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MARCELA CHRISTOFOLI
ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica E SUA ADIÇÃO EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE
Rio Verde Goiás-Brasil 2020
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO (TECA) PARA DISPONIBILIZAR VERSÕES ELETRÔNICAS DE TESES
E DISSERTAÇÕES NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº 832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei 9.610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. O conteúdo das Teses e Dissertações disponibilizado na BDTD/UFG é de responsabilidade exclusiva do autor. Ao encaminhar o produto final, o autor(a) e o(a) orientador(a) firmam o compromisso de que o trabalho não contém nenhuma violação de quaisquer direitos autorais ou outro direito de terceiros. 1. Identificação do material bibliográfico [ ] Dissertação [ X ] Tese
2. Nome completo do autor Marcela Christofoli 3. Título do trabalho ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica E SUA ADIÇÃO EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE 4. Informações de acesso ao documento (este campo deve ser preenchido pelo orientador) Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO¹ [1] Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. Após esse período, a possível disponibilização ocorrerá apenas mediante: a) consulta ao(à) autor(a) e ao(à) orientador(a); iii
b) novo Termo de Ciência e de Autorização (TECA) assinado e inserido no arquivo da tese ou dissertação. O documento não será disponibilizado durante o período de embargo. Casos de embargo: - Solicitação de registro de patente; - Submissão de artigo em revista científica; - Publicação como capítulo de livro; - Publicação da dissertação/tese em livro. Obs. Este termo deverá ser assinado no SEI pelo orientador e pelo autor.
Documento assinado eletronicamente por Paulo Sérgio Pereira, Usuário Externo, em 02/10/2020, às 17:15, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
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Referência: Processo nº 23070.029979/2020-21 SEI nº 1469518
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MARCELA CHRISTOFOLI
ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica E SUA ADIÇÃO EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE
Tese apresentada ao Programa de Pós– Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biodiversidade.
Universidade Federal de Goiás – UFG Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade
Orientador: Paulo Sérgio Pereira
Rio Verde Goiás – Brasil 2020 v
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
ATA DE DEFESA DE TESE
ATA DA REUNIÃO DA BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE TESE DE MARCELA CHRISTOFOLI - Aos dez dias do mês de julho do ano de 2020 (10/07/2020), às 08h30min, reuniram-se os componentes da Banca Examinadora: Profs. Drs. Paulo Sérgio Pereira (IFGoiano) (oritentador), Cibele Silva Minafra (IFGoiano), Cíntia Silva Minafra e Rezende (UFG), Adriano Carvalho Costa (IFGoiano) e Cristiane de Melo Cazal (IFSudeste de Minas) para, sob a presidência do primeiro, e em sessão pública por Webconferência, procederem à avaliação da defesa de tese intitulada: “ATIVIDADE BACTERICIDA E ANTIOXIDANTE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica E SUA ADIÇÃO EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE”, em nível de DOUTORADO, área de concentração em BIOTECNOLOGIA, de autoria de MARCELA CHRISTOFOLI, discente do PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE, da Universidade Federal de Goiás. A sessão foi aberta pelo orientador da discente, Prof. Dr. PAULO SÉRGIO PEREIRA, que fez a apresentação formal dos membros da Banca e orientou a Candidata sobre como utilizar o tempo durante a apresentação de seu trabalho. A palavra a seguir, foi concedida à autora da tese que, em 30 minutos procedeu à apresentação de seu trabalho. Terminada a apresentação, cada membro da Banca arguiu a Candidata, tendo-se adotado o sistema de diálogo sequencial. Terminada a fase de arguição, procedeu-se à avaliação da defesa. Tendo-se em vista o que consta na Resolução nº. 1181/2013 do Conselho de Ensino, Pesquisa, Extensão e Cultura (CEPEC), que regulamenta o Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade a Banca, em sessão secreta, expressou seu Julgamento, considerando a candidata Aprovada ou Reprovada: vii
Banca Examinadora
Aprovada / Reprovada
Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira ______Aprovada______
Profa. Dra. Cibele Silva Minafra ______Aprovada______
Profa. Dra. Cíntia Silva Minafra e Rezende ____Aprovada______
Prof. Dr. Adriano Carvalho Costa ______Aprovada______
Profa. Dra. Cristiane de Melo Cazal ______Aprovada______
Em face do resultado obtido, a Banca Examinadora considerou a candidata ___Habilitada ______, (Habilitada ou não Habilitada), cumprindo todos os requisitos para fins de obtenção do título de DOUTORA EM BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE, na área de concentração em BIOTECNOLOGIA, pela Universidade Federal de Goiás. Cumpridas as formalidades de pauta, às 13_h_10_min, a presidência da mesa encerrou esta sessão de defesa de tese e para constar eu, HELOÍSA DE SOUSA VIEIRA, secretária do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade lavrei a presente Ata que depois de lida e aprovada, será assinada pelos membros da Banca Examinadora.
TÍTULO SUGERIDO PELA BANCA
ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica E SUA ADIÇÃO EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE
Documento assinado eletronicamente por Cíntia Silva Minafra E Rezende, Professora do
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Magistério Superior, em 30/09/2020, às 09:16, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Cristiane de Melo Cazal, Usuário Externo, em 02/10/2020, às 16:21, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Paulo Sérgio Pereira, Usuário Externo, em 02/10/2020, às 17:13, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Cibele Silva Minafra, Usuário Externo, em 02/10/2020, às 17:28, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Adriano Carvalho Costa, Usuário Externo, em 05/10/2020, às 08:34, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
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Referência: Processo nº 23070.029979/2020-21 SEI nº 1580168
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A Deus, pelas bênçãos recebidas;
A minha graciosa filha Bárbara que sempre renova minhas forças com seu doce sorriso;
Ao meu companheiro Rodrigo, pelo amor, paciência e compreensão nos momentos de ausência;
Aos meus pais Luiz e Vilma, por todo amor e dedicação com minha educação;
A minha irmã Rosane e sua família, por tudo que significa para mim;
A todos os meus familiares e amigos por fazer parte dessa minha jornada.
Com Amor,
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus que sempre esteve ao meu lado em todos os momentos de minha vida. Ao meu marido Rodrigo e a minha filha Bárbara que me incentivaram e apoiaram nos momentos difíceis e aos meus queridos pais, que sempre me orientaram e apoiaram em meus estudos. Aos meus familiares, em especial a Célia, Maria Alvínia e a minha vó Mariquinha e meu vô Honestino, Rosane, Bianca e Pedro e aos meus amigos que tanto me apoiaram nessa jornada. Ao meu orientador, professor Dr. Paulo Sérgio Pereira, que acreditou em minha capacidade intelectual, confiou em meu potencial para a pesquisa e muito me ensinou com dedicação sabedoria e paciência e principalmente pela sua eterna amizade. À professora Dra. Cibele Silva Minafra pelo acolhimento em seu laboratório, e pelos ensinamentos e colaboração. À professora Dra.Cristiane de Melo Cazal e ao professor Dr. Moacir Rossi Forin pela imensa colaboração com as análises de CG-EM. À professora Dra.Cíntia Silva Minafra-Rezende pela imensa colaboração com a doação das cepas de batérias. Aos meus colegas do Laboratório de Biomoléculas e Bioensaios (LaBiBi) do IF Goiano – Campus Rio Verde Isac, Ana Luiza, Nayara, e Hanyeny, que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho. Aos colegas do Laboratório de Metabolismo Animal (LABMA) Weslane, Thiago, Lorrayne, Alisson, Jadinéia, Elísio e Karine pelo grande apoio, colaboração e boa convivência. Aos meus amigos Anna Caroline, Josemar e Antônio, e a todos colegas da Pós- Graduação pelos momentos compartilhados nessa jornada. Às minhas grande amigas Silvânia e Joema pelo apoio nos momentos difíceis, aconselhamento e eterna amizade. A todos professores da Pós-Graduação, cujas disciplinas contribuíram paraa realização desta pesquisa através das inúmeras leituras, discussões e trabalhos, recebamminha admiração, respeito e meu muito obrigado. xi
À FAPEG pela concessão da bolsa de estudos, providencial para o desenvolvimento desta pesquisa. Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, à Universidade Federal de Goiás e ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano, pela oportunidade de aprimoramento profissional, intelectual e pessoal. E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para mais uma etapa de minha vida. Obrigada!
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BIOGRAFIA DO AUTOR
Marcela Christofoli, filha de Luiz Christofoli e Vilma Terezinha Christofoli, graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Iporá – GO e em Licenciatura em Química pela Universidade de Uberaba. Possui especialização em Metodologia do Ensino Fundamental e especialização em Tecnologias Aplicadas ao Ensino de Biologia, ambas pela Universidade Federal de Goiás. Professora na Universidade Estadual de Goiás, na Faculdade de Iporá e na Secretaria Estadual de Educação, Mestre em Ciências Agrárias pelo Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano – área de concentração Agronomia e Doutora em Biotecnologia e Biodiversidade pela Universidade Federal de Goiás através da Rede Pró Centro-Oeste.
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RESUMO Atualmente avicultura tem buscado adaptar-se ás exigências do mercado mundial, tanto as normas sanitárias quanto as de padrão de qualidade do produto final do qual tem alicerçado a nutrição. Sabe-se que os alimentos utilizados na nutrição de frangos de corte são em sua maioria de origem vegetal e temos a opção enriquecer o valor biológico de seus nutrientes com o uso de aditivos naturais. Neste cenário surge o uso de óleos essenciais extraídos de vegetais, os quais apresentam rica atividade antiinflamatória, antimicrobiana, com o potencial de tornar a ração um alimento funcional. Sendo assim, objetivou-se estudar a atividade antioxidante e bactericida do óleo essencial dos frutos de Citrus sinensis e de Xylopia aromatica sobre Echerichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritidis e Typhimurium e seu efeito na inclusão à dieta de frangos de corte de um a 14 dias. O óleo essencial foi obtido em hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger e caracterizado por cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massas. As atividades antioxidantes foram realizadas por método espectrofotométrico. As atividades bactericidas foram testada pelo método de difusão em ágar, e pela microdiluição em caldo por espectrofotometria. Foram identificados 6 compostos químicos presentes no óleo essencial dos frutos de X. aromatica, sendo que os majoritários foram Silvestreno (63,56%), α-Pineno (18,00%) e β-Pineno (10,88%). A análise da composição química do óleo essencial de C. sinensis revelou o Limoneno como composto majoritário. O óleo essencial de X. aromatica nas concentrações entre 5 a 0,15 mg.mL-1 apresentou elevada atividade antioxidante, entre 100 e 45,8% de sequestro do radical livre DPPH enquanto o óleo essencial de C. sinensis apresentou 28,2% de atividade antioxidante na maior concentração (50 mg.mL-1). Os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica apresentaram propriedades bactericidas em ambos os métodos avaliados. Pelo método de microdiluição em caldo, o óleo essencial de C. sinensis apresentou um IC50 de 0,17; 0,14; e 0,28 mg.mL-1sobre as cepas de S. aureus, E. coli e Salmonella spp. sorovar
Typhimurium, respectivamente. O óleo essencial de X. aromatica apresentou um IC50 de 0,15; 1,23 e 0,13 mg.mL-1sobre a cepas de S. aureus, E. coli e Salmonella spp. sorovar Typhimurium, respectivamente. No ensaio de inclusão de óleos essenciais em rações de frangos de corte foram utilizados 180 pintinhos de um dia, machos, da linhagem Cobb alojados em gaiolas de arame galvanizados com dimensões 0,90m x xiv
0,60m x 0,45m. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 3 tratamentos e 6 repetições de 10 animais cada. Os frangos alimentados com óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica não apresentaram efeito significativo no desempenho quando comparados ao controle. No entanto, os frangos tratados com os óleos essenciais de de C. sinensis e X. aromatica apresentaram menor peso da Bursa indicando uma melhora na resposta imune do animal. Nas análises de sangue os frangos tratados com óleos essenciais de de C. sinensis e X. aromatica apresentaram um bom indicativo da saúde animal devido ao menor teor de triglicerídeos. Além disso, a adição de óleos essenciais dos frutos de C. sinensis foram benéficos para o animal por meio da redução de microorganismos patogênicos como E. coli, quando comparado com os demais tratamentos. Esses resultados demonstram que os óleos essenciais dos frutos de C. sinensis e X. aromatica podem ser utilizados na alimentação de frangos de corte como aditivos fitogênicos e potenciais antimicrobianos. Palavras-chave: Aditivos fitogênicos, Antimicrobiano, Nutrição de frangos de corte, Produtos naturais, Antioxidante.
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ABSTRAT Currently, poultry has sought to adapt to the demands of the world market, both the sanitary norms and the quality standards of the final product on which nutrition has been based. It is known that the foods used in the nutrition of broilers are mostly of vegetable origin and we have the option to enrich the biological value of their nutrients with the use of natural additives. In this scenario comes the use of essential oils extracted from vegetables, which have a rich anti-inflammatory and antimicrobial activity, with the potential to make the feed a functional food. Thus, the objective was to study the antioxidant and bactericidal activity of the essential oil of the fruits of Citrus sinensis and Xylopia aromatica on Echerichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. Enteritidis and Typhimurium serovars and its effect on the inclusion of a broiler in the diet to 14 days. The essential oil was obtained in hydrodistillation in a Clevenger type apparatus and characterized by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Antioxidant activities were performed by spectrophotometric method. Bactericidal activities were tested by the agar diffusion method, and by broth microdilution by spectrophotometry. Six chemical compounds present in the essential oil of the fruits of X. aromatica were identified, with the majority being Sylvestrene (63.56%), α-Pinene (18.00%) and β-Pinene (10.88%). The analysis of the chemical composition of the essential oil of C. sinensis revealed Limonene as a major compound. The essential oil of X. aromatica in concentrations between 5 to 0.15 mg.mL-1 showed high antioxidant activity, between 100 and 45.8% of free radical scavenging DPPH while the essential oil of C. sinensis showed 28.2 % of antioxidant activity in the highest concentration (50 mg.mL-1). The essential oils of C. sinensis and X. aromatica showed bactericidal properties in both methods evaluated. Using the broth microdilution -1 method, the essential oil of C. sinensis showed an IC50 of 0.17; 0.14; and 0.28 mg.mL on the strains of S. aureus, E. coli and Salmonella spp. Typhimurium serovar, respectively. The essential oil of X. aromatica had an IC50 of 0.15; 1.23 and 0.13 mg.mL-1 on strains of S. aureus, E. coli and Salmonella spp. Typhimurium serovar, respectively. In the trial of inclusion of essential oils in broiler rations, 180 male day-old chicks of the Cobb strain were used, housed in galvanized wire cages with dimensions of 0.90m x 0.60m x 0.45m. The experimental design was completely randomized, with 3 treatments and 6 repetitions of 10 animals each. Broilers fed with essential oils of C. xvi
sinensis and X. aromatica had no significant effect on performance when compared to the control. However, broilers treated with the essential oils of C. sinensis and X. aromatica had a lower weight of the Bursa indicating an improvement in the animal's immune response. In blood analysis, broilers treated with essential oils of C. sinensis and X. aromatica showed a good indication of animal health due to the lower content of triglycerides. In addition, the addition of essential oils from the fruits of C. sinensis were beneficial to the animals through the reduction of pathogenic microorganisms such as E. coli, when compared with the other treatments. These results demonstrate that the essential oils from the fruits of C. sinensis and X. aromatica can be used in the feed of broilers as phytogenic additives and potential antimicrobials. Key words: Phytogenic additives, Antimicrobial, Broiler nutrition, Natural products, Antioxidant.
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LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
Ca+2 íon de cálcio
K+ íon de potássio
ATP Adenosina trifosfato
PAL Fenilalanina amomialiase
MEP Metileritritol fosfato
IPP Isopentenil difosfato
MDA Método de difusão em ágar
MIC Concentração mínima inibitória
UFC Unidade formadora de colônia
DMSO Dimetil sulfóxido
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
CG-EM/EM Cromatógrafo gasoso acoplado a Espectrômetro de Massas Sequencial
TGI Trato gastrointestinal
ID Intestino delgado
IG Intestino grosso
MS Matéria seca
PB Proteína Bruta
EE Extrato etéreo
Ca Cálcio
P Fósforo
PT Proteína total
FA Fosfatase alcalina
T Triglicerídeo
Col Colesterol iii
Lip Lipase
Am Amilase
TGO glutamato-oxaloacetato transaminase
TGP glutamato-piruvato transaminase
GP Ganho de peso
CR Consumo de ração
CA Conversão alimentar
Fi Fígado
MO Moela
PA Pâncreas
PESTGI Peso trato gastrointestinal
ESOPAPO Esôfago e papo
B Bursa de Fabricius
IMOT Índice de massa óssea da tíbia
IMOF Índice de massa óssea do fêmur
DT Diâmetro da tíbia
DF Diâmetro do fêmur
HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A
PCR Reação em cadeia da Polimerase
DNA Ácido desoxirribonucleico
RNA Ácido ribonucleico
HDL Lipoproteína de alta densidade
LDL Lipoproteína de baixa densiadade
IDL Lipoproteína de densidade intermedrária
VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa iv
ÍNDICE DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA Figura 1: Propagação de resistencia a antibióticos no ambiente 05 Figura 2: Via metabólica secundaria ênfase para terpenoides e fenilpropanóides 09 Figura 3: Via da biossíntese dos terpenoides 10 Figura 4: Origem dos monoterpenos a partir do Geranil difosfato (GPP) 11 Figura 5: Espécie de X. aromática, árvore (A), folha e flor (B) e fruto (C). 13 Figura 6: Espécie de X. aromática, árvore (A), folha, flor e fruto (B) e bagaço (C). 14 CAPÍTULO 1: COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica Figura 1: Ampliação do cromatograma obtido no GC-EM para o óleo essencial dos frutos de X. aromatica 56 Figura 2: Fórmula estrutural dos compostos químicos do óleo essencial dos frutos de X. aromatica obtido por GC-EM 57 Figura 3: Ampliação do cromatograma obtido no CG-EM para o óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis. 58 Figura 4: Fórmula estrutural dos principais compostos químicos do óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis identificados por GC-EM. 59 Figura 5: Porcentagem de sequestro de radicais livres pelo óleo essencial de C. sinensis. 59 Figura 6: Porcentagem de sequestro de radicais livres pelo óleo essencial de X. aromatica 60 Figura 7: Comparação entre as médias das porcentagens de inibição do óleo essencial de C.sinensis sobre as cepas de S. aureus, E. coli, S. enteritides e S. typhimurium obtidas pelo método de microdiluição em caldo 63 Figura 8: Comparação entre as médias das porcentagens de inibição do óleo essencial de X. aromatica sobre as cepas de S. aureus, E. coli, S. enteritides e S. typhimurium obtidas pelo método de microdiluição em caldo 64 CAPÍTULO 3: ANÁLISE DA MICROBIOTA INTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE ALIMENTADOS COM ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica UTILIZANDO SEQUENCIAMENTO DO GENE 16S rRNA v
Figura 1: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de filos microbianos presentes nas aves de sete (Figura 1A) e 14 dias (Figura 1B) de idade. 124 Figura 2: Dendograma de agrupamento hierárquico a nível de filo de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 2A) e 14 dias (Figura 2B) de idade. Os números de 1 a 4 correspondem aos filos Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria, respectivamente. 125 Figura 3: Abundância relativa dos principais filos bacterianos em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade. 126 Figura 4: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de classes microbianas presentes nas aves de sete (Figura 3A) e 14 dias (Figura 3B) de idade. 127 Figura 5: Dendograma de agrupamento hierárquico a nível de classe de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 4A) e 14 dias (Figura 4B) de idade. Os números de 1 a 9 correspondem às classes Actinobacteria (A), Alphaproteobacteria (A1), Bacilli (B), Bacteroidia (B1), Betaproteobacteria (B2), Clostridia (C), Erysipelotrichia (E), Flavobacteriia (F) e Gammaproteobacteria (G), respectivamente. 128 Figura 6: Abundância relativa das principais classes bacterianas em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade. 129 Figura 7: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de ordens microbianas presentes nas aves de sete (Figura 5A) e 14 dias (Figura 5B) de idade. 130 Figura 8: Dendograma de agrupamento hierárquico a nível de ordem de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 6A) e 14 dias (Figura 6B) de idade. As ordens apresentadas no Cluster são: Actinomycetales (A), Aeromonadales (A1), 131 vi
Alteromonadales (A2), Bacillales (B), Bacteroidales (B1), Burkholderiales (B2), Caulobacterales (C), Clostridiales (C1), Enterobacteriales (E), Erysipelotrichales (E1), Flavobacteriales (F), Lactobacillales (L), Methylophilales (M), Pseudomonadales (P), Rhizobiales (R), Rhodobacterales (R1), Rhodocyclales (R2), Rhodospirillales (R3), Sphingomonadales (S), Vibrionales (V) e Xanthomonadales (X). Figura 9: Abundância relativa das principais ordens bacterianas em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade. 132
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ÍNDICE DE TABELAS
CAPÍTULO 1: COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica Tabela 1: Constituintes químicos do óleo essencial dos frutos de X. aromatica 57 Tabela 2: Constituintes químicos do óleo essencial dos frutos de X. aromatica. 58 Tabela 3: Comparação entre as medidas dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano (mm) das cepas de S. aureus, E. coli, S. typhimurium e S. enteritides obtidas pelas metodologias de disco utilizando os óleos essenciais de C. sinensis. 61 Tabela 4: Comparação entre as medidas dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano (mm) das cepas de S. aureus, E. coli, S. typhimurium e S. enteritides obtidas pelas metodologias de disco utilizando os óleos essenciais de X. aromatica. 62 CAPÍTULO 2: ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE Tabela 1: Composição centesimal e níveis nutricionais calculados das dietas contole; óleo essencial (OE) de X. aromatica e C. sinensis 82 Tabela 2: Temperatura °C e umidade relativa do ar dentro do galpão, em cada fase de produção 84 Tabela 3: Chemical constituents of the essential oil of the fruits of X. aromatica (OEX) and C. sinensis (OEC). 86 Tabela 4: Desempenho de frangos de corte alimentados no período de um a 14 dias com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica 87 Tabela 5: Coeficientes de digestibilidade de proteína bruta, fibra bruta, extrato etéreo e matéria seca em frangos de corte alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e OE C. sinensis 88 Tabela 6: Avaliação biométrica dos órgãos: Fígado (FI), Moela (MO), Pâncreas (PA), Intestino Grosso (IG), Intestino Delgado (ID), Peso Trato Gastrointestinal (PESTGI), Esôfago e Papo (ESOPAPO) e Bursa (B) de frangos de corte no período de um a 14 dias alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis 89 viii
Tabela 7: Avaliação biométrica óssea de frangos de corte no período de um a 14 dias alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis 90 Tabela 8: Análises bioquímicas no soro sanguíneo dos frangos de corte alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis 91 Tabela 9: Análises bioquímicas no fígado dos frangos de corte alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis 92 Tabela 10: Análises bioquímicas no pâncreas dos frangos de corte alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis 93 Tabela 11: Altura de vilo, profundidade de cripta e relação vilo/cripta do duodeno de frangos de corte de um a 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica e OE C. sinensis 94 CAPÍTULO 3: ANÁLISE DA MICROBIOTA INTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE ALIMENTADOS COM ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica UTILIZANDO SEQUENCIAMENTO DO GENE 16S rRNA Tabela 1. Composição centesimal e níveis nutricionais calculados das dietas contole; com adição de 200ppm de óleo essencial de C. sinensis ou X. aromatica. 122 Tabela 2: Proporção de Filo, Classe e Ordem da população de microorganismos presentes no conteúdo íleal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica. 133 Tabela 3: Proporção de Espécies da população de microorganismos presentes no conteúdo íleal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica. 135
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SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 01 2. REVISÃO DE LITERATURA 04 2.1. Promotores de crescimento e aditivos fitogênicos 04 2.2. Óleos Essenciais 07 2.3. Óleo essencial de Xylopia 12 2.4. Óleo essencial de Citrus 14 2.5. Óleo essencial como antioxidantes e o mecanismo de ação 15 2.6. Óleo essencial como antimicrobianos e o mecanismo de ação 17 2.7. Microorganismos indicadores de contaminação 18 2.8. O mecanismo de ação dos óleos essenciais no trato gastrointestinal 21 2.9. Importância da manutenção da qualidade intestinal 22 2.10. Microbiota intestinal 24 2.11. Técnicas moleculares 26 2.12. Óleos essenciais para frangos de corte 28 3. REFERÊNCIAS 30 4. OBJETIVOS 48 4.1. Objetivo Geral 48 4.2. Objetivos Específicos 48 CAPÍTULO 1: COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica 49 1. Resumo 49 2. Abstrat 50 3. Introdução 51 4. Material e métodos 53 5. Resultados 56 6. Discussão 64 7. Conclusões 68 8. Referências 68 CAPÍTULO 2: ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE 76 x
1. Resumo 76 2. Abstrat 77 3. Introdução 78 4. Material e métodos 80 5. Resultados 85 6. Discussão 94 7. Referências 103 CAPÍTULO 3: ANÁLISE DA MICROBIOTA INTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE ALIMENTADOS COM ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica UTILIZANDO SEQUENCIAMENTO DO GENE 16S rRNA 115 1. Resumo 115 2. Abstrat 116 3. Introdução 117 4. Material e métodos 121 5. Resultados 123 6. Discussão 136 7. Conclusão 142 8. Referências 143
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1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento biotecnológico, amparado por investimentos em pesquisas tem impulsionado o crescimento da avicultura, tanto nos aspectos quantitativos e econômicos quanto tecnológico, com isso o Brasil se tornou um dos maiores exportadores de carnes de frango do mundo (ABPA, 2020). A nutrição desempenha importante papel, que abrange desde a formulação de dietas que visam atender as exigências nutricionais, como a busca pelo incremento no aproveitamento dos nutrientes presentes nos alimentos formulados, proporcionando condições que favoreçam a expressão do máximo potencial genético das aves, sem acréscimos aos custos de produção. Dessa forma, as dietas precisam passar por uma formulação que atenda as demandas das aves e resultem em melhor desempenho na obtenção de carnes e ovos, a menor custo possível (SCHENEIDERS et al., 2017). Uma das possibilidades de melhorar a eficiência das dietas formuladas para aves é a inclusão de aditivos, como promotores de crescimento, com o propósito de melhorar o desempenho dos animais, principalmente devido ao aumento na digestibilidade dos nutrientes, à manutenção da integridade do trato gastrointestinal e o equilíbrio da microbiota intestinal das aves (ADASZYŃSKA-SKWIRZYŃSKA & SZCZERBIŃSKA, 2017). Esses promotores de crescimento incluem antibióticos e quimioterápicos inseridos na alimentação animal, desde a década de 50, porém a constante exposição dos animais a esses agentes pode induzir a seleção de uma biota resistente, atuando como fator de risco à saúde humana, devido ao possível aparecimento da resistência múltipla cruzada (FERNANDES et al., 2015). Por esse motivo, a União Europeia proibiu a utilização de antibióticos como promotores de crescimento da alimentação de aves (MENDES et al., 2013). Diante deste cenário, houve um crescimento de pesquisas por aditivos alternativos que possam seu usados em substituição desses antibióticos com a finalidade de fornecer produtos seguros e de qualidade ao consumidor (FERNANDES et al., 2015). Dentre eles podemos citar os aditivos fitogênicos que são substâncias derivadas de plantas como óleo essencial, extrato vegetal, óleo resina, especiarias, entre outros,que têm efeito positivo sobre a produção e a saúde dos animais (PERIĆ et al., 2009). Os óleos essenciais estimulam o apetite e a secreção de enzimas digestivas endógenas, além de exercerem atividades antimicrobianas, coccidiostáticas ou anti- 2 helmínticas, aumentar as vilosidades e diminuir as criptas, resultando em melhor aproveitamento dos nutrientes e consequentemente melhora do desempenho (CHOWDHURY et al., 2018). Os óleos essenciais são uma mistura complexa de substâncias voláteis e lipofílicas com baixo peso molecular, produzidas como metabólitos secundários pelas plantas (SOUZA et al., 2010). Estas substâncias são responsáveis pelo odor característico das plantas, proteção contra predadores e patógenos, atração de agentes polinizadores, proteção contra perda de água, aumento de temperatura foliar, e como inibidores de germinação, atuam como antibacterianos, antivirais, antifúngicos, inseticidas e protegem as plantas de patógenos e predadores (KNAAK & FIUZA, 2010; SANTOS et al., 2013a, PERRICONE et al., 2015). Isso levou os pesquisadores a explorar novas moléculas-chave como alternativas no controle de microorganismos. O grande potencial anticrobiano dos óleos essenciais se deve ao fato de serem lipofílicos, e por esse motivo, podem entrar facilmente nas células, romper a membrana e/ou permeabilizá-la, e consequentemente, ocasionar a perda de íons como de Ca2+, por exemplo, reduzindo o potencial de membrana e o gradiente de pH, resultando em colapso da bomba de prótons e o esgotamento do pool de ATP (BAKKALI et al., 2008). Vários estudos in vitro têm sido realizados para avaliar as propriedades antibacterianas e antifúngicas dos óleos essenciais, mas ainda há poucos relatos quanto a sua bioatividade in vivo. Os efeitos observados in vivo podem ser alcançados, desde que sejam utilizados concentrações mais altas dos óleos essenciais. Adicionalmente, os óleos essenciais podem ter efeitos tóxicos em frangos quando administrados em doses muito altas (TYAGI et al., 2013). A dose letal (DL50), em ratos, é de 810 e 980 mg/kg para o carvacrol e para o timol, respectivamente (LEE et al., 2004). Entre os efeitos toxicológicos de plantas medicinais de uso condimentar em humanos, consta que a sálvia poderia causar insuficiência renal e que o alecrim, em doses altas, pode intoxicar e ocasionar nefrite (STRALLO’S, 2008). Neste cenário, as propriedades antimicrobianas dos óleos essenciais (in vitro) os tornam uma excelente opção para pesquisas in vivo como melhoradores de desempenho para atender a exigência do mercado europeu sobre a retirada de antibióticos durante a criação normativa União Européia 1831/2003 de 2006. 3
Várias espécies de plantas tem sido estudadas como melhoradores de desempenho em aves. Adição de uma mistura de óleos essenciais de manjericão, cominho, louro, limão, oregano, sálvia, chá e tomilho na dieta de frangos de corte refletiu em melhorias como ganho de peso e conversão alimentar das aves (KHATTAK et al., 2014). Os efeitos do óleo essencial de orégano no desempenho do crescimento e na prevenção da coccidiose em frangos de corte foram avaliados, verificando melhor desempenho além de menores escores de lesões de coccidiose (MOHITI-ASLI e GHANAATPARAST-RASHTI, 2015). Em outro trabalho, também foi avaliado o efeito do óleo essencial de Lippia berlandieri e Poliomintha longiflora no desempenho, perfis sanguíneos, variáveis de carcaça e composição da carne de frangos de corte verificando aumento de leucócitos sanguíneos, linfócitos, lipoproteínas de baixa densidade além de efeitos positivos no desempenho de frangos de corte e características de carcaça dos animais (SILVA-VÁZQUEZ et al., 2018). A escolha da planta deve ser feita com cuidado pensando também em sua viabilidade de uso. O óleo essencial extraído da casca de Citrus sinensis (laranja) é usado como anti-séptico, digestivo, sedativo e tônico geral, além de representar a maior porção do óleo essencial extraído da laranja (95%), na casca tem como compostos majoritários o Limoneno e o Linalol (MARTINS et al., 2017). Além do óleo essencial oriundo da casca de laranja, temos plantas aromáticas que apresentam compostos de valor biológico importantes para o organismo animal, por exemplo da família Annonaceae, com destaque para o gênero Xylopia, vegetal amplamente distribuído no Brasil com um número considerado de espécies presentes no bioma Cerrado (CHATROU et al., 2012; MAAS et al., 2015; ZHAI et al., 2018). Dentre essas espécies do Cerrado, a Xylopia aromatica comumente conhecida como pimenta- de-macaco, pindaíba, pindaíba-do-campo e pindaíba-de-macaco, usada popularmente como condimentos, apresenta diversas atividades biológicas, como antimicrobiana, citotóxica, acaricida, antibactericida, anti-inflamatória, antifúngica e hipolipidêmica (OLIVEIRA et al., 2014; WOGUEM et al., 2014; MAAS et al., 2015). No entanto, até o presente momento, não há registros na literatura sobre o uso dos óleos essenciais de X. aromatica como aditivos na ração animal. 4
Portanto, se faz necessário novas pesquisas na busca de produtos alternativos como os óleos essenciais aplicados como aditivos para rações animal, que apresentem ação antimicrobiana e que favoreçam o desempenho das aves.
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Promotores de crescimento e aditivos fitogênicos A produção de aves no Brasil vem crescendo a cada ano alcançando seu ápice em 2015 com 13,14 milhões de toneladas e com uma pequena queda em 2016 com 12,9 toneladas de carne. Isso é resultado do aumento do consumo per capita, com 41,1 Kg de carne por habitante, e também do aumento das exportações para 4,384 milhões de toneladas em 2016, gerando uma receita de 6,848 milhões de dólares (ABPA, 2017). Esse crescimento vem acompanhado com os avanços nas pesquisas sobre a produção de insumos e rações associada ao uso de melhoradores de desempenho objetivando melhorias na produtividade das aves, na conversão alimentar e nas taxas de sobrevivência (FARIA et al., 2009). Os antibióticos são substâncias produzidas por fungos ou algumas bactérias com a finalidade de combater microrganismos (monocelulares ou pluricelulares), causadores de infecções no organismo (MEHDI et al., 2018). Esses antimicrobianos foram bastante utilizados como promotores de crescimento na produção animal em vários países uma vez que apresentam eficácia comprovada sobre a produtividade e saúde animal, expressos principalmente por melhoria de desempenho e consequentemente, maior lucratividade (FARIA et al., 2009). Os mecanismos de ação dos promotores de crescimento antimicrobianos ainda não estão completamente elucidados, mas sua atuação ocorre sobre a microbiota intestinal dos animais, inibindo o metabolismo bacteriano, reduzindo a competição entre a bactéria e o hospedeiro, reduzindo as bactérias indesejáveis, favorecendo a colonização das desejáveis no trato gastrintestinal e controlando a microflora gastrintestinal (FLEMMING & FREITAS, 2005; FARIA et al., 2009). No entanto, o uso de antibióticos como promotores de crescimento na avicultura tem resultado na emergência de resistência ao antimicrobiano, na possibilidade da transferência dessa resistência a bactérias patogênicas, e a emergência de resistência cruzada entre o promotor de crescimento e um antimicrobiano de uso terapêutico devido 5
à presença de seus resíduos na carne (PALERMO NETO et al., 2005; PEARCE & JIN, 2010; MENDES et al., 2013). Isso acontece quando antibióticos adicionados a ração animal ou a água não são completamente metabolizados podendo permanecer na carne do animal ou ainda quando excretados, contaminam o solo e os recursos hídricos (SURESH et al., 2017). No ambiente, podem ser degradados dentro de algumas horas ou dias, ou podem persistir por vários meses a anos causando alteração significativa da microbiota (JECHALKE et al., 2014). Esses fatores promovem a proliferação seletiva de cepas resistentes além de aumentar a diversidade de genes de resistência a drogas que podem ser subsequentemente transferidos vertical ou horizontalmente (DING & HE 2010; JECHALKE et al., 2014) (Figura 1). Dentre algumas das principais bactérias com resistência a múltiplas drogas e estão incluídas na categoria de patógenos comunitários e hospitalares adquiridos destacam-se as Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus , Salmonella spp, Staphylococcus coagulase-negativo , Shigella, Enterococcus spp. e Escherichia coli.
Figura 1: Propagação de resistência a antibióticos no ambiente. (Fonte: SURESH et al., 2017). 6
Em virtude disso, em janeiro de 2006, a União Europeia baniu a utilização de antibióticos como promotores de crescimento da alimentação de aves, permitindo somente o emprego dos ionóforos monensina sódica e salinomicina como agentes anticoccidianos (FARIA et al., 2009; LINZMEIER et al., 2009; MENDES et al., 2013). A proibição do uso de antibióticos resultou em perdas econômicas na produção avícola devido piora na saúde intestinal, na absorção de nutrientes e no desempenho produtivo, ao aumento da incidência de colibacilose e de enterite necrótica causada pela presença de micoorganismos em aves (GODOI et al., 2008; CATALAN et al, 2012). Diante disso, a mobilização de pesquisadores para a substituição dos antimicrobianos nas dietas dos animais cresceu rapidamente com finalidade de reduzir problemas econômicos, sanitários e fornecer produtos seguros e de qualidade ao consumidor (FERNANDES et al., 2015). Dentre estas pesquisas, destaca-se o uso de probióticos, prebióticos, simbióticos, enzimas, acidificantes e aditivos fitogênicos derivados de óleos essenciais ou extratos vegetais, capazes de melhorar a resposta imune e a microbiota intestinal, prevenindo efeitos negativos na estrutura do intestino, melhorar a digestão e absorção dos nutrientes e consequentemente, o desempenho dos animais (KOIYAMA, 2012; PELÍCIA et al., 2015). Aditivos fitogênicos são substâncias derivadas de plantas, como ervas, especiarias, extratos, óleos essenciais e seus metabólitos secundários isolados de plantas, incluídos a rações para melhoria da qualidade e segurança dos alimentos, bem como para promoção da saúde e bem-estar dos animais, atuando como imunomoduladores, antioxidantes, antimicrobianos, estimulantes digestivos e substâncias que podem aumentar o desempenho e qualidade dos produtos animais (FERNANDES et al., 2015; YANG et al., 2015; STEVANOVIC et al., 2018; YANG et al., 2018). Além disso, esses aditivos refletem o conceito “limpo”, pela redução do uso de compostos sintéticos; “verde”, uma vez que podem reduzir os impactos ambientais; e “ético”, pois promovem o bem estar animal (STEVANOVIC et al., 2018). Nos últimos anos, um considerável número de pesquisas tem sido realizadas quanto ao uso de aditivos fitogênicos na ração de aves (KARÁSKOVÁ et al., 2015; STEVANOVIC et al., 2018). Cristo (2017) avaliaram o efeito da adição de uma mistura de extrados vegetais e óleos essenciais composto de carvacrol, cinamaldeido e eugenol, extraídos do orégano, canela e cravo na dieta de frangos de corte e verificaram maior 7 rendimento de carcaça no tratamento com 100 g.t-1 de ração, além de obterem resultados satisfatórios sobre qualidade intestinal e modulação da microbiota intestinal. Os extratos da casca de limão e laranja proporcionaram a diminuição na contagem de coliformes no íleo e o óleo de C. xantrhorrhiza reduziu a contagem de coliformes no ceco em relação ao grupo controle. Al-Yasiry et al. (2017) utilizaram resina de Boswellia serrata na dieta de frangos de corte e observou-se a melhor qualidade de carcaça com alta proporção de músculos e baixo teor de gordura abdominal. Enquanto Chowdhury et al. (2018) verificaram uma melhorara no desempenho, no crescimento e na utilização de nutrientes, além da redução da excreção de nitrogênio pelos frangos tratados com óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum. Estes trabalhos destacam o potencial dos óleos essenciais como aditivos fitogênicos, podendo ser utilizados como promissores promotores de crescimento em frangos de corte.
2.2. Óleos Essenciais Conhecidas por seu valor ornamental e por fornecer oxigênio, alimentos, bebidas, roupas, perfumes e materiais de construção, as plantas são ainda uma fonte de um enorme número de compostos, conhecido como metabólitos secundários com importância inestimável. Metabólitos secundários, hoje designados como “metabólitos especiais”, uma vez que assume funções tão importante quanto os "metabólitos primários", desempenham um papel imprescincível nas interações entre plantas e seu ambiente (com outras plantas, herbívoros, patógenos e polinizadores, entre outros) (FIGUEIREDO et al., 2008; KNAAK & FIUZA, 2010; SANTOS et al., 2013b). Apesar de não ter implicação direta sobre o crescimento e desenvolvimento de plantas, esses metabólitos, frequentemente sintetizados a partir de metabólitos primários, podem ser produzidos e acumulados em diferentes estruturas da planta de acordo com a família, nos vacúolos em uma forma glicosídica ou acumular-se em estruturas secretoras como pêlos glandulares, células parenquimáticas diferenciadas, canais oleíferos, em bolsas lisígenas e tricomas em diferentes concentrações, podendo ter um efeito biológico marcado em outros organismos e por esse motivo têm sido utilizados a milhares de anos, na forma de extratos ou óleos essenciais, por suas propriedades farmacêuticas e de proteção ou na fabricação de perfumes e cosméticos (FIGUEIREDO et al., 2008). 8
Nas plantas superiores os metabólitos secundários incluem flavonóides, alcalóides, saponinas e taninos, compostos esses envolvidos na defesa contra herbívoros e patógenos, regulação da simbiose, controle da germinação de sementes, inibição de espécies de plantas (alelopatia) e, portanto, são parte integrante das interações de espécies em comunidades vegetais e animais e a adaptação das plantas ao seu ambiente (FIGUEIREDO et al., 2008;BENHAMMOU et al., 2009; DE LA ROSA et al., 2010). Dentre esses metabólitos secundários, os óleos essenciais merecem grande destaque como compostos voláteis responsáveis pelo odor característico das plantas, pela interação inseto-planta, autodefesa, atração e proteção contra perda de água e aumento de temperatura foliar, entre outras funções (CASTRO, 2004; SILVA-SANTOS et al., 2006; SOUZA et al., 2010). Os óleos essenciais podem ser extraídos por diversas técnicas tais como maceração, expressão do pericarpo de frutos cítricos, extração por solventes orgânicos, gases supercríticos (CO2), micro-ondas e arraste a vapor (hidrodestilação), sendo esta última a técnica mais utilizada (SILVA-SANTOS et al., 2006; MORAIS, 2009). São formados por um conjunto de moléculas lipofílicas, com baixo peso molecular, constituídas de misturas de compostos orgânicos voláteis constituídos de hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostos oxigenados (álcoois, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas e fenóis), podendo ser comercializados na sua forma bruta ou beneficiada, fornecendo substâncias purificadas como o limoneno, citral, citronelal, eugenol, mentol e safrol (NERIO et al., 2010; MACHADO & FERNANDES JÚNIOR, 2011). Alguns metabólitos secundários como os fenilpropanóides e terpenos abrangem uma grande variedade de substâncias de origem vegetal de grande importância ecológica amplamente estudadas quanto as suas atividades biológicas, composição química e biossíntese (JÚNIOR, 2003). A formação dos fenilpropanóides origina-se a partir da via do ácido chiquímico (Figura 2), a qual resulta na formação do aminoácido aromático fenilalanina, que pela ação da enzima fenilalanina amonialiase (PAL) origina o ácido cinâmico, que por meio de reduções enzimáticas dá origem aos alilbenzenos e propenilbenzenos, esqueletos carbônicos dos fenilpropanóides (SIMÕES & SPITZER, 2004; BASER & BUCHBAUER, 2012). Os terpenóides podem ser formados a partir de via de biossíntese conhecida como via do mevalonato, responsável pela formação dos 9 sesquiterpenos (C15) e triterpenos (C30), que ocorre no citosol e cujos precursores são piruvato e acetil-coA (Figura 3) (SANTOS, 2007).
Figura 2: Via metabólica secundaria ênfase para terpenoides e fenilpropanóides. Fonte: Santos, 2007.
Outra via alternativa de síntese de compostos terpênicos apresentada na Figura 3, é conhecida como via do metileritritol fosfato (MEP), origina os monoterpenos (C10), diterpenos (C20) e tetraterpenos (C40), ocorre nos plastídeos e cujos precursores são piruvato e gliceraldeído-3-fosfato (CROTEAU et al., 2000; VERPOORTE, 2000; BASER & BUCHBAUER, 2012). De acordo com Croteau et al. (2000) a biossíntese dos compostos terpênicos a partir dos mais simples metabólitos primários (piruvato e gliceraldeído-3-fosfato) pode ser basicamente dividida em 4 etapas: 1) síntese do precursor fundamental Isopentenil Difosfato (IPP); 2) oligomerização das unidades de IPP para formação de séries homólogas de prenilas difosfatadas, por meio de adições eletrofílicas; 3) ciclização destes prenildifosfatos alílicos resultando na formação dos esqueletos dos sequiterpenos e; 4) modificações enzimáticas secundárias (majoritariamente reações oxidação e redução) que fazem surgir as funções orgânicas das moléculas e a quimiodiversidade desta família de produtos naturais.
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Figura 3: Via da biossíntese dos terpenoides. Fonte: Adaptado de Taiz & Zeiger, 2004.
Por fim, o Geranil Difosfato (GPP) dará origem ao cátion α-terpinil que por sua vez originará os monoterpenos conhecidos, conforme representado na Figura 4 (CROTEAU et al., 2000). A síntese e liberação desses compostos naturais estao sujeitas variações como as interações planta/microrganismos, planta/insetos e planta/planta; idade e estádio de desenvolvimento da planta, fatores abióticos como luminosidade, pluviosidade, nutrição, clima, solo, época e forma de plantio, adubação, uso de agrotóxicos, irrigação, tempo e condições ambientais, época e horário de coleta, técnicas de colheita e pós- 11 colheita, proveniência do material da planta (fresco ou seco), técnica de extração, fonte botânica, variação geográfica (latitudes e longitudes) e principalmente a temperatura (NASCIMENTO et al., 2007; MORAIS, 2009). Além disso, as características dos óleos essenciais como volatilidade, insolubilidade em água, facilidade de oxidação, dificultam os estudos sobre suas atividades biológicas e a viabilidade de aplicação destes compostos no campo (NASCIMENTO et al, 2007; MORAIS, 2009).
Figura 4: Origem dos monoterpenos a partir do Geranil Difosfato (GPP). Fonte: Croteau et al., 2000. α Diante disso, estudos a cerca de rotas metabólicas para síntese compostos bioativos derivados dos óleos essenciais tem proporcionado uma vasta descoberta de técnicas de biologia molecular além de outras áreas da ciência (PAVARINI & LOPES, 2016). Algumas das propriedades dos óleos essenciais e seus constituintes químicos têm um grande espectro de modos de ação bem diversificado quanto a atividade biológica incluindo inseticida, repelência, deterrência, inibição enzimática, atividade citotóxica, 12 antimicrobiana, antioxidante, como aditivos fitogênicos, entre outras (LOIZZO et al., 2007; MARINHO et al., 2008; WOGUEM et al., 2014; CHRISTOFOLI et al., 2015; COSTA et al., 2017; BOUYAHYA et al., 2017; MOHITI-ASLI e GHANAATPARAST-RASHTI, 2017). Estes estudos têm como perspectiva a síntese de bioativos com atividades biológicas diversas tais como inseticida, antimicrobiana, fungicida, antiviral, entre outras, uma vez que tem se mostrado um recurso natural valioso, seja na forma in natura, como em sinergia com outros compostos naturais ou sintéticos, podendo ser utilizados para o controle de pragas por meio da aplicação direta do óleo essencial ou do princípio ativo isolado, ou servir como base para descoberta de novos produtos sintéticos (CASTRO, 2004; PADUCH et al., 2007; NERIO et al., 2010). Segundo Figueiredo et al. (2008), várias famílias de plantas como Anonaceae, Apiaceae, Asteraceae, Cupressaceae, Hypericaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Fabaceae, Liliaceae, Malvaceae, Myrtaceae, Oleaceae, Pinaceae, Rosaceae e Rutaceae são particularmente ricas em metabólitos secundários como os óleos essenciais e o reconhecimento da espécie potencialmente utilizável pelos produtores pode contribuir para um equilíbrio utilização dos espaços rurais, incentivando a conservação do patrimônio florestal e potencializando a preservação da biodiversidade.
2.3. Óleo essencial de Xylopia A família Annonaceae Juss. compreende uma larga família da ordem Magnoliales, possui cerca de 2.500 espécies e 135 gêneros (CHATROU et al., 2012). Somente no Brasil ocorrem 29 gêneros e 386 espécies, sendo que no Cerrado ocorrem 10 gêneros e 47 espécies sendo que nenhuma destas é endêmica e algumas plantas desta família são bastante comuns e possuem ampla distribuição, como é o caso da Xylopia aromatica (MAAS et al., 2015). Xylopia aromatica (Lam.) Mart. (Figura 5), espécie conhecida como "pimenta-de-macaco" é encontrada no Cerrado, cujos frutos são comumente utilizados como condimento em alimentos, carminativo e afrodisíaco na medicina tradicional (SILVA & ROCHA, 1981; CORRÊA, 1984; OLIVEIRA et al., 2012).
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Figura 5: Espécie de X. aromatica, árvore (A), folha e flor (B) e fruto (C). Fonte: Arquivo pessoal.
Os óleos essenciais de diversas espécies de plantas da família Annonaceae vêm sendo estudadas na busca de substâncias que apresentem alguma atividade biológica. Segundo Krinski et al. (2014), na literatura são relatadas mais de 40 espécies de Annonaceae com potencial inseticida, destacando os gêneros (Annona, Artabotrys, Asimina, Cardiopetalum, Dennettia, Duguetia, Guatteria, Monodora, Mkilua; Oxandra, Polyathia, Rollinia, Unonopsis e Xylopia). As espécies do gênero Xylopia (Annonaceae Juss) têm demonstrado grande importância devido a inúmeras atividades biológicas relatadas na literatura, sobretudo, antimicrobiana, citotóxica, acaricida, antibactericida, anti-inflamatória, antifúngica, fumigante, antitumoral e hipolipidêmica (PONTES, 2007; VIEIRA, 2010; FERRAZ et al., 2013; KRINSKI et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2014; WOGUEM et al., 2014; SILVA et al., 2015). O óleo essencial das folhas de Xylopia laevigata foi avaliados quanto a atividade biológica apresentando resultados satisfatórios quanto a sua atividade tripanocida, antifúngica e bactericida (COSTA et al., 2013). Quintans et al. (2013) destacaram o potencial antitumoral in vitro e in vivo dos óleos essenciais de X. aromatica. Mouta et al. (2016) também reportaram a atividade antitumoral e de toxicidade dos óleos essenciais de Xylopia langsdorffiana. Nwozo et al. (2011) destacaram a atividade antioxidante e hipolipidêmica de Xylopia aethiopica, e Fleischer et al. (2008) relataram a atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e o fungo Candida albicans, enquanto Wouatsa et al. (2014) observaram moderada atividade bactericida contra S. aureus e E. coli pelos óleos 14 essenciais de X. aethiopica.Todos esses trabalhos destacam o potencial biológico dos óleos essenciais das espécies desse gênero.
2.4. Óleo essencial de Citrus O gênero Citrus inclui as laranjeiras doces (Citrus sinensis Osbeck) e azedas (C. aurantium), tangerineiras (C. reticulata), limão siciliano (C. limon Burm), ‘Tahiti’ (C. latifolia Tanaka) e ‘Galego’ (C. aurantiifolia Christm.), entre outras (Figura 6), e seus óleos essenciais estão entre os mais utilizados na indústria química, de cosméticos, perfumaria, de alimentos, em produtos de limpeza e medicamentos (PEREIRA et al., 2008; KAMAL et al., 2011; MUSTAFA et al., 2015).
Figura 6: Espécie de C. sinensis, fruto (A), fruto com polpa (B) e bagaço (C). Fonte: Arquivo pessoal.
Martins et al. (2017) destacaram a atividade toxica dos óleos essenciais comerciais de laranja doce (C. sinensis), laranja amarga (C. aurantium), limão siciliano (C. limon) contra Dysmicoccus brevipes. Pires & Piccoli (2012) relataram o efeito inibitório dos óleos essenciais da casca e da folha de Citrus limonia Osbeck (limão- cravo), Citrus aurantifolia (Chrst.) Swingle (limão-galego) e C. latifolia Tanaka (limão- tahiti) sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Outros autores destacaram o potencial biotecnológico das espécies do gênero Citrus. Hsouna et al., (2017) destacaram a atividade antimicrobiana do óleos essenciais de C. lemon contra cepas bacterianas Listeria monocytogenes, e um forte efeito inibitório sobre o crescimento de Aspergillus niger e A. flavus, além da atividade antioxidante contra 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) conferindo maior proteção a alimentos como a carne bovina. Segundo os autores, a atividade antimicrobiana dos 15
óleos essenciais de C. lemon pode estar relacionada com seus componentes terpênicos, como Pineno, Mirceno e Limoneno, uma vez que existe uma relação entre as estruturas químicas dos óleos mais abundantes e suas atividades antimicrobianas. Todos esses trabalhos conduzem a pesquisas a respeito do mecanismo de ação dos óleos essenciais como antioxidantes e antimicrobianos.
2.5. Óleo essencial como antioxidantes e o mecanismo de ação Auto-oxidação e oxidação térmica de lipídios, vias de oxidação celular e inúmeros efeitos fisiológicos e processos bioquímicos em circunstâncias normais, produzem dois grupos de radicais livres: espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio (BENHAMMOU et al., 2009). De modo geral, a ação dos radicais livres se deve a presença de um elétron livre o qual pode se ligar a qualquer outro elétron de uma molécula e, assim, reagir com lipídeos das membranas celulares, nucleotídeos do DNA e ligações sulfidril em proteínas (NGO et al., 2016). Por esse motivo, os antioxidantes tornaram-se importante fonte de estudos na busca por compostos naturais capazes de reduzir o efeito dos oxidantes sobre os sistemas biológicos. Antioxidantes são moléculas capazes de impedir ou retardar a oxidação de um material oxidável, ou seja, capazes de intervir na iniciação ou propagação de reações em cadeia de oxidação que originam compostos tóxicos como cetonas, aldeídos, hidrocarbonetos e álcoois, retardando, neutralizando ou prevenindo ações de substratos oxidáveis, além de atuar na inibição da peroxidação lipídica e da lipoxigenase (HUBER et al., 2012; AMORATI et al., 2013). As funções dos antioxidantes podem ser divididas em duas categorias: quebra de cadeia (reagem com radicais peroxil mais rapidamente que o substrato oxidável para formar espécies que não propagam a cadeia de oxidação) e inibidores de caminho, ambos atuando principalmente na transferência de átomos de hidrogênio ou na transferência única de elétrons para inativar os radicais (SAHARI & BERENJI, 2015). Os produtos naturais como óleos essenciais possuem uma abundância de compostos terpênicos (monoterpenos, sesquiterpenos ou diterpenos), fenólicos e fenilpropanóides (JÚNIOR, 2003). Compostos fenólicos são os principais componentes da planta com atividade antioxidante e a doação de hidrogênio do polifenol é 16 responsável pela prevenção da produção de radical causando peroxidação lipídica (AJILA et al., 2007; LUO et al., 2009; SAHARI & BERENJI, 2015). Torres-Martinez et al. (2017), avaliaram a atividade antioxidante do óleos essenciais de Satureja macrostema e seus compostos majoritários isodamente e observaram que os principais terpenos com capacidade antioxidante foram Timol e Linalol. A presença de compostos fenólicos como Timol e Carvacrol por exemplo, também foi relacionada a atividade antioxidante (AMORATI et al., 2013). Quiroga et al., (2014) avaliaram a estabilidade de parâmetros sensoriais e químicos em sementes de girassol torrado suplementadas com monoterpenos como Carvacrol, Timol e Hidrato de Sabineno e destacam que estes compostos forneceram proteção a esse alimento, inibindo a formação de compostos de deterioração oxidativa, como peróxidos e hexanal, e sabores indesejados, como sabores oxidados. No entanto, terpenóides não fenólicos, especialmente os insaturados, podem ser oxidados de maneira similar com lipídios insaturados a serem protegidos (NGO et al., 2016). Seu mecanismo de auto-oxidação é iniciado por uma reação de remoção de átomos de hidrogênio com radicais peroxil (ROOc) ou adição de ROOc a um carbono insaturado (AMORATI et al., 2013), este mecanismo é caracterizado por um processo de terminação muito rápido como relatado em detalhes no caso do α-Pineno (NEUENSCHWANDER et al., 2010), e α-Fellandreno (VALGIMIGLI & PRATT, 2012), do γ-Terpineno (FOTI & INGOLD, 2003), assim como α-Terpineno (NGO et al., 2016). De fato, este tipo de componente causa um aumento global na taxa de terminação da cadeia oxidativa e reduz a taxa global de oxidação, assim se comportará como um antioxidante (AMORATI et al., 2013). Isso explica a atividade antioxidante de terpenos não fenólicos relatados na literatura. Toscano-Garibay et al. (2017) verificaram uma excelete atividade antimutagênica com redução da apoptose das células testadas além de uma representativa atividade antioxidante do óleo essencial de Citrus sinensis e Citrus latifolia com destaque para seus compostos majoritários R-(+)- Limoneno, β-Tujeno, α-Mirceno e γ-Terpineno. Enquanto Pandini et al. (2018), verificaram o potencial antioxidante dos óleos essenciais de Guarea kunthiana A. Juss os quais apresentaram 13 compostos terpênicos sendo os majoritários α-Zingibereno, β- Sesquifelandreno e α-Curcumeno.
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2.6. Óleo essencial como antimicrobianos e o mecanismo de ação O mecanismo de ação antimicrobiana varia com o tipo de óleo essencial ou a cepa do microrganismo utilizado, no entanto, fatores determinantes da atividade dos óleos essenciais são composição, grupos funcionais presentes nos componentes ativos e suas interações sinérgicas (DORMAN et al., 2000). As bactérias Grã-negativas são mais suscetíveis aos óleos essenciais que as Grã- positivas, pois estas últimas possuem uma membrana externa rígida, rica em lipopolissacarídeos, limitando a difusão de compostos hidrofóbicos através da membrana (HUANG et al., 2014; AZHDARZADEH & HOJJATI, 2016). Segundo pesquisa reportada por Bajpai et al. (2013) os componentes bioativos presentes nos óleos essenciais podem se ligar à superfície da célula e, posteriormente, penetrar na bicamada fosfolipídica da membrana celular, perturbando a integridade da membrana celular e afetando negativamente o metabolismo, levando a morte celular. Yang et al. (2015) avaliaram o efeito do óleo essencial de folhas de Forsythia koreana sobre Salmonella enteritidis, E. coli, S. aureus, L. monocytogenes e diferentes cepas de L. monocytogenes, verificando perda da integridade e aumento da permeabilidade da membrana, além da representativa atividade antioxidante. Outros autores, também reportaram o dano no potencial de membrana celular de E. coli e S. aureus, nos tratamentos com óleo essencial de canela, além de relatarem aumento na condutividade elétrica devido ao vazamento de pequenos eletrólitos, aumento da concentração de proteínas e ácidos nucléicos na suspensão celulares e redução da atividade metabólica bacteriana (ZHANG et al., 2016). Patra & Baek (2016) observaram um forte efeito prejudicial do óleo essencial de Enteromorpha linza contra Bacillus cereus e Staphylococcus aureus causado pelos danos na viabilidade de células bacterianas, alternâncias morfológicas e permeabilidade da membrana, indicado por um aumento significativo no vazamento de íons de potássio (K+) resultando em lise e morte celular. Há relatos na literatura que os óleos essenciais comprovam a perda de conteúdos intracelulares vitais como proteínas, açúcares redutores, ATP e DNA, além de inibição da geração de energia (ATP) e enzimas relacionadas (CUI et al., 2015; LAKEHAL et al., 2016). Zhang et al. (2016) investigaram a atividade bactericida e o mecanismo de ação do óleo essencial de pimenta preta sobre E. coli verificando a 18
morte celular causada por quebra da membrana seguido por desordem e vazamento do conteúdo celular. Os relatos acima comprovam a promissora atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, relacionadas principalmente à susceptibilidade individual da membrana celular das bactérias. Nesse sentido, ainda são necessárias mais pesquisas para entender completamente os mecanismos, assim como a inibição de patógenos de origem alimentar para justificar as aplicações dos óleos essenciais como agente antibacteriano natural.
2.7. Microorganismos indicadores de contaminação O aumento do consume de carne de frango e seus derivados nos últimos anos, foi acompanhado pelo crescente risco de contaminação dos alimentos (ROUGER et al., 2017). As fontes de contaminação podem ser exógena, por contaminação do ar no setor de criação e abate dos animais (WÓJCIK et al., 2010), ou endógena, por contato do material gastrointestinal e/ou biliar com a superfície da carcaça (BRIZIO et al., 2015), ou seja, a contaminação pode ocorrer durante processamento, armazenamento e até mesmo na dispersão do produto (MACIOROWSKI et al., 2007). Alguns destes contaminantes bacterianos, com destaque para as espécies patogênicas como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Campylobacter e coliformes podem crescer ou sobreviver durante o processamento e armazenamento de alimentos, causando gastroenterite humana devido ao consumo de carne de aves (MATTHEW et al., 2017; ROUGER et al., 2017). Salmonella spp. são bacterias Gram-negativas pertencente a família Enterobacteriaceae que estão entre as mais importantes bactérias patogênicas humanas que freqüentemente causam doenças transmitidas por alimento em todo o mundo segundo o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) e a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA), (EFSA e ECDC, 2017; CDC, 2018). Os sintomas de salmonelose incluem diarréia, febre e cólicas abdominais no período de 12 a 72 horas após a infecção Salmonella spp. (CDC, 2017). Na Austrália, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é o sorovar de Salmonella mais comum associado a surtos de doenças transmitidas por alimentos e foi responsável por 48% dos casos notificados de salmonelose humana em 19
2011 (OzFoodNet, 2015). Adeyanju & Ishola (2014) verificaram que a carne de frango importada nos mercados de Ibadan Estado de Oyo (Nigéria) estava contaminada com Salmonella e E. coli. Segundo Arnold et al. (2014) os ovos também são fontes de contaminação por Salmonella. Como visto, outros microorganismos também são encontrados como contaminantes em alimentos de origem animal. Matthew et al. (2017) avaliaram amostras de alimentos para aves e isolaram as bactérias ali presentes identificado-as como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus spp, Lactobacillus spp, Salmonella spp, sendo que a maior porcentagem de a ocorrência foi obtida com Staphylococcus aureus 35,6%. Chaillou et al. (2014) avaliaram a contaminação da carne de frando e perú identificando vários patógenos como E. coli , S. aureus e C. perfringens e coliforms totais e fecais. Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa que pertence à família das Enterobacteriaceae comumente encontrada no trato gastrointestinal dos seres humanos e animais, e devido a sua alta prevalência no intestino é usada como indicador para detectar e medir contaminação na avaliação de segurança alimentar e hídrica (MIRANDA et al., 2008). Segundo Stromberg et al. (2017) as cepas de E. coli patogênica extraintestinal são importantes patógenos que causam diversas doenças em humanos e aves. Alguns isolados de E. coli de fezes de frangos contêm genes de virulência associados a esse microorganismo potencialmente patogênicos, que poderiam ser transmitidos aos seres humanos através do manuseio e/ou consumo de carne contaminada (STROMBERG et al., 2017). Estudos epidemiológicos documentaram a presença de E. coli no intestino e em carnes de aves saudáveis, sendo algumas estirpes geneticamente semelhantes às responsáveis por infecções humanas (DELICATO et al., 2003; MANGES & JOHNSON, 2012). Em outro trabalho os autores relataram a presença de E . coli em isolados de fezes em ovos e carne de frango indicando que as aves comerciais podem abrigar esse patógeno com características de virulência e que poderiam ser transmitidos a outros frangos em aviários ou contaminar carcaças durante o processamento (OBENG et al., 2012). Stromberg et al. (2017) verificaram que as cepas de E. coli isoladas do intestino de frangos de corte saudáveis podem causar contaminação, meningite e sepse 20 letal em ratos demonstrando o potencial de E . coli para causar doenças graves em aves e humanos. Outro patógeno de destaque presente em vários hospedeiros, incluindo seres humanos e animais produtores de alimentos, como suinos, bovinos, caprinos e aves é Staphylococcus aureus, que apresenta um potencial de contaminar produtos de origem animal, podendo entrar na cadeia alimentar, durante o processamento, preparação, corte, embrulho e armazenamento (GAO et al., 2012; WANG et al., 2017a). Esse patógeno pode causar várias infecções, desde infecções superficiais da pele e dos tecidos moles até doenças potencialmente fatais, como septicemia, fasciite necrosante, endocardite e pneumonia necrosante (KRISHNA e MILLERM, 2012; CHEN e HUANG, 2014 ; RODRÍGUEZ-LÁZARO et al., 2015). Mkize et al. (2017) investigaram a prevalência de S. aureus em frangos de corte comerciais, bem como estabeleceu a susceptibilidade antimicrobiana e a distribuição de determinantes genéticos que conferem resistência e virulência. Segundo os autores aproximadamente 54% das 194 amostras foram positivas para S. aureus os quais apresentaram um alto nível (79,4%) de resistência à tetraciclina, seguido de ampicilina, vancomicina, cefoxitina, trimetoprim, eritromicina e estreptomicina com taxas de resistência de 65,1%, 61,9%, 60,3% 58,7%, 57,1% e 46,0%, respectivamente. Islam et al. (2014) relataram que 95% das amostras de frango avaliadas em seu trabalho estavam contaminadas por S. aureus. Wang et al. (2017b) avaliaram a resistência à meticilina e as capacidades toxigênicas de um total de 1.150 isolados de S. aureus cultivados a partir de 27.000 itens de varejo de alimentos de 203 cidades de 24 províncias da China em 2015 e realizaram testes para suscetibilidade antimicrobiana, verificando que 4,3% dos alimentos vendidos no varejo estavam contaminados com S. aureus, com cerca de 97,6% dos isolados foram resistentes aos antimicrobianos testados e 16 isolados confirmados com a capacidade de produzir simultaneamente dois ou três tipos de enterotoxinas. Para Mkize et al. (2017) a presença de S. aureus em carne de frango em um abatedouro apresenta a possibilidade de que esse patógeno seja disseminado para a comunidade através dos trabalhadores dos matadouros durante o manuseio da carne ou durante o transporte para os pontos de venda, o que implica na possibilidade de contaminação dos consumidores por da ingestão de carne de frango contaminada com 21 esse patógeno. S. aureus foi responsável por mais de 300 surtos de origem alimentar registrados na União Europeia em 2012, representando 6,4% de todos os surtos relatados (MACORI et al., 2016). Nos Estados Unidos, 241.000 enfermidades que requerem hospitalização anualmente são causadas po intoxicação alimentar estafilocócica (SCALLAN et al., 2011; BYRD-BREDBENNER et al., 2013). Na China, mais de 20% dos surtos bacterianos transmitidos por alimentos são causados por S. aureus (WANG et al., 2014). Isso levanta sérias preocupações de segurança alimentar em todo o mundo, uma vez que esses organismos podem ser transmitidos aos seres humanos através do consumo de carne contaminada, contaminação cruzada durante a preparação de alimentos ou pelo contato direto entre humanos e animais (PU et al., 2011).
2.8. O mecanismo de ação dos óleos essenciais no trato gastrointestinal A característica promotora de crescimento dos óleos essenciais tem sido relatado na literatura e essa característica está associada principalmente aos efeitos sobre o trato gastrointestinal (KOIYAMA et al., 2014; SIMITZIS, 2017; STEVANOVIC et al., 2018). No entanto, o mecanismo de ação dos óleos essenciais no organismo animal ainda não estão bem elucidados, e a aplicação de óleos essenciais em rações tem sido baseada principalmente nos efeitos antimicrobianos (OMONIJO et al., 2018). Contudo, há relatos que os óleos essenciais melhorem o desempenho dos animais através do aumento da palatabilidade da ração, do estímulo da secreção de enzimas endógenas e da função digestiva, da redução de infecções subclínicas, da sua ação ansiolítica e imunoreguladora e principalmente do controle da microflora intestinal devido a sua ação antimicrobiana (CATALAN et al., 2012). A palatabilidade da ração animal estimula o apetite e aumenta a ingestão de alimentos de forma diferente entre as espécies (YAN et al., 2010) podendo influenciar na digestibilidade e velocidade de passagem do alimento do trato gastrointestinal, aumentando a secreção de saliva, secreção biliática e de muco, e aumentando a atividade enzimática (MUHL & LIEBERT, 2007; MANZANILLA, et al., 2009). Relatos na literatura destacam o uso de óleos essenciais na dieta de frangos de corte com efeitos benéficos no desempenho animal, além melhorar a absorção de nutrientes causados pelo aumento da altura de vilosidade no íleo e menor profundidade de cripta 22 quando comparados com as aves que receberam a dieta controle (BASMACIOGLU- MALAYOGLU et al., 2016). Segundo Zeng et al. (2015) o aumento da secreção de muco no intestino desencadeada por compostos de origem vegetal impede a possibilidade de adesão bacteriana e fúngica ao epitélio no intestino de aves. Os óleos essenciais também reduzem os efeitos de bactérias patogênicas por efeitos antibióticos diretos e crescimento da microflora intestinal benéfica. Alali et al., (2013) verificaram uma melhora considerável no desempenho de frangos com a adição de uma mistura de óleos essenciais (eucalipto, tomilho e limão) a água como resultado da redução da colonização de Salmonella entérica. Hosseini e Meimandipour, (2018) verificaram uma redução do número de bactérias aeróbicas e coliformes totais, melhorando o desempenho dos frangos alimentados com óleo essencial de tomilho por meio da melhora do estado fisiológico e modulação da microbiota intestinal. Estudos em frangos de corte desafiados com E. coli, Clostridium perfrigens e Eimeria sp. mostrou que o número de patógenos diminuiu com a adição de óleos essenciais (BODAS et al., 2012; HUANG et al., 2012; ZHANG et al., 2012). Além disso, na alimentação animal, os óleos essenciais têm papéis como agentes hipolipidêmicos, imunomoduladores, anti- inflamatório, antioxidantes, bem como aliviadores de estresse de calor (BENCHAAR et al., 2008; STEVANOVIC et al., 2018). Entretanto, apesar desses resultados o mecanismos de ação do óleo essencial no trato gastrointestinal não são muito claros, o que remete a futuros desafios para pesquisas quanto ao uso de óleos essenciais em alimentos para animais.
2.9. Importância da manutenção da qualidade intestinal O trato gastrointestinal é um sistema bem organizado e complexo, cujas funções incluem a absorção de nutrientes, eletrólitos, água e proteção seletiva contra antígenos nocivos, toxinas e patógenos, constituido principalmente de células epiteliais, do sistema imunológico da mucosa e da microbiota intestinal com bactérias comensais e benéficas, bem como patógenos bacterianos (OMONIJO et al., 2018). É a maior e mais vulnerável superfície do mundo externo ao corpo e não apenas absorve nutrientes, mas também detecta nutrientes, substâncias químicas e microorganismos através de um sistema quimiossensorial com muitos nervos e receptores (FURNESS et al., 2013). 23
O sistema digestório deve apresentar características estruturais que possibilitem a ingestão e a passagem do alimento pelo trato, as alterações físicas e químicas do alimento e a absorção dos produtos da digestão, garantindo assim, o bom desempenho das aves através da obtenção adequada de energia e compostos químicos (água, sais minerais, lipídios, carboidratos, vitaminas e aminoácidos) (FERNANDES, 2012). O aspecto morfológico do sistema digestório das aves, está diretamente relacionado a absorção de nutrientes, além de influenciar no desempenho das funções desse sistema e nas condições de sanidade dessas aves (SOUSA et al., 2015). O intestino das aves é formado pelo intestino delgado, que é composto por três segmentos (duodeno, jejuno e íleo) que apresentam diferenças funcionais e morfológicas, e pelo intestino grosso que é relativamente pequeno e compreende os cecos, cólon e cloaca. A maioria dos processos digestivos e de absorção ocorre no intestino delgado sendo que parte da digestão ocorre na superfície das vilosidades, que são formadas por células da mucosa, os enterócitos, e pela ação das enzimas de membrana (BOARO, 2009). O intestino das as aves é revestido por muitas dobras microscópicas denominadas vilosidades ou vilos, que proporcionam aumento na superfície interna do órgão, ou seja, na área de digestão e absorção intestinal constituídos de enterócitos, células caliciformes e enteroendócrinas que tem a função de absorção, secreção de muco e produção de hormônios, respectivamente (BOLELI et al., 2002). Além da estrutura morfológica, a microbiota intestinal contribui de maneira importante para o desempenho das aves, estimulando a maturação e renovação do epitélio intestinal, a produção de muco e a motilidade do trato (CHERBUY et al., 2010; EL AIDY et al., 2012; SOMMER & BACKHED, 2013). Por esse motivo, vários estudos sobre a suplementação de óleos essenciais no setor avícola sugerem que este tratamento leva a algumas mudanças fundamentais no intestino, bem como na microbiota intestinal (TIIHONEN et al., 2010; AMERAH et al., 2011; CETIN et al., 2016; OMONIJO et al., 2018). A exemplo, Liu et al. (2017) investigaram os efeitos de óleos essenciais e uma mistura de ácidos orgânicos na alimentação de aves e na análise da sequência bacteriana do trato intestinal observaram que a suplementação de óleos essenciais e da mistura de ácidos orgânicos modificou a microflora intestinal principalmente nos Lactobacillus. 24
Basmacioglu-Malayoglu et al. (2016) avaliaram o efeito de misturas de ácidos orgânicos e óleo essencial, individualmente ou em combinação na alimentação de frangos de corte e observaram maior altura de vilosidade no íleo aos 21 e 42 dias de idade e tiveram menor profundidade de cripta no íleo aos 42 dias de idade do que as aves que receberam a dieta controle. Todos esses relatos destacam os benefícios do uso de óleos essenciais na alimentação animal para melhorias do trato gastrointestinal.
2.10. Microbiota intestinal A microbiota intestinal de frango de corte representa uma grande e complexa comunidade de microorganismos especializada e adaptada às condições físico-químicas, à fisiologia do hospedeiro e aos nutrientes disponíveis no habitat específico (APAJALAHTI & VIENOLA, 2016). A microbiota benéfica é composta por bactérias facultativas (aeróbicas ou anaeróbicas) como Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp., Streptococcus spp., além de bactérias exclusivamente anaeróbicas como Bacterioides spp., Fusobacterium spp. e Eubacterium spp. (LODDI, 2001; LEE, 2010). Esses microorganismos agem em simbiose com o hospedeiro, regulando a eficiência absortiva, o tempo de permanência do bolo alimentar no trato, o aproveitamento de alguns nutrientes pouco digestíveis pelas enzimas endógenas do animal, a maturação intestinal, antagonismo contra patógenos, o reforço da integridade intestinal e a modulação da imunidade (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Segundo Ducatelle et al. (2015) a microbiota intestinal transmite alterações fisiológicas ao hospedeiro interagindo com as células epiteliais intestinais por meio de receptores imunes inatos. Assim o tecido linfoide associado ao intestino transmite os sinais da superfície da mucosa para o resto do corpo, desempenhando um papel crucial não apenas no seu próprio desenvolvimento mas também na regulação de mecanismos que permitem que as superfícies da mucosa tolerem bactérias inofensivas, e respondam adequadamente a microorganismos patogênicos invasores (DUCATELLE et al., 2015). O desenvolvimento desta microbiota inicia-se de dois a quatros dias pós-eclosão, sendo predominante nessa fase principalmente cepas de Streptococcus e Enterobacteria, após uma semana, Lactobacillus predominam no intestino delgado e se mantém ao longo da vida do animal (AMIT-ROMACH et al., 2004). 25
As cepas de Lactobacillus que colonizam o intestino delgado das aves são incapazes de sintetizar aminoácidos para o seu anabolismo e são, portanto, altamente dependentes da disponibilidade de aminoácidos no ambiente de crescimento, auxiliando na digestão de proteínas, e competindo por aminoácidos entre a microbiota e o hospedeiro, assimilando de 3 a 6% do total de aminoácidos da dieta do animal. (APAJALAHTI e VIENOLA, 2016). No intestino dos frangos de corte é encontrado principalmente bactérias anaeróbicas das famílias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae e Coriobacteriaceae capazes de utilizar carboidratos como celulose e outros polissacarídeos altamente recalcitrantes, amido, carboidratos simples, produzir vitaminas como B6 e K, aminoácidos e ácidos graxos de cadeia curta (propionato e butirato), ácido lático e acético, além de estarem relacionadas ao metabolismo lipídico e do colesterol (BIDDLE et al., 2013; MARTÍNEZ et al., 2013 ). Além disso, as bactérias podem ser promotoras da saúde animal por meio da regulação positiva da defesa imunológica do hospedeiro, a estimulação da produção de mucina e a proliferação de células epiteliais (HÖRMANN et al., 2014). O butirato, por exemplo, produzido por bactérias do gênero Bifidobacteriaceae é uma importante molécula sinalizadora, ativamente absorvido pelas células epiteliais que revestem o trato intestinal, suprime a atividade da histona deacetilase nuclear, o que leva a uma mudança drástica no perfil de expressão gênica das células, resultando no aumento da replicação, aumento da diferenciação celular, fortalecendo a barreira intestinal (DUCATELLE et al., 2015). No duodeno e jejuno, o número total de bactérias é menor do que no íleo, no entanto, alguns fatores como dieta, processamento de ração, aditivos na alimentação, o estresse ambiental, como jejum prolongado e estresse térmico, a presença de patógenos intestinais podem influenciar a microflora intestinal, causando alterações na microbiota benéfica das aves, levando a um desequilíbrio microbiano com multiplicação dos microrganismos patogênicos, ou seja, uma disbiose (CHAN et al., 2013; POWER et al., 2014). No entanto, a denominação de bactérias benéficas e prejudiciais não é muito clara, uma vez que microrganismos intestinais, que são normalmente benéficos podem em algum momento se tornar uma ameaça potencial ao hospedeiro. Desse modo, microbiota é considerada prejudicial quando causa uma perturbação do equilíbrio 26 resultando em uma resposta imune agressiva, causando lesões intestinais e encurtamento das vilosidades, afetando absorção de nutrientes, além de favorecer a colonização de microrganismos patogênicos (MAIORKA, 2004; BISWAS e KOBAYASHI, 2013). Os microrganismos dos gêneros Coccidia spp. Salmonella spp. Escherichia spp e Campylobacter spp. são os mais predominantes patógenos que afetam a produção e a infecção de frangos de corte, além de serem responsáveis por inúmeros distúrbios alimentares em humanos (AMIT-ROMACH et al., 2004; BURKHOLDER et al., 2008; THANISSERY et al., 2014). Salmonella spp. é uma das cepas de microrganismos mais comuns encontrados em carne de aves, suína e bovina, em alimentos de origem animal, como laticínios, produtos cárneos, aves, ovos e frutos do mar, além de produtos como legumes frescos, frutas e cereais (ARNOLD et al., 2014; PAUDYAL et al., 2017; CRABB et al., 2019). Esses e outros patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, também estão presentes em rações animais (MATTHEW et al., 2017). Patógenos como E. coli e S. aureus e coliformes totais e fecais foram identificados como contaminantes da carne de frango e perú (CHAILLOU et al., 2014). Stromberg et al. (2017) verificaram que alguns isolados de E. coli de fezes de frangos contêm genes de virulência potencialmente patogênicos similares os dos microorganismos transmitidos aos seres humanos através do manuseio e/ou consumo de carne contaminada.
2.11. Técnicas moleculares Devido a importância dessa relação microbiota/hospedeiro, vários estudos tem sido desenvolvido para identificação da comunidade intestinal, envolvendo desde cultura de microorganismos a técnicas moleculares de alta tecnologia, permitindo revelar a diversidade de microorganismos de forma abrangente e confiável (VALVERDE e MELLADO, 2013; LI et al., 2012; PEDROSO et al., 2006). A Subunidade menor do RNA ribossomal, 16S rRNA é um dos principais alvos moleculares para análise microbiana, uma vez que possui regiões de sequências de bases de nucleotídeos nomeadas de V1 a V9 altamente conservadas no domínio bacteriano, intercaladas por regiões variáveis, possibilitando o estudo de caracterização filogenética entre os microorganismos (YAZAR et al., 2014). 27
A descoberta do gene 16S rRNA conduziu a diversos métodos moleculares para identificação da microbiota do conteúdo intestinal incluindo o métodos de FISH, que utiliza recursos moleculares para analisar os cromossomos, ou seja, é o mapeamento de um gene por hibridização molecular de uma sequência de DNA clonada, marcada por fluorescência, num cromossomo espalhado em lâmina (NEVES e GUEDES, 2012). A técnica de PCR (polymerase chain reaction) convencional e a mais inovadora técnica de PCR em tempo real (Real-Time polymerase chain reaction), baseada no princípio da reação em cadeia da polimerase para multiplicar ácidos nucleicos e quantificar o DNA obtido, onde o material genético inicial na reação de PCR é o RNA, que é transcrito no reverso em seu complemento de DNA pela enzima transcriptase reversa (LADEIRA et al., 2011). O sequenciamento de DNA de nova geração conhecidos como NGS (Next Generation Sequencing), permite uma nova abordagem de sequenciamento em larga escala (HGS – High throughput sequencing), e vem se tornando uma ferramenta importante na compreensão da diversidade biológica que nos cerca, podendo ser diretamente aplicada em questões de saúde pública e qualidade de vida (MARDIS, 2013). Um método utilizado atualmente é o protocolo de sequenciação do Illumina (Illumina Genome Analyzer), que tem como base a sequenciação de 2ª geração, que baseia no método de amplificação isotermal na “flow cell” (célula de fluxo) onde os moldes de DNA clonal individual são amplificados com a adição de bases que podem ser feitas recorrendo ao uso de polimerização (amplificação clonal enzimática), e a visualização é feita por emissão de fluorescência de nucleotídeos marcados com fluorocromos (PAREEK et al., 2011; KIRCHER e KELSO, 2010). Outro método bastante utilizado para otimizar a identificação de microorganismos em amostras com pequena quantidade de DNA, compara a amplificação padrão da região V4 16S rRNA com a região V3-V4, uma vez que a região V4 pode melhor representar o perfil taxonômico das comunidades microbiana, quando comparado a caracterização utilizando a sequência completa de genes 16S rRNA (WANG et al., 2007). Os principais intereferentes associados à genômica unicelular, incluem os métodos de armazenamento e estocagem das amostras que podem aumentar o número de colônias ou degradar o DNA ali presente, o alto potencial de contaminação que dificultam o aumento de escala, a necessidade de amplificação do genoma completo, a 28 completude média de um genoma unicelular, entre outros (RIBEIRO, 2017; PARKS et al., 2015; LASKEN e McLEAN, 2014). Contudo, o sequenciamento e o PCR tem comprovadamente uma aplicabilidade clínica, por meio da detecção específica de agentes patogênicos, na avaliação de novas infeções emergentes, vigilância, deteção precoce de ameaças biológicas e perfis de resistência a antibióticos em bactérias como a Staphylococus aureus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, entre outras (MORENO, 2013). Diante dos exposto, monitorar a dinâmica da microbiota intestinal das aves, determinar os principais membros desse microbioma e estabelecer sua funcionalidade é de suma importância na prevenção de problemas zoonóticos, bem como para o desenvolvimento de produtos que consigam modular as comunidades microbianas intestinais, melhorando o desempenho animal das aves, com maior segurança alimentar para o consumidor final dos produtos (YANG et al., 2009; OVIEDO-RONDÓN, 2009).
2.12. Óleos essenciais para frangos de corte Dentre os múltiplos usos dos óleos essenciais discutidos até o momento (antibacterianos, anti-inflamatórios, antioxidantes, estimulantes do sistema imune, do consumo, das secreções enzimáticas e dos sulcos digestivos) o foco nas propriedades funcionais relacionadas à produção e desempenho animal são fontes de inúmeras pesquisas (FERNANDES et al., 2015; SIMITZIS, 2017; CHOWDHURY et al., 2018; ZHAI et al., 2018). Em um trabalho reportado por Traesel et al. (2011) em experimento recente com frangos de corte alimentados com óleos essenciais de orégano, sálvia, alecrim e extrato de pimenta os autores obtiveram peso final e ganho de peso similares aos animais suplementados com antibióticos promotores de crescimento. Koiyama et al. (2014) avaliaram três misturas diferentes de óleos essenciais, uma delas contendo óleo essencial de alecrim, cravo, gengibre e orégano; outra contendo uma mistura de óleos essenciais de canela, sálvia, tomilho branco e óleo-resina de copaíba; e outra contendo a junção de todos esses óleos, comparados com a atividade do antibiótico virginiamicina, concluindo que a mistura, na dieta de frangos de corte, de aditivos fitogênicos à base de óleos essenciais de canela, sálvia, tomilho branco e copaíba, associada ou não à mistura de óleos essenciais de alecrim, cravo, gengibre e orégano, pode proporcionar 29 desempenhos zootécnicos comparáveis ao do uso de antibióticos promotores de crescimento. Bona et al., (2012) avaliaram a inclusão de composto vegetal à base de óleo essencial de alecrim (cineol), canela (cinamaldeído), extrato de pimenta vermelha (capsaicina) e orégano (carvacrol) para controle de Eimeria, Clostridium perfringes e Salmonella em frangos de corte e verificaram a redução na excreção desses microorganismos nas aves. Em outro trabalho, uma pesquisa realizada por Akabarian et al. (2013) incluíram óleo essencial de Curcuma xantrhorrhiza, extrato da casca de laranja e de limão na dieta de frangos criados em condições de estresse térmico. Sarica e Toptas (2014) verificaram que a suplementação dietética de 250 e 500 ppm de óleo essencial de orégano em dietas para frangos de corte aumentou o tamanho do jejuno e a área da superfície do vilo de frangos de corte aos 14 dias de idade. Em um ensaio de concentração mínima inibitória in vitro, Du et al. (2015) relataram que a atividade antibacteriana do óleo essencial, contendo timol e carvacrol, foi forte contra cepas patogênicas de E. coli , C. perfringens e Salmonella, e fraca atividade foi encontrada em relação às cepas benéficas de Lactobacillus concluindo que os compostos fenólicos, incluindo timol e carvacrol, melhoram potencialmente a integridade intestinal, responsável pela absorção de nutrientes. Em outro trabalho os autores avaliaram o efeito de uma mistura de óleo essenciais de orégano, anis e casca de Citrus (OEO) em comparação com o outro fitogênico contendo apenas óleo essencial de Origanum vulgare sobre o peso dos órgãos digestivos, morfologia intestinal e contagem de microflora ileocecal em frangos de corte e concluíram que a suplementação de 300 ppm de OEO na dieta de frangos de corte poderia melhorar os parâmetros morfométricos do intestino delgado e reduzir a presença de E. coli no conteúdo ileal (MOHITI-ASLI e GHANAATPARAST-RASHTI, 2017). No entanto, nem todos os resultados são positivos. Kirkpinar et al. (2011) avaliaram o efeito da adição de óleo essencial de orégano, de alho e a mistura de ambos na dose de 300mg/Kg de ração em dietas de frangos de corte verificando que não houve efeito no desempenho, além de uma redução significativa no peso de carcaça das aves. Saleh et al. (2014) também não encontraram melhora significativo nos parâmetros de desempenho das aves, porém verificaram uma melhora no perfil imunológico com a 30 adição de óleos essenciais de Tomilho ou de orégano (100, 200 e 300mg/Kg) nas rações dos frangos decorte. Segundo Adaszyńska-Skwirzyńska e Szczerbińska (2017) fatores como a concentração de óleo essencial, o tempo de aplicação, fatores ambientais como cama, iluminação, equipamentos, presença de roedores podem ser os responsáveis por essas discrepância. Dessa forma, a busca por alternativas aos antibióticos é um grande desafio para a sustentabilidade a longo prazo e a rentabilidade do setor avícola. Nesse sentido, os óleos essenciais e seus ingredients ativos são uma alternativa promissora. Entretanto, nosso conhecimento sobre suas atividades em organismos animais (bem como em humanos) ainda é bastante limitada e existe uma forte necessidade de informação sobre a sua absorção, distribuição, metabolismo e excreção. Portanto, a compreensão do modo de ação desses produtos naturais é um pré-requisito para sua aplicação regular em produção animal.
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4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo Geral Avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo essencial dos frutos de C. sinensis e de X. aromatica sobre E. coli, S. aureus, S. enteritidis e S. typhimurium e seu efeito na inclusão na dieta de aves.
4.2. Objetivos Específicos - Extração dos óleos essenciais dos frutos de C. sinensis e de X. aromatica; - Caracterização química dos óleos essenciais por cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas; - Avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais dos frutos de C. sinensis e de X. aromatica sobre E. coli, S. aureus, S. enteritidis e S. typhimurium; - Inclusão dos óleos essenciais dos frutos de C. sinensis e de X. aromatica na dieta de frangos de corte; - Avaliar o desempenho, o ganho de peso, o consumo de ração, a conversão alimentar das aves; - Avaliar o perfil bioquímico do sangue quanto aos teores de cálcio (Ca), fósforo (P), proteína total (PT), triglicerídeos (T), colesterol (Col). - Avaliar a biometria dos órgãos digestórios; - Avaliar comprimento e peso da tíbia e fêmur; - Mensurar a altura de vilo, profundidade de cripta relação vilo/cripta do duodeno; - Caraceterizar a microbiota intestinal por meio do sequenciamento do gene 16S rRNA.
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CAPÍTULO 1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica.
Resumo Os óleos essenciais tem sido amplamente estudados nas mais diversas aplicações pela industria farmacêutica, alimentícia ou agronômica como antimicrobianos, antioxidantes ou aditivos fitogênicos para alimentação animal. Nesse sentido, o objetivo com esse trabalho foi avaliar as atividades antioxidante e bactericida dos óleos essenciais dos frutos de Xylopia aromatica e Citrus sinensis. O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger e caracterizado por cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massas. A atividades antioxidante foi realizada por métodos espectrofotométrico e a atividade bactericida foi testada por método espectrofotométrico e de difusão em ágar. Os componentes principais identificados no óleo essencial dos frutos de X. aromatica foram silvestreno (63,56%), α-pineno (18,00%) e β-pineno (10,88%), enquanto que o composto majoritário presene no óleo essencial de C. sinensis foi o limoneno (95,64%). O óleo essencial de X. aromatica nas concentrações entre 0,15 a 5 mg.mL-1 apresentou elevada atividade antioxidante, entre 100 e 45,8% de sequestro do radical livre pelo método utilizando o radical livre 2,2- difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), enquanto o óleo essencial de C. sinensis apresentou atividade antioxidante de aproximadamente 28,2% na maior concentração (50mg.mL-1). Os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica apresentaram halos de inibição acima de 10 mm sobre os microsganismos avaliados (Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Salmonella Enteritides e Salmonella Typhimurium). Atraves do método de microdiluição em caldo, o óleo essencial dos frutos de C. sinensis demonstrou resultados satisfatórios com inibição entre 47 e 73% para as cepas de S. aureus; 47 e 92% para as cepas de E. coli; 9,5 e 83% para as cepas de Salmonella sorovar Typhimurium; e 68 e 78% para as cepas de Salmonella sorovar Enteritides. Pos este mesmo método, o óleo essencial de X. aromatica apresentou resultados promissores com inibição entre 44 e 81% para as cepas de S. aureus; 33 e 64% para as cepas de E. coli; 27 e 100% para as cepas de Salmonella sorovar Typhimurium; e 67 e 81% para as 50 cepas de Salmonella sorovar Enteritides nas menores e maiores concentrações avaliadas. Os achados deste estudo sugerem que os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica possuem compostos bioativos com excelentes efeitos inibitórios sobre os microsganismos avaliados, além de expressiva atividade antioxidante, podendo ser utilizados como promissores aditivos na indústria de alimentos. Palavras-chave: Produtos naturais, Antimicrobiano, Antioxidante.
Abstrat Essential oils have been widely studied in the most diverse applications by the pharmaceutical, food or agronomic industry as antimicrobials, antioxidants or phytogenic additives for animal feed. In this sense, the objective with this work was to evaluate the antioxidant and bactericidal activities of the essential oils of the fruits of Xylopia aromatica and Citrus sinensis. The essential oil was obtained by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus and characterized by a gas chromatograph coupled to the mass spectrometer. Antioxidant activities were performed by spectrophotometric methods and bactericidal activity was tested by spectrophotometric and agar diffusion methods. The main components identified in the essential oil of the fruits of X. aromatica were silvestrene (63.56%), α-pinene (18.00%) and β-pinene (10.88%), while the major compound is present in the oil essential part of C. sinensis was limonene (95.64%). The essential oil of X. aromatica in concentrations between 0.15 to 5 mg.mL-1 showed high antioxidant activity, between 100 and 45.8% of free radical scavenging by the method using the free radical 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), while the essential oil of C. sinensis showed antioxidant activity of approximately 28.2% in the highest concentration (50 mg.mL-1). The essential oils of C. sinensis and X. aromatica showed inhibition halos above 10 mm on the evaluated microorganisms (Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella Enteritides and Salmonella Typhimurium). Through the broth microdilution method, the essential oil of the fruits of C. sinensis showed satisfactory results with inhibition between 47 and 73% for the strains of S. aureus; 47 and 92% for E. coli strains; 9.5 and 83% for the strains of Salmonella serovar Typhimurium; and 68 and 78% for the strains of Salmonella serovar Enteritides. After this same method, the essential oil of X. aromatica showed promising results with inhibition between 44 and 81% for the strains 51 of S. aureus; 33 and 64% for E. coli strains; 27 and 100% for the strains of Salmonella serovar Typhimurium; and 67 and 81% for the strains of Salmonella serovar Enteritides in the lowest and highest concentrations evaluated. The findings of this study suggest that the essential oils of C. sinensis and X. aromatica have bioactive compounds with excellent inhibitory effects on the evaluated microorganisms, in addition to significant antioxidant activity, which can be used as promising additives in the food industry. Keywords: Natural products, Antimicrobial, Antioxidant.
1. Introdução Bactérias como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium, entre outros microorganismos são as principais responsáveis por doenças humanas causadas por alimentos em todo o mundo, sendo as aves e produtos avícolas, como carnes e ovos, os principais veículos para a transmissão desses patógenos para seres humanos (THANISSERY et al., 2014; ALALI et al., 2013; FDA, 2010). Essas bactérias possuem características epidemiológicas complexas que favorecem sua distribuição no meio ambiente, o que contribui para seu elevado impacto em saúde pública. A resistência das bactérias aos antimicrobianos é motivo de preocupação tanto para a saúde pública como para a saúde animal (OIE, 2012). Nesse sentido várias pesquisas sobre a substituição dos antimicrobianos com destaque para os produtos naturais como extratos vegetais e óleos essenciais. Os óleos essenciais são quimicamente constituídos de hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostos oxigenados (álcoois, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas e fenóis) (CHOUHAN et al., 2017). Eles apresentam papel importante na natureza através da proteção das plantas, portanto, vários estudos sobre o uso dos óleos essenciais como inseticidas, antivirais, antifúngico, antibacteriano, antioxidante e contra patógenos e contaminantes de alimentos (DJENANE et al., 2012), sugerem suas aplicações na indústria farmacêutica e de alimentos (BURT, 2004). Os óleos essenciais das folhas de Melaleuca armillaris (Sol. ex Gaertn.) foram testados quanto a atividade antioxidante e atividade antimicrobiana sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Salmonella enterica, entre outras bactérias, apresentando excelentes resultados (SIDDIQUE et al., 2017). Os óleos essências de Lavandula 52 stoechas foram testados quanto seu potencial de sequestradores de radical livre frente ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), além de sua atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus, apresentando resultados promissores (BOUYAHYA et al., 2017). Os óleos essenciais de espécies do gênero Xylopia também se destacam por sua atividade quimioterapêutica, antiinflamatória e antimicrobiana (WOGUEM et al., 2014). No Brasil, a espécie mais comum deste gênero é a Xylopia aromatica (conhecida popularmente como pimenta de macaco), que se destaca pela presença de alcalóides, compostos voláteis, flavonóides, terpenóides e esteróis em sua composição química, o que explica sua atividade antimicrobiana e antioxidante (PONTES et al, 2007; MOREIRA et al., 2013; MAAS et al., 2015). A laranja, assim como outros frutos cítricos possuem uma representativa quantidade de óleo essencial, estão entre os mais vendidas no mundo para a perfumaria (BIZZO et al., 2009). Na indústria de sucos de laranja (Citrus sinensis) a quantidade de resíduos (bagaço) gerados é em torno de 50% do peso da fruta, e estes são destinados à produção de farelo peletizado para ração animal ou podem ser destinados à obtenção de coprodutos com maior valor comercial como os óleos essenciais que pode ser utilizado comercialmente em alimentos, bebidas, aromatizantes, perfumes, cosméticos, medicamentos, entre outros (QIAO et al., 2008; DUGO et al., 2012). Uma característica importante dos óleos essenciais e seus componentes é a hidrofobicidade, que permite a interação com os lipídios presentes na membrana celular das bactérias e mitocôndrias, tornando-os mais permeáveis ao perturbar as estruturas celulares, o que resulta na morte da célula bacteriana devido ao vazamento de moléculas críticas e íons, como potássio (14 mM.L-1) e fosfato (6 mM.mL-1) por exemplo (BURT, 2004; ZHANG et al, 2017). Outra propriedade biológica de grande interesse é a atividade antioxidante dos óleos essenciais. Sua capacidade de eliminar os radicais livres pode desempenhar um papel importante na prevenção de algumas doenças causadas pelos radicais livres, como câncer e doenças cardíacas (KAMATOU e VILJOEN, 2010; MIGUEL, 2010). Segundo Fernandez-Panchon et al. (2008) e Giannenas et al. (2013) a capacidade de doar hidrogênio ou um elétron a radicais livres e também a deslocalização do elétron desemparelhado dentro da estrutura aromática são os principais mecanismos de proteção de moléculas biológicas contra a oxidação. 53
Os óleos essenciais de diversas espécies de plantas como Citrus sinensis, Citrus latifólia, Satureja macrostema, entre outras e seus compostos majoritários como Limoneno, β-Tujeno, α-Mirceno, α-Terpineno, γ-Terpineno, α-Felandreno, Timol, Carvacrol, Linalol, entre outros tem apresentado expressiva atividade antioxidante (VALGIMIGLI e PRATT, 2012; QUIROGA et al., 2014; NGO et al., 2016; TOSCANO-GARIBAY et al., 2017). Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi determinar a composição química dos óleos essências dos frutos de Xylopia aromatica e do resíduo da indústria de sucos de Citrus sinensis (bagaço de laranja) e avaliar sua atividades antioxidante e bactericida sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium.
2. Material e métodos 2.1. Coleta do material vegetal A coleta dos frutos de X. aromática foi realizada em uma região de cerrado no município de Iporá – GO entre os meses de março a maio de 2017. A excicata n° 627 está depositada no herbário do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano – Campus Rio Verde. O resíduo dos frutos de C. sinensis (bagaço da Laranja variedade Pêra) foram cedidos pela empresa de sucos Naturanja.
2.2. Obtenção do óleo essencial Para obtenção do óleo essencial 1000g dos frutos de X. aromática ou de bagaço de C. sinensis foram triturados em liquidificador, com 2 L de água destilada e acondicionado em um balão de fundo redondo de 3 L sobre uma manta aquecedora. O óleo essencial dos frutos foi obtido por hidrodestilação, em aparelho tipo Clevenger. O hidrolato foi armazenado em congelador (– 20°C) e após o congelamento foi separado a fase aquosa da fase orgânica. O rendimento da extração foi determinado pela relação da massa de óleo obtida e a massa de material vegetal utilizado na extração.
2.3. Análise química do óleo essencial As análises dos constituintes químicos dos óleos essenciais foram realizadas no laboratório de Química de Produtos Naturais da Universidade Federal de São Carlos 54
(UFSCar) por sistema de cromatografia a gás acoplado a espectrômetro de massas sequencial (CG-EM/EM), equipado com auto-injetor (Combi PAL AOC-5000 Shimadzu), coluna Restek Rtx-5ms (30m x 0,25 mm x 0,25 μm) fundida com sílica, espectrômetro de massas sequencial (MS TQ8030; Shimadzu) e detector por ionização por impacto eletrônico (IE) (70 eV). Os dados de separação e seus tratamentos foram realizados utilizando-se o Software GCMS Real Time Analysis®. A temperatura inicial foi mantida a 60 ºC por 3,0 min, seguido de um acréscimo de 3 ºC.min-1 até atingir 200 ºC e posteriormente foi programada para um aumento de temperatura de 15° C.min-1 até 280° C, permanecendo nessa temperatura por mais 1,0 min. Temperatura do injetor: 230 °C, temperatura do detector: 300 °C, pressão de injeção: 57,4 KPa, razão de Splitless: 150, faixa de detecção do espectrômetro de massas: 43-550 m/z, start time (cut time do solvente): 3,0 min e fluxo de 3 mL.min-1. A identificação das substâncias do óleo essencial foi estabelecida com base na comparação dos índices de retenção calculados com base na co-injeção de amostras de n-alcanos de C7 a C40 e conforme descrito na literatura (van Den Dool and Dec. Kratz, 1963) e dos espectros de massa das amostras com os dados da biblioteca do National Institute of Standards and Technology (NIST 2011) e da literatura (Adams, 2007).
2.4. Atividade antioxidante Os óleos essenciais de X. aromatica e C. sinensis foram avaliados quanto à capacidade antioxidante, pelo uso dos métodos do sequestro do radical livre de 2,2- difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). O experimento foi realizado conforme Mezza et al. (2018) adaptado para o método de microdiluição em microplacas de 96 poços para economia de reagentes. Em cada poço da microplaca foi adicionado 100 µL de DPPH em metanol, foram misturados a 100 µL de solução metanólica de óleo essencial em diferentes concentrações, (5 a 50 mg.mL-1 para óleo de C. sinensis e 0,15 a 5 mg.mL-1 para óleo de X. aromatica). O sistema foi mantido em repouso no escuro por 2 horas e posteriormente submetidos a leitura a 517 nm em espectrofotômetro de microplacas (VersaMax Tunable ™ - Molecular Devices - Sunnyvale, CA, EUA). A capacidade percentual de eliminação de radical livre foi calculada de acordo com a Equação 1: ((AC–AS)/AC)*100 Eq. 1 55
Onde: “AC” é a absorbância da solução de controle e “AS” é a absorbância da solução de amostra contendo antioxidante.
2.5. Atividade Bactericida pelo método de difusão em ágar (MDA) e concentração mínima inibitória (MIC) As bactérias S. aureus ATCC 25923 e E. coli O157: H7 foram cedidas pelo Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Brasília, Campus Planaltina. As bactérias Salmonella sorocar Enteritides ATCC 13076 e sorovar Typhimurium ATCC 14028 foram cedidas pelo Centro de Pesquisa em Alimentos da Universidade Federal de Goiás. A cultura estoque foi armazenada em meio de congelamento (3 g de extrato de carne, 5 g de peptona bacteriológica, 1 L de água destilada e glicerol). As bactérias foram reativadas em meio líquido e incubadas a 37 °C por 24 horas. A suspensão bacteriana foi padronizada diluindo em meio líquido até a turvação da solução equalizado com solução padrão 0,5 McFarland, o que corresponde a 1,5 × 108 UFC.mL1. Para o método de difusão em discos as placas de Petri previamente esterilizadas foram preparadas com meio ágar nutriente e após a solidificação do meio, 100 µL da suspensão bacteriana (1,5 × 108 UFC.mL-1) foi espalhado sobre o meio sólido com auxílio de uma alça de Drigalski na superfície de toda a placa. Posteriormente, discos de papel filtro de 6 mm foram mergulhados nas soluções de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis nas diferentes concentrações (0,078 a 2,5 mg.mL-1), em Dimetil sulfóxido (DMSO), e em seguida foram colocados sobre o meio de cultura e mantido em estufa bacteriológica a 37 °C por 24 horas. A atividade bactericida foi determinada em termos de diâmetro (mm) do halo de inibição. Para determinação da concentração mínima inibitória foi utilizado o método de diluição em caldo Muller-Hinton. Neste método, 100 µL das suspensões bacterianas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium (1,5 x 108 UFC.mL-1) foram misturadas a 50 µL das soluções de óleo essencial de X. aromatica e e C. sinensis nas diferentes concentrações (0,078 a 2,5 mg.mL-1), em Tween 80® a 1% (v/v), e mantidos em estufa bacteriológica a 37 °C por 24 horas. Por fim, as amostras foram submetidas a leitura em um espectrofotômetro de microplacas (VersaMax Tunable ™ - Molecular Devices - Sunnyvale, CA, EUA) para 56 medir a absorbância em 630 nm. A taxa de inibição foi calculada utilizando a equação 2: % Remoção = ((Abs controle – Abs amostra)/ Abs controle)*100 Eq.2
2.6. Análise Estatística Os experimentos foram realizados em triplicata e o delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias dos tratamentos foram avaliadas por meio do teste de Tukey a 5% de significância pelo software SISVAR® (FERREIRA, 2011).
3. Resultados 3.1. Teor, aspecto físico e composição química do óleo essencial dos frutos de X. aromatica A hidrodestilação dos frutos de X. aromatica forneceu um óleo essencial translúcido, menos denso que a água, com rendimento médio 1,4% ± 0,01. Os cromatogramas obtidos nas melhores condições estabelecidas para análise do óleo essencial dos frutos de X. aromatica está apresentado na Figura 1.
Figura 1: Ampliação do cromatograma obtido no CG-EM/EM para o óleo essencial dos frutos de X. aromatica.
Foram identificados seis compostos químicos presentes no óleo essencial dos frutos de X. aromatica (Tabela 1) e a estrutura química destes compostos estão representadas na Figura 2. Os compostos encontrados nas maiores porcentagens foram 57 silvestreno (63,56%), α-pineno (18,00%), β-pineno (10,88%), mirceno (2,73%), α- fellandreno (2,20%) e sabineno (2,00%).
Tabela 1: Constituintes químicos do óleo essencial dos frutos de X. aromatica.
Área (%) Pico TR (min) Composto IR exp.* IR lit.** GC-EM/EM 1 5.516 1R-(+)-alpha-pineno 0.17 927 - 2 5,716 α-pineno 18.00 934 932 3 6,781 sabineno 2.00 974 969 4 6,901 β-pineno 10.88 979 974 5 7,239 myrceno 2.73 992 988 6 7,701 α-fellandreno 2.20 1007 1002 7 8,350 ο-cimene 0.46 1025 1022 8 8,505 silvestreno 63.56 1030 1030 * = índice de retenção calculado usando a equação de Van den Dool e Kratz. ** = Índice de retenção da literatura (ADAMS, 2007) baseada na equação de Van den Dool e Kratz.
α-Pineno Sabineno β-Pineno
Mirceno α-Fellandreno Silvestreno Figura 2: Fórmula estrutural dos principais compostos químicos do óleo essencial dos frutos de X. aromatica identificados por CG-EM/EM.
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3.2. Teor, aspecto físico e composição química do óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis O óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis apresentaram uma coloração translúcida, menos denso que a água, com rendimento médio 0,5% ± 0,01. Na Figura 3 está apresentado o cromatograma obtido nas melhores condições estabelecidas para análise do óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis.
Figura 3: Ampliação do cromatograma obtido no CG-EM/EM para o óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis. Sete compostos químicos foram identificados no óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis conforme a Tabela 2, a estrutura química destes compostos estão representadas na Figura 4 e os compostos majoritários encontrados foram Limoneno (95,64%) e Mirceno (1,86%). Tabela 2: Constituintes químicos do óleo essencial dos frutos de C. sinensis.
Área (%) Pico TR (min) Composto IR exp.* IR lit.** GC-MS 1 9,119 α-Pineno 0,53 928 932 2 10,623 Sabineno 0,32 968 969 3 11,287 Mirceno 1,86 985 988 4 12,130 α-Fellandreno 0,24 1006 1002 5 13,471 Limoneno 95,64 1036 1034 6 16,202 Linalol 0,55 1096 1095 7 20,608 α-Terpineol 0,87 1189 1186 * = índice de retenção calculado usando a equação de Van den Dool e Kratz. ** = Índice de retenção da literatura (ADAMS, 2007). 59
Limoneno Mirceno Figura 4: Fórmula estrutural dos principais compostos químicos do óleo essencial do bagaço dos frutos de C. sinensis identificados por CG-EM/EM.
3.3. Atividade antioxidante
Os óleos essenciais apresentaram resultados promissores quanto a atividade antioxidante nas concentrações testadas. O óleo essencial de C. sinensis apresentou uma atividade antioxidante com 28,2% de sequestro de radical livre nas maiores concentrações (Figura 5).
Figura 5: Porcentagem de sequestro de radicais livres pelo óleo essencial de C. sinensis. 60
Quanto ao óleo essencial dos frutos de X. aromatica, este apresentou um ótimo potencial antioxidante com 100; 98,8; 87,6; 66,9; 62,59 e 45,8% de sequestro de DPPH nas concentrações 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125 e 0,15625 mg/mL de óleo essencial em metanol, respectivamente (Figura 6).
Figura 6: Porcentagem de sequestro de radicais livres pelo óleo essencial de X. aromatica.
3.4. Atividade Bactericida pelo método de difusão em ágar (MDA) e concentração mínima inibitória (MIC) Os resultados dos efeitos antimicrobianos dos óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica pelo método de difusão em ágar estão apresentados nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. O óleo essencial de C. sinensis apresentou halos de inibição sobre as cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium em todas as concentrações avaliadas (Tabela 3). Os halos de inibição contras cepas de Staphylococcus aureus diferenciaram significativamente variando entre 20,00 mm a 6,66 mm para as maires e menores concentrações (2,5 a 0,07 mg.mL-1), respectivamente. Nas cepas de Escherichia coli a maior concentração diferenciou significativamente das demais com halo de inibição de 21,66 mm. Não 61 houve diferença na ação do óleo essencial de C. sinensis contra as cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium.
Tabela 3: Comparação entre as medidas dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano (mm) das cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium obtidas pelas metodologias de disco utilizando os óleos essenciais de C. sinensis. Halos de inibição (mm) Concentações Staphylococcus Escherichia Salmonella Salmonella (mg.mL-1) aureus coli Typhimurium Enteritides 2,5 20,00±2,00 a 21,66±0,01 a 13,50±1,50 a 16,16±2,84 a 1,25 14,66±0,58 b 15,50±0,50 b 14,16±0,29 a 16,00±2,00 a 0,62 13,00±3,00 b 13,50±1,50 b 14,66±1,53 a 16,00±3,16 a 0,31 14,50±0,50 b 12,50±0,50 b 13,00±1,00 a 16,33±3,21 a 0,15 13,00±1,00 b 13,66±3,21 b 13,33±2,08 a 12,00±3,16 a 0,07 6,66±0,01 c 13,16±1,61 b 16,66±1,53 a 13,00±2,52 a CV (%) 10,27 8,63 10,22 18,93 Valor de p 0,000 0,000 0,097 0,316 SEM 0,80 0,74 0,83 1,63 CV: Coeficiente de variação, SEM: erro médio padrão.
No controle das cepas de Staphylococcus aureus o óleo essencial de X. aromatica apresentou halo de inibição de 11,8; 11,3 e 10,3 mm nas maiores concentrações (2,5; 1,25; e 0,62 mg.mL-1) sem diferença significativa entre esses tratamentos. As concentrações 0,31 e 0,15 mm apresentaram halos de inibição de 10,1 e 10,0 mm, respectivamente, sem diferença significativa entre esses tratamentos, porém diferenciaram significativamente da menor concentração (0,07 mg.mL-1) com halo de inibição de 8,8 mm. O óleo essencial de X. aromatica apresentou diferença significativa para inibição do crescimento bacteriano da cepa de Escherichia coli na maior concentração de 2,5 mg.mL-1 quando comparado aos demais tratamentos com halo de inibição de 9,75 mm. Nas demais concentrações (1,25; 0,62; 0,31 e 0,15 mg.mL-1) não houve diferença significativa, com exceção para menor concentração de óleo essencial (0,07 mg.mL-1) com halo de inibição de 6,67 mm. Os halos de inibição contra as sorovares de Salmonella Typhimurium e Enteritides não diferenciaram significativamente nas diferentes concentrações do óleo essencial de X. aromatica. 62
Tabela 4: Comparação entre as medidas dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano (mm) das cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium obtidas pelas metodologias de disco utilizando os óleos essenciais de X. aromatica. Halos de inibição (mm) Concentações Staphylococcus Escherichia Salmonella Salmonella (mg/mL) aureus coli Typhimurium Enteritides 2,5 11,84±1,53 a 9,75±0,20 a 18,33±3,00 a 15,66±3,04 a 1,25 11,34±0,76 a 8,5±1,30 ab 19,16±0,76 a 13,66±3,21 a 0,62 10,34±0,57 a 7,84±1,04 ab 16,66±3,16 a 14,33±0,50 a 0,31 10,17±0,76 ab 7,47±0,05 ab 14,33±3,04 a 11,00±0,50 a 0,15 10,00±0,50 ab 7,17±1,05 ab 15,33±3,06 a 14,33±1,15 a 0,07 8,84 ± 0,76 b 6,67±0,50 b 14,66±2,98 a 13,00±2,00 a CV (%) 9,11 9,19 18,11 13,66 Valor de p 0,036 0,005 0,320 0,589 SEM 0,547 0,419 1,71 1,79 CV: Coeficiente de variação, SEM: erro médio padrão.
Os resultados do teste em microdiluição em calda e IC50 dos óleos essenciais C.sinensis e X. aromatica sobre as cepas bacterianas Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium estão apresentados nas Figuras 7 e 8. Os óleos essenciais de X. aromatica e C. sinensis também apresentaram bons resultados quanto a inibição do crescimento bacteriano das cepas testadas pelo método de microdiluição em caldo. O óleo essencial C. sinensis apresentou resultados satisfatórios com inibição entre 47 e 73% para as cepas de Staphylococcus aureus; 47 e 92% para as cepas de Escherichia coli; 9,5 e 83% para as cepas de Salmonella spp. sorovar Typhimurium; e 68 e 78% para as cepas de Salmonella spp. sorovar Enteritides nas menores e maiores concentrações avaliadas (Figura 7).
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Figura 7: Comparação entre as médias das porcentagens de inibição do óleo essencial de C. sinensis sobre as cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium obtidas pelo método de microdiluição em caldo. ND = Não detectado.
O óleo essencial de X. aromatica apresentou inibição entre 44 e 81% para as cepas de Staphylococcus aureus; 33 e 64% para as cepas de Escherichia coli; 27 e 100% para as cepas de Salmonella spp. sorovar Typhimurium; e 67 e 81% para as cepas de Salmonella spp. sorovar Enteritides nas menores e maiores concentrações avaliadas (Figura 8).
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Figura 8: Comparação entre as médias das porcentagens de inibição do óleo essencial de X. aromatica sobre as cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. sorovares Enteritides e Typhimurium obtidas pelo método de microdiluição em caldo. ND = Não detectado.
4. Discussão Com os resultados encontrados no presente estudo, verificou-se que o óleo essencial do resíduo dos frutos de C. sinensis apresenta como principal composto químico o limoneno. Este composto é comum nas espécies deste gênero e também foi identificado no óleo essencial de outras espécies Citrus, que compreendem principalmente os limões, as laranjas e as tangerinas, conforme reportado na literatura (VELÁZQUEZ-NUÑEZ et al., 2013; MARTINS et al., 2017; GUO et al., 2018). Também identificou-se neste estudo que os frutos de Xylopia aromatica (Annonaceae), coletados em região do Cerrado brasileiro, são fonte de óleos essenciais ricos em compostos como α-pineno, β-pineno e silvestreno, com ações de grande importancia para indústria de perfumaria, cosméticos, farmacêutica, agronômica e de alimentos. Os compostos α-pineno e β-pineno também foram identificados por outros autores nos óleos essenciais desta mesma espécie coletados em diferentes regiões, inclusive no Cerrado (SILVA e ROCHA, 1981; ANDRADE et al., 2004; JUNQUEIRA, 65
2015; PERES et al., 2020). Entre outras espécies deste gênero também foram identificados compostos como α-pineno e β-pineno nos óleos essenciais dos frutos de Xylopia aethiopica (KEITA et al., 2003) de Xylopia langsdorffiana (MOURA et al., 2016), sugerindo que estes compostos podem ser comum nas espécies deste gênero. Entretanto, apesar de apresentarem compostos similares, em nenhum desses trabalhos foi citado a presença do silvestreno, composto majoritário identificado neste estudo. O composto silvestreno foi identificado entre os compostos majoritários do óleo essencial nas folhas de outra espécie da família Annonaceae (Guatteria pogonopus) (FONTES et al., 2013); e de outras famílias botânicas como nas folhas e flores de Artemisia dracunculus (Asteraceae) (JEPPESEN et al., 2012); nas folhas de Chrysactinia mexicana (Asteraceae); nas folhas e frutos de Schinus Molle (Anacardiaceae) (GUERRA-BOONE et al., 2013); nas folhas de Zanthoxylum caribaeum (Rutaceae) (NOGUEIRA et al., 2014); e nas folhas de Zanthoxylum bungeanum (Rutaceae) (LIU et al., 2017). No entanto, a quantidade de compostos e as porcentagens dos componentes majoritários encontrados no presente trabalho difere ligeiramente dos resultados encontrados na literatura, uma vez que o material vegetal foi coletado em regiões diferentes, com outras condições climáticas, de sazonalidade, e propriedades do solo, sendo estes fatores determinantes no rendimento e composição dos óleos essenciais (ELHASSAN e AYOUB, 2014). Neste estudo evidenciou-se resultados promissores quanto a atividade antioxidante dos óleos essenciais dos frutos de X. aromatica sobre DPPH, o que pode estar correlacionado à presença dos monoterpenos silvestreno, α-pineno e β-pineno, entretanto, não foi encontrado na literatura registros de análise antioxidante dos óleos essenciais de X. aromatica. Por outro lado, a atividade antioxidante de outras espécies deste gênero também foi reportada na literatura, as quais apresentaram entre seus compostos majoritários os monoterpenos α-pineno e β-pineno (KONAN et al., 2009; COSTA et al., 2013; ALPHONSE et al., 2017). De acordo com Neuenschwander et al. (2010) terpenos como α-Pineno são compostos insaturados que tendem a sofrer auto-oxidação similarmente aos lípidos insaturados. Segundo os autores, a auto-oxidação térmica do α-Pineno resulta na formação de quatro tipos diferentes de radicais peroxil, que se propagam numa longa 66 cadeia radical. Assim, quando α-Pineno ou componentes similares como γ-Terpineno e α-Felandreno, encontrados em menor proporção no óleo essencial de X. aromatica quando misturados com material oxidável como lipídios insaturados, se comportam como antioxidantes, pois ambos sofrerão auto-oxidação, e os produtos resultantes das reações com radicais peroxila irão se propagar ao longo da cadeia oxidativa, reduzindo a taxa global de oxidação (FOTI e INGOLD, 2003; AMORATI et al., 2013). Por outro lado, a atividade antioxidante dos óleos voláteis é dificilmente atribuída para um único composto, uma vez que apresentam uma composição química complexa, e a bioatividade pode estar relacionada ao sinergismo entre todos os constituintes e não a um ou dois constituintes isoladamente (KULISIC et al., 2005; MENDES et al., 2017). Neste estudo, identificou-se nos óleos essenciais das duas espécies avaliadas, C. sinensis e X. aromatica, um grupo significativo de monoterpenos insaturados que ao agir em sinergismos, podem apresentar o potencial antioxidante conforme observado. Adicionalmente, esses resultados são bastante promissores, uma vez que o uso de óleos essenciais pela indústria de alimentos é uma tendência crescente, pois além de contribuírem com aromas e sabores, apresentam um ótimo potencial para serem utilizados como antioxidantes naturais, em substituição aos antioxidantes sintéticos como BHA (hidroxianisol butilado) e BHT (hidroxitolueno butilado), uma vez que estes podem estar relacionados ao estresse oxidativo e consequentemente ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, processo de envelhecimento, diabetes, câncer, inflamação, cardiopatias, citotoxicidade, entre outros problemas (THOMPSON e MOLDEUS, 1988; KANG et al., 2004; MENDES et al., 2017). Considerando o ensaio microbiológico, os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica também apresentaram resultados promissores quanto a inibição do crescimento bacteriano das cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Salmonella spp. sorovar Typhimurium e Enteritides. Outros autores encontraram resultados similares para os óleos essenciais de C. sinensis, usados no controle de Listeria monocytogenes, Lactobacillus plantarum, Salmonella spp. (CHALOVA et al., 2010); Staphylococcus aureus e Escherichia coli (TAO et al., 2009); Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis resistentes à vancomicina (FISHER e PHILLIPS, 2009). 67
Nos estudos que envolveram o gênero Xylopia, Alcântara et al., (2018) verificaram atividade antimicrobiana do óleo essencial de X. aromatica coletadas na Amazônia sobre Streptococcus sanguinis. Outra espécie de destaque deste gênero é a Xylopia sericata, cujo óleo essencial se destacou quanto a atividade bactericida contra S. aureus, Enterobacter cloacae, Bacillus cereus e Klebsiella pneumonia (MENDES et al., 2017). Tomados em conjunto, os isolados de bactérias acima citados, estão relacionadas a micro-organismos que comprometem a inocuidade de alimentos, e portanto, devem ser explorados quanto às possibilidades de princípios químicos que possam ser inibidores ou controlem sua proliferação. Em outra espécie desse gênero, o óleo essencial dos frutos de X. aethiopica foi caracterizado por alta concentração de monoterpenos entre os quais se destacam α- Pinene, 1S-β-Pineno e Limoneno, além de apresentar atividade antimicrobiana sobre Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Raoultella planticola e Salmonella spp (WOUATSA et al., 2014). É importante mencionar que as espécies do gênero Citrus tem em comum o limoneno como composto majoritário, enquanto as espécies do gênero Xylopia tem em comum a presença de compostos como α-Pineno e β-Pineno, além do Silvestreno encontrado em abundancia no óleo essencial analisado neste trabalho. Os resultados do estudo em questão, denotam que os princípios ativos identificados, bem como os microorganismos testados podem ser importantes elementos que suscitem alternativa para inibição bacteriana, seja para patógenos ou microorganismos deteriorantes de alimentos. No entanto a atividade biológica dos óleos essenciais geralmente não é atribuída a um único composto, mas sim como resultado da ação de seus compostos em sinergismo, o que representa uma vantagem para o uso de óleos essenciais como uma alternativa aos agentes antibacterianos convencionais na indústria de alimentos, na alimentação animal, ou na área da saúde (MENDES et al., 2017; ADASZYŃSKA- SKWIRZYŃSKA e SZCZERBIŃSKA, 2017). Os resultados positivos do presente estudo no controle de microorganismos podem ser explicados pelas propriedades dos óleos essenciais. Segundo Sharma et al. (2013), a membrana externa das bactérias Gram-negativas como a Salmonella spp. 68 apresenta caráter lipofílico, tornando-as impermeáveis a vários agentes antibacterianos. No caso dos óleos essenciais, suas pequenas moléculas de caráter lipofílico permite que penetre na célula bacteriana através das porinas bacterianas, afetando suas enzimas e causando lise e morte celular (KOTZEKIDOU et al., 2008). Patra et al. (2015) avaliaram o mecanismo de ação do óleo essencial de Enteromorpha linza L. sobre E. coli, analisando parâmetros como viabilidade celular, observação por microscopia eletrônica de varredura, efeito no vazamento da membrana celular e perda de tolerância ao sal. Os autores verificaram diminuição da viabilidade celular, aumento da condutividade elétrica, alteração da morfologia bacteriana, rompimento celular e vazamento dos íons de K+ após 6 horas de incubação, o que justifica a eficiência dos óleos essenciais e seus componentes no controle de microorganismos. Os achados deste estudo sugerem que os óleos essenciais de X. aromatica e C. sinensis possuem compostos bioativos com expressiva atividade antioxidante e antibacteriana podendo ser utilizados como alternativas na busca de aditivos para indústria de alimentos ou como aditivos fitogênicos aplicados na avicultura.
5. Conclusões O óleo essencial dos frutos de X. aromatica e C. sinensis contém constituintes bioativos e potencial atividade antimicrobiano, além de ser uma alternativa ao antioxidante sintético. O efeito antioxidante e bactericida desses óleos essenciais e seus componentes continuam sendo uma importante área para futuras pesquisas. O estudo dos efeitos sinérgicos entre os óleos essenciais e/ou seus componentes deve ser considerado quanto a otimização da atividade biológica, reduzindo as concentrações necessárias para alcançar um específico para segurança do alimento resguardando a saúde pública.
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CAPÍTULO 2 Essential oil from Citrus sinensis and Xylopia aromatica fruits in the diet of broilers
Marcela Christofolia; Weslane Justina da Silvab; Isac Gonçalves da Silvab; Elisio Marques de Almeida Juniorb; Alison Batista Vieira Silva Gouveiab; Lorrayne Moraes de Paulob; Cibele Silva Minafrab; Paulo Sérgio Pereirab. aUniversidade Federal de Goiás. Avenida Esperança s/n, Câmpus Samambaia. CEP 74690-900 Goiânia - Goiás - Brasil. bInstituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano – Campus Rio verde, Rod.Sul Goiana Km 01, CEP 75.901 – 970, Zona Rural, Rio Verde – GO – Brasil.
Corresponding author: Paulo Sérgio Pereira, Rodovia Sul Goiana, km 01, Zona Rural, 75901-970, Fone: +55 64 98147-0822, e-mail: [email protected]
Resumo Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão do óleo essencial dos frutos de Citrus sinensis e Xylopia aromatica na alimentação de frangos de corte. Neste estudo, pintos machos de 180 dias da linhagem Cobb 500 foram alimentados com milho e farelo de soja, incluindo os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica. O experimento foi realizado com três tratamentos e seis repetições, e o delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos avaliadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Na fase inicial da criação de frangos de corte, foi monitorado o efeito das dietas experimentais sobre o desempenho, parâmetros sanguíneos, biometria dos órgãos digestivos, análise óssea, perfil bioquímico das vísceras, bem como histomorfometria do intestino delgado. Os principais compostos identificados no óleo essencial dos frutos de X. aromatica foram silvestreno, α-pineno e β-pineno, enquanto os frutos de C. sinensis foram limoneno e mirceno. Os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica não tiveram efeito significativo no desempenho aos 14 dias. No entanto, houve melhoras significativas com a presença dos óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica na resposta imune, por meio da diferenciação do peso da Bursa e melhorias nos lipídios 77 sanguíneos e hepáticos representados pela redução dos triglicerídeos. Além disso, a adição de óleo essencial aumentou a absorção de nutrientes, aumentando as vilosidades e a profundidade das criptas, o que refletiu em um maior coeficiente de metabolismo da proteína bruta, matéria seca e extrato etéreo. Esses resultados demonstram que os óleos essenciais dos frutos de C. sinensis e X. aromatica podem ser utilizados na alimentação de frangos de corte como aditivos fitogênicos promotores de crescimento. Palavras-chave: Aves, Aditivos fitogênicos, Limoneno, Óleo Essencial de Laranja.
Abstract This study aimed to evaluate the effect of including essential oil from the fruits of Citrus sinensis and Xylopia aromatica in the broiler feed. In this study, 180-day-old male chicks of the Cobb 500 strain were fed with corn and soybean meal, including the essential oils of C. sinensis and X. aromatica. The experiment were performed with three treatments and six replications, and the experimental design was completely randomized. Data were subjected to analysis of variance, and treatment means were evaluated by the Tukey test at 5% significance. In the initial phase of broiler breeding, the effect of experimental diets on performance, blood parameters, biometrics of digestive organs, bone analysis, biochemical profile of viscera, as well as histomorphometry of the small intestine, was monitored. The major compounds identified in the essential oil of the fruits of X. aromatica were Sylvestrene, α-Pinene and β-Pinene, while the fruits of C. sinensis were Limonene and Myrcene. The essential oils of C. sinensis and X. aromatica had no significant effect on performance at 14 days. However, there were significant improvements with the presence of the essential oils of C. sinensis and X. aromatica on the immune response, through differentiation of the weight of the Bursa and improvements in blood and liver lipids represented by the reduction of triglycerides. Also, the addition of essential oil increased the absorption of nutrients by increasing the villi and depths of the crypts, which reflected in a higher metabolism coefficient of crude protein, dry matter, and ether extract. These results demonstrate that the essential oils of the fruits of C. sinensis and X. aromatica can be used in the feed of broilers as growth promoter phytogenic additives. Keywords: Poultry, Phytogenic additives, Limonene, Orange Essential Oil.
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1. Introduction Animal nutrition plays an important role in the production of broiler birds through the use of high-quality ingredients with nutritional levels that fully meet the animal's needs, in addition to antibiotics that selectively stimulate the growth of healthy intestinal microbiota, thus contributing to animal growth (Classen, 2017; Sharifi-Rad et al., 2017; Almeida et al., 2020; Gouda et al., 2020). However, the European Union's ban on the use of antibiotics as growth promoters for poultry in 2006 boosted research in the search for alternative phytogenic additives. In this search, essential oils arise, which are lipophilic molecules, with low molecular weight, consisting of mixtures of volatile organic compounds produced as secondary metabolites by plants, consisting of hydrocarbons (terpenes and sesquiterpenes) and oxygenated compounds (alcohols, ethers, aldehydes, ketones, lactones, and phenols) (Christofoli et al., 2015). The diversity of metabolites is immense, with around 320,000 secondary metabolites (Banerjee et al., 2015), and a single plant has a biosynthesis capacity of up to 25,000 compounds (Verpoorte, 1998). Essential oils have been widely used as bactericide, antioxidant, antiviral, fungicide, insecticide, acaricide, antiparasitic activities, expectorant, anticancer and cytotoxic (Mezza et al., 2018, Costa et al., 2017, Christofoli, et al., 2015, Calo et al., 2015). They have also been studied as phytogenic additives, since they contribute to better use of nutrients and consequently improve performance, as they stimulate the appetite and secretion of endogenous digestive enzymes, improve the integrity of the intestinal epithelium, in addition to exercising antimicrobial, coccidiostatic or anthelmintic activities (Oviedo-Rondón et al., 2019; Chowdhury et al., 2018; Van Der Aar et al., 2017; Hafeez et al., 2020). Some species stand out as many as their biological activities, such as the species of the Citrus genus (Rutaceae). Studies highlight the antioxidant activity with free radical reduction 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) by the essential oils of Citrus sinensis (Orange) and Citrus latifolia, in addition to a reduction in reactive oxygen species (EROS) (Toscano-Garibay et al., 2017). Another study also highlights the antioxidant potential of the essential oil of the skin of fruits of Citrus sinensis, Citrus reticulata, and Citrus paradisi, as well as its antimicrobial activity against strains of 79
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, among other pathogenic microorganisms (Khan et al., 2012). In addition to the Citrus genus, the Xylopia genus also stands out for its antioxidant and bactericidal activity. Costa et al. (2013) identified the microbiological, antioxidant and anti-tumor potential of the essential oils of Xylopia laevigata; Konan et al. (2009) highlight the antioxidant activity of the essential oil of Xylopia aethiopica, Tegang et al. (2017) identified an excellent antifungal and antioxidant potential of the essential oil of X. aethiopica with up to 72% free radical (DPH) scavenging highlighting the potential of species of this genus, and Wouatsa et al. (2014) identified moderate biological activity of the essential oil of X. aethiopica on Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, S. aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Raoultella planticola, and Salmonella typhimurium, among others. The potential of essential oils with antimicrobial, antiparasitic, antioxidant, immunomodulatory activity, among others, has been reported in the literature, which points to the benefits of their use as phytogenic additives in poultry feed (North et al., 2019; Krishan e Narang, 2014). Erhan and Bölükbaşı (2017) evaluated the benefits of using essential oil of lemon, orange, and bergamot peel as phytogenic additives obtaining promising results regarding performance, histomorphology of the jejunum and reduction of intestinal microbiota in broilers. Khattak et al. (2014) also evaluated the effect of a natural mixture of essential oil of basil, caraway, laurel, lemon, oregano, sage, tea, and thyme as a phytogenic additive in poultry feed obtaining an improvement in weight gain and carcass quality of broilers. Karadas et al. (2014) included a mixture of essential oils in chicken feed, including oleoresin from Carvacrol, Cinnamaldehyde and Capsicum, checking the antioxidant potential of these essential oils, improving liver function, and increasing the concentration of carotenoids and coenzyme Q10. Comparisons of research on the antioxidant and antimicrobial properties of essential oils of species of the genera Citrus and Xylopia lead to future research on the use of these natural products as alternatives as phytogenic additives to replace growth promoters while maintaining performance and quality of the animal product. In this sense, the objective of the present study was to determine the effects of adding essential oils from the fruits of C. sinensis and X. aromatica in broiler diets on performance, biometrics, biochemistry, and duodenal histomorphology in broilers from 1 to 14 days. 80
2. Material and methods
2.1. Extraction and chemical analysis of essential oils The fruits of X. aromatica were collected in a cerrado region in the municipality of Iporá - GO between the months of March to May 2017, while the residues of the fruits of C. sinensis were provided by the juice company Naturanja after pulp extraction. To obtain the essential oils, the fruits were crushed in a blender and submitted to the hydrodistillation process in a Clevenger-type apparatus for a period of 3 hours. Then, the hydrolate was stored in a freezer (- 20 °C) and after freezing the aqueous phase was separated from the organic phase, for further chemical analysis and biological tests. The analysis of the chemical constituents of the essential oil was carried out using a GCMS System (TQ8030 Shimadzu) in the Laboratory of Chemistry of Natural Products of the Federal University of São Carlos (UFSCar). Separation was performed on a fused‐silica capillary column RTX‐5MS (30 m × 0.25 mm id, 0.25 μm film thickness, Restek) using ultra‐high purity helium as a carrier gas at a flow rate of 3.0 mL/min. The mass spectrometer was operated in the electron impact mode (EI) at 70 eV, scanning at a range of 43–550 m/z. The ion source temperature was set at 230 °C. The separation data were analyzed using the GCMS Real Time Analysis® Software. The temperature was initially maintained at 60 ° C for 3 min, followed by an increase of 3 ° C/min until reaching 200 °C. Next, temperature was programmed to increase 15 °C/min until reaching 280 °C, which was maintained for 1 min. The apparatus settings were as follows: Injection temperature: 230 °C, detection temperature: 300 ° C, injection pressure: 57.4 KPa, Splitless ratio: 150, detection range of the mass spectrometer: 43-550 m/z; start time (cut time of the solvent): 3.0 min and flow 3 mL/min. The identification of the oil components was based on the Kovats retention index, calculated in relation to the retention times of a homologous series of n-alkanes (C-7 to C-40), and based on the fragmentation pattern observed in mass spectra by comparing them with the literature data (Adams, 2007) and the Nist spectra (NIST 2011).
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2.2. Biological Assay The experiment was carried out at the Poultry Sector of the Instituto Federal Goiano - Campus of Rio Verde and at the Animal Nutrition and Biochemistry and Animal Metabolism Laboratories from August to December of 2018. Before the arrival of the batch, the usual rules for both the shed and the batteries were obeyed. The period of cleaning and disinfection of the facilities (screens, curtains, floor, outdoor area, equipment) lasted seven days. Two days for cleaning and five days for the sanitary break (due the installation does not maintain intermittent production), with the spraying of disinfectant based on quaternary ammonia and glutaraldehyde.
2.2.1. Broilers farming One hundred eighty male day-old Cobb 500 chicks, with initial weight of ± 45.3 g, housed in galvanized wire cages with dimensions 0.90m x 0.60m x 0.45m were used. The experimental design was completely randomized with three treatments and six replications of 10 birds each. The treatments were: control - with corn and soybean meal (T1), corn, soybean meal and 200 ppm of C. sinensis essential oil (T2), corn, soybean meal and 200 ppm of X. aromatica essential oil (T3). The inclusion of 200 ppm of essential oils was defined after a bacteriological test. In each cage was placed a feeder and a gutter type drinking fountain. Poultry feed and water were provided freely throughout the experimental period. The light program was 24 hours, considering natural and artificial light. The diets were prepared in the Instituto Federal Goiano according to the phases: pre-initial (1 to 7 days) and initial (7 to 14 days) following the nutritional recommendations of Rostagno et al. (2017) (Table 1).
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Table 1. Centesimal composition and calculated nutritional levels of the diets: control, and with the addition of 200 ppm of essential oils of C. sinensis or X. aromatica. Ingredients (g/kg) Pre-initial Initial Yellow Corn 8,58% 55.3000 56.0200 Soybean meal 46% 39.3706 37.9300 Soybean oil 0.8000 1.7000 Limestone 2.2000 1.1200 Dicalcium phosphate 0.0648 1.2500 Premix Vit/Min 1.0000* 1.0000** DL- Methionine 0.2645 0.2200 L- Lysine 0.3000 0.2000 L- Threonine 0.1944 0.0700 Common salt 0.5058 0.4900 Total 100.0000 100.0000 Calculated levels Met. energy (Kcal/kg) 3000.00 3100.00 Crude protein (%) 25.31 24.30 Digestible lysine (%) 1.36 1.31 Digestible methionine (%) 0.55 0.53 Calcium (%) 1.01 0.91 Available phosphorus (%) 0.48 0.43 Sodium (%) 0.23 0.22 Analyzed composition Dry Matter (%) 92,44 91,88 Crude protein (%) 26,42 26,42 Crude fiber (%) 21,86 21,03 Ether extract (%) 6,66 7,01 *Premix 1 - Vitaminic Mineral (Nutritional levels per kilogram of product) –Methionine (Min): 290 g/kg, Iron (Min): 5,000 mg/kg, Copper (Min): 1,500 mg/kg, Manganese (Min): 14 g/kg, Zinc (Min): 12 g/kg, Iodine (Min): 28 mg/kg, Selenium (Min) 70 mg/kg, Vitamin A (Min): 1,500,000 IU/kg, Vitamin D3 (Min ): 500,000 IU/kg, Vitamin E (Min): 3,333 IU/kg, Vitamin K3 (Min): 250 mg/kg, Vitamin B1 (Min): 300 mg/kg, Vitamin B2 (Min): 1,000 mg/kg, Vitamin B6 (Min): 500 mg/kg, Vitamin B12 (Min) 3.333 mcg/kg, Niacin (Min): 6.667 mg/kg, Calcium Pantothenate (Min): 2000 mg/kg, Folic Acid (Min): 280 mg/kg Biotin (Min): 8.3 mg/kg, Choline Chloride (Min): 70 mg/kg. **Premix 2 - Vitaminic Mineral (Nutritional levels per kilogram of product) –Methionine (Min): 300 g/kg, Iron (Min): 6,000 mg/kg, Copper (Min): 1,850 mg/kg, Manganese (Min): 16.8 g/kg, Zinc (Min): 14.5 g/kg, Iodine (Min): 330 mg/kg, Selenium (Min) 84 mg/kg, Vitamin A (Min): 1,500,000 IU/kg, Vitamin D3 (Min ): 500,000 IU/kg, Vitamin E (Min): 3,600 IU/kg, Vitamin K3 (Min): 240 mg/kg, Vitamin B1 (Min): 300 mg/kg, Vitamin B2 (Min): 1,100 mg/kg , Vitamin B6 (Min): 500 mg/kg, Vitamin B12 (Min) 3,600 mcg/kg, Niacin (Min): 7,000 mg/kg, Calcium Pantothenate (Min): 2,000 mg/kg, Folic Acid (Min): 320 mg/kg Biotin (Min): 6 mg/kg, Choline Chloride (Min): 65 mg/kg. Inclusion of 200 ppm of X. aromatica and C. sinensis essential oils.
The average maximum and minimum temperatures and relative air humidity measured throughout the experiment are shown in Table 2.
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Table 2: Average temperature and relative air humidity inside the shed in each production phase. Phase Temperature (°C) Relative air humidity (%) Maximum Minimum Maximum Minimum Pre-initial 29.77 18.22 76.00 58.37 Initial 27.83 17.21 67.50 58.87
2.2.2. Performance evaluation Feed and poultry were weighed in the 1-7-day, 8-14-day and 1-14-days phases to assess weight gain, feed intake, feed conversion.
2.2.3. Morphometry of the Gastrointestinal Tract and Tibia On the 7th and 14th days, one bird from each repetition was separated for fasting and after about 8 hours euthanized by cervical dislocation to evaluate the biometrics of the digestive tract organs. At necropsy, the viscera that make up the gastrointestinal tract (GIT) were removed; These were weighed and measured according to the length of the GIT, as measured by the size of the GIT from the insertion of the esophagus into the oropharynx until the communication of the large intestine with the cloaca; Then, the weight of the organs was measured separately, from the esophagus plus crop; from the pro-ventricle plus gizzard (with remaining content); the weight of the pancreas, after its separation from the duodenal loop; small intestine weight (SI), portion comprising the end of the muscular stomach to the beginning of the caecum; large intestine weight (LI), represented by the weight of the caecum, colon, and rectum; liver weight, given by liver weight without gallbladder according to Minafra et al. (2007). Results were converted to relative weights according to equation 1: Relative Organ Weight (ROW) = (Organ Weight/Body Weight) x 100 Eq. 1 The tibial bones were cleaned from all adherent tissue, weighed on a precision scale, and their length and diameter measured with a digital caliper to determine the Seedor index (bone mass index). Results were converted to relative weights according to equation 2: Bone Mass Index (BMI) = Organ Weight/Organ Length Eq. 2
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2.2.4. Metabolizability apparent analysis After a period of adaptation of three days began the period of collection of excreta for five days. 1% ferric oxide was used as a fecal indicator in the rations corresponding to the first and last excreta collection to determine the beginning and end of collections. The excreta were collected in trays and stored in adequately identified plastic bags and stored in a freezer until laboratory analysis. The poultry feed and excreta were thawed, weighed, homogenized, and pre-dried in a forced circulation oven at 55°C. After equilibrium with the ambient temperature and humidity, the samples were again weighed to calculate the humidity. The excreta aliquots were ground in a Willey type mill using a 2 mm sieve for the analysis of dry matter (DM), crude protein (CP) and ether extract (EE), following the methodology of Silva and Queiroz (2002). The metabolizability calculations for determination of dry matter (DM), crude protein (CP) and ether extract (EE) are expressed in equations 3, 4 and 5.): DM (%) = ((DM feed – DM excreta) / DM feed) * 100 Eq. 3 CP (%) = ((CP feed – CP excreta) / CP feed) * 100 Eq. 4 EE (%) = ((EE feed – EE excreta) / EE feed) * 100 Eq. 5
2.2.5. Serum, liver and pancreas biochemical profile The biochemical evaluation of the serum was performed according to Minafra et al. (2010) with adaptations. The blood of the sacrificed animals was collected by cardiac puncture, centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes, and the serum was frozen for further analysis using commercial DOLES® kits. The levels of calcium (Ca), phosphorus (P), total proteins (TP), alkaline phosphatase (AP), triglycerides (T), cholesterol (Col), lipases (Lip), amylase (Am), and the enzymes, glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP) were evaluated. After slaughter, the liver and pancreas of the birds were removed and frozen for further biochemical analysis. One gram of each sample was ground and homogenized in 9 mL of distilled water. In the liver, the content of total proteins (TP), cholesterol (Col), triglycerides (T), and the enzymes glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP) were analyzed. While in the pancreas, the total protein content (TP), lipases (Lip) and amylases (Am) were evaluated, according to the methodology of Minafra et al. (2010), with commercial DOLES® kits. 85
2.2.6. Intestinal histomorphometry
The villi and crypts of the duodenum will also be evaluated microscopically after slaughter using methodology adapted from Almeida et al. (2016). Intestinal segments of approximately 4.0 cm length were carefully collected and washed immediately in distilled water, identified, stored in a 10% formaldehyde solution for 24 hours until the slides were made. For the assembly of the slides, the intestinal cuts were dehydrated in an increasing series of ethanol, diaphanized in xylol, and included in paraffin. Afterward, 6.0 μm thick multi-series cuts were made, placed on a glass slide, stained in hematoxylin-eosin, and covered with a glass coverslip. Histomorphometric analyses of the duodenal mucosa were performed using images obtained in 4 x magnifications with the aid of an optical microscope and analyzed using the Image-Pro Plus® Software. The studied variables were the height of the intestinal villi, depth of the crypts and the villus:crypt ratio. The villus measurements were made from the basal region, coinciding with the upper portion of the crypts up to the apex of the villi. The depth of the crypts was taken from the basal region of the villi to its delimitation with the muscular of the mucosa.
2.3. Statistical analysis The experiments were performed with three treatments and six replications, and the experimental design was completely randomized. Data were subjected to analysis of variance (ANOVA), and treatment means were evaluated by the Tukey test at 5% significance by SISVAR® statistical software (Ferreira, 2011).
3. Results 3.1. Chemical composition of essential oils The hydrodistillation of the fruits of X. aromatica and C. sinensis provided translucent oils, less dense than water, with an average yield of 1.4% ± 0.01 and 0.5% ± 0.01. In the essential oil of the fruits of X. aromatica the main compounds found were Sylvestrene (63.56%), α-Pinene (18.00%), β-Pinene (10.88%), Myrcene (2.73%), α- 86
Phellandrene (2.20%) and Sabinene (2.00%), while in the essential oil of the fruits of C. sinensis seven chemical compounds were identified, with the majority being Limonene (95.64%) and Myrcene (1, 86%) (Table 3).
Table 3: Chemical constituents of the essential oil of the fruits of X. aromatica (OEX) and C. sinensis (OEC).
R OEX1 OEC2 Pico t Compound RI exp.* RI lit.** (min) (%) (%) 1 5.516 1R-(+)-α-Pinene 0.17 - 927 - 2 5.716 α-Pinene 18.00 0.53 934 932 3 6.781 Sabinene 2.00 0.32 974 969 4 6.901 β-Pinene 10.88 - 979 974 5 7.239 Myrcene 2.73 1.86 992 988 6 7.701 α-Phellandrene 2.20 0.24 1007 1002 7 8.350 ο-Cymene 0.46 - 1025 1022 8 8.505 Sylvestrene 63.56 - 1030 1030 9 13.471 Limonene - 95.64 1036 1034 10 16.202 Linalol - 0.55 1096 1095 11 20.608 α-Terpineol - 0.87 1189 1186 1 OEX = essential oil of Xylopia aromatica. 2 OEC = essential oil of Citrus sinensis. * = retention index calculated using the Van den Dool and Kratz equation. ** = Literature retention index (ADAMS, 2007) based on the Van den Dool and Kratz equation.
3.2. Performance analysis
The performance results of the broilers fed in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days and period total to experiment of 1 to 14 days with diets containing 200 ppm of X. aromatica and C. sinensis essential oils are shown in Table 4. The supplementation of X. aromatica and C. sinensis essential oils in the diet of the broilers did not result in a difference in weight gain, feed consumption and feed conversion.
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Table 4. Performance of broilers fed in the period from 1 to 7 days, 8 to 14 days and 1 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM WG (g) 0.105 0.107 0.100 0.078 0.0020 FCP (g) 0.124 0.123 0.120 0.762 0.0035 FCV 1.176 1.153 1.200 0.715 0.0399 Initial phase (8-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM WG (g) 0.278 0.265 0.270 0.433 0.0065 FCP (g) 0.347 0.341 0.344 0.762 0.0054 FCV 1.251 1.289 1.275 0.462 0.0213 Overall (1-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM WG (g) 0.406 0.407 0.411 0.195 0.0021 FCP (g) 0.506 0.520 0.501 0.502 0.0118 FCV 1.246 1.281 1.220 0.388 0.0304 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means, WG: weight gain, FCP: feed consumption, and FCV: feed conversion.
3.3. Nutrient metabolism analysis
The metabolism coefficients of crude protein, ether extract, and dry matter in broilers fed diets containing 200 ppm of the C. sinensis and X. aromatica essential oils had no significant difference in the pre-initial phase. However, in the initial phase, the C. sinensis and X. aromatica essential oils resulted in a higher metabolism coefficient of dry matter, crude protein, and ether extract than control treatment (p < 0.05) (Table 5).
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Table 5: Metabolism coefficients of dry matter, crude protein, and ether extract in broilers fed diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM MCCP 69.41 75.10 74.43 0.359 2.912 MCDM 65.19 66.04 68.30 0.904 5.058 MCEE 70.95 78.31 78.86 0.1094 2.646 Initial phase (8-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM MCCP 81.11 b 90.87 a 91.46 a 0.0023 0.865 MCDM 79.57 b 88.28 a 88.63 a 0.0001 0.095 MCEE 84.10 b 88.45 a 87.82 a 0.0050 0.765 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM standard error of means, MCCP: Metabolism coefficient of crude protein, MCDM: Metabolism coefficient of dry matter and MCEE: Metabolism coefficient of ether extract.
3.4. Morphometry of the gastrointestinal tract and tibia
The results of the gastrointestinal tract morphometry are shown in Table 6. There was also no significant difference between the biometrics of the organs that make up the gastrointestinal tract, except for the weight of the Bursa of Fabricius (Table 6). At seven days, the Bursa of Fabricius of broilers fed with control treatment and C. sinensis essential oil were larger than the Bursa of Fabricius of broilers fed with X. aromatica essential oil. At 14 days, the Bursa of Fabricius of the broilers fed with control treatment was larger than the Bursa of Fabricius of broilers fed with the essential oils of C. sinensis and X. aromatica essential oils.
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Table 6: Biometric evaluation of the organs of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables X. Control C. sinensis p-value SEM aromatica Liver 3.985 3.888 3.932 0.795 0.100 Gizzard 7.464 7.766 7.491 0.763 0.318 Pancreas 0.692 0.673 0.648 0.585 0.029 LI 1.365 1.273 1.194 0.062 0.046 SI 8.371 8.010 7.970 0.580 0.294 GITW 22.750 23.114 23.056 0.921 0.680 EPCP 1.329 1.283 1.269 0.586 0.042 Bursa 0.264 a 0.244 a 0.177 b 0.050 0.007 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables X. Control C. sinensis p-value SEM aromatica Liver 3.405 3.435 3.416 0.986 0.132 Gizzard 5.648 5.071 5.109 0.103 0.197 Pancreas 0.549 0.532 0.528 0.660 0.016 LI 1.021 0.978 0.942 0.590 0.053 SI 5.434 5.512 5.497 0.962 0.211 GITW 16.979 16.463 16.390 0.506 0.380 EPCP 0.830 0.833 0.848 0.926 0.034 Bursa 0.648 a 0.485 b 0.481 b 0.050 0.025 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means, LI: Large Intestine, SI: Small Intestine, GITW: Gastrointestinal Tract Weight, EPCP: Esophagus and Crop.
In the evaluation of tibial morphometry (Table 7), there was no significant difference between treatments for weight, diameter, and bone mass index at 7 and 14 days.
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Table 7: Bone biometric evaluation of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM BMIT (g/mm) 72.46 70.90 70.74 0.757 0.0017 DT (mm) 3.61 3.34 3.68 0.355 0.1634 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM BMIT (g/mm) 152.01 141.85 148.14 0.568 0.0006 DT (mm) 4.74 4.99 4.99 0.648 0.2113 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means, BMIT: bone mass index of the tibia, DT: diameter of the tibia.
3.5. Serum, liver and pancreas biochemical profile The results of the serum biochemical profile of the pre-initial and initial phases are shown in Table 8. There was no significant difference between treatments for the content of phosphorus, calcium, total proteins (TP), alkaline phosphatase (AP), cholesterol, and amylase in the pre-initial phase (Table 8). However, in this phase, there was a significant reduction in the content of triglycerides, glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP) in blood serum in the treatments with C. sinensis and X. aromatica essential oils, when compared to the control treatment. Also, in the serum, the levels of lipases were lower in the treatment with C. sinensis than the treatment with X. aromatica essential oil and control. In the initial phase, there was no significant difference in the cholesterol content, and in the enzymes alkaline phosphatase (AP), glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP). However, in this initial phase, there was an increase in serum phosphorus levels for birds fed with C. sinensis essential oil and a reduction in calcium levels in birds fed with X. aromatica essential oil. In birds fed with X. aromatica essential oil, there was a significant increase in the total protein content (TP) and a reduction in the lipase and amylase content in the blood serum. Also, birds fed with C. sinensis and X. aromatica essential oils had a significant reduction in the content of triglycerides when compared to the control treatment.
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Table 8: Serum biochemical profile of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM Phosphorus 6.95 6.97 6.52 0.141 0.162 Calcium 6.38 6.74 6.39 9.030 0.240 TP 2.62 2.73 2.80 0.265 0.290 Cholesterol 125.01 123.30 118.64 0.580 4.350 Triglycerides 180.42 a 110.89 b 102.51 b 0.000 2.718 Lipase 171.17 a 89.68 b 176.22 a 0.000 3.49 Amylase 642.20 634.96 616.50 0.094 7.639 AP 68.18 65.54 67.40 0.338 1.229 TGP 34.93 a 16.65 b 17.08 b 0.000 0.701 TGO 141.05 a 106.72 b 101.14 b 0.002 6.026 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM Phosphorus 6.12 b 6.97 a 6.12 b 0.008 0.174 Calcium 6.93 a 6.99 a 6.20 b 0.020 0.180 TP 2.66 b 2.79 b 3.25 a 0.002 0.091 Cholesterol 197.33 173.80 171.44 0.140 9.223 Triglycerides 179.75 a 110.36 b 116.49 b 0.000 2.370 Lipase 263.62 a 276.87 a 234.33 b 0.000 3.873 Amylase 624.82 a 585.74 a 427.57 b 0.000 12.14 AP 66.54 66.42 66.44 0.209 0.049 TGP 18.10 16.06 16.76 0.081 0.574 TGO 109.23 107.66 103.68 0.155 1.906 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means, total proteins (TP), alkaline phosphatase (AP), triglycerides (T), and the enzymes glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP).
The results of the biochemical analysis of the liver are shown in Table 9. At seven days of age, higher levels of total proteins, triglycerides, and glutamate-pyruvate transaminase enzyme were observed in the liver of broilers fed the control diet than the broilers fed with essential oils. In the pre-initial phase, there was a significant reduction in the cholesterol (Col) content in the liver of broilers fed with X. aromatica essential oil. In the initial phase, birds fed a diet containing C. sinensis and X. aromatica essential oil had lower cholesterol content than birds fed with the control diet, and birds 92 fed with C. sinensis essential oil had a significant reduction in the content of triglycerides. The other parameters analyzed were not significantly influenced.
Table 9: Biochemical analysis in the liver of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM TP 3.33 a 2.63 b 2.89 b 0.000 0.077 Cholesterol 392.06 a 387.86 a 366.18 b 0.000 2.087 Triglycerides 298.18 a 240.51 b 232.84 b 0.000 2.508 TGP 63.10 a 41.03b 43.21b 0.000 1.329 TGO 209.01 198.52 210.82 0.150 16.960 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM TP 2.80 2.74 3.01 0.053 0.012 Cholesterol 376.1 a 364.60 b 364.99 b 0.000 1.538 Triglycerides 215.46 a 198.80 b 213.72 a 0.000 1.971 TGP 41.84 42.12 43.04 0.721 1.084 TGO 182.55 197.90 192.76 0.171 5.374 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means, Total Proteins (TP), Cholesterol, Triglycerides, glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP).
In the pancreas, the analysis of the total protein and lipase content in the pre- initial and initial phases had no significant difference between treatments (Table 10). In the initial phase, higher levels of pancreatic amylase were observed in broilers fed with 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica than broilers fed with the control diet.
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Table 10: Biochemical analysis of the pancreas of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables X. Control C. sinensis p-value SEM aromatica Total proteins 3.22 3.09 3.16 0.099 0.038 Lipase 163.09 152.90 158.76 0.797 10.626 Amylase 319.82 305.28 312.72 0.519 8.692 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables X. Control C. sinensis p-value SEM aromatica Total proteins 3.24 3.29 3.21 0.621 0.054 Lipase 148.07 137.02 132.88 0.100 4.597 Amylase 308.57 b 332.64 a 331.08 a 0.047 6.559 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means
3.6. Intestinal histomorphometry The results of the height of the villi, depth of the crypts and villi:crypt ratio of the duodenum of broilers from 1 to 14 days old are shown in Table 11. In the pre-initial phase, there was no significant difference in the height of the villi of the duodenum, but the depth of the crypts was significantly greater in the control treatment than in the other treatments, which significantly reduced the villus:crypt ratio for the control diet. In the initial phase, the height of the villi of the duodenum was significantly higher in broilers fed with C. sinensis and X. aromatica essential oils, respectively, while the depth of the crypts was lower in these treatments than the broilers fed with the control diet. However, there was no significant difference in the villus:crypt ratio between treatments at this stage.
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Table 11: Villus height, crypt depth, and villus:crypt ratio of the duodenum of broilers in the period from 1 to 7 days and 8 to 14 days with diets containing 200 ppm of C. sinensis and X. aromatica essential oils. Pre-initial phase (1-7 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM Villus (µm) 529.82 513.36 511.04 0.485 8.745 Crypt (µm) 132.18 a 103.44 b 99.69 b 0.000 2.783 Villus:crypt (µm) 4.02 b 4.98 a 5.13 a 0.000 0.122 Initial phase (1-14 days) Treatments Probabilities Variables Control C. sinensis X. aromatica p-value SEM Villus (µm) 501.99 b 557.72 a 536.72 a 0.017 7.89 Crypt (µm) 76.98 b 88.09 a 85.88 a 0.005 1.966 Villus:crypt (µm) 6.55 6.51 6.79 0.733 0.261 Means on the same row with different letters (a, b, c) are significantly (P < 0.05) different SEM: standard error of means
4. Discussion The C. sinensis essential oil has Limonene as the major compound and the essential oil of species of the Xylopia genus has the major compounds as Sylvestrene, α- Pinene and β-Pinene. These major compounds were also identified by other authors for species of the genus Citrus (Khan et al., 2012) and Xylopia (Tegang et al., 2017; Moura et al., 2016), both from the Rutaceae family. The species of this family are extensively studied, mainly the Citrus genus, which includes lemons, oranges and tangerines, whose major compound is Limonene (Martins et al., 2017; Guo et al., 2018). As for the genus Xylopia, it is a little less studied, as they comprise less known wild plants, but which present among the major compounds of its fruits α-Pinene, β-Pinene and Myrcene (Costa et al., 2013; Peres et al., 2020). Despite presenting similar compounds, in none of these studies was the presence of Sylvestrene, the major compound identified here mentioned. However, Nogueira et al. (2014) identified Sylvestrene among the major compounds of the essential oil of the leaves of Zanthoxylum caribaeum (Rutaceae), and Liu et al. (2017a) also identified the compound Sylvestrene among the majority in the essential oil of Z. Bungeanum (Rutaceae) from different regions of China. In this study, supplementation with C. sinensis and X. aromatica essential oils did not present significant results on animal performance. Similar results were reported 95 by Zamora et al. (2017), who found that there was no significant effect on the performance of broiler treated with essential oil of Mexican oregano at 7, 14 and 21 days of the experiment. However, several authors report the positive impact of essential oils on broiler performance (Ghozlan et al., 2017; Adaszyńska-Skwirzyńska & Szczerbińska, 2017; Zeng et al., 2015; Saleh et al., 2014). Some authors observed that supplementation to the diet of broilers with essential oils of orange, lemon, and bergamot peel significantly improved the feed conversion rate (Erhan & Bölükbaşi, 2017). Al-Yasiry et al. (2017) found better weight gain in birds fed Boswellia serrataresina essential oil (Indian tree popularly known as frankincense) from 1 to 42 days. Chalghoumi et al. (2013) had no significant effect in the initial phase (8-14 days) in treatments with essential oil of garlic and cinnamon but highlighted an improvement in performance after 35 days of the experiment. Wade et al. (2018) reported an improvement in the performance of broilers fed with thyme essential oil, reporting greater gain in body weight, better feed conversion, viability, and profit in the production of broilers. El-Latif et al. (2013) obtained improvement in the performance of broilers fed essential oil of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Allium sativum (garlic) for 42 days, in addition to observing a stimulation of innate immunity by increasing the phagocytic capacity of heterophile. Differentiation in feed consumption would be expected, as essential oils stimulate appetite and release digestive enzymes, in addition to increasing nutrient absorption by increasing villi and decreasing crypts (Chowdhury et al., 2018). However, in this test, there was no evidence of the effects of the essential oils of C. sinensis and X. aromatica and, consequently, of their major compounds on the performance of birds. The metabolization of nutrients showed a significant effect at 14 days, although the feed consumption was not affected, there was greater use of nutrients. According to Catalan et al. (2012) and Yang et al. (2010), essential oils improve palatability, stimulating appetite and increasing food intake, influencing the speed of passage of food from the gastrointestinal tract, increasing the secretion of saliva, bile and mucus secretion, and increasing enzyme activity. The X. aromatica essential oil has among its major chemical compounds Sylvestrene, α-Pinene, and β-Pinene while the C. sinensis essential oil had an abundance of limonene, compounds that may have influenced both palatability and hydrolysis of nutrients present in the feed, however, they did not 96 influence the animal performance. According to Barbosa et al. (2008), the metabolism coefficient reflects the digestibility of nutrients; that is, an increase in this coefficient indicates greater absorption of nutrients from a diet. In this sense, it is possible to conclude that there was a greater absorption of these nutrients in diets with essential oils concerning the control group in this phase of animal development, at 14 days of age. Amad et al. (2011) observed that the metabolizability of crude protein, ether extract, calcium, and phosphorus was significantly higher in birds fed diets containing essential oil of thyme and anise than the control group. According to Borsatti et al. (2016) and Baurhoo et al. (2009), one of the reasons why essential oils improve nutrient absorption can be justified by the fact that essential oils reduce the bacterial load by acidifying the intestinal lumen, and thereby reduce the competition of intestinal bacteria with the host for energy supplying nutrients. For this reason, in this work, it was verified that better metabolism coefficients of crude protein, dry matter, and ether extract when the C. sinensis and X. aromatica essential oils were added. The addition of the C. sinensis and X. aromatica essential oils in the diet of broilers did not influence the biometrics of the gastrointestinal tract. The literature data on the effect of essential oils on the biometrics of the gastrointestinal tract of birds is still very controversial. Contrary to the present study, Denli et al. (2004) found that quails that received thyme essential oil as a phytogenic additive had a larger intestine length and weight than the control treatment. Çabuk et al. (2006) reported that the blend of essential oils from Origanum sp., Laurus nobilis L., Salvia triloba L., Myrtus communis, Foeniculum vulgare, Citrus sp. did not result in a significant difference in organ biometrics, whereas Amad et al. (2011) observed an increase in the relative weight of the liver in broilers from the inclusion of essential oils. Kiczorowska et al. (2016) found a reduction in proventriculus and gizzard, and an increase in the length of the duodenum in broilers fed a diet supplemented with 3% of Boswellia serrata, resin, which reflected in better use of nutrients. Contradictorily, Domingues et al. (2016) found no effects between treatments with pepper oil on the relative weight of the organs, which is also in agreement with the results of the present study. The size of the bursa of birds fed with X. aromatica essential oil was smaller than birds fed with the control diet at seven days of age. At 14 days, birds fed diets containing C. sinensis and X. aromatica essential oils had bursa with small size, 97 showing that the essential oil can have a positive effect on animal immunity, acting on the reduction of lymphocyte production. Knowledge of the typical morphology of primary and secondary lymphoid organs and tissues is an essential morphometric analytical tool for determining the intensity of the immune response in these locations (Eto et al., 2015). The Bursa of Fabrícius is a lymphoepithelial organ found only in birds. It is a rounded pouch located just above the cloaca and reaches its largest size about one or two weeks after hatching and then decreases as the bird ages; it is hardly identified in older birds (Pelícia et al., 2015; Tizard, 2009; Oláh & Vervelde, 2008, Glick, 1956). According to Pelícia et al. (2015), the Bursa of Fabrícius is a primary lymphoid organ that functions as a place for maturation and differentiation of the cells that make up the antibody-producing system such as B and T lymphocytes, despite the involution with age. Histomorphometric studies of the Bursa of Fabricius in birds subjected to stress conditions concluded that stress affects the development of bursa with increasing size; thus, the weight of lymphoid organs such as the Bursa of Fabricius for example, reflects the body's ability to produce lymphoid cells during the immune response (Ribeiro et al., 2008). The literature presents different data regarding the effects of essential oils on lymphoid organs. Mohammad et al., (2013) evaluated the addition of Satureja khuzistanica essential oil in the diet of broiler chickens, and noted that there was no significant difference in the development of lymphoid organs such as Bursa, thymus, and spleen at 21 and 42 days, in the different doses tested and in the control treatment. El-Latif et al. (2013) also found no significant difference in the weight of the Bursa between control and treatments containing different doses of essential oil of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Allium sativum (garlic). Yang et al. (2018) found that the mixture of organic acids and essential oil had no significant effect on the performance and size of Bursa of the 21- and 42-day old broiler. Contradictorily, Awaad et al., (2010) evaluated the immunostimulating effect of essential oil of peppermint and eucalyptus added to water at a dose of 0.25 mL/L and found an increase in the weight of Bursa of chickens treated with these essential oils concluding that they are capable of implementing an immune response in broilers. 98
Bone mineral density can be measured by the Seedor index that represents the weight:length ratio of the organ (Almeida Paz et al., 2009). The Seedor index of the tibia and its diameter was not influenced by the diet containing C. sinensis and X. aromatica essential oils. Murakami et al. (2009) evaluated the effect of adding flaxseed oil to the feed of broilers and observed a positive influence of these on the bone development of the animal, verifying greater mineralization of the femur and tibia bones. It is known that the addition of lipids in broiler diets promotes a significant reduction in the rate of bone calcification (Duarte, 2007). However, there are no records in the literature on the influence of essential oils and their major compounds on bone metabolism. Calcium (Ca) and phosphorus (P) ions are essential to maintain animal homeostasis in the 2:1 ratio and are related to bone formation (Andriguetto et al., 1990). However, the 2:1 ratio was not observed in this experiment, not even for the control treatment. In this experiment, at 14 days, there was a significant differentiation for the essential oil of C. sinensis for the levels of calcium and phosphorus, a result not reflected in the differentiation of bone biometrics. According to Cardoso-Teixeira (2018), monoterpenes such as limonene have vasorelaxant activity due to electromechanical coupling, which promotes the influx of Ca2+ ions into the intracellular medium, which may have reflected in the imbalance of these ions. The biochemical constituents of blood, liver, and pancreas reflect the physiological responses resulting from internal (age and sex) and external (food and environment) factors, providing information on the metabolism and health of the animals; thus the feed consumption and diet composition affect blood, enzymatic and metabolic parameters (Yari et al., 2014). Thus, the present study analyzed the biochemical parameters of blood, liver, and pancreas, which revealed the animals' metabolic response to the diet supplemented with C. sinensis and X. aromatica essential oils. The protein concentration in birds consists of 40 to 50% of albumin, in addition to proteins of transport and coagulation, enzymes and hormones produced in the liver, and immunoglobulins synthesized by B lymphocytes and plasma cells (Campbell, 2007). This parameter was observed in the blood of broilers fed with X. aromatica essential oil at 14 days of age, which had levels of total proteins higher than those of the 99 control diet. As essential oils can have an immunomodulatory effect, a stimulus to the immune system can increase the bird's ability to synthesize antibodies, represented by immunoglobulins, which would lead to an increase in serum levels of proteins such as albumin, alpha globulins (1 and 2), beta globulins, gamma globulins, among others (Campbell, 2007; Fudge, 2000;). The primary lipids present in the blood are triglycerides and cholesterol. Triglycerides are an essential source of energy for the body and the main lipids in adipose tissue and circulate through the blood of the intestine to adipose tissues, where they are stored to supply energy to the muscles during fasting periods (Hochleithner, 1994). Both cholesterol and triglycerides, as they are insoluble in the blood, need an adjuvant to transport them in the bloodstream, such as HDL (High Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein), IDL (Intermediate Density Lipoprotein), VLDL (Very Low Density Lipoprotein) and chylomicrons. VLDLs are synthesized in the liver and transport triglycerides from the liver to peripheral tissues. LDL and IDL are synthesized in plasma by the action of lipoprotein lipase. As the VLDL deposit their triglycerides, there is an increase in density due to the release of triacylglycerol fatty acid. These fatty acids enter the cell where they are re-esterified for storage or are metabolized for energy. The glycerol of triglyceride returns to the liver, where it is metabolized (Moura & Melo, 2018; Rader & Hobs, 2017). Therefore, the concentration of circulating triglycerides reflects the balance between its intestinal absorption, its synthesis, and secretion in hepatocytes, and its absorption in adipose tissue, influenced by the fat content in the diet and the production of hormones (Traesel et al., 2011; Lassen & Fettman, 2007). In this work, triglycerides in blood serum were reduced in treatments with C. sinensis and X. aromatica essential oils, at 7 and 14 days, as well as in the liver at seven days, being a good indicator of animal health. Another indication of the animal's health was verified with the reduction of cholesterol in the liver of chickens fed with essential oils of C. sinensis and X. aromatica at 14 days. The use of natural compounds as essential oils in the feed can lead to hypocholesterolemia, by inhibiting the regulatory enzyme of cholesterol synthesis, 3- hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, produced in the liver (Moura & Melo, 2018; Elson et al., 1989). The inhibition of cholesterol synthesis 100 requires two regulators that modulate HMG-CoA reductase activity, LDL-derived cholesterol, and non-steroidal products derived from mevalonic acid (Moura & Melo, 2018; Goldstein & Brown, 1990). According to Case et al. (1995) and Lee et al. (2004), the active principles of some essential oils like Timol, Carvacrol, and Borneol can cause hypocholesterolemia in broilers inducing non-steroidal regulatory products like mevalonate that inhibit HMG-CoA reductase. The mechanism of action of limonene has been described by Peffley & Gayen (2003), who report its potential to inhibit 70% of HMG-CoA reductase at a post-transcriptional level, thereby interfering with cholesterol synthesis. Furthermore, according to Crowell & Gould (1991) limonene is metabolized in the liver and transformed into perillyl alcohol, perillyl aldehyde, and perillyl acid, all of which can prevent protein isoprenylation by interfering with the isoprenoid pathway. These data justify the benefits of adding the essential oil of C. sinensis rich in Limonene and of X. aromatica in the feed of broilers. However, no reports were found in the literature on the mechanism of action of the major compounds of essential oil of X. aromatica. Literature data on the effects of natural products such as essential oils on biochemical parameters are very different. The data obtained here corroborate the results of Silva et al. (2017), who found a reduction in cholesterol and triglycerides in quail eggs fed 0.5% saffron (Curcuma longa). Gerzilov et al. (2011) also indicated a significant reduction in the concentrations of triglycerides and total cholesterol in the blood of ducks fed a mixture of herbs found a reduction in cholesterol and triglyceride levels with the addition of turmeric in quail diets at doses starting from 0.05g/100g of feed, highlighting the ability to inhibit the synthesis of triglycerides in liver cells. According to the authors, the expression of genes involved in energy metabolism may have been influenced by turmeric, resulting in reduced expression, decreasing the accumulation of fats in the blood and tissues, with decreased intracellular levels of lipids (Allappat & Awad, 2010; Budiman et al. 2015). Domingues et al. (2016) also found a reduction in triglyceride levels in broilers fed with Piper cubeba. Manan et al. (2012) observed a decrease in triglyceride levels when supplementing the diet of broilers with medicinal plants. Contradictorily, some authors have not verified the effect of rosemary and garlic essential oils on broiler performance, besides causing an increase 101 in serum triglyceride levels, total cholesterol, low density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL) (El-Latif et al., 2013). In this experiment, blood lipase levels were lower at seven days in broilers fed with essential oil of C. sinensis, which was not observed at 14 days. In this initial phase, the levels of lipase and amylase were slightly lower in broilers fed with essential oil of X. aromatica than broilers fed with other treatments. However, these variations were not observed in the biochemical analysis of the pancreas. In broilers, essential oils can also stimulate the activity of certain digestive and pancreatic enzymes (Jang et al., 2007). Another explanation for the increase in enzyme activity and pancreatic secretion would be the increase in the relative weight of the pancreas that these oils could produce (Oetting et al., 2006; Jang et al., 2007). However, such a change was not observed in the present study. The levels of the enzymes glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP) in the blood were lower in broilers fed with essential oils of C. sinensis and X. aromatica than broilers fed with control diet at seven days, a result that was not observed at 14 days. In the liver, only the levels of glutamate- pyruvate transaminase (TGP) were lower in broilers fed with essential oils of C. sinensis and X. aromatica than broilers fed with control diet at seven days. The enzymes glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) and glutamate-pyruvate transaminase (TGP) are essential in the diagnosis of liver damage caused by drugs or infections, since after these events several enzymes, including aminotransferases, leak from the injured cells and pass into the blood (Willard et al., 1993). However, these lesions were not observed in the present study. Borsa et al. (2006) defined the following values for glutamate-pyruvate transaminase (TGP) in serum: 2-13 and 9-22 (U/dL) for birds at 7 and 14 days, respectively, while Minafra et al. (2008) found values of 203-267 (U/dL) at seven days, 251-375 (U/dL) at 14 days for glutamate-oxaloacetate transaminase (TGO) levels, and values around 73.3-79.5 (U/dL) at seven days, 72.2-75.6 (U/dL) at 14 days for glutamate-pyruvate transaminase levels in the liver tissue of chickens fed diets supplemented with glutamic acid and vitamin K, which reveals divergent results regarding the biochemical parameters of normality for this enzyme in liver tissue. In another study, the addition of a mixture of essential oils containing Timol and Carvacrol in the diet of ducks also did not change the biochemical parameters regarding the levels 102 of total proteins, glycemia, calcium, triglycerides, cholesterol, and the enzymes glutamate-oxaloacetate transaminase and glutamate-pyruvate transaminase, but, significantly improved phagocytic activity when compared to control (El-Katcha et al., 2017). In this study, the addition of the C. sinensis and X. aromatica essential oils to the broiler feed positively influenced the intestinal health of the animals, promoting an increase in the height of the villi and depth of the crypts, mainly in the initial phase of development of the animals, which evidences the maintenance of the intestinal integrity of the animal. According to Kuzmuk et al. (2005), the height of the villi and the depth of the crypts are considered indicators of proper intestinal development. The results found in the present study corroborate with the literature data regarding the effect of essential oils on the intestine histomorphometry of broilers. Basmacioğlu-Malayoğlu et al. (2016) also found greater villus height and less depth in the ileum crypts of 21- and 42-days old broilers fed with essential oil of oregano (Origanum onites), cloves (Syzygium aromaticum) and cumin (Cuminum cyminum). Liu et al. (2017) found the greater height of villi and depth of crypts in the jejunum of chickens fed with a mixture of organic acids and essential oil at 42 days of age. Yang et al. (2018) also found greater villus height and depth of the duodenal crypts of birds fed with a mixture of sorbic acid, fumaric acid and thymol at 42 days of age, highlighting the potential of using essential oils and their active principles in improving the health of birds. The results suggest that the essential oils of C. sinensis and X. aromatica in the tested dose (200 ppm/kg of feed) can be used in diets for broilers up to 14 days of age, without impairing performance, in addition to improving digestibility of feed nutrients, reduce triglyceride levels, as well as provide stimulate the immune system of broilers.
5. Acknowledgment The authors are grateful to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), Universidade Federal de Goiás (UFG), Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano (IF Goiano) for the financial support.
6. Conflict of interest None. 103
7. Ethical approval All procedures were approved by the Animal Use Ethics Committee of the Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano, Campus of Rio Verde, Brasil (n° 5622220718) and carried out following the guidelines for the use of research animals.
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CAPÍTULO 3 MICROBIOTA INTESTINAL DE FRANGOS DE CORTE ALIMENTADOS COM RAÇÕES CONTENDO ÓLEOS ESSENCIAIS DE Citrus sinensis E Xylopia aromatica
Resumo A microbiota intestinal de frango de corte caracteriza-se pela comunidade de micro- organismos benéficos e prejudiciais que contribuem, respectivamente, para melhor aproveitamento de nutrientes, manutenção da integridade intestinal, auxílio à resposta imune e predisposição à ocorrência de lesões intestinais, encurtamento das vilosidades, afetando absorção de nutrientes, além de favorecer a colonização de microrganismos patogênicos. Neste sentido, o uso de óleos essenciais em substituição aos antibióticos promotores de crescimento na alimentação de frangos de corte são excelente alternativa, uma vez que tais aditivos podem explicitar atividade antimicrobiana e favorecer a relação microbiota/hospedeiro. Portanto, objetivou-se descrever a microbiota intestinal de frangos de corte alimentados com óleos essenciais de Citrus sinensis e Xylopia aromatica. Foram avaliados três tratamentos denominados T1 (dieta controle, a base de milho e farelo de soja), T2 (T1 + 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis) e T3 (T1 + 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica), com seis repetições de 10 aves cada, totalizando 180 pintinhos da linhagem Cobb. Aos sete e aos 14 dias de idade, uma ave por repetição foi eutanasiada (n=6), por deslocamento cervical, para a coleta do conteúdo intestinal do íleo. A identificação de bactérias nas amostras foi realizada utilizando-se amplificação de alto desempenho com os primers específicos da região das regiões V3/V4 do gene 16S rRNA. Dentre as unidades taxonômicas operacionais (OTUs) identificadas, o filo predominante foi Proteobacteria seguido por Firmicutes no conteúdo ileal das aves aos sete e aos 14 dias de idade e em todos os tratamentos. A classe microbiana mais comum foi Gammaproteobacteria compreendendo principalmente organismos da ordem Pseudomonadales em todos os tratamentos. Dentre as principais espécies identificadas nas aves de sete dias de idade destacam Lactobacillus salivarius, Hydrocarboniphaga effusa e Acinetobacter lwoffii, em aves alimentadas com ração controle e ração contendo óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica, respectivamente. Aos 14 dias de idade a espécie de maior frequência no 116 conteúdo ileal das aves, em todos os tratamentos, foi Pseudomonas putida. Observou-se que ocorreu redução da população microbiana nesta fase de desenvolvimento. Portanto, conclui-se que os óleos essenciais de C. sinensis e de X. aromatica, adicionados às rações de frangos de corte, podem ser utilizados como aditivos fitogênicos moduladores da microbiota intestinal das aves. Palavras chave: Aditivos fitogênicos, Saúde intestinal, Modulação microbiana.
Abstract The intestinal microbiota of broiler chicken is characterized by the community of beneficial and harmful microorganisms that contribute, respectively, to better use of nutrients, maintenance of intestinal integrity, aid to the immune response and predisposition to the occurrence of intestinal lesions, shortening of the villi, affecting nutrient absorption, besides favoring the colonization of pathogenic microorganisms. In this sense, the use of essential oils to replace antibiotics that promote growth in the broiler feed is an excellent alternative, since such additives may explain antimicrobial activity and favor the microbiota / host relationship. Therefore, the objective was to describe the intestinal microbiota of broilers fed with essential oils of Citrus sinensis and Xylopia aromatica. Three treatments called T1 (control diet, based on corn and soybean meal), T2 (T1 + 200 ppm of essential oil of C. sinensis) and T3 (T1 + 200 ppm of essential oil of X. aromatica) were evaluated, with six replicates of 10 birds each, totaling 180 chicks of the Cobb strain. At seven and 14 days of age, a bird by repetition was euthanized (n = 6), by cervical dislocation, to collect the intestinal content of the ileum. The identification of bacteria in the samples was carried out using high performance amplification with the specific primers of the region of the V3 / V4 regions of the 16S rRNA gene. Among the operational taxonomic units (OTUs) identified, the predominant phylum was Proteobacteria followed by Firmicutes in the ileal content of birds at seven and 14 days of age and in all treatments. The most common microbial class was Gammaproteobacteria, comprising mainly organisms of the order Pseudomonadales in all treatments. Among the main species identified in the seven- day-old birds stand out Lactobacillus salivarius, Hydrocarboniphaga effusa and Acinetobacter lwoffii, in birds fed with control ration and ration containing essential oil of C. sinensis and X. aromatica, respectively. At 14 days of age, the most frequent 117 species in the ileal content of birds, in all treatments, was Pseudomonas putida. It was observed that there was a reduction in the microbial population at this stage of development. Therefore, it is concluded that the essential oils of C. sinensis and X. aromatica, added to broiler diets, can be used as phytogenic additives that modulate the intestinal microbiota of birds. Keywords: Phytogenic additives, Intestinal health, Microbial modulation.
1. Introdução A microbiota intestinal de frango de corte representa uma grande e complexa comunidade de microorganismos especializada e adaptada às condições físico-químicas, à fisiologia do hospedeiro e aos nutrientes disponíveis no habitat específico (APAJALAHTI & VIENOLA, 2016). A microbiota benéfica é composta por bactérias facultativas (aeróbicas ou anaeróbicas) como Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., e Streptococcus spp., além de bactérias exclusivamente anaeróbicas como Bacterioides spp., Fusobacterium spp. e Eubacterium spp. (LEE, 2010; LODDI, 2001). Esses micro- organismos agem em simbiose com o hospedeiro, regulando a eficiência absortiva, o tempo de permanência do bolo alimentar no trato gastrointestinal, o aproveitamento de alguns nutrientes pouco digestíveis pelas enzimas endógenas do animal, a maturação intestinal, antagonismo contra patógenos, o reforço da integridade intestinal e a modulação da imunidade induzindo a produção de anticorpos (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Segundo Ducatelle et al. (2015) a microbiota intestinal pode causar alterações fisiológicas ao hospedeiro interagindo com as células epiteliais intestinais por meio de receptores imunes inatos. Assim, o tecido linfoide associado ao intestino transmite os sinais da superfície da mucosa para o resto do corpo, desempenhando um papel crucial não apenas no seu próprio desenvolvimento, mas, também na regulação de mecanismos que permitem que as superfícies da mucosa tolerem bactérias inofensivas e respondam adequadamente a micro-organismos patogênicos invasores. O desenvolvimento desta microbiota inicia-se logo após a eclosão dos pintos, de dois a quatros dias, sendo predominante nessa fase principalmente de Streptococcus e Enterobacteria, após uma semana, Lactobacillus predominam no intestino delgado e se mantém ao longo da vida do animal (AMIT-ROMACH et al., 2004). 118
Os Lactobacillus que colonizam o intestino delgado das aves são incapazes de sintetizar aminoácidos para o seu anabolismo e são, portanto, altamente dependentes da disponibilidade de aminoácidos no ambiente de crescimento, auxiliando na digestão de proteínas, e competindo por aminoácidos entre a microbiota e o hospedeiro e assimilando de 3 a 6% do total de aminoácidos da dieta do animal (APAJALAHTI & VIENOLA, 2016). No duodeno e jejuno, o número total de bactérias é menor do que no íleo, no entanto, alguns fatores como dieta, processamento de ração, aditivos na alimentação, o jejum prolongado, o estresse ambiental ou térmico e a presença de patógenos intestinais podem influenciar a microflora intestinal (POWER et al., 2014) Esses fatores podem causar alterações na microbiota benéfica das aves, levando ao desequilíbrio microbiano com multiplicação dos microrganismos patogênicos, ou seja, uma disbiose (CHAN et al., 2013). No entanto, a denominação de bactérias benéficas ou prejudiciais não é muito clara, uma vez que microrganismos intestinais, que são normalmente benéficos podem em algum momento se tornar uma ameaça potencial ao hospedeiro. Desse modo, a microbiota é considerada prejudicial quando causa uma perturbação do equilíbrio resultando em uma resposta imune agressiva, afetando absorção de nutrientes (MAIORKA, 2004; BISWAS & KOBAYASHI, 2013). Agentes como Salmonella spp. e Escherichia spp. afetam a produção de frangos de corte, além de serem responsáveis por distúrbios alimentares em humanos (THANISSERY et al., 2014; BURKHOLDER et al., 2008; AMIT-ROMACH et al., 2004). Salmonella spp. é uma das cepas de microrganismos mais comuns encontrados em carne de aves, suína e bovina, em alimentos de origem animal, como laticínios, produtos cárneos, aves, ovos e frutos do mar, além de produtos como legumes frescos, frutas e cereais (ARNOLD et al., 2014; PAUDYAL et al., 2017; CRABB et al., 2019). Patógenos como Escherichia coli e Staphylococcus aureus e coliformes totais e fecais foram identificados como contaminantes da carne de frango e peru (CHAILLOU et al., 2014). Stromberg et al. (2017) verificaram que alguns isolados de Escherichia coli de fezes de frangos contêm genes de virulência potencialmente patogênicos similares os dos microrganismos transmitidos aos seres humanos através do manuseio e/ou consumo de carne contaminada. 119
Os antibióticos usados para o controle de patógenos e como promotores de crescimento, frequentemente podem induzir a seleção de biota resistente (FERNANDES et al., 2015). Com isso, após a proibição do uso de antibióticos como promotores de crescimento da alimentação de aves pela União Europeia, extensivas pesquisas foram relatadas quanto ao uso de aditivos fitogênicos como os óleos essenciais em substituição aos antimicrobianos, uma vez que eles melhoram a resposta imune e a microbiota intestinal, prevenindo efeitos negativos na estrutura do intestino (MARTYNOVA et al., 2012; KOIYAMA, 2012; MENDES et al., 2013; PELÍCIA et al., 2015). Os benefícios do uso de óleos essenciais justificam-se pela atividade antimicrobiana desses fitobióticos uma vez que seus componentes hidrofóbicos permitem a interação com os lipídios presentes na membrana celular das bactérias causando perturbação das estruturas celulares e morte bacteriana (THANISSERY et al., 2014; ZHANG et al, 2017). Frangos de corte desafiados com Escherichia coli, Clostridium perfrigens e Eimeria sp. tiveram redução no número de patógenos com a adição de óleos essenciais (HUANG et al., 2012; ZHANG et al., 2012; BODAS et al., 2012).Uma mistura de óleos essenciais (eucalipto, tomilho e limão) à água dos frangos de corte resultou em melhora considerável no desempenho além da redução da colonização de Salmonella enterica (ALALI et al., 2013). Hosseini e Meimandipour (2018) verificaram redução do número de bactérias aeróbicas e coliformes totais, melhorando o desempenho dos frangos alimentados com óleo essencial de tomilho por meio da melhoria do estado fisiológico e modulação da microbiota intestinal. Devido à importância dessa relação microbiota/hospedeiro, vários estudos têm sido desenvolvidos com o propósito de identificar a comunidade intestinal, envolvendo desde cultura de microrganismos a técnicas moleculares de alta tecnologia, permitindo revelar a diversidade de micro-organismos de forma abrangente e confiável (VALVERDE & MELLADO, 2013; LI et al., 2012; PEDROSO et al., 2006). A subunidade menor do RNA ribossomal 16S rRNA é um dos principais alvos moleculares para análise microbiana, uma vez que possui regiões de sequências de bases de nucleotídeos nomeadas de V1 a V9 altamente conservadas no domínio bacteriano, intercaladas por regiões variáveis, possibilitando o estudo de caracterização filogenética entre os micro-organismos (YAZAR et al., 2014). Outro método bastante 120 utilizado para otimizar a identificação de microorganismos em amostras com pequena quantidade de DNA, compara a amplificação padrão da região V4 16S rRNA com a região V3-V4, uma vez que a região V4 pode melhor representar o perfil taxonômico das comunidades microbiana, quando comparado a caracterização utilizando a sequência completa de genes 16S rRNA (WANG et al., 2007). Contudo, o sequenciamento e o PCR tem comprovadamente aplicabilidade clínica, por meio da detecção específica de agentes patogênicos como Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila e Listeria monocytogenes na avaliação de novas infecções emergentes, vigilância, detecção precoce de ameaças biológicas e perfis de resistência a antibióticos em bactérias como a Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, entre outras (MORENO, 2013). Liu et al. (2017) analisaram a sequencia bacteriana do trato intestinal de aves alimentadas com óleos essenciais e uma mistura de ácidos orgânicos e observaram que a suplementação de óleos essenciais e da mistura de ácidos orgânicos modificou a microflora intestinal principalmente nos Lactobacillus, enquanto Du et al. (2015) relataram que a forte atividade antibacteriana contra cepas patogênicas de Escherichia coli, Clostridium perfringens e Salmonella spp., e a fraca atividade em relação às cepas benéficas de Lactobacillus de uma mistura de óleos essenciais contendo timol e carvacrol, concluindo que esses compostos fenólicos melhoram potencialmente a integridade intestinal, responsável pela absorção de nutrientes. Diante do exposto, monitorar a dinâmica da microbiota intestinal das aves, determinar os principais membros desse microbioma e estabelecer sua funcionalidade é de suma importância na prevenção de problemas zoonóticos, bem como para o desenvolvimento de produtos que consigam modular as comunidades microbianas intestinais, melhorando o desempenho animal das aves, com maior segurança alimentar para o consumidor final dos produtos (YANG et al., 2009; OVIEDO-RONDÓN, 2009). Nesse sentido, o objetivo com este trabalho foi analisar a microbiota intestinal de frangos de corte alimentados com óleos essenciais de Citrus sinensis e Xylopia aromatica utilizando sequenciamento do gene 16S rRNA.
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2. Material e métodos O ensaio biológico de campo foi realizado no Setor de Avicultura do Instituto Federal Goiano – Campus Rio Verde e nos Laboratórios de Nutrição Animal e Bioquímica e Metabolismo Animal no período de agosto a dezembro de 2018. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano Campus Rio Verde, Brasil (n° 5622220718) e realizados em conformidade com diretrizes para o uso de animais em pesquisa. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com três tratamentos, seis repetições com 10 aves, totalizando 180 pintinhos, de um dia, machos, da linhagem Cobb alojados em gaiolas de arame galvanizados com dimensões 0,90m x 0,60m x 0,45m. Os tratamentos foram: T1 (dieta controle, a base de milho e farelo de soja); T2 (T1 + 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis) e T3 (T1 + 200 ppm de óleo essencial de X. aromatica), seis repetições de 10 aves cada, totalizando 180 pintinhos da linhagem Cobb. As rações foram preparadas na própria instituição de acordo com as fases pré-inicial (1 a 7 dias) e inicial (7 a 14 dias) seguindo as recomendações nutricionais de Rostagno et al. (2017) (Tabela 1). Aos sete e aos 14 dias de idade uma ave por repetição foi eutanasiada por deslocamento cervical, para a coleta do conteúdo intestinal do íleo (divertículo até a inserção ileocecal). O material foi coletado em ambiente esterilizado, armazenado em freezer de -80°C, havendo o processo de liofilização para realização da extração do DNA.
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Tabela 1. Composição centesimal e níveis nutricionais calculados das dietas controle com adição de 200ppm de óleo essencial de C. sinensis ou X. aromatica Ingredientes (g/Kg) Pré-inicial Inicial Milho 8,58% 55,3000 56,0200 Farelo de Soja 46% 39,3706 37,9300 Óleo de Soja 0,8000 1,7000 Calcário 2,2000 1,1200 Fosfato Bicálcico 0,0648 1,2500 Premix Vit/Min 1,0000* 1,0000** DL-Metionina 0,2645 0,2200 L-Lisina 0,3000 0,2000 L-Treonina 0,1944 0,0700 Sal Comum 0,5058 0,4900 Total 100,0000 100.0000 Níveis Calculados Energia Met (Kcal/kg) 3000,00 3100,00 Proteína Bruta, (%) 25,31 24,30 Lisina dig (%) 1,36 1,31 Metionina dig (%) 0,55 0,53 Cálcio (%) 1,01 0,91 Fósforo disp (%) 0,48 0,43 Sódio (%) 0,23 0,22 *Premix 1 Vitamínico Mineral (Níveis Nutricionais por Kilo de Produto) –Metionina (Min): 290 g/kg, Ferro (Min): 5.000 mg/kg, Cobre (Min): 1.500 mg/kg, Manganês (Min): 14 g/kg, Zinco (Min): 12 g/kg, Iodo (Min): 28 mg/kg, Selênio (Min) 70 mg/kg, Vitamina A (Min): 1.500.000 UI/kg, Vitamina D3 (Min): 500.000 UI/kg, Vitamina E (Min): 3.333 UI/kg, Vitamina K3 (Min): 250 mg/kg, Vitamina B1 (Min): 300 mg/kg, Vitamina B2 (Min): 1.000 mg/kg, Vitamina B6 (Min): 500 mg/kg, Vitamina B12 (Min) 3.333 mcg/kg, Niacina (Min): 6.667 mg/kg, Pantotenato de Cálcio (Min): 2.000 mg/kg, Ácido Fólico (Min): 280 mg/kg Biotina (Min): 8.3 mg/kg, Cloreto de Colina (Min): 70 mg/kg. **Premix Vitamínico Mineral (Níveis Nutricionais por Kilo de Produto) –Metionina (Min): 300 g/kg, Ferro (Min): 6.000 mg/kg, Cobre (Min): 1.850 mg/kg, Manganês (Min): 16.8 g/kg, Zinco (Min): 14.5 g/kg, Iodo (Min): 330 mg/kg, Selênio (Min) 84 mg/kg, Vitamina A (Min): 1.500.000 UI/kg, Vitamina D3 (Min): 500.000 UI/kg, Vitamina E (Min): 3.600 UI/kg, Vitamina K3 (Min): 240 mg/kg, Vitamina B1 (Min): 300 mg/kg, Vitamina B2 (Min): 1.100 mg/kg, Vitamina B6 (Min): 500 mg/kg, Vitamina B12 (Min) 3.600 mcg/kg, Niacina (Min): 7.000 mg/kg, Pantotenato de Cálcio (Min): 2.000 mg/kg, Ácido Fólico (Min): 320 mg/kg Biotina (Min): 6 mg/kg, Cloreto de Colina (Min): 65 mg/kg. Inclusão de 200ppm de óleo essencial de X. aromatica e C. sinensis.
O conteúdo intestinal foi encaminhado e analisado em Laboratório especializado em análises metagenômicas (Neoprospecta Microbiome Technologies, Florianópolis/SC, Brasil). O procedimento para determinar o perfil microbiano intestinal seguiu as instruções de Christoff et al. (2017). A identificação de bactérias foi realizada utilizando-se o sequenciamento de alto desempenho das regiões V3/V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado no equipamento MiSeq (Illumina Inc., USA). As sequências de DNA dos micro-organismos foram analisadas através de um 123 pipeline proprietário (Neoprospecta Microbiome Technologies, Brasil) considerando no máximo de 1% de erro acumulado no sequenciamento. Para a identificação das espécies de micro-organismos presentes nas amostras, as sequências de DNA obtidas foram comparadas com Banco de Dados contendo outras sequências de DNA já caracterizadas para as espécies de interesse. Para estimar a similaridade da estrutura da comunidade microbiana entre os tratamentos foram realizadas análises de componentes principais (PCA), com base no perfil das unidades taxonômicas operacionais (OTUs). Todos os experimentos foram realizados em seis repetições e três tratamentos, com delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado. Todos os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias dos tratamentos foram avaliadas por meio do teste de Tukey a 5 % de significância pelo software SISVAR® (FERREIRA, 2011).
3. Resultados 3.1. Análise de componentes principais sobre Filo A análise de componentes principais (PCA) para a diversidade de filos microbianos presentes nas aves com sete e 14 dias de idade estão representadas na Figura 1, sendo que os plots de PCA definiram grupos onde as amostras dos grupos controle (T1) e tratamentos com óleo essencial de C. sinensis (T2) e X. aromatica (T3) ocupavam posições distintas. A ordenada representa o primeiro componente principal, as abscissas representam o segundo componente principal e a porcentagem representa a contribuição do componente principal para a diferença da amostra. Na Figura 1A, o primeiro eixo do PCA explicou 85,9% da variação na diversidade microbiana dos frangos de sete dias de idade, enquanto o segundo eixo explicou 11,2%. Na Figura 1B, o primeiro eixo do PCA explicou 87% da variação na diversidade microbiana dos frangos de 14 dias de idade, enquanto o segundo eixo explicou 13%.
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Figura 1: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de filos microbianos presentes nas aves de sete (Figura 1A) e 14 dias (Figura 1B) de idade.
O agrupamento das amostras do conteúdo ileal dos frangos também foi analisado em dois “clusters” para os filos microbianos dos frangos de sete e 14 dias de idade (Figura 2). O primeiro é formado por amostras dos frangos de corte de sete dias de idade (Figura 2A) e possui como característica uma alta porcentagem do filo Proteobacteria, além do distanciamento na variação da diversidade de filos microbianos do grupo controle (T1) e demais tratamentos (T2 e T3). O mesmo padrão quanto a abundância do filo Proteobacteria ocorreu nas aves aos 14 dias de idade (Figura 2A) com o distanciamento da variação da diversidade microbiana entre o tratamento controle (T1) e tratamentos com óleos essenciais de C. sinensis (T2) e X. aromatica (T3).
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Figura 2: Dendrograma de agrupamento hierárquico a nível de filo de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 2A) e 14 dias (Figura 2B) de idade. Os números de 1 a 4 correspondem aos filos Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria, respectivamente.
Essa variação da diversidade de filos entre os tratamentos pode ser observada na Figura 3. Aos sete e 14 dias o filo predominante foi Proteobacteria seguido de Firmicutes para todos os tratamentos (Figura 3). No entanto, houve uma redução significativa do filo Firmicutes e maior desenvolvimento do filo Proteobacteria nos frangos alimentados com dieta controle de 7 para 14 dias. Nos demais tratamentos, não houve variações ao longo dos dias. 126
Figura 3: Abundância relativa dos principais filos bacterianos em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade.
3.2. Análise de componentes principais sobre classe Quanto à diversidade de classes microbianas presentes nas aves com sete e 14 dias de idade, a análise de componentes principal (PCA) demonstrou que o tratamento com óleo essencial de C. sinensis (T2) distanciou-se do grupo controle e tratamento com óleo essencial de X. aromatica (T3) ocupando posições distintas (Figura 4). O primeiro componente principal, representado pela ordenada, explicou 76,9% da variação na diversidade, enquanto o segundo componente principal, representado pela abscissa, explicou 14,9% da variação na diversidade de classes microbianas dos frangos de sete dias de idade (Figura 4A). Na Figura 4B, o tratamento com óleo essencial de C. sinensis (T2) se distanciou do tratamento com óleo essencial de X. aromatica (T3) ocupando posições distintas, sendo que o primeiro componente principal explicou 98,2% da variação na diversidade e o segundo componente principal explicou 1,8% da variação na diversidade de classes microbianas identificadas nos frangos de 14 dias de idade. 127
Figura 4: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de classes microbianas presentes nas aves de sete (Figura 4A) e 14 dias (Figura 4B) de idade.
Para prever o agrupamento das classes microbianas presentes nas amostras do íleo dos frangos de sete e 14 dias de idade também foi usado dois “clusters” (Figura 5). O cluster apresentado na Figura 5A é formado por amostras dos frangos de corte de sete dias de idade, os quais apresentaram maior porcentagem da classe Gammaproteobacteria nas aves alimentadas com óleo essencial de X. aromatica (T3) se distanciando da variação de diversidade de classes microbianas encontradas nas amostras de aves do grupo controle (T1) e alimentadas com óleo essencial de C. sinensis (T2), que apresentaram menor porcentagem da classe Gammaproteobacteria e maior proporção das classes Alphaproteobacteria e Bacilli. Nas amostras dos frangos de 14 dias de idade alimentados com óleo essencial de C. sinensis (T2) foi observada maior predominância da classe Gammaproteobacteria e nos frangos alimentados com óleo essencial de X. aromatica (T3) também verificou a presença da classe Bacilli o que corrobora com o distanciamento da variação da diversidade microbiana entre os tratamentos com óleos essenciais de C. sinensis (T2) e X. aromatica (T3) (Figura 5B). 128
Figura 5: Dendrograma de agrupamento hierárquico a nível de classe de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 5A) e 14 dias (Figura 5B) de idade. Os números de 1 a 9 correspondem às classes Actinobacteria (A), Alphaproteobacteria (A1), Bacilli (B), Bacteroidia (B1), Betaproteobacteria (B2), Clostridia (C), Erysipelotrichia (E), Flavobacteriia (F) e Gammaproteobacteria (G), respectivamente.
As proporções de classes identificadas na microbiota dos frangos de sete e 14 dias estão representadas na Figura 6. Aos sete dias, Bacilli (32,73%) e Gammaproteobacteria (30,91%) foram as classes predominantes na microbiota intestinal de frangos alimentados com dieta controle. Nesta fase houve uma maior diversidade de classes quando comparado com os resultados de 14 dias, que apresentou abundância de 98,75% da classe Gammaproteobacteria. Também foi observado maior diversidade de classes de microrganismos no conteúdo intestinal dos frangos de sete dias alimentados com ração e óleo essencial de C. sinensis (T2) quando comparados com os frangos de 14 dias e mesma dieta. Aos sete dias as classes predominantes foram Gammaproteobacteria (49,20%) e Alphaproteobacteria (43,77%), enquanto aos 14 dias a classe Gammaproteobacteria teve 95,24% de predominância. 129
Nos frangos alimentados com ração contendo óleo essencial de X. aromatica aos sete e 14 dias as classes predominantes foram Gammaproteobacteria com abundância 80,94 e 78,00%, seguidos da classe Bacilli 18,17 e 21,88%, respectivamente.
Figura 6: Abundância relativa das principais classes bacterianas em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade.
3.3. Análise de componentes principais sobre ordem A diversidade microbiana presentes nas aves com sete e 14 dias de idade alimentadas com óleo essencial de C. sinensis (T2) distanciou-se do tratamento com óleo essencial de X. aromatica (T3) ocupando posições distintas (Figura 7). O primeiro componente principal explicou 53,4% da variação na diversidade, enquanto o segundo componente principal explicou 46,6% da variação na diversidade de classes microbianas dos frangos de sete dias de idade (Figura 7A). Esse distanciamento também foi observado nos frangos de 14 dias de idade (Figura 7B), sendo que o primeiro componente principal explicou 86,4% da variação na diversidade e o segundo 130 componente principal explicou 13,6% da variação na diversidade de classes microbianas identificadas.
Figura 7: Análise de componentes principais (PCA) da diversidade de ordens microbianas presentes nas aves de sete (Figura 7A) e 14 dias (Figura 7B) de idade.
Na Figura 8A, o cluster destaca o distanciamento entre a variação da diversidade de ordens microbianas nas amostras intestinais dos frangos de sete dias de idade tratados com óleo essencial de C. sinesis (T2) e X. aromatica (T3), sendo que as amostras do tratamento T2 apresentaram entre as principais ordens Sphingomonadales e Caulobacterales, e em T3 Pseudomonadales, Enterobacteriales e Lactobacillales foram as ordens de destaque. Nas aves de 14 dias de idade (Figura 8B), as ordens sofreram variações, sendo que no tratamento T2 a maior porcentagem de ordens foram Pseudomonadales e Caulobacterales, enquanto que em T3, as ordens mais abundantes foram Pseudomonadales, Enterobacteriales e Bacillales.
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Figura 8: Dendrograma de agrupamento hierárquico a nível de ordem de bactérias do íleo de frangos de corte alimentados com dieta controle e com óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica aos sete (Figura 8A) e 14 dias (Figura 8B) de idade. As ordens apresentadas no cluster são: Actinomycetales (A), Aeromonadales (A1), Alteromonadales (A2), Bacillales (B), Bacteroidales (B1), Burkholderiales (B2), Caulobacterales (C), Clostridiales (C1), Enterobacteriales (E), Erysipelotrichales (E1), Flavobacteriales (F), Lactobacillales (L), Methylophilales (M), Pseudomonadales (P), Rhizobiales (R), Rhodobacterales (R1), Rhodocyclales (R2), Rhodospirillales (R3), Sphingomonadales (S), Vibrionales (V) e Xanthomonadales (X).
A proporção da diversidade de ordens entre os tratamentos nas aves de sete e 14 dias de idade está representada na Figura 9. De acordo com os resultados da análise de microbioma, a microbiota ileal das aves alimentadas com dieta controle aos sete dias de idade apresentou como ordem mais abundante foram Lactobacillales (29,09%), Enterobacteriales (16,36%) e Clostridiales (12,73%). Aves de sete dias de idade alimentadas com ração contendo óleo essencial de C. sinensis tiveram como ordens predominantes Xantomonadales (43,13%), Sphingomonadales (21,09%), Caulobacterales (12,06%) e Rhizobiales (9,58%). Por outro lado, aves alimentadas com ração contendo óleo essencial de X. aromatica, demonstraram as ordens predominantes 132
Pseudomonadales (44,04%), Enterobacteriales (36,12%) e Lactobacillales (17,08%). A ordem Pseudomonadales teve maior abundância entre as aves de 14 dias de idade em todos os tratamentos, seguido da ordem Enterobacteriales também encontrada nos frangos do tratamento controle e do tratamento com óleo essencial de X. aromatica (Figura 9).
Figura 9: Abundância relativa das principais ordens bacterianas em amostras do conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta controle com milho e farelo de soja (T1), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de C. sinensis (T2), milho, farelo de soja e 200ppm de óleo essencial de X. aromatica (T3) aos 14 dias de idade.
3.4. Microbiota ileal do Filo, Classe e Ordem Na Tabela 2 estão apresentados os resultados da abundância de filo, classe e ordem de microrganismos presentes no conteúdo ileal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica.
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Tabela 2: Proporção de Filo, Classe e Ordem da população de microrganismos presentes no conteúdo íleal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica FILO Controle C. sinensis X. aromatica Controle C. sinensis X. aromatica 7 dias 14 dias Actinobacteria - 1,6 0,52 - - 0,08 Bacteroidetes 5,45 - 0,01 - - - Firmicutes 45,45 3,83 18,17 1,25 1,95 21,88 Proteobacteria 49,09 94,57 81,3 98,75 98,05 78,04 CLASSE Controle C. sinensis X. aromatica Controle C. sinensis X. aromatica 7 dias 14 dias Actinobacteria - 1,6 0,52 - - 0,08 Alphaproteobacteria 14,55 43,77 0,36 - 2,81 - Bacilli 32,73 2,56 18,17 1,25 1,95 21,88 Bacteroidia 3,64 - - - - - Betaproteobacteria 3,64 1,6 - 5,79 - - Clostridia 12,73 0,96 - - - - Erysipelotrichia - 0,32 - - - - Flavobacteriia 1,82 - 0,01 - - - Gammaproteobacteria 30,91 49,2 80,94 98,75 95,24 78 ORDEM Controle C. sinensis X. aromatica Controle C. sinensis X. aromatica 7 dias 7 dias 7 dias 14 dias 14 dias 14 dias Alteromonadales 1,82 - 0,18 - - - Bacillales 3,64 0,32 1,1 - - 18,43 Bacteroidales 3,64 - - - - - Burkholderiales 3,64 1,28 - - - 0,01 Caulobacterales - 12,46 0,09 - 2,81 - Clostridiales 12,73 0,96 - - - - Enterobacteriales 16,36 4,15 36,12 17,84 1,3 34,81 Flavobacteriales 1,82 - 0,01 - - - Lactobacillales 29,09 2,24 17,08 1,25 1,95 3,45 Pseudomonadales 7,27 1,92 44,04 80,91 92,64 42,95 Rhizobiales 5,45 9,58 0,1 - - - Rhodobacterales 3,64 0,64 0,01 - - - Rhodospirillales 1,82 - - - - 0,03 Sphingomonadales 3,64 21,09 0,17 - - - Vibrionales 5,45 - - - - - Xanthomonadales - 43,13 0,54 - 1,3 0,25
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3.5. Espécies presentes na microbiota ileal A Tabela 3 contém resultados das espécies de microrganismos e suas respectivas famílias presentes no conteúdo ileal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica. De acordo com os resultados obtidos, as amostras dos conteúdos intestinais dos frangos de sete e 14 dias de idade alimentados com óleo essencial de X. aromatica apresentaram maior diversidade de espécies quando comparadas aos demais tratamentos, registrando as famílias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. No entanto, houve variação entre a representatividade das espécies entre os tratamentos e ao longo das fases de desenvolvimento das aves. Hydrocarboniphaga effusa foi a principal bactéria da família Burkholderiaceae encontrada apenas no conteúdo intestinal dos frangos de corte alimentados com óleo essencial de C. sinensis aos sete dias de idade compreendendo 42,81% da microbiota, enquanto Clostridium difficile (Clostridiaceae) foi encontrada na proporção de 10,91% apenas nos frangos alimentados com dieta controle de sete dias de idade. Para a família Enterobacteriaceae, destacam-se as bactérias Enterococcus faecalis na proporções 5,45; 0,64 e 16,27% nos frangos alimentados com dieta controle e com óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica aos sete dias de idade, respectivamente. Outra bactéria de destaque dessa família foi Escherichia coli presente no conteúdo intestinal dos frangos alimentados com óleo essencial de C. sinensis e X. aromática aos sete dias de idade, nas proporções 1,92 e 17,26% e aos 14 dias de idade nas proporções 1,25 e 17,43% no tratamento controle e com óleo essencial de X. aromatica, respectivamente. Nesta mesma família Klebsiella pneumoniae foi identificada em menor proporção (10,91 e 4,73%) no conteúdo intestinal dos frangos de sete dias de idade alimentados com dieta controle e com óleo essencial de X. aromatica, respectivamente. Lactobacillus salivarius (Lactobacillaceae) foi identificada no conteúdo intestinal de frangos alimentados com dieta controle com uma predominância de 16,36% e Phenylobacterium koreense (Leptospiraceae) foi identificada no conteúdo intestinal dos frangos alimentado com óleo essencial de C. sinensis com uma abundância de 7,99%, ambos aos sete dias de idade. Ainda nesta fase de desenvolvimento das aves, a espécie Acinetobacter lwoffii (Moraxellaceae) foi 135
identificada com 27,03% de abundancia no conteúdo intestinal dos frangos alimentados com óleo essencial de X. aromatica e com predominância de 10,49; 18,40 e 8,52% nos frangos de 14 dias alimentados com dieta controle, e com rações contendo óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica, respectivamente.
Tabela 3: Percentual da população de microrganismos presentes no conteúdo ileal de frangos de corte de sete e 14 dias de idade alimentados com rações contendo 200 ppm de óleo essencial de C. sinensis e X. aromatica
C. X. C. X. Controle Controle FAMÍLIAS ESPÉCIES sinensis aromatica sinensis aromatica
7 dias 14 dias Hydrocarboniphaga Burkholderiaceae - 42,81 - - - - effusa Clostridiaceae Clostridium difficile 10,91 - - - - - Enterobacter cloacae 1,82 - 4,32 1,88 - 8,15 Enterobacteriaceae sp. 1,82 - 6,93 8,76 1,3 1,09 Enterobacteriaceae Enterococcus faecalis 5,45 0,64 16,27 - - 3,04 Escherichia coli - 1,92 17,26 1,25 - 17,43 Klebsiella pneumoniae 10,91 - 4,73 - - 0,15 Lactobacillaceae Lactobacillus salivarius 16,36 0,32 - - - 0,01 Phenylobacterium Leptospiraceae - 7,99 0,04 - - - koreense Moraxellaceae Acinetobacter lwoffii - 0,32 27,03 10,49 18,4 8,52 Pseudomonas fulva - - 0,69 15,02 17,97 2,19 Pseudomonas Pseudomonadaceae 5,45 - - - - - mendocina Pseudomonas putida - 1,6 12,48 50,08 44,81 29,95 Sphingobium lactosutens - 8,63 0,11 - - - Sphingomonadaceae Sphingomonas wittichii - 5,43 0,02 - - - Staphylococcus Staphylococcaceae - 0,32 0,41 - - 13,74 saprophyticus
Outra família de destaque foi Pseudomonadaceae, sendo que a espécie Pseudomonas mendocina foi identificada com 5,45% de representatividade apenas nos frangos de sete dias alimentados com dieta controle. Pseudomonas fulva foi identificada com uma representatividade de 15,02; 17,97 e 2,19% nos frangos de sete dias alimentados com dieta controle, e com óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica, 136 respectivamente, e Pseudomonas putida presente na microbiota intestinal dos frangos de sete dias alimentados com óleo essencial de C. sinensis (1,60%) e X. aromatica (12,48%); e nos frangos de 14 dias alimentados com dieta controle (50,08%) e com óleos essenciais de C. sinensis (44,81%) e X. aromatica (29,95%). Sphingobium lactosutens e Sphingomonas wittichii (Sphingomonadaceae) foram identificadas nos frangos de sete dias alimentados com óleo essencial de C. sinensis nas porcentagens de 8,63 e 5,4%, respectivamente e Staphylococcus saprophyticus (Staphylococcaceae) foi verificada no conteúdo intestinal dos frangos de corte de 14 dias alimentados com óleo essencial de X. aromatica correspondendo a 13,74% da microbiota.
4. Discussão Durante a vida das aves, as populações microbianas entéricas passam por alterações como resultado de variáveis relacionadas ao desenvolvimento da competência imune, diferenças entre indivíduos, idade da ave, interações ambientais e principalmente pela dieta (GABRIEL et al., 2006; OVIEDO-RODÓN, 2009; CHRISTOFOLI et al., 2020). Segundo Barnes et al. (1972), a microbiota típica de aves adultas se estabelece por volta de 14 dias no intestino das aves. No presente trabalho o filo Firmicutes esteve evidente nas proporções de 45,45; 3,83 e 18,17% nas aves com sete dias de idade, e 1,25; 1,95 e 21,88% nas aves com 14 dias de idade alimentadas com ração controle, e com rações contendo óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica, respectivamente. Segundo Lu et al. (2003) e Pedroso et al. (2016), quatro filos importantes compreendem toda microbiota das aves: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacterias e Proteobacterias, o que corrobora com os resultados encontrados. A prevalência do filo Firmicutes na microbiota intestinal de frangos também foi relatada por Wei et al. (2013), Wang et al. (2016), Kers et al. (2018) e Pereira et al. (2019), em grupos de aves criados com e sem desafio sanitário. O filo Firmicutes foi o mais frequente (74%), seguido dos filos Bacteroidetes (16%), Verrucomicrobia (7%) e Proteobacteria (3%) na microbiota intestinal de frangos de corte de 35 dias alimentados com ração e uma mistura de extratos vegetais (CRISTO, 2017). Foi possível verificar grande diversidade na microbiota intestinal das aves de sete dias idade em todos os tratamentos, com uma variação de algumas espécies da 137 população bacteriana aos 14 dias de idade, evidenciado pela redução das espécies do filo Firmicutes e aumento das espécies do filo Proteobacteria. De acordo com Torok et al. (2011), os filos Firmicutes e Proteobacteria compreendem os principais representantes da microbiota identificadas no íleo e no ceco, com base nas sequências do gene 16S rRNA, ligada ao desempenho das aves, sendo que essas comunidades microbianas sofrem várias alterações a medida que as aves crescem (CLAVIJO e FLÓREZ, 2018), o que corrobora com os dados deste estudo. Adicionalmente, a variação observada no presente trabalho também pode ser atribuída à atividade inibitória dos óleos essenciais conforme relatado por vários autores, que utilizaram óleos essenciais como aditivos fitogênicos na alimentação das aves reduzindo a população de bactéria patogênicas como Clostridium perfringes e Salmonella enterica (BONA-MOLINA et al., 2012; DU et al., 2015) e Escherichia coli (MOHITI-ASLI e GHANAATPARAST-RASHTI, 2017), destacando o potencial biotecnológico dos óleos essenciais como fitobióticos. O óleo essencial de C. sinensis é rico em limoneno (FISHER e PHILLIPS, 2009) enquanto o óleo essencial de X. aromatica é rico em compostos como silvestreno, α- pineno e β-pineno compostos esses relatados na literatura por suas atividades antimicrobianas (WOUATSA et al., 2014). No presente trabalho, as aves alimentadas com óleo essencial de C. sinensis não apresentaram bactérias reconhecidamente como patogênicas, presentes na microbiota das aves dos demais tratamentos, reforçando a suposição de que este óleo possa ter ação inibitória para crescimento de alguns microrganismos. O óleo de C. sinensis apresentou inibição do crescimento de cepas Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, entre outros (TAO et al., 2009) e contra as cepas de Salmonella spp. sorovar Typhimurium (CHALOVA et al., 2010) demonstrando resultados promissores no controle desses microrganismos. Ambrosio et al. (2017) avaliaram o efeito de vários óleos essenciais em bactérias patogênicas Salmonella spp. sorovar Enteritidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Listeria innocua e em bactérias benéficas como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus subtilis e verificaram que o óleo essencial de laranja foi o que apresentou maior atividade em bactérias patogênicas e menor em bactérias benéficas, apresentando, portanto, a melhor atividade 138 antibacteriana seletiva entre os dois grupos de bactérias. Wouatsa et al. (2014) reportaram a atividade biológica do óleo essencial de Xylopia aethiopica sobre Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Raoultella planticola e Salmonella spp. sorovar Typhimurium, enquanto Alcantara et al. (2018) verificaram que os óleos essenciais de X. aromatica coletadas na Amazônia apresentaram expressiva atividade contra bactérias como Streptococcus sanguinis. Pelos resultados, pode-se afirmar que há indícios de que exista adequada digestão e absorção dos nutrientes, degradação de muco e desenvolvimento tecidual na fase inicial da vida das aves, tendo em vista as constatações referentes à maior frequência do filo Firmicutes e às descrições feitas por Lunedo e Pedroso (2017). Em contraposição, a maior ocorrência do filo Bacteroidetes pode ser evidenciado em animais pouco eficientes para extrair nutrientes da dieta e deposição tecidual. Além disso, o filo Proteobacteria foi o mais abundante em todos os tratamentos e fases de desenvolvimento das aves, compreendendo bactérias Gram-negativas anaeróbicas ou facultativas, cuja classe predominante é Gammaproteobacteria que atuam na manutenção da homeostase do ambiente anaeróbico do trato gastrointestinal e na preparação do intestino para posterior colonização por microrganismos anaeróbios estritos necessários para a função intestinal saudável (Shin et al., 2015). Outro papel importante das Proteobacterias é a codificação de uma variedade de funções, principalmente no metabolismo de ácidos graxos, proteínas e aminoácidos, metabolismo de carboidratos e vitaminas (CHEN et al., 2018; MOON et al., 2018). Sabe-se que a estrutura anatômica e funcional do sistema digestório está associada às populações microbianas presentes. Considerando proventrículo e moela, pode-se dizer há degradação inicial, física e química do alimento, exigindo eficiência para quebra, exposição dos alimentos, desejáveis ao processo inicial das fermentações futuras de substratos complexos como amido e outros polissacarídeos. Lactobacillus predominam e são importantes nestes segmentos. Desta forma, pode-se supor que as populações serão co-dependentes da estrutura anatômica e sua função inicial, mas também serão favorecedores por seus subprodutos para as fases posteriores da digestão, com atenção às populações dos próximos nichos (BORDA-MOLINA et al, 2018). Por tais afirmações, é importante ressaltar que segmentos anatômicos anteriores ao 139 intestino, devem ser considerados, por somarem ação aos microrganismos que serão identificados, motivo pela qual foram mencionados. Dentre as principais classes identificadas por Fagundes (2016), ao avaliarem a influência de diferentes dietas a base de sorgo (em substituição do milho) sobre a microbiota intestinal de frangos de corte, destacam-se Bacilli, Clostridia, Actinobacteria e Alphaproteobacteria. Esses dados corroboram com os dados encontrados no presente trabalho, no qual foi identificado, além das classes acima citadas, a presença da classe Gammaproteobacteria entre as mais abundantes na microbiota intestinal dos frangos em todos os tratamentos aos sete e 14 dias de idade, isto pelo fato de que a composição do alimento é um direcionador para ativação de enzimas, produção de muco, movimentação peristáltica e absorção. Soma-se a estes processos a ação consorciada das bactérias que otimizam o meio em que estão instaladas. Aquele autor também identificou as ordens Lactobacillales, Clostridiales, Bacillales, Actinomycetales, Turicibacterales, Enterobacterales, Busrkholderiales, Rizobiales, Pseudomonadales e Rubrobacterales compreendendo 95,4% das bactérias encontradas. Cabe reforçar que as ordens Lactobacillales, Xantomonadales, Sphingomonadales, Pseudomonadales e Enterobacteriales foram igualmente encontradas no conteúdo ileal das aves do presente estudo. De acordo com Pedroso et al. (2011), existe grande diversidade e variação de bactérias conforme o segmento intestinal, sendo o intestino delgado colonizado por bactérias representadas por Lactobacillus, Clostridiaceae, Streptococcus, Enterococcus, e o íleo colonizados por significativamente por Streptococcus e Clostridiales, com predominância de Lactobacillus. Conforme a estrutura anatômica e sua função, as variações populacionais são evidentes. O ceco apresenta complexidade quanto às populações microbianas (TAN et al., 2019). A colonizção predominante ocorre por Clostridiaceae, seguida de Fusobacterium, Eubactterium, Proteobacterias, Bacteroides e bactérias microaerófilas facultativas que são Lactobacillus, Streptococcus e Enterococcus. Essa similaridade foi identificada no presente trabalho, devido à diversidade de gêneros de microrganismos no conteúdo intestinal dos frangos de sete e 14 dias de idade com destaque para os gêneros Lactobacillus, Acinetobacter, Hydrocarboniphaga, Clostridium, Enterococcus, 140
Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Sphingobium e Sphingomonas e Staphylococcus, sendo Lactobacillus, Acinetobacter e Hydrocarboniphaga os mais abundandes na fase pré-inicial (sete dias), enquanto Pseudomonas e Acinetobacter foram os mais abundantes aos 14 dias de desenvolvimento das aves em todos os tratamentos. Estas alterações podem estar relacionadas à maior concentração de ácidos graxos de cadeia curta no ceco. Os suplementos de origem vegetal modificam a composição da microbiota intestinal, aumentando a abundância relativa de Firmicutes no intestino em testes in vivo (DIAZ CARRASCO et al., 2016). Segundo Zeng et al. (2015) os compostos de origem vegetal promovem o aumento da secreção de muco no intestino que impede a adesão de bactérias patogênicas ao epitélio no intestino de aves. Os resultados obtidos permitem afirmar que pelas espécies identificadas em aos sete e 14 dias para aves que receberam X. aromatica houve maior diversidade populacional, o que contribui para maior produção de muco, tendo em vista os gêneros identificados. Clavijo e Flórez (2018) discorreram sobre a dinâmica do trato gastrintestinal das aves, bem como a microbiota presente, com atenção aos aditivos probióticos e prébióticos como moduladores. Pelas descrições das autoras, compostos bioativos podem ter efeito direcionado ao animal, bem como às populações microbianas; o que foi possível observar no estudo em questão, quando não foi constatada a presença de Salmonella enterica, por exemplo. Pode-se salientar que a baixa identificação de microrganismos patogênicos que naturalmente iniciam sua colonização seja por exposição ao meio, manipulação das aves, contaminação da dieta, pode ter sido favorecida pela administração dos óleos essenciais, havendo a sugestão de maior exploração dos mesmos e seus compostos bioativos. Hosseini e Meimandipour (2018) utilizaram óleo essencial de tomilho na alimentação de frangos de corte e observaram redução do número de bactérias aeróbicas e coliformes totais, além da melhora do estado fisiológico e modulação da microbiota intestinal das aves. Pourhossein et al. (2012) também verificaram maior incidência de bactérias do gênero Lactobacilli no íleo e no ceco das aves de 21 dias alimentadas com rações contendo 1,5 a 3% de óleo essencial de C. sinensis; o que diverge das constatações para aves analisadas aos sete e 14 dias no presente estudo, sendo possível considerar a concentração do óleo, mas também o tipo de alimento oferecido às aves em 141 associação ao efeito do princípio ativo, uma vez que as populações microbianas decorrem do efeito de variáveis combinadas. Segundo Erhan e Bolukbasi (2017), o óleo essencial da casca de laranja na concentração de 3 mL.Kg-1 de ração, aumentou significativamente a contagem de bactérias do ácido lático apresentando efeitos positivos no desempenho, na microbiota e morfologia do jejuno das aves. Além disso, os autores também testaram o óleo essencial da casca de outras espécies de Citrus como limão e bergamota, verificando redução na população de Escherichia coli no conteúdo intestinal dos frangos de corte avaliados. Os óleos essenciais dos frutos de C. sinensis são ricos em limoneno, assim como de outras espécies de Citrus (Martins et al., 2017), composto este capaz de modular a microbiota intestinal de camundongos (WANG et al., 2019). Esta modulação intestinal foi reportada por Wang et at. (2019), os quais avaliaram o efeito da administração intragástrica dos óleos essenciais de laranja, bem como seus componentes limoneno, linalool e citral em camundongos. Os autores observaram aumento da atividade da H + K + -ATPase e de imunoglobulinas (IgA e IgG) no tratamento com limoneno, além de aumento de Lactobacillus no ceco e cólon dos camundongos nos demais tratamentos, destacando o potencial imunorregulador do óleo essencial de laranja e do limoneno. Lactobacillus são Gram-positivos que predominam ao longo de todos os segmentos do intestino, auxiliam a imunidade, ao estimular a secreção de imunoglobulina IgA intestinal (ANDREATTI-FILHO, 2007) e apresentam metabolismo fermentativo, produzindo principalmente lactato, acetato, etanol, formiato e succinato, (KANDLER e WEISS, 1986) os quais auxiliam na proliferação de outras bactérias como Veillonella spp., Bacillus spp., Bifidiobacteriuim spp., Bacteriodes spp. que sintetizam ácidos graxos voláteis, diminuem a concentração de oxigênio, reduzem o pH e se aderem a mucosa intestinal limitando a multiplicação de bactérias patogênicas como Escherichia coli, Salmonella spp. e Campylobacter spp. (ANDREATTI-FILHO, 2007). Além disso, promovem efeito negativo à mucina produzida no intestino que é fonte de carbono, nitrogênio vitais às bactérias comensais e patogênicas. Bactérias que degradam mucina favorecem a saúde intestinal pois desorganizam a fixação de microrganismos indesejáveis. No presente trabalho o gênero de maior abundância comum aos três tratamentos foi Pseudomonas. Bactérias deste gênero também indicam aumento observado no 142 desempenho de crescimento de frangos após a suplementação com extratos vegetais, o que pode ser atribuído à melhora na composição microbiana intestinal e na função metabólica (ZHU et al., 2019). Segundo Jouybari et al. (2009), Pseudomonas putida, encontradas em abundância no conteúdo ileal das aves de 14 dias em todos os tratamentos avaliados neste trabalho, estão relacionadas à solubilização e metabolismo de fosfato. Esses autores avaliaram a adição de Pseudomonas putida como probiótico e verificaram melhora na absorção de fosfato. Linhagens de Pseudomonas putida estão associadas à biorremediação pelos efeitos positivos que desencadeiam, podendo haver comparação ao ambiente intestinal (ZHOU et al., 2019). O fósforo (P) é um elemento essencial para o crescimento muscular normal e a formação de óvulos, na manutenção do equilíbrio osmótico e ácido-base, metabolismo energético, metabolismo de aminoácidos e síntese de proteínas, na formação dos ácidos nucléicos, dos fosfolipídios e também é um co-fator de muitos sistemas enzimáticos (LI et al., 2016). Segundo Maougal et al. (2014) Pseudomonas spp., comumente detectados na mucosa ileal, têm a capacidade de hidrolisar o fitato, degradar o amido e são conhecidas por melhorar a disponibilidade de fósforo no solo. Esses relatos destacam que os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica possuem compostos bioativos com efeito inibitório devendo ser melhor explorados quanto aos compostos, bem como às concentrações. Observou-se no presente estudo, ação similar à de aditivos fitogênicos, bem como expressiva ação para seleção de microrganismos, sendo interessante mencionar que há potencial antimicrobiano, tendo em vista a biblioteca de bactérias que foi caracterizada aos sete e 14 dias de vida das aves.
5. Conclusão A microbiota ileal das aves demonstrou mudanças substanciais de sete para 14 dias de idade, em todos os tratamentos, evidenciados por meio da alteração dos principais filos e gêneros de bactérias. Aos sete dias de idades, a microbiota intestinal das aves presentou abundância de espécies diferentes para cada um dos tratamentos, mas aos 14 dias de idade a microbiota intestinal das aves eram similares em todos os tratamentos, com predominância principalmente de Pseudomonas putida. Além disso, as aves alimentadas com óleo essencial de C. sinensis apresentaram uma redução da 143 população microbiana quando comparados aos demais tratamentos, além de reduzirem a população de bactérias patogênicas como Escherichia coli em sua microbiota intestinal. Portanto é possível concluir que os óleos essenciais de C. sinensis e X. aromatica podem ser utilizados como aditivos fitogênicos na suplementação alimentar de frangos de corte uma vez que promovem alteração benéfica da microbiota intestinal, o que pode refletir direta ou indiretamente no desempenho e a saúde das aves.
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