Polymere und Fluoreszenz Gleichgewicht der 360°-Trinkwasseranalyse Kräfte Trilogie Fluoreszenzspektroskopie von Basispolymeren aus der Leistung und Robustheit in Automatische, simultane Industrie Einklang mit Empfindlichkeit und schnelle Analyse von und Geschwindigkeit Pestiziden INHALT

APPLIKATION »Plug und Play«-Lösung für das Krankheits-Screening – MALDI-8020 zum Screening der Sichelzellen anämie 4 Maßgeschneiderte Software- Lösungen für jede Messung – Makro-Programmierung für Shimadzu UV-Vis und FTIR 8 Auf der sicheren Seite: Steroid- nachweis in Arzneimitteln und Nahrungsergänzungsmitteln mit einem LCMS-8045 11 MSn-Analyse nicht-derivatisier- ter und Mtpp-derivatisierter Peptide – Zwei aktuelle Unter- suchungen zur Anwendung von LC-MS-IT-TOF-Geräten 18 Polymere und Fluoreszenz – Teil 2: Wieviel Fluoreszenz zeigt ein Polymer für eine Qualitäts- kontrolle? 26

PRODUKTE Gleichgewicht der Kräfte – LCMS-8060NX: Leistung und Robustheit mit Empfindlichkeit, und Geschwindigkeit 7 360°-Trinkwasseranalyse: Episode 2 – Automatische, simul- Enrico Davoli mit dem PESI-MS-System – einem Gerät zu reinen Forschungszwecken (research-use only = RUO) tane und schnelle Analyse von Pestiziden mit Online-SPE und UHPLC-MS/MS 14 Vielseitiges Tool für die Automobil - industrie – Neue HMV-G3 Serie 17 Eine globale Lösung Kopfschmerz ade – Anleitung zur Auswahl der idealen C18-Säule 22 Validierte Methode für monoklo- nale Antikörper-Medikamente – dank globaler Bewertung der nSMOL-Methodik in menschlichem Serum 24

AKTUELLES Zusammenarbeit Eine globale Lösung dank globaler Zusammenarbeit – Innovations - zentren von Shimadzu als Partner Krebsdiagnostik: Innovationszentren von Shimadzu der wissenschaftlichen Forschung 2 als Partner der wissenschaftlichen Forschung

MÄRKTE s begann 1875 als Ein- Mann-Unternehmen im Chemical, Petrochemical, japanischen Kyoto und hat Biofuel and Energy E heute weltweit mehr als 10.000 Clinical Mitarbeiter: Shimadzu trägt mit seinen Lösungen dazu bei, „der Environment Gesellschaft zu nützen durch Wissenschaft und Technologie“, Food, Beverages, Agriculture so die Unternehmensphilosophie. Für seine zukünftigen Geräte - Pharmaceutical generationen, die den eigenen Anspruch „Excellence in Science“ Plastics and Rubber tragen, hat Shimadzu rund um den Globus Innovationszentren Automotive (SIC - Shimadzu Innovation Silvia Giordano und Enrico Davoli vor dem Mario-Negri-Institut, Mailand

SHIMADZU NEWS 2/2020 AKTUELLES

Cen ter) eingerichtet. 2017 wurde ogischen Untersuchung an einen talen Forschungs verbunds wesent - betrachten ihre Forschungsko - für Europa in Duisburg das Pathologen weiter, um zu ent - lich beteiligt war. opera tionen daher wie eine wis- European Innovation Center schei den, ob mehr Gewebeentfer - senschaftliche Zusammenarbeit, (EUIC) eröffnet. nung notwendig ist. Jede Probe SICs als wirtschaftlich- die niemals die akademische benötigt etwa 30 Minuten zur akademischer Partner Unabhängigkeit gefährdet, zu Basierend auf seinem seit mehr als Aufbereitung und Analyse, was Publikationen ermutigt und die 50 Jah ren entwickelten Netzwerk nicht nur hohe Kosten verursacht, In gewisser Weise lassen sich Hochschul-Ausbildung unter- in Europa, betreut Shimadzu seit sondern auch mit einer hohen Shimadzu Innovation Center als stützt. 2017 über ein Dutzend aktuelle Infektionswahrscheinlichkeit ein- Hybrid aus Industrie und Wissen - Projekte mit dem EUIC. Sie um - hergeht. schaftswelt betrachten. Alle SICs Der Erfolg von SICs baut auf fassen Lebensmittel-, Umwelt - haben das Ziel, neue Märkte zu neuen Gedanken und Zugangs - schutz und klinische Anwendun - Neue Lösung dank globaler erschließen, aber Märkte wachsen weisen auf. Deshalb stimmen sich gen mit Fokus auf neue Metho - Partner nicht nur aus wirtschaftlichem die Teams von Shimadzu fort- den, Werkzeuge, Techniken, Antrieb, sondern auch durch laufend mit den Universitäts for - Diagnostik und Lösungen. Eine Japan ist ein führendes Land bei wachsende Kompetenz und Ex - schern ab, um von wissenschaft - ganz aktuelle Zusammen arbeit den Behandlungsergebnissen für pertise, erläutert Dr. Ann-Christin lichen Fragestellungen zu erfah - wird die Krebsbehandlung voran- Leberkrebs, größtenteils aufgrund Niehoff, EUIC-Produktmanager ren, bei deren Lösung Innovatio - bringen. der neuartigen diagnostischen für analytische Bildgebungstech - nen von Shimadzu helfen können. Techniken in Japan (Kudo, 2018). nologien (Imaging). Deshalb bilden SICs auch For - Forschung zur Verbesserung Im Projekt von Davoli und schungsnetzwerke, wodurch auch der Krebserkennung Shimadzu wird KI darauf trai niert, Davoli und Takeda einander vor - eine Probe von PESI-MS-Daten gestellt wurden. Takeda wurde An einem neuen Ansatz, Krebs - ohne irgendeine Histo logie oder eingeladen, während des Shimadzu zellen zu diagnostizieren, forscht Laboraufbe reitung zu ana lysieren. Global Innovation Summit 2017 Shimadzu zusammen mit Dr. KI trifft eine binäre Entschei dung im japanischen Kyoto zu spre - Enrico Davoli. Er arbeitet am mit statistischer Wahr - chen. Dort lernte er auch andere Mario-Negri-Institut für Pharma - scheinlichkeit – normal oder wissenschaftliche Partner von kologische Forschung im italienis- Krebs. Vom Zeitpunkt der Pro - Shimadzu kennen und konnte sich chen Mailand, und war der erste ben gewin nung durch den Chirur - mit Ihnen über ihre letzten Ergeb - Präsident der italienischen Gesell - gen bis zur KI-Ent scheidung nisse in der analytischen For - schaft für Massenspektrometrie. dauert der gesamte Vorgang nicht schung austau schen. Shimadzu regte die Zusammen - länger als zwei Minuten. arbeit für Europa an, nachdem das „Der Gesellschaft zu nützen Unternehmen erfolgreich eine Nachdem Takeda und Shimadzu durch Wissenschaft und Tech - Kooperation mit Professor Sen die Effektivität dieses Ansatzes in nologie“ – diese Philosophie wen- Takeda von der Yamanashi Uni - Japan gezeigt hatten, ergab sich die den Shimadzu und seine SICs an, versität in Japan begonnen hatte. Frage, ob eine Hochrechnung auch um akademisch-wissenschaftliches Dabei geht es um ein neues Sys - auf andere Länder mög lich sei, da Fachwissen von Universitäten in tem, das künstliche Intelligenz die KI ursprünglich mit Daten von technologische Lösungen zu über- (KI) mit einer Elektrospray- japanischen Proben trainiert wor- tragen und einige der weltweit Ionisations-Massenspektrometrie- den war. So trat Shimadzu mit größten Herausforderungen zu Sonde (PESI-MS - Probe Electro - Davoli in Verbindung und fragte lösen. spray Ionization Mass Spectro - an, ob er Zugang zu Gewebe - Prof. Sen Takeda von der Universität metry) kombiniert, um den for - proben aus italienischen Klini ken Yamanashi beim Shimadzu Global Die Informationen inklusive der schungsbasierten Nachweis von habe. Davoli war begeistert Innovation Summit 2017 Partner und der Titel der in die - Krebszellen der Leber zu fördern mitzuwirken. sem Artikel genannten Personen (Yoshimura et al., 2012). „Mehr als 90 % der promovierten entsprechen dem Stand zum Zeit - „Ein Forscher wünscht sich sein Chemiker bleiben nicht im Wis - punkt der Interviews (Dezem ber Leberzellkarzinome sind eine häu- ganzes Leben lang, einen Prototyp senschaftsbetrieb. Wir helfen beim 2018). fige Ursache bei Krebstod. Zur zu besitzen und der erste zu sein, Aufbau ihrer Karriere“, sagt sie. üblichen Behandlungsweise gehört der etwas versucht. Das Instru - Deshalb fördert Shimadzu Promo - Referenzen die Abtragung der Krebszellen. ment ist brandneu. Der Ansatz ist tionsstudierende und kann sogar Kudo, M. (2018). Management of Hepato - Die Fachwelt diskutiert, wie viel brandneu. Es war eine sehr gute Mitantragsteller für Zuschüsse cellular Carcinoma in Japan as a World- gesundes, in die Teilentfernung Gelegenheit”, sagt er. sein. Zu den Beispielen gehören Leading Model. Liver Cancer 7, 134-147. einbezogenes Gewebe der Leber gemeinsame Projekte an der für das Überleben des Patienten Die ersten Ergebnisse sind viel - Klinik im französischen Limoges, Yoshimura, K., Chen, L.C., Mandal, am besten ist: Einige Forscher hal- versprechend, und mit Förderung und dem University College M.K., Nakazawa, T., Yu, Z., Uchiyama, ten eine kleine Pufferzone für ak - von Shimadzu erweitert Davoli London, England, bei denen das T., Hori, H., Tanabe, K., Kubota, T., Fujii, zeptabel, in der gesundes Gewebe seine Probensammlungen auf EUIC mit Promotionsstipendien H., et al. (2012). Analysis of renal cell carci- entfernt wird, während andere der andere solide Tumore. „Unser für drei Jahre unterstützt. noma as a first step for developing mass Ansicht sind, dass nichts anderes Plan besteht darin, mit anderen spectrometry-based diagnostics. J Am Soc als das Tumorgewebe entfernt europäischen Nationen zusammen Unabhängig von der hohen Qua - Mass Spectrom 23, 1741-1749. werden sollte. zu arbeiten, um PESI-MS an lität seiner technologischen Lö - anderen Populationen zu testen“, sungen sieht Shimadzu das pri - Im Verlauf einer Operation leitet sagt er und fügt hinzu, dass das märe Ziel seiner SICs darin, der der Chirurg eine Probe zur histol- EUIC am Aufbau eines kontinen- Gesellschaft zu nützen. SICs

SHIMADZU NEWS 2/2020 3 APPLIKATION »Plug und Play«-Lösung für das Krankheits-Screening Das MALDI-8020 zum Screening der Sichelzellenanämie

3D-Illustration von Sichelzellen

ie Weltgesundheits ver - schrieben. Derzeit finden sich ca. Die Anforderungen der und Datenverarbeitungssoftwares sammlung verabschiedete 80 % aller Fälle von Sichelzellen - Gesundheitsschutzmaßnahmen basieren. Wirtschaftlichkeit ist D 2006 eine Resolution, die anämie in tropischen Regionen, bedienen eine weitere Anforderung und hat Sichelzellenanämie (Sickle Cell insbesondere südlich der Sahara. zum Einsatz von Hochdurchsatz- Disease = SCD) als gesundheits- Aufgrund von Migrationsbewe - Screening-Programme sind Erst - Systemen geführt, die die Kosten politische Priorität anzuerkennen, gungen steigen die Zahlen aber maßnahmen zum Gesundheits - der einzelnen Analysen mindern. und rief die Länder dazu auf, die in den letzten Dekaden auch in schutz und müssen daher auf Gleichzeitig erlauben sie durch Krankheit zu bekämpfen. Diese Europa. zuverlässigen Analysemethoden eine größtmögliche Automatisie - Resolution wurde 2009 auch von den Vereinten Nationen übernom- men. In diesem Zusammenhang wurden weltweit zahlreiche Screening-Programme in vielen Laboren ins Leben gerufen.

SCD bezeichnet eine Gruppe erb- licher Erkrankungen roter Blut - körperchen. Ursache ist anomales Hämoglobin (HbS), das durch Mutationen des Beta-Hämoglo - bins entsteht. Diese Krankheit wurde bereits im Jahr 1910 be - Abbildung 1: Arbeitsablauf eines automatisierten Screenings

4 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

und ein normales Gen vererbt Neue Technik, Hochdurchsatz, Massen von etwa 15 kDa erfordert. haben, besitzen eine Sichel zell- Anwenderfreundlichkeit Abbil dung 3 zeigt das erwartete Veranlagung (SCT) und sind hete- Auflö sungsvermögen des rozygot-XS. Menschen mit SCT Biomaneo hat eine „Plug und MALDI-8020, um die verschiede- zeigen für gewöhnlich keine SCD- Play“-Analyselösung entwickelt, nen Hämoglo bin ketten HbS, HbA Symptome, können aber die Ver - die ein Probenverarbeitungs-Kit und HbF nachzuweisen. anlagung auf ihre Kinder übertra- und die MALDI-MS-Technik mit gen. einer Software zur automatischen Bei diesem ersten Ansatz ist es Ergebnisinterpretation durch nicht möglich, andere Varianten Effiziente Analysemethode Kombination mit klinischen von Hämoglobinketten wie HbC Daten bündelt (Abbildung 1). und HbE zu trennen, die gegen- Das Screening Neugeborener wird über der normalen HbA-Kette üblicherweise zentral in speziali- Das erste NeoSickle®-Kit wurde einen Massenunterschied von 1 Da sierten Labors durchgeführt. Die in zwei Ausführungen entwickelt: aufweisen. Der zweite, von Bio - Abbildung 2: Spezifische Unterstützung hierfür verwendete biologische Die erste ist für Hochdurchsatz- maneo genutzte Ansatz besteht für das Fleximass-Target Probe besteht aus einem trocke- Analysen per Roboter bestimmt; deshalb aus der Analyse von Pep - nen Bluttropfen auf Vliespapier. dazu wurde eigens eine Unter - tiden der Hämoglobinketten. Auf - rung, dass sich die Ärzteteams stützung für den Einsatz des lösung und dynamischer Bereich ausschließlich auf anomale Proben Der Einsatz von MALDI-MS in Fleximass-Targets des MALDI- des Benchtop-MALDI-8020 erlau- konzentrieren können. Das klinischen Labors hat sich bereits 8020 (Abbildung 2) entwickelt ben die Auftrennung der interes- MALDI-MS (Massenspektrome - bewährt, insbesondere bei der und das Roboter-Skript wurde sierenden Peptide. Abbil dung 4 ter) von Shimadzu in Kombination Identifikation von Mikroorganis - angepasst. Bei der zweiten Version (Seite 6) illustriert die Möglichkeit, mit Technologiepaketen des Unter- men (beispielsweise der Einsatz handelt es sich um ein Kit für Pro ben gruppen homozygoter AA nehmens Biomaneo aus dem fran- von VITEK®MS). MALDI-MS- Labors, die etwa 200 Pro ben pro oder heterozygoter AE zu tren- zösischen Dijon begegnen diesen Techniken werden den Anforder - Tag manuell analysieren. Das nen. Herausforderungen. Sie umfassen ungen von Screening-Anwendun - Fleximass-Target ist für beide vor- ein Probenverarbeitungs-Kit so wie gen gerecht, speziell hinsichtlich genannten Optionen geeignet. Empfindlichkeit und Dynamik- Datenverarbeitungs- und Manage - Automatisierung, Empfindlich - bereich des Nachweises mentsoftware. keit, Auflösung, Stabilität, Analy - Auflösung ist ein extrem wich- segeschwindigkeit, Zuverlässigkeit tigstes Kriterium bei Analysen Andere ausschlaggebende Krite - Zweistufiges Verfahren für und Robustheit auch bei hohen von Hämoglobinopathien rien beim SCD-Screening sind genauere Ergebnisse Analyseraten sowie Benutzer - Empfindlichkeit und Dynamik - freundlichkeit. Betrachtet man das anomale bereich des Nachweises. Tatsäch - Screening-Programme werden Hämoglobin, entsteht eine SCD lich besitzt die Probe eines sehr üblicherweise nach einem zweistu- Mit der Einführung eines Scree - durch Mutationen im Beta- früh geborenen Säuglings einen figen Verfahren organisiert. Bei nings auf Sichelzellanämie hat Hämoglobin-Gen (HbS), wodurch sehr niedrigen Prozentsatz, weni- der ersten Stufe handelt es sich in Biomaneo gezeigt, dass ein Glutaminsäure an Position 6 ger als 3 % der Erwachsenen- der Regel um eine Routinemetho - Benchtop-MALDI-8020-Massen - durch Valin ersetzt wird und zu Hämoglobinkette verglichen mit de, die in der Lage sein muss, spektrometer den oben dargeleg- einer Massenverminderung von anderen Verbindungen in der Pro - pathologische Proben auch mit ten Qualitätskriterien entspricht 30 Da führt. Die erste NeoSickle- be (fötale Beta-Hämoglobin- und nur einer einzigen Mutation nach- und den Einsatz der MALDI-MS Lösung basiert auf der Analyse Alpha-Hämoglobinkette). zuweisen und sie eindeutig einer auf Laborebene leichter, komfor- des gesamten Proteins, was eine von drei Gruppen zuzuordnen: tabel und schnell macht. ausreichende Massenauflösung bei Heterozygote ohne HbS-Varian - ten, Heterozygote mit HbS- Varianten und HbS-Homozygote. Der zweite Schritt basiert auf einer zweiten Standard-Referenz - methode und dient dazu, die Hb S 15837 Da Hb A 15867 Da Hb S 15837 DaHb A 15867 Da Hb S 15837 Da Hb A 15867 Da 2,0 1,2 ersten Ergebnisse zu bestätigen. 0,12 1,0 1,5 0,10 Ein Screening auf Hämoglobino - 0,8 pathien lässt sich bei Neugebo - 0,08 0,6 renen durchführen, um eine früh- 1,0 0,06 zeitige Versorgung der Kinder zu Intensität 0,4 0,04 sichern; das ermöglicht, die 0,5 0,2 Lebenserwartung wesentlich zu 0,02 0,0 erhöhen. Ein zweiter Screening- 15.840 15.860 15.880 15.900 15.840 15.860 15.880 15.900 15.840 15.860 15.880 15.900 Anwendungsbereich betrifft m/z m/z m/z Jugendliche oder Erwachsene im Zuge der Primärprävention, die es AS SS S␤+ Menschen ermöglicht, ihren ho - mozygoten AA- oder heterozygo- Abbildung 3: Das erhaltene Probenspektrum aus Heterozygote AS-, Sbeta+ - und Homozygote SS mit dem Nachweis von Hämoglobin ten XS-Status zu erfahren. Men - HbA- und HbS-Ketten schen, die nur ein Sichelzell-Gen

SHIMADZU NEWS 2/2020 5 APPLIKATION

Nach weis und Unterscheidung der Leistung und Geschwindigkeit der HbS-Beta-Hämoglobinkette ist in MALDI-Geräte bedeutet, dass sie diesen Proben sehr wichtig, um nur in sehr wenigen Ausnahme - eine weitere Blutentnahme und/ fällen ausschließlich für eine ein- oder eine falsche Klassifizierung zelne Anwendung eingesetzt wer- der Neugeborenen zu vermeiden. den. Für Kliniken oder Labore ist Diese Untersuchung zeigt die es effektiv, die in diese Technolo - hohe Qualität des MALDI-8020- gien gemachten Investitionen 100 Gerätes anhand des Klassifika - optimal zu nutzen. Daher ist die tions prozentsatzes, der bei sehr 80 Systemvielseitigkeit ein wichtiges früh geborenen Babys oberhalb 60 finanzielles Kriterium, das in von 90 % liegt. 40 Betracht zu ziehen ist. Für Labore

Intensität % mit einer geringen Zahl an Scree - 20 SCD-Screening wird in zentrali- ning-Analysen liegt der Vorteil sierten Laboren durchgeführt, die 0 eines MALDI-8020 im Manage - täglich eine große Zahl von Pro - ment der Erfassungsparameter, ben analysieren. Die Technik muss denn die Akquisitions methoden somit automatisiert und/oder Abbildung 4: Analyse der spezifischen Peptide aus Hämoglobin-Ketten HbE und HbA fassen alle für die Gerätekontrolle komfortabel für die Laboranten notwendigen Parameter zusam- sein. Benutzerfreundlichkeit ist ein men. Das macht ein MALDI-8020 unverzichtbares Kriterium für den 150.000 Proben pro Jahr oder So lässt sich die Extraktions - für vielfache Anwendungen ein- Betrieb und die Verwendung der etwa 20 % aller Geburten. Weni - elektrode in-situ reinigen, ohne setzbar, ohne das Risiko, Indivi - Massenspektrometrie in Ana lyse - ger als sechs Analysestunden pro das Gerätevakuum zu brechen; es dualanalysen zu stören. laboren. Die Benutzerfreund lich - Tag mit einem MALDI-8020 wür- handelt sich um ein automatisier- keit des Benchtop-MALDI-8020 den ausreichen, um alle Neugebo - tes und rasches (<10 min) UV- Um die Leistung der automatisier- erweist sich klar als Vorteil für renen in einem einzigen Labor zu Laser-basiertes Verfahren. Darü - ten Hochdurchsatz-Datenproduk - Labore mit großer, eventuell fluk- screenen. ber hinaus minimiert eine Ionen - tion mit einem MALDI-8020 zu tuierender Mitarbeiterzahl, die optik mit weiter Öffnung das steigern, hat Biomaneo ein Soft - nicht unbedingt auf MALDI-MS Vollständige Erfüllung der Risiko der Quellenverschmutzung ware-Paket entwickelt (LIMS: spezialisiert ist. Bedürfnisse von Screening- im Laufe der Zeit und sorgt damit Laboratory Information Manage - Labors für eine stabile Plattform. ment System), das die Ergebnisse MALDI-8020 ist das System zusammenfasst und bei der Inter - der Wahl Neben dem täglichen Durchsatz Diese Charakteristiken und pretation der massenspektrometri- stellen die Lebensdauer des Geräts Ergebnisse zeigen die Eignung des schen Daten assistiert. Das LIMS Das MALDI-8020 erfüllt diese und geringe Wartungsanforder - Benchtop-MALDI-8020-Massen - NeoScreening® erlaubt Dateien Kriterien mit gut kalibrierten und ungen das letzte Kriterium dar. spektrometers für den Nachweis zu erzeugen, die für die Kontrolle standardisierten Methoden. Die Um die Geräteleistung bei einer von Hämoglobinopathien bezie- des MALDI-8020 und den Start Bedienung des MALDI-8020 ist Zielsetzung von 500.000 Tests hungsweise für Hochdurchsatz- eines Analyselaufs notwendig intuitiv, was seine rasche Inte gra - pro Jahr zu erhalten, bietet das Analysen komplexer Blutproben. sind, wobei Daten auch automa- tion in Laboruntersuchungen MALDI-8020 mit TrueClean eine Es erfüllt sehr klar die Bedürfnisse tisch abgerufen werden und dann erlaubt und die Arbeit des techni- automatisierte Quellenreinigung. von Screening-Laboren. die Verarbeitung und Klassifi - schen Personals erleichtert. Zu dem zierung jedes Probenergebnisses ist das System sehr kompakt und erfolgt. lässt sich leicht auf einem Labor - tisch unterbringen. Fazit

Der Durchsatz ist in Screening- Die Erfassungsgeschwindigkeit Laboren eine zentrale Bedingung, und die Einfachheit eines Verfah - die bei der Einführung neuer Ana - renswechsels macht das Benchtop- lysemethoden berücksichtigt wer- MALDI-8020 ideal für viele An - den muss. Die in die Neo Sickle- wendungen und zu einem unver- Lösung eingebundene Erfassungs - zichtbaren Messgerät für bioche- methode der Spektren kombiniert mische Labore. Im Zusammen - mit der Leistungs fähigkeit des hang mit dem SCD-Screening Benchtop-MALDI-8020 erlaubt erfüllt ein MALDI-8020 alle die Analyse eines MALDI-Targets Erfordernisse. Dieses kompakte, mit 48 Proben in weniger als drei einfach einsetzbare und hoch lei- Minuten. Inklu sive Target-Tausch stungsfähige Instrument ist für die im Gerät ermöglicht dieser meisten Screening-Anwen dungen Durchsatz 576 Analy sen pro geeignet. Stunde. NeoSickle® ist ein eingetragenes Das französische Screening- Warenzeichen von Biomaneo. Hauptlabor für SCD analysiert Abbildung 5: Screenshot der NeoScreening LIMS nach Analyse einer Platte NeoScreening® ist ein eingetragenes etwa 600 Proben täglich, d.h. über Warenzeichen von Biomaneo.

6 SHIMADZU NEWS 2/2020 PRODUKTE Gleichgewicht der Kräfte Das LCMS-8060NX bringt Leistung und Robustheit in Einklang mit Empfindlichkeit und Geschwindigkeit

Das neue LCMS-8060NX gekoppelt an die Nexera LC-40 Serie

eit 2010 belebt Shimadzu Modus erlaubt eine sichere und nutzerfreund licher Metho denent - meter für Einstellungen in der regelmäßig den Markt mit eindeutige Identifizierung von wicklung und Analyse bestärkt Ionenquelle dehnt die Möglich - S wegweisenden Triple- Substanzen und eine vereinfachte Shimadzu, bestehende Labor lösun- keiten für hochempfindliche Ana - Quadrupol-LC-MS-Technologien. Auswertung von Multikompo - gen weiter zu überarbeiten und lysen weiter aus. Die zusätzliche Es begann mit dem LCMS-8030, nenten-Analysen, da im Falle von neue Produkte zu entwickeln, um Verbesserung im Design des das einen schnellen Polaritäts - Interferenzen andere MRM- die ständig wachsenden Anfor de - Ionenflugwegs etabliert das wechsel von 15 ms vereint mit Übergänge zur Auswertung her- rungen moderner Analytiklabore LCMS-8060NX als bestes Triple- ultraschneller Elektronik für eine angezogen werden können, ohne ideal bedienen zu können. Quadrupol-LCMS seiner Klasse. kurze Datenaufnahme- (Dwell eine wiederholte Analyse durch- Time) und Spannungseinstellzeit führen zu müssen. Aktuell erweitert das Triple-Quad - Analytical Intelligence (Pause Time) sowie mit hoher rupol-Massenspektrometer LCMS- für ein vereinfachtes Scan-Geschwindigkeit und einer Danach eingeführte Systeme, das 8060NX das LC-MS-Sortiment Labormanagement schnellen Kollisionszelle. Diese LCMS-8060 (2016) und das von Shimadzu und bietet für eine Techniken sind am Markt bestens LCMS-8045 (2017), basieren auf zunehmend anspruchs volle Analy - Gekoppelt an die neue Nexera bekannt als ultra-schnelle Massen - der erfolgreichen LCMS-8050- tik neue Lösungen im High-End- LC-40 Serie mit der qualitativen spektrometrie (Ultra Fast Mass Plattform. Sie bietet dem Markt Bereich. Eine noch leichtere Hand - Strategie der „Analytical Intelli - Spectrometry = UFMS). 2015 eine Bandbreite verschiedener habung, die hohe Stabilität auch gence“ bietet auch das neue wurde mit dem LCMS-8050 ein Empfindlichkeiten, die individuel- bei höchstem Pro bendurchsatz und LCMS-8060NX eine herausragen- Pola ritätswechsel von 5 ms und le Bedürfnisse mit Anwender - ein breites Spektrum an Standard - de Lösung für Routineanaly tik. eine Scan-Geschwindigkeit von flexibilität verbindet. parametern schaffen ein Gleich - „Analytical Intelligence“ er mög - 30.000 amu/s eingeführt, die neue gewicht von hoher Empfindlichkeit licht den Anwendern, mühelos Möglichkeiten eröffnet, Tandem- Nutzerfreundlich, robust und Robustheit. den Gerätestatus zu überprüfen, LC-MS einzusetzen. und hochempfindlich die Ressourcenauslastung zu opti- Mit der neuen IonFocus-Ionen - mieren und einen höheren Durch - Die hohe Geschwindigkeit dieser Es besteht eine allgemeine Markt - quelle trennt ein LCMS-8060NX satz zu erreichen. Die Strategie neuen Techniken ermöglicht, nachfrage nach robusten und effizient Ionen von ungeladenen vereinfacht das Labor management gleichzeitig eine hohe Anzahl von gleichzeitig hochempfindlichen Neutralteilchen bereits in der und ermöglicht eine höhere Pro - Fragmenten für jede Substanz zu Gerä ten. Das LCMS-8060 ist be - Quelle. Nur geladene Moleküle duktivität, maximale Zuverlässig - erfassen (umfangreicher als die reits ein hochrobustes System, das gelangen ins System, während die keit und bessere Gerätevernetzung Standard MRM-Technik (Multiple bei zahlreichen Applikationen im neutralen Partikel effizient entfernt durch IoT-Funktio nen (Internet of Reaction Monitoring), die übli- klinischen Sektor oder in der werden. Things) künstlicher Intelligenz cherweise nur zwei Fragmente für Lebens mittelsicherheit zum Ein - (Artificial Intel ligence = AI) und jeden Precursor verwendet). Die - satz kommt. Der Bedarf an höhe- Die Möglichkeit zur individuellen M2M-Kommu nikation (Machine ser sogenannte MRM-Spektrum- rer Robustheit sowie Steuerung weiterer Standardpara - to Machine).

SHIMADZU NEWS 2/2020 7 APPLIKATION Maßgeschneiderte Software- Lösungen für jede Messung Makro-Programmierung für Shimadzu UV-Vis und FTIR

Abbildung 1: Beispiel für ein EasyMacro zur Messung einer Probe mit vordefinierten Abbildung 2: Kontrollfenster von EasyMacro. Das LabSolutions-IR-Programm läuft im Messparametern Hintergrund ab. Die Ausführung des Makros kann in jedem Schritt unterbrochen werden.

ie Datenausgabe von Spek - Beide Anforderungen werden durch messung“, „Glättung“ oder „Spek - die zuletzt eingestellten Parameter trophotometern hat seit der maßgeschneiderte Software oder trensuche“. Zwischen diesen verwendet. In Schritt 4 und 5 wer- D Zeit der mechanischen Makros erfüllt. Shimadzu bietet Blöcken können Hinweis fenster den zuerst der Hintergrund und Schreiber eine lange Entwicklung dafür verschiedene Werk zeuge an, mit frei definierbarem Text einge- anschließend die Probe gemessen. hinter sich. Heute steht den Nut - je nach Komplexität der Aufgabe. fügt werden, um beispielsweise in Proben- und Dateiname können zern ein umfangreiches Software- Welche Möglichkeiten gibt es, Landessprache aufzufordern, die im Makro fest vorgegeben wer- Paket zur Verfügung, das verschie- Shimadzu FTIR und UV-Vis Spek - Probe einzusetzen oder das ATR- den, aber in diesem Beispiel wird denste Methoden zur Messung trophotometer durch maßgeschnei- Zubehör zu reinigen. Ein Beispiel vor der Messung ein Dialogfenster und Auswertung der Daten bereit- derte Software anzusteuern? ist in Abbildung 1 gezeigt. geöffnet, um diese Informationen stellt. Während sich die Spezifika - einzugeben. Jedes EasyMacro tionen – wie Messgeschwindigkeit, FTIR – EasyMacro In diesem Beispiel wird die Spek - beginnt mit „Program Start“ und Signal-Rausch-Verhältnis oder trum-Software benutzt. Schritt 1 endet mit „Program End“, um die Auflösung – mit jeder Geräte - Der Ausgangspunkt für die meisten ist der Start der Software, das vor- Software nach dem Ablauf kor- genera tion graduell verbessern, ist FTIR-Makros ist das Werkzeug eingestellte Gerät wird in Schritt 2 rekt zu schließen. die enthaltene Software ebenfalls EasyMacro, enthalten im Liefer - initialisiert, und in Schritt 3 wer- zu einem wichtigen Verkaufsargu - umfang von LabSolutions IR. Es den schließlich die Messparameter EasyMacro hat den großen Vor - ment geworden. erlaubt den Anwendern, typische gesetzt. Während das Makro ab - teil, dass keine Programmier - Arbeitsabläufe durch Zusammen - läuft, wird die Mess-Software im kenntnisse erforderlich sind, um Obwohl die LabSolutions fügen vorgefertigter Code-Blöcke Hintergrund gestartet. Ohne den ein solches Makro zu entwickeln. Software-Pakete bereits eine breite zu automatisieren, wie „Proben - Befehl „Scan Parameters“ würden Die vorgefertigten Blöcke verhin- Auswahl an Werkzeugen anbieten, gibt es nach wie vor Bedarf nach Tool Easy Macro VB Macro maßgeschneiderten Lösungen zu Instrument IRSpirit, IRAffinity-1s, IRTracer-100 IRSpirit, IRAffinity-1s, IRTracer-100 spezifischen Fragestellungen. So Entwickler Kunde oder Shimadzu Shimadzu suchen manche Kunden eine einfa- Anwendung Einfache Automatisierung, starten von VB Macros Komplexe Automatisierung, IRPilot, Validierung che Bedienoberfläche und automa- Beschreibung Drag & Drop von vorgefertigten Code-Blöcken Visual Basic Quellcode in LabSolutions IR tisierte Analysen, um das Labor - Vorteile Einfach zu verstehen Volle Integration in LabSolutions IR personal bei Routineaufgaben zu Verhindert Syntaxfehler Enthält VB Klassen, zum Beispiel Formular unterstützen. Andere Anwender Kann komplexere Makros nachladen Ermöglicht komplexe Programmierung benötigen spezielle Methoden der Nachteile Nur Spektrum und Postrun automatisierbar Endkunde hat keinen Zugriff auf den Editor Datenauswertung, die nicht in LabSolutions integriert sind. Tabelle 1: Vergleich der Makro-Werkzeuge für Shimadzu FTIR

8 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

Abbildung 3: Bedienoberfläche des IRPilot Abbildung 4: Der »Initialize« Block aus EasyMacro konvertiert in Visual Basic Quellcode

dern Syn taxfehler oder einen EasyMacro erzeugt einen Visual Der Visual Basic Makro Editor in die Software die enthaltenen Be - schädlichen Code. Für Anwender Basic Code, der von LabSolutions LabSolutions IR stellt für trainier- fehle aus und schreibt die Resul - ist im Kontroll fenster sichtbar, ob IR interpretiert wird. te Spezialisten eine komplette tate in die „Response“ Textdatei beim Ablauf des Makros ein exter- Entwicklungsumgebung bereit. im gleichen Ordner. ner Code aufgerufen wird, und FTIR – Visual Basic (VB) Macro Fertig entwickelte Makros können der Pro gramm ablauf kann in je - beim Nutzer zur Werkzeugleiste Die Syntax dieser Kommandos ist dem Schritt unterbrochen werden. Der Visual Basic Code hinter von LabSolutions IR Spectrum leicht zu verstehen, und die einzi- einem EasyMacro kann extrahiert oder Postrun hinzugefügt oder ge Anforderung an die Entwick - Die meisten Anwender begegnen und als Basis für komplexere über den „Load Basic File“-Block lungsumgebung ist, dass Text - EasyMacro durch die Validie - LabSolutions VB Makros genutzt aus EasyMacro heraus gestartet dateien geschrieben und gelesen rungsfunktionen der Shimadzu werden. Ein sehr komplexes Bei - werden. Abbildung 4 zeigt einen werden können. Da sich Nutzer - FTIR-Spektrophotometer, die spiel ist der IRPilot aus dem Screenshot vom LabSolutions IR rechte und Protokollierung in durch solche Makros aufgerufen Lieferumfang des Shimadzu VB Makro Editor mit dem auto- LabSolutions DB oder CS nicht werden. Jeder Block von IRSpirit, gezeigt in Abbildung 3. matisch generierten Code des durch diese Befehle umgehen las- „Initialize“-Blocks aus sen, ist der Einsatz einer solchen EasyMacro. Software-Lösung auch in validier- ter Umgebung möglich. Eine bidi- UV – Automatic Control rektionale Kommunikation zwi- schen LabSolutions und einem In der Welt von LabSolutions kundenspezifischen LIMS-System UV-Vis gibt es kein zu EasyMacro wird ermöglicht, indem letzteres vergleichbares Werkzeug, da „Command Files“ erzeugt und LabSolutions UV-Vis bereits an anschließend die von Abbildung 5: Schematische Darstellung der Kommunikation zwischen LabSolutions UV-Vis vielen Stellen automatisierbar ist, LabSolutions automatisch gene- und einem Host-System per Automatic-Control-Option beispielsweise durch den automa- rierten Text- oder pdf-Dateien tischen Export in Textdateien, importiert. vordefinierte Postrun-Berechnun - gen oder die Evaluierungs-Funk - UV – String-Kommandos tionen. Eine weitergehende Auto - matisie rung von LabSolutions Der schnellste Zugang zur Gerä - UV-Vis und sogar die externe tekontrolle durch maßgeschnei- Ansteuerung über kundenspezifi- derte Software besteht in den sche Program me bietet die Auto - externen Befehlen, die im Hand - matic-Control-Option. Eine typi- buch des UV-1280 und UV-1900i sche Anwendung ist die Kommu - dokumentiert sind. nikation zwischen LabSolutions UV-Vis und der Steuer-Software eines Autosamp lers.

Die verfügbaren Befehle ähneln den Blöcken aus LabSolutions IR EasyMacro. Textdateien mit die- sen Befehlen werden in einem spe- ziellen Ordner abgelegt, den die Abbildung 6: Autosampler-Ansteuerung als Beispiel einer LabSolutions UV-Vis LabSolutions UV-Vis kontinuier- Automatic-Control-Anwendung lich durchsucht. Wird eine „Com - mand“ Textdatei gefunden, führt

SHIMADZU NEWS 2/2020 9 APPLIKATION

Tool LabSolutions UV-Vis Automatic Control String Kommandos UV-OCX Instrument UV i-Selection (UV-1900i, UV-2600i, UV-2700i, UV-1280, UV-1900i UV-1280, UV-1900i, UV-3600i plus, SolidSpec-3700i) UV-2600i, UV-2700i Entwickler Kunde oder Shimadzu Kunde oder Shimadzu Shimadzu Anwendung Einfache Automatisierung, Autosampler, PC-Kontrolle von UV-1280, Excel Makros, Maßgeschneiderte Software mit voller LIMS-Anbindung Drittanbieter-Software Gerätekontrolle Beschreibung Kontrolle von LabSolutions UV-Vis über einfache ASCII-Kommandos für einfache Gerätekontrolle Indirekte Gerätekontrolle über Active X Textdateien Steuerlement Vorteile Kommandos unabhängig vom Gerät Kommandos offen zugänglich Nahezu vollständige Kontrolle über Gerätefunktionen Einfach zu implementieren Kurzer, effizienter Quellcode Kommunikationsfehler werden verhindert LabSolutions DB/CS Nutzerrechte nicht verletzbar Freie Wahl der Programmierumgebung Hilfe für Entwickler durch Microsoft IntelliSense Nachteile Nur bestimmte Funktionen von LabSolutions Gute Programmierkenntnisse notwendig Keine LabSolutions Integration möglich UV-Vis nutzbar

Tabelle 2: Vergleich der Makro-Werkzeuge für Shimadzu UV-Vis

den und Eigenschaften implemen- tiert. Dadurch entfällt die Not - wendigkeit, die Übersetzung zwi- schen Quellcode und ASCII- Zeichenfolge selber zu entwickeln.

In einer Programmierumgebung, wie Microsoft Visual Studio oder dem Microsoft Excel VBA Editor, stellt UV-OCX auch hilfreiche Funktionen bereit, wie die intelli- gente Code-Vervollständigung, um Syntaxfehler zu verringern.

Fazit Abbildung 8: Einfaches Gerätekontroll- Abbildung 7: Excel-Makro für Bilirubin in Rückenmarkflüssigkeit als typische Fenster in einem VBA-Formular mittels kundenspezifische Anwendung der externen Befehle Makro-Programmierung ist ein UV-OCX leistungsfähiges Werkzeug zur Unterstützung der Kunden. Eini - Sie sind auch als String-Komman - Programmierung erforderlich als ge Makros ermöglichen Anwen - dos bekannt, da die Kommuni - bei LabSolutions UV-Vis Auto - dungen, die nicht von der Stan - kation durch ASCII-Zeichenfol - matic Control. dard-Software abgedeckt werden, gen (englisch „ASCII string“) während andere Makros dem erfolgt, die über eine virtuelle UV – OCX-Kommandos Zweck dienen, zeitraubende COM-Schnittstelle übertragen Arbeitsschritte zu automatisieren werden. Eine weitere Möglichkeit zur direkten Gerätekontrolle bietet Abbildung 9: UV-OCX Steuerelement, Diese Befehle werden typischer- die Option UV-OCX. Hier wird direkt in eine Excel-Tabelle eingebettet weise genutzt, um maßgeschnei- ein Active X Steuerelement ge - derte Excel-Makros mit Geräte - nutzt, um zwischen dem Quell - kontrolle auszustatten oder Trei - code aus VBA oder Microsoft.net und Anwenderfehlern vorzubeu- ber für Software zu schreiben, die Framework und dem Maschinen - gen. Die beste Herangehensweise Spektrophotometer verschiedener code des Spektrophotometers zu hängt dabei nicht nur von der Hersteller einbindet. Beispiel- übersetzen. Mit dieser Option Komplexität der Aufgabe ab, son- Quellcode für die Implementie - können UV-1280, UV-1900i, dern auch von der Erfahrung des rung dieser Befehle in Microsoft UV-2600i und UV-2700i angesteu- Entwicklers. Tabelle 1 vergleicht Visual Basic 2015 und die notwen- ert werden. die verschiedenen Werkzeuge zur digen Einstellungen sind im Programmierung von Shimadzu Gerätehandbuch dokumentiert. Verglichen mit den String-Kom - FTIR-Instrumenten, und Tabelle 2 Zur Umsetzung ist ein tieferes mandos erfordern diese OCX- zeigt die entsprechenden Werkzeu - Verständnis der Schnittstellen- Kommandos weniger Kenntnisse ge für Shimadzu UV-Vis Geräte. über Schnittstellen, da die Kom - munikation mit dem Gerät vom OCX-Steuerelement übernommen wird. So werden auch Fehler ver- hindert, wie zum Beispiel das Abbildung 10: Die optionale VisEase Setzen nicht zulässiger Wellen - Software, die mit UV-OCX entwickelt längen-Werte. UV-OCX wird als wurde Klasse mit vordefinierten Metho -

10 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION Auf der sicheren Seite: steroid- freie Nahrungsergänzungsmittel Steroidnachweis in Arzneimitteln und Nahrungsergänzungsmitteln mit einem LCMS-8045

nabolika finden sich häufig in Stichproben von Nah - A rungsergänzungsmitteln und Arzneimittelzubereitungen, entweder mit Doping-Aktivitäten verbunden [1] oder wegen Kreuz - kontaminationen während der Produktion [2]. Methodenent - wicklungen zum Nachweis von Steroiden in derartigen Proben können herausfordernd sein; die Technik muss fähig sein, zahlrei- che Steroide mit großen Unter - schieden in der Polarität nachzu- weisen. Die zu überwachenden Verbindungen umfassen relativ polare Steroide wie Anastrozol ebenso wie Steroid-Ester mit geringer Polarität, die zunehmend in Stichproben von Nahrungs - ergänzungen aufgetreten sind [3].

Die entwickelte Methode prüft LCMS-8045 Triple-Quadrupol- auf Testosteroncaproat und Tes - Massenspektrometer gekoppelt tosteronisocaproat, eine schwieri- ist. Das System besteht aus zwei 200.000 ge Isomerenkomposition, die teil- LC-30AD Pumpen, einem weise getrennt wurde (Auflösung SIL-30AC Autosampler und 175.000 0,6 laut Eur.Ph.), so dass die einem CTO-20AC Säulenofen mit Analysetechnik nachweisen konn- einem Flusslinien-Auswahlventil. 150.000 te, welches der beiden Isomere in Das Ventil wurde zur Flussum - der Probe enthalten ist. Im Falle leitung der mobilen Phase einge- 125.000 des Tibolon, ein synthetisch her- setzt, um die ersten 1,5 Minuten gestellter Arzneistoff mit Hor - zu verwerfen und eine Kontami - monwirkung, werden drei MRM- nation des Massenspektrometers 100.000 Übergänge dargestellt, die auf eine mit früh-eluierenden Matrixkom - Derivatisierung verzichten, was ponenten zu vermeiden. 75.000 die Regel ist bei Tibolon und sei- nen Metaboliten. Zuletzt wird Die chromatographische Tren - 50.000 eine umfassende Begründung für nung wurde mit einer Zorbax SB- die Wahl der MRM-Übergänge C18 Rapid Resolution HT, 50 x 25.000 bei Steroid-Estern geliefert, die 4,6 mm, 3,5 μm (Artikelnummer auf Fragmenten der freien Steroi - 835975-902) bei 40 °C erreicht. 0 de basieren. Als mobile Phase wurde ein Gradient aus 0,1 % wässriger 20,50 20,75 21,00 21,25 21,50 21,75 22,00 22,25 Instrumentierung, Ameisensäure und Methanol, mit Methodenparameter und Gradientenelution zur Elution bei Probenaufbereitung einer Flussrate von 0,4 ml/min eingesetzt. Abbildung 1: Chromatogramm der Standardlösung, welche die partielle Trennung von Die Versuche wurden mit einem Testosteroncaproat und Testosteronisocaproat zeigt Nexera X2 UHPLC-System durchgeführt, das mit einem

SHIMADZU NEWS 2/2020 11 APPLIKATION

Fragmenten der freien Steroide basieren. 350.000

300.000 Hinsichtlich der Testosteron- 250.000 Gruppe wurde m/z 109 zur Quantifizierung verwendet und 200.000 m/z 97 zur Bestätigung. Beide 150.000 Ionen sind charakteristische 100.000 Testosteron-Fragmente, und ihr Einsatz ist in der Literatur belegt 50.000 [1-3]. Da sich die beiden Ionen 0 mit Fragmenten des Steroid-Kerns 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 im Molekül decken, wurde dar- über hinaus ihre Eignung für alle Minuten Testosteronester untersucht und bestätigt. Ein vergleichbares Prin - Abbildung 2: Chromatogramm der Standardlösung zip wurde bei der Nandrolon- und Nandrolonester-Gruppe ver- folgt, m/z 257 und m/z 239. Zeit (min) % B früh-eluierende Verbindungen ester. Von den Fragmenten der Für die Gruppe der Trenbolon - 0,0 - 5,0 35 eine etwa 20 % höhere Retention Steroid-Ester der gleichen Gruppe ester wurde m/z 253 und m/z 107 5,0 - 20,5 35 → 100 zeigten, spät-eluierende dagegen wird erwartet, bis zu einem gewis- verwendet, für die Gruppe der 20,5 - 25,0 100 eine etwa 10 % höhere Retention. sen Grade übereinzustimmen; das Boldenonester m/z 135 und für 25,01 - 31,0 35 wurde im Verlauf der anfänglichen Drostanolonpropionat m/z 215. Zwei Analysesäulen wurden gete- massenspektrometrischen Experi - Tabelle 1: Gradientenelutionsprogramm stet, eine Zorbax SB-C18 Rapid mente bestätigt, wie in Tabelle 2 Die optimierten massenspektro- Resolution HT, 50 x 2,1 mm, ersichtlich. Daher können die metrischen Parameter lauten: Durch diese Parame terwahl erga- 1,8 μm (Artikelnummer 822700- gemeinsamen, dort aufgeführten Positive Ionisierung: (ESI, Kapil - ben sich Retentionszeiten von 2,4 902) und eine Zorbax SB-C18 Fragmente genutzt werden, larspannung -4 kV) - 24 Minuten und eine Gesamt - Rapid Resolution HT, 50 x MRM-Übergänge für andere Heizblocktemp.: 400 °C laufzeit von 31 Minu ten inklusive 4,6 mm, 3,5 μm (Artikelnummer Steroid-Ester zu wählen, die auf Desolvatisierungstemp.: 250 °C Äquilibrierungs schritt. 835975-902). Da die erste Säule Partikel unterhalb von 2 μm ent- Vorläufer- Produkt- Produkt- Gruppe Flüssigchromatographie hält, war eine erheblich kürzere Ion Ion 1 Ion 2 Probenlaufzeit zu erwarten, Testosteron Die Strategie der Methodenent - jedoch wurden mit beiden Säulen Testosteron 289,4 109,1 97,0 wicklung zielte darauf ab, bezüg- vergleichbare Retentionszeiten Methyltestosteron 303,4 109,1 97,1 lich der Polarität ein breites Sub - erhalten. Da eine UHPLC-Säule Testosteronpropionat 345,1 109,1 97,0 stanzspektrum einzuschließen und für Überdruck und Verstopfen Testosteronphenylpropionat 421,6 105,1 97,1 gleichzeitig eine angemessene nach wenigen Analysen anfällig Testosteronisocaproat 387,1 109,0 97,2 Laufzeit zu gewährleisten – für ist, wurde eine 3,5 μm-Säule für Testosteroncaproat 387,1 109,0 97,2 insgesamt 16 ausgewählte Steroid- die Aufgabe bevorzugt – mit Testosteronenanthat 401,6 271,3 183,0 Ester. Hinsichtlich der Flussrate einem Injektionsvolumen von Testosterondecanoat 443,7 109,2 97,0 der mobilen Phase wurden 0,5 ml/ 2 μl. Testosteronundecanoat 457,7 109,0 97,1 min und 0,4 ml/min getestet, Trenbolon wobei die letztere aufgrund der Die Temperatur des Autosamplers Methyltrenbolon 285,0 227,1 198,0 gesteigerten Empfindlichkeit wurde anfänglich auf 4 °C einge- Trenbolonacetat 313,0 253,1 107,5 gewählt wurde. stellt, um die Stabilität der Proben Trenbolonenanthat 383,1 253,1 107,5 sicherzustellen. Da eine starke Trenbolonhexahydrobenzylcarbonat 411,1 253,0 107,5 Zwei unterschiedlich zusammen- Ausfällung von Matrixkompo - Nandrolon gesetzte mobile Phasen wurden nenten beobachtet wurde sobald Nandrolon 275,4 257,2 239,0 untersucht, die erste bestehend die Fläschchen 4 °C ausgesetzt Nandrolonphenylpropionat 407,1 257,1 105,2 aus einem Gradienten von 1 mM wurden, wurde der Autosampler Nandrolondecanoat 429,7 257,3 239,0 wässrigem Ammoniumacetat und auf Raumtemperatur gehalten und Methenolon 1 mM methanolischem Ammoni - eine 24-stündige Stabilität für die Methenolon (nur zur Referenz) 303,0 83,0 187,0 umacetat sowie die zweite aus Analyten etabliert. Methenolonacetat 345,0 83,1 97,0 einem Gradienten von 0,1 % wäs - Methenolonenanthat 415,1 82,9 187,1 sriger Ameisensäure und Metha - Probenaufbereitung Boldenon nol. Die zweite mobile Phase Boldenon (nur zur Referenz) 287,5 134,6 120,5 wurde gewählt, da sie ein einfa- Die zu bestimmenden Verbindun - Boldenoncypionat 411,6 135,4 125,1 cheres Herstellungsverfahren gen wurden in sechs Gruppen Boldenonundecylenat 453,2 135,2 67,2 gewährleistet. Die Aziditätsände - ähnlicher Struktur unterteilt: Drostanolon rung in der mobilen Phase durch Testosteron und Testosteronester, Drostanolon (nur zur Referenz) 305,0 161,0 215,0 Ameisensäure schien geringe Trenbolonester, Nandrolon und Drostanolonpropionat 361,1 269,2 215,2 Effekte auf die Retentionszeit der Nandrolonester, Methenolonester, Substanzen zu haben, in dem Boldenonester und Drostanolon - Tabelle 2: Prinzip der Auswahl von MRM-Übergängen

12 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

Retentions-Zeit MRM- Referenz-Ion Referenz-Ion C std Verbindung S/N-Verhältnis (min) Quantifizierung 1 2 (ug ml-1) Clenbuterol 2,4 277,3 → 203,3 167,5 –– 0,05 1,9 x 103 Anastrozol 10,0 294,0 → 225,1 210,1 –– 0,05 1,2 x 104 Fluoxymesteron 14,9 337,0 → 281,2 317,2 299,2 1,0 204 Oxandrolon 15,0 307,0 → 289,2 93,4 –– 1,0 213 Nandrolon 15,2 275,1 → 239,1 257,2 –– 5,0 87 Methyltrenbolon 15,6 285,0 → 227,1 198,0 –– 0,05 61 Methandienon 16,1 301,0 → 283,1 283,1 149,1 0,5 694 Testosteron 16,1 289,1 → 109,2 97,0 –– 0,05 44 Methyltestosteron 16,9 303,1 → 108,8 96,8 –– 0,05 207 Mesterolon 17,4 304,5 → 269,2 229,2 –– 5,0 103 Trenbolonacetat 17,7 313,0 → 253,1 107,5 –– 0,05 388 Danazol 17,6 338,4 → 148,0 121,2 –– 0,5 891 Stanozolol 17,4 328,6 → 81,0 121,1 –– 1,0 471 Tibolon 16,6 313,3 → 295,1 91,1 105,1 5,0 252 Methenolonacetat 19,3 344,6 → 82,8 187,1 297,2 1,0 557 Oxymetholon 18,6 333,0 → 159,1 279,1 –– 1,0 110 Testosteronpropionat 19,7 345,1 → 109,1 97,0 271,0 0,05 2,2 x 103 Nandrolonphenylpropionat 20,7 407,1 → 105,2 257,1 –– 0,05 616 Drostanolonpropionat 21,0 361,1 → 269,2 215,2 –– 5,0 552 Testosteronphenylpropionat 21,0 420,6 → 105,0 97,1 –– 1,0 646 Testosteronisocaproat 21,4 387,1 → 97,2 109,0 –– 0,05 148 Trenbolonenantat 21,5 383,1 → 253,1 107,5 –– 0,05 867 Testosteroncaproat 21,5 387,1 → 97,0 109,1 –– 0,05 188 Trenbolonhexahydrobenzylcarbonat 21,6 411,1 → 253,0 107,5 –– 0,05 2,1 x 103 Boldenoncypionat 21,6 411,1 → 135,1 125,1 –– 0,5 3,216 Testosteronenantat 21,9 401,1 → 96,8 109,0 ––- 0,5 194 Methenolonenantat 22,3 415,1 → 187,1 144,9 –– 0,5 2,0 x 103 Boldenonundecylenat 22,6 453,2 → 135,2 67,2 –– 1,0 3,0 x 103 Nadrolondecanoat 23,0 429,4 → 257,3 274,6 239,0 0,2 1,5 x 103 Testosterondecanoat 23,4 443,2 → 109,2 97,0 43,1 0,2 1,6 x 103 Testosteronundecanoat 24,0 457,2 → 109,0 169,1 –– 0,2 1,1 x 103

Tabelle 3: MRM-Übergänge für jede Komponente

Heizgastemp.: 350 °C Die Verweilzeit wurde auf 20 ms Methyltrenbolon: 150 ms Literatur Trocknungsgasfluss: 10,0 l/min eingestellt, ausgenommen: Methenolonazetat: 50 ms [1] C. Borges, N. Miller, M. Shelby, Zerstäubergasfluss: 3,0 l/min Nandrolon: 100 ms Drostanolonpropionat: 150 ms M. Hansen, C. White, M.H. Slawson, Heizgasfluss: 10,0 l/min Fluoxymesteron: 50 ms K. Monti, D.J. Crouch, Fazit Analysis of a challenging subset of World Anti Doping Agency-Banned ste- Eine Analysemethode wurde ent- roids and anti-estrogens by LC-MS-MS, wickelt, um 31 Steroide in Arznei - Journal of Analytical Toxicology, 31 mitteln und Nahrungsmittelergän - (2007) 125-131. zungen nachzuweisen. Dies ist die [2] S. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler, erste Methode zur Identifikation Validated UPLC method for the fast and von Testosteroncaproat in Gegen - sensitive determination of steroid residu- wart seines Isomers Testosteron - es in support of cleaning validation in isocaproat, und umgekehrt. formulation area, Journal of Pharma - Schlüsselparameter, die die Analy - ceutical and Biomedical analysis, 49 se der 31 Steroide beeinflussen, (2009) 833-838. wurden ermittelt und berücksich- [3] M. Thevis, Y. Schrader, A. Thomas, tigt. G. Sigmund, H. Geyer, W. Schanzer, Analysis of confiscated black market drugs using chromatographic and mass spectrometric approaches, Journal of Analytical Toxicology 2008;32:232-240.

Autoren Dr. Gerasimos Liapatas, Dr. Manos Barbounis Applications Department of N.Asteriadis S.A. 31 Dervenion Str. & Poseidonos Str., 144 Abbildung 3: Fragmentierungsverlauf der Verbindungen der Testosteron-Gruppe und der 51 Metamorfossi – Athen, Griechenland Boldenon-Gruppe [3] [email protected]

SHIMADZU NEWS 2/2020 13 PRODUKTE 360°-Trinkwasseranalyse: Episode 2 Automatische, simultane und schnelle Analyse von Pestiziden mit Online-SPE und UHPLC-MS/MS

Die Gesamtentnahme an Frischwasser in ganz Europa beläuft sich auf etwa 182 Mrd. m3/Jahr – zu etwa gleichen Anteilen gewonnen aus Grund wasser und Oberflächenwasser. EU-Trinkwasser stammt von etwa 11.000 Groß- und 85.000 Klein versorgern, die etwa 80 % beziehungsweise 20 % der Bevöl kerung beliefern.

Mehr als 60 % der EU-weiten Wasserinfrastruktur besteht aus Dienst - leistungen, die von Unternehmen der öffentlichen Hand erbracht wer- den – der Rest sind regulierte Unternehmen, zu unterschiedlichen Anteilen privatwirtschaftlich strukturiert. Die europäische Wasserwirt - schaft ist ein wirtschaftlich bedeutender Akteur (1 % des BIP) mit einem Jahresumsatz innerhalb der EU von etwa 80 Mrd. Euro. Sie stellt circa 500.000 Vollzeit-Arbeitsplätze und investiert jährlich etwa 7 Mrd. Euro [1].

56 Liter Wasser – so viel ver- Hintergrund Kontaminationen aus der Land - same natürliche Abbau tragen zur brauchen EU-Bürger täglich wirtschaft zu vermeiden, wurden Verunreinigung des Oberflächen- 1pro Kopf. Grundwasser und 1998 verabschiedete die Europäi - Parameter wie Nitrate und Pesti - und Grundwassers bei – den Oberflächengewässer wie Flüsse, sche Union (EU) die Trinkwasser - zide in die DWD einbezogen. wichtigsten Quellen für Trinkwas - Seen, Talsperren sowie Meerwasser richtlinie 98/83/EC1 (Drinking Diese Standards tragen dazu bei, ser. Diese Belastung kann für dienen als Ressourcen. Die sichere Water Directive = DWD) [2]. Für das Ausbringen von Dünger und Tiere, Menschen und Ökosysteme und hohe Qualität des Wassers ist mehr als 20 Jahre hat die DWD Pflanzenschutzmitteln zu reduzie- gefährlich sein – mit einem sofor- für die öffentliche und individuelle die Qualität von Wasser für den Gesundheit unverzichtbar, ebenso menschlichen Verbrauch festge- für die Wirt schaft. legt. Die Beurteilung dieser Richt - linie wurde in das Arbeitspro - Pathogene Mikroorganismen ge - gramm 20152 als Teil des behörd- fährden die Wasserbestände, aber lichen Fitness- und Leistungspro - auch chemische Substanzen aus gramms der Kommission aufge- Haushalt, Landwirtschaft, Gewer - nommen („Programm zur Ge - be oder der Natur. Mangelhafte währleistung der Effizienz und Qualität und Quantität erzeugen Leistungsfähigkeit der Rechtset - massive Probleme und verursachen zung“ = REFIT), um zu bewer- hohe soziale und wirtschaftliche ten, ob dieses Instrument weiter- Kosten. Strenge und stetige hin seinen Zweck erfüllt. Als erste Kontrollen sind daher unerlässlich. vollständige Evaluierung der DWD wurde sie im Dezember Wie in den Shimadzu NEWS 1/ 2016 als Arbeitsdokument der Abbildung 1: Schema der Online-SPE und UHPLC-MS/MS 2020 in Episode 1 der Wasser - Kommissionsdienststellen (Com - (Patentnummer: WO 2016/098169 A1) trilogie dargestellt, erfüllen mission Staff Working Document ICPMS-2030 und TOC-L von = SWD, 2016, 428 abschließend) ren, so die Umwelt zu schützen tigen oder einem Langzeiteffekt. Shimadzu die analytischen Anfor - veröffentlicht. und sicheres Trinkwasser von Bezüglich dieser Substanzen derungen für eine effektive Trink - hoher Qualität zu gewährleisten. haben einige Untersuchungen wasserkontrolle. Die Systeme sind Der Umgang der Landwirtschaft Gesundheitsauswirkungen aufge- anwenderfreundlich und bieten mit der DWD ist ein entscheiden- Pestizide im deckt, wie Veränderungen im eine wirtschaftliche Lösung für der Faktor für sicheres und hoch- Trinkwasser Nervensystem, Erkrankungen des moderne Labore. Diese Episode 2 wertiges Trinkwasser. Düngung Immunsystems, Fertilitäts- und beschäftigt sich mit der empfind - oder Pflanzenschutz mit Pestizi - Pestizide werden häufig für den Entwicklungsstörungen sowie lichen Online-SPE-UHPLC-MS/ den wirken sich beträchtlich auf Pflanzenschutz eingesetzt. Ihr Krebs. Deshalb wurde in der MS-Technik. die Trinkwasserqualität aus. Um intensiver Gebrauch und der lang- DWD eine Konzentrationsgrenze

14 SHIMADZU NEWS 2/2020 PRODUKTE

von 0,1 μg/l für einzelne Pestizide 4.500.000 und 0,5 μg/l für die Gesamtmenge 4.250.000 an Pestiziden festgelegt. 4.000.000 3.750.000 Bestimmung von 272 Pestiziden 3.500.000 in Wasser 3.250.000 3.000.000 Herkömmliche Trennmethoden 2.750.000 benötigen ein langwieriges Vor - 2.500.000 bereitungsprotokoll, um die durch 2.250.000 Umweltstandards festgesetzten 2.000.000 Schwellenwerte zu erreichen. Die 1.750.000 schnelle und empfindliche Online- 1.500.000 SPE-LC-MS/MS-Methode von 1.250.000 Shimadzu quantifiziert gleichzei- 1.000.000 750.000 tig 272 Pestizide in Oberflächen- 500.000 und Grundwasser. Diese hoch- 250.000 empfindliche Technik benötigt 0 Lösungsmittel und Reagenzien 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 hoher Qualität für die mobilen Minuten Phasen (LCMS-Grade Biosolve1). Abbildung 2: Chromatogramm von Grundwasser mit 100 ng/l versetzt Zwei Oberflächenwasser- und eine Grundwasserprobe wurden mit Standardpestiziden von Q 229,90 > 174,05 (+) 2,30e4 Q 212,90 > 88,95 (+) 1,42e3 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mis - 100,00 souri, USA) versetzt. Sechs Kali - 100,00 brationsstufen von 1, 10, 20, 50, 100 und 500 ng/l wurden dreimal in jeder Matrix angefertigt. % %

SPE-UHPLC-Betriebsbedin- gungen: Nexera X2 0,00 0,00 15,6 15,7 15,8 15,9 16,0 16,1 16,2 16,3 16,4 16,5 10,5 10,6 10,7 10,8 10,9 11,0 11,1 11,2 11,3 System: Shimadzu Nexera X2 RT RT Säule SPE: Mayi-ODS C18 Q 410,90 > 182,10 (+) 1,29e3 Q 331,00 > 127,10 (+) 2,22e3 Säule LC: C18AQ CS Interchim 100,00 100,00 2,6 μm 150 * 3 mm A/B (SPE): Wasser/Acetonitril +

0,002 % Ameisensäure + 2 mM % % Ammoniumformiat A: Wasser + 0,002 % Ameisen - säure + 2 mM Ammoniumformiat B: 50/50 Acetonitril/Methanol + 0,00 0,00 11,0 11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 11,9 17,0 17,1 17,2 17,3 17,4 17,5 17,6 17,7 17,8 17,9 0,002 % Ameisensäure + 2 mM RT RT Ammoniumformiat LC-Fluss: 0,7 ml/min Abbildung 3: Beispiel eines Chromatogramms an der unteren Quantifizierungsgrenze SPE-Elutionsfluss: 0,2 ml/min Ofentemperatur: 40 °C Injektionsvolumen: 1.000 μl Temperatur des Heizblockes: topen markierten Standards wur- und 25 ng/l. Die erhaltenen 300 °C den hinzugefügt, um eine interne LLOQs (lower limit of quantifi- MS-Betriebsbedingungen: Temperatur der Schnittstelle: Kali brierung durchzuführen. Um cation/untere Quantifizierungs - LCMS-8050 350 °C den Matrixeffekt zu beseitigen, grenze) entsprechen den Anfor - wurden interne Standards (ISTD) derungen der europäischen Richt - System: Shimadzu LCMS-8050 Die Analyse zeigt die unterschied- gewählt, die die Hauptfamilien linien und den Vorgaben der Welt - ESI-Ionisationsmodus: Positiv lichen, in drei Wasserproben her- von Pestiziden abdecken, wie gesundheitsorganisation WHO. und negativ gestellten Konzentrationsstufen Phenylharnstoffe, Triazine, Car - Verweildauer: 4 bis 199 msec, (Abbildung 2). bamate, Sulphonylharnstoffe und Leistungsbewertung um mindestens 15 Datenpunkte Organophosphorverbindungen. pro Peak zu erhalten Eine der vorigen, mit verschiede- Die Reproduzierbarkeit wurde auf Fluss des Zerstäubergases: nen Konzentrationsstufen versetz- Die Quantifizierungsgrenzen wur- der niedrigsten Konzentration ei - 2,8 l/min ten Matrizes wurde ausgewählt, den für jede Verbindung durch ein nes jeden Wassers mit drei Injek - Fluss des Heizgases: 10 l/min um eine Kalibrationskurve zu Signal-Rausch-Verhältnis größer tionen bestimmt. Ungeachtet der Fluss des Trocknungsgases: generieren. Die anderen dotierten 10 festgelegt. Tabelle 1 klassifiziert Wassermatrix lag die Reprodu - 10 l/min Wasserproben dienten als Kon - die Verbindungen gemäß ihrer zierbarkeit bei weniger als 15 % Desolvatisierungsgrenze: 150 °C trollen. Die 23 verschiedenen Iso - Quantifizierungsgrenzen: 1, 10 für alle 272 Zielsub stanzen.

SHIMADZU NEWS 2/2020 15 PRODUKTE

Verbindungen mit LOQ bei 1 ng/l 4MBC Chlorfluazon Ethidimuron Ioxynil Oxamyl Simazin Acetamiprid Chloridazon Ethiofencarb IPPMU Oxasulfuron Simazin Hydroxy Acetochlor Chlorsulfuron Ethiprol IPPU Oxazepam Simetryn Niflumsäure Chlortoluron Enbuconazol Iprovalicarb Oxydemeton Methyl Spirotetramat Alachlor Clethodim Fenobucarb Isoprothiolan Paclobutrazol Sulfometuron Methyl Ametryn Coumafen Fenothiocarb Isoproturon Penconazol Sulfosulfuron Amidosulfuron Coumatetralyl Fenpyroximat Isoxaben Penoxsulam Tebuconazol Aminocarb Cyanazin Fensulfothion Lufenuron Phosphamidon Tebufenosid Atenolol Cybutryn Fenuron Malaoxon Pinoxaden Tebutam Atrazin Cycloxydim Fipronil Sulfon Malathion Pirimicarb Tebuthiuron Atrazin Desethyl Cyflufenamid Fluazinam Mandipropamid Pirimicarb Desmethyl Teflubenzuron Atrazin-OH Cyproconazol Flufenacet Mecarbam Pirimicarb II Tepraloxydim Azaconazol DCPMU Fluometuron Mefluidid Prochloraz Terbumeton Azamethiphos Desmetryn Fluopicolid Mercaptodimethur Progesteron Terbumeton Desethyl Azimsulfuron Dichlorophen Fluoxastrobin Metabenzthiazuron Promecarb Terbuthylazin Azinphos Ethyl Dicrotophos Flupyrsulfuron Methyl Metalaxyl Prometryn Terbuthylazin Desethyl Azinphos Methyl Diethofencarb Fluridon Metazachlor Propachlor Terbuthylazin Hydroxy Azoxystrobin Difenacoum Flurtamon Metconazol Propazin Tetraconazol Bensulfuron Methyl Difenoconazol Flusilazol Methomyl Propiconazol Thiabendazol Benthiavalicarb Isopropyl Difethialon Fluxapyroxad Metobromuron Propoxur Thiacloprid Bisphenol S Diisobutylphtalat Foramsulfuron Metolachlor Propoxycarbazon Thiazafluron Buturon Dimetachlor Formetanat Metosulam Propyl Paraben Thiobencarb Coffein Dimethenamid Fosthiazat Metoxuron Proquinazid Thiophanat Methyl Carbamazepim Dimethomorph Fuberidazol Metribuzin Prosulfuron Triadimefon Carbamazepin Epoxyd Dimetilan Halosulfuron Methyl Metropolol Pyrazophos Triazamat Carbaryl Dimoxystrobin Hexaconazol Metsulfuron Methyl Pyrifenox Tribenuron Methyl Carbendazim Diniconazol Hexaflumuron Monolinuron Pyrimethanil Trietazin Carbetamid Dinoseb Hexazinon Monuron Pyroxsulam Trietazine-2-OH Carbofuran Dinoterb Hexythiazox Myclobutanil Quizalofop Ethyl Triflumizol Carbofuran 3 Hydroxy Diuron Hydroxypropazin Neburon Rimsulfuron Trimetoprime Carboxin Econazol Imazapyr Nicosulfuron Rotenon Trinexapac Ethyl Chlorantraniliprol Epoxiconazol Imazaquin Oruface Sebuthylazin Triticonazol Chlorbromuron Erythromicin Imidacloprid Oryzalin Siduron Vamidothion Verbindungen mit LOQ bei 10 ng/l 245T Fenoprop Cyprosulfamid Fenarimol Imazamox Metazachlo oa Quizalofop Aldicarb Cyromazin Fenoxycarb Imazofulfuron Methidathion Roxythromycin Atrazin Desisopropyl Desethyl Terbutylazine 2-0H Flazasulfuron Iodosulfuron Methyl Oxadixyl Tembotrion Bentazon Desmedipham Florasulam Isoprocarb Paraoxon Testosteron Benzafibrat Dia2hydroxy Flufenacet Isoxadifen Ethyl Phenmedipham Thiencarbazon Methyl Brodifacoum Dichlorprop-P Fluroxypyr Lorazepam Phoxim Thiodicarb Bromadiolon Diclofenac Fomesafen MCPA Propamocarb Tolytriazol Butyl Paraben Dimetachlor oa Forchlorfenuron MCPP Propanolol Triasulfuron Chloroxuron Epitestosteron Haloxyfop Medroxyprogesteron Propyzamid Triazoxid Clofentezin Ethoxysulfuron Haloxyfop Methyl Mesosulfuron Methyl Prothioconazol Triclopyr Clorsulon Ethyl Paraben Imazalil Metamitron Pymetrozin Trietazin Desethyl Closantel Tylosin aVerbindungen mit LOQ bei 25 ng/l 2,4-D Dea 2 Hydroxy Fluquinconazol Linuron Titrosulfuron Triflumuron

Tabelle 1: Quantifizierungsgrenze in ng/l für jede Verbindung

Die erhaltenen Ergebnisse zeigten 25 ng/l bei einer Probeninjek tion Zusätzlich zur Pestizid-Kontami - Biosolve ist der Handelsname der BioSolve® Wiederfindungsraten von 85 bis von 1 ml. Die Wiederfin dungsraten nation sind für Trinkwasserver - Company (TBC) 115 % für die Kalibrationsstan - reichen von 85 - 115 %, wobei die sorger und Wasseraufbereitungs - dards und die Kontroll proben. Repro duzierbarkeit bei kleiner als anlagen die erhöhten Konzentra - Referenzen 15 % für die vollständige Liste tionsniveaus an Nitrat eine Her - [1] REFIT EVALUATION of the Drinking Water Fazit liegt. Letztlich ist diese Technik ausforderung. Nitrate werden Directive 98/83/EC, 2016. geeignet für die Schwel lenwerte durch extensive landwirtschaftli- [2] European Drinking Water Directive Shimadzu bietet eine einzigartige, des aktuellen normativen Umfelds che Verfahren freigesetzt. 98/83/EC1. automatisierte und empfindliche wie der DWD. Sie ist ein perfektes Methode an, um eine große Zahl Bei spiel, wie Chromato graphie Episode 3 der Wasser-Trilogie von Pestiziden in Wasser zu quan- und Massenspektrometrie zusam- wird in der nächsten Shimadzu tifizieren. Die Quantifizierungs - mengehen als leistungsstarke, NEWS einen Überblick geben, grenzen lagen im Bereich von 1 bis anwenderfreundliche und zeitspa- wie sich Anio nen mit Hilfe der rende Technik, die die Bedürf nisse Ionen chromato graphie analysieren der Anwender bedient. lassen, etwa Nitrate oder andere.

16 SHIMADZU NEWS 2/2020 PRODUKTE Vielseitiges Tool für die Automobilindustrie Neue HMV-G3 Serie: neu konzipiert mit Farbkamera und Datenschutzfunktionen Zentraleinheit der HMV-G3 Serie

ie Zukunft der Mobilität, haltigen Komponenten nach inter- die zukünftige Nutzung nationalen Standards ist ein be - D von Kraftfahrzeugen eben- kanntes Verfahren auf dem Auto - so wie ihre Antriebstechniken mobilmarkt. Verschleiß- und Fes - sind facettenreich wie nie zuvor. tigkeit smerkmale von rotierenden Die Automobilindustrie mit ihren Komponenten und Gussteilen im immer kürzeren Entwicklungszei - Motor oder anderen antriebszuge- ten hat derzeit Ideen und Vorha - hörigen Parts werden streng gete- ben in ihren F&E-Abteilungen stet, weil sie kritische Para meter (Forschung & Entwicklung), die sind. Falls ein Verfahren nicht diese zukünftigen Bedürfnisse ordnungsgemäß ausgeführt wird, erfüllen sollen. Zugleich ist diese sind zusätzliche Kosten die Folge Industrie einer der wettbewerbs- und im riskantesten Fall steht die intensivsten Märkte mit sehr Fahrgastsicherheit auf dem Spiel. hohen Qualitätsstandards. Die neuen HMV-G3-Härtetester Als ein weltweiter Zulieferer der von Shimadzu zielen auf For - Automobil-Logistikkette stellt schungs- und Produktionsverfah - Shimadzu das gesamte Spektrum ren. Neue Funktionen verbessern instrumenteller Analytik und die Datenzuverlässigkeit, berück- Verbesserung der automatischen Auslesefunktion Prüflösungen bereit für Chroma - sichtigen ISO-Vorgaben bezüglich tographie, Spektroskopie, Massen - der Vickers-Härtetests als Stan - züge. Neben Metallen ist ein Datenmanagementfunktionen, spektrometrie, TOC und Materi - dard und lassen sich erweitern. Mikro-Härtetester auch bei der leichterer Handhabung und erwei- alprüfung. Dies umfasst Maschi - Bewertung von Feinkeramiken terten Funktionen entsprechend nen, Motoren und Stromquellen, Für mechanische Bauteile, und technischen Kunststoffen der Anwendungsgebiete. Karosserien und Innenräume, Metalle, Beschichtungen, hilfreich. Umweltschutz, Aufhängungs- und Keramiken und Kunststoffe Konform mit Kraftübertragungssysteme, Elek - Die Geräte der HMV-G3 Serie ISO-Standards tronik, Batterien und Brennstoff - Ein Mikro-Härtetester ist in der messen die Vickers-Härte mit sehr zellen. Diese Vielfalt der Prüf - metallographischen Strukturfor - geringen Prüfkräften. Ein gleich- Alle Modelle der Shimadzu-HMV- methoden entspricht den gelten- schung, bei der Qualitätskontrolle mäßiger rechteckiger pyramidaler G3 Serie sind nun standardmäßig den Standards, Normen, Vor - von Waren und zur Erstellung Diamant, als Eindringkörper normgerecht bei Messungen mit schriften und Konformitätsanfor - zertifizierter Produktdokumente bezeichnet, übt eine Kraft auf die niedrigen Prüfkrä ten gemäß den derungen. unverzichtbar. Die zuverlässige Probe aus. Die Härte der Probe ISO-Stan dards bei Vickers- Härteprüfung in eingeschränkten lässt sich über eine Messung der Härtetests. Schutzfunk tionen, die Tests von antriebszugehörigen mikroskopischen Bereichen ist entstandenen Vertiefung an der die Datenzuverlässig keit steigern, Teilen sind kritische Parameter notwendig für kleine mechanische Oberfläche berechnen. sind ebenso als Standard integriert Präzisionsteile, für Metallstruktu - wie Dokumen tationsfunktionen. Insbesondere eine Härteprüfung ren oder für bearbeitete Ober - In den letzten Jahren stieg die Optional lässt sich die Arbeits - von eisenhaltigen und nicht-eisen- flächenbeschichtungen und Über - Nachfrage nach verbesserten fläche mikrometergenau per Motor positionieren, und es wurde eine 5-Megapixel-Kamera, industrieweit die beste, in die Serie integriert. Das System lässt sich anwendungs- und nutzerspezifisch konfigurie- ren.

Im Vergleich: Farbiges und monochromes Bild

SHIMADZU NEWS 2/2020 17 APPLIKATION

stellt, die aufgrund der benötigten n MSn-Analytik nur durch den Ein - MS -Analyse nicht- satz eines LC-MS-IT-TOF-Sys - tems möglich wurden.

1. MSn-Analyse mit derivatisierter und Mtpp- 4-(4-Methoxyphenyl)- 2,6-diphenylpyryliumsalz- derivatisierter Peptide mit LC-MS-IT-TOF derivatisierter Peptide Tandemmassenspektrometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Zwei aktuelle Untersuchungen zur Anwendung von der Proteomikforschung. Trotz der rapiden Entwicklung dieser LC-MS-IT-TOF-Geräten Technik besteht noch immer das Problem unzureichender Emp - findlichkeit wegen der schlechten Inten. (x100.000) A) ESI-MS Ionisierung einiger Peptide, die in der biologischen Probe in geringer 1,00 339,139(1) 379,207(2) Konzentration vorhanden sind. 0,75 Der Einbau einer funktionellen 0,50 Gruppe erlaubt, dieses Problem 0,25 758,417 zu umgehen. Sie bringt eine stabi- 0,00 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z le positive Ladung innerhalb des Peptidmoleküls ein, steigert damit Inten. (x1.000.000) 2 212,138(1) B) ESI-MS die Ionisierungseffizienz und 1,0 Vorläufer-Ion: 379,205 [M+H]2+ 322,166(2) 546,275(1) ermöglicht einen empfindlichen 0,5 273,340(2) Kollisionsenergie: 70 % Nachweis mit der Elektrospray- 0,0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Massenspektrometrie (ESI-MS).

Inten. (x1.000.000) 2 C) ESI-MS Kürzlich haben Forscher diverse 420,259(1) Vorläufer-Ion: 758,417 [M+H]2+ 309,190(1) 5,0 Kollisionsenergie: 70 % effiziente Methoden zur Peptid- 338,154(1) Derivatisierung durch eine quartä- 0,0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z re Ammoniumsalz(QAS)-Syn -

Inten. (x1.000.000) these entwickelt [2]. Die höchste 1,0 D) ESI-MS3 209,127 Intensitätssteigerung (etwa 1.000- 379,205 –> 546,276 –> Fragmente 0,5 Kollisionsenergie: 70 % fach) wurde bei Pyrylium-Ionisie - 338,152 rungsreagenzien beobachtet, die 0,0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z leicht mit der primären Amino - gruppe in der Lysinseitenkette reagieren, um Pyridiniumsalze mit stabiler positiver Ladung zu bil- Abbildung 1: ESI-MS-Spektrum des rohen Synthetik-Peptids Lys(Mdpp)-Pro-Pro-Pro (Tafel A), ESI-MS2-Fragmentierungs-Spektrum den [3]. Die mit Pyrylium- 2+ 1+ 3 2+ → + → von [M+H] (Tafel B) und das Fragmentierungs-Spektrum von [M] (Tafel C) und die ESI-MS -Analyse von [M+H] b2 Reagenzien derivatisierten Peptide (Tafel D). (Mdpp – 4-(4-Methoxyphenyl)-2,6-diphenylpyryliumsalz). lassen sich sogar auf attomolarem Niveau (10-18) nachweisen. Eine neue Art von isobarer Peptid- in LC-MS-IT-TOF koppelt Ein IT-TOF-Gerät bietet hohe Polen, untersucht Peptide und Markierung wurde ebenfalls vor- die Techniken der Ionenfalle Auflösung und Genauigkeit für Proteine hauptsächlich mit Hilfe geschlagen [4], die auf dem Aus - E (QIT) und der Flugzeitana - alle MS- und MSn-Modi ebenso der Massenspektrometrie. Profes - tausch der 16O/18O-Paarung und lyse (TOF – Time-of-Flight). Die wie Massenstabilität und ausge- sor Zbigniew Szewczuk und sein der Derivatisierung von Isotopo - QIT-Ionenfalle bietet leistungs- zeichnete Auflösung für LC-MS- Team erforschen die Struktur na - logen der Pyridiniumsalze beruht. starke MSn-Fähigkeiten. Nach Analysen. Solche Eigenschaften türlicher und synthetischer Pepti - Auswahl des geeigneten Vorläufer- machen ein LC-MS-IT-TOF zum de, Peptidkonjugate und -addukte, Allerdings ist es notwendig, nach Ions lassen sich mehrere MSn- bevorzugten Instrument für mo - indem sie nach posttranslationalen neuen Ionisationsmarkern zu Experimente im Verlauf einer ein- derne wissenschaftliche Unter - Modifikationen und Biomarkern suchen, die einen vergleichbaren zigen Probenaufgabe durchführen. suchungen zur Verunreinigungs - suchen. Auf Grund der geringen Grad an Ionisierungssteigerung Es werden Produkt-Ionen erhal- analyse, für die Erstellung meta- Konzentra tion einiger Peptide in zeigen und verbesserte Eigenschaf- ten, die als Vorläufer-Ionen für die bolischer Profile und zur Biomar - biologischen Proben besteht in ten besitzen (höhere Löslichkeit, nächste Fragmentierungsstufe die- ker-Forschung [1]. der Emp findlichkeitssteigerung Empfindlichkeit und Analyseprä - nen. MSn-Spektren mit einer ho - der MS-Analyse eines der wichtig- zision). Forscher entwickelten hen Massengenauigkeit liefern Die Forschungsprojekte der sten For schungsziele der Arbeits - kürzlich ein neues Ionisierungs - eine verbesserte Zuverlässigkeit Arbeitsgruppe für Chemie und grup pe. reagenz (4-[4-Metho xyphenyl]- der Signalzuordnung und eine Stereochemie von Peptiden und 2,6-diphenylpyryliumsalz, Mdppl), Strukturanalyse durch den Frag - Proteinen der Chemischen Fakul - Zwei Beispiele für aktuelle Unter - um die Anwend barkeit in der mentierungsablauf. tät der Universität Wroclaw, suchungen werden hier vorge- Proteomikforschung zu verbes-

18 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

m/z 209 und 338, entweder als der hohen Empfindlichkeit und (x10.000.000) [M+H]2+ oder [M]+ (Abbildung der eindeutigen Produktidentifi - 3 3,0 1B, 1C). Die MS -Technik führt kation mit ausgezeichneten Nach - daher zu eindeutigen Fragmenten, weisgrenzen sowie der Möglich - was bedeutet, dass sie sich einset- keit zur Anwendung bei isoto- 2,0 zen lässt für eine empfindliche pisch modifizierten Referenz - und eindeutige Analyse von materialien. Anzeige-Ionen bei proteomischen 1,0 Untersuchungen von mit Mtppl Die Lipophilizität chemischer derivatisierten Verbindun gen wie Verbindungen, ausgedrückt als → → 0,0 beispielsweise: 379 546 338 Logarithmus des Oktanol-Wasser- 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 und 379 → 546 → 209. Dies eröff- Verteilungskoeffizienten (logP), net vollständig neue Möglich - ist ein sehr wichtiger Parameter in (x10.000.000) n 2,0 keiten für den Einsatz einer MS - der medizinischen Chemie. Übli - Analyse bei der quantitativen und cherweise wird logP mit der tradi- qualitativen Proteomik. tionellen Flaschen-Schüttelmetho - 1,5 de (shake-flask method = SFM) Zusammenfassend bleibt festzu- ermittelt, die sehr zeitaufwendig 1,0 halten, dass sich die MSn-Technik ist, beträchtliche Materialmengen erfolgreich für eine empfindliche benötigt und im Falle von stark 0,5 Peptidsequenzierung mit hohen hydrophoben Verbindungen nur Kollisionsenergien einsetzen lässt. begrenzt einsetzbar ist. Zahlreiche 0,0 Diese schnelle Bestäti gung der chromatographische Methoden 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Struktur derivatisierter Peptide ist wie RP-TLC und RP-HPLC extrem zuverlässig. Eine MSn- ergänzen oder ersetzen eine SFM. Abbildung 2: LC-MS-Chromatogramme der Peptid-Teilbibliotheken. Extrahierte Analyse ermöglicht die eindeutige Sie bieten verschiedene praktische Ionenchromatogramme (XIC) für +2 Ionen abbildende Bibliothekskomponenten. Identifikation von Peptidfragmen - Vorzüge, darunter Reproduzier - ten, die sich aus MS2-Experimen - barkeit, Unempfindlichkeit gegen- ten ergeben. Die Genauigkeit des über Verunreinigungen und sern (unveröffentlichte Daten). ches Proton enthält. Resultierende IT-TOF-Instru ments erlaubt die Abbauprodukten, einen größeren Spezifische MSn-Übergänge wer- einfach geladene Fragmente ent- Summenformel von Fragmenten Dynamikbereich sowie eine ver- den für die eindeutige Analyse halten kein mobiles Proton und zu bestimmen, was es möglich minderte Probenbehandlung und bestimmter, mit Mdppl derivati- können einer Fragmentierung macht, Struktur formeln anhand einen geringeren Probenumfang sierter Peptide eingesetzt. gemäß ladungsfernem Fragmentie - der erhaltenen Ionen vorzuschla- [6]. Einer der Hauptvorzüge der rungsmechanismus unterliegen. gen. Weiterhin bieten sie zudem HPLC bei der Lipophilizitäts - Das 4-(4-Methoxyphenyl)-2,6- Eine Kombination dieser zwei auf- auch neue und schnelle Methoden bestimmung besteht diphenylpyryliumsalz wurde mit einander folgenden Fragmentie- zum Nachweis von Biomarker - der Seitenkettenaminogruppe rungsreaktionen, die nach verschie- spuren in den getesteten Proben. n eines Modell-Peptids verknüpft denen Mechanismen ablaufen, kön- MS -Experimente kombinieren IMPRESSUM (Lys-Pro-Pro-Pro). Abbildung 1 nen nur mit Hilfe von mit Ionen- zwei Fragmentierungsmechanis - zeigt die ESI-MS- und ESI-MSn- fallen (IT = ion trap) ausgestatte- men: ladungsfern und ladungsge- Shimadzu NEWS, Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH, Duisburg Analyse von Lys(Mtpp)-Pro-Pro- ten Geräten durchgeführt werden. richtet. Pro. Herausgeber Eine präzise Analyse der sich erge- 2. Innere Fragmente, die im Shimadzu Europa GmbH Bei MS2-Experimenten wurde eine benden Fragmente benötigt hoch- MSn-Verlauf zur Analyse von Albert-Hahn-Str. 6 -10 · D-47269 Duisburg Telefon: +49 (0)203 76 87-0 Reihe von b- und y-Ionen erhal- auflösende Spektren, die sich nur Peptid-Isomeren gebildet Telefax: +49 (0)203 76 66 25 ten. Aufgrund des Anstiegs der mit IT-TOF-Geräten garantieren werden [email protected] Kollisionsenergie vergrößerte sich lassen. Die Forscher stellten fest, www.shimadzu.eu die Stärke des Signals m/z 338, dass eine Fragmentierung von ein- Die Bedeutung der massenspek- Redaktion obwohl sie weiterhin recht gering fach geladenen Ionen Informatio - trometrischen Analyse bei der Uta Steeger 3 war. Nach dem MS -Experiment nen über die Ionisierungsstelle Peptidforschung ist auf diversen Telefon: +49 (0)203 76 87-410 entsprach der Peak bei m/z 209 gibt, wohingegen das gleiche Ebenen offensichtlich – von der Ralf Weber, Maximilian Schulze dem inneren Fragment der Peptid - Experiment für ein zweifach gela- Charakterisierung natürlicher Gestaltung und Produktion sequenz. Das Signal ist für Pyridi - denes Ion mehr Information über oder synthetischer Produkte, über m/e brand communication GmbH GWA niumsalz charakteristisch, er - die Peptidsequenz liefert. In Kom - die Sequenzanalytik, bis hin zu Düsseldorf scheint aber hauptsächlich beim bination liefern diese Experimente Stabilitätsstudien und Quantifi - Auflage ladungsfernen Fragmentierungs - zuverlässigere und umfangreichere zierung. Es gibt auch ein steigen- Deutsch: 5.020 · Englisch: 3.270 mechanismus [5]. Strukturinformationen. Das Ionen - des Interesse an massenspektro- © fragment m/z 338 lässt sich beim metrischen Anwendungen für Copyright Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Um diese Aussage eindeutig zu MRM oder Vorläufer-Ionenscan physikochemische Untersuchun - Juni 2020. Nachdruck, auch auszugs- 3 bestätigen, wurde ein MS -Expe - einsetzen, um all die Peptide zu gen. Dazu gehören Ladungsvari - weise, nur mit Genehmigung der Redaktion riment durchgeführt, bei dem für untersuchen, die 4-(4-Methoxy - anten, molekulare Interaktionen gestattet. die erste Fragmentierungsreaktion phenyl)-2,6-diphenylpyrylium- und Stabilitätsstudien von zusam- Windows ist Warenzeichen der Microsoft ein [M+H]2+ ausgewählt wurde, Gruppen enthalten. mengesetzten Molekülen. Corporation. ©2020 Apple Inc. Alle Rechte das ein einziges mobiles, für einen vorbehalten. Apple, das Apple Logo, Mac 3 ladungsgerichteten Fragmentie - Als ein MS -Ergebnis erscheinen Die wesentlichen Vorteile der und Mac OS sind Warenzeichen von Apple. 2+ + rungsmechanismus verantwortli- [M+H] → b2 → Fragmente bei Massenspektrometrie bestehen in

SHIMADZU NEWS 2/2020 19 APPLIKATION

Inten. (x100.000) Inten. (x100.000) 3,0 624,297 3,0 624,300 201,122 201,122 2,0 2,0 310,173 1,0 285,151 369,229 1,0 461,237 397,627 515,254 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Inten. (x100.000) Inten. (x100.000)

2,0 201,121 3,0 201,121 562,280 1,5 280,145 558,281 2,0 1,0 372,691 559,291 244,163 558,279 218,148 1,0 372,696 0,5 362,143 458,653 801,967 440,139 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Inten. (x100.000) Inten. (x100.000) 558,289 5,0 279,643 3,0 201,121 201,121 558,287 2,0 244,164 2,5 515,246 1,0 315,125 370,157 370,150 455,723 628,215 458,186 669,565 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Inten. (x100.000) Inten. (x100.000)

201,121 575,277 2,0 575,276 201,122 2,5 1,0 297,150 377,648 377,644 471,702 261,158 515,253 766,998 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Inten. (x100.000) Inten. (x100.000) 532,272 4,0 532,273 201,122 3,0 201,121 2,5 2,0 307,273 439,666 439,673 1,0 262,213 357,689 435,692 307,283 436,181 569,276 887,873 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Inten. (x100.000) Inten. (x10.000)

518,255 7,5 315,125 518,257 2,5 201,122 5,0 296,329 2,5 429,205 218,148 342,186 426,144 248,148 708,310 0,0 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Abbildung 3: MS2-Analyse der Peptid-Teilbibliotheken, [M+2H]2+-Ionen wurden als Vorläufer ausgewählt

in der Fähig keit, unmittelbar die Forscher auf ein Problem, das Die zwei resultierenden Teilbibli - kalibrierung. Vorläufer-Ionen von Eigenschaf ten einer Reihe von einen fortschrittlicheren Ansatz otheken (modifiziert an Position 3 überlappenden chromatographi- Verbindungen durch Analyse von zur Unterschei dung von Peptid - bzw. 6) wurden mit einem LC-MS schen Peaks wurden erfolgreich Mischungen zu vergleichen. isomeren erfordert. analysiert. Die Peptide in jeder ausgelesen und aufgrund der Teilmenge unterscheiden sich im hohen Auflösung und Genauigkeit Wegen der Blut-Hirn-Schranken- Um den Effekt einer Sequenz - Molekular gewicht, und die MS- der IT-TOF-Anordnung fragmen- Problematiken wird Lipophilizität modifikation auf das chromato- Analyse reichte aus, die Signale tiert. Praktisch in allen Fällen intensiv bei der Konzeptionierung graphische Verhalten von Pepti - zuzuordnen. Über extrahierte erzeugte die Fragmentierung b2- und Entwicklung von Neuro - den und nachfolgend ihre Lipo - Chromato gramme (XIC) darge- und y5-Ionen, die bei den Peptid- pharmaka untersucht. Diverse philizität zu untersuchen, wurde stellte Elu tionsprofile sind in Isomeren paarweise identisch sind Forschungsgruppen studieren die eine Peptidbibliothek konzipiert Abbildung 2 gezeigt. Retentions - und nicht verwendet werden kön- antinozizeptive Aktivität von und aufgebaut, die auf dem zeit-Unter schiede zwischen nen, um Peaks im Chromato - Peptiden [7, 8], und es besteht ein Podocin-Fragment 290 - 296 mit Peptidisomeren sind minimal, und gramm einer Bibliotheksmischung erhebliches Interesse an der der Sequenz Ser-Ile-Ala-Gln-Asp- der Positions effekt der modifizier- zuzuordnen. Einige beobachtete Anwendung von RP-HPLC zum Ala-Lys basiert. Alanin-Reste ten Rück stände auf die Reten - Unterschiede wurden als +2 Vergleich der Lipophilizität der wurden als variable Stellen ausge- tionszeit konnte erst untersucht Fragment-Ionen (Thr- und Pro- vorgeschlagenen Analoga. wählt und ersetzt durch Tyrosin, werden, nachdem eine Methode Peptide) identifiziert oder waren Threonin, Prolin, Glycin und zur Unterscheidung von Peptid- ziemlich schwach (Gly-Analog). Ein LC-MS-Verfahren erscheint Asparagin, um ein breites Spek - Isomeren für eine Reihenanalyse ideal für diese Anwendung, da zu - trum an Änderungen zur Verfü - erarbeitet werden konnte. Die Analyse wurde mit einem sätzliche nützliche Hinweise über gung zu stellen. IT-TOF-Gerät von Shimadzu den Ladungszustand der unter- Die Forscher benutzten die Teil - durchgeführt, und es wurde ent- suchten Peptide erhalten werden. Teilbibliothek 1: bibliotheken zur MS2-Analyse, schieden, das MSn-Merkmal zu 2 +2 Ein komplexerer Tandem-MS - Ser-Ile-Xxx-Gln-Asp-Ala-Lys indem sie [M+2H] -Peptid-Ionen nutzen sowie y5-Ionen der weite- Ansatz wird im Falle von isome- als Vorläufer (Abbildung 3) ein- ren Fragmentierung (MS3) zu ren Peptiden benötigt, um die Teilbibliothek 2: setzten. Die hohe Massenstabilität unterwerfen. Die Tyr-Analoga Peak-Reihenfolge den richtigen Ser-Ile-Ala-Gln-Asp-Xxx-Lys von TOF erlaubte die Durchfüh - wurden für Voruntersuchungen Probenkomponen ten zuzuordnen. wobei Xxx für Gly, Tyr, Thr, Pro, rung einer langen Reihe von LC- ausgewählt, und die in Abbildung Im aktuellen Projekt stießen die Asn oder Ala steht MS-Experimenten ohne Nach - 4 gezeigten Ergebnisse offenbaren

20 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

interessante Unterschiede in den Inten. (x100.000) MS3-Fragmentierungsmustern. 624,298 2,0 201,122 Der charakteristische MS3-Über - gang wird in weiteren Lipophili - 1,0 285,151 369,229 zitätsstudien der Podocin-Peptid - 323,087 402,682 461,228 507,243 607,267 0,0 fragmentbibliotheken genutzt 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z werden. 2,5 Inten. (x10.000) 333,166 Basierend auf individuellen Eigen - 2,0 schaften der untersuchten Peptid - 292,124 1,5 sequenz konnten normale MS2- 1,0 275,100 407,154 Experimente nicht bestätigen, 218,142 478,195 589,256 welcher Ala-Rest in einem vorlie- 0,5 425,203 genden Peptid ersetzt wurde. Die 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Peptid-Isomere konnten nur iden- Inten. (x10.000) tifiziert werden, nachdem ein tie- 7,5 310,173 ferer Einblick in die Fragmen - tierung mit Hilfe der MS3-Funk - 5,0 tion der IT-TOF-Anordnung erhalten wurde. 2,5 450,197 226,077 346,224 407,184 478,205 589,256 Fazit 0,0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Wissenschaftliche Herausforde - rungen konnten schnell, erfolg- reich und effizient gelöst werden Abbildung 4: MSn-Analyse von Tyr-enthaltenen Bibliothekselementen. MS2-Ergebnisse waren nicht ausreichend, charakteristische dank der MSn-Fähigkeit und der Ionen zu erzeugen, wohingegen MS3-Experimente verwendet werden konnten, Isomere eindeutig zu identifizieren. hohen Massengenauigkeit des LC-MS-IT-TOF-Instruments von Shimadzu. methanesulfonsäure (TFMSA) als Schritten genutzt. Für die LC- Autoren Gegen-Ion. MS-Experimente wurden Rohpro - Dr. Dorota Gaszczyk, Prof. Zbigniew Methoden: dukte eingesetzt. Szewczuk, Dr. Alicja Kluczyk Derivatisierungsverfahren: Eine Faculty of Chemistry, University of Wroclaw Pyryliumsalz-Synthese: Die Syn - Modellpeptidprobe wurde in MS- und MSn-Experimente: 50-383 Wroclaw – Polen these von Pyryliumsalzen umfasst Dimethylformamid (DMF) gelöst MS und MSn wurden mit einem zwei Schritte. Der erste besteht in und ein geeignetes Pyryliumsalz IT-TOF-Massenspektrometer von Literatur der Synthese eines spezifischen und Trimethylamin (TEA) im Shimadzu vorgenommen. Für [[1] www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/ Chalkon, das auf einer Konden - Überschuss hinzugefügt. Die Experimente im Vorläufer-Ionen - ittof.html, accessed 14.01.2020 sationsreaktion mit verschiedenen, Mischung wurde bei 60 °C für modus wurde ein dem Pyrylium - [2] M. Cydzik, M. Rudowska, P. Stefanowicz, kommerziell verfügbaren Alde - drei Stunden inkubiert. Nach die- salz entsprechendes Fragment-Ion Z. Szewczuk, J. Pept. Sci. 17 (2011), hyden und Ketonen beruht. Die ser Zeit wurde das Lösungsmittel ausgewählt. 445-453 Reaktion wird in alkalischer unter Stickstoff verdampft und [3] M. Waliczek, M. Kijewska, M. Rudowska, Umgebung durchgeführt – in der Rückstand lyophilisiert. LC-MS-Bedingungen: Eine B. Setner, P. Stefanowicz, Z. Szewczuk, Gegenwart von 10 % NaOH in UHPLC Nexera, ausgestattet mit Sci. Rep., 6 (2016), 1-12 Ethanol. Im zweiten Schritt wird Die Peptid-Bibliothekssynthese einer Aeris Peptide XB-C18-Säule [4] M. Waliczek, R. Bachor, M. Kijewska, eine Zyklisierungsreaktion mit wurde mit massiver Unterstüt - (50 x 2,1 mm, 3,6 μm) wurde ein- D. Gaszczyk, K. Panek-Laszczynska, dem erhaltenen Chalkon und zung unter Einsatz von Fmoc- gesetzt unter Verwendung einer A. Konieczny, K. Dabrowska, einem geeigneten Keton ange- Chemie umgesetzt, und äquimola- Gradientenauftrennung von 5 bis W. Witkiewicz, K. Marek-Bukowiec, schlossen. Die Reaktion benötigt re Mischungen von Peptid-Deri - 60 % B in 15 min, A: 0,1 % J. Tracz, M. Luczak, Z. Szewczuk, das Vorhandensein von Trifluor - vaten wurden bei verschiedenen HCOOH in Wasser, B: 0,1 % P. Stefanowicz, Anal. Chimica Acta, 1048 HCOOH in Acetonitril, Flussrate (2019), 96-104 0,2 ml/min. Das IT-TOF-Gerät [5] M. Rudowska, D. Wojewska, A. Kluczyk, wurde im positiven Ionen-Modus R. Bachor, P. Stefanowicz, Z. Szewczuk, betrieben, und der 150 - 1.000 m/z- J. Am. Soc. Mass Spectrom., 23 (2012), Bereich wurde analysiert. 1024-1028. [6] C. Liang, J. Qiao, H. Lian, J. Chrom. Danksagungen A, 1528 (2017) 25-34 Die Forschung wurde teilweise unterstützt [7] H. Liu, B. Zhang, X. Liu, Ch. Wang, J. Nib, durch die Forschungsförderung R. Wanga, Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) Nr. UMO-2016/23/B/ST4/01036 vom Natio- 1694-1702 nalen Wissenschaftszentrum in Polen. Die [8] K. Wtorek, R. Artali, J. Piekielna- Autoren danken O. Uysal und P.U. Godiga- Ciesielska, J. Koszuk, A. Kluczyk, muwa Acharige für die Bibliothek-Synthese. L. Gentilucci, A. Janecka, Eur. J. Med. Ein Dank geht auch an Andrzej Reszka Chem. 179 (2019) 527-536 (Shim-Pol, Polen) für den Zugang zum Die Autoren des Artikels (von links): Dr. Dorota Gaszczyk, Prof. Zbigniew Szewczuk IT-TOF-Instrument von Shimadzu. und Dr. Alicja Kluczyk

SHIMADZU NEWS 2/2020 21 PRODUKTE

eignet sich somit für MS-Detek - toren. Da die Adsorption von Kopfschmerz ade Peptiden an Partikel minimiert ist, sichert die Shim-pack Arata Pep - tide C18-Säule eine hohe Rückge - Eine Anleitung zur Auswahl der idealen C18-Säule winnung von Peptiden und liefert eine exzellente Peptidanalyse.

unterschiedli- Shim-pack G-Serie: chen Partikel - geeignet für allgemeine wie größen (1,9 μm, spezielle Anwendungen 3 μm, 5 μm) und Säulendimen - Die Shim-pack G-Serie besteht sionen sind sie aus GIST, GISS und GIS, die komplett an nicht nur für konventionelle Ana - UHPLC, HPLC lysen entwickelt wurde, sondern und präparative auch für Hochgeschwindigkeits- LC anpassbar und präparative Methoden – und ermöglichen wegen der unterschiedlichen Par - einen nahtlosen tikelgrößen. Zur Shim-pack GIST- Methodentrans - Serie gehören Standardsäulen für fer zwischen allgemeine Anwendungen, wäh- unterschiedli- rend Shim-pack GIS-Säulen spe- chen HPLC- ziell für die präparative Chroma - Instrumenten. tographie und Shim-pack GISS für MS-Analysen ausgelegt sind. Die Shim-pack Scepter HD-C18 Shim-pack GIST-Serie: Kopfschmerzen bei der Säulenauswahl? mit ihrer hohen höchste Inertheit und lange Kohlenstoffbela - Lebensdauer ie Multitalente der Flüssig - sung einer komplexen Trennung dung und daher hohen Hydro - chromatographie: C18- zu verbessern – Shim-pack Velox- phobizität ist ideal für die Analyse Säulen der Shim-pack GIST-Serie D Säulen werden vielfältig in Säulen erfüllen die Bedürfnisse von Isomeren. Dies ist vor allem sind mit neu entwickelten, hoch- der pharmazeutischen, klinischen, jedes Anwenders. für pharmazeutische Anwendun - reinen, offenporigen Silica-Kügel - Nahrungsmittel- und Umwelt- gen nützlich, bei denen medizini- chen gepackt. Die überragende Industrie für Applikationen in der Aufgrund ihrer Robustheit erzie- sche Verbindungen von Verunrei - chemische Inertheit verbessert Umkehrphasen(RP-)chromatogra- len die Säulen ausgezeichnete ni gungen ähnlicher Struktur ge - nicht nur die analytische Präzi - phie eingesetzt. Bei marktweit Langlebigkeit, sogar für die her- trennt werden müssen. sion, sondern verlängert auch die Tausenden von Alternativen kann ausforderndsten Probenmatrizes. Lebensdauer der Säule. Sogar bei es schwierig sein, die richtige C18- Shim-pack Arata LC-Säulen: starken Ionenverbindungen sorgt Säule zu wählen. Wie findet man Die Shim-pack Velox SP-C18- beispiellose Auflösungen und sie für symmetrische Peaks. Uner - angesichts ihrer Vielseitigkeit die Serie (Sterically Protected = ste- Peakverläufe bei basischen wünschte Adsorption und Peak - am besten geeignete Säule? risch geschützt) wurde speziell für Verbindungen verbreiterung werden auf ein Shimadzu bietet daher für sein Anwendungen bei niedrigen pH- Minimum reduziert. Die Säule ist Portfolio an C18-Säulen eine An - Bedingungen konzipiert; sie bietet LC-Säulen, mit dem Anspruch für imstande, einen breiten pH- leitung, die den Auswahlprozess ein ausgewogenes Retentionsprofil basische Verbindungen konzipiert Bereich (1- 10) abzudecken, und vereinfacht (Abbildung 1). Dadurch mit langen Lebensspannen sogar zu sein, scheitern oft daran eine ist damit für viele Anwendungen gibt es keine Kopfschmerz gefahr unter schwierigen sauren Bedin - angemessene Auflösung bestimm- geeignet. mehr durch die Informationsflut. gungen, die für eine LC-MS(/MS)- ter Verbindungen zu erreichen. Analyse notwendig sind. Diese Problematik wurde mit den Darüber hinaus ist die Shim-pack Shim-pack Velox: maximiert Shim-pack Arata-Säulen erfolg- GIST-Serie in verschiedenen Par - die Trennleistung durch die Shim-pack Scepter: ausge- reich überwunden. Sie beseitigen tikelgrößen verfügbar, was es CoreShell-Technologie zeichnete Stabilität und Leis- Schwierigkeiten, wie die Gegen - erleichtert, ihre Hochgeschwin - tung unter verschiedensten überstellung von hochpolaren digkeitsanalyse auf konventionelle Entwickelt um die Leistung von Bedingungen basischen Verbindungen, die Ver - Methoden zu übertragen. LC-Systemen zu erhöhen, ermög- schlechterung des Peakverlaufs lichen die Shim-pack Velox-Säulen Diese neue Generation organi- von sauren Verbindungen oder die Verglichen mit herkömmlichen mit der CoreShell-Technologie scher, hybrid-basierter Silica-Säu - langen Äquilibrierungszeiten, die C18-Säulen realisiert eine Shim- von Shimadzu, auf jedem LC Ins - len erreichen eine ausgezeichnete bei der geringen Ionenstärke in pack GIST C18-AQ eine starke trument eine erhöhte Trennleis - Stabilität und Leistung über einen der sauren mobilen Phase benötigt Retention von hydrophilen, hoch- tung und schnellere Analysen zu breiten pH-Bereich. Mit unter- werden. polaren Verbindungen, während erreichen. Ob es darum geht, eine schiedlichen chemischen Eigen - sie eine hohe Inertheit und Lang - hocheffiziente LC-Trenntechnik schaften erweisen sich Shim-pack Die Shim-pack Arata Peptide C18- lebigkeit in hoch- oder 100 %- zu entwerfen, eine vorhandene Scepter-Säulen als effektiv bei der Säule liefert eine ausgezeichnete wässrigen mobilen Phasen beibe- Methode zu übertragen, die den Methodenentwicklung und sind Trennleistung von Peptiden, sogar hält. Darüber hinaus vermindert Durchsatz steigert und die Auf - für vielfältige Anwendungen bei schwacher Ionenpaarung in sie die Absorption basischer und lösung beibehält oder die Auflö - geeignet. Bedingt durch ihre der sauren mobilen Phase, und saurer Verbindungen und erzielt

22 SHIMADZU NEWS 2/2020 PRODUKTE

überragende Peakformen bei der Shim-pack GIS-Serie: Hohe Octadecylgruppe versehen, die durch andere Methoden umge- Analyse von Metallkomplexen. Remanenz, geringerer Säulen- eine hohe sterische Selektivität für setzt werden können, wie hydro- Rückdruck, hohe chemische die Trennung von planaren und phobe Wechselwirkungen oder Shim-pack GISS-Serie: Hoch - Inertheit nicht-planaren Verbindungen bie- π-π-Wechselwirkungen. geschwindigkeitsanalyse mit tet, wie Vitamin D2/D3 oder höchster chemischer Inertheit Diese Säulen sind mit hochreinem PAKs. Shim-pack MC: eine perfekte und langer Lebensdauer Silikagel gepackt und eignen sich Säule für die Mikro-LC ideal als allgemeine HPLC-Säulen. Eine Shim-pack GIS RP-Shield Die Shim-pack GISS-Serie verfügt Äußerst einheitliche Partikel sor- enthält zwischen der Silica-Ober - Shim-pack MC-Säulen sind kom- über die gleiche höchste chemi- gen für eine stabile mobile Phase fläche und einer Octadecylgruppe patibel mit Flussratenbereichen sche Inertheit und den größeren und einen bemerkenswert niedri- eingebettete polare funktionelle der mobilen Phase, von einem bis pH-Bereich wie die Shim-pack gen Druck. Shim-pack GIS-Säulen Gruppen, was sie stabil für eine zu Dutzenden von Mikrolitern GIST-Serie, sorgt aber für rasche helfen nicht nur Lösungsmittel - 100%-wässrig-mobile Phase ohne pro Minute, was sie zu idealen Trennungen mit symmetrischen kosten zu reduzieren, sondern Phasenkollaps macht. Die einge- Säulen für die Mikro-LC macht. Peaks. Die Optimierung von mindern auch die Systembelas - bettete polare funktionelle Gruppe Oberfläche, Porengröße und che- tung. Die einheitliche Silica-Ober - ist auch extrem basen-deaktiviert, Weitere Informationen zum C18-Säulensorti - mischer Bindung liefert überra- fläche und stabile chemische was es der Säule ermöglicht, ment unter: www.shimadzu.eu/hplc-columns gende Peakformen. Deshalb eig- Modifikationen sichern zudem außerordentliche Peakformen für nen sich diese Säulen ideal für eine hohe Analysereproduzierbar - Säuren zu liefern. Sie sorgt zudem LC-MS(/MS)-Analysen. Zur keit. für eine einzigartige Selektivität Shim-pack GISS-Serie gehören aufgrund der Wasserstoffbrücken - auch eine 1,9 μm und eine 3 μm Eine Shim-pack GIS C18-P ist mit bindungen, sodass sie für Tren - HP-Serie für UHPLC-Analysen. einer an das Polymer gebundenen nungen geeignet ist, die nicht

START: Verschiedene Scepter C18 Ī Micro LC MC C18 Welches Gerät Geräte Ī (allgemeine Einsatz- (z.B. Nexera Mikros) gebiete) verwenden Sie? auf/ab skalieren Scepter HD-C18 (isomere Verbindungen) Gerät

Applikation HPLC UHPLC-ähnlich UHPLC (z.B. Prominence) (z.B. Nexera XR) (z.B. Nexera X2/X3) Säulenempfehlung < 440 bar < 700 bar < 1.300 bar Ī Ī Ī

Scepter C18 Ja Möchten Sie Ja NeinSind ihre Analyte Ja Ī Ī Wünschen Sie eine präparative LC Ī Peptide oder größere Ī Arata Peptide C18 GIS C18-P ≥ 5 μm-Säulen? durchführen? Moleküle?

Nein Ī Ī Nein

Ja Haben Sie sowohl Ja Ī Sind ihre Analyte GIS C18-P saure als auch basische Ī Arata C18 PAHs? Analyte?

Nein Ī Ī Nein

GIS RP Shield Ja Sind ihre Analyte polare Nein Nein Ī Ī Hat Geschwindigkeit Ist ihr Detektor GIST C18-AQ Verbindungen Ī Vorrang? ein MS? Velox SP-C18 (z.B. organische Säuren?)

Nein Ī Ja Ī Ī Ja

Velox C18 (allgemeine

Scepter C18 Sind ihre Analyte

Einsatzgebiete) Nein Ja Ī polare Verbindungen GIST C18-AQ GIST C18 Ī Velox SP-C18 (höhere (z.B. organische Velox SP-C18 Velox C18 pH-Stabilität) Säuren)? GISS C18*

Abbildung 1: Anleitung zur Auswahl der richtigen Säule. *Die Velox-Serie, mit CoreShell-Technologie, ist erste Wahl für Hochgeschwindigkeitsanalysen. Die empfohlenen Säulen für eine MS sind fett dargestellt.

SHIMADZU NEWS 2/2020 23 PRODUKTE Validierte Methode für mono - klonale Antikörper-Medikamente Bewertung der nSMOL-Methodik bei der Bevacizumab-Bestimmung in menschlichem Serum

Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml)

100 300 3.000 7.500 Amount Gefundene Dev. Gefundene Dev. Gefundene Dev. Gefundene Dev. foundLauf Menge (%) Menge (%) Menge (%) Menge (%) (ng/mL)# (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) 97,1 -2,90 276 -8,00 2.540 -15,3 7.110 -5,20 91,2 -8,80 264 -12,0 2.910 -3,00 6.960 -7,20 88,1 -11,9 306 2,00 3.030 1,00 8.370 11,6 1 105 5,00 276 -8,00 2.910 -3,00 7.660 2,13 90,2 -9,80 238 -20,7 2.860 -4,67 7.850 4,67 79,1 -20,9 292 -2,67 3.110 3,67 8.030 7,07 a a 302 0,667 2.800 -6,67 6.970 -7,07 107 7,00 311 3,67 3.170 5,67 7.370 -1,73 2 132 32,0 271 -9,67 2.720 -9,33 6.990 -6,80 117 17,0 286 -4,67 2.720 -9,33 7.020 -6,40 111 11,0 297 -1,00 2.910 -3,00 6.580 -12,3 108 8,00 281 -6,33 2.740 -8,67 6.740 -10,1 118 18,0 289 -3,67 2.750 -8,33 7.610 1,47 3 104 4,00 292 -2,67 2.500 -16,7 7.780 3,73 86,4 -13,6 a a 3.070 2,33 4.560 b -39,2 b 98,5 -1,50 254 -15,3 2.840 -5,33 7.590 1,20 Mittelw. 102 282 2.850 7.380 sd 14,1 19,9 190 515 % CV 13,8 7,05 6,65 6,98 % Dev 2,17 -5,89 -5,04 -1,66

3D-Illustration von Antikörpern Tabelle 1: Ergebnisse der Qualitätskontrolle für Bevacizumab in menschlichem Serum. a = Keine nachgewiesene Antwort des Analyten. Probe wird verworfen. ntwicklung und Validierung eines speziellen Protein-A-Bin - b = Ausreißer per Dixon-Test; Wert fließt nicht in die statistische Berechnung ein. bioanalytischer Methoden für dungsharzes und Trypsin-immo- E Proteine können durch die bilisierter Nanopartikel für den dards für pharmazeutische Wirk - ne Standard allerdings untypische mangelnde Verfügbarkeit von Prüf - Proteinabbau. stoffkandidaten übereinstimmt Messergebnisse bei hohen Analyt- reagenzien erschwert werden. LC- [3, 4]. Bevacizumab ist ein Medi - Konzentrationen in eingefrorenen MS/MS-Analysen erlauben eine Überprüfung der Methode kament zur Behandlung zahlrei- QC-Proben. Herangehensweise, die allgemeine- mit einem Medikament zur cher Krebsvarianten. re Reagenzien nutzt. Bei solchen Krebsbehandlung Geeignet für eine rasche Analysen sind aber das Proben - Um den Nutzen der nSMOL- Methodenentwicklung? handling sowie die Aufarbeitung Wissenschaftler von Shimadzu Technik zu beurteilen, wurde die der Proben entscheidende kritische haben diese Technik getestet und LC-MS/MS-Analyse von Bevaci - Im nächsten Schritt wurde die Parameter für die nötige Selektivi - erfolgreich eine validierte Metho - zumab in menschlichem Serum Methode auf eine 96-well-Mikro - tät und Empfindlichkeit der Mes - de für diverse monoklonale Anti - über den Bereich einer Standard - titerplatten-Methode optimiert. sungen. körper-Medikamente entwickelt konzentration von 100 ng/ml bis Hierzu wurde ein stabil peptid- [1, 2]. Als Teil einer unabhängigen 10.000 ng/ml entwickelt. Zunächst markierter interner Standard ver- Die nSMOL-Techologie (nano- Methodenüberprüfung beurteilte wurde hierbei dem Standard- wendet. Die Optimierung sollte Surface and Molecular Orientation das kalifornische Auftragsfor - Probenbearbeitungsprotokoll den Probendurchsatz, die Selekti - Limited Proteolysis) liefert einen schungsunternehmen Intertek gefolgt, das den internen Standard vität und die Leistungsfähigkeit einzigartigen Ansatz, um monoklo- Pharmaceutical Services die Tech - des Kit-Systems verwendet. So der Methode verbessern. Wesent - nale Antikörper(IgGs)-Medika - nik und validierte eine LC-MS/ wurden bereits Ergebnisse mit liche Veränderungen an den ent- mente in biologischen Proben zu MS-Methode für Bevacizumab hinreichender Genauigkeit und scheidenden Protokollschritten quantifizieren. Sie ermöglicht die mithilfe eines Validierungsproto - Präzision erreicht. Für die intern des Shimadzu-Protokolls wurden selektive Proteolyse der FAB- kolls, das mit industriellen Stan - entwickelte Chromatographie- nicht vorgenommen. Hierbei soll- Region im Antikörper mithilfe dards und den Regulierungsstan - Methode ergab der analoge inter- te festgestellt werden, ob sich das

24 SHIMADZU NEWS 2/2020 PRODUKTE

nSMOL Kit-System eignet, um beitung und dem Trypsinabbau Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml) rasch Methoden ohne aufwendige unterschiedlich auswirken können Optimierung zu entwickeln. und zudem bei der massenspektro- 300 7.500 metrischen Analyse durch Ionen - Gefundene Dev. (%) Gefundene Dev. (%) Bei Verwendung von 10 μl Serum suppression- oder Verstärkungs - Charge # Menge Menge wurde die untere Grenze der effekte zu Abweichungen der (ng/ml) (ng/ml) Quantifizierung (LLOQ = lower Messergebnisse führen können. Charge 1 340 13,3 8.160 8,80 limit of quantification) mit einem Charge 2 393 31,0 8.680 15,7 soliden Signal-Rausch-Verhältnis Bei den Experimenten zum Matrix - Charge 3 351 17,0 8.620 14,9 (>20:1 S/N) beobachtet. Die Pro - effekt lagen mindestens zwei Drit - Charge 4 225 -25,0 5.540 -26,1 benaufarbeitung auf ein 96-well- tel der einzelnen Chargen inner- Charge 5 326 8,67 7.350 -2,00 Mikrotiterplatten-Format umzu- halb von 20 % der Nennkonzen - Charge 6 342 14,0 8.110 8,13 setzen, erforderte eine Methoden - tration und die mittlere Gesamt - Mittelwert 330 7.740 änderung bei der Aliquotgröße, konzentration lag ebenfalls inner- sd 56,0 1.180 aufgrund eines unbekannten Emp - halb 20 %, was darauf hinweist, % CV 17,0 15,2 findlichkeitsabfalls. Hierbei wur- dass keine wesentlichen Matrix - % Dev 9,83 3,24 den 10 μl als ein mehr als akzepta- effekte vorhanden waren (Tabelle A.V. 4/6 5/6 bles Probenvolumen angesehen. 2). Zusätzlich lagen sowohl die hämolytischen als auch die hyper- Tabelle 2: Matrixeffekte für Bevacizumab in einzelnen Anteilen menschlichen Serums. Die Leistungsfähigkeit der Analy se lipämischen QC-Chargen inner- A.V. = Akzeptanzverhältnis. bezüglich der Standardabwei chung halb der 20 %-Abweichung der im Verlauf der Validierung war Nennkonzentration (Abbildung 3). Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml) hinreichend und lag deutlich Da einige individuelle Chargen Probentyp 300 7.500 unterhalb des ± 20 % Akzeptanz - außerhalb der 20 % lagen, und da Konz. (ng/ml) Dev. (%) Konz. (ng/ml) Dev. (%) kriteriums (Tabelle 1). Interassay- es auch in den gemessenen Kon - Hyper- 373 24,3 8.670 15,6 Abweichungen wurden mit pro- zentrationen der hyperlipämischen lipämisches 342 14,0 8.550 14,0 zentualen Werten im Bereich von - Charge einen Ausreißer gab, könn- Serum 346 15,3 8.450 12,7 5,89 % bis -1,66 % (2,17 % beim ten weitere chromatographische Mittelwert 354 8.560 LLOQ) und Interassay-Präzi - Anpassungen oder Modifika tionen sd 16,9 110 sionswerten bei ≤ 7,05 % (13,8 % bei der Pro benaufarbeitung hilf- % CV 4,77 1,29 beim LLOQ) bestimmt. Die Sig - reich sein, um die Leistungsfähig - % Dev 17,9 14,1 nalintenstät von Blankproben lag keit der Metho de zusätzlich zu 301 0,333 7.810 4,13 in allen Fällen unterhalb von 20 % verbessern. Hämolisier- 252 -16,0 7.610 1,47 des LLOQ-Wertes, was eine hin- tes Serum 276 -8,00 7.420 -1,07 reichende Selektivität zeigt. Fazit Mittelwert 276 7.610

sd 24,5 195 Keine wesentlichen Insgesamt erzielte die nSMOL- % CV 8,87 2,56 Matrixeffekte Methode mit einer nur minimalen % Dev -7,89 1,51 Anpassung des Standardverfahrens Eine möglichst geringe Matrix - eine hinreichende Leistungsfähig - Tabelle 3: Matrixeffekte für Bevacizumab in hämolysierten und hyperlipämischen Anteilen belastung ist für jede LC-MS/MS- keit bei der Validierung der menschlichen Serums Analyse sehr wichtig. Bei dieser Bestimmung von Bevacizumab in Validierung wurden niedrig- und menschlichem Serum. Der Einsatz Referenzen hochkonzentrierte Qualitätskon - von nSMOL in verschiedenen [1.] Iwamoto N., Umino Y., Aoki C., [3.] Guidance for Industry: Bioanalytical trollproben (QC) aus sechs unter- Laboren, könnte eine individuelle Yamane N., Hamada A., Shimada T. Method Validation, U.S. Department of schiedlichen Serumchargen mensch- Anpassung rechtfertigen, und es Fully validated LC-MS bioanalysis of Health and Human Services, Food and lichen Serums angefertigt und zum wird wie bei jeder LC-MS-Analy - Bevacizumab in human plasma using Drug Administration, May 2018. Vergleich ebenso aus einem hyper- tik die Verwendung stabil markier- nano-surface and molecular-orientation [4.] Jenkins R., Duggan JX., Aubry AF., lipämischen und einem hämolyti- ter interner Standards ausdrücklich limited (nSMOL) proteolysis. Drug Metab Zeng J., Lee JW., Cojocaru L., Dufield D., schen Serum. Die Wahl der QC- empfohlen. Pharmacokinet. 31 (2016), 46-50. Garofolo F., Kaur S., Schultz GA., Xu K., Bewertungen unter Berücksichti - [2.] Iwamoto N., Takanashi M., Umino Y., Yang Z., Yu J., Zhang YJ., Vazvaei F. gung unterschiedlicher Matrices nSMOL ist eine Marke der Shimadzu Corp. Aoki C., Hamada A., Shimada T. Recommendations for validation of lag darin be gründet, einen strenge- Application of nano-surface and LC-MS/MS bioanalytical methods for ren Ansatz im Falle der nSMOL- Autoren molecular-orientation limited proteolysis protein biotherapeutics. AAPS J. 17 Bewertung zu testen, da die unter- Michael H. Buonarati, Ph.D., Senior Director to LC-MS bioanalysis of Cetuximab. (2015), 1-16. schiedlichen Matrices in den QC- Dale Schoener, Scientific Director Bioanalysis. 8 (2016), 1009-20. Proben sich bei der Probenaufar - Intertek Pharmaceutical Services

SHIMADZU NEWS 2/2020 25 APPLIKATION Wieviel Fluoreszenz zeigt ein Polymer für eine Qualitäts - kontrolle? Polymere und Fluoreszenz – Teil 2: Fluoreszenzspektroskopie von Basispolymeren aus der Industrie

Polymere ihre naturgemäße Fluo - reszenz zeigen.

Fluoreszenz kann dann entstehen, wenn das Molekül viel Energie aufnehmen kann. Betrachtet man die Moleküle von PC, GPPS und SAN oder dem PET, dann lassen sich in den Strukturen energierei- che Ringsysteme erkennen.

Fluoreszenz und Phosphoreszenz

Wenn ein Elektron im Grundlevel S0-Licht ausgesetzt wird, verän- dert sich die Energie des Elek - trons im Molekül. Dadurch wird es in den angeregten Zustand S1 Mikroplastik und Kunststoffe in der Umwelt sind weltweit eine der größten Herausforderungen: für die Menschheit, die mit höherem Energielevel ge - Tierwelt und die Umwelt. Am Beispiel von PET-Flaschen wurde gezeigt, dass deren Fluoreszenz-Intensität Rückschlüsse auf die bracht (Abbildung 2). Dieser Materialzusammensetzung gibt. Dieser Teil 2 der Artikelfolge erweitert den Fokus auf verschiedene Polymere, und Teil 3 in der nächsten angeregte Zustand ist nicht lang - NEWS untersucht die Partikelgröße und ihren Effekt auf die Fluoreszenz. zeitstabil und verändert sich schnell, in dem es dem Grund - ie im Teil 1 in der letzten Die hier aufgezählten industriellen zustand entgegenstrebt. Das ange - Ausgabe berichtet, lässt Polymervarianten werden als regte Elektron wird deaktiviert W sich Polyethylentereph - „Glas-Ersatz“ zum Beispiel in der unter Ausstrahlung der Energie thalat (PET) mit der Fluoreszenz- Industrie eingesetzt, weil sie durch Hitze oder Licht. Das Licht Spektroskopie gut untersuchen, Härte (Schlagfestigkeit) und dieses Wegs von Zustand S1 zu S0 wobei einfach ein Stück der PET- Robustheit mit sich bringen. Die wird Fluoreszenz genannt. Der Flaschenwand zur Fluoreszenz - Granulate zeigen teils eine zylin- zweite aufgeführte Weg der bestimmung genutzt wurde. drische Form oder leicht trübe Anregung von T1 nach S0 wird Fluorophore wurden dabei sicht- Linsenform. Die untersuchten Phosphoreszenz genannt. Im T1- bar, die man vielleicht nicht in den Biopolymergranulate, wie Poly - Zustand befinden sich drei Elek - transparenten, farblosen oder lactide (PLA) und Polybutylen - tronen auf höherem Energieniveau leicht bläulichen klaren Polymer - succinat (PBS), waren transparent (angeregter Triplett-Zustand). stücken vermutet hätte. und farblos, mit leichter Trübung. S1 ist der Angeregte-Singulett- Die nicht-aromatischen Polymere Zustand (1 angeregtes Elektron Im nächsten Schritt werden Poly - wie Polypropylen (PPhomo), auf höherem Energielevel). mere untersucht, die nicht aus Polyethylen (PE) und Polyvinyl - dem Verbraucherbereich kommen, chlorid (PVCsoft) erschienen Polycarbonate enthalten mehrere sondern „frisch“ oder „rezykliert“ ebenfalls als farblose, trübe und phenylbasierende Molekülgrup - direkt aus der industriellen Her - weiche Granulate in Linsenform. pen, die sehr energiereich sind stellung. Dazu wurden glasklare durch die π-Elektronen der und farblose Polymere ausge- „Industrielle“ Polymere und wie- Abbildung 1: Ein typisches Polymergranulat Doppelbindung im Ring. In der wählt, wie Polycarbonat (PC), derverwertete Polymere sind in in glasklarer und farbloser zylindrischer Fluoreszenz lassen sich aus einem Polystyrol (GPPS), Styrolacryl - dieser Applikation alle farblos, Form auf einem Millimeterpapier. Das energiereichen Ringsystem mit nitril (SAN) und ein Rezyklat aus transparent oder trübe. Die orangefarbene Gitter im Hintergrund des harter Strahlung Elektronen in Polycarbonat (PCrec). Erwartung wäre, dass nun alle Granulats entspricht 1 mm pro Quadrat. höhere energetische Orbitale (S1)

26 SHIMADZU NEWS 2/2020 APPLIKATION

heben. Diese Energielage ist insta- Spuren fluoreszierender Beimen - bil und das Elektron verlässt die - gungen enthalten können. ses Orbital unter Aussenden von Photonen (Leuchten = Fluores - Rein chemisch besteht SAN aus zenz). Styrol und Acrylnitril. Als domi - nierende Molekülstruktur liegt Die Bedeutung der wieder der Phenylring in der Phenyl-Gruppe Styrol-Komponente vor.

Die allgemeine Struktur der PC ist

SAN wobei R als Platzhalter für Hy - droxyphenole steht. Am bekan- ntesten ist die PC-Variante, die mit Bisphenol A unter Einsatz von Phosgen hergestellt wird, wobei Phenol als Abfallprodukt mono-PS anfällt. Da bei allen betrachteten Poly - meren die Phenyl-Gruppe eine Abbildung 2: Die imaginären Achsen wären hier wie folgt zu sehen: die X-Achse bedeutende Rolle in der Molekül - entspricht der Zeit und Wellenlängen, die Y-Achse steht für Energie. Die Anregung durch struktur spielt, könnte man davon Licht (Pfeil nach oben) zu der Zeit 00:00 bei vorgegebener Wellenlänge, führt nach kurzer ausgehen, dass die analytischen Zeit (Verweilzeit im S1 und Abgabe von erster Energie) zu einem Wellenlängenversatz zu Die Molekülstruktur zeigt 2- Fluoreszenzwellenlängenpaare in den langen Wellenlängen. Daher gilt: Fluoreszenz braucht eine Anregung/Lichtquelle und Ringsysteme (phenolisch) und gleichen Bereichen zu finden sind. erscheint kurz nach der Anregung mit höheren Wellenlängen. Eine weitere Schlussfolge- eine Carbonylgruppe mit der rung ist, dass harte Strahlung reduziert um Energie weicher wird oder sich von kurzwelli- üblichen -C=O Doppelbindung, Polylactide und Polybutylensucci - ger (harter) zu langwelliger (weicher) Strahlung verändert. die durch die Stellung in der nat sind Kettenmoleküle, die eine Estergruppe R-CO2- elektronisch Estergruppe enthalten, die mit dungen oder aromatische Elemen - aufgeweicht wird. Hier stehen energiereichen Elektronen aus- te für eine Fluoreszenz zur Verfü - genügend π-Elektronen für eine gerüstet sind, wie es in den Struk - gung stehen. Fluoreszenz zur Verfügung. In turen zu erkennen ist. dem in dieser Applikation ver- wendeten Polycarbonat, ist das PBS PE PCMonomer auf Basis von BPA (Bisphenol A) erstellt worden. PE, PP und PVC sind im Ver - Rezyklierte Proben des PC sollten gleich dazu Kettenmoleküle, bei im Sinne einer Qualitätskontrolle denen keine überschüssigen ener - zu identifizieren sein, da diese PLA giereichen π-Elektronenverbin - PP

PVC

Probenvorbereitung

Die Probengröße und Position in dem Bariumsulfat (BaSO4)-Bett im Feststoffhalter sind bei den Messungen zu berücksichtigen. Das Experiment mit den Granu - laten zeigte, dass die Spaltgeome - trie des Lichtspots eine wesent - liche Rolle spielt. Die Abbildung des Spalts (Rechteck) zielt genau auf das Zentrum des runden Halters. Der Innendurchmesser des BaSO4-Betts ist 2,5 cm. Je Abbildung 3: Fluoreszenzspektren von sechs unterschiedlichen Polymeren: oben von links nach rechts – GPPS, PC und PBS; nach gewähltem Spalt wird diese unten von links nach rechts – SAN, PCrec und PLA (Positionen der Spots in der EEM siehe Tabelle 1 [Seite 28]). runde Fläche entsprechend mehr oder weniger groß rechteckig

SHIMADZU NEWS 2/2020 27 APPLIKATION

Polymer Bereich [nm] Form [μm] stoffs (zum Bleichen) das Rezy - unterschiedlicher Anregungsposi - Industriell Hotspot (EM/EX) Pellet klat farblos und transparent tionen in dem kompakten PLA- PC 350/310 Zylindrisch erscheinen soll (Tabelle 1). Molekül weist dieses dem Bedarf PC rec 305/290 Linse an Energie entsprechend harte 350/310 Fazit Strahlung auf, während das PBS 435/375 mit langen CH2-Ketten weniger 435/400 Jedes hier eingesetzte Polymer harte Strahlung benötigt. Die SAN 315/290 Zylindrisch weist ein eigenes Fluoreszenzs - nicht-aromatischen Polymere wie 370/315 pektrum auf. Bei den industriellen LDPE, PPhomo und PVCsoft 400/350 Kunststoffen PC, GPPS, SAN weisen Fluoreszenz auf, obwohl GPPS 310/290 Zylindrisch wird die Fluoreszenz von der man in diesen π-Elektronen Biopolymer Fluoreszenzaktivität des Phenyl - armen Stoffen keine erwartet. PLA 370/275 Linse rings bestimmt, während die 440/360 Kettenmoleküle der Kunststoffe Die Fluoreszenzspektroskopie PBS 430/360 Linse PLA und PBS unter anderem lässt sich somit einfach für eine Nicht aromatisch durch die Ester fluoreszieren. Qualitätskontrolle einsetzen, um LDPE 285/260 Trübe Linse Gemäß des Molekülaufbaus und „Unsichtbares“ sichtbar zu 330/290 sterischer Hinderungen und machen. PP homo 300/280 Trübe Linse 330/300 PVC soft 405/325 Trübe Linse 445/360

Tabelle 1: Aktive Fluoreszenzzonen (Hotspots) von den Polymergranulaten in unter- schiedlichen Erscheinungsformen – Granulat zylindrisch und linsenförmig ausgeleuchtet. Das Granulat zenz. In den Abbildungen 3 (Seite wurde im Zentrum des Halters 27) und 4 sind die ermittelten eingebettet und mit einer Quarz - EEM-Matri zen (Anregungs platte verschlossen. Dies wird [Excitation]-Emission-Matrix) erwähnt, da die Granulate nicht dargestellt. eben sind und diese sich aufgrund ihrer Größe und Härte nicht mit Auffällig ist, dass sich in allen dem BaSO4 homogenisieren las - Polymeren Fluoreszenzaktivitäten sen. BaSO4 ist hier in der Funk - finden ließen. Die erwartete Aus - tion als Fixier pulver. sage „keine Fluoreszenz mit LDPE und PP” wurde nicht er - Auswertung der füllt. Es scheinen hier bereits Messungen Zuschlagstoffe enthalten zu sein, Abbildung 4: Sicht für langkettige nicht aromatische Polymere bei gleicher Skalierung die eine Fluoreszenz begünstigen. der Intensität. Oben links liegt keine Probe vor – es ist die Kontroll-EEM von der Gemäß der beschriebenen Natur Der Vergleich zwischen PC und Quarzplatte über dem BaSO4-Bett, oben rechts PPhomo, unten links PVCsoft und zeigen die verschiedenen Poly - PCrec ist ein Beispiel, das zeigt, unten rechts LDPE (Low density Polyethylen). mere auch verschiedene Fluores - dass mit Hilfe eines Zuschlags -

NEWS – gedruckt und digital

Printversion: Wenn Sie die Shimadzu NEWS regelmäßig erhalten wollen, senden Sie uns einfach Ihre Post-Adresse an folgende E-Mail: [email protected]

Auch als App: Die Shimadzu NEWS gibt es auch Shimadzu Digital Classrooms. Ganz nach Ihrem Interesse – wählen Sie als WebApp unter www.shimadzu-webapp.eu Ihre Wunschinhalte und verschaffen Sie sich Vorsprung mit unseren Webinaren. www.shimadzu.eu/support/digital_classrooms

Registrieren Sie sich für unseren Newsletter: www.shimadzu.eu/newsletter @ShimadzuEurope

Gedruckt auf 100 % Recyclingpapier