Analisis Morfogenetico De La Gastrulacion En Peces Teleosteos Anuales Del Genero
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO ANALISIS MORFOGENETICO DE LA GASTRULACION EN PECES TELEOSTEOS ANUALES DEL GENERO AUSTROLEBIAS LUISA PEREIRO GONZALEZ TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS Director de Tesis: Prof. Dr. Miguel Concha Co-Director de Tesis: Prof. Dr. Jochen Wittbrodt 2008 UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE POSTGRADO INFORME DE APROBACION TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de Medicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas presentada por el candidato. LUISA PEREIRO GONZALEZ ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de Defensa de Tesis rendido el día 18 de agosto de 2008. Prof. Dr. Miguel Concha Director de Tesis Dpto. de Anatomía y Biología del Desarrollo, Facultad de Medicina, Universidad de Chile COMISION INFORMANTE DE TESIS PROF. DR. JUAN LARRAIN PROF. DR. MARCELO ANTONELLI PROF. DR. JUAN FERNANDEZ PROF. DR. NORBEL GALANTI Presidente Comisión de Examen 2 Dedicatoria A mis viejos, por heredarme lo más valioso y necesario para esta tesis, la convicción de que “hay que agarrarse con uñas y dientes en la búsqueda del conocimiento ” . Para Uds. parres. 3 Agradecimientos A Jochen Wittbrodt por devolverme la pasión por la ciencia y por marcar un rumbo, que seguramente será un ejemplo a seguir. A Felix Loosli por enseñarme los trucos de la biología molecular y por los post-it con chistes que me dejabas (¿o eran en serio?). A todos los integrantes del laboratorio Wittbrodt, por hacerme sentir en casa. A Nibia Berois y María José Arezo por enseñarme lo que es un equipo de trabajo y por el entusiasmo compartido de trabajar con “Cynolebias”. A Miguel Concha, por aceptar el desafío de trabajar con un organismo nuevo. A Luis Cifuentes por cuidar a los peces, a Alejandra Catenaccio por la colaboración/paciencia y a Steffen Hartel por todos los aportes, humanos y científicos. Al Dr. Juan Fernandez por su poesía humana y su sabiduría científica (también por el pez-pollo). A toda la comisión evaluadora por el esfuerzo para que esta tesis fuera posible y por el entusiasmo en la discusión de los resultados. A las secretarias del postgrado, Mónica y Paola, por la buena disposición constante y “muchachas las dejo tranquilas, ya pueden dejar de soñar conmigo”. A Marcello Antonelli por sus comentarios positivos sobre mi trabajo y por ser un ejemplo de humildad. A “Moni” integrante del laboratorio de Jorge Allende, por estar siempre dispuesta a ayudar y prestarme toda clase de soluciones. A Eugenia Díaz por el té, la charla, la honestidad y el ejemplo de dedicación. A Soledad De La Piedra por sus nuevos aportes al entendimiento del desarrollo embrionario de Austrolebias y también por el buceo. A María Eugenia Cabrejos por todos los consejos de biología molecular (gracias por la información de páginas web a consultar, aún la uso) y de la vida. A todos los integrantes del laboratorio de Miguel Allende, por ofrecerme siempre ese huequito para trabajar y hacerme sentir una más. 4 A Florencio Espinoza (Floro) por permitirme invadir su oficina, con el trabajo de la tesis y por el cariño de siempre. A mi padre por enseñarme el disfrute también de las pequeñas cosas y las ganas de aprender. A mi madre por darme los valores que me acompañan día a día y apoyarme incluso a cruzar Los Andes. A mis hermanas: Tere, Alicia e Inés y mis seis sobrinos, por estar siempre conmigo, en todas. A la Pim, mi cuarta hermana, por todo lo vivido y todo lo que nos queda... A todos mis amigos de Uruguay, repartidos por todo el mundo, por todas las experiencias vividas. A Cathy y Jorge por el cariño de todos los días. A Rosario, Benjamín y Matías por permitirme aprender todos los días algo nuevo y por ayudar en la construcción de una familia. A Miguel (el mio) por el apoyo incondicional, la actitud positiva frente a la vida y por ser mi justo complemento. 5 Indice de materias Resumen 1 Abstract 4 Introducción 6 1.- Peces anuales del género Autrolebias: como modelo de estudio de la gastrulación 7 12 2.- La gastrulación en vertebrados 2.1.- Eventos Morfogenéticos de la Gastrulación 13 2.2.- Combinación de movimientos celulares durante la gastrulación en diversos organismos 17 20 2.3.- Internalización endomesodérmica: el blastoporo y brachyury 2.4.- Formación y mantenimiento del organizador, expresión del gen 22 goosecoid 2.5.- goosecoid y brachyury en la gástrula de vertebrados 25 25 2.6.- Establecimiento de ejes y rompimiento de la simetría 2.7.- El primordio de la cola: ¿una continuación de la gastrulación? 30 31 3.- Gastrulación en peces teleósteos 3.1.- Gastrulación “tipo” en peces teleósteos 32 36 3.2.- Gastrulación “atípica": peces anuales, Austrolebias 3.3.- Semejanzas y diferencias entre Austrolebias y otros organismos 40 vertebrados Hipótesis de trabajo 42 42 Objetivo general Objetivos específicos 42 43 Metodología 1.- Mantenimiento y reproducción de los adultos, cultivo y manejo de 43 embriones 2.- Análisis morfológico del proceso de agregación celular 44 44 2.1. Microscopía de campo claro 2.2. Microscopía Confocal 45 46 2.3. Cortes histológicos 6 3.- Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación 47 3.1.- Clonamiento de genes de interés 47 3.2.- Preparación de sondas 50 3.3.- PCR en Tiempo Real 51 3.4.- Hibridación in situ 53 4.- Análisis de destino celular durante la agregación 54 Resultados 56 1. Análisis morfológico del proceso de agregación celular en Austrolebias 56 1.1.- Descripción y definición de estadíos de agregación celular 56 1.1.a.- Estadíos de agregación celular 58 1.1.b.- Estadíos de eje embrionario y somitogénesis inicial 67 1.2.- Estudio morfológico a través de cortes histológicos 70 2. Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación 73 2.1.- Clonamiento de fragmentos génicos de Austrolebias 73 2.2.- Análisis de secuencias de goosecoid y brachyury 74 2.3.- Expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en Tiempo Real 82 2.4.- Estudio del patrón de expresión de goosecoid y brachyury 84 3. Estudio de mecanismos celulares morfogenéticos involucrados en el proceso de agregación 93 3.1.- Análisis de destino celular durante la agregación 93 3.2.- Estudio dinámico, por microscopía en tiempo extendido, del proceso de agregación temprano 99 3.2.1a.- Poblaciones celulares del agregado 100 3.2.1b.- Poblaciones celulares externas al agregado 102 3.2.2.- Epitelialización y migración centrípeta de células embrionarias durante la agregación 103 3.2.3.- Análisis del proceso de internalización celular en AIIIm 108 Discusión 112 1.- El blastoporo en Austrolebias: ¿sin surco y con anillo? 113 2.- Tejido extraembrionario posterior: posible función instructiva de la formación del embrión. 116 7 3.- ¿Cómo se forma un embrión a partir de un grupo de células? 122 4.- Resumen de los resultados obtenidos 126 Conclusión 128 Bibliografía 129 Apéndice 136 Indice de tablas Tabla 1. Comparación de tiempos post-fecundación entre peces anuales y no anuales. 39 Tabla 2. ARNs polimerasas utilizadas en la transcripción de las sondas de gsc y bra. 51 Tabla 3. Estadíos, tiempos y características del proceso de agregación 69 Tabla 4. Porcentajes de identidad de gsc (A) y bra (B) en comparación con otros vertebrados y entre si. 76 Tabla 5. Ensayos realizados para el estudio del destino celular 99 Indice de figuras Figura 1.- Ciclo de vida y hábitat de Austrolebias 10 Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos 11 Figura 3.- Tipos de movimientos celulares durante la gastrulación 16 Figura 4.- Morfogénesis temprana en las cuatro especies de vertebrados más estudiadas 19 Figura 5.- Esquema que compara algunos estadíos del desarrollo embrionario de D.rerio y Austrolebias 34 Figura 6A.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana 60 Figura 6B.- Esquemas de los estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y somitogénesis temprana 61 Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío 64 8 Figura 8.- Estudio histológico del proceso de agregación celular y formación 72 del eje embrionario Figura 9.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de goosecoid (gsc) 78 79 Fig 10.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de brachyury (bra) Figura 11.- Comparación de secuencias aminoacídicas de goosecoid de 80 Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados Figura 12.- Comparación de secuencias aminoacídicas de brachyury de 81 Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados Figura 13.- Estudio de la expresión temporal de goosecoid y brachyury 83 86 Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury Figura 15.- Análisis del patrón de expresión de brachyury durante el estadío AV 89 92 Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid y brachyury Figura 17.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación temprano 95 Figura 18.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación medio 97 Figura 19.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación 98 celular tardío Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm 101 104 Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de 107 estadío AIIIm Figura 23.- Proceso de intercalación (B-E) e internalización (F-J) en estadío 110 de AIIIm 9 Resumen Durante la gastrulación, las células de la blástula experimentan una redistribución dramática para originar un embrión multilaminar. Esto ocurre a través de movimientos celulares altamente coordinados mediante los cuales, grupos definidos de células se internalizan desde la superficie formando un blastoporo y dando origen al endomesodermo.