UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PATRONES DE VARIACIÓN QUÍMICA DE POBLACIONES DEL COMPLEJO PINUS AYACAHUITE-PINUS STROBIFORMIS

Por

LETICIA MAYA ZEPEDA

Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (ÁREA DE ECOLOGÍA)

LAS AGUJAS, ZAPOPAN, JALISCO MAYO DEL 2006

PATRONES DE VARIACIÓN QUÍMICA DE POBLACIONES DEL COMPLEJO PINUS AYACAHUITE-PINUS STROBIFORMIS

Por

LETICIA MAYA ZEPEDA Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (ÁREA DE ECOLOGÍA)

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS MAYO DE 2006

Aprobada por:

______Dra. Alma Rosa Villalobos Arámbula Fecha Asesor del Comité Particular

______M. en C. Antonio Rodríguez Rivas Fecha Asesor del Comité Particular

______Dr.a Anne Santerre-Lucas Fecha Sinodal del Comité Particular

______Dr. Jorge A. Pérez de la Rosa Fecha Sinodal del Comité Particular

______Dr. Fernando A. López Dellamary Fecha Presidente del Comité Particular

Este trabajo se llevo a cabo en el Laboratorio de Cromatografía del Departamento de Madera Celulosa y Papel y en el Laboratorio de Bioprocesos del Departamento de Ingeniería de la División de Ingenierías del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías; Universidad de Guadalajara y forma parte del proyecto, “PINOS BLANCOS MEXICANOS: DIVERSIDAD GENÉTICA, QUÍMICA Y UBICACIÓN TAXONÓMICA”. financiado SEP-CONACYT (33129-B) (Responsable Dra. Alma Rosa Villalobos Arámbula), con la Beca de Proyectos de Investigación Número 3204 para Leticia Maya Zepeda. v

CONTENIDO ÍNDICE DE FIGURAS...... vi ÍNDICE DE TABLAS...... ix RESUMEN...... x SUMMARY...... xii INTRODUCCIÓN...... 1 ANTECEDENTES...... 3 1. Descripción del Complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis. 2. Variación de la Composición Química de los Pinos. 3. Quimiotaxonomía de Pinos. 4. Monoterpenos reportados en Pinos de México y Mesoamérica. 5. Biogeografía 6. Metabolómica OBJETIVO GENERAL...... 11 OBJETIVOS PARTICULARES...... 11 HIPÓTESIS...... 11 MATERIALES Y MÉTODOS...... 12 RESULTADOS Y DISCUSIÓN...... 15 CONCLUSIONES...... 40 BIBLIOGRAFÍA...... 42 ANEXOS ….………………………………………………………………………….45

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Características morfológicas de acículas, conos y semillas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis...... 17

Figura 2. Mapa de localización de los sitios de colecta ...... 12

Figura 3. Perfiles cromatográficos en diferentes extractos de acículas de P. ayacahuite Ehrenberg ex Schlechtendal, localizado en el Departamento de Madera Celulosa y Papel ………...... 15

Figura 4. Perfiles cromatográficos de ramas y acículas de P. ayacahuite y P. strobiformis ...... 16

Figura 5 . Perfiles cromatográficos de muestras de acículas extraídas sonicación ...... 17

Figura 6. Compuesto sugerido conforme a su índice de similitud ...... 18

Figura 7. Perfil cromatográfico de P. strobiformis 138, localidad de Creel en Chihuahua ...... 24

Figura 8. Perfil cromatográfico de P. ayacahuite, muestra 45b, comparado con el perfil cromatográfico de P. oocarpa, muestra 151 ...... 25

Figura 9. . Perfil cromatográfico de P. ayacahuite, muestra 45b (arriba), comparado con el perfil cromatográfico del P. ayacahuite localizado en el DMCyP (abajo) ...... 26 vii

Figura 10. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, localidad: Las Palmas, municipio de Los Reyes, Michoacán ...... 27

Figura 11. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, localidad: Comunidad de Palo Hueco, municipio de Real del Monte, en el Edo. de Hidalgo ...... 28

Figura 12. Perfil cromatográfico de acículas de de P. ayacahuite, de la localidad Km. 228 carretera 186 Palenque-San Cristóbal, municipio de San Cristóbal Chiapas ...... 28

Figura 13. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, de la localidad: Km. 4.5, 6, 9, 31 y 32 del camino Talpa-Cuale, municipio de Talpa de Allende, en el Edo. de Jalisco ...... 29

Figura 14. Comparación de los perfiles cromatográficos de acículas de P. ayacahuite muestreado en diferentes localidades ...... 29

Figura 15. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite var. Veitchii ...... 30

Figura 16. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite var. veitchii comparado con el perfil cromatográfico de acículas P. ayacahuite ...... 31

Figura 17. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: km 130 de la carretera 40 Durango-Mazatlán, 3 km al S por el camino a Chavaría, municipio de Pueblo Nuevo, en el Edo. de Durango ……………………………………………………...... 32 Figura 18. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: Observatorio INAOE, en el municipio de Cananea, en el Edo. de Sonora ...... 33 viii

Figura 19. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: Carretera Creel-Divisadero, en el municipio de Boycona, Chihuahua ...... 33

Figura 20. Comparación de los perfiles cromatográficos de acículas de P. strobiformis muestreado en diferentes localidades ...... 34 Figura 21. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Parada La Reforma, 8 km al oeste de Tlapacoyan, municipio de Tlapacoyan , Edo. de Veracruz ...... 35 Figura 22. Perfil cromatográfico de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Km. 200 carretera 195 en el municipio de Bochil, Estado de Chiapas ...... 35 Figura 23. Identificación de los compuestos elegidos ...... 36 Figura 24. Correlación de los pinos blandos analizados en el estudio ………………………...... 37

ix

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Compuestos sugeridos en ramas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis...... 19

Tabla 2. Compuestos sugeridos para acículas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis ...... 21

Tabla 3. Resumen de las funciones canónicas discriminante ...... 38

Tabla 4. Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes canónicas ……………………………………………………………………………...... 38

Tabla 5. Clasificación de los grupos ...... 39

x

RESUMEN

El complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis son pinos de condiciones ecológicas restringidas y como resultado de la enorme presión antropogénica hay una continua reducción de los bosques de estas especies. Este complejo presenta problemas para su correcta identificación porque aunque presenta algunas características distintivas, tiene muchas semejantes. Entre las características distintivas se puede mencionar las dimensiones relativas del ala de la semilla, tradicionalmente utilizadas para separar ambos taxa. El estudio de la composición de monoterpenos de las oleoresinas se ha utilizado como complemento en la definición de la variabilidad genética y ubicación taxonómica de ellos. La porción volátil es apropiada para propósitos de estudio de la geografía química de pinos. Los ácidos resínicos de coníferas son empleados también como biomarcadores. Sin embargo, no existe un tratamiento sistemático de la composición de la oleoresina de los pinos blancos mexicanos y en especial en lo que respecta a este complejo los estudios son escasos. En tal marco, este trabajo se efectuó con el objetivo de evaluar los patrones de composición química dentro y entre de las poblaciones del complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis por cromatografía de gases con el fin de comparar los perfiles cromatográficos de las especies y la variación de estos en las diferentes localidades e identificar algunos de los compuestos presentes en las muestras por medio de espectrometría de masas. El estudio estuvo enmarcado dentro del proyecto CONACYT “PINOS BLANCOS MEXICANOS: DIVERSIDAD GENÉTICA, QUÍMICA Y UBICACIÓN TAXONÓMICA”. El muestreo se llevó a cabo de marzo del 2001 a junio del 2002. Las extracciones se realizaron de acículas y ramas por el método de sonicación en pentano y fueron analizadas por CG y CG/EM. Se encontró diferencias en los perfiles cromatográficos entre las muestras de las localidades analizadas. En las acículas es evidente el mayor prporción y número de compuestos, con respecto a las ramas Las ramas poseen mayor proporción de diterpenos. El análisis xi discriminante muestra que las especies analizadas forman grupos discretos, aunque en algunos casos estos se traslapan. El patrón en los componentes químicos del complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis tiene correspondencia con su taxa. El perfil cromatográfico podría ser empleado como una útil herramienta para distinguir entre especies de diferentes localidades.

xii

SUMMARY

The Pinus ayacahuite-P. strobiformis taxonomic complex is made up of pines that grow under restricted ecological conditions, as a result of high anthropogenic pressures and the resulting reduced forested areas. This complex has taxonomic difficulties within and although there are several characteristics that differentiate each taxon from another, there are many similarities. A specific characteristic is for example the seed wing size which has been used commonly to differentiate taxa. The oleoresin monoterpene composition has been used as a complement to study the genetic variability and thus their taxonomic position. The volatile fraction has been considered appropriate to study the chemical-geography of pines. Moreover, resinic acids have been used as biomarkers in conifers. However, there has not been any report on a systematic treatment of the chemical composition of oleoresins of the Mexican white pines, indeed this group has been almost neglected. Thus, this work has been carried out to evaluate the chemical composition patterns between and within populations of the Pinus ayacahuite-P. strobiformis complex. Gas chromatography alone and coupled to Mass Spectrometry (GC and GC-MS) was chosen as the analytical tool to compare and assess the variability of the chromatographic profiles of samples obtained from different populations of the species comprising the complex. Mass spectrometry was used to identify chemically as much as possible the different and individual chromatographic peaks. This study was part of a broader project sponsored by CONACYT “ White Mexican Pines: Genetic, Chemical Diversity and Taxonomic Placement”. Sampling was carried out from March 2001 to June 2002. Extracts were obtained from pine needles and wood from branches using pentane under sonication, thereafter they were analyzed by GC(FID) and GC-MS. Clearly, differences were found in the chromatographic profiles when comparing samples from different populations and geographical regions. Pine needle extracts were more abundant in concentration and number in compounds than branch-wood extracts. xiii

Branches show a larger share of diterpenes. Statistical discriminant analysis shows that the samples here studied constitute discrete groups, although some times they overlap. The chromatographic profile-chemical composition of the Pinus ayacahuite-P. strobiformis complex exhibits a good correspondence to the taxonomic placement of its taxa. Thus, chromatographic profiles could be useful to distinguish different species from different localities.

INTRODUCCIÓN

Los pinos representan el componente dominante de la vegetación en amplias regiones del hemisferio norte. Su valor económico es muy importante como fuente de madera, pulpa celulósica, semillas, resina y otros productos. Los bosques de pinos tienen influencia en su entorno de muchas formas, afectan procesos biogeoquímicos, hidrológicos y los regímenes de incendios, proporcionan alimento y crean hábitat para muchas plantas y animales (Richardson, 1998). El género Pinus es el más grande de la familia Pinaceae con cerca de 120 especies reconocidas. El grupo tiene una distribución geográfica casi exclusiva en el hemisferio norte desde las zonas boreales hasta las francamente tropicales. Hay alrededor de 65 especies en centro y Norte-América, de las cuales 43 están representadas en México (Farjon y Styles, 1997), razón por la cual México es considerado el país más rico en especies de pinos del mundo. Mas aún, si se toman en cuenta variedades y formas reconocidas, el número de taxa aumenta a aproximadamente a 70 (Perry, 1991).

El complejo taxonómico Pinus ayacahuite Enrenberg ex. Schlechtendal -P. strobiformis Engelm. se encuentra ubicado dentro del subgénero Strobus, sección Strobus, subsección Strobi (Little y Critchfield, 1969), formando parte del grupo de pinos conocido como pinos blancos. Al ser pinos de condiciones ecológicas restringidas y como resultado de la enorme presión antropogénica hay una continua reducción de los bosques de estas especies, lo que afecta la distribución y calidad fenotípica de las poblaciones de Pinos Blancos Mexicanos (Mirov, 1997; Hernández, 1991; Ramírez, 1990).

El complejo taxonómico Pinus ayacahuite-P. strobiformis, presenta características similares morfológicamente, lo que dificulta frecuentemente su correcta identificación. Aunque se han definido tres variedades de P. ayacahuite: P. ayacahuite Ehrenb. Ex Schtdl. var. ayacahuite, P. ayacahuite Ehrenb. ex Schltdl. var. brachyptera Shaw (Martínez, 1948), existe aún controversia en relación a la variedad brachyptera, ya que las diferencias se han considerado a nivel específico con el nombre de P. strobiformis (Little y Critchfield, 1969).

El estudio de la composición de monoterpenos de las oleoresinas se ha utilizado en la definición de la variabilidad genética y ubicación taxonómica de ellos. Sin embargo, no existe un tratamiento sistemático de la composición de la oleoresina de los pinos blancos mexicanos; en especial no se conocen con detalle los sesquiterpenos y ácidos diterpénicos. Tampoco hay estudios sistemáticos de los ciclitoles identificados en algunos pinos blancos entre ellos Pinus lambertiana "sugar pine" y Pinus ayacahuite. La porción volátil de las oleoresinas ha sido considerada como la más apropiada para propósitos de estudio de la geografía química de pinos (Mirov, 1967).

En tal marco, este trabajo se efectuó con el objetivo de determinar los perfiles de los componentes químicos de acículas y ramas del complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis. Con ello se espera contribuir con el conocimiento del complejo y de los productos naturales obtenidos de este recurso.

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ANTECEDENTES

1. Descripción del Complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis El género Pinus está dividido en dos subgéneros, el Pinus y el Strobus. La sección Strobus subsección Strobi del subgénero Strobus abarca a los llamados pinos blancos, que son alrededor de 16 especies en todo el mundo. En el noreste de Norteamérica, el Pinus strobus L., es uno de los más importantes árboles maderables, el cual es plantado ampliamente, lo mismo el P. lambertiana Dougl. en el Oeste Norteamericano. En México están representados principalmente por el complejo taxonómico P. ayacahuite-P. strobiformis y el Pinus strobus var chiapensis Martínez, además de unas pequeñas poblaciones norteñas de Pinus lambertiana en San Pedro Mártir, Baja California y de Pinus flexilis James en Chihuahua, Coahuila y Nuevo León (Farjon y Styles, 1997).

En México estos pinos se encuentran de manera dispersa, casi nunca formando masas puras y en muchos casos en poblaciones aisladas (Pérez de la Rosa, 1993; Ramírez y Musálem, 1999). De este grupo el Pinus strobus var. chiapensis (= Pinus chiapensis) y el complejo P. ayacahuite-P. strobiformis son los más explotados comercialmente en México.

El complejo P. ayacahuite-P. strobiformis presenta problemas para su correcta identificación al poseer muchas características semejantes y algunas distintivas; entre éstas últimas las dimensiones relativas del ala de la semilla, tradicionalmente utilizadas para separar ambos taxa. Little y Critchfield (1969), señalan que estas especies se encuentran ubicadas en la subsección Strobi y forman parte del complejo Pinus flexilis-P. strobiformis- P. ayacahuite. Estos poseen fascículos de vaina caediza y cinco acículas de 6-11.5 cm de longitud, conos ligeros de 20-45 cm de longitud (Fig. 1). Son árboles en general de gran porte, de hasta 200 cm de diámetro y hasta 50 m de altura (Farjon y Styles, 1997), con fustes rectos, de madera clara de buena calidad, ligera y fácil de trabajar, con amplia demanda en carpintería de muebles, construcción, torneados, ebanistería, etc. El tallo y las ramas también se usan como leña, la planta completa es explotada actualmente como el

3 árbol de Navidad Mexicano (SEMARNAT, 2003). En el proceso Kraft para obtener pulpa celulósica se obtiene aguarrás, colofonia y ácidos grasos. El aguarrás puede destilarse y así separar compuestos de alto valor como precursores para síntesis orgánica de aromas, perfumes y fármacos. La colofonia tiene más alto valor cuanto mayor cantidad de ácidos diterpénicos diinsaturados contenga, pues pueden ser condensados por reacciones Diels- Alder para la preparación de encolantes en la fabricación del papel y cartón (Drew y Props., 1981).

Clasificación de los pinos blancos mexicanos Reino: Vegetal División: Espermatofita Subdivisión: Gymnospermae Orden: Coniferales Familia: Pinaceae Género: Pinus Subgénero: Strobus Sección: Strobus Subsección: Strobi Especies: Pinus lambertiana Dougl. Pinus flexilis James Pinus strobiformis Engelm. Pinus chiapensis (Martínez) Andersen Pinus ayacahuite Enrenberg ex. Schlechtendal var. veitchii Shaw var. brachyptera Shaw (Perry, 1991; Farjon y Styles, 1997).

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Pinus ayacahuite var. veitchii* Pinus strobiformis * Fig. 1. Características morfológicas de acículas, conos y semillas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis. * Ilustraciones por Rosemary Wise (Farjon et al., 1995)

Debido a su amplia y fragmentada distribución, los ejemplares de P. ayacahuite-P. strobiformis presentan tendencia a cierta variación ecotípica, Silba (1990) describe hasta cuatro variedades (P. ayacahuite var. loudoniana (Gordon) Silba, P. ayacahuite var. oaxacana Silba, P. ayacahuite var. veitchii (Roezl) Shaw y P. strobiformis var. potosiensis Silba). En Jalisco existe una población de P. ayacahuite que presenta características morfológicas intermedias entre las poblaciones del norte y del centro. Ésta ha sido definida como: P. ayacahuite var. brachyptera Shaw (Martínez, 1948), P. ayacahuite var. novogaliciana Carvajal (Carvajal, 1986).

Pinus ayacahuite es mas frecuente en bosques mixtos de coníferas en sitios mesófilos de montaña. Su mejor desarrollo lo alcanza en suelos margosos y bien drenados, en altitudes entre 1500-3600 msnm. En México se encuentra según Frajon en Guanajuato, Querétaro, Hidalgo, Puebla, Veracruz, Tlaxcala, México, Morelos, Michoacán, Guerrero, Oaxaca y Chiapas (Farjon et. al., 1995).

5 Pinus strobiformis habita pinares y bosques mixtos de pino y encino de montaña, en sitios mesófilos con suelos relativamente profundos, también en laderas de exposición norte y en bosques de coníferas de las altas montañas con Abies y/o Pseudotsuga; en altitudes entre 1900-3500. En México se encuentra principalmente en la Sierra Madre Occidental y Sierra Madre Oriental, en Sonora, Chihuahua, Coahuila, Nuevo León, Sinaloa, Durango, Jalisco y muy localmente en Zacatecas y San Luis Potosí (Farjon et. al., 1995).

2. Variación de la Composición Química de los Pinos Los metabolitos secundarios de las células de las plantas, son compuestos de bajo peso molecular que no están involucrados en la actividad del metabolismo principal, incluidos monoterpenos C10, sesquiterpenos C15 y diterpenos C20 (Croteau y Johnson, 1985). En los canales resiníferos se produce la oleoresina que es una mezcla de compuestos terpenoides, flavonides y de ácidos grasos, éstos juegan un papel importante en la resistencia a enfermedades y en la defensa contra el ataque de insectos fitófagos y hongos (Phillips y Croteau, 1999).

Dado que la resina se sintetiza en los ductos resiníferos de cada tejido específico la composición obtenida de diferentes fuentes del mismo árbol no es la misma. Las concentraciones de monoterpenoides pueden variar entre los diferentes tejidos de un mismo árbol, entre los mismos tejidos del mismo árbol y entre localizaciones geográficas diferentes (Mannien et al., 1998).

Los estudios relacionados con la composición química de la trementina en acículas y madera son escasos (Sjödin et al., 1996, 2000; Kleinhentz et al., 1999; Latta et al., 2000). Recientemente, Mannien (2002) reportó para Pinus sylvestris L que la concentración de monoterpenos es más grande en acículas que en madera, y que la madera tiene más ácidos resínicos triciclicos que las acículas. La composición varía en el mismo sistema a diferentes exposiciones cardinales del mismo árbol (Rockwood, 1973; Roberts, 1970). Hay variación por el estado de desarrollo del árbol y con la estación del año (von Rodloff, 1975). Loreto et al., (2000), han determinado que la emisión de monoterpenos es mayor en plantas jóvenes y que la cantidad es diferente en acículas primarias que en secundarias. El estrés

6 generado por la sequía incrementa las concentraciones de varios monoterpenos y ácidos resínicos en Pinus sylvestris. (Turtola et al., 2003, Langenheim, et al., 1979).

Una infestación por insectos puede incrementar la producción de monoterpenos y diterpenos (Rafa & Berryman, 1983). Los monoterpenos constituyen parte de los volátiles de estas especies de coníferas y muchos de ellos se han encontrado ser activos en la interacción insecto-conífera. También ha sido reportada la variación intraespecífica en la cantidad relativa de monoterpenos, así como en su composición enantiomérica. Se conoce de grandes diferencias entre los contenidos de los tejidos del mismo árbol. Esta variación en la composición de monoterpenos puede afectar la preferencia de los insectos por un tejido específico o por un árbol en particular (Sjödin et al., 1996; Loreto et al., 2000).

3. Quimiotaxonomía de Pinos Los criterios alternativos a los morfológicos que sean útiles para la clasificación y la identificación de taxa en grupos de plantas en donde la falta de consenso en la ubicación y delimitación de los diferentes elementos es una constante, como es el caso del género Pinus, pueden ser de mucha utilidad. Para que los componentes químicos de las plantas tengan importancia taxonómica, deben tener ciertas características, con patrones o perfiles tendientes a ser especie-específicos; es decir, una variación correlacionada y coherente entre taxa (Almaraz, 2000).

La composición de monoterpenos de las oleoresinas de los pinos ha sido ampliamente usada para ayudar en el estudio de la variabilidad genética y filiación taxonómica de ellos (Mirov, 1967; Perry, 1991; Farjon Styles, 1997; Donahue, 1995). Se piensa convencionalmente que los monoterpenos están bajo control genético, y que los niveles totales de éstos varían con la estación y la fenología (Langenheim, 1994). Los datos de monoterpenos tienen un papel importante en la delimitación de especies, como complemento a caracteres taxonómicos. Los ácidos resínicos de coníferas son empleados también como biomarcadores (Simoneit, 2005).

7 Inicialmente los caracteres cualitativos o discretos (la presencia o la ausencia de compuestos) han sido utilizados para examinar relaciones o para delimitar taxa, pero cuando la especie investigada presentaba el mismo sistema de compuestos, los rasgos cuantitativos ofrecen mejor apoyo para dicha delimitación de taxa. Ocasionalmente los datos de monoterpenos demuestran las diferencias cualitativas entre especies, pero a menudo son el reflejo de un muestreo inadecuado en uno o más niveles. También sucede que un compuesto que había sido declarado ausente en una población de estudio puede ser detectado en porciones pequeñas, o en frecuencias bajas en otra población (Birks y Kanowski, 1988). Algunos pinos, que se suponían estrechamente relacionados, pueden tener oleoresinas de diferente composición, por otro lado, se sabe que dos especies taxonomicamente remotas pueden tener oleoresinas de similar composición (Birks, 1997).

A pesar de que numerosos estudios acerca de la composición de oleoresina de varias especies de pinos han sido publicados desde principios del siglo pasado, lamentablemente un número limitado de ellos se refiere a los pinos blancos mexicanos. Mirov (1961) en su publicación “Composición de las Trementinas de los Pinos Mexicanos” es el único antecedente de análisis químico, en él se describe de manera somera la composición de la trementina de P. ayacahuite.

4. Monoterpenos reportados en Pinos de México y Mesoamérica Las oleoresinas de pinos mexicanos y mesoamericanos se diferencian claramente de otros pinos; los constituyentes principales reportados han sido α-pineno y β-felandreno, el β- felandreno es casi único para las especies de México y Mesoamérica (Mirov, 1967). El ∆-3- careno y el longifoleno son constituyentes comunes de las oleoresinas, raramente encontrados en pinos de otras regiones excepto en especies del oeste de Norteamérica con la cuales hay relación estrecha. La oleoresina de Pinus jeffreyi, especie del norte de México, es dominada por n-heptano y mínima proporción de α-pineno. P. culteri, al norte de México posee una resina en la cual en sus componentes químicos domina α-pineno más β-felandreno. (Birke y Kanowski, 1988).

8 Entre los sesquiterpenos (C15) de alguna posible importancia comercial, figuran las sustancias análogas al cadineno, estos se emplean como fijadores (porta-aromas) en la industria de la perfumería. El longifoleno, un sesquiterpeno que anteriormente sólo había sido encontrado en dos pinos de la India, es el sesquiterpeno más común en las trementinas mexicanas (así como en las de Norteamérica occidental). La presencia de un hidrocarburo parafínico semejante al queroseno, el undecano normal (C11H24) en algunas trementinas mexicanas tiene interés científico; pero existe otro hidrocarburo parafínico, el n-heptano

(C7H16), que se ha encontrado en por lo menso seis pinos mexicanos (Mirov, 1967).

5. Biogeografía De la misma manera que el estudio de grupos sanguíneos se usa para estudios del origen y migración de diferentes razas humanas, la distribución geográfica de los constituyentes químicos puede ser usada en estudios del género Pinus (Mirov, 1961, 1967). Con este propósito la porción volátil de las oleoresinas ha sido considerada como la más apropiada. Mirov en la década de los 60 hace una contribución valiosa a este respecto, reportando que el α-pineno se ha encontrado en toda el área donde esta distribuido el género Pinus, variando solamente la proporción. Se encuentra más β-pineno en las especies encontradas en el este de Norte América y en Euroasia que en el oeste de América y México. El ∆- careno se ha reportado en el este asiático y oeste americano. metil chavicol se encuentra solamente es pinos del Nuevo Mundo, hacia el sur de la distribución general del género Pinus. El longifoleno ha sido reportado en más especies de pinos del oeste de Estados Unidos (no ha sido encontrado es especies del este), en especies de México y en unas pocas en Asia. Para un alcano, el n-heptano la distribución esta restringida al oeste de Estados Unidos y en algunas especies a lo largo de México.

6. Metabolómica (Metabolomics) La metabolómica es el “estudio sistemático de la huella digital particular de los productos de un proceso celular específico” - concretamente, el estudio de los perfiles de metabolitos de bajo peso molecular. Representa la colección de metabolitos en un organismo biológico, la cual es el producto final que resulta de la expresión genética. En la metabolómica, el objetivo principal es identificar diferencias en los perfiles metabólicos entre las muestras (Bahlla, et al., 2005). La huella digital obtenida puede ser usada como una herramienta de

9 clasificación. La meta ideal sería llegar a identificar y cuantificar todos y cada uno de los metabolitos en un sistema biológico (Jonsson et al., 2005).

La metabolómica es una herramienta poderosa para estudiar los cambios en la expresión genética y los efectos fenotípicos y metabólicos provocados por la repuesta al ambiente o al estrés. La clasificación de la muestra es rápida, representa un análisis global, sin la identificación precisa de los compuestos. Los resultados no son realmente cuantitativos, pero son consistentes para un análisis comparativo (Glass, 2000).

La metabolómica es una ciencia multidisciplinaria, requiere la cooperación entre químicos, biólogos e informáticos. No se utiliza un método analítico único, para detectar al conjunto de metabolitos en un sistema aislado de un tejido biológico, se requiere la preparación de un extracto. La elección del disolvente usado inicialmente para la extracción inmediatamente dictamina la clase de compuestos presentes en el extracto. Actualmente no existe un método analítico único capaz de detectar todas las clases de metabolitos y diferenciarlos. Por lo tanto se aplican una amplia variedad de métodos y los datos resultantes se conjuntan para evaluar y proporcionar el panorama más completo posible del estado metabólico del organismo en estudio. Las técnicas mas utilizadas son: Cromatografía de Gases (GC), Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (CG/EM).

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OBJETIVO GENERAL

Evaluar los patrones de composición química dentro y entre de las poblaciones del complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis por cromatografía de gases.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1.- Establecer el método de extracción adecuado para acículas y ramas 2.- Identificar algunos de los compuestos presentes en las muestras por medio de espectrometría de masas 3.- Comparar los perfiles cromatográficos de las especies y la variación de estos en las diferentes localidades

HIPÓTESIS

El patrón en los componentes químicos del complejo Pinus ayacahuite-P. strobiformis puede tener correspondencia con su taxa.

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MATERIALES Y MÉTODOS

1. Área y métodos de muestreo. Se analizaron las muestras colectadas para el proyecto CONACYT “PINOS BLANCOS MEXICANOS: DIVERSIDAD GENÉTICA, QUÍMICA Y UBICACIÓN TAXONÓMICA”. El muestreo se llevó a cabo de marzo del 2001 a junio del 2002 (Anexo 1). Las localidades donde se colectó el material se señalan en la figura 2.

Atlas mundial Encarta 1996 Fig. 2. Mapa de localización de los sitios de colecta

Se estudió la composición química en acículas de 132 individuos y en ramas de 20 individuos. En todos los casos se eligieron árboles adultos y de apariencia sana, las muestras fueron colectadas en diferentes condiciones ecológicas. Con fines comparativos se analizó también una muestra de acículas de Pinus oocarpa, colectada en el campo experimental del Bosque Escuela en la Sierra de La Primavera (área de protección) localizado en el municipio de Tala, Jalisco; la fecha de colecta se realizó el día 30 de octubre de 2005.

12 2. Tratamiento de las muestras.

Ramas: se seleccionaron ramas maduras de pinos tomados al azar de la población. Para minimizar la volatilización de compuestos entre el campo y laboratorio, las muestras fueron refrigeradas. Una vez en el laboratorio, se tomó una muestra del extremo de la rama distante al corte inicial para reducir la influencia sobre la composición que se hubiera causado con el primer corte. Se cortó una rebanada con espesor de 2 cm, se le despojó de la corteza y se redujo a astillas, posteriormente fueron congeladas con nitrógeno y molidas. Se pesó una alícuota de aproximadamente 10.0 g y se sometió a extracción con 20 mL de pentano sonicandola durante 15 minutos (Sulman et al., 1998; Semagina et al., 2000; Conners et. al., 2001), utilizando el aparato de ultrasonido marca Bransonic, modelo 5210R.

Acículas: Igualmente se transportaron al laboratorio bajo refrigeración. Se tomaron aproximadamente 5 g de acículas, las cuales se congelaron con nitrógeno líquido para ser molidas y se sometieron a extracción con 20 mL de pentano (Sjödin et al., 1996) y se sonicaron durante 15 minutos. Concluido el tiempo de extracción, las muestras se filtraron y concentraron hasta un volumen de 0.5 mL y se almacenaron a –25 º C hasta su posterior análisis. A cada extracto se adicionaron 2µL de una solución de guayacol (concentración 4.5 mg/mL en pentano), como estándar interno.

3. Materiales El pentano utilizado en la extracción es grado HPLC, de Laboratorios Caledon (Ontario, Canada) y el guayacol es grado espectroscópico marca Merck (Darmstadt, Alemania).

4. Análisis Químico Los cromatogramas se obtuvieron con un Cromatógrafo de Gases/Detector de Ionización de Flama (GC/F.I.D.), marca Chrompack mod CP9000 bajo las siguientes condiciones de análisis: tipo de columna, DB 5 (5% difenil, 95% dimetilsiloxano); largo de columna, 30.0 m; diámetro de columna, 0.32 mm, y película de 0.20 µm; gas portador He; a flujo de 1.0

13 mL/min; relación de split, 1:3; inyector a temperatura de 250 º C; en el horno el siguiente programa de temperaturas: temperatura inicial, 70 º C con un tiempo inicial de 5 min., incremento de 5 º C por min. hasta llegar a 220 º C, con tiempo final de 19 min., inyectando 1 µL de muestra. Los espectros de masas fueron registrados con un Cromatógrafo de gases/ Espectrómetro de masas (CG/EM), marca Varian modelo 1090, Espectrómetro de Masas marca Varian modelo Saturno. El CG/EM fue operado bajo las siguientes condiciones: Cromatógrafo de gases; tipo de columna, DB 5 (5% difenil, 95% dimetilsiloxano); largo de columna, 30.0 m; diámetro de columna, 0.25 mm, y película de 0.25 µm; gas portador He; a flujo de 1.0 mL/min; relación de split, 1:3; inyector a temperatura de 250 º C; en el horno el siguiente programa de temperaturas: temperatura inicial, 70 º C con un tiempo inicial de 5 min., incremento de 5 º C por min. hasta llegar a 220 º C, con tiempo final de 19 min., inyectando 1 µL de muestra. Espectrómetro de masas; modo EI; EI energía de 70 eV, intervalo de masas 20-600 Daltons, scan/min, 0.98; trampa 250 º C, manifold 35 º C y línea de transferencia a 250 º C.

El perfil cromatográfico generado por cada muestra fue analizado en forma visual y empleado como huella digital con la finalidad de comparar entre los individuos y especies colectadas de las diferentes localidades y entre los tejidos analizados (ramas y acículas). Los nombres de los componentes sugeridos fueron identificados por comparación del generado por cada muestra con la espectroteca del banco de datos NIST98, y seleccionado como posible conforme a su índice de similitud.

Con la finalidad de comparar los componentes químicos de las muestras colectadas en las diferentes localidades, se eligieron al azar 20 compuestos, bajo el criterio de mayor abundancia aparente, representada por el área bajo la curva (cuando se menciona proporción del compuesto se refiere al área bajo la curva, del análisis correspondiente). Los datos obtenidos se analizaron con el método estadístico de Análisis Discriminante, en el programa Statgraphics Plus V.5.

14

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1 Método de extracción En la fig. 3 se presentan los perfiles cromatográficos de 2 extractos de acículas de P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal, de 6 años de edad, colectado en el DMCyP, el árbol fue germinado de semilla proveniente de la población de Cuale-Talpa, Jalisco. Las extractos fueron obtenidos por dos métodos diferentes: sonificación y maceración. Se observó que el extracto en pentano y sonicado durante 15 min. se intensificó la extracción de compuestos, lo que concuerda con los estudios de Sulman et al., 1998; Semagina et al., 2000; Conners et. al., 2001; en contraposición con el extracto extraído durante 24 horas en

CH2Cl2:MeOH 3 : 1 el cual presenta una concentración menor.

MCounts RIC all 050.sms

70 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal (DMCyP)

60 Extracto en pentano y sonicado.

50

40

30

20

10

0

MCounts RIC all 051.sms

70 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal (DMCyP)

60 Ext. CH2Cl2:MeOH 3 : 1

50

40

30

20

10

0

10 20 30 40 minutes

Fig. 3. Perfiles cromatográficos en diferentes extractos de acículas de P. ayacahuite Ehrenberg ex Schlechtendal, localizado en el Departamento de Madera Celulosa y Papel

15

2 Método de análisis cromatográfico para ambos tipos de tejidos

Se realizó una comparación entre el perfil cromatográfico de ramas y acículas de la muestra 54 de P. ayacahuite y la muestra 129 de P. strobiformis (anexo 1). En general las acículas contienen aproximadamente 10 veces más proporción de compuestos y son más abundantes en compuestos volátiles (fig. 4).

P. ayacahuite

C10 y C15 C20

Acículas

Rama

P. strobiformis

C20

C10 y C15

Acículas Rama Rama

Fig. 4. Perfiles cromatográficos de ramas y acículas de P. ayacahuite y P. strobiformis

16

Mannien (2002) ha reportado para Pinus sylvestris que la concentración de monoterpenos es más grande en acículas que en madera; en la madera predominan ácidos resínicos triciclicos.

Se compararon las muestras 101, 27, 89, 17 y 54, de acícula de diferentes taxa y se encontró que la proporción de los compuestos es similar; excepto que en la muestra 54 hay un compuesto predominante con un alta concentración (fig. 5).

101 P. strobiformis 27 P. cembroides 89 P. culmínicola 17 P. strobus 54 P. ayacahuite

Fig. 5. Perfiles cromatográficos de muestras de acículas extraídas por sonicación

3 Identificación por espectrometría de masas de algunos compuestos presentes en las muestras

Los análisis fueron realizados en dos equipo analíticos con principios diferentes de detección, por lo que es importante considerar que la comparación entre los perfiles cromatográficos, la correspondencia con los tiempos de retención se muestra desplazada.

Los nombres de los compuestos sugeridos fueron identificados por comparación con la espectroteca NIST98, y elegido como compuesto posible conforme a su índice de similitud (fig. 6). En las Tablas 1 y 2 se resumen los compuestos encontrados en ramas y acículas del

17 complejo P. ayacahuite-P. strobiformis, algunos de los compuestos sugeridos aparecen bajo el mismo nombre, esto se debe a que se tratan de compuestos con espectro de masa semejante, diferenciados solamente por la proporción de la abundancia de los fragmentos generados. Adicionalmente debe considerarse que bajo ésta metodología de análisis es frecuente la co-elución de enantiomeros, por lo que los espectros de masa generados no corresponden a un compuesto puro, sino a la mezcla de estos isómeros ópticos (Sjödin, et al., 2000).

Spect 1 BP 91 (108598=100%) 026.sms 20.330 min. Scan: 1282 Chan: 1 Ion: 314 us RIC: 1288802

100% 91

75%

79 105 41 133

50% 67

119 161 25% 53 147 189

175 204 228 281 0%

50 100 150 200 250 m/z MCounts RIC all 026.sms

1.00 20.327 min

0.75

0.50

0.25 19.565 min

18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 minutes Segment 2 Scans 1134 1165 1197 1229 1261 1293

Purity = 922 Fit = 960 RFit = 922 Average = 934 Ion Range: 29 - 238 Spect 1 BP 91 (108598=100%) 026.sms 20.330 min. Scan: 1282 Chan: 1 Ion: 314 us RIC: 1288802 91 100%

75% 79 105 41 133 50%

119 161 25% 53 147 189 175 204 228 0% Match 3 of 200 Caryophyllene BP 93 (100000=100%) 9913 in nist98r.lbr CAS No. 87-44-5, C15H24, MW 204 93 100% 41 69

75% 133 79

50% 105 55 120 161 147 25% 204 29 189 175

0%

Fig. 6. Compuesto sugerido conforme a su índice de similitud

18

Tabla 1. Compuestos sugeridos en ramas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis Índice de # Tr min Similitud % Nombre del compuesto

1. 5.40 α-pineno 97 2. 5.70 α-pineno 96 3. 6.59 β-pineno 95 4. 6.71 6,6-dimetil-2-metilen-, (1S)-biciclo[3.1.1]heptano 94 5. 7.77 Ácido hexanóico 96 6. 9.63 Cis-β-terpineol 96 7. 10.5 Guayacol (Estándar interno) 99 8. 10.73 Undecano (1881 S4) 95 9. 12.16 4,6,6-trimetil-biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-ol 90 10 12.84 Borneol (1881 S4) 91 11 13.82 p-alil-anisol 97 12 14.15 Biciclo[3.1.1]hept-3-en-2-one, 4,6,6-trimetil-, (1S)- 97 13 16.47 Acetato de bornilo 99 14 16.61 (E,E)-2,4-Decadienal 91 15 17.25 (E,E)-2,4-Decadienal 94 16 18.92 [1S-(1.alfa.,2.alfa.,3a.beta.,4.alfa.,8a.beta.,9R*)]-1,2,4- decahidro-1,5,5,8a- 99 tetrametil- metanoazuleno 17 19.03 Copaeno 98 18 19.43 NI 19 19.86 [1S-(1.alfa.,3a.beta.,4.alfa.,8a.beta.)]-decahidro-4,8,8-trimetil-9-metilen-1,4- 98 metanoazuleno 20 20.44 (+)-Epi-biciclosesquifelandreno 95 21 21.62 1,2,4a,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil)- naftaleno 98 22 22.21 α-muuroleno 99 23 23.64 3,7,11-trimetil-, (E)-1,6,10-Dodecatrien-3-ol, 91 24 25.55 Copaeno 96 25 28.75 Ácido pimárico 83 26 29.06 Ácido pimárico 83 27 30.10 Ácido pimárico 90 28 32.28 Ácido n-hexadecanóico 98 29 35.92 Metil ester del ácido 9,12-octadecadienóico (Z,Z) 95

19 30 37.74 Ácido abiético 95 31 37.83 Ácido abiético 99 32 40.33 Ácido abiético 91 33 40.00 Nonadecano 97 34 40.45 11-Tricoseno 99 35 43.24 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 99 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 36 45.8 NI 37 47.32 NI

20

Tabla 2. Compuestos sugeridos en acículas del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis. Índice de # tr Similitud Nombre del compuesto min % 1. 2.12 n-heptano 85 2. 2.32 Metil ciclohexano 88 3. 2.58 2-metil-heptano 83 4. 2. 94 2,4-dimetil-heptano 87 5. 5.45 α-pineno 91 6. 5.75 3-careno 91 7. 6.20 camfeno 90 8. 7.05 β-pineno 95 9. 7.40 β-pineno 91 10 8.09 3-careno 92 11 8.37 D-limoneno 90 12 8.68 NI 13 10.5 Guayacol (estándar interno) 83 14 11.1 Tujol 73 15 12.21 4-metilen-1-(1-metiletil), biciclo[3.1.0.] hexan-3-ol., 84 16 12.37 Camfor 83 17 12.51 Hidrato de cis-sabineno 69 18 13.29 2,6,6,trimetil(1-alfa,2,alfa) biciclo[3.1.1]heptan-3-ona. 81 19 13.79 α,α,4-trimetil- bencen metanol 90 20 14.34 2,7,7-trimetil biciclo[3.1.1]hepten-2-en-ona 87 21 15.09 2-metoxi-4-metil-1-C-(metiletil), benceno 93 22 15.52 4-(2-propenil)-fenol 95 23 16.51 1,2,4,-trietilbenceno 93 24 16.61 Acetato de bornilo 87 25 18.35 2,6,6,9-tetrametil-triciclo[5.4.0.0(2,8)]undec-9-eno 98 26 19.03 1,2,3,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil)-, (1S-cis)- naftaleno, 83 27 19.43 1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-1,4-dimetil-7-(1- metiletenil)-, [1S- 96 (1.alfa.,7.alfa.,8a.beta.)]- azuleno 28 19.85 Decahidro-4,8,8-trimetil-9-metilen-, [1S-(1.alfa.,3a.beta.,4.alfa.,8a.beta.)]- 99 1,4-metanoazuleno, 29 20.30 α-Cariofileno 98

21 30 21.18 (+)-epi-biciclo, sesquifelandreno 85 31 21.43 1-dodeceno 83 32 21.86 1,2,3,4,4a,5,6, 8a-octahidro-7-metil-4-metilen-1-(1-metiletil), naftaleno 83 33 22.66 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidro-7-metil-4-metilen-1-(1-metiletil), naftaleno 90 34 2 2.86 1,2,3,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil),(1S-cis)-naftaleno 88 35 23.63 Ácido tridecanóico 90 36 24.24 Óxido de cariofileno 86 37 25.38 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-ácido 1-fenantrenecarboxílico 38 25.47 Epóxido de isoaromadendreno 89 39 25.61 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidro-7-metil-4-metilen-1-(1-metiletil), naftaleno 86 40 25.93 Tau-murolol 84 41 26.28 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 42 27.68 Ácido pimárico 90 43 28.08 Ácido tetradecanoico 95 44 28.87 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 45 29.05 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 46 29.69 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 47 30.54 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 48 30.99 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 91 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 49 31.42 Metil ester del ácido 14-metil-pentadecanóico 98 50 32.28 Dibutilftáto 80 51 32.31 Ácido hexadecanóico 95 52 32.59 NI 53 32.81 Ácido abiético 83 54 33.10 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 79 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 55 33.73 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 56 34.87 6,8,9-trimetil-4-(2-feniletil)-3-oxabiciclo[3.3.1]non-6-en-1-il)- metanol. 84

22 57 35.47 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 58 35.80 Metil ester del ácido 9,12-octadecadienóico 99 59 36.09 Metil ester del ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrienóico 99 60 36.54 Fitol 99 61 38.09 NI 62 39.55 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 90 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico 63 41.92 NI 64 42.81 NI 65 43.69 Ciclododecino 84 66 45.10 NI 67 47.91 Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R- 91 (1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1-fenantrencarboxílico

23 4. Metabolómica a partir de Cromatografía de Gases

La muestra 138 de Pinus strobiformis, presenta el patrón de perfil cromatográfico de los 20 compuestos elegidos para el análisis de las 132 muestras analizadas en el estudio (fig. 7, anexo 3).

Fig 7. Perfil cromatográfico de P. strobiformis 138, localidad de Creel en Chihuahua

Los perfiles cromatográficos obtenidos vía CG/FID se analizaron en forma visual, ejemplos de estos perfiles cromatográficos se muestran en las figuras 8-19.

La comparación de un pino duro como Pinus oocarpa con un pino blando P. ayacahuite, muestra 45b, muestra diferencias en su composición; el cual es observado en el perfil cromatográfico (fig. 8). En el perfil cromatográfico de P. ayacahuite están representados un mayor número de compuestos distribuidos a través de los 50 minutos del análisis, comparado con el perfil cromatográfico de l amuestra 151, donde el mayor número de compuestos eluidos aparecen entre los 20 y los 27 min.

24

MCounts RIC all 027.sms

12.5 P. ayacahuite

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

MCounts RIC all 151.sms P. oocarpa 30

20

10

0

10 20 30 40 50 minutes

Fig. 8. Perfil cromatográfico de P. ayacahuite, muestra 45b, comparado con el perfil cromatográfico de P. oocarpa, muestra 151

El perfil cromatográfico de acículas, de una muestra de P. ayacahuite, que corresponde a la muestra 45b colectada en la localidad de Real del Monte en Hidalgo, comparado con una muestra de P. ayacahuite localizado en el Departamento de Madera Celulosa y Papel (DMCyP), los perfiles son similares en lo que se refiere a los compuestos presentes, la diferencia entre ellos es la proporción en que los compuestos se encuentran; siendo menor en la muestra 45b (fig. 9). Es probable, que esta diferencia sea atribuída a que la colecta localizada en el DMCyP fue procesada de manera inmediata después de su corte, por el contrario en la muestra 45b transcurrieron días antes de su procesamiento. Este hecho influye en la conservación y permanencia de los compuestos, algunos de los cuales se volatilizan muy rápidamente, por ejemplo los del grupo de los monoterpenos que es el caso de este estudio.

25

MCounts RIC all 027.sms

70

60

50

40

30

20

10

0

MCounts RIC all 050.sms

70

60

50

40

30

20

10

0

10 20 30 40 minutes Fig. 9. Perfil cromatográfico de P. ayacahuite, muestra 45b (arriba), comparado con el perfil cromatográfico del P. ayacahuite localizado en el DMCyP (abajo)

Por otro lado, las acículas de seis individuos (muestras 3, 4, 5, 6 y 9) de la localidad Los Reyes, Michoacán fueron analizados (Anexo 1). De la comparación entre ellas (fig. 10) se observa similar proporción en los compuestos presentes excepto que el compuesto eluido a los 34 min (un ácido resínico), en las muestras 4 y 5 se presenta en mayor proporción. Esto es discutido por algunos autores (Roberts, 1970; Rockwood, 1973; Langenheim, et al., 1979; Turtola et al., 2003), lo cual es posible que se atribuya al stress hídrico. En los perfiles cromatográficos de las muestras de acícula de P. ayacahuite, localidad: Comunidad de Palo Hueco, municipio de Real del Monte, en el Edo. de Hidalgo, se observa baja proporción de compuestos (muestras 39-45B) (fig.11, anexo 1) cuando se compara con P. ayacahuite de las localidades de Las Palmas, municipio de Los Reyes, Michoacán (fig. 10); con las muestras Km. 4.5, 6 y 9, 31, y 32 del camino Talpa-Cuale, municipio de Talpa de Allende, en el Edo. de Jalisco y las muestras 83 a 89, de la localidad Km. 228 carretera 186 Palenque-San Cristóbal, municipio de San Cristóbal Chiapas (fig 12, anexo 1). Lo mismo ocurre con la muestra 29, de la localidad Omitlán, Guerrero y las muestras 48 y 49 de la localidad: Barranca El Copal, municipio de Pinal de Amoles, estado de Querétaro (anexo 1, figuras no mostradas).

26

6 4 5 9 3

Fig. 10. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, localidad: Las Palmas, municipio de Los Reyes, Michoacán

27

Fig.11. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, localidad: Comunidad de Palo Hueco, municipio de Real del Monte, en el Edo. de Hidalgo

Volts c:\star\data\1800.8006-12-0385+ si aciculas001.run c:\star\data\1800.8004-11-0388 + si aciculas.run c:\star\data\1800.8031-10-0389 aciculas+si.run 1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

-0.12 10 20 30 40 50 Minutes Fig. 12. Perfil cromatográfico de acículas de de P. ayacahuite, , de la localidad Km. 228 carretera 186 Palenque-San Cristóbal, municipio de San Cristóbal Chiapas

En los perfiles cromatográficos de las muestras 51, 54, 55, 56, 57, 60 (anexo 1), extraídos de acículas de P. ayacahuite, de la localidad: Km.32,32, 4.5, 6 y 9 del camino Talpa-Cuale, municipio de Talpa de Allende, en el Edo. de Jalisco, se observa mayor proporción del compuesto que aparece a los 34 min (fig. 13).

28

Fig. 13. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite, de la localidad: Km. 4.5, 6 , 9, 31 y 32 del camino Talpa-Cuale, municipio de Talpa de Allende, en el Edo. de Jalisco

89 34 42 34 3

Fig. 14. Comparación de los perfiles cromatográficos de acículas de P. ayacahuite muestreado en diferentes localidades

Este es un peculiar resultado ya que las concentraciones para esta población son mucho más altas si la comparamos con el resto de las poblaciones del estudio (fig. 14). Este compuesto probablemente corresponde a un ácido resínico.

29 Las acículas de ocho muestras de P. ayacahuite var, veitchii fueron analizadas (muestras 30-37), de la localidad Cañada al E. de San Rafael, municipio de Tlalmanalco, Edo. De México, anexo 1. Los especímenes presentan baja proporción de compuestos volátiles (fig. 15) en relación con P. ayacahuite (fig. 9). Se observa mayor proporción en el grupo de los compuestos eluidos entre los min. 10 y 20. Esto sugiere un posible marcador químico para diferenciar la variedad, lo cual también es soportado por el análisis discriminante (fig. 24).

mV olts

750

500

250

36 35 32 0 30 -43 10 20 30 40 50 Minutes

Fig. 15. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite var. veitchii

La comparación de los perfiles cromatográficos de acículas de las muestras 82 y 114, de P. ayacahuite muestran mayor proporción de los compuestos con tiempo de retención 2, 14.9 min. respecto de los perfiles cromatográficos de las muestras 61 y 147, de P. ayacahuite var. veitchii. La variedad veitchii muestra mayor proporción del compuesto eluido a los 25 min. El resto de los compuestos presentan diferente proporción, incluso entre la misma variedad (fig. 16).

30

Fig. 16. Perfil cromatográfico de acículas de P. ayacahuite var. veitchii comparado con el perfil cromatográfico de acículas P. ayacahuite

El perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de las muestras 22 y 23 se observa diferencia en la proporción de compuestos volátiles (fig. 17). La muestra 23, presenta un compuesto eluido al min. 13.5, que no se observa en la 22; mientras que la en región tr = 5- 10 min. algunos compuestos no aparecen o se encuentran en baja cantidad en la muestra 23. La región donde aparecen los monoterpenos (tr = 2-10 min.) y la de los sesquiterpenos (tr = 13-20 min.), son las de mayor variabilidad en estas muestras, cuyo incremento puede ser 31 ocasionado por infestación por insectos (Rafa & Berryman, 1983). Por otro lado, es importante considerar la edad del árbol, lo cual no fue considerado en este estudio (von Rodloff, 1975; Loreto et a l., 2005). Se encontró que los compuestos con mayor proporción son constantes en las diferentes muestras independientemente de la localidad, edad, exposición y estación del año, entre otras, los compuestos en menor proporción pueden estar o no presentes. Este hecho puede ser considerado para su uso en el análisis quimiotaxonómico.

P. strobiformis Engelmann, km 130 de la carretera 40 Durango-Mazatlán, mpio. de Pueblo Nuevo, Durango.

*

23

22

Fig. 17. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: km 130 de la carretera 40 Durango-Mazatlán, 3 km al S por el camino a Chavaría, municipio de Pueblo Nuevo, en el Edo. de Durango

Las muestras 90-115 de Pinus strobiformis, de la localidad: Observatorio INAOE, en el municipio de Cananea, en el Edo. de Sonora presentan perfiles cromatográficos muy semejantes entre ellos, respecto a los compuestos presentes y la proporción en la que aparecen (fig. 18). Mientras que las muestras 116-140 de P. strobiformis de la localidad: Carretera Creel-Divisadero, en el municipio de Boycona, Chihuahua, presentan diferente proporción en los compuestos presentes (fig. 19). Al analizar los perfiles cromatográficos

32 de las muestras del estudio de Pinus strobiformis, los compuestos que aparecen en la región tr = 5-10 min, estan siempre presentes, por lo que su ausencia en la muestra 23 puede deberse a una variación intraespecífica.

Fig. 18. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: Observatorio INAOE, en el municipio de Cananea, en el Edo. de Sonora

Fig. 19. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobiformis, de la localidad: Carretera Creel-Divisadero, en el municipio de Boycona, Chihuahua

Las comparación de las muestras de P. strobiformis de las diferentes localidades muestran similitud en la presencia de compuestos en las diferentes regiones elución; sin embargo, la proporción de estos puede variar inclusive dentro de la misma localidad (fig. 20).

33

Fig. 20. Comparación de los perfiles cromatográficos de acículas de P. strobiformis muestreado en diferentes localidades

Los perfiles cromatográficos de las muestras 10-14, de acículas de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Parada La Reforma, 8 km al oeste de Tlapacoyan, municipio de Tlapacoyan, Edo. de Veracruz y las muestras 15-21 de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Km. 200 carretera 195 en el municipio de Bochil, Estado de Chiapas, muestran similitud de compuestos con las otras especies del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis (figs. 21, 22). Pinus strobus var. chiapensis aunque es un pino blando no hace parte de éste complejo, por lo que se esperaría existieran diferencias significativas en la proporción y tipos de compuestos; sin embargo, con esta metodología no se detectaron diferencias en los compuestos eluídos por lo que es necesario realizar otro tipo de análisis.

34

Fig. 21. Perfil cromatográfico de acículas de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Parada La Reforma, 8 km al oeste de Tlapacoyan, municipio de Tlapacoyan , Edo. de Veracruz

Volts c:\star\data\1800.8006-12-0385+ si aciculas001.run c:\star\data\1800.8004-11-0388 + si aciculas.run c:\star\data\1800.8031-10-0389 aciculas+si.run 1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

-0.12 10 20 30 40 50 Minutes Fig. 22. Perfil cromatográfico de P. strobus var. chiapensis Martínez, de la localidad: Km. 200 carretera 195 en el municipio de Bochil, Estado de Chiapas

35 De los 20 compuestos elegidos al azar, 18 de ellos fueron identificados (fig. 23, anexo 3)

Fig.23. Identificación de los compuestos elegidos

Análisis Discriminante

Para el análisis discriminante se incluyeron seis especies de pinos blandos: P. ayacuhuite, P. ayacahuite var. veitchii, P. cembroides, P. culminícola, P. strobiformis y P. strobus var. chiapensis); tres de ellos del complejo P. ayacahuite-P. strobiformis. Los análisis de correlación fueron realizados teniendo en cuenta 20 compuestos (anexo 3) de los aproximadamente 50 compuestos (tabla 1 y 2) que se observaron en los perfiles cromatográficos, los cuales fueron elegidos al azar, bajo el criterio de mayor abundancia aparente, representada por el área bajo la curva. De éste análisis se formaron 6 grupos, los pinos del complejo fueron agrupados de manera independiente, como se muestra en la figura 24. La correlación esta explicada por el 61.62% de los casos.

36 Gráfica de Funciones Discriminantes

4. Especie 4 Pinus ayacahuiteEhrenberg. P. ayacahuite var. veitchii 2. P. cembroides 4 P. culminícula 0. P. strobiformis Engelmann Función 2 4 P. strobus var. chiapensis Centroids - 1.6 - 3.6 - 2 6 1 1 2 Función 1 0 4

Fig 24. Correlación de los pinos blandos analizados en el estudio

Cuatro funciones fueron las que mejor explican la correlación de los grupos formados (tabla 3, 4 y 5). • En la función 1 el compuesto que mejor explica la correlación es el chavicol (10), en contraste de una correlación negativa con el compuesto 20. • En la función 2 quienes mejor explican la correlación son el β-pineno (2) y un isómero de ácido resínico (19), en contraste con los compuestos 20 y 14. • En la función 3 la correlación es explicada por el 3-careno (3) en contraste con el compuesto 16. • En la función 4 el borneol (7) es quien explica mejor la correlación, en contraste con el compuesto 18.

De las 35 muestras analizadas de Pinus ayacahuite Ehrenberg. 20 están bien identificados como grupo y esto corresponde al 57.14%. Respecto a las 8 muestras analizadas de P. ayacahuite var. veitchii cinco se hallan bien identificados como grupo, es decir, el 62.50%. En relación a las 42 muestras analizadas de P. strobiformis 27 están bien identificadas como grupo, esto se refiere al 64.29%. De P. strobus var. chiapensis se analizaron 11 muestras y 7 de ellas se encuentran bien identificadas como grupo, lo que corresponde al 63.64% (tabla 5).

37

Tabla 3. Resumen de las funciones canónicas discriminantes

Función Autovalor Porcentaje Porcentaje Correlación Discriminante Relativo acumulado Canónica 1 1.24665* 38.93 38.93 0.74491 2 0.770542* 24.07 63. 0.6597 3 0.67193* 20.99 83.99 0.63395 4 0.495712* 15.48 99.47 0.57569 5 0.0170739* 0.53 100 0.12957

Tabla 4. Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes canónicas

1 2 3 4 5 comp1 0.210971 -0.417496 0.257352 -0.223565 0.311902 comp2 0.15689 1.04169 -0.349579 0.0159902 0.18972 comp3 0.0402529 0.0726039 0.808592 0.0980561 0.189722 comp4 -0.00382208 0.273714 0.327222 -0.0307632 0.285742 comp5 -0.144127 -0.186994 -0.105787 -0.0378728 0.218375 comp6 -0.0942449 0.10879 0.16 -0.153864 -0.0252251 comp7 -0.158375 -0.281228 -0.203205 1.00559 0.564005 comp8 0.106722 -0.171104 0.128672 0.0853729 0.0644038 comp9 0.15141 -0.0237859 -0.0914202 0.220612 -0.491796 comp10 0.868027 -0.157192 -0.074909 -0.191631 -0.215329 comp11 0.328196 0.295303 -0.0266752 0.0733115 0.122097 comp12 -0.228275 -0.207586 -0.245518 -0.505896 0.533067 comp13 -0.170498 0.174648 0.333325 -0.452266 0.191257 comp14 0.00830989 -0.498006 -0.0398301 0.364681 -0.59955 comp15 -0.00410215 0.34493 0.288927 -0.166563 -0.390431 comp16 -0.148631 -0.356884 -0.670708 0.413218 0.662812 comp17 0.16387 -0.0501238 -0.0509226 -0.0517343 0.101784 comp18 0.189498 0.209454 0.0962081 -0.545738 -0.716557 comp19 0.0643568 0.665961 -0.201991 -0.215934 -0.10208 comp20 -0.260048 -0.510681 0.0223017 -0.111497 0.496199

38 Tabla 5. Clasificación de los grupos

Grupo Tamaño P. P. ayacahuite P. P. P. P. strobus var taxonómico de ayacahuite var. veichii cembroides culminícola strobiformis chiapen sis actual Grupo Ehn P. ayacahuite 35 20 0 10 0 4 1 Ehn (57.14%) (0.00%) (28.57%) (0.00%) (11.435) (2.86%) P. ayacahuite 8 0 5 3 0 0 0 veichii (0.00%) (62.5%) (37.50%) (0.00%) (0.00%) (0.00%) P. cembroides 1 0 0 1 0 0 0 (0.00%) (0.00%) (100.00%) (0.00%) (0.00%) (0.00%) P. culminícola 2 0 0 0 1 1 0 (0.00%) (0.00) (0.00%) (50.00%) (50.00%) (0.00%) P. strobiformis 42 3 2 9 0 27 1 (7.14) (4.76%) (21.43%) (0.00%) (64.29%) (2.38%) P. strobus var 11 1 0 1 0 2 7 chiapensis (9.09) (0.00) (9.09%) (0.00%) (18.18%) (63.64%)

Porciento de casos correctamente clasificados: 61.62%

39

CONCLUSIONES

La extracción con pentano y sonicación de las muestras intensifica la extracción de compuestos y disminuye el tiempo de procesamiento y análisis, por consiguiente es posible el tratamiento de un mayor número de muestras simultáneamente.

Las áciculas poseen mayor número de compuestos respecto a las ramas. Las ramas contienen mayor proporción de compuestos del tipo diterpenos.

La concentración de compuestos totales extraídos conforme al área bajo la curva es aproximadamente 10 veces mayor en acículas que en ramas.

El perfil cromatográfico de los pinos blandos analizados es significativamente diferente al de Pinus oocarpa, el cual es un pino duro.

Es importante que transcurra el menor tiempo posible desde la toma de la muestra hasta su tratamiento, para evitar la pérdida de compuestos de característica volátil o semivolátil.

Las muestras de la localidad de Talpa, Jalisco presentan un peculiar perfil, pues es constante la abundancia del isómero de ácido resínico eluído a los 34 min.

En algunas localidades el compuesto eluído a los 34 min. se presenta en marcada proporción, este corresponde a un isómero de ácido resínico, el cual según algunos autores se incrementa por causa de estrés hídrico.

El análisis discriminante muestra que las especies analizadas forman grupos discretos, aunque en algunos casos estos se sobrelapan.

40

Los datos reflejan una amplia variabilidad lo cual sugiere la necesidad de un plan de muestreo estricto para tener conocimiento y en la medida de lo posible control de algunas de las diversas situaciones que causan variabilidad en la presencia y abundancia de los compuestos analizados.

41

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ANEXO 1

Número de muestra y localidades

Muestra Especie Estado Localidad Fecha 1 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 12-Mar-01 2 P. strobiformis Engelmann Nuevo León Galeana 19-Mar-01 3 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 5 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 6 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 7 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 8 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 9 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Michoacán Los Reyes 28-Abr-01 10 P. strobus chiapensis Martínez Veracruz Tlapacoyan 06-Jun-01 11 P. strobus chiapensis Martínez Veracruz Tlapacoyan 06-Jun-01 12 P. strobus chiapensis Martínez Veracruz Tlapacoyan 06-Jun-01 13 P. strobus chiapensis Martínez Veracruz Tlapacoyan 06-Jun-01 14 P. strobus chiapensis Martínez Veracruz Tlapacoyan 06-Jun-01 15 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 16 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 17 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 18 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 19 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 20 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 21 P. strobus chiapensis Martínez Puebla Hueytamalco 06-Jun-01 22 P. strobiformis Engelmann Durango Pueblo Nuevo 06-Jun-01 23 P. strobiformis Engelmann Durango Pueblo Nuevo 06-Jun-01 24 P. strobiformis Engelmann Durango Pueblo Nuevo 06-Jun-01 25 P. culminícula NVL POT 19-Mar-01 26 P. culminícula NVL POT 19-Mar-01 27 P. cembroides NVL POT 19-Mar-01 28 P. cembroides NVL POT 19-Mar-01 29 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Guerrero Omitlán 18-Oct-01 30 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 31 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 32 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 33 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 34 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 35 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 36 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 37 P. ayacahuite var. veitchii Edo. De México Tlalmanalco 17-Oct-01 39 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 40 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 41 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 42 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 45 43 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 44 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 45-A P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 45-B P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Hidalgo Real del Monte 18-Oct-01 48 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Querétaro El Copal 18-Oct-01 49 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Querétaro El Copal 18-Oct-01 50 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 22-Jul-01 51 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 52 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 53 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 54 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 55 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 56 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 02-Nov-01 57 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 58 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 59 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 60 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 62 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 63 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Jalisco Talpa 03-Nov-01 64 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Veracruz Xico 08-Dic-01 65 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Veracruz Xico 08-Dic-01 66 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Veracruz Xico 08-Dic-01 80 P. strobus chiapensis Martínez Chiapas Bochil 24-Feb-02 81 P. strobus chiapensis Martínez Chiapas Bochil 24-Feb-02 83 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 84 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 85 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 87 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 88 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 89 P. ayacahuite Ehrenberg ex. Schlechtendal Chiapas San Cristóbal 20-Feb-02 90 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 91 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 92 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 93 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 94 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 95 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 96 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 97 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 98 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 99 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 100 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 101 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 102 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 103 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 104 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 106 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 107 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02

46 108 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 109 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 110 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 111 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 112 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 113 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 114 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 115 P. strobiformis Engelmann Sonora Cananea 12-Jun-02 116 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 117 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 118 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 119 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 120 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 121 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 122 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 123 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 124 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 125 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 126 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 127 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 128 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 129 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 130 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 131 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 132 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 133 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 134 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 135 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 136 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 137 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 138 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02 140 P. strobiformis Engelmann Chihuahua Bocoyna 10-Jun-02

47

ANEXO 2

Localidades donde se colectaron las muestras de acículas y ramas.

Ubicación de las localidades de colecta Pinus ayacahuite Ehrenberg. ex Schlechtendal.

Fecha de Localidad n Altitud Lat. N/Long. O Hábitat Observaciones colecta ejemplares msnm Sierra de (1) Zimapán, Jal. Mina del 1 2000 Con Pinus Pino escaso Mar. 12 2001 Cuale, Jal. douglasiana

Camino (50-63) Talpa- Cuale, Jal Km 4.5 1 1810 20º 22’ 41’’/ Bosque mixto de “Piñones” Nov. 3 2001 105º 02’ 37’’ pino encino con Árboles frecuentes de Pinus ayacahuite, 25 m de altura. La Abies guatemalensis época de dehiscencia var. jaliscana y de los conos fue en Quercus spp. octubre. Km 6 3 1970 20º 22’ 50’’/ Bosque mixto de Árboles frecuentes de Nov. 3 2001 105º 02’ 19’’ pino encino con 10 a 22 m de altura. Pinus ayacahuite, P. La época de lumholtzii, P. dehiscencia de los oocarpa, P. conos fue en octubre. douglasiana, Abies guatemalensis var. jaliscana y Quercus spp. Km 9 3 2100 20º 21’ 42’’/ Bosque mixto de Árboles frecuentes de Nov. 3 2001 105º 02’ 08’’ pino encino con 25 m de altura. La Pinus ayacahuite, época de dehiscencia P.herrerae, P. de los conos fue en oocarpa, P. octubre. Colecta de douglasiana, Abies ramas. guatemalensis var. jaliscana y Quercus spp. Km 31 5 2340 20º 22’ 25’’/ Bosque mixto de Árboles frecuentes de Nov. 2 2001 104º 59’ 32’’ pino encino con 18 a 25 m de altura. Pinus ayacahuite, P. La época de herrerae, P. dehiscencia de los douglasiana y conos fue en octubre. Quercus spp. Km 32 1 2340 20º 21’ 48’’/ Bosque mixto de Árboles frecuentes de Nov. 2 2001 104º 59’ 38’’ pino encino con 25 m de altura. La Pinus ayacahuite, época de dehiscencia Abies guatemalensis de los conos fue en var. jaliscana y octubre. Quercus spp. Los Reyes (3-9)

48 Mich. Las Palmas 9 2260 19º 40’/ 102º Excursión de Abr. 28 2001 25’ reconocimiento de la fenología. Colecta de ramas. Omitlán Hgo. (1) Poblado 1 2450 20º 09’ 13’’ / Restos de bosque a “Piñon Cimarron” Oct 18 2001 Guerrero 98º 39’ 20’’ orilla N del poblado Dos árboles de 20-30 con P. teocote, m Topotipo de P. Juniperus deppeana ayacahuite. y Quercus spp. Real del (39-45b) Monte Hgo. Comunidad 9 2630 20º 09’ 13’’ / Bosque de Pinus Pino frecuente Oct. 18 2001 Palo Hueco 98º 38’ 07’’ ayacahuite, P. patula localmente, y Quercus rugosa. comenzando la dispersión de semillas. Colecta de ramas. Pinal de (48-49) Amoles, Qro. Barranca El 4 2800 21º 10’ 09’’ / Bosque de Pinus “Pino abeto” Oct. 19 2001 Copal 99º 41’ 49’’ ayacahuite, P. Pinos de 25-40 m, teocote, Pseudotsuga frecuentes menziesii y Quercus localmente, iniciando spp. la dehiscencia. Localidad nueva. Colecta de ramas. Xico, Ver. Corral de 3 2930 19º 31’ 08’’/ Bosque húmedo de “Jalocote” Dic. 8 2001 Rajas 97º 05’ 42’’ coníferas con Pinus Árboles frecuentes de ayacahuite, P. 15-25 m patula, P. teocote y Abies religiosa. San Cristóbal (83-89) Chis. Km 228 Carr 7 2930 16º 40’ / 92º Bosque de Pinus Pino abundante Feb. 20 2002 186 Palenque- 33’ ayacahuite, P. localmente de 15-25 San Cristóbal pseudostrobus var. m y DAP de 40-80 apulcensis y Quercus cm spp.

Ubicación de las localidades de colecta Pinus ayacahuite var. veitchii (Roezl) G.R. Shaw.

Fecha de Localidad n Altitud Lat. N./Long. O. Hábitat Observaciones colecta msnm Tlalmanalco, (30- Edo de Mex. 37) Cañada al E. De 8 2720 19º 12’ 38’’/ 98º Bosque muy Pinos de 25-35 m Oct. 17 2001 San Rafael 44’ 10’’ perturbado de Pinus Pinus ayacahuite var. ayacahuite, var. veitchii iniciando la veitchii, Pinus spp. dehiscencia Y Cupressus lusitanica.

49

Ubicación de las localidades de colecta Pinus strobiformis Engelmann.

Fecha de Localidad n Altitud Lat. N./Long. O. Hábitat Observaciones colecta msnm Cerro El (2 ) Potosí, Galeana, N. L. Km 12 1 2800 Mar. 19 2001 Pueblo Nuevo, (22-24) Durango Km 130 Carr. 3 2520 23 43’ 37’’ / 105º Bosque con Pinus Colecta de ramas. Jul. 13 2001 40 33’ 33’’ arizonica, P. strobiformis, Pseudotsuga menziezii, Cupressus arizonica, Populus sp. Y Quercus spp. Cananea, (90- Sonora 115) Observatorio 26 2470 31º 03’ / 110º 22’ Bosque de P. Árboles frecuentes de Jun. 12 2002 INAOE strobiformis, P 8-15 m de altura y 30- arizonica, P 100 cm de DAP, en engelmannii, laderas de exposición Juniperus deppeana y norte. Quercus spp. Bocoyna, (116- Chihuahua 140) Carretera Creel- 25 2470 20º 43’ / 107º 40’ Bosque de P. Árboles frecuentes de Jun 10 2002 Divisadero strobiformis, P 8-20 m de altura y 20- arizonica, Juniperus 80 cm de DAP, en deppeana y Quercus laderas de exposición spp. norte.

Ubicación de las localidades de colecta Pinus strobus var. chiapensis Martínez.

Fecha de Localidad n Altitud Lat. N./Long. Hábitat Observaciones colecta msnm O. (10- Tlapacoyan, 14) Ver. Parada la Reforma 5 750 19º 55’ 17’’ / Restos de bosque Árboles de 20-25 m, Jun. 6 2001 97º 15’ 26’’ mesófilo en huertos muy escasos. Suelo de plátano y café. profundo y húmedo. Colecta de ramas. Hueytamalco, Pue. (15- 21) El Mohon 7 1000 19º 53’ / 97º 16’ Restos de bosque de Árboles de 20-30 m. Jun. 6 2001 50 pino entre las casas Suelo profundo y del poblado. húmedo. Pinos utilizados como tutores de café. Colecta de ramas. (80- Bochil, 81) Chis. Km 200 carr. 195 2 1400 16º 59’ / 92º 50’ Cañada húmeda en Pino frecuente Feb.19 2002 laderas de exposición localmente de 15-25 norte, con Pinus m y DAP de 60-120 strobus var. cm. chiapensis y P. pseudostrobus.

51 ANEXO 3

Identificación de los 20 compuestos elegidos

1 α-pineno (2.25)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 93 (3065000=100%) 027.sms 5.752 min. Scan: 354 Chan: 1 Ion: 45 us RIC: 14271080

100% 93

75%

50%

79

25% 136 105 67 121 41 51

143 0% 50 75 100 125 m/z MCounts RIC all 027.sms

12.5 5.755 min 7.036 min 10.0

7.5

5.0 6.192 min 2.5 8.649 min 10.517 min 8.058 min 5.431 min 7.389 min 11.319 min 11.010 min 0.0

4 5 6 7 8 9 10 11 minutes Segment 2 246 308 369 431 493 556 620 684 Scans

Scan 354 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 40147 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 888 Fit = 920 RFit = 928 Average = 912 Ion Range: 30 - 228 Spect 1 BP 93 (3065000=100%) 027.sms 5.752 min. Scan: 354 Chan: 1 Ion: 45 us RIC: 14271080 93 100%

75%

50%

79 25% 136 67 105 121 41 51 157 171 0% Match 2 of 200 1R-.alpha.-Pinene CAS No. 7785-70-8, C10H16, MW 136 93 100%

75%

50% 77 41 25% 53 105 67 121 136 0%

52 2 ß-pineno (2.5 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 93 (2252450=100%) 027.sms 7.033 min. Scan: 433 Chan: 1 Ion: 51 us RIC: 10962215

100% 93

75%

50%

79 41

25% 69 121 136 53 107

129 143 0%

50 75 100 125 m/z MCounts RIC all 027.sms

12.5 5.755 min 7.036 min 10.0

7.5

5.0 6.192 min 2.5 8.649 min 10.517 min 8.058 min 5.431 min 7.389 min 11.319 min 11.010 min 0.0

4 5 6 7 8 9 10 11 minutes Segment 2

246 308 369 431 493 556 620 684 Scans

Scan 433 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 39850 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 886 Fit = 900 RFit = 937 Average = 908 Ion Range: 26 - 163 Spect 1 BP 93 (2252450=100%) 027.sms 7.033 min. Scan: 433 Chan: 1 Ion: 51 us RIC: 10962215 93 100%

75%

50% 79 41 25% 69 121 136 53 107 0% Match 24 of 200 .beta.-Pinene CAS No. 127-91-3, C10H16, MW 136 93 100%

75% 41

50% 69 79 25% 27 53 121 107 136 0% Diff Spect 1 Match 24 of 200 7 033 min Scan: 433 Chan: 1 Ion: 51 us RIC: 10962215

53 3 3- Careno (3.00 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 93 (87101=100%) 027.sms 8.636 min. Scan: 533 Chan: 1 Ion: 502 us RIC: 766044

100% 67 93

75%

79

50%

136 25% 41 53 107 121

149 115 0%

50 75 100 125 m/z MCounts RIC all 027.sms 4 7.036 min 3 5.755 min 6.192 min

2

1 8.649 min 10.517 min 8.058 min 5.431 min 7.389 min 11.319 min 11.010 min 0

4 5 6 7 8 9 10 11 minutes Segment 2 246 308 369 431 493 556 620 684 Scans

Scan 533 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 40142 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 843 Fit = 876 RFit = 848 Average = 856 Ion Range: 33 - 147 Spect 1 BP 93 (87101=100%) 027.sms 8.636 min. Scan: 533 Chan: 1 Ion: 502 us RIC: 766044 67 93 100%

75% 79

50%

136 25% 41 53 107 121

147 0% Match 2 of 200 3-Carene CAS No. 13466-78-9, C10H16, MW 136 93 100%

75%

50%

77 25% 121 105 136 41 53 67 0% Diff Spect 1 Match 2 of 200 8 636 min Scan: 533 Chan: 1 Ion: 502 us RIC: 766044

54 4 Tujol (4.90min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 55 (30903=100%) 027.sms 12.185 min. Scan: 759 Chan: 1 Ion: 957 us RIC: 439513

55 100% 91

75%

77 50%

119

105

25% 134 149

179

161 188 207 222 0%

50 75 100 125 150 175 200 225 m/z MCounts RIC all 027.sms 3.5

3.0 12.344 min 2.5

2.0 13.030 min

1.5

1.0 10.517 min 13.269 min

0.5 12.187 min 13.766 min 13.373 min 12.844 min 13.564 min 13.457 min 12.484 min 11.319 min 11.010 min 0.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 minutes Segment 2

652 684 716 747 778 810 841 Scans

Scan 759 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 39727 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 718 Fit = 879 RFit = 761 Average = 786 Ion Range: 27 - 198 Spect 1 BP 55 (30903=100%) 027.sms 12.185 min. Scan: 759 Chan: 1 Ion: 957 us RIC: 439513 55 100% 91

41 75%

77 50% 119 105 25% 134 149

179 161 0% Match 1 of 200 Bicyclo[3.1.0]hexan-3-ol, 4-methylene-1-(1-methylethyl)-, acetate CAS No. 3536-54-7, C12H18O2, MW 194 92 100%

75%

50% 81 41 134 25% 55 109 27 70 119

0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 12 185 min Scan: 759 Chan: 1 Ion: 957 us RIC: 439513

55

5 No identificado (5.30 min.)

6 Alcanfor (5.60 min)

Chromatogram Plots Plot 1: c:\... \busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms RIC all Plot 2: c:\... \busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms RIC all

Spect 1 BP 95 (498255=100%) 027.sms 12.348 min. Scan: 769 Chan: 1 Ion: 86 us RIC: 3519726 95 100%

75% 81

67 50% 108

55

25% 152

137 119 179 0% 50 75 100 125 150 175 200 225 m/z MCounts RIC all 027.sms

3 12.344 min

2 13.030 min

1 13.269 min 12.187 min 14.320 min 13.766 min 13.373 min 12.844 min 13.564 min 13.457 min 12.484 min 0 MCounts RIC all 039.sms

6

5

4

3

2 14.349 min 1 12.373 min 13.796 min 12.212 min 13.295 min 13.059 min 13.115 min 12.513 min 13.592 min 14.749 min 13.979 min 12.932 min 14.679 min 11.777 min 12.872 min 12.119 min 0 13.651 min

11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 minutes

Scan 769 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 10288 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 878 Fit = 923 RFit = 895 Average = 899 Ion Range: 28 - 227 Spect 1 BP 95 (498255=100%) 027.sms 12.348 min. Scan: 769 Chan: 1 Ion: 86 us RIC: 3519726 95 100%

75% 81 67 50% 108 41 55

25% 152

137 179 0% Match 1 of 200 Camphor CAS No. 76-22-2, C10H16O, MW 152 95 100%

81 75% 41

108 50% 69 55 152 25%

29 121 137 0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 12 348 min Scan: 769 Chan: 1 Ion: 86 us RIC: 3519726 56

7 Borneol (6.20 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\025.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2998 Time Range: 0.00 - 47.98 min. Date: 28/09/2005 12:56

Spect 1 BP 95 (58765=100%) 025.sms 13.059 min. Scan: 803 Chan: 1 Ion: 1600 us RIC: 263773

100% 95

75%

50%

67 25% 41

55 110 136 281 165 189 207 228 252 267 355 0%

50 100 150 200 250 300 350 m/z kCounts RIC all 025.sms

400 7.049 min 8.665 min 8.074 min 10.533 min 13 779 min 300 12.378 min 13.048 min 7.407 min 10.580 min

200 13.387 min 12.200 min 13.575 min 13.468 min

100 11.977 min 11.027 min

0

7 8 9 10 11 12 13 minutes Segment 2 429 491 552 614 676 737 799 Scans

Scan 803 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\025.sms Entry 10217 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 839 Fit = 927 RFit = 855 Average = 873 Ion Range: 53 - 176 Spect 1 BP 95 (58765=100%) 025.sms 13.059 min. Scan: 803 Chan: 1 Ion: 1600 us RIC: 263773 95 100%

75%

50%

67 25% 55 77 110 121 136 147 165 173 0% Match 1 of 200 Borneol CAS No. 10385-78-1, C10H18O, MW 154 95 100%

75%

50%

25% 110 55 67 79 121 139 154 Diff Spect 1 Match 1 of 200 13 059 min Scan: 803 Chan: 1 Ion: 1600 us RIC: 263773

57

8 Verbenona (6.90 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3134 Time Range: 0.00 - 49.97 min. Date: 04/10/2005 10:52

Spect 1 BP 107 (156727=100%) 039.sms 14.345 min. Scan: 903 Chan: 1 Ion: 275 us RIC: 1348145

100% 107

91 75%

79 135

50%

150

25% 65 122 41

239 50 100 150 200 250 m/z MCounts RIC all 039.sms

1.25 14.349 min 1.00

0.75 13.796 min 0.50

0.25 13.592 min 13.979 min 13.651 min

0.00

13.75 14.00 14.25 14.50 minutes Segment 2 866 882 897 913 Scans

Scan 903 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Entry 11790 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 879 Fit = 904 RFit = 934 Average = 905 Ion Range: 39 - 236 Spect 1 BP 107 (156727=100%) 039.sms 14.345 min. Scan: 903 Chan: 1 Ion: 275 us RIC: 1348145 107 100%

91 75%

79 135 50% 150

25% 41 65 122

0% Match 1 of 200 Bicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one, 4,6,6-trimethyl- CAS No. 80-57-9, C10H14O, MW 150 107 100%

135 75% 80 150 91

50% 41

55 25% 67 122

0% Diff Spect 1 - Match 1 of 200 14.345 min. Scan: 903 Chan: 1 Ion: 275 us RIC: 1348145 N li d Bi l [311]h t3 2 466ti thl

58

9 α-Terpineol (7.00min.)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3134 Time Range: 0.00 - 49.97 min. Date: 04/10/2005 10:52

Spect 1 BP 59 (49309=100%) 039.sms 13.796 min. Scan: 869 Chan: 1 Ion: 724 us RIC: 542664

100% 59 93

121 75%

43 81 136

50%

25%

107

189 209 237 281 0%

50 100 150 200 250 m/z MCounts RIC all 039.sms

1.25 14.349 min 1.00

0.75 13.796 min 0.50

0.25 13.592 min 13.979 min 13.651 min

0.00

13.75 14.00 14.25 14.50 minutes Segment 2

866 882 897 913 Scans

Scan 869 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Entry 5451 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 878 Fit = 938 RFit = 886 Average = 900 Ion Range: 27 - 192 Spect 1 BP 59 (49309=100%) 039.sms 13.796 min. Scan: 869 Chan: 1 Ion: 724 us RIC: 542664 59 100% 93

121 75% 43 81 136 67 50%

25% 107 147 189 0% Match 1 of 200 3-Cyclohexene-1-methanol, .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-, (S)- BP 59 (100000=100%) 5451 in nist98r.lbr CAS No. 10482-56-1, C10H18O, MW 154 59 100%

75%

93 121 136 50%

81

25% 43 67 31 107 0% Diff Spect 1 - Match 1 of 200 13.796 min. Scan: 869 Chan: 1 Ion: 724 us RIC: 542664 100% Normalized 3-Cyclohexene-1-methanol, .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-, (S)-

59

10 4-(2-propenil)-fenol ( Chavicol 9.00min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 133 (555063=100%) 027.sms 15.583 min. Scan: 970 Chan: 1 Ion: 79 us RIC: 3830973

100% 133

75%

105 50% 77

91 25% 115 51 63

41 149 0%

50 75 100 125 m/z MCounts RIC all 027.sms

6

5 15.594 min 4 12.344 min

3

2 13.030 min

1 19.384 min 13.269 min 19.133 min 12.187 min 14.320 min 16.591 min 18.054 min 18.506 min 16.331 min 13.766 min 13.373 min 12.844 min 13.564 min 13.457 min 12.484 min 11.319 min 11.010 min 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 minutes Segment 2 Scans 684 747 810 872 934 996 1057 1119 1180

Scan 970 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 60606 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 919 Fit = 944 RFit = 964 Average = 942 Ion Range: 25 - 142 Spect 1 BP 133 (555063=100%) 027.sms 15.583 min. Scan: 970 Chan: 1 Ion: 79 us RIC: 3830973 133 100%

75%

105 50% 77

91 25% 51 115 63 41 0% Match 3 of 200 Phenol, 4-(2-propenyl)- CAS No. 501-92-8, C9H10O, MW 134 134 100%

75%

107 50% 77 39 25% 27 51 91 115 65

0% Diff Spect 1 - Match 3 of 200 15.583 min. Scan: 970 Chan: 1 Ion: 79 us RIC: 3830973 N li d Ph l 4 (2 l) 60

11 No identificado (12.5 min.)

12 Cariofileno (13.50 min.)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 91 (589285=100%) 027.sms 20.323 min. Scan: 1260 Chan: 1 Ion: 49 us RIC: 8000975

100% 91

105 75% 133

79 41

50% 67 119

147 25% 55

0%

50 75 100 125 m/z MCounts RIC all 027.sms

12.5 20.308 min 21.860 min 10.0

7.5

5.0

2.5 22.236 min 21.167 min 22.841 min 22.641 min 21.713 min 19.384 min 22.046 min 21.440 min 21.543 min 22.456 min 21.991 min 19.533 min 20.532 min 20.918 min 0.0

19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 minutes Segment 2 Scans 1210 1240 1271 1301 1331 1361 1391 1422

Scan 1260 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 9964 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 914 Fit = 965 RFit = 921 Average = 933 Ion Range: 27 - 225 Spect 1 BP 91 (589285=100%) 027.sms 20.323 min. Scan: 1260 Chan: 1 Ion: 49 us RIC: 8000975 91 100%

105 75% 133 41 79

50% 67 119 161 147 25% 55 189 175 204 223 0% Match 2 of 200 Caryophyllene BP 93 (100000=100%) 9964 in nist98r.lbr CAS No. 87-44-5, C15H24, MW 204 93 100% 69 133 75% 41 79

50% 105 120 55 148 161

25% 189 175 204

0% Diff Spect 1 - Match 2 of 200 20.323 min. Scan: 1260 Chan: 1 Ion: 49 us RIC: 8000975 100% Normalized Caryophyllene

61

13 α-Cariofileno (14.50 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 93 (239766=100%) 027.sms 21.164 min. Scan: 1311 Chan: 1 Ion: 171 us RIC: 2066602

100% 93

75%

50%

67 79 147 105 121 25% 41 53 204 161 179 133 189 223 233 0%

50 75 100 125 150 175 200 225 m/z MCounts RIC all 027.sms

12.5 20.308 min 21.860 min 10.0

7.5

5.0

2.5 22.236 min 21.167 min 22.841 min 22.641 min 21.713 min 19.384 min 22.046 min 21.440 min 21.543 min 22.456 min 21.991 min 19.533 min 20.532 min 20.918 min 0.0

19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 minutes Segment 2 Scans 1210 1240 1271 1301 1331 1361 1391 1422

Scan 1311 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 40106 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 791 Fit = 895 RFit = 799 Average = 828 Ion Range: 32 - 263 Spect 1 BP 93 (239766=100%) 027.sms 21.164 min. Scan: 1311 Chan: 1 Ion: 171 us RIC: 2066602 93 100%

75%

50% 67 79 147 105 121 25% 41 53 204 161 179 223 0% Match 1 of 200 4,7,10-Cycloundecatriene, 1,1,4,8-tetramethyl-, cis, cis, cis- C15H24, MW 204 93 100%

75%

50% 80 121 25% 147 107 41 55 67 204 161 175 189 0% Diff Spect 1 - Match 1 of 200 21.164 min. Scan: 1311 Chan: 1 Ion: 171 us RIC: 2066602 N li d 4710C l d ti 1148t t thl i i i

62

14 (+) epi-biciclosesquifelandreno (15min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2972 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 29/09/2005 7:23

Spect 1 BP 161 (1698529=100%) 027.sms 21.861 min. Scan: 1353 Chan: 1 Ion: 34 us RIC: 13922730

100% 161

105 75%

91 50% 119

81 204

133 25% 41 67 53 147

177 189 225 239 0%

50 100 150 200 m/z MCounts RIC all 027.sms

12.5 20.308 min 21.860 min 10.0

7.5

5.0

2.5 22.236 min 21.167 min 22.841 min 22.641 min 21.713 min 19.384 min 22.046 min 21.440 min 21.543 min 22.456 min 21.991 min 19.533 min 20.532 min 20.918 min 0.0

19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 minutes Segment 2 Scans 1210 1240 1271 1301 1331 1361 1391 1422

Scan 1353 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\027.sms Entry 71005 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 844 Fit = 923 RFit = 853 Average = 873 Ion Range: 39 - 251 Spect 1 BP 161 (1698529=100%) 027.sms 21.861 min. Scan: 1353 Chan: 1 Ion: 34 us RIC: 13922730 161 100%

105 75%

91 50% 119 204 133 25% 41 53 147 177 189 225 239 0% Match 2 of 200 (+)-Epi-bicyclosesquiphellandrene CAS No. 54324-03-7, C15H24, MW 204 161 100%

75%

50%

105 25% 91 119 204 41 55 67 133 147 189 0% Diff Spect 1 - Match 2 of 200 21.861 min. Scan: 1353 Chan: 1 Ion: 34 us RIC: 13922730 Normalized (+)-Epi-bicyclosesquiphellandrene

63 15 Nerolidol (17.40 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\029.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3120 Time Range: 0.00 - 49.98 min. Date: 29/09/2005 9:10

Spect 1 BP 41 (63878=100%) 029.sms 23.708 min. Scan: 1462 Chan: 1 Ion: 553 us RIC: 805416

100% 41

93 69 75%

107 50%

121

161 25% 136

189 204 281 0%

50 100 150 200 250 300 350 m/z kCounts RIC all 029.sms

700

600 23.704 min

500

400

300 24.418 min 24.517 min 25.707 min

200 24.308 min 24.918 min 100

24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 minutes Segment 2

1480 1511 1543 1575 1607 Scans

Scan 1462 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\029.sms Entry 947 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 896 Fit = 949 RFit = 905 Average = 917 Ion Range: 39 - 242 Spect 1 BP 41 (63878=100%) 029.sms 23.708 min. Scan: 1462 Chan: 1 Ion: 553 us RIC: 805416 41 100%

93 69 75%

107 50% 79 55 121 161 25% 136

147 189 179 204 0% Match 1 of 200 1,6,10-Dodecatrien-3-ol, 3,7,11-trimethyl- BP 41 (100000=100%) 947 in nist98r.lbr CAS No. 7212-44-4, C15H26O, MW 222 41 100% 69

75%

93 50% 55 107 25% 81 136 161 121 148 179 189 204 0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 23 708 min Scan: 1462 Chan: 1 Ion: 553 us RIC: 805416

64 16 Dibutilftalato (25.00 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\026.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3043 Time Range: 0.00 - 47.97 min. Date: 28/09/2005 13:50

Spect 1 BP 149 (46702=100%) 026.sms 32.298 min. Scan: 2043 Chan: 1 Ion: 1888 us RIC: 227135

149 100%

75%

50%

25% 41

77 105 223

281 355 415 576 614 0%

100 200 300 400 500 600 m/z kCounts RIC all 026.sms

350

300

250 32.289 min

200 32.595 min 33.315 min

150 33.110 min

100

32.0 32.5 33.0 33.5 34.0 34.5 35.0 35.5 minutes Segment 2

Scans 2024 2056 2088 2119 2151 2183 2215 2247

Scan 2043 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\026.sms Entry 15540 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 667 Fit = 881 RFit = 685 Average = 744 Ion Range: 27 - 309 Spect 1 BP 149 (46702=100%) 026.sms 32.298 min. Scan: 2043 Chan: 1 Ion: 1888 us RIC: 227135 149 100%

75%

50%

25% 41 77 105 223 121 205 179 244 281 0% Match 1 of 200 Dibutyl phthalate CAS No. 84-74-2, C16H22O4, MW 278 149 100%

75%

50%

25% 29 57 76 104 205 223 121 278 0% Diff Spect 1 - Match 1 of 200 32.298 min. Scan: 2043 Chan: 1 Ion: 1888 us RIC: 227135 Normalized Dibutyl phthalate

65

17 Ácido resínico (28.70 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\029.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3120 Time Range: 0.00 - 49.98 min. Date: 29/09/2005 9:10

Spect 1 BP 137 (918650=100%) 029.sms 35.268 min. Scan: 2197 Chan: 1 Ion: 63 us RIC: 5007080

100% 137 228

75%

91

50%

25% 65

51 213 107 124 165 197 295 359 0% 50 100 150 200 250 300 350 m/z MCounts RIC all 029.sms

4 35.268 min

3

2

1 37.665 min 35.921 min 37.434 min 37.788 min 36.134 min 37.992 min 38.026 min 38.089 min 38.154 min 38.184 min 38.236 min 38.283 min 36.833 min 38.363 min 38.396 min 36.980 min 37.011 min 37.060 min 38.589 min 38.670 min 33.804 min 0

34 35 36 37 38 39 minutes Segment 2 2116 2181 2241 2303 2364 2427 Scans

Ácido 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-, [1R-(1.alfa.,4a.beta.,10a.alfa.)]-1- fenantrencarboxílico

66

18 Ácido graso (30.20)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\025.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 2998 Time Range: 0.00 - 47.98 min. Date: 28/09/2005 12:56

Spect 1 BP 79 (90000=100%) 025.sms 36.165 min. Scan: 2264 Chan: 1 Ion: 370 us RIC: 1177605

100% 79

75%

67

50% 41 55 93

25% 107 121 135 149

292 264 191 207 222 236 339 0%

50 100 150 200 250 300 350 m/z MCounts RIC all 025.sms

1.00 36.164 min

0.75

0.50 35.948 min 34.763 min 36.048 min 0.25 34.964 min 35.801 min 35.561 min

34.75 35.00 35.25 35.50 35.75 36.00 36.25 minutes Segment 2

Scans 2176 2191 2207 2223 2239 2254 2269

Scan 2264 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\025.sms Entry 7981 from nist98r.lbr Saturn Library Purity = 627 Fit = 887 RFit = 680 Average = 731 Ion Range: 40 - 650 Spect 1 BP 79 (90000=100%) 025.sms 36.165 min. Scan: 2264 Chan: 1 Ion: 370 us RIC: 1177605 79 100%

75%

50%

25%

292 339 0% Match 1 of 200 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- BP 79 (100000=100%) 7981 in nist98r.lbr CAS No. 301-00-8, C19H32O2, MW 292 79 100%

75%

50%

25% 292 236 0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 36 165 min Scan: 2264 Chan: 1 Ion: 370 us RIC: 1177605

67 19 Isómero de ácido resínico (30.50 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3134 Time Range: 0.00 - 49.97 min. Date: 04/10/2005 10:52

Spect 1 BP 91 (10498=100%) 039.sms 39.562 min. Scan: 2475 Chan: 1 Ion: 1524 us RIC: 286548

100% 91

271 75%

41 133 50%

25% 187

337 502 414 0%

100 200 300 400 500 600 m/z kCounts RIC all 039.sms

800

700 33.277 min 42.812 min 600

500 41.129 min 45 763 min

400 38.091 min 41.921 min 33.104 min 41.409 min 45.112 min

300 39.556 min 43.485 min

200 41.653 min 42.179 min 34.963 min 42.296 min 37.568 min 37.445 min 37.606 min 42.361 min 37.711 min 37.790 min 42.424 min 42.469 min 43.808 min 35.808 min 33.842 min 43.838 min 43.884 min 43.933 min 44.002 min 44.213 min 44.389 min 44.428 min 44.772 min 34.764 min 33.978 min 36.641 min 100 33.424 min

35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 minutes Segment 2 Scans 2187 2346 2503 2659 2818

Scan 2475 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Entry 94154 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 671 Fit = 881 RFit = 697 Average = 750 Ion Range: 40 - 650 Spect 1 BP 91 (10498=100%) 039.sms 39.562 min. Scan: 2475 Chan: 1 Ion: 1524 us RIC: 286548 91 100%

271 75%

41 50%

25%

337 414 502 0% Match 1 of 200 1-Phenanthrenecarboxaldehyde, 7-ethenyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-dodeca CAS No. 472-39-9, C20H30O, MW 286 257 100%

75%

123 50% 91

25%

0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 39 562 min Scan: 2475 Chan: 1 Ion: 1524 us RIC: 286548

68 20 Isómero de ácido resínico (30.80 min)

Chromatogram Plot File: c:\... \mis documentos\escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Sample: Operator: maya Scan Range: 1 - 3134 Time Range: 0.00 - 49.97 min. Date: 04/10/2005 10:52

Spect 1 BP 121 (92322=100%) 039.sms 42.794 min. Scan: 2677 Chan: 1 Ion: 508 us RIC: 925578

100% 121

75%

50%

91

301 25% 257 41 180

502 0%

100 200 300 400 500 600 m/z kCounts RIC all 039.sms

800

700 33.277 min 42.812 min 600

500 41.129 min 45 763 min

400 38.091 min 41.921 min 33.104 min 41.409 min 45.112 min

300 39.556 min 43.485 min

200 41.653 min 42.179 min 34.963 min 42.296 min 37.568 min 37.445 min 37.606 min 42.361 min 37.711 min 37.790 min 42.424 min 42.469 min 43.808 min 35.808 min 33.842 min 43.838 min 43.884 min 43.933 min 44.002 min 44.213 min 44.389 min 44.428 min 44.772 min 34.764 min 33.978 min 36.641 min 100 33.424 min

35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 minutes Segment 2

Scans 2187 2346 2503 2659 2818

Scan 2677 from c:\... \escritorio\busquedas maya\letty\lety'cg\039.sms Entry 55258 from nist98m.lbr Saturn Library Purity = 772 Fit = 966 RFit = 782 Average = 840 Ion Range: 40 - 650 Spect 1 BP 121 (92322=100%) 039.sms 42.794 min. Scan: 2677 Chan: 1 Ion: 508 us RIC: 925578 121 100%

75%

50% 91 301 25% 257 41 180

502 0% Match 1 of 200 1-Phenanthrenecarboxylic acid, 7-ethenyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-dodecah CAS No. 1686-54-0, C21H32O2, MW 316 121 100%

75%

50%

301 25% 91 181 257 41

0% Diff Spect 1 Match 1 of 200 42 794 min Scan: 2677 Chan: 1 Ion: 508 us RIC: 925578

69