MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav botaniky a zoologie
Obsah DNA a AT/GC genomový poměr u druhů rodu Carex Diplomová práce
Bc. Ivana Hralová Brno2010 Školitel: doc. RNDr. Petr Bureš, Ph.D.
Prohlášení
Souhlasím s uložením této diplomové práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a využitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, že převzaté informace budou řádně citovány a nebudou využívány komerčně.
V Brně dne ......
Poděkování
Na tomto místě bych chtěla poděkovat lidem, kteří se na této práci podíleli a bez jejichž pomoci by tato práce nikdy nevznikla. Poděkování za patří doc. RNDr. Petru Burešovi Ph.D. za vedení, nápady a konzultace, jakožto i za organizování rozsáhlých sběrů a měření ostřic. Dále Mgr. Olze Rotreklové, Ph.D. a Mgr. Františku Zedkovi za napočítání spousty malých chromozomů. Mgr. Lucce Horové a dalším za cytometrické změření většiny ostřic, Mgr. Petru Šmardovi, Ph.D. pak za obětavé konzultace nad problémy phylocomu a sekvencí obecně. Ing. Radomíru Řepkovi, Ph.D. a doc. RNDr. Vítku Grulichovi, CSc. patří dík za determinaci druhů. Poděkování patří všem, kteří se podíleli na sběru a dovážení ostřic ze všech koutů Evropy a Ruska, kromě výše jmenovaných také Ph.D., Ing. Jiřímu Danihelkovi, Ph.D., doc. Michalu Hájkovi, Ph.D., Mgr. Karlu Fajmonovi, Mgr. Kláře Helánové, Mgr. Janu Rolečkovi, Ph.D., Mgr. Danu Dvořákovi, RNDr. Zdeně Lososové, Ph.D., Ph.D., Ing. Tomáši Kouteckému, Mgr. Pavlu Veselému a mnoha dalším. Děkuji také všem svým přátelům, kteří mi poskytli neocenitelné rady a trpělivě snášeli všechny možné i nemožné výkyvy nálad. Jmenovitě patří dík Bc. DAniele Bártové a Mgr. Pavlu Veselému za dlouhé noční konzultace statistických a jiných problémů, Bc. Janě "šnečkovi" Dvořákové za nezřízený optimismus a Bc. Tomáši Lipnerovi a Bc. Hance Buchtové za zdravou míru realismu a kibicování. Poděkování patří také mým nejbližším, mé rodině, bratříčkovi a Tasmince.
Abstrakt Tato práce se zabývala vztahy genomických znaků, jako je velikost genomu, AT/GC genomový poměr a počet chromozomů, k evoluci rodu, k faktorům prostředí a k morfologickým znakům. Byla změřena velikost genomu a AT/GC genomový poměr pro 159 druhů rodu Carex a 55 dalších zástupců čeledi Cyperaceae, pro část druhů byly spočítány počty chromozomů. Byly změřeny délky průduchů, z literatury byly převzaty informace o ekologických nárocích druhů (Ellenbergovy indikační hodnoty) a rozměry mošniček a nažek. K určení vztahů mezi získanými hodnotami byly použity neparametrické korelace a analýzy fylogenetických kontrastů. Rod Carex má jedny z nejmenších genomů mezi vyššími rostlinami, AT/GC genomový poměr je pak v rozmezí běžném mezi rostlinami. Velká variabilita v chromozomových počtech je ve shodě s obecně přijímanými názory na evoluci karyotypu v rodu. Ekologické parametry prostředí, vyjádřené pomocí Ellenbergových indikačních skupin, hrály v evoluci rodu určitou roli a podílejí se na dnešní variabilitě rodu, nicméně jejich vliv není jednoznačný. Závislosti velikosti genomu a AT/GC genomového poměru mezi sebou a na teplotě prostředí naznačují možnost proliferace transpozonů jako jedné z hybných sil evoluce genomických znaků rodu. Soustředění velké části zamokření tolerujících druhů do jedné větve fylogenetického stromu naznačuje možnost evoluci tohoto znaku v modu konzervativnosti niky spíš než adaptivní radiací. Délka průduchů u ostřic není ve vztahu k velikosti genomu, což je v protikladu k obecně přijímaným názorům a důkazům plynoucím z několika rozsáhlých studií na těsnou závislost těchto dvou znaků. Možné důvody a důsledky tohoto stavu jsou diskutovány.
Klíčová slova: průtoková cytometrie, ostřice, Cyperaceae, velikost genomu, zastoupení AT bazí, Ellenbergovy indikační hodnoty, délka průduchů, adaptabilita velikosti genomu
Abstract This study was focused on determining relationship among genetical, morphological and ecological characters of species of genus Carex. Its aim was to find out whether the environmental effect on the evolution of species resulted in changes of genome size (studied on closely related species); if AT/GC genomic ratio was shifted during phylogeny, e. g., by transposone proliferation, and if there is correlation between DNA composition and genome size. Its aim was also to find whether the changes in genome are correlated with changes in stomatal length or length of peryginia or achenes. We measured DNA content, AT/GC genomic ratio, and average chromosomal size for 159 species of the genus Carex and 55 other species of the Cyperaceae family growing mainly in Central Europe and for some other Russian or North American taxa. Stomatal length was measured for 110 species of Carex and 17 other species of family Cyperaceae. The genus Carex has one of the smallest genome size among angiosperms. We found high chromosomal count variability as expected. Environmental effects, aproximated by Ellenberg's indicator values, played siginificant role in evolution of genus, although the way of interaction with genomic characters is not clear. The relationship between genome size and AT/GC genomic ratio and among these characters and temperature suggest shift of these characters due to transposone proliferation. The clustering of main part of wetland species within one particular clade sugests a niche conservatism as a mode of evolution in traits related to waterlooging tolerance. Stomatal length is not correlated with genome size. Such absence of realtionship was not observed before. Reasons and conclusions of genome size unrelated variation in stomatal length is discussed.
Key words: flow cytometry, sedges, Cyperaceae, genome size, A+T content, Ellenberg's indicator value, stomatal length, genome size adaptability 1
OBSAH 1. Úvod...... 1 1.1. Rod Carex...... 1 1.1.1. Taxonomické pojetí založené na morfologických znacích...... 1 1.1.2. Taxonomické pojetí založené na molekulárních znacích...... 2 1.1.3. Taxonomické pojetí použité v této práci...... 6 1.2. Velikost genomu...... 6 1.2.1. Variabilita velikosti genomu...... 6 1.2.2. Mechanismy změn velikosti genomu...... 9 1.2.3. Selekční vlivy na velikost genomu...... 10 1.3. AT/GC genomový poměr...... 13 1.4. Chromozomy...... 13 1.5. ITS sekvence...... 15 1.6. Fylogenetické kontrasty...... 17 1.6.1. Úvod do fylogenetických kontrastů ...... 17 1.6.2. Předpoklady analýzy...... 17 1.6.3. Phylocom...... 19 1.6.4. Fylogenetické kontrasty...... 19 1.6.5. Fylogenetický signál...... 20 1.6.6. Kontribuční index...... 21 2. Cíle práce...... 23 3. Materiál a metodika...... 24 3.1. Materiál...... 24 3.2. Průtoková cytometrie...... 24 3.3. Stanovení počtu chromozomů...... 25 3.4. Morfologické znaky...... 25 3.5. Ellenbergovy indikační hodnoty...... 26 3.6. Nomenklatura...... 26 3.7. Analýza ITS sekvencí...... 27 3.8. Analýza fylogenetických kontrastů ...... 28 3.9. Zpracování výsledků ...... 28 2
4. Výsledky...... 31 4.1. Sekvence a fylogenetické analýzy...... 31 4.2. Popisná statistika...... 32 4.2.1. Genomické znaky...... 32 4.2.2. Morfologické znaky...... 33 4.3. Korelace a fylogenetické kontrasty genomických znaků...... 33 4.4. Korelace a fylogenetické kontrasty EIH s genomickými znaky...... 35 4.4.1. EIH pro vlhkost...... 35 4.4.2. EIH pro teplotu...... 48 4.4.3. EIH pro obsah živin...... 48 4.5. Korelace a fylogenetické kontrasty morfologických znaků...... 49 4.5.1. Vztah délky průduchů k Ellenbergovým indikačním hodnotám...... 50 4.5.2. Mošničky a nažky...... 51 4.5.3. Vzájemné vztahy morfologických znaků...... 52 5. Diskuse...... 53 5.1. Sekvence a fylogenetický strom...... 53 5.2. Genomické znaky...... 54 5.2.1. Velikost genomu, zastoupení AT bazí, počet chromozomů...... 54 5.2.2. Vztah genomických znaků k vlhkosti prostředí...... 54 5.2.3. Vztah genomických znaků k teplotě prostředí...... 56 5.2.4. Vztah genomických znaků k obsahu živin v prostředí...... 58 5.3. Morfologické znaky ...... 59 6. Závěr...... 62 7. Literatura...... 63 8. Přílohy...... 76
- 1 -
1. Úvod
1.1. Rod Carex Rod Carex patří do čeledi Cyperaceae, která zahrnuje 98 rodů a cca 4350 druhů (APWeb, Stevens 2001 onwards) a je tudíž jednou z největších čeledí krytosemenných rostlin. V rámci čeledi jsou pak ostřice řazeny do tribu Cariceae Kunth ex Dumort. Tribus je charakterizován nerozlišenými jednopohlavnými květy se samičími kvítky částečně nebo úplně uzavřenými v mošničce listenového původu (Blaser 1944 v Reznicek 1990). V tribu jsou kromě rodu Carex rozlišovány další 4 rody, Kobresia Willd. (tuřička, cca 40 eurasijských druhů hor a chladného pásma), Uncinia Pers. (50 druhů převážně na jižní polokouli a ve střední Americe), Schoenoxiphium Nees (17 druhů jihu a východu Afriky) a Cymophyllus MacKenzie (severoamerický monotypický rod; C. fraserianus je endemitem Apalačských hor). Až na rod Cymophyllus, který se vyznačuje z větší části bezčepelnými listy, je morfologie vegetativních částí zástupců tohoto tribu poměrně uniformní. Vymezení rodů a druhů se proto opírá hlavně o znaky generativní, avšak ani jejich použití nemusí být samo sobě jednoznačným klasifikačním kriteriem (Reznicek 1990). Rod Carex je celosvětově rozšířený; roste převážně v temperátní zóně a horských oblastech severní polokoule, v tropech se omezuje na horské polohy. Rod zahrnuje celkem zhruba 2000 druhů, což je přibližně polovina všech druhů čeledi Cyperaceae a drtivá většina druhů tribu Cariceae (Reznicek 1990).
1.1.1. Taxonomické pojetí založené na morfologických znacích
Kükenthal (1909) rozdělil rod Carex do 4 podrodů, a to Primocarex (= Psyllophora), Vignea, Indocarex (= Vigneastra) a (eu)Carex. MacKenzie (1931, 1935), který vymezil 5 základních tribů čeledi Cyperaceae (Cariceae, Scirpae, Rynchosporeae, Cypereae a Sclerieae), dále rozdělil rod Carex do 71 sekcí. Spolu s rody Kobresia, Unicinia a Cymophyllus tvoří ostřice v jeho pojetí tribus Cariceae. Reznicek (1990) provedl morfologickou srovnávací studii tribu Cariceae, shrnul dosavadní taxonomické názory a navrhl řešení klasifikace této skupiny. V tribu rozeznává tradičních pět rodů (oproti MacKenzie navíc i Schoenoxiphium). Zamítl hypotézy o vývojové spojitosti rodu Carex a Uncinia (tedy že se některé druhy Carex vyvinuly z druhů rodu Uncinia nebo naopak). - 2 -
Stejně tak zamítl vymezování jednoklasých ostřic do podrodu Primocarex a diskutoval vznik jednoklasých ostřic nezávisle na sobě několikrát v průběhu evoluce rodu. Analýza morfologických znaků naznačila bazální pozici podrodu Indocarex a odvozenost podrodů Vignea a Carex z předka podobného ostřicím v podrodu Indocarex. Rod Schoenoxiphium byl vymezen v samostatné větvi sesterské ostatní druhům v tribu. Bruhl (1995) na základě rozsáhlé morfologické analýzy navrhl nový systém klasifikace Cyperaceae včetně tribu Cariceae. Na rozdíl od MacKenzie (1931, 1935) rozlišil dvě podčeledě a ty dále rozlišil na 10 tribů (4 v Cyperoideae, 6 v Caricoideae), sám ale připouští, že některé jeho triby mohou být polyfyletické. Rod Carex považuje za polyfyletický. Podrod Primocarex spojuje s kladem rodů Uncinia a Cymophyllus, stojícím na bázi celého tribu. Rody Schoenoxiphium a Kobresia považuje za sesterské ke zbytku rodu Carex a dobře od sebe odlišené. Někdy vymezovaný monotypický rod Vesicarex nemá podle něj opodstatnění a zařazuje proto jeho zástupce (C. collumanthus) do podrodu Indocarex, který tvoří sesterskou skupinu podrodům Vignea a Carex. Egorova (1999) v práci shrnující ostřice z oblastí bývalého Sovětského svazu rozlišila 5 podrodů ostřic. Kromě 4 dříve vymezovaných podrodů (Carex, Vignea, Psyllophora a Vigneastra) navrhla ještě pátý podrod, subg. Kreczetoviczia, který vymezila na základě několika morfologických znaků (např. přítomnost aerenchymatických pletiv – Guibert 2008). Současnými autory není tento podrod vždy akceptován (Ball & Reznicek 2002 in Ford et al. 2006).
1.1.2. Taxonomické pojetí založené na molekulárních znacích První náhled na fylogenezi rodu, založenou na molekulárních znacích přinesli Yen & Olmsted (2000). Použili při tom 29 druhů vybraných tak, aby postihli co největší spektrum potenciální taxonomické diverzity v rámci tribu, zároveň však přihlíželi také k co největší geografické a morfologické variabilitě. Opírali se o druhový materiál pocházející především ze Severní a Jižní Ameriky, jižní Afriky, východní Asie, Havajských ostrovů a Nového Zélandu. Jako marker použili chloroplastovou DNA (gen ndhF a trnL-intron). Výsledky této práce podpořily některé Reznickovy na morfologii založené hypotézy (Reznicek 1990). Podrod Primocarex určili jako jednoznačně polyfyletický. Podrod Carex považovali rovněž za polyfyletický, kdežto podrod Vignea se jim jeví jako velmi dobře vymezená monofyletická skupina. Čtvrtý podrod, subg. Indocarex, sice vytvářel v jejich analýze spolu se subg. Carex - 3 - samostatný klad, ale vzhledem k nedostatečnému zastoupení vzorků reprezentujících tento klad se autoři omezili na konstatování, že podrod Indocarex je zřejmě heterogenní skupinou, jejíž vymezení je potřeba podrobněji prozkoumat v dalších studiích. Nenalezli dostatečnou podporu pro vymezování rodu Kobresia proti rodu Carex, neboť jeho umístění v topologii fylogenetického stromu bylo nejasné a zaujímalo při nízké podpoře jak bazální pozici v rámci rodu Carex tak i hlubší zanoření do rodu. Výsledky rovněž ukazovaly, že rod Uncinia má původ uvnitř rodu Carex. Rod Schoenoxiphium se jevil jako sesterský ke zbytku tribu, což je ve shodě s hypotézami o vzniku ostatních druhů z předka podobného rodu Schoenoxiphium, vytvořenými na základě morfologie květenství (Reznicek 1990). Celý tribus Cariceae je na základě jejich analýzy ve shodě s morfologickými systémy monofyletický. Rozsáhlejší studii publikovali o rok později Roalson et al.(2001), kteří použili 100 druhů ostřic a 16 dalších zástupců tribu Cariceae. Vedle chloroplastových (trnT-L-F) použili i jaderné sekvenční markery (ITS). Podrod Vignea se opět ukázal být dobře etablovaným kladem. Druhým velkým kladem byly ostřice z podrodů Indocarex spolu s většinou druhů z podrodu Carex. Zbývající část ostřic, zejména skupina jednoklasých ostřic vymezovaná do podrodu Primocarex (Kükenthal 1909), pak vytvořila velký klad s ostatními rody v rámci tribu (Kobresia a Uncinia a Schenoxiphium). Autoři tedy rozlišili tři hlavní vývojové větve (klady) v tribu Cariceae, mezi nimiž bazální postavení zaujímal podrod Vignea. Hlavní odlišností oproti předešlé studii je právě jednoznačné spojení rodů Schoenoxiphium a Kobresia s rodem Carex, naznačující tak, že všechny 3 rody mají původ v "ostřicoidním" předku. Starr et al. (2004) se zaměřili primárně na jednoklasé druhy, pracovali s 52 zástupci všech druhů v tribu. V rámci rodu Carex pak zahrnuli do své analýzy zástupce všech 4 podrodů sensu Kükenthal (1909), přičemž z největších podrodu Vignea a Carex vybrali jen několik reprezentativních zástupců. Analyzovali ITS a ETS f1 sekvence z jaderné DNA. Výsledky této studie jsou víceméně ve shodě s předchozími molekulárními analýzami. Autoři rozlišili 4 různě silně podpořené klady. Opět zde nalézáme dobře podpořený monofyletický klad/podrod Vignea a klad tvořený druhy podrodů Carex a Indocarex. Rody Uncinia, Kobresia, Cymophyllus a velká část jednoklasých ostřic z podrodu Primocarex (Kükenthal 1909) vytvořily jen slabě podpořený klad, který byl sesterský k o něco lépe podpořenému kladu sdružujícímu rod Schoenoxiphium s menší částí jednoklasých ostřic. Obecně se dá říct, že autoři této studie přidali další argumenty zpochybňující monofyletičnost rodu Carex tak, jak je dnes vymezován. Na druhé straně potvrdili - 4 - monofyletičnost druhů sdružovaných do podrodu Vignea, stejně jako monofyletičnost kladu tvořeného druhy z podrodů Carex a Indocarex. Rovněž potvrdili monofyletičnost větve tvořené druhy rodu Uncinia, avšak její pozice byla vnořená do rodu Carex. Starr & Ford (2009), v práci navazující na předchozí studii, přidali další druhy a podrobněji prozkoumali postavení rodu Uncinia. V této práci již používají pojmosloví navržené ve Waterway et Starr (2007) místo do té doby používaného označování kladů na fylogenetických stromech písmeny abecedy. Zároveň pod nově navrženými názvy kladů shrnuli výsledky předchozích studií (Yen & Olmsted 2000, Roalson et al. 2001, Starr et al. 2004, Waterway & Starr 2007). Nová označení byla vybrána podle nejodvozenějších zástupců 4 hlavních kladů druhů v tribu Cariceae. Ve všech pracích dobře vylišovaný klad, který obsahoval většinu druhů zařazovaných morfologickými systémy do podrodu Vignea (až na výjimky jako C. curvula) a také dvoudomé druhy C. dioica a C. davalliana (subg. Primocarex sensu Kükenthal 1909; subg. Carex, sect. Physoglochin sensu Egorova 1999), označili jako klad Vignea. Druhý velmi dobře vymezený klad byl označen jako "core Carex". Obsahuje typické zástupce různoklasých ostřic vymezovaných morfologicky do podrodu Carex (z našich druhů např. C. nigra, C. vaginata nebo C. sylvatica) a podrodu Indocarex (C. echinochloe, C. filicina, C. baccans, C. polystachya). Dalším kladem, jehož vymezení již nebylo tak dobře podpořené, byl klad Schoenoxiphium s monofyletickou větví rodu Schoenoxiphium a s přidruženými jednoklasými ostřicemi z Evropy a jižní Ameriky, jako jsou C. pulicaris nebo C. acicularis a které byly řazeny do podrodu Primocarex. Poslední klad, sdružující zbývající druhy a rody, pojmenovali "core Unispicate". Zařadili do něj rod Uncinia (který v něm tvoří monofyletickou větev), rod Kobresia (jehož postavení v rámci kladu se v jednotlivých studiích liší), rod Cymophyllus a některé ostřice z podrodu Carex a Primocarex (C. obtusata, C. rupestris a další). Poslední dva jmenované klady označují souhrnně jménem Caricoidea, aby naznačili jejich odlišnost od kladů core Carex a Vignea. Vzájemné postavení výše popsaných kladů se v jednotlivých studiích lišilo a odlišovaly se i topologie stromů získané ze stejných dat jinými metodami (Obr. 1). Starr & Ford (2009) proto doporučili pracovat se vztahy mezi hlavními klady jako s nevyjasněnými.
- 5 -
Obr. 1. Vzájemné vztahy 4 hlavních kladů v tribu Cariceae nalezené v 6 studiích založených na molekulárních markerech, převzato ze Starr & Ford (2009). Metody, použité ke konstrukci fylogenetického stromu, jsou vyznačeny v levém horním rohu každého diagramu (PARS maximální parsimonie, ML maximum likelihood, Bayes Bayesiánská metoda), čísla nad větvemi označují hodnoty boostrapování spolehlivost větví (hodnoty > 75 jsou považovány za velmi dobré). Znaky označují jednotlivé klady: čtverec (core Carex), trojúhelník (Vignea), plné kolečko (core Unispicate), prázdné kolečko (Schoenoxiphium).
Waterway et al. (2009) ve své studii naznačili možnost existence pátého kladu sesterského ke 4 dříve vymezeným kladům v tribu Cariceae. Tento nový klad, zahrnující dva druhy z východoasijské sekce Siderostictae (C. siderosticta a C. pachygina, Egorova 1999) se odlišil jako velmi dobře podpořená samostatná skupina ve všech jimi provedených analýzách. Složité fylogenetické vztahy na vyšších taxonomických úrovních zrcadlí složitost vzájemných vztahů na úrovni sekcí a příbuzenských skupin. Těmito vztahy se zabývalo již mnoho prací, kromě výše vypsaných studií rodu Carex to jsou například práce o podrodu Vignea (Hendrichs et al. 2004a, Ford et al. 2006, Hipp et al. 2006, King et Roalson 2008 a další) nebo o - 6 - sekcích v podrodu Carex (Escudero 1993, Roalson & Friar 2004, Hendrichs et al. 2004b, Stoeva et al. 2005, Derieg et al. 2008 a další).
1.1.3. Taxonomické pojetí použité v této práci V předkládané práci používám dvě taxonomická pojetí rodu Carex. První pojetí je postavené na morfologickém systému a odpovídá práci Egorova (1999). Rozlišuji 3 poddruhy v rámci rodu Carex, a to subg. Carex, subg. Vignea a subg. Primocarex (Příloha 1.) Druhé pojetí vychází z práce Starr & Ford (2009) a používám ho kde pracuji s fylogenetickým stromem. Rozlišuji 3 hlavní klady, klad core Carex, klad Vignea a klad Caricoidea (Příloha 3.)
1.2. Velikost genomu 1.2.1. Variabilita velikosti genomu Velikost genomu u rostlin je pozoruhodně variabilní. Nejmenší dosud nalezený rostlinný genom má Genlisea margaretae 63 MBp, tj. 2C = 0,026 pg (Greilhuber et al. 2006), největší pak Fritillaria assyriaca 2C = 254,8 pg (Bennett & Leitch 2005), to je zhruba 2000násobný rozdíl. Rozložení velikostí genomu není rovnoměrné, většina rostlin má malé genomy (Obr. 2). U ostatních mnohobuněčných organismů jsou rozdíly mezi největšími a nejmenšími hodnotami mnohem menší (Gregory 2004; Obr. 3). Obsah jaderné DNA v buňce byl popisován různými termíny, nejčastěji "C-value", "Cx- value" a "genome size". Velikost genomu tedy může popisovat jak obsah DNA v buňce bez ohledu na ploidii (označení C-value), tak i velikost monoploidního genomu (Cx-value) s použitím násobku x pro označení stupně ploidie (Greilhuber et al. 2005). Hodnotu "1C-value" definoval Swift (1950) jako obsah DNA v nereplikované haploidní buňce. O dvě desítky let později již byla známa velikost genomu různých organismů od mloků po člověka a bylo stále zjevnější, že tehdejší představa, spojující obsah DNA s komplexností organismu, není dále udržitelná (Obr. 3). Thomas (1971) pro tento jev navrhl termín "C-value paradox". Tento paradox byl záhy odstraněn objevem nekódující DNA, která může tvořit většinu DNA v buňce (až 70% u Zea mays, SanMiguel & Bennetzen 1998) a na jejíž konto padá hlavní část variability ve velikosti genomu. - 7 -
Obr. 2. Histogram velikostí genomu 3493 vyšších rostlin z Plant C-values database (Bennet & Leitch 2005). Histogram je oříznut u hodnoty 1C = 30 pg, celý graf pokračuje až k 1C = 127,4 pg. Převzato z Knight et al. (2005).
Obr. 3. Rozsah hodnot velikostí haploidního genomu u různých skupin organismů. Krytosemenné rostliny (angiosperms, červeně) mají největší rozsah hodnot ze všech eukaryotních - 8 - organismů. Černě jsou označeny ostatní zástupci vyšších rostlin, šedivě pak zástupci ostatních skupin organismů.Tento obrázek zároveň ilustruje tzv. C-value paradox. Převzato z Gregory (2004).
Role této nekódující DNA nebyla dosud spolehlivě vysvětlena, pro což Gregory (2001) navrhl termín "C-value enigma". Vysvětlující hypotézy se dají shrnout do 3 hlavních směrů: a) nukleoskeletární teorie (Cavalier-Smith 1978, 2005) – Nekódující DNA je nezbytná pro správnou funkčnost cytoplazmatického a jaderného aparátu. Tato teorie pohlíží na nekódující DNA z mechanického hlediska, "nadbytečná" DNA zde slouží jako výplň jádra zajišťující ideální poměr mezi objemem jaderné a cytoplazmatické hmoty (tzv. karyoplasmatic ratio). Tento poměr má být esenciální pro zajištění optimální rychlosti syntézy a transportu proteinů a RNA. b) "sobecká" nebo "odpadní" DNA – Nekódující oblasti v genomu nemají žádný nebo jen malý vliv na funkčnost buňky nebo organismu, většina z nich je jen pouhou sobeckou DNA, která parazituje na hostitelském genomu. Parazitická DNA si nemůže dovolit příliš ovlivňovat, a tedy potenciálně znevýhodňovat, své hostitelské organismy a proto se fenotypově neprojevuje vůbec nebo jen nepatrně (Doolitle & Sapienza 1980, Orgel & Crick 1980, zpopularizované Dawkinsem 1989). c) Sobecká/zbytečná DNA s vlivem na hostitelský organismus – Tento pohled je kompromisem mezi extrémy obou předchozích. Velký genom může být pro rostlinu nevýhodný, jeho replikace je pro ni zátěží a snižuje tak životaschopnost rostliny i druhu, na což poukazuje pohled na zastoupení velikostí genomů rostlin v Kew C-value databázi (Knight et al. 2005) nebo na seznam ohrožených druhů rostlin (Vinogradov 2003). Z druhé strany sem spadají úvahy o možném vlivu amplifikace mobilních repetitivních sekvencí v genomu rostlin vystavených stresu, které by tímto mohly získat dostatečnou genetickou variabilitu k vyselektování lépe přizpůsobeného fenotypu. A nebo naopak tato amplifikace může vést ke snížení životaschopnosti rostliny či druhu (Kalendar 2000, Charlesworth et al. 2002).
- 9 -
1.2.2. Mechanismy změn velikosti genomu Mechanismy změn obsahu DNA u kvetoucích rostlin shrnuli Bennetzen et al. (2005). Polyploidizace je nejrychlejším způsobem navýšení obsahu DNA v jediné generaci. V historii evoluce rostlin je velmi častá (většina rostlin prošla několika koly polyploidizace a následující diploidizace spojené se ztrátou části nově nabyté DNA) a má svůj podíl na současné variabilitě velikosti genomu (Adams & Wendell 2005). Druhou možností je amplifikace již zmíněných repetitivních sekvencí DNA, zejména skupina nazývaná retrotransposony. Jsou to představitelé sobecké DNA, kteří neobsahují jiné geny než gen pro reverzní transkriptázu, která jim umožňuje se duplikovat a začleňovat do genomu nezávisle na buněčném dělení. Jejich amplifikace nejen následuje polyploidizační události (Adams & Wendell 2005), je také spojena s biotickým a abiotickým stresem (vyvolaným např. globálními změnami klimatu v poslední době ledové, blíže viz Vitte & Panaud 2005). V genomu rostlin se nacházejí nejen velmi staré skupiny retrotranspozonů, které jsou společné pro nahosemenné a krytosemenné rostliny a tedy pocházejí z doby před asi 200 miliony let, nejpočetnější jsou ale relativně mladé skupiny, které se amplifikovaly v posledních několika málo milionech let a které se v genomu rostlin mohou vyskytovat ve velkém počtu kopií (Vitte & Panaud 2005). Retrotranspozonové sekvence mohou ovlivnit expresi genů inzercí do genové sekvence nebo do (blízkosti) regulačních oblasti genů a tím buďto přímo ovlivnit fenotypovou reakci druhu nebo alespoň vytvořit dostatečnou variabilitu a potenciální adaptabilitu potomstva. Takovýto zásah do genové exprese je razantnější než pozvolna působící selekce a mohl by takto snáze vzniknout jedinec schopný přeskočit údolí v adaptivní krajině, obsadit jiné niky a tím začít cestu k vytvoření nového druhu (Wright 1932, Vitte & Panaud 2005). Mechanismy snižování obsahu DNA nejsou zcela objasněny. Jednou z hypotéz je vliv homologních a nehomologních rekombinací DNA, při kterých dochází k menším či větším delecím ale i inzercím. Rekombinace jsou podmíněny alespoň částečnou shodou okrajů rekombinovaných sekvencí, mezi nimiž dochází k vystřižení nebo vložení rekombinovaného úseku. V genomu rostlin se vyskytují jak oblasti bohaté na geny, tak oblasti bohaté na nekódující DNA, ve kterých pak může rekombinacemi docházet i k významným delecím v relativně krátké době (Vitte & Panaud 2005). Jiní autoři navrhují spíše pomalejší proces kumulací menších delecí v delším časovém měřítku (Bennetzen et al. 2005). - 10 -
Rozdíly ve velikosti genomu, nebo spíš v poměru nekódujících a kódujících sekvencí, jsou tedy nejspíše způsobeny rozdílnými rychlostmi a efektivitou výše uvedených mechanismů u různých organismů. U rostlin s holocentrickými chromozomy se k tomu mohou přidávat změny způsobené rozpady a fůzemi chromozomů, které jsou doprovázené snížením nebo zvýšením obsahu DNA (Leitch et al. 2010).
1.2.3. Selekční vlivy na velikost genomu Adaptabilita velikosti genomu je otázkou, která vědce zajímá již dlouhá desetiletí. Velikost genomu je ve vztahu k velikosti celé buňky (Jovtchev et al. 2006, Cavalier-Smith 2005, Knight & Beaulieu 2008), délce buněčného cyklu (Grime & Mowforth 1982, Cavalier-Smith 2005, Francis et al. 2008), velikosti rostlinných orgánů (Hodgson et al. 2010, Beaulieu et al. 2007a, Knight & Beaulieu 2008) a nebo rychlosti metabolismu (Beaulieu et al. 2007b, Knight & Beaulieu 2008). Buňky s velkým genomem mají pomalejší mitotické dělení. Důsledky se projevují ve fenologii druhu. Rostliny, které rostou v létě, mají obecně menší genomy, zatímco rostliny s většími genomy těží z chladných teplot na v zimě a začátku jara. Buněčný růst může probíhat za nižších teplot než buněčné dělení a to umožňuje jarním rostlinám za dostatku vody rychlou expanzi dlouživým růstem buněk, které se rozdělily (ale nerostly) během předchozí sezony. Tak mohou rostliny obsadit niku dříve než jejich rychleji rostoucí konkurenti s menšími genomy (Grime et Mowforth 1982). Velikost buněk je další faktor, který je ve vztahu k velikosti genomu. Tato závislost je silná, pozitivní a nejspíše všeobecná, byla nalezena u krytosemenných rostlin (přehled v Knight & Beaulieu 2008, Jovtchev et al. 2006 a další), řas (Connolly et al. 2008), ryb (Hardie & Hebert 2003) nebo u ptáků (Organ et al. 2007) a je jedním ze základních stavebních kamenů nukleoskeletární teorie (Cavalier-Smith 2005). Buňky průduchů jsou nejvhodnějším typem rostlinných buněk z několika důvodů: Vyskytují se na povrchu listů a lodyh a proto se dají snadno měřit na optických mikroskopech. Narozdíl od některých epidermálních buněk neprocházejí endopolyploidizací (Melaragno et al. 1993 in Knight & Beaulieu 2008) a jak zjistili Jovtchev et al. (2006), vztah velikosti genomu k velikosti buněk není ovlivněn ani endopolyploidizací ani vakuolizací buněk. Existuje silný selekční tlak na velikost průduchů tak, aby byla zajištěna dostatečná výměna plynů a nedocházelo ke zbytečným ztrátám vody (Hetherington & Woodward 2003 in Hodgson et al. 2010). - 11 -
Beaulieu et al. (2008) a Hodgson et al. (2010) zkoumali závislost velikosti genomu a velikosti průduchů u krytosemenných rostlin, první s přihlédnutím k zastoupení různých růstových forem a s využitím metody fylogenetických kontrastů, druzí s ohledem na geografické zastoupení vzorků a s využitím PCA k odhalení vzájemných vztahů. Beualieu et al. (2008) nalezli silnou pozitivní závislost délky průduchů na velikosti genomu a z výsledků odvodili, že velikost genomu determinuje minimální velikost jakéhokoli typu (nevakuolizovaných) buněk a další faktory, jako je vliv jednotlivých genů a podmínek prostředí, už pouze upravují výslednou velikost buňky v mantinelech vystavěných obsahem DNA. Jak ovšem upozornili Hodgson et al. (2010), autoři nepodávají žádný důkaz, proč by prediktorem měla být velikost genomu a ne velikost buněk. Hodgson et al. (2010) předložili komplexnější pohled, ve kterém uvažovali větší náklady větších buněk na tvorbu proteinů a udržení osmotické rovnováhy. Jako pravděpodobnější se jim jevila situace, kdy primární byla velikost buněk a velikost genomu se jí přizpůsobila. Další často zkoumanou závislostí je vztah velikosti genomu k hmotnosti semen. Různí autoři publikovali pozitivní závislost těchto dvou znaků (Thompson 1990, Knight & Ackerly 2002, Knight et al. 2005, Beualieu et al. 2007a), nicméně tato závislost nebyla tak jednoznačná jako u délky průduchů. Hmotnost semen je ovlivněna souhrou mnoha faktorů, jako je životní strategie druhu, zdatnost rostliny nebo ekologické podmínky prostředí (Fenner & Thompson 2005 in Hodgson et al. 2010). Beaulieu et al. (2007a) ve své studii napříč krytosemennými rostlinami potvrdili, že velikost genomu předurčuje hmotnost semen jen malou měrou (mezi 3-6 %) a to tak, že udává nejmenší možnou hmotnost semen. Důležitější jsou ale jiné, výše zmíněné faktory. Přesto tu zůstává stále nevysvětlený jev, kdy se relativně těžká semena vyvinula jak u druhů s malými tak i s velkými genomy, kdežto rostliny s velkým genomem jen vzácně mají malá semena. Robustní závislost velikosti genomu a velikosti buněk přivedla některé autory k otázkám, zda se tato závislost neprojeví i na vyšší organizační úrovni rostlinného těla nebo zda není ve vztahu k rychlosti fotosyntézy a metabolismu. Beaulieu et al. (2007b) sledovali parametr LMA (leaf mass per unit area, sušina listů vtažená na plochu), který vypovídá o životním cyklu listu, rychlosti jeho růstu a fotosyntézy a nebo obsahu dusíku v něm (Wright et al. 2004 in Beaulieu et al. 2007), rychlost fotosyntézy a dýchání v temné fázi vyšších rostlin, vše s ohledem na příbuzenské vazby studovaných druhů. Ve výsledcích jejich analýz byl LMA sice negativně korelovaný s velikostí genomu, ale pravděpodobně to bylo způsobeno nějakým selekčním tlakem, - 12 - který působil na oba znaky společně. Dále s opatrností konstatovali, že neexistuje přímý vztah mezi velikostí genomu a rychlostmi metabolismu, tedy že účinnost metabolismu není omezována velikostí genomu. V přehledu, napsaném autory o rok později, přidali ke sledovaným závislostem ještě hustotu dřeva a konstatovali, že ani zde neobjevili statisticky významnou závislost na velikosti genomu. Metabolické dráhy a vyšší organizační struktury těla rostlin jsou tedy pod vnějšími selekčními tlaky, které jsou silnější než vliv velikosti genomu na velikost buňky (Knight & Beaulieu 2008). První pokusy korelovat velikost genomu s ekologickými parametry vycházely z aproximací ekologických faktorů zeměpisnou šířkou nebo nadmořskou výškou. Výsledky těchto prací byly nejednoznačné, část studií nalezla pozitivní závislosti, část negativní a část žádnou signifikantní závislost. To může být známkou toho, že tato závislost není jednoduše lineární, ale je spíš unimodální s omezením velkých genomů mimo extrémy (přehled v Knight et al. 2005). Nadmořská výška a zeměpisná šířka mohou být příliš hrubými měřítky k zaznamenání adaptací genomu, proto začaly být zkoumány takové ekologické faktory, které mohly mít na rostliny přímější vliv. Jsou to vlhkost a teplota, vyjádřené různými způsoby, od ročních průměrů přes sezónní maxima po teploty nutné k růstu a tolerance k mrazu. Knight et al. (2005) shrnují několik takových prací a ukazují, že ani zde není jednoznačný trend. Grime & Mowforth (1982) zjistili, že rostliny, které mají maximum růstu v letních měsících, mají menší genomy než rostliny s růstem na podzim či na jaře (viz odstavec o vztahu GS k mitóze). MacGillivray & Grime (1995) k tomu dodali, že mrazuvzdornost bylin britské flory je spojena s větším genomem. Suda et al. (2003) nalezli v makronézské floře jak pozitivní tak negativní vztah k velikosti genomu. Knight & Ackerly (2002) na základě studie kalifornské flory diskutovali, že takovéto výsledky by mohly být opět důsledkem nelineárního vztahu velikosti genomu a teploty. Výsledky studií zabývajících se vztahem velikosti genomu a vlhkosti prostředí jsou obdobně rozporuplné a také často trpí malým počtem studovaných druhů (Knight et al. 2005). Leitch et al. (2009) zmiňují další spojitosti s velikostí genomu, které nejspíš nemají mnoho co říct k evoluci genomu u ostřic, proto je zde zmiňuji jen okrajově - se zvýšeným obsahem DNA se pojí zvýšená citlivost na ozáření (Sparrow & Miksche 1961, Abrahamson et al. 1973) a znečištění těžkými kovy (Vidic et al. 2003), snižuje se rychlost speciace druhů (Vinogradov 2003), druhy s genomem větším než cca 20 pg (=1C) již nemohou být jednoletými (Bennet 1972) a jsou ve větším nebezpečí vyhynutí (Vinogradov 2003). - 13 -
1.3. AT/GC genomový poměr DNA rozdílných druhů obsahuje rozdílné zastoupení bazí a poměr mezi obsahem komplementárních bazí adeninu a thyminu (AT) a guaninu a cytosinu (GC) je druhově charakteristický. Tento poměr je pomocným taxonomickým znakem mikroorganismů pro vymezování vyšších hierarchických úrovní (např. Yamada & Komagata 1970, Holländer & Pohl 1980, Meier et al. 1999). Role a význam obsahu bazí v genomu rostlin jsou nejasné. V porovnání s mikroorganismy (25-75 % AT, Musto et al.) je zastoupení AT bazí v genomu rostlin v poměrně úzkém rozmezí 47-70 % a rozdíly mezi druhy jsou povětšinou malé (Barrow & Meister 2007). Několik prací zkoumalo vztah zastoupení AT bazí (AT/GC genomový poměr) k velikosti genomu a některým dalším biologickým parametrům. Studie založené na různě velkém vzorku taxonů dospěly k odlišným vztahům velikosti genomu a obsahu AT bazí. Vinogradov (1994) nalezl silný pozitivní vztah pro 12 nepříbuzných druhů živočichů, pozitivní vztah velikosti genomu a zastoupení AT bazí v rostlinách byl nalezen v rodu Allium (Narayan 1988) a mezi blízce příbuznými skupinami druhů čeledí Brassicaceae, Cyperaceae, Poaceae nebo Salicaceae (Bureš et al. 2007). Negativní vztah byl nalezen v rodu Lactuca (Koopman 2002 in Barrow & Meister 2007), žádný vztah pak nebyl nalezen v několika dalších studiích, například v rodu Hydrangea (Cerbach et al. 2001) nebo Allium (Ricroch et al. 2005). Barrow & Meister (2002), kteří analyzovali do té doby největší počet druhů z různých taxonomických skupin, nepotvrdili existenci tohoto vztahu napříč hlavními liniemi krytosemenných rostlin. Dá se tedy říct, že mezi blízce příbuznými skupinami lze tento vztah vysledovat, v rámci celých vyšších rostlin se však obecně platný trend nejspíš nevyskytuje a nebo je zamlžen rozdílnými evolučními událostmi v různých liniích vývoje krytosemenných rostlin. Takovými změnami, které mohou ovlivnit poměr zastoupení bazí v genomu, by mohla být polyploidie s následnou diploidizací genomu (spojená s preferenčním odstraňováním některých úseků z jaderné DNA, Vitte & Panaud 2005) a nebo amplifikace transpozonů s odlišným poměrem zastoupení bazí než v hostitelském taxonu (Vinogradov 2005, Šmarda et al. 2007 a další).
1.4. Chromozomy Rod Carex, stejně jako celá čeleď Cyperaceae, má takzvané holokinetické nebo holocentrické chromozomy, které postrádají centromeru a mají kinetochor rozptýlený po celé délce chromatid. Fragmentace (agmatoploidie) a fůze (symploidie) chromozomů nejsou pak tak - 14 - závažné jako u druhů s monocentrickými chromozomy, protože fragmenty holocentrických chromozomů nejsou v meióze ztráceny a dědí se, neboť nevedou ke vzniku neživotaschopné gamety. V populaci druhů tak mohou vznikat skryté chromozomové rasy, které se odlišují pouze počty chromozomů, morfologicky mohou být neodlišitelné. Holocentrické chromozomy se vyvinuly nezávisle v několika dalších liniích vyšších rostlin (všechny citace zde z Hipp 2007), kromě Juncaceae, sesterské čeledi k čeledi Cyperaceae (popsal Heilborn 1924), také v rodech Drosera (Sheikh et al. 1995), Cuscuta (Pazy & Plitmann 1994), Chionographis (Tanaka & Tanaka 1977) a Myristica (Flach 1966). Kromě toho se vyvinuly také v několika živočišných skupinách, jako jsou hlístice (Nematoda, Buchwitz et al. 1999), nebo hmyz (Perez et al. 2000, Nokkala et al. 2002). Rod Carex se vyznačuje neobvykle různorodými chromozomovými počty, od n=6 (C. siderosticta, Tanaka 1940) po n= 62 (C. roraimensis, Hipp 2007). Zároveň se v rodu vyskytuje více jak 100 druhů ostřic, které mají více chromozomových počtů, v některých druzích bylo zjištěno k 10 různým počtům chromozomů (Roalson 2008). Původ této variability je spojen s holocentrickou stavbou chromozomů, nicméně její příčiny jsou nejasné. (Hipp 2007). Ostřice, narozdíl od ostatních rostlinných druhů s holocentrickými chromozomy, mají nejenom různorodé chromozomové počty, ale vyznačují se také vysokou druhovou diverzitou. V rodu Carex je polyploidie vzácná, byla dokumentována jen u C. siderosticta, C. dolichostachya, C. parciflora a C. roraimensis (Hipp et al. 2009). To naznačuje, že s diverzifikací a speciací rodu jsou spojeny zejména změny v chromozomových počtech, kdežto polyploidie je pouze okrajový jev. Chromozomální evoluce je hnací silou speciace u různých skupin organismů (Coyne & Orr 2005 v Hipp 2007) včetně těch, které mají holocentrické chromozomy (motýli rodu Agrodiaetus, Kandul et al. 2007). Nelze však prozatím rozhodnout, zda u ostřic tyto změny přecházely nebo následovaly evoluci druhů Stejně tak nelze s jistotou říct, zda společný předek všech ostřic měl malý nebo větší počet chromozomů, případně o jaký konkrétní počet se jedná (Hipp 2007, Hipp et al. 2009). Velikost genomu je u většiny druhů pozitivně korelovaná s monoploidním počtem chromozomů, u ostřic nalezli Nishikawa et al. (1984) opačnou závislost. To je ve shodě s pozorovanou vzácností polyploidie, která způsobuje nejen zvětšení velikosti genomu, ale i zdvojnásobení počtu chromozomů. U agmatoploidie a symploidie se obecně nepředpokládá významný vliv na obsah jaderné DNA (Kuta et al. 2004). - 15 -
1.5. ITS sekvence Rozvinutí a s tím spojené zlevnění sekvenačních metod umožnilo velký rozmach molekulárně genetických metod, které se začaly široce používat i v rostlinné taxonomii (Feliner & Roselló 2007). Pro studie na vyšších taxonomických úrovních (rody, čeledě) se využívají kódující geny, které jsou poměrně konzervativní a dobře vypovídají o zásadnějších změnách. Jsou to zejména plastidové geny rbcL, atpB, matK a další (např. Graham & Olmstead 2000, Jansen et al. 2007, Hilu et al. 2003). Ke studiu na nižších úrovních, mezirodové, mezidruhové a vnitrodruhové úrovni, se používají variabilnější úseky genomu, introny a spacery, tedy nekódující DNA oddělující kódující úseky. Jsou to zejména chloroplastový trnL intron a trnL-F spacer (i kombinované s chloroplastovými geny – např. Muasya et al. 2009, Systma et al. 2002) a jaderné ITS spacery. Již více jak deset let (Baldwin 1995, Felliner & Roselló 2007) je internal transcribed spacer, ITS, nejrozšířenější sekvencí používanou v rostlinné fylogenetice. ITS jsou nekódující úseky jaderné ribozomální 18S-5.8S-26S DNA (nrDNA), které oddělují 5.8S podjednotku (Obr. 4).
Obr. 4. Schématické znázornění sekvence ribozomální jaderné DNA s ITS markery. Geny 18S, 5.8S a 26 podjednotky jsou odděleny sekvencemi ITS1 a ITS2. ITS marker je tvořen sekvencemi ITS1, 5.8S podjednotky a ITS2. Převzato Calonche et al. (2008).
Celý úsek nrDNA je přepisován společně jako jedna transkripční jednotka, kterých se v genomu vyskytuje několik stovek až tisíc kopií, a ačkoli jsou ITS přepisovány do RNA, nepodílejí se na stavbě zralého ribozomu a jsou z RNA vystřiženy. Baldwin (1995) uvedl několik studií, které popisovaly funkci ITS sekvencí při dozrávání ribozomů a jejich podíl na regulaci tvorby ribozomálních podjednotek. Obecným předpokladem využití ITS ve fylogenetických studiích je představa, že všechny kopie ribozomální DNA v celém genomu jsou identické, protože jejich produkty jsou esenciální pro život buňky a mutace v sekvenci by vedla k vytváření vadných a hůře fungujících proteinů. - 16 -
Jelikož jsou ITS vystřihovány a nezúčastňují se přímo na stavbě ribozomu, mohou se v nich hromadit mutace, zatímco v kódujících podjednotkách (18S, 5.8S, ...) by mutace mohly být fatální. 5.8S podjednotka není naprosto identická ve všech živých organismech, změny v ní ale nejsou tak časté a výrazné. Starr et al. (2007) našli inzerci 3 nukleotidů (označili ji za velkou!), ke které došlo kdysi krátce po oddělení Cyperaceae a Juncaceae a která byla v několika větvích nezávisle na sobě ztracena. Důvody, proč jsou studie založené na ITS sekvencích tak rozšířené, se dají shrnout v několika bodech (Felliner & Roselló 2007): (i) dostupnost setů primerů k osekvenování širokého spektra druhů, (ii) mnoho kopií v genomu usnadňuje amplifikaci hledané sekvence a umožňuje použít i herbarizovaný materiál, (iii) sekvence jsou dlouhé tak, že je lze sekvenovat bez mezistupňů interních primerů a zároveň poskytují dostatečnou variabilitu v bazích k provedení fylogenetických studií na druhové úrovni, (iv) na rozdíl od chloroplastových genů se dědí od obou rodičů (biparentálně), (v) v neposlední řadě velké množství osekvenovaných druhů (více než 165 000 ITS sekvencí vyšších rostlin k březnu 2010, databáze GenBank, Benson et al. 2010,) umožňuje provádět velké srovnávací studie bez nutnosti rozsáhlého a nákladného sekvenování. Také to umožňuje do studií zařadit i druhy ze zajímavých, ale pro badatele aktuálně obtížně dostupných skupin. Výhrady a doporučení při používání ITS markerů shrnuli Felliner & Roselló (2007) a Calonje et al. (2009). Za prvé upozornili, že předpoklad shodné evoluce (concerted evolution), zajišťující jednotnost sekvencí v rámci genomu, pro ITS neplatí. Zejména v hybridně vzniklém organismu (taxonu) spolu mohou koexistovat sekvence různého původu po dlouhou dobu. Stejně tak mohou ITS sekvence a jejich doprovod (myšlena jednotka ribozomální DNA, do níž ITS spadá a která je přepisována jako celek) mutovat rychleji než je rychlost homogenizujících procesů a nebo se mohou vyskytovat na místech, kde nejsou pod tak silným selekčním tlakem a kde mohou hromadit mutace nezávisle na zbytku sesterských sekvencí v genomu. Pak se zvyšuje možnost osekvenování takovéto sekvence, která vypovídá spíš o vymanění se z okovů funkčnosti (ortology, paralogy, pseudogeny) nebo o hybridním původu genomu, než aby postihovala výsledek evoluce taxonu a umožňovala ve fylogenetických analýzách najít správnou pozici studované sekvence v topologii fylogenetického stromu. Šance použití takové sekvence se dá snížit důkladným prozkoumáním sekvence s vyhledáváním typických motivů (např. Buckler et - 17 - al. 1997, Hughes et al. 2002), nepřímo ze změněného obsahu bazí (Razafimandimbison et al. 2004) nebo spolehlivě složitějšími molekulárními metodami (přehled viz Bailey et al. 2003).
1.6. Fylogenetické kontrasty 1.6.1. Úvod do fylogenetických kontrastů Druhy se vyvíjejí ze společného předka a mají jeden společný výchozí bod pro všechny vlastnosti. Příbuznější druhy mají podobnější hodnoty znaků (genomických, morfologických, ekologických) než druhy, které si jsou méně příbuzné. Proto není možné ve statistických analýzách brát druhy/taxony jako na sobě nezávislé jednotky, což nejen omezuje sílu a stupně volnosti statistických testů, ale i ovlivňuje stanovování vzájemných vztahů mezi nimi (viz Garland et al. 1992). Felsentstein (1985) proto navrhnul metodu, která tyto problémy odstraňuje. Navrhl počítat rozdílnost (kontrast) hodnot znaků mezi párem sesterských druhů nebo uzlů tak, jak jsou dané fylogenetickým stromem, a v počítání jít od koncových větví ke kořenům stromů. Pokud je topologie stromů správná, pak evoluční změny, které zapříčinily změny hodnot znaků jednoho kontrastu, neovlivňují hodnoty druhého kontrastu (Garland et al. 1992). Analýza fylogenetických kontrastů tak umožňuje zjistit, zda se vztah, který se objevuje mezi dnešními daty (třeba závislost zastoupení AT bazí na velikosti genomu), objevoval i v minulosti. Umožňuje zjistit, zda se sledované znaky měnily v evoluci taxonů společně. Zároveň umožňuje pro každý znak zjistit, zda se v evoluci taxonů vyvíjel náhodně, stochasticky, nebo zda jsou jeho hodnoty předurčeny fylogenetickými vztahy taxonů. K výpočtu těchto kontrastů je možné použít různé programy, zde rozepíšu pouze mnou použitý modul AOTF (Ackerly 2006) v programu phylocom (Webb et al. 2006).
1.6.2. Předpoklady analýzy K analýze je potřeba mít evoluční strom a znaky, jejichž evoluční signál a závislosti chceme studovat. Topologie stromu může být jak výsledkem molekulárních analýz, tak stejně dobře může být vytvořena na základě morfologických znaků nebo i velmi hrubě podle aktuálního systému daných taxonů. Toho využívají studie pracující s širokým taxonomickým záběrem (geofyty, krytosemenné, vyšší rostliny apod.), jejichž autoři mohou využít hierarchie taxonů v morfologických systémech (čeleď, tribus, rod). Jinou možnost nabízí domovský web programu phylocom, phylomatic (http://www.phylodiversity.net/phylomatic/). Je to online nástroj pro - 18 - generování stromu na základě vložených druhů. Strom, ze kterého phylomatic vychází, je vytvářen ve spolupráci se skupinou Angiosperm Phylogeny Group, studující a shrnující dosavadní poznatky o fylogenetických vztazích krytosemenných rostlin. Bližší informace k tomuto projektu viz web Angiosperm Phylogeny Website (Stevens 2001 onwards). Důležitou informací jsou délky větví stromu, které by měly odrážet předpokládanou míru evolučních změn znaku/taxonů. Stromy sestavené na základě genomových sekvencí tento předpoklad splňují. Délka větví je stanovována podle míry změn/shody v sekvencích dvou porovnávaných taxonů a tedy délka větve k nejbližšímu uzlu vyjadřuje, jak moc se daný taxon liší od svého nejbližšího příbuzného taxonu nebo skupiny taxonů. Pokud je k dispozici pouze strom bez délek větví (například získaný z webu phylomatic), je možné přidat délky větví dodatečně datací uzlů podle fosilních nálezů. Fosilní nálezy neumožňují říct, kdy přesně se od sebe 2 taxony oddělily, protože paleontologický záznam není a nemůže být kompletní, ale umožňují provést konzervativní odhad doby, kdy už od sebe taxony byly jistě odděleny (tedy v době, kam je datovaný fosilní nález). Datací stromů podle fosilních nálezů se zabývá řada badatelů a metody, které je umožňují, jsou založeny na různých předpokladech míry, rychlosti a směru změn (r8s [Sanderson 2003], multidivtime [Thorne & Kishino 2002], PATHd8 [Britton et al. 2007] a další). Datování stromů je primárně děláno na molekulárních stromech a slouží k doplnění obrazu nastíněného změnami v sekvencích a ke studiu změn míry rychlosti evolučních změn, nicméně je možné takto odatovat i stromy, které nejsou založeny na molekulárních datech. Existuje i jednodušší, hrubší, způsob datace takovýchto stromů. Slouží k tomu modul BLADJ v programu phylocom. BLADJ vyžaduje přesnou dataci kořenového uzlu (tedy toho nejstaršího, musí být dichotomický) a případně i dataci dalších uzlů uvnitř stromu, které již může být zadaná jako minimální stáří daného uzlu. Na základě těchto datací BLADJ rovnoměrně rozpočítá stáří pro neodatované nody a koncové taxony. Pro hlavní větve krytosemenných je možné využít informací z práce Wikström et al. (2001) anebo z APG webu. Sledované znaky, které vstupují do analýzy fylogenetických kontrastů, musejí být vztaženy k taxonům používaného stromu a musejí být vždy alespoň dva (aby bylo možné zjišťovat jejich vzájemný vztah v průběhu evoluce).
1.6.3 Phylocom - 19 -
Phylocom umožňuje oproti jiným programům práci se stromy s polytomiemi (z jednoho uzlu vycházejí víc jak 2 větve), tedy se stromy, ve kterých nejsou zcela jasné vztahy mezi některými skupinami, a to i při výpočtu fylogenetických kontrastů. Umožňuje také počítat se stromy, které nemají stanovené délky větví (délky všech větví jsou arbitrárně nastaveny na 1). Je tu jedno omezení týkající se hodnot znaků, phylocom zvládá pouze kontinuální a binární data, s daty na ordinální škále pracuje jako s kontinuálními (to se týká např. Ellenbergových indikačních hodnot). Pro všechny parametry, ať už genomové, morfologické nebo ekologické, je před hodnocením výsledků analýzy fylogenetických kontrastů potřeba zjistit, zda v této analýze nekorelují kontrasty s délkou větví stromu. Pokud by korelovaly, pak by výsledné fylogenetické kontrasty mohly vyjadřovat výsledek pouhého náhodného vývoje a rozrůznění parametrů (Garland et al. 1992). Čím déle se nějaký parametr vyvíjí, tím různorodějších hodnot může dosáhnout pouze tím, že má více času se vyvíjet (toto popisuje rovnice Brownova pohybu, názorné simulace např. v Butler & King 2004). Pokud kontrasty znaků korelují s délkou větví stromu, pak je potřeba sáhnout ke transformacím znaků nebo větví. Je možné použít jakékoli transformace obvyklé pro daná data a na každý znak může být použitá jiná transformace. Jak upozorňují Garland et al. (1992), toto se týká i délek větví, které mohou být transformovány stejnými metodami jako znaky. Krajním řešením je vymazání nebo nastavení konstantní délky větví stromu (délky větví blíže kořenu stromu jsou i přes to algoritmem výpočtu lehce prodlouženy, viz Ackerly 2006) a nebo vypnutí standardizace kontrastů v nastavení phylocomu (- e), ve výsledném souboru pak budou korelace nestandardizovaných kontrastů (výhody a nevýhody použití nestandardizovaných kontrastů viz Martins & Garland 1991). Standardizace kontrastů má ještě jeden význam, pokud je provedena, pak je možné kontrasty statisticky testovat stejnými způsoby jako normálně rozložená data (regrese, t-testy apod.). Modul AOTF počítá nejen hodnoty fylogenetických kontrastů, ale i fylogenetický signál znaků a kontribuční index uzlů.
1.6.4. Fylogenetické kontrasty Jak je řečeno výše, fylogenetické kontrasty se počítají jako rozdíly znaků mezi sesterskými taxony nebo uzly a výpočet postupuje od koncových větví ke kořenu stromu. Výsledkem je n-1 kontrastů, kde n je počet hodnot znaků, pro které se kontrast počítá. Směr odečítání kontrastů je - 20 - arbitrárně nastaven tak, že hodnoty kontrastu prvního znaku jsou vždy kladné a směr ostatních kontrastů na daném uzlu je vztažen k tomuto kontrastu. K porovnání vztahu dvou kontrastů je možné použít lineární regresi, která musí procházet počátkem právě kvůli arbitrárnímu přiřazení znamének kontrastům (matematické zdůvodnění viz. Garland et al. 1992, appendix 1). Statistickou významnost korelace standardizovaných kontrastů, jejíž korelační koeficient je v poslední výsledkové tabulce, lze zjistit z tabulek kritických hodnot pro Pearsonovo rozložení nebo použitím běžného t-testu se ztrátou jednoho stupně volnosti (df=n-1, kde n je počet kontrastů; Ackerly 2006). Zacházení s nestandardizovanými kontrasty viz práce Martins & Garland (1991). Lineární regrese fylogenetických kontrastů slouží k zjištění, zda se sledované znaky měnily v evoluci společně (ať už stejným směrem nebo proti sobě). Pokud je regrese kontrastů signifikantní, pak se evoluce obou sledovaných znaků odehrávala společně. Pokud není, pak se hodnoty jednoho znaku měnily v evoluci nezávisle na hodnotách znaku druhého. Určení směru, kterým se hodnoty znaků měnily, tedy jestli je zvyšování hodnoty jednoho znaku spojené se zvyšováním hodnoty druhého znaku a nebo jestli se zvětšení jednoho znaku pojí se zmenšením znaku druhého, není možné odvozovat z regrese kontrastů, je k němu potřeba provést přímou korelaci znaků vstupujících do analýzy. Může to být opět lineární regrese (pokud mají znaky normální rozložení), tentokráte bez nuceného průchodu počátkem, a nebo neparametrická korelace (pokud je rozložení znaků příliš vzdálené od normálního rozložení).
1.6.5. Fylogenetický signál Fylogenetický signál umožňuje určit, zda evoluce znaku byla náhodná (když není statisticky průkazný) a nebo šla ruku v ruce s evolucí taxonů a odpovídá fylogenezi nastíněné použitým stromem (když je průkazný). Jeho přítomnost nebo nepřítomnost se zjišťuje porovnáním variability mezi hodnotami standardizovaných kontrastů vzhledem k výsledkům permutačního testu, ve kterém jsou náhodně zaměňovány hodnoty znaků u koncových taxonů. (Šmarda, ústní sdělení). Výsledek těchto dvou kroků phylocom sumarizuje ve druhé tabulce výsledků analýzy. Statistická významnost fylogenetického signálu se určuje z podílu stromů se stejnou nebo nižší variabilitou znaku ku počtu permutovaných stromů + nepermutovaný strom (phylocom defaultně provádí 999 permutací, pak je podíl stromů s nižší nebo stejnou variabilitou znaku dělen 1000). - 21 -
Pokud je fylogenetický signál pro daný znak průkazný, pak to znamená, že se tento znak v evoluci sledovaných taxonů mění nenáhodně, jeho dnešní variabilita není výsledkem náhodných změn. Znamená to, že se tento znak měnil spolu s evolucí taxonů, že zde existuje posloupnost hodnot znaku od ancestrálního předka po dnešní taxony. Můžeme si pak dovolit spekulovat na základě korelací fylogenetických kontrastů, že buď přímo jeden znak předurčuje znak druhý (tedy hodnoty jednoho znaku závisí na hodnotách druhého znaku) a nebo že na oba znaky působí stejné selekční tlaky, které způsobují, že se hodnoty obou znaků mění pospolu. Pokud znak nevykazuje fylogenetický signál, pak se v evoluci měnil náhodně a bez vztahu k evoluci taxonů. To může být důsledek působení silných vnějších selekčních tlaků (prostředí, herbivorie, změna životní formy atp.), které umožňují přežití pouze takových taxonů, které mají určité hodnoty tohoto znaku. A nebo to může být důsledek chyb v topologii a délkách větví stromu, což by znamenalo, že se znak vyvíjel podle jiného schématu, než jaké je nastíněné tou konkrétní topologií stromu (Leitch et al. 2007).
1.6.6. Kontribuční index Kontribuční index (Moles et al. 2005) popisuje, jak moc daný uzel přispěl k dnešní variabilitě hodnot znaků, a umožňuje porovnávat příspěvky jednotlivých uzlů k této variabilitě. Počítá se jako poměr dvou parametrů: a) hodnota ukazující, kolik možné variability znaku se ztratilo shluknutím taxonů do dceřiných uzlů a b) hodnota ukazující, kolik může daný uzel vyčerpat variability z celkové možné variability stromu (Šmarda, ústní sdělení, přesný výpočet viz Ackerly 2006). Tedy čím více se liší hodnota znaku pro druhy vycházející z daného uzlu a čím více druhů z daného uzlu vychází, tím vyšší kontribuční index bude tento uzel mít (Leitch et al. 2007). Na základě kontribučních indexů pak lze říct, které uzly/divergence nejvíce přispěly k dnešní variabilitě znaků. Velké kontribuční indexy spojené s bazálními nody naznačují, že rozdíly mezi znaky jsou zásadní a pojí se s dávnou minulostí taxonů. Například rozdíl v listové ploše vztažené na plochu mezi nahosemennými a krytosemennými rostlinami se projevil ve vysokém kontribučním indexu uzlu oddělujícím tyto dvě skupiny (Beaulieu et al. 2007). Naopak velké kontribuční indexy spojené s koncovými větvemi naznačují, že k největším změnám došlo v nedávné době. V takové případě je dobré se podívat, zda daný znak vykazuje fylogenetický signál, a podle toho takovýto výsledek interpretovat. 22
2. Cíle práce
Hlavním cílem této práce bylo studovat genomické znaky a jejich adaptabilitu v rodu Carex. Ke studiu tohoto problémy sloužily následující dílčí cíle:
1. Změřit velikostí genomu, AT/GC genomového poměru a počtu chromozomů u středoevropských a dalších zástupců rodu Carex 2. Sestavit fylogenetický strom těchto druhů na základě literární rešerše a publikovaných ITS sekvencí 3. Studovat vzájemné vztahy genomických znaků neparametrickými korelacemi a analýzou fylogenetických kontrastů 4. Stejným způsobem studovat vztah genomických znaků k faktorům prostředí a k morfologickým znakům
23
3. Materiál a metodika 3.1. Materiál Rostliny byly sbírány v průběhu let 2006-2009 v terénu i z botanických zahrad (Příloha 2.) Herbářové položky těch druhů, u kterých to bylo možné, jsou uloženy v herbáři Ústavu botaniky a zoologie MU (BRNU). Všechny druhy ostřic byly revidovány R. Řepkou (Ústav lesnické botaniky, dendrologie a geobiocenologie, MZLU Brno), materiál z Ruska byl revidován také A. J. Koževnikem (Institute of Biology and Soil Science of the Russian Academy of Science, Vladivostok, Russia).
3.2. Průtoková cytometrie Velikost genomu a zastoupení AT bazí v DNA byly změřeny průtokovou cytometrií. Jako standard byly použity mladé listy Lycopersicon esculentum cv. ’Stupické polní tyčkové rané’ (1C ≈ 0,87 pg, AT% ≈ 61,15), u některých Cyperaceae byl nutný vnitřní standard Carex acutiformis (1C ≈ 0,41 pg, AT% ≈ 63,41). Oba standardy byly přeměřeny vůči Oryza sativa subsp. japonica 'Nipponbare' (International Rice Genome Sequencing Project 2005), u které bylo přečteno 95 % genomu a velikost genomu stanovena na 388,82 Mb s 56,4% zastoupením AT bazí. Přepočet velikosti genomu z Mb na pg byl proveden podle Dolezel et al. (2003), 1 pg DNA = 978 Mb. Ze vzorku a standardu byly odebrány malé části listové čepele (cca 0,5 cm2), které byly společně jemně rozsekány ostrou žiletkou v Petriho misce spolu s 0,5 ml ledového roztoku pufru Otto I (4,2 g monohydrátu kyseliny citronové a 1 ml 0,5% polyoxyethylenesorbitanu monolaurátu - vodný roztok, obchodním názvem Tween20, rozpuštěno ve 200 ml destilované vody a přefiltrováno). Vzniklá suspenze byla po přidání dalšího 0,5 ml pufru Otto I přefiltrována přes nylonový filtr s velikostí ok cca 0,45 μm a filtrát byl rovnoměrně rozdělen do 2 zkumavek. Filtrát v jedné ze zkumavek byl smíchán s 2 ml směsi pufru Otto II, RNAázy a fluorescenčního barviva PI (50 μg/ml propidium jodid) a analyzován na Partec Cy-flow (Green Laser Cobolt, Samba 100 mW, Partec GmbH., Německo). Obsah druhé zkumavky byl smíchán s 2 ml směsi pufru Otto II (0,4 M dodekahydrát hydrogenfosfátudisodného) a fluorescenčního barviva DAPI (4 μg/ml 4’,6-diamidino-2- fenylindol) a změřen na průtokovém cytometru PA-1 (Ploidy Analyser 1, HBO-lamp, Partec GmbH., Německo). 24
Každý vzorek byl změřen 3x v různé dny a to obě části vzorku zároveň. Získané hodnoty byly zprůměrovány, pro zastoupení AT bazí byl použit postup vycházející z práce Barrow & Meister (2002) a upravený a algoritmizovaný P. Šmardou (http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/Data/Festuca/ATGCFlow.xls). Všechna měření byla prováděna v Laboratoři průtokové cytometrie Ústavu botaniky a zoologie MU.
3.3. Stanovení počtu chromozomů K určení chromozomového počtu byly použity čerstvé kořenové špičky získané z kultivovaných rostlin a byla použita roztlaková metoda. Vzorky rostlin byly zbaveny hlíny, omyty čistou vodou a následně umístěny do sklenic s čistou vodou a kultivovány v pokojové teplotě a světelném režimu 16 h světla/8 hodin tmy. Kořenové špičky dlouhé asi 1 cm byly odebrány okolo 8. hodiny ranní, ihned umístěny do nasyceného roztoku paradichlorbenzenu a v něm ponechány 2 hodiny. Paradichlorbenzen je mitotický jed zastavující buněčné dělení a naložení špiček do něj zastaví buněčné dělení víceméně v metafázi, v níž jsou chromozomy nejsnadněji a nejlépe pozorovatelné. Po 2 hodinách byly kořenové špičky zafixovány ve směsi 96% alkoholu a ledové kyseliny octové v poměru 3:1 a ponechány přes noc v lednici. Takto nafixovaný materiál vydrží v chladu delší dobu (až 3 týdny), ale delší doba uchovávání může způsobit problémy s probarvením preparátu. Nafixované špičky byly následně macerovány ve směsi 96% alkoholu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové v poměru 1:1 po dobu 1-2 minut a poté vyprány v destilované vodě (1-2 minuty). Z macerovaných špiček byly vytvořeny dočasné preparáty jejich roztlačením pod krycím sklíčkem a obarvením kapkou červeného barviva laktopropionorcein. Preparáty byly pozorovány imerzním objektivem se zvětšením 100x na mikroskopu Olympus BX51, počítané buňky byly vyfoceny v programu cell^B (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Německo). Chromozomové počty pro nepočítané druhy byly převzaty z přehledu Roalson (2008) s přihlédnutím k jeho komentářům důvěryhodnosti údajů některých autorů.
3.4. Morfologické znaky Ke zjištění délek průduchů jsem použila mikroreliéfová metoda. Část čepele listu zhruba uprostřed až v horní polovině listu (aby byly otisky a potažmo velikosti buněk srovnatelné mezi druhy) jsem potřela jednou vrstvou bezbarvého rychleschnoucího laku na nehty. U Eleocharis 25 acicularis, Scirpoides holoschoenus a u druhů rodu Schoenoplectus jsem kvůli absenci listové čepele použila horní polovinu lodyhy. Po zaschnutí jsem vrstvička laku přenesla kouskem izolepy na podložní sklíčko a tímto kouskem izolepy jsem ji zároveň zafixovala. Většinu otisků ostřic jsem měřila opticky na mikroskopu Amplival (Carl Zeiss, Jena) s nástavným měřítkem, menší díl a všechny ostatní Cyperaceae pak za použití stejného mikroskopu a softwaru, jako byl použit při počítání chromozomů. Od každého druhu jsem změřila 10 průduchů (z 1 listu), ve většině případů přímo z cytometricky analyzovaného listu. Hodnoty jsem poté zprůměrovala. Údaje o rozměrech mošniček a nažek byly excerpovány z Klíče ke květeně České Republiky (Kubát et al. 2002), z Flora Europea (Chatter 1980) a z Flora of North America North of Mexico (Flora of North America Editorial Committee 1993+).
3.5. Ellenbergovy indikační hodnoty Pro vyjádření ekologických nároků druhů byly využity tzv. Ellenbergovy indikační hodnoty (Ellenberg et al. 1992; zkratka EIH). Nejsou to měřené hodnoty, ale hodnoty vyjadřující určitým způsobem empirické zkušenosti Ellenbergova týmu o typických podmínkách, ve které druhy rostou a které jsou pro ně nejspíš optimální. Tyto hodnoty jsou vztažené ke středoevropské floře a udávají, jaká teplota, světlo, kontinentalita, vlhkost, půdní reakce, obsah živin a salinita půdy jsou pro druhy typické. Pro jihoevropské druhy byly použity Ellenbergovy indikační hodnoty uváděné Pignattim (Pignatti et al. 1982). U rostlin s těžištěm rozšíření v oblastech s jinými podmínkami (například sibiřské nebo blízkovýchodní druhy) nemusejí hodnoty vyjadřovat fyziologické optimum druhu, ale jen jeho ekologické chování v oblasti střední a jižní Evropy. To ale není problém, protože měřené druhy, pro které jsou tyto hodnoty dohledatelné, pocházejí z Evropy a Ellenbergovy indikační hodnoty tedy vyjadřují ekologické optimum zde rostoucích a měřených populací.
3.6. Nomenklatura Nomenklatura byla sjednocena podle Klíče ke květeně České Republiky (Kubát et al. 2002), v Česku se nevyskytující druhy podle Flóry Skandinávie (Lid 1985), Illustrierte Flora von Mitteleuropa (Hegi 1967–1980).
26
3.7. Analýza ITS sekvencí ITS sekvence použité v této práci byly vzaty z databáze NCBI GenBank, přístupová čísla viz příloha XX. Jako outgroup byly vybrány druhy Scirpus radicans a Eriophorum vaginatum na základě práce Muasya et al. (2009), kteří se zabývali fylogenezí celé čeledi Cyperaceae. Skřípiny a suchopýry byly v této studii součástí větve Scirpoideae, sesterské větvi Cariceae. Tyto dva rody byly sloužily jako outgrupy i v dalších studiích tribu Cariceae a rodu Carex (viz Úvod 1.1.2.). Prvotní alignment sekvencí jsem provedla v programu ClustalX podle defaultního nastavení programu (slow-accurate). Takto získaný alignment jsem posléze manuálně upravovala v programu MEGA4 podle kriterií navržených v práci Starr et al. (2004). Úpravu alignmentu lze přijmout tehdy, pokud se touto úpravou zkrátí nebo alespoň neprodlouží délka parsimonického stromu získaného z alignmentu bez sledované úpravy. Použila jsem také alignment sekvencí, ze kterého Starr et al. (2004) vygenerovali výsledný publikovaný strom (uloženo v databázi TreeBASE, přístupové číslo alignmentu M485), a to jako předlohu pro úpravy alignmentu. Báze na pozicích 1-47, 73, 87, 99, 119-148, 164, 183, 188-190, 206-214, 247-275, 313-317, 324-325, 377, 509, 518, 530, 548-563, 582, 649-650, 672, 760, 767, 774 a 782-1376 předběžného alignmentu byly odstraněny podle výše uvedeného pravidla. Vyřazené pozice obsahovaly buď inzerce specifické pro jediný druh, které byly zkráceny na délku jednoho nukleotidu a v analýzách tudíž považovány za jediný evoluční krok, nebo mezery společné všem druhům, které zde zůstaly jako artefakty ručních úprav. Dwivedi & Gadagkar (2009) testovali chování nejčastěji používaných fylogenetických modelů v závislosti na množství mezer v sekvencích a zjistili, že všechny modely jsou schopné bezpečně vygenerovat správnou topologii stromu až do 20% zastoupení mezer v alignmentu. Se zvyšujícím se zastoupením mezer všechny modely generovaly stále nepřesnější topologie, nejlépe si i přes tyto obtíže vedla Bayesiánská analýza s Markov Chain Monte Carlo algoritmem. Podíl mezer v mém výsledném alignmentu nebyl vyšší než 7 % délky sekvencí, proto se jimi nebylo potřeba zabývat a kódovat je jako další znak. Výsledný alignment jsem použila pro konstrukci fylogenetického stromu. K výběru modelu pro fylogenetické analýzy jsem použila Modeltest (Posada & Crandall 1998) via jeho online podobu FindModel (http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/findmodel/findmodel.html). Tím, který nejlépe odpovídá mým datům, je General-Time-Reversible model. 27
K nalezení topologie stromu jsem použila program MrBayes 3.1 (Ronquist & Huelsenbeck 2003), pracující s Bayesianskou analýzou s Markov Chain Monte Carlo algoritmem. Byl použit GTR model s různými poměry mezi nukleotidy (gamma-shaped rate variation with a proportion of invariable sites; "lset nst=6 rates=invgamma"). Analýza běžela ve 4 simultánních Markovových řetězcích po 4 miliony generací se vzorkováním stromů každou 100 generaci ("nchains=4 ngen=4000000 samplefreq=100"). Se stejným alignmentem jako v Bayesianské analýze jsem také vyzkoušela často používanou metodu maximální parsimonie v programu MEGA 4 (Tamura et al. 2007) s defaultním nastavením až na zacházení s mezerami (Gaps/Missing Data – Use All Sites) a s bootstrapem 15 000. Míra spolehlivosti větví fylogenetického stromu vyjadřují v případě metody maximální parsimonie hodnoty bootstrapu, v případě Bayesiánské metody pak posterior probabilities (bližší informace a srovnání viz Alfaro et al. 2003, Zander 2004). Za velmi dobře podpořené, spolehlivé a věrohodné větve se považují ty, které mají hodnoty bootstrapu mezi 75-100 % a hodnoty posterior probabilities v rozmezí 1-0,9 (Zander 2004). Za větve s ještě dostatečnou podporou se dají brát ty, které mají hodnoty bootstrapu 50-74 % a posterior probabilities 0,7-0,89. Nižší hodnoty již naznačují, že pozice dané větve není jasná a je to potřeba brát v úvahu při hodnocení výsledků dalších analýz.
3.8. Analýza fylogenetických kontrastů Velikost genomu, zastoupení AT bazí a délku průduchů jsem netransformovala. Počty chromozomů (2n) splňovaly podmínky pro analýzu fylogenetických kontrastů po transformaci 1/2n, EIH pro teplotu (T) po logaritmické transformaci logT+1, EIH pro vlhkost (F) po transformaci 1/F4 a EIH pro dostupnost živin (N) po mocninné transformaci N4. Pro prezentaci výsledků analýz fylogenetických kontrastů jsem zvolila formu použitou v článcích Beaulieu et al. (2007) a Leitch et al. (2007), viz na další stránce (Tab. 1.) a (Tab. 2).
3.8. Zpracování výsledků Výsledky měření byly přeneseny do tabulkového procesu Excel, statistické analýzy byly provedeny v softwaru Statistica v9 (StatSoft, Inc. 1999). Fylogenetické stromy byly zobrazeny a upravovány v programu TreeGraph 2 (Stöver & Müller 2010). 28
Tab. 1. a) Spearman korelovaná proměnná Tab. 1. První část této tabulky, a), obsahuje korelující proměnné výsledky neparametrických korelací (Spearman's R) n R p rod Carex daných proměnných. Jsou korelovány jak všechny subg. Carex subg. Vignea druhy v rodu Carex ("rod Carex"), tak zástupci 3 subg. Primocarex rozlišovaných podrodů ("subg. Carex", "subg. Cyperaceae všechny Vignea", "subg. Primocarex"). Dále jsou korelovány phylo b) fylogenetické korelovaná proměnná zástupci čeledi Cyperaceae kromě rodu Carex kontrasty korelující proměnné ("Cyperaceae"). Řádek "všechny" obsahuje korelace n r2 p phylo všech měřených druhů, tedy všech zástupců čeledi Cyperaceae včetně rodu Carex. V řádku "phylo" jsou výsledky korelací pro ty druhy, které vstupovaly do analýzy fylogenetických kontrastů. Ellenbergovy indikační hodnoty, délky průduchů a délky mošniček a nažek nebyly získány pro všechny druhy zastoupené ve fylogenetickém stromu. Pro analýzy fylogenetických kontrastů jednotlivých znaků byl proto fylogenetický strom prořezáván v programu TreeGraph 2 (Stöver & Müller 2010) tak, aby obsahoval pouze druhy, u kterých byly známy dané znaky. Počet druhů, které vstupovaly do analýzy fylogenetických kontrastů, a výsledky neparametrických korelací hodnot těchto druhů jsou obsaženy právě v řádku "phylo". Důvodem pro tyto korelace byla potřeba srovnávat porovnatelné, tedy porovnávat výsledky analýzy fylogenetických kontrastů s neparametrickými korelacemi pro stejný soubor dat. Druhá část tabulky, b), obsahuje výsledky analýzy fylogenetických kontrastů. N je počet korelovaných kontrastů (vždy o 1 menší než počet druhů vstupujících do analýzy), r2 je hodnota spolehlivosti lineární regrese fylogenetických kontrastů skrz počátek (viz Úvod 1.6.), p je pravděpodobnostní hodnota hodnoty spolehlivosti získaná s pomocí online kalkulátoru (http://department.obg.cuhk.edu.hk/researchsupport/Correlation_coeff.asp), r2 musí být před tím odmocněno. Velmi podobné pravděpodobnostní hodnoty (lišící se na 4. desetinném místě) dává i korelační koeficient vypočítaný phylocomem (PicR). V tabulce a pro výpočet statistické významnosti korelací fylogenetických kontrastů jsem však raději použila hodnotu spolehlivosti r2 získanou z lineární regrese kontrastů v Excelu, neboť se mi z manuálu k modulu aotf (Ackerly 2006) nepodařilo jednoznačně potvrdit, že hodnota PicR je získaná z lineární regrese kontrastů skrze počátek.
29
Tab. 2. znak 1 divergence znak 2 Tab. 2. Tato tabulka popisuje
rank příspěvek uzel rank příspěvek příspěvky (tzn. kontribuční indexy) 1 - 2 + jednotlivých uzlů fylogenetických 3 + stromů k variabilitě daného znaku. Příspěvky sledovaného znaku (znak 1) jsou seřazeny od největšího po nejmenší a ty nejvýznamnější, tedy největší, jsou vloženy do tabulky do sloupců znaku 1. Rank znaku 1 označuje pořadí těchto příspěvků. Informace, v jakých uzlech se projevily největší příspěvky k variabilitě znaku 1, je ve sloupci "divergence" – uzel označuje písmennou zkratku daného uzlu ve fylogenetickém stromu (Příloha XX), ve druhém sloupci je pak slovní popis daného uzlu vyjadřující, jaká evoluční událost se k danému uzlu váže (např. oddělení kladu Vignea od kladu core Carex v uzlu C12). Rank znaku 2 označuje pořadí příspěvku znaku 2 v daném uzlu vzhledem k pořadí tohoto příspěvku v rámci všech příspěvků znaku 2 (např. uzel C12 nese pouze malý příspěvek k variabilitě ve znaku 2, ačkoli je pro znak 1 tím nejvýznamnějším uzlem, proto bude mít v kolonce "rank" znaku 2 vysoké číslo). Konkrétní číselné hodnoty příspěvků znaku 2 jsou vypsány ve sloupci "příspěvek" znaku 2. Znaménko za každým příspěvkem označuje směr fylogenetického kontrastu v daném uzlu. "+" označuje stav, kdy se se zvyšováním hodnoty znaku 1 zvyšovaly hodnoty znaku 2, "-" pak stav, kdy došlo ke zvýšení hodnoty znaku 1 a zároveň snížení hodnoty znaku 2.
30
4. Výsledky 4.1. Sekvence a fylogenetické analýzy Prvotní alignovaná matice sekvencí obsahovala sekvence dlouhé 781 nukleotidů náležející regionům ITS1, 5.8S ribozomální RNA a ITS2 (u některých druhů byla k dispozici i částečné sekvence ETS1, ty nebyly do analýz zařazeny). Po úpravách alignmentu zůstala matice obsahující sekvence dlouhé 648 bazí. Bayesiánskou analýzou bylo po 4 milionech generací nalezeno 72002 stromů vytvořených po dosažení stacionární fáze (indikuje ji hodnota "average standard deviation of split frequencies" < 0.01 vyjadřující míru rozdílnosti topologií stromů nalezených v každé generaci) a z nich posléze vytvořen konsenzuální strom ("sumt burnin=4000 contype=allcompat") s Bayesiánskými posterior probabilities, vyjadřujícími míru spolehlivosti větví (viz Metodika 3.7.; Příloha 3.). Topologie stromu získaného metodou maximální parsimonie odpovídala topologii nalezené Bayesiánskou metodou, obsahovala ale více polytomií a měla horší hodnoty věrohodnosti větví (Příloha 4.). Bayesiánská metoda je podle simulačních studií schopna lépe odhalit pravou topologii fylogenetického stromu a je robustnější vůči chybám v alignmentu sekvencí (Alfaro et al. 2003, Zander 2004, Dwivedi & Gadagkar 2009). Proto jsem zvolila Bayesiánský fylogenetický strom jako výchozí bod pro další analýzy. Tento fylogenetický strom odpovídá předchozím pracím (viz Úvod 1.1.2.). Bazální větve, odlišující 3 hlavní klady, jsou velmi dobře podpořené. Prvním kladem je klad Vignea zahrnující druhy z morfologického podrodu Vignea a oba dvoudomé druhy ostřic, C. dioica a C. davalliana. Druhým dobře vymezeným kladem je klad core Carex, obsahující druhy vymezované do morfologického podrodu Carex. V tomto kladu se hned na bázi oddělily dvě slabě podpořené větve, které označuji core Carex 1 a core Carex 2 a které se částečně liší v genomických a ekologických znacích. Třetí skupinu, kterou souhrnně označuji Caricoidea, tvoří ostřice morfologickým systémem řazené do podrodu Primocarex a některé další druhy, které se ve výše zmíněných studiích vymezují mimo podrod Carex. Vzájemné postavení 3 hlavních kladů, tedy Caricoidea, Vignea a core Carex, odpovídá nejlépe pracím Yen & Olmstead (2000) a Waterway & Starr (2007). Bazálním kladem je klad Caricoidea, odvozenější jsou pak klady Vignea a core Carex. Některé z menších příbuzenských kladů odpovídají sekcím sensu Egorova (1999) a morfologickým názorům (např. okruh C. muricata agg., sect. Paniceae nebo okruh okolo C. 31 flava). Postavení některých ostřic je naproti tomu nejednoznačné. Například C. curvula, která je v morfologickém sytému řazena do podrodu Carex (Egorova 1999) nebo Vignea (Chater 1980 v Ford 2006), spadá ve fylogenetických studiích a v této práci mimo tyto dva podrody a řadí se někam do kladu Caricoidea, přesná fylogenetická pozice není vyjasněná.
4.2. Popisná statistika 4.2.1. Genomické znaky Cytometricky bylo změřeno celkem 212 zástupců z čeledě Cyperaceae, z toho 159 zástupců rodu Carex se zaměřením na středoevropské zástupce, chromozomové počty byly spočítány pro 96 druhů rodu Carex (Příloha 1.). Velikost genomu se v rodu Carex pohybovala v rozmezí 0,24 pg (C. secalina) až 1,64 pg (C. flacca subsp. serrulata), obsah AT bazí v genomu od 59,39 % (C. firma) do 65,25 % (C. secalina) a počty chromozomů v rozmezí 18 (C. pilulifera) - 112 chromozomů (C. hirta). Rozsah hodnot v podrodech, jakožto v ostatních měřených zástupcích čeledi Cyperaceae, je rozepsán v Tab. 3.
a) 1C (pg) N min max průměr medián Tab. 3. Tabulka rod Carex 159 0,24 1,64 0,46 0,40 naměřených hodnot (1C = subg. Carex 108 0,24 1,64 0,50 0,41 subg. Vignea 40 0,24 0,75 0,37 0,36 velikost genomu, AT % = subg. Primocarex 9 0,28 0,53 0,37 0,32 Cyperaceae 55 0,20 7,41 1,12 0,43 zastoupení AT bazí, 2n = počet chromozomů) pro celý b) AT % N min max průměr medián rod Carex 159 59,39 65,25 63,30 63,36 rod Carex, podrody Carex, subg. Carex 108 59,39 65,25 63,27 63,36 Vignea a Primocarex a pro subg. Vignea 40 61,92 64,78 63,48 63,58 subg. Primocarex 9 61,28 64,73 62,96 63,17 ostatní zástupce čeledě Cyperaceae 55 57,32 65,61 62,05 62,53 Cyperaceae (bez rodu c) 2n N min max průměr medián Carex). N je počet rod Carex 152 18 112 59,5 58 subg. Carex 102 18 112 58,5 58 změřených druhů, min a max subg. Vignea 39 42 90 62,2 60 subg. Primocarex 9 46 76 59,5 52 označují nejmenší a největší Cyperaceae 46 10 136 56,0 57 hodnoty.
32
4.2.2. Morfologické znaky Délky průduchů jsem změřila celkem pro 110 druhů ostřic a 17 dalších zástupců Cyperaceae (Příloha 1.). Nejmenší průduchy má C. rostrata (15,1 μm, subg. Carex), největší C. baldensis (123,9 μm, subg. Vignea), z ostatních Cyperaceae má nejmenší průduchy Rhynchospora alba (24,9 μm) a největší tropická Fimbristylis nutans (63,3 μm). Rozsahy hodnot pro další taxonomické úrovně viz Tab. 4.
a) délka průduchů (μm) N min max průměr medián Tab. 4. Tabulka rod Carex 110 15,1 123,9 36,1 32,5 naměřených hodnot subg. Carex 70 15,1 116,4 36,3 32,9 subg. Vignea 32 20,5 123,9 35,6 31,7 délek průduchů, subg. Primocarex 8 26,7 45,5 36,5 36,5 Cyperaceae 17 24,9 63,3 37,9 38,6 mošniček a nažek pro celý rod Carex, b) délka mošniček (mm) N min max průměr medián rod Carex 126 2,25 16,25 4,2 3,58 podrody Carex, Vignea subg. Carex 85 2,25 16,25 4,2 3,50 a Primocarex a pro subg. Vignea 33 2,50 8,50 4,1 3,75 subg. Primocarex 8 2,75 6,50 3,9 3,63 ostatní zástupce čeledě c) délka nažek (mm) N min max průměr medián Cyperaceae (bez rodu rod Carex 87 1,35 4,80 2,2 2,00 Carex; délka mošniček subg. Carex 50 1,35 4,80 2,3 2,05 subg. Vignea 30 1,45 2,60 1,9 1,83 není uvedena, neboť subg. Primocarex 7 1,70 2,75 2,2 2,25 Cyperaceae 20 0,80 3,20 1,9 1,75 mošničky se vyskytují pouze v rodu Carex). N je počet změřených druhů, min a max označují nejmenší a největší hodnoty.
4.3. Korelace a fylogenetické kontrasty genomických znaků Velikost genomu je negativně koreluje se zastoupením AT bazí jak v rodu Carex a v jeho vnitřních skupinách (až na podrod Primocarex), tak v rámci studovaných druhů z čeledě Cyperaceae (Tab. 5.). Vztah velikosti genomu k zastoupení AT bazí potvrdily i fylogenetické kontrasty, oba znaky vykazují silný fylogenetický signál (p1C = 0,001, pAT = 0,021). Jejich změny nejsou náhodné a nezávislé na evolučních vztazích a předpokladech a evoluce těchto změn nejspíš odpovídá takové evoluci druhu, jaká je nastíněna zde použitým fylogenetickým stromem. S rostoucí velikostí genomu klesá zastoupení AT bazí a tudíž je změna velikosti genomu 33 důsledkem přibývání něčeho s vyšším obsahem GC bazí, nejspíš repetitivních sekvencí. To také svědčí o tom, že cesta navyšování obsahu DNA v buňce skrze polyploidizaci je u ostřic nepravděpodobná, což je ve shodě s dosavadními poznatky (Hipp et al. 2009). Počet chromozomů je také negativně korelovaný s velikostí genomu jak v rodu Carex a jeho vnitřních skupinách (opět až na podrod Primocarex), tak i v čeledi Cyperaceae (Tab. 5.). Fylogenetické kontrasty tuto závislost nepotvrdily. V průběhu evoluce rodu se tedy počet chromozomů měnil nezávisle na změnách velikosti genomu. To, co vytváří korelace velikosti genomu a počtu chromozomů v rodu Carex, jsou menší příbuzenské skupiny druhů. Jsou to druhy ze sekcí Phacocystis a Carex, které mají malé genomy a velké počty chromozomů, a druhy ze sekcí Aulocystis, Acrocystis a Paniceae, které mají malé počty chromozomů a větší velikosti genomu (sekce sensu Egorova 1999; Obr. 5). Počet chromozomů vykazuje silný fylogenetický signál (p = 0,001), tedy změny v počtech chromozomů nejsou úplně náhodné a jsou ovlivněny evolucí rodu.
Obr. 5. Bodový graf počtu chromozomů vynesených proti velikosti genomu v rodu Carex. Vyznačené sekce dle Egorova (1999) ukazují, že neparametrické korelace těchto dvou veličin jsou zkresleny vlivem příbuzenských skupin.
Kontribuční indexy všech genomických znaků spolu silně pozitivně korelují (RSp 1C-AT =
0,482, RSp 1C-2n = 0,617, RSp AT-2n = 0,273, p < 0,01), to znamená, že k významným změnám docházelo na stejných uzlech. Uzly, které nejvíce přispívají k dnešní variabilitě ve velikosti genomu, také nejvíce přispívají k variabilitě v zastoupení AT bazí a v počtu chromozomů (Tab. 34
6.). Pro velikost genomu to jsou ty bazální – k rozrůznění došlo při oddělování kladu Caricoidea od zbytku ostřic a pak zejména při oddělení kladu core Carex od kladu Vignea. Další velká změna je spojená s oddělením dvou velkých kladů uvnitř core Carex. U zastoupení AT bazí nejsou rozdíly v příspěvcích jednotlivých uzlů tak velké, vyčnívá zde jen změna na bázi core Carex spojená s oddělením dvou velkých kladů, o něco méně i změna na společném uzlu kladů Vignea a core Carex. U počtu chromozomů si největší podíl variability nárokuje bazální uzel oddělující C. baldensis a C. pauciflora od ostatních ostřic. Podstatně menší podíl na variabilitě, přesto větší než u většiny uzlů, vykazuje uzel ležící na bázi kladů Vignea a core Carex.
4.4. Korelace a fylogenetické kontrasty s EIH a genomickými znaky 4.4.1. Vlhkost (EIH pro vlhkost) Pro všechny ostřice (rod Carex) není vztah velikosti genomu a zastoupení AT bazí v něm k vlhkosti prostředí statisticky významný, na rozdíl od chromozomů, kterých s přibývající vlhkostí přibývá. V rámci podrodu Carex byly průkazné korelace všech genomických parametrů. Se zvyšující se vlhkostí prostředí se tedy zmenšuje velikost genomu a zároveň se zvyšuje zastoupení AT bazí a počet chromozomů. V podrodu Vignea průkazně klesá zastoupení AT bazí při vzrůstajících nárocích na vlhkost prostředí. Ostatní zástupci čeledě Cyperaceae projevují pozitivní vztah velikosti genomu a negativní vztah počtu chromozomů k vlhkosti prostředí, tyto závislosti jsou ale podmíněny zařazením rodu Eleocharis, bez něj jsou již všechny závislosti statisticky nevýznamné (nezařazeno; Tab.7.). Analýza fylogenetických kontrastů neukázala signifikantně pozitivní závislost vlhkosti prostředí s velikostí genomu. Oproti tomu zastoupení AT bazí se v průběhu evoluce rodu měnilo spolu s nároky na vlhkost prostředí. Změny zastoupení AT bazí šly proti změnám v nárocích na vlhkost, počet chromozomů ruku v ruce se s těmito změnami (Tab. 7.). Samotná EIH pro vlhkost nicméně nevykazuje fylogenetický signál (p = 0,794), čemuž nasvědčují i největší příspěvky k dnešní variabilitě v nárocích na vlhkost, které nese několik koncových uzlů zahrnujících jen malý počet druhů (Tab. 10.). Výsledky korelací fylogenetických kontrastů je proto potřeba brát s rezervou a považovat je spíš za výsledek náhody než za vypovídající veličiny. Z těchto výsledků tedy plyne, že Ellenbergova indikační hodnota pro vlhkost prostředí nejspíš není ve vztahu ke genomickým parametrům. 35
a) Spearman 1C Tab. 5. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) AT 2n genomových znaků (1C = velikost genomu, AT = zastoupení n R p n R p rod Carex 157 -0,588 0,000 150 -0,231 0,004 AT bazí, 2n = počet chromozomů) pro celý rod Carex, podrody subg. Carex 108 -0,660 0,000 102 -0,270 0,006 subg. Vignea 40 -0,675 0,000 39 -0,147 0,372 Carex, Vignea a Primocarex, zástupce čeledě Cyperaceae subg. Primocarex 9 -0,583 0,099 9 -0,513 0,158 vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Cyperaceae 55 -0,626 0,000 46 -0,545 0,000 všechny 212 -0,584 0,000 196 -0,366 0,000 "Phylo" označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických phylo 107 -0,557 0,000 107 0,337 0,000 kontrastů, počty chromozomů v ní a ve zde uváděné b) fylogenetické 1C -1 kontrasty AT 2n neparametrické korelaci byly transformovány (2n ). n r2 p n r2 p b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze phylo 107 -0,396 0,000 107 -0,194 0,000 počátek) genomických znaků, phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, počty chromozomů byly transformovány (2n-1). Znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
1C divergence AT 2n rank příspěvek uzel rank příspěvek rank příspěvek
1 0,209 C12 oddělení Vignea vs. core Carex 2 0,123 - 3 0,129 - 2 0,197 C9 oddělení dvou vnitřních kladů core Carex 1 0,273 - 8 0,034 - 3 0,111 base C. baldensis a C. pauciflora vs. zbytek rodu 35 0,007 + 2 0,500 + 4 0,097 C13 oddělení Caricoidea vs. Vignea a core Carex 46 0,005 + 35 0,006 + Tab. 6. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě genomických znaků. Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí nejvýznamnějších příspěvků pro velikost genomu. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy se s růstem velikosti genomu zvyšovalo zastoupení AT bazí nebo počet chromozomů, "-" pak zvětšení velikosti genomu spojené s poklesem zastoupení AT bazí nebo počtu chromozomů.
36
a) Spearman EIH F 1C AT 2n n R p n R p n R p rod Carex 108 -0,142 0,144 108 0,027 0,780 107 0,279 0,004 subg. Carex 74 -0,334 0,004 74 0,300 0,009 73 0,440 0,000 subg. Vignea 26 0,246 0,227 26 -0,543 0,004 26 -0,064 0,756 subg. Primocarex 8 0,464 0,247 8 -0,546 0,162 8 0,041 0,923 Cyperaceae 33 0,426 0,013 33 -0,180 0,315 33 -0,345 0,049 všechny 141 0,017 0,843 141 -0,137 0,106 140 0,052 0,545 phylo 90 0,130 0,222 90 -0,027 0,801 90 0,293 0,005 b) fylogenetické EIH F kontrasty 1C AT 2n n r2 p n r2 p n r2 p phylo 89 0,013 0,270 89 0,080 0,007 89 0,169 0,000 Tab. 7. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) Ellenbergovy indikační hodnoty pro vlhkost prostředí (EIH F) s genomovými znaky pro celý rod Carex, podrody Carex, Vignea a Primocarex, zástupce čeledě Cyperaceae vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány počty chromozomů (2n-1) a EIH F (1/F4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) EIH F a genomových znaků. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, počty chromozomů a EIH F byly před vstupem do analýzy transformovány (2n-1 a 1/F4); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
37
a) Spearman EIH T 1C AT 2n n R p n R p n R p rod Carex 101 -0,300 0,002 101 0,383 0,000 100 0,194 0,053 subg. Carex 67 -0,317 0,009 67 0,355 0,003 66 0,172 0,167 subg. Vignea 34 -0,108 0,542 34 0,521 0,019 34 0,129 0,468 subg. Primocarex 8 -0,204 0,627 8 0,204 0,627 8 0,084 0,844 Cyperaceae 33 0,264 0,137 33 0,078 0,668 33 -0,444 0,010 všechny 134 -0,132 0,130 134 0,296 0,001 133 0,003 0,972 phylo 84 -0,317 0,003 84 0,408 0,000 84 -0,222 0,043 b) fylogenetické EIH T kontrasty 1C AT 2n n r2 p n r2 p n r2 p phylo 83 -0,265 0,015 83 0,534 0,000 83 -0,091 0,410 Tab. 8. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) Ellenbergovy indikační hodnoty pro teplotu prostředí (EIH T) s genomovými znaky pro celý rod Carex, podrody Carex, Vignea a Primocarex, zástupce čeledě Cyperaceae vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány počty chromozomů (2n-1) a EIH T (logT+1), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) EIH T a genomových znaků. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, počty chromozomů a EIH T byly před vstupem do analýzy transformovány (2n-1 a logT+1); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
38
a) Spearman EIH N 1C AT 2n n R p n R p n R p rod Carex 105 -0,135 0,171 101 0,383 0,032 100 0,194 0,053 subg. Carex 67 -0,317 0,020 67 0,355 0,067 66 0,172 0,010 subg. Vignea 26 0,312 0,121 26 0,456 0,831 26 -0,129 0,529 subg. Primocarex 8 -0,385 0,346 8 0,204 0,821 8 0,084 0,844 Cyperaceae 33 0,125 0,487 33 0,189 0,292 33 -0,279 0,116 všechny 138 -0,058 0,502 138 0,247 0,003 138 0,126 0,142 phylo 88 -0,053 0,621 88 0,176 0,100 88 -0,249 0,019 b) fylogenetické EIH N kontrasty 1C AT 2n n r2 p n r2 p n r2 p phylo 87 0,033 0,094 87 0,112 0,002 87 0,203 0,000 Tab. 9. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) Ellenbergovy indikační hodnoty pro obsah živin v prostředí (EIH N) s genomovými znaky pro celý rod Carex, podrody Carex, Vignea a Primocarex, zástupce čeledě Cyperaceae vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány počty chromozomů (2n-1) a EIH N (N4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) EIH N a genomových znaků. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, počty chromozomů a EIH N byly před vstupem do analýzy transformovány (2n-1 a N4); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
39
EIH F divergence 1C AT 2n rank příspěvek uzel rank příspěvek rank příspěvek rank příspěvek 1 0,757 Cm6 C. alba a C. humilis vs. sect. Microrhynchae 44 0,000 + 17 0,025 - 5 0,078 + 2 0,355 C2 uzel okolo sect. Aulocystis 54 0,003 - 24 0,020 - 9 0,034 + 3 0,253 Cm1 C. alba vs. C. humilis 45 0,000 + 38 0,007 - 12 0,017 + 4 0,166 V1 C. remota vs. C supina 88 0,000 + 23 0,020 + 15 0,012 + 5 0,160 Ce3 C. ericetorum vs. C. kitaibeliana 32 0,005 + 88 0 - 26 0,004 - Tab. 10. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě v nárocích na vlhkost. Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí nejvýznamnějších příspěvků pro EIH F. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy s růstem EIH F rostla velikost genomu, zastoupení AT bazí nebo počet chromozomů, "-" pak zvýšení EIH F spojené s poklesem velikosti genomu, zastoupení AT bazí nebo počtu chromozomů.
EIH T divergence 1C AT 2n rank příspěvek uzel rank příspěvek rank příspěvek rank příspěvek 1 0,335 C13 oddělení Caricoidea vs. Vignea a core Carex 5 0,100 + 23 0,019 + 18 0,012 + 2 0,187 Cx8 vnitřní klad v core Carex s C. rariflora 27 0,007 - 9 0,046 + 11 0,018 - 3 0,159 C12 oddělení Vignea vs. core Carex 2 0,216 - 3 0,157 + 4 0,178 - 4 0,092 Cap3 C. capillaris vs. větev s C. acutiformis 32 0,005 - 20 0,025 + 34 0,003 - 5 0,086 Cp7 C. fuliginosa vs. sect. Paniceae 24 0,009 - 15 0,035 + 76 0 + Tab. 11. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě v teplotním optimu druhů. Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí nejvýznamnějších příspěvků pro EIH T. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy s růstem EIH T rostla velikost genomu, zastoupení AT bazí nebo počet chromozomů,, "-" pak zvýšení EIH T spojené s poklesem velikosti genomu, zastoupení AT bazí nebo počtu chromozomů.
40
EIH N divergence 1C AT 2n rank příspěvek uzel rank příspěvek rank příspěvek rank příspěvek 1 0,337 V1 C. remota vs. C supina 86 0 - 22 0,021 - 15 0,012 - 2 0,163 Vig3 vnitřní uzel zahrnující i C. supina 38 0,002 + 11 0,037 - 50 0,001 + 3 0,139 V2 C. divisa vs. C. remota a C. supina 42 0,001 + 17 0,025 - 33 0,003 + 4 0,117 C12 Vignea vs. core Carex 2 0,185 - 2 0,134 + 3 0,156 - 5 0,092 C13 Caricoidea vs. Vignea a core Carex 4 0,085 - 14 0,029 + 20 0,007 - Tab. 12. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě v nárocích na živiny. Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí nejvýznamnějších příspěvků pro EIH N. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy s růstem EIH N rostla velikost genomu, zastoupení AT bazí nebo počet chromozomů, "-" pak zvýšení EIH N spojené s poklesem velikosti genomu, zastoupení AT bazí nebo počtu chromozomů.
41
a) Spearman délka průduchů Tab. 13. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) délky průduchů s 1C velikostí genomu pro celý rod Carex, podrody Carex, Vignea a Primocarex, zástupce n R p rod Carex 110 0,052 0,591 čeledě Cyperaceae vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Phylo subg. Carex 70 -0,005 0,966 subg. Vignea 32 0,314 0,080 označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. subg. Primocarex 8 -0,476 0,233 b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) délky průduchů a Cyperaceae 17 0,445 0,073 všechny 127 0,128 0,150 velikosti genomu. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, n označuje počet phylo 83 -0,021 0,852 fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní b) fylogenetické délka průduchů kontrasty 1C přímky. Statisticky významné vztahy by byly vyznačeny tučně. n r2 p phylo 82 0,044 0,058
délka průduchů divergence 1C rank příspěvek uzel rank příspěvek 1 0,233 C13 oddělení Caricoidea vs. Vignea a core Carex 4 0,090 - 2 0,075 Ves C. rostrata, C. saxatilis, C. vesicaria 41 0,001 + 3 0,054 base C. baldensis a C. pauciflora vs. zbytek rodu 14 0,016 - 4 0,037 V24 muricátní Vignea vs. ostatní Vignea 74 0,000 + 5 0,034 C8 C. montana vs. core Carex 2 30 0,004 - Tab. 14. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě v délkách průduchů. Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí nejvýznamnějších příspěvků pro délku průduchů. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy s délkou průduchů rostla velikost genomu, "-" pak zvětšení délky průduchů spojené se zmenšením velikosti genomu.
42
a) Spearman délka průduchů EIH F EIH T EIH N n R p n R p n R p rod Carex 84 -0,180 0,102 81 -0,152 0,175 81 -0,103 0,360 subg. Carex 54 -0,201 0,145 51 -0,098 0,493 51 -0,049 0,735 subg. Vignea 23 -0,306 0,155 23 0,104 0,637 23 0,237 0,277 subg. Primocarex 7 -0,267 0,562 7 -0,478 0,278 7 -0,474 0,282 Cyperaceae 8 -0,321 0,438 8 -0,336 0,416 8 -0,103 0,809 všechny 92 -0,099 0,347 89 -0,132 0,218 89 -0,098 0,363 phylo 73 0,169 0,153 70 -0,218 0,070 71 -0,112 0,354 b) fylogenetické délka průduchů kontrasty EIH F EIH T EIH N n r2 p n r2 p n r2 p phylo 72 -0,029 0,152 69 -0,069 <0.05 70 0,080 0,010 Tab. 15. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) délky průduchů s Ellenbergovými indikačními hodnotami pro vlhkost, teplotu a živiny pro celý rod Carex, podrody Carex, Vignea a Primocarex, zástupce čeledě Cyperaceae vyjma rodu Carex a všechny analyzované druhy dohromady. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány EIH F (1/F4), EIH T (logT+1) a EIH N (N4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) délky průduchů a genomových znaků. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy, EIH byly před vstupem do analýzy transformovány (viz výše); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
43
délka průduchů divergence EIH F EIH T EIH N rank příspěvek uzel rank příspěvek rank příspěvek rank příspěvek 1 0,317 C13 oddělení Caricoidea vs. Vignea a core Carex 45 0 + 1 0,391 - 7 0,070 - 2 0,085 Ves C. rostrata, C. saxatilis, C. vesicaria 61 0 + 31 0,009 - 35 0,001 +
3TN 0,037 V24 muricátní Vignea vs. ostatní Vignea 15 0,024 + 11 0,034 +
3F 0,034 C8 C. montana vs. core Carex 2 24 0,004 + Tab. 16. Tabulka srovnání příspěvků (kontribučních indexů) jednotlivých uzlů ke dnešní variabilitě v délkách průduchů v porovnání s Ellenbergovými indikačními hodnotami pro vlhkost (EIH F), teplotu (EIH T) a živiny (EIH N). Rank označuje pořadí daného příspěvku podle velikosti od největšího k nejmenšímu, vše vztaženo k pořadí 3 nejvýznamnějších příspěvků pro délku průduchů. Znaménko označuje směr kontrastu v daném uzlu, "+" označuje stav, kdy s délkou průduchů rostla velikost genomu, "-" pak zvětšení délky průduchů spojené se zmenšením velikosti genomu. 3TN označuje 3. nejvýznamnější příspěvek při porovnávání s EIH T a EIH N,
3F označuje 3. nejvýznamnější příspěvek při porovnávání s EIH F.
44
a) Spearman délka mošniček 1C EIH F EIH T EIH N n R p n R p n R p n R p rod Carex 125 -0,008 0,932 104 -0,063 0,523 97 0,014 0,892 101 0,142 0,155 subg. Carex 84 0,028 0,799 71 -0,031 0,796 64 -0,091 0,474 68 0,126 0,308 subg. Vignea 33 -0,023 0,899 23 -0,306 0,155 26 0,337 0,092 26 0,248 0,222 subg. Primocarex 8 -0,108 0,798 7 0,680 0,093 7 -0,152 0,745 - - - phylo 101 -0,026 0,798 86 0,062 0,568 80 0,033 0,711 85 0,116 0,289 b) fylogenetické délka mošniček kontrasty 1C EIH F EIH T EIH N n r2 p n r2 p n r2 p n r2 p phylo 100 0,006 0,455 85 0,017 0,237 79 0,088 0,006 84 -0,002 0,672 Tab. 17. a) Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) délky mošniček s velikostí genomu a s Ellenbergovými indikačními hodnotami pro vlhkost (EIH F), teplotu (EIH T) a živiny (EIH N) pro celý rod Carex a podrody Carex, Vignea a Primocarex. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány délky mošniček (délka4) EIH F (1/F4), EIH T (logT+1) a EIH N (N4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". Hodnoty korelace délky mošniček s EIH N pro podrod Primocarex nejsou uvedeny, neboť EIH pro živiny v tomto podrodu nabývá pouze hodnoty 2. b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) délky mošniček, velikosti genomu a EIH. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy; všechny znaky byly před vstupem do analýzy transformovány (viz výše); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
45
a) Spearman délka nažek 1C EIH F EIH T EIH N n R p n R p n R p n R p rod Carex 87 0,151 0,163 71 -0,257 0,031 67 0,159 0,197 70 0,263 0,028 subg. Carex 50 0,014 0,924 42 -0,300 0,054 38 0,293 0,074 41 0,397 0,010 subg. Vignea 30 0,291 0,118 23 -0,332 0,122 23 0,471 0,023 23 0,526 0,010 subg. Primocarex 7 -0,786 0,036 6 -0,393 0,411 6 -0,370 0,470 6 0,131 0,805 Cyperaceae 20 0,296 0,205 19 0,631 0,004 19 -0,162 0,508 19 -0,137 0,575 všechny 107 0,173 0,074 90 -0,153 0,151 86 0,077 0,480 89 0,199 0,061 phylo 77 0,170 0,134 65 0,148 0,240 60 -0,073 0,577 64 0,025 0,842 b) fylogenetické délka nažek kontrasty 1C EIH F EIH T EIH N n r2 p n r2 p n r2 p n r2 p phylo 76 0,0218 0,203 64 0,012 0,374 59 -0,036 0,101 63 -0,001 0,834 Tab. 18. Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) délky nažek s velikostí genomu a s Ellenbergovými indikačními hodnotami pro vlhkost, teplotu a živiny pro celý rod Carex a podrody Carex, Vignea a Primocarex. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány délky nažek (délka4) EIH F (1/F4), EIH T (logT+1) a EIH N (N4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". b) Výsledky lineární regrese fylogenetických kontrastů (skrze počátek) délky mošniček, velikosti genomu a EIH. Phylo označuje druhy zahrnuté do této analýzy; všechny znaky byly před vstupem do analýzy transformovány (viz výše); n označuje počet fylogenetických kontrastů, znaménko u regresního koeficientu r2 označuje sklon regresní přímky. Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
46
Spearman délka průduchů délka mošniček délka mošniček délka nažek délka nažek n R p n R p n R p rod Carex 96 0,329 0,001 70 0,394 0,001 87 0,438 0,000 subg. Carex 60 0,415 0,001 37 0,328 0,048 50 0,466 0,001 subg. Vignea 28 0,225 0,249 26 0,422 0,032 30 0,724 0,000 subg. Primocarex 8 0,108 0,798 7 0,500 0,253 7 0,182 0,696 Cyperaceae - - - 6 0,290 0,577 - - - všechny 96 0,329 0,001 76 0,373 0,001 87 0,438 0,000 phylo 59 0,312 0,044 59 0,426 0,001 59 0,384 0,003 Tab. 19. Výsledky neparametrických korelací (Spearman R) morfologických znaků pro celý rod Carex a podrody Carex, Vignea a Primocarex. Phylo označuje druhy zahrnuté do analýzy fylogenetických kontrastů. Pro tuto analýzu byly transformovány délky mošniček (délka4) a délky nažek (délka4), tyto transformované hodnoty byly použity pro neparametrické korelace "phylo". Statisticky významné vztahy jsou vyznačeny tučně.
47
4.4.2. Teplota (EIH pro teplotu) Rod Carex vykazuje negativní závislost velikosti genomu a pozitivní závislost zastoupení AT bazí s Ellenbergovou indikační hodnotou pro teplotní optimum druhu. Vztah počtu chromozomů k EIH pro teplotu nebyl signifikantní. Zajímavá je závislost obsahu AT bazí na teplotě, která se ukázala jako statisticky významná nejen v celém rodu Carex, ale i v rámci nižších vymezovaných jednotek a také pro všechny měřené druhy společně (Tab. 8.). Analýza fylogenetických kontrastů ukázala stejné závislosti jako neparametrické korelace. Tomu odpovídají uzly, které nejvíce přispívají k dnešní variabilitě teplotních optim druhů a které se příliš neliší od uzlů přispívajících k variabilitě genomických znaků (korelace kontribučních indexů EIH pro teplotu a genomických znaků RSp = 0,223-0,384, p < 0,05). Jsou to uzly oddělující hlavní vymezované klady (Caricoidea, Vignea, core Carex) a uzly uvnitř kladu core Carex, které vymezují větší skupiny druhů (Tab. 11.). Nejvýznamnější příspěvek nese uzel oddělující relativně chladnomilný klad Caricoidea od teplomilnějšího kladu Vignea a různorodého kladu core Carex. EIH pro vlhkost vykazuje silný fylogenetický signál (p = 0,001). Dá se tedy říct, že čím má ostřice vyšší teplotní optimum, tím má menší genom, ve kterém se zvětšuje podíl AT bazí.
4.4.3. Obsah živin (EIH pro obsah živin) EIH pro obsah živin v prostředí není statisticky významně korelovaná s velikostí genomu a počtem chromozomů v rodu Carex, jeho vnitřních skupinách až na podrod Carex a ani u Cyperaceae. Naproti tomu se zvyšující se dostupností živin roste v rodu Carex zastoupení AT bazí. Zastoupení AT bazí statisticky významně koreluje i v podrodu Carex a pro všechny měřené druhy společně (Tab. 9.). Fylogenetické kontrasty tyto výsledky víceméně potvrzují. Velikost genomu se v evoluci nevyvíjela spolu s nároky ostřic na dostupnost živin, kdežto zastoupení AT bazí a počet chromozomů ano. Narozdíl od neparametrických korelací jsou zvyšující se nároky na živiny spojeny v evoluci rodu s klesáním počtu chromozomů (Tab. 9.). Nicméně, EIH pro obsah živin nevykazuje průkazný fylogenetický signál (p = 0,903) a výše zmíněné korelace kontrastů jsou nejspíš důsledkem setkání kontrastních druhů v koncové větvi stromu spojující živinami náročnou C. remota a živinami nenáročnou C. supina (Tab. 12.). Po vyřazení těchto ostřic z analýzy už spolu fylogenetické kontrasty nekorelují. 48
Souhrnně tyto výsledky říkají, že obsah dostupných živin v prostředí nejspíš neovlivňuje genomické znaky u ostřic.
4.5. Korelace a fylogenetické kontrasty morfologických znaků Neparametrické korelace velikosti genomu a délky průduchů neukázaly žádný statisticky významný vztah pro rod Carex nebo pro jeho vnitřní skupiny (Tab. 13., Obr. 6). Použití fylogenetických kontrastů potvrzuje výsledky z neparametrických korelací. V evoluci ostřic se neobjevil žádný převládající trend změn délek průduchů a s tím spojených změn velikosti genomu, tedy velikost genomu nepředurčuje délku průduchů tak, jak je tomu u ostatních dosud zkoumaných rostlin (včetně mechorostů). Délka průduchů nevykazuje fylogenetický signál (p = 0,24). Předběžné srovnání pro ostatní druhy čeledě Cyperaceae naznačuje, že ani u nich není délka průduchů spjata s velikostí genomu (RSp = 0,445, p = 0,073). Největší rozdíly v délkách průduchů jsou mezi bazálně postaveným kladem Caricoidea a odvozenějšími klady Vignea a core Carex (Tab. 14.). Tento rozdíl platí i při porovnávání druhů mimo vymezený fylogenetický rámec, podrod Primocarex (obsahující zejména druhy kladu Caricoidea) má průduchy delší než zbytek rodu Carex (viz Výsledky 4.2.2.). Tyto výsledky naznačují, že odvozenější druhy by mohly mít menší průduchy. I přes tyto náznaky délka průduchů nevykazuje žádný fylogenetický signál, to znamená, že evoluce délky průduchů není ve vztahu k evoluci druhu.
49
Obr. 6. Fotografie lakových otisků epidermis ostřic s pozorovatelnými průduchy. Měřítko viz levá horní fotografie, číslo v bílém poli označuje velikost genomu (1C) v pikogramech. A C. montana, B C. melanostachya, C C. aterrima, D C. chabertii, E C. hallerana, F C. pilulifera, G C. macrolepis, H C. vaginata, I C. sempervirens. Jak je vidět ze srovnání délek průduchů a velikostí genomu, délka průduchů neodpovídá velikosti genomu, průduchy u C. sempervirens a C. montana jsou srovnatelně dlouhé.
4.5.1. Vztah k Ellenbergovým indikačním hodnotám Neparametrické korelace délek průduchů s EIH pro teplotu, živiny a vlhkost neodhalily průkazné vztahy s délkou průduchů. Fylogenetické kontrasty naopak naznačují, že zde takový vztah existuje, že změny v délkách průduchů šly ruku v ruce se změnami v náročnosti na živiny a proti změnám v teplotním optimu ostřic (Tab. 15.). Tedy naznačuje, že průduchy se prodlužovaly se zvětšujícím se obsahem živin a s klesajícím teplotním optimem druhu. Tento vztah je nejspíš důsledkem rozdílů mezi chladnomilnějšími ostřicemi v kladu Caricoidea, lehce 50 teplomilnějším kladem Vignea a různorodým kladem core Carex (Kruskal-Wallis ANOVA,
H3=17,11, p < 0,01). V nárocích na živiny žádný obecný vysledovatelný trend není, snad jen to, že klad Caricoidea je spíše méně náročný na živiny, kdežto zbytek ostřic je v nárocích mnohem variabilnější. Pro zhodnocení významu těchto výsledků je nicméně potřeba mít na zřeteli to, že délka průduchů nevykazuje fylogenetický signál. Největší kontribuční indexy obsahu živin se nevážou k nodům v hloubce stromu, ale jsou nahloučeny v jedné větvi uvnitř kladu Vignea, kde se potkaly živinami náročná C. remota a nenáročná C. supina (Tab. 16.). Tyto dvě ostřice generují největší kontrasty v datovém souboru a po jejich vyřazení není vztah fylogenetických kontrastů průkazný (r2 = 0,011, p = 0,681).
4.5.2. Mošničky a nažky Stejný vzor najdeme i u dalších dvou morfologických znaků, délky mošniček a délky nažek. Oba znaky nekorelují s velikostí genomu ani v rodu Carex, ani v jeho vnitřních skupinách a v případě délky nažek ani v ostatních Cyperaceae (Tab. 17 a Tab. 18). Stejně jako u délek průduchů, ani zde fylogenetické kontrasty neukázaly jiný obrázek a tedy změny velikosti mošniček a velikosti nažek šly jinou cestou než změnami velikosti genomu (a naopak). V případě délek mošniček je jediný statisticky významný vztah s parametry prostředí ten s EIH pro teplotu, který se objevil pouze v analýze fylogenetických kontrastů, neparametrické korelace nejsou průkazné pro žádnou sledovanou EIH. Existence tohoto vztahu je opět nejspíš důsledkem rozdílů mezi chladnomilnějšími ostřicemi z kladu Caricoidea, lehce teplomilnějším kladem Vignea a různorodým kladem core Carex (viz Výsledky 4.5.1.) a také toho, že ani délka mošniček nevykazuje fylogenetický signál (p = 0,301). Délka nažek naproti tomu v rodu Carex a jeho podrodech pozitivně koreluje s obsahem živin v prostředí, tedy čím živinami bohatší prostředí je, tím větší nažky ostřice vyprodukují. Vztah délky nažek a teplotního optima druhu je průkazný pouze v podrodu Vignea, vztah s vlhkostí prostředí pak v rodu Carex a v celých Cyperaceae (Tab. 18.). Analýza fylogenetických kontrastů tyto závislosti nepotvrdila, v evoluci rodu spolu délka nažek a parametry prostředí nešly, nicméně délka nažek nevykazuje fylogenetický signál (p = 0,101) a proto se z výsledků této analýzy fylogenetických kontrastů nedá vyslovit jednoznačný závěr.
51
4.5.3. Vzájemné vztahy morfologických znaků. Morfologické znaky spolu pozitivně korelují, tedy ostřice s velkými průduchy mívají velké nažky a mošničky (Tab. 19.). K případné společné evoluci těchto znaků se nemohu vyjádřit, protože, jak už je napsáno výše, ani jeden z nich nevykazuje fylogenetický signál a proto není možné o jejich evoluci usuzovat z analýz provedených na mnou prezentovaném fylogenetickém stromu. Evoluce těchto znaků šla jinou cestou, než je ta zde nastíněná. Jinak řečeno, je možné, že tu působil vliv tak silných recentních selekčních tlaků, že vliv převážil nad vlivem příbuznosti druhů a překryl evolucí vygenerovaný vzor.
52
5. Diskuse 5.1. Sekvence a fylogenetický strom Protože zde použité ITS sekvence pocházejí z databáze z NCBI a jejich variabilita byla popsána v primárních studiích, nemá smysl zde diskutovat jejich variabilitu a porovnávat ji s jinými studiemi. Starr et al. (2004) a Ford et al. (2006), z jejichž prací byly některé sekvence použité v této práci, shodně konstatují, že variabilita sekvencí v rodu Carex odpovídá rozsahu variability tribu Cariceae a je v některých případech větší než variabilita mezi rody a některými ostřicemi (viz Úvod 1.1.2.). Nechci vydávat zde prezentovaný fylogenetický strom za ten vyjadřující jedinou a správnou fylogenezi ostřic, ale beru ho jako nutný prostředek k provedení dalších, zásadnějších analýz. Důležitá je informace o délkách větví stromu, což je informace, která se z jiných prací dá získat jen velmi obtížně nebo vůbec. Pokud autoři zveřejní matici sekvencí, kterou přímo použili ke svým analýzám, a dostatečně podrobně popíší všechny použité úpravy defaultních algoritmů, pak je možné jejich analýzy zopakovat a dospět k obdobným výsledkům. Toto by bylo možné provést se studiemi tribu Caricoidea od Starr (2009) nebo podrodu Vignea od Ford (2006), kteří sdílejí použitou matici v databázi TreeBase (Sanderson et al. 1994, Piel et al. 2002). Práce jiných autorů, zejména staršího data (Yen & Olmstead 2000, Roalson et al. 2001, Hendrichs et al. 2004a, b), jsou zopakovatelné jen s obtížemi, protože matice sekvencí použité při jejich analýzách nejsou dostupné a nebo nejsou z popsaného postupu zrekonstruovatelné. Všechny zmíněné studie jsou i přes některé nedostatky přínosné, protože umožňují srovnat získaný fylogenetický strom s dříve publikovanými a umožňují tak získat nezávislé ohodnocení korektnosti provedených analýz výsledků. Pokud by byla topologie mnou vytvořeného stromu srovnatelná s publikovanými stromy, pak lze tento strom považovat ne za správný, ale za odpovídající dnešním náhledům na molekulární fylogenezi rodu. Topologie fylogenetického stromu, vytvořeného Bayesiánskou metodou a použitého pro další analýzy, odpovídá stromům publikovaným v předchozích pracích (viz. úvod a výsledky). Proto lze považovat výsledky navazující analýzy fylogenetických kontrastů za vycházející z pravděpodobné fylogeneze rodu a tedy smysluplné.
53
5.2. Genomické znaky 5.2.1. Velikost genomu, zastoupení AT bazí, počet chromozomů Změřené hodnoty velikostí genomu ostřic svým rozsahem odpovídají údajům zveřejněným v Angiosperm C-value database (Bennet & Leitch 2005). V této databázi jsou pouze 4 druhy shodné se zde měřenými, jejich hodnoty se ale od udávaných liší. C. flacca má udávanou mnohem menší hodnotu než je zde naměřená (cca o tři čtvrtě pikogramu), u zbylých tří druhů (C. pulicaris, C. caryophyllea a C. panicea) jsou udávané hodnoty o něco vyšší (zhruba o 0,3 pg). Původ rozdílů je nejspíš možné hledat v odlišné metodě měření velikosti genomu, pro všechny druhy ostřic v Angiosperm C-value database byla stanovena Feulgenovou mikrodensitometrií, kdežto zde byla použita průtoková cytometrie. Hodnoty zastoupení AT bazí v rodu Carex jsou srovnatelné s jinými vyššími rostlinami až na Poaceae, které se vyznačují neobvykle nízkým obsahem AT bazí (Barrow & Meister 2001). Přímé srovnání naměřených hodnot není možné, protože dosud nebyla publikována studie, ve které by bylo změřeno zastoupení AT bazí u ostřic a která by tím toto srovnání umožnila. Rozsah chromozomových počtů v této práci pokrývá téměř celý rozsah rodu tak, jak jej shrnul Roalson (2008), a hodnoty jednotlivých druhů také odpovídají dříve publikovaným hodnotám. Rozdíly v rozsahu hodnot mezi dvěma velkými podrody, subg. Carex a subg. Vignea, ač statisticky neprůkazné odpovídají poznatkům dřívějších prací (např. Tanaka 1949, Hendrichs et al. 2004a, b), ve kterých se podrod Vignea jevil uniformnější než podrod Carex.
5.2.2. Vztah genomických znaků k vlhkosti prostředí V pracích shrnutých v Knight et al. (2005) byly popsány průkazné závislosti velikosti genomu na vlhkostními parametrech prostředí (dostupnost vody, roční chod srážek, nejnižší měsíční úhrn srážek atp.), které by mohly být zprostředkované nutností udržet dostatečný turgor větších buněk s větším genomem (Wakamiya et al. 1996). Guibert (2008) argumentuje ve prospěch velmi silné závislosti vlhkosti (v jeho případě vyjádřené jako dostupnost vody excerpovaná z klimatického atlasu Švýcarska) na evolučních pochodech v rodu. Dostupnost vody byla v jeho studii velmi konzervativním znakem, který se vázal k evoluci rodu tak, jak byla nastíněna použitým fylogenetickým stromem. Převodníkem mezi vlivem vlhkosti a fylogenezí by mohly být morfologické adaptace pro přežití v trvale zamokřených stanovištích, konkrétně přítomnosti aerenchymu v kořenech. Tato adaptace byla jedním z morfologických znaků 54 vymezujících nepříliš akceptovaný podrod Kreczetoviczia v práci Egorova (1999). Do tohoto rodu jsou řazeny ostřice, které mají vyšší hodnoty EIH pro vlhkost (C. nigra, C. acuta, C. buekii, C. elata a další), nicméně stejně vysoké hodnoty se vyskytují i u jiných ostřic a příbuzenských skupin ostřic. Oproti tomu výsledky analýz provedených v této práci naznačují, že změny v nárocích ostřic na vlhkost prostředí nejsou ve vztahu ke genomickým znakům ani k evoluci rodu. Vysvětlení tohoto nesouladu se možná skrývá v rozdílnosti aproximací ekologických faktorů prostředí. Je otázkou zda o reálných vztazích a tlacích více vypovídají empiricky získané EIH nebo spíše data získaná z klimatických atlasů a meteorologických záznamů. Waterway et al. (2009) studovali fylogenezi a ekologickou specializaci v tribu Cariceae. V jejich studii byla většina mokřadních druhů ostřic soustředěna v několika málo větvích stromu, tyto větve sdružovaly buď výhradně mokřadní druhy a nebo v nich měly mokřadní ostřice převahu a byly doplněny několika málo zástupci lesních, na vodu méně náročných druhů. Ostřice, které se sdružily v "mokřadních" větvích fylogenetického stromu autorů, sdílejí některé morfologické adaptace spojené se zamokřením: (i) oddenkovitý netrsnatý růst, který umožňuje rychle kolonizovat zamokřená stanoviště, (ii) aerenchymatická pletiva v kořenech, oddencích a stonku a (iii) nafouknuté mošničky usnadňující šíření vodou. To nasvědčuje tomu, že alespoň pro některé ostřice byl převládajícím modem evoluce tzv. niche conservatism. Tento termín vyjadřuje ekologický konservatismus nebo ekologickou setrvačnost znaků spojených s adaptací pro danou niku a sdílených v linii od společného předka (přehled viz Wiens & Graham 2005). Vyjadřuje tedy to, že příbuzné druhy si jsou ve svých znacích (v tomto případě ekologických nárocích) podobnější než druhy sobě nepříbuzné. Druhý, částečně doplňující a částečně protichůdný modus evoluce znaků vychází z nutnosti nově vznikajících druhů se vymezit proti rodičovským druhům a vymanit se tak z jejich konkurence. Klíčovou myšlenkou je představa, že nově vznikající druhy buď osídlí nové niky a nebo dojde k jemnější diferenciaci v rámci stávající niky. Toto popisuje termín adaptivní evoluce nebo radiace, nebo také segregace či rozrůznění nik (niche segregation). Jak ale upozornil například Ackerly (2009), k zodpovězení otázky, zda evoluce znaků v dané taxonomické skupině vykazuje známky konservatismu niky a nebo spíše znaky adaptivní radiace, je nutné znát rychlost evoluce znaků a taxonů. Tedy to, že je nějaký znak velmi diferencovaný mezi příbuznými druhy, může být jak důsledek rychlé adaptivní evoluce nedávno vzniklých taxonů tak i důsledek pozvolného měnění se taxonů starých. A naopak to, že je daný 55 znak mezi příbuznými taxony méně variabilní než mezi nepříbuznějšími, ještě neznamená, že je v dané skupině taxonů převládajícím modem evoluce konservatismus niky a ne adaptivní evoluce. Příčinou takového stavu může být i jen to, že k dostatečnému projevení adaptivních změn ještě neuběhl dostatečně dlouhý čas. Podobný vzor jako ve studii Waterway et al. (2009) se ukázal i v této práci. V jedné ze dvou velkých skupin uvnitř kladu core Carex se soustředily pouze druhy s vysokou EIH pro vlhkost, nicméně druhy s vysokou EIH pro vlhkost se vyskytovaly i v jiných kladech (Příloha. 5.). Druhy z "vlhkomilného" kladu uvnitř kladu core Carex jsou mokřadní a slatiništní druhy s převážně netrsnatým růstem a s většími mošničkami. Patří sem i druhy s největšími mošničkami (např. C. grayi s až 16mm mošničkami nebo C. vesicaria s mošničkami dlouhými 7,5 mm), ale také druhy s malými mošničkami (např. C. paupercula a C. nigra s asi 2,75 mm dlouhými mošničkami). Výhradní zastoupení druhů s většími nároky na vlhkost prostředí v tomto kladu a zároveň statistická neprůkaznost fylogenetického signálu pro EIH pro vlhkost v rámci celého rodu naznačují, že by převládajícím modem evoluce v této skupině druhů mohla být konzervativnost niky. K vyslovení jednoznačnějšího závěru bude ale nutné provést důkladnější modelování evoluce znaků metodami citlivějšími než je analýza fylogenetických kontrastů (nastíněno v Hipp et al. 2009).
5.2.3. Vztah genomických znaků k teplotě prostředí Knight et al. (2005) shrnuli práce studující vztah klimatických parametrů, založených na teplotě, k velikosti genomu u rostlin. Nalezli však poněkud nejednoznačné výsledky: v některých studiích byl vztah k teplotě pozitivní, v jiných velikost genomu klesala se vzrůstající teplotou (viz Úvod XX) V rodu Carex je velikost genomu negativně závislá na vzrůstajícím teplotním optimu druhu (vyjádřenému prostřednictvím EIH pro teplotu). Rovněž další studované genomické znaky se zdají být teplotou ovlivněny. V evoluci rodu se měnily tyto znaky společně, tedy se zvyšujícím se teplotním optimem druhu se zmenšovala velikost genomu a velikost chromozomů a zároveň stoupal podíl AT bazí. Knight et al. (2005) ve své práci nastínili hypotézu vyloučení velkých genomů z extrémních podmínek. Zeměpisné rozšíření ostřic (temperátní zóna severní polokoule se zvyšujícím se poměrným zastoupením ve vegetaci směrem na sever) by mohlo umožnit tento 56 trend vysledovat. S vyšší zeměpisnou šířkou jsou zároveň spojeny extrémnější teplotní charakteristiky chodu klimatu (nižší roční průměrná teplota, nižší průměrné teploty nejteplejšího a nejchladnějšího měsíce, vyšší počet mrazivých dnů/měsíců atp.). Nicméně rod Carex má jedny z nejmenších genomů u vyšších rostlin vůbec, a proto na něj nelze tuto hypotézu vztahovat. U ostřic je vztah dokonce opačný, s extrémnějšími podmínkami (chladem) se velikost genomu zvětšuje. Chladnější oblasti s vyšší zeměpisnou šířkou jsou spojeny s vyšším zastoupením polyploidů (Stebbins 1984), tedy druhů s větším genomem. Obdobná závislost velikosti genomu na snižující se teplotě je i v rodu Carex, nicméně na místě jsou pochybnosti, zda je možné vztahovat tento jev (větší genomy na severu skrze polyploidii) i na nepolyploidizující ostřice, u nichž nejsou rozdíly ve velikosti genomu mezi druhy tak razantní jako mezi polyploidy a příbuznými druhy s nižším stupněm ploidie. Je nutné poznamenat, že ve studiích zastoupení polyploidních druhů ve vztahu k zeměpisné šířce je rod Carex z úvah arbitrárně vylučován, protože polyploidie je v něm okrajovým jevem a zvyšující se podíl ostřic ve vegetaci severnějších zemí celou teorii o vyšším zastoupení polyploidů podkopává. Jaká je však podstata selekčního účinku teploty obecně nebo teplotního optima druhu vůči genomickým parametrům, jakými jsou obsah jaderné DNA a zastoupení AT bází? Výhody větších genomů v chladnějších podmínkách jsou nejasné. Větší genom znamená pomalejší dělení buněk a je spojen s vyššími náklady na syntézu DNA, což by mělo takové druhy znevýhodňovat. Je možné, že ostřice mají tak malé genomy, že ekonomie životních nákladů buněk zde již není tak významných selekčním tlakem, jakým může být u jiných rostlin (jarní geofyty, viz Grime & Mowforth 1982). Větší velikost genomu ostřic rostoucích v chladnějších oblastech by mohla být i jen vedlejším důsledkem proliferace repetitivních sekvencí indukované teplotním stresem (Capy et al. 2000, Zeh et al. 2009). Proliferace repetitivních sekvencí může vést ke změnám v expresi genů jejich inzercí do sekvence genů nebo regulačních oblastí genů a tím buďto přímo ovlivnit fenotypovou reakci druhu nebo alespoň vytvořit dostatečnou variabilitu a potenciální adaptabilitu (Vitte & Panaud 2005). Takovýto zásah do genové exprese je razantnější než pozvolna působící selekce a hypoteticky tímto způsobem může snáze vzniknout jedinec schopný přeskočit údolí v adaptivní krajině a obsadit jiné niky a tím začít cestu k vytvoření nového druhu (Wright 1932). Tato hypotéza předpokládá, že ancestrální předek ostřic 57 měl malý genom a vyvíjel se v teplejších podmínkách, než jaké panují v temperátní zóně severní polokoule. Tento předpoklad není dosud doložený. Molekuly DNA s vyšším obsahem AT (nižším obsahem GC) jsou považovány za labilnější, tedy i teplotně nestabilnější. Tato destabilizace je zprostředkovaná jak skrze nižší energii dvojné vazby A-T páru, tak stejnou měrou skrze horší stohování (stacking) molekuly DNA v oblastech bohatých na AT páry (Yakovchuk et al. 2006). Tedy se zvyšující se teplotou by mělo být výhodnější mít v genomu méně AT bazí. Selektivní význam teploty byl v tomto směru dokumentován zatím pouze u prokaryot, u nichž termofilní druhy vykazují mnohem nižší obsahy AT bazí v genomu než druhy s chladnějším teplotním optimem (Musto et al. 2004). Vztah obsahu AT bází k teplotnímu optimu je u ostřic zcela opačný, než naznačují studie chování molekuly DNA v laboratorních podmínkách a studie prokaryot. Je však třeba vzít v úvahu, že rozsah hodnot, na němž se oba parametry projevují u bakterií (25–75 % AT; 0–100+ °C) je s rozsahem hodnot, který dané parametry vykazují u rostlin, nesouměřitelný. Vyšší obsah AT u druhů rostoucích v teplejších podmínkách by však mohl být i pouze vedlejším důsledkem mechanismu změny velikosti DNA založeného na proliferaci GC-bohatých repetitivních sekvencí, např. retrotranspozonů.
5.2.4. Vztah genomických znaků k obsahu živin v prostředí Obsah dostupných živin se neukázal být tím faktorem, který by mohl ovlivňoval velikost genomu a další genomické znaky ostřic. Ke stejnému závěru dospěl také Guibert (2008), který ve své doktorské práci studoval také vztah nároků ostřic na obsah živin k evoluci rodu. K určení míry konservatismu daného znaku využil konzistenční index, který vyjadřuje míru, jakou sledovaný znak odpovídá (fit) nastíněné fylogenezi (sestavené na základě ITS a trnTLF sekvencí). Obsah živin dostupný ostřicím vyjádřil ve 4 kategoriích od oligotrofních stanovišť po zemědělsky využívanou půdu. Dospěl k obdobnému závěru, tedy že nároky na živiny v evoluci rodu Carex neodpovídají fylogenezi rodu a jsou nejspíš výsledkem působení různých faktorů dohromady. Guibert (2008) poukazuje na to, že nároky ostřic na živiny mohou být ovlivněny jak sezónními změnami v kořenovém systému a případnou absencí mykorrhizy v některých druzích, tak i samotnými změnami dostupnosti živin v průběhu roku.
58
5.3. Morfologické znaky Vztahem velikosti genomu k velikostem buněk a rostlinných orgánů (včetně průduchů) se v poslední době zabývaly dvě studie se širokým záběrem druhů napříč vyššími rostlinami, Knight & Beaulieu (2008) a Hodgson et al. (2010). Obě ukazují, že u všech jimi zkoumaných druhů velikost genomu předurčuje velikost buněk a délku průduchů. Hypotézy, proč tomu tak je, vycházejí z nukleoskeletární teorie, která předpokládá, že čím větší molekulu jaderné DNA buňka obsahuje, tím větší musí buňka být, aby se do ní jádro vešlo a zároveň nedošlo k porušení homeostáze buněčných procesů (Cavalier-Smith 2005). Ani jedna z prací nicméně neodpovídá na otázku, zda je primární změna velikosti genomu, která je až poté následována změnou velikosti buněk, nebo je tomu naopak. Velikosti genomu a buněk jsou spojitou nádobou a tak je možné, že změny mohou být iniciovány oběma směry. U ostřic, stejně jako u studovaných Cyperaceae, tato závislost překvapivě není. Nejenom že spolu délka průduchů a velikost genomu nekorelují ani při použití evolučně nezávislých fylogenetických kontrastů, samotná délka průduchů nevykazuje fylogenetický signál. Délka průduchů tedy u ostřic není předurčena velikostí genomu (nebo naopak) a její změny jsou nezávislé na evolučním předurčení hodnoty znaku, které si s sebou druhy nesou od společného předka. Srovnání velikostí buněk a velikostí genomu ostřic s druhy z prací Knight & Beaulieu (2008) a Hodgson et al. (2010) ukazuje, že ostřice mají ve srovnání s ostatními rostlinami příliš velké buňky na to, jak mají malý genom, nebo naopak, mají příliš malý genom na to, jak mají velké buňky (Obr. 7.).
59
Obr. 7. Bodové grafy velikosti průduchů (stomatal length a guard cell length) vynesené proti velikosti genomu (2C nuclear content DNA a 2C DNA content). Oba grafy ilustrují všeobecný silný vztah těchto dvou znaků u všech semenných rostlin s výjimkou ostřic, u kterých je délka průduchů nezávislá na velikosti genomu. Graf vlevo je převzat z práce Hodgson et al. (2010), graf vpravo z Beaulieu et al. (2008), do obou grafů jsou přidány červeně vyznačené hodnoty pro rod Carex.
Hodgson et al. (2010) také nastolují otázku minimální nutné délky průduchů, aby byla výměna plynů ještě dostatečně efektivní. Měření provedená v této práci naznačuje, že v rodu Carex by tato hranice mohla být okolo 15-20 mikrometrů. Ostřice s nejmenšími průduchy mají velikost genomu okolo 0,35-0,4 pg, což je jen o něco méně než průměrná a nejčastější hodnota velikosti genomu ostřic. Tedy nejmenší průduchy nejsou spojeny s nijak vybočujícími velikostmi genomu. Toto, spolu s neexistencí průkazného vztahu velikosti genomu a délky průduchů, svědčí o existenci rozdílných selekčních tlaků na velikost průduchů než na velikost genomu. Jaké selekční tlaky by to mohly být? Délka průduchů u ostřic není ve vztahu k teplotnímu ani vlhkostnímu optimu druhů a nezávisí ani na dostupnosti živin, tedy tyto faktory prostředí nejspíš velikost průduchů přímo neovlivňují. Je otázkou, nakolik Ellenbergovy indikační hodnoty vystihují ekologické faktory prostředí a selekční tlaky. Ačkoli zde prezentované negativní výsledky nastiňují, které parametry prostředí nejspíše nemají vliv na variabilitu délek průduchů v rodu Carex, je potřeba vzít v úvahu možnou komplexní podmíněnost tohoto znaku, která nemusí 60 být redukovatelná na vztah k jednomu parametru. Vlhkost, teplota ani úživnost prostředí nejsou tím hlavním faktorem, který by ovlivňoval délku průduchů. Lze se nicméně domnívat, že variabilita délek průduchů je odpovědí na komplexní vliv prostředí neredukovatelný na jeden nebo dva parametry. Stejně tak, jako nebyl nalezen vztah velikosti genomu k délce průduchů, není délka průduchů korelována ani se dvěma dalšími morfologickými znaky, délkou mošniček a délkou nažek. I tyto znaky jsou nejspíš ovlivněny více vnějšími selekčními tlaky než velikostí genomu, a i pro tyto znaky to nejspíš nejsou teplotní nebo vlhkostní optima druhů. Délka nažek se zdála být ve vztahu k dostupnosti živin, ale tato závislost byla nejspíš ovlivněna příbuzenskými skupinami, analýza nezávislých kontrastů tento vztah nepotvrdila. Otázkou tedy zůstává, proč mají ostřice relativně velké buňky a nebo relativně malý genom. Prošly ve své evoluční historii tak drastickým snížením obsahu DNA, že se z toho ještě nevzpamatovaly? Potřebují mít určitou velikost buněk, aby zajistily dostatečnou funkci průduchů nebo dostatečnou velikost mošniček a nažek? Jaký silný selekční tlak nutí ostřice a potažmo šáchorovité si udržovat malé genomy a k nim relativně velké buňky? Jsou ostřice opravdu tak výjimečné nebo se takto chovají i jiné druhy rostlin, které však dosud nebyly tak důkladně studované? Jaké má tento výsledek důsledky pro obecně přijímanou nukleoskeletární teorii? To jsou otázky, jejichž řešení by mohlo nastínit hlubší studium problému, dnes k nim ale nelze říct nic bližšího.
61
6. Závěr Rod Carex má jedny z nejmenších rostlinných genomů s u rostlin běžným zastoupením AT bazí. Velikost genomu je u ostřic negativně korelovaná se zastoupením AT bazí, což je v rozporu s teoriemi vysvětlujícími selektivní výhody AT bohatých molekul DNA. Možným vysvětlením tohoto stavu je proliferace AT chudých (GC bohatých) repetitivních sekvencí indukovaná vnějšími stresovými faktory. Měření provedená v této práci potvrdila velkou chromozomální variabilitu rodu. Nalezené neprůkazné vztahy počtu chromozomů s velikostí genomu odpovídají převládajícím názorům na evoluci karyotypu rodu, ve které převládají fúze a fragmentace chromozomů nad v jiných rostlinách častou polyploidizací. Ekologické parametry prostředí, vyjádřené pomocí Ellenbergových indikačních skupin, hrály v evoluci rodu určitou roli a podílejí se na dnešní variabilitě rodu, nicméně jejich vliv není jednoznačný. Koncentrace části mokřadních a slatiništních druhů v jedné větvi fylogenetického stromu naznačuje možnost, že by pro tyto ostřice mohl být převládajícím modem evoluce spíše konservatismus niky než adaptivní radiace. Závislost velikosti genomu na teplotě je negativní, vysvětlení by nejspíš bylo možné hledat v proliferaci transpozonů, jejímž vedlejším důsledkem by mohly být nejen nalezené průkazné vztahy, ale zejména vytvoření dostatečné variability a potenciální adaptivity druhu. Někteří jedinci by pak s takto zvětšeným genomem a rozkolísaným fenotypovým projevem mohli být schopni osidlovat do té doby nepříznivé prostředí. Nebyl nalezen vztah genomických znaků k obsahu živin v prostředí, důvodem jsou nejspíš různé fyziologické potřeby ostřic a rozkolísanost tohoto faktoru prostředí v průběhu ročního chodu klimatu. Nejzajímavějším výsledkem této práce je nepotvrzení vztahu délky průduchů k velikosti genomu, který byl dosud považován za všeobecně platný pro všechny semenné rostliny. Velikost genomu u ostřic je příliš malá vzhledem k délkám průduchů, nejmenší i největší délky průduchů byly nalezeny u ostřic s průměrně velkými genomy. Ekologické parametry prostředí samy o sobě nevysvětlují variabilitu v délkách průduchů ostřic, jejich vliv bude nejspíš komplexního charakteru a není tudíž zjistitelný jednoduchými korelacemi a fylogenetickými kontrasty. Význam a původ variability délek průduchů v rodu Carex je neobjasněný a bude třeba důkladnějšího studia k zodpovězení nastolených otázek.
62
7. Literatura
Abrahamson S, Bender MA, Conger AD, Wolff S. (1973): Uniformity of radiation–induced mutation rates among different species. Nature 245: 460–462. Ackerly DD. (2006): Analysis pf traits (AOT): A module of phylocom. Version 3.1. http://www.phylodiversity.net/phylocom Ackerly DD. (2009): Conservatism and diversification of plant functional traits: Evolutionary rates versus phylogenetic signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 106(Suppl 2): 19699–19706. Adams KL, Wendel JF. (2005): Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant Biology 8: 135–141. Alfaro ME, Zoller S, Lutzoni F. (2003): Bayes or bootstrap? A simulation study comparing the performance of Bayesian Markov chain Monte Carlo sampling and bootstrapping in assessing phylogenetic confidence. Molecular Biology and Evolution 20: 255–266. Bailey CD, Carr TG, Harris SA, Hughes CE. (2003): Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes. Molecular Phylogenetics and Evolution 29: 435–455. Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, Donoghue MJ. (1995): The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden 82: 247–277. Ball PW, Reznicek AA. (2002): Carex Linnaeus. In: Flora of North America Editorial Committee (eds.): Flora of North America, north of Mexico, vol. 23. New York, Oxford University Press, pp. 254–273. Barow M, Meister A. (2002): Lack of correlation between AT frequency and genome size in higher plants and the effect of nonrandomness of base sequences on dye binding. Cytometry 47: 1–7. Barow M, Meister A. (2002): DNA base composition of plant genomes. In: Doležel J, Greilhuber J, Suda S. [eds.]: Flow cytometry with plants cells: Analysis of genes, chromosomes and genomes. WILEY-VCH, Weinheim, pp. 177–213. Beaulieu JM, Moles AT, Leitch IJ, Bennett MD, Dickie JB, Knight CA. (2007a): Correlated evolution of genome size and seed mass. New Phytologist 173: 422–437. 63
Beaulieu JM, Leitch IJ, Knight CA. (2007b): Genome size evolution in relation to leaf strategy and metabolic rates revisited. Annals of Botany 99: 495–505. Beaulieu JM, Leitch IJ, Patel S, Pendharkar A, Knight CA. (2008): Genome size is a strong predictor of cell size and stomatal density in angiosperms. New Phytologist 179: 975–986. Bennett MD. (1972): Nuclear DNA content and minimum generation time in herbaceous plants. Proceedings of the Royal Society of London B 181: 109–135. Bennett MD, Leitch IJ. (2005): Angiosperm DNA C–values Database (Release 6.0, Oct. 2005). http://www.kew.org/cvalues/ Bennetzen J, Ma J, Devos KM. (2005): Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants. Annals of Botany 95: 127–132. Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Wheeler DL. (2009): GenBank. Nucleic Acids Research, 38: database issue. www.ncbi.nlm.nih.gov Blaser HW. (1944): Studies in the morphology of the Cyperaceae. II. The prophyll. American Journal of Botany 5: 115–128. Britton T, Andersoon CJ, Jacquet D, Lundqvist S, Bremer K. (2007): Estimating divergence times in large phylogenetic trees. Systematic Biology 56: 741–752. Bruhl JJ. (1995): Sedge genera of the world: relationships and a new classification of the Cyperaceae. Australian Systematic Botany 8: 125–305. Buckler ESI, Ippolito A, Holtsford TP. (1997): The evolution of ribosomal DNA: divergent paralogues and phylogenetic implications. Genetics 145: 821–832. Buchwitz BJ, Ahmad K, Moore LL, Roth MB, Henikoff S. (1999): A histon-H3-like protein in C. elegans. Nature 401: 547–548. Bureš P, Šmarda P, Hralová I, Helánová K, Fuentes-Soriano S, Procházková J. (2007): Is GC-content correlated with genome size in plants. Plant Genome Horizons - Vistas & Visions, Royal Botanic Gardens Kew, London, p. 17. Butler MA, King AA. (2004): Phylogenetic comparative analysis: a modeling approach for adaptive evolution. The American Naturalist 164(6): 683–695. Calonje M, Martín-Bravo S, Dobeš Ch, Gong W, Jordon-Thaden I, Kiefer C, Kiefer M, Paule J, Schmickl R, Koch MA. (2009): Non-coding nuclear DNA markers in phylogenetic reconstruction. Plant Systematics and Evolution 282: 257–280. 64
Capy P, Gasperi G, Biemont C, Bazin C. (2009): Stress and transposable elements: co- evolution or useful parasites? Heredity 85(2): 101–106. Cavalier-Smith T. (1978): Nuclear volume control by nucleoskeletal DNA, selection for cell volume and cell growth rate, and the solution of the DNA C-value paradox. Journal of Cell Science 34: 247–278. Cavalier-Smith T. (2005): Economy, speed and size matter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturization and expansion. Annals of Botany 95: 147–175. Cerbah M, Mortreau E, Brown S, Siljak-Yakovlev S, Bertrand H, Lambert C. (2001): Genome size variation and species relationships in the genus Hydrangea. Theoretical and Applied Genetics 103: 45–51. Connolly JA, Oliver MJ, Beaulieu JM, Knight CA, Tomanek L, Moline MA. (2007): Correlated evolution of genome size and cell volume in diatoms (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 44(1): 124–131. Coyne JA, Orr HA. (2004): Speciation. Sinauer Associates, Sunderland, pp. 545. Darrouzet-Nardi A. (1993): Systematics of the genus Carex. Dostupné z http://anthony.darrouzetnardi.net/works/carex.html Dawkins R. (1989): The Selfish Gene. Oxford University Press, Oxford, p. 66. Derieg NJ, Sangaumphai A, Bruederle LP. (2008): Genetic diversity and endemism in North American Carex section Ceratocystis (Cyperaceae). American Journal of Botany 95: 1287– 1296. Dolezel J, Bartos J, Voglmayr H, Greilhuber J. (2003): Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry 51: 127–128. Doolittle WF, Sapienza C. (1980): Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution. Nature 284: 601–603. Dwivedi B, Gadagkar SR. (2009): Phylogenetic inference under varying proportions of indel- induced alignment gaps. BMC Evolutionary Biology 9:211. Egorova TV. (1999): The sedges (Carex L.) of Russia and adjactent states (within the limits of the former USSR). Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, pp. 773. Ellenberg H, Weber HE, Düll R, Wirth V, Werner W, Paulissen D. (1992): Indicator values of plants in Central Europe. Scripta Geobotanica 18: 1–258. 65
Escudero M, Valcárcel V, Vargas P, Luceño M. (2008): Evolution in Carex L. sect. Spirostachyae (Cyperaceae): A molecular and cytogenetic approach. Organisms Diversity & Evolution 7(4): 271–291. Feliner GN, Rosselló JA. (2007): Better the devil you know? Guidelines for insightful utilization of nrDNA ITS in species-level evolutionary studies in plants. Molecular Phylogenetics and Evolution 44: 911–919. Felsenstein J. (1985): Phylogenies and the comparative method. The American Naturalist 125: l– 15. Fenner M, Thompson K. (2005): The ecology of seeds. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 264. Flach M. (1966): Diffuse centromeres in a dicotyledoneous plant. Nature 209: 1369–1370. Flora of North America Editorial Committee [eds.] (1993+): Flora of North America North of Mexico. 16+ vols. New York and Oxford. Ford BA, Iranpour M, Naczi RFC, Starr JR, Jerome CA. (2006): Phylogeny of Carex subg. Vignea (Cyperaceae) based on non–coding nrDNA sequence data. Systematic Botany 31: 70–82. Francis D, Davies MS, Barlow PW. (2008): A strong nucleotypic effect on the cell cycle regardless of ploidy level. Annals of Botany 101: 747–757. Garland TJ, Harvey PH, Ives AR. (1992): Procedures for the analysis of comparative data using phylogenetically independent contrasts. Systematic Biology 41: 18–32. Graham SW, Olmstead RG (2000): Utility of 17 chloroplast genes for inferring the phylogeny of the basal angiosperms. American Journal of Botany 87: 1712–1730. Gregory TR. (2001): Coincidence, coevolution, or causation? DNA content, cell size, and the C– value enigma. Biological Reviews 76(1): 65–101. Greilhuber J, Borsch T, Müller K, Worberg A, Porembski S, Barthlott W. (2006): Smallest angiosperm genomes found in Lentibulariaceae, with chromosomes of bacterial size. Plant Biology 8(6): 770–7. Greilhuber J, Doležel J, Lysak MA, Bennett MD. (2005): The origin, evolution and proposed stabilization of the terms ‘genome size’ and ‘C-value’ to describe nuclear DNA contents. Annals of Botany 95: 255–260. 66
Grime JP, Mowforth MA. (1984): Variation in genome size – an ecological interpretation. Nature 299: 151–153. Guibert C. (2008): Macroeecologie et evolution des Carex en Suisse. Disertační práce, Université de Toulouse, Toulouse, pp. 205. Hardie DC, Hebert PDN. (2003): The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartilaginous and ray-finned fishes. Genome 46: 683–706. Hegi G. [ed.] (1967–1980): Illustrierte Flora von Mitteleuropa. [Ed. 3. Band II/ Teil 1, ed. W. Schultze–Mottel]. Paul Parey, Berlin & Hamburg, pp. 693. Heilborn O. (1924): Chromosome numbers and dimensions, species-formation and phylogeny in the genus Carex. Hereditas 5: 129–221. Hendrichs M, Michaelski S, Begerow D, Oberwinkler F, Hellwig FH. (2004a): Phylogenetic relationships in Carex, subgenus Vignea (Cyperaceae), based on ITS sequences. Plant Systematics and Evolution 246: 109–125. Hendrichs M, Oberwinkler F, Begerow D, Bauer R. (2004b): Carex, subgenus Carex (Cyperaceae) – A phylogenetic approach using ITS sequences. Plant Systematics and Evolution 246: 89–107. Hetherington AM, Woodward FI. (2003): The role of stomata in sensing and driving environmental change. Nature 424: 901–908. Hilu KW, Borsch T, Müller K, Soltis DE, Soltis PS, Savolainen V, Chase MW, Powell MP, Alice LA, Evans R, Sauquet H, Neinhuis C, Slotta TAB, Rohwer JG, Campbell CS, Chatrou LW. (2003): Angiosperm phylogeny based on matK sequence information. American Journal of Botany 90: 1758–1776. Hipp AL, Reznicek AA, Rothrock PE, Weber JA. (2006): Phylogeny and classification of Carex section Ovales (Cyperaceae). International Journal of Plant Sciences 167(5): 1029– 1048. Hipp AL. (2007): Nonuniform processes of chromosome evolution in sedges (Carex: Cyperaceae). Evolution 61(9): 2175–2149. Hipp AL, Rothrock PE, Roalson EH. (2009): The Evolution of Chromosome Arrangements in Carex (Cyperaceae). Botanical Review 75: 96–109. Hodgson JG, Sharafi M, Jalili A, Díaz S, Montserrat–Martí G, Palmer C, Cerabolini B, Pierce S, Hamzehee B, Asri Y, Jamzad Z, Wilson P, Raven JA, Band SR, Basconcelo 67
S, Bogard A, Carter G, Charles M, Castro–Díez P, Cornelissen JHC, Funes G, Jones G, Khoshnevis M, Pérez–Harguindeguy N, Pérez–Rontomé MC, Shirvany FA, Vendramini F, Yazdani S, Abbas–Azimi R, Boustani S, Dehghan M, Guerrero–Campo J, Hynd A, Kowsary E, Kazemi–Saeed F, Siavash B, Villar–Salvador P, Craigie R, Naqinezhad A, Romo–Díez A, de Torres Espuny L, Simmons E. (2010): Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog? Annals of Botany 105: 573–584. Holländer R, Pohl S. (1980): Deoxyribonucleic acid base composition of bacteria. Zentralbl Bakteriol A 246(2): 236–75. Hughes CE, Bailey CD, Harris SA. (2002): Divergent and reticulate species relationships in Leucaena (Fabaceae) inferred from multiple data sources: insights into polyploid origins and nrDNA polymorphism. American Journal of Botany 89: 1057–1073. Charlesworth B, Jarne P, Assimacopoulos S. (1994): The distribution of transposable elements within and between chromosomes in a population of Drosophila melanogaster. III. Element abundances in heterochromatin. Genetics Research 64(3): 183–197. Charlesworth B, Sniegowski P, Stephan W. (2002): The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature 371: 215–220. Chatter AO. (1980): Carex L. – In: Tutin T G, Akeroyd JR, Newton ME, Chater AO, Burges NA. [eds.]: Flora Europaea. Cambridge University Press, Cambridge, 5: 290–323. International Rice Genome Sequencing Project. (2005): The map-based sequence of the rice genome. Nature 436: 793–800. Jansen RK, Cai Z, Raubeson LA, Daniell H, dePamphilis CW, Leebens–Mack J, Müller KF, Guisinger-Bellian M, Haberle RC, Hansen AK, Chumley TW, Lee SB, Peery R, McNeal JR, Kuehl JV, Boore JL. (2007): Analysis of 81 genes from 64 plastid genomes resolves relationships in angiosperms and identifies genome-scale evolutionary patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 104: 19369–19374. Jovtchev G, Schubert V, Meister A, Barow M, Schubert I. (2006): Nuclear DNA content and nuclear and cell volume are positively correlated in angiosperms. Cytogenetic and Genome Research 114: 77–82. Kalendar R, Tanskanen J, Immonen S, Nevo E, Schulman AH. (2000): Genome evolution of wild barley (Horedeum spontaneum) by BARE–1 retrotransposon dynamics in response to 68
sharp microclimate divergence. Proceedings of the National Academy of Sciences 97: 6603–6607. Kandul NP, Lukhtanov VA, Pierce NE. (2007): Karyotypic diversity and speciation in Agrodiaetus butterflies. Evolution 61: 546–559. King MG, Roalson EH. (2008): Exploring evolutionary dynamics of nrDNA in Carex subgenus Vignea (Cyperaceae). Systematic Botany 33: 514–524. Knight CA, Ackerly DD. (2002): Variation in nuclear DNA content across environmental gradients: a quantile regression analysis. Ecology Letters: 5: 66–76. Knight CA, Molinari NA, Petrov DA. (2005): The large genome constraint hypothesis: evolution, ecology and phenotype. Annals of Botany 95: 177–190. Knight CA, Beaulieu JM. (2008): Genome size scaling through phenotype space. Annals of Botany 101: 759–766. Koopman WJM. (2002): Zooming in on the lettuce genome: species relationships in Lactuca s.l., inferred from chromosomal and molecular characters. Disertační práce, Wagening University, Washington, pp. 196. Kubát K, Hrouda L, Chrtek J jun., Kaplan Z, Kirschner J, Štěpánek J. [eds.] (2002): Klíč ke květeně České republiky. Academia, Praha, pp. 928. Kuta E, Bohanec B, Dubas E, Vizintin L, Przywara L. (2004): Chromosome and nuclear DNA study on Luzula – a genus with holokinetic chromosomes. Genome 47: 246–256. Kükenthal G. (1909): Cyperaceae - Caricoideae. In: Engler A. (ed.): Das flanzenreich, IV. 20 (Heft 38). Wilhelm Englemann, Leipzig, pp. 824. Leitch IJ, Beaulieu JM, Cheung K, Hanson L, Lysak MA, Fay MF. (2007): Punctuated genome size evolution in Liliaceae. Journal of Evolutionary Biology 20: 2296–2308. Leitch IJ, Kahandawala I, SudaJ, Hanson L, Ingrouille MJ, Chase MW, Fay MF. (2009): Genome size diversity in orchids: consequences and evolution. Annals of Botany 104(3): 469–481. Leitch IJ, Beaulieu JM, Chase MW, Leitch AR, Fay MF. (2010): Genome size dynamics and evolution in monocots. Journal of Botany, v tisku. Lid J. (1985): Norsk, svensk, finsk flora. [Ed.5., ed. O. Gjærevoll]. Det Norske Samlaget, Oslo, pp. 837. 69
MacGillivray CW, Grime JP. (1995): Genome size predicts frost resistance in British herbaceous plants: implications for rates ofvegetation response to global warming. Functional Ecology 9: 320–325. MacKenzie K. K. (1931). (Poales) Cyperaceae - Cariceae. North American Flora 18: 1–168. MacKenzie K. K. (1935). (Poales) Cyperaceae - Cariceae. North American Flora 18: 169–478. Martins EP, Garland TJ. (1991): Phylogenetic analyses of the correlated evolution of continuous characters: A simulation study. Evolution 45: 534–557. Meier H, Amann R, Ludwig W, Schleifer KH. (1999): Specific oligonucleotide probes for in situ detection of a major group of gram-positive bacteria with low DNA G + C content. Systematic and Applied Microbiology 22(2): 186–196. Melaragno JE, Mehrotra B, Coleman AW. (1993): Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. The Plant Cell 5: 1661–1668. Moles AT, Ackerly DD, Webb CO, Tweddle JC, Dickie JB, Westoby M. (2005): A brief history of seed size. Science 307: 576–580. Musto H, Nayaa H, Zavala A, Romero H, Alvarez-Valín F, Bernardi G. (2004): Correlations between genomic GC levels and optimal growth temperatures in prokaryotes. FEBS Letters 573: 73–77. Naczi RFC (1999): Chromosome numbers of some eastern North American species of Carex and Eleocharis (Cyperaceae). Contributions from the University of Michigan Herbarium 22: 105–119. Narayan RKJ. (1988): Constraints upon the organisation and evolution of chromosomes in Allium. Theoretical and Applied Genetics 75: 319–329. Nishikawa K, Furuta Y, Ishitobi K. (1984): Chromosomal evolution in genus Carex as viewed from nuclear DNA content, with special reference to its aneuploidy. Japanese Journal of Genetics 59: 465–472. Nokkala S, Laukkanen A, Nokkala C. (2002): Mitotic and meiotic chromosomes in Somatochlora metallica (Cordulidae, Odonata). The absence of localized centromeres and inverted meiosis. Hereditas 136: 7–12. Organ CL, Shedlock AM, Meade A, Pagel M, Edwards SV. (2007): Origin of avian genome size and structure in non-avian dinosaurs. Nature 446: 180–184. Orgel LE, Crick FHC. (1980): Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature 284: 604–607. 70
Pazy B, Plitmann U. (1994): Holocentric chromosome behaviour in Cuscuta (Cuscutaceae). Plant Systematics and Evolution 191: 105–109. Perez R, Rufas JS, Suja JA, Page J, Panzera F. (2000): Meiosis in holocentric chromosomes: orientation and segregation of an autosome and sex chromosomes in Triatoma infestans (Heteroptera). Chromosome Research 8: 17–25. Piel WH, Donoghue MJ, Sanderson MJ. (2002): TreeBASE: a database of phylogenetic knowledge. In: Shimura J, Wilson KL, Gordon D. [eds.]: To the interoperable "Catalog of Life" with partners Species 2000 Asia Oceanea. Research Report from the National Institute for Environmental Studies No. 171, Tsukuba, Japan, pp. 41–47. Pignatti S, Menegoni P, Pietrosanti P. (2005): Valori di bioindicazione delle piante vascolari della flora d'Italia. Braun–Blanquetia 39. Posada D, Crandall KA. (1998): Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14(9): 817–818. Razafimandimbison SG, Kellogg EA, Bremer B. (2004): Recent origin and phylogenetic utility of divergent ITS putative pseudogenes. Systematic Biology 53(2): 177–192 Reznicek AA. (1990): Evolution in sedges (Carex, Cyperaceae). Canadian Journal of Botany 68: 1409–1432. Ricroch A, Yockteng R, Brown SC, Nadot S. (2005): Evolution of genome size across some cultivated Allium species. Genome 48(3): 511–520. Roalson EH, Columbus JT, Friar EA. (2001): Phylogenetic relationships in Cariceae (Cyperaceae) based on ITS (nrDNA) and trnT–L–F (cpDNA) region sequences: assessment of subgeneric and sectional relationships in Carex with emphasis on section Acrocystis. Systematic Botany 26: 318–341. Roalson EH, Friar EA. (2004): Phylogenetic relationships and biogeographic patterns in Carex section Acrocystis (Cyperaceae) using nrDNA ITS and ETS sequence data. Plant Systematics and Evolution 243: 175–187. Roalson EH (2008): A synopsis of chromosome number variation in the Cyperaceae. Botanical Review 74: 209–393. Ronquist F, Huelsenbeck JP. (2003): MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574. 71
Sanderson MJ, Donoghue MJ, Piel W, Eriksson T. (1994): TreeBASE: a prototype database of phylogenetic analyses and an interactive tool for browsing the phylogeny of life. American Journal of Botany 81(6): 183. http://www.treebase.org Sanderson MJ. (2003): r8s: Inferring absolute rates of molecular absence of a molecular clock. Bioinformatics 19: 301–302. http://ginger. ucdavis.edu/r8s/ SanMiguel P, Gaut BS, Tikhonov A, Nakajima Y, Bennetzen JL. (1998): The paleontology of intergene retrotransposons of maize. Nature Genetics 20: 43–45. Sheikh SA, Kondo K, Hoshi Y. (1995): Study of diffused centromeric nature of Drosera chromosomes. Cytologia 60: 43–47. Sparrow AH, Miksche JP. (1961): Correlation of nuclear volume and DNA content with higher plant tolerance to chronic radiation. Science 134: 282–283. Starr JR, Harris SA, Simpson DA. (2004): Phylogeny of the unispicate taxa in Cyperaceae tribe Cariceae I: generic relationships and evolutionary scenarios. Systematic Botany 29(3): 528– 544. Starr JR, Gravel G, Bruneau A, Muasya AM. (2007). Phylogentic implications of a unique 5.8S nrDNA insertion in Cyperaceae. Aliso 23: 84–98. Starr JR, Ford BA. (2009): Phylogeny and evolution in Cariceae (Cyperaceae): current knowledge and future directions. Botanical Review 75: 110–137. Stebbins GL. (1984): Polyploidy and the distribution of the arctic-alpine flora: new evidence and a new approach. Botanica Helvetica 94: 1–13. Stevens PF. (2001 onwards): Angiosperm phylogeny website. Version 9, June 2008 [and more or less continuously updated since]. http://www.mobot.org/MOBOT/research/APWeb/ Stoeva M, Uzunova K, Popova E, Stoyanova K. (2005): Patterns and levels of variation within section Phacocystis of genus Carex (Cyperaceae) in Bulgaria. Phytologia Balcanica 11(1): 45–62. Stöver BC, Müller KF. (2010): TreeGraph 2: Combining and visualizing evidence from different phylogenetic analyses. BMC Bioinformatics 11: 7. Suda J, Kyncl T, Freiova R. (2003): Nuclear DNA amounts in Macronesian angiosperms. Annals of Botany 92: 152–164. Swift HH. (1950): The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 36: 643–654. 72
Systma KJ, Morawetz J, Pires JC, Nepokroeff M, Conti E, Zjhra M, Hall JC, Chase MW. (2002): Urticalean rosids: circumscription, rosid ancestry, and phylogenetics based on rbcL, trnL–F, and ndhF sequences. American Journal of Botany 89: 1531–1546. Šmarda P, Bureš P, Horová L, Foggi B, Rossi G. (2007): Genome size and GC Content evolution of Festuca: Ancestral expansion and subsequent reduction. Annals of Botany 101(3): 421–433. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. (2007): MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596–1599. Tanaka N. (1940): Chromosome studies Cyperaceae, VIII.. Meiosis in diploid and tetraploid forms of Carex siderosticta Hance. Cytologia 11: 282–310. Tanaka N. (1949): Chromosome studies in the genus Carex with special reference to aneuploidy and polyploidy. Cytologia 15: 15–29. Tanaka N, Tanaka R. (1977): Chromosome studies in Chionographis (Liliaceae). I. On the holokinetic nature of chromosomes in Chionographis japonica Maxim. Cytologia 42: 754– 763. Thomas CA. jr. (1971): The genetic organization of chromosomes. Annual Review of Genetics 5: 237–256. Thome JL, Kishino H. (2002): Divergence time and evolutionary rate estimation with multilocus data. Systematic Biology 51: 689–702. Thompson K. (1990): Genome size, seed size and germination temperature in herbaceous angiosperms. Evolutionary Trends in Plants 4: 113–116. Vidic T, Greilhuber J, Vilhar B. (2003): Genome size is associated with differential survival of plant species. Abstracts of the Second Plant Genome Size Meeting, The Royal Botanic Gardens, Kew. Vinogradov AE. (2003): Selfish DNA is maladaptive: evidence from the plant Red List. Trends in Genetics 19: 609–614. Vinogradov AE. (2004): Measurement by flow cytometry of genomic AT/GC ratio and genome size. Cytometry 16(1): 34–40. Vinogradov AE. (2005): Noncoding DNA, isochores and gene expression: nucleosome formation potential. Nucleic Acids Research 33(2): 559–563. 73
Vitte C, Panaud V. (2005): LTR retrotransposons and flowering plant genome size: emergence of the increase/decrease model. Cytogenetic and Genome Research 110: 91–107. Wakamiya I, Price JH, Messina MG, Newton RJ. (1996): Pine genome size diversity and water relations. Physiologia Plantarum 96: 13–20. Waterway MJ, Starr JR. (2007): Phylogenetic relationships in the tribe Cariceae (Cyperaceae) based on nested analyses of three molecular data sets. Aliso 23: 165–192. Waterway MJ, Hoshino T, Masaki T. (2009): Phylogeny, species richness, and ecological specialization in Cyperaceae tribe Cariceae. Botanical Review 75: 138–159. Webb CO, Ackerly DD,Kembel SW. (2008): Phylocom: software for the analysis of phylogenetic community structure and character evolution. Bioinformatics 24: 2098–2100. http://www.phylodiversity.net/phylocom Wendel JF. (2000): Genome evolution in polyploids. Plant Molecular Biology 42: 225–249. Wiens JJ, Graham CH. (2005): Niche conservatism: integrating evolution, ecology, and conservation biology. Annual Review of Ecology and Systematics 36: 519–539. Wikström N, Savolainen S, Chase MW. (2001): Evolution of the angiosperms: calibrating the family tree. Proceedings of the Royal Society B 268: 2211–2220. Wright S. (1932): The roles of mutation, inbreeding, crossbreeding, and selection in evolution. Proceedings of the Sixth International Congress on Genetics, pp. 355–366. Wright IJ, Reich PB, Westoby M, Ackerly DD, Baruch Z, Bongers F, Cavender–Bares J, Chapin T, Cornelissen JHC, Diemer M, Flexas J, Garnier E, Groom PK, Gulias J, Hikosaka K, Lamont BB, Lee T, Lee W, Lusk C, Midgley JJ, Navas M, Niinemets Ü, Oleksyn J, Osada N, Poorter H, Poot P, Prior L, Pyankov VI, Roumet C, Thomas SC, Tjoelker MG, Veneklaas EJ, Villar R. (2004): The worldwide leaf economics spectrum. Nature 428: 821–827. Yamada K, Komagata K. (1970): Taxonomic studies on coryneform bacteria. III. DNA base composition of coryneform bacteria. The Journal of General and Applied Microbiology 16(3): 215–224. Yen AC, Olmstead RG. (2000): Molecular systematics of Cyperaceae tribe Cariceae based on two chloroplast DNA regions: ndhF and trnL intron–intergenic spacer. Systematic Botany 25: 479–494. 74
Zander HR. (2004): Minimal values for reliability of bootstrap and jackknife proportions, decay index, and bayesian posterior probability. PhyloInformatics 2: 1–13. Zedek F, Šmerda J, Šmarda P, Bureš P. (v tisku): LTR retrotransposons drive the evolution of Eleocharis species. Zeh DW, Zeh JA, Ishida Y. (2009): Transposable elements and an epigenetic basis for punctuated equilibria. BioEssays 31(7): 715–726.
75
8. Přílohy Seznam příloh: Příloha 1. Tabulka hodnot všech druhů změřených v této práci. Příloha 2. Lokality měřených vzorků. Příloha 3. Fylogenetický strom vygenerovaný Bayesiánskou metodou. Příloha 4. Fylogenetický strom vygenerovaný metodou maximální parsimonie. Příloha 5. Strom s namapovanými hodnotami Ellenbergovy indikační hodnoty pro vlhkost
Přiložený CD-ROM. Elektronická verze diplomové práce spolu se zdrojovými daty a výsledky analýz.
76
Příloha 1. Tabulka hodnot všech druhů změřených v této práci. délka průduchů mošniček nažek taxon 1C (pg) AT% 2n sekce (μm) (mm) (mm) subg. Carex C. saxatilis 0,416 63,15 80* vesicariae 43,2 3,5 C. *laxa 0,399 63,11 80 vesicariae C. vesicaria 0,396 63,73 82 vesicariae 33,4 7,5 2,45 C. rostrata 0,370 64,20 70* vesicariae 15,1 5 1,90 C. *dichroa 0,381 63,22 vesicariae C. riparia 0,410 64,05 72* tumidae 6 2,7 C. melanostachya 0,377 64,20 54* tumidae 116,4 4,5 3,25 C. pseudocyperus 0,362 63,99 66* pseudocyperae 29,6 4,75 1,80 C. antoniensis 0,370 63,45 C. lupulina 0,407 64,59 56 35,4 15 4 C. lurida 0,403 63,90 60* 29,5 8,65 C. hirta 0,333 63,42 112 carex 33,0 6,25 3,25 C. sordida 0,352 64,38 100* carex C. lasiocarpa 0,385 64,31 56 carex 36,9 4,25 2,05 C. paupercula 0,468 63,06 58 24,7 2,75 C. limosa 0,448 63,27 58* limosae 4 C. rariflora 0,468 62,66 52 limosae 3,5 C. koraginensis 0,509 63,62 scitae C. *krascheninnikovii 0,426 63,39 64* scitae C. pallescens 0,387 64,18 64* porocystis 28,1 3,25 2 C. acutiformis 0,431 63,07 78 paludosae 37,1 4,5 1,90 C. grayi 0,466 63,54 52* 25,6 16,25 4,8 C. lepidocarpa 0,366 63,74 68* ceratocystis 34,4 4,5 C. viridula 0,357 63,98 70 ceratocystis 2,25 1,7 C. demissa 0,350 64,12 70 ceratocystis 60,9 3,4 C. flava 0,347 64,07 56* ceratocystis 31,9 5,75 1,5 C. jemtlandica 0,370 63,67 68* ceratocystis 34,3 4,25 C. hostiana 0,345 64,00 56* ceratocystis 3,5 2 C. sylvatica 0,385 63,88 58* silvaticae 33,2 4,75 2,6 C. strigosa 0,337 64,70 66* silvaticae 35,2 3,5 2,10 C. flacca 1,056 62,73 76* glaucae 2,5 2,05 C. *serrulata 1,642 62,49 108 glaucae 3,5 C. firma 1,149 59,39 34 aulocystis 35,1 4 C. fuliginosa 0,692 61,30 40* aulocystis 34,2 4,75 1,75 C. sempervirens 0,810 63,49 32* aulocystis 34,7 5,25 C. bulgarica 0,794 61,16 34 C. macrolepis 0,708 64,58 36 aulocystis 85,9 6 C. kitaibeliana 0,710 61,87 36 aulocystis 4,25 C. frigida 0,384 64,30 58* aulocystis 29,6 5,5 C. atrofusca 0,715 62,07 38 chartoteuchium 29,1 4,25 1,6 C. capillaris 0,502 62,45 54 chlorostachyae 33,1 3 1,80 C. tenuiformis 0,364 62,85 40 chlorostachyae C. brachystachys 0,614 62,24 40 aulocystis 34,8 C. ferruginea 0,605 62,64 40* aulocystis 31,7 3,5 C. austroalpina 0,576 63,50 40 33,6 4 C. mucronata 0,679 61,59 36* aulocystis 37,6 4,5 C. curvula 0,837 61,46 86 curvulae 48,1 6,5 C. punctata 0,343 64,66 68 spirostachyae 3,5 C. distans 0,373 64,26 70* spirostachyae 33,3 4,5 C. aquatilis 0,410 63,17 74* phacocystis 21,1 2,5 77
délka průduchů mošniček nažek taxon 1C (pg) AT% 2n sekce (μm) (mm) (mm) C. *stans 0,388 63,74 76 phacocystis C. nigra 0,404 63,67 84* phacocystis 2,75 1,75 C. acuta 0,414 63,76 82* phacocystis 22,8 2,75 1,95 C. elata 0,402 63,54 74* phacocystis 21,3 3,25 1,70 C. cespitosa 0,394 63,06 72* phacocystis 22,8 2,5 1,75 C. bigelowii 0,423 63,36 70 phacocystis 23,1 2,75 2,00 C. *rigidioides 0,436 62,21 70* phacocystis C. kamtschatica 0,405 62,93 phacocystis C. buekii 0,439 63,29 64* phacocystis 33,5 3,85 C. digitata 0,379 62,55 48* digitatae 35,9 2,75 C. ornithopoda 0,365 63,08 54 digitatae 2,75 C. quadriflora 0,354 63,01 46* digitatae C. lanceolata 0,874 63,21 70* digitatae C. callitrichos 0,901 63,05 70* digitatae C. aurea 0,596 63,06 52* paniceae 25,4 C. livida 0,701 62,19 32* paniceae 31,6 3,25 2,5 C. vaginata 0,745 61,97 32* paniceae 25,3 3,25 3 C. panicea 0,691 62,34 32* paniceae 8 2,9 C. falcata 0,749 62,20 48 paniceae C. depauperata 0,723 62,54 44* depauperatae 30,4 4,25 C. pilosa 0,478 62,94 44 depauperatae 28,7 6,5 C. xiphium 0,397 62,93 56* depauperatae C. campylorhina 0,391 63,36 58* depauperatae C. michelii 0,389 63,69 62 depauperatae 25,4 2,5 2,40 C. tomentosa 0,396 63,95 48* acrocystis 32,9 2,25 2,00 C. ericetorum 0,565 61,92 30 acrocystis 2,5 1,8 C. pilulifera 0,498 62,68 18* acrocystis 32,6 3,75 3,00 C. riloensis 0,493 62,28 26* acrocystis C. montana 0,337 63,85 38* acrocystis 40,4 3,25 2,35 C. fritschii 0,502 62,62 30* acrocystis 27,7 3,75 2,55 C. buxbaumii 0,715 63,85 100* microrhynchae 32,3 2,5 2,50 C. adelostoma 0,728 63,29 106* microrhynchae 23,3 3 2,05 C. hartmanii 0,345 63,46 68* microrhynchae 27,5 3,5 2,2 C. atrata 0,401 63,41 54* microrhynchae 4,5 2,4 C. aterrima 0,386 63,70 52* microrhynchae 23,3 3,25 C. parviflora 0,389 63,52 54* microrhynchae 33,9 2,65 C. norvegica 0,384 63,10 54* microrhynchae 21,5 2,25 2 C. rufina 0,416 62,94 86* phacocystis 4,5 C. hallerana 0,484 62,61 54* hallerianae 59,1 2,75 C. humilis 0,466 62,63 36* digitatae 33,3 3,75 C. pediformis 0,885 62,71 70* digitatae 32,0 3,75 C. ussuriensis 0,416 63,82 albae C. alba 0,434 63,35 54* albae 24,0 3,25 1,8 C. pendula 0,372 63,37 58* rhynchocystis 2,9 C. microcarpa 0,585 63,45 36* rhynchocystis 48,5 2,75 1,85 C. umbrosa 0,503 62,64 62* mitratae 27,9 2,5 1,9 C. caryophyllea 0,507 63,16 62* mitratae 3 2,2 C. depressa 0,511 63,16 70 mitratae 43,4 9,5 4,25 C. hordeistichos 0,246 64,67 58* secalinae 39,0 6 2,75 C. secalina 0,240 65,25 secalinae 27,8 2,75 C. supina 0,401 63,54 38 lamprochlaenae 31,1 3,5 2 78
délka průduchů mošniček nažek taxon 1C (pg) AT% 2n sekce (μm) (mm) (mm) C. liparicarpos 0,534 62,90 38 lamprochlaenae 3,15 C. blanda 0,411 64,41 36* 78,6 2,8 2,5 C. pensylvanica 0,497 63,22 36* 77,9 4,3 2,3 C. plantaginea 0,395 64,44 50* 73,5 3,1 2,7 C. platyphylla 0,359 64,68 70* 64,7
subg. Vignea C. cristatella 0,308 64,31 64* 46,9 3,35 1,5 C. leiorhyncha 0,242 64,78 78 phleoideae C. otrubae 0,394 63,41 60* vulpinae 34,4 5,5 2,35 C. vulpina 0,361 62,65 68 vulpinae 22,7 4,5 2 C. disticha 0,427 63,80 60* ammoglochin 31,2 4,5 2,05 C. remota 0,401 61,92 62* remotae 39,7 3 1,7 C. remotiuscula 0,334 63,44 remotae C. hansenii 0,376 63,15 64* heleoglochin C. paniculata 0,375 62,67 60* heleoglochin 2,75 1,5 C. appropinquata 0,364 62,50 64 heleoglochin 20,5 2,75 1,5 C. diandra 0,417 62,91 60* heleoglochin 22,6 2,75 1,65 C. arenaria 0,353 63,58 64 ammoglochin 26,8 4,75 C. ligerica 0,333 63,63 58 ammoglochin 38,6 4,25 C. pseudobrizoides 0,348 63,82 56* ammoglochin 34,3 5 1,95 C. brizoides 0,327 64,43 58* ammoglochin 33,1 4 1,75 C. praecox 0,319 64,09 58* ammoglochin 29,7 2,75 1,75 C. curvata 0,324 64,29 58* 34,3 3,65 1,9 C. chordorrhiza 0,343 63,10 62* divisae 27,4 3,75 2 C. divisa 0,345 64,13 60 divisae 21,4 3,25 1,5 C. stenophylla 0,302 63,75 60* boernera 31,5 3,5 2,1 C. echinata 0,376 63,15 58* stellulatea 32,5 3,5 1,75 C. divulsa 0,407 63,30 58 phaestoglochin 32,8 4,6 2,25 C. muricata 0,388 63,66 58 phaestoglochin 32,5 4,1 2,33 C. leersiana 0,391 63,58 58 phaestoglochin 35,1 4,5 2,29 C. contigua 0,390 63,60 58 phaestoglochin 28,5 4,9 2,31 C. chabertii 0,394 63,54 54* phaestoglochin 5,1 2,6 C. pairae 0,405 63,36 58 34,8 3,5 2,03 C. canariensis 0,393 63,61 58* C. lachenalii 0,396 62,27 64* canescentes 2,75 1,5 C. elongata 0,366 63,08 56* elongatae 29,7 3,25 1,9 C. canescens 0,362 62,65 56* canescentes 23,2 2,5 1,5 C. brunnescens 0,352 63,07 56* canescentes 21,5 2,5 1,45 C. crawfordii 0,302 64,48 68* 26,6 3,75 1,5 C. ovalis 0,293 63,98 68* ovales 31,8 4,25 1,7 C. muskingumensis 0,311 64,45 80* 21,1 7,5 2,35 C. bohemica 0,288 63,68 80* cyperoideae 28,0 8,5 1,6 C. baldensis 0,754 63,11 90 baldenses 4,5 C. argunensis 0,330 64,08 42* petratae C. enervis 0,331 64,01 60* enerves C. micropoda 0,444 62,21 70 callistachys
subg. Primocarex C. dioica 0,510 61,48 52* physoglochin 26,7 3 1,7
79
délka průduchů mošniček nažek taxon 1C (pg) AT% 2n sekce (μm) (mm) (mm) C. davalliana 0,533 61,28 46* physoglochin 32,4 4 1,8 C. pulicaris 0,316 63,17 60 psyllophora 34,5 4,5 2,75 C. capitata 0,322 63,22 50* capituligerae 45,4 2,75 C. obtusata 0,317 63,74 52* petraeae 27,4 3,25 2,25 C. rupestris 0,342 62,95 50 petraeae 38,4 3 2,5 C. microglochin 0,304 62,77 58 leucoglochlin 45,5 4 2,4 C. pauciflora 0,376 63,32 76* leucoglochlin 38,5 6,5 2,05 C. distachya 0,280 64,73 74
Kobresia simpliciuscula 0,358 63,03 76* 3 Elyna myosuroides 0,397 62,50 58* Bolboschoenus laticarpus 0,235 64,18 110* Bolboschoenus glaucus 0,237 64,07 110* Bolboschoenus yagara 0,234 64,03 110* Bolboschoenus maritimus 0,239 64,08 110* Bolboschoenus planiculmis 0,239 63,72 110* Eriophorum gracile 0,410 62,59 60 1,75 Eriophorum russeolum 0,389 63,16 58 Eriophorum scheuchzerii 0,427 61,78 58 Eripophorum latifolium 0,496 62,54 58 38,9 Eriophorum vaginatum 0,376 62,45 58 Eriophorum angustifolium 0,445 63,10 58 39,0 3 Trichophorum alpinum 0,424 62,50 58 1,25 Trichophorum caespitosum 0,306 62,70 104 1,75 Trichophorum pumilum 0,339 62,53 78 1,5 Scirpus radicans 0,391 62,58 56 Scirpus sylvaticus 0,339 64,15 62 39,6 1 Isolepis setacea 0,409 58,79 26 29,8 Schoenoplectus triqueter 0,586 63,67 42 Schoenoplectus tabernaemontani 0,585 63,90 42 33,2 2,25 Schoenoplectus lacustris 0,570 63,90 42 33,7 3 Schoenoplectus pungens 0,463 65,61 74 30,7 Schoenoplectus mucronatus 1,064 61,77 44 2 Holoschoenus romanus 0,230 63,40 70* 0,8 Eleocharis quinqueflora 0,499 62,61 136* Eleocharis acicularis 1,184 60,56 20* 38,9 Eleocharis ovata 0,639 61,30 10* Eleocharis carniolica 1,143 61,16 20* Eleocharis erythropoda 2,432 59,98 18* Eleocharis macrostachya 4,357 59,84 38* Eleocharis vigens 3,885 59,94 36* Eleocharis xyridiformis 2,448 60,01 18* Eleocharis palustris 1,833 60,22 16* Eleocharis vulgaris 4,856 60,50 40* Eleocharis austriaca 2,122 59,94 16* Eleocharis mamillata 2,076 60,21 16* Eleocharis uniglumis 4,519 60,25 46* Eleocharis sterneri 7,414 60,25 82* Schoenus nigricans 0,830 60,56 44 Schoenus ferrugineus 0,909 60,87 76 Cladium mariscus 0,262 62,94 36 80
délka průduchů mošniček nažek taxon 1C (pg) AT% 2n sekce (μm) (mm) (mm) Rhynchospora alba 0,249 63,83 26 24,9 Rhynchospora fusca 0,232 64,33 26 Cyperus fuscus 0,222 64,15 72 Cyperus flavescens 0,346 63,78 50 Scirpoides holoschoenus 0,253 63,61 38,6 Blysmus sp. 5,775 58,50 46,9 Fimbristylis nutans 0,573 62,71 63,3 Fimbristylis sieboldii 0,413 64,49 57,4 Paramapania radians 0,456 57,32 40,2 Cyperus fertilis 0,290 60,17 30,2 Machaerina glomerata 0,279 59,78 Neesenbeckia punctoria 0,898 61,25 33,3 Scleria levis 0,202 61,11 26,2
1C ... velikost haploidního genomu AT% ... zastoupení AT bazí v genomu 2n ... počet chromozomů sekce ... dle Egorova (1999) délka průduchů ... aritmetický průměr z 10 změřených průduchů délka mošniček ... převzato z literatury (viz. Metodika 3.4.) délka nažek ... převzato z literatury (viz. Metodika 3.4.) * u jména taxonu označuje subspecii * u 2n označuje počty chromozomů převzaté z Roalson (2008), pro C. buekii ze Stoeva et al. (2005), pro C. platyphylla z Naczi (1999) 81
Příloha 2. Lokality měřených vzorků Carex acuta – Bohemia, Hluboká, slatinné louky J rybníka Řeka S obce, 49°40’03.3” / 15°51’15.1”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex acutiformis – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž hospody „U borovice“ v Mariánském údolí, 49°12'45" / 16°42'40"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex adelostoma – Norvegia, Dovrefjell, mezi vesnicemi Dombås a Hjerkinn, přírodní rezervace Haukskardmyrin; 09°22'24" / 62°08'51.9"; leg. Petra Hájková a Michal Hájek 22. 8. 2006. Carex adelostoma – Norvegia, Tynset, Stormyra, údolí Østerdalen, podél východního břehu řeky Glomma; 10°39'45.9" / 62°14'18.4"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 19. 8. 2006. Carex alba – Austria superior, Hinterstoder, údolí Krumme Steir, 47°41'48" / 14°06'10"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex antoniensis – Kapverdské ostrovy, Santo Antao, cca 2 km JV od města Janela; 17°06'59" / 25°03'27"; leg. Vít Grulich podzim 2007. Carex appropinquata – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’35.1” / 15°52’29.3”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex aquatilis – Norvegia, Tynset, Stormyra, údolí Østerdalen, podél východního břehu řeky Glomma; 10°40'01.6" / 62°14'48.0"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 19. 8. 2006. Carex arenaria – Denmark, Gedsen, ; 54°35'21.4" / 11°56'03.2"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 23. 8. 2006. Carex argunensis – Russia (Republic of Buryatiya, distr. Barguzinskii rayon), Ust'– Barguzin, 3.7 km JZ od přívozu ve vesnici; 53°23'52" -/ 108°59'43"; leg. T. Koutecký 13. 8. 2008. Carex atrata – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Fragant Hütte, Ofenspitze, 46°57'02" / 13°00'52"; leg. Vít Grulich 4.7.2006. Carex atrata – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Bretterach, 46°57'22" / 13°01'03"; leg. Vít Grulich 5.7.2006. Carex atrofusca – Norvegia, Røros, přírodní rezervace Sølendet; 11°50'04.4" / 62°40'58.3"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 18. 8. 2006. Carex atterima – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, 1.2 km ZJZ od chaty Fraganter Hütte, 46°56'55" / 13°00'47"; leg. Petr Šmarda 4.7.2006. 82
Carex aurea – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex austroalpina – Italia, prov. Veneto, distr. Verona, Ferrara di Monte Baldo: Monte Baldo, na východním svahu hory Cima Valdritta; 45°42'52" / 10°51'04"; leg. V. Grulich 29. 5. 2008. Carex baldensis – Italia, prov. Veneto, distr. Verona, Ferrara di Monte Baldo: Monte Baldo, na východním svahu hory Cima Valdritta; 45°43'09" / 10°50'50"; leg. V. Grulich 29. 5. 2008. Carex bigelowii – Moravia, Králický Sněžník, vrcholové plató V od vrcholu, 50°12'27" / 16°50'55"; leg. Dan Dvořák 16. 7. 2006. Carex bigelowii subsp. rigidioides – Russia (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon) Oblachnaya Mt., horské sedlo 0,45 km JJZ od hlavního vrcholu; 43°41'28" / 134°11'53" ; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008. Carex blanda – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex bohemica – Moravia, Horní Bečva, přehrada VJV obce, 49°25'21" / 18°18'59"; leg. Petr Šmarda 26. 6. 2006. Carex brachystachys – Austria superior, Hinterstoder, Klein Ofen, 47°41' 45" / 14°05' 53"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex brizoides – Moravia, Cikháj, lesní silnička na Žákovu horu S obce, 49°39’31.4” / 15°58’43.3”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex brunnescens – Norvegia, Røros, přírodní rezervace Sølendet, u parkoviště; 11°50' / 62°41'; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 18. 8. 2006. Carex buekii – Moravia, Bulhary, nivy S od obce; 48°50'34" / 16°44'01"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex bulgarica – Bulharsko, pohoří Rila, prameniště mezi přehradou Belmeken a sedlem Premkata, horní část svahu; 23°45'29" / 42°10'05"; leg. Z. Rozbrojová 11. 7. 2008. Carex buxbaumii – Moravia, Dolní Bojanovice, olšina v Hodonínské dúbravě 3,7 km VSV od kostela, 48°51'49" / 17°04'42"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex buxbaumii – Norvegia, Stormyra, údolí Østerdalen, podél východního břehu řeky Glomma; 10°39'45.9" / 62°14'18.4"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 19. 8. 2006. 83
Carex callitrichos – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, jižní svah v horní části údolí, 3,6 km Z od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'27" / 134°09'16"; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008. Carex campylorhina – Russia (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, střední část údolí, 6,5 km ZJZ od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'04" / 134°07'11"; leg. T. Koutecký 15. 7. 2008. Carex canariensis – Kanárské ostrovy, Tenerife, pohoří Anaga, na cestě do vesnice Chamorga, jižně od vrcholu Chinobre Mt.; 28º33'28" / 16º10'36.4"; leg. P. Šmarda & B. Kučerová 24. 4. 2007. Carex canescens – Moravia, Cikháj, rybník pod myslivnou JZ obce, 49°38’36.8” / 15°57’43.7”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex canescens – Norvegia, Røros, přírodní rezervace Sølendet, na cestě v rezervaci; 11°50' / 62°41'; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 18. 8. 2006. Carex capillaris – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, 1.2 km ZJZ od chaty Fraganter Hütte; 46°56'58" / 13°00'48"; leg. Petr Šmarda 4.7.2006. Carex capillaris – Suecia, Jämtland, Hammerdal, za kempem; 15°18'31.7" / 63°34'14.1"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 15. 8. 2006. Carex capitata – Suecia, Jämtland, Hammerdal, cca 500 m V od Näverkälsbodarna; 15°13'52.1" / 63°34'48.6";leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 15. 8. 2006. Carex caryophyllea – Moravia, Rašovice, 49°07'20" / 16°56'33"; leg. Zdena Lososová a Olga Rotreklová 31. 5. 2006. Carex caryophyllea – Slovakia, Velká Fatra, Čierny kameň na JZ úpatí kopce, roztroušeně; 48°55'54.2" / 19°08'04,3"; leg. Petr Šmarda 24. 6. 2006. Carex cespitosa – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’35.5” / 15°52’22.4”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex contigua – Moravia, Štramberk, hřbitov; 49°34’33",18°07’42"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex contigua – Moravia, Vranovice, zasolené louky a rákosiny podél lužního lesa zv. Velké louky; 48°58’24" / 16°36’41"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex crawfordii – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. 84
Carex cristatella – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex curvata – Moravia, Dolní Bojanovice, Baaderova alej v Hodonínské dúbravě 3,7 km VSV od kostela, 48°51'49" / 17°04'42"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex curvula – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, 1.16 km VSV od vrcholu Sadnik, 46°56'40" / 13°00'16"; leg. Petr Šmarda 4.7.2006. Carex curvula – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Fragant Hütte, Ofenspitze, 46°56'52" / 13°00'47"; leg. Vít Grulich 4.7.2006. Carex davalliana (samčí i samičí rostliny) – Bohemia, Vortová, pod hřbitovem SV obce, 49°42'56" / 15°56'20"; leg. Josef Bureš a Petr Bureš 18. 6. 2006. Carex demissa – Bohemia, Vortová, rašelinné louky pod hřbitovem 500 m SV od kapličky, 49°42'57" / 15°56'19"; leg. Petr Bureš 30.7.2006. Carex depauperata – Italia, region Abruzzo, Veiste, u parkoviště ve Foresta Umbra, bukový les; 41°49'7" / 15°59'55"; leg. Vít Grulich, Petr Šmarda & Ivana Hralová 15. 5. 2007. Carex diandra – Bohemia, Jizerské hory, rezervace Rašeliniště Jizery, 50°50'43" / 15°21'22"; leg. Štěpánka Králová 17. 6. 2006. Carex digitata – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž Muchovy boudy v Mariánském údolí, 49°13'15" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex dioica (samčí i samičí rostliny) – Bohemia, Hluboká, slatinné louky J rybníka Řeka S obce, 49°39’59.6” / 15°51’10.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex distans – Moravia, Javorník nad Veličkou, PR Machová; 48°51’16" / 17°33’30"; leg. K. Fajmon 10. 6. 2006.. Carex disticha – Moravia, Nové Mlýny, Křivé jezero; 48°51’03" / 16°43’48"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex divisa – Italia, region Abruzzo, Veiste, světlina v borovém lese na píscích; 41°54'52" / 15°19'27"; leg. Vít Grulich, Petr Šmarda & Ivana Hralová 16. 5. 2007. Carex divulsa – Moravia, Břeclav, Kančí obora; 48°46’7.4" / 16°52’10.4"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex dystachia – Italia, region Abruzzo, Veiste, spásané doubravy pod Foresta Umbra; 41°47'26" / 15°58' 47"; leg. Vít Grulich, Petr Šmarda & Ivana Hralová 15. 5. 2007. 85
Carex echinata – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’35.0” / 15°52’30.6”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex elata – Moravia, Hodonín, olšina při železniční trati v Hodonínské dúbravě 3,25 km SZ od nádraží, 48°52'52" / 17°05'54"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex elongata – Moravia, Cikháj, rybník pod myslivnou JZ obce, 49°38’36.8” / 15°57’43.7”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex enervis – Russia, (Republic of Buryatiya, distr. Ivolginskii rayon), Dacan, vlhká pastvina, 0,2 km SZ od vchodu do kláštera Dacan; 51°45'30" / 107°11'30"; leg. T. Koutecký 8. 7. 2008. Carex ericetorum – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Bretterach, 46°57' 22" / 13°00' 52"; leg. Vít Grulich 5.7.2006. Carex falcata – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Elizovo: na cestě do Moroznaya, 3 km ZSZ od hlavní autobusové zastávky ve městě; 53°11'31" / 158°20'45"; leg. T. Koutecký 27. 7. 2008. Carex ferruginea – Austria superior, Spital am Pyhrn, Wurzeralm, 47°38'48" / 14°17'17"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 18. 6. 2006. Carex firma – Austria superior, Hinterstoder, Klein Ofen, 47°41'44" / 14°05'46"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex flacca – Moravia, Sedlec, Nový Rybník; 48°47'17.1" / 16°40'19.3"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex flacca – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž Muchovy boudy v Mariánském údolí, 49°13'15" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex flava – Bohemia, Borová u Poličky, vlhké louky 0,4 km V od železniční stanice, 49°44'35" / 16°09'54"; leg. Petr Bureš 29.7.2006. Carex flavocuspis subsp. krascheninnikovii – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Termalnii, v kopcích Dvugorbaya, 7,3 km JZ od geotermální elektrárny; 52°30'30" / 158°07'30"; leg. T. Koutecký 25. 7. 2008. Carex frigida – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, 1.8 km SV vrcholu Sadnik, 46°56'47" / 13°00'43"; leg. Petr Šmarda 4.7.2006. Carex fritschii – Moravia, Lednice, Rendesvous; 48°48'34" / 16°47'48"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. 86
Carex fuliginosa – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Bretterach, 46°57'23" / 13°01'00"; leg. Vít Grulich 5.7.2006. Carex grayi – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF MU, Brno; 49°12'16" / 16°35'47"; leg. I. Hralová 2007. Carex hallerana – Hungaria, Budakeszi (pohoří Budai Hegység), 47° 31'44" / 18° 53'50"; leg. Jan Roleček a Barbora Zemanová 19.7.2006. Carex hanseni – Kapverdské ostrovy, Santo Antao, cca 2 km V od města Janela; 17°07'48" / 25°04'16"; leg. Vít Grulich podzim 2007. Carex hartmanii – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’35.1” / 15°52’27.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex hirta – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž hospody „U borovice“ v Mariánském údolí, 49°12'45" / 16°42'40"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex hordeistichos – Moravia, Javorník nad Veličkou, PR Machová, údolí Rybnického potoka; 48°49'42" / 17°32'41"; leg. K. Fajmon 9. 6. 2006.. Carex hostiana – Bohemia, Trhová Kamenice, rezervace Buchtovka, 1,4 km JJZ obce, 49°46'26" / 15°48'37"; leg. Josef Bureš a Petr Bureš 18. 6. 2006. Carex humilis – Moravia, Marefy, přírodní rezervace Šévy, 49°08'25" / 16°58'47"; leg. Zdena Lososová a Olga Rotreklová 31. 5. 2006. Carex chabertii – Bohemia, Olešnice v Orl. horách, meze podél silnice v obci v SZ části obce, 250 m Z kostela, 50°22'23,7" / 16°18'27.3"; leg. Radomír Řepka srpen 2006. Carex chordorrhiza – Moravia, Jihlávka, rezervace Kaliště, 49°15'01" / 15°17'47"; leg. Vít Grulich 21.8.2006. Carex jemtlandica – Suecia, Jämtland, Hammerdal, ca 500 m V od Näverkälsbodarna; 15°13'52.1" / 63°34'48.6"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 15. 8. 2006. Carex kamtschatica – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Ecco, východní svah pod vrcholem Digeren– Olengende, 2,1 km SSV od vrcholu; 53°13'30" / 158°06'7"; leg. T. Koutecký 25. 7. 2008.. Carex kitaibeliana – Italia, region Abruzzo, Pescara, pod horní stanicí lanovky na Gran Sasso; 42°25'50" / 13°32'11"; leg. Vít Grulich & Karel Fajmon 17. 5. 2007. 87
Carex koraginensis – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Termalnii, na okraji cesty z Elizova, 10,6 km SSV od geotermální elektrárny; 52°30'30" / 158°07'30"; leg. T. Koutecký 25. 7. 2008.. Carex lachenalii – Norvegia, Jotunheimen Mts., Lom, nedaleko vesnice Krossbu na okraji ledovce, SZ svahy Galdhøpiggen; 08°03'07.7" / 61°34'16.3"; leg. Petra Hájková a Michal Hájek 23. 8. 2006. Carex lanceolata – Russia, (Republic of Buryatiya, distr. Barguzinskii rayon), Ust'– Barguzin, JV okraj hory Pik Markova, 26,6 km SSZ od přívozu ve vesnici; 53°38'09" / 108°49'33" ; leg. T. Koutecký 13. 7. 2008. Carex lasiocarpa – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’35.1” / 15°52’31.6”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex leersiana – Moravia, Štramberk, Kotouč; 49°34’33",18°07’42"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex leiorhyncha – Russia, (Primorskii krai, Artemsii rayon), Artem, střední část údolí, 6,5 km ZJZ od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 53°41'04" / 158°07'11"; leg. T. Koutecký 15.7. 2008.. Carex lepidocarpa – Bohemia, Hluboká, slatinné louky J rybníka Řeka S obce, 49°39’59.6” / 15°51’10.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex ligerica – Bulharsko, Primorsko, pobřežní duny 1,7 km S od města; 42°15'39" / 27°45'26"; leg. Milan Chytrý 19. 7. 2008. Carex ligerica – Italia, prov. Veneto, distr. Verona, Ferrara di Monte Baldo: Monte Baldo; 45°43'09" / 10°50'50"; leg. V. Grulich 29. 5. 2008. Carex limosa – Bohemia, Jizerské hory, rezervace Rašeliniště Jizery, 50°50'48" / 15°20'59"; leg. Štěpánka Králová 17. 6. 2006. Carex limosa – Austria superior, Spital am Pyhrn, Wurzeralm, Teichlboden, 47°39'03" / 14°17'14"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 18. 6. 2006. Carex liparicarpos – Hungaria, Fót, kopec Fóti Somlyó, 47° 38'01" / 19° 12'24"; leg. Jan Roleček a Barbora Zemanová 19.7.2006. Carex livida – Norvegia, Verdal, vesnice Buran, přírodní rezervace Kaldvassmyra; 11°34'53.6" / 63°43'21.0"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 17. 8. 2006. 88
Carex lupulina – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex lurida – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex macrolepis – Italia, region Abruzzo, Pescara, pod lanovkou na Gran Sasso; 42°25'50" / 13°32'11"; leg. Vít Grulich, Petr Šmarda & Ivana Hralová 17. 5. 2007. Carex macroura – Russia, (County Irkutskaya oblast), Slyudyanka, střední část údolí, 6,5 km ZJZ od hlavního vrcholu; 51°37'52" -/ 103°38'53" ; leg. T. Koutecký 17. 7. 2008. Carex melanostachya – Moravia, Bulhary, nivy S od obce; 48°50'30" / 16°44'07.3"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex microcarpa – Italia, poloostrov Gargano, Marina di Lesina, borový les 0,8 km ZSZ od kostela ve vesnici; 41°54'52.1" / 15°19'37.1"; leg. V. Grulich, P. Šmarda a I. Hralová 16. 5. 2007. Carex microglochin – Norvegia, Dovrefjell, JZ svahy nad vesnicí Kongsvoll; 09°36'22.7" / 62°18'01.9"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 20. 8. 2006. Carex micropoda – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Ecco, břeh jezera pod severním svahem Digeren– Olengende; 53°13'35" / 158°06'8"; leg. T. Koutecký 25. 7. 2008.. Carex michelii – Moravia, Marefy, přírodní rezervace Šévy, 49°08'25" / 16°58'47"; leg. Zdena Lososová a Olga Rotreklová 31. 5. 2006. Carex montana – Moravia, Javorník nad Veličkou, PR Machová; 48°51’16" / 17°33’30"; leg. K. Fajmon 12. 6. 2006.. Carex mucronata – Austria superior, Hinterstoder, Polsterluke, 47°41' 38" / 14°07' 41"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex mucronata – Austria, Tirol, Lienzer Dolomiten; J svah kopce Bromachnocke, SV okraj masívu Grosse Sandspitze, 46°46'37" / 12°47'58"; leg. Petr Šmarda 6. 7. 2006. Carex muricata – Moravia, Štramberk, Kotouč; 49°34’33",18°07’42" leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex muskingumensis – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF MU, Brno; 49°12'16" -/ 16°35'47"; leg. I. Hralová 2007. Carex nigra – Moravia, Cikháj, louka pod památníkem odboje SZ obce, 49°38’53.1” / 15°57’39.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. 89
Carex norvegica – Norvegia, Dovrefjell, 8 km SV od vesnice Kongsvoll; 09°39'58.6" / 62°21'20.8"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 21. 8. 2006. Carex norvegica – Norvegia, Dovrefjell, JZ svahy nad vesnicí Kongsvoll; 09°36'22.7" / 62°18'01.9"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 20. 8. 2006. Carex obtusata – Moravia, Vícov, západní svahy Malé horky 1,4 km VSV od kostela, 49°29'20" / 16°58'44"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex ornithopoda – Austria superior, Hinterstoder, Polsterluke, 47°41'35" / 14°07'27"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex otrubae – Moravia, Brno– Líšeň, hráz prostředního ze 3 rybníků v Mariánském údolí, 49°12'58" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex otrubae – Moravia, Vranovice, zasolené louky a rákosiny podél lužního lesa zv. Velké louky; 48°58’24" / 16°36’41"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. Carex ovalis – Moravia, Cikháj, rybník pod myslivnou JZ obce, 49°38’36.8” / 15°57’43.7”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex pairae – Bohemia, Olešnice v Orl. horách, meze podél silnice v obci v SZ části obce, 250 m Z kostela, 50°22'23,7" / 16°18'27.3"; leg. Radomír Řepka srpen 2006. Carex pallescens – Moravia, Cikháj, louka pod památníkem odboje SZ obce, 49°38’53.1” / 15°57’39.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex panicea – Moravia, Cikháj, louka pod památníkem odboje SZ obce, 49°38’53.1” / 15°57’39.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex paniculata – Moravia, Útěchov, olšinka u přítoku potoka Melatín; 49°43’09" / 16°38’35"; leg. Radek Řepka 1. 8. 2006. Carex parviflora – Austria, Kärnten, Hohe Tauern, Goldberg Gruppe, Bretterach, 46°57'40" / 13°00'24"; leg. Vít Grulich 5.7.2006. Carex pauciflora – Bohemia, Jizerské hory, rezervace Rašeliniště Jizery, 50°50'48" / 15°20'59"; leg. Štěpánka Králová 17. 6. 2006. Carex pauciflora – Austria superior, Spital am Pyhrn, Wurzeralm, Teichlboden, 47°39'03" / 14°17'14"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 18. 6. 2006. Carex paupercula – Bohemia, Šumava, Borová lada, Chalupská slať, 49°00'03" / 13°39'31"; leg. Vít Grulich 21.8.2006. 90
Carex pediformis subsp. macroura – Bohemia, Mimoň– Vranov, hora Ralsko, písčitý osyp na patě skal pod Juliinou vyhlídkou 0,3 km SV středu osady, 50°40'05" / 14°45'23"; leg. Vít Grulich 22.8.2006. Carex pediformis subsp. rhizodes – Moravia, Brno– Líšeň, podél silničky Mariánské údolí– Horákov; 49°12'49" / 16°43'51"; leg. Radomír Řepka Carex pendula – Bohemia, Staré Ransko, V svahy kopce Babylon, 49°40’25.8” / 15°50’06.3”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex pensylvanica – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex pilosa – Moravia, Pavlovské vrchy, Soutěska pod Děvínem; 48°50’10,3" / 16°41’25"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex pilulifera – Moravia, Cikháj, louka pod památníkem odboje SZ obce, 49°38’53.1” / 15°57’39.5”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex plantaginea – vzorek z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007.. Rostlina pochází ze Severní Ameriky, přesná lokace není známa Carex platyphylla – vzorek neznámého původu z botanické zahrady a arboreta při MZLU, Brno; 49°12'54" / 16°36'52"; leg. M. Nohelová a P. Bureš 9. 8. 2007. Carex praecox – Moravia, Lednice Rendesvous; 48°48'34" / 16°47'48"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex praecox – Moravia, Pavlovské vrchy, Děvín; 48°50’10,3" / 16°41’25"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex praecox – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž Muchovy boudy v Mariánském údolí, 49°13'15" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex pseudobrizoides – Bohemia, Pardubice, Zminný, borový les 200m SZ od osady Malolánské; 50°02’0,3" / 15°52’13"; leg. Radomír Řepka srpen 2006. Carex pseudocyperus – Bohemia, Staré Ransko, hráz rybníka Ranský v obci, 49°41'02" / 15°49'56"; leg. Josef Bureš a Petr Bureš 18. 6. 2006. Carex pulicaris – Bohemia, Trhová Kamenice, rezervace Buchtovka, 1,4 km JJZ obce. 49°46'26" / 15°48'37"; leg. Josef Bureš a Petr Bureš 18. 6. 2006. 91
Carex quadriflora – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, jižní ssvah v horní části údolí, 3,6 km Z od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'27" / 134°09'16"; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008.. Carex rariflora – Norvegia, Dovrefjell, 8 km SV od vesnice Kongsvoll; 09°39'58.6" / 62°21'20.8"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 21. 8. 2006. Carex rariflora – Norvegia, Dovrefjell, 8 km SV od vesnice Kongsvoll; 09°40'12.7" / 62°21'17.2"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 21. 8. 2006. Carex remota – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž Muchovy boudy v Mariánském údolí, 49°13'15" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex remotiuscula – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, prostřední údolí, 6,5 km ZJZ od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'25" / 134°09'16"; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008.. Carex riloensis – Bulharsko, pohoří Stara Planina, Kalofer, alpínské trávníky na jižním svahu JV od předělu Botevské hory; 42°42'92.9" / 24°57'07.3"; leg. R. Řepka 24. 6. 2009. Carex riparia – Moravia, Nové Mlýny, Křivé jezero; 48°51’03" / 16°43’48"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex rostrata – Moravia, Radostín, mezi Radostínským opukovým kopcem a vrchovištěm Padrtiny, 49°38’34.7” / 15°52’35.2”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex rufina – Norvegia, Geiranger, JZ svahy Dalsnibba Mt., near the road no. 58; 07°16'17.4" / 62°01'48.5"; leg. Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 23. 8. 2006. Carex rupestris – Moravia, Hrubý Jeseník, Červená hora (vřesová studánka), 50°08'44" / 17°08'08"; leg. Vít Grulich 21.8.2006. Carex saxatilis – Norvegia, Dovrefjell, JZ svahy nad vesnicí Kongsvoll; 09°36'22.7" / 62°18'01.9"; leg., Petra Hájková, Michal Hájek a Daniel Dítě 20. 8. 2006. Carex secalina – Moravia, Mikulov, Mušlov; 48°47'42,6" / 16°41'06"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex sempervirens – Austria superior, Hinterstoder, Klein Ofen, 47°41'47" / 14°05'37"; leg. Alena Vydrová a Vít Grulich 17. 6. 2006. Carex sempervirens – Slovakia, Velká Fatra, Blatnica, Čierny kameň, 800 m JZ od vrcholu; 48°55'54,2" / 19°08'04,3"; leg. Petr 24.5.2006. 92
Carex sempervirens subsp. laxiflora – Slovakia, Veľká Fatra, Borišov; 48°56'18.6" / 19°06'15.1"; leg. P. Šmarda 25. 6. 2006. Carex sordida – Russia, (Kamčatský poloostrov, distr. Elizovskii rayon), Elizovo: na cestě do Moroznaya, 3 km ZSZ od hlavní autobusové zastávky ve městě; 53°11'31" / 158°20'45"; leg. T. Koutecký 27. 7. 2008. Carex stenophylla – Moravia, Brno– Medlánky, 49°14'17" / 16°34'06"; leg. Jan Roleček a Dan Dvořák 10.7.2006. Carex strigosa – Moravia, Lanžhot, lužní les 1,6 km V od kostela, 48°43'25" / 16°59'22"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex supina – Moravia, Pavlovské vrchy, Děvín; 48°50’10,3" / 16°41’25"; leg. Jiří Danihelka a Petr Bureš 15. 6. 2006. Carex sylvatica – Moravia, Brno– Líšeň, poblíž Muchovy boudy v Mariánském údolí, 49°13'15" / 16°43'09"; leg. Ivana Hralová a Petr Bureš 24. 5. 2006. Carex tenuiformis – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, na hlavním vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'24" / 134°09'15"; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008.. Carex tomentosa – Moravia, Marefy, přírodní rezervace Šévy, 49°08'25" / 16°58'47"; leg. Zdena Lososová a Olga Rotreklová 31. 5. 2006. Carex umbrosa – Bohemia, Chvalšiny,louka u rybníka 2 km ZJZ od obce, 48°50'57" / 14°10'59"; leg. Vít Grulich 30.7.2006. Carex ussuriensis – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii rayon), Yasnoe, jižní svah v horní části údolí, 3,6 km Z od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'27" / 134°09'16"; leg. T. Koutecký 14. 7. 2008.. Carex vaginata – Moravia, Karlov pod Pradědem, SZ část svahů Velké kotliny; 50°03'09" / 17°14'45"; leg. Radek Řepka 1.8.2006. Carex vesicaria – Moravia, Cikháj, rybník pod myslivnou JZ obce, 49°38’36.8” / 15°57’43.7”; leg. Petr Bureš a Klára Helánová 2. 6. 2006. Carex viridula – Moravia, Křtiny, slatina v lesním lomu 1 km S od kostela, 49°18'22" / 16°44'33"; leg. Radek Řepka a Petr Bureš 25.7.2006. Carex vulpina – Moravia, Břeclav, Kančí obora, paseka lužního lesa podél Nové Dyje; 48°46’7.4" / 16°52’10.4"; leg. Radek Řepka 8. 7. 2006. 93
Carex xiphium – Russia, (County Primorskii krai, distr. Chuguevskii region), Yasnoe, střední část údolí, 6,5 km ZJZ od hlavního vrcholu Oblachnaya Mt.; 43°41'04" / 134°07'11"; leg. T. Koutecký 15.7. 2008.. Cyperus fertilis – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Eriophorum angustifolium – Moravia, okres Ždár nad Sázavou, Veselíčko, na louce u rybníka Lesní, 1 km JJV od nádraží; 49°32'54" -/ 16°0'45; leg. Adam Veleba Eripophorum latifolium – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Fimbristylis nutans – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Fimbristylis sieboldii – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Isolepis setacea – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Machaerina glomerata – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Neesenbeckia punctoria – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Paramapania radians – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Scirpoides holoschoenus – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Scleria levis – vzorek neznámého původu z botanické zahrady hl. m. Prahy, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Schoenoplectus lacustris – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Schoenoplectus pungens – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009. Schoenoplectus tabernaemontani – vzorek neznámého původu z botanické zahrady při PřF UK, Praha; 50°4'14" / 14°25'11"; leg. I. Hralová 30. 9. 2009.