Antidepresszánsok nem konvencionális hatásai a központi és perifériás idegrendszerben

Doktori értekezés

Dr. Mayer Aliz

Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola

Témavezet ő: Dr. Kiss János, Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Köles László egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. K őfalvi Attila tudományos f őmunkatárs, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kecskeméti Valéria egyetemi tanár, az orvostudományok kandidátusa Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hársing László Gábor tudományos tanácsadó, az MTA doktora Dr. Tretter László, egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa

Budapest 2009 TARTALOMJEGYZÉK

1. Rövidítések jegyzéke………………………………………………………………....3

2. Bevezetés…………………………………………………………………………...…4

3. Irodalmi háttér és el őzetes eredmények………………………………………...... 6 3.1. A monoamin teória és egyéb, alternatív depresszió-teóriák……………...... ……….6 3.2. Antidepresszánsok…………………………………………………………..………8 3.3. Antidepresszánsok hatása a központi idegrendszer nAChR-aira………………….11 3.4. A nAChR-ok és a monoamin transzporterek közös sajátságai ………………….....15 3.4.1. A központi idegrendszer nikotinos acetilkolin receptorai (nAChR)...... 15 3.4.2. A monoamin transzporterek jellemz ői...... ….……………….……….18 3.5. Az ionotróp receptorok általános áttekintése …………………...... 21

4. Célkit űzések…………………………………………………………...……………36

5. Módszerek………………………………………………………………..…………38 5.1. In vitro szeletperfúziós technika……………………………………….....……...... 38 5.1.1. Tríciált noradrenalin [ 3H]NA felszabadulás mérése patkány hippokampusz szeletb ől………………………………………………………….……………....38 5.1.2. Tríciált noradrenalin [ 3H]NA felszabadulás mérése tengerimalac jobb pitvar- preparátumból……………………………………………………………...... 39 5.2. In vivo mikrodialízis technika altatott patkányon…………………………...... 40 5.3. Statisztikai analízis………………………………………………………...... 41 5.4. Felhasznált anyagok…………………………………………………………...... 43

6. Eredmények……………………………………………………………………...... 44

6.1. Monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok (maprotilin, tineptin) nAChR antagonista tulajdonsága…………………………...... 44 6.2. Monoamin uptake inhibítorok (fluoxetin, desipramin) NMDA-receptor antagonista tulajdonsága…...... 50 6.3. Monoamin uptake gátlók (fluoxetin, desipramin) P2X-receptor antagonista tulajdonsága………...…...... 54 6.4. Csatorna-blokkoló típusú ionotróp receptor antagonista vegyületek hatása a DA felszabadulásra patkány striatumában, in vivo mikrodialízis kísérletben ………...57 6.4.1. Az NMDA-receptor antagonista dizocilpin (MK-801) hatása a striatális dopamin felszabadulásra……...... …….………………...... …….…..58 6.4.2. A nAchR antagonista mekamilamin hatása a striatális dopamin felszabadulásra……...... ………………………………………...... 59

7. Megbeszélés………………………………………………………………………....61

7.1. Monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok nAChR antagonista tulajdonságai. A depresszió nikotinikus teóriájának farmakológiai meger ősítése...61

1 7.2. Monoamin uptake inhibítorok NMDA-receptor antagonista tulajdonsága: NMDA receptorok lehetséges szerepe a depresszió patomechanizmusában...... 68

7.3. Monoamin uptake inhibítorok P2X-receptor antagonista tulajdonsága: a P2X receptorok lehetséges szerepe az antidepresszánsok terápiás és mellékhatásaiban..73

7.4. Csatorna-blokkoló típusú ionotróp receptor antagonista vegyületek dopamin-uptake gátló hatása...... 77

8. Következtetések………………………………………………………………….....80

9. Összefoglalás………………………………………………………………………..82

10. Ábrák jegyzéke……………………………………………………………………84

11. Irodalomjegyzék…………………………………………………………………..87

12. Saját publikációk jegyzéke……………………………………………………...117

13. Köszönetnyilvánítás……………………………………………………………..118

2 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ACh: acetilkolin ATP: adenozin-trifoszfát DA: dopamin DMI: desipramin DMPP: dimetil-fenil-piperazinium Flx: fluoxetin GABA: gamma-amino-vajsav HEK: humán embrionális vese sejtek mAChR: muszkarinos acetilkolin receptor MAO-A, MAO-B: monoamin oxidáz A és B Map: maprotilin MK-801: dizocilpin maleát Mec: mekamilamin Nic: nikotin nAChR: nikotinos acetilkolin receptor NMDA: N-metil-d-aszpartát NA: noradrenalin Nomif: nomifensin

P2x -R: x-típusú (serkent ő) purinerg receptor PPADS: piridoxál foszfát diszulfonsav SSRI: szelektív szerotonin visszavétel gátló 5-HT: szerotonin Tian: tianeptin TTX: tetrodotoxin TCA: triciklikus antidepresszáns VDSC: feszültség-függ ő Na +-csatorna VDCC: feszültség-függ ő Ca 2+ -csatorna

3 2. BEVEZETÉS

A depresszió

Napjainkban az affektív kórképek közül a depresszió az egyik legjelent ősebb neuropszichiátriai betegség. Az Egészségügyi Világszervezet 2007-ben publikált, úgynevezett WHS (World Heath Survey)-vizsgálata szerint, mely összesen 60 országra terjedt ki a világ összes régiójából (26 európai, 15 afrikai, 6 amerikai, 4 kelet- mediterrán, 5 dél-kelet ázsiai és 4 nyugat-csendes-óceániai ország) a vizsgált populáció 3.2 %-ánál észleltek depressziót önmagában, míg egyéb krónikus betegségekkel társultan a depresszió el őfordulása már 9.3 és 23 % között mozgott (Moussavi et al., 2007). Egy multicentrikus európai vizsgálat adatai szerint 2001-ben a depresszió prevalenciája a feln őtt európai népességben mintegy 8.56 % (n ők: 10.5 %, férfiak: 6.61 %) volt (Ayuso-Mateos és mtsai., 2001). Minden országban nagyobb volt a n ői depressziós betegek aránya a férfiakéval összehasonlítva (Weissman és mtsai., 1996). A betegség magyarországi epidemiolgiája hasonló értékeket mutat: 1998-ban Szádócky és munkatársai azt találták, hogy a 18-64 éves korosztálynál a major depreszió élettartam-prevalenciája 15.1% volt, a bipoláris betegségé pedig 5.1%. A major depresszió 2.7-szer gyakoribb n őknél, mint férfiaknál (bipoláris betegségnél ez az arány 1). Az éves prevalencia értéke 7.1%, az egyhónapos prevalencia pedig 2.6% . A legmagasabb el őfordulási kockázatot a 15–19 illetve 45–50 éves korosztály esetén találták. Ezek az értékek a súlyos depresszió el őfordulásának jelent ős emelkedését mutatják, mivel 1988-ban Magyarországon ez a betegség a lakosságnak mindössze 2.9 %-át érintette (Kopp és mtsai., 1997). A fenti adatok is illusztrálják, hogy adott id őpontban meglehet ősen széles rétegeket érint ez a betegség (és még hozzávet őleg sem felmérhet ő, hogy valójában az emberek hány százaléka érintett, mivel sokszor maguk a betegek sem hajlandók felvállalni a betegség tényét). A depresszió jelent ős mértékben növeli az egyéb megbetegedések, mint például a kardiovaszkuláris betegségek, illetve az id ő el őtti elhalálozás gyakoriságát (Harris és Barraclough, 1998), éppen ezért a depressziós tünetegyüttes jelent ős egészségügyi

4 rizikófaktornak tekinthet ő, ami magyarázza azt, hogy miért fontos az id őben történ ő diagnosztizálása és hatékony kezelése a kés őbbi magatartási zavarok, egészségügyi következmények megel őzése céljából. A depresszió legsúlyosabb következménye az öngyilkosság, mely a 15-24 éves korosztályban a harmadik, a 25-44 éves korosztályban, pedig a negyedik leggyakoribb halálok az Egyesült Államokban (Wong és Licinio, 2001). Ennél sokkal gyakoribb szöv ődmények a másodlagos alkoholizmus, valamint a munkaképesség csökkenése (mely gyakran egészen munkaképtelenségig fokozódhat, következményes munkanélküliséggel, illetve a család széthullásával). Az Egyesült Államok gazdaságában a depresszióval kapcsolatos direkt és indirekt kiadások hozzávet őleg 43 milliárd dollárt tettek ki egyetlen év alatt (Greenberg és mtsai., 1993). A kezeletlen depresszió okozta társadalmi károk (öngyilkosság, szekunder alkoholizmus, másodlagos gyógyszer abúzus, a produktivitás csökkenése, tartós betegállomány stb.) kompenzálására fordított költségek lényegesen meghaladják a depresszió kezelésének költségeit (Rihmer és Rutz, 2000). Az elmúlt 20 évben igen jelent ős haladás történt úgy a depressziók klinikai osztályozása, mint azok biológiai hátterének tisztázása, valamint az alkalmazott terápia hatékonyságának fejlesztése terén. Annak ellenére, hogy napjainkban több mint 30, el őnyös mellékhatásprofillal rendelkez ő antidepresszáns van forgalomban, az eredményes kezelések aránya egyik szer esetén sem haladja meg az 50-60 %-ot, vagyis a betegek mintegy 40 %-a nem reagál a kezdeti gyógyszeres kezelésre. Komoly fejl ődés következett be a depresszió pszichoterápiás kezelési módszereiben is; ma már bizonyítottnak tekinthet ő, hogy a depresszió bizonyos formáinak kognitív terápiája ugyanolyan hatékony, mint a gyógyszeres kezelés, valamint az a tény, hogy a gyógyszeres és pszichoterápiás kezelések kombinált alkalmazása sokkal eredményesebb, mint ezek bármelyike önmagában. A gyógyszeres kezelést segíthetik a depresszió egyéb (nem gyógyszeres) biológiai kezelési módjai: alvásmegvonás, elektrokonvulzív terápia, fényterápia,.

5 3. IRODALMI HÁTTÉR ÉS ELŐZETES EREDMÉNYEK

3.1. A monoamin teória és egyéb, alternatív depresszió-teóriák Annak ellenére, hogy már Hippokratész is leírta a betegséget és hogy több mint 40 éve már hatékonyan kezelhet ő a depresszió, pontos neurokémiai háttere még napjainkban sem teljesen tisztázott. A múlt század hatvanas éveiben dolgozták ki az affektív kórképek monoamin hipotézisét, mely szerint a betegség a NA illetve a 5-HT által közvetített ingerületátviteli folyamatok elégtelenségének a következménye (Schildkraut, 1965; Coppen, 1967; Doris et al., 1999). A monoamin teória alapját azon megfigyelések képezték, miszerint a depresszió kezelésében véletlenszer űen hatásosnak bizonyuló szerek közös tulajdonsága, hogy valamilyen módon serkenteni képesek a monoaminerg ingerület-átvitelt. Az antihisztaminokkal kapcsolatos kutatások során ismerték fel, hogy a triciklikus vegyületek (pl. imipramin) javítják a betegek hangulati életét. Szintén véletlen felfedezés volt, hogy a tuberkulózis kezelésére használt MAO inhibítorok, mint például az iproniazid szintén antidepresszáns hatásúak. Mivel a triciklikus vegyületek gátolják a NA visszavételét, a MAO inhibítorok pedig megakadályozzák a monoaminok citoplazmatikus lebontását, kézenfekv őnek t űnt az a feltételezés, hogy kedvez ő klinikai hatásuk a lecsökkent monoamin szintek normalizálásával hozható összefüggésbe (Nestler és mtsai, 2002). Az elméletet az is alátámasztotta, hogy a monoamin raktárakat kiürít ő rezerpin a depresszió klinikai tüneteit (levertség, szomorúság, anhedónia) produkálta, valamint a katekolaminok mennyiségét csökkent ő diétával a depresszió tünetei súlyosbodtak (Wong és Licinio, 2001). Ugyanakkor az elmúlt 30 évben számos olyan megfigyelés halmozódott fel, ami nincs összhangban a monoamin teóriával. Noha a monoamin transzporter gátló típusú antidepresszánsok a transzportert már az alacsony nanomoláris koncentráció- tartományban is gátolják (Torres et al., 2003), ugyanakkor a terápiásan hatékony plazma- és agyi-koncentrációjuk ennél jóval magasabb (Bolo et al., 2000; Karson et al., 1993; Muscettola et al., 1978) és a klinikai hatás mégsem jelenik meg azonnal, hanem 2-3 hét a latencia ideje.

6 A másik probléma, hogy id őközben megjelentek olyan szerek is a klinikai gyakorlatban, melyek hatékony antidepresszánsok, azonban vagy nem gyakorolnak hatást a monoaminerg transzmisszióra, mint az iprindol, vagy éppen hogy csökkentik az extracelluláris monoamin szinteket, mint a tianeptin, ami fokozza a 5-HT felvételét (Wilde és Benfield, 1995). Ezen megfigyelések hatására az elmúlt években számos alternatív hipotézis született a depresszió etiológiájával kapcsolatban, melyekben többek között felmerült a nikotin receptorok és a kolinerg transzmisszió (Shytle és mtsai, 2002), illetve az NMDA receptorok és a glutamáterg transzmisszió (Palucha és Pilch, 2005) lehetséges szerepe. Legtöbbjük továbbra is feltételezi a monoamin funkció valamilyen zavarát, ám a depressziót nem egyszer űen a monoamin neurotranszmitterek egyszer ű deficitjével magyarázza. A hipofízis-hipotalamusz-mellékvesekéreg tengely gyakran hiperaktivált a depressziós betegeknél. A depressziós betegeknél észlelt neuroendokrin diszfunkció emelkedett bazális kortizol szinttel, negatív dexamethasone szuppressziós teszttel és megnövekedett liquor corticotropin releasing hormon (CRH) szinttel jellemezhet ő (Plotsky és mtsai., 1998). A fent bemutatott tengely-diszfunkció mellett egyes kutatók felvetették a hipofízis- hipotalamusz-pajzsmirigy tengely zavarát is (Jackson, 1998), amelyet alátámaszt az a tény is, hogy hipotireózisban szenved ő betegek esetében a depresszió prevalenciája emelkedett, a depressziós tünetek pedig a hatékony pajzsmirigykészítményeket alkalmazó kezelést követ ően megsz űnnek. Éppen ezért sok esetben alkalmazzák a pajzsmirigykészítményeket az antidepresszáns terápia kiegészít ő szereiként. Az antidepresszánsok krónikus adagolása olyan, hosszú távú adaptív változásokat is indukálhat a monoamin és más neurotranszmitter (pl. glutamát) rendszerekben, amelyek megmagyarázhatják a kezelés kezdete és a tünetek enyhülése közötti id őbeli diszkrepanciát (Skolnick és mtsai., 1996). A citokin elmélet egyesíti a depresszió immun- illetve hipofízis-hipotalamusz- mellékvesekéreg hiperreaktivitás-elméletét. A citokineket több vonatkozásban is kapcsolatba hozzák a depresszió etiológiájával. Citokinekkel kezelt betegekben depressziós tüneteket észleltek, ill. depressziós betegekben az immunrendszer fokozott aktivitását figyelték meg. Emellett bizonyos citokinek agyi noradrenerg illetve

7 szerotonerg rendszereket is aktiválnak (Dunn et al., 2005; Simmons and Broderick, 2005; Schiepers et al., 2005; Leonard and Song, 2002). Immunzavarral járó betegségekben szenved őknél gyakrabban észleltek depressziót, és azt is megfigyelték, hogy számos citokin aktiválja a hipofízis-hipotalamusz-mellékvesekéreg tengelyt. A depresszió egyik legmodernebb felfogása, az ú.n. network-hipotézis szerint a depresszió els ődleges kiváltó oka az idegrendszert ér ő különböz ő ártalmas hatások következtében fellép ő sejtdegeneráció illetve sejtpusztulás. Emiatt el őször csökken a szinaptikus kapcsolatok száma, majd a neurális hálózatokat felépít ő sejtek száma is, ami az információfeldolgozás zavaraihoz, végeredményben pedig a depresszió kialakulásához vezet (Castren, 2005). Az elmélet szerint az antidepresszánsok hatása azért fejl ődik ki lassan, mert az általuk indukált plaszticitási folyamatokhoz, melyek az ideghálózatok regenerációját segítik el ő, hosszabb id őre van szükség. Az elképzelést igazolni látszik az a megfigyelés, hogy az antidepresszánsok serkentik az új idegsejtek képz ődését patkány hippocampusában (Malberg és mtsai, 2000). Az elmélet képes egyesíteni a korábban említett számos depresszió teóriát, hiszen az agyi sejthálózatokat a korábban felsorolt tényez ők mindegyike képes befolyásolni, így az említett rendszerek megfelel ő irányba történ ő elmozdulása el őidézheti a hálózatok ismertetett leépülését és a depresszió következményes kialakulását.

3.2. Antidepresszánsok

Tekintettel a depresszió relatíve magas el őfordulási gyakoriságára valamint a betegség okozta átmeneti vagy tartós munkaképesség-csökkenésre, érthet ő, hogy a betegség kezelésében alkalmazott gyógyszerek, az antidepresszánsok jelenleg az egyik legfontosabb központi idegrendszeri gyógyszercsoportot alkotják. Mindazonáltal a depresszió kezelésében nem történt forradalmi el őrelépés az elmúlt évtizedekben. A jelenleg használt legújabb szerek klinikai hatékonysága nem jobb, mint a 40 évvel ezel őttieké, az egyetlen lényeges különbség a kedvez őbb mellékhatás- profilban fedezhet ő fel (Wong and Licinio, 2001). Noha jelenleg több mint 30 antidepresszáns van forgalomban, az eredményes kezelések aránya egyik szer esetén sem haladja meg az 50-60 %-ot, ami azt jelenti, hogy a betegek mintegy 40 %-a nem reagál a kezdeti gyógyszeres kezelésre. Még többféle

8 antidepresszáns használata esetén sem magasabb a sikerráta 70 %-nál. Ez különösen csalódást kelt ő, ha figyelembe vesszük, hogy a megfelel ő módon megtervezett placebót használó klinikai vizsgálatokban a placebót kapó betegek jelent ős részénél, akár 50 %- ánál is megfigyelhet ő javulás (Walsh és mtsai, 2002). A jelenleg használt antidepresszánsok dönt ő többsége a szerotonerg- és/vagy noradrenerg ingerületátvitel fokozásán keresztül fejti ki hatását: a felszabadult monoaminok szinaptikus résb ől történ ő visszavételének gátlása révén (reuptake-gátlók), a katekolaminok intracelluláris lebontásáért felel ős monoaminoxidáz-A (MAO-A) enzim bénítása révén (MAO-A bénítók), a monoamin szintézishez szükséges prekurzorok által, a posztszinaptikus receptorok m űködésének fokozásával (posztszinaptikus receptor agonisták) valamint a preszinaptikus (monoamin felszabadulást gátló) autoreceptorok gátlásával. Az antidepresszánsok els ő két csoportjára, a triciklusos antidepresszánsokra (TCA) és a monoamin oxidáz (MAO) gátlókra mintegy véletlenképpen találtak rá. Az els ő modern antidepresszánst, az iproniazidot, eredetileg antituberkulotikumnak szánták az ötvenes években. A tuberkulózisra gyakorolt hatása mellett az iproniazid a betegek kedélyére és aktivitására is jótékony hatással volt. Ezek a hatások arra ösztönözték a kutatókat, hogy megvizsgálják a gyógyszer hatékonyságát a depresszió vonatkozásában. 1957-ben bíztató, el őzetes eredmények alapján széles körben kezdték felírni major depresszióban szenved ő betegeknek. További vizsgálatok során kiderült, hogy az iproniazid képes gátolni a monoamin oxidázt, a monoamin neurotranszmitterek (noradrenalin (NA), szerotonin (5-HT), dopamin (DA)) lebontásáért felel ős enzimet. Napjainkban az iproniazidot toxikus mellékhatásai miatt már nem használják, Az els ő triciklikus antidepresszáns, az imipramin, antipszichotikumként került kifejlesztésre. Bár a klinikai vizsgálatokban hatástalannak bizonyult a skizofrénia kezelésére, egy kísérletez ő kedv ű klinikus elhatározta, hogy kipróbálja depressziós betegeken is. 1957 és 1958 között végzett vizsgálatokban úgy találták, hogy az imipramin jelent ősen enyhítette a depressziós betegek tüneteit. Bár az imipramin hatására javult a kedély és fokozódott az aktivitás, a gyógyszer különös módon szedálta a depressziós betegeket. Ezen hatások vezettek ahhoz a feltevéshez, hogy az imipramin szelektíven dolgozik a depresszió ellen, és nem általános aktivitásfokozódás révén hat.

9 További biokémiai vizsgálatok igazolták az imipramin, a transzmitter-visszavétel gátlásán keresztül megvalósuló, monoamin (NA és 5-HT) neurotranszmisszió fokozó hatását. Ezek a szerek ugyan hatékonynak bizonyultak a depressziók terápiájában, de a gyakran fellép ő kellemetlen, jórészt antikolinerg mellékhatások (szédülés, álmosság, szájszárazság, obstipáció, vizeletretenció, ortosztatikus hipotónia, súlygyarapodás, stb.) miatt, alkalmazásuk napjainkban, a korszer űbb szerek birtokában háttérbe szorult. A fent említett mellékhatások néha megakadályozták, hogy az optimális terápiás dózist elérjék, így a beteg ugyan kapott antidepresszánst, de annak szubterápiás adagja miatt kedvez ő klinikai hatás nem alakulhatott ki. A MAO-gátlók a monoamin-oxidáz gátlásán keresztül fokozták a monoamin neurotranszmissziót, de kellemetlen és esetenként veszélyes mellékhatásaik (hipertóniás krízis vagy más néven „sajt-reakció”, fényérzékenység, nyakmerevség, palpitáció, fejfájás, ortosztatikus hipotónia) tekintetében csak kis mértékben tértek el a TCA-októl. A MAO-gátlók és a TCA-ok, bár eltér ő hatásmechanizmussal, de végeredményben fokozzák a monoamin aktivitást az agyban. Ez a megfigyelés vezetett a monoamin teória megalkotásához és ezen keresztül az antidepresszánsok újabb csoportjának, a szelektív szerotonin visszavétel gátló, úgynevezett SSRI-ok kifejlesztéséhez. A cél olyan antidepresszánsok kifejlesztése volt, melyek hatásosan csökkentik a depresszió tüneteit, de nem rendelkeznek a MAO-gátlók illetve a TCA-ok igencsak széles mellékhatásspektrumával. Míg a TCA szerek általánosan gátolják a monoamin visszavételt, az SSRI-ok szelektíven a 5-HT visszavételét gátolják. Az els ő SSRI, a fluoxetin (Prozac) 1987-ben került forgalomba. Ezek a gyógyszerek, nevüknek megfelel ően szelektíven gátolják a 5-HT visszavételt és így a szerotonerg neurotranszmisszió aktivitását fokozzák a központi idegrendszerben. Az elmúlt két évtized során újabb gyógyszertípusok, új klasszifikáció és ennek megfelel ően újabb rövidítések láttak napvilágot, így megjelentek a nem-szelektív 5-HT és NA visszavétel gátló SNRI (korábbi TCA-ok, venlafaxin), NA és 5-HT antagonista NASA (mirtazapin), NA és dopamin visszavétel gátló NDRI (bupropion), illetve 5-HT antagonista és visszavétel gátló SARI (trazodon, nefazodon) vegyületek. A nevezéktant tovább bonyolítja, hogy a SNRI rövidítést a szelektív NA visszavétel gátlók jelölésére is használják (atomoxetin).

10 Az úgynevezett atípusos antidepresszánsok nem a monoamin transzporterekre hatnak, de feltételezett m űködési mechanizmusuk összeegyeztethet ő a monoamin teóriával, így az autoreceptorokon ható anyagok (pl. az α2 receptorokon ható mianserin (Tolvon) és mirtazapine (Remeron)) a negatív visszacsatolás kikapcsolása révén képesek fokozni a monoaminok extracelluláris koncentrációját. Bevezetésre kerültek azonban olyan vegyületek is, melyek mai ismereteink szerint nem a monoamin teóriával összhangban m űködnek. Jó példa erre a tianeptin (Coaxil), amely a 5-HT visszavételt serkenti (Mennini és mtsai., 1987; Fattacini és mtsai., 1990), így elvileg csökkenti e transzmitter extracelluláris koncentrációját, ennek ellenére klinikai hatékonyságban nem marad el a többi antidepresszánstól (Loo és mtsai., 1999). Mindezek alapján érthet ő, hogy a depresszió neurokémiai hátterének és az antidepresszánsok hatásmechanizmusának tisztázása els ődleses fontosságú, mivel új központi idegrendszeri célpontok azonosításához vezethet és hatékonyabb terápiás eljárások kifejlesztését eredményezheti.

3.3. Antidepresszánsok hatása a központi idegrendszer nAChR-aira

El őzetes eredményeink arra utalnak, hogy az antidepresszánsok egyéb, a monoaminerg rendszerekkel nem összefügg ő támadáspontokkal is rendelkeznek a központi idegrendszerben. Munkacsoportunk már korábban foglalkozott a nikotin központi idegrendszeri kognitív folyamatokra, addiktív mechanizmusokra gyakorolt hatásával. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a nAChR-ok jelent ős befolyással bírnak a noradrenerg neurotranszmisszióra a központi- és perifériás idegrendszerben (Sershen és mtsai., 1995; Vizi és mtsai., 1991; 1995). Számos szövetben, így patkány hippocampusban is kimutatták, hogy a nikotin fokozza a NA felszabadulást (Arqueros és mtsai., 1978; Mitchell, 1993). Hogy jobban megérthessük ezeket a hatásokat, megvizsgáltuk a nikotin és nikotin agonisták monoaminerg neurotranszmisszióra kifejtett hatását patkány hippocampusban (Vizi és mtsai., 1995; Sershen, 1997). Mivel a hippocampális NA-felszabadulás javítja a memóriatárolást (Lee és Ma, 1995), a hippocampus kolinerg kapcsolatai pedig a memóriafunkciók és a tanulás szabályozásában játszanak kulcsszerepet (Ridley, 1996), helyénvalónak t űnt megvizsgálnunk a két rendszer kapcsolatát. Korábbi vizsgálatainkban nikotinnal és

11 nikotin agonistákkal váltottunk ki NA felszabadulást in vitro , patkány hippocampus szeletekben (Vizi és mtsai., 1995). A nikotin agonisták hatásukat a nAChR-on keresztül fejtették ki. Ezekben a kísérletekben bebizonyosodott, hogy a klasszikus nikotin agonistaként használt DMPP (amely egy szintetikus ganglion izgató anyag), a többi nikotin agonistától eltér ő módon nemcsak a nAChR ingerlésével fokozza a NA felszabadulást, hanem egy ett ől különböz ő, másik mechanizmussal is, melynek jellemz ői (nikotin antagonistával nem megszüntethet ő, Ca 2+- és TTX-inszenzitív, transzporter gátlóra érzékeny) arra utalnak, hogy a DMPP a noradrenalin transzporter működését is befolyásolja és annak közvetítésével szintén fokozza a hippocampusban a noradrenalin felszabadulást (Kiss és mtsai, 1997). A DMPP, tehát két úton fejt ki hatást, egyrészt nAChR-on keresztül exocitózist vált ki, másrészt a NA transzport megfordításával, hordozó követítette NA felszabadulást vált ki (Kiss és mtsai., 1997; 2001). A NA transzportert gátló vegyületekkel (desipramin, nisoxetin, nomifensin), végzett kísérleteink során sikerült bizonyítanunk a NA transzporter szerepét a DMPP hatásban, azonban emellett egy újabb érdekes felfedezésre jutottunk. Kiderült, hogy a NA transzportert gátló vegyületek amellett, hogy a transzportert specifikusan bénítják, igen hatásosan gátolják a nikotin receptorokat is az 1-10 µM-os koncentráció-tartományban (Kiss és mtsai., 1997). A további kísérletek során azt találtuk, hogy a desipramin, nisoxetin és nomifensin mellett a kokain, illetve a szerotonin transzportert szelektíven gátló antidepresszánsok, mint a fluoxetin (Hennings és mtsai., 1997) és a citalopram (Hennings és mtsai., 1999), valamint a szelektív dopamin visszavételt gátló GBR-12909 (Szász és mtsai., 2006), egyaránt rendelkeznek antinikotinikus tulajdonságokkal (1. ábra). Tehát a monoamin visszavételt gátlók kémiai szerkezetükt ől és szelektivitásuktól függetlenül gátolni képesek a központi idegrendszer nAChR-ait, méghozzá hasonló hatékonysággal (IC 50 : 0.36 és 1.84 µM között), mint az egyik leger ősebb nikotin antagonista vegyület, a mekamilamin (IC 50 : 0.19 µM) (1. táblázat).

12

100

Mekamilamin 75 Desipramin Fluoxetin Nisoxetin 50 Kokain Gátlás (%) Gátlás Citalopram Nomifensin 25 GBR-12909

0

-8 -7 -6 -5 -4

Log koncentráció (M)

1. ábra. Különböz ő monoamin uptake gátlók hatása a nikotin-kiváltotta [3H]NA felszabadulásra patkány hippocampus szeletekb ől. A dózis-hatás görbék alapján számított gátlási (IC 50 ) értékeket az 1. táblázat tartalmazza (Kiss és mtsai, 1997; 1999; Szász és mtsai, 2006).

IC ( µM) 50 Mekamilamin 0.19

Fluoxetin 0.57

Desipramin 0.36 Nisoxetin 0.59 Kokain 0.81 Citalopram 0.93

Nomifensin 1.84

GBR – 12909 2.37

1.táblázat. Monoamin visszavételt gátlók nikotin antagonista hatásának jellemzése. (Módszer: nikotin kiváltotta NA felszabadulás patkány hippocampus szeletekb ől. A mekamilamin referencia-vegyületként szerepel a táblázatban. Az egyes transzporter gátlók nikotin receptor antagonista képességét mennyiségileg az IC 50 értékkel jellemeztük (Hennings és mtsai., 1997; 1999; Szász és mtsai., 2006).

13 A nAChR-on legalább két különálló köt őhelyet tudunk megkülönböztetni. A receptor extracelluláris oldalán található egy endogén ligand-köt őhely, ahová az ACh és a nikotin köt; egy másik köt őhely pedig az ioncsatorna pórusában található, oda köt ődnek a csatornablokkolók, mint például a mekamilamin (Banerjee és mtsai., 1990). Kísérleteink és az irodalmi adatok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a központi idegrendszerben az antidepresszánsok a nAChR pórusához köt ődnek, akárcsak a csatornablokkoló mekamilamin. Eredményeinknek klinikai jelent őséget szolgáltat az a tény, hogy az antidepresszáns vegyületek plazma koncentrációja antidepresszáns terápia során az 1-2 µM-t is elérheti (Pato és mtsai., 1991; Besret és mtsai., 1996), így az agyban kialakulhat olyan koncentráció, amelynél már jelent ősen gátolják a neuronális nikotin receptorok funkcióját. Közleményeink megjelenése óta több, független, eltér ő metodikával dolgozó csoport is meger ősítette, hogy a különböz ő, monoamin visszavétel gátló típusú antidepresszánsok antagonistaként viselkednek a központi idegrendszer nAChR-ain (Fryer és Lukas, 1999; Lopez-Valdes és mtsai., 2002; Miller és mtsai., 2002.). Mindezek alapján és részben kutatócsoportunk el őzetes eredményeire is támaszkodva megfogalmazódott a depresszió neurokémiai hátterének egy új típusú elmélete, mely központi szerepet tulajdonít a nAChR-oknak (Shytle és mtsai, 2002). Az elmélet arra a régi megfigyelésre épít, miszerint a depressziós betegekben kolinerg túlsúly figyelhet ő meg a visszaszorult monoaminerg aktivitás mellett. A szerz ők szerint a kolinerg túlsúllyal járó depressziós tünetek kialakulásáért a központi idegrendszer neuronális nAChR-ainak túlingerl ődése a felel ős. Valóban, a nAChR-ok fontos szerepet játszanak a hipotalamusz-hipofízis tengely m űködésében, a mezolimbikus dopaminerg rendszer szabályozásában, illetve a cirkadián ritmus kialakításában és fenntartásában (Shytle és mtsai, 2002). Mindezek a funkciók, illetve ezek zavara jelent ős tényez ő a depresszió kialakulásában. A szerz ők elgondolása szerint az antidepresszáns hatás kifejl ődésének dönt ő lépése a túlingerelt nAChR-ok gátlása, amit a jelenleg használt antidepresszánsok meg is tudnak tenni (lásd el őzetes eredményeinket és az irodalmi adatokat). Az elképzelés szerint a nAChR antagonista vegyületek képesek lehetnek a depressziós tünetek enyhítésére, amit a mekamilaminnal folytatott klinikai vizsgálatok meg is er ősítettek (Shytle és mtsai, 2000). Az elmélet alapján már fejlesztés alatt is vannak

14 bizonyos nikotin antagonista vegyületek, melyek az antidepresszánsok egy új csoportját alkothatják.

3.4. A nAChR-ok és a monoamin transzporterek közös sajátságai

3.4.1. A központi idegrendszer nikotinos acetilkolin receptorai (nAChR) A neuronális nAChR-ok szöveti elhelyezkedésük alapján három nagyobb csoportot (izom, ganglion és központi idegrendszer) alkotnak, megtalálhatóak a neuromuszkuláris junkcióban, szimpatikus és paraszimpatikus ganglionokban és kiterjedten a központi idegrendszerben, ahol molekuláris összetételük és elhelyezkedésük igen heterogén. A neuronális nAChR-ok a ligand-vezérelt ionotrop receptorok családjába tartoznak, a harántcsíkolt izom nAChR-ai, a GABA A, 5-HT 3, és a glycin receptorokkal együtt (Ortells és Lunt, 1995; Nicke és mtsai, 1999). A nAChR-ok pentamer szerkezet ű fehérjék, öt alegységb ől állnak. Alapvet ően kétféle alegység (α és β) vesz részt a felépítésükben, az alegységek heterogenitása miatt azonban az altípusok száma igen nagy. A nAChR alegységeit kódoló géncsalád tagjai a központi idegrendszerben: α2 - α10, illetve a β2 - β4 alegységeket fejezik ki. Az α1 és β1 alegységek a harántcsíkolt izomban fordulnak el ő (Wada és mtsai, 1988; Coutrier és mtsai, 1990; Patrick, 1993). Megkülönböztetünk heteromer ill. homomer receptorokat, aszerint, hogy egy vagy több típusú alegységet tartalmaznak. A heteromer nAChR minden esetben két α alegységet tartalmaz a ß alegységek mellett, relatíve nagy affinitás jellemzi, f őbb antagonistái a mekamilamin és a dihydro-β-erythrodine, míg a homomer (α7, α8, α9 vagy α10 alegységekből felépül ő) receptor alacsony affinitású, α- bungarotoxinra és a szelektív antagonista methyllycaconitine-re érzékeny. A receptor agonistái két α-alegységhez kapcsolódva, konformációs változást előidézve nyitják a csatornát, amely els ősorban Na + és K + ionokat ereszt át (a neuronális nAChR- ra ezen felül még fokozott Ca 2+ permeabilitás is jellemz ő). A kationok mozgása depolarizálja a sejtet és feszültség-függ ő ioncsatornákat is aktivál. A nAChR a gyors, serkent ő neurotranszmisszió egy kulcseleme, amelyre jó példa a neuromuszkuláris junkció, amelyben kizárólag nAChR-ok felel ősek az ingerületátvitelért. A neuronális nAChR-ok idegrendszeri funkciója egyelőre még kevésbé tisztázott. Az autonóm idegrendszerben egyértelm űbb e receptorok szerepe: a ganglionokban az

15 idegsejtek közötti szinaptikus transzmisszió els ősorban a nikotin receptorok közvetítésével megy végbe. A központi idegrendszerben azonban nagyon kevés bizonyítékot találtak arra, hogy a klasszikus szinaptikus transzmissziót nikotin receptorok közvetítenék. Ugyanakkor egyre több adat van e receptorok szerepér ől a neurotranszmisszió preszinaptikus szabályozását illet ően. Monoaminerg, glutamáterg, kolinerg, és GABA-erg rendszerekben kimutatták, hogy a neurotranszmitter felszabadulás a nAChR-okon keresztül fokozható. Noha a jelenség mögött meghúzódó neuronális mechanizmusok még nem tisztázottak, viselkedési kísérletek egyértelm űen bizonyították, hogy a központi idegrendszer nAChR-nak fontos szerepe van a figyelem, az éberségi szint, a tanulási, illetve a memóriával kapcsolatos kognitív folyamatokban (Levin és mtsai, 1987; Newhouse és mtsai, 1997; Levin és mtsai, 1998). A központi idegrendszer különböz ő területein eltér ő nAChR altípusok lehetnek felel ősek egy-egy nikotinos funkcióért. Az eltér ő alegység-összetétel ű nAChR-ok elvileg vizsgálhatók olyan farmakológiai módszerekkel, melynek alapját az agonisták és antagonisták hatékonysági rangsora képezi (2. táblázat).

β2 α2 Nic > DMPP > ACh > Cyt α3 DMPP = ACh >> Nic > Cyt α4 Nic = ACh > DMPP > Cyt β4 α2 Cyt > Nic > ACh > DMPP α3 Cyt > Nic = ACh = DMPP α4 Cyt > Nic > ACh > DMPP α7 Nic > Cyt > DMPP > ACh

2. táblázat. A nAChR-ok agonista érzékenysége az alegység összetétel függvénye Az agonisták hatáser ő sorrendjét a Xenopus oocytában kifejez ődő nAChR aktivációt követ ő normalizált ion-áramok összehasonlítása alapján határozták meg (Patrick és mtsai, 1993). Nic: nikotin, ACh:acetilkolin, Cyt: cytizin.

A mesocortico-limbicus dopaminerg neuronok mind nagy-, mind alacsony affinitású nAChR-okat expresszálnak (Wooltorton és mtsai., 2003), míg a hippocampusban és a kéregben nagy számban találhatók α7 receptorok (Leonard és Bertrand, 2001).

16 Számos adat szól amellett, hogy a nikotinos kolinerg neurotranszmisszió zavarai számos kórfolyamat kialakulásában játszhatnak szerepet. A kognitív m űködések szempontjából az ACh az egyik legfontosabb ismert neurotranszmitter. Az Alzheimer-kór ACh deficienciával, pontosabban a nucleus basalis Meynerti mag kolinerg neuronjainak pusztulásával, az ebb ől következ ő nikotinos acetilkolin receptorszám (nAChR) csökkenéssel (Terry és Buccafusco, 2003), illetve a kolinerg-monoaminerg egyensúly felborulásával jellemezhet ő (Garcia-Alloza és mtsai., 2005). Az Alzheimer-kór esetén észlelt receptorszám-csökkenés eltér attól a képt ől, amit az öregedés során tapasztalunk (Court és mtsai., 2001). A dohányzás és az Alzheimer-kór kapcsolata ellentmondásos. Brenner és munkatársai vetették fel (Brenner és mtsai., 1993), hogy a dohányzás csökkenti az Alzheimer-kór kialakulásának esélyét. Egy klinikai vizsgálat (Wang és mtsai., 1997) úgy találta, hogy a mérsékelt dohányzás valóban csökkenti az Alzheimer- kór kialakulásának esélyét, egy 2000-ben megjelent összefoglaló tanulmány azonban nem igazolta a dohányzás esetleges neuroprotektív hatásait Alzheimer-kórban (Fratiglioni és Wang, 2000). A nikotin az elmúlt húsz év folyamán egyre növekv ő humán farmakológiai jelent őségre tett szert. Korábbi vizsgálatok eredményei arra utaltak, hogy a dohányzás csökkenti az Alzheimer- és a Parkinson kór incidenciáját (Levin és Rezvani, 2002). Az elmúlt évek meta-analízisei (Letenneur és mtsai., 2004; Sabbagh és mtsai., 2002; Kukull, 2001), a vizsgálatok hibás tervezését okolva, cáfolták ezt a hipotézist. Továbbra is folynak azonban kísérletek nikotintapaszokkal ill. specifikus α7 nAChR agonistákkal, amelyekben Alzheimer-kóros betegek reakcióidejének, percepciójának és rövid-távú memóriájának javulását írták le (Picciotto és mtsai., 2000). A preszinaptikus receptorok a perifériás idegrendszerben is fontos moduláló funkciót töltenek be. A neuromuszkuláris junkcióban preszinaptikus nAChRok serkentik az acetilkolin felszabadulást (Prior és mtsai., 1995). Ez a mechanizmus teszi lehet ővé a szinapszis hosszú távú, nagyfrekvenciájú m űködését. A nAChR a perifériás idegrendszerben, a paraszimpatikus beidegzésen kívül meghatározó szerepet játszik az enterikus idegrendszer m űködésében is.

17 3.4.2. A monoamin transzporterek jellemz ői A kémiai ingerület-átvitel specificitásának egyik alapfeltétele, hogy a felszabadult neurotranszmitter nem tartózkodhat hosszabb ideig a receptorok közelében, mert máskülönben az elektromos jelek kémiai kódolása megbízhatatlanná válik. A monoaminerg ingerület-átvitel tanulmányozása során nyilvánvalóvá vált, hogy a NA, DA és 5-HT esetében a legfontosabb eltakarító mechanizmus nem az enzimatikus lebontás (mint pl. az acetilkolin esetében), hanem a monoaminok neuronális visszavétele, melyet az idegsejtek plazmamembránjában elhelyezked ő fehérjék, a monoamin transzporterek biztosítanak. Kiderült, hogy noha minden monoaminnak létezik specifikus visszavételi rendszere, funkcionális sajátságaik igen hasonlóak. Már a 70-es években megfigyelték, hogy ezek a visszavételi rendszerek csak Na +- és Cl --ionok jelenlétében m űködnek, ezért besorolták őket a Na/Cl-dependens transzporterek családjába (Nelson, 1998). Mint kés őbb kiderült, ebbe a családba tartoznak a monoamin transzporterek mellett a GABA, a glicin, a prolin, a betain és a taurin transzporterek is (Amara és Arriza, 1993). A fehérjecsalád megismerése nagy lendületet kapott a kilencvenes évek elején, amikor eredményesen klónozták a GABA transzportert (Nelson és mtsai, 1990), majd az itt szerzett ismeretek birtokában sikerült klónozni és szekvenálni az összes monoamin transzportert is. Megállapították, hogy mindegyik tanszporter kb 69000 kD molekulasúlyú, egyetlen aminosavláncból álló fehérje, a humán NA transzportert (NET) 617 aminosav alkotja (Paczholczyk és mtsai, 1991), a humán DA transzporter (DAT) 619 aminosavból épül fel (Shimada és mtsai, 1991), míg a humán 5-HT tarnszporter (SERT) 630 aminosavból áll (Ramamoorthy és mtsai, 1993). A szekvencia analízis kimutatta, hogy a monoamin transzporterek nagyfokú homológiát mutatnak, a humán DAT 67 %-ban azonos a humán NET-tel, és a nem- konzervatív szubsztitúciókat is figyelembe véve a szekvencia hasonlóság már 81 %-os. A SERT nagyobb eltéréseket mutat, de a NET-tel mutatott aminosav azonosság még mindig meghaladja a 48 %-ot. Mindez azt eredményezi, hogy a monoamin transzporterek struktúrális felépítése is nagyon hasonló: a hidrofóbicitási térkép alapján 12 transzmembrán (TM) régiót sikerült azonosítani bennük, melyek aminosav szekvenciája különösen konzervatív, mivel több mint 90 %-ban megegyezik minden transzporterben. Az N- és a C- végz ődés intracellulárisan található, és mindegyik transzporter tartalmaz egy nagy extracelluláris

18 „loop”-ot a harmadik és negyedik TM régió között. A transzporterek harmadlagos struktúrája még nem ismert, azonban a velük nagy hasonlóságot mutató bakteriális leucin transzportert már sikerült kristályosítani és röntgen diffrakciós módszerrel elemezni (Singh és mtsai, 2007; Zhou és mtsai, 2007), ami valószín űsíti, hogy a monoamin transzporterek térszerkezetére is hamarosan fény derül. A monoamin transzporterek els ődleges feladata a transzmitterek eltávolítása az extracelluláris térb ől. M űködésükhöz a Na +-ion elektrokémiai gradiense szolgáltat energiát, normál körülmények között ugyanis az extracelluláris Na +-koncentráció 140 mM, míg az intracelluláris 10 mM körül mozog. A NET transzport-ciklusa során el őször egy Na +-ion, majd a szubsztrát, végül egy Cl --ion köt ődik a carrierhez és a transzlokáció ezután zajlik le. Az intracelluláris oldalon el őször a Na +-ion disszociálódik le, majd a szubsztrát és a Cl --ion (Trendelenburg, 1991). A többi monoamin transzporter hasonlóan m űködik, kisebb nagyobb eltérésekkel. A DAT esetében két Na +-ion és egy Cl --ion köt ődik be, míg a SERT a NET-hez hasonlóan csak egy Na +- és egy Cl --iont használ, azonban m űködését egy K +-ion is segíti, mely a transzport ciklus lezajlása után kapcsolódik a carrierhez az intracelluláris oldalon és az extracelluláris térbe transzportálódik, miközben elősegíti a transzporter alapállapotba való visszatérését (Rudnick és Clark, 1993). Mivel a szubsztrát általában pozitív töltést hordoz, a felvételi folyamat elektrogenikus, azaz depolarizálja a sejtmembránt. A transzport-ciklus nem túl gyors, másodpercenként mindössze 2-10 szubsztrát felvételét teszi lehet ővé. Normál körülmények között a monoamin transzporterek kívülr ől a sejtbe juttatják a transzmittereket, azonban bizonyos feltételek mellett a folyamat megfordulhat és a transzporter a citoplazmából az extracelluláris térbe szállítja a monoaminokat. Ezt a jelenséget carrier-mediálta transzmitter felszabadulásnak nevezzük (Levi és Raiteri, 1993). El őfordulásának három f ő okát ismerjük: a citoplazmatikus transzmitter koncentráció megnövekedése (a monoaminokra jellemz ő, bizonyos szerek: rezerpin, MAO inhibítorok, amfetamin váltják ki), a Na +-gradiens csökkenése (az intracelluláris Na +-koncentráció megemelkedése miatt), illetve a transzporterek endogén transzmittert ől különböz ő szubsztrátjainak extracelluláris jelenléte. A carrier-mediálta felszabadulás a citoplazmából történik, nem függ a Ca 2+ -ionoktól, de értelemszer űen Na +-függ ő, nem modulálható preszinaptikus receptorok által, de gátolható uptake

19 inhibítorokkal, így elkülöníthet ő a vezikuláris exocitózistól, mely esetén a transzmitter felszabadulás a vezikulából történik, éppen ezért Ca 2+ -függ ő a folyamat, modulálható preszinaptikus receptorok által, viszont nem gátolható uptake inhibítorokkal. Bár minden monoaminnak van saját specifikus plazmamembrán transzportere, a már ismertetett nagyfokú sruktúrális hasonlóság miatt funkcionálisan nem olyan éles az elkülönülés. A monoaminerg pályák autoradiográfiás vizsgálata során megfigyelték, hogy a szerotonerg és noradrenerg idegvégz ődések képesek a [ 3H]DA felvételére (Berger és Glowinski, 1978; Descarries és mtsai, 1987). Hasonló módszerekkel igazolták, hogy a dopaminerg terminálisok felvehetnek [ 3H]NA-t és [ 3H]5-HT-t is (Doucet és mtsai, 1988). Kés őbbi funkcionális vizsgálatok kimutatták, hogy a NET hatékonyabban veszi fel a DA-t mint saját szubsztrátját, a NA-t (Buck és Amara, 1994). A jelenséget heterológ visszavételnek nevezzük, és fiziológiás jelent őségét mutatja, hogy bizonyos agyterületeken (pl. prefrontális kéreg) a dopaminerg beidegzésb ől felszabaduló DA visszavételét a noradrenerg terminálisokon elhelyezked ő NET látja el, mivel a DAT s űrűség igen alcsony (Ciliax és mtsai, 1995; Sesack és mtsai, 1998). Neurofarmakológiai szempontból a monoamin transzporterek számos központi idegrendszerre ható szer célpontjai. Jól ismert, hogy a kokain els ődlegesen a DA transzporter gátlásán és a következményes DA szint emelkedésen keresztül fejti hatását, míg az amfetaminok a transzporter m űködési irányának megfordításával váltanak ki jelent ős monoamin felszabadulást (Sulzer és mtsai, 2005). Talán még ennél is fontosabb azonban a monoamin transzportereknek a depresszió kezelésében betöltött szerepe, hiszen a jelenleg használt antidepresszánsok dönt ő többsége a monoamin transzporterek gátlásán keresztül éri el terápiás hatását. A monoamin transzporterek csatorna-tulajdonságai Számos megfigyelés támasztja alá, hogy a monoamin transzporterek bizonyos csatorna- tulajdonságokkal rendelkeznek. Elektrofiziológiai adatok arra utalnak, hogy számos membrán transzporter fehérje ioncsatorna-jelleg ű tulajdonságokkal rendelkezik (Larsson és mtsai., 1996; Sonders és Amara, 1996; Lester, 1996; Sonders és mtsai, 1997). A NA felvétel és az áramok párhuzamos mérése NA transzporterrel transzfektált HEK sejtekben nagy különbségeket mutatott a töltések és a szubsztrát fluxusa között (Galli és mtsai, 1995). Ez arra utalt, hogy a NA transzporter m űködése során a transzportfolyamattal párhuzamosan, nem sztöchiometrikusan kapcsolt ionáramok is

20 keletkeznek. Ezen megfigyelés alapján merült fel, hogy a transzporterekben ioncsatorna-szer ű struktúrák találhatók (DeFelice és Blakely, 1996; Galli és mtsai., 1998). Ugyanakkor leírták azt is, hogy az NMDA receptor antagonista MK-801 gátolja a HEK sejtekben expresszálódó monoamin transzportereket (Nishimura és mtsai., 1998) ami szintén alátámasztani látszik hipotézisünket, mert a fenciklidin-típusú NMDA antagonistáról azt is kimutatták, hogy a nAChR-ok ioncsatornájába is képes beköt ődni (Aronstam, 1981) és elektrofiziológiai megfigyelések bizonyították, hogy a nAchR-ok nemkompetitív módon gátolhatók az MK-801-el (Ramoa és mtsai., 1990). Az általunk végzett farmakológiai megfigyelések jól illeszkednek ehhez az elképzeléshez. Feltételezésünk szerint a monoamin transzporterekben valóban találhatók csatorna-szer ű képz ődmények, melyek fontos szerepet játszanak a szubsztrát transzlokációjában. Amennyiben e csatornák m űködésképtelenek, a transzmittert visszavev ő funkció megsz űnik. A monoamin transzportert gátló vegyületek általános hatásmechanizmusa valószín űleg az, hogy az ioncsatorna pórusába “ülve” gátolják a transzportereket. Elképzelésünk szerint a monoamin uptake gátló vegyületek (például az antidepresszánsok) azért képesek a nAChR-okat is hatékonyan gátolni, mert ezen receptorok és a monoamin transzporterek ioncsatornái közös farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

3.5. Az ionotróp receptorok általános áttekintése

A szinaptikus résbe felszabaduló neurotranszmitter passzív diffúzióval eljut a posztszinaptikus membránhoz és ott specifikus receptorokhoz köt ődik. Adott transzmitter hatása a célsejt-neuronon található receptorok típusától függ. Az összes klasszikus neurotranszmitter receporai integrális membránproteinek, melyek saját neurotranszmitter-köt őhelyekkel rendelkeznek a küls ő vagy ahhoz közeli felszínükön. Szerkezetük és szerepük alapján két f ő receptor-típust különböztetünk meg: ionotróp és metabotróp (G-protein kapcsolt) receptorokat. Mivel a jelen disszertáció az uptake-rendszerekre ható különböz ő antidepresszánsok ionotróp receptorokra gyakorolt hatásával foglalkozik, ezért a továbbiakban ezen

21 receptorcsalád (és azon belül is az általunk vizsgált receptor-típusok) f őbb jellemz őit ismertetném. Az ionotróp receptorok integrális, többféle alegységb ől felépül ő, membránt áthídaló fehérjék, melyek alegységei ioncsatornát képeznek és ez az ioncsatorna különböz ő (az adott receptor-típusra jellemz ő) ligand-köt őhelyekkel rendelkezik. A neurotranszmitter beköt ődése egy konformáció-változást okoz, mely lehet ővé teszi az ionok szelektív áramlását a csatornán keresztül. A következményes ionáram posztszinaptikus potenciált hoz létre, amely az ionszelektivitástól függ ően lehet serkent ő (EPSP) vagy gátló (IPSP) hatású, és ennek megfelel ően a posztszinaptikus neuront fokozottabb vagy csökkentettebb tüzelésre készteti. Az ionotróp receptorokat használó jelátvitel nagyon gyors és az agy különböz ő területeit összeköt ő f őbb pályákon és a perifériás idegrendszer motoros pályáin következik be. Az ionotróp-receptorok három családba osztályozhatók: az ú.n. „cys-loop” receptorok (nikotinikus receptor család), az ionotróp glutamát receptorok és az ATP receptorok családjába (2. ábra).

Ionotróp receptorok

nAChR család P2XR család nAChR P2X1-7 GABA A GluR család Gly NMDA 5-HT 3 AMPA KA

2. ábra. Az ionotróp receptor családok.

A “cys-loop” receptorok egy jellegzetes hurkot tartalmaznak (melyet 2 cystein reziduum közötti diszulfid-kötés alkot) és az adott csatorna által átengedett ionok milyensége alapján két típusra oszthatók: anionos (GABA A-R, Glycin-R) illetve

22 kationos (5-HT 3-R, nAChR és az ú.n. zink-aktiválta ioncsatorna – ZAC) receptorokra. A „cys-loop” receptorok általában pentamer szerkezet űek. Ezen receptorcsalád legismertebb tagjának, az általunk is vizsgált nAChR-nak a f őbb jellemz őit és farmakológiai tulajdonságainak leírását jelen disszertáció el őző fejezete tárgyalja. A következ ő ionotróp receptor-család az ionotróp glutamát receptorok családja. Őket tetramer szerkezet jellemzi. Ide tartozik az AMPA, a kainát és az NMDA-receptor. Az L-Glutamát a központi idegrendszer f ő serkent ő (excitátoros) neurotranszmittere, mely hatásait részben ligand-vezérelt (ionotróp), részben G-protein kapcsolt (metabotróp) receptorok aktiválásán keresztül fejti ki. Ezen receptorok aktiválása felel ős az alapvet ő szinaptikus jelátvitelért valamint a szinaptikus plaszticitás számos formájáért, mint az LTP (long-term-potentiation) és az LTD (long-term-depression), melyekr ől azt feltételezik, hogy a tanulás és a memória alapjait képezik. Ezáltal ezen receptorok potenciális célpontjai olyan központi idegrendszeri betegségek gyógyszereinek, mint például az epilepszia és az Alzheimer-kór. A három f ő ionotróp glutamát receptor (iGluR) típus: az NMDA, az AMPA és a kainát receptorok. Ezen receptortípusok natív formái tetramer szerkezet űek és több mint egyféle receptor-alegységet tartalmaznak. Annak ellenére, hogy e három különböz ő ionotróp glutamát receptor alegységeinek átlagos aminosav azonossága mindössze 20-30% közötti, számos egyértelm ű szerkezeti hasonlóságot mutatnak. A transzmembrán topológiájuk egyértelm űen különbözik a klasszikus, nAChR-ra jellemz ő, négy transzmembrán-doménes receptor-modellt ől (James N. C. Kew et al., 2005). Az iGluR-alegységek tartalmaznak egy extracelluláris amino-terminális domént (mely homológiát mutat a metabotrop glutamát receptor (mGluR) agonista köt őhelyével, ezt követi az els ő transzmembrán domén majd egy “pórust” alkotó transzmembrán domén, mely nem keresztezi a membránt, viszont egy olyan visszahajló hurkot képez, ami a citoplazmából lép ki és oda is tér vissza. A második és a harmadik transzmembrán domént egy hosszú extracelluláris hurok köti össze, a harmadik TM domén után pedig egy intracelluláris karboxi-terminális következik (Dingledine és mtsai., 1999; Mayer és Armstrong 2004).

23 Az NMDA receptorok Az NMDA receptor (NMDAR) a glutamát ionotróp receptora, mely nevét a szelektív és specifikus agonistájáról (N-methyl-D-aspartate) kapta. Az NMDA receptor aktivációja az alegységek által közrezárt nemszelektív kationcsatorna nyitását okozza. Ez teszi lehet ővé a Na + ionok és kis mennyiségben a Ca 2+ ionok beáramlását a sejtbe, a K + ionok egyidej ű kilépésével a sejtb ől (Dingledine és mtsai., 1999; Liu és Zhang 2000; Cull- Candy és mtsai., 2001; Paoletti és Neyton 2007). Az NMDA receptoron keresztül történ ő Ca beáramlásról azt feltételezik, hogy dönt ő szerepe van a szinaptikus plaszticitásban. Az NMDA receptor azért is egyedi, mert nemcsak ligand-vezérelt, hanem feszültség-függ ő működésre is képes. Az NMDA receptor a ligand-vezérelt ioncsatornák közül az egyetlen, melynek működéséhez két ko-agonista szükséges, melyek az NR1 (Kuryatov és mtsai., 1994; Wafford és mtsai., 1995; Hirai és mtsai., 1996; Kew és mtsai. 2000) illetve az NR2 (Laube és mtsai., 1997; Anson és mtsai., 1998) alegységen elhelyezked ő glycine- és glutamát-köt őhelyhez kapcsolódnak. Elektrofiziológiai tanulmányok bebizonyították, hogy az NMDA receptor aktivációjához két független glicin és két független glutamát köt őhely egyidej ű elfoglalása szükséges (Benveniste és Mayer 1991; Clements és Westbrook 1991). Úgy tűnik tehát, hogy a minimális követelménye annak, hogy egy NMDA receptor működ őképes legyen az az, hogy két NR1 és két NR2 alegységb ől felépül ő tetramer szerkezettel rendelkezzen. Ezzel egybehangzóan, más tanulmányok is meggy őző bizonyítékokat találtak arra nézve, hogy (akárcsak a többi iGluR-ok) az NMDA receptorok is tetramer szerkezet űek, és alegység-párok vagy dimerek építik fel őket (például egy NR1 dimer kombinációja egy NR2X dimerrel) (Schorge és Colquhoun 2003; Mayer és Armstrong 2004). Az NMDA receptorok családjának felépítésében 7 alegység szerepel: NR1, NR2A–D, NR3A és B, melyeket különböz ő gének kódolnak. Az NR1 alegységnek nyolc funkcionális és egy nem funkcionális splice-variánsát írták le (McBain és Mayer 1994). Az NR2 alegységek átlagosan 27%-os homológiát mutatnak az NR1-el (Monyer et al. 1992; Ikeda et al. 1992; Kutsuwada et al. 1992; Meguro et al. 1992; Ishii et al. 1993). Az NR3 alegységek szintén közel 27%-os homológiát mutatnak az NR1- illetve az NR2-alegységekkel (Ciabarra és mtsai., 1995). A m űköd őképes NMDA receptorokat

24 általában NR1 alegységek és legalább egy NR2-alegység vagy NR1, NR2 és NR3 alegység egyidej űleg építi fel. Eml ős agyban az NR2 és az NR3 alegységek térben és id őben különböz ő módon expresszálódnak (Watanabe és mtsai., 1992, 1993; Monyer és mtsai. 1992; Sheng és mtsai., 1994; Zhong és mtsai., 1995; Wenzel és mtsai., 1997; Kew és mtsai., 1998a) és az NR1 koexpressziója egy vagy több NR2 alegységel különböz ő funkcionális és farmakológiai tulajdonságokkal rendelkez ő receptorokat eredményez, melyek a natív receptorokhoz hasonlítanak (Monyer et al. 1992; Kutsuwada et al. 1992). Eml ősők és rágycsálók agyában az NR2A és az NR2B alegységek expressziója dominál az el őagyban, míg az NR2C alegység nagymértékben expresszált a kisagyi szemcsesejtekben és a különféle magvakban, az NR2D expressziója szorosan köt ődik a diencephalonhoz és a középagyhoz és a korai fejl ődés id őszaka alatt kifejezettebb (Kutsuwada és mtsai., 1992; Monyer és mtsai., 1992, 1994; Ishii és mtsai., 1993; Rigby és mtsai., 1996). Az NR3 alegységek behatárolt térbeli és id őbeli eloszlást mutatnak, az NR3A alegység főként a fejl ődés id őszakában expresszálódik (noha néhány neuron-populációban még feln őttkorban is megmarad), az NR3B alegység pedig az agytörzs és a gerincvel ő szomatikus motoneuronjaira korlátozódik (Nishi és mtsai., 2001). Úgy t űnik, hogy az NR3 alegységek nem tudnak m űköd őképes NMDA receptorokat képezni amikor csak NR1 vagy csak NR2 alegységekkel expresszálódnak egyszerre (azaz NR1/NR3 vagy NR2/NR3 összetétel ű receptorok jönnek létre), ugyanakkor megfigyelték, hogy a Xenopus oocytában NR1-el együtt expresszálódó NR3 alegységek excitátoros glycin-receptorokat képeznek, melyekre nincs hatással a glutamát vagy az NMDA (Chatterton és mtsai., 2002). Abban az esetben, ha az NR3 alegység egyidej űleg expresszálódik az NR1 és NR2 alegységekkel (vagyis NR1/NR2/NR3 összetétel ű receptor jön létre), az NR3 alegység elnyomja az NMDA csatorna egységes vezetését és Ca 2+ - permeabilitását az NR1/NR2 összetétel ű receptorokhoz képest (Ciabarra és mtsai., 1995; Nishi és mtsai., 2001; Matsuda és mtsai., 2002; Sasaki és mtsai. 2002). Ezen felfedezésekkel egyez ően ko-immunoprecipitációs tanulmányok felvetik, hogy az NR1, NR2 és NR3 alegységek a natív, egyedülálló receptor-komplexekben együttesen létezhetnek (Al-Hallaq és mtsai., 2002).

25 Ráadásul az NR3A alegységgel nem rendelkez ő egereknél emelkedett NMDA-mediált áramokat és emelkedett tüske s űrűséget találtak a corticalis neuronokban (Das és mtsai., 1998). Ezek alapján úgy t űnik, hogy a natív NMDA receptorok vagy egy NR1 alegység és egy vagy több NR2 alegység kombinációjából épülnek fel (NR1/NR2A, NR1/NR2B vagy NR1/NR2A/NR2B) vagy egy NR1 alegység és NR2 valamint NR3 alegységek kombinációjából (NR1/NR2A/NR3A). Azon receptorokban, melyek tartalmazzák mind a három típusú alegységet (NR1, NR2 és NR3), úgy t űnik, hogy az NR3 alegység helyettesíti az egyik NR2 alegységet. Az NMDA receptor ioncsatorna-komplexében számos kötőhely található és az oda beköt ődő anyagok gátló, aktiváló vagy m űködést fokozó hatást váltanak ki (Kemp és McKernan 2002). Számos anyag, mely ezeken a köt őhelyeken hat vizsgálatok tárgya volt a központi idegrendszer különféle betegségeire ható új terápiás szerek kifejlesztése céljából. A leggyakrabban használt agonista az NMDA receptorok glutamát-felismer ő köt őhelyén (mely az NR2 alegységeken helyezkedik el) maga az NMDA. Alacsony szelektivitással rendelkezik a receptor altípusokra és a glutamátnál alacsonyabb a hatékonysága, nem egészen „full”-agonista, nem szubsztrátja a glutamát uptake-nek, ezekb ől adódóan sokkal hatékonyabb az intakt preparátumokban. Ugyanakkor nagyon jó szelektivitást mutat a non-NMDA ionotróp és metabotróp glutamát receptorcsaládokkal szemben. Számos vegyületr ől mutaták ki, hogy agonista vagy parciális agonista hatású az NR1 alegységen elhelyezked ő glycin ko-agonista köt őhelyen. A D-serine a glicinhez hasonló affinitással és intrinzik aktivitással rendelkezik, úgyszintén az ACPC (1-amino- cyclopropanecarboxylic acid) is (Priestley és Kemp 1994), ugyanakkor magas koncentrációban kompetitív antagonistaként hat a glutamát köt őhelyen (Nahum-Levy és mtsai., 1999). Az NMDA receptor antagonistáit anesztetikumként használják állatok és bizonyos esetekben emberek számára, hallucinogén hatásaik miatt pedig gyakran “szórakozási” (recreational) drogokként. Amennyiben az NMDA antagonistákat nagy dózisban adják rágcsálóknak, akkor egy olyan agykárosodást okozhatnak, ami Olney-féle lézióként ismert.

26 Az NMDA receptor glutamát-felismer ő köt őhelyének számtalan kompetitív antagonistáját azonosították és szintetizálták (pl. AP-5). Annak ellenére, hogy ezen vegyületek rendelkeznek in vivo aktivitással, magas töltéss űrűségük miatt csak igen kismértékben jutnak át a vér-agy gáton. Az el őbbiekhez hasonlóan számtalan glicin-köt őhely antagonistát azonosítottak. Ezen anyagok full-agonistaként hatnak a glicin-köt őhelyen, vagyis kell őképpen magas koncentrációban képesek teljes mértékben gátolni az NMDA-válaszokat. Ezzel ellentétben, az alacsony hatáser ősség ű parciális agonisták, melyek a fiziológiás módon aktivált NMDA receptorok inkomplett antagonistáiként hatnak pyrrolidone- származékok, HA-966 és közülük a leger ősebb az L-687,414. Utóbbi - a kinurénsav- származékoknál sokkal alacsonyabb affinitású anyagok- jó orális biológiai hasznosulást mutatnak, átjutnak a vér-agy gáton és ezáltal meglehet ősen hatékony in vivo aktivitással rendelkeznek (Gill és mtsai., 1995) és a full-agonistáknál el őnyösebb terápiás profiljuk van (Priestley és mtsai., 1998). Általában a glicin-köt őhely antagonistái és parciális agonistái csak alacsony receptor altípus-szelektivitást mutatnak. Az NMDA receptor csatorna-blokkolói közül kerültek ki a hatékony, szelektív, gyógyszer-szer ű antagonisták. Az els őként azonosított szelektív NMDA receptor antagonisták a ketamin és a phencyclidin volt (Anis és mtsai., 1983), kés őbb viszont a dizocilpin-ről (MK-801) bizonyosodott be, hogy nagyon hatékony, in vivo aktivitást mutató antagonistája az NMDA receptornak (Wong és mtsai., 1986). Ezután alacsonyabb affinitású anyagokra is rábukkantak, mint például az 1,3-dimethyl- 5-aminoadamantane (memantine) (Bormann 1989; Parsons és mtsai., 1995), melyet humán használatra is engedélyeztek (Farlow 2004). Ezek az anyagok úgynevezett „open-channel” gátlók, melyek magas affinitásuk és irreverzibilitásuk miatt nagyon meredek dózis-hatás görbékkel rendelkeznek. Ennek következtében a terápiás és a váratlan mellékhatásaik alig vagy egyáltalán nem választhatók szét. Mindamellett úgy tűnik, hogy az olyan kisebb affinitású anyagok, mint például a memantine (melynek gyorsabb a reverzibilitása) alacsonyabb hatékonysága mellett is el őnyösebb hatású. Az NMDA receptor pozitív alossztérikus modulátorai közül az els őként felismert NMDA receptor m űködést potenciáló anyagok a poliaminok, a spermin és a spermidin voltak (Ransom és Stec 1988). Úgy t űnik, ezen anyagok két mechanizmus révén képesek növelni az NMDA receptor m űködését: egy glicin-függ ő mechanizmus

27 (melynek lényege a receptor glicin iránti affinitásának növelése) illetve egy glicin- független mechanizmus révén (mely szaturáló glicin-koncentrációk jelenlétében áll fenn és csak az NR2B alegységet tartalmazó receptorokra jellemz ő) (Williams 1997). A spermin, a spermidin és a poliamin köt őhelyen aktív többi anyag nagymérték ű pozitív töltéssel rendelkezik és ez megnehezíti a szisztémásan aktív szerek hozzáférését ehhez a köt őhelyhez. A magnézium utánozza a poliaminok valamennyi potencírozó hatását (Kew és Kemp 1998) és ezáltal endogén liganddá válhat ezen köt őhely számára (Paoletti és mtsai., 1995). Azon aminoglikozid antibiotikumok, melyek több mint három amino-csoportot tartalmaznak szintén képesek potencírozni az NMDA receptorokat egy olyan mechanizmussal, amely részben a poliamin köt őhely által közvetített (Masuko és mtsai., 1999; Harvey és Skolnick 1999). Az NMDA receptorok egy másik potencírozója (mely az el őzőekt ől különböz ő mechanizmus révén hat) az endogén neuroszteroid pregnenolon szulfát (Malayev és mtsai., 2002). A Mg2+ ionok feszültségfügg ő módon gátolják a receptor csatornáját, ugyanakkor pozitív membrán potenciál esetén képesek potencírozni az NMDA-kiváltotta válaszokat. Régebb a magnézium-kezelést a depresszió tüneteinek gyors javítására is használták (Eby GA és Eby KL, 2006). A Na +, K + és a Ca 2+ -ionok nemcsak áthaladnak az NMDA receptor csatornáján, de képesek szabályozni annak m űködédét is. A Zn 2+ ionok nemkompetitív, feszültség-független módon képesek gátolni az NMDA- áramokat. Az NMDA receptor m űködését kifejezetten befolyásolja az úgynevezett “redox-szabályozó hely”-en keresztül a kémiai redukció és az oxidáció. Ezen a támadásponton keresztül a redukáló vegyületek drámai módon megnövelik az NMDA csatorna aktivitását, míg az oxidánsok vagy megfordítják a redukáló anyagok hatását vagy gátolják a receptor natív válaszát (Aizenman és mtsai., 1989). Az NMDA receptorok farmakológiájának valószín űleg egyik legfontosabb felfedezése az olyan kifejezetten alítpus-szelektív antagonisták azonosítása volt, melyek allosztérikus módon, az NR2 alegység extracellulárisan található N-terminális doménjével interakcióba lépve felytik ki hatásukat (Perin-Dureau és mtsai., 2002; Malherbe és mtsai., 2003c). Legtöbbjük szelektív az NR2B alegységet tartalmazó receptorokra. Számos ifenprodil-származékot vizsgáltak meg az els ő NR2B altípus-

28 szelektív antagonista azonosításáig (Williams, 1993). Olyan, az NR2B alegység iránt nagy affinitással és szelektivitással rendelkez ő anyagokat fedeztek fel, meylek átjutnak a vér-agy gáton és szisztémás aktivitással is rendelkeznek. Ilyenek például a Troxoprodil/CP101, 606 (Chenard és mtsai., 1995), vagy a Ro 25-6981 (Fischer és mtsai., 1997), Az NR2A altípus specifikus gátlószere az (1RS,1 ′S)-PEAQX (Auberson és mtsai., 2002) illetve ennek aktív diasztereomere, az NVP-AAM077 (Chaperon és mtsai., 2003), mely már nanomoláris koncentrációban is 100-szor nagyobb affinitást mutat a humán NR1/NR2A receptorok iránt, az NR1/NR2B receptorokhoz képest, és szisztémás adagolás esetén in vivo is van hatása. Az NMDA receptorok kritikus szerepet játszanak az excitátoros típusú szinaptikus neurotranszmisszióban és plaszticitásban. Ugyanakkor, egyedi csatorna-jellemz őiknek következtében (mint a nagymérték ű Ca 2+ -permeabilitás, a relatíve lassú aktivációs illetve dezaktivációs kinetika, és a Mg 2+ okozta feszültségfügg ő gátlás, melyet a depolarizáció megsz űntet), bonyolult módon részt vesznek a tanulás és a memória molekuláris mechanizmusaiban (Massey és mtsai., 2004). Másrészt, az NMDA receptorok kóros körülmények között bekövetkez ő krónikus túlingerlése excitotoxicitáshoz és sejtpusztuláshoz vezet (Zhou és Baudry 2006).

Monoamin uptake gátló antidepresszánsok hatása az NMDA receptorokra. Az NMDA receptorok és a nAChR-ok közös sajátságai. Az ionotróp receptor-családok közt fennálló szerkezetbeli eltérések ellenére a nAChR- ok és az NMDA receptorok rendelkeznek néhány közös farmakológiai tulajdonsággal, mivel a megfelel ő csatornablokkoló-típusú antagonistáik, a mekamilamin illetve a dizocilpin (MK-801) úgynevezett “kereszt-gátlás”-t mutatnak, azaz, a nAChR antagonista mekamilamin gátolja az NMDA receptorok m űködését (Snell és Johnson, 1989), illetve a szintén csatornablokkoló NMDA receptor antagonista MK-801 képes gátolni a nAChR-okat (Ramoa és mtsai, 1990). Azon megfigyelésekre alapozva, hogy a monoamin uptake gátló-típusú antidepresszánsok a mekamilaminhoz hasonló módon, csatorna-blokkoló mechanizmus révén képesek antagonizálni a nACh receptorokat (Lerner-Marmarosh és mtsai., 1995; Garcia-Colunga és mtsai., 1997; Maggi és mtsai., 1998), azt feltételeztük, hogy az NMDA antagonizmus szintén egy általános

29 jellegzetessége lehet az uptake-gátló antidepresszánsoknak (3. ábra). Jelen munkánk során egyik célunk az volt, hogy ellen őrizzük ezen feltételezést (lásd „Célkit űzések”).

Monoamin transzporterek

Monoamin uptake gátló - ? típusú antidepresszánsok (desipramin, fluoxetin)

NMDAR nAChR KERESZT-GÁTLÁS

MK -801 Mekamilamin

3. ábra. A nAChR és az NMDA receptorok csatorna gátló antagonistái egymásra kölcsönösen hatnak. A monoamin transzporter gátló antidepresszánsok a csatorna gátló mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal, nem-kompetitív módon gátolják a nAChR-ok m űködését. Felmerül a kérdés, hogy vajon a fenti farmakológiai hasonlóság alapján, a nAChR-okat gátló antidepresszánsok befolyásolják-e az NMDA receptor m űködését is?

Az ATP receptorok A harmadik ionotróp receptor-család az úgynevezett ATP-vezérelt csatornák, másnéven ionotróp purinerg receptorok családja. Ezek trimer szerkezet űek. Képvisel őjük a P2X-receptor. A P2X-receptorok nem-szelektív kationcsatornák, melyek az extracelluláris ATP beköt ődésekor nyílnak ki. Mivel a P2X receptoroknak relatíve magas a Ca 2+ permeabilitásuk (Egan és Khakh, 2004; Rogers és mtsai., 1997), ezen tulajdonságuk képessé teszi őket arra, hogy a receptor ioncsatornáján keresztül létrejöv ő Ca 2+ beáramlás révén neurotranszmitter felszabadulást váltsanak ki, vagy el ősegítsék a

30 Ca 2+-függ ő neurotranszmitter felszabadulást, feltéve ha a release site-ok közelében helyezkednek el. Az ATP a P2X receptor extracelluláris hurok-részéhez köt ődik, ezáltal az ioncsatorna konformáció-változását hozva létre, ami azt eredményezi, hogy megnyílik az ionok számára permeábilis pórus, lehet ővé téve a Na + és Ca 2+ ionoknak a sejtbe történ ő bejutását és ennek következtében a sejtmembrán depolarizációját valamint különféle, Ca 2+ -szenzitív intracelluláris folyamatok aktivációját. A csatornanyitás id őtartama a receptor alegység-összetételét ől függ, míg a P2X 1 és a P2X 3 receptorok az ATP folyamatos jelenléte ellenére gyorsan deszenzitizálódnak (néhányszáz milliszekundum alatt), addig a P2X 2 receptor csatornája mindaddig nyitott állapotban marad, amíg az ATP köt ődik a receptorhoz. Három ATP molekula szükséges egy P2X receptor aktivációjához, ami azt sugallja, hogy az ATP-nek minden egyes alegységhez köt ődnie kell ahhoz, hogy a csatorna kinyíljon, a legújabb bizonyítékok is azt valószín űsítik, hogy az ATP három alegység határterületéhez (interface) köt ődik (Evans 2008). A pontos mechanizmus, amivel az ATP beköt ődése kiváltja a P2X receptor csatornájának kinyílását még nem teljesen tisztázott, de jelenleg is vizsgálatok tárgyát képezi (Egan és mtsai., 2006).

A P 2X -receptorokat eddig a legkülönfélébb szervezetekben sikerült kimutatni: ember, egér, patkány, nyúl, csirke, am őba stb. (North, 2002). Minden m űköd őképes P2X - receptor három fehérje alegységb ől felépül ő trimer, mely alegységek egy, az ionok számára átjárható csatornát zárnak közre (Nicke és mtsai., 1998). A P2X receptor alegységek 379-595 aminosavból álló polipeptid láncok, két transzmembrán-doménnel (TM1 és TM2), egy széles extracelluláris hurokkal és egy intracelluláris karboxi- valamint egy amino-terminális résszel (Khakh, 2001; Valera és mtsai., 1994).

Napjainkig hét darab, különböz ő P2X -receptor alegységet kódoló gént azonosítottak, melyek által kódolt alegységeket P 2X1 -P2X7 –ként tartanak számon (North, 2002; Gever és mtsai., 2006). Minden egyes alegységet egyedi kinetika és farmakológiai fenotípus jellemez (North és Surprenant, 2000). Az alegységek különböz ő, homo- vagy heterooligomer társulásával jönnek létre a m űköd őképes receptorok. A lehetséges kombinációk közül eddig 16-ról bizonyosodott be, hogy m űköd őképes (Torres és mtsai., 1999). Ezek zöme homooligomer receptor, kivéve a P2X6-ot, mely homooligomer formában nem m űköd őképes, a többi receptor pedig heterooligomer,

31 melyek felépítésében a P2X1-P2X6 alegységek vesznek részt. Mindamellett nemrég kiderült, hogy N-glikoziláció révén még a homomer P2X6 receptor is m űköd őképes lehet (Jones és mtsai., 2004). Ezzel szemben a P2X7 receptor csak homooligomer formában m űköd őképes és a P2X7 alegység nem társul egyetlen másik ismert P2X alegységgel sem. A P2X receptorok átjárhatók úgy a monovalens (Na+, K+) mind a divalens (Ca2+) kationok számára és a receptor aktivációja egy befele irányuló ionáramot idéz el ő, ezáltal a sejtmembrán helyi depolarizációját okozva, ezenkívül a Ca2+ beáramlás a receptor ioncsatornáján keresztül képes közvetlen módon kiváltani a transzmitter felszabadulást. Ráadásul, elhúzódó vagy ismételt agonista alkalmazása esetén egyes P2X receptoroknál (különösen a a P2X7 receptor esetén) az ioncsatorna kitágulása következik be és ennek következményeképp a csatorna átereszt ővé válik 800 Da-nál nagyobb méret ű kationok számára is (Sperlágh és mtsai., 2007). A P2X receptorok alapvet ően az ATP-re illetve annak különb őző szintetikus analógjaira érzékenyek, míg az AMP-re és az adenozinra nem, ugyanakkor a homomer P2X receptorok ligand-köt ő profilja jól meghatározott (North és Surprenant 2000; Gever és mtsai., 2006). A heteromer receptorok farmakológiája kevésbé ismert, ez alól kivételt képez a P2X2/3, P2X2/6, P2X1/2, P2X1/4, P2X1/5, és a P2X4/6 receptor, melyek farmakológiai jellemz őit már leírták (Nicke és mtsai., 2005; Le és mtsai., 1998; Lewis és mtsai., 1995; Brown és mtsai., 2002; King és mtsai., 2000; Torres és mtsai., 1998). A P2X receptorok széleskör ű eloszlást mutatnak a legkülönfélébb szövetek sejtjein. Mindenütt a központi, a perifériás valamint az autonóm idegrendszer pre- és posztszinaptikus idegvégz ődésein a P2X receptorok a szinaptikus jelátvitelt szabályozzák (North RA 2002, Burnstock G 2000). Ráadásul a P2X receptorok képesek a szívizom, a vázizmok és számos símaizom (érrendszer, vas deferens, vízhólyag stb.) sejtjeinek összehúzódását is kiváltani. A P2X receptorok a fehérvérsejteken (beleértve a limfocitákat és makrofágokat) is expresszálódnak, valamint jelen vannak még a trombocitákon is. Egy adott P2X receptor farmakológiai tulajdonságait nagymértékben befolyásolja az alegység-összetétele (Gever és mtsai., 2006). A különböz ő alegységek különböz ő

32 érzékenységet mutatnak az olyan purinerg agonistákra, mint az ATP, az α,β-meATP és a BzATP, illetve az olyan antagonistákra, mint a PPADS és a suramin (North 2002).

Továbbra is érdekl ődés tárgya az a tény, hogy egyes P2X receptorok (P2X 2, P2X 4, humán P2X 5, és P2X 7) az ATP-re adott válasz során többféle “open state” állapotot mutatnak, melyt az jellemez, hogy id ő-függ ő módon megnövekedik a permeabilitásuk olyan nagyméret ű szerves ionok számára, mint például az N-methyl-D-glucamine (NMDG +) és a nukleotid-köt ő festékek számára, mint a propidium-jodid (YO-PRO-1). Az még nem pontosan tisztázott, hogy ez a permeabilitás-változás a P2X receptor csatornájának kiszélesedésének vagy pedig egy különálló ion-átereszt ő pórus megnyílásának a következménye. Összhangban az egész testre kiterjed ő széleskör ű eloszlásukkal, a P2X receptorok számtalan élettani folyamatban vesznek részt (North, 2002; Khakh és North, 2006). Ezek közé tartozik a szívritmus és a kontraktilitás szabályozása (Vassort, 2001), az érfalak tónusának szabályozása (North, 2002), a fájdalomérzékelés közvetítése ( Chizh és Illés, 2001) (így például a gerincvel ői P2X4 receptorok up-regulációja kapcsán hiperszenzitivitás lép fel az egyébként fájdalmat nem okozó ingerekre is), a vas deferens összehúzódásának szabályozása az ejakuláció során ((North, 2002). Régóta ismert, hogy az ATP extracelluláris messengerként hat a kardiovaszkuláris rendszerben (Drury és Szent-Györgyi, 1929). A szimpatikus idegvégz ődésekben a neuronális aktivitás hatására a noradrenalinnal egyszerre szabadul fel (Fredholm és mtsai., 1982; Sperlágh és Vizi, 2000), de ugyanakkor posztszinaptikus célsejtekb ől is felszabadulhat (Vizi és Sperlágh, 1999; Vizi és mtsai., 1992), így például az endotélsejtekb ől (Milner és mtsai., 1990; Yang és mtsai., 1994) és a szívizomsejtekb ől energiadepriváció hatására (Borst és Schrader, 1991). Az ATP többféle ionotróp (P2X) illetve metabotróp (P2Y) receptor altípust aktivál, ezáltal szabályozva a miokardiális működést, a hemosztázist és az endotélium proliferációját (Boarder és Hourani, 1998; Rongen és mtsai., 1997). Az idegrendszerben a P2X receptorok közvetítik az extracelluláris ATP jól ismert gyors transzmitter hatását a neuro-neuronális (Edwards és mtsai., 1992) valamint a neuro- effektor szinapszisokban (Evans és mtsai., 1992). A P2X receptorok megtalálhatók a kolinerg idegvégz ődések preszinaptikus részén (Sperlágh és Vizi, 1991; Sun és Stanley, 1996), ezen kívül részt vesznek a glutamát (Gu és MacDermott, 1997), a dopamin

33 (Zhang és mtsai., 1996) és a GABA felszabadulásának szabályozásában (Hugel és Schlichter, 2000). Kimutatták, hogy a szív szimpatikus idegeib ől a noradrenalin felszabadulását a preszinaptikus P2X receptorok szabályozzák. Ezen receptor farmakológiai fenotípusa hasonlít a homo-oligomér P2X3 és a hetero-oligomér P2X2/P2X3 receptorokhoz, egybehangzóan azzal a ténnyel, hogy a receptor alegységének mRNS-e expresszálódik az SCG-ben (Sperlágh és mtsai., 2000). Ezen receptorok támadáspontjai lehetnek a különféle helyekr ől felszabaduló endogén ATP-nek (Sperlágh és Vizi, 2000) illetve a nem-szinaptikus módon ható gyógyszereknek (Vizi, 2000) a kardiovaszkuláris rendszer szintjén. A P2X receptorok szerepe a monoaminok felszabadulásában A perifériás idegrendszerben az ATP preszinaptikus serkent ő hatását a noradrenerg jelátvitelre els őként 1987-ben írták le nyúl fül-artéria esetén (Miyahara és Suzuki 1987). Ezt követ ően bebizonyították az ATP és a metabolikusan stabil analógjának, az α,β- methylene-ATP-nek a [ 3H]noradrenalin felszabadulásra gyakorolt serkent ő hatását PC12 sejtekben (Inoue és mtsai., 1989) és tengerimalac ileumában (Sperlágh és Vízi 1991). Utóbb, a P2 receptorok altípusainak azonosítását követ ően, az el őbbi tanulmányokat felülvizsgálták és azt találták, hogy a szimpatikus idegvégz ődéseken ionotróp P2X receptorok találhatók, mely receptorok aktivációja közvetlen módon kiváltja vagy el ősegíti a stimulációra fellép ő noradrenalin felszabadulást (Boehm és Kubista 2002; Arthur és mtsai., 2007; Queiroz és mtsai., 2003; Sesti és mtsai., 2002; Sperlágh és mtsai., 2000) a receptor ioncsatornáján keresztül történ ő direkt Ca2+ beáramlás révén. Ezen receptorok farmakológiai fenotípusa különbözik: fajtánként, a szimpatikus idegrendszeri ingerületátviteli helyenként, s őt, még egyazon neuron sejttestje és idegvégz ődései között is. Ennélfogva, patkány szimpatikus neuronjainak tenyészetében egy α,β-methylene ATP-inszenzitív P2X-szer ű receptort sikerült azonosítani (Boehm 1999), míg tengerimalac jobb pitvarában azt találták, hogy az α,β- methylene ATP serkenti a noradrenalin felszabadulást és ezen folyamatot mediáló receptor farmakológiai profilja hasonló volt a P2X3 vagy a P2X2/P2X3 receptorokéhoz, egybehangzóan azzal a ténnyel, hogy ezen P2X receptortípusok mRNS-e expresszálódik a szimpatikus dúcokban (Sperlágh és mtsai., 2000).

34 Egy másik tanulmány kimutatta, hogy patkány vas deferens-ben a noradrenalin felszabadulást facilitáló P2X receptorok a következőek: P2X1, P2X3, vagy P2X2/P2X3 receptorok (Queiroz és mtsai., 2003). Ellenben úgy t űnik, hogy egér szimpatikus neuron-tenyészetben az idegvégz ődések nem expresszálnak serkent ő típusú nukleotid- érzékeny receptorokat (Norenberg és mtsai., 2001). Jelent őséggel bír, hogy ezen receptorokat valószín űleg endogén módon aktiválja a folyamatban lev ő neuronális m űködésre válaszul felszabaduló ATP (Sperlágh és mtsai., 2000; Boehm 1999) illetve tengerimalac, sertés és humán szív esetén (Sesti és mtsai., 2003; Machida és mtsai., 2005) a szívizom ischemia során felszabaduló ATP, ami által ezek a receptorok képesek hozzájárulni az ischemia által kiváltott arritmiákhoz és az ischemiás szívm űködés-zavarokhoz. A patkány központi idegrendszerében, a locus coeruleus (LC) neuronjain találhatók ATP-szenzitív, P2X-szer ű receptorok, melyek a spontán akciós potenciálok kisülését segítik el ő (Frohlich és mtsai., 1996). Facilitátoros P2X receptorokat leírtak még a hippocampust beidegz ő noradrenerg axonterminálisokon, és a homomer P2X1 és P2X3 receptorokat azonosították, mint az ezen hatásért legvalószín űbben felel ős alegységeket (Papp és mtsai., 2004). A kardiovaszkuláris rendszer szintjén a P2X receptorok számos folyamat szabályozásában vesznek részt. Így például a patkány jobb pitvarában az ATP és az UTP pozitív ionotróp hatását közvetítik (Froldi és mtsai, 2001); növelik a szívfrekvenciát (Anikina és mtsai., 2005), stimuláló hatást közvetítenek a szívizom kontraktilitásra (Hu és mtsai., 2001); megemelik az átlagos artériás vérnyomást (Tarasova és mtsai., 1998); az erek símaizomsejtjein keresztül vazokonstrikciót okoznak (Rongen és mtsai., 1997), ugyanakkor azt is megfigyelték, hogy krónikus szívbetegségben szenved ők baloldali miokardiumában a P2X6 receptorok up- regulálódtak (Banfi és mtsai., 2005). A preszinaptikusan elhelyezked ő P2X receptorok szabályozzák a noradrenalin felszabadulását a szívben (Sperlágh és mtsai., 2000).

35 4. CÉLKIT ŰZÉSEK El őzetes eredményeink alapján két f ő témakörben kívántunk vizsgálatokat végezni:

I. Témakör.: Milyen módon és mértékben befolyásolják a monoamin transzporterekre ható különböz ő típusú antidepresszánsok (maprotilin, tianeptin, desipramin, fluoxetin) a központi idegrendszer ligand-vezérelt ionotróp receptorainak m űködését?

Célkit űzés 1. Atípusos antidepresszánsok hatásának vizsgálata a központi idegrendszer nikotinikus acetilkolin receptoraira (nAChR) Munkacsoportunk korábbi eredményei bizonyították, hogy a különböz ő monoamin uptake gátló vegyületek (nomifensin, kokain, desipramine, fluoxetin stb.) szerkezetükt ől és szelektivitásuktól függetlenül gátolni képesek a központi idegrendszer nAChR-ait. Részben ezen eredményekre alapozva kidolgozásra került a depresszió egy új elmélete (Shytle és mtsai, 2002), mely a tünetek kialakulását a nAChR-ok túlingerl ődésével, az antidepresszánsok hatását pedig ezen receptorok gátlásával magyarázza. Kísérleteinkben ezt az új elméletet kívántuk vizsgálni oly módon, hogy egy olyan atípusos antidepresszáns, a tianeptin nAChR-ra gyakorolt hatását vizsgáltuk, mely a monaomin teóriával nem összeegyeztethet ő módon hat, mivel a szerotinin visszvételét serkenti. Ezen kívül egy további, eddig még nem vizsgált antidpresszáns, a NA uptake gátló maprotilin hatását is vizsgáltuk a nikotin-kiválotta NA-felszabadulásra patkány hippocampus szeletekb ől.

Célkit űzés 2. Monoamin uptake gátló típusú antidepresszánsok hatásának vizsgálata a központi idegrendszer NMDA receptoraira Korábbi eredményeink azt mutatták, hogy monoamin uptake gátló típusú antidepresszánsok a nAChR-ok gátlását a mekamilaminéhoz hasonló csatornablokkoló mechanizmussal érik el. Mivel a nAChR és az NMDA receptor csatornablokkoló típusú antagonistái egymást kölcsönösen gátolják (Snell és Johnson, 1988; Ramoa és mtsai, 1990), felmerül a kérdés, hogy vajon az antidepresszánsok a nAChR-okon kívül az NMDA receptorok m űködését is befolyásolják-e? Ennek tanulmányozására az SSRI típusú fluoxetin és a triciklikus desipramin NMDA-kiváltotta NA-felszabadulásra gyakorolt hatását vizsgáltuk patkány hippocampus szeletekb ől.

36 Célkit űzés 3. Monoamin uptake gátló típusú antidepresszánsok hatásának vizsgálata a perifériás idegrendszer P2X receptoraira Korábbi eredményeinkre való tekintettel, melyek bebizonyították, hogy a triciklikus desipramin valamint az SSRI típusú fluoxetin nAChR-antagonista tulajdonságokkal rendelkezik, ki akartuk terjeszteni ezen antidepresszánsok hatásának vizsgálatát az ionotróp receptorok családjának más képvisel őire is. Kísérleteinkben arra a kérdésre kerestük a választ, hogy vajon a nAChR gátló hatású desipramin és fluoxetin rendelkezik-e egyidej űleg a purinerg jelátvitelben résztvev ő, ionotróp típusú P2X receptor gátló hatással is ? A kérdés vizsgálatára ezen antidepresszánsok ATP-kiváltotta NA-felszabadulásra gyakorolt hatását vizsgáltuk tengerimalac jobb pitvar-preparátumon.

II. Témakör.: Milyen módon és mértékben befolyásolják az ionotróp receptorokra ható csatorna blokkoló típusú receptor antagonisták (MK-801, mekamilamin) a központi idegrendszer monoamin transzportereinek m űködését ?

Célkit űzés 4.: Csatorna-blokkoló típusú ionotróp receptor antagonista vegyületek hatásának vizsgálata a striatális dopamine (DA) felszabadulásra. Az els ő témakörben végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a monoamine uptake gátló típusú antidepresszánsok gátolják mind a nAChR-ok mind az NMDA receptorok működését, és a gátlás az irodalmi adatok alapján nagy valószín űséggel csatorna blokkoló mechanizmussal történik. Mivel az elmúlt évtized eredményei azt mutatják, hogy a monoamin transzporterek is rendelekeznek csatornaszerr ű tulajdonságokkal, melyek fontos szerepet játszanak a transzmitterek visszavételének mechanizmusában, tanulmányozni kívántuk hogy a nAChR és NMDA receptor csatorna blokkoló antagonistái befolyásolják a monoamin transzporterek m űködését. A kérdés vizsgálatára a nAChR antagonista mekamilamin illetve az NMDA receptor antagonista MK-801 (dizocilpin) hatását vizsgáltuk a striatum extracelluláris DA- szintjére in vivo mikrodialízis technika segítségével

37 5. MÓDSZEREK

5.1. In vitro szeletperfúziós technika 5.1.1. Tríciált noradrenalin [ 3H]NA felszabadulás mérése patkány hippokampusz szeletb ől Az összes, állaton végzett kísérletet a hatályos állatvédelmi törvénnyel összhangban, az Állatetikai Bizottság által engedélyezett módon végeztük. Kísérleteinkben 150-200 g súlyú hím Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat nyaktiló segítségével dekapitáltuk, agyukat gyorsan eltávolítottuk és hideg, buborékoltatott Krebs-oldatba helyeztük. Mindkét hippocampust kipreparáltuk, majd egy McIlwain chopper segítségével 400 µm vastagságú szeletekre vágtuk. A szeleteket 45 percig inkubáltuk 37 °C-on 1 ml, 10 µCi tríciummal jelölt noradrenalint (30-50 Ci/mmol specifikus aktivitású [ 3H]NA)-t tartalmazó, folyamatosan buborékoltatott

Krebs oldatban (összetétele mM-ban: NaCl 113, KCl 4.7, CaCl 2 2.5, KH 2PO 4 1.2,

MgSO 4 1.2, NaHCO 3 25, glükóz 11.5, aszkorbinsav 300 µM, Na 2EDTA 30 µM). Az inkubációs id ő leteltével az agyszeleteket, kamránként négyet, egy alacsony térfogatú, 4 csatornás mikroperfúziós készülékbe helyeztük (Vizi és mtsai, 1985). A karbogénnel

(95 % O 2, 5 % CO 2) buborékoltatott Krebs oldatot 0.6 ml/perc sebességgel áramoltattuk a kamrákon át. Az els ő hatvan percben, az ú.n. preperfúzió során, az idegsejtek varikozitásai által fel nem vett, extracellulárisan megmaradó neurotranszmittert mostuk ki (nem gy űjtöttük a kifolyó oldatot), majd ezt követ ően 3 perces mintákat szedtünk. A nyugalmi transzmitter felszabadulás vizsgálata során nem alkalmaztunk elektromos ingerlést, az agonista ( nikotin, NMDA) csak a 6-7. frakció alatt volt jelen, ezzel szemben a vizsgálni kívánt anyagok (maprotilin, tianeptin, desipramin, fluoxetin) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen voltak. Az NMDA-receptor vizsgálata során Mg 2+ -mentes Krebs-oldatot használtunk. A nyugalmi felszabadulást vizsgáló kísérletekben 12-15 frakciót gy űjtöttünk. Az elektromos ingerlés kiváltotta felszabadulás vizsgálata esetén a kísérlet során kétszer, a 3. és a 13. frakcióban alkalmaztunk elektromos téringerlést (60 V, 2 Hz, 1 ms impulzus szélesség, 240 impulzus) egy Grass S88 stimulátor segítségével. Az anyagokat általában a 8. frakció után kezdtük adni, összesen 19 frakciót gy űjtöttünk.

38 A kísérletek végén az agyszeleteket 500 µl 10 %-os triklórecetsav oldatba tettük és egy ultrahangos homogenizáló segítségével elroncsoltuk. A gy űjtött mintákból 500 µl-t, a szöveti homogenizátum felülúszójából 100 µl-t mértünk 2 ml szcintillációs koktélhez (Ultima Gold, Packard) majd egy Packard 1900TR típusú folyadékszcintillációs mér őműszer segítségével meghatároztuk a keverékek radioaktivitását. Az aktivitást Bq/g-ban illetve frakcionális release-ben (FR) adtuk meg. Az FR érték a minta radioaktivitásának és a minta gy űjtésének megkezdésekor a szövetben található radioaktivitás értéknek a hányadosa, százalékos formában kifejezve. Az adatok feldolgozását külön, a statisztikai módszerekkel foglalkozó fejezetben ismertetjük.

5.1.2. Tríciált noradrenalin [ 3H]NA felszabadulás mérése tengerimalac jobb pitvar- preparátumból Kísérleteinkben 250-30, 5 µCi tríciummal jelölt 350 g súlyú hím tengerimalacokat használtunk. Az állatokat nyaktiló segítségével dekapitáltuk, a mellkast felnyitva a szívet gyorsan eltávolítottuk és hideg, buborékoltatott Krebs-oldatba helyeztük. A jobb pitvart leválasztottuk a szívr ől és 2 egyforma méret ű darabra vágtuk szét. Kísérletenként 2 db állatot használtunk fel, a két állatból származó fél-pitvarokat külön-külön kezeltük a továbbiak során.A pitvar-darabokat 45 percig inkubáltuk 37 °C-on 1 ml noradrenalint (30-50 Ci/mmol specifikus aktivitású [ 3H]NA)-t tartalmazó, folyamatosan buborékoltatott Krebs oldatban (összetétele mM-ban: NaCl 113, KCl 4.7, CaCl 2 2.5,

KH 2PO 4 1.2, MgSO 4 1.2, NaHCO 3 25, glükóz 11.5, aszkorbinsav 300 µM, Na 2EDTA 30 µM). Az inkubációs id ő leteltével a pitvar darabokat, kamránként egyet, egy alacsony térfogatú, 4 csatornás mikroperfúziós készülékbe helyeztük (Vizi és mtsai,

1985). A karbogénnel (95 % O 2, 5 % CO 2) buborékoltatott Krebs oldatot 0.6 ml/perc sebességgel áramoltattuk a kamrákon át. Az els ő hatvan percben, az ú.n. preperfúzió során nem gy űjtöttük a kifolyó oldatot, majd ezt követ ően 3 perces mintákat szedtünk. A nyugalmi transzmitter felszabadulás vizsgálata során az agonistát (jelen esetben az ATP-t) a 6-7. frakció alatt adagoltuk, a vizsgálni kívánt anyagok (PPADS, desipramin, fluoxetin) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen voltak. Az elektromos ingerlés kiváltotta NA felszabadulás vizsgálata esetén a kísérlet során kétszer, a 3. és a 13. frakcióban alkalmaztunk elektromos téringerlést (60 V, 2 Hz, 1 ms

39 impulzus szélesség, 240 impulzus) egy Grass S88 stimulátor segítségével. A vizsgálni kívánt anyagokat a 8. frakció után kezdtük adni, összesen 19 frakciót gy űjtve. A kísérletek végén a pitvar-feleket 500 µl 10 %-os triklórecetsav oldatba tettük és egy ultrahangos homogenizáló segítségével elroncsoltuk. A gy űjtött mintákból 500 µl-t, a szöveti homogenizátum felülúszójából 100 µl-t mértünk 2 ml szcintillációs koktélhez (Ultima Gold, Packard) majd egy Packard 1900TR típusú folyadékszcintillációs mér őműszer segítségével meghatároztuk a keverékek radioaktivitását. Az aktivitást Bq/g-ban illetve frakcionális release-ben (FR) adtuk meg. Az FR érték a minta radioaktivitásának és a minta gy űjtésének megkezdésekor a szövetben található radioaktivitás értéknek a hányadosa, százalékos formában kifejezve.

5.2. In vivo agyi mikrodialízis technika altatott patkányon Műtét és mintagy űjtés . A módszert a különböz ő anyagok nyugalmi DA felszabadulásra gyakorolt hatásának vizsgálatakor használtuk (Kiss és mtsai, 1999). A hím Wistar patkányokat (280-350 g) uretánnal (1300 mg/kg) elaltattuk, majd sztereotaxikus készülékre (Stoelting, Kiel, USA) helyeztük és egy házi készítés ű koncentrikus dialízis mintavev őt (polyacrylonitrile/sodium methallyl sulphonate kopolimer dializáló membrán, Hospal, Italy: i.d.: 0.22 mm, o.d.: 0.31 mm, aktív membrane hossz 5 mm) ültettünk az állat jobb striátumába (a bregmához viszonyított koordináták: A/P +2.0; M/L 3.0, D/V 8.0 a Paxinos és Watson sztereotaxikus atlasz alapján). A mintavev őt egy módosított Ringer-oldattal perfundáltuk (összetétele mM-ban: NaCl 147, KCl 4.0,

CaCl 2 1.2, MgCl 2 1.0) 2.0 µl/perc sebességgel egy CMA 100 mikrodialízis pumpa segítségével (CMA Microdialysis, Solna, Svédország). A DA szint stabilizálódása után, általában 60 perccel a mintavev ő beültetése után megkezdtük a 15 perces minták gy űjtését. Négy nyugalmi frakció után az állatok a mintavev őn keresztül, a dializáló oldathoz adva kapták a vizsgálni kívánt anyagot (MK-801, mekamilamin, nomifensin) . Az új megemelkedett DA szint általában 1 órán belül kialakult. A testh őmérsékletet f űtőpárna segítségével 37 °C-on tartottuk az egész kísérlet folyamán. A kísérlet végén az állatokat túlaltattuk, az agyat egészben kivettük és formalinba helyeztük egy napra, majd a mintavev ő elhelyezkedését

40 sztereomikroszkópos vizsgálattal ellen őriztük. Csak azokat az adatokat használtuk fel, melyek esetén a mintavev ő a megfelel ő területen volt. Mintaelemzés . A minták dopamin (DA), dihydroxi-fenil-ecetsav (DOPAC) és homovanillin sav (HVA) koncentrációját elektrokémiai detektorral kombinált nagy nyomású folyadékkromatográfiás rendszerrel (HPLC-ECD) határoztuk meg, mely a következ ő elemekb ől állt: Waters M510 HPLC pumpa, Waters M460 elektrokémiai detektor glassy carbon munkaelektróddal (munkapotenciál +650 mV) és a Maxima 820 kromatográfiás szoftver, melynek segítségével gy űjtöttük és elemeztük a kromatogrammokat. Az elválasztást egy Hypersil ODS fordított fázisú oszlopon valósítottuk meg (Hewlett Packard, 5 µm, 100 x 2.1 mm), melyen a mozgó fázist (0.15

M NaH 2PO 4, 1.6 mM Na oktánszulfonsav, 1.0 mM Na 2EDTA és 12 % metanol, pH 3.7) 0.5 ml/perc sebességgel áramoltattuk. Ilyen körülmények között a DA detekciós limitje 1 pg/ minta körüli értéken mozgott.

5.3. Statisztikai analízis

5.3.1. A nyugalmi noradrenalin felszabadulás eredményeinek feldolgozása szeletkísérletekben A frakcionális felszabadulás (fractional release, FR) értékeit normalizáltuk, hogy csökkentsük az egyedi biológiai varianciát. Az anyagadás el őtti három frakció átlagát vettük 100%-nak, és minden frakciót ehhez viszonyítva, normalizált százalékos formában adtunk meg (normalizált frakcionális felszabadulás, nFR). Mivel a FR értékek kiszámítása a szöveti tartalmon alapszik, a különböz ő kísérletekben gyakran igen nagy, nem biológiai okból származó eltérések mutatkoznak. A fent említett normalizálás és a normalizált FR értékek (nFR) használata ezt a hibát küszöböli ki és ezzel mintegy kontrasztosítja, kiemeli a biológiai eredet ű különböz őségeket. A különböz ő módokon (elektromos ingerléssel vagy farmakonnal) kiváltott, fokozódó transzmitter felszabadulást a görbe alatti terület (A) nagyságával jellemeztük.

A = (∑i=10-19 nFR i)nicotine(c) -(∑i=10-19 nFR i)nicotine(0)

41 ahol i a frakciók sorszáma. A nicotine(c)-vel illetve nicotine(0)-val jelölt kifejezések a c koncentrációjú nikotin jelenlétében illetve a nikotin hiányában mérhet ő választ képviselik. Hasonló görbe alatti terület számításon alapuló módszert használtunk az NMDA illetve az ATP hatás értékelésekor is. A közölt adatok 4-10 kísérlet átlagát és az átlag standard hibáját (mean ± S.E.M.) képviselik. A statisztikai elemzést ANOVA-t követ ő Dunnett teszt, illetve ANOVA-t követ ő Student-Newman-Keuls-féle többszörös összehasonlítás segítségével (* p<0.05, ** p<0.01) végeztük.

5.3.2. Az elektromos ingerlés-kiváltotta noradrenalin felszabadulás eredményeinek feldolgozása szeletkísérletekben Az elektromos ingerléses kísérletek esetében az FR értékekkel dolgoztunk, el őször ezeket ábrázoltuk az id ő, azaz a frakciók függvényében. Majd a fent leírt módon kiszámítottuk a két stimulusra (S1 és S2) adott választ jellemz ő két görbe alatti területet, a vizsgált anyagok gátlási értékét pedig az S2/S1 arányból határoztuk meg (S2/S1 az anyag jelenlétében / S2/S1 az anyag hiányában; counterbalanced design, minden egyes gyógyszer-hatást a megfelel ő kontroll értékével hasonlítottunk össze). A gátlási értékek statisztikai analízisét egyutas ANOVA-val, majd Dunnet-teszttel végeztük.

5.3.3. A mikrodialízis kísérletek eredményeinek feldolgozása Itt a mikrodialízis eredmények értékelésénél általánosan elfogadott eljárást alkalmaztuk. A kezelés el őtti három nyugalmi frakció monoamin tartalmának átlagát 100 %-nak tekintettük, és az összes frakció monoamin tartalmát ennek az átlagértéknek a százalékában fejeztük ki. A statisztikai értékelést általában a normalizált értékekkel végeztük, az ábrázolt eredményeknél 4-8 kísérlet átlagát és az átlag standard hibáját (mean ± S.E.M.) tüntettük fel. A statisztikai elemzésben ANOVA-t használtunk ismételt mérésekkel, post hoc tesztként pedig Dunnett tesztet vagy Tukey-Kramer féle többszörös összehasonlítást (* p<0.05 , ** p<0.01).

42 5.4. Felhasznált anyagok

Kísérleteinkben az alábbi anyagokat használtuk: maprotiline hydrochloride (SIGMA), tianeptine hydrochloride (SIGMA), desipramine hydrochloride (SIGMA), fluoxetine hydrochloride (Ely Lilly), (-)- nicotine hydrogen tartarate (SIGMA), ATP (adenosine 5 ′- triphosphate disodium salt) (SIGMA), PPADS (pyridoxal-phosphate-6-azo (benzene- 2',4'-disulfonic acid) tetrasodium salt) (SIGMA) , mecamylamine hydrochloride (SIGMA), (+)-MK-801 hydrogen maleate (RBI, Natick, USA), tetrodotoxin (SIGMA, pargyline hydrochloride (SIGMA), nomifensine maleat (SIGMA), NMDA (N-methyl- D-aspartate) (SIGMA), L-7,8-[3H]noradrenalin ([ 3H]NA, specifikus aktivitás 30-50 Ci/mmol) (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Minden egyéb felhasznált anyag analitikai tisztaságú volt. Az összes anyagot Krebs- oldatban, módosított Ringer-oldatban, fiziológiás sóoldatban vagy desztillált vízben oldottuk fel.

43 6. EREDMÉNYEK

6.1. Monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok (maprotilin, tianeptin) nAChR antagonista tulajdonsága

A nikotin hatása a nyugalmi [ 3H]NA-felszabadulásra patkány hippocampus szeletben A kontroll csatornák esetében a hippocampus szeletek radioaktivitása a 30 perces izotópos feltöltést és a 60 perces preperfúziót követ ően, a perfúzió kezdetekor 3418 ± 79 Bq/mg (mean ± SEM, n=39) volt. A 6-7. frakció során 50 µM-os koncentrációban perfundált nikotin szignifikánsan 3 fokozta a nyugalmi [ H]NA felszabadulást (AUC 6-11 = 1703 ± 101 %, n=39). A NA release–emelkedés átmeneti jelleg ű volt, a nikotin adását követ ő 4 frakción belül visszatért az alapvonalra (4. ábra).

1200 Nikotin 50µM 1050 Mekamilamin 10 µM 900 750

(%) 600

450 H]NA normalizált H]NA 3

[ 300 Nikotin

felszabadulása frakcionális 150 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Frakciók

4. á bra. A hippokampuszban a nikotin-kiváltotta NA-felszabadulást a nemkompetitív nikotin antagonista mekamilamin hatékonyan gátolta, ami azt bizonyítja, hogy a nikotin válasz létrejöttéhez a nAChR-ok aktivációja szükséges.

A nikotin kiváltotta [ 3H]NA felszabadulást dózis-függ ő módon gátolta a nikotin receptor antagonista mekamilamin 0.32 µM-os IC 50 értékkel (5. ábra), 10 µM-os koncentrációban pedig teljes mérték ű gátlást okozott, ami arra utal, hogy a folyamat a nikotin receptorok közvetítésével zajlik le (4. ábra).

44

100

75 Mekamilamin IC = 0.32 µM 50 H]NA felszabadulás H]NA 3 50

(%) gátlása

25

[ Nikotin-kiváltotta 0 -8 -7 -6 -5 -4 Log koncentráció (M)

5. ábra. A mekamilamin dózis-függ ő hatása a nikotin-kiváltotta NA-felszabadulásra. A görbe alatti területet a “Módszerek”-ben leírt egyenlet alapján számítottuk ki. A görbe minden egyes pontja n=4-5 független kísérlet átlagát reprezentálja (átlagok ± standard hiba). Az EC 50 értéket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

A NA reuptake gátló maprotilin és az atípusos antidepresszáns tianeptin hatása a nikotin kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra

A noradrenalin reuptake-gátló maprotilin (0.1-100 µM-os koncentráció-tartományban) a 3. frakciótól kezd ődően, a szerotonin reuptake-fokozó tianeptin (szintén 0.1-100 µM-os koncentráció-tartományban) pedig a mintagy űjtés elkezdését ől végig jelen voltak a mintagy űjtés során. Egyik anyag sem befolyásolta a nyugalmi [ 3H]NA-felszabadulást, ugyanakkor mindkett ő dózisfügg ő módon gátolta a nikotin-kiváltotta választ. A maprotilin IC 50 értéke 5.7 µM, a tianeptiné pedig 11.32 µM volt (6. ábra).

A nikotin kiváltotta NA-felszabadulás gátlására nézve a maprotilin IC 50 -értéke csak igen kis mértékben, mindössze egy nagyságrenddel tér el a mekamilamin 0.32 µM-os IC 50

értékét ől, ugyanakkor a tianeptin IC 50 -értéke már csaknem két nagyságrendnyi eltérést mutat.

45 100

75 H]NA

3

Maprotilin 50 IC 50 = 5.7 µM Tianeptin IC = 11.32 µM 50

felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás 25 [ Nikotin-kiváltotta

0 -8 -7 -6 -5 -4 -3

Log koncentráció (M)

6. ábra. A maprotilin és a tianeptin hatása a nikotin kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra patkány hippocampus szeletb ől. A gátlási értékek az antidepresszánsok jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nonlineáris regresszióval határoztuk meg.

Az antidepresszánsok nikotin receptor antagonista és transzporter gátló képessége közötti korreláció vizsgálata A monoamin uptake gátló vegyületek egymástól eltér ő hatékonysággal ugyan, de képesek gátolni egyrészt a noradrenalin transzportert, másrészt a nikotin kiváltotta noradrenalin-felszabadulás folyamatát. Felmerült annak a lehet ősége, hogy az uptake inhibítorok esetleg éppen a noradrenalin visszavétel gátlásán keresztül befolyásolnak valamilyen intracelluláris folyamatot, és ezáltal csökkentik a nikotin kiváltotta noradrenalin-felszabadulást. E feltételezés tisztázása céljából megvizsgáltuk, hogy van-e korreláció a különböz ő transzporter gátlók NA transzporter gátló képessége (K i értékek) és nikotin kiváltotta

NA felszabadulást csökkent ő hatása (IC 50 értékek) között ? A K i-értékek az irodalomból származnak (Schacht és Heptner, 1974; Wong és Bymaster, 1976; Hyttel, 1977;

Heikkila és Manzino, 1984, Richelson és Pfenning, 1984), míg az IC 50 -értékeket részben jelen tanulmányban (a maprotilin esetén), részben pedig csoportunk korábbi

46 vizsgálatai során (Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999; Kiss és mtsai., 2000, Szász és mtsai., 2007) határoztuk meg (7. ábra).

5

50

4 Map

H]NA 3 Nom G B R 3 Cit N is Kok Flx (nM) DMI 2

Nikotin-kiváltotta [ Nikotin-kiváltotta 1

logIC gátlása, felszabadulás 0 -1 0 1 2 3 4 3 [ H]NA felvétel gátlása, log K i (nM) 7. ábra. Különböz ő antidepresszánsok nAChR közvetítette NA felszabadulást gátló hatásának

IC 50 értékei a NA transzporter gátló hatás (log Ki) függvényében. DMI: desipramin, Nis: nisoxetin, Kok: kokain, Flx: fluoxetin, Cit: citalopram, Nom: nomifensin, GBR: GBR-12909, Map: maprotilin.

A két változó (logK i és logIC 50 ) között a Pearson-féle korreláció analízis nem mutatott ki összefüggést (7. ábra): a korrelációs koefficiens értéke r = 0.17-nak adódott, ami nem különbözött szignifikánsan a nullától (p=0.69). Tehát a monoamin uptake inhibítoroknak – köztük a maprotilinnek – a nikotin kiváltotta noradrenalin- felszabadulásra kifejtett gátló hatása nem a noradrenalin transzporter gátlásán keresztül valósul meg.

Az antidepresszánsok és a TTX gátló hatásának összehasonlítása a nikotin és az elektromos stimuláció kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra nézve Az irodalmi adatok alapján a monoamin transzporter gátló vegyületek képesek a Na +- csatornák bizonyos fokú gátlására. Mivel ez a mechanizmus elvileg magyarázatul szolgálhat a nikotin kiváltotta NA felszabadulás gátlására (Kiss és mtsai, 1997), kísérleteinkben összehasonlítottuk a Na +-csatorna gátló tetrodotoxin (TTX) és az

47 atípusos antidepresszánsok hatását a különböz ő módokon (nikotin illetve elektromos ingerlés) kiváltott [ 3H]NA felszabadulásra nézve, hogy megvizsgáljuk a Na +- csatorna lehetséges részvételét ezen anyagok gátló hatásában. Ezen kísérletekben 19 frakciót gy űjtöttünk és két elektromos ingerlést alkalmaztunk a harmadik valamint a tizenharmadik frakciók esetén (lásd „Módszerek” fejezet). A vizsgált anyagok a kilencedik frakciótól kezd ődően a kísérlet végéig jelen voltak; a gátló hatást pedig szintén a „ Módszerek” fejezetben leírt módon számítottuk ki. A TTX egyforma hatékonysággal blokkolta mind gátolta mind a nikotinnal (IC 50 = 0.033 µM), mind az elektromos ingerléssel (IC 50 = 0.039 µM) kiváltott NA felszabadulást (8. ábra).

TTX

100

Elektromosan kiváltott felszabadulás 75 IC 50 =0.039 µM

Nikotin-kiváltott felszabadulás 50 IC 50 =0.033 µM

25 H]NA felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás H]NA 3

[

0 -8 -7 -6 Log koncentráció (M)

8. ábra. A Na +-csatorna blokkoló tetrodotoxin (TTX) hatásának összehasonlítása a nikotin- illetve az elektromos ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra, patkány hippocampus szeletb ől. A TTX a harmadik frakciótól kezd ődően végig jelen volt a mintagy űjtés során. Az IC 50 értékek nemlineáris regresszióval lettek meghatározva.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Na +-csatornáknak egyforma szerepe van mindkét stimulációs mód által kiváltott transzmitter felszabadulásban. Ezzel ellentétben, az atípusos antidepresszánsok nagyságrendekkel gyengébb gátló hatást mutattak az elektromos ingerlés kiváltotta [3H]NA-felszabadulásra, mint a nikotin

48 által kiváltott neurotranszmitter felszabadulásra. A maprotilin IC 50 -értéke 177.4 µM (9. ábra), míg a tianeptiné 177.2 µM volt (10. ábra).

Maprotilin

100

Nikotin-kiváltotta IC 50 = 5.7 µM 75 Elektromosan-kiváltott IC = 177.4 µM 50 50

25

H]NA felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás H]NA 3 [

0 -8 -7 -6 -5 -4 -3 Log koncentráció (M) 9. ábra. A maprotilin hatásának összehasonlítása a nikotin- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg. Tianeptin 100 Nikotin-kiváltotta IC = 11.32 µM 50 75 Elektromosan-kiváltott IC = 177.2 µM 50 50

25

(%) gátlása felszabadulás H]NA 3 [

0 -8 -7 -6 -5 -4 -3

Log koncentráció (M)

10. ábra. A tianeptin hatásának összehasonlítása a nikotin- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

49 6.2. Monoamin uptake inhibitorok (fluoxetin, desipramin) NMDA-receptor antagonista tulajdonsága

Az NMDA hatása a nyugalmi [ 3H]NA-felszabadulásra A kontroll csatornák esetében a hippocampus szeletek radioaktivitása a 30 perces izotópos feltöltést és a 60 perces preperfúziót követ ően, a perfúzió kezdetekor 1460 ± 185 Bq/mg volt (mean ± SEM, n=12). A 6.-7. frakció során 100 µM-os koncentrációban adott NMDA szignifikánsan fokozta a 3 nyugalmi [ H]NA felszabadulást (AUC 6-13 = 1572 ± 283 %, n=12). A NA release–emelkedés átmeneti jelleg ű volt, az NMDA adását követ ően 21 percen belül visszatért az alapvonalra. (11. ábra)

Kontroll MK-801 10µM 500

400

300

(%) 200

H]NA normalizált H]NA 3 [ 100

frakcionális felszabadulása frakcionális NMDA MK-801 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Frakciók

11. ábra. Az NMDA hatásának jellemzése a nyugalmi [3H]NA felszabadulásra patkány hippocampus szeletben. A nemkompetitív NMDA receptor antagonista MK-801 (10 µM-os koncentrációban) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen volt. A görbe alatti terület (AUC) az alapvonalhoz viszonyított többlet-felszabadulásként lett kiszámítva.

Az NMDA kiváltotta [ 3H]NA felszabadulást dózisfügg ő módon gátolta a nemkompetitív NMDA receptor antagonista dizocilpin (MK-801), 0.54 µM-os IC 50 értékkel, míg 10 µM-os koncentrációban teljes mérték ű gátlást okozott, ami azt mutatja, hogy a folyamat az NMDA receptorok közvetítésével zajlik le (12. ábra).

50

100

H]NA

3 75

MK-801 50 IC 50 = 0.54 µM

25 felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás NMDA-kiváltotta [ NMDA-kiváltotta

0 -9 -8 -7 -6 -5 -4

Log koncentráció (M)

12. ábra. Az MK-801 dózis-hatásgörbéje az NMDA-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra. A gátlási értékek az antagonista jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

Antidepresszánsok hatása az NMDA-kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra A triciklikus desipramin (1-100 µM-os koncentráció-tartományban) és az SSRI fluoxetin (szintén 1-100 µM-os koncentráció-tartományban) a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen voltak a mintagy űjtés során. Egyik anyag sem befolyásolta a nyugalmi [3H]NA-felszabadulást, ugyanakkor mindkett ő dózisfügg ő módon gátolta az NMDA- kiváltotta választ. A desipramin IC 50 értéke 14.57 µM, a fluoxetiné pedig 41.06 µM volt

(13. ábra). 13. ábra. A desipramin (DMI) és a fluoxetin hatása az NMDA 100 kiváltotta [ 3H]NA- felszabadulásra patkány H]NA

3 75 Fluoxetin ő IC 50 = 41.06 µM hippocampus szeletb l. A gátlási értékek az 50 DMI IC 50 = 14.57 µM antidepresszánsok jelenlétében illetve azok hiányában kapott 25

(%) gátlása felszabadulás NMDA-kiváltotta [ NMDA-kiváltotta AUC értékek arányaként lettek

kiszámítva. Az IC 50 értékeket 0 -7 -6 -5 -4 -3 nonlineáris regresszióval Log koncentráció (M) határoztuk meg.

51 Az antidepresszánsok és a TTX gátló hatásának összehasonlítása az NMDA- és az elektromos stimuláció kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra nézve Összehasonlítottuk a Na +-csatorna blokkoló tetrodotoxin (TTX) és az antidepresszánsok hatását az NMDA- és az elektromos ingerlés által kiváltott [3H]NA felszabadulásra, hogy megvizsgáljuk a Na +- csatorna lehetséges részvételét a desipramin és a fluoxetin gátl hatásában. Ezen kísérletekben 19 frakciót gy űjtöttünk és két elektromos ingerlést alkalmaztunk a harmadik valamint a tizenharmadik frakciók esetén (lásd „Módszerek” fejezet). A vizsgált anyagok a kilencedik frakciótól kezd ődően a kísérlet végéig jelen voltak; a gátló hatást pedig szintén a „ Módszerek” fejezetben leírt módon számítottuk ki. A TTX hasonló hatékonysággal gátolta úgy az NMDA-, mind az elektromos ingerlés-kiváltotta NA felszabadulást (az IC 50 értékek 66 nM illetve 55 nM voltak) (14. ábra).

Tetrodotoxin 100

H]NA

3 75 NMDA-kiváltotta IC 50 = 66 nM

50 Elektromosan kiváltott IC 50 = 55 nM

25 felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás NMDA-kiváltotta [ NMDA-kiváltotta

0 -9 -8 -7 -6 -5

Log koncentráció (M)

14. .ábra. A Na +-csatorna blokkoló tetrodotoxin (TTX) hatásának összehasonlítása az NMDA- illetve az elektromos ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra, patkány hippocampus szeletb ől. A TTX a harmadik frakciótól kezd ődően végig jelen volt a mintagy űjtés során. Az IC 50 értékek nemlineáris regresszióval lettek meghatározva.

Ezzel ellentétben, az antidepresszánsok csak az NMDA-kiváltotta NA-felszabadulást gátolták, de sem a triciklikus desipramin (15. ábra), sem az SSRI fluoxetin (16. ábra) nem voltak hatással az elektromos ingerlés-kiváltotta válaszra, még 100 µM koncentráció fölött sem.

52

Desipramin 100

H]NA

3 75 NMDA-kiváltotta IC 50 = 14.57 µM 50 Elektromosan kiváltott IC 50 = 0 µM 25

(%) gátlása felszabadulás NMDA-kiváltotta [ NMDA-kiváltotta

0

-7 -6 -5 -4 -3 Log koncentráció (M) 15. ábra. A desipramin hatásának összehasonlítása az NMDA- és az elektromos ingerlés- kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

Fluoxetin 100

H]NA 3 75 NMDA-kiváltotta IC 50 = 41.06 µM

50 Elektromosan kiváltott

IC 50 = 0 µM

25

(%) gátlása felszabadulás NMDA-kiváltotta [ NMDA-kiváltotta

0

-7 -6 -5 -4 -3

Log koncentráció (M)

16. ábra. A fluoxetin hatásának összehasonlítása az NMDA- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

53 6.3. Monoamin uptake gátlók (fluoxetin, desipramin) P2X-receptor antagonista tulajdonsága

Az ATP hatása a nyugalmi atriális [ 3H]NA-felszabadulásra A kontroll csatornák esetében a tengerimalac jobb pitvar-preparátumok radioaktivitása a 45 perces izotópos feltöltést és a 60 perces preperfúziót követ ően, a perfúzió kezdetekor 3300 ± 905 Bq/mg volt (mean ± SEM, n=20). A 6-7. frakció során 1 mM-os koncentrációban adott ATP hatására a 7. frakcióban az 3 alapvonalhoz képest a [ H]NA felszabadulása mintegy hatszorosára emelkedett (AUC 6-

12 = 508 ± 58 %, n=20). A release–emelkedés átmeneti jelleg ű volt, az ATP adását követ ő 4 frakción belül visszatért az alapvonalra (17. ábra).

ATP 1mM ATP 1mM + PPADS 30 µM 750

600

450

(%) 300 H]NA normalizált H]NA

3 [ 150 ATP

felszabadulása frakcionális PPADS 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Frakciók

17. ábra. Az ATP hatásának jellemzése a nyugalmi [3H]NA felszabadulásra tengerimalac jobb atriumában. A P2X receptor antagonista PPADS (30 µM-os koncentrációban) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen volt. A görbe alatti terület (AUC) az alapvonalhoz viszonyított többlet-felszabadulásként lett kiszámítva.

Az ATP kiváltotta [ 3H]NA felszabadulást dózisfügg ő módon gátolta a purinerg P2X receptor antagonista PPADS, 1.70 µM-os IC 50 értékkel, míg 30 µM-os koncentrációban teljes mérték ű gátlást okozott, ami azt mutatja, hogy a folyamat a P2X receptorok közvetítésével zajlik le (18. ábra).

54

100 18. ábra. A PPADS dózis- hatásgörbéje az ATP- kiváltotta [ 3H]NA 75 H]NA 3 PPADS felszabadulásra. A gátlási IC = 1.70 µM 50 értékek az antagonista 50 jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC 25 ATP-kiváltotta [ ATP-kiváltotta (%) gátlása felszabadulás értékek arányaként lettek

kiszámítva. Az IC 50 értékeket 0 nemlineáris regresszióval -8 -7 -6 -5 -4 -3 Log koncentráció (M) határoztuk meg.

Antidepresszánsok hatása az ATP kiváltotta atriális [ 3H]NA-felszabadulásra A triciklikus desipramin (0.1-30 µM-os koncentráció-tartományban) és az SSRI fluoxetin (szintén 0.1-30 µM-os koncentráció-tartományban) a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen voltak a mintagy űjtés során. Egyik anyag sem befolyásolta a nyugalmi [3H]NA-felszabadulást, ugyanakkor mindkett ő dózisfügg ő módon gátolta az ATP- kiváltotta választ (19. ábra).

100

75 H]NA 3 Fluoxetin

IC 50 = 2.48 µM 50 Desipramin IC = 4.45 µM 50

ATP-kiváltotta [ ATP-kiváltotta 25 felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás

0 -8 -7 -6 -5 -4 -3 Log koncentráció (M) 19. ábra. A desipramin (DMI) és a fluoxetin hatása az ATP kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra tengerimalac jobb atriumában. A gátlási értékek az antidepresszánsok jelenlétében illetve azok hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nonlineáris regresszióval határoztuk meg.

55 Az antidepresszánsok hatásának összehasonlítása az ATP- és az elektromos stimuláció kiváltotta atriális [ 3H]NA felszabadulásra nézve Összehasonlítottuk az antidepresszánsok hatását az ATP- és az elektromos ingerlés által + kiváltott [3H]NA felszabadulásra, hogy megvizsgáljuk a Na - csatorna lehetséges részvételét a desipramin és a fluoxetin gátló hatásában. Ezen kísérletekben 19 frakciót gy űjtöttünk és két elektromos ingerlést alkalmaztunk a harmadik valamint a tizenharmadik frakciók esetén (lásd „Módszerek” fejezet). A vizsgált anyagok a kilencedik frakciótól kezd ődően a kísérlet végéig jelen voltak; a gátló hatást pedig szintén a „ Módszerek” fejezetben leírt módon számítottuk ki.

Desipramin

100 20. ábra. A desipramin

hatásának összehasonlítása ATP-kiváltotta 75 IC 50 = 4.45 µM az ATP- illetve az elektromos

ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA

50 Elektromosan-kiváltott felszabadulásra nézve IC = 16.68 µM 50 tengerimalac jobb

25 átriumában. Az IC 50 H]NA felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás H]NA 3

[ értékeket nemlineáris

0 regresszióval határoztuk -8 -7 -6 -5 -4 -3 meg. Log koncentráció (M)

Fluoxetin 100

21. ábra. A fluoxetin ATP-kiváltotta hatásának összehasonlítása 75 IC 50 = 2.48 µM az ATP- illetve az elektromos ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA 50 Elektromosan-kiváltott IC 50 = 141 µM felszabadulásra nézve tengerimalac jobb 25 átriumában. Az IC 50 H]NA felszabadulás gátlása (%) gátlása felszabadulás H]NA 3 [ értékeket nemlineáris

0 regresszióval határoztuk -8 -7 -6 -5 -4 -3 meg. Log koncentráció (M)

56 Mindkét antidepresszáns gátolta úgy az ATP-, mind az elektromos ingerlés-kiváltotta NA felszabadulást, viszont eltér ő hatáser ősséggel. Míg a triciklikus desipramin esetén a kapott IC 50 értékek csak egy nagyságrenddel tértek el egymástól (20. ábra), addig az SSRI fluoxetin esetében ez az eltérés már két nagyságrendnyinek bizonyult (21. ábra).

6.4. Csatorna-blokkoló típusú ionotróp receptor antagonista vegyületek hatása a DA felszabadulásra patkány striatumában, in vivo mikrodialízis kísérletben

Kísérleteink során a mikrodialízis mintavev őn keresztül helyileg alkalmazott 300 µM-os koncentrációjú dizocilpin (MK-801) illetve 1 mM-os koncentrációjú mekamilamin, illetve ezen anyagok nomifensin jelenlétében történő adását követ ően vizsgáltuk a DA illetve a DA-metabolitok felszabadulását altatott patkány striatumában, in vivo mikrodialízis technika segítségével.

A DA uptake gátló nomifensin hatása a striatális dopamin felszabadulásra A DA uptake-gátló nomifensin folyamatos helyi alkalmazása (10 µM-os koncentrációban, a mintavev őn keresztül bejuttatva) közel nyolcszorosára emelte a nyugalmi DA koncentrációt és 60 perc elteltével stabilizálta ezen a magasabb szinten (22. ábra). Kontroll 1000 Nomifensin ** ** ** ** ** 800 **

600 **

400

viszonyított% 200 Nomifensin (10 µM) felszabaduláshoz DA Bazális 0 -45 -30 -15 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Idõ (perc) 22. ábra. A nomifensin hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. A nomifensint (10 µM) a 0 id őponttól kezd ődően a mintavev őn keresztül adagoltuk (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (** p < 0.01).

57 A DA-metabolitok (DOPAC és HVA) koncentrációját a nomifensin nem befolyásolta. Az adatok 10-12 kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) képviselik.

6.4.1. Az NMDA receptor antagonista dizocilpin (MK-801) hatása a striatális dopamin felszabadulásra Normál körülmények között a nyugalmi DA felszabadulás az altatott patkány striatumában 12.3 ± 2.1 pg/minta volt (n = 18). A DA és metabolitjainak (DOPAC, HVA) felszabadulási értékeit a bazális válaszhoz viszonyított százalékos formában fejeztük ki. Az NMDA receptor antagonista tulajdonságú dizocilpin (MK-801) 300 µM-os koncentrációban helyileg alkalmazva (a mikrodialízis mintavev őn keresztül) szignifikáns emelkedést váltott ki a striatum DA koncentrációjában. A legmagasabb DA-szint emelkedés a második frakcióban volt észlelhet ő (85% emelkedés), és a DA- szint stabilizálódott ezen a szinten (23. ábra).

Kontroll MK-801 250 ** 200 ** ** 150

100 Bazális DA Bazális

viszonyított% felszabaduláshoz MK-801 (300 µM) 50 0 -45 -30 -15 0 15 30 45 60

Idõ (perc)

23. ábra. Az MK-801 hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. Az antagonista 300 µM-os koncentrációban a dializáló oldatban lett feloldva és a mintavev őn keresztül adagoltuk a 0 id őponttól kezd ődően (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (** p < 0.01).

A DA metabolitok (DOPAC, HVA) szintjére nem volt szignifikáns befolyása az MK- 801-nek. Az adatok 4-6 kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) képviselik.

58 A szelektív dopamin uptake gátló nomifensin (10 µM-os koncentrációban, a mintavev őn keresztül adagolva) jelenlétében az MK-801 (300 µM, szintén a mintavev őn keresztül adva) egyáltalán nem volt hatással a striatum DA koncentrációjára (24. ábra), valamint DA-metabolitok szintjére sem. Az adatok 4-5 kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) képviselik.

MK-801 Nomifensin + MK-801 250 ** 200 ** **

150

DA Bazális 100 viszonyított% felszabaduláshoz 50 MK-801 (300 µM)

0 -45 -30 -15 0 15 30 45 60

Idõ (perc)

24. ábra. A nomifensin hatása az MK-801 által kiváltott striatális DA felszabadulásra altatott patkányban. A nomifensin (10 µM) perfúziója 2 órával az MK-801 (300 µM) 0 id őponttól induló adagolása el őtt kezd ődött el. Az adatok egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel lettek kiértékelve (** p < 0.01).

6.4.2. A nAChR antagonista mekamilamin hatása a striatális dopamin felszabadulásra

A nAChR antagonista mekamilamin 1 mM-os koncentrációban, a mintavev őn keresztül helyileg alkalmazva szignifikáns emekedést okozott a striatum extracelluláris DA koncentrációjában. A legmagasabb DA-szint emelkedés itt is a második frakcióban volt észlelhet ő (75% emelkedés) (25. ábra). A DA metabolitok (DOPAC, HVA) szintjét nem befolyásolta szignifikánsan a mekamilamin. Az adatok 4-6 kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) képviselik.

59 Kontroll Mekamilamin 250

** 200 ** * 150

Bazális DA Bazális 100 viszonyított%

felszabaduláshoz 50 Mekamilamin (1mM)

0 -45 -30 -15 0 15 30 45 60 Idõ (perc) 25. ábra. A mekamilamin hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. Az antagonista 1mM-os koncentrációban a dializáló oldatban lett feloldva és a mintavev őn keresztül adagoltuk a 0 id őponttól kezd ődően (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (* p < 0.05, ** p < 0.01). A szelektív dopamin uptake gátló nomifensin (10 µM-os koncentrációban, a mintavev őn keresztül adagolva) jelenlétében a mekamilamin (1 mM, szintén a mintavev őn keresztül adva) egyáltalán nem volt hatással a striatum DA koncentrációjára (26. ábra), valamint a DA-metabolitokéra sem. Az adatok 4-5 kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) képviselik.

Mekamilamin Nomifensin + Mekamilamin 250 ** 200 ** * 150

Bazális DA Bazális 100

viszonyított% felszabaduláshoz Mekamilamin (1mM) 50 0 -45 -30 -15 0 15 30 45 60

Idõ (perc)

26. ábra. A nomifensin hatása a mekamilamin által kiváltott striatális DA felszabadulásra altatott patkányban. A nomifensin (10 µM) perfúziója 2 órával a mekamilamin (1 mM) 0 id őponttól induló adagolása el őtt kezd ődött el. Az adatokat ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (* p < 0.05, ** p < 0.01).

60 7. MEGBESZÉLÉS

7.1. Monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok nAChR antagonista tulajdonságai: A depresszió nikotinikus teóriájának farmakológiai meger ősítése Annak ellenére, hogy a depresszió egyike a legfontosabb pszichiátriai betegségeknek (élettartam prevalenciája 15-25% között mozog (Wong és Licinio, 2004), a kórkép neurokémiai háttere még nem pontosan tisztázott. A leginkább elfogadott hipotézis, a monoamin teória szerint a depresszió a monoaminerg neurotranszmisszió elégtelenségének a következménye (Schildkraut 1965; Doris és mtsai., 1999; Kiss 2008). Mindazonáltal az elmúlt évtízedekben felhalmozódott számos preklinikai és klinikai megfigyelés nem magyarázható meg a monoamin teória segítségével (Bylund és Reed, 2007; Elenkov 2008; Longone és mtsai., 2008). Kutatócsoportunk el őzetes eredményei szerint a különböz ő kémiai struktúrával és szelektivitással rendelkez ő monoamin uptake gátlók (beleértve olyan uptake gátló típusú antidepresszánsokat is, mint a desipramin, a fluoxetin és a citalopram) kivétel nélkül dózis-függ ő módon gátolták a központi idegrendszer nACh receptorait (Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999; Szász és mtsai., 2007). Közleményeink megjelenése óta több független, különböz ő metodikákkal dolgozó csoport jutott hasonló eredményre, azaz hogy különböz ő, uptake gátló típusú antidepresszánsok nikotin antagonistaként viselkednek (Fryer és Lukas, 1999; Lopez-Valdes és mtsai, 2002; Miller és mtsai, 2002). Mindezek alapján megfogalmazódott egy hipotézis, mely szerint az antidepresszáns hatás kialakulásában dönt ő szerepe van az idegrendszeri nikotin receptorok gátlásának (Shytle és mtsai, 2002), tehát a depresszió egyik fontos neurokémiai történése lehet a központi idegrendszer nikotin receptorai által közvetített kolinerg túlsúly. Munkánk egyik f ő kérdése az volt, vajon érvényesül-e a nAChR-teória a monoamin-teóriával csak részben vagy egyáltalán nem összeegyeztethet ő hatású antidepresszánsok esetében is. Ezért vizsgálni kívántuk azt a kérdést, hogy a fent említett nikotin antagonista tulajdonság jellemz ő-e az olyan atípusos antidepresszánsokra is, mint a maprotilin, valamint a szerotonin uptake-et fokozó tianeptin ? A jelen PhD értekezés egyik tárgyát képez ő kísérlettsorozatban megvizsgáltuk a maprotilin illetve a tianeptin hatását a nikotin-kiváltotta [3H]NA felszabadulásra nézve

61 patkány hippokampusz szeletekb ől. Err ől a kísérleti felállásról már korábban bebizonyosodott, hogy különösen érzékeny a nAChR gátló tulajdonságok kimutatására (Hennings és mtsai., 1997, Hennings és mtsai., 1999). Továbbá, ezt a kísérleti protokollt alkalmazva megbízható összehasonlításokat tehetünk kutatócsoportunk korábbi eredményeivel is. Ilyen körülmények között azt találtuk, hogy a nikotin-kiváltotta [3H]NA felszabadulást dózisfügg ő módon gátolta a nikotin receptor antagonista mekamilamin 0.32 µM-os IC 50 értékkel, ami arra utal, hogy a választ a nACh receptorok közvetítik. A maprotilin és a tianeptin szintén dózisfügg ő módon gátolták a nikotin-kiváltotta transzmitter felszabadulást, de a mekamilaminnál kisebb hatékonysággal, mivel IC 50 értékük 5.7 illetve 11.32 µM volt. Mindazonáltal, a nikotinra adott válasz gátlása még nem feltétlenül jelenti azt, hogy az adott szer közvetlenül a nAChR-t gátolja, a hatás lehet indirekt is, mivel a nikotin- kiváltotta NA-felszabadulás több lépéses folyamatnak az eredménye, amelyben a Na + és Ca 2+ csatornák aktivációja éppúgy szerepet játszik, mint a nACh receptoroké (X. ábra, varikozitásos ábra, bilikék). Felmerült korábban, hogy a nikotin NA felszabadulásra kifejtett hatása csak ép és működ ő NA uptake mellett lehetséges (Su és Bevan, 1970), vagyis hogy a funkcionális nAChR antagonizmus a NA transzporteren, esetlegesen annak gátlásán keresztül közvetít ődik. Ebben az esetben viszont korrelációnak kellene fennálnia a NA felvételre illetve a nikotin-kiváltotta NA felaszabadulásra gyakorolt gátló hatás között. A feltételezés ellen őrzése céljából összevetettük a maprotilin és számos más monoamin transzportert gátló vegyület általunk mért IC 50 értékeit e szerek NA felvételre gyakorolt gátló hatásával. hatásával. Az uptake gátlók K i értékeit az irodalomból vettük (Hyttel 1982; Andersen, 1989; Bolden-Watson és Richelson, 1993; Wong és mtsai, 1995). A

Pearson-féle korreláció analízis nem mutatott összefüggést a K i és az IC 50 értékek között (7. ábra), azt jelezve hogy a NA transzporter nem vesz részt a maprotilin és a többi monoamin uptake gátló anyag nAChR antagonista hatásának kialakulásában. Ezek szerint a transzporterre kifejtett hatás és a nikotin receptor antagonizmus két, egymástól független tulajdonsága ezen vegyületeknek. Ezt a következtetést kutatócsoportunk azon korábbi eredménye is, miszerint a nomifensin 1 µM-os koncentrációban szinte teljes mértékben gátolta a nikotin agonista DMPP-kiváltotta NA felszabadulás carrier-

62 mediálta komponensét, de nem befolyásolta a nAChR-közvetítette választ (Kiss és mtsai, 1997), bizonyítva, hogy a transzporterre kifejtett hatás független a nAChR-ra gyakorolttól. A maprotilin és a tianeptin másik lehetséges célpontja a feszültségfügg ő Na +-csatorna lehet. Leírták, hogy a desipramin és az imipramin gátolni képes a gyors Na +-áramokat különböz ő idegsejt preparátumokban (Ogata és mtsai, 1989, Deffois és mtsai, 1996, Pancrazio és mtsai, 1998). A DA-uptake gátló GBR-12909-el kapcsolatban megfigyelték, hogy nagy affinitással köt ődik a Na +-csatornákhoz (Andersen, 1989). Mivel kutatócsoportunk már korábban igazolta, hogy a nikotin-kiváltotta NA felszabadulás TTX-érzékeny folyamat (Vizi és mtsai, 1995; Kiss és mtsai, 1997; Sershen és mtsai, 1997), a Na +-csatornák esetleges érintettségét mindenképpen vizsgálnunk kellett. Ezt tisztázandó, összehasonlítottuk, hogy a maprotilin illetve a tianeptin hogyan befolyásolja a különböz ő módokon, vagyis nikotinnal, illetve elektromos ingerléssel kiváltott NA felszabadulás folyamatát. Amennyiben a monoamin uptake rendszerekre ható két antidepresszáns vegyület a Na +-csatornák gátlásán keresztül függeszti fel a nikotin-kiváltotta NA felszabadulást, akkor gátolniuk kellene az elektromos ingerlés-kiváltotta transzmitter kiáramlást is. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a Na +-csatorna gátló TTX egyforma hatékonysággal gátolja mindkét ingerlési formát. Ugyanakkor a maprotilin és a tianeptin is gátolta a nikotinnal valamint az elektromos-ingerléssel kiváltott NA felszabadulást, viszont nagyon eltér ő hatáser ősséggel. Míg a nikotinos ingerlés esetén a két anyag IC 50 értéke csak egy-két nagyságrenddel volt magasabb, mint a nAChR antagonista mekamilaminé, addig az elektromos ingerlés esetén kapott IC 50 értékek mindkét anyag esetén már három + nagyságrendnyi eltérést mutattak a mekamilaminhoz képest. Mivel a Na -csatornák aktivációja hasonlóan fontos szerepet játszik mind az elektromos ingerléssel, mind a nikotin által kiváltott NA felszabadulás folyamatában, eredményeink arra utalnak, hogy + az adott kísérleti körülmények között a Na -csatornák gátlása a nAChR-ok gátlásánál kevésbé fontos szerepet játszik a maprotilin és a tianeptin hippocampális NA felszabadulást gátló hatásában. A nikotin-kiváltotta NA felszabadulás els ő lépése a nAChR aktiválódása az agonista jelenlétében, ami megnyitja a receptor ioncsatornáját és kationok belépését teszi lehet ővé a sejtbe. Ez egy kezdeti, kisebb mérték ű membrándepolarizációt okoz, ami

63 aktiválja a feszültségfügg ő Na +-csatornákat és így további depolarizációhoz vezet. Ezután már a feszültségfügg ő Ca 2+ -csatornák is aktiválódnak és a sejtbe áramló Ca 2+ kiváltja a vezikuláris exocitózist (27. ábra). Egyértelm ű, hogy a Na +-csatornák aktiválódásától kezdve az elektromos stimuláció és a nikotin által kiváltott folyamat ugyanazon az úton halad tovább. Ha tehát az antidepresszánsok eltér ő módon gátolják a kétfajta ingerlés által kiváltott választ, célpontjuknak a Na+-csatornák megnyílása el őtti szakaszon kell keresnünk.

Elektromos Receptor ingerlés agonista

Ionotrop receptor

+ Antidepresszánsok TTX Na -csatorna nyitás

2+ Ca -csatorna nyitás

NA felszabadulás (exocitózis)

27. ábra. A tetrodotoxin (TTX) és a monoamin uptake rendszeren ható antidepresszánsok hatásmechanizmusának összehasonlítása. A NA felszabadulás mindkét, elektromos ingerléssel vagy receptor agonistával (nikotin, NMDA, ATP) kiváltott folyamatában a Na + csatornák aktivációja egyaránt esszenciális, mivel mindkét folyamatot egyforma hatékonysággal gátolja a TTX.

El őzetes eredményeinkt ől eltér ően (melyek azt mutatták hogy a kutatócsoportunk által korábban megvizsgált monoamin uptake gátló vegyületek nem befolyásolták az elektromos ingerléssel kiváltott transzmitter-felszabadulást) azt találtuk, hogy a két atípusos antidepresszáns, a maprotilin és a tianeptin dózisfügg ő módon gátolta nemcsak a nikotin, de az elektromos ingerlés révén kiváltott NA felszabadulást is. Ám amíg a TTX mindkét folyamatot egyforma hatékonysággal gátolta, addig a két atípusos antidepresszáns (maprotilin és tianeptin) több nagyságrenddel gyengébben gátolta az elektromos ingerlés kiváltotta NA felszabadulásl, ami arra útal, hogy els ődleges támadáspontjuk valószín űleg a Na +-csatornák kinyílása el őtti eseménnyel, vagyis a nAChR-ok aktiválódásával

64 függ össze, és a Na +-csatornákra gyakorolt hatásuk csak másodlagos szerepet játszik a NA-felszabadulást gátló hatásukban. Mindkét vizsgált vegyületr ől leírták, hogy számos receptorral kölcsönhatásba lépnek. Így például a maprotilin gátolta a szívizomsejtek szintjén az akciós potenciál befelyezéséért felel ős késleltetett, egyenirányú K +-áramot ( Casis és mtsai., 2002 ); szignifikáns gátlást okozott a GABA illetve az NMDA-kiváltotta intracelluláris Ca 2+ - koncentráció emelkedésben (Takebayashi és mtsai., 2000 ); patkány vas deferens szintjén a preszinaptikus α2-adrenoceptor aktiválását okozta ( Garcia-Sevilla és Zubieta, 1986 ); kompetitív vagy allosztérikus mechanizmusok révén antagonistaként viselkedett az enterális 5-HT7 receptorok esetén ( Lucchelli és mtsai., 2000 ); gátolta a vaszkuláris hisztamin-receptorokat ( Cavero és mtsai., 1981 ); némileg gátolta az NMDA-áramot (patkány-agy RNS-el injektált Xenopus oocytában) ( Tohda és mtsai., 1995 ). A tianeptinr ől hasonlóképpen kimutatták, hogy a dorsal raphe szintjén gátló hatása van a GABA és a glicin-kiváltotta ionáramokra, valamint az 5-HT által kiváltott késleltetett, egyenirányú K +-áramra, mely hatás megnövelheti az itt található szerotonerg neuronok ingerelhet őségét (Kim és mtsai., 2002). Intraperitoneálisan adva (30 mg/kg) a dorsalis hippocampus szintjén 40%-al, a frontális cortexben pedig 30%-al csökkentette a az ACh felszabadulását, ugyanakkor kisebb adagban (10 illetve 20 mg/kg) már nem volt ilyen hatása (Bertorelli és mtsai., 1992). Farmakológiai tanulmányok viszont azt mutatták, hogy nincsenek antikolinerg hatásai, és semmi hatása nincs a kardiovaszkuláris valamint a neuro-endokrin rendszerekre (Mocaër és mtsai., 1988). Azt a kérdést, hogy a maprotilin illetve a tianeptin a nACh receptorokat pontosan milyen mechanizmussal is gátolja, ebben a tanulmányban nem vizsgáltuk, azonban irodalmi adatok alapján valószín ű, hogy mindkét anyag esetében a nAChR közvetlen gátlásáról lehet szó. Kimutatták, hogy a desipramin nagy affinitással köt ődik a nAChR ioncsatornájába (Aronstam, 1981). Ez a csatornán belül elhelyezked ő köt őhely a célpontja a non-kompetitív nAChR antagonista mekamilaminnak is (Banerjee és mtsai, 1990). A monoamin uptake gátlók kölcsönhatását a mekamilamin köt őhellyel más megfigyelések is alátámasztják. A kokain és analógjai antagonizálták a nikotin viselkedési hatásait és nagy affinitással versengtek a mekamilamin köt őhelyért receptor kötési kísérletekben (Lerner-Marmarosh és mtsai, 1995). Elektrofiziológiai kísérletek

65 adatai szerint a fluoxetin a nAChR ioncsatornájába köt ődve gátolni képes a receptor közvetítette áramokat (Garcia-Colunga és mtsai, 1997; Maggi és mtsai, 1998). Egy másik csoport négy további monoamin uptake gátlóról, az SSRI sertralinról és paroxetinr ől, illetve az SNRI nefazodonról és venlafaxinról jelentette, hogy non- kompetitív módon gátolják a nAChR-t (Fryer és Lucas, 1999a). Az elmúlt évtizedben számos, egymástól független munkacsoport számolt be hasonló nAChR gátló tulajdonságról más monoamin uptake gátlókkal (imipramin, amytriptylin, bupropion, reboxetin) kapcsolatban (Izaguirre és mtsai, 1997; Park és mtsai, 1998; Fryer és Lucas, 1999b; Slemmer és mtsai, 2000; Miller és mtsai, 2002). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a különböző kémiai szerkezettel és szelektivitással rendelkez ő monoamin transzporter gátló vegyületek képesek közvetlenül gátolni a nAChR-t, és ezért lehetséges, hogy a NA visszavételt gátló maprotilin illetve az 5-HT visszavételt serkent ő tianeptin is hasonló hatásmechanizmussal, vagyis a mekamilaminéhoz hasonló, non- kompetitív csatornablokkoló mechanizmussal gátolja a nAChR-t. Eredményeink támogatják azt az elképzelést, miszerint a nAChR antagonizmus a monoamin visszavételt gátló anyagok általános tulajdonsága lehet. Az egyre gyarapodó megfigyelések szerint a monoamin transzporterek rendelkeznek bizonyos ioncsatorna- tulajdonságokkal (Lester és mtsai, 1996, Sonders és Amara, 1996, Sonders és mtsai, 1997). Kimutatták, hogy a NA neuronális visszavételéhez nem sztöchiometrikus ionáramok kapcsolódnak, melyeket gátolni lehet kokainnal és egyéb uptake inhibítorokkal (Galli és mtsai, 1995). Érdekes megfigyelés, hogy a DAT csatorna mechanizmussal depolarizálja a neuronokat, és a DA felvétellel párosuló csatorna aktivitás szelektív DA uptake gátlókkal megakadályozható (Carvelli és mtsai, 2004). Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy funkcionális szempontból fontos csatornák találhatók a monoamin transzporterekben (DeFelice és Blakely, 1996; Sulzer és Galli, 2003), és e csatornák gátlása lenne a hatásmechanizmusa az uptake gátló vegyületeknek. Ha feltételezünk bizonyos struktúrális hasonlóságot a transzporterekben és a nAChR-okban található csatornák között, akkor érthet ővé válik a monoamin uptake gátlók nAChR antagonista tulajdonsága is. Ezen adatok kapcsán javasolt modell alapján valószín ű, hogy a nAChR csatornablokkoló típusú antagonistáinak gátolnia kell a monoamin transzportereket is. Ezt a feltételézsünket igazoltuk is a (ld a disszertáció mikrodialízissel foglalkozó részét).

66 Eredményeinknek nem csak alapkutatási, de klinikai jelent ősége is van. A depressziós betegeken folytatott vizsgálatok szerint a monoamin uptake gátló típusú antidepresszánsok plazmakoncentrációja 1-2 µM (Muscettola és mtsai, 1978; Hyttel, 1982; Pato és mtsai, 1991; Besret és mtsai, 1996). Tekintettel arra, hogy a felhalmozódási folyamatok miatt az agyi antidepresszáns koncentráció magasabb, mint a plazmaszint (Besret és mtsai, 1996), ezek az anyagok könnyen elérhetnek olyan agyi koncentrációt az antidepresszáns kezelés során, melynél már jelent ősen gátolni képesek a központi idegrendszer nAChR-ait. Mivel ezek a receptorok központi szerepet játszanak számos magasabb rend ű agyi folymatban (Newhouse és mtsai, 1997; Levin és Simon, 1998; Steinlein, 1998), a monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok hatása a nAChR-ra hozzájárulhat e szerek terápiás, illetve mellékhatásainak kialakulásához. Az elmúlt id őszakban, jelent ős mértékben csoportunk eredményeire is támaszkodva, megszületett a depresszió neurokémiai hátterének egy új típusú elmélete, mely központi szerepet tulajdonít a nAChR-oknak (Shytle és mtsai, 2002). Az elmélet arra a régi megfigyelésre épül, mely szerint a depressziós betegekben kolinerg túlsúly figyelhet ő meg a visszaszorult monoaminerg aktivitás mellett. A szerz ők szerint a kolinerg túlsúllyal járó depressziós tünetek kialakulásáért a központi idegrendszer neuronális nACh receptorainak túlingerl ődése a felel ős. A nAChR-ok fontos szerepet játszanak a hipotalamusz-hipofízis tengely m űködésében, a mezolimbikus dopaminerg rendszer szabályozásában, illetve a cirkadián ritmus kialakításában és fenntartásában (Shytle és mtsai, 2002). Mindezek a funkciók, illetve ezek zavara jelent ős tényez ő a depresszió kialakulásában. A szerzők elgondolása szerint az antidepresszáns hatás kifejl ődésének dönt ő lépése a túlingerelt nAChR-ok gátlása, amit a jelenleg használt antidepresszánsok meg is tudnak tenni (lásd eredményeinket és az irodalmi adatokat). Az elképzelés szerint a nAChR antagonista vegyületek képesek lehetnek a depressziós tünetek enyhítésére, amit a mekamilaminnal folytatott klinikai vizsgálatok meg is er ősítettek (Shytle és mtsai, 2000). Összefoglalva, a triciklikus valamint az SSRI típusú antidepresszánsokon kívül az atípusos antidepresszánsok két képvisel ője, a NA transzporter gátló maprotilin illetve az 5-HT transzporter serkent ő tianeptin szintén képes gátolni a nAChR-t a központi idegrendszerben. Ezek szerint a monoamin transzporter rendszerekre ható anyagok szelektivitásuktól független, általános tulajdonsága lehet a nAChR antagonizmus.

67 Eredményeink rámutatnak a monoamin transzporterek és a nAChR-ok közötti farmakológiai hasonlóságokra.

7.2. Monoamin uptake inhibítorok NMDA-receptor antagonista tulajdonsága: NMDA receptorok lehetséges szerepe a depresszió patomechanizmusában

El őzetesen már kimutattuk, hogy a különböz ő kémiai szerkezettel és szelektivitással rendelkez ő monoamin uptake gátló-típusú antidepresszánsok képesek gátolni a nACh receptorokat a klinikailag releváns, alacsony mikromoláris koncentráció-tartományban (Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999; Szász és mtsai., 2007b). Ezen anyagok hatásmechanizmusa hasonló a nACh receptor egyik csatornablokkoló típusú antagonistájának, a mekamilaminnak a hatásmechanizmusához. Mivel kimutatták, hogy a csatornablokkoló nAChR antagonista mekamilamin az NMDA receptorokat is képes gátolni, illetve az NMDA csatornablokkoló antagonista, a dizocilpin a nAChR-okat is gátolja, ezen felül az antidepresszánsok a nAChR csatornablokkoló antagonistájaként viselkednek, célunk az volt, hogy megvizsgáljuk: képesek-e a monoamin uptake gátló anyagok befolyásolni ezen ionotróp glutamát receptorok m űködését? Ennek érdekében tanulmányoztuk a két leghatékonyabb nAChR antagonista tulajdonsággal rendelkez ő antidepresszáns, a triciklikus desipramin és az SSRI fluoxetin hatását az NMDA-kiváltotta [3H]noradrenalin ([ 3H]NA) felszabadulásra patkány hippocampus szeletb ől. Ezt a kísérleti metodikát azért választottuk, mivel az NMDA-kiváltotta NA felszabadulás egy széleskörben elterjedt módszer olyan anyagok vizsgálatára, melyek az NMDA receptoron hatnak (Vizi és Kiss, 1998). Kísérleti körülményeink között az NMDA-kiváltotta [3H]NA felszabadulást dózisfügg ő módon gátolta a nemkompetitív NMDA antagonista MK-801 (dizocilpin) 0.54 µM-os

IC 50 értékkel, ami arra útal, hogy a válasz az NMDA receptorok ingerlése által mediált. A desipramin és a fluoxetin is szintén dózisfügg ő módon gátolták az NMDA-kiváltotta transzmitter felszabadulást, de az MK-801-nél kisebb hatékonysággal, IC 50 értékük 14.57 illetve 41.06 µM volt. Ezen eredmények több kérdést is felvetnek. Mi az antidepresszánsok hatásmechanizmusa ? Közvetlen módon gátolják az NMDA receptorokat, vagy a gátlás

68 indirekt módon, más struktúrákon keresztül valósul meg ? Van-e klinikai jelent ősége ezen felfedezéseknek ? Az antidepresszánsok célpontja Az NMDA-kiváltotta NA-felszabadulás els ő lépése a noradrenerg varikozitásokon preszinaptikusan elhelyezked ő NMDA-receptorok aktivációja (Clarke és Reuben, 1996), mely a ligand-vezérelt ioncsatorna kinyitását okozza, ezáltal lehet ővé téve a kationok sejtbe történ ő belépését. Ez egy kezdeti depolarizációt okoz, mely következtében kinyílnak a feszültségfügg ő Na +-csatornák és ezáltal a neuron további depolarizációja következik be. Végül aktiválódnak a feszültségfügg ő Ca 2+-csatornák is, ami a noradrenalin exocitózissal történ ő felszabadulásához vezet. Ennek következtében egyértelm ű, hogy a [3H]NA felszabadulás nemcsak a direkt NMDA antagonisták által gátolható, hanem az olyan anyagok által is, melyek a Na +- és/vagy a Ca 2+ csatornák szintjén fejtik ki hatásukat. És valóban, kimutatták, hogy úgy a desipramin, mint a fluoxetin képes gátolni a a Na +- áramokat különböz ő neuronális preparátumokon (Ogata és mtsai., 1989; Deffois és mtsai., 1996; Pancrazio és mtsai., 1998), valamint azt is, hogy a fluoxetin gátolja a Ca 2+ - csatornákat a szívben (Pacher és mtsai., 2000), illetve a központi idegrendszer szintjén (Deák és mtsai., 2000). Azon megfigyelésünk, hogy az NMDA-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulást a TTX gátolta azt mutatja, hogy az NMDA-ra adott válaszhoz szükséges a Na +-csatornák aktivációja, minek következtében a feszültségfügg ő ioncsatornák lehetséges részvételét vizsgálnunk kellett. Korábban már bebizonyítottuk, hogy a desipramin és a fluoxetin Na +-csatornákra gyakorolt gátló hatása nagymértékben függ a csatorna funkcionális állapotától, és hogy a membrán- potenciál valamint az ingerlési paraméterek függvényében az IC 50 -értékek széles koncentráció-tartományban mozognak (Lenkey és mtsai., 2006). Mivel nehéz meghatározni, hogy a mi szelet-preparátumaink esetén az NMDA pontosan milyen aktivitás mintázatot vált ki, az elektrofiziológiai tanulmányok esetén a Na +-csatornák részvételét nem lehet egyhangúan kizárni. Éppen ezért a következ ő kísérletsorozatban összehasonlítottuk az antidepresszánsok NMDA- illetve elektromos ingerlés-kiváltotta [3H]NA felszabadulásra gyakorolt gátló hatását patkány hippocampus szeletben. A Na +- csatornagátló TTX-el kapott eredményeink azt mutatták, hogy a Na +-csatornák gátlása az ingerlés típusától függetlenül azonos hatékonysággal gátolja a NA felszabadulást, ami arra utal, hogy a Na +-csatornák hasonlóan fontos szerepet játszanak úgy az

69 elektromos-ingerléssel, mint az NMDA-val kiváltott transzmitter-felszabadulásban. Mindamellett, kísérleteinkben úgy a desipramin mint a fluoxetin csak az NMDA- kiváltotta release-t gátolta, de egyáltalán nem voltak hatással az elektromos ingerlés- kiváltotta válaszra (15. ábra, 16. ábra), ami arra utal, hogy a mi kísérleti körülményeink között a Na +-csatornáknak nem lehet szerepe az antidepresszánsok hatásában. Ha megnézzük azon kaszkád-szer ű események sorát, melyek a transzmitter felszabadulásához vezetnek (27. ábra), egyértelm ű, hogy a Na +-csatornák aktivációjától kezd ődően úgy az elektromos ingerléssel, mint az NMDA-val kiváltott transzmitter felszabadulás közös útvonalon halad tovább. Ennek következtében az NMDA-kiváltotta válasz szelektív gátlása kizárja a Na +- csatornák és az ezek után következ ő bármely célpont (például a Ca 2+-csatornák) részvételét az antidepresszánsok hatásában. Mivel a Na +-csatornák aktivációját megel őző lépés az az NMDA receptor-mediálta sejtmembrán-depolarizáció, adataink azt mutatják, hogy az antidepresszánsok els ődleges támadáspontja maga az NMDA- receptor. Ezt a következtetést leellen őriztük egy párhuzamosan elvégzett elektrofiziológiai vizsgálattal, melyben bizonyítottuk, hogy úgy a desipramin, mint a fluoxetin képes gátolni az NMDA-kiváltotta ionáramokat patkány kortikális sejttenyészetben (Szász és mtsai., 2007a). Antidepresszánsok nAChR-ra és NMDA receptorra gyakorolt hatásának összehasonlítása Jelen munka egyik nagy el őnye, hogy az NMDA-kiváltotta NA felszabadulás patkány hippocampus szeletb ől természetében nagyon hasonló folyamat a hippocampális nikotin-kiváltotta NA felszabaduláshoz, ezáltal lehet ővé teszi az antidepresszánsok különböz ő receptorokra gyakorolt hatásának összehasonlítását. Úgy a nAChR, mint az NMDA receptor ligand-vezérelt ionotrop receptorok, melyek a noradrenerg varikozitásokon helyezkednek el (Pittaluga és Raiteri, 1990; Wang és mtsai., 1992; Clarke és Reuben, 1996). Ezen receptorok aktivációja Ca 2+ és Na + beáramlást okoz a sejtbe és ennek következtében a terminális membrán deplarizációja jön létre, mely viszont helyileg kezd ődő akciós potenciálokat generál. A NA felszabadulását ezek a tovaterjed ő akciós potenciálok váltják ki, ami megmagyarázza a NA felszabadulás TTX-érzékenységét, noha a nAChR-ok és az NMDA receptorok preszinaptikusan helyezkednek el a noradrenerg axon elágazásokon. Egy további hasonlóság a nAChR

70 illetve az NMDA receptor-közvetítette NA felszabadulás között, hogy az agonista által kiváltott válasz nagyon hatékonyan gátolható az adott receptor csatornablokkoló típusú antagonistáival. Egy korábbi tanulmányunk során (Hennings és mtsai., 1997) a nikotin- kiváltotta NA felszabadulást patkány hippocampusban a mekamilamin 0.19 µM-os IC 50 értékkel gátolta, míg a jelen munkánk során az NMDA-kiváltotta transzmitter felszabadulást az MK-801 nagyon hasonló hatékonysággal gátolta (IC 50 =0.54 µM). Amennyiben összehasonlítjuk az antidepresszánsok gátló hatását ezekkel a referencia- értékekkel, levonhatjuk a következtetést, hogy a desipramin 0.36 µM-os és a fluoxetin

0.57 µM-os IC 50 -értéke a nACh receptorokon ugyanazon nagyságrendben mozog, mint a mekamilaminé, viszont 1.5-2.0 nagyságrenddel alacsonyabb, mint az MK-801 hatáser őssége az NMDA receptorok esetén. A hatáser ősségek arányának kiszámítása

(IC 50NMDAR /IC 50nAChR = 56 a desipramin és 72 a fluoxetin esetén) ugyancsak egyértelm űen arra utal, hogy ezek az antidepresszánsok sokkal gyengébb antagonistaként viselkednek az NMDA receptor esetén, mint a nACh receptoron. Klinikai jelent őség Az antidepresszánsok állandósult plazma-koncentrációja általában nem haladja meg az 1-2 µM-os koncentráció-tartományt (Muscettola és mtsai., 1978; Hyttel 1982; Pato és mtsai., 1991). Ugyanakkor a monoamin-uptake gátlók koncentrációja az agyban jóval magasabb, ezen anyagok speciális eloszlási jellemz őinek következtében. A desipraminnal kapcsolatban ugyanezt közölték egy, patkányokon végzett farmakokinetikai vizsgálatban is (Besret és mtsai., 1996), ugyanakkor a fluoxetinnel meggy őző humán megfigyelések léteznek ezzel a kérdéssel kapcsolatban. Egy, depressziós betegeken végzett mágneses rezonancia spektroszkópiás vizsgálatban a fluoxetin állandósult agyi koncentrációja 13 µM körül mozgott (Bolo és mtsai., 2000). Az általunk párhuzamosan elvégzett elektrofiziológiai tanulmányban (Szász és mtsai., 2007a) mindkét antidepresszáns hozzávet őleg háromszor er ősebb NMDA antagonistának bizonyult, mint a szeletkísérletek esetén, ami valószín űleg a kísérleti körülmények közt fennálló különbségeket tükrözi és lehet, hogy az NMDA antagonista tulajdonság mértékének megítélésében sokkal megbízhatóbb. Ezen adatok és a jelen eredményeink arra utalnak, hogy az antidepresszáns kezelés során a desipramin és a fluoxetin elérhetnek olyan koncentrációt az agyban, melynél már az NMDA receptorok - különösen az extraszinaptikusan elhelyezked ő, nagy affinitású NMDA receptorok

71 (Vizi 2000) – m űködését számottev ően befolyásolják, ennek következtében ésszer ű azt feltételezni, hogy az antidepresszánsok gátló hatása hozzájárulhat a terápiás hatásukhoz. Az elmúlt évtizedekben számtalan tanulmány bizonyította, hogy az NMDA receptorok részt vehetnek a depresszió kórélettanában valamint az antidepresszánsok hatásmechanizmusában. Az NMDA antagonisták antidepresszáns hatást mutattak a magatartási tanulmányok során (Trullas és Skolnick, 1990; Maj és mtsai., 1992; Panconi és mtsai., 1993; Papp és Moryl, 1994; Layer és mtsai., 1995; Redmond és mtsai., 1997). Az olyan nem-kompetitív NMDA antagonisták, mint az amantadin és a memantin együttadása különböz ő antidepresszánsokkal fokozta azok hatékonyságát a kényszerített úszás-teszt során (Rogoz és mtsai., 2002). Terápia-rezisztens depressziósokon végzett klinikai tanulmányokban az amantadin javította a depressziós skála pontszámát (Stryjer és mtsai., 2003). A nem-kompetitív NMDA antagonista ketamin infúzióban történ ő adása akut és tartós javulást okozott major depresszióban szenved ő betegeknél (Berman és mtsai., 2000; Zarate és mtsai., 2006). Ezen adatokkal párhuzamosan, számos tanulmány azt mutatta, hogy a krónikus antidepresszáns kezelés során az NMDA receptorok funkciója csökkent (Nowak és mtsai., 1993; Popik és mtsai., 2000; Bobula és mtsai., 2003). Egy radioligand kötési tanulmány során azt találták, hogy a krónikus antidepresszáns kezelés csökkentette az NMDA receptorok számát, míg az akut kezelés esetén ez nem következett be (Paul és mtsai., 1994). Ezen tanulmányok csak az antidepresszánsok indirekt hatásmechanizmusát vetették fel; ugyanakkor ezen gyógyszerek és az NMDA receptor közti direkt kölcsönhatást csak a triciklikus vegyületek esetében észlelték (Sernagor és mtsai., 1989; Cai és McCaslin, 1992; Watanabe és mtsai., 1993). Mindazonáltal, a triciklikus antidepresszánsok számos receptor m űködését befolyásolják (ilyenek például a muszkarinos és a nikotinos ACh receptorok, az 5-HT 3 receptorok, az alpha 1-adrenoceptorok, a hisztamin H 1 receptorok) és ezek az interakciók magyarázzák ennek a gyógyszercsoportnak az el őnytelen mellékhatás-profilját, ennek következtében az NMDA receptorokra gyakorolt hatásuknak nem tulajdonítottak különösebb jelent őséget. Adataink, miszerint a triciklikus szereknél jóval kevesebb mellékhatással rendelkez ő SSRI vegyületek egyik képvisel ője, a fluoxetin, a klinikailag releváns koncentráció- tartományban képes gátolni az NMDA receptorokat, egy fontos alátámasztást nyújt azon elképzeléshez, hogy az NMDA receptor m űködésének szabályozása fontos lehet a

72 depresszió kezelésében. Mindamellett nyilvánvaló, hogy az antidepresszánsok NMDA antagonista tulajdonsága nem az egyetlen és valószín űleg nem is a legfontosabb hatásmechanizmus, melynek révén ezen gyógyszerek kifejtik terápiás hatásukat. Jelenlegi és el őző eredményeink azt mutatják, hogy a monoamin-szintek megemelésén kívül az antidepresszánsok képesek befolyásolni a nAChR-ok (Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999; Szász és mtsai., 2007b), a feszültségfügg ő Na +- csatornák (Lenkey és mtsai., 2006) és az NMDA receptorok (Szász és mtsai., 2007a) működését, és a végs ő terápiás hatásuk mindezen folyamatok (és esetleg egyéb, jelenleg még nem ismert tényez ők) összeadódásából származik. Mindazonáltal az itt bemutatott eredményeink farmakológiai bizonyítékot szolgáltatnak az NMDA receptorok lehetséges részvételére az antidepresszánsok hatásában és segíthetnek a depresszió neurokémiai hátterének jobb megértésében.

7.3. Monoamin uptake inhibítorok P2X-receptor antagonista tulajdonsága: a P2X receptorok lehetséges szerepe az antidepresszánsok terápiás és mellékhatásaiban

Az ionotróp receptorok 3 nagy családba oszthatók (Nicke és mtsai, 1999): a pentamer szerkezet ű nikotin receptor családra (nikotin, GABA, glicin, 5-HT3), a tetramer szerkezet ű glutamát receptor családra (GLU, AMPA, kainát) és a trimer szerkezet ű P2X receptor családra. Az el őző fejezetekben közölt eredményeink azt mutatják, hogy az antidepresszánsok gátolni képesek mind a nAChR-okat mnd az NMDA receptorokat. Ezen megfigyelésekre alapozva felvet ődött a kérdés, hogy az uptake-gátló típusú antidepresszánsok nemcsak a fent említett két ionotrop receptor esetén bizonyulnak antagonistának, hanem az ionotrop receptorok családjánal harmadik képvisel őjét, a P2X receptort is képesek gátolni. Annak érdekében, hogy ezt a feltételezést tisztázzuk, megvizsgáltuk a két leghatékonyabbnak bizonyult nAChR antagonista antidepresszáns, a triciklikus desipramin (Hennings és mtsai., 1999) és az SSRI típusú fluoxetin (Hennings és mtsai., 1997) hatását az ATP-kiváltotta [ 3H]noradrenalin ([ 3H]NA) felszabadulásra tengerimalac jobb pitvar-preparátumból in vitro szeletperfúziós technika segítségével. Ilyen körülmények között azt találtuk, hogy az ATP-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulást dózisfügg ő módon gátolta a P2X receptor antagonista PPADS 1.7 µM-os

IC 50 értékkel, ami arra utal, hogy a válasz a P2X receptorok ingerlése által mediált. A

73 triciklikus desipramin és az SSRI fluoxetin is szintén dózisfügg ő módon gátolták az ATP-kiváltotta transzmitter felszabadulást, de a PPADS hatékonyságához hasonló er ősséggel, , mivel IC 50 értékük 4.45 illetve 2.48 µM volt. Ugyanakkor, az ATP-re adott válasz gátlása még nem egyértelm űen jelenti, hogy az adott szer közvetlenül a P2X receptort gátolja, a hatás lehet indirekt is, mivel (hasonlóan a nikotin- illetve az NMDA-kiváltotta NA-felszabaduláshoz) ez is egy több lépéses folyamatnak az eredménye, amelyben a feszültségfüggő Na + és Ca 2+ -csatornák aktivációja követi a P2X receptorok által kiváltott depolarizációt a korábbiakban az NMDA és nAChR-okkal teljesen megegyez ő folymat során. Az ATP-kiváltotta NA felszabadulás els ő lépése a P2X receptorok aktivációja, ami megnyitja a receptor ioncsatornáját és kationok belépését teszi lehet ővé a sejtbe. Az így fellép ő membrán- depolarizáció aktiválja a feszültségfügg ő Na +-csatornákat és így további depolarizációhoz vezet. Ezek után már a feszültségfügg ő Ca 2+ -csatornák is aktiválódnak és a sejtbe áramló Ca 2+ kiváltja a vezikuláris exocitózist. Elméletieg tehát ezen membránproteinek bármelyike célponja lehet a monoamin uptake-gátlóknak (28. ábra).

2+ Ca Na + +

+ + IR

Nikotin, NMDA, NA ATP

28. ábra. Monoamin uptake gátlók hatásának lehetséges célpontjai: ionotróp receptorok (IR), feszültségfügg ő Na + - csatornák és/vagy feszültségfügg ő Ca 2+ - csatornák.

Eddigiekben már leírták, hogy az imipramin és a desipramin közepes illetve lassú kinetikájú Na +-csatorna-blokkolóknak tekinthet ők (Delpon és mtsai., 1993), a fluoxetin

74 pedig gátolja az L-típusú Ca 2+ (Witchel és mtsai., 2002) és a kifele irányuló tranziens K+-áramokat (Park és mtsai., 1999; Magyar és mtsai., 2004), gátolja a kardiális Na + és Ca 2+ -csatornákat (Pacher és mtsai., 1999; Magyar és mtsai., 2003). Fentiek alapján a Na +-csatornák esetleges érintettségét mindenképpen vizsgálnunk kellett. Ennek tisztázására, összehasonlítottuk, hogy a desipramin illetve a fluoxetin hogyan befolyásolja a különböz ő módokon, vagyis ATP-vel, illetve elektromos ingerléssel kiváltott NA felszabadulás folyamatát. Amennyiben a két monoamin uptake gátló antidepresszáns vegyület a Na +-csatornák gátlásán keresztül függeszti fel az ATP- kiváltotta NA felszabadulást, akkor gátolniuk kellene az elektromos ingerlés-kiváltotta transzmitter kiáramlást is. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy mindkét antidepresszáns vegyület dózisfügg ő módon gátolta úgy az ATP-vel, mint az elektromos-ingerléssel kiváltott NA felszabadulást, viszont eltér ő hatáser ősséggel. Míg az ATP-vel kiváltott ingerlés esetén a két anyag IC 50 értéke ugyanazon nagyságrendben mozgott, mint a P2X receptor antagonista PPADS- nek, addig az elektromos ingerlés esetén kapott IC 50 értékek a desipramin esetén közel négyszeres, míg a fluoxetin esetén csaknem két nagyságrendnyi eltérést mutattak a + PPADS-hez képest. Mivel a Na -csatornák aktivációja hasonlóan fontos szerepet játszik mind az elektromos ingerléssel, mind az ATP által kiváltott NA felszabadulás folyamatában, eredményeink arra utalnak, hogy az adott kísérleti körülmények között a + Na -csatornák gátlása a P2X receptorok gátlásánál kevésbé fontos szerepet játszik a két uptake-gátló antidepresszáns atriális (pitvari) NA felszabadulást gátló hatásában. Az antidepresszánsok számos kardiovaszkuláris mellékhatással rendelkeznek, melyek egy része valószín űleg a P2X receptorokhoz kapcsolódik. A triciklikus desipramin dózisfügg ő módon gátolta a humán szívizom-működést (Heard és mtsai., 2001); szignifikánsan megemelte a 24 órára es ő átlagos pulzusszámot, egyidej űleg szignifikáns csökkenést okozva az RR intervallum változékonyságában (Walsh és mtsai., 1999); patkányokban megváltoztatta a nyugalmi állapotra jellemz ő rövidtávú artériás vérnyomás-változásokat (Bertram és mtsai., 1999); helyileg alkalmazva felt űnő módon megemelte a szívizom bazális interszticiális NA koncentrációját, valamint a szív szimpatikus aktivációra adott válaszait (vérnyomásemelkedés, RR intervallum csökkenés stb.) (Walsh és mtsai., 1994). A desipraminnal kezelt betegeknél szignifikánsan kevesebb volt a sinus kihagyás és a jonctionális ritmus, ugyanakkor

75 megemelkedett a korai pitvari beütések és a szupraventrikuláris tahikardia el őfordulása (Biederman és mtsai., 1993). Az imipramin és a desipramin közepes illetve lassú kinetikájú Na+ csatorna- blokkolóknak tekinthet ők (Delpon és mtsai., 1993). Számos antidepresszáns, köztük a desipramin is, a katekolamin reuptake-gátló hatásuknak köszönhet ően antiarritmiás tulajdonsággal bír (Manoach és mtsai., 1992). Fiatal feln őtteknél a DMI megnyújtja az intrakardiális vezetést (Stern és mtsai., 1991). Nyulak esetén pulzusszám emelkedést okoz (Dorward és mtsai., 1991). A fluoxetin esetén is emelkedik azon esettanulmányok száma, melyek arról számolnak be, hogy az FLX- illetve egyéb SSRI-kezelésben részesül őknél (vagy ezen gyógyszereknek a túladagolásakor) gyakoribbak az olyan dysrhytmiák, mint a pitvarfibrilláció vagy a bradikardia és a syncope (Pacher és mtsai., 1999; Ellison és mtsai., 1990). Ezeken kívül még leírták azt is, hogy a fluoxetin úgy antiarritmiás, mint proarritmiás tulajdonságokkal (Pacher és mtsai., 2000) illetve kardiodepresszív és vazodilatátoros hatással (Pacher és mtsai., 1998) is rendelkezhet. Megfigyelték, hogy negatív kronotrop és inotrop hatása van (Pousti és mtsai., 2006), illetve hogy megnyújtja a QT távolságot és megemeli a “torsades de pointes”-ok kockázatát (Curtis és mtsai., 2003). Egy vizsgálatban azt találták, hogy a fluoxetin kezelésben részesül ők 4%-ánál lép fel kardiovaszkuláris mellékhatás. Az FLX a szívfrekvencia 6%-os csökkenését valamint az ejekciós frakció 7%-os emelkedését okozta (Roose és mtsai., 1998). FLX kezelést kapó bulimia nervosában szenvedő betegeknél a kardiális vagus tónus csökkenését észlelték (Rissanen és mtsai., 1998). Viszont voltak olyan megfigyelések is, melyek azt mutatták ki, hogy nem volt észlelhet ő EKG elváltozás az FLX-kezelt betegeknél (Baker és mtsai., 1997). A fluoxetin kezelésben részesül őknél megfigyeltek ortosztatikus hipotenziót és különféle arritmiákat (Park és mtsai., 1999). Mindazonáltal, P2X receptorok el őfordulnak az agy különböz ő területein is, így a kardiovaszkuláris mellékhatások mellett a központi idegrendszeri hatásokkal is számolnunk kell. Habár az SSRI fluoxetin és a triciklikus desipramin hatékonysága hozzávet őleg egy nagyságrenddel kisebbnek bizonyult a P2X receptorok esetén, mint a nAChR-on, a kapott IC 50 értékek (4.45µM a desipramin illetve 2.48 µM a fluoxetin esetén) még mindig a klinikailag releváns koncentráció-tartományban mozognak, mivel az antidepresszáns kezelés során ezen anyagok állandósult plazma-koncentrációja 1-2

76 µM körül van (Muscettola és mtsai., 1978; Hyttel 1982; Pato és mtsai., 1991), de speciális eloszlási jellemz őiknek köszönhet ően az agyban ennél jóval magasabb koncentráció-értékeket is elérnek. Összefoglalásul levonhatjuk a következtetést, miszerint jelen eredményeink azt bizonyítják, hogy a két, széleskör űen használt monoamin uptake gátló antidepresszáns gátolni képes a P2X receptorok által mediált válaszokat is. Ezen adatok a nAChR-ok (Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999; Szász és mtsai., 2007b) és az NMDA receptorok (Szász és mtsai., 2007a) esetén kapott korábbi eredményeinkkel együtt felvetik annak lehet őségét, hogy az antidepresszáns vegyületeknek a monoamin transzportereken kívül más támadáspontjai is vannak a központi idegrendszer szintjén (Vizi, 2000), és ezen kölcsönhatások hozzájárulhatnak az antidepresszánsok terápiás illetve mellékhatásainak kifejl ődéséhez.

7.4. Csatorna-blokkoló típusú ionotróp receptor antagonista vegyületek dopamin- uptake gátló hatása

Munkacsoportunk egy korábbi tanulmánya során azt találtuk, hogy a nem-kompetitív NMDA receptor antagonista dizocilpin (MK-801) megemelte a striatális dopamin (DA) szintet, a mecahnizmusról azonban akkor csak annyit sikerült kideríteni, hogy az MK- 801 NMDA receptorokra gyakorolt hatásától független (Kiss és mtsai., 1994). Érdekes módon az antidepresszánsok nem-konvencionális hatásainak tanulmányozása során olyan eredményekre jutottunk, melyek megmagyarázhatják e régi megfigyelésünket. MInt azt korábban említettük, azt tapasztaltuk, hogy monoamin uptake gátló antidepresszánsok kémiai szerkezeükt ől és szelektivitásuktól függetlenül gátolni képesek a neuronális nACh receptorok működését a mekamilaminéhoz hasonló csatornablokkoló mechanizmus révén (Kiss és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1999). Elektrofiziológiai adatok arra utalnak, hogy számos membrán transzporter fehérje ioncsatorna-jelleg ű tulajdonságokkal rendelkezik (Larsson és mtsai., 1996; Sonders és Amara, 1996; Lester, 1996; Sonders és mtsai, 1997). A NA felvétel és az áramok párhuzamos mérése NA transzporterrel transzfektált HEK sejtekben nagy különbségeket mutatott a töltések és a szubsztrát fluxusa között (Galli és mtsai, 1995). Ez arra utalt,

77 hogy a NA transzporter m űködése során a transzportfolyamattal párhuzamosan, nem sztöchiometrikusan kapcsolt ionáramok is keletkeznek. Ezen megfigyelés alapján merült fel, hogy a transzporterekben ioncsatorna-szer ű struktúrák találhatók (DeFelice és Blakely, 1996; Galli és mtsai., 1998). A felhalmozódó adatok azt mutatják, hogy e csatornáknak fontos funkcionális szerepük lehet a transzport folymat lezajlásában, mivel, az uptake gátlókról kimutatták, hogy gátolják a transzportereken keresztül folyó nem sztöchiometrikus áramokat is. Ez alapján feltételeztük, hogy az uptake gátlók nAChR csatornáját blokkoló sajátossága talán éppen azzal magyarázható, hogy valamifajta hasonlóság áll fenn transzporterek és receptorok csatornastruktúrája között. Ha ez így van, akkor ezek alapján az is feltételezhet ő, hogy a nAChR csatornablokkoló antagonistái képesek gátolni a monoamin transzporterek m űködését is. Jelen munkánk során ezt a hipotézist kívántuk vizsgálni két csatorna-blokkoló típusú receptor antagonista vegyület, a nAChR antagonista mekamilamin és az NMDAR antagonista, de nAChR-on is aktív dizocilpin (MK-801) sztriatális dopamin felszabadulásra kifejtett hatásának tanulmányozásával, in vivo mikrodialízis technika segítségével..Egyúttal tisztázni kívántuk azt is, hogy a DA visszavétel gátlása szerepet játszik-e az MK-801 általunk korábbiakban észlelt sztriatális dopamin-szint emel ő hatásában ? Kísérleteink során azt találtuk, hogy a szelektív dopamin uptake-gátló nomifensin közel nyolcszoros emelkedést okozott a nyugalmi DA koncentrációban. A csatornablokkoló- típusú NMDA receptor antagonista MK-801 mintegy 85 %-kal emelte meg a sztriatális DA kiáramlást, viszont a dopamin uptake gátló nomifensin jelenlétében már egyáltalán nem volt hatással a striatum extracelluláris DA koncentrációjára. Az el őzőekhez hasonló módon a nAChR antagonista mekamilamin szintén szignifikáns, mintegy 75%- os emekedést okozott a striatum extracelluláris DA koncentrációjában, viszont a dopamin uptake gátló nomifensin jelenlétében ennek az anyagnak sem volt hatása a sztriatális DA szintre. Adataink azt mutatják, hogy az MK-801 és a mekamilamin sztriatális DA-szint emel ő hatása szoros összefüggésben van a dopamin uptake rendszer m űködésével, mivel a transzmitter visszavételének gátlása a nomifensin által megakadályozta ezen hatásukat. Eredményeinket elméletileg két hatásmechanizmus részvételével is magyarázhatjuk: egyrészt, a receptor antagonista vegyületek megfordíthatják a DA transzporterek

78 működését, ezáltal úgynevezett “carrier-mediálta felszabadulást” okozva; másrészt pedig egyszer űen csak meggátolják ezen transzporterek m űködését. Kizárólag eredményeinkre alapozva nem foglalhatunk egyértelm ű állást egyik hatásmechanizmus mellett sem, viszont az irodalmi adatok a második változatot (vagyis az uptake közvetlen gátlását) valószín űsítik, mivel megfigyelték, hogy az MK-801 dózisfüggő módon, szignifikánsan gátolta mindhárom monoamin transzporter (DA, NA és 5-HT) működését ezen transzportereket expresszáló HEK sejteken (Nishimura és mtsai., 1998). További adatok szerint az MK-801 gátolta a [3H]NA uptake-et patkány vas + deferens preparátumon (IC 50 = 1.79 µM), magnézium jelenlétében, Na -függ ő módon, ami kizárja az NMDA receptorok közvetlen részvételét ezen hatásban (Pubill és mtsai., 1996). Ugyanakkor a hippocampus szintjén az MK-801 gátolta a [ 3H]NA uptake-et, striatum szinaptoszóma preparátumon pedig a [ 3H]DA uptake-et (Snell és Johnson, 1988). Voltammetriás vizsgálatokban azt is megfigyelték, hogy az MK-801 szignifikáns emelkedést okozott a noradrenalin és a szerotonin felszabadulásban az uptake gátlása révén a locus coeruleus és a dorsalis raphe mag szintjén (Callado és mtsai., 2000). A mecamilaminnal kapcsolatban leírták, hogy emelei a 5-HT szintet a dorsalis raphe magban a 5-HT transporter gátlása révén (Ma és mtsai, 2006). A mekamilamin és az MK-801 dopamin uptake-gátló hatása összhangban van azon elektrofiziológiai eredményekkel, melyek szerint csatorna-szer ű struktúrák léteznek a monoamin uptake rendszerekben (Sonders és Amara, 1996) és támogatja azon elképzelést, hogy ezek a “pórusok” fontos szerepet játszanak a neurotranszmitterek visszavételének folyamatában.

79 8. KÖVETKEZTETÉSEK

1. Két atípusos antidepresszánsról, a NA uptake gátló maprotilinr ől, valamint a szerotonin visszavételt serkent ő, tehát a monoamin teóriával nem összeegyeztethet ő módon ható tianeptinr ől sikerült kimutatnunk, hogy a korábban vizsgált antidepresszánsokhoz hasonlóan, a klinikailag releváns koncentráció-tartományban gátolják a nAChR közvetítette noradrenerg választ a hippokampuszban. Mivel e vegyületek az elektromos ingerléssel kiváltott transzmitter felszabadulást sokkal kisebb mértékben gátolták, mint a nAChR-mediálta választ, megállapíthatjuk, hogy els ődleges célpontjaik nem lehettek sem a Na +-csatornák sem a Ca 2+ -csatornák, és hatásukat a nAChR közvetlen gátlása révén fejtik ki. Ezen megfigyelésünk meger ősíti a depresszió nAChR-teóriáját, és azt mutatja, hogy a központi idegrendszer nAChR-orainak gátlása hozzájárulhat az antidepresszáns hatás kialakulásához.

2. A korábban két leger ősebb nAChR antagonistának bizonyult antidepresszánsról, a triciklikus desipraminról és az SSRI fluoxetinr ől kimutattuk, hogy a klinikailag releváns koncentráció-tartományban képesek gátolni hippokampusz szeleten az NMDA receptorok által mediált [ 3H]NA-felszabadulást, vagyis NMDAR antagonista tulajdonsággal rendelkeznek. Mivel egyik vegyület sem befolyásolta az elektromos ingerléssel kiváltott transzmitter felszabadulást, egyértelm ű, hogy célpontjuk maga az NMDA receptor. Eredményeink azt mutatják, hogy az NMDA receptorok gátlása szintén egyik elemét képezheti az antidepresszánsok hatásmechanizmusának.

3. Tengerimalac jobb pitvar-preparátumon végzett kísérleteinkkel igazoltuk, hogy a nAChR-okon és NMDA receptorokon antagonistának bizonyult desipramin és fluoxetin, a klinikailag releváns koncentráció-tartományban képes gátolni az ATP ionotrop (P2X) receptorai által közvetített [ 3H]NA-felszabadulást, azaz mindkét vegyület P2X-R antagonista tulajdonsággal rendelkezik. Eredményeinkb ől arra következtethetünk, hogy a szívben található P2X receptorok gátlása hozzájárulhat az antidepresszánsok kardiovaszkuláris mellékhatásainak kialakuláshoz, míg az agyi P2X receptorokra gyakorolt hatásuk esetleg szerepet játszhat a terápiás hatás kifejl ődésében.

80 5. Adataink azt mutatják, hogy az antidepresszánsok többféle célponttal rendelkezhetnek a központi idegrendszerben, hiszen a monoamin szintek emelésén kívül mindhárom ionotrop receptor-család egy-egy képviselője (nAChR, NMDAR és P2X-R) esetén receptor antagonistákként viselkedtek, ami felveti annak lehet őségét, hogy az antidepresszánsok befolyásolhatják számos ionotróp receptor m űködését, és ezen interakciók ered őjeként alakul ki a klinikai hatásuk.

5. In vivo mikrodialízis kísérleteinkkel igazoltuk, hogy két ionotrop receptor antagonista vegyület, a nAChR antagonista mekamilamin, illetve az NMDAR antagonista dizocilpin (MK-801) megemelik a striatum extracelluláris DA szintjét (anélkül, hogy ezen neurotranszmitter metabolitjaira hatással lennének), mely hatás nagy valószín űséggel a monoamin uptake rendszerekre gyakorolt közvetlen gátló hatásuknak a következménye. Eredményeink meger ősítik azt az elképzelést, hogy a monoamin transzporterekben található csatornaszer ű struktúráknak funkcionális jelent ősége lehet a monoaminok visszavételi folyamataiban.

81 9. ÖSSZEFOGLALÁS

Általánosan elfogadott nézet, hogy a jelenleg használt antidepresszáns vegyületek túlnyomó többsége a monoamin transzporterek gátlása és a következményes monoaminr szint emelkedés révén fejti ki hatását. Munkacsoportunk korábbi eredményei bizonyították, hogy ezen anyagoknak egyéb, a monoaminerg transzporterekt ől eltér ő támadáspontjai is vannak. Jelen munkánkban 1.) a monoamin uptake rendszerekre ható antidepresszánsok ionotrop receptorokra gyakorolt hatásával, valamint 2.) ezen receptorok és a monoamin transzporterek közti hasonlóság vizsgálatával kívántunk foglalkozni. 1. Két atípusos antidepresszánsról, a maprotilinr ől és a tianeptinr ől kimutattuk, hogy gátolják a nAChR-ok m űködését. Mivel a tianeptin a monoamin tóriával nem összeegyeztethet ő módon, a szerotonin visszvétel serkentése révén fejti ki hatását, eredményeink meger ősítik a depresszió új kolinerg teóriáját, mely szerint a depresszió kialakulásában fontos szerepe van a nAChR-ok túlingerl ődésének, az antidepresszánsok egyik f ő hatása pedig ezen receptorok gátlása. Továbbá bizonyítottuk, hogy a korábban leger ősebb nAChR antagonistának bizonyult triciklikus desipramin és az SSRI fluoxetin képes gátolni a központi idegrendszer NMDA receptorainak, valamint a perifériás idegrendszer P2X receptorainak m űködését is a klinikailag releváns, alacsony mikromólos koncentráció tartományban. Eredményeink azt mutatják, hogy az antidepresszánsok ionotróp receptorokra kifejtett gátló hatása hozzájárulhat e szerek terápiás illetve mellékhatásainak kifejl ődéséhez így felismeréseink el ősegíthetik az antidepresszánsok hatásmechanizmusának és a depresszió neurokémiai hátterének jobb megértését. 2. Korábbi eredményeink azt mutatták, hogy a monoamin uptake gátló vegyületek csatornablokkoló mechanizmussal gátolják a nACh és NMDA receptorokat. Jelen munkánkban azt találtuk, hogy a nAChR illetve az NMDAR csatornablokkoló típusú antagonistái, a mekamilamin illetve az MK-801 gátolják a monoamin transzporterek egyik képvisel őjének, a DA transzporternek a m űködését. Adataink alátámasztják azt a feltételezést, miszerint a transzporterekben leírt csatorna-szer ű struktúráknak funkcionális jelent ősége van a monoamin uptake rendszerek m űködésében.

82 SUMMARY

It is generally accepted that the majority of currently used antidepressants acts through the inhibition of monoamin reuptake and the concomitant increase of extracellular monoamin levels. Previously our research goup proved that these compounds might have other targets than the monoamine transporters. In this work we investigated 1.) the effects of monoamine uptake inhibitor and enhancer antidepressants on the ionotropic receptors, as well as 2.) we studied the similarities amongst monoamine transporters and ionotropic receptors. 1. We have shown that two atypical antidepressants, maprotilin and tianeptine acting on monoamine uptake systems are able to inhibit the function of nACh receptors. Since tianeptine is a 5-HT reuptake enhancer, its mechanism of action cannot be explained on the basis of monoamine theory. Thus our results confirm the nAChR-theory of depression, which explains the development of depression by an overactivation of nAChRs and the mechanism of action of antidepressants by the inhibition of these receptors. Furthermore, we proved that the two most potent nAChR antagonist antidepressants, the tricyclic desipramine and the SSRI fluoxetine inhibit not only the function of NMDA receptors in the central nervous system, but also the P2X receptor’s function in the periferal nervous system in the clinically relevant, low micromolar concentration range. Our data suggest that the interaction of antidepressants with ionotropic receptors might contribute to their clinical effects, thus our results might help to better understand the neurochemical background of depression and the mechanism of action of antidepressants. 2. Previously we have shown the monoamine uptake inhibitors behave like channel blocker type nAChR and NMDAR antagonists. In this work we found that the channel blocker antagonists of nAChRs and NMDARs, mecamylamine and MK-801 inhibit the function of the striatal DA uptake system. Our data support the idea, that the channel structures in transporters have functional significance in the process of monoamine reuptake.

83 10. ÁBRÁK JEGYZÉKE

1. táblázat. Monoamin visszavételt gátlók nikotin antagonista hatásának jellemzése. (Módszer: nikotin kiváltotta NA felszabadulás patkány hippocampus szeletekb ől. A mekamilamin referencia-vegyületként szerepel a táblázatban. Az egyes transzporter gátlók nikotin receptor antagonista képességét mennyiségileg az IC 50 értékkel jellemeztük (Hennings és mtsai., 1997; 1999; Szász és mtsai., 2006).

2. táblázat. A nAChR-ok agonista érzékenysége az alegység összetétel függvénye Az agonisták hatáser ő sorrendjét a Xenopus oocytában kifejez ődő nAChR aktivációt követ ő normalizált ion- áramok összehasonlítása alapján határozták meg (Patrick és mtsai, 1993). Nic: nikotin, ACh:acetilkolin, Cyt: cytizin.

1. ábra. Különböz ő monoamin uptake gátlók hatása a nikotin-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra patkány hippocampus szeletekb ől. A dózis-hatás görbék alapján számított gátlási (IC 50 ) értékeket az 1. táblázat tartalmazza (Kiss és mtsai, 1997; 1999; Szász és mtsai, 2006).

2. ábra. Az ionotróp receptor családok.

3. ábra. A nAChR és az NMDA receptorok csatorna gátló antagonistái egymásra kölcsönösen hatnak. A monoamin transzporter gátló antidepresszánsok a csatorna gátló mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal, nem-kompetitív módon gátolják a nAChR-ok m űködését. Felmerül a kérdés, hogy vajon a fenti farmakológiai hasonlóság alapján, a nAChR-okat gátló antidepresszánsok befolyásolják-e az NMDA receptor m űködését is?

4. ábra. A hippokampuszban a nikotin-kiváltotta NA-felszabadulást a nemkompetitív nikotin antagonista mekamilamin hatékonyan gátolta, ami azt bizonyítja, hogy a nikotin válasz létrejöttéhez a nAChR-ok aktivációja szükséges.

5. ábra. A mekamilamin dózis-függ ő hatása a nikotin-kiváltotta NA-felszabadulásra. A görbe alatti területet a “Módszerek”-ben leírt egyenlet alapján számítottuk ki. A görbe minden egyes pontja n=4-5 független kísérlet átlagát reprezentálja (átlagok ± standard hiba). Az EC 50 értéket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

6. ábra. A maprotilin és a tianeptin hatása a nikotin kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra patkány hippocampus szeletb ől. A gátlási értékek az antidepresszánsok jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nonlineáris regresszióval határoztuk meg.

7. ábra. Különböz ő antidepresszánsok nAChR közvetítette NA felszabadulást gátló hatásának IC 50 értékei a NA transzporter gátló hatás (log Ki) függvényében. DMI: desipramin, Nis: nisoxetin, Kok: kokain, Flx: fluoxetin, Cit: citalopram, Nom: nomifensin, GBR: GBR-12909, Map: maprotilin.

8. ábra. A Na +-csatorna blokkoló tetrodotoxin (TTX) hatásának összehasonlítása a nikotin- illetve az elektromos ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra, patkány hippocampus szeletb ől. A TTX a harmadik frakciótól kezd ődően végig jelen volt a mintagy űjtés során. Az IC 50 értékek nemlineáris regresszióval lettek meghatározva.

84 9. ábra. A maprotilin hatásának összehasonlítása a nikotin- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

10. ábra. A tianeptin hatásának összehasonlítása a nikotin- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

11. ábra. Az NMDA hatásának jellemzése a nyugalmi [3H]NA felszabadulásra patkány hippocampus szeletben. A nemkompetitív NMDA receptor antagonista MK-801 (10 µM-os koncentrációban) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen volt. A görbe alatti terület (AUC) az alapvonalhoz viszonyított többlet-felszabadulásként lett kiszámítva.

12. ábra. Az MK-801 dózis-hatásgörbéje az NMDA-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra. A gátlási értékek az antagonista jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

13. ábra. A desipramin (DMI) és a fluoxetin hatása az NMDA kiváltotta [ 3H]NA- felszabadulásra patkány hippocampus szeletb ől. A gátlási értékek az antidepresszánsok jelenlétében illetve azok hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nonlineáris regresszióval határoztuk meg.

14. ábra. A Na +-csatorna blokkoló tetrodotoxin (TTX) hatásának összehasonlítása az NMDA- illetve az elektromos ingerlés-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra, patkány hippocampus szeletb ől. A TTX a harmadik frakciótól kezd ődően végig jelen volt a mintagy űjtés során. Az IC 50 értékek nemlineáris regresszióval lettek meghatározva.

15. ábra. A desipramin hatásának összehasonlítása az NMDA- és az elektromos ingerlés- kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

16. ábra. A fluoxetin hatásának összehasonlítása az NMDA- és az elektromos ingerlés-kiváltotta 3 [ H]NA felszabadulásra nézve patkány hippocampus szeletb ől. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

17. ábra. Az ATP hatásának jellemzése a nyugalmi [3H]NA felszabadulásra tengerimalac jobb atriumában. A P2X receptor antagonista PPADS (30 µM-os koncentrációban) már a 3. frakciótól kezd ődően végig jelen volt. A görbe alatti terület (AUC) az alapvonalhoz viszonyított többlet-felszabadulásként lett kiszámítva.

18. ábra. A PPADS dózis-hatásgörbéje az ATP-kiváltotta [ 3H]NA felszabadulásra. A gátlási értékek az antagonista jelenlétében illetve annak hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

19. ábra. A desipramin (DMI) és a fluoxetin hatása az ATP kiváltotta [ 3H]NA-felszabadulásra tengerimalac jobb atriumában. A gátlási értékek az antidepresszánsok jelenlétében illetve azok hiányában kapott AUC értékek arányaként lettek kiszámítva. Az IC 50 értékeket nonlineáris regresszióval határoztuk meg.

20. ábra. A desipramin hatásának összehasonlítása az ATP- illetve az elektromos ingerlés- 3 kiváltotta [ H]NA felszabadulásra nézve tengerimalac jobb átriumában. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

85 21. ábra. A fluoxetin hatásának összehasonlítása az ATP- illetve az elektromos ingerlés- 3 kiváltotta [ H]NA felszabadulásra nézve tengerimalac jobb átriumában. Az IC 50 értékeket nemlineáris regresszióval határoztuk meg.

22. ábra. A nomifensin hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. A nomifensint (10 µM) a 0 id őponttól kezd ődően a mintavev őn keresztül adagoltuk (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (** p < 0.01).

23. ábra. Az MK-801 hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. Az antagonista 300 µM-os koncentrációban a dializáló oldatban lett feloldva és a mintavev őn keresztül adagoltuk a 0 id őponttól kezd ődően (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (** p < 0.01).

24. ábra. A nomifensin hatása az MK-801 által kiváltott striatális DA felszabadulásra altatott patkányban. A nomifensin (10 µM) perfúziója 2 órával az MK-801 (300 µM) 0 id őponttól induló adagolása el őtt kezd ődött el. Az adatok egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel lettek kiértékelve (** p < 0.01).

25. ábra. A mekamilamin hatása a striatális DA felszabadulásra altatott patkányon. Az antagonista 1mM-os koncentrációban a dializáló oldatban lett feloldva és a mintavev őn keresztül adagoltuk a 0 id őponttól kezd ődően (vízszintes vonal), a 4 nyugalmi frakció gy űjtését követ ően. Az adatokat egy-utas ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (* p < 0.05, ** p < 0.01).

26. ábra. A nomifensin hatása a mekamilamin által kiváltott striatális DA felszabadulásra altatott patkányban. A nomifensin (10 µM) perfúziója 2 órával a mekamilamin (1 mM) 0 id őponttól induló adagolása el őtt kezd ődött el. Az adatokat ANOVA-t követ ő Dunnett teszttel értékeltük ki (* p < 0.05, ** p < 0.01).

27. ábra. A tetrodotoxin (TTX) és a monoamin uptake rendszeren ható antidepresszánsok hatásmechanizmusának összehasonlítása. A NA felszabadulás mindkét, elektromos ingerléssel vagy receptor agonistával (nikotin, NMDA, ATP) kiváltott folyamatában a Na + csatornák aktivációja egyaránt esszenciális, mivel mindkét folyamatot egyforma hatékonysággal gátolja a TTX.

28. ábra. Monoamin uptake gátlók hatásának lehetséges célpontjai: ionotróp receptorok (IR), feszültségfügg ő Na + - csatornák és/vagy feszültségfügg ő Ca 2+ - csatornák.

86 11. IRODALOMJEGYZÉK

Aizenman E, Lipton SA and Loring RH (1989) Selective modulation of NMDA responses by reduction and oxidation. Neuron 2(3):1257-1263. Al-Hallaq RA, Jarabek BR, Fu Z, Vicini S, Wolfe BB and Yasuda RP (2002) Association of NR3A with the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 and NR2 subunits. Mol Pharmacol 62(5):1119-1127. Amara SG and Arriza JL (1993) Neurotransmitter transporters: three distinct gene families. Current opinion in neurobiology 3(3):337-344. Andersen PH (1989) The dopamine inhibitor GBR 12909: selectivity and molecular mechanism of action. Eur J Pharmacol 166(3):493-504. Anikina TA, Sitdikov FG, Khamzina EY and Bilalova GA (2005) Role of purinoceptors in cardiac function in rats during ontogeny. Bull Exp Biol Med 140(5):483-485. Anis NA, Berry SC, Burton NR and Lodge D (1983) The dissociative anaesthetics, ketamine and phencyclidine, selectively reduce excitation of central mammalian neurones by N-methyl-aspartate. Br J Pharmacol 79(2):565-575. Anson LC, Chen PE, Wyllie DJ, Colquhoun D and Schoepfer R (1998) Identification of amino acid residues of the NR2A subunit that control glutamate potency in recombinant NR1/NR2A NMDA receptors. J Neurosci 18(2):581-589. Aronstam RS (1981) Interactions of tricyclic antidepressants with a synaptic ion channel. Life sciences 28(1):59-64. Arqueros L, Naquira D and Zunino E (1978) Nicotine-induced release of catecholamines from rat hippocampus and striatum. Biochem Pharmacol 27(23):2667-2674. Arthur DB, Taupenot L and Insel PA (2007) Nerve growth factor-stimulated neuronal differentiation induces changes in P2 receptor expression and nucleotide- stimulated catecholamine release. J Neurochem 100(5):1257-1264. Auberson YP, Allgeier H, Bischoff S, Lingenhoehl K, Moretti R and Schmutz M (2002) 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorg Med Chem Lett 12(7):1099-1102. Ayuso-Mateos JL, Vazquez-Barquero JL, Dowrick C, Lehtinen V, Dalgard OS, Casey P, Wilkinson C, Lasa L, Page H, Dunn G and Wilkinson G (2001) Depressive

87 disorders in Europe: prevalence figures from the ODIN study. Br J Psychiatry 179:308-316. Baker B, Dorian P, Sandor P, Shapiro C, Schell C, Mitchell J and Irvine MJ (1997) Electrocardiographic effects of fluoxetine and doxepin in patients with major depressive disorder. J Clin Psychopharmacol 17(1):15-21. Banerjee S, Punzi JS, Kreilick K and Abood LG (1990) [3H]mecamylamine binding to rat brain membranes. Studies with mecamylamine and nicotine analogues. Biochemical pharmacology 40(9):2105-2110. Banfi C, Ferrario S, De Vincenti O, Ceruti S, Fumagalli M, Mazzola A, N DA, Volonte C, Fratto P, Vitali E, Burnstock G, Beltrami E, Parolari A, Polvani G, Biglioli P, Tremoli E and Abbracchio MP (2005) P2 receptors in human heart: upregulation of P2X6 in patients undergoing heart transplantation, interaction with TNFalpha and potential role in myocardial cell death. J Mol Cell Cardiol 39(6):929-939. Benveniste M and Mayer ML (1991) Kinetic analysis of antagonist action at N-methyl- D-aspartic acid receptors. Two binding sites each for glutamate and glycine. Biophys J 59(3):560-573. Berger B and Glowinski J (1978) Dopamine uptake in serotoninergic terminals in vitro: a valuable tool for the histochemical differentiation of catecholaminergic and serotoninergic terminals in rat cerebral structures. Brain research 147(1):29-45. Berman RM, Cappiello A, Anand A, Oren DA, Heninger GR, Charney DS and Krystal JH (2000) Antidepressant effects of ketamine in depressed patients. Biol Psychiatry 47(4):351-354. Bertorelli R, Amoroso D, Girotti P and Consolo S (1992) Effect of tianeptine on the central cholinergic system: involvement of serotonin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 345(3):276-281. Bertram D, Barres C and Julien C (1999) Effect of desipramine on spontaneous arterial pressure oscillations in the rat. Eur J Pharmacol 378(3):265-271. Besret L, Debruyne D, Rioux P, Bonvalot T, Moulin M, Zarifian E and Baron JC (1996) A comprehensive investigation of plasma and brain regional pharmacokinetics of imipramine and its metabolites during and after chronic administration in the rat. J Pharm Sci 85(3):291-295.

88 Biederman J, Baldessarini RJ, Goldblatt A, Lapey KA, Doyle A and Hesslein PS (1993) A naturalistic study of 24-hour electrocardiographic recordings and echocardiographic findings in children and adolescents treated with desipramine. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 32(4):805-813. Boarder MR and Hourani SM (1998) The regulation of vascular function by P2 receptors: multiple sites and multiple receptors. Trends Pharmacol Sci 19(3):99- 107. Bobula B, Tokarski K and Hess G (2003) Repeated administration of antidepressants decreases field potentials in rat frontal cortex. Neuroscience 120(3):765-769. Boehm S (1999) ATP stimulates sympathetic transmitter release via presynaptic P2X purinoceptors. J Neurosci 19(2):737-746. Boehm S and Kubista H (2002) Fine tuning of sympathetic transmitter release via ionotropic and metabotropic presynaptic receptors. Pharmacol Rev 54(1):43-99. Bolden-Watson C and Richelson E (1993) Blockade by newly-developed antidepressants of biogenic amine uptake into rat brain synaptosomes. Life sciences 52(12):1023-1029. Bolo NR, Hode Y, Nedelec JF, Laine E, Wagner G and Macher JP (2000) Brain pharmacokinetics and tissue distribution in vivo of fluvoxamine and fluoxetine by fluorine magnetic resonance spectroscopy. Neuropsychopharmacology 23(4):428-438. Bormann J (1989) Memantine is a potent blocker of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor channels. Eur J Pharmacol 166(3):591-592. Borst MM and Schrader J (1991) Adenine nucleotide release from isolated perfused guinea pig hearts and extracellular formation of adenosine. Circ Res 68(3):797- 806. Brenner DE, Kukull WA, van Belle G, Bowen JD, McCormick WC, Teri L and Larson EB (1993) Relationship between cigarette smoking and Alzheimer's disease in a population-based case-control study. Neurology 43(2):293-300. Brown SG, Townsend-Nicholson A, Jacobson KA, Burnstock G and King BF (2002) Heteromultimeric P2X(1/2) receptors show a novel sensitivity to extracellular pH. J Pharmacol Exp Ther 300(2):673-680.

89 Buck KJ and Amara SG (1994) Chimeric dopamine-norepinephrine transporters delineate structural domains influencing selectivity for catecholamines and 1- methyl-4-phenylpyridinium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91(26):12584-12588. Burnstock G (2000) P2X receptors in sensory neurones. Br J Anaesth 84(4):476-488. Bylund DB and Reed AL (2007) Childhood and adolescent depression: why do children and adults respond differently to antidepressant drugs? Neurochem Int 51(5):246-253. Cai Z and McCaslin PP (1992) Amitriptyline, desipramine, cyproheptadine and carbamazepine, in concentrations used therapeutically, reduce kainate- and N- methyl-D-aspartate-induced intracellular Ca2+ levels in neuronal culture. Eur J Pharmacol 219(1):53-57. Callado LF, Hopwood SE, Hancock PJ and Stamford JA (2000) Effects of dizocilpine (MK 801) on noradrenaline, serotonin and dopamine release and uptake. Neuroreport 11(1):173-176. Carvelli L, McDonald PW, Blakely RD and Defelice LJ (2004) Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(45):16046-16051. Casis O, Gallego M and Sanchez-Chapula JA (2002) Imipramine, mianserine and maprotiline block delayed rectifier potassium current in ventricular myocytes. Pharmacol Res 45(2):141-146. Castren E (2005) Is mood chemistry? Nat Rev Neurosci 6(3):241-246. Cavero I, Lefevre-Borg F and Roach AG (1981) Effects of mianserin, desipramine and maprotiline on blood pressure responses evoked by acetylcholine, histamine and 5-hydroxytryptamine in rats. Br J Pharmacol 74(1):143-148. Chaperon F, Muller W, Auberson YP, Tricklebank MD and Neijt HC (2003) Substitution for PCP, disruption of prepulse inhibition and hyperactivity induced by N-methyl-D-aspartate receptor antagonists: preferential involvement of the NR2B rather than NR2A subunit. Behav Pharmacol 14(5-6):477-487. Chatterton JE, Awobuluyi M, Premkumar LS, Takahashi H, Talantova M, Shin Y, Cui J, Tu S, Sevarino KA, Nakanishi N, Tong G, Lipton SA and Zhang D (2002)

90 Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature 415(6873):793-798. Chenard BL, Bordner J, Butler TW, Chambers LK, Collins MA, De Costa DL, Ducat MF, Dumont ML, Fox CB, Mena EE and et al. (1995) (1S,2S)-1-(4- hydroxyphenyl)-2-(4-hydroxy-4-phenylpiperidino)-1-propanol: a potent new neuroprotectant which blocks N-methyl-D-aspartate responses. J Med Chem 38(16):3138-3145. Chizh BA and Illes P (2001) P2X receptors and nociception. Pharmacol Rev 53(4):553- 568. Ciabarra AM, Sullivan JM, Gahn LG, Pecht G, Heinemann S and Sevarino KA (1995) Cloning and characterization of chi-1: a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic glutamate receptor family. J Neurosci 15(10):6498- 6508. Ciliax BJ, Heilman C, Demchyshyn LL, Pristupa ZB, Ince E, Hersch SM, Niznik HB and Levey AI (1995) The dopamine transporter: immunochemical characterization and localization in brain. J Neurosci 15(3 Pt 1):1714-1723. Clarke PB and Reuben M (1996) Release of [3H]-noradrenaline from rat hippocampal synaptosomes by nicotine: mediation by different nicotinic receptor subtypes from striatal [3H]-dopamine release. British journal of pharmacology 117(4):595-606. Clements JD and Westbrook GL (1991) Activation kinetics reveal the number of glutamate and glycine binding sites on the N-methyl-D-aspartate receptor. Neuron 7(4):605-613. Coppen A (1967) The biochemistry of affective disorders. Br J Psychiatry 113(504):1237-1264. Court J, Martin-Ruiz C, Piggott M, Spurden D, Griffiths M and Perry E (2001) Nicotinic receptor abnormalities in Alzheimer's disease. Biol Psychiatry 49(3):175-184. Couturier S, Bertrand D, Matter JM, Hernandez MC, Bertrand S, Millar N, Valera S, Barkas T and Ballivet M (1990) A neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit (alpha 7) is developmentally regulated and forms a homo-oligomeric channel blocked by alpha-BTX. Neuron 5(6):847-856.

91 Cull-Candy S, Brickley S and Farrant M (2001) NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opin Neurobiol 11(3):327-335. Curtis LH, Ostbye T, Sendersky V, Hutchison S, Allen LaPointe NM, Al-Khatib SM, Usdin Yasuda S, Dans PE, Wright A, Califf RM, Woosley RL and Schulman KA (2003) Prescription of QT-prolonging drugs in a cohort of about 5 million outpatients. Am J Med 114(2):135-141. Das S, Sasaki YF, Rothe T, Premkumar LS, Takasu M, Crandall JE, Dikkes P, Conner DA, Rayudu PV, Cheung W, Chen HS, Lipton SA and Nakanishi N (1998) Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature 393(6683):377-381. Deak F, Lasztoczi B, Pacher P, Petheo GL, Valeria K and Spat A (2000) Inhibition of voltage-gated calcium channels by fluoxetine in rat hippocampal pyramidal cells. Neuropharmacology 39(6):1029-1036. DeFelice LJ and Blakely RD (1996) Pore models for transporters? Biophysical journal 70(2):579-580. Deffois A, Fage D and Carter C (1996) Inhibition of synaptosomal veratridine-induced sodium influx by antidepressants and neuroleptics used in chronic pain. Neuroscience letters 220(2):117-120. Delpon E, Valenzuela C, Perez O and Tamargo J (1993) Electrophysiological effects of the combination of imipramine and desipramine in guinea pig papillary muscles. J Cardiovasc Pharmacol 21(1):13-20. Descarries L, Lemay B, Doucet G and Berger B (1987) Regional and laminar density of the dopamine innervation in adult rat cerebral cortex. Neuroscience 21(3):807- 824. Dingledine R, Borges K, Bowie D and Traynelis SF (1999) The glutamate receptor ion channels. Pharmacol Rev 51(1):7-61. Doris A, Ebmeier K and Shajahan P (1999) Depressive illness. Lancet 354(9187):1369- 1375. Dorward PK, Saigusa T and Eisenhofer G (1991) Differential effects of central and peripheral desipramine on sympathoadrenal function and heart rate in conscious rabbits. J Cardiovasc Pharmacol 17(4):519-531.

92 Doucet G, Descarries L, Audet MA, Garcia S and Berger B (1988) Radioautographic method for quantifying regional monoamine innervations in the rat brain. Application to the cerebral cortex. Brain Res 441(1-2):233-259. Drury AN and Szent-Gyorgyi A (1929) The physiological activity of adenine compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart. J Physiol 68(3):213-237. Dunn AJ, Swiergiel AH and de Beaurepaire R (2005) Cytokines as mediators of depression: what can we learn from animal studies? Neurosci Biobehav Rev 29(4-5):891-909. Eby GA and Eby KL (2006) Rapid recovery from major depression using magnesium treatment. Med Hypotheses 67(2):362-370. Edwards FA, Gibb AJ and Colquhoun D (1992) ATP receptor-mediated synaptic currents in the central nervous system. Nature 359(6391):144-147. Egan TM and Khakh BS (2004) Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci 24(13):3413-3420. Egan TM, Samways DS and Li Z (2006) Biophysics of P2X receptors. Pflugers Arch 452(5):501-512. Elenkov IJ (2008) Neurohormonal-cytokine interactions: implications for inflammation, common human diseases and well-being. Neurochem Int 52(1-2):40-51. Ellison JM, Milofsky JE and Ely E (1990) Fluoxetine-induced bradycardia and syncope in two patients. J Clin Psychiatry 51(9):385-386. Evans RJ (2009) Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J 38(3):319-327. Evans RJ, Derkach V and Surprenant A (1992) ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons. Nature 357(6378):503-505. Farlow MR (2004) NMDA receptor antagonists. A new therapeutic approach for Alzheimer's disease. Geriatrics 59(6):22-27. Fattaccini CM, Bolanos-Jimenez F, Gozlan H and Hamon M (1990) Tianeptine stimulates uptake of 5-hydroxytryptamine in vivo in the rat brain. Neuropharmacology 29(1):1-8. Fischer G, Mutel V, Trube G, Malherbe P, Kew JN, Mohacsi E, Heitz MP and Kemp JA (1997) Ro 25-6981, a highly potent and selective blocker of N-methyl-D-

93 aspartate receptors containing the NR2B subunit. Characterization in vitro. J Pharmacol Exp Ther 283(3):1285-1292. Fratiglioni L and Wang HX (2000) Smoking and Parkinson's and Alzheimer's disease: review of the epidemiological studies. Behav Brain Res 113(1-2):117-120. Fredholm BB, Hedqvist P, Lindstrom K and Wennmalm M (1982) Release of nucleosides and nucleotides from the rabbit heart by sympathetic nerve stimulation. Acta Physiol Scand 116(3):285-295. Frohlich R, Boehm S and Illes P (1996) Pharmacological characterization of P2 purinoceptor types in rat locus coeruleus neurons. Eur J Pharmacol 315(3):255- 261. Froldi G, Ragazzi E and Caparrotta L (2001) Do ATP and UTP involve cGMP in positive inotropism on rat atria? Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 128(2):265-274. Fryer JD and Lukas RJ (1999) Antidepressants noncompetitively inhibit nicotinic acetylcholine receptor function. J Neurochem 72(3):1117-1124. Fryer JD and Lukas RJ (1999) Noncompetitive functional inhibition at diverse, human nicotinic acetylcholine receptor subtypes by bupropion, phencyclidine, and ibogaine. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 288(1):88-92. Galli A, Blakely RD and DeFelice LJ (1998) Patch-clamp and amperometric recordings from norepinephrine transporters: channel activity and voltage-dependent uptake. Proc Natl Acad Sci U S A 95(22):13260-13265. Galli A, DeFelice LJ, Duke BJ, Moore KR and Blakely RD (1995) Sodium-dependent norepinephrine-induced currents in norepinephrine-transporter-transfected HEK- 293 cells blocked by cocaine and antidepressants. The Journal of experimental biology 198(Pt 10):2197-2212. Garcia-Alloza M, Gil-Bea FJ, Diez-Ariza M, Chen CP, Francis PT, Lasheras B and Ramirez MJ (2005) Cholinergic-serotonergic imbalance contributes to cognitive and behavioral symptoms in Alzheimer's disease. Neuropsychologia 43(3):442- 449.

94 Garcia-Colunga J, Awad JN and Miledi R (1997) Blockage of muscle and neuronal nicotinic acetylcholine receptors by fluoxetine (Prozac). Proc Natl Acad Sci U S A 94(5):2041-2044. Garcia-Sevilla JA and Zubieta JK (1986) Activation and desensitization of presynaptic alpha 2-adrenoceptors after inhibition of neuronal uptake by antidepressant drugs in the rat vas deferens. Br J Pharmacol 89(4):673-683. Gever JR, Cockayne DA, Dillon MP, Burnstock G and Ford AP (2006) Pharmacology of P2X channels. Pflugers Arch 452(5):513-537. Gill R, Hargreaves RJ and Kemp JA (1995) The neuroprotective effect of the glycine site antagonist 3R-(+)-cis-4-methyl-HA966 (L-687,414) in a rat model of focal ischaemia. J Cereb Blood Flow Metab 15(2):197-204. Greenberg PE, Stiglin LE, Finkelstein SN and Berndt ER (1993) The economic burden of depression in 1990. J Clin Psychiatry 54(11):405-418. Gu JG and MacDermott AB (1997) Activation of ATP P2X receptors elicits glutamate release from sensory neuron synapses. Nature 389(6652):749-753. Harris EC and Barraclough B (1998) Excess mortality of mental disorder. Br J Psychiatry 173:11-53. Harvey SC and Skolnick P (1999) Polyamine-like actions of aminoglycosides at recombinant N-methyl-D-aspartate receptors. J Pharmacol Exp Ther 291(1):285- 291. Heard K, Cain BS, Dart RC and Cairns CB (2001) Tricyclic antidepressants directly depress human myocardial mechanical function independent of effects on the conduction system. Acad Emerg Med 8(12):1122-1127. Heikkila RE and Manzino L (1984) Behavioral properties of GBR 12909, GBR 13069 and GBR 13098: specific inhibitors of dopamine uptake. Eur J Pharmacol 103(3-4):241-248. Hennings EC, Kiss JP, De Oliveira K, Toth PT and Vizi ES (1999) Nicotinic acetylcholine receptor antagonistic activity of monoamine uptake blockers in rat hippocampal slices. J Neurochem 73(3):1043-1050. Hennings EC, Kiss JP and Vizi ES (1997) Nicotinic acetylcholine receptor antagonist effect of fluoxetine in rat hippocampal slices. Brain research 759(2):292-294.

95 Hirai H, Kirsch J, Laube B, Betz H and Kuhse J (1996) The glycine binding site of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1: identification of novel determinants of co-agonist potentiation in the extracellular M3-M4 loop region. Proc Natl Acad Sci U S A 93(12):6031-6036. Hu B, Mei QB, Yao XJ, Smith E, Barry WH and Liang BT (2001) A novel contractile phenotype with cardiac transgenic expression of the human P2X4 receptor. FASEB J 15(14):2739-2741. Hugel S and Schlichter R (2000) Presynaptic P2X receptors facilitate inhibitory GABAergic transmission between cultured rat spinal cord dorsal horn neurons. J Neurosci 20(6):2121-2130. Hyttel J (1977) Neurochemical characterization of a new potent and selective serotonin uptake inhibitor: Lu 10-171. Psychopharmacology (Berl) 51(3):225-233. Hyttel J (1982) Citalopram--pharmacological profile of a specific serotonin uptake inhibitor with antidepressant activity. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry 6(3):277-295. Ikeda K, Nagasawa M, Mori H, Araki K, Sakimura K, Watanabe M, Inoue Y and Mishina M (1992) Cloning and expression of the epsilon 4 subunit of the NMDA receptor channel. FEBS Lett 313(1):34-38. Inoue K, Nakazawa K, Fujimori K and Takanaka A (1989) Extracellular adenosine 5'- triphosphate-evoked norepinephrine secretion not relating to voltage-gated Ca channels in pheochromocytoma PC12 cells. Neurosci Lett 106(3):294-299. Ishii T, Moriyoshi K, Sugihara H, Sakurada K, Kadotani H, Yokoi M, Akazawa C, Shigemoto R, Mizuno N, Masu M and et al. (1993) Molecular characterization of the family of the N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J Biol Chem 268(4):2836-2843. Izaguirre V, Fernandez-Fernandez JM, Cena V and Gonzalez-Garcia C (1997) Tricyclic antidepressants block cholinergic nicotinic receptors and ATP secretion in bovine chromaffin cells. FEBS Lett 418(1-2):39-42. Jackson IM (1998) The thyroid axis and depression. Thyroid 8(10):951-956. Jones CA, Vial C, Sellers LA, Humphrey PP, Evans RJ and Chessell IP (2004) Functional regulation of P2X6 receptors by N-linked glycosylation:

96 identification of a novel alpha beta-methylene ATP-sensitive phenotype. Mol Pharmacol 65(4):979-985. Karson CN, Newton JE, Livingston R, Jolly JB, Cooper TB, Sprigg J and Komoroski RA (1993) Human brain fluoxetine concentrations. J Neuropsychiatry Clin Neurosci 5(3):322-329. Kemp JA and McKernan RM (2002) NMDA receptor pathways as drug targets. Nat Neurosci 5 Suppl:1039-1042. Kew JN and Kemp JA (1998) An allosteric interaction between the NMDA receptor polyamine and ifenprodil sites in rat cultured cortical neurones. J Physiol 512 ( Pt 1):17-28. Kew JN and Kemp JA (2005) Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure and pharmacology. Psychopharmacology (Berl) 179(1):4-29. Kew JN, Koester A, Moreau JL, Jenck F, Ouagazzal AM, Mutel V, Richards JG, Trube G, Fischer G, Montkowski A, Hundt W, Reinscheid RK, Pauly-Evers M, Kemp JA and Bluethmann H (2000) Functional consequences of reduction in NMDA receptor glycine affinity in mice carrying targeted point mutations in the glycine binding site. J Neurosci 20(11):4037-4049. Kew JN, Richards JG, Mutel V and Kemp JA (1998) Developmental changes in NMDA receptor glycine affinity and ifenprodil sensitivity reveal three distinct populations of NMDA receptors in individual rat cortical neurons. J Neurosci 18(6):1935-1943. Khakh BS (2001) Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci 2(3):165-174. Khakh BS and North RA (2006) P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature 442(7102):527-532. Kim YJ, Shin MC, Kim SA, Chung JH, Kim EH and Kim CJ (2002) Modulation of tianeptine on ion currents induced by inhibitory neurotransmitters in acutely dissociated dorsal raphe neurons of Sprague-Dawley rats. Eur Neuropsychopharmacol 12(5):417-425. King BF, Townsend-Nicholson A, Wildman SS, Thomas T, Spyer KM and Burnstock G (2000) Coexpression of rat P2X2 and P2X6 subunits in Xenopus oocytes. J Neurosci 20(13):4871-4877.

97 Kiss JP (2000) Role of nitric oxide in the regulation of monoaminergic neurotransmission. Brain Res Bull 52(6):459-466. Kiss JP (2008) Theory of active antidepressants: a nonsynaptic approach to the treatment of depression. Neurochem Int 52(1-2):34-39. Kiss JP, Hennings EC, Zsilla G and Vizi ES (1999) A possible role of nitric oxide in the regulation of dopamine transporter function in the striatum. Neurochemistry international 34(4):345-350. Kiss JP, Toth E, Lajtha A and Vizi ES (1994) NMDA receptors are not involved in the MK-801-induced increase of striatal dopamine release in rat: a microdialysis study. Brain Res 641(1):145-148. Kiss JP, Windisch K, Balla A, Sershen H and Lajtha A (1997) Dual effect of DMPP on the resting release of noradrenaline from rat hippocampal slices. Brain Res Bull 43(3):257-262. Kiss JP, Windisch K, De Oliveira K, Hennings EC, Mike A and Szasz BK (2001) Differential effect of nicotinic agonists on the [3H]norepinephrine release from rat hippocampal slices. Neurochemical research 26(8-9):943-950. Kopp M, Szedmák S, L őke J, Skrabinski Á (1997) A depressziós tünetegyüttes gyakorisága és egészségügyi jelent ősége a magyar lakosság körében. Lege Artis Med 7:136-144. Kukull WA (2001) The association between smoking and Alzheimer's disease: effects of study design and bias. Biol Psychiatry 49(3):194-199. Kuryatov A, Laube B, Betz H and Kuhse J (1994) Mutational analysis of the glycine- binding site of the NMDA receptor: structural similarity with bacterial amino acid-binding proteins. Neuron 12(6):1291-1300. Kutsuwada T, Kashiwabuchi N, Mori H, Sakimura K, Kushiya E, Araki K, Meguro H, Masaki H, Kumanishi T, Arakawa M and et al. (1992) Molecular diversity of the NMDA receptor channel. Nature 358(6381):36-41. Larsson HP, Picaud SA, Werblin FS and Lecar H (1996) Noise analysis of the glutamate-activated current in photoreceptors. Biophys J 70(2):733-742. Laube B, Hirai H, Sturgess M, Betz H and Kuhse J (1997) Molecular determinants of agonist discrimination by NMDA receptor subunits: analysis of the glutamate binding site on the NR2B subunit. Neuron 18(3):493-503.

98 Layer RT, Popik P, Olds T and Skolnick P (1995) Antidepressant-like actions of the polyamine site NMDA antagonist, eliprodil (SL-82.0715). Pharmacol Biochem Behav 52(3):621-627. Le KT, Babinski K and Seguela P (1998) Central P2X4 and P2X6 channel subunits coassemble into a novel heteromeric ATP receptor. J Neurosci 18(18):7152- 7159. Lee EH and Ma YL (1995) Amphetamine enhances memory retention and facilitates norepinephrine release from the hippocampus in rats. Brain Res Bull 37(4):411- 416. Lenkey N, Karoly R, Kiss JP, Szasz BK, Vizi ES and Mike A (2006) The mechanism of activity-dependent sodium channel inhibition by the antidepressants fluoxetine and desipramine. Mol Pharmacol 70(6):2052-2063. Leonard BE and Song C (2002) Changes in the immune system in rodent models of depression. Int J Neuropsychopharmacol 5(4):345-356. Leonard S and Bertrand D (2001) Neuronal nicotinic receptors: from structure to function. Nicotine Tob Res 3(3):203-223. Lerner-Marmarosh N, Carroll FI and Abood LG (1995) Antagonism of nicotine's action by cocaine analogs. Life sciences 56(3):PL67-70. Lester HA, Cao Y and Mager S (1996) Listening to neurotransmitter transporters. Neuron 17(5):807-810. Letenneur L, Larrieu S and Barberger-Gateau P (2004) Alcohol and tobacco consumption as risk factors of dementia: a review of epidemiological studies. Biomed Pharmacother 58(2):95-99. Levi G and Raiteri M (1993) Carrier-mediated release of neurotransmitters. Trends in neurosciences 16(10):415-419. Levin ED, Castonguay M and Ellison GD (1987) Effects of the nicotinic receptor blocker mecamylamine on radial-arm maze performance in rats. Behav Neural Biol 48(2):206-212. Levin ED and Rezvani AH (2002) Nicotinic treatment for cognitive dysfunction. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord 1(4):423-431. Levin ED and Simon BB (1998) Nicotinic acetylcholine involvement in cognitive function in animals. Psychopharmacology (Berl) 138(3-4):217-230.

99 Lewis C, Neidhart S, Holy C, North RA, Buell G and Surprenant A (1995) Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons. Nature 377(6548):432-435. Liu Y and Zhang J (2000) Recent development in NMDA receptors. Chin Med J (Engl) 113(10):948-956. Longone P, Rupprecht R, Manieri GA, Bernardi G, Romeo E and Pasini A (2008) The complex roles of neurosteroids in depression and anxiety disorders. Neurochem Int 52(4-5):596-601. Loo H, Saiz-Ruiz J, Costa e Silva J, Ansseau M, Herrington R, Vaz-Serra A, Dilling H and de Risio S (1999) Efficacy and safety of tianeptine in the treatment of depressive disorders in comparison with fluoxetine. J Affect Disord 56(2-3):109- 118. Lopez-Valdes HE, Garcia-Colunga J and Miledi R (2002) Effects of clomipramine on neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Eur J Pharmacol 444(1-2):13-19. Lucchelli A, Santagostino-Barbone MG, D'Agostino G, Masoero E and Tonini M (2000) The interaction of antidepressant drugs with enteric 5-HT7 receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 362(3):284-289. Ma Z, Pearson E, Isgor C and Tao R (2006) Evidence of reuptake inhibition responsible for mecamylamine-evoked increases in extracellular serotonin. Brain Res 1073- 1074:321-324. Machida T, Heerdt PM, Reid AC, Schafer U, Silver RB, Broekman MJ, Marcus AJ and Levi R (2005) Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1/CD39, localized in neurons of human and porcine heart, modulates ATP-induced norepinephrine exocytosis. J Pharmacol Exp Ther 313(2):570-577. Maggi L, Palma E, Miledi R and Eusebi F (1998) Effects of fluoxetine on wild and mutant neuronal alpha 7 nicotinic receptors. Mol Psychiatry 3(4):350-355. Magyar J, Rusznak Z, Harasztosi C, Kortvely A, Pacher P, Banyasz T, Pankucsi C, Kovacs L, Szucs G, Nanasi PP and Kecskemeti V (2003) Differential effects of fluoxetine enantiomers in mammalian neural and cardiac tissues. Int J Mol Med 11(4):535-542. Magyar J, Szentandrassy N, Banyasz T, Kecskemeti V and Nanasi PP (2004) Effects of norfluoxetine on the action potential and transmembrane ion currents in canine

100 ventricular cardiomyocytes. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 370(3):203-210. Maj J, Rogoz Z, Skuza G and Sowinska H (1992) The effect of CGP 37849 and CGP 39551, competitive NMDA receptor antagonists, in the forced swimming test. Pol J Pharmacol Pharm 44(4):337-346. Malayev A, Gibbs TT and Farb DH (2002) Inhibition of the NMDA response by pregnenolone sulphate reveals subtype selective modulation of NMDA receptors by sulphated steroids. Br J Pharmacol 135(4):901-909. Malberg JE, Eisch AJ, Nestler EJ and Duman RS (2000) Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci 20(24):9104-9110. Malherbe P, Mutel V, Broger C, Perin-Dureau F, Kemp JA, Neyton J, Paoletti P and Kew JN (2003) Identification of critical residues in the amino terminal domain of the human NR2B subunit involved in the RO 25-6981 binding pocket. J Pharmacol Exp Ther 307(3):897-905. Manoach M, Erez M, Wozner D and Varon D (1992) Ventricular defibrillating properties of catecholamine uptake inhibitors. Life Sci 51(17):PL159-164. Massey PV, Johnson BE, Moult PR, Auberson YP, Brown MW, Molnar E, Collingridge GL and Bashir ZI (2004) Differential roles of NR2A and NR2B-containing NMDA receptors in cortical long-term potentiation and long-term depression. J Neurosci 24(36):7821-7828. Masuko T, Kuno T, Kashiwagi K, Kusama T, Williams K and Igarashi K (1999) Stimulatory and inhibitory properties of aminoglycoside antibiotics at N-methyl- D-aspartate receptors. J Pharmacol Exp Ther 290(3):1026-1033. Matsuda K, Kamiya Y, Matsuda S and Yuzaki M (2002) Cloning and characterization of a novel NMDA receptor subunit NR3B: a dominant subunit that reduces calcium permeability. Brain Res Mol Brain Res 100(1-2):43-52. Mayer ML and Armstrong N (2004) Structure and function of glutamate receptor ion channels. Annu Rev Physiol 66:161-181. Mayer ML and Armstrong N (2004) Structure and function of glutamate receptor ion channels. Annu Rev Physiol 66:161-181.

101 McBain CJ and Mayer ML (1994) N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function. Physiol Rev 74(3):723-760. Meguro H, Mori H, Araki K, Kushiya E, Kutsuwada T, Yamazaki M, Kumanishi T, Arakawa M, Sakimura K and Mishina M (1992) Functional characterization of a heteromeric NMDA receptor channel expressed from cloned cDNAs. Nature 357(6373):70-74. Mennini T, Mocaer E and Garattini S (1987) Tianeptine, a selective enhancer of serotonin uptake in rat brain. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 336(5):478-482. Miller DK, Wong EH, Chesnut MD and Dwoskin LP (2002) Reboxetine: functional inhibition of monoamine transporters and nicotinic acetylcholine receptors. J Pharmacol Exp Ther 302(2):687-695. Milner P, Kirkpatrick KA, Ralevic V, Toothill V, Pearson J and Burnstock G (1990) Endothelial cells cultured from human umbilical vein release ATP, substance P and acetylcholine in response to increased flow. Proc Biol Sci 241(1302):245- 248. Mitchell SN (1993) Role of the locus coeruleus in the noradrenergic response to a systemic administration of nicotine. Neuropharmacology 32(10):937-949. Miyahara H and Suzuki H (1987) Pre- and post-junctional effects of adenosine triphosphate on noradrenergic transmission in the rabbit ear artery. J Physiol 389:423-440. Mocaer E, Rettori MC and Kamoun A (1988) Pharmacological antidepressive effects and tianeptine-induced 5-HT uptake increase. Clin Neuropharmacol 11 Suppl 2:S32-42. Monyer H, Burnashev N, Laurie DJ, Sakmann B and Seeburg PH (1994) Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron 12(3):529-540. Monyer H, Sprengel R, Schoepfer R, Herb A, Higuchi M, Lomeli H, Burnashev N, Sakmann B and Seeburg PH (1992) Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science 256(5060):1217-1221.

102 Moussavi S, Chatterji S, Verdes E, Tandon A, Patel V and Ustun B (2007) Depression, chronic diseases, and decrements in health: results from the World Health Surveys. Lancet 370(9590):851-858. Muscettola G, Goodwin FK, Potter WZ, Claeys MM and Markey SP (1978) Imipramine and desipramine in plasma and spinal fluid: relationship to clinical response and serotonin metabolism. Archives of general psychiatry 35(5):621-625. Nahum-Levy R, Fossom LH, Skolnick P and Benveniste M (1999) Putative partial agonist 1-aminocyclopropanecarboxylic acid acts concurrently as a glycine-site agonist and a glutamate-site antagonist at N-methyl-D-aspartate receptors. Mol Pharmacol 56(6):1207-1218. Nelson H, Mandiyan S and Nelson N (1990) Cloning of the human brain GABA transporter. FEBS letters 269(1):181-184. Nelson N (1998) The family of Na+/Cl- neurotransmitter transporters. Journal of neurochemistry 71(5):1785-1803. Nestler EJ, Barrot M, DiLeone RJ, Eisch AJ, Gold SJ and Monteggia LM (2002) Neurobiology of depression. Neuron 34(1):13-25. Newhouse PA, Potter A and Levin ED (1997) Nicotinic system involvement in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Implications for therapeutics. Drugs Aging 11(3):206-228. Nicke A, Baumert HG, Rettinger J, Eichele A, Lambrecht G, Mutschler E and Schmalzing G (1998) P2X1 and P2X3 receptors form stable trimers: a novel structural motif of ligand-gated ion channels. EMBO J 17(11):3016-3028. Nicke A, Kerschensteiner D and Soto F (2005) Biochemical and functional evidence for heteromeric assembly of P2X1 and P2X4 subunits. J Neurochem 92(4):925-933. Nicke A, Rettinger J, Buttner C, Eichele A, Lambrecht G and Schmalzing G (1999) Evolving view of quaternary structures of ligand-gated ion channels. Prog Brain Res 120:61-80. Nishi M, Hinds H, Lu HP, Kawata M and Hayashi Y (2001) Motoneuron-specific expression of NR3B, a novel NMDA-type glutamate receptor subunit that works in a dominant-negative manner. J Neurosci 21(23):RC185.

103 Nishimura M, Sato K, Okada T, Schloss P, Shimada S and Tohyama M (1998) MK-801 blocks monoamine transporters expressed in HEK cells. FEBS Lett 423(3):376- 380. Norenberg W, Gobel I, Meyer A, Cox SL, Starke K and Trendelenburg AU (2001) Stimulation of mouse cultured sympathetic neurons by uracil but not adenine nucleotides. Neuroscience 103(1):227-236. North RA (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev 82(4):1013- 1067. North RA and Surprenant A (2000) Pharmacology of cloned P2X receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 40:563-580. Nowak G, Trullas R, Layer RT, Skolnick P and Paul IA (1993) Adaptive changes in the N-methyl-D-aspartate receptor complex after chronic treatment with imipramine and 1-aminocyclopropanecarboxylic acid. J Pharmacol Exp Ther 265(3):1380- 1386. Ogata N, Yoshii M and Narahashi T (1989) Psychotropic drugs block voltage-gated ion channels in neuroblastoma cells. Brain research 476(1):140-144. Ortells MO and Lunt GG (1995) Evolutionary history of the ligand-gated ion-channel superfamily of receptors. Trends Neurosci 18(3):121-127. Pacher P, Magyar J, Szigligeti P, Banyasz T, Pankucsi C, Korom Z, Ungvari Z, Kecskemeti V and Nanasi PP (2000) Electrophysiological effects of fluoxetine in mammalian cardiac tissues. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 361(1):67-73. Pacher P, Ungvari Z, Kecskemeti V and Furst S (1998) Review of cardiovascular effects of fluoxetine, a selective serotonin reuptake inhibitor, compared to tricyclic antidepressants. Curr Med Chem 5(5):381-390. Pacher P, Ungvari Z, Nanasi PP, Furst S and Kecskemeti V (1999) Speculations on difference between tricyclic and selective serotonin reuptake inhibitor antidepressants on their cardiac effects. Is there any? Curr Med Chem 6(6):469- 480. Pacholczyk T, Blakely RD and Amara SG (1991) Expression cloning of a cocaine- and antidepressant-sensitive human noradrenaline transporter. Nature 350(6316):350-354.

104 Palucha A and Pilc A (2005) The involvement of glutamate in the pathophysiology of depression. Drug News Perspect 18(4):262-268. Panconi E, Roux J, Altenbaumer M, Hampe S and Porsolt RD (1993) MK-801 and enantiomers: potential antidepressants or false positives in classical screening models? Pharmacol Biochem Behav 46(1):15-20. Pancrazio JJ, Kamatchi GL, Roscoe AK and Lynch C, 3rd (1998) Inhibition of neuronal Na+ channels by antidepressant drugs. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 284(1):208-214. Paoletti P and Neyton J (2007) NMDA receptor subunits: function and pharmacology. Curr Opin Pharmacol 7(1):39-47. Paoletti P, Neyton J and Ascher P (1995) Glycine-independent and subunit-specific potentiation of NMDA responses by extracellular Mg2+. Neuron 15(5):1109- 1120. Papp L, Balazsa T, Kofalvi A, Erdelyi F, Szabo G, Vizi ES and Sperlagh B (2004) P2X receptor activation elicits transporter-mediated noradrenaline release from rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther 310(3):973-980. Papp M and Moryl E (1994) Antidepressant activity of non-competitive and competitive NMDA receptor antagonists in a chronic mild stress model of depression. Eur J Pharmacol 263(1-2):1-7. Park KS, Kong ID, Park KC and Lee JW (1999) Fluoxetine inhibits L-type Ca2+ and transient outward K+ currents in rat ventricular myocytes. Yonsei Med J 40(2):144-151. Park TJ, Shin SY, Suh BC, Suh EK, Lee IS, Kim YS and Kim KT (1998) Differential inhibition of catecholamine secretion by amitriptyline through blockage of nicotinic receptors, sodium channels, and calcium channels in bovine adrenal chromaffin cells. Synapse (New York, NY 29(3):248-256. Parsons CG, Quack G, Bresink I, Baran L, Przegalinski E, Kostowski W, Krzascik P, Hartmann S and Danysz W (1995) Comparison of the potency, kinetics and voltage-dependency of a series of uncompetitive NMDA receptor antagonists in vitro with anticonvulsive and motor impairment activity in vivo. Neuropharmacology 34(10):1239-1258.

105 Pato MT, Murphy DL and DeVane CL (1991) Sustained plasma concentrations of fluoxetine and/or norfluoxetine four and eight weeks after fluoxetine discontinuation. Journal of clinical psychopharmacology 11(3):224-225. Patrick J, Sequela P, Vernino S, Amador M, Luetje C and Dani JA (1993) Functional diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Prog Brain Res 98:113- 120. Paul IA, Nowak G, Layer RT, Popik P and Skolnick P (1994) Adaptation of the N- methyl-D-aspartate receptor complex following chronic antidepressant treatments. J Pharmacol Exp Ther 269(1):95-102. Perin-Dureau F, Rachline J, Neyton J and Paoletti P (2002) Mapping the binding site of the neuroprotectant ifenprodil on NMDA receptors. J Neurosci 22(14):5955- 5965. Picciotto MR, Caldarone BJ, King SL and Zachariou V (2000) Nicotinic receptors in the brain. Links between molecular biology and behavior. Neuropsychopharmacology 22(5):451-465. Pittaluga A and Raiteri M (1990) Release-enhancing glycine-dependent presynaptic NMDA receptors exist on noradrenergic terminals of hippocampus. Eur J Pharmacol 191(2):231-234. Plotsky PM, Owens MJ and Nemeroff CB (1998) Psychoneuroendocrinology of depression. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Psychiatr Clin North Am 21(2):293-307. Popik P, Wrobel M and Nowak G (2000) Chronic treatment with antidepressants affects glycine/NMDA receptor function: behavioral evidence. Neuropharmacology 39(12):2278-2287. Pousti A, Deemyad T, Malihi G and Brumand K (2006) Involvement of adenosine in the effect of fluoxetine on isolated guinea-pig atria. Pharmacol Res 53(1):44-48. Priestley T and Kemp JA (1994) Kinetic study of the interactions between the glutamate and glycine recognition sites on the N-methyl-D-aspartic acid receptor complex. Mol Pharmacol 46(6):1191-1196. Priestley T, Marshall GR, Hill RG and Kemp JA (1998) L-687,414, a low efficacy NMDA receptor glycine site partial agonist in vitro, does not prevent

106 hippocampal LTP in vivo at plasma levels known to be neuroprotective. Br J Pharmacol 124(8):1767-1773. Prior C, Tian L, Dempster J and Marshall IG (1995) Prejunctional actions of muscle relaxants: synaptic vesicles and transmitter mobilization as sites of action. Gen Pharmacol 26(4):659-666. Pubill D, Canudas AM, Gasulla D, Pallas M, Escubedo E and Camarasa J (1996) MK- 801 enhances noradrenergic neurotransmission in rat vas deferens. Eur J Pharmacol 303(3):171-175. Queiroz G, Talaia C and Goncalves J (2003) ATP modulates noradrenaline release by activation of inhibitory P2Y receptors and facilitatory P2X receptors in the rat vas deferens. J Pharmacol Exp Ther 307(2):809-815. Ramamoorthy S, Bauman AL, Moore KR, Han H, Yang-Feng T, Chang AS, Ganapathy V and Blakely RD (1993) Antidepressant- and cocaine-sensitive human serotonin transporter: molecular cloning, expression, and chromosomal localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(6):2542-2546. Ramoa AS, Alkondon M, Aracava Y, Irons J, Lunt GG, Deshpande SS, Wonnacott S, Aronstam RS and Albuquerque EX (1990) The anticonvulsant MK-801 interacts with peripheral and central nicotinic acetylcholine receptor ion channels. J Pharmacol Exp Ther 254(1):71-82. Ransom RW and Stec NL (1988) Cooperative modulation of [3H]MK-801 binding to the N-methyl-D-aspartate receptor-ion channel complex by L-glutamate, glycine, and polyamines. J Neurochem 51(3):830-836. Redmond AM, Kelly JP and Leonard BE (1997) Behavioural and neurochemical effects of dizocilpine in the olfactory bulbectomized rat model of depression. Pharmacol Biochem Behav 58(2):355-359. Richelson E and Pfenning M (1984) Blockade by antidepressants and related compounds of biogenic amine uptake into rat brain synaptosomes: most antidepressants selectively block norepinephrine uptake. Eur J Pharmacol 104(3- 4):277-286.

107 Ridley RM, Baker HF, Harder JA and Pearson C (1996) Effects of lesions of different parts of the septo-hippocampal system in primates on learning and retention of information acquired before or after surgery. Brain Res Bull 40(1):21-32. Rigby M, Le Bourdelles B, Heavens RP, Kelly S, Smith D, Butler A, Hammans R, Hills R, Xuereb JH, Hill RG, Whiting PJ and Sirinathsinghji DJ (1996) The messenger RNAs for the N-methyl-D-aspartate receptor subunits show region- specific expression of different subunit composition in the human brain. Neuroscience 73(2):429-447. Rihmer Z, Rutz W (2000) Depresszió és öngyilkosság. Hippocrates 2:169-174 Rissanen A, Naukkarinen H, Virkkunen M, Rawlings RR and Linnoila M (1998) Fluoxetine normalizes increased cardiac vagal tone in bulimia nervosa. J Clin Psychopharmacol 18(1):26-32. Rogers M, Colquhoun LM, Patrick JW and Dani JA (1997) Calcium flux through predominantly independent purinergic ATP and nicotinic acetylcholine receptors. J Neurophysiol 77(3):1407-1417. Rogoz Z, Skuza G, Maj J and Danysz W (2002) Synergistic effect of uncompetitive NMDA receptor antagonists and antidepressant drugs in the forced swimming test in rats. Neuropharmacology 42(8):1024-1030. Rongen GA, Floras JS, Lenders JW, Thien T and Smits P (1997) Cardiovascular pharmacology of purines. Clin Sci (Lond) 92(1):13-24. Rongen GA, Floras JS, Lenders JW, Thien T and Smits P (1997) Cardiovascular pharmacology of purines. Clin Sci (Lond) 92(1):13-24. Roose SP, Glassman AH, Attia E, Woodring S, Giardina EG and Bigger JT, Jr. (1998) Cardiovascular effects of fluoxetine in depressed patients with heart disease. Am J Psychiatry 155(5):660-665. Rudnick G and Clark J (1993) From synapse to vesicle: the reuptake and storage of biogenic amine neurotransmitters. Biochimica et biophysica acta 1144(3):249- 263. Sabbagh MN, Lukas RJ, Sparks DL and Reid RT (2002) The nicotinic acetylcholine receptor, smoking, and Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 4(4):317-325. Sasaki YF, Rothe T, Premkumar LS, Das S, Cui J, Talantova MV, Wong HK, Gong X, Chan SF, Zhang D, Nakanishi N, Sucher NJ and Lipton SA (2002)

108 Characterization and comparison of the NR3A subunit of the NMDA receptor in recombinant systems and primary cortical neurons. J Neurophysiol 87(4):2052- 2063. Schacht U and Heptner W (1974) Effect of nomifensine (HOE 984), a new antidepressant, on uptake of noradrenaline and serotonin and on release of noradrenaline in rat brain synaptosomes. Biochem Pharmacol 23(24):3413-3422. Schiepers OJ, Wichers MC and Maes M (2005) Cytokines and major depression. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29(2):201-217. Schildkraut JJ (1965) The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of supporting evidence. The American journal of psychiatry 122(5):509-522. Schorge S and Colquhoun D (2003) Studies of NMDA receptor function and stoichiometry with truncated and tandem subunits. J Neurosci 23(4):1151-1158. Sernagor E, Kuhn D, Vyklicky L, Jr. and Mayer ML (1989) Open channel block of NMDA receptor responses evoked by tricyclic antidepressants. Neuron 2(3):1221-1227. Sershen H, Balla A, Lajtha A and Vizi ES (1997) Characterization of nicotinic receptors involved in the release of noradrenaline from the hippocampus. Neuroscience 77(1):121-130. Sershen H, Toth E, Lajtha A and Vizi ES (1995) Nicotine effects on presynaptic receptor interactions. Ann N Y Acad Sci 757:238-244. Sesack SR, Hawrylak VA, Matus C, Guido MA and Levey AI (1998) Dopamine axon varicosities in the prelimbic division of the rat prefrontal cortex exhibit sparse immunoreactivity for the dopamine transporter. J Neurosci 18(7):2697-2708. Sesti C, Broekman MJ, Drosopoulos JH, Islam N, Marcus AJ and Levi R (2002) EctoNucleotidase in cardiac sympathetic nerve endings modulates ATP- mediated feedback of norepinephrine release. J Pharmacol Exp Ther 300(2):605- 611. Sesti C, Koyama M, Broekman MJ, Marcus AJ and Levi R (2003) Ectonucleotidase in sympathetic nerve endings modulates ATP and norepinephrine exocytosis in myocardial ischemia. J Pharmacol Exp Ther 306(1):238-244.

109 Sheng M, Cummings J, Roldan LA, Jan YN and Jan LY (1994) Changing subunit composition of heteromeric NMDA receptors during development of rat cortex. Nature 368(6467):144-147. Shimada S, Kitayama S, Lin CL, Patel A, Nanthakumar E, Gregor P, Kuhar M and Uhl G (1991) Cloning and expression of a cocaine-sensitive dopamine transporter complementary DNA. Science (New York, NY 254(5031):576-578. Shytle RD, Silver AA, Lukas RJ, Newman MB, Sheehan DV and Sanberg PR (2002) Nicotinic acetylcholine receptors as targets for antidepressants. Mol Psychiatry 7(6):525-535. Shytle RD, Silver AA and Sanberg PR (2000) Comorbid bipolar disorder in Tourette's syndrome responds to the nicotinic receptor antagonist mecamylamine (Inversine). Biological psychiatry 48(10):1028-1031. Simmons DA and Broderick PA (2005) Cytokines, stressors, and clinical depression: augmented adaptation responses underlie depression pathogenesis. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29(5):793-807. Singh SK, Yamashita A and Gouaux E (2007) Antidepressant binding site in a bacterial homologue of neurotransmitter transporters. Nature 448(7156):952-956. Skolnick P, Layer RT, Popik P, Nowak G, Paul IA and Trullas R (1996) Adaptation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors following antidepressant treatment: implications for the pharmacotherapy of depression. Pharmacopsychiatry 29(1):23-26. Slemmer JE, Martin BR and Damaj MI (2000) Bupropion is a nicotinic antagonist. J Pharmacol Exp Ther 295(1):321-327. Snell LD and Johnson KM (1989) Effects of nicotinic agonists and antagonists on N- methyl-D-aspartate-induced 3H-norepinephrine release and 3H-(1-[1-(2- thienyl)cyclohexyl]-piperidine) binding in rat hippocampus. Synapse 3(2):129- 135. Snell LD, Yi SJ and Johnson KM (1988) Comparison of the effects of MK-801 and phencyclidine on catecholamine uptake and NMDA-induced norepinephrine release. Eur J Pharmacol 145(2):223-226. Sonders MS and Amara SG (1996) Channels in transporters. Current opinion in neurobiology 6(3):294-302.

110 Sonders MS, Zhu SJ, Zahniser NR, Kavanaugh MP and Amara SG (1997) Multiple ionic conductances of the human dopamine transporter: the actions of dopamine and psychostimulants. The Journal of neuroscience 17(3):960-974. Sperlagh B, Erdelyi F, Szabo G and Vizi ES (2000) Local regulation of [(3)H]- noradrenaline release from the isolated guinea-pig right atrium by P(2X)- receptors located on axon terminals. Br J Pharmacol 131(8):1775-1783. Sperlagh B, Heinrich A and Csolle C (2007) P2 receptor-mediated modulation of neurotransmitter release-an update. Purinergic Signal 3(4):269-284. Sperlagh B and Vizi ES (1991) Effect of presynaptic P2 receptor stimulation on transmitter release. J Neurochem 56(5):1466-1470. Steinlein O (1998) New functions for nicotinic acetylcholine receptors? Behav Brain Res 95(1):31-35. Stern SL, Ribner HS, Cooper TB, Nelson LD, Johnson MH and Suckow RF (1991) 2- Hydroxydesipramine and desipramine plasma levels and electrocardiographic effects in depressed younger adults. J Clin Psychopharmacol 11(2):93-98. Stryjer R, Strous RD, Shaked G, Bar F, Feldman B, Kotler M, Polak L, Rosenzcwaig S and Weizman A (2003) Amantadine as augmentation therapy in the management of treatment-resistant depression. Int Clin Psychopharmacol 18(2):93-96. Su C and Bevan JA (1970) Blockade of the nicotine-induced norepinephrine release by cocaine, phenoxybenzamine and desipramine. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 175(2):533-540. Sulzer D and Galli A (2003) Dopamine transport currents are promoted from curiosity to physiology. Trends in neurosciences 26(4):173-176. Sulzer D, Sonders MS, Poulsen NW and Galli A (2005) Mechanisms of neurotransmitter release by amphetamines: a review. Progress in Neurobiology 75(6):406-433. Sun XP and Stanley EF (1996) An ATP-activated, ligand-gated ion channel on a cholinergic presynaptic nerve terminal. Proc Natl Acad Sci U S A 93(5):1859- 1863. Szadoczky E, Papp Z, Vitrai J, Rihmer Z and Furedi J (1998) The prevalence of major depressive and bipolar disorders in Hungary. Results from a national epidemiologic survey. J Affect Disord 50(2-3):153-162.

111 Szasz BK, Mike A, Karoly R, Gerevich Z, Illes P, Vizi ES and Kiss JP (2007) Direct inhibitory effect of fluoxetine on N-methyl-D-aspartate receptors in the central nervous system. Biological psychiatry 62(11):1303-1309. Szasz BK, Vizi ES and Kiss JP (2007) Nicotinic acetylcholine receptor antagonistic property of the selective dopamine uptake inhibitor, GBR-12909 in rat hippocampal slices. Neuroscience 145(1):344-349. Takebayashi M, Kagaya A, Inagaki M, Kozuru T, Jitsuiki H, Kurata K, Okamoto Y and Yamawaki S (2000) Effects of antidepressants on gamma-aminobutyric acid- and N-methyl-D-aspartate-induced intracellular Ca(2+) concentration increases in primary cultured rat cortical neurons. Neuropsychobiology 42(3):120-126. Tarasova OS, Golubinskaya VO, Kosiakov AN, Borovik AS, Timin EN and Rodionov IM (1998) The role of purinergic and adrenergic transmitters of the sympathetic system in the control of arterial blood pressure variability. J Auton Nerv Syst 70(1-2):66-70. Terry AV, Jr. and Buccafusco JJ (2003) The cholinergic hypothesis of age and Alzheimer's disease-related cognitive deficits: recent challenges and their implications for novel drug development. J Pharmacol Exp Ther 306(3):821- 827. Tohda M, Urushihara H and Nomura Y (1995) Inhibitory effects of antidepressants on NMDA-induced currents in Xenopus oocytes injected with rat brain RNA. Neurochem Int 26(1):53-58. Torres GE, Egan TM and Voigt MM (1999) Hetero-oligomeric assembly of P2X receptor subunits. Specificities exist with regard to possible partners. J Biol Chem 274(10):6653-6659. Torres GE, Gainetdinov RR and Caron MG (2003) Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nat Rev Neurosci 4(1):13-25. Torres GE, Haines WR, Egan TM and Voigt MM (1998) Co-expression of P2X1 and P2X5 receptor subunits reveals a novel ATP-gated ion channel. Mol Pharmacol 54(6):989-993. Trendelenburg U (1991) The TiPS lecture: functional aspects of the neuronal uptake of noradrenaline. Trends in Pharmacological Sciences 12(9):334-337.

112 Trullas R and Skolnick P (1990) Functional antagonists at the NMDA receptor complex exhibit antidepressant actions. Eur J Pharmacol 185(1):1-10. Valera S, Hussy N, Evans RJ, Adami N, North RA, Surprenant A and Buell G (1994) A new class of ligand-gated ion channel defined by P2x receptor for extracellular ATP. Nature 371(6497):516-519. Vassort G (2001) Adenosine 5'-triphosphate: a P2-purinergic agonist in the myocardium. Physiol Rev 81(2):767-806. Vizi ES (2000) Role of high-affinity receptors and membrane transporters in nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system. Pharmacol Rev 52(1):63-89. Vizi ES, Harsing LG, Jr., Zimanvi I and Gaal G (1985) Release and turnover of noradrenaline in isolated median eminence: lack of negative feedback modulation. Neuroscience 16(4):907-916. Vizi ES, Kiss J and Eenkov IJ (1991) Presynaptic modulation of cholinergic and noradrenergic neurotransmission: interaction between them. News Physiol Sci 6:119-123. Vizi ES and Kiss JP (1998) Neurochemistry and pharmacology of the major hippocampal transmitter systems: synaptic and nonsynaptic interactions. Hippocampus 8(6):566-607. Vizi ES, Sershen H, Balla A, Mike A, Windisch K, Juranyi Z and Lajtha A (1995) Neurochemical evidence of heterogeneity of presynaptic and somatodendritic nicotinic acetylcholine receptors. Annals of the New York Academy of Sciences 757:84-99. Vizi ES and Sperlagh B (1999) Receptor- and carrier-mediated release of ATP of postsynaptic origin: cascade transmission. Prog Brain Res 120:159-169. Vizi ES, Sperlagh B and Baranyi M (1992) Evidence that ATP released from the postsynaptic site by noradrenaline, is involved in mechanical responses of guinea-pig vas deferens: cascade transmission. Neuroscience 50(2):455-465. Wada E, Wada K, Boulter J, Deneris E, Heinemann S, Patrick J and Swanson LW (1989) Distribution of alpha 2, alpha 3, alpha 4, and beta 2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: a hybridization

113 histochemical study in the rat. The Journal of comparative neurology 284(2):314-335. Wada K, Ballivet M, Boulter J, Connolly J, Wada E, Deneris ES, Swanson LW, Heinemann S and Patrick J (1988) Functional expression of a new pharmacological subtype of brain nicotinic acetylcholine receptor. Science 240(4850):330-334. Wafford KA, Kathoria M, Bain CJ, Marshall G, Le Bourdelles B, Kemp JA and Whiting PJ (1995) Identification of amino acids in the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit that contribute to the glycine binding site. Mol Pharmacol 47(2):374-380. Walsh BT, Giardina EG, Sloan RP, Greenhill L and Goldfein J (1994) Effects of desipramine on autonomic control of the heart. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 33(2):191-197. Walsh BT, Greenhill LL, Giardina EG, Bigger JT, Waslick BD, Sloan RP, Bilich K, Wolk S and Bagiella E (1999) Effects of desipramine on autonomic input to the heart. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 38(9):1186-1192. Walsh BT, Seidman SN, Sysko R and Gould M (2002) Placebo response in studies of major depression: variable, substantial, and growing. Jama 287(14):1840-1847. Wang JK, Andrews H and Thukral V (1992) Presynaptic glutamate receptors regulate noradrenaline release from isolated nerve terminals. J Neurochem 58(1):204- 211. Wang PN, Wang SJ, Hong CJ, Liu TT, Fuh JL, Chi CW, Liu CY and Liu HC (1997) Risk factors for Alzheimer's disease: a case-control study. Neuroepidemiology 16(5):234-240. Watanabe M, Inoue Y, Sakimura K and Mishina M (1992) Developmental changes in distribution of NMDA receptor channel subunit mRNAs. Neuroreport 3(12):1138-1140. Watanabe M, Inoue Y, Sakimura K and Mishina M (1993) Distinct distributions of five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain. J Comp Neurol 338(3):377-390.

114 Watanabe Y, Saito H and Abe K (1993) Tricyclic antidepressants block NMDA receptor-mediated synaptic responses and induction of long-term potentiation in rat hippocampal slices. Neuropharmacology 32(5):479-486. Weissman MM, Bland RC, Canino GJ, Faravelli C, Greenwald S, Hwu HG, Joyce PR, Karam EG, Lee CK, Lellouch J, Lepine JP, Newman SC, Rubio-Stipec M, Wells JE, Wickramaratne PJ, Wittchen H and Yeh EK (1996) Cross-national epidemiology of major depression and bipolar disorder. Jama 276(4):293-299. Wenzel A, Fritschy JM, Mohler H and Benke D (1997) NMDA receptor heterogeneity during postnatal development of the rat brain: differential expression of the NR2A, NR2B, and NR2C subunit proteins. J Neurochem 68(2):469-478. Wilde MI and Benfield P (1995) Tianeptine. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in depression and coexisting anxiety and depression. Drugs 49(3):411-439. Williams K (1993) Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors. Mol Pharmacol 44(4):851-859. Williams K (1997) Modulation and block of ion channels: a new biology of polyamines. Cell Signal 9(1):1-13. Witchel HJ, Pabbathi VK, Hofmann G, Paul AA and Hancox JC (2002) Inhibitory actions of the selective serotonin re-uptake inhibitor citalopram on HERG and ventricular L-type calcium currents. FEBS Lett 512(1-3):59-66. Wong DT and Bymaster FP (1976) Effect of nisoxetine on uptake of catecholamines in synaptosomes isolated from discrete regions of rat brain. Biochem Pharmacol 25(17):1979-1983. Wong DT, Bymaster FP and Engleman EA (1995) Prozac (fluoxetine, Lilly 110140), the first selective serotonin uptake inhibitor and an antidepressant drug: twenty years since its first publication. Life sciences 57(5):411-441. Wong EH, Kemp JA, Priestley T, Knight AR, Woodruff GN and Iversen LL (1986) The anticonvulsant MK-801 is a potent N-methyl-D-aspartate antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A 83(18):7104-7108. Wong ML and Licinio J (2001) Research and treatment approaches to depression. Nature reviews 2(5):343-351.

115 Wong ML and Licinio J (2004) From monoamines to genomic targets: a paradigm shift for drug discovery in depression. Nature Reviews Drug Discovery 3(2):136-151. Wooltorton JR, Pidoplichko VI, Broide RS and Dani JA (2003) Differential desensitization and distribution of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in midbrain dopamine areas. J Neurosci 23(8):3176-3185. Yang S, Cheek DJ, Westfall DP and Buxton IL (1994) Purinergic axis in cardiac blood vessels. Agonist-mediated release of ATP from cardiac endothelial cells. Circ Res 74(3):401-407. Zarate CA, Jr., Singh JB, Carlson PJ, Brutsche NE, Ameli R, Luckenbaugh DA, Charney DS and Manji HK (2006) A randomized trial of an N-methyl-D- aspartate antagonist in treatment-resistant major depression. Arch Gen Psychiatry 63(8):856-864. Zhang YX, Yamashita H, Ohshita T, Sawamoto N and Nakamura S (1996) ATP induces release of newly synthesized dopamine in the rat striatum. Neurochem Int 28(4):395-400. Zhong J, Carrozza DP, Williams K, Pritchett DB and Molinoff PB (1995) Expression of mRNAs encoding subunits of the NMDA receptor in developing rat brain. J Neurochem 64(2):531-539. Zhou M and Baudry M (2006) Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. J Neurosci 26(11):2956-2963. Zhou Z, Zhen J, Karpowich NK, Goetz RM, Law CJ, Reith ME and Wang DN (2007) LeuT-desipramine structure reveals how antidepressants block neurotransmitter reuptake. Science (New York, NY 317(5843):1390-1393.

116 12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

Disszertációhoz kapcsolódó publikációk:

Mayer A, Szasz BK, Kiss JP: Inhibitory effect of antidepressants on the NMDA- evoked [ 3H]noradrenaline release from rat hippocampal slices. Neurochemistry International. 2009 Apr 22. (Epub ahead of print).

Szász BK, Mayer A, Zsilla G, Lendvai B, Vizi ES, Kiss JP. Carrier-mediated release of monoamines induced by the nicotinic acetylcholine receptor agonist DMPP. Neuropharmacology. 2005 Sep;49(3):400-9.

Két további publikáció el őkészületben van

Disszertációtól független közlemények:

Sylvester Vizi E, Rózsa B, Mayer A, Kiss JP, Zelles T, Lendvai B. Further evidence for the functional role of nonsynaptic nicotinic acetylcholine receptors. Eur J Pharmacol. 2004 Oct 1;500(1-3):499-508.

Petkova-Kirova P, Rakovska A, Della Corte L, Zaekova G, Radomirov R, Mayer A. Neurotensin modulation of acetylcholine, GABA, and aspartate release from rat prefrontal cortex studied in vivo with microdialysis. Brain Res Bull . 2008 Sep 30;77(2-3):129-35. Epub 2008 May 7.

117 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet szeretnék mondani témavezet őmnek, Dr. Kiss Jánosnak, hogy doktori munkám elkészítését lehet ővé tette, és mindezekhez magas színvonalú szakmai feltételeket biztosított számomra. Ugyanakkor köszönettel tartozom az intézet korábbi igazgatójának, a Magyar Tudományos Akadémia el őző elnökének, Dr. Vizi E. Szilveszter Professzor Úrnak, aki lehet ővé tette számomra, hogy bekapcsolódjak az intézet munkájába. Szerz őtársaimnak, Dr. Lendvai Balázsnak, Dr. Rózsa Balázsnak, Dr. Zelles Tibornak, Dr. Angelina Rakovska-nak és Dr. Zsilla Gabriellának köszönöm a közös munkát. Szeretném továbbá megköszönni a Gyógyszerhatástan munkacsoport volt tagjainak, Szász Bernadett és Dr. Mandl Péter PhD-hallgató társaimnak a segítségét. Külön köszönet illeti Meskó Györgyné Évát és Tischler Erikát, akik nemcsak a kísérletek lefolytatásában nyújtottak elengedhetetlen segítséget, de emberileg is mindvégig támogattak. Köszönettel tartozom a Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézet Gyógyszerkutatási Osztály valamennyi dolgozójának, akik hasznos tanácsaikkal és baráti magatartásukkal segítségemre voltak az évek során. Családomnak, els ősorban fiamnak, férjemnek és szüleimnek köszönöm türelmüket és megért ő támogatásukat, mely nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre.

118