UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO
ANALISIS MORFOGENETICO DE LA GASTRULACION EN PECES TELEOSTEOS ANUALES DEL GENERO
AUSTROLEBIAS
LUISA PEREIRO GONZALEZ
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Director de Tesis: Prof. Dr. Miguel Concha
Co-Director de Tesis: Prof. Dr. Jochen Wittbrodt
2008
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO
INFORME DE APROBACION TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Medicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por el candidato.
LUISA PEREIRO GONZALEZ
ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 18 de agosto de 2008.
Prof. Dr. Miguel Concha Director de Tesis Dpto. de Anatomía y Biología del Desarrollo, Facultad de Medicina, Universidad de Chile
COMISION INFORMANTE DE TESIS
PROF. DR. JUAN LARRAIN PROF. DR. MARCELO ANTONELLI
PROF. DR. JUAN FERNANDEZ PROF. DR. NORBEL GALANTI Presidente Comisión de Examen
2 Dedicatoria
A mis viejos, por heredarme lo más valioso y necesario para esta tesis, la convicción de que “hay que agarrarse con uñas y dientes en la búsqueda del conocimiento ” . Para Uds. parres.
3 Agradecimientos
A Jochen Wittbrodt por devolverme la pasión por la ciencia y por marcar un rumbo, que seguramente será un ejemplo a seguir.
A Felix Loosli por enseñarme los trucos de la biología molecular y por los post-it con chistes que me dejabas (¿o eran en serio?).
A todos los integrantes del laboratorio Wittbrodt, por hacerme sentir en casa.
A Nibia Berois y María José Arezo por enseñarme lo que es un equipo de trabajo y por el entusiasmo compartido de trabajar con “Cynolebias”.
A Miguel Concha, por aceptar el desafío de trabajar con un organismo nuevo.
A Luis Cifuentes por cuidar a los peces, a Alejandra Catenaccio por la colaboración/paciencia y a Steffen Hartel por todos los aportes, humanos y científicos.
Al Dr. Juan Fernandez por su poesía humana y su sabiduría científica (también por el pez-pollo).
A toda la comisión evaluadora por el esfuerzo para que esta tesis fuera posible y por el entusiasmo en la discusión de los resultados.
A las secretarias del postgrado, Mónica y Paola, por la buena disposición constante y “muchachas las dejo tranquilas, ya pueden dejar de soñar conmigo”.
A Marcello Antonelli por sus comentarios positivos sobre mi trabajo y por ser un ejemplo de humildad.
A “Moni” integrante del laboratorio de Jorge Allende, por estar siempre dispuesta a ayudar y prestarme toda clase de soluciones.
A Eugenia Díaz por el té, la charla, la honestidad y el ejemplo de dedicación.
A Soledad De La Piedra por sus nuevos aportes al entendimiento del desarrollo embrionario de Austrolebias y también por el buceo.
A María Eugenia Cabrejos por todos los consejos de biología molecular (gracias por la información de páginas web a consultar, aún la uso) y de la vida.
A todos los integrantes del laboratorio de Miguel Allende, por ofrecerme siempre ese huequito para trabajar y hacerme sentir una más.
4 A Florencio Espinoza (Floro) por permitirme invadir su oficina, con el trabajo de la tesis y por el cariño de siempre.
A mi padre por enseñarme el disfrute también de las pequeñas cosas y las ganas de aprender.
A mi madre por darme los valores que me acompañan día a día y apoyarme incluso a cruzar Los Andes.
A mis hermanas: Tere, Alicia e Inés y mis seis sobrinos, por estar siempre conmigo, en todas.
A la Pim, mi cuarta hermana, por todo lo vivido y todo lo que nos queda...
A todos mis amigos de Uruguay, repartidos por todo el mundo, por todas las experiencias vividas.
A Cathy y Jorge por el cariño de todos los días.
A Rosario, Benjamín y Matías por permitirme aprender todos los días algo nuevo y por ayudar en la construcción de una familia.
A Miguel (el mio) por el apoyo incondicional, la actitud positiva frente a la vida y por ser mi justo complemento.
5 Indice de materias
Resumen 1 Abstract 4 Introducción 6
1.- Peces anuales del género Autrolebias: como modelo de estudio de la gastrulación 7 12 2.- La gastrulación en vertebrados 2.1.- Eventos Morfogenéticos de la Gastrulación 13
2.2.- Combinación de movimientos celulares durante la gastrulación en diversos organismos 17 20 2.3.- Internalización endomesodérmica: el blastoporo y brachyury 2.4.- Formación y mantenimiento del organizador, expresión del gen 22 goosecoid 2.5.- goosecoid y brachyury en la gástrula de vertebrados 25 25 2.6.- Establecimiento de ejes y rompimiento de la simetría 2.7.- El primordio de la cola: ¿una continuación de la gastrulación? 30 31 3.- Gastrulación en peces teleósteos 3.1.- Gastrulación “tipo” en peces teleósteos 32 36 3.2.- Gastrulación “atípica": peces anuales, Austrolebias 3.3.- Semejanzas y diferencias entre Austrolebias y otros organismos 40 vertebrados Hipótesis de trabajo 42 42 Objetivo general Objetivos específicos 42 43 Metodología 1.- Mantenimiento y reproducción de los adultos, cultivo y manejo de 43 embriones 2.- Análisis morfológico del proceso de agregación celular 44 44 2.1. Microscopía de campo claro 2.2. Microscopía Confocal 45 46 2.3. Cortes histológicos
6 3.- Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación 47 3.1.- Clonamiento de genes de interés 47
3.2.- Preparación de sondas 50 3.3.- PCR en Tiempo Real 51
3.4.- Hibridación in situ 53 4.- Análisis de destino celular durante la agregación 54
Resultados 56 1. Análisis morfológico del proceso de agregación celular en Austrolebias 56
1.1.- Descripción y definición de estadíos de agregación celular 56 1.1.a.- Estadíos de agregación celular 58
1.1.b.- Estadíos de eje embrionario y somitogénesis inicial 67 1.2.- Estudio morfológico a través de cortes histológicos 70
2. Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación 73 2.1.- Clonamiento de fragmentos génicos de Austrolebias 73
2.2.- Análisis de secuencias de goosecoid y brachyury 74 2.3.- Expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en Tiempo Real 82
2.4.- Estudio del patrón de expresión de goosecoid y brachyury 84 3. Estudio de mecanismos celulares morfogenéticos involucrados en el
proceso de agregación 93 3.1.- Análisis de destino celular durante la agregación 93
3.2.- Estudio dinámico, por microscopía en tiempo extendido, del proceso de agregación temprano 99
3.2.1a.- Poblaciones celulares del agregado 100 3.2.1b.- Poblaciones celulares externas al agregado 102
3.2.2.- Epitelialización y migración centrípeta de células embrionarias durante la agregación 103
3.2.3.- Análisis del proceso de internalización celular en AIIIm 108 Discusión 112
1.- El blastoporo en Austrolebias: ¿sin surco y con anillo? 113 2.- Tejido extraembrionario posterior: posible función instructiva de la
formación del embrión. 116
7
3.- ¿Cómo se forma un embrión a partir de un grupo de células? 122 4.- Resumen de los resultados obtenidos 126 Conclusión 128 Bibliografía 129 Apéndice 136
Indice de tablas
Tabla 1. Comparación de tiempos post-fecundación entre peces anuales y no
anuales. 39 Tabla 2. ARNs polimerasas utilizadas en la transcripción de las sondas de gsc y bra. 51 Tabla 3. Estadíos, tiempos y características del proceso de agregación 69 Tabla 4. Porcentajes de identidad de gsc (A) y bra (B) en comparación con otros vertebrados y entre si. 76 Tabla 5. Ensayos realizados para el estudio del destino celular 99
Indice de figuras
Figura 1.- Ciclo de vida y hábitat de Austrolebias 10
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos 11 Figura 3.- Tipos de movimientos celulares durante la gastrulación 16
Figura 4.- Morfogénesis temprana en las cuatro especies de vertebrados más estudiadas 19
Figura 5.- Esquema que compara algunos estadíos del desarrollo embrionario de
D.rerio y Austrolebias 34
Figura 6A.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana 60
Figura 6B.- Esquemas de los estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana 61
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío 64
8 Figura 8.- Estudio histológico del proceso de agregación celular y formación 72 del eje embrionario
Figura 9.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de goosecoid (gsc) 78 79 Fig 10.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de brachyury (bra)
Figura 11.- Comparación de secuencias aminoacídicas de goosecoid de 80 Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados
Figura 12.- Comparación de secuencias aminoacídicas de brachyury de 81 Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados
Figura 13.- Estudio de la expresión temporal de goosecoid y brachyury 83 86 Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury
Figura 15.- Análisis del patrón de expresión de brachyury durante el estadío AV 89 92 Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid y brachyury
Figura 17.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación temprano 95
Figura 18.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación medio 97 Figura 19.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación 98 celular tardío
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm 101 104 Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de 107 estadío AIIIm
Figura 23.- Proceso de intercalación (B-E) e internalización (F-J) en estadío 110 de AIIIm
9 Resumen
Durante la gastrulación, las células de la blástula experimentan una redistribución dramática para originar un embrión multilaminar. Esto ocurre a través de movimientos celulares altamente coordinados mediante los cuales, grupos definidos de células se internalizan desde la superficie formando un blastoporo y dando origen al endomesodermo. Los movimientos celulares que ocurren durante este proceso varían entre especies y las principales diferencias radican en la topología, contextos geométricos y citomecánica de los distintos comportamientos celulares que los embriones usan. En los vertebrados, el proceso de internalización celular de la gastrulación ocurre formando dos patrones morfo-topológicos fundamentales: en anillo (observado en el blastoporo de anfibios y peces) o en línea o surco (visto en amniotas). En todos los casos, la gastrulación ocurre al mismo tiempo que el proceso de epibolia. El género de peces teleósteos anuales Austrolebias habita cuerpos de aguas continentales altamente inestables y su desarrollo embrionario está adaptado para la sobrevivencia en ellas. Los peces anuales tienen dos características que los distinguen: (a) existe un proceso de dispersión-agregación de las blastómeras profundas previo a la formación del eje embrionario, (b) pueden ocurrir detenciones reversibles del desarrollo (diapausas) en tres estadios específicos del desarrollo. Por otro lado, los procesos de epibolia y gastrulación están separados tanto en el tiempo como espacio, y el eje embrionario se forma a partir de células que se agrupan formando una estructura de tipo discoidal. En esta tesis la pregunta a responder es si la gastrulación en Austrolebias está influenciada por la morfología discoidal de la gástrula y si esta ocurre siguiendo patrones morfogenéticos semejantes a los de otros embriones discoidales (p.e. embrión de pollo) o si por el contrario, debido a su pertenencia al grupo de los teleósteos, la gastrulación ocurrirá según lo descrito para otros peces teleósteos, como es el caso del pez cebra. Los objetivos planteados fueron: (1) caracterizar y describir el proceso de agregación celular; (2) estudiar la posible existencia de estructuras tipo nodo y surco primitivo en Austrolebias; (3)
1 analizar el destino de las células que se agregan; y (4) investigar como ocurre el proceso de internalización del endomesodermo, durante la gastrulación en Austrolebias. Para el análisis y descripción morfológica del proceso de agregación celular se utilizaron tres abordajes: microscopía DIC, microscopía confocal y cortes histológicos. Estos abordajes descartaron la presencia de una línea o surco primitivo, característico de los embriones discoidales. Para poder marcar las regiones celulares participantes en el proceso de gastrulación, se clonaron los genes goosecoid (marcador de nodo) y brachyury (marcador del blastoporo), y se estudió sus patrones de expresión por hibridación in situ. Se observó que la expresión temprana de estos genes no se asemeja a la de otros embriones discoidales, pero tampoco es completamente equivalente al de otros teleósteos. brachyury por ejemplo, se expresa en un patrón circular, dentro del cual goosecoid ocupa una posición periférica. Más tardíamente, sin embargo, la expresión de brachyury adquiere un patrón similar al de otros peces teleósteos evidenciando la forma de anillo. Por otro lado, el estudio de destino celular reveló que las primeras células que se agregan son extraembrionarias, las que posteriormente migran y se concentran en la región caudal del embrión, siendo reemplazadas en el centro del agregado por las células embrionarias definitivas. El análisis in vivo del comportamiento y movimiento celular por microscopía confocal corroboró que el agregado inicial corresponde a un tejido extraembrionario. A medida que las células embrionarias se organizanan al centro del agregado, el tejido extraembrionario se desplaza inicialmente a la periferia y finalmente a la región posterior del agregado. El organizador (evidenciado por la expresión de goosecoid) está contenido en la zona central del agregado celular, y el proceso de internalización del endomesodermo parecería ocurrir a través de un blastoporo en forma de anillo, el cual sólo se hace evidente en estadíos tardíos de agregación. Las células que se internalizan tempranamente se desprenden de la superficie como células en botella sugiriendo un proceso de delaminación. Se concluye que posiblemente los procesos morfogenéticos que ocurren durante la gastrulación de Austrolebias se asemejen más al de otros teleósteos que
2 al de embriones discoidales. Las diferencias principales con otros organismos de peces teleósteos radicarían en la baja densidad celular de sus embriones y el desacoplamiento que existe entre el proceso de epibolia y los movimientos de internalización celular. Esto obligaría a los embriones de Austrolebias a cursar un proceso único de agregación celular previo al inicio de la gastrulación, generando una arquitectura celular nueva, dentro de la cual se adaptaría la topología de los procesos inductivos.
3 Abstract
During gastrulation, cells in the blastula undergo a dramatic redistribution to give rise to a multilayered embryo. This transformation occurs through a series of highly coordinated cell movements that allow the internalization of groups of cells from the surface to form the endomesoderm and the blastopore. The organization of cells to carry out this process varies among species, and the main differences between them lie in the topology, geometrical context and mechanical constraints present in the different embryos. In vertebrates, cell internalization during gastrulation is characterized by one of two possible morphogenetic events: the formation of a ring (observed surrounding the blastopore of fish and amphibians) or a streak or furrow (present in amniotes). In all cases, gastrulation is concomitant with the process of epiboly. Annual fish of the genus Austrolebias inhabit highly unstable freshwater bodies and their development has adapted for survival under these conditions. Embryos of these fish display two features that distinguish them: (a) there is a dispersal-agregation of the deep blastomeres prior to the formation of the embryonic axis; (b) a reversible arrest of development (diapause) can occur at three specific developmental timepoints. On the other hand, the processes of epiboly and gastrulation itself are temporally and spacially disconnected and the embryonic axis forms from a group of cells that congregate into a discoidal structure. The question addressed in this thesis, was whether gastrulation in Austrolebias is influenced by the disc shape of the gastrula and thus follows the mode of cell internalization of other discoidal embryos (e.g., avian embryos), or whether its morphogenetic movements resemble more closely those of other teleosts, such as those of the zebrafish. The specific aims of this work were: (1) to characterize and describe the process of cell aggregation; (2) to search for the presence of a node or furrow in the gastrula of Austrolebias; (3) to follow the fate of the cells that aggregate to form the embryo; and (4) to establish the mechanism of internalization of the endomesoderm during gastrulation in this fish. For the morphological analysis and descriptive aspects of this
4 thesis, three approaches were used: DIC microscopy, confocal microscopy, and histological sectioning. This analysis demonstrated that there is no structure comparable to the amniote primitive streak in Austrolebias. To label the cells that undergo internalization, the marker genes goosecoid (specific for the node or organizer) and brachyury (specific for the blastopore) were cloned, and their expression patterns were revealed by in situ hybridization. Early expression of both genes is unlike that found in other discoidal embryos, though it is not entirely comparable to that of other teleosts either. brachyury, for example, is expressed in a circular pattern, with goosecoid expressing cells located eccentrically, occupying a peripheral position. Later on, however, brachyury expression adopts a pattern similar to that of other fish, forming a ring of expression. Analysis of cell fate in these embryos revealed that the first group of cells to arrive at the aggregation site are extraembryonic, as they subsequently become positioned at the caudal end of the embryo and are replaced at the center of the agregate by the definitive embryonic cells. The in vivo analysis of the behavior of these cells using time-lapse confocal microscopy, confirmed this finding. The organizer (distinguished by the expression of goosecoid) is localized at the center of the aggregate, and the process of endomesoderm internalization occurs through a ring-shaped blastopore, a structure that only becomes distinguishable during the late aggregation stages. The earliest cells to ingress abandon the surface adopting a bottle shape, suggesting they do so through a process of delamination. The conclusion from this study, is that the morphogenetic events occurring during gastrulation in Austrolebias resemble more closely those of other teleosts than those of discoidal embryos beloning to other groups of vertebrates. The differences observed with other fish are related to the low cell density found in the pre-gastrula stage embryos and the uncoupling of epiboly and cell internalization. Thus, Austrolebias embryos must go through an obligatory, and unique, aggregation stage prior to gastrulation, requiring a novel cellular organization in which the ensuing inductive processes must be accomodated.
5 Introducción
La evolución de los metazoarios ha producido tanto una complejidad fenotípica como mecanismos del desarrollo encargados de generar dicha complejidad. Durante el desarrollo, una célula única se transforma en un organismo compuesto por múltiples tipos celulares, organizados en una distribución espacial que es arquitectónicamente compleja y al mismo tiempo funcionalmente coherente. Uno de los principales desafíos de la última década ha sido entender cómo, a partir de interacciones génicas y comportamientos celulares, los distintos tipos o estados celulares se establecen en tiempo y espacio en un organismo en desarrollo (Salazar- Ciudad et al., 2003). La embriogénesis de los vertebrados involucra una combinación coordinada de proliferación, especificación de destino y movimiento celular. Luego de la inducción de las hojas embrionarias, la blástula es transformada por los movimientos de la gastrulación, en un embrión multilaminar con rudimentos de cabeza, tronco y cola (Solnica-Krezel, 2005). En los bilateria es conocida la existencia de genes conservados tanto en estructura como en función. En particular dentro del grupo de los vertebrados el estudio de un número limitado de organismos, ha permitido describir mecanismos de desarrollo, algunos de los cuales son claramente conservados entre grupos lejanos, y que en algunos casos se han considerado representativos de todo un grupo, como el de los peces teleósteos. A partir del estudio de una decena de especies de teleósteos de órdenes lejanos y diversos, se ha descrito el desarrollo embrionario considerándolo representativo de todo el grupo. Pero ¿será este tipo de desarrollo realmente representativo de todos los peces teleósteos? En esta tesis se analiza el desarrollo embrionario y en particular el proceso de gastrulación, en un pez teleósteo anual que aparentemente presenta rasgos del desarrollo embrionario sumamente derivados, los cuales posiblemente estén relacionados con el éxito de estrategias para sobrevivir en un habitat inestable.
6 La introducción ha sido subdividida en tres secciones. En la primera se hará mención brevemente de las características del modelo en estudio en relación a su modo de vida, habitat y relaciones filogenéticas. En la segunda sección se describirá, en forma comparada, las características principales del proceso de gastrulación en distintos organismos vertebrados. En la tercera sección se comparará la gastrulación de los peces teleósteos más estudiados (gastrulación “típica”) y los peces teleósteos anuales (gastrulación “atípica”), considerando para esto último la información existente sobre Austrolebias.
1.- Peces anuales del género Austrolebias como modelo de estudio de la gastrulación
Dentro del orden Cyprinodontiformes existen géneros que presentan ciclos de vida anual. Estos son peces que habitan masas de agua temporales en las que, durante los períodos estivales de sequía, ocurre la muerte tanto de adultos como de formas post-embrionarias. Estos peces dejan sus huevos enterrados en el sustrato, los cuales permanecen vivos gracias a varias características particulares de su desarrollo embrionario. La eclosión de dichos huevos ocurre en la siguiente estación lluviosa y en pocas semanas los juveniles alcanzan la madurez sexual (Figura 1). Esta estrategia reproductiva sugiere una plasticidad de respuesta a un entorno sumamente variable. Ejemplos de géneros que poseen este ciclo de vida son Austrofundulus, Austrolebias, Rachovia y Pterolebias de Sudamérica y Aphyosemion y Nothobranchius de África (Wourms, 1964, 1967, Wourms 1972, a,b,c). La capacidad de las poblaciones de peces anuales para sobrevivir a las estaciones secas, está localizada en sus huevos. Estos son resistentes a la desecación y exhiben un modelo de desarrollo embrionario que difiere del descrito para otros peces y vertebrados. Las dos características fundamentales que definen a los peces anuales son: (1) el desarrollo temprano se caracteriza por presentar una fase de dispersión total de las blastómeras profundas durante el proceso de epibolia y una posterior agregación de éstas, previo a la formación del eje embrionario.
7 (2) poseen la capacidad de experimentar detención reversible del desarrollo embrionario (diapausa) en tres momentos definidos: diapausa I (fase dispersa), diapausa II (embrión somítico antes o después de la formación del tubo endocardíaco) y diapausa III (pre-eclosión). En los géneros Austrolebias y Nothobranchius las diapausas I y II son facultativas, siendo la diapausa III la única obligatoria (Wourms, 1972 a, b, c). El género Austrolebias Costa, 1998a (Cyprinodontiformes, Rivulidae) constituye un ejemplo de peces anuales presentes en regiones bajas de Argentina, Uruguay y Brasil. El mismo ha sido objeto de estudio en diferentes áreas: a nivel eco-etológico y morfológico (Vaz Ferreira et al. 1964, Vaz Ferreira y Sierra, 1973), aspectos citogenéticos (Máspoli y García, 1988, García et al., 1993, 1995), análisis filogenéticos (García et al., 2000, 2001, 2002), estudio de parámetros morfométricos y ultraestructurales (Loureiro y de Sá, 1996, 1998) y taxonómicos (Loureiro et al., 2004). A su vez se realizó la caracterización de los estadios del desarrollo en A. viarius (la cual no difiere mayormente en otras especies de este género) y se establecieron los tiempos de desarrollo de cada estadio (Arezo et al. 2005). Estos estudios del desarrollo embrionario, han permitido obtener información en cuanto a la descripción de las características más sobresalientes de los distintos estadíos embrionarios, así como una descripción ultraestructural del proceso de dispersión (100% de epibolia) (Wourms 1972a, b y c; Carter & Wourms 1991; Arezo, et al., 2005). Dichos trabajos pioneros abrieron interrogantes en cuanto a las características únicas de estos peces teleósteos. Para la descripición de su desarrollo se habla de un proceso de “dispersión-reagregación” entre las etapas de clivaje/epibolia y formación del eje embrionario (Wourms, 1972b). El orden Cyprinodontiformes al que pertenecen los peces anuales del género Austrolebias, se ubica filogenéticamente más cercano a los Beloniformes donde se ubica la especie Orizias latipes (medaka) y Tetraodontiformes al que pertenece Takifugu rubripes (Fugu) teniendo un antecesor común hace 195 millones de años. Los Cypriniformes, orden al que pertenece Danio rerio (pez cebra), tiene un antecesor común con los Cyprinodontiformes (Austrolebias) que existió hace 290 millones de años (ver filogenia en Fig. 2). Tanto pez cebra, medaka como Fugu
8 presentan un desarrollo embrionario similar, en cuanto a sus características morfológicas, es posible que la aparición de las innovaciones en el desarrollo embrionario, características del género Austrolebias, serían más recientes y derivadas del patrón descrito para estos teleósteos.
9
A 5 B
4
6
3 1
2
Figura 1.- Ciclo de vida y habitat de Austrolebias A. Ciclo de vida de peces anuales. 1-2. Puesta de huevos durante periodo de invierno, 2-3 muerte de adultos a medida que los charcos se secan y los huevos quedan enterrados en el sustrato durante el verano, 3-4 período de lluvias donde los charcos se llenan de agua y nacen las larvas, 4-6 desarrollo y maduración de larvas a adultos, inicio del nuevo periodo reproductivo (modificado de Wourms, 1972 c) B Charco típico donde habita Austrolebias. En particular habitat de A. charrua en Rocha, Uruguay.
10 Orizias latipes
Takifugu rubripes
Danio rerio
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos
11 2.- La gastrulación en vertebrados
La morfogénesis es un proceso fundamentalmente biomecánico, propiedad especialmente cierta para la gastrulación, una de las mayores transformaciones morfogenéticas en el desarrollo (Keller et al., 2003). La gastrulación es un proceso que implica una redistribución dramática de las células de la blástula a través de movimientos altamente coordinados de células y tejidos. El embrión en el estadío de blástula consta de numerosas células cuya posición relativa es establecida durante el clivaje. Cuando la gastrulación comienza, estas células adquieren nuevas posiciones y nuevos vecinos, estableciéndose un plan corporal multilaminar que consta de tres hojas embrionarias: externa (ectodermo), interna (endodermo) e intermedia (mesodermo). Los movimientos celulares que ocurren en este proceso involucran a la totalidad del embrión y la migración en una zona particular de éste, implica necesariamente la coordinación con movimientos que ocurren simultáneamente en otra región del embrión (Gilbert, 2000). Gastrulación significa formación de una cavidad gástrica, el arquenterón, en el cual ocurrirá la digestión en el organismo adulto. En la mayoría de los animales la formación del endodermo ocurre al mismo momento que la formación de la tercer hoja embrionaria, el mesodermo. Pero sin embargo esto no ocurre siempre, y la formación del mesodermo puede estar temporalmente separada de la formación de la cavidad gástrica. Sin embargo el término gastrulación es comúnmente utilizado como un sinónimo de la formación del endomesodermo (Technau & Scholz, 2003).
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos Análisis filogenético entre diez especies de peces teleósteos, modelo de estudio en diferentes áreas, pertenecientes a siete órdenes diferentes, donde se estiman los tiempos de divergencia. En rojo se indican los órdenes y especies de teleósteos a las que se hace referencia en el texto: Beloniformes al cual pertenece el modelo medaka (Orizias latipes), Tetraodontiformes pertenece Fugu (Takifugu rubripes) y Cypriniformes al que pertenece el pez cebra (Danio rerio). En azul se indica el orden Cyprinodontiformes (flecha), dentro del cual está el género de peces anuales Austrolebias. Los valores a la derecha de los nodos representan la edad estimada (en millones de años atrás, MYA) del último antecesor común (en recuadro rojo se indican los antecesores comunes de los peces de interés). Modificado de Steinke et al. 2006.
12 Los embriones vertebrados despliegan un plan corporal conservado, con un eje rostrocaudal elongado. A lo largo del eje dorsoventral, el sistema nervioso toma la posición más dorsal, por encima de la notocorda y flanqueado por los somitos bilaterales (Solnica-Krezel, 2005). Las hojas embrionarias son las distintas capas celulares que se forman tempranamente en el desarrollo embrionario (durante la gastrulación) y dan origen a todos los tejidos del adulto. Por ejemplo, el ectodermo va a originar al sistema nervioso y la epidermis, el endodermo al intestino medio (y algunos órganos internos en vertebrados) y el mesodermo a la sangre, tejido muscular y en los vertebrados a los huesos y algunos órganos internos (Technau & Scholz, 2003). Por otro lado la terminología “endodermo, mesodermo y ectodermo” no es correcta en estricto sentido. El sufijo - dermo es usado para referirse a un tejido diferenciado, como el tejido epitelial. Por el contrario el sufijo - blasto indica un tejido proliferativo, no diferenciado. Por lo tanto parece más apropiado hablar de mesoblasto, endoblasto y ectoblasto como una hoja embrionaria proliferativa con diferentes destinos posibles, durante la embriogénesis de los animales (Salvini- Plawen & Splechtna, 1979). De todos modos, y a los efectos de esta tesis, la referencia a las hojas embrionarias se hará como se acostumbra tradicionalmente: ectodermo, mesodermo y endodermo.
2.1.- Eventos Morfogenéticos de la Gastrulación
Los movimientos que ocurren durante la gastrulación varían de especie a especie, lo que sugiere la existencia de una variada gama de estrategias para generar el mismo plan corporal básico. Esta diversidad, sin embrago, contrasta con el hecho de que los diversos embriones utilizan un repertorio limitado de comportamientos celulares, el cual está sumamente conservado a lo largo de la filogenia (migración de células únicas con conducta de gateo, migración de poblaciones de células, rearreglo celular, cambio de forma celular, cambio en la adhesividad celular, transición epitelio-mesénquima y mesénquima-epitelial, división celular, crecimiento, apoptosis). La diferencias entre especies radican, entonces, en las distintas combinaciones de comportamientos celulares que los embriones usan,
13 las cuales acontecen a su vez, en diferentes contextos geométricos y mecánicos, así como en tiempos disímiles (Keller et al., 2003). Esta diversidad de combinaciones de mecanismos morfogenéticos surgida durante la evolución sería, en parte, consecuencia de distintas estrategias reproductivas y ciclos de vida, lo que involucra la evolución a su vez de huevos de diferentes tamaños, cantidad y proporción de vitelo así como de distintas tasas de desarrollo. Lo fundamental para entender la gastrulación, en un sentido amplio y profundo, reside por lo tanto, en entender el diseño celular biológico y biomecánico de la gástrula, producido estocásticamente durante la evolución (Keller et al., 2003). Uno de los eventos fundamentales de la gastrulación es la formación de las hojas embrionarias. Este proceso usualmente involucra la combinación de uno o más de los siguientes tipos de movimientos celulares en las distintas especies (Figura 3):
- Invaginación: plegamiento localizado de una lámina de células (Ej. formación de endomesodermo en Xenopus [Keller, 1981]) - Involución: movimiento coordinado de una población de células hacia posiciones más profundas dentro del embrión (Ej. movimiento de las células del margen del blastodermo hacia el interior para generar el hipoblasto en el pez cebra [Warga & Kimmel, 1990] y Barbus conchonius [Wood & Timmermans, 1988]) - Ingreso (“Ingression”): movimiento de células individuales hacia posiciones más profundas del tejido, cambiando las relaciones entre ellas durante el proceso (Ej. formación del hipoblasto a partir del epiblasto en Fundulus [Trinkaus, 1996] y pez cebra [Carmany-Rampey & Shier, 2001], formación del endomesodermo a través del surco primitivo en pollo [Hashimoto & Nakatsuji, 1989]). - Delaminación: desprendimiento de células individuales a partir de una capa de células epiteliales, generando una capa paralela y más profunda a la primera (Ej. formación del hipoblasto en Salmo gairdneri [Ballard, 1966] y del hipoblasto primario en pollo [Eyal-Giladi et al., 1992]).
14 - Epibolia: movimiento de capas epiteliales que se dispersan como una unidad, a fin de cubrir las capas profundas de un embrión, la que puede llevarse a cabo por una activa intercalación radial de células (Ej. movimiento del ectodermo presuntivo sobre el endodermo presuntivo por activa intercalación radial de células en Xenopus [Keller, 1980]; movimiento de la capa celular envolvente (EVL), blastómeras profundas (BP) y capa sincicial vitelina (YSL) sobre el vitelo en pez cebra [Kimmel et al., 1995]; movimiento de las células ectodérmicas presuntivas sobre la envoltura vitelina en el pollo [New, 1959]).
El otro gran movimiento que ocurre durante la gastrulación es el de extensión convergente. Este involucra la migración en dirección medio-lateral de células de las tres hojas embrionarias, lo que lleva a un angostamiento lateral y elongación a lo largo del eje antero-posterior del tejido. Los comportamientos celulares que dirigen la extensión convergente se conocen bien en Xenopus, y en un grado menor en los teleósteos. Se basan en la intercalación activa de células a lo largo del eje medio- lateral del embrión. Se ha visto que la intercalación medio-lateral es dirigida por la actividad protrusiva unipolar o bipolar de las células, dependiendo de la hoja germinal involucrada. Las células inicialmente se elongan, luego se alinean en el sentido medio-lateral y posteriormente se intercalan (Keller, 1976, 1980, Concha & Adams, 1998). Finalmente, estudios en pez cebra y Fundulus, indican la existencia de convergencia en ausencia de movimientos de extensión en regiones laterales de la gástrula, en las cuales las células migran hacia regiones dorsales predominantemente por medio de filolamelipodios y casi no se intercalan (Trinkaus et al., 1992, Concha & Adams, 1998).
15 Invaginación Involución Ingreso
Ej. endodermo Ej. mesodermo Ej. mesodermo de erizo, de erizo en anfibios neuroblastos Drosohila
Delaminación Epibolia
Ej. hipoblasto de Ej. ectodermo en mamíferos y aves anfibios y erizo
Figura 3.- Tipos de movimientos celulares durante la gastrulación. La gastrulación de un organismo cualquiera, involucra una combinación de estos movimientos. Modificado de Gilbert, 2000.
16 2.2.- Combinación de movimientos celulares durante la gastrulación en diversos organismos
El oocito de la rana Xenopus presenta una cantidad de vitelo intermedia (mesolecito) en relación a otros organismos, el cual está desplazado hacia el polo vegetal, determinando de esta forma un clivaje total pero enlentecido en el hemisferio vegetal. Esto genera una blástula cuyas células vegetales (futuro endodermo) serán de mayor tamaño que las animales (ectodermo y mesodermo presuntivo) y con un blastocele desplazado hacia el polo animal. Cuando la gastrulación comienza, ciertas células localizadas justo debajo del ecuador, cambian dramáticamente su morfología (células en botella) e involucionan a través de una región circunscrita del dorso del embrión, el labio dorsal del blastoporo. Estas primeras células se transformarán en células faríngeas del intestino anterior (endodermo). El próximo evento de la gastrulación involucra la invaginación de las células de la zona marginal, a la vez que las células animales realizan epibolia y convergencia hacia el blastoporo (Figura 4). Las siguientes células en involucionar formarán la placa precordal y la notocorda. Posteriormente, las células del mesodermo involucionado realizan convergencia y extensión, y se mueven como una lámina de células sobre la superficie interna del blastocele en dirección al polo animal del embrión (Keller, 1980, 1981). En el caso del pez cebra, la blástula tiene la forma de una copa invertida sobre el vitelo. Esta polaridad se adquiere debido a que su huevo es telotecito (con gran contenido de vitelo, al igual que en otros teleósteos) y el clivaje es meroblástico discoidal (clivaje parcial según un disco). Durante la gastrulación las células del blastodermo profundo se expanden sobre el vitelo por medio de intercalación radial (movimiento de epibolia) y posteriormente a través de movimientos de involución y/o ingreso (ver discusión abajo). El borde del blastodermo se pliega hacia el interior, a lo largo de toda la circunferencia del embrión, formando una región marginal bilaminar (epiblasto-hipoblasto) denominada anillo germinal (Figura 4). Posteriormente, las células de la región dorsal del embrión se reorganizan por movimientos de convergencia generando el escudo embrionario (Warga & Kimmel,
17 1990), una estructura homóloga al labio dorsal del blastoporo en anfibios y al nodo de Hensen, en aves. Finalmente, al igual que en anfibios, el embrión adquiere su forma alargada a través de movimientos de convergencia y de extensión convergente (Solnica-Krezel & Eaton, 2003; Keller 2002; 2003). Los embriones amniotas, como las aves y los mamíferos, adquieren forma de disco (Ej. pollo y humanos) o copa (Ej. ratón) y están formados por una lámina de células epiteliales. En ambas geometrías (disco y copa), el primer signo morfológico de la gastrulación es la formación del nodo de Hensen y el surco primitivo. Este último se forma a lo largo de la línea media embrionaria como consecuencia del ingreso o delaminación de células epiteliales del epiblasto en un proceso denominado transición epitelio-mesenquimática (Figura 4). Una vez que el surco primitivo se ha establecido, las células mesenquimáticas comienzan una migración anterolateral y se diferencian en células endomesodérmicas (Vakaet, 1984; Eyal- Giladi, 1991; Psychoyos & Stern, 1996; Hashimoto & Nakatsuji,1989) .
18 Pez Rana Pollo Ratón
polo animal polo animal proximal blastodermo blastodermo
epiblasto vitelo
vitelo cel. vit.
distal polo vegetal polo vegetal
blast. prof EVL blastocele linea primitiva margen vitelo blastodermo labio dorsal blastoporo
50% epibolia Estadío 10 Estadío XIV 6.5 días post coitum 8000 células en blastodermo 5000 células en blástula 600-700 células en epiblasto 600 células en epiblasto
Figura 4.- Morfogénesis temprana en las cuatro especies de vertebrados más estudiadas. A. Apariencia de los embriones antes de la gastrulación. Escala de barras: peces, 500-600 μm; rana, 1-2mm; pollo, 2-3mm; ratón, 700 μm. Las flechas verdes indican la dirección de movimiento de la epibolia. Las líneas rojas indican las regiones donde comienza a internalizarse el endomesodermo (blastoporo): peces, margen del blastodermo; rana, labio dorsal del blastoporo; pollo y ratón, línea primitiva. B. Mecanismo de formación de las hojas embrionarias. En el pez cebra las células superficiales del margen forman el hipoblasto moviéndose por involución. En la rana, el endomesodermo se forma por invaginación de las células de la blástula a través de la cincunferencia del blastoporo, localizado en la mitad más vegetal del embrión, seguido este movimiento por involución. En el pollo y el ratón las células del epiblasto “ingresan” individualmente a través de un surco primitivo lineal, para originar el endomesodermo. Los movimientos de internalización celular están indicados por diferentes colores a cada lado del embrión. C. Comparación de los mapas de destino de diferentes gástrulas tempranas, mostrando una regionalización similar en los tejidos progenitores. En cada esquema el organizador se encuentra representado como una región roja. Orientación de embriones: pez y rana - vista lateral izquierda; pollo - vista dorsal; ratón - la mitad izquierda del epiblasto está representada en una posición invertida, con su extremo proximal hacia abajo. se: ectodermo superficial, ne: neuroectodermo, mes: mesodermo, org: organizador, yolk end. endodermo que contiene vitelo, ks. media luna de Koller. Modificado de Gilbert & Raunio,1997; Concha, 1998. 19 2.3.- Internalización endomesodérmica: el blastoporo y brachyury
El blastoporo es la región por donde las hojas embrionarias, endodermo y mesodermo se internalizan, en el embrión temprano. Los precursores endomesodérmicos se internalizan vía el blastoporo en la rana, el margen del blastodermo en el pez y el surco primitivo en los amniotas (Solnica-Krezel, 2005). Por lo tanto, estas estructuras son homólogas entre si, en los diferentes organismos y de modo genérico le llamaremos blastoporo en esta tesis. En los distintos vertebrados analizados hasta la actualidad se han distinguido dos formas básicas de blastoporo: en anillo (Ej. en anfibios y peces) y en línea/surco (Ej. amniotas). Las variaciones principales entre organismos, están dadas en términos de los comportamientos celulares que acontecen en la internalización del endomesodermo, algunos de los cuales están aún en discusión. En relación al orden en el cual las hojas embrionarias se internalizan existen similitudes pero también diferencias entre los distintos organismos. En el pez cebra los movimientos de internalización se inician en el margen del blastodermo axial, donde se formará el organizador, y luego rápidamente se propaga la internalización por todo el margen (Warga & Kimmel, 1990). En la rana y el pez cebra los primeros tejidos que se internalizan son el mesodermo dorsoanterior y el endodermo. Esto contrasta con el pollo y el ratón, donde la línea primitiva aparece primero en la futura región caudal del embrión, luego se elonga hacia la futura región cefálica adquiriendo una forma lineal (Vakaet, 1970). La expansión de la línea está acompañada por el ingreso de células mesendodérmicas destinadas a transformarse en tejido extraembrionario y posterior. Solamente una vez que la línea primitiva alcanza su largo máximo, se forma el nodo de Hensen en su extremo rostral, por el cual ingresará el endomesodermo dorsoanterior (Schoenwolf, 1992). Por lo tanto, la internalización temprana en el pez cebra y la rana involucra tejidos dorsoanteriores, mientras que en amniotas, lo primero que se internaliza es tejido extraembrionario y posterior (Solnica-Krezel, 2005). Sin embargo, una vez que comienza la internalización del endomesodermo, ésta también ocurre siguiendo un orden similar al visto para otros organismos. En pez cebra, pollo y ratón el endodermo es
20 internalizado via el blastoporo, por la región proximal al organizador. (Lawson & Schoenwolf, 2003). Con respecto a la formación del mesodermo, existe una tendencia en todos los vertebrados donde la organización rostrocaudal de los tejidos mesodérmicos refleja el orden temporal de su internalización, a través de una posición específica proximo-distal al blastoporo, por lo tanto la internalización de estructuras rostrales precede la de las caudales. Otro aspecto común de la internalización, es que la organización mediolateral de los tejidos mesodérmicos y probablemente endodérmicos, está asociada con el orden espacial a través del cual se mueven por el blastoporo, en relación al organizador. El mesodermo axial se mueve a través de la región axial del blastoporo: Ej. por el labio dorsal del blastoporo en ranas, el escudo en peces y el nodo en amniotas, y se internaliza la placa precordal que precede al cordamesodermo. Sin embargo, el mesodermo intermedio y la placa lateral se internalizan a través de regiones más distales (al organizador) del blastoporo (Solnica-Krezel, 2005). brachyury (bra) es un gen cuya expresión se ha detectado en todos los vertebrados, en el blastoporo/línea cuyas células contribuyen masivamente a la hoja embrionaria mesodérmica (Smith et al., 1991). Este no es simplemente un gen restringido al mesodermo, sino que más bien restringido al blastoporo (Technau & Scholz, 2003). Un análisis comparativo de los patrones de expresión de bra en distintos grupos indentifica su sitio original de expresión en la región del blastoporo (Technau, 2001). En los vertebrados el dominio de expresión de brachyury, el cual está bajo el control de la vía Nodal, corresponde al mesodermo presuntivo (Schulte- Merker et al., 1992, Smith et al., 1991). Se ha propuesto que el rol ancestral de brachyury fue controlar los movimientos celulares que permiten la internalización, más que el control de la diferenciación celular (Gross & McClay, 2001). bra es un factor de transcripción con un dominio de unión al ADN altamente conservado (Kispert et al., 1995), el dominio-T (T-box). Este dominio comprende 180-200 aminoácidos en la porción N-terminal de la proteina y un dominio de activación C-terminal, menos conservado (Kispert et al., 1995). Los genes con dominio-T aislados, de una amplia gama de organismos, comparten un alto grado de
21 identidad aminoacídica (40-90%) en el dominio-T. Todos los genes con dominio-T estudiados tienen roles importantes en el desarrollo embrionario temprano, principalmente, pero no exclusivamente en el tejido mesodérmico (Papaioannou & Silver, 1998). El gen bra apareció primero en metazoarios y tempranamente especifica el blastoporo/boca de los Cnidarios, el cual corresponde al organizador de dichos organismos. El origen de la expresión de bra en el mesodermo se remonta al mesodermo visceral caudal de los poliquetos, insectos y hemicordados. En los vertebrados bra es inicialmente panmesodérmico en la zona marginal para volverse tardíamente restringido al mesodermo axial (notocorda), el cual representa las células de la línea media que se segregan de la región del blastoporo (Technau, 2001). Por lo tanto, bra uno de los factores de transcripción involucrado en la diferenciación y determinación temprana del mesodermo de los vertebrados, se expresa primero en la zona marginal de la blástula tardía, el mesodermo presuntivo, pero se mantiene restringido a la notocorda y el organizador de la cola (“tailbud”), durante la gastrulación (Ej. mesodermo axial y posterior). Por lo tanto actúa en la especificación temprana del mesodermo posterior y la formación de la notocorda (Technau, 2001).
2.4.- Formación y mantenimiento del organizador, expresión del gen goosecoid
La actividad del “organizador”, el que fue descrito inicialmente por Spemann y Mangold en 1924, es una de las demostraciones más claras de la importancia de la comunicación célula-célula en la generación de diversidad de tejidos, durante el desarrollo embrionario. El organizador es un centro inductor de la formación del eje y puede generar la formación de ejes ectópicos si es transplantado a otra zona de un embrión (Spemann & Mangold, 1924; Joubin & Stern , 2001). A pesar de las diferentes estrategias reproductivas y geometrías del huevo, el organizador puede ser identificado en todos los vertebrados. Esta estructura es establecida en el estadío de gástrula bajo la influencia de una región especial conocida como el centro de Nieuwkoop en anfibios. El centro de Nieuwkoop es una
22 región dorso-vegetal del embrión, definida por su habilidad para inducir la formación de un organizador, sin contribución celular a éste, ni a las estructuras axiales derivadas (Bachvarova, 1998). Las estructuras homólogas en los distintos vertebrados que contienen al organizador son: el labio dorsal del blastoporo en anfibios, el escudo embrionario en pez cebra y el nodo de Hensen en pollo. La región organizadora consiste en una población de células que está continuamente cambiando, las cuales adquieren y pierden las propiedades organizadoras de acuerdo a su posición en un tiempo determinado (Joubin & Stern, 1999). La pregunta que surge entonces es ¿cómo se mantiene la actividad organizadora durante el tiempo necesario? Se propone que al menos en pollo, las mismas vías de señalización molecular involucradas en el posicionamiento del organizador, estarían jugando un rol en su regeneración. La regeneración sería una consecuencia del mecanismo normal de mantenimiento del nodo. Este mecanismo asegura que exista un grupo constante de células no organizadoras (células que no han entrado aún al nodo) que pueden responder a las señales liberadas por el organizador y tranformarse, por ejemplo, en tejido neural. A su vez permite la migración de las células alejándose del nodo, sin formar parte de éste (Joubin & Stern, 2001). goosecoid (gsc) de Xenopus, fue el primer gen aislado específico de organizador (Blumberg et al., 1991; Cho et al., 1991). A partir del descubrimiento de que gsc se expresaba en el organizador, fue posible visualizar, mediante el análisis de la expresión de dicho gen, una región del embrión con actividad inductiva. Por lo tanto el organizador de Spemann se convirtió en un grupo concreto de células y dejó de ser solamente un concepto embriológico (De Robertis, 2004). Por lo tanto gsc es uno de los primeros genes expresados en la región organizadora de todos los vertebrados estudiados y especifica la futura región dorsal, a lo largo del eje antero- posterior (De Robertis et al., 1992). El gen gsc, es un factor de transcripción que codifica para una proteína de unión al ADN con un dominio homoebox. Puede inducir la formación de un eje secundario parcial si su ARNm es microinyectado en un embrión temprano, indicando que este gen puede ejecutar parte de las actividades del organizador de
23 Spemann (Cho et al., 1991). gsc es activado por Nodal y β-catenina nuclear en la región dorsal del embrión (ver abajo). Una de las funciones de los factores de trascripción presentes en el organizador, es activar la producción de moleculas señalizadoras, las que permiten el reclutamiento de células vecinas hacia destinos dorsales (Niehrs et al., 1993). Dentro de los factores secretados por el organizador se encuentran: Chordin y Noggin. Estas moléculas de señalización cumplen un rol inhibiendo a los factores de crecimiento en el espacio extracelular. En particular Chordin y Noggin son antagonistas de BMP (bone morphogenetic proteins, inductores de destino ventral y lateral), impidiendo la unión con sus receptores. Dichos factores secretados antagonistas de BMP, son importantes para el establecimiento de los tres ejes en el embrión (Niehrs et al., 1993). En Xenopus la expresión de gsc más intensa comienza en el labio dorsal del blastoporo y se extiende a la placa precordal en la neurula tardía (Cho, et al., 1991). En pollo gsc comienza su expresión en la hoz de Koller del blastodisco, desde donde las células migran al extremo anterior de la línea primitiva, el nodo de Hensen y posteriormente la placa precordal, marcando el endodermo faríngeo y el mesodermo de la cabeza. Su expresión continúa hasta la somitogénesis (Izpisua-Belmonte et al., 1993). En el pez cebra gsc se expresa inicialmente en las primeras células que se internalizan por la región dorsal del margen en la gástrula temprana. Durante la gastrulación estas células se mueven delante de las células que formarán la notocorda. Cuando se aprecia la doble expresión de gsc y bra se observa que al inicio los dominios de expresión se solapan, separándose tardíamente. El límite posterior de expresión de gsc marca el extremo anterior de la notocorda, por lo tanto el solapamiento con bra es de pocas células. La expresión de gsc dura hasta la somitogénesis temprana en el pez cebra. Las células que expresan gsc darán origen a la glándula de eclosión (“hatching gland”), el endodermo faríngeo y el mesodermo de la cabeza. La placa precordal (región anterior del hipoblasto) también se marca con gsc.
24 2.5.- goosecoid y brachyury en la gástrula de vertebrados
Morfológicamente la gástrula del pez cebra, Xenopus, pollo y ratón son bien diferentes. Sin embargo usando dos marcadores gsc y bra, es posible definir regiones homólogas. Por lo tanto el escudo embrionario (pez cebra), labio dorsal del blastoporo (rana), el nodo de Hensen temprano (pollo) y el extremo de la línea primitiva (ratón) se consideran homólogos, ya que expresan altos niveles de ARNm de gsc e inician el movimiento celular que llevará al desarrollo del mesendodermo en la región de la cabeza (Schulte-Merker et al., 1994). De modo similar el anillo germinal (pez cebra), la zona marginal (rana), y la línea primitiva (pollo y ratón) son homólogos, ya que expresan bra y dirigen la formación del resto del mesodermo. Las mismas células que expresan gsc en el embrión temprano también inician la expresión temprana de bra en el lado dorsal, al menos en el pez cebra (Schulte- Merker et al., 1994). La expresión de gsc llega hasta el tejido más anterior, el borde anterior de la placa precordal, mientras que bra en estadíos tardíos del desarrollo, se expresa específicamente en los tejidos más posteriores, como la notocorda posterior y el organizador de la cola (“tailbud”), tanto en embriones de pez cebra (Schulte- Merker et al., 1992), Xenopus (Gont et al., 1993) como en ratón (Herrmann, 1990).
2.6.- Establecimiento de ejes y rompimiento de la simetría
El cigoto contiene todas las instrucciones para su desarrollo embrionario en el genoma cigótico y en moleculas citoplasmáticas maternas. La contribución relativa de la regulación materna y cigótica varía entre los vertebrados y esto se refleja particularmente en la velocidad y el patrón de los clivajes tempranos, en consecuencia en la morfología de la blástula (Solnica-Krezel, 2005). Los peces y las ranas se desarrollan externamente y la velocidad de su desarrollo embrionario, asegura que se formen rápidamente larvas independientes (Solnica-Krezel, 2005). Estos embriones constan de un gran almacenaje de energia en la forma de vitelo y de determinantes maternos que median el desarrollo, hasta el estadío de blástula media, cuando el genoma cigótico se vuelve transcripcionalmente activo y toma el
25 control (Newport & Kirscher, 1982; Kane & Kimmel, 1993). El vitelo está generalmente concentrado en el hemisferio vegetal y se distribuye en las blastómeras vía el clivaje completo, como en los embriones de rana, o se deposita en una célula vitelina separada, como se observa cuando el clivaje es incompleto en los embriones de peces y aves. Por lo tanto, la blástula de los peces consiste en un grupo de blastómeras en la región animal, sobre una gran célula sincicial vitelina (Solnica-Krezel, 2005). Los embriones pueden ser básicamente de dos tipos, en función de como se establece el destino de sus células, (a) mosaico: el destino celular está establecido por la localización de determinantes maternos, los cuales son diferencialmente heredados, (b) regulatorios: la interacción celular determina el destino celular. En general se considera que los amniotas (aves y mamíferos) son extremadamente regulatorios, mientras que la mayoria de los invertebrados, cordados inferiores y anamniotas son más mosaico. Además existen otras diferencias como el tamaño del huevo, el momento de inicio de la transcripción cigótica y la velocidad del desarrollo. Sin embargo, entre los vertebrados se ha descubierto que existe una gran conservación entre los mecanismos intercelulares de señalización, los que regulan el destino celular y la polaridad embrionaria antes de la gastrulación (Stern, 2006). Los embriones de vertebrados tempranos además del eje animal-vegetal, establecen un segundo eje que es usualmente referido como anterior-posterior (A-P) en los amniotas y dosal-ventral (D-V) en los anfibios y peces. Se ha visto que estos ejes están determinados tempranamente por gravedad en el pollo y por el punto de entrada del espermatozoide en la rana (Eyal-Giladi, 1997). La formación de este segundo eje establece la región del organizador en un lado de la blástula/blastodermo y por lo tanto impone una simetría bilateral en el embrión vertebrado (Spemann & Mangold, 1924). En todos los vertebrados los mecanismos genéticos y moleculares presentes en la inducción de las hojas embrionarias, involucran cascadas de factores de transcripción y vías de señalización altamente conservadas, que resultan en una distribución relativamente similar de las hojas embrionarias en los diferentes embriones de vertebrados durante la gastrulación (Solnica-Krezel, 2005). La
26 inducción de los precursores del endodermo y mesodermo, involucra la señalización mediante ligandos de Nodal de la superfamilia TGF-β (Transforming Growth Factor beta), aunque las vías moleculares que activan la expresión de los genes nodal inicialmente pueden ser distintas (Shier, 2004). El evento crucial de rompimiento de la simetría temprana, involucra el transporte asimétrico a lo largo de microtúbulos de determinantes dorsales tanto en rana como en pez cebra (Elinson & Rowning, 1988, Jesuthasan & Strahle, 1997). Este proceso culmina con el enriquecimiento y la localización nuclear de β-catenina, un efector transcripcional de la vía de señalización Wnt canónica, en la futura región dorsal de la blástula, la región señalizadora conocida como el centro de Nieuwkoop (Schneider et al., 1996). A su vez β-catenina activa vías genéticas que establecen al organizador en la región dorsal de la gástrula. Los genes blanco de β-catenina incluyen a los genes nodal o genes que promueven la expresión de nodal, generando un gradiente dorso-ventral de actividad de señalización de Nodal (Gritsman et al., 2000). Probablemente uno de los roles principales del organizador es limitar la actividad ventralizante y posteriorizante de BMP (Bone Morphogenetic Protein) y ligandos de Wnt canónico, durante la gastrulación. β-catenina promueve la producción de antagonistas secretados de Wnt y BMP, además de factores de transcripción como Bozozok en pez cebra. También promueve la expresión de factores de la familia FGF (Fibroblast Growth Factor), así como de sus reguladores negativos. La expresión de FGF en la región dorsal del embrión, contribuye al establecimiento del patrón dorso-ventral, restringiendo la expresión de los genes BMP (Furthauer et al., 2004). La plasticidad de los embriones tempranos de pez cebra y pollo, abre la interrogante de cómo se integra el blastodermo para formar un solo embrión. ¿Existen mecanismos similares que previenen la formación de organizadores ectópicos durante la gastrulación, así como de líneas primitivas ectópicas durante la polarización inicial del blastodermo? (Joubin & Stern, 2001). En particular en el pez cebra el vitelo parece ser una estructura extraembrionaria importante como recurso de señales tempranas que generan patrones, y es esencial para la induccción celular dorsal y marginal. Los
27 determinantes dorsales están localizados en el polo vegetal del embrión. La naturaleza molecular de dichos determinantes dorsales se desconoce, pero se sabe que su función está relacionada con la estabilización y translocación nuclear de β- catenina a la futura región dorsal y la activación de genes como bozozok, chordin, dickkopf1 (dkk1) y squint (sqt) (Schneider et al., 1996). Luego de la transcripción cigótica sqt y β-catenina se concentran en la zona dorsal del YSL. Este proceso establece el organizador de la blástula en el lado dorsal del embrión, el cual es comparable con el centro de Nieuwkoop de anfibios (Schneider et al., 1996). El cigoto de pollo está también dotado de una gran cantidad de vitelo y divide el citoplasma celular incompletamente formando células pequeñas al centro de la célula vitelina. Las divisiones posteriores generan un epitelio monolaminar grueso, el epiblasto. Este tejido va a dar origen al embrión y consiste en una zona central (zona pelúcida) rodeada por una zona periférica (área opaca). Por debajo de ésta capa superficial se ubica el endodermo primitivo, conocido como hipoblasto primario, mientras que el hipoblasto secundario (endoblasto) marca la futura región posterior del blastodermo (Kochav, et al., 1980). Si bien estos tejidos forman estructuras extraembrionarias, juegan un papel activo en el establecimiento de patrones en el embrión (Keller & Davidson, 2004). En el pollo existen tres tejidos extraembrionarios que parecen estar involucrados con la inducción de la línea primitiva: 1- El hipoblasto primario/endoblasto, el cual se forma debajo del epiblasto embrionario antes de la gastrulación e inhibe la formación de la línea primitiva, y es desplazado posteriormente por el endoblasto hacia la zona anterior, 2- La hoz de Koller parece contribuir con células a la formación de la línea primitiva (Izpisua-Belmonte et al., 1993; Bachvarova et al., 1998, Callebaut et al., 1998a; 1998b), 3- La zona marginal posterior (PMZ), el cual es un tejido que induce la formación de una línea primitiva ectópica, si es transplantado en un embrión temprano (Khaner et al., 1985), pero sin contribuir con células a la línea primitiva inducida. A su vez las vías Vg1/Nodal y Wnt8C/β-catenina nuclear están activas en la PMZ del pollo (Hume & Dodd, 1993). Parecería que la PMZ es la única que cumple todos los requisitos para ser el equivalente al centro de Nieuwkoop en pollo:
28 actúa antes de la gastrulación, e induce la formación de un organizador pero sin una contribución celular a las estructuras axiales (Joubin & Stern, 2001). En resumen, se propone que los tres tejidos (hipoblasto/endoblasto, hoz de Koller y PMZ) tienen una actividad inductora del eje, teniendo la habilidad de influir en la formación de la línea primitiva. Sin embargo, sus mecanismos de acción e importancia relativa difieren. La hoz de Koller tiene capacidad inductiva pero probablemente solo porque contiene células destinadas a formar el nodo de Hensen. La influencia más temprana viene dada por la PMZ, donde se solapa la actividad de Vg1 y wnt. La actividad de ambos genes induce la expresión de Nodal en el área del epiblasto vecina, pero Nodal es capaz de actuar (induciendo el mesendodermo) únicamente una vez que el hipoblasto (que expresa Cerberus) ha sido desplazado por el endoblasto (Stern, 2004). El hipoblasto es uno de los tejidos que se forma más tempranamente en el embrión de pollo y expresa Cerberus el cual inhibe a Nodal, expresado por el epiblasto. La línea primitiva solo se puede formar una vez que el hipoblasto fue desplazado por otro tejido extraembrionario, el endoblasto, que no expresa Cerberus. Por lo tanto este mecanismo controla tanto el momento, como la posición en la formación de la línea primitiva (Bertocchini & Stern, 2002). En amniotas, la línea primitiva es el sitio de formación de mesodermo y endodermo, donde la parte más anterior (incluído el nodo de Hensen) origina el mesodermo más dorsal/axial y el endodermo definitivo. Progresivamente las regiones más posteriores dan origen al mesodermo ventral/lateral, así como al extraembrionario (Psychoyos & Stern, 1996). La iniciación de la actividad de señalización de Nodal ocurre una vez que el hipoblasto fue desplazado lejos del sitio de formación de la línea primitiva, lo cual permite que comience el proceso de formación del mesodermo, pero al mismo tiempo se generan gradientes de la actividad de Nodal, los que van a contribuir eventualmente, a generar patrones en los descendientes de la línea primitiva. El eje antero-posterior de la línea va a corresponder con el eje axial-lateral del mesodermo (Bertocchini & Stern, 2002). Por lo tanto las vías que involucran la señalización por Vg1, Wnt, Nodal, FGF y BMP, son altamente conservadas en los vertebrados, independientemente de si los
29 embriones de éstos, son principalmente regulatorios o mosaico, en términos del mecanismo que establece las asimetrías de destino celular en el embrión temprano (Stern, 2006).
2.7.- El primordio de la cola: ¿una continuación de la gastrulación?
El desarrollo de la región posterior del embrión (región lumbosacra y cola) en los vertebrados está retrasada en el tiempo en relación a la gastrulación. En amniotas esta ocurre mediante el reemplazo del nodo en regresión y la línea primitiva por una masa celular de tipo blastema de mesénquima, conocida como el primordio u organizador de la cola (“tailbud”). Esta se ubica a continuación de las estructuras axiales (tubo neural, notocorda, intestino) y paraxiales (somitos), formadas en etapas tempranas de la gastrulación (Kispert et al., 1995). Por otro lado se describió que el primordio de la cola expresa bra en amniotas (Kispert et al., 1995). Se sugiere que el desarrollo de la cola en amniotas es en esencia una continuación de la gastrulación, al igual que en anfibios (Knezevic et al., 1998). En este período ha terminado tanto el ingreso masivo de células del epiblasto para formar tejido axial, así como la formación de nuevo endodermo. Además el nodo comienza a perder su capacidad de inducir tejido neural (Stern, 2004). En el pez cebra, al inicio de la gastrulación las células marginales convergen y se extienden de acuerdo a su posición a lo largo del eje dorso-ventral. Mientras que las células marginales dorsales involucionan y se extienden hacia el polo animal, las más ventrales (llamadas células de la zona de “no convergencia y no extensión”) se desplazan sobre el vitelo. Al final de la gastrulación, la agregación de las células marginales, establece el primordio de la cola, el cual contiene células derivadas del organizador dorsal y células marginales ventrales (Kanki & Ho, 1997). Por lo tanto, la formación de la región caudal del embrión de pez cebra, no resulta de la actividad de un organizador dorsal, sino que de la actividad de un organizador independiente, el organizador de la cola, localizado en el margen ventral de la blástula y el cual resulta de la triple estimulación de las vías de señalización BMP, Nodal y Wnt8 (Agathon, et al., 2003).
30 3.- Gastrulación en peces teleósteos
La observación directa de los embriones translúcidos de peces teleósteos ha aportado evidencia crucial sobre la forma en que las células se mueven durante la gastrulación. Todos los movimientos descritos a la fecha en los teleósteos tienen su contraparte en otros organismos vertebrados (Kimmel et al., 1989) (Figura 4). En particular, la gastrulación de los teleósteos parece ser cualitativamente muy similar a aquella de los anfibios, mientras que la gastrulación de los anfibios comparte mucho con la de los reptiles, aves y mamíferos (ver Fig. 4). Es posible entonces que exista más uniformidad evolutiva durante el desarrollo temprano de los vertebrados de lo que antes se creía (Trinkaus, 1990). A su vez los mapas de destino son suficientemente consistentes entre los distintos organismos vertebrados, como para pensar que ciertos mecanismos, que permiten el establecimiento de patrones corporales, se han conservado durante la evolución (Tam & Quinlan, 1996) (Figura 4). La importancia de comparar los mismos procesos del desarrollo en diversos organismos radica, entonces, en dilucidar los mecanismos conservados que permitan explicar la generación del plan corporal básico en estos organismos. Dentro de los vertebrados, los peces representan el grupo más grande y diverso. Su posición evolutiva relativa a otros vertebrados, así como su habilidad para adaptarse a una amplia variedad de ambientes, los transforma en un excelente modelo experimental (Powers, 1989). Los teleósteos son un grupo monofilético de peces óseos muy diverso, que pertenecen a la subclase Actinopterygii (Nelson, 1984). El pez cebra (Danio rerio) es un teleósteo que representa uno de los organismos de estudio de vertebrados más utilizado en biología del desarrollo. En este modelo ha sido posible realizar estudios de genómica funcional y mutagénesis, lo que ha permitido avanzar en el conocimiento de genes importantes durante el desarrollo. Otros peces teleósteos, como son Fundulus y Orizias latipes (Medaka), presentan un desarrollo embrionario similar al de pez cebra, en particular durante el proceso de gastrulación, donde se generan estructuras celulares equivalentes como son el anillo germinal y el escudo embrionario. A este modelo de gastrulación que
31 involucra a la mayoría de los teleósteos estudiados hasta el momento le llamaremos: “gastrulación tipo”.
3.1.- Gastrulación “tipo” en peces teleósteos
Si bien hablar de características típicas o atípicas dentro de los teleósteos probablemente no sea conceptualmente muy correcto, considerando que éste es el grupo de peces más diverso y especiado de los existentes y que sólo una decena de especies han sido investigadas a nivel de biología del desarrollo, para los efectos de este trabajo y con el fin de facilitar la discusión de los objetivos que se abordarán, haremos esta distinción. Dentro del grupo de especies con gastrulación “tipo” se encuentra el pez cebra (Warga & Kimmel, 1990), Medaka (Iwamatsu, T., 1994), Fundulus heteroclitus (Armstrong & Child, 1965), Barbus conchonius (Gevers & Timmermans, 1991) y salmónidos (Ballard,1973a). El elemento común entre estas especies es que la gastrulación es un fenómeno concomitante a la epibolia, y que acontece a partir de un grupo de células localizadas en el polo animal del huevo telolecito (blástula) (Figura 5). Debido a que Fundulus y pez cebra han sido los organismos más estudiados dentro de este grupo a nivel de la gastrulación, nos referiremos a ellos como representantes del modelo de gastrulación “tipo”, y entregaremos información relevante a otras especies cuando sea necesario. En anfibios y peces la gastrulación es precedida y acompañada por la epibolia (Solnica-Krezel & Driever, 1994). Previo al inicio de la epibolia en el pez cebra ocurre la transición de la blástula media (entre los ciclos 10 y 13 de división celular) donde las células pierden la sincronía y comienza la expresión del genoma embrionario (Kane & Kimmel, 1993). Es durante este período donde el blastodermo se separa en tres dominios. Las células del margen del blastodermo colapsan y liberan sus núcleos hacia el vitelo subyacente, constituyéndose la capa vitelina sincicial (yolk syncytial layer o YSL), la cual será en parte responsable del movimiento del blastodermo hacia el polo vegetal (epibolia). Las células más externas del blastodermo se vuelven epiteliales y forman la capa celular envolvente (enveloping layer o EVL): tejido extraembrionario que cubrirá al blastodermo. Las células
32 restantes entre ambas capas se denominan blastómeras profundas (BP) y son las que experimentarán los movimientos celulares de la gastrulación y formarán finalmente al embrión (Kane & Warga, 1994).
33
A. D. rerio
blástula 50% epib. escudo emb. 75% epib. 100% epib. (domo) anillo emb. “tailbud”
e
B. Austrolebias
blástula 60% epibolia 100% epib. reagregación eje emb.
BP
EVL BP A YSL BP EE
Figura 5.- Esquema que compara algunos estadíos del desarrollo embrionario de D.rerio
(A) y Austrolebias (B). Nótese la similitud entre los estadíos más tempranos, blástula. Cabe destacar la ausencia de estructuras equivalentes al anillo y escudo embrionario en Austrolebias (60% de epibolia). Líneas de colores entre A. y B. representan: rojo: período de blástula, azul: proceso de epibolia, verde: morfogénesis. Nótese la separación de los procesos de epibolia y morfogénesis en Austrolebias, los cuales están solapados en D. rerio a partir del estadío de escudo embrionario. A. Arriba: vista lateral, e. escudo embrionario, B. flecha. indica dirección de movimiento, PB. blastómera periférica, BP. blastómera profunda, Sc. cavidad de segmentación, YSL. capa vitelina sincicial, EVL. capa envolvente, Sl. capa sincicial, A. agregado celular, EE. eje embrionario. A. Modificado de Kimmel et al., 1995, B. Modificado de Arezo et al., 2005.
34 Al comienzo de la gastrulación, las blastómeras profundas que contribuirán al endomesodermo se mueven hacia las capas inferiores por todo el margen del blastodermo (blastoporo) formando el anillo germinal, mientras que las que permanecen en la superficie formarán el ectodermo (Warga y Kimmel, 1990; Kane & Adams, 2002). El anillo germinal está constituído por dos capas de blastómeras: una superficial (epiblasto) y una profunda (hipoblasto). Cabe señalar que aunque esta terminología es la misma usada en el desarrollo del embrión de pollo, dichas estructuras no tienen homología con la de los peces (Eyal-Giladi, 1997; Collazo et al., 1994). En estos grupos el hipoblasto se forma por diferentes procesos morfogenéticos, y en el caso del pollo sus células no contribuyen a la formación de tejidos embrionarios. Se ha sugerido que la formación del hipoblasto, y por lo tanto del anillo germinal, ocurre por involución (Warga y Kimmel, 1990), ingreso (Carmany- Rampey & Shier, 2001) o delaminación (Montero, et al., 2004) en pez cebra, ingreso en Fundulus (Trinkaus, 1996) y delaminación en salmón (Ballard, 1966). En Fundulus se ha visto que, previo a la migración de las células endomesodérmicas, existe una constricción de la región apical de éstas (Trinkaus, 1984,1996) pero no se conoce el mecanismo subyacente. Además se sabe muy poco de los cambios que ocurren en las asociaciones célula-célula durante este proceso en teleósteos, tanto las que ocurren en el epiblasto, como cuando las células migran formando parte del hipoblasto. Tampoco están claras las interacciones que ocurren entre las células del epiblasto y las del hipoblasto. Las células del blastodermo superficial parecen ingresar autónomamente y probablemente necesiten estar especificadas como células mesendodérmicas a fin de ser competentes para ingresar (Carmany-Rampey & Shier, 2001). Si bien los cambios de forma celular parecen preceder siempre al proceso de ingreso, estos no parecen dirigirlo; más bien los cambios en las afinidades adhesivas parecen ser los responsables de la de-epitelialización e ingreso desde la superficie epitelial. La expresión de cadherinas e integrinas permitiendo la interacción tanto entre células como con la matriz extracelular en posiciones más profundas, podrían ser importantes para el movimiento de las células desde la capa epitelial, y son claramente importantes para la migración que ocurre alejándose del punto de ingreso hacia el polo animal del embrión, así como la correcta asociación
35 con los tejidos profundos (Shook & Keller, 2003; Babb et al., 2001; Babb and Marrs, 2004; Kane et al., 2004; Montero et al., 2005). Luego de la formación del anillo germinal las blastómeras profundas convergen dorsalmente para formar el escudo embrionario (Fig. 5A). Esta estructura representa el equivalente al labio dorsal del blastoporo en anfibios, donde se encuentra un centro de señalización llamado organizador de Spemann (Spemann & Mangold, 1924). El organizador está ubicado en el mesodermo dorsal e induce la especificación y regionalización del eje embrionario dorsal del embrión, tanto en peces como en anfibios (Harland & Gerhart, 1997; Schier &Talbot, 1998) La región dorsal de la gástrula, posteriormente se angosta por medio de intercalación medio-lateral (convergencia) y se extiende a lo largo del eje antero- posterior (extensión) por migración activa de sus células. Luego de este proceso y a medida que la epibolia avanza, comienza la formación del eje embrionario y la neurulación (Collazo et al., 1994; Keller, 2003). En el pez cebra cuando la epibolia culmina se puede distinguir un primordio de cola prominente y es posible diferenciar la notocorda de la placa neural (Kimmel et al., 1995) (Fig. 5A).
3.2.- Gastrulación “atípica": peces anuales, Austrolebias
Las características fundamentales de la gastrulación “atípica” de peces teleósteos son dos. Primero, los procesos de epibolia y gastrulación están separados tanto en el tiempo como en el espacio. Segundo, la gastrulación no acontece a partir de un grupo de células congregadas en el hemisferio animal del huevo telolecito (blástula), sino más bien, a partir de un grupo disperso de células que cubren la totalidad del huevo y se agregan en un punto del embrión. Este tipo de gastrulación acontece en los denominados peces anuales (Figura 5B). El proceso de epibolia implica, al igual que en otros teleósteos, la migración hacia el polo vegetal de las tres capas que se han generado: EVL, blastómeras profundas y YSL. Pero en Austrolebias a diferencia de lo que ocurre en los teleósteos “tipo” la epibolia no se da concomitantemente con la gastrulación (Figura 6). Por lo tanto, mientras la epibolia ocurre y hasta que culmina, no se forma ninguna
36 estructura embrionaria como el anillo germinal o el escudo embrionario (característicos de los teleósteos con gastrulación tipo). Durante la epibolia y probablemente debido al limitado número de células (aproximadamente 200 células al inicio) las blastómeras profundas se dispersan sobre el vitelo. Cuando este proceso culmina (100% de epilobia, 44 - 48hpf) (ver Tabla 1) el embrión se encuentra en la fase de dispersión y toda la masa de vitelo esta cubierta por dos capas concéntricas, la EVL y el YSL. En el espacio entre estas dos capas, las blastómeras profundas están distribuidas aisladamente en toda la superficie del huevo, formando una capa celular discontinua. No existe en este estadío ninguna estructura multicelular organizada, ni células que recuerden a las células precursoras (forerunner cells) de otros embriones. Las células profundas tienen aspecto ameboideo y son activamente móviles. La gran gota lipídica que poseen estos embriones en su vitelo (formada por coalescencia de otras de menor tamaño) inicialmente se desplaza por el vitelo en función de la gravedad, pero en el estadío de dispersión adquiere una posición periférica (Wourms, 1972a; Carter & Wourms, 1991). En el estadío de dispersión los peces anuales pueden entrar en la primera diapausa, que como ya se mencionó, para el caso de Austrolebias, es facultativa (Wourms, 1964). Posteriormente comienza el período de reagregación (definido por Wourms, 1972a) al inicio del cual lo primero que se observa es la protrusión de la gota lipídica desde el vitelo, casi hasta la mitad de su volumen y por lo tanto se fija en una posición determinada del embrión (Wourms, 1972a). Luego de esto se observa un incremento paulatino en el número de células en un único punto del embrión (esto ocurriría en el hemisferio vegetal del embrión, en relación a la gota lipídica que siempre se dispone hacia arriba, Wourms, 1972a). Esta acumulación de células ameboideas ocurre por migración de éstas hacia la zona de reagregación, las que aumentan los contactos entre ellas formando un reagregado definido consistente en una monocapa de células (Reagregación1). A medida que el desarrollo transcurre, el área de reagregación aumenta de tamaño, por incremento en el número de células, las que se disponen muy próximas entre sí en el centro del reagregado celular,
37 dificultando la distinción de los límites celulares (Reagregación 2). En éste estadío el reagregado celular consiste en una monocapa de células en la periferia, presentando multicapas en el centro (Wourms, 1972a, 1972b). Posteriormente el reagregado celular adquiere una forma de disco lenticular, siendo mucho más grueso en el centro que en la periferia y aumentando bastante su área a medida que disminuye el tamaño de las células que lo componen (Reagregación 3). El siguiente estadío se caracteriza por un aumento importante en el área y masa del reagregado celular, donde los límites celulares son indistinguibles (Reagregado celular 4). El último estadío de reagregación descrito, involucra un aumento en el tamaño del reagregado celular a la vez que una distorsión en la forma, pasando de discoidal a elipsoidal (mirando el reagregado celular desde arriba) (Reagregación 5) (Wourms, 1972a, 1972b). El eje mayor del reagregado celular 5 coincide con la dirección de formación del eje embrionario. Cabe destacar que entre cada uno de estos estadíos de reagregación transcurren aproximadamente 24 horas y que desde la fecundación hasta que el embrión llega a un estadío de reagregación 5, han pasado entre 9 y 12 días (ver Tabla 1) (Arezo et al., 2005). Alrededor de 30 minutos después que se forma el reagregado celular final, se puede observar la formación del eje embrionario. Lo primero que se identifica de esta organización axial, es el alineamiento de las células superficiales del reagregado celular, el que coincidirá posteriormente con el lugar en el que se formará la quilla neural. Esta es la primera estructura embrionaria típica que se observa en este organismo. Dicha estructura se extiende a lo largo del reagregado celular y en uno de sus extremos se puede observar un cuerpo esférico conspicuo, probablemente el equivalente a la vesícula de Kupffer. Posteriormente comienza a observarse la formación de los somitos y el embrión adquiere características similares a otros teleósteos (Wourms, 1972a). En esta descripción del desarrollo de Austrolebias se utilizó la palabra “reagregado” (Wourms, 1972a) para nombrar al agregado celular. A continuación se utilizará la denominación agregado celular para referirse a dicha estructura (ver Resultados).
38 Tabla 1 Comparación de tiempos post-fecundación entre peces anuales y no anuales.
Estadío Peces anuales Peces no anuales A. whitei, A. viarius A. myersi N.korthausae nigripinnis, D. rerio F.heteroclitus (25ºC) (25ºC) (25ºC) constanciae (28ºC) (20ºC) (28ºC)
Clivaje 1 día 7 hs 15 hs 9 hs 2 hs 10 hs
Formación 3 días 20 hs 24 hs 20-22 hs 5 hs 24 hs blástula
Epibolia 7 días 44-48 hs 51 hs 44-48 hs 11 hs 40 hs
Agregación 12 días 9 días 3 días 9 días
Eje 13 días 9.5 días 4 días 9.5 días 37 hs embrionario
Somitogénesis 16 días 11 días 6 días 11 días 14 hs 56 hs (0-10 pares)
Peces anuales: A. viarius, A. myersi (Wourms, 1972a), N. korthausae (Van Haarlem, 1983), A. whitei, A. nigripinnis, A. constanciae (Carter & Wourms, 1991). Peces no anuales: D. rerio (Kimmel et al. 1995); F. heteroclitus (Armstrong & Child, 1965). Los tiempos representan horas y días postfecundación. Modificado de Arezo et al., 2005.
39 3.3.- Semejanzas y diferencias entre Austrolebias y otros organismos vertebrados
Si bien los peces teleósteos presentan un huevo con gran cantidad de vitelo y por lo tanto clivaje parcial o meroblástico, donde se genera finalmente (en varios de ellos) una blástula desplazada hacia el polo animal, los mecanismos por los cuales estos organismos generan un eje embrionario al culminar la gastrulación, difieren al menos en su aspecto. En los teleósteos “tipo” el modo de movimiento de las células endomesodérmicas para formar inicialmente un embrión bilaminar es controversial, pero en cualquier caso éste ocurre a través de todo el borde del blastodermo (homólogo al blastoporo de Xenopus). En Austrolebias no existe ninguna estructura que recuerde este “blastoporo” de los peces con gastrulación tipo y la primera estructura donde se puede reconocer más de una capa de células durante su desarrollo, corresponde al agregado celular. Como ya se mencionó la formación del eje embrionario ocurre a partir de este grupo de células, las que se agregan luego de haberse dispersado durante el proceso de epibolia. La morfología discoidal de este agregado celular recuerda más a la del blastodisco de un embrión de pollo que al blastodermo de los teleósteos con gastrulación “tipo”. Estas similitudes plantean la interrogante de sí, debido a la influencia de esta geometría tan particular, las especies de Austrolebias estarán utilizando movimientos similares a los descritos en pollo a la hora de originar las hojas embrionarias y finalmente el plan corporal básico del embrión. A la fecha, sin embargo, no hay ningún estudio que haya abordado esta posibilidad, y por lo tanto se desconoce si en Austrolebias se desarrollan estructuras similares al nodo de Hensen y surco primitivo. Por otro lado, se desconoce si los mecanismos celulares que participan en la formación de las hojas embrionarias en Austrolebias, son del tipo ingreso, delaminación y/o involución. En todas las especies de vertebrados estudiadas hasta la fecha se han identificado estructuras análogas al organizador de Spemann. Este centro expresa genes específicos como es el caso de goosecoid y chordin. El gen gsc, en particular, es muy conservado en la evolución (se ha visto la presencia de un homólogo de este gen en diversas especies de vertebrados [Blum et al., 1992]), y su análisis de
40 expresión es sumamente útil para estudios comparados (De Robertis et al., 1992). En los vertebrados, la formación de la línea media ocurre por una elongación secuencial bajo la fuerza directriz del organizador y ésta siempre aparece del mismo lado que el organizador (Meinhardt, 2004). En Austrolebias, tal como se mencionó previamente, la morfogénesis se produce a partir de un agregado celular inicialmente de pocas células, el que aumenta en número y complejidad a medida que transcurre el tiempo y donde finalmente se forma el eje embrionario. Teniendo en consideración los estudios previos que muestran la existencia, en todos los vertebrados de una región organizadora que coincide finalmente con la región donde se formará el eje embrionario, es posible que el agregado celular temprano de Austrolebias corresponda al homólogo del organizador de Spemann de Xenopus. El estudio de la expresión de marcadores específicos de organizador, como es el caso de gsc, en los estadíos de agregación en Austrolebias, será de gran utilidad para verificar esta idea. Por todo lo anterior, el modelo Austrolebias, con su desarrollo “atípico” puede ser utilizado para responder preguntas básicas sobre la conservación de los mecanismos celulares morfogenéticos que operan durante la gastrulación de un organismo donde la epibolia parece estar desacoplada de éste proceso. Burggren y Warburton plantean que: “numerosos descubrimientos han resultado de la focalización y persistente investigación en ciertos organismos, como son la mosca de la fruta (Drosophila), el pez cebra (Danio rerio), el pollo (Gallus gallus), el gusano nemátodo (Caenorhabditis elegans), el ratón (Mus musculus) o plantas como Arabidopsis. En muchos casos, sin embargo, los organismos modelo han emergido simplemente por las ventajas metodológicas que ofrecen, y porque fueron las primeras especies en ser investigadas en un contexto en particular. El estudio de nuevos organismos animales, por lo tanto, es fundamental para lograr un entendimiento profundo de los procesos del desarrolo, ya que permite entender cuánto de los hallazgos realizados en los organismos clásicos son generalizables y cuántos correspondedn a caracteres derivados propios de cada linaje” (Burggren & Warburton, 2005).
41 Hipótesis de trabajo
En Austrolebias el agregado celular corresponde a la gástrula y el patrón de gastrulación sería similar al observado en otros embriones discoidales (como el de pollo).
Objetivo general
Estudiar el patrón morfogenético y la expresión de genes durante la gastrulación en peces anuales del género Austrolebias, así como describir los mecanismos celulares morfogenéticos involucrados en la formación del endomesodermo.
Objetivos específicos
1- Caracterizar el proceso de agregación celular en Austrolebias.
2- Determinar los cambios morfológicos y de dominios de expresión de genes marcadores del blastoporo y organizador, durante la agregación celular.
3-. Estudiar el destino de las células que forman el agregado celular.
4- Explorar los movimientos celulares morfogenéticos involucrados en el proceso de internalización del endomesodermo.
42 Metodología
1.- Mantenimiento y reproducción de los adultos, cultivo y manejo de embriones
El presente estudio se realizó en dos especies del género Austrolebias: A. bellottii (Steindachner, 1881) y C. charrua (Costa et al., 2001), las cuales fueron seleccionadas en función de la resistencia de los individuos adultos al cautiverio, su amplia distribución geográfica y sus relaciones filogenéticas bien establecidas. Se establecieron las condiciones ideales para el mantenimiento y reproducción. como son el tipo y fórmula del agua a utilizar. El agua para los acuarios se preparó según la siguiente formula: a 110 litros de agua obtenida por osmosis reversa se agregaron 385g de Microsalt (Brustmann), 385g de Mineral Salt (Sera) y 11 gotas de hierro líquido Ferrogan Sluid (Hobby), a partir de una dilución stock en agua destilada: 1:4v/v. Esto genera agua con una conductividad de aproximadamente 150µS y el pH se ajustó a 7, con bicarbonato de sodio. El ciclo de luz/oscuridad fué de 12h/12h, la temperatura se mantuvo en 20˚C ± 2. Se utilizó filtración biológica en los acuarios, mediante filtros de esponja y se adicionó una gran concentración de plantas (lo cual genera lugares de refugio para los peces y disminuye el estrés). Todos los peces, tanto alevines como adultos, recibieron alimento vivo (nauplios de Artemia salina y lombrices). A su vez se establecieron las dimensiones óptimas de los acuarios según la edad de los peces y los objetivos de uso (eclosión, mantenimiento y cruzamiento). Los cruzamientos se realizaron con peces agrupados en tríos (2 hembras y un macho) o cuartetos (3 hembras por cada macho). Debido a que estas especies presentan fecundación externa y además necesitan enterrarse para poner sus huevos, es imprescindible suministrarles un sustrato. Por lo tanto, y a fin de obtener embriones en cada acuario de cruzamiento, se les colocó un recipiente conteniendo un sustrato vegetal (turba) durante un período variable, dependiendo del objetivo para el cual se colectarán los embriones. Previo a su uso los embriones extraidos de la turba se limpiaron mediante rotación
43 con un pincel sobre un papel absorbente húmedo. Cuando fue necesario obtener individuos adultos, la eclosión de los embriones se logró mediante el semi-secado del sustrato (conteniendo los huevos) y almacenado en una bolsa plástica en oscuridad, por un tiempo mínimo de 3 meses. Luego de este período el sustrato fué colocado en un acuario de eclosión con agua y se obtuvo una nueva generación de alevines. El cultivo de embriones se realizó en una solución isotónica ERM (Embryo
Rearing Medium: NaCl 17.1 mM, KCl 402 μM, CaCl2 2(H2O) 272 μM, MgSO4 7(H2O) 661 μM pH 6.3) a 25˚C. En estas condiciones no se han registrado eventos de diapausa I. Con la finalidad de obtener embriones más translúcidos y así poder observarlos con diversas técnicas de microscopía, los embriones fueron “pelados” previo a la observación, lo cual implica la remoción de las proyecciones filamentosas que contiene el corion, cortándolas mediante el uso de un bisturí. La inyección de los embriones se realizó mediante el uso de agujas preparadas a partir de capilares de borosilicato con filamento interno (OD: 1mm, ID: 0.58mm, largo: 10cm, Harvard Apparatus Ltd.). Estos capilares fueron estirados mediante el uso de un puller (David Kopf Instruments, Model 740) utilizando los siguientes parámetros: Solenoid 0, Solenoid delay 0 , Heat 1 14.9 y dist. 5.10. Este método genera agujas de punta fina y relativamente cortas, a fin de atravesar fácilmente el corion de Austrolebias.
2.- Análisis morfológico del proceso de agregación celular
2.1. Microscopía de campo claro Con el fin de determinar y definir los estadíos a través de los cuales ocurre el proceso de agregación, se realizaron observaciones con microscopía DIC y se tomaron imágenes de los estadíos más representativos de este proceso. La adquisición de los datos se realizó mediante el uso del programa Openlab (Improvisión, Ltd.) en un computador Macintosh conectado a un microscopio motorizado Nikon Eclipse E1000 y a una cámara CCD enfriada Hamamatsu Orca.
44 Los embriones fueron montados dentro de una cámara construida artesanalmente. Dicha cámara consiste en 8 trozos de huincha aisladora pegadas unas sobre otras a un portaobjetos. Posteriormente se recortó una ventana rectangular en el centro de estas, dejando por tanto un espacio central libre. Este espacio (cámara) se llenó del medio de cultivo de los embriones, donde se colocó al embrión en estudio cubierto con un cubreobjetos, de tal modo que mediante la rotación del cubreobjetos se permitiera la orientación, en la posición correcta, del embrión. En todos los estudios microscópicos se utilizaron estas cámaras y en particular con microscopía confocal, debido a que el microscopio utilizado es invertido, el cubreobjetos se fijó con grasa siliconada, la cual fija el vidrio a la cámara pero permitiendo cierto movimiento, a fin de poder orientar al embrión. A su vez se realizaron observaciones y toma de imágenes en tiempo extendido (“time lapse”) de embriones desde el estadío AII hasta AIV, utilizando la óptica de campo claro de un microscopio confocal Spinning Disk Zeiss Axiovert 200, utilizando objetivos de 10x y 25x.
2.2. Microscopía Confocal En el estadío de una célula se co-inyectaron embriones con ARNm codificante de las proteínas de fusión Gap43-GFP (con destinación a membrana, GFPm) y H2B- RFP (con destinación nuclear, RFPn). Se realizaron observaciones y se registraron imágenes en un Microscopio Confocal Espectral Olympus Fluoview FV1000 y en un Microscopio de disco giratorio Zeiss Axiovert 200. Se utilizaron láseres de 488nm y 543nm del microscopio Olympus, así como láseres de 488nm y 568nm del microscopio Zeiss. Se utilizaron objetivos de inmersión en agua 10x, 20x, 25x y 40x. Los cortes ópticos en el eje z para 10x fueron de 1μm - 5μm y para los objetivos 20x y 25x fueron de 0,5μm -1,5μm. Por lo tanto, se obtuvieron aproximadamente 15 imágenes para cada tiempo con 10x y unas 30 imágenes en promedio con 25x. La frecuencia con que fueron tomadas las imágenes dependió del experimento. Con el microscopio Olympus se tomaron imágenes cada 30-40min (AII y AIII), cada 4-6hs (a partir de AIII tardío a eje tardío) con un objetivo 20x en agua. Se registraron imágenes de distintos embriones a fin de cubrir un período total de desarrollo de
45 aproximadamente 7 días. Es decir, desde el estadío AII hasta el de eje tardío. Posteriormente con el microscópio de disco giratorio Zeiss se tomaron imágenes cada 2-5 minutos durante 4 a 48hs, en embriones de estadíos de RI a AIII tardío. En todos los casos las imágenes fueron primero deconvolucionadas utilizando el programa Huygens Professional (SVI, Hilversum, NL) y posteriormente el análisis morfológico se realizó mediante el uso del programa Volocity (Improvision, Ltd.). Este último programa tiene diferentes herramientas las que permiten el análisis de la disposición de las células vistas mediante cortes ortogonales en el embrión, así como realizar modelos 3D de cada grupo de imágenes en cada tiempo. Las animaciones se realizaron a partir de las imágenes correspondientes a un valor específico en z, para cada tiempo (elegido para ambos canales). Estas imágenes fueron procesadas y compiladas utilizando el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).
2.3. Cortes histológicos Se realizaron cortes transversales semifinos seriados de embriones en los estadíos de: AIII (n=2), AIV (n=2), RV (n=2), eje temprano (n=1), eje medio (n=1), eje tardío (n=1) y 2 somitos (n=1). Los embriones fueron procesados según un protocolo de rutina (ver apéndice). Luego de la inclusión de las muestras en bloques de Epon 810, cada uno de éstos bloques fue orientado y tallado. Mediante el uso de un ultramicrótomo Sorvall Modelo MT5000 y con cuchilla de vidrio, se realizaron los cortes semifinos seriados transversales de 0,7-0,9μm de espesor. Dado que los embriones miden aproximadamente 600μm de diámetro, se obtuvieron en promedio unos 600 cortes por embrión. Los cortes fueron colocados sobre porta-objetos (aproximadamente 10 cortes por cada uno), teñidos con azul de toluidina y montados con Entellan. Posteriormente se tomaron imágenes alineadas de un corte por cada preparado. La alineación final de los cortes se realizó con el programa Amira.
46 3.- Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación
3.1.- Clonamiento de genes de interés Se realizó la extracción de ARN total, de diferentes grupos de embriones tempranos y tardíos, seleccionados en 12 estadíos diferentes. Se utilizaron en promedio 12 embriones por estadío, tanto para A. bellottii como para A. charrua. Con este fin se utilizó el método de extracción de Trizol, de acuerdo a protocolos del fabricante. Los embriones fueron lisados y se sometieron a extracción con cloroformo. Se recuperó la fase acuosa y el ARN se precipitó con isopropanol y se centrifugó. El precipitado de ARN obtenido se lavó con etanol y luego se resuspendió en 20µl de agua libre de ARNasa. El ARN extraído fue tratado con ADNasa y su concentración se determinó corriendo una alícuota en un gel de agarosa (entre 50ng/µl y 350ng/µl). La transcripción reversa se realizó usando el kit “First Strand cDNA Syntesis” (Super Script Kit, Fermentas) según protocolo del fabricante. Se transcribieron aproximadamente 2µg de ARN en cada caso y se utilizó la enzima Super Script III RT (200u/µl). La transcripción se realizó a 50ºC durante 50 min. y se terminó a 85ºC por 5 min. y en hielo por 2 min. Para eliminar el posible ARN remanente se agregó 1µl de ARNasa H a cada tubo. Con el fin clonar los fragmentos génicos de interés se diseñaron oligonucleótidos degenerados, mediante la comparación de la secuencias conocidas de los genes de interés en otros organismos. El alineamiento de dichas secuencias se realizó mediante el uso del programa ClustalW. El diseño de los oligonucleótidos fue manual, pero se utilizó el programa Oligo 6.8 para comprobar la calidad de éstos. Mediante la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) se amplificaron y luego se clonaron en el vector TOPO TA (Invitrogen, California, EE.UU.) fragmentos de las secuencias codificantes de 12 fragmentos génicos de A. charrua y de A. bellottii. En esta tesis centraremos el estudio en los genes goosecoid (gsc) y brachyury (bra) para el caso del análisis del patrón de expresión espacial y además α-tubulina (α-tub), como control positivo, en experimentos donde se analizó la
47 expresión temporal de gsc y bra. Los oligonucleotidos degenerados diseñados para clonar gsc y bra fueron: gsc: F1-TGCCIRCYGGIATGTTYWSIATHGA R1- CAYTTIGCICKICKRTTYTTRAACCA bra: F1- TTCAARGAGCTIACCAAYGAGATGAT R1- TTGGCGAARGGGTTGTGYTTDATYTT Donde I representa inosina, R (A/G), W (A/T), S (G/C), Y(C/T), K (G/T) y H (A/C/T). Para el caso de α-tub se utilizaron los oligonucleótidos diseñados previamente para para el mismo gen de pez cebra. Estos son: α-tub F1- GGCACCGGTTCTGGCTTCAC R1- CGGAGATCACTGGGGCATAGGTA Las condiciones utilizadas en el PCR para el clonamiento de gsc fueron: 94˚ 1min 94˚ 1min 51˚ 2min 5X 72˚ 4min 94˚ 1min 56˚ 2min 35X 72˚ 4min Para el caso de bra estas fueron: 94˚ 1min 94˚ 1min 53˚ 2min 5X 72˚ 4min 94˚ 1min 58,8˚ 2min 35X 72˚ 4min
48 En todos los casos se utilizaron 0,5µl de la enzima Taq polimerasa de Qiagen en un volumen total de 20µl por tubo. Los fragmentos génicos amplificados fueron separados en un gel de agarosa al 1,5% desde el cuál se cortó la banda en cada caso y se purificó usando un kit para la extracción por elusión del ADN desde un gel (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen). Los fragmentos purificados fueron clonados en el plasmidio TOPO TA (Invitrogen) según indicaciones del fabricante. Usando bacterias electrocompetentes se electroporó el plasmidio ligado con el inserto y se cultivaron las células en placas de agar con ampicilina 0,5mg/ml y X-gal/IPTG, para distinguir colonias que contienen plasmidios recombinantes. Las colonias seleccionadas (18 colonias para cada gen) conteniendo el inserto (blancas) se cultivaron en medio líquido LB con ampicilina (50mg/ml), toda la noche a 37˚C. A partir de dichos cultivos se realizó la preparación de plasmidios (“Minipreps”). Para esto se utilizó el Fast Plasmid Mini kit (Eppendorf) y se siguieron las indicaciones del fabricante. Con el fin de seleccionar clones para secuenciar se realizaron para cada muestra dos digestiones, una con EcoRI y otra con HinfI durante 1h 30min. a 37˚C. La comparación de las secuencias obtenidas se realizó mediante el uso de BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), por medio del cual se confirmó el clonamiento de dichos genes, dada su alta identidad en comparación con secuencias de medaka, pez cebra y pollo. Para el alineamiento de secuencias se utilizó ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, http://align.genome.jp/). Para la traducción de las secuencias en los seis marcos de lectura se utilizó BCM Search Laucher (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq- util/Options/sixframe.html) y para la búsqueda de dominios proteicos se utilizó Prosite (http://www.expasy.ch/prosite/). Los árboles filogenéticos radiales (unrooted trees) se construyeron a partir de los resultados obtenidos con ClustalW. Para el caso de gsc se utilizó como gen externo la secuencia aminoacídica de Hox2.2 de D. rerio cuyo número de acceso del Genbank es CAA35171. Para la construcción del árbol de bra, se utilizó como gen externo tbx24 de D. rerio, el cual contiene un dominio de caja-T (T-box) y cuyo número de acceso en el Genbank es BAB97298.
49
3.2.- Preparación de sondas Con el fin de generar sondas antisentido, para el análisis mediante hibridación in situ del patrón de expresión de los genes en estudio, los plamidios que resultaron tener el fragmento génico de interés fueron amplificados y purificados mediante la realización de Maxipreps (Plasmid Maxi Kit, Qiagen). Para esto se utilizaron células quimiocompetentes (40µl) + 4µl de cada plasmidio diluído 1:100v/v. La mezcla se colocó 30min. en hielo, 30seg. a 42˚C, luego 2min. en hielo y se le agregó 250ml de medio LB incubándose por 1h a 37˚C con agitación. Posteriormente se cultivaron 100µl de cada cultivo en placas de agar conteniendo Xgal/IPTG toda la noche a 37˚C. Se seleccionó una colonia de cada cultivo, la que fue a su vez cultivada en 250ml de medio LB + 500µl de ampicilina (50mg/ml) toda la noche a 37˚C con agitación. Luego se purificó el ADN plasmidial y se cuantificó en espectrofotómetro por su absorbancia a 260nm. En todos los casos se linearizaron los plasmidios con la enzima de restricción EcoRI y dependiendo de la orientación del inserto se usó la ARN polimerasa (T7 o SP6) adecuada para sintetizar la sonda (ver Tabla 2). Se digirieron entre 12µg y 18µg de plasmidio en cada caso. Los plasmidios linealizados se purificaron usando el kit Quiaquick Gel Extraction (Quiagen) según indicaciones del fabricante. Por lo tanto para la purificación se corrieron 1,5 - 2,25µg de los plasmidios linealizados y se cortó la banda en cada caso desde un gel de agarosa no desnaturante al 1,5%. Para la transcripción de las sondas se siguieron las instrucciones de manufactura de las ARN polimerasas respectivas. Se colocaron en un tubo libre de ARNasas: 5µl de cada ADN lineal, 2µl 100mM DTT, 1,3µl mezcla de NTPs 2,5mM, 0,7µl Dig-UTP 10mM, 0,5µl RNasin, 2µl tampón de transcripción 10X, 7,5µl de agua libre de ARNasas y 1µl de la RNA polimerasa correspondiente (T7 o SP6). Esta mezcla se incubó durante 2h a 37˚C, luego se agregó 1µl de ADNasa I y se incubó 15min. a 37˚C. Posteriormente se purificó la sonda mediante el uso de Rneasy Mini Kit (Quiagen) según indicaciones del fabricante. Las sondas fueron eluídas en 50µl de agua libre de ARNasas. Para evaluar la calidad de las sondas sintetizadas, se corrieron 2µl de cada muestra en un gel de agarosa al 1% durante 10 min., luego de
50 lo cuál se le agregó a cada sonda 150µl de tampón de hibridación para su almacenaje a -20oC. Se realizó la transcripción de las ribosondas sentido, marcadas con digoxigenina, (control negativo) y antisentido tanto para gsc como para bra. Para el caso de bra además se sintetizó la ribosonda antisentido marcada con fluoresceína .
Tabla 2 ARNs polimerasas utilizadas en la transcripción de las sondas de gsc y bra. Nombre sonda ARN polimerasa Hebra sentido Hebra antisentido gsc32 (C.charrua) T7 SP6 gsc41 (C.bellottii) T7 SP6 bra32 (C.charrua) SP6 T7 bra44 (C.bellottii) SP6 T7
3.3.- PCR en Tiempo Real Se determinó la expresión del mRNA de gsc, bra y α-tub (como gen constitutivo, control positivo) por medio de la técnica PCR en Tiempo Real. La detección por fluorescencia mide la cantidad de ADN sintetizado en cada momento de la reacción. La emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN amplificado. Como sistema de detección de fluorescencia se utilizó un agente intercalante de ADN de doble hebra, denominado SYBR Green I Platinum SYBER Green qPCR SuperMix UDG (SYBR Green I, 60 U/ml Platinum Taq
DNA polymerase, 40 mM Tris-HCl pH 4.8, 100 mM KCl, 6 mM MgCl2, 400 μM dGTP, 400 μM dATP, 400 μM dCTP, 400 μM dUTP, 40 U/ml UDG) de Invitrogen. Se diseñaron oligonuecleótidos específicos para cada gen, los cuales amplifican productos no mayores a 150pb (requisito impuesto por la técnica). Dichos oligonucleótidos fueron: gsc esp. F1 TTCTGATCTCGCCGGTCCCGC R1 CGCGCGATTTTTGAACCAGAC
51 bra esp. F1 CGCCATGTACTCGGTTCTGCTGGACTTCGT R1 GGATGCGGGGCTCGTACTTGTGCAAC α-tub esp. F1 AGAGAGGCGGTTATGGAGGAGACAATCTGA R1 GGTGGACAACGAGGCGATCTACGACATCTG
Cada reacción individual de PCR en tiempo real se realizó para un volumen final de 25μl, conteniendo 15μl de Platinum SYBER Green qPCR SuperMix UDG, 1μl de cada oligonucleótido específico (10μM), 8μl de agua y 1μl de muestra. El control negativo consistió en sustituír la muestra por agua, por lo tanto en ese caso se colocaron 9μl de agua. Se realizaron varios ensayos a fin de encontrar las condiciones más adecuadas para el programa de PCR. Las condiciones que se utilizaron finalmente para los tres genes en paralelo fueron las siguientes: una primera etapa de activación a 94ºC por 10 minutos, luego a 94ºC por 30 segundos (denaturación), el alineamiento a 59ºC por 1 min., la elongación a 72ºC por 45 segundos y la cuantificación fue a 83ºC por 7 segundos, esta primera etapa se realizó durante 45 ciclos. Luego se realizó la curva de disociación, donde se incubó a 74ºC por 7 segundos y posteriormente se realizó un gradiente de temperatura desde los 74ºC hasta los 98ºC, con una lectura de la caída de la luminiscencia cada 0,5ºC. Se utilizó un termociclador Stratagene Mx3000P. El análisis de los resultados del producto amplificado se realizó a través del programa Stratagene Mx3000 Pro. Mediante esta técnica se obtienen dos tipos de resultados. Por un lado curvas de disociación y por otro curvas de amplificación para cada estadío y gen. Las curvas de disociación grafican la disociación de los dímeros de producto obtenido en función de la temperatura. Cuanto mayor es el tamaño del dímero mayor es la tempreratura necesaria para disociarlo. Mediante esta información se pudo saber por un lado cual era la temperatura de disociación del producto de interés en cada caso. Por otro lado se corroboró que se obtuvo un solo producto mayoritario en cada caso y a su vez éste era el mismo, en todos los estadíos analizados para cada gen. Esto demuestra que el PCR funcionó como esperábamos amplificando un solo producto específico mayoritario.
52 Los resultados de amplificación corresponden a los valores de fluorescencia en función del número de ciclos para cada estadío. A partir de estos datos se pueden obtener los valores Ct. El Ct corresponde al punto de intersección de la curva de amplificación de cada producto, con la línea base de detección, que fija el propio programa, detectando con ello el ciclo donde se inicia el aumento significativo de la fluorescencia, siendo este inversamente proporcional a la cantidad de ADN inicial de cada muestra. Debido a que no se contaba con una curva estándar, a partir de la cual calcular el nivel exacto del templado en cada muestra, se realizó una cuantificación relativa. Esto consistió en la comparación de los productos de amplificación de gsc o bra en cada estadío analizado, en relación al control positivo, α-tub (gen de expresión constitutiva), para ese mismo estadío. Por lo tanto se compararon las diferencias entre los Ct. Además, y debido a que la amplificación mediante PCR es exponencial, para el cálculo de la concentración relativa de cada gen en cada punto, se utilizó la fórmula: 2 (Ct α-tub st1 - Ct muestra st.1). Donde st1 representa un estadío en particular y “Ct α-tub st1” representa el valor Ct para α-tub en ese estadío y “Ct muestra st1” el valor Ct del gen en estudio (gsc o bra) para el mismo estadío. Mediante estos cálculos se obtuvo un valor relativo a α-tub para cada gen en cada estadío, los cuales fueron graficados y comparados.
3.4.- Hibridación in situ Se estudió la expresión de gsc y bra mediante hibridación in situ simple (una sonda) y doble (dos sondas) utilizando el protocolo modificado de Gamse et al.. 2002 (ver apéndice). Básicamente las hibridaciones con las sondas se hicieron a 70˚C toda la noche y el revelado se realizó con BM-Purple (Roche) durante aproximadamente 14 hs para el caso de gsc y 6hs para bra. En el caso de las hibridaciones dobles la segunda sonda se reveló con INT/BCIP (Roche), hasta obtener la intensidad de la marca deseada. Para el caso de bra esto ocurrió a las 8hs. Posteriormente los embriones fueron lavados 4 veces por 5 min. cada una, en PBS e incubados en DAPI (4µg/ml) por 2 hs. Luego fueron lavados 6 veces en PBT (PBS 1x + Tween 0,1%) por 5min cada uno. Se cortó parte del vitelo, en la región
53 contraria al embrión, utilizando pinzas, se montó y orientó cada embrión en una gota de metilcelulosa al 1%. Las imágenes se tomaron en un microscopio DIC, Nikon Eclipse 80i con objetivos de 10-40x, mediante una cámara digital color Nikon E4500. A su vez se realizaron cortes en vibrátomo de embriones hibridados, tanto para bra como para gsc. Para esto se realizaron dos lavados en PBS y luego se estabilizaron durante 10min. en solución de embebido (gelatina/BSA/sacarosa). Luego en placa Petri (de 40mm de diámetro) se agregó 4ml de solución de embebido y 200µl de glutaraldehído al 25%, se mezcló sin generar burbujas y se colocaron los embriones equidistantes. Luego de que la solución solidificara (aproximadamente 1 min.) se recortaron bloques conteniendo un embrión por bloque. Luego se pegó (con un pegamento instantáneo) un bloque orientado a la platina del vibrátomo y se realizaron cortes de 20µm de espesor. Dichos cortes se recogieron con pincel del agua destilada, se colocaron en portaobjetos y se montaron en 100µl de Moviol (Sigma). Para preparaciones permanentes se selló el borde con Entellan (Merck).
4.- Análisis de destino celular durante la agregación
Fotoconversión de Kaede Con el propósito de analizar el destino temprano y tardío de las células que forman el agregado celular, se utilizó el método de fotoconversión de Kaede. Se realizaron inyecciones de ARNm de una proteína fluorescente del coral (Kaede) en el embrión de una célula. Esta proteína contiene el tripéptido His-Tyr-Gly, el cual actúa como cromóforo verde que puede ser fotoconvertido a rojo con luz UV. La luz UV cliva la proteína de Kaede y permite la formación de nuevos enlaces dobles, creando un nuevo cromóforo que emite en rojo (Ando et al., 2002). Se ha visto que esta molécula es estable, permaneciendo inalterada en embriones de A. bellottii de 4 a 9 días post-fecundación. Luego de la inyección, los embriones fueron mantenidos en la oscuridad, a fin de evitar su fotoactivación espontánea. El análisis de los embriones inyectados se realizó fotoactivando con luz UV en un microscopio
54 compuesto, después de cerrar el diafragma móvil de campo fluorescente o por medio de un diafragma pequeño o “pinhole". La fotoactivación se realizó según el siguiente esquema:
1- Agregación temprana: a- fotoconvirtiendo un grupo, entre 30% y 50%, del conjunto de células que confluyen al agregado celular temprano, tanto en RI como en el AII, b- fotoconversión de la totalidad de las células que forman lo dos primeros estadios (agregados I y II), (n total= 22) 2- Agregación intermedia: a- fotoconversión de la totalidad de las células del agregadotres inicial (AIIIi, n=5), b- fotoconversión de células centrales de agregadotres medio así como de la totalidad de las células de éste agregado(n total=8), c- zona central de agregadotres tardío (n=5). 3- Agregación tardía: fotoconversión en zona central de agregado cuatro (n=3) y agregado cinco (n=3).
Posteriormente se realizó un seguimiento en el tiempo de las células marcadas verdes (no fotoconvertidas) y marcadas rojas (fotoconvertidas) en cada embrión, a fin de analizar su destino. Esto se realizó mediante Microscopía de Fluorescencia (microscopio Nikon optishot 3490) y se tomaron imágenes aproximadamente cada 20hs con una cámara CCD enfriada Hamamatsu Orca.
55 Resultados
Los resultados se han subdividido en tres secciones. En la primera se definen los estadíos de agregación y se describen sus características morfológicas basado en microscopía DIC (Differential Interference Contrast), microscopía confocal y mediante cortes histológicos semifinos (Objetivos específicos 1 y 2). En la segunda sección se muestran los patrones de expresión de genes marcadores del blastoporo (brachyury) y organizador (goosecoid), tanto a nivel temporal como espacial (Objetivo específico 2). Finalmente en la tercera se realiza un análisis dinámico de los procesos celulares que acontecen durante la agregación celular y la formación de múltiples capas celulares de la gástrula. Se presenta un estudio de destino celular temprano del agregado y se analizan las características morfológicas mediante microscopía confocal 3D de tiempo extendido (Objetivos específicos 3 y 4).
1. Análisis morfológico del proceso de agregación celular en Austrolebias
1.1.- Descripción y definición de estadíos de agregación celular
Al culminar el proceso de epibolia (100%) el embrión de Austrolebias consta de tres tipos celulares: un epitelio superficial que cubre el embrión, denominado capa celular envolvente (Enveloping Layer, EVL), una capa sincicial vitelina (Yolk Sincitial Layer, YSL) que corresponde a un sincicio de núcleos inmersos en una única célula vitelina y las blastómeras profundas (BP), que formarán al embrión, ubicadas entre la EVL e YSL (Carter & Wourms, 1991). En el estadío de 100% de epibolia las blastómeras profundas están distribuidas por toda la superficie del huevo (Carter & Wourms, 1991). Es a partir de este estadío que comienza el proceso de agregación celular que se estudiará en la presente tesis.
56 Ensayos preliminares indicaban que la agregación celular ocurriría preferentemente en el polo vegetal del embrión. Debido a que luego del proceso de epibolia se pierde completamente el marco de referencia en relación al eje animal- vegetal, ya que las células se aprecian homogéneamente distribuídas en el huevo, se hizo imprescindible establecer algún punto de referencia, a fin de poder analizar donde ocurre la agregación celular. Para esto se inyectaron embriones con ARNm de Kaede (ver Metodología y estudio de destino celular en Resultados) y se fotoconvirtieron en el estadío de 90% de epibolia las células de la EVL (y algunas BP) que se encontraban en el polo animal. En otros embriones se impregnó de cristales de DiI la punta de un filamento de tungsteno, mediante el cual se penetró el corion hasta llegar a la membrana vitelina en el polo vegetal. Esto generó una marca, tanto del corion como de la membrana vitelina en esta región. Mediante ambas aproximaciones se pudo apreciar que el agregado celular en todos los casos se formó en el polo vegetal del embrión (n=15 embriones). Estudios previos sugieren que el proceso de agregación celular involucra la migración de células hacia un punto del embrión, donde se agrupan y posteriormente, a medida que aumenta el número de células, se organizan para formar el eje embrionario (Wourms, 1972a). Esta descripción inicial del desarrollo de Austrolebias fue realizada por Wourms (Wourms, 1972a), quien denominó a este proceso como reagregación. Esta denominación surge de considerar que las células embrionarias en el período de blástula están agregadas en el polo animal, se dispersan durante la epibolia y después se “reagregan” a fin de formar el eje embrionario. Además Wourms definió para el proceso cinco estadíos, desde reagregado I a reagregado V (Wourms, 1972a). Dicha descripción se basó en las características morfológicas, evidenciadas a partir de un estudio con microscopía de campo claro (Wourms, 1972a). En esta tesis denominaremos agregación celular, al proceso definido por Wourms como reagregación. Por lo tanto los estadíos de agregación se nombrarán como agregados (A). Al inicio del proceso de agregación se forma una monocapa de aproximadamente 50 células agrupadas en una zona del embrión. A medida que el tiempo transcurre se forma un embrión discoidal, de más de una capa de células. Posteriormente y
57 mientras el agregado celular aumenta de tamaño y cambia de forma, de circular a elíptico, las células de la zona central disminuyen mucho su tamaño y se reorganizan de tal modo que cuando este proceso culmina se puede apreciar la formación de una estructura axial central, probablemente la notocorda. En este trabajo se estudió el proceso de agregación en dos especies de Austrolebias: A. bellottii y A. charrua. Se observó que A. charrua presenta un desarrollo más lento que A. bellottii. El proceso de agregación dura en total 6 días de desarrollo en A. charrua mientras que en A. bellottii éste ocurre en 5 días, sin embargo no se apreciaron diferencias significativas en las características del proceso entre las especies. Por lo tanto se utilizó indistintamente una u otra especie para la descripción del proceso de agregación. Sin embargo cuando se haga referencia a tiempos de desarrollo, éstos corresponderán a los tiempos descritos para A. bellottii (ver Tabla 3). El proceso de epibolia culmina a los 4,4 días postfecundación (dpf) en A. bellottii o 7 dpf en A. charrua a 25˚C. (S. De La Piedra, com. pers.). Posteriormente comienza el período de agregación, al inicio del cual lo primero que se observa es un incremento paulatino en el número de células en una zona del embrión. Esta acumulación de células ocurre, aparentemente, por migración de éstas hacia la zona de agregación . Los estadíos del proceso de agregación, fueron esencialmente definidos mediante microscopia DIC y complementados con microscopía confocal de embriones que expresaban GFP con destinación a membrana y RFP con destinación nuclear.
1.1.a. - Estadíos de agregación celular
Agregado uno (AI) Este estadío consiste en una monocapa de aproximadamente 10 células que aumentan en número a medida que el tiempo transcurre. Se define como AI un embrión cuyo agregado consta de un número de células entre 10 y 30, con un eje mayor de 80μm±17μm, (n=30) (AI en Fig. 6A y 6B). Estas células son bipolares y forman lamelipodios y filopodios. Este estadío dura en promedio 20 horas a 25˚C.
58 Agregado dos (AII) A medida que el desarrollo transcurre, existe un incremento en el número de células en la zona del agregado. Se define al AII como una monocapa de células donde los espacios entre las células han disminuido (respecto al AI). El agregado en este estadío tiene una forma variable, circular o alargada y consta de un número promedio de 80 células ± 25, (n=5). La gran mayoría (95%, n=5) de las células que lo componen tienen un diámetro de 25,5μm ± 4μm, (n=40). Estas células tienen forma redondeada y en general no se aprecian proyecciones de membrana destacables (AII en Fig. 6A y 6B). Se distingue además un pequeño grupo de células de tamaño mayor (5%, n=5), cuyo eje mayor mide en promedio 80μm±25μm, (n=10). Estas células se mantienen en la periferia del agregado y presentan forma trapezoidal. Este estadío dura en promedio 10 horas a 25˚C.
59
AI AIIIt
* AII AIV
AIIIi AV
ejei AIIIm vK * 3 som.
Figura 6A.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana.
60 AI AIV
AII AV
AIIIi ejei
*
AIIIm 3 som. vK
Figura 6B.- Esquemas que representan los estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y AIIIt somitogénesis temprana.
61 Agregado tres (AIII) El período de agregación tres dura 65hs en total. Debido a su extensión y a que en esté período ocurren cambios morfológicos importantes en el agregado, se subdividió en tres estadíos: agregado tres inicial (AIIIi), medio (AIIIm) y tardío (AIIIt).
Figura 6.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana A. AI (estadío agregado I), grupo de unas 10 células de morfología migratoria. La flecha indica una célula alargada de tipo bipolar. AII (estadío agregado II), formado por una monocapa de unas 100 células, la mayoría redondeadas (asterisco indica una de ellas) y de tamaño similar (aprox. 20μm de diámetro). Las flechas indican dos células mayores que se ubican en la periferia. La línea punteada indica el borde aproximado del agregado. AIIIi (estadío agregado III inicial), se aprecia la superposición de células en diferentes regiones del agregado (la cabeza de flecha indica células superpuestas). La línea punteada indica el borde aproximado del agregado. AIIIm (estadío agregado III medio), se aprecia una zona central de células de menor tamaño, las que se disponen a diferentes niveles en el eje z (zona indicada con línea punteada). En la periferia se observa una corona de células redondeadas de mayor tamaño (flecha). AIIIt (estadío agregado III tardío), la zona central de células de menor tamaño ha aumentado en área (zona indicada con línea punteada). La corona de células externas se aprecia más compacta (flecha). AIV (estadío agregado IV), se aprecia un área central formada por células de menor tamaño (delimitada por línea punteada) y células periféricas redondeadas de mayor tamaño (flecha). AV (estadío agregado V), de forma elíptica, se observa una acumulación de las células externas de mayor tamaño en el extremo posterior (flecha). La zona central del agregado está delimitada por una línea punteada. ejei (estadío eje inicial), de forma elíptica (borde indicado con línea punteada), presenta dos pliegues paralelos en el primer tercio posterior, que corresponden a la notocorda (señalada con cabezas de flecha). 3 som. (estadío 3 somitos), se aprecia la región cefálica ensanchada, 3 somitos (asterisco) en la zona medial-posterior del eje y el organizador de la cola, en el extremo posterior (flecha). Además se aprecia una estructura elíptica posterior, posiblemente la vesícula de Kuppfer (vK). B. Se ilustran, mediante esquemas, las principales características de los estadíos correspondientes al proceso de agregación celular, eje inicial y somitogénesis temprana. Cada círculo/óvalo representa una célula. La zona central de los agregados con alta densidad celular es representada con una trama cuadriculada. Las línea roja en ejei, indica los bordes del eje embrionario en formación. En 3 som. vK: vesícula de Kupffer, asterisco en somito, flecha indica el organizador de la cola.
62 Agregado tres inicial (AIIIi) En este estadío existe un aumento moderado del número de células, en relación al AII. En promedio presenta alrededor de 100 células y se pueden reconocer las mismas dos poblaciones celulares descritas en el AII. La principal diferencia con éste último es que el embrión deja de ser una monocapa y se observan algunas células ocupando lugares más profundos dentro del agregado (AIIIi en Fig. 6A y 6B). Se pueden reconocer células de morfología variada. En la zona central del agregado predominan las células redondeadas y células de morfología alargada de tipo filiforme se concentran en la periferia. Este estadío en promedio dura 15 horas.
Agregado tres medio (AIIIm) En éste estadío ha aumentado el número de células del agregado al doble del AIIIi (aproximadamente 200 células), así como su superposición en el eje z. El eje mayor del agregado mide aproximadamente 400μm y la zona central 150μm. Se pueden reconocer tres poblaciones celulares de distinto tamaño: 1- las de mayor tamaño (descritas previamente) representan el 2,5% de la población, de forma trapezoidal y de tamaño promedio de 80±25μm. 2- grupo de células de un tamaño intermedio representa el 85% del total de células del agregado. Está formado por células redondeadas de 30±4μm (n=20), muchas de las cuales se observan superpuestas hacia la periferia. 3- grupo de células más pequeñas, con un eje mayor de 14,6±1μm (n=15), corresponden a células redondeadas, que se ubican en la zona central del agregado, lugar donde se aprecia mayor superposición de células en el eje z (AIIIm en Fig. 6A y 6B). Este período es el más largo del proceso de AIII y dura 35 horas. En la Fig. 7 se muestra una secuencia de microscopía confocal de los cambios que ocurren en este estadío, se puede observar como las células más pequeñas (grupo 3) se organizan en la zona central del agregado (Fig. 7A y B) y forman una estructura circular central (Fig. 7C) claramente separada de la zona de células periféricas de mayor tamaño (grupo 2).
63 A B
AIIIm inicial AIIIm medio
C D
AIIIm tardío AIIIt
E F
AIV AV
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío
64 Agregado tres tardío (AIIIt) Este estadío se caracteriza porque las células de menor tamaño (grupo 3, definido para el AIIIm) están concentradas en la zona central, formando una estructura circular compacta fácilmente reconocible. El embrión en este estadío tiene forma circular y mide en promedio 300μm de diámetro (n=4). La zona central circular, ocupada por estas células de menor tamaño, abarca el 18% del área total del agregado. El eje mayor de dichas células de menor tamaño mide 13±1μm (n=13) (AIIIt en Fig. 6A y 6B). Las células de tamaño intermedio (grupo 2) están agrupadas en la periferia formando una estructura similar a una corona, de aproximadamente 4 filas concéntricas de células, en torno a la estructura central. Con microscopía confocal se pudo apreciar que en este estadío existe una mayor compactación de células en la zona central del embrión y el área central se alarga midiendo 200μm en su eje mayor y 150μm en su eje menor (Fig. 7D). Este estadío dura 15 horas a 25˚C.
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío A. AIIIm temprano, se aprecian células de tamaños similares formando un agregado celular circular, donde ya existe más de una capa de células. B. AIIIm intermedio, las células centrales disminuyen de tamaño y se reorganizan en la zona central (flecha), a su vez las células de mayor tamaño se desplazan hacia la periferia. C. AIIIm tardío, las células centrales han disminuído considerablemente de tamaño y se agrupan en la zona central (indicada con línea punteada). D. AIIIt, donde la zona central de células más pequeñas ocupa un área mayor del agregado. Se aprecia claramente la corona de células de mayor tamaño que la rodea (flecha). E. AIV, aumenta el área circular ocupada por células pequeñas (indicada con línea punteada) y las células de mayor tamaño se desplazan hacia la futura región posterior del embrión (indicada por una flecha). F. AV, el cual se extiende y cambia de forma de circular a elíptico, al igual que la zona ocupada por células pequeñas (línea punteada). La mayoría de las células de mayor tamaño están concentradas en la región caudal presuntiva del embrión (flecha). El grupo de imágenes tomadas en cada tiempo fue procesado con el programa Volocity, el cual permite generar un modelo 3D del grupo de imágenes aduiridos en z para cada estadío. El modelo 3D fue luego rotado de tal forma que las imágenes que se muestran corresponden a una vista desde el vitelo del agregado. Desde esta perspectiva, las células superficiales (como las de la EVL) no se aprecian.
65 Agregado cuatro (AIV) Las dos características principales que definen éste estadío son: (a) una disminución general del tamaño de las células que conforman el agregado: células del grupo 2 (intermedias) y 3 (pequeñas) descritas previamente en AIIIm; y (b) un aumento del área ocupada por la zona circular central de células más pequeñas, en relación al área total del agregado. En este estadio el agregado tiene una forma circular con un diámetro aproximado de 450μm y las células que forman la corona concéntrica a la zona central tiene un diámetro promedio de 18±2μm, (n=20) y comienzan a concentrarse en un extremo del embrión. Los bordes de las células menores centrales no son apreciables con microscopía DIC (AIV en Fig. 6A y 6B) y con microscopía confocal se determinó que miden en promedio 9,8±2μm (n=18). El área que ocupa la zona central en este estadío, es en promedio de un 55% del área total del agregado (Fig. 7E). Este estadío dura 15 horas a 25˚C.
Agregado cinco (AV) La característica más sobresaliente que define éste estadío es el cambio de forma del agregado. Mientras la forma del AIV es aproximadamente circular, el AV pasa a tener una forma elíptica (AV en Fig. 6A y 6B). El eje mayor del embrión mide aproximadamente 460μm y el eje menor 300μm. Las células externas (grupo 2) que rodean la zona central miden en promedio 12±2μm (n=20) (Fig. 7F). Otra particularidad de éste estadío es que la mayoría de las células externas, se concentran en un extremo del agregado Este estadío dura 22 horas a 25˚C. El AV representa el último estadío del proceso de agregación, luego de lo cual se puede apreciar la formación del eje embrionario. El estadío de eje fue subdividido en tres: eje inicial (ejei), eje medio (ejem) y eje tardío (ejet).
66 1.1.b.- Estadíos de eje embrionario y somitogénesis inicial
Eje inicial (ejei) Treinta minutos después de que el AV está formado, se observa la aparición de una estructura axial. Esta estructura aparece inicialmente como dos pliegues paralelos en la zona central del agregado, separados a una distancia aproximada de 20μm (cabezas de flecha en ejei de Fig. 6A). El embrión en éste estadío es una elipse con un largo promedio de 500μm y un ancho de 250μm, (n=3) (ejei en Fig. 6A y 6B). Este estadío dura 5 horas.
Eje medio (ejem) La característica principal por la cual se definió este estadío es por el aumento longitudinal en el tamaño de ésta estructura axial, posiblemente la notocorda, que se hace evidente en la zona central, la cual se alarga hacia los extremos del embrión y mide aproximadamente 160μm, de un extremo al otro. A su vez se observa el ensanchamiento de ésta estructura en la zona anterior y posterior. Este estadío dura aproximadamente 11 horas.
Eje tardío (ejet) En este estadío la característica principal es que los extremos de la estructura axial se hacen evidentes, por lo tanto se puede apreciar un eje completo, donde se distingue claramente la zona cefálica (65μm de ancho) de la caudal (40μm). En todos los estadíos de eje se aprecian las células de mayor tamaño en la periferia y concentradas en la zona caudal. Este estadío dura aproximadamente 7 horas a 25˚C.
Embrión de 3 somitos (3som) A medida que el desarrollo avanza, se segmenta el mesodermo paraxial y se pueden distinguir los somitos a los costados del eje. Los primeros somitos que se forman se ubican en el primer tercio posterior del embrión. En éste estadío el eje
67 embrionario mide 400μm de largo. Se distingue una estructura elíptica posterior, posiblemente la vesícula de Kupffer (vK, en 3 som. de Fig. 6A y 6B).
68 Tabla 3. Estadíos, tiempos y características del proceso de agregación Estadíos Días postfecundación (dpf) Características: en A. charrua generales agregado, poblaciones celulares, tamaños 100% 6 Blastómeras profundas dispersas sobre vitelo, forma epibolia variada: filiforme, triangular, bipolar. Grupo laxo de 20 células, migrando hacia un punto, forma AI 6,8 alargada tipo bipolar, con filopodios y lamelipodios, 80±17μm. Monocapa de 80 células±25, agregado de forma variada, AII 7,25 95% células redondeadas de 25,5±4μm, 2,5% de células alargadas de eje mayor de 80±25μm. AIIIi 7,9 Agregado celular de alrededor de 100 células, de formas y tamaños similares a las del AII. Primeras células que se profundizan en eje z en diversas zonas del R. Más de una capa células en zona central, aproximadamente 200 células, 3 grupos poblacionales: 1- representan el 2,5% AIIIm 9,1 miden 80±25μm, multinucleadas, 2- 85% de la población miden 30±4μm, 3- 12,5% de la población, miden 14,6±1μm y se ubican en zona central. Forma circular de 300μm de diámetro y multilaminar en AIIIt 10 zona central, aumento y compactación células centrales (grupo 3) que miden 13±1μm, corona de células de grupo 2, área central ocupa 18% del R. Forma relativamente circular 450μm de diámetro, AIV 10,6 disminución general tamaño células, periféricas 18μm±2μm (grupo 2) comienza su migración a un extremo, centrales 9,8μm±2μm (grupo 3), área central ocupa 55% del R. AV 11,5 Forma elíptica de eje mayor 460μm y eje menor 300μm, células periféricas de 12μm±2μm concentradas en posterior. ejei 11,7 Aparición estructura axial central, pliegues paralelos separados 20μm, posiblemente inicio de notocorda. ejem 12,2 Crecieminto de estructura axial hacia extremos midiendo aproximadamente 160μm entre sus extremos. ejet 12,5 Se aprecia eje completo, con zona celálica y caudal ensanchadas.
69 1.2.- Estudio morfológico a través de cortes histológicos
Mediante cortes histológicos semifinos seriados se analizó la morfología histológica de distintos estadíos de agregación, desde AIIIm hasta el estadío de 3 somitos (Fig. 8). De cada secuencia de cortes se seleccionó el/los cortes más informativos. En el estadio de AIIIm se realizaron cortes transversales del agregado y se seleccionó un corte de la zona central (Fig. 8A). En el corte, el agregado presenta una forma lenticular, teniendo más de una capa de células en la zona central, las cuales se van reduciendo hacia la periferia, hasta llegar a formar una monocapa. En la zona central no se aprecia ninguna organización particular de las células. En un extremo del corte (hacia la derecha en Fig. 8A) se distingue una estructura homogénea, que se tiñe rosada con azul de toloudina, la cual ocupa el espacio entre el agregado y el vitelo. Dicha estructura podría corresponder a matríz extracelular. En la zona central más ancha el embrión mide 47μm de ancho. El agregado en AIV tiene también una forma lenticular, aunque la periferia no es una monocapa, sino que se observan al menos tres capas de células. Se aprecia como ha aumentado la compactación entre células, debido a que la distancia entre sus núcleos ha dismunuído. En la zona central se observa que las células se organizan formando una estructura circular (indicada por puntas de flecha en la Fig. 8B) la cual parece afinarse, a medida que se aproxima a la superficie (EVL). Esta estructura mide aproximadamente 70μm en su diámetro mayor. A su vez el agregado mide en su zona central aproximadamente 60μm de ancho. En la figura 8C se muestra un corte a través del eje mayor de un AV. En la zona central de éste los nucleos de las células parecen disponerse en círculos concéntricos dando al conjunto el aspecto de una estructura circular (cabezas de flecha en Fig. 8C). En la zona central el agregado mide aproximadamente 70μm. El embrión en eje tardío presenta estructuras claramente diferenciadas. En la figura 8 se muestran dos cortes histológicos, uno en la zona anterior del embrión (Fig. 8D) y el otro en la región posterior (Fig. 8E). En la región anterior se aprecia la quilla neural (asterisco en Fig. 8D) y bajo ella la notocorda (indicada con una flecha
70 en Fig. 8D). A los costados de la quilla neural se puede apreciar el mesodermo paraxial, aún no segmentado. En el corte a nivel posterior (Fig. 8E) se aprecia claramente una estructura circular central, la cual podría corresponder al organizador de la cola o “tailbud”, descrito en otros teleósteos (ver discusión y cabezas de flecha en 8E). En las figura 8 se muestran además cortes a tres niveles de un embrión en el estadío de 3 somitos. Estos cortes se realizaron en la región cefálica (Fig. 8F), en la zona medial (Fig. 8G) y en la región caudal (Fig. 8H). En la zona cefálica se aprecia la quilla neural de forma triangular en el centro de la cual se aprecia un espacio que probablemente corresponda al inicio de la formación del lumen (indicado por una cabeza de flecha en 8F). El corte medial se realizó a nivel del segundo somito. Se puede apreciar la notocorda como un grupo pequeño de células (indicada por flecha) debajo de la quilla neural y a los costados el mesodermo paraxial segmentado, formando los somitos (asterisco en Fig. 8G). El corte caudal muestra un engrosamiento importante de esa zona, con un aumento en el número de capas de células. Se distingue una estructura circular que abarca la casi totalidad del ancho del embrión, que es de aproximadamente 90μm. La estructura circular identificada a éste nivel mide 80μm de diámetro (borde indicado con una línea discontinua en Fig. 8H).
71 Nivel de los cortes A A
AIIIm
B B
AIV C C
AV D E D E * ejet
F G H F H * 3 som.
Figura 8.- Estudio histológico del proceso de agregación celular y formación del eje embrionario A la izquierda se muestran imágenes de cortes histológicos transversales teñidos con azul de toluidina de agregados celulares, embriones en estadío de eje y somitogénesis temprana. A la derecha representación esquemática de cada estadío así como de la orientación de los cortes en cada caso (indicado con línea discontinua roja). A. Corte transversal de AIIIm. Se aprecia un agregado de forma lenticular, con células centrales a diferentes niveles en el eje z y una sola capa de células periféricas. A la derecha del corte se aprecia una estructura que se tiñe homogéneamente de rosado con azul de toluidina, la que podría corresponder a matriz extracelular (flecha). B. Corte transversal de AIV. Se observa alrededor de dos capas de células periféricas y cinco centrales. Se distingue estructura circular central, la cual se afina hacia la superficie, indicada con línea punteada y cabezas de flecha. C. Corte longitudinal de AV. Se observa un aumento en el número de capas celulares centrales y una disminución en el tamaño de las células. D. Corte transversal anterior de un embrión en eje tardío (nivel del corte indicado en esquema adyacente). Se aprecia la quilla neural (asterisco) y por debajo la notocorda (flecha). A los costados se observa el mesodermo paraxial. E. Corte transversal de región posterior de embrión en eje tardío (nivel del corte indicado en esquema adyacente). Se indica estructura circular compacta (cabezas de flecha) al centro del reagregado, posiblemente el organizador de la cola. F. Corte transversal anterior de embrión de 3 somitos. Se observa la quilla neural triangular con lumen al centro (flecha). G. Corte transversal medio de embrión de 3 somitos. Con asterisco se indica un somito y con la flecha la notocorda. H. Corte transversal posterior de embrión de 3 somitos. Se aprecia estructura circular que abarca casi 72todo el ancho del embrión, posiblemente el organizador de la cola. 2. Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación
Mediante el análisis de la expresión de marcadores genéticos de la gastrulación se buscó entender en que momento y en que forma ocurrían procesos tales como: diferenciación de las células mesodérmicas, formación del blastoporo, establecimiento del organizador o la inducción del neuroectodermo. Por lo tanto, se buscó establecer cuando y donde ocurren algunos de los procesos morfogenéticos de la gastrulación en Austrolebias. Con éste fin se realizó el clonamiento de fragmentos génicos codificantes de éste género, los que fueron posteriormente analizados a nivel temporal mediante PCR en tiempo real y a nivel espacio-temporal mediante hibridación in situ. Para la selección de los genes a estudiar se utilizaron varios criterios. Debido a que el clonamiento se realizó mediante la generación de oligonucleótidos degenerados, los genes de interés debían ser conservados en la evolución, a fin de tener más posibilidades de éxito. En segundo lugar debian ser genes cuyas funciones fueran conocidas durante la gastrulación de otros organismos. En particular el interés se centró en localizar el blastoporo y el organizador en Austrolebias, por lo que se clonaron los genes ortólogos de brachyury y goosecoid, respectivamente. Además se intentó el clonamiento de algunos marcadores de tejidos que se forman más tardíamente, como es el caso del neuroectodermo, a fin de poder realizar, a futuro, un estudio más completo del desarrollo de Austrolebias.
2.1.- Clonamiento de fragmentos génicos de Austrolebias
Mediante la técnica de RT-PCR y utilizando oligonucleótidos degenerados se clonaron 12 fragmentos génicos a partir del ADNc preparado de varios estadíos embrionarios de Austrolebias (ver Metodología). Para esto, se compararon las secuencias codificantes de diversos genes de otros vertebrados (peces, aves y
73 mamíferos) a través de su alineamiento con ClustalW y se diseñaron oligoncleótidos degenerados correspondientes a las regiones aminoacídicas más conservadas. Se diseñaron los partidores tal que los productos a amplificar fueran mayores a 400pb, a fin de poder generar posteriormente sondas específicas y así analizar su patrón de expresión. Los fragmentos génicos clonados y su tamaño son los siguientes: goosecoid (gsc, 600pb), brachyury (bra, 480pb), wnt 11 (420pb), wnt8b (420pb), pax6 (840pb), opl1 (620pb), otx2 (551pb), sonic hedgehog (shh, 512pb), bmp4 (713pb), sox2 (593pb), β-actina (550pb), α-tubulina (α-tub, 403pb). Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las bases de datos mediante el programa BLAST (Altschul et al.., 2005) y se corroboró en cada caso que se trata de un posible ortólogo del gen en cuestión. A los efectos de contestar las preguntas planteadas en el presente trabajo, los genes que resultaron más informativos de estudiar en una primera etapa, fueron dos: goosecoid (marcador del organizador y placa precordal) y brachyury (marcador del blastoporo, mesodermo axial y “tailbud”). Por lo tanto centramos nuestro análisis en dichos genes.
2.2.- Análisis de secuencias de goosecoid y brachyury
Para el clonamiento de estos genes primero se realizó una búsqueda en GenBank, donde se tuvo acceso a secuencias codificantes conocidas de otros vertebrados, tanto para gsc como para bra. Posteriormente estas secuencias fueron alineadas usando ClustalW y comparadas mediante el uso de Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Las secuencias comparadas para el caso de gsc fueron: Especie Número Acceso GeneBank Xenopus tropicalis scaffold_185:1840522:1843227:1 Gallus gallus X70471 Danio rerio NM131017 Takifugu rubripes scaffold_266:1:381343:1 Orizias latipes TC39765
74 Mus musculus NM010351
Para el caso de bra se compararon secuencias de: Gallus gallus NM204940 Orizias latipes AB001871 Danio rerio NM131162 Mus musculus NM009309 Xenopus tropicalis BC067315
Dado que estos genes son muy conservados en la evolución fue posible seleccionar en ambos casos las regiones de mayor identidad aminoacídica, a partir de las cuales se diseñaron los pares de oligonucleótidos degenerados, como ya se mencionó anteriormente, para el clonamiento de fragmentos génicos que superaran los 400pb. Luego del diseño de los oligonucleótidos se utilizó el programa Oligo 6.8 para corroborar la calidad de éstos, respecto a la posible formación de bucles, dímeros, etc. Mediante RT-PCR se amplificaron los fragmentos de ambos genes a partir de ARN preparado tanto de A. bellottii como de A. charrua, los que luego se clonaron y secuenciaron (Fig. 9 y 10). Se confirmó el clonamiento de dichos genes mediante la comparación de secuencias con BlastN. A continuación se indican los porcentajes de indentidad encontrados en cada caso (Tabla 4).
75 Tabla 4. Porcentajes de identidad de gsc (A) y bra (B) en comparación con otros vertebrados y entre si.
A- % identidad Mm gsc Xl gsc Dr gsc Gg gsc Hs gsc Ab gsc Ab gsc 64 69 76 67 65 Ac gsc 62 65 71 65 62 85
B- % identidad Mm bra Xl bra Dr bra Gg bra Ol bra Ab gsc Ab bra 94 93 91 93 89 Ac bra 96 94 92 95 91 97
Mm: Mus musculus, Xl: Xenopus laevis, Dr: Danio rerio, Gg: Gallus gallus, Hs: Homo sapiens, Ab: Austrolebias bellottii, Ac: Austrolebias charrua, Ol: Orizias latipes.
La comparación de las secuencias de Austrolebias con las correspondientes secuencias ortólogas de otros organismos, permitió identificar por un lado los dominios encontrados en las secuencias clonadas y por otro generar árboles filogenéticos, los cuales permiten agrupar a los distintos genes según su similitud de secuencias (Figs. 11 y 12). Para el caso de gsc la secuencia clonada contiene parte (57 aminoácidos) del homeodominio 2, conocido en otros organismos. A partir de esta comparación de las secuencias aminoacídicas de los fragmentos de gsc de Austrolebias con las de otros organismos, se construyó un árbol filogenético radial (unrooted tree), en el cual se puede apreciar como las especies de Austrolebias son agrupadas con las de los demás peces analizados: T. rubripes y D. rerio. Por otro lado en un grupo aparte quedaron los demás organismos comparados: X. tropicalis, G. gallus y M. musculus (Fig. 11). La secuencia de bra de C. charrua contiene el dominio de caja-T (T-box) 3, formado por 169 aa. Mediante el árbol filogenético radial construído para bra se pudo observar la misma agrupación de los peces por un lado y los demás organismos por otro, visto para el caso de gsc. En este caso se compararon las
76 secuencias de los peces O. latipes y D. rerio, así como las de X. tropicalis, G. gallus y M. musculus (Fig. 12). Dadas las altas identidades de secuencia encontradas entre los genes amplificados de Austrolebias con los genes gsc y bra de otros vertebrados, consideramos que las secuencias identificadas corresponden a los genes ortólogos de gsc y bra de ambas especies de Austrolebias y los hemos nombrado Abgsc, Abbra, Acgsc y Acbra. Estos son los primeros genes codificantes aislados de este género y nos permiten caracterizar los patrones de expresión temporal y espacial de ellos, durante la embriogénesis.
77 A >gscAch DNA: TGCCGGCTGGGATGTTTAGGATCGACAGCATCCTTTCTGGACCGGTTCTGT +3: P A G M F R I D S I L S G P V L S DNA: CCGGACGGCCGAACTGCAAGGAGCCGCTGCTGCTGCACCGAACCGGGCCGC +3: G R P N C K E P L L L H R T G P L DNA: TGGTTCTGCCCGGACTCACGGACTCCATGTACGCGGACTACAGCGCACTGT +3: V L P G L T D S M Y A D Y S A L S DNA: CCCCCCCGGGGGTCCACTCCGTGGGCGGAACCAGGTTCGGGTACGCGGGCT +3: P P G V H S V G G T R F G Y A G C DNA: GTTACTACGGGCAGCTGCAGGTCCAGGGGCCCGGAGCGGGGCCCCCGTGCT +3: Y Y G Q L Q V Q G P G A G P P C C DNA: GCGGGGCGGTACCGGGTCTGAGCCCGCAACAGTGCCCCTGCTTCCCCGCAG +3: G A V P G L S P Q Q C P C F P A G DNA: GCTACGACAGTCCGGGCTCGGTTCTGATCTCGCCGGTCCCGCACCACATGA +3: Y D S P G S V L I S P V P H H M M DNA: TGTCCTACATGAACGTGGGCAGCCTCTCGCGCACGGAGCTGCAGCTGCTCA +3: S Y M N V G S L S R T E L Q L L N DNA: ACCAGCTGCACTGCAGGAGGAAGAGGAGGCACCGCACCATCTTCACCGACG +3: Q L H C R R K R R H R T I F T D E DNA: AGCAGCTCGAGGCTCTGGAGGGCCTCTTCCAGGAGACCAAGTACCCGGATG +3: Q L E A L E G L F Q E T K Y P D V DNA: TTGGCACGAGGGAGCAGCTGGCCCGGAAGGTCCACCTGAGGGAGGAGAAGG +3: G T R E Q L A R K V H L R E E K V DNA: TCGAGGTCTGGTTCAAAAATCGCGCGCCAAATG +3: E V W F K N R A P N
B >gscAb DNA: TGCCGGCCGGGATGTTCTGGATCGACAGCATCTTGTCCGGACGGCCGAGCT +3: P A G M F W I D S I L S G R P S C DNA: GCAAGGAGCCGCTGCTGCTGCACCGCGGGGGCCCGCTGCTGCTGTCCGGTC +3: K E P L L L H R G G P L L L S G L DNA: TCGCAGACTCGGTCTACGGGGACTACGGCGGACTGTACCCGGCCGCGCGCG +3: A D S V Y G D Y G G L Y P A A R G DNA: GGCCGTCCCCGCCGGGGGTTCACTCCGTGAGCGGCACGCGGATCGGATATA +3: P S P P G V H S V S G T R I G Y N DNA: ACGGCTACTACTACGGACAGCTGCAGGTTCAGGGCGCCGGGGGGGCGCCAC +3: G Y Y Y G Q L Q V Q G A G G A P P DNA: CATGCTGCGGGGCCGTGGGAGGCCTGAGCCCGCAGCAGTGCCCCTGCATCC +3: C C G A V G G L S P Q Q C P C I P DNA: CCGCAGGCTACGACAGCCCGGGCTCGGTGCTCATCTCCCCCGTGCCGCACC +3: A G Y D S P G S V L I S P V P H H DNA: ACATGATGTCCTACGTGAACGTGGGCAGCCTGTCGCGCACGGAGCTGCAGC +3: M M S Y V N V G S L S R T E L Q L DNA: TTCTGAACCAGCTGCACTGCCGCAGAAAGCGGAGGCATCGCACCATCTTTA +3: L N Q L H C R R K R R H R T I F T DNA: CCGACGAGCAGCTCGAGGCTCTGGAGGGGCTCTTTCAGGAGACCAAGTACC +3: D E Q L E A L E G L F Q E T K Y P DNA: CGGACGTTGGCACGCGGGAGCAGCTCGCGCGGAAGGTCCATTTGAGGGAGG +3: D V G T R E Q L A R K V H L R E E DNA: AAAAGGTGGAGGTGTGGTTCAAGAATCGCCGCGCCAAATG +3: K V E V W F K N R R A K
Figura 9.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de goosecoid (gsc) A. Secuencias de gsc de A. charrua. Secuencia aminoacídica en el marco de lectura +3. B. Secuencias de gsc de A. bellottii. Secuencia aminoacídica en el marco de lectura +3.
78 A >braAch DNA: TTTCAAGGAGCTGACCAACGAGATGATCGTCACCAAGAACGGCAGGCGCAT -2: F K E L T N E M I V T K N G R R M DNA: GTTTCCGGTTCTGAAAGTGAACGTGTCCGGACTGGACCCGAACGCCATGTA -2: F P V L K V N V S G L D P N A M Y DNA: CTCGGTTCTGCTGGACTTCGTGTCGGCGGACAACCACAGGTGGAAGTATGT -2: S V L L D F V S A D N H R W K Y V DNA: GAACGGGGAGTGGGTGCCCGGAGGCAAACCCGAACCCCAGACCCCCAGCTG -2: N G E W V P G G K P E P Q T P S C DNA: CGTGTACATCCACCCGGACTCCCCGAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGC -2: V Y I H P D S P N F G A H W M K A DNA: CCCGGTCTCCTTCAGTAAAGTCAAGCTGACGAACAAGCTCAACGGCGGAGG -2: P V S F S K V K L T N K L N G G G DNA: TCAGATCATGTTAAATTCGTTGCACAAGTACGAGCCCCGCATCCACATCGT -2: Q I M L N S L H K Y E P R I H I V DNA: GCGCGTTGGAGGCCCGCGGAGGATGATCACCAGCCACTCGTTTCCGGAGAC -2: R V G G P R R M I T S H S F P E T DNA: GCAGTTTATCGCAGTTACAGCTTATCAAAACGAAGAGATTACGGCTCTGAA -2: Q F I A V T A Y Q N E E I T A L K DNA: GATAAAACACAACCCCTTCGCCAA -2: I K H N P F A
B >braAb DNA: TTCAAGGAGCTGACCAATGAGATGATCGTCACCAAAAACGGCAGGCGCATG -1: F K E L T N E M I V T K N G R R M DNA: TTTCCGGTTCTGAAAGTGAACGTGTCCGGACTGGACCCGAACGCCATGTAC -1: F P V L K V N V S G L D P N A M Y DNA: TCGGTTCTGCTGGACTTTGTGTCGGCGGACAACCACAGGTGGAAGTATGTG -1: S V L L D F V S A D N H R W K Y V DNA: GACGGGGAGTGGGTGCCCGGGGGCAAACCCGAACCCCAGACCCCCAGCTGC -1: D G E W V P G G K P E P Q T P S C DNA: GTTTACATCCACCCGGACTCCCCGAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGCC -1: V Y I H P D S P N F G A H W M K A DNA: CCGGTCTCCTTCAGTAAAGTCAAGCTGACGAACAAGCTCAACGGCGGAGGG -1: P V S F S K V K L T N K L N G G G DNA: CAGATCATGTTAAACTCGTTGCACAAGTACGAGCCCCGCATTCACATCGTG -1: Q I M L N S L H K Y E P R I H I V DNA: CGGGTCGGAGGCCCGCGGAGGATGATCACCAGCCACTCGTTTCCAGAGACG -1: R V G G P R R M I T S H S F P E T DNA: CAGTTTATCGCTGTTACAGCTTATCAAAACGAAGAGATTACGGCCCTGAAA -1: Q F I A V T A Y Q N E E I T A L K DNA: ATCAAGCACACCCCTTCGCCAA -1: I K H T P S P
Fig 10.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de brachyury (bra) A. Secuencias de bra de A. charrua. Secuencia aminoacídica en el marco de lectura -2. B. Secuencias de bra de A. bellottii. Secuencia aminoacídica en el marco de lectura -1.
79 A Gg MPASMFSIDNILA-----ARPRCKDSVLLPP---SAPVVFPSLHGDSLYGA----ASDYG 48 Mm MPASMFSIDNILA-----ARPRCKDAVLPVAPSAAAPVVFPALHGDSLYGAGGGTSSDYG 55 Xt MPSGMFSIDNILA-----ARPRCKESVLLPQ---NGPMVFSSLG-ESLYGP-----ADYS 46 Dr MPAGMFSIDSILA-----GRPSCKDSVLLHR---NAPVVFSNLT-ESLYTA----AGDFN 47 Ol ------Ab -PAGMFWIDSILS-----GRPSCKEPLLLHR---GGPLLLS-GLADSVYG------DYG 43 Ach -PAGMFRIDSILSGPVLSGRPNCKEPLLLHR---TGPLVLP-GLTDSMYA------DYS 48 Tr MPSGMFSIDSILS-----GRPSCKEPLLLHR---SGPAVLPAGLSESLYT------DYS 45
Gg GFYSRAVAPG-SALP-AVGRSRLGYNNYYYGQLHVATSPVGPSCCGAVPPLGAQQCSCVP 106 Mm AFYPRPVAPGGAGLPAAVGSSRLGYNSYFYGQLHVQAAPVGPACCGAVPPLGAQQCSCVP 115 Xt GFYNRAVAPT-STLQ-AVTGSRLGFNNYYYGQLHVQT-PMGPSCCGAVQSLGTQQCSCVP 103 Dr GLYSHTGPPA-PNLQ-SVNG-RIGYNNYYYGQLHVQG-PTGPACCGAIPTLGSQQCPCIP 103 Ol ------G----LSPQQCPCIP 11 Ab GLYPAARGPSPPGVHSVSG-TRIGYNGYYYGQLQVQGAGGAPPCCGAVGGLSPQQCPCIP 102 Ach AL------SPPGVHSVGG-TRFGYAGCYYGQLQVQGPGAGPPCCGAVPGLSPQQCPCFP 100 Tr GLYSATCGPSPTGIQPVSGGTRIGYNGYYYGQLHVQASGGGAPCCVSVPSLSPQQCPCIP 105 *..***.*.*
Gg -PAGYEGAGSVLMSPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 165 Mm TPPGYEGPGSVLVSPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 175 Xt PATAYDGAGSVLMPPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 163 Dr --TGYDSAGSVLISPVPHQMMSYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 161 Ol --AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYVNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 69 Ab --AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYVNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 160 Ach --AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYMNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 158 Tr --AGYDSAGSVLLSPVPHQMMSYMNMGSLTRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL 163 ..*:..****:.****:*:.*:*:*:*:******************************
Gg ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENAQKWNKA 225 Mm ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENAEKWNKT 235 Xt ENLFQETKYPDVGTREQLARRVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENTQKWNKS 223 Dr ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENSQKWNKS 221 Ol EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEEPENPQKWNQR 129 Ab EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAK------199 Ach EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRAPN------197 Tr EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESEKSQKWN-- 221 *.******************:*************** .:
B Figura 11.- Comparación de secuencias aminoacídicas de goosecoid de Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados A. Comparación de secuencias aminoacídicas de gsc entre A. charrua (Ach) y A. bellottii (Ab) con Gallus gallus (Gg), Mus musculus (Mm), Xenopus tropicalis (Xt), Danio rerio (Dr) y Orizias latipes (Ol). El recuadro indica el homeodominio. Los aminoácidos fueron coloreados según sus características fisicoquímicas. B. Arbol filogenético radial (unrooted tree) donde se puede observar que todos los peces se agrupan juntos entre sí y separados del resto de los organismos comparados. Hox2.2: gen de D. rerio que contiene también un homeodominio y que se utilizó como gen externo para la comparación. Se eliminó medaka (Ol) para la construcción del árbol debido a que el tamaño de la secuencia comparada no era suficiente.
80 Mm ------MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVESELQAGSEKGD---PTERELRVGLE 47 A Gg ------MGSP--EDAGKAPAYRVDHLLSAVESELQAGSEKGD---PTERELRVALE 45 Xt ------MSTGTAESCGKNLPCRMDHLLTAVENELQVGSEKGD---PTERELKVNLE 47 Ach PRLYTLCFRLVCCVELADNNFTQETAMTMITPSYLGDTIEYSSYASSLVPSSDPLVTAAS 60 Ab ------Ol ------MSASNPDQRLEHLLSAVESEFQKGSEKGD---ASERDIKLTLE 40 Dr ------MSASSPDQRLDHLLSAVESEFQKGSEKGD---ASERDIKLSLE 40
Mm ESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVTADNHRWKYVNG 107 Gg DGELXLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVSVSGLDPNAMYSFLLDFVAADGHRWKYVNG 105 Xt DTDLWIRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKISVTGLDPNAMYSFLMDFVTADNNRWKYVNG 107 Ach VLEFAL-FKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSVLLDFVSADNHRWKYVNG 119 Ab ------FKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSVLLDFVSADNHRWKYVDG 53 Ol DADLWNKFKELTNEMIVTKTGRRMFPVLRASVSGLDPNAMYSVLLDFVAADNNRWKYVNG 100 Dr DAELWTKFKELTNEMIVTKTGRRMFPVLRASVTGLDPNAMYSVLLDFVAADNNRWKYVNG 100 ************.********: .*:*********.*:***:**.:*****:*
Mm EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE 167 Gg EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE 165 Xt EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKMNGEGQIMLNSLHKYE 167 Ach EWVPGGKPEPQTPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE 179 Ab EWVPGGKPEPQTPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE 113 Ol EWVPGGKPEPQSPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLSNKLNGGGQIMLNSLHKYE 160 Dr EWVPGGKPEPQSPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLSNKLNGGGQIMLNSLHKYE 160 ***********:*****************************:**:** ************
Mm PRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKYNPFAKAFLDAKERNDHK 227 Gg PRIHIVRVGGPQRMITSHSFPETQFTAVTAYQNEEITALKIKYNPFAKAFLDAKERNDHK 225 Xt PRIHIVRVGGPQKMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK 227 Ach PRIHIVRVGGPRRMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAK------RANSA 232 Ab PRIHIVRVGGPRRMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHTPSP------160 Ol PRIHIVKVGGIQKMISSQSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK 220 Dr PRIHIVKVGGIQKMISSQSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK 220 ******:*** ::**:*:.****** ****************:.* .
B Figura 12.- Comparación de secuencias aminoacídicas de brachyury de Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados A- Comparación de secuencias aminoacídicas de bra entre A. charrua (Ach) y A. bellottii (Ab) con Mus musculus (Mm),
Gallus gallus (Gg), Xenopus tropicalis (Xt), Orizias latipes (Ol) y Danio rerio (Dr). El recuadro indica la caja T (T-box). Los aminoácidos fueron coloreados según sus características fisicoquímicas. B- Arbol filogenético radial (unrooted tree) donde se puede observar que todos los peces se agrupan juntos entre sí y separados del resto de los organismos comparados. Tbx24Dr: gen de D. rerio que contiene también un dominio de caja-T (T-box) y que se utilizó como gen externo para la
comparación. Se eliminó la secuencia de A. bellottii para la construcción del árbol, debido a que el tamaño de la secuencia comparada no era suficiente.
81 2.3.- Expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en Tiempo Real
A partir de los ADNc obtenidos por retrotranscripción del ARN total de cada estadío, 12 en total (desde el clivaje a embrión de 20 somitos) se analizó la expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en tiempo real. Se decidió usar esta técnica ya que no fue posible una reproducibilidad confiable en los resultados mediante PCR convencional. Para estos ensayos se diseñaron oligonucleótidos específicos para cada gen, que permitieran la amplificación de un fragmento no mayor a 150pb, dado que se ha demostrado que este requisito aumenta la eficiencia de la técnica. Luego de conocer las condiciones adecuadas para estos genes se realizó un ensayo por duplicado donde se analizaron en el mismo experimento los 12 estadíos tanto para gsc, bra y α-tub (como control positivo). El control negativo correspondió a un tubo conteniendo todos los componentes excepto la muestra de templado (ADNc), la que se sustituyó por agua destilada. Los resultados muestran que no existe expresión de ARNm, de ninguno de los 2 genes en estudio, durante el estadío de clivaje (2-8 células). La expresión en ambos casos comienza a partir del estadío 50-90% de epibolia y se mantiene hasta el estadío de somitogénesis (Fig. 13A y B). Por lo tanto con estos resultados corroboramos que tanto gsc como bra estan presentes durante el período de agregación coincidentemente con lo que se observa por hibridación in situ (ver abajo).
82 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 cnt (-) 500 gsc
α-tub
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1- 2-8cel. 2- 30-40% 3- 50-90% 500 4- 100% 5- AI bra 6- AII 7- AIII 8- AIV 9- AV 10- eje α-tub 11- 3som. 12- 20som.
B 0.8 gsc 0.7 bra 0.6
0.5
0.4 1- 30-40% 2- 50-90% 0.3 3- 100% 4- AI 5- AII 0.2 6- AIII 7- AIV 0.1 8- AV 9- eje 10- 3som. 0 11- 20som. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Figura 13.- Estudio de la expresión temporal de goosecoid y brachyury A. Productos de amplificación por PCR de gsc y bra con su respectivo control positivo de α-tub desde clivaje (2-8 células) hasta el estadío de 20 somitos. Tanto en gsc como en bra se detecta producto de amplificación a partir de 30-40% de epibolia (carril 2) hasta el estadío de 20 somitos (12). Cnt (-) representa el control negativo. A la izquierda de cada gel se señalan los tamaños del estándar de peso molecular en pares de bases (pb). B. Se graficaron los valores de cada gen en relación al valor de α-tub en cada estadío. Para el cálculo de la concentración relativa de cada gen en cada punto, se utilizó la fórmula: 2 (Ct α-tub st1 - Ct muestra st.1). Donde st1 representa un estadío en particular y “Ct α-tub st1” representa el valor Ct para α-tub en ese estadío y “Ct muestra st1” el valor Ct del gen en estudio (gsc o bra) para el mismo estadío. Mediante estos cálculos se obtuvo un valor relativo a α-tub, para cada gen en cada estadío. Se eliminó el estadío 2-8cel., ya que se consideró con valor 0. 83 2.4.- Estudio del patrón de expresión de goosecoid y brachyury
A partir de los fragmentos génicos de gsc y bra clonados, se generaron ribosondas específicas que permitieron realizar un análisis del patrón de expresión mediante hibridación in situ, de uno (simple) o de ambos (doble) genes, en Austrolebias. Los resultados de las hibridaciones simples revelan que bra comienza su expresión antes que gsc. La expresión de bra comienza en un grupo de células centrales del AIIIm (Fig. 14A). Dicha marca se aprecia como una agrupación celular de forma circular, que rodea un zona de menor concentración celular en la región central de la marca (Fig. 14A'). Posteriormente, a partir de AIIIt se aprecia la expresión de ambos genes, bra y gsc (Fig 14B y G). El patrón de expresión de bra corresponde a una marca circular más compacta. En este estadío se observan prolongaciones de la tinción, que sugieren el rompimiento de la simetría radial (no es posible aún distinguir el eje antero-posterior del embrión) (Fig 14B’). En el caso de gsc, la expresión comienza en un grupo muy pequeño de células en la zona central del AIIIt (Fig. 14G). A medida que el desarrollo avanza aumenta el tamaño del dominio de expresión de bra y en el estadío AIV la marca se dispone según un círculo central al agregado (Fig. 14C y C’). La expresión de gsc durante el AIV también aumenta de tamaño y cambia de forma a una marca alargada elíptica (Fig. 14H). Durante AV la marca de bra se hace elíptica, afinándose hacia un extremo (Fig. 14D). En el extremo contrario se aprecia una región circular libre de marca (Fig. 14D’, flecha). A partir de éste estadío, AV, se distingue el futuro eje antero-posterior del embrión. Las células que expresan gsc durante el AV se disponen formando una estructura axial, la cual se ensancha hacia el extremo anterior (Fig. 14I), la placa precordal presuntiva. En el estadío de eje inicial la expresión de bra se concentra en el extremo posterior, marcando un dominio celular circular, el cual correspondería al organizador de la cola o “tailbud”. A partir de ese dominio surgue una estructura axial que se marca inténsamente, la notocorda posterior, que está comenzando a formarse (Fig. 14E y E’). La marca de
84 gsc en el estadío de ejei se mantiene ancha hacia anterior y afinada hacia posterior (Fig. 14J).
85
brachyury goosecoid DAPI A A’ L
AIIIm
B B’ G M
AIIIt
C C’ H N
AIV
D D’ I O
AV
E E’ J P ejei
F F’ K Q * ejet
Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury
86 En el último estadío analizado, eje tardío, bra se concentra en la región caudal del embrión (Fig. 14F) marcando claramente parte de la notocorda posterior y el organizador de la cola (Fig. 14F’). El patrón de expresión de gsc en ejet corresponde a un grupo pequeño de células formando un círculo concentrado en el extremo anterior del eje (Fig. 14K). En la secuencia de la figura 15 de L a Q se puede apreciar como cambia la forma del embrión (cuyos núcleos celulares están marcados con DAPI) a medida que el desarrollo transcurre.
Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury A-F patrón de expresión de bra, A’-F’ detalle con mayor aumento del patrón de expresión de bra, analizado en secuencia A-F, G-K patrón de expresión de gsc, L-Q cambios morfológicos del agregado a través del tiempo, marcado con DAPI. A. Inicio de la expresión bra en el AIIIm, se aprecia un grupo de células marcadas al centro del agregado. Con línea punteada se indica el borde aproximado del agregado. A’. Detalle a mayor aumento de expresión de bra al inicio
de su expresión, AIIIm. Un grupo poco compacto de células rodea la región central sin marca. B. Aumento en número de células que expresan bra en el estadío de AIIIt. B’. AIIIm, bra se expresa en un grupo más compacto de células a partir de las cuales se aprecian dos prolongaciones que rompen la simetría radial del agregado (flecha indica una prolongación). C. bra se expresa en un círculo compacto de células al centro del AIV. D. En AV, las células que expresan bra se organizan según una estructura elíptica, afinada hacia el extremo anterior. C’. Expresión de bra en AIV según un círculo central de un número mayor de células. Se aprecian regiones circulares no marcadas. E. En ejei se observa que bra se expresa marcando una estructura axial, la notocorda posterior presuntiva (flecha), y un círculo desplazado hacia posterior, el organizador de la cola. E’. Expresión de bra en ejet, marca región circular posterior, el organizador de la cola y estructura axial, notocorda posterior presuntiva (flecha). F. ejet, la marca de bra está más desplazada hacia posterior. D’. Agregado en RV, bra se expresa formando una elípse, en la región central posterior de la cual se aprecia una zona circular menos marcada (flecha). F’. Expresión de bra en ejet, se aprecia claramente la marca en un segmento de la notocorda posterior (flecha) y en el organizador de la cola (asterisco). G. Inicio de la expresión gsc en el AIIIt, se aprecia un grupo poco compacto de células marcadas al centro del agregado (flecha). H. La expresión de gsc en AIV, tiene forma circular más compacta (flecha). I. En AV gsc marca una estructura axial, la placa precordal (cabeza de flecha),
desplazada hacia anterior. J. Expresión de gsc en ejei como estructura axial ensanchada hacia anterior, la placa precordal. K. En ejet gsc se concentra en la región más anterior del agregado con una marca circular. L. AIIIm marcado con DAPI se aprecia acumulación de células poco compacta en un punto del agregado. M. AIIIt, aumento en compactación de células en zona central del reagregado. N. AIV, agregado circular y con un aumento importante en la concentración de células. O. AV cambio de forma del agregado a elíptico P. ejei, embrión elíptico con región posterior ensanchada. Q. ejet, embrión alargado donde se aprecia eje embrionario coomo estructura axial afinada que ocupa dos tercios del embrión. A partir de AV, donde el eje antero-posterior es identificable, los embriones fueron orientados con su extremo anterior hacia la izquierda. Barras corresponden a 150μm.
87 Se realizó un estudio detallado de la expresión de bra en AV. Para esto se realizaron cortes, transversales y longitudinales, de embriones en AV hibridados para bra (Fig. 15A,C yD). Como se mencionó previamente durante AV bra se expresa según una elipse desplazada hacia la región posterior del embrión, la cual se afina hacia el polo anterior (Fig. 15A). En la zona central de dicha marca se distingue una región circular de menor concentración de marca (indicada con línea discontinua en Fig. 15A). Al analizar los embriones en AV hibridados para bra mediante cortes, se observó que en un corte transversal la marca de bra se presenta como dos engrosamientos simétricos a ambos lados de una región central menos marcada (engrosamientos delineados con lineas discontinuas en Fig 15C). Al centro de dicha zona de menor marca se observa, a su vez, una estructura circular al corte, formada por células que se disponen concéntricas a un punto, la cual podría correspoder a la notocorda en formación (asterisco en Fig. 15C). Los cortes longitudinales revelan que las células que expresan bra forman una estructura engrosada hacia un extremo de la marca (flecha en Fig 15D). El resto de las células marcadas se disponen alineadas y paralelas a la superficie del embrión, disminuyendo su expresión a medida que se alejan de la zona del engrosamiento. Se observó también que bra se expresa intensamente en las células más superficiales del embrión.
88
A A P B C
D 1
B 1 C
C *
D
Figura 15.- Análisis del patrón de expresión de brachyury durante el estadío AV A. Patrón de expresión de bra en AV, se aprecia como las células que expresan bra se concentran formando una estructura elíptica al centro de la cual existen células con menor marca (línea blanca discontinua indica borde de zona menos marcada). El óvalo punteado indica los bordes aproximados del agregado, la flecha A-P indica la dirección del eje antero-posterior. B. Agregado en AV hibridado para bra, cuyos nucleos celulares están marcados con DAPI. En la región donde se expresa bra la marca de DAPI no se aprecia. Se observa una región central a la marca de bra donde se aprecian núcleos marcados con DAPI, por lo tanto pertenecientes a células que no expresan bra (línea discontinua marca borde de dicha región). C. Corte transversal de embrión en RV hibridado para bra (a través de línea discontinua roja en A). Se observa una región central donde se concentran las células que no expresan bra (flecha negra), y dos zonas simétricas a sus lados, donde se concentran las células mesodérmicas que expresan bra (el borde de dichas estructuras se muestra con línea blanca discontinua). El asterisco está debajo de una estructura circular marcada con bra, que probablemente corresponda a la notocorda en formación. D. Corte longuitudinal, a través de la línea discontinua blanca en A. Se observa un engrosamiento formado por células que expresan bra (flecha) hacia un extremo. Hacia el extremo contrario la marca se afina.
89 Cuando se estudió la expresión de ambos marcadores a la vez, mediante hibridación in situ doble, se verificó que la expresión de bra comienza previo a la de gsc, en AIIIm (Fig. 16A). Las células que expresan bra forman una estructura circular al centro del agregado. Posteriormente comienza la expresión de gsc, en un grupo pequeño de células de una región marginal a la marca de bra en el AIIIt (Fig. 16B, flecha), indicando que existe un pequeño grupo de células que expresa ambos marcadores simultáneamente. Posteriormente, y a medida que el desarrollo avanza, ambas marcas se segregan, manteniendose una región central donde se solapan (Fig. 16C). En un embrión al inicio del proceso de agregación IV (AIVi) las células que expresan bra forman una estructura circular compacta y algo alargada, a partir de la cual se aprecia una estructura menor y redondeada de células que expresan gsc (Fig. 16C). Al final de éste estadío, AIV tardío, ambas marcas se han separado aún más, aunque manteniendo cierta superposición al centro del embrión (Fig. 16D). gsc se expresa en células que forman una estructura axial ancha, con un eje mayor de 50μm y un eje menor de 35μm. Las células que expresan bra se organizan formando un círculo de aproximadamente 100μm de diámetro, con una región de menor marca en la zona central posterior (Fig. 16D). Al inicio del proceso de agregación V (AV inicial) se aprecia como las células que expresan gsc se han extendido a lo largo del eje antero-posterior, formando una estructura alargada de 100μm en su eje mayor, la cual se ensancha hacia la región anterior (Fig. 16E). La marca de bra se mantiene como un círculo en contacto con las células que expresan gsc. Al final del proceso de AV (AV tardío) las células que expresan bra se extienden y disponen formando una elípse cuyo extremo anterior se afina. Como se observó previamente, en las hibridaciones simples, se aprecia que en la región central posterior de dicha marca, existen células que no expresan bra (Fig. 16F, flecha blanca). El eje mayor de dicha elipse mide aproximadamente 190μm. En este estadío la marca de gsc ha disminuido en extensión y en la región anterior se concentra la mayor parte de las células que expresan gsc (Fig. 16F). Posteriormente, cuando ya se formó el eje embrionario (eje medio), se aprecia como ambas marcas se distancian disminuyendo su extensión, con patrones de expresión opuestos, concentrándose gsc en la región cefálica y bra en la región caudal (Fig. 16G). El
90 patrón de expresión de gsc recuerda a una flecha, patrón descrito en otros organismos para la placa precordal. En el último estadío analizado, embrión en eje tardío, las marcas de ambos genes están completamente segregadas a los extremos del embrión y se aprecia como bra marca parte de la notocorda posterior (Fig. 16H). Las células que expresan gsc marcan una franja transversal al eje en la región cefálica, donde se están formando las vesículas ópticas (Fig. 16H, flecha).
91 A B
C D
E F
vo G ppc H ntc
Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid (azul) y brachyury (rojo)
92 3. Estudio de mecanismos celulares morfogenéticos involucrados en el proceso de agregación
3.1.- Análisis de destino celular durante la agregación
Con el objeto de determinar el destino de las células que forman el agregado de Austrolebias, se analizaron embriones microinyectados con Kaede y fotoconvertidos en diferentes estadíos del desarrollo. Se realizaron ensayos de fotoconversión en embriones en AI, fotoactivando tanto la totalidad de las células agregadas, como regiones del agregado que abarcaban aproximadamente la mitad del agregado. En todos los ensayos realizados (n=12) se observó que las células fotoactivadas (marcadas con fluorescencia roja) se desplazaban hacia la periferia del agregado, formando inicialmente una corona que rodeaba una estructura central de células más compactadas del agregado, no fotoactivadas (marcadas con fluorescencia verde) (AIV) (Fig. 17).
Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid y brachyury A. Inicio de la expresión de bra en AIIIm, formando un círculo en la zona central del agregado. B. Inicio de la expresión de gsc en región marginal a la marca de bra. Existe solapamiento de un grupo de células que expresa ambos marcadores. gsc marca extremo anterior presuntivo (flecha). Línea punteada indica borde aproximado de agregado. C. AIV inicial, las marcas de gsc y bra se segregan hacia extremos opuestos, pero manteniendo región central de superposición. D. En AIV tardío las células que expresan gsc se organizan según una estructura axial la cual se conecta en la zona central con las células que expresan bra. Estas últimas se disponen formando un círculo, cuya zona central posterior presenta menor marca (flecha). E. AV inicial, la marca de gsc se ha extendido en el eje antero-posterior, formando una estructura axial de unos 100 μm (flecha). bra con una expresión circular está presente en un extremo de dicha marca. F. AV tardío, la marca de gsc se acorta presentando su extremo anterior ensanchado. bra presenta una marca en forma elíptica con su extremo anterior (el que hace contacto con gsc) afinado. Se aprecia una zona de menor marca dentro de la región de expresión de bra (flecha). G. ejei, donde se aprecia la segregación de ambas marcas, gsc hacia anterior marcando la placa precordal (ppc) y bra con una forma elíptica (con el extremo anterior más fino) hacia posterior. H. Segregación completa de ambas marcas hacia los extremos. gsc se concentra en extremo anterior marcando una franja transversal al eje, donde se aprecian las vesículas ópticas en formación (vo). bra se concentra en extremo posterior marcando la notocorda posterior (ntc) y el organizador de la cola (asterisco). Los embriones fueron orientados con su extremo anterior hacia la izquierda.
93 Posteriormente, se observó que el grosor de la corona celular disminuía a medida que el área ocupada por las células centrales aumentaba. Finalmente, las células de la corona se redistribuían formando al inicio una estructura en forma de herradura y posteriormente concentrándose en un polo del agregado en AV (Fig 17A a C). Una vez que se aprecia la formación del eje y se puede distinguir la región cefálica de la caudal, es evidente que la región de acumulación de las células correspondía al futuro extremo posterior del embrión. Por lo tanto en base a estos experimentos, podemos concluir que ninguna de las células del AI forman parte del embrión propiamente tal y que además mantienen un tamaño considerablemente mayor al de células embrionarias (Fig. 17D a F). En la mayoría de los casos cuando el embrión presenta alrededor de 15 somitos, se observan que el AI da origen a células que se localizan en forma simétrica a ambos lados del eje embrionario, pero en una posición profunda, hacia el vitelo. Fotoconversiones en embriones en AII tanto en la región central como en la totalidad del agregado, originó los mismos resultados descritos para el AI, (n=10).
94
A B C
*
AII
D E F
Figura 17.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación temprano A-F. Proceso de agregación celular, donde se observa un grupo de células fotoconvertidas (rojas) y el resto del agregado formado por células no activadas (verdes). A. AII, cuyas células centrales fueron fotoconvertidas (zona de fotoconversión indicada con línea discontinua). B. AIIIt las células fotoconvertidas migran hacia la periferia. C. AV, las células activadas se concentran en la periferia del agregado, acumulándose en un extremo. La zona central del agregado está formada por células no activadas (asterisco). D. Región posterior de embrión en ejem. Se observan las células concentradas en la periferia de dicha región. El eje embrionario está formado exclusivamente por células no activadas (flecha). E-F. Embriones somíticos (3 y 10 somitos, respectivamente), la totalidad de las células activadas se concentran en la periferia de la región posterior del embrión, no formando parte de este (flecha en F indica una células roja externa al embrión).
95 Ensayos de fotoactivación en embriones en AIIIi, (Fig. 18A-E) en los cuales se intentó abarcar a todas las células que formaban el agregado (n=5), evidenció que si bien gran parte de las células fotoactivadas tienen destino extraembrionario y se concentran en la región posterior del embrión, algunas de ellas también forman parte del embrión, ubicándose en la notocorda (Fig. 18G) o formando parte de los somitos (Fig. 18H). Fotoconversiones de embriones en AIIIm, tanto en la región central de éstos como abarcando a la mayoría (90%) de las células del agregado, dio resultados similares a los descritos para AIIIi (Fig. 19A-C, n=8). Sin embargo, se comprobó que existía un aumento muy importante en el número de células que tenian destino a tejidos embrionarios (Fig. 19D-I). Muchas de éstas células se observaron formando parte de un tejido poco compacto de tipo mesenquimático, que se ubicó a ambos costados del tubo neural, desde la región cefálica a la caudal (Fig. 19G-I) Pruebas de fotoconversión tardías, en la zona central de AIV y AV (n=3 en cada caso) mostraron que si bien algunas células permanecen con destino extraembrionario, la gran mayoría, si no todas formarán parte de tejidos embrionarios (ver Tabla 5).
En resumen a partir de estas observaciones podemos decir que: 1- Las primeras células que se agregan (AI y AII) son de destino extraembrionario. 2- A partir de AIIIi comienza la agregación de células embrionarias. 3- Es posible identificar la futura región caudal del embrión a partir de AIV, debido a la concentración de células extraembrionarias de mayor tamaño en un polo del agregado.
Estos resultados fueron muy útiles para los experimentos posteriores, ya que permitieron entender que debíamos focalizar el estudio del proceso de formación del embrión, propiamente tal, a partir del AIIIi.
96 A B C
AIIIi
D E F
G H I
Figura 18.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación medio A. La totalidad de las células del AIIIi fueron fotoconvertidas (células rojas). B. AIIIm, se observa como las células activadas se disgregan mezclándose con otras no activadas. C. AIV tardío, donde se aprecia como la mayoría de las células activadas están concentradas en la región posterior (flecha). La mayoría de las células que forman el agregado no están activadas. D. AV, células activadas concentradas en región posterior. E. Embrión en ejet. La mayoría de las células activadas se encuentran en periferia posterior de embrión, aunque algunas se aprecian mezcladas en región de células no activadas embrionarias (flecha) F. Embrión de 15 somitos. Un grupo de las células activadas se concentra en la zona medial profunda del embrión, debajo de los somitos, formando dos estructuras simétricas a ambos lados del tubo neural. G. Inserto de embrión de 15 somitos (F) donde se aprecian células activadas formando parte de la notocorda (cabezas de flecha). H. Inserto de embrión de 15 somitos (F) donde se aprecia somito formado por células activadas. I. Inserto de embrión de 15 somitos (F) por debajo de somitos donde se aprecian estructuras bilaterales a los lados de tubo neural, formadas principalmente por células activadas. Barras G-I 100μm.
97 A B C
AIIIm
D E F
G H I
Figura 19.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación celular tardío A. Fotoconversión de células correspondientes a la mitad de las células agregadas en AIIIm. B. Durante AIIIt, algunas de las células activadas se concentran en la periferia y otras se mantienen cercanas a la zona central del agregado (flecha). C. AV, la mayoría de las células activadas se aprecian concentradas en el extremo posterior (agregado delimitado con línea discontinua). D a F Embriones somíticos: 3 somitos (D), 10 somitos (E) y 15 somitos (F). Se aprecia que existen células activadas tanto en la periferia, como formando parte del embrión. G a I Insertos correspondientes a la secuencia D a F respectivamente, donde se aprecia como un número importante de células activadas forman parte principalmente de un tejido embrionario, el que se ubica a los costados del tubo neural (flecha en H). Los rectángulos de línea discontinua en D a F señalan la zona donde se tomaron las imágenes correspondientes a G a I.
98 Tabla 5. Ensayos realizados para el estudio del destino celular
Estadío Zona fotoconversión Destino n
AI centro y todo extraembrionario 12
AII centro y todo extraembrionario 10
AIIIi todo Extraembr. y embr. 5
AIIIm centro y todo Extraembr. y embr. 8
AIIIt centro Extraembr. y embr. 5
AIV centro Extraembr. y embr. 3
AV centro Embrionario 3
3.2.- Estudio dinámico, por microscopía en tiempo extendido, del proceso de agregación temprano
A partir de las imágenes en tiempo extendido tomadas tanto con campo claro como con microscopía confocal, se realizó un análisis de la dinámica del proceso de agregación, desde AI a AIV. Además se identificaron distintos tipos celulares por su morfología y comportamiento migratorio. Inicialmente el agregado celular de Austrolebias está formado por células de aspecto mesenquimático, las que migran activamente produciendo filopodios y lamelipodios. Se aprecia que la mayoría de dichas extensiones de membrana se dirigen hacia la superficie, aparentemente contactando con la superficie interna de la EVL. Una vez que un grupo de células coincide en el punto inicial de agregación, disminuye la formación de proyecciones de membrana. En este momento (AII) el movimiento celular dentro del agregado, se hace apenas perceptible. Sin embargo fuera de éste las células mantienen un movimiento activo. El análisis de la dinámica de migración celular permitió extender la descripción de los tres grupos celulares hecha previamente para el AIIIm y definir tres poblaciones nuevas, las cuales se mantienen externas al agregado celular (Fig. 20).
99 3.2.1a.- Poblaciones celulares del agregado
Los criterios para definir las poblaciones celulares se basaron en: morfología celular, tamaño, ubicación en relación al agregado, comportamiento migratorio (tipo de proyecciones de membrana, dirección y velocidad de desplazamiento). Ya que las tres primeras fueron definidas previamente (y se mantuvo su numeración), para ellas se mencionará únicamente la información relacionada con comportamiento migratorio.
Población celular 1.- Células multinucleadas grandes Grupo que representa aproximadamente el 2-5% de células del agregado, distinguibles tempranamente en la zona de agregación y que posteriormente se ubican en la periferia del agregado. Si bien presentan proyecciones de membrana de tipo filopodios, su desplazamiento es casi nulo. Se mantienen ancladas en diversos puntos externos al agregado (Fig. 20B). Otra particularidad de estas células es que son multinucleadas. Durante el proceso de AIIIm se observó que la división de una de éstas células originó 6 células mononucleadas.
Población celular 2.- Células extraembrionarias Población de células redondeadas que representa aproximadamente el 70% del total de células del AIIIi (Fig. 20C). Estas células no emiten prolongaciones evidentes y se desplazan intercalándose unas con las otras, a través de un movimiento oscilatorio. Esto genera que constantemente las células cambien de posición en relación a sus células vecinas. A medida que el desarrollo avanza éstas células se concentran en la periferia del agregado y posteriormente (AIV-AV) en la región caudal del embrión. Esta población celular formará el tejido extraembrionario descrito previamente, identificado mediante los experimentos de destino celular.
100
A
C
D B
E
F
B E E’ . .
C F F’ . .
D G G’ . .
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm
101 Población celular 3.- Células embrionarias Población que corresponde a las células de menor tamaño, las cuales se ubican en la zona central del agregado a medida que el desarrollo avanza. Esta es la población celular embrionaria (Fig. 20D). La descripción de su desplazamiento e internalización dentro del agregado se realizará más adelante (ver sección 3.2.2.).
3.2.1b.- Poblaciones celulares externas al agregado
Población celular 4.- Células periféricas con lamelipodios Población celular mayoritaria dentro del grupo de las células externas al agregado. Presentan características de células migratorias mesenquimáticas, generalmente formando un gran lamelipodio en la dirección de avance de la célula (Fig. 20E). Miden en promedio 60±7μm (n=20). Se encuentran en la periferia del agregado y muchas de ellas permanecen asociadas a la zona externa del agregado. Migran a una velocidad promedio de 0,7±0,3μm/min con movimientos en círculo y un desplazamiento neto reducido (Fig. 20H). Una proporción importante de dichas células parecen migran preferentemente en los bordes de las células que forman la EVL, tejido suprayacente.
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm A. Vista superior de AIIIm, donde se distinguen cinco de las seis poblaciones celulares descritas. Se indican con rectángulos de línea discontinua los lugares de los insertos B a F. B. Célula perteneciente a la población 1 (borde indicado con línea discontinua), de gran tamaño, multinucleada, la que se mantiene en la periferia del agregado. C. Células pertenecientes a la población 2 (una célula delimitada con línea discontinua). Son las primeras células que se agregan y en este estadío se aprecian epitelializadas. D. Célula perteneciente a la población 3 (indicada con flecha y borde con línea discontinua), las de menor tamaño intercaladas entre células de la población 2. Corresponden a las células embrionarias. E. Célula perteneciente a la población 4. Células periféricas, pero cercanas, al agregado, que forman grandes lamelipodios. F. Célula de la población 5, externa al agregado, que forma proyecciones de membraba de tipo blebs. G. Célula de la población 6 (indicada con flecha y borde con línea discontinua). Célula que pasa esporádicamente por la zona de agregación a gran velocidad, formando filopodios y lamelipodios en diferentes direcciones. E’, F’ y G’. Representación esquemática de caminos hechos por dos células pertenecientes a las poblaciones 4 (E), 5 (F) y 6 (G), respectivamente. Con un punto azul se indica el lugar desde donde parte el movimiento y con cabeza de flecha la dirección del desplazamiento.
102 Población celular 5.- Células formadoras de blebs Grupo celular reducido en número pero que se aprecia con una distribución aleatoria (dentro y fuera) por toda la suerficie del huevo. Formado por células redondeadas cuya característica principal es que forman numerosas proyecciones de membrana de tipo bleb con un desplazamiento no direccional, en círculos (Fig. 20F, F’). La velocidad promedio de desplazamiento es de 0,7±0,4μm/min (n=5).
Población celular 6.- Células migratorias rápidas Población de células externas al agregado formada por células de movimiento rápido que se ubican por toda la superficie del huevo y que esporádicamente pasan por la zona de agregación, a una velocidad promedio de 4,9±2μm/min (n=5). Presentan formas diversas (alargadas de tipo bipolar, triangulares, filiformes, etc.) y forman lamelipodios en diferentes direcciones, generando un desplazamiento direccional que puede cambiar de sentido muy rápidamente (Fig. 20G, G’). Al pasar por el agregado diminuyen su velocidad, pero una vez que lo atraviesan aceleran nuevamente su desplazamiento.
3.2.2.- Epitelialización y migración centrípeta de células embrionarias durante la agregación
Al inicio del proceso de agregación (AI) el embrión está formado únicamente por células de tipo mesenquimático, de formas diversas, muchas de ellas alargadas de tipo bipolar (Fig. 21A y B). Estas células migran activamente emitiendo filopodios en todas direcciones, mediante los cuales se contactan tanto entre ellas como con la EVL. A medida que tiempo transcurre el número de células en la zona de agregación aumenta pero todavía presentan morfología de células mesenquimáticas, y se mantienen distanciadas unas de otras (AI tardío, Fig. 21B).
103
A B
AI inicial AI tardío
C D
*
AII inicial AII tardío
E F
AIIIi AIIIm
G H I *
Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana
104 Durante AII si bien existe una población importante de células migratorias y de aspecto mesenquimatoso, las células al centro del agregado se aproximan, dejan de emitir proyecciones de membrana, generando un grupo celular más compacto de aspecto epitelial con células de morfología poliédrica (AII inicial, asterisco Fig. 21C). Estas células pertenecen a la población 2, descrita previamente, las cuales formarán un tejido extraembrionario caudal, tardíamente en el desarrollo. A medida que el proceso de agregación avanza, los contactos celulares aumentan, y se forma una monocapa celular compacta (AII tardío, Fig. 21D y corte óptico transversal). En la periferia de esta población celular, se aprecia un número reducido de células grandes y alargadas cuyo desplazamiento es casi nulo (población 1). El proceso de transición entre una monocapa y el agregado celular multicapa, está representado por el AIIIi. A partir de éste momento se aprecia como las células que forman el agregado se agrupan en diversos puntos formando estructuras supracelulares epitelializadas (AIIIi, Fig. 21E). Si bien las regiones libres de células han disminuído considerablemente, aún se aprecian algunos pequeños espacios entre estas agrupaciones celulares epiteliales. En AIIIi se pueden distinguir la aparición de células en zonas más profundas del agregado (ver corte óptico transversal de AIIIi en Fig. 21E).
Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana A. AI temprano, formado por pocas células de aspecto mesenquimático, que forman filopodios, lamelipodios y lobopodios (flecha). B. AI tardío, aumento en el número de células mesenquimáticas, las que se contactan emitiendo una red de filopodios (cabezas de flecha). C a F. Vista superior y cortes asociados (transversales en el eje z), durante el proceso de agregación temprano (RII a RIIIm). C. AII inicial, se aprecian células migratorias mesenquimáticas (flecha) migrando hacia el agregado celular. Existe zona de células agregadas previamente (asterisco), las cuales se mantienen como una monocapa (ver corte transversal asociado). D. AII tardío, se observa como las células aumentan sus contactos (región delimitada con línea punteada), aún existen células migratorias que se incorporan al agregado (flecha), el cual se mantiene como una monocapa (ver corte) E. AIIIi, las células agregadas se reorganizan comenzando la internalización de células individuales (ver flecha en corte asociado) F. AIIIm, de aspecto epitelial, con células en estrecho contacto que se internalizan. Se aprecia la formación de estructuras organizadas supracelulares, con aspecto de rosetas (borde de una roseta delíneado con línea discontinua). G. Inserto de F (al nivel indicado con rectángulo). Se muestra una roseta, la cual se define como una célula central
redondeada (asterisco) rodeada en general por seis o más células, cuyas membranes laterales están en estrecho contacto. H. Representación según un modelo 3D de la roseta mostrada en G. I. Representación según un modelo 3D de una vista inferior de la roseta mostrada en G. Se aprecian las proyecciones de membrana de tipo lobopodio, que emiten éstas células (flechas) en diferentes direcciones. Barras C a F, 80μm y G 30μm. 105 Desde el inicio del proceso de AIIIm se observan en la zona central del agregado la formación de estructuras supracelulares organizadas en forma de rosetas (Fig. 21F) formadas por una célula central rodeada de al menos seis células, cuyas membranas laterales se aprecian en estrecha aposición (Fig. 21G, H y I). Estas agrupaciones celulares son las primeras estructuras supracelulares distinguibles durante el proceso de agregación temprano (desde el inicio de AIIIm) y serían un indicio del proceso de epitelialización que sufre el embrión en éste período. Mediante la segmentación y reconstrucción en 3D de dichas estructuras en roseta, se pudo apreciar que en general las células que las componen forman proyecciones de membrana de tipo lobopodios, tanto hacia la superficie como hacia zonas profundas, mediante los que se contactan con las células vecinas (Fig. 21H,I). En el AIIIm temprano y a medida que el desarrollo avanza, se puede apreciar como células de menor tamaño, las células embrionarias pertenecientes a la población celular 3, comienzan a intercalarse entre los agregados de células extraembrionarias de aspecto epitelial (Fig. 22A y D). Las células embrionarias posteriormente migran en forma centrípeta, concentrándose en la zona central del agregado (AIIIm intermedio). Concomitantemente las células extraembrionarias, que originalmente se encontraban formando diversas agrupaciones supracelulares de aspecto epitelial en la zona central del agregado, se desplazan hacia la periferia, inicialmente quedando como grupos separados de células, en distintas zonas de la periferia del agregado (Fig. 22B y E). A medida que las células embrionarias se concentran en el centro del agregado, las células extraembrionarias se reorganizan en la periferia formando un tejido coherente, con aspecto de corona (Fig. 22C y F).
106
A A’ *
AIIIm
B B’
C C’
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de estadío AIIIm
107 3.2.3.- Análisis del proceso de internalización celular en AIIIm
Debido a que el período de agregación involucra aproximadamente 5 días de desarrollo, para el análisis del proceso de internalización del endomesodermo fue necesario centrar el estudio en un período acotado del desarrollo. Mediante los experimentos de destino celular se pudo entender que: 1- Los AI y AII corresponden a una monocapa celular de tejido extraembrionario. 2- La formación del embrión multilaminar ocurre a partir del AIIIi.
Por lo tanto, el análisis de los eventos de internalización de células embrionarias, se centró en el proceso de AIII. Como se mencionó previamente, el período de AIII dura aproximadamente 65hs y para su descripción fue necesaria su subdivisión en AIIIi, AIIIm y AIIIt. El análisis celular del proceso de internalización se concentró en el período intermedio del AIIIm, este estadío dura 35hs. Se estudió el proceso de internalización celular en la región central del AIIIm intermedio, mediante microscopía confocal en 3 dimensiones, cubriendo un período de 3 horas. Para analizar el desplazamiento de células individuales en el eje z, a través del tiempo se utilizó una herramienta (Slice) en el programa Volocity, la cual permite realizar cortes ópticos del embrión.
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de estadío AIIIm A. Agregado al inicio de AIIIm. Se aprecian células grandes y poliédricas (extraembrionarias, población 2) desplazadas hacia la periferia (flechas). Las células embrionarias (asterisco) de menor tamaño se aprecian abarcando todos los espacios entre las células extraembrionarias, distribuidas por toda la superficie del agregado. A’. Núcleos (canal rojo) correspondientes a células de A. Los núcleos de las células extraembrionarias son más grandes y brillantes que los núcleos de las células embrionarias. Las células embrionarias muestran una distribución amplia en el agregado. B. AIIIm intermedio. Las células embrionarias se concentran hacia la zona central del agregado mientras las células extraembrionarias se mantienen en la periferia. B’. Núcleos (canal rojo) correspondientes a células de B. Se aprecia movimiento centrípeto de núcleos embrionarios (flechas), mientras que núcleos extraembrionarios se mantienen en la periferia. Disminución en el área central del agregado ocupada por nucleos embrionarios. C. AIIIm tardío. Células embrionarias concentradas en zona central y rodeadas por una corona de células extraembrionarias (corona indicada por llave). C’. Núcleos (canal rojo) correspondientes a células de C. Concentración de núcleos en zona cetral con disminución en el área transversal ocupada por estos. De A’ a C’, línea discontinua marca borde aproximado de área ocupada por células embrionarias. Barra 100μm.
108 El AIIIm intermedio consta de varias capas de células. Como se describió previamente, las células embrionarias son pequeñas (aproximadamente 15μm) y se concentran en la región central del agregado. Rodeando ésta zona central existe un tejido extraembrionario de células de mayor tamaño (aproximadamente 30μm). El análisis dinámico de éste estadío, se focalizó en la zona central del agregado, a fin de estudiar el movimiento de las células individuales. En general el tejido es de aspecto epitelial con células poliédricas que no muestran proyecciones de membrana evidentes, y cuyas membranas se encuentran en estrecha aposición (Fig. 23A). El tamaño entre las células es heterogeneo observándose dos poblaciones principales: células muy grandes (población 1, asterisco en Fig. 23A), y células de tamaños comprendidos entre 14-25μm. Debido a que en este estadío las células extraembrionarias deberían estar desplazándose a la periferia, se presume que la mayoría de las células centrales son embrionarias. De todos modos para el seguimiento de células individuales se intentó evitar las células de mayor tamaño, centrando el estudio en las más pequeñas (células marcadas de azul de Fig. 23A). En el plano superficial (x-y), se pudo apreciar que existen células cuya superficie disminuye paulatinamente a medida que la célula se profundiza, hasta que desaparece. A medida que esto ocurre las células vecinas ocupan el espacio dejado por la célula que se internaliza. A su vez se aprecia la aparición de células nuevas en el plano, por emergencia desde posiciones más profundas del agregado (células 1 y 2 en Fig. 23B a E). Este evento se aprecia inicialmente como la aparición de células circulares de pequeño diámetro, cuyo volumen va aumentando a medida que desplazan a las células vecinas, hasta que finalmente se integran al tejido. En el transcurso de la animación analizada (3 horas) se observaron 35 eventos de internalización y emergencia de células, en total.
109
Internalización
A B-E EVL F-J F
2 1 * G
H
Intercalación B C D E I
2 1 2 1 2 1 2 J 1
Figura 23.- Proceso de intercalación (B-E) e internalización (F-J) en estadío de AIIIm A. Vista superior de AIIIm según un corte óptico en el plano x-y. En amarillo y con borde delimitado con línea discontinua, se indica una célula en proceso de intercalación (seguimiento en B-E). En azul y con borde delimitado con línea discontinua, se observan células pequeñas que se están internalizando. La línea discontinua más gruesa indica lugar donde se realizó el corte óptico en el eje z (F-J). Asterisco indica el núcleo de célula grande multinucleada (población 1). B-E. Seguimiento en el plano x-y de célula en proceso de intercalación (en amarillo). 1 y 2 indican células que están emergiendo desde planos más profundos, además son puntos de referencia para ver desplazamiento de célula que se intercala. F-J. Vista según un corte transversal en el eje z (indicado en A como línea discontinua), donde se realizó un seguimiento de células en proceso de intercalación (amarilla) y de internalización (azul). Se aprecia como célula azul cambia de forma, disminuyendo su contacto con la superficie (EVL, indicada con línea discontinua roja) hasta que finalmente (J) se desprende de esta. La célula amarilla está en proceso de intercalación con células vecinas. La célula se desplaza en el plano x-y, entre dos células vecinas, hasta que desaparece del plano de corte (línea discontinua en I). Las barras en B y F representan 20μm.
110 Otro proceso que fue posible observar fue el desplazamiento de células a lo largo del plano x-y y la intercalación entre células vecinas a una velocidad aproximada de 0,6μm/min (Fig 23B a E). Debido a que muchas de las células que se internalizan simultáneamente se intercalan en el plano x-y, su seguimiento en el eje z no fue fácil, ya que a medida que se intercalan desaparecen del plano de estudio (ver célula amarilla Fig. 23F a I). Por ello del total de eventos de internalización detectados por el análisis en el plano x-y (20 eventos), solo fue posible realizar el seguimiento en el eje z de seis. Para el seguimiento de células individuales en el eje z, se intentó mantener en todo momento el nucleo de la célula en foco. Inicialmente, las células están en contacto con la superficie interna de la EVL. Por lo tanto en el corte óptico se aprecia una zona de la membrana celular paralela y en contacto con la superficie de la EVL (célula azul en Fig. 23F). A su vez las células vecinas se aprecian en estrecho contacto unas con otras. A medida que el tiempo transcurre se observa una deformación general de la célula que está en proceso de internalización, la cual disminuye su superficie de contacto con la EVL. Por lo tanto dicha célula, adquiere el aspecto de “célula en botella”, afinando su extremo superior (hacia la EVL) y ensanchando el extremo contrario, en la dirección del movimiento. Aproximadamente 15 minutos después, la célula se desprende de la superficie, perdiendo contacto con la EVL y delaminándose como una célula individual hacia una región más profunda del agregado (célula azul Fig. 23F a J). La continuidad el epitelio no se pierde, ya que el lugar de la célula que se internaliza es simultáneamente ocupado por células vecinas.
111 Discusión
La existencia de mecanismos de desarrollo divergentes en los peces anuales del género Austrolebias, induce a buscar explicaciones causales en las presiones selectivas a que ha estado sujeto este grupo animal durante su historia evolutiva. Esto es particularmente evidente para la estrategia de diapausas, una adaptación de clara utilidad en el ambiente natural de las especies de éste género. Sin embargo, el desarrollo de Austrolebias no sólo esta sujeto a diapausas sino que existe una manifiesta variación en la secuencia de eventos morfogenéticos que llevan a la formación del eje embrionario, comparado con otros teleósteos. El análisis descriptivo de los mecanismos de desarrollo en un rango diverso de especies de peces teleósteos, ha mostrado una fuerte conservación en aspectos fundamentales como la simultaneidad de la epibolia con la formación de un escudo embrionario, producto de movimientos de involución y convergencia (Kimmel et al., 1989). Esta conservación en especies pertenecientes a diversos órdenes ha llevado a establecer estas características como "ancestrales" en los teleósteos. En Austrolebias, así como en otros peces anuales, existe un desacoplamiento entre la epibolia y la formación del eje embrionario, generándose una estrategia aparentemente disímil para la obtención de un embrión somítico. Por lo tanto, la conclusión más obvia es que Austrolebias posee características de desarrollo embrionario derivadas, y probablemente recientes. Nuestra hipótesis inicial, que planteaba que el patrón de gastrulación de Austrolebias se asemejaría a aquel presente en aves, resultó ser incorrecta. Austrolebias parece gastrular como otros peces teleósteos, aunque presenta diferencias mecanísticas y temporales en las etapas tempranas de la gastrulación. Esto último podría ser producto de presiones selectivas, que actúarían sobre la embriogénesis misma, más que sobre las características morfológicas, fisiológicas o conductuales del individuo adulto.
112 1.- El blastoporo en Austrolebias: ¿sin surco y con anillo?
En esta tesis hemos centrado el estudio de la gastrulación en peces del género Austrolebias, donde el embrión temprano se forma a partir de un grupo de células agrupadas sobre una gran masa de vitelo, las cuales migran y se organizan para formar las hojas y eje embrionario. Durante este trabajo el interés estuvo centrado en entender si estos peces, cuyo patrón de desarrollo embrionario es marcadamente diferente al de otros peces utilizan mecanismos morfogenéticos y estrategias celulares propios del grupo filogenérico al que pertenecen a la hora de internalizar el endomesodermo, formar el blastoporo y organizar su eje embrionario. Se intentó contestar dos preguntas principales. Primero, ¿por dónde y cómo se internalizan las primeras células endomesodérmicas en Austrolebias? En este contexto, se estudio si el embrión de Austrolebias que por su morfología se parece a un embrión temprano de pollo (de tipo discoidal) forma un blastoporo en forma de línea/surco, o si más bien forma un anillo como consecuencia de su pertenencia filogenética al grupo de los peces teleósteos. Segundo, se preguntó si existe y donde se localiza el organizador de Spemann en Austrolebias. Estas interrogantes fueron abordadas desde diversas aproximaciones. Para responder la primera interrogante, se evaluó a través de cortes histológicos seriados de los diversos estadíos de la gástrula, si morfológicamente era posible identificar estructuras similares a un surco primitivo. Los resultados, demostraron la inexistencia de un surco, al menos como aquel observado en el embrión de pollo. Para responder a la segunda de las interrogantes, se examinó el perfil temporal y espacial de expresión de dos genes característicos de poblaciones celulares que se internalizan en la gástrula de los vertebrados. brachyury (bra) es un gen marcador del mesodermo presuntivo, el cual se internaliza a través del blastoporo. Analizar el patrón de expresión de este gen, tiene la doble virtud de permitir evidenciar por un lado las células panmesodérmicas tempranas y por otro revelar la morfología del blastoporo en el organismo en estudio. goosecoid (gsc) es un marcador del organizador, que se expresa en las primeras células dorsales axiales que se internalizan.
113 Mediante el estudio del patrón de expresión de bra y gsc durante el proceso de agregación y formación del eje embrionario, se pudo constatar que:
1- bra inicia su expresión antes que gsc y lo hace en el estadío de AIIIm. 2- El patrón de expresión temprano de bra corresponde a una región circular al centro del agregado. 3- La expresión de gsc se inicia en un grupo pequeño de células, en una zona marginal a la marca de bra y con una región de solapamiento, marcando el extremo anterior presuntivo del embrión. 4- En estadíos de AIV tardío y AV se observa una zona central de células que no expresan bra, evidenciando posiblemente un patrón de expresión en anillo. 5- En estadíos tardíos ambos genes se expresan en dominios opuestos y complementarios, marcando estructuras características comunes a otros vertebrados: notocorda posterior (bra) y placa precordal (gsc).
Estos resultados sugieren que una vez comenzado el proceso de gastrulación en Austrolebias, se forma un blastoporo por donde ocurre la internalización del endomesodermo y en el cuál las células panmesodérmicas expresan bra. A su vez la expresión subsecuente de gsc señala la formación del organizador, cuyas células se solapan inicialmente con las células mesodérmicas que expresan bra. Además, la expresión inicial de gsc evidencia por primera vez el eje antero-posterior (A-P), ya que se expresa en la futura región anterior del embrión. En estadíos más tardíos la existencia de células centrales a la marca de bra que no expresan dicho gen, sugiere que existiría una estructura en forma de anillo por donde ocurriría la internalización de las células endomesodérmicas, región que sería homóloga al blastoporo del embrión típico de peces teleósteos. Posteriormente las células, presumiblemente internalizadas y que expresan gsc, se desplazan hacia la región contraria (anterior) a aquellas que expresan bra (posterior). Dada la función ampliamente conservada de estos dos genes en la evolución (Schulte-Merker, et al., 1994, Gont et al., 1993, Herrmann, 1990), podemos concluir que ellos marcarán los
114 precursores de estructuras características como la placa precordal (gsc) y la notocorda posterior (bra). El análisis de estos resultados pone de manifiesto ciertas diferencias con lo descrito para otros teleósteos. Debido a que tardíamente se aprecia un blastoporo que se asemeja a un anillo, la observación inicial de la expresión de bra formando un círculo, podría deberse a las características propias del agregado. El estadío AIIIm corresponde a un agregado celular compacto, donde las celulas centrales están formando múltiples capas a distintos niveles del eje z. Es posible que las células mesodérmicas que expresan bra se estén internalizando por el márgen de un anillo, de manera análoga a lo que ocurre en pez cebra en las etapas intermedias de la epibolia (Warga & Kimmel, 1990). Una posibilidad de que el las etapas tempranas no se aprecie la formación de un anillo podría ser debido a lo reducido del espacio en el cual este proceso tiene lugar en Austrolebias. Esto explicaría el porque es posible apreciar la región central libre de expresión de bra, sólo una vez que el agregado crece y se expande (estadío AV). Por lo tanto, es posible que la internalización del endomesodermo en Austrolebias ocurra a través de un anillo, de manera análoga a cómo ocurre en pez cebra, por ejemplo. A futuro, la realización de cortes traversales de embriones tempranos hibridados para bra, posiblemente dará luces respecto a este punto. Estas observaciones nos llevan a concluir que la diferencia entre la gastrulación de Austrolebias y la de otros peces teleósteos no sería el modo de internalizar el endomesodermo (en relación a la morfología del blastoporo), sino más bien el hecho de que este proceso esté desacoplado con el proceso de la epibolia. El embrión de pez cebra durante el proceso de epibolia presenta una alta densidad de células, y a medida que este proceso transcurre, el blastodermo se aprecia como una capa celular compacta migrando hacia el polo vegetal (Warga & Kimmel, 1990). Cuando comienza la internalización del endomesodermo por todo el borde del blastodermo, el blastoporo consiste en un anillo en torno a una gran masa de vitelo. El huevo de Austrolebias mide aproximadamente 1mm de diámetro (pez cebra aproximadamente 0,7mm), sin embargo tiene alrededor de 10 veces menor cantidad de celulas que el pez cebra, al inicio de la epibolia (Wourms, 1972b). Por lo tanto el
115 embrión de Austrolebias cubrirá una superficie similar con un número muy reducido de células. Si además consideramos que la epibolia está desacoplada con la gastrulación, es evidente que al final de la epibolia el embrión consistirá en células dispersas por todo el huevo. Por lo tanto para que la gastrulación pueda tener lugar, será necesaria la agrupación y organización de dichas células. Una vez que el agregado se formá probablemente la internalización del endomesodermo ocurra a través de un anillo pero ahora (sin el vitelo en medio) el aspecto del embrión es muy diferente. Este proceso único de agregación celular, previo al inicio de la gastrulación, genera una arquitectura celular nueva, la cual obligaría a una adaptación de los procesos inductivos a dicha morfología (a través del YSL, tejido extraembrionario, etc.). Este desacoplamiento también podría estar influenciando la velocidad a la cuál ocurre el proceso de internalización y migración de las células embrionarias. En pez cebra el acoplamiento de la gastrulación con la epibolia, favorecería el proceso de gastrulación, y la extensión del eje embrionario a lo largo del eje A-P o animal- vegetal. De esta forma la falta de dicho acoplamiento podría explicar en parte, la lentitud del proceso de gastrulación y extensión del eje embrionario en Austrolebias.
2.- Tejido extraembrionario posterior: ¿posible función instructiva de la formación del embrión?
El agregado celular corresponde a un grupo de células que se congrega en una región del embrión de peces del género Austrolebias a partir del cual, y luego de un proceso de aproximadamente cinco días, se forma el eje embrionario. mediante estudios preliminares se pudo identificar que el agregado se forma posiblemente en el hemisferio vegetal del huevo, posteriormente a la culminación del proceso de epibolia. El agregado celular temprano (estadíos AI y AII) está formado por un grupo de células ajenas al embrión propiamente tal (extraembrionarias). Estas células son las primeras que se agregan y van siendo desplazadas del centro del agregado por las células embrionarias a medida que avanza el desarrollo. Eventualmente, las células
116 iniciales del agregado se desplazan hacia la periferia y posteriormente se localizan en la región caudal del embrión. En el embrión de pollo es conocida la formación temprana de varios tejidos de destino extraembrionario. Por ejemplo, se ha descrito que el hipoblasto primario juega un papel central como antagonista de la formación de ejes múltiples; ya que su remoción induce la formación de líneas primitivas ectópicas (Bertocchini & Stern, 2002). El hipoblasto es uno de los tejidos que se forma más tempranamente en el embrión de pollo y expresa Cerberus el cual inhibe a Nodal, expresado por el epiblasto. La línea primitiva solo se puede formar una vez que el hipoblasto ha sido desplazado por otro tejido extraembrionario, el endoblasto, el cual no expresa Cerberus. Por lo tanto este mecanismo controla tanto el momento, como la posición en que se forma la línea primitiva (Bertocchini & Stern, 2002). Además se ha visto que el hipoblasto expresa gsc una vez que está formado y durante todo el transcurso de su desplazamiento hacia anterior (Bachvarova et al., 1998). La influencia más temprana en la inducción de la línea primitiva esta dada por la zona marginal posterior (PMZ) este corresponde a un tejido extraembrionario, que se concentra en la región posterior del embrión de pollo (Bachvarova et al., 1998). En esta zona se ha visto que la actividad de Vg1 y Wnt se solapan, induciendo la expresión de Nodal en el área vecina del epiblasto. Nodal únicamente puede actuar (presumiblemente induciendo la formación del endomesodermo) una vez que el hipoblasto a sido desplazado por el endoblasto (Skromne & Stern, 2001). Se propone que la PMZ podría actuar como un análogo al centro de Nieuwkoop de anfibios, induciendo un eje completo, incluído el organizador, pero sin realizar una contribución celular directa (Bachvarova et al., 1998). En el caso del pez cebra los determinantes dorsales están localizados en la zona vegetal de la capa sincicial del vitelo (YSL). En la formación correcta del eje embrionario, el YSL tiene dos funciones fundamentales: (1) la translocación de los determinantes dorsales, que originalmente están en la zona vegetal, a las blastómeras dorsales, generando una actividad dorsalizante tanto del YSL dorsal, como del margen dorsal del blastodermo que está por encima (Jesuthasan & Strahle, 1997) y (2) la generación de la señal requerida para la inducción de genes
117 que se expresan en el margen lateral y ventral del blastodermo (Schneider, et al., 1996). Aún no se conocen los determinantes dorsales localizados en el polo vegetal, ni los factores liberados por el YSL. Sin embargo se sabe que su función estaría mediada, al menos en parte, por señales de β-catenina y Nodal (Schier, 2004). El patrón dorso-ventral dentro de la gástrula depende del establecimiento de centros señalizadores mutuamente antagónicos que involucran la liberación de moléculas como Chordin y Noggin, las cuales se expresan dorsalmente en el organizador, y moléculas de BMP (de la superfamilia TGF-β) las cuales se expresan en la región ventral (Schneider, et al., 1996). Esto lleva a la formación de un gradiente dorso- ventral de BMP el cual establece el patrón dorso-ventral del mesodermo y neuroectodermo (Köpper & Heisenberg, 2005). En Austrolebias las primeras células en agregarse formarán entonces un tejido extraembrionario de destino desconocido. La existencia de este tejido extraembrionario, podría estar jugando un rol inductivo e instructivo, en relación al momento y lugar en el cual debe ocurrir la formación del embrión. En el pez cebra, el tejido extraembrionario temprano involucrado en el establecimiento de patrones es el YSL (Jesuthasan & Strahle, 1997). Este sincicio es el encargado de transmitir señales (luego de la acumulación de β-catenina en la región dorsal – centro de Nieuwkoop) que permiten el estableciemiento del eje dorso-ventral del embrión. El hecho de que la agregación celular en Austrolebias ocurra en un punto determinado en el polo vegetal del huevo, probablemente esté también determinado tempranamente por factores presentes en el YSL. Las células tempranas del agregado podrían en ese contexto, servir de nexo, permitindo que las señales inductoras del YSL sean transmitidas o propagadas a las futuras células embrionarias. Es posible que, en Austrolebias, el establecimiento de los ejes antero- posterior y dorso-ventral requieran de la combinatoria de señales tempranas, provenientes tanto del YSL, para el establecimiento del sitio de agregación y de las células extraembrionarias que se agregan tempranamente. Si el mecanismo por el cual actúa el tejido extraembrionario en Austrolebias fuera similar al que se conoce en pollo, existen al menos dos posibles funciones:
118 (1) inhibir la formación del embrión tempranamente, para lo cual sería necesario su desplazamiento hacia la periferia primero, y finalmente hacia la región posterior, para que el embrión se forme, (2) dar identidad a la región posterior del embrión, a partir de la cual, el embrión crecerá en dirección posterior-anterior (ver más abajo). En el caso 1, el tejido extraembrionario estaría actúando de modo similar al hipoblasto primario en pollo. Por lo tanto su función sería la de controlar tanto el momento como la posición en la formación del embrión, ya que inhibiría la formación de éste y por lo tanto sería necesario su desplazamiento para que este proceso se revirtiera. Sin embargo existen dos diferencias principales con el tejido extraembrionario en Austrolebias: (1) el hipoblasto se concentra en la región anterior del embrión y (2) expresa gsc durante todo el proceso. En el caso 2, el tejido extraembrionario estaría cumpliendo una función similar a la PMZ (zona marginal posterior). Este tejido está tempranamente concentrado en la región posterior del embrión de pollo y actúa como un análogo al centro de Nieuwkoop de anfibios, induciendo un eje completo, incluído el organizador, pero sin realizar una contribución celular directa. En apoyo a esta última posibilidad, podemos considerar una observación fortuita que se realizó a partir de los experimentos de destino celular con Kaede. En estos experimentos la fotoactivación de las blastómeras profundas (BP) además fué acompañada de la fotoactivación de las celulas de la capa celular envolvente (EVL), localizadas sobre el agregado. Estas células resultaron ser un buen punto de referencia dentro del embrión, ya que durante la agregación no existe un desplazamiento real de ellas sino más bien un cambio de morfología. Una observación recurrente fue que las células de la EVL fotoactivadas siempre coincidían con la región caudal de embriones tardíos. Ya que es poco probable que el embrión logre desplazar a estas enormes células a medida que crece su región caudal, la explicación más plausible de este fenómeno, es que el agregado crece únicamente en dirección cefálica, manteniéndose la región caudal fija durante todo el proceso.
119 En el pez cebra los procesos de epibolia y gastrulación están acoplados. Por lo tanto, a medida que se forma el eje embrionario se aprecia un desplazamiento de todo el embrión hacia el polo vegetal. Sin embargo al analizar el proceso de gastrulación propiamente tal, las células endomesodérmicas se internalizan y migran, primero convergiendo hacia dorsal, y luego hacia el polo animal, organizando los distintos tejidos que formarán el eje embrionario. Por lo tanto también en pez cebra el proceso de formación del eje, luego de la internalización del endomesodermo, es en dirección caudal-cefálica (o vegetal-animal), con la diferencia de que el proceso de epibolia genera un desplazamiento neto de todo el embrión hacia el polo vegetal. Por lo tanto si el tejido extraembrionario en Austrolebias cumple la función de indicar o delimitar la región presuntiva posterior del embrión, es posible que a partir de esa zona se forme el embrión en dirección caudal-cefálica. A diferencia del pez cebra en Austrolebias este proceso ocurriría independientemente al de epibolia, no apreciándose un desplazamiento del embrión hacia el polo vegetal. El estudio de cortes semifinos reveló la presencia de una estructura esferoidal en el extremo posterior del embrión, la cual expresa bra en estadíos de eje. Esto es semejante a lo observado en pez cebra en el mismo estadío, y podría corresponder al organizador de la cola o “tailbud” en la cual continúan internalizándose células tardíamente, vinculado al desarrollo de estructura caudales del embrión de pez cebra (Kanki & Ho, 1997). Otra observación a partir de los experimentos de Kaede, fue que el grupo de células extraembrionarias del agregado temprano, se deplazan hacia regiones mediales del embrión somítico, concentrándose como dos estructuras bilaterales al eje embrionario. Al analizar que ocurre con las células de la EVL que fueron fotoactivadas en forma concomitante, se observó que ellas continúan sobre el tejido extraembrionario, pero ahora en la región medial del embrión. Esto sugiere que en estadíos tardíos el embrión comenzaría a extenderse en la dirección cefálica-caudal, al igual que en pez cebra, a expensas del organizador de la cola. En el contexto de lo discutido anteriormente, sería muy útil contar con un análisis temprano (final de epibolia, estadíos AI y AII) de la expresión de genes
120 conocidos como marcadores del PMZ de pollo y que cumplen funciones homólogas al centro de Nieuwkoop. Por ejemplo se podría analizar la expresión de wnts (wnt8c o wnt11) o también analizar si β-catenina se concentra tempranamente en alguna región del huevo, marcando lo que será la futura región dorsal del embrión. Además y con la finalidad de entender la función que cumple este tejido, sería interesante transplantar células del tejido extraembrionario en la zona contraria a la formación del agregado temprano. Mediante esta aproximación sería posible analizar si este tejido es capaz de inducir la formación de un eje secundario en Austrolebias. A su vez la remoción total de estas células, aportaría información en el mismo sentido.
121 3.- ¿Cómo se forma un embrión a partir de un grupo de células?
Si bien dentro de los objetivos de esta tesis no estaba incluido el análisis celular del proceso de iniciación de la agregación, los datos obtenidos a partir de las observaciones en tiempo extendido, permiten hacer algunos aportes al respecto. La información preliminar con la que se contaba al inicio de este trabajo daba cuenta de que el embrión de Austrolebias deriva de un conjunto de células agrupadas en una región del huevo. A partir de esta observación, surge un número de interrogantes: (a) la zona de agregación celular ¿corresponde a un lugar definido dentro del huevo o es aleatoria?, (b) ¿cómo se comunican entre sí las células migratorias aisladas a fin de establecer un tejido?, (c) ¿todas las células dispersas formarán parte del embrión?, (d) ¿existe algun tipo de internalización celular previo al proceso de agregación (durante la epibolia, como ocurre en otros peces)?. Se discuten a continuación algunas ideas en relación a estas preguntas, ya que los experimentos específicos para contestarlas, son tareas pendientes para el futuro. Durante el proceso de agregación celular el embrión de Austrolebias pasa de estar formado por células mesenquimáticas dispersas por toda la superficie del huevo, a formar un tejido epitelializado, a partir del cual comenzará la internalización del endomesodermo. Al inicio de este proceso el embrión consta de poblaciones celulares diversas, las cuales presentan una amplia gama de comportamientos celulares, desde células migratorias rápidas a células grandes estáticas y multinucleadas. A partir de dichas poblaciones se formará un embrión con un plan corporal común a los demás peces teleósteos. Uno de los primeros tópicos a analizar es, como a partir de células dispersas y alejadas se forma un tejido epitelial. Las observaciones realizadas muestran que inicialmente solo un reducido grupo de células migran en la dirección de la zona de agregación, la cual aparentemente coincide con el hemisferio vegetal. Estas son células de aspecto mesenquimático, las cuales a medida que migran, emiten una red de filopodios, mediante los que se contactan entre sí y con la superficie interna de la EVL. Por lo tanto dichas células serían las primeras en alcanzar la zona de agregación en el polo vegetal. Posteriormente y a medida que su número aumenta,
122 estas células dejan de emitir filopodios, adquieren aspecto epitelial de tipo poliédrico y se asocian formando estructuras supracelulares, agrupadas en forma de roseta. Existen varios ejemplos de migración de células de tipo mesenquimático que, luego de hacer contacto, establecen un tejido epitelializado. Se ha descrito una maquinaria de adhesión celular basada en filopodios (protrusiones de actina), tanto en el cierre ventral al final del proceso de epibolia en C. elegans (Williams-Masson et al., 1997) como en el cierre dorsal de Drosophila (Jacinto, et al., 2000) o en la reparación de un tejido (wound healing, Vasioukhin, et al., 2000). En este último caso se ha visto que la inhibición de la protrusión de filopodios, mediante dominantes negativos de Cdc42, altera la fusión epitelial (Vasioukhin, et al., 2000). Los filopodios también estarían involucrados en el reconocimiento de células apropiadas para interaccionar, por lo tanto serían análogos a los “filopodios sensoriales” de los conos de crecimieno axonal, los cuales son capaces de buscar las células blanco correctas en el sistema nervioso en desarrollo (Jacinto, et al., 2001). Debido a la diversidad de poblaciones celulares observadas en Austrolebias, es probable que exista algún mecanismo que permita el reconocimiento entre células homólogas. A partir de los experimentos de destino celular, pudimos comprobar que estas primeras células que se agregan formarán un tejido que denominamos extraembrionario, dado que no forma parte del embrión, al menos en el período analizado, durante el período de la agregación celular y hasta la somitogénesis temprana. Sin embargo el término “extraembrionario” podría no ser estrictamente correcto, debido a que no se analizó el destino de este tejido hasta el final de la embriogénesis. Luego del contacto inicial entre las células del agregado, comienza un proceso de epitelialización del tejido, lo que implica una transición del tipo mesenquima-epitelial en las células que conforman el agregado. Esto convella un aumento en los contactos y probablemente también en las uniones célula-célula. Progresivamente se observa la formación de estructuras supra-celulares en diversas partes del agregado, las que luego convergen formando un tejido monoestratificado de tipo epitelial, donde se aprecia la formación de estructuras tipo roseta.
123 La organización multicelular puede ser vista como la suma de eventos celulares individuales o como un fenómeno único del tejido todo. Las células individuales comunmente coordinan su comportamiento dentro de una estructura multicelular cohesiva. Podría considerarse que las unidades funcionales de los tejidos son en realidad grupos de células, donde cada célula censa su posición con respecto al grupo y adopta un comportamiento de acuerdo a dicha posición (Blankenship, et al., 2006). Estudios recientes han mostrado la formación de estructuras de tipo roseta en diferentes procesos morfogenéticos. Dos ejemplos de esto son la extensión de la banda germinal de Drosophila (Blankenship, et al., 2006) y la migración del primordio en la línea lateral de pez cebra (Lecaudey et al., 2008). El mecanismo por el cual se forma una roseta, es un tema que está en discusión. Uno de los modelos propuestos es el que corresponde a las rosetas que se forman en el primordio de la línea lateral del pez cebra. Existiría un sistema del tipo inhibición lateral mediado por Fgf, que induce la epitelialización radial de las células que rodean a una central, generando una polaridad apico-basal y formando uniones estrechas (“tight”) entre dichas células. Debido a que la célula central sería refractaria a la inhibición lateral, mantendría su estado de tipo mesenquimático. Esto resultaría en un anillo de células epiteliales en torno a una célula central aplanada (Lecaudey et al., 2008). Otra posibilidad es que el tejido realice constricción apical coordinada de un grupo de sus células en el momento en que se pierde su integridad, algo similar a lo que ocurre en los procesos de cierre de una herida (Lecaudey et al., 2008, Jacinto et al., 2001). Independientemente de cual sea su mecanismo de formación, sería interesante entender que papel juegan las rosetas en el tejido en formación. Se propone para el pez cebra que las rosetas en el primordio de la línea lateral en migración, convertirían un gran número de células migratorias de tipo mesenquimático en dos o tres paquetes celulares que pudieran ser controlados como unidades individuales, reduciendo así la complejidad del sistema (Lecaudey et al., 2008). Esta hipótesis parece plausible también para el caso de las primeras celulas que se agregan en Austrolebias, ya que la organización en rosetas del tejido, podría permitir la simplificación en la generación de un tejido epitelial a futuro. Las
124 unidades funcionales (rosetas) podrían organizarse primero independientemente unas de otras, para luego contactárse paulatinamente, generando un tejido de tipo epitelial. Este primer tejido en el caso de Austrolebias tendría un destino extraembrionario (al menos durante el período analizado) y una función posiblemente instructiva. La formación del embrión propiamente tal es posterior a estos eventos, ya que sus células comienzan a observarse en las inmediaciones del agregado, una vez que el tejido extraembrionario esta formando. Mediante los experimentos de destino celular fue posible concluir que la formación del embrión comienza a partir del estadío AIIIi. Debido a limitaciones técnicas no fue posible hacer un seguimiento de células individuales, a fin de entender si las células embrionarias se agregan tardíamente o si por el contrario derivan de algunas de las células agregadas inicialmente. Lo que se pudo constatar, eso sí, es que una vez identificadas las células embrionarias por su menor tamaño, estas inicialmente se intercalan con las células extraembrionarias, excepto en aquellos lugares donde estas últimas estan formando agregados epitelializados. Posteriormente existe un desplazamiento coordinado y acumulación de las células embrionarias hacia el centro del agregado. Este movimiento es acompañado por un desplazamiento hacia la periferia del tejido extraembrionario. A través del análisis por microscopía en tiempo extendido realizado durante un subperíodo del estadio AIIIm, se pudo apreciar que células centrales al agregado se internalizaban como células individuales experimentando un cambio estereotipado de su forma al desprenderse de la superficie para ocupar posiciones más profundas dentro del agregado. Este modo de internalizacion recuerda al mecanismo de ingreso (“ingression”) de células individuales que ocurre en el mesenquima primario de erizo, donde las primeras células que se internalizan lo hacen en la región vegetal de la blástula, sufriendo una transición epitelio- mesenquima (Katow & Solursh, 1981). También en Fundulus el ingreso de células individuales es un mecanismo descrito durante la gastrulación temprana (Trinkaus, 1996). Más aún, el concepto de la involución de células a través del margen del anillo germinal en pez cebra correspondería al ingreso coordinado de células
125 individuales. Así mismo se ha descrito la delaminación de células individuales, precursoras del endomesodermo, a través del margen del blastodermo en la región dorsal/axial del embrión de Danio (Montero et al., 2005). Si bien es probable que la internalización del endomesodermo en Austrolebias involucre un mecanismo de migración de células individuales, sería útil en el futuro poder unificar la nomenclatura y describir estos procesos mediante abordajes que impliquen tanto el análisis detallado de polaridad celular como de marcadores de diferenciación, a fin de poder comparar procesos entre los diversos organismos con datos más precisos. Al inicio de esta tesis se postuló que las primeras células que se agregan en Austrolebias corresponderían a las células embrionarias que formarían parte del organizador. Por lo tanto el análisis detallado del desarrollo se centró en el período inicial de agregación (AI – AIII). Sin embargo, a partir de los resultados obtenidos, se ha llegado a la conclusión que el embrión comienza a formarse recién a partir del AIIIi. Por lo tanto para analizar el proceso de internalización del endomesodermo y la formación de estructuras derivadas, será necesario a futuro centrar el estudio a partir de estadíos más tardíos (AIIIm).
4.- Resumen de los resultados obtenidos
En esta tesis, se describe por primera vez el desarrollo temprano de un pez anual usando una combinación de técnicas de expresión génica, marcación celular, microscopía y análisis de imágenes en tiempo extendido. Se estableció que en este organismo el proceso de gastrulación ocurre de manera diferente comparado con otros teleósteos, pero que es posible reconocer un paralelo en las estrategias morfogenéticas utilizadas para la formación del embrión temprano.
Los hallazgos específicos de esta tesis son:
1- La gastrulación en Austrolebias ocurre durante el proceso de agregación celular.
126 2- Las etapas iniciales de agregación (estadíos AI y AII) corresponden a la formación de un tejido extraembrionario, el cual posteriormente se concentra en el futuro extremo posterior del embrión.
3- La internalización del endomesodermo se inicia en el estadío AIIIm y podría ocurrir a través de la formación de un blastoporo en forma de anillo.
4- En Austrolebias se forma un organizador en el estadío AIIIt.
5- El proceso de formación de las hojas embrionarias a nivel molecular parece estar conservado.
Existiría un proceso de internalización temprano a través de células individuales que se desprenden de la superficie con morfología similar a “células en botella”.
127 Conclusión
Austrolebias posee una embriogénesis relacionada con la del resto de los teleósteos. Este hecho permite especular que las diferencias observadas en la organización de las células durante la formación del eje embrionario obedecerían al menos a dos factores principales: (i) el desfase temporal entre los movimientos morfogenéticos de la epibolia y gastrulación; y (ii) la baja densidad celular del embrión temprano. El resultado final sería la adquisición de una morfología embrionaria particular previo al inicio de la gastrulación, el agregado celular. La información obtenida de este estudio permite especular acerca de como la adaptación de un organismo a su hábitat puede generar cambios importantes en el desarrollo embrionario, sin afectar fundamentalmente la morfología adulta. Esto sugiere que, el desarrollo embrionario presenta etapas permisivas al cambio y que pueden estar sujetas a presión selectiva. Se propone entonces, que los teleósteos dispondrían de algunas etapas o procesos "obligatorios", como son el clivaje meroblástico, la epibolia, la internalización para formar las hojas embrionarias, la formación de un anillo endomesodérmico y la formación de un organizador. Otras características del desarrollo, sin embargo, serían modificables, como por ejemplo, el número de células que sufren epibolia, el acoplamiento de la internalización con la epibolia, y la migración celular en forma coordinada como hoja epitelial. Entendemos entonces, que estaríamos frente a un ejemplo en que las adaptación de la especie a una condición de vida particular, generó una modificación en la velocidad y continuidad del desarrollo (diapausas) que se acompañó con un cambio de estrategia para la formación del eje embrionario. No es posible saber si una necesariamente conlleva a la otra o si pueden surgir independientemente. Responder esta pregunta requerirá mayor indagación experimental y comparada entre especies.
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135 Apéndice
Protocolo de doble hibridación in situ (modificado de: Gamse et al., 2002).
Día 1.- A partir de embriones fijados toda la noche en paraformaldehído 4% y guardados a -20˚C en metanol (MetOH), en tubos de 2ml, 1- Rehidratación 5min. (cada uno) 75% MetOH/25%PBT 50% MetOH/50%PBT 25% MetOH/75%PBT 2- 4X 5min. PBT 3- Prehibridación 2-3hs a 70˚C en tampón de hibridación (Hyb+, Formamida 50%, 5X SCC, 0,1% Tween 20, 5mg/ml ARN Tórula (Sigma), 50µg/ml Heparina). 4- Hibridación con una o ambas sondas juntas (Dig. y Fluo.) diluídas en tampón de hibridación. Se diluyeron 6µl sonda Dig. (gsc) + 9µl sonda Fluo. (bra) en 300µl de tampón de hibridación por embrión, se incubó a 70˚C toda la noche. Día 2.- 5- Lavados a 70˚C (precalentar las soluciones) 2X 30min. Hyb (-) (Formamida 50%, 5X SCC, 0,1% Tween 20) 1X 15min. 75% Hyb(-)/25% 2XSSC 1X 15min. 50% Hyb(-)/50% 2XSSC 1X 15min. 25% Hyb(-)/75% 2XSSC 1X 15min. 2XSSC 3X 30min. 0,2XSSC 6- Lavados a temperatura ambiente 1X 5min. 75% 0,2XSSC/25% PBT 1X 5min. 50% 0,2XSSC/50% PBT 1X 5min. 25% 0,2XSSC/75% PBT 1X 5min. PBT 7- Bloqueo en BR (Blocking Reagent, Roche) al 2% en MAB 1X al menos 1h.
136 8- Incubar en Anticuerpo anti-DIG-AP (Roche) diluído 1:2000 en BR 2%/MAB 1X toda la noche a 4˚C. Día 3.- 9- Lavados a temperatura ambiente 1. Enjuague en PBT 2. 8X 15min. PBT 3. 3X 5min. BCL 10- Pasar los embriones a placa de 24 pocillos y agregar 500µl BM-Purple (Roche) en oscuridad. Incubar hasta que el color de la marca esperada sea suficiente. Para gsc aproximadamente 14hs. Para parar la reacción reemplazar BMP por BCL (para 100ml 1X, 5ml TrisHCl pH 9,5 1M, 2ml NaCl
5M, 5ml MgCl2 1M, 1ml Tween 20 10%). Día 4.- 11- Lavados 2X 20min en 1X MABT pH 7,5 (NaCl 150mM, Acido Maleico 100mM, Tween 0,1%) 12- 1X MABT + 10mM EDTA 10min. a 70˚C (precalentar solución) 13- Rehidratar: 10min MetOH 100% 10min. 75% MetOH/25% MABT 10min. 50% MetOH/50% MABT 10min. 25% MetOH /75% MABT 14- Lavado 4X 10min. en MABT 15- Bloqueo 1 - 4hs en BR (Blocking Reagent, Roche) al 2% en MAB 1X. 16- Incubar en anticuerpo anti-Fluo-AP (Roche) diluído 1:2000 en BR 2% / MAB 1X toda la noche a 4˚C. Día 5.- 17- Lavados: enjuague en MABT 6X 15min. MABT 3X 5min. BCL 18- Revelado en placa de pocillos con 500µl por pocillo BCL + INT/BCIP (Roche) 7,5µl/ml, hasta obtener marca deseada. Para bra aproximadamente 8hs. Detener reacción con BCL. Postfijación en PFA 4% toda la noche.
137 Protocolo de inclusión en Epon 812
1- Fijación durante 3hs en solución de Karnovsky 50% 2- Descorionado manual, inclusión en bloque de agarosa al 2% y corte con vibratomo en polo vegetal (método utilizado para orientar los embriones al momento de realizar los cortes semifinos) 3- 4 lavados de 10 minutos cada uno en buffer cacodilato 0,1M
4- Postfijación en OsO4 1% durante 1h 30min., a tempertura ambiente y oscuridad 5- Lavado de 10 minutos en buffer cacodilato 0,1M 6- Deshidratación: Etanol 30% 5min. 50% 5min. 70% 5min. 80% 8min. 90% 8min. 95% 8min. 100% x3 10min. (cada uno) 7- Pre-inclusión: Oxido de propileno x 2 10min. (cada uno) Oxido de propileno – Epon 812 (1:1v/v) 12hs al vacío 8- Inclusión: Epon 812 puro x2 durante 5h al vacío Hacer bloques, orientar y catalizar por 24hs a 60°C
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