UNICAMP
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia
DANIELA MARTINS ALVES
DESENVOLVIMENTO DA ANTERA E DOS GRÃOS-DE-PÓLEN EM Aspidosperma Mart. & Zucc. E SUAS IMPLICAÇÕES EVOLUTIVAS E TAXONÔMICAS PARA APOCYNACEAE
ANTHER AND POLLEN GRAINS DEVELOPMENT IN Aspidosperma Mart. & Zucc. AND EVOLUTIONARY AND IT´S TAXONOMIC IMPLICATIONS FOR APOCYNACEAE
CAMPINAS 2019
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DANIELA MARTINS ALVES
DESENVOLVIMENTO DA ANTERA E DOS GRÃOS-DE-PÓLEN EM Aspidosperma Mart. & Zucc. E AS IMPLICAÇÕES EVOLUTIVAS E TAXONÔMICAS PARA APOCYNACEAE
ANTHER AND POLLEN GRAINS DEVELOPMENT IN Aspidosperma Mart. & Zucc. AND EVOLUTIONARY AND IT´S TAXONOMIC IMPLICATIONS FOR APOCYNACEAE
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em BIOLOGIA VEGETAL.
Supervisora/Orientadora: Profa. Dra. INGRID KOCH Co-supervisora/Coorientadora: Profa. Dra. LETÍCIA SILVA SOUTO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA DANIELA MARTINS ALVES E ORIENTADA PELA ,,,, PROFA. DRA. INGRID KOCH.
CAMPINAS 2019 3
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Campinas, 25 de fevereiro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Ingrid Koch (Orientadora)
Profa. Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer
Prof. Dr. Orlando Cavalari de Paula
*A Ata de defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na secretaria do programa da unidade.
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho e seus frutos futuros aos meus avós: Francisco Castellini (vô Chico) e Terezinha Brunassi Castellini (vó Tereza). Através da vida de vocês aprendi que a beleza do amor está na simplicidade com que ele se apresenta.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao CNPq pela bolsa concedida neste período (No do processo: 131323/2017-2), sem a qual a realização deste trabalho não seria possível. Ao Departamento de Biologia Vegetal do Instituto de Biologia da UNICAMP, que me concederam a infraestrutura necessária para que este trabalho pudesse ser desenvolvido. Ao Laboratório de Diversidade Vegetal (Ladive – UFSCar), onde grande parte deste trabalho foi realizado. A minha Orientadora Ingrid Koch, por todo amor, carinho, atenção e paciência ao longo dessa caminhada. Você é um dos meus maiores exemplos e inspiração, em todos os aspectos possíveis na vida. Obrigada por colocar a botânica na minha vida. A minha Co-orientadora Letícia Silva Souto, por todos os ensinamentos, atenção e pela amizade. Graças a você conheci o universo de possibilidades chamado anatomia vegetal, e sigo nele. Ao “Aspidogrupo”: Carol, Ana, Pati e Deza. Ter vocês comigo nesta caminhada foi um presente. Nos tornamos uma família, e assim permaneceremos, estudando esse gênero tão lindo, e compartilhando os frutos destes trabalhos. A Denisele, por toda ajuda de laboratório. Obrigada por ter me ensinado as técnicas de microscopia eletrônica, e pela amizade que construímos nesta convivência. Aos professores: Orlando Cavalari de Paula, Simone de Pádua Teixeira e Juliana Lischka Sampaio Mayer, por todas as contribuições dadas, desde a qualificação até essa versão do trabalho. Ao José Oswaldo Guimarães, por ser marido da Ingrid e se tornar um grande incentivador, não só meu, mas de todas nós, obrigada por cada conselho. Aos amigos do laboratório de Taxonomia da Unicamp. Obrigada por tornar esses dois anos mais leves. A pós-graduação ficou bem mais fácil de ser encarada, graças as pessoas fantásticas que conheci aqui. Aos amigos do laboratório de Anatomia Vegetal da Unicamp. Obrigada por toda ajuda, risada e conselhos. Ao técnico João Carlos Galvão, você tem sido de fundamental importância na vida de todos que passam pela BV. Obrigada pela companhia e pelas coletas de Combi. E por último, mas não menos importante, a minha família, especialmente aos meus pais: Roseli Castellini e Euclidio Martins Alves. Pelo apoio incondicional aos meus 7 sonhos, e por me proporcional a melhor família que se pode ter. Faço e sempre farei tudo da melhor forma que eu posso, para que minha vida seja motivo de orgulho para vocês. Porque sem sombra de dúvidas vocês são meu maior orgulho. Eu vos amo.
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RESUMO Aspidosperma Mart. & Zucc. pertence à tribo Aspidospermateae Miers de Apocynaceae Juss. (Gentianales) e vem sendo posicionado como grupo irmão dos demais gêneros. Esse posicionamento confere especial interesse para a compreensão da evolução das características embriológicas na família. Nesse contexto, este estudo objetivou ampliar os conhecimentos sobre microesporogênese e microgametogênese em Aspidosperma Mart. & Zucc, a fim de compreender os padrões evolutivos dentro da família, além de verificar possíveis implicações taxonômicas dos caracteres levantados. Para isso, botões florais de tamanhos diversos e flores em antese de Aspidosperma australe Müll.Arg., A. cylindrocarpon Müll.Arg., A. pyrifolium Müll.Arg., A. tomentosum Mart. & Zucc. e A. verbascifolium Müll.Arg. foram coletados e fixados em Karnovsky. As anteras foram isoladas, desidratadas, incluídas em historesina, seccionadas, coradas com azul de toluidina e submetidas a testes histoquímicos. Grãos de pólen também foram analisados em microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. As anteras de Aspidosperma são bitecas e tetrasporangiadas, a parede da antera jovem é formada por uma camada epidérmica, uma camada de endotécio, uma camada média e uma camada de tapete, permanecendo assim durante o desenvolvimento. Exceção em A. verbascifolium que apresenta de duas a três camadas de cada estrato parietal. O tapete tem origem parietal e é classificado como tipo secretor. As células esporogênicas se diferenciam em células mãe de micrósporo ampliando seu volume, iniciando deposição de calose e a condensação cromossômica antes que as camadas da parede da antera estejam delimitadas. A meiose é do tipo simultânea e as tétrades são tetraédricas, decussadas ou isobilaterais. Os micrósporos se separam e a exina é depositada de forma irregular. A primeira mitose é assimétrica origina a célula vegetativa e a célula generativa. Os grãos de pólen maduros são tricelulares, 4-6 porados, a exina forma alças (pseudocolpos) e são dispersos em mônades. Os processos de microesporogênese e microgametogênese são, em linhas gerais, bastante conservados dentro de Apocynaceae e, até mesmo, quando consideramos a ordem Gentianales. Os caracteres que variam na família e são potencialmente plesiomorficos são: o tipo de citocinese simultâneo, as tétrades tetraédricas, decussadas ou isobilaterais, e os grãos de pólen apresentados em mônades com aberturas em poros. A presença de pseudocolpos é conservada dentro do gênero e parece constituir uma sinapomorfia para Aspidospermateae.
Palavras-chave: Anatomia, Aspidospermateae, embriologia, microsporogênese, microgametogênese, rauvolfioide.
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ABSTRACT Aspidosperma Mart. & Zucc. is vested to the Aspidospermateae Miers tribe of Apocynaceae Juss. (Gentianales) and has been considered the sister group of the all other genera of the family. This positioning confers a special interest to the understanding of the evolution of the embryological features in the family. Studies on embryological features have brought light for the understanding of evolutionary and taxonomic aspects of Apocynaceae. In this context, this study aimed to increase knowledge about microsporogenesis and microgametogenesis in Aspidosperma, in order to understand the evolutionary patterns within the family and to verify possible taxonomic implications. For this purpose, floral buds of various sizes and flowers in the anthesis of Aspidosperma australe Müll.Arg., A. cylindrocarpon Müll.Arg., A. pyrifolium Müll.Arg., A. tomentosum Mart. & Zucc. and A. verbascifolium Müll.Arg. were collected and fixed in Karnovsky. Anthers were isolated, dehydrated, embedded in historesin, sectioned and stained with toluidine blue and submitted to histochemical tests. Pollen grains were also analyzed by scanning and transmission electron microscopy. The anthers of Aspidosperma are bithecous and tetrasporangiate, the wall of the young anther is formed by an epidermal layer, an endothecium layer, a middle layer and a tapetum layer, thus remaining in this way during the development. An exception is A. verbascifolium that has two to three layers of each parietal stratum. The tapetum has parietal origin and is classified as secretory type. Sporogenic cells differentiate into microspore mother cells by enlarging their volume, initiating callose deposition and chromosome condensation before the anther wall layers are delimited. Meiosis is of the simultaneous type and the tetrads are tetrahedral, decussate or isobilateral. Microspores are separated and the exine is deposited irregularly. Asymmetric mitosis originates a vegetative cell and a generative cell. The mature pollen grains are tricellular, 4-6 porates, have the plicated exine and are dispersed in monads. The processes of microsporogenesis and microgametogenesis are in general conserved within Apocynaceae and even when considering the order Gentianales. The features that vary in the family and are potentially plesiomorphic are the type of simultaneous cytokinesis, the tetrahedral, decussate or isobilateral tetrads, and the pollen grains presented in monads with pore openings. The presence of pseudocolpus is conserved within the genus and seems to constitute a synapomorphy for Aspidospermateae.
Key words: Anatomy, Aspidospermateae, embryology, microsporogenesis, microgametogenesis, rauvolfioid. 10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Filogenia organizada por tribos de Apocynaceae ...... 16 Figura 2. Flores de Aspidosperma Mart. & Zucc. em antese...... 20 Figura 3. Desenvolvimento da parede da antera de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz...... 25 Figura 4. Microesporogênese em espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz...... 27 Figura 5. Microgametogênese em espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz...... 30 Figura 6. Grãos de pólen de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz (a-b) e microscopia eletrônica de varredura (c-g)...... 31 Figura 7. Grãos de pólen de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia eletrônica de transmissão...... 32 Figura 8. Acúmulo e degradação de amido na parede da antera e grãos de pólen em Aspidosperma...... 33
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Trabalhos científicos que tratam de embriologia, com representantes de Apocynaceae. (╺ ) ausência da abordagem desse carácter no estudo; (✔) presença da abordagem desse carácter no estudo...... 17 Tabela 2: Espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. utilizadas no estudo do desenvolvimento da parede da antera, microesporogênese, microgametogênese e grãos de pólen, incluindo os dados dos vouchers...... 21 Tabela 3: Características morfológicas do tapete da antera em Apocynaceae...... 37 Tabela 4: Características de grãos de pólen em Apocynaceae...... 40 Tabela 5: Características de grãos de pólen em espécies de Aspidosperma...... 42
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SUMÁRIO INTRODUÇÃO ...... 13 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 20 Material Vegetal ...... 20 Microscopia de Luz ...... 21 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ...... 22 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ...... 22 RESULTADOS ...... 23 Desenvolvimento da Parede da Antera ...... 23 Microesporogênese ...... 26 Microgametogênese ...... 28 Grãos de pólen ...... 28 Acúmulo e degradação de amido no desenvolvimento da antera e grãos de pólen...... 33 DISCUSSÃO ...... 34 Desenvolvimento da Antera...... 34 Microesporogênese e Microgametogênese ...... 37 Grãos de pólen ...... 38 Acúmulo e degradação do amido nos grãos de pólen e na parede da antera ...... 42 Valor taxonômico dos caracteres embriológicos masculinos em Apocynaceae e em Aspidosperma Mart. & Zucc...... 43 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 44 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 46 ANEXOS ...... 49 Anexo 1:Termo de Bioética/Biossegurança...... 49 Anexo 2: Declaração de direitos autorais...... 50
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INTRODUÇÃO
Apocynaceae, em sua configuração atual constitui um dos grupos mais diversos e bem distribuídos entre as Angiospermas, com cerca de 4.500 espécies e 370 gêneros nos trópicos e subtrópicos (Fishbein et al., 2018), e interessante variação em suas características reprodutivas. Entre seus membros há desde aqueles com estames livres da cabeça do estilete, até aqueles com fusão total destas peças em uma estrutura denominada ginostégio (Endress & Bruyns, 2000). Além de Apocynaceae, a fusão entre os estames e o gineceu, bem como a presença de polínias, é reportada apenas para Orchidaceae, posicionada entre as monocotiledôneas, família também amplamente diversificada (Stevens, 2001 onwards; Endress, 2016). A circunscrição original de Apocynaceae, sob “Apocyneae” (Jussieu, 1789), é muito parecida com aquela considerada atualmente. Porém, durante grande parte do século XIX e XX, Apocynaceae foi separada em duas famílias, Apocynaceae s.s., constituída por espécies nas quais a dispersão do pólen ocorre principalmente em mônades, e Asclepiadaceae, constituída de espécies com transladores sólidos e dispersão do pólen em tétrades, políades ou em polínias (Endress, 2004). Estudos filogenéticos embasaram a junção de Asclepiadaceae e Apocynaceae s.s. em Apocynaceae s.l. e demonstraram, adicionalmente, que as classificações infrafamiliares se baseavam, em grande parte, em homoplasias, não caracterizando grupos monofiléticos (Endress et al., 1996; Sennblad & Bremer, 1996; Endress & Bruyns, 2000). Foram propostas, então, adequações para a organização dos gêneros em tribos monofiléticas e um arranjo dessas tribos em três subfamílias monofiléticas e dois grados. Ao todo são consideradas 25 tribos: 11 para o grado rauvolfioide, nove para o grado apocynoide, e cinco para a subfamília Asclepiadoideae, sendo que as subfamílias Periplocoideae e Secamonoideae não são divididas em tribos (Endress & Bruyns, 2000; Simões et al., 2007; Endress et al., 2014; Fishbein et al., 2017 – Fig. 1). Os representantes dos grados rauvolfioide e apocynoide são facilmente reconhecidos, um por possuir flores com anteras não são fusionadas à cabeça do estilete – rauvolfioideas (Simões et al., 2007; Fishbein et al., 2018), outro por conter flores em que as anteras são fusionadas à cabeça do estilete mas o pólen não se apresenta em polínias – apocynoideas (Livshultz et al., 2007), características estas consideradas plesiomórficas na família. Os dois grados reúnem linhagens amplamente variáveis quanto ao hábito e às características reprodutivas (Endress & Bruyns 2000; Endress et al. 2014). 14
Particularmente interessante na evolução dos caracteres reprodutivos na família é o surgimento de polínias nas subfamílias Periplocoideae, Secamonoideae e Asclepiadoideae. Estas são consideradas como uma inovação-chave para a diversificação da família (Endress 2016; Fishbein et al., 2018) e estudos de evolução estado de caráter mostraram que as polínias evoluíram ao menos cinco vezes na família, sendo uma na subfamília Secamonoideae e Asclepiadoideae e quatro em Periplocoideae (Fishbein et al., 2018). Os estudos da microsporogênese e microgametogênese em Apocynaceae são mais concentrados na morfologia dos grãos de pólen (Tab. 1). Entretanto, permitem reconhecer a variação nos processos para a formação dos grãos de pólen em grupos da família. Assim, é possível verificar o número de microesporângios, entre quatro nas linhagens que não possuem polínias e dois nas que possuem (Endress, 2016); o tipo de divisão meiótica das células mãe dos micrósporos, que pode ser do tipo simultâneo ou sucessivo (Endress & Bruyns, 2000); a forma de dispersão dos grãos de pólen - desde mônades nos grados apocynoide e rauvofioide (Middleton, 2007), até polínias complexas em Asclepiadoideae (Verhoever & Venter, 2001); e o número (1, 3-6, 8, 12) e forma (poros, colporos ou colpos) de aberturas (Verhoeven & Venter, 2001; Van der Ham et al., 2001; Van der Weide & Van der Ham, 2012; Koch et al. 2018). Estes estudos permitem que se tenha uma ideia da variação dos caracteres masculinos e são mais frequentes em algumas tribos como: Alyxieae, Vinceae, Tabernaemontaneae, Plumerieae, Apocyneae, Malouetiae, Asclepiadeae, Ceropegieae e na subfamília Periplocoidaeae (Tab. 1). A tribo Aspidospermateae, grupo irmão das demais tribos de Apocynaceae, possui apenas registros de estudos para os gêneros Geissospermum Allemão, Vallesia Ruiz & Pav. e Aspidosperma Mart. & Zucc., mesmo assim, apenas para a caracterização morfológica dos grãos de pólen (Middleton 2007; Rodrigues et al., 2016). A tribo é composta também pelos gêneros Haplophyton A. DC., Microplumeria Baill. e Strempeliopsis Benth. (Simões et al. 2007, Endress et al., 2014, Pereira et al., 2017). O gênero Aspidosperma é o maior da tribo Aspidospermateae em número de espécies (Pereira et al., 2016), atualmente com 66 (Aspidosperma in Flora do Brasil 2020 em construção). De acordo com as filogenias publicadas mais recentemente (Fishbein, et al., 2018) Aspidosperma é a linhagem que primeiro divergiu dentro de Apocynaceae, e nas investigações dos caracteres masculinos para o gênero, há apenas a descrição dos grãos de pólen como 4-6 colporados (Barth & Luz, 2008; Laboriau, 1973; Moreira et al., 15
2004; Radaeski et al., 2014; Sánchez-Dzib et al., 2009) ou pseudocolporados (Barth & Luz, 2008). A descrição dos processos de microesporogênese e microgametogênese de Aspidosperma é essencial para a discussão sobre a variação e evolução dos caraceteres reprodutivos masculinos em Apocynaceae, que culminaram na grande diversificação da família. Assim, estudamos cinco espécies do gênero e reunimos toda a informação encontrada para a família. Discutimos alguns aspectos do desenvolvimento da parede da antera e dos grãos de pólen como: tipo de formação de parede, tipo de endotécio, número de camadas por estrato parietal, tipo de tapete, tipo de divisão meiótica das células mãe de micrósporo, números de células na fase de dispersão dos grãos de pólen e morfologia dos grãos de pólen de modo geral, comparando ao que existe na bibliografia para Apocynaceae e para Gentianales. Estudar a linhagem que divergiu primeiro nos auxiliará a compreender quais foram as novidades evolutivas nas diferentes linhagens e identificar os eventos que precederam o surgimento das polínias. Além disso, permitirá avaliar como essas características se comportam em Aspidosperma e na tribo Aspidospermateae, e verificar seu valor na sistemática. 16
. Figura 1: Filogenia organizada por tribos de Apocynaceae. Árvore simplificada, baseada no cronograma de Fishbein et al (2018): obtida por uma filogenia de máxima verossimilhança estimada a partir de 21 loci de plastídios. 17
Tabela 1: Trabalhos científicos que tratam de embriologia, com representantes de Apocynaceae. (╺ ) ausência da abordagem desse carácter no estudo; (✔) presença da abordagem desse carácter no estudo.
Tribo/Subfamília/grado Obra Antera Microesporogênese Microgametogênese Grãos de Pólen
Plumerieae / Apocyneae Anantaswamy Rau, 1940 Desenvolvimento ╺ ╺ ╺ Apocyneae Balasubramanian V, 1983 Desenvolvimento ╺ ╺ ╺ Aspidospermeae / Vinceae Barth OM, Luz CFP, 2008 ╺ ╺ ╺ Morfologia Vinceae Bhasin RK , 1971 ╺ ✔ ✔ ╺ Asclepiadeae Biwas I, 1957 Desenvolvimento ╺ ╺ ╺ Plumerieae Chauhan SVS, 1979 Desenvolvimento ✔ ✔ Morfologia Vinceae Cousin MT ,1979 ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Vinceae El-Ghazaly G, 1990 ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Ghimire B, Ghimire B, Vinceae Desenvolvimento ✔ ✔ ╺ Heo, 2011 Güven S, Makbul S, Ceropegieae Coskuncelebi K, Pinar ╺ ╺ ╺ Morfologia MN, 2015 Vinceae / Malouetieae Johri et al, 1992 ╺ ╺ ╺ Morfologia Alyxieae / Aspidospermeae / Echiteae / Mesechiteae / Odontadenieae / Labouriau MLS, 1973 ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Tabernaemontaneae / Vinceae / Willughbeieae Koch I, Alves DM, Souto Vinceae Desenvolvimento ✔ ✔ Morfologia e exina LS, 2018 18
Apocyneae / Malouetieae Latto CS, 1974 ╺ ✔ ✔ ╺ Aspidospermeae / Alyxieae / Echiteae / Mesechiteae / Macedo RB, 2009 ╺ ╺ ╺ ✔ Tabernaemontaneae / Vinceae Vinceae Maheswari Devi, 1970 Desenvolvimento ✔ ✔ Morfologia Asclepiadeae / Ceropegieae Maheswari Devi, 1964 ╺ ✔ ✔ ╺ Asclepiadeae Maheswari Devi, 1977 Desenvolvimento ╺ ╺ ╺ Apocynoideae / Middleton DJ, 2007 ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Rauvolfioideae Aspidospermeae / Echiteae Moreira FF, Mendonça / Mesechiteae / Plumerieae CBF, Pereira JF, ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina / Rhabdadenieae / Gonçalves-Esteves V, Tabernaemontaneae 2004 Asclepiadeae / Ceropegieae Mulay BN, 1965 Desenvolvimento ╺ ╺ ╺ Nirula RL, Richharia RH, Asclepiadeae ╺ ✔ ✔ ╺ 1945 Radaeski JF, Evaltd ACP, Aspidospermeae ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Bauermann SG, 2014 Aspidospermeae / Rodrigues ID, Absy ML, Mesechiteae / Silva-Caminha SAF, Odontadenieae / Gonçalves-Esteves V, ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Plumerieae / Mendonça CBF, Ferreira Tabernaemontaneae / MG, Moura CO, 2016 Vinceae / Willughbeieae Aspidospermeae / Sànches-Dzib YA, Sosa- Plumerieae / Nájera S, Lozano-García, ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Tabernaemontaneae / 2009 Vinceae 19
Asclepiadeae / Ceropegieae / Marsdenieae / Shah SA, Ahmad M, 2014 ╺ ╺ ╺ ✔ Periplocoideae Apocyneae Sud KC, 1984 Desenvolvimento ✔ ✔ Morfologia e exina Van Campo M, Nilsson S, Tabernaemontaneae ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Leeuwenberg JM, 1979 Van der Ham R, Alyxieae Zimmerman YM, Nilsson ╺ ╺ ✔ Morfologia e exina S, Igersheim A, 2001 Ceropegieae / Venkata Rao C, Rama Rao ╺ ✔ ✔ ╺ Periplocoideae 1954 Asclepiadeae / Ceropegieae / Fockeeae / Marsdenieae / Verhoven RL, Venter HJT, ╺ ╺ ╺ Morfologia e exina Periplocoideae / 2001 Secamonoideae Vijayaraghavan MR, Asclepiadeae ╺ ╺ ╺ Morfologia Shukla AK, 1976
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MATERIAIS E MÉTODOS Material Vegetal Foram selecionadas cinco espécies de Aspidosperma (Fig. 1, Tab. 2), das quais foram coletados botões florais em diferentes estádios do desenvolvimento e flores em antese.
Figura 2. Flores de Aspidosperma Mart. & Zucc. em antese. Detalhes da morfologia floral de das flores de A. australe Müll.Arg. (a), A. cylindrocarpon Müll.Arg. (b), A. pyrifolium Mart. & Zucc. (c), A. tomentosum Mart. & Zucc. (d) e A. verbascifolium Müll.Arg. (e).
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Tabela 2: Espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. utilizadas no estudo do desenvolvimento da parede da antera, microesporogênese, microgametogênese e grãos de pólen, incluindo os dados dos vouchers.
Espécie Localidade Cordenadas Voucher Gomes, SM. 495 (UEC142027) Gomes, SM. A. australe Campinas, SP. S: 22o 53’59’’ W:47o 03’36’’ 656 (UEC142189) Gomes, SM. 658 (UEC142188) Gomes, SM. 576 S: 22o 53’59’’ W:47o 03’36’’ A. cylindrocarpon Campinas, SP. (UEC037405) Gomes, SM. 518 S: 22o 53’59’’ W:47o 03’36’’ (UEC109244) Gomes, SM. A. pyrifolium Campinas, SP. 564 (UEC109294) S: 22o 15’10’’ W:47o 49’22’’ Itirapina, SP. / S: 22o10’53.2’’ W:47o (UEC 202506) Alves, DM./ A. tomentosum Pirenópolis, GO. 52’48.1’’ S: 15o 48’31’’ (UEC 202504) Alves DM. W:48o 55’09’’.
Senador Canedo, S:16o 40’16’’ W:49o 09’47’’ Voucher ainda não A. verbascifolium GO. / Tupaciguara, S:18o37’17.7’’ W: incorporado*/ (UEC 202503) MG. 48o40’51.3’’ Alves DM, 01. Ferreira P. S/N -Vouchers não incorporados.
Microscopia de Luz Imediatamente após a coleta, as amostras foram fixadas em solução de Karnovsky (Karnovsky 1965) por 72 horas, lavadas em tampão fosfato, desidratadas em série etanólica crescente e estocadas em etanol 70%. Os botões e flores foram dissecados para isolamento das anteras ou do tubo da corola com os estames, que foram então desidratados em série etanólica até etanol P.A., incluídos em historresina (Leica Microssistems) conforme o protocolo proposto pelo fabricante, e seccionados a uma espessura de 3 – 3,5µm usando um micrótomo rotativo (RM 2255, Leica). As secções foram coradas com azul de toluidina 0,05% em tampão acetato pH 4,7 (O’Brien et al., 1964, modificado) e contrastados com uma solução aquosa de 0,02% de vermelho de rutênio (E.A.S Paiva, info. pess.). Lâminas foram montadas com água destilada no momento da observação e os registros fotográficos foram obtidos usando microscópio de campo claro BX53 Olympus, e luz polarizada quando necessário. Amostras fixadas e incluídas foram submetidas aos seguintes testes: - Azul de anilina, para identificar calose em cortes onde os micrósporos estão em fase de tétrade. 22
- Azul mercúrio de bromofenol, para identificar proteínas nos grãos de pólen na fase de dispersão. - Lugol, para identificar grãos de amido nos grãos de pólen na fase de dispersão. - PAS (Reagente de Schiff) para identificar polissacarídeos nos grãos de pólen na fase de dispersão. - Sudan IV, para identificar substâncias lipídicas nos grãos de pólen na fase de dispersão. - Vermelho de rutênio 0.02%, para identificar substâncias pécticas nos grãos de pólen na fase de dispersão.
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Anteras retiradas de flores em antese foram fixadas em solução de Karnovsky (Karnovisky, 1965) e desidratadas em série etanólica crescente até etanol P.A. As anteras foram secas em um aparelho de ponto crítico (CPD-030 Balzers) usando CO2 como intermediário. As anteras foram rompidas para liberação dos grãos de pólen, que foram fixados em stubs de alumínio, e cobertos com ouro, usando revestimento por aspersão (SCD-050, Balzers). As amostras foram analisadas usando um microscópio eletrônico de varredura JSM 5800LV, Jeol.
Microscopia eletrônica de transmissão (MET) As amostras foram fixadas em solução 3% de glutaraldeído, num pH 7,2 para 0,1M de cacodilato, por 24h. Em seguida as amostras foram lavadas por 3 vezes de 30 minutos em água destilada, e fixadas em tetróxido de Ósmio (OsO4) a 1M, por pelo menos 12 horas (overnight). Em seguida as amostras foram lavadas por 3 vezes de 10 minutos em água destilada e desidratadas em série etanólica ascendente (de 10% - 100%, 1 hora por etapa, repetindo 3 vezes a última etapa), e incluídas em RL White “Hard grade” numa proporção de 1:1 com etanol absoluto por no mínimo 12 horas em geladeira, e em seguida polimerizada em cápsulas de gelatina em estufa à 60ºC por 8 horas. O material foi trimado, submetido ao corte semifino em navalha de vidro em 0,5µm, trimado novamente e seccionado em navalha de diamante em 0,075µm. Os cortes foram colocados em grades de cobre. As grades de cobre com os cortes foram contrastadas com Acetato de Uranila a 7% por 30 minutos, lavados com água destilada e contrastados novamente com Citrato 23 de Chumbo a 0,4% por 30 minutos e lavados novamente com água destilada. As eletromicrografias foram obtidas com o microscópio eletrônico de transmissão LEO 906.
RESULTADOS Desenvolvimento da Parede da Antera A antera das espécies estudadas de Aspidosperma apresentam formato lobado nos estádios iniciais do desenvolvimento, já sendo possível observar nesse estágio os quatro microsporângios (Fig. 3a). A antera é revestida pela protoderme (Fig. 3b), que vai apresentar apenas divisões anticlinais e, futuramente, dará origem à epiderme. Internamente à protoderme observa-se a camada parietal primária (Fig. 3b-c). Com o desenvolvimento da antera, essa camada se divide periclinalmente (Fig. 3c), dando origem a duas camadas parietais secundárias (Fig. 3d). A camada parietal secundária externa, passa por mais uma divisão (Fig. 3d) dando origem ao endotécio e a uma camada média (Fig. 3e). A camada parietal secundária interna dá origem ao tapete (Fig. 3d-e). Em Aspidosperma verbascifolium, após a formação dos estratos parietais, essas camadas continuam se dividindo periclinalmente dando origem a duas ou três camadas de endotécio, duas a três camadas médias e duas a três camadas de tapete (Fig. 3f-g). A epiderme possui células com pequenos vacúolos e núcleo evidente (Fig. 3e, g). As células do endotécio e da camada média possuem parede celular delgada, pequenos vacúolos e núcleo evidente (Fig. 3e), podendo ser observadas duas camadas médias em pontos isolados. O tapete é do tipo secretor e, apesar de possuir apenas uma camada celular na maior parte da parede da antera, também pode apresentar duas camadas em pontos isolados. As células do tapete são isodiamétricas, com citoplasma bastante denso, indicando a intensa atividade celular desse tecido, e apenas um núcleo por célula (Fig. 3e, g). Em Aspidosperma verbascifolium, o endotécio, camadas médias e tapete podem apresentar até seis camadas em pontos isolados. Durante a microesporogênese e a microgametogênese, a parede da antera passa por mudanças significativas. Na antera em deiscência, a parede das células da epiderme fica mais espessada e o vacúolo se amplia (Fig. 3h-i). As células do endotécio aumentam seu volume, e suas paredes adquirem espessamentos de lignina (Fig. 3h-i). A camada média colapsa e é consumida no estádio de dispersão do grão de pólen (Fig. 3h-i). O tapete começa a ser degradado durante a fase de vacuolização dos micrósporos, até estar completamente ausente no estágio de deiscência da antera (Fig. 3h-i). Em Aspidosperma 24 verbascifolium a epiderme permanece uniestratificada e o endotécio apresenta duas ou três camadas (Fig. 3i).
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Figura 3. Desenvolvimento da parede da antera de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz. Cortes transversais (a-b, d-e,-h) e longitudinais (c, f-g). A. australe Müll.Arg. (a-b, d), A. cylindrocarpon Müll.Arg. (c), A. pyrifolium Mart. & Zucc. (h), A. tomentosum Mart. & Zucc. (e) e A. verbascifolium Müll.Arg. (f-g, i). a – antera no início do desenvolvimento, com os quatro microsporângios delimitados (círculos pretos pontilhados). b – detalhe de um microsporângio, mostrando divisões anticlinais na protoderme (), e a camada parietal primária. c – microsporângio com divisões periclinais (seta preta) na camada parietal primaria que darão origem às duas camadas parietais secundárias. d – detalhe das camadas parietais secundárias externa e interna. Camada parietal secundária externa com divisão celular periclinal (seta preta) que dará origem ao endotécio e camada média. Camada parietal secundária interna que dará origem ao tapete. e – microsporângio com os estratos parietais formados. f - divisões celulares periclinais () que darão origem às camadas múltiplas de endotécio e camadas médias em A. verbascifolium. g – parede do microsporângio em A. verbascifolium, mostrando as múltiplas camadas celulares de endotécio, camadas médias e tapete. h-i – parede da antera em deiscência, notar o maior número de camadas em A. verbascifolium (i). ce: camada parietal secundária externa, ci: camada parietal secundária interna, cm: camada média, co: conectivo, cp: camada parietal primária, en: endotécio, ep: epiderme, gp: grão de pólen, pr: protoderme, ta: tapete, te: tecido esporogênico. 26
Microesporogênese No tecido esporogênico, as células tornan-se bem diferenciadas por seu tamanho quando comparadas às demais células das camadas parietais. Na sequência, começam a depositar calose ao redor de si (Fig. 4a-d), isolando-se umas das outras, a não ser por canais citoplasmáticos (Fig. 4b). As células mãe de micrósporo (CMM) passam por meiose (Fig. 4c) e a citocinese dos micrósporos é do tipo simultânea (Fig. 4c-d). Nas cinco espécies o tipo de tétrade de micrósporos predominante é tetraédrica (Fig. 4e-f), mas também ocorrem tétrades isobilaterais (Fig. 4f-g) e decussadas (Fig. 4e) em Aspidosperma australe, A. cylindrocarpon, e A. verbascifolium, e isobilaterais em A. pyrifolium e A. tomentosum (Fig. 4f-g). Os diferentes tipos de tétrades frequentemente ocorrem no mesmo microesporângio (Fig. 4f). Ocorre sincronismo das fases no mesmo microesporângio, mas não entre os microesporângios da mesma antera.
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Figura 4. Microesporogênese em espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz. Cortes transversais. A. tomentosum Mart. & Zucc. (a), A. cylindrocarpon Müll.Arg. (b, e), A. verbascifolium Müll.Arg. (c-d, f), A. australe Müll.Arg. (g). a – células do tecido esporogênico destacadas das demais devido ao maior volume celular e início da deposição de calose () ao seu redor. b – células mãe de micrósporo ligadas por canais citoplasmáticos (seta preta), com calose depositada ao seu redor (). c – células mãe de micrósporo na fase de meiose, com setas indicando os núcleos formados na primeira e segunda fase da meiose. d – célula mãe de micrósporo na fase de citocinese dando origem a uma tétrade tetraédrica (seta preta) e – tétrades tetraédrica e decussada (). f – tétrades tetraédricas () e isobilateral, mostrando que os dois tipos podem ocorrer no mesmo microsporângio g – tétrade isobilateral. cl: célula mãe de micrósporo, m1: núcleos formados na primeira fase da meiose, m2: núcleos formados na segunda fase da meiose. 28
Microgametogênese Depois que as tétrades de micrósporos são formadas, a calose é degradada, deixando os micrósporos livres entre si. Concomitantemente, a exina começa a ser depositada, formando uma camada espessa e com contorno plicado (Fig. 5a). Então, os micrósporos começam a vacuolizar (Fig. 5b-e). Nesse estádio, a intina começa a ser depositada (Fig. 5b), formando uma camada delgada exceto na região do poro onde a intina é espessa (Fig. 5c). A intina se torna espessa em todo diâmetro do micrósporo (Fig. 5d-e) e o conteúdo citoplasmático do micrósporo começa a condensar (Fig. 5e). Uma divisão celular assimétrica dá origem à célula vegetativa e à célula generativa (Fig. 5f). A célula vegetativa é maior, com vários vacúolos, e a célula vegetativa é menor, de formato lenticular (Fig. 5f). Nessa fase os vacúolos da célula vegetativa começam a diminuir de volume e o citoplasma começa a se tornar denso (Fig. 5g), pelo acúmulo de polissacarídeos de reserva (Fig. 5h). A célula generativa migra para a região central da célula vegetativa (Fig. 5g) e, então, se divide formando os gametas (Fig. 5i).
Grãos de pólen Na fase de deiscência da antera, os grãos de pólen são tricelulares (Fig. 6a) e o citoplasma da célula vegetativa é bastante denso (Fig. 6a-c), com acúmulo de amido e polissacarídeos de reserva na célula vegetativa (Fig. 6c). Os gametas apresentam conteúdo celular bastante denso, ficando difícil distinguir núcleo e citoplasma (Fig. 6a). Nas regiões dos poros a exina não é depositada (Fig. 6c). Algumas regiões da exina são depositadas de forma mais espessa formando alças, em outras ela é mais delgada, formando pseudocolpos (Fig. 6-h). Os grãos de pólen são liberados da antera em mônades (Fig. 6c-h), são oblatos (Fig. 5d), apresentam de quatro a cinco poros localizados na região equatorial (Fig. 6e-g) e exina plicada (Fig. 6). Os poros se localizam entre as depressões formadas pelas alças de exina que dão o formado plicado à superfície dos grãos de pólen (Fig. 6e-g). Em Aspidosperma verbascifolium, a exina tem aspecto rugoso (Fig. 6g) ao passo que nas outras espécies, as alças apresentam aspecto liso (Fig. 6d-f, h). A camada mais externa da exina, que compõe a superfície do grão de pólen, é lisa (Fig. 6d-g) com exceção de Aspidosperma pyrifolium, que tem aspecto pulverulento (Fig. 6h). A exina apresenta endexina, foot layer, columela e tectum. (Fig. 7a). Apesar dos poros se localizarem nas depressões da exina, e morfologicamente se assemelharem a colporos, todas as camadas 29 da exina são mantidas mesmo nas depressões (Fig. 7 a,b), não formando colporos. Na região da abertura, nenhuma camada da exina é depositada (Fig. 7b). Entretanto, a deposição de intina é continua, inclusive nessa região (Fig. 7b). Na camada mais externa da exina, o tectum é contínuo, não sendo observados muros, o que caracteriza a exina como lisa (Fig. 7c) Em Aspidosperma pyrifolium, o tectum se apresenta de maneira diferente (Fig. 7d), provavelmente por isso, os grãos de pólen dessa espécie apresentam aspecto pulverulento (Fig. 6h).
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Figura 5. Microgametogênese em espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz. Cortes transversais. A. australe Müll.Arg. (a, f, h), A. cylindrocarpon Müll.Arg. (c), A. pyrifolium Mart. & Zucc. (d-e), A. verbascifolium Müll.Arg. (g), A. tomentosum Mart. & Zucc. (i). a – micrósporos livres depois da calose ser degradada, notar a deposição de exina de forma plicada (seta preta). b – micrósporo com citoplasma condensado antes da fase de vacuolização. c - início da vacuolização dos micrósporos, com a intina começando a espessar na região dos poros (), e a exina plicada. d – micrósporo vacuolizado, com vários vacúolos grandes, intina espessa em todo o micrósporo. e – micrósporo com o citoplasma se condensando. f – microgametófito após a primeira divisão celular, notar a célula vegetativa maior e a célula generativa menor e de formato lenticular. g – microgametófito com a célula generativa na região central da célula vegetativa. h – teste histoquímico PAS com resultado positivo para polissacarídeo no citoplasma da célula vegetativa do microgametófito. i - citoplasma da célula vegetativa condensado e os dois microgametas. cg: célula generativa, cv: célula vegetativa, ex: exina, ga: gameta, in: intina, mi: micrósporo, ta: tapete, va: vacúolo. 31
Figura 6. Grãos de pólen de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia de luz (a-b) e microscopia eletrônica de varredura (c-g). Cortes transversais (a-c) A. pyrifolium Mart. & Zucc. (a, h), A. australe Müll.Arg. (b-d), A. cylindrocarpon Müll.Arg. (e), A. tomentosum Mart & Zucc. (f), A. verbascifolium Müll.Arg. (g). a – grão de pólen tricelular na fase da deiscência da antera, evidenciando a intina espessa e uniforme e a exina plicada. b – grão de pólen, mostrando o acúmulo de amido no citoplasma da célula vegetativa antes da deiscência da antera. c – grão de pólen na fase de deiscência da antera, observar quatro poros (seta) e quatro pseudocolpo com menor deposição de exina. d – grão de pólen em vista equatorial, com formato oblato. e – detalhe do poro (seta) e do pseudocolpo. f – grãos de pólen em vista polar e equatorial g – grão de pólen em vista polar, notar as alças rugosas de A. verbascifolium. os poros (seta) e os pseudocolpos h – grão de pólen em vista equatorial com superfície pulverulenta em A. pyrifolium. ga: gameta, pc: pseudocolpo.
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Figura 7. Grãos de pólen de espécies de Aspidosperma Mart. & Zucc. em microscopia eletrônica de transmissão (a, b ,d) e de transmissão (c). A. australe Müll.Arg. (a, b, c) e A. pyrifolium Mart. & Zucc. (d). Detalhe da deposição da exina mostrando as camadas da exina (a), da falta de deposição de exina na região do colpo (b – seta) e da deposição desigual na região do pseudocolpo (b). Observar que todas as camadas da exina se mantêm em todas as regiões, descartando a possibilidade de endoaberturas nos grãos de pólen. O tectum é continuo, e não forma muros na camada mais externa da exina (c). Em A. pyrifolium o tectum, se apresenta apresenta de maneira diferenciada, provavelmente dando o aspecto pulverulento observado nos grãos de pólen dessa espécie. ca: columela, ed: endexina, fl: foot layer, in: intina, tc: tectum.
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Acúmulo e degradação de amido no desenvolvimento da antera e grãos de pólen. Durante o desenvolvimento da antera e dos grãos de pólen, processos de síntese e degradação do amido são observados nas células dos estratos parietais e dos grãos de pólen nas espécies de Aspidosperma aqui estudadas. Dois eventos de síntese são observados. O primeiro acúmulo de amido é observado nos estratos parietais da antera e acontece desde o início da meiose até a fase de vacuolização dos micrósporos (Fig. 8a). Nesse primeiro evento, os micrósporos não acumulam amido (Fig. 8a). O segundo acúmulo de amido é observado nos micrósporos após sua fase de vacuolização (Fig. 8b). Nessa etapa, quase não são observados grãos de amido nos estratos parietais da antera (Fig. 8b). Após a vacuolização o amido acumulado deve ser convertido em outras formas de açúcares dissolvidos, não sendo encontrados nas células da parede da antera ou dos grãos de pólen na fase de deiscência da antera (Fig. 8c). Essa conversão é observada em quatro das cinco espécies aqui analisadas. Em Aspidosperma verbascifolium a conversão de amido em polissacarídeos dissolvidos não ocorre, e o conteúdo de reserva dos grãos de pólen na fase de dispersão continua sendo amido (Fig. 8d).
Figura 8. Acúmulo e degradação de amido na parede da antera e grãos de pólen em Aspidosperma. A. australe (a, b), A. pyrifolium (c), A. verbascifolium (d). Teste histoquímico com Lugol (a, b, d) e PAS (c). a – acúmulo de grãos de amido nos estratos parietais, sem acúmulo de amido nos micrósporos. b – acúmulo de grãos de amido nos micrósporos, sem acúmulo nos estratos parietais. c – grãos de pólen na fase de dispersão de A. pyrifolium, com polissacarídeos dissolvidos como substância de reserva dos grãos de pólen na fase de dispersão. d – grãos de pólen na fase de dispersão de A. verbascifolium com grãos de amido como conteúdo de reserva. ep: epiderme; en: endotécio; mi: micrósporo; ta: tapete.
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DISCUSSÃO Desenvolvimento da Antera Nossos resultados demonstram que as anteras em Aspidosperma são tetraesporangiadas, concordando com o que é comumente encontrado dentro das Apocynaceae s.s. (Davis, 1966; Johri et al., 1992). As anteras biesporangiadas, reportadas para os membros da antiga família Asclepiadaceae, atualmente distribuídos nas subfamílias Periplocoideae, Secamonoideae e Asclepiadoideae (Johri et al., 1992), é uma condição derivada, que surgiu de forma independente, ao menos cinco vezes na família (Fishbein et al., 2018). Endress (2016) reporta a redução no número de microsesporângios por teca, como uma característica fixa, resultante do alto grau de sinorganização requerido para a formação do polinário. As divisões celulares que dão origem aos estratos parietais das espécies de Aspidosperma analisadas são do tipo dicotiledôneo, um tipo de formação de parede da antera bastante comum, reportado para ao menos 43 famílias atualmente posicionadas nas Eudicotiledôneas, e também o tipo de formação descrito para Apocynaceae (Davis 1966). Este tipo já foi descrito em Apocyneae (Trachelospermum lucidum (D. Don) K. Schum. sob T. fragrans Hook. f. - Sud, 1984), grado apocynoide; em Vinceae (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz – Ghimire et al., 2011; R. vomitoria Afzel. e R. weddelliana Müll. Arg. – Koch et al., 2018), grado rauvolfioide; e em Asclepiadeae (Asclepias mexicana Cav. – Davis, 1966), Asclepiadoideae (anexo 1). O endotécio apresenta espessamentos fibrilares na parede, descritos como característicos das Apocynaceae (Davis, 1966; Johri et al., 1992) e também para as outras famílias da ordem Gentianales (Johri et al., 1992), o que também se confirma nas espécies de Aspidosperma analisadas. Entretanto, endotécio sem espessamentos fibrilares foi reportado para Asclepiadeae, em Calotropis gigantea (L.) R. Br. ex Schult. (Maheswari, 1964), Doemia extensa R. Br. (Biwas, 1957) e Oxystelma esculentum (L. f.) Sm. (Maheswari & Lakshminaravana, 1977). O número de camadas nesse estrato parietal apresenta alguma variação, sendo reportados uma camada em Alyxieae, para Cerbera odollam Gaertn., e para quatro das cinco espécies de Aspidosperma analisadas neste trabalho (A. australe, A. cylindrocarpon, A. pyrifolium e A. tomentosum), incluidas no grado rauvolfioide, e em Apocyneae, para Vallaris heynii Spreng. (Anantaswamy Rau 1940), apocynoidea. Foram reportadas, entretanto, cinco à seis camadas em Tabernamontaneae, especificamente em Voacanga foetida (Blume) Rolfe (Maheswari Devi, 1971), e duas a três camadas (podendo chegar a seis em pontos isolados) em 35
Aspidosperma verbascifolium, também analisada neste estudo, mostrando que há então, variação no número de camadas mesmo dentro do gênero. O número de camadas médias nas espécies de Aspidosperma analisadas neste estudo apresenta variação. Das cinco espécies analisadas, quatro (Aspidosperma australe, A. cylindrocarpon, A. pyrifolium e A. tomentosum) apresentam uma camada, podendo ser encontradas duplicações pontuais. Aspidosperma verbascifolium apresenta de duas a três camadas médias. Recentemente, Koch et al. (2018), também observaram camadas médias que se duplicam em algumas regiões em espécies de Vinceae (Rauvolfia vomitoria e R. weddelliana). Em Apocynaceae, Davis (1966) reporta como característica comum possuir uma ou duas camadas médias, dado confirmado para Apocyneae, em Anodendron paniculatum A. DC. (Balasubramanian, 1983), descrita como possuindo duas camadas médias. Johri et al. (1992) também destacam uma ou duas camadas médias como a condição mais comum em todas as famílias que constituem a ordem Gentianales. Entretanto, camadas médias com cinco a seis camadas são reportadas em Asclepiadoideae (Johri, 1992). O tapete é do tipo secretor nas espécies de Aspidosperma aqui analisadas, como é característico na ordem Gentianales, entretanto, tapete ameboide ocorre em Loganiaceae e Gentianaceae (Johri et al., 1992) linhagens irmãs de Apocynaceae (Stevens, 2001 onwards). O número de camadas do tapete e o número de núcleos por célula apresentam variação interessante na família Apocynaceae (Tab. 3). Chama a atenção que cada uma das células do tapete das espécies aqui estudadas tem um único núcleo e que há somente uma camada de células, assim como reportado para Apocyneae (Anodendron paniculatum – Balasubramanian, 1983), e Vinceae (R. vomitoria e R. weddelliana – Koch et al., 2018). Aspidosperma verbascifolium é a única exceção em nossos resultados por apresentar de duas a três camadas de tapete, porém suas células também são uninucleadas. Em Asclepiadoideae tanto o número de camadas no tapete quanto o número de núcleos por célula são variáveis (Johri et al., 1992). Nas tribos Ceropegieae (Leptadenia reticulata (Retz.) Wight & Arn.), Asclepiadeae (Pentatropis spiralis (Forssk.) Decne. e Tylophora cordifolia Thwaites – Mulay et al., 1965), por exemplo, é reportado que o tapete é uniestratificado com muitos núcleos por célula. Ainda dentro desta tribo é reportado também que tapete pode ser multiestratificado com um núcleo por célula (Cynanchum callialatum Buch.-Ham. ex Wight, Pergularia daemia (Forssk.) Chiov. e Tylophora indica (Burm. f.) Merr. – Maheswari Devi, 1964); ou ser multiestratificado com muitos núcleos por célula (Oxystelma esculentum – Johri et al., 36
1992). Nas famílias que constituem a ordem, são reportados comumente um ou poucos núcleos por célula, sendo um núcleo por célula para Gentianaceae e Rubiaceae, e um ou dois núcleos por célula em Loganiaceae (Johri et al., 1992). Em Apocynaceae, aparentemente, um núcleo por célula e uma ou duas camadas no tapete são as condições plesiomórficas para o desenvolvimento da antera. Considerando as informações levantadas até então, nossos dados corroboram a literatura quanto ao padrão de desenvolvimento da parede da antera em Apocynaceae. Apontam, entretanto, para uma mudança nas características do endotécio nas tribos de Asclepiadoideae e para uma maior variação no número de camadas do endotécio, da camada média e do tapete. O número de camadas destes três estratos da parede da antera parece ser maior nas tribos de Asclepiadoideae, porém há alguma variação nas demais tribos e até mesmo em espécies de um mesmo gênero, como o reportado para Aspidosperma. A variação verificada para Aspidosperma pode estar relacionada ao tipo de ambiente, uma vez que A. verbascifolium ocorre em cerrado e as demais espécies analisadas ocorrem em Floresta Estacional Semidecidual, mas é necessário analisar um maior número de espécies de cerrado e ampliar a amostragem de ambientes para se concluir se há de fato correlação entre ambiente e constituição da parede da antera. Outra hipótese sobre a variação no número de camadas na parede da antera é a possibilidade de Aspidosperma verbascifolium ser um poliploide de Aspidosperma macrocarpon Mart. & Zucc. Segundo a base de dados Chromosome counts database (CCDB – Rice et al., 2014) o número cromossômico para A. macrocarpon é 2n=34, o número cromossômico para A. verbascifolium não é conhecido, porém semelhanças morfológicas e a ocorrência dessas espécies no mesmo tipo de ambiente, não excluem essa possibilidade. Portanto, estudos citogenéticos com o grupo, principalmente incluindo Aspidosperma verbascifolium seriam interessantes para elucidar esse aspecto.
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Tabela 3: Características morfológicas do tapete da antera em Apocynaceae. Número de núcleos por Número de Tribo Espécies/Estudo célula camadas Leptadenia reticulata Ceropegieae/ Pentatropis spiralis Muitos Uniestratificado Asclepiadeae Tylophora cordifolia (Mulay et al., 1965) Cynanchum callialatum Pergularia daemia e Asclepiadeae Um Multiestratificado Tylophora indica (Maheswari Devi, 1964) Oxystelma esculentum (Johri Asclepiadeae Muitos Multiestratificado et al., 1992)
Apocyneae Anodendron paniculatum Um Uniestratificado (Balasubramanian, 1983) Rauvolfia vomitoria e R. Vinceae weddelliana (Koch et al., Um Uniestratificado 2018) Aspidosperma australe, A. cylindrocarpon, A. Aspidospermateae Uniestratificado pyrifolium, A. tomentosum Um (este estudo) Aspidosperma Aspidospemateae verbascifolium Um Multiestratificado (este estudo)
Microesporogênese e Microgametogênese O padrão simultâneo de citocinese encontrado nas espécies de Aspidosperma analisadas é o mais comumente reportado para Apocynaceae (Johri, 1992; Venkata Rao e Rama Rao, 1954; Maheswari, 1964), entretanto, a citocinese sucessiva já foi reportada para Plumerieae (Plumeria – Chauhan, 1979 - rauvolfioide), Apocyneae (Apocynum – Latto, 1974), Malouetieae (Holarrhena – Latto, 1974) (apocynoide) Ceropegieae (Caralluma – Maheswari Devi, 1964) e Asclepiadeae, (Doemia – Maheswari Devi, 1964; Oxystelma – Johri et al., 1992) (Asclepiadoideae). Além disso, os dois tipos de citocinese em uma mesma espécie já foram reportados para Catharanthus pusillus (Murray) G. Don (Bhasin, 1971) e Rauvolfia tetraphylla L. (sob R. canescens, Meyer, 1938), ambos pertencentes a Vinceae (rauvolfioide). Citocinese simultânea, também descrita como condição comum para as outras famílias da ordem Gentianales (Johri et al., 1992), parece ser o estado plesiomórfico em Apocynaceae. 38
As tétrades tetraédricas e isobilaterais são mais comumente descritas para a família (Johri, 1992), como reportado para Vinceae (Rauvolfia weddelliana e Rauvolfia vomitoria – Koch et al., 2018) e Apocyneae (Trachelospermum lucidum, sob T. fragrans – Sud, 1984). Entretanto, tétrades decussadas, lineares e em forma de T foram reportados para Malouetieae (Holarrhena pubescens Wall. ex G. Don, sob Holarrhena antidysenterica – Latto, 1974), lineares e em forma de T para Asclepiadeae (Johri et al.,1992) e tetraédricas, lineares, isobilaterais e em forma de T para Periplocoideae (Hemidesmus indicus (L.) R. Br. ex Schult. – Nirula & Richharia, 1945). Entre as demais famílias que constituem a ordem Gentianales, tétrades tetraédricas, isobilaterais e decussadas são reportadas (Johri et al., 1992). Nas espécies de Aspidospermateae aqui avaliadas observamos tétrades tetraédricas, isobilaterais e decussadas. A partir das informações até então levantadas, o padrão de citocinese, e a forma das tétrades são variáveis entre as tribos e parecem não ter valor informativo para níveis taxonômicos inferiores.
Grãos de pólen Os grãos de pólen são tricelulares no estágio de dispersão nas espécies de Aspidosperma analisadas, como descrito geralmente para Apocynaceae (Maheswari Devi, 1970). Johri et al. (1992) reportaram, entretanto, grãos de pólen bicelulares neste estágio para Vinceae (Catharanthus), Malouetieae (Holarrhena) e Plumerieae (Plumeria) e apontam que grãos de pólen com duas ou três células na fase de dispersão são comumente descritos para toda a ordem Gentianales. Os grãos de pólen das espécies estudadas são dispersos na forma de mônades, como descrito para as Apocynaceae s.s. (Middleton, 2007), com exceção dos gêneros Condylocarpon (Alyxieae; Van der Ham et al. 2001) e Aspidosperma huberianum A.S.S. Pereira (Pereira et al., no prelo) que dispersam os grãos de pólen em tétrades. Em Periplocoideae, os grãos de pólen se dispersam em tétrades livres ou reunidas em polínias macias, sem translador, e em Secomonoideae e Asclepiadoideae em polínias anexadas a um translador, ou em tétrades - Secamonoideae (Verhoven & Venter, 2001; Endress 2016). Em Secamonoideae, há cinco polinários, cada um formado por quatro polínias ligadas a um translador (Verhoeven & Venter, 2001). Já em Asclepiadoideae os cinco polinários são formados por duas polínias cada (Verhoeven & Venter, 2001). Quanto às aberturas dos grãos de pólen, Maheswari Devi (1970), descreve o pólen das Apocynaceae como triporado em sua maioria (Tab. 4). Entretanto, variações 39 quanto ao número e às formas das aberturas vem sendo descritas na literatura. Assim, dentro da tribo Alyxiaea, o número de aberturas varia entre zero – em Condylocarpon – até cinco em Lepinia, todos em forma de poro (Van der Ham et al., 2001). Em Vinceae (Rauvolfia weddelliana e Rauvolfia vomitoria), os grãos de pólen são tricolpados (Koch et al., 2018). Em Whillughbeieae, são descritos grãos de pólen 4-colporados (Lacmellea), 2-porados em Tabernaemontaneae (Macoubea), 4-porados (Forsteronia) e 4-6 porados (Mandevilla) em Mesechiteae, 6-8 porados (Odontadenia) e 3-porados (Secondatia) em Odontadenieae (Rodrigues et al., 2016). Em Periplocoideae, são reportados grãos de pólen 4-6 porados, em Secamonoideae e Asclepiadoideae, não são observadas aberturas nos grãos de pólen (Verhoeven & Venter, 2001). Dentro de Gentianales, existe bastante variação nas características dos grãos de pólen, quanto a forma de dispersão e também quanto ao número e forma das aberturas. Na maior parte, a apresentação dos grãos de pólen em Gentianales é descrita como em mônades (Johri et al., 1992), entretanto, são reportados grãos de pólen em forma de tétrades e políades em Gentianaceae (Struwe & Albert, 2002) e em Apocynaceae (Van der Ham et al. 2001; Verhoeven & Venter, 2001). O número de aberturas varia de três a cinco em Loganiaceae, de três à cinco colporos ou um à seis poros em Gentianaceae e dois à três colporos ou poros em Rubiaceae (Stevens, 2001 onwards). Em Aspidospermateae, existem descrições dos grãos de pólen para Geissospermum, Vallesia e Aspidosperma. Em Geissospermum, os grãos são descritos como tendo 6 colporos, todos na região equatorial do grão (Rodrigues et al., 2016). Em Aspidosperma, os grãos de pólen vêm sendo descritos como colporados ou pseudocolporados, com cinco(seis) colporos ou pseudocolporos em A. australe (Barth & Luz, 2008), seis colporos em A. megalocarpon Müll. Arg. (Sánchez-Dzib et al., 2009), cinco(seis) em A. parvifolium A. DC (Moreira et al., 2004) e quatro colporos em A. tomentosum (Labouriau, 1973) e A. quebracho-blanco Schltdl. (Radaeski et al., 2014).
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Tabela 4: Características de grãos de pólen em Apocynaceae.
Número de Tribo Gênero Forma Referência aberturas Condylocarpon 0 Van der Ham et al., Alyxieae Poro Lepinia até 5 2001 Vinceae Rauvolfia 3 Colpo Koch et al., 2018 Whillughbeieae Lacmellea 4 Poro Rodrigues et al., 2016 Macoubea 2 poro Tabernaemontaneae Rodrigues et al., 2016 Tabernaemontana 3 colporo Forsteronia 4 Mesechiteae Poro Rodrigues et al., 2016 Mandevilla 4-6 Odontadenia 6-8 Odontadenieae Poro Rodrigues et al., 2016 Secondatia 3 Verhoeven & Venter, Periplocoideae ╺ 4-6 Poro 2001 Secamonoideae Verhoeven & Venter, ╺ 0 ╺ Asclepiadoideae 2001
Aspidospermateae Geissospermum 6 colporo Rodrigues et al., 2016
Nilson (1986) aponta para as semelhanças entre os grãos de pólen de Aspidosperma e Geissospermum, principalmente quanto às alças na ornamentação da exina. Middleton (2007) relata a ocorrência dessas alças também para o gênero Vallesia. Nossos resultados confirmam estas descrições quanto ao número de aberturas nos grãos de pólen, porém temos uma interpretação diferente a respeito do uso do termo “colporo”. O termo colporo é definido como uma abertura composta por um ectocolpo e uma ou mais endoaberturas (Punt et al., 2007). Apesar de o tipo colporado ser descrito para Apocynaceae e para Aspidosperma, observamos nas espécies analisadas que o que é definido como colporo é aparentemente resultado de um espessamento desigual da exina que resulta em costas longitudinais na superfície dos grãos e não constitui uma abertura verdadeira, por isso preferimos não adotar este termo. Estas mesmas costas definem espaços sem aberturas entre os poros, chamados por alguns autores de pseudocolpos, que também observamos nas espécies de Aspidosperma analisadas. Consideramos mais adequado, então, definir que os grãos de pólen em Aspidosperma são 4-6 porados, com pseudocolpos delimitando os espaços entre os poros, uma vez que as aberturas propriamente ditas apresentam formato arredondado, característico dos poros. Considerando as características levantadas até então há uma grande variação no número de aberturas dos grãos de pólen em Apocynaceae mesmo dentro das tribos e 41 espécies, porém um predomínio da abertura em poros, sendo os colpos verdadeiros encontrados apenas em Vinceae (Rauvolfia). O tipo de pólen colporado é reportado em Tabernaemontaneae e em Aspidospermateae, porém questionamos esta definição para as espécies aqui analisadas e acreditamos que a descrição deste tipo de abertura possa ser resultado de uma interpretação equivocada nos demais casos em que foram reportadas. É necessário, entretanto, a análise do pólen de outros táxons das duas tribos para uma definição final. Quanto à forma de apresentação e dispersão dos grãos de pólen, o esperado em estudos recentes é que ela ocorra na direção de mônade para tétrade, e de tétrade para polínia (Fishbein et al., 2018). Entretanto, a evolução das tétrades aconteceu mais de uma vez em Apocynaceae (Fishbein et al., 2018), incluindo linhagens onde a dispersão em mônade é mais comum, como no caso de Condylocarpon (Van der Ham, et al. 2001). Dispersão em tétrade foi reportada também dentro do gênero Aspidosperma, especificamente em Aspidosperma huberianum A.S.S. Pereira, uma espécie amazônica descrita recentemente (Pereira et al., no prelo). Nessa espécie, os grãos são dispersos de maneira agrupada, mas diferente do que ocorre em Condylocarpon, os grãos de pólen nas tétrades possuem aberturas (Tab. 5). Fishbein et al. (2018) interpretaram isso como surgimentos independentes da mesma característica, mostrando que as tétrades surgem dentro da família quatro vezes. Concordamos com essa abordagem, aumentando para cinco o número de surgimentos independentes de tétrades dentro do grupo, uma vez que se observa além de mônades, a presença de tétrades dentro do gênero Aspidosperma.
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Tabela 5: Características de grãos de pólen em espécies de Aspidosperma.
Número de Espécie Forma Referência aberturas colporos ou A. australe 5 (6) Barth & Luz, 2008 pseudocolporo Sánchez-Dzib et A. megalocarpon 6 colporos al., 2009 A. parvifolium 6 colporos Moreira et al., 2004 A. tomentosum 4 colporos Labouriau, 1973 Radaeski et al., A. quebracho-blanco 4 colporos 2014 Pereira et al. (no A. huberianum 12(-4) poros prelo) A. australe, A. cylindrocarpon, A. pyrifolium, A. tomentosum, A. 4-6 poros Presente trabalho verbascifolium
Acúmulo e degradação do amido nos grãos de pólen e na parede da antera Reservas em grão de pólen são importantes na fase de dispersão, pois estes precisam de energia para germinar e suprir o crescimento do tubo polínico. As reservas podem se apresentar em forma de açúcares, lipídios ou amidos (Baker & Baker, 1979), e os grão de pólen podem ser classificados em amilados ou sem amido na fase de dispersão (Baker & Baker, 1979). Os grãos de pólen que utilizam amido como conteúdo de reserva são mais documentados na bibliografia que os grãos que utilizam outros açúcares ou outras formas de reserva (Bhandari, 1984). Grãos de pólen ricos em amido são característicos de plantas anemófilas ou, raramente, plantas hidrófilas, enquanto plantas entomófilas apresentam, maior ou menor substituição do amido por lipídios ou açucares (Baker & Baker, 1979). Oliveira et al. (2004), em seu estudo sobre polinização de arvores do cerrado, apontam as mariposas como os principais polinizadores para Aspidosperma macrocarpon e A. tomentosum. Lin & Bernadello (1999), em um estudo sobre biologia reprodutiva de Aspidosperma quebracho-blanco Schlecht., mostraram que as flores desta espécie recebem muitos visitantes florais durante o dia, como formigas e besouros, entretanto durante a noite recebem a visita de mariposas, que efetivamente são as grandes responsáveis pela polinização, pois são os únicos visitantes que inserem a probóscide no tubo da corola. Nossos resultados mostram que apenas Aspidosperma verbascifolium utiliza amido como conteúdo de reserva na fase de dispersão, ao passo que as demais espécies utilizam açucares dissolvidos como principal conteúdo de reserva na fase de 43 dispersão, corroborando a caracterização feita por Baker & Baker (1979). Para avaliar se isso se confirma em Aspidosperma verbascifolium, entretanto, será necessário realizar estudos de polinização e verificar como os grãos de pólen são dispersos.
Valor taxonômico dos caracteres embriológicos masculinos em Apocynaceae e em Aspidosperma Mart. & Zucc. Algumas contribuições quanto a taxonomia e evolução de Apocynaceae podem ser inferidas a partir dos resultados encontrados no presente estudo. As características relacionadas à formação de parede de antera, como o número de camadas, tipo de endotécio, tipo de tapete e número de núcleos por célula do tapete, são muito conservadas dentro da ordem Gentianales, salvo algumas exceções. Sendo assim essas características não podem ser usadas como diagnósticas para Apocynaceae. O tipo de citocinese da célula mãe de micrósporo (CMM) na maior parte das Gentianales é descrita como simultânea (Johri et al., 1992). Entretanto, dentro de Apocynaceae, há registros de citocinese sucessiva em Plumeria (Chauhan, 1979), Apocynum (Latto, 1984), Horlarrhena (Latto, 1984), Caraluma (Maheswari Devi, 1964), Doemia (Maheswari Devi, 1964), Oxystelma (Johri et al., 1992). Além da ocorrência dos dois tipos na mesma espécie em Rauvolfia e em Catharanthus. Este caráter poderá ser avaliado em estudos futuros para verificar se são constantes nestes gêneros e qual o seu valor taxonômico. Apesar de toda a variação na forma, no número e tipo de abertura e na ornamentação da exina nos grãos de pólen de Apocynaceae, as alças de exina observadas neste estudo são bastante características para Aspidosperma, dado confirmado em outros trabalhos de palinologia com o gênero (Barth & Luz, 2008; Sánchez-Dzib et al., 2009; Moreira et al., 2004; Labouriau, 1973; Radaeski et al., 2014). Este mesmo padrão foi observado também em Geissospermum (Middlenton 2007; Rodrigues et al., 2016) e Vallesia (Middleton 2007), ambos os gêneros da tribo Aspidospermateae. Este caráter parece ser um bom caráter taxonômico para agrupar os membros da tribo Aspidospermateae, e pode ser uma sinapomofia para esta linhagem, porém é necessário verificar se é mantido para os gêneros Haplophyton, Microplumeria e Strempeliopsis, uma vez que as características de grãos de pólen para esses gêneros são desconhecidas.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS Considerando, os resultados encontrados nesse estudo e as informações levantadas da bibliografia para Apocynaceae e para Ordem Gentianales, podemos concluir alguns pontos. 1. Por se tratar de uma linhagem irmã dos demais representantes de Apocynnaceae, o gênero Aspidosperma nos permite inferir características plesiomorficas sobre as características reprodutivas e embriológicas e nos auxilia na compreensão da evolução desses caracteres ao longo da família. Quanto as características aqui observadas, podemos considerar como condição plesiomórfica: os estames serem livres da cabeça do estilete na flor, não possibilitando a formação das polínias; a parede da antera constituída por uma camada de cada estrato parietal; A dispersão dos grãos de pólen em mônades; os grãos de pólen porados. 2. Formação da parede da antera - características encontradas em Aspidosperma como a parede com quatro camadas, o endotécio fibroso, o tapete do tipo secretor com células com um único núcleo, são caracteres conservados para maior parte das Apocynaceae e também para a Gentianales, com exceções pontuais dentro dos grupos. Em Aspidosperma verbascifolium, o número de camadas da parede da antera aumentado pode estar relacionado com variação ambiental, ou a possibilidade de possuir um alto número cromossômico. Para que isso se confirme, estudos sobre o desenvolvimento da antera com mais espécies de Aspidosperma que ocorram no cerrado precisam ser feitos, assim como estudos citogenéticos para verificar o número cromossômico em A. verbascifolium. 3. Tipo de citocinese - encontramos o tipo simultâneo para todas as espécies de Aspidosperma, que é o mais comumente reportado para Apocynaceae e para as Gentianales. A citocinese do tipo sucessiva também tem sido reportada para Apocynaceae em Plumeria e vários gêneros de Asclepiadoideae, provavelmente tendo evoluído em mais de uma ocasião. Além disso, citocinese simultânea e sucessiva foram reportadas para a mesma espécie em Rauvolfia e Catharanthus e estes grupos devem ser melhor investigados. 4. Em todas as espécies de Aspidosperma analisadas as tétrades são tetraédricas, decussadas ou isobilaterais, o que é reportado também para outros táxons de Apocynaceae e para Gentianales e pode ser o estado plesiomórfico do caráter na família. 45
5. Os grãos de pólen em Aspidosperma são apresentados em mônades (raro tétrades) e possuem quatro a seis poros (raro 12). O número de aberturas é bastante variável em Apocynaceae, porém as aberturas em poros são mais constantes dentro do grupo, com exceção em Rauvolfia em que se apresentam como colpos. Acreditamos que os registros de colporos da literatura se devam a um erro de interpretação considerando que estes foram reportados para Aspidosperma e o que observamos foram pseudocolpos formados a partir de um espessamento desigual da exina. Estes pseudocolpos se mostraram constantes no gênero e são reportados para outros gêneros da tribo, constituindo potenciais sinapomorfias para Aspidospermateae. 46
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ANEXOS
Anexo 1:Termo de Bioética/Biossegurança
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Anexo 2: Declaração de direitos autorais.