Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Ciencias
PROFESOR PATROCINANTE Alejandra Zúñiga-Feest Instituto de Ciencias Ambientales y Evolutivas Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile
EFECTO DEL FÓSFORO EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE RAÍCES PROTEOIDEAS EN TRES PROTEÁCEAS CHILENAS (Embothrium coccineum, Gevuina avellana y Orites myrtoidea)
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Licenciado en Ciencias Biológicas.
MARGARITA AURORA DÍAZ SOTO
VALDIVIA – CHILE
2012 2
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, agradezco a Dios por darme la oportunidad de poder llegar a estas instancias y abrir puertas que veía imposibles, muchas gracias a mis maravillosos padres, Benjamín Díaz C.
y Jacqueline Soto S., por todo el apoyo que siempre me han brindado, tanto en lo académico
como en lo espiritual.
A mi hermano Benjamín Díaz y a mi hermana Silvana Ulloa, por estar en cada momento de mi
vida, entregándome su cariño y el ánimo de seguir adelante.
La realización de este trabajo, no habría sido posible sin el apoyo y consejo de la Dra. Alejandra
Zúñiga, quien me entregó las herramientas necesarias para completar este ciclo, además de su compañerismo y confianza, a la Dra. Susana Valle. Junto a ellas, agradezco el apoyo del equipo del laboratorio de Fisiología Vegetal: Ángela, Andrea, Fernanda y Vanessa. Y a mis compañeras
y amigas de la Universidad.
No puedo dejar de agradecer también a todos mis amigos, jóvenes y hermanos en la Fe de mi amada Iglesia Pentecostal de Chile que día tras día me demostraban su cariño y oraban por mí.
Gracias a mis amados pastores que siempre tenían un consejo sabio en los momentos difíciles.
Y por supuesto, a la Escuela de Ciencias, al Instituto de Ciencias ambientales y evolutiva de la
Universidad Austral de Chile y al Proyecto Fondecyt Nº 11080162, que financió este
trabajo. 3
A mi Dios y mi familia… 4
INDICE DE CONTENIDOS
Páginas
RESUMEN ...... 9
ABSTRACT ...... 10
1. INTRODUCCIÓN...... 11
FAMILIA PROTEACEAE, RAÍCES PROTEOIDEAS (RP) Y EXUDACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS ...... 12
1.2 ROL ECOLÓGICO DE LAS RAÍCES PROTEOIDEAS...... 13
1.3 LAS RAÍCES PROTEOIDEAS SON INDUCIDAS EN CONDICIONES DE DEFICIENCIA DE FÓSFORO... 14
1.4 CONTENIDO DE FÓSFORO, MECANISMO DE ALMACENAMIENTO Y CRECIMIENTO EN VEGETALES
...... 15
1.5 TOXICIDAD DEL FÓSFORO EN VEGETALES ...... 16
1.6 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ...... 18
1.7 PROTEÁCEAS CHILENAS ...... 19
1.7.1 Orites myrtoidea ...... 20
1.7.2 Embothrium coccineum...... 21
1.7.3 Gevuina avellana ...... 22
1.8 HIPÓTESIS...... 24
1.9 OBJETIVOS...... 25
1.9.1 Objetivo general: ...... 25
1.9.2 Objetivos específicos:...... 25
2. MATERIALES Y MÉTODOS...... 26 5
2.1 PROCEDENCIA DEL MATERIAL VEGETAL...... 26
2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL...... 26
2.3 MEDICIÓN DE BIOMASA ...... 28
2.4 BIOMASA EN CULTIVO BAJO INVERNADERO ...... 29
2.5 EVALUACIÓN DE VITALIDAD POR ASPECTO...... 29
2.6 EVALUACIÓN DEL NÚMERO DE RP...... 30
2.7 MORFOLOGÍA DE RAÍCES PROTEOIDEAS...... 30
2.8 EXUDACIÓN DE RP ...... 31
2.9 ANÁLISIS DE FÓSFORO INTERNO (FOLIAR) ...... 32
2.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ...... 32
3. RESULTADOS ...... 33
3.1 EFECTO DEL P SOBRE EL CRECIMIENTO EN ALTURA DE LAS PLÁNTULAS...... 33
3.2 EFECTO DEL P EN LA BIOMASA ...... 35
3.2.1 Biomasa total ...... 35
3. 3 EFECTO DEL FÓSFORO EN LA FORMACIÓN RP Y RAÍZ TOTAL ...... 40
3.4 CONCENTRACIÓN DE FÓSFORO FOLIAR POR TRATAMIENTOS...... 43
3.5 EFECTO DEL P EN LA CALIDAD MORFOLÓGICA Y SOBREVIVENCIA DE LAS PLANTAS...... 44
3.6 MORFOLOGÍA DE RAÍCES PROTEOIDEAS ...... 46
3.6.1 Morfología RP a simple vista...... 46
3.6.2. Morfología de RP electrónica...... 48
3.7 EXUDACIÓN ÁCIDA DE RP ...... 50
4. DISCUSIÓN...... 51 6
4.1 EFECTO DEL FÓSFORO A NIVEL MORFOLÓGICO...... 51
4.2 EFECTO DEL FÓSFORO A NIVEL FOLIAR...... 54
4.3 EXUDACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS...... 56
5. CONCLUSIONES...... 57
6. LITERATURA CITADA...... 58
7. ANEXOS …...... 71
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Efecto del abastecimiento de P en la velocidad de absorción de fósforo (P) 17
en dos especies con regulación contrastante, bajo condiciones de
invernadero: Grevillea crithmifolia y Hakea prostrata
Figura 2. Rango de distribución de las especies de Proteácea chilenas 20
Figura 3. Cultivo Plántulas de Embothrium coccineum, Gevuina avellana y Orites 27
myrtoidea
Figura 4. Representantes de cada nivel para evaluación de calidad morfológica en 30
plántulas de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea
Figura 5. Exudación de ácidos en clusters de raíces proteoídeas 31
Figura 6. Efecto del fósforo en la altura promedio inicial – final en E. coccineum, G. 34
avellana y O. myrtoidea.
Figura 7. Biomasa inicial, seca total de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea 36 7
Figura 8. Distribución de biomasa inicial de E. coccineum, G. avellana y O. 36
myrtoidea.
Figura 9. Distribución de biomasa inicial de E. coccineum, G. avellana y O. 37
myrtoidea
Figura 10. Efecto del fósforo en la distribución de biomasa final de E. coccineum, G. 39
avellana y O. myrtoidea.
Figura 11. Efecto del fósforo en el Número de RP inicial – final en E. coccineum, G. 41
avellana y O. myrtoidea.
Figura 12. Efecto del fósforo en el N° promedio de RP y el peso relativo RP/Raíz total 42
en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea
Figura 13. Imágenes de RP representativas en E. coccineum 46
Figura 14. Imágenes de RP representativas en G. avellana 47
Figura 15. Imágenes de RP representativas en O. myrtoidea 47
Figura 16. Microscopia electrónica de raíces proteoideas de O. myrtoidea 48
Figura 17. Microscopia electrónica de raíz proteoideas completa de O. myrtoidea 49
Figura 18. Detección de la acidificación de la rizófera en placas de agar, con púrpura 50
de bromocresol como indicador de pH
.
INDICE DE TABLA
Tabla 1. Tratamientos aplicados a cada proteáceas en estudio E. coccineum, 28
G. avellana y O. myrtoidea
Tabla 2. Incremento relativo en altura (%) en E. coccineum, G. avellana y O. 35
myrtoidea 8
Tabla 3. Relación porcentaje de plantas con RP en E. coccineum, G. avellana y O. 43
myrtoidea por tratamientos.
Tabla 4. Concentración de fósforo interno foliar de E. coccineum, G. avellana 44
y O. myrtoidea.
Tabla 5. Calidad por tratamientos en cada especies de E. coccineum, G. avellana 45
y O. myrtoidea.
Tabla 6. Porcentaje de sobrevivencia en cada especies de E. coccineum, G. avellana 45
y O. myrtoidea.
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 Soluciones Hoagland 71
ANEXO 2 Método para análisis de fósforo interno 73
ANEXO 3 Protocolo para microscopia electrónica de barrido (MEB) 76
ANEXO 4 Intensidad lumínica y temperatura en invernadero 79 9
RESUMEN
Las raíces proteoideas (RP) son densos conglomerados de raíces, relacionados con la adquisición de fósforo (P) en suelos con limitaciones nutricionales. Las RP se han estudiado principalmente en Proteáceas australianas, siendo la deficiencia de P el factor inductor clave de dichas estructuras. Plántulas de Proteáceas chilenas desarrollan RP tanto en nutrición completa, como sin abastecimiento de P. Se desconoce si la suplementación de distintas concentraciones de
P afecta en la formación de RP en proteáceas de distinta distribución geográfica, el objetivo de esta tesis es estudiar el efecto del P en el crecimiento y formación de RP en 3 proteáceas chilenas, que difieren en su área de distribución y la composición nutricional de suelos donde habitan.
Se realizaron ensayos con E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea para observar el crecimiento y desarrollo de las plántulas, bajo riego con diferentes concentraciones de P. Se sugiere que plántulas de E. coccineum y G. avellana crecen en variadas condiciones de suelo, por ende un riego deficiente en P, promoverá una mayor formación de RP, mientras que O. myrtoidea proviene de suelos de mayor déficit nutricional, y se esperaría que formara raíces proteoideas en todos los tratamientos en la misma proporción.
En dicho experimento, se utilizaron plántulas de E. coccineum, G. avellana procedencia
Capitán Pastene y Orites myrtoidea de Tolhuaca, para poner a prueba 4 tratamientos nutricionales
(Agua, sin P, Hoagland completo (1mM), Hoagland con exceso de P (10mM)). Las plantas fueron mantenidas en arena durante dos meses, bajo condiciones de invernadero.
Los resultados mostraron una mayor formación de RP y mayor RP/Raíz total en los tratamientos sin P y diferencias en la respuesta de las 3 especies estudiadas.
En conclusión, La formación de RP en estas especies guarda estrecha relación con el déficit nutricional, principalmente de fósforo, al igual que en Proteáceas Australianas. 10
ABSTRACT
Cluster Roots (CR) are dense conglomerate lateral branches, related to the acquisition of phosphorus (P) on soils with nutritional limitations. CR has mainly been studied in Australian
Proteaceae, being deficiency P the key inducing factor of these structures. Chilean Proteaceae develop CR both on complete nutrition, and without P treatment. It is unknown how P availability could lead CR formation in Chilean Proteaceae from different geographical distribution. The objective of this thesis is to study the effect of P on the growth and formation of
RP in three Chilean Proteaceae, which differ in their geographic distribution range and the soil nutritional composition on its environment.
Tests were performed with E. coccineum, G. avellana and O. myrtoidea to observe the growth and development of plants, irrigated with different P concentrations solutions. It was hypothesized that seedlings of E. coccineum and G. avellana that normally grow in various soil conditions, and P availability higher CR promote formation on while P solution treatment, while
O. myrtoidea that comes from deficit nutritional soils, is expected to form CR in all nutritional treatments at the same proportion.
E.coccineum and G. avellana seedling from Captain Pastene, and O. myrtoidea seedling from Tolhuaca, were use during 2 months experiment with four nutritional treatments (water, without P, complete Hoagland (1 mM), P Hoagland with excess (10 mM)). The experiment was maintained under greenhouse conditions
Results showed a higher CR formation and CR/total roots in treatments without P and differences in the response of the three studies species.
In conclusion, CR formation in these species is closely related to the nutritional deficit, primarily phosphorus, as in Australian Proteaceae, have been reported. 11
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Familia Proteaceae, raíces proteoideas (RP) y exudación de ácidos orgánicos
La Familia Proteáceas, constituidas principalmente por arbustos o pequeños árboles de hojas perennes y coriáceas, constan de unos 75 géneros y más de 1.400 especies, que están ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales, especialmente en zonas cálidas del hemisferio Sur (Ricardi, 1992), dicha familia presentan una adaptación a nivel radicular denominada raíces proteoideas (RP) que le permiten abastecerse del fósforo (P) poco disponible en el suelo.
Las raíces proteoideas son una de las principales adaptaciones que presentan algunas plantas para aumentar la absorción de nutrientes (Skene, 1998). Estas raíces, se componen de una serie de agrupaciones de raicillas laterales unidas a un mismo eje (Purnell, 1960) y se caracterizan por estar presentes en especies que crecen en suelos antiguos y nutricionalmente pobres, como por ejemplo los de Australia y del Sudáfrica (Lamont, 2003; Lambers et at., 2007). Sin embargo, recientemente se ha reportado que este mismo tipo de estructuras están presentes en Proteáceas
Chilenas (ejem. Gevuina avellana, Embothrium coccineum, Lomatia ferruginea), en suelos jóvenes de origen volcánico y con mayor concentración de nutrientes (Lambers et al., 2012)
El desarrollo de estas raíces proteoideas, se ve influenciado por diversos factores, principalmente aquellos relacionados con la baja disponibilidad de nutrientes (P y Fe+) (Shu, et al., 2007; Shen et al., 2005; Diem et al., 1999). Además estas raíces, presentan una mayor exudación de ácidos orgánicos, ectoenzimas y carboxilasas comparado con raíces no proteoideas
(Shane y Lambers, 2007; Denton et al., 2006; Playsted et al., 2006; Shane et al., 2004; Lamont,
2003; Newman y Martinoia, 2002; Skene et al., 1996). 12
Estudiando las propiedades de estas raíces proteoideas en otras especies de Proteáceas, como
Banksia prionotes, se ha descubierto que exudan una gran cantidad de ácidos orgánicos liberadores de fósforo, elemento normalmente inmovilizado en suelos ácidos (Jeschke y Pate,
1995).
Los suelos del Sur de Chile se caracterizan por tener un alto contenido de fósforo total, pero bajos niveles de fósforo disponible, altas concentraciones de aluminio, debido a su alta acidez
(Borie y Rubio, 2003). Los suelos de Chile son más ricos nutricionalmente que los de Australia y
Sudáfrica, en al menos en un orden de magnitud (Lambers et al., 2012). Las condiciones químicas de los suelos donde crecen las Proteáceas chilenas, también muestran variaciones sobre su amplia distribución (35°–55°S), pero por lo general, crecen en suelos volcánicos (Andosoles), localmente conocidos como “trumaos” (Donoso, 2006). Dichos suelos son derivados de cenizas volcánicas, los cuales tienen una alta retención de fósforo debido a la atracción de este elemento por Al y Fe que lo ocluye o acompleja (Lambers et al., 2012). Esto se debe, a que en Chile la actividad volcánica ha sido frecuente desde hace millones de años y los derivados de cenizas volcánicas antiguas están más desarrollados y son más ricos nutricionalmente que los derivados de depósitos recientes.
La morfología y funciones de estas raíces proteoideas han sido estudiadas ampliamente en
Lupinus albus (Johnson et al., 1994; Johnson et al., 1996; Neumann et al., 2006; Kihara et al.,
2004) y también en Proteáceas de Australia y Sudáfrica (Lamont, 2003; Shane et al., 2004;
Lambert et al., 2006). Por el contrario, en Chile existen pocos estudios sobre su formación y factores que la regulan (Grinbergs et al., 1987; Ramírez et al., 2004). Sin embargo, existen experimentos recientes con E. coccineum, que muestran formación de RP en plantas regadas con y sin P (Zuñiga-Feest et al., 2008), lo que sugiere que dichas estructuras podrían formarse 13
constitutivamente. Sin embargo, al igual que en otras Proteáceas, la proporción de raíces proteoideas aumenta cuando E. coccineum crece en bajos niveles o ausencia de fósforo tanto en arena (Ochoa, 2010), como en cultivos hidropónicos, en los cuales se suprime su formación cuando las plantas son suplementadas con P, a una concentración de 50 µM (Delgado, M. comunicación personal). Sin embargo, no se sabe a qué niveles de P interno foliar se gatilla la formación de RP en Proteáceas chilenas y si especies que difieren en sus áreas de distribución y composición de los suelos, podrían presentar distintos niveles de regulación en el contenido interno de fósforo y formación de raíces proteoideas. Para tratar de contestar estas preguntas en este trabajo, se estudió el efecto del fósforo en el crecimiento y formación de RP en tres proteáceas chilenas (Embothrium coccineum, Gevuina avellana y Orites myrtoidea) que son especies que difieren en su área de distribución y composición de suelos a nivel nutricional.
1.2 Rol ecológico de las raíces proteoideas
Las raíces proteoideas (RP) son una adaptación que se presentan en la mayoría de los miembros pertenecientes a las familias Proteácea, Fabaceae, Casuarinaceae, entre otras, (Shane y
Lambers, 2005; Lambers y Shane, 2007), pudiendo encontrarlas en el Norte y Sudamérica, también en Europa, Australia, África, Asia y en Islas del Pacifico (Skene, 1998).
Las raíces proteoideas, son frecuentes en especies de regiones con significativa biodiversidad, tal como sucede en Fynbos, Sudáfrica y también al sudoeste de Australia. Las especies que presentan estas raíces proteoideas, se caracterizan por ser a menudo pioneras en primer y segundo orden, como por ejemplo: Lupinus albus que es usado como cultivo pionero en tierras bajo recuperación (Smartt, 1990). Así también crecen en las dunas de la Isla Fraser, 14
Australia, que son ocupadas por Banksia y Casuarina como especies colonizadoras (White,
1986).
1.3 Las raíces proteoideas son inducidas en condiciones de deficiencia de fósforo
Las RP son inducidas por deficiencia de nutrientes, principalmente de fósforo (P) el cual es un macro nutriente esencial para las plantas (Raghothama, 1999). Por ejemplo, en condiciones de deficiencia de P, Lupinus albus desarrolla hasta cinco veces más RP que cuando es mantenido en concentraciones óptimas de fósforo (Gardner et al., 1981; Johnson et al., 1994; Neumann et al., 2000). Otras especies en las cuales se ha observado el desarrollo de RP en condiciones de deficiencia de P son: Hakea prostrata (Roelofs et al., 2001), Grevillea crithmifolia (Skene et al.,
1996), Casuarina glauca y C. cunninghamiana (Diem et al., 2000). Los cambios morfológicos producidos por la deficiencia de P en Lupinus albus son acompañados por cambios en la expresión de algunos genes relacionados con el metabolismo como enzimas de la glicólisis, fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC), malato deshidrogenasa (MDH), entre otras (Uhde-Stone et al., 2003; Peñaloza et al., 2005). En Proteáceas chilenas no se ha estudiado la posible inducción de algunos de estos genes en raíces proteoideas. 15
1.4 Contenido de fósforo, mecanismo de almacenamiento y crecimiento en vegetales
Debido a la alta fijación de P en el suelo y a que este elemento puede llegar a ser limitante para los vegetales, el estudio de los mecanismos fisiológicos y bioquímicos que se activan en respuesta a la deficiencia de P, ha causado mucho interés, siendo Lupinus sp., y la regulación del contenido interno de fósforo, uno de los modelos más estudiados hasta el momento (Raghothama, 1999).
Entre estos mecanismos se incluyen; la regulación intracelular de P, la activación de enzimas que participan en el reciclaje de P y la inducción de rutas metabólicas alternativas (Plaxton, 1998).
La importancia del almacenamiento de P en tejidos de tallo ha sido demostrada en Banksia prionotes (Jeschke y Pate, 1995) y B. ericifolia (Parks et al., 2000). Sin embargo, debido a que la capacidad de almacenamiento de P en los tejidos es limitado, cuando el fósforo absorbido excede la capacidad de almacenamiento, se puedan desarrollar síntomas de toxicidad en las hojas (Parks et al., 2000).
Es relevante mencionar que también la concentración de fósforo en los tejidos vegetales, pueda variar estacionalmente; en donde el fósforo es almacenado en invierno, luego debe ser re- movilizado y exportado para el crecimiento de los tejidos en verano. Hay estudios, que revelan la variación estacional de fósforo en los tejidos en E. coccineum (Zuñiga-Feest et al., 2009). Así como en Proteáceas australianas como Banksia menziesii, B. attenuata, y B. hookeriana, donde la formación de raíces proteoideas ocurre especialmente en periodos de más humedad (Lamont,
2003).
Una de las estrategias para mejorar el abastecimiento de nutrientes, es la exudación de ácidos orgánicos a la rizósfera. Mediante reacciones de intercambio, estos ácidos orgánicos pueden movilizar fósforo unido a compuestos de Al3+ y Fe3+ presentes en la matriz del suelo (Marschner, 16
1995). De acuerdo a Jones y Darrah (1994), la movilización del P es un evento suelo-específico esperable en aquellos de pH ácido y en situaciones donde ocurra una activa excreción de ácidos orgánicos en la rizósfera. Estimaciones matemáticas señalan que, para lograr una eficiente movilización de P, la concentración de carboxilatos en la solución del suelo debería ser alrededor de un mili molar (Neumann y Römheld, 2001).
En la actualidad, concentraciones de este orden de magnitud han sido informadas sólo entre especies de la familia Proteácea y en Lupinus albus (Gerke et al., 1994; Dinkelaker et al., 1995). En
Proteáceas chilenas sólo se ha estudiado la exudación de ácidos orgánicos en E. coccineum y G. avellana, observándose en forma cualitativa sólo durante el otoño. No se sabe qué ácidos podrían estar exudando estas especies y si existen diferencias entre ellas, en magnitud y composición
1.5 Toxicidad del fósforo en vegetales
La capacidad de almacenamiento de P es limitado en muchas especies. Cuando el fósforo absorbido excede la capacidad de almacenamiento del tejido, se desarrollan los síntomas de toxicidad por fósforo (Parks et al., 2000). Dentro de estos síntomas, está la inhibición en el crecimiento, senescencia temprana de las hojas y presencia de regiones cloróticas/necróticas en
éstas, como ocurre por ejemplo en B. serrata, (Groves y Keraitis, 1976); B. ericifolia, (Handreck,
1991; Parks et al. 2000); B. grandis, (Lambers et al., 2002); Triticum aestivum, (Asher y Loneragan
1967).
Según Shane et al. (2004), la toxicidad por P en Proteáceas está correlacionada con una incapacidad de reducir las tasas de P absorbido a una elevada concentración de P interno, pero relativamente baja concentración de P externo. Esta escasa capacidad de regulación se ha reportado 17
en especies de Hakea prostrata, que provienen de suelos antiguos en Western Australia, donde la concentración de P es muy baja, al contrario que Grevillea crithmifolia especie que si muestra una autorregulación en la absorción de P, como se observa en la figura extraída de Lambers et al. 2008, que muestra la velocidad de absorción de P. Los niveles más alto de concentración interna de P, cuando se produce toxicidad son de 0,09 mmol P/ g-1 FM.
Fig. 1. Efecto del abastecimiento de P en la velocidad de absorción de fósforo (P) en dos especies con regulación contrastante, bajo condiciones de invernadero: Grevillea crithmifolia y Hakea prostrata (Fuente: Lambers et al., 2008)
Las proteáceas chilenas presentan niveles altos de fósforo interno, comparado con Proteáceas australianas que corresponden a contenidos tóxicos para la mayoría de ellas. Esto ha sido reportado por Lambers et al. (2012), donde L. hirsuta y E. coccineum presentan una concentración de P tres veces mayor en las hojas, en comparación con las especies de Western Australia. Es decir, las
Proteáceas chilenas tolerarían mayores concentraciones de P interno, sin desarrollar toxicidad y al mismo tiempo formarían RP a altas concentraciones de P interno, aunque estas hipótesis no se han verificado aun. 18
1.6 Formulación del problema
Los suelos del Centro – Sur de Chile son jóvenes y muy fértiles, caracterizados por sus bajos niveles de fósforo disponible, altas concentraciones de aluminio, gran cantidad de materia orgánica, alta acidez (pH bajo) y alto contenido de P total (Borie y Rubio, 2003). Los suelos derivados de cenizas volcánicas, caracterizados por la presencia de aluminosilicatos no cristalinos también presentan alta capacidad de fijación de P (Besoain y Sepúlveda, 1985), aumentando la fracción de P no disponible. Adicionalmente, las condiciones químicas de los suelos donde crecen las Proteáceas chilenas, también muestran variaciones dentro de su amplia distribución geográfica, pero por lo general, crecen en suelos Andisoles, (Donoso, 2006), y condiciones de humedad muy contrastantes, que varía entre 0,5 a 1871mm. de agua caída (Vicuña et al., 2011).
También algunas especies de Proteáceas pueden crecer sobre suelos jóvenes, recién formados proveniente de roca granítica en la cordillera de los Andes, como es el caso de E. coccineum y O. myrtoidea (Piper et al., 2010; Lambers et al., 2012)
La oclusión de P en los suelos a nivel mundial se ha relacionado con la presencia de especies vegetales que poseen mecanismos para tolerar esta deficiencia, como es el caso de zonas de alta diversidad como SW Australia, Sud África (Lambers et al., 2012). Sin embargo, en Chile la relación entre la disponibilidad de P del suelo donde crecen las Proteáceas y los mecanismos regulatorios de la formación de RP han sido escasamente estudiados
Existe diferencias en las 3 especies de Proteáceas estudiadas en esta tesis: E. coccineum se caracteriza por presentar la mayor área de distribución, por lo tanto están sometidas a condiciones de humedad, de suelo y de clima muy diferentes en toda su distribución, en cambio O. myrtoidea presenta la distribución geográfica más restringida de todas las Proteáceas chilenas, mientras que
G. avellana presenta una distribución y variación en la composición nutricional de suelos 19
intermedia, siendo también intermedia en cuanto a su extensión geográfica. No se sabe si estas especies presentarán diferencias en los niveles internos de P al ser tratados con distintas soluciones nutritivas (sin P, óptimo y exceso) y si la regulación en la formación de RP se podría relacionar con su distribución geográfica y de suelos.
1.7 Proteáceas chilenas
La Familia Proteácea se distribuye en el rango de los suelos de origen volcánico en el sur de
Chile, estando representada por seis especies: Embothrium coccineum Forst, notro o fosforito;
Gevuina avellana Mol., avellano (Marticorena, 1985); Orites myrtoidea (Poepp. Et Endl), Benth.
Et Hook, radal enano o mirtillo; Lomatia ferruginea, fuinque o romerillo; Lomatia hirsuta (Lam)
Diels, radal; Lomatia dentata (R. et Pav) R.Br., avellanillo. Cada una de estas especies difiere en su rango de distribución y capacidad de colonización, como se muestra en la Fig. 2. Algunos autores han atribuido a las raíces proteoideas un rol en su capacidad de colonización para E. coccineum
(Piper et al. 2012). Debido a que Embothrium coccineum, G. avellana y Orites myrtoidea son especies, que difieren en sus áreas de distribución, siendo la más extendida E. coccineum ya que abarca desde la VIII hasta la XII región, y el más restringido es O. myrtoidea, que crece en suelos cordilleranos de la VIII hasta la IX región (ver Fig.2) ya que difieren los suelos donde crecen, se plantea usar estas 3 especies para contestar las preguntas expuestas anteriormente. 20
Fig. 2 Muestra el rango de distribución de cada unas de las proteáceas chilenas. A) Embothrium coccineum;
B) Gevuina avellana; C) Orites myrtoidea; D) Lomatia ferruginea, E) Lomatia hirsuta y Lomatia dentata.
1.7.1 Orites myrtoidea
Orites myrtoidea es una especie endémica de Chile, en peligro de extinción. Esta especie crece desde el rio Maule (35° 57´S) hasta el Bio – Bio (38°00´S), habitando especialmente sobre suelos rocosos y volcánicos. (Hoffmann, A. 2005). En cuanto a su estudio, en relación de las raíces proteoideas y el efecto del fósforo en la formación de RP, es una de las especies menos estudiadas, solamente hay antecedentes preliminares que dicen que Orites myrtoidea presenta una alta tolerancia al exceso de P e insensibilidad a deficiencia de P, como mecanismo inductor de P.
Dichas características, fueron estudiadas por primera vez para esta especie endémica chilena, usando cultivos hidropónicos. (Díaz et al., 2010). Sin embargo, se desconoce los niveles internos de fósforo que gatillarían la formación de raíces proteoideas y si esto se relaciona con las 21
características de los suelos donde habita. Se esperaría que presentara una baja regulación de la absorción de P, como lo han exhibido otras especies que se desarrollan en suelos muy pobres en
SW Australia.
1.7.2 Embothrium coccineum.
Embothrium coccineum es una especie endémica de los bosques de Chile y Argentina, que presenta un amplio rango de distribución creciendo desde Curicó – Linares (alrededor de los 35°
S) hasta Tierra del Fuego (alrededor de los 56°S), desde el nivel del mar hasta los 1.200 metros de altitud (Donoso et al., 2006). E. coccineum es una especie intolerante a la sombra, con alta capacidad colonizadora y gran producción de semillas, las cuales son diseminadas por el viento
(semillas aladas). Dichas semillas poseen alta viabilidad y germinación (sobre 90 %), además poseen una alta capacidad de regeneración y rápido desarrollo (Donoso et al., 2006). Esta planta puede desarrollarse exitosamente en ambientes con escasa disponibilidad de nutrientes. Estas condiciones ambientales favorecen la aparición de RP en E. coccineum (Donoso, 2006).
Experimentos realizados por Zuñiga-Feest et al., (2010) mostraron que, de forma similar a lo reportado en otras Proteáceas, E. coccineum, en condiciones de deficiencia de P desarrolla mayor proporción de RP, aunque dichas estructuras se formaron tanto en plantas regadas con solución nutritiva completa (Hoagland) en condiciones de invernadero, como en plantas sin nutrientes. 22
1.7.3 Gevuina avellana
G. avellana, es una especie que pertenece al género monotípico, que crece desde la IV
(32º 16’ S) a la XI región de Chile (49º 16’ S) y también crece en lugares adyacentes en
Argentina. Se desarrolla en condiciones variadas de suelo, haciéndolo en suelos profundos, con buena fertilidad, buena porosidad y baja densidad aparente y por otro lado, sobre sustratos como lavas, escorias y en suelos ñadis (Donoso, 2006). Su capacidad para establecerse en suelos erosionados y sobre escorias y rocas, se ha atribuido a sus raíces proteoideas, que le permiten mejorar la absorción de agua y nutrientes (Del Fierro y Pancel, 1998), sin tener aun evidencia que sustente esta observación.
Además el sistema radical de G. avellana, se destaca por su volumen y biomasa relativa dentro de la planta y la calidad estructural de ellas, las cuales presentan una estructura similar a una ventosa en su extremos en contacto con el suelo, denominada claviforme (Ramírez et al.,
2005). Hay varios estudios relacionados con su morfología y anatomía (Grinbergs et al., 1986;
Ramírez et al., 2005), sobre la formación de estas raíces proteoideas en distintos sustratos (Pozo,
1989; Krause, 1996), pero no existen estudios que evalúen el efecto de la nutrición en la formación de RP en esta especie.
Existen numerosas interrogantes, sobre qué factores regulan la formación de RP en
Proteáceas chilenas, existiendo algunos reportes que muestran la formación de RP en E. coccineum ocurre en tratamientos nutricionales con o sin P (Zuñiga et al., 2010; Morales, 2004), en donde la formación de RP se presenta en todos los tratamientos, pero la proporción de RP disminuye en plantas bien nutridas. Además existe otro antecedente para la misma especie, en 23
plantas cultivadas en hidroponía (50 µM P) donde la formación de RP es suprimida en plantas suplementadas con P (Delgado M, comunicación personal).
No se saben los niveles internos de fósforo que gatillan la formación de RP en estas 3 especies, y si hay alguna relación entre el área de distribución y el tipo de suelo que habitan con la regulación interna de P y la formación de RP. En esta Tesis se pretende establecer el posible efecto que producen distintas concentraciones de fósforo (externo) en la sobrevivencia, crecimiento, formación de RP, P interno (foliar) y posible toxicidad en proteáceas chilenas que difieren en su distribución geográfica y el tipo de suelo en que crecen. 24
1.8 Hipótesis
1 Debido a que E. coccineum y G. avellana crecen en variadas condiciones de suelo, la
deficiencia de fósforo induciría la formación de raíces proteoideas, entonces un riego
sin fósforo, promoverá un mayor número de RP y/o mayor proporción de RP/raíz
total, comparado con plántulas bajo condiciones nutricionales óptimas y exceso de P.
2 Debido a que O. myrtoidea proviene de suelos de mayor déficit nutricional, se
esperaría que formara raíces proteoideas en todos los tratamientos en la misma
proporción, al contrario que E. coccineum y G. avellana que crecen en suelos de
variado contenido nutricional.
3 O. myrtoidea, al ser una especie que puede vivir en suelos empobrecidos y con baja
concentraciones de fósforo, se espera que un exceso de dicho nutriente tenga un
efecto más negativo en el desarrollo de sus plántulas, comparado con E. coccineum y
G. avellana, presentando menor crecimiento, así como toxicidad y muerte
4 E. coccineum al ser una especie colonizadora y que puede vivir en suelos con baja
concentración de P, se propone que un exceso de dicho nutriente, no aumentará la
concentración de P interno, evidenciando mayor capacidad de autorregular la
absorción de fosforo. 25
1.9 Objetivos
1.9.1 Objetivo general:
Estudiar el efecto del fósforo en el crecimiento y formación de RP en 3 proteáceas
chilenas (Gevuina avellana, Embothrium coccineum y Orites myrtoidea), que difieren en
su área de distribución y la composición nutricional de suelos donde habitan.
1.9.2 Objetivos específicos:
Determinar los efectos del riego con distintas disponibilidad de fósforo, sobre la
formación de RP, exudación de ácidos orgánicos, sobrevivencia y crecimiento en las 3
proteáceas en estudio.
Determinar la posible relación entre concentración interna (tejido vegetal) y externa de P
(disponibilidad), con la sobrevivencia, el crecimiento y la formación de RP de las
proteáceas en estudio.
Determinar la posible relación entre el área de distribución (restringida: suelos pobres v/s
amplia: suelos variados) de las proteáceas estudiadas, con los niveles de regulación del
fósforo interno y la formación de raíces proteoideas. 26
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Procedencia del material vegetal
Se colectaron semillas de Gevuina avellana, Embothrium coccineum y estacas de Orites myrtoidea de 1 año de edad. Las semillas de Gevuina avellana, y Embothrium coccineum, fueron colectadas en la localidad de Capitán Pastene ubicada en la comuna de Lumaco (38° 11′ 36″ S;
72° 59′ 33″ W), IX Región, dichas plántulas fueron producidas en vivero, mientras que las estacas de Orites myrtoidea, fueron colectadas en el Parque Nacional Tolhuaca (38° 10´S; 71°
40′ W), IX Región, Chile, que posteriormente fueron enraizadas en vivero.
2.2. Diseño experimental
Para lograr los objetivos señalados, se efectuó un experimento bajo condiciones de invernadero, en donde se seleccionaron 36 plantas por especie (108 plantas en total), las que fueron trasplantadas a maceteros de 21cm. de diámetro, que contenían como sustrato arena lavada. Se mantuvieron en condiciones de invernadero cerca de 1 mes (Octubre de 2011), siendo regadas 2 veces por semana, con agua y solución nutritiva completa (Phostrogen ®) alternadamente. Posteriormente, se tomaron al azar 9 individuos por cada uno de los tratamientos
(ver Tabla 1), sumando 36 plántulas por especie, en donde cada grupo se regó dos veces por semana con distintas soluciones nutritivas de fósforo (P): solución completa (H-Comp.), deficiente de P (H-P), con exceso de P (H– 10 X) y agua destilada. Las soluciones se agregaron una vez a la semana, usando la solución nutritiva respectiva y haciendo otro riego con agua durante dos meses. Para E. coccineum y G. avellana, los meses de experimentación fueron de 27
noviembre a enero del 2012, mientras que O. myrtoidea fue de diciembre a febrero del mismo
año, bajo condición de invernadero.
A A B
Fig. 3. A) Cultivo de plántulas de E. coccineum, G. avellana. B) Cultivo de plántulas de O. myrtoidea bajo
condiciones de invernadero.
Durante estos 4 meses se evaluó la tasa de sobrevivencia y se registró la altura de todas las
plántulas, al inicio y al final del experimento.
La temperatura registrada durante los meses de riego con las soluciones, fue en promedio
20,9 º C, con una mínima de 14,9 º C y una máxima de 29,3 ºC. La intensidad lumínica registró
un promedio de 4.217 LUX, con una mínima de 0 y una máxima de 8.152 LUX (ver Anexo 4). 28
Tabla 1. Tratamientos aplicados a cada proteáceas en estudio: Gevuina avellana, Embothrium coccineum y
Orites myrtoidea, con un tamaño muestral de 9 plántulas por tratamiento. La concentración de fósforo de cada solución se indica en la penúltima columna de la tabla. En la última columna, se indican los códigos correspondientes a cada concentración.
Proteáceas Tratamientos Concentración de Códigos P Hoagland sin P - H -P Gevuina avellana Hoagland completo 1mM H- Comp. (Avellano) Hoagland con exceso 10mM H- 10X de P Agua - Agua Hoagland sin P - H -P Embothrium Hoagland completo 1mM H- Comp. coccineum Hoagland con exceso 10mM H- 10X (Notro) de P Agua - Agua Hoagland sin P - H -P Orites myrtoidea Hoagland completo 1mM H- Comp. (Radal enano) Hoagland con exceso 10mM H- 10X de P Agua - Agua
2.3 Medición de biomasa
Se midió la biomasa seca total, aérea (tallo y hojas) y radical, de seis plántulas por procedencia, antes de comenzar con los tratamientos nutritivos en invernadero. Dicho valor corresponde al tiempo cero.
Al finalizar los tratamientos, se midió la biomasa seca total, aérea (tallo y hojas) y radicular de las plántulas en ambos experimentos, utilizando una balanza de precisión (ACCULAB VIC -
303) para medir el incremento en masa seca. 29
2.4 Biomasa en cultivo bajo invernadero
Al finalizar los dos meses del experimento, se cosecharon las 29 plántulas de cada especie, para luego lavarlas y secarlas a 60 º C en estufa (VENTICELL, Medcenter Einrichtunga Gmbh,
Alemania), durante 48 horas. Se pesó el tejido seco total de las 9 plántulas por procedencia y luego, fue separado en parte aérea (hojas y tallo), raíz normal y raíces proteoideas. Éstas últimas, fueron cuidadosamente lavadas con agua destilada, una vez separadas del resto de la raíz.
Con los valores obtenidos se determinó la tasa de crecimiento relativo, la distribución de biomasa y la proporción masa RP/ masa total raíz.
2.5 Evaluación de vitalidad por aspecto
Se elaboró un parámetro cualitativo, para designar el nivel de calidad a cada plántula. Se definieron tres categorías: (-1), (0) y (1), en las cuales se agrupó a los individuos según apariencia, considerando coloración y turgencia, principalmente.
Para una apreciación más objetiva de este parámetro, se definieron los tres niveles de calidad:
(-1) En su mayor parte seca o totalmente muerta. Poco o nada de turgencia, falta de
coloración, tamaño pequeño generalizado de la planta.
(0) Plántula con turgencia y coloración adecuada. Hojas suaves de tamaño medio.
Desarrollo normal, pero sin brotes nuevos.
(1) Representa la mejor calidad. Las hojas son grandes, verdes, turgentes y con brotes
nuevos. Mayor desarrollo radical y tallo rígido. 30
Fig. 4. Representantes de cada nivel para evaluación de calidad morfológica en plántulas de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, desde el más bajo hasta el más alto: estado -1(plantas muertas), estado 0 (plantas intermedias) y estado 1(plantas sanas).
2.6 Evaluación del número de RP
Se contó el número total de raíces proteoideas por plántula, luego de ser extraídas del sistema radical. Se calcularon valores absolutos, frecuencia de plántulas con RP, razón RP/ Raíz Total y relación parte aérea/raíz (shoot/root).
2.7 Morfología de raíces proteoideas
Al inicio del experimento, se extrajeron raíces proteoideas de O. myrtoidea, las cuales fueron fijadas con glutaraldehido 1-4% tamponado con fosfato de sodio de pH 7.2- 7.4 durante
2 hrs a 4°C. Posteriormente se siguió utilizando el Protocolo de microscopia electrónica de barrido MEB (ver anexo 3). Dicho análisis se hizo sólo a esta especie, debido a la mayor disponibilidad de tejido. 31
2.8 Exudación de RP
Al final del experimento en invernadero, se extrajeron raíces proteoideas de aquellas plantas en los tratamientos en que se formaron. Las RP fueron cuidadosamente separadas del resto de la raíz, con ayuda de tijeras, y posteriormente lavadas con agua destilada.
Luego se pusieron a secar al aire por cinco minutos. Posteriormente, se dejaron inmersas en agar e indicador de pH, siguiendo la metodología descrita por Neumann et al., (2000), usando placas estériles con agar preparado con indicador de pH (Púrpura de Bromocresol, 0,1% w/v), previamente esterilizado a 121º C por 24 horas. La exudación de ácido fue detectada por un cambio de color de púrpura a amarillo. Se tomaron fotografías después de 24 horas de exposición al indicador de pH y las imágenes se evaluaron usando el software de análisis de imágenes
ImageJ (ImageJ v.1.42, National Institutes of Health, U.S.A.), midiendo el área del halo cuando
éste fue detectable. Previamente la exudación habría sido detectada en Gevuina avellana y E. coccineum a través de este método, como lo muestra la figura 5.
Figura 5. Exudación de ácidos en clusters de raíces proteoídeas, (a) raíces de E. coccineum y (b) raíces de G. avellana (Zúñiga-Feest et al., 2010) 32
2.9 Análisis de fósforo interno (foliar)
Al inicial y final del experimento de invernadero, se extrajeron 20 mg. de tejido foliar de 3 plántulas por tratamiento de cada una de las especies. Las cuales fueron molidas con nitrógeno líquido y 1 ml de ácido acético al 2%. Una vez extraído el P soluble se traspasaron a tubos eppendorf, los cuales fueron puestos en un agitador horizontal a 50 rpm por 30 min. y T° ambiente. Posteriormente se procedió a extraer nuevamente el sobrenadante del P soluble para proceder a la determinación del fósforo interno foliar, siguiendo el protocolo adaptado de Bollons y Barraclogh. (Anexo 2)
2.10 Análisis estadísticos
Se realizó un análisis ANOVA desbalanceado de dos vías para determinar diferencias entre tratamientos y procedencias. Luego se usó test de Tukey para identificar aquellos valores con diferencias significativas. Se consideraron con diferencia significativa los valores p < 0.05.
Los análisis y las ilustraciones gráficas, fueron realizados con Sigma Plot 11.0 y Statistica 8.0 y Microsoft Office Excel 2007. 33
3. RESULTADOS
3.1 Efecto del P sobre el crecimiento en altura de las plántulas.
Se registró la altura inicial y final del vástago de 24 plántulas por especie (todas enumeradas). De acuerdo a los valores obtenidos al inicio, la altura promedio de E. coccineum, fue de 41,64 cm aprox. y el promedio más bajo se presentó en O. myrtoidea, de 12,53 cm. aprox.
Al final de los dos meses bajo distintos tratamientos de riego, se realizó una segunda medición de altura en cada plántula. En el caso de aquellas plántulas que murieron durante el experimento, se consideró sólo la primera medida. De los promedios finales obtenidos (Fig. 6) se observó que E. coccineum y G. avellana no mostraron incremento (inicial – final) entre tratamientos, pero sí las hubo en O. myrtoidea. Mientras que entre especies, sí hubo diferencias significativas en altura, puesto que todas las plántulas presentaron tamaños iniciales distintos (Fig. 6).
Los mayores incrementos en altura se observaron en G. avellana en el tratamiento Hoagland sin P (37,5%) y Hoagland completo (37,1%) y O. myrtoidea con 33,1% en agua. El menor incremento relativo se observó en O. myrtoidea con un 2,9 % presentado por el tratamiento de exceso de P (H-10X) (Tabla 2). 34
Alt. inicial E. coccineum 60 Alt. final
40 Alt. inicial-final(cm) Alt. 20
0 G. avellana 60
40 Alt. inicial-final(cm) Alt. 20
0
O. myrtoidea 60
40 Alt. inicial-final(cm) Alt. a b 20 b b
0 Agua H-P H-Comp H-10X Tratamientos Fig. 6. Efecto del fósforo en la altura promedio inicial – final en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. El tamaño muestral fue de 6 plántulas por tratamientos en cada una de las especies. Las barras de colores blanco indican los promedio iniciales de las plántulas y las barras achuradas indican los promedios finales, después de 2 meses de tratamientos nutricionales (Nov.- Ene. en E. coccineum y G. avellana) y (Dic. – Feb. en O. myrtoidea): Agua;
Hoagland sin P (H – P); Hoagland completo o 1mM P (H – Comp.) y Hoagland con exceso de P o 10mM P (H –
10X). Letras minúsculas indican diferencia significativa entre tratamientos y letras mayúsculas indican diferencia entre especies (p > 0,05). 35
Tabla 2. Incremento relativo en altura (%) en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. Tamaño muestral de 6 plántulas por tratamiento de cada una de las especies. No hay diferencias significativas entre tratamientos, pero sí entre especies.
Tratamientos
Especies Agua H-P H-Comp. H -10X
E. coccineum 16,5% + 9,3 14,1% + 9,3 23,6% + 9,2 11,4% + 6,4
G. avellana 25,5% + 7,6 37,5% + 9,3 37,1% + 7,6 21,4% + 11,3
O. myrtoidea 33,1% + 11,8 20,1% + 5,2 17,1% + 7,8 2,9% + 1,7
3.2 Efecto del P en la biomasa
3.2.1 Biomasa total
Respecto a la biomasa total promedio por especies, E. coccineum tuvo los valores más altos al inicio de los tratamientos nutricionales, seguidos después por G. avellana y finalmente O. myrtoidea, donde fueron significativamente menores comparados con las otros especies
(p < 0,001) (Fig. 7)
Al final de los 2 meses de tratamiento nutricional los resultados no siguieron la misma tendencia que al inicio, puesto que G. avellana fue quien presentó los valores más altos en peso seco con un promedio de 15,85 + 1,12 g. en el tratamiento con Agua, luego E. coccineum con un promedio de 10,57 + 3,00 grs. en Hoagland sin P y finalmente O. myrtoidea con 2,74 +
0,44g. en agua. Observando los datos de la Fig. 8 podemos ver que no hay diferencias significativas entre tratamientos, pero si entre especies (p < 0,001). 36
15 a
10 a peso seco total(gr) seco peso 5
b
0 E. coccineum G. avellana O. myrtoidea especies
Fig. 7. Biomasa inicial, seca total de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. Cada valor corresponde al promedio de 6 individuos por especies. Letras minúsculas indican variación significativa entre especies (p< 0,001)
E. coccineum G. avellana O. myrtoidea
15
10
5 Peso seco (grs.) seco Peso
0 Agua H-P H-Comp H-10X Agua H-P H-Comp H-10X Agua H-P H-Comp H-10X
Tratamientos Tratamientos Tratamientos
Fig. 8. Efecto del fósforo en la biomasa seca total de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. Cada valor corresponde al promedio de 6 individuos por tratamiento, de cada una de las especies. No hay diferencias significativas entre tratamientos, pero si entre especies (p< 0,001) 37
En la distribución de biomasa inicial (Fig. 9) las especies difirieron entre sí p< 0,05. En la distribución de los órganos que está compuesta la plántula (Hojas, tallo, RN y RP), se puede observar en la figura 9, que en G. avellana el porcentaje de hojas fue mayor al 50% del total de la plántula, mientras que en E. coccineum y O. myrtoidea no sobrepasan el 40%, presentando así diferencias significativas entre especies. Con respecto al tallo no hay diferencias ya que la proporción se mantiene entre las especies en estudio, en cambio, en la proporción de raíz normal
(RN) E. coccineum presentó un 37% superando a las demás especies, sin embargo tiene una menor proporción de raíces proteoideas (RP), en donde O. myrtoidea se destaca por presentar un
9,9 % de su peso total en RP, siendo estadísticamente significativo entre especies (p=0,003)
140 % Hoja % Tallo 120 % RN %RP 100 b a a
80 b a c
a 60 a a 40 % Distribución biomasa inicial biomasa Distribución % 20 a b a
0 E. coccineum G. avellana O. myrtoidea Especies
Fig. 9. Distribución de biomasa inicial de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. Cada valor corresponde al promedio de 6 individuos por especies. Letras minúsculas indican variación significativa entre especies (p= 0,003) 38
Al finalizar los 2 meses de experimentación la distribución de biomasa final (Fig. 10) se puede observar que mantuvo la tendencia, aumentando en cada una de ellas. O. myrtoidea fue la especie que formó más RP y su porcentaje relativo fue más alto con nutrición completa (H-
Comp.), bordeando el 15 % del peso seco total de la plántula, mientras G. avellana formó mas
RP en Hoagland sin P (H-P) y en E. coccineum en Hoagland completo (H-Comp.) al igual que O. myrtoidea pero en menor porcentaje relativo. Entre tratamientos no hay diferencias significativas, pero si hay entre especies p<0,001. 39
140 E. coccineum % Hoja % Tallo 120 % RN % RP 100
80
60
b a b a 40
20 Distribución biomasa final(%)
0 G. avellana 120
100
80
60
40
20 Distribución biomasa final(%)
0
O. myrtoidea 120
100
80
60
40 Distribución biomasa final (%) 20
0 Agua H -P H - Comp. H - 10X
Tratamientos
Fig. 10. Efecto del fósforo en la distribución de biomasa final de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea.
Cada valor corresponde al promedio de 6 individuos por especies. Letras minúsculas indican variación significativa entre tratamientos (p< 0,001). 40
3. 3 Efecto del fósforo en la formación RP y Raíz total
El número de raíces proteoideas varió significativamente entre especies, pero no entre tratamientos. Como puede observarse en la Figura 11, inicialmente todas las especies presentaron raíces proteoideas, y también al final de los 2 meses bajo distintos tratamientos nutricionales.
Plántulas de E. coccineum formaron más RP en Hoagland completo, a pesar de ser la especie que tenía menor número de RP inicial (de 3 a 4 RP por planta en cada tratamiento). Sin embargo, en
G. avellana y O. myrtoidea formaron más RP en Hoagland sin P (H-P), (Ver Fig. 11). 41
E. coccineum RP inicial RP final
30
20 RP Inicial-final RP
10
0 G. avellana
30
20 RP Inicial-final RP
10
0 O. myrtoidea
30
20 RP Inicial-final RP
10
0 Agua H -P H-Comp H -10X Tratamientos Fig. 11. Efecto del fósforo en el número de RP inicial – final en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea. El tamaño muestral fue de 6 plántulas por tratamientos de cada una de las especies. Las barras de colores blanco indican los promedio iniciales de las plántulas y las barras oscuras indican los promedios finales, después de 2 meses de tratamientos nutricionales: Agua; Hoagland sin P (H – P); Hoagland completo o 1mM P (H – Comp.) y Hoagland con exceso de P o 10mM P (H – 10X). No hay diferencia significativa entre tratamientos, para un mismo tiempo. 42
En cuanto a la proporción RP/RT se puede observar que O. myrtoidea presentó mayor proporción de RP, en comparación a las demás especies en estudio, siendo cercano al 15%, pero aun así no hay diferencias significativas entre tratamientos y especies (Fig. 12).
Embothrium coccineum
30 30
20 20 RP/RT
N° PROMEDIO RP N°PROMEDIO 10 10
0 0 Gevuina avellana 30 30
20 20 RP/RT N° PROMEDIO RP N°PROMEDIO
10 10
0 0 Orite myrtoidea
30 30
20 20 RP/RT N° PROMEDIO RP N°PROMEDIO 10 10
0 0 Agua H -P H-Comp H -10X Agua H -P H-Comp H -10X
Tratamientos Tratamientos Fig. 12. Efecto del Fósforo en el N° promedio de RP y el peso relativo RP/Raíz total en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, indicado en cada uno de los tratamientos. Estos valores se obtuvieron del promedio de 6 plántulas por tratamientos, luego de dos meses con tratamientos nutricionales, bajo condiciones de invernadero. Las plántulas de E. coccineum y G. avellana tenían 6 meses de edad, mientras que O. myrtoidea 4 meses al inicio de los experimentos. No presentan diferencias significativas. 43
La frecuencia o proporción de plantas que presentan RP, varió con el tratamiento nutricional, especialmente para G. avellana y O. myrtoidea, disminuyendo con el exceso de fósforo.
Tabla 3. Relación porcentaje de plantas con RP en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea por tratamientos.
La segunda columna indica el efecto del fósforo en la razón shoot/root para cada especie por tratamientos. Los valores son promedios de 6 réplicas + error estándar. No hay diferencias significativas.
Tratamientos Tratamientos Especies Agua H-P H-Comp. H -10X Agua H-P H-Comp. H -10X
E. coccineum 29% 45% 53% 42% 0,35 + 0,02 0,44 + 0,04 0,34 + 0,02 0,43 + 0,03
G. avellana 31% 36% 28% 25% 0,59 + 0,04 0,71 + 0,11 0,63 + 0,06 0,76 + 0,15
O. myrtoidea 36% 36% 33% 14% 0,22 + 0,01 0,19 + 0,02 0,21 + 0,02 0,37 + 0,03
3.4 Concentración de fósforo foliar por tratamientos.
El análisis de fósforo interno foliar, efectuado en plántulas de E. coccineum, G. avellana y
O. myrtoidea bajo condiciones de invernadero, muestra la relación que existe entre la cantidad de fósforo agregado a la solución y la cantidad de este dentro del tejido seco, luego de dos meses de tratamientos nutricionales.
Como muestra la Tabla 4 no se observaron diferencias significativas (p>0,05), sin embargo, se ve claramente que al inicio del experimento las plántulas tenían una alta concentración de fosforo foliar, destacándose O. myrtoidea con 1,71 mg P/g -1 tejido seco, y una baja concentración en G. avellana bordeando los 0,31 mg P/g -1 tejido seco. 44
Una vez finalizado el experimento se observó que el contenido de P de los tratamientos
1mM P (Hoagland completo) y 10mM P (exceso de P) no influyó significativamente en la concentración interna de P en las plantas, puesto que tuvieron un bajo contenido de fosforo foliar en ambas condiciones. La menor concentración se presentó en G. avellana en el tratamiento sin fosforo y Hoagland completo (1mM P) con valores de 0,15 y 0,16 mg P /g -1 tejido seco y O. myrtoidea en Hoagland completo donde fue de 0,80 mg. P /g -1 tejido seco.
Tabla 4. Concentración de fósforo interno foliar de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, en miligramos por gramos de tejido seco inicial y cada uno de los tratamientos. Cada valor corresponde al promedio + error estándar de la concentración de P interno, siendo determinaciones independientes. No hay variaciones significativas entre tratamientos.
Tratamientos Inicial Agua H-P H-Comp. H -10X -1 -1 -1 -1 -1 Especies mg P/g Ts mg P/g Ts mg P/g Ts mg P/g Ts mg P/g Ts E. coccineum 1,03 + 0,15 0,64 + 0,01 0,43 + 0,08 0,68 + 0,07 0,73 + 0,12 G. avellana 0,31 + 0,03 0,19 + 0,03 0,15 + 0,02 0,16 + 0,00 0,21 + 0,07 O. myrtoidea 1,71 + 0,06 0,73 + 0,01 0,75 + 0,03 0,80 + 0,06 0,65 + 0,01
3.5 Efecto del P en la calidad morfológica y sobrevivencia de las plantas
Se estableció arbitrariamente un valor de calidad por aspecto asignado que corresponde a: -
1 (dañada), 0 (intermedia) y 1 (sana), tal como se observa en la figura 4. Se evaluaron 6 plantas por tratamiento, sumando un total de 24 plantas por especies; lo cual significa, que el puntaje ideal en este caso es de 24 (si todas las plantas fueran calificadas con 1 positivo). En el puntaje real, G. avellana mostró la mejor calidad, con un valor de 16, que lo aleja por mucho de E. coccineum, con un valor de 7 y de O. myrtoidea, que tuvo un valor de 4. Esto indica que G. 45
avellana tuvo el mejor valor como especie entre los tratamientos. El resumen evaluativo de calidad por tratamientos y por especies se indica en la tabla 5.
Tabla 5. Calidad por tratamientos en cada especies de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, indicado como la sumatoria de todas las plantas evaluadas de acuerdo a su categoría (1= sana; 0=intermedia; -1= dañadas). Se utilizó un tamaño muestral de 6 plántulas por tratamientos.
Especies E. coccineum G. avellana O. myrtoidea Sumatoria Agua 2 6 6 14 H-P 3 6 -1 8 H-Comp. 3 3 1 7 H -10X -1 1 -2 -2 Sumatoria 7 16 4
Las Plántulas de G. avellana presentan 100% de sobrevivencia en agua, mientras que O. myrtoidea en Hoagland sin P. Sin embargo las plántulas de E. coccineum y O. myrtoidea alcanza el 50% de sobrevivencia en tratamiento con exceso de P. Según la prueba de X2 (X2 calculado:
75,2 y X2 esperado: 12,59) existen diferencias significativas entre especies y tratamientos nutricionales. (Tabla 6)
Tabla 6. Porcentaje de sobrevivencia de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, durante 2 meses de experimentación. Se utilizó un tamaño muestral de 8 plántulas por tratamientos. X2 p>0,05
Especies E. coccineum G. avellana O. myrtoidea Tratamientos Agua 75% 88% 100% H-P 88% 100% 63% H-Comp. 75% 75% 75% H -10X 50% 63% 50% 46
3.6 Morfología de raíces proteoideas
3.6.1 Morfología RP a simple vista.
En cuanto a la morfología de las RP, se pueden observar que tienen distintas formas y tamaños. Las RP observadas de E. coccineum mantuvieron una forma casi esférica durante su desarrollo, aunque fueron variables en tamaño, los cuales fluctuaron entre 1,5 -3,5 cm de largo
(Fig.13). Mientras que las RP de G. avellana presentan una estructura muy similar a las de E. coccineum (esférica – ovalada) variando su tamaño entre 1,0 – 4,0 cm. de largo (Fig. 14), y finalmente las raíces proteoideas de O. myrtoidea no tienen una forma tan regular, ya que sus pelos radicales tienden a disponerse como entretejidos, formando una masa menos definida, con un largo de 1 cm (Fig. 15).
Fig. 13. Imágenes de RP representativas en E. coccineum, observadas en diferentes estados. A) Planta entera de E. coccineum. B) Detalle del sistema radical, flechas indican RP en distintas etapas de desarrollo. C) Detalle de RP en desarrollo, joven de acuerdo a la clasificación de Shane et al., (2002) 47
1 2 3
Fig. 14. Imágenes de RP representativas en G. avellana, observadas en diferentes estados. A) Planta entera de G. avellana. . B) Etapas de desarrollo de RP (1: Jóven – 2: madura – 3: senescente). C) Detalle del sistema radical, flechas indican RP en distintas etapas de desarrollo
Fig. 15. Imágenes de RP representativas en O. myrtoidea, observadas en diferentes estados. . A) Planta entera de
O. myrtoidea. B) Detalle de RP bajo lupa de O. myrtoidea. C) Detalle del sistema radical, flechas indican RP en distintas etapas de desarrollo. 48
3.6.2. Morfología de RP electrónica
Las imágenes obtenidas de la observación al microscopio electrónico de barrido (MEB), se puede apreciar las estructuras de raíces proteoideas, en detalle. En la Figura 16 se observa el largo y disposición de los pelos radicales de O. myrtoidea, mientras que en la Figura 17 se observa la estructura general de la raíz proteoídea de O. myrtoidea, donde se ve una masa de raicillas muy entretejidas, cuyos pelos radicales son extremadamente largos, con E. coccineum (datos no mostrados).
Fig. 16. Imagen de pelos radicales de raíces proteoideas de O. myrtoidea, obtenida por microscopia de Barrido
(LEO – 420) 49
Fig. 17. Imagen de raíz proteoideas completa de O. myrtoidea, obtenida por microscopia de Barrido (LEO –
420). Escala al costado inferior izquierdo igual a 1 mm.
3.7 Exudación ácida de RP
Para determinar el nivel de exudación de las raíces proteoideas de las 3 especies en estudio, se utilizaron el tipo de raíces proteoideas representativas de cada tratamiento (agua, H-P, H-
Comp., H-10X) en las 3 especies de estudio (E.coccineum, G. avellana y O. myrtoidea). Se usaron RP vivas, no senescentes tomadas al azar de las plantas sanas que fueron cosechadas. 50
A B
Fig. 18. Placas de agar, con púrpura de bromocresol como indicador de pH (ver metodología en página 23).
Fotografía con aumento de saturación y cambio de matiz. A) Halo de exudación de RP jóvenes de E. coccineum, apreciable en los tratamientos de riego con agua. Flechas blancas indican los cambios de coloración más representativos. B) Halo de exudación de RP madura de G. avellana en Agua.
Las raíces proteoideas de las 3 especies de Proteáceas en estudio, en los distintos tratamientos nutricionales, no mostraron exudación. Sin embargo, sólo en E. coccineum y G. avellana, hubo una leve exudación en las raíces proteoideas que estaban bajo tratamiento con agua, ya que se apreció un pequeño cambio de tonalidad en el agar, como se observa en la Figura
18. 51
4. DISCUSIÓN
4.1 Efecto del fósforo a nivel morfológico.
El presente estudio buscó determinar el efecto del fósforo en el crecimiento y formación de
RP, en proteáceas chilenas que tienen distinto rango de distribución geográfica.
En este trabajo, se comprobó que el crecimiento y desarrollo de las plántulas de E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, están muy vinculados con el suministro de fósforo durante el período de crecimiento. Se observó que con riegos más ricos en fósforo (Hoagland completo y exceso de P), no hay aumento de la biomasa radical, lo cual es un aspecto normal según la literatura (Marschner, 1995); esto no sólo se ha observado en plántulas con exceso de fósforo, sino también cuando hay otros nutrientes en altas concentraciones (por ejemplo potasio y calcio) (Marschner y Richter, 1973). Si por el contrario, la plántula se encuentra bajo déficit nutricional, la raíz presenta mayor crecimiento, tal como se observó en un trabajo de Clarkson et al., (1998), donde se comparó el crecimiento radical de plántulas de cebada con y sin fósforo. El resultado mostró que bajo déficit de fósforo, la raíz puede crecer hasta un 500% más que el control.
Según los resultados de este trabajo, el mayor desarrollo radical lo presentó O. myrtoidea en los tratamientos nutricionales de Hoagland sin P y nutrición completa. Estos resultados son similares a los de experimentos desarrollados con plántulas de O. myrtoidea bajo distintas soluciones nutritivas en medio hidropónico, donde la formación de RP se produce tanto con nutrición completa y en déficit de P. (Díaz et al., 2010). Sin embargo, en el experimento hidropónico de Díaz et al. (2010), las plántulas eran de 2 meses provenientes de semillas
(Antuco), mientras que las plántulas de esta investigación eran de 4 meses, y fueron cultivadas 52
en sustrato de arena, provenientes de enraizamiento de estacas. En el caso del material vegetal usado en esta tesis se esperaría gran homogeneidad en la respuesta, ya que se trata de plantas desarrolladas no a partir de semillas, sino de reproducción vegetativa de un número limitado de individuos de un mismo origen (Tolhuaca). Las limitaciones para obtener plántulas, debido a la baja germinación de las semillas y a la escasa distribución de las poblaciones actuales, son posiblemente uno de los factores que han reducido la capacidad de estudiar esta especie de
Proteácea endémica en peligro de extinción y este trabajo constituye a uno de los primeros experimentos sobre el efecto del fósforo en la formación de las raíces proteoideas, de ésta especie.
En esta experimentación todas las plántulas de las 3 especies en estudio formaron RP en todos los tratamientos, sin embargo, existen variaciones en la frecuencia de las plántulas que presentan RP. Dicha proporción de plantas fue mayor en los tratamientos con déficit de P y
Hoagland completo. Al mismo tiempo, cuando las concentraciones de fósforo son altas (H-10X), se produce menor número de RP. Como se observó claramente en O. myrtoidea, que a medida que aumentaban las concentraciones de fósforo (10 mM de P), suprimió la formación de RP, mientras que en medio hidropónico reflejan que a 50µm se suprime la formación de RP (Díaz et al., 2010). En los medios de cultivo hidropónico, las plantas se encuentran directamente con la solución nutritiva, en cambio en arena, debido al alto porcentaje de macro poros, las soluciones no permanecen el mismo tiempo de contacto con las raíces y esto podría estar influyendo en los resultados observados.
En cuanto a la proporción de RP/Raíz total en este trabajo, fue mayor cuando las plantas fueron regadas sin P en las 3 especies en estudio, resultados similares a los encontrados en plántulas de
E. coccineum que fueron regadas con o sin P (Zuñiga et al., 2010). A pesar que se observa una 53
variación en la proporción RP/Raíz total entre especies, no muestran diferencias significativas.
Posiblemente, debido a que estas RP poseen distintos estados de desarrollo y difieren en el tamaño de una especie a otra. En esta tesis se observó abundancia de raíces proteoideas, que se dió durante los meses de verano (Noviembre y Enero), datos que están de acuerdo con lo observado en plántulas de E. coccineum, bajo condiciones de invernadero sin fertilización
(Zuñiga, et al., 2009). La formación de RP posiblemente depende del abastecimiento de carbohidratos asimilados durante la época de crecimiento, en que la tasa de fotosíntesis es posiblemente más alta, así como también su exportación hacia las raíces que sustenta la inversión en biomasa que representan dichas estructuras. Otros reportes confirman esta explicación de los resultados, ya que una mayor intensidad lumínica (plena luz v/s sombra) promueve un incremento en biomasa, altura y formación de RP en E. coccineum, atribuido a que en dichas condiciones se presenta una alta tasa fotosintética (Bustos et al., 2011).
Según publicaciones anteriores (Grinbergs et al., 1987, Ramírez et al., 1990; Pozo, 1989;
Krause, 1996) son varios los factores que pueden estar activando la formación de raíces proteoideas. Muchos de éstos factores se han estudiado principalmente en Lupinus sp. y en varias
Proteáceas de Australia, Sudáfrica y Marruecos, señalando que las RP se forman principalmente por déficit de P interno.
Resultados más recientes, muestran que plántulas de Gevuina avellana creciendo bajo tratamientos con o sin fósforo, forman raíces proteoideas (Zúñiga-Feest et al., 2010), lo cual se contrapone con el clásico modelo para Lupinus albus, donde la deficiencia de P sería el factor clave para la inducción de RP. (Skene et al., 1996, Gilbert et al., 2000, Neumann y Römheld,
2000). 54
4.2 Efecto del Fósforo a nivel foliar
Aún no se ha estudiado la capacidad de almacenamiento de fósforo en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea, ni las concentraciones bajo las cuales podría ser tóxico. En Chile la relación entre la disponibilidad de P y las características de la vegetación ha sido escasamente explorada (Lambers, et al., 2012). Sin embargo, se sabe que dicho elemento puede causar síntomas de toxicidad, manifestándose con la senescencia de las hojas, menor crecimiento, regiones necróticas y cloróticas de las hojas, en varias especies de Proteáceas tales como: Banksia ericifolia (Handreck, 1991, Parks et al., 2000), B. grandis, (Lambers et al., 2002a), B. serrata,
(Groves y Keraitis, 1976), Grevillea cv. “poorinda firebird”, (Nichols y Beardsell, 1981), H. prostrata, (Shane et al., 2004a). Algunos de estos síntomas, particularmente senescencia y menor desarrollo, fueron apreciables en E. coccineum. Sin embargo, simultáneamente se registraron también altas temperaturas (sobre 35°C) en el invernadero, generando mortalidad durante el experimento. O. myrtoidea también presento síntomas de toxicidad y senescencia en sus hojas cuando estuvo expuesto a altas concentraciones de fosforo (H – 10X). Posiblemente O. myrtoidea suprime la formación de raíces proteoideas y disminuye la absorción de fósforo a altas concentraciones externas (riego H-10X), como se ha observado en especies de Australia (Shane y
Lambers, 2006)
A través de este estudio se comprobó que hay una concentración óptima de P, es decir, que la toxicidad se manifiesta sólo a concentraciones próximas a 10mM P tanto para E. coccineum,
G. avellana y en O. myrtoidea. Sin embargo, cada especie presenta distintas concentraciones internas de P, siendo significativamente menor en G. avellana, esto se debería a que las hojas de
G. avellana poseen mayor contenido de fibra que las otras dos especies estudiadas y menor tejido parenquimático (fotosintético). Aunque estos valores son más bajos que los reportados para la 55
misma especies en otras investigaciones, como Alberdi, et al. 1977, que informa valores de 2,20 mg P/g -1(tejido seco), para plantas en condiciones naturales sobre suelos fértiles. Una de las hipótesis de este estudio, fue que E. coccineum debería tener los valores de fósforo interno más bajos de las 3 especies en estudio, debido a que es una especie colonizadora que puede vivir en suelos con baja concentración de P, sin embargo esta hipótesis planteada no se cumple, puesto que G. avellana presenta los valores más bajo seguido por E. coccineum. Los factores que pudieron afectar dichos resultados podrían ser la fertilización inicial de estas Proteáceas, en especial E. coccineum, debido a que correspondían a plantas producidas en vivero. En otras especies de proteáceas chilenas, los valores son mucho más altos, lo que podría significar que tolerarían mayores concentraciones de P interno, sin desarrollar toxicidad y al mismo tiempo formar RP. Según Ochoa (2010), E. coccineum sería menos sensible a la toxicidad por fósforo, comparado con otras Proteáceas que crecen en suelos antiguos e infértiles tales como los de
Australia y Sud áfrica, mientras que O. myrtoidea se comprobó que es altamente tolerante a la exceso de P e insensible a la deficiencia de dicho nutriente (Díaz et al. 2010). En esta Tesis se observó que tanto E. coccineum y O. myrtoidea no son tolerantes al exceso de fósforo, debido a que sus plántulas sobreviven sólo un 50%, en exceso de dicho nutriente (H-10X). También, a medida que aumentaba las concentración de fósforo, O. myrtoidea comenzó a disminuir la formación de raíces proteoideas. A pesar que O. myrtoidea también tuvo un 50% sobrevivencia en exceso de P, presentó valores altos de concentración de fósforo foliar en todos sus tratamientos, menos en exceso de P, disminuyendo un 18% en su concentración de P, comparado con Hoagland (nutrición completa). Mientras que en E. coccineum aumento un 7,3% y G. avellana un 30% en H-10X (exceso de P), esto mostraría que O. myrtoidea regula la absorción de fósforo y suprime la formación de raíces proteoideas bajo alta disponibilidad de P. Sin embargo, 56
E. coccineum y G. avellana no regulan en la misma medida la concentración interna de P, en exceso de este elemento. Estos resultados no apoyan una de las hipótesis planteada en esta Tesis en que proponía que E. coccineum debería regular la absorción de P por vivir en suelos variados con baja concentración de P. Sin embargo, por el contrario se puede observar que O. myrtoidea tiene mayor capacidad auto-reguladora aunque es la especie que vive en suelos más deficitarios nutricionalmente (rocas y escoria volcánica).
4.3 Exudación de ácidos orgánicos
Las raíces proteoideas se caracterizan por exudar ácidos orgánicos y en este estudio se puede dar cuenta de un pequeño halo de exudación, la más notoria correspondió a las raíces proteoideas generadas en el tratamiento con agua de E. coccineum y G. avellana (ver Fig. 18). Este resultado coincide con trabajos previos en que Hakea prostrata, mostró la mayor tasa de exudación cuando no hubo aporte de fósforo, siendo significativamente distinto a los valores de exudación bajo tratamientos con abastecimiento de 1µM de P (Shane, 2003).
Posiblemente, no se observó una amplia exudación de raíces proteoideas a pesar que eran
RP jóvenes y maduras, pudiendo estar relacionado con la variación estacional, que se ha observado antes en plántulas de E. coccineum, la cual se registra sólo durante el otoño (Zuñiga et al., 2009). 57
5. CONCLUSIONES
Finalmente y considerando lo anterior, se puede concluir en este trabajo:
La primera hipótesis se cumple, puesto que la deficiencia de P induce la formación de
raíces proteoideas en E. coccineum, G. avellana y O. myrtoidea.
Las proteáceas estudiadas son tolerantes a exceso de P y sólo se observa toxicidad en O.
myrtoidea.
Sólo se observó exudación de ácidos en raíces proteoideas de plantas provenientes del
tratamiento con agua
Sólo O. myrtoidea regula la concentración interna de fósforo, cuando se encuentra en
exceso.
No se encontró una relación entre la amplitud del rango de distribución y status
nutricional de los suelos (amplia=variados niveles de P v/s restringida = escaso contenido
de P) con la regulación de la concentración interna de P y la formación de RP, en las tres
especies estudiadas. 58
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ANEXO 1
SOLUCIONES HOAGLAND 72
Tabla de preparación de Soluciones Hoagland
Para preparar Hoagland sin P Hoagland completo Hoagland exceso de P 1Lt. (H-P) (H- Comp.) (H-10X)
KNO3 5ml 5ml 5ml
Ca(NO3)2 5ml 5ml 5ml
MgSO4 2ml 2ml 2ml
KCl 1ml 1ml 1ml
Micronutrientes 1ml 1ml 1ml
KH2PO4 - 1ml 10ml
AGUA 986ml 985ml 976ml 73
ANEXO 2
MÉTODO PARA ANÁLISIS DE FÓSFORO INTERNO 74
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO INORGÁNICO EN TEJIDO FOLIAR Y RADICAL
Dr. Enrique Peñaloza H. Laboratorio de Fisiología Molecular, Unidad de Biotecnología,
INIA Carillanca
(Protocolo adaptado de Bollons y Barraclogh y Murphy y Riley, para trabajar con volúmenes pequeños)
Extracción de Pi soluble
1. Prepara una solución de ácido acético al 2% en agua bidestilada.
2. Transferir 20 a 30 mg de tejido a un eppendorf destarado. Registrar el peso exacto del
tejido.
3. Agregar 1:50 (peso: vol) 2% ácido acético ( ie. 1 ml para 0,02 gr de tejido).
4. Tapar los tubos herméticamente y extraer el P soluble en el shaker a 50 rpm (o en vortex
en mínima revolución) por 30 min. a temperatura ambiente.
5. En un nuevo eppendorf, filtrar el extracto a través de papel Whatman Nº 2.
Cuantificación de Pi soluble
1. Preparar estándares de P (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 mM P).
2. En eppendorf de 1,5 ml, agregar 60 µl de cada una de las soluciones estándares.
3. En eppendorf de 1,5 ml, agregar 60 µl de extractos.
4. A cada tubo (estándares y muestras) agregar 780 µl H20 bidestilada.
5. A cada tubo (estándares y muestras) agregar 160 µl del reactivo MyR*.
6. Agitar los tubos con vortex para mezclar, en el mismo orden en que se agregó el reactivo
MyR. Dejar los tubos a temperatura ambiente por 30 min.
7. Leer absorbancia a 880 nm, en el mismo orden en que se les agregó el reactivo MyR 75
8. Determinar la concentración de P en el tejido (mM P) en función a la recta de
calibración. Expresar los resultados como µmoles P/ g de tejido o µg P/ mg de tejido
(considerando el volumen de Ác. acético en que se extrajo el P soluble, y el peso fresco
del tejido).**
* La preparación del reactivo MyR se indica en la siguiente página
** En este caso se utilizó la unidad de medida mg P/ g de tejido seco.
Preparación del reactivo MyR
1. Ácido sulfúrico 5N. En una probeta de 500 ml, agregue 71 ml de ácido sulfúrico (H2SO4)
concentrado y enrase a 500 ml con agua desionizada.
2. Potassium antimony tartrato. Disuelva 0,2743 g del reactivo en agua desionizada y enrase
a 100 ml. Viértala en un frasco con tapa y mezcle.
3. Molibdato de amonio. Disuelva 10,00 g del reactivo en agua desionizada y enrase a 250
ml. Viértalo en un frasco con tapa y mezcle.
4. Acido ascórbico. En un vaso de precipitado de 30 ml, disuelva 0,132 g del reactivo en 7,5
ml de agua desionizada. Agite el vaso con la mano hasta que el reactivo se disuelva.
NOTA: este reactivo se debe preparar sólo inmediatamente antes de las mediciones.
REACTIVO MyR (25 ml)
Acido sulfúrico 5N 12,50 ml
Molibdato de amonio 3,75 ml
Acido ascórbico 7,50 ml
Potasio antimonio tartrato 1,25 ml
NOTA: El reactivo MyR se debe utilizar dentro de las 12 horas de preparado. 76
ANEXO 3
PROTOCOLO PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
(MEB) 77
PROTOCOLO PARA MEB
1. Fijación: Glutaraldehido 1 -4% tamponado con cacodilato de sodio o tampón
fosfato de sodio, pH 7.2 – 7.4, (0,2M) durante 2 horas a 4°C.
2. Lavado: En el mismo buffer varios rápidos
3. Post-fijación: Tetróxido de osmio (OsO4) al 1% en el mismo buffer, 2 hrs. A 4°C.
4. Lavado: En el mismo buffer varios rápidos
5. Deshidratación:
Etanol 50% (v/v) 10min.
Etanol 70% (v/v) 10min.
Etanol 90% (v/v) 10min.
Etanol 96% (v/v) 10min.
Etanol 100% (v/v) 5 y 10 min.
Acetona 100% (v/v) 5 y 10 min.
6. Secado: Al punto crítico del CO2 liquido
7. Montaje: En porta especímenes de MEB 78
8. Ionización o Recubrimiento de las muestras con Oro (pelicula de 10 a 15nm.)
9. Observación en un LEO -420
10. Almacenamiento de las muestras en campana al vacio o con silica Gel. 79
ANEXO 4
INTENSIDAD LUMINICA Y TEMPERATURA EN INVERNADERO 80
CONDICIONES DE LUZ Y TEMPERATURA DURANTE EL CULTIVO EN INVERNADERO (Datos obtenidos con un medidor de luz y temperatura HOBO)
35
30
25
20
15 Temperatura(°C) 10
5
0 0 20 40 60 80 100 Dias Figura A. Registro de temperatura durante el período octubre-enero, durante el cultivo de plántulas en invernadero. La curva indica los valores de temperatura, expresados en ºC.
10000
8000
6000
Luz(LUX) 4000
2000
0 0 20 40 60 80 100 Dias Figura B. Registro de luz durante el período octubre-enero, durante el cultivo de plántulas en invernadero. La curva indica los valores de intensidad lumínica, expresados en lux.