: • absorción espectral de los monómeros individuales • contribución de la cadena de polímero • estructuras secundarias y terciarias, incluyendo la formación de hélices • Efectos de la cuveta y del solvente.

Una de las limitaciones de la espectrometría es que es necesario trabajar en contenedores de vidrio o de plástico. Esto restringe la espectrometría en el rango UV porque muchos de los plasticos usados para las microplacas y las microcuvetas bloquean la luz UV de 170-310 nm.

10.2.4.1. Espectro de los ácidos nucleicos Poner ejemplo de espectro de adenina y de ADN y ARN.

10.2.4.2. Espectro de las proteínas Los cromóforos presentes en una proteína pueden dividirse en tres clases: el enlace peptídico, la cadena lateral de los aminoácidos y el grupo prostético. . Figura 10-20. Espectro de una proteína

En cuanto a las cadenas laterales de las proteínas, las bandas de absorción más significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente, los aminoácidos aromáticos absorben en el rango de 260-280nm.

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La fenilalanina es la que menos absorbe, aunque muestra un espectro complejo con múltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta también bandas de mayor energía que solapan con el espectro del enlace peptídico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribución al espectro en la zona del ultravioleta cercano de proteínas suele ser pequeña.

La tirosina presenta un máximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonación del OH del anillo aromático. Un cambio de pH produce grandes efectos en los espectros de tirosina ya que el lugar de protonación afecta directamente a la conjugación electrónica de la cadena lateral. El mayor cambio en el espectro de la tirosina por diferentes pHs se da a 240nm, pero también a 280nm.

La triptófano también presenta un máximo a 280 nm. A diferencia de la tirosina, el especto del triptófano se mantiene casi inalterado a diferentes pHs. La cisteína presenta una banda centrada a 250 nm, n-->σ* (εmax ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy débil.

10.2.4.3. Grupos prostéticos Muchas proteínas contienen además de los aminoácidos otros grupos que pueden encontrarse unidos a la proteína tanto de forma covalente como no covalente. En muchos casos puede que estos grupos sean cromóforos y contribuyan al espectro de absorción de la proteína en el UV- cercano o en el visible. Por ejemplo, flavinas, fosfato de piridoxal, metales presentan bandas de absorción intensas en estas regiones espectrales, que pueden resultar casi imprescindibles para muchos estudios físico-químicos de la acción de estas proteínas. Cambios espectrales en los distintos estados redox o según el entorno en que se encuentran.

Figura 10-21. Estructuras y espectros de algunos grupos prostéticos 10.2.5. La ley de Beer-Lambert Cuando la luz atraviesa un medio acuoso su intensidad decae. Es decir, no todos los fotones que entran a un medio salen, ya que algunos son absorbidos (Figura 10-22). La ley de Beer-Lambert dice que la caída de intensidad es exponencial y depende de sólo tres parámetros:

282

1) el factor molar de extinción del cromóforo (ε) 2) la concentración del cromóforo en la solución (c) 3) la longitud de la cubeta que la luz atraviesa (d)

Esto se puede representar de la siguiente forma:

Microcubeta

c= concentración de cromóforo

I I1 o ε = Intensidad inicial coeficiente de Intensidad final absorción molar Fotocelda Fuente de luz detectora

d Figura 10-22. Ley de Beer- Lambert. Usando una microcubeta, se mide la intensidad que entra y que sale.

I log 0 == ε ** dcA En donde: I1 Ecuación 13 log = logaritmo decimal I0 = intensidad de la luz incidente I1 = intensidad de la luz una vez que ha atravesado el medio A = valor decimal de absorbancia ε = coeficiente de absorción molar de la sustancia c = concentración de sustancia absorbente en el medio d = distancia que la luz atraviesa por el medio

Las unidades de ε dependen del modo en que se exprese la distancia y la concentración de la sustancia absorbente. Por lo regular, la distancia se especifica en centímetros (cm), la concentración en micro moles por litro (μmol/l) mientras que el coeficiente molar se expresa en las unidades reciprocas (l/μmol*cm). De esta forma, el valor de absorbancia (A) no tiene unidad. Fotocelda Monocromador 0 II

0%T 100%T

Microcubeta

Fuente luminosa

Figura 10-23. Medición de la luz que atraviesa un medio acuoso. Ley de Beer-Lambert

283

La relación entre la concentración y la absorción de luz a una determinada longitud de onda es la base de la espectrofotometría para identificar y cuantificar diversas sustancias. Si conocemos de y ε, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz absorbida, y esto se logra con un espectrofotómetro. El parámetro de lectura que arroja un espectrofotómetro es el valor de transmitancia (%T) o el valor de absorbancia (A) a una determinada longitud de onda usando una cubeta de definido grosor (d) (Figura 10-23).

El por ciento de transmitancia (%T) se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. Una solución límpida, no absorbente, mostrará una lectura de 100% de transmitancia, mientras que un cuerpo opaco absorberá toda la radiación que le llega resultando en una transmitancia de 0%. Las unidades de absorbancia son al revés. Una solución translucida da una absorbancia de cero, mientras que entre más opaco sea, mayor será el valor de A. Las unidades de absorbancia van de 0 al infinito, pero los aparatos por lo regular solamente dan una respuesta lineal en el intervalo de 0 a 2 (Skoog et al., 1998) .La transmitancia (T), intensidad (I) y absorbancia (A) se relacionan de esta forma: I T 1 == 10 − A I 0 Ecuación 14

10.2.6. Métodos enzimáticos.

10.2.6.1. ¿Qué es un ensayo enzimático? Un ensayo enzimático es un procedimiento experimental, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática, o bien, medir la concentración de un sustrato. Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios, bien en la concentración de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentración de producto (que va aumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimática. También se puede utilizar la espectrometría de masas para detectar la incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es convertido en producto.

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láser dirigidos a través de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reacción. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catálisis o bien unir moléculas fluorescentes en lugares específicos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catálisis. Estos estudios están dando una nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales, en oposición a los estudios de cinética enzimática tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una población de millones de moléculas de enzima.

En la Figura 10-24 se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica en la gráfica.

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Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimáticos suelen estar estandarizados para que el período inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas más fácilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rápida de líquidos permiten llevar a cabo medidas cinéticas de períodos iniciales cuya duración puede llegar a ser inferior a un segundo. Esté tipo de ensayos rápidos son esenciales para medidas de la cinética del estado estacionario, discutida más abajo.

Figura 10-24. Curva de saturación de una reacción enzimática.

En la figura anterior la pendiente representa, en el periodo inicial, la velocidad de la reacción. La ecuación de Michaelis-Menten describe como va variando la pendiente con la concentración de sustrato o de enzima. En estos experimentos los parámetros cinéticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentración del sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rápida fase inicial y durante un tiempo lo suficientemente largo que permita a la reacción acercarse al equilibrio. Este tipo de ensayos se intenta evitar por el error matemático que se puede introducir y es cada vez menos practicado, pero fue muy ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cinética enzimática.

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática (Figura 10-24). Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. La forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Está aproximación es muy útil como alternativa a las cinéticas rápidas, cuando el período inicial es demasiado rápido para ser medido con precisión.

Según la fase de la reacción estudiada, todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo. Por ejemplo, se miden los micromoles (μmol) de producto generados por minuto. A la velocidad reacción también se le llama actividad enzimática. Existe un número grande de diferentes métodos para medir la concentración de sustratos y productos, y muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras.

Según el seguimiento de la reacción, los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos grupos según la manera en que se sigue la medición. Por una parte están los ensayos continuos, en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Por otra parte existen ensayos discontinuos, en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos.

10.2.6.2. Ensayos continuos. Los ensayos del tipo continuo son los más convenientes, al obtener la velocidad de la reacción directamente en tiempo real (online). Para que se puedan realizar, la detección tiene que hacerse de manera no intrusiva.

10.2.6.3. Ensayos discontinuos. En un ensayo discontinuo se toman muestras de una reacción enzimática en intervalos y se mide en ellas la cantidad de producto formado o sustrato consumido.

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10.2.6.4. Métodos de detección. Tanto para los ensayos continuos como discontinuos hay muchos métodos diferentes de detección.

Espectrofotométricos: En los ensayos espectrofotométricos puede seguirse el curso de una reacción observando como cambia la luz absorbida por la solución en la que se está dando la reacción. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la única molécula de la mezcla de reacción que lo hace a la misma; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminución de la absorbancia a dicha longitud de onda.

Cuando la luz absorbida se encuentra en el espectro visible es posible observar un cambio en el color de la muestra, y entonces hablamos de método colorimétrico. También es usual el uso de la luz ultravioleta (luz UV), especialmente porque sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH, coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioquímicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH y NADPH), pero no en forma oxidada (NAD+ y NADP+). Así, la actividad de una oxidorreductasa que use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH

Calorimétricos: La calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por una reacción química. Estos ensayos son muy generales, ya que muchísimas reacciones llevan asociado algún cambio de calor y utilizando un microcalorímetro no es necesario utilizar grandes cantidades de enzima o sustrato. Estos ensayos pueden ser usados para medir reacciones imposibles de medir con otros métodos.

Quimioluminiscencia: La quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y esta puede ser medida para detectar la formación de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede ser registrada en una película fotográfica por días e incluso semanas, pero al mismo tiempo son de difícil cuantificación, porque no toda la luz emitida por la reacción será detectada. La detección de la peroxidasa de rábano por quimioluminiscencia enzimática (ECL, enzymatic chemiluminiscence) es un método común para detectar anticuerpos en el western blot. Otro ejemplo de quimioluminiscencia es la luciferasa, enzima presente en las luciérnagas que produce luz de forma natural a partir de su sustrato, luciferina.

Radiométricos: En los ensayos radiométricos se mide la incorporación de radiactividad en los productos o su liberación desde sustratos. Los radioisótopos más usados en estos ensayos son 14C, 32P, 33P, 35S y 125I. Como los isótopos radiactivos permiten el marcaje de un sólo átomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Son frecuentemente utilizados en bioquímica y son a menudo la única manera de medir una reacción específica en extractos crudos (mezclas complejas de las enzimas liberadas al lisar células). En estos procedimientos la radiactividad es normalmente medida en contadores de centelleo.

Cromatográficos: En los ensayos cromatográficos se mide la formación de producto separando los componentes de la mezcla de reacción por cromatografía. Normalmente se lleva a cabo mediante HPLC. Aunque esta aproximación puede requerir grandes cantidades de material de partida, su sensibilidad puede incrementarse mediante marcaje radiactivo de los sustratos o los productos.

Fluorimétricos: En el fenómeno de la fluorescencia una molécula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimétricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reacción enzimática. Estos

286 ensayos son generalmente mucho más sensibles que los espectrométricos, ya que son más específicos al tener que utilizar dos longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir más interferencias por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos compuestos fluorescente presentan al ser expuestos a la luz.

Un ejemplo de estos ensayos es, una vez más, el uso de las coenzimas NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las oxidadas no. Las reacciones de oxidación pueden, por tanto, ser seguidas por el descenso de la intensidad de fluorescencia, y las de reducción por el aumento. También existen sustratos sintéticos que liberan un fluoróforo en reacciones catalizadas por enzima, como por ejemplo el 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido para ensayar la β-galactosidasa.

10.2.6.5. Métodos enzimáticos acoplados a NADPH En los ensayos espectrofotométricos puede monitorearse una reacción bioquímica observando cómo cambia la densidad óptica de la solución en la que se está dando. Para utilizar un ensayo de este tipo debe haber un substrato que absorba la luz de manera diferente al producto que genera. Por medio de espectrofotómetro se puede observar la disminución de la concentración del substrato (o el aumento del producto) en tiempo real. Cuando la luz absorbida se encuentra dentro del rango del espectro visible se observa un cambio en el color de la muestra, y entonces hablamos de un método colorimétrico. En muchos casos se usa luz ultravioleta (luz UV). Para esos casos se necesitan cubetas especiales, que sí sean transparentes a una longitud de onda menor de 400nm. La luz UV sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH. Estás coenzimas participan en infinidad de reacciones bioquímicas, principalmente de oxidorreducción. NADH y NADPH en su forma reducida absorben luz UV a 340nm, mientras que en su forma oxidada (NAD+ y NADP+) son casi transparentes a esta longitud de onda (Figura 10-25). Así, la actividad de una oxidorreductasa que use NADP como coenzima puede ser monitoreada, siguiendo el incremento de la absorbancia a 340 nm a medida que se produce el NADPH.

Figura 10-25. Especto del Absorción del NAD+ y del NADH

Incluso cuando la reacción enzimática estudiada no provoca ningún cambio de absorbancia o esta no es específica, pueden usarse ensayos espectrofotométricos para la enzima realizando un ensayo acoplado. En este, el producto de la reacción a estudiar se usa como sustrato de una segunda reacción, que ha de ser de fácil seguimiento y cuyos otros sustratos, coenzimas y enzimas deben encontrarse a concentraciones saturantes para que la velocidad de la segunda reacción no sea limitante. Por ejemplo, en la Figura 10-26 puede verse el esquema de un ensayo acoplado para la hexocinasa, que puede medirse acoplando la producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH usando la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

Figura 10-26. Esquema del ensayo acoplado para la hexocinasa

10.2.6.6. Ejemplo: Análisis de Azúcares En la siguiente figura se puede observar el esquema de un ensayo acoplado para la medición de tres azucares de forma secuencial: glucosa, fructosa y sacarosa. Por cada molécula de hexosas se produce un mol de NADPH, mientras que por cada mol de sacarosa se produce 2 moles de NADPH.

287

Figura 10-27. Ejemplificación de la producción de NADPH a partir de glucosa, fructosa y sacarosa.

Tarea 10-13 El maíz produce sacarosa a través de la fotosíntesis en las hojas. Bajo condiciones limitantes de agua (sequía), las estomas de las hojas se cierran, evitando así el escape de vapor de agua. Esto también limita la entrada de dióxido de carbono, y por consiguiente, inhibe la fotosíntesis. Un fisiólogo de maíz ha propuesto un proyecto en donde se medirán los niveles de glucosa y sacarosa en las hojas y tallos de diferentes genotipos de maíz contrastantes, ya sea más, o menos tolerantes a la sequía. ¿Cree usted que la medición de azucares es pertinente? ¿Se justifica el uso de esta herramienta bioquímica para un proyecto de mejoramiento genético de maíz? Asuma una postura como evaluador de este proyecto y defiéndala con argumentos.

10.2.6.7. Métodos cinéticos Uno de los métodos recientes para cuantificar metabolitos en un tejido es conocido como cycling assay. Esta técnica consiste en la medición o cuantificación de metabolitos a muy bajas concentraciones basado en la actividad de dos enzimas que en su conjunto catalizan una reacción cíclica. Una enzima convierte el metabolito A en el metabolito B y una segunda enzima convierte el metabolito B otra vez en el A. Es decir, la reacción global consiste en un reciclaje de una misma molécula. El truco de los cycling assays es acoplarlos a la generación de una molécula reportera, es decir, cogenerar algún metabolito que pueda ser fácilmente cuantificado, como por ejemplo, NADH o MTT. Como las enzimas y cofactores están en exceso, la velocidad del ciclo depende de la suma de concentración A y B. Las concentraciones pueden ser determinadas específicamente ya que la velocidad de la reacción será linealmente dependiente de la concentración de estos sustratos. Según la ecuación de Michaelis-Menten la relación entre la concentración de los sustratos ciclicos y la velocidad de reacción es lineal en el rango de S

Gly 3PDH

O2 H2O2

Gly3P DAP

NAD+ NADH+H+ Gly 3POX

288

Figura 10-28. Reacción de cycling assay basada en el ciclo de glicerol-3-P

Gly3POX cataliza la conversión de 02 del Gly3P en dihidroacetona-P (DAP) y Gly3P convierte DAP a Gly3P y simultáneamente oxida el NADH a NAD+ el cuál es detectado espectrofotométricamente a 340 nm. Esté tipo de reacciones acopladas que no dependen directamente del sustrato utilizado para monitorear la reacción se llaman pseudo orden cero. En el caso de la Figura 10-28 la velocidad de la reacción cíclica no depende ni de la concertación de O2 ni de NADH. La velocidad solo dependerá de la suma de DAP y Gly3P. La velocidad de disminución de NADH determinará la concentración de este metabolito (Gibon et al., 2002). Idealmente, los cycling assay se llevan a cabo a concentraciones de sustrato que son menores que el Km de las dos enzimas participantes (Gly3PDH y Gly3POx), que por lo regular son del orden de micromoles por litro, por lo que con este tipo de ensayos son muy sensibles, ya que se pueden detectar cantidades del rango de 10 picomoles de Gly3P.

10.3. Análisis de macromoléculas La electroforesis y la cromatografía comprenden un conjunto diverso de métodos que permite a los científicos separar componentes en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar macromoléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, entre otros.

10.3.1. Electroforesis La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético, basada en el movimiento o migración de las macromoléculas como resultado de la acción de un campo eléctrico. Por lo regular la migración se hace con macromoléculas disueltas en un determinado medio (solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado. El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética, y esta por la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico. Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución. La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta área. La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel, ya sea en base a agarosa o acrilamida, se utiliza generalmente con propósitos cualitativos, pero también analíticos. Puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.

10.3.1.1. Ácidos nucleicos En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es inversamente proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma más complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados

289 para 'desplegar' las moléculas lineales y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento.

10.3.1.2. Proteínas Por otra parte, las proteínas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoeléctrico). Laemnli, 1970, modificó la electroforesis para proteínas mediante la adición de un detergente como el dodecilsulfato sódico/dodecilfosfato sódico (SDS/SDP) y un agente reductor como el 2- mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o tinción de plata, azul de coomassie o tinción fluorescente, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.

Las bandas en diferentes separaciones paralelas, que están a la misma distancia del principio, significan que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño o punto isoeléctrico. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula.

Figura 10-29. Ejemplos de separación de proteínas (SDS-PAGE) izquierda y de ácidos nucleicos derecha.

10.3.2. Cromatografía La cromatografía se distingue de la electroforesis por la forma en que migran las partículas. En las técnicas cromatográficas, la migración de las moléculas esta dado por un flujo de masas, y no por una fuerza eléctrica, como en la electroforesis. La cromatografía no sólo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. Se pueden distinguir compuestos que están muy estrechamente relacionados. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.

290

En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas o un líquido. La fase móvil puede pasarse a través de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así, en la cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.

Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente. Sólo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil. La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. A continuación se describe este método de separación.

La cromatografía líquida de proteínas la podemos diferenciar en cuatro grupos:

• de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad • de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción • de exclusión: separa solutos según el peso molecular • de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica

Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes. Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.

291

En la siguiente sección se explican algunos ejemplos de los métodos cromatográficos más usados hoy en día para el mejoramiento genético, por ejemplo, la determinación de la calidad nutricional del maíz. 10.4. Metodologías y Equipos 10.4.1. Cromatografía de líquidos (HPLC)

La clave para conseguir la precisión deseada en la bioquímica analítica es el método de extracción y el método de cuantificación. El protocolo y la apropiada configuración de los instrumentos son muy importantes, así como el entrenamiento del personal que los utilizará. El instrumento mejor diseñado, el más resistente en el mundo, no va a dar resultados adecuados a largo plazo si los usuarios finales no entienden cómo usarlo ni mantenerlo. El soporte técnico y el personal calificado son factores críticos. El protocolo mejor escrito no funcionará si la persona que realiza la extracción no tiene experiencia en el laboratorio y al menos un mínimo de conocimientos químicos. Es muy importante que los estudiantes entiendan todos los fundamentos de la bioquímica y de la cromatografía para sacarle mayor provecho a estas herramientas analíticas dentro de sus proyectos experimentales.

Introducción a Cromatografía La Cromatografía líquida de altaresolución o High Performance Liquid Chromatography (HPLC) es el tipo de cromatografía utilizada con más frecuencia en la bioquímica analítica. Las columnas de HPLC separan los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la fase de la columna cromatográfica. La separación física está basada en la distribución de los componentes químicos de una mezcla entre dos fases, una fase fija o estacionaria y otra móvil.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en columnas generalmente de vidrio o plástico, las cuales se rellenan de manera manual con una resina tipo gel. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Esto todavía se hace mucho para separar y purificar proteínas

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, se fue disminuyendo el tamaño de las partículas de fase fija hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. Así nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial para trabajar con las altas presiones requeridas. En HPLC la fase móvil es un líquido que fluye a altas presiones a través de una columna de metal que contiene una resina empacada desde la fábrica. Dependiendo del tipo de fase móvil o fija, y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, existen diversas variantes de cromatografía líquida:

Cromatografía De Exclusión La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Esté tipo de separación por tamaño difiere de las

292 demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida.

La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.

Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. Está técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la determinación de las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas purificadas.

La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más precisamente, según su radio de Stokes. La ley de Stokes se refiere a la fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en el seno de un fluido viscoso en un régimen laminar de bajos números de Reynolds. En general la ley de Stokes es válida en el movimiento de partículas esféricas pequeñas moviéndose a velocidades bajas.

La ley de Stokes puede escribirse como: Fr = 6πRην, Donde R es el radio de la esfera, ν su velocidad y η la viscosidad del fluido.

En está cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Para los fines prácticos, las columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de está. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente.

Figura 10-30 Cromatografía de exclusión molecular.

Cromatografía de Adsorción La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000.

293

En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En esté tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

Cromatografía De Intercambio Iónico La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.

Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Un incremento en la concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiónico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniónico.

Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Sílice porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones de elevada carga y radio pequeño. Este tipo de cromatografía es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificación de agua, concentración de componentes traza, Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

Figura 10-31. Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía basada en bioafinidad Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones

294 electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.

Figura 10-32. Cromatografía de biofinidad, tomado de www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Tarea 10-14: Realice diagramas explicando cada una de las cromatografías, con un ejemplo ya sea que tomes de la literatura o que inventes, explica, ¿cuál de las cromatografías escogería y por qué? Comentario [EVO9]: ¿Para qué? En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cuál fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.

Cromatografía de fase normal La cromatografía de fase normal (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Está técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se usa cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.

La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también de los factores estéricos, de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

La NP-HPLC cayó en desuso a los años setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa debido a la falta de reproducibilidad de los tiempos de retención puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la sílice o alúmina de la cromatografía.

Cromatografía de fase reversa La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina. Sin embargo, aquí la fase estacionaria es de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matríz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifáticos.

Por tal razón, esté tipo de cromatografía ha sido también llamada como cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En general, esté último término se ha empleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos. Por tanto, el termino HIC es común cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos, en tanto que RPC es más empleado para referirse a la separación de moléculas en sistemas que son inadecuados para la separación de macromoléculas biológicas.

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía

295 es la de sílice tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. Fructanos LDP130808 #42 E M32 ED_1 1,200 nC Az

1,000

columna Glucosa 2:

750 Bomba Solventes 500 4: Sacarosa 4: Detector 250 3: Fructosa 3:

colector Rafinosa 6: 1: 1: Inositol -20 min 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 Figura 10-33. Diagrama del funcionamiento de la cromatografía de fase reversa. Y un cromatograma típico. http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/

El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.

Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como que la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.

Otra variable importante es el pH, puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de sílice de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de sílice normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por sílice modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de sílice subyacente. Las columnas se pueden utilizar en medio

296 acuoso ácidos, pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.

10.4.2. Cromatografía de gases (GC) La cromatografía de gases (GC por sus siglas en inglés) es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna capilar. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.

La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Este consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

Microjeringa Detector

Rotámetro

Columna Gas acarreador Figura 10-34. Diagrama de un cromatógrafo de gases.

Rampas de temperatura La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a él. Para estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de temperatura, con lo cual esta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución ya que aunque a mayor temperatura la elución es más rápida, se corre el riesgo de descomponer el analito.

Columnas capilares En el GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno, y las tubulares abiertas o capilares. Estas últimas son más comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 50 metros, y están construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Debido a su longitud y a la

297 necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicoidal con diámetros de 10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno.

Las columnas capilares son de dos tipos básicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie mayor de intercambio. Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de sílice fundida o FSOT. Estás columnas se fabrican a partir de sílice especialmente pura, sin apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a la fragilidad inherente a esté material, en el mismo proceso de obtención del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un diámetro de unos pocos centímetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.

Jeringa de Inyección

Septum Entrada de gas

Muestra vaporizada

Columna Horno Cromatográfico Figura 10-35. Columna capilar.

Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm (para columnas normales) y 150-200 μm para columnas de alta resolución. Estas últimas requieren menor cantidad de analito y un detector más sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con diámetros de hasta 530 μm, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores cánones. En estas columnas existe un problema debido a la adsorción del analito sobre la superficie de la sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con moléculas polares orgánicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililación con dimetilclorosilano (DMCS). La adsorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la sílice empleada. Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno.

Detector de ionización de llama, FID El detector de ionización de llama, es un detector utilizado en cromatografía de gases. Es uno de los detectores más usados y versátiles. Básicamente, es un quemador de hidrógeno/oxígeno, donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador y analito) con hidrógeno. Inmediatamente, esté gas mezclado se enciende mediante una chispa eléctrica, produciéndose una llama de alta temperatura. La mayoría de compuestos orgánicos al someterse a altas temperaturas, pirolizan y se producen iones y electrones, que son conductores eléctricos. Esté hecho se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial de unos centenares de voltios

298 entre la parte inferior del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. La corriente generada es baja (del orden de los 10-12 Ǻ), por lo tanto debe ser amplificada mediante un amplificador de alta impedancia. Detector por ionización de flama

Los compuestos orgánicos se pirolizan, produciendo iones , que son direccionados a un colector en donde generan corriente eléctrica

H2+O2 Flujo de la columna con CnHn

El detector es insensible a gases no

combustibles, como H2O, CO2, CO y SO2

H2+O2 Flujo de la columna con SO2

Figura 10-36. Detector por ionización de flama y formación de iones cuando un compuesto orgánico es quemado en una flama de H2 y O2

El proceso de ionización que se da en la llama es complejo, pero se puede aproximar el número de iones producidos al número de átomos de carbono transformados en la llama. Esto produce que sea un detector sensible a la masa (al número de átomos de carbono que salen de la columna) más que a la concentración, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida.

Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo, alcohol, halógeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y óxidos de nitrógeno. Este hecho, más que limitar el ámbito de aplicación de este detector, permite el análisis de muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados.

Ventajas: • Alta sensibilidad, del orden de 10-13 g/s. • Amplio intervalo lineal de respuesta, 107 unidades. • Bajo ruido de fondo (elevada relación señal/ruido). • Bajo mantenimiento, fácil de fabricar.

Desventajas: • Destruye la muestra (la piroliza).

10.4.2.1. Ejemplo: Análisis de alcoholes y ácidos por GC-FID El control de calidad por análisis de laboratorio usualmente se efectúa en las reservas alimenticias, en materiales procesados y en los productos terminados. La cromatografía líquida HPLC se usa comúnmente para analizar materiales durante el proceso de fermentación, para

299 monitorear la ruptura de las moléculas de fécula en glucosa, luego la conversión a etanol. El etanol en presencia de oxígeno puede ser convertido en ácido acético. Esto es la forma en que se produce el vinagre a partir de jugo de caña de azúcar. El análisis de alcohol por GC-FID no es el mismo que se hace con el alcoholímetro. EL GC-FID permite distinguir diferentes alcoholes y el acido acético por sus tiempos de retención.

PONER aquí solo un ejemplo de un cromatograma de claudia con todos los estándares de MeOH, EtOH, acetico, propanol, butanol, etc,

10.4.3. Ejemplos de metodologías usadas para el mejoramiento de maíz

10.4.3.1. Análisis de Triptófano El maíz es uno de los cultivos más importantes de América, por el área cultivada, el valor de la cosecha y su amplia utilización en la alimentación. Se ha establecido que alrededor del 70% del suministro mundial de proteínas es de origen vegetal y aproximadamente el 30% es de origen animal. Los cereales, son los alimentos de principal consumo en la gran mayoría de los países en desarrollo y aportan a la dieta promedio el 80% de las calorías totales y el 70% de las proteínas requeridas. El desarrollo de los híbridos QPM, con un alto contenido de aminoácidos esenciales (lisina y triptófano), presenta nuevas posibilidades y esperanzas para reducir las deficiencias nutricionales de las familias de bajos ingresos en los países subdesarrollados, en los cuales el maíz representa una parte muy importante en la alimentación. En la actualidad se conocen genes recesivos, por ejemplo, el gen opaque2, cuya incorporación a variedades corrientes permiten mejorar sustancialmente la calidad de las proteínas en dichas variedades.

Figura 10-37. Molécula de triptófano.

La cuantificación de triptófano es difícil debido a la inestabilidad del triptófano en condiciones ácidas. Los métodos convencionales de detección de los demás aminoácidos principalmente se basan en la hidrólisis ácida de las proteínas. Esto se hace a 110ºC -125ºC por 6 - 24 horas con ácido clorhídrico 6-7N. Hay evidencia de que la destrucción de triptófano durante la hidrólisis ácida con ácido clorhídrico, se debe a que este es oxidado por el enlace disulfuro de la cisteína, ya que se ha observado que hay un incremento de esta en hidrolizados de proteínas que contienen cistina y triptófano (Olocott y Fraenkel-Conrat, 1947). En ausencia de oxígeno, el triptófano es relativamente estable en ácidos calientes ya sea solo o en presencia de otros aminoácidos (Lugo, 1933). Sin embargo, cuando están presentes cistina u otros bisulfatos, el triptófano es destruido. La destrucción de triptófano también se ha observado cuando es calentado en solución ácida con ácido pirúvico. La reacción de triptófano con ácido pirúvico, así como la reacción con carbohidratos, resulta en soluciones negras o cafés, y precipitados (huminas) dependiendo de la cantidad de triptófano destruido. En cambio la reacción con cistina promueve la destrucción de triptófano sin la formación de huminas y las soluciones permanecen claras (Olocott y Fraenkel-Conrat, 1947).

300

Los métodos desarrollados hasta ahora no están bien adaptados para una determinación rutinaria en muestras de alimentos vegetales. Para detectar y cuantificar triptófano en mezclas complejas en general, es necesario seguir algunos pasos, dependiendo del método a emplear. La mayoría de las técnicas requieren de una previa extracción pues el triptófano debe de estar en forma libre (no formando parte de una cadena polipeptídica) para poder ser detectado, (algunos casos de métodos colorimétricos). Después de la extracción puede seguir un proceso de separación (principalmente cromatográfica), y por último un proceso de detección y cuantificación.

Tarea 10-15 Haga una búsqueda bibliográfica sobre las publicaciones sobre el gen opaco 2 y los maíces QPM que han sido liberados por el CIMMYT.

Tarea 10-16 Para un fitomejorador que quiere generar variedades de maíz con mayor calidad de proteínas, ¿qué tan importante es el método analítico que va a utilizar para medir esas características nutricionales? Haga un listado de lo que esperaría de un servicio analítico en términos de: rapidez, cercanía, confiabilidad, número de muestras que pueden procesar, precio, garantía, etc. ¿Cuáles serían sus prioridades como fitomejorador? ¿Qué porcentaje de su presupuesto utilizaría para trabajo de campo, que tanto para marcadores moleculares, y que tanto para análisis bioquímicos?

Métodos de Extracción a) Hidrólisis ácida Para extraer triptófano por hidrólisis ácida existen varias técnicas, algunas recurren a la protección del anillo indólico contra la oxidación que sufre por la hidrólisis ácida. Algunos de estos compuestos protectores son ρ- tolueno, ácido sulfónico (Liu & Chang, 1971), ácido tioglicólico (Gruen & Nicholls, 1972; Matsubara & Sasaki, 1969), β-Mercaptoetanol (Pascaud et al., 1987), ácido 3,3 indoilpropiónico y otros reactivos (Penke et al., 1974). Sin embargo, la utilización de estos compuestos no da buenos porcentajes de recuperación de triptófano, aunado a que estás técnicas sólo han sido utilizadas para determinar triptófano en proteínas puras, ya que algunos compuestos del grano suelen disminuir su poder protector como son los carbohidratos resultantes de la hidrólisis del almidón (Piombo y Lozano, 1980). Alternativamente se han usado otros compuestos para hidrolizar en vez del HCl, que mejoran la recuperación, como el ácido metanosulfónico conteniendo 3-(2- aminoetil) indol, y el ácido mecaptometanosulfónico (Creamer & Matheson, 1976). b) Hidrólisis Básica Se ha optado también por la hidrólisis básica utilizando NaOH en concentraciones de 4 a 6 M y protegiendo con algunos compuestos para su degradación como Stanita (Lugg, 1938) con Acetato e Histidina (Spies, 1967) o con almidón (Dreze, 1960). Con la extracción básica se llegan a obtener mejores porcentajes de recuperación aunque involucran procedimientos más elaborados: Si se va a utilizar NaOH es necesaria una predigestión de almidón pues este suele gelificar en soluciones básicas. También son necesarias condiciones de vacío durante la hidrólisis en tubos de polipropileno (Oelshlegel, 1970) para evitar la oxidación del triptófano (Spies, 1967; Oelshlegel, 1970) y calentando a temperaturas de aproximadamente 135°C (Hugli & Moore, 1972). El uso de de Ba (OH)2 puede ayudar a evitar la formación de gel por el almidón del grano, pero también puede formar compuestos que co-precipitan al triptófano como BaSO4 o BaCO3 (Robel, 1967). c) Buffers de proteínas totales

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La extracción de proteínas también puede ser llevada a cabo con los llamados buffers de proteínas totales, que pueden contener principalmente agentes caotrópicos como la urea además de detergentes y agentes reductores como dithiothreitol (DTT) o β-Mercaptoetanol entre otros compuestos. Sin embargo, algunos métodos de cuantificación no pueden trabajar adecuadamente si el triptófano todavía esta unido a una cadena polipetídica. d) Hidrólisis enzimática Y por último están los métodos de extracción con enzimas como la pronasa (Spies, 1967), pepsina, tripsina (Opienska-Blauth et al., 1963) y papaína (Hernández & Bates, 1969; Oste et al., 1976). Las enzimas se encargan de romper los enlaces peptídicos que hay entre aminoácidos siendo algunas de ellas muy específicas. Estás enzimas requieren de una molécula de agua para realizar su función por eso a las proteasas también se les puede catalogar como hidrolasas. Los tiempos de hidrólisis son muy similares a los usados con la digestión básica. Una desventaja de estos métodos es que la hidrólisis puede no ser completa. La hidrólisis de todos los enlaces peptídicos es importante por ejemplo, para la cuantificación por HPLC, ya que la presencia de oligopéptidos causa grandes cambios en los tiempos de retención pero no se requiere una digestión completa para métodos espectrofotométricos. Si se usa hidrólisis enzimática y HPLC en combinación, existe el riesgo de no cuantificar todo el triptófano que en realidad hay en la muestra.

Métodos Características Ventajas Desventajas Hidrólisis El trp debe ser Se puede analizar trp Bajas recuperaciones. ácida protegido de su junto con los demás Usados solo para proteínas degradación por HCl. aminoácidos puras Hidrólisis NaOH y BaOH2 a Buenas Gelificación del almidón si se básica concentraciones 4 a recuperaciones. usa NaOH. Digestión al vacío y 6 N Menor degradación a altas temperaturas. de trp. El Ba (OH)2 puede formar BaSO4 o BaCO3 que co- precipita con trp. Buffers de Contienen Eficiencia en la Algunos compuestos interfieren proteínas principalmente: extracción de con algunos métodos de totales Agentes caotrópicos proteínas. detección. Detergentes Agentes reductores Hidrólisis Proteasas: Pronasa, La papaína es barata Digestión a veces incompleta y enzimática pepsina, tripsina y e inespecífica por lo tanto no compatible con papaína algunos métodos que requieren que el trp se encuentre en forma libre. Tabla 10-1.Características de métodos de extracción/digestión

10.4.3.2. Análisis de Carotenos Las frutas y vegetales de la dieta humana contienen entre 20 y 30 carotenoides que se absorben en el plasma. Los carotenoides y los tocoferoles presentan especial interés para los investigadores médicos debido a sus características antimutagénicas y anticarcinogénicas,como también a su asociación con mayor longevidad y disminución del riesgo de cáncer y enfermedades cardiovasculares observadas en estudios epidemiológicos. Aunque el suplemento con β-carotenos no ha sido asociado con efectos beneficiosos sobre la reducción del riesgo de cáncer o enfermedades cardiovasculares, en estudios recientes se ha señalado que tanto la luteína como la zeaxantina dietarias o plasmáticas elevadas se asociaron con reducción de la progresión de lesiones ateroscleróticas y con menor riesgo de cataratas.

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La deficiencia en vitamina A (VAD) causa síntomas que van desde ceguera, xeroftalmia, insuficiencias en el sistema inmune, hasta mortalidad materna e infantil. Este problema es frecuente en zonas como el Sudeste de Asia y países de África, donde el arroz sin cáscara, que carece de vitamina A, es la fuente principal de la alimentación. La administración oral de la vitamina A en estos países es problemática debido a la falta de infraestructura y capital, por lo que son requeridas soluciones alternativas (Ye, 2000). La vitamina A es producida naturalmente por carotenos con actividad provitamina A y el β- caroteno es la más importante provitamina A para los mamíferos.

Se ha reportado una línea genéticamente modificada de arroz, llamada Arroz Dorado, diseñada para sintetizar y acumular provitamina A (β-caroteno) en el endospermo. A partir de esto que se desarrolla el concepto de ingeniería genética basada en el aumento nutricional del arroz para lograr una reducción en la deficiencia de vitamina A (Hoa, 2003). El desarrollo se basó en la presencia del precursor geranil-geranildifosfato, el cual es capaz de ser sintetizado en el endospermo del arroz salvaje.

Proveyendo mediante ingeniería genética todos los genes necesarios para completar la ruta biosintética de la provitamina A, se obtienen granos de arroz amarillos que contienen altas cantidades de β-caroteno (mas de 1.6 μg/g) (Ye, 2000). Se ha mostrado que el uso de una desaturasa de bacteria (crtI) disminuye el esfuerzo de transformación ya que está es capaz de producir ambas desaturaciones (Kaspar, M. 2005). Además no es necesaria la transformación con el gen Licopeno-ciclasa para la obtención de β- caroteno, esto puede deberse a una expresión constitutiva en el endospermo o una inducción por licopeno de esta enzima (Ye, 2000).

Sin embargo, la línea mas coloreada producida tenía problemas tales como muchos eventos de integración de los genes foráneos, el marcador de selección era un gen antibiótico y la línea transformada era poco consumida en los países con VAD, todos estos problemas hacían que el producto obtenido fuera indeseable para la desregulación como cultivo transgénico (Hao, 2003). A partir de esos antecedentes, se desarrolló un proyecto para obtener una nueva línea de Arroz Dorado que satisficiera todos los requerimientos regulatorios para su liberación como producto (Hoa, 2003). La siguiente hipótesis fue; “La transformación de líneas de arroz, mediante técnicas moleculares que cumplan con los requerimientos regulatorios, con los genes psy y crtI, es suficiente para generar líneas que acumulen provitamina A en el endospermo”. Se transformaron mediante el sistema mediado por Agrobacterium tumefaciens, por el patrón de integración simple que produce, dos cultivares de arroz, Indica y Japonica.

La construcción combina el gen fitoeno-desaturasa (crtI), fusionado con un péptido señal de transporte a plástidos bajo el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor y el gen psy, bajo el promotor específico de endospermo Gt-1. El gen pmi (Foso-Man-Isomerasa) fue usado como gen selector, el cual permite la selección de las líneas transformadas pero no tiene actividad antibiótica.

Las semillas obtenidas en la T1 fueron seleccionadas fenotipicamente por el color visible antes de someterlas a otro tipo de análisis. Las mejores líneas desde el punto de vista fenotípico fueron chequeadas para confirmar la ausencia de integración más allá de los bordes derecho e izquierdo del vector. Este ensayo se llevó a cabo utilizando distintas combinaciones de “primers” y el posterior análisis de amplificación en distintas reacciones de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

La técnica HPLC permite la cuantificación de muchos carotenos simultáneamente. La cantidad de carotenos fue variable entre las distintas líneas. Se obtuvieron valores mas altos con la línea

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Japónica que con los cultivares Indica y la cantidad parece ser independiente del número de integraciones.

10.4.3.3. Análisis de flavonoides. La ingeniería genética de flavonoides se ha utilizado para aumentar o suprimir la concentración de flavonoides en las plantas, o bien para sintetizarlos a través de cultivos de bacterias. La ingeniería metabólica de los flavonoides empezó en 1987(Meyer P, Heidmann I, Forkmann G, Saedler H. 1987.) y ha sido un área de investigación muy fructífera en la década del '90 (Dixon R, Steele C. 1999.)

La ingeniería metabólica consiste en la introducción o supresión de genes específicos en una planta objetivo. Su realización es cara y trabajosa. Por eso se realiza previamente una caracterización minuciosa de los genes, la ruta biosintética, la especificidad de sustrato de las enzimas concernientes y la disponibilidad de sustratos definidos de la planta objetivo.

El conocimiento profundo de la planta objeto de estudio mejora mucho la probabilidad de éxito para el mejoramiento y la ingeniería genética. Por eso se realizan experimentos previos como la aplicación de inhibidores específicos de las enzimas, que puede proveer información adicional. Existen inhibidores específicos para enzimas dioxigenasas dependientes de 2- oxoglutarato, como son: flavanona 3-hidroxilasa (F3H), flavonol sintasa (FLS), antocianidina sintasa (ANS) y flavona sintasa I (FS I); y para enzimas monooxigenasas dependientes de citocromo P450: flavonoide 3’ hidroxilasa (F3’H), flavonoide 3’5’ hidroxilasa (F3’5’H), flavona sintasa II (FSII) e isoflavona sintasa (IFS). Suplementar a las plantas con intermediarios de flavonoides que no se encuentran naturalmente en dichas plantas es una manera de probar si la planta tiene un sistema interno de enzimas necesario para convertir dichos intermediarios en los flavonoides deseados. La aplicación in vivo de inhibidores puede reflejar los resultados de estrategias de antisentido o de supresión.

El desarrollo de estos experimentos previos permite hacer una predicción del resultado final de un experimento de ingeniería metabólica, ahorrando tiempo y dinero. Gracias a estos experimentos previos o aproximaciones podemos hacer también análisis químicos de alteraciones en el patrón de metabolitos, incluyendo la síntesis de nuevos compuestos o, en el caso de cambios de color, incluso inspección ocular.

La innovación en el color de las flores, en particular la generación de variedades azules y amarillas desconocidas, es una de las mayores fuerzas conductoras en el desarrollo del cultivo de plantas ornamentales. En una combinación de métodos clásicos y moleculares. La ingeniería metabólica es una herramienta muy poderosa para generar nuevos colores de flores sin cambiar otras características preexistentes en una determinada variedad o cultivar.

El éxito conseguido en la síntesis de pelargonidina expresando unos genes adecuados de la enzima dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) procedentes de otras plantas, que permite conseguir flores naranjas de Petunia, ha conllevado mucho trabajo, incluyendo la introducción de nuevos genes en determinadas especies de plantas, la complementación de mutantes definidos, y la supresión de la síntesis de flavonoides por antisentido o supresión de sentido (Forkmann, G., S. Martens. 2001).

La formación de delfinidina por la introducción del gen F3’5’H también ha sido alcanzada en cultivos ciánicos de Dendranthema, Dianthus y Rosa, pero las antocianinas basadas en cianidina y/o pelargonidina aún permanecen en estas variedades.

Un nuevo avance concerniente a la manipulación de la síntesis de chalcona ha llevado a la formación de flores amarillo pálido de Petunia. Expresando el gen chalcona quetido-reductasa (CHKR) de alfalfa en una línea aciánica de Petunia se permite la síntesis de 6′-deoxichalcona isoliquiritigenina, a través de la acción conjunta de la enzima introducida con la chalcona sintasa (CHS). Como la isoliquiritigenina no es un sustrato de la chalcona isomerasa (CHI) de Petunia, cierta cantidad de chalcona se acumula en las flores, provocando una coloración

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amarilla pálida. Una concentración mayor de chalcona puede llevar a flores verdaderamente amarillas, lo cual podría ser alcanzado por la glicosilación e hidroxilación de la isoliquiritigenina. La introducción de CHKR podría ser exitosa en todas las especies de plantas con alta actividad CHS.

La coloración invariable amarilla de los pétalos de Forsythia es causada por la acumulación de carotenoides, sin embargo, algunas antocianinas se forman en los sépalos. Se ha estudiado la ruta de estos flavonoides de los sépalos, revelando que la formación de antocianinas en los pétalos es deteriorada en los pasos controlados por las enzimas DFR y ANS, sobre todo en este último paso. Introduciendo el gen DFR de Antirrhinum y el ANS de Matthiola se consigue una variedad transgénica de Forsythia con flores ligeramente marrones, debido a la síntesis de algunas antocianinas en un fondo amarillo producido por los carotenoides.

Introduciendo y expresando el gen difF en las flores de Dianthus que serán también transformadas por el gen F3 ‘5 ‘H de Petunia conseguimos unas flores casi negras, debido a la gran acumulación de derivados de delfinidina.

Transformado la variedad de Dianthus ‘Eliat’ con el antisentido del gen F3H que codifica para la enzima flavanona 3-hidroxilasa, conseguimos flores amarillo crema, debido a la acumulación de naringenina-chalcona 2’-glucósido.

Además de la supresión de la formación de antocianina, la fragancia media de las plantas transgénicas era significativamente mayor que en las flores control debido a los muy elevados niveles de metilbezoato. Así, suprimiendo la biosíntesis de flavonoides con el F3H antisentido se desvía el flujo metabólico a la biosíntesis de derivados del ácido benzoico.

¿Qué conclusiones se pueden sacar sobre los trabajos previos de ingeniería genética en los flavonoides? A pesar del éxito de los trabajos recientes, es muy difícil generar o suprimir compuestos flavonoides específicos de forma altamente controlada por ingeniería metabólica de la ruta de los flavonoides. El aislamiento y clonación de más genes implicados en la ruta biosintética de los flavonoides y de secuencias promotoras, permitirá conseguir grandes avances. No sólo será posible promover una determinada ingeniería metabólica o flavonoides con funciones terapéuticas en plantas de cultivo, si no que también será concebible desarrollar mejoras en las plantas, tales como un aumento de la resistencia generando o manipulando fitoalexinas, o mejorando la protección a los rayos UV y mejorar la eficiencia de nodulación. Además, un mejor conocimiento de los mecanismos implicados en la co-pigmentación y el pH vacuolar, así como la disponibilidad de respectivos genes y la mejora de sistemas de transformación para plantas ornamentales, hará que la modificación del color de las flores sea más factible.

10.4.3.4. Análisis de lípidos

Figura 10-38. Extracción por solventes y saponificación de lípidos.

10.4.3.5. Análisis de proteínas totales Los granos de maíz común son fuente alimenticia para humanos y animales domésticos, y contienen en su mayor parte hidratos de carbono (74%), y en menor proporción, proteínas (9%), aceite comestible (3.4%) y fibra (1%) (Paliwal et al., 2001). Análisis bromatológicos de los maíces comunes que llenan actualmente el mercado mundial de granos indican que los niveles de proteína cruda están en la banda de 7.5 a 8.4 por ciento, con bajo contenido de aminoácidos esenciales, especialmente de lisina y triptófano; el porcentaje de grasa está en el intervalo de 3.0 a 3.5; excepción hecha en los maíces altamente especializados, sea para calidad proteica o para alto contenido de aceite, cuyos valores son significativamente más altos que los anteriores (Dale,1997).

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Comparado con otros cereales, el grano de maíz es una fuente importante de energía, pero menor como fuente de proteína, tanto en proporción como en calidad, dada las carencias en aminoácidos esenciales; el porcentaje de lisina en grano es menor a 0.29, y el triptófano no rebasa el 0.07 (Dale, 1997; Araba, 1998, citado en Feed and Grain, 1998).

Desde la mejora genética del maíz, se han desarrollado variedades especializadas tanto para calidad proteica (ricos en lisina y triptófano) como para alto contenido de aceite (de 6 a 9% de grasa cruda), las cuales están en proceso de adopción por los agricultores y usuarios; en México, los maíces de alta calidad proteica (conocidos como QPM, por su denominación en lengua inglesa: quality protein maize) se han venido promoviendo durante los últimos seis años con éxito limitado todavía; los maíces de alto contenido en aceite (conocidos como HOC: high oil corn) no ingresan al mercado nacional de semillas por su origen transgénico, así como las variantes en el manejo especializado para su producción.

10.4.3.6. Espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIR) La espectroscopía en el infrarrojo cercano (Near Infrared Spectroscopy NIRS) es un complemento de las técnicas analíticas tradicionales. El NIRS se fundamenta en un principio según el cuál, al irradiar con un haz de luz monocromática los materiales orgánicos, estos (en función de la naturaleza de los enlaces y cargas electrostáticas existentes entre sus átomos y moléculas), absorben una determinada cantidad de energía. La absorción de energía en el rango NIR se debe a las vibraciones de los diferentes tipos de enlances C-O, C-H y C-N. El espectro NIR es un poco más complejo, ya que contiene bandas de absorpción sobrelapadas que corresponden a vibraciones simples y multiples de los diferentes enlaces. La absorpción puede expresarse en términos de la reflectancia (log reflectancia estándar/ reflectancia de la muestra) a partir de lo cual se logra un espectro característico de cada material que refleja su composición química. La cuantificación por medio de NIRS se fundamenta en la quimiométrica, es decir, la aplicación de las matemáticas a la química analítica. Esta técnica combina la espectroscopía, la estadística, y la computación, generando modelos matemáticos que relacionan la composición química (presencia de grupos químicos activos) con cambios de energía en la región correspondiente al rango infrarrojo cercano (longitudes de onda entre 800 y 2500nm). Las ventajas de está técnica es: proveer información acerca de un metabolito en segundos, ser un método no destructivo, que requiere un mínimo o ningún tratamiento de la muestra, minimiza el daño ambiental y es una técnica multianalítica de alta precisión que permite predecir varios factores simultáneamente. Una vez calibrado el espectrofotómetro, el uso del NIRS redunda en bajos costos de análisis para los usuarios que los requieran, por lo que, a nivel internacional, es una metodología que tiene amplia acogida.

La aplicación de las ecuaciones de calibración para el NIRS es un procedimiento sencillo, pudiéndose combinar estas calibraciones dentro de un mismo programa, de manera que con un único barrido de cada muestra, se pueden realizar simultáneamente todos los análisis citados. Facilitándose el análisis de materia seca, ceniza, lípidos, proteína, fibra, humedad, etc.

El método de selección de ecuaciones de calibración desarrollado en el Handbook of agriculture No. 643 (ARS, agricultural research service, USDA, Washington, DC) para el análisis de forrajes por NIR establece que para cada componente, el error estándar de calibración (SEC) y el

306 coeficiente de determinación (RSQ) de cada ecuación de calibración, representan criterios importantes para tomar una decisión respecto de la selección de la ecuación.

En la calibración, un grupo de espectros y un grupo de datos químicos se usan para derivar el coeficiente de correlación, mientras que en la validación y la subsecuente predicción, un grupo de espectros y la derivada del coeficiente de correlación se utilizan para predecir un dato químico desconocido.

En la siguiente sección se describe en inglés el principio de espectroscopia de infrarrojo cercano:

Near infrared spectroscopy (NIRS) is based on molecular overtone and combination vibrations. Such transitions are forbidden by the selection rules of quantum mechanics. As a result, the molar absorptivity in the near IR region is typically quite small. One advantage is that NIR can typically penetrate much farther into a sample than mid infrared radiation. Near infrared spectroscopy is therefore not a particularly sensitive technique, but it can be very useful in probing bulk material with little or no sample preparation. The molecular overtone and combination bands seen in the near IR are typically very broad, leading to complex spectra; it can be difficult to assign specific features to specific chemical components. Multivariate (multiple wavelength) calibration techniques (e.g., principal components analysis or partial least squares) are often employed to extract the desired chemical information. Careful development of a set of calibration samples and application of multivariate calibration techniques is essential for near infrared analytical methods.

Figura 10-39. Ejemplo de un espectro en el rango NIR

Tarea 10-17 ¿En qué principios está basada la metodología NIR? Haga una búsqueda en la biblioteca y averigüe los detalles.

307

11. Fisiología vegetal 11.1. Introducción La fisiología vegetal es fundamental para el mejoramiento de un cultivo como el maíz. Se requieren conocimientos profundos sobre los distintos procesos que ocurren dentro de las células vegetales para poder plantear estrategias adecuadas de selección fenotípica y genética. Por ejemplo, para incrementar la tolerancia a sequía de un cultivo, primero hay que entender cuales son las partes de la planta que están involucradas. ¿Qué procesos metabólicos están afectados? Sólo así se pueden identificar las limitantes y seleccionar de manera apropiada los genotipos que se comportan mejor bajo ese tipo de estrés. A qué órgano hay que darle más atención: ¿a la raíz, a las hojas o al tallo? ¿Qué es más importante bajo sequía? ¿El metabolismo en los órganos fotosintéticos, o los procesos de biosintéticos en los órganos reproductores? ¿Qué hormonas podrían estar involucradas? ¿Qué genes se pueden mejorar? ¿Cuáles son los alelos superiores?

Antes de convertirse en un fitomejorador, primero hay que dominar todos los temas de la fisiología vegetal. Estos incluyen tópicos tan amplios como: fotosíntesis, transporte vascular, xilema, floema, hormonas, etc. Sin estas bases mínimas, no se puede llegar muy lejos. Es decir, sin ciertos fundamentos sólidos no se puede construir algo perdurable. Es como si una persona tratara de diseñar un coche de carreras sin antes conocer los principios básicos de la mecánica. Si no sabe nada del fenómeno de combustión, ¿cómo sabrá si es mejor inyectarle más o menos oxigeno a los cilindros? Si no sabe de aerodinámica, ¿cómo podría diseñar el prototipo más veloz? Los estudiantes que quieran convertirse en buenos fitomejoradores tienen que aprender ciertos principios científicos, para así evitar trabajar sólo a base de prueba y error. Como un chimpancé con una maquina de escribir tratando de componer un poema de Shakespeare. Si lo intenta suficientes veces durante millones de años, tarde o temprano logrará escribir algún soneto. Lo escribirá pero no sabrá como lo logró, ni lo podrá repetir la próxima vez. El que quiera ser más creativo y eficiente que un mono, le conviene primero aprender el vocabulario y dominar algo de gramática.

En este capítulo se dará una recapitulación de los fundamentos y los principales temas de la fisiología vegetal, con un enfoque tanto de ciencia básica, como de tecnología aplicada.

11.2. Asimilación de carbono 11.2.1. La fotosíntesis

11.2.1.1. La evolución de la foto-autotrofía En el comienzo de la vida, la tierra estuvo dominada por diferentes tipos de bacterias. Algunas eran heterotróficas mientras que otras tenían un metabolismo autotrófico. Las bacterias fotoautotróficas podían utilizar la energía de la luz para producir su propio alimento. Las cianobacterias aparecieron hace 2.7 millones de años, como una combinación genómica de dos grupos de bacterias: las que tenían un fotosistema del tipo uno (bacterias verdes), con las que tenían un fotosistema tipo dos (bacterias púrpuras). Las bacterias que solo tenían un tipo de fotosistema sólo podían usar H2S como donador de electrones para la fijación y reducción de dióxido de carbono. Las cianobacterias fueron las primeras que lograron acoplar los dos tipos de

308 fotosistemas de manera seriada para un mismo proceso de fotofosforilación. Esta innovación biológica permitió por primera vez usar agua (H2O) como donador de electrones para la fotosíntesis. Esto tuvo como consecuencia que en lugar de liberarse S2 a la atmósfera como antes sucedía, las cianobacterias empezaron a liberar otro gas, el O2. En un millón de años aproximadamente, las cianobacterias incrementaron el nivel de oxígeno de la atmósfera hasta un 5%, casi la cuarta parte del nivel actual (21% O2).

La razón por la que el incremento de oxígeno tardo tantos años es que en la tierra primitiva había mucho hierro en su forma reducida Fe2+ que reaccionaba con el oxígeno, oxidándose así a Fe3+. Sólo hasta que se terminaron de oxidar miles de millones de toneladas de hierro fue cuando el oxigeno atmosférico incremento más. Hoy en día, todavía podemos admirar el legado de las primeras cianobacterias fotosintéticas en forma de diversos colores. El pigmento que utilizan las cianobacterias, la clorofila, refleja la parte media del espectro, por lo que es de color verde. El oxígeno que se libera de la fotosíntesis a partir de agua, causa una difracción especial de la luz solar en la atmósfera. Es la razón por la que nuestro cielo es de color azul. Por si fuera poco, el color rojizo de algunas suelos se debe al óxido ferroso que se produjo por el oxígeno, también por culpa de las cianobacterias. Podemos decir entonces que algunos de los colores más característicos de nuestro planeta se deben precisamente a la fotosíntesis, que inventaron por primera vez las cianobacterias hace millones de años. Podemos decir también que uno de los inventos biológicos con más repercusión evolutiva, el acoplamiento de los fotosistemas I y II, se logró a través de la combinación de cientos genes de organismos diferentes, lo que hoy en día se llama ingeniería genética. La diferencia es que en ese entonces la transferencia genética horizontal de dio por el azar (“la mano de Dios”), mientras que hoy en día la transferencia de genes en los laboratorios esta supervisada por científicos mas o menos creativos, que por lo regular prefieren tardarse menos de cien años, no millones como la evolución natural.

El éxito de las cianobacterias pudo deberse no sólo a la ventaja que supuso el aprovechamiento de la energía solar (la fotosíntesis), sino también a la abundancia del substrato H2O en comparación de H2S (que solo se presenta en zonas volcánicas o dentro de fumarolas marinas con emisión de azufre). Otra ventaja competitiva pudo ser la inhibición de otros organismos competidores por el oxígeno liberado (como agente tóxico generador de radicales oxidantes). La emergencia de los primeros eucariontes data de 1.8 millones de años, y se debió a la incorporación de otra bacteria heterotrófica a una célula eucariótica con un sistema de membranas internas (núcleo y retículo endoplasmático). Así fue como las células eucarióticas adquirieron sus primeros organelos por endosimbiosis. Las células eucarióticas con mitocondrias pudieron multiplicarse mucho mas rápido, ya que podían aprovechar el oxigeno para oxidar alimentos (Ciclo de Krebs y fosforilación oxidativa), y de esta forma obtenían mucho más ATP que las otras células fermentadoras. Muchos millones de años después, algunas de estas células eucarióticas heterotróficas, incorporaron por endosimbiosis a las cianobacterias fotosintéticas formándose así células eucarióticas con cloroplastos, dando lugar a las algas verdes. A partir de entonces, la fotosíntesis de las algas verdes disminuyó los niveles de dióxido de carbono e incrementó el nivel de oxígeno hasta llegar al actual. Por último, los descendientes de las algas verdes, las plantas terrestres, aparecieron hace 500 millones de años creando así la tierra que hoy habitamos, con sus diversos paisajes y ecosistemas. Si antes la vida dependía más de la fotosíntesis marina, hoy en día la mayor parte de la biomasa y de nuestros alimentos la obtenemos de la fotosíntesis de plantas terrestres.

11.2.1.2. El esquema global La vida sobre la Tierra depende de la luz solar. La energía lumínica es capturada por los organismos fotosintéticos quienes la usan para formar ATP, NADPH, carbohidratos y oxígeno libre a partir del dióxido de carbono y del agua, en una serie compleja de reacciones. En la fotosíntesis, la energía lumínica se convierte en energía química y el carbono se fija en compuestos orgánicos. La ecuación generalizada para este proceso es:

CO2 + 2H2A + energía lumínica ----> (CH2O) + H2O + A2

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en la cual H2A significa agua o alguna otra sustancia como H2S cuyos electrones puedan ser desprendidos fácilmente. Esta fórmula deja claro que el oxígeno (A2) que se libera a partir de la fotosíntesis viene de las dos moléculas de agua (H2A) y no del dióxido de carbono. El oxígeno de la molécula de dióxido de carbono (CO2) se queda una parte en los carbohidratos (CH2O) y otra parte se libera en forma de agua (H2O).

La energía lumínica es capturada por el mundo vivo por medio de pigmentos especiales unidos a complejos de proteínas llamados fotosistemas. La fotosíntesis en las plantas ocurre dentro de organelos celulares, cloroplastos, que están rodeados por dos membranas. Dentro de las membranas del cloroplasto está contenida una solución de compuestos orgánicos e iones, conocida como estroma, y un sistema complejo de membranas internas fusionadas que forman sacos llamados tilacoides. Los tilacoides se apilan formando la grana. Se llaman así porque se ven como pequeños manchones verdes (gránulos) cuando uno mira los cloroplastos con un microscopio. Los pigmentos y los complejos fotosintéticos responsables de la captura de la luz están situados en las membranas tilacoides.

Hace unos 200 años se demostró que se requiere luz para la fotosíntesis de las plantas con generación de oxígeno. La evidencia de que este proceso puede ser influenciado por distintos factores llevó a distinguir una etapa 100% dependiente de la luz -las reacciones lumínicas- y una etapa más bien dependiente de la temperatura. Es decir, se llego a reconocer que existía una etapa fotoquímica dependiente de luz y una etapa enzimática no dependiente de la luz. A esta segunda etapa se le llama reacciones "oscuras". Ahora se sabe que la etapa que requiere luz es la que se lleva a cabo en los tilacoides (liberación de oxigeno), mientras que la fase oscura se lleva a cabo en el estroma (fijación de dióxido de carbono).

Figura 11-1. Esquema global de la fotosíntesis

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11.2.1.3. La clorofila y otros pigmentos Para que la energía lumínica pueda ser usada por los sistemas vivos, primero debe ser absorbida. Aquí entran en juego los pigmentos. Un pigmento es cualquier sustancia que absorbe luz en el rango visible. Algunos pigmentos absorben luz de todas las longitudes de onda y, por lo tanto, parecen negros. Otros solamente absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo o reflejando las longitudes de onda que no absorben.

La naturaleza de la luz La luz blanca se separa en sus colores componentes cuando pasa a través de un prisma. A este fenómeno lo llamo Newton, el "célebre fenómeno de los colores". La luz visible es sólo una pequeña porción del vasto espectro electromagnético. De acuerdo con el llamado modelo corpuscular de la luz, un haz de luz está compuesto por pequeños paquetes de energía, denominados actualmente cuantos de luz o fotones.

La energía de un fotón no es la misma para todos los tipos de luz, sino que, en realidad, es inversamente proporcional a la longitud de onda: cuanto mayor sea la longitud de onda, menor será la energía. Los fotones de luz violeta (420nm), por ejemplo, tienen casi el doble de energía que los fotones de luz roja (700nm). Para el ojo humano, el espectro visible va desde la luz violeta -cuyos rayos de longitudes de onda más cortos son de 380 nanómetros- a la luz roja, cuyos rayos visibles de mayor longitud son de 730 nanómetros (nm).

Figura 11-2. La luz blanca es una mezcla de colores diferentes, que van desde el violeta, en un extremo del espectro, hasta el rojo, en el otro.

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Los pigmentos que intervienen en la fotosíntesis de los eucariotes incluyen las clorofilas y los carotenoides. Diferentes grupos de plantas y algas usan distintos pigmentos en la fotosíntesis. Hay varios tipos diferentes de clorofila que varían ligeramente en su estructura molecular.

Figura 11-3. Estructura de la clorofila a, b, d, c1 y c2. De wikipedia

La clorofila a es el pigmento involucrado directamente en la transformación de la energía lumínica en energía química. La mayoría de las células fotosintéticas también contienen un segundo tipo de clorofila (clorofila b y c). Con respecto a los carotenoides, uno de los que se encuentran en las hojas es el beta-caroteno y otro es la luteína. Los carotenoides son pigmentos rojos, anaranjados o amarillos. En las hojas verdes su color está enmascarado por las clorofilas, que son más abundantes. En algunos tejidos, sin embargo, predominan los colores reflejados por los carotenoides, como el licopeno en los tomates maduros. Lo mismo ocurre en las células foliares cuando degradan su clorofila en el otoño. La luz absorbida por los pigmentos lanza los electrones a niveles energéticos más altos. Dada la forma en que los pigmentos están compactados en las membranas, son capaces de transferir su energía a moléculas reactivas de clorofila a, empaquetadas en una forma particular.

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Figura 11-4. La curva superior muestra el espectro de acción de la fotosíntesis, y las curvas inferiores, los espectros de absorción para distintos pigmentos: la clorofila a, la clorofila b y los carotenoides que se encuentran dentro del cloroplasto.

11.2.1.4. Los órganos fotosintéticos Los tejidos internos de las hojas están completamente encerrados por células epidérmicas transparentes, cubiertas con una capa cerosa, la cutícula. Esta capa la hace impermable a los gases y los líquidos. El oxígeno, el dióxido de carbono y el vapor de agua salen o entran a la hoja principalmente a través de aberturas especiales: los estomas. Los gases y el vapor de agua llenan los espacios existentes entre las células de la capa esponjosa, entrando y saliendo de las células por difusión. El agua, absorbida por las raíces, entra en la hoja por medio de los vasos del xilema del haz conductor, en tanto que los azúcares, producto de la fotosíntesis, dejan la hoja a través de un tejido conductor conocido como floema, viajando a otras partes de la planta, entre ellas, los órganos no fotosintetizantes. La mayor parte de la fotosíntesis se realiza en las células del parénquima en empalizada, células alargadas que se encuentran directamente por debajo de la epidermis superior y que constituyen el mesófilo. Tienen una vacuola central grande y numerosos cloroplastos que se mueven dentro de la célula, orientándose con respecto a la luz. La luz es capturada en las membranas de los tilacoides, dentro de los cloroplastos.

11.2.1.5. Las membranas fotosintéticas La unidad estructural de la fotosíntesis en las células vegetales es el cloroplasto. Dentro del cloroplasto se encuentran las membranas tilacoides, una serie de membranas internas que contienen los pigmentos fotosintéticos. Cada tilacoide tiene habitualmente la forma de un saco aplanado o vesícula.

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Figura 11-5. Ampliaciones de una hoja verde, y estructura membranal de un cloroplasto.

11.2.1.6. Las etapas de la fotosíntesis La evidencia de que la fotosíntesis puede ser influenciada por distintos factores llevó a distinguir una etapa dependiente de la luz, la etapa llamada de reacciones "lumínicas", y una etapa enzimática, independiente de la luz, las reacciones "oscuras". Los términos reacciones "lumínicas" y "oscuras" han creado mucha confusión pues, aunque las reacciones "oscuras" no requieren de la luz como tal, sino solamente de los productos químicos de las reacciones "lumínicas", pueden ocurrir tanto en la luz como en la oscuridad. Mas aún, trabajos recientes han mostrado que varias enzimas que controlan reacciones "oscuras" claves son reguladas indirectamente por la luz. Como resultado, estos términos han caído en desuso y están siendo

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reemplazados por vocablos que describen más precisamente los procesos que ocurren durante cada etapa de la fotosíntesis: las reacciones que capturan energía y las reacciones de fijación del carbono.

En la primera etapa de la fotosíntesis, la luz es absorbida por las moléculas de clorofila a, que están compactadas de un modo especial en las membranas tilacoides. Los electrones de las moléculas de clorofila a son lanzados a niveles energéticos superiores, y, en una serie de reacciones, su energía adicional es usada para formar ATP a partir de ADP y para reducir una molécula transportadora de electrones conocida como NADP+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate). .

El NADP+ es muy semejante al NAD+ y también se reduce por la adición de dos electrones y de un protón, formando NADPH. Tanto el ADP, ATP como NAD+ y NADP+ son moléculas de azúcares fosforilados unidos a una base nitrogenada (nucleótidos). Sin embargo, los papeles biológicos de estas moléculas son notablemente distintos. El NADH generalmente transfiere sus electrones a otros transportadores de electrones, que continúan transfiriéndolos en pasos discretos a niveles de energía sucesivamente más bajos. El NADPH principalmente su usa para procesos de biosíntesis, mientras que el NADH se utiliza en la glicólisis y la respiración. En el curso de esta transferencia de electrones se forman moléculas de ATP. En contraste, el ATP y ADP proporcionan energía directamente a los procesos biosintéticos de la célula que requieren grandes ingresos de energía.

Figura 11-6. Esquema de la molécula de NADP+.

En esta primera etapa de la fotosíntesis, también se escinden moléculas de agua, suministrando electrones que reemplazan a los que han sido lanzados desde las moléculas de clorofila a. La escisión de las moléculas de agua es la causa de que se forme oxígeno libre, que difunde hacia el exterior. En la segunda etapa de la fotosíntesis, el ATP y el NADPH formados en la primera etapa se utilizan para reducir el carbono del dióxido de carbono a un azúcar simple. Así, la energía química almacenada temporalmente en las moléculas de ATP y de NADPH se transfiere a moléculas adecuadas para el transporte y el almacenamiento de energía en las células de las algas o en el cuerpo de las plantas. La resultante de este proceso es pues la formación de un esqueleto de carbono, a partir del cual pueden construirse luego otras moléculas orgánicas. La incorporación inicial de CO2 en compuestos orgánicos se conoce como fijación del carbono. Los pasos por los cuales se lleva a cabo, llamados las reacciones de fijación del carbono, ocurren en el estroma del cloroplasto.

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11.2.1.7. Reacciones que capturan energía

En el siglo pasado se postuló un modelo para explicar cómo ocurren las reacciones que capturan energía. Según este modelo, la energía lumínica incide sobre pigmentos antena del Fotosistema II; luego, los electrones pasan cuesta abajo al Fotosistema I, a lo largo de una cadena de transportadores de electrones. Este pasaje genera un gradiente de protones que impulsa la síntesis de ATP a partir de ADP, proceso llamado fotofosforilación. Más adelante se explican estos procesos en detalle.

Al igual que la fosforilación oxidativa en las mitocondrias, la fotofosforilación en los cloroplastos es un proceso quimiosmótico. En las reacciones de fijación del carbono los productos de la primera etapa de la fotosíntesis se usan en la síntesis de moléculas orgánicas. Estas reacciones, que ocurren en el estroma, forman parte del ciclo reductivo de las pentosas fosfato (Ciclo de Calvin). Las moléculas orgánicas obtenidas en el Ciclo de Calvin -azúcares de tres, cuatro, cinco y seis carbonos- son usadas por las células vegetales para elaborar sacarosa, almidón, aminoácidos y ácidos grasos. Estas moléculas son utilizadas in situ para los propios fines de la planta o para exportar a otros tejidos a través del floema.

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Figura 11-7. Esquema resumen del acoplamiento de los dos fotosistemas para romper molécula de agua, liberar oxigeno, generar energía química (ATP) y poder reductor (NADPH).

La energía lumínica incide sobre pigmentos antena del Fotosistema II, que contiene algunos cientos de moléculas de clorofila, a y b. Los electrones son lanzados cuesta arriba desde la molécula reactiva P680 de la clorofila a un aceptor de electrones primario. Cuando se eliminan los electrones, ellos son reemplazados por electrones de las moléculas de agua, con la producción simultánea de O2 libre y protones (iones H+). Luego, los electrones pasan cuesta abajo al Fotosistema I a lo largo de una cadena de transportadores de electrones; este pasaje genera un gradiente de protones que impulsa la síntesis de ATP a partir de ADP, proceso denominado fotofosforilación. La energía lumínica absorbida en los pigmentos antena del Fotosistema I y transferida a la clorofila P700 da como resultado que se lancen electrones hacia otro aceptor primario de electrones. Los electrones eliminados del P700 son reemplazados por electrones del Fotosistema II y son finalmente aceptados por el transportador de electrones NADP+. La energía proveniente de esta secuencia de reacciones está contenida en las moléculas de NADPH y en el ATP formado por fotofosforilación. Entre éstas se distinguen los pigmentos, los transportadores de electrones, los Fotosistemas I y II y enzimas necesarias, incluyendo las ATP sintetasas. La disposición de estas moléculas en la membrana tilacoidal hace posible la síntesis quimiosmótica del ATP durante la fotofosforilación.

Los electrones pasan desde el aceptor de electrones primario, a lo largo de una cadena de transporte de electrones, a un nivel de energía inferior, el centro de reacción del Fotosistema I. A medida que pasan a lo largo de esta cadena de transporte de electrones, parte de su energía se empaqueta en forma de ATP. La energía lumínica absorbida por el Fotosistema I lanza los electrones a otro aceptor primario de electrones. Desde este aceptor son transferidos mediante otros transportadores de electrones al NADP+ para formar NADPH. Los electrones eliminados del Fotosistema I son reemplazados por los del Fotosistema II. El ATP y el NADPH representan la ganancia neta de las reacciones que capturan energía. Para generar una molécula de NADPH, deben ser lanzados dos electrones desde el Fotosistema II y dos del Fotosistema I. Se escinden dos moléculas de agua para formar protones y gas oxígeno, poniendo en disponibilidad los dos electrones de reemplazo necesarios para el Fotosistema II. Se regenera una molécula de agua en la formación de ATP.

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Figura 11-8. Complejos proteicos presentes en la membrana tilacoidal.

La fotofosforilación también ocurre como resultado del flujo cíclico de electrones, proceso en el que no participa el Fotosistema II. En el flujo cíclico de electrones, los electrones lanzados desde el P700 en el Fotosistema I no pasan al NADP+, sino que son desviados a la cadena de transporte de electrones que une al Fotosistema II con el Fotosistema I. A medida que fluyen a lo largo de esta cadena, nuevamente al P700, se transportan cargas a través de la membrana. Esto genera un potencial electroquímico en los tilacoides, que finalmente genera ATP. En un proceso quimiosmótico, como la fotofosforilación que ocurre en los cloroplastos, a medida que los electrones fluyen en la cadena de transporte de electrones desde el Fotosistema II al Fotosistema I, los protones son bombeados desde el estroma al espacio tilacoide, creando un gradiente electroquímico. A medida que los protones fluyen a favor de este gradiente desde el espacio tilacoide nuevamente al estroma, pasando a través de los complejos de ATP sintetasa, se forma ATP. Al igual que la fosforilación oxidativa en las mitocondrias, la fotofosforilación en los cloroplastos es un proceso de acoplamiento quimiosmótico.

Figura 11-9. Los dos fotosistemas generan un gradiente de protones para la síntesis de ATP. En el interior del tilacoide hay un pH bajo, mientras que en el exterior predomina un pH 8.

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En este proceso, los electrones de la molécula reactiva de clorofila a del Fotosistema II son impulsados a niveles energéticos superiores por la luz solar. A medida que descienden por una cadena de transportadores de electrones hacia la molécula reactiva de clorofila a del Fotosistema I, la energía que liberan es empleada para bombear protones (H+). Los protones se bombean desde el estroma al espacio tilacoidal. Esto crea un gradiente electroquímico. Cuando los protones se mueven a favor del gradiente a través del complejo de la ATP sintetasa, desde el espacio tilacoidal al estroma del cloroplasto, el ADP se fosforila a ATP.

11.2.1.8. Reacciones de fijación de carbono Las reacciones que fijan carbono son también conocidas como reacciones "oscuras" o reacciones "independientes de la luz". En organismos autótrofos acuáticos el dióxido de carbono (CO2) penetra en los sin necesidad de estructuras especiales. Sin embargo, las plantas terrestres deben protegerse de la desecación y han desarrollado aberturas especiales denominadas estomas que regulan la entrada y salida del gas por las hojas. La fase oscura de la fotosíntesis también se denomina ruta reductiva de las pentosas fosfato (RPP) o mejor conocido como ciclo de Calvin (en honor a su descubridor Melvin Calvin). Las reacciones tienen lugar en el estroma dentro de los cloroplastos.

A fines de la segunda guerra mundial, en los laboratorios de Berkeley (California), Calvin y sus colaboradores, usando Carbono-14 y las entonces nuevas técnicas de intercambio iónico, cromatografía en papel y radiografía "mapearon" completamente el ciclo del carbono en la fotosíntesis. Por estos trabajos resultó laureado con el premio Nobel en 1961, y el ciclo del carbono se conoce comúnmente como ciclo de Calvin, o de Calvin-Benson.

En las reacciones de fijación del carbono que ocurren en el estroma, el NADPH y el ATP, producidos en las reacciones de captura de energía, se usan para reducir un compuesto de tres carbonos, el gliceraldehído-3-fosfato (GAP). A esta vía en la que el carbono se fija para formar 3- fosfoglicerato (3PGA) mediante ribulosa-1,5- bifosfato y CO2., se le denomina vía de tres carbonos o C3. Esta reacción es catalizada por medio de la enzima Ribulosa 1-5-bifosfato carboxilasa oxidasa, RUBISCO. Rubisco presenta 8 subinidades grandes y 8 subunidades pequeñas ensambladas en 4 dímeros ( figura 10-8). Los genes que codifican para las unidades pequeñas son nucleares, mientras que los genes de las subunidades grandes son plastídicos. La subunidad pequeña se ensambla en los ribosomas del citosol y se dirige al cloroplasto por medio de un péptido señal. La enzima es ensamblada por completo en este organelo.

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Figura 11-10. Estructura secundaria y terciaria de la holoenzima Rubisco. En rojo se muestran las moléculas de ribulosa-1-5-bisfosfato unidas a los sitios activos de la enzima.

Además de la reacción de carboxilación, rubisco también reacciona con O2, dando lugar al proceso de fotorrespiración. Como el CO2 y el O2 son sustratos que compiten por la enzima, la carboxilación de la ribulosa -1, 5- bifosfato depende de la relación CO2/O2 del medio.

Durante la carboxilación, rubisco ingresa tres moléculas de dióxido de carbono por cada ciclo. (figura 10-9).

Se combinan seis moléculas de ribulosa bifosfato (RuBP), un compuesto de cinco carbonos, con seis moléculas de dióxido de carbono, produciendo seis moléculas de un intermediario inestable que pronto se escinde en doce moléculas de fosfoglicerato, un compuesto de tres carbonos. Estos últimos se reducen a doce moléculas de gliceraldehído fosfato. Diez de estas moléculas de tres carbonos se combinan y se regeneran para formar seis moléculas de cinco carbonos de RuBP. Las dos moléculas "extra" de gliceraldehído fosfato representan la ganancia neta del ciclo de Calvin. Estas moléculas son el punto de partida de numerosas reacciones que pueden implicar, por ejemplo, la síntesis de glúcidos, aminoácidos y ácidos grasos.

La energía que impulsa al ciclo de Calvin son el ATP y el NADPH producidos por las reacciones de captura de energía en la primera etapa de la fotosíntesis.

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El gliceraldehído-3-fosfato también puede ser utilizado como material de partida para otros compuestos orgánicos necesarios para la célula. Otras plantas que viven en ambientes secos y cálidos tienen mecanismos que les permiten fijar inicialmente el CO2 por una de dos vías, y así logran minimizar la pérdida de agua. Estas vías se conocen como la vía de cuatro carbonos, o C4 y el camino de las plantas CAM, y preceden al Ciclo de Calvin.

Figura 11-11. Ciclo de Calvin. Las enzimas están representadas por números: 1 Rubisco; 2 3- phosphoglycerate kinase; 3 glyceraldehyde-3-phosphate kinase;4 triose phosphate isomerase; Aldolase; 6 fructose-1,6-biphosphate phosphatase;7transketolase; 8Aldolase; 9 Sedoheptulose- 1,7-biphosphate phosphatase; 10 transketolase; 11Ribulose-5-phosphate epimerase;12 ribose-5- phosphate isomerase;13Ribulose-5-phosphate kinase (modificada de Taíz y Zeiger 1998).

11.2.1.9. Fotorrespiración

Como ya se mencionó, la fotorrespiración es el proceso por el cual Rubisco fija O2 en lugar de fijar CO2. Las tasas relativas de carboxilación/oxigenación están determinadas por la concentración de ambos gases y por la preferencia de Rubisco hacia cada uno de ellos (Foyer et al., 2009). Dado que la reacción de carboxilación de Rubisco evolucionó en condiciones de alta concentración de CO2, las consecuencias de la oxigenación eran mínimas (Holland, 2006), pero en las condiciones atmosféricas actuales la reacción de oxigenación se lleva a cabo mucho más rápido en las plantas C3, por lo que la fotorrespiración es considerada uno de los procesos biológicos más ineficientes, por lo que ,desde hace décadas se han realizado varios esfuerzos por erradicarlo (Foyer 2009). Aunque, por otro lado, se ha demostrado que este proceso es

321 necesario en algunas plantas C3. Por ejemplo, se ha propuesto que procesos tan importantes como la fijación de nitrógeno pueden depender de la fotorrespiración (Rachmilevitch et al., 2004)

El oxígeno, un inhibidor de la fotosíntesis, puede estar presente en alta concentración en las hojas de las plantas. La elevada concentración de oxígeno en los cloroplastos puede inducir fotorrespiración. En la fotorrespiración, el oxígeno sustituye al CO2 como sustrato de la RUBISCO, provocando la liberación de CO2 y la oxidación de la RuBP como se muestra en la siguiente ecuación: H

- H-C-O-PO3

H C=O

- C H-C-O-PO3 -O O C=O 3-fosfoglicerato Rubisco O=O + H-C-OH Oxígeno H-C-OH O O- C - H-C-O-PO3 - H-C-O-PO3 H

Ribulosa-1,5-bifosfato H 2-fosfoglicolato

La elevada concentración de oxígeno en el lugar de reacción de la RUBISCO es la causa de la fotorrespiración. Las plantas C4 evitan la fotorrespiración mediante una extensión del ciclo de Calvin-Benson que consigue concentrar el CO2, y no el oxígeno, en las células de la vaina del haz, donde tiene lugar la reacción catalizada por la RUBISCO. Las plantas C4 pueden mantener alta la concentración loca del CO2 para la actividad de la RUBISCO sin incremento simultáneo de la concentración de oxígeno.

Calvin Chloroplast Cycle

RuBP

CO2 PGA O2

P -Glycolate

Peroxisome

Glycerate Glycolate

NAD ½O2 NADH H2O2 H2O+O2

OH Piruvate Glyxolate Glu 2OG Gln

2OG Glu Glu Ser Glycine

Gly Gly Ser

CO2

THF C NH3 THF

NAD Citoplasm

Mitochondrion NAD H

Figura 11-12. Esquema metabólico de la fotorrespiración.

322

An abbreviated scheme of the photorespiratory pathway. Phosphoglycolate produced by ribulose bisphosphate (RuBP) oxygenase activity is converted to glycolate by phosphoglycolate phosphatase in the chloroplast. Glycolate enters peroxisomes and is converted to glyoxylate by glycolate oxidase. Glyoxylate is transaminated to Gly by either Ser:glyoxylate aminotransferase or Glu:glyoxylate aminotransferase. In mitochondria, Gly is converted to CO2, ammonia and the methylene group of methylene tetrahydrofolate (C1-THF). Gly and C1-THF condense to produce Ser. Peroxisomal Ser is deaminated to hydroxypyruvate, which is reduced to glycerate by hydroxypyruvate reductase. Glycerate enters the chloroplast and is phosphorylated to 3- phosphoglycerate, an intermediate of the Calvin cycle. Ammonia released during Gly decarboxylation is used by Gln synthetase to produce Gln. Glu synthase condenses 2- oxoglutarate (2-OG) and Gln to produce two molecules of Glu. A dicarboxylate transporter in the chloroplast envelope transfers oxoglutarate, Glu, and Gln across the chloroplast envelope. Overall, two molecules of phosphoglycolate are converted to one molecule of phosphoglycerate and one molecule of CO2 (Modificada de Somerville C R., 2001). Tarea 11-1 Traduzca el anterior recuadro en inglés, al castellano, y dibuje su propio esquema de fotorrespiración considerando los diferentes compartimentos subcelulares.

11.2.2. Plantas C3, C4 y CAM

11.2.2.1. Plantas C3

Se denominan así a las plantas en las que el primer producto de la fijación de CO2 es una molécula de 3 carbonos, el 3 fosfoglicerato. La ruta metabólica C3 se encuentra en los organismos fotosintéticos como las cianobacterias, algas verdes y en la mayoría de las plantas vasculares. Estas últimas, son plantas que crecen en zonas templadas (15-25°C) y se saturan de luz con 200-300 J m-2 s-1. Como la intensidad de la luz solar en el verano es de 800 a 1000 J m-2 s-1, la mayoría de esa luz no la pueden aprovechar esas plantas.

11.2.2.2. Plantas C4

Existe otro grupo denominadas plantas C4. En estas el primer producto de la fijación de CO2 es un compuesto de 4 carbonos como el malato y el aspartato. En estas plantas la captura del dióxido de carbono se da mediante la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC). Este proceso ocurre en el mesófilo, mientras que la asimilación de carbono, ya en azúcares se realiza en el haz de vaina, tras la descarboxilación de la molécula de 4 carbonos, se continúa con el ciclo que presentan las plantas C3.Por lo anterior las plantas C4 presentan otro tipo de anatomía foliar, denominada anatomía tipo Kranz (figura10-11).

a) Anatomía típica de planta C3 B) Anatomía típica de planta C4

Figura 10-11. a) típica anatomía de una planta C3; b) anatomía tipo Kranz, típica de plantas C4. (http://www.etsmre.upv.es/varios/biologia/Temas/tema_11.htm)

323

Una característica de la anatomía Kranz es la presencia de cloroplastos de distinto tipo. Los cloroplastos del mesófilo solo tienen fotosistema I, no acumulan almidón ni tampoco tienen proteína Rubisco. Mientras que los cloroplastos del haz vascular si tienen los dos fotosistemas, si tienen actividad de Rubisco y si acumulan almidón. El hecho de que la proteina Rubisco solo se concentre en ciertas células permite a las plantas C4 tener una mayor eficiencia de uso de agua, y también de nitrógeno. La proteína Rubisco representa casi el 30% del nitrógeno que requiere la planta para crecer, por lo que cualquier ahorro en Rubisco, permite ahorrar nitrógeno como fertilizante.

Las especies C4, que incluyen, la caña de azúcar, el sorgo, el maíz y otros pastos, crecen en climas tropicales, pues presentan temperaturas óptimas de crecimiento entre 30 y 47°C; no exhiben prácticamente ningún síntoma de saturación de luz. Aún con intensidades de 880 J m-2 s-1 por lo cual pueden hacer mejor uso de las intensidades de luz altas y crecen bien en condiciones de escasez de agua.

11.2.2.3. Plantas CAM Otras especies realizan la fotosíntesis denominada CAM (Crassulacean Acid Metabolism). En estas plantas los procesos C3 y C4 se llevan a cabo en la misma célula, pero están separados temporalmente. Durante la noche se fija el CO2 atmosférico como malato (C4) mediante la PEPC en el citosol. El malato se guarda en la vacuola. Durante el día, el malato sale de la vacuola y se descarboxila. El CO2 liberado se asimila mediante el ciclo C3 (Dodd et al., 2002). Las plantas que realizan este proceso crecen en climas cálidos, pues su temperatura óptima de crecimiento es 35°C o mayor. Entre estas se encuentra la piña, el agave y el nopal.

Figura 11-13. Planta CAM del género Opuntia

11.2.3. Descripción de las distintas rutas fotosintéticas

11.2.3.1. Fotosíntesis C3 Comentario [EVO10]: Esta Todas las plantas C3 fijan el carbono a través de un ciclo fotosintético de varios átomos de información ya está carbono que involucra sobre todo un primer intermediario con tres átomos de carbono: el mencionada. La figura de fosfoglicerato. Se denominan plantas C3 las que solamente disponen de ese ciclo básico. La abajo se podría colocar a un enzima responsable es la Rubisco. Es la proteína más abundante de la biosfera. lado de cualquiera de los 2 esquemas del ciclo de calvin desarrollado, eliminando . alguna de las figuras (hay 3 figuras de ciclo de calvin, 2 desarrollados y uno resumido)

324

Figura 11-14. Ciclo de Calvin simplificado.

325

Figura 11-15. Ruta reductiva de las pentosas fosfato.

11.2.3.2. Fotosíntesis C4 La respuesta se relaciona con la presión selectiva que ejercen ciertos ambientes en cuanto a la relación CO2 fijado vs. H2O transpirada o Eficiencia en el Uso del Agua (WUE de water use efficiency). Puede demostrarse que incluso bajo condiciones ambientales favorables, una planta C3 pierde aproximadamente 100 moléculas de H2O por molécula de CO2 que entra por los estomas. En zonas con aporte constante de agua este hecho no representa un problema pero en regiones áridas y semiáridas sí llega a serlo. Comentario [EVO11]: Este parrafo no esta relacionado con el título

326

Figura 11-16. La escasez de agua es un problema cada vez mas serio en el mundo.

Figura 11-17. Fotosíntesis tipo C4. El CO2 es fijado en dos compartimientos diferentes: en el mesófilo el CO2 es fijado como HCO3- por la anhidrasa carbónica para ser tomado a continuación por la PEPCasa que incorpora el carbono en un ácido C4. Este ácido C4 es

327 transportado hacia el haz de vaina por la acción de acarreadores específicos ATP dependientes, en donde es descarboxilado para liberar CO2 que es fijado por RUBISCO e incorporado en el ciclo de Calvin-Benson.

Por otro lado, dado que la actividad estomática responde finamente al balance entre CO2 ganado/H2O perdida, aquellas condiciones que lleven a un balance desfavorable como alta temperatura e irradiancia, alto déficit de presión de vapor entre mesófilo y atmósfera, aporte limitado de agua por el suelo o conductividad eléctrica muy alta en la solución de agua del suelo, tenderán al incremento en la restricción difusiva del agua con el cierre estomático parcial o total. Dicho cierre estomático también impacta negativamente en la difusión de CO2, lo cual se traduce en aumento en la actividad fotorrespiratoria de la planta, cosa que no ocurre en las plantas C4 o CAM.

En aquellos ambientes con restricciones hídricas constantes, estacionales o diarias como son las zonas áridas, semiáridas y ambientes epifíticos las plantas C4 y CAM funcionan como especialistas de gran éxito con mayor WUE en comparación con las plantas C3. Las modificaciones bioquímicas con lo cual se consigue esto se relacionan con el aumento en la cantidad y eficiencia de acción de la anhidrasa carbónica (AC), enzima que tiene importancia marginal en las plantas C3, y con la acción de un sistema de bombeo del CO2 conseguido a través de la acción de la fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPCasa) y ATPasas de membrana.

Para las plantas C4 el resultado de las modificaciones evolutivas es que el CO2 es fijado en dos compartimientos diferentes: en el mesófilo el CO2 es fijado como HCO3- por la AC para ser tomado a continuación por la PEPCasa que incorpora el carbono en un ácido C4. Este ácido C4 es transportado hacia la vaina del haz vascular por la acción de acarreadores específicos ATP dependientes en donde es descarboxilado para liberar CO2 que es fijado por RUBISCO e incorporado en el ciclo de Calvin-Benson. Con la acción de este mecanismo de concentración y bombeo de CO2 hacia los sitios de fijación por RUBISCO la planta es capaz mantener tasas altas de asimilación de CO2 en presencia de baja concentración intercelular de dicho gas. A pesar de estas adaptaciones las plantas C4 no son más tolerantes al estrés hídrico severo que las C3; esto significa que el mecanismo C4 es una adaptación encaminada al uso eficiente del agua, no a la tolerancia al estrés hídrico.

Algunas plantas que viven en climas secos y calurosos mantienen una baja concentración de oxígeno en sus hojas pues mantienen los estomas cerrados para evitar la pérdida de agua. Para alcanzar concentraciones de CO2 adecuadas para la fotosíntesis, las plantas C4 han adaptado la fotorrespiración con una modificación del ciclo de Calvin-Benson. Las plantas C4 tienen una anatomía especial, con prominentes células de vaina de haz alrededor de los vasos de las hojas. La fotorrespiración es mínima en plantas C4 comparada con plantas C3, y el CO2 es concentrado activamente en las células de la vaina del haz.

11.2.3.3. Fotosíntesis CAM

En las plantas CAM, sin embargo, el resultado de las modificaciones evolutivas es que el CO2 es fijado en dos etapas separadas temporalmente, y no físicamente como ocurre en las C4. Durante la noche la apertura de los estomas permite la difusión de CO2 que es fijado como HCO3- por la AC y es tomado por la PEPc que lo incorpora en ácidos C4 que se acumulan en las vacuolas vía una bomba de membrana ATP dependiente. Durante el día, los estomas cierran y los ácidos C4 son llevados al citoplasma, a través de un mecanismo aparentemente pasivo, en donde son descarboxilados. El CO2 liberado, que alcanza concentraciones internas muy altas, es fijado en los cloroplastos por RUBISCO para incorporarlo al ciclo de Calvin-Benson. La respuesta se relaciona con la presión selectiva que ejercen ciertos ambientes en cuanto a la relación CO2 fijado vs. H2O transpirada o Eficiencia en el Uso del Agua (WUE). Puede demostrarse que incluso bajo condiciones ambientales favorables, una planta C3 pierde aproximadamente 100

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moléculas de H2O por molécula de CO2 que entra por los estomas. En zonas con aporte constante de agua este hecho no representa un problema pero en regiones áridas y semiáridas sí llega a serlo.

Figura 11-18. Metabolismo tipo CAM. Con las flechas azules se indican las reacciones nocturnas del ciclo C4 y con rojas, las reacciones que ocurren durante el día. Algunas enzimas están indicadas con números: 1 anhidrasa carbónica; 2 Fosfoelnolpiruvato carboxilasa; 3 malato deshidrogenasa; 4 enzima málica.

Tarea 11-2 ¿Cuál de los siguientes enunciados sobre la fotosíntesis en plantas C4 NO es cierto? A. El primer producto de la fijación del dióxido de carbono es un compuesto con 4 átomos de carbono. B. La fotosíntesis C4 es una adaptación para las plantas que viven en climas cálidos y áridos. C. El dióxido de carbono es fijado inicialmente en células mesófilas, pero el ciclo de Calvin es activo en las células de la vaina del haz en las hojas de las plantas C4. D. El ATP total que usan las plantas C4 para la biosíntesis de azúcares es mayor que el usado en las plantas C3. E. La fotorrespiración es mínima en plantas C4 comparada con plantas C3.

11.2.3.4. Consideraciones ecofisiológicas Mientras que las plantas C3 transpiran 500-700 g de agua por cada gramo de materia seca, las plantas C4 pierden solamente 250-400 g de agua. Entre las plantas que alcanzan altas eficiencias fotosintéticas están el maíz, sorgo y caña de azúcar.

329

Las diferencias metabólicas y de gasto energético entre plantas C3, C4 y CAM son debidas a una respuesta ambiental. Cada uno de estos tipos se desarrolla en climas diferentes, y cada uno representa una adaptación a ese clima. Esto hace que el mayor gasto energético para la fijación de CO2 que existe en plantas CAM y c4 tenga sentido. Las plantas C3 para fijar una molécula de O2 gastan 3 moléculas de ATP y dos moléculas de NADPH, mientras que las plantas C4 y CAM gastan para lo mismo 5 o 6.5 moléculas de ATP respectivamente, y 2 de poder reductor. La conversión diurna de málico para formar almidón requiere ATP y justifica la diferencia en consumo energético.

CAM y C4 son tipos de plantas adaptadas a vivir en ambientes cálidos y áridos las primeras y cálidos pero más húmedos las segundas. En estos ambientes la apertura de estomas para dejar circular el aire y así poder fijar el CO2 les supondría perdidas de agua, de ahí que las C4 y CAM utilicen mecanismos de acumulación de CO2 que les permitan evitar esas perdida de agua.. Pero no sólo presenta esa ventaja la acumulación de CO2 en la planta para después ser utilizado en el ciclo de Calvin. La Rubisco a altas temperaturas (a partir de los 30º C más o menos) pierde afinidad por el CO2 con lo que el mayor gasto energético que se utiliza para acumularlo dentro de la planta queda compensado, ya que en el caso de una planta c3 tuviese humedad suficiente para realizar la fijación sin desecarse pasaría mucho tiempo en fase oxigenativa, lo cual representa un gasto energético extra (gasta ATP y poder reductor) y además no estaría fijando CO2 con lo que el rendimiento sería inferior {Foyer, 1994 #530}.

Por tanto el mayor gasto energético de plantas C4 y CAM queda compensado en los ambientes en los que viven, ya que en esos ambientes un metabolismo tipo C3 sería menos rentable y en algunos casos inviable debido a la desecación.

Si por el contrario atendemos a la producción de biomasa entre estos 3 tipos de plantas nos encontramos con una serie de diferencias. Biomasa bruta producirían menos las plantas C3, ya que estas alternan fase oxigenativa con fase carboxilativa. Por el contrario C4 y CAM prácticamente no presentan fotorespiración debido a que acumulan CO2 con lo que estas planta producen más biomasa ya que aprovechan todo el CO2 en formación de fotosintatos {Pietrini, 1999 #430}.

Pero si atendemos a biomasa neta en relación con la energía que se invierte, entonces son las plantas C3 las que más producen y esto es debido a que gastan menos energía (pese a alternar fase oxigenativa con fase carboxilativa) que las plantas CAM y C4, las cuales hacen un mayor gasto de ATP y poder reductor para acumular CO2. |

11.2.3.5. Resumen de diferencias entre los diferentes tipos de fotosíntesis

• Diferencias en el gasto energético. Las plantas C3 para fijar una molécula de O2 gastan 3 moléculas de ATP y dos moléculas de NADPH, mientras que las plantas C4 y CAM gastan para lo mismo 5 o 6.5 moléculas de ATP respectivamente, y 2 de poder reductor. La conversión diurna de malato para formar almidón requiere ATP.

• Uso eficiente del agua. Mientras que las plantas C3 transpiran entre 450 y 950 g gramos de agua por cada gramo de materia ceca que producen las plantas C4 y CAM pierden entre 250 -350 y 18-125, respectivamente. (referencias)

330

• Uso eficiente del nitrógeno. Las plantas C4 requieren de menos Rubisco para alcanzar la misma tasa fotosintética. Esto se traduce en un menor consumo de nitrógeno como fertilizante. (referencias)

• Producción de biomasa. Tomando en cuanta la biomasa bruta, las plantas C3 producen menos que C4 y CAM, pero si de eficiencia neta se trata, la plantas C3 producen más biomasa con menos energía, pues gastan menos ATP que las C4 y las CAM.

Para entender por qué existen otros procesos de fijación y asimilación de CO2 con diferencias energéticas y metabólicas, es importante tomar en cuenta que: • El CO2 es menos soluble conforme aumenta la temperatura (Taiz y Zeiger, Plant Physiology on line, http://4e.plantphys.net), por lo que el costo de la fotorrespiaració aumenta, al disminuir la concentración de CO2 • Tanto Plantas C4 como CAM evitan en gran medida la fotorrespiración, por medio de mecanismos de concentración de CO2. En las plantas C4 la fijación y asimilación de CO2 están separados espacialmente, permitiendo concentrar el CO2 en el sitio de catálisis de Rubisco y evitando el ciclo de oxigenación (Leegood 2002). En las plantas CAM los procesos se encuentran separados temporalmente; los estomas se abren generalmente por la noche cuando la temperatura ha descendido, lo que además de hacer el CO2 mas soluble, evita la perdida de agua y la fotorrespiración (Dodd et al., 2002), • Por lo anterior, los gastos energéticos y metabólicos extraordinarios que parecen presentar los mecanismos C4 y CAM, se ven compensados y llegan a ser menores conforme aumenta la temperatura

Tabla 11-1. Diferencias entre plantas C3, C4 y CAM Especies típicas de C3 Trigo, cebada, C4 CAM Importancia papa, frijol, arroz, Maíz, sorgo, caña de Piña, nopal económica tomate azúcar, mijo perla % de la flora mundial 89% <1% 10% en numero de especies Hábitat típico Distribución amplia Sitios cálidos y Sitios xéricos y praderas epifíticos Primer producto PGA Malato Malato estable de la fijación Aspartato de CO2 Anatomía Vaina del haz Vaina del haz Suculencia celular o vascular no presente vascular con de los tejidos o sin cloroplastos cloroplastos (Kranz) Fotorrespiración Hasta 40% de la No detectable No detectable fotosíntesis Punto de 40-100 µl/L 0-10 µl/L 0-10 µl/L compensación para la asimilación de CO2 [CO2] intracelular en 200 100 10000 luz de día (µl/L)

Frecuencia 40 - 300 100 - 160 1 - 8 estomática (estomas mm-2)

EUA (g CO2 fijado 1 - 3 2 - 5 10 - 40

331 por kg H2O transpirada) Tasa máxima de 5-20 40-50 0.2 crecimiento (g m-2 d-1) Productividad 10-30 40-80 Generalmente menor máxima. (ton ha-1 a 10* año-1 ) * Sin embargo, bajo condiciones de riego las plantas CAM se encuentran entre las más productivas conocidas.

11.2.3.6. Discriminación isotópica Las plantas C3 y C4 se llaman así por la molécula que primero se detectaron Calvin y sus colaboradores en experimentos con radioisótopos de carbono 14. Como se mencionó anteriormente, en las plantas C3 el primer compuesto orgánico fabricado en la fotosíntesis tiene tres átomos de carbono y en el tipo C4 tiene 4. La biomasa que se produce por medio de estos tipos de fotosíntesis C3 o C4 se puede distinguir por su composición isotópica de sus átomos de carbono.

Si midiéramos el carbono atmosférico, casi el 99 % del CO2 será del tipo que contiene el 12 carbono ligero C. Una pequeña parte, el 1,1 % del CO2, es algo más pesado, ya que contiene 13C. Y finalmente existe también en la atmósfera, en muy pequeña proporción, un tipo 14 de CO2 que contiene C, que es radiactivo e inestable, y cuyas aplicaciones han solidó ser fundamentalmente paleocronológicas.

Las plantas C3 y C4 tienen valores δ13C muy diferentes. Esto se debe a que la enzima Rubisco discrimina el dióxido de carbono de una manera más fuerte que la enzima PEPCase. El 85 % de las plantas superiores son del tipo C3 (casi todas las arbóreas) y tienen unos valores de δ13C muy bajos, entre –22 % y –30 %. El otro 15 % de las plantas son del tipo C4. En su mayoría son hierbas tropicales y tienen unos valores de δ 13C más altos, entre –10 % y –14 %.

Por lo tanto, el valor d13C del carbono de los paleosuelos depende en gran parte del tipo de planta que ha crecido en ellos. Es menor cuando han dominado las plantas C3 y mayor cuando han proliferado las del tipo C4. Por eso, el estudio de las variaciones de δ13C en los paleosuelos continentales nos puede dar indicaciones del tipo de plantas, C3 o C4, que han predominado en determinados períodos.

Indirectamente, el valor δ 13C de los paleosuelos puede también indicarnos la evolución de la concentración de CO2 atmosférico. Ocurre que con concentraciones elevadas de CO2, las plantas de tipo C3 se ven favorecidas con respecto a las plantas de tipo C4, ya que las plantas de tipo C3 requieren menos energía para realizar la fotosíntesis. Por el contrario, cuando la concentración de CO2 es baja, aumentan las del tipo C4, ya que poseen un mecanismo de concentración de CO2 que las favorece. Por lo tanto, cuanto menor sea δ 13C en el paleosuelo analizado, más probabilidad hay que la concentración de CO2 haya sido alta. Y viceversa.

La concentración de carbono 13 de las plantas también puede indicarnos la existencia de los períodos de sequía. Durante las sequías algunas plantas tienden a cerrar sus estomas para perder menos agua. Entonces, al haber disponible menos CO2 entrante, las plantas discriminan menos al carbono 13 y su concentración en los azúcares aumenta. Al parecer, antes del Mioceno (hace 15 millones de años), las plantas C4 eran casi inexistentes. De ahí que se piense que la disminución de CO2 en el Mioceno, causada quizás por una mayor meteorización ligada a la emersión del Tibet, pueda haber originado el desarrollo de las plantas C4, y que el avance de las

332 hierbas tropicales, que suelen ser de tipo C4, favoreció la evolución de los grandes mamíferos de la sabana {Foyer, 1998 #445}.

11.3. Tejidos vegetales 11.3.1. Monocotiledóneas y dicotiledóneas Los nombres dicotiledóneas y monocotiledóneas se refieren al hecho de que el embrión de una dicotiledónea tiene dos cotiledones (hojas seminales) y el embrión de una monocotiledónea tiene uno. Otras diferencias características se hacen visibles en el cuerpo de la planta. Los haces vasculares principales de las hojas de las dicotiledóneas habitualmente se disponen en red; los haces vasculares de las hojas de las monocotiledóneas habitualmente son paralelos. En los tallos de las dicotiledóneas, los haces de tejido vascular se disponen alrededor de un núcleo central de tejido fundamental; en los tallos de las monocotiledóneas, los haces vasculares están dispersos en el tejido fundamental. Existen también diferencias características en el número de piezas florales y en el número de hendiduras de los granos de polen entre ambas clases de angiospermas. Los gases -oxígeno y dióxido de carbono- entran y salen de las hojas por difusión a través de estomas.

Figura 11-19. Las dos clases de angiospermas son las dicotiledóneas y las monocotiledóneas.

Las células del embrión de una angiosperma se diferencian tempranamente en su desarrollo en tres tejidos distintos: la protodermis, el procambio y el meristema fundamental. Estos tejidos embrionarios, conocidos como meristemas primarios, producen los tres sistemas de tejidos que son continuos en todo el cuerpo de la planta. La protodermis, el primer tejido que se diferencia, es el origen del sistema de tejido dérmico, que proporciona una cubierta externa protectora para todo el cuerpo de la planta. El procambio, el tejido que se diferencia luego, origina el sistema de tejido vascular, compuesto por xilema y floema. El xilema transporta agua y minerales disueltos, mientras que el floema transporta azúcares disueltos y otros compuestos orgánicos desde las células fotosintéticas (autótrofas) de las hojas y de los tallos verdes a las células no fotosintéticas (heterótrofas) de la planta. Los tejidos vasculares están rodeados por el sistema de tejido

333 fundamental, derivado del meristema embrionario fundamental. Las principales diferencias en la estructura de las hojas, tallos y raíces residen en la distribución relativa de los sistemas de tejido vascular y fundamental. Las células que se encuentran más frecuentemente en el cuerpo de la planta son del tipo conocido como parénquima. Estas células, que aparecen en los tres sistemas de tejidos y predominan en los tejidos fundamentales, son típicamente poliédricas y tienen paredes delgadas y flexibles. Además de un núcleo, mitocondrias y otras organelas, las células parenquimáticas generalmente contienen plástidos que, según la ubicación de la célula, pueden ser cloroplastos, leucoplastos o cromoplastos. Además de la fotosíntesis, las células parenquimáticas desempeñan una variedad de funciones esenciales en la planta, que incluyen la respiración y el almacenamiento de alimento y agua. Cada uno de los sistemas de tejidos contiene también tipos celulares adicionales, especializados en funciones particulares de cada órgano. 11.3.2. Semillas Los embriones de muchas angiospermas pasan por un período de latencia antes de que germine la semilla. Con la germinación se reinicia el crecimiento, se rompe la cubierta de la semilla y surge el esporofito joven. Las primeras hojas de follaje se abren hacia el sol y comienzan a hacer fotosíntesis, mientras que, internamente, continúa el proceso de crecimiento que da origen al cuerpo de la planta. En los primeros estadios del desarrollo, el crecimiento del joven esporofito depende de las reservas acumuladas en la semilla.

Figura 11-20. Desarrollo de una plántula dicotiledónea (frijol).

334

Figura 11-21. Desarrollo de una plántula monocotiledónea (maíz).

Antes de la germinación, la semilla absorbe agua y se hincha, rompiendo la cubierta seminal. Primero emerge la raíz joven, seguida del hipocótilo ("debajo de los cotiledones"). Los cotiledones finalmente se marchitarán y caerán. Luego emerge el epicótilo que se encuentra entre cotiledón y haz de hojas. La primera estructura que aparece por encima del suelo es el coleóptilo, que forma una vaina cilíndrica sobre el vástago en crecimiento de la planta. Típicamente, el resto de endosperma, con el escudete (el cotiledón único) en su interior, está presente en la joven plántula. El crecimiento primario de la planta implica la diferenciación de los tres sistemas de tejido, el alargamiento de las raíces y tallos, y la formación de las raíces laterales y de las ramas. Después de completarse el desarrollo del embrión, el crecimiento primario posterior se origina en los meristemos apicales de la raíz y del vástago. Las plantas, a diferencia de los animales, continúan creciendo durante todo su ciclo de vida.

11.3.3. Hojas Las hojas son las principales áreas fotosintéticas de una planta. Las células fotosintéticas de las hojas son células parenquimáticas que forman dos tipos de tejidos: parénquima en empalizada, constituido por células alargadas y densamente empaquetadas ubicadas justo por debajo de la superficie superior de la hoja, y parénquima esponjoso, que consiste en células de contorno irregular situadas en el interior de la hoja y con grandes espacios intercelulares. Estos espacios están llenos de gases, que incluyen vapor de agua, oxígeno y dióxido de carbono. La mayor parte de la fotosíntesis ocurre en las células en empalizada, que están especializadas en la captación de la luz. El parénquima en empalizada y el parénquima esponjoso constituyen el tejido fundamental de la hoja, conocido como mesófilo. El mesófilo está envuelto casi herméticamente por las células

335 epidérmicas, que secretan una sustancia cérea llamada cutina, formando una cubierta denominada cutícula, sobre la superficie externa de la epidermis. Las células epidérmicas y la cutícula son transparentes, lo que permite que la luz las atraviese y penetre en las células fotosintéticas. Las sustancias entran y salen de las hojas a través de dos estructuras completamente diferentes: los haces vasculares y los estomas. El agua y los minerales disueltos son transportados a las hojas, y los productos de la fotosíntesis son transportados fuera de ellas, por medio de los haces vasculares. Los haces vasculares atraviesan los pecíolos y se continúan con los tejidos vasculares del tallo y la raíz.

Figura 11-22. Estructura celular de una hoja.

Ejemplos de hojas: Las hojas presentan una variedad de formas y tamaños, que van desde frondes grandes a escamas diminutas. Estas diferencias en la morfología y tamaño guardan una estrecha relación con los ambientes en los cuales vive la planta.

Figura 11-23. Hojas modificadas. a) Espinas de un nopal. b) Hojas suculentas adaptadas al almacenamiento de agua (Sedum). c) Zarcillo de una planta de guisante. En la planta de guisante, que tiene hojas compuestas, sólo los folíolos individuales se modifican como zarcillos; otros folíolos de hojas compuestas son aplanados, lo que proporciona una superficie amplia para la fotosíntesis.

336

11.3.4. Raíces Las raíces son estructuras especializadas que fijan la planta al suelo e incorporan agua y minerales esenciales. La raíz embrionaria, o radícula, es la primera estructura que rompe la cubierta seminal y se elonga rápidamente. La estructura interna de la raíz de las angiospermas es comparativamente simple. En las dicotiledóneas y en la mayoría de las monocotiledóneas los tres sistemas de tejidos (dérmico, fundamental y vascular) están dispuestos en tres capas concéntricas: la epidermis, la corteza y el cilindro central.

Figura 11-24. Raíz de un ranúnculo, una dicotiledónea, en corte transversal. Los plástidos en las células parenquimáticas de la corteza contienen granos de almidón, teñidos en púrpura en esta preparación.

Las raíces jóvenes tienen una capa externa de epidermis y, a lo sumo, una cutícula muy delgada. Prolongaciones de las células epidérmicas forman los pelos radicales, que incrementan en sumo grado la superficie absorbente de la raíz. Debajo de la epidermis está el tejido fundamental de la raíz, la corteza, compuesta principalmente por células parenquimáticas, frecuentemente especializadas en el almacenamiento. La capa más interna de la corteza es la

337 endodermis, una sola capa de células especializadas cuyas paredes contiguas, en las que se ha depositado suberina, conforman la banda de Caspary.

Figura 11-25. Diagrama de un corte transversal de una raíz que muestra las dos vías de absorción de agua y sustancias disueltas.

La mayor parte de los solutos y parte del agua que entra en la raíz siguen la vía A, que se indica en color rojo; los solutos penetran a las células de la epidermis de la raíz por transporte activo o por difusión facilitada; en tanto que el agua se mueve por diferencia de gradiente de potencial hídrico. Luego de atravesar las membranas celulares, ya en el simplasma de la raíz, el agua y los solutos se desplazan de una a otra célula a través de los plasmodesmos. El simplasma es la continuidad del protoplasma a través de los plasmodesmos. Otra parte del agua y algunos de los solutos que entran a la raíz siguen la vía B, indicada en color azul, moviéndose a través de las paredes celulares y a lo largo de sus superficies (por el apoplasto). Nótese, sin embargo, la ubicación de la banda de Caspary y de qué manera bloquea la vía B en torno a todo el cilindro vascular de la raíz.

338

Para atravesar la banda de Caspary, tanto el agua como los solutos tienen que ser transportados a través de las membranas celulares de las células endodérmicas o de otras células situadas más externamente, a través de la vía A. Después que el agua y los solutos han cruzado la endodermis, la mayoría de los solutos continúan a lo largo de la vía A hasta las células conductoras del xilema, y la mayor parte del agua retorna a la vía B para cubrir la distancia que resta hasta las células del xilema. En las zonas más jóvenes de la raíz, donde aún no se ha formado la banda de Caspary, el agua y los nutrientes esenciales pueden alcanzar el xilema a través de la vía B. Inmediatamente por dentro de la endodermis hay otra capa de células, el periciclo, del cual surgen las ramificaciones de la raíz. Por dentro del periciclo están el xilema y el floema. Las Figuras 9.17 y 9.18 muestran las diferencias de las estructuras celulares entre una raíz de una planta monocotiledónea y dicotiledónea.

Figura 9.17 Detalle del cilindro vascular de la raíz del ranúnculo (una dicotiledónea).

339

Figura 9.18 Corte transversal de la raíz de una planta de maíz (una monocotiledónea), que muestra el cilindro vascular que rodea la médula. La endodermis, que está por fuera del periciclo, se considera parte de la corteza. La endodermis contiene las bandas de Caspary

11.3.5. Tallos Los tallos portan las hojas y flores de la planta. Son la vía por la cual las sustancias se transportan desde las raíces hacia las hojas, y viceversa. Los tallos verdes, al igual que las hojas, tienen una capa externa de células epidérmicas cubiertas con una cutícula. La masa del tallo joven es tejido fundamental, que puede dividirse en un cilindro externo (la corteza) y un núcleo interno (la médula). El tejido fundamental está compuesto principalmente por células parenquimáticas, pero también puede contener células colenquimáticas y esclerenquimáticas (fibras y esclereidas). Las figuras 9.19 y 9.20 muestran algunos ejemplos de cortes tallos de diferentes especies.

Figura 11-26. Algunos tipos de células del tejido fundamental de los tallos. a) Células colenquimáticas vistas en corte longitudinal. b) Corte transversal y c) corte longitudinal de fibras del floema del tallo de un tilo (Tilia americana ). Sólo una porción de la longitud de las

340 fibras puede verse en c). d) Las esclereidas, otro tipo de células esclerenquimáticas, tienen paredes lignificadas muy gruesas. Diferencias de cortes transversales de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas:

341

Figura 9.22 Cortes transversales de dos tallos de dicotiledónea y de un tallo de monocotiledónea. a) En la alfalfa, una dicotiledónea, el cilindro vascular está formado por haces vasculares separados. b) En este tallo joven del tilo, también una dicotiledónea, el tejido vascular forma un cilindro continuo. Este tallo contiene conductos de mucílago, que se tiñen de rojo. c) En el maíz, una monocotiledónea, numerosos haces vasculares están dispersos en el tejido fundamental.

11.3.6. Tejido Vascular

11.3.6.1. Floema El floema es un tejido especializado en transportar azúcares a larga distancia. Está formado por dos tipos celulares relacionados ontogenéticamente: elementos cribosos (ECs) y células acompañantes (CAs). Los ECs son células altamente modificadas que durante la maduración pierden el núcleo y las mitocondrias. Poseen abundantes perforaciones en las paredes celulares de la zona donde se unen a otros ECs para formar conductos conocidos como tubos cribosos por donde viajan los azúcares. Las CAs se caracterizan por tener un protoplasma denso, núcleo y numerosas mitocondrias, se encuentran conectadas a los ECs por una red de plasmodesmos, de tal forma que la funcionalidad metabólica de los ECs depende de los procesos que ocurren en las Cas. Figura 9.20 Los ECs de la mayoría de las plantas contienen proteínas específicas conocidas como proteínas- P, las cuales pueden formar filamentos, túbulos y agregados cristalinos. Las proteínas-P de la familia Cucurbitaceae son las que mejor se han caracterizado, pues se les puede purificar fácilmente a partir del exudado del floema. En Cucurbita máxima se han encontrado dos polipéptidos: PP1 de 96 KDa que forma filamentos y la PP2 de 48 KDa que funciona como lectina. Las proteinas PP1 y PP2 son responsables de formar un sello cuando los ECs sufren heridas.

342

Figura 9.20 En las angiospermas, las células de conducción del floema son los miembros de tubo criboso, células vivas con paredes terminales perforadas, que forman tubos cribosos continuos. Asociada íntimamente con cada miembro de tubo criboso hay una célula acompañante.

11.3.6.2. Simplasto y apoplasto Un aspecto de gran importancia en la distribución de fotosintatos, es la forma en que tanto las células del mesófilo de las hojas como las del tejido demanda están comunicadas con el floema, pues ello define la ruta que seguirá el movimiento de los fotosintatos. Al movimiento de los azúcares por medio de plasmodesmos se denomina vía simplástica y el gradiente de concentración determina la magnitud y la dirección del flujo de fotosintatos Figura 9.22 .Existe otra vía denominada apoplástica, la cual se caracteriza porque los azúcares que viajan por el floema se liberan al espacio intercelular de las células que forman los órganos de demanda. En este caso, la cantidad de azúcares que dichas células asimilen dependerá de la actividad de transportadores ubicados en la membrana plasmática. La sacarosa que se descarga en el apoplasto puede ser incorporada por las células del tejido demanda mediante un transportador específico y/o puede ser hidrolizada por la invertasa de pared celular. Las membranas plasmáticas de las células de los órganos de demanda también expresan transportadores de hexosas que permiten la entrada de la glucosa y fructosa, producidas por la invertasa.

Algunos de los transportadores de azúcares han sido caracterizados en sistemas heterólogos. Se ha determinado que funcionan como simporter (H+/sacarosa ó H+/hexosas) y su actividad permite el movimiento de azúcares en contra del gradiente de concentración. Se ha sugerido que la predominancia de las rutas de descarga de fotosintatos simplastica y apoplastica está relacionada con la forma en que se usan los fotosintatos. En tejidos que acumulan almidón la descarga es por vía simplastica, pues el almidón además de ser osmóticamente menos activo que la sacarosa, se compartamentaliza en los amiloplastos, lo cual ayuda a que se mantenga el gradiente de concentración, que favorece la asimilación de fotosintatos. Por otro lado, en tejidos con descarga apoplástica generalmente se acumulan azúcares libres, algunos de los cuales se almacenan en la vacuola, si bien esto favorece la formación de un gradiente de concentración que facilita a la asimilación de azúcares la participación de los transportadores ubicados en la membrana celular es fundamental. Figura 9.22

343

elemento criboso luz CO2

mesófilo célula acompañante H2O

cloroplasto C a Sac b Sac Sac triosa-P sacarosa d H+ H+ sacarosa H+ Sac vacuola

tejido fuente Sac H+ g Glucosa + fructosa sacarosa Invertasa

plastidio H+ e H+ H+ f Sac Sac vacuola Sac H+

tejido demanda

Figura 9.21. Ruta de fotosintatos de tejido fuente hacia tejido demanda . a. La planta realiza fotosíntesis en el cloroplasto. b. Mediante en ciclo de Calvin se forman triosas fosfato que son exportadas el citosol y se forma sacarosa, donde puede ser almacenada en la vacuola o ser exportada hacia tejidos demanda. c. Mecanismo de vía simplasto, la sacarosa viaja a través de conductos llamados plasmodemata hasta el floema. d. Mecanismo vía apoplásto, la sacarosa es liberada al apoplasto y transportadores de sacarosa H+/sacarosa cargan la sacarosa hacia el floema. e y f. Descarga del floema via simplasto y apoplasto respectivamente.g. La sacarosa puede ser hidrolizada por una invertasa de pared cuyos productos; glucosa y fructosa y son incorporados por transportadores de hexosas H+/hexosa. Tomado de Lalonde et al., 1999.

11.3.6.3. Xilema El xilema se encarga de trasladar la savia bruta desde la raíz hacia la parte proximal de la planta. La savia bruta se compone en su mayor parte de agua e iones inorgánicos, aunque algunos compuestos orgánicos pueden estar presentes. La energía para este transporte no la proporcionan los mismos elementos traquearios, que en el tejido desarrollado están de hecho muertos, sino por dos fenómenos físicos: La ósmosis, que desplaza hacia arriba el agua acumulada en la raíz gracias a la diferencia en potencial soluble del tejido radical y la humedad del suelo; al absorber agua, la raíz impulsa hacia arriba parte de la misma. Este fenómeno, sin embargo, no basta para llevarla hasta las hojas, y su intensidad varía enormemente entre especies; en Vitis riparia alcanza los 145 kPa, mientras que en Celastrus orbiculatus es virtualmente cero. La succión, que atrae hacia las hojas el agua contenida en el tejido vascular para compensar la pérdida de la misma por la transpiración a través de las hojas. El tejido de conducción del xilema está constituido por una serie de traqueidas o vasos. Se trata de un tejido leñoso de los vegetales superiores que conduce agua y sales inorgánicas en forma

344 ascendente por toda la planta y proporciona también soporte mecánico. En las hojas, las flores y los tallos jóvenes, el xilema se presenta combinado con floema en forma de haces vasculares conductores. Las raíces tienen un cilindro central de xilema. El xilema formado a partir de los puntos de crecimiento de tallos y raíces se llama primario. Pero además, la división de las células del cámbium, situado entre el xilema y el floema, puede producir nuevo xilema o xilema secundario; esta división da lugar a nuevas células de xilema hacia el interior en las raíces y hacia el exterior en casi todos los tallos. Algunas plantas tienen muy poco xilema secundario o ninguno, en contraste con las especies leñosas; el término botánico xilema significa madera. Por otro lado, el xilema puede contener tres tipos de células alargadas: traqueidas, elementos vasculares o vasos (tráqueas) y fibras. En la madurez, cuando desempeñan funciones de transporte, todas estas células están muertas. Las traqueidas son células alargadas con paredes gruesas caracterizadas por la presencia de zonas delgadas muy bien definidas llamadas punteaduras. Los elementos vasculares o vasos son traqueidas especializadas cuyas paredes terminales están atravesadas por uno o varios poros; una serie vertical de elementos vasculares que forman un tubo continuo se llama vaso. Las fibras son traqueidas especializadas de pared muy engrosada que apenas realizan funciones de transporte y que sirven para aumentar la resistencia mecánica del xilema.

El xilema de las especies más antiguas desde el punto de vista de la evolución, como los helechos y las coníferas, está formado por traqueidas. En casi todas las angiospermas (plantas con flor), el xilema contiene también vasos y fibras bien desarrollados. Como las secuencias de especialización de todos estos elementos tisulares se observan con bastante claridad, el estudio del xilema aporta importantes claves para dilucidar la evolución de las plantas superiores. Comentario [EVO12]: Este parrafo lo copie de las siguientes paginas, es la única información que no estaba repetida y parece importante

Figura 11-27. Elementos del xilema

Las traqueidas y los vasos, las células que componen el xilema en las angiospermas.a) Las traqueidas son un tipo más primitivo y menos eficiente de célula conductora que predominan en las gimnospermas. El agua que se mueve de una traqueida a otra pasa a través de depresiones. Estas depresiones no son perforaciones, sino simplemente áreas en las cuales no hay una pared celular secundaria. Por lo tanto, el agua que se mueve de una traqueida a otra pasa a través de dos paredes celulares primarias y de la laminilla media. Los vasos, característicos de las

345 angiospermas, difieren de las traqueidas en que las paredes primarias y las laminillas medias de los vasos están perforadas en los extremos, donde se unen con otros vasos. b) Puede haber numerosas perforaciones en células contiguas de miembros de vaso, o c) las paredes contiguas pueden disolverse por completo cuando las células maduran formando una sola abertura. Los vasos se caracterizan también por ser más cortos y más anchos que las traqueidas y sus paredes contiguas son menos oblicuas. Los vasos se conectan con otros vasos y también con otras células por depresiones de las paredes laterales. 11.3.7. Transporte vascular

11.3.7.1. Sistema vascular

Figura 11-28. a) formas de vaso del xilema. Fig. B: miembro de vaso en el xilema del quebracho blanco, MEB 700x. Fig c: Las células del floema conducen alimento desde las hojas al resto de la planta. Las células del floema están ubicadas por fuera del xilema. Fig. D: Esquema de células de colénquima en corte transversal. Fig. E: A la derecha esquema de braquisclereidas de pera (Malus sylvestris). Al centro esquema de las astroesclereidas del pecíolo de Nymphaea sp. (Planta acuática) y macrosclereidas del la cubierta seminal de la arveja (Pisum sativum). A la izquierda esquema de las fibras, en vista longitudinal y en cort

346

e transversal. Fig. F: esquema de las células parenquimáticas; Fig. G: imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) de las células del parénquima medular de un tallo de amor seco (Bidens pilosa) 430x.

11.3.7.1.1. Apoplasto y Simplasto En el siglo 19, el fisiólogo alemán E. Munch introdujo un concepto de valor en la discusión del camino del agua en la planta. El sugirió que las paredes celulares interconectadas y los elementos del xilema llenos de agua deberían considerarse como un único sistema que denominó apoplasto. Es decir en cierto sentido, la parte no viva del vegetal. Consiste de todos las paredes celulares en la corteza de la raíz y técnicamente las paredes de la endodermis, aunque para nuestros propósitos no incluiría las bandas de Caspary de las células endodérmicas que tienen suberina que es hidrófoba. Todas las traqueidas y vasos en el xilema serían también parte del apoplasto como también lo son todas las paredes celulares del resto de la planta, incluyendo aquellas de tejidos tales como floema, otras células en la corteza y en las hojas. Se entiende que el ELA no sería equivalente al apoplasto, puesto que termina en las bandas de Caspary. Excepto por el engrosamiento de la endodermis, el ascenso del agua en el

347 vegetal tendría lugar por el apoplasto, particularmente la porción de xilema, pero incluyendo las paredes celulares de la corteza y aún las de las células vivas en las hojas. Munch también denominó al resto de la planta, la porción viva, como simplasto. Esté incluiría el citoplasma de todas las células en la planta. Se ha encontrado que el citoplasma de células adyacentes se encuentra conectado por pequeños poros en las paredes celulares. Esas conexiones citoplasmáticas reciben el nombre de plasmodesmos.

La hipótesis formulada por Dixon a principios de siglo sigue teniendo el mayor atractivo en la explicación del ascenso del agua. Uno de sus elementos es la propiedad de adhesión del agua. Hay muchos datos en la actualidad que apoyan esta teoría. En ella hay tres elementos básicos, a saber: • la fuerza impulsora, • la hidratación en el camino por adhesión a las sustancias del camino y • la cohesión de las moléculas del agua. La fuerza impulsora es, como se vio, el gradiente decreciente en el potencial agua desde el suelo hacia la atmósfera a través de la planta. El agua se mueve en el camino desde el suelo a través de la epidermis, corteza y endodermis, dentro del tejido vascular de las raíces, hacia arriba a través del xilema del leño, al interior de las hojas y finalmente por transpiración a través de los estomas hacia la atmósfera. Y es la estructura especial de este camino, es decir el relativamente pequeño diámetro y espesor de las paredes de los tubos, y la propiedad de imbibición de las paredes celulares del parénquima foliar los que hacen que el sistema sea funcional. Las fuerzas de imbibición o hidratación entre las moléculas de agua y las paredes celulares, se deben a uniones hidrógeno y es llamada adhesión, la cual es una fuerza atractiva entre moléculas disímiles. La tercera clave es la cohesión, esto es, la fuerza de atracción mutua entre moléculas de agua que también se debe a sus uniones H+. En el ambiente del camino del agua, las fuerzas cohesivas son tan grandes que el agua puede ser tirada desde la punta de los árboles altos por la evaporación en la atmósfera, y este estiramiento puede extenderse por todo el trayecto hacia abajo a través del tronco y las raíces y hasta el suelo mismo. Comentario [EVO13]: Esta figura se podría eliminar, ya hay una de simplasto y apoplasto

Figura 11-29. Absorción por los pelos radiculares. Ruta del agua y nutrientes absorbidos hasta las raíces. Apoplasto y simplasto. Papel de la Endodermis. Banda de Caspary.

348

Figura 11-30.Capilaridad y presión radicular. Teoría de la tensión cohesión. Evidencias. Estado metaestable de la columna de agua en el xilema. Tensión o presión negativa de la columna de agua en el xilema. Cavitación. Protección.

Figura 11-31. Los elementos del Xilema. http://trc.ucdavis.edu/biosci10v/bis10v/week8/xylem.gif Comentario [EVO14]: Todo esto está repetido y es exactamente lo mismo 11.3.7.1.2. Movimientos de Agua El agua se mueve a través de las plantas por medio de los tejidos vasculares. La fuerza motriz para que se den movimientos de agua dentro del xilema se deriva de la transpiración en las hojas. La fuerza motriz para que se de el movimiento dentro del floema se deriva del metabolismo de los carbohidratos en los tejidos source y tejidos sink. El agua penetra en la planta a través del sistema radicular y pasa por un filtro selectivo en las células de la endodermis. El agua asciende por los tubos del xilema, desde las raíces al resto de la planta. El agua es un disolvente universal y por eso lleva consigo sales minerales y algunos productos de las reacciones químicas de la planta como metabolitos y hormonas.

El agua también circula por los tubos cribosos del floema, para transportar el azúcar por las hojas durante la fotosíntesis. Las raíces no disponen de otro medio de nutrición y morirían sin la presencia de estos azúcares translocados por las hojas. Por medio de la translocación, el agua aporta turgencia y rigidez a las células. Estás características favorecen el anclaje de las hojas y tejidos nuevos, también es el medio por el que

349 se realiza la transpiración, amortigua los cambios de temperatura, estabiliza el pH de su metabolismo. Mantiene el volumen del citoplasma que está formado mayoritariamente por agua.

La transpiración de la planta es la evaporación del agua efectuada desde la hoja y desde el resto de las superficies de la planta. La transpiración es el último paso del recorrido del agua, habiéndose iniciado en el suelo y continuado por toda la planta. Tanto la respiración como la fotosíntesis aportan agua y calor. La primera enfría el tejido vegetal, haciendo que las plantas transpiren. Alrededor del 90% de toda el agua que penetra en la planta por medio de las estructuras llamadas estomas. Por la acción de las “células guarda”, los estomas se abren durante las horas diurnas para permitir el libre intercambio y la liberación de vapor de agua.

Fuente de poder Capilar Micrómetro

Menisco

Cámara de Motor presión Tejido Figura 11-32. Prueba para determinar la presión positiva del floema

El agua procedente de las precipitaciones o el riego penetra en el suelo, donde toma contacto con el sistema radicular. La evapotranspiración es el proceso mediante el cual se expulsa agua de los suelos mediante la evaporación y la traspiración de las plantas.

El estrés hídrico es más significativo en una planta que en otra, dependiendo de donde se produce dicho estrés. No solamente las plantas, que dejan caer las yemas florales, las flores e incluso los frutos pequeños sin madurar, sino las semillas germinales pueden morir con gran facilidad por falta de agua. El maíz, por ejemplo, puede manifestar una pérdida de grano en la mazorca si no se aplica la cantidad adecuada de agua durante la polinización. La mayoría de las plantas muestran indicios de necesidades hídricas ante la aparición de trastornos irreparables. Las hojas se decoloran y pueden llegar a marchitarse o retorcerse, como en el caso del maíz. Otras plantas como la yuca tienen la capacidad de tirar sus hojas un día (marchitarse) y recobrarse cuando vuelve a llover.

El exceso de agua es tan perjudicial como la escasez. Las semillas y las plantas también necesitan oxígeno para germinar y crecer. Las semillas y las raíces de las plantas en suelos encharcados, no tienen oxigeno suficiente para el mantenimiento de sus procesos vitales. El exceso de humedad en las raíces produce la aparición de enfermedades, por lo que esta parte de la planta se puede podrir y morir. Las plantas se amarillean y se deforman Entre las formas de agua no disponible en el suelo para las plantas se incluyen: • El agua gravitacional que se pierde en el drenaje • El agua higroscópica la que se fija a las partículas del suelo.

11.3.7.1.3. Transpiración y estomas La pérdida de agua por parte de las plantas en forma de vapor es una consecuencia inevitable de la apertura de los estomas. La transpiración es un proceso fundamental para que las sales minerales puedan moverse desde el suelo hasta la hoja y para controlar la temperatura del vegetal. Esta apertura es necesaria pues a través de los estomas ingresa el dióxido de carbono que se utiliza en la fotosíntesis (Figura 11-33.). A medida que el dióxido de carbono, esencial para la fotosíntesis, penetra en las hojas por los estomas se pierde vapor de agua a través de estos. Esta pérdida de agua plantea problemas serios para las plantas. La transpiración también

350 suministra la fuerza motriz mediante la que se absorbe agua por las raíces. Además provee un mecanismo que enfría las hojas. La temperatura de una hoja puede ser hasta 10 ó 15 º C inferior a la del aire circundante. Esto ocurre porque el agua, al evaporarse, lleva consigo calor.

El proceso de transpiración de las plantas produce la presión negativa que jala el agua hacia arriba. Este proceso continúa hacia las raíces, donde el agua en los espacios extra celulares que rodean al xilema es jalada hacia adentro por las perforaciones de las paredes de los elementos de los vasos y las traqueidas. Esté movimiento del agua hacia arriba y hacia adentro finalmente causa que el agua presente en el suelo se mueva hacia el cilindro vascular por ósmosis a través de las células endodérmicas. La fuerza generada por la evaporación del agua desde las hojas, transmitida hacia abajo por el xilema hacia las raíces, es tan fuerte que se puede absorber agua de los suelos bastantes secos.

La transpiración tiene efectos positivos y negativos. Los positivos le proporcionan la energía capaz de transportar agua, minerales y nutrientes a las hojas en la parte superior de la planta. Los negativos son la mayor fuente de pérdida de agua, pérdida que puede amenazar la supervivencia de la planta, especialmente en climas muy secos y calientes.

Casi toda el agua se transpira por los estomas de las hojas y del tallo, por lo tanto una planta al abrir y cerrar sus estomas debe lograr un equilibrio entre la absorción de CO2 para la fotosíntesis y la pérdida de agua de la transpiración. El flujo de agua es unidireccional desde la raíz hasta el brote porque sólo éste puede transpirar (figura 10-X)

351

Figura 10-X. La transpiración provoca la evaporación en las paredes celulares del mesófilo, generando tensión en el xilema, La cohesión entre las moléculas de agua en el xilema transmite la tención desde las hojas a la raíz, provocando así, el movimeineto de agua desde el suelo hacia la atmósfera (tomado dehttp://www.bufordcityschools.org/bhs/teachers/melissagreen/documents/34Ch36PlantTranspor t2005a.pdf).

Figura 11-33. Mecanismo de movimiento estomático.

11.3.7.2. Floema En las plantas superiores, el floema es un tejido vascular que conduce azúcares y otros nutrientes sintetizados desde los órganos que los producen hacia aquéllos en que se consumen y almacenan (en forma ascendente y descendente). El floema está organizado en haces vasculares, que son los filamentos longitudinales del tejido conductor, asociados con el tejido conductor de agua o xilema. Los haces vasculares constituyen importantes órganos estructurales de los tallos herbáceos y los nervios de las hojas. En el cilindro vascular que atraviesa el centro de la raíz del ranúnculo, por ejemplo, el xilema forma un núcleo central estrellado en cuyas ranuras se insertan los haces de floema. De forma típica, el xilema ocupa el lado del haz vascular más próximo a la médula, aunque no son raras disposiciones distintas. En las partes más viejas de la planta, las células blandas del floema son aplastadas y empujadas hacia afuera por el floema nuevo que se va formando en el proceso de crecimiento. El floema nuevo se crea

352 por la acción del cámbium o zona de crecimiento, una capa celular que separa el xilema del floema y produce células de este segundo tipo hacia el exterior de la planta.

El floema consta de dos tipos de células conductoras: tubos cribosos, que son los elementos más característicos, y células anexas. Los tubos cribosos son células alargadas con las paredes de los extremos perforadas por numerosos poros diminutos; a través de ellos pueden pasar las sustancias disueltas. Estos elementos están conectados en series verticales. Las células están vivas cuando llegan a la madurez, pero los núcleos se desintegran antes de iniciar la función conductora. Las células anexas, más pequeñas, conservan los núcleos durante la madurez y también están vivas; se forman junto a los tubos cribosos y se cree que controlan el proceso de conducción.

Varios tipos celulares forman el floema, tejido vegetal encargado del transporte de una solución de sacarosa y otras muchas sustancias orgánicas conocidas tradicionalmente como savia elaborada. Estos tipos celulares son: los elementos de los tubos cribosos con sus células anexas, las células cribosas, las fibras y las células parenquimáticas (Figura 11-34).

Placa cribosa compuesta

Figura 11-34 .Corte longitudinal de tallo de chopo (Populuxs boleana) (200x) mostrando una región del floema secundario donde pueden observarse algunas placas cribosas compuestas y algunas células del parénquima floemático axial. http://www.inea.uva.es/servicios/hist

El floema puede tener fibras de líber, que son muy fuertes, y en algunas especies constituyen la materia prima de la que se obtienen fibras comerciales, como lino y yute, utilizadas en la confección de tejidos, arpillera y sacos o costales.

11.3.7.2.1. Transporte de solutos La actividad metabólica de los diferentes órganos (o partes de órganos vegetales) requiere el aporte de fotoasimilados en cantidades diversas. En algunos casos, los procedentes de la actividad fotosintética de ese órgano, o bien de la hidrólisis de reservas acumuladas previamente en él, pueden satisfacer y sobrepasar los niveles señalados por estas necesidades; el órgano se autoabastece y está en condiciones de exportar fotoasimilados. En otros casos, el órgano puede ser claramente deficitario y debe importar fotoasimilados. El transporte de fotoasimilados a larga distancia, de un órgano a otro, se denomina translocación y se lleva a cabo, en general, por el floema. . Así como el agua y los solutos inorgánicos ascienden a través del xilema, o corriente de transpiración, los azúcares manufacturados durante la fotosíntesis salen de la hoja a través del floema, o corriente de asimilables (Figura 11-35) hacia lugares donde se utilizan, como el

353 vástago en crecimiento y la caliptra de la raíz, así como a lugares de almacenamiento como frutos, semillas y el parénquima de almacenamiento de tallos y raíces.

Figura 11-35. Diagrama de la hoja que muestra los caminos seguidos por las moléculas de agua de la corriente de transpiración a medida que se mueven desde el xilema de un vaso menor hacia las células mesofíticas, se evaporan de las superficies de las paredes de las células mesofílicas, y se difunden después fuera de la hoja a través de un estoma abierto (líneas continuas). También se muestran los caminos seguidos por las moléculas de azúcar producidas durante la fotosíntesis a medida que se mueven desde las células mesofílicas al floema del mismo vaso y entran en la corriente de asimilación. Se cree que las moléculas de azúcar producidas en el parénquima en empalizada se dirigen al parénquima esponjoso y después lateralmente al floema a través de las células esponjosas (líneas discontinuas).

Las células conductoras del floema de las Angiospermas son los elementos cribosos que carecen de núcleo y de la mayoría de los orgánulos, pero son ricos en una proteína filamentosa específica del floema, llamada proteína P. Los elementos cribosos forman series longitudinales llamadas tubos cribosos. Los elementos cribosos presentan poros, que forman áreas cribosas en las paredes laterales, y placas cribosas en las paredes transversales. Las placas cribosas posibilitan la comunicación y amplia continuidad citoplasmática entre elementos cribosos de un mismo tubo criboso (Figura 11-37).

354

11.3.7.2.2. Translocación y Plasmodesmas

Figura 11-36. Diagrama que muestra los elementos básicos en la circulación del agua, iones inorgánicos, y fotoasimilados en la planta.

El agua y los iones inorgánicos que absorbe la raíz se mueven hacia arriba por el xilema en la corriente de transpiración. Parte se mueve lateralmente hacia los tejidos de la raíz y del tallo, mientras que otra parte es transportada hacia zonas de la planta en crecimiento y hojas maduras. En las hojas, cantidades sustanciales de agua e iones inorgánicos son transferidos al floema y son exportados con sacarosa y la corriente de asimilación. Las partes de la planta en crecimiento, que son relativamente inefectivas capturando agua a través de la transpiración, reciben muchos de sus nutrientes y agua vía el floema. El agua y los solutos que entran en las raíces en el floema se pueden transferir al xilema y ser recirculados en la corriente de transpiración. En la figura 10-35 la letra A indica sitios especializados en la absorción y asimilación de materias primas del entorno. C y D designan sitios de carga y descarga, respectivamente, e I, puntos principales de intercambio entre el xilema y el floema. (La figura anterior y está modificadas de Raven, P.H. & Eichhorn, S.E. (1999). Biology of Plants. 6th ed., W.H. Freeman and Company. Worth Pub en.).

355

Poro Placa cribosa Proteína P citoplásmica

Plasto modificado

Vacuola

Célula acompañante

Placa cribosa

Núcleo

Mitocondria

Figura 11-37. Estructura interna de los tubos cribosos. En la izquierda podemos observar un esquema de los elementos de los tubos cribosos. En la derecha se observa una micrografía electrónica de transmisión de una placa cribosa en sección longitudinal.

El floema es el tejido conductor especializado en la translocación de fotoasimilados. El movimiento de este contenido puede ser tanto ascendente como descendente y sus diferentes componentes pueden moverse en sentidos contrarios, aún dentro de un mismo haz conductor.

Del movimiento de los fotoasimilados, se dice que sigue un modelo de tejido fuente a tejido sumidero (consumidor). Las principales fuentes de solutos asimilables son las hojas fotosintetizantes, pero los tejidos de almacenamiento pueden servir también como importantes fuentes. Todas las partes de las plantas incapaces de satisfacer sus propias necesidades nutricionales, pueden actuar como sumideros, esto es, pueden importar productos asimilables. Así, los tejidos de almacenamiento actúan como sumideros cuando están importando productos asimilables y como fuentes cuando los exportan (Figura 11-40).

consumidor

Fotosíntesis Hojas maduras Órgano productor Fotosíntesis (fuente, source) Órganos de reserva maduros

consumidor Ápices de raíces y tallos Yemas axilares en crecimiento Órgano consumidor (sumidero, sink) Hojas en expansión Flores frutos y semillas consumidor Órganos de reserva en desarrollo

356

Figura 11-38. Esquema donde se muestra la diferencia de función entre los órganos fuente y los sumideros. También se indican los principales órganos de la planta que actúan como fuente o como sumidero.

Las primeras evidencias que apoyan el papel del floema en el transporte de productos asimilables llego por las observaciones de árboles a los que se les había quitado un anillo completo de corteza. La corteza de los tallos más viejos está compuesta principalmente de floema y no contiene xilema. Cuando a un árbol que está fotosintetizando se le quita una tira de corteza o se le hace una incisión circular alrededor de él, la corteza por encima de la manipulación se hincha, indicando la acumulación de productos que se mueven hacia abajo por el floema desde las hojas fotosintetizadoras (Figura 11-39).

a) b)

Corteza Hinchamiento por materiales acumulados

Madera

Figura 11-39.Cuando de un tallo se extrae un trozo de corteza en forma de anillo a), los tejidos por encima del corte se abultaban b). Esté fenómeno se debe a un crecimiento nuevo de la madera y tejidos de la corteza estimulado por una acumulación de alimento que se desplaza hacia abajo desde las hojas y que queda interceptado en al anillo. Esté fenómeno no se produce durante los meses de invierno. (Figura modificada de Raven, P.H. & Eichhorn, S.E. (1999). Biology of Plants. 6th ed., W.H. Freeman and Company. Worth Pub.).

La savia elaborada es una solución muy concentrada con un contenido de materia seca de 50 a 300 g/l. El 90 por 100 de la materia seca de la savia elaborada corresponde a azúcares, particularmente sacarosa. En otras plantas también se encuentran otros oligosacáridos, por ejemplo, rafinosa y estaquiosa, así como alditoles. Los monosacáridos (por ejemplo glucosa, fructosa) no se transportan. En cambio, la savia elaborada contiene también aminoácidos, amidas, nucleótidos, ácidos orgánicos e iones inorgánicos (aunque no Ca2+). Estas sustancias, no obstante, aparecen en concentraciones mucho más pequeñas, comparadas con las de azúcares. Los pulgones y otros parásitos requieren los azúcares y otros compuestos acompañantes, como compuestos nitrogenados, en cantidades equilibradas. Es por eso cuando toman la alimentación descrita el exceso de azúcar lo exudan en forma de “melaza.

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Figura 11-40.Diferenciación entre fuentes y sumideros en una planta. Según su función o su estado de desarrollo una parte u órgano de una planta será fuente o sumidero de fotoasimilados Comentario [EVO15]: No es necesaria se explica arriba A lo largo de los años se han propuesto diferentes mecanismos para explicar el transporte de productos asimilables en los tubos cribosos del floema. Probablemente el primero fue el de difusión, seguido del de corriente citoplasmática. La difusión y la corriente citoplasmática normales, del tipo que se encuentra en las células de las plantas superiores, fueron en gran parte abandonados como posibles mecanismos de translocación cuando se supo que las velocidades del transporte de asimilables (típicamente 50 a 100 centímetros por hora) eran demasiado altas para que cualquiera de estos fenómenos justificara el transporte a grandes distancias vía los tubos cribosos.

Se han propuesto hipótesis alternativas para explicar el mecanismo de transporte en el floema, pero sólo una, la hipótesis de flujo de presión, justifica satisfactoria y prácticamente todos los datos obtenidos en estudios experimentales y estructurales del floema. Todas las otras hipótesis tienen serias deficiencias.

En la planta, la sacarosa producida por la fotosíntesis en una hoja es secretada activamente a los tubos cribosos menores. Este proceso activo, llamado carga de floema, disminuye el potencial hídrico en el tubo criboso y hace que el agua que está entrando a la hoja por la corriente de transpiración penetre en el tubo criboso por ósmosis. Con el movimiento de agua al tubo criboso de esta fuente, la sacarosa es transportada pasivamente por el agua a un sumidero, como una raíz de almacenamiento donde la sacarosa es extraída (descargada) del tubo criboso (descarga floemática). La extracción de sacarosa provoca un aumento del potencial hídrico en el tubo criboso del sumidero y el movimiento subsiguiente del agua fuera de él en ese lugar. La

358 sacarosa puede ser utilizada o almacenada en el sumidero, pero la mayor parte del agua regresa al xilema y recircula en la corriente de transpiración

Tarea 11-3. Realice un mapa conceptual sobre lo aprendido. Compare del sistema vascular de las plantas con el sistema vascular de los animales. Indique las similitudes y las diferencias.

11.3.7.3. Interacciones source-sink Describir aquí el uso de carbohidratos para acumular reservas.

Comentario [EVO16]: 11.3.8. Movimientos de agua La pérdida de agua por parte de las plantas en forma de vapor se conoce como transpiración. Es una consecuencia inevitable de la apertura de los estomas. Esta apertura es necesaria pues a través de los estomas ingresa el dióxido de carbono que se utiliza en la fotosíntesis. Si se cierran los estomas entonces se puede ahorrar agua, pero por otro lado, no se puede llevar a cabo la fijación de dióxido de carbono. A medida que el dióxido de carbono, esencial para la fotosíntesis, penetra en las hojas por los estomas se pierde vapor de agua a través de éstos. Aunque esta pérdida de agua plantea problemas serios para las plantas, suministra la fuerza motriz mediante la que se absorbe agua por las raíces. Además provee un mecanismo que enfría las hojas. Esto ocurre porque el agua, al evaporarse, lleva consigo calor. La temperatura de una hoja puede ser hasta 10 ó 15 º C inferior a la del aire circundante. Esto se puede medir por medio de un termómetro de infrarojo. Comentario [EVO17]: Esta De hecho, algunos mejoradores usan estos aparatos de medición de la temperatura de las hojas información esta repetida en la para detectar diferencias fisiológicas entre diferentes variedades. sección 10.3.7.2.2, se puede copiar todo esto y llevarlo hacia la sección mencionada, donde también esta lo de estomas con la misma figura que la de la sección 1.3.8.1

Figura 11-41. Intercambio de gases por los estomas.

El agua entra en la planta desde el suelo por las raíces. El movimiento del agua hacia las células de la raíz sólo es posible cuando el potencial hídrico en el suelo es mayor al potencial hídrico en las raíces. Los datos sugieren que la pérdida de agua genera fuerzas que permiten su absorción. Los procesos que conducen a la entrada de agua a las células de la raíz son capaces por sí

359 solos -y bajo ciertas condiciones- de generar una presión positiva. Tal presión, conocida como presión de raíz es, sin embargo, sólo suficiente para que el agua ascienda un corto trecho en el tallo. El agua viaja a través del cuerpo vegetal en las células conductoras del xilema (vasos y traqueidas).

Figura 11-42. Mediciones efectuadas en árboles de fresno muestran que un aumento en la transpiración es seguido por un aumento en la absorción de agua.

De acuerdo con la teoría de cohesión-tensión, el agua se mueve en las traqueidas y vasos bajo presión negativa (presión menor a la atmosférica, también denominada tensión). Dado que las moléculas de agua se mantienen juntas (cohesión), hay una columna continua de moléculas de agua que es arrastrada por tracción, desde la solución que se encuentra en el suelo al interior de la raíz, molécula por molécula, debido a la evaporación del agua en la parte superior. Comentario [EVO18]: Esto se puede llevar a la sección 11.3.8.1. Estomas 10.3.7.2.2, la figura está La difusión de los gases, incluyendo al vapor de agua, hacia el interior y exterior de la hoja es repetida regulada por los estomas. Los estomas se abren y se cierran por la acción de las células oclusivas, debido a cambios en la turgencia. La turgencia de estas células aumenta o disminuye por el movimiento del agua, que sigue al movimiento de iones potasio hacia adentro o hacia afuera de las células oclusivas. Diversos factores concurren a regular la apertura y cierre de estomas, los cuales incluyen el estrés hídrico, la concentración de dióxido de carbono, la temperatura y la luz.

360

Figura 9.25 Mecanismo de movimiento estomático.

Un estoma está bordeado por dos células oclusivas que: a. abren el estoma cuando están turgentes b. lo cierran cuando pierden turgencia. La clave de la apertura de los estomas reside en las microfibrillas de celulosa dispuestas alrededor de las células oclusivas. c. Cuando el agua entra a las células oclusivas, las células sólo pueden expandirse en dirección longitudinal. d. Como las dos células están unidas por los extremos, esta expansión longitudinal las obliga a arquearse y al estoma a abrirse. 11.4. Asimilación de nutrientes 11.4.1. Nitrógeno De los elementos del suelo, el nitrógeno es el más necesario para el desarrollo y sobrevivencia - + de las plantas. El nitrógeno en sus iones solubles, ya sea nitratos (NO3 ) o amonios (NH4 ) es el que presenta más transformaciones microbiológicas y por consiguiente el que más comúnmente se encuentra deficiente en el suelo, contribuyendo a la reducción de los rendimientos agrícolas en todo el mundo.

El nitrógeno es un macronutrimento de alta demanda en la producción moderna del maíz, pero debido a su gran movilidad no se acumula en el suelo; además, la materia orgánica que lo contiene tiende a descomponerse rápidamente bajo las condiciones tropicales. Por esas razones, en la explotación comercial de maíz son imprescindibles las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados, ocasionando una fuerte dependencia por ese insumo externo de costos elevados y crecientes. Esto motiva a la selección de cultivares híbridos más eficientes

361

en el aprovechamiento del nitrógeno aplicado. Los fitomejoradores pueden seleccionar sus progenies en base a su rendimiento con una cantidad de nitrógeno limitada.

Los organismos emplean el nitrógeno en la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y otras moléculas fundamentales del metabolismo. Su reserva fundamental es la atmósfera, en donde se encuentra en forma de N2, pero esta molécula no puede ser utilizada directamente por la mayoría de los seres vivos (exceptuando algunas bacterias).

Las principales formas de mantener suficiente nitrógeno en el suelo, es mediante la aplicación de fertilizantes nitrogenados y la fijación biológica. Debido al alto costo de los fertilizantes nitrogenados, la gran cantidad de energía requerida para su producción y las capacidades subóptimas para su transportación limita su uso en países subdesarrollados, especialmente en comunidades agrícolas pequeñas.

La agricultura moderna depende en gran medida del uso de fertilizantes químicos y pesticidas para mantener sus altas producciones agrícolas. Algunas veces el uso indebido puede ocasionar daños terribles, contaminando las aguas subterráneas y superficiales e incrementando los riesgos de intoxicaciones químicas.

El nitrógeno suele ser uno de los elementos que mas escasean. Es el factor más limitante de la productividad de muchos ecosistemas. Tradicionalmente se han abonado los suelos con nitratos para mejorar los rendimientos agrícolas. Durante muchos años se usaron productos naturales ricos en nitrógeno como el guano o el nitrato de Chile. Desde que se consiguió la síntesis artificial de amoniaco por medio del proceso Haber-Bosh fue posible fabricar abonos nitrogenados que se emplean actualmente en grandes cantidades en la agricultura.

El uso de nitrógeno sintético en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5 millones a 80 millones de toneladas, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, incrementándose sus costos de producción a más de $ 20 billones USD anualmente. Para el año 2050 la población mundial se espera crezca el doble de la cifra actual de habitantes, de esta proyección el 90% debe residir en las regiones tropicales o subtropicales de los países en desarrollo de Asia, África y América Latina. Según estos datos, es razonable esperar que la necesidad de fijación de N2 para la producción de alimentos agrícolas para esta fecha también duplique la cifra fijada actualmente. Si esta es suministrada por fuentes industriales, su uso se incrementará en 160 millones de toneladas de nitrógeno por año; lo que requerirá quemar más de 270 millones de toneladas de energía para su producción, sin tener en cuenta la duplicación de las fatales consecuencias que pudieran ocasionar.

El ciclo del nitrógeno Los procesos naturales de fijación biológica del N2 juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo del nitrógeno, y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas.

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Figura 11-43. Ciclo del nitrógeno (wikipedia).

El nitrógeno se considera generalmente un factor limitante en la producción de cultivos y es altamente susceptible a las pérdidas del sistema suelo-planta. Por lo tanto, cualquier factor que afecta a procesos de transformación en el suelo tendrá una incidencia en el crecimiento de las plantas y la eficiencia en el uso de N2. Se han propuesto diferentes enfoques para mejorar la eficiencia en el uso por las plantas y controlar las pérdidas en particular que se produzcan a través de la desnitrificación. La inhibición de la nitrificación se considera un enfoque beneficioso no sólo los fertilizantes para reducir las pérdidas de N2 a través de la desnitrificación y la

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lixiviación de NO3 (Aulakh l. 1984), sino también a prolongar la persistencia de fertilizante N2 en forma amoniacal (Crawford y Tiza 1993).

Las bacterias y algas cianofíceas que pueden usar el N2 del aire tienen un papel muy importante en el ciclo de este elemento, al hacer la fijación del nitrógeno. De esta forma convierten el N2 en otras formas químicas (nitratos y amonio) asimilables por las plantas.

El amonio (NH4+) y el nitrato (NO3-) lo toman las plantas mediante las raíces y los incorporan en su metabolismo para la síntesis de las proteínas y ácidos nucleicos, entre otras sustancias.

En el metabolismo de los compuestos nitrogenados en los animales acaba formándose ión amonio que es muy tóxico y debe ser eliminado. Esta eliminación se hace en forma de amoniaco (algunos peces y organismos acuáticos), o en forma de urea (el hombre y otros mamíferos) o en forma de ácido úrico (aves y otros animales de zonas secas). Estos compuestos van a la tierra o al agua de donde pueden tomarlos de nuevo las plantas o ser usados por algunas bacterias.

Donde existe un exceso de materia orgánica, en condiciones anaerobias, hay otras bacterias que producen desnitrificación, convirtiendo los compuestos de N en N2, lo que hace que se pierda de nuevo nitrógeno del ecosistema a la atmósfera.

La Inhibición de la nitrificación podría aumentar los efectos positivos en el N2 de la mezcla de nutrición por la prolongación de la disponibilidad de NH3 y el aumento de su absorción por las plantas. Se ha propuesto la mejora de la productividad de maíz debido a una mayor oferta de nitrógeno puede atribuirse a los efectos de iones específicos sobre la fisiología vegetal.

Existen algunas especies de microorganismos que poseen la habilidad de convertir el nitrógeno atmosférico (N2) a amonio (NH4+) mediante la acción de la enzima nitrogenasa. Dentro de las bacterias capaces de realizar este proceso se encuentran los denominados fijadores de vida libre, los cuales fijan N2 atmosférico sin la cooperación de otras formas vivas, siendo la familia Azotobacteriaceae la que agrupa uno de los géneros más importantes utilizados en la biofertilización a diferentes cultivos.

Microorganismo Tipo de metabolismo al fijar Importancia Económica nitrógeno BACILACEAS Bacillus polimyxa Aeróbico Beneficios marginales a la Clostridium heterotrófico agricultura AZOTOBACTERIAS Azotobacter Azomonas insignis Aeróbico Beneficios a cosechas no Beijennckia derxii heterotrófico confirmados Derxia gummonsa Xhantobacter flavus

ENTEROBACTERIAS Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Anaeróbico o microaerófilo Importantes en la fijación Erwinia herbicola asociativa Citrobacter freundii Azospinllum brasilense RIZOBIACEAS Rhizobium Microaerófilo, Muy importantes en el cultivo de Bradyrhysobium Heterotrófico leguminosas STREPTOMICETACEAS

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Frankia Microaerófilo, Uso potencial en bosques Heterotrófico METNOMONADACEAS Methylocystis Microaerófilo, Obtención de proteína unicelular methylococcus autotrófico TIOBACTERIACEAS Minería microbiana Thiobacillus ferrooxidans Microaerófilo CIANOFICEAS Anabaena Anaeróbico o Cultivo de arroz, Nostoc Microaerófilo fotolitotrófico Producción de proteína unicelular Gloeothece Spirulina Synechococcus CROMATIACEAS Chromatium vinosum Anaeróbico o Cultivo de arroz, fotolitotrófico Producción de proteína unicelular CLOROBIACEAS Chlorobium liminicola Anaeróbico o fotolitotrófico RODOSPIRILACEAS Anaeróbico o fotolitotrófico Tabla 11-2. Microorganismos fijadores de nitrógeno (tomado de Castillo & Cárdenas (1990) (modificado por Wilmer P. F. Universidad Nacional de San Agustín).

Algunas bacterias convierten amoniaco en nitrito y otras transforman este en nitrato. Una de estas bacterias (Rhizobium) se aloja en nódulos de las raíces de las leguminosas (alfalfa, alubia, etc.) y por eso esta clase de plantas son tan interesantes para hacer un abonado natural de los suelos.

El nitrógeno de la biósfera está sujeto a un rápido recambio, y debido a que es perdido como N2 a la atmósfera, su mantenimiento requiere de un continuo reemplazo con nitrógeno reducido a partir del N2 atmosférico.

Las señales implicadas en la percepción y en la ruta de transducción de señales que conduce a la fijación biológica de nitrógeno son complejas. Son necesarios futuros estudios para comprender los mecanismos de regulación de la fijación biológica de nitrógeno, y de esta forma poder optimizar las plantas.

La fijación biológica de nitrógeno es una manera efectiva, menos cara y no contaminante, para mejorar la fertilidad del suelo comparada con otras vías (como la fertilización química). Tomando en consideración la producción obtenida, la simbiosis Rhizobium-leguminosa es superior a los otros sistemas de fijación de nitrógeno. Sin embargo, investigación reciente realizada con otros microorganismos alternativos podría representar la mejor fuente de fertilizantes "renovables", por lo que demandan un gran interés como área de futura investigación.

11.4.2. Azufre El azufre es un elemento abundante a lo largo de la corteza terrestre. Se encuentra disponible como sulfato soluble o en compuestos orgánicos. En la biosfera se produce la reducción del azufre a H2S por obra de microorganismos. Salvo en la situaciones de anaerobiosis se oxida rápidamente de forma espontánea.

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El azufre lo asimilan las plantas y microorganismos, estos los absorben del suelo y lo asimilan -2 como ion sulfato (SO4 ) y lo reducen a HS. Los animales no pueden realizar esta operación, y deben recibir el azufre en su forma reducida (aminoácidos azufrados).

El ciclo de azufre La intemperización extrae sulfatos de las rocas, los que recirculan en los ecosistemas. En los lodos reducidos, el azufre recircula gracias a las bacterias reductoras del azufre que reducen sulfatos y otros compuestos similares, y a las bacterias desnitrificantes, que oxidan sulfuros. El H2S que regresa a la atmósfera se oxida espontáneamente y es acarreado por la lluvia. Los sulfuros presentes en combustibles fósiles y rocas sedimentarias son oxidados finalmente a ser empleados como combustible por el hombre, debido a movimientos de la corteza terrestre, y a la intemperización, respectivamente.

La mineralización del azufre ocurre en las capas superiores del suelo, el sulfato liberado del humus es fijado en pequeñas escala por el coloide del suelo, la fuerza de absorción con la cual -1 -1 -2 -2 -2 -1 son fijadas los aniones crecen en la siguiente escala: Cl - -NO3 - - SO4 - -PO4 - -SiO3 -–OH -

El sulfato es ligado correspondientemente mucho más débilmente que el fosfato del cual pequeñas cantidades es suficiente para reemplazar el SO4 a través de las raíces. El sulfato es la forma soluble del tratamiento del azufre en la planta donde es reducido para integrar compuestos orgánicos. La reabsorción del SO4, depende del catión acompañante y crece en el sentido siguiente. Ca < Mg. < Na < NH < K

Entre el azufre orgánico y el mineral, no existe una concreta relación en la planta; la concentración de azufre mineral, depende en forma predominante de la concentración del azufre in situ, por la cual pueden darse notables variaciones. En cambio el azufre de las proteínas depende del nitrógeno, su concentración es aproximadamente 15 veces menos que el nitrógeno.

El azufre es absorbido por las plantas en su forma sulfatado, es decir en forma aniónica perteneciente a las distintas sales: sulfatos de calcio, sodio, potasio, etc. El azufre no solo ingresa a la planta a través del sistema radicular sino también por las hojas en forma de gas de SO2, que se encuentra en la atmósfera, a donde se concentra debido a los procesos naturales de descomposición de la materia orgánica, combustión de carburantes y fundición de metales.

El azufre en el interior de las células tiene características de poca movilidad. Cumple fisiológicamente algunas funciones importantes, además de constituir distintas sustancias vitales, estas son: • Forma parte constituyente de las proteínas (cisteína, metionina). • Forma parte de las vitaminas (biotina). • Es constituyente de las distintas enzimas con el sulfidrilo (SH-) como grupo activo, que actúan en el ciclo de los hidratos de carbono y en los lípidos (en la oxidación de los ácidos grasos, como la coenzima A, CoA). • Interviene en los mecanismos de óxido-reducción de las células (con el glutatión). • Interviene en la estructura terciaria de las proteínas.

Algunas especies como las crucíferas, y entre ellas las liliáceas, absorben una gran cantidad de sulfatos, produciendo sulfuro de alilo que ocasiona el olor característico de algunos vegetales como la cebolla. El contenido de azufre en las oleaginosas, y especialmente de aquellos frutos con alto contenido de aceite como la mostaza, es notablemente elevado. El azufre es un componente insustituible de algunas grasas (mostaza y ajo), y también forma parte de las vitaminas (tiamina y biotina). Este elemento contribuye en la formación de la clorofila, a un desarrollo más acelerado del sistema radicular y de las bacterias nodulares, que asimilan el nitrógeno atmosférico, que viven en simbiosis con las leguminosas.

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Deficiencias del Azufre en el Suelo: Parte del azufre se encuentran en las plantas en forma oxidada de compuestos inorgánicos. Las gramíneas y la papa requieren entre 10-15 Kg/Ha. Las coles 40-70 Kg/Ha. La deficiencia de azufre se observa en suelos pobres en materia orgánica, suelos arenosos franco arenosos. Una deficiencia de azufre en el suelo puede traer una disminución de la fijación de nitrógeno atmosférico que realizan las bacterias, trayendo consecuentemente una disminución de los nitratos en el contenido de aquél. Por su parte, una deficiencia del azufre altera algunos procesos metabólicos y la síntesis de proteínas. La insuficiencia del azufre influye en el desarrollo de las plantas.

11.4.3. Fósforo El fósforo es uno de los tres minerales más limitantes para los cultivos agrícolas. Es un componente de los ácidos nucleicos. Muchas sustancias intermedias en la fotosíntesis y en la respiración celular están combinadas con esteres de acido fosfórico. Los átomos de fósforo proporcionan la base para la formación de los enlaces de alto contenido de energía del ATP

El fósforo, es la fuente de energía necesaria para que se produzcan todos los procesos metabólicos en la planta. Su deficiencia le imposibilita a la planta completar normalmente dichos procesos metabólicos. Los dos momentos críticos en los que su presencia es fundamental son: a la germinación, para favorecer un rápido crecimiento radicular y en pre-floración. En la planta el fósforo es requerido en la formación de ácidos nucleicos, fosfatos de azúcares, fosfolípidos para las membranas, síntesis de proteínas, entre otros, por lo que es necesario un adecuado abastecimiento de este elemento en el suelo.

Su reserva fundamental en la naturaleza es la corteza terrestre y en los depósitos de rocas marinas. Por meteorización de las rocas o sacado por las cenizas volcánicas, queda disponible para que lo puedan tomar las plantas. Con facilidad es arrastrado por las aguas y llega al mar. Parte del que es arrastrado sedimenta al fondo del mar y forma rocas que tardarán millones de años en volver a emerger y liberar de nuevo las sales de fósforo.

Otra parte es absorbida por el plancton que, a su vez, es comido por organismos filtradores de plancton, como algunas especies de peces. Cuando estos peces son comidos por aves que tienen sus nidos en tierra, devuelven parte del fósforo en las heces (guano) a tierra (Figura 11-44).

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Figura 11-44. Ciclo del fósforo.

Los lodos residuales (biosólidos) son sólidos ricos en materia orgánica con contenidos suficientes de nitrógeno y fósforo que los hace potencialmente útiles como fertilizantes y como fuente de materia orgánica. Además pueden mejorar las propiedades físicas del suelo como la densidad aparente, la estructura, porosidad y retención de agua; todo lo cual puede reflejarse en un incremento en el rendimiento de los cultivos.

Gran parte del fósforo soluble de los fertilizantes químicos se convierte en insoluble a poco de su aplicación, y su eficiencia de absorción está entre el 10 y el 30%. Actualmente está aumentando el uso de métodos biológicos para nutrir las plantas, se ha buscado incrementar el aprovechamiento del fósforo utilizando microorganismos como bacterias y hongos que habitan los suelos y cuya capacidad de solubilizar sus compuestos es bien conocida.

En estudios de marcaje isotópico han demostrado que las plantas micorrizadas tienen una mayor tasa de absorción y acumulación de fósforo. En este sentido, la micorriza arbuscular transfiere a sus hospedantes beneficios como absorción de fósforo, nitrógeno, zinc, protección contra patógenos, longevidad de la planta y absorción de agua, etc. Las micorrizas como tecnología biológica aplicada representan un área de explotación en beneficio del desarrollo de cultivos más productivos. Para el mejoramiento genético de maíz, aun no se ha considerado las interacciones benéficas entre planta y microorganismos. Existe todavía un potencial muy grande para explotar en estas áreas.

11.4.4. Otros minerales La productividad de las tierras de cultivo está muy ligada a su equilibrio en materias orgánicas e inorgánicas. Además de mantener los suelos en condiciones físicas adecuadas, el manejo agronómico debe mantener las reservas de nitrógeno y otros nutrientes también necesarios, como el fósforo, azufre, potasio y microelementos.

11.4.4.1. Potasio La función más relevante del potasio lo cumple en todo proceso de traslado de azúcares fotosintetizados. A medida que la planta fotosintetiza, va acumulando azúcares en las hojas.

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Estos azúcares son los que la planta trasloca a los granos en el momento del llenado de los mismos. El potasio es el responsable principal de este traslado. El trigo es altamente exigente en esté nutriente. La deficiencia de potasio aparece primeramente en las hojas periféricas y después en las mas jóvenes, el síntoma característico es clorosis alrededor del limbo, posteriormente el borde de la hoja se necrosa, las hojas más nuevas son pequeñas. Afecta el rendimiento por una disminución del crecimiento de la raíz y menor cantidad de azúcar.

Figura 11-45. Hoja con deficiencia de potasio.

11.4.4.2. Hierro El hierro está directamente ligado a la fotosíntesis. Participa en la síntesis de clorofila junto con el magnesio. Es fundamental para el aprovechamiento del nitrógeno, cumpliendo una función, similar al azufre en este sentido, así como, para el aprovechamiento interno del fósforo por parte de la planta.

Figura 11-46. Planta con deficiencia de hierro. Se observa una clorosis de las hojas centrales, jaspeado verde pálido seguido de un blanqueamiento del limbo de las hojas. Causas: pH alto. Deficiencia del suelo.

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El hierro es otro de los elementos indispensables para el desarrollo de las plantas. Es un elemento esencial para la vida, puesto que participa en muchos procesos de oxidación- reducción. Lo podemos hallar formando parte esencial de las enzimas del ciclo de Krebs, en la respiración celular y como transportador de electrones en los citocromos. Esta presente en numerosas enzimas involucradas en el mantenimiento de la integridad celular, tales como las catalasas, peroxidasas y oxigenasas. En la biosfera aparece como hierro orgánico, hierro inorgánico bien soluble o en sedimento. El hierro orgánico pasa a formas de mayor o menor estado de oxidación. El ion ferroso puede transformarse en ion férrico y viceversa pasando finalmente de nuevo hierro orgánico.

11.4.4.3. Magnesio El magnesio en las plantas se encuentra en contenidos menores al de calcio. (0.15-0.75% de materia seca). Este nutriente forma parte de la molécula de clorofila por lo que se encuentra íntimamente involucrado en la fotosíntesis. Tiene función en la síntesis de aceites y proteínas y la actividad de enzimática del metabolismo energético. El principal síntoma por deficiencia es la presencia de clorosis internerval en las hojas viejas. Es un elemento móvil en la planta a diferencia del calcio. Es muy común la deficiencia de Mg. en suelos arenosos.

Formas de Magnesio en el suelo: • Magnesio contenido en minerales (primarios y secundarios) • Magnesio intercambiable: representa la fracción sorbida al complejo de cambio arcillo húmico. • Magnesio en solución: se encuentra en pequeñas cantidades pero hay una rápida reposición a partir de la fase de cambio. La principal fuente disponible para las plantas se encuentra en la forma intercambiable, como el Mg intercambiable es removido por las plantas y es factible de lavarse, este pool es repuesto a partir del Magnesio mineral por la meteorización de los minerales (como dolomita, hornblenda y serpentina). Algunos suelos también proveen al contenido de Mg intercambiable a partir de Mg que se encuentra en las interlaminas de ciertas arcillas de tipo 2:1 (Mg lentamente disponible).

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Figura 11-47. En cultivos de maíz se forman fajas de color amarillento o verde claro en las hoja, mientras que las venas permanecen verdes, si continua la deficiencia se desarrolla un color rojizo-púrpura, pero la nervadura permanece verde.

Tarea 11-4: Sobre los principales cultivos de su región, estudie las más importantes deficiencias de nutrientes, e indique que síntomas o enfermedades padecen las plantas.

11.4.5. Resumen de minerales esenciales Los elementos esenciales de origen mineral son incorporados desde el suelo al interior de las células de las raíces a través de la actividad de transportadores específicos, y son transportados al vástago -tras ser volcados al xilema- junto con la corriente de transpiración. Cumplen una variedad de funciones en las plantas, algunas de las cuales no son específicas, como, por ejemplo, los efectos que ejercen sobre el potencial osmótico. Otras funciones son específicas, como la presencia de magnesio en la molécula de clorofila. Algunos minerales son componentes esenciales de los sistemas enzimáticos. En la siguiente tabla se resumen los principales elementos minerales (micronutrientes y macronutrientes) requeridos por todas las plantas.

Tabla 11-3. Funciones de los nutrientes en las plantas y sus síntomas de deficiencia. Comentario [atf19]: Poner esta tabla como texto, no como figura

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11.4.6. El suelo y la nutrición Las características del suelo que afectan la disponibilidad de minerales para las plantas incluyen: la roca madre, el tamaño de las partículas, la cantidad de humus que contiene y el pH. El suelo, la capa más superficial de la corteza terrestre, está compuesto por minerales derivados de las rocas que les han dado origen. El suelo agrícola también esta compuesto por material orgánico en diversos grados de descomposición. Típicamente tiene tres capas: el horizonte A, el horizonte B y el horizonte C. El horizonte A, o capa superior del suelo, es la zona de acumulación máxima de materia orgánica (humus). El horizonte B, o subsuelo, está formado por el producto de la alteración de la roca madre y es pobre en materia orgánica; en este horizonte, se suelen acumular los nutrientes minerales que se han lixiviado del horizonte A. El horizonte C está constituido por rocas sueltas que se extienden hasta el lecho de rocas que se encuentra por debajo de ellas y que constituye el material originario del suelo. La profundidad y la composición de estas tres capas y en consecuencia la fertilidad del suelo varían considerablemente en ambientes diferentes.

Figura 11-48. Diagrama de las capas de suelo de tres tipos principales de suelos. a) Bosque de coníferas. b) Bosques caducos fríos o templados. c) Praderas de gramíneas.

El mantillo material en descomposición que se encuentra sobre la superficie del suelo de los bosques australes y septentrionales de coníferas es ácido y se descompone lentamente; el suelo tiene poca acumulación de humus, es muy ácido y pierde elementos minerales por lixiviación (lavado). En los bosques caducos fríos o templados, la descomposición es algo más rápida, la pérdida de minerales por lixiviación es menos extensa y el suelo es más fértil. Estos suelos han sido usados intensamente para la agricultura, por lo cual es necesario prepararlos añadiendo cal (para disminuir la acidez) y fertilizantes. En las praderas de gramíneas, casi todo el material vegetal que se encuentra sobre la superficie del suelo muere cada año, al igual que muchas de las raíces, y grandes cantidades de materia orgánica regresan, así, constantemente al suelo. Además, las raíces finamente divididas penetran extensamente en el suelo. El resultado es un suelo muy fértil.

La disponibilidad de nutrientes minerales esenciales depende, en gran medida, de las características de la roca madre a partir de la cual se ha formado.

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El material originario tiene una obvia influencia sobre las características de los suelos, entre ellas, la capacidad de retención del agua y la disponibilidad de nutrientes esenciales. Tales características dependen de la incidencia de otros factores igualmente importantes: el clima (sobre todo las precipitaciones y la temperatura), el relieve, los seres vivos que lo habitan y la edad del suelo. En un ambiente no perturbado, la mayor parte de los nutrientes minerales permanecen dentro del sistema formado por el suelo mismo, las plantas, los microorganismos y la pequeña fauna que el suelo contiene y mantiene. Las propiedades de los suelos resultan de la interacción entre los factores mencionados. Esta interacción se refleja en el tamaño de los fragmentos producidos por la alteración del material originario. Los fragmentos más pequeños de roca se clasifican como arena, limo y arcilla. La proporción entre estos componentes varía de un suelo a otro. El agua y los iones en solución drenan rápidamente a través de suelos compuestos en su mayor parte por partículas grandes (suelo arenoso). Un suelo compuesto principalmente por partículas pequeñas (arcilla) retiene agua. El pH del suelo es determinado por los múltiples factores que intervienen en la génesis del suelo. A su vez, el pH del suelo afecta de modo singular su capacidad para retener minerales. Afecta también, en forma marcada y diferente, la solubilidad de ciertos iones. Las plantas, en general, producen una acidificación del medio, lo que ayuda a degradar las superficies de las rocas y a liberar iones cargados positivamente de estas superficies. Cuando las partes vegetales mueren y se descomponen, se añaden constantemente al humus, cambiando así, no sólo el contenido del suelo, sino también su textura y su capacidad para retener minerales y agua. A su vez, las plantas dependen del contenido mineral del suelo y de su capacidad de retención de agua y nutrientes. Cuando estos factores mejoran, se favorece el crecimiento de las plantas. A menudo cambia también la abundancia relativa de las especies que en él crecen; nuevas especies son capaces de colonizarlo en tanto que otras desaparecen. Esto produce, a su vez, cambios posteriores en el suelo. Así, en condiciones naturales, el suelo -y la disponibilidad de nutrientes y agua para las raíces de las plantas- están cambiando constantemente. En la nutrición de las plantas, hay dos tipos de relaciones simbióticas que son importantes: las micorrizas y las relaciones en que intervienen bacterias fijadoras de nitrógeno. Las asociaciones entre bacterias fijadoras de nitrógeno, tales como los rizobios, y las raíces de ciertas plantas, particularmente leguminosas, dan como resultado la incorporación del nitrógeno gaseoso de la atmósfera en compuestos orgánicos nitrogenados.

Figura 9.27 a) Nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces de una planta de soja, una leguminosa. b) Microfotografía de barrido de las células del interior del nódulo radical de la alfalfa. Los nódulos como los que se ven en la figura son el resultado de una asociación simbiótica entre una bacteria del suelo (Rhizobium) y células de la raíz.

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El pH del suelo es grandemente regulado por la fracción coloidal del suelo (arcilla y humus) y los cationes de intercambio asociados a ella. Los niveles satisfactorios de la fertilidad de un suelo en las regiones húmedas dependen del uso de enmiendas para balancear las pérdidas de Ca y Mg. Las enmiendas no sólo mantienen los niveles de Ca y Mg sino que también proveen de una estabilidad física y química en el suelo. Se pueden usar como enmiendas la cal y el yeso, por otra parte también es juicioso el uso plantas tolerantes a la acidez en lugar de intentar un cambio en la química del suelo. En términos generales el Ca y Mg se encuentran disponibles como cationes de intercambio y la cantidad disponible tiene una relación directa con la meteorización de los minerales y el grado de lixiviación. Los principales caminos de pérdidas y ganancias para mantener un nivel de suficiencia o disponibilidad de los mismos para las plantas. Nótese que la principal pérdida en los sistemas agrícolas es el lavado y posteriormente la erosión.

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12. Crecimiento, desarrollo y reproducción 12.1. Fundamentos del desarrollo vegetal 12.1.1. El ciclo celular

Figura 12-1. El ciclo celular se compone de varias fases, cada una con una serie de procesos característicos para esa etapa celular. El ciclo completo se puede dividir en la interfase (I) y la mitosis (M). La interfase se puede subdividir en tres etapas: la etapa síntesis (S) de DNA y dos etapas de gap (G1 y G2).

Durante la fase S se lleva a cabo la replicación del DNA. Las células que están en fase G1 y G2 se distinguen entre si, en que las de G1 solo tienen una copia del DNA, mientras que las que están en la etapa G2 ya tienen el DNA duplicado. Una célula en etapa G2 da a lugar a dos células hijas en etapa G1 por medio de la mitosis. La mitosis se puede subdividir en subetapas, como se explica en la siguiente sección. 12.1.2. La mitosis La división celular consiste en que a partir de una célula se obtienen 2 células hijas. La división del citoplasma se llama citocinesis, y la división del núcleo, cariocinesis. A todo en su conjunto se le llama mitosis. La mitosis produce células genéticamente idénticas a la madre, ya que mantiene

376 invariable el número de cromosomas. Se lleva a cabo en cualquier célula eucarionte, ya sea diploide o haploide. Las células hijas resultarán diploides si la madre era diploide. Algunas células no realizan mitosis y permanecen en un estado interfásico, pero otras la realizan frecuentemente (células embrionarias, células de zonas de crecimiento, células de tejidos sujetos a desgaste.). La función de la mitosis deriva de la necesidad de crecimiento y desarrollo del organismo multicelular, y la regeneración de tejidos expuestos a destrucción de células. En unicelulares, la mitosis cumple la función de reproducción asexual.

Cada mitosis está precedida por una interfase, donde se produce la duplicación del material genético. Actúa como un mecanismo que asegura que cada célula hija reciba la misma información genética.

Figura 12-2. Etapas de la mitosis. Inicia con una célula en etapa G2 de la interfase. Después sigue la profase, la metafase, la anafase y la telofase para continuar con la citocinesis (división celular) en donde se forman dos células hijas en fase G1.

Las etapas de la mitosis son profase, prometafase, metafase, anafase y telofase, estas se describen a continuación:

PROFASE: La cromatina se condensa para formar los cromosomas y los dos centríolos migran a polos opuestos organizando un sistema de microtúbulos (aparato mitótico) para permitir la migración de los cromosomas. El aparato mitótico está constituidos por: • Centríolos: Están rodeadas por el centrosoma. A medida que cada centríolo migra, tiene un hijo y cuando llega al polo se ven dos ásteres (conjunto de microtúbulos cortos que se extienden desde cada centríolo). • Huso acromático: Tiene forma ovoide y está formado por muchos microtúbulos sin ramificaciones. Cada cromosoma está constituido por dos cromátidas unidas por el centrómero. La envoltura nuclear se desorganiza y sus fragmentos no se distinguen del retículo endoplasmático. Desaparece el nucleolo.

PROMETAFASE: Los cromosomas condensados migran hacia la placa ecuatorial del huso acromático.

METAFASE: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial, y cada uno está unido por su centrómero a una fibra del huso acromático.

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ANAFASE: Las dos cromátidas de cada cromosoma se separan por fisión del centrómero y se dirigen hacia polos opuestos. El movimiento de los cromosomas hijos hacia los polos se debe a un acortamiento de las fibras cromosómicas y se alargan las fibras interzonales.

TELOFASE: El huso mitótico y los ásteres se desorganizan. Alrededor de cada grupo cromosómico se organiza una envoltura nuclear a partir del retículo endoplasmático y de la envoltura original. Los cromosomas se dispersan y retoman el aspecto de cromatina que tenían antes de iniciarse la división. Los nucleolos reaparecen a partir de sus organizadores.

Citocinesis: La división del citoplasma se produce junto con la telofase. Se produce un surco en la membrana plasmática, producido por un anillo de microfilamentos unidos a ella. Las 2 células hijas se separan, distribuyéndose el hialoplasma y los organelos de un modo equitativo.

Cuando no ocurre citocinesis luego de la cariocinesis, los dos núcleos quedan en el mismo citoplasma y resulta una célula binucleada.

División en células vegetales: No hay centríolos ni ásteres, pero se organiza el huso acromático.

Citocinesis: el citoplasma se divide mediante un tabique, que se forma por la agrupación de microtúbulos y vesículas. Las vesículas crecen, se ordenan y se funden entre si originando la placa celular. Finalmente se arman las paredes celulares a partir de celulosa, hemicelulosa y pectina.

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Figura 12-3. Célula teñida con fluorescencia (microtubulos verdes y DNA azul) y vista con un microscopio confocal durante las diferentes etapas de la mitosis

12.1.3. La meiosis La meiosis es un proceso celular en donde el número de cromosomas se reduce a la mitad. En la meiosis I (etapa de reducción) una célula diploide se convierte en dos células haploides, pero aún con cromosomas dobles (2c). En la meiosis II los cromosomas se vuelven simples (Griffiths et al., 2003).

La meiosis es diferente y a la vez similar a la mitosis en varios aspectos. Las dos inician con células en fase G2, es decir, con células diploides (2n) pero con el DNA duplicado, es decir, cada célula tiene 4 copias (4c) de todos los genes. La primera etapa de la meiosis se da un apareamiento de los cromosomas homólogos (metafase I) y una reducción del material genético (telofase I). En la metafase I es donde se da la recombinación genética de los cromosomas (crossing over). De una célula diploide se producen dos células haploides (2n -> 1n) en la meiosis I, y posteriormente en la meiosis II se producen 4 células haploides por medio de una división mitótica (de dos células 2c se producen 4 células 1c). En la mitosis no se da esa reducción ya que las células hijas siguen siendo 2n. Es decir, en la mitosis a partir de una célula 2n4c se produce dos células 2n2c. Una de las diferencias más importantes entre la meiosis y la mitosis, es que en la metafase I de la meiosis, los cromosomas se aparean en pares homólogos (ver Figura 12-4). Esto no sucede en la mitosis. En la meiosis cada cromosoma homologo solo se une de un lado a los microtubulos, mientras que en la metafase de la mitosis los cromosomas todos se acomodan a lo largo de la línea ecuatorial y están unidos por los dos lados a microtubulos (ver Figura 12-2). En la Figura 12-7 se compara la mitosis y la meiosis.

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Figura 12-4. Etapas de la Meiosis

La meiosis I está precedida por una interfase durante la cual se duplica el material genético (Figura 12-5).

PROFASE I: La envoltura nuclear y el nucleolo se desorganizan, los centríolos migran a polos opuestos, duplicándose y se ordena el huso acromático. Se divide en 5 etapas: Leptonema, Cigonema, Paquinema, Diplonema y Diacinesis.

PROMETAFASE I: Los cromosomas migran al plano ecuatorial de la célula.

METAFASE I: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial. Los 2 cromosomas del bivalente se unen por medio del centrómero a la misma fibra del uso acromático.

ANAFASE I: Los 2 cromosomas homólogos unidos a la misma fibra del huso se repelen y migran a polos opuestos. Cada cromosoma está formado por 2 cromatinas.

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TELOFASE I: Cuando los cromosomas llegaron a los polos, se desorganizan el huso acromático y los ásteres, se reorganizan la envoltura nuclear y los nucleolos y se constituyen los núcleos hijos.

Figura 12-5. La meiosis I .En la profase I es donde se da el intercambio genético. http://botit.botany.wisc.edu/images/130/Meiosis/

Citocinesis: Se produce simultáneamente con la telofase, y da como resultado 2 células hijas con un número haploide de cromosomas.

Intercinesis: Es un período que tiene lugar entre la meiosis I y II y no se realiza duplicación del ADN.

Meiosis II: Los procesos de esta división son semejantes a los de una mitosis en una célula haploide.

PROFASE II: Se condensan los cromosomas, se desintegran los nucleolos, los centríolos migran a los polos y se duplican, formación del huso acromático y se desorganiza la envoltura nuclear.

PROMETAFASE II: Los cromosomas condensados migran a la placa ecuatorial de la célula.

METAFASE II: Los cromosomas se alinean en la placa ecuatorial, y cada cromosoma se une a una fibra del huso acromático.

ANAFASE II: Se fusiona el centrómero y se separan las dos cromátidas de cada cromosoma. Cada una migra a un polo diferente.

TELOFASE II: Los grupos cromosómicos llegan a los polos, el huso acromático se desorganiza, se reorganizan la envoltura nuclear y el nucleolo, se dispersan los cromosomas y se transforman en cromatina.

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Figura 12-6. La meiosis II www.iesmcervantes.es Citocinesis: Separación de los citoplasmas de las células hijas.

El proceso meiótico parte de una célula diploide que da como resultado 2 haploides, y a partir de éstas dos (meiosis II) se obtienen 4 haploides. La Meiosis, implica variabilidad genética y evolución {Griffiths, 2003 #35} .

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Figura 12-7. Comparación de la mitosis y la meiosis. kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/mitosis_meiosis.jpg.

La reproducción sexual introduce una importante proporción de variaciones genéticas. Cuanto mayor sea la diversidad de gametos formadas en cada progenitor, mayor será la probabilidad de originar combinaciones diferentes por fecundación, y mayor será la diversidad de los descendientes. Una célula diploide, con 2 pares de cromosomas homólogos, originará por meiosis 4 gametos haploides (uno de la madre y otro del padre). En la Metafase I se va a determinar en qué sentido migrarán en la Anafase I. Hay dos opciones:

Puede ocurrir que los 2 cromosomas paternos migren juntos a un polo y los dos maternos al opuesto. Puede ocurrir que migren al mismo polo el cromosoma materno del par homólogo y el paterno del par homólogo. Los otros cromosomas, migran al polo opuesto{Gupta, 1997 #112; Enger, 2005 #630}.

La mitosis asegura el reemplazo de las células desgastadas y la preservación de la información genética. La meiosis es la que forma las células sexuales. Ambas divisiones, entonces, son importantes para la vida celular y finalmente, para el cuerpo. (Stansfield, 2004)

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12.1.4. Ciclo de vida y reproducción sexual 12.1.5. Desarrollo de flores y semillas La flor es el órgano reproductor de la planta. Puede contener estructuras masculinas y femeninas. A las flores que presentan un único sexo se les llama flores unisexuadas, mientras que a las que contienen ambas se les denomina flores hermafroditas. Cuando las flores son unisexuales, estas se pueden presentar en un solo individuo (plantas monoicas) o en diferentes individuos (plantas dioicas). Los tipos de flores, sus verticilos (las distintas partes de la flor) o su posición en la planta son características que se utilizan para clasificar e identificar taxonomicamente a las plantas en diferentes familias.

En una flor el tallo se modifica mucho, perdiendo su característico crecimiento indefinido; a su vez, las hojas florales, las cuales carecen de yemas axilares, sustituyen la función de fotosíntesis de las hojas normales por la de protección, reclamo, producción de esporangios, etc. Es en la flor donde transcurre la mayor parte del ciclo vital de los espermatofitos. Por esta razón, cualquier modificación en la flor afecta a su biología, creando barreras reproductoras entre los diferentes individuos y produciendo, por tanto, nuevas especies con diferentes características. Por está razón, por la constancia de los caracteres de la flor, esta tiene un gran valor para diagnosticar una especie. Son las flores, y los frutos que se derivan de ellas, los que sirven para determinar las características morfológicas de las especies, así como su evolución y grado de parentesco.

Las partes de una flor de una planta dicotiledónea son: • Pedúnculo: el rabillo de la flor • Sépalos: las hojas modificadas que constituyen el cáliz. • Pétalos: las hojas modificadas que forman la corola. A veces tienen colores vistosos. • Androceo: la estructura reproductora masculina y está formada por el conjunto de estambres. • Gineceo: la composición reproductora femenina y está formada por los carpelos (Figura 12-8).

Como la flor es un brote, en ella existen elementos de tallo y elementos foliares. Los nudos y entrenudos del tallo que constituye la flor aquí se denominan pedicelo y tálamo o receptáculo. En cuanto a las hojas florales que se insertan en ese tallo, que son muy variadas, podemos distinguir:

Unas inferiores, que son estériles, que tienen funciones protectoras y/o de reclamo y se llaman antófilos. Constituyen el perianto, el cuál suele diversificarse en unas piezas externas con carácter protector, los sépalos, que constituyen el cáliz, y unas internas, por lo general vistosas y a veces fragantes, denominadas pétalos, que constituyen la corola.

Unas apicales, reproductoras, que se llaman esporófilos y están diversificadas en microesporófilos o estambres, que producen los microesporangios y constituyen el llamado androceo y en macroesporófilos o carpelos, que producen los macroesporangios y constituyen el denominado gineceo o pistilo.

Las especies vegetales que se reproducen mediante flores (una gran mayoría), se denominan plantas "fanerógamas". Para ellas no es imprescindible que haya agua para reproducirse, por lo que pueden crecer por zonas que no son húmedas.

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a) b)

Figura 12-8. a) Algunas partes de la flor. b) Ciclo de vida y desarrollo de una planta superior.

La planta tiene sus órganos reproductores en las flores. De las flores se forman los frutos y las semillas, que son necesarias para que una planta de esta clase se reproduzca. Algunos vegetales producen flores una o dos veces cada año, como los naranjos o los jazmines; otros sólo producen flores una vez en toda su vida. La pita, por ejemplo, es una planta con espinas, que crece silvestre por toda la zona cercana al Mediterráneo. Soporta la sequía almacenando agua en sus gruesas hojas. Hasta los 20 ó 25 años no produce flores y muere tras la floración {Arevalo, 2009 #635; Pino, 2009 #636}.

Las plantas con flores se dividen en dos grandes grupos: • gimnospermas

• angiospermas

Las gimnospermas no tienen carpelos para proteger sus embriones. Sus flores son muy simples y suelen pasar inadvertidas a nuestra vista. Son gimnospermas, por ejemplo, los pinos, los abetos y los cipreses. Son las plantas con semillas más antiguas.

Las angiospermas son las plantas más recientes y más evolucionadas. Tienen flores complejas que suelen ser llamativas a nuestra vista. Las semillas están recubiertas por un fruto que las protege. Son la fuente de alimentación del ser humano y de muchos mamíferos. De ellas también se obtiene gran número de materias primas y productos naturales. Los jazmines, los rosales, el trigo y la encina son angiospermas

La semilla o pepita es cada uno de los cuerpos que forman parte del fruto que da origen a una nueva planta es la estructura mediante la que realizan la propagación las plantas que por ello se llaman espermatófitas (plantas con semilla). La semilla se produce por la maduración de un óvulo de una gimnosperma o de una angiosperma. Una semilla contiene un embrión del que

385 puede desarrollarse una nueva planta bajo condiciones apropiadas. Pero también contiene una fuente de alimento almacenado y está envuelto en una cubierta protectora.

El alimento almacenado comienza como un tejido fino y delgado llamado endospermo que es provisto por la planta progenitora y puede ser rico en aceite o almidón y en proteínas. En ciertas especies, el embrión se aloja en el endospermo, que la semilla utilizará para la germinación. En otros, el endospermo es absorbido por el embrión mientras que la última crece dentro de la semilla en desarrollo, y los cotiledones del embrión se llenan del alimento almacenado. En la madurez, las semillas de estas especies carecen de endospermo. Algunas semillas de plantas comunes que carecen de endospermo son las habas, guisantes, calabazas, girasoles, y rábanos. Las semillas de plantas con endospermo incluyen todas las coníferas, la mayoría de los monocotiledones, las hierbas, tales como el maíz y el coco.

La envoltura de la semilla se desarrolla a partir de cubiertas, llamadas tegumentos, que originalmente rodean al óvulo. En la semilla esta envoltura madura se puede convertir en una fina cubierta, como en el cacahuete, o en algo más sustancial.

Las semillas de las angiospermas quedan contenidas en estructuras secas o carnosas (o en capas de ambas), llamadas frutos. En español se llama fruta al alimento que representan los frutos carnosos y dulces. En cambio las semillas de las gimnospermas comienzan su desarrollo "desnudas" sobre las brácteas de los conos, aunque en su desarrollo son acompañadas por escamas, que ayudan a su protección o a su dispersión.

Existe también un concepto legal de semillas, en el que se considera como semilla a cualquier parte de la planta cuando su fin es la multiplicación, incluyéndose entonces plantones, vitroplantas, esquejes, etc.

Figura 12-9. Partes de una semilla.

A diferencia de los animales, las plantas están limitadas en su habilidad de buscar las condiciones favorables para la vida y el crecimiento. Por consiguiente, han evolucionado de muy diversas formas para propagarse y aumentar la población a través de las semillas. Una semilla debe llegar a la localización adecuada en el momento óptimo de germinación. Estas propiedades que fomentan la producción de la siguiente generación es posible que estén más relacionadas con los frutos que con las mismas semillas, ya que la función típica de la semilla es la de servir de mecanismo retardante, permitiendo suspender el crecimiento si las condiciones no son favorables o dar el tiempo necesario para su dispersión {Whipple, 2009 #634}.

Cada especie logra su objetivo de una forma diferente: produciendo gran cantidad de semillas, envolviendo las semillas en duras capas que se van ablandando con las lluvias y el frío invernal para germinar en la primavera.

Germinación es el proceso en el cual el crecimiento emerge desde un estado de reposo. El ejemplo más común de la germinación, es el brote de un semillero a partir de una semilla de una

386 planta floral o angiosperma. Sin embargo, el crecimiento de una hifa a partir de una espora micótica es también germinación. En un sentido más general, la germinación puede implicar todo lo que se expande en un ser más grande a partir de una existencia pequeña o germen. La germinación es un mecanismo de la reproducción sexual de las plantas. La semilla se desarrolla de un óvulo situado en el interior del ovario de una flor. Esté ovario puede contener uno o varios óvulos. Mientras que el óvulo da lugar a la semilla, el ovario da lugar al fruto que, por tanto, puede tener una o varias semillas en su interior.

En el desarrollo de la semilla podemos distinguir tres estados después que se ha efectuado la polinización: Se llama germinación al proceso por el que se reanuda el crecimiento embrionario después de la fase de descanso. Esté fenómeno no se desencadena hasta que la semilla no ha sido transportada hasta un medio favorable por alguno de los agentes de dispersión. Las condiciones determinantes del medio son: aporte suficiente de agua y oxígeno y temperatura apropiada. Cada especie prefiere para germinar una temperatura determinada; en general, las condiciones extremas de frío o calor no favorecen la germinación. Algunas semillas necesitan pasar por un período de dormancia y, después de éste, también un tiempo determinado de exposición a la luz para iniciar la germinación.

Durante la germinación, el agua se difunde a través de las envolturas de la semilla y llega hasta el embrión, que durante la fase de descanso se ha secado casi por completo. El agua hace que la semilla se hinche, a veces hasta el extremo de rasgar la envoltura externa. El oxígeno absorbido proporciona a la semilla la energía necesaria para iniciar el crecimiento.

Figura 12-10. Ejemplo de algunas semillas. www.derechoalimentacion.org/gestioncontenidosKWDERECHO/imgsvr Tarea 12-1. De las semillas de la Figura 12-10 juegue a identificarlas con sus compañeros, gana el que identifique más.

Tarea 12-2. Vaya a las páginas Web http://www.botanical-online.com/lasflores.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/concurso2004/ver/09/testc1.htm y resuelva las actividades.

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12.2. Crecimiento y desarrollo vegetativo 12.2.1. Regulación del crecimiento Las plantas responden a los estímulos de sus ambientes internos y externos. Estas respuestas les permiten desarrollarse normalmente y mantenerse en contacto con las condiciones cambiantes que imperan en el medio en que viven. Las hormonas son factores importantes en las respuestas de las plantas. Una hormona es un producto químico producido en tejidos particulares de un organismo y llevado a otros tejidos de este, donde ejerce una o más influencias específicas. Característicamente, una hormona es activa en cantidades extremadamente pequeñas.

El conocimiento de las hormonas vegetales y de sus efectos sobre el crecimiento comenzó con algunos estudios relacionados con fototropismos. Este sigue siendo un punto de partida apropiado en la consideración de las respuestas de las plantas. Los cinco grupos principales de hormonas que han sido aisladas de las plantas son las auxinas, citocininas, etileno, ácido abscísico y giberelinas. También pueden estar presentes otras sustancias reguladoras del crecimiento.

Las plantas responden a diversos estímulos ambientales. El fototropismo -la curvatura de una planta hacia la luz- y el geotropismo -la capacidad del vástago para crecer hacia arriba y de la raíz para crecer hacia abajo- son dos respuestas que otorgan un alto valor de supervivencia a las plantas jóvenes. En muchas regiones, los cambios ambientales más importantes que afectan a las plantas (y, de hecho, a los organismos terrestres en general) son los que resultan del cambio de las estaciones. La respuesta de los organismos a cambios en la duración relativa de los períodos de luz y oscuridad en un ciclo de 24 horas se denomina fotoperiodicidad. Esta respuesta controla la iniciación de la floración en muchas plantas. Algunas especies vegetales muestran movimientos específicos, rápidos, que se producen como respuesta al tacto. Además, todas las plantas vasculares parecen responder a otros estímulos mecánicos con patrones de crecimiento alterados, lo que da como resultado plantas más bajas y robustas. Muchas angiospermas también pueden liberar sustancias volátiles, lo que constituye una comunicación química con otros individuos de la misma especie. 12.2.2. Tropismos y su relación con hormonas Un tropismo es una respuesta de crecimiento que implica la curvatura de una parte de la planta en el mismo sentido -o en sentido contrario- en el que actúa un estímulo. Si la parte de la planta se curva hacia el estímulo, se dice que el tropismo es positivo, si se curva en sentido contrario, el tropismo es negativo. Una de las respuestas más evidentes y de utilidad en las plantas es su fototropismo positivo, o sea, su curvatura hacia la luz.

Charles Darwin y su hijo Francis realizaron, en 1880, algunos de los primeros experimentos sobre fototropismo. Trabajando con plántulas de gramíneas, fueron capaces de determinar que ciertas zonas de las plantas son las que perciben el estímulo necesario para que ocurra la curvatura hacia la luz. En efecto, ellos observaron que la curvatura ocurre por debajo del ápice, en una parte inferior del coleóptilo.

La luz que incide en un coleóptilo en crecimiento hace que se curve hacia ella. La colocación de una cubierta opaca sobre el extremo de la plántula inhibe su curvatura, pero un collar opaco ubicado por debajo del ápice no la inhibe. Estos experimentos indican que "algo" producido en el ápice de la plántula, y transmitido hacia abajo en el tallo, provoca la curvatura. En 1926, el fisiólogo botánico holandés Frits W. Went logró, por medio de un experimento, separar esa "influencia" de las plantas que la producían. Went cortó los ápices de los coleóptilos de plántulas de avena y los colocó sobre una capa de agar, con las superficies de corte en contacto con el agar, de modo que la hipotética sustancia que transmitía el estímulo pudiera

388 difundir hacia el agar. Después de aproximadamente 1 hora, sacó el ápice del copleóptilo del agar y cortó el agar en pequeños bloques. Luego, colocó cada bloque sobre el borde de una plántula cortada que había sido mantenida en la oscuridad. La plántula se curvó hacia el lado contrario a aquel en el cual había sido colocado el bloque de agar. La curvatura es el resultado de la influencia de un estímulo, la auxina, que se desplaza desde el bloque hacia la zona subapical donde promueve el alargamiento celular. Los bloques de agar que no habían estado previamente en contacto con el ápice de un coleóptilo iluminado no produjeron ninguna curvatura o sólo lo hicieron levemente hacia el lado en el que se había colocado el bloque. Los bloques de agar que se habían colocado sobre un corte de coleóptilo realizado más abajo no produjeron efecto fisiológico. Went interpretó los resultados de sus experimentos como la demostración de que el ápice del coleóptilo ejercía sus efectos por medio de un estímulo químico y no por un estímulo físico como, por ejemplo, un impulso eléctrico. Este estímulo químico fue denominado auxina, vocablo acuñado por Went a partir de la palabra griega auxein que significa "incrementar". La auxina fue una de las primeras hormonas vegetales descubiertas. Se sabe ahora que el fototropismo resulta del hecho de que, bajo la influencia de la luz, una hormona, la auxina migra del lado iluminado al lado oscuro del ápice caulinar. Las células del lado oscuro, que contienen más auxina, se alargan más rápidamente que las del lado iluminado, haciendo que la planta se curve hacia la luz. Esta respuesta otorga, a las plantas jóvenes, un alto valor de supervivencia. Sólo la luz azul -o sea la luz de menos de 500 nanómetros de longitud de onda- resulta efectiva. 12.2.3. Geotropismo El fototropismo otorga una ventaja de supervivencia a una planta joven. Otra respuesta con un alto valor de supervivencia es la capacidad de responder a la gravedad, enderezándose, de modo que el vástago crece hacia arriba y las raíces hacia abajo. Esta respuesta es conocida como geotropismo; al igual que el fototropismo, el geotropismo involucra a las auxinas como hormonas regulatorias de la elongación celular. Este proceso, el geotropismo, implica cuatro pasos secuenciales: la percepción de la gravedad en células sensoras, la producción de señales, la transducción de señales tanto dentro de células sensoras como entre células y, finalmente, la respuesta. Una cuestión central se vincula con el modo en que se detecta la influencia de la gravedad: ¿cómo "sabe" una plántula si está en posición horizontal o vertical? Las hormonas y los iones son solubles por lo que la gravedad misma no debería tener efecto sobre su distribución. De acuerdo con una hipótesis vigente, la gravedad es percibida por organelos especializadas conocidas como estatolitos, que no son otra cosa que amiloplastos especializados que contienen almidón y que responen a la gravedad. La acumulación de gránulos almidón en tales estructuras es necesaria en este proceso. Esto se sabe de mutantes de arabidopsis como pgm o adg1 que no tienen almidón que también tienen defectos en la percepción de la gravedad. Cuando una raíz crece en forma vertical, los amiloplastos se reúnen cerca de las paredes inferiores de las células centrales. Sin embargo, si la raíz se coloca en posición horizontal, los amiloplastos se deslizan hacia abajo y se disponen cerca de las que previamente eran paredes orientadas en forma vertical. A los pocos minutos, la raíz comienza a curvarse hacia abajo y los amiloplastos retornan gradualmente a su posición original.

12.2.4. Fotoperiodicidad Las plantas son capaces de acomodarse a los cambios estacionales en virtud de su capacidad de anticipar el calendario anual de los acontecimientos: la llegada del otoño, las lluvias de primavera, los largos períodos de sequía, los largos períodos de crecimiento, y hasta la época en que florecen las plantas vecinas de la misma especie. Para muchas plantas, todas estas determinaciones se hacen de la misma manera: "midiendo" los períodos relativos de luz y

389 oscuridad. Este fenómeno se conoce como fotoperiodicidad. Otras plantas como el maíz también usan un reloj biológico que es dependiente de la temperatura. Es por ello que los días de germinación a floración dependen tanto del genotipo si es precoz o tardío, pero también de la temperatura durante el día y la noche.

Algunas plantas, conocidas como plantas de días largos, florecerán sólo cuando los períodos de luz excedan una longitud crítica. Otras plantas, las de días cortos, florecerán sólo cuando los períodos de oscuridad sean mayores que cierto tiempo crítico. Las plantas neutras dan flores independientemente del fotoperíodo. Los experimentos han mostrado que el período de oscuridad, y no el período de luz, es el factor crítico. (ver Figura 12-11)

Figura 12-11. Experimentos de fotoperiodicidad.

Las dos curvas de la Figura 12-12 muestran el cambio anual de la longitud del día en dos ciudades de América del Norte, ubicadas a diferentes latitudes. La línea verde indica el fotoperíodo que resulta eficaz para el abrojo, que requiere menos de 16 horas de luz para florecer.

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Figura 12-12. La longitud relativa de la noche determina cuándo florecerán muchas plantas.

En Chicago, el abrojo puede florecer al finalizar el mes de julio, cuando las plantas ya son adultas pero, en Winnipeg, las yemas florales no aparecen hasta los primeros días de agosto de modo que, habitualmente, la helada mata a las plantas antes de que maduren las semillas.

Se han realizado experimentos con fotoperiodicidad y han mostrado que las plantas miden la longitud del período de oscuridad y no del de luz. En la Figura 12-11 se muestra que en a) Las plantas de día corto florecen sólo cuando el período de oscuridad excede cierto valor crítico. Así, el abrojo, por ejemplo, florece con 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad. Si el período de 16 horas de oscuridad es interrumpido, aunque sea brevemente, como se muestra a la derecha, la planta no florece. b) La planta de día largo, por otra parte, que no florece con 16 horas de oscuridad, lo hace si el período de oscuridad se interrumpe. Las plantas de día largo florecen sólo cuando el período de oscuridad es menor que cierto valor crítico.

Figura 12-13. Una planta de abrojo (quelite). La planta de día corto que puede soportar toda clase de inclemencias ambientales, ha sido importante para estudios experimentales de fotoperiodicidad. Cada receptáculo espinoso es una inflorescencia con dos flores. Para los agricultores esta planta mas bien es una molestia como maleza.

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12.2.5. Fitocromo El fitocromo es una proteína unida a un cromóforo sensor. Está presente en pequeñas cantidades en los tejidos de las plantas, es uno de los sistemas receptores que detectan las transiciones entre la luz y la oscuridad. El pigmento existe en dos formas, Pr y Pfr. Pr absorbe luz roja, mientras que Pfr absorbe luz roja-lejana. Pfr es la forma biológicamente activa del pigmento; entre sus muchos efectos conocidos, promueve la floración en las plantas de días largos, inhibe la floración en las plantas de días cortos, promueve la germinación en las semillas pequeñas de plantas como la lechuga, e interviene en numerosos procesos de los vegetales.

Figura 12-14. Interconversión de las dos formas del fitocromo.

Los fitocromos son sintetizados en la forma Pr. Pr cambia a Pfr cuando se lo expone a luz roja. Pfr es la forma activa que induce la respuesta biológica. Pfr revierte a Pr cuando se lo expone a la luz roja lejana (730nm). En la oscuridad, Pfr lentamente revierte a Pr o es degradado.

Las similitudes entre los espectros de acción de las respuestas biológicas y los espectros de absorción de los pigmentos suministraron importante evidencia de que el fitocromo es el pigmento responsable de las respuestas.

Figura 12-15. Espectros de absorción de las dos formas del fitocromo.

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12.2.6. Ritmos circadianos y relojes biológicos ¿Cómo puede una planta de espinaca distinguir un día de 14 horas de un día de 13 horas? La medición del fotoperíodo requiere, por un lado, de fotorreceptores que permitan distinguir el día de la noche y, por otro lado, de un mecanismo que mida las horas de oscuridad. En cuanto a los fotorreceptores, se sabe que tanto los fitocromos como los criptocromos están involucrados. El tema pendiente es, ¿cómo miden las plantas la duración del período de oscuridad?

Esta pregunta nos lleva a otro grupo de fenómenos fácilmente observables. Algunas especies de plantas tienen flores que se abren por la mañana y se cierran al atardecer. Otras extienden sus hojas a la luz del Sol y las pliegan hacia el tallo durante la noche.

Figura 12-16. Hojas de una planta de trébol falso (oxalis), durante el día a) y la noche b).

Una hipótesis reciente, pero aún sin pruebas, es que los "movimientos de sueño" evitan que las hojas absorban la luz que refleja la luna en las noches muy claras, protegiendo los fenómenos fotoperiódicos. Estos movimientos diurnos continúan aunque las plantas se mantengan en condiciones lumínicas constantes. Actividades menos evidentes, tales como la fotosíntesis, la producción de auxinas y la tasa de inhibición celular, también tienen ritmos diarios. Los ritmos que continúan con un período cercano a 24 horas aun, cuando todas las condiciones del ambiente se mantengan constantes se llaman ritmos circadianos y se han encontrado en todos los organismos eucarióticos y en algunos procarióticos (Gardner et al., 2006).

Los ciclos regulares de crecimiento y actividad que ocurren aproximadamente cada 24 horas se denominan ritmos circadianos. Estos ritmos son controlados por un oscilador endógeno - el reloj biológico -. La principal función del reloj biológico, aparentemente, es suministrar el mecanismo de medición del tiempo necesario para los fenómenos de fotoperiodicidad. Por ejemplo, la orientación de las flores de girasol durante la noche anticipando la salida del sol en la madrugada.

En general, se considera que los ritmos circadianos son endógenos, o sea, se originan dentro del propio organismo y son controlados por lo que se conoce como reloj biológico. La evidencia que apoya la idea del reloj biológico interno es que, en condiciones ambientales constantes, los ritmos circadianos persisten por varios días. Diferentes especies y diferentes individuos de la misma especie suelen tener ritmos ligeramente diferentes, pero constantes, a menudo de hasta una o dos horas más largos o más cortos que 24 horas. Dado que el período endógeno de los ritmos no es exactamente igual a 24 horas, en condiciones naturales los relojes deben ser diariamente ajustados o sincronizados por el ambiente. Los factores más importantes en la sincronización de los relojes son las transiciones luz/oscuridad que ocurren al atardecer y al amanecer. Actualmente se sabe que tanto los fitocromos como los criptocromos son responsables de la sincronización por luz de los relojes de las plantas.

Por ejemplo, en Arabidospsis se ha observado que en días cortos, la síntesis de almidón es mayor que en días largos y que la tasa de degradación de este es más lenta. Así, la planta se ajusta a una noche más larga. Si hay un cambio repentino hacia noches más largas, se observa

393 que el almidón almacenado se degrada por completo y el crecimiento de la raíz de detiene (Gibon y col., 2004.

En los últimos años se han acumulado evidencias de que el reloj está constituido por proteínas que regulan negativamente la expresión de sus propios genes, constituyendo una retroalimentación negativa de 24 horas de duración. Los relojes biológicos desempeñan un papel importante en muchos aspectos de la fisiología vegetal y animal, sincronizando acontecimientos internos y externos (Gardner et al., 2006, Harmer et al., 2000)

12.3. Hormonas vegetales ¿Por qué germinan las semillas? ¿Por qué algunas plantas producen flores y otras no? ¿Por qué el meristemo de un árbol crece? Si se corta una rama ¿Por qué se forma un brote en la parte de arriba mientras que en la parte de abajo se forman otra vez raíces? ¿Puede ser esto una indicación de un transporte polar de sustancias reguladoras del desarrollo de las plantas?

Los reguladores de crecimiento, son compuestos orgánicos que, aparte de los nutrientes, influyen sobre los procesos fisiológicos de las plantas. Estos compuestos pueden ser promotores o inhibidores. Estos casi siempre actúan en conjunto y casi nunca de forma aislada, ya que la mezcla y la proporción de las diferentes hormonas determinan la respuesta final del tejido. Los reguladores se han agrupado en clases según su naturaleza química: auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno, acido absicico, acido jasmonico, brasinoesteroides, etc. (Figura 12-17).

Figura 12-17. Formulas químicas de cinco fitohormonas

Las auxinas representan un grupo de componentes caracterizados por su capacidad de inducir la elongación de las células localizadas en los brotes y en el extremo apical, así como la formación de esquejes de la planta, la abscisión de las hojas y de los frutos sin semillas y la producción de tejido nuevo en las zonas deterioradas.

Las giberalinas se emplean para la floración o para estimular el crecimiento para que estas adquieran mayor altura y tamaño, y produzcan frutas de mayor tamaño. Las giberelinas favorecen la floración de muchas especies de plantas suprimiendo la necesidad de estas plantas a la exposición a bajas temperaturas como en la zanahoria, el crisantemo entre otras. Las citoquininas estimulan la división celular y el despertar de la latencia en las semillas. Los inhibidores comprenden un grupo diverso de reguladores de la planta que inhiben o retrasan los procesos fisiológicos y bioquímicos. Uno de los primeros inhibidores del crecimiento que se aplicaron desde el punto de vista comercial fue el hidrácido maléico (HM). Se empleó para prevenir la formación de brotes en los tubérculos de las papas y cebollas. También para controlar

394 el rebrote del tabaco y el excesivo crecimiento de malas hiervas. El Cycocel también se utiliza en la reducción de la altura de la poinsetia, para que adquiera una forma más compacta y más corta en la época de Navidad (Figura 12-18) (Parker

Figura 12-18. Se ejemplifica en que lugares de la planta interviene cada hormona vegetal. http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/1bachillerato/reino_vegetal/contenidos10.htm

12.3.1. Auxinas El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la elongación. El ácido indolacético (IAA) es la forma predominante, sin embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indólicas naturales en plantas {Enger, 2005 #630} . Aunque la auxina se encuentra en toda la planta, las más altas concentraciones se localizan en las regiones meristemáticas en crecimiento activo. Se le encuentra tanto como molécula libre o en formas conjugadas inactivas. Cuando se encuentran conjugadas, las auxinas se encuentran metabólicamente unidas a otros compuestos de bajo peso molecular. Este proceso parece ser reversible. La concentración de auxina libre en plantas varía de 1 a 100 mg/kg peso fresco. En contraste, la concentración de auxina conjugada ha sido demostrada en ocasiones que es sustancialmente más elevada.

La auxina tiene una característica sorprendente que es la fuerte polaridad exhibida en su transporte a través de la planta. Es transportada por medio de un mecanismo dependiente de energía, alejándose en forma basipétala desde el punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical. El movimiento de la auxina fuera de la lámina foliar hacia la base del pecíolo parece también prevenir la abscisión.

La auxina ha sido implicada en la regulación de un número de procesos fisiológicos: 1.- Promueve el crecimiento y diferenciación celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta, 2.- Estimulan el crecimiento y maduración de frutas, 3.- floración,

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4.-Senectud, 5.- Geotropismo, 6.- Retardan la caída de hojas, flores y frutos jóvenes, 7.- dominancia apical

La auxina se dirige a la zona oscura de la planta, produciendo que las células de esa zona crezcan más que las correspondientes células que se encuentran en la zona clara de la planta. Esto produce una curvatura de la punta de la planta hacia la luz, movimiento que se conoce como fototropismo.

El efecto inicial preciso de la hormona que subsecuentemente regula este arreglo diverso de eventos fisiológicos no es aún conocido. Durante la elongación celular inducida por la auxina se piensa que actúa por medio de un efecto rápido sobre el mecanismo de la bomba de protones ATPasa en la membrana plasmática, y un efecto secundario mediado por la síntesis de enzimas.

La principal auxina endógena es el ácido indolil-3-acético (AlA). Es sintetizada en la planta a partir del L-triptofano, que puede estar libre o formando parte de proteínas. Por acción de una transaminasa se transforma en ácido indolpirúvico el cual se descarboxila por acción de una descarboxilasa formándose indol-acetaldehído. Luego actúa una oxidasa que lo transforma en ácido indol acético. Existen otras vías de síntesis que conducen al compuesto mediante la formación intermedia de triptamina, o bien mediante un intermediario nitrílico. El AIA se puede transformar en ácido indol butírico por acción de una sintasa (Figura 12-19)

Figura 12-19. Ruta metabólica del ácido 3-Indolbutírico

Dentro de las funciones tenemos: 1.- Promueven el crecimiento en tallos y coleóptilos. La elongación se produce por aumento de: a. extensibilidad de la pared: surgió así la “hipótesis del crecimiento ácido”: que sugiere que una de las principales acciones auxínicas es la de inducir a las células a transportar protones hacia la pared celular tanto por estimulación de H+ ATPasas existentes como por incremento en la síntesis de estas proteínas. La capacidad de los protones para provocar la pérdida de pared esta mediada por proteínas llamadas “Expansinas”, que rompen los puentes hidrógeno entre los polisacáridos de la pared. b. Captación de solutos. c. Síntesis y depósito de polisacáridos y proteínas: necesarias para mantener la capacidad de desgaste de la pared inducida por ácidos.

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2. Promueven la formación de raíces adventicias. 3. Inhiben el crecimiento en raíces en concentraciones bajas. 4. Promueven la dominancia apical (fenómeno por el cual las yemas apicales de muchas plantas presentan mayor crecimiento que las yemas laterales). Los brotes apicales inhiben el crecimiento de los brotes laterales (axilares), se cree que las auxinas convierten al ápice del tallo en un vertedero de citocininas provenientes de la raíz, lo que explicaría la dominancia apical. 5. Favorecen la floración. 6. Inducen la diferenciación vascular. 7. Retardan la abscisión de hojas, flores y frutos jóvenes. La abscisión es la caída de hojas, flores y frutos en plantas vivas. Este efecto está regulado por un balance hormonal que implica a las auxinas y al etileno, cuando el órgano vegetal (hoja, flor o fruto) es joven el balance favorece al AIA, que disminuye la sensibilidad al etileno (lo que retarda la abscisión), pero cuando el órgano vegetal envejece, disminuyen los niveles de AIA, y se incrementan la de etileno, por ello el balance hormonal termina por favorecer al etileno (que incrementa la abscisión) 8. Estimulan la formación de raíces adventicias de tallos y hojas. Por lo que comercialmente son usadas como hormonas de enraizamiento.

Hay evidencias de una biosíntesis de AIA independiente de L-triptofano (cuyos precursores son el indol y el indol-3-glicerol fosfato) en una planta mutante de maíz. Se comprobó que a pesar de que la mutante tiene 1/7 parte de triptofano que la cepa salvaje, tiene 50 veces más AIA que el maíz salvaje.

Receptores hormonales Las plantas, aunque carecen de sistema nervioso, poseen, al igual que los animales, un sistema hormonal de comunicación a larga distancia mediante el cual las células blanco traducen la señal hormonal en una respuesta específica. Estos receptores son proteínas que se unen de forma específica y reversible a la señal química; tras realizarse la unión experimentan un cambio conformacional, pasando de una forma inactiva a una forma activa, poniendo en marcha un programa molecular que conduce a la respuesta característica.

La búsqueda de receptores para auxinas en plantas se ha basado en el estudio de dos respuestas características: la proliferación de callos e inducción de raíces o tallos regulado por el balance auxinas / citocininas y la elongación del coleóptilo o secciones de tallo.

En callos desarrollados a partir de médula de tabaco se encontró que existían tres clases de proteínas que actuaban como receptores, perfectamente distinguibles por su capacidad de ligamiento y su localización. Dos de estás proteínas estaban ligadas a membranas y localizadas en el plasmalema, una de ellas presenta a pH 4 elevada afinidad con el ácido naftilftalámico (NPA), un potente inhibidor sintético del transporte de AIA: ligaría el AIA en la zona del plasmalema que limita con el citoplasma y lo transportaría a través de la membrana al apoplasto. La otra proteína tiene una afinidad mayor por el AIA 10-7 M a pH 5 y no liga NPA, se localiza en la parte exterior de la membrana plasmática, dada la elevada concentración de auxinas necesaria para la inducción de raíces en el callo de médula de tabaco y la baja afinidad de esta proteína por las auxinas naturales podría estar implicada en el proceso de regeneración radicular.

En fracciones solubilizadas de tejidos homogeneizados se localiza una tercera proteína citoplásmica / nuclear a muy baja concentración, con elevada afinidad por el AIA 2.5 nM a pH 7.5, superior a la de las proteínas de membrana, la existencia de esta proteína hace pensar que jugaría un papel análogo al que explica el mecanismo de acción de las hormonas esteroides en células animales: la auxina controlaría directamente la actividad transcripcional en el núcleo al acoplarse con el receptor citoplásmico / nuclear.

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En coleóptilos de maíz se han buscado receptores que ayudarán a explicar la respuesta más característica de las auxinas, es decir, la elongación celular, llegándose a la evidencia de que existen tres fracciones membranosas con capacidad de ligar auxinas. Estas fracciones son el retículo endoplásmico, el tonoplasma y la membrana plasmática. Para el receptor del retículo endoplásmico la constante de afinidad frente a ANA es 0.5-0.7 µM y la afinidad del receptor frente a varias auxinas y compuestos relacionados guarda bastante paralelismo con la actividad promotora del crecimiento de los mismos. A pesar de que en los coleóptilos de maíz el retículo endoplásmico es el receptor mayoritario en el control de la acción de la auxina sobre el crecimiento, en el caso de células de callo de médula de tabaco ya hemos visto que no se localiza ningún receptor en RE, por tanto no puede generalizarse que este receptor localizado en el RE sea el punto central para la acción de las auxinas.

Una vez que se ha producido la unión de la auxina, bien sea un único factor de unión o bien a varios, la percepción por la célula de esta unión debe traducirse en una respuesta. Varios laboratorios han abordado este problema mediante el estudio del efecto de las auxinas sobre la expresión génica (Theologis, 1986). Mediante el estudio de los promotores de los genes activados por las auxinas se están estudiando las primeras etapas de los mecanismos de acción de estas.

Las auxinas inducen un grupo específico de mRNAs. En la soja, el tratamiento con auxinas activa un grupo de genes que codifica para varios polipéptidos de pequeño tamaño (8-10 kDa) en 2-5 minutos. Estos pequeños mRNAs inducidos por las auxinas (small auxin upregulated mRNAs SAUR), también se expresan a los pocos minutos de haberse producido el estímulo geotrópico (Guilfoyle et al., 1992). Otros mRNAs también se activan además por calor (heat shock) y metales pesados y pueden estar implicados en aspectos más generales de la activación metabólica.

Las auxinas participan en una gran variedad de fenómenos dentro de la planta. Así en el desarrollo del fruto es consecuencia de la liberación de auxinas por la semilla. De hecho muchos cultivadores inducen el desarrollo del fruto en flores no polinizadas (frutos partenocárpicos) mediante la aplicación de auxinas a las flores. Otro fenómeno gobernado por las auxinas es la dominancia apical o inhibición del desarrollo de las yemas laterales por la yema apical. Este hecho parece estar producido por el transporte descendente de auxina. La caída de las hojas y frutos, así como la iniciación de la raíz, también parece ser gobernada por las auxinas. En el primer caso se ha observado que demora su desprendimiento, mientras que en el segundo estimulan la aparición de raíces, como es el caso de las raíces adventicias. Así, de manera de resumen, podemos concluir que las auxinas son las fitohormonas responsables de las nastias y tropismos. Como mencionamos anteriormente, el abanico de procesos gobernados por las auxinas es muy variado. Sin embargo, todavía falta estudiar los mecanismos de acción a nivel molecular, ya que no se conocen todos los componentes de señalización y respuesta.

12.3.2. Citocininas Son un grupo de hormonas que regulan la división celular. Derivan de la adenina o de aminopurinas. Las diferentes cadenas laterales se unen al nitrógeno del carbono 6. Pueden presentarse como: bases libres (que constituyen las formas activas de las citoquininas), o bien ribonucleósidos, ribonucleótidos y glicósidos (que se activan por conversión a la forma de base libre); también pueden hallarse como bases modificadas formando parte de los tRNA (aunque la cantidad de citoquininas derivadas de esta fuente carece de gran relevancia) La primera citocinina natural aislada fue la zeatina [N-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil)aminopurina] obtenida de granos de maíz (Zea mays).Una buena fuente de citocininas la constituyen los frutos y semillas

398 inmaduras y los hidrolizados de tRNA de plantas, animales y micoorganismos.Estructura de algunas citocininas naturales. La biosíntesis tiene lugar principalmente en el citosol de las células de meristemas apicales de raíz, y también en embriones jóvenes de maíz y hojas jóvenes en desarrollo. La cadena lateral deriva de la vía del acetato-mevalonato. El isopentenil pirofosfato se transfiere al AMP (derivado de la síntesis de purinas) por acción de la Citoquinina sintasa (una prenil transferasa similar a las de la síntesis de los terpenos). El isopentenil adenina ribonucleótido generado se transforma en las diferentes citoquininas, sin embargo muchas de las enzimas involucradas todavía no se han identificado.

Las provenientes del tRNA se forman durante el procesamiento del precursor del tRNA (existe una prenil transferasa diferente a la vista en la otra vía que reconoce una secuencia específica de bases, y no emplea AMP como sustrato). El catabolismo de auxinas tiene lugar principalmente por: • Conjugación: Conversión a ribonucleósidos o ribonucleótidos. Tambien pueden convertirse a glicósidos: éstos constituyen la principal forma de almacenamiento de las citoquininas. Degradación a adenina o sus derivados por acción de la citoquinina oxidasa. • Ubicación: Se las encuentra en tejido vascular, sobre todo en el xilema, en puntasde raíces, en frutos en desarrollo, en tejidos tumorales infectados por Agrobacterium tumefaciens, en semillas en germinación, en nódulos de raíces de leguminosas, en algas, bacterias y hongos. • Movilización: Las citocininas sintetizadas en las raíces son movilizadas (comoribonucleótidos principalmente) por el xilema hacia la hoja, donde se acumulan (enprimavera y principios del verano) o bien se desglicosilan cobrando actividad. Cuando las hojas alcanzan el máximo desarrollo, las citocininas son glicosiladas y luego exportadasvía floema a otros órganos, como los frutos.

Efectos fisiológicos: 1. Promueven la división celular. Asociadas a las auxinas favorecen el transcurso deG2a M.2. Promueven la formación y crecimiento de brotes laterales (axilares). Es decir que vencen la dominancia apical.

12.3.3. Giberelinas Las giberelinas (GA) son esencialmente hormonas estimulantes del crecimiento al igual que las auxinas, coincidiendo con estas en algunos de sus efectos biológicos.

1. Estimulan la elongación de los tallos (el efecto más notable). Debido al alargamiento de las células más que a un incremento de la división celular, es decir que incrementan la extensibilidad de la pared, este efecto lo consiguen con un mecanismo diferente al de las auxinas, pero es aditivo con el de estás. Uno de los mecanismos más estudiados involucra la activación de la enzima XET (Xiloglucano endo transglicosilasa), responsable de la hidrólisis interna de los xiloglucanos, lo que permite la transferencia de un extremo cortado hacia un extremo aceptor libre de una molécula de xiloglucano aceptora. Esto también facilitaría la penetración de las expansinas en la pared celular.

2. Estimulan germinación de semillas en numerosas especies, y en cereales movilizan reservas para crecimiento inicial de la plántula. Las semillas se encuentran encerradas en una pared celular (proveniente del fruto) llamada “pericarpo testa”. (1) Las GAs son sintetizadas por los coleóptilos y el escutelo del embrión, y liberadas al endosperma amiláceo. (2) Las GAs difunden hacia la capa de aleurona (3) las células de la aleurona son estimuladas para sintetizar y secretar α-amilasa y otras hidrolasas hacia el endosperma amiláceo. (4) El almidón y otras

399 macromoléculas se degradan hasta pequeñas moléculas sustrato. (5) Esos solutos son captados por el escutelo y transportados hacia el embrión en crecimiento {Emons, 1993 #546}.

3.- A nivel de las células de la aleurona, en semillas de cereales estimulan la síntesis y secreción de α-amilasas, y la síntesis de otras enzimas hidrolíticas (por ejemplo β-1,3-glucanasa y ribonucleasa). La unión de GA a su receptor membranal produce la activación de la proteína G de membrana, lo que deriva en: (I.) una vía de transducción dependiente de Ca+2 que involucra a la aalmodulina y a proteínas cinasas, que favorecen la exocitosis (hacia el endosperma) de vesículas cargadas de α-amilasa; (II.) una vía de transducción independiente de Ca+2, que involucra al GMP cíclico como segundo mensajero, activando un intermediario de transducción proteico, que a nivel del núcleo favorece la degradación del represor genético, que impide la expresión del gen GA-myb; la proteína GA-myb es un factor de transcripción que favorece la expresión de genes que codifican la biosíntesis de α-amilasa (y otras enzimas hidrolíticas) que se almacenan en vesículas para su posterior exocitosis.

4. Inducen la partenocarpia. Proceso por el cual se forma fruto sin fertilización. Las auxinas también producen partenocarpia, pero las giberelinas son más activas.

5. Reemplaza la necesidad de horas frío (vernalización) para inducir la floración en algunas especies (hortícolas en general).

6. Inducción de floración en plantas de día largo cultivadas en época no apropiada.

7. Detienen el envejecimiento (senescencia) en hojas y frutos de cítricos

Se puede decir que los primeras pasos de síntesis son comunes al camino biosintetico de poliisoprenoides; a partir de la Acetil CoA y por la vía del acetato mevalonato se forma isopentenil PP (IPP), que representa Ia unidad isoprénica base de estos compuestos. Luego continuará la síntesis con formación de geranil PP (GPP), farnesil PP (FPP)y geranil geranil PP (GGPP) (compuesto de 20 carbonos, dador de todos los carbonos de las giberelinas). Este compuesto se cicla para formar el ent-Kaureno o (-) Kaureno. Por acción de monooxigenasas (del tipo citocromo P450) el C19 de este compuesto es oxidado a alcohol (ent-Kaurenol), aldehído (ent-Kaurenal) y ácido ent-Kaurenoico, a nivel de la membrana del retículo endoplásmico. En un paso posterior el anillo B se contrae por expulsión del C7 pasando de un anillo de 6 Carbonos a otro de 5, formando el gibano, luego por oxidacion en C7 se forma el GA12 aldehído.

El aldehído GA12 se transforma en giberelinas tipo C19 mediante dos rutas, una que involucra la 13 hidroxilación temprana y otra donde no se hidroxila esa posición. En ambas vías hay descarboxilación y reacciones catalizadas por oxidasas de membrana y citosólicas {Kaur, 1998 #447; Stoll, 1998 #51}.

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Figura 12-20. Síntesis de giberelinas. a) Posibles rutas de la síntesis de los isoprenoides en plantas. La ruta citosólica o ruta del mevalonato (MVA) y ruta plástidica o ruta del metil-eritrol- fosfato (MEP) a partir de la vía acetato-mevalonato. b) Síntesis de las giberelinas a partir del ent- kaureno. http://4e.plantphys.net/article.php?ch=20&id=366

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Figura 12-21. Mecanismo de estimulación para la síntesis y secreción de enzimas hidrolíticas a nivel de la aleurona.

Su uso está limitado por su costo. Se usa para incrementar el tamaño de las uvas sin semillas haciendo que se elonguen los racimos, de modo que estén menos apretados y sean menos susceptibles a infecciones por hongos.

Para aumentar la producción de malta en cervecería, mediante efectos promotores de la digestión de almidón por las giberelinas.

Para aumentar la longitud de los tallos de la caña de azúcar, mejorando así el rendimiento.

12.3.4. Etileno Etileno es una hormona que afecta el crecimiento, desarrollo, maduración y envejecimiento de todas las plantas. Normalmente es producido en cantidades pequeñas por la mayoría de las frutas y vegetales. La acción del etileno es más lenta en temperaturas más bajas. A su más bajo nivel de temperatura, la fruta es básicamente inactiva y no responde bien al etileno aplicado

402 externamente. El etileno penetra en muchas sustancias. De hecho, penetra a cajas de cartón, madera (que son usadas para envío de los productos) y hasta paredes de concreto.

Mientras que el etileno es invaluable debido a su habilidad para iniciar el procesamiento de maduración en muchas frutas, este puede también ser muy dañino para otros, vegetales, flores y plantas ya que acelera el proceso de envejecimiento, disminuyendo así la calidad del producto y su vida de anaquel. El grado de daño depende de la concentración de etileno, tiempo que ha sido expuesto y temperatura del producto. Uno de los siguientes procesos debe ser usado para asegurar que los productos sensitivos al etileno no sean expuestos al mismo a) frutas que produzcan etileno (como manzanas, aguacates, plátanos, melones, melocotones, peras y tomates) deberán ser situados separadamente de los que son sensibles al etileno (brócoli, col, coliflor, hojas verdes, lechugas, etc.).

En general el etileno no es dañino o toxico para los humanos en las concentraciones que se encuentran en los cuartos de maduración.

12.3.5. Acido Abcísico La fitohormona Acido Abscisico (ABA) es una reguladora de procesos importantes como son el desarrollo de la semilla, dormancia y posterior germinación. También interviene en la respuesta adaptativa de tejidos vegetativos frente a estreses ambientales de sequía, salinidad y frío. Muchos de los efectos del ABA están mediados por cambios en la expresión génica principalmente a nivel de transcripción. Entre estos genes se encuentran los denominados LEA (late embryogenesis abundant), como el rab28. Este gen contiene en su promotor 2 elementos ABRE (ABA responsive element) necesarios para su inducción durante la embriogénesis y en respuesta al ABA. Estudios in vivo han mostrado que a estos elementos se unen factores de la familia bZIP. En este trabajo presentamos el aislamiento y la caracterización de dos factores de transcripción de la familia de las bZIP, denominados EmBP-2 y ZmBZ. Se ha analizado la expresión de los factores a nivel de mRNA y de proteína, su interacción in vitro con los elementos ABRE del gen rab28, su actividad in vivo sobre la expresión del gen rab28 en tejidos embrionarios y vegetativos y los mecanismos que pueden modificar su actividad, como el estado de fosforilación y su localización subcelular. Nuestros resultados apuntan a que estos factores tienen un papel regulador de la expresión del gen rab28 a través del elemento ABRE. 12.3.6. Resumen de hormonas como reguladoras del desarrollo vegetal Las hormonas integran el crecimiento, desarrollo y actividades metabólicas en los distintos tejidos de una planta. Son típicamente activas en cantidades muy pequeñas. Las hormonas se consideran reguladores bioquímicos endógenos. La respuesta a un "mensaje" regulador determinado depende no sólo de sus características (o sea de su estructura química) sino también de la identidad del tejido específico u órgano blanco sobre el que actúa y de cuándo y cómo se recibe. Además, la respuesta a cualquier hormona dada es influida por una variedad de otros factores del ambiente interno del organismo, entre los cuales cabe destacar el efecto conjunto de otras hormonas. Se conocen cinco tipos principales de hormonas vegetales, o reguladores del crecimiento: las auxinas, las citocininas, el etileno, el ácido abscísico y las giberelinas. La evidencia reciente sugiere que otros compuestos también funcionan como hormonas vegetales.

Las auxinas -ácido indolacético o AIA- son producidas principalmente en tejidos que se dividen rápidamente, como los meristemas apicales. Participan en muchas respuestas de las plantas, de las cuales la respuesta fototrópica es solo un ejemplo. Las auxinas provocan el alargamiento del vástago, promoviendo principalmente el alargamiento celular. En conjunción con la citocinina y el

403 etileno, las auxinas parecen intervenir en la dominancia apical, en la cual se inhibe el crecimiento de las yemas axilares, restringiendo así el crecimiento al ápice de la planta. En concentraciones bajas, las auxinas promueven el crecimiento de las raíces secundarias y de las raíces adventicias. En concentraciones más altas, inhiben el crecimiento del sistema principal de raíces. En los frutos en desarrollo, las auxinas producidas por las semillas estimulan el crecimiento de la pared del ovario. La producción disminuida de auxinas se correlaciona con la abscisión de frutos y hojas. La capacidad de las auxinas para producir estos variados efectos parece resultar de las diferentes respuestas de los distintos tejidos "blanco" y de la presencia de otros factores, incluyendo otras hormonas.

La citocininas promueven la división celular. Alterando las concentraciones relativas de auxinas y citocininas, es posible cambiar los patrones de crecimiento de un tejido vegetal indiferenciado.

Figura 12-22. La respuesta de las células de tabaco en cultivo de tejido a combinaciones de auxina (AIA) y citocinina (cinetina). Las concentraciones de AIA (en miligramos por litro) se indican en las curvas.

La cinetina sola tiene poco efecto en el crecimiento del tejido indiferenciado de tabaco (un callo). El AIA sólo hace que el cultivo crezca hasta un peso de aproximadamente 10 gramos, independientemente de la concentración usada. Cuando ambas hormonas están presentes, el crecimiento se incrementa en gran medida. Nótese, sin embargo, que cuando se exceden las concentraciones óptimas, la tasa de crecimiento declina.

El etileno es un gas producido por los frutos durante el proceso de maduración, proceso que ese mismo gas promueve. Desempeña un papel central en la abscisión de las hojas y se piensa que es un efector de la dominancia apical.

El ácido abscísico, una hormona inhibidora del crecimiento, puede estar involucrado en la inducción de la dormancia en las yemas vegetativas y en el mantenimiento de la dormancia de las semillas.

Las giberelinas estimulan el alargamiento del vástago, inducen el repentino crecimiento y floración de muchas plantas y también están implicadas en el crecimiento del embrión y de la

404 plántula. En las gramíneas estimulan la producción de enzimas hidrolíticas que actúan sobre el almidón almacenado, los lípidos y las proteínas del endosperma, convirtiéndolos en azúcares, ácidos grasos y aminoácidos que nutren a la plántula. Figura 9.29

Figura 12-23. La acción de la giberelina en una semilla de cebada.

En la anterior figura se puede ver que el embrión libera giberelina que difunde hacia la capa aleurónica. La giberelina hace que las células de aleurona sinteticen enzimas que digieren las reservas alimenticias del endosperma convirtiéndolas en moléculas más pequeñas. Estas moléculas son transportadas a las regiones del embrión en crecimiento.

Tabla 12-1. Las principales hormonas y sus efectos

405

12.4. Desarrollo reproductivo de maíz Tarea 12-3. Haga una búsqueda bibliográfica y averigüe las particularidades de la reproducción y desarrollo en maíz. Tarea 12-4. Haga un dibujo comparando el ciclo reproductivo de animales con el de plantas superiores. Ponga especial énfasis en la fase gametofítica, y en la doble fecundación que solo se da en plantas. Indique en que etapas se da la meiosis, y la mitosis.

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13. Transferencia Genética 13.1. Transferencia sexual TRANSFERENCIA VERTICAL VS. TRANSFERENCIA HORIZONTAL La información genética se transmite de padres a hijos verticalmente. La recombinación es la unión de la información genética de dos individuos por medio de la reproducción sexual. Visto así, se trata de un mecanismo transmisión de información. La probabilidad de que dos alelos existan en estado homocigoto (digamos AA y BB) en un mismo individuo a partir de otro aabb y sin que haya recombinación mediada por la reproducción sexual será la probabilidad de que "A" mute a "a" al cuadrado multiplicada por la probabilidad de que B mute a "b" al cuadrado. El efecto de la recombinaciones entonces aumentar la probabilidad de aparición de combinaciones genéticas en varios órdenes de magnitud. Este efecto se hace más manifiesto si consideramos una mayor cantidad de genes determinando el fenotipo sujeto a estudio. Para varios genes el fenómeno se hace con una probabilidad de un millón de veces más que si consideramos únicamente dos genes. Cada gene que agregamos, por su efecto en un fenotipo poligénico, incrementa la relevancia de la recombinación en seis órdenes de magnitud al ser comparada con la mutación como fuente de variación genética. Algunos fenotipos resultan afectados por decenas de genes y esto causa que la relevancia de la recombinación en tales casos sea muy clara.

TRANSFERENCIA DE GENES VS. TRANSFERENCIA DE GENOMAS. Uno de los aspectos más interesantes a considerar es la diferencia en cuanto a su mecanismo y las implicaciones que tiene la transferencia de un gene para aquélla de todo el genoma. Si recordamos, la especie es comúnmente definida como aquel grupo de individuos que comparten la misma poza génica. En este caso, la transferencia horizontal específica es una vía de la reproducción sexual que junto con la recombinación, constituyen fenómenos comunes; pero no es tan común, si consideramos que la transferencia se lleva a cabo entre individuos de especies diferentes. Esta transferencia cuando existe, llega a desempeñar un impacto central sobre la manera de generar nueva variabilidad.

La teoría endosimbiótica del origen del cloroplasto y la mitocondria es un típico caso de esta clase de transferencia. Aquí no sólo se rebasan las barreras entre especies, sino que la cantidad de material genético que se moviliza es tal, que la variante producida crea una novedad que difícilmente se obtendría de otra manera. Existen especies de bacterias y de otros organismos que no tienen reproducción sexual; en la mayoría de ellas, la recombinación no presenta un papel importante cuando se consideran genes localizados en el cromosoma 27. El mismo principio no parece aplicarse al estudiar los genes presentes en plásmidos (genomas circulares físicamente independientes del cromosoma), en los cuales se han localizado, por ejemplo, los genes responsables de la resistencia a algunos antibióticos y que pueden ser transferidos en forma horizontal.

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Una pregunta que parecería central para abordar este problema, en poblaciones naturales, es ¿cómo se puede detectar la transferencia horizontal y cómo sería posible estimar la tasa de ocurrencia en la naturaleza?

DETECCIÓN DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL Un experimento que se antoja útil para detectar la transferencia horizontal consistiría en usar a un organismo marcado con ciertos genes e introducirlo a una población con otros marcadores genéticos, registrando así, el paso de ellos entre las cepas. Por lo que el experimento podría hacerse con mayor factibilidad en bacterias, dado lo breve de su ciclo de vida, para una revisión asi la tasa de transferencia y la tasa de fijación combinadas es del orden de la tasa de mutación como se ha sugerido para genes cromosomales en bacterias, digamos10 9 éste fenómeno sería difícil de detectar sobre todo si consideramos que el marcador genético puede aparecer en la población con esa misma tasa. Si se quisiera obtener un nivel de sensibilidad mayor, entonces Comentario [ATF20]: A qué se pueden usar tres marcadores genéticos, detectando el paso de dos de ellos que estén se refiere ligados; en cambio, si la tasa es mayor y se utiliza una fuerte presión selectiva para hacer que la tasa de fijación sea igual a uno, entonces esté enfoque puede ser usado para detectar la transferencia, pero si no se halla de esta manera, hay que argumentar las siguientes razones: a) el gene o los genes que se utilizaron probablemente estén localizados en regiones del genoma que no se transfieren o bien, b) la sensibilidad de la metodología usada tal vez no sea eficaz para revelar valores mínimos de transferencia. 13.1.1. Cruzas entre individuos de la misma especie El concepto de especie se presenta como un concepto absolutamente clave, pero en la práctica no resulta un asunto trivial determinar cuando debemos considerar a un grupo de individuos como pertenecientes a la misma especie y cuando no. Una extraordinaria disparidad morfológica no asegura que dos individuos pertenezcan a especies distintas. Por ejemplo en las hormigas hay distintos tipos de individuos en una misma colonia, o individuos de ciertas especies que cambian su aspecto dependiendo del biotopo donde viven, o variedades obtenidas por selección artificial. El caso de los perros y sus razas es muy llamativo. De un gran danés, a un mastín, o a un caniche enano hay tanta variabilidad morfológica, que luego, cuando nos dicen que dos peces pertenecen a especies distintas porque uno de ellos tiene un hueso interno con una forma ligeramente distinta, nos desconcierta y nos hace preguntarnos por qué son especies distintas si son tan parecidos.

Tampoco el caso contrario de total coincipencia morfológica entre dos individuos permite asegurar que pertenezcan a la misma especie. Esto desconcierta a mucha gente y ocurre porque no hemos entendido el concepto de especie que intentaremos definir a continuación.

Los individuos de una misma especie son individuos que componen una población donde todos comparten un mismo legado genético que está sometido a un libre intercambio genético de forma preferente entre individuos de su misma especie, de forma que dicha población de individuos evolucionará y se adaptará a su entorno natural de forma independiente a la de otras poblaciones. Esta no es la única definición posible, pero la idea subyacente en muchas definiciones ampliamente aceptadas es esta. Es importante recalcar que el concepto de especie está ligado al de poblaciones donde se intercambian genes entre ellos y no meramente al aspecto de los individuos.

Esta definición sólo es aplicable a las especies de animales y plantas que se reproducen sexualmente Gracias a esta definición, podemos ya descartar varios casos de individuos que no podrán pertenecer a una misma especie. • Si los machos y las hembras no pueden procrear porque hay una incompatibilidad a nivel genético, queda claro que no son de la misma especie. Ya es algo pero con eso no

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hemos adelantado mucho, porque eso únicamente ocurre entre especies que están bastante alejadas entre si. • Si la descendencia de dos individuos pertenecientes a poblaciones distintas da lugar a híbridos estériles que no pueden procrear como el caso de los mulos, significará que los padres tampoco son de la misma especie porque ambos grupos poblacionales presentan una barrera a nivel genético que a la postre, igual que en el caso anterior, les impide el libre intercambio de genes a nivel poblacional. • La cosa se vuelve menos evidente cuando intentamos cruzar individuos de distintas poblaciones y obtenemos una descendencia fértil. Si los padres se consideran especies distintas se tratara de híbridos fértiles y si los padres son simplemente razas distintas los consideraremos una raza mestiza, pero el criterio de fertilidad genética en este caso no nos sirve para discernir si estamos ante un caso de especies distintas o de razas distintas de una misma especie.

13.1.1.1. Meiosis y fecundación En las plantas con flor, podemos reconocer estructuras masculinas y femeninas. El grano de polen (que se encuentra en las anteras de las flores) posee los gametos masculinas. Estos gametos deberán llegar hasta las estructuras femeninas de la misma u de otra flor para dar lugar al embrión. Todas las plantas con flor poseen estructuras reproductivas de ambos sexos. La parte masculina está compuesta por los granos de polen contenidos en las anteras y la femenina por el óvulo que se encuentra en el interior del ovario de la flor. La fecundación es la unión del gameto masculino, llamado anterozoide, con el gameto femenino, denominado oósfera, la cuál se encuentra en el ovario de la flor. Como estas dos células son haploides, su unión dará origen a un embrión diploide que se encuentra dentro de la semilla. En las plantas, la fecundación es algo más compleja, ya que este embrión -como los de todos los organismos- necesita de sustancias de reserva para desarrollarse; y a diferencia de los animales, las sustancias de reserva que lo nutren deberán estar contenidas en la misma semilla.

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Figura 13-1.El grano de polen formando el tubo polínico.

Para alcanzar la gameta femenina (oósfera), el grano de polen primero se deposita en el estigma y luego avanza hasta la parte inferior del carpelo (a través de un tubo que él mismo genera llamado tubo polínico) hasta llegar a la oósfera (Figura 13-1).

En el grano de polen existen dos tipos de células: la vegetativa, cuyo núcleo gobernará el crecimiento del tubo polínico, y otra muy pequeña, la generativa, la cuál se dividirá para producir dos gametas masculinas. El tubo polínico crece atravesando el estigma y el estilo, llevando en su extremidad el núcleo de la célula vegetativa, seguido por el núcleo de la célula generativa.

El crecimiento del tubo continúa por el estilo, nutriéndose a expensas de sus tejidos, y dirigiéndose al ovario. Luego prosigue por las paredes del ovario hasta llegar al óvulo.

En las plantas, el óvulo está formado por siete células, de las cuales las más importantes son el gameto femenino (oósfera) y otra célula de mayor tamaño que contiene dos núcleos llamados núcleos polares. (Figura 13-2)

Cuando el tubo polínico llega hasta el óvulo, uno de los gametos masculinos se fusiona con la oósfera para dar la cigota (diploide), a partir de la cual se formará luego el embrión por sucesivas mitosis; mientras que el otro gameto se une con los núcleos polares para dar la célula madre del endospermo (triploide). A partir de esta célula, también por mitosis, se formará el endospermo, tejido que almacena las sustancias de reserva de la semilla.

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Figura 13-2. La fecundación. Figura del gineceo.

13.1.2. Cruzas entre especies diferentes El tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproducción sexual. La transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en inglés) consiste en la transmisión del genoma, o parte de este, de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia

Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugación bacteriana, descubierto a mediados del siglo pasado, en la que una célula transfiere información genética a otra diferente con la mediación de plásmidos. Estos procesos son muy importantes como fuente de variación genética, equivalentes en cierto modo a la recombinación cromosómica de los organismos con reproducción sexual. Sin embargo, la HGT en bacterias iría más allá, dado que también se produce transferencia genética entre especies alejadas filogenéticamente, lo cual permite la formación de genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos.

El papel de la HGT en la evolución es uno de los puntos más activos de discusión en biología evolutiva. Desde aquellos que la consideran una fuente más de variación genética, hasta algunos investigadores que creen que nos hallamos ante un nuevo paradigma biológico, que no se limitaría a completar la nueva síntesis evolutiva, sino incluso a sustituirla en buena parte.

La transferencia horizontal de genes en plantas y animales

411

Como nos referimos más arriba, la transferencia de genes bacterianos a genomas de eucariotas, parece estar facilitada por endosimbiontes, desde las mitocondrias y plastos (Margullis, 1967; 1970; Gupta, 2000), pasando por los bien conocidos procesos de transmisión bacteriana a algunos hongos como Saccharomyces o la bacteria Wolbachia pipientis en la línea germinal de algunos eucariotas. Gupta (2000), también describe importantes parentescos entre genes implicados en la transmisión genética en eucariotas y arqueobacterias, así como los implicados en el metabolismo celular eucarita y las eubacterias. Recientemente se ha comprobado la integración del genoma de Wolbachia en insectos y nemátodos en porciones de tamaño variable, desde 500 pares de bases hasta el genoma completo de la bacteria. También recientemente, ha sido referida la transferencia horizontal de genes bacterianos en rotíferos (Gladyshev, Meselson & Arkhipova, 2008). Algunos de estos genes no son operativos en el organismo receptor, pero otros sí son transcritos, indicando que este fenómeno representa un mecanismo real para la adquisición de nuevos genes.

La incorporación de genoma vírico a las células procariotas y eucariotas se ha revelado también en los últimos años como un fenómeno no solo habitual, sino importantísimo en la incorporación de genes reguladores de la expresión e incluso, codificadores de proteínas muy similares en distintos grupos animales, y tan variadas como las DNA polimerasas (Villareal & DeFilippis, 2000), proteínas involucradas en el desarrollo de la placenta (MI et al., 2000), en los procesos autoinmunitarios o en la espermatogénesis (Jamain et al., 2001).

Algunos autores afirman que la explicación a la presencia de genes reguladores similares en diferentes grupos de organismos -como los genes HOX, implicados en el control del desarrollo embrionario (Ronemus y Martienssen, 2005)- podrían tener un origen vírico (Sandín, 2000, 2002). Se ha llegado a calcular que entre el 60 y el 80% de los intrones (genes no codificadores de proteínas) de animales contemporáneos fueron adquiridos por inserción después de la divergencia evolutiva de animales y plantas (Fedorov et al. 2003).

Trabajos recientes apuntan hacia el hecho de que virus y bacterias no se limiten a transferir sus propios genes al organismo eucariota, sino que puedan servir de vectores para el intercambio genético entre distintos huéspedes, incluso alejados filogenéticamente entre si. Esto podría suponer un mecanismo de recombinación global, infinítamente más poderoso en la generación de variación que la tradicional recombinación cromosómica en la meiosis.

A pesar de que la controversia sobre el origen de los virus es tan antigua como su descubrimiento, estos últimos datos alimentan la hipótesis de que las partículas virales pudieran ser fragmentos de ADN o ARN independizados de las células, aunque otros autores opinan que los virus no solamente no proceden de estructuras celulares, sino que tienen una función vital para la evolución (Sandín, 1998).

En cualquier caso, los virus e incluso las bacterias podrían representar un verdadero sistema de mensajería interespecífica, y no únicamente un sistema de transmisión unidireccional. Las consecuencias de esto, obviamente, son importantísimas para la biología evolutiva.

¿Es incompatible la transmisión horizontal de genes con la teoría sintética?

Muchos autores asumen estos mecanismos, incluso los más complejos, como una fuente más de variación (Kidwell & Lisch 1997), sobre la que la selección natural trabajaría posteriormente del modo habitual, de igual forma que la endosimbiosis (Margullis, 1995).

412 críticas se basan más en motivos que podríamos llamar filosóficos, presentando un rechazo visceral -y habría que decir poco científico- al concepto de competencia y selección del “más apto” sin detenerse en explicar cual sería el mecanismo alternativo de selección de toda esta inmensa variabilidad producida por los incansables mensajeros.

Particularmente, quizá se trate de un enfoque más integrador el que la propia Margullis (1995) realiza sobre la simbiogénesis -que podría considerarse como la transmisión horizontal total “Eventualmente, tenemos que comprender que la selección natural opera, no tanto actuando sobre mutaciones al azar, que son a menudo dañinas, sino sobre nuevas clases de individuos que evolucionan por simbiogénesis” por incorporación de genes o incluso genomas completos. Un burro macho puede ser cruzado con una yegua y producir una mula (mulo si es macho), y un caballo macho puede ser cruzado con una burra y producir un burdégano.

Los mulos son extraordinariamente dóciles, fuertes y resistentes (al contrario de las mulas que generalmente son intratables), por lo que se consideran unos animales particularmente valiosos a la hora de llevar cargas pesadas durante largas distancias, sobre todo en terrenos montañosos y desérticos; antiguamente solían transportar el agua usada por el servicio de bomberos para apagar los incendios, ya que su desarrollado sentido de la obediencia prevalece incluso sobre el miedo natural al fuego. A esta característica de ser más resistentes que sus progenitores, los cuales son en este caso especies distintas, se denomina vigor híbrido.

Figura 13-3. La mula, sirve para cargar al ser más fuerte que el burro.

Los burdéganos, en cambio, son bastante pequeños y débiles. Aunque menos comunes, también se han conseguido híbridos de asnos domésticos y varias especies de cebras, conocidos como ceburros o cebrasnos. Todos estos híbridos son estériles, ya que las especies del género Equus tienen diferente número de cromosomas. Así, los caballos, que tienen 64 cromosomas, y los burros, que tienen 62, producen crías con 63 cromosomas.

Figura 13-4. El trigo.

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Las gramíneas conocidas como "parientes silvestres" del trigo estuvieron expuestas al frío, la sequía, el calor, el anegamiento y todo tipo de enfermedades y plagas. Las especies que hoy sobreviven resistieron esos flagelos y adquirieron una protección genética casi invencible. Ahora una estrategia de pre-mejoramiento recupera este patrimonio genético para los trigos harineros. Estas gramíneas resistentes no son sólo parientes del trigo, sino también sus antepasados. Los cruzamientos espontáneos entre especies diferentes dieron origen a trigos primitivos que los seres humanos comenzaron a sembrar y seleccionar hace miles de años. Cuando el trigo se domesticó, adquirió la capacidad de producir granos más grandes y numerosos, pero perdió una buena parte de la protección genética duramente ganada por sus antepasados. (http://www.cimmyt.org/whatiscimmyt/AR99_2000Spa/futuro/recuperacion/)

El trigo es la planta más cultivada del mundo, y de las primeras históricamente, posiblemente porque sus granos contienen los cinco nutrientes: carbohidratos, proteínas, grasas, minerales y vitaminas. Pero esto es sólo un poco de lo que usted debe saber acerca de esté cereal. El trigo es probablemente el primer cereal que fue cultivado por la humanidad), se encontraron granos de trigo carbonizados de hace 6,700 años en la localidad Jarmo (Irak), poblado más antiguo de los descubiertos hasta ahora y uno de los lugares donde naciera la agricultura.

Otra investigación indica que el lugar de origen del trigo es la actual Etiopía (en el continente africano), el cual se cultivaba en esa zona hace aproximadamente ocho mil años. Lo cierto es que fueron los griegos los que molieron el grano hasta obtener harina y con ella fabricaron pan, tras ponerla a cocer en hornos diseñados para tal fin. Posteriormente, en esta forma de alimento llegó a Egipto y se constituyó en elemento esencial de la dieta de sus pobladores, quienes sofisticaron la forma de hacer harina, incorporándole mantequilla, leche, huevos y miel para hacer panes de distintas formas, tamaños y sabores. A América, los trajeron los ingleses a Estados Unidos, y los españoles a México y el resto de Latinoamérica.

El trigo es una planta gramínea de la familia del césped. Presenta espigas que contienen los granos;que a su vez tienen una envoltura o cáscara (epispermo), llamada afrecho. El afrecho está formado por seis capas distintas, las cuales son ricas en celulosa, hierro, fósforo, calcio, magnesio, fluor y vitaminas del complejo B. En su interior se encuentra el germen o embrión que contiene proteínas, fibra cruda, aceites, vitamina E y B, además del ácido graso llamado linoleico que actúa en los casos de exceso de colesterol en la sangre.

Un elemento más que forma parte del trigo es el gluten, compuesto que cuenta con alto contenido de proteínas a las que se divide en dos grupos: glutelinas, comunes en todo cereal, y prolaminas, de las que cada grano posee un tipo único, gliadina. Ahora bien, del trigo se aprovecha todo como unidad o bien por separado. Por ejemplo, la cáscara o salvado es excelente proveedor de fibra, proteínas, vitaminas y minerales; se puede encontrar en el mercado desde casi entero hasta molido muy fino, y puede mezclarse con diversos jugos de frutas y verduras, o bien ser ingrediente de panes, pastas o galletas.

Por otra parte, se llama sémola a la trituración del grano de trigo junto a pequeñas cantidades de cáscara; se utiliza como pasta para sopa e incluso para postres.

13.1.3. Poliploidia en el reino vegetal

13.1.3.1. El maíz como especie autotetraploide

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13.2. Organismos Genéticamente Modificados 13.2.1. Transferencia por Agrobacterium Agrobacterium es una proteobacteria alpha de la familia Rhizobiaceae, la cual también incluye a las fijadoras de nitrógeno que viven en simbiosis con las legumbres. A diferencia de estas, Agrobacterium es un parásito y causa grave daño a la planta afectada (Figura 13-5).

Figura 13-5. Infección de Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria que causa en las plantas dicotiledóneas unos tumores conocidos como "agallas" o "tumores del cuello", que crecen en la zona donde se unen la raíz y el tallo (cuello).

Es de notar que Agrobacterium no es ni el único ni el más común causante de tumores en las plantas. Muchos pueden ser causados por insectos o larvas que segregan ciertas sustancias que producen el mismo efecto aparente, sin embargo la capacidad de transmisión de DNA por el Agrobacterium está siendo extensamente explotada en biotecnología, como medio de insertar genes foráneos dentro de las plantas y desarrollar organismos modificados genéticamente. Se trata entonces de un vehículo óptimo para operaciones de ingeniería genética. Entre los transgénicos creados por este método están las plantas productoras del insecticida Bt, una toxina originalmente producida por el Bacillus thuringiensis.

La bacteria se guía por las sustancias que la planta excreta de heridas pequeñas, por las que se introduce. Se ubica entonces en los espacios intercelulares y desde allí transfiere a las células de la planta un fragmento de su material genético, un plásmido (DNA circular extracromosómico bacteriano) para transferir un segmento conocido como T-DNA, que se integra en alguna zona del genoma de la planta.

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Figura 13-6. Mecanismo de infección de Agrobacterium tumefaciens.

Este T-DNA insertado por el Agrobacterium contiene genes que provocan la producción de reguladores del crecimiento vegetal, de lo cual resulta el desarrollo del tumor. El T-DNA también contiene genes codificadores de enzimas que causan que la planta produzca aminoácidos especializados llamados opinas. Estos son una fuente de energía específica para A. tumefaciens, pero no para otros organismos (Figura 13-6).

13.2.2. Transferencia por Biobalística

13.2.3. Vectores virales para expresión transiente 13.2.4. Legislación sobre los OGM en Latinoamérica Marco jurídico de bioseguridad. Situación Legal

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• Ventajas y desventajas de los OGM Ventajas científicas para investigación Ventajas económicas en su aplicación Punto de vista del agricultor Punto de vista del consumidor

13.3. Divergénicos 13.3.1. Definiciones

¿Qué es un transgénico? El término “transgénico” significa la inclusión de un gen extraño a un organismo. Normalmente usamos el prefijo “trans” cuando atravesamos distancias. Por ejemplo, un viaje trasatlántico es cuando cruzamos un océano muy grande, mientras que una trans-fusión sanguínea es cuando un enfermo recibe sangre de otra persona. Decimos que trans-portamos productos o trans- mitimos mensajes. En el contexto biotecnológico, un trans-génico es cuando se transfiere un pedazo de DNA de una célula a otra. Por ejemplo, introducir el gen de una bacteria a una planta de maíz.

La definición legal de transgénicos no solo esta basado en la técnica para introducir los genes, sino que además implica forzosamente que el científico estuvo consciente. Cuando los genes se introducen sin la intervención activa del ser humano, por ejemplo cuando las bacterias absorben por sí solas los pedazos de DNA o cuando las agrobacterias del suelo transforman en el campo a las plantas, o cuando los virus infectan a los organismos, entonces no se les llama transgénicas. Por ejemplo, muchos virus se integran en los cromosomas de animales y plantas, pero como no es un proceso que se supervisa por un científico en un laboratorio, entonces no se les cataloga como organismos transgénicos desde el punto de vista legal. Sería un poco complicado si consideráramos a todos los organismos o células que tienen dentro un gen extraño como transgénicos, ya que tendríamos que decir que nos hemos vuelto transgénicos cada vez que tenemos una gripa. Es decir, transgénico tiene que ver con el gen extraño y con la técnica, pero también con 'laboratorio'.

Si bien muchos de nosotros hemos escuchado hablar sobre los transgénicos, a veces se trata de opiniones, más que de noticias o información fidedigna. Para formarnos una idea propia sobre un tema, primero es necesario entender todos los términos y sus definiciones. Si bien ya se dijo lo que es un transgénico, es muy importante notar que el concepto “divergénico” es similar pero no idéntico. La palabra “divergénico” es más amplia, ya que además de los genes extraños también incluye las nuevas combinaciones de genes, mutaciones, hibridaciones y demás modificaciones genéticas y genómicas. En la definición del término transgénico, no importa si el organismo o el gen es beneficioso o no para el ser humano, siendo la metodología que se utilizo para introducir el gen la que define a los organismos transgénicos. Por ejemplo, cuando se utiliza una pistola de presión o si se usan agrobacterias para transformar las plantas. Si consultamos la legislación sobre bioseguridad que se ha implementado en algunos países, veremos que el común denominador sobre la definición de los transgénicos es la tecnología y procedimientos que se aplican. En otras palabras, las definiciones no dicen que es un transgénico per se, sino más bien, como se hace un transgénico. Es decir, no importa el resultado, sino el método. Esta forma de definir es fácil y sencilla, pero también puede ser un poco ambigua, y a veces hasta problemática.

Por ejemplo, podríamos definir a un automóvil como un objeto que se produce en la fábrica de Ford usando la tecnología de producción en masa. Muy fácil, ¿o no? Entonces, ¿dónde esta el

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problema? Si somos consecuentes, entonces, si de la Fábrica de Ford sale una bicicleta, de todos modos se le tendría que considerar como automóvil, aunque no tenga motor. Al mismo tiempo, lo que se produzca fuera de la fábrica de Ford no se consideraría como automóviles, aunque tengan cuatro ruedas y motor. Exactamente ese es el problema legal con los transgénicos. Aunque no contengan un transgen sino solo un gen propio en sentido contrario de todos modos se les considera como transgénico. En cambio, el trigo harinero es una planta que contiene cromosomas no solo de una o dos, sino de tres especies diferentes, y sin embargo, el trigo no se considera una planta transgénica, ¿o sí?

¿De dónde viene la palabra divergénico? La palabra se deriva de diversidad y de genética. Se parece a la palabra divergencia, que significa una división de algo en dos o más partes. Un organismo divergénico es aquel que contiene una nueva secuencia de DNA o una nueva combinación de genes. El término describe el aumento de la variabilidad biológica, uno de los procesos básicos de la evolución. La diversidad genética es la base de la riqueza de las selvas tropicales y los ambientes naturales. La diversidad biológica, además de ser algo estético, es un valor práctico ya que al incrementar la flexibilidad de los ecosistemas se disminuyen los riesgos a largo plazo. Es decir, la diversidad es la esencia de la sostenibilidad. La diversidad es algo que se agota por la selección natural, y es por ello que tiene que ser constantemente renovada.

¿En qué se diferencian transgénico y divergénico? A diferencia de la palabra transgénico, que significa la inclusión de un gen extraño a un organismo, el concepto divergénico es más amplio, incluyendo las nuevas combinaciones de viejos genes, mutaciones, hibridaciones y demás modificaciones genéticas y genómicas. En la definición del término transgénico, no importa si el organismo o el gen es beneficioso o no para el ser humano, siendo la metodología que se utilizo para introducir el gen a la célula la que define a los transgénicos. En la definición del término divergénico, no importa las condiciones ni los procesos que llevaron a esa nueva diversidad genética, siendo el resultado final el que determina si un organismo es divergénico o no. Para que se pueda llamar divergénico, se tiene que cumplir los tres requisitos esenciales: 1) nueva diversidad, 2) beneficioso para el ser humano y 3) no estar patentado. Digamos entonces que para algunas personas el hecho de generar plantas hexaploides con miles de genes de especies distintas es algo habitual, mientras que introducir un gen es algo tan extraordinario, que es necesario restringirlos. Ya que es un producto de la fabrica Ford, las autoridades exigen que se cumplan todas las normas y reglamentos de los automóviles, aunque se trate solo de una bicicleta. Entre más lo analicemos, más nos daremos cuenta de lo absurdo que es la legislación actual sobre los transgénicos. Aunque el producto de una cruza sexual, una mutación o una modificación genética sea el mismo, el método de obtenerlo es lo que determina si se considera silvestre o transgénico

En la definición de los divergénicos, no importa las condiciones ni los procesos que llevaron a esa nueva diversidad genética, siendo el producto final el que determina si un organismo es divergénico o no. Para que se pueda llamar divergénico, se tiene que cumplir tres requisitos esenciales: 1) nueva diversidad, 2) beneficioso para el ser humano y 3) no patentado.

Nota 1: la definición legal de transgénicos no solo esta basado en la técnica para introducir los genes, sino que además implica forzosamente que el científico estuvo consciente. Cuando los genes se introducen sin la intervención activa del ser humano, por ejemplo cuando las bacterias absorben por si solas los pedazos de DNA o cuando las agrobacterias del suelo transforman a las plantas en el campo, o cuando los virus infectan a los organismos, entonces no se les llama transgénicas. Por ejemplo, muchos virus se integran en los cromosomas de animales y plantas, pero como no es un proceso que se supervisa por un científico en un laboratorio, entonces no se les catalogiza como organismos transgénicos desde el punto de vista legal. Sería un poco

418 complicado si insistiéramos en que cada organismo o célula que tiene un gen extraño es transgénica, ya que tendríamos que decir que nos hemos vuelto transgénicos cada vez que tenemos una infección viral. Es decir, transgénico tiene que ver con el gen extraño y con la técnica, pero también con 'laboratorio'. Para los organismos divergénicos, lo que importa es el Comentario [ATF21]: Ya resultado final y no la técnica. Tampoco importa el lugar en que se genere, ya sea el laboratorio esta en el primer recuadro del o el campo, sino que sea libremente disponible para así aumentar la diversidad y evitar los subtema monopolios.

Tarea 13-1: Elabora un ensayo en dos partes representando dos opiniones opuestas. Primero discuta las razones por la que el trigo se debería considerar una especie completamente normal desde el punto de vista genético. En la segunda parte explica las razones por las que el trigo si es especial ya que combina los genomas de especies diferentes.

Tarea 13-2 Elabora otro ensayo en donde de su opinión sobre la siguiente cuestión: ¿Es un proceso natural o un proceso artificial cuando el DNA de especies diferentes se combina en una misma célula? Haga una búsqueda bibliográfica para recabar evidencia científica que sustente sus conclusiones de manera objetiva y sólida. Cada estudiante puede leer su ensayo en clase y después discutir las diferentes opiniones en grupo con su maestro. Respeten los diferentes puntos de vista, pero también sean objetivos y críticos con las premisas y la evidencia que sustenta cada argumento (fundamentos).

¿Qué es un divergénico? Un organismo divergénico es una especie mejorada que contiene genes diversos. Estos genes deben de ser para características beneficiosas para el ser humano y el medio ambiente. Pueden ser microorganismos, animales o plantas. Los organismos divergénicos pueden ser creados a partir de mutaciones, cruzas y mejoramiento genético clásico, así como también por hibridaciones y otras tecnologías innovadoras para combinar los genes o genomas deseados en un contexto y una configuración beneficiosa. Los organismos divergénicos están definidos por tres características esenciales:

• nueva diversidad genética • beneficio para el ser humano • sin restricciones de patentes

El requisito principal es que el organismo contenga una nueva diversidad genética, ya sea una nueva secuencia de ADN, un nuevo gen, un nuevo alelo, o una innovadora combinación de genes o genomas. Lo importante es el resultado final a nivel del organismo, independientemente de la metodología o la tecnología que se utilizó. Es decir, la diversidad genética puede ser generada por cruza natural o artificial, por hibridación sexual o somática, por mutación puntal o genómica, o por ingeniería genética o cualquier otra metodología novedosa. Igualmente, la reacomodación de antiguos genes o una nueva combinación de viejas secuencias de DNA también pueden ser consideradas como diversidad genética. Por esa razón podemos decir que los organismos divergénicos representan una nueva diversidad biológica en nuestro planeta. La segunda característica que distingue a los divergénicos de los demás organismos, es el beneficio que generan para el ser humano. Para que se merezcan llamar divergénicos tienen que ser más útiles y eficientes que los organismos silvestres, contribuyendo así a una mejor satisfacción de las necesidades humanas, ya sean de alimentación, estéticas, ecológicas, tecnológicas o médicas.

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La tercera característica de los divergénicos es que no pueden ser monopolizados ni su uso puede ser restringido por corporaciones privadas. Por definición, los organismos divergénicos llevan a un aumento de la diversidad y no a su disminución como en el caso de los monocultivos agrícolas o monopolios comerciales. Ningún patente puede restringir la libre reproducción, distribución e inclusión de los organismos divergénicos en subsecuentes programas de mejoramiento genético. Es decir, todos los agricultores de todos los países del mundo pueden usar las semillas divergénicas para replantarlas o cruzarlas libremente. De esta forma, los divergénicos aumentan el número de variedades y de especies útiles y de libre acceso a todos los seres humanos.

A veces la ciencia nos revela realidades tan especiales, que es necesario inventar nuevos términos y metáforas para describir exactamente los fenómenos tecnológicos. Quién hubiera entendido el significado de teléfonos celulares, discos duros, cámaras digitales, rayos láser, internet, quimioterapia o viagra hace tan solo 50 años. El término “transgénico” surgió muy temprano al inicio de los trabajos moleculares con bacterias y DNA en la década de los sesenta. Sin embargo, la palabra 'transgénico' es limitada, y con el tiempo la realidad ha superado a su definición. El nuevo término “divergénico” pretende resaltar la importancia de la diversidad genética. La diversidad no sólo es sustentable, sino que también representa una fuente de bienestar colectivo. Es una riqueza biológica que debe de estar al alcance de todos los seres humanos de este planeta.

13.3.2. Ejemplos Un ejemplo de una planta divergénica que no se considera transgénica por las leyes de Bioseguridad es el trigo moderno. El trigo que conocemos comúnmente se generó a través de la combinación de los genomas de tres especies diferentes de cereales. Surgió por medio de cruzas sexuales, de mutaciones genómicas y un proceso extensivo de selección. Y aunque solo se han identificado tentativamente a las variedades parentales, el proceso de modificación no fue consciente ni planeado, sin propósito o una metodología definida, el producto final, el trigo hexaploide con el nuevo genoma AABBDD, es sumamente beneficioso para el ser humano. Y como no está patentado, entonces se cumplen los tres requisitos para la definición de los divergénicos.

Casi todas las plantas útiles se han generado a través de mutaciones y recombinaciones de genes por cruzamientos. Sin embargo, también se pueden generar plantas divergénicas sin involucrar procesos sexuales. Por ejemplo, los injertos son una combinación somática y fisiológica entre dos especies parecidas, pero con genomas diferentes. Los injertos unen las ventajas de la raíz de una planta, con los beneficios del tallo de otra variedad o especie. Por ejemplo, el tallo del limón sin semilla se puede injertar en el tronco de la naranja ácida. De esta forma la raíz vigorosa de la naranja ayuda a producir un árbol que da más limones. Otro ejemplo, es el injerto de la vid europea con la vid americana. La ventaja de la variedad americana es que su raíz es resistente a ciertos patógenos del suelo, mientras que las variedades europeas producen excelentes uvas dándole una alta calidad al vino. De hecho, sin los injertos, la vinicultura en Europa sería imposible por culpa de las plagas del suelo.

Dado a que los injertos significan un aumento de la diversidad genética por utilizar dos genomas complementarios para hacer un solo individuo, además de que son beneficiosas para el uso humano y no son patentables, los injertos son plantas divergénicas. Considerando la definición que es simple pero también muy rigurosa, existen muchas plantas divergénicas, casi tantas como plantas que conocemos como domesticadas.

Un ejemplo de una planta transgénica que si es divergénica, es el arroz supervitamínico (golden rice). El arroz dorado contiene nuevos genes que son responsables de la síntesis de beta- caroteno (provitamina A). Las semillas de arroz que son normalmente blancas, adquieren un color anaranjado como la zanahoria. En el arroz dorado de la primera generación se introdujeron

420 genes bacterianos, mientras que en el arroz de segunda generación se usaron algunos genes del maíz. Los genes originales fueron introducidos al arroz a través de la ingeniería genética. Por haberse usado esa metodología, el arroz dorado se considera como una planta transgénica. Esta planta novedosa ha resultado ser beneficiosa para el ser humano, sobre todo por su valor nutritivo y su aporte de vitaminas en los países que tienen altos índices de ceguera debido a la falta de vitamina A en su dieta. Por otro lado, los agricultores de bajos recursos pueden usar el arroz dorado sin pagar regalías. El uso y reproducción de sus semillas no esta limitada por las empresas (Solo se aplican ciertas restricciones a los agricultores que obtengan ganancias superiores a los 10 mil dólares). En términos prácticos podemos decir que el arroz dorado no esta patentado. Con esto se cumplen los tres requisitos, de forma que también podemos hablar de arroz divergénico.

También existen ejemplos de plantas transgénicas que no son divergénicas. No por que se produjeron con ingeniería genética ya los convierte automáticamente en divergénicos. Primero tiene que demostrarse que son útiles para el ser humano, y además no deben estar restringidas con patentes. Aunque es difícil determinar si una planta es beneficiosa o no, porque cada quien puede tener criterios diferentes, el hecho de no ser patentado es fácil de controlar. Por ejemplo, el maíz, algodón y la soja Roundup son plantas transgénicas porque se crearon usando técnicas moleculares para hacerlas resistentes a ese herbicida. Estás variedades transgénicas no generan valor agregado para el consumidor, pero si traen ventajas para los agricultores porque les ahorra trabajo y dinero para mantener sus cultivos libres de malezas. Sin embargo, las variedades roundup están patentadas, de forma que los agricultores no tienen permiso de conservar las semillas para los siguientes ciclos. Esto obliga a los campesinos a comprar continuamente semilla nueva y cara. Además, como los mismos genes están patentados, los mejoradores no pueden usar esas plantas como padres para sus cruzas, ya que cualquier variedad que contenga esos genes pasa a ser propiedad de la compañía.

Ejemplos: Transgénica Divergénica Planta silvestre No No Roundup Si No Trigo, Injertos No Si Golden Rice Si Si

Por ejemplo, los microorganismos divergénicos producen medicinas para enfermedades como la diabetes, o aditivos que mejoran nuestra digestión y nutrición, o enzimas que nos ayudan eliminar la mugre de la ropa o nos permiten combatir los desastres ecológicos como las contaminaciones de petróleo en el mar. Por otro lado, las plantas divergénicas producen frutos de mayor calidad, requieren de menos agua y fertilizantes para crecer, y contienen más vitaminas para la alimentación y la salud. Finalmente, los animales divergénicos producen huevos, leche y lana mejorada, así como proteínas dietéticas y terapéuticas, u órganos como hígados o riñones para trasplantación en humanos enfermos.

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13.3.2.1. Híbridos

Figura 13-7. Origen genómico del Trigo Un organismo diploide tiene el doble, mientras que un tetraploide tiene cuatro y un hexaploide seis veces el número de cromosomas de un organismo haploide. Por ejemplo, la cebada es diploide, mientras que el trigo durum es tetraploide y el trigo harinero es hexaploide. Lo interesante del trigo es que contiene el genoma de tres especies que generalmente no se cruzan en la naturaleza.

13.3.2.2. Injertos

En unir una parte de una planta a otra. El resultado es un individuo autónomo formado por 2 plantas diferentes.

Es posible hacer injertos múltiples, es decir, injertar más de una yema o púa sobre un mismo patrón. Por ejemplo, para obtener un manzano con varias variedades de manzanas; un rosal con flores de distintos colores; Datura arbórea con flores blancas y rojas a la vez. El inconveniente es que la vida de las plantas con injertos múltiples se acorta bastante y puede llegar a durar sólo 2 ó 3 años; depende. Por ejemplo: casi todos los árboles frutales se producen cultivando un patrón a partir de semilla y a él se le injerta una yema de la variedad deseada. Si te fijas un poco por encima del cuello podrás observar un pequeño abultamiento o curvatura; ese es el punto donde se injertó la yema. (Figura 13-8).

Figura 13-8. A: Injerto - B: Patrón

Por tanto, la mayoría de árboles frutales que vemos son en realidad 2 plantas: las raíces pertenecen a una especie o variedad y el tronco y las ramas pertenecen a otra.

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Punto de injerto. Algunos frutales no hay necesidad de injertarlos, como el olivo o la higuera. Los rosales que compramos vienen casi todos injertados. El injerto es un método de multiplicación que mantiene las características de una variedad de fruta o de planta ornamental. Lo he explicado más arriba. Es decir, que una variedad de fruta de calidad o un árbol con una floración ornamental, si queremos que la descendencia tenga estas características con exactitud, se multiplica por esquejes, acodo o injerto; no por semilla, donde la descendencia suele ser variable.

2. Permite aprovechar las buenas características que aportan los patrones.

El patrón o portainjerto pone las raíces y ofrece una mayor resistencia a suelos malos, calizos, encharcados, con hongos, plagas... depende del patrón que sea

Figura 13-9. Ejemplos de injertos

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13.3.2.3. Endosimbiosis

Figura 13-10. Célula vegetal mostrando diferentes organelos y subcompartimentos 13.4. Ejercicios de Discusión Existe una gran polémica en torno a la biotecnología. Algunas personas dicen que los transgénicos atentan contra la biodiversidad. Que las plantas mejoradas van a acabar con las plantas tradicionales. Dicen que la ingeniería genética es mala y por eso quisieran prohibirla. Sin embargo, los científicos dicen que los hechos demuestran lo contrario. La biotecnología crea nuevas combinaciones de genes, y por eso podemos decir que se incrementa la diversidad. La biotecnología es una forma de creatividad genética que permite generar nuevas variedades de plantas y animales. A pesar de lo que puedan opinar los demás, lo importante es lo que opina cada uno. No dejemos que los demás decidan por nosotros. Es mejor estar bien informados para así tomar la decisión que mas nos convenga a todos. En esta sección incluimos una serie de preguntas con un enfoque más de discusión y desarrollo. En algunos casos incluimos algunos ejemplos de respuestas a las diferentes preguntas. La intención es fomentar la capacidad crítica del lector en torno a los debates actuales sobre la biotecnología. Un investigador que pretenda hacer mejoramiento genético no podrá ignorar el contexto económico, ecológico, social y filosófico en torno a las preguntas polémicas de la ingeniería genética.

Tarea 13-3 ¿Cómo será la agricultura del futuro? ¿Podrían haber una con más biología y menos química?

Ejemplo: Tal vez no lo podemos predecir a ciencia cierta. Lo que si podemos decir es que las plantas mejoradas son la base de la agricultura moderna, y seguirán siendo importantísimas en la agricultura integral, asegurando así la alimentación mundial. Tal vez si podamos decir que las plantas divergénicas seran una parte cada vez más importante de la agricultura moderna

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Tarea 13-4: ¿Podríamos usar las plantas divergénicas en la agricultura orgánica del futuro? ¿Deberíamos? Haga un ensayo contestando estas preguntas.

Ejemplo: Si la evidencia indicara que las mejoras genéticas permiten cultivarlas con menos fertilizantes, insecticidas y químicos, entonces, ¿porqué no? Al ser resistentes a herbicidas de bajo impacto ecológico también permiten el cultivo "cero labrado" con un mínimo requerimiento de movimientos de tierra y el correspondiente ahorro de maquinaria agrícola pesada y consumo de petróleo. Esta práctica agrícola también reduce la erosión del suelo y la pérdida de la fertilidad de los campos. Además, al contener mayor cantidad de vitaminas y crecer más rápido, éstas plantas no sólo son más saludables y nutritivas, sino también más eficientes. Esto beneficia tanto al ser humano como al ambiente, ya que el incremento del rendimiento permite dedicar menos superficie para la agricultura, ayudando así a conservar las áreas naturales.

Tarea 13-5 Prepare un ensayo sobre los organismos genéticamente modificados en México. Exponga los diferentes puntos de vista ya sea como: empresario, político, agricultor, ambientalista, consumidor y científico.

Tarea 13-6 Los organismos Divergénicos son ¿Enemigos o Aliados? Organice un debate entre sus compañeros de clases.

Tarea 13-7: Algunas personas afirman que es una necesidad ética y moral, la de tomar las medidas técnicas necesarias para impedir que el hambre y la pobreza se generalicen más en nuestro planeta. Sin la diversidad y la genética, no podremos aumentar la eficiencia ni sobrevivir a largo plazo. ¿Podríamos progresar sin innovar? ¿Es necesaria la ingeniería genética? Haga un ensayo contestando las preguntas anteriores.

Ejemplo: La población mundial sigue creciendo y aumentando, pero los recursos naturales son limitados y están disminuyendo rápidamente. La creatividad científica ha sido uno de los pilares de nuestra civilización, y hoy más que nunca tenemos que aprovecharla al máximo. Los microorganismos y los animales divergénicos ya nos están ayudando a superar algunos retos. Usamos sus productos diariamente en nuestros jabones, ropa y medicinas. Las plantas verdes siempre han sido y seguirán siendo nuestras aliadas. Aprovechar al máximo las ventajas que nos pueden ofrecer las plantas divergénicas no solo es vital para nuestro bienestar, sino que es una tarea para cual todas las personas pueden contribuir con su granito de arena.

Tarea 13-8 ¿Cómo podríamos obtener más organismos divergénicos? Platique con sus compañeros.

Ejemplo: Los organismos divergénicos no son ciencia ficción. Son usados a diario en todo el mundo. Aunque ya constituyen una parte integral de nuestra civilización, lo novedoso es que en las últimas décadas hemos desarrollado herramientas más rápidas y mejores para generar organismos divergénicos. La investigación biológica ha generado conocimiento valiosísimo contribuyendo así al avance tecnológico. La historia de la humanidad nos demuestra que el progreso científico conlleva al bienestar social. Sin embargo, a veces los cambios han sido tan rápidos, que no todas las personas se logran adecuar. Especialmente la biotecnología ha progresado de forma tan espectacular, que a veces no ha podido comunicar sus resultados de una forma fácil y sencilla. Cuando la población no entiende de qué se trata, surgen los temores. Esas inseguridades se convierten en angustias y al final en oposiciones a las nuevas tecnologías. Es bueno ser cauteloso, pero no debemos dejar que el miedo nos paralice y nos

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imposibilite progresar. Por lo menos hay que ser tan inteligentes como para escuchar las nuevas ideas, para así usar la lógica y la razón para juzgar objetivamente.

Tarea 13-9 ¿Podrían llegar a ser peligrosos los organismos divergénicos? Trate de entender los puntos de vista de todos sus compañeros.

Ejemplo: Es normal que existan reservas acerca de las cosas que no nos son familiares. Tal vez pensemos que las desconozcamos, pero en realidad los divergénicos nos han acompañado durante muchos años. De hecho, ya nos hemos acostumbrado a las ventajas de esos organismos. Por ejemplo, algunos jabones para la ropa contienen enzimas producidas por bacterias recombinantes. Son aditamentos que nos ayudan a lavar mejor al mismo tiempo que ahorra energía porque no es necesario usar temperaturas tan altas como lo hacían nuestras abuelas. ¿Nos deberíamos alarmar por algo así? Algunas personas dicen que si. Muchas pertenecen a grupos políticos que se han querido hacer famosos por los escándalos. Ha creado una angustia alrededor de la modificación genética. El miedo es similar al de los monstruos, fantasmas y demonios. De niños nuestros padres nos enseñaron que el pánico a lo que desconocemos es más perjudicial que benigno. Los científicos y la sociedad deben de ver la realidad de frente y sin prejuicios. ¿Podrían ser peligrosos los jabones modernos, el trigo harinero o el limón sin semillas? Tal vez si lo puedan ser, pero también es probable que pueden ser mucho mas útiles de lo que son dañinos. El peligro no deriva de como se genere la diversidad genética, sino del resultado final. Por ejemplo, ¿pensaríamos que un becerro que nace por fertilización in vitro sería mas peligroso que el que nace por parto natural? Tal vez no dependa de como nació, sino de que si es animal bravo o manso. Es necesario que se monitoreé constantemente la calidad y la utilidad de esos organismos para asegurar que todos nuestros alimentos sean saludables. Sin embargo, este control no se debe restringir a los productos que se generen con una metodología específica, sino que se debe aplicar a todos los que contengan una nueva diversidad genética. Por ejemplo, una nueva variedad de papa debería someterse a todos los controles de calidad aunque halla sido generada por el método tradicional, y no solo si fue por ingeniería genética. En la mayoría de los casos las metodologías modernas son más precisas y eficientes.

Tarea 13-10 ¿La transferencia de genes es un fenómeno nuevo dentro de la evolución normal? Discuta objetivamente con sus compañeros.

Ejemplo: La teoría de la evolución nos invita a recordar los procesos naturales que permitieron que una bacteria se convirtiera en una célula eucariótica, un organismo multicelular, un pez y después en un mamífero. La transferencia de genes entre bacterias, plantas y animales ha sido uno de los requisitos de la evolución. No hay duda de que los procesos naturales pueden generar alteraciones genéticas sorprendentes, la diferencia con respecto a la biotecnología no son las modificaciones per se, sino mas bien la rapidez. Algunos eco-activista tal vez no estarán de acuerdo. Ellos dirían que es normal que entre especies de cereales como el trigo exista un intercambio de genes, pero es algo totalmente distinto si de una bacteria se saca un gen para metérselo a una planta o a un animal. Son especies muy diferentes que en la naturaleza nunca intercambiarían genes. Y sin embargo, se equivocan, ya que eso es exactamente lo que pasa en la naturaleza. Sólo basta mencionar como las plantas se volvieron verdes al adquirir genes de las cianobacterias. Viéndolo desde esta perspectiva más amplia, diríamos que los métodos 'artificiales' que se aplican en la biotecnología no son nada nuevos, sino son una combinación de procesos enteramente naturales. En realidad podemos decir que las modificaciones que se hacen actualmente con la ingeniería genética son solamente una mínima parte de lo que normalmente pasa en los ecosistemas

Tarea 13-11

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Discuta críticamente la siguiente cuestión. ¿A quién le daría usted más credibilidad? ¿A una organización política como Greenpeace o los científicos que tienen experiencia directa con la biotecnología? Asuma una posición y defiéndala ante sus compañeros de clases

Ejemplo: Pareciera que algunas personas han descartado el uso de ingeniería genética para su aplicación en una agricultura más ecológica. Pero, ¿por qué no usar plantas mejoradas si los hechos demostraran que son seguras, eficientes, y traen ventajas para la salud, la ecología, y la agricultura? Si usamos estiércol y substancias tóxicas como sulfato de cobre para crecer verduras con denominación orgánica, ¿por qué nos deberíamos negar a comer genes en nuestros tomates? La agricultura orgánica usa Bacilos como control biológico. Si se pueden usar extractos que contienen todos los genes de esas bacterias, ¿por qué no se puede usar una planta mejorada que sólo contenga uno de esos genes insertados en su genoma? ¿Por qué comer miles de genes no es malo, pero comer uno solo si es malo? ¿Estamos dispuestos a considerar la posibilidad de que las nuevas plantas mejoradas sean más saludables que las tradicionales? ¿Deberíamos cerrar nuestros ojos antes de tener todos los datos? ¿Estaríamos dispuestos a liberarnos de las ideologías para analizar la ingeniería genética desde un punto de vista racional? Las plantas modernas pueden ser superiores y más saludables que las plantas tradicionales. Por ejemplo: Antes de ser llevadas a Europa por los españoles, las papas silvestres eran mucho más venenosas. De hecho, las papas pertenecen a una de las familias de plantas más venenosas, las solanáceas. Hoy en día, las papas se han mejorado de forma que podemos comerlas cocinadas. Sin embargo, la tarea de mejoramiento no ha acabado, ya que los tubérculos todavía son tóxicos si son consumidas crudos o verdes. Por otro lado, algunas plantas se han mejorado considerablemente por ingeniería genética. Por ejemplo, se ha demostrado que el maíz Bt contiene menos contaminaciones por insectos, hongos y micotoxinas. Estos ejemplos nos demuestran que una planta mejorada como el maíz Bt puede ser mucho más segura, mientras que al comer una planta salvaje como la papa podríamos hasta morir.

Tarea 13-12 ¿Es normal o no es normal insertar genes en otra especie? Discútalo con sus compañeros.

Ejemplo: Para algunas personas el hecho de generar plantas hexaploides con miles de genes de especies distintas es algo habitual, mientras que introducir un solo gen es algo tan extraordinario, que es necesario restringirlos. Ya que es un producto de la fabrica Ford, las autoridades exigen que se cumplan todas las normas y reglamentos de los automoviles, aunque se trate solo de una bicicleta. Si lo analizamos a fondo, nos damos cuenta de que la legislación actual sobre los transgénicos es algo absurda en ciertos puntos. Aunque el producto de una cruza sexual, una mutación o una modificación genética sea el mismo, el método de obtenerlo es lo que determina si se considera silvestre o transgénico.

Tarea 13-13 ¿Es bueno o es malo comer DNA? No es peligroso insertar genes de bacterias al maíz, ¿Qué pasa cuando nos comemos las tortillas? Asuma una posición y defiéndala ante sus compañeros de clases

Ejemplo: Durante nuestra evolución como seres vivos hemos comido plantas con todo su ADN, sin que alguna vez un gen vegetal haya tenido un efecto adverso en nuestro genoma. El ADN está presente en todas las células vivas. Comerlo no es algo peligroso sino es algo muy nutritivo. Es tan bueno que se ha empezado a usar en algunas novedosas cremas faciales y productos cosméticos. En realidad, la modificación genética no es ningún invento reciente del hombre sino es algo muy antiguo. La transformación de bacterias con pedazos externos de ADN es un proceso común de la evolución. La introducción de genes a las plantas es un proceso natural que llevan a cabo las bacterias del suelo. Aunque no nos habíamos dado cuenta, las agrobacterias, virus y retrotransposones lo han estado haciendo desde hace millones de años.

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Tarea 13-14. Busque otras analogías o discusiones sobre nuevos avances científicos o tecnológicos, y cómo se han visto envueltos en la polémica. Proponga una analogía en donde se vea reflejada la discusión de los transgénicos y divergénicos, con su propuesta. Finalmente defienda su postura sobre los transgénicos y divergénicos. Algunas páginas que puede consultar son: http://www.elmundo.es/elmundo/2009/02/18/ciencia/1234974212.html http://www.elmundo.es/mundodinero/2007/01/18/economia/1169118808.html http://www.ecoportal.net/content/view/full/34967 http://www.tierramerica.info, http://www.finanzas.com/noticias/empresas/2009-02-12/91032_paris-cancelo-maiz-razones- ecologicas.html http://www.e- consulta.com/index.php?option=com_content&task=view&id=22994&Itemid=181

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14. Genética de Poblaciones 14.1. Las leyes de Mendel Explicación breve de las 3 leyes de Mendel. Ejemplo de los chícharos. 1) Homogeneidad de la F1 2) Segregación en la F2. Porcentajes de segregación 3:1 3) Independencia de los genes. Excepción: ligamiento de genes

Blanca aristas Negra aristas lisas ásperas ♀

P0 b b R R B B r r

♀ Meiosis ♂

b R B r

Fecunda ción

Meiosis en el B R B r b R b r F1 espermatozoide Negra áspera b R B r BBRR BBRr BbRR BbRr

B R Negra Negra Negra Negra áspera áspera áspera áspera

Progenie BBRr BBrr BbRr Bbrr Meiosis en el F2 óvulo B r Negra Negra Negra Negra áspera lisa áspera lisa

Segregación BbRR BbRr bbRR bbRr

9:3:3:1 b R Negra Negra Blanca Blanca áspera áspera áspera áspera

BbRr Bbrr bbRr bbrr

b r Negra Negra Blanca Blanca áspera lisa áspera lisa

Figura 14-1. Ejemplo de segregación mendeliana con dos genes independientes. Los alelos son completamente recesivos o dominantes. Los padres son homocigotos y la F1 es toda homogénea. La segregación de la F2 es de 9:3:3:1

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Tarea 14-1. Considere tres guisantes amarillos, redondos, etiquetados A, B y C. Cada uno fue cultivado en una planta y luego se cruzó a una planta cultivada de un guisante verde, arrugado. Exactamente fueron 100 guisantes de cada cruza y fueron clasificados en clases fenotípica como sigue: A 51 amarillo, redondo 49 verde, redondo B 100 amarillo, redondo. C 24 amarillo, redondo 26 amarilla arrugado. 25 verde, redondo 25 verde, arrugado. ¿Cuáles son los genotipos de A, B y C? Puede resolver más problemas en el libro modern genetic analysis de Griffiths et al o del libro Génetica, serie Schaum de W.D. Stansfield.

14.2. La genética de poblaciones clásica Hay que tener en cuenta que gran parte del marco teórico de la evolución y la genética surgió en una época anterior al descubrimiento del DNA como molécula portadora de la información biológica. Solo hasta después de 1940-1953 fue cuando se supo que el DNA era tan relevante para la herencia. Antes se pensaba que las proteínas eran las responsables. En ese entonces se pensaba que el DNA era un polisacárido monótono y demasiado sencillo como para ser portador de una información tan compleja. En la década de los 70s surge la biología moderna con las herramientas del DNA recombinante. En 1988 se desarrolla la metodología de PCR, y eso le da un gran impulso a la genética molecular (antes solamente existía la genética clásica). La teoría sobre la genética de poblaciones es algo antigua, pero sus principios básicos son los mismos aún hoy en día.

14.3. Ley de equilibrio Hardy-Weinberg Una población no solo se puede ver como un número de individuos, cada uno con un determinado genotipo (combinación de dos alelos en organismos diploides), sino que del punto de vista global (no individual) también puede verse como una población de alelos con determinada frecuencia. A esto se le llama pool genético.

Para los mejoradores genéticos el enfoque suele ser la población (queremos que todos los individuos sean buenos). Si nos quedamos con un solo individuo, después no tendremos diversidad genética y no podremos continuar haciendo mejoramiento. Recordemos que la diversidad se forma por medio de mutaciones y recombinación (ver capitulo 2). La selección por si sola no permite avance genético más allá de la curva de distribución inicial (Griffiths, et al 2004). Para el mejoramiento es necesario tener el conocimiento de la genética mendeliana en la población y no solo del individuo. Cuando hablamos de frecuencias génicas o fenotípicas nos puede interesar la disminución de una determinada frecuencia génica, por ejemplo, de un homocigótico recesivo que causa un defecto o una enfermedad. Ahora todo lo analizaremos en poblaciones (alelos y fenotipos) y veremos cómo se transmiten de generación en generación.

Ejemplo de los chícharos: Tenemos dos fenotipos; (gg) = amarillo, el resto = verde. Contando individuos podemos determinar frecuencias, pero a veces no tenemos el conocimiento exacto del genotipo, sólo del fenotipo (porque no podemos discriminar entre GG y Gg). Asumiendo una

430 serie de premisas como que los individuos se cruzan de forma aleatoria2 podemos usar entonces la fórmula binomial (Ley de Hardy Weinberg):

2 2 Formula Binomial: += qp )(1 2 Æ 1 = p + 2pq + q

Si determinamos el número de individuos amarillos de una muestra representativa de la población, podemos estimar el valor para la frecuencia genotípica de los amarillos homocigóticos recesivos (gg) que es q2. Con el valor de q podemos estimar la frecuencia de p que sería p = 1 - q (asumiendo que en total solo hay dos alelos y que todos los alelos que no son q tienen que ser p). Usando esos dos valores se puede calcular la frecuencia de los heterocigotos (Gg) y homocigotos (GG).

Fórmula binomial para inferir las frecuencias génicas en una población. Esto 2 2 Æ ⎧ = pGG se utiliza a nivel de poblaciones, por ejemplo cuando queremos estimar el += qp )(1 ⎨ ⎩ = ·2 qpGg número de portadores potenciales (heterocigotos) de una enfermedad que solo se observa en estado recesivo.

Cuando los alelos son igual de frecuentes en una población (p = q = 0.5), entonces tenemos el caso típico de la genética de Mendel, en donde la formula binomial nos dice que la frecuencia de los individuos se comporta como 1:2:1 a nivel de genotipo o 3:1 a nivel de fenotipo.

Ejemplo carácter multialélico: El modelo se complica cuando el carácter es multialélico (más de dos alelos). Es el caso de los grupos sanguíneos donde hay tres alelos, ABO y seis posibles genotipos, pero tan sólo cuatro fenotipos.

Fórmula binomial para 3 alelos: ++= rqp )(1 2 Æ p2(AA) + 2pq(AB) + 2pr(A0) + q2(BB) +2qr(B0) + r2(00) = 1

En ese caso, primero nos tenemos que preguntar: ¿Hay algún fenotipo que se le pueda asignar un genotípo específico? Sí. Podemos decir que los 0 son homocigotos recesivos 00 y los AB son heterocigotos codominantes AB;

Fenotipo A = (AA) + (A0) = p2 + 2pr Fenotipo B = (BB) + (B0) = q2 +2qr Fenotipo AB = (AB) = 2pq Fenotipo O = (00) = r2

Ejemplo: En una ciudad hay 64% de personas con grupo sanguíneo O y 1% de personas con grupo sanguíneo AB. Asumiendo que la población se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg calcule el porcentaje de personas con grupo sanguíneo B y A.

Forma de resolver: En realidad con estos datos no podremos distinguir entre el grupo A y el B, pero primero hagamos los cálculos para las probabilidades r, p, q y después asumamos que el grupo sanguíneo A es mas frecuente que el grupo B. De los datos mencionados sobre los individuos 00 y AB sabemos que (r2=0.64) y (2pq=0.01). Con esto calculamos que (r=0.8) y que (q=0.005/p). Substituya la fórmula (1= p + q + r) con los valores (r y q) y después resuelva todo para p. Usando la solución a la formula binomial obtenga que p=0.1707 (primera solución cuadrática) o también p=0.02903 (segunda solución cuadrática). Como dijimos que A es más frecuente que B, entonces el valor de p=0.1707 corresponde a A y el valor de q=0.02903

2 Hay que asumir una serie de premisas: Apareamiento aleatorio. La probabilidad de que un óvulo o esperma tenga tal o tal genotipo esta determinado por la frecuencia genética de los alelos en la población. Se asume que todos los óvulos y espermas tienen la misma viabilidad y que los individuos no tienen preferencias sexuales, sino que escogen a su pareja al azar.

431 corresponde a B. Usando el primer valor de p confirme que el valor de q=(0.05/p)=0.02903. Ahora si, con esos valores calcule las frecuencias de todos los genotipos posibles. Respuestas: r=0.8 , p=0.1707, q=0.0293 AA= 2.91%, AB=1% , AO=27.31%, BB=0.09%, BO=4.69%, OO=64% Los genotipos AA y A0 tendrán el fenotipo A; y los BB y B0 serán B. Con ello podemos decir que los grupos sanguíneos esperados en esa población serán de: A= 30.23%, AB=1%, B=4.77%, O=64%

Tarea 14-2: Haga una encuesta en su salón de clases: ¿Qué grupo sanguíneo tiene cada alumno? Usando esos datos calcule las frecuencias de los fenotipos AB y O. Con esos valores que corresponden a (r2) y (2pq) use las formulas binomiales para calcular el porcentaje de genotipos AA, AO, BB y BO. Compruebe si su salón de clases se encuentra en equilibro de Hardy Weinberg. Para hacer esto debe comparar el valor que estimo por medio de la fórmula binomial para los genotipos AA y AO, con el valor real observado de alumnos con grupo sanguíneo A (recuerde que el fenotipo A es la suma de los genotipos AA + AO). Discuta posibles razones por la que los valores calculados para los grupos sanguíneos A y B puedan ser diferentes a los observados.

* En realidad siempre hay factores que cambian las frecuencias génicas en la población y a la larga se traducen en cambios fenotípicos. ¿Cuáles son esos factores?: Mutaciones, migraciones, selección natural, selección artificial, preferencias sexuales, viabilidad de los gametos, deriva genética, etc. Cuando el número de individuos analizado es pequeño, el azar juega un papel importante y los resultados pueden no ser los esperados. Se dan cambios genéticos de generación a generación por el número tan reducido de individuos (efecto de cuello de botella), lo que hace que a la larga las frecuencias genéticas cambien de forma impredecible por el factor del azar.

14.3.1. Ejemplos de aplicaciones de la Ley de Hardy- Weinberg

Equilibrio en cromosomas autosómicos: Asumiendo que se cumplen los anteriores requisitos de equilibrio; y que se tienen unas determinadas frecuencias genotípicas de los alelos dominantes. Para que esto sea así es necesario que en la población ninguno de los anteriores factores tenga un papel importante. Si hay mutación y migración estos cálculos se complican. Bajo esas circunstancias no se podrá inferir las frecuencias genotípicas a partir de frecuencias génicas. En esta ley las frecuencias genotípicas se mantendrán estables generación a generación si no hay factores que varíen las frecuencias génicas y por tanto, las genotípicas. Para el caso que analicemos podemos preguntarnos: ¿Se cumple lo que dice Hardy-Weinberg? ¿Está en equilibrio Hardy-Weinberg? Si la respuesta es que no, nos debemos preguntar por qué no se cumple: Por mutaciones, migración, azar por población pequeña, etc…

Aplicaciones de la ley de Hardy-Weinberg: Inferir el número de individuos portadores de una enfermedad. Conociendo los individuos que la tienen (dominantes), sabremos sus frecuencias y podremos calcular los portadores recesivos si se cumple la ley de Hardy-Weinberg.

Alelos ligados a cromosomas sexuales, por ejemplo el cromosoma X: En el caso de los genes ligados al cromosoma X es necesario una segunda generación para llegar al equilibrio porque la madre contribuirá con dos alelos y el padre solo con uno. El cálculo de HW no será igual; en hembras sí (pq son diploides) pero no en machos (será A- o a-). Una

432 vez conocemos (q = Frecuencias(aa)) nos dará directamente el número de machos afectados (Ias anomalías ligadas al sexo, habrá más machos afectados porque se esperan q machos y q2 hembras). Si los machos están más afectados que las hembras es una enfermedad ligada al cromosoma X. Se cumple HW si: No hay mutaciones. No hay selección Buscar un equilibrio donde las Población de gran natural. fuerzas que afectan HW no tengan un tamaño. No hay migración. peso importante.

Genotipado de individuos:

Figura 14-2. Gráfico-modelo simple de 2 alelos

En la Figura 14-2 se representan las frecuencias genotípicas frente a la frecuencias de uno de los alelos (aa) = rojo; (Aa) = lila. Cuando q = 1: aumenta el número de individuos (aa) y disminuyen (AA). Cuando p = q: (Aa) llegan al máximo, 0,5 (50%), sí se cumple HW. Si el número (Aa) > 0,5: en una población afirmaremos que no se cumple HW. Además, cuando p = q = 0,5 también tendremos el mismo número de (AA) y (aa) (25% cada uno). Además a partir de esta gráfica también inferiremos cuándo la frecuencia de (AA) = (aa).

Ejemplo: El problema que se nos plantea para predecir la variación del carácter con el modelo de HW. ¿Qué pasará si en la población provocó un cambio en las frecuencias génicas?. ¿Cómo afectará ésto a las frecuencias genotípicas?. Por ejemplo, hacemos PCR y obtenemos los siguientes individuos observados:

AA Aa Para ver si esto se ajusta a HW habremos de ver los individuos aa esperados: calcular p y q para nuestra población. En la población OBS 25 60 tenemos 125: 40 ESP 24.2 61.6 AA = 25 / 125 Aa = 60 / 125 aa = 40 /125 39.2

Ahora vamos a calcular la frecuencia de cada alelo: * Para ver sí esto se ajusta a HW pAA 2 == 2 = 2,24125·44,0 A p ==+= 44,0250/)6050( ⎫ habremos de ver los individuos ⎬ pqAa == = 6,61125)·56,0·44,0·(22 esperados: calcular p y q para nuestra a q ==+= 56,0250/)6080( ⎭ qaa 2 == 2 = 2,39125·56,0 población. Recordemos que en la población tenemos 125:

2 2 2 2 ()− EO ()− 2.2425 ( − 6.6160 ) ( − 2.3940 ) 2 * X 2 = = + + Comparar Tabla X . ∑ E 2.24 6.61 2.39

El valor que nos dé lo buscaremos en las tablas de X2. Hay que buscar en la columna de 2 grados de libertad porque tenemos tres clases genotípicas (grado de libertad = n-1). Si X2 ≤ valor de la tabla, afirmaremos con una P (95%) que las diferencias son debidas al azar y que por tanto; HW se cumple.

433

14.3.1.1. Cálculo de las generaciones necesarias para eliminar un genotipo Si queremos eliminar los individuos aa de una población (por ejemplo porque es un alelo detrimental para el rendimiento), nos podemos preguntar: ¿Cuántas generaciones tendré que esperar para que cambien las frecuencias alélicas? En genética de poblaciones se puede definir un parámetro muy importante: Coeficiente de selección negativa (S): Indica la frecuencia de muerte o penalización. Un valor de cero implica que no se penaliza y el valor de 1, que se penaliza al máximo. Un valor de 0.5 significa que eliminaremos la mitad de los individuos. Este valor de selección negativa S es reciproco a un valor de selección positiva (Fitness W) de la siguiente manera:

W = 1 – S

Dependiendo de nuestro punto de vista podemos usar un coeficiente de selección negativa (S) o el coeficiente de Fitness (W). Un individuo con S = 0 Æ W = 1. Estos valores se refieren a las probabilidades de que un individuo pase sus genes a la siguiente generación.

Cuando queremos seleccionar, el modelo teórico nos indicará la W que debemos de aplicar a cada genotipo para lograr un cambio de las frecuencias p ó q en la población. ¿Cómo calcular las nuevas frecuencias génicas en la siguiente generación? Para ello primero calculamos las frecuencias de cada uno de los genotipos en la población inicial usando la Ley de Hardy Weinberg. AA Aa aa 2 2 Frecuencias p 2pq q 2 21 ++= qpqp 2

Después se le asigna un valor de Fitness W a cada genotipo:

AA Aa aa Fitness W WAA WAa Waa

En términos globales, la población tendrá un fitness reducido que será el resultado de las sumas del fitness de cada genotipo multiplicado por su frecuencia de aparición en la población.

2 2 Wglobal = WAA * p + WAa * 2pq + Waa * q

Supongamos entonces que vamos a eliminar a todos los genotipos aa y vamos a conservar a todos los AA y Aa (WAA=1, WAa=1 , Waa=0 ). Esto significa que vamos a eliminar a un número de individuos que equivale al porcentaje de q2 de la población inicial. Con los valores de Fitness mencionados y usando un valor inicial p=q=0.5 entonces esto representa que eliminaremos a q2 =0.25 de los individuos. El fitness global de la población se reducirá en la siguiente proporción:

2 2 Wglobal = (1) * (0.5) + (1) * 2*0.5*0.5 + (1) * (0.5) = 0.75

¿Cómo podemos calcular los valores de p´ y q´ de la siguiente generación? Para ello podemos usar las siguientes fórmulas:

W ·W W ·W ' = pp 2 AA + pq Aa y ' = qq 2 aa + pq Aa W global W global W global W global

Modelos de selección Selección en Contra del Alelo Recesivo (SARA).

434

Asumimos el equilibrio Hardy-Weinberg para la población y queremos hacer selección en contra del recesivo (aa). Definimos entonces un coeficiente de selección S. ¿Qué pasara en la siguiente generación si hago una selección diferente para cada grupo de individuos? Si eliminamos a todos los (aa), entonces esos individuos no tendrán descendencia ni transmitirán sus genes. La Fitness W promedio de la población será:

AA Aa aa Frecuencias p2 2pq q2 2 2 −=−++= 2 ·1)1()1(2)1( SqSqpqpW Fitness W 1 1 1-S Una vez que tenemos W, debemos saber cuántos individuos con un genotipo determinado tendremos en la población (frecuencias genotípicas):

p 2 )1( pq )1(2 2 − Sq )1( AA = Aa = aa = 1− 2 Sq 1− 2Sq 1− 2Sq

A partir de esto nos preguntaremos; con qué medida he hecho disminuir la frecuencia del alelo a partir de una selección en contra:

Q’ = Frecuencias (aa) 1 2 − Sq )1( 1 ⎛ 2/ pq ⎞ H’ = Frecuencias (Aa) '' HQq ' =+= + ⎜ ⎟ 2 ⎜ 2 ⎟ 2 1− Sq 2/ ⎝1− Sq ⎠ 2 − Sq )1( pq − Sqq )1( q' = + 1 qp →−=→ q' = Estimación de las − 2Sq 11 − 2Sq 1− 2Sq frecuencias génica de (a).

S = 1 para eliminar todos los aa en la siguiente generación:

− Sqq )1( − qq )1( q' = Æ q' = 1− 2Sq 1− q2

¿Cuánto ha cambiado la frecuencia de un gen (a) cuando hacemos selección?

2 −− qSq )1( Vemos que todo dependerá de la frecuencia inicial y el valor de s. ' qqq =−=Δ Imaginemos que un alelo inicialmente está presente con una 1− Sq 2 frecuencia muy baja, casi nula, matemáticamente Δq será muy pequeño.

Figura 14-3 Diferentes curvas de coeficiente de selección negativa.

Cuando se hace selección contra uno de los genes, aunque partamos de una situación de frecuencias intermedias (50%), con pocas generaciones Δq ya es importante, pero la pendiente de la curva cada vez se hace mas plana. Así, si el valor de q es muy bajo, no notaremos cambio

435 de una generación a la siguiente. Si lo hacemos contra un alelo recesivo la magnitud de cambio de q entre una generación y otra, dependerá mucho de la frecuencia inicial de q. Cuando q es muy baja, Δq también es muy baja. A medida que q tiene un valor mayor Δq también será más grande. Erradicar completamente un alelo recesivo a través de los homocigotos recesivos tendería a infinitas generaciones ya que sólo erradicamos aa pero no Aa, de forma que siempre quedarán portadores que de nuevo pueden originar aa.

Un S = 0.5 quiere decir que el 50% de (aa) ya no les dejaría reproducir. En este caso y a medida que cambia la frecuencias del alelo, vemos que con 0.5 también harán falta más generaciones.

Tasa de Mutación / Balance de Selección Si la mutación en la población es prácticamente despreciable no se toma en cuenta, pero si eliminamos uno de los alelos ¿podría aparecer de nuevo el alelo por mutación? Sí, aunque no sea muy probable. Está probabilidad vendrá definida por la tasa de mutación. Si asumimos esto que la tasa de mutación = μ, llegaría un momento en que Δq sea tan pequeño que q = μ y los alelos que saco entre generaciones se vean compensados por los formados por mutaciones. Se llega a un equilibrio mutación-selección. ¿Cuándo pasará esto?:

μ Haciendo selección contra un alelo puedo determinar cuando llegaré a este qe = equilibrio? Sí, aplicando la anterior fórmula: S = 1 y μ = 1.5·10-5 Æ qe = 0.004. S

Así pues nunca llegaré a erradicar del todo un alelo. No se puede erradicar (aa) porque se llega a un equilibrio en la mutación. Si fuera eliminación de Aa y aa en una generación entonces sí podrían ser erradicados.

Selección en contra del alelo dominante. Selection Against a Dominant Allele. (SADA) En ocasiones se quiere seleccionar a los alelos dominantes (individuos portadores). Veremos que el modelo general explicado anteriormente también sirve en este caso. Al hacerlo cabe decir que las frecuencias de los genotipos (aa) y (Aa) no tienen porque tener el mismo valor.

AA Aa aa 2 2 p 2pq q 2 2 )1()1(2)1( −−=→−+−+= qpsqwsqspqpw )2(1 1 1-s 1-s Y en la siguiente generación será: p 2 )1( − spq )1(2 2 − sq )1( AA = Aa = aa = −− qpsq )2(1 −− qpsq )2(1 −− qpsq )2(1

Se ha de combinar el número de reproductores que utilizamos y el factor de selección para que podamos obtener mejoras rápidamente pero sin disminuir mucho la población. Cuando actúo sobre Aa y aa, ó AA y Aa (contra el dominante) se puede llegar rápidamente a anular la anomalía en pocas generaciones, siempre en función de s, de forma que si s = 1, se necesita una sola generación pero se reduce mucho la población. En herencia codominante, puede que nos interese mantener los heterocigotos. También se puede hacer. Esto es más normal en la selección natural cuando el heterocigoto presenta ventaja.

Selección a favor del heterocigoto En función de los coeficientes de selección por cada heterocigoto podré predecir cuando se dará la situación de equilibrio.

AA Aa aa 2 2 )1()1(2)1( 1 −−=→−++−= 22 tqspwtqpqspw p2 2pq q2

1-s 1 1-t

436

Y en la siguiente generación será: 2 − sp )1( pq )1(2 2 − tq )1( AA = Aa = aa = 1 −− 22 tqsp 1 −− 22 tqsp 1 −− 22 tqsp

Cuando se hace selección a favor del heterocigoto, es como si se hiciera selección a favor de los dos alelos. Se llegará a un equilibrio porque p y q se mantendrán constantes.

Figura 14-4 Frecuencia de alelos − tqq 2 q =Δ − q Æ En el equilibrio Δp = 0 y Δq = 0 Æ 1 −− tqsp 22 s t q = p = s + t s + t

Para una determinada frecuencia alélica de q, si s = t significará que q = 0,5 y p = 0,5 Æ vemos que si el coeficiente de selección es igual para ambos heterocigotos, vemos que estaremos en equilibrio y que Δq = 0. Si q < 0,5, q irá cambiando hacia el equilibrio hasta llegar a 0,5. Si q > 0,5 la tendencia de q será disminuir para llegar al equilibrio. En está gráfica se representa s = t.

Selección en contra del heterocigoto: Implica que el valor de fitness de los homocigotos es superior al de los heterocigotos. Los valores del equilibrio de p y de q son los mismos que en el caso anterior. Cabe decir que no hacemos A1A2, 1 – X, porque entonces estaríamos afirmando que los dos homocigotos tienen el mismo fitness (w).

AA Aa aa 2 2 )1()1(2)1( 1 ++=→++++= 22 tqspwtqpqspw p2 2pq q2

1+s 1 1+t

Y en la siguiente generación será: 2 + sp )1( pq )1(2 2 + tq )1( AA = Aa = aa = 1 ++ 22 tqsp 1 ++ 22 tqsp 1 ++ 22 tqsp s t Y en el equilibrio Δp = 0 y Δq = 0 Æ q = p = s + t s + t

437

Figura 14-5

Los homocigotos tienen w > heterocigotos, pero no tienen necesariamente la misma w. Como que ambos alelos A y a están favorecidos respecto al heterocigoto se llegará a un equilibrio. Cuando s = t (favorecimiento de los homocigotos en igual medida) vemos que estamos en q = 0,5 (equilibrio).

Modelos simples de selección:

Si WAA > WAa > Waa Æ Selección a favor del alelo dominante se fijará el alelo A. Si WAA < WAa > Waa Æ Selección a favor del heterocigoto y se llegará al equilibrio Æ polimorfismo estable. Si WAA > WAa < Waa Æ Selección a favor del homocigoto: Æ Si s = t Æ polimorfismo estable. Æ Si s ≠ t Æ polimorfismo inestable. Si s > t o s < t se fijará un alelo u otro. Si WAA < WAa < Waa Æ Selección a favor del alelo recesivo se fijará el alelo a.

Tarea 14-3 The actual rate of mutations creating new c alleles is about 0.00000067. Is a balance between mutation and selection a plausible explanation the maintenance of the c allele at a frequency of 0.02? If not, develop an alternative explanation and use AlleleA1 to demonstrate that it is plausible.

14.3.1.2. Consanguinidad Hardy-Weinberg asumía que si se da el fenómeno de consanguinidad, es decir, si se parte de individuos emparentados no se cumplirá el emparejamiento aleatorio. Esto por que habrá individuos con más probabilidad de aparearse que otros.

¿Cómo varía la consanguinidad las frecuencias? La primera consecuencia es una disminución de los heterocigotos a favor de homocigotos. Debido a que la mayoría de enfermedades son recesivas, a más homocigotos, mayor probabilidad de que haya anomalías genéticas. La situación más extrema sería la autofecundación (selfing). Si cruzamos heteros tendré 1/4, 1/4 y 1/2. Si ahora cruzo los AA con AA toda su descendencia será AA al 100%. El 25% de A vuelve a generar Aa pero hay que sumarle 1/4 de 50 Aa que también generarían AA, y solo nos quedarían pocos heterocigotos. Si ahora volvemos ha hacer selfing y cruzamos de nuevo el 37.5% de AA con ellos, 25% aA entre ellos y 37.5% aa todavía disminuirán más los heterocigotos.

¿Cómo se calcula el valor de la consanguinidad? Si la consanguinidad disminuye en heterocigotos, hay que tener en cuenta que las frecuencias génicas (p y q) no varían como pasaría con la selección, sino que variarán las frecuencias genotípicas, por lo que hay la misma proporción de alelos pero distribuidos de forma diferente.

438

F es una manera de estimar en una población si hay mucha consanguinidad. Según la ley de HW podríamos calcular los heterocigotos esperados y podemos vía PCR genotipear la población y observar los resultados. Si hay más heterocigotos de los esperados podremos atribuirlo a consanguinidad.

HeteroOBS H F 1−= 1 −=→−= FpqH )1(2 HeteroESP 2 pq

Si los observados son iguales a los esperados, F=0, lo que nos indica que no hay consanguinidad. Si hay menos observados que los esperados la F comenzará a tener un valor positivo hasta llegar al valor máximo de 1 cuando no hay ningún hetero observado.

Desde el punto de vista teórico, conocidos los genotipos puedo hacer predicciones de Hardy- Weinberg. Si no hay HW es porque alguna de las frecuencias observadas es diferente a la esperada. Si vemos menos heteros de los esperados una de las explicaciones más plausibles es porque no habrá aparejamiento aleatorio.

Hay relación directa entre F y probabilidad de aparición de enfermedades. Si F > 0.3-0.4 acostumbra a ir acompañados a una situación de aparición de enfermedades genéticas. Un ejemplo importante es cuando en los partos se ve un número creciente de animales muertos Æ consanguinidad..

La única manera de normalizar F es introducir nuevos animales en la población para volver así a tener los heteros esperados.

¿Cómo concebimos estrategias para detectar animales portadores de la enfermedad genética (portadores de alelos a) si solo puedo discriminar homocigotos recesivos (aa) de los que no lo son? Como sabemos si un macho que no presenta la anomalía es aA o AA? Si no se tienen técnicas moleculares (PCR), se harán cruzamientos y veremos los resultados, así inferiremos probabilidades. Hacemos cruzamientos parciales de este individuo A_ con un individuo afectado aa:

AA x aa Æ Aa Æ todos los descendientes serán sanos Aa x aa Æ 1/2 Aa + 1/2 aa Æ el 50% estarán enfermos.

Si el macho A_ cruzado con hembras aa da lugar a una descendencia aa (sólo 1) ya nos índica que será portador pero si nos salen Aa, ¿cuántos descendientes habrá de tener para afirmar al 95% de probabilidad que siempre será Aa? Si ha tenido n descendientes y el animal es Aa y todos son los descendientes Aa la probabilidad de no detectar que es portador es de (1/2)n, la probabilidad de detectar que sea portador es 1 - (1/2)n. Así pues los individuos que debería tener con 0,95:

0.95 = 1 - (1/2)nÆ n = indica el número de descendientes necesarios para afirmar que ese individuo es portador con un 95% {Assaf, 2009 #190; Bacolod, 2009 #191}

¿Cuál es la magnitud del cambio que quiero obtener y cuánto tiempo quiero esperar para conseguirlo?

439

14.3.1.3. Marcador bialélico Ejemplo marcador M1 bialélico: Tendré 3 genotipos diferentes. Quiero saber potencia de diferentes de 2 individuos de este marcador. ¿Cómo se hace? Calculamos la probabilidad de que escogiendo 2 individuos al azar, los dos sean iguales, sabemos las frecuencias alélicas Æ el panel de marcadores ha de tener probabilidad muy baja de que dos individuos sean iguales, si no es así ese marcador no nos servirá. AA AA Æ p2 x p2 = p4 Aa Aa Æ 2pq x 2pq = 4p2q2 Aa aa Æ q2 x q2 = q4 Æ p4 + 4p2q2 + q4 = PI (*)

(*) Es la P (de que este marcador no diferencie dos individuos), P (dos individuos escogidos al azar sean iguales).

¿Sabiendo p y q de cada alelo puedo calcular P (dos individuos = para todos los SNP’s)? Sí, haciendo producto de probabilidades. Si uno de los marcadores no es polimórfico (p = 1) en este caso la probabilidad de que dos sean iguales es 1. En una población alemana, haciendo esto con 37 SNP’s, la probabilidad de tener 2 iguales era del orden de 10-13, pero, ¿cuál es el problema? Que estos 37 SNP’s no tienen por qué ser polimorficos en otras poblaciones y en ellas el valor cambia drásticamente y no nos serviría.

14.4. Heredabilidad Usando el modelo lineal que presentamos anteriormente (capítulo X), podemos decir que la varianza fenotípica total (VF) depende de la varianza ambiental (VE), las varianzas genéticas (VG + VGxE + VGxG) y la varianza aleatoria (VR).

VF = VE + VG + VGE + VGG + VR

Para algunos caracteres, los resultados de la selección son muy modestos. Esto es debido a que tienen baja influencia genética. A esté grado de influencia se le llama heredabilidad (h2). La heredabilidad indica el por ciento de varianza fenotípica que corresponde a la varianza genética (peso de los genes en un carácter).

h2 = 1 Un caracter tiene alta heredabilidad cuando la Variabilidad Fenotípica (VF) se puede explicar enteramente por la Variabilidad VG Genética (VG). VF ≈ VG. Esto implica que VE y VGE son cercanos a Heredabili hdad 2 == 0. VF h2 = 0 La baja heredabilidad se da cuando VG es muy pequeña y VF muy grande. VF >> VG. Esto también indica que VE es muy predominante.

La heredabilidad indica que tanto de la varianza fenotípica VF depende de la varianza genética y no de la ambiental.

Por otro lado, la heredabilidad también se puede entender como la correlación fenotípica entre el padre y el hijo. Si comparamos dos padres con una diferencia genotípica dada (valor x), y vemos que esta misma diferencia fenotípica se observa en los respectivos hijos (valor y), entonces la heredabilidad es alta. La pendiente (valor a) que obtenemos de esa línea de regresión corresponde en cierta forma a un factor de respuesta a ese carácter. El coeficiente de regresión lineal (Coeficiente de Pearson) es un indicador directo de la heredabilidad.

Estimación del valor genético (Método de genetistas clásicos):

440

Los mejoradores clásicos no podían medir la VG directamente. Cuando conocían el grado de parentesco entre diversas poblaciones entonces podían evaluar indirectamente VG. Para conocer h2 se asume pues la idea de que cuanto más se parezcan entre ellos, los genes tendrán más influencia del caracter. Para calcular la VG no se usa el coeficiente de regresión sino la pendiente de la recta de regresión de los datos experimentales. R2 para saber si la extrapolación Comentario [atf22]: Tengo es correcta. que checar si esto es cierto o R2 ≈ 1: Indica que la importancia de los genes en un carácter es muy alta. Podremos modificar es al revez. un valor en función de otro. Conocido el valor fenotípico del progenitor podremos calcular el valor fenotípico del hijo. R2 ≈ 0: Indica que la importancia de los genes en un carácter es baja.

Datos de 1 progenitor: h2 = 2·a: Sólo están el 50% de los genes. Datos de 2 progenitores: h2 = a (pendiente de regresión): 100% de los genes. Mucho más exacto.

Utilizando esta regla matemática será necesario tener en cuenta que si un carácter está determinado por los genes esperaríamos que en todas las poblaciones R2 fuera muy alto aunque no siempre es así: ↑ h2: h2 ≥ 0,4–0,5: Margen importante de selección (estudiar poblaciones con alto grado de parentesco). ↓ h2: h2 ≤ 0,4: Poco margen de selección. El 60% del carácter vendrá determinado por el ambiente.

14.5. Parámetros matemáticos de variabilidad genética Existe una gran diversidad de estadísticas para cuantificar la variabilidad genética y resumir la información a términos más manejables. Los parámetros estadísticos más empleados son: porcentaje de locis polimórficos, número medio de alelos/locus, la heterocigosidad esperada (HE) y observada (HO) y el índice de contenido de polimórfico (PIC).

Índice de heterocigosidad (H) – P (Individuo heterocigoto): La H indica, en una población y para cada marcador, la probabilidad de que el individuo sea heterocigoto. La H se calcula midiendo el número de heterocigotos totales. Para ello es necesario especificar los genotipos posibles, indicando cuántos individuos de cada genotipo integran esa población.

2 K ⎧ )( = pAAP H 1−= Pi2 ⎪ H +−= qp 22 )(1 Æ H = − hom1 ocigotos = Heterocigotos De 0 a 1 ∑ ⎨ = 2)( pqAaP ∑ i=1 ⎪ 2 ⎩ )( = qaaP - Dice si un marcador es mucho o poco informativo. - hace una estimación de las frecuencias de los alelos en la población.

La constitución genética de la población quedaría descrita por la proporción, porcentaje o por las frecuencias de los tres genotipos (frecuencias genotípicas). Si la cuarta parte de los individuos son AA, la frecuencia de este genotipo sería 25% Obviamente, la suma de las frecuencias genotípicas debe ser 1-100%.

H máxima: Si los alelos presentan frecuencias idénticas. H menor: Cuanto menos individuos se muestren (en poblaciones consanguíneas).

441

H aumenta: A medida que sube el número de alelos en una frecuencia elevada (en poblaciones abiertas).

Índice del Contenido de información de un Polimorfismo (PIC): El PIC es similar al valor de heterocigosidad, y oscila entre 0 y 1. Este índice evalúa la informatividad de un marcador en la población de acuerdo a las frecuencias de los alelos. Para su cálculo se multiplica la probabilidad de cada posible cruzamiento (estimado a partir de las frecuencias alélicas) por la P (de que sean informativos) es decir, que se pueda identificar al progenitor del que procede el alelo. Es el índice que más se usa en estudios genéticos, los individuos informativos son los heterocigotos:

H = Heterocigosidad. C = Coeficiente de ambigüedad y describe la P (de no poder discriminar de quién proviene el alelo del hijo si los 2 padres son heterocigotos para el mismo alelo).

⎛ n ⎞ ⎛ n n ⎞ * Si los alelos en la población 2 ⎜ 2 2 ⎟ CHPIC ⎜1−=−= ∑Pi ⎟ − ⎜∑∑2 PjPi ⎟ poseen una frecuencia 2 KK +− )1()1( 2 ⎝ i=1 ⎠ ⎝ i=+1 =ij 1 ⎠ PIC = 14243 1424 434 equivalente podemos realizar el K 3 Nivel heterocigocidad . deCoef ambigüedad cálculo con otra fórmula más reducida:

* PIC siempre será menos que (H) pq es una H modificada. Se desarrolló para estudiar cómo los alelos se transmitían en la siguiente generación y para los alelos codominantes.

442

15. Genética cuantitativa 15.1. Carácteres de distribución discontinua Básicamente se puede hablar de dos tipos de caracteres: los de distribución discontinua y los de distribución continua. A los primeros también se les llama caracteres cualitativos. Son aquellos que están determinados por uno o muy pocos genes, por eso también son llamados oligogénicos. Presentan una variación cualitativa, discreta o discontinua: en una población se observan clases de individuos según el genotipo que presenten y el mecanismo de acción génica actuante. Las observaciones que sirvieron de base a las Leyes de Mendel se realizaron en caracteres cualitativos que expresaban diferencias de clase entre dos fenotipos: chíncharos de color verde o amarillo, flores blancas o rojas, etc. Sin embargo, se define como fenotipo de un individuo a toda característica visible o medible de dicho individuo. Muchos caracteres de interés económico en producción animal, específicamente los que pueden ser medidos, varían en forma continua, lo que significa que los individuos no pueden ser clasificados en clases discretas. La genética cuantitativa es la rama de la genética que estudia los caracteres controlados por muchos genes, denominados poligénicos, y de sus propiedades genéticas en las poblaciones {Griffiths, 2003 #35}.

15.2. Carácteres de distribución continua Los Cuantitativos: Otro tipo de características no pueden ser encuadradas dentro de la una variación discreta, ya que para ellas puede existir un espectro de fenotipos que cambian imperceptiblemente de un tipo a otro. Son denominados cuantitativos, métricos o continuos, ya que son aquellos que pueden ser medidos en los individuos: peso, altura, tamaño de camada, conversión alimenticia, etc. La mayoría de ellos, en una población, presentan una distribución normal.

La variación continua y normal está dada por dos causas: • La segregación simultánea de muchos pares de genes: son caracteres poligénicos. Están determinados por muchos pares génicos, cada uno de los cuales hace un pequeño aporte a la determinación del carácter. El genotipo de un individuo es la sumatoria de los efectos individuales (efecto aditivo) de cada uno de estos genes. • La acción o efecto del ambiente, que modifica al fenotipo en cierto grado. El peso adulto de un individuo está determinado genéticamente, pero puede verse modificado según la alimentación recibida a lo largo de su vida. Esta influencia ambiental, considerando como ambiente como todo aquello que no sea genético, hace que la simple medición del carácter en el individuo nada haga inferir cual es su genotipo. Un mismo fenotipo puede así, corresponder a distintos genotipos con distinta influencia ambiental.

Modelo genético para caracteres cuantitativos Un modelo es un esquema teórico, generalmente en forma matemática, de un sistema o de una realidad compleja, que se elabora para facilitar su comprensión y el estudio de su comportamiento.

El valor que se observa cuando un carácter se mide sobre un individuo es el valor fenotípico de ese individuo. El modelo que se utiliza para estudiar el valor fenotípico (P) es en componentes atribuibles a la influencia del genotipo (G) y del ambiente (E) es la ecuación:

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P = G + E

En la que P es el valor fenotípico, G el valor genotípico y E el efecto ambiental.

Se define como genotipo como al arreglo particular de genes que presenta el individuo, y el ambiente como todas las circunstancias bioticas y abioticas que afectan al valor fenotípico. Al englobar todas las circunstancias no genéticas dentro del término ambiente es claro que el genotipo y el ambiente son, por definición, los únicos dos determinantes del valor fenotípico, ya que todo lo que no es genotipo, por definición, es ambiente.

Los caracteres cualitativos tienen muy poca o nula influencia ambiental, por lo que el modelo que se aplica a ellos es:

P = G

Genotipo

El Genotipo de un individuo o Valor Genotípico se particiona en componentes atribuibles a diferentes causas:

Valor Genético Aditivo (Ga): como ya se mencionó, para los caracteres cuantitativos, cada gen hace un pequeño aporte individual al genotipo. Ese aporte se denomina valor aditivo del gen. El genotipo aditivo es la sumatoria de dichos efectos de todos los genes que determinan en genotipo de ese individuo para ese carácter. También se lo denomina Valor de Cría, Reproductivo o Mejorante. El valor representa, del valor genotípico, sólo la parte que puede ser transmitida de los padres a su descendencia. Valor Genético por Dominancia (Gd): o desviación por dominancia que surge de la interacción entre alelos de un locus. Es la sumatoria de los efectos producidos debido a las interacciones alélicas entre todos los pares de genes que determinan el carácter en un individuo. Valor Genético por Interacciones (Gi): con más de un locus determinando el carácter, se debe tener en cuenta también las interacciones entre loci (no alélicas), que se denominan epítasis. Es la sumatoria de los efectos producidos debido a las interacciones no alélicas entre todos los pares de genes que determinan el carácter en un individuo. G = Ga + Gd + Gi

Ambiente

Los efectos ambientales son independientes del genotipo del individuo y ocasionan una desviación del valor fenotípico del mismo, con respecto al valor genético, que en muchos casos puede ser considerable. En términos generales, se puede hablar de dos clases de efectos ambientales: • Permanentes: son todos aquellos que una vez que actúan sobre el individuo lo afectan durante toda su vida. Por ejemplo, una deficiencia nutricional prolongada durante el período de crecimiento puede provocar un efecto, que no es genético, que afecte el peso adulto de un animal. • Temporales: son los que actúan sobre el genotipo de manera transitoria: alimentación, estado sanitario, condiciones climáticas, etc.

Considerando todos los elementos que componen el valor fenotípico de un individuo, sólo el valor genético aditivo es heredable. En rigor, el 50 % del mismo, ya que se hereda el 50 % de los genes y no se heredan ni las interacciones alélicas, ni los efectos ambientales.

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Parámetros poblacionales para caracteres cuantitativos El hecho de que exista gran cantidad de genes que determinan un carácter cuantitativo y la influencia del ambiente, hace que sea imposible la estimación de las frecuencias génicas de cada uno de ellos. Para estos caracteres la caracterización de la estructura poblacional se realiza en base a otros elementos que, en definitiva, dependen de las frecuencias génicas.

Media Poblacional

Uno de los elementos que definen a una distribución normal es su media. La media fenotípica para una población, para un carácter cuantitativo, está dada por la suma del valor genético promedio de todos los individuos que la componen y el promedio de las desviaciones ambientales que los afectan.

Varianza Fenotípica

El estudio genético de un carácter métrico se centra en el estudio de su variación, cuya medida matemática más comúnmente usada es la varianza. Para estudiar esta variación es necesario desglosarla en componentes atribuibles a diferentes causas. La magnitud relativa de estos componentes es la que determina las propiedades genéticas de una población

Por tanto, la varianza fenotípica se puede descomponer en varianza genotípica (VG) y varianza ambiental (VE). La varianza genotípica es la varianza de los valores genotípicos y la varianza ambiental es la varianza de las desviaciones ambientales:

VP = VG + VE

Si se consideran todos los componentes del modelo genético, puede desglosarse como:

VP = VGa + VGd + VGi +VE

Es decir, existe en la población distintas fuentes de variación debidas a cada uno de los componentes: varianza genética aditiva (VGa), varianza genética por dominancia (VGd), varianza genética por interacciones (VGi) y varianza ambiental (VE).

El grado de variabilidad genotípica de un carácter en una población tiene relación directa con las frecuencias génicas de la misma. Con frecuencias extremas (p = 0, p= 1) la varianza genética aditiva es cero, ya que los individuos no presentan diferencias genéticas entre ellos, son todos homocigotos. Cuando toman valores intermedios (p = q = 0.5) la variabilidad aditiva es máxima. {Griffiths, 2003 #35; Aldridge, 2009 #176}

15.2.1.1. Diseños experimentales para detectar QTL’s Algunas poblaciones se han utilizado mucho para detectar QTLs de enfermedades o productividad. En algunos casos esas poblaciones se han derivado de cruzamientos experimentales entre dos lineas homocigotas, por ejemplo, la linea Mo17 y el B73 que dieron lugar a los RILS de la población IBM (intermated B73 Mo17 population). En muchos países no existe una infraestructura pública para evaluar diferentes genotipos de maíz en múltiples ambientes. En algunos centros se evalúan líneas homocigóticas. Pero ¿de que sirve eso si las líneas no son las que se liberan a campo? El rendimiento lo debemos medir en los híbridos. Si las líneas per se no dan un resultado confiable, entonces la debemos utilizar en todos los cruzamientos posibles. A esto se le llama un cruzamiento tipo dialelo.

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Figura 15-1. Aspecto del cromosoma 4, vemos que hay varios QTL’s en este cromosoma. Por ejemplo 4 es igual a la escala de probabilidad de que el QTL esté en algún lugar del cromosoma 4, en el eje x está el marcador a lo largo de QTL. La región del grueso es igual a la zona en la que trabajaremos en el laboratorio (la primera), donde vemos que se han buscado todavía marcadores, es una región de 20 cM Æ 1 cM ≈ 1 Mb Æ 20 Mb, puede representar muchos años de trabajo

Detección: Un QTL se localiza en un intervalo 10-30 cM. La probabilidad de detectarlo dependerá de una serie de factores que nosotros no podemos controlar: • Heredabilidad del carácter • Naturaleza genética (dominante, recesivo o aditivo) • Números. de genes que afecten el carácter • Magnitud del efecto del QTL sobre el carácter

15.2.1.2. Clonación por posición A partir del pedigrí podemos detectar que el QTL está en una zona concreta. Por ejemplo, gracias a la asociación a un microsatélite. Entonces, debemos buscar BAC’s que representen aquella región del genoma y comenzar a secuenciarlos para identificar que genes hay en aquella zona. Ahora hay que ver cual de los genes es el responsable y más concretamente la mutación que hay en él. Teniendo las secuencias de los BAC’s ¿como se predice la existencia de genes en ellos? Se puede hacer de dos maneras:

“In silico” por medio de bases de datos Búsqueda en bancos de datos de genes y EST’s localizados en la región, análisis de homología con genes y EST’s de las bancos de datos, análisis de secuencia para detectar ORF’s y exones. Una posibilidad es detectar ORF’s y exones, en los eucariotas ORF’s no sirve igual que en procariotas porque están separados por exones e intrones, por eso en eucariota para identificar los exones se buscan secuencias consenso de inicio o final de los intrones y del “lariat”.

El codón bias tambien puede ser usado para detectar regiones de genes. Una región codificante (exón) se puede diferenciar del resto por su composición de tripletes. Por ejemplo la prolina puede estar codificada por cuatro tripletes diferentes pero hay algunos más frecuentes que otros. Si miramos los RNA’s de transferencia que se unirán a este triplete en humanos veremos que no habrá ninguno que pueda unir a CGG, de manera que CGG se unirá al AGG que también se unirán a CCU. Esto quiere decir que para algunos codones hay más RNA’s de transferencia y esto acelerará su traducción.

También podemos detectar islas de CpG. Las zonas poco metiladas están asociadas a la presencia y expresión de un gen.

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Hibridación de clones genómicos sobre RNA o sobre genotecas de cDNA Tenemos un BAC de 150 kb y queremos saber si contiene un gen, para lo cual cogemos fragmentos del BAC, marcamos e hibridamos sobre RNA (northern) o sobre gametotecas de DNA. Si realmente hay algún gen veremos una banda. Problema, si el exon que detecta nuestro fragmento es pequeño bajará la sensibilidad y no veremos banda. También puede ser que este gen no se exprese en aquel momento o en aquel tejido, por lo que puede que no veamos que está aquel gen. Si el gen se expresa poco el northern tampoco tendrá suficiente sensibilidad para detectarlos

Islas CpG No de forma computacional, es decir, que tengo clones sin secuenciar, por ejemplo tengo enzimas de restricción que cortan en zonas CG cuando no están metiladas (hipometiladas < 20% de los Cg’s metilados, hipermetiladas como mínimo hay un 30%). Si vemos que corta es que hay diana.

Identificación de genes en una región Generamos fragmentos aleatorios del BAC usando enzimas de restricción que reconocen diana de 4 pb (Æ como media tendré una diana cada 256 pb Æ (1/4)4 = 1/256). Los fragmentos aleatorios contendrán todo el BAC y se pueden solapar entre sí. Añadimos dinkers y hacemos PCR usando primers marcados con biotina. Por otro lado tenemos una genoteca de cADN del tejido donde sospecho que se expresa el gen, hago PCR y amplifico todos los insertos para obtener una colección de fragmentos de los genes que se expresan en ese tejido. Entonces haré hibridación:

La molécula de DNA genómico se hibrida con una igual. La cadena 5-3 de cDNA se une con el complementario del clon genómico o la 3-5. La molécula del clon se hibrida con si misma.

Aprovechando el marcaje con biotina se pueden retener con un imán, tan solo aquellas que tengan hibridación BAC-genómico o BAC-BAC. Ahora hacemos PCR usando primers de la genoteca de cDNA, de forma que así conseguiremos tener grandes cantidades de BAC+cDNA y no BAC.

15.2.1.3. Dificultad en la identificación de genes y mutaciones que explican los QTL’s: La mayor dificultad no es detectar QTL’s sino identificar el gen responsable o la mutación causal. Los QTL’s tienen efecto limitado. La mayoría de las veces, un solo QTL puede explicar de 0.5% a 5 % del total de la varianza fenotípica. Otro problema es que pueden existir diferentes QTL’s ligados que afectan conjuntamente un carácter. Una posible explicación es porque hay diversas mutaciones causales: no hemos de buscar un solo gen con importancia causal, sino tres genes con efecto pequeño, que sumados tienen un efecto grande que se observa como un solo QTL.

También hay fenómenos de epistasia. La epítasis es cuando hay una interacción no aditiva entre los QTL’s. Es decir, cuando el efecto combinado de los QTLs no es la simple suma del efecto de los QTLs individuales.

Los polimorfismos causantes de los QTL’s podrían ser mutaciones que afectan la regulación génica, por ejemplo que disminuyen en un 20% la expresión de un gen. Pero también pueden ser mutaciones en las regiones codificantes de las proteínas que afectan la función de una enzima o sus propiedades catalíticas o cinéticas {Collard, 2005 #22}.

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16. Mapas genéticos 16.1. Tipos de mapas Los primeros mapas genéticos datan de 1900. En esa época solo se utilizaban marcadores fenotípicos tipo I. Ya en ese entonces se establecieron grupos de ligamentos (conjuntos de genes que se heredan juntos). En 1960 se pudo empezar a trabajar con proteínas, gracias a la electroforesis y agentes inmunológicos que podían detectar proteínas con muy alta especificidad y sensibilidad. En 1980 se desarrollaron técnicas de detección basadas en hibridación obteniendo así marcadores moleculares como; RFLP’s. En 1988 surgió el PCR y por tanto los microsatélites, RAPD, AFLPs, etc.

Existen 2 tipos de mapas genéticos: Los mapas de ligamento que utilizan como medida la distancia de las frecuencias de recombinación (medida indirecta de la distancia). Los mapas de ligamiento dan medidas en centimorgan. Un centimorgan es cuando de un grupo de cien descendientes, en 99 de los casos los alelos de un padre se heredan en bloque, mientras que en un solo caso (1/100) se da una recombinación entre los alelos del padre y de la madre. Los mapas físicos Se basan en secuencias contiguas y completas de DNA (contigs) y que posicionan físicamente sobre un cromosoma o unos marcadores en el DNA. Los mapas físicos dan medidas en kilobases.

16.1.1. Mapas de ligamiento Comenzaron a inicios del siglo XX. El primero en desarrollarlos fue Thomas Hunt Morgan quien escogió Drosophila melanogaster como organismo de experimentación genética. Se hacían cruzas para revalidar las teorías de Mendel. El cruzó en Drosophila homocigotos para alelo mutante y homocigotos para alelo normal. La descendencia (F1) se cruzó con homocigoto recesivo. (Griffiths,et.al. 2004).

P: pr pr / vg vg X pr+ pr+ / vg+ vg+ = pr+ pr / vg+ vg F: pr+ pr / vg+ vg X pr pr / vg vg

¿Qué se esperaba obtener? Las hembras T1 pueden producir cuatro gametos mientras que el macho homocigoto recesivo sólo tieneuno, por lo que se obtienen cuatro genotipos diferentes y por tanto cuatro fenotipos. La 2ª ley de Mendel de distribución independiente decía que de cuatro gametos era probable que se heredaran, pero Morgan vio que no era así: habrá dos fenotipos mucho más abundantes y dos mucho menos de lo que se espera. Curiosamente los dos más frecuentes vemos que corresponden con los gametos pr+vg+ y prvg que se conocen como los parentales, los otros dos son los recombinantes. Se les llama parentales porque son los que produjeron los progenitores originales en la FO. Si los gametos parentales son más frecuentes es porque los dos genes están ubicados en el mismo cromosoma.

(A) ¿Qué pasa si están ligados? Sólo se observarán gametos del tipo parental (A)

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(B) Morgan: pero esto no fue lo que observó Morgan. Afirmó que debía de existir algún mecanismo que permitiera cruzar cromosomas (quiasmo): Se obtienen pues ¼ de cada gameto como afirmaba Mendel:

2 gametos parentales

2 gametos recombinantes

N Reº combinantes Fr entrecruzamiento = ·2 Fr recombinación Æ Fr recombinación = Entre 0 y N ºTotal 50%

La frecuencia de entrecruzamiento es el doble de la frecuencia de recombinantes porque el entrecruzamiento sólo afecta a dos de las cuatro cromátidas. Lo que se verá en la descendencia (fenotipo) no serán los gametos, pero en función del fenotipo podemos saber que gametos se han recibido.

Mapas de dos puntos: Sturtevant: encontró una aplicación a la ligadura: Hacer mapas usando frecuencias de recombinación. En el caso de dos locus, cruzamos un individuo doble heterocigoto con un individuo prueba con lo que obtenemos cuatro genotipos diferentes. Vemos que las frecuencias de cada uno de los cuatro no son iguales, viendo de nuevo mucha mayor frecuencia de 1 de lo que se espera y 2 mucho menos. A partir de esto se ha deducido que quien condiciona el genotipo en la descendencia es el doble heterocigoto que puede ser dibujado AaBb:

Fase de Fase de acoplamiento repulsión

¿Cómo averiguaremos en qué fase están los alelos? Sabemos que siempre habrá menos recombinantes que parentales, si nos fijamos en la tabla (AB) y (ab) son los gametos parentales Comentario [ATF23]: Cuál (que siempre están en una Frecuencias ≥ 50%, así que el individuo heterocigoto del ejemplo está tabla en fase de acoplamiento. Una vez se sabe la fase, se conocen los gametos parentales y recombinantes y ya se puede calcular la frecuencia de recombinación:

R + 5446 Ahora podemos hacer un mapa que nos FR == = 1,0 total 1000 indica que locus A y B están separados por una frecuencia de recombinación del 10%.

¿Qué frecuencia de entrecruzamiento hay? FE = 2FR = 1 Æ FE = 20%. Sturtevant dijo que la frecuencia de recombinación era proporcional a la distancia, así se podían hacer mapas, además también decía que las probabilidades de que se de entrecruzamiento es uniforme a lo largo del cromosoma, lo que implica que cuanto mayor distancia haya entre los locus, mayor frecuencia de recombinación hay, si se asume que la recombinación se da de forma aleatoria a lo largo del cromosoma.

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A B En este caso es más probable que se de entrecruzamiento entre A y C que C entre A y B. Esto nos permite usar las frecuencias de recombinación como A B una medida de la distancia. C

Situaciones en las que nos podemos encontrar: Frecuencia = 50%: No nos permite saber si están en el mismo cromosoma con FE del 100% o si están en diferente cromosoma y si se sigue la 2ª ley de Mendel no nos da ninguna información, porque si dos genes están muy lejanos entre sí se puede dar entrecruzamiento y parecería que estuvieran en cromosomas diferentes. Frecuencia << 50%: Podemos asegurar que están en el mismo cromosoma y nos indica la distancia aproximada entre ellos. Es una situación informativa. Entonces hablaremos de que están ligados. Podríamos diferenciar dos situaciones: los dos locus están tan juntos que la Frecuencia es 0%, si están parcialmente ligados es la situación más interesante para hacer mapas porque nos indica la distancia.

Mapa con tres locus (puntos): Cruzamos un heterocigoto de tres genes con un homocigoto recesivo y se obtienen ocho genotipos diferentes. Para hacer el mapa comenzaremos calculando la distancia entre B y C sin tener en cuenta A, y así sucesivamente. B c En este caso es más probable que se de entrecruzamiento entre A y C que entre A A y B. Esto nos permite usar las frecuencias de recombinación como una medida b C de la distancia. a

Primero calcularemos la fase de BbCcAa: los gametos más abundantes son BcA y bCa (son los parentales) sin haber sufrido entrecruzamiento: P: BbCcAa x bbccaa Cálculo de las distancias de 2 en 2: BC Æ los recombinantes serán BC y bc que están con 38, 147,135 y 44: +++ 4413514738 = %4.36 1000 CA Æ los recombinantes serán ca y CA que están en 38, 7, 11 y 44: +++ 4411738 = %10 1000 + + +135117147 BA Æ los recombinantes serán Ba y bA que están en 147, 7, 11 y 135: = %30 1000

¿Puede ser? 30+10 no es 36,4 si no 40.

Gametos parentales: Gametos rocomb (I): Gametos rocomb Gametos doble P BAc (320) RI BaC (147) (II): recomb: baC (298) bAc (135) RII BAC (38) DR Bac (7) bac (44) bAC (11)

Cálculo de las distancias: Para calcular la distancia AB hemos de tener en cuenta los gametos y como hay recombinación entre AB:

+ DRRI +++ 117135147 ABD )( = = = %30 total 1000

450

+ DRRII +++ 1174438 ACD )( = = = %10 total 1000 ++ 2DRRIIRI +++++ )117(24438135147 BCD )( = = = %40 total 1000

Antes salía 36.4 porque no teníamos en cuenta a uno de los tres marcadores y al hacer distancias de 2 en 2, no tuvimos en cuenta el DR y estábamos asignando una distancia menor de la que hay realmente.

DRobservados Cálculo de los esperados: Afirmamos que la Coincidenc eia int erferencia = D Re sperados probabilidad de recombinación en I y II son independientes entonces ¿cuál es la probabilidad de tener una recombinación doble?

(DRP esperados = NRIIPRIP º)·()·() individuos

Verdad, siempre y cuando los dos sucesos sean independientes. La P(Re I) = distancia AB en tanto por 1. DR esp. = 0,3 · 0,1 · 1000 = 30 Æ C = 18 / 30 = 0.6. Sólo se observa el 60% de los DR que se esperan, en este caso nos está indicando que la proteína recombinante no es independiente a la Re II, hay una interferencia que hace que cuando hay recombinación en I disminuye la recombinación en II.

Cálculo interferencia: I = 1-C Æ I = 0,4 obsDR obsDR Si I = 0 Æ C = 1 = 1 Si I = 1 Æ C = 0 = 0 Tanto I como C espDR espDR (0 ≤ C ≤ 1) y (0 ≤ I ≤ 1)

* Cuando se produce recombinación en I nunca se da en II, ya que habría una interferencia total.

Análisis de ligamento: Pedigrí: Suponiendo que el padre está sano y la madre está enferma (enfermedad autosómica dominante, donde el alelo A provoca la enfermedad). ¿Estará en todos los hijos que han recibido A de la madre (enfermos)?. Desconocemos el gen que la provoca pero podemos determinar genotipos de marcadores si tengo un microsatélite cerca del locus que determina la enfermedad Æ cuando se transmite el alelo A la madre también transmite el alelo 1 del microsatélite (sólo se romperá esta situación si hay recombinación o si están A y 1 cerca, casi no habrá recombinación). Vemos que en la descendencia hay un recombinante porque A se hereda con 2 (FREQUENCIA = 1 / 6 = 0.18)

A partir de esto podemos afirmar que el microsatélite está cerca del locus de la enfermedad (estará pues en el mismo cromosoma y cerca, porque si no estuviera cerca, tendríamos la misma probabilidad de observar A-1 y A-2, y no es así) Æ El gen está próximo al marcador de posición conocida, por lo que sabemos en qué zona (+ o -) se sitúa el gen de la enfermedad porque se hereda conjuntamente con el alelo de un marcador. En un mapa de ligamento de cerdo con medidas de distancias en cM. En un color están los marcadores y en otro los genes. ¿Entre el marcador SO11 y SO23 qué FRecomb hay?: Aunque la distancia es 80, la frecuencia es 50% máximo Æ no detectaré si están ligados y pensaré que están en cromosomas diferentes.

451

16.1.2. Características de la recombinación Para hacer mapas de ligamento hacen falta marcadores polimórficos. Es necesario que el marcador presente diferentes variantes (alelos) para distinguir entre A y a. La frecuencia de recombinación nunca supera el 50%. Si hay 2 marcadores que están muy lejos en un mismo cromosoma no se puede detectar que están ligados, ni calcular la distancia entre ellos. Dos marcadores muy separados no dan suficiente información. Hace falta disponer de muchos marcadores para superar este inconveniente y detectar todos los marcadores que pertenecen al mismo cromosoma. Si la distancia entre marcadores es muy pequeña, por ej. 1cM entre A y B querrá decir que habrá que analizar 100 individuos para encontrar 1 recombinante. La cercania de los loci implica dificultad para encontrar recombinación en la descendencia. Múltiples entrecruzamientos; implica que si se dan 2 entrecruzamientos entre A y B y no hay un marcador entre ellos vemos el resultado como gametos parentales. Bajo estas condiciones se subestima la distancia. ¿Cómo se puede corregir ésto? Si una “a” media se da en 0,2 entrecruzamientos la distancia será de 10 cM, si se da un entrecruzamiento a distancia de 50 cM a nosotros nos gustaría esto, que hubiese relación lineal entre distancia y número de entrecruzamientos (a). En realidad tenemos (b): para frecuencias de entrecruzamiento pequeñas, las distancias o frecuencias de recombinación se comportan de forma lineal, pero si aumenta la frecuencia de entrecruzamiento, obtendremos una frecuencia de recombinación por debajo de lo que es normal. Æ Por ejemplo en un 0,6 deberíamos observar un 30% pero vemos un 20%. Este problema se agrava a medida que aumenta la distancia porque es más probable que se den más recombinaciones para corregir está diferencia, se hace siguiendo la función del mapa. Esta es una ecuación que relaciona la frecuencia con la distancia genética de un mapa. Está ecuación se aplica en valores grandes cuando se ha comenzado a desviar de la realidad, porque si la distancia es pequeña se asume que no hay múltiples entrecruzamientos.

FR = 10% Æ D = 10 cM. FR = 40% Æ D = función del mapa.

Existen distintas formas de calcular esta relación:

1. Función del mapa de Haldane Æ se basa en la distribución de Poisson: D = -1/2 ·Ln (1-2r) Donde i es la frecuencia de recombinación observada i = 1/2 · (1-e-2d)

Si en el mapa tenemos el valor de distancia, y queremos saber la frecuencia de recombinación, se procede al revés que en el caso anterior. En esta fórmula se asume que no hay interferencia, que si se da entrecruzamiento en una zona no disminuye la probabilidad de que haya entrecruzamiento en la zona adyacente.

2. Función del mapa de Kosambi Æ para distancias grandes donde sí que asumimos hay interferencia: D = 1/4 · Ln (1+2r / 1-2r)

La frecuencia es diferente en machos y hembras: Cuando se han hecho mapas de ligamento en machos y hembras, los machos son normalmente diferentes. En el esquema vemos el Comentario [ATF24]: Cual cromosoma tres de un animal, en macho, hembra y la media. El mapa de ligamento en la esquema? hembra suele ser más largo. Cabe decir que las distancias físicas entre los marcadores son iguales, pero en las hembras se da más recombinación y por eso las distancias en cM son diferentes.

La frecuencia no es uniforme a lo largo del cromosoma: Se encuentran zonas “hot spots”, llamados puntos calientes de recombinación. Esto se da tanto a nivel cromosómico como a nivel génico, se consideran heredables. Si yo tengo un mapa físico (p) con marcadores distribuidos

452 uniformemente a lo largo del cromosoma, realizo un mapa de ligamento (c) entre los marcadores veríamos que las distancias entre ellos son variables según la probabilidad de que haya recombinación. En el mapa no es cierto que los extremos disminuyan, sino que aumentan porque la probabilidad de recombinación es mayor en los telómeros. Si miramos el verde veremos que la distancia aumenta de forma exponencial a medida que nos alejamos del centrómero y nos acercamos al telómero.

Hasta ahora habíamos observado un pedigrí con una frecuencia de 0.18 entre A y 1. ¿Nos lo podríamos creer?: No, ya que por azar nos podrían haber salido aquellos datos ya que sólo hemos medido en seis individuos y hace falta una medida de mayor fiabilidad. Esta medida es el Lod score, que mide la probabilidad de que exista ligadura entre dos loci. Para calcular Lod score, primero hay que calcular Odds ratio (razón de semejanza).

Odds: Probabilidad de encontrar una recombinación entre seis individuos si la frecuencia es del 10%.

( losobtenerdeP fenotipos observados Frsi = %)0 L θ )( RatioOdds = == L θ )(* ( losobtenerdeP fenotipos observados Frsi = %)50 L )5,0( Probabilidad de obtener (1 recombinación / 6) si la frecuencia es del 50%, lo cual implica que no están ligados. El Lod score es el logaritmo de la anterior ecuación:

Ej: Imaginemos que tengo 40 individuos, 8 de ellos son ⎡ L θ )( ⎤ θ 10 *)( == LogLLogZ 10 ⎢ ⎥ L )5,0( recombinantes y 32 parentales. ⎣ ⎦ FR = 8/40 = 0.2 Æ 20% ¿Están ligados?

Aparentemente diríamos que sí porque 20 < 50, pero ¿nos lo podemos creer? Calculemos Lod score.

Para calcular las probabilidades tomemos en cuenta que estamos ante una distribución binomial:

⎛ N ⎞ −KNK KXP == ⎜ ⎟ ··)( qp ⎝ K ⎠ Si FR = 0,2Æ R = 20%; P = 80% ⎛48⎞ ⎜ ⎟ 8,0·2,0· 328 ⎛40⎞ ⎜8 ⎟ XP )8( == ⎜ ⎟ 8,0·2,0· 328 Æ a ⎡ L )2,0( ⎤ ⎝ ⎠ ⎜ ⎟ Z θ = log)( 10 ⎢ ⎥ = = 35,3 ⎝8 ⎠ ⎣ L )5,0( ⎦ ⎛48⎞ 328 ⎜ ⎟ 5,0·5,0· ⎝8 ⎠ Si FR = 0,5Æ R = 50%; P = 50% Log de 1000 = 3 significa que la P (numerador) 40 ⎛ ⎞ 328 Æ b = 0,2 es 1000 veces más probable que la XP )8( == ⎜ ⎟ 5,0·5,0· ⎝8 ⎠ P(denominador) = 0,5 por lo que podemos afirmar que están ligados.

Zmáx ≥ 3 Æ se acepta la ligadura. Zmáx < -2 Æ se rechaza la ligadura.

Si representamos todos los Lod score de las frecuencias veremos que para θ=0,2 el Lod score es máximo. Esté es el obtenido al calcularlo por diferentes frecuencias de recombinación (θ). Se trata por tanto de una mezcla de probabilidades de ligadura, el valor θ para el cual se obtiene una Zmáx. Es una estimación de la frecuencia de recombinación:

Ejemplo: Vemos 2 pedigrís, no muy significativos porque no hay mucha descendencia. Vemos que el Lod score no supera el 2, así que no podemos afirmar nada. La ventaja del Lod score es que se pueden sumar los datos de diferentes familias.

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Zmáx (a) = 0,623 (0,623 + 0,3 = 0,9) Æ Log (A x B) = Log (A) + Log (B) Zmáx (b) = 0,3

Si supera 3 están ligados, por debajo de -2 no están ligados.

16.1.3. Mapas físicos Mapas de clones solapados Secuencia de DNA. Un contig map es un mapa genético que representa el orden relativo de un vinculado (contiguos) de la pequeña biblioteca con la superposición de clones que representan un segmento cromosómico completo. Los contig maps ofrecen la posibilidad de un estudio completo y, a menudo, de gran parte del genoma mediante el examen de una serie de clones que se superponen, después, una sucesión ininterrumpida de información sobre esa región. Estos mapas se han hecho con YAC’s pero hoy ya no se usan porque recombinan mucho, pese a tener la ventaja de que cabe una Mb. Debido a la recombinación de los YACs se vió que en las genotecas había un 30% de quimerismos y por eso se usan hoy mas los BAC’s, en los cuales caben de 100 a 300 kb. Se aisla DNA genómico y se hace una genoteca dentro de vectores BAC’s. Se buscan clonas que se solapan para reconstruir cada cromosoma. Despues se secuencias los BACs de forma individual.

¿Cómo se hace el contig? Una posibilidad es por Fish, se marca cada BAC fluorescentemente y sabremos en que zona se sitúa. Otra metodología son los mapas de macrorestricción o digestión parcial (cogemos BAC’s y digerimos con enzimas de baja frecuencia de corte como Not I, que corta cada ocho pares de bases, Sal I que solo corta secuencias no metiladas). Finalmente podemos usar tecnologías con marcadores comunes; por Fish sabemos que los BAC’s se sitúan en una zona, pero no sabemos el orden, aprovechamos que conocemos microsatélites en aquella región y hacemos PCR para ellos viendo así su orden.

Estas genotecas también se pueden hacer de un solo cromosoma y no de todo el genoma. ¿Cómo lo aislamos? Por electroforesis de campo pulsado (PFGE). Pero en levadura que tiene pocos cromosomas va bien, pero no con mamíferos que tienen muchos. También por citometría de flujo que permite separar cromosomas humanos, pero si los cromosomas (como 21 y 23) tienen un tamaño similar no podremos. El cuatro sí, porque es el más pequeño. La última opción es por microdisección de cromosomas donde pescamos 1 y lo aislamos, por lo que ya lo podemos observar al microscopio.

Como tenemos mapas físicos y de ligamiento podemos integrar los dos tipos de información Æ mapas genómicos integrados. Si vemos un mapa físico y uno de ligamiento, se ha buscado la relación entre los cM y las Mb, y se ha visto que 1 cM (1% de frecuencia recombinante) equivale a 1 Mb, aunque esto es aproximado porque variará en función de la especie, del sexo, etc.

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Figuras 16-1. Contig map del cromosoma 3p21.1-9 y megaplasmido pSymB de S. meliloti Strain 1021

Composición de mapas genéticos-físicos: La medida de los cromosomas influirá, ya que se ha visto que los cromosomas pequeños presentan una mayor frecuencia de recombinación. En el gráfico se representan los brazos de Comentario [ATF25]: Cuál los cromosomas y la relación de cM-Mb para cada uno Æ brazos más grandes tienen como gráfico media 1 cM -1 Mb, mientras que los brazos menores podemos llegar a 2,4 cM por 1 Mb.

Así pues, dada 1Mb tendremos 1 recombinación cada 100 gametos en cromosomas grandes y dos recombinaciones en cromosomas pequeños.

Los diferentes mapas que hemos visto tienen una cierta jerarquía. Los cromosómicos y los genéticos son los que tienen menor resolución mientras que la secuencia es la que presenta mayor resolución. A partir de los mapas genético y cromosómico, se amplia una zona más concreta y después todavía se amplia más viendo así no tan solo microsatélites sino también ESTs Æ podemos hacer mapas de clones solapados que nos permitirán determinar el orden de los genes y conocer la secuencia.

Tarea 16-1 En relación a los mapas explicados, realiza un cuadro sinoptico explicando las caracteristicas de cada uno. ¿Dónde crees que tengan aplicación cada uno? 16.1.4. Mapas cromosómicos o citogénicos: Bandeo: Para los mapas cromosomicos es necesario poder identificar los cromosomas de cada especie. Al principio esto ha de ser posible gracias a técnicas de bandeo. El patrón de bandas permitirá identificar los cromosomas. Existen 4 tipos de bandeo, entre los más usados tipos de bandeo; bandeo G y el R. Ideograma: El patrón de bandas se puede representar gráficamente en lo que se conoce como un ideograma Æ a la izquierda tenemos tinción como Giemsa y a la derecha con reverso. En el caso de los bovinos vemos que solo X e Y tienen brazo p y q. Identificación cromosomas: No siempre es fácil identificar cromosomas. Por ejemplo en pájaros hay sólo ocho parejas de macrocromosomas, mientras que puede haber hasta treinta pares de microcromosomas. Los microcromosomas son muy pequeños (como un punto) y haciendo técnicas de bandeo no se pueden diferenciar.

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¿Cómo diferenciar cromosomas? Con la técnica del Chromosome Painting. Se desarrollan sondas específicas para cada microcromosoma y se hace hibridación in situ. Las sondas se marcan con fluoroforos que despues pueden ser visualizados en un microscopio (Figura 16-1).

Figura 16-1. Algunos cromosomas marcados con fluoroforos. Mapas cromos Vemos algunos genes marcados con verde. En algunos casos se puede precisar su localización más exacta mientras que en otros sólo podemos decir que está en un cromosoma determinado.

Método FISH y sus variantes: Cromosomas normalmente en metafase (está condensado y lo podemos ver al microscopio óptico). Con las sondas fluorescentes se ven cuatro cromosomas. Hay dos cromosomas homólogos y cada una de las dos cromátidas hermanas unidas. Una vez identificado dónde está, teñiremos para conocer en que cromosoma está. El problema es que es necesario elaborar la sonda y unicamente lo podemos hacer si previamente hemos aislado el gen.

Metafase: La resolución es bastante baja. Para incrementarla puedo estirar cromosomas y los dos puntos de hibridación quedarán más separados. Esto se puede hacer por estiramiento mecánico a través de centrifugación. Núcleo interfásico: Otra opción es hacer Fish con cromosomas que tengan núcleo interfásico, pero ahora el DNA no está compactado, lo usaremos principalmente para ordenar genes, pero con el inconveniente de que la distancia no puede ser correcta porqué los puntos estarán curvados, es necesaria una media entre diversos núcleos. Fibras de DNA (BAC o YAC): La otra alternativa es usar fibras de DNA que son BAC o YAC, Comentario [ATF26]: Qué sobre los que puedo saber la posición de genes dentro de éstos. significa

Método Células somáticas híbridas (RH): Se debe escoger la especie de interés, y por otro lado disponer de células tumorales de ratón o hámster. Las células de la especie de interés (en esté caso de vaca) son irradiadas (si no hiciéramos esto no se romperían los cromosomas). Seguidamente se fusionan los dos tipos de células (usando PEG) que favorece la fusión de citoplasma o bien usando virus como el (Sendai) que se unen a la matriz y por contacto permiten la fusión. Obtendremos una célula híbrida que tendrá cromosomas de ratón enteros y cromosomas de vaca rotos. Seguidamente se hace el proceso de selección, donde de forma aleatoria se van perdiendo los fragmentos de la vaca, pese que a veces queda retenido de forma estable algún trocito de uno de los cromosomas de la vaca (la retención de un fragmento u otro es aleatoria). Tendremos una colección de células, cada una de ellas, con diferentes fragmentos de cromosoma de la vaca. En esté proceso nos interesa tener más de 100 clones o células diferentes que entre todas contengan el genoma de la vaca.

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Caracterizar los clones: Seguidamente es necesario caracterizar lo que tiene cada uno de estos clones celulares. ¿Cómo lo sabremos? Si tengo marcadores que sé que están en un cierto cromosoma, puedo hacer Fish e identificar en que clon está aquella región del cromosoma, o PCR, bandeo… Una vez que hemos caracterizado éste es muy útil para localizar y posicionar nuevos genes. Determinar las células en un cromosoma: Imaginemos que tenemos 27 células de parejas para el cromosoma 4 del cerdo. La línea vertical negra nos indica que trozo del cromosoma tiene cada célula; por ejemplo la 6, 18, 20, 25 y 27 tiene todo el cromosoma 4. Si tenemos el gen entre FABP4 puedo hacer PCR para identificar (tan sólo es necesario hacer ésta para amplificarlo sobre las células que tengo en el par, e identificar en que región del cromosoma está). Por ejemplo si hacemos esto y solo nos saliera una banda en el gel (por lo tanto ha habido amplificación): 1, 6, 9, 11, 12 puedo acotar que estaría en el cromosoma 4 brazo p, entre las bandas 13 y 15 Æ 4p 13-15.

Estos mapas conocidos como RH (Radiation Hibrids) tienen ventajas respecto a los mapas de ligamiento: Los marcadores no deben ser polimórficos. No debe haber interferencia. No hay diferencia entre sexos. La resolución puede ser más grande que en los mapas genéticos pero depende del par, es decir de la radiación que hayamos utilizado. A más radiación más trozos pequeños.

Con estos mapas no tan solo podemos identificar la localización, sino también establecer distancia con otro marcador que ya estaba localizado. La probabilidad de que A y B estén en el mismo fragmento es más elevada que en BC. La medida de la distancia es la probabilidad de rotura cromosómica entre los dos marcadores Ώ (omega). Además no hay interferencia porque el hecho de que haya rotura en un punto no quita que se pueda dar en otro. El valor de omega oscila entre 0 y 1, no es aditiva y es necesario aplicar función de mapa como en los mapas de ligamiento. La medida de la distancia es cR (unidad de distancia que indica frecuencia de rotura):

Ejemplo: 1 cR Æ A y B están en células diferentes en 1 de cada 100. 10 cR Æ B y C están en células diferentes en 10 de cada 100.

Pero la distancia dependerá de la radiación que se utilice para construir el panel. Más radiación, más fragmentos pequeños y por tanto la probabilidad de que A y B estén separados será mayor. Por ello se evalúa la relación kb / cR ern cada panel RH. Si sé que el marcador 1 y 2 están a 20 mega bases (distancia real) y al hacer esta técnica me salen 20 cR podré establecer que en este panel 1 cR es igual a 1 Mb.

16.2. Aplicaciones de los mapas genéticos Los mapas genéticos se puede usar para identificar las regiones que contienen genes que determinan caracteres económicos y cuantitativos importantes (Quantitative Trait Loci o QTL’s). Por ejemplo, rendimiento de grano, días de floración femenina, altura de planta, tolerancia a la sequía, etc. También nos interesan las características que determinan susceptibilidades, defectos o genes que determinan resistencia a cierta enfermedad.

Además de identificar los genes, la genómica (no tan solo los mapas) permite otras aplicaciones como genotipado de genes de interés productivo, hacer selección asistida por marcadores MAS (usa información de marcadores para introducir de un genotipo a otro un carácter de interés, haciendo cruzamiento en la zona del genoma que nos interesa), también introgresión asistida (pasar de una raza a otra) por marcadores MAI (Marker assisted Introgession). Otra utilidad es identificar paternidades, y finalmente también modificar los genes de interés.

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El número de genes que provocan enfermedades hereditarias y que han sido identificados aumentó exponencialmente.

Caracteres cualitativos: Son aquellos caracteres con variación fenotípica en dos o pocas categorías. La variación de esté carácter es discontinua ya que da saltos de una forma a otra (verde, amarillo o blanco). Generalmente se deben a caracteres determinados por un único gen, que ya sea que está en su versión normal o mutada (negro o albino).

Caracteres cuantitativos: Son aquellos caracteres con variación fenotípica en una escala continua medible debido a causas genéticas o ambientales. La variación de este carácter puede ser discreta o continua pero siguiendo una distribución normal. Suelen ser multifactoriales. Se utiliza el modelo de Fisher (modelo infinitesimal) que determina los caracteres por infinitos genes (poligenes) con efecto muy pequeño y aditivo.

Esto es difícil de creer porque no hay infinitos genes, además, no siempre es aditivo porque no puede haber equidistancia y tampoco todos tienen un efecto pequeño, aunque a pesar de todo esto es un modelo muy utilizado actualmente porque funciona bastante bien.

Hasta que no hemos tenido herramientas que nos permiten caracterizar los caracteres cuantitativos. Vemos que cuando tenemos dos loci no es igual a una distribución normal, pero cuando ya tenemos mas de 3 sí. Comentario [ATF27]: Cómo QTL’s: es esto? Locus que afecta a caracteres cuantitativos, es una región de un cromosoma que tiene uno a más genes que afectan a un carácter cuantitativo. Cabe decir que sólo podemos detectar los loci que tienen un efecto importante sobre el carácter. La contribución de cada QTL puede ser diferente aunque influyan sobre el mismo carácter, depende del fondo genético. Un QTL puede ser muy importante en una variedad y en otra no.

Se ha visto que hay enfermedades multifactoriales: cáncer, asma… en las que tendremos factores genéticos y ambientales que determinan la enfermedad: puedo clasificar individuos en la población según su predisposición a sufrir la enfermedad en función de sus genes y factores ambientales.

Vemos dos poblaciones diferentes. La población 1 da lugar a una media diferente a la población 2. La media de 2 es mayor porqué está desplazada hacia la derecha. Sólo los individuos que superen un determinado lindar sufrirán la enfermedad. Comentario [ATF28]: Qué significa ¿Cómo se detectan los QTL’s? Intentar asociar el fenotipo con un determinado locus. Para hacerlo hace falta una población de estudio o bien unos cruzamientos hechos expresamente para abordar este problema. Hay un gran trabajo de genotipar marcadores y polimorfismos de genes, finalmente hay una parte estadística para asociar fenotipo con genotipo.

Todo esto se basará en el análisis de ligamento. Partimos de un individuo heterocigoto por un QTL: los que reciban Q grande tendrán más prolifericidad, junto QTL hay un marcador para que el individuo sea heterocigoto. Si no hay ligamento tendremos cuatro gametos con probabilidad ¼, los que tienen Q la ½ van com M y ½ con m: no se encuentra ningún tipo de asociación. Si están ligados (están en el mismo cromosoma y muy cerca por lo que no hay recombinación) Æ Q siempre irá con M, miremos si el individuo es M y entonces eso será que ha tenido Q y que es

458 prolífico. Esto solo ocurre si están totalmente ligados. Habrá asociación total entre marcador y fenotipo (Q y M).

Si están parcialmente ligados sí que se podrá dar recombinación, pero recordemos que los recombinantes estarán en menor proporción. Si la FR es 20% veremos QM en un 80% y Qm en un 20% Æ encontraremos una cierta asociación, M está relacionado con Q.

Si el locus que afecta al carácter cuantitativo está cerca del marcador podremos establecer la anterior asociación.

Veamos el toro que es Qq para el locus que determina la producción de leche. Miramos en sus hijas: el amarillo produce menos leche y vemos que en ellos es más frecuente el alelo m.

16.2.1. Mapa genético de maíz

Figura 16-2. Mapa genético de maíz

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16.2.2. Metodologías para identificar genes

16.2.2.1. Aproximación de genes candidatos Consiste en analizar genes que están relacionados con la fisiología del carácter de interés. Por lo regular son genes cuya función o fenotipo se determino en una especie modelo. Primero de hace una lista de todos los genes candidatos. Después se pueden determinar polimorfismos en estos genes para hacer un estudio de asociación. La Diabetes es una alteración metabólica producida por un incremento en los niveles de glucosa en sangre, la Diabetes Tipo 2 (DT2) es la que se presenta generalmente en el 95% de los casos y en México y es la segunda causa de muerte a nivel nacional en los adultos. Se han descubierto más de 40 genes candidatos ara explicar el desarrollo de este padecimiento que es multifactorial y poligénico.( García Fajardo LV1, García Mena J1, Wacher Rodarte N2, de la Vega F3, Kumate J4, Cruz López M2 asociación de polimorfismos de una sola base (snps) en genes candidatos capn10, irs-1 y ppar-γ con diabetes tipo 2 en una muestra de población mexicana www.smb.org.mx/XXVICONGRESO/text). Por ejemplo los genes candidatos podrían ser en el cerdo ibérico, que tiene una prolificidad baja, pero en cambio hay una raza china que no es tan buena en la producción de carne pero que su prolificidad es el doble y llega antes a la pubertad. Quiero saber los genes del cerdo chino que determinan la prolificidad y transferirlos al ibérico. Para ello, cruzó un macho ibérico y una hembra china, la F1 se cruzó entre sí dando F2 Æ 1000 animales con diferencias fenotípicas. Se hace la lista de genes candidatos: receptor de prolactina, ESR, FSMα, FSMβ y seguidamente buscar polimorfismos.

Una vez que tengo la lista de candidatos escogemos unos cuantos y buscamos polimorfismos por ejemplo la FSMα: sabemos que tiene 4 exones: elaboramos primers y hacemos PCR, secuenciamos el fragmento y puede ser que encontremos algún polimorfismo en aquel intrón. Entonces secuenciamos nuestros individuos FO y vemos que todos los Meishan (chino) son T en aquel polimorfismo y los ibéricos son C.

Seguidamente haremos un estudio de asociación en la F2. Para hacerlo primero hay que genotiparlos porque todos los F1 son CT de forma que en F2 podemos encontrar 3 genotipos: CC, CT y TT. T (presente en meishan) será el responsable de que haya mayor prolificidad: miramos de contrastar si los TT serán más prolíficos que los CC. Si la respuesta es afirmativa nos indicará que este gen tiene influencia sobre la prolificidad.

¿Puedo asegurar que este cambio nucleotídico es el causante de las diferencias? Como que es un carácter cuantitativo solamente si el gen tiene un peso importante lo detectaremos (15-20%) porque también intervienen efectos ambientales.

Imaginemos que esto explica un 20% de las diferencias de prolificidad, ¿puedo afirmar que este SNP es responsable? En principio no, porque hemos de tener en cuenta que este SNP se situará dentro de un intrón: poco probable que tenga efecto, pero esto no nos lo podemos creer del todo. Si estuviera en un exon y diera un cambio en la proteína.

Lo que tendríamos que hacer para saberlo es identificar la mutación causal. Si CC o TT no explica las diferencias ha de ser alguna otra cosa que esté próxima al SNP (ya que se heredan conjuntamente). Por tanto hay que secuenciar, todo y que es bastante difícil porque la mutación puede estar en muchas kb, por ejemplo se observa que hay una delección o inserción en el exon 1. Hay que tener en cuenta que podría darse recombinación de forma que T se heredase con deleción excepto si hay recombinación que el marcador y la mutación causal no se heredan conjuntamente).

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Una vez se ha encontrado la mutación causal hay que hacer validación genética: hay que mirar si esto se da en otra población. También hemos de validarla funcionalmente: vamos a otro modelo animal diferente del cerdo como el ratón e intentamos simular el cambio nucleotídico para ver si pasa esto. También se podría actuar sobre el cerdo y hacer estudios de expresión para ver si se expresa más o menos.

Para verificar la asociación habría que hacerlo en más generaciones y en otras poblaciones. En el caso de que haya asociación puede ser debido por desequilibrio, azar o que la mutación no actúe sola. Hay muchos otros genes que afectarán a la prolificidad, por lo que dependerá del fondo genético aunque el gen tenga influencia importante siempre dependerá de otros genes o factores. Al hacer aproximación por genes candidatos apostamos por un número limitado de genes y el genoma es muy grande, así que puede ser que los genes que miramos no sean realmente los causantes. Aun así se han obtenido muy buenos resultados. En el cerdo se han utilizado para estudiar caracteres como la prolificidad, calidad de la carne, etc. En la prolificidad se han visto muchos genes implicados.

ESTs Se hacen muchos estudios de ESTs que son secuencias expresadas cortas y parciales. A partir de mRNA obtenemos cDNA que ponemos en el plásmido y tendremos así una genoteca, ahora lo secuenciaremos. Esto permite caracterizar todo aquello que se está expresando en un tejido concreto o en un momento concreto Æ sabemos que genes están activos, es como hacer un northern virtual ya que la abundancia de un mRNA concreto nos indicará donde expresará más.

¿Qué tipo de comparación haremos? Líneas especializadas Æ por ejemplo, una línea A produce muchos más óvulos que una línea B, podemos ver genes implicados comparando los dos ovarios. Diferencias en producción Æ líneas de buena calidad de la carne vs. Líneas de baja calidad, o bien vacas con mucha leche y vacas con poca. Buscar los genes responsables. Diferencias en tratamientos Æ ver como influyen a uso de los medicamentos.

16.2.2.2. Clonación por posición Supongamos que no se sabe nada (o muy poco) del conjunto de genes que determinan algun carácter. ¿Que podemos hacer? Se puede buscar marcadores a lo largo de todos los cromosomas. Por ejemplo si se quiere analizar 100 microsatélites en 300 variedades, eso supone analizar 30.000 genotipos.

Si vemos el resultado que nos muestra este diagrama afirmaremos que estos microsatélites no son informativos para el gen de interés: el estudio de asociación con esté microsatélite no nos indica nada, se hereda independientemente del carácter cuantitativo porque o bien se encuentra en un cromosoma diferente, o bien está en el mismo cromosoma pero muy alejado del QTL.

En este caso encontramos asociación entre B y el QTL. Como que usamos marcadores que se donde están en este punto del mapa cromosómico ya que Q y B se encuentran tan cerca que siempre se heredan juntos y no hay posibilidad de recombinación. Una vez situamos más o menos el gen habrá que refinar esta posición, por esto buscaremos todos los posibles marcadores que haya en esa región. También lo que podemos hacer es ampliar el número de individuos segregantes estudiados.

Para hacer esto con humanos, usaremos familias en las que segrega una enfermedad (rojo). Normalmente se trabaja con parejas de individuos emparentados (hermanos) que tienen la

461 enfermedad. Se analiza si tienen los mismos alelos de microsatélites y si es así querrá decir que el microsatélite está asociado al gen responsable de la enfermedad.

La otra posibilidad es hacer el estudio de asociación en una población donde haya individuos enfermos y sanos, mirar si hay microsatélites asociados a las personas sanas y que no estén en las enfermas.

Lo que es ideal y se utiliza con especies domésticas son los cruzamientos experimentales para generar desequilibrios de ligamento, como por ejemplo cruzar dos variedades que son muy diferentes genéticamente.

A veces no se puede validar el gen debido a: - el desequilibrio de ligamiento - asociación del gen candidato al azar - interacción del gen con el fondo genético específico de la población estudiada.

16.2.2.3. Genes candidatos por posición Es una estrategia, donde por análisis por ligamiento localizamos en que cromosoma está el gen, entonces, miramos los genes candidatos que hayan sido descritos en aquella región del cromosoma o en cromosomas homólogos de otras especies. Seguidamente se hace detección de polimorfismos y estudios de asociación. Se hace con mapas comparativos si no se dispone del genoma secuenciado y si se tiene, se hace un análisis de genes candidatos en la región exacta. Después se detectan polimorfismos y se hacen estudios de asociación.

16.2.2.4. Mapas comparativos Si detectamos QTL’s en el cromosoma 4 de la caña de azucar, vamos a encontrarnos con la limitante de que el genoma de esa especie no se ha secuenciado al 100%. Sin embargo, si vemos que esa zona genomica es sintenica con el cromosoma 8 del arroz, entonces podemos buscar los genes del arroz (que si se ha secuenciado en su totalidad), y depues tratar de confirmar la presencia de esos en caña de azucar. Se pueden realizar dos líneas paralelas de investigación.

Detección de barridos selectivos Cada vez es más económico secuenciar el genoma completo de una especie. No es necesario analizar todos los SNP’s (son millones), si identificamos los tag SNP’s, con ellos ya tendríamos suficiente debido a que diversos SNP’s están ligados. A eso se le llama desequilibrio de ligamiento (linkage desequilibrium).

Hablaremos entonces de hacer un genoma scan usando mapa de SNP’s de alta densidad o bien resecuenciar el genoma de una población, por lo que podríamos detectar barridos selectivos. Las especies domésticas se han seleccionado de forma muy intensa por ciertas características fenotípicas, lo que ha producido una huella en el genoma que podríamos detectar (barrido de selección). Cuando un locus es seleccionado se intensifica la frecuencia en detrimento del resto.

Imaginemos que se produce una mutación que es favorable para que aumente el contenido de azúcar. Seleccionamos esa mutación y aumentamos su frecuencia en la población, al cabo de unas generaciones la mayoría de individuos tendrán la mutación en su genoma, pero aumentar la frecuencia de la mutación implica aumentar la frecuencia de un trozo del genoma, lo cual arrastrará otros SNP’s que estén cerca y que también serán seleccionados (Haplotipos). Con el paso del tiempo irá desapareciendo este desequilibrio por ligamiento y aumentará la diversidad genética por recombinación, aparición de nuevas mutaciones, etc. Este proceso es más lento.

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Después del proceso de selección en esta zona del genoma se espera una zona cromosómica con poca variabilidad, ya que los individuos serán homocigotos para esta región del genoma.

Otra manera de verlo es a través de un gráfico presentando el grado de heterocigoticidad a lo largo del cromosoma. Azul es igual en una zona del cromosoma, esperamos una bajada del heterocigotizado porque un cambio nucleotídico ha sido escogido.

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17. Metodologías de Mejoramiento 17.1. Metodologías clásicas 17.1.1. Introducción El mejoramiento de plantas es un término utilizado para describir la creación, selección y establecimiento de fenotipos superiores de especies vegetales. El desarrollo de cultivos mejorados debe responder a las necesidades tanto de los productores como de los consumidores. Las principales metas del mejoramiento de plantas, incluyendo a los cultivos agrícolas y hortícolas, se han enfocado a mejorar el rendimiento, la calidad nutrimental y otras características de valor comercial. Dentro de la escala global, el paradigma del mejoramiento de plantas ha sido extraordinariamente exitoso, encontrando ejemplos importantes como la introducción de variedades de trigo (Triticum aestivum) y arroz (Oryza sativa) que generaron la revolución verde (Everson y Golin, 2003). También están los ejemplos sobre el desarrollo de híbridos de maíz (Zea mays; Duvick, 2001) y la reciente comercialización de cultivos transgénicos (James 2007). Estos y muchos otros productos que resultaron del mejoramiento de plantas, han generado múltiples beneficios para la sociedad en general, en términos de un mayor y sustentable suministro de biomasa, la cual es cosechada y aprovechada en forma de alimentos, vitaminas, medicinas y diversas materias primas como fibras, madera, papel, lubricantes y combustibles. El mejoramiento de plantas tiene una larga historia integrando las últimas innovaciones en biología y genética para optimizar el desarrollo de cultivos optimizados. La selección prehistórica de fenotipos visibles que facilitaban la cosecha e incrementaban la productividad, llevaron a la domesticación de las primeras variedades de cultivos (Harlan, 1992). Esta domesticación puede ser considerada como uno de los primeros ejemplos de biotecnología, entendida en un sentido amplio, como el uso de herramientas tecnológicas para facilitar procesos biológicos.

17.1.2. Importancia del ambiente La información genética determina el potencial de una especie. Pero eso no significa que el potencial que tienen los genes realmente se expresen a nivel de fenotipo. La interacción inherente de los genes, los transcritos, las proteínas y los metabolitos con el ambiente es la que finalmente determina el fenotipo observable de un individuo. La evaluación correcta y precisa de la variación fenotípica es el elemento crucial para una selección efectiva. No es suficiente con medir solo la variación genotípica, ya que esta no incluye los otros parámetros que son muy importantes. La variación expresada depende tanto del potencial genético como de las condiciones del ambiente (factores bióticos y abióticos), así como de las variaciones circunstanciales del azar. La magnitud del efecto de cada uno de estos componentes puede variar de caso en caso. Las metodologías clásicas de mejoramiento genético parten precisamente de este punto. Las metodologías modernas deben tomar en cuenta esta complejidad. La conexión entre genotipo y fenotipo no es tan simple como la conexión entre una secuencia nucleotídica y su secuencia proteínica.

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17.1.3. Importancia de los modos de reproducción El conocimiento detallado del modo de reproducción de una especie es esencial para su mejoramiento. La forma de reproducción de un cultivo es un factor categórico para el desarrollo adecuado de esquemas de cruzas, incluyendo los métodos de selección que se deben aplicar para el mejoramiento. Lo que se entiende es por ejemplo: la auto-fertilización de cultivos como en el trigo, implica formas de trabajo muy diferentes a los que se usan en una especie de polinización cruzada como el maíz, que además muestra un fuerte efecto de heterosis. Por lo regular se usan métodos de selección para un cultivo que toman en cuenta el estado genético en que van a ser usados en campo. Es difícil escoger lo que se quiere a nivel de hibrido, si solo de evalúa el fenotipo a nivel de línea. Por ejemplo, la autopolinización de cultivos de polinización cruzada conduce a la drástica reducción en su rendimiento. A esto se le llama depresión endogámica. Un investigador que no este acostumbrado a trabajar con híbridos tal vez pueda subestimar estos detalles al inicio. Es por ello que muchas veces los investigadores deben aprender las particularidades de una especie antes de convertirse en buenos mejoradores. Un mejorador que ha trabajado con trigo tarda de 2 a 5 años en convertirse en un buen mejorador de maíz. Por otro lado, los mejoradores de arroz y de trigo pueden transferir sus prácticas más rápidamente debido a que estos dos cultivos son igualmente autógamos. Lo mismo sucede entre sorgo y maíz, que son ambos cultivos heterógamos.

Por otro lado, los métodos de mejoramiento de cultivos sexuales son totalmente diferentes de los cultivos de reproducción asexual (por ejemplo, cultivos clonales como el agave o el plátano). La propagación asexual es un tipo de reproducción en donde alguna planta o parte de ella pueden ser utilizadas para la multiplicación, sin siquiera implicar un cambio genético de generación en generación. Es por ello que deben de tomarse muy en cuenta los parámetros sexuales y las condiciones genéticas en que se hacen las evaluaciones de campo y la selección de los genotipos.

La selección de vegetales se puede dividir en cuatro grandes categorías: • la cría de líneas de cultivos autógamos (trigo, arroz, etc) • la cría de poblaciones de cultivos alógamos ( • la cría de híbridos en cultivos alegamos que presentan una fuerte heterosis (maíz, sorgo, etc) • la cría de clones de cultivos de propagación vegetativa (por ejemplo agave, henequén, plátano, papa, fresa, aguacate, etc).

Dentro de estas categorías, hay varios métodos de cultivos posibles. Además, existe un amplio espectro de técnicas y tecnologías para realizar pasos más fáciles de estos métodos, más rápidos, más precisos, o permitir a todos ellos, como: El cultivo de de microsporas, el rescate de embriones, mutagénesis, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, el análisis de QTLs, los marcadores moleculares, etc.

17.1.4. Autopolinización o polinización libre Algunas de las razones por las cuales el método de auto fertilización es tan efectiva, es por la eficacia de la reproducción, así como la disminución de la variación genética. La mayoría de los loci se fija con una tasa alta. Lo que se pretende es la fijación de alelos superiores correspondientes a genotipos altamente adaptados. Esto se debe a que con cada generación de autopolinización la tasa de heterocigotos disminuye en un 50%, por lo tanto, una homocigosis de 99% se obtiene después de 5 a 8 autofecundaciones. En las plantas de polinización libre, casi no se produce la endogamia. Este modo de reproducción permite la selección natural en las poblaciones silvestres de esas plantas. Las plantas no-genéticamente fuertes o inestables se eliminan de la población en una primera fase

465 evolutiva. Los pasos críticos en la mejora de la libre fertilización de los cultivos, son la elección de los padres y la identificación de las mejores variantes, que se generan por la segregación en cada generación. Los métodos de selección que se usan son por ejemplo: la selección masal, la selección por pedigrí y la selección recurrente. También existen formas de derivar líneas como la selección de descendientes de sola semilla (SSD), o la generación de líneas por medio de de dobles haploide (DH) duplicados. En la mayoría de los programas de mejoramiento genético se aplica una combinación de algunos de estos métodos. En las siguientes secciones explicaremos algunos de los métodos de selección de forma resumida. 17.1.5. Selección Masal Este método de selección depende principalmente de la selección masiva de plantas dentro de una población, de acuerdo a criterios del fenotipo de plantas individuales. Se siembra una población en una parcela aislada, y se fomenta la polinización cruzada entre todas las plantas (recombinación por polinización libre). Por lo regular se usan densidades de plantación altas. Este tipo de selección se lleva a cabo sobre todo con cultivos semilla pequeña como la alfalfa, que generalmente son plantadas en altísimas densidades. También se hacen selección Masal para diversas poblaciones criollas de maíz. Se seleccionan plantas en base a alguna característica de interés. Por ejemplo: aspecto de planta, tamaño de mazorca, forma de grano, color de semillas, etc. Las plantas, mazorcas y semillas seleccionadas se mezclan y se siembran a granel para la próxima generación. Este método se utiliza para mejorar la población en general por medio de un criterio o varios criterios fenotípicos o genotípicos. La selección puede ser positiva o negativa. Es un método sencillo y a la vez eficaz y rápido para la mejora de razas o poblaciones criollas. Un inconveniente de la selección masal es la gran influencia que el ambiente tiene sobre el desarrollo del fenotipo y el rendimiento de las plantas individuales. A menudo no está claro si las plantas fenotípicamente superiores son también genotípicamente superiores. Las diferencias de ambiente pueden conducir a que la selección masal tenga muy baja eficacia, y por consiguiente, el progreso genético por unidad de tiempo sea menor al que se puede obtener con otros esquemas de mejoramiento.

En la selección en masa hay algunos factores que deben tenerse en cuenta al seleccionar las plantas. Es mejor seleccionar por bloques. El gradiente de campo puede ser un factor muy importante en el momento de la selección. La selección se debe hacer cuando la mayoría de las características de la planta se presenten claramente. En algunas plantas es durante la floración, mientras que en otras es durante la cosecha.

El método de selección masal sólo será efectivo para los rasgos altamente hereditarios. Es decir, solo funcionará para los razgos fenotípicos que sean altamente visibles a nivel de planta o semilla individual. Esto solo se da para características con alta heredabilidad, por ejemplo, el color azul o amarillo de las semillas de maíz. Sin embargo, este método es simple y barato y supone menos trabajo que la selección pedigrí en las generaciones primordiales. Es muy recomendable tener grandes poblaciones de plantas para garantizar que suficiente segregación para que los mejores combinaciones de alelos se presenten en algunas plantas individuales cuando empieza la selección. Durante los avances generacionales, un número menor de registros se mantienen a comparación que la selección por pedigrí.

La selección masal es el método más simple, más fácil y más antiguo de selección de plantas. Las plantas individuales son seleccionadas en base a su desempeño fenotípico. Se utilizan semillas a granel para producir la próxima generación. La selección en masa ha demostrado ser muy eficaz en el mejoramiento de maíz en las etapas iniciales. Pero su eficacia para la mejora del rendimiento fue objeto de severas críticas en los años 40 en Estados unidos. Esto finalmente culminó en el perfeccionamiento de los métodos de selección para maíz. Esta selección no prevé ningún control sobre la matriz de polen durante la polinización. La fuente de polen no se conoce en una polinización cruzada. Como consecuencia, la selección se limita

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sólo a las madres. Las estimaciones de heredabilidad se reducen a la mitad, ya que sólo los padres se utilizan para la cosecha de semillas. Sin embargo, los avances generacionales son de un solo ciclo, por lo que se pueden llevar mas rondas de selección a comparación con otros métodos de selección que requieren de 2 a 3 años para cada ciclo de selección.

Variedad A x Variedad B

Polinización libre Lote aislado F 2 Parcela masiva

Polinización libre Selección de mejores plantas Lote aislado

F3 Parcela masiva

Selección de mejores plantas Polinización libre Lote aislado F 4 Parcela masiva

Siembra espaciada F5 Mazorca por surco

Surcos de plantas F6

Cruzamiento con probador

F a F Loc 1 7 10 Pruebas de rendimiento Loc 1

Rep 1 Rep 2 Figura 17-1. Método de selección de población masiva (Masal).

Método de selección Masal: La progenie de la cruza se cultiva en forma masiva hasta le generación F5. Se seleccionan plantas o cabezas de línea y se siembran en surcos de plantas o cabezas de línea en la F6. Se seleccionan los surcos superiores y se cultivan en un ensayo preliminar de rendimiento. Las cepas superiores se hacen crecer en pruebas de rendimiento de la F8 a la F10. Pueden hacerse varias modificaciones a este procedimiento, por ejemplo la selección podría comenzar en la F3 o F4, purificando las líneas que tengan un rendimiento superior en las siguientes generaciones; o bien, las parcelas masivas podrían repetirse y cosecharse para determinar el rendimiento y desechar cruzas completas con base en el rendimiento de dichas parcelas.

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Selección periódica Este tipo de selección es una versión refinada de la masa y difiere de la siguiente manera: Visualmente los individuos son seleccionados de poblaciones sometidas a pruebas de progenie. Las plantas seleccionadas sobre la base a los datos de la prueba de progenie se cruzan unos con otras en todas las formas posibles para producir semillas. Esto forma la base para la nueva población.

Generación de líneas por medio de semillas únicas (SSD) Este método se introdujo como un medio para transformar toda la generación F2 tan rápido como sea posible en una generación de plantas homocigotas. Esto a pesar de que la población inicialmente sea muy heterogénea. Este método puede utilizarse para reducir el tiempo que se requiere para eliminar los genotipos que aún no son homocigotos. Debido a que con sólo se desea obtener una semilla por planta (no toda una mazorca), entonces las plantas pueden ser sembradas a muy alta densidad. También se puede intentar tener dos o tres, a veces incluso más ciclos por año. Esto puede hacer que el proceso para la liberación de un cultivar, se disminuya de 10 a 5 años. El mantenimiento de registros no es necesario a principios de cada generación. La desventaja es que este método no elimina las plantas más débiles como en otros métodos, y no existe ninguna disposición para la selección de plantas superiores en la generación F2. Algunos investigadores han hecho modificaciones de este método para remediar esos problemas. Una variedad desarrollada por este método será más uniforme que los elaborados por la selección masal, porque todas las plantas de tal variedad tendrán el mismo genotipo. Las semillas de plantas seleccionadas no se agregan. Si no que están separados y son utilizados para realizar pruebas de progenie. Esto se hace para estudiar el comportamiento reproductivo de las plantas seleccionadas.

Selección de hermanos completos Las plantas de la población original se autofecundan para producir progenies S1, que son evaluados en el próximo ciclo. Esto se puede hacer con ensayos de múltiples repeticiones y en diferentes localidades para identificar las familias S1 prometedoras. El remanente de semillas S1 de estas familias seleccionadas se recombina en la tercera temporada. Como consecuencia, un ciclo se puede completar en tres ciclos. Las unidades de selección y recombinación son las progenies S1.

Selección de medios hermanos La selección se hace en base a pruebas de progenie de rendimiento en lugar de la apariencia fenotípica de las plantas de sus padres. Las semillas seleccionadas de medios hermanos, que han sido polinizadas al azar por el polen de la población, se cultivan en filas con el propósito de selección. Una parte de la semilla se siembra para determinar la capacidad de rendimiento, de cualquier carácter de cada planta. La semilla de las familias más productivas se cosecha a granel para completar un ciclo de selección.

Método dobles haploides Se pueden producir plantas haploides por la eliminación de cromosomas. Se pueden obtener a por medio del cultivo de microesporas. Sin embargo, las cruzas con inductores de haploidía son mas utilizados hoy en día por su capacidad para producir plantas haploides con mucha mayor cantidad en comparación con los otros métodos. Destaca que son necesarias para alterar el desarrollo de vías de microsporas de producir polen a la formación de plantas haploides. Actualmente, el llamado método inductor es muy utilizado en el mejoramiento del maíz (el maíz híbrido)

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El número de cromosomas haploides de las plantas se duplica con el tratamiento de colchicina. Espontáneamente las plantas haploides se duplica, sin embargo, también puede ser producido directamente a partir de los tres métodos. Los métodos de rescate de embriones pueden utilizarse para garantizar que las semillas de estos cruces no se aborten. Este método tiene el potencial de acortar los ciclos de mejoramiento genético en comparación con los métodos del pedigrí o de distribución masiva. Al igual que el único método de selección de semillas, a principios de generaciones no están sujetos a la selección, pero la mayoría de las líneas se eliminan durante la evaluación de campo los ensayos. El objetivo es el mismo que para SSD: transformar el material genético de la F1 tan rápido como sea posible en un homocigoto en la mayor parte de las plantas. Este método en mano de obra es muy intenso y el más caro de los procedimientos porque aumenta la cantidad de generaciones por año. Por este método para tener éxito, los vegetales deben ser genéticamente estables.

Retrocruzas: Es un método de selección para el mejoramiento de genotipos. Este es un tipo de cruza repetida con el mismo padre recurrente. Se puede generar así una línea isogénica. Un alelo puede ser incorporado en el fondo genético de una línea elite. El llamado padre recurrente (a la variedad) es altamente productiva y comercialmente de éxito, pero carece de este gen específico (por ejemplo, la resistencia a las enfermedades). Este rasgo es, por ejemplo, puede estar presente en una variedad silvestre o exótica (donante). Después de la primera cruza, se repite la cruza con el padre recurrente. Después de cada cruza las plantas híbridas con la combinación de genes deseados deben ser identificadas y seleccionadas. Después se cruzan de nuevo con el padre recurrente. Esta técnica es fácil cuando los rasgos que se añaden son fácilmente heredados. Es decir, es adecuada para introgresar alelos dominantes y fácilmente identificables en las plantas híbridas. Si hay genes no deseados que están estrechamente emparentados con el gen deseado, los genes no deseados son transferido junto con el gen deseado y los descendientes pueden sufrir de un desperfecto. Una de las ventajas del método de la parte de atrás, es que las pruebas (para que no sea el rasgo deseado) no es necesaria. Este método se utiliza para, por ejemplo, transferencia de la esterilidad masculina en líneas puras, que es un requisito previo para muchos programas de mejoramiento híbrido. Mientras el Marcador de retrocruzas asistida es habitualmente aplicada en programas de mejoramiento de la introgresión de genes.

Métodos de selección tradicionales Se ha generado una cantidad de variedades muy diversas con los métodos de selección tradicionales. Hay un cúmulo de oportunidades para la recombinación de genes, para piramizar alelos en cultivares superiores. Sin embargo, hay pocas oportunidades para la rotura de bloques de genes ligados y haplotipos. Los mejoradores están buscando superar estas deficiencias a través del aumento de la cantidad de cruzas y recombinaciones realizadas. También se esta tratado de iniciar las pruebas de rendimiento en las generaciones anteriores e introducir sistemas modificados para la mejora de poblaciones. Por ejemplo, la selección recurrente de poblaciones pertenecientes a grupos heteróticos recíprocos (reciprocal recurrent selection RRS).

Las líneas que básicamente son genéticamente idénticas, a excepción de un único gen, se llaman líneas isogénicas.

La cría híbrida es una categoría muy importante para fertilizar los cultivos y tiene las siguientes ventajas en comparación con la alternativa natural que es la población de cría: • Más heterosis • Máxima intensidad posible de selección (mejor genotipo posible de la población) • Más fácil para crear variedades con múltiples genes de resistencia (cruza entre dos líneas complementarias)

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• Método atractivo para las empresas privadas a causa de la depresión endogámica, que constituye un mecanismo natural para la protección de las variedades.

El incremento de semillas híbridas ha sido uno de los principales objetivos de la horticultura y prácticas agrícolas, porque son las plantas híbridas más productivas (debido al vigor híbrido) y más uniformes que las plantas procedentes de la polinización al azar. Para aumentar semillas híbridas, de polinización libre y polinización de medios hermanos (polinización por una planta de la misma línea) de las semillas madre debe ser rehuido.

Un método de castración de la línea femenina utilizada, que luego, naturalmente, es de polinización cruzada por el polen de la línea que actúa como padre. Esta debe plantarse en una fila adyacente. Sin embargo, este proceso es muy intensivo de mano de obra y caro. Si las plantas se pueden hacer auto-incompatibles con la introducción de genes que controlan la auto-incompatibilidad, esto facilitaría la producción de semilla hibrida, ya que reduce los costos de mano de obra. Las semillas para los híbridos se generan por medio de la polinización cruzada entre dos diferentes líneas. Sin embargo, el paso necesario de los padres en la fertilización de formas homocigóticas por cuenta propia no es fácil con el material auto-incompatible. Lo más conveniente es utilizar un sistema de esterilidad de polen citoplásmico-génico. Auto-esterilidad, auto-incompatibilidad, flores imperfectas, y obstrucciones mecánicas de la flor.

Selección de polinización cruzada de cultivos El estado natural para los cultivos de auto-fertilización es el homocigotico. Especies de plantas que el modo normal, las característica reproductiva y las características de la estructura de la población de las semillas es a través de establecer un alto grado de polinización cruzada. Cada planta recibe una mezcla de polen de un gran número de individuos que tienen diferentes genotipos. Estas poblaciones se caracterizan por un alto grado de heterocigosidad. Esto permite un libre flujo de genes entre los individuos dentro de las poblaciones, generando asi un enorme potencial de la variación genética, que se mantiene.

En el desarrollo de variedades híbridas, el objetivo es identificar a los heterocigotos más productivos de la población, que entonces se producen con la exclusión de los demás miembros de la población. En contraste, en el mejoramiento poblacional se prevé una mejora por medio de la eliminación gradual de los alelos nocivos y menos productivos. Esto se logra por ciclos repetidos de recombinación y selección. Los programas de mejoramiento de poblaciones son lentos, pero deben de ser constantes y con un compromiso a largo plazo. Por otro lado, la producción de híbridos tiene por objeto aprovechar al máximo los beneficios de la heterosis en mucho menos tiempo. Los dos enfoques son complementarios y no mutuamente excluyentes.

Selecciones con prueba cruzada de rendimiento El propósito de este tipo de selección es una ligera desviación del concepto de población. La intra-mejora en el sentido de que la población se mejora, no sólo para el rendimiento, sino también con respecto a la capacidad de combinación con una población de referencia. Se trata del mejor aprovechamiento del vigor híbrido. Consiste de tres pasos: 1. Auto-polinización y la prueba de cruce de individuos 2. Evaluación de los cruces en los ensayos replicados 3. Recombinación cruzada remanente de las semillas de plantas seleccionadas

Métodos de selección para el desarrollo de cultivos de cría pura en la cruza entre variedades. La introducción de germoplasma y líneas de cría se realizan para crear nuevas combinaciones de genes. En las generaciones siguientes, los genotipos óptimos (presumiblemente superior que tengan los genes y combinaciones de genes) son seleccionados y fijados en los estados

470 homocigotos por medio de fertilización y selección. Son ampliamente probadas estas selecciones, con el objetivo de la liberación de algunos predominantes para el cultivo.

Cultivos de propagación asexual (selección de clones) La reproducción asexual cubre aquellos modos de multiplicación de plantas, en los que la formación de gametos y fertilización no se lleva a cabo. Es decir, no hay meiosis ni fecundación. A falta de la recombinación genética que se da durante la meiosis, la composición genética de material vegetal que se multiplica sigue siendo esencialmente la misma. La composición de alelos es exactamente la de la planta madre. A esto se le llama clon. Los clones superiores son seleccionados y propagados vegetativamente. La descendencia permite la liberación de variedades estables sin ningún tipo de deterioro debido a la segregación. Esta característica singular de la reproducción asexual ha ayudado a desarrollar una serie de cultivos de frutas y hortalizas, incluidas uvas, fresas, aguacates, platanos, mangos, manzanas, etc. La uniformidad tan alta de los clones es algo destacado. En cuanto se encuentra una planta superior, esta se puede reproducir ilimitadamente de manera vegetal. Sin embargo existe el riesgo de patógenos altamente especializados. La variabilidad genética es necesaria para amortiguar los cultivos contra agentes patógenos, así como la estabilidad de la producción bajo condiciones ambientales variables.

Mutagénesis El mejoramiento de plantas a través de mutaciones inducidas tiene claras ventajas y limitaciones. Cualquier clon vegetativo pueden ser tratados con mutágenos, e incluso con un único mutante deseable o una parte de un propágulo mutado puede ser multiplicado como un tipo mejorado de la variedad original.

Desarrollo de nuevos clones El desarrollo y registro de nuevos clones debe tener lugar por medio de la selección local del clon en plantaciones antiguas, así como la importación de clones de alta calidad desde el extranjero, para la evaluación local. Un clon es la descendencia vegetativa de una planta madre específicas, pero no muestran ninguna desviación genética, morfológica o fisiológicoa de la planta madre. La evaluación se lleva a cabo con los diferentes clones seleccionados después de la selección. Los diferentes clones se comparan entre sí para determinar su calidad y capacidad de resistencia. La Cría no participa en la selección del clon, el clon no puede ser criado para la resistencia de ciertos tipos de virus, el énfasis debe ponerse en asegurarse de que el clon al salir de la guardería es libre de virus. Se han desarrollado técnicas para poner a prueba los clones para cualquier virus nocivo. Los virus nocivos a veces no muestran en las evaluaciones del anteproyecto de.desarrollo fitosanitario (detección de virus y erradicación de virus) es, pues, realizado en los laboratorios e invernaderos, en paralelo con el terreno y la evaluación de la calidad en el campo del clon. Los desarrolladores tuvieron que incorporar técnicas, como los cultivos de tejidos y propagación in vitro de material limitado para desarrollar clones libres de virus de la madre. El meristemo apical está libre de cualquier virus nocivo. Al utilizar el meristemo apical para el cultivo de tejidos pueden ser desarrollados un clon libre de virus.

Multiplicación de clones Durante la primera fase de multiplicación, cada uno de los clones candidatos se mantiene en un almacén. A partir de ese tejido núcleo se harán todas las futuras multiplicaciones y evaluaciones. Durante la segunda fase de multiplicación, los portainjertos (el patrón) y el injerto se deberán mantener en lugares libres de insectos dentro de instalaciones de campo en zonas aisladas. El vástago y material patrón de la segunda fase de la fuente son injertadas y encalladas. Las plantas injertadas se plantaron en zonas aisladas para el establecimiento de bloques de la madre. Estos bloques se utilizan para fines de multiplicación. La tercera fase es la creación de bloques descendiente de la madre de las explotaciones de los productores contratados de la citada fuente en el pre-selección, se mantienen. Unos 4 km ² de suelo virgen

471

17.1.6. Esquemas de selección

Vivero fuente Vivero Fuente: Se reúnen varios miles de plantas de diversas fuentes.

Líneas clonales

Líneas clonales: De 200 a 400 plantas establecidas.

Policruzamiento Policruza: De 25 a 50 clones superiores se cultivan en un vivero aislado, permitiendo polinización cruzada aleatoria. La semilla se cosecha y se mezcla.

Progenie del Policruzamiento Prueba de la progenie de la policruza: Semilla de la policruza cultivada en pruebas de rendimiento. Las clonas se evalúan con base a este comportamiento.

Clones seleccionados para establecer variedad sintética Establecimiento del cultivar síntético: con base al comportamiento de la progenie del policruzamiento se seleccionan de 4 a 10 clones para establecer un cultivar sintético. Los clones se aíslan y se permite interpolinización aleaoria. La semilla cosechada es la generación Sin 0. Sin 1 Multiplicación de la semilla del nuevo sintético: Se cosechan cantidades iguales de semilla de cada clon y se mezclan parea cultivar la generación Sin 1. Para la generación Sin 2 y Sin 2 sucesivas se cosecha semilla de polinización abierta.

472

Población Fuente: Seleccionar plantas superiores y cruzar con un progenitor probador

Recombinación libre Autofecundación controlada

Polinización libre

Ciclo1 x x

Planta Progenitor Progenitor Planta seleccionada probador probador seleccionada

Progenie del cruzamiento de prueba Progenie del cruzamiento de prueba

Ciclo 2

a) Mezclar semilla de polinización libre b) Mezclar semilla autofecundada procedente de plantas con progenies procedente de plantas con progenies superiores en el cruzamiento de prueba superiores en el cruzamiento de prueba Figura 17-2. Selección de familias de medios hermanos basada en el rendimiento de la progenie del cruzamiento de prueba

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Población Fuente: Seleccionar plantas superiores y autopolinizar

Plantas autofecundadas (S0)

Prueba de Progenie S1

Mezclar la semilla autofecundada sobrante de las plantas S0 con progenie superior y sembrarla en aislamiento

Figura 17-3. Selección basada en el rendimiento de la progenie S1.

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Variedad A x Variedad B

Parcela masiva F1

F2 Plantas individuales

Una semilla por Mazorca. Sembrar en bulk

F3 Plantas individuales

Selección de mejores plantas

Plantas individuales F4

Selección de mejores plantas

F 5 Plantas individuales

Mazorca por surco

Surcos de plantas

F6 Cruzamiento con probador

Loc 1 F a F Pruebas de 7 10 rendimiento Loc 1

Rep 1 Rep 2 Figura 17-4. Método de selección de descendencia uniseminal. Las semillas cosechadas de la F1 se siembran de manera espaciada en la F2. Una sola semilla cosechada de cada planta F2 se utiliza para obtener la generación F3. Esto se repite hasta la generación F5. En esta generación las plantas se cosechan y se siembra en un surco de progenie en la F6. En la generación F7 se establece un ensayo preliminar de rendimiento. Este ensayo se repite hasta la F10. Algunos fitomejoradores combinan este método, con el método de selección por pedigree. Cultivan sólo las generaciones F3 y F4 utilizando el primero de estos métodos, acortando el tiempo que se requiere para hacer la prueba de rendimiento.

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Hibrido o F1 variedad

Cruzar con inductor de haploidía

Seleccionar semillas de haploides

Doblar cromosomas Transplantar a campo con colchizina

H0 F2 Parcela de plantas individuales Germinar semillas de Haploides duplicados en Haploides en laboratorio invernadero

Autofecundar. Sembrar mazorca por surco

F3 Surcos de plantas H1

Surcos de plantas H2 F4 Líneas homocigotas Cruzamiento con probador

Loc 1 Pruebas de F5 a F8 rendimiento Loc 1

Rep 1 Rep 2 Figura 17-5. Método de haploides duplicados para la generación de líneas homocigotas.

Para el método de dobles haploides, se parte de una población elite o de un híbrido de alto rendimiento (F1). Las plantas se cruzan con un inductor de haploidía. Las mazorcas se desgranan en bulk. Se seleccionan las semillas haploides (aleurona azul con embrión blanco). Se germinan las semillas haploides y se tratan con colchizina (inhibidor de mitosis) para generar plantas con cromosomas duplicados (F2=H0). Las plantas se transfieren a invernadero o directamente a campo en una parcela de plantas individuales. Ahí se autofecundan todas las plantas (H0-->H1). Se cosechan y se siembran mazorca por surco. Se avanza una generación mas seleccionando las mejores líneas (H1-->H2). Se hace cruza con un probador y se evalúan los híbridos de las líneas haploides en ensayos de rendimiento en las generaciones F5 a F8. 17.1.7. Mejoramiento por pedigrí

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Parentales Variedad A x Variedad B

Híbrido F1 F1 Autofecundación

Parcela masiva Siembra espaciada. F 2 Plantas individuales Autofecundación. Selección de mazorcas.

Siembra mazorca por surco

Surcos de plantas=familias F3 F3 Selección de (50-300 surcos) mazorcas Familias F4. Surcos F XXX XXXSelección de plantas 4 por Familias

Familias F5. Surcos F5 de plantas

Líneas semi-avanzadas F6

Mazorcas desgranadas en bulk

Pruebas de rendimiento Loc 1 F7 a F10 Con repeticiones y múltiples localidades Loc 1

Rep 1 Rep 2 Líneas avanzadas Figura 17-6. Diagrama que muestra la metodología de mejoramiento por pedigree.

Método de selección por pedigree: A partir de plantas F2 seleccionadas, se hacen crecer en surcos progenies de 25-30 plantas en la F3. De los mejores surcos se seleccionan las plantas superiores y las mazorcas mas bonitas se desgranan mazorca por sobre y se siembran en familias de surcos. La selección consiste en escoger las mejores plantas de las mejores familias. Al llegar a F6, las familias empiezan a ser relativamente mas uniformes. En la F7 se establecen pruebas preliminares de rendimiento mismas que se continúan hasta la F10.

El método de pedigrí es generalmente rápido y fácil. Sin embargo, este método es muy intenso en mano de obra. Los padres se cruzan y se genera una F1, que después se autofecunda para generar una población F2, que después deriva en familias de líneas F3, F4, etc. La selección de plantas con nuevas combinaciones de genes se hace en base a la genealogía. La descendencia se somete repetidamente a la selección y siempre las plantas individuales se toman como fuente de nuevas familias descendientes (mazorca por sobre, mazorca por surco), hasta que se alcanza la uniformidad genética. Sólo entonces, las semillas de varias mazorcas se combinan y

477 mezclan para tener más semillas para pruebas de extensas de combinaciones híbridas. Es importante llevar un registro detallado del origen de las plantas o las líneas seleccionadas. La intensidad de selección puede ser variada, en la práctica, de acuerdo a la disponibilidad de infraestructura (espacio de campo, almacenaje de semilla, instalaciones, personal para desgrane, selección y preparación de ensayos, etc.). Con una sola planta de selección se debe llevar a cabo en base a rasgos de alta heredabilidad. En la primera fase se deben concentrar los alelos mayoritarios y favorables. En una fase posterior, cuando las unidades de evaluación son parcelas y ya no plantas individuales, se puede hacer selección para algunos rasgos con menor heredabilidad. Una objeción en contra de este método es que la variación genética disponible para la selección de los rasgos cuantitativos, se puede reducir drásticamente en las primeras generaciones. Es por ello que es importante tener una población de familias lo mas grande posible desde el inicio de la generación F3. Por lo regular se deben empezar con 100 a 300 líneas S2. La purificación de semillas y la multiplicación suele ser incorporado en una de las últimas generaciones de selección de pedigrí. La eficiencia de la cría es uno de los objetivos para la generación de pruebas. Esto se hace por la identificación temprana de familias superiores. La eliminación rápida de las poblaciones inferiores y la posterior concentración de los esfuerzos de selección en las poblaciones superiores se traducen en un aumento de la eficiencia. Una evaluación precisa de genotipos es esencial para el éxito de este método.

17.1.8. Selección recurrente Falta hacer una grafica de este método 17.1.9. Metas de mejoramiento

17.1.9.1. Rendimiento La agricultura se centra en el consumidor, para innovar y mejorar la calidad y cantidad de los suministros alimenticios en el mundo globalizado. Este es un punto de partida muy importante, si tenemos en cuenta que hasta ahora la biotecnología agrícola, a través de la genética, se había centrado en la lucha contra los insectos y la desratización

Falta input

17.1.9.2. Calidad nutricional Entre las tendencias más importantes de la nueva agricultura, nos encontramos con la formación de nuevos productos y servicios, influidos por una demanda de alimentos de mejor calidad. Pero también, nos encontramos con una expansión biotecnológica cada vez más rápida, con una mayor tecnología informática, con nuevas empresas relacionadas con el sector y con una expansión global en potencia. Gracias a la biotecnología, la mejora de los alimentos, a través de la incorporación de nuevas propiedades nutricionales potencialmente beneficiosas, reducirá los riesgos vinculados con el padecimiento de algunas afecciones, como la osteoporosis o los procesos cardiacos. Desde la mejora genética del maíz, se han desarrollado variedades especializadas tanto para calidad proteica (ricos en lisina y triptófano) como para alto contenido de aceite (de 6 a 9% de grasa cruda), las cuales están en proceso de adopción por los agricultores y usuarios; en México, los maíces de alta calidad proteica (conocidos como QPM, por su denominación en lengua inglesa: quality protein maize) se han venido promoviendo durante los últimos seis años con éxito limitado todavía; los maíces de alto contenido en aceite (conocidos como HOC: high oil corn) no ingresan al mercado nacional de semillas por su origen transgénico, así como las variantes en el manejo especializado para su producción.

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La condición gemelar o poliembrionía en semillas de maíz es una característica natural que puede ser aprovechable como una vía alterna en el diseño de variedades de aplicación especial, buscando además de potencial de rendimiento, el valor nutritivo del grano, incrementando cantidad y calidad de aceites y proteína; esto, bajo la hipótesis de que dos o más embriones por semilla, permitirán incrementar la capacidad de almacenamiento de nutrientes de calidad (Castro, 1973; Rodríguez, 1981; Espinoza et al, 1998; Espinoza et al., 1999).El planteamiento de que la condición gemelar o poliembriónica de las poblaciones PE ( frecuencias poliendromicas) del IMM (instituto Mexicanan del maíz) debe estar asociado a un mayor y mejor contenido de nutrientes en la semilla, principalmente en cuanto a aceites y proteína embrionaria, se ha venido documentando, inicialmente por la vía de análisis bromatológicos de las semillas (Espinoza et al., 1999), y recientemente por la cuantificación de ciertos nutrientes específicos, como el caso de los ácidos grasos (Valdés et al, 2004) y, planeado para realizarse en fechas del año 2004, la determinación de los aminoácidos lisina y triptofano en harina de granos completos. La hipótesis en esta línea de trabajo es que dos o más embriones por semilla, deben conferirle a ésta una mejor constitución nutritiva y cierta ventaja selectiva. La selección aplicada para incrementar la poliembrionía en las poblaciones de maíz bajo estudio influye de manera positiva en los contenidos nutrimentales de las semillas, e.g. aumentando el nivel de grasa cruda por encima del promedio conocido en el maíz común y la proporción de ácidos grasos insaturados, mejorando la relación oleico:linoleico. La cantidad de proteína cruda en maíces PE no presenta variaciones significativas a los testigos, sean maíz común o especializado del tipo QPM; sin embargo, será importante corroborar, en estudios a realizar otros estudios, cual es el nivel de lisina y triptofano, estableciendo la hipótesis de que los maíces PE han acumulado mayores contenidos en estos aminoácidos esenciales por el hecho de presentar un mayor número de embriones por semilla.

Ingeniería Metabólica La ingeniería metabólica ofrece un medio para mejorar la calidad y cantidad de flavonoides presentes en los alimentos que ingerimos. Siendo otro ejemplo de mejoras en el potencial nutricional de los alimentos

En tomate, que produce naturalmente sólo pequeñas cantidades de kaempferol y quercetina en la piel del fruto, se ha conseguido introducir y sobre-expresar los genes reguladores Lc y C1 de maíz, lo que lleva a un incremento de la formación de kaempferol de más del 60%, principalmente en la pulpa de los frutos. Además, la introducción del gen CHI de Petunia aumenta la biosíntesis de quercetina en más del 70% en la piel. La expresión de Lc y C1 en patata causa una marcada acumulación de kaempferol en los tubérculos. En el futuro, la disponibilidad del gen FLS, codificante de la enzima flavonol sintasa, obtenido de varias fuentes permitirá una ingeniería mucho más directa en la síntesis de los flavonoles.

17.1.9.3. Calidad industrial En un fuuro no muy lejano los científicos agrícolas podrán desarrollar polímeros industriales o productos fibrosos procedentes de fuentes renovables como el maíz o la soja.(Parker) tanto dentro como fuera del sector agrícola. Desde el siglo XX, el interés se ha incrementado. De un tiempo a esta parte, la cuestión más importante ha sido cómo perfeccionar el empleo de los excedentes por parte de los agricultores de los paises industrializados. Una segunda cuestión importante ha sido la necesidad de encontrar sustitutos a los productos disponibles en ese momento, sustitutos que nos evitaran depender de importaciones foráneas. Los biocombustibles son productos alternativos fabricados a partir de la "biomasa", que es materia orgánica, como madera, plantas o desechos orgánicos, que puede ser convertida directamente en líquidos combustibles para propósitos de transporte. Estos biocombustibles están siendo investigados y desarrollados como reemplazo de los combustibles derivados del

479 petróleo y como sustitutos parciales de los aditivos, para de esta manera "estirar" las reservas de petróleo existentes y reducir la dependencia general de los combustibles fósiles.

Fabricación del etanol El etanol o etil alcohol es un combustible de alto octanaje, producido a partir de la fermentación de las plantas de azúcar. En Estados Unidos, el E-10 (10% etanol / 90% gasolina) es la combinación alcohol/gasolina más ampliamente disponible para la compraventa minorista del transporte, pero también se producen mezclas de combustibles para automóviles superiores a E- 85. (La operación con E-85 requiere de "vehículos de combustible flexible", fabricados especialmente (FFV), de los cuales actualmente hay en uso cinco millones). Aunque el etanol se está usando como oxigenante para el diesel tradicional, la mayoría de las investigaciones y del mercadeo se centran en su uso en mezclas de gasolina. El maíz es la principal reserva alimenticia para la fabricación de etanol en Estados Unidos. El etanol también se produce a partir de fuentes orgánicas tales como cebada, trigo, arroz, soya, girasol, papa, mandioca y melaza. Fuera de Norteamérica, la caña de azúcar y la remolacha de azúcar son las reservas alimenticias más comunes. También puede producirse a partir de hierbas silvestres, paja de trigo y otros elementos orgánicos, comúnmente considerados como basuras, tales como paja de arroz, desechos de maderamen y hojas y tallos de plantas (afrecho). El afrecho de maíz es el desecho agrícola más importante en toda América. De acuerdo con la National Corn Growers Association, cerca del 13% del maíz cultivado en Estados Unidos (unos 1,43 mil millones de bultos) se transformaron en etanol en 2005. Un bulto de maíz produce cerca de 2,8 galones de etanol.

La molienda húmeda y la molienda seca son dos mecanismos de producción para generar etanol a partir del maíz. En la molienda seca, el grano entero primero es convertido en harina de maíz. El polvo con agua se transforma en una suspensión a la que se le agregan enzimas para convertir la fécula en dextrosa. Se agrega amoníaco para control del pH y como nutriente para la levadura. La masa se procesa en una cocción a alta temperatura para reducir los niveles de bacterias. Luego se enfría la masa y se agrega la levadura.

El proceso de fermentación toma por lo general entre 40 y 50 horas. Luego se separa el etanol y se concentra a 190 grados, usando destilación convencional; después se deshidrata a etanol anhidro de 200 grados. Enseguida se mezcla con un desnaturalizador, como la gasolina u otros destilados del petróleo.

En la molienda húmeda, el grano es embebido en agua y ácido sulfuroso diluido por más de 48 horas, para facilitar la separación del grano en sus partes componentes. Después de remojar, el compuesto acuoso de maíz es molido para separar el germen del maíz. Luego la fécula y cualquier remanente acuoso de la masa se fermentan en un proceso similar al del método seco. También hay mejoras en el potencial farmacéutico de los alimentos Los isoflavonoides pueden actuar como fitoestrógenos, lo cual ha generado un gran interés en el uso de estos compuestos para tratar desórdenes hormonales en humanos. Los isoflavonoides sólo se presentan en las leguminosas, en las cuales el primer paso de la biosíntesis de las mismas está regulado por la isoflavona sintasa (IFS). Recientemente se ha clonado el gen que codifica para dicha enzima, lo cual ha abierto un nuevo campo de ingeniería para la formación de isoflavonoides en plantas de cultivo que normalmente no presentaban dichos compuestos. Se ha realizado un experimento inicial en Arabidopsis thaliana introduciendo el gen IFS de soja por el promotor 35S, resultando la conversión de la naringenina en el isoflavonoide genisteina, que pertenece al grupo de los fitoestrógenos de alto interés médico.

En maíz, las mutaciones recesivas de dos genes CHS: C2 y Whp dan como resultado polen estéril de color blanco, producto de la ausencia de flavonoides en él. En la Petunia, la supresión de sentido de CHS causa flores blancas y esterilidad a la vez. La expresión antisentido de CHS en las anteras causa también esterilidad masculina. Por su parte en las plantas de tabaco, la

480 introducción y sobre-expresión del gen STS que codifica para la estibeleno sintasa, que compite con la CHS endógena por sustratos comunes, y por tanto también se produce esterilidad masculina y pigmentación alterada de las flores (Forkmann, G., S. Martens. 2001). Estudios adicionales muestran que los fenotipos estériles pueden ser complementados por la adición de flavonoles.

Supresión de la fertilidad del polen La esterilidad masculina es un requisito para el desarrollo de sistemas de semillas híbridos, por tanto, la generación de este hecho por ingeniería metabólica es una meta muy importante.

En consecuencia, la estrategia del antisentido o la supresión de sentido de FLS bajo el control de un promotor específico es una alternativa a la supresión completa de la síntesis de los flavonoides. Parece ser que esta es la estrategia más prometedora para la generación de esterilidad masculina. Biosíntesis de flavonoides por bacterias genéticamente modificadas. Recientemente mediante la ingeniería genética se ha logrado cultivar bacterias capaces de sintetizar flavonoides de tipo flavanonas. (Hwang E. I. , M. Kaneko , Y. Ohnishi , S. Horinouchi. 2003)

17.1.9.4. Tolerancia a la sequía Con el propósito de mejorar la tolerancia del maíz y el trigo a condiciones de escasez de agua, se adoptaron varias estrategias, entre ellas, generar por medio de ingeniería genética variedades que contienen diversas construcciones genéticas que podrían mejorar el desempeño de las variedades en condiciones desfavorables. Si bien existen ciertos asuntos que deben atenderse antes de que las variedades transgénicas lleguen a los agricultores (p. ej. propiedad intelectual, bioseguridad, conservación del ambiente y seguridad de los alimentos humanos y animales), si se demuestra que los sistemas genéticos basados en transgenes son efectivos, ofrecerán la posibilidad de mejorar el comportamiento de las plantas en condiciones desfavorables. De particular importancia es la naturaleza (unigénica y dominante) del transgene que hace más fácil la transferencia y el mantenimiento de los sistemas en cualquier variedad, en comparación con la de aquellos que se basan en genes múltiples y genética cuantitativa.

Los mecanismos moleculares de la respuesta a la escasez de agua se han estudiado principalmente en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Los análisis de la expresión de genes inducidos por deshidratación han demostrado que por lo menos cuatro vías de señalización metabólica independientes funcionan en la inducción de genes inducidos por factores desfavorables, en respuesta a la deshidratación: dos son dependientes de ABA y dos son independientes. Varios de los genes inducidos por condiciones desfavorables, como rd29A en A. thaliana, son activados mediante una vía metabólica independiente de ABA. El gene 1 de Ligamiento al Elemento de Respuesta a la Deshidratación (DREB1 por sus siglas en inglés) y DREB2 son factores de transcripción que se unen al promotor de genes como rd29A, por lo que inducen la expresión en respuesta a la sequía, la sal y el frío.

DREB1A ha sido sobreexpresado en plantas transgénicas Arabidopsis y el fenotipo resultante ha mostrado una sólida inducción de la expresión de los genes objetivo en condiciones favorables, pero también se ha observado enanismo en los fenotipos de las plantas transgénicas. Las plantas también mostraron tolerancia al congelamiento y la deshidratación. Por el contrario, la sobreexpresión de DREB2A produjo una expresión débil de los genes objetivo en condiciones favorables y el crecimiento de las plantas transgénicas fue lento. La regulación de la expresión del gene DREB1A por mediación del promotor rd29A en condiciones desfavorables produjo

481 plantas con mayor tolerancia al congelamiento, la sal y la sequía y sin cambios drásticos en el fenotipo normal de las plantas transformadas. 3 Avances: Se han generado varios cientos de eventos y se han probado en condiciones de escasez de agua en el invernadero de bioseguridad. Se ha confirmado que los eventos que han mostrado los más altos niveles de tolerancia a las condiciones de escasez de agua contienen el gene DREB y se están evaluando en condiciones de campo en el invernadero del CIMMYT en El Batán, México. Si se observa que el comportamiento de los transgénicos mejora en las condiciones que se están evaluando, se realizarán más ensayos de campo. La sequía reduce la fijación de nitrógeno en leguminosas. En condiciones de sequía, se produce una limitación de carbono en los nódulos de las leguminosas que podría ser la causa del descenso de la fijación de nitrógeno en las mismas. Ésta es una de las conclusiones que ha presentado María Dolores Gálvez en su tesis defendida en la Universidad Pública de Navarra. El trabajo doctoral se titula: Metabolismo nodular en Pisum sativum L. en respuesta a estrés hídrico. Interacciones carbono/nitrógeno y posibles moléculas implicadas en la modulación de la respuesta.

Fijación de nitrógeno y sequía. La fijación biológica de nitrógeno es un proceso de gran interés agronómico y ecológico, puesto que el nitrógeno, después del agua y el carbono, es el nutriente que limita en mayor medida el crecimiento vegetal y la producción de los cultivos. Este proceso resulta particularmente sensible a condiciones ambientales adversas, como el estrés hídrico o sequía. Precisamente el objetivo de la tesis doctoral de María Dolores Gálvez ha sido investigar cómo se produce la regulación de la fijación biológica de nitrógeno en condiciones de sequía.

La reducción del nitrógeno atmosférico a amonio, o fijación de nitrógeno, la llevan a cabo únicamente determinados organismos procariotas. Entre ellos, los denominados genéricamente rizobios son capaces de establecer simbiosis con plantas leguminosas dando lugar a la formación de una nueva estructura radical: el nódulo.

Por un lado, la planta se beneficia del microorganismo, que se encarga de tomar el nitrógeno del aire y transformarlo en amonio de forma que se lo facilita a la planta. Este amonio se incorpora a esqueletos de carbono para formar aminoácidos y proteínas. Por su parte, el microorganismo obtiene de la planta los nutrientes necesarios para su crecimiento.

En condiciones de sequía, se detectó un descenso de la actividad sacarosa sintasa nodular. Este descenso se produjo simultáneamente al descenso de la fijación de nitrógeno, pudiéndose establecer una elevada correlación entre ambos procesos en condiciones adversas. Como consecuencia de la inhibición de la actividad sacarosa sintasa, se observó también un descenso de la concentración de azúcares fosfato y ácidos orgánicos, lo que indica un descenso en el flujo de carbono en los nódulos que limitaría, a su vez, el suministro de carbono al bacteroide, viéndose afectada la capacidad del bacteroide para fijar nitrógeno. Con el fin de profundizar en el proceso de percepción y transducción del estrés hídrico que lleva a la inhibición de la fijación de nitrógeno, María Dolores Gálvez estudió también el ácido abscísico y las especies de oxígeno activado como posibles moléculas implicadas en la regulación de la fijación de nitrógeno.

17.1.9.5. Resistencia a enfermedades El proceso por el cual las plantas desarrollan una enfermedad se puede dividir en cinco fases.

3 Como parte de las actividades del CIMMYT para aumentar la tolerancia a la sequía en el trigo, JIRCAS, por conducto del Dr. Shinozaki, proporcionó el gene DREB1A de A. thaliana controlado por un promotor inducido por sequía, para probarlo primero en trigo y posteriormente en maíz

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1. Inoculación: Es la introducción del agente patógeno dentro del tejido de la planta huésped. Por ejemplo las esporas son los principales agentes transmisibles de los hongos. El agua o el viento pueden trasportar este agente, pero también los insectos, pájaros, mamíferos. 2. Incubación: Es un período de desarrollo durante el cual el agente patógeno experimenta una serie de cambios hasta llegar a una forma que le permite penetrar e infectar. Los hongos forman la estructura denominada anclaje de penetración. 3. Penetración: Es el proceso por el cual el agente se introduce dentro de la planta, puede ser un proceso activo como pasivo. Algunos agentes patógenos elaboran enzimas que disuelven las capas superficiales y la celulosa, o introducirse por los estomas, lenticelas o heridas. Algunas estructuras comunes son los apresorios. 4. Infección: Cuando el agente invade el tejido de una planta y se establece una relación parasitaria. También se generan nuevas esporas y la enfermedad se dispersa de forma exponencial. 5. Enfermedad: Cuando en la planta huésped se manifiesta una respuesta a la presencia del agente, como clorosis o necrosis. Son los síntomas del patógeno que muchas veces reducen considerablemente el rendimiento.

El mejoramiento para la resistencia a una enfermedad puede estar enfocado a cualquiera de esas etapas. Se pueden seleccionar genes que dificultan la penetración, genes que bloquean la infección sistémica, o bien genes que disminuyen la severidad de los síntomas.

17.2. Metodologías innovadoras 17.2.1. Retrospectiva histórica del mejoramiento molecular de plantas Evolución del mejoramiento: de Darwin a Mendel hasta Hallauer, Watson y Crick Es cierto que Darwin delineó los principios científicos de la hibridación y la selección. Mientras fue Mendel quien definió la asociación fundamental entre el genotipo y el fenotipo. Por medio de sus teorías fue posible hacer mejoramiento con un enfoque científico a inicios del siglo 20 (e.g. Shull, 1909). A pesar de que algunos mejoradores reconocieron inmediatamente la importancia de la genética mendeliana (genética cualitativa), la integración total se retrazo alrededor de 20 años, hasta que la genética cuantitativa reconcilió los principios de Mendel con la continua variación observada en la mayoría de los rasgos considerados importantes por los mejoradores (Paul and Kimmelman, 1988). Los principios de genética cuantitativa descritos en el famoso libro de Hallauer son primordiales para entender este proceso. Los subsecuentes avances en nuestro entendimiento de la biología de plantas, análisis e inducción de la variación genética, genética celular y cuantitativa, biología molecular, biotecnología y más recientemente de genómica, se han aplicado exitosamente para incrementar la base científica y su aplicación en el proceso de mejoramiento de plantas (e.g. Baenziger et al., 2006; Jauhar, 2006; Varshney et al., 2006).

La era de la biotecnología de plantas comienza a inicios de los años ochenta, con los conocidos reportes de producción de plantas trasgénicas utilizando Agrobacterium (Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983). A partir de entonces se desarrollaron sistemas de marcadores moleculares para crear mapas genéticos de alta resolución y así explotar la relación entre marcadores y características importantes de los cultivos (Edwards et al., 1987; Paterson et al., 1988).

Para 1996 la comercialización de cultivos transgénicos demostró la exitosa integración de la biotecnología en el mejoramiento de plantas y en los programas de mejora de cultivos (Koziel et

483 al., 1993; Delannay et al., 1995). Como se observa en la Figura 17-8, la introgresión de uno, o algunos genes en un cultivo, comúnmente utilizado retrocruzas, es una práctica común de mejoramiento. Algunos métodos de retrocruza asistida por marcadores fueron desarrollados rápidamente para hacer introgresión de características transgénicas y reducir el arrastre por ligamiento (linkage drag), en donde los marcadores moleculares se utilizaron para explorar el genoma y seleccionar aquellos individuos que contuvieran el transgen y la proporción más alta de alelos favorables del genoma parental recurrente (e.g. Ragot et al., 1995; Johnson and Mumm, 1996).

Durante los últimos 25 años, el desarrollo y aplicación continua de la biotecnología de plantas, marcadores moleculares y genómica, han establecido nuevas herramientas para la creación, análisis y manipulación de la variación genética, así como el desarrollo de cultivos mejorados. Ver reviews (Sharma et al., 2002;Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). El mejoramiento molecular es actualmente una práctica estándar en varios cultivos, sobre todo en las empresas privadas de semillas. En las siguientes secciones revisaremos brevemente el impacto positivo tanto de la información molecular como de la ingeniería genética, en el paradigma del mejoramiento de plantas.

17.2.1.1. Principios y prácticas del mejoramiento

Esquemas de mejoramiento y concepto de ganancia genética Conceptualmente, el mejoramiento de plantas es simple: cruzar los mejores padres e identificar y recupera la progenie que supera a los padres. En la práctica, el mejoramiento consta de tres pasos, en el cual, poblaciones o colecciones de germoplasma con variación genética útil son creadas o acopladas, se identifican los individuos con fenotipos superiores y se desarrollan cultivos mejorados a partir de los individuos seleccionados. Se ha desarrollado una amplia gama de acercamientos para hacer mejoramiento de plantas, dependiendo de la especie a cultivar y los objetivos del mejoramiento (Fehr, 1987; Stoskopf et al., 1993). Estos métodos de mejoramiento difieren en los tipos de población, procedimientos de selección y el producto final.

En la figura x se muestra un resumen de los métodos de mejoramiento que comúnmente se emplean en programas de desarrollo de cultivos. Como ya se mencionó, cuando la meta es mejorar un genotipo elite establecido, con características controladas por uno o pocos loci, se utiliza la retrocruza para lograr la introgreción de un solo gen (Fig. 1A), o una pirámide de pocos genes (Fig. 1B). Para características genéticas complejas, el desarrollo de germoplasma mejorado requiere la reorganización del genoma para producir nuevas combinaciones de genes favorables en la progenie. El método de mejoramiento por pedigrí genera estas nuevas combinaciones mediante la cruza y recombinación entre padres superiores y complementarios, así como mediante la selección entre la progenie segregante para rendimiento mejorado (Fig. 1C).

La selección periódica pretende incrementar de manera simultanea las frecuencias de alelos favorables en loci múltiples de la población mejorada, a través de la cruza entre individuos seleccionados (Fig. 1D). Para cultivos híbridos como el maíz, la selección periódica podría extenderse para mejorar el rendimiento de poblaciones complementarias distintas (e.g. grupos heterocigotos) que se utilizan como padres para generar combinaciones hibridas superiores. A esta práctica se le conoce como selección periódica reciproca.

Los principios de genética cuantitativa han sido particularmente poderosos como la base teórica tanto para el desarrollo de poblaciones, como para los métodos de selección y estabilización de genotipos deseables (Hallauer, 2007). Un concepto importante en la genética cuantitativa y el mejoramiento de plantas es la ganancia genética (DG), el cual se refiere al cambio predicho del valor promedio de una característica dentro de la población donde ocurre la selección. Sin tener

484 en cuenta la especie, la característica de interés o el método de mejoramiento utilizado, el valor DG sirve como una expresión universal simple para la mejora genética esperada (Fehr, 1987; Falconer and Mackay, 1996). La figura 2 muestra la ecuación de DG y una expansión de sus términos para parámetros fundamentales de la genética cuantitativa. Aunque el mejoramiento de plantas utiliza claramente una sobresimplificación de los principios de la genética cuantitativa, la ecuación de ganancia genética relaciona los cuatro factores centrales que influencian el proceso de mejoramiento: el grado de variación fenotípica presente en la población (representado por su SD, sP), la probabilidad de que una característica fenotípica se transmita de los padres a la progenie (heredabilidad, h2)la proporción de la población seleccionada como padres de la siguiente generación ( intensidad de selección, i, expresada como unidades de SD del promedio) y el tiempo necesario para completar un ciclo de selección (L). L, no sólo es función del número de generaciones que re requieren para completar un siclo de selección, sino también, de que tan rápido se complete una generación y el número de generaciones por año.

Es claro que DG se puede aumentar incrementando sP, h2 o i, y disminuyendo L. Por lo tanto, la ecuación de ganancia genética provee un marco de comparación de la efectividad de estrategias particulares de mejoramiento, y comúnmente se utiliza como una guía para asignar juiciosamente los recursos necesarios para alcanzar los objetivos de mejoramiento. Cuando se considera dentro del contexto de ganancia genética, el mejoramiento molecular de plantas ofrece nuevos y poderosos acercamientos que permiten superar las limitaciones previas para maximizar DG. En las siguientes secciones se citan ejemplos en dónde le mejoramiento molecular de plantas ejerce un impacto positivo en DG y cada una de las variables que la integran. Por cuestión de brevedad, nos enfocaremos en ejemplos de maíz, en donde el mejoramiento molecular está más avanzado y se ha convertido en uno de los primeros cultivos en el que se han desarrollado híbridos comerciales mejorados.

El mejoramiento molecular de plantas expande la diversidad genética útil para la mejora de cultivos. El máximo potencial para la ganancia genética es proporcional a la variación fenotípica (sP) presente en la población fuente original, y se mantiene en los ciclos subsiguientes de selección. La variación fenotípica está asociada positivamente a la diversidad genética, aunque también depende de factores ambientales y de las interacciones entre genotipo y ambiente. La diversidad genética se puede derivar de poblaciones cultivadas (naturales o sintéticas), progenie segregante de la cruza de líneas parentales seleccionadas, materiales exóticos que no están adaptados al medio ambiente, cruzas interespecíficas entre especies silvestres, mutaciones naturales o inducidas, introducción de eventos transgénicos, o combinaciones de estos.

Sin embargo, no todas las variaciones fenotípicas son iguales. Por ejemplo, el uso de germoplasma exótico ha sido extremadamente exitoso para mejora varias especies de cultivo, pero puede haber dificultades si se introducen alelos no deseados, relacionados con pérdida de adaptación. La necesidad de diversidad genética debe ser balanceada mediante desempeño elite, puesto que es clave escoger los mejores padres, para maximizar la probabilidad de una mejora exitosa. En contraste, el incremento esperado en el desequilibrio por ligamento entre las poblaciones elite, derivado de intensas selecciones previas, también puede limitar la creación de nuevas combinaciones genéticas para ganancia futura. Con el entrecruzamiento de especies fuente, para lograr la recombinación genética se puede superar este problema, pero esto retrasa el desarrollo del cultivo.

Los marcadores moleculares y más recientemente, los esfuerzos de secuenciación del genoma con altos rendimientos, han incrementado dramáticamente el conocimiento y la habilidad de caracterizar la diversidad genética en el fondo común de germoplasma, para esencialmente cualquier especie de cultivo. Usando maíz como ejemplo, el reconocimiento de alelos de marcadores moleculares y la variación en la secuencia nucleotídica han proporcionado

485 información básica sobre la diversidad genética antes y después de la domesticación de su antecesor silvestre, el teosintle, entre razas domesticadas distribuidas geográficamente y dentro de germoplasmas elite históricos (para una revisión, leer Cooper et al., 2004; Niebur et al., 2004; Buckler et al., 2006).

Esta información enriquecerlas investigaciones sobre evolución de plantas y genómica comparativa, contribuye a entender la estructura de la población, proporciona medidas empíricas de las respuestas genéticas hacia la selección y sirve también para identificar y mantener reservas de variabilidad genética para una futura mina de alelos benéficos (McCouch, 2004; Slade et al., 2005). Además, el conocimiento de las relaciones genéticas entre recursos de germoplasma puede ser una guía al escoger padres para la producción de híbridos o poblaciones mejoradas (e.g. Dudley et al., 1992; Collard and Mackill, 2008).

Mientras que los marcadores moleculares y otras aplicaciones genómicas han sido altamente exitosas caracterizando la variación genética existente, la biotecnología de plantas genera nueva diversidad genética, que generalmente va más aya de especies relacionadas (Gepts, 2002; Johnson and McCuddin, 2008). La biotecnología permite acceso a genes que no estaban disponibles al utilizar cruzas y crea un fondo de variación genética esencialmente infinito. Los genes pueden ser adquiridos de los genomas existentes en todos los reinos de vida, o pueden ser diseñados y ensamblados en el laboratorio. Ejemplos tanto sutiles como extremos, sobre el poder de los transgenes para introducir variación fenotípica, se pueden encontrar en tres diferentes transgenes que desarrollan resistencia en maíz y otros cultivos, contra los herbicidas de glifosfato. En el primer híbrido de maíz tolerante al glifosfato, se utilizó una versión modificada del gen endógeno de maíz que codifica para la 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (Spencer et al., 2000). A este híbrido le siguieron una serie de eventos producidos por el gen de la 5-enol- piruvilshikimato-3-fosfato sintetasa aislado de Agrobacterium (Behr et al., 2004). Más recientemente un gen sintético con la actividad de glifosfato acetil transferasa aumentada, fue creado utilizando reordenamiento de genes (gene shuffling) y selección en sistemas microbianos (Castle et al., 2004). Cada uno de estos casos de maíz tolerante al glifosfato, ilustra también otro beneficio de la biotecnología, donde nuevas combinaciones de secuencias regulatorias (por ejemplo los promotores del virus del mosaico del la coliflor, y el de actina 1 de arroz) pueden ser usadas para lograr la expresión óptima de una característica, con respecto a la actividad general y la distribución relativa de tejido, lo que podría ser imposible con los genes endógenos (Heck et al., 2005).

El mejoramiento molecular de plantas incrementa la acción favorable de los genes La genética cuantitativa utiliza el concepto teórico de heredabilidad para cuantificar la proporción de la variación fenotípica que es controlada por el genotipo. En la práctica, la heredabilidad está considerablemente influenciada por la arquitectura genética de la característica de interés, la cual esta descrita por el número de genes, la magnitud de sus efectos y el tipo de acción del gen sobre el fenotipo. Un mejor conocimiento de la arquitectura genética y de la acción benéfica de la acción de los genes (la cual es más preferible para la selección) tiene un mayor impacto sobre la optimización de la ganancia genética. Para la fórmula de la ganancia genética, la heredabilidad (h2) se utiliza en un sentido estricto, representando la proporción de la variación fenotípica debida a los efectos genéticos (aquellos que reflejan sustituciones de alelos o cambios en su proporción).

Los efectos genéticos aditivos también son considerados como valor de cultivo (valor de cría), puesto que su transferencia a la progenie es predecible. Las desviaciones de los afectos aditivos son significativas para muchas características, y están divididas en efectos dominantes que reflejan las interacciones entre los diferentes alelos en el mismo lucus, y efectos epistáticos resultado de las interacciones entre los diferentes loci.

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La acción de los genes y los valores de cultivo (valor de cría?) se caracterizan mediante pruebas de progenie, en las cuales los fenotipos de individuos de la población se compran con los padres y hermanos producidos por autopolinización o cruza. Los esfuerzos previos para desarrollar un gran número de marcadores moleculares, mapas genéticos de alta densidad y mapeo de poblaciones apropiadamente estructurado, han hecho rutina la habilidad de definir simultáneamente la acción del gen y su valor de cultivo en cientos y a veces miles de loci distribuidos relativamente uniforme entre genomas completos, en una gran variedad de cultivos. Los resultados de estos estudios de mapeo proporcionan estimados altamente mejorados de el número de loci, efectos alelicos y acción del gen que controlan las características de interés. Y aún más importante, se pueden identificar fácilmente segmentos genómicos que muestren asociaciones estadísticamente significativas con características cuantitativas (loci de características cuantitativas, QTL por sus siglas en inglés). Además del mapeo genético en familias derivadas de cruzas biparentales, nuevos avances en la genética de asociación con genes candidatos y acercamientos que combinan el análisis de desequilibrio por ligamiento en familias y poblaciones (Holland, 2007; Yu et al., 2008) en un futuro aumentaran el poder de los QTL.

La información sobre los QTL puede ser utilizada de diversas maneras para incrementar la heredabilidad y la acción benéfica de los genes. Para los rasgos que tienen heredabilidad moderada o baja, como el rendimiento de grano, los QTL y otros marcadores moleculares asociados generalmente cuentan más para una mayor proporción de efectos genéticos aditivos, que el fenotipo solo. Además, el conocimiento de la arquitectura genética se puede explotar para añadir o eliminar alelos específicos que contribuyan al valor de cultivo. Cuando la epistasis o el ligamiento genético entre loci con efectos antagónicos en una característica limitan la ganancia genética, la información de los QTL puede ser usada para romper estas indeseables relaciones. El éxito para incrementar la ganancia genética utilizando la información sobre QTL depende en gran medida de la magnitud de los efectos de los QTL, la estimación precisa de su posición, la estabilidad de sus efectos en múltiples ambientes y si los QTL son robustos en el germoplasma mejorado. La predicción de la posición de los QTL se puede aumentar con mapeos finos, los cuales facilitan las pruebas de los efectos de QTL y los valores en poblaciones adicionales.

Cuando la densidad de las recombinaciones observadas se acerca a la resolución de genes aislados, el cambio genético causal del QTL puede ser determinado (para revisión, Salvi y Tuberosa, 2005; Yu and Buckler, 2006; Belo´ et al., 2008; Harjes et al., 2008). El aislamiento molecular de estos QTL permite el desarrollo de marcadores moleculares perfectos o funcionales con el potencial de resolución de la unidad fundamental de la herencia, el nucleótido, y aumenta dramáticamente la especificidad y precisión con las cuales los efectos genéticos se estiman y manipulan en los programas de mejoramiento.

El uso de transgenes podría simplificar la arquitectura genética de características deseables de formas superiores, o incluso que no son posibles cuando hay disponibles marcadores perfectos para QTL robustos de efecto amplio. Típicamente los transgenes condicionan efectos genéticos fuertes a particulares loci operacionales, los cuales también exhiben acción de genes dominantes en donde sólo se necesita una copia del evento para lograr la máxima expresión en un cultivar híbrido. Las características de los transgenes pueden reducir el complicado proceso de mejora cuantitativa a una solución directa y frecuentemente dramática. Un excelente ejemplo es la expresión de toxinas proteicas insecticidas de Bacillus thuringiensis (Bt) en híbridos transgénicos de maíz para reducir el daño por herbivoría provocado por Ostrinia nubilalis y Diabrotica spp.

La resistencia parcial de germoplasmas de maíz a estas plagas había sido caracterizada como una característica cuantitativamente heredable con poca heredabilidad (Papst et al., 2004;

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Tollefson, 2007), pero los eventos transgénicos con Bt ofrecen una alternativa heredable simple que es eficientemente manipulada en los programas de mejoramiento.

A través de la simplificación de la estructura génica, los transgenes también permiten la interrupción de las interacciones alélicas entre factores que controlan el rasgo de interés y otras características de rendimiento importantes. Por ejemplo, utilizando un recurso transgénico de resistencia a insectos (por ejemplo un solo locus del transgen Bt) se puede facilitar la selección de alelos favorables para mejorar el rendimiento que están reprimen fuertemente unidos a genes endógenos de resistencia a estas plagas. Además, los eventos transgénicos pueden ser diseñados para desacoplar efectos pleiotrópicos negativos en fenotipos benéficos condicionados por mutaciones recesivas. Esta aplicación se puede ilustrar con le uso de ARN interferente para disminuir específicamente la expresión del gen de almacenamiento de zeína en semilla (Segal et al., 2003; Huang et al., 2004). Esta estrategia imita los efectos de la mutación opaque2, mejorando el perfil de aminoácidos en granos de maíz para alimentación animal, a la vez que evita la textura suave del endospermo y la susceptibilidad a hongos patógenos típicamente asociados con opaque2.

Los eventos transgénicos también pueden ser diseñados para intervenir en pasos regulatorios clave para una ruta metabólica completa o para rutas de desarrollo, tales como aquellos genes de acción para el rasgo correspondiente que son heredados en factores dominantes únicos que son menos sensible a los efectos ambientales.

Algunos ejemplos incluyen la expresión de un factor de transcripción que incrementa la tolerancia a la sequía (Nelson et al., 2007) y la alteración del balance entre los niveles del factor de transcripción GLOSS15 y su represor, el micro ARN 172, para retardar la floración en híbridos de maíz (Lauter et al., 2005).

La biotecnología también facilita el agrupamiento de transgenes que controlan un rasgo, o serie de rasgos, en un haplotipo de un solo locus definido por un evento transgénico.

Ejemplos de esta estrategia incluyen, el Arroz Dorado inicial (Ye et al., 2000), el reciente lanzamiento de híbridos de maíz triplemente trasgénico Yield-Guard VT, en el cual, las características de tolerancia a herbicidas y resistencia a múltiples insectos se integran en un solo locus genómico (http://www.yieldgardvt.com/VTScience/Default.aspx), o la combinación de transgenes que simultáneamente incrementan la síntesis y disminuyen el catabolismo de lisina en semillas de maíz (Frizzi et al., 2008). Reportes recientes sobre mejoras en la tecnología de marcaje de genes (Ow, 2007) y la construcción de minicromosomas de plantas meióticamente transmisibles (Carlson et al., 2007; Yu et al., 2007) preparan el terreno para introducir más características con mayor complejidad. Con estos logros la biotecnología es ahora en posición de ensamblar diversidad genética útil, desde esencialmente cualquier recurso, en construcciones que concentren acción genética favorable y maximice la heredabilidad para un conjunto de características muy amplio.

Para cerrar esta sección sobre cómo el mejoramiento molecular de plantas incrementa la acción benéfica del gen, es importante enfatizar que los estudios de QTL, cuando se llevan a cabo con la escala y posición adecuadas para identificar genes causales, representan una estrategia genómica funcional muy poderosa.

La clonación de QTL ha producido nuevas perspectivas acerca de la biología de las características cuantitativas, que no hubieran sido descubiertas desde el análisis de genes mediante estrategias de pérdida de función, o sobreexpresión, en particulares impacto de la variación regulatoria en la variación fenotípica y en la evolución (e.g. Cong et al., 2002; Clark et al., 2006; Yan et al., 2004; Salvi et al., 2007).

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Por otra parte, los marcadores moleculares, la genómica y la biotecnología se aplican de una red de trabajo iterativa, explotando así la diversidad genética para la mejora de cultivos. La información genética permite el descubrimiento de alelos benéficos mediante el mapeo y clonación de QTL, seguido del uso de la información aprendida sobre caracterización molecular de QTL, para diseñar estrategias transgénicas óptimas para el mejoramiento de plantas.

El mejoramiento molecular de plantas incrementa la eficiencia de la selección El mejoramiento convencional de plantas, que se basa sólo en la selección de fenotipos, ha sido históricamente efectiva. Sin embargo, para algunas características, la selección fenotípica ha logrado poco progreso debido a los retos al medir fenotipos o identificar individuos con el mayor valor de mejoramiento. Los efectos de ambiente, interacción ambiente- genotipo y errores de medición, también contribuyen a las diferencias observadas. La evaluación de genotipos en ambientes múltiples con réplicas permite una mejor estimación del valor de mejoramiento, pero requiere gasto y tiempo adicionales. Para algunos rasgos, podría ser necesario sacrificar individuos para medir el fenotipo, o la expresión de un rasgo puede depender de condiciones variables del ambiente (por ejemplo, presión por enfermedades) y el estado de desarrollo (la calidad del grano solo se puede conocer después de la floración). Además los mejoradores típicamente den mejorar de manera simultánea una serie de características valoradas comercialmente, lo que podría limitar la cantidad de grano para seleccionar. Así como el mejoramiento molecular ayuda a expandir la diversidad genética, caracterizar la estructura genética y modificar la acción del gen, sus métodos también pueden ser aplicados para incrementrar la eficiencia de la selección.

Una gran parte de la literatura ha considerado la utilidad de la selección asistida por marcadores moleculares y su ajuste con los diferentes métodos de mejoramiento (Fig. 1)tupiendo al lector a un gran número de revisiones excelentes del tema (Dekkers and Hospital, 2002; Holland, 2004; Johnson, 2004; Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). Los genotipos de marcadores moleculares que se utilizan dentro de genes o muy cercanos a los QTL, que influencian rasgos bajo selección, pueden ser empleados como un suplemento a las observaciones fenotípicas en una guía de selección (Lande and Thompson, 1990). En los casos donde las correlaciones genéticas son altas, se pueden ganar eficiencias adicionales sustituyendo la selección genotípica por la fenotípica, durante algunos ciclos de selección, lo que puede reducir los esfuerzos de fenotipaje, así como el número de ciclos que permitan el uso de viveros fuera de temporada. Johnson (2004) resume un ejemplo anticipado de combinar los datos fenotípicos y las puntuaciones de marcadores moleculares para incrementar las ganancias en rendimiento de maíz y resistencia a plagas debida a la selección. Una estrategia efectiva para modificar simultáneamente características múltiples, es el uso de índices de selección que consideren múltiples factores para escoger el fenotipo mejorado final. Recientemente Eathington et al. (2007) reportaron su resultados sobre el uso de índices de múltiples características y la selección asistida por marcadores en cerca de 250 poblaciones únicas de maíz El uso de marcadores moleculares incrementan la eficiencia de la mejora alrededor de 2 veces en relación a la selección fenotípica, también con ganancias similares en poblaciones de soya (Gyicine max) y girasol (Helianthus annuus).

La selección asistida por marcadores también puede aumentar significativamente la ganancia genética para características en las que el fenotipo es difícil de evaluar ya sea por su costo, o por su dependencia e condiciones ambientales específicas. Los marcadores moleculares se pueden utilizar para fomentar la probabilidad de identificar realmente genotipos superiores, concentrándose en probar recursos de genotipos con el mayor potencial (i.e. con la eliminación temprana de genotipos inferiores), disminuyendo el número de la progenie que se necesita analizar para recuperar un nievel dado de ganancia, y permitiendo la mejora simultanea de características que están negativamente correlacionadas (Knapp, 1998).Algunos ejemplos exitosos incluyen resistencia de la soya a nematodos (Young, 1999), resistencia a enfermedades

489 en cereales (revisado por Varshney et al., 2006) y tolerancia a sequía en maíz (Ribaut and Ragot, 2007; Tuberosa et al., 2007). La eficiencia de la selección fenotípica para lagunas características complejas se puede incrementar si se incluyen fenotipos bioquímicos o fisiológicos como características secundarias, cuando estos exhiben correlaciones genéticas fuertes con la característica de interés y alta heredabilidad. Los recientes avances en genómica funcional permiten escalar a nivel de población el perfil de abundancia de RNA, niveles y actividades de proteínas y metabolitos que están asociados con características importantes. A parte de los marcadores moleculares que identifican variaciones en la secuencia de ADN, estas estrategias genómicas podrían proveer fenotipos secundarios adicionales como objetivos de selección (Jansen and Nap, 2001; Johnson, 2004), particularmente para aquellas características definidas por su respuesta a factores como medio, estado fisiológico o desarrollo.

La selección asistida por marcadores, también acelera el uso de transgenes en cultivares comerciales. Típicamente, esto se ha logrado mediante la retrocruza asistida por marcadores. Sin embargo, para mejoras futuras en biotecnología, como tolerancia a la sequía o a la limitación de nutrientes, el mejoramiento directo podría requerir de la cooptimización de expresión del transgen y el origen genético, puesto que los genes endógenos y los factores ambientales, podrían tener el potencial de influir en los fenotipos resultantes de las modificaciones transgénicas (Mumm, 2007).

Por supuesto, que el uso de marcadores moleculares, podría también contribuir con los esfuerzos de mejoramiento directo. Alternativamente los esfuerzos por descubrir genes adicionales o QTL, que son necesarios para el desempeño fiable de una característica, podrían proponer el diseño de nuevas construcciones de transgenes que agrupen transgenes primarios con modificadores genéticos, en una segunda generación de eventos transgénicos.

Incremento en la aprobación del mejoramiento molecular de plantas La aceptación de las estrategias de mejoramiento molecular de plantas ha ocurrido a diferentes ritmos, dentro de las especies y las instituciones comprometidas con el mejoramiento de estos, debido a la influencia combinada de factores científicos, económicos y sociológicos. Algunas barreras científicas importantes, incluyendo la recalcitrancia de los cereales a la transformación mediada por Agrobacterium y la falta de conocimientos sobre el control genético, son definidas como objetivos importantes del mejoramiento. El desarrollo continuo de investigación y tecnología ha superado los obstáculos presentes en la transformación de plantas, en casi todos los cultivos y especies de horticultura de importancia económica (Wenzel, 2006). De manera similar la información obtenida de la investigación genómica en plantas y otros organismos ha generado bastante información sobre estructura y función génica, así como grandes cantidades de marcadores moleculares para ser usados en el mejoramiento de plantas.

A pesar de estos recursos, la genética específicamente de QTL robustos permanece ambigua, amenos que los programas de mejoramiento y los sistemas de manejo de la información asociada, sean reestructurados para integrar por completo el conocimiento sobre pedigríes, fenotipos, y marcadores de genotipos que puedan ser influenciados para optimizar la respuesta a la selección (Cooper et al., 2004; Eathington et al., 2007). Aún con una integración de este tipo, modificar las funciones regulatorias sigue siendo un reto científico de mejoramiento molecular, puesto que es difícil determinar la secuencia de bases responsable de los cambios regulatorios y predecir los efectos fenotípicos (Morgante and Salamini, 2003).

Una vez que las tecnologías en biotecnología y genómica estén disponibles, los factores económicos generalmente dictan el grado en que estas innovaciones se integren a los programas existentes de mejora de plantas. El costo de ganar la aprobación regulatoria gubernamental, para la liberación comercial de variedades transgénicas (recientemente estimadas por Kalaitzandonakes et al., 2007, entre $7-$10 millones) es una barrera económica

490 significativa. El costo asociado con el desarrollo, establecimiento y operación del mejoramiento molecular de plantases mayor que para las prácticas convencionales de mejoramiento (Koebner and Summers, 2003; Morris et al., 2003), pues requiere inversiones importantes en nueva infraestructura de investigación y capacidad intelectual. Estos recursos sólo existen de forma inicial en compañías agrícolas privadas y en un puñado de instituciones públicas, promoviendo la aceleración con tendencia a incrementar la industrialización de los programas de mejoramiento en cultivos mayores como maíz, soya, algodón (Gossypium hirsutum) y trigo (Johnson, 2007). Cuando ha habido aceptación por las compañías, la balanza favorece a la biotecnología sobre los QTL, para mejorar características complejas, a pesar de aumentar los costos de desarrollo del producto, ya que los transgénicos pueden ser diseñados para producir efectos fenotípicos más fuertes, incluso dramáticos y generalmente se pueden desplegar más rápido en un amplio rango del germoplasma, resultando en nuevas soluciones aún más rápido.

A pesar de que actualmente el mejoramiento molecular es considerado por las grandes compañías, como un componente esencial en los esfuerzos de mejoramiento de cultivos mayores, la amplia aplicación de las estrategias moleculares modernas a las técnicas de mejoramiento convencionales, sigue siendo un tema de debate entre algunos mejoradores de plantas que participan en el sector público, particularmente, para cultivos menores (e.g. Gepts, 2002; Goodman, 2004). Además de los muy válidos factores científicos y económicos, que han retrazado o prevenido, la aceptación de las estrategias moleculares para alcanzar algunos objetivos del mejoramiento molecular, al menos hay tres razones adicionales que contribuyen a esta visión. En primera, el mejoramiento molecular de plantas requiere entrenamiento y experiencia en biología molecular y mejoramiento de plantas. Los esfuerzos educativos que otorgan este tipo de entrenamiento interdisciplinario fueron establecidos a inicios de 1990, pero continúan limitados a un pequeño grupo de instituciones académicas con tradición en mejoramiento de plantas (Guner andWehner, 2003; Gepts and Hancock, 2006; Guimara˜es y Kueneman, 2006). Una segunda razón que reduce el entusiasmo para que la biotecnología sea abrazada por los mejoradores, son los problemas de aceptación de cultivos transgénicos entre algunos gobiernos y grupos de consumidores, como ha sucedido al posponer variedades de trigo con transgenes que brindan resistencia hacia los herbicidas con glifosfato (Sokstad, 2004). Finalmente, la exaltación sobre el potencial del mejoramiento molecular de plantas, también estimula cambios en el financiamiento de instituciones publicas para incrementar la capacidad intelectual y la infraestructura de las investigaciones en genómica y genética molecular, lo cual ocurre, ironicamente, a expensas de el mejoramiento convencional (Knight, 2003).

Este énfasis puede ser temporalmente necesario para establecer los fundamentos de la biología de plantas de siglo 21, pero actualmente, hay un reconocimiento creciente de que el incremento en la inversión en capacidad de mejoramiento de plantas y en investigación de transferencia, uniendo los métodos moleculares con los objetivos de mejoramiento, necesita del desarrollo del potencial de los avances recientes en biotecnología y genómica (Guimara˜es and Kueneman, 2006; National Research Council, 2008).

17.2.1.2. CONCLUSIÓN A pesar de los recientes avances y ejemplos exitosos del mejoramiento molecular de plantas, uno de los grandes retos actuales en la biología de plantas es identificar aquellas combinaciones de genes que llevan a una mejora significativa de cultivos. Este comentario se concluye sugiriendo que la estrategia más efectiva para acelerar estos esfuerzos, es integrar mejor las diferentes disciplinas de investigación y las actividades centrales que conforman el mejoramiento molecular de plantas. Como aquí se describe, y anteriormente por otros (e.g. Gepts y Hancock, 2006; Bliss, 2007), esta integración requiere el conocimiento de la organización genómica y de la función de los genes, fundamentos sólidos en estrategias estadísticas par estimar los efectos genéticos, bases fuetes sobre biología de plantas, experiencia con los métodos de laboratorio sobre biología molecular y genómica funcional, así como en práctica en campo sobre

491 mejoramiento, y la habilidad de manejar grandes conjuntos de datos de diversos tipos. Aunque se reconoce, con conciencia y apreciación la importancia de cada una de estas disciplinas por todos los científicos de plantas la formación de estudiantes, y los esfuerzos de entrenamiento, los fondos de financiamiento y los programas de investigación, todavía enfatizan en subgrupos específicos del paradigma de mejoramiento molecular de plantas. Lo anterior se justifica dada l a amplitud de las disciplinas involucradas, sin embargo, se necesita hacer mayores esfuerzos para implementar programas educativos y de investigación que promuevan la participación activa en el mejoramiento molecular de plantas para la mejora de cultivos. Este tipo de programas debería ser desarrollado fomentando las colaboraciones entre grupos con experiencia complementaria. Absolutamente, las agencias de financiamiento deben expandir su portafolio de proyectos que da apoyo para la transferencia tecnológica mediante requerimiento de propuestas que integren esfuerzos en investigación básica y también en productos tangibles de mejoramiento de plantas. Algunos ejemplos dignos de imitarse incluyen el programa Harvest-Plus (http://www.harvestplus.org/), el MASwheat (Dubcovsky, 2004), y el U.S. Department of Agriculture Coordinated Agricultural Projects. El sector privado también debe seguir con inversiones que estimulen la integración y brinde el ambiente de entrenamiento apropiado para los futuros científicos que se integren a la fuerza de trabajo del mejoramiento molecular. Además de apoyo directo para entrenamiento de graduados y el patrocinio de investigación, las compañías seguido pueden proporcionar apoyo "en especie" que ayude a reducir la brecha en tecnología en expansión entre el sector de investigación en mejoramiento molecular de plantas público y privado. Con los esfuerzos colectivos de la amplia comunidad de científicos comprometidos con la biología de plantas y la mejora de cultivos, el mejoramiento molecular de plantas podrá expandir su impacto y contribuciones que dan respuesta a las necesidades de incremento sustentable de la producción agrícola.

Tarea 17-1 Haga un resumen en español de los siguientes párrafos: Plant breeding has a long history of integrating the latest innovations in biology and genetics to enhance crop improvement. Prehistoric selection for visible phenotypes that facilitated harvest and increased productivity led to the domestication of the first crop varieties (Harlan, 1992) and can be considered the earliest examples of biotechnology. Darwin outlined the scientific principles of hybridization and selection, and Mendel defined the fundamental association between genotype and phenotype, discoveries that enabled a scientific approach to plant breeding at the beginning of the 20th century (e.g. Shull, 1909). Despite the immediate recognition among some plant breeders of the importance of Mendelian genetics, full integration was delayed for nearly 20 years until quantitative genetics reconciled Mendelian principles with the continuous variation observed for most traits considered important by most plant breeders (Paul and Kimmelman, 1988). Subsequent advances in our understanding of plant biology, the analysis and induction of genetic variation, cytogenetics, quantitative genetics, molecular biology, biotechnology, and, most recently, genomics have been successively applied to further increase the scientific base and its application to the plant breeding process (e.g. Baenziger et al., 2006; Jauhar, 2006; Varshney et al., 2006). The plant biotechnology era began in the early 1980s with the landmark reports of producing transgenic plants using Agrobacterium (Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983). Molecular marker systems for crop plants were developed soon thereafter to create high-resolution genetic maps and exploit genetic linkage between markers and important crop traits (Edwards et al., 1987; Paterson et al., 1988).

By 1996, the commercialization of transgenic crops demonstrated the successful integration of biotechnology into plant breeding and crop improvement programs (Koziel et al., 1993; Delannay et al., 1995). As depicted in Figure 1, introgression of one or a few genes into a current elite cultivar via backcrossing is a common plant breeding practice. Methods for markerassisted backcrossing were developed rapidly for the introgression of transgenic traits and reduction of linkage drag, where molecular markers were used in genome scans to select those individuals that contained both the transgene and the greatest proportion of favorable alleles from the recurrent parent genome (e.g. Ragot et al., 1995; Johnson and Mumm, 1996). During the past 25 years, the continued development and application of plant biotechnology, molecular markers, and genomics has established new tools for the creation, analysis, and manipulation of genetic variation and the development of improved cultivars (for review, see Sharma et al., 2002;Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). Molecular breeding is

492

currently standard practice in many crops, with the following sections briefly reviewing how molecular information and genetic engineering positively impacts the plant breeding paradigm.

17.2.2. Modernización de viejas herramientas Metodologías de mejoramiento: Metodologías Metodologías Metodologías Metodologías empíricas clásicas modernas innovadoras Selección y Hibridización, Marcadores Estrategias de serendipia. recombinación, moleculares, fenotipo, selección por fisiología, dobles pedigrí. bioquímica. haploides, MARS, transformación, etc.

Unidad de selección: Metodologías Metodologías clásicas innovadoras

17.2.2.1. Parámetros primarios y secundarios En maíz, el parámetro agronómico más importante es el rendimiento de grano por hectárea. Este por su parte puede ser expresado en dos componentes: el número total de granos (KN de kernel number) multiplicado por el peso promedio de ellos (KW de kernel weight). Para seleccionar líneas de maíz, por lo regular se les compara en términos de los rendimientos de sus combinaciones hibridas. Es decir, no importa tanto el rendimiento de la línea per se, sino mas bien el rendimiento de los híbridos que puede formar esa línea con algún probador del grupo heterotico opuesto. Adicionalmente a los parámetros primarios de rendimiento, existen otros parámetros que también son característicos de cada genotipo. Estos pueden ser por ejemplo, el número de mazorcas por planta (EPP de Ear number per plant), los días de floración femenina (SD de Silking days), días de floración masculina (AD de anthesis days), intervalo de floración femenina-masculina (ASI de anthesis-silking interval), la senescencia (SEN), el enrollamiento de las hojas bajo sequía (ROL), el contenido de clorofila en determinada etapa de desarrollo (SPAD), etc. A estos y otros parámetros que no son primariamente de rendimiento de grano se les llama carácteres secundarios (secondary traits). Por lo regular son más fáciles o más rápidos de medir que el rendimiento final de grano. Algunos de los parámetros secundarios mas importantes, son el número promedio de mazorcas por planta (EPP) y el intervalo de floración (ASI), sobre todo bajo condiciones de sequía.

493

17.2.2.2. Índices de Selección Muchas veces, al agricultor no solo le interesa un solo carácter sino varios. Los índices de selección se usan precisamente cuando uno quiere evaluar varios parámetros al mismo tiempo.

Ejemplo de un análisis multicaracter en animales: Aunque las hijas del toro 1 produzcan más leche que las hijas del toro 2 estas pueden tener mejor calidad de las proteínas para la producción de queso. Por ello se utilizan herramientas matemáticas para combinar todos los parámetros de selección en una sola ecuación. El resultado se expresa como un indice de selección. De esta forma se puede seleccionar no solo para un único caracter (producción de leche) si no también para una combinación de varios caracteres a la vez (producción y calidad). Por ejemplo, nos puede interesar la producción de queso en términos de kilos de queso de buena calidad por vaca, más que la producción de litros de leche por vaca. Los factores que se le asignan a cada variable que se usa para calcular el índice de selección permiten darle un peso diferente a cada uno de los parámetros de interés.

Ejemplo de un análisis multicaracter en plantas:

El índice de selección también permite incluir parámetros secundarios para así mejorar la selección de un carácter primario. La inclusión de caracteres secundarios ayuda a reducir el error de las mediciones y de los experimentos. De esta forma se puede discriminar mejor los genotipos que son genéticamente superiores a pesar de una variabilidad ambiental muy grande.

Veamos un ejemplo que se refiere a un experimento de campo bajo condiciones de sequía:

Rendimiento de Floración Intervalo Mazorcas por Indice de Genotipo grano Masculina Floración planta Selección REP PLOT ENTRY GYF (ton/ha) AD (days) ASI (days) EPP Selection Index 1 1 1 3.00 60 6 1.05 -0.22 2 4 1 1.60 63 13 0.66 -4.46 3 7 1 3.46 60 12 1 -1.22 1 2 2 2.99 63 13 0.88 -2.32 2 5 2 3.23 63 10 1.04 -0.87 3 8 2 4.87 62 8 1.1 1.34 1 3 3 2.71 63 3 1.46 1.62 2 6 3 4.95 63 1 1.52 4.41 3 9 3 3.19 64 2 1.3 1.71

Tomando los datos de la tabla arriba debemos encontrar el mejor genotipo (ENTRY). En primer lugar nos interesa el rendimiento de grano en campo (GYF). Para ello calculamos los promedios de las 3 repeticiones por entrada y obtenemos la siguiente tabla resumen:

PROMEDIOS ENTRY GYF (ton/ha) AD (days) ASI (days) EPP Selection Index 12.69 61.0 10.3 0.9 -2.0 23.70 62.7 10.3 1.0 -0.6 33.62 63.3 2.0 1.4 2.6

Parece que la entrada 2 con 3.7 toneladas es la que mas rinde, sin embargo, ¿es una diferencia significativa? Para contestar esa pregunta debemos calcular los errores estándares y hacer las pruebas T.

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Errores Estándar ENTRY GYF (ton/ha) AD (days) ASI (days) EPP Selection Index 10.56 1.00 2.19 0.12 1.28 20.59 0.33 1.45 0.07 1.06 30.68 0.33 0.58 0.07 0.92

Pruebas T Selection Index (valor de P) ENTRY GYF (p value) AD (p value) ASI (p value) EPP (p value) (p value) 1 vs 2 0.14 0.12 0.50 0.26 0.23 1 vs 3 0.18 0.07 0.03 0.02 0.03 2 vs 3 0.47 0.12 0.01 0.01 0.04

Podemos ver que los errores estándares del rendimiento son de 0.56 a 0.68, que son mas grandes que las diferencias de rendimiento entre genotipos. La prueba T de la comparación entre la entrada 2 y la 3 nos da un valor de p no significativo (p=0.47). De hecho, si consideramos solo el rendimiento, ningún genotipo es significativamente mejor o peor que el otro ya que los valores p son mayores a 0.05. ¿Que se hace en esos casos? Una opción es volver a sembrar esos mismos genotipos ya sea con muchas más repeticiones o en más localidades. Solo así se obtendrán suficientes datos de rendimiento para tener mayor certeza de escoger el genotipo superior. Sin embargo, repetir ensayos o hacerlos más grandes es bastante laborioso y caro. Afortunadamente los mejoradores han desarrollado algunos procedimientos para ahorrarse estos costos. El uso de parámetros fisiológicos secundarios y el cálculo de índices de selección es un ejemplo. De muchos experimentos anteriores bajo condiciones de sequía se ha visto que el rendimiento de grano (GYF) esta correlacionado con el intervalo de floración (ASI) y también con el número de mazorcas por planta (EPP). La correlación es positiva para EPP y negativa para ASI. Si el rendimiento es el parámetro primario, al EPP y ASI se les llama parámetros secundarios. Si queremos ver cual genotipo es mejor, adicionalmente a buscar la entrada que tenga el GYF mayor, también se puede considerar el genotipo con el EPP mayor o el ASI menor. Si revisamos la tabla de resultados vemos que el genotipo 3 tiene un EPP mayor y un ASI menor a los demás. Los tres genotipos son muy parecidos en términos de rendimiento. Sin embargo, si adicionalmente consideramos el EPP y el ASI podemos ver que la entrada 3 es mucho mejor que todas las demás. Esto lo concluimos de los datos que ya tenemos del ensayo sin necesidad de repetir el experimento. Es decir, el uso correcto de las matemáticas y la estadística a veces nos ayuda a ahorrarnos trabajo experimental.

Para combinar los diferentes parámetros en un solo indice, primero hay que estandarizar los valores numéricos de cada parámetro. No podemos sumar toneladas con días de floración o número de mazorcas. Las unidades de cada medición son muy diferentes. Si no normalizamos los datos no podremos calcular un indice de selección.

Una forma de estandarizar los datos es restarle el valor promedio a cada dato, y el resultado dividirlo entre la desviación estándar. De esta forma obtenemos un valor sin unidades, que se refiere a que tantas desviaciones estándares arriba (valor positivo) o abajo (valor negativo) del promedio se encuentra cada genotipo con relación al parámetro secundario. El selection index se calcula entonces sumando o restando los diferentes valores estandarizados dependiendo si están positivamente o negativamente correlacionados con el rendimiento. El índice de selección de las tablas anteriores fue calculado tomando en cuenta los datos estandarizados de GFY, EPP y ASI de la siguiente manera:

Selection Index = GYFest - ASIest + EPPest

495

-GYF Promedio(GYF) -ASI Promedio(ASI) GYF = ASI = est DesviaciónEstandard(GYF) est DesviaciónEstandard(ASI)

-EPP Promedio(EPP) EPP = est DesviaciónEstandard(EPP)

Rendimiento GYF Selection Index

5.0 4 4.5 3 4.0 2 3.5 3.0 1

2.5 x 0 ton/ha inde 2.0 123 1.5 -1 1.0 -2 0.5 -3 0.0 123 -4 Entrada Entrada

Figura 17-7. Grafica de rendimiento de grano (grain yield field GYF). Las diferencias de GYF no son significativas. A la derecha se muestra la grafica con los valores del indice de selección. Las diferencias si son significativas.

17.2.2.3. Parámetros fisiológicos

17.2.2.4. Parámetros bioquímicos

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17.2.2.4.1. Carotenos y lípidos

17.2.2.4.2. Triptófano y proteínas

17.2.2.4.3. Antocianinas y antioxidantes

17.2.2.4.4. Almidón y azucares en grano y tallo 17.2.3. Aprovechamiento de la información molecular disponible

17.2.3.1. Información sobre rutas metabólicas Ejemplo ruta de carotenos. Input NPR

17.2.3.2. Información sobre QTLs

17.2.3.3. Información sobre genes

17.2.3.4. Información sobre factores de transcripción Input FGM 17.2.4. Selección asistida por marcadores Tradicionalmente, la única forma de saber si la descendencia de una cruza en particular había heredado caracteres útiles (p. ej. tolerancia a la sequía, resistencia a enfermedades o calidad de

497 grano) era sembrando los materiales en parcelas y evaluando las plantas adultas. La selección asistida por mejoradores acelera el proceso de mejoramiento, ya que hace posible rastrear la presencia de genes útiles en cada generación. Esto no excluye la necesidad de hacer evaluaciones en el campo, pero hace muchísimo más eficiente el proceso. “Para la selección en el campo necesitamos tiempo, espacio y recursos, y nuestra capacidad es limitada", explica Gary Atlin, mejorador de maíz del CIMMYT, “pero si aplicamos MAS podremos emplear los recursos de manera más eficaz, concentrándonos en las mejores líneas y filtrando aquellas que no hayan heredado los caracteres que nos interesan.”

Cuando los investigadores quieren saber si una línea de trigo o de maíz en particular tiene la versión útil de un gene (por ejemplo, resistencia en lugar de susceptibilidad a las enfermedades), emplean secciones adyacentes e identificables de DNA conocidas como marcadores, a las cuales se aplica tintura fluorescente para distinguirlas. Las distintas versiones de marcadores y genes se llaman alelos. El DNA que se encuentra junto al cromosoma suele mantenerse unido durante generaciones, de manera que cierto alelo de un marcador, por lo general, es heredado junto con el alelo útil de un gene adyacente. Con el uso de nuevas máquinas de electroforesis capilar, la muestra es forzada a través de un tubo capilar estrecho bajo la influencia de una corriente eléctrica. Un láser al final del tubo detecta los diferentes alelos de los marcadores fluorescentes y esto indica al científico si la muestra contiene los alelos que está buscando. Además de ser rápida y menos costosa en lo que respecta a mano de obra, la electroforesis capilar permite hacer pruebas con más de un marcador y colocar más de una muestra al mismo tiempo en cada tubo. Al utilizar colores de tintura fluorescente ligeramente distintos para cada muestra, es posible distinguir los marcadores en cada una de ellas, igual que los grupos de corredores que utilizan camisetas de distintos colores. Para lograr una máxima eficiencia, los científicos pueden también formar grupos de muestras que pueden examinar con pequeños intervalos de tiempo, igual que cuando los corredores se preparan para el momento de salir. El CIMMYT podrá incluso generar un marcadores tipo SNP (single nucleotide polymorphism), que son automatizables y permiten hacer ensayos con numerosos caracteres simultáneamente y aporta muchos más datos por muestra.

Todo esto quiere decir que las nuevas máquinas tienen mayor capacidad de producción y que se pueden analizar más muestras con la misma cantidad de mano de obra, reduciendo de manera impresionante el costo individual de las muestras. Actualmente la mayor limitante del uso de los marcadores es el costo. Si la selección asistida por marcadores fuera significativamente más económica, sin duda la emplearía en el mejoramiento de maíz dentro de instituciones de mejoramiento públicas. En efecto, se puede hacer la transferencia de genes en variedades mejoradas en poco tiempo. Si uno hace una retrocruza entre un donador que contiene una característica genética y un progenitor mejorado con buen comportamiento agronómico, está tratando de seleccionar una característica del donador, aunque distinta de todos sus otros genes. Con varios marcadores, la selección asistida por marcadores indica exactamente cuál progenie posee la combinación de los genes deseados de un donador y los genes buenos del otro progenitor. Se pueden obtener resultados en dos generaciones, en comparación con las cuatro o cinco que normalmente había que evaluar.

El problema de la selección asistida por marcadores es encontrar genes con efectos substanciales, en especial de caracteres complejos, como la tolerancia a la sequía en el maíz. Se que aún habrá que encontrar esos genes. “En el pasado, era difícil aplicar en el mejoramiento donadores con genes o caracteres únicos útiles pero que por lo demás poseen cualidades agronómicas pobres, en virtud de que esto implicaba introducir mucho material que no era de utilidad. Por medio de la selección asistida por marcadores nos podemos deshacer del material que no es útil, y esto nos abre la posibilidad de encontrar el gen útil en una amplia variedad de progenitores. La tecnología de los genotipos está volviéndose menos costosa y más eficiente

498 para identificar genes todo el tiempo." Fuente: http://www.cimmyt.org/spanish/wps/news/2007/aug/genetic.htm

El mejoramiento genético actual se base en el efecto infinitesimal, basándonos en fenotipos y genealogía. Se aplica una metodología estadística y se predicen cuáles son los mejores alelos (mide la parte aditiva del fenotipo de un individuo). La idea es poder usar marcadores moleculares o los propios genes para tener la inferencia genotípica, lo que no nos ahorra hacer lo que hemos mencionado. Si desconocemos el gen, entonces podemos estudiar un microsatélite que esté asociado al gen. En estos caso se habla de Marker Assisted Selection (MAS). Si en cambio sí usamos el gen porque lo conocemos entonces se llama Gene Assisted Selection (GAS).

Puedo tener marcadores directos (en el mismo gen mayor) o indirectos (ligado al gen mayor). Lo ideal seria tener un marcador directo, pero también presenta problemas.

MAS es útil para caracteres: • Unigenicos o oligogénicos. • limitados a un solo ambiente no disponible en la estación experimental. • difíciles o caros de medir, como la resistencia a enfermedades. • mesurables solo cuando la planta madura, como el rendimiento.

El MAS en especialmente útil en animales para caracteres: • de baja heredabilidad, como los reproductivos. • limitados a un sexo, como la producción de leche. • difíciles o caros de medir, como la suceptibilidad a enfermedades. • mesurables después del sacrificio del animal, como por Ej., la calidad de la carne…

17.2.5. Nuevos esquemas de mejoramiento Cambio de enfoque para la unidad de selección Individuo Æ Haplotipo Ejemplo de nuestro proyecto de GCP

Unidad de selección: Metodologías Metodologías clásicas innovadoras

499

500

Figura 17-8. Common breeding and selection schemes. Each vertical bar is a graphical representation of the genome for an individual within a breeding population, with colored segments indicating genes and/or QTLs that influence traits under selection. Genes associatedwith different traits are shown in different colors (e.g. red, blue). ‘‘X’’ indicates a cross between parents, and arrows depict successive crosses of the same type. Asterisk below an individual signifies a desirable genotype. A, Backcrossing. A donor line (blue bar) featuring a specific gene of interest (red) is crossed to an elite line targeted for improvement (white bar), with progeny repeatedly backcrossed to the elite line. Each backcross cycle involves selection for the gene of interest and recovery of increased proportion of elite line genome. B, Gene pyramiding. Genes/QTLs associated with different

501 beneficial traits (blue, red, orange, green) are combined into the same genotype via crossing and selection. C, Pedigree breeding. Two individuals with desirable and complementary phenotypes are crossed; F1 progeny are self-pollinated to fix new, improved genotype combinations. D, Recurrent selection. A population of individuals (10 in this example) segregate for two traits (red, blue), each of which is influenced by two major favorable QTLs. Intermating among individuals and selection for desirable phenotypes/genotypes increases the frequencies of favorable alleles at each locus. For this example, no individual in the initial population had all of the favorable alleles, but after recurrent selection half of the population possesses the desired genotype. For hybridized crops, recurrent selection can be performed in parallel within two complementary populations to derive lines that are then crossed to form hybrids; this method is called reciprocal recurrent selection.

Figura 17-9. The genetic gain equation and its component variables. The top portion illustrates an idealized distribution showing the frequency of individuals within a breeding population (y axis) that exhibit various classes of phenotypic values (x axis). Mean phenotypic value (m0) of the original population (shown as entire area under the normal curve) and mean (mS) for the group of selected individuals (shaded in blue) are indicated. In this generalized example, trait improvement is achieved by selecting for a lower phenotypic value, e.g. grain moisture at harvest in maize. Components of variation (s2) that contribute to the SD of the phenotypic distribution (sP) are indicated below the histogram.

17.3. Retos para el futuro Ejemplos de nuestro proyecto de GCP Uso de NIR como marcador bioquímicos Uso de pirosecuenciador para genotipaje (marcadores mas baratos) Crió conservación de polen (facilidad para hacer cruzas de prueba para mejoramiento) Agente que incremente la tasa de recombinación genética (tamaño de haplotipos mas pequeños) Agente que afecte la metilación del DNA y de esta forma se reduzca la Heterosis. Tener plantas con vigor hibrido sin que sean cruzas. Compañías semilleras interesadas en mejor producción de semilla hibrida.

502

Mutación inducida en ciertos genes (oligos) sin que sea transgénico Dobles haploides (ya se esta haciendo con maíz para generar líneas homocigóticas mucho mas rápido)

503

18. Mejoramiento Genético de Maíz 18.1. Introducción Dar una pequeña introducción sobre este capitulo. Considerar los antecedentes de los demás capítulos. Si en los otros se hablo más general sobre mejoramiento, en este se hablara muy específicamente sobre el maíz.

La evolución del maíz La radiación de las angiospermas. El maíz y las gramíneas (Poaceae) Teocinte. La aparición del Maíz. Evolución y selección empírica. La agricultura. Desde sus inicios hasta antes de la revolución verde. El mejoramiento moderno del maíz: La aplicación de conceptos de la ciencia: La revolución verde. Mejoramiento del rendimiento por selección. Variedades de polinización libre, líneas, híbridos. Mejoramiento de la calidad nutricional y tolerancia a sequía. Maíz QPM, Vitamaíz, etc.

El maíz transgénico Conclusiones: el futuro próximo

18.1.1. Características distintivas del Maíz Describir que es lo que hace especial al maíz. Que lo distingue de todos los demás cultivos. Características genéticas (genoma, transposones, etc.), morfológicas (crecimiento determinado, flores separadas), fisiológicas (fotosíntesis C4), bioquímicas (almidón en endospermo), etc.

18.1.1.1. Morfológicas Algunas plantas poseen flores separadas en las que se presentan únicamente partes masculinas o partes femeninas. Cuando las flores femeninas y masculinas se presentan en individuos diferentes, a este tipo de plantas se les llama dioicas. A menudo las flores masculinas o femeninas se encuentran en la misma planta, como es el caso del maíz, el trigo y el fríjol. A estas plantas se les llama monoicas. Estas pueden presentar órganos femeninos y femeninos en una sola inflorescencia, o bien flores separadas estaminadas o pistiladas. En el fríjol y el trigo, las flores son bisexuales, mientras que en el maíz, la inflorescencia femenina (jilote) y masculina (espiga) están físicamente separadas.

Planta con flores separadas, etc. Explicar morfología y términos… jilote, totomoxtle, etc… mostrar fotos El jilote en México es de tanta importancia que tuvo incluso su propia diosa, Xilonen, asumida bajo la forma de Chicomecóatl, la diosa del maíz en general, a veces también xilote– (náhuatl: xilotl, ‘cabello’) es el nombre americano dado al maíz tierno en referencia a las barbas del maíz joven, es decir, a la mazorca de maíz cuando sus granos todavía no han cuajado.

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Figura 18-1. Jilote En algunas regiones de México es habitual el referirse a las hojas secas de la mazorca del maíz con el nombre de totomoxtle. La mazorca después de ser cosechada es transportada a los lugares de almacenamiento donde es depositada a granel, estos pueden ser zarzos o cualquier tipo de lugar que reúna las condiciones optimas de ventilación, que este seco, protegido de roedores, aves etc. (Figura 18-2) El grano es utilizado en alto porcentaje para el autoconsumo y alimentación de aves, ganado de traspatio y un bajo porcentaje es destinado al mercado a través de acaparadores e intermediarios regionales y consumidores directos.

Figura 18-2. Aprovechamiento del totomoxtle. http://148.235.138.11/cadenas/guias/guiasPDF/aprovechamiento

La polinización es la transferencia del polen desde una antera hacia el estigma. La autofecundación se da cuando el polen se transfiere desde la antera de una flor hasta un estigma de la misma planta. La autopolinización se puede dar de manera natural como en el trigo y en arabidopsis, cuando el polen cae sobre el estigma o las anteras se frotan con la superficie del estigma. También se puede dar de manera controlada como en el maíz. Para ello se debe cubrir el jilote y la espiga, para usar el polen para la fecundación de la misma planta. Cuando la transferencia del polen desde una antera de una planta hasta el estigma de otra planta se llama polinización cruzada. Este tipo de polinización es fomentada principalmente por la acción de insectos como abejas y escarabajos. En algunos casos, la polinización cruzada se da por la acción del viento, como es el caso en el maíz, los pastos, y algunos árboles como los pinos.

Una vez que se realizo la polinización, un diminuto tubo crece hacia el interior del ovario. Un gameto procedente del grano de polen desciende por el tubo polínico, para liberarse en el ovario

505 a través del micrópilo. El gameto del polen se fusiona con la célula del ovario. A esta unión se le denomina fertilización. En las plantas, se da el fenómeno de la doble fecundación. Esto se refiere a que el segundo núcleo espermático que fue llevado por el tubo del polen hacia el óvulo se une a los dos núcleos polares para formar una estructura triploide, que da lugar al tejido del endospermo. Una vez realizada la doble fertilización, empieza a desarrollarse la semilla. El cigoto, diploide formara el embrión, en cambio en núcleo triploide formara el endospermo, mientras que la pared del ovario, que es un tejido materno diploide, dará lugar a la cáscara de la semilla.

Las semillas son seres vivos que se encuentran en estado latente o inactivo, las cuales presentan tres estructuras: una envoltura seminal, un aporte de nutrientes de reserva que es el cotiledón o endospermo y un embrión. La envoltura seminal protege a la semilla. Los cotiledones es la porción nutritiva, necesaria para el embrión hasta que la planta joven pueda elaborar su propio alimento. El embrión a su vez consta de tres partes: un brote joven (plúmula), un tallo (hipócotilo) y una raíz (radícula).

18.1.1.2. Genéticas Genoma diploide (pseudotetraploide) Transposones >60% del genoma son secuencias repetitivas Genes saltarines (Bárbara Maclintock)

18.1.1.3. Bioquímicas Fotosíntesis C4 Síntesis de almidón de endospermo (AGPasa citoplásmica) 18.2. Origen y razas del Maíz

Poner aquí un breve resumen sobre las distintas razas de maíz. El maíz fue el primer cultivo que se implantó en Norteamérica hacia el año 200 D.C. Cuando llegaron los primeros colonos europeos, éstos aprendieron de los indios a cultivar el maíz, de tal manera que de su cultivo llegó a depender su sobrevivencia y tradiciones. Antes de que Colón descubriera el Nuevo Mundo, los cultivos europeos más importantes como el trigo apenas ofrecían resultados suficientes para abastecer a una población hambrienta. El éxito del cultivo del maíz ahí se debió a la oferta de una alternativa de alta producción con relación a otros granos y a que requería relativamente poco trabajo. La papa, se ha convertido en la base de la dieta de las comarcas pobres desde Irlanda hasta Alemania. Por otra parte, el tomate, que se tachaba de venenoso y de no ofrecer ventaja, después de varios siglos se ha convertido en un producto esencial. El propio maíz, al principio, se destinaba únicamente para alimentar al ganado, ya que los europeos lo encontraban muy duro. Teosinte Criollos Maíz Palomero Cónico Toluqueño Maíz Norteamericano (Flint y Dent) VARIEDADES BOTÁNICAS DEL MAÍZ. Zea mays TOMADO (Parker, 2000).

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TIPO VARIEDAD CARACTERÍSTICAS. Maíz dentado Indentata. Principal maíz para la alimentación. Granos amarillos o blancos. Maíz vítreo Indurata Producido para la obtención de almidón. Maíz harinoso Amylacea Se produce para elaborar harina de maíz. Maíz dulce Saccharata Granos azucarados cuando son inmaduros.

Maíz reventón o palomero Praecox Su endospermo fibroso revienta cuando se pone en contacto con el calor. Maíz envainado. Tunicata Es un antecesor del maíz. Los granos individuales se encuentran encerrados en cáscaras o vainas. No es comercial.

18.3. Heterosis 18.3.1. Magnitud del vigor híbrido en maíz La heterosis es uno de los fenómenos más importantes para la agricultura. Es un fenómeno que todavía no se entiende del todo. Existen varias teorías que tratan de explicar la heterosis, pero hasta ahora, ninguna puede explicar satisfactoriamente todas las observaciones. Los efectos de endogamia como los tipos de vigor híbrido no son un simple efecto aditivo de la ausencia de genes, sino que es un efecto sinérgico de la presencia de ciertos alelos. Científicamente sigue siendo un enigma, como es que la cruza entre dos líneas puede dar lugar a un híbrido F1 con tan alto rendimiento. En el caso del maíz, el efecto absoluto y porcentual de heterosis es espectacular. Un híbrido F1 por lo regular rinde más de 300% de cualquiera de las líneas parentales. Típicamente, las líneas rinden de 1 a 3 ton/ha de grano mientras que los híbridos F1 rinden de 8 a 13 ton/ha. Actualmente no se conoce ningún efecto genético que sea de mayor relevancia para incrementar el rendimiento de grano como la heterosis. La magnitud del vigor hibrido se puede apreciar mejor al comparar las mazorcas de los híbridos con sus respectivas líneas parentales (ver siguiente figura)

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Figura 18-3. Ejemplo de mazorcas de dos líneas homocigóticas y el híbrido F1 (CML460xCML461) que se forma de la cruza de esas líneas parentales. El tamaño de la mazorca del híbrido y su respectivo rendimiento es más del triple que la suma de las dos líneas por sí solas. 18.3.2. Teorías y Explicaciones

18.3.2.1. Teoría de dominancia Describir teoría de heterosis basado en un efecto genético de dominancia. Faltan genes en algunos genotipos. En teoría seria posible construir un genotipo con todos los alelos favorables.

18.3.2.2. Teoría de sobredominancia Describir teoría de heterosis basado en un efecto genético de sobredominancia. El heterocigoto es más que la suma de los homocigotos. En teoría no es posible construir un genotipo con todos los alelos favorables. Siempre se tienen que hacer cruzas.

18.3.2.3. Teoría mixta de diferentes tipos de heterosis Input de Axel sobre los dos tipos de heterosis. Efecto genético, y efecto epigenético. 18.3.3. Grupos heteróticos Flint y Dent en germoplasma templado. Diversos grupos heteroticos en germoplasma tropical.

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18.3.4. Aprovechamiento de heterosis en maíz Describir las particularidades del mejoramiento para la heterosis. Explicar grupos heteróticos y estrategias de selección reciproca recurrente. Explicar cruzas de prueba para determinar patrones heteróticos. 18.4. Manejo de Cultivo y Fitotecnia INPUT DE UN AGRONOMO Describir aquí el manejo agronómico de maíz Preparación de terreno Siembra Riego Fertilización Cultivos Agricultura de conservación Control de malezas Control de insectos Control de hongos Control de otros tipos: bacterias, virosis, etc. Consideraciones para la cosecha Tipos de aprovechamientos: Aprovechamiento para grano Aprovechamiento como forraje Aprovechamiento para totomoxtle (hojas para tamales) Aprovechamiento para biomasa y biorefinación

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19. Anexos 19.1. Fundamentos varios 19.2. Cronología de algunas teorías genéticas 1903 Redescubrimiento de las leyes de Méndel. Se comienza a aplicar la mejora genética animal. 1918 Método infinitesimal de Fisher: (matemático) comenzó a pensar en términos de varianza y población. 1 población: = +VEVGVF Por lo que comenzó a descomponer cada una de estas varianzas en diferentes componentes (modelo infinitesimal). Como los caracteres son descritos por 1 sólo gen se puede asumir que los de distribución continua están regulados por numero ∞ genes (y cada uno tiene una influencia pequeña Æ componente aditivo que se va sumando). Los modelos matemáticos permiten aproximar la distribución de estos caracteres con una dist.normal. Así nace la genética biométrica. 1920- Waight y Haldane aplicaron Fisher tanto en la selección artificial como natural. Se 1930 crearon modelos teóricos para explicar la evolución en base de selección, mutación, migración y deriva genética. Son la base de la genética cuantitativa o de poblaciones. 1937 Luz aplicó estos modelos en la mejora genética a animales y vegetales, también Hazle hizo mejora. Lush lo aplicó a la mejora de la producción de leche en poblaciones reales. 1940 Teoría de los índices de selección Lush y Hazel: Modelos matemáticos que tienen en cuenta muchos caracteres para llevar a cabo la selección. Además se da diferente importancia para cada carácter. 1950- Método BLUP de Henderson: Desarrolló un método matemático (Best Line ζ 1970 Prevission) que lleva a cabo matrices fenotípicas para ordenar o realizar un ranking de los mejores valores genéticos de los individuos. Comparando los valores genéticos de las hijas.

Ejemplo-Toros: Queremos saber cuál de los 10 es mejor para producir leche. Se cruzan con muchas hembras recogiendo los datos de las mejores hijas.

Asumimos (por Fisher) que G y E determinan P (recordemos que Fisher consideró genes infinitos y de igual peso). Tendremos en cuenta pues los valores fenotípicos y los mismos de los parientes. Si como promedio los parientes del individuo 1 son mejores que los del 2, los genes de 1 serán mejores Æ llevaremos a cabo la selección. 1990 Genética molecular: Se produjeron avances que permitieron observar los genes … (Aparece la genética molecular) que podía darnos información directa de los individuos no infundada matemáticamente. Pero ésta no trata de sustituir la cuantitativa por la molecular sino de tener herramientas complementarias. Se introducen términos como QTL y técnicas como el MAS (selección asistida por marcadores): QTL (Loci de un Caracter Cuantitativo): Región del genoma donde hay genes que intervienen para 1 carácter cuantitativo. Datos necesarios para detectar estos QTL’s: Datos genéticos y datos fenotípicos. En el ámbito de la genética veterinaria (perro y pollo) fueron las primeras especies domésticas con mapas genéticos. Hasta que no se obtuvieron estos mapas no se podía determinar los QTL’s. A partir de los caracteres cuantitativos existen otros genes en los animales domésticos que siguen una genética mendeliana. Después de implantar la tecnología del DNA se comienzan a realizar experimentos más directos para detectar patógenos, identificaciones de animales, pruebas de paternidad, genotipeado de genes de interés productivo: caracteres

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cuantitativos implicados en enfermedades…

19.3. Catálogo de preguntas interesantes 1.1. Catálogo de Preguntas Interesantes

¿Cómo se remueven los intrones del ADN? Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN, el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir, es un proceso de remoción de intrones), que ocurre dentro del núcleo de una célula. Existen diferentes métodos de empalme del ARN. La mayoría requiere de la ayuda de proteínas que reconocen secuencias específicas en el pre-ARN. (PONER DIBUJO y EXPLICAR EN MAS DETALLE)

¿Qué hacen los intrones? Esta pregunta sigue siendo tema de estudio. La denominada "teoría exónica de los genes"[6] sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. Esta teoría nos lleva hacia la "hipótesis de barajeo de exones"[3], la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinación de los exones, haciendo más fácil moverlos y crear nuevos genes. Walter Gilbert afirma que: [7]"...los intrones [estadísticamente hablando] representan puntos de gran propensión a la recombinación: por su mera presencia y longitud, incrementan el porcentaje de recombinación, y en consecuencia incrementan el barajeo de exones por factores del orden de 106 a 108". Hay evidencia que parece sugerir que los exones pueden corresponder a subunidades estructurales y funcionales de las proteínas, incluyendo ejemplos específicos del mismo exón, que existe en diferentes genes donde se requiere la misma estructura o funcionamiento de dos proteínas distintas. De acuerdo a esta teoría, la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos, motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes, en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. Ante esta teoría, la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación, entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? TRANSFERENCIA VERTICAL VS. TRANSFERENCIA HORIZONTAL La información genética se transmite de padres a hijos verticalmente. La recombinación como ya mencionamos, es la unión de la información genética de dos individuos coetáneos por medio de la reproducción sexual. Visto así, se trata de un mecanismo transmisión de información que incluye “además del aspecto estrictamente vertical” un aspecto de transferencia horizontal de información genética. La probabilidad de que dos alelos existan en estado homocigoto (digamos AA y BB) en un mismo individuo a partir de otro aabb y sin que haya recombinación mediada por la reproducción sexual será la probabilidad de que "A" mute a "a" al cuadrado multiplicada por la probabilidad de que B mute a "b" al cuadrado. El efecto de la recombinaciones entonces aumentar la probabilidad desaparición de combinaciones genéticas en varios órdenes de magnitud. Éste efecto se hace más manifiesto si consideramos una mayor cantidad de genes determinando el fenotipo sujeto a estudio. Para varios genes el fenómeno se hace con una probabilidad de un millón de veces más (diez mil millones de millones de veces) que si consideramos únicamente dos genes. Cada gene que agregamos, por su efecto en un fenotipo poligénico, incrementa la relevancia de la recombinación en seis órdenes de magnitud al ser comparada con la mutación como fuente de variación genética. Algunos fenotipos resultan afectados por decenas de genes y esto causa que la relevancia de la recombinación en tales casos sea muy clara.

TRANSFERENCIA DE GENES VS. TRANSFERENCIA DE GENOMAS.

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Uno de los aspectos más interesantes a considerar, es la diferencia en cuanto a su mecanismo y las implicaciones que tiene la transferencia de un gene sobre todo el genoma. La especie es comúnmente definida como aquel grupo de individuos que comparten la misma poza génica. En este caso, la transferencia horizontal específica es una vía de la reproducción sexual junto con la recombinación, constituyen fenómenos comunes; pero si consideramos que la transferencia se lleva a cabo entre individuos de especies diferentes, no se debe considera en este caso. Está transferencia cuando existe, llega a desempeñar un impacto central sobre la manera de generar nueva variabilidad.

Supongamos por un momento que los genes de la fotosíntesis rebasaran los límites específicos transfiriéndose a un heterótrofo multicelular: constituiría entonces un organismo que en la actualidad no existe. De hecho la ingeniería genética trata primordialmente este tipo de transferencia; por ejemplo, transferir genes de resistencia a la sequía entre plantas diferentes es la versión biotecnológica de un fenómeno que ha prevalecido en la naturaleza por mucho tiempo. Así como en cada evento de reproducción sexual se ponen en contacto dos genomas distintos, podríamos imaginar la transferencia de un genoma de una especie a otra distinta. La teoría endosimbiótica del origen del cloroplasto y la mitocondria es un típico caso de esta clase de transferencia. Aquí no sólo se rebasan las barreras entre especies sino que la cantidad de material genético que se moviliza es tal, que el variante producido crea una novedad que difícilmente se obtendría de otra manera. Como sabemos existen especies de bacterias y de otros organismos que no tienen reproducción sexual; en la mayoría de ellas, la recombinación no juega un papel importante. El mismo principio no parece aplicarse al estudiar los genes presentes en plásmidos (genomas circulares físicamente independientes del cromosoma), en los cuales se han localizado, por ejemplo, los genes responsables de la resistencia a algunos antibióticos y que pueden ser transferidos en forma horizontal.

Una pregunta que parecería central para abordar este problema en poblaciones naturales es, ¿cómo se puede detectarla transferencia horizontal, y cómo sería posible estimar la tasa de ocurrencia en la naturaleza?

DETECCIÓN DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL

Un experimento que se antoja útil para detectar la transferencia horizontal consistiría en usar a un organismo marcado con ciertos genes e introducirlo a una población con otros marcadores genéticos, registrando así el paso de ellos entre las cepas. Esté experimento podría hacerse con mayor factibilidad en bacterias, dado lo breve de su ciclo de vida, para una revisión así, la tasa de transferencia y la tasa de fijación combinadas es del orden de la tasa de mutación como se ha sugerido para genes cromosomales en bacterias, digamos10 9 esté fenómeno sería difícil de detectar sobre todo si consideramos que el marcador genético puede aparecer en la población con esa misma tasa. Si se quisiera obtener un nivel de sensibilidad mayor, entonces se pueden usar tres marcadores genéticos, detectando el paso de dos de ellos que estén ligados; en cambio si la tasa es mayor y se utiliza una fuerte presión selectiva para hacer que la tasa de fijación sea igual a uno, entonces este enfoque puede ser usado para detectar la transferencia, pero si no se halla de esta manera, hay que argumentar las siguientes razones: a) el gene o los genes que se utilizaron probablemente estén localizados en regiones del genoma que no se transfieren o bien, b) la sensibilidad de la metodología usada tal vez no sea eficaz para revelar valores mínimos de transferencia. Piñero, D. 1988. Revista Ciencias. La transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en inglés) consiste en la transmisión del genoma o parte de éste de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia. Por el contrario, el tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproducción sexual Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugación bacteriana, descubierto a mediados del siglo pasado, en la que una célula transfiere información genética a otra diferente con la mediación de plásmidos. Estos

512 procesos son muy importantes como fuente de variación genética, equivalentes en cierto modo a la recombinación cromosómica de los organismos con reproducción sexual. Sin embargo, la HGT en bacterias iría más allá, dado que también se produce transferencia genética entre especies alejadas filogenéticamente, lo cual permite la formación de genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos.

Sin embargo, en los últimos años se han acumulado evidencias de que este proceso puede ser mucho más generalizado de lo que se pensaba en un principio, no estando reducido a ciertos tipos de bacterias. La transferencia horizontal de genes parece haber tenido una gran importancia en todos los grupos de seres vivos, incluyendo plantas superiores y animales, al menos en las primeras etapas de la evolución. Hoy sabemos que gran parte del genoma humano está constituido por ADN vírico, incorporado al material genético de la célula. El papel de la HGT en la evolución es uno de los puntos más activos de discusión en biología evolutiva. Desde aquellos que la consideran una fuente más de variación genética, hasta algunos investigadores que creen que nos hallamos ante un nuevo paradigma biológico, que no se limitaría a completar la nueva síntesis evolutiva, sino incluso a sustituirla en buena parte.

La transferencia horizontal de genes en plantas y animales Como nos referimos más arriba, la transferencia de genes bacterianos a genomas de eucariotas parece estar facilitada por endosimbiontes, desde las mitocondrias y plastos (Margullis, 1967; 1970; Gupta, 2000), pasando por los bien conocidos procesos de transmisión bacteriana a algunos hongos como Saccharomyces o la bacteria Wolbachia pipientis en la línea germinal de algunos eucariotas. Gupta (2000) también describe importantes parentescos entre genes implicados en la transmisión genética en eucariotas y arqueobacterias, así como los implicados en el metabolismo celular eucaria y las eubacterias. Recientemente se ha comprobado la integración del genoma de Wolbachia en insectos y nemátodos en porciones de tamaño variable, desde 500 pares de bases hasta el genoma completo de la bacteria. También recientemente, ha sido referida la transferencia horizontal de genes bacterianos en rotíferos (Gladyshev, Meselson & Arkhipova, 2008). Algunos de estos genes no son operativos en el organismo receptor, pero otros sí son transcritos, indicando que este fenómeno representa un mecanismo real para la adquisición de nuevos genes.

La incorporación de genoma vírico a las células procariotas y eucariotas se ha revelado también en los últimos años como un fenómeno no solo habitual, sino importantísimo en la incorporación de genes reguladores de la expresión e incluso, codificadores de proteínas muy similares en distintos grupos de animales, y tan variadas como las DNA polimerasas (Villareal & DeFilippis, 2000), proteínas involucradas en el desarrollo de la placenta (MI et al., 2000), en los procesos autoinmunitarios o en la espermatogénesis (Jamain et al., 2001).

Algunos autores afirman que la explicación a la presencia de genes reguladores similares en diferentes grupos de organismos -como los genes HOX, implicados en el control del desarrollo embrionario (Ronemus y Martienssen, 2005)- podrían tener un origen vírico (Sandín, 2000, 2002). Se ha llegado a calcular que entre el 60 y el 80% de los intrones (Recuerde que son, genes no codificadores de proteínas) de animales contemporáneos fueron adquiridos por inserción después de la divergencia evolutiva de animales y plantas (Fedorov et al. 2003).

A pesar de que la controversia sobre el origen de los virus es tan antigua como su descubrimiento, los últimos datos alimentan la hipótesis de que las partículas virales pudieran ser fragmentos de ADN o ARN independizados de las células, aunque otros autores opinan que los

513 virus no solamente no proceden de estructuras celulares, sino que tienen una entidad propia vital en la evolución (Sandín, 1998).

¿Es incompatible la transmisión horizontal de genes con la teoría sintética?

Otros especialistas creen que si la incorporación de genes nuevos mediante la HGT es algo tan generalizado como algunos datos parecen indicar, cuestionaría la teoría sintética en sus propios cimientos, tanto en cuanto al papel de la mutación como fuente de variación, como al de la selección natural como fuerza modeladora (Sandín, 2005). Sin embargo, muchas de estas críticas se basan más en motivos que podríamos llamar filosóficos, presentando un rechazo visceral -y habría que decir poco científico- al concepto de competencia y selección del «más apto» sin detenerse en explicar cuál sería el mecanismo alternativo de selección de toda está inmensa variabilidad producida por los incansables mensajeros.

“Eventualmente, tenemos que comprender que la selección natural opera, no tanto actuando sobre mutaciones al azar, que son a menudo dañinas, sino sobre nuevas clases de individuos que evolucionan por simbiogénesis” por incorporación de genes o incluso genomas completos.enético entre distintos huéspedes, incluso alejados filogenéticamente entre sí. Esto podría suponer un mecanismo de recombinación global, infinitamente más poderoso en la gene ¿Cuál es el origen de los intrones? Existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". Según la primera, los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones, pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teoría, estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. (Revista UNAM) La teoría de los "intrones tempranos" sugiere que el último ancestro común de los procariotas y los eucariotas, tenía intrones en su genoma. Para dar cabida a sus cortos períodos reproductivos y de vida, los procariotas, subsecuentemente, perdieron los intrones de sus genomas debido a la selección natural que buscó incrementar la eficiencia de la expresión de sus genes, así como una reducción en el tamaño de sus genomas. Según esta teoría, el precio que hubieron de pagar los organismos procariotas por esta mayor eficiencia, fue el decremento en el potencial para evolucionar más en el futuro, ya que se perdieron los intrones que podrían ayudar al barajeo de exones. Los organismos eucariotas, por su parte, continuaron evolucionando con la asistencia de sus intrones y dieron lugar a formas de vida mucho más complejas. De ahí que haya mucho menos complejidad y variación en los organismos procariotas que en los eucariotas. La teoría de los "intrones tardíos" sugiere que éstos se desarrollaron en el proceso evolutivo eucariótico. Puesto que los organismos procariotas han sido considerados tradicionalmente más primitivos que los eucariotas, el genoma aún más primitivo del ancestro común de estos dos tipos de organismos, se supone que asemejaría a un genoma procariota en lo referente a su fuerte organización. Según esta teoría, los intrones habrían sido insertados en los genomas

514 eucarióticos, poco después de haberse originado la división entre los dos tipos de organismos (eucariotas y procariotas). Ambas teorías han sido debatidas y tienen puntos a favor y en contra. El paradigma Neo- Darwiniano todavía no ha llegado a un consenso respecto a este asunto, y existe actualmente un acalorado debate en torno a estas dos posturas.

¿Por que al descubrise cambio la visión Evolutiva.

¿Por qué es importante dar a conocer a la sociedad a los transgénicos? Los cientificos no solamente deben trabajar y conocer sobre los transgénicos, sino por tres principales razón deben intervenir en el conocimiento de la sociedad en su conjunto sobre ellos. En primer lugar, por que es una necesidad primordial que la sociedad conozca de su importancia, de los logros y alcances, de la magnitud del desafío, así como de las problemáticas tanto con que se enfrenta, como las que puede conllevar este tipo de investigación científica. En segundo lugar porque debe existir una etica y responsabilidad en cada investigador sobre lo que esta haciendo. En tercer lugar Continuar en la investigación aparte de aportar nuevos conocimientos, en que está sea en pro de la sociedad y el ambiente con la conciencia y responsabilidad de que todo se le puede dar un mal uso. En ese sentido es importante que los científicos también intervengan en la normatividad, y poner candados para el mal uso de la nueva tecnologías, como pretenden las multinacionales.

Tareas. Responda verdadero o falso. 1.- Todos los suelos se originan a partir de la arcilla. 2.- El limo posee las partículas más pequeñas del suelo. 3.- El drenaje del suelo influye sobre el tipo de planta que en él puede crecer y el grado en el que se puede crecer y desarrollar. 4.- La atmósfera contiene un 78% de nitrógeno. 5.- El potasio es un micronutrientes.

1.- Defina con sus palabras suelo. 2. Explique qué es el perfil del suelo y cómo se diferencian. 3.-¿Qué es la erosión? 4.- ¿Cuáles son los tipos de erosión. 5.- ¿Qué se puede hacer para prevenir la erosión?

1.- Cite cuatro sustancias que formen el suelo. 2-. ¿Cuál es el pH neutro del suelo? 3.- ¿Cuáles son los cuatro efectos beneficiosos que la materia orgánica ejerce sobre el suelo? 4.- ¿En qué se basa el nuevo sistema de clasificación de los suelos?

RESPUESTAS A LAS TAREAS: Respuesta a la pregunta 2.2. Una hipótesis sería, que como los prehispanicos se alimentaron preferentemente de plantas, pero también de peces e insectos, a estos preferentemente se les puso atención y se les cultivo y domestico, y a los animales solamente se les cazaba cuando requerían carne, y no se les domestico. Si a esto le sumamos que no había mamíferos grandes para usarlos como medios de transporte y carga (sólo la llama y el guanaco en Sudamérica) Respuesta pregunta 2.3. 1983 Barbara McClintock recibe el Premio Nobel por su descubrimiento de los genes "intercambiables"

Barbara McClintock nació el 16 de junio de 1902 en Hartford (Connecticut, Estados Unidos). En 1919 se matriculó en la Facultad de Agronomía de la Universidad de Cornell, en Nueva York. Ya

515 desde su época de estudiante se dedicó plenamente a la investigación, desarrollando un método para la identificación de los cromosomas del maíz, con cuya ayuda se podía distinguir cada uno de los cromosomas en la dotación cromosómica de cada célula; esta técnica la seguiría desarrollando a lo largo de toda su vida. En la Universidad de Cornell desempeñó el puesto de profesora de botánica y perteneció al grupo de investigación. A partir de 1936 trabajó como profesora ayudante en la Universidad de Missouri, en Columbia, en donde permaneció durante cinco años. En 1942 obtuvo un puesto en el departamento de Genética de la Carnegie Institution en Cold Spring Harbor de Long Island (Nueva York). Murió el 3 de septiembre de 1992. Las investigaciones de Barbara McClintock se centraron en el campo de la genética, y al igual que los estudios de Mendel, el creador de esta especialidad, los trabajos de la investigadora americana no tuvieron una excesiva acogida dentro del mundo dedicado a esa rama de la biología. McClintock recibió el Premio Nobel treinta años después de haber comunicado sus hallazgos y de que la comunidad científica reconociera el valor de sus descubrimientos y la importancia que habían tenido para el posterior desarrollo de la genética Por qué producen los genes proteínas suficientemente similares como para sustituir unas por otras pero bastante distintas como para hacerlo imperfectamente? El grupo de Pilpel ha propuesto que las pequeñas variaciones entre los genes intercambiables, tales como las diferencias entre las condiciones que hacen que se activen, imparten a cada uno una función única. Esas diferencias en la función los hacen suficientemente vitales como para ser preservados por la evolución pero, los habilitan, cuando es necesario, para reemplazar a un gen de un equipo diferente, como un jugador sustituto. Respuesta tarea 2-6 Ver el articulo Elaboración de un Protocolo de Análisis Cuantitativo Heat Shock Protein 70 in Heat Stressed Sugar Beet Proteínas de choque térmico 70 en calor Subrayó la remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) KATERINI KARETSOU KATERINI KARETSOU 1,2,* 1,2, * , OLGA KOUTITA , OLGA KOUTITA 1 1 and GEORGE SKARACIS y GEORGE SKARACIS Biología molecular de plantas reporter 23: 195ª-195j. Junio del 2005. Respuesta tarea 2.7. El organismo que tiene mayor plásticidad de los mensionados ahí es la bacteria. Escherichia Coli, El 30%, Una molécula de ADN consiste en dos hebras que se encuentran arrolladas una alrededor de la otra formando una doble hélice. Las bases de las dos hebras se disponen en manera tal que cuando en una de ellas hay una adenina en la enfrentada hay timina y, cuando hay guanina en la otra hay citosina. Esto satisface la regla de Chargaff en manera tal que: la cantidad de adenina = a la cantidad de timina (A = T) la cantidad de guanina = a la cantidad de citosina (G = C) Respuesta 2.8. No necesariamente A tiene más genes que B, los factores que determinan la cantidad de genes o de DNA son la selección natural que reduce la diversidad génica, también las mutaciones y la deriva génica. Así como la presencia de intrones y “DNA basura” Respuesta 2.9. Realice un dispositivo o una fórmula que relacione el tamaño del mRNA con el tamaño del gene, el número de intrones, el tamaño medio de intrones, y el tamaño de la región reguladora.

En la nterior tabla se puede ver el tamaño del genoma, número de genes y densidad génica en diferentes especies.

El tamaño del genoma en eucariotas se define como el valor C o cantidad de DNA por genoma haploide, tal como el que existe en el núcleo de un espermatozoide. Se denomina C, por constante o característico, para indicar el hecho de que el tamaño es prácticamente constante dentro de una especie así mRNA = Intrones + exones + región reguladora Tarea 2 10 a) 3´ CGAAGGGUUCCA 5´ b) 3´ Thr,leu, gly, ser. 5´

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5´ Thr, Arg, Val, Pro. 3´ 5´Ala, Ser, Gln, Gly 3´

Tarea 2.11. a) el fenotipo dominante es gris b) los genotipos son: Ratón 1: Dominante homocígoto. Ratón 2: Dominante homcígoto Ratón 3: Dominante heterocígoto. Ratón 4: recesivo homocigoto.

Cruza 3 x 4 Aa x aa ¾ negro y ¼ gris

Tarea 2.12. doble fecundación ocurrida en el saco embrinario, la 1º fecundación resulta de la unión de un Anterozoide con la Oósfera para formar los elementos de la plántula o eje embrionario de la semilla( plúmula o gémula, talluelo, radícula), el 2º anterozoide al fecundarse con el nucleo secundario del saco embrionario formará en tejido triploide donde almacenará las sustancias de reserva( cotiledones). Tarea 2.13. Dimorfismo son las diferencias entre los machos y hembras de una misma especie. La relación con el polimorfismo son los múltiples alelos de un gen entre una población, normalmente expresados como diferentes fenotipos (p.e. el color de la piel es un polimorfismo). Esto permite que la selección natural pueda facilitar a una variedad sobre otra ante los cambios en el ambiente.

Tarea 2.14. Población; Es el conjunto de individuos de la especie que habitan en el mismo lugar y tiempo. Comunidad: Conjunto de poblaciones diferentes que habitan el mismo ecosistema o bioma

517 mismo exón, que existe en diferentes genes donde se requiere la misma estructura o funcionamiento de dos proteínas distintas. De acuerdo a esta teoría, la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos, motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes, en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. Ante esta teoría, la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación, entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas?

¿Cuál es el origen de los intrones? Existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". Según la primera, los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones, pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teoría, estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. (revista UNAM) La teoría de los "intrones tempranos" sugiere que el último ancestro común de los procariotas y los eucariotas, tenía intrones en su genoma. Para dar cabida a sus cortos períodos reproductivos y de vida, los procariotas, subsecuentemente, perdieron los intrones de sus genomas debido a la selección natural que buscó incrementar la eficiencia de la expresión de sus genes, así como una reducción en el tamaño de sus genomas. Según esta teoría, el precio que hubieron de pagar los organismos procariotas por esta mayor eficiencia, fue el decremento en el potencial para evolucionar más en el futuro, ya que se perdieron los intrones que podrían ayudar al barajeo de exones. Los organismos eucariotas, por su parte, continuaron evolucionando con la asistencia de sus intrones y dieron lugar a formas de vida mucho más complejas. De ahí que haya mucho menos complejidad y variación en los organismos procariotas que en los eucariotas. La teoría de los "intrones tardíos" sugiere que éstos se desarrollaron en el proceso evolutivo eucariótico. Puesto que los organismos procariotas han sido considerados tradicionalmente más primitivos que los eucariotas, el genoma aún más primitivo del ancestro común de estos dos tipos de organismos, se supone que asemejaría a un genoma procariota en lo referente a su fuerte organización. Según esta teoría, los intrones habrían sido insertados en los genomas eucarióticos, poco después de haberse originado la división entre los dos tipos de organismos (eucariotas y procariotas). Ambas teorías han sido debatidas y tienen puntos a favor y en contra. El paradigma Neo- Darwiniano todavía no ha llegado a un consenso respecto a este asunto, y existe actualmente un acalorado debate en torno a estas dos posturas.

¿Por que al descubrise cambio la visión Evolutiva.

1.- Defina con sus palabras suelo. 2.. Expolique qué es el perfil del suelo y cómo se diferencian. 3.-¿Qué es la erosión? 4.- ¿Cuáles son los tipos de erosión. 5.- ¿Qué se puede hacer para prevenir la erosión?

1.- Cite cuatro sustancias que formen el suelo. 2-. ¿Cuyál es el pH neutro del suelo?

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3.- ¿Cuáles son los cuatro efectos beneficiosos que la materia orgánica ejerce sobre el suelo? 4.-¿En qué se basa el nuevo sistema de clasificación de los suelos? 19.4. Catálogo de respuestas a las tareas

Para consultar las respuestas visite la página del Cinvestav Irapuato. www.ira.cinvestav.mx

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