Cilvēka 14.Hromosomas Proteasomu Gēnu Polimorfismu Saistība Ar Metaboliskām Un Autoimūnām Slimībām

Latvijas Universit āte Medic īnas fakult āte

Cilv ēka 14.hromosomas proteasomu gēnu polimorfismu saist ība ar metabolisk ām un autoim ūnām slim ībām

PROMOCIJAS DARBS

Darba autors: Ilva Trapi Ħa (dzimusi Poudžiunas) stud. apl. Nr.: Dokt06004 Darba vad ītājs: Dr.habil.biol, prof. Nikolajs Sjakste Recenzenti: Dr.med. Gustavs Latkovskis Dr. med. Rita Lugovska Prof. Elza Husnutdinova

RĪGA, 2010

SATURS KOPSAVILKUMS...... 6 SUMMARY ...... 7 IEVADS ...... 8 1. LITERAT ŪRAS APSKATS ...... 11

1.1. 2. TIPA CUKURA DIAB ĒTS ...... 11 1.1.1. Slim ības pato ăen ēze un izplat ība ...... 11 1.1.2. 2.tipa cukura diab ēta molekul ārā ăen ētika ...... 12

1.2. JUVEN ĪLAIS IDIOP ĀTISKAIS ARTR ĪTS ...... 16 1.2.1. Slim ības pato ăen ēze un izplat ība ...... 16 1.2.2. JIA molekul ārā ăen ētika: asoci āciju mekl ējumi...... 18

1.3. CILV ĒKA GENOMA 14. HROMOSOMA ...... 22

1.4. PROTEASOMAS ...... 25 1.4.1. Proteasomu visp ārīgais apraksts...... 25 1.4.2. Proteasomas aktivatori...... 29 1.4.3. Proteasomu neproteol ītisk ā darb ība...... 33 1.4.4. Proteasomu saist ība ar slim ībām ...... 34 1.4.5. Proteasomu prote īnu g ēni cilv ēka genom ā...... 36 1.4.6. Proteasomu sist ēmas prote īnu g ēnu saist ība ar slim ībām...... 39 2. MATERI ĀLI UN METODIKA ...... 43

2.1. DNS PARAUGU KOLEKCIJA ...... 43

2.2. DNS IZDAL ĪŠANA UN KONCENTR ĀCIJAS NOTEIKŠANA ...... 45

2.3. ANALIZ ĒTIE LOKUSI UN TO GENOTIP ĒŠANAS METODES ...... 46 2.3.1. Mikrosatel ītu anal īze ...... 47 2.3.2. SNP anal īze ...... 52

2.4. MAR ĖIERU FUNKCIONALIT ĀTES BIOINFORM ĀTISK Ā ANAL ĪZE ...... 57 2.4.1. Polimorfismu sekvences izmai Ħu ietekme uz DNS un RNS sekund āraj ām strukt ūrām...... 57 2.4.2. Polimorfismu saitu sekvences izmai Ħu ietekme uz DNS liekumiem...... 58 2.4.3. Polimorfismu saitu saist ība ar transkripcijas faktoriem un to modifik ācija atkar ībā no sekvences izmai Ħā m ...... 58 2.4.4. Polimorfismu saitu sekvences izmai Ħu ietekme uz mikroRNS piesaisti un/vai veidošanos ...... 59 2.4.5. Polimorfismu saitu sekvences ietekme uz matricas RNS veidošanos...... 59

2 2.5. DATU APSTR ĀDE UN STATISTISK Ā ANAL ĪZE ...... 59 3. REZULT ĀTI ...... 62

3.1. 14 Q HROMOSOMAS POLIMORFISMI ...... 62 3.1.1. 14q13 re ăiona mikrosatel ītu izp ēte...... 62 3.1.2. 14q proteasomu prote īnu g ēnu SNP anal īze un atlase...... 64

3.2. 2. TIPA CUKURA DIAB ĒTA ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE ...... 66 3.2.1. Lokusa 14q13 HSMS mar ėieru asoci ācijas anal īze ar T2DM ...... 67 3.2.2. SNP asoci ācijas anal īze ar T2DM ...... 71

3.3. JUVEN ĪLĀ IDIOP ĀTISK Ā ARTR ĪTA ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE ...... 74 3.3.1. Lokusa 14q13 HSMS mar ėieru asoci ācijas anal īze ar JIA...... 74 3.3.2. SNP asoci ācijas anal īze saist ībā ar JIA ...... 80

3.4. IESP ĒJAMO FUNKCIJU BIOINFORM ĀTISK Ā ANAL ĪZE POLIMORFISMIEM SAIST ĪTIEM

AR JIA UN T2DM...... 84 3.4.1. HSMS mar ėieri...... 84 3.4.2. Viena nukleot īda polimorfismi...... 88 4. DISKUSIJA...... 92

4.1. 14 Q HROMOSOMAS POLIMORFISMI ...... 92 4.1.1. 14q13 re ăiona MS polimorfismi un to variabilit āte ...... 92 4.1.2. 14q proteasomu prote īnu g ēnu SNP ...... 93

4.2. 2. TIPA CUKURA DIAB ĒTA ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE ...... 94 4.2.1. Lokusa 14q13 saist ība ar T2DM ...... 94 4.2.2. 14q proteasomu prote īnu g ēnu saist ība ar T2DM ...... 96

4.3. JUVEN ĪLĀ IDIOP ĀTISK Ā ARTR ĪTA ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE ...... 97 4.3.1. Lokusa 14q13 saist ība ar JIA...... 97 4.3.2. 14q proteasomu prote īnu g ēnu saist ība ar JIA ...... 100

4.4. AR SLIM ĪBĀM ASOCI ĒTO POLIMORFISMU IESP ĒJAMĀ FUNKCION ĀLĀ NOZ ĪME...... 103 4.4.1. HSMS mar ėieru iesp ējam ā funkion ālā noz īme...... 103 4.4.2. SNP mar ėieru iesp ējam ā funkion ālā noz īme...... 105

4.5. REZULT ĀTU KOPSAVILKUMS ...... 107 SECIN ĀJUMI ...... 108 IZMANTOT Ā LITERAT ŪRA ...... 111 PUBLIK ĀCIJAS UN PREZENT ĀCIJAS ...... 133 PATEIC ĪBA ...... 138 PIELIKUMI...... 140

3 SAĪSIN ĀJUMI 14ch – 14.hromosoma 14q – 14.hromosomas garais plecs 3’UTR – G ēna 3’ netransl ējam ā da Ĝa 5’UTR – G ēna 5’ netransl ējam ā da Ĝa 95% CI – Konfidences interv āls ( confidence intervals ) pie 95% ANA – Antinukle ārās antivielas ATF – Adenoz īntrifosf āts BMC – Latvijas Biomedic īnas p ētījumu un studiju centrs BMI – Ėerme Ħa svara indekss ( body mass index ) bp – B āzu p āris cDNS – Kod ējoš ā dezoksiribonukle īnsk ābe del – Del ēcija DNS – Dezoksiribonukle īnsk ābe HapMap – Starptautisks projekts cilv ēka genoma haplotipu kartes izveidošanai (hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ ) HLA – Cilv ēka leikoc ītu antig ēns ( Human leukocyte antigen ) HSMS – Mikrosatel ītu nosaukums „Human Salaspils Microsatellites” ins – Insercija JIA – Juven īlais idiop ātiskais artr īts JIoA – Juven īlais idiop ātiskais oligoartr īts JIpA – Juven īlais idiop ātiskais poliartr īts kDa – Kilodaltons LMP2 – Liela mutifunkcion ālā peptid āze 7 (apz īmēts ar ī ar PSMB8) LMP7 – Liela mutifunkcion ālā peptid āze 2 (apz īmēts ar ī ar PSMB9) MAF – Ret ās al ēles frekvence ( minor allele frequency) MALDI-TOF MS – Polimorfismu genotip ēšanas metode ar MALDI-TOF masas spektrometru MECL-1 – Multikatal ītisk ā endopeptid āzes kompleksa subvien ība (apz īmēts ar ī ar PSMB10) microRNS – Mikro ribonukle īnsk ābe mM – Milimols mRNS – Matricas ribonukle īnsk ābe MS – Mikrosatel īts NCBI – Nacion ālais Biotehnolo ăijas inform ācijas centrs ( National Center for Biotechnology Information , ASV; www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) OR – Starp ību jeb izredžu attiec ība 4 P – Statistisk ā ticam ība PCR – Polimer āzes ėē des reakcija PSMA – Proteasomu alfa tipa subvien ība PSMB – Proteasomas beta tipa subvien ība PSMC – Proteasomas 26S ATF āzes subvien ība PSME – Proteasomas aktiviz ātora subvien ība RESP – Restrikcijas enz īma saita polimorfisma jeb restrikcijas enz īma al ēlspecifisk ā saita metode RF – Reimato īdais faktors RR – Relat īvais risks SNP – Viena nukleto īda polimorfisms ( single nucleotide polymorphisms ) SS – Sekund ārā strukt ūra T2DM – 2. tipa cukura diab ēts (no slim ības anglisk ā nosaukuma 2 type diabetes mellitus ) TF – Transkripcijas faktors TFBS – Transkripcijas faktoru piesaistes vieta ( transcription factor binding site) Ub – Ubikvit īns l – Mikrolitrs

5 KOPSAVILKUMS

Postgenoma ēras iest āšan ās 21.gadsimt ā izrais īja interesi par multifaktori ālo slim ību ăen ētiskajiem aspektiem, iesp ējam ām saist ībām starp kandid ātg ēnu al ēĜ u vari ācij ām un hroniskaj ām slim ībām. M ēs savos p ētījumos esam piev ērsuši uzman ību 2.tipa cukura diab ētam (T2DM) un juven īlajam idiop ātiskais artr ītam (JIA). Asoci ācijas p ētījumiem ar ab ām slim ībām tika izv ēlēti vair āki 14q hromosomu lokusi. Cilv ēka 14. hromosoma ir viena no piec ām akrocentriskaj ām hromosom ām, kur ā ir lokaliz ēti asto Ħi proteasomu prote īnu g ēni, tai skait ā, PSMB5, PSMB11, PSME1 un PSME2 lokus ā 14q11.2, PSMA6 lokus ā 14q13.1, PSMC6 lokus ā 14q21.1, PSMA3 lokus ā 14q23 un PSMC1 lokus ā 14q32.11. Darba m ērėis bija raksturot saist ību starp 14q polimorfismiem un JIA un T2DM Latvijas popul ācij ā. Piecus HSMS mikrosatel ītu al ēles un septi Ħus SNP ( PSMB5 g ēna SNP c.70C>T, PSMA6 gēna SNP c.-4543_-4544insC, c.-110C>A un c.-8C>G, PSMC6 g ēna polimorfismu c.86- 104A>G un c.86-46C>T un c.543+138G>A lokaliz ētu PSMA3 g ēnā) genotip ējām divos gad ījuma/kontroles p ētījumos, attiec īgi ar T2DM un JIA. Sekvenc ējot noteic ām, ka Latvijas popul ācij ā HSMS602 mar ėiera mot īvā ir divas main īgas da Ĝas jeb (CAA) n(A) m, HSMS701 ir ar vienk āršu atk ārtojumu (AC) n.

Konstat ējām, ka Latvijas popul ācij ā T2DM ir saist īts ar HSMS006 al ēli (TG) 22 ,

HSMS801 al ēli (AC) 24 un HSMS602 al ēli (CAA) 8, k ā ar ī ar HSMS602 homozigoto genotipu

(CAA) 8/8 un HSMS801 heterozigoto genotipu (CA) 20/22 . Analiz ējot proteasomu prote īnu g ēnu SNP, pier ādījām, ka PSMA6 g ēna c.-8C>G genotipu sadale ir saist īta ar T2DM Latvijas popul ācij ā.

Ar JIA kopum ā Latvijas popul ācij ā ir saist ītas HSMS006 al ēles (TG) 19 un (TG) 23 ,

HSMS701 al ēle (AC) 20 un HSMS801 al ēle (AC) 17 , bet HSMS006 al ēle (TG) 20 , HSMS702 al ēles (TG) 10 un HSMS602 al ēles ar 178 bp ir saist īta ar JIoA un HSMS702 mar ėiera al ēle

(TG) 13 - ar JIpA. Turkl āt vair āki iepriekš min ēto mikrosatel ītu genotipi ir saist īti ar JIA Latvijas popul ācij ā. SNP anal īze uzr ādīja, ka PSMA6 g ēna c.-4543_-4544insC un c.-110C>A un PSMC6 g ēna c.86-104A>G al ēĜ u sadale ir saist īta ar JIA un t ā viegl āko formu - oligoart ītu. Turkl āt c.86-104A>G ret ā al ēle ir riska al ēle oligoartr īta att īst ībā (OR = 2,43). SNP c.-110C>A un c.86-104A>G genotipu sadale ir saist īta ar JIA un JIoA, bet PSMA3 g ēna SNP c.543-138G>A genotipu sadale - ar JIA un JIpA.

6 SUMMARY

Association of Chromosome 14 proteasomal gene polymorphisms with metabolic and autoimmune diseases Advent of the post-genome era in the 21 st century switched interest of many researchers to study of genetic component of multifactorial diseases, possible association of allelic variants of candidate genes with different chronic diseases are intensively sought. We have focused our attention on type 2 diabetes mellitus (T2DM) and juvenile idiopathic arthritis (JIA). The single 14q chromosome locus was chosen for association studies with both diseases. Human chromosome 14 is one of five acrocentric chromosomes, harbouring eight proteasomal genes, including, PSMB5, PSMB11, PSME1 and PSME2 in locus 14q11.2, PSMA6 in locus 14q13.1, PSMC6 in locus 14q21.1, PSMA3 in locus 14q23 and PSMC1 in locus 14q32.11. Goal of the study was to characterize association of 14q polymorphisms with T2DM and JIA in the Latvian population. Five HSMS markers and seven SNPs (c.70C>T of PSMB5, c.-4543_-4544insC, c.110C>A and c.-8C>G of PSMA6 , c.86-104A>G and c.86-46C>T of PSMC6 and PSMA3 SNP c.543+138G>A) were genotyped in two case/control studies with T2DM and JIA.

Direct sequencing revealed two variable components of the (CAA) n(A) m motif in

HSMS602 marker and simple repeat motive (AC) n of the HSMS701 in Latvian population.

It was revealed that alleles (TG) 22 of HSMS006, (AC) 24 of HSMS801 and (CAA) 8 of

HSMS602 and also homozygote genotype (CAA) 8/8 of HSMS602 and heterozygote genotype

(CA) 20/22 are associated with T2DM in Latvian population. By analyzing SNP of proteasomal genes, we have proved that genotypes distribution of c.-8C>G of PSMA6 gene is associated with T2DM in Latvian population.

Alleles (TG) 19 and (TG) 23 of HSMS006, (AC) 20 of HSMS701 and (AC) 17 of HSMS801 are associated with JIA in Latvian population, but alleles (TG) 20 of HSMS006, (TG)10 of

HSMS702 and 178bp of HSMS602 – with JIoA, and (TG) 13 of HSMS702 – with JIpA. Also several genotypes of all microsatellites are associated with JIA in Latvian population. In study of SNP were develop that distribution of alleles of c.-4543_-4544insC and c.-110C>A of PSMA6 and PSMC6 SNP c.86-104A>G are relevant to JIA and JIoA, besides rear allele of c.86-104A>G is risk factor of JIoA (OR = 2.43). Genotype distribution of SNPs c.-110C>A and c.86-104A>G are associated with JIA and JIoA, but c.543-138G>A of PSMA3 – with JIA and JIpA.

7 IEVADS

Postgenoma ēras iest āšan ās 21.gadsimt ā izrais īja interesi p ētīt multifaktori ālo slim ību ăen ētiskos aspektus, iesp ējam ās saist ībās starp kandid ātg ēnu al ēĜ u vari ācij ām un hroniskaj ām slim ībām, tai skait ā metaboliskaj ām un autoimm ūnaj ām patolo ăij ām. M ēs savos asoci āciju pētījumos esam piev ērsuši uzman ību p ēdējām div ām min ētaj ām slim ību grup ām. Š īs slim ības ir juven īlais idiop ātiskais artr īts (JIA), kas izpaužas b ērn ībā, un 2. tipa cukura diab ēts (T2DM; type 2 diabetes mellitus ), kas skar p ārsvar ā pusm ūža un vecākus cilv ēkus. Asoci ācijas p ētījumiem ar ab ām slim ībām izv ēlējāmies vair ākus 14.hromosomas gar ā pleca (14q) lokusus. Bērnu mirst ības un invalidit ātes indikatori raksturo valsts labkl ājību. B ērnu mirst ība Latvij ā ir starp augst ākajiem r ādītājiem Eirop ā un augst ākais Baltijas valst īs. Att īst ītās valst īs bērnu mirst ību un invalidit āti liel ā m ērā nosaka iedzimt ība. B ērnu hronisk ās autoim ūnās un im ūnmedi ētās slim ības, tai skait ā juven īlais idiop ātiskais artr īts, ir b ūtisks darba nesp ējas un invalidit ātes c ēlonis. Š īs slim ības ir multifaktori ālas, t ās att īst ās uz ăen ētisk ās b āzes k ā vides un slimnieka organisma mijiedarb ības rezult āts (Rumba-Rozenfelde u.c., 2009a). Daudz ās popul ācijas ir pier ādīta, JIA uz Ħē mības g ēni ir HLA lokuss un PTPN22 g ēns. Citi g ēni, piem ēram, MIF , Il6 , Il10 , TNF un VTCN1, ar ī uzr āda saist ību ar JIA un/vai t ā subtipiem daž ādās popul ācij ās. Tom ēr, iepriekš min ētie g ēni ir atbild īgi tikai par nelielu ăen ētisko faktoru devumu da Ĝu, un ir j ābūt citiem uz Ħē mības lokusiem jeb „JIA rika al ēlēm”, kas ir iesaist īti daž ādos metabolisma ce Ĝos, ietekm ējot slim ības pato ăen ēzi un/vai j ūtību pret terapiju (Glass, Giannini, 1999; Hinks et al., 2009a). Tādējādi tādu mar ėieru mekl ējumi, kas būtu saist īti ar JIA augstu asoci ācijas pak āpi, joproj ām ir aktu āla probl ēma. 2. tipa cukura diab ēta un ar to saist ītie vielmai Ħas trauc ējumu (aptaukošan ās, hipertensija utt.) sastopam ība Latvijas popul ācijas ir sal īdzinoši augsta. Tradicion ālā augstu kaloriju di ētas un iedz īvot āju paradumi veicina šo trauc ējumu att īst ību. Tom ēr T2DM att īst ības ăen ētisk ā izcelsme ir noz īmīga. T ādej ādi slim ības ăen ētisk ās izcelsmes p ētījumi piesaista daudzus p ētniekus; ir veikti p ētījumi, lai mekl ētu un noteiktu g ēnus, kas ir iesaist īti patalo ăijas att īst ībā. Vair āku og Ĝhidr ātu, lip īdu un insul īna regul ācijas metabolism ā un/vai to darb ības ce Ĝos iesaist īto hormonu, receptoru un enz īmu gēnu mut ācijas vai al ēĜ u vari ācijas ir pārbaud ītas saist ībā ar T2DM un/vai aptaukošanos. Šo p ētījumu rezult ātus bieži ir gr ūti interpret ēt. Pozit īva korel ācija vien ā popul ācij ā netiek atkārtota cit ā. Pēdējo gadu sasniegumi š ūnu biolo ăij ā skaidri par āda, ka efekt īva un pareiza biopolim ēru no ārd īšana ir svar īga š ūnas funkcion ēšanai, tik pat cik pareiza olbaltumvielu

8 biosint ēze. Ubikvit īna – proteasomu sist ēma veic prote īnu degrad āciju liel ā apjom ā. Vair āku slim ību att īst ība ir saist īta ar nepareizu transkripcijas faktoru, onkog ēnu produktu un/vai enz īmu degrad āciju, kam par iemeslu ir trauc ējumi ubikvit īna – proteasomu sist ēmā (Ciechanover et al., 2000). Proteasomas ir iesaist ītas insul īna darb ības meh ānism ā, t ādej ādi iesp ējams cukura diab ēta att īst ībā. Gan in vitro , gan in vivo p ētījumos ir pier ādīts, ka insul īns ietekm ē proteasomu aktivit āti (Fawcett et al., 2001). Cukura diab ēta indukcija izraisa proteasomu subtipu p ārk ārtošanos (Merforth et al., 2003). Noz īmīga proteasomu prote īnu gēnu PSMA6 un PSMA3 mRNS ekspresijas izmai Ħas ir konstat ētas cilv ēka skeleta musku Ĝos pēc insul īna ievad īšanas (Rome et al., 2003). Turkl āt proteasomu aktivit ātes nom ākšana samazina diab ēta izpaušanos (Petrovic et al., 2004). M ūsdien ās ir izteikts viedoklis, ka proteasomas var ētu b ūt iesaist ītas 2.tipa cukura diab ēta pato ăen ēzē. Šis pie Ħē mums ir veidots, balstoties uz to, ka ubikvit īna – proteasomu sist ēma ir iesaist īta insul īna receptoru darb ībā, kontrol ējot insul īna receptora 1. un 2. substr āta daudzumu, un insul īna degrad ācij ā. Ubikvitin ēšana regul ē transkripcijas faktorus un kodola receptorus, kas nodrošina insul īna atkar īgo g ēnu ekspresiju (Rome et al., 2004). T ātad ăen ētisk ās vari ācijas g ēnos, kas kod ē proteasomu prote īnus, var ētu b ūt noz īmīgas 2.tipa cukura diab ēta pato ăen ēzē. Līdz īgi, proteasomas ir iesaist ītas autoim ūno slim ību pato ăen ēzē, jo t ās piedal ās antig ēnu veidošan ās proces ā. Ir zin āms, ka proteasomu prote īna LMP2 g ēna polimorfisms ietekm ē uz Ħē mību pret juven īlo idiop ātisko artr ītu un ietekm ē HLA-B27 saist ītā JIA smaguma pak āpi (Pryhuber et al., 1996). Citu ubikvit īna – proteasomu sist ēmas prote īnu gēnu al ēĜ u vari ācijas var ētu veicin āt autoim ūno slim ību att īst ību, kontrol ējot IgE veidošanos un kontrol ējot „im ūn”-proteasomu kompleksa efektivit āti imunit ātes atbildes metabolisma kask ādē. Mekl ējot perspekt īvus lokusus asoci ācijas p ētījumiem ar T2DM un JIA, m ūsu grupa piev ērsa uzman ību iesp ējamai saist ībai starp cilv ēka 14. hromosomu un autoim ūnām un/vai metabolisk ām slim ībām. 14. hromosomas gar ā pleca lokusi izr ādījās īpaši perspekt īvi tieši autoim ūno slim ību izp ētei. Lokusos atrodas vair āki proteasomu g ēni, tai skait ā, lokus ā 14q11.2 proteasomas beta tipa 5. un 11. subvien ība (attiec īgi PSMB5 un PSMB11 ) un proteasomas aktivatora 1. un 2. subvien ība (attiec īgi PSME1 (PA28 α) un PSME2 (PA28 β)), lokus ā 14q13.1 proteasomas alfa tipa 6. subvien ība ( PSMA6 ), kas ir viskonservat īvākais no proteasomu prote īnu alfa saimes g ēniem (Bey et al., 1993) proteasomas 26S ATF āzes 6. subvien ība ( PSMC6 jeb Rpt4) lokus ā 14q21.1, alfa tipa 3. subvien ība ( PSMA3 ) lokus ā 14q23 un proteasomas 26S ATF āzes 1.subvien ība (PSMC1 jeb Rpt2) lokus ā 14q32.11, kam ir

9 pier ādīta saist ība gan ar 1. tipa (Mein et al., 1998), gan 2. tipa cukura diab ētu (Permuntt et al., 2001). Visbeidzot ir j āpiemin, ka vairums asoci ācijas p ētījumu rezult āti saist ībā ar multifaktori ālaj ām slim ībām dod negat īvu rezult ātu vai neatk ārtojas vair ākās popul ācij ās. Mēs iesak ām, ka vair āku polimorfismu p ētījumi ar t ūkstošs paraugiem b ūtu j āaizst āj ar pētījumiem, kuros katram perspekt īvajam polimorfismam veiktu r ūpīgu funkciju anal īzi. M ēs šī p ētījuma s ākuma da Ĝu veic ām ar domu: izv ērt ēt polimorfismu sekven ču iesp ējamo funkcion ālo noz īmi, analiz ējot in silico transkripcijas faktoru piesaistes vietu un sekund āro strukt ūru izmai Ħas atkar ībā no mikrosatel ītu atk ārtojumu skaita vai nukleot īdu mai Ħas. Tika veikta ar ī DNS liekumu un procesing ā iesaist īto prote īnu piesaistes vietas prognoz ēšana in silico katra polimorfiska re ăionam. Pētījuma m ērėis: Raksturot saist ību starp 14q proteasomu prote īnu g ēnu un to rajonu polimorfismiem un juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai 2.tipa cukura diab ētu Latvijas popul ācij ā. Pētījuma uzdevumi : 1. Noteikt 14.hromosomas gar ā pleca proteasomu prote īnu g ēnu un to rajonu polimorfismus un izv ēlēties perspekt īvus polimorfismus asoci ācijas p ētījumiem. 2. Izstr ādāt molekul āros mar ėierus, kuri b ūtu piem ēroti 14.hromosomas gar ā pleca proteasomu g ēnu polimorfismu raksturošanai. 3. Noteikt prec īzu HSMS mikrosatel ītu re ăionu mot īvus un main īgās da Ĝas Latvijas popul ācij ā. 4. Veikt atlas īto polimorfismu (mikrosatel ītu un viena nukleot īda polimorfismu) pirm ējo raksturošanu Latvijas popul ācij ā. 5. Izp ētīt saist ību starp 2.tipa cukura diab ēta un 14.hromosomas gar ā pleca lokusa 14q13 HSMS mikrosatel ītiem un izv ēlētajiem viena nukleot īda polimorfismiem. 6. Izp ētīt saist ību starp juven īlo idiop ātisko artr ītu un 14.hromosomas gar ā pleca lokusa 14q13 HSMS mikrosatel ītiem un izv ēlētajiem viena nukleot īda polimorfismiem. 7. Veikt in silico anal īzi statistiski noz īmīgajiem 14.hromosomas gar ā pleca proteasomu prote īnu g ēnu polimorfismiem.

10 1. LITERAT ŪRAS APSKATS

1.1. 2.tipa cukura diab ēts

1.1.1. SLIM ĪBAS PATO ĂEN ĒZE UN IZPLAT ĪBA

2. tipa cukura diab ēts (T2DM; type 2 diabetes mellitus ), agr āk saukts ar ī par insul īna neatkar īgo cukura diab ētu, ir metaboliska slim ība, kuras pato ăen ēzes meh ānisma pamat ā ir gan ārējo (aptaukošan ās, fizisk ās aktivit ātes tr ūkums un s ēdošais dz īvesveids), gan iekš ējo (iedzimt ība) faktoru ietekme. Otr ā tipa cukura diab ēts ir endokrinolo ăiska slim ība, kurai rakstur īga noz īmīgas izmai Ħas aizku Ħă a dziedzera, aknu un musku Ĝškiedru galvenajos metabolisma procesos. Pacientiem ir izmain īta taukaudu jut ība pret insul īnu, t ādej ādi veidojas insul īna rezistence (Karim et al., 2006; Kato et al., 2006; Marchetti et al., 2006; Tokuyama et al., 2006; Jin, Patti, 2009; Lin, Sun, 2010). Otr ā tipa cukura diab ēta pacientiem ir nov ērojami daž ādas pak āpes insul īnu sint ēze un/vai t ā metabolisma izmai Ħas, robež ās no insul īna rezistences ar relat īvu insul īna defic ītu l īdz insul īna sekr ēcijas defektam (Genuth et al., 2003; Lin, Sun, 2010). Otr ā tipa diab ēta gad ījum ā organism ā veidojas hiperglik ēmija, kas ir vair āku metabolisma procesu izmai Ħu rezult āts, tai skait ā, aizku Ħă a dziedzera sali Ħā s β š ūnās pasliktin ās insul īna sekr ēcija un palielin ās β šūnu veidošan ās, glikoneo ăen ēzes intensifik ācijas rezult ātā akn ās palielin ās glikozes produkcija (Petersen, Shulman, 2006; Lin, Sun, 2010). 2003. gad ā ar T2DM slimoja ap 194 miljoni pasaules iedz īvot āju, bet tika prognoz ēts, ka tuv ākajos 20 gados šis skaitlis palielin āsies vid ēji par 70%, tas ir no 20% Eirop ā l īdz 111% Āfrik ā (Karim et al., 2006; Petersen, Shulman, 2006; Jin, Patti, 2009). Prognoz ē, ka l īdz 2025. gadam 2TD slimnieku skaits b ūs sasniedzis 333 miljonus (Petersen, Shulman, 2006), bet jau 2030.gad ā – 366 miljonus (Schinner et al., 2005; Karim et al., 2006; Lin, Sun, 2010). Tādej ādi š ī slim ība ir viena no izplat ītākaj ām, turkl āt aptuveni 5 l īdz 10% no daudzu valsts vesel ības budžetiem tiek t ērēts tikai š īs slim ības pacientu apr ūpei (Lin, Sun, 2010). Otr ā tipa cukura diab ēts izraisa pacientiem dz īves ilguma sa īsin āšanos, k ā ar ī ir izmaina tās kvalit āti. Pacientiem palielin ās risks saslimt ar daž ādām sirds un nieru slim ībām, k ā ar ī ir palielin āts akluma, amput āciju, īpaši apakš ējo ekstremit āšu, un triekas risks. Š īs slim ības pacientiem 75% gad ījumos n āves iemesls ir koron ārā sirds slim ība. Koron āro nepietiekam ības risks T2DM pacientiem ir 2 l īdz 5 reizes liel āks nek ā veseliem indiv īdiem (Freeman, Cox, 2006; Prokopenko et al., 2008). Liela noz īme slim ības etiolo ăij ā ir dz īves stilam jeb ārējiem vides faktoriem, starp kuriem var min ēt aptaukošanos jeb korpulenci, fizisko treni Ħu tr ūkumu un s ēdošu dz īvesveidu, kas 11 bieži ir veicinošais faktors insul īna rezistences att īst ībai. Tas noz īmē, ka organisma š ūnas nesp ēj atbild ēt uz insul īna sign āliem (Goldstein, 2002; Lin, Sun, 2010). Ir pier ādīts, ka daudziem T2DM pacientiem ėerme Ħa svara indekss (BMI; body mass index ) ir palielin āts, tas ir virs 25, kas ir norm āla svara indeksa augš ējā robeža (Petersen, Shulman, 2006). Otr ā tipa cukura diab ēts ir saist īts ar novecošanu jeb slim ība izpaužas vair āk cilv ēkiem pēc 40 gadiem. Sal īdzinot ar gados jaun ākiem cilv ēkiem, vec āka gadu g ājuma person ām ir nosliece uz insulīna rezistenci, k ā ar ī uz samazin ātu insul īna stimul ēto glikozes metabolismu musku Ĝos un uz palielin ātu tauku uzkr āšanos musku Ĝos un akn ās (Petersen, Shulman, 2006). Vair ākās popul ācijas l īdz 20% iedz īvot āju virs 65 gadiem ir T2DM slimnieki (Lin, Sun, 2010). Zin ātnieki prognoz ē, ka tuv ākajos gados šis skaitlis strauji augs, saist ībā ar daudzu popul āciju iedz īvot āju aptaukošanos (Jin, Patti, 2009). Slim ības att īst ībā svar īgs ir ar ī iedzimt ības faktors, ko pier āda vair āki fakti, piem ēram, monozigotiskiem dv īĦiem 70 l īdz 80% gad ījumos slim ība izpaužas abiem, bet dizigotiskiem dv īĦ iem konkordance sastopama 10 – 30% gad ījumos (Goldstein, 2002; Ridderstråle, Groop, 2009). Ăimen ēs, kur ās k āds no vec ākiem slimo ar T2DM, risks saslimt p ēcn ācējam ir 40% (Ridderstråle, Groop, 2009). Savuk ārt, ja slimo abi vec āki, š ī iesp ējam ība sasniedz pat 70% (Morino et al., 2005; Ridderstråle, Groop, 2009; Lin, Sun, 2010). Sal īdzinot ar 2.tipa cukura diab ēta saslimšanas risku popul ācij ā, pirm ās pak āpes radiniekiem tas palielin ās l īdz pat trim reiz ēm (Ridderstråle, Groop, 2009; Lin, Sun, 2010).

1.1.2. 2.TIPA CUKURA DIAB ĒTA MOLEKUL ĀRĀ ĂEN ĒTIKA

Pēdējos gados 2.tipa cukura diab ēta risks ir p ētīts, ne tikai analiz ējot metaboliskos procesus, bet ar ī mekl ējot saist ību ar konkr ētu prote īnu kod ējošiem g ēniem. Molekul ārās ăen ētikas nozares att īst ība ir Ĝā vusi p ētīt ne tikai atseviš ėu lokusus, bet mekl ēt g ēnu kandid ātus uzreiz vis ā cilv ēka genom ā ( genome-wide association study ). Kopš 2007.gada visa genoma p ētījumiem (Scott et al., 2007; Sladek et al., 2007; Salonen et al., 2009) ir pier ādīta statistiski ticama saist ība ( P<0,05 – atseviš ėu lokusu p ētījumos, vai <5x10 -8 – visa genoma saist ību p ētījumos; McCarthy, Zeggini, 2009) starp T2DM un 85 jauniem vai iepriekš p ētītiem g ēniem vai lokusiem, tie ir taukš ūnu prote īnu g ēni, piem ēram, plazmas š ūnu membr ānas glikoprote īns 1 (ENPP1; Bouhaha et al., 2008; Gaulton et al., 2008), un aizku Ħă a dziedzera š ūnu prote īnu g ēni, piem ēram, cikl īna atkar īgās kin āzes inhibitors 2a jeb CDKN2A (Duesing et al., 2008b). 1.1.att ēlā ir redzams biež āk p ētīto g ēnu sintez ēto prote īnu audu un org ānu specifiskums. K ā redzams visbiež āk ir p ētīti g ēni, kas kod ē aizku Ħă a dziedzera š ūnās esošos prote īnus, kas ir izskaidrojams ar to, ka T2DM pamat ā ir beta š ūnu funkciju izmai Ħas (Jin, Patti, 2009).

1.1.att ēls Ar 2.tipa cukura diab ētu saist īto ( P<0,05) g ēnu sintez ēto prote īnu audu un org ānu specifiskums. 1.1.tabula apkopo ar 2. tipa cukura diab ētu saist īto g ēnu lokaliz āciju cilv ēka 23 hromosom ās. Ir redzams, ka visvair āk ar slim ību saist ītie g ēni ir atrasti 1., 3. un 17.hromosom ā. L īdz šim ar T2DM saist ītie g ēni nav atrasti tikai tr īs hromosom ās, tai skait ā ab ās dzimuma hromosom ās. Ir pier ādīts, ka T2DM slim ībai ir ăen ētiska saist ība ne tikai ar g ēniem, kas kod ē insul īna atkar īgajos metabolisma ce Ĝos iesaist ītus prote īnus, bet ar ī ar g ēniem, kas regul ē insul īna atkar īgo metabolisma ce Ĝu prote īnu g ēnu ekspresiju, jeb ar transkripcijas faktoru g ēniem, piem ēram, augšup izvietotais transkripcijas faktors 1 jeb USF1 ( upstream transcription factor 1 ; Meex et al., 2009). K ā ar ī ir konstat ēts, ka 2. tipa cukura diab ēts ir saist īts ar ubikvit īna – proteasomu degrad ācijas ce Ĝu, piem ēram, ar ubikvit īna lig āzes E3 komponentu 1 jeb UBR1 (Yamaguchi et al., 2008). Viens no pirmajiem g ēniem, kura mut ācijas tika saist ītas ar T2DM, bet produkts ir iesaist īts prote īnu degrad ācij ā, ir kalpa īns-10 ( CAPN10, calpain -10; Baier et al., 2000; Horikawa et al., 2000), kas ir nelizosomas ciste īna prote āze ekspres ēta daž ādos audos, tai skait ā, sird ī, skeleta musku Ĝos, akn ās un aizku Ħă a dziedzer ī (Baier et al., 2000; Horikawa et al., 2000; Tsuchiya et al., 2006; Ling et al., 2009). Tsu čija ( Tsuchiya ) ar kol ēă iem 2006.gad ā apkopoja vair āku zin ātnieku daž ādu popul āciju p ētījumus, kuros analiz ējas CAPN10 mut āciju saist ība ar T2DM. Kop ējais secin ājums bija, ka š īs mut ācijas ir Ĝoti noz īmīgas, bet ir svar īgi

13 kādā kombin ācij ā t ās ir sastopamas genom ā. Dažas kombin ācijas saslimšanas risku palielina līdz pat 168%, bet citas šo risku samazina l īdz 15% (Tsuchiya et al., 2006).

1.1. tabula Ar T2DM statistiski ticami (P<0,05) saist īto g ēnu vai lokusu izvietojums cilv ēka hromosom ās (dati apkopoti no 2007.gada visa genoma p ētījumu publik ācij ām un no publik ācij ām s ākot ar 2008.gadu*).

Hromosoma 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Gēnu vai 12 3 10 4 2 5 4 2 lokusu skaits Piez īme 8 īsaj ā plec ā un 3 īsaj ā plec ā un 4 garaj ā plec ā 7 garaj ā plec ā Hromosoma 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Gēnu vai 4 4 7 2 1 1 4 3 lokusu skaits Piez īme Pa diviem 5 īsaj ā plec ā gēniem lokusos p21 un q34.2 Hromosoma 17. 18. 19. 20. 21. 22. X Y Gēnu vai 9 - 1 2 3 2 - - lokusu skaits Piez īme Četri gēni īsā Abi pleca lokus ā lokus ā p13, p ārējie q13 garaj ā plec ā *Izmantot ās publik ācijas: Scott et al., 2007; Sladek et al., 2007; Andersen et al., 2008; Bouhaha et al., 2008; Duesing et al., 2008a; Duesing et al., 2008b; Galanakis et al., 2008; Gaulton et al., 2008; Hertel et al., 2008; Qu et al., 2008a; Qu et al., 2008b; Ramachandran et al., 2008; Sanghera et al., 2008; Xiang et al., 2008; Baroudi et al., 2009; Bossé et al., 2009; Choquet et al., 2009; Ezzidi et al., 2009; Jonsson et al., 2009; Meex et al., 2009; Prokopenko et al., 2009; Rees et al., 2009; Salonen et al., 2009; Sanghera et al., 2009; Song et al., 2009; Szopa et al., 2009; Tabara et al., 2009; Yajnik et al., 2009; Iordanidou et al., 2010; Jing et al., 2010; Perry et al., 2010; Sanghera et al., 2010; Tan et al., 2010. Pēdējos gados lielu noz īmi v ērš g ēnu ekspresijas anal īzei saist ībā ar analiz ējam ām slim ībām. Linga ar kol ēă iem (Ling et al., 2009) analiz ēja kalpa īna-10 ekspresiju tieši aizku Ħă a dziedzera β šūnas pacientiem ar T2DM un sal īdzin āja ar veseliem donoriem. Vi Ħi konstat ēja, ka ir statistiska atš ėir ība starp CAPN10 gēna ekspresiju T2DM pacientiem un veseliem cilv ēkiem.

14 Daudzi g ēni ir p ētīti tikai vienreiz ējos p ētījumos, tai skait ā ar ī analiz ējot visu genomu, tādej ādi to rezult āti ir attiecin āmi tikai uz konkr ētu popul āciju. Citiem g ēniem asoci ācija ar T2DM ir pier ādīta vair ākos neatkar īgos p ētījumos (1.2.tabula):

1.2. tabula Gēni, kuriem konstat ēta asoci ācija ar 2.tipa cukura diab ētu neatkar īgos p ētījumos. G ēns Kod ētais prote īns Lokaliz ācija Saist ība ar Avoti genom ā T2DM* PPARG Periksomu 3p25 Kl īniska vai Scott et al., 2007 (PPARG2) prolifer ācijas neliela saist ība Sanghera et al., 2008 aktiviz ācijas receptors Gaulton et al., 2008 gamma Sanghera et al., 2010 ADIPOQ Adiponekt īns 3q27 Kl īniska vai Szopa et al., 2009 neliela saist ība Sanghera et al., 2010 IGF2BP2 Pie insul īnam l īdz īga 3q27.2 Neliela saist ība Scott et al., 2007 augšanas faktora 2 Sanghera et al., 2008 mRNS saistošais Tabara et al., 2009 prote īns 2 ENPP1 (PC-1) Ektoenz īma kodola 6q22-q23 Vid ēja vai Bouhaha et al., 2008 fosforil ēta neliela saist ība Gaulton et al., 2008 fosfodiester āze 1 (plazmas š ūnu membr ānas glikoprote īns 1) CDKAL1 CDK5 regul ācijas 6p22.3 Neliela saist ība Scott et al., 2007 subvien ības saist ītajam Tabara et al., 2009 prote īnam 1 l īdz īgais Tan et al., 2010 prote īns 1 SLC30A8 Cinka transporta 8q24.11 Vid ēja vai Scott et al., 2007 prote īnu elements 8 neliela saist ība Sladek et al., 2007 Hertel et al., 2008 Xiang et al., 2008 Bossé et al., 2009 Jing et al., 2010 Tan et al., 2010 CDKN2B Cikl īna atkar īgās 9p21 Neliela saist ība Scott et al., 2007 kin āzes inhibitors 2B Duesing et al., 2008 (p15, inhib ē CDK4) Hertel et al., 2008 Tan et al., 2010

TCF7L2 Transkripcijas faktoram 10q25.3 Kl īniska, Scott et al., 2007 7 l īdz īgais prote īns 2 vid ējai vai Sladek et al., 2007

15 (specifisks T š ūnām) neliela saist ība Bossé et al., 2009 Ezzidi et al., 2009 Salonen et al., 2009 Sanghera et al., 2009 Tabara et al., 2009 HHEX Hematopo ēzes laik ā 10q23.33 Neliela saist ība Scott et al., 2007 ekspresētais Sladek et al., 2007 homeobokss Bossé et al., 2009 Tabara et al., 2009 Tan et al., 2010 LOC387761 11p12 Neliela saist ība Sladek et al., 2007 Bossé et al., 2009 KCNJ11 ATF atkar īgais k ālija 11p15.1 Neliela saist ība Scott et al., 2007 kan āla, apakšsaimes J, Gaulton et al., 2008 elements 11 KCNQ1 Kālija sprieguma jona 11p15.5 Neliela saist ība Jonsson et al., 2009 kan āla, KQT l īdz īgās Tan et al., 2010 apakšsaimes elements 1 FTO Tauku masas 16q12.2 Neliela saist ība Scott et al., 2007 aptaukošan ās saist ītais Hertel et al., 2008 gēns Sanghera et al., 2008 Yajnik et al., 2009 SLC2A4 Izš ėī dušo vielu 17p13 Vid ēja vai Gaulton et al., 2008 transporta saimes 2 neliela saist ība Yamaguchi et al., 2008 (glikozes transporta veicin ātājs) elements 4 ACE Angiotens īna 17q23 Kl īniska Ramachandran et al., konvert ējošais enz īms saist ība 2008 Baroudi et al., 2009 * Saist ība ar slim ību p ēc relat īvās starp ības (OR; Odds ratio ): ≥ 2 vai ≤ 0,5 - kl īniska noz īme jeb augsta saistība ar slim ību, ≥ 1,5 vai ≤ 0,66 - vid ēja saist ība ar slim ību, bet ne kl īniska noz īme; ≤ 1,5 vai ≥ 0,66 - neliela saist ība ar slim ību (Schlesselman, Stolley, 1982; Daly, Bourke, 2000; Uthoff et al., 2002; Motulsky , 2010). 1.2. Juven īlais idiop ātiskais artr īts

1.2.1. SLIM ĪBAS PATO ĂEN ĒZE UN IZPLAT ĪBA

Juven īlais idiop ātiskais artr īts (JIA), agr āk saukts par juven īlo reimato īdālo artr ītu, ir autoim ūna slim ība, kuras izcelsmes pamat ā ir multifaktori āls meh ānisms, proti, gan ārējie faktori (infekcija, traumas, stress, fizikālie faktori, sm ēėē šana ăimen ē), gan iekš ējie (iedzimt ība). Im ūnsist ēmas disfunkcijas ierosin ātāji, iesp ējams, ir infekcija (v īrusu vai

16 vīrusbakt ēriju), neliela trauma (sasitums), fizik āla ietekme (Rumba-Rozenfelde u.c., 2009b; Berkun, Padeh, 2010). Pirmie dati par juven īlo idiop ātisko artr ītu tika public ēti 19. gadsimt ā. Š ī slim ība ir viena no izplat ītākaj ām hronisk ām reimatisk ām autoim ūnām b ērnu slim ībām (Phelan et al., 2006; Ravelli, Martini, 2007; Gabriel, Michaud, 2009; Woo, Colbert, 2009). 1993. gad ā Dr. Finks (Fink) defin ēja, ka juven īlais hroniskais jeb idiop ātiskais artr īts ir artr īts, kas s ākas l īdz 16 gadu vecumam (Ansell, 1999; Ringold et al., 2005) ar vienas vai vair āku loc ītavu iekaisumu un ilgst vismaz sešas ned ēĜ as (Petty et al., 1998). JIA izplat ība aptuveni ir 1 l īdz 2 b ērni no 1000, prec īzāk, jauni slim ības gad ījumi tiek konstat ēta vid ēji 10 l īdz 14 b ērniem no 100’000 (Ilowite, 2002; Prahalad et al., 2002, Ravelli, Martini, 2007), lai gan daž ās valst īs izplat ība ir pat l īdz 150 (Gabriel, Michaud, 2009) un 440 (Berkun, Padeh, 2010) b ērniem no 100’000. Juven īlajam idiop ātiskajam artr ītam p ēc 2001.gada Starptautisk ās reimatodologu asoci ācijas l īgas klasifik ācijas izš ėir septi Ħus apakštipus (Petty et al., 2004): • sistem ātiskais artr īts; • oligoartr īts – persist ējošs vai ekstend ējošs (vienoti JIoA); • poliartr īts ar negat īvu reimato īdo faktoru (vienoti JIpA); • poliartr īts ar pozit īvu reimato īdo faktoru (vienoti JIpA); • psori ātiskais artr īts; • artr īts kop ā ar entez ītu; • nediferenc ēts artr īts. Pacienta slim ības apakštipu nosaka atkar ībā no slim ības izpausmes pirmaj ā pusgad ā (Rumba-Rozenfelde u.c., 2009b; Woo, Colbert, 2009), nov ērt ējot gan kl īnisko ainu (iekaisušo loc ītavu skaits un s ākuma uzliesmojuma ilgums), gan serolo ăisko raksturojumu (reimato īdā faktora (RF) pozitivit āte, antinukle ārās antivielas (ANA), cilv ēka leikoc ītu antig ēns B27 (HLA-B27)). Visbiež āk sastopam ā forma, pat l īdz 56% no visiem gad ījumiem, ir JIoA, kurš daudz biež āk ir sastopams meiten ēm. Otra biež āk sastopam ā forma ir JIpA ar negat īvu RF – l īdz pat 28% un biež āk sastopams meiten ēm (Ringold et al., 2005; Ravelli, Martini, 2007; Woo, Colbert, 2009). Vien īgais subtips, kur ā dzimumu sadale ir l īdzv ērt īga ir sistem ātiskais artr īts, kurš ir sastopams l īdz pat 17% no visiem gad ījumiem (Ravelli, Martini, 2007). Pēdējo gadu p ētījumos ir konstat ēts, ka aptuveni 40 l īdz 60% pacientiem slim ība 5 gadu laik ā p āriet tik pat strauji, k ā t ā ir izpaudusies, bet aptuveni 10% att īst ās Ĝoti augsta funkcionalit ātes nesp ēja (III vai IV klase p ēc Steinbrokera ( Steinbrocker ) funkcionalit ātes

17 iedal ījuma). Pacientiem ar JIoA slim ība norit visviegl āk – konstat ēts, ka slim ības remisija 6. līdz 10. gadam notiek l īdz pat 47% pacientiem (Ravelli, Martini, 2007). Juven īlā idiop ātisk ā artr īta slimniekiem dz īves ilgums ir sa īsin āts (Rumba-Rozenfelde u.c., 2009b; Gabriel, Michaud, 2009) jeb mirst ība JIA gad ījum ā ir 0,27 l īdz 0,29%, kas ir gandr īz 4 reizes vair āk nek ā vid ēji popul ācij ā (Gabriel, Michaud, 2009). N āves c ēlo Ħi ir daž ādi autoim ūni trauc ējumi, tai skait ā, amiloidoze, makrof āgu aktiv ācijas sindroms (Rumba- Rozenfelde u.c., 2009b; Gabriel, Michaud, 2009). Iedzimt ības noz īmi juven īlā idiop ātisk ā artr īta att īst ībā apliecina augsta konkordance starp sibsu p āriem, kas daž ādām slim ības form ām sast āda 70 – 80% (Prahalad et al., 2002). Slim ības sastopam ība starp sibsiem palielin ās no 15 l īdz 30 reiz ēm atkar ībā no popul ācijas. Kā ar ī sibsi m ēdz saslimt vien ā vecum ā, daudz biež āk nek ā vien ā kalend āraj ā gad ā, kas izsl ēdz psiholo ăisko ietekmi (Prahalad, Glass, 2008; Woo, Colbert, 2009). Dv īĦ u p ētījumi ir par ādījuši, ka monozigoto dv īĦ u konkordance attiec ībā uz JIA ir starp 25% un 40%, k ā ar ī palielin ās saslimšanas risks. No visiem re ăistr ētajiem JIA dv īĦ u gad ījumiem 80% ir monozigotiski (Prahalad, Glass, 2008; Woo, Colbert, 2009).

1.2.2. JIA MOLEKUL ĀRĀ ĂEN ĒTIKA: ASOCI ĀCIJU MEKL ĒJUMI

Visvair āk tiek p ētīta JIA saist ība ar cilv ēka leikoc ītu antig ēnu (HLA - Human leukocyte antigen ) lokusu, kurš ir lokaliz ēti 6.hromosomas gar ā pleca lokus ā 6q21. Šaj ā lokus ā ir atrodams ar ī galven ā audu sader ības kompleksa ( Major histocompatibility complex ) lokuss ar vair āk nek ā 200 g ēniem (Prahalad, Glass, 2008; Woo, Colbert, 2009). Prahalads un Glass (Prahalad, Glass, 2008) sav ā rakst ā par JIA ir apkopojis p ētījumu rezult ātus par HLA lokusiem l īdz 2008. gadam (1.3.tabula ). 1.3. tabula Cilv ēka leikoc ītu antig ēnu (HLA) lokusu saist ība ar JIA subtipiem. HLA lokuss HLA klase I HLA klase II A B C DR DP DQ Fenotips B1 B1 A1 B1 Oligoartr īts *2 - - *01, *04 , *07 , *08, *11, *13 *02 *03 , *04 *04 Poliartr īts ar RF- - - - *04 - *03 *03 Poliartr īts ar RF+ *2 - - *08 - *04 *03 Psori ātiskais artr īts - - - *01 - *0101 Artr īts kop ā ar entez ītu - *27 - *01, *04 - *0101, *03 *05 Sist ēmātiskais artr īts - - - *04, *11, - *05 Dati no Prahalad, Glass, 2008; *n – lokusa al ēles, kas atš ėiras p ēc mut ācij ām, „treknrakst ā” iez īmētas al ēles ar aizsarg ājošu efektu.

18 2010. gad ā Tomsons ar kol ēă iem (Thomson et al., 2010) pier ādīja HLA klases II lokusa DRB1 vair āku al ēĜ u saist ību ar juven īlo oligoartr īta persist ējošo formu Austrij ā. Trim al ēlēm *1103, *1104 un *0801 tika konstat ēts saslimšanas riska palielinošs efekts, bet al ēlēm *0101, *0404, *0401, *0701 un *1501 – riska samazinošs efekts. Paral ēli HLA lokusa p ētījumiem ir analiz ēti ar šo lokusu nesaist ītu g ēnu loma JIA att īst ībā. No visiem pētītajiem 54 g ēni vai lokusi uzr ādīja statistiski ticamu saist ību ( P < 0,05) ar slim ību, tai skait ā ar ī interleik īnu saimes prote īnu g ēni (McDowell et al., 1995; Donn et al., 2001; Hinks et al., 2010; Ogilvie et al., 2003; Cinek et al., 2004; Fife et al., 2006; Sugiura et al., 2006; Cimaz et al., 2007; Stock et al., 2008; Hinks et al., 2009; Prahalad et al., 2009; Hinks et al., 2010). 1.4. tabula apkopo analiz ēto vietu lokaliz āciju cilv ēka hromosom ās. Redzams, ka visvair āk ir p ētītas 1., 2. un 6. hromosomas. To var izskaidrot ar to, ka 1. hromosom ā ir lokaliz ēts PTPN22 g ēns, kas bija viens no pirmajiem, kam pier ādīja saist ību ar JIA, k ā ar ī vair āki interleik īnu g ēni. 2. hromosom ā ir lokalizēti IL-1 prote īnu saimes g ēni, bet 6. hromosom ā ir lokaliz ēts HLA lokuss, kas izraisa īpašu p ētnieku interesi. L īdz šim ar JIA saist ītie g ēni nav atrasti tikai piec ās hromosom ās (8., 14., 19., 20. un Y), neskatoties uz to, ka, piem ēram, 14. hromosomas garaj ā plec ā ir lokaliz ēti vair āki kandid ātg ēni asoci ācijai ar autoim ūnām slim ībām, tai skait ā kodola faktora kappa B inhibitora (NF κBI) prote īna g ēns lokus ā 14q13 (le Beau et al., 1992) un im ūnglobul īna smag ās ėē des prote īna g ēns lokus ā 14q23.33 (Kamnasaram, Cox, 2002). Ja apskata g ēnu kod ēto prote īnu darb ību organisma metabolisma ce Ĝos, tad var secin āt, ka liel ākā da Ĝa (70% no visiem g ēniem) ir saist īti ar im ūnsist ēmas funkcij ām. Asoci āciju atrod ar ī ar g ēniem, kuru produkti ir iesaist īti asinsrit ē, ren īna – angiotenz īna sist ēmā, transkripcijas faktoru darb ībā, aminosk ābju sint ēzē, dzelzs metabolisma ce Ĝos, transkripcijas regul ācij ā (augšanas faktori), k ā ar ī prote īnu degrad ācijas procesos. Juven īlajam idiop ātisko artr ītam ir saist ība ar LMP2 g ēna kod ējoš ā reăiona CfoI polimorfismu. Proteasomas subvien ības LMP2 B al ēles homozigot ā forma palielina uz Ħē mību pret JIA un ietekm ē slim ības fenotipu (Pryhuber et al., 1996; Thomson, 2002).

19 1.4. tabula Ar JIA statistiski ticami (P<0,05) saist īto g ēnu vai lokusu (neskaitot HLA lokusus) izvietojums cilv ēka hromosom ās (dati apkopoti no publik ācij ām s ākot ar 1995.gadu*). Hromosoma 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Gēnu vai 9 6 2 4 5 9 2 - lokusu skaits Piez īme 3 g ēni Visi Visi Četri 7 g ēni lokaliz ēti lokusi Abi lokusi gēni lokaliz ēti lokus ā garaj ā īsaj ā garaj ā lokus ā lokus ā 1p13 plec ā plec ā plec ā 5q31 6q21 Hromosoma 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Gēnu vai 1 3 1 2 1 - 1 3 lokusu skaits Piez īme Hromosoma 17. 18. 19. 20. 21. 22. X Y Gēnu vai 3 1 - - 1 2 1 - lokusu skaits Piez īme Abi g ēni atrodas 22q11.23 *Izmantot ās publik ācijas: McDowell et al., 1995; Pryhuber et al., 1996; Date et al., 1999; Sanjeevi et al., 2000; Donn et al., 2001; Donn et al., 2002; Ozen et al., 2002; Alsaeid et al., 2003; Ogilvie et al., 2003; Cinek et al., 2004; Donn et al., 2004; Miterski et al., 2004; Runstadler et al., 2004; Smerdel et al., 2004; Bukulmez et al., 2005; Hinks et al., 2005; Lamb et al., 2005; Runstadler et al., 2005; Viken et al., 2005; Fife et al., 2006; Marciano et al., 2006; Prahalad et al., 2006; Schmeling et al., 2006; Sugiura et al., 2006; Cimaz et al., 2007; Cinek et al., 2007; Eastell et al., 2007; Eike et al., 2007; Lamb et al., 2007; Lindner et al., 2007; Ozyürek et al.,2007; Behrens et al., 2008; Day et al., 2008; Prahalad, Glass, 2008; Prahalad et al., 2008; Rohr et al., 2008; Scheibel et al., 2008; Stock et al., 2008; Albers et al., 2009; Gergely et al., 2009; Hinks et al., 2009a, b, c; Jiménez- Morales et al., 2009; Prahalad et al., 2009; Yao et al., 2009; Zeng et al., 2009; Hinks et al., 2010.

Daudzi g ēni ir p ētīti tikai vienreiz ējos p ētījumos, t ādej ādi to rezult āti ir attiecin āmi tikai uz konkr ētu popul āciju. Citiem g ēniem asoci ācija ar JIA ir pier ādīta vair ākos neatkar īgos pētījumos (1.5.tabula):

20 1.5. tabula Gēni, kuriem konstat ēta asoci ācija ar juven īlo idiop ātisko artr ītu neatkar īgos p ētījumos. G ēns Kod ētais prote īns Lokaliz ācija Saist ība ar Avots genom ā JIA* CCR5 Hemok īna receptors 3p21.31 Nav apr ēė in āta Scheibel et al., 2008 ar C-C mot īvu 5 Lindner et al., 2007 Prahalad et al., 2006 CTLA4 Citotoks īna T- 2q33 Vid ēja vai Hinks et al., 2010 limfoc īta antig ēns 4 neliela saist ība Prahalad et al., 2008 Miterski et al., 2004 IL10 Interleik īns-10 1q31-q32 Neliela saist ība Fife et al., 2006 Donn et al., 2001 IL-1α Interleik īns-1 alfa 2q14 Augsta vai Stock et al., 2008 vid ēja saist ība Donn et al., 2001 McDowell et al., 1995 IL2RA Interleik īna-2 10p15-p14 Vid ēja vai Hinks et al., 2009 receptors alfa neliela saist ība Prahalad et al., 2009 MIF Makrof āga migr ācijas 22q11.23 Vid ēja saist ība Donn et al., 2004 inhib īcijas faktors vai nav Miterski et al., 2004 apr ēė in āta Donn et al., 2001 PTPN22 Prote īnu tiroz īna 1p13.3-p13.1 Augsta vai Cinek et al., 2007 fosfot āze N22 vid ēja saist ība Hinks et al., 2005 Viken et al., 2005 STAT4 Sign āla transdukcijas 2q32.2-q32.3 Vid ēja vai Hinks et al., 2009 un transkripcijas neliela saist ība Prahalad et al., 2009 aktivators 4 TNFAIP3 Tumora nekrozes 6q23 Neliela saist ība Hinks et al., 2009 faktora induc ētais Prahalad et al., 2009 prote īns 3 TNF α Tumora nekrozes 6p21.3 Augsta vai Jiménez et al., 2009 faktors alfa vid ēja saist ība Schmeling et al., 2006 Miterski et al., 2004 Ozen et al., 2002 Date et al., 1999 TRAF1 Tumora nekrozes 9q33-q34 Neliela saist ība Hinks et al., 2009 faktora receptora Prahalad et al., 2009 saist ītais faktors 1 Behrens et al., 2008 * Saist ība ar slim ību p ēc relat īvās starp ības (OR; Odds ratio ): ≥ 2 vai ≤ 0,5 - kl īniska noz īme jeb augsta saist ība ar slim ību, ≥ 1,5 vai ≤ 0,66 - vid ēja saist ība ar slim ību, bet ne kl īniska noz īme; ≤ 1,5 vai ≥ 0,66 - neliela saist ība ar slim ību (Schlesselman, Stolley, 1982; Daly, Bourke, 2000; Uthoff et al., 2002; Motulsky , 2010). Nav apr ēė in āts, ja p ētījum ā OR nav nor ādīts.

21 1.3. Cilv ēka genoma 14. hromosoma

Cilv ēka 14. hromosoma (14ch; Chromosome 14 ) ir viena no piec ām akrocentriskaj ām hromosom ām, kur ām ir rakstur īgs heterohromatisks īsais plecs (14p) un eihromatisks garais plecs (14q), kur ā iesp ējams ir lokaliz ēti visi hromosom ā esošie g ēni (Heilig et al., 2003). 14ch satur apm ēram 3,0 – 3,5 % no visas š ūnas DNS (ghr.nlm.nih.gov/chromosome=14 ). Hromosomas garums ir ap 107 Mbp. 2003. gad ā, kad tika pazi Ħots par 14. hromosomas sekvenc ēšanu, tika secin āts, ka visa kod ējoš ā sekvence jeb eihromatisk ā da Ĝa satur 87’410’661 b āzu p ārus (bp) jeb 87 Mbp (Heilig et al., 2003). Hromosomas garais plecs ir apm ēram 93 Mb garš, apr ēė inot tam vajadz ētu satur ēt 1800 g ēnus, ja katrs g ēns vid ēji genom ā ir lokaliz ēts ik p ēc 30 – 50 kb garas sekvences (Kamnasaram, Cox, 2002). Apskatot 14ch sekvences nukleot īdu sadal ījumu, var teikt, ka guan īna un citoz īna l īmenis ir atbilstošs vid ējam cilv ēka genom ā, jeb prec īzāk 40,86% (Heilig et al., 2003). Visi 14.hromosom ā atrastie g ēni ir lokaliz ēti tikai garaj ā plec ā, k ā to var ētu paredz ēt. L īdz 2003.gadam bija atrasti 1443 g ēni vai g ēniem l īdz īgi rajoni. P ēc šiem datiem g ēni p ārkl āj 38,07Mb no visas sekvences, kas ir 43,6% (Heilig et al., 2003). Šobr īd p ēc GeneCard (http://www.genecards.org/ ) datiem 14.hromosom ā ir 2127 g ēni vai g ēniem l īdz īgi rajoni. Pēc NCBI datu b āzes datiem 14. hromosomas sekvenc ē ar numuru NT_026437.12 ir 1453 gēni, kuriem ir prec īzi noteikts DNS apgabals, mRNS sekvence un da Ĝai ar ī prote īnu funkcija. Gēnu izvietojums hromosom ā ir diezgan neparasts, sal īdzinot ar cit ām cilv ēka hromosom ām. G ēni p ārsvar ā ir izvietoti īpaši bl īvi. Liel ākie g ēnu sabl īvējumi ir no 2 Mb l īdz 6 Mb gari. Turpret ī liel ākais g ēnu „tuksnesis” (vieta, kur nav sastopami g ēni) ir 1,11 Mb liels (vid ēji genom ā tikai 43,5 kb jeb 0,043 Mb). Šaj ā „tuksnes ī” nav sastopami ne tikai g ēni, bet ar ī CpG sali Ħas. Š ādi g ēnu „tuksneši” aiz Ħem 11,7 Mb no visas 14. hromosomas, kas ir 13,4% no visas sekvences (Heilig et al., 2003). Apskatot g ēnu sabl īvējumu un g ēnu „tuksnešu” (1.2.att ēlā F) jaun ākos datus no NCBI datu b āzes, var secin āt, ka nav lielas atš ėir ības ar 2003. gada datiem. Cilv ēka 14. hromosoma ir ar augstu konserv ātismu. T ās homolog ā pe Ĝu genom ā hromosoma (12. hr.) ir Ĝoti l īdz īga p ēc g ēnu un CpG sali Ħu izvietojuma (Heilig et al., 2003). 2003. gad ā bija noteikts, ka vis ā 14.hromosom ā ir atrodams l īdz pat 1768 CpG sali Ħā m, no kur ām 530 ir Ĝoti tuvu g ēnu 5’ galiem. Liels CpG sali Ħu sabl īvējums ir pie subcentrom ēras un subtelom ēras rajoniem, kuros t ās ir sastopamas ik p ēc 9 kb (vid ējais genom ā ir viena CpG sali Ħa ik p ēc 50 kb; Heilig et al., 2003). Šobr īd NCBI datu b āzē 14ch sekvenc ē ar numuru NT_026437.12 ir jau zin āmas 9803 CpG sali Ħas. Neskatoties uz to, ka ir palielin ājies šo sali Ħu skaits, nav izteikti main ījies to sabl īvējuma izvietojums pie subcentrom ēras un

22 subtelom ēras (1.2. att ēls C). CpG sali Ħas aiz Ħem 4,04% no hromosomas sekvences. Gar ākā no t ām ir 4557 bp gara, bet īsākā 201 bp. Vid ējais CpG sali Ħu garums ir aptuveni 442 b āzu pāri.

1.2.att ēls 14.hromosomas uzb ūve (A), kod ējoš ās sekvences NT_026437.12 (B), CpG sali Ħu (C), polimorfismu jeb vari āciju (D), atk ārtojumu un lielu inserciju (E) un g ēnu (F) izvietojums hromosom ā (www.ncbi.nlm.nih.gov ).

Pēc 14. hromosomas piln īgas atkod ēšanas, secin āja, ka dažādu veida atk ārtojumi aiz Ħem 40,37 Mb. Īsie un garie izkais ītie nukleot īdu elementi (SINE un LINE; short interspersed nucleotide elements un large interspersed nucleotide elements ) atrad ās 11,62 un 17,33 Mb liel ā da Ĝā no hromosomas sekvences. Uz 2003. gadu bija konstat ēti vismaz 14 lieli inserciju/del ēciju rajoni, kas ir vismaz 100 b āzu p āru lieli. Asto Ħi no tiem bija Alu tipa insercijas (Heilig et al., 2003). Šobr īd p ēc NCBI datu b āzes datiem 14. hromosomas sekvenc ē ir atrasti 161 018 atk ārtojumi un specifiskas insercijas (daž āda veida transpozoni). No tiem

23 36 638 un 44 018 attiec īgi ir SINE un LINE. No SINE 36 444 ir Alu tipa. Visā apskat ītaj ā hromosom ā ir lokaliz ēti nedaudz vair āk k ā 12 t ūkstoši daž ādu veidu un garuma atk ārtojumu, tai skait ā ar ī viena nukleot īda atk ārtojumi. Atk ārtojumu un specifisku inserciju izvietojums (1.2.att ēls E) kopum ā ir neatkar īgs no g ēnu izvietojuma. Apskatot inform āciju par vienk ārš ām sekvences vari ācij ām jeb polimorfismiem, kas sev ī ietver viena nukleot īda nomai Ħu, mazu b āzu p āru skaitu insercijas/del ēcijas, 14ch sekvenc ē šobr īd ir zin āmas 520 272 vari ācijas, kas vienm ērīgi ir izk ārtotas pa visu garo plecu (1.2.att ēls D). L īdz 2006. gad ā bija zin āmi gandr īz uz pusi maz āk polimorfismi – 259 435. Hromosom ā ir divi 1 MB gari re ăioni, kas ir saist īti ar im ūnsist ēmu – T š ūnas alfa un delta receptoru lokusi, kas atrodas net ālu no centrom ēras, un im ūnglobul īna smag ās ėē des lokusi blakus telom ērai (Heilig et al., 2003). Vair āki svar īgi kandid ātg ēni saist ībai ar autoim ūnām slim ībām ir lokaliz ēti 14ch garaj ā plec ā. Š ādi g ēni ir kodola faktora kappa B inhibitora (NF κBI) prote īna g ēns lokus ā 14q13 (le Beau et al., 1992), transkripcijas faktors FOS un TGF-beta g ēns lokus ā 14q23, im ūnglobul īna smag ās ėē des prote īna g ēns lokus ā 14q23.33 (Kamnasaram, Cox, 2002), presenil īna 1 (PSEN1 ) g ēns lokus ā 14q24.3 (Kamnasaram, Cox, 2002) un vair āki proteasomu g ēni. Proteasomu proteīnu gēni veido specifisku g ēnu klasteri no asto Ħiem g ēniem, tai skait ā, proteasomas beta tipa 5. un 11. subvien ība (attiec īgi PSMB5 un PSMB11 ) un proteasomas PA28 aktivatora 1. un 2. subvien ība (attiec īgi PSME1 (PA28 α) un PSME2 (PA28 β)) lokus ā 14q11.2, proteasomas alfa tipa 6. subvien ība ( PSMA6 ) lokus ā 14q13.1, proteasomas 26S ATF āzes 6. subvien ība ( PSMC6 jeb Rpt4) lokus ā 14q21.1, alfa tipa 3. subvien ība ( PSMA3 ) lokus ā 14q23 un proteasomas 26S ATF āzes 1. subvien ība (PSMC1 jeb Rpt2) lokus ā 14q32.11. 14. hromosomas garaj ā plec ā ir konstat ēti g ēni kandid āti vair ākām slim ībām, piem ēram, Alcheimera slim ībai, musku Ĝu distrofijai, 1. tipa cukura diab ētam. Š īm daž ādaj ām slim ībām ir saist ība ar konkr ētu 14ch g ēnu vai ar ī ar noteiktu 14q lokusu (Kamnasaram, Cox, 2002). Ir zin āmi aptuveni 60 g ēni, kas ir saist īti ar t ādām slim ībām k ā Nimana-Pika slim ība, agr īnā Alcheimera slim ība un Ušera sindroms un t ā formas (Heilig et al., 2003). 14. hromosomas garaj ā plec ā lokaliz ēto 14 mikrosatel ītu mar ėieru atkl āšanas un izp ētes rezult ātā tika konstat ēta IgE fenotipu ăen ētisk ā saist ība ar lokusiem 14q11.2 un 14q13 (Mansur et al.,1999, cit ēts - Sjakste et al., 2004). Vair ākiem 14ch molekul ārajiem mar ėieriem daž ādos lokusos ir ar ī asoci ācija ar daž ādām v ēža form ām (Kamnasaram, Cox, 2002). Pēdējos gados, analiz ējot pacientus ar iedzimt ām anom ālij ām, ir atkl āti hromosomu rajoni, kuriem ir rakstur īgi del ēcijas, inversijas vai duplik ācijas. Piem ēram, analiz ējot genomu

24 pacientam ar iedzimtu kropl ību, tika konstat ēta lokusa 14q32.1 duplik ācija. Pacienta m ātei tika konstat ēts lokusa 14p11.2q32.1 inversija (Sliuzas et al., 2008). Analiz ējot genomu četru gadu vecam pacientam ar iedzimt ām anom ālij ām (dismorfisms un att īst ības trauc ējumi), bez īpašas slim ību v ēstures ăimen ē, tika atkl āta lokusa 14q21q23 inversija (Jiang et al., 2008). Hromosomas centrom ēras gal ā ir segments, kam ir dublik āts ar augstu konserv ātismu 22.hromosomas garaj ā plec ā, aptuveni taj ā paš ā viet ā k ā 14. hromosom ā. Bez t ā ir zin āms, ka 1,6% no 14.hromosomas sekvences sast āv no starphromosom āliem duplik ācijas fragmentiem jeb fragmentiem, kam ir 90% homologs atk ārtojums k ādā cit ā cilv ēka hromosom ā. Šie fragmenti ir vismaz 1kb lieli. Liel ākais š āds fragments ir iepriekš aprakst ītais segments 22. hromosom ā. Tom ēr 14.hromosoma ir ar vismaz āko starphromosom ālo dublic ēto fragmentu daudzumu (Heilig et al., 2003). Dublic ējošie fragmenti, kas atrodas 14ch, sast āda 1,1% sekvences un veido 4 segmentus. Liel ākais no tiem ir 800 kb garš un atrodas tuvu centromērai, k ā ar ī ir da Ĝa no 22. hromosom ā esoš ā dublik āta (Heilig et al., 2003). Hromosom ā l īdz 2003. gadam bija atrasti 20 transportRNS (tRNS) g ēni, no kuriem 14 veido 75 kb lielu kl āstera segmentu. Š īs tRNS g ēnu klasteris ir visbl īvākais vis ā genom ā. Hromosomas garaj ā plec ā ir atrodamas arī nepiln īgas ribosom ālās RNS kod ējošo g ēnu kopijas (Heilig et al., 2003). Analiz ējot specifisku mikroRNS jeb miRNS ( microRNA ) lokaliz āciju genom ā, 2009. gad ā tika atkl āts, ka 14. hromosom ā ir aptuveni 200kb liels apgabals, kas satur 48 miRNS un 41 maz ā kodola RNS ( small nucleolar RNA ) sekvences. Š īs re ăions ir lokaliz ēts hromosomas telom ērā, aptuveni lokus ā 14q32.31, un pagaid ām nav saist īts ne ar vienu g ēnu (Quach et al., 2009). 1.4. Proteasomas

1.4.1. PROTEASOMU VISP ĀRĪGAIS APRAKSTS

Lai nodrošin ātu vienm ērīgu dz īves procesu š ūnā, ir nepieciešams uztur ēt stabilu prote īnu līmeni. Š ūnā nep ārtraukti daž ādu faktoru ietekm ē notiek prote īnu sint ēze, t ātad ir j ābūt ar ī nep ārtrauktai nevajadz īgo, nolietoto un boj āto prote īnu degrad ācijai. Š ī procesa nodrošin āšanai š ūnā eksist ē vair āki prote āžu kompleksi, tai skait ā, proteasomu sist ēma, lizosomu un to enz īmu komplekss, kodola prote āzes, kalpa īns, k ā ar ī kasp āzes (Ciechanover, 2005; Gomes et al., 2006). Liel āko da Ĝu no š ūnas prote īniem (l īdz pat 80%) atpaz īst un degrad ē tieši proteasomu sist ēma, kas, atš ėir ībā no p ārējiem kompleksiem, ir lokaliz ēta gan citoplazm ā, gan kodol ā (Gomes et al., 2006). Turkl āt proteasomu sist ēma degrad ē prote īnus,

25 kas piedal ās visos š ūnas procesos, tai skait ā š ūnas cikla regul ācij ā, apoptoz ē, g ēnu transkcipcij ā un citos procesos (Konstantinova et al., 2008). Pirm ā inform ācija par proteasom ām par ādījās 20. gadsimta 70. gadu beig ās, kad vair ākas enzimologu grupas, kas p ētīja olbaltumvielu katabolismu, atkl āja protein āzi ar lielu molekul āro masu, kas sasniedza 700 kDa, bet olbaltumu kompleksa sediment ācijas koeficients l īdzin ājās 20S. Enz īmam nebija izteikta specifiska substr āta k ā cit ām protein āzēm, t ādēĜ to nosauca par multikatal ītisku protein āžu kompleksu ( multicatalytic proteinase complexes ). Rentgena strukt ūranal īze pier ādīja, ka kompleksam ir cilindriska forma, un izr ādījās, ka šie veidojumi ir Klausa Šerera ( Klauss Sherrer ) 1970. gad ā atkl ātās prosomas. Tagad lieto tikai terminu „proteasomas” (Scherrer, 1990; Scherrer, Bey, 1994; Wolf, Hilt, 2004). Veicot p ētījumu cilv ēka asins š ūnās, Zo ēă ers ar kol ēă iem (Zoeger et al., 2006) pier ādīja, ka visas proteasomas var iedal īt div ās liel ās grup ās – standarta proteasomas un “im ūn”- proteasomas, lai gan var veidoties ar ī proteasomas, kas p ēc uzb ūves da Ĝē ji pieder gan vienai, gan otrai grupai. Bet katrai lielajai grupai ir iesp ējams izdal īt v ēl 6 apakštipus (Glickman, Raveh, 2005; Rechsteiner, Hill, 2005; Gomes et al., 2006): 1. bez aktivatora; 2. ar vienu aktiv ātoru 19S; 3. ar diviem aktivatoriem 19S; 4. ar aktivatoriem 19S un PA28 αβ ; 5. ar aktivatoriem 19S un PA28 γ; 6. ar aktivatoriem 19S un PA200. Ir pier ādīts, ka proteasomas ir atrodamas gan kodol ā, gan citoplazm ā, tom ēr to koncentr ācija daž ādās š ūnas da Ĝā s ir atš ėir īga. Citoplazm ā proteasomas savienojas ar centrosom ām, citoskeletu un glud ā endoplazmatisk ā t īkla ārējo pusi, bet kodol ā t ās ir sastopamas uz kodola matriksa, kodoli Ħā to nav (Scherrer, 1990; Wojcik, DeMartino, 2003; Glickman, Raveh, 2005). Vair ākiem proteasomu prote īniem ir ar ī kodola lokaliz ācijas sign āls, kas apliecina proteasomu pieder ību kodolam (Bey et al., 1993; Tanaka, 1995). Citoplazm ā šie prote īni koncentr ējas galvenok ārt br īvās netransl ējam ās mRNS frakcij ās (Sjakste et al., 2001). Apskatot, k ādos audos jeb š ūnu tipos ir atrodamas proteasomas, ir j āsaka, ka t ās ir sastopamas vis ās š ūnās (Scherrer, 1990; Wojcik et al., 2000; Krüger et al., 2001), k ā ar ī starpš ūnu telp ā, piem ēram, plazm ā vai alveolu š ėidrum ā (Zoeger et al., 2006; Sixt, Dahlmann, 2008).

26 Proteasomu pamatstrukt ūra ir 20S proteasoma (1.3.att ēls), kas ir kompleksa galven ā da Ĝa jeb serde, kas p ēc izskata atg ādina 15x10 nm cilindru un kuras molmasa ir aptuveni 700kDa (Scherrer, Bey, 1994; Tanaka, 1995; Coux et al., 1996; Wojcik et al., 2000; Wolf, Hilt, 2004). To veido četri gredzeni, no kuriem katru veido septi Ħas attiec īgas subvien ības, kuru molekulmasas ir no 20 līdz 36 kDa (Scherrer, Bey, 1994; Tanaka, 1995; Coux et al., 1996; Wolf, Hilt, 2004). Ārējie gredzeni ir veidoti no daž ādām α subvien ībām, bet iekš ējie – no β subvien ībām (Adams, 2003; Groll et al., 2003; Wolf, Hilt, 2004; Gomes et al., 2006).

1.3.att ēls Proteasomu pamatstrukt ūra jeb 20S proteasoma un „im ūn”-proteasoma.

Proteasomas sav ā vienk ārš ākaj ā form ā, k ādas t ās ir arheobakt ērij ās, satur tikai viena tipa α un viena tipa β subvien ības. Z īdītāju š ūnas satur septi Ħus daž ādus α subvien ību g ēnus un 11 daž ādus β subvien ību g ēnus (Wolf, Hilt, 2004; Groettrup et al., 2010). Z īdītāju organismos, tai skait ā ar ī cilv ēka, α subvien ības savstarp ēji ir ar vid ēji 30% identisk ām sekvenc ēm (Gomes et al., 2006). Proteasomu veidošan ās proces ā (1.4.att ēls) pirmais solis ir visu subvien ību sint ēze līdz īgos daudzumos, kas liek dom āt par vienotu transkripcijas meh ānismu. Ir zin āms, ka tieši stresa laik ā visu proteasomu prote īnu sint ēze strauji palielin ās. P ētot augoš ās raugu š ūnas, ir pier ādīts, ka vienotais transkripcijas faktors, kas nodrošina visu proteasomu kodolu prote īnu gēnu sint ēzi, ir prote īns Rpn4. Šis prote īns ir proteasomu aktivatora subvien ība, k ā ar ī tas atpaz īst proteasomu aktiviz ācijas kontroles elementu (PACE; proteasome activation control element ) visu subvien ību g ēnu promoteros (Glickman, Raveh, 2005). Visas beta subvien ības, iz Ħemot β3 un β4, sintez ējas neakt īvā form ā ar propet īdu N-gal ā, kas tiek atš ėelts, saistoties ar akt īvo subvien ību, veidojoties gredzenam (Meiners et al., 2003).

27 Nākošais posms (1.4.att ēls) ir specifisku kompleksu izveidošan ās citoplazm ā (Meiners et al., 2003; Glickman, Raveh, 2005; Hirano et al., 2008), jeb prec īzāk, pie endoplamatisk ā t īkla (Fricke et al., 2007). Vis ātr āk z īdītāju š ūnās izveidojas α subvien ības gredzens ar visiem septi Ħiem prote īniem. Ies ākum ā pie š ī gredzena piesaist ās PAC1/PAC2 heterodim ērs un PAC3/PAC4 komplekss (Hirano et al., 2008). Alfa gredzena piln īga izveidošan ās, ir sign āls, lai s āktos beta subvien ību pievienošan ās. Pirm ā pievienojas β2 subvien ība, kam seko β3 un β4 (šī br īža sediment ācijas koeficents proteasomu veidojumiem ir 13S), bet p ēdējā piesaist ās β7 subvien ība. Pievienojoties β4, pie proteasomas pievienojas ar ī Ump1 jeb POMP prote īns (Wolf, Hilt, 2004; Fricke et al., 2007; Hirano et al., 2008). Gala proces ā izveidojas „pus”- proteasomas ar sediment ācijas koeficentu 16S. Tad notiek dimeriz ācijas process jeb divu 16S kompleksu savienošan ās, tam seko beta subvien ību N-termin ālo galu atdal īšan ās un Ump1 prote īna degrad ācija (Meiners et al., 2003; Wolf, Hilt, 2004; Glickman, Raveh, 2005; Fricke et al., 2007; Hirano et al., 2008).

1.4.att ēls Proteasomu veidošan ās š ūnā endoplazmatisk ā t īkla (ET) membr ānas tuvum ā (Fricke et al., 2007).

Esot „pus”-proteasomu st āvokl ī, notiek kompleksa transport ēšana caur kodola membr ānu, kur tai piesaist ās heterodim ērs Nob1 un Pno1/Dim2, rezult ātā tiek aktiviz ēta β subvien ību prote āžu darb ība kodol ā, dimeriz ācija un prote īna Ump1 degrad ācija (Glickman, Raveh, 2005). Pārējie piesaist ītie prote īni un to kompleksi tiek vai nu degrad ēti, vai tie atdal ās (Hirano et al., 2008).

28 Proteasomas p ēc proteol ītisk ās aktivit ātes ir N-termin ālā nukloef īla hidrol āzes ar treon īnu kā N-termin āla akt īvo nukleof īlu (Wolf, Hilt, 2004; Rechsteiner, Hill, 2005; Konstantinova et al., 2008). Proteasom ām piem īt vismaz piecas daž ādas proteol ītisk ās aktivit ātes, kas ir atkar īgas no β subvien ību kombin ācijas. Brīvā N-termin ālā treon īna atlikumi, trij ās no septi Ħā m β tipa subvien ībām, darbojas k ā nukleof īli un ir svar īgi katal īzes meh ānism ā. Sal īdzinot ar zem ākiem eikariotiem, z īdītāju genom ā ir kod ētas septi Ħas β subvien ības ar prote āžu aktivit āti, lai gan katr ā proteasom ā atrodamas tikai tr īs. Š īs subvien ības var main īties p ēc īpašas stimul ācijas (Wolf, Hilt, 2004; Glickman, Raveh, 2005; Rechsteiner, Hill, 2005; Groettrup et al., 2010). Sadarbojoties abu iekš ējo gredzenu trim beta subvien ībām ar proteol ītisko aktivit āti, t ās kop īgi tiek gal ā gandr īz ar vis ām pept īdsait ēm, vien īgi ne ar sait ēm, kas seko p ēc glic īna un prol īna (Meiners et al., 2003; Rechsteiner, Hill, 2005; Kapeta et al., 2010). Prote īni p ēc degrad ācijas proteasom ās tiek sadal īti 4 – 25 pept īdu garos fragmentos (Gomes et al., 2006). Dažos gad ījumos degrad ācija notiek tikai l īdz noteiktam l īmenim, piem ēram, lai aktiv ētu prote īnu. K ā piem ēru var min ēt NFkappaB, kad no neakt īva prote īna p105 tiek atš ėelt da Ĝa, lai izveidotos akt īvā prote īna subvien ība p50 (Gomes et al., 2006). ěoti l īdz īgas 20S proteasom ām ir t ā saucam ā “im ūn”-proteasomas (1.3. att ēls). Abas proteasomas sav ā starp ā atš ėiras ar trim β subvien ības prote īniem. Subvien ību nomai Ħu izraisa š ūnas indukcija ar iekaisuma citok īniem, piem ēram, interferonu-γ vai tumoru nekrozes faktors α (TNF-α). Standarta proteasom ām β1, β2 un β5 subvien ības tiek aizvietotas ar LMP2 jeb β1i (saukt ar ī par PSMB9), LMP7 jeb β5i (PSMB8) un MECL-1 jeb β2i (PSMB10, LMP10), kas ir prote īni ar zemu molekulmasu un ko m ēdz ar ī saukt par proteasomu „im ūn”- subvien ībām (Brooks et al., 2000; Mishto et al., 2003; Konstantinova et al., 2008; Scheffler et al., 2008; Groettrup et al., 2010). “Im ūn”-proteasomas tiek saist īta ar I klases galven ā audu sader ības kompleksa prote īnu veidošanos jeb aktiviz āciju (Mishto et al., 2003). Tīmusa garozas š ūnās ir sastopamas īpašas formas „im ūn”-proteasomas, kas no parast ās atš ėiras ar LMP7 jeb β5i. T ās viet ā ir specifiska β5t (saukta ar ī par PSMB11) molekula, kas ir sastopama tikai t īmusa garozas š ūnās. Š ī prote īna sint ēze un nomai Ħa nav atkar īga no interferonu-γ indukcijas (Murata et al., 2007; Tomaru et al, 2009; Groettrup et al., 2010).

1.4.2. PROTEASOMAS AKTIVATORI

Degrad ējamais prote īns 20S proteasom ā iek Ĝū st caur alfa subvien ību gredzenu, kas parasti ir sl ēgt ā veid ā un veido Ĝoti šauru kan ālu, jo trauc ē alfa subvien ību savstarp ēji saist ītie N-termin āli (Tanaka, 1995; Coux et al., 1996; Wojcik et al., 2000). T āpēc 20S proteasomas proteol ītisk ā darb ība ir zema. Lai tiktu degrad ētas lielas olbaltumvielas, pie 20S proteasomas

29 ir j āpievienojas aktivatoriem jeb regulatorajiem kompleksiem, kas atvieglo pieeju akt īvajam proteasomu centriem. Tieši aktivatori, saistoties ar α subvien ību br īvajiem galiem, atver proteasomu kan ālu prote īnu degrad ācijai (Tanaka, 1995; Coux et al., 1996; Rechsteiner, Hill, 2005). Šobr īd ir zin āmi tr īs aktivatori: 19S jeb PA700, 11S jeb PA28 un PA200. 19S aktivators ir ATF āzes komplekss (~800 – 1300 kDa), kas ir V-tipa termin āls ar vair ākām subvien ībām, kuru molekulmasa ir no 25 l īdz 110 kDa (Tanaka, 1995; Tanaka, Tsurumi, 1997; Glickman, Raveh, 2005). Z īdītājiem 19S komplekss sast āv no 16 l īdz 20 subvien ībām (Konstantinova et al., 2008). Visas subvien ības var iedal īt div ās grup ās. Vien ā grup ā ietilpst vismaz sešas subvien ības, kuras veido unik ālu multig ēnu homolo ăisku polipept īdu saimi, un otra grupa – apm ēram 15 ATF āzi nesaturošas subvien ības, vairums no kur ām p ēc uzb ūves nav savstarp ēji saist ītas (Glickman, Raveh, 2005). Piem ēram, sirds musku Ĝa šūnās esošais 19S regulatorais komplekss satur 6 ATF āzes subvien ības (Rpt1 - 6), kas veido pamata da Ĝu, un 11 ne ATFatkar īgās subvien ības (Rpn), no kur ām 3 atrodas pamata da Ĝā, bet p ārējās veido „v āka” ( lid ) da Ĝu (Plemper, Hammond, 2002; Glickman, Raveh, 2005; Gomes et al., 2006; Konstantinova et al., 2008), kas ir saist īta ar COP9 sign ālmolekulu (Collins, Tansey, 2006). 19S komplekss ir Ĝoti konservat īvs: tas maz atš ėiras raugu un pat zīdītāju organismos (Rechsteiner, Hill, 2005). 19S aktivatori var pievienoties 20S proteasom ām vien ā vai abos galos (1.5. att ēls), atkar ībā no k ā veidojas proteasomas ar sediment ācijas koeficientu attiec īgi 26S vai 30S (~1500 – 2000 kDa). Tom ēr literat ūrā abas š īs proteasomas apz īmē ar vienu nosaukumu – 26S proteasoma (Wojcik et al., 2000; Wolf, Hilt, 2004; Collins, Tansey, 2006; Gomes et al., 2006). Šis komplekss ir Ĝoti stabils un iztur īgs pret deter ăentu un s āĜ u iedarb ību (Scherrer, Bey, 1994; Coux et al., 1996), lai gan 26S proteasomas ir daudz j ūtīgākas pret oksidat īvo stresu, nek ā 20S proteasomas. Tas liek dom āt, ka tieši vienk ārš ā proteasomas forma piedal ās šūnas izdz īvošanas procesos, piem ēram, pie oksid ācijas stresa (Gomes et al., 2006). Apm ēram 80 – 90% no visiem iekšš ūnu prote īniem tiek degrad ēti 26S proteasom ā (Zolk et al., 2006). Visi no šiem prote īniem pirms degrad ācijas tiek „iez īmēti” jeb tiem tiek pievienota poliubikvit īna ėē de ar vismaz trim l īdz četr ām molekul ām (Coux et al., 1996; Wojcik et al., 2003; Wolf, Hilt, 2004).

1.5.att ēls Proteasomu serdes (20S) un aktivatoru (19S un 11S) iesp ējamo kombin āciju mikroskopiskie un grafiskie att ēli (http://www.servlab.co.kr/biomol/focus0802.htm).

Ubikvit īns (Ub) ir 76 aminosk ābju gara polipept īdu ėē de, kas ir atrodama visos eikariotos. Izopept īda saite veidojas starp substr āta liz īna (Lys) atlikumu un ubikvit īna glic īna (Gly) C-termin ālu ar enz īmu kask ādes pal īdz ību (Wojcik et al., 2003; Yang, Yu, 2003). Ubikvit īna pievienošanas process ir ATF atkar īgs un s ākas ar ubikvit īna aktiviz ācijas enz īmu E1, kas saist ās ar Ub molekulu un nodrošina š īs molekulas transportu un saist īšanos pie ubikvit īna saist īšan ās prote īna E2. Treš ā prote īnu grupa E3 jeb ubikvit īna-prote īna lig āzes, saistoties ar prote īnu, veido sign ālu E2 prote īnam, un notiek E2 un E3 savstarp ēja saist īšan ās. Šī procesa laik ā Ub pievienojas pie degrad ējam ā prote īna. E3 prote īniem ir divi specifiski dom ēni, no kuriem viens atpaz īst degrad ējamos prote īnus un saist ās ar tiem, bet otrs saist ās ar E2 molekulu. Pie katra degrad ējam ā prote īna piesaist ās vismaz v ēl divas Ub molekulas, kas noz īmē, ka E1-E2-E3 kask āde tiek atk ārtota vair ākk ārt īgi. Otra iesp ēja piesaist īt papildus v ēl divas Ub molekulas ir notiekot reakcijai starp monoubikvitin ēto prote īnu un poliubikvit īna ėē des/elong ācijas faktora (E4) kompleksu. Bet tas var notikt tikai p ēc pirm ās Ub molekulas piesaist īšan ās (Wolf, Hilt, 2004; Ciechanover, 2005; Martinez-Vicente et al., 2005). Ubikvitin ētais substr āts savienojas ar 19S regulator ā kompleksa „v āka” subvien ībām un ar ATF āzes pal īdz ību tiek ievirz īts 26S proteasom ās. Pirms substr āts nok Ĝū st proteasomu serdes dobum ā, 19S aktivatora pamata da Ĝa atdala ubikvit īna molekulas (Wolf, Hilt, 2004; Collins, Tansey, 2006; Zolk et al., 2006; Konstantinova et al., 2008). Atš ėir ībā no 20S proteasomas, 26S proteasomas sp ēj degrad ēt ar ī poliadenil ētu mRNS (Konstantinova et al., 2008).

31 Divi citi evolucion āri konservat īvi aktivatori ir PA28 jeb 11S un PA200. Visbiež āk šie divi aktivatori veido t ā saucam ās „hibr īd”-proteasomas, kur ām vien ā gal ā ir 19S komplekss, bet otr ā 11S vai PA200 (1.5.att ēls; Kloetzel, 2004; Rechsteiner, Hill, 2005). PA200 ir vienas ėē des prote īns ar aptuveni 200 kDa lielu molekulmasu, kas ir sastopams organismos, s ākot ar raugu un beidzot ar cilv ēku (Ustrell et al., 2002; Rechsteiner, Hill, 2005). PA200 aktivators ir visv ēlāk atkl ātais. Par t ā lomu š ūnā ir izteikta hipot ēze, ka tas ir saist īts ar DNS repar āciju. Tiešu pier ādījumu tam nav, bet par labu šai hipot ēzei ir vair āki fakti. K ā pirmo faktu ir j āmin, ka aktivators ir daudz vair āk sastopams kodol ā nek ā citoplazm ā (Ustrell et al., 2002). Otrk ārt, PA200 prote īns ir izteikti ekspres ēts s ēkliniekos, kur mejozes laik ā palielin ās DNS dubultp ārāvumi. (Ustrell et al., 2002; Rechsteiner, Hill, 2005). Tom ēr piln īga skaidr ība par PA200 lomu š ūnā v ēl nav. PA28 aktivators ir sastopams augst ākajos eikariotiskajos organismos, bet ne raug ā. Aktivators sast āv no septi Ħiem 28 kDa lieliem prote īniem (Kloetzel, 2004; Rechsteiner, Hill, 2005). Ir sastopamas tr īs PA28 subvien ības: α, β un γ. Alfa un beta subvien ības veido heteroheptom ēru, bet gamma subvien ība – homohepterom ēru. 11S aktivators, pievienojoties 20S proteasomai, veido papildus gredzenu (Rechsteiner, Hill, 2005). Analiz ējot visu subvien ību sekvences, ir pier ādīts, ka dublic ējoties g ēnam, kas kod ē γ subvien ību, veidojas g ēns, kas kod ē α subvien ību. Turpret ī dublic ējoties α subvien ības gēnam, veidojas β subvien ības kod ējošais g ēns (Rechsteiner, Hill, 2005). Ir zin āms, ka α un β subvien ības ir sastopamas gandr īz visos audos, tai skait ā ar ī im ūnsist ēmas š ūnās, bet nav sastopamas smadze Ħu š ūnās. Turkl āt γ subvien ībā l īmenis smadze Ħu š ūnās ir Ĝoti augsts, sal īdzinot ar zemo l īmeni p ārējos audos (Kloetzel, 2004; Rechsteiner, Hill, 2005). Atš ėiras ar ī PA28 αβ un PA28 γ izvietojums š ūnā: PA28 αβ ir galvenok ārt sastopams citoplazm ā, bet PA28 γ – kodol ā (Rechsteiner, Hill, 2005). PA28 αβ veidošanos stimul ē interferons gamma un daž ādas infekcijas, turpretim PA28 γ sint ēzi interferons neietekm ē un infekcijas laik ā tā samazin ās (Rechsteiner, Hill, 2005). Tādej ādi var secin āt, ka PA28 αβ aktivatoram ir noz īme im ūnsist ēmas darb ībā. Zinot šo faktu rodas jaut ājums, vai PA28 αβ aktivatoram nav saist ība ar „im ūn”- proteasom ām, kas ir izteikti sintez ētas tieši im ūnš ūnās (Kloetzel, 2004; Rechsteiner, Hill, 2005). Veicot p ētījumus, ir pier ādīta „im ūn”-proteasomas un PA28 αβ aktivatora iesp ējam ā saist ība. Izol ējot pel ēm PA28 β g ēnu, neveidojas PA28 αβ aktivators un „im ūn”-proteasomas līmenis izteikti samazin ās, sal īdzinot ar pel ēm, kur ām š īs g ēns ekpres ējas (Rechsteiner, Hill,

32 2005 – cit ēts Preckel et al., 1999). Pret ēji Preckela ( Preckel ) un kol ēă a rezult ātiem Murata (Murata ) ar kol ēă iem (Rechsteiner, Hill, 2005 – cit ēts Murata et al., 2001) konstat ēja, ka visticam āk PA28 αβ neiesaist ās tieši „im ūn”-proteasomas sint ēzē, bet dr īzāk im ūnš ūnās nodrošina melanomas antig ēna TRP-2 specifiska epitopa veidošanos. T āpēc ir izteikta varb ūtība, ka PA28 αβ aktivators pal īdz specifisku epitopu veidošan ās proces ā (Kloetzel, 2004; Glickman, Raveh, 2005). PA28 αβ darbojas ar ī cit ā š ūnās. Piem ēram, hroniski stimul ējot truša skeleta musku Ĝus, tajos tr īsk ārt īgi palielin ās 20S proteasomas sint ēze un 70-kārt īgi tieši PA28 αβ aktivatora sint ēze (Rechsteiner, Hill, 2005). Par PA28 γ lomu organisma šūnās v ēl piln īgas skaidr ības nav. Ir konstat ēts, ka pelēm bez PA28 γ subvien ības g ēna ir liel āki embrion ālie fibrioblasti un ir nov ērota liel āka G1 š ūnu proporcija un bl īvums, kas liek dom āt par iesp ējamo PA28 γ lomu šūnas cikl ā (Rechsteiner, Hill, 2005 – cit ēts Murata et al., 1999).

1.4.3. PROTEASOMU NEPROTEOL ĪTISK Ā DARB ĪBA

Proteasomu loma organisma š ūnās galvenok ārt tiek saist īta ar t ās proteol ītiskaj ām īpaš ībām, tom ēr p ēdējos gados ir par ādījušies p ētījumi, kas pier āda, ka proteasomu darb ība var b ūt nesaist īta ar prote īnu degrad āciju (Collins, Tansey, 2006; Malik et al., 2009). Proteasomu sist ēmas neproteol ītisk ā darb ība ir saist īta gan ar 20S proteasomu (Malik et al., 2009), gan ar t ās 19S un 11S aktivatoru kompleksiem (Collins, Tansey, 2006; Konstantinova et al., 2008; Kim et al., 2009; Malik et al., 2009). Pētījumos ar rauga genomu ir atkl āts, ka vair āki simti g ēnu ir saist īti ar 20S proteasomu un/vai 19S kompleksu neatkar īgi no prote īnu degrad ācijas procesa (Malik et al., 2009) Ir pier ādīts, ka 19S komplekss ir iesaist īts vair āku stresa atbildes reakcijas prote īnu g ēnu transkripcij ā. Turkl āt š ī funkcija ir neatkar īga no t ā dal ības proteol īzē (Collins, Tansey, 2006; Malik et al., 2009). Viens no g ēniem, kura transkripcij ā piedal ās 19S pamata subvien ības, ir p53, turkl āt š ī regul ācija ir negat īva (Kim et al., 2009). 19S aktivators veido transkripcijas kompleksu g ēna promoter ī RNS sint ēzes procesa uzs ākšanai. Liela noz īme šaj ā proces ā ir aktivatora pamata subvien ībām un to ATF āžu aktivit ātei (Collins, Tansey, 2006; Konstantinova et al., 2008; Malik et al., 2009). Turpretim ribosom ālo prote īnu g ēnu ekspresija ir atkar īga tieši no 20S proteasomas (Malik et al., 2009). Kā v ēl vienu 19S kompleksa funkciju var min ēt histonu metil ēšanu. Pamata da Ĝas prote īni Rpt4 un Rpt6 ir nepieciešami histona H3 metil ēšanai pie liz īna 4. un 79. atlikuma, kas ir sign āls akt īvās vietas transkripcijai (Konstantinova et al., 2008).

33 Šie fakti atbalsta s ākotn ējo K. Šerera (C.Scherrer) hipot ēzi par to, ka proteasomas ir prote īnu ekspresijas regul ātējas (Scherrer, Bey, 1994)

1.4.4. PROTEASOMU SAIST ĪBA AR SLIM ĪBĀM

Šūnas homeost āze ir atkar īga no prote īnu degrad ācijas intensit ātes, tās izmai Ħas var izrais īt patolo ăiju att īst ību (Gomes et al., 2006). Ja k āds prote īns netiek laic īgi degrad ēts, tad sekas var b ūt sākot ar neirolo ăisk ām slim ībām (piem ēram, Parkinsona, Hantingtona slim ības) un beidzot ar daž ādiem jaunveidojumiem (Plemper, Hammond, 2002; Wolf, Hilt, 2004). 1.6. tabul ā ir apkopoti dati par daž ādu patolo ăiju saist ību ar proteasomu sist ēmu (p ēc Plemper, Hammond, 2002). 1.6. tabula Dažas proteasomu sist ēmas saist ības ar daž ādām patolo ăij ām atkar ībā no degrad ējam ā prote īna (dati no publik ācijas Plemper, Hammond, 2002). Slim ību grupa Slim ība Ietekm ētie prote īni Neirode ăenerat īvās Alcheimera slim ība Ubikvit īns B Presenil īns 1 un 2 Parkinsona slim ība Parkins UCH-L1 Α-sinukl ēins Hantingtona slim ība Hantingt īns Spinocerebellar ā trieka Ataks īns 1 Angelma Ħa sindroms E6-AP Audz ēji Papilomas v īrusa izrais ītais dzemdes p53 kakli Ħa v ēzis Kolorekt ālā un kr ūts karcinoma p27 Von Hippel Lindau sindroms Von Hippel Lindau prote īns Metabolisk ās Cistisk ā fibroze CFTR Vilsona slim ība Vilsona prote īns Lidleja sindroms ENaC A tipa insul īna rezistences sindroms Insul īna proreceptors

Bērnu aknu slim ība, α1-AT emfiz ēma α1-antitrips īns Infekcijas vai v īrusu MHC negat īva regul ācija Epšteina EBNA-1 izrais ītās Barra v īrusa ietekm ē MHC negat īva regul ācija MHC klase I citomegalov īrusa ietekm ē CD4 negat īva regul ācija HIV ietekm ē CD4

34 Vair āki p ētījumi pier āda, ka ubikvit īna – proteasomu sist ēma ir noz īmīga Ĝaundab īgo audz ēju att īst ībā, regul ējot š ūnas cikla gaitu, apoptozes inhib īciju vai palaišanu, k ā ar ī transkripcijas faktoru darb ību. Ubikvit īna – proteasomu sist ēma ir iesaist īta daž ādu audz ēju att īst ībā, degrad ējot transkripcijas faktorus, piem ēram, p53, c-Jun, Nf-κB, t ādej ādi kontrol ējot g ēnu ekspresiju. Turkl āt ubikvit īna – proteasomu sist ēma regul ē audz ēju supresoru (piem ēram, retinoblastomas, VHL prote īns), k ā ar ī protoonkog ēnu (piem ēram, Raf, Abl) un š ūnas ciklu regul ējošo prote īnu (piem ēram, cikl īns, cikl īnatkar īgā kin āze) un to inhib ītoru degrad āciju (Golab et al., 2004). Cukura diab ēta iesp ējam ā saist ība ar proteasom ām ir caur insul īna receptora 1. un 2. substr āta (IRS-1 un IRS-2) prote īnu ubikvitin ēšanu un degrad ēšanu proteasom ās. Šiem prote īniem ir liela noz īme insul īna sign āla kask ādē š ūnā (Golab et al., 2004; Rome et al., 2004; Rhodes, 2005). Aizku Ħă a dziedzera β-šūnu skaits, kas zin āmā m ērā nosaka 2. tipa cukura diab ēta pato ăen ēzes gaitu, ir atkar īgs no IRS-2 prote īna daudzuma š ūnās. Ja IRS-2 prote īna daudzums β šūnās ir samazin āts, pastiprin ās β šūnu apoptoze, k ā sekas var att īst īties cukura diab ēts (Rhodes, 2005). Ir izteikta hipot ēze, ka pazemin āts IRS-1 prote īna l īmenis šūnā var ētu b ūt iesaist īts insul īna rezistences meh ānism ā (Golab et al., 2004). Proteasomu aktivit ātes izmai Ħas ar ī ietekm ē daž ādu patolo ăiju att īst ību (1.7. tabula). Proteasomas aktivitātes izmai Ħas ir saist ītas ar š ūnas novecošanu, kurai seko proteasomu aktivit ātes krišana (Mishto et al., 2003; Martinez-Vicente et al., 2005; Dahlmann, 2007). Citos gad ījumos proteasomu proteol ītisko darb ību inhib ē anom ālais substr āts, piem ēram, Parkinsona slim ības gad ījum ā mut ētais α-sinukl ēins (Martinez-Vicente et al., 2005). Trešais iesp ējamais iemesls proteasomu aktivit ātes izmai Ħai var ētu b ūt proteasomu skaita palielin āšan ās daž ādu iemeslu d ēĜ . Piem ēram, 20-kārt īgs proteasomu koncentr ācijas palielin ājums serum ā tika nov ērots pacientiem ar sistem ātisk ām un org ānu specifisk ām autoim ūnām slimībām (Sixt, Dahlmann, 2008). Alcheimera slim ības viena no biež āk sastopam ām form ām tiek raksturota ar progres ējošu de ăener āciju un smadze Ħu garozas un neironu zudumu, kam seko ekstracelul āru β amilo īda pept īdu nogulsn ēšan ās senil ā plakn ē. Beta amilo īds selekt īvi inhib ē 26S proteasomu peptid āzes aktivit āti, proteasomu inhib ēšana izraisa palielin ātu β amilo īda un t ā priekšte ča produkciju (Lee, Yu, 2005; Martinez-Vicente et al., 2005; Schmitt, 2006). Ir ar ī atkl āts, ka samazinot proteasomas aktivit āti aizku Ħă a dziedzera beta š ūnās, izteikti samazin ās insul īna sekr ēcija (Kawaguchi et al., 2006).

35 1.7. tabula Proteasomu aktivit ātes patalo ăisma izmai Ħas ( p ēc Dahlmann, 2007). Slim ību grupa Slim ība Aktiviz ācijas izmai Ħa Proteasomu forma Sirds slim ības Pārejoša iš ēmija Samazin āta 26S proteasomas Spiediena Samazin āta 26S proteasomas palielin āšan ās Neirode ăenerat īvās Alcheimera slim ība Samazin āta 20S un 26S proteasomas Parkinsona slim ība Samazin āta 20S un 26S proteasomas Amiotrofisk ā later ālā Samazin āta 20S un 26S proteasomas skleroze Hontingtona slim ība Samazin āta 20S un 26S proteasomas Infekcijas vai v īrusu HIV/adenov īrus Nom ākta 26S proteasomas; izraist ītās im ūnproteasomas Hepat īts B Nom ākta 20S un 26S proteasomas HTLV Aktiv ēta Kodola proteasomas Kaheksijas Sepse Palielin āta 20S un 26S proteasomas; Metabolisk ā acedoze Palielin āta 20S un 26S proteasomas;

Kā p ēdējo saikne starp proteasomas sist ēmu un daž ādām patolo ăij ām var min ēt proteasomu sist ēmā iesaist īto g ēnu mut ācij ām un/vai attiec īgi gēnu ekspresiju daž ādās slim ībās (Martinez-Vicente et al., 2005). S īkāk šo t ēmu apskat ījām apakšnoda Ĝā „Proteasomu gēnu p ētniec ība saist ībā ar daž ādām slim ībām”.

1.4.5. PROTEASOMU PROTE ĪNU GĒNI CILV ĒKA GENOM Ā

Arheobakt ēriju proteasomu α un β subvien ību cDNS ir Ĝoti l īdz īga eikariotu proteasomu subvien ību cDNS, kas noz īmē, ka abu proteasomu g ēni pieder vienai saimei. T āpēc visas eikariotu proteasomu subvien ības iedala div ās grup ās – arheobakt ēriju proteasomu α un β subvien ībām l īdz īgās grup ās (Scherrer, Bey, 1994). Cilv ēka proteasomu prote īnu g ēni visi ir c ēlušies no alfa vai beta arheobakt ēriju proteasomu olbaltumiem. Visiem proteasomu prote īniem rakstur īgs īpašs konsensa mot īvs, kas lokaliz ējas ėē des s ākum ā un ir lab āk izteikts α grup ā (Scherrer, Bey, 1994; Sjakste, Sjakste, 2001). Proteasomu g ēnu un aminosk ābju sekvences ir atš ėir īgas, bet ar izteiktu homolo ăiju starp sug ām (DeMartino et al., 1991). Cilv ēka proteasomu un to aktivatoru subvien ību g ēnu nomenklat ūrā tiek lietots sa īsin ājums, kas ir veidots no trim da Ĝā m. Pirmo da Ĝu veido burti PSM ( Proteasome Subunit Macropain ), ko papildina ar attiec īgo subvien ību grupu apz īmējumu: A – 20S proteasomu α tipa subvien ība, B – 20S proteasomu β tipa subvien ība, C un D – attiec īgi proteasomu ATF āžu un neATF āžu subvien ība, E – PA28 kompleksa subvien ība, F – proteasomu

36 inhibitors, G – proteasomu veidošan ās kompleksa subvien ības. Pie burtu savienojuma kl āt tiek pievienots skaitlis, kas apz īmē subvien ības numuru. Visu apkopojot, izveidojas noteiktas subvien ības gēna apz īmējums, piem ēram, PSMA3 (20S proteasomu alfa tipa 3. subvien ība) vai PSMB4 (20S proteasomu beta tipa 4. subvien ība) (James et al., 2006; p ēc NCBI datu bāzes).

1.6.att ēls Proteasomu prote īnu g ēnu izvietojums cilv ēka genom ā. Ar zilu un pasv ītrotu skaitli apz īmēts hromosomas numurs (MT – mitohondrin ālais genoms), ar sarkanu ciparu apz īmēts g ēnu skaits hromosom ā (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/).

Cilv ēka genom ā, tai skait ā ar ī mitohondrion ālaj ā, ir izvietoti 50 proteasomu prote īnu g ēni (1.6. att ēls). Proteasomu g ēni nav sastopami 4., 5., 8., 10., 22. un Y hromosomās. Visvair āk proteasomu g ēni ir sastopami 14. un 17. hromosom ā, kur attiec īgi ir asto Ħi un septi Ħi g ēni, veidojot specifisku proteasomu prote īnu gēnu kl āsteri. Turkl āt 14.hromosom ā visi g ēni ir lokaliz ēti garaj ā plec ā. Visliel āko proteasomu prote īnu g ēnu kl āsteri 14q veido g ēni, kas kod ē proteasomu beta tipa 5. un 11. subvien ību (attiec īgi PSMB5 un PSMB11) un proteasomu PA28 aktivatora 1. un 2. subvien ību (attiec īgi PSME1 (PA28 α) un PSME2 (PA28 β), ) lokus ā 14q11.2, proteasomu alfa tipa 6. subvien ību ( PSMA6 ) lokus ā 14q13.1, proteasomu 26S ATF āzes 6. subvien ību ( PSMC6 jeb Rpt4) lokus ā 14q21.1, alfa tipa 3. subvien ību ( PSMA3 ) lokus ā 14q23 un proteasomu 26S ATF āzes 1. subvien ību (PSMC1 jeb Rpt2) lokus ā 14q32.11 (Sjakste et al., 2004). Inform ācija par šiem g ēniem apkopota 1.8.tabul ā.

37 1.8. tabula 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu raksturojums. Gēns Poz īcija Gēna/prote īna garums SNP / Blakus Mijiedarb ības hromosom ā STR a izvietotie prote īni c Promoteris Eksonu/ cDNS, gēni b + mRNA, bp intronu aminosk skaits . skaits PSMB5 14q11.2 1110 + 9295 2/1 263 19/0 C14orf93 un PSME1 , PSME2 , 880 + 9370 3/2 160 PSMB11 PLK1, PSME3, 1110 + 9295 4/3 203 SKP1 PSMB11 14q11.2 501 + 1894 1/0 300 13/0 PSMB5 un - CDH24 PSME1 14q11.2 531 + 2799 10/9 249 24/0 FITM1 un PSME2 , PSMB5 , 11/10 250 FAM158A PSMB10, PSMB2, PSMB3 PSME2 14q11.2 564 + 3282 11/10 239 12/0 FAM158A un PSME1 , PSMB5 , RNF31 PSMB10, PSMB2, PSMB3 PSMA6 14q13.1 582 + 25107 7/6 246 88/13 KIAA0391 un PSMA7, PSMA4, NFKBIA PSMA3 , PSMA2, PSMA1 PSMC6 14q21.1 513 + 20821 13/12 403 49/3 ERO1L un PSMD6, PSMD4, STYX PSMC5, PSMD9, PSMD2 PSMA3 14q23 640 + 27134 10/9 255 67/11 TRNAK -CUU PSMA7, PSMA4, 10/9 248 un PSMA6 , PSMA1, HMGB1L14 PSMA2 PSMC1 14q32.11 501 + 17015 11/10 440 119/3 KCNK13 un PSMD5, PSME1 , C14orf102 PSMB10, PSMD14, SKP1 a – viena nukleot īda polimorfismi / vienk ārši tand ēmiski atk ārtojumi - inform ācija no datu b āzēm GeneCards (www.genecards.org ) un NCBI; b – Inform ācija no NCBI datu b āzes, pirmais g ēns min ēts 5’ gal ā, bet otrs 3’ gal ā; c – inform ācija no GeneCards datu b āzes, pasv ītroti prote īni, kuru g ēni atrodas 14ch.

Bez proteasomu un t ās aktivatoru subvien ību g ēniem, cilv ēka genom ā ir atrodami v ēl 124 gēni, kas ir iesaist īti proteasomu sist ēmā. Galvenok ārt tie ir prote īni, kas ir saist īt ar ubikvit īnu un š īs molekulas pievienošanu pie degrad ējam ā prote īna (NCBI datu b āze).

38 1.4.6. PROTEASOMU SIST ĒMAS PROTE ĪNU G ĒNU SAIST ĪBA AR SLIM ĪBĀM

Analiz ējot proteasomu prote īnu g ēnu saist ību ar daž ādām slim ībām, uzman ība ir jāpiev ērš ne tikai pašu proteasomu prote īnu g ēniem, bet ar ī ubikvitin ēšanas proces ā iesaist īto prote īnu g ēniem. Otrk ārt, ir j āizdala divi p ētniec ības virzieni, viens ir saist īts ar paša g ēna sekven ču vari ācij ām (viena nukleot īda nomai Ħa, insercijas un del ēcijas, vienk ārši atk ārtojumi jeb mikorsatel īti utt.), bet otrs virziens – ar g ēna ekspresiju slim ībā iesaist ītaj ās š ūnās, sal īdzinot ar vesel ām š ūnām. Prote īnu degrad ācijas proces ā proteasomu sist ēmā ir iesaist īti aptuveni 170 prote īni, t āpēc sīkāk apskat īsim tos g ēnus, kuriem ir atrasta saist ība ar autoim ūnām un/vai metabolisk ām slim ībām, konkr ētāk, ar 2.tipa cukura diab ētu, un g ēnus, kas atrodas cilv ēka 14.hromosom ā. Ir pier ādīts, ka T2DM ir saist īts ar ubikvit īna - proteasomu degrad ācijas ce Ĝu, piem ēram, ar ubikvit īna lig āzes E3 komponentu 1 jeb UBR1. P ētījum ā analiz ēja 15.hromosomas lokusu 15q14 – 22.1 un tur lokaliz ēto g ēnu polimorfismus Jap ānas popul ācij ā. No 21 p ētītamjiem SNP, tikai UBR1 g ēna SNP rs2412747 uzr ādīja saist ību ar 2.tipa cukura diab ētu divos neatkar īgos p ētījumos. Turkl āt ir zin āms, ka pel ēm bez š ī g ēna pastiprin āti samazin ās ėerme Ħa svars uz tauku š ūnu skaita r ēė ina un veidojas aizku Ħă a dziedzera darb ības nepietiekam ība (Yamaguchi et al., 2008). Turpretim It ālijas popul ācij ā tika sekvenc ēts viss PSMD9 g ēns, lai mekl ētu saist ību ar T2DM. P ētnieki atkl āja tr īs vari ācijas, kas bija sastopamas gad ījuma grup ā, bet ne kontroles paraugos, un ir izteikuši pie Ħē mumu, ka tieši šie polimorfismi veicina 2.tipa cukura diab ēta vēlīnu att īst ību it āliešiem (Gragnoli, Cronsell, 2007). Ar 1. tipa cukura diab ētu, kas ir autoim ūna slim ība, ir saist īti „im ūn”-proteasomas proteīnu g ēnu LMP2 (PSMB9 ) un LMP7 (PSMB8) polimorfismi (Deng et al., 1995). LMP2 un LMP7 atrodas II klases galven ā audu sader ības lokus ā un ir lokaliz ēti transporta prote īnu gēnu TAP1 un TAP2 tuvum ā (Kloetzel, 2004). LMP7 g ēna vari ācijas ret ās al ēles homozigotisk ā forma bija ar zem āku frekvenci gad ījuma grup ā nek ā kontrol ē, turkl āt p ēc relat īvā risk ā šis genotips darbojas k ā slim ības aizsarg ājošais faktos. LMP2 g ēna asoci āciju ar 1. tipa cukura diab ētu uzr ādīja kod ējoš ā re ăiona polimorfisms, kas izraisa aminosk ābes argin īna nomai Ħu pret histid īnu 60. poz īcij ā. Š ī vari ācija bija ar v āju saist ību, analiz ējot paraugus kopum ā, bet uzr ādīja augstu asoci āciju starp gad ījuma paraugiem ar specifisku DR4-DQB1*0302 haplotipu (Deng et al., 1995). Iepriekš min ētā p ētījum ā ieg ūtos rezult ātus apstiprina ar ī 2005.gad ā public ētā anal īze (Sia, Weinem, 2005).

39 LMP2 g ēna kod ējoš ā re ăiona polimorfisms ir bieži p ētīts saist ībā ar autoim ūnām slim ībām. Piem ēram, reimato īdālā artr īta juven īlās formas gad ījum ā LMP2 g ēna polimorfisms ietekm ē HLA-B27 jut īgumu (Pryhuber et al., 1996; Thomson, 2002). Kā ar ī š ī polimorfisma asoci ācijas anal īzē ar JIA ir konstat ēts, ka B al ēle un BB genotips ir izteikt āks pacientiem ar pauciartr īta formu, bet, sal īdzinot ar kontroli, BB genotips bija biež āk pacientiem ar poliartr īta formu. Maksimovi ča (Maksymowych) (1995) grup ā tika secin āts, ka proteasomu subvien ības LMP2 B al ēles homozigota forma palielina jut īgumu pret noteikt ām JIA form ām un ietekm ē slim ības fenotipu (Maksymowych et al., 1995a,b; 1997). Analiz ējot citas autoim ūnas slim ības – psori āzi (Krämer et al., 2007) un Greivs slim ību (Heward et al., 1999), statistiski ticami rezult āti tika atkl āti saist ībā ar LMP2 g ēna iepriekš min ēto kod ējoš ā re ăiona polimorfismu, bet ne ar LMP7 g ēna polimorfismu. Turkl āt psori āzi asoci ācijas pētījum ā izteikt āka saist ība LMP2 g ēnam tika konstat ēta starp v īriešu dzimuma paraugiem ar slim ības artrop ātisko formu (Krämer et al., 2007). Pētot Šegr ēna sindromu, divas zin ātnieku grupas analiz ēja LMP7 (Egerer et al., 2006; Krause et al., 2006) un LMP2 , MECL1 , PA28alfa ( PSME1 ), PA28beta ( PSME2 ), PSMA2 , k ā ar ī PSMA4 (Krause et al., 2006) g ēnu ekspresiju. Egerers (Egerer et al., 2006) ar kolēă iem pier ādīja, ka LMP7 g ēna ekspresija ir statistiski noz īmīgi palielin āta siekalu dziedzera š ūnās pacientiem ar prim āro vai sekund āro Šegr ēna sindromu, sal īdzinot ar Sika (Sicca) sindromu. Turpretim Krause (et al., 2006) ar kol ēă iem konstat ēja LMP2 , MECL1 un PSME1 g ēnu ekspresijas palielin āšanos, turkl āt Šegr ēna sindroma pacientiem tika konstat ēta LMP2 prote īna l īme Ħa izteikta palielin āšan ās. Kopsumm ā var secin āt, ka no visiem ubikvit īna – porteasomu sist ēmas g ēniem, kas nav lokaliz ēti 14.hromosom ā, visvair āk saist ībā ar autoim ūnām slimībām ir p ētītas tieši „im ūn”- proteasomu subvien ības LMP2 jeb PSMB9 un LMP7 jeb PSMB8. Šobr īd nav publik āciju tikai par trim 14.hromosom ā lokaliz ētiem proteasomu prote īnu gēniem, tie ir PSMB11 , PSMC6 un PSMC1 . PSME1 un PSME2 g ēni p ārsvar ā ir pētīti kop ā ar LMP2 un LMP7 g ēniem (Miyagi et al., 2003; Krause et al., 2006) un statistiski ticami rezult āti visbiež āk tiek nov ēroti „im ūn”- proteasomu subvien ībām. PSMB5 g ēns ir p ētīts prote īna l īmen ī saist ībā ar t ādu farmakolo ăisku vielu k ā bortezomibs, nevis saist ībā ar slim ībām (Lü et al., 2008; Oerlemans et al., 2008; Wang et al., 2008; Lü et al., 2009). No 14.hromosom ā lokaliz ētajiem proteasomu prote īnu g ēniem visvair āk p ētīts ir PSMA6 . Sākot ar 2003.gadu ir public ēti vismaz 19 p ētījumi, kuros ir analiz ēti PSMA6 g ēna

40 polimorfismi saist ībā ar daž ādām slim ībām (Kalis et al.,2003; Sjakste et al., 2004; Ozaki et al., 2006; Sjakste et al., 2007a, b; Takashima et al., 2007; Barbieri et al., 2008; Banerjee et al., 2008; Bennett et al., 2008; Alsmadi et al., 2009; Banerjee et al., 2009; Freilinger et al., 2009; Hinohara et al., 2009; Honcharov et al., 2009; Lui et al., 2009; Trapina et al., 2009; Bachmann et al., 2010; Sjakste et al., 2010). Pirms tam vai paral ēli v ēl ir public ēti vismaz četri darbi, kuros apskata PSMA6 g ēna uzb ūvi vai funkciju (Sjakste et al., 2001; Sjakste et al., 2002; Sjakste et al., 2003; Tang et al., 2007; Sjakste et al., 2008). Pētot polimorfismu saist ību ar daž ādām slim ībām ir analiz ēti PSMA6 g ēna 6. introna dinukleot īdu atk ārtojums (TG) n (Kalis et al.,2003; Sjakste et al., 2004; Sjakste et al., 2007a; Sjakste et al., 2010) un vair āki SNP, no kuriem visvair āk p ētīts ir 5’UTR re ăiona vari ācija c.- 8C>G (Ozaki et al., 2006; Sjakste et al., 2007b; Takashima et al., 2007; Barbieri et al., 2008; Banerjee et al., 2008; Bennett et al., 2008; Alsmadi et al., 2009; Banerjee et al., 2009; Freilinger et al., 2009; Hinohara et al., 2009; Honcharov et al., 2009; Lui et al., 2009; Trapina et al., 2009; Bachmann et al., 2010). Dinukleot īdu atk ārtojums ir lokaliz ēts PSMA6 g ēna 6.intron ā un tam ir pieš ėirts nosaukums HSMS006 (Sjakste et al., 2003). Š īs mikrosatel īts ir p ētīts saist ībā ar autoim ūno Greivsa slim ību Latvijas popul ācij ā (Sjakste et al., 2004) un ar metabolisko slim ību – 2.tipa cukura diab ētu - Botnijas (Somija) popul ācij ā (Kalis et al.,2003; Sjakste et al., 2007a).

Analiz ējot (TG) n atk ārtojumu Greivsa slim ībā, tika pier ādīta četru al ēĜ u saist ība ar slim ību, turkl āt tr īs no al ēlēm bija ar aizsarg ājošu efektu, bet viena al ēle uzr ādīja rika al ēles paz īmes (OR = 4,18; Sjakste et al., 2004). P ētījum ā Botnijas popul ācij ā par saist ību ar T2DM statistiski ticama atš ėir ība tika konstat ēta vienai al ēlei, un t ā bija ar riska al ēles paz īmēm (OR = 1,99; Kalis et al.,2003; Sjakste et al., 2007a). Izmantojot vair ākus mode Ĝus, Ozaki ar kol ēă iem konstat ēja, ka c.-8C>G SNP ret ā al ēle G palielina g ēna ekspresiju par 1,5 l īdz 1,8 reizes, sal īdzinot ar biež āk sastopamo al ēli. Tam par iemeslu var ētu b ūt specifiska nezin āma kodola faktora saist īšan ās pie DNS al ēles G (Ozaki et al., 2006; Bachmann et al., 2010). Tas var ētu b ūt par iemeslu konkr ētā SNP p ētīšanai tik daž ādās popul ācij ās (dati par G al ēles frekvences sadali daž ādās popul ācijas att ēloti 1.7.att ēlā). K ā redzams 1.7.att ēlā, G al ēles frekvences sadal ījum ā var izdal īt tr īs popul ācijas – Āfrika (1.7. att ēlā dzelteni rombi), Austum āzija (1.7 att ēlā za Ĝi rombi) un Eiropa un Rietum āzija ((1.7. att ēlā violeti rombi). Starp š īm zon ām ir nov ērojama atš ėir ības tieši al ēles sadal ē.

1.7.att ēls PSMA6 g ēna SNP c.8C>G ret ās al ēles frekven ču apkopojums. HAPMAP - HapMap datu b āzē (hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ ); CCR – p ētījums „Coriel Cell Repository” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP ); CEPH – fran ču p ētījums „Centre d'Etude du Polymorphisme Humain”; JBIC-allele – p ētījums, kur ā piedal ījās br īvpr ātīgie Jap ānā. Dzeltenie rombi – Āfrikas popul ācija, za Ĝie rombi - Austum āzija popul ācija; violetie rombi - Eiropa un Rietum āzija popul ācija.

Asoci ācijas dati par c.-8C>G saist ību ar daž ādām slim ībām ir variabli. K ā piem ēru var min ēt p ētījumus par miokarda infarktu. Jap ānas popul ācij ā saist ība ar slim ību tika konstat ēta ar augstu statistisko ticam ību (Ozaki et al., 2006), k ā ar ī statistiski ticama saist ība tika pier ādīta Sa ūda Ar ābijas (Alsmadi et al., 2009) un Ėī nas (Lui et al., 2009) popul ācij ā, bet Lielbrit ānijas (Sjakste et al., 2007b; Bennett et al., 2008) un Jap ānas (Takashima et al., 2007) popul ācij ās saist ība ar šo slim ību netika konstat ēta. Citas sirds un asinsvadu slim ības, kam ir pier ādīta saist ība ar PSMA6 g ēna SNP c.-8C>G, ir Kono ārā nepietiekam ība Jap ānas, Korejas (Hinohara et al., 2009) un Indijas (Banerjee et al., 2009) popul ācij ās un arteri ālā hipertensija pusaudžiem Ukrainas popul ācij ā (Honcharov et al., 2009). Galvas smadze Ħu insults tika p ētīta It ālijas (Banerjee et al., 2008) un V ācijas (Freilinger et al., 2009) popul ācij ās, un netika konstat ēta statistiski ticama atš ėir ība starp kontroles un gad ījuma grup ām. Multipl ās mielomas gad ījum ā V ācijas popul ācij ā al ēle G tika saist īta ar dz īves ilguma palielin āšanos, sal īdzinot ar pacientiem ar C al ēli (Bachmann et al., 2010).

42 2. MATERI ĀLI UN METODIKA

2.1. DNS paraugu kolekcija

Analiz ējot iesp ējamo 14.hromosmas proteasomu prote īnu g ēnu saist ību ar metabolisko un autoim ūno slim ību, izmantoj ām gad ījuma/kontroles p ētījuma sh ēmu. Kop ā analiz ējām četru kolekciju DNS paraugus. Divas no kolekcij ām bija gad ījuma grupas, kuras veidoja DNS paraugi no pacientiem ar 2. tipa cukura diab ētu vai juven īlo idiop ātisko artr ītu, bet p ārējas divas bija attiec īgi pacientu DNS bez š īm slim ībām. S īkāks kolekciju raksturojums sniegts turpm ākaj ā tekst ā.

2.1. tabula Juven īlā idiop ātisk ā artr īta un kontroles 1 grupas DNS kolekcijas apraksts (ANA – antinukle ārās antivielas; RF – reimato īdais faktors; HLB B27 – cilv ēka leikoc ītu antig ēns B27). Kolekcija JIA Kontrole 1 Paz īmes Kop ā JIoA JIpA Paraugu skaits 180 103 56 238 Vid ējais vecums, gadi 14,45 14,65 14,49 - Vid ējais saslimšanas vecums, gadi 11,6 12,45 10,07 - Sievietes, % 62,92 60,40 67,86 58,43 RF „-”, % 83,82 91,67 74,55 - ANA „-”, % 83,87 91,84 75,00 - HLA B27 „+”, % 73,63 66,67 85,71 -

Juven īlā idiop ātisk ā artr īta kolekciju (2.1.tabula) veidoj ām sadarb ībā ar profesori Ingr īdu Rumbu-Rozenfeldu. No vi Ħas grupas sa Ħē mām Bērnu kl īnisk ās universit ātes slimn īcas „Gai Ĝezers” un P. Stradi Ħa universit ātes slimn īcas JIA pacientu asins paraugus. DNS kolekcija veidojām, s ākot ar 2003. gadu. Sa Ħemtos paraugus dal ījām p ēc slim ības apakštipiem, cenšoties veidot katram apakštipam atseviš ėu apakšgrupu. Gala rezult ātā izveidojām divas apakšgrupas – oligoartr īta grupu (turpm āk JIoA), kur ā iek Ĝā vām gan persist ējošo, gan ekstend ējošo oligoartr īta formu, un poliartr īta grupu (JIpA), kur ā ietv ērām poliartr īta formas gan ar negat īvu, gan ar pozit īvu reimatodologo faktoru. P ārējiem subtipiem bija p ārāk maz paraugu atseviš ėas grupas veidošanai. JIoA un JIpA grupas sadale pēc dzimuma (2.1. tabula) ir atbilstoša literat ūrā esošajiem datiem (Ravelli, Martini, 2007). K ā kontroles grupu (turpm āk Kontrole 1) šaj ā p ētījum ā izmantoj ām atseviš ėu Latvijas popul ācijas DNS paraugu kolekciju, ko veidojām no anon īmu (zin āms tikai dzimums un tas,

43 ka pacientam nav autoim ūna slim ība) SIA "R īgas Austrumu kl īnisk ā universit ātes slimn īcas" kl īnika "Bi ėernieki" pacientu asins paraugiem. No slimn īcas sa Ħē mām asins paraugus no pacientiem, kas griez ās slimn īcā p ēc medic īnisk ās pal īdz ības daž ādu traumu ieg ūšanas gad ījumos. Juven īlā idiop ātisk ā artr īta DNS gad ījuma un kontroles 1 kolekciju apraksts ir redzams 2.1. tabul ā. 2. tipa cukura diab ēta asoci ācijas p ētījuma DNS kolekcijas, gan gad ījuma, gan kontroles, vodojām, sadarbojoties ar profesoru Valdi P īrāgu. Gad ījuma grup ā bija iek Ĝauti P. Stradi Ħa universit ātes slimn īcas T2DM pacientu DNS paraugi, bet kontroles grupu veidoja DNS paraugi no šīs slimn īcas endokrinolo ăisk ās noda Ĝas pacientiem, kuriem nekonstat ēja nevienu no cukura diab ēta form ām un kuru vecums un ar slim ību nesaist ītie parametri bija l īdzv ērt īgi gad ījuma grupas pacientiem. 2.2. tabul ā ir redzamas abu grupu raksturojums; gad ījuma grupa turpm āk tiks apz īmēta k ā T2DM (no slim ības anglisk ā nosaukumu type 2 diabetes mellitus ), bet kontroles grupa tiks apz īmēta k ā Kontrole 2. Abu DNS paraugu kolekciju pacientiem noteicām r ādītājus, kas var ietekm ēt slim ības izpausmi, sm ēėē šanu, ėerme Ħa masas indeksu (BMI), k ā ar ī vair ākus medic īniskus parametrus, tai skait ā, arteri ālo hipertensiju, triglicer īdu daudzumu plazm ā, holester īna l īmeni, glikozes l īmeni. Darbam ar DNS paraugu kolekcij ām sa Ħemta at Ĝaujas s ākotn ēji no Latvijas Eksperiment ālās un kl īnisk ās medic īnas instit ūta Zin ātnisk ās izp ētes ētikas komisijas, bet vēlāk no Centr ālās Ētikas komisijas.

44 2.2. tabula 2. tipa cukura diab ēta p ētījuma gad ījuma un kontroles grupas DNS kolekcijas apraksts. T2DM Kontrole 2 Paraugu skaits 104 123 Vid ējais vecums 59,19 ± 9,58 53,78 ± 12,93 Sievietes, % 66,99 53,66 Vid ējais BMI 35,41 ± 16,51 25,82 ± 8,03 Sm ēėē šana: Nav sm ēėē juši 73,68 75,00 Ir atmetuši 18,42 15,00 Sm ēėē 7,89 10,00 Laboratorijas r ādītāji: Arteri ālā hipertensija (%) 70,19 15,45 Dislipid ēmija (%) 33,65 15,45 Triglicer īdi plazm ā, ( mMol/l) 2,51 2,59 Kop ējais holester īns ( mMol/l) 5,64 5,59 ZBL holester īns ( mMol/l) 3,32 3,59 ABL holester īns ( mMol/l) 1,35 1,37 Glik ēmija tukš ā d ūšā ( mMol/l) 9,39 5,09 Hemoglob īns (g/dl) 13,24 12,87 Eritroc ītu skaits (milj/mkl) 4,44 4,35 Leikoc ītu skaits (t ūkst./mkl) 7,80 7,72 Tromboc ītu skaits (t ūkst./mkl) 246,45 265,26 Protein ūrija (g/l) 0,27 0,60 Kreatin īns (mg/%) 1,11 1,76

2.2. DNS izdal īšana un koncentr ācijas noteikšana

DNS izdal īšan ā no asin īm izmantoj ām divas metodes: izs ālīšanas metodi (Juodka et al., 1995) un izdal īšanu ar rea ăenta komplekta jeb kita pal īdz ību (Genomic DNA Purification Kit, Fermentas, Lietuva). Izs ālīšanas metodes protokols: ⇒ Asin īm pievienoj ām atdzes ētu destil ētu ūdeni (vismaz 4 reizes vair āk), mais ījumu sakrat ījām un centrifug ējām, lai nogulsn ētu leikoc ītus. ⇒ Nogulsn ēm pievienoj ām l īzes buferi (10 mM Tris - HCl, 0,32M saharoze,

5 mM MgCl 2, 1% TRITON X100, pH = 7,5), hemogoniz ējām, izmantojot krat ītāju, 10 min ūtes mais ījumu patur ējām uz ledus (-4 o C) un centrifug ējām, lai izgulsn ētu š ūnas kodolus.

45 ⇒ Nogulsn ēm pievienoj ām resuspensijas š ėī dumu (120 mM NaCl, 15 mM EDTA, pH = 8,0), protein āzi K (Proteinase K), RN āzi un 10% SDS (n ātrija dodecilsulf āts). Inkub ējam divas stundas pie 56 o C. ⇒ Pēc inkub ācijas pievienoj ām 5 M NaCl š ėī dumu, atst ājām mais ījumu pie -4o C pusstundu, p ēc tam centrifug ējām, lai atdal ītu š ėidraj ā f āzē DNS molekulas. ⇒ Supernatantam pievienoj ām 96% etilspirtu un atst ājām pie -20 o C l īdz n ākošajai dienai. Centrifug ējām, lai izgulsn ētu DNS molekulas. ⇒ Nogulsn ēm pievienoj ām 70% etilspirtu. Centrifug ējām un nogulsnes ž āvējām. ⇒ Pievienoj ām 100 l destil ētu, autkol āvētu ūdeni, lai izš ėī din ātu nogulsnes. Izdalot DNA ar rea ăenta komplektu, vad ījāmies p ēc pievienot ā protokola. Savstarp ēji metodes atš ėiras ar nepieciešamo asins daudzumu un procesa ilgumu. Pēc DNS izdal īšanas, neatkar īgi no metodes, ir j āpārliecin ās par parauga kvant āti un kvalit āti. Kvalit ātes noteikšanai izmantoj ām elektrofor ēzes metodi 1% agarozes g ēlā. Elektrofor ēzes g ēla att ēlā analiz ējām, vai paraug ā nav RNS un/vai prote īnu piemais ījums, k ā ar ī vai genomisk ā DNA nav fragment ējusies. Paral ēli kvalit ātes anal īzei noteic ām ar ī parauga aptuveno koncentr āciju, izmantojot mar ėieri GeneRuler TM 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Lietuva), kura 500 bp fragments 1:3 š ėaid ījum ā fluoresc ē UV gaism ā kā 20 ng DNS. Noteic ām katra DNS parauga aptuveno koncentr āciju vien ā mikrolitr ā, ko p ārbaud ījām ar spektrofotometra pal īdz ību, nosakot prec īzu DNS koncentr āciju katr ā paraug ā. P ēc ieg ūtās koncentr ācijas apr ēė in ājām cik reizes ir j āšėaida paraugs, lai ieg ūtu darba koncentr āciju, kas ir no 10 l īdz 20 ng/ l. Elektrofor ēzei izmantoj ām 1% agarozes (Chempol, Čehija) g ēlu un 1% TAE buferi (pH = 8,5, 40 mM Tris, 20 mM eti ėsk ābe, 2 mM EDTA). Koncentr ācijas noteikšanai izmantoj ām Eppendorf BioPhotomter (Eppendorf, V ācija). 2.3. Analiz ētie lokusi un to genotip ēšanas metodes

Visu četru kolekciju paraugiem analiz ējām piecus mikrosatel ītus (MS) un septi Ħas viena nukleot īda nomai Ħas (SNP; single nucleotide polymorphisms ) lokaliz ētus 14.hromosomas gar ā pleca proteasomas g ēnu kl āstera rajon ā no 14q11.2 l īdz 14q23. Visi pieci MS ir lokaliz ēti tr īs g ēnu intronos loks ā 14q13.1 – q13.3 (2.1.att ēls). HSMS006 mar ėieris ir lokaliz ēts proteasomas alfa 6. subvien ības g ēnā, bet p ārējie augšup no š ī g ēna divos citos g ēnos - FAM177A1 ( C14orf24) un KIAA0391 . PSMA6 g ēna sestaj ā intron ā lokaliz ētais HSMS mar ėieris ir dinukleot īdu atk ārtojuma jeb (TG) n mikrosatel īts. KIAA0391 gēnā ir lokaliz ēti tr īs mikrosatel īti: HSMS801, HSMS702, HSMS701, kas visi ir dinukleot īdu

46 atk ārtojumi, prec īzāk, attiec īgi (CA) n, (TG) n un (AC) mAT(AC) n. P ēdējais un vist ālāk no

PSMA6 g ēna lokaliz ētais HSMS mar ėieris ir HSMS602, s ākotn ēji raksturots k ā (CAA) n atk ārtojumu.

2.1.att ēls HSMS mar ėieru izvietojums 14.hromosomas lokus ā q13 – q13.2. G ēna eksoni iekr āsoti melni, bet introni – pel ēki; mikrosatel īti atz īmēti ar piecstratu zvaigzni; ar bult ām nor ādīts g ēnu transkripcijas virziens.

Septi Ħus SNP ( PSMB5 gēna polimorfisms c.70C>T; PSMA6 gēnā c.-4543_-4544insC, c.110C>A un c.-8C>G; c.86-104A>G un c.86-46C>T lokaliz ēti PSMC6 gēnā un PSMA3 SNP c.543+138G>A) izv ēlējāmies p ēc to variabilit ātes 40 JIA un Kontroles 1 kolekcijas paraugos. Šaj ā p ētījum ā analiz ējām 14ch proteasomu g ēnu 22 polimorfismus. Izv ēlējāmies SNP, kuru ret ās al ēles frekvence bija liel āka par 0,05 jeb 5,00 %, k ā ar ī kuru genotipēšanas bija pozit īva vismaz 95% paraugu.

2.3.1. MIKROSATEL ĪTU ANAL ĪZE

2.3.1.1. Mikrosatel ītu rajonu amplifik ācijas

Visu mikrosatel ītu genotip ēšan ā izmantoj ām fragmentu garuma anal īzes metodi, kuras pamat ā ir MS re ăiona amplifik ācijas produkta garuma noteikšana. Visu mar ėieru re ăionus amplific ējām ar polimer āzes ėē des reakciju (PCR; polymerase chain reaction ), izmantojot praimeru p ārus (2.3. tabul ā), kuros tiešie praimeri satur fluoresc ējošo iez īmi. PCR praimeru sekvences ir public ētas agr āk (Sjakste et al., 2004). Pirms visu paraugu genotip ēšanas veic ām papildus PCR un sekvenc ēšanas optimiz āciju, kur ā noteic ām gan lab ākos apst ākĜus amplifik ācijai, gan amplific ētā DNS optim ālo koncentr āciju sekvenc ēšanas anal īzei. Katram paraugam veic ām visu piecu mikrosatel ītu rajonu amplifik āciju, PCR produktus sajauc ām un mais ījumu analiz ējām uz sekven ātora ABI Prism® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Lielbrit ānija). Sekven ātor ā tiek izmantoti kapil āri ar g ēlu, kur ā notiek produktu sadal īšana, balstoties uz to migr ācijas ātrumu atkar ībā no DNS molekulas garuma jeb lieluma. Kapil āra vienu galu ievada paraug ā un pievieno spriegumam. Izrais ītā elektrisk ā lauku ietekm ē fragments s āk

47 migr ēt pa kapil ārā esošo g ēlu. Kapil āra otr ā gal ā ir pievienots l āzers, kas izraisa fragmenta fluorescent ās iez īmes sp īdēšanu jeb fluorescenci, ko fiks ē dators un p ārveido analiz ējamos datos.

2.3. tabula HSMS genotip ēšā izmantotie praimeri, to sekvences un sagaid āmais fragmentu garums. MS Praimera Praimera sekvence Sagaid ā- (nosaukums virziens mais PCR _atk ārtojums) fragmenta garums, bp HSMS602 Tiešais 5’-6-FAM-GAGACTCCGTCTCAAAACAG -3’ 177 (CAA) 10 (A) 8 Atgriezeniskais 5’-ACAGTTTGGGGGAAATGTCTTA -3’ HSMS701 Tiešais 5’- HEX-TCCATAGCACTTATCTGACATGC -3’ 136 (AC) 5AT(AC) 19 Atgriezeniskais 5’-AAAATCCCTACCCTTGTGGTG -3’ HSMS702 Tiešais 5’-6-FAM-TGCATCCATTAGACTGGCTTT -3’ 124 (TG) 12 Atgriezeniskais 5’-TGCAGTGACCTTTATTATTGTTTTG -3’ HSMS801 Tiešais 5’- NED-ATGCAGTATGCCACCAACTGT -3’ 147 (CA) 20 Atgriezeniskais 5’-CCGAGAGGCAACCAGTATTATC -3’ HSMS006 Tiešais 5’- HEX-AGGCCAATACAAATTCAATTCC -3’ 182 (TG) 18 Atgriezeniskais 5’-CAGCCCTGTGAGGCAGTT -3’

PCR metodika visiem lokusiem:

PCR amplifik ācij ā izmantoj ām 5x NH 4 PCR buferi (gala koncentr ācija 1x) (Fermentas,

Lietuva), MgCl 2 š ėī dumu (1 – 1,5 mM) (Fermentas, Lietuva), Taq DNA polimer āzi (koncentr ācija 5u/ l) (Fermentas, Lietuva), dNTP (200 M) (Fermentas, Lietuva) un konkr ētā MS genotip ēšanai paredz ētos praimerus (10 pM) (Applied Biosystems, Lielbritānija un Metabion International AG, V ācija). Kop īgais tilpums mais ījumam, kur notika PCR process, bija 15 l.

MgCl 2 š ėī duma koncentr ācija katra MS PCR izv ēlējāmies p ēc iepriekš veiktas optimiz ācijas, kur ā p ārbaud ījām 1 mM, 1,5 mM, 2,0 mM un 2,5 mM MgCl 2 koncentr ācijas. Programma: 5 min ūtes pie 94 o C; 35 cikli 30 sekund ēs pie 94 oC, 30 sekundes pie 55 oC, 30 sekundes pie 72 oC; 10 min ūtes pie 72 oC; 4 oC (GeneAmp PCR System 9700, Perkin Elmer ). Fragmenta garuma noteikšanas metode: Izmantoj ām 1 l no PCR produktu mais ījuma, kam pievienoj ām rea ăentu ROX 400 HD un HiDi (Applied Biosystems, Lielbrit ānija) mais ījumu ar gala tilpumu 10 l 2.tipa cukura

48 diab ēta gad ījuma un kontroles 2 paraugiem un 21 l JIA gad ījuma un kontroles 1 grup ās paraugiem. Ieg ūto mais ījumu denatur ējām 5 min ūtes pie 95 ºC, p ēc tam tur ējām 5 min ūtes uz ledus.

Pēc tam mais ījumu ievietojām sekven ātor ā ABI Prism® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Lielbrit ānija) fragmenta garuma noteikšanai.

2.3.1.2. Mikrosatel ītu sekvenc ēšana un genotip ēšana

Pēc MS amplific ēšanas un sekvenc ēšanas paraugus analiz ējām ar datorprogramm ām ABI Prism Genotyper (v. 3.7, Applied Biosystems) vai Peak Scanner (v.1.0, Applied Biosystems), ar kuru pal īdz ību var noteikt amplific ētā un nosekvenc ētā fragmenta garumu. Datorprogramma, izmantojot sekvenc ēšan ās reakcij ā pievienoto mar ėieri un inform āciju par t ā fragmenta garumiem, veic katra parauga visu amplific ēto fragmentu anal īzi. Katram PCR produktam tiek noteikts prec īzs fragmenta garums b āzu p āros, izmantojot programmas algoritmu.

2.2.att ēls Mikrosatel īta HSMS602 (zilais p īė is) un HSMS006 (za Ĝie p īė i) sekvenc ēšanas rezult āta att ēlojums; HSMS602 gad ījum ā viens „p īė is” jeb homozigota, bet HSMS006 gad ījum ā divi maksim ālie „p īė i” jeb heterozigota. Sarkanie „p īė i” – garuma mar ėieris.

Apskatot katra parauga rezult ātu (piem ērs 2.2.att ēlā), ir iesp ējams noteikt visu piecu mar ėieru abas al ēles. Zinot katra mar ėiera praimeriem pievienoto iez īmi, ir iesp ējams noteikt tā kr āsu sekvenc ēšanas apstr ādes programm ā atkar ībā no anal īzē izmantot ā gaismas filtra. Mūsu gad ījum ā 6-FAM b ūs redzams k ā zil ā kr āsa, HEX – k ā za Ĝā , bet NED – k ā melna. Otrk ārt, zinot sagaid āmo fragmenta garumu, ir iesp ējams vienlaic īgi analiz ēt vair ākus mikrosatel ītus jeb datorprogrammas rad ītaj ā att ēlā esošos „p īė us” jeb maksimuma punktus, kas apz īmē al ēles. Ja ir redzami divi „p īė i”, tad ir heterozigota p ēc mikrosatel īta, bet, ja ir tikai viens izteikts „p īė is”, tad ir homozigota. 2.2. att ēlā ir redzams viena parauga HSMS602

49 un HSMS006 mar ėiera anal īzes rezult āts. Šis paraugs p ēc HSMS602 ir homozigotis p ēc al ēles ar garumu 169 b āzes p āri un p ēc mikrosatel īta HSMS006 heterozigots ar al ēlēm 188 un 192 bp.

2.3.1.3. Mikrosatel ītu mot īvu noteikšana

Lai noteiktu prec īzu katra MS atk ārtojumu katram paraugam, ir j āveic mar ėieru mot īvu preciz ēšana. Šim nol ūkam izmantoj ām sekvenc ēšanas metodi, nosakot amplific ētā HSMS rajona fragmenta nukleot īdu sec ību. PCR reakcij ā izmantoj ām 2.4. tabul ā sniegtos praimerus. Amplifik āciju veic ām paraugiem, kuri bija homozigoti p ēc konkr ētā mikrosatel īta un kuriem zin ājām š ī mar ėiera prec īzu genotip ēšan ā ieg ūto fragmentu garumu.

2.4. tabula HSMS mar ėieru sekvenc ēšan ā izmantotie praimeri, to sekvences un sagaid āmais sekvenc ējamais fragments. STR Praimera Praimera sekvence Sagaid āmais nosaukums virziens fragments, bp HSMS602 Tiešais 5’- CCTGGGTGCATTTTACACG -3’ 801 (CAA) 10 (A) 8 Atgriezeniskais 5’- TGAAAATGACGTGGCTTCCT -3’ HSMS701 Tiešais 5’- GCATCATTTGGCTTGGAAAC -3’ 1103 (AC) 5AT(AC) 19 Atgriezeniskais 5’- TCATCACCACTCCCTAATCTCA -3’ HSMS702 Tiešais 5’- TGCATCCATTAGACTGGCTTT -3’ 124 (TG) 12 Atgriezeniskais 5’- TGCAGTGACCTTTATTATTGTTTTG -3’ HSMS801 Tiešais 5’- GCTGGGTAGGTATCCTGCAT -3’ 1013 (CA) 20 Atgriezeniskais 5’- GTCCATTTGCATTGCTCAGA -3’ HSMS006 Tiešais 5’- CCCAGCACCTGAGATCTGTT -3’ 925 (TG) 18 Atgriezeniskais 5’- GTTGAAAGCTGTAGTGCGCA -3’

Katra parauga PCR produkts, kas tika paredz ēts sekvenc ēšanai, tika att īrīts. Att īrīšanas proces ā atbr īvoj āmies no amplifik ācij ā neizmantotajiem rea ăentiem, kas var trauc ēt kvalitat īvas sekvences mot īva ieg ūšanai. Att īrīšanai izmantoj ām divas metodes: vien ā PCR produktu att īrījām, izgriežot no 1% agarozes g ēla. Šaj ā gad ījum ā izmantoj ām DNS ekstrakcijas kitu (DNA Extraction kit, Fermentas, Lietuva). Otr ā metod ē att īrījām pašu PCR produktu, izmantojot DNS att īrīšanas kitu (Wizard DNA Clean-Up System, Promega, ASV).

50 Izmantojot abas metodes, att īrīto produktu p ārbaud ījām 1% agarozes g ēlā, ar kura pal īdz ību ar ī noteic ām aptuveno produkta koncentr āciju, ko nor ādījām Latvijas Biomedic īnas pētījumu un studiju centra (BMC) Genoma centra zin ātniekiem, kas veica sekvenc ēšanas proced ūru. Pēc PCR produkta att īrīšanas, tam tika veikta atk ārtots PCR, kur ā ar ī tika izmantoti 2.4.tabul ā redzamie praimeri. Atš ėir ībā no iepriekš ējā PCR šaj ā tika papildus pievienoti didezoksinukleot īdi ar daž ādām fluoresent ām iez īmēm. Š īs PCR produkts tika analiz ēts ar sekven ātora Applied Biosystems 3130 xl Genetic Analyzer ABI Prism® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Lielbrit ānija) pal īdz ību. Pēc sekvenc ēšanas ieg ūtos rezult ātus apstr ādājām ar datorprogrammu ChromasLite vers.2.01 (Technelysium Pty Ltd, Austr ālija). Ieg ūtaj ā att ēlā (piem ērs 2.3. att ēlā) noteic ām konkr ētā mar ėiera atk ārtojuma skaitu, ko piel īdzin ājām zin āmajam genotip ēšanas fragmenta garumam. Piem ēram, 2.3.att ēlā redzamajam paraugam HSMS006 mikrosatel īta lokusa genotip ēšan ā ieg ūtais fragmenta garums ir 188 b āzu p āri (2.3.att ēls A), bet p ēc sekvences mot īvs ir (TG) 19 (2.3.att ēls B). T ātad citiem paraugiem ar t ādu pašu fragmenta garumu b ūs tāds pats atk ārtojums, bet paraugiem ar fragmenta garumu, piem ēram, 184 bp, atk ārojuma skaits b ūs par četriem nukleo īdiem īsāks jeb (TG) 17 . L īdz īga anal īze tika veikta ar ī p ārējiem četriem mikrosatel īta lokusiem.

2.3.att ēls Mikrosatel īta HSMS006 mot īva noteikšanas rezult āta att ēlojums; A – mar ėiera genotip ēšanas rezult āts ar redzamu 188 bp garu al ēles homozigotu; B – mar ėiera mot īva

sekvenc ēšanas rezult āts ar redzamu (TG) 19 atk ārtojumu: 1. att ēlā tieš ā praimera sekvenc ēšanas rezult āts; 2. att ēlā atgriezenisk ā praimera sekvenc ēšanas rezult āts.

51 2.3.2. SNP ANAL ĪZE

2.3.2.1. SNP un to amplifik ācijas

Ar NCBI un Genomatix (http://www.genomatix.de ) datu b āžu pal īdz ību veic ām bioinform ātisko anal īzi PSMB5, PSME1, PSME2, PSMA6, PSMC6 un PSME3 g ēniem, lai noskaidrotu ar šiem g ēniem saist ītos SNP. Ieg ūtos rezult ātus analiz ējām ar HapMap datu bāzē (hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ ) pieejamo datorprogrammu Haploview vers.4.01 (Barrett et al., 2005), lai noteiktu tagSNP. No ieg ūtās inform ācijas izv ēlējāmies četrus SNP lokaliz ētus PSMA6 gēna intronos, divus SNP – PSMC6 un vienu SNP – PSMA3 gēnos. PSMB5, PSME1 un PSME2 gēniem nav zin āms neviens tagSNP, t āpēc šo gēnu anal īzei izv ēlējāmies divus polimorfismus, kas ir lokaliz ēti kod ējošaj ā da Ĝā . 2.4. att ēlā ir redzami izv ēlētie SNP. PSMA6 g ēnu analiz ējām padzi Ĝin āti, jo taj ā ir lokaliz ēts viens no HSMS mar ėieriem. Šim gēnam, izmantojot PupaSNP (http://pupasnp.bioinfo.ochoa.fib.es/ ) datu b āzi, noteic ām SNP, kas ir lokaliz ēti g ēna 5’ gal ā, promoter ī un 10000 b āzu p āru re ăion ā no pirm ā g ēna metion īna. No analiz ētā rajona izv ēlējāmies četrus polimorfismus, lokaliz ētus pirms promotera, tai skait ā vienu inserciju/del ēciju (c.-4543_-4544insC). Papildus nol ēmām sekvenc ēt g ēna promoteri un 5’UTR galu, kas sev ī ietver m ūsu grupas iepriekš analiz ētos SNP – c.-110C>A un c.-8C>G. Kop ā genotip ējām 14. hromosomas sešos proteasomas g ēnos lokaliz ētus 22 SNP, no kuriem septi Ħus izv ēlējāmies asoci ācijas anal īzei saist ībā ar 2. tipa cukura diab ētu un juven īlo idiop ātisko artr ītu (2.4. att ēls). Izv ēli veic ām p ēc 40 juven īlā idiop ātisk ā artr īta un 40 kontroles 1 grupas paraugu genotip ēšanas. SNP atlas ē vad ījāmies p ēc diviem principiem: pirmk ārt, pozit īvo paraugu procentualit ātes (vismaz 95% gan kontroles, gan gad ījuma grup ā). Otrk ārt, p ēc ret ās al ēles frekvences abās grup ās (vismaz 0,05 jeb 5% vien ā no grup ām). Darba metodes pl ānošan ā izmantoj ām bioinform ātikas anal īzi. Interneta programm ā RestrictionMapper (www.restrictionmapper.org ) SNP re ăioniem p ārbaud ījām iesp ējamos restrikcijas saitus. Š ādu anal īzi veic ām, lai noteiktu, vai mums interes ējošos viena nukleot īda polimorfismus varam analiz ēt ar restrikcijas enz īma saita polimorfismu (RESP) jeb restrikcijas enz īma al ēlspecifisk ā saita metodi, ja n ē, tad izv ēlējāmies al ēlspecifisko polimer āzes ėē des reakciju vai genotip ēšanu ar MALDI-TOF MS. 1. pielikum ā ir redzams visu analiz ēto viena nukleot īda polimorfismu izv ēlētās metodes un t ām paredz ētos praimerus. Septi Ħus SNP analiz ējām, izmantojot restrikcijas enz īma saita polimorfismu, tr īs polimorfismus analiz ējām sekvenc ējot, divu vari āciju gad ījum ā

52 izv ēlējāmies al ēĜ specifisko polimer āzes ėē des reakciju un vienas SNP gad ījum ā izmantoj ām ar nesakrit ības ( mismatch ) praimeru PCR izveidotu RESP, bet devi Ħus polimorfismus analizējām, izmantojot MALDI-TOF MS metodi.

2.4.att ēls Analiz ēto SNP lokaliz ācija 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēnos. a – g ēna poz īcijas hromosom ā p ēc sekvences NT_026437.12; b – g ēnu izoformu numer ācija; MA – ret ā al ēle; MAF – ret ās al ēles frekvence gad ījuma (Gad.) un kontrole (Kontr.) grup ās; SG – polimorfisma lokaliz ācija starp g ēniem, Pr – polimorfisma lokaliz ācija g ēna promoter ī; ^ - polimorfismi, kuri nebija NCBI datu b āzē pirms p ētījuma; # - polimorfismi, kuru pozit īvi genotip ēto paraugu skaits bija maz āks par 95%; !!! - asoci ācijas p ētījumos analiz ētie SNP. Polimorfismu numer ācija izmantojot sekvences NM_002797.3 priekš PSMB5 , NM_006263.2 – PSME1 , NM_002818.2 – PSME2 , NM_002791.1 – PSMA6 , NM_002806.2 – PSMC6 un NM_002788.2 priekš PSMA3 .

53 Vis ām metod ēm, iz Ħemot MALDI-TOF MS, izstr ādājām jaunus praimerus, izmantojot Primer3 interneta programmu (Rozen, Skaletsky, 2000). Visus praimerus p ārbaud ījām, izmantojot NCBI pied āvāto programmu BLAST, lai p ārliecin ātos par to, ka polimer āzes ėē des reakcij ā neamplific ēsies nespecifiski fragmenti. Praimerus pas ūtījām firm ā „Metabion International AG” (V ācija). Sekvenc ēšanas metodik ā izmantoj ām ABI Prism R Genetic Analyzer. Šo proced ūru uztic ējām BMC Genoma centra zin ātniekiem. M ēs veic ām fragmenta amplifik āciju, aptuveno koncentr ācijas noteikšanu un produkta att īrīšanu. Sekvenc ētais rajons ietv ēra PSMA6 g ēna apgabalu pirms promotera, promoteri, 5’galu un nelielu da Ĝu no 1. eksona. Veicot anal īzi ar MALDI-TOF MS metodiku, izmantoj ām BMC Genoma centra pied āvāto pakalpojumus. Š īs metodikas pamat ā ir Bruker genoSNIP metode, kas ir balst īta uz samazin āta garuma praimeru ekstenzijas produktu (size reduced primer extension – PEX – products) masas nov ērt ēšanu MALDI-TOF masas spektrometr ā. Ekstenzijas produkti veidojas, pievienojoties PEX praimerim dNTP un ddNTP (didezoksinukleot īdi), t ādējādi veidojot daž āda garuma fragmentus, kas atbilst daž ādām SNP al ēlēm. PEX praimeri ir biotinil ēti (saist īti ar biot īnu), un to sekvenc ē iek Ĝauj nenukleot īdu saiti, ko š ėeĜ UV gaisma. Tas nodrošina ekstenzijas reakcij ā biotinil ēto praimeru ekstenzijas produktu saist īšanos pie plates virsmas, kas ir p ārkl āta ar streptavid īnu. PEX produkti, kuru garums j ānosaka MALDI- TOF MS, tiek noš ėelti no praimeriem UV apstarošanas laik ā un noskaloti. V ēlāk tos nov ērt ē MALDI-TOF masas spektrometr ā. Lai veiktu šo procesu, Genoma centr ā tika pas ūtīti praimeri gan PCR, gan sekvenc ēšanai. Viena polimorfisma anal īzei izmantoj ām metodi, kur ā ar neprec īzu ( mismatch ) praimera PCR veidoj ām restrikcijas enz īma PscI (A ↓CATGT) saitu. Šai metodei ir tr īs posmi: pirmaj ā amplific ējām liel āku DNS fragmentu, kur ā ir ietverti neprec īzā PCR praimeri. Otrais posms ir PCR ar neprec īzajiem praimeriem, bet p ēdējais posms ir restrikcijas enz īma saita polimorfisma metode. Šaja gad ījum ā ar restrikcijas enz īmu PscI , kas atpaz īst sekvenci A↓CATGT. Restrikcijas enz īma saita polimorfisma metod ē vispirms veic ām PCR katra SNP re ăionam, lai amplific ētu DNS fragmentu, kuram veikt “griešanu” ar restrikcijas enz īmu. Katram SNP izmantoj ām daž ādus restikcijas enz īmus, kas ir nor ādīti 1. pielikum ā. PCR amplifik ācijas metodi izmantoj ām ar ī analiz ējot c.-110C>A un c.-8C>G SNP. Šajos eksperimentos izmantoj ām al ēĜ specifisko PCR, kur ā katram paraugam veic ām divas amplifik ācijas. Savstarp ēji reakcijas atš ėiras ar tiešo praimeri jeb prec īzāk ar t ā 3’gala p ēdējo

54 nukleot īdu. Atkar ībā no paraug ā esoš ā nukleot īda polimorfisma poz īcij ā, pozit īvs rezult āts ir vai nu vien ā, vai ab ās amplifik ācij ās. PCR amplifik ācij ā izmantoj ām 10x PCR buferi (gala koncentr ācija 1x) (Fermentas,

Lietuva), MgCl 2 š ėī dumu (1,5 – 3 mM) (Fermentas, Lietuva), Taq vai DreamTaq DNA polimer āzi (koncentr ācija 5u/ l) (Fermentas, Lietuva), dNTP (200 M) (Fermentas, Lietuva) un konkr ētā SNP genotip ēšanai paredz ētos praimerus (10pM) (Metabion International AG, Vācija). Kop īgais mais ījuma tilpums: 30 l.

MgCl 2 š ėī duma koncentr āciju katra SNP genotip ēšanas metodes PCR izv ēlējāmies p ēc iepriekš veiktas optimiz ācijas, kur ā tika p ārbaud ītas 1,5 mM, 2,0 mM un 3 mM MgCl 2 koncentr ācijas. PCR programma: 3 min ūtes pie 94 o C; 35 cikli 30 sekund ēs pie 94 oC, 30 sekundes pie 55 - 61 oC, 30 l īdz 60 sekundes pie 72 oC; 7 min ūtes pie 72 oC; 4 oC (GeneAmp PCR System 9600, Perkin Elmer un GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer ). RESP metod ēs izmantoj ām vair ākus enz īmus ar daž ādiem atpaz īšanas saitiem (nor ādīti 1. pielikum ā). Katram enz īmam ir noteikta aktivit āte konkr ētā bufer ī, kas ir nor ādīts restikcijas enz īma inform ācijas buklet ā. Šaj ā p ētījum ā izmantojām Fermentas (Lietuva) buferus, kuros restrikcijas enz īmiem ir 100% aktivit āte. Tie bija buferis R (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 at

37°C), 10 mM MgCl 2, 100 mM KCl, 0.1mg/ml BSA), buferis B (10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at

37°C), 10 mM MgCl 2 un 0,1 mg/ml BSA), buferis Tango (33 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37°C), 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate un 0.1 mg/ml BSA). K ā ar ī katram restrikcijas enz īmam ir noteikta temperat ūra un darb ības ilgums, kur ā t ā darb ība ir optim āla, tas ir, DNS produkts tiek saš ėelts piln ībā.

2.3.2.2. SNP genotipa noteikšana

Pēc katra PCR, izmantojot 1 – 1,5% agarozes (Chempol, Čehija) g ēlu un 1% TAE buferi, veic ām elektrofor ēzi, lai noskaidrotu PCR amplifik ācijas pozitivit āti un/vai PCR produkta koncentr āciju.

2.5.att ēls Elektrofor ēzes att ēls SNP c.-110C>A genotip ēšanai p ēc PCR amplifik ācijas. Paraugiem JA104, 105, 106 ir homozigotiski ar genotipu CC, bet JA107 un JA116 – heterozigotiski ar genotipu CA. Genotip ēšan ā izmantojot alelspecifisk ā PCR, veic ām divas elektrofor ēzes, lai noteiktu katra parauga genotipu. Katram paraugam veic ām divas polimer āzes ėē des reakcijas, tātad ar ī divas elektrofor ēzes, kuru att ēlos p ēc PCR produkta esam ības vai iztr ūkuma secin ājām par SNP al ēlēm. Piem ēram, c.-110C>A genotipa noteikšan ā, ja bija amplifik ācijas produkts p ēc PCR, izmantojot tiešo praimeri ar p ēdējo 3’gala nukleot īdu C (citoz īns) vai A (aden īns), var ēja secin āt, ka parauga DNS konkr ētaj ā poz īcij ā ir al ēle ar attiec īgi citoz īns vai aden īns. Ja produkta nebija, tad attiec īgā al ēle nav sastopama p ētāmaj ā DNS paraug ā. Ja bija PCR produkti p ēc ab ām amplifik ācij ām, tad DNS paraugs ir heterozigots p ēc p ētāmās poz īcijas (2.5. att ēls). RESP metod ē ar ī veic ām divas elektrofor ēzes: pirmo p ēc restikc ējam ā produkta amplifik ācijas, lai noteiktu amplific ētā fragmenta koncentr āciju, bet otro – pēc fragmenta apstr ādes ar restrikcijas enz īmu, lai noteiktu genotipu. Pirmaj ā elektrofor ēzē, izmantojot GeneRuler TM 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Lietuva) mar ėieri, noteic ām PCR produkta aptuveno koncentr āciju, lai p ēc tam veiktaj ā restrikcij ā var ētu izmantot optim ālo produkta daudzumu, kas ir 1 vien ība enz īma uz 1 g DNS amplific ētaj ā produkt ā.

2.6.att ēls Elektrofor ēzes att ēls p ēc SNP c.-4543_-4544insC genotip ēšanas ar RESP. PCR produkts 981 bp, RESP gala produkts pie š ėelšanas 754 un 229 bp gari fragmenti. Att ēlā redzams, ka JA88 un JA91 paraugs ir heterezigots p ēc mut ācijas, bet p ārējiem paraugiem homozigoti. Otru elektrofor ēzi veic ām, lai analiz ētu rezult ātu p ēc PCR produkta apstr ādāšanas ar restrikcijas enz īmu. SNP poz īcijas genotipu noteicām pēc t ā, cik daudz PCR produkts bija saš ėelts restrikcij ā. Ja produkts bija sagriezts piln ībā, tas ir, redzami divi īsāki produkti nek ā pirms restrikcijas, tad p ētāmaj ā paraug ā ir al ēle, kas satur nukleot īdu, kas ir restrikcijas enz īma sait ā. Bet, ja p ēc apstr ādes ar restrikcijas enz īmu elektrofor ēzē bija redzams nemain īgi garš produkts, tāpat kā pirms restrikcijas, tad DNS paraugs ir homozigots p ēc al ēles, kas nerada restrikcijas saitu. Ja elektrofor ēzes att ēlā redz ējām gan š ėeltos, gan nes ėelto fragmentu, tad DNS paraugs ir heterozigots p ēc genotip ētā SNP (2.6. att ēls). 2.4. Mar ėieru funkcionalit ātes bioinform ātisk ā anal īze

Nosakot molekul āro mar ėieru saist ību ar k ādu konkr ētu slim ību, ir nepieciešamas saprast MS vai SNP funkcion ālo noz īmi slim ības pato ăen ēzē. Polimorfismu funkcionalit āte var b ūt daž āda, t āpēc pirms anal īzes in vitro ir nepieciešama bioinform ātisk ā anal īze jeb anal īze in silico .

2.4.1. POLIMORFISMU SEKVENCES IZMAI ĥU IETEKME UZ DNS UN RNS SEKUND ĀRAJ ĀM STRUKT ŪRĀM

DNS sekvences izmai Ħas atkar ībā no MS garuma vai SNP nomai Ħas var ētu b ūt DNS un/vai RNS sekund ārās strukt ūras (SS) izmai Ħas. Sekund ārās strukt ūras mode Ĝus veidoj ām,

57 izmantojot interneta datorprogrammu MFOLDROOT (Zuker, 2003; http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold ). Šaj ā datorprogramm ā ir iesp ējams main īt SS ietekm ējošos parametrus, piem ēram, Na + un Mg + jonu koncentr ācijas un temperat ūru. Izmantojot public ētās (Alberts et al., 2002) š ūnas komponentu Na + un Mg + jonu koncentr ācijas anal īzes, izv ēlējāmies Na + jona koncentr āciju 140 mM, bet Mg 2+ – 0,8 mM. Izv ēlētā temperat ūra bija 37° C, kas ir cilv ēka ėerme Ħa optim ālā temperat ūra.

2.4.2. POLIMORFISMU SAITU SEKVENCES IZMAI ĥU IETEKME UZ DNS LIEKUMIEM

DNS strukt ūras liekumi ir lok āli molekulas mikropolimorfismu konform ācijas, kur ās B- DNS strukt ūra ir stipri izmain īta, bet nav plašas modifik ācijas. Lok āli strukt ūras polimorfismi ir nepieciešami, lai veicin ātu specifiskus biolo ăiskos procesus: g ēnu regul āciju, DNS iepakojums, piem ēram, caur specifisku prote īnu pievienošanos. DNS segments, kas ir iesaist īts prote īnu izrais ītos un/vai iedzimtos DNS liekumos, ir 10 l īdz 50 b āzu p āru garš, kas ir gar āks nek ā segments, ko var vienk ārši izloc īt ar laboratorijas metod ēm (Vlahovicek et al., 1999). Iesp ējamo molekul āro mar ėieru ietekmi uz DNS molekulas izliekšanos prognoz ējām, izmantojot bend.it (hydra.icgeb.trieste.it/dna/bend_it.html ; Munteanu et al., 1998) servera pied āvātās iesp ējas. Šaj ā gad ījum ā apskat ījām pašas molekulas iesp ējamo izliekuma le Ħė a lielumu un attiec īgi molekulas liekšan ās sp ēju. Pie maz āka DNS molekulas liekuma le Ħka ir nepieciešams liel āka liekšan ās sp ēja, un otr ādi.

2.4.3. POLIMORFISMU SAITU SAIST ĪBA AR TRANSKRIPCIJAS FAKTORIEM UN TO MODIFIK ĀCIJA ATKAR ĪBĀ NO SEKVENCES IZMAI ĥĀ M

Daudzi no analiz ētajiem mar ėieriem atrodas gēna netransl ējam ās da Ĝā s (starpg ēnu re ăion ā, promoter ī, 5’UTR un intronos), kas noz īmē, ka netieši neietekm ē prote īna sint ēzi. Bet netieš ā ietekme var ētu b ūt, ja DNS sekvenc ē, kur atrodas molekul ārie mar ėieri, ir transkripcijas faktora piesaistes vieta (TFBS; transcription factor binding site ). T āpēc m ēs izveidoj ām transkripcijas faktoru piesaistes vietas mode Ĝus visu molekul āro mar ėieru DNS sekvenc ēm. TFBS mode Ĝi tika veidoti, izmantojot datorprogrammu MatInspector, Release 7.4 datu b āzē Genomatix (Cartharius et al., 2005; http://www.genomatix.de ), kur ā ir pieejama inform ācija par transkripcijas faktoru piesaistes vietu sekvenc ēm. Ticamai mode Ĝu izveidei izmantoj ām nosac ījumus, ka TF serdes ( core ) sekvencei ir j ābūt ar 1,00 jeb 100% atbilst ību, bet faktora matricas sekvencei ar ≥0,90 jeb 90%. 58 2.4.4. POLIMORFISMU SAITU SEKVENCES IZMAI ĥU IETEKME UZ mikroRNS PIESAISTI UN/VAI VEIDOŠANOS

Pēdējos gados liela uzman ība ir piev ērsta specifiskas RNS molekulas lomai prote īnu veidošan ās proces ā. Š ī molekula ir mikroRNS ( microRNA ). MikroRNS loma š ūnā iesp ējams ir transl ācijas intensit ātes kontrole (John et al., 2004). MikroRNS ir l īdz 20 - 24 bp gara, bet serdes ( core ) jeb galven ā sekvence, kas saistas pie DNS molekulas, ir 5 – 7 nukleot īdi (John et al., 2004; Flynt, Lai, 2008). Attiec īgi, ja k āds no šiem nukleot īdiem DNS sekvenc ē ir main īgs, saist īšan ās nenotiek. Otra iespējam ā saist ība ar mikroRNS molekulu ir t ātad, ka netransl ējam ā genoma da Ĝa tiek izmantota mikroRNS sint ēzei. Introna izgriešanas proces ā RNS molekula paliek š ūnā, un tā var ētu tikt izmantota citas RNS molekulas veidošan ā (Flynt, Lai, 2008). Molekul āro mar ėieru ietekmi uz mikroRNS sp ēju saist īties ar DNS vai iesp ējamo izmantošanu t ās veidošan ā noteic ām, izmantojot miRBase programmu (Griffiths-Jones et al., 2008; http://microrna.sanger.ac.uk/ ).

2.4.5. POLIMORFISMU SAITU SEKVENCES IETEKME UZ MATRICAS RNS VEIDOŠANOS

Tā k ā analiz ētie polimorfismi atrodas gan intronos, gan eksonos, tad iesp ējam ā to loma šūnā var ētu b ūt saist īta ar intronu izgriešanu un eksonu saš ūšanu jeb matricas RNS (mRNS) veidošanos. Gan eksonos, gan intronos specifisk ās viet ās piesaist ās procesinga un splaisinga elementi, kas nodrošina piln īgu un prec īzu intronu izgriešanu un eksonu savienošanu. Ja šajās piesaistes viet ās ir vari ācijas, tad var nenotikt piesaiste un attiec īgi procesings vai splaisings. Otra iesp ēja ir, ka piesaistes vieta polimorfisma ietekm ē veidojas cit ā introna vai eksona rajon ā, attiec īgi var notiek alternat īvs splainigs. Lai noteiktu iesp ējam ās procesinga un splaisinga elementu piesaistes vietas un to mai Ħas atkar ībā no vari āciju al ēlēm, anal īzei izmantoj ām programmu Human Splicing Finder Version 2.4 (www.umd.be/HSF ; Desmet et al., 2009). 2.5. Datu apstr āde un statistisk ā anal īze

Viena nukleot īda polimorfismu statistisk ās anal īzes apr ēė inos izmantoj ām paraugus, kuriem bija noteikts genotips visos septi Ħos genotip ētajos lokusos. Mikrosatel ītu gad ījum ā anal īzē iek Ĝā vām visus paraugus ar pozit īvu rezult ātu. Pirms SNP atlases un polimorfismu statistisk ās anal īzes vis ās grup ās, noteic ām polimorfismu esam ību l īdzsvar ā p ēc H ārdija – Veinberga vienādojumu. To noteic ām,

59 izmantojot sagaid āmo un ieg ūto heterozigot ātes indeksu, kas r āda, cik liela da Ĝa no popul ācijas genotipiem ir heterozigot ā st āvokl ī. Noteikšanai izmantoj ām

2 formulu: h = (1− ∑ pi ). Abus heterozigot ātes indeksus sal īdzin ājām, izmantojot h ī kvadr āta (χ2) krit ērija metodi. No ieg ūtajiem rezult ātiem katram lokusam apr ēė in ājām al ēĜ u un genotipu frekvences gad ījuma un kontroles grup ās katrai slim ībai. Apr ēė inos izmantotajiem paraugiem, izmantojot datorprogrammu DNASP 4.50.3 (Rozas et al., 2003), izveidoj ām septi Ħu SNP haplotipu kombin ācijas un noteic ām to frekvences gad ījuma un kontroles grup ās. Asoci ācijas anal īzē izsl ēdz ām ret ās al ēles un genotipus MS un retos haplotipus (frekvence vien āda vai maz āka par 0,05 kontroles un gad ījuma grup ās) SNP. Katra polimorfisma saist ību ar T2DM vai JIA noteic ām, analiz ējot al ēĜ u un genotipu, k ā ar ī SNP haplotipu frekven ču statistiski ticam ībās atš ėir ības starp gad ījuma un kontroles grup ām, izmantojot adapt īvo modeli h ī kvadr āta ( χ2) krit ērija metod ē ar daž ādām br īvības pak āpēm.

Par svar īgu atš ėir ību uzskat ījām, ja statistik ā ticam ība ( Pa) un t ā kori ăē tais lielums ( Pb), kas tiek apr ēė in āts k ā 10’000 reižu permut āciju anal īžu vid ējais lielums, bija maz āks par 0,05 (Liepa, 1974). Šos apr ēė inus veic ām ar statistikas programmu PAST (PAlaentological Statistics, ver. 1.63; Hammer et al., 2001). P v ērt ību apr ēė in ājām, pirmk ārt, katram lokusam atseviš ėi p ēc al ēĜ u un genotipu sadales gad ījuma un kontroles grup ās un, otrk ārt, katrai al ēlei, genotipam un haplotipam atseviš ėi, izmantojot to ieg ūto un sagaid āmo frekven ču lielumu gad ījuma un kontroles grup ās (Wright un Hastie, 2007). 2. tipa cukura diab ēta slim ības izpausm ē lielu lomu sp ēlē daž ādi faktori (piem ēram, ėerme Ħa masas indekss), t āpēc visiem polimorfismiem pirms asoci ācijas anal īzes veic ām lo ăistisko regresijas anal īzi saist ībā ar slim ības faktoriem. Š ī anal īze ir nepieciešama, lai pārliecin ātos, ka al ēĜ u sadale nav saist īta ar k ādu no faktoriem. HSMS mar ėieriem šo anal īzi veic ām izmantojot NCSS/PASS/GESS, bet SNP gad ījum ā – PLINK 2.050. Lai noskaidrotu paz īmes (polimorfisma) ietekmi uz saslimšanas iesp ējam ību, noteic ām starp ību jeb izredžu attiec ību ( odds ratio ; OR), relat īvo risku (RR) un abu indeksu konfidences interv ālu ( confidence interv āls ; CI) 95% gad ījumos. OR r āda, cik reižu konkr ētais r ādītājs (al ēle, genotips, haplotips) palielina vai samazina iesp ējam ību saslimt ar p ētāmo slim ību. To apr ēė in ājām ar datorprogrammu, kura izmanto formulu: , kas ir ieg ūta no 2x2 kontingences tabulas:

60 . Izredžu attiec ību apr ēė inos izmantoj ām adapt īvo modeli, kur ā k ā references lielumu izmantoj ām biež āko al ēli, genotipu vai haplotipu, ko noteic ām izv ērt ējot ieg ūtās un sagaid āmās frekvences gad ījuma un kontroles grup ās. Ja OR = 1, tad konkr ētā lokusa riska al ēle (genotips, haplotips) nepalielina iesp ējam ību saslimt ar konkr ēto slim ību p ētītās popul ācijas p ārst āvjiem. Ja šis r ādītājs ir liel āks par 1, tad popul ācijas p ārst āvim ar p ētīto paz īmi palielin ās iesp ējam ība saslimt, bet ja r ādītājs ir maz āks par 1, tad iesp ējam ība samazin ās. Ja r ādītājs ir liel āks par 2, tad iesp ējam ība saslimt ir kl īniski noz īmīga jeb saslimšanas risks ir Ĝoti augsts (Uthoff et al., 2002). RR r āda, cik liels risks, ka paz īme par ādīsies personai no analiz ētās popul ācijas. T ā apr ēė in āšan ā ar ī izmantoj ām datorprogrammu, kur ā matem ātisk ās funkcijas formula

tiek veidota p ēc jau iepriekš min ētās 2x2 tabulas. Ja RR ir vien āds ar 1, tad paz īme par ādīsies vienl īdz bieži gad ījuma un kontroles grup ās. Ja šis r ādītājs ir liel āks par 1, tad palielin ās ticam ība, ka p ētāmā paz īme b ūs biež āk izplat īta slim ības riska grupas person ām. Ja r ādītājs RR ir maz āks par 1, tad šis risks samazin ās (Ardlie et al., 2002; Uthoff et al., 2002). Lai apr ēė in ātu OR, RR un to CI pie 95% izmantojām MedCalc 3000 datorprogrammu (http://medcalc3000.com/OddsRatio.htm ).

61 3. REZULT ĀTI

3.1. 14q hromosomas polimorfismi

3.1.1. 14Q13 RE ĂIONA MIKROSATEL ĪTU IZP ĒTE

HSMS (Human Salaspils Microsatellites) mar ėieru nosaukumu propon ēja T. Sjakste, izpildot pirmo p ētījumu par to asoci āciju ar Greivsa slim ību (Sjakste et al., 2004). Bez š ī pētījuma vair āk p ētīts ir tikai HSMS701 mar ėieris (3.1. tabula). 3.1. tabula HSMS mar ėieru sekvences mot īvi un polimorfisma ID un iepriekš public ētie dati par lokusa polimorfismu un/vai saist ību ar slim ībām. MS Sekvences mot īvs, polimorfisma ID Iepriekš public ētie dati par lokusu mar ėieris numuria un nomenklat ūra p ēc HGVS b Slim ība Aso- Pētījums Atsauce ci ācija 16519463 16519502 HSMS602 G (CAA) 10 (A) 8C Greivsa slim ība Jā Latvijas popul ācija Sjakste et al., 2004

rs63749745, rs35134468, rs71717758, rs67535644, rs66704652, rs56397960, rs58108395

c.164+1128CAA(7_10)A(5_8) 16620590 16620641 HSMS701 A (AC) 5AT(AC) 19 G - - Eiropas popul ācija Dib et al., 1996

D14S1014, rs3223236, rs12147502, Fāra slim ība Nē Ăimenes Geschwind et al., rs12147993, rs71928782, 1999 rs71862757, rs55940352, Dismorfiskais Nē Ăimenes Boyadjiev et al., rs57727346, rs35123864 sindroms 2003 Greivsa slim ība Nē Latvijas popul ācija Sjakste et al., 2004 c.1167+24018AC(14_22) 16649488 16649513 HSMS702 C (TG) 12 T Greivsa slim ība Nē Latvijas popul ācija Sjakste et al., 2004

rs5807818, rs35228370, rs66471614, rs3058430

c.1168-143TG(10_25) 16699900 16699942 HSMS801 A (AC) 21 C Greivsa slim ība Jā Latvijas popul ācija Sjakste et al., 2004

rs71444202, rs68081862, rs10647945, rs71820751, rs72196957, rs60270535

c.1276-35788AC(12_28) 16783905 16783942 HSMS006 A (TG) 18 T Greivsa slim ība Jā Latvijas popul ācija Sjakste et al., 2004

rs34580276, rs36054664

c.683+497TG(18_25) a - p ēc NCBI datu b āzes (www.ncbi.nlm.nih.gov ) sekvences NT_026437; b - p ēc Cilv ēka genoma vari ācijas savien ība (Human Genome Variation Society; HGVS; http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/ ) nomenklat ūras; Pieci HSMS mikrosatel īti atrodas lokus ā 14q13.2 – q13: HSMS006 mar ėieris ir lokaliz ēts PSMA6 g ēna sestaj ā intron ā, bet p ārējie augšup no š ī g ēna divos citos g ēnos. KIAA0391 g ēnā

62 ir lokaliz ēti tr īs mikrosatel īti: HSMS801, HSMS702, HSMS701. P ēdējais un vist ālāk no PSMA6 g ēna lokaliz ētais HSMS mar ėieris ir HSMS602, kas atrodas FAM177A1 ( C14orf24) gēnā. Lai var ētu pareizi interpret ēt fragmentu anal īzes datus, bija nepieciešams preciz ēt mikrosatel ītu mot īvus. Pēc datu b āzēs pieejam ās inform ācijas HSMS006, HSMS801, HSMS702, HSMS701 ir dinukleot īdu atk ārtojumi attiec īgi (TG) n, (CA) n, (TG) n un (AC) mAT(AC) n, bet HSMS602 ir trinukleot īdu atk ārtojums - (CAA) n. Veicot katra mar ėiera atk ārtojuma re ăiona sekvenc ēšanu, secin ājām (3.1. att ēls), ka HSMS006, HSMS801, HSMS702 mikrosatel ītu mot īvi ir vienk ārši dinukleot īdu atk ārtojumi kā tas ir dots NCBI datu b āzē. HSMS006 un HSMS701 ir ar (TG) n atk ārtojumu, bet

HSMS801 – ar (AC) n.

3.1.att ēls 14q13 re ăiona HSMS mar ėieru mot īvs.

HSMS701 gad ījum ā Latvijas popul ācij ā mot īvā (AC) mAT(AC) n main īgā da Ĝa ir tikai

3’gala atk ārtojums (AC) n. Tas noz īmē, ka ar ī šo mikrosatel ītu varam uzskat īt par vienk āršu dinukleot īdu atk ārojumu ar mot īvu (AC) n. Pēdējā mikrosatel īta HSMS602 mot īvs iepriekš (Sjakste et al., 2004) tika uzskat īts par

(CAA) n atk ārtojumu. P ēc 16 paraugu sekvenc ēšanas, secin ājām, ka š ī mar ėiera mot īvs ir

(CAA) m(A) n. Turkl āt konstat ējām, ka Latvijas popul ācij ā ir sastopami vismaz 8 mot īvi:

(CAA) 7(A) 7, (CAA) 7(A) 8, (CAA) 8(A) 5, (CAA) 8(A) 6, (CAA) 8(A) 7, (CAA) 10 (A) 7,

(CAA) 10 (A) 8, (CAA) 11 (A) 5, ar main īgām ab ām mot īva da Ĝā m. Datu anal īzes rezult ātā

63 atkl ājām, ka vair āki mot īvi atbilst vienam genotip ēšan ā ieg ūtajam fragmenta garumam, piem ēram, mot īvi (CAA) 7(A) 8 un (CAA) 8(A) 5 atbilst 167 bp garajai al ēlei. Tas noz īmē, ka nav iesp ējams attiecin āt vienu mot īvu vienam konkr ētam fragmenta garumam. T āpēc š ī mar ėiera al ēĜ u un genotipu anal īzē atst ājām genotip ēšan ā ieg ūtos fragmenta garumus (b āzes pāros) nevis preciz ējām katra parauga mar ėiera mot īvu.

3.1.2. 14Q PROTEASOMU PROTE ĪNU G ĒNU SNP ANAL ĪZE UN ATLASE

Izmantojot vair ākas ăen ētikas datu b āzes, veic ām bioinform ātisko anal īzi sešiem no asto Ħiem 14.hromosomas proteasomas prote īnu PSMB5, PSME1, PSME2, PSMA6, PSMC6 un PSME3 g ēniem, lai noskaidrotu ar šo g ēnu SNP. No visiem SNP izv ēlējāmies četrus tagSNP lokaliz ētus PSMA6 gēna intronos, divus un vienu tagSNP – attiec īgi PSMC6 un PSMA3 gēnos. PSMB5, PSME1 un PSME2 gēnos nav zin āms neviens tagSNP, t āpēc šo gēnu anal īzei izv ēlējāmies pa diviem polimorfismiem lokalizētiem kod ējošaj ā g ēna da Ĝā . PSMA6 g ēnu analiz ējām padzi Ĝin āti, jo taj ā ir lokaliz ēts viens no HSMS mar ėieriem. No datu b āzes ieg ūtajiem datiem izv ēlējāmies tr īs SNP lokaliz ētus pirms PSMA6 gēna un papildus nol ēmām sekvenc ēt g ēna promoteri un 5’UTR galu, kas sev ī ietver m ūsu grupas iepriekš analiz ētos SNP - c.-110C>A un c.-8C>G (Sjakste et al., 2007a). P ēc sekvenc ēšanas konstat ējām divus viena nukleot īda polimorfismus, par kuriem nebij ām ieguvuši inform āciju bioinform ātiskaj ā anal īzē. Šo SNP iesniedz ām NCBI datu b āzē k ā jaunatkl ājumu. Kop ā genotip ēšanai atlas ījām 22 viena nukleot īda polimorfismus (2.4.att ēls Materi ālos un metod ēs). Lai no atlas ītajiem SNP atlas ītu perspekt īvus mar ėierus asoci ācijas anal īzēm ar izv ēlētaj ām slim ībām, ir j āpārbauda SNP izplat ība popul ācij ā. Nav noz īmes analiz ēt saist ības anal īzē SNP, kuru ret ās al ēles frekvence (MAF; minor allele frequency ) ir maz āka par 0,05 jeb 5%. Turkl āt, lai veiktu piln īgu gad ījumu un kontroles paraugu anal īzi, ir j āatlasa lokusi, kuriem genotip ēšana ir veiksm īga vismaz 95% no visiem paraugiem. Tas dos iesp ēju noteikt ne tikai al ēĜ u un genotipu frekven ču sadali analiz ētaj ās grup ās, bet ar ī izveidot haplotipus. Tā k ā m ēs pl ānoj ām veikt asoci ācijas anal īzi, bija svar īgi ar ī apskat īt MAF gad ījuma grup ā. Balstoties tikai uz popul ācijas ret ās al ēles frekvenci, var neiev ērot perspekt īvu molekul āro mar ėieri saist ībā ar slim ību. Tāpēc nol ēmām pirm ējo genotip ēšanu veikt 40 nejauši izv ēlētiem JIA paraugiem un 40 nejauši izv ēlētiem kontroles 1 paraugiem. Nejaušo paraugu izv ēli veic ām ar datorprogrammu „Random Number Generator Program” (http://www.acsu.buffalo.edu/~raulin/random.html ).

64 Starp nejauši izv ēlētajiem JIA paraugiem 23 bija ar oligoartr īta formu, 11 – ar poliartr īta formu un seši – ar k ādu no cit ām JIA form ām. SNP, kurus analiz ējām sekvenc ējot (1. pielikums), ret ās al ēles frekvences noteic ām p ēc 22 JIA un 25 kontroles 1 paraugu genotip ēšanas. Papildus sal īdzin ājām m ūsu ieg ūtos rezult ātus ar HapMap datu b āzē esošo inform āciju par SNP al ēĜ u sadali Eiropas popul ācij ā. Visu ieg ūtos datus apkopoj ām 3.2.tabul ā.

3.2. tabula 22 viena nukleot īda polimorfisma anal īze pirms asoci āciju p ētījumiem 40 gad ījuma un kontroles 1 paraugos Gēns ID numurs Mot īvs Ret ā MAF al ēle Pētījums HapMap Gad ījuma Kontrole PSMB5 rs11543947* c.70C>T T 0,07 0,09 0,10 rs12043 c.616C>A A 0,00 0,00 0,00 PSME1 rs11548692 c.312G>A A 0,00 0,02 Nav dati rs14930 c.731C>A A 0,00 0,00 0,00 PSME2 rs1136581 c.181C>G G 0,00 0,00 Nav dati rs7146672 c.266A>C C 0,01 0,01 0,02 PSMA6 rs5807825* c.-4543_-4544insC delC 0,46 0,46 Nav dati rs9322944 c.-2486A>G G 0,01 0,03 0,03 rs7493194 c.-1910C>T T 0,00 0,00 0,00 rs71640264^ c.-632A>C C 0,03 0,01 Nav dati rs71640265^ $ c.-128A>G G 0,00 0,02 Nav dati rs2277460* c.-110C>A A 0,11 0,05 0,11 rs2277459 $ c.-91G>A A 0,00 0,03 0,02 rs11547365 $ c.-43T>G G 0,03 0,00 Nav dati rs1048990* c.-8C>G G 0,14 0,08 0,12 rs8017676 # c.76+908G>A A 0,10 0,06 0,09 rs6571711 c.409+380T>G G 0,03 0,04 0,07 rs17597267 # c.410-183T>C C 0,11 0,12 0,09 rs9322946 c.684-822A>G G 0,00 0,00 0,03 PSMC6 rs2295826* c.86-104A>G G 0,20 0,09 0,09 rs2295827* c.86-46C>T T 0,20 0,18 0,09 PSMA3 rs2348071* c.543+138G>A A 0,34 0,21 0,27 ^ - SNP par kuriem nebija inform ācijas datu b āzē, bet, ko atkl ājām sekvenc ējot; $ - SNP, kas tika analiz ēti, sekvenc ējot 22 JIA un 25 kontroles 1 paraugos; # - SNP, kuru genotip ēšan ā veiksm īgo anal īžu skaits bija maz āks par 95%; * - asoci ācijas p ētījumiem izv ēlētie SNP .

65 Pieci SNP Latvijas popul ācij ā bija monomorfiski jeb bija sastopama tikai viena al ēle. Šos lokusu neiek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē. Asto Ħu vari āciju ret ās al ēles frekvence bija maz āka par 0,05 gan gad ījuma paraugos, gan kontroles 1 paraugos, t āpēc ar ī šie lokusi tika izsl ēgti no turpm ākajiem p ētījumiem. Divu SNP c.76+908G>A un c.410-183T>C genotip ēšan ā ret ās al ēles frekvence bija virs 5%, bet veiksm īgo anal īžu skaits bija maz āks par 95% no visiem paraugiem. T āpēc ar ī šos polimorfismus no t ālākā pētījuma izsl ēdz ām. Gala rezult ātā atlas ījām septi Ħu SNP lokaliz ētus četros g ēnos: PSMB5 g ēna SNP c.70C>T, PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC, c.-110C>A un c.-8C>G, PSMC6 g ēna polimorfismi c.86-104A>G un c.86-46C>T un c.543+138G>A lokaliz ētu PSMA3 g ēnā. Visus šos lokusus analiz ējām saist ībā ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un t ā subform ām un ar 2. tipa cukura diab ētu.

3.1.2.1. SNP sadales sal īdzin āšana kontroles grup ās

Katr ā asoci ācijas anal īzē izmantoj ām speci āli veidotu kontroles grupu – T2DM gad ījum ā tie bija P. Stradi Ħa Universit ātes slimn īcas endokrinolo ăijas noda Ĝas pacienti bez cukura diab ēta, bet JIA gad ījum ā - SIA "R īgas Austrumu kl īnisk ā universit ātes slimn īcas" kl īnika "Bi ėernieki" nejauši izv ēlēti pacienti bez autoimm ūnām slim ībām. T āpēc nol ēmām sal īdzin āt arī pašas kontroles grupas, lai p ārbaud ītu atš ėir ības. 2.pielikum ā ir tabula, kur ā var redz ēt datus un statistisko anal īzi kontroles 1 un kontrole 2 grup ām. Šaj ā sal īdzin ājum ā nenoteic ām OR un RR, jo netiek mekl ēta asoci ācija ar slim ību. Kā varam redz ēt, tad abas grupas statistiski neatš ėiras tikai p ēc diviem SNP: PSMB5 gēna c.70C>T un PSMA6 g ēna c.-110C>A. No šiem abiem polimorfisiem tieši c.70C>T gad ījum ā nekonstat ējām saist ību ar k ādu no analiz ētaj ām slim ībām. Polimorfisma c.-110C>A gad ījum ā nevien ā no kontroles grup ām, k ā ar ī gad ījuma grup ās, neatrad ām ret ās al ēles homozigoto formu. Šis genotips nav konstat ēts nevien ā no p ētījumiem, kur b ūtu analiz ēts PSMA6 g ēna SNP c.-110C>A. Š ādi dati tiek uzr ādīta ar ī NCBI datu b āzē pie SNP apraksta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2277460). Pārējo lokusu ieg ūtie dati ir statistiski atš ėir īgi p ēc viena no analiz ētajiem parametriem – vai al ēĜ u vai genotipu sadales lokus ā, vai pat p ēc ret ās al ēles frekvenc ēm. 3.2. 2. tipa cukura diab ēta asoci ācijas anal īze

66 3.2.1. LOKUSA 14Q13 HSMS MAR ĖIERU ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE AR T2DM

HSMS mikrosatel ītus genotip ējām 104 2.tipa cukura diab ēta un 123 kontroles 2 paraugos. Pozit īvo paraugu skaits nor ādīts 3. pielikum ā pie MS nosaukuma. No ieg ūtajiem mikrosatel ītu genotip ēšanas rezult ātiem noteic ām genotipu (3. pielikums) un al ēĜ u (4. pielikums) sadali 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma un kontroles 2 grup ās. Veicot asoci ācijas anal īzi saist ībā ar T2DM, v ēl nebija veikta prec īzu mot īvu noteikšana mar ėierim HSMS602, t āpēc al ēĜ u anal īzē izmantoj ām mot īvu (CAA) n, Ħemot v ērā, ka atk ārtojumam (CAA) 10 p ēc sekvences atbilsts fragmenta garums ar 177 b āzu p āriem. No al ēĜ u frekven ču rezult ātiem katram MS noteic ām sagaid āmo heterozigot ātes indeksu ab ās grup ās, bet no genotipu sadales apr ēė in ājām iegūto heterozigot ātes lielumu, t ādej ādi noteic ām, vai gad ījuma un kontroles grupas atbilst H ārdija – Veinberga vien ādojumam (4. pielikums). Konstat ējām, ka neskatoties uz nelielaj ām atš ėir ībām, p ēc χ2 krit ērija metodes visu pieci lokusu genotipu sadale ab ās grup ās atbilsts H ārdija – Veinberga vien ādojumam. Lai izsl ēgtu aptaukošan ās noz īmi asoci ācijas anal īzē, ies ākum ā veic ām lo ăistisk ās regresijas anal īzi, lai p ārliecin ātos, ka HSMS mar ėieri nav saist īti ar aptaukošanos. Nevienam no mar ėieriem netika konstat ēta saist ība ( P > 0,05) ar aptaukošanos.

3.2.1.1. Genotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Molekul ārajam mar ėierim HSMS601 konstat ējām visu sešus iesp ējamos genotipus, pārējiem mikrosatel ītiem konstat ējām maz āk genotipu, sal īdzinot ar iesp ējamo skaitu, ko apr ēė in ājām no al ēĜ u skaita. HSMS701 un HSMS006 mar ėieriem – attiec īgi 22 un 27 genotipi no iesp ējamiem 36, HSMS702 – 23 genotipi no 91, bet visvairāk genotipu nov ēroj ām molekul ārajam mar ėierim HSMS801 – attiec īgi 43 genotipi no 105 genotipiem. Ne visi ieg ūtie genotipi bija sastopami vismaz 5% paraugu vismaz vien ā no grup ām. HSMS602 gad ījum ā no asoci ācijas anal īzes izsl ēdz ām vienu genotipu, HSMS701 un HSMS802 gad ījum ā no visiem genotipiem saist ības anal īzē iek Ĝā vām 8 genotipus, bet HSMS702 mar ėierim bieži sastopami bija tr īs genotipi. Visvair āk genotipi asoci ācijas anal īzē bija ietverti mar ėierim HSMS006 – devi Ħi. Apskatot mar ėieru HSMS genotipu frekven ču atš ėir ības 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma un kontroles 2 grup ās, statistiski ticamu atš ėir ību nov ēroj ām divu mikrosatel ītu genotipu frekvenc ēm. Statistiski ticamu atš ėir ību nenov ēroj ām mar ėieriem HSMS701, HSMS702 un HSMS006.

67 HSMS602 molekul ārajam mar ėierim konstat ējam visus sešus iesp ējamos genotipus, no kuriem ab ās grup ās biež āk tika konstat ēts genotips ar homozigotu p ēc īsākās al ēles, tas ir, p ēc al ēles ar atk ārtojumu (CAA) 7 (3.2. att ēls B). Statistiski ticamu atš ėir ību nov ēroj ām homozigotam genotipam p ēc al ēles ar atk ārtojumu (CAA) 8. Šis genotips netika konstat ēts -2 pacientu grup ā ( Pa = 1,03 x 10 ).

3.2.att ēls HSMS801 (A) un HSMS602 (B) mar ėieru biež āk sastopamo genotipu frekven ču sadale starp kontroli un 2. tipa cukura diab ētu (T2DM). Abscisa – genotipu al ēĜ u atk ārojuma

skaits, ar * atz īmētas genotipi ar statistiski ticamu saist ību ar 2. tipa cukura diab ēti ( Pb > 0,05). Otrs MS, kam konstat ējām statistiski ticamu atš ėir ību genotipa frekvenc ēs ir HSMS801

(3.2.att ēls A). Statistiski ticamu atš ėir ību pier ādījām vienam no genotipiem – (AC)20/22 , kura -2 Pa v ērt ība ir 4,22 x 10 . Šo genotipu nenov ēroj ām 2. tipa cukura diab ēta pacientiem.

68 Abus genotipus, kuriem uzr ādījās statistiska saist ība ar 2. tipa cukura diab ētu var ētu izmantot, lai noteiktu saslimšanas risku. Šie genotipi ir ar aizsarg ājošu efektu attiec ībā pret slim ību.

3.2.1.2. Al ēĜ u frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

No katra parauga genotipa rezult āta noteic ām mikrosatel ītu al ēles un apr ēė in ājām to frekven ču sadali gad ījuma un kontroles 2 grup ās. HSMS602 molekul ārajam mar ėierim, analiz ējot 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma un kontroles grupas, atrad ām tr īs al ēles ((CAA) 7, 8, 10 ), no kur ām biež āk sastopam ā bija al ēle ar atk ārtojumu (CAA) 7. Visas tr īs al ēles gad ījuma un kontroles 2 grup ā bija sastopamas vismaz

5% paraugos. HSMS701 mikrosatel ītam konstat ējām asto Ħas al ēles ((AC) 15 – 22 ), no kur ām piecas iek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē, bet visbiež āk sastopam ā bija al ēle (AC) 19 . HSMS702 gad ījum ā bija sastopamas 13 al ēles ((TG) 12 – 16 un (TG) 18 – 25 ), no kur ām divas vismaz vien ā no grup ām p ārsniedza 5% sastopam ības robežu. Visliel āko frekvenci nov ēroj ām al ēlei

(TG) 12 . HSMS801 mar ėierim ab ās grup ās kop ā atrad ām 14 al ēles ((AC) 13 un (AC) 15 – 27 ), no kur ām septi Ħas iek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē ar 2. tipa cukura diab ētu, bet visliel ākā sastopam ības frekvence bija al ēlei (AC) 21 . HSMS006 mar ėierim bija asto Ħas al ēles ((TG) 17 –

24 ), no kur ām sešas bija sastopamas biež āk par 5%. Šis mikrosatel īts bija vien īgais, kuram atš ėī rās biež āk sastopam ā al ēle gad ījuma un kontroles 2 grup ā – attiec īgi (TG) 21 un (TG) 18 . Veicot statistisko anal īzi HSMS701 un HSMS702 mikrosatel ītiem p ēc al ēĜ u frekvenc ēm, nekonstat ējam statistiski noz īmīgas atš ėir ības ( P < 0,05) starp grup ām.

HSMS602 molekul ārajam mar ėierim konstat ējām, ka al ēlei ar atk ārtojumu (CAA) 8 ir statistiski ticama atš ėir ība ar kori ăē to P vērt ību 1,08 x 10 -2 (3.3. att ēls C). Š īs al ēles izredžu attiec ība jeb OR ir 0,44, kas nor āda, ka al ēle var ētu samazin āt saslimšanas iesp ējam ību t ās nēsātājam l īdz 44% attiec ībā pret sastopam ību popul ācij ā. Analiz ējot HSMS801 mar ėieri gad ījuma un kontroles 2 grup ās (3.3. att ēls B), konstat ējām, ka ir atš ėir ība ne tikai al ēĜ u frekvenc ēs, bet ar ī al ēĜ u skait ā. Otr ā tipa cukura diab ēta gad ījuma grup ā konstat ējām 12 al ēles, bet kontroles grup ā 13. Mikrosatel ītam HSMS801 konstat ējām bimod ālu sadal ījumu, apskatot visu al ēĜ u frekvences.

3.3.att ēls HSMS006 (A), HSMS801 (B) un HSMS602 (C) mar ėieru biež āk sastopamo al ēĜ u frekven ču sadale starp kontroli un 2.tipa cukura diab ētu (T2DM).

Abscisa – al ēĜ u atk ārojuma skaits, statistiski noz īmīgā Pb v ērt ība nor ādīta pie al ēles.

Al ēli (AC)24 statistiski ticami ret āk nov ēroj ām kontroles 2 grup ā (3.3. att ēls B). -2 Statistisk ās anal īzes rad ītāji šai al ēlei ir Pb = 3,00 x 10 , OR = 0,37. P ēc izredžu attiec ības koeficienta var secin āt, ka al ēle ar š ādu atk ārtojumu samazina saslimšanas izredzes uz 37% jeb gandr īz 3 reizes. Pēdējais MS, kam pier ādījām statistiski ticamu atš ėir ību al ēĜ u frekvenc ēs ir PSMA6 g ēnā lokaliz ētajam mar ėierim HSMS006. Šim molekul āro mar ėieri ar ī konstat ējām bimodi ālu sadal ījumu, apskatot visu al ēĜ u frekvences. -2 Statistiski ticamu atš ėir ību ar kori ăē to P vērt ību 4,64 x 10 konstat ējām al ēlei ar atk ārtojumu (TG) 22 . Šo al ēli gandr īz divas reizes biež āk nov ērojama slimnieku grup ā, bet izredžu attiec ības indekss bija 1,94 jeb saslimšanas iesp ējam ību al ēle palielina gandr īz 2 reizes (3.3. att ēls A).

Šo tr īs MS al ēles var ētu izmantot slim ības prognoz ēšan ā, jo HSMS602 al ēle (CAA) 8 un

HSMS006 al ēle (TG) 22 ir ar slim ības riska palielinošu efektu, bet HSMS801 al ēle tieši pretēji – ar aizsarg ājošu.

70 3.2.2. SNP ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE AR T2DM

14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu septi Ħu SNP genotip ēšanas rezult āti pozit īvi bija 103 2. tipa cukura diab ēta pacientu un 121 kontroles 2 grupas DNS paraugos. Pa diviem paraugiem no katras grupas izsl ēdz ām no asoci ācijas anal īzes sakar ā ar negat īvu rezult ātu vien ā vai vair ākos lokusos. Lai izsl ēgtu aptaukošan ās noz īmi asoci ācijas anal īzē, visiem paraugiem kop īgi veic ām lo ăistik ā regresijas anal īzi, lai p ārliecin ātos, ka SNP nav saist īti ar aptaukošanos. Nevienam no SNP nekonstat ējām saist ību ar aptaukošanos ( P > 0,05).

3.2.2.1. Al ēĜ u un genotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Analiz ējot SNP al ēĜ u frekven ču sadali gad ījuma un kontroles 2 grup ās, konstat ējām, ka statistiski ticamu saist ību ar T2DM neuzr āda neviens no septi Ħiem lokusiem (3.3. tabula).

3.3. tabula 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu al ēĜ u un genotipu frekven ču sadale 2. tipa cukura diab ēta un kontroles 2 grup ās.

MAF – ret ās al ēles (trekntekst ā; c,-4543_-4544insC gad ījum ā al ēle bez insercijas) frekvence P a - 2 statistisko ticam ība p ēc χ krit ērija metodi; Pb – kori ăē ta statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 reižu permut āciju anal īžu; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvo risks; CI 95% - konfidences interv ālu pie 95%; * — P<0,05 starp analiz ētaj ām grup ām

PSMA6 g ēna SNP c.-8C>G gad ījum ā konstat ējām, ka statistiski ticam ā saist ība ar 2. tipa cukura diab ētu ir uz robežas ( P ~ 0,05). Š īs vari ācijas reto al ēli G nov ēroj ām pusotru reizi biež āk gad ījuma (14,56%) nek ā kontroles 2 (8,68%) grup ā. Apskatot rezult ātus par genotipu sadali T2DM un kontroles 2 grup ās (3.3. tabula), statistiski ticamu saist ību ar 2. tipa cukura diab ētu pier ādījām iepriekš min ētais SNP c.-8C>G -2 (Pb = 3,81 x 10 ). Š ī polimorfisma genotipu sadal ē nebija sastopamas ret ās al ēles homozigot ā forma ne gad ījuma, ne kontroles 2 grup ā. Turpretim heterozigotais genotips

71 T2DM grup ā bija sastopams par 10% maz āk paraugos nekā kontroles paraugos, bet bez statistiski ticama atš ėir ības p ēc konkr ētā genotipa. Pēc genotipu sadales tr īs SNP ( PSMB5 g ēna SNP c.70C>T, PSMA6 g ēna SNP c.- 110C>A un c.-8C>G) gad ījumos ne kontroles, ne T2DM grup ās nekonstat ējām ret ās al ēles homozigoto formu.

3.2.2.2. Haplotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Al ēĜ u un genotipu frekven ču sadal ē saist ību ar 2. tipa cukura diab ētu pier ādījām vienam SNP, kas ir lokaliz ēts PSMA6 g ēnā. T āpēc haplotipu anal īzē izv ēlējāmies, pirmk ārt, izskat īt haplotipus, ko veido visi analiz ētie SNP (3.4. att ēls un 5. pielikums A), un, otrk ārt, izskat īt haplotipus, ko veido visi 20S proteasomu prote īnu g ēnu SNP (3.5. att ēls un 5. pielikums B). 3.4. att ēlā ir apkopoti dati un statistisk ās anal īzes rezult āti par biež āk sastopamajiem visu septi Ħu SNP veidotajiem haplotipiem. Pavisam kop ā izveidoj ām 28 haplotipus, no kuriem asto Ħiem frekvence vismaz vien ā grup ā bija liel āka par 5%.

3.4.att ēls Septi Ħu SNP lokusu biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze T2DM un kontroles 2 grup ās. SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMB5 vari ācija c.70C>T; PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC (2.; D/I), c.-110C>A (3.) un c.-8C>G (4.), PSMC6 g ēnā lokaliz ētie c.86-104A>G (5.) un c.86-46C>T (6.) un PSMA3 SNP c.543+138G>A (7.).

Visbiež āk sastopamais haplotips bija Hl5, kuru veido visu SNP biež āk sastopam ās al ēles. Haplotips ar visu lokusu retaj ām al ēlēm nenov ēroj ām nevienam paraugam no ab ām analiz ētaj ām grup ām. No asto Ħiem haplotipiem divi (Hl6 un Hl8) p ēc statistisk ās anal īzes uzr ādīja ticamu saist ību ar 2. tipa cukura diab ētu. Haplotips Hl6 bija pret slim ību aizsarg ājošs haplotips, bet

72 Hl8 tieši pret ēji – riska haplotips. Pirmais no min ētajiem haplotipiem samazina n ēsātājam saslimšanas izredzes vairāk k ā 4 reizes, bet otrs haplotips tieši otr ādi 4 reizes palielina saslimšanas iesp ējam ību, sal īdzinot ar saslimšanas risku Latvijas popul ācij ā. Apskatot šo haplotipu sekvences, secin ājām, ka vien īgais lokuss, kas ir main īgs ir c.- 8C>G – Hl6 gad ījum ā al ēle C, bet Hl8 gad ījum ā al ēle G. Tas apliecina š ī SNP lomu saist ībā 2. tipa cukura diab ētu, ko secin ājām asoci ācijas anal īzēs p ēc al ēĜ u un genotipu frekvenc ēm. Turkl āt šos abus aprakst ītos haplotipus var izmantot k ā molekul āros mar ėierus T2DM prognoz ēšan ā, jo p ārējo haplotipu saist ība ar analiz ēto slim ību ir Ĝoti neizteikta (OR ~ 1,00). 3.5. att ēlā ir apkopoti dati un statistisk ās anal īzes rezult āti par biež āk sastopamajiem 20S proteasomas prote īnu g ēnu ( PSMB5 , PSMA6 un PSMA3 ) SNP veidotajiem haplotipiem. Pavisam kop ā izveidoj ām 17 haplotipus, no kuriem piecus iek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē.

3.5.att ēls 20S proteasomas prote īnu g ēnu SNP lokusu biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze T2DM un kontroles 2 grup ās. SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMB5 vari ācija c.70C>T; PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC (2.; D/I), c.-110C>A (3.) un c.-8C>G (4.), un PSMA3 SNP c.543+138G>A (5.).

Visbiež āk sastopamais genotips šaj ā gad ījum ā ab ās grup ās bija Ha4, kuru veido visu SNP biež āk sastopam ās al ēles. Haplotipu ar visu piecu SNP retaj ām al ēlēm, l īdz īgi k ā analiz ējot septi Ħu SNP haplotipus, nekonstat ējām nevienam kontroles 2 vai T2DM paraugam. Tas apstiprina, ka reto al ēĜ u kombin ācijas ir reti vai visp ār nav sastopamas Latvijas popul ācij ā. No šo haplotipu kombin ācij ām vienai (Ha1) pier ādījām saist ību ar 2.tipa cukura diab ētu pēc Pa v ērt ības. P ēc kori ăē tās P v ērt ības š ī saist ība mazin ās, bet saglab ājās uz robežas ( Pb ~ 0,07). Izredžu attiec ība haplotipam Ha1 ir 3,10, kas noz īmē, ka saslimšanas iesp ējam ība š ī haplotipa n ēsātājam palielin ās nedaudz vair āk k ā 3 reizes.

73 Apskatot haplotipu Ha1 veidojoš ās al ēles, secin ājām, ka divu SNP ( PSMA6 g ēna SNP c.- 4543_-4544insC un PSMA3 SNP c.543+138G>A) lokusos ir ret ās al ēles, bet p ārējos lokusos – biež āk sastopam ās al ēles. Izmainot haplotip ā Ha1 kaut vienu no div ām retaj ām al ēlēm (SNP c.-4543_-4544insC gad ījum ā veidojas Ha2, bet SNP c.543+138G>A gad ījum ā – Ha3), samazin ās haplotipa sastopam ība kontroles grup ā, bet palielin ās T2DM grup ā. Gala rezult ātā abu grupu frekvences k Ĝū st l īdz īgas. Turkl āt OR Ha2 un Ha3 gad ījumos ir maz āka, t ātad haplotipi ir aizsarg ājoš āki pret slim ību nek ā Ha1 haplotips. 3.3. Juven īlā idiop ātisk ā artr īta asoci ācijas anal īze

3.3.1. LOKUSA 14Q13 HSMS MAR ĖIERU ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE AR JIA

HSMS mikrosatel ītus genotip ējām 170 juven īlā idiop ātisk ā artr īta un 230 kontroles 1 paraugos. JIA grup ā 97 paraugi bija ar oligoartr īta formu, bet 50 – ar poliartr īta formu. Pozit īvi genotip ēto paraugu skaits nor ādīts 6. pielikum ā pie MS nosaukuma. No ieg ūtajiem mikrosatel ītu genotip ēšanas rezult ātiem noteic ām genotipu (6. pielikums) un al ēĜ u (7. pielikums) sadali juven īlā idiop ātisk ā artr īta un t ā subformu (oligoartr īta (JIoA) un poliartr īta (JIpA)) gad ījumu un kontroles grup ās. No al ēĜ u frekven ču rezult ātiem katram mikrosatel ītam noteic ām sagaid āmo heterozigot ātes indeksu ab ās grup ās, bet no genotipu sadales apr ēė in ājām ieg ūto heterozigot ātes lielumu, t ādej ādi noteic ām, vai gad ījuma un kontroles grupas atbilst H ārdija – Veinberga vien ādojumam (7. pielikums). Konstat ējām, ka, neskatoties uz nelielaj ām atš ėir ībām, p ēc χ2 krit ērija metodes visu lokusu al ēĜ u sadale atbilsts H ārdija – Veinberga vien ādojumam.

3.3.1.1. Genotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Visiem mikrosatel ītiem bija sastopami mazāk genotipi nek ā b ūtu sagaid āms p ēc al ēĜ u skaita: HSMS601 mar ėierim konstat ējām 19 no iesp ējamiem 28 genotipiem, HSMS701 un HSMS006 – 28 un 31 genotipi no iesp ējamiem 45, HSMS702 – 27 genotipi no 78, bet visvair āk genotipu nov ēroj ām molekul ārajam mar ėierim HSMS801 – attiec īgi 59 genotipi no 136 genotipiem Ne visi ieg ūtie genotipi bija sastopami ar vismaz 5% frekvenci vismaz vien ā no grup ām. HSMS602 gad ījum ā asoci ācijas anal īzē ietv ērām septi Ħus genotipus, HSMS801 un HSMS006 gad ījum ā no visiem genotipiem saist ības anal īzē iek Ĝā vām attiec īgi asto Ħus un

74 devi Ħus genotipus, bet HSMS702 mar ėierim bieži sastopami bija pieci genotipi. Visvair āk genotipi asoci ācijas anal īzē bija mar ėierim HSMS702 – 12. Veicot statistisko anal īzi genotipu frekvenc ēm, konstat ējām, ka ar JIA ir saist īti visi HSMS mikrosatel īti. Daži no MS genotipiem ir saist īti izteikt āk vai tikai ar JIoA un/vai JIpA apakšgrup ām (3.4. tabula). Divi 169 un 170 bp al ēĜ u homozigotie HSMS602 mikrosatel īta genotipi uzr ādīja saist ību tikai ar juven īlo idiop ātisko artr ītu, bet, dalot kop ējo grupu apakštipos, P v ērt ība bija liel āka nek ā 0,05. Genotipam 170/170 bp konstat ējām izteiktu riska genotipa izredžu starp ību, kas bija 3,25 jeb genotips saslimšanas izredzes palielina 3,25 reizes, sal īdzinot ar popul āciju. Tātad šo mar ėiera genotipu var ētu izmantot JIA prognoz ēšan ā. Mar ėiera HSMS006 gad ījum ā pier ādījām tr īs genotipu saist ību ar JIA un/vai t ā form ām.

Apskatot slim ības grupu kopum ā, konstat ējām divus genotipus, no kuriem viens (TG) 19/19 bija ar aizsarg ājošu efektu (OR = 0,12), bet otrs (TG) 20/23 – ar kl īniski noz īmīgu riska efektu

(OR = 9,75). Analiz ējot atseviš ėi JIoA un JIpA grupas, secin ājām, ka genotips (TG) 20/23 ir k ā riska genotips ab ām JIA form ām, bet izredžu attiec ība, sal īdzinot ar kop ējo grupu, palielin ās JIpA gad ījum ā. Juven īlā idiop ātisk ā oligoartr īta gad ījum ā statistiski ticamu atš ėir ību nov ēroj ām ar ī genotipam (TG) 19/19 . Turkl āt šaj ā apakšgrup ā konstat ējām genotipu, kurš nebija asoci ēts ar JIA kop ējo grupu - (TG) 18/18 . Abi homozigotie genotipi JIoA grup ā ir ar aizsarg ājošu efektu (3.4. tabula). T ātad JIpA prognoz ēšanai var ētu izmantot genotipu

(TG) 20/23 , bet abas homozigot ās formas tieši JIoA prognoz ēšanai. Otrs MS, kuram pier ādījām saist ību ar vis ām gad ījuma grup ām, bija HSMS701. Kop ējā

JIA grup ā pēc Pa v ērt ības saist ību konstat ējām sešiem genotipiem, bet, kori ăē jot P v ērt ību, diviem genotipiem nebija statistiski ticama saist ība. No atlikušajiem četriem genotipiem divi

((AC) 16/16 un (AC) 17/17 ) uzr ādīja aizsarg ājošu efektu, bet divi ((AC) 16/19 un (AC) 17/19 ) – palielin ātu riska efektu. Apskatot katru apakštipu atseviš ėi, secin ājām, ka JIoA gad ījum ā ir divi genotipi, kuriem ir saist ība ar slim ību p ēc Pa v ērt ības, bet ne p ēc Pb. JIpA gad ījum ā statistiski ticamu saist ību p ēc Pa ar ī nov ēroj ām diviem genotipiem, bet vienam genotipam t ā saglab ājās ar ī p ēc P v ērt ības kori ăē šanas. Šis genotips (AC) 16/18 palielina saslimšanas iesp ēju par 89% un gad ījuma grup ā ir sastopams četras reizes biež āk. Genotips (AC) 17/19 neuzr ādīja saist ību ar konkr ētu apakštipu, bet tikai ar JIA kopum ā (3.4. tabula).

75 3.4. tabula Ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai t ā form ām saist īto HSMS mar ėieru genotipu statistisk ās anal īzes rezult āti. JIA HSMS Gad ījuma OR RR Genotips P P grupa mar ėieris grupa a a b (CI 95%) (CI 95%) -2 -2 JIoA 701 (AC) 16/19 ↑ 4,04 x 10 6,76 x 10 R 2,47 (1,41 – 4,33) -2 -2 (AC) 17/17 ↓ 2,97 x 10 9,70 x 10 - - -2 -2 702 (TG) 10/10 ↑ 1,43 x 10 5,83 x 10 - - -2 -2 801 (AC) 20/21 ↑ 4,54 x 10 3,10 x 10 R 2,72 (1,48 – 5,00) -3 -3 (AC) 22/23 ↑ 2,70 x 10 8,40 x 10 - - -2 -3 006 (TG) 18/18 ↓ 3,48 x 10 9,50 x 10 0,16 0,19 (0,03 – 0,74) (0,05 – 0,79) -3 -3 (TG) 19/19 ↓ 1,85 x 10 1,70 x 10 0,06 0,07 (0,01 – 0,47) (0,01 – 0,50) -3 -3 (TG) 20/23 ↑ 6,42 x 10 3,30 x 10 7,62 9,32 (1,93 – 30,02) (2,69 – 32,29) -2 -1 JIpA 701 (AC) 16/16 ↓ 3,71 x 10 1,13 x 10 - - -2 -2 (AC) 16/18 ↑ 3,63 x 10 7,90 x 10 1,89 4,15 (0,58 – 6,11) (1,78 – 9,67) -2 -3 006 (TG) 20/23 ↑ 1,02 x 10 1,60 x 10 15,24 12,05 (3,23 – 71,87) (3,31 – 43,82) JIA 602 169/169 ↑ 1,93 x 10 -2 2,53 x 10 -2 R 1,78 (1,34 – 2,36) 170/170 ↑ 1,46 x 10 -2 6,50 x 10 -3 1,82 3,25 (0,81 – 4,11) (1,60 – 6,61) -3 -2 701 (AC) 16/16 ↓ 6,61 x 10 1,30 x 10 0,07 0,17 (0,02 – 0,26) (0,05 – 0,55) -2 -2 (AC) 16/18 ↑ 3,84 x 10 7,41 x 10 1,14 2,86 (0,45 – 2,89) (1,38 – 5,94) -2 -2 (AC) 16/19 ↑ 1,56 x 10 1,03 x 10 R 2,52 (1,54 – 4,14) -2 -2 (AC) 17/17 ↓ 1,28 x 10 3,76 x 10 - - -2 -2 (AC) 17/19 ↑ 1,80 x 10 3,98 x 10 1,99 5,01 (0,58 – 6,83) (1,68 – 14,94) -2 -2 (AC) 18/21 ↑ 2,53 x 10 5,83 x 10 2,27 5,72 (0,57 – 8,97) (1,64 – 19,94) -2 -2 702 (TG) 10/10 ↑ 1,80 x 10 7,15 x 10 - - -2 -2 (TG) 11/12 ↓ 2,91 x 10 1,91 x 10 R 0,58 (0,43 – 0,78) -2 -2 801 (AC) 20/21 ↑ 3,87 x 10 2,20 x 10 R 2,40 (1,37 – 4,20) -3 -3 (AC) 22/23 ↑ 1,67 x 10 4,60 x 10 - - -4 -4 006 (TG) 19/19 ↓ 5,41 x 10 8,00 x 10 0,10 0,12 (0,03 – 0,35) (0,04 – 0,38) -3 -3 (TG) 20/23 ↑ 1,02 x 10 1,80 x 10 8,38 9,75 (2,31 – 30,41) (2,97 – 32,04) 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija metodes; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 reižu permut āciju anal īžu; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; a - ar bulti Ħā m nor ādīts genotipa frekvences palielin āšan ās ( ↑) vai samazin āšan ās ( ↓) attiec ībā pret kontroles grupu.

76 Atlikušie divi MS (HSMS801 un HSMS702) neuzr ādīja saist ību ar juven īlo idiop ātisko poliartr ītu. Abos gad ījumos kop ējā grup ā atkl ājām divus genotipus ar statistiski ticamu saist ību.

HSMS801 genotipi (AC) 20/21 un (AC) 22/23 uzr ādīja asoci āciju gan ar JIA kopum ā, gan atseviš ėi ar oligoartr īta formu. Turkl āt genotips (AC) 20/21 palielina saslimšanas iesp ējam ību par 140%, bet genotips (AC) 22/23 netika konstat ēts kontroles 1 grup ā. Iesp ējams, ka šis genotips ar ī ir slim ību veicinošs.

HSMS702 gad ījum ā ar JIA saist ību konstat ējām genotipiem (TG) 10/10 un (TG) 11/12 , bet ar

JIoA – genotipam (TG) 10/10 . Turkl āt genotips (TG) 10/10 netika konstat ēts veseliem indiv īdiem. Apskatot visus genotipu sadales rezult ātus kopum ā, var secin āt, ka ar JIA asoci ētos genotipus var izmantot slim ības prognoz ēšan ā, nosakot saslimšanas iesp ējam ības pak āpi.

3.3.1.2. Al ēĜ u frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

No katra parauga genotipa rezult āta noteic ām mikrosatel ītu al ēles un apr ēė in ājām to frekven ču sadali gad ījuma un kontroles 1 grup ās. HSMS602 molekul ārajam mar ėierim, analiz ējot JIA gad ījuma un kontroles 1 grupas, konstat ējām septi Ħas al ēles (167 – 171 bp un 177 – 178 bp), no kur ām biež āk sastopam ā bija al ēle ar 169 b āzu p āriem. No vis ām al ēlēm gad ījuma un kontroles 1 grup ās sešas bija sastopamas vismaz 5% paraugu (3.6. att ēlā). HSMS701 mikrosatel ītam konstat ējām devi Ħas al ēles ((AC) 14 – 22 ), no kur ām sešas iek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē (3.6. att ēlā), bet visbiež āk sastopam ā al ēle bija (AC) 19 . HSMS702 gad ījum ā bija sastopamas 12 al ēles ((TG) 10 – 14, 17-18, 20

– 25 ), no kur ām četras vismaz vien ā no grup ām p ārsniedza 5% sastopam ības robežu

(3.6. att ēlā). Visbiež āk sastopam ā al ēle ab ās grupas bija al ēle (TG) 11 . HSMS801 mar ėierim ab ās grup ās kop ā atrad ām 16 al ēles ((AC) 12 un (AC) 14-28 ), no kur ām septi Ħas iek Ĝā vām asoci ācijas anal īzē ar JIA (3.6. att ēlā), bet ar visliel āko sastopam ības frekvenci bija al ēle

(AC) 21 . HSMS006 mar ėierim bija devi Ħas al ēles ((TG) 16 un (TG) 18-25 ), no kur ām sešas bija sastopamas biež āk par 5% (3.6. att ēlā). Šis MS bija vien īgais, kuram atš ėī rās biež āk sastopam ā al ēle starp grup ā – JIA un JIoA grup ā t ā bija al ēle (TG) 18 , JIpA grup ā – (TG) 21 un kontroles 1 grup ā – al ēle (TG) 19 .

3.6.att ēls HSMS602 (A), HSMS702 (B), HSMS701 (C), HSMS801 (D) un HSMS006 (E) mar ėieru biež āk sastopamo al ēĜ u sadale kontroles 1 un Juven īlā idiop ātisk ā artr īta grup ās. Abscisa - al ēles apz īmētas ar fragmenta garumu (bp) HSMS602 un ar atk ārtojumu skaitu (n) pārējiem mar ėieriem; ar * atz īmētas al ēles ar statistiski ticamu saist ību ar JIA un/vai JIoA un

JIpA form ām ( Pb < 0,05).

Veicot asoci ācijas anal īzi, m ēs secin ājām (3.5. tabula), ka ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai t ā subform ām ir saist īta vismaz viena al ēle no katra HSMS mikrosatel īta.

HSMS801 mar ėiera al ēle (AC) 17 ir saist īta tikai ar JIA kopum ā un ir ar nelielu aizsarg ājošu efektu, samazinot saslimšanas iesp ēju par 45%, sal īdzinot ar popul āciju.

HSMS006 mikrosatel īta al ēles (TG) 19 , (TG) 20 un (TG) 23 ir saist ītas ar analiz ēto slim ību kopum ā. Al ēles (TG) 20 gad ījumā statistiski ticamu saist ību konstat ējām, ar ī apskatot JIoA apakšgrupu atseviš ėi. Turkl āt (TG) 20 palielina t ās n ēsātājam iesp ēju saslimt ar juven īlo idiop ātisko oligoartr īta formu vismaz 3,83 reizes, sal īdzinot ar šo r ādītāju Latvijas popul ācij ā.

78 3.5. tabula Ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai t ā form ām saist īto HSMS mar ėieru al ēĜ u statistisk ā anal īzes rezult āti. JIA HSMS Gad ījuma OR RR Al ēle P P grupa mar ėieris grupa a a b (CI 95%) (CI 95%) JIoA 602 0,30 0,38 168 bp ↓ 8,07 x 10 -3 1,28 x 10 -2 (0,16 – 0,56) (0,22 – 0,67) 2,21 2,81 170 bp ↑ 1,30 x 10 -2 5,90 x 10 -2 (1,20 – 4,08) (1,63 – 4,83) 0,16 0,20 178 bp ↓ 3,48 x 10 -2 1,06 x 10 -2 (0,04 – 0,69) (0,05 – 0,84) 701 11,08 10,39 (AC) ↑ 3,41 x 10 -3 9,70 x 10 -3 15 (3,01 – 40,43) (2,97 – 36,37) 2,42 2,27 (AC) ↑ 3,81 x 10 -2 4,99 x 10 -2 18 (1,33 – 4,40) (1,41 – 3,65) 702 7,39 7,67 (TG) ↑ 2,00 x 10 -3 3,00 x 10 -4 10 (2,64 – 20,69) (2,85 – 20,64) 006 3,83 3,49 (TG) ↑ 1,64 x 10 -2 2,93 x 10 -2 20 (1,79 – 8,18) (1,812 – 6,72) JIpA 602 0,23 0,28 168 bp ↓ 1,74 x 10 -2 3,23 x 10 -2 (0,09 – 0,59) (0,12 – 0,67) 2,74 3,35 170 bp ↑ 2,46 x 10 -2 4,15 x 10 -2 (1,35 – 5,56) (1,83 – 6,14) 701 24,00 15,69 (AC) ↑ 1,64 x 10 -3 4,70 x 10 -3 15 (6,08 – 94,97) (4,40 – 55,94) 4,95 3,24 (AC) ↑ 9,72 x 10 -3 5,70 x 10 -3 18 (2,42 – 10,13) (1,97 – 5,32) 702 4,38 4,33 (TG) ↑ 1,53 x 10 -2 3,12 x 10 -2 13 (1,89 – 10,14) (2,04 – 9,20) JIA 602 0,28 0,35 168 bp ↓ 9,02 x 10 -4 3,00 x 10 -4 (0,17 – 0,47) (0,22 – 0,55) 2,40 3,01 170 bp ↑ 1,33 x 10 -3 2,30 x 10 -3 (1,40 – 4,12) (1,86 – 4,88) 701 15,43 12,87 (AC) ↑ 4,91 x 10 -5 <0,0001 15 (4,54 – 52,41) (3,94 – 42,06) 3,16 2,64 (AC) ↑ 1,09 x 10 -3 6,00 x 10 -4 18 (1,90 – 5,25) (1,76 – 3,96) 0,55 0,46 (AC) ↓ 1,54 x 10 -2 1,09 x 10 -2 20 (0,31 – 0,96) (0,29 – 0,74) 702 5,64 5,75 (TG) ↑ 4,37 x 10 -3 1,30 x 10 -3 10 (2,09 – 15,25) (2,19 – 15,09) 2,58 2,63 (TG) ↑ 3,83 x 10 -2 1,92 x 10 -2 13 (1,29 – 5,18) (1,37 – 5,06) 801 0,54 0,55 (AC) ↓ 3,55 x 10 -2 2,37 x 10 -2 17 (0,33 – 0,88) (0,37 – 0,81) 006 0,73 0,65 (TG) ↓ 4,67 x 10 -2 3,39 x 10 -2 19 (0,48 – 1,12) (0,49 – 0,86) 3,73 3,32 (TG) ↑ 4,27 x 10 -3 1,70 x 10 -3 20 (1,88 – 7,39) (1,82 – 6,07) 2,29 2,04 (TG) ↑ 2,91 x 10 -2 4,26 x 10 -2 23 (1,31 – 4,00) (1,29 – 3,21) 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija metodes; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 reižu permut āciju anal īžu; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; a - ar bulti Ħā m nor ādīts al ēĜ u frekvences palielināšan ās (↑) vai samazin āšan ās ( ↓) attiec ībā pret kontroles grupu.

79 Div ām HSMS602 al ēlēm (168 un 170 bp) pier ādījām saist ību ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un ar ab ām analiz ētaj ām slim ības form ām atseviš ėi. Turkl āt al ēle ar 168 bp ir ar aizsarg ājošu efektu, bet al ēle 170 bp ir k ā riska al ēle attiec ība pret slim ību vai t ās form ām. Analiz ējot JIoA grupu atseviš ėi, papildus saist ību ar slim ību uzr ādīja v ēl viena al ēle – ar 178 bp. Turkl āt š īs al ēles OR attiec ībā pret slim ību ir 0,16, kas noz īmē, ka al ēles n ēsātāja iesp ējam ība saslimt samazin ās no 100% l īdz 16%, sal īdzinot ar popul ācijas saslimšanas koeficientu.

Mar ėierim HSMS701 bija divas al ēles ((AC) 15 un (AC) 18 ), kur ām konstat ējām asoci āciju ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un ar ab ām analiz ētaj ām slim ības formām. Š īs abas al ēles ir ar augstu riska pak āpi attiec ībā pret slim ību. Al ēle (AC) 15 iesp ējams palielina t ās n ēsātājam risku saslimt l īdz pat 15 reiz ēm, atkar ībā no prognoz ētās slim ības formas. HSMS701 mikrosatel īta gad ījum ā ir v ēl viena al ēle, kurai bija saist ība ar JIA kopum ā, bet ne ar k ādu subformu atseviš ėi. T ā ir al ēle (AC) 20 . HSMS702 al ēĜ u sadal ē konstat ējām divas al ēles, kur ām bija saist ība ar JIA kopum ā, bet, apskatot katru analiz ēto formu atseviš ėi, secin ājām, ka katru no al ēlēm var ētu izmantot k ā molekul āro mar ėieri pie atš ėir īgām JIA form ām. Al ēle (TG) 10 uzr ādīja augstu izredžu saist ību ar oligoartr īta formu (OR = 7,67), bet al ēle (TG) 13 – ar poliartr īta formu (OR = 4,33). Apskatot kopum ā ieg ūtos al ēĜ u sadales rezult ātu, secin ājām, ka HSMS mikrosatel ītus al ēles var ētu izmantot k ā molekul āros mar ėierus, prognoz ējot saslimšanas iesp ējam ību saist ībā ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai t ā subtipiem.

3.3.2. SNP ASOCI ĀCIJAS ANAL ĪZE SAIST ĪBĀ AR JIA

Vair ākos JIA un kontroles 1 kolekcijas paraugos p ēc HSMS mikrosatel ītu anal īzes DNS bija palicis maz vai bija beidzies. T āpēc atlas ījām 139 gad ījuma un 175 kontroles paraugus, kuriem analiz ējām 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu SNP. No visiem JIA paraugiem 84 bija ar oligoartr īta formu, bet 42 – ar poliartr īta formu.

3.3.2.1. Al ēĜ u frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Analiz ējot SNP al ēĜ u frekven ču sadali JIA, JIoA un JIpA pret frekven ču sadali kontroles grup ā (8. pielikums), konstat ējām, ka statistiski ticamu saist ība ar slim ību ir trim lokusiem (3.7. att ēls). PSMA6 g ēnam piesaist ītais polimorfisms jeb prec īzāk insercija/del ēcija c.-4543_- -2 4544insC uzr ādīja statistisku ticamu saist ību ( Pb = 2,36 x 10 ) kop ējā al ēĜ u sadal ē ar juven īlo idiop ātisko oligoartr ītu (3.7. att ēls A), bet saist ība ar kop ējo JIA grupu nebija statistiski ticama ( Pb = 0,25). Apskatot katras al ēles frekvences atš ėir ības starp grup ām atseviš ėi,

80 neatrad ām statistiski ticamu saist ību ar slim ību. Tas noz īmē, ka šis polimorfisms ir saist īts ar JIoA p ēc al ēĜ u sadales nevis k ādas konkr ētas al ēles. Līdz īgu ainu nov ēroj ām PSMA6 g ēna promoter ī lokaliz ētajam SNP c.-110C>A (3.7. att ēls B). Š ī polimorfisma gad ījum ā statistiski ticamu saist ību konstat ējām gan ar -2 - juven īlo idiop ātisko artr ītu kopum ā ( Pb = 2,39 x 10 ), gan oligoartr īta formu (Pb = 2,56 x 10 2). T ātad varam dom āt, ka ar ī šis SNP ir saist īts tieši ar oligoartr īta formu. Analiz ējot katras al ēles frekvences atseviš ėi, nenov ēroj ām statistiski ticamu saist ību, t ātad arī šis polimorfisms uzr ādījās saist ību p ēc al ēĜ u visp ārīgās sadales.

3.7.att ēls PSMA6 g ēna polimorfisma c.-4543_-4544insC (A) un c.-110C>A (B) un PSMC6 g ēna c.86-104A>G (C) al ēĜ u frekven ču sadale starp kontroles 1 un Juven īlā idiop ātisk ā artr īta grup ās. Trešais polimorfisms, kuram pier ādījām statistiski ticamu atš ėir ību starp analiz ētaj ām grup ām, ir PSMC6 g ēna 1. intron ā lokaliz ētais SNP c.86-104A>G (3.7. att ēls C). Š īs vari ācijas gad ījum ā, pirmk ārt, atkl ājām saist ību gan ar juven īlo idiop ātisko artr ītu kopum ā -3 -4 (Pb = 1,00 x 10 ), gan oligoartrīta formu (Pb = 1,00 x 10 ) al ēĜ u sadal ē. Otrk ārt, ret ās al ēles -2 sadale bija statistiski ticama atš ėir ība starp JIA un kontroli 1 ( Pb = 3,13 x 10 ), k ā ar ī starp -2 JIoA un kontroli 1 ( Pb = 1,84 x 10 ). Apskatot SNP G al ēles saist ību ar slim ību, noteic ām izredžu attiec ību. Secin ājām, ka š īs al ēles n ēsātājam palielin ās iesp ējam ība saslimt ar JIoA 2,43 reizes, sal īdzinot ar popul āciju kopum ā.

81 3.3.2.2. Genotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Apskatot genotipu sadali visas grup ās, izveidoj ām kop ēju tabulu (9. pielikums), kur ā par katru SNP un katru slim ības grupu var redz ēt, pirmk ārt, heterozigot ā un ret ās al ēles homozigot ā genotipa frekvences, otrk ārt, statistiski ticamo saist ību anal īzē starp lokusu un slim ību, apskatot genotipu sadali, un trešk ārt, heterozigotā un ret ās al ēles homozigot ā genotipa frekven ču statistisko anal īzi. No rezult ātiem secin ājām, ka PSMA6 g ēna SNP c.-110C>A un PSMC6 g ēna SNP c.86- 104A>G (3.8. att ēls A un B) ir saist īti ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un t ā oligoartr īta formu ar ī p ēc genotipu sadal ē. Nevienam no šiem diviem polimorfismiem, analiz ējot atseviš ėi katra genotipa frekvences, nerad ām statistiski ticamu saist ību ar JIA kopuma un/vai t ās subform ām.

3.8.att ēls PSMA6 g ēna polimorfisma c.-110C>A (A), PSMC6 g ēna c.86-104A>G (B) un PSMA3 g ēna c.543+138G>A (C) genotipu frekven ču sadale kontroles 1 un Juven īlā idiop ātisk ā artr īta (JIA, JIoA, JIpA) grup ās. Treš ā vari ācija, kuras genotipiem konstat ējām asoci āciju ar slim ību, bija PSMA3 g ēna SNP c.543+138G>A (3.8. att ēls C). Šis polimorfisms bija vien īgais, kuram konstat ējām

82 -3 saist ību ne tikai ar JIA kopum ā, bet ar ī ar poliartr īta formu ( Pb = 9,60 x 10 ). Ar ī š ī SNP gad ījum ā asoci āciju nenov ēroj ām, analiz ējot katru genotipu atseviš ėi.

3.3.2.3. Haplotipu frekven ču sadale un asoci ācijas anal īze

Tā k ā visus SNP genotip ējām vien ādā paraugu skait ā, tad nol ēmām izveidot katra parauga haplotipus un apr ēė in āt to frekvenci gad ījuma un kontroles 1 grup ās. No iepriekš aprakst ītajiem rezult ātiem haplotipu izveidei izv ēlējāmies tos SNP, kuriem konstat ējām statistiski ticamu saist ību ar JIA: PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC un c.-110C>A, PSMC6 g ēna polimorfisms c.86-104A>G un PSMA3 g ēna vari ācija c.543+138G>A (10. pielikums). 3.9.att ēlā ir apkopoti haplotipi, kuru frekvence JIA un/vai kontroles 1 grup ā bija ar sastopam ību vismaz 0,05 jeb 5%. Pavisam kop ā JIA un kontroles 1 grup ā bija 14 haplotipi, bet piecus no tiem iek Ĝā vām asoci ācijas p ētījum ā.

3.9.att ēls Četru SNP lokusu biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze JIA, JIoA, JIpA un kontroles 1 grup ās. SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMA6 SNP c.- 4543_-4544insC (1.; D/I) un c.110C>A (2.), PSMC6 SNP c.86-104A>G (3.) un PSMA3 SNP c.543+138G>A (4.). * atz īmētas al ēles ar statistiski ticamu saist ību ar JIA vai

subformu ( P < 0,05). Ar raust ītu l īniju, ja Pa < 0,05 un Pb > 0,05, ar nep ārtrauktu l īniju, ja

Pa < 0,05 un Pb < 0,05.

Visbiež āk sastopamais haplotips atš ėī rās starp grup ām. Kontroles 1 un JIpA grupās tas bija haplotips H1, bet JIA un JIoA grup ās – H4. Haplotipam H3 asoci ācijas anal īzē pier ādījām saist ību ar JIA un ab ām analiz ētaj ām form ām pirms P v ērt ības korekcijas. P ēc permut ācijas anal īzes P v ērt ība saist ība ar poliartr ītu palielin ājās virs 0,05 jeb 5,00 x 10 -2. Šo haplotipu nekonstat ējām gad ījuma grup ā, t āpēc

83 iesp ējams pie liel ākas JIpA grupas nov ērotu statistiski ticamu asoci ācija ar ī p ēc kori ăē tās P vērt ības. Kontroles grup ā haplotips bija sastopams 6% paraugu. Haplotips H3 sast āv no div ām (c.-4543_-4544insC un c.543+138G>A) retaj ām al ēlēm un div ām biež āk sastopam ām al ēlēm (c.-110C>A un c.86-104A>G). Haplotipu ar visu četru lokusu retaj ām al ēlēm konstat ējām vienam JIA, prec īzāk, JIoA, paraugam. Turkl āt š īs paraugs bija homozigots p ēc ret ās al ēles trijos no četriem haplotipa lokusiem, iz Ħē mums bija SNP c.-110C>A. 3.4. Iesp ējamo funkciju bioinform ātisk ā anal īze polimorfismiem saist ītiem ar JIA un T2DM

Asoci ācijas anal īzē pier ādījām, ka visiem pieciem HSMS mikrosatel ītiem, visiem trim PSMA6 g ēna SNP, PSMC6 polimorfismam c.86-104A>G un PSMA3 g ēna vari ācijai c.543+138G>A ir saist ība ar 2.tipa cukura diab ētu un/vai juven īlo idiop ātisko artr ītu. T āpēc visiem šiem polimorfismiem, veic ām iesp ējamo funkciju anal īzi, in silico apskatot polimorfismu ietekmi uz DNS un RNS sekund āraj ām strukt ūrām, ietekmi uz DNS liekumiem un uz transkripcijas faktoru, mikroRNS un/vai intronu izgriešan ā un eksonu savienošan ā jeb procesing ā un splaising ā iesaist īto faktoru piesaistes viet ām. Analiz ējot RNS sekund ārās strukt ūras, procesing ā un splaising ā iesaist īto faktoru piesaistes vietu izmai Ħas atkar ībā no polimorfisma, Ħē mām v ērā, vai polimorfisms atrodas re ăion ā, kas piedal ās šajos procesos. Visiem polimorfismiem neatrad ām saist ību ar mikroRNS, tas noz īmē, ka polimorfismi neatrodas iesp ējamo mikroRNS piesaistes viet ās vai re ăionos, ko izmanto molekulas sint ēzē. 13. pielikum ā ir sniegta inform ācija par transkripcijas faktoriem, kuriem polimorfismu ietekm ē iesp ējams main ās piesaistes vieta DNS molekul ā.

3.4.1. HSMS MAR ĖIERI

HSMS602 mikrosatel ītam bioinformātisko anal īzi veic ām, vispirms mainot mot īva pirmo da Ĝu, bet otro da Ĝu nemainot, attiec īgi – (CAA) 7(A) 8, (CAA) 8(A) 8, (CAA) 10 (A) 8,

(CAA) 11 (A) 8. Otr ā anal īzē main ījām atk ārtojuma otro da Ĝu – (CAA) 7(A) 5-8. Rezult āti par HSMS mikrosatel ītu iesp ējamo funkcion ālo noz īmi ir apkopoti 11. pielikuma A un B tabul ās. Analiz ējot HSMS mar ėieru ietekmi uz DNS un/vai RNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħā m, secin ājām, ka SS izmai Ħā ir iesaist īti tr īs MS. HSMS602 mar ėieris, analiz ējot mot īva (CAA) n da Ĝu, izraisa DNS strukt ūras izmai Ħas, kas veidojas palielinoties atk ārtojuma skaitam no 8 uz

10 (al ēle ar atk ātojumu (CAA) 9 netika izmantot anal īzē, jo nekonstat ējām popul ācij ā).

3.10.att ēls Iesp ējam ā HSMS006 mar ėiera sekvences DNS sekund ārā strukt ūra atkar ībā

no atk ārtojuma skaita. A – al ēle ar atk ārtojumu (TG) 19 , B – al ēle ar atk ārtojumu (TG) 20 . Ar sarkanu atz īmēts mikrosatel īts. dG – br īvā ener ăija. Otrs mikrosatel īts, kas izraisa DNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħas ir HSMS006 (3.10. att ēls). Šaj ā gad ījum ā strukt ūru izmai Ħas nov ēroj ām, palielinot atk ārtojuma skaitu no

(TG) 19 uz (TG) 20 . RNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħā s izraisa divu MS atk ārtojumu palielin āšana. Viens no mar ėieriem ir HSMS702 (3.11. att ēls). Izteiktas strukt ūras izmai Ħas notiek, ja atk ārtojuma skaits tiek palielin āts no (TG) 11 uz (TG) 12 . 3.11. att ēlā ir att ēlotas al ēles (TG) 10 un (TG) 13 , kur ām pier ādījām saist ību ar juven īlā idiop ātisk ā artr īta daž ādām form ām. Otrs mar ėieris ir HSMS006, kuru atk ārtojumu vari ācija izraisa ne tikai DNS SS mai Ħu, bet ar ī RNS strukt ūras. Atš ėir ībā no DNS, RNS gad ījum ā strukt ūras izmai Ħas notiek pie gar āku atk ārojuma skaita - palielinoties no (TG) 21 uz (TG) 22 .

3.11.att ēls Iesp ējam ā HSMS702 mar ėiera sekvences RNS sekund ārā strukt ūra atkar ībā

no atk ārtojuma skaita. A – al ēle ar atk ārtojumu (TG) 10 . B – al ēle ar atk ārtojumu (TG) 13 . Ar sarkanu atz īmēts mikrosatel īts. dG – br īvā ener ăija. Pārējos HSMS mar ėieru DNS un RNS sekund āro strukt ūru gad ījum ā, palielinoties atk ārtojuma skaitam, palielin ājās konkr ētas matadatas jeb cilpas diametrs. Veicot visu HSMS mar ėieru iesp ējamo DNS liekumu anal īzi, secin ājām, ka, palielinot atk ārojuma skaitu, palielin ās sekvences apgabals ar nemain īgu DNS molekulas le Ħė i. Piem ērs par ādīts 3.12. att ēlā, kur ā ir att ēlots HSMS006 mar ėiera (atk ārtojums no 24. l īdz 59. poz īcijai) re ăiona iesp ējam ā DNS liekumu strukt ūras grafiskais att ēlojums. Ar sarkano l īniju ir nor ādīts katras sekvences poz īcijas liekuma iesp ējamais le Ħė is. K ā var redz ēt att ēlā, HSMS006 mar ėiera poz īcij ā no 24. l īdz 59. liekuma le Ħė is paliek nemain īgs.

3.12.att ēls Iesp ējam ā HSMS006 mar ėiera re ăiona DNS liekumu strukt ūra. Ar zilo l īniju attēlots poz īcijas liekšan ās sp ējas pak āpe, bet ar sarkano l īniju – iesp ējam ā liekuma le Ħė is konkr ētā poz īcij ā. HSMS006 mikrosatel īta poz īcija no 24. l īdz 59. Analiz ējot HSMS mar ėieru atk ārtojuma skaitu ietekmi uz daž ādu prote īnu piesaistes vietu mai Ħu (11.Pielikums B), konstat ējām vair ākas lietas. Transkripcijas faktori piesaist ās tikai HSMS602 mikrosatel īta atk ārtojuma sekvenc ē. Konkr ētāk palielinoties vai samazinoties (CAA) atk ārtojuma skaitam main ās transkripcijas faktora FAC1.01 piesaistes vietu skaits. Atk ārtojuma (CAA) 10 gad ījum ā veidojas asto Ħu faktoru FAC1.01 piesaistes vietas. Pārējo mar ėieru gad ījum ā transkripcijas faktori piesaist ās tikai flank ējošajos galos. Palielinot atk ārtojuma skaitu, palielin ās att ālums starp šiem faktoriem, kas var b ūt noz īmīgi, ja TF savstarp ēji ietekm ē viens otra darb ību. Tā k ā visi HSMS mikrosatel īti atrodas intronos, tad tie var ietekm ēt mRNS veidošanos no pre-RNS. Bioinform ātiskaj ā anal īzē konstat ējām, ka HSMS702 un HSMS006 sekvenc ē veidojas alternat īva introna donora poz īcijas, bet HSMS701 un HSMS801 sekvenc ē – alternat īva atzarošan ās punkta vietas. Turkl āt, palielinot atk ārtojuma skaitu min ētajos mar ėieros, palielin ās alternat īvā introna donora vai alternat īvā atzarošan ās punkta vietu skaits. Visu MS mot īvu sekvences ir labv ēlīgas daž ādu cis-aktiviz ācijas elementu piesaistei, kuru skaits main ās atkar ībā no atk ārtojuma skaita. Kopum ā varam secin āt, ka HSMS mikrosatel ītu noz īme š ūnā var b ūt daž āda, bet ikviena no t ām b ūtu v ēlams p ārbaud īt in vitro .

87 3.4.2. VIENA NUKLEOT ĪDA POLIMORFISMI

Rezult āti par iesp ējamo funkcion ālo noz īmi viena nukleot īda polimorfismiem, kuriem pier ādījām statistiski ticamu saist ību ar k ādu no analiz ētaj ām slim ībām, ir apkopoti 12. pielikum ā A un B tabul ā. Analiz ējot SNP mar ėieru ietekmi uz DNS un/vai RNS sekund āro strukt ūru, secin ājām, ka SS izmai Ħu izraisa tr īs polimorfismi, no kuriem divi ietekm ē DNS strukt ūru, bet viens – RNS. DNS molekulas p ārstruktur ēšanos izraisa PSMA6 g ēna insercija/del ēcija jeb c.-4543_- 4544insC un SNP lokaliz ēts -1 poz īcij ā attiec ībā pret g ēna 5’UTR galu jeb c.-110C>A. Otr ā SNP rajona DNS sekund ārās strukt ūras atkar ībā no al ēles ir redzama 3.13. att ēlā.

3.13.att ēls DNS sekund āra strukt ūra atkar ībā no SNP c.-110C>A al ēlēm. A – SNP al ēle C, B – SNP al ēle A. dG – br īvā ener ăija. RNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħas izraisa PSMA3 g ēna SNP c.543+138G>A (3.14.att ēls). SNP atrodas g ēna 7. introna 138. poz īcij ā, t āpēc 3.14. att ēlā ir par ādīts introna 5’UTR l īdz 298. nukleot īdam. Polimorfisma ietekm ē RNS strukt ūra izmain ās no 109. poz īcijas l īdz 222. poz īcijai.

3.14.att ēls RNS sekund āra strukt ūra atkar ībā no SNP c.543+138G>A al ēlēm. Att ēlota PSMA3 g ēna 7. introna pirmie 292 nukleot īdi. A – SNP al ēle G, B – SNP al ēle A. dG – br īvā ener ăija. Otra iesp ējam ā polimorfismu funkcija DNS molekulas l īmen ī ir DNS liekumu veidošana. Mēs konstat ējām, ka DNS liekumu izmai Ħā var ētu b ūt iesaist īti divi SNP: c.-110C>A un c.543+138G>A. Otra SNP re ăiona iesp ējam ā DNS liekumu strukt ūras grafiskais att ēlojums ir redzams 3.15. att ēlā. Ar sarkano l īniju ir nor ādīts katras sekvences poz īcijas liekuma iesp ējamais le Ħė is, bet ar zilo l īniju molekulas liekšanas sp ēja. Att ēlā ir par ādīts PSMA3 g ēna 7. introna s ākums l īdz 200. nukleot īdam, SNP ir lokaliz ēts 138. poz īcij ā. Pēc att ēla ir redzams, ka SNP al ēles G nomai Ħa uz al ēli A, izraisa re ăiona iesp ējam ā liekuma (sarkan ā l īnija) le Ħė a samazin āšanos no aptuveni 7,0º uz 4,8º, k ā ar ī liekšan ās sp ēja (zil ā l īnija) samazin ās no aptuveni 5,1 uz 4,8 vien ībām. Polimorfisma c.-110C>A gad ījum ā palielin ās iesp ējamā liekuma le Ħė is no aptuveni 5,8º uz aptuveni 7,0º, bet molekulas liekšan ās sp ēja samazin ās no aptuveni 5,1 uz 4,9 vien ībām.

3.15.att ēls Iesp ējam ā DNS liekuma izmai Ħa atkar ībā no SNP c.543+138G>A al ēlēm. A – al ēle G, B – al ēle A. Ar zilo l īniju att ēlots poz īcijas liekšan ās sp ējas pak āpe, bet ar sarkano līniju – iesp ējam ā liekuma le Ħė is konkr ētā poz īcij ā, SNP poz īcija analiz ētaj ā sekvenc ē 138. Bioinform ātiski analiz ējot transkripcijas faktoru un/vai alternat īvā prote īna veidošan ās elementu piesaistes vietas SNP lokusu re ăionos (12. pielikums B), secin ājām, ka TFBS izmai Ħas notiek četru polimorfismu ietekm ē. PSMA6 g ēna vari ācijas c.-110C>A gad ījum ā (3.16. att ēls), ja ir al ēle ar nukleot īdu C, pie sekvences piesaist ās ATp1a1 regulator ā elementa piesaist īšan ās faktors (ZFHX/AREB6.04). Polimorfisma gad ījum ā š ī faktora piesaistes vieta zūd, bet veidojas cita faktora (Barbitur āta indukcijas elementu bokss) piesaistes vieta. PSMA6 g ēna polimorfisma c.-4543_-4544insC (delC>insC) gad ījum ā al ēĜ u mai Ħas rezult ātā z ūd tr īs TF piesaistes vietas (LEFF/LEF1.02, CHRF/CHR.01 un HOXF/NANOG.01). PSMC6 SNP c.86-104A>G ret ās al ēles gad ījum ā veidojas NKXH/TTF1.01 piesaistes vieta. Biež ās G al ēles nomai Ħa pret reto A al ēli PSMA3

90 polimorfisma c.543+138G>A gad ījum ā izraisa divu TF (HOMF/BARX2.01 un HBOX/GSH2.01) piesaistes vietas zušanu un EVI1/MEL1.02 piesaistes sekvences veidošanos.

3.16.att ēls Iesp ējam ā PSMA6 g ēna SNP c.-110C>A funkcion ālā noz īme. Transkripcijas faktori ZFHX/AREB6.04 un BARB/BARBIE.01 piesaist ās attiec īgi no -113. l īdz -98. un no - 116. l īdz -102. poz īcijai. SNP c.-110C>A ir ier āmēts; al ēĜu varianti ir atz īmēti ar abpus ēju bulti Ħu; g ēna 5’UTR ir iekr āsots pel ēks. Numer ācija ir dota no g ēna pirm ā nukleot īda jeb ATG. Saist ībā ar introna izgriešanas proces ā iesaist īto prote īnu piesaistes vietu mai Ħu analiz ējām PSMC6 g ēna 1.intron ā lokaliz ēto SNP c.86-104A>G un PSMA3 g ēna 7. intron ā lokaliz ēto c.543+138G>A polimorfismu. P ārējos neiek Ĝā vām anal īzē, jo tie ir lokaliz ēti ārpus introniem. Abu analiz ēto vari āciju gad ījum ā z ūd eksona identifik ācijas elementu piesaistes vieta un veidojas vair āku intronu splaisinga enhanceru un silenceru piesaistes vietas. SNP c.86- 104A>G vari ācijas ietekm ē z ūd iesp ējamais alternat īvā procesinga akceptora jeb introna 5’UTR atpaz īšanas vieta. K ā ar ī al ēles A gad ījum ā lokuss var kalpot k ā alternat īvā procesinga atzarojuma vieta. Otrais SNP c.543+138G>A atrodas alternat īva procesinga atzarošanas viet ā. Vari ācijas gad ījum ā palielin ās intensit āte un ticam ība, ka šai vietai piesaist īsies atbilstošais prote īns. Kopum ā varam secin āt, ka proteasomu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu noz īme š ūnā var b ūt daž āda, bet ikviena no t ām b ūtu v ēlams p ārbaud īt in vitro .

91 4. DISKUSIJA

4.1. 14q hromosomas polimorfismi

4.1.1. 14Q13 RE ĂIONA MS POLIMORFISMI UN TO VARIABILIT ĀTE

Sav ā p ētījum ā izmantoj ām, iepriekš aprakst ītos, lokus ā 14q13 esošos piecus HSMS mikrosatel ītus. HSMS006 mar ėieris ir lokaliz ēts proteasomas alfa 6.subvien ības g ēna sestaj ā intron ā, bet p ārējie augšup no š ī g ēna divos citos g ēnos. KIAA0391 g ēnā ir lokaliz ēti tr īs mikrosatel īti: HSMS801, HSMS702, HSMS701, bet p ēdējais un vist ālāk no PSMA6 gēna lokaliz ētais HSMS mar ėieris ir HSMS602, kas atrodas FAM177A1 ( C14orf24) gēna 1.intron ā (Sjakste et al., 2004). Šie mikrosatel īti atrodas re ăion ā ar augstu konserv ātismu, piem ēram, 4.1. att ēlā ir redzams cilv ēka, šimpanzes, su Ħa un peles genomu attiec īgo re ăionu sal īdzin ājums.

4.1.att ēls 14q13 re ăiona filo ăen ētik ā anal īze (Sjakste et al., 2007b). Cilv ēka PSMA6 g ēnam ir sastopami g ēna homologi daudzos zīdītāju organismos, piem ēram, peles genom ā (4.1. att ēls). Š ī g ēna homologi ir p ārsteidzoši l īdz īgi ne tikai p ēc funkcijas, bet ar ī p ēc intronu un eksonu skaita, k ā ar ī p ēc sekvences. Ar ī š ī re ăiona citiem gēniem ir homolo ăiski g ēni citos organismos. T ādej ādi izveidoj ās konkr ēta g ēnu sec ība, kas nav Ĝoti mainījusies evol ūcijas laik ā. Tas noz īmē, ka izmai Ħas lokusa 14q13 jebk āda

92 polimorfisma veid ā var b ūt saist īti ar fenotipisk ām izmai Ħā m, ko ar ī sav ā darb ā cent āmies pier ādīt. Apskatot l īdz 2007. gadam veiktos popul āciju asoci ācijas p ētījumus starp HSMS mar ėieriem un daž ādām slim ībām, konstat ējām, ka t āds ir tikai viens saist ībā ar Greivsa slim ība (Sjakste et al., 2004). Šaj ā p ētījum ā bija pier ādīts, ka HSMS602, HSMS801 un HSMS006 mikrosatel ītu al ēles ir saist ītas ar Greivsa slim ību. Turkl āt izredžu attiec ību koeficients statistiski noz īmīgaj ām al ēlēm bija augsts. Tas saskan ar m ūsu ieg ūtajiem rezult ātiem saist ība ar citu autoim ūno slim ību – juven īlo idiop ātisko artr ītu. Šaj ā asoci ācijas p ētījum ā (Sjakste et al., 2004) netika noteikti HSMS mar ėieru prec īzi mot īvi, ko m ēs izdar ījām m ūsu p ētījum ā pirmo reizi. Secin ājām, ka ar NCBI datu b āzē esošo inform āciju sakr īt tr īs lokusu mot īvi: HSMS006 un HSMS701 ir ar (TG) n atk ārtojumu, bet

HSMS801 – ar (AC) n.

Bet mar ėierim HSMS701 ar mot īvu (AC) mAT(AC) n Latvijas popul ācij ā variabl ā da Ĝa ir tikai 3’gala atk ārtojums jeb ir ar mot īvu (AC) 5AT(AC) n. T ātad šo MS var uzskat īt par vienk āršu dinukleot īdu atk ārtojumu (AC) n. HSMS602, iepriekš (Sjakste et al., 2004) uzskat īts par vienk āršu trinukleot īdu atk ārtojumu jeb (CAA) n, Latvijas popul ācij ā ir ar saliktu mot īvu

(CAA) m(A) n. B ūtu interesanti noskaidrot, vai HSMS701 un HSMS602 mot īvi ir l īdz īgi cit ās popul ācij ās.

4.1.2. 14Q PROTEASOMU PROTE ĪNU GĒNU SNP

Vēl viens no p ētījum ā s ākum ā uzst ādītajiem uzdevumiem bija veikt pirm ējo viena nukleot īda polimorfismu raksturošanu Latvijas popul ācij ā. Š ī uzdevuma ietvaros m ēs analiz ējām 22 viena nukleot īda polimorfismus lokaliz ētus sešos no asto Ħiem 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēniem. Divus SNP ( PSMA6 g ēna promoter ī lokaliz ētie c.-632A>C un c.-128A>G), sekvenc ējot 47 Latvijas popul ācijas paraugus, konstat ējām un analiz ējām pirmo reizi. T āpēc inform āciju par tiem iesniedz ām Nacion ālajam Biotehnolo ăijas inform ācijas centram (NCBI, ASV), ko izmantot daudzu valstu zin ātnieki. Tas noz īmē, ka esam devuši paliekošu ieguld ījumu cilv ēka genoma sekvenc ēšan ā. Pēc m ūsu ieg ūtajiem datiem pieci polimorfismi ( PSMB5 SNP c.616C>A, PSME1 - c.731C>A, PSME2 polimorfisms c.181C>G, PSMA6 SNP c.-1910C>T un c.684-822A>G) Latvijas popul ācij ā ir monomorfiski, kas noz īmē, ka ir sastopama tikai viena no al ēlēm. Apskatot inform āciju par šiem pieciem lokusiem HapMap datu b āzē, secin ājām, ka divi SNP ir monomorfiski ar ī Eiropas popul ācij ā, bet divi SNP nav analiz ēti š ī p ētījuma ietvaros.

93 PSMA6 g ēna vari ācija c.684-822A>G ir sastopama Eiropas popul ācij ā ar zemu frekvenci jeb 0,03. T ātad m ūsu ieg ūtie dati apliecina šo SNP reto sastopam ību Eiropas popul ācij ā. Asto Ħu vari āciju ( PSME1 SNP c.312G>A, PSME2 polimorfisms c.266A>C, PSMA6 g ēna lokaliz ētie c.-2486A>G, c.-632A>C, c.-128A>G, c.-91G>A un c.-43T>G, c.409+380T>G) ret ās al ēles frekvence kontroles 1 un gad ījuma grup ā Latvijas popul ācij ā bija maz āka par 0,05. Tas noz īmē, ka ticamu rezult ātu ieg ūšanai ar šiem polimorfismiem b ūtu nepieciešama liel ākas kolekcijas. Sal īdzinot m ūsu ieg ūtos datus par šiem SNP ar HapMap p ētījuma datiem, secin ājām, ka l īdz īgi dati ir par visiem, iz Ħemot PSMA6 gēna SNP c.409+380T>G, polimorfismiem Eiropas popul ācij ā. PSMA6 gēna SNP c.409+380T>G p ēc HapMap datiem Eiropas popul ācij ā ir sastopams 7% gad ījumos, bet p ēc m ūsu datiem 3 - 4% paraugos atkar ībā no kolekcijas. To var ētu izskaidrot ar p ētījumu atš ėir īgajiem paraugiem, jo HapMap pētījum ā analiz ētaj ā kolekcij ā ir ietverti gan Zieme Ĝeiropas, gan Rietumeiropas popul ācijas paraugi. T ātad ir aptverta vair āku valstu teritoriju popul ācijas, bet m ūsu p ētījum ā ir paraugi no vienas valsts teritorijas popul ācijas. Divu lokusu PSMA6 g ēna lokusu c.76+908G>A un c.410-183T>C ret ās al ēles frekvence bija liel āka nek ā 5%, bet pozit īvi genotip ēto paraugu skaits bija maz āks nek ā 95%. To var ētu izskaidrot ar nezin āma polimorfisma lokaliz āciju izmantotajos praimeros, kas dažos paraugos trauc ē veikt veiksm īgu genotip ēšanu. To var ētu p ārbaud īt n ākotn ē, sekvenc ējot šo SNP rajonus paraugos ar negat īvu rezult ātu. Praimeru sekvenc ēs, p ēc NCBI datu b āzē esoš ās inform ācijas, nav sastopami polimorfismi. 4.2. 2.tipa cukura diab ēta asoci ācijas anal īze

Viens no p ētījuma uzdevumiem bija izp ētīt 14ch gar ā pleca lokusa 14q13 MS un proteasomu prote īnu g ēnu SNP saist ību ar 2.tipa cukura diab ētu Latvijas popul ācij ā. No ieg ūtajiem rezult ātiem m ēs varam secin āt, ka T2DM ir statistiski ticama saist īts ar trim HSMS mar ėieriem Latvijas popul ācij ā.

4.2.1. LOKUSA 14Q13 SAIST ĪBA AR T2DM

PSMA6 g ēnā lokaliz ētā mikrosatel īta HSMS006 al ēli (TG) 22 konstat ējām gandr īz divas reizes biež āk gad ījuma grup ā nek ā kontroles 2 paraugiem (attiec īgi 15,35% un 8,54%). Turkl āt indiv īdam ar š ādu al ēles palielina saslimšanas risks par 94% (jeb OR = 1,94), sal īdzinot ar vid ējo slim ības izplat ību popul ācij ā. Līdz īgā p ētījum ā, ko veica T. Sjakstes grupa sadarb ībā ar Lundas Universit ātes zin ātnieka Leifa Groopa grupu (Lund University, Leif Groop) Botnijas (Somijas) popul ācij ā, arī tika atrasta T2DM saist ība ar HSMS006 lokusa al ēli (TG) 22 , kas l īdz īgi k ā Latvijas popul ācij ā

94 biež āk bija sastopama tieši pacientu grup ā. Abu p ētījumu rezult āti nor āda uz to, ka HSMS006 mikrosatel īts, prec īzāk t ā al ēle (TG) 22 , ir saist īts ar 2. tipa cukura diab ētu daž ādās Eiropas popul ācij ās. To apstiprina ar ī konkr ētās al ēles izredžu saist ības koeficients, kas ab ās populācij ās bija l īdz īgs – Botnijas popul ācija 1,99, bet Latvijas – 1,94. Tātad šobr īd varam izteikt pie Ħē mumu, ka HSMS006 mar ėiera (TG) 22 al ēle ir T2DM riska al ēle Eiropas popul ācij ā. Otrs MS, kurš p ēc m ūsu rezult ātiem ir saist īts ar 2. tipa cukura diab ētu Latvijas popul ācij ā, ir HSMS801. Šis mar ėieris ir lokaliz ēts KIAA0391 (zin āms ar ī k ā MRPP3 jeb mitohondrion ālās RN āzes P 3.prote īna g ēns (Walker, Engelke, et all., 2008)) g ēna 4.intron ā. HSMS801 ir visvariabl ākais mikrosatel īts no visiem HSMS mar ėieriem. P ēc m ūsu rezult ātiem Latvijas popul ācij ā ir 17 al ēles diapazon ā no (AC) 12 līdz (AC) 28 .

Ar T2DM ir saist īta al ēle (AC) 24 un heterozigotais genotips (AC) 20/22 . Al ēli konstat ējām divarpus reizes ret āk gad ījuma grup ā (attiec īgi 3,88 un 9,76), bet genotipus nekonstat ējām nevienam gad ījuma grupas paraugam (frekvence kontroles 2 grup ā 4,07%). T ātad abas formas var uzskat īt par slim ību aizsarg ājoš ām. Al ēle (AC) 24 samazina tās nēsātājam saslimšanas izredzes par 64% (jeb OR = 0,37), sal īdzinot ar saslimšanas izredz ēm popul ācij ā. Pēdējais HSMS mar ėieris, kurš p ēc m ūsu rezult ātiem ir saist īts ar 2. tipa cukura diab ētu

Latvijas popul ācij ā, ir HSMS602, jeb prec īzāk t ā al ēle ar atk ārojumu (CAA) 8 un š īs al ēles homozigotais genotips. Šis MS ir lokaliz ēts g ēnā FAM177A1 , kura funkcija nav prec īzi zin āma.

Al ēli (CAA) 8 gad ījuma un kontroles 2 grup ā konstat ējām attiec īgi ar frekvenc ēm 10,10% un 20,49%, bet homozigoto genotipu neatrad ām gad ījuma grup ā, lai gan kontroles 2 grup ā tas bija 6,56% paraugiem. T ātad ar ī š īs abas formas var uzskat īt par slim ību aizsarg ājoš ām.

Al ēles (CAA) 8 nēsātājam samazin ās saslimšanas izredzes līdz 44% (jeb OR = 0,44), sal īdzinot ar saslimšanas izredz ēm popul ācij ā. Ja personai ir divas š ādas al ēles, tad p ēc m ūsu datiem saslimšanas iesp ējam ība ir minim āla. Dati par pēdējiem divi MS bija atš ėir īgi starp Latvijas un Botnijas popul ācij ām (Sjakste et al., 2007b). Pirmk ārt ir j āmin, ka Botnijas popul ācij ā netika konstat ēta saist ība ar T2DM nevienai no HSMS801 vai HSMS602 mar ėieru al ēlei vai genotipam. Otrk ārt, HSMS801 mar ėiera al ēle (AC) 24 Botnijas popul ācijas ar ī tika nov ērota biež āk kontroles grup ā, bet ne tik izteikti k ā Latvijas popul ācij ā. Attiec īgi Botnijas popul ācij ās T2DM grup ā ar frekvenci

5,49% un kontroles grup ā – 8,70%. Genotips (AC) 20/22 Botnijas populācij ā tika konstat ēts ab ās grup ās un tr īs reizes ret āk tieši T2DM grup ā. Trešk ārt, HSMS602 al ēles (CAA) 8 rezult āti ir izteikti atš ėir īgi starp popul ācij ām. Botnijas popul ācij ā al ēle ir nedaudz biež āk

95 sastopama tieši gad ījuma grup ā (attiec īgi 11,54% un 9,89%), tom ēr genotips (CAA) 8/(CAA) 8 netika konstat ēts gad ījum ā grup ā l īdz īgi k ā Latvijas popul ācij ā. Tas liek dom āt, ka šis homozigotais genotips nav sastopam T2DM pacientiem, iesp ējams vis ā Eiropas popul ācij ā. Tātad HSMS801 un HSMS602 mar ėieru saist ību ar 2. tipa cukura diab ētu b ūtu jāpārbauda cit ās Eiropas popul ācij ās, lai var ētu run āt par to izmantošanu slim ības prognoz ēšan ā. Šobr īd noteikti varam pie Ħemt, ka HSMS801 un HSMS602 mar ėieru al ēles

(AC) 24 un (CAA) 8 un genotipi (AC) 20/22 un (CAA) 8/8 ir attiec īgi T2DM aizsarg ājoš ās al ēles un genotipi Latvijas popul ācij ā.

4.2.2. 14Q PROTEASOMU PROTE ĪNU G ĒNU SAIST ĪBA AR T2DM

Asoci ācijas anal īzē saist ībā ar 2.tipa cukura diab ētu iek Ĝā vām septi Ħus 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu polimorfismus, no kuriem visnoz īmīgākos rezult ātus ieguv ām PSMA6 gēna 5’UTR lokaliz ētajam SNP c.-8C>G . Š īs polimorfisms ir lokaliz ēts -8 poz īcij ā no g ēna 1. eksona jeb pirm ā ATG. Kā riska al ēli saist ībā ar T2DM var uzskat īt vari ācijas reto al ēli jeb al ēli ar G nukleot īdu. Šādu secin ājumu var izdar īt, pirmk ārt, jo p ēc al ēles sadales SNP lokusa saist ība ar slim ību ir uz robežas ( P ~ 0,05), otrk ārt, jo p ēc genotipu sadales šis SNP lokuss ir saist īts ar T2DM ( Pb = 3,81 x 10 -2). Al ēli G nov ēroj ām gandr īz divas reizes biež āk gad ījuma grup ā, bet heterozigoto genotipa formu – pusotrreiz biež āk tieši pacientiem. Turpretim ret ās al ēles homozigoto formu nekonstat ējām ne T2DM, ne kontroles 2 grup ā. Citos Eiropas popul ācijas pētījumos GG genotipa frekvence ir no 0,017 (HapMap p ētījum ā) l īdz 0,042 („ Coriel Cell Repositoty ” p ētījum ā). Kā papildus pier ādījums SNP c.-8C>G noz īmei T2DM slim ības att īst ībā ir septi Ħu SNP lokusu haplotipu anal īze, kur ā konstat ējām divu haplotipu (Hl6 un Hl8) saist ību ar 2. tipa cukura diab ētu. Šie haplotipi savstarp ēji atš ėī rās tikai ar nukleot īdu c.-8C>G SNP lokus ā. Turkl āt haplotips Hl8 ar š ī SNP reto al ēli G uzr ādīja augstu izredžu attiec ības koeficientu (OR = 4,00), kas nor āda, ka š āda haplotipa nēsātāja saslimšanas iesp ēja palielin ās četras reizes, sal īdzinot ar popul ācijas saslimšanas biežumu. PSMA6 g ēna polimorfisms c.-8C>G ir bieži analiz ēts gan popul ācijas p ētījumos, gan saist ībā ar daž ādām slim ībām (Ozaki et al., 2006; Sjakste et al., 2007a; Takashima et al., 2007; Barbieri et al., 2008; Banerjee et al., 2008; Bennett et al., 2008; Alsmadi et al., 2009; Banerjee et al., 2009; Freilinger et al., 2009; Hinohara et al., 2009; Honcharov et al., 2009; Lui et al., 2009; Trapina et al., 2009; Bachmann et al., 2010). Asoci ācijas dati saist ībā ar daž ādām slim ībām ir atš ėir īgi. K ā piemēru var min ēt pētījumus ar miokarda infarktu. Jap ānas popul ācij ā saist ība tika konstat ēta ar augstu

96 statistisko ticam ību (Ozaki et al., 2006), l īdz īgi rezult āti tika ieg ūti ar ī Ėī nas (Lui et al., 2009) popul ācij ā. Analiz ējot piecu KIAA0391 un PSMA6 g ēnu SNP, tai skait ā c.-8C>G, haplotipu frekvences, statistiski ticama saist ība ar miokarda infarktu tika pier ādīta Sa ūda Ar ābijas (Alsmadi et al., 2009). Turpretim, analiz ējot Eiropas popul āciju, prec īzāk Lielbrit ānijas (Sjakste et al., 2007a; Bennett et al., 2008), un citu Jap ānas (Takashima et al., 2007) popul āciju, saist ība ar šo slim ību netika konstat ēta. Starp starptautiski cit ējamiem rakstiem ir atrodams viens p ētījums, kur ā ir analiz ēta PSMA6 g ēna SNP c.-8C>G saist ība ar 2. tipa cukura diab ētu (Barbieri et al., 2008). Šaj ā pētījum ā tika pier ādīts, ka šis SNP ir saist īts ar miokarda infarkta att īst ības palielin āšanos T2DM pacientiem. Turkl āt tika konstat ēts, ka tieši ret ā al ēle G palielina ubikvit īna un 20S proteasomas koncentr ācijas l īmeni miokarda musku Ĝa š ūnās. Rezult āti par šo SNP ir Ĝoti daž ādi, īpaši analiz ējot daž ādas popul ācijas (1.7.att ēls; Literat ūras apskata 1.4.6. apakšnoda Ĝā ), tom ēr tas tiek uzskat īt par v ērt īgu molekul āro mar ėieri, kuru iesaka p ētīt saist ībā ar daž ādām slim ībām. To var ētu izskaidrot ar faktu, ka Ozaki ar kol ēă iem jau pirmaj ā š ī SNP anal īzē pier ādīja, ka tas ir noz īmīgs tieši g ēnu ekspresij ā jeb prec īzāk ret ā al ēle G palielina g ēna ekspresiju par 1,5 l īdz 1,8 reizes, sal īdzinot ar biež āk sastopamo al ēli (Ozaki et al., 2006). T ādejādi SNP vari ācija iesp ējams palielina PSMA6 prote īna sint ēzi un autom ātiski š ūnā tiek palielin āts citu 20S proteasomu prote īnu sint ēze (Barbieri et al., 2008; Bachmann et al., 2010). Mūsu p ētījums apliecina PSMA6 g ēna SNP c.-8C>G lomu 2.tipa cukura diab ēta patalo ăij ā Latvijas popul ācij ā. Turkl āt šo SNP var ētu n ākotn ē izmantot k ā molekul āro mar ėieri š īs slim ības prognoz ēšan ā Latvijas popul ācij ā. 4.3. Juven īlā idiop ātisk ā artr īta asoci ācijas anal īze

4.3.1. LOKUSA 14Q13 SAIST ĪBA AR JIA

Nākošais m ūsu p ētījuma uzdevums bija izp ētīt saist ību starp 14q mikrosatel ītiem un juven īlo idiop ātisko artr ītu Latvijas popul ācij ā. M ūsu rezult āti liecina par to, ka visu piecu HSMS mar ėieru al ēles vai genotipi ir saist īti ar JIA vai t ā oligo- vai poliartr īta formu. Apskatot al ēles un genotipus, kam pier ādījām statistiski ticamu saist ību ar JIA, JIoA un/vai JIpA, ir j āizdala četras grupas. Pirmk ārt, al ēles un/vai genotipi, kuriem pier ādījām saist ību ar JIA kopum ā un, sadalot paraugus p ēc slim ības smaguma pak āpēm (attiec īgi JIoA un JIpA grupās), ar ī ar ab ām subform ām. Šaj ā gad ījum ā al ēles un/vai genotipus Latvijas popul ācij ā var izmantot, pirmk ārt,

97 prognoz ējot indiv īda saslimšanas iesp ējam ību ar slim ību kopum ā; otrk ārt, var noteikt ar k ādu ticam ību b ūs oligo- vai poliartr īta forma, bet nenosakot kura no form ām tieši b ūs. Otra grupa ir al ēles un/vai genotipi ar statistiski ticamu saist ītu ar JIA kopum ā, bet ne ar vienu no slim ības subform ām. Šīs formas var izmantot prognoz ējot indiv īda saslimšanas iesp ējam ību ar slim ību kopum ā Latvijas popul ācij ā, bet nevar preciz ēt kura no septi Ħā m slim ības subform ām b ūs indiv īdam. Trešaj ā un ceturtaj ā grup ā var izdal īt al ēles un/vai genotipus, kurus var izmantot, prognoz ējot indiv īda saslimšanas iesp ējam ību ar konkr ētu slim ības subformu (oligo- vai poliartr īta subformu) Latvijas popul ācij ā. Prec īzāk š īm al ēlēm un genotipiem ir vai nav saist ība ar JIA kopum ā, bet ir statistiski ticama saist ība tikai ar vienu no JIoA vai JIpA subform ām. HSMS801 gad ījum ā par JIA slim ības aizsarg ājošo al ēli var uzskat īt al ēli ar atk ārtojumu

(AC) 17 , bet par JIoA subformas riska genotipiem var uzskat īt divus heterozigotos genotipus –

(AC) 20/21 un (AC) 22/23 . Turkl āt genotipu (AC) 22/23 nekonstat ējām nevienam JIoA grupas paraugam, k ā ar ī nevienam no p ārējiem JIA paraugiem. HSMS701 mar ėiera al ēles ar (AC) atk ārtojumu 15 un 18 reizes ir JIA riska al ēles (attiec īgi OR = 15,43 un 3,16), bet al ēle ar (AC) atk ārtojumu 20 reizes – pret slim ību aizsarg ājoša al ēle. Al ēles (AC) 15 un (AC) 18 ir ar ī abu subformu riska al ēles, turkl āt indiv īdam ar kaut vienu no š īm al ēlēm ir palielin āta iesp ējam ība saslimt ar poliartr īta formu nek ā ar oligoartr īta formu. HSMS701 mikrosatel īta divi heterozigotie genotipi ((AC) 16/19 un

(AC) 17/19) ir juven īlā idiop ātisk ā artr īta riska formas, bet divi homozigotie genotipi ((AC) 17/17 un (AC) 16/16 ) ir attiec īgi pret JIA un JIoA aizsarg ājošie genotipi. HSMS602 mikrosatel īta al ēles ar 168 un 170 bp ir attiec īgi JIA slim ību aizsarg ājoš ā un riska al ēle (attiec īgi OR = 0,28 un 2,40), bet al ēle ar 178 b āzu p āriem ir pret JIoA aizsarg ājoša al ēle. Saslimšanas gad ījum ā indiv īdam gan ar 168 bp garu al ēli, gan ar 170 bp garu al ēli palielin ās iesp ējam ība, ka b ūs poliartr īta forma, nevis oligoartr īta forma. P ēc š ī MS diviem homozigotajiem genotipiem (169/169 bp un 170/170 bp) var ētu prognoz ēt JIA kopum ā, bet nevar ētu noteikt, kura no subform ām b ūs.

HSMS006 mar ėiera gad ījum ā JIA slim ības aizsarg ājoš ā un riska al ēle ir attiec īgi (TG) 19

(OR = 0,73) un (TG) 23 (OR = 2,29), bet al ēle (TG) 20 ir JIoA subformas riska al ēle (OR =

3,83). Al ēle (TG) 23 kop ā ar al ēli (TG) 20 veido heterozigoto genotipu, kas t ā nēsātājam palielina iesp ējam ību saslimt juven īlā idiop ātisko artr ītu 8,38 reizes, sal īdzinot ar popul āciju kopum ā. Turkl āt indiv īdam ar š ādu genotipu ticam āk b ūs poliartr īta (OR = 15,24) forma nek ā oligoartr īta (OR = 7,62). Turpret ī, ja indiv īdam ir divas al ēles (TG) 19 jeb al ēles homozigotais

98 genotips, tad iesp ējam ība saslimt ar oligoartr īta formu samazin ās l īdz 6%. Asoci ācijas anal īzē pēc genotipu sadales, konstat ējām ar ī al ēles (TG) 18 homozigot ās formas saist ību ar JIoA. Š ī al ēli bija vienl īdz bieži izplat īta gad ījuma un kontroles 1 grup ās. Īpaši interesanti izr ādījās dati par HSMS702 mar ėieri, ko var ētu izmantot gan JIoA, gan

JIpA prognoz ēšan ā. Mēs pier ādījām divu al ēĜ u (TG) 10 un (TG) 13 saist ību attiec īgi ar JIoA un

JIpA. Al ēle (TG) 10 palielina saslimšanas iesp ējam ību ar oligoartr īta formu vair āk k ā 7,5 reizes (OR = 7,67), bet al ēle (TG) 13 palielina saslimšanas iesp ējam ību ar poliartr īta formu vair āk nek ā četras reizes (OR = 4,33). Ja indiv īdam ir divas al ēles (TG) 10 jeb al ēles homozigot ā form ā, tad saslimšanas iesp ējam ība ar oligoartr īta formu izteikti palielin ās, jo veseliem indiv īdiem š ādas formas Latvijas popul ācijas nav. Starptautiski cit ējamo literat ūru arh īvā ir viens p ētījums, kur ā b ūtu analiz ēta HSMS mar ėieru saist ība ar kādu no autoim ūnām slim ībām. Šaj ā p ētījum ā tika pier ādīta HSMS602, HSM801 un HSMS006 mar ėieru saist ība ar Greivsa slim ību Latvijas popul ācij ā (Sjakste et al., 2004). Pirms sal īdzin ām m ūsu p ētījum ā ieg ūtos rezult ātus ar Greivsa slim ības asoci ācijas pētījuma rezult ātiem, ir nepieciešams p ārveidot jeb vien ādot abu p ētījuma al ēĜ u nosaukumus. Katrs p ētījums ir veikts ar atš ėir īgām genotip ēšanas metod ēm, t āpēc nav iesp ējams sal īdzin āt al ēles ar vien ādiem b āzu p āru garumiem. Bet t ā, k ā abi p ētījumi ir veikti vien ā popul ācij ā, tad, sal īdzinot kontroles grupu sadales, ir iesp ējams atrast al ēles ar atbilstošiem garumiem. Gan m ūsu p ētījum ā, gan Greivsa slim ības p ētījum ā statistiski ticam saist ība ar slim ību tika pier ādīta HSMS006 al ēlēm (TG) 19 un (TG) 23 . Vien īgi JIA gad ījum ā šis al ēles bija attiec īgi pret slim ību aizsarg ājoša un slim ības riska al ēle, bet Greivsa slim ības gad ījum ā otr ādi. Al ēle (TG) 20 abos p ētījumos biež āk bija sastopama gad ījuma grup ā nek ā kontroles, vien īgi m ūsu p ētījumā š ī atš ėir ība bija statistiski ticama, bet Greivsa slim ības gad ījum ā P vērt ība bija uz robežas (0,07). Turkl āt abu slim ību asoci ācijas p ētījumos š ī al ēle bija pret slim ību aizsarg ājoša. T ātad abu p ētījumu rezult āti liecina, ka HSMS006 mar ėieris ir saist īts ar autoim ūno slim ību att īst ību Latvijas popul ācij ā. Otrs lokuss, kas uzr ādīja statistiski ticamu saist ību ar ab ām autoim ūnaj ām slim ībām, ir HSMS801. Šaj ā gad ījum ā Greivsa slim ības p ētījum ā tika konstat ētas divas riska al ēles

(AC) 15 un (AC) 20 , bet m ūsu p ētījum ā saist ībā ar JIA viena pret slim ību aizsarg ājoš ā al ēle –

(AC) 17 . Al ēle (AC) 17 Greivsa slim ības p ētījum ā, l īdz īgi k ā m ūsu p ētījum ā, biež āk bija sastopama kontroles grup ā, kas liek dom āt, ka š ī al ēle var ētu b ūt ar aizsarg ājošu efektu ar ī cit ās autoim ūnās slim ībās.

99 Asoci ācijas p ētījum ā ar Greivsa slim ību HSMS602 al ēĜ u sadal ē T.Sjakste grupa iesp ējams ir izveidojusi četras daž āda garuma al ēĜ u grupas, kas atbilstu (CAA) n mot īvam. Neskatoties uz to, Greivs slim ības p ētījuma gad ījuma grup ā ir konstat ētas al ēles, kas var ētu atbilst 173, 174 un 175 b āzu p āriem (iesp ējams apvienotas zem grupas ar 174 bp) (Sjakste at el., 2004). M ēs sav ā p ētījum ā š īs al ēles nekonstat ējām ne gad ījuma, ne kontroles grup ā. Tas var ētu noz īmē, pirmk ārt, ka š ī al ēle ir Ĝoti reti sastopama un, otrk ārt, ka t ā ir Greivsa slim ības riska al ēle Latvijas popul ācij ā. Sal īdzinot Greivsa slim ību asoci ācijas anal īzes ale Ĝu datus ar m ūsu p ētījuma rezult ātiem par JIA kopum ā, varam secin āt, ka katra slim ībai ir savas riska al ēles, neskatoties uz kopīgaj ām. Bet apvienojot abu pētījum ā ieg ūtos datus, varam apstiprin āt 14q re ăiona noz īmi saist ībā ar autoim ūnām slim ībām, kas ir iepriekš postul ēta (John, Worthington, 2001). Turkl āt izv ērt ējot m ūsu p ētījum ā ieg ūtos rezult ātus, HSMS mikrosatel ītus var ētu izmantot, lai prognoz ētu JIA slim ības saslimšanas iesp ējamību b ērniem Latvijas popul ācij ā. Tas dotu iesp ēju ne tikai laic īgāk veikt daž ādus profilaktiskos pas ākumus, bet ar ī laic īgāk diagnostic ēti slim ību. Turkl āt šie mar ėieri ir perspekt īvi p ētījumos ar dažādām autoim ūnām slim ībā, t ātad ar ī to prognoz ēšan ā.

4.3.2. 14Q PROTEASOMU PROTE ĪNU G ĒNU SAIST ĪBA AR JIA

Septi Ħu 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu asoci ācijas p ētījum ā ar juven īlo idiop ātisko artr ītu konstat ējām, ka četri SNP ( PSMA6 g ēnā lokaliz ētie c.-4543_-4544insC un c.-110C>A, PSMC6 g ēna SNP c.86-104A>G un PSMA3 gēna polimorfisms c.543+138G>A), ir saist īti ar juven īlo idiop ātisko artr ītu un/vai t ā oligoartr īta vai poliartr īta form ām. Analiz ējot ieg ūtos datus saist ībā ar JIA, ir j āĦ em v ērā, ja SNP ir statistiski ticami saist īts ar slim ību kopum ā un ar tikai vienu no t ās apakštipiem, tad var uzskat īt, ka šis lokusu ir saist īts ar konkr ēto slim ības subformu (oligo- vai poliartr īta subformu) Latvijas popul ācij ā, nevis ar slim ību kopum ā. Tādej ādi m ūsu dati liecina, ka PSMA6 g ēna insercija/del ēcija c.-4543_-4544insC un SNP c.-110C>A, k ā ar ī PSMC6 g ēna 1. intron ā lokaliz ētais SNP c.86-104A>G ir saist īti ar juven īlo idiop ātisko oligoartr ītu, bet PSMA3 g ēna 7.introna SNP c.543+138G>A – ar juven īlo idiop ātisko poliartr ītu. PSMA6 g ēna polimorfismu c.-4543_-4544insC un c.-110C>A saist ību ar JIoA pier ādījām, analiz ējot lokusu p ēc al ēĜ u un/vai p ēc genotipa sadales. Insercijas/del ēcijas gad ījum ā saist ību ar kop ējo slim ības grupu nekonstat ējām, bet p ēc genotipu sadales lokusa

100 saist ība ar JIoA ir uz robežas. K ā ar ī asoci ācijas anal īzē neuzr ādījās saist ība starp k ādu no konkr ētaj ām al ēlēm vai genotipiem un JIoA, tom ēr par riska al ēli var uzskat īt al ēli bez insercijas jeb ar del ēciju. To var pamatot ar faktu, ka tikai JIoA grup ā al ēle ar del ēciju bija biež āk sastopam ā al ēle atš ėir ībā no p ārējām trim grup ām (kontrole1, JIA kopum ā un JIpA). Kā ar ī š īs al ēles homozigoto formu JIoA grup ā sastap ām pusotrreiz biež āk nek ā kontroles grup ā. SNP c.-110C>A gad ījum ā statistiski ticamu saist ību konstat ējām ar ī ar JIA kopum ā. Ar ī šī polimorfisma gad ījum ā asoci ācijas anal īzē neuzr ādījās saist ība starp k ādu no konkr ētaj ām al ēlēm vai genotipiem un JIoA. Tom ēr apskatot ieg ūtos datus, varam secin āt, ka riska al ēle ir ret āk sastopam ā al ēle ar nukleot īdu A. Juven īlā idiop ātisk ā oligoartr īta grup ā šo al ēli un heterozigoto genotipu konstat ējām gandr īz divas reizes biež āk nek ā kontroles 1 grup ā, bet ret ās al ēles homozigotais genotips nebija nevienam paraugam ab ās grup ās. Trešais polimorfisms, kuram pier ādījām statistiski ticamu saist ību ar oligoartr īta formu, ir PSMC6 g ēna 1. intron ā lokaliz ētais SNP c.86-104A>G. Š īs vari ācijas gad ījum ā, pirmk ārt, saist ību pier ādījām ar ī ar juven īlo idiop ātisko artr ītu kopum ā. Otrk ārt, analiz ējot atseviš ėi katras al ēles saist ību ar slim ību, konstat ējām, ka riska al ēle ir ret ā al ēle ar nukleot īdu G. Šīs al ēles n ēsātājam palielin ās iesp ējam ība saslimt ar juven īlo idiop ātisko oligoartr ītu 2,43 reizes, sal īdzinot ar popul āciju kopum ā. K ā papildus pier ādījums al ēles noz īmei ir fakts, ka t ās homozigotais genotips JIoA grup ā ir gandr īz tr īs reizes biež āk sastopams nek ā kontroles 1 grup ā. Ceturt ās vari ācijas ( PSMA3 g ēna SNP c.543+138G>A) gad ījum ā statistiski ticamu saist ību konstat ējām ar poliartr īta subformu, analiz ējot genotipu sadali lokus ā. Sal īdzinot ar iepriekš trim aprakst ītajiem SNP, šis polimorfisms ir pret slim ību aizsarg ājošs. K ā aizsarg ājošo al ēlei var izdal īt reto al ēli ar nukleot īdu A. Prec īzāk par aizsarg ājošo faktoru būtu j āuzskata gan heterozigotais, gan ret ās al ēles homozigotais genotips. Heterozigot ā form ā JIpA grup ā bija sastopama 1,7 reizes ret āk nek ā kontroles grup ā, bet ret ās al ēles homozigot ā forma – 2,64 reizes ret āk. Apskatot pieejam ās publik ācijas, secin ājām, ka no visiem četriem SNP iepriekš analiz ēts ir tikai PSMA6 g ēna polimorfisms c.-110C>A. Šis SNP ir p ētīts saist ībā ar miokarda infarktu Lielbrit ānijas popul ācij ā (Sjakste et al., 2007a). P ārējās vari ācijas saist ībā ar daž ādām slim ībām nav analiz ēti, tāpēc nol ēmām sal īdzin āt mūsu ieg ūtos datus par visiem četriem SNP Latvijas popul ācij ā un HapMap p ētījuma datus Zieme Ĝ- un Rietumeiropas popul ācijas 60 paraugos.

101 Pirmk ārt, secin ājām, ka insercija/del ēcija c.-4543_-4544insC nav p ētīta ne tikai HapMap paraugos. K ā ar ī NCBI datu bāzē pie š ī SNP apraksta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=5807825 ) nav inform ācija par vari ācijas anal īzi citos pētījumos. PSMA3 g ēna SNP gad ījum ā m ūsu dati bija l īdz īgi ar HapMap datiem p ēc al ēĜ u sadales, bet p ēc genotipa frekvenc ēm nov ēroj ām atš ėir ības. Kontroles 1 grup ā atš ėī rās ret ās al ēles homozigot ās un heterozigot ās formas frekvences, sal īdzinot ar HapMap datiem, bet gad ījuma grup ā atš ėī rās biež ās al ēles homozigot ā un heterozigot ā genotipa frekvences. Tas nor āda, ka pēc al ēĜ u sadales m ūsu popul ācija ir l īdz īga ar Zieme Ĝ- un Rietumeiropas popul ācijai, bet genotipu sadale Latvijas popul ācij ā ir atš ėir īga. Interesantus rezult ātus ieguv ām, sal īdzinot PSMC6 g ēna polimorfismu. Ies ākum ā ir jāsaka, ka p ēc HapMap datiem SNP c.86-104A>G un c.86-46C>T savstarp ēji ir saist īti p ēc nel īdzsvaroto saist ības ( linkage disequilibrium jeb LD) ar koeficientu r 2 = 1,00. Latvijas popul ācij ā šis koeficents bija 0,74 (kontrolei 1) un no 0,83 JIpA grup ā l īdz 0,93 JIoA grup ā gad ījuma kolekcijai. Dom ājams, ka šo atš ėir ību var ētu izskaidrot ar daž ādo paraugu skaitu: HapMap p ētījum ā šie lokusi bija analiz ēti 60 paraugos, bet m ūsu p ētījum ā gandr īz tr īs reizes vair āk kontroles grupā un vair āk nek ā divas reizes vair āk gad ījuma kolekcij ā. Lokus ā c.86-104A>G Latvijas popul ācijas paraugos (kontroles 1 grup ā) konstat ējām vair āk paraugus ar reto al ēli, sal īdzinot ar HapMap datiem (0,009), un vair āk heterozigoto paraugu gad ījuma grup ā. Visvair āk daž ādos p ētījumos analiz ēts ir PSMA6 g ēna vari ācija c.-110C>A. Apskatot daž ādu p ētījumu datus (HapMap un “ Coriell Cell Repository ” pētījumi; NCBI datu b āze) konstat ējām, ka tajos, t āpat k ā m ūsu asoci ācijas p ētījum ā ar JIA, nav atrasts paraugs ar reto al ēĜ u homozigoto formu. Šo genotipu neatrad ām ar ī mūsu pētījum ā saist ībā ar 2. tipa cukura diab ētu. Abos iepriekšmin ētajos ārzemju p ētījumos, kas ir veikti Eiropas popul ācij ās, c.- 110C>A ret ās al ēles frekvence ir sal īdzinoši zem āka nek ā m ūsu kontroles 1 grup ā. Mūsu p ētījums apliecina lielo noz īmi analiz ēt daž ādus molekul āros mar ėierus daž ādās popul ācij ās, jo katrai popul ācijai ir savas īpatn ības. Turkl āt analiz ēt jauktas popul ācijas rezult āti var b ūt neviennoz īmīgi. Otrk ārt, līdz īgi k ā p ēc MS p ētījum ā, varam atk ārtoti apstiprin āt iepriekš postul ēto 14q noz īmi saist ībā ar autoim ūnām slim ībām (John, Worthington, 2001). Turkl āt, apvienojot abus JIA asoci ācijas p ētījumus, varam secin āt, ka lokuss 14q ir saist īts ar konkr ēto slim ību, uz ko nor āda augst ā saist ība ar HSMS mikrosatel ītiem (P < 0,01 un OR > 2,00 vai < 0,05). Turkl āt izvel ētie un analiz ētie SNP da Ĝē ji apstiprina šo secin ājumu.

102 Iesp ējams ir nepieciešams papildus citu viena nukleot īda polimorfismu anal īze vai visu proteasomu prote īnu g ēnu vair āku polimorfismu haplotipu anal īze 4.4. Ar slim ībām asoci ēto polimorfismu iesp ējam ā funkcion ālā noz īme

Kā p ēdējo m ūsu p ētījuma uzdevumu, m ēs izvirz ījām veikt in silico anal īzi statistiski noz īmīgajiem 14.hromosomas gar ā pleca polimorfismiem. Šo uzdevumu sev uzst ādījām, jo uzskatam, ka vair āku polimorfismu p ētījumi ar t ūkstošs paraugiem b ūtu j āaizst āj ar pētījumiem, kuros katram perspekt īvajam polimorfismam veiktu r ūpīgu funkciju anal īzi. Mūsdienas liela loma tiek piev ērsta tieši molekul āro mar ėieru noz īmei š ūnā. T āpēc pirms daž ādiem p ētījumiem in vitro ir j āveic bioinform ātisk ā jeb in silico anal īze, lai noteiktu k āda var ētu b ūt polimorfisma loma organism ā, iesp ējams ar ī g ēna ekspresij ā. Pētījum ā izv ērt ējām polimorfismu sekven ču iesp ējamo funkcion ālo noz īmi, analiz ējot in silico transkripcijas faktoru piesaistes vietu un sekund āro strukt ūru izmai Ħas atkar ībā no mikrosatel ītu atk ārtojumu skaita vai nukleot īdu nomai Ħas. Veic ām ar ī DNS liekumu un procesing ā un splaising ā iesaist īto prote īnu piesaistes vietu prognoz ēšanu in silico katra polimorfiska re ăionam. Analiz ējot RNS sekund ārā strukt ūras un procesinga iesaist īto faktoru piesaistes vietu izmai Ħas atkar ībā no polimorfisma, Ħē mām v ērā, vai polimorfisms atrodas re ăion ā, kas piedal ās šajos procesos. Šaj ā p ētījuma da Ĝā iek Ĝāvām polimorfismus, kuriem asoci ācijas anal īzēs pier ādījām saist ību ar k ādu no patalo ăij ām, prec īzāk in silico analiz ējām visus piecus HSMS mikrosatel ītu, visu tr īs PSMA6 g ēna SNP, PSMC6 polimorfismu c.86-104A>G un PSMA3 gēna vari āciju c.543+138G>A.

4.4.1. HSMS MAR ĖIERU IESP ĒJAM Ā FUNKION ĀLĀ NOZ ĪME

Iesp ējamais HSMS mar ėieru ietekme uz 2. tipa cukura diab ēta un/vai juven īlo idiop ātisko artr ītu var ētu b ūt daž ādi, tai skait ā ietekme uz konkr ēto g ēnu ekspresiju. Šobr īd varam skaidri run āt tikai par PSMA6 g ēnā lokaliz ēto HSMS mar ėieri, jo piln īgi skaidri ir zin āma tikai š ī g ēna darb ība. Par KIAA0391 g ēnu ir zin āms, ka tas sintez ē mitohondrion ālo RN āzes P 3.prote īnu, bet nav zin āms piln īga š ī prote īna darb ība cilv ēka mitohondrij ā (Walker, Engelke, et all., 2008). Bet par FAM177A1 ( C14orf24) gēna darb ību pagaid ām inform ācijas nav. Ir pier ādīts, ka MS var ietekm ēt g ēnu ekspresijas l īmeni, ietekm ējot sailenseru vai enhanseru elementu piesaisti vai aktivit āti (Bassuny et al., 2003), izraisot vai ietekm ējot

103 alternat īvo procesingu un t ā regul āciju (Horikawa et al., 2000; Hui et al, 2005), k ā ar ī mikrosatel īti intronos var ietekm ēt multifaktori ālo slim ību etiolo ăiju un pato ăen ēzi (Sjakste et al., 2004). Tāpat ir pier ādīts, ka MS var ietekm ēt g ēna ekspresiju caur kodola matriksa asoci ācij ām (Boulikas, 1993) vai mRNS stabilit ātes regul āciju (Lee et al., 2004). MS ir ar ī svar īgi insulatoru (Filippova et al., 2001), sailenseru (Rothenburg et al., 2001a, b) un enhanseru (Bassuny et al., 2003) komponenti. Ir zin āms, ka daži mikrosatel īti veido piesaistes vietas kodola matriksam (Boulikas, 1993), bet citos gad ījumos veido audu specifiskas piesaistes vietas matriksam (Lenartowski, Goc, 2002). Vienk ārši MS atk ārtojumi var k Ĝū t par pamatu sarež ăī tām DNS telpisk ām strukt ūrām ar lielu funkcionālu noz īmi (Tolstonog et al., 2000; 2005; Li et al., 2003; Rothenburg et al., 2001a,b). MS ar ī ir iesaist īti rekombin ācij ā un atjaunošan ā (Wang, Vasquez, 2007; Chin et al., 2007). Tātad iesp ējams, ka HSMS006 ietekm ē izmain ās PSMA6 g ēna ekspresija un t ātad var main īties proteasomu darb ības intensit ātes š ūnā. PSMA6 prote īns ir viens no proteasomas prote īniem, kas atbild par degrad ējamo substr ātu atpaz īšanas pirms degrad ācijas. Piem ēram, T2DM gad ījum ā IRS-1 un IRS-2 prote īnu, kas ir noz īmīgi insul īna rezistences meh ānism ā (Golab et al., 2004) un cukura diab ēta att īst ībā (Rhodes, 2005), daudzumu š ūnā regul ē tieši proteasomas, kas nodrošina šo prote īnu degrad āciju (Rome et al., 2004; Rhodes, 2005). T ādej ādi, izmainoties proteasomas darb ībai gan uz akt īvāku degradāciju, gan tieši otr ādi uz pas īvāku, var main īties IRS-1 un IRS-2 prote īni degrad ācija intensit āte, un sekas var būt cukura diab ēta att īst ība. JIA gad ījum ā HSMS mar ėierus izv ēlējāmies, balstoties uz hipot ētisku defekt īvo proteasom ālo prote īnu degrad ācijas noz īmi slim ības pato ăen ēzē. Ir pier ādīta vair āku autoim ūno slim ību asoci ācija ar “im ūno”-proteasomu prote īnu LMP2 un LMP7 gēniem. Dažos p ētījumos ir inform ācija par šo g ēnu polimorfismu asoci āciju ar 1. tipa diab ētu (Deng et al., 1995), pieaugušo reimato īdo artr ītu (Maksymowych et al., 1995), juven īlo idiop ātisko artr ītu (Pryhuber et al., 1996) un Greivsa slim ību (Heward et al., 1999). Uzskata, ka ar patolo ăiju asoci ētās al ēles noved l īdz LMP prote īnu nepietiekamai produkcijai un proteasomu funkcijas traucējumiem, kuri, piem ēram, izpaužas k ā transkripcijas faktora NF κB veidošan ās samazin ājums, un š ūnu uz Ħē mības palielin āšan ās pret audz ēju nekrozes faktoru alfa (Hayashi, Faustman, 2001). Ja š ī hipot ēze ir pareiza, m ēs varam propon ēt hipot ēzes par to, ka jebkāda proteasomu prote īna nepietiekama ekspresija var ētu izrais īt t ādu pašu efektu. Run ājot par konkr ētu HSMS mar ėieru lomu š ūnā, m ēs in silico pier ādījām, ka visi pieci HSMS mar ėieri ir iesaist īti procesinga elementu piesaist ē. Tai skait ā, HSMS702 un HSMS006

104 mikrosatel ītu atk ārtojuma sekvenc ē veidojas alternat īva introna donora poz īcijas, bet HSMS701 un HSMS801 sekvenc ē – alternat īva atzarošan ās punkta vietas. T ātad iesp ējams, ka tieši šo MS ietekm ē veidojas izmain īti prote īni. Papildus šai funkcijai HSMS006 mar ėiera atk ārtojumu skaita mai Ħa ietekm ē DNS un RNS sekund āro strukt ūru izmai Ħas, bet HSMS602 un HSMS702 mikrosatel īti – attiec īgi DNS un RNS SS. No visu piecu HSMS mar ėieru atk ārtojumu sekvenc ēm, tieši HSMS602 re ăions ir atbilstošs specifisku transkripcijas faktora (FAC1.01) piesaistei. Š ī TF funkcija v ēl nav piln īgi skaidra, bet ir zin āms, ka tas palielina kasp āzes-3 prote īna aktivit āti (Strachan et al., 2005). Šie bioinform ātisk ās anal īzes rezult āti apstiprina izteikt ās hipot ēzes par mikrosatel ītu nozīmi tieši g ēnu ekspresij ā.

4.4.2. SNP MAR ĖIERU IESP ĒJAM Ā FUNKION ĀLĀ NOZ ĪME

Bioinform ātiski analiz ējot tr īs PSMA6 g ēna SNP, PSMC6 polimorfismu c.86-104A>G un PSMA3 g ēna vari āciju c.543+138G>A, m ēs ieguv ām daž ādus rezult ātus. M ēs konstat ējām, ka SNP var b ūt iesaistīti gan DNS vai RNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħās, gan saist īti ar daž ādu prote īnu piesaistu vietu mai Ħu. In silico anal īzē m ēs neatrad ām inform āciju par šo vari āciju lomu tieši mikroRNS piesaist ē. Ko var ētu izskaidrota ar to, ka visi m ūsu analiz ētie polimorfismi ir lokaliz ēti intronos vai g ēna 5’UTR gal ā, bet p ēc izteiktaj ām hipot ēzēm mikroRNS piesaist ās gēna 3’UTR galam (Furer et al., 2010). Pēc m ūsu dom ām starp g ēniem vai intronos lokaliz ētie SNP var ētu sp ēlēti lielu lomu tieši gēnu ekspresij ā (Villard, 2004; Kurmangaliyev, Gelfand, 2008; Tazi et al., 2009), l īdz īgi k ā tas ir ar intronos lokaliz ētajiem mikrosatel ītiem. Protams, ka ir nepieciešams papildu padzi Ĝin āta anal īzes, tai skait ā in vitro , par SNP iesp ējamo noz īmi g ēnu ekspresij ā. To pier āda literat ūras dati par PSMA6 g ēnā lokaliz ēto polimorfismu c.-8C>G. Neskatoties uz to, ka bioinform ātiskaj ā anal īzē nekonstat ējām š ī SNP iesp ējamo funkcion ālo noz īmi, tai skait ā ietekmi uz transkripcijas faktoru piesaistes vietas mai Ħu, Ozaki ar kol ēă iem, izmantojot vair ākus mode Ĝus, ir konstat ējis, ka c.-8C>G SNP ret ā al ēle G palielina g ēna ekspresiju par 1,5 l īdz 1,8 reizes, sal īdzinot ar biež āk sastopamo al ēli. Tam par iemeslu var ētu b ūt specifiska nezin ām kodola faktora saist īšan ās pie DNS al ēles G gad ījum ā (Ozaki et al., 2006; Bachmann et al., 2010). Pārējie divi PSMA6 g ēna SNP (c.-4543_-4544insC un c.-110C>A) ir lokaliz ēti pirms gēna s ākuma un abi ir saist īti tieši ar JIoA. Turkl āt abu polimorfismu rezult ātā var main īties DNS sekund ārās strukt ūras un vair āku TF piesaistes vietas.

105 Par c.-4543_-4544insC tiešo ietekmi uz g ēnu ekspresiju v ēl ir j āveic papildus anal īzes, bet PSMA6 g ēna SNP c.-110C>A ir lokaliz ēts -1 poz īcij ā no g ēna 5’UTR gala, t ātad no transkripcijas s ākuma punkta. T āpēc varam teikt, ka š īs SNP ir lokaliz ēts re ăion ā, pie kura piesaist ās pamata transkripcijas faktori g ēna ekspresijas s ākum ā. To apliecina ar ī fakts, ka neatkar īgi no polimorfisma al ēĜ u nomai Ħas šaj ā poz īcij ā veidojas modulis ETSF_SP1F_2, kura funkcija ir regul ēts g ēna ekspresiju, sadarbojoties faktoram SP1 un limfu/melo īdu faktoram PU.1. Bioinform ātisk ā anal īze atkl āja, ka pie c.-110C>A re ăiona piesaist ās divu atbalsta cinka pirkstu homedom ēna transkripcijas faktora saimes Atp1a1 regulator ā elementa piesaist īšan ās faktors (ZFHX/AREB6.04), ja ir al ēle ar nukleot īdu C. Šis TF pie sekvences GTTT[C/G] saist ās ar N-termin āla cinka pirkstu klasteri, nodrošinot augst āku piesaisti pie DNS, un tad darbojas k ā silencers g ēna transkripcijas proces ā (Ikeda, Kawakami, 1995). Ret ās al ēles gad ījum ā veidojas barbitur āta veicinoša elementa transkripcijas faktors, kas ar ī parasti darbojas negat īvi uz prote īna ekspresiju (Liang et al., 1995). Šo transkripciju faktoru nomai Ħa var ētu izrais īt daž ādas saiknes ar citiem transkripcijas faktoriem, kas ir lokaliz ēti šaj ā rajon ā. Turkl āt c.-110C>A ietekm ē iesp ējams main ās ar ī DNS specifisko liekumu veidošan ās. Ret ās al ēles gad ījum ā palielin ās iesp ējam ā liekuma le Ħė is un samazin ās molekulas sp ēja liekties, kas var ietekm ēt gan DNS SS veidošanos, gan daž ādu prote īnu, piem ēram, TF, piesaisti. In silico anal īze uzr ādīja, ka PSMC6 g ēnā lokaliz ētā SNP c.86-104A>G ret ās al ēles gad ījum ā veidojas vairogdziedzeris transkripcijas faktora-1 (TTF-1) piesaistes vieta. Š ī faktora kod ējošais g ēns atrodas 14. hromosom ā (Boggaram, 2009) un paša faktora piesaiste DNS ir atkar īga no proteasomu inhibitora (Das, Boggaram, 2007). Ir zin āms, ka žurku parafolikul ārās C š ūnās palielin āts TTF-1 prote īna l īmenis, ko izraisa samazin āts Ca 2+ līmenis, samazina Ca 2+ jūtīgā receptora g ēna ekspresijas l īmen ī (Suzuki et al., 1998) un aktiviz ēt kalciton īna g ēna transkripcija vairogdziedzera C š ūnas (Suzuki et al., 2007). PSMA3 g ēna SNP c c.543+138G>A bioinform ātisk ās anal īzes rezult ātā konstat ējām, ka šīs vari ācijas ietekm ē main ās ne tikai RNS sekundārā strukt ūra, bet ar ī main ās aktivit āte ar kādu prote īns piesaist ītos introna atzarošan ās punktam. Š īs izmai Ħas var ētu b ūt viens no cēlo Ħiem prote īna div ām izoform ām, kas savstarp ēji atš ėiras ar septi Ħā m aminosk ābēm lokaliz ētām tuv āk 3’UTR galam. Šie bioinform ātisk ās anal īzes rezult āti apstiprina izteikt ās hipot ēzes par polimorfismu iesp ējamo lomu tieši g ēnu ekspresij ā, k ā ar ī paver jaunu un v ēl neizp ētītu zin ātnes jomu, kas raisa daudzu jaunus, interesantus jaut ājumus.

106 4.5. Rezult ātu kopsavilkums Apkopojot mūsu rezult ātus un p ārskatot kop ējo projekta sh ēmu, m ēs varam izdal īt galvenos darba posmus. 1. 14. Hromosomas garais plecs tika izv ēlēts asoci ācijas anal īzei, Ħemot v ērā proteasomu un attiec īgi proteasomu prote īnu g ēnu iesp ējamo lomu interes ējošo patalo ăiju pato ăen ēzē. 2. Asoci ācijas anal īzei atbilstoši polimorfismi tika izv ēlēti un analiz ēti. 3. Balstoties uz mikrosatel ītu anal īzi, m ēs konstat ējām lokusa 14q augstu saist ību ar JIA un maz āk noz īmīgu, bet tom ēr statistiski ticamu saist ību ar T2DM. Iesp ējams, mikrosatel īti paši par sevi nav saist īti ar patalo ăiju, tom ēr rezult āti skaidri par āda lokusa saist ību ar analiz ētaj ām slim ībām. 4. Dati par SNP saist ību ar izv ēlētaj ām patalo ăij ām apstiprina saist ības ar slim ībām, lai gan saist ība ir maz āka sal īdzinot ar mikrosatel ītu anal īzi. Iesp ējams, ka m ēs neesam izv ēlējusies izš ėirošos SNP. 5. Ħemot v ērā, ka proteasomas sast āv no vair ākām subvien ībām, t ās funkcijas izteikt āka modifik ācija dr īzāk var ētu notikt, ja ir izmain īta strukt ūra vai ekspresija vair ākām subvien ībām vienlaic īgi. Tas nor āda uz haplotipu anal īzes noz īmīgumu, lai prec īzi raksturotu atrast ās asoci ācijas. T āpēc b ūtu v ēlams visa genoma proteasomu prote īnu g ēnu polimorfismu kombin āciju anal īze. 14q hromosomas polimorfismu haplotipu anal īzē nekonstat ējām izteiktu asoci āciju, lai gan m ūsu rezult āti nor āda uz to, ka š āds p ētījums ir perspekt īvs. T āpēc uzskatam, ka ir j āturpina proteasomu prote īnu g ēnu polimorfismu asoci ācijas anal īzes ar daž ādām patalo ăij ām.

107 SECIN ĀJUMI

1. 14.hromosomas garaj ā plec ā ir lokaliz ēti asto Ħi proteasomu prote īnu g ēni ( PSMB5, PSMB11, PSME1, PSME2, PSMA6, PSMC6, PSMA4 un PSMC1 ) un ar tiem saist īti 391 viena nukleot īda polimorfismi un vismaz 30 mikrosatel īti. Genotip ēšanai izv ēlēti 22 SNP un piecus MS lokaliz ētus sešos proteasomu prote īnu g ēnos vai to rajonos.

2. HSMS602, HSMS701, HSMS702, HSMS801 un HSMS006 mikrosatel īti, k ā ar ī PSMB5 gēna SNP c.70C>T, PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC, c.-110C>A un c.-8C>G, PSMC6 g ēna polimorfisms c.86-104A>G un c.86-46C>T un c.543+138G>A lokaliz ēts PSMA3 g ēnā ir piem ēroti asoci ācijas p ētījumiem Latvijas popul ācij ā.

3. Mūsu rezult āti apstiprina HSMS702, HSMS801 un HSMS006 mar ėieru mot īvus: attiec īgi

(TG) n, (AC) n un (TG) n. Pirmo reizi ir prec īzi noteikti MS HSMS701 un HSMS602

mot īvi. Mar ėierim HSMS701 ir nevis salikts mot īvs (AC) 5AT(AC) n, bet vienk āršs -

(AC) n, bet HSMS602 ir ar saliktu mot īvu (CAA) m(A) n, nevis vienk āršu (CAA) n.

4. Ir veikta atlas īto molekul āro mar ėieru (lokusa 14q13 piecu HSMS mikrosatel ītu un 22 14q hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu SNP) al ēĜ u sadales Latvijas popul ācij ā. HSMS602 molekul ārajam mar ėierim Latvijas popul ācij ā ir sastopamas vismaz

asto Ħas daž ādu mot īvu al ēles ar kop ējo mot īvu (CAA) 7-8;10-11 (A) 5-8, HSMS701

mar ėierim – devi Ħas al ēles diapozon ā (AC) 14-22 , HSMS006 mar ėieriem – desmit al ēles

(TG) 16-25 , bet HSMS702 un HSMS801 – attiec īgi 16 un 17 ((TG) 10-25 un (AC) 12-28 ). No atlas ītajiem 22 viena nukleot īda polimorfismiem pieci SNP Latvijas popul ācij ā bija monomorfiski, asto Ħu vari āciju ret ās al ēles frekvence bija reti sastopamas (maz āka par 0.05), bet divu genotip ēšana nebija veiksm īga vismaz 95% paraugu. Septi Ħi 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismus: PSMB5 gēna SNP c.70C>T, PSMA6 g ēna SNP c.-4543_-4544insC, c.-110C>A un c.-8C>G, PSMC6 g ēna polimorfisms c.86-104A>G un c.86-46C>T un c.543+138G>A lokaliz ēts PSMA3 g ēnā, p ēc pirm ējās genotip ēšanas atzin ām par perspekt īviem asoci ācijas anal īzei (frekvence >0,05 un genotip ēšana pozit īva vismaz 95% paraugos) ar 2.tipa cukura diab ētu un juven īlo idiop ātisko artr ītu.

5. Mūsu rezult āti pier āda, ka ar 2.tipa cukura diab ētu Latvijas popul ācij ā ir saist īta ar PSMA6 g ēna SNP c.-8C>G un HSMS602, HSMS801 un HSMS006 mikrosatel ītiem, ko

108 var ētu izmanto k ā molekul āros mar ėierus 2.tipa cukura diab ēta prognoz ēšan ā Latvijas popul ācij ā.

HSMS006 al ēle (TG) 22 ir saist īta ar 2.tipa cukura diab ētu. HSMS602 al ēle (CAA) 8 un -2 HSMS801 al ēle (AC) 24 ir pret T2DM aizsarg ājošas al ēles (attiec īgi Pb = 1,08x10 , -2 OR = 0,44 un Pa = 3,00x10 , OR = 0,37). Kā ar ī ir identific ēta saist ība starp HSMS602

genotipu (CAA) 8/(CAA) 8 un HSMS801 genotipu (CA) 20 /(CA) 22 un T2DM. Proteasomas prote īna PSMA6 g ēna viena nukleot īda polimorfisma c.-8C>G al ēĜ u sadale ir saist īts ar T2DM Latvijas popul ācij ā uz statistikas ticam ības robežas un slim ības riska al ēle iesp ējams ir ar nukleot īdu G.

6. Ir identific ēts jauns JIA uz Ħē mības lokuss genoma re ăion ā 14q13.2, ietverot KIAA0391 un PSMA6 g ēnus, k ā ar ī ir pier ādīs, ka 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu SNP un lokus ā 14q13.2 esošos HSMS mikrosatel ītus var ētu izmantot k ā molekul āros mar ėierus juven īlā idiop ātisk ā artr īta un t ā oligoartr īta vai poliartr īta formu prognoz ēšan ā Latvijas popul ācij ā.

Ar JIA kopum ā Latvijas popul ācij ā ir saist ītas HSMS006 al ēles (TG) 19 un (TG) 23 ,

HSMS701 al ēles (AC) 15 , (AC) 18 un (AC) 20 , HSMS602 al ēles ar 168 un 170 bp un

HSMS801 al ēle (AC) 17 , k ā ar ī HSMS006 genotips (TG) 20/23 , HSMS701 genotipi

(AC) 16/19 , (AC) 17/19 un (AC) 17/17 un HSMS602 169 un 170 bp al ēĜ u homozigotie genotipi.

HSMS006 al ēle (TG) 20 un homozigotie genotipi (TG) 18/18 un (TG) 19/19 , HSMS702

al ēle (TG) 10 un t ās homozigotais genotips, HSMS701 homozigotais (AC) 16/16 genotips

un HSMS801 divi heterozigotie genotipi (AC) 20/21 un (AC) 22/23 ir saist īta ar JIoA, bet ne

poliartr ītu. Turpretim HSMS702 mar ėiera al ēle (TG) 13 ir saist īta ar JIpA, bet ne oligoartr ītu. PSMA6 g ēna SNPc.-4543_-4544insC un c.-110C>A al ēĜ u un genotipu sadale ir saist īta ar JIoA, bet PSMA3 g ēna SNP c.543-138G>A genotipu sadale - ar JIpA. PSMC6 g ēna 1. introna SNP c.86-104A>G al ēĜ u sadale ir saist īta gan ar JIA kopum ā -3 -4 gan ar t ā subtipu oligoartr ītu (attiec īgi Pb = 1,00x10 un Pb = 1,00x10 ). Ret ās al ēles frekvence ir augst āka gan JIA, gan JIoA grup ās, sal īdzinot ar kontroli, un t ā ir oligoartr īta att īst ības riska al ēle (OR = 2,43).

7. In silico anal īze rezult āti pier āda, ka gan lokusa 14q13.2 mikrosatel ītu, gan 14q proteasomas prote īnu SNP, asoci ētiem ar JIA un/vai T2DM, sekven ču izmai Ħas iesp ējams ietekm ē transkripcijas faktoru piesaistes vietu un/vai DNS vai transkripta

109 sekund ārās strukt ūras modifik ācijas, kā ar ī iesp ējams ietekmē DNS liekšan ās sp ējas un/vai procesing ā un splaising ā iesaist īto prote īnu piesaistes vietu mai Ħu. Visu piecu HSMS mar ėieru sekvences ir piem ērotas procesinga cis-elementu piesaistei, k ā ar ī HSMS702 un HSMS006 atk ārtojuma sekvenc ē veidojas alternat īva introna donora poz īcijas, bet HSMS701 un HSMS801 sekvenc ē – alternat īva atzarošan ās punkta vietas. HSMS006 mar ėiera atk ārtojumu skaita mai Ħa ietekm ē DNS un RNS sekund āro strukt ūru izmai Ħā , bet HSMS602 un HSMS702 mikrosatel īti – attiec īgi DNS un RNS SS. HSMS602 re ăions ir atbilstošs specifisku transkripciju faktora (FAC1.01) piesaitei. Divu PSMA6 g ēna SNP (c.-4543_-4544insC un c.-110C>A) al ēĜ u nomai Ħa ietekm ē transkripcijas faktoru piesaistes vietu un DNS sekund ārās strukt ūras izmai Ħas, k ā ar ī c.- 110C>A ietekm ē DNS molekulas liekumu. Pie PSMC6 polimorfisma c.86-104A>G re ăiona sekvences ret ā al ēle gad ījum ā piesaist ītas TF, vair āki procesinga cis- aktiviz ācijas elementi un z ūd introna atzarošanas prote īna piesaistes vieta. PSMA3 g ēna SNP c.543+138G>A re ăions sekvence ir atbilstoša vair āku transkripcijas faktoru, introna atzarošanas prote īna un procesinga cis-aktiviz ācijas elementi piesaistei atkar ībā no al ēles, k ā ar ī polimorfismu ietekm ē samazin ās DNS liekuma le Ħė is.

110 IZMANTOT Ā LITERAT ŪRA

1. Adams J. The proteasome: structure, function, and role in the cell. Cance Treat Rev. 2003; 39(s1): 3 - 9. 2. Albers HM, Kurreeman FA, Stoeken - Rijsbergen G, Brinkman DM, Kamphuis SS, van Rossum MA, Girschick HJ, Wouters C, Saurenmann RK, Hoppenreijs E, Slagboom P, Houwing - Duistermaat JJ, Verduijn W, Huizinga TW, Ten Cate R, Toes RE, Schilham MW. Association of the autoimmunity locus 4q27 with juvenile idiopathic arthritis, Arthritis Rheum. 2009; 60(3): 901 - 904. 3. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition, New York: Garland Science, 2002; 615 - 659 pp. 4. Alsaeid K, Haider MZ, Ayoub EM. Angiotensin converting enzyme gene insertion - deletion polymorphism is associated with juvenile rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 2003; 30(12): 2705 - 2709. 5. Alsmadi O, Muiya P, Khalak H, Al - Saud H, Meyer BF, Al - Mohanna F, Alshahid M, Dzimiri N Haplotypes encompassing the KIAA0391 and PSMA6 gene cluster confer a genetic link for myocardial infarction and coronary artery disease. Ann Hum Geney. 2009; 73(Pt 5): 475 - 483. 6. Andersen G, Burgdorf KS, Sparsø T, Borch - Johnsen K, Jørgensen T, Hansen T, Pedersen O AHSG tag single nucleotide polymorphisms associate with type 2 diabetes and dyslipidemia: studies of metabolic traits in 7,683 white Danish subjects. Diabetes. 2008; 57(5): 1427 - 1432. 7. Ansell BM. Prognosis in juvenile arthritis. Adv Exp Med Biol. 1999; 455: 27 - 33. 8. Ardlie KG, Lunetta KL, Seislstad M. Testing for population subdivision and association in four case - control studies. Am J Hum Genet, 2002; 71: 304 - 311. 9. Bachmann HS, Novotny J, Sixt S, Liebisch P, Frey UH, Dührsen U, Siffert W, Nückel H. The G Allele of the PSMA6 -8C>G polymorphism is associated with poor outcome in multiple myeloma independently of circulating proteasome serum levels. Eur J Haematol. 2010; In press. 10. Baier LJ, Permana PA, Yang X, Pratley RE, Hanson RL, Shen GQ, Mott D, Knowler WC, Cox NJ, Horikawa Y, Oda N, Bell GI, Bogardus C. A calpain - 10 gene polymorphism is associated with reduced muscle mRNA levels and insulin resistance. J Clin Invest. 2000; 106(7): R69 - R73. 11. Banerjee I, Gupta V, Ahmed T, Faizaan M, Agarwal P, Ganesh S. Inflammatory system gene polymorphism and the risk of stroke: a case - control study in an Indian population. Brain Res Bull. 2008; 75(1): 158 - 165. 12. Banerjee I, Pandey U, Hasan OM, Parihar R, Tripathi V, Ganesh S. Association between inflammatory gene polymorphisms and coronary artery disease in an Indian population. J Thromb Thrombolysis. 2009; 27(1): 88 - 94.

111 13. Barbieri M, Marfella R, Rizzo MR, Boccardi V, Siniscalchi M, Schiattarella C, Siciliano S, Lemme P, Paolisso G. The -8 UTR C/G polymorphism of PSMA6 gene is associated with susceptibility to myocardial infarction in type 2 diabetic patients. Atherosclerosis. 2008; 201(1): 117 - 23. 14. Baroudi T, Bouhaha R, Moran-Moguel C, Sanchez-Corona J, Ben Maiz H, Kammoun Abid H, Benammar-Elgaaied A. Association of the insertion/deletion polymorphism of the angiotensin - converting enzyme gene with type 2 diabetes in two ethnic groups of Jerba Island in Tunisia. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2009; 10(1): 35 - 40. 15. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005; 21(2): 263 – 265. 16. Bassuny WM, Ihara K, Sasaki Y, Kuromaru R, Kohno H, Matsuura N, Hara T. A functional polymorphism in the promoter/enhancer region of the FOXP3/Scurfin gene associated with type 1 diabetes. Immunogenetics. 2003; 55(3): 149 - 156. 17. le Beau MM, Ito C, Cogswell P, Espinosa R 3rd, Fernald AA, Baldwin AS JR. Chromosomal localization of the genes encoding the p50/p105 subunits of NF-kappaB (NFKB2) and the I kappa B/MAD-3 (NFKBI) inhibitor of NF-kappaB to 4q24 and 14q13, respectively. Genomics. 1992; 14(2): 529 - 531. 18. Behrens EM, Finkel TH, Bradfield JP, Kim CE, Linton L, Casalunovo T, Frackelton EC, Santa E, Otieno FG, Glessner JT, Chiavacci RM, Grant SFA, Hakonarson H, The Children’s Hospital of Philadelphia Philadelphia. Association of the TRAF1–C5 locus on chromosome 9 with juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2008; 58(7): 2206 - 2207. . 19. Bennett DA, Xu P, Clarke R, Zondervan K, Parish S, Palmer A, Cardon L, Peto R, Lathrop M, Collins R; International Study of Infarct Survival Collaborators. The exon 1 - 8C/G SNP in the PSMA6 gene contributes only a small amount to the burden of myocardial infarction in 6946 cases and 2720 controls from a United Kingdom population. Eur J Hum Genet. 2008; 16(4): 480 - 486. 20. Berkun Y, Padeh S. Environmental factors and the geoepidemiology of juvenile idiopathic arthritis. Autoimmun Rev. 2010, 9: A319 - A324. 21. Bey F, Silva Pereira I, Coux O, Viegas - Pequignot E, Recillas Targa F, Nothwang HG, Dutrillaux B, Scherrer K. The prosomal RNA - binding protein p27K is a member of the alpha - type human prosomal gene family. Mol Gen Genet. 1993; 237: 291 - 297. 22. Boggaram V. Thyroid transcription factor-1 (TTF-1/Nkx2.1/TITF1) gene regulation in the lung. Clin Sci. 2009; 116: 27 - 35. 23. Bossé Y, Bacot F, Montpetit A, Rung J, Qu HQ, Engert JC, Polychronakos C, Hudson TJ, Froguel P, Sladek R, Desrosiers M. Identification of susceptibility genes for complex diseases using pooling - based genome - wide association scans. Hum Genet. 2009; 125(3): 305 - 318.

112 24. Bouhaha R, Meyre D, Kamoun HA, Ennafaa H, Vaillant E, Sassi R, Baroudi T, Vatin V, Froguel P, Elgaaied A, Vaxillaire M. Effect of ENPP1/PC-1 - K121Q and PPARgamma - Pro12Ala polymorphisms on the genetic susceptibility to T2D in the Tunisian population. Diabetes Res Clin Pract. 2008; 81(3): 278 - 283. 25. Boulikas T. Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix. J Cell Biochem. 1993; 52: 14 - 22. 26. Brooks P, Murrray RZ, Mason GGF, Hendil KB, Rivetta AJ. Association of immunoproteasomes with the endoplasmic reticulum. Biochem J. 2000; 352: 611 - 615. 27. Bukulmez H, Fife M, Tsoras M, Thompson SD, Twine NA, Woo P, Olson JM, Elston RC, Glass DN, Colbert RA. Tapasin gene polymorphism in systemic onset juvenile rheumatoid arthritis: a family - based case - control study. Arthritis Res Ther. 2005; 7(2): R285 – R290. 28. Cartharius K, Frech K, Grote K, Klocke B, Haltmeier M, Klingenhoff A, Frisch M, Bayerlein M, Werner T. MatInspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites. Bioinformatics. 2005; 21: 2933 – 2942. 29. Chin JY, Schleifman EB, Glazer PM. Repair and recombination induced by triple helix DNA. Front Biosci. 2007; 12: 4288 - 4297. 30. Choquet H, Cavalcanti - Proença C, Lecoeur C, Dina C, Cauchi S, Vaxillaire M, Hadjadj S, Horber F, Potoczna N, Charpentier G, Ruiz J, Hercberg S, Maimaitiming S, Roussel R, Boenhnke M, Jackson AU, Patsch W, Krempler F, Voight BF, Altshuler D, Groop L, Thorleifsson G, Steinthorsdottir V, Stefansson K, Balkau B, Froguel P, Meyre D. The T -381C SNP in BNP gene may be modestly associated with type 2 diabetes: an updated meta-analysis in 49 279 subjects. Hum Mol Genet. 2009; 18(13): 2495 – 2501. 31. Ciechanover A, Orian A, Schwartz AL. The ubiquitin - mediated proteolytic pathway: mode of action and clinical implications. J Cell Biochem Suppl. 2000; 34: 40 - 51. 32. Ciechanover A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6(1): 79 - 87. 33. Cimaz R, Cazalis MA, Reynaud C, Gerloni V, Zulian F, Biggioggero M, Martini G, Pontikaki I, Fantini F, Mougin B, Miossec P. IL1 and TNF gene polymorphisms in patients with juvenile idiopathic arthritis treated with TNF inhibitors. Ann Rheum Dis. 2007; 66(7): 900 - 904. . 34. Cinek O, Hradsky O, Ahmedov G, Slavcev A, Kolouskova S, Kulich M, Sumnik Z. No independent role of the 1123 G>C and +2740 A>G variants in the association of PTPN22 with type 1 diabetes and juvenile idiopathic arthritis in two Caucasian populations. Diabetes Res Clin Pract. 2007; 76: 297 - 303. 35. Cinek O, Vavrincová P, Striz I, Drevínek P, Sedláková P, Vavrinec J, Slavcev A. Association of single nucleotide polymorphisms within cytokine genes with juvenile idiopathic arthritis in the Czech population. J Rheumatol. 2004; 31(6): 1206 – 1210.

113 36. Collins GA, Tansey WP. The proteasome: a utility tool for transcription? Curr Opin Genet Dev. 2006; 16(2): 197 - 202. 37. Coux O, Tanaka K, Goldberg AL. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Ann Rev Biochem. 1996; 65: 801 - 847. 38. Dahlmann B Role of proteasomes in disease. BMC BiocheM 2007; 8 Suppl 1: S3. 39. Daly LE, Bourke GJ. Interpretation and uses of medical statisticS Oxford: Blackwell Science: 2000; 166 - 173. 40. Das A, Boggaram V. Proteasome dysfunction inhibits surfactant protein gene expression in lung epithelial cells: mechanism of inhibition of SP - B gene expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007; 292: L74 - L84. 41. Date Y, Seki N, Kamizono S, Higuchi T, Hirata T, Miyata K, Ohkuni M, Tatsuzawa O, Yokota S, Joo K, Ueda K, Sasazuki T, Kimura A, Itoh K, Kato H. Identification of a genetic risk factor for systemic juvenile rheumatoid arthritis in the 5'-flanking region of the TNFalpha gene and HLA genes. Arthritis Rheum. 1999; 42(12): 2577 - 2582. 42. Day TG, Ramanan AV, Hinks A, Lamb R, Packham J, Wise C, Punaro M, Donn RP. Autoinflammatory genes and susceptibility to psoriatic juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2008; 58(7): 2142 - 2146. 43. DeMartino GN, Orth K, McCullough ML, Lee LW, Munn TZ, Moomaw CR, Dawson PA, Slaughter CA. The primary structures of four subunits of the human, high molecular weight proteinase, macropain (proteasome), are distinct but homologous. Biochim Biophys Acta. 1991; 1079: 29 - 38. 44. Deng GY, Muir A, Maclaren NK, She JX. Association of LMP2 and LMP7 genes within the major histocompatibility complex with insulin - dependent diabetes mellitus: population and family studies. Am J Hum Genet. 1995; 56(2): 528 - 534. 45. Desmet FO, Hamroun D, Lalande M, Collod-Béroud G, Claustres M, Béroud C. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acids Res. 2009; 37(9): e67. 46. Donn R, Lunt M, Alourfi Z, Zeggini E, Lamb R, the British Paediatric Rheumatology Study Group, De Benedetti F, Thomson W, Jury F, Meazza C, Ray D. A Functional Promoter Haplot ype of Macrophage Migration Inhibitory Factor Is Linked and Associated With Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheum. 2004; 50(5): 1604 - 1610. 47. Donn R, Zeggini E, Alourfi Z, Lunt M, De Benedetti F, Stevens A, Meazza C, Shelley E, the British Paediatric Rheumatology Study Group, Thomson W, Lamb R, Ollier WER, Ray D. Mutation Screening of the Macrophage Migration Inhibitory Factor Gene: Positive Association of a Functional Polymorphism of Macrophage Migration Inhibitory Factor With Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheum. 2002; 46(9): 2402 - 2409. 48. Donn RP, Barrett JH, Ollier WER, Farhan A, Thomson W, Stopford A, Pepper L, Shelley E, Davies N, the British Paediatric Rheumatology Study Group. Cytokine Gene

114 Polymorphisms and Susceptibility to Juvenile Idiopathic ArthritiSs. Arthritis Rheum. 2001; 44(4): 802 - 810. . 49. Duesing K, Charpentier G, Marre M, Tichet J, Hercberg S, Balkau B, Froguel P, Gibson F. Evaluating the association of common PBX1 variants with type 2 diabetes. BMC Med Genet. 2008a; 9: 14. 50. Duesing K, Fatemifar G, Charpentier G, Marre M, Tichet J, Hercberg S, Balkau B, Froguel P, Gibson F Strong association of common variants in the CDKN2A/CDKN2B region with type 2 diabetes in French Europids. Diabetologia. 2008b; 51(5): 821 - 826. 51. Eastell T, BSPAR Study Group, Hinks A, Thomson W, SNPs in the FOXP3 gene region show no association with Juvenile Idiopathic Arthritis in a UK Caucasian populatioNRheumatology (Oxford). 2007; 46(8): 1263 - 1265. 52. Egerer T, Martinez - Gamboa L, Dankof A, Stuhlmüller B, Dörner T, Krenn V, Egerer K, Rudolph PE, Burmester GR, Feist E. Tissue - specific up-regulation of the proteasome subunit beta5i (LMP7) in Sjögren's syndrome. Arthritis Rheum. 2006; 54(5): 1501 - 1508. 53. Eike MC, Nordang GB, Karlsen TH, Boberg KM, Vatn MH; IBSEN study group, Dahl- Jørgensen K, Rønningen KS, Joner G, Flatø B, Bergquist A, Thorsby E, Førre O, Kvien TK, Undlien DE, Lie BA. The FCRL3 -169T>C polymorphism is associated with rheumatoid arthritis and shows suggestive evidence of involvement with juvenile idiopathic arthritis in a Scandinavian panel of autoimmune diseases. Ann Rheum Dis. 2008; 67(9): 1287 - 1291. 54. Ezzidi I, Mtiraoui N, Cauchi S, Vaillant E, Dechaume A, Chaieb M, Kacem M, Almawi WY, Froguel P, Mahjoub T, Vaxillaire M. Contribution of type 2 diabetes associated loci in the Arabic population from Tunisia: a case - control study. BMC Med Genet. 2009; 10: 33. 55. Fawcett J, Hamel FG, Bennett RG, Vajo Z, Duckworth WC. Insulin and analogue effects on protein degradation in different cell types Dissociation between binding and activity. J Biol Chem. 2001; 276: 11552 - 11558. 56. Fife MS, Gutierrez A, Ogilvie EM, Stock CJW, Samuel JM, Thomson W, Mack LF, Lewis CM, Woo P. Novel IL10 gene family associations with systemic juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Res Ther. 2006; 8: R148. 57. Filippova GN, Thienes CP, Penn BH, Cho DH, Hu YJ, Moore JM, Klesert TR, Lobanenkov VV, Tapscott SJ. CTCF - binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation - sensitive insulator at the DM1 locus. Nat Gen. 2001; 28, 335 - 343. 58. Flynt AS, Lai EC. Biological principles of microRNA - mediated regulation: shared themes amid diversity. Nat Rev Genet. 2008; 9(11): 831 - 842. 59. Freeman H, Cox RD. Type - 2 diabetes: a cocktail of genetic discovery. Hum Mol Genet. 2006; 15 (2): R202 – R209. 60. Freilinger T, Bevan S, Ripke S, Gschwendtner A, Lichtner P, Müller - Myhsok B, Wichmann HE, Markus HS, Meitinger T, Dichgans M. Genetic variation in the

115 lymphotoxin - alpha pathway and the risk of ischemic stroke in European populations. Stroke. 2009; 40(3): 970 - 972. 61. Fricke B, Heink S, Steffen J, Kloetzel PM, Krüger E. The proteasome maturation protein POMP facilitates major steps of 20S proteasome formation at the endoplasmic reticulum. EMBO Rep. 2007; 8(12): 1170 - 1175. 62. Furer V, Greenberg JD, Attur M, Abramson SB, Pillinger MH. The role of microRNA in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. Clin Immunol. 2010; In press. 63. Gabriel SE, Michaud K Epidemiological studies in incidence, prevalence, mortality, and comorbidity of the rheumatic diseases. Arthritis Res Ther. 2009; 11(3): 229. 64. Galanakis E, Kofteridis D, Stratigi K, Petraki E, Vazgiourakis V, Fragouli E, Mamoulakis D, Boumpas DT, Goulielmos GN. Intron 4 a/b polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with both type 1 and type 2 diabetes in a genetically homogeneous population. Hum Immunol. 2008; 69(4 - 5): 279 - 283. 65. Gaulton KJ, Willer CJ, Li Y, Scott LJ, Conneely KN, Jackson AU, Duren WL, Chines PS, Narisu N, Bonnycastle LL, Luo J, Tong M, Sprau AG, Pugh EW, Doheny KF, Valle TT, Abecasis GR, Tuomilehto J, Bergman RN, Collins FS, Boehnke M, Mohlke KL. Comprehensive association study of type 2 diabetes and related quantitative traits with 222 candidate genes. Diabetes. 2008; 57(11): 3136 - 3144. . 66. Genuth S, Alberti KG, Bennett P, Buse J, Defronzo R, Kahn R, Kitzmiller J, Knowler WC, Lebovitz H, Lernmark A, Nathan D, Palmer J, Rizza R, Saudek C, Shaw J, Steffes M, Stern M, Tuomilehto J, Zimmet P, Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Follow - up report on the diagnosis of diabetes mellitus. Diabetes Care. 2003; 26(11): 3160 - 3167. 67. Gergely P Jr, Pazár B, Nagy ZB, Gombos T, Rajczy K, Balogh Z, Orbán I, Sevcic K, Poór G. Structural polymorphisms in the mannose - binding lectin gene are associated with juvenile idiopathic arthritis. J Rheumatol. 2009; 36(4): 843 - 847. 68. Glass DN, Giannini EH. Juvenile rheumatoid arthritis as a complex genetic trait. Arthritis Rheum. 1999; 42(11): 2261 - 2268. 69. Glickman MH, Raveh D. Proteasome plasticity. FEBS Lett. 2005; 579(15): 3214 - 3223. 70. Golab J, Bauer T M, Daniel V, Naujokat C. Role of the ubiquitin – proteasome pathway in the diagnosis of human diseases. Clin Chim Acta. 2005; 340: 27 - 40. 71. Goldstein BJ. 2002. Insulin Rezistence as the Core Defect in Type 2 Diabetes Mellitus. Am J Cardiol. 2002; 90: 3G - 10G. 72. Gomes AV, Zong C, Ping P. Protein degradation by the 26S proteasome system in the normal and stressed myocardium. Antioxid Redox Signal. 2006; 8(9 - 10): 1677 - 1691. 73. Gragnoli C, Cronsell J. PSMD9 gene variants within NIDDM2 may rarely contribute to type 2 diabetes. J Cell Physiol. 2007; 212(3): 568 - 571.

116 74. Griffiths - Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. miRBase: tools for microRNA genomics. NAR. 2008; 36(Database Issue): D154 - D158. 75. Groettrup M, Kirk CJ, Basler M Proteasomes in immune cells: more than peptide producers? Nat Rev Immunol. 2010; 10(1): 73 - 78. 76. Groll M, Huber R. Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle. Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35(3): 606 - 616. 77. Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica. 2001; 4(1): 9. 78. Hayashi T, Faustman DL. Selected Contribution: Association of gender - related LMP2 inactivation with autoimmune pathogenesis. J Appl Physiol. 2001; 91: 2804 - 2815. 79. Heilig R, Eckenberg R, Petit JL, Fonknechten N, Da Silva C, Cattolico L, Levy M, Barbe V, de Berardinis V, Ureta - Vidal A, Pelletier E., Vico V, Anthouard V, Rowen L, Madan A, Qin S, Sun H, Du H, Pepin K, Artiguenave F, Robert C, Cruaud C, Bruls T, Jaillon O, Friedlander L, Samson G, Brottier P, Cure S, Segurens B, Aniere F, Samain S, Crespeau H, Abbasi N, Aiach N, Boscus D, Dickhoff R, Dors M, Dubois I, Friedman C, Gouyvenoux M, James R, Madan A, Mairey - Estrada B, Mangenot S, Martins N, Menard M, Oztas S, Ratcliffe A, Shaffer T, Trask B, Vacherie B, Bellemere C, Belser C, Besnard - Gonnet M, Bartol - Mavel D, Boutard M, Briez - Silla S, Combette S, Dufosse - Laurent V, Ferron C, Lechaplais C, Louesse C, Muselet D, Magdelenat G, Pateau E., Petit E., Sirvain - Trukniewicz P, Trybou A, Vega - Czarny N, Bataille E., Bluet E., Bordelais I, Dubois M, Dumont C, GueriNT, Haffray S, Hammadi R, Muanga J, Pellouin V, Robert D, Wunderle E., Gauguet G, Roy A, Sainte - Marthe L, Verdier J, Verdier - Discala C, Hillier L, Fulton L, McPherson J, Matsuda F, Wilson R, Scarpelli C, Gyapay G, Wincker P, Saurin W, Quetier F, Waterston R, Hood L, Weissenbach J. The DNA sequence and analysis of human chromosome 14. Nature. 2003; 6923(421): 601 - 607. 80. Hertel JK, Johansson S, Raeder H, Midthjell K, Lyssenko V, Groop L, Molven A, Njølstad PR. Genetic analysis of recently identified type 2 diabetes loci in 1,638 unselected patients with type 2 diabetes and 1,858 control participants from a Norwegian population - based cohort (the HUNT study). Diabetologia. 2008; 51(6): 971 - 977. 81. Heward JM, Allahabadia A, Sheppard MC, Barnett AH, Franklyn JA, Gough SC. Association of the large multifunctional proteasome (LMP2) gene with Graves' disease is a result of linkage disequilibrium with the HLA haplotype DRB1*0304 - DQB1*02 - DQA1*0501. Clin Endocrinol (Oxf). 1999; 51(1): 115 - 118. 82. Hinks A, Barton A, Shephard N, Eyre S, Bowes J, Cargill M, Wang E, Ke X, Kennedy GC, John S, Worthington J, Thomson W, British Society of Paediatric and Adolescent Rheumatology Study Group. Identification of a novel susceptibility locus for juvenile idiopathic arthritis by genome - wide association analysis. Arthritis Rheum. 2009c; 60(1): 258 - 263.

117 83. Hinks A, Barton S, John CE, Griffiths M, Silman A, Bruce I, Donn R, Hawkins C, Thomson W, Worthington J, Association Between the PTPN22 Gene and Rheumatoid Arthritis and Juvenile Idiopathic Arthritis in a UK Population: Further Support That PTPN22 Is an Autoimmunity Gene. Arthritis Rheum. 2005; 52(6): 1694 - 1699. 84. Hinks A, Eyre S, Ke X, Barton A, Martin P, Flynn E, Packham J, Worthington J, Childhood Arthritis Prospective Study (CAPS), UKRAG Consortium, BSPAR Study Group, Thomson W. Association of the AFF3 gene and IL2/IL21 gene region with juvenile idiopathic arthritis. Genes Immun. 2010; 11(2): 194 - 198. 85. Hinks A, Eyre S, Ke X, Barton A, Martin P, Flynn E, Packham J; Childhood Arthritis Prospective Study (CAPS); UKRAG Consortium; BSPAR Study Group, Worthington J, Thomson W. Overlap of disease susceptibility loci for rheumatoid arthritis and juvenile idiopathic arthritis. Ann Rheum Dis. 2009a; 69(6): 1049 - 1053. 86. Hinks A, Ke X, Barton A, Eyre S, Bowes J, Worthington J, Thompson SD, Langefeld CD, Glass DN, Thomson W; UK Rheumatoid Arthritis Genetics Consortium; British Society of Paediatric and Adolescent Rheumatology Study Group. Association of the IL2RA/CD25 gene with juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2009b; 60(1): 251 - 257. 87. Hinohara K, Nakajima T, Sasaoka T, Sawabe M, Lee BS, Ban J, Park JE, Izumi T, Kimura A. Replication studies for the association of PSMA6 polymorphism with coronary artery disease in East Asian populations. J Hum Genet. 2009; 54(4): 248 - 251. 88. Hirano Y, Kaneko T, Okamoto K, Bai M, Yashiroda H, Furuyama K, Kato K, Tanaka K, Murata S. Dissecting beta - ring assembly pathway of the mammalian 20S proteasome. EMBO J. 2008; 27(16): 2204 - 2213. 89. Honcharov SV, Dosenko VIe, Kha ĭtovych MV, Mo ĭbenko OO. [Allele polymorphism of genes coding proteasome subunits is associated with an enhanced risk for arterial hypertension in adolescents] Fiziol ZH. 2009; 55(2): 3 - 10. 90. Horikawa Y, Oda N, Coux N J, Li X, Orho - Melander M, Hara M, Hinokio Y, Linder T H, Mashima H, Schwartz P, del Bosque - Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polomsky K S, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier L J, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E., Hanis CL, Bell GI. Genetic variation in the gene envoding calpain - 10 in associated with type 2 diabetes mellitus. Nature Genet. 200; 26: 63 - 175. 91. Hui J, Hung LH, Heiner M, Schreiner S, Neumüller N, Reither G, Haas SA, Bindereif A. Intronic CA - repeat and CA - rich elements: a new class of regulators of mammalian alternative splicing. EMBO J. 2005; 24(11): 1988 - 1998. 92. Ikeda K, Kawakami K. DNA binding through distinct domains of zinc - finger - homeodomain protein AREB6 has different effects on gene transcription. Eur J Biochem. 1995; 233(1): 73 - 82. 93. Ilowite NT. Current Treatment of Juvenile Rheumatoid Arthritis. Pediatrics. 2002; 109: 109 – 115.

118 94. Iordanidou M, Tavridou A, Petridis I, Arvanitidis KI, Christakidis D, Vargemezis V, Manolopoulos VG. The serotonin transporter promoter polymorphism (5 - HTTLPR) is associated with type 2 diabetes. Clin Chim Acta. 2010; 411(3 - 4): 167 - 171. 95. James AB, Conway AM, Morris BJ Regulation of the neuronal proteasome by Zif268 (Egr1). J Neurosci. 2006; 26(5): 1624 - 1634. 96. Jiang YH, Martinez JE, Ou Z, Cooper ML, Kang SH, Pursley A, Cheung SW. De novo and complex imbalanced chromosomal rearrangements revealed by array CGH in a patient with an abnormal phenotype and apparently "balanced" paracentric inversion of 14(q21q23). Am J Med Geneta. 2008; 146A(15): 1986 - 1993. 97. Jiménez-Morales S, Velázquez-Cruz R, Ramírez-Bello J, Bonilla-González E, Romero- Hidalgo S, Escamilla-Guerrero G, Cuevas F, Espinosa-Rosales F, NE Martínez-Aguilar, Gómez - Vera J, Baca V, Orozco L. Tumor necrosis factor–α is a common genetic risk factor for asthma, juvenile rheumatoid arthritis, and systemic lupus erythematosus in a Mexican pediatric population. Hum Immunol. 2009; 70: 251 - 256. 98. Jin W, Patti ME. Genetic determinants and molecular pathways in the pathogenesis of Type 2 diabetes. Clin Sci (Lond). 2009; 116(2): 99 - 111. 99. Jing YL, Sun QM, Bi Y, Shen SM, Zhu DL. SLC30A8 polymorphism and type 2 diabetes risk: Evidence from 27 study groups. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2010; In press. 100. John B, Enright AJ, Aravin A, Tuschl T, Sander C, Marks DS. Human MicroRNA targets. PLoS Biol. 2004; 2(11): e363. 101. Jonsson A, Isomaa B, Tuomi T, Taneera J, Salehi A, Nilsson P, Groop L, Lyssenko V. A variant in the KCNQ1 gene predicts future type 2 diabetes and mediates impaired insulin secretion. Diabetes. 2009; 58(10): 2409 - 13. 102. Juodka B, Spiess E, Angiolillo A, Joswig G, Rothbarth K, Werner D. High salt- and SDS- stable DNA binding protein complexes with ATPase and protein kinase activity retained in chromatin - depleted nuclei. Nucleic Acids Res. 1995; 23(8): 1359 - 1366. 103. Kalis M, Sjakste T, Sjakste N, Groop L. Association study between (TG) repeat polymorphism in PSMA6 gene and type II diabetes mellitus in Botnia. Biologija. 2003; 2: 12 - 14. 104. Kamnasaran D, Cox DW. Current status of human chromosome 14. J Med Geneti. 2002; 29: 81 - 90. 105. Kapeta S, Chondrogianni N, Gonos ES. Nuclear erythroid factor 2 - mediated proteasome activation delays senescence in human fibroblasts. J Biol Chem. 2010; 285(11): 8171 - 8184. 106. Karim MA, Craig RL, Wang X, Hale TC, Elbein SC. Analysis of FOXO1A as a candidate gene for type 2 diabetes. Mol Genet Metab. 2006; 88(2): 171 - 177. 107. Kato H, Nomura K, Osabe D, Shinohara S, Mizumori O, Katashima R, Iwasaki S, Nishimura K, Yoshino M, Kobori M, Ichiishi E., Nakamura N, Yoshikawa T, Tanahashi T, Keshavarz P, Kunika K, Moritani M, Kudo E., Tsugawa K, Takata Y, Hamada D, Yasui N,

119 Miyamoto T, Shiota H, Inoue H, Itakura M. Association of single - nucleotide polymorphisms in the suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) gene with type 2 diabetes in the Japanese. Genomics. 2006; 87: 446 - 458. 108. Kawaguchi M, Minami K, Nagashima K, Seino S. Essential role of ubiquitin - proteasome system in normal regulation of insulin secretion. J Biol Chem. 2006; 281(19): 13015 - 13020. 109. Kim YC, Wu SY, Lim HS, Chiang CM, Kodadek T. Non - proteolytic regulation of p53 - mediated transcription through destabilization of the activatoRpromoter complex by the proteasomal ATPases. J Biol Chem. 2009; 284(50): 34522 - 34530. 110. Kloetzel PM. The proteasome and MHC class I antigen processing. Biochim Biophys Acta. 2004; 1695(1 - 3): 225 - 233. 111. Konstantinova IM, Tsimokha AS, Mittenberg AG. Role of proteasomes in cellular regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 2008; 267: 59 - 124. 112. Krämer U, Illig T, Grune T, Krutmann J, Esser C. Strong associations of psoriasis with antigen processing LMP and transport genes TAP differ by gender and phenotype. Genes Immun. 2007; 8(6): 513 - 517. 113. Krause S, Kuckelkorn U, Dörner T, Burmester GR, Feist E, Kloetzel PM. Immunoproteasome subunit LMP2 expression is deregulated in Sjogren's syndrome but not in other autoimmune disorders. Ann Rheum Dis. 2006; 65(8): 1021 - 1027. 114. Krüger E, Kloetzel PM, Enenkel C. 20S proteasome biogenesis. Biochimie. 2001; 83(3 - 4): 289 - 293. 115. Kurmangaliyev YZ, Gelfand MS. Computational analysis of splicing errors and mutations in human transcripts. BMC Genomics. 2008 14; 9: 13. 116. Lamb R, Thomson W, British Society of Paediatric and Adolescent Rheumatology, Ogilvie EM, Donn R. Positive association of SLC26A2 gene polymorphisms with susceptibility to systemic-onset juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2007; 56(4): 1286 - 1291. 117. Lamb R, Thomson W, Ogilvie E, Donn R, British Society of Paediatric and Adolescent Rheumatology. Wnt-1 - inducible signaling pathway protein 3 and susceptibility to juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2005; 52(11): 3548 - 3553. 118. Lee C, Yu MH. Protein Folding and Diseases. J Biochem Mol Biol, 2005; 38(3): 275 - 280. 119. Lee JH, Jeon MH, Seo YJ, Lee YJ, Ko JH, Tsujimoto Y, Lee JH. CA repeats in the 3'- untranslated region of bcl-2 mRNA mediate constitutive decay of bcl-2 mRNA. J Biol Chem. 2004; 279: 42758 - 42764. 120. Lenartowski R, Goc A. Tissue-specific association of the human tyrosine hydroxylase gene with the nuclear matrix. Neurosci Lett. 2002; 330: 151 - 154. 121. Li G, Tolstonog GV, Traub P. Interaction in vitro of type III intermediate filament proteins with Z-DNA and B-Z-DNA junctions. DNA Cell Biol. 2003; 22: 141 - 169.

120 122. Liang Q, He JS, Fulco AJ. The role of Barbie box sequences as cis-acting elements involved in the barbiturate - mediated induction of cytochromes P450BM-1 and P450BM-3 in Bacillus megaterium. J Biol Chem. 1995; 270: 4438 - 4450. 123. Liepa I. BiometrijA R īga: Zvaigzne. 1974; 336 lpp. 124. Lin Y, Sun Z. Current views on type 2 diabetes.S J Endocrinol. 2010; 204(1): 1 - 11. 125. Lindner E, Nordang GBN, Melum E, Flatø B, Selvaag AM, Thorsby E, Kvien TK, Førre ØT, Lie BA. Lack of association between the chemokine receptor 5 polymorphism CCR5delta32 in rheumatoid arthritis and juvenile idiopathic arthritis. BMC Med Gen. 2007; 8: 33 – 38. 126. Ling C, Groop L, Guerra SD, Lupi R. Calpain - 10 expression is elevated in pancreatic islets from patients with type 2 diabetes. PLos. One. 2009; 4(8): e6558. 127. Liu X, Wang X, Shen Y, Wu L, Ruan X, Lindpaintner K, Yusuf S, Engert JC, Anand S, Tan X, Liu L The functional variant rs1048990 in PSMA6 is associated with susceptibility to myocardial infarction in a Chinese population. Atherosclerosis. 2009; 206(1): 199 - 203. 128. Lü S, Chen Z, Yang J, Chen L, Gong S, Zhou H, Guo L, Wang J. Overexpression of the PSMB5 gene contributes to bortezomib resistance in T - lymphoblastic lymphoma/leukemia cells derived from Jurkat line. Exp Hematol. 2008; 36(10): 1278 - 1284. 129. Lü S, Yang J, Chen Z, Gong S, Zhou H, Xu X, Wang J. Different mutants of PSMB5 confer varying bortezomib resistance in T lymphoblastic lymphoma/leukemia cells derived from the Jurkat cell line. Exp Hematol. 2009; 37(7): 831 - 837. 130. Maksymowych W P, Tao S, Luong M, Suarez - Almazor M, Nelson R, Pazderka F, Russell AS. Polymorphism in the LMP2 and LMP7 genes and adult rheumatoid arthritis: no relationship with disease susceptibility or outcome. Tissue Antigens. 1995a; 46(2): 136 - 139. 131. Maksymowych WP, Jhangri GS, Gorodezky C, Luong M, Wong C, Burgos-Vargas R, Morenot M, Sanchez-Corona J, Ramos-Remus C, Russell AS. The LMP2 polymorphism is associated with susceptibility to acute anterior uveitis in HLA-B27 positive juvenile and adult Mexican subjects with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 1997; 56(8): 488 - 492. 132. Maksymowych WP, Russel AS. Polymorphism in the LMP2 gene influences the relative risk for acute anterior uveitis in unselected patients with ankylosing spondylitis. Clinical Investigation Medicine. 1995; 18: 42 - 46. 133. Maksymowych WP, Suarez - Almazor M, Chou CT, Russell AS. Polymorphism in the LMP2 gene influences susceptibility to extraspinal disease in HLA - B27 positive individuals with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 1995b; 54(4): 321 - 324. 134. Malik S, Shukla A, Sen P, Bhaumik SR. The 19 s proteasome subcomplex establishes a specific protein interaction network at the promoter for stimulated transcriptional initiation in vivo . J Biol Chem. 2009; 284(51): 35714 - 35724.

121 135. Marchetti P, Del Prato S, Lupi R, Del Guerra S.The pancreatic beta - cell in human Type 2 diabetes. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2006; 16: S3 - S6. 136. Marciano R, Giacopelli F, Divizia MT, Gattorno M, Felici E, Pistorio A, Martini A, Ravazzolo R, Picco P. Polymorphic variant inside the osteopontin gene shows association with disease course in oligoarticular juvenile idiopathic arthritis. Ann Rheum Dis. 2006; 65(5): 662 - 665. 137. Martinez-Vicente M, Sovak G, Cuervo AM. Protein degradation and aging. Exp Gerontol. 2005; 40: 622 - 633. 138. McCarthy MI, Zeggini E. Genome - wide association studies in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 2009; 9(2): 164 - 171. 139. McDowell TL, Symons JA, Ploski R, Førre O, Duff GW. A genetic association between juvenile rheumatoid arthritis and a novel interleukin-1 alpha polymorphism. Arthritis Rheum. 1995; 38(2): 221 - 228. 140. Meex SJ, van Vliet-Ostaptchouk JV, van der Kallen CJ, van Greevenbroek MM, Schalkwijk CG, Feskens EJ, Blaak EE, Wijmenga C, Hofker MH, Stehouwer CD, de Bruin TW. Upstream transcription factor 1 (USF1) in risk of type 2 diabetes: association study in 2000 Dutch Caucasians. Mol Genet Metab. 2008; 94(3): 352 - 355. 141. Mein CA, Esposito L, Dunn MG, Johnson GC, Timms AE, Goy JV, Smith AN, Sebag- Montefiore L, Merriman ME., Wilson AJ, Pritchard LE, Cucca F, Barnett AH, Bain SC, Todd JA. A search for type 1 diabetes susceptibility genes in families from the United Kingdom. Nature Genet. 1998; 19: 297 - 300. 142. Meiners S, Heyken D, Weller A, Ludwig A, Stangl K, Kloetzel P-K, Krüger E. Inhibition or Proteasome Activity Induces Concerted Expression of Proteasome Genes and de Novo Formation of Mammalian Proteasomes. J Biol Chem. 2003; 278 (24): 21517 - 21525. 143. Merforth, S, Kuehn L, Osmers A, Dahlmann B. Alteration of 20S proteasome subtypes and proteasome activator PA28 in skeletal muscle of rat after induction of diabetes mellitus. Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35: 740 - 748. 144. Mishto M, Santoro A, Bellavista E., Bonafé M, Monti D, Franceschi C. Immunoproteasomes and immunosenescence. Ageing Res Rev. 2003; 2: 419 - 432. 145. Miterski B, Drynda S, Böschow G, Klein W, Oppermann J, Kekow J, Epplen JT. Complex genetic predisposition in adult and juvenile rheumatoid arthritis. BMC Genet. 2004, 5: 2 - 15. 146. Miyagi T, Tatsumi T, Takehara T, Kanto T, Kuzushita N, Sugimoto Y, Jinushi M, Kasahara A, Sasaki Y, Hori M, Hayashi N. Impaired expression of proteasome subunits and human leukocyte antigens class I in human colon cancer cells. J Gastroenterol Hepatol. 2003; 18(1): 32 - 40. 147. Morino K, Petersen KF, Dufour S, Befroy D, Frattini J, Shatzkes N, Neschen S, White MF, Bilz S, Sono S, Pypaert M, Shulman GI. Reduced mitochondrial density and increased

122 IRS - 1 serine phosphorylation in muscle of insulin - resistant offspring of type 2 diabetic parents. J Clin Invest. 2005; 115: 3587 - 3593. 148. Motulsky H. Intuitive Biostatistics: A Nonmathematical Guide to Statistical Thinking, Second edition, New York: Oxford University Press, Inc. 2010; 204 – 209. 149. Munteanu MG, Vlahovicek K, Parthasaraty S, Simon I, Pongor S. Rod models of DNA: sequence - dependent anisotropic elastic modelling of local bending phenomena. Trends Biochem Sci. 1998; 23(9): 341 - 346. 150. Murata S, Sasaki K, Kishimoto T, Niwa S, Hayashi H, Takahama Y, Tanaka K. Regulation of CD8+ T cell development by thymus - specific proteasomes. Science. 2007; 316(5829): 1349 - 1353. 151. Oerlemans R, Franke NE, Assaraf YG, Cloos J, van Zantwijk I, Berkers CR, Scheffer GL, Debipersad K, Vojtekova K, Lemos C, van der Heijden JW, Ylstra B, Peters GJ, Kaspers GL, Dijkmans BA, Scheper RJ, Jansen G. Molecular basis of bortezomib resistance: proteasome subunit beta5 (PSMB5) gene mutation and overexpression of PSMB5 protein. Blood. 2008; 112(6): 2489 - 2499. 152. Ogilvie EM, Fife MS, Thompson SD, Twine N, Tsoras M, Moroldo M, Fisher SA, Lewis CM, Prieur AM, Glass DN, Woo P. The -174G allele of the interleukin-6 gene confers susceptibility to systemic arthritis in children: a multicenter study using simplex and multiplex juvenile idiopathic arthritis families. Arthritis Rheum. 2003; 48(11): 3202 - 3206. 153. Ozaki K, Sato H, Iida A, Mizuno H, Nakamura T, Miyamoto Y, Takahashi A, Tsunoda T, Ikegawa S, Kamatani N, Hori M, Nakamura Y, Tanaka T. A functional SNP in PSMA6 confers risk of myocardial infarction in the Japanese population. Nat Genet. 2006; 38(8): 921 - 925. 154. Ozen S, Alikasifoglu M, Bakkaloglu A, Duzova A, Jarosova K, Nemcova D, Besbas N, Vencovsky J, Tuncbilek E. Tumour necrosis factor α G →A -238 and G →A -308 polymorphisms in juvenile idiopathic arthritis. Rheumatology. 2002; 41: 223-227. 155. Ozyürek AR, Gürses D, Ulger Z, Levent E, Bakiler AR, Berdeli A. Allelic frequency of the MCP-1 promoter -2518 polymorphism in the Turkish population and in Turkish patients with juvenile rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2007; 26(4): 546 - 550. 156. Permutt MA, Wasson JC, Suarez BK, Lin J, Thomas J, Meyer J, Lewitzky S, Rennich JS, Parker A, DuPrat L, Maruti S, Chayen S, Glaser B. A genome scan for type 2 diabetes susceptibility loci in a genetically isolated population. Diabetes. 2001; 50, 681 - 685. 157. Perry JR, Weedon MN, Langenberg C, Jackson AU, Lyssenko V, Sparsø T, Thorleifsson G, Grallert H, Ferrucci L, Maggio M, Paolisso G, Walker M, Palmer CN, Payne F, Young E, Herder C, Narisu N, Morken MA, Bonnycastle LL, Owen KR, Shields B, Knight B, Bennett A, Groves CJ, Ruokonen A, Jarvelin MR, Pearson E, Pascoe L, Ferrannini E, Bornstein SR, Stringham HM, Scott LJ, Kuusisto J, Nilsson P, Neptin M, Gjesing AP, Pisinger C, Lauritzen T, Sandbaek A, Sampson M, Zeggini ME, Lindgren CM,

123 Steinthorsdottir V, Thorsteinsdottir U, Hansen T, Schwarz P, Illig T, Laakso M, Stefansson K, Morris AD, Groop L, Pedersen O, Boehnke M, Barroso I, Wareham NJ, Hattersley AT, McCarthy MI, Frayling TM. Genetic evidence that raised sex hormone binding globulin (SHBG) levels reduce the risk of type 2 diabetes. Hum Mol Genet. 2010; 19(3): 535 - 544. 158. Petersen KF, Shulman GI. Etiology of Insulin Rezistence. Am J Med. 2006; 119(5A): 10S - 16S. 159. Petty RE, Southwood TR, Baum J, Bhettay E., Glass DN, Manners P, Maldonado- Cocco J, Suarez-Almazor M, Orozco-Alcala J, Prieur AM. Revision of the proposed classification criteria for juvenile idiopathic arthritis: Durban, 1997. J Rheumatol. 1998; 25(10): 1991 - 1994. 160. Petty RE, Southwood TR, Manners P, Baum J, Glass DN, Goldenberg J, Xiaohu H, Maldonado-Cocco J, Orozco-Alcala J, Prieur AM, Suarez-Almazor ME., Woo P. International League of Association for Rheumatology Classification of juvenile idiopathic arthritis: Second Revision, Edmonton, 2001. J Rheumatol. 2004; 31: 2 - 3. 161. Phelan JD, Thompson SD, Glass DN. Susceptibility to JRA/JIA: complementing general autoimmune and arthritis traits. Genes and Immun. 2006; 7: 1 - 10. 162. Plemper RK, Hammond AL. Protein degradation in human disease. Prog Mol Subcell Biol. 2002; 29: 61 - 84. 163. Prahalad S, Bohnsack JF, Jorde LB, Whiting A, Clifford B, Dunn D, Weiss R, Moroldo M, Thompson SD, Glass DN, Bamshad MJ. Association of two functional polymorphisms in the CCR5 gene with juvenile rheumatoid arthritis. Genes and Immun. 2006; 7: 468 – 475. 164. Prahalad S, Glass DN. A comprehensive review of the genetics of juvenile idiopathic arthritis. Pediatr Rheumatol. 2008; 6: 11 - 27. 165. Prahalad S, Glass DN. Is Juvenile rheumatoid arthritis/juvenile idiopathic arthritis different from rheumatoid erthtitis? Arthritis Res. 2002; 4(3): 3003 - 3010. 166. Prahalad S, Hansen S, McNally B, Whiting A, Zeft AS, Guthery SL, Bohnsack JF, Clifford B, Jorde LB. Variants in TNFAIP3, STAT4, and C12orf30 Loci Associated With Multiple Autoimmune Diseases Are Also Associated With Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheum. 2009; 60(7): 2124 - 2130. 167. Prahalad S, Shear ES, Thompson SD, Giannini EH, Glass DN. Increased prevalence of familial autoimmunity in simplex and multiplex families with juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2002; 46(7): 1851 - 1856. 168. Prokopenko I, McCarthy MI, Lindgren CM. Type 2 diabetes: new genes, new understanding. Trends Genet 2008; 24(12): 613 - 621. 169. Prokopenko I, Zeggini E, Hanson RL, Mitchell BD, Rayner NW, Akan P, Baier L, Das SK, Elliott KS, Fu M, Frayling TM, Groves CJ, Gwilliam R, Scott LJ, Voight BF, Hattersley AT, Hu C, Morris AD, Ng M, Palmer CN, Tello - Ruiz M, Vaxillaire M, Wang CR, Stein L, Chan J, Jia W, Froguel P, Elbein SC, Deloukas P, Bogardus C, Shuldiner AR,

124 McCarthy MI. International Type 2 Diabetes 1q ConsortiuM Linkage disequilibrium mapping of the replicated type 2 diabetes linkage signal on chromosome 1q. Diabetes. 2009; 58(7): 1704 - 1709. 170. Pryhuber KG, Murray KJ, Donnelly P, Passo MH, Maksymowycz WP, Glass DN, Giannini EH, Colbert RA. Polymorphism in the LMP2 gene influences disease susceptibility and severity in HLA - B27 associated juvenile rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 1996; 23: 747 - 752. 171. Qu Y, Yang Z, Jin F, Sun L, Feng J, Tang L, Zhang C, Zhu X, Shi X, Sun H, Wang B, Wang L. The haplotype identified in LEPR gene is associated with type 2 diabetes mellitus in Northern Chinese. Diabetes Res Clin Pract. 2008a; 81(1): 33 - 37. 172. Qu Y, Yang Z, Jin F, Sun L, Zhang C, Ji L, Sun H, Wang B, Wang L. The Ser311Cys variation in the paraoxonase 2 gene increases the risk of type 2 diabetes in northern Chinese. J Genet. 2008b; 87(2): 165 - 169. 173. Quach H, Barreiro LB, Laval G, Zidane N, Patin E, Kidd KK, Kidd JR, Bouchier C, Veuille M, Antoniewski C, Quintana - Murci L. Signatures of purifying and local positive selection in human miRNAs. Am J Hum Genet. 2009; 84(3): 316 - 327. 174. Ramachandran V, Ismail P, Stanslas J, Shamsudin N, Moin S, Mohd Jas R. Association of insertion/deletion polymorphism of angiotensin - converting enzyme gene with essential hypertension and type 2 diabetes mellitus in Malaysian subjects. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2008; 9(4): 208 - 14. 175. Ravelli A, Martini A. Juvenile idiopathic arthritis. Lancet. 2007; 369: 767 - 778. 176. Rechsteiner M, Hill CP. Mobilizing the proteolytic machine: cell biological role of proteasome activators and inhibitors. Trends Cell Biol, 2005; 15(1): 27 - 33. 177. Rees SD, Britten AC, Bellary S, O'Hare JP, Kumar S, Barnett AH, Kelly MA. The promoter polymorphism - 232C/G of the PCK1 gene is associated with type 2 diabetes in a UK - resident South Asian population. BMC Med Genet. 2009; 10: 83. 178. Rhodes CHJ. Type 2 Diabetes - a Matter of b - Cell Life and Death? Science. 2005; 37: 380 - 383. 179. Ridderstråle M, Groop L. Genetic dissection of type 2 diabetes. Mol Cell Endocrinol. 2009; 297(1 - 2): 10 - 17. 180. Ringold S, Burke A, Glass RM. Juvenile Idiopathic Arthritis. JAMA. 2005; 294(13): 1722 pp. 181. Rohr P, Veit TD, Scheibel I, Xavier RM, Brenol JC, Chies JA, Kvitko K. GSTT1, GSTM1 and GSTP1 polymorphisms and susceptibility to juvenile idiopathic arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2008; 26(1): 151 - 155. 182. Rome S, Clement K, Rabasa - Lhoret R, Loizon E, Poitou C, Barsh GS, Riou JP, Laville M, Vidal H. Microarray profiling of human skeletal muscle reveals that insulin regulates ~ 800 genes during an hyperinsulinemic clamP J Biol Chem. 2003; 278: 18063 - 18068.

125 183. Rome S, Meugnier E, Vidal H. The ubiquitin - proteasome pathway is a new partner for the control of insulin signaling. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2004; 7: 249 - 254. 184. Rothenburg S, Koch - Nolte F, Haag F. DNA methylation and Z - DNA formation as mediators of quantitative differences in the expression of alleles. Immunol Rev. 2001a; 184: 286 - 298. 185. Rothenburg S, Koch - Nolte F, Rich A, Haag F. A polymorphic dinucleotide repeat in the rat nucleolin gene forms Z - DNA and inhibits promoter activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001b; 98(16): 8985 - 8990. 186. Rozas J, Sánchez - DelBarrio JC, Messeguer X, Rozas R. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics. 2003; 19(18): 2496 - 2497. 187. Rozen S, Skaletsky H J. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 2000; 132: 365 - 386. 188. Rumba - Rozenfelde I, Bi ėis E, Braclavska O, Daugule I, Ebela I, Folkmanis V, Karaševica J, ĥikitina - Za ėe L, Remberga S, Saul īte I, Sjakste T, Trapi Ħa I, Venti Ħš J, Bērnu slim ību riska faktori. LU Akad ēmiskais apg āds. 2009b; 183 lpp. 189. Rumba-Rozenfelde I, Ebele I, Remberga S, Daugule I, Trapi Ħa I, Saul īte I, Bi ėis E, Karašk ēvica J, Sjakste T. B ērnu mirst ību un invalidit āti ietekm ējošo faktoru izp ēte Gr āmata: Latvijas iedz īvot āju dz īvildzi un dz īves kvalit āti apdraudoš ās slim ībaS Zin ātnisk ā anal īze un galven ās rekomend ācijaS Autoru kolekt īvs Valda P īrāga redakcij ā. Valsts pētījumu programma medic īnas zin ātn ē. R īga, 2009a: 67 - 75. 190. Runstadler JA, Säilä H, Savolainen A, Leirisalo - Repo M, Aho K, Tuomilehto - Wolf E, Tuomilehto J, Seldin MF. HLA - DRB1, TAP2/TAP1, and HLA - DPB1 haplotypes in Finnish juvenile idiopathic arthritis: more complexity within the MHC. Genes Immun. 2004; 5(7): 562 - 571. 191. Salonen JT, Uimari P, Aalto JM, Pirskanen M, Kaikkonen J, Todorova B, Hyppönen J, Korhonen VP, Asikainen J, Devine C, Tuomainen TP, Luedemann J, Nauck M, Kerner W, Stephens RH, New JP, Ollier WE, Gibson JM, Payton A, Horan MA, Pendleton N, Mahoney W, Meyre D, Delplanque J, Froguel P, Luzzatto O, Yakir B, Darvasi A. Type 2 diabetes whole - genome association study in four populations: the DiaGen consortium. Am J Hum Genet. 2007; 81(2): 338 - 345. 192. Sanghera DK, Been L, Ortega L, Wander GS, Mehra NK, Aston CE, Mulvihill JJ, Ralhan S. Testing the association of novel meta-analysis - derived diabetes risk genes with type II diabetes and related metabolic traits in Asian Indian Sikhs. J Hum Genet. 2009; 54(3): 162 - 168. 193. Sanghera DK, Demirci FY, Been L, Ortega L, Ralhan S, Wander GS, Mehra NK, Singh J, Aston CE, Mulvihill JJ, Kamboh IM. PPARG and ADIPOQ gene polymorphisms increase type 2 diabetes mellitus risk in Asian Indian Sikhs: Pro12Ala still remains as the strongest predictor. Metabolism. 2010; 59(4): 492 - 501.

126 194. Sanghera DK, Ortega L, Han S, Singh J, Ralhan SK, Wander GS, Mehra NK, Mulvihill JJ, Ferrell RE, Nath SK, Kamboh MI. Impact of nine common type 2 diabetes risk polymorphisms in Asian Indian Sikhs: PPARG2 (Pro12Ala), IGF2BP2, TCF7L2 and FTO variants confer a significant risk. BMC Med Genet. 2008; 9: 59. 195. Sanjeevi CB, Miller EN, Dabadghao P, Rumba I, Shtauvere A, Denisova A, Clayton D, Blackwell JM. Polymorphism at NRAMP1 and D2S1471 loci associated with juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2000; 43(6): 1397 - 1404. 196. Scheffler S, Kuckelkorn U, Egerer K, Dörner T, Reiter K, Soza A, Burmester GR, Feist E. Autoimmune reactivity against the 20S-proteasome includes immunosubunits LMP2 (beta1i), MECL1 (beta2i) and LMP7 (beta5i). Rheumatology (Oxford). 2008; 47(5): 622 - 626. 197. Scheibel I, Veit T, Neves AG, Souza L, Prezzi S, Machado S, Kohem C, Icarelli M, Xavier R, Brenol JC, Chies JA. Differential CCR5Delta32 allelic frequencies in juvenile idiopathic arthritis subtypes: evidence for different regulatory roles of CCR5 in rheumatological diseases. Scand J Rheumatol. 2008; 37(1): 13 - 17. . 198. Scherrer K, Bey F. The Prosomes (Mulicatalytic Proteinases; Proteasomes) and Their Relationship to the Untranslated Messenger Ribonucleoproteins, the Cytoskeleton, and Cell Differentiation. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994; 49: 1 - 64. 199. Scherrer K. Prosomes, subcomplexes of untranslated mRNA. P Mol Biol Rep. 1990; 14(1): 1 - 9. 200. Schinner S, Scherbaum WA, Bornstein SR, Barthel A. Molecular mechanisms of insulin rezistence. Diabet Med. 2005; 22: 674 - 682. 201. Schlesselman JJ, Stolley PD. Case - control studies: design, conduct, analysis. New York: Oxford University Press, Inc. 1982; 33 - 42. 202. Schmeling H, Wagner U, Peterson A, Horneff G. Tumor necrosis factor alpha promoter polymorphisms in patients with juvenile idiopathic arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2006; 24(1): 103 - 108. 203. Schmitt HP. Protein ubiquitination, degradation and the proteasome in neuro - degenerative disorders: No clear evidence for a significant pathogenetic role of proteasome failure in Alzheimer disease and related disorders. Med Hypotheses. 2006; 67(2): 311 - 317. 204. Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, Willer CJ, Li Y, Duren WL, Erdos MR, Stringham HM, Chines PS, Jackson AU, Prokunina - Olsson L, Ding CJ, Swift AJ, Narisu N, Hu T, Pruim R, Xiao R, Li XY, Conneely KN, Riebow NL, Sprau AG, Tong M, White PP, Hetrick KN, Barnhart MW, Bark CW, Goldstein JL, Watkins L, Xiang F, Saramies J, Buchanan TA, Watanabe RM, Valle TT, Kinnunen L, Abecasis GR, Pugh EW, Doheny KF, Bergman RN, Tuomilehto J, Collins FS, Boehnke M. A genome - wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants. Science. 2007; 316(5829): 1341 - 1345.

127 205. Sia C, Weinem M. Genetic susceptibility to type 1 diabetes in the intracellular pathway of antigen processing - a subject review and cross-study comparison. Rev Diabet Stud. 2005; 2(1): 40 - 52. 206. Sixt SU, Dahlmann B Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin - incidence and relevance. Biochim Biophys ActA 2008; 1782(12): 817 - 823. 207. Sjakste J, Sjakste T, Jurk ēvi čs S, ěauberte L, Collan Y, Vikamnis U, Sjakste N. Loss of heterozygocity in an intron of pros - 27 K gene revealed by microsatellite analysis. Biologija. 2003; 1: 33 - 36. 208. Sjakste N, Sjakste T, Rumba I, Vikmanis U. Proteasomes in pathology. Proc Latv Acad Sci Sect B. 2002; 1/2: 7 - 16. 209. Sjakste N, Sjakste T. Kas ir proteasoma? Latvijas ārstu žurn āls. 2001; 4: 22 - 25. 210. Sjakste T, Eglite E, Sochnev A, Marga M, Pirags V, Collan Y, Sjakste N. Microsatellite genotyping of chromosome 14q13.2 - 14q13 in the area of proteasomal PSMA6 gene on association with Graves’ disease in the Latvian population. Immunogenetics. 2004; 56(4): 238 - 243. 211. Sjakste T, Kalis M, Poudziunas I, Pirags V, Lazdins M, Groop L, Sjakste N. Association of microsatellite polymorphisms of the human 14q13.2 region with type 2 diabetes mellitus in Latvian and Finnish populations. Ann Hum Genet. 2007b; 71(Pt 6): 772 - 776. 212. Sjakste T, Poudziunas I, Ninio E, Perret C, Pirags V, Nicaud V, Lazdins M, Evanss A, Morrison C, Cambien F, Sjakste N. SNPs of PSMA6 gene - investigation of possible association with myocardial infarction and type 2 diabetes mellitus. Genetika. 2007a; 43(4): 553 - 559. 213. Sjakste T, Poudziunas I, Pirags V, Lazdins M, Sjakste N. Bioinformatic analysis of evolutional conservatism and functional significance of microsatelliete alleles of human 14q13.2 region associated with type 2 diabetes mellitus. Proc Latv Acad Sci Sect B. 2008; 62(3): 91 - 102. 214. Sjakste T, Sjakste N, Scherrer K Exon/intron organisation of human proteasome PROS - 27 K gene. DNA Seq. 2001; 12(4): 261 - 265. 215. Sjakste T, Trapina I, Rumba - Rozenfelde I, Lunin R, Sugoka O, Sjakste N. Identification of a Novel Candidate Locus for Juvenile Idiopathic Arthritis at 14q13.2 in the Latvian Population by Association Analysis with Microsatellite Markers. DNA Cell Biol. 2010, In press. 216. Sladek R, Rocheleau G, Rung J, Dina C, Shen L, Serre D, Boutin P, Vincent D, Belisle A, Hadjadj S, Balkau B, Heude B, Charpentier G, Hudson TJ, Montpetit A, Pshezhetsky AV, Prentki M, Posner BI, Balding DJ, Meyre D, Polychronakos C, Froguel P. A genome - wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes. Nature. 2007; 445(7130): 881 - 885.

128 217. Sliuzas V, Utkus A, Kucinskas V. Recombinant chromosome 14 due to maternal pericentric inversion. J Appl Genet. 2008; 49(2): 205 - 207. 218. Smerdel A, Dai KZ, Lorentzen AR, Flatø B, Maslinski S, Thorsby E, Førre Ø, Spurkland A. Genetic association between juvenile rheumatoid arthritis and polymorphism in the SH2D2A gene. Genes Immun. 2004; 5(4): 310 - 312. 219. Song F, Li X, Zhang M, Yao P, Yang N, Sun X, Hu FB, Liu L. Association between heme oxygenase-1 gene promoter polymorphisms and type 2 diabetes in a Chinese population. Am J Epidemiol. 2009; 170(6): 747 - 756. 220. Stock CJW, Ogilvie EM, Samuel JM, Fife M, Lewis CM, Woo P. Comprehensive association study of genetic variants in the IL - 1 gene family in systemic juvenile idiopathic arthritis. Genes Immun. 2008; 9: 349 - 357. 221. Strachan GD, Ostrow LA, Jordan-Sciutto KL. Expression of the fetal Alz-50 clone 1 protein induces apoptotic cell death. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 336(2): 490 - 495. 222. Sugiura T, Maeno N, Kawaguchi Y, Takei S, Imanaka H, Kawano Y, Terajima - Ichida H, Hara M, Kamatani N. A promoter haplotype of the interleukin - 18 gene is associated with juvenile idiopathic arthritis in the Japanese population. Arthritis Res Ther. 2006; 8(3): R60. 223. Suzuki K, Lavaroni S, Mori A, Okajima F, Kimura S, Katoh R, Kawaoi A, Kohn LD. Thyroid Transcription Factor 1 Is Calcium Modulated and Coordinately Regulates Genes Involved in Calcium Homeostasis in C Cells. Mol Cell Biol. 1998; 18(12),: 7410 - 7422. 224. Suzuki M, Katagiri N, Ueda M, Tanaka S. Functional analysis of Nkx2.1 and Pax9 for calcitonin gene transcription. Gen Comp Endocrinol. 2007; 152(2 - 3): 259 - 266. 225. Szopa M, Malczewska - Malec M, Kiec - Wilk B, Skupien J, Wolkow P, Malecki MT, Sieradzki J. Variants of the adiponectin gene and type 2 diabetes in a Polish population. Acta Diabetol. 2009; 46(4): 317 - 322. 226. Tabara Y, Osawa H, Kawamoto R, Onuma H, Shimizu I, Miki T, Kohara K, Makino H. Replication study of candidate genes associated with type 2 diabetes based on genome - wide screening. Diabetes. 2009; 58(2): 493 - 498. 227. Takashima N, Shioji K, Kokubo Y, Okayama A, Goto Y, Nonogi H, Iwai N. Validation of the Association Between the Gene Encoding Proteasome Subunit α Type 6 and Myocardial Infarction in a Japanese Population. Circ J. 2007; 71: 495 - 498. 228. Tan JT, Ng DP, Nurbaya S, Ye S, Lim XL, Leong H, Seet LT, Siew WF, Kon W, Wong TY, Saw SM, Aung T, Chia KS, Lee J, Chew SK, Seielstad M, Tai ES. Polymorphisms identified through genome - wide association studies and their associations with type 2 diabetes in Chinese, Malays, and Asian - Indians in Singapore. J Clin Endocrinol Metab. 2010; 95(1): 390 - 397. 229. Tanaka K, Tsurumi C. The 26S proteasome: subunits and functions. Mol Biol Rep. 1997; 24(1 - 2): 3 - 11.

129 230. Tanaka K. Molecular biology of proteasomes. Mol Biol Rep. 1995; 21(1): 21 - 26. 231. Tang Y, Lin Y, Han S, Liang S. Yeast surface display of Human proteasome subunit alpha 6 and expression enhancement. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 2007; 25(6): 1 - 6. 232. Tazi J, Bakkour N, Stamm S. Alternative splicing and disease. Biochim Biophys Acta. 2009; 1792(1): 14 - 26. 233. Thomson G, Marthandan N, Hollenbach JA, Mack SJ, Erlich HA, Single RM, Waller MJ, Marsh SG, Guidry PA, Karp DR, Scheuermann RH, Thompson SD, Glass DN, Helmberg W. Sequence feature variant type (sfvt) analysis of the hla genetic association in juvenile idiopathic arthritis. Pac Symp Biocomput. 2010: 359 - 370. 234. Thomson W, Donn R. Juvenile idiopathic arthritis genetics - What’s new? What’s next? Arthritis Res. 2002; 4: 302 - 306. 235. Tokuyama Y, Matsui K, Ishizuka T, Egashira T, Kanatsuka A. The Arg121Trp variant in PAX4 gene is associated with beta - cell dysfunction in Japanese subjects with type 2 diabetes mellitus. Metabolism Clinical and Experimental. 2006; 55: 213 - 216. 236. Tolstonog GV, Li G, Shoeman RL, Traub P. Interaction in vitro of type III intermediate filament proteins with higher order structures of single - stranded DNA, particularly with G - quadruplex DNA. DNA Cell Biol. 2005; 24(2): 85 - 110. 237. Tolstonog GV, Wang X, Shoeman R, Traub P. Intermediate filaments reconstituted from vimentin, desmin, and glial fibrillary acidic protein selectively bind repetitive and mobile DNA sequences from a mixture of mouse genomic DNA fragments. DNA Cell Biol. 2000; 19(11): 647 - 677. 238. Tomaru U, Ishizu A, Murata S, Miyatake Y, Suzuki S, Takahashi S, Kazamaki T, Ohara J, Baba T, Iwasaki S, Fugo K, Otsuka N, Tanaka K, Kasahara M. Exclusive expression of proteasome subunit β5t in the human thymic cortex. Blood. 2009; 113(21): 5186 - 5191. 239. Trapina I, Rumba-Rozenfelde I, Sjakste N, Sokolovska J, Sugoka O, Sjakste T. Association study of genetic variants in the 14q11 – 14q13 proteasomal genes cluster with juvenile idiopathic arthritis (JIA) in Latvian population. Proc Latv Acad Sci Sect B. 2009; 63(3/4): 20 - 30. 240. Tsuchiya T, Schwarz PE, Bosque - Plata LD, Geoffrey Hayes M, Dina C, Froguel P, Wayne Towers G, Fischer S, Temelkova - Kurktschiev T, Rietzsch H, Graessler J, Vcelák J, Palyzová D, Selisko T, Bendlová B, Schulze J, Julius U, Hanefeld M, Weedon MN, Evans JC, Frayling TM, Hattersley AT, Orho - Melander M, Groop L, Malecki MT, Hansen T, Pedersen O, Fingerlin TE, Boehnke M, Hanis CL, Cox NJ, Bell GI. Association of the calpain-10 gene with type 2 diabetes in Europeans: results of pooled and meta – analyses. Mol Genet Metab. 2006; 89(1 - 2): 174 - 184. . 241. Ustrell V, Hoffman L, Pratt G, Rechsteiner M. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair. EMBOJ 2002; 21(13): 3516 - 3525.

130 242. Uthoff SMS, Hunt LE, Grant BS, Young V, Eichenberger MR, Cobbs GA, Galandiuk S. T-Cell Receptor γ: A Microsatellite Marker for Colorectal Cancer. Ann Surg Oncol. 2002; 9(1): 88 - 93. 243. Viken MK, Amundsen SS, Kvien TK, Boberg KM, Gilboe IM, Lilleby V, Sollid LM, Førre ØT, Thorsby E, Smerdel A, Lie BA. Association analysis of the 1858C4T polymorphism in the PTPN22 gene in juvenile idiopathic arthritis and other autoimmune diseases. Genes Immun. 2005; 6: 271 - 273. 244. Villard J. Transcription regulation and human diseases. Swiss Med Wkly. 2004; 134(39-40): 571 - 579. 245. Vlahovicek K, Munteanu MG, Pongor S. Sequence - dependent modelling of local DNA bending phenomena: curvature prediction and vibrational analysis. Genetica. 1999; 106(1 - 2): 63 - 73. 246. Walker SC, Engelke DR. A protein-only RNase P in human mitochondria. Cell. 2008; 135(3) :412 - 414. 247. Wang G, Vasquez KM. Z-DNA, an active element in the genome. Front Biosci. 2007; 12: 4424 - 4438. 248. Wang L, Kumar S, Fridley BL, Kalari KR, Moon I, Pelleymounter LL, Hildebrandt MA, Batzler A, Eckloff BW, Wieben ED, Greipp PR. Proteasome beta subunit pharmacogenomics: gene resequencing and functional genomics. Clin Cancer Res. 2008; 14(11): 3503 - 3513. 249. Wojcik C, Benchaib M, Lornage J, Czyba JC, Guerin JF. Proteasomes in human spermatozoa. Int J Androl. 2003; 200(23): 169 - 177. 250. Wojcik C, DeMartino GN. Intracellular localization of proteasomes. Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35(5): 579 - 589. 251. Wolf DH, Hilt W. The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation and waste disposal. Biochim Biophys Acta. 2004; 1695: 19 - 31. 252. Woo P, Colbert RA. An overview of genetics of paediatric rheumatic diseases. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2009; 23: 589 - 597. 253. Wright AF, Hastie N. Genes and common diseases. Cambridge University Press. 2007; 69 - 72 pp. 254. Xiang J, Li XY, Xu M, Hong J, Huang Y, Tan JR, Lu X, Dai M, Yu B, Ning G. Zinc transporter-8 gene ( SLC30A8 ) is associated with type 2 diabetes in Chinese. J Clin Endocrinol Metab. 2008; 93(10): 4107 - 4112. 255. Yajnik CS, Janipalli CS, Bhaskar S, Kulkarni SR, Freathy RM, Prakash S, Mani KR, Weedon MN, Kale SD, Deshpande J, Krishnaveni GV, Veena SR, Fall CH, McCarthy MI, Frayling TM, Hattersley AT, Chandak GR. FTO gene variants are strongly associated with type 2 diabetes in South Asian Indians. Diabetologia. 2009; 52(2): 247 - 252. 256. Yamaguchi Y, Moritani M, Tanahashi T, Osabe D, Nomura K, Fujita Y, Keshavarz P, Kunika K, Nakamura N, Yoshikawa T, Ichiishi E, Shiota H, Yasui N, Inoue H, Itakura M.

131 Lack of association of genetic variation in chromosome region 15q14-22.1 with type 2 diabetes in a Japanese population. BMC Med Genet. 2008; 9: 22. 257. Yao TC, Tsai YC, Huang JL. Association of RANTES promoter polymorphism with juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009; 60(4): 1173 - 1178. 258. Zeng HS, Chen XY, Luo XP. The association with the -159C/T polymorphism in the promoter region of the CD14 gene and juvenile idiopathic arthritis in a Chinese Han population. J Rheumatol. 2009; 36(9): 2025 - 2028. 259. Zoeger A, Blau M, Egerer K, Feist E, Dahlmann B. Circulating proteasomes are functional and have a subtype pattern distinct from 20S proteasomes in major blood cells. Clin Chem. 2006; 52(11): 2079 - 2086. 260. Zolk O, Schenke C, Sarikas A, The ubiquitin - proteasome system: focus on the heart. Cardiovasc Res. 2006; 70(3): 410 - 421. 261. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13): 3406 - 3415.

132 PUBLIK ĀCIJAS UN PREZENT ĀCIJAS

Ar darbu saist īto rezult ātu public ēšana un prezent ēšana

Pilna teksta publik ācijas Starptautiski cit ējamos žurn ālos 1. T. Sjakste, I. Trapina , I. Rumba-Rozenfelde, R. Lunin, O. Sugoka, N. Sjakste, Identification of a novel candidate locus for juvenile idiopathic arthritis at 14q13.2 in the Latvian population by association analysis with microsatellite markers. DNA, Cell Biology, 2010 2. T. Sjakste, I. Poudziunas , E. Ninio, C. Perret, V. Pirags, V. Nicaud, M. Lazdins, A. Evans, C. Morrison, F. Cambien, N. Sjakste, SNPs of PSMA6 gene – investigation of possible association with myocardial infarction, type 2 diabetes mellitus, Russian Journal of Genetics , 2007 , V.43, No 4, P. 442-448. 3. T. Sjakste, M.Kalis, I. Poudziunas , V. P īrāgs, M. Lazdins, L. Groop, N. Sjakste, Association of microsatellite polymorphisms of the human 14q13.2 region with type 2 diabetes mellitus in Latvian, Finnish populations, Annals of Human Genetics, 2007 , Oct, V. 71, No. Pt6, pp. 772 -776. 4. N. Sjakste, L. Bagdoniene, А. Gutcaits, D. Labeikyte, K. Bielskiene, I. Trapi Ħa, I. Muižnieks, Y. Vassetzky, T. Sjakste, Tightly bound to DNA proteins: new data and old problems. Biochemistry (Moscow) , in press

Latvijas zin ātiskajos žurn ālos 1. I. Trapina , I. Rumba-Rozenfelde, N.Sjakste, J. Sokolovska, O. Sugoka, T. Sjakste, Association study of genetic variants in the 14q11 – 14q13 proteasomal genes cluster with juvenile idiopathic arthritis (JIA) in Latvian population. Proceedings of the Latvian Academy of Science SectionB , 2009 , V.63, N3/4, pp. 20 – 30. 2. T.Sjakste, I.Poudziunas , V.Pirags, M.Lazdins, N.Sjakste, Bioinformatic analysis of evolutional conservatism, functional significance of microsatelliete alleles of humane 14q13.2 region associated with type 2 diabetes mellitus. Proceedings of the Latvian Academy of Science SectionB , 2008 , V.62, N3/4.

Monogr āfija, kur ā ir public ēti rezult āti: 1. I. Rumba-Rozenfelde, E. Bi ėis, O. Braclavska, I. Daugule, I. Ebela, V. Folkmanis, J. Karaševica, L. ĥikitina-Za ėe, S. Remberga, I. Saul īte, T. Sjakste, I. Trapi Ħa, J. Venti Ħš, Bērnu slim ību riska faktori. LU Akad ēmiskais apg āds, 2009 , 183 lpp. 2. I. Rumba-Rozenfelde, I. Ebele, S. Remberga, I. Daugule, I. Trapi Ħa, I. Saul īte, E. Bi ėis, J. Karašk ēvica, T. Sjakste, B ērnu mirst ību un invalidit āti ietekm ējošo faktoru izp ēte. Gr āmata: Latvijas iedz īvot āju dz īvildzi un dz īves kvalit āti apdraudoš ās slim ības. Zin ātnisk ā anal īze un galven ās rekomend ācijas. Autoru kolekt īvs Valda P īrāga redakcij ā. Valsts p ētījumu programma medic īnas zin ātn ē. R īga, 2009 : 67-75.

133 T ēžu prezent ēšana un public ēšana: Starptautisk ās zin ātnisk ās konferenc ēs

1. I. TRAPINA, I. Rumba-Rozenfelde, N. Sjakste, T. Sjakste Study of 14q13.2 region microsatellites, SNPs resulted in identification of novel candidate locus for association with JIA. Poster presentation. Disk of abstracts of the 7th Internationaal Congress on Autoimmunity, Ljubljana, Slovenia, May 5 -9, 2010. 2. I. TRAPINA , I. Rumba-Rozenfelde, N.Sjakste, T. Sjakste Case/control study on the association of SNP in proteasomal genes with juvenile idiopathic arthritis (JIA) in Latvian population. 11th International Meeting On Human Genome Variation, Complex Genome Analysis, Tallin, Estonia, 11th – 13 th of September, 2009, Abstract book pp.117. 3. Rumba I., POUDŽIUNAS I., Sugoka O., Sarnavska L., Sokolovska J., Sjakste T., Association of 14q 13.2 region microsatellite polymorphism with juvenile idiopathic arthritis in Latvian population. Ann. Rheum. Dis., July 2008, Vol.67, Suppl. II, 273. 4. I. POUDZIUNAS , I.Rumba, O.Sugoka, T. Sjakste, 14q13.2 region microsatellite polymorphism, risk of juvenile idiopathic arthritis: A case-control study in Latvian population, Poster presentation, International Congress of Genetics 2008, Berlin, Germany, July 12 −17, 2008, Abstract book, pp. 148. 5. I. POUDZIUNAS , J.Sokolovska, I.Rumba, O.Sugoka, T. Sjakste, Investigation of association of SNP polymorphisms in proteasomal genes cluster on Chromosome 14 with juvenile idiopathic arthritis (JIA) in the Latvian population, Poster presentation, International Congress of Genetics 2008, Berlin, Germany, July 12 −17, 2008, Abstract book, pp.265. 6. T. Sjakste, I. POUDZIUNA S, V. Pirags, M. Lazdins, J. Sokolovska, N. Sjakste, Association study of the 14q13.2 region microsatellite, SNP polymorphism with type 2 diabetes mellitus in Latvian population, Oral poster presentation, IV Baltic Genetical Congress, Daugavpils, Latvia, October 9 −12, 2007, Abstract book, pp. 180. 7. I. POUDŽIUNAS , T. Sjakste, M. K ālis, M. Lazdi Ħš, V. P īrāgs, L. Groop, N. Sjakste, Genetic association of microsatellite markers in 14q13 region with type 2 diabetes mellitus in Latvian, Botnia populations, their potential functional significance, Oral poster presentation, Genomic Disorders 2007, Hinxton, Cambridge, Great Britain, March 21-24, 2007, Abstract book, pp. 74. 8. T. Sjakste, I. POUDŽIUNAS , M. K ālis, L. Groop, N. Sjakste, Genetic association, eventual functional significance of 14q13 microsatellite polymorphisms in type 2 diabetes mellitus, Oral poster presentation, 2nd International Tandem Repeat Consortium Workshop on the Bioinformatics, Genomics, Functionality of Microsatellites, VNTRs, Budapest, Hungary, Abstrac book, September 8-11, 2006, pp 24. 9. I. POUDŽIUNAS , T. Sjakste, M. K ālis, M. Lazdi Ħš, V. P īrāgs, L. Groop, N. Sjakste, Microsatellite profile of the 14q13 in association with non-insulin dependent diabetes mellitus, Oral presentation, 1st Baltic Sea Region Students’ Scientific Conference in Medical Sciences, Riga, Latvia, April 21, 2006, pp 13.

134 Latvijas zin ātnisk ās konferenc ēs

1. I. TRAPINA , T. Sjakste, I. Rumba-Rozenfelde, R. Lu Ħins, O. Sugoka, N. Sjakste Jauns 14q13.2 asoci ācijas lokuss ar juven īlo idiop ātisko artr ītu. Mutisk ā prezent ācija LU 68. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2010. gada 5.febru ārī, Tēžu apkopojums, 29.lpp. 2. R. Lu Ħins, I. TRAPINA , I. Rumba-Rozenfelde, T. Sjakste G ēna PSMC6 viena nukleo īda polimorfismu saist ība ar juven īlo idiop ātisko artr ītu Latvijas popul ācij ā. Mutisk ā prezent ācija LU 68. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2010. gada 5.febru ārī, T ēžu apkopojums, 24.lpp. 3. I. TRAPINA , I. Rumba, T. Sjakste PSMA6 gene related microsatellite polymorphism, risk of juvenile idiopathic arthritis in Latvian population. Book of abstracts of the 51 st The International Scientific Conference of Daugavpils University, Daugavpils, Latvia, 15. – 18. April, 2009, pp.35. 4. I. TRAPI ĥA, I. Rumba, O. Sugoka, T. Sjakste, Jauni cilv ēka 14. hromosomas polimorfismi, Mutisk ā prezent ācija LU 67. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2009. gada 6.febru ārī. 5. I. Rumba, O. Sugoka, I. TRAPI ĥA, I. Saul īte, I.Rinkuža, S.Remberga, J. Sokolovska, L. Sarnavska, T. Sjakste, Autoim ūno slim ību pediatrisko slimnieku DNS paraugu kolekcijas izveide VPP programmas izpildes gait ā, Postera prezent ācija LU 67. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2009. gada 6.febru ārī. 6. R. Lu Ħins, I. Rumba, I. TRAPI ĥA, T. Sjakste, Cilv ēka 14. hromosomas divu viena nukleot īda polimorfismu izp ēte JIA slimniekiem, Postera prezent ācija LU 67. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2009. gada 6.febru ārī. Ar darbu nesaist īto rezult ātu public ēšana un prezent ēšana

Pilna teksta publik ācijas Starptautiski cit ējamos žurn ālos N. Sjakste, L. Bagdoniene, А. Gutcaits, D. Labeikyte, K. Bielskiene, I. TRAPI ĥA, I. Muižnieks, Y. Vassetzky, T. Sjakste, Tightly bound to DNA proteins: new data and old problems. Biochemistry (Moscow), in press

Latvijas un citos valsts žurn ālos 1. T. Sjakste, Z. Grislis, I. TRAPINA , N. Paramonova, O. Sugoka, Intra- and interhaplotype variability of the myostatin gene ( MSTN ) in Latvian Blue and Latvian Brown cattle breeds. Proceedings of the International Scientific Conference “Implication of different production technologies on animal health and food products quality indices” , 2008, December 4-5, Sigulda, Latvia, p.171-176. 2. T. Sjakste., A. Jemeljanovs, I. Zitare, N. Paramonova, I. TRAPINA , V. Sterna, L. Paura, Microsatellite and single nucleotide polymorphism of prolactin gene ( PRL ) Latvian Brown cattle breed. Proceedings of the International Scientific Conference “Implication of different

135 production technologies on animal health and food products quality indices” , 2008, December 4-5, Sigulda, Latvia, p.177-182. 3. J.Sokolovska, I.P OUDŽIUNAS , R.Paeglis, M.Dzintare, Individual Susceptibility to hypotensive action of Mildronate, Latvijas ėī mijas žurn āls , 2006, Nr. 4, 398.lpp.

T ēžu prezent ēšana un public ēšana: Starptautisk ās zin ātnisk ās konferenc ēs 1. Jemeljanovs A., I. Zitare, N. Paramonova, I. POUDZIUNAS , O. Sugoka, J. Miculis, T. Sjakste, Association study of the PRL gene polymorphisms with milk performance traits in Latvian Brown cattle breed. Book of abstracts of the 59 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, EAAP 2008 Vilnius, Lithuania, August 24th – 27th, 2008, p. 24. 2. Grislis Z., I. POUDZIUNAS , O. Sugoka, N. Paramonova, T. Sjakste, Allele and haplotype polymorphism of the myostatin gene ( MSTN ) microsatellite containing region in Latvian Blue and Latvian Brown cattle breeds. Book of abstracts of the 59 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, EAAP 2008 Vilnius, Lithuania, August 24th – 27th, 2008, p. 23. 3. Jemeljanovs A., I. Zitare, N. Paramonova, I. POUDZIUNAS , L. Paura, V. Sterne, T. Sjakste, Association study of the PRL and MSTN gene polymorphisms with milk performance traits in Latvian Brown cattle breed. Book of abstracts of the 10th World Conference on Animal Production, WCAP 2008, Cape Town, South Africa, 2008 November 23rd- 28th 4. Paramonova N., Jemeljanovs A., Zitare I., POUDZIUNAS I., Sugoka O., Miculis J., T. Sjakste, Genetic diversity of the PRL gene in Latvian Brown cattle breed. EADGENE 2008 „Animal Disease genomics: Opportunities and Applications”, Edinburgh, UK, 9th - 12th June 2008,. Poster abstracts, p.6. 5. Paramonova N., Grislis Z., POUDZIUNAS I., Sugoka O., T. Sjakste, Microsatellite and SNP polymorphism of the MSTN gene in Latvian cattle breeds. EADGENE 2008 „Animal Disease genomics: Opportunities and Applications”, Edinburgh, UK, 9th - 12th June 2008,. Poster abstracts, p.6. 6. I. POUDŽIUNAS , Encouragement and obstacles starting a PhD project in Latvia, Oral presentation, Interfaces of Molecular Biology and Agriculture: Perspectives of Molecular Breeding in The Next Decade, in round table, March 14-15, 2007, Riga, Latvia.

Latvijas zin ātnisk ās konferenc ēs 1. I. TRAPI ĥA, Miostat īna g ēna polimorfismu iesp ējam ās funkcion ālās noz īmes anal īze ar bioinform ātikas metodiku, Semin ārs projekta „Miostat īna g ēna polimorfismu izp ēte Latvijas govju, aitu un zirgu viet ējās š ėirn ēs” ietvaros, Jelgava, Latvija, 11.decembris 2008.gads.

136 2. I. POUDŽIUNAS , T. Sjakste, N.Sjakste, Miostat īna (MSTN) g ēna polimorfismu izp ētes perspekt īvas, Mutisk ā prezent ācija LU 66. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, Rīga, Latvija, 2008. gada 1.febru ārī. 3. I. POUDŽIUNAS , R.Paeglis, M.Dzintare, Individu ālā uz Ħē mība pret Mildron āta hipotens īvo iedarbību, Postera prezent ācija LU 65. zin ātnisk ā konferenc ē Dabas zin ātne, Medic īna, R īga, Latvija, 2007. gada 1.febru ārī. 4. I. POUDŽIUNAS , M ājdz īvnieku genoma projekti un to internetu datu b āzes, Refer āts, projekta „Pārtik ā izmantojamo dz īvnieku ăen ētisko resursu un š ėir Ħu kvalit ātes izv ērt ējums un t ālākās izmantošanas efektivit ātes nodrošin āšana.” semin ārs, Jelgava, Latvija, 2006.gada 24.novembr ī 5. I. POUDŽIUNAS , 2nd International Tandem Repeat Consortium Workshop on the Bioinformatics, Genomics and Functionality of Microsatellites and VNTRs, Refer āts LZP sadarb ības projekta s ēde, R īga, Latvija, 2006.gada 7.novembr ī

137 PATEIC ĪBA

Lielu pateic ību izsaku, pirmk ārt, savam darba vad ītājam Dr. habil. biol, prof. Nikolajam Sjakstem par darba vad īšanu, k ā ar ī Dr. biol. Tatjanai Sjakstei par iesp ēju izstr ādāt šo darbu vi Ħas vad ītaj ā Latvijas Universit ātes a ăent ūras „LU Biolo ăijas instit ūta” „Genomikas un bioinform ātikas” grupas laboratorij ā un par konsult ācij ām. T āpat gribu pateikties profesorei Ingr īdai Rumbai – Rozenfeldei par asins paraugiem juven īlā idiop ātisk ā artr īta pacientu DNS kolekcijas veidošanai un profesoram Valdim P īrāgam un M ārim Lazdi Ħam par 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma/kontroles DNS paraugiem, k ā ar ī „Genomikas un bioinform ātikas” grupas un Medic īnisk ās bioėī mijas doc ētāju grupas (Latvijas Universit āte, Medic īnas fakult āte) kolekt īvam par pal īdz ību un atbalstu darba veikšanai.

Tāpat gribu pateikt lielu paldies Latvijas Biomedic īnas p ētījumu un studiju centra Genoma centra zin ātniekiem par iesp ēju vi Ħu laboratorij ā veikt sekvenc ēšanu, MALDI-TOF masas spektrometriju un fragmenta garuma anal īzi. Sirsn īgs paldies profesoram Leifam Gr ūpam (prof. Leif Groop) par iesp ēju veikt dažus p ētījumus vi Ħa laboratorij ā Endokrinolo ăijas noda Ĝa, Malm ē slimn īcas universit āte (Zviedrija) un Dr. M ārti Ħam K ālim, kas vad īja šos p ētījumus. Staž ēšan ās Helsinku universit ātē Augu genomu laboratorij ā profesora Alana Šulmana (prof. Alan Schulman) un Dr. Ruslana Kalendara (Dr. Ruslan Kalendar) vad ībā Ziem ēĜ u Ministru padomes projekta „NeigbourPlus Program” ietvaros bija papildus ieguvums; par to liels paldies gan abiem zin ātniekiem, gan Zieme Ĝu Ministru padomei.

Protams, liels paldies manam v īram Aigaram par atbalstu darba rakst īšanas laik ā, dodot papildu stimulu un ener ăiju. Un lielu paldies gribu izteikt ar ī saviem vec ākiem par atbalstu veicot ne p ārāk vieglo izgl ītības ce Ĝu.

Nobeigum ā ar ī grib ētu pateikties Laurai Ritumai par teksta redi ăē šanu latviešu valod ā.

Šis darbs ir veikts Latvijas zin ātnes padomes grantu Nr. 05.1399. „14. hromosomas molekul āro mar ėieru saist ība ar cilv ēka patolo ăij ām” un Nr. 09.1369. „Struktur ālas izmai Ħas mikrosatel ītu saturoš ās nekod ējoš ās sekvenc ēs un to funkcion āla noz īme” (abu projektu vad ītāja Tatjana Sjakste) ietvaros, k ā ar ī sadarbojoties „Latvijas popul ācijas genofonda pētījuma” apakšprojekt ā Nr. 05.0023.07.1. „Asinsspiedienu noteicošie ăen ētiskie faktori Latvijas popul ācij ā” un sadarb ības projekta Nr. 10.0010 „Slim ību etiolo ăijas, pato ăen ēzes un cilv ēka novecošanas procesu ăen ētiska izp ēte Latvijas popul ācij ā (apakšprojekt ā „Proteasomu gēnu polimorfismu genoma skr īnings un to saist ība ar autoim ūnām slim ībām” (abu apakšprojektu vad ītājs Nikolajs Sjakste). Da Ĝē ji š ī darba izmaksas ir segtas no Valsts p ētījuma

138 programmas Nr. 9. „Latvijas iedz īvot āju dz īvildzi un dz īves kvalit āti apdraudošo galveno patolo ăiju zin ātnisk ā izp ēte ar multidisciplin āra p ētniecisk ā konsorcija pal īdz ību” apakšprojekta „B ērnu mirst ību un invalidit āti ietekm ējošo slim ību m ūsdien īgu agr īnās diagnostikas, profilakses un terapijas pas ākumu izstr āde” (apakšprojekta vad ītāja I.Rumba- Rozenfelde).

Darba autore ir sa Ħē musi Eiropas soci ālā fonda projekta „Doktorantu un jauno zin ātnieku pētniec ības darba atbalsts Latvijas Universit ātē” (2007. un 2008.gad ā) un projekt ā „Atbalsts doktora studij ām Latvijas Universit ātē” (2009. un 2010. gad ā) stipendiju, kas bija papildus finansi ālais atbalsts.

139 PIELIKUMI

140 1. Pielikums Viena nukleot īda polimorfisma genotip ēšanas metožu apraksts, ietverot tiešo (F), atgriezenisko (R) un genotip ējamo (G) praimeru sekvences. F un R praimeri, kas tika izmantoti sekvenc ējot vai nesakrit ības ( mismatch ) polimer āzes ėē des reakcij ā apz īmēti ar Fs un Rs un Fm un Rm, attiec īgi. MALDI-TOF MS un restrikcijas enz īma saita polimorfismu metode apz īmēta ar genoSNIP un RESP. Restrikcijas enz īms , kas tika izmantots RESP metod ē, ir uzr ādīts sl īprakst ā. Restrikcijas enz īma atpaz īstamais saits nor ādīts p ēc enz īma nosaukuma, ar bulti Ħu nor ādīta š ėelšanas vieta. Nukleotīds, kas tika analiz ēts izmantojot genoSNIP, nesakrit ības RESP vai al ēĜ specifisko PCR metodi ir nor ādīts praimer ī to pasv ītrojot. Polimorfisma ID Metode Praimeru sekvence Fragmenta garums, bp amplific ētā / šėelt ā rs11543947 RESP F-5’-AAATGGTCTTTCGCATCTGG-3’ 691/457 + 234 AasI - GACNNNN ↓NNGTC R-5’-CTCGGCCAAGATTCATTGTT-3’ rs12043 RESP F-5’-GGCAACAAGAGCAAAACTCC-3’ 546/316 + 230 RseI -CAYNN ↓NNRTG R-5’-AGGTCAATGTGCCAGAGCTT-3’ rs11548692 genoSNIP F-5’-CACACAGGCTCAATCATGT-3’ 179 R-5’-GACTTGAAGCCTGAGAGTTT-3’ G-5’-TCCTCCCTGLGGCCCAGT-3’ G-5’-TCCTCCCTGLGGCCCAGTG-3’ G-5’-TCCTCCCTGLGGCCCAGTAAACTG-3’ rs14930 genoSNIP F-5’-ACGTTGGATGGCCCTGTAGGCTGTGTTAT-3’ 264 R-5’-ACGTTGGATGCCACTCCCTCTACCTCTTCT-3’ G-5’-biotin-CAAGAAGCCLAGGGGAGAAA-3' rs1136581 genoSNIP F-5’-AGGCATGAGCCTAGGTTG-3’ 263 R-5-GAGGTTGAAGGGCTATCTT-3’ G-5’-GGCTGACTTGACTLCCCTC-3’ G-5’-GGCTGACTTGACTLCCCTCG-3’ G-5’-GGCTGACTTGACTLCCCTCCG-3’

rs7146672 genoSNIP F-5’-GGGTGATGGCACACTGAC-3’ 153 R-5’-AATGCATTTCTCTTTGAGAGT-3’ G-5’-CAGGGAGAALTCCACACTTA-3’ G-5’-CAGGGAGAALTCCACACTTAT-3’ G-5’-CAGGGAGAALTCCACACTTAGGGACT-3’ rs5807825 RESP F-5’-GTCCTCAGGGAGGAAGCTCT-3’ 981/754 + 227 BseMI - GCAATG ↓ R-5’-AGCCTGAGGTAAGCACTCCA-3’ rs9322944 genoSNIP F-5’-CAGAATAGCAGAGCAGGAAC-3’ 211 R-5’-GCCAATGGGATATTTTTCAC-3’ G-5’-AGGGGGAGALGTATTAAGAA-3’ G-5’-AGGGGGAGALGTATTAAGAAA-3’ G-5’-AGGGGGAGALGTATTAAGAAGTTA-3’ rs7493194 RESP F-5’-TCCAGAGAAGGGTCCAGCTA-3’ 920/ 405 + 515 EcoNI - CCTNN ↓NNNAGG R-5’-CAGGAGATCCAGGTTGCAGT-3’ rs71640264 Nesakrit ības RESP F-5’-GCCTCCCAAGTATATGGGACTAC-3’ 958 PciI - A↓CATGT R-5’-CTAAGGGGGTGGTGGAGTGA-3’ Fm-5’-6-FAM-GAGTTCGAGAGCTGCCTGAC-3’ 252/230 + 22 Rm-5’-AGCCCCGACAATTTTTAGACAT-3’ rs71640265 Sekvenc ēšana F-5’-CAGGAGAATCGCTTGAACTCAG-3’ 876 R-5’-ACCATGACAGGGCAATTCAG-3’ rs2277460 Al ēĜ specifiskais PCR F-5’-ATGCAAGAGCGGAAGAAAC-3’ 256 F-5’-ATGCAAGAGCGGAAGAAAA-3’ R-5’-CTGAATTGCCCTGTCATGGTA3’ rs2277459 Sekvenc ēšana F-5’-CAGGAGAATCGCTTGAACTCAG-3’ 876

rs11547365 R-5’-ACCATGACAGGGCAATTCAG-3’ rs1048990 genoSNIP F-5’-ACGTTGGATGCTCCAGATGAAAGCCTGA-3’ 899 R-5’-ACGTTGGATGGCCCTATCTTCCTTAACTCTC-3’ G-5’-biotin-AGGGATTGTGTTTLAAGTAGTGCTT-3’ Al ēĜ specifiskais PCR F-5’-GGGATTGTGTTTAAAGTAGTGCTTC-3’ 159 F-5’-GGGATTGTGTTTAAAGTAGTGCTTG-3’ R-5’-CTGAATTGCCCTGTCATGGTA-3’ rs8017676 genoSNIP F-5’-ACGTTGGATGGATTATAAGCCAGACCCTTG-3’ 150 R-5’-ACGTTGGATGATGATTCCAAGCACAGATG-3’ G-5’-biotin-GCCACTAAACTCATTCAAALATAAAAC-3’ rs6571711 genoSNIP F-5’-ACGTTGGATGAGTATGTCGGGCATTATCTTTA-3’ 310 R-5’-ACGTTGGATGAATCAGTAAATCTCATCCCTCTC-3’ G-5’ – biotin-GTTTGTTTTGACCACCLTAAAGAAT – 3’ rs17597267 RESP F-5’-ACCAGGCAACATCTTGAAGG-3’ 506/141 + 365 EcoRI - G↓AATTC R-5’-TCCACTGTCTGTTCAAATGTCC-3’ rs9322946 RESP F-5’-TAGCCAGATGTGGTGGTGGA-3’ 556/189 + 368 MaeII - ACGT ↓ R-5’-CCCAGGTTCAAACGATTCTT-3’ rs2295826 RESP F-5’-GCTTAAACAAGTATTGCCGATCA-3’ 252/133 + 119 rs2295827 DdeI - C↓TNAG R-5’-AATTGTTCCCTTACTGAAATAATACAA-3’ 252/196 + 58 rs2348071 genoSNIP F-5’-ACGTTGGATGATAGGGTTATTGGGGCTGT-3’ 338 R-5’-ACGTTGGATGCTCTCAACATCAAACCACACT-3’ G-5’-biotin-CCACACATAAAATLCACCAACACT-3’ RESP F-5’-GTCTAAGGCAGGGATGTCCA-3’ 232/153+66 TscAI -NNCASTGNN ↓ R-5’-ACCAGCTTTCCCATTCAGTG-3’

2. Pielikums 14.hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu al ēĜ u un genotipu frekven ču sadale kontroles 1 un kontroles 2 grup ās. Gēns PSMB5 PSMA6 PSMC6 PSMA3 ID numurs rs11543947 rs5807825 rs2277460 rs1048990 rs2295826 rs2295827 rs2348071 Mot īvs c.70C> T c.-4543_-4544insC c.-110C> A c.-8C> G c.86-104A> G c.86-46C> T c.543+138G> A MAF Kontrole 1 (175) 9,14 42,00 6,57 16,25 11,71 19,14 30,00 Kontrole 2 (121) 11,16 26,03 4,96 8,68 17,77 20,25 35,12 -5 -2* -2* Lokusa statistisk ā anal īze Pa 0,42 6,55 x 10 * 0,41 1,18 x 10 3,80 x 10 0,74 0,19 -2* -2* pēc al ēlēm Pb 0,40 <0,0001* 0,48 1,14 x 10 3,03 x 10 0,67 0,21 -2* Ret ās al ēles statistisk ā Pa 0,58 1,90 x 10 0,62 0,10 0,16 0,79 0,47 -2* anal īze Pb 0,47 1,42 x 10 0,46 0,14 0,22 0,69 0,41

Genotipu Heterozigot ā Kontrole 1 16,00 52,00 13,14 27,50 16,57 29,14 34,86 frekvence Kontrole 2 13,59 13,59 15,53 29,13 20,39 26,21 51,46 Ret ās al ēles Kontrole 1 1,14 16,00 0,00 2,50 3,43 4,57 12,57 homozigot ā Kontrole 2 0,00 38,83 0,00 0,00 12,62 12,62 8,74 -2* -3* -2* -2* Lokusa statistisk ā anal īze Pa 0,47 3,34 x 10 0,58 0,27 6,73 x 10 4,92 x 10 2,45 x 10 -2* -3* -2* -2* pēc genotipiem Pb 0,52 3,68 x 10 0,48 0,32 6,60 x 10 4,88 x 10 2,20 x 10 2 MAF – ret ās al ēles (izcelts; c,-4543_-4544insC gad ījum ā al ēle bez insercijas) frekvence P a - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē ta statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; * — P<0,05 starp analiz ētaj ām grup ām

3. Pielikums Mikrosatel ītu HSMS genotipu frekven ču sadal ījumi starp 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma un kontroles grup ām Mikrosatel īts Genotipa frekvences, % (paraugu skaits Genotips gad ījuma / Kontrole 2 T2DM Pa Pb OR RR kontroles grup ās)

(CAA) 7/7 36,89 49,04 0,24 0,26 1,65 1,33

(CAA) 7/8 20,49 15,38 0,40 0,40 0,71 0,75

HSMS602 (CAA) 7/10 25,41 28,85 0,65 0.70 1,19 1,14 -2* -2* (101/123) (CAA) 8/8 6,56 0,00 1,03 x 10 1,50 x 10

(CAA) 8/10 7,38 4,81 0,45 0,70 0,63 0,65

(CAA) 10/10 3,28 1,92 - - - -

(AC) 15/16 2,44 1,94 - - - -

(AC) 15/17 2,44 0,97 - - - -

(AC) 15/18 0,00 0,97 - - - -

(AC) 16/16 3,25 7,77 0,15 0,20 2,51 2,39

(AC) 16/17 12,20 11,65 0,91 0,98 0,95 0,96

(AC) 16/18 2,44 2,91 - - - -

(AC) 16/19 11,38 19,42 0,14 0,12 1,88 1,71

(AC) 16/20 4,88 6,80 0,56 0,60 1,42 1,39

(AC) 17/17 3,25 1,94 - - - -

(AC) 17/18 4,07 1,94 - - - -

HSMS701 (AC) 17/19 8,94 5,83 0,41 0,50 0,63 0,65

(103/123) (AC) 17/20 3,25 5,83 0,37 0,32 1,84 1,79

(AC) 17/21 0,00 0,97 - - - -

(AC) 17/22 0,00 0,97 - - - -

(AC) 18/18 0,00 0,97 - - - -

(AC) 18/19 2,44 4,85 - - - -

(AC) 18/20 3,25 0,97 - - - -

(AC) 18/21 0,81 0,00 - - - -

(AC) 18/22 0,00 0,97 - - - -

(AC) 19/19 18,70 13,59 0,38 0,40 0,68 0,73

(AC) 19/20 13,82 7,77 0,19 0,25 0,53 0,56

(AC) 20/20 2,44 0,97 - - - -

HSMS702 (TG) 12/12 30,77 23,14 0,32 0,30 1,48 1,33

(104/121) (TG) 12/13 36,54 42,15 0,57 0,57 0,79 0,87

(TG) 12/15 1,92 4,96 - - - -

(TG) 12/16 0,96 0,00 - - - -

(TG) 12/18 2,88 1,65 - - - -

(TG) 12/20 0,00 0,83 - - - -

(TG) 12/21 0,96 1,65 - - - -

(TG) 12/22 0,96 0,00 - - - -

(TG) 12/23 4,81 4,13 - - - -

(TG) 13/13 6,73 12,40 0,19 0,18 0,51 0,54

(TG) 13/14 0,96 0,00 - - - -

(TG) 13/15 1,92 0,83 - - - -

(TG) 13/16 2,88 1,65 - - - -

(TG) 13/22 1,92 0,83 - - - -

(TG) 13/24 1,92 3,31 - - - -

(TG) 14/22 0,96 0,00 - - - -

(TG) 15/15 0,00 0,83 - - - -

(TG) 15/18 0,00 0,83 - - - -

(TG) 18/21 0,00 0,83 - - - -

(TG) 18/22 0,96 0,00 - - - -

(TG) 18/25 0,96 0,00 - - - -

(TG) 19/25 0,96 0,00 - - - -

HSMS801 (AC) 13/17 0,00 0,97 - - - -

(103/123) (AC) 15/17 1,63 0,97 - - - -

(AC) 15/21 3,25 5,83 0,37 0,37 1,84 1,79

(AC) 15/22 3,25 3,88 - - - -

(AC) 15/23 0,00 0,97 - - - -

(AC) 15/24 0,81 0,00 - - - -

(AC) 15/25 0,00 1,94 - - - -

(AC) 16/17 1,63 0,00 - - - -

(AC) 17/17 4,88 1,94 - - - -

(AC) 17/19 0,81 0,97 - - - -

(AC) 17/20 1,63 2,91 - - - -

(AC) 17/21 8,94 18,45 0,06 0,09 2,30 2,06

(AC) 17/22 2,44 7,77 0,07 0,15 3,37 3,18

(AC) 17/11 1,63 0,97 - - - -

(AC) 17/13 0,81 0,00 - - - -

(AC) 18/20 0,00 0,97 - - - -

(AC) 18/22 0,81 0,00 - - - -

(AC) 19/21 2,44 0,97 - - - -

(AC) 19/22 1,63 0,00 - - - -

(AC) 19/23 0,00 0,97 - - - -

(AC) 19/24 0,81 0,00 - - - -

(AC) 19/26 0,00 0,97 - - - -

(AC) 20/20 0,81 0,00 - - - -

(AC) 20/21 6,50 3,88 0,40 0,70 0,58 0,60 -2* -2* (AC) 20/22 4,07 0,00 4,22 x 10 4,99 x 10

(AC) 20/23 2,44 0,97 - - - -

(AC) 20/25 1,63 0,00 - - - -

(AC) 21/21 8,94 8,74 0,96 1,00 0,97 0,98

(AC) 21/22 8,94 15,53 0,17 0,16 1,87 1,74

(AC) 21/23 1,63 0,00 - - - -

(AC) 21/24 7,32 2,91 0,16 0,25 0,38 0,40

(AC) 21/25 2,44 0,97 - - - -

(AC) 21/26 0,81 0,97 - - - -

(AC) 21/27 0,81 0,00 - - - -

(AC) 22/22 4,07 2,91 - - - -

(AC) 22/23 1,63 2,91 - - - -

(AC) 22/24 2,44 1,94 - - - -

(AC) 22/25 1,63 0,97 - - - -

(AC) 22/26 1,63 0,97 - - - -

(AC) 23/24 2,44 1,94 - - - -

(AC) 23/25 0,00 2,91 - - - -

(AC) 24/24 1,63 0,00 - - - -

(AC) 24/25 0,81 0,00 - - - -

(TG) 17/18 0,00 0,99 - - - -

(TG) 17/19 0,81 0,00 - - - -

(TG) 18/18 6,50 5,94 0,87 0,99 0,91 0,91

(TG) 18/19 13,01 8,91 0,38 0,56 0,65 0,69

(TG) 18/20 3,25 2,97 - - - -

(TG) 18/21 13,01 6,93 0,17 0,15 0,50 0,53

(TG) 18/22 6,50 9,90 0,39 0,50 1,58 1,52

(TG) 18/23 4,88 1,98 - - - -

(TG) 18/24 0,81 1,98 - - - -

(TG) 19/19 8,13 3,96 - - - -

(TG) 19/20 1,63 0,99 - - - -

(TG) 19/21 8,94 13,86 0,29 0,29 1,64 1,55 (TG) 4,07 7,92 0,24 0,24 2,03 1,95 HSMS006 19/22 (TG) 5,69 1,98 0,17 0,12 0,33 0,35 (101/123) 19/23 (TG) 19/24 0,81 0,99 - - - -

(TG) 20/20 0,00 1,98 - - - -

(TG) 20/21 1,63 3,96 - - - -

(TG) 20/22 0,00 1,98 - - - -

(TG) 20/23 2,44 0,00 - - - -

(TG) 21/21 8,13 6,93 0,75 0,89 0,84 0,85

(TG) 21/22 4,88 6,93 0,53 0,55 1,45 1,42

(TG) 21/23 1,63 1,98 - - - -

(TG) 21/24 0,00 0,99 - - - -

(TG) 22/22 0,00 0,99 - - - -

(TG) 22/23 1,63 1,98 - - - -

(TG) 23/23 0,81 0,99 - - - -

(TG) 23/25 0,81 1,98 - - - - 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; „-„ — genotips netika iek Ĝauts asoci ācijas anal īzē; * — P<0,05 starp kontroles un T2DM grup ām

4. Pielikums Mikrosatel ītu HSMS al ēĜ u frekven ču un heterozigot ātes indeksu sadal ījumi starp 2. tipa cukura diab ēta gad ījuma un kontroles grup ām

Heterozigot ātes Al ēĜ u frekvences (%) indekss Mikrosatel īts Al ēles sagaid āmais/ieg ūtais

Kontrole T2DM Pa Pb OR RR Kontrole T2DM

(CAA) 7 59,84 71,75 0,25 0,26 1,66 1,19 0,56 0,45 -3 -2 HSMS602 (CAA) 8 20,49 10,10 9,70 x 10 * 1,08 x 10 * 0,44 0,49 / /

(CAA) 10 19,67 18,75 0,84 0,91 0,94 0,95 0,47 0,49

(CA) 13 2,44 1,94 - - - -

(CA) 14 19,92 29,13 0,08 0,09 1,65 1,46 (CA) 18,70 16,02 0,53 0,54 0,83 0,86 15 0,76 0,76 (CA) 6,50 7,28 0,76 0,72 1,13 1,12 HSMS701 16 / / (CA) 32,52 36,99 0,49 0,52 0,82 0,88 17 0,72 0,77 (CA) 18 15,04 11,65 0,36 0,34 0,74 0,77

(CA) 19 0,41 0,49 - - - -

(CA) 20 0,00 0,97 - - - -

(TG) 12 50,83 55,29 0,60 0,57 1,20 1,09

(TG) 13 36,78 29,81 0,27 0,30 0,73 0,81

(TG) 14 00,00 0,96 - - - -

(TG) 15 4,13 1,92 - - - -

(TG) 16 0,00 0,48 - - - -

(TG) 17 3,85 2,48 - - - - 0,60 0,60

HSMS702 (TG) 18 00,00 0,48 - - - - / /

(TG) 19 0,41 0,00 - - - - 0,64 0,63

(TG) 20 0,41 0,00 - - - -

(TG) 21 1,24 2,40 - - - -

(TG) 22 0,00 0,96 - - - -

(TG) 23 3,72 3,37 - - - -

(TG) 24 0,00 0,48 - - - -

HSMS801 (CA) 13 0,00 0,49 - - - - 0,83 0,80

(CA) 15 4,47 6,80 - - - - / /

(CA) 16 0,81 0,0 - - - - 0,80 0,86

(CA) 17 14,63 18,45 0,36 0,39 1,32 1,26

(CA) 18 0,41 0,49 - - - -

(CA) 19 2,85 1,94 - - - -

(CA) 20 8,94 4,37 0,07 0,09 0,47 0,49

(CA) 21 30,49 33,50 0,62 0,64 1,15 1,10

(CA) 22 18,29 19,90 0,72 0,73 1,11 1,09

(CA) 23 4,07 5,34 0,54 0,66 1,33 1,31 -2 -2 (CA) 24 9,76 3,88 2,34 x 10 * 3,00 x 10 * 0,37 0,40

(CA) 25 3,25 3,40 - - - -

(CA) 26 1,63 1,46 - - - -

(CA) 27 0,41 0,00 - - - -

(TG) 17 0,41 0,00 - - - -

(TG) 18 27,24 22,77 0,40 0,46 0,79 0,84 (TG) 25,61 21,29 0,40 0,39 0,79 0,83 19 0,79 0,81 (TG) 4,47 6,93 0,21 0,21 1,59 1,55 HSMS006 20 / / (TG) 21 23,17 24,26 0,83 0,83 1,06 1,05 -2 -2 0,76 0,80 (TG) 22 8,54 15,35 4,64 x 10 * 4,00 x 10 * 1,94 1,80

(TG) 23 9,35 5,94 0,22 0,16 0,61 0,64

(TG) 24 1,22 2,97 - - - - 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; „-„ — al ēle netika iek Ĝauta asoci ācijas anal īzē; * — P<0,05 starp kontroles un T2DM grup ām

5. Pielikums A Visu septi Ħu lokusu biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze T2DM un kontroles 2 grup ās. Haplotips Apz īmējums Hl1 Hl2 Hl3 Hl4 Sekvence CDCCACA CDCCACG CDCCGTG CICCACA Frekvence Kontrole 13,11 11,17 5,34 12,62 T2DM 7,44 6,20 3,31 15,29

Statistisk ā Pa 0,20 0,17 0,52 0,59

anal īze Pb 0,29 0,26 0,33 0,47 OR 1,09 1,12 1,00 0,51 (95%) (0,37 - 3,24) (0,37 - 3,43) (0,28 - 3,63) (0,18 - 1,44) RR 1,76 1,8 1,62 0,83 (95%) (1,00 - 3,10) (0,97 - 3,36) (0,66 - 3,95) (0,52 - 1,32) Haplotips Apz īmējums Hl5 Hl6 Hl7 Hl8 Sekvence CICCACG CICCGTG CICGACG CICGGTG Frekvence Kontrole 21,36 3,40 5,34 5,34 T2DM 28,51 8,68 7,02 0,83 -2 -2 Statistisk ā Pa 0,28 9,43 x 10 0,59 3,93 x 10 * -2 -2 anal īze Pb 0,34 4,97 x 10 * 0,79 1,01 x 10 * OR R 0,24 0,47 4,00 (95%) (0,07 - 0,84) (0,14 - 1,54) (0,69 - 23,26) RR 0,75 0,39 0,76 6,46 (95%) (0,54 - 1,04) (0,17 - 0,90) (0,36 - 1,59) (1,45 - 28,81) SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMB5 vari ācija c.70C>T; PSMA6 g ēna SNP c.- 4543_-4544insC (2.; I/D), c.-110C>A (3.) un c.-8C>G (4.), PSMC6 g ēnā lokaliz ētie c.86- 104A>G (5.) un c,86-46C>T (6.) un PSMA3 SNP c.543+138G>A (7.). 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; R – references haplotips OR apr ēė inam; * — P < 0,05 starp analiz ētaj ām grup ām.

5. Pielikums B. 20S proteasomu prote īnu g ēnu analiz ēto SNP biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze T2DM un kontroles 2 grup ās. Haplotips Apz īmējums Ha1 Ha2 Ha3 Ha4 Ha5 Sekvence CDCCA CDCCG CICCA CICCG CICGG Frekvence Kontrole 7,44 9,09 18,60 41,32 7,02 T2DM 16,02 15,53 12,14 28,64 10,68 -2 Statistisk ā Pa 4,66 x 10 * 0,18 0,23 0,11 0,36 -2 anal īze Pb 7,14 x 10 0,25 0,30 0,09 0,51 OR 3,11 2,47 0,94 2,19 (95%) (1,61 - 6,01) (1,31 - 4,64) (0,52 - 1,69) R (1,08 - 4,45) RR 2,15 1,71 0,65 0,69 1,52 (95%) (1,25 - 3,70) (1,03 - 2,85) (0,41 - 1,02) (0,53 - 0,90) (0,83 - 2,78) SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMB5 vari ācija c.70C>T; PSMA6 g ēna SNP c.- 4543_-4544insC (2.; I/D), c.-110C>A (3.) un c.-8C>G (4.), un PSMA3 SNP c.543+138G>A (5.). 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; R – references haplotips OR apr ēė inam; * — P < 0,05 starp analiz ētaj ām grup ām.

6. Pielikums Mikrosatel ītu HSMS genotipu frekven ču sadal ījumi starp juven īlā idiop ātisk ā artr īta un t ā formu pacientiem un kontroles grup ām Genotipa frekvences, % Mikrosatel īts Genotips Kontrole 1 JIA JIoA JIpA 167/168 0,44 0,00 0,00 0,00 167/170 0,00 0,60 0,00 0,00 168/168 7,08 1,80 1,05 2,04 168/169 10,62 4,19 5,26 4,08 168/171 4,87 1,80 3,16 0,00 168/177 4,87 2,40 3,16 2,04 168/178 0,44 0,60 0,00 0,00 169/169 25,22 44,91 45,26 40,82 169/170 0,44 0,00 0,00 0,00 HSMS602 169/171 15,04 8,98 10,53 10,20 169/177 9,73 11,98 11,58 16,33 169/178 7,52 2,40 1,05 2,04 170/170 4,42 14,37 13,68 16,33 170/177 0,44 0,00 2,11 2,04 171/171 1,77 2,40 0,00 0,00 171/177 3,54 1,20 2,11 0,00 171/178 1,77 0,60 1,05 0,00 177/177 1,33 1,20 0,00 4,08 178/178 0,44 0,60 0,00 0,00

HSMS701 (AC) 14/18 0,44 0,63 1,15 0,00

(AC) 15/15 2,21 1,27 0,00 2,04

(AC) 15/16 2,65 3,16 2,30 4,08

(AC) 15/17 2,21 1,27 2,30 0,00

(AC) 15/18 5,31 4,43 3,45 6,12

(AC) 15/19 5,31 5,06 5,75 4,08

(AC) 15/20 3,10 0,63 0,00 2,04

(AC) 15/21 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 16/16 11,06 1,90 3,45 0,00

(AC) 16/17 2,21 1,27 2,30 0,00

(AC) 16/18 4,42 12,66 11,49 18,37

(AC) 16/19 9,29 23,42 22,99 20,41

(AC) 16/20 5,75 2,53 2,30 4,08

(AC) 17/17 5,75 0,00 0,00 0,00

(AC) 17/18 1,33 1,27 1,15 0,00

(AC) 17/19 1,77 8,86 10,34 6,12

(AC) 17/20 4,87 7,59 8,05 6,12

(AC) 17/21 0,00 1,27 1,15 2,04

(AC) 18/18 7,08 3,80 4,60 2,04

(AC) 18/19 1,77 2,53 1,15 2,04

(AC) 18/20 2,21 0,63 0,00 2,04

(AC) 18/21 1,33 7,59 4,60 12,24

(AC) 19/19 10,62 5,06 8,05 2,04

(AC) 19/20 4,42 1,90 3,45 0,00

(AC) 19/21 0,44 0,63 0,00 2,04

(AC) 19/22 0,44 0,63 0,00 2,04

(AC) 20/20 2,65 0,00 0,00 0,00

(AC) 20/21 0,88 0,00 0,00 0,00

(TG) 10/10 0,00 4,17 6,25 2,04

(TG) 10/11 2,17 3,57 4,17 4,08

(TG) 10/22 0,00 0,60 0,00 0,00

(TG) 11/11 24,35 36,90 36,46 32,65

(TG) 11/12 45,22 26,19 28,13 28,57

(TG) 11/13 1,30 0,60 1,04 0,00

(TG) 11/14 3,91 1,79 2,08 2,04

(TG) 11/17 0,43 2,38 1,04 6,12

(TG) 11/18 1,74 0,00 0,00 0,00

(TG) 11/20 0,43 0,00 0,00 0,00

(TG) 11/21 0,87 0,00 0,00 0,00

(TG) 11/24 0,43 1,19 2,08 0,00 (TG) 2,17 0,00 0,00 0,00 HSMS702 11/25 (TG) 12/12 8,26 11,31 9,38 8,16

(TG) 12/13 0,43 0,00 0,00 0,00

(TG) 12/14 0,87 0,00 0,00 0,00

(TG) 12/18 0,43 0,00 0,00 0,00

(TG) 12/22 0,87 0,60 0,00 2,04

(TG) 12/24 1,30 1,19 1,04 0,00

(TG) 12/25 1,74 1,19 1,04 2,04

(TG) 13/13 1,74 7,14 6,25 12,24

(TG) 13/14 0,43 0,00 0,00 0,00

(TG) 14/14 0,00 0,60 0,00 0,00

(TG) 17/24 0,00 0,60 1,04 0,00

(TG) 18/18 0,43 0,00 0,00 0,00

(TG) 21/24 0,43 0,00 0,00 0,00

HSMS801 (AC)11/15 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 12/17 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 12/21 0,00 0,60 1,08 0,00

(AC) 14/22 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 15/15 1,33 0,00 0,00 0,00

(AC) 15/17 2,65 0,00 0,00 0,00

(AC) 15/19 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 15/20 0,44 1,81 3,23 0,00

(AC)15/21 3,10 1,20 0,00 2,00

(AC) 15/22 1,77 0,60 0,00 2,00

(AC) 15/23 0,88 0,60 0,00 2,00

(AC) 15/25 0,88 0,00 0,00 0,00

(AC) 15/26 0,00 1,20 1,08 0,00

(AC) 15/27 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 16/17 0,88 0,00 0,00 0,00

(AC) 16/20 1,77 0,00 0,00 0,00

(AC)16/22 0,00 0,60 0,00 2,00

(AC) 17/17 4,87 1,20 1,08 2,00

(AC) 17/19 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 17/20 1,77 0,60 0,00 2,00

(AC) 17/21 8,85 4,22 4,30 6,00

(AC) 17/22 3,54 6,02 5,38 6,00

(AC) 17/23 3,54 1,20 1,08 2,00

(AC) 17/25 2,65 2,41 3,23 0,00

(AC)17/26 0,44 0,60 0,00 2,00

(AC) 17/27 0,00 1,81 3,23 0,00

(AC) 18/21 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 18/24 0,00 0,60 0,00 2,00

(AC) 19/21 0,88 1,20 1,08 2,00

(AC) 19/22 1,33 0,60 0,00 2,00

(AC) 19/23 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 19/27 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC)20/20 0,88 0,60 0,00 0,00

(AC) 20/21 7,52 18,07 20,43 12,00

(AC) 20/22 1,77 6,02 6,45 2,00

(AC) 20/23 0,88 1,20 1,08 2,00

(AC) 20/24 0,88 0,60 1,08 0,00

(AC) 20/25 1,33 1,20 2,15 0,00

(AC) 20/26 1,77 0,00 0,00 0,00

(AC) 21/21 10,18 4,82 3,23 6,00

(AC) 21/22 6,64 14,46 12,90 16,00

(AC) 21/23 2,65 3,61 4,30 2,00

(AC) 21/24 0,88 2,41 4,30 0,00

(AC) 21/25 3,98 3,61 3,23 6,00

(AC) 21/26 1,33 0,00 0,00 0,00

(AC) 21/27 0,88 0,00 0,00 0,00

(AC) 21/28 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 22/22 5,75 2,41 3,23 0,00

(AC) 22/23 0,00 7,23 9,68 6,00

(AC) 22/24 0,00 0,60 1,08 0,00

(AC) 22/25 0,88 1,81 1,08 4,00

(AC) 22/27 0,44 0,60 0,00 2,00

(AC) 23/23 1,33 3,01 1,08 6,00

(AC) 23/25 0,88 0,00 0,00 0,00

(AC) 23/26 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 24/24 0,88 0,00 0,00 0,00

(AC) 24/25 0,44 0,00 0,00 0,00

(AC) 25/25 0,88 0,60 0,00 2,00

(AC) 27/27 0,44 0,00 0,00 0,00

(TG) 16/22 0,88 0,00 0,00 0,00

(TG) 18/18 10,62 2,94 2,06 4,00

(TG) 18/19 5,75 7,06 5,15 12,00

(TG) 18/20 0,44 3,53 5,15 0,00

(TG) 18/21 17,70 20,59 21,65 14,00

(TG) 18/22 3,98 4,71 5,15 2,00

(TG) 18/23 1,77 1,76 3,09 0,00

(TG) 18/24 0,00 1,76 2,06 2,00

(TG) 19/19 15,04 1,76 1,03 2,00

(TG) 19/20 1,33 0,59 1,03 0,00

(TG) 19/21 7,52 7,65 8,25 8,00

(TG) 19/22 5,31 11,76 13,40 12,00

(TG) 19/23 1,33 2,94 1,03 4,00

(TG) 19/24 0,44 0,00 0,00 0,00

(TG) 20/20 0,44 0,00 0,00 0,00

HSMS006 (TG) 20/21 0,88 2,94 3,09 2,00

(TG) 20/22 0,88 0,00 0,00 0,00

(TG) 20/23 1,33 12,94 12,37 16,00

(TG) 20/24 0,44 0,59 0,00 2,00

(TG) 21/21 5,31 2,35 2,06 4,00

(TG) 21/22 4,87 4,71 4,12 8,00

(TG) 21/23 2,21 2,35 2,06 4,00

(TG) 21/24 0,44 0,00 0,00 0,00

(TG) 21/25 0,44 0,00 0,00 0,00

(TG) 22/22 4,87 2,35 2,06 2,00

(TG) 22/23 3,98 0,59 0,00 2,00

(TG) 22/24 0,44 0,59 0,00 0,00

(TG) 22/25 0,00 0,59 0,00 0,00

(TG) 23/23 0,44 2,35 4,12 0,00

(TG) 23/24 0,88 0,00 0,00 0,00

(TG) 25/25 0,00 0,59 1,03 0,00

7. Pielikums Mikrosatel ītu HSMS al ēĜ u frekven ču un heterozigot ātes indeksu sadal ījums juven īlā idiop ātisk ā artr īta un t ā subformu pacientu un kontroles 1 grup ās Heterozigot ātes indekss Al ēĜ u frekvences (%) Mikrosatel īts Al ēles sagaid āmais / ieg ūtais Kontrole 1 JIA JIoA JIpA Kontrole JIA JIoA JIpA 167 0,22 0,30 0,00 0,00 168 17,92 6,29 6,84 5,10 169 46,68 58,68 59,47 57,14 0,71 / 0,61 / 0,60 / 0,62 / HSMS602 170 4,87 14,67 13,68 16,33 0,60 0,45 0,45 0,46 171 14,38 8,68 10,53 7,14 177 10,62 8,98 8,42 13,27 178 5,31 2,40 1,05 1,02

(AC) 14 0,22 0,32 0,57 0,00

(AC) 15 0,66 8,54 6,90 10,42

(AC) 16 28,10 23,42 24,14 23,96 (AC) 15,71 10,76 12,64 6,25 17 0,77 / 0,81 / 0,80 / 0,82 / HSMS701 (AC) 7,08 18,67 16,09 22,92 18 0,61 0,88 0,84 0,94 (AC) 19 31,86 26,58 29,89 20,83

(AC) 20 14,60 6,65 6,90 6,25

(AC) 21 1,55 4,75 2,87 8,33

(AC) 22 0,22 0,32 0,00 1,04

(TG) 10 1,09 6,25 8,33 4,08

(TG) 11 53,70 54,76 55,73 53,06

(TG) 12 33,70 25,89 24,48 24,49

(TG) 13 2,83 7,44 6,77 12,24

(TG) 14 2,61 1,49 1,04 1,02 (TG) 0,22 1,49 1,04 3,06 0,60 / 0,69 / 0,69 / 0,68 / HSMS702 17 (TG) 18 1,52 0,00 0,00 0,00 0,65 0,50 0,50 0,50

(TG) 20 0,22 0,00 0,00 0,00

(TG) 21 0,65 0,00 0,00 0,00

(TG) 22 0,43 0,60 0,00 1,02

(TG) 24 1,09 1,49 2,08 0,00

(TG) 25 1,96 0,60 0,52 1,02

HSMS801 (AC)12 0,22 0,30 0,54 0,00 0,84 / 0,82 / 0,82 / 0,83 /

(AC)14 0,22 0,00 0,00 0,00 0,73 0,87 0,91 0,84

(AC)15 6,67 2,71 2,15 3,00

(AC)16 1,33 0,30 0,00 1,00

(AC)17 17,56 9,64 9,68 11,00

(AC)18 0,22 0,30 0,00 1,00

(AC)19 2,00 0,90 0,54 2,00

(AC)20 10,00 15,36 17,20 9,00

(AC)21 29,11 29,52 29,03 29,00

(AC)22 14,22 21,69 21,51 21,00

(AC)23 6,22 9,94 9,14 13,00

(AC)24 2,00 2,11 3,23 1,00

(AC)25 6,44 5,12 4,84 7,00

(AC)26 2,00 0,90 0,54 1,00

(AC)27 1,56 1,20 1,61 1,00

(AC)28 0,22 0,00 0,00 0,00

(TG) 16 0,44 0,00 0,00 0,00

(TG) 18 25,44 22,65 23,20 19,00

(TG) 19 25,88 16,76 15,46 20,00 (TG) 3,10 10,29 10,82 10,00 20 0,79 / 0,83 / 0,83 / 0,83 / HSMS006 (TG) 22,35 21,47 21,65 22,00 21 0,63 0, 88 0, 88 0, 88 (TG) 22 15,04 13,82 13,40 14,00

(TG) 23 6,19 12,65 13,40 13,00

(TG) 24 1,33 1,47 1,03 2,00

(TG) 25 0,22 0,88 1,03 0,00

8. Pielikums 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu al ēĜ u frekven ču sadale juven īlā idiop ātisk ā artr īta un kontroles grup ās Gēns PSMB5 PSMA6 PSMC6 PSMA3 ID numurs rs11543947 rs5807825 rs2277460 rs1048990 rs2295826 rs2295827 rs2348071 Mot īvs c.70C> T c.-4543_-4544insC c.-110C> A c.-8C> G c.86-104A> G c.86-46C> T c.543+138G> A MAF Kontrole (175) 9,14 42,00 6,57 16,25 11,71 19,14 30,00 JIA (139) 7,55 46,40 11,87 12,50 20,86 21,58 34,17 JIoA (84) 5,36 52,38 12,50 12,70 24,40 24,40 34,52 JIpA (42) 9,52 38,10 9,52 12,07 16,67 17,86 34,52 -2 -3 Lokusa JIA Pa 0,48 0,27 2,06 x 10 * 0,27 1,78 x 10 * 0,45 0,26 -2 -3 statistisk ā Pb 0,57 0,25 2,39 x 10 * 0,22 1,00 x 10 * 0,43 0,30 -2 -2 -4 anal īze JIoA Pa 0,14 2,63 x 10 * 2,35 x 10 * 0,37 2,12 x 10 * 0,17 0,30 -2 -2 -4 Pb 0,15 2,36 x 10 * 2,56 x 10 * 0,44 1,00 x 10 * 0,20 0,32

Kontrole pret JIpA Pa 0,91 0,51 0,35 0,59 0,22 0,79 0,42

Pb 1,00 0,46 0,35 0,79 0,27 0,88 0,42 -2 Ret ās al ēles JIA Pa 0,69 0,59 0,13 0,47 4,65 x 10 * 0,61 0,55 -2 statistisk ā Pb 0,85 0,64 0,18 0,59 3,13 x 10 * 0,71 0,61 anal īze OR 0,81 0,84 1,91 0,74 1,99 1,16 1,21 (95%) (0,46 - 1,44) (0,61 - 1,15) (1,09 - 3,34) (0,43 - 1,27) (1,29 - 3,08) (0,78 - 1,71) (0,86 - 1,70) Kontrole pret. RR 0,83 0,92 1,81 0,77 1,78 1,13 1,14 (95%) (0,49 - 1,41) (0,80 - 1,06) (1,09 - 3,01) (0,48 - 1,23) (1,23 - 2,57) (0,83 - 1,54) (0,91 - 1,43) -2 JIoA Pa 0,32 0,27 0,13 0,54 2,65 x 10 * 0,39 0,56 -2 Pb 0,46 0,31 0,08 0,69 1,84 x 10 * 0,47 0,49 OR 0,56 0,66 2,03 0,75 2,43 1,36 1,23 (95%) (0,26 - 1,20) (0,46 - 0,96) (1,09 - 3,78) (0,40 - 1,40) (1,50 - 3,93) (0,87 - 2,11) (0,83 - 1,82) RR 0,59 0,82 1,90 0,78 2,08 1,27 1,15 (95%) (0,29 - 1,21) (0,68 - 0,98) (1,08 - 3,33) (0,45 - 1,34) (1,41 - 3,08) (0,90 - 1,79) (0,88 - 1,50)

JIpA Pa 1,00 0,74 0,54 0,58 0,49 0,84 0,65

Pb 1,00 0,83 0,76 0,79 0,64 0,69 0,76 OR 1,05 1,18 1,5 0,71 1,51 0,92 1,23 (95%) (0,47 - 2,37) (0,72 - 1,92) (0,65 - 3,48) (0,30 - 1,68) (0,78 - 2,92) (0,50 - 1,71) (0,74 - 2,04) RR 1,04 1,07 1,45 0,74 1,42 0,93 1,15 (95%) (0,50 - 2,17) (0,88 - 1,29) (0,67 - 3,13) (0,35 - 1,57) (0,81 - 2,48) (0,56 - 1,54) (0,82 - 1,61) 2 MAF – ret ās al ēles (trekntekst ā; c.-4543_-4544insC gad ījum ā al ēle bez insercijas) frekvence Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; * — P < 0,05 starp analiz ētaj ām grup ām.

9. Pielikums 14. hromosomas proteasomu prote īnu g ēnu viena nukleot īda polimorfismu genotipu frekven ču sadale juven īlā idiop ātisk ā artr īta un kontroles grup ās Gēns PSMB5 PSMA6 PSMC6 PSMA3 ID numurs rs11543947 rs5807825 rs2277460 rs1048990 rs2295826 rs2295827 rs2348071 Apraksts c.70C> T c.-4543_-4544insC c.-110C> A c.-8C> G c.86-104A> G c.86-46C> T c.543+138G> A Frekvence Hetero- Kontrole 16,00 52,00 13,14 27,50 16,57 29,14 34,86 zigota JIA 12,23 55,40 23,74 22,77 27,34 28,78 49,64 JIoA 10,71 54,76 25,00 22,22 29,76 29,76 47,62 JIpA 19,05 57,14 19,05 24,14 28,57 30,95 59,52 Ret ās Kontrole 1,14 16,00 0,00 2,50 3,43 4,57 12,57 al ēles JIA 1,44 18,71 0,00 2,97 7,19 7,19 9,35 homo- JIoA 0,00 25,00 0,00 3,17 9,52 9,52 10,71 zigota JIpA 0,00 9,52 0,00 0,00 2,38 2,38 4,76 -2 -2 -2 Lokusa statistisk ā JIA Pa 0,63 0,48 1,48 x 10 * 0,72 1,36 x 10 * 0,61 3,03 x 10 * -2 -2 -2 anal īze Pb 0,64 0,49 1,85 x 10 * 0,73 1,50 x 10 * 0,61 3,14 x 10 * -2 -3 JIoA Pa 0,31 0,07 1,74 x 10 * 0,73 3,18 x 10 * 0,28 0,14 -2 -3 Kontrole pret Pb 0,27 0,07 2,13 x 10 * 0,73 2,40 x 10 * 0,30 0,14 -2 JIpA Pa 0,71 0,56 0,33 0,63 0,20 0,81 1,10 x 10 * -3 Pb 0,88 0,56 0,33 0,71 0,18 0,82 9,60 x 10 * 2 MAF – ret ās al ēles (trekntekst ā; c.-4543_-4544insC gad ījum ā al ēle bez insercijas) frekvence P a - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums p ēc 10’000 permut āciju anal īzēm; * — P < 0,05 starp analiz ētaj ām grup ām.

10. Pielikums Četru SNP lokusu biež āk sastopamo haplotipu sadale un statistisk ā anal īze JIA, JIoA, JIpA un kontroles 1 grup ās. Haplotips Apz īmējums H1 H2 H3 H4 H5 Sekvence ICAG ICAA DCAA DCAG DCGG Frekvence Kontrole (175) 30,29 17,71 6,00 27,71 6,86 (paraugu JIA (139) 21,58 15,83 0,00 26,98 6,47 numurs) JIoA (84) 19,64 12,50 0,00 28,57 8,33 JIpA (42) 26,19 21,43 0,00 22,62 4,76 -4 Statistisk ā JIA Pa 0,15 0,68 7,13 x 10 * 0,91 0,83 -3 anal īze; Pb 0,12 0,79 1,00 x 10 * 1,00 0,66 Kontrole OR 0,73 0,92 0,97 pret (95%) (0,47 - 1,13) (0,56 - 1,50) - R (0,49 - 1,92) RR 0,71 0,89 0,97 0,94 (95%) (0,54 - 0,93) (0,63 - 1,27) - (0,75 - 1,25) (0,52 - 1,70) -3 JIoA Pa 0,11 0,30 3,75 x 10 * 0,90 0,63 -3 Pb 0,14 0,39 9,00 x 10 * 1,00 0,81 OR 0,63 0,68 1,18 (95%) (0,37 - 1,06) (0,37 - 1,24) - R (0,56 - 2,48) RR 0,65 0,71 1,03 1,22 (95%) (0,46 - 0,92) (0,45 - 1,12) - (0,77 - 1,38) (0,65 - 2,30) -2 JIpA Pa 0,63 0,56 3,55 x 10 * 0,61 0,72 -1 Pb 0,52 0,68 1,03 x 10 0,50 0,47 OR 1,06 1,48 0,85 (95%) (0,54 - 2,08) (0,72 - 3,04) - R (0,26 - 2,73) RR 0,86 1,21 0,82 0,69 (95%) (0,58 - 1,27) (0,76 - 1,93) - (0,53 - 1,26) (0,25 - 1,94) SNP sec ība haplotipu kombin ācij ās: PSMA6 SNP c.-4543_-4544insC (1.; I/D) un c.110C>A (2.), PSMC6 SNP c.86-104A>G (3.) un PSMA3 SNP c.543+138G>A (4.). 2 Pa - statistisk ā ticam ība p ēc χ krit ērija; Pb – kori ăē tā statistisk ā ticam ība, apr ēė in āta k ā vid ējais lielums pēc 10’000 permut āciju anal īzēm; OR un RR – starp ību attiec ība un relat īvais risks; CI 95% - konfidences interv āls pie 95%; R – references haplotips OR apr ēė inam; * — P<0,05 starp analiz ētaj ām grup ām.

11. Pielikums A. HSMS mar ėieru iesp ējam ā funkcion ālā noz īme DNS sekvences l īmen ī atkar ībā no atk ārtojumu skaita. Gēns Mar ėieris Atk ārtojumi Lokaliz ācija Iesp ējam ā funkcija No – l īdz Biež āk SS izmai Ħa* DNS liekuma izmai Ħa sastopamais DNS RNS Iesp ējam ā Sp ēja liekuma liekties

FAM177A1 HSMS602 (CAA) 7-8,10-11 (A) 8 (CAA) 7(A) 8 1.introns Ch - (CAA) 7(A) 8 uz (CAA) 10(A) 8 - - -

(C14orf24) (CAA) 7(A) 5-8 (CAA) 7(A) 8 - - - -

KIAA0391 HSMS701 (AC) 14 – 22 (AC) 19 3.introns - - - -

HSMS702 (TG) 10 – 25 (TG) 11 vai 12 3.introns - Ch - (TG) 11 uz (TG) 12 - -

HSMS801 (AC) 12 – 28 (AC) 21 4.introns - - - -

PSMA6 HSMS006 (TG) 16 – 25 (TG)18 6.introns Ch - (TG) 19 uz (TG) 20 Ch - (TG) 21 uz (TG) 22 - - SS – sekund ārā strukt ūra; Ch – izmain ās; „-„ – neieteikm ē jeb nemain ās atkar ībā no atk ārtojumu izmai Ħas; NA – nav analiz ēts; ↓ un ↑ iesp ējam ā liekuma le Ħka un liekšan ās sp ēju izmai Ħas. * - pie kāda atk ārtojuma nomai Ħas

11. Pielikums B. HSMS mar ėieru iesp ējam ā funkcion ālā noz īme saist ībā ar prote īnu piesaisti atkar ībā no atk ārtojumu skaita. Gēns Mar ėieris Atk ārtojumi Lokaliz ācija Iesp ējam ā funkcija No – l īdz Biež āk TF piesaistes vietas Iesp ējamie introna procesinga un eksonu sastopamais splaisinga elementi Funkcija & Piesaistes Donora (5’ss) “Branch” Cis - Ăimene/Matrica sekvence (Lielie vai/ un punkts aktiviz ācijas (virziens -/+) burti – kodola akceptora elements sekvence) (3’ss) piesaistes vieta

FAM177A1 HSMS602 (CAA) 7,8,10 (A) 8 (CAA) 7(A) 8 1.introns G & BPTF/FAC1.01 acaacAACAac - - L or G & ISS

(C14orf24) (CAA) 7(A) 5-8 (CAA) 7(A) 8 - - - - L or G & ISS

KIAA0391 HSMS701 (AC) 14 – 22 (AC) 19 3.introns - - - L or G L or G & ISS

HSMS702 (TG) 10 – 25 (TG) 11 vai 12 3.introns - - L or G & 5’ss L or G & EIE L or G & ISS

HSMS801 (AC) 12 – 28 (AC) 21 4.introns - - L or G L or G & ISS

PSMA6 HSMS006 (TG) 16 – 25 (TG) 18 6.introns - - L or G & 5’ss - L or G & ISS TF – transkripcijas faktori; L – paz ūd, G – veidojas, Ch – izmain ās; „-„ – neieteikm ē jeb nemain ās atkar ībā no al ēles nomai Ħas; NA – nav analiz ēts, jo nevar būt saist īts; ↓ un ↑ molekulas piesaistes aktivit ātes mai Ħa. Cis -aktiviz ācijas elementi apz īmēti k ā EIE (eksona identifik ācijas elements) un ISS (introna spaisinga silencers).

12 . Pielikums A. Statistiski ticami ar slim ībām saist īto SNP iesp ējam ā funkcion ālā noz īme DNS sekvences l īmen ī atkar ībā no al ēles nomai Ħas. Gēns Polimorfisms Lokaliz ācija Iesp ējam ā funkcija SS izmai Ħas DNS liekumi DNS RNS Iesp ējamais liekums Sp ēja liekties PSMA6 c.-4543_-4544insC Starp g ēnu rajon ā Ch Na - - (delC>insC) c.-110C>A Promoteris; -1 no 5’UTR Ch Na ↑ ↓ c.-8C>G 5’UTR - Na - - PSMC6 c.86-104A>G 1.introns - - - - PSMA3 c.543+138G>A 7.introns - Ch ↓ ↓ SS – sekund ārā strukt ūra; , Ch – izmain ās; „-„ – neieteikm ē jeb nemain ās atkar ībā no atk ārtojumu izmai Ħas; NA – nav analiz ēts; ↓ un ↑ iesp ējam ā liekuma le Ħka un liekšan ās sp ēju izmai Ħas.

12. Pielikums B Statistiski ticami ar slim ībām saist īto SNP iesp ējam ā funkcion ālā noz īme saist ībā ar prote īnu piesaisti atkar ībā no al ēles nomai Ħas. Gēns Polimorfisms Lokaliz ācija Iesp ējam ā funkcija TF piesaistes vietas Iesp ējamie introna procesinga un eksonu splaisinga elementi Funkcija & Ăimene/Matrica Piesaistes sekvence Akceptora (5’ss) vai/ Atzarošanas Cis - (virziens -/+) (Lielie burti – kodola un donora (3’ss) (Branch ) aktiviz ācijas sekvence) piesaistes vieta punkts elements PSMA6 c.-4543_-4544insC Starp g ēnu L & LEFF/LEF1.02 (-) ttccattC _AAAgggaaa NA NA NA (delC>insC) rajon ā L & CHRF/CHR.01 (+) ccctTTG _Aatgga L & HOXF/NANOG.01 (+) ccctttg _AATGgaattggc c.-110C>A Promoteris; - L & ZFHX/AREB6.04 (-) gccgc GTTTcttc NA NA NA 1 no 5’UTR G & BARB/BARBIE.01 (+) aagaAA AGcggctgg c.-8C>G 5’UTR - - NA NA NA PSMC6 c.86-104A>G 1.introns G & NKXH/TTF1.01 (-) ttacc CAAGtttcacatcc L & 5’ss L L & EIE G & ISS 2x G & ISE 4x PSMA3 c.543+138G>A 7.introns L & HOMF/BARX2.01 (+) ccaacacT AATgatagctg - Ch ↑ L & EIE L & HBOX/GSH2.01 (+) caacacT AATgatagctga G & ISS G & EVI1/MEL1.02 (+) caacact GATGatagct G & ISE 3x TF – transkripcijas faktori; L – paz ūd, G – veidojas, Ch – izmain ās; „-„ – neieteikm ē jeb nemain ās atkar ībā no al ēles nomai Ħas; NA – nav analiz ēts, jo nevar būt saist īts; ↓ un ↑ molekulas piesaistes aktivit ātes mai Ħa. „_” - del ēcijas poz īcija c.-4543_-4544insC gad ījum ā. Cis -aktiviz ācijas elementi apz īmēti k ā EIE (eksona identifik ācijas elements), ISE (introna splaisinga enhancers) un ISS (introna splaisinga silencers).

13. Pielikums. Transkripcijas faktori, kuru piesaistes vietas z ūd vai veidojas atkar ībā no analiz ēto HSMS mar ėieru vai SNP sekven ču vari ācij ām (Genomatix Matrix Family Library (Version 0.80)) Ăimene (saime) Matrica Sa īsin ājums Infrom ācija Sa īsin ājums Infrom ācija Barbitur ātu – induc ējamo elementu sakopojums no BARB BARBIE.01 Barbitur āta indukcijas elementu bokss pro+eikariotu g ēniem

BPTF Bromodom ēna un PHD dom ēna transkripcijas faktori FAC1.01 Fetal Alz-50 klons 1 (FAC1)

Šūnas cikla g ēna homolo ăijas rajons (CDE/CHR tand ēmas CHRF Šūnas cikla regul ātors: š ūnas cikla homolo ăijas elementi CHR.01 elementi, kas regul ē š ūnas cikla atkar īgo apspiešanu) MEL1 (MDS1/EVI1-līdz īgais g ēns 1) DNA saist īšan ās EVI1 EVI1-mileoida transform ācijas prote īns MEL1.02 dom ēns 1 HBOX Homeobox transcription factors GSH2.01 Homeodom ēna transkripcijas faktors Gsh-2 Barx2, Homeodom ēna transkricpijas factors, kas pirmk ārt HOMF Homeodom ēna transkripcijas faktors BARX2.01 saist ās pie dubulta TAAT mot īva

HOXF Paralogie hox g ēni 1-8 no četru hox kl āstera A, B, C, D NANOG.01 Homeodom ēna transkricpijas factors Nanog

LEFF LEF1/TCF LEF1.02 TCF/LEF-1, iesaist īti WnT sign ālā transdukcijas ce Ĝā

NKXH NKX homeodom ēna faktori TTF1.01 Vairogdziedzeris transkripcijas faktors-1 Divu atbalsta cinka pirksu homedom ēna transkripcijas ZFHX AREB6.04 AREB6 (ATp1a1 regulator ā elementa piesaist īšan ās factors 6) faktora