Etude Des Relations Chêne-Liège / Platypus Cylindrus

Home , Penicillium corylophilum, Taphrina wiesneri

République Tunisienne

Ministère de l’Enseignement Supérieur Ministère de l’Agriculture, des Ressources Hydrauliques et de la Pêche et de la Recherche Scientifique Institution de la Recherche et de Université de Carthage l’Enseignement Supérieur Agricoles

Institut National Agronomique de Tunisie

Thèse de Doctorat en Sciences Agronomiques

Spécialité : Phytiatrie

Etude des relations chêne-liège / Platypus cylindrus (Fabricius, 1792 ) (Coleoptera, Curculionidae: Platypodinae) / champignons associés dans les subéraies tunisiennes

Présentée par :

Amani BELLAHIRECH

Soutenue publiquement le 15 Juillet 2016 devant le Jury composé de :

Pr. Mohamed Nejib REJEB : Président

Pr. Mohamed Lahbib BEN JAMAA : Directeur de thèse

Pr. Bouzid NASRAOUI : Rapporteur

Pr. Mohamed Lahbib DHOUIBI : Rapporteur

Pr. Kaouthar GRISSA-LEBDI : Examinateur

Dr. Edmundo SOUSA : Invité

Année Universitaire : 2015-2016

DEDICACES

Je dédie cette thèse

A l’âme de mon cher père Hédi qui m’a quitté beaucoup trop tôt. Je n’oublierai jamais

ses sacrifices et ses encouragements. Puisse DIEU Le Tout Puissant lui accorde sa

Clémence, sa Miséricorde et l’accueille dans son paradis

A ma chère mère Souad qui ne cesse de me soutenir dans les moments les plus

difficiles. Que DIEU lui préserve santé et longue vie et qu’elle trouve dans ce travail

le fruit de ses sacrifices

A mon cher mari Naoufel qui m’a toujours encouragé et qui a toujours été

compréhensif

A mes chers frères Hamdi et Helmi qui m’ont toujours encouragés

A tous mes oncles, tantes, cousins et cousines.

Je ferai toujours de mon mieux pour mériter votre fierté.

Et à toute personne qui m’a aidée tout au long de ce travail.

Remerciements

Je voudrais adresser mes plus vifs remerciements et exprimer toute ma reconnaissance et ma gratitude à tous ceux, très nombreux, qui ont contribué par un apport scientifique, technique ou humain à la réalisation de cette thèse.

Je souhaiterai tout d‟abord remercier les membres du jury qui ont accepté d‟évaluer ce travail de thèse. Merci au Pr. Mohamed Nejib Rejeb d‟avoir accepté la présidence du jury, cela signifie énormément pour moi. Qu‟il trouve ici mes profonds respects. Merci au Pr. Mohamed Lahbib Dhouibi et au Pr. Bouzid Nasraoui d‟avoir rapporté cette thèse et apporté leur éclairage sur les problématiques présentées. Je tiens également à remercier le Pr. Kaouther Lebdi Grissa qui a accepté de juger ce travail en tant qu'examinatrice. Je lui adresse mes sentiments les plus respectueux, et je remercie Dr. Edmundo Sousa d‟avoir accepté de faire partie de mon Jury.

Je tiens à exprimer mes plus profonds sentiments de gratitude, particulièrement, à mon directeur de thèse Dr. Mohamed Lahbib Ben Jamâa, Professeur à l‟Institut National de Recherches en Génie Rural Eaux et Forêts (INRGREF) et Directeur du Laboratoire de Gestion et Valorisation des Ressources Forestières (LGVRF), pour la qualité d‟encadrement et l'aide compétente apportées, pour sa patience, son encouragement et son soutien pour réaliser ce travail de recherche. Son œil critique et ses conseils m'ont été très précieux pour structurer ma thèse. Je le remercie aussi pour sa gentillesse et sa qualité humaine.

Mes remerciements sont également adressés à tous les membres du Laboratoire de la Recherche forestière à l‟Institut National d‟Investigation Agronomique et Vétérinaire (INIAV, IP) à Lisbonne (Oeiras) pour l‟accueil chaleureux et l‟agréable ambiance de travail. Qu‟ils trouvent ici ma profonde reconnaissance. Je remercie Dr. Edmundo Sousa pour la convention de coopération bilatérale qu‟il a élaborée avec notre laboratoire et qui m‟a permise de réaliser de nombreux séjours scientifiques, aussi enrichissants qu‟agréables, au sein de l‟unité forestière de l‟INIAV. Je les remercie également pour leurs conseils et recommandations. Je souhaite également exprimer ma gratitude envers Dr. Maria Lurdes Inácio, qui a contribué à l‟encadrement de ce travail (étude des champignons associés à Platypus cylindrus) avec qui j‟ai beaucoup appris. Je la remercie pour son accueil, sa disponibilité, et pour avoir répondu à mes questions ou pour me relire même pendant les

périodes difficiles de ses expérimentations. Je la remercie pour sa vigilance scientifique, ainsi que sa patience dans la correction de mes écrits.

Je remercie aussi Dr. Luis Bonifácio, pour les échanges et discussions scientifiques constructifs et intéressants et pour sa rigueur, notamment pour l‟énorme travail d‟analyses statistiques de ma thèse. J‟exprime de même ma reconnaissance à Dr. Filomena Nóbrega pour son accueil dans son laboratoire et sa grande contribution pour la réalisation des analyses moléculaires aussi bien de mes insectes que de mes champignons. Je remercie aussi Dr. Pedro Naves pour m‟avoir aidée à identifier mes insectes et Dr. Joana Henriques pour sa participation aux analyses moléculaires de mes échantillons d‟insectes et pour les discussions fructueuses.

Je les remercie d'avoir cru en mes capacités, pour le temps et la patience qu‟ils m‟ont accordé tout au long de mes séjours en me fournissant d'excellentes conditions logistiques. Je garderai dans mon cœur leur générosité, leur compréhension et leur efficacité.

J‟exprime ma gratitude au Pr. Manuela Branco, enseignante à l‟Institut Supérieur Agronomique (ISA) de Lisbonne (Portugal) pour m‟avoir aidé à mieux comprendre et exploiter les analyses statistiques de mes données. Je la remercie, également, pour sa gentillesse et disponibilité malgré ses multiples responsabilités.

Je tiens aussi à remercier Pr. Mohamed Elyes Hamza, Directeur de l‟Institut National Agronomique de Tunisie (INAT), pour sa qualité humaine et sa coopération qui ont grandement facilité toutes les démarches administratives pour la réalisation de mes stages dans le cadre de ma thèse.

J‟adresse mes remerciements à l‟ensemble des membres du Laboratoire de Gestion et Valorisation des Ressources Forestières (LGVRF), unité de la protection phytosanitaire des forêts à l‟INGREF pour les moyens logistiques et techniques qu‟ils ont déployé. Je remercie Mr Mabrouk Grami pour son aide sur terrain et ses conseils techniques pour la réalisation du travail énorme de relevé des données des différentes forêts, ainsi que Béchir, Ridha, Zeineb, Mahbouba, Sarra et Mohsen pour leur gentillesse et collaboration tout le long des années de thèse.

J‟exprime ma gratitude au personnel de la Direction Générale des Forêts (DGF), des arrondissements régionaux des forêts de Béja, Bizerte et Jandouba ainsi que les postes forêts pour leurs coopérations techniques.

iii

Je remercie mes collègues Samir Dhahri, Manel Mejri, Rim Mkaouar, Olfa Ezzine et Yossra Manai pour leur sympathie et les discussions variées mais toujours fructueuses, et pour partager d‟innombrables moments de bonne humeur et de complicité.

Un grand merci à ma famille, Ma mère, Mes frères et Mon mari pour leur soutien au quotidien, de m‟avoir remotivé dans les moments difficiles de la thèse, et de m‟avoir encouragée, sans quoi je n‟aurai pas pu tenir ces années. Une pensée particulière à l‟âme de mon très cher père qui n‟a cessé de compter les jours pour fêter ma réussite. Je lui dédie affectueusement cette thèse.

Table des Matières

Résumé en Arabe i Résumé en Français ii Résumé en Anglais iii Liste des figures iv Liste des tableaux viii Introduction générale 1 Chapitre 1 : Synthèse bibliographique 5 1.1. Le chêne-liège 6 1 .1. 1. Présentation 6 1.1.2. Importance du chêne-liège 6 1.1.3. Biogéographie du chêne-liège 9 1.1.4. Exigence écologique 11 1.1.5. Contraintes et menaces 12 1.2. Situation phytosanitaire du chêne-liège 13 1.2.1. Le dépérissement du chêne-liège 14 1.2.2. Maladies du chêne-liège 16 1.2.3. Les insectes ravageurs du chêne-liège 17 1.3. Platypus cylindrus comme agent du dépérissement de chêne-liège 20 1.3.1. Taxonomie et aire de répartition de Platypus cylindrus 20 1.3.2. Description de l‟insecte 21 1.3.3. Biologie de Platypus cylindrus 23 1.3.4. Importance des attaques de Platypus cylindrus 25 1.4. Relation symbiotique entre Platypus cylindrus et les champignons 27 1.4.1. Importance de la relation symbiotique 29 1.4.2. Ecologie des champignons „ambrosia‟ 31 1.4.3. Classification des champignons „ambrosia‟ 32 1.4.4. Principaux champignons „ambrosia‟ associés à Platypus cylindrus 33 1.4.5. Aspects évolutifs des associations insecte‟ ambrosia‟- champignon „ambrosia‟ 34 1.5. Moyens de lutte contre Platypus cylindrus 36 1.5.1. Lutte culturale 36 1.5.2. Lutte biotechnique 36 1.5.3. Lutte biologique 37 1.5.4. Lutte chimique 37

Chapitre 2. Etude du comportement de Platypus cylindrus dans les subéraies 38 tunisiennes

2.1. Introduction 39 2.2. Matériel et Méthodes 39 2.2.1. Présentation des forêts : sites de travail 39 2.2.2. Protocole expérimental et techniques d'observation 39 2.2.3. Analyse statistique 46 2.3. Résultats 47 2.3.1. Importance des attaques de l‟insecte 47 2.3.2. Caractérisation des parcelles 48 2.3.3. Caractérisation phytosanitaire des parcelles 53 2.3.4. Caractérisation de l‟exploitation des arbres 52 2.3.5. Distribution spatiale des attaques de Platypus cylindrus en Tunisie 54 2.3.6. Emergence de Platypus cylindrus et sex-ratio 58 2.3.7. Collecte d‟autres espèces d‟insectes 60 2.4. Discussion 62 2.5. Conclusion 69

Chapitre 3. Comparaison des caractéristiques morphologiques et moléculaires 70 de Platypus cylindrus en Tunisie et au Portugal

3.1. Introduction 71 3.2. Matériel et méthodes 71 3.2.1. Echantillonnage des insectes 71 3 .2.2. Caractérisation morphologique 73 3.2.3. Caractérisation moléculaire 74 3.3. Résultats 76 3.3.1. Caractérisation morphologique 76 3.3.2. Caractérisation moléculaire 78 3.4. Discussion 80 3.5. Conclusion 83

Chapitre 4. Etude des champignons associés à Platypus cylindrus dans les 85 subéraies tunisiennes 4.1. Introduction 86 4.2. Matériel et méthodes 86 4.2.1. Sites d‟étude 86 4.2.2. Collecte du matériel biologique 87 4.2.3. Isolement des champignons 88 4.2.4. Identification des champignons 89 4.2.5. Analyse statistique 89 4.3. Résultats 89 4.3.1. Principaux genres de champignons isolés 89 4.3.2. Etude des champignons isolés au niveau des sites 92 4.3.3. Etude des champignons selon le lieu d‟isolement (galeries et insectes) 99 4.4. Discussion 105 4.5. Conclusion 112 Chapitre 5. Caractérisation moléculaire des champignons Ophiostomatales associés à Platypus cylindrus et évaluation de leur pathogénie sur jeunes plants 113 de chêne-liège 5.1. Introduction 114 5.2. Matériel et Méthodes 115 5.2.1. Isolement des champignons 115 5.2.2. Identification morphologique 115 5.2.3. Identification moléculaire 116 5.2.4. Etude de la pathogénie des Ophiostomatales associés à Platypus cylindrus 123 5.3. Résultats 125 5.3.1. Caractérisation morphologique 125 5.3.2. Caractérisations moléculaire et phylogénique 128 5.3.3. Evaluation de la pathogénie des espèces 134 5.4. Discussion 135 5.5. Conclusion 141 Conclusion générale 143 Références bibliographiques 149 Annexes 179 vii

ملخص: دراسة العالقات بين شجرة بلوط الفلين / Platypus cylindrus / والفطورالمرتبطة به في غابات بلوط الفلين بتونس. ؼٔزجش وُع Platypus cylindrus مه أٌم حششاد األمجشَصٔب )ambrosia( اٌمبدسح ػٍّ إلبمخ ػاللبد رطفٍٕخ مغ أوُاع مؼٕىخ مه اٌفطُس ومصذس ٌٍغزاء َثؼعٍب لذ ٔىُن ممشض ٌٍىجبد. رأثٕشارٍب فٓ مىطمخ غشة اٌجحش األثٕط اٌمزُسػ )مىطمخ اٌزُاجذ اٌطجؼٕٓ ٌجٍُغ اٌفٍٕه( مزغٕشح فٓ اٌجشرغبي َاٌمغشة َمؤخشا فٓ اٌجضائش. َ رزصشف االفخ 'وحششح إٌَٔخ' مشرجطخ مجبششح ثزثُي أشجبس ثٍُغ اٌفٍٕه، أمب فٓ رُوس فئوٍب رزصشف 'وحششح ثبؤُخ' ال رٍبجم سُِ األشجبس اٌعؼٕفخ َاٌمٕزخ.

ٍٔذف ٌزا اٌجحث إٌٓ دساسخ اؼٌاللخ ثٕه اٌحششح Platypus cylindrus َاٌفطُس اٌمشرجطخ ثٍب، َشجشح ثٍُغ اٌفٍٕه فٓ غبثبد ثٍُغ اٌفٍٕه اٌزُوسٕخ، َوزٌه اوزسبة اٌمؼشفخ حُي دَس ٌزا اٌزفبػً فٓ ظبٌشح رثُي ثٍُغ اٌفٍٕه.

ٌمذ أظٍشد ػمٍٕخ اٌجحث َاٌزىمٕت فٓ 22 مه غبثبد ثٍُغ اٌفٍٕه فٓ رُوس أن اٌزُصٔغ اٌجغشافٓ ٌٍحششح مزطبثك مغ اٌزُصٔغ اٌجغشافٓ ٌشجشح ثٍُغ اٌفٍٕه. إن دساسخ سٍُن Platypus cylindrus مغ األخز ثؼٕه االػزجبس وال مه اؼٌُامً اٌجٕئٕخ ٌٍغبثبد ٌَألشجبس مىىذ مه اٌمالحظخ ثأن ٌجمبد اٌحششح رجذَ أوثش اسرجبغب ثؼمٍٕخ جىٓ اٌفٍٕه )اٌخفبف( مىً مه اٌحبٌخ اٌصحٕخ ٌألشجبس َاٌظشَف اٌمىبخٕخ. ثٕىذ ممبسوخ رجمؼبد اٌحششاد فٓ رُوس َاٌجشرغبي، حٕث األظشاس وجٕشح جذا ثبٌجٍذ األخٕش، أن اخزالف دسجخ ػذَاوٕخ اٌحششح ثٕه اٌجٍذٔه ال ٔمىه رفسٕشي ال ػجش اٌخصبئص اٌجضٔئٕخ َال اٌمُسفٌُُجٕخ ٌٍحششح. ٌىه ٔجذَ أن غشٔمخ اٌزصشف فٓ اٌغبثبد اٌزٓ ٌٓ أوثش حذح َوثبفخ فٓ اٌجشرغبي ثبإلظبفخ إٌّ خصبئص اٌطمس األوثش حذح، ٔمىه أن رفسش ٌزا اإلخزالف.

مىىذ دساسخ اٌفطشٔبد اٌمشرجطخ ثبٌحششح Platypus cylindrus َاألوفبق اٌمحفُسح داخً اٌخشت، مه رشخٕصئحذِ ػشش جىسب مه اٌفطشٔبد. اٌجؼط مىٍب ثمثبثخ فطشٔبد األمجشَصٔب اٌثبؤُخ ) Penicilliumَ Aspergillus(، َاٌجؼط اٖخش مثً ) Trichoderma َ Gliocladium( مؼشَفخ ثأوشطزٍب اٌمعبدح َثئمىبوٍب اٌسٕطشح ػٍّ ومُ اٌفطُس داخً األوفبق. ٌَىبن فطشٔبد األمجشَصٔب )ambrosia( أخشِ أسبسٕخ ال غىّ ػىٍب فٓ رغزٔخ اٌحششح َثمبءٌب ػٍّ لٕذ اٌحٕبح َدَسٌب اٌىجٕش فٓ اسزؼمبس اٌشجشح اؼٌبئٍخ. مه ثٕه ٌزي اٌفطشٔبد ٌىبن جىسٓ Botryosphaeria َ Biscogniauxia، اٌمؼشَفبن ثمذسرٍمب اإلمشاظٕخ اؼٌبٌٕخ، َ لذ رم رشخٕصٍمب وفطشٔبد مشرجطخ ثبٌحششح Platypus cylindrus. َثبإلظبفخ إٌّ رٌه، رم رشخٕص خمسخ أوُاع مه سرجخ Ophiostomatales. َلذ رم رمٕٕض اؼٌضالد َفمب ٌخصبئصٍب اٌمُسفٌُُجٕخ َاٌجضٔئٕخ اسزىبدا إٌّ مىطمخ ITSَاٌزشمٕض ٌٍجشَرٕه β-tubulin . ومب رم رشخٕص وػُٕه مه جىس Raffaelea َثالثخ أوُاع مه جىس Ophiostoma ألَي مشح فٓ رُوس ٌَٓ: O. َ O. quercus َ Ophiostoma sp.َ R. canadensis َ Raffaelea montetyi tsotsi. مه وبحٕخ أخشِ أظٍش اخزجبس إمشاض ٌزي اٌفطُس ٌشزالد شجٕشاد ثٍُغ اٌفٍٕه ثؼط أػشاض اإلصبثبد َلًٍٕ مه اٌُفٕبد ٌَىه ثذَن اٌزمىه مه إػبدح ػضي اٌفطُس مشح أخشِ مه اٌشزالد.

ثٕىذ وزبئج ٌزي األغشَحخ اٌسٍُن اٌثبوُْ ٌحششح Platypus cylindrus َأوذد اٌحبٌخ اٌصحخ اٌىجبرٕخ اٌجٕذح ٌغبثبد ثٍُغ اٌفٍٕه اٌزُوسٕخ. َمغ رٌه، ٔجت ارخبر رذاثٕش َلبئٕخ، ال سٕمب فٕمب ٔزؼٍك ثزحسٕه ػمٍٕخ جمغ اٌفٍٕه، َرٌه ثٍذف اٌحفبظ ػٍّ ٌزي اٌثشَح مه اٌغبثبد اٌطجؼٕٕخ اٌفشٔذح مه وػٍُب فٓ مىطمخ اٌجحش األثٕط اٌمزُسػ.

كلمات مفتاحية: اٌفطُس/ رُوس/ شجشح ثٍُغ اٌفٍٕه/ Ophiostoma /Platypus cylindrus

Résumé Platypus cylindrus est un insecte ambrosia capable d‟établir des relations symbiotiques avec des champignons lui servant de source de nourriture et dont certains peuvent être phytopathogènes. Son incidence dans la région de la Méditerranée occidentale, aire de dispersion du chêne-liège, est variable. Alors qu‟au Portugal, au Maroc et récemment en Algérie, il se comporte comme un insecte primaire directement lié au phénomène de dépérissement du chêne-liège, en Tunisie, il se comporte comme un insecte secondaire ne s‟attaquant qu‟aux sujets affaiblis ou morts. L‟objectif du présent travail de thèse est d‟étudier la relation entre P. cylindrus et les champignons qui leur sont associés et l‟arbre du chêne- liège dans les subéraies tunisiennes, ainsi que d‟acquérir des connaissances sur le rôle de cette interaction dans le phénomène du dépérissement du chêne-liège. La prospection de 22 forêts dans la région subéricole de la Tunisie a montré que la distribution de l‟insecte suit celle de l‟arbre hôte. L‟étude du comportement de P. cylindrus, en tenant compte aussi bien des paramètres du milieu que ceux des arbres, a permis d‟avancer que ses attaques semblent être plus liées à une mauvaise opération de la levée du liège qu‟à la vigueur et à la situation phytosanitaire des arbres et aux conditions climatiques du milieu. En effet, la comparaison des populations de l‟insecte en Tunisie et au Portugal, où les infestations sont très importantes, a montré que la différence d‟agressivité n‟est pas justifiée par les traits moléculaires, ou morphologiques de l‟insecte. C‟est probablement le mode de gestion des forêts qui est plus sévère au Portugal en plus des conditions climatiques plus extrêmes, qui peuvent expliquer cette variation. L‟étude de la flore fongique associée à P. cylindrus et à ses galeries a permis d‟obtenir onze genres de champignons. Certains peuvent agir comme des champignons ambrosia secondaires tels qu‟Aspergillus et Penicillium, d‟autres comme Gliocladium et Trichoderma, connus pour leurs activités antagonistes, peuvent jouer le rôle de modérateurs et contrôler le développement du mycélium à l‟intérieur des galeries. D‟autres encore sont des champignons ambrosia primaires indispensables pour l‟alimentation et la survie de l‟insecte ainsi que dans la colonisation de l‟arbre hôte. Deux genres connus comme phytopathogènes sont rapportés pour la première fois en Tunisie en association avec P. cylindrus à savoir Biscogniauxia et Botryosphaeria. De plus, un total de cinq espèces de l‟ordre des Ophiostomatales a été identifié. La caractérisation des isolats a été effectuée selon les traits morphologiques et moléculaires en se basant sur la région ITS et celle codant pour la protéine β-tubulin. Deux espèces du genre Raffaelea et trois espèces du genre Ophiostoma ont été identifiées pour la première fois en Tunisie à savoir Raffaelea montetyi, R. canadensis, Ophiostoma sp., O. quercus et O. tsotsi. Le test de pathogénie de ces champignons sur jeunes plants de chêne a montré des symptômes et quelques mortalités mais sans pouvoir les obtenir par ré-isolement. Les résultats du présent travail de thèse justifient le comportement secondaire de l‟insecte et confirment le bon état phytosanitaire des forêts tunisiennes de chêne-liège. Cependant, des mesures préventives doivent être entreprises, notamment celle relative à une amélioration de l‟opération de la levée du liège, dans l‟objectif de préserver ce patrimoine forestier naturel, unique dans le bassin méditerranéen. Mots-clés : champignons / Ophiostomatales / Platypus cylindrus / Quercus suber / Tunisie ii

Abstract: Study of the relationship between cork oak/Platypus cylindrus/associated fungi in Tunisian cork oak forests. Platypus cylindrus is an ambrosia beetle able to establish symbiotic associations with fungi serving as nourishment source, some of which may be phytopathogenic. Its incidence in the Western Mediterranean, area of cork oak dispersal, is variable. While in Portugal, Morocco and recently Algeria, the insect behaves as a primary pest directly related to cork oak decline, in Tunisia, it is considered as secondary attacking only weakened or dead trees. The objective of this work is to study the relations between P. cylindrus, the associated fungi and cork oak trees in Tunisian forests, gathering knowledge about their role in cork oak decline. The investigation of 22 forests in the Tunisian cork oak region showed that the distribution of the insect follows host trees distribution. The study of P. cylindrus’ behaviour, taking in consideration both stand and tree parameters, allowed to conclude the attacks appear to be more related to inappropriate cork removal than to tree vigour and phytosanitary status of the stand and climatic conditions. In fact, the comparison of insects from Tunisia and Portugal, where infestations are very important, has shown that the differences in behaviour are not related to molecular or morphological features of the insect. Probably, the forest management that is more severe in Portugal may explain the variation, along with more extreme climatic conditions. The study of fungal flora associated with P. cylindrus and galleries yielded eleven genera of fungi. Some may act as secondary pathogen such as Aspergillus and Penicillium, others as Gliocladium and Trichoderma, known for their antagonistic activities, control the mycelial development within galleries. Others are primary ambrosia fungi essential for food and survival of the insect and its progeny and for host plant colonization. Two known phytopathogenic fungal genera are reported for the first time in Tunisia in association with P. cylindrus namely Biscogniauxia sp. and Botryosphaeria sp. In addition, a total of five species of Ophiostomatales was identified. Characterisation of the isolates was carried out according to morphological and molecular features based on the ITS and protein-coding the β-tubulin gene regions. Two species of Raffaelea and three species of Ophiostoma were identified for the first time in Tunisia namely Raffaelea montetyi, R. canadensis, Ophiostoma sp., O. quercus and O. tsotsi. The pathogenicity test of these fungi on oak seedlings showed symptoms and low mortality but the re-isolation from symptomatic plants was not achieved. The results of this work support the secondary status of the insect and confirm the good phytosanitary conditions of Tunisian cork oak forests. However, preventive measures must be taken, particularly to improving the cork remove operation, aiming to preserve this natural forest heritage, unique in the Mediterranean. Key words: fungi / Ophiostomatales / Platypus cylindrus / Quercus suber / Tunisia.

iii

Liste Des Figures

Figure 1. Aire de répartition naturelle du chêne-liège (Anonyme 5, 2009). 9

Figure 2. Aire de répartition du chêne-liège en Tunisie (Anonyme 3, 2006). 11

Figure 3. Platypus cylindrus. A gauche : femelle ; A droite mâle se caractérisant par la 22 présence de deux denticules à l‟extrémité abdominale (Photo personnelle, 2010).

Figure 4. Les œufs et les larves de Platypus cylindrus: a) les œufs dans la galerie; b) les œufs de P. cylindrus et une larve nouvellement éclose; c) premier stade larvaire avec 23 tubercules pleurales; d) quatrième stade larvaire (Inácio, 2011).

Figure 5. Symptômes d‟attaque de Platypus cylindrus: a, b) sciure blanchâtre sur tronc montrant les trous d‟entrée/sortie de l‟insecte; c) galeries construites par l‟insecte à 26 l‟intérieur du tronc; d) Jaunissement du feuillage (Photos personnelles, 2011)

Figure 6. Localisation des forêts objets de l‟étude approfondie pendant l‟année 2011. 40

Figure 7. Relevés des paramètres dendrométriques et phytosanitaires des arbres: a) Mesure du diamètre du fût; b) Mesure de la circonférence du tronc; c) Observation du feuillage; d-f) Observation du tronc: d) Ecoulement noirâtre sur tronc, e) Dénombrement 41 des cicatrices et du dessèchement, f) Cavité et éclatement de l‟écorce (Photos personnelles, 2011).

Figure 8. Suivi de l‟émergence des adultes de Platypus cylindrus sur terrain (a) et au 46 laboratoire (b) (Photos personnelles, 2011).

Figure 9. Niveau d‟infestation des différentes forêts prospectées en 2010 et 2011. Les lettres au dessus des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse 48 Kurskal-Wallis.

Figure 10. Moyennes du coefficient de démasclage dans les forêts étudiées de chêne- 52 liège.

Figure 11. Nombre moyen des cicatrices dans les forêts étudiées. 53

Figure 12. Analyse multifactorielle avec l‟analyse en composantes principales (ACP) des 55 différents sites étudiés.

Figure 13. Effectifs d‟insectes collectés au laboratoire pour les forêts étudiées. 59

Figure 14. Emergence de Platypus cylindrus au laboratoire. 59

Figure 15. Répartition des mâles et femelles de Platypus cylindrus émergés au 60 laboratoire.

Figure 16. Photos de quelques insectes collectés des tronçons de chêne-liège. 1. Carabidae, 2. Colydium elongatum, 3. Anobiidae, 4. Tenebrionidae, 5. Xyleborus 62 monographus, 6. X. pfeili (femelle à gauche, mâle à droite), 7. Rhyncolus sp.

Figure 17. Les étapes effectuées pour collecter les insectes : A : Arbres avec des symptômes d‟attaques de l‟insecte; B : tronçons coupés et ramenés au laboratoire; C : 73 Pièges posées sur trous d‟entrée/sortie de l‟insecte (Photos personnelles, 2012).

Figure 18. Photos de microscope électronique à balayage des mâles de Platypus cylindrus 76 du Portugal (A) et de la Tunisie (B); le mycangia est signalé par un cercle blanc.

Figure 19. Photos de microscope optique de mycangia de Platypus cylindrus adultes tunisiens et portugais montrant de multiples cavités sphéroïdes: (a) femelle tunisienne; (b) 71 femelle portugaise; (c) mâle tunisien; (d) mâle portugais.

Figure 20. Comparaison entre le nombre de mycangia chez Platypus cylindrus mâle et 71 femelle au Portugal et en Tunisie.

Figure 21: Révélation sur gel d‟agarose des produits d‟amplification par PCR spécifique à la région COI. M : Marqueur d‟ADN (GeneRuler 1kb DNA Ladder, Fermentas) ; C : 78 Témoin ; 1-7 : produits du PCR.

Figure 22. Arbre phylogénétique des séquences COI de Platypus cylindrus. L'histoire de l'évolution a été déduite en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur 79 le modèle Tamura-3-Paramètres.

Figure 23. Analyse ISSR-PCR de Platypus cylindrus: Consensus dendrogramme avec les amorces (GTG)3, (GGA)7, (AG)8YT et (TG)8RT effectuée dans NTSYSpc2 utilisant le 80 coefficient de corrélation de DICE et UPGMA.

Figure 24. Sites d‟échantillonnage pour l‟étude de la mycétophagie de Platypus cylindrus 87 dans la région du Nord Ouest de la Tunisie.

Figure 25. Isolement des mycangia de Platypus cylindrus (Photos personnelles, 2011). 88

Figure 26. Collecte des galeries de Platypus cylindrus. 1. Tronçons infestés par l‟insecte. 2. Rondelles de 5 cm. Galeries transversales de P. cylindrus. 4. Morceaux de bois 88 contenant les galeries (Photos personnelles, 2011).

Figure 27. Conidies et conidiophores de quelques champignons isolés à partir du 90 mycangia et des galeries de Platypus cylindrus.

Figure 28. Pourcentage des genres de champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses 92 galeries pendant l‟année 2010.

Figure 29. Répartition des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries 93 pendant l‟année 2010 dans les trois forêts de chêne-liège étudiées.

Figure 30. Distribution des champignons isolés à partir de Platypus cylindrus et de ses 95 galeries sur les sept sites étudiés pendant l‟année 2011.

Figure 31. Diversité des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries dans 96 chaque site.

Figure 32. Fréquences des champignons associés à Platypus cylindrus et à ses galeries isolés de sept forêts de chêne-liège en Tunisie en 2011. Les lettres à coté des 97 histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 33: Fréquence des champignons associés à Platypus cylindrus et à ses galeries, en éliminant le genre Penicillium. Les lettres à coté des histogrammes représentent les 98 groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les champignons suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 34. Répartition des champignons Ophiostomatales sur les sites étudiés. 99

Figure 35. Diversité des champignons isolés à partir de Platypus cylindrus (A) et de ses 100 galeries (B) dans l‟ensemble des forêts étudiées.

Figure 36. Répartition des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries dans sept forêts de chêne-liège en Tunisie en 2011. Les lettres sur les histogrammes 101 représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes ayant la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 37. Champignons isolés à partir des galeries de P. cylindrus en Tunisie. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc 102 LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 38. Fréquence de présence des champignons isolés à partir des adultes et larves de Platypus cylindrus. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes 103 homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 39. Les champignons isolés à partir de Platypus cylindrus. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les 104 histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

Figure 40. Fréquence des champignons Ophiostomatales isolés à partir de Platypus 105 cylindrus des différents sites étudiés.

Figure 41. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité répétée de l'ADN ribosomique chez les champignons. Les flèches représentent les sites de fixation 116 des amorces les plus utilisées (Tedersoo et al., 2007).

Figure 42. Représentation schématique du gène de la tubuline. Les flèches représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées (Glass et Donaldson, 1995; O‟Donnell 117 et Cigelnik, 1997).

Figure 43. Représentation schématique du gène du facteur d‟élongation. Les flèches 118 représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées (Rehner, 2001).

Figure 44. Plants de chêne-liège dans la pépinière de l‟INRGREF (Photo personnelle, 123 2013).

Figure 45. Schéma d‟inoculation des plants de chêne-liège par les champignons. 124

Figure 46. Disques de 3 mm du mycélium de Raffaelea. 124

Figure 47. Aspects culturaux représentants les différents isolats d‟Ophiostomatales isolés 126 à partir de Platypus cylindrus.

Figure 48. Conidies et conidiophores des Ophiostomatales isolés à partir de Playpus cylindrus et de leurs galeries: A) Ophiostoma sp1 (x400), B) Ophiostoma sp2 (x200), C) 128 Ophiostoma sp1 (x400), D) Raffaelea sp2 (x400), E) Raffaelea sp3 (x400).

Figure 49. Structures de l‟isolat Ophiostoma sp 2: 1, 2. Corémies (synnema) du champignon sur milieu de culture; Conidiophores illustrant la structure anamorphique 128 bien adaptée au transport par les insectes (x5); 3. Périthèce (x6, 5).

Figure 50. Arbre phylogénétique basé sur 20 séquences nucléotidiques de l‟ADNr (5.8S- ITS2-28S) d‟Ophiostomatales isolés à partir de Platypus cylindrus sur les peuplements de chêne-liège en Tunisie construit par la méthode du maximum de vraisemblance (ML) basé sur le modèle Tamura à 3 paramètres (Tamura et Nei, 1993) et supporté par 1000 130 réplicats de bootstraps. Il y avait un total de 247 locations dans l'ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été menées avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Figure 51. Arbre phylogénétique d‟Ophiostomatales isolés de Platypus cylindrus sur les peuplements de chêne-liège en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance (ML) basée sur le modèle Tamura 3- paramètres. L'analyse a consisté en 27 séquences de 132 nucléotides codant pour le gène de la protéine ß-tubuline. Il y avait un total de 213 postes dans l'ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été menées à l‟aide du logiciel MEGA v.6.0.

Figure 52 : Répartition des champignons Ophiostomatales dans les forêts étudiées. 133

Figure 53. Effet de l‟inoculation de jeunes plants de chêne-liège par le champignon Raffaelea montetyi : 1. Témoin, 2. Jaunissement des feuilles, 3. Dessèchement des feuilles 135 et de la tige.

vii

Liste des Tableaux

Tableau 1. Les principaux ravageurs de chêne-liège en Tunisie. 19

Tableau 2. Les paramètres observés pour les sites et les arbres échantillonnés des 43 différentes forêts.

Tableau 3. Caractéristiques écologiques des différentes forêts étudiées de chêne-liège 44 en 2011.

Tableau 4. Principaux paramètres dendrométriques des parcelles d‟étude. 49

Tableau 5. Principaux paramètres phytosanitaires du feuillage et du tronc des arbres de 51 chêne-liège des forêts étudiées.

Tableau 6. Modèle linéaire généralisé expliquant le pourcentage d‟attaque et la densité 56 moyenne des trous de Platypus cylindrus en fonction des paramètres des sites.

Tableau 7. Modèle linéaire généralisé (GLM) expliquant la présence/absence de Platypus cylindrus et le nombre moyen de trous d‟attaque de l‟insecte en fonction des 57 variables étudiés sur les arbres.

Tableau 8. Résultats de l‟émergence des insectes xylophages dans la station El Jouza. 58

Tableau 9. Classification des insectes collectés des tronçons de chêne-liège au 51 laboratoire.

Tableau 10. Localisation et paramètres des sites échantillonnés au Portugal et en 72 Tunisie.

Tableau 11. Caractéristiques culturales des champignons identifiés. 91

Tableau 12. Champignons isolés à partir de l‟insecte et des galeries. 92

Tableau 13. Les séquences de champignons puisées de la banque des gènes (Genbank) 121 des champignons inclus dans le travail.

Tableau 14. Les espèces de champignons utilisées pour le test de pathogénie et leurs 123 codes.

Tableau 15. Description macroscopique des différents isolats de l‟ordre des 127 Ophiostomatales.

Tableau 16. Nombre de jours avant le dépérissement ou la mortalité des plants 134 inoculés : n. nombre de plants total, N. nombre de plants présentant des symptômes.

viii

Introduction générale

Le chêne-liège (Quercus suber) est une espèce végétale à feuilles persistantes appartenant à la famille des Fagacées. Elle présente une très longue longévité, jusqu‟à 200 ans et plus. L‟arbre de chêne-liège peut survivre dans des conditions difficiles qu‟elles soient d‟origine humaine ou naturelle (coupe, pâturage, sécheresses prolongées et feux de forêts) mais il ne supporte pas les froids extrêmes. Son écorce externe est caractérisée par des cellules subérisées qui forment une couche compacte, élastique, imperméable et isolante thermiquement, pouvant atteindre jusqu‟à 30 cm d‟épaisseur (Natividade, 1950; Nsibi et al., 2006). C‟est aussi l‟unique espèce végétale capable de renouveler la production de liège (Gil et Varela, 2009).

Les forêts de chêne-liège représentent une composante caractéristique de l‟écosystème méditerranéen. Elles se trouvent dans les zones les plus chaudes des aires biogéographiques humide et subhumide et couvrent la région de la Méditerranée occidentale notamment au Portugal et en Espagne mais, également, au Maroc et au nord de l'Algérie et de la Tunisie. En outre, elles couvrent des zones plus restreintes au sud de la France et sur la côte ouest de l'Italie, y compris la Sicile et la Sardaigne (Pereira et al., 2008). Les subéraies couvrent presque 1,5 millions d‟hectares en Europe et pratiquement 700 000 hectares en Afrique du Nord (Anonyme 9, 2013).

En Tunisie, les forêts de chêne-liège (subéraies) se trouvent dans la région du Kroumirie- Mogods (Nord-Ouest) et couvre environ 70 113 ha (Anonyme 7, 2012). Elles ont une grande importance écologique, socio-économique et culturelle et offrent de nombreuses possibilités de développer des activités de loisirs en milieu rural (écotourisme).

Outre l‟exploitation de son écorce, le chêne-liège joue un rôle écologique important, depuis la dépollution de l‟environnement par l‟absorption de l‟anhydride carbonique et la production d‟oxygène jusqu'à l‟amélioration et la conservation du sol (Pereira et al., 2009; Bugalho et al., 2011, Zribi et al., 2015).

Malgré le fort impact des interventions humaines dans cet écosystème emblématique, les subéraies restent un important réservoir génétique et sont très riches en biodiversité: environs 700 espèces végétales ainsi qu'une faune comprenant environ 70 espèces d'oiseaux et 25

espèces de mammifères (Damergi, 2011) assure leurs protections grâce au fonctionnement des processus écologiques forestiers.

La population du nord-ouest tunisien (aire de chêne-liège) est estimée à 300 000 personnes et sa densité est parmi les plus élevées du pays: 100 habitants au Km² et parfois plus (Ben M‟hamed et al., 2002), ce qui constitue une pression anthropique très importante sur les ressources forestières.

Les subéraies offrent un large éventail de biens et de services avec la production de bois de bonne qualité calorifique, ainsi que les glands et le fourrage qui sont très appréciés par les animaux domestiques et sauvages (Nsibi et al., 2006). En outre, elles présentent d'autres opportunités de sources de revenus et contribuent au développement de l‟économie locale des zones forestières, grâce à la cueillette des champignons comestibles et la production de miel (Nsibi et al., 2006) et la production de produits forestiers non ligneux dont les souches de bruyères (Erica arborea) pour la production de pipes, le myrte (Myrtus communis) et le lentisque pour la production des huiles essentielles à effets aromatique et médicinales (Ben Jamâa et Nouiui, 2008; Damergi, 2011; Mezni, 2015).

Mais c‟est l‟écorce produite par le chêne‐liège qui constitue la production principale de cet arbre. En effet, le liège est utilisé comme matière première pour la fabrication des bouchons et des agglomérés et contribue entre 40 et 60% des recettes forestières nationales (Nsibi et al., 2006; Daly et Leforts, 2010). Au cours des dernières décennies, la production de liège a régressé de façon remarquable à cause, essentiellement, d‟une réduction de la superficie de la subéraie de 47,5% en l‟espace de 50 ans (Abid et Selmi, 1998), due à la pression humaine, aux incendies, aux attaques d‟insectes et de champignons et au dépérissement (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996). D‟autre part, les modes de gestion inappropriés et la surexploitation de la subéraie sont en grande partie la cause d‟une telle dégradation, sans oublier l‟action de plus en plus inquiétante du changement climatique (Ennajeh, 2010).

Les plus anciens dégâts attribués au dépérissement dans la subéraie tunisienne ont été signalés en 1967, mais sans précision quant à leur nature (Delatour, 1969). Depuis 1988, de nouveaux cas ont été notés sur l‟ensemble des peuplements; ils se caractérisent, le plus souvent, par un dessèchement complet ou partiel de plusieurs arbres (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996).

Bien qu‟en Tunisie ce phénomène ne soit pas aussi inquiétant tel qu‟au Maroc et au Portugal (Bakry et Abourouh, 1995, 1996; Barros et al., 2002), il risque de devenir plus important dans les années à venir.

En Tunisie, si l‟on se base sur l‟état phytosanitaire du feuillage, on peut dire que les subéraies tunisiennes se comportent bien. Toutefois, une observation plus fine au niveau des branches et du tronc montre la présence de dégâts très inquiétants, pouvant affecter l‟avenir des arbres et principalement la production du liège en quantité comme en qualité (Ben Jamâa et al., 2005, 2010). Parmi les dégâts observés, les symptômes de présence du platype (Platypus cylindrus) ont été notés et ont fait l‟objet de quelques études préliminaires entre 2004 et 2005 (Ben Jamâa et al., 2010), mais d'autres investigations sont aujourd'hui nécessaires pour estimer l'importance de cet insecte dans les subéraies tunisiennes.

Le platype est un insecte xylomycétophage qui est capable d‟établir des relations symbiotiques avec des champignons dit „ambrosia‟ qu‟il les transporte et qui sont nécessaires pour la nourriture des adultes et des larves (Batra, 1967). C‟est grâce à des organes spécialisés, appelés, „mycangia‟ que P. cylindrus transporte et conserve les champignons ambrosia (Batra, 1963). Les attaques de l‟insecte se manifestent par la construction de galeries à l‟intérieur du bois et la dissémination des champignons (Balachowsky, 1949).

P. cylindrus est décrit au Portugal et au Maroc comme le ravageur le plus redoutable du chêne-liège et est directement lié au dépérissement généralisé et à la mort des arbres (Ferreira et Ferreira, 1989; Sousa et Debouzie, 1993; Sousa et Inàcio, 2005). Cet insecte est également présent dans d'autres pays mais se comporte comme un ravageur secondaire attaquant des arbres préalablement affaiblis, cas de l‟Algérie (Bouhraoua et Villemant, 2005 ; Belhoucine et Bouhraouia, 2012), de l‟Espagne (Espagnole, 1964, Soria et al., 1994), de la France (Balachowsky, 1949; Durand et al., 2004) et de l‟Italie (Cecconi, 1924). Pour la Tunisie, le comportement de l'insecte semble être similaire à ces derniers pays (Ben Jamâa et al., 2007; Ben Jamâa et al., 2010).

En se basant sur la coévolution qui peut exister entre l‟insecte forestier et son arbre hôte (Vité et Gara, 1962) et entre l‟insecte et les champignons qu‟il transporte (Beaver, 1989), que découle la problématique du présent travail. Cette coévolution peut induire le changement de comportement d‟un ravageur secondaire vis à vis de la santé des peuplements forestiers, ainsi qu‟entre l‟insecte et les champignons qu‟il transporte (Beaver, 1989).

L‟objectif principal de la thèse est de comprendre la relation entre le chêne-liège, le platype et les champignons qui leur sont associés. Il vise une meilleure compréhension du comportement de P. cylindrus dans les subéraies tunisiennes en évaluant le niveau d‟infestation en relation avec les facteurs sylvicoles et écologiques du milieu. En étudiant les champignons associés à l‟insecte, il serait possible d‟établir une relation tri-trophique intéressante qui pourrait expliquer la contribution de la présence de l‟insecte dans le déclin du chêne-liège en Tunisie. Les observations ne peuvent êtres judicieuses que si le contexte méditerranéen de l‟étude est pris en compte.

Cette recherche est une première en Tunisie et est organisée en cinq chapitres, en plus d'une introduction générale et d'une conclusion générale :

 Un premier chapitre est une synthèse bibliographique qui survole des connaissances préalablement connues sur les forêts de chêne-liège, l‟insecte et les champignons qui leur sont associés.  Un deuxième chapitre s‟intéresse à l‟étude de P. cylindrus en relation avec le chêne- liège. Cette partie présentera les résultats des prospections effectuées pendant les années 2010 et 2011 dans un total de 22 forêts du Nord Ouest de la Tunisie et dont l‟objectif était d‟apporter des connaissances sur la relation de l‟insecte dans les subéraies tunisiennes et son degré d‟infestation.  Un troisième chapitre est consacré à des études comparatives génétique et morphologique de l‟insecte entre la Tunisie et le Portugal, où P. cylindrus est étroitement lié au dépérissement et à la mortalité du chêne-liège. L‟objectif est d‟essayer d‟expliquer la différence d‟agressivité entre les deux pays étant donné qu‟en Tunisie, P. cylindrus est considéré comme ravageur secondaire.  Un quatrième chapitre présentera un inventaire du cortège de champignons isolés à partir de l‟insecte et du bois des différentes forêts prospectées.  Un cinquième chapitre s‟intéresse particulièrement aux champignons „ambrosia‟ de l‟ordre des Ophiostomatales par une identification spécifique (moléculaire) et une estimation de leur pathogénie.

Chapitre 1: Synthèse bibliographique

1.1. Le chêne-liège

1.1.1. Présentation

Le chêne-liège (Quercus suber) est une espèce végétale à feuilles persistantes appartenant à la famille des Fagacées, sous-famille des Quercoïdées (Nsibi, 2005). Le chêne-liège peut vivre entre 150 et 200 ans, voire 500 ans. C‟est un arbre généralement de taille moyenne, pouvant atteindre 7 à 10 m de hauteur lorsqu‟il est en peuplement, comme il peut atteindre jusqu‟à 20 à 25 m à l‟état isolé. Cette espèce se caractérise par un port trapu, un tronc court et flexueux et un houppier peu dense, montrant quelques grosses branches (Gil et Varela, 2009). L‟arbre de chêne-liège se caractérise par (i) un système racinaire bien développé en profondeur des nappes aquifères utile pendant les périodes de sécheresse, et en surface pour assurer un approvisionnement suffisant en nutriments; (ii) une durée de vie des feuilles qui permet le maintien de la photosynthèse depuis le début de la période de croissance jusqu'au renouvellement complet de la canopée; (iii) une longue période de floraison permettant des productions annuelle et biannuelle des glands; (iv) des diversités morphologique et phénotypique et la formation de couche de liège de protection sur l'écorce extérieure qui confère une résistance considérable au feu. Ces caractéristiques contribuent au succès écologique du chêne-liège et lui confèrent sa notoriété et son importance économique en tant que producteur de liège (Pereira, 2007).

Les feuilles sont de forme ovale, plus ou moins dentées, de couleur vert foncé sur la face supérieure et vert clair sur la face inférieure, qui est légèrement pubescentes. Elles se renouvellent tous les 3 à 4 ans (Nsibi et al., 2006). Les fleurs, de couleur jaunâtre, s'épanouissent vers avril-mai. Les fleurs mâles sont regroupées en grappes ou « châtons » et les fleurs femelles sont minuscules et poussent à la base des feuilles. Les fruits sont des glands oblongs, enveloppés sur la moitié de leur longueur par des cupules à écailles inégales. Ces glands sont réunis par deux, sur des pédoncules courts et renflés (Nsibi, 2005).

1.1.2. Importance du chêne-liège

Les forêts de chênes-liège (subéraies) représentent une composante caractéristique de l‟écosystème méditerranéen qui est particulièrement riche en espèces animales et végétales, constituant un hotspot de biodiversité (Pereira et al., 2008). Selon le Fonds Mondial de la Nature, ces paysages soutiennent l'un des plus hauts niveaux de biodiversité parmi les habitats forestiers, y compris les espèces mondialement menacées comme le lynx ibérique, l'aigle impérial ibérique et le cerf de Barbarie (Anonyme 4, 2006). 6

En Tunisie, la subéraie constitue un important réservoir génétique abritant une riche biodiversité comportant près de 700 espèces végétales ainsi qu'une faune comprenant environ 70 espèces d'oiseaux et 25 espèces de mammifères (Damergi, 2011).

Le chêne-liège se caractérise par la présence d‟une écorce externe formée par des cellules mortes subérisées qui constituent une couche compacte, élastique, imperméable et thermiquement isolante pouvant atteindre jusqu‟à 30 cm d‟épaisseur (Natividade, 1950; Pereira, 2007). Ce tissu qui est « le liège » est un produit incombustible et très résistant à la friction (Santos et al., 2009).

L‟opération de « démasclage » ou levée de liège, se fait dès que le tronc atteint 70 cm de circonférence (liège mâle). Le chêne-liège produit un nouvel anneau en liège chaque année. Cette fonction a évolué comme une adaptation aux feux périodiques très fréquents dans la région méditerranéenne (Pausas, 1997). Les arbres survivent et produisent de nouvelles couches de liège lorsque l‟écorce d‟origine est enlevée. La première récolte de liège est effectuée lorsque l‟arbre atteint approximativement 30 ans. Les récoltes sont réalisées à intervalle régulier tous les 9 à 15 ans ce qui est une période suffisante pour permettre aux arbres de développer une nouvelle couche de liège d‟environ 3 cm d‟épaisseur « liège femelle » ou « de reproduction » (Anonyme 9, 2013).

En produisant plus de 50% de la production mondiale de liège, le Portugal est le principal producteur de liège devant l‟Espagne, l‟Italie, l‟Algérie, le Maroc, la Tunisie et la France. L‟Algérie, le Maroc et la Tunisie contribuent ensemble avec environ 14% de cette production mondiale de liège (Anonyme 6, 2010). Le marché du bouchon de liège est considéré comme la colonne vertébrale de l‟industrie du liège avec environ 70% de la valeur économique totale de la filière liège (Anonyme 1, 1999).

Grace à ses propriétés, le liège est utilisé dans de nombreux secteurs, principalement en agro- alimentaire et plus particulièrement en œnologie dans le bouchonnage des bouteilles d‟une multitude de produits alimentaires liquides surtout ceux d‟origine viticole (Pereira, 2007). A titre d‟exemple, 42% de la production annuelle de liège au Portugal est utilisée pour la fabrication de bouchons naturels (Anonyme 10, 2013).

Les autres usages comprennent les revêtements des murs et des sols (e.g. le sol de la Sagrada Familia à Barcelone), les matériaux d‟isolation thermique et/ou phonique (e.g. les réservoirs extérieurs de la navette spatiale de la NASA), les vêtements, les produits pour l‟industrie des chaussures (semelles), les produits pour les industries chimique et pharmaceutique, les 7

accessoires et autres articles décoratifs (Pereira et al., 2009). Globalement, le liège est le sixième produit forestier non ligneux le plus utilisé dans le monde. La valeur totale estimée des exportations mondiales de liège s‟élevait à 1.305.9 millions d‟euros en 2013 (Anonyme 9, 2013).

Outre l‟exploitation de son écorce, le chêne-liège joue un rôle écologique important. Grâce à la litière abondante, les forêts ralentissent la dispersion de l'eau et favorisent une infiltration lente mais complète de l'eau de pluie protégeant ainsi les ressources en eaux. En outre, le couvert forestier ralentit les ruissellements de l'eau et limite l'érosion et les risques d'avalanche protégeant ainsi le sol. En contrôlant la vitesse du vent et les flux d'air, la forêt a une incidence sur la circulation locale de l'air et peut ainsi retenir les suspensions solides et les éléments gazeux; elle peut également filtrer les masses d'air et piéger les polluants. Egalement, elle contribue à l‟atténuation du changement climatique au niveau local en limitant l‟évaporation des sols et en influençant le cycle de l‟eau (Gottle et Sène, 1997).

Ainsi, la forêt de chêne-liège a une grande importance économique et culturelle. Façonnée par les activités humaines au cours des millénaires, elle coexiste avec l‟agriculture et de multiples autres activités traditionnelles. Elle intègre la plupart des systèmes agro-forestiers multifonctionnels (Pereira, 2007) et fournit un large éventail de biens et de services avec la production de liège, de bois de feu, de fourrage et pâturage du bétail, d‟herbes aromatiques, de champignons, de miel et offre de nombreuses possibilités de développer des activités de loisir en milieu rural (écotourisme) (Anonyme 8, 2012).

En Tunisie, la forêt de chêne-liège joue un rôle économique et social important. Le liège constitue la production principale et représente un produit à forte valeur ajoutée (Ben Jamâa et Nouiui, 2008). En effet la collecte du liège procure près de 180 000 journées de travail et la transformation de ce produit garantit 500 emplois permanents (Nsibi et al., 2006). Pendant les dix dernières années, la quantité moyenne annuelle de liège produite est de l‟ordre de 6 663 tonnes procurant une recette moyenne de 5 878 000 dinars et la recette de l‟année 2014 étant de l‟ordre de 8 milliards de dinars (Anonyme 11, 2015). En outre, la subéraie tunisienne fournit des unités fourragères appréciables (tapis herbacé et glands) (Nsibi et al., 2006).

La subéraie tunisienne offre d'autres opportunités de sources de revenus grâce à la production du bois (50 000 m3/an) et aux produits non ligneux dont les souches de bruyères (Erica arborea) (700-800 tonnes /an) pour la production des pipes, le myrte (Myrtus communis) (80

milles tonnes/an) pour la production de l‟huile essentielle à effets aromatiques et médicinales (Ben Jamâa et Nouiui, 2008; Damergi, 2011).

1.1.3. Biogéographie du chêne-liège

Le chêne-liège est une espèce typique de la région de la Méditerranée occidentale, qui se produit spontanément au Portugal et en Espagne mais, également, au Maroc, dans le nord de l'Algérie et de la Tunisie. En outre, il se trouve dans des zones plus restreintes dans le sud de la France et sur la côte ouest de l'Italie, y compris la Sicile et la Sardaigne (Pereira et al., 2008) (Figure 1).

Aujourd‟hui, le chêne-liège ne se trouve que dans les zones les plus chaudes de l‟aire biogéographique humide et subhumide de l‟Ouest de la Méditerranée (Figure 1) où il occupe une superficie d‟environ 1,5 millions d‟hectares en Europe et 700 milles hectares en Afrique du Nord (Mendes et Graça, 2009; Bugalho et al., 2011).

Figure 1. Aire de répartition naturelle du chêne-liège (Anonyme 5, 2009).

Le chêne-liège a été introduit au vingtième siècle dans certains pays en dehors de son aire de répartition naturelle comme une plante ornementale ou avec l‟objectif de produire du liège (Anonyme 9, 2013).

En Tunisie, le chêne-liège est l‟espèce forestière feuillue autochtone la plus représentée sur le territoire tunisien. La subéraie tunisienne, ayant une étendue relativement faible couvrant environ 70 113 ha (Anonyme 7, 2012) se trouve dans la région du Kroumirie-Mogods (Nord- Ouest) faisant partie des gouvernorats de Jendouba, Béjà et Bizerte. La région de Kroumirie- Mogods est constituée par une bande étroite qui occupe presque toute la partie septentrionale et qui est délimitée au Nord par la Méditerranée et au Sud par une ligne partant de la frontière algérienne au niveau du Bec de Canard jusqu‟à Bizerte (Figure 2). Egalement, cette région du pays renferme 70% des espaces forestiers du pays et certainement plus de 80% des ressources forestières. Leur population pèse d‟un poids considérable sur les forêts mais aussi sur l‟ensemble des équilibres écologiques du pays dans la mesure où cette partie du pays constitue le château d‟eau de la Tunisie. Les principaux cours d‟eau ont leurs bassins-versants dans cette région (Ben Jamâa et al., 2006).

Des groupements isolées se retrouvent au Cap Bon (Djebel Abderrahman) et se disséminent dans la dorsale tunisienne jusqu‟à Jebel Serj qui est la station la plus méridionale Les subéraies sont, généralement, des mosaïques de plusieurs types d'habitats forestiers avec dans le même territoire du maquis, des pâturages et des zones d'agriculture extensive (Selmi, 2006).

Légende : Gouvernorat Forêts de chêne-liège

Figure 2. Aire de répartition du chêne-liège en Tunisie (Anonyme 3, 2006).

1.1.4. Exigences écologiques

Les arbres de chêne-liège montrent une plasticité écologique élevée, se produisant dans un large éventail de conditions environnementales (Pausas et al., 2009). Cette espèce est bien adaptée au climat de type méditerranéen, avec des hivers doux et humides et des étés chauds et secs, se produisant à partir de régions plus continentales vers les zones côtières avec la Méditerranée et de l'influence de l'Atlantique. Le chêne-liège pousse bien avec des précipitations annuelles de 600-1000 mm moyenn. Une pluviométrie moyenne minimale de 500 mm est considéré comme nécessaire au développement équilibré de l'arbre (Natividade, 1950; Pereira, 2007). La température moyenne annuelle est optimale dans la gamme 13-16 ºC, bien que les espèces peuvent également se produire dans des environnements avec un maximum de 19ºC. En général, les températures de -5°C et 40°C peuvent être considérées comme les limites à la croissance du chêne-liège (Pereira, 2007). Le chêne-liège pousse dans des altitudes variant de 0 à 2000 m d'altitude, avec une croissance optimale se produit en dessous de 600 m. L'espèce est tolérante à une variété de sols, à l'exception des substrats calcaires. Elle peut pousser sur des sols pauvres et peu profonds, avec une faible teneur en azote et en matière organique et une gamme de pH variant entre 4,8 et 7,0. Toutefois, le

chêne-liège se produit préférentiellement dans les sols siliceux et sablonneux, préférant les sols profonds bien aérés et drainés, étant très sensible à la rétention de l'eau (Pereira, 2007; Catry et al., 2012). En Tunisie, les sols de la subéraie sont des sols lessivés, acides, parfois à gleys en raison de l‟abondance des précipitations et de la prédominance du substrat gréseux (Ben M‟hamed et al., 2002).

En Tunisie, la région forestière des subéraies par excellence se caractérise par un relief souvent accidenté et des altitudes variables passant de 1 203 m (Jebel Ghorra à la frontière avec l‟Algérie) à 400 m dans la partie Est. Les pluies sont abondantes, en moyenne 800 mm (1500 mm à Aïn Drahem). Si les pluies sont abondantes, la période estivale est sèche et longue et les arbres souffrent énormément. La température moyenne annuelle décroît avec l‟altitude, 18°C à Tabarka sur la côte et 15°C à Aïn Draham à 720 m d‟altitude. Les températures maximales absolues de 47°C à Tabarka, 43°C à Aïn Draham et 49°C à El Feija sont toutes enregistrées au cours du mois d‟août. Cette zone est caractérisée par une sécheresse estivale très forte (plus longue pour la partie côtière) contrastant avec une pluviométrie hivernale très importante. Cette sécheresse estivale est encore plus accusée au niveau du sol et s‟étale sur une période encore plus longue. Les étages bioclimatiques de cette zone sont l‟humide et le sub-humide (Selmi, 2006).

1.1.5. Contraintes et menaces

Le surpâturage (qui limite la régénération), la dégradation et l‟abandon des zones rurales, le remplacement du chêne-liège par des plantations d‟eucalyptus et de pins, l‟expansion du labour réalisé avec des charrues dans les terres boisées et diverses autres évolutions observées dans les territoires méditerranéens ont contribué à faire diminuer les superficies des subéraies (Anonyme 9, 2013).

Les menaces sur la subéraie s‟aggravent avec le changement climatique. Dans la région méditerranéenne, depuis les années 1970 la fréquence des sécheresses a augmenté de manière significative, et un processus d'aridification semble être en cours dans un contexte généralisé du réchauffement climatique (Pereira et al., 2009). Les scénarios de changement climatique suggèrent une aggravation des conditions environnementales de chêne-liège en Méditerranée, notamment à travers l'augmentation des températures et la diminution des précipitations (Pausas, 2004; Giannakopoulos et al., 2009; Pereira et al., 2009). Généralement, ces facteurs sont susceptibles d'augmenter la sévérité du stress hydrique des plantes et le taux de pertes d'éléments nutritifs dans le sol (Pereira et al., 2009). Des sécheresses plus fréquentes peuvent 12

affecter négativement les écosystèmes de chênes-lièges dans le futur, en altérant la santé des arbres et en augmentant les conditions favorisant la propagation de certains ravageurs et maladies. Le changement climatique peut aussi affecter les régimes de feu actuels dans de nombreuses régions, y compris la Méditerranée, en prolongeant la saison des incendies et en augmentant leurs danger (Pausas, 2004; Westerling et al., 2006, Flannigan et al., 2009; Catry et al., 2012).

Ces effets auront un impact direct négatif sur les ressources en eau, la conservation de la biodiversité et les moyens d'existence des communautés dépendantes de l'écosystème des forêts de chêne, ce qui pourrait à son tour conduire à des déplacements économiques et des migrations (Damergi, 2011).

Les attaques d'insectes et de champignons contribuent, pour une part importante, au dépérissement de ces forêts (Ben Jamâa et al., 2005). L‟importance des dommages occasionnés par de tels agents biotiques peut être liée à de nombreux facteurs tels que l‟effet du changement climatique et la mauvaise exploitation de l‟arbre lors de la levée du liège (Ben Jamâa, 2014).

1.2. Situation phytosanitaire du chêne-liège

Les forêts de chêne-liège sont très particulières car il s‟agit d‟un écosystème complexe et délicatement équilibré qui existe naturellement dans le bassin méditerranéen. L'espèce a une grande valeur pour son importance économique, sociale et écologique. Cependant, la mortalité dans les peuplements de chênes-lièges a été enregistrée dès la fin du XIXe et au XXe siècles (Natividade, 1950). En effet, au cours des trois dernières décennies une perte globale et continue de la vigueur a été enregistrée dans toute sa gamme dans le bassin méditerranéen. La diminution de la densité des peuplements, le manque de régénération et la diminution de la qualité du liège produit sont les principales causes de préoccupation. La sécheresse et les températures élevées, l'appauvrissement de la fertilité des sols due aux pratiques agricoles, ainsi que les ravageurs et les maladies sont impliqués dans le déclin du chêne-liège (Cabral et al., 1993; Sousa et al., 1995; Costa et al., 2010).

Le patrimoine subéricole tunisien a souffert de l‟action négative de nombreux facteurs biotiques et abiotiques qui ont rendu cet écosystème très fragile et sa régénération naturelle très aléatoire, entraînant une régression graduelle des surfaces de subéraie. Selon Débierre (1922) la subéraie tunisienne occupait 140 000 ha, alors qu‟en 2003, elle n‟occupe que 90 000 ha, ce qui montre une régression alarmante en l'espace de 81 ans (Nsibi et al., 2006). 13

1.2.1. Le dépérissement du chêne-liège

Le terme „dépérissement‟ est avant tout un terme de symptomatologie: il traduit « une altération durable de l'aspect extérieur des arbres (mortalité d'organes pérennes, réduction de la qualité et de la quantité de feuillage) et une réduction de leur croissance. La mort d'un certain nombre de sujets est observée mais l'issue n'est pas obligatoirement fatale même si la situation est préoccupante » (Delatour, 1990).

Le dépérissement du chêne-liège est un phénomène général et préoccupant, non seulement en Tunisie mais aussi dans la plupart des pays méditerranéens, comme le confirment les travaux du groupe de travail « Protection Intégrée des Forêts de Chênes » de L‟Organisation Internationale de Lutte Biologique et Intégrée (OILB), créé en 1993, qui tentent d‟évaluer l‟importance du dépérissement des forêts de chêne-liège et d‟éclaircir son étiologie dans l‟ensemble de l‟aire géographique (Luciano, 1995; Villemant, 1999; Villemant et Sousa, 2002; Villemant et Ben Jamâa, 2005; Villemant et al., 2010 ; Ruiu et Villemant, 2012; Villemant et Ruiu, 2014).

Bien qu‟en Tunisie le déclin du chêne-liège ne soit pas aussi alarmant que celui d‟autres subéraies comme celle de la Mamora au Maroc (Bakry et Abourouh, 1995, 1996) et celles des „Montato‟ au Portugal (Santos, 1995; Sousa et al., 1995; Costa et al., 2010), ce phénomène risque de s‟amplifier et devenir préoccupant dans les années à venir. En Tunisie, le pourcentage des subéraies touchées par le dépérissement varie de 8 à 10% selon les années et les localités (Aloui, 2002; Brinsi, 2004). Ce phénomène semble être lié au changement climatique. En effet pendant la sécheresse de 1988-1990, la situation est devenue inquiétante où plus de 60 000 arbres ont montré un dessèchement complet et sont morts dans la seule subéraie d‟Aïn Draham (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996).

Dans le même contexte, Kurz-Benson et al. (2006) ont confirmé que pendant les périodes de sécheresse le phénomène de dépérissement est plus présent et est accentué. Ainsi, il a été démontré que les attaques des insectes et l‟apparition de maladies sur le chêne-liège sont associées à ce phénomène de sécheresse (Sousa et Débouzie, 1993; Costa et al., 2002).

Le phénomène de dépérissement pourrait, également, être lié à un écorçage mal effectué (mauvaise technique, période mal choisie et fréquence d'extraction excessive) entraînant de grands dégâts au niveaux de la couche mère (Ben Jamâa et al., 2006) et par la suite une réduction de la capacité de défense de l‟arbre (Ben Jamâa et Piazzetta, 2010; Oliveira et Costa, 2012; Ben Jamâa, 2014), et créant ainsi des conditions favorables à l‟installation 14

d‟agents biotiques notamment les attaques des champignons et l‟installation des insectes défoliateurs et des xylophages (Franceschini et al., 2008; Ben Jamâa, 2014). Les principaux symptômes de dépérissement de chêne-liège peuvent être récapitulés comme suit : (i) diminution de la densité du fût qui devient plus ou moins transparente et ne présentant que les feuilles âgées d‟une année ; (ii) dessiccation prématurée des feuilles qui persiste sur l‟arbre même après sa mort ; (iii) dessèchement des feuilles ; (iv) apparition de taches de couleur foncée qui deviennent des nécroses et qui signalent la présence d‟insectes et de champignons sur le tronc et les branches ; (v) desséchement des parties terminales des branches (Cabral and Sardinha 1992; Franceschini et al., 1999; Ragazzi et al., 2002).

Ces symptômes peuvent être résumés en deux grands types de dépérissement : (i) un dépérissement progressif observé essentiellement sur les arbres âgés et de grande circonférence et qui se caractérise par une défoliation partielle, absence de nouvelles feuilles et mort des branches. (ii) un dépérissement brutal : il concerne les arbres de tout âge et peut entrainer la mort en très peu de temps entre 2 et 4 semaines suite au jaunissement soudain des premières feuilles (Franceschini et Luciano, 2009).

Ces deux types de phénomène de dépérissement sont souvent accompagnés par des attaques secondaires d‟insectes et de champignons (Pereira el al., 1999).

Le dépérissement du chêne-liège est un phénomène très complexe dû à l‟interaction de multiple facteurs biotiques et abiotiques (Cabral et Sardinha, 1992; Silva, 2002; Amandier, 2006; Sousa et al., 2007) qui interviennent de façon séquentielle ou simultanée (Sousa et Kadiri, 2005). Les principaux facteurs se regroupent en trois catégories selon Cabral et Sardinha (1992) et Sousa (1995) : (i) les facteurs de prédisposition qui agissent tout au long de la vie de l‟arbre et concernent la mauvaise gestion de la forêt, les pratiques inappropriées (Ruiu et al., 2005) ainsi que la perturbation de la structure du sol et de la fertilité; (ii) les facteurs d‟induction sont ceux qui conduisent au déclanchement du phénomène de dépérissement tels que le changement climatiques (sécheresse) (Brasier et Scott, 2008; Costa et al., 2010) et l‟écorçage excessif ; (iii) les facteurs d‟accélération qui sont essentiellement les incendies, les insectes (défoliateurs, xylophages et xylomycétophages) et les champignons pathogènes (Franceschini et al., 2008).

1.2.2. Maladies du chêne-liège

De nombreux champignons sont associés au chêne-liège à savoir des champignons pathogènes, saprotrophes et symbiotiques. Selon Sousa et al. (2007) les champignons 15

pathogènes peuvent être distingués comme des agents pathogènes primaires tels que Phytophthora cinnamomi et Botryosphaeria spp., ou comme agents pathogènes secondaires tels que Armillaria mellea, Biscogniauxia mediterranea, Coryneum modonium et Endothiella gyrosa.

En Tunisie, les premières observations de symptômes de champignons dans les subéraies tunisiennes ont été effectuées par de Delatour (1969) qui a signalé la présence de champignons en relation avec le dépérissement du chêne sans précision quant à leur nature. Par la suite, très peu de travaux portant sur l‟inventaire fongique associé au chêne-liège ont été réalisés. Les résultats de ces recherches ont montré la présence de nombreux champignons pathogènes à savoir Biscognauxia mediterranea, Botryosphaeria corticola, Cytospora sp., Discula quercina, Fusicoccum sp., Hypoxylon sp., Phomopsis sp. et Pleurophoma cava (Khouja et al., 2010; Linaldeddu et al., 2010).

Dans le bassin méditerranéen, B. mediterranea est associé au déclin du chêne-liège au Portugal (Santos, 2003; Sousa et al., 2007; Inácio et al., 2011b; Henriques et al., 2012), en Espagne (Jiménez et al., 2005; Serrano et al., 2012), en Italie (Franceschini et al., 2005), au Maroc (Assali et Falki, 2006), en Algérie (Khouja et al., 2010) et en Tunisie (Linaldeddu et al., 2010).

Une étude plus récente menée par Linaldeddu et al. (2013) a confirmé la présence de Diplodia (Botryosphaeria) corticola sur chêne-liège en Tunisie. Ce champignon représente un des agents pathogènes primaires provoquant la mortalité des arbres au Portugal (Bragança et al., 2013) ainsi qu‟en Espagne (Oliva et Molinas, 1986). L'implication de D. corticola sur le déclin des forêts de chêne-liège est également bien connu, provoquant des symptômes comme le dépérissement, le chancre et la nécrose vasculaire dans les arbres de chêne (Alves et al., 2004; Linaldeddu et al., 2009; Fernandes et al., 2014).

P. cinnamomi a été considéré comme le principal agent pathogène responsable de la mortalité du chêne-liège et du chêne vert au Portugal (Brasier et al., 1993; Moreira et al., 1999; Moreira et Martin, 2005) et en Sardaigne (Scanu et al., 2013). Cet agent pathogène transmis par le sol qui provoque des infections primaires dans le système de la racine, étant souvent souligné comme un facteur déterminant de la mort subite du chêne-liège (Brasier, 1992; Moreira, 2002; Tuset et al., 2002).

D‟autres champignons tels que Armillaria mellea (Bragança et al., 2004), Pythium spiculum et P. sterilum ont été recensés sur chêne-liège, en Espagne et au Portugal (Serrano et al., 16

2012), ainsi que de nombreux champignons Ophiostomatoides tels que Raffaelea spp. ont été rapportés en relation avec le déclin du chêne-liège au Portugal (Inácio et al., 2012b).

Malgré que ces champignons soient fréquemment associés au dépérissement et à la mortalité du chêne-liège, il existe une évidence que certains se comportent comme agents pathogènes secondaires par exemple B. mediterranea qui est recensé sur des arbres déjà attaqués soit par P. cinnamomi ou D. corticola, qui sont des pathogènes primaires (Branco et al., 2014).

1.2.3. Les insectes ravageurs du chêne-liège

Les attaques du chêne-liège par des insectes peuvent être liées aux changements écologiques de l‟écosystème associés aux symptômes de dépérissement. Diverses espèces d‟insectes s‟attaquent au chêne-liège. Cependant, les insectes défoliateurs sont ceux qui agissent directement par l‟affaiblissement de l‟arbre et facilitent l‟installation des insectes xylophages (Sousa, 1995).

Bien que de nombreux insectes peuvent agir comme des ravageurs primaires, s‟attaquant aux plantes vigoureuses en surmontant leurs défenses, d‟autres espèces colonisent des arbres déjà affaiblis dont les systèmes de défenses ont été déjà brisés par d‟autres agents biotiques et abiotiques (Sousa et al., 2011).

Les principaux ravageurs de chêne-liège en Tunisie, sont récapitulés dans le tableau 1.

 Insectes défoliateurs

Les arbres de chêne-liège sont vulnérables à la défoliation par les insectes pendant leur période de pullulation. L‟attaque peut se prolonger sur plusieurs milliers d'hectares et peut persister pendant deux ou plusieurs années successives (Branco et al., 2014).

Parmi les principales espèces potentiellement dangereuses pour le chêne-liège, la tordeuse verte du chêne Tortrix viridana et Lymantria dispar (Khous, 1993). Depuis 1925, année où L. dispar a été signalé pour la première fois en Tunisie (Debazac, 1952), quatre dégradations principales se sont succédées, chacune ayant un cycle moyen d‟environ 20 ans. En Kroumirie, la région d‟Ain Draham-Babouche a été le point de départ des pullulations de 1945, 1966 et 1986 (Ben Jamâa et al., 2001). La dernière infestation (1986) s‟est achevée en 1999, après un pic de pullulation en 1992. L‟année 2000 coïncide avec l‟entrée en latence du lépidoptère dans les subéraies tunisiennes et, actuellement L. dispar ne présente aucun danger dans les forêts tunisiennes, ce ci peut être expliqué par l‟augmentation des températures extrêmes qui ont dépassé les 45°C (Ben Jamâa et Piazzetta, 2010). Dans ces conditions climatiques 17

extrêmes, l‟émergence d‟espèces au cycle biologique plus précoce, telles que la tordeuse verte du chêne (T. viridana) ou l‟hibernie défeuillant (Erranis defoliaria) sont favorisées (Ben Jamâa et Piazzetta, 2010).

D‟autres défoliateurs polyphages peuvent attaquer le chêne-liège et ont été recensés en Tunisie à savoir Orgyia trigotephras (Ezzine et al., 2010), Anacampsis scintillella (Ezzine et al., 2015) et Erranis defoliaria (Mannai et al., 2015). L‟orgie a été signalée pour la première fois en Tunisie en 1955, et a été repérée au nord près du littoral dans la région du Cap Bon et de Bizerte (Chnéour, 1955; Ezzine et al., 2010) et dont les chenilles causent des dégâts considérables aussi bien sur le chêne-liège que sur le maquis, essentiellement le chêne kermès (Ezzine et al., 2010; Dahmouni et al., 2012 ). Ce ravageur est un compétiteur des autres lépidoptères phyllophages du chêne-liège et plus particulièrement de L. dispar (Fraval et al., 1989). Pendant l‟année 2013, A. scintillella a substitué l‟orgie sur le maquis de chêne-liège (Ezzine et al., 2014, 2015).

 Insectes xylophages

Les insectes xylophages peuvent être des facteurs d‟accélération du dépérissement du chêne- liège ce qui permet de les considérer comme des agents secondaires (Sousa, 1995). On distingue les xylophages primaires, capables de s‟attaquer à un arbre sain et vigoureux tel que Platypus cylindrus au Portugal (Sousa, 1995, Sousa et Débouzie, 2002), les xylophages secondaires qui sont attirés par des arbres dépérissants, préalablement attaqués par d‟autres parasites, ainsi que des saproxylophages qui se nourrissent de bois mort, antérieurement colonisé et dégradé par les organismes précédents (Bouget et al., 2007).

Coraebus untadus se nourrit presque exclusivement de chêne-liège et représente un énorme problème dans le bassin méditerranéen (Soria et Ocet, 1990). L'insecte ne tue pas les arbres, mais endommage les planches de liège en réduisant la qualité de liège (Lieutier, 2007). Les principaux insectes xylophages sur arbres de chêne-liège recensés en Tunisie sont le grand capricorne, Cerambyx cerdo, Cossus cossus et le platype Platypus cylindrus (Villemant et Fraval, 1991; Ben Jamâa et al., 2005).

Tableau 1. Les principaux ravageurs de chêne-liège en Tunisie (adapté de Villemant et Fraval, 1993).

Nom Ordre / Famille Symptômes de présence Facteurs favorables scientifique

Défoliateurs

Lymantria - Ponte couleur crème à blanc sur tronc - Extension du pâturage et de la pression Lepidoptera / Lymantriidae dispar - Défoliation humaine sur les forêts

- Feuilles enroulées avec des bandes de soie Tortrix - Cycle végétatif de l‟arbre coïncide avec Lepidoptera / Tortricidae - Destruction des bourgeons viridana l‟éclosion de l‟insecte - Défoliation

Xylophages

Cyrambyx Coleoptera/ Cerambycidae - Trous en bas du tronc et sciures abondantes - Arbres fortement dépérissants ou morts cerdo

- Feuilles brunâtres qui finissent par tomber Platypus - Arbres affaiblis et physiologiquement stressés Coleoptera / Curculionidae - Trous circulaires avec une sciure blanchâtre sur le cylindrus - Arbres nouvellement démasclés tronc

1.3. Platypus cylindrus agent de dépérissement du chêne-liège

1.3.1. Taxonomie et aire de répartition de Platypus cylindrus

L‟insecte xylomycétophage Platypus cylindrus Fabr. (= P. binaculatus Duff.) (Balachowsky, 1949) décrit pour la première fois en France en 1801 (Fabricus, 1801), est aujourd‟hui appelé « oak pinhole borer » en langue anglaise (Hichin, 1863), « platype » en français (Villemant et Faval, 1993) et « platipo » en portugais et en italien (Ferreira et Ferreira, 1991).

P. cylindrus appartient à l‟ordre des Coleoptera, à la famille des Curculionidae et à la sous- famille des Platypodinae (Bright, 2014), bien qu‟il fût classé antérieurement avec tous les autres platypes dans la famille des Scolytidae (Balachowsky, 1949).

La grande majorité des 1000 espèces du genre Platypus actuellement connues (Husson, 1995; Balachowsky et al., 1963; Shedl et al., 1972) vit dans les régions tropicales (Espagnole, 1964; Dajoz, 1980; Subramanian, 1983). Néanmoins, quatre d‟entre elles se répartissent dans les régions néoarctiques (P. wilsoni Sw, P. flavicornis Fabr., P. compositus Say et P. quadridentatus Oliv.) (Husson, 1955) tandis que seulement deux espèces parmi 550 du genre Platypus qui sont P. cylindrus et P. oxyurus vivent dans les Paléoarctiques (Balachowsky et al., 1963; Espagnole, 1964).

P. cylindrus vit principalement sur les chênes (Duffy, 1953), notamment Quercus sissiliflora, Q. robur, Q. suber, Q. ilex, Q., afares et Q. mirbecki (Cocconi, 1924 ; Balachowsky et al., 1963). Il a également été cité comme s‟attaquant aux châtaigniers et provoque le dépérissement même si l‟hôte est robuste et centenaire (Cebeci et Ayberk, 2010), aux hêtres, aux frênes, aux eucalyptus, aux ormes et aux cerisiers sauvages (Balachowsky, 1949; Husson, 1955; Graham, 1967; Ferreira et Ferreira, 1991; Gabral et Ferreira, 1999).

L‟aire de répartition de P. cylindrus s‟étend sur toute l‟Eurasie et la région méditerranéenne, y compris le Nord de l‟Afrique (Balachowsky et al., 1963). En Allemagne, l‟espèce a été décrite dès 1905 surtout au nord et sud de Pfatz (Strohmeyer, 1907). Par contre, en Angleterre, l‟espèce se trouve sur tout le territoire de Kent à New Forest, en Oxfordshire et dans la forêt de Den (Hickin, 1963) tandis qu‟en Italie elle est présente, essentiellement, en Sardaigne (Cecconi, 1924). En Espagne, c‟est dans la région de Catalogne que P. cylindrus est observé (Espagnole, 1964), alors qu‟en France, l‟insecte a été signalé surtout en Corse (Balachowsky, 1949) et au Portugal, c‟est au sud du pays, que l‟insecte a été identifié dès

l‟année 1870 par Heyden (1870). L‟insecte est également nuisible au Caucase, en Arménie et en Iran (Balachowsky et al., 1963).

En Afrique du Nord, P. cylindrus existe dans toutes les subéraies de l‟Algérie, du Maroc et de la Tunisie. Au Maroc, P. cylindrus a été signalé de Tanger à Debdour et en Haut Atlas (Kocher, 1961), à Chaouen, Larach et surtout au niveau de la Mâamoura (Villemant et Faval, 1991). En Algérie, l‟insecte a été cité pour la première fois par Lucas (1849) à l‟est et aux environs d‟El Colle puis par Chapuis en 1865 en Kabylie et à Alger en 1907 par Rudolf- Tredl. Dans les régions de Tlemcen, Oran, Mascara, l‟insecte a été associé aux dégâts économiquement importants (Bouhraoua et Villemant, 2005; Belhoucine et Bouhraoua, 2012) ainsi que dans la région de Béjaia (Chakali et al., 2002). En Tunisie, l‟insecte a été signalé en 1955 par Boudy (Boudy, 1955) et les premiers travaux menés sur P. cylindrus n‟ont commencé qu‟en 2004 en vue de caractériser son incidence dans la forêt de Bellif (Ben Jamâa et al., 2010).

1.3.2. Description de l’insecte

P. cylindrus est un insecte plus longiligne que les scolytes mesurant 5 à 7 mm de longueur et environ 1,5 mm de largeur (Balachowsky, 1949). Il est de couleur brun foncé. La tête est verticale et elle est aussi large que le corselet. Les yeux sont arrondis et les antennes courtes, sont terminées par une massue aplatie formée d‟un seul segment. Les pattes sont de même couleur. Les élytres sont ponctués par des stries longitudinales et portent des soies jaunâtres à son extrémité postérieure (Villemant et Faval, 1991).

Comme la plupart des Platypodinae, P. cylindrus présente un dimorphisme sexuel accusé, caractérisé par la présence de deux dents inégales développées sur l‟extrémité postérieure des élytres des mâles (Husson, 1955) (figure 3).

1 1

Figure 3. Platypus cylindrus. A gauche : femelle ; A droite mâle se caractérisant par la présence de deux denticules à l‟extrémité abdominale (photo personnelle, 2010).

Les œufs sont blancs, ovales et translucides, et sont déposés en groupes de trois à quatre à la fin des galeries. Les larves sont de petits « vers » gris sale ou blanchâtres glabres, à tête assez grosse, sans pattes. Les premiers stades ont un corps plat, des tubercules pleuraux équipés de soies solides qui jouent le rôle de fausses pattes pour leur permettre de se déplacer le long de la paroi du tunnel. Après la dernière mue, les larves ont des mandibules peu sclérifiées, adaptées pour se nourrir de champignons (Korolyov, 1989). Le quatrième stade larvaire a un corps plus épais que le diamètre de la galerie et est de forme cylindrique. Les mandibules de la larve du cinquième stade ont une arête en forme de ciseau, qui peut être une adaptation pour couper à travers le bois dur (figure 4).

Figure 4. Les œufs et les larves de Platypus cylindrus. a) les œufs dans la galerie; b) les œufs de P. cylindrus et une larve nouvellement éclose; c) premier stade larvaire avec tubercules pleurales; d) quatrième stade larvaire (Inácio, 2011).

Baker (1963) suggère que les particules de bois (plancher de bois) dans les parois de la galerie subissant la décomposition par les larves servent comme substrat supplémentaire pour la croissance des champignons. En conséquence, la plupart du bois libéré lors de la construction des galeries par les adultes est utilisée. Le reste du bois décomposé est évacué à l‟extérieur de la galerie. Les nymphes sont de couleur blanche, avec les appendices de l'imago (Ferreira et Ferreira, 1991; Sousa et Debouzie, 2002).

1.3.3. Biologie de Platypus cylindrus

L‟envol des adultes et la construction des galeries de P. cylindrus se produisent pendant les saisons chaudes. L‟émergence a lieu environ de mai à octobre au Portugal (Sousa, 1996; Sousa et Inácio, 2005), alors qu‟en Tunisie, l‟insecte n‟est actif qu‟au printemps et en été (Ben Jamâa et al., 2010). Au Maroc, c‟est de fin mai à début juin que les adultes émergent (Chadigan et al., 1991; Sousa et al., 2005). En Algérie, Bouhraoua (2003) a rapporté que l‟émergence s‟effectue entre mai et juillet. Cependant, en Angleterre, une sortie sporadique a été remarquée tout au long de l‟année (Baker, 1963; Tilbury, 2010). Ces auteurs pensent que seulement les émergeants du mois de juin jusqu‟à la fin du mois de septembre sont capables de survivre et de se reproduire avec succès. La dispersion et la durée de vie des insectes adultes sont directement influencées par une combinaison de facteurs environnementaux et populationnels (Sousa et Inácio, 2005).

Le mécanisme de sélection des arbres par l'insecte n'est pas complètement claire et obéit sans doute à des stimuli complexes visuels tels que la silhouette des arbres (Chararas, 1979; Byers et al., 1985) et olfactifs, en particulier volatiles comme l'éthanol et les terpènes (Shore et 23

McLean, 1983). La préférence des insectes pour un arbre hôte prend probablement en compte l'humidité du bois, la pression osmotique, l‟écoulement de la sève et la densité du feuillage (Sousa et al., 1995; Yamasaki et Futai, 2008). De plus, des kairomones médiateurs de cette attraction primaire à P. cylindrus ont été décrites (Algarvio et al., 2002, Teixeira et al., 2003). L‟analyse de l'évolution de l‟attaque de P. cylindrus révèle une préférence pour les plus grands hôtes (hauteur et périmètre), principalement pour ceux récemment démasclés (Sousa et Debouzie, 1999).

Les mâles de P. cylindrus commencent la colonisation par le choix de l‟hôte le plus approprié en se basant sur les paramètres cités précédemment, ensuite il creusent des trous de pénétration de taille de 1 à 2 mm sur le tronc de l‟arbre. Ils commencent ainsi à construire la galerie (Baker, 1963). L‟attraction des insectes par l‟arbre dépend aussi d‟une agrégation au sein du même sexe suivie d‟une attraction du sexe opposé (Ytsma, 1986; Atkinson, 2004). En effet, la présence de plusieurs attaques sur le même arbre hôte confirme l‟existence d‟un appel d‟autres mâles grâce à des phéromones d‟agrégation (Algarvio et al., 2002) similaires aux autres Platypodinae (Renwick et al., 1977; Milligan et al., 1988; Tokoro et al., 2007; Kim et al., 2009). Une fois la galerie est suffisamment construite, le mâle s‟installe à l‟entrée du couloir en attendant l‟arrivée d‟une femelle et ne laissant dépasser qu‟une petite partie de l‟apex de ses élytres à l‟extérieur de l‟orifice d‟entrée (Husson, 1955). Chaque mâle est rejoint par une seule femelle dont l'attraction est éventuellement établie par une phéromone sexuelle (Allegro et Della Beffa, 2001). Selon un rituel bien spécifique, le mâle et la femelle ressortent de la galerie pour s‟accoupler (Hickin, 1963). Il s‟agit d‟un accouplement unique, pendant toute la vie du couple (2 à 3 ans) et les spermatozoïdes resteront emmagasinés dans la spermathèque de la femelle (Baker, 1963). La femelle retourne ensuite vers le trou de pénétration initial et le mâle la suit. Elle poursuit la construction de la galerie en Y, inocule les champignons, tandis que le mâle éjecte le bois à l‟extérieur (Sousa et Inácio, 2005). En raison de ramifications abondantes, et dans toutes les directions, le système de galeries peut devenir très complexe. La ponte a lieu en automne et se poursuit jusqu‟au printemps. La femelle peut produire entre 150 et 200 œufs (Sousa et Debouzie, 1999). Les œufs, les larves, les nymphes et les adultes peuvent être trouvés simultanément dans les galeries. Le comportement et la fécondité des femelles dépendent de divers facteurs tels que la disponibilité de l'espace et de la nourriture dans la galerie et le nombre de larves en développement (Sousa, 2006).

Les œufs éclosent 2 à 6 semaines après la ponte. Le nombre exact de stades larvaires est inconnu. Il varie entre 4 à 6 stades (Baker, 1963; Sousa et al., 2005; Bouhraoua et Villemant, 2010). Pour que la nymphose se déroule normalement au printemps, les larves ferment l‟entrée de leur chambre nymphale par un mélange de sciure et de sécrétion glandulaire (Strohmeyer, 1907; Baker, 1965). Le développement des larves et des nymphes peut atteindre environ 5 mois du stade œuf au stade adulte. La période d‟émergence des adultes pendant la première année du cycle de vie de l‟insecte est plus longue que celle de la deuxième année puisque la période de ponte est moins prolongée, étant donnée que les galeries ont été déjà construites (Sousa et Inácio, 2005).

1.3.4. Importance des attaques de Platypus cylindrus

A partir des années 80 et 90, et avec l‟altération inquiétante de l‟état sanitaire des peuplements de chêne-liège, il a été noté une augmentation des pullulations du platype dans de nombreuses régions entrainant des dommages importants au Portugal (Ferreira et Ferreira, 1989), en Espagne (Soria et al., 1994), en France (Nageleisen et Hett, 1989) et au Maroc (Chadigan, 1990). Cependant, en Italie comme en Tunisie, P. cylindrus est encore considéré comme un ravageur secondaire en n‟affectant que les arbres presque morts ou affaiblis (Villemant et Fraval, 1993; Sousa et al., 2005). Il s‟attaque essentiellement aux arbres nouvellement démasclés de tout âge en gardant une certaine humidité du bois (Ferreira et Ferreira, 1991; Sousa et Débouzie, 1999).

Les attaques de P. cylindrus se localisent principalement sur le tronc d‟arbres de grands diamètres. Les symptômes d‟attaque de l‟insecte sont très caractéristiques (Figure 5) car le feuillage des arbres attaqués prend une coloration marron-rougeâtre (Ferreira et Ferreira, 1989), et va chuter graduellement. Sur le tronc, des petits trous circulaires d'entrée (environ 2 mm) produits par les insectes sont remarquables au printemps et en automne et une sciure abondante est rejetée de ces trous et déposée à la base de l‟arbre (Balachowsky et al., 1963).

Une coupe transversale d‟un tronc attaqué par l‟insecte montre la présence d‟un système de galeries qui au début suit les cernes du bois puis migrent dans toutes les directions ce qui peut suggérer que l‟insecte est à la recherche des conditions d‟humidité de bois les plus favorables (Sousa et Débouzie, 1999). Les trous et galeries observés à l‟intérieur du tronc ne déprécient pas la qualité du bois mais affectent plutôt la qualité et le poids du liège (Sousa et Inácio, 2005).

a b

c d

Figure 5. Symptômes d‟attaque de Platypus cylindrus: a, b) sciure blanchâtre sur tronc montrant les trous d‟entrée/sortie de l‟insecte; c) galeries construites par l‟insecte à l‟intérieur du tronc; d) Jaunissement du feuillage (Photos personnelles, 2011)

Les facteurs climatiques d‟extrême température et sécheresse provoquant l‟asphyxie des racines et perturbant ainsi la physiologie de l‟arbre, sont favorables au développement de P. cylindrus. Des attaques d'insectes sont, également, déclenchées par des pratiques de gestion inappropriées, comme le démasclage des arbres par une main d‟œuvre non spécialisée (Ben Jamâa, 2014) et la blessure des arbres. Les attaques de l‟insecte sont, en effet, plus fréquentes sur les arbres sévèrement blessés que sur les arbres sains (Ben Jamâa et al., 2010). Si l‟opération de démasclage est mal effectuée, elle constitue un facteur prédisposant les arbres à l‟attaque des insectes xylophages et des agents pathogènes; c‟est aussi une cause de perte de croissance du liège qui peut dépasser 40% (Ben Jamâa et al., 2005). En outre, la persistance des sujets fortement atteints par l‟insecte représente un foyer de multiplication et de forte dispersion des insectes (Sousa et Inácio, 2005).

1.4. Relation symbiotique entre Platypus cylindrus et les champignons

P. cylindrus, comme tous les Platypodinae (Platypus, Crosstarsus, Platyscapulus et Dolyopugus) et certains insectes de la famille des Scolytidae, est considéré comme un insecte „ambrosia‟ ou „xylomycétophage‟ (Franke Grosmann, 1967; Dajoz, 1980 ; Beaver, 1989) car leurs larves et leurs adultes se nourrissent essentiellement de champignons dit „champignons ambrosia‟, qui tapissent les parois de leurs galeries (Batra, 1963). Le terme ambrosia a été utilisé pour la première fois par Schmidberger (1836) qui a trouvé que les parois des galeries de Xyleborus dispar (F.) étaient couvertes d‟un revêtement très visqueux. Comme il n‟a pas pu identifier la composition de ce dernier, il la désigné par le mot „ambrosia‟ qui a un sens mythique d‟origine grec qui veut dire „la nourriture des Dieux‟. En 1844, lors de l‟étude du scolyte, X. dispar, Hartig a pu identifier le revêtement comme étant des champignons, en gardant l‟idée de génération spontanée et en adaptant l‟origine de ces champignons à la sève et aux excréments de l‟insecte (Hartig, 1844).

L‟expression „ambrosia insect‟ ou „insecte ambrosia‟ est appliquée à tous les insectes montrant ce type de relations (Graham, 1967). Les insectes „ambrosia‟ sont polyphylétiques et forment un groupe écologique comptant environ 3 400 espèces dérivant des scolytes (Farrell et al., 2001; Marvaldi et al., 2002; Kim et al., 2011).

Les informations et les connaissances des relations de symbiose entre les insectes ambrosia et leurs champignons ont été approfondies plus tard par Hubbard (1897) aux Etats Unis et essentiellement pendant les années 60 et 80 (Baker, 1963; Batra, 1963; Franck-Grosmann 1967; Norris et Baker; 1968; Batra, 1985). Ces études se sont par la suite poursuivies afin de déterminer le rôle des champignons associés dans le déclanchement des maladies des arbres. En effet, ces insectes xylomycétophages, qui colonisent un grand nombre d‟arbres forestiers, peuvent provoquer des dégâts assez importants dans les peuplements forestiers (Beaver, 1989), surtout dans les régions tropicales (Coulson et Witter, 1984). Dans les régions tempérées, ce sont surtout les scolytes phloeophages notamment des genres Dendroctonus, Ips, Orthotomicus, Scolytus et Tomicus qui causent les dégâts les plus considérables chez de nombreux résineux. Ces scolytes qui vivent sous l‟écorce dans la zone cambiale, sont aussi associés à certains champignons pathogènes qui jouent un rôle fondamental dans le dépérissement de l‟arbre hôte et/ou dans l‟établissement des conditions favorables pour leur installation. En effet, dans ce contexte, des études ont été menées sur diverses espèces forestières essentiellement le pin (Lieutier, 1993; Ben Jamâa et al., 2007), le cyprès (Tibberi

et Batisti, 1998; Belhabib, 2010), l‟orme (Smalley et al., 1993) et le chêne-liège (Sousa, 1996; Sousa et al., 1997). La majorité des insectes ambrosia ont une relation symbiotique avec les champignons du genre Ophiostoma (Gebhardt et al., 2005; Kolarik et Hulcr 2009; Massoumi Alamouti et al., 2009). D‟autres travaux de recherche ont mis en relief la relation symbiotique entre les insectes ambrosia et les champignons du genre Ophiostoma comme responsable de maladies du bois (Lieutier et Levieux, 1985 ; Lieutier et al., 1989 ; Levieux et Cassier, 1994 ; Wingfield et al., 2013). De nos jours, l‟étude des interactions entre les champignons „ambrosia‟ et les insectes xylophages ne cesse de susciter un intérêt de plus en plus particulier (Gebhardt et al., 2004; Henriques et al., 2006 ; Massoumi Alamouti et al., 2009, Matsuda et al., 2010; Harrington et al., 2011; Inácio, 2011; Belhoucine, 2012; Wingfield et al., 2013; Bellahirech et al., 2014).

L‟interaction entre les insectes et les champignons ambrosia est une relation de symbiose (Francke-Grosmann, 1967). Les champignons peuvent être transportés dans des organes spécialisés et peuvent être stockés dans des organes ectodermiques nommés „mycangia‟. Ils renferment des glandes de sécrétion et favorisent les meilleures conditions aux développement et conservation des champignons pendant le vol et la dispersion des insectes (Levieux et al., 1991). Certains mycangia sont bien développés alors que d‟autres sont de structures morphologiques plus simples (Harrington, 1993). Ils peuvent être sous forme de simples poches membraneuses localisées sur la partie inférieure des mandibules, des tubes sur l‟exosquelette de la tête, des poches à la base des élytres de l‟insecte ou des dépressions sur la paroi dorsale du prothorax (Farris et Funk, 1965 ; Cassier e al., 1996).

Les mycangia sont généralement présents chez tous les individus du même sexe et peuvent varier selon les espèces. Chez certains scolytes, les mycangia sont présents chez le sexe responsable de l‟attaque de l‟hôte (Francke-Grosmann, 1967). Cependant, pour la majorité des espèces de platypes c‟est le contraire car bien que ce soient les mâles qui s‟attaquent aux arbres, ce sont les femelles qui possèdent les mycangia les plus développés (Baker, 1963, Inácio et al., 2011a; Belhoucine et al., 2013).

Néanmoins, dans certains cas la transmission des champignons par les insectes peut se réaliser sans la présence de transport spécialisé sur le corps, grâce au contenu intestinal (Baker, 1963).

Etant un insecte ambrosia, P. cylindrus assure le transport et la conservation du mycélium des champignons dans les mycangia (Baker, 1963). Chez le platype, les mycangia consistent en des structures ovoïdes localisées sur la partie supérieure du prothorax. Ce sont des cavités 28

semi-sphériques servant au transport des champignons et reliés à des cellules glandulaires (Cassier et al., 1996). L‟observation microscopique de ces structures révèle la présence d'un grand nombre de faisceaux micro-tubulaires tissés à travers la cuticule et allant de la cavité des cellules glandulaires vers les cavités contenant les spores. Les glandes sécrétrices pourraient jouer un rôle important dans le contrôle de la croissance des champignons indésirables, ainsi que le maintien de conditions favorables pour les champignons pendant le vol et la dispersion des insectes (Cassier et al., 1996). Ces microtubules sont beaucoup plus nombreux chez la femelle que chez le mâle (Cassier et al., 1996 ; Sousa et Inácio, 2005; Inácio et al., 2011a; Belhoucine et al., 2013). Sur les insectes morts, le développement fongique n'est plus contrôlé et le mycélium se disperse sur le corps de l'insecte (Inácio, 2011).

1.4.1. Importance de la relation symbiotique

La relation ectosymbiotique entre les insectes „ambrosia‟ et les champignons qui leurs sont associés est une relation de mutualisme où les deux partenaires bénéficient des avantages (Beaver, 1989). Ainsi, ce système sert de modèle pour l‟étude des interactions multi- organisme et leur évolution (Paine et al., 1997; Six et Paine, 1998; Ayres et al., 2000). Les insectes bénéficient de ce mutualisme par la symbiose avec les champignons qui servent d‟enrichissement de l‟alimentation par des suppléments nutritionnels (Norris et Baker, 1968; Beaver, 1977; Six et Paine, 1998; Eckhardt et al., 2004; Gebhardt et Oberwinkler, 2005; Inácio, 2011) en augmentant la concentration de l‟azote (Ayres et al., 2000) à partir de faibles proportions dans le bois qui est plutôt riche en protéines (Martin 1979, Swift et Boddy, 1984).

En plus des composés azotés, les champignons produisent des stérols qui sont essentiels pour le développement des différents stades de l‟insecte (Norris, 1979) dont principalement l‟ergostérol qui forme la base chimique de la relation symbiotique insectes-champignons (Kok, 1979).

D‟autre part, le bois est un mauvais substrat pour la nourriture des insectes qui sont incapables de digérer les principaux composés du xylème, essentiellement la lignine, la cellulose et l‟hémicellulose. Le bois est, également, déficient en vitamines B que l'insecte ne peut pas synthétiser de lui-même (Baker, 1963; Graham, 1967; Beaver, 1989).

Outre le rôle de la nourriture, les champignons symbiotiques contribuent à la construction des galeries en facilitant la décomposition des tissus du bois et la création de conditions favorables à l‟installation des progénitures (Berryman, 1982; Six, 2003). Les champignons

participent au dépérissement de l‟arbre hôte fragilisant son système de défense, favorisant ainsi l‟installation des insectes (Christiansen et Hornvedt, 1983).

Les champignons à leur tour bénéficient de la relation symbiotique avec les insectes. Pour les champignons „ambrosia‟, les insectes représentent un moyen de transport permettant leur diffusion quelque soit la distance entre les plantes hôtes (Harrington, 2005) en assurant une protection contre l‟exposition aux ondes ultra-violetes et la dessiccation (Klepzig et Six, 2004). A l‟intérieur de la galerie, les champignons jouissent des conditions de température et d‟humidité favorables pour leur développement et leur croissance au sein de l‟arbre hôte (Beaver, 1989) permettant ainsi l‟inoculation d‟hôtes sensibles. Cette association se montre obligatoire étant donné que les champignons montrent une grande adaptation au transport et à la dissémination par les insectes (Blackwell et Jones, 1997).

Mis à part le mutualisme existant entre les organismes, la perte d‟indépendance des organismes se présente comme le coût de cette relation. En effet, les spores des champignons „ambrosia‟ ne peuvent pas se développer sur le bois et doivent dépendre de la survie de l‟insecte pour leurs nouvelles générations. Ainsi, les champignons perdent le contrôle de leur développement végétatif et leur multiplication par voie sexuée (Gebhardt et Oberwinkler, 2005). D‟autre part, une fois les galeries construites, les progénitures de l‟insecte dépendent entièrement du développement mycélien (Baker, 1963). De même, un coût énergétique supplémentaire est dépensé par les insectes adultes pour la production et la maintenance des mycangia spécialisés (Beaver, 1989).

Pour une meilleure compréhension de la relation entre l‟insecte et le champignon, il est indispensable de tenir compte de l‟arbre hôte. Pour la majorité des insectes „ambrosia‟, l‟arbre hôte est un facteur passif puisqu‟il est déjà en dépérissement au moment de l‟attaque (Sousa, 1996). De nombreux insectes „ambrosia‟ sont classés comme des ravageurs secondaires en ne prenant que des hôtes morts ou déjà affaiblis (Harrington, 2005). Cependant, il existe plusieurs exemples d'espèces qui attaquent les arbres sains présentant une défense active contre les attaques d'insectes et de champignons (Kubono et Ito 2002; Külnholz et al., 2003; Harrington et al., 2010). La relation entre l‟insecte, les champignons, et l'arbre hôte peut être considérée comme une relation antagoniste (Beaver, 1989).

1.4.2. Ecologie des champignons ‘ambrosia’

L‟inoculation des champignons s‟effectue pendant la construction des galeries par les femelles. Sous l‟effet du processus de perforation du bois, les secrétions glandulaires des mycangia augmentent et stimulent ainsi la multiplication des champignons à l‟intérieur des mycangia (Farris et Funk, 1965; Francke-Grossmann, 1967). Lors de la construction des galeries, un mélange de sciures de bois et d‟exsudats est préparé par la femelle créant ainsi des conditions très favorables d‟humidité et de températures pour le développement des champignons (Baker, 1963).

En général, les champignons „ambrosia‟ se reproduisent par voie asexuée et forment des conidies dans des gouttelettes d‟eaux contenants les conidiophores, ce qui facilite leur adhésion aux insectes qui se trouvent obligatoirement à leur contact dans l‟espace restreint de la galerie (Beaver, 1989). Ce processus d‟accrochage qui est connu sous le nom de „pinceau‟ ou „paint brush‟ est employé par les champignons à spores gluants (Beaver, 1989). Cependant, les insectes peuvent aussi transporter des spores sous forme de poussières pour les champignons à spores secs. Dans tous les cas, la dispersion des spores est assurée par l‟accrochage aux insectes qui se déplacent et colonisent les différents substrats (Harrington, 2005).

Les champignons „ambrosia‟ sont classés en primaires et auxiliaires (Batra, 1985), où les premiers sont très spécifiques à l‟insecte „ambrosia‟ (Beaver, 1989) et leur distribution est étroitement liée à celle de l‟insecte qui lui sont associés. Ils sont présents et dominent dans les galeries où ils sont consommés et ils peuvent souvent être isolés à partir des mycangia d‟insectes ou à partir des galeries. Les champignons „ambrosia‟ primaires sont obligatoirement mutualistes et extrêmement sensibles à la sécheresse. Il est très rare de les rencontrer à l‟extérieur des galeries ou des mycangia (Batra, 1966). Les champignons „ambrosia‟ auxiliaires sont, toutefois, relativement non spécifiques à l‟insecte. Ils peuvent apparaître après le développement complet des insectes ou éventuellement dans les galeries des larves et sur les insectes adultes (Batra, 1985). Beaucoup de ces champignons opportunistes produisent des spores mucilagineuses qui leur permettent d‟être transportés à l'extérieur par des insectes, tels que les champignons des genres Gliocladium et Acremonium (Levieux et Cassier, 1994). De nombreux champignons auxiliaires sont facilement isolés et cultivés, en étant considérés par erreur comme des champignons „ambrosia‟ primaires (Levieux et Cassier, 1994).

Depuis très longtemps, il a été admis que certains champignons „ambrosia‟ sont associés à certains insectes „ambrosia‟ de manière spécifique (Batra, 1967; Funk, 1970).

Cependant, des études plus récentes ont montré que la relation symbiotique est plus diversifiée, plus prometteuse et plus compétitive (Harrington et al., 2010, 2011).

Dans certain cas, plus de quinze champignons Ophiostomatales ont été isolés à partir d‟un individu de Dendroctonus ponderosae (Plattner, 2008), alors que dans d‟autres cas, plus de six espèces appartenant aux genres Raffaelea et Ophiostoma ont été obtenues à partir de Xyleborus glabratus (Harrington et Aghayeva; 2008; Harrington et al., 2011) et de P. cylindrus (Inácio et al., 2012b).

En plus des insectes „ambrosia‟, les acariens jouent également un rôle important dans la dispersion des champignons „ambrosia‟ (Moser, 1985; Klepzig et al., 2001; Lombardero et al., 2003). Tout comme dans le cas des insectes, les acariens ont aussi développé des structures de téguments spécialisés appelées sporothecae dans lesquels le transport des spores de champignons mutualistes est effectué (Roets et al., 2007). Par exemple, les ascospores de Ophiostoma minus et Ceratocystiopsis ranaculosus sont souvent contenus dans des structures spécialisées des espèces d'acariens Tarsonemus ips, T. krantzii et T. furasii (Acari : Tarsonemidae) (Moser, 1985). Dans certains cas, les acariens se nourrissent et se reproduisent exclusivement sur leurs partenaires fongiques (Roets et al., 2007). En effet, les acariens qui sont phorétiques pour les insectes „ambrosia‟ (Klepzig et al., 2001; Lombardero et al., 2003) et de leurs champignons associés peuvent interférer sur le développement de l‟insecte. Par exemple, il a été démontré qu‟Ophiostoma minus associé à l‟acarien T. ips, limite la reproduction du scolyte D. frontalis sur lequel ces acariens sont phorétiques (Lombardero et al., 2003).

1.4.3. Classification des champignons ‘ambrosia’

Les caractéristiques morphologiques des champignons „ambrosia‟ sont très réduites ce qui a engendré une grande ambigüité dans le système de classification. Mais, grâce à l‟application de la séquence d‟ADN, la taxonomie de ces champignons est devenue plus claire (Rollins et al., 2001; Massoumi Alamouti et al., 2009; Harrington et al., 2010).

Batra (1967) a placé la plupart des espèces dans les genres anamorphiques Ambrosiella et Raffaelea. Cependant, les analyses phylogénétiques actuelles ont classé les espèces de ces

genres respectivement dans les genres Ceratocystis et Ophiostoma, des Ascomycota (Cassar et Blackwell, 1996; Jones et Blackwell, 1998; Harrington et al., 2010; De Beer et al., 2013).

Les champignons symbiotiques asexués d‟insectes „ambrosia‟ se produisent dans un groupe monophylétique au sein des genres Ophiostoma, alors que Raffaelea est proposé comme étant un genre anamorphique de ce groupe (Harrington et al., 2010). Massoumi Alamouti et al. (2009) ont trouvé deux sous-groupes dans Raffaelea qui devraient être séparés en Ophiostomatales et Microascales. Cependant, aucun caractère phénotypique ne pourrait distinguer ces deux sous-groupes.

Les conidies et les conidiophores des espèces Raffaelea pourraient correspondre au genre Hyalorhinocladiella, qui est un anamorphe des espèces du genre Ophiostoma (Gebhardt et Oberwinkler, 2005; Zipfel et al., 2006; Massoumi Alamouti et al., 2009). Finalement, tous les Ascomycota du genre Ophiostoma, Ceratocystis, Ceratocystiopsis et Grosmannia ainsi que les champignons anamorphiques des genres Leptographium, Pesotum, Hyalorhinocladiella, Sporothrix et Raffaelea sont groupés dans deux ordres qui sont les Ophiostomatales et les Microascales qui sont appelés les champignons « Ophiostomatoïdes » (Wingfield et al., 1999; Zipfel et al., 2006; Kirisits, 2007). Ces champignons sont considérés comme un groupe polyphylétique des genres morphologiquement semblables qui sont artificiellement regroupés (Spatafora et Blackwell, 1994; De Beer et al., 2013).

1.4.4. Principaux champignons ‘ambrosia’ associés à Platypus cylindrus

P. cylindrus est associé à de nombreux champignons dont le rôle principal n‟est pas suffisamment connu. Les premières études sur les champignons „ambrosia‟ associés à P. cylindrus ont été menées par Arx et Hennebert (1965) par l‟identification de Raffaelea ambrosiae qui a été considéré comme un champignon primaire spécifique à l‟insecte. En France, R. montetyi a été, également, signalé associé au platype (Cassier et al., 1996; Morelet, 1998). Ce champignon a été considéré comme primaire pour Xyleborus monographus (Fabr.) et X. dryographus (Gebhardt et al., 2004).

Au Portugal, des champignons Ophiostomatales appartenant au genre Raffaelea ont été identifiés en association avec P. cylindrus notamment R. ambrosia (Sousa, 1996), R. montetyi (Morelet, 1998 ; Inácio et al., 2011a), une espèce proche de R. canadensis et une espèce d‟Ophiostoma ont été également signalées (Inácio et al., 2012a). En Algérie, Belhoucine et al.

(2011) ont pu isoler R. montetyi, O. quercus, O. stenoceras et O. nigrocarpum en association avec P. cylindrus et ses galeries.

En plus de ces champignons „ambrosia‟ primaires, d‟autres champignons ont été isolés à partir de galeries colonisées par l‟insecte, de son contenu intestinal et des mycangia de l‟adulte (Cassier et al., 1996; Sousa, 1996; Sousa et al., 1997; Inácio et al., 2011a) et la majorité des isolats appartient aux genres Acremonium, Aspergillus, Beauveria, Biscogniauxia, Botryosphaeria, Fusarium, Gliocladium, Paecilomyces, Penicillium, Scytalidium, Trichoderma et Trichothecium.

Le rôle spécifique de ces champignons secondaires associés à P. cylindrus n‟est pas suffisamment clair. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer leur rôle. Nommément, certains peuvent être des champignons antagonistes contrôlant le développement mycélien à l‟intérieur des galeries. Cependant, d‟autres peuvent contribuer à la dégradation du bois, ce qui leur permet d‟être un agent d‟affaiblissement de l‟hôte et donc de sa colonisation (Sousa et al., 2011).

Etant donnée que P. cylindrus est capable de transporter de nombreux champignons cosmopolites, il serait difficile de désigner quel genre pourrait être pathogène pour l‟hôte et donc contribuerait au dépérissement du chêne-liège. Cependant, les genres Raffaelea et Ophiostoma doivent attirer plus d‟attention compte tenu de leur relation directe avec la mortalité des arbres (Inácio et al., 2012b). En effet, au Japon, Raffaelea quercivora s‟est montré responsable de la mortalité des chênes attaqués par P. quercivorus depuis les années 1980 (Kubono et Ito, 2002; Matsuda et al., 2010). De plus, R. lauricola transporté par Xyleborus glabratus au sud des Etats Unis est actuellement l‟agent causal du flétrissement vasculaire létal sur les Lauraceae (Fraedrich et al., 2008; Smith et al., 2009; Harrington et Fraedrich, 2011 ; Hughes et al.,2014).

1.4.5. Aspects évolutifs des associations insecte ‘ambrosia’-champignon ‘ambrosia’

Les relations symbiotiques entre les insectes et les champignons se sont développées à partir d‟une similitude des caractéristiques des arbres hôtes favorables à l‟attaque (Batra, 1963). La coévolution entre les deux partenaires a donné naissance à une relation de mutualisme dont le taux de bénéfice varie selon les espèces et selon le degré d‟interdépendance (Beaver, 1989). Dès que la nourriture des insectes commence à dépendre des champignons, ils deviennent capables de s‟attaquer au xylème qui moins rigide et moins riche en éléments nutritifs pour

l‟insecte. L'exploitation d'une nouvelle niche écologique a conduit à son tour à la création d‟une panoplie d'espèces au sein des Scolytinae et des Platypodinae (Atkinson, 2004). Il n'est donc pas surprenant que la plupart des relations symbiotiques au sein des scolytes soit accompagnée par l‟évolution des champignons du genre Ophiostoma, qui accueille la majorité des champignons transportés par les scolytes (Jones et Blackwell, 1998). Malgré les ressemblances dans les adaptations morphologiques des champignons associés aux insectes „ambrosia‟, l‟analyse des séquences 18S-r de l‟ADN montre qu‟ils dérivent d‟ascendants indépendants sans avoir la même origine (Rollin et al., 2001).

Plusieurs espèces de coléoptères peuvent s‟installer sur le même arbre hôte et permettent les échanges symbiotiques entre les champignons associés à l‟insecte et les galeries d‟autres coléoptères ou d‟autres insectes „ambrosia‟ (Gebhardt et al., 2004; Kim et al., 2011). Dans ce contexte, une hypothèse a été avancée par Inácio (2011) en expliquant que des échanges des champignons symbiotiques liés à P. cylindrus et X. monographus pourraient se produire étant donné que leurs galeries se croisent. Ce phénomène peut donc empêcher la spécificité des champignons symbiotiques et les insectes qui leur sont associés (Inácio, 2011).

Malgré que la majorité des champignons „ambrosia‟ ne choisissent pas leur insecte vecteur, il existe un nombre considérable d‟espèces qui se sont montrées spécifiques à certains insectes. L‟arbre hôte peut être un facteur déterminant de la relation entre l‟insecte et les champignons qui lui sont associés (Six et Pain, 1998). Par exemple le scolyte Ips perturbatus s‟attaque uniquement à certaines espèces d‟épicéa dans le Nord de l‟Amérique. L‟association particulière de cet insecte avec le champignon Leptographium fruticetum peut être la conséquence de la préférence de cet insecte à des espèces particulières d‟épicéa. Par contre, avec l‟insecte Dryocoetes affaber, qui s‟attaque à de nombreux conifères notamment le pin, l‟épicéa et le mélèze, il est souvent associé au champignon le plus généraliste qui est Grosmannia piceiperda. Les analyses phylogénétiques ont montré que G. piceiperda est étroitement lié à G. clavigerda qui est généralement lié à tous les scolytes des pins (Massoumi Alamouti et al., 2013). Ainsi, l‟association de ces champignons avec l‟insecte qui s‟attaque à l‟arbre hôte et/ou avec l‟arbre hôte lui-même, obéit à une certaine coévolution (Massoumi Alamouti et al., 2013). Cependant, Harrington et al. (2011) confirment que les scolytes se nourrissent des mêmes champignons quelques soit l‟arbre hôte qu‟ils colonisent.

Les conditions climatiques peuvent, également, influencer la relation symbiotique notamment l‟humidité et la température. Une corrélation avec la latitude a été, aussi, montrée par Beaver

(1989). Les régions tropicales présentent les pourcentages les plus élevés d‟ insectes xylomycétophages que les régions tempérées. Cependant, avec les changements climatiques et les échanges intercontinentaux de matériaux contenant des insectes „ambrosia‟ associés aux agents pathogènes des arbres, le climat méditerranéen pourrait offrir des conditions favorables pour une telle évolution (Nkuekam et al., 2012)

1.5. Moyens de lutte contre Platypus cylindrus

La lutte contre les pullulations de P. cylindrus dans les pays à fortes infestations tels que le Portugal se base sur la biologie de l‟insecte. Elle se réalise moyennant la combinaison de quatre types de méthodes à savoir les luttes, culturales, biotechnique, biologique et chimique.

1.5.1. Lutte culturale

Des techniques culturales ont été mises au point telle que l‟opération de démasclage qui devrait être décalée de deux ans chez des peuplements abritant des attaques actives du platype (Sousa et al., 1997). De plus, une surveillance précoce, essentiellement, si les saisons d‟hiver et de printemps présentent des températures élevées, pourrait limiter les niveaux d‟infestation des arbres de chêne-liège par P. cylindrus (Sousa et Inácio, 2005). Cette méthode peut être la plus efficace puisqu‟elle se montre la plus spécifique et la plus écologique et peut être appliquée de manière préventive (Henriques et al., 2010).

Dans l‟objectif d‟améliorer l‟état sanitaire de l‟arbre, des techniques culturales telles que la fertilisation du sol et la plantation des plantes à mycorhizes pourrait diminuer la sensibilité des arbres aux attaques de P. cylindrus (Bonifácio et al., 2014).

1.5.2. Lutte biotechnique

L‟installation de tronçons nouvellement coupés comme attractifs aux insectes durant leur période d‟envol pourrait avoir de bons résultats (Ferreira et Ferreira, 1991). Pour attirer les deux sexes, ce sont les phéromones d‟agrégation qui ont été utilisées et qui sont composées essentiellement d'hexanol, de sulcatol et de sulcatone (Teixeira et al., 2003). A ces phéromones, des substances chimiques génériques à la composition des kairomones ont été ajoutés aux pièges (ß-pinene, thujene, camphene) (Casas-Novas, 2001). Des essais de lutte sur P. quercivorus ont montré que la présence des mâles à l‟entrée des trous sur le tronc est plus attractive que les odeurs dégagés par les tronçons coupés (Ueda et Kobayashi, 2004). D‟autre part, l‟utilisation des pièges à phéromones au Portugal a permis de contrôler la population d‟insectes et de réduire ainsi le nombre d‟arbres infestés, suite à des essais durant les années 36

2011 et 2013. L‟efficacité des phéromones est de 6 semaines et le nombre d‟insectes capturés était d‟environs 5,6/piège/jour avec une densité de 1 piège/10 hectares (Bonifácio et al., 2014).

1.5.3. Lutte biologique

Le contrôle biologique le plus approprié à P. cylindrus est la considération de l‟effet antagoniste de certains champignons qui sont nécessaires pour leur installation et développement dans les galeries. L‟exemple des genres Acremonium et Gliocladium a donné de bons résultats au laboratoire. Cette méthode nécessite des essais in vivo (Henriques et al., 2010).

L‟effet des prédateurs sur P. cylindrus est très limité. L‟espèce Colydium elongatum (Coleoptera, Zopheridae) a été citée au Portugal (Ferreira et Ferreira, 1991), en France (Dajoz, 1980) et en Algérie (Bouhraoua et Villemant, 2010). Au Maroc, deux autres espèces ont été signalées Corticeus pini (Coleoptera, Tenebrionidae) et Platysoma oblongum (Coleoptera, Histeridae) qui sont aussi présentes au Portugal mais en association avec d‟autres plantes hôtes (Sousa et al., 2005).

1.5.4. Lutte chimique

Cette méthode s‟applique lorsque les adultes sont en période d‟envol. Une fois à l‟intérieur des galeries, les insectes seraient à l‟abri de tout traitement chimique. Cependant, des restrictions pour l‟utilisation des pesticides dans les zones subéricoles présentent la limite du contrôle chimique de l‟insecte, notamment en grande Bretagne (Tilbury, 2009) et au Portugal (Anonyme 2, 2005). D‟autre part, le contrôle des champignons associés à l‟insecte pourrait se réaliser par l‟application de fongicides systémiques sur les troncs de chêne-liège. Cependant cette méthode n‟est pas suffisamment étudiée (Pires, 2007).

Chapitre 2:

Etude du comportement de Platypus cylindrus dans les subéraies tunisiennes

2.1. Introduction

Les symptômes d'une attaque d'insectes au niveau du tronc n'attirent souvent l'attention que tardivement, lorsque l'arbre est condamné. De plus, même lorsque le diagnostic est très précoce, il n'existe souvent pas de remèdes pour sauver l'arbre et l'on ne peut alors compter que sur les capacités intrinsèques de défense de celui-ci. Toutefois, même tardif, un diagnostic des attaques sur l'arbre attaqué est indispensable car, au-delà de l'individu, c'est le peuplement qui est menacé. Le diagnostic des attaques sur quelques individus est un des éléments de base de la lutte préventive contre une épidémie (Lieutier, 1988). C‟est dans ce cadre que s‟inscrit le présent chapitre dont l‟objectif est d‟étudier le comportement de P. cylindrus dans les subéraies tunisiennes en relation avec la vitalité des arbres.

2.2. Matériel et Méthodes

2.2.1. Présentation des forêts : sites de travail

Le travail a été effectué entre 2010 et 2011 sur un total de 22 forêts du Nord Ouest de la Tunisie, région appelée Mogods-Kroumirie où se trouve la quasi-totalité des forêts de chêne- liège.

2.2.2. Protocole expérimental et techniques d'observation

Pendant l‟année 2010, dix forêts ont été choisies, dans chacune d‟elles, 50 arbres nouvellement démasclés (en 2009) ont été échantillonnés au hasard selon les transects Nord- Sud, Est-Ouest (Picard, 2007). Durant l‟année 2011, l‟étude a été menée dans 15 forêts (trois forêts de l‟année 2010 et 12 forêts nouvellement choisies) et où 50 à 75 arbres ont été échantillonnés au hasard dans chaque forêt.

Les coordonnées géographiques de chaque forêt ont été obtenues grâce à un GPS (Golobal Positioning System) enregistrant la position lors des investigations.  Caractérisation du niveau de l’infestation

C‟est la partie démasclée du tronc qui a été observée en dénombrant le nombre de trous de pénétration, de 1 à 2 mm de diamètre, de P. cylindrus caractérisés par une fine sciure blanchâtre.

Le niveau d‟infestation des forêts de chêne-liège a été déterminé en se basant sur deux critères (Soria et al., 1994): (i) l‟incidence d'‟attaque de P. cylindrus (en pourcentage) qui représente le rapport du nombre d‟arbres présentant au minimum un trou de pénétration sur le nombre

total d‟arbres échantillonnés, et (ii) l‟intensité d'‟attaque de P. cylindrus qui représente le nombre moyen de trous par arbre attaqué.

 Caractérisation des arbres et des parcelles d’étude

Cette caractérisation s‟est effectuée sur les 15 forêts étudiées en 2011 (Figure 6).

En plus des critères d‟infestation (incidence et taux d‟attaque) effectués en 2010 et 2011, les paramètres dendrométriques ainsi que phytosanitaires des arbres échantillonnés ont été relevés en 2011 (Figure 7). Des observations complémentaires ont également, été réalisées et ceci en ajoutant d'autres paramètres liés aussi bien aux forêts qu‟aux arbres (Tableau 2).

Figure 6. Localisation des forêts objets de l‟étude approfondie pendant l‟année 2011.

Figure 7. Relevés des paramètres dendrométriques et phytosanitaires des arbres: a) Mesure du diamètre du fût; b) Mesure de la circonférence du tronc; c) Observation du feuillage; d-f) Observation du tronc: d) Ecoulement noirâtre sur tronc, e) Dénombrement des cicatrices et du dessèchement, f) Cavité et éclatement de l‟écorce (photos personnelles, 2011).

Les moyennes de températures et de précipitations ont été fournies par l‟Institut National de Météorologie (INM) de Tunisie pour les gouvernorats de Beja, Bizerte et Jendouba (Annexe 1). 41

A l‟échelle des forêts, des données floristiques (maquis) et topographiques ont été relevées par des observations sur terrain et à partir d‟informations supplémentaires collectées des Procès Verbaux (PV) d‟aménagement des différentes forêts étudiées des arrondissements forestiers de Ain Drahem, Béja et Bizete.

Le tableau 3 présente les caractéristiques écologiques, édaphiques, climatiques et topographiques des différentes forêts étudiées en 2011.

Tableau 2. Les paramètres observés pour les sites et les arbres échantillonnés des différentes forêts.

Types de variables Description de variables

Hauteur du fût (m) Diamètre de fût E-W (m) Paramètres dendrométriques Diamètre de fût N-S (m) Circonférence du tronc à 1, 3 m (cm) Circonférence du tronc à 0, 3 m (cm) Défoliation (indices) Dessèchement des feuilles (présence/absence) Jaunissement des feuilles (présence/absence) Arbres Insectes défoliateurs (présence/absence) Paramètres phytosanitaires Dessèchement du tronc (présence/absence) Symptômes de champignons pathogènes (présence/absence) Déformation du tronc (présence/absence) Ecoulement noirâtre du tronc (présence/absence)

Coefficient de démasclage : Indice obtenu en divisant hauteur de démasclage par la Paramètres d‟exploitation circonférence du tronc à 1, 3 m Nombre de cicatrices après déliégeage

Forêts étudiées Paramètres topographiques, Maquis, Climat

Tableau 3. Caractéristiques écologiques des différentes forêts étudiées de chêne-liège en 2011.

Long. Latit. Altit. Pluv. Température Site Topographie Type de sol Bioclimat sous-bois (degré) (degré) (degré) (mm) (°C) Sol très gypseux Pteridium aquilinum, Erica Humide gréseux, Dégradé très peu arborea et Urginea El Jouza 9°014' 36°86' 520,3 Haut versant 1222 16 inférieur à hiver Terreaux, sol dense maritima, présence de tempéré et doux peu évolué fougères Versant à pente Dégradé, très peu Humide à hiver Arbosier, phillaire, ronce, Ain Drahem 9°050' 36°99' 728 forte, exposition 1780 20,8 Sablo-limoneux dense, litière foliacée doux et tempéré smilax, ciste Ouest aérée Erica arborea, Pistacia Très dense avec une lentiscus, Myrthus Rocheux, faible Humide diversité floristique communis, Smilax aspera, A l'ouest d'un Tabouba 9°063' 36°97' 332,9 800 28,2 pourcentage de inférieur à hiver importante avec Phyllaria media, Arbutus flan sable tempéré vigueur importante unedo, Scilla naritima, d'Erica arborea Brisa maxima, Aira toneri, Lavandula stoechas, Relief très atténué et, est Forêt thermophile, Bruyère arboré, myrte, Fernana Sablo-argileux, Subhumide à 8°938' 36°65' 375,1 drainée par 600 12 sous bois vigoureux flaire, calycotome et (Ain Beya) pierreux hiver tempérés plusieurs et dense lentisque. affluents Relief relativement peu Humide, sous difficile avec des Argile et grès Maquis de petite Myrthe, bruyère, arbousier, Bellif 9°013' 37°04' 276,7 879 18,8 étage inférieur à versants acide taille parfois dense chêne kermès hiver doux exposition Est à pente moyenne versant à pente Humide à hiver Litière ligno-foliacée: Arbousier, phillaire, ronce, Ain Sarouia 8°499' 36°73' 298,20 moyenne, 1300 14,8 Sablo-limoneux doux tempéré maquis très dense à ciste, calycotome exposition Ouest

Long. Latit. Altit. Pluv. Température Site Topographie Type de sol Bioclimat sous-bois (degré) (degré) (degré) (mm) (°C)

Exposition S-W, Litière foliacée : Chihiya 8°823' 36°782' 450 1000 17 Argilo-sableux Humide frais Phillaire,lentisque, erica Pente 30 % recouvrement dense Mi versant, exposition Nord- Humide à hiver Pistacia lentiscus, Erica Adissa 8°615' 36°74' 386,8 900 17 Sablo-argileux Maquis très claire Ouest à pente doux et tempéré arborea moyenne Versants vifs, Choucha Humide à hiver Pistacia lentiscus, Quercus 9°209' 37°03' 307,6 exposition Nord- 878 16 Grèsseux Maquis dégradé (Sejnène) doux coccifera Ouest Versant Nord- Chêne zen (strate Ouest, pente Sol grossier, Maquis très dense et herbacée), arbousier, Sidi Badr 8°834' 36°93' 233,7 1200 15,9 Subhumide régulière, amas rocheux bien développé lentisque, erica, cyste, modérée lentisque Haut versant, moyenne à forte Erica arborea, Phyllyrea Gréseux, Humide (20-70%), media, Quercus Ain Soltan 8°347' 36°55' 773,4 1570 11,7 rocailleux en inférieur à hiver Maquis peu dense exposition Sud- canariensis , Pistacia surface tempéré Est avec micro- lentiscus expositions Exposition Nord Myrte, erica, phyllaire, Hamdiya °8.792' 36°890' 306,7 Ouest, pente 800 15 Sablo- argileux Humide frais Maquis faible lentisque modéré (20%) Vallée, pente forte en amont et Humide à hiver Litière foliacée : Arbousier, phillaire, ronce, Ain Hamraya 8°823' 36°782' 609 1400 15 Sablo-argileux légère en aval, doux tempéré maquis très dense ciste, calycotome exposition Ouest Exposition Est, Argilo- Myrte, erica, phyllaire, Mzara 8°720' 36°769' 653,2 pente modéré 900 13,5 Humide frais Recouvrement dense sablonneux arbousier (15-20%) Exposition Est, Myrte, erica, phyllaire, Babouch 8°709' 36°835' 207,1 pente modéré 950 20 Sablo-argileux Humide frais Maquis très dense lentisque (15-20%) 45

 Suivi de l’émergence de P. cylindrus

Les observations ont été menées dans 10 forêts de chêne-liège: 3 forêts pendant l‟année 2010 et 7 pendant l‟année 2011. Dans chaque forêt, un arbre fortement infesté par P. cylindrus a été abattu pendant le mois de novembre. Au laboratoire, la partie démaclée du tronc, a été débitée en 2 à 3 tronçons de 50 cm et leurs sections ont été protégées par de la paraffine.

Pendant, l‟année 2010, cinq trous de pénétration de P. cylindrus ont été sélectionnés sur arbre infesté à El Jouza pour y installer un petit tube fermé à l‟une de ses extrémités par une pochette en tissu laissant passer l'air (Figure 8.a), afin de maintenir l'humidité et la température. La surface de contact est isolée par un joint en silicone (Sousa et Debouzie 2002). Cette technique a été aussi appliquée au laboratoire sur des tronçons d‟un arbre fortement infesté de la forêt El Jouza.

En 2011, les forêts de Ain Beya, Ain Sarouia, Babouch, Bellif, Hamdiya, Mzara, Oued Zen et Sejnène, ont fait l‟objet du suivi de l‟émergence. Les tronçons (2 à 3) ont été placés dans un sac en tissu afin de pouvoir collecter tous les insectes, qui peuvent émerger (Figure 8.b).

Figure 8. Suivi de l‟émergence des adultes de Platypus cylindrus sur terrain (a) et au laboratoire (b) (Photos personnelles, 2011).

2.2.3. Analyse statistique

Les paramètres dendrométriques, la hauteur des arbres, le diamètre de fût ainsi que l‟intensité d‟attaque exprimée en nombre de trous par arbre ont été comparés entre les sites à l‟aide du 46

test ANOVA (Kurskal-Wallis). La proportion d‟arbres infestés par P. cylindrus entre les sites a été comparée en utilisant le Modèle Linéaire Généralisé (GLM). Ce même modèle a été, également, utilisé à l‟échelle des forêts, pour relier les proportions des arbres infestés (binomiale) et le nombre de trous d‟entré (distribution négative) avec les différents paramètres des sites, dendrométriques et phytosanitaires (attaque avec les agents biotiques).

Une analyse factorielle utilisant la composante principale (ACP) a été conduite pour identifier les variables qui pourront expliquer la variabilité entre les sites. Les résultats ont été représentés selon un graphe bidimensionnel avec l‟extraction de deux axes. Finalement, à l‟échelle des arbres, le GLM a été utilisé pour relier la présence/absence de l‟insecte (binomial) et le nombre de trous d‟entrée (binomiale négative) avec les différentes variables : hauteur et diamètres du fût, hauteur de démasclage et blessures occasionnées lors du démasclage, présence de décoloration et défoliation de feuillage, état phytosanitaire du tronc.

Les modèles ajustés ont été comparés au modèle de l'interception par le rapport de vraisemblance Khi-carré (χ 2)

La relation entre les variables a été testée avec le test de corrélation de Pearson.

Toutes les analyses statistiques supposent un taux d'erreur „α = 0,05‟. Les données ont été analysées avec le logiciel IBM SPSS Statistics 21 et Statistica, version 9.0, StatSoft Inc. Tulsa. OK. USA.

2.3. Résultats

2.3.1. Importance des attaques de l’insecte

La figure 9 présente le niveau d‟infestation des différentes forêts prospectées en 2010 et 2011.

L‟insecte est présent dans toutes les forêts prospectées avec des niveaux d‟attaque différents (Figure 9). La plupart des forêts sont faiblement attaquées (entre 5 et 15%), et seulement 6 forêts parmi les 22 prospectées présentent des pourcentages supérieurs à 40%. Les pourcentages d‟attaques les plus élevés ont été observés à Ain Drahem (100%), Tabouba (88%), Jouza (68%). Fernana est atypique puisque seuls cinq arbres ont été attaqués sur ce site, mais trois d'entre eux étaient en dépérissement total avec une forte densité de trous. Par conséquent, une variance élevée est observée sur ce site.

La figure 9 montre la présence de trois groupes de forêts, un premier groupe (G1) avec un taux d'infestation faible ne dépassant les 20%, un deuxième groupe (G2) présentant une

incidence d‟attque moyenne entre 20 % et 50%, et un troisième groupe (G3) composé de forêts sévèrement attaquées avec une incidence d'attaque variant de 50% et à 100%.

Toutes les forêts prospectées présentent des symptômes d‟attaque par P. cylindrus à l‟exception de celle d‟Adissa où aucun arbre attaqué n‟a été enregistré. L‟importance des attaques est hautement significativement différente entre les forêts (P < 0,0001*). L'intensité de l'attaque était plus élevée dans le site d‟Ain Draham avec une moyenne de 19 trous/arbre (min. 2 trous/arbre; max.82 trous/arbre). Les autres forêts présentent entre 1 et 8 trous/arbre.

2.3.2. Caractérisation des parcelles

Les parcelles d‟étude présentent des structures différentes concernant les paramètres dendrométriques (Tableau 4).

La hauteur et le diamètre de fût sont hautement significativement différents entre les sites

étudiés (F(14,716) = 19,59, P < 0,0001 et F(14,716) = 26,70, P < 0,0001, respectivement). La hauteur de fût est significativement plus elevée à Babouch, Ain Hamraya et Ain Drahem en comparaison avec les autres sites. D‟autre part, cette hauteur est moins importante à Jouza, Sidi Badr, Hamdia et Tabouba. Les arbres les plus larges (en termes de diamètre) ont été trouvés dans le site d‟Ain Drahem et les moins larges sont repérés à Fernana, Hamdyia et Ain Hamraya (3,83 ±0,100) (Tableau 4).

Entre les sites, la différence pour la circonférence du tronc est aussi hautement significative

F(14,716) = 25,5445; P < 0,0001*. D‟après le tableau 4, ce sont les sites de Ain Drahem, Adissa et El Jouza qui présentent des circonférences du tronc les plus élevées et les forêts de Ain Hamraya, Ain Soltan et Choucha ont des moyennes de circonférence plus faibles.

Tableau 4. Principaux paramètres dendrométriques des parcelles d‟étude.

Moyenne de la Moyenne du Moyenne de la circonférence Site hauteur du fût (m) diamètre de fût (m) du tronc à 1,30 m (m) cde Tabouba 1,964a±0,745 6,474efg ±1,711 0,929 ±0,250 Hamdia 2,305ab±0,694 3,860a±0,971 0,875bcde ±0,263 El_Jouza 2,536abc±1,024 6,548gh±1,123 1,229gh±0,423 Sidi_Badr 2,526bc±1,086 5,735cde±1,340 0,936de±0,334 Chihiya 2,764c±0,522 5,218c ±1,977 0,864bcde±0,454 Bellif 2,854cd±0,818 5,848def±1,463 0,866bcde±0,294 Adissa 3,202de±0,794 6,511g ±1,709 1,391h±0,322 Fernana 3,298e±1,325 4,171ab ±1,383 0,780bcd±0,369 Choucha 3,322e±1,201 5,209c ±1,453 0,746abc±0,260 Ain_Sarouia 3,441e±0,712 5,599cd ±1,515 0,987ef±0,272 Mzara 3,579e±1,307 5,794cdef±1,941 1,019ef±0,421 Ain_Soltan 3,596e±1,163 4,566b±1,209 0,727ab ±0,303 Ain_Hamraya 4,210f±1,059 3,810a±0,710 0,620a±0,140 Babouch 4,409f±1,247 5,736cde±1,496 1,126fg±0,822 Ain_Drahem 4,147f±1,657 7,788i±2,312 1,640i±0,568

Les lettres après les moyennes représentent les groupes homogènes, d‟après l‟analyse ANOVA Les moyennes présentant des lettres différentes sont significativement différentes.

En tenant compte de l‟ensemble des paramètres dendrométrique étudiés, la forêt de Ain Drahem se montre plus vigoureuse et plus fertile en ayant des arbres de plus grands diamètre et hauteur de fût avec une circonférence moyenne du tronc la plus élevée (Tableau 4).

2.3.3. Caractérisation phytosanitaire des parcelles

Pour la situation phytosanitaire du feuillage, les parcelles qui peuvent être considérées comme en bon état et celles qui présentent le moins de dégâts au niveau de la canopée sont les forêts de Bellif, El Jouza et Tabouba, en se basant sur les indices de défoliation et les pourcentages de jaunissement et du desséchement des feuilles. Cependant les forêts de Choucha, Ain Sarouia, Ain Hamraya et Adissa présentent un feuillage moins sain (Tableau 5).

Tableau 5. Principaux paramètres phytosanitaires du feuillage et du tronc des arbres de chêne-liège des forêts étudiées.

Paramètres Etat du feuillage Etat du tronc Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage Indice de Pourcentage de jaunissement des dessèchement du dessèchement du d’écoulement défoliation pourriture et cavité Site feuilles (%) feuillage tronc noirâtre Bellif 0,4a 16a 27ab 10a 37a 29ab El_jouza 0,5ab 16a 16ab 60b 48b 16ab Tabouba 0,6abc 36a 44ab 36a 100b 0a Ain_Drahem 0,7abcd 56ab 45ab 24a 23a 39ab Mzara 0,9abcd 65b 46ab 8a 6a 54ab Ain_Soltan 0,9abcd 76b 76bc 0a 15a 7a Chihiya 1,0abcd 60ab 64ab 6a 24a 36ab Sidi_Badr 1,1bcd 12a 53ab 0a 20a 6a Fernana 1,1bcd 59ab 63ab 2a 27a 33ab Babouch 1,1bcd 76b 65ab 24ab 29a 29ab Hamdia 1,2cde 49a 47ab 0a 14a 25ab Adissa 1,3de 54a 72bc 16a 14a 22ab Ain_Sarouia 1,5de 67b 76bc 10a 27a 24ab Ain_Hamraya 1,9ef 55ab 47ab 2a 8a 12a Choucha 2,4f 51a 73bc 18ab 18a 29ab

Les lettres après l‟indice de défoliation et les pourcentages représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse non paramétrique de Kruskal-Wallis. 51

Une différence hautement significative entre les sites a été notée pour le dessèchement du tronc (KW test: H (14, N = 731) = 117,2742; P < 0,0001*), l‟écoulement noirâtre (KW test: H (14,

N= 731) = 68,14563; P < 0,0001*) et la présence de pourriture et cavités (KW test: H (14, N = 731) = 119,6525; P < 0,0001*). Les autres paramètres n‟ont pas présenté de différences.

D‟après le tableau 5, toutes les parcelles présentent des pourritures et des cavités au niveau du tronc avec des pourcentages variant de 6% dans le site de Mzara à 100 % dans le site de Tabouba. Cependant, les symptômes de dessèchement ne sont pas présents dans tous les sites et ils sont absents dans les sites de Hamdiya, Sidi Badr et Ain Soltan. Le site qui présente le plus d‟arbres avec des signes de dessèchement est celui de El Jouza (60%). L‟écoulement noirâtre sur tronc est présent dans toutes les forêts avec des pourcentages de 6 à 54%, à l‟exception de la forêt de Tabouba. Les forêts qui présentent le plus de dégâts sur tronc sont El Jouza, Babouch et Choucha contrairement à celles de Sidi Badr, Ain Soltan et Hamdiya dont les troncs des arbres sont les plus sains (Tableau 5).

2.3.4. Caractérisation de l’exploitation des arbres

Pour évaluer la qualité de l‟exploitation des arbres de chêne-liège, nous avons étudié la hauteur de démasclage et le nombre de cicatrices occasionnées sur tronc.

Pour le coefficient de démasclage (hauteur démasclée/circonférence à 1,5 m), il existe une différence hautement significative entre les sites, F(14,716) = 15,3238; P < 0,0001*. En effet, ce coefficient varie entre 1,5 et 3. La majorité des forêts présente un coefficient inférieur à 2, 5.

3,5 a 3 a a 2,5 b b b bc bc bc cd cd 2 d d e 1,5 e

Coéficient de démasclage de Coéficient 0,5

Forêt étudiée

Figure 10. Moyennes du coefficient de démasclage dans les forêts étudiées de chêne-liège. 52

La figure 10 montre que les arbres à valeur moyenne de coefficient de démasclage le moins faible se trouvent dans les sites de El Jouza, Adissa et Ain Drahem contrairement aux sites de Ain Hamraya, Ain Soltan et Fernana (Ain Beya) où le démasclage est plutôt excessif avec des coefficients entre 2,5 et 3 et dont les pourcentages d‟arbres fortement exploités sont respectivement de 80, 78 et 69%. Les forêts qui forment un groupe central avec un coefficient de l‟ordre de 2, sont Bellif, Mzara et Hamdiya (Figure 10).

Concernant le nombre de blessures occasionnées sur le tronc lors de l‟opération de la levée du liège, toutes les forêts présentent des cicatrices (Figure 11). Sur un total de 731 arbres échantillonnés dans les 15 forêts, uniquement 5 arbres ne présentent pas de cicatrices.

Il existe une différence hautement significative entre les sites étudiés (F(14,716) = 25,9645 ; P < 0,0001).

45 h 40

35 g 30 def f def def def def ef 25 de def cd 20 b bc 15

a Nombre moyen des cicatrices des moyen Nombre 5

Sites

Figure 11. Nombre moyen des cicatrices dans les forêts étudiées.

Le plus grand nombre de blessures observé était de l‟ordre de 90 et a été noté dans la forêt de Ain Drahem, sur un arbre ayant un coéficient de démascalge de l‟ordre de 1,47. La valeur de la hauteur de démasclage est de 3,1 m et de la circonférence du tronc est de 2,25 m.

D‟après la figure 11, c‟est le site de Ain Drahem qui présente le plus de blessures sur tronc par rapport aux autres sites avec un nombre moyen de 42 cicatrices contrairement au site de Tabouba dont le nombre de cicatrices ne dépasse pas les 8 cicatrices.

Les forêts où l‟opération de démasclage a le moins endommagé le tronc sont Tabouba, Choucha et Ain Hamraya (moins de 20 blessures par arbre). Les sites de Bellif, Hamadiya, Sidi Badr, Mzara, Adissa, Babouch et Chihiya présentent un nombre moyen entre 21 et 27 cicatrices par arbres, alors que les forêts de Fernana et Ain Drahem présentent un nombre moyen supérieur à 33 blessures. Pour les autres sites qui sont au nombre de 6, le nombre moyen de blessures est de l‟ordre de 25.

2.3.5. Distribution spatiale des attaques de Platypus cylindrus en Tunisie

 Différences entre les sites

Les paramètres climatiques et topographiques diffèrent pour les 15 sites étudiés (Tableau 2).

Par l‟analyse en composantes principales (ACP), les facteurs les plus pertinents expliquant l'axe 1 ont été la température, la latitude et la longitude. Les deux sites positionnés le long de l'axe 1 avec des positions extrêmes sont Tabouba, caractérisé par des températures plus élevées en moyenne par mois (28,2ºC) et Ain Soltan avec des températures plus faibles par mois en moyenne (11,7ºC).

Pour l'axe 2 (50,6% de variance), la présence des insectes xylophages (Cossus cossus et Cerambyx cerdo) et la taille des arbres (hauteur et diamètre) ont émergé comme des variables les plus pertinentes. Deux sites semblaient se différencier avec des valeurs positives élevées le long de l‟axe 2 qui sont Babouch et Ain Drahem. Ces deux sites, caractérisés par des arbres les plus hauts et les plus larges, présentent le plus de xylophages autres que P. cylindrus par rapport aux autres sites. Sur le côté négatif de l‟axe 2 c‟est le site de Hamdyia qui est bien séparé des autres sites. Aucun autre site n‟a été particulièrement individualisé, la majorité des sites sont groupés au centre du graphe (Figure 12).

3,5

Babouch 3 50,6% Variance

2,5

1,5

Cossus Ain Drahem Cerambyx 1 Hauteur de fût Diamètre de fût 0,5 Température Dessèchement du 1 Latitude Pluviométrie feuillage Chihiya Tabouba 0 Longitude ACP Adissa Mzara Sidi Badr Choucha -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5Ain Sarouia0 0,5 1 1,5 2 2,5 Altitude Bellif Ain Hamraya -0,5 Champignons Jouza Ain Soltan Fernana

-1

-1,5 Hamdiya

-2 ACP 2

Figure 12. Analyse multifactorielle avec l‟analyse en composantes principales (ACP) des différents sites étudiés.

 Platypus cylindrus en relation avec les paramètres milieu

Les corrélations bivariées de Pearson (n = 15) ont montré une corrélation positive significative entre la proportion d'arbres attaqués et la température annuelle moyenne des sites (r = 0,699, P = 0,004) et la moyenne des diamètres des arbres (r = 0,679, P = 0,005).

Le GLM met en évidence cinq variables significativement liées au pourcentage d‟arbres attaqués au niveau des sites (χ2 = 436,34; P < 0,001). Pour les variables climatiques, la proportion d‟arbres attaqués augmente avec la température moyenne et les précipitations annuelles (Tableau 6). Un plus grand nombre d'arbres attaqués a, également, été trouvé à des 55

latitudes plus élevées (près de la côte). De plus, le pourcentage d‟infestation par P. cylindrus est plus important dans les sites qui présentent les plus grands diamètres de fût et où les troncs sont les plus atteints par des champignons. Pour les six autres variables testées, aucune relation significative n'a été observée (Tableau 6).

Tableau 6. Modèle linéaire généralisé expliquant le pourcentage d‟attaque et la densité moyenne des trous de Platypus cylindrus en fonction des paramètres des sites.

Incidence d‟attaque Intensité d‟attaque Variables étudiées χ2 P χ2 P

Hauteur de fût 1,076 0,300 7,072 0,008* Diamètre de fût 7,609 0,006* 131,396 <0,001* Température 10,078 0,002* 24,440 <0,001* Altitude 3,803 0,051 0,295 0,587 Précipitation 4,950 0,026 102,594 <0,001* Latitude 15,765 <0,001* 44,738 <0,001* Longitude 0,975 0,323 13,048 <0,001* Dessèchement des feuilles 1,501 0,221 0,111 0,739 Cerambyx cerdo 2,396 0,122 13,376 <0,001* Cossus cossus 0,215 0,643 6,123 0,013 Champignons sur tronc 9,786 0,002* 612,584 <0,001*

Neuf variables expliquent de manière significative le nombre moyen de trous par arbre au niveau du site (χ2 = 70,723, dl = 11, P < 0,001). Le nombre moyen de trous augmente avec la hauteur et la moyenne des diamètres du fût (Tableau 6). La température et les précipitations ont eu un effet positif sur la densité des trous. En effet, la densité de trous était plus élevée dans les sites de l'ouest et à des latitudes plus élevées (Tableau 6). Egalement, la densité des trous est plus élevée dans les sites dont les troncs d‟arbres présentent des attaques de champignons et d‟autres insectes xylophages (Tableau 6).

Entre les arbres, cinq variables étaient significativement corrélées avec la probabilité de présence de P. cylindrus (χ2 = 149,09, dl = 10, P < 0,001).

La probabilité de l‟attaque augmente de façon linéaire avec le diamètre de fût et la hauteur de démasclage (Tableau 7). D'autre part, une relation négative a été trouvée avec la densité du feuillage. Pour les variables binaires, la présence d‟insectes défoliateurs et du jaunissement de feuillage et la présence de cavités sur tronc, se montrent significatives et augmentent avec la probabilité d'une attaque par P. cylindrus (Tableau 7).

Tableau 7. Modèle linéaire généralisé (GLM) expliquant la présence/absence de Platypus cylindrus et le nombre moyen de trous d‟attaque de l‟insecte en fonction des variables étudiés sur les arbres.

Présence/absence de l‟insecte Intensité d‟attaque Variable étudiée χ2 P χ2 P

Hauteur de fût 0,879 0,348 0,066 0,797 Diamètre de fût 7,621 0,006* 2,402 0,121 Défoliation 14,303 0,000* 21,891 <0,001* Hauteur de démasclage 10,976 0,001* 66,900 <0,001* Cicatrices de démasclage 2,472 0,116 20,537 <0,001* Jaunissement du feuillage = 1* 5,835 0,016* 76,940 <0,001* Insectes défoliateurs = 1* 13,237 0,000* 1,497 0,221 Champignons sur tronc = 1* 0,343 0,558 0,084 0,772 Cavité sur tronc = 1* 10,697 0,001* 12,857 <0,001*

* Variables catégoriques binaires, 0-absence; 1-présence

L'intensité de l'attaque de P. cylindrus, exprimée par le nombre de trous sur le tronc, était significativement liée avec la hauteur de démasclage, la défoliation, l‟état phytosanitaire du tronc et les variables biotiques (Tableau 7). L‟intensité de l'attaque augmente avec la hauteur démasclée du tronc et le nombre de blessures occasionnées sur tronc lors de l‟opération de la levée du liège. D'autre part, l'intensité de l'attaque a été liée à la défoliation. Pour les variables binaires, la présence de feuilles jaunes et de cavités sur tronc émergent comme positivement corrélée avec l'intensité de l'attaque par P. cylindrus. La présence de défoliateurs et de champignons sur tronc n‟a pas de relation significative avec le nombre de trous de P. cylindrus (Tableau 7).

2.3.6. Emergence de Platypus cylindrus et sex-ratio

 Chronologie d’émergence de l’insecte

Le suivi de l‟émergence sur terrain pendant l‟année 2010 réalisé dans le site d‟El Jouza n‟a pas permis d‟avoir beaucoup de résultats (Tableau 8).

Tableau 8. Résultats de l‟émergence des insectes xylophages dans la station El Jouza.

Dates Arbre Nombre d‟individus émergés

1 12 coléoptères à identifier et 0 platype 10/6/2010 2 6 platypes (2 mâles et 4 femelles) 11 coléoptères à identifier 30/6/2010 2 et 2 platypes (1 mâle et 1 femelle)

Le suivi de 7 sites pendant l‟année 2011 au niveau du laboratoire a permis de collecter un total de 343 insectes adultes et de 155 larves de platypes (Figure 13). Nous avons de même noté qu‟il y a une différence statistiquement significative entre les sites (F(7,1) = 25,85 ; P = 0,0002) avec la distinction du site de Ain Beya.

Sur la figure 13, les larves ont été récupérées des tronçons appartenant aux forêts de Ain Beya et Bellif. Ce sont les forêts de Mzara, Bellif et Ain Sarouia qui ont présenté le plus d‟insectes par rapport aux autres sites notamment la forêt de Sejnène d‟où on n‟a pu récupérer qu‟un seul insecte adulte.

100 90 Mâle Femelle Larve 80 70 60 50

Effectif 40 30 20 10 0 Ain Beya Ain Babouch Belif Hamdiya Mzara Oued Sejnène Sarouia Zen Site

Figure 13. Effectifs d‟insectes collectés au laboratoire pour les forêts étudiées.

Le suivi au laboratoire, à température ambiante, s‟est étendu sur la période de novembre 2011 jusqu‟au mois de juillet 2012, soit 34 semaines à raison de 3 observations par semaine, et a permis d‟établir la chronologie d‟émergence des adultes de P. cylindrus (Figure 14, Annexe 2).

25 Ain Beya 20 Ain Sarouia Babouch 15 Belif

10 Hamdiya Mzara 5 Oued Zen

Effectifs Effectifs d'insectes adultes émergés Sejnène 0

Semaine d'observation

Figure 14. Emergence de Platypus cylindrus au laboratoire.

Sur la figure 14, pour la majorité des sites, l‟émergence s‟est étalée entre décembre 2011 et juin 2012 sauf pour la forêt de Sejnène où uniquement un seul insecte adulte a émergé pendant la première semaine de suivi. Les pics d‟émergence des sites ont été enregistrés pendant les mois de janvier, mars et avril soit les 1er, 11ème et 17ème semaines de l‟année 2012.

 Sex –Ratio

Le nombre total d‟adultes émergés était de 163 mâles et 180 femelles. La sex-ratio qui représente le nombre total de mâles sur le nombre total de femelles était de l‟ordre de 0,9 (Figure 15).

100

90 Mâle Femelle 80

Effectif 40

0 Ain Beya Ain Sarouia Babouch Belif Hamdiya Mzara Oued Zen Sejnène Site

Figure 15. Répartition des mâles et femelles de Platypus cylindrus émergés au laboratoire.

2.3.7. Collecte d’autres espèces d’insectes

En plus de P. cylindrus, nous avons pu collecter de nombreuses autres espèces d‟insectes. L‟identification de ces insectes a été effectuée au laboratoire de l‟INIAV-Oeiras au Portugal (Tableau 9, Figure 16).

D‟après le tableau 9, c‟est le genre Xyleborus représenté par les espèces X. monographus et X. pfeili qui sont les plus fréquents avec un effectif de 74 spécimens en comparaison avec les autres insectes dont le nombre est de l‟ordre de 37 individus. Le genre Xyleborus a été

collecté sur des arbres provenant des forêts de Mzara et Ain Sarouia. De même, l‟espèce Colydium elongatum a été identifiée et collectée des sites de Ain Beya et Bellif.

Les autres insectes ont été classés selon leurs familles notamment les Anobiidae, Carabidae, et Tenebrionidae. Le genre Rhyncolus a été également identifié et représenté par 17 individus collectés principalement de l‟arbre appartenant au site de Hamdiya.

Tableau 9. Classification des insectes collectés des tronçons de chêne-liège au laboratoire.

Site Insecte Effectifs

Carabidae 1 Xyleborus pfeili 7 Mzara Xyleborus mongraphus 9 Tenebrionidae 1 Rhyncolus sp. 16 Hamdiya Anobiidae 1 Carabidae 2 Colydium elongatum 9 Ain Beya Rhyncolus sp. 1 Xyleborus mongraphus 35 Xyleborus pfeili 12 Colydium elongatum 6 Bellif Xyloborus pfeili 1 Xyleborus mongraphus 9 Ain Sarouia Xyleborus pfeili 1

Figure 16. Photos de quelques insectes collectés des tronçons de chêne-liège. 1. Carabidae, 2. Colydium elongatum, 3. Anobiidae, 4. Tenebrionidae, 5. Xyleborus monographus, 6. X. pfeili (femelle à gauche, mâle à droite), 7. Rhyncolus sp. (Photos personnelles, 2012).

2.4. Discussion

P. cylindrus est présent dans toute la région subéricole prospectée pendant les années 2010 et 2011 avec des pourcentages et des taux d‟attaque qui diffèrent entre les forêts. Un total de 22 forêts et de 1300 arbres a fait l‟objet d‟une observation du nombre de trous par arbre et d‟incidence (pourcentage) d‟infestation par site. Le pourcentage d‟attaque varie de 1 à 100 % et le nombre moyen de trous par arbre se situe entre 1 et 20. Une telle observation nous a incité à mener plus profondément nos analyses et d‟étudier les paramètres et facteurs qui pourront expliquer le comportement du platype dans les forêts tunisiennes de chêne-liège.

En analysant les principaux paramètres dendrométriques corrélés avec l‟attaque de P. cylindrus qui sont la hauteur et le diamètre du fût et la circonférence du tronc, nous avons remarqué que le site de Ain Hamraya présente des arbres de plus faible diamètres de fût et de circonférence mais de plus grande hauteur de fût. Ce site attire aussi l‟attention par le fait qu‟il s‟est montré avec le plus grand coefficient de démasclage, donc le plus sévèrement démasclé. Ainsi, la présence d‟un démasclage sévère est plus liée à la hauteur et à la

circonférence de l‟arbre. Cependant, le nombre de cicatrices occasionnées lors du démasclage est parmi les moins faibles par rapport aux autres sites (moyenne de 16 blessures par arbre) de même pour le pourcentage d‟attaque qui ne dépasse pas 4%. Avec une faible circonférence, le coefficient de démasclage est plus grand mais le taux d‟attaque est faible malgré la présence de quelques blessures sur tronc. La situation phytosanitaire du feuillage qui présente quelques jaunissements et dessèchement par contre, pour l‟état du tronc, Ain Hamraya est en bon état et présente de très faibles pourriture ou écoulement (environ 6%). Ce résultat permet d‟avancer une possible relation directe entre la situation phytosanitaire du tronc et le niveau d‟infestation: plus le tronc est en bonne état, moins l‟insecte est attiré et présent.

Au niveau du site El Jouza, les arbres présentent des valeurs de diamètre de fût et de circonférence du tronc assez élevés contrairement à la hauteur du fût qui est faible. Ce site s‟est montré dans le groupe où le démasclage n‟est pas excessif. Cependant, le nombre moyens de cicatrices sur tronc est assez important (environ 21). Il est important de noter que ce site présente le plus d‟arbres dont le tronc possède le plus de dessèchement, d‟écoulement noirâtre, de pourriture et de cavités contrairement à la situation phytosanitaire du feuillage qui est considérée comme bonne (15%). Quant à la présence de l‟insecte, la forêt d‟El Jouza est fortement infestée avec un pourcentage d‟attaque de 68% et une moyenne de 5 trous par arbre. L‟hypothèse précédente de la relation directe entre le niveau d‟infestation et l‟état phytosanitaire du tronc se consolide et on y ajoute une possible relation entre le niveau d‟infestation et le nombre de cicatrices.

Une autre situation remarquable se présente à la forêt de Ain Drahem, où les arbres se montrent plus vigoureux avec des valeurs de diamètre et hauteur de fût et circonférence de tronc assez importantes. De plus, les caractéristiques édaphiques et climatiques de cette station sont très favorables au développement des arbres de chêne-liège et offrent de bonnes conditions de fertilité. De même, la situation phytosanitaire des arbres (tronc et feuillage) est bonne. Cependant, cette forêt présente 100 % d‟attaque avec un taux d‟infestation de 20 trous par arbre. Il est important de noter que les paramètres dendrométriques de l'arbre notamment la hauteur de fût et le diamètre du tronc influencent les attaques de P. cylindrus. L'insecte semble être attiré par des arbres de plus en plus vigoureux comme rapporté précédemment au Portugal (Sousa et Inácio, 2005). De même, des études précédentes ont montré (Sousa et Débouzie, 1999) que l'incidence de P. cylindrus était plus élevée sur les grands arbres de chêne-liège, avec une hauteur de fût importante, que chez les jeunes ou les petits arbres. Cette

observation a été également confirmée dans les forêts de chêne-liège tunisiennes dans le cadre d‟une étude pérliminaire (Bellahirech et al., 2012).

Un autre indicateur d'un changement possible de comportement pour devenir primaire, comme il a déjà enregistré pour le Portugal (Sousa et al., 2005) peut être trouvé au niveau des variables de feuillage. Le niveau de défoliation (indicateur de l'état phytosanitaire global des arbres) a été négativement lié avec P. cylindrus. Ceci est inattendu pour une espèce d'insectes secondaire. La présence d‟autres insectes xylophages tels que Cossus cossus ou Cerambyx cerdo ainsi que certains champignons sur feuillages ou tronc de certains arbres attaqués par P. cylindrus, laisse penser que ces agents biotiques sont la conséquence de l‟affaiblissement de la plante hôte.

D‟autre part, en observant le nombre moyen de blessures sur tronc d‟Ain Drahem qui sont de l‟ordre de 42 par arbre, il serait possible d‟avancer que l‟attaque des arbres est plus influencée par l‟opération de la levée du liège que par la situation phytosanitaire des arbres et le démasclage excessif. Ce résultat corrobore les travaux de Bellahirech et al. (2015) qui, en étudiant le comportement de P. cylindrus dans 3 sites du Nord ouest de la Tunisie, ont pu montrer que les sites représentant un diamètre moyen le plus élevé sont les plus attaqués.

Il a été démontré que les insectes xylophages utilisent les signaux olfactifs de leur hôte dans un mode sensoriel unique de sélection de l'hôte (Wood, 1982; Byers, 1985; Seybold, et al., 2006; Campbell et Borden, 2009). Généralement, les espèces primaires ou agressives utilisent les substances volatiles de l‟arbre en association avec une phéromone d'agrégation généralement pour organiser des attaques de masse et submerger les défenses d'un arbre hôte choisi (Rudinsky, 1976; Wood, 1982; Raffa et al., 1993). En revanche, les espèces secondaires ou non agressives n‟utilisent généralement pas de phéromones d'agrégation, mais se concentrent uniquement sur l'hôte, indice spécifique d'orientation vers de nouveaux matériaux de l‟hôte (Rudinsky, 1976; Wood, 1982; Lindgren et Raffa, 2013).

Par ailleurs, les variables de démasclage (hauteur et surface démasclées du tronc) pourraient être les facteurs déterminants pour les attaques de l‟insecte. Nos travaux ont montré la présence d‟une relation directe entre le mode d‟exploitation du chêne-liège et le niveau d‟infestation par P. cylindrus. Oliveira et Costa (2012) ont rapporté que le déliégeage par les ouvriers non qualifiés peut laisser des blessures sur l'arbre, qui finissent par entraver la régénération du liège et conduire à la mort prématurée de l'arbre. La relation entre les pratiques de récolte de liège et la résistance des arbres n‟est pas tout à fait établi. Les 64

pressions de déliégeage élevées semblent déclencher des réponses plus ou moins drastiques des arbres et/ou d'accroître leur déclin.

Considérant les infestations d'insectes, les attaques étaient identiques sur les arbres présentant des conditions de défoliation différentes. Ce comportement était plutôt inattendu pour une espèce d'insecte secondaire (Ben Jamâa et al., 2005) et peut être un indicateur d'un changement de statut du ravageur pour devenir un ravageur primaire attaquant de préférence les arbres sains, comme déjà observé au Portugal (Sousa et al., 2005), ou bien tout simplement, la situation phytosanitaire des arbres n‟est pas un facteur déterminant dans le choix de l‟arbre à coloniser par l‟insecte.

La hauteur de démasclage et le nombre de cicatrices sur arbres sont des variables liées à la gestion du chêne-liège et sont significativement corrélées avec la présence de l‟insecte.

D'autres variables liées à la gestion du chêne-liège, tels que le nombre de blessures causées lors de l‟écorçage du chêne-liège, sont positivement corrélées avec le nombre de trous d'insectes. Ces résultats sont conformes à ceux de Ben Jamâa (2014). Auparavant, Natividade (1956) a démontré que, même si la levée du liège est correctement faite, il reste un facteur prédisposant fort pour l‟arbre d‟être colonisé par P. cylindrus puisque cette opération a conduit à la blessure de l'arbre. Plusieurs études ont montré la relation entre l'attaque de l'insecte et l'état physiologique de l'arbre (Sousa et Débouzie, 1999; Bouhraoua et al., 2002; Sousa et al., 2005; Ben Jamâa et al., 2010). La suppression de liège a un effet négatif sur la défoliation de la couronne et donc sur la physiologie de l'arbre (Fialho et al., 2001).

Quel que soit son intensité, l‟opération de la levée du liège met l‟arbre en situation de stress physiologique étant donné que les tissus vivants du tronc et des branches sont totalement non protégés contre les agents pathogènes et les insectes (Sousa et Débouzie, 2002) et contribuent à l'attaque par les insectes, en particulier sur les arbres présentant des blessures visibles sur l'écorce. Plusieurs travaux montrent une corrélation positive significative entre la surface à blessures et la fréquence d'attaque des insectes (Delvaux et al., 2009). Les blessures accidentelles résultant d‟un déliégeage mal effectué constituent souvent une porte d‟entrée aux infestations par des agents biologiques (García Blanco, 1898; Cabral et al., 1993; Martín et al., 2005; Pereira, 2007; Franceschini et al., 2008; Moreira et al., 2012). En outre, certaines conditions météorologiques présentent pendant peu de temps après la levée du liège accroissent l‟infestation par des agents fongiques, ce qui mène à la mort de l‟arbre quelques années après le démasclage (Franceschini et al., 2008). 65

L‟absence d‟attaque de P. cylindrus dans la forêt de Adissa suscite un intérêt particulier. La situation phytosanitaire du feuillage de ce site est moyenne avec un pourcentage de jaunissement et de défoliation d‟environ 70% alors que l‟état des troncs des arbres dans ce site est plutôt bon avec 15% d‟arbres présentant des dessèchements, pourriture et écoulement. Le nombre moyen de cicatrices occasionnées est de l‟ordre de 26. Il est important de noter que le site de Adissa présente le coefficient de démasclage le plus faible avec uniquement 14 % d‟arbres présentant un coefficient supérieur à 2. Nous pouvons avancer que la présence de l‟insecte est liée à la situation phytosanitaire du tronc comme mentionné ci haut. Cependant, malgré la présence de cicatrices, les arbres n‟étaient pas réceptifs à l‟insecte. C‟est dans les caractéristiques écologiques du site que se présente l‟explication. En effet, le site de Adissa présente des conditions de développement très favorable pour le chêne liège avec des conditions de fertilité, une exposition Nord Ouest à mi versant, un sol sablo-limoneux, un climat humide à hivers doux et tempéré (température moyenne de 17°C et une pluviométrie de 900 mm) et la présence d‟un maquis très claire. Ces conditions pourraient jouer un rôle important dans la défense de l‟arbre aux attaques par les bio-agresseurs. Malgré que une opération de démasclage et des blessures sur tronc qui rendent l‟arbre plus fragile, les conditions écologiques et environnementales lui ont permis de résister.

Les températures les plus élevées se sont montrées plus favorables à l‟attaque de P. cylindrus. Plusieurs auteurs se réfèrent à ce que dans ces conditions (Liebhold et Bentz, 2011), les insectes peuvent développer des cycles de vie plus courts augmentant ainsi leurs populations, ainsi l‟intensité d‟attaque sera plus importante. En effet, les analyses multivariées ont mis en exergue les deux extrêmes de température qui sont à Tabouba caractérisés par des températures les plus élevées en moyenne par mois de l‟ordre de 28,2ºC et à Ain Soltan des températures les plus faibles par mois en moyenne de l‟ordre de 11,7ºC. Et nos résultats sont cohérents étant donnés que le pourcentage d‟attaque à Tabouba est d‟envirion 86% contrairement à Ain Soltan dont 4% des arbres uniquement sont infestés. P. cylindrus sera probablement plus favorisé par l‟augmentation des températures.

Nous avons remarqué que le pourcentage d‟attaque de l‟insecte augmente avec la latitude. L‟insecte semble être plus favorisé dans les zones côtières ce qui pourrait être bien adapté avec les insectes „ambrosia‟ qui transportent des champignons nécessitant ainsi des conditions d‟humidité et de température pour la reproduction et le développement dans les organes spécialisés et dans le bois. Des modifications dans la biologie et la distribution de certains

insectes forestiers en réponse aux changements des conditions climatiques ont déjà été observés au cours des années 30-50. Dans l'hémisphère Nord, la dispersion de certaines espèces d'insectes à la latitude nord ou à la zone plus froide a été enregistrée (Bale et Hayward, 2010; Menéndez, 2007).

Les changements se produiront pour le cycle de développement, la survie et la reproduction des insectes. Les températures estivales moyennes plus élevées devraient diminuer la durée du cycle de vie provoquant un plus grand nombre de générations chaque année et augmentater leur capacité de reproduction (Menéndez, 2007), tandis que des températures hivernales plus douces pourraient diminuer leur taux de mortalité (Ayres et Lambardero, 2000; Logan et al., 2003). Des événements d‟extrêmes fortes précipitations ou d‟extrêmes températures élevées peuvent également avoir un impact négatif sur les insectes ravageurs en augmentant leur taux de mortalité (Moore et Allard, 2008; Robinet et Roque, 2010; Robinet et al., 2013).

Concernant les précipitations, c‟est plutôt le cas contraire qui est rencontré, une réduction de la pluviométrie contribue à une augmentation de l‟infestation de certains scolytes due à l‟affaiblissement de la résistance de l‟hôte (Liebhold et Bentz, 2011). Cependant, nos résultats ont révélé que le pourcentage d‟attaque est plus élevé dans les sites ayant une moyenne élevée de précipitations annuelles, ce qui corrobore les résultats d‟une étude récente (sur l‟influence des températures et précipitation sur l‟abondance d‟un insecte ambrosia en Alaska) qui a montré que la population de l‟insecte est d‟autant plus importante que les taux de températures et précipitations sont élevées (Reich et al., 2014). C‟est le site de Ain Drahem qui présente la pluviométrie la plus élevée avec 1740 mm ainsi que le pourcentage et le taux d‟attaque les plus importants. De même Ribeiro et Surový (2008) montrent, dans le premier inventaire forestier national d'arbres morts dans les peuplements de chênes-lièges au Portugal, que les fortes précipitations sont statistiquement liées à des indices élevés de dépérissement et de mortalité des arbres. Ces deux paramètres peuvent être indispensables dans l‟interaction de facteurs qui assurent la présence et l‟abondance de l‟insecte (Campbell et Borden, 2009). Une autre explication peut être avancée, c‟est que l‟abondance des précipitations ainsi que l‟augmentation de la température peuvent avoir des conséquences négatives sur la santé de l‟arbre ce qui augmente sa vulnérabilité ainsi que sa réceptivité aux attaques par les bio- agresseurs.

Selon les résultats de ce chapitre, il serait possible de répartir la région subéricole tunisienne (Figure 2) en deux zones (i) une première formée par des forêts de la partie nord-est et sud-

est de la subéraie et une (ii) deuxième formée par les forêts de la partie centrale. En effet, la première zone se caractérise par des forêts présentant des conditions phytosanitaires assez bonnes, des conditions de fertilité favorables pour le développement du chêne-liège (sol, exposition, climat et nature du sous bois) et où les niveaux d‟infestation par P. cylindrus sont les moins importantes. Cette zone inclus les forêts de Sejnène et Bellif dans la partie Nord Est et les forêts de AinSolta, Ain Sarouia et Adissa dans la partie Sud Est. Alors que la deuxième zone englobe la partie des forêts appartenant aux séries montagneuses de Ain Drahem, Tabarka et Nefza.

Le suivi de l‟émergence de l‟insecte au laboratoire a montré que ce dernier quitte l‟arbre entre décembre et juin avec des pics en janvier, mars et avril. Ces observations sont différentes de celles réalisées par Ben Jamâa et al. (2010) qui ont rapporté que l‟insecte en Tunisie n‟est actif qu‟au printemps et en été. Elles sont aussi différentes des celles rapportées au Portugal, Algérie et Maroc (Sousa, 1996; Bouhraoua, 2003; Sousa et al., 2005). C‟est probablement les conditions du laboratoire qui ont provoqué une émergence précoce. Une étude de l‟émergence et de l‟envol des adultes, en forêt, devrait être menée affin d‟éclaircir davantage les caractéristiques biologiques de l‟insecte.

La valeur du sex-ratio qui est de l‟ordre de 0,9 montre une population équilibrée où les femelles sont légèrement plus abondantes que les mâles. Cette observation est en accord avec la valeur en Algérie qui était de l‟ordre de 0,92 (Belhoucine et Bouhraoua, 2015) mais différente de celles observées au Portugal et au Maroc où la sex-ratio est déséquilibrée en faveur des femelles (Sousa et al., 2005).

L‟identification de Xyleborus monographus et de Colydium monographus parmi les insectes qui ont émergé du tronc de chêne-liège est une première en Tunisie. Xyleborus monographus est un insecte ambrosia qui est capable de transporter certains champignons identiques à ceux véhiculés par P. cylindrus notamment Raffaelea montetyi (Gebhardt et al., 2004). L‟espèce Colydium elongatum est connue comme prédatrice d‟insectes ambrosia (Buckland et Kenward, 1973). Il a été rapporté en association avec P. cylindrus au Portugal (Ferreira et Ferreira, 1991), au Maroc (Villemant et Fraval, 1991, 1993) et en Algérie (Bouhraoua, 2003). C‟est dans les sites de Bellif et Ain Beya que ce dernier a été collecté. Les infestations des sites sont plus ou moins faibles (moins de 10%). Il est possible que C. elongatum exerce son action de prédation et contribue ainsi à la régulation de la population de P. cylindrus dans ces forêts.

2.5. Conclusion

Les attaques de P. cylindrus sont le résultat de l‟association de plusieurs facteurs qui semblent être liés entre eux. En effet, les infestations sont plus liées à l'activité d'écorçage du chêne- liège, qui affecte également l'état phytosanitaire des arbres, qu‟à la vigueur des arbres et aux conditions climatiques et édaphiques des forêts. Notre cas est totalement différent de celui de l‟Algérie où il existe une corrélation nettement positive entre l‟état phytosanitaire de l‟arbre et les attaques de P. cylindrus (Belhoucine et Bouhraoua, 2012) et de celui du Portugal où l‟insecte colonise des arbres ne présentant pas de signes de dépérissement (Sousa et al., 2005)

Dans les conditions des forêts tunisiennes de chêne-liège, cet insecte est présent à de faibles taux en comparaison avec la situation dans d‟autres pays méditerranéens (Sousa et Débouzie, 1993, Sousa et al., 1995, 2005).

Affin de comprendre la différence de comportement de l‟insecte entre la Tunisie et le Portugal (pays qui présente le plus d‟infestation), des comparaisons morphologique et génétique entre les populations de P. cylindrus des deux pays ont fait l‟objet du chapitre qui suit.

Chapitre 3:

Comparaison des caractéristiques morphologiques et moléculaires de Platypus cylindrus en Tunisie et au Portugal

3.1. Introduction

En Tunisie, Platypus cylindrus possède le statut de ravageur secondaire et ses attaques ne sont observées que sur des arbres morts ou affaiblis (Ben Jamâa et al., 2010; Bellahirech et al., 2014). Cependant, au Portugal, et depuis les années 1980 de fortes infestations ont été observées dans les peuplements sains du chêne-liège (Ferreira et Ferreira, 1989; Sousa et Débouzie, 2002; Inácio et al., 2012a). En considérant la différence de comportement de P. cylindrus dans les peuplements de chêne-liège dans les deux pays, nous allons essayer de répondre à une question fondamentale: « La différence de comportement de P. cylindrus en Tunisie et au Portugal peut-elle être expliquée par des traits génétiques et morphologiques ? ».

Afin de répondre à cette question, des analyses morphologiques et moléculaires des différentes populations ont été réalisées. Étant donné le rôle des mycangia dans la propagation des agents pathogènes, leur structure a été examinée et comparée pour l‟étude de la différenciation morphologique.

Il s‟agit d'évaluer les caractéristiques morphologiques et génétiques de P. cylindrus en tenant compte de la situation géographique et des différences de comportement, visant à clarifier la relation possible de ces paramètres avec le dépérissement des arbres. À notre connaissance, ceci est une approche innovante sur l'étude du comportement de P. cylindrus, en considérant les conditions phytosanitaires différentes des peuplements portugais et tunisiens de chêne- liège.

3.2. Matériel et méthodes

3.2.1. Echantillonnage des insectes

Les insectes ont été collectés en 2012 dans cinq peuplements de chêne-liège en Tunisie et au Portugal (Tableau 10).

Tableau 10. Localisation et paramètres des sites échantillonnés au Portugal et en Tunisie.

Age et Forêt de Coordonnées Altitude Température Pluviométrie Pays Densité du Maquis Gestion Etat sanitaire chêne-liège géographiques (m) moyenne (°C) annuelle (mm) peuplement Forêt thermophile, sous Naturelle et bois vigoureux et dense Bonne avec 36°65‟17.79”N, 100 ans, 180 coefficient de Ain Beya 375 12 600 (bruyère arborescente, quelques 8°93‟83.85”W arbres/ha démasclage myrte, filaire, dépérissements respecté calicotome, lentisque.) Recouvrement dense Naturelle et Bonne avec 36°76‟94.67”N, 120 ans, 200 (myrte, bruyère coefficient de Mzara 653 13,5 900 quelques 8°72‟04.31”W arbres/ha arborescente, filaire, démasclage Tunisie dépérissements arbousier) respecté

Moyennement Maquis très dense Naturelle et bonne avec 36°83‟59.66”N, 90 à 100 ans, (Myrte, bruyère coefficient de Babouch 207 20 920 quelques 8°70‟91.40”W 150 arbres/ha arborescente, filaire, démasclage symptômes de lentisque) respecté dépérissement

Plus ou moins 50 à 60 ans, intensive: activité Moyenne avec 40° 21′ 35″ N, Maquis naturel Chamusca 560 16,6 722 70/80 d‟élevage quelques 7° 48′ 55″ W moyennement dense arbres/ha (bovins) mais mortalités bonne gestion Portugal Intensive et labouré avec 50 à 60 ans, Végétation naturelle et Moyenne avec 39° 17′ 3″ N, activité d‟élevage Crato 251 16,4 737 40/50 plantations pour quelques 7° 38′ 40″ W (ovins) arbres/ha alimentation du bétail mortalités mais bon management

Après le démasclage (pendant les mois de juillet et août), un arbre symptomatique a été choisi au hasard dans chaque site, coupé et sectionné en trois tronçons de 50 cm d‟hauteur et installés au laboratoire. Sur chaque tronçon, deux petits pièges en tissu ont été attachés avec de la silicone au niveau des trous d'entrée de l‟insecte pour récupérer les individus lors de l‟émergence puisqu‟il s‟agit des mêmestrous de sortie (Figure 17).

Figure 17. Les étapes effectuées pour collecter les insectes : A : Arbres avec des symptômes d‟attaques de l‟insecte; B : tronçons coupés et ramenés au laboratoire; C : Pièges posées sur trous d‟entrée/sortie de l‟insecte (Photos personnelles, 2012).

3.2.2. Caractérisation morphologique

De chaque pays, 100 insectes (50 mâles et 50 femelles) ont été observés sous un stéréo- microscope affin de séparer les mâles des femelles. Leurs mycangia ont été isolés et montés entre lames et lamelles en ajoutant quelques gouttes de lactophénol pour une meilleure observation suivant les protocoles adoptés par Inácio et al. (2011).

Pour la microscopie électronique à balayage (SEM), 10 spécimens de P. cylindrus de chaque pays (5 mâles et 5 femelles), préalablement nettoyés par ultrasons, ont été revêtus d'or palladium (98: 2) (Inácio et al., 2011a) et examinés à l'aide d'un JEOL 35 SEM (JEOL Inc., Massachusetts, USA).

Analyse statistique

Les données morphologiques ont été analysées par des tests d'analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour comparer entre les sexes et les pays, et les hypothèses ont été testées pour l'homogénéité des variances en utilisant le test Levene. La plus petite difference significative (PPDS) ou LSD (Least Significant Différence) a été utilisée pour créer des groupes homogènes (logiciel Statistica 6.0, Tulsa, États-Unis).

3.2.3. Caractérisation moléculaire

 Extraction d’ADN

Avant l‟extraction de l'ADN, l‟ensemble des individus adultes (mâles et femelles) a été rincé dans de l'éthanol (70%) pendant 30 secondes puis dans de l'eau distillée pour éliminer les substances exogènes. A partir de chaque échantillon, les pattes ont été isolées, broyées dans de l'azote liquide en utilisant un micro-pilon, puis incubées à 56°C pendant une nuit dans du tampon de lyse et 100 µg/ml proteinase K. Après incubation, l‟extraction totale de l'ADN génomique a été réalisée en utilisant le kit „DNeasy blood et tissue Kit‟ (Qiagen, Hilden, Allemagne) en suivant les instructions du manuel du fabricant. La quantité d'ADN et la pureté ont été vérifiées à l'aide d'un NanoDrop 2000 spectrophotomètre UV-VIS (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

 Amplification du Cytochrome Oxidase I (COI)

L‟amplification de la région COI a été réalisée en utilisant un couple d'amorces: amorce sens (forward) LCO1490 (5'GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3') (Folmer et al., 1994) et amorce anti-sens (reverse) TL2-N-3014 (5'TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA3') (Simon et al., 1994).

Les réactions d'amplification ont été effectuées dans un volume réactionnel final de 25 μl contenant 1 μl (100 ng) d'ADN de matrice, 0,4 μM de chaque amorce et 1 x tampon de PCR

Master Mix, qui comprenait 1,5 μM de MgCl2 et 0,2 μM de chaque dNTP.

Les conditions thermiques des cycles étaient les suivantes: une température de dénaturation de 94°C pendant 2 min, une température d'annelage de 50 °C pendant 1 min et une température d'allongement de 72°C pendant 1 min pour un total de 35 cycles, suivi d'une extension finale pendant 10 min à 72°C. Les produits amplifiés ont été chargés sur un gel d‟agarose à 1,2% contenant 0,5 µg/ml de 1-bromure d'éthidium et 0,5 × EDTA Tris-borate (TBE) à une électrophorèse et un tampon en cours d'exécution à 5 V/cm.

Les amplifications ont été visualisées en utilisant le système d'imagerie Versa DocGel (Bio- Rad, USA) et ont été considérées comme un succès lorsqu‟une bande de la taille attendue a été observée. Les produits de PCR ont été nettoyés en utilisant le Kit PCR Purification Kit GeneJET (Fermentas, Allemagne) selon le protocole fournit par le fabricant.

Les amplicons ont été séquencés dans les deux senses au laboratoire de séquençage STABVida (Lisbonne, Portugal) sur un analyseur d'ADN ABI PRISM 3730xl (Applied 74

Biosystems). Les séquences de P. cylindrus ont été tout d‟abord recherchées par BLAST contre la base de données de nucléotides non redondant dans la banque des gènes (GenBank). La version 1.4.0 (Geospiza Inc.) du programme FinchTV et la version 7.2.0 du programme BioEdit (Hall, 2007) ont été utilisées pour analyser les séquences d'ADN. Les séquences consensus ont été compilées dans un seul fichier (format Fasta) et ont été alignées en utilisant ClustalW (Thompson et al., 1994).

Les alignements nucléotidiques ont été ensuite exportés vers la version 6 MEGA (Tamura et al., 2013) pour l‟estimation des distances génétiques et les analyses phylogénétiques. Les distances génétiques ont été calculées en utilisant le modèle Tamura-3-Paramètres avec un bootstrap de 1000 réplicats.

L‟arbre phylogénétique a été construit en utilisant les méthodes de maximum de vraisemblance (Maximum Likelihood-ML) et la méthode de Neighbour-Joining (NJ) avec le modèle Tamura-3-Paramètres. En utilisant le même modèle, il était possible de calculer les distances inter et intraspécifique génétiques par le programme MEGA et en effectuant les modèles de substitutions (transition et transversion).

Trois espèces références du genre Platypus (P. jansoni, P. magnus et P. geminates) ont été utilisées dans l'analyse phylogénétique comme exogroupe (outgroup). Les séquences ont été sélectionnées à partir de la base de données dans la banque des gènes (GenBank) et leurs codes d'accès ont été représentés graphiquement dans les arbres phylogénétiques.

 Amplification d’ISSR-PCR (microsatellites)

Les profils d'empreintes ISSR-PCR ont été générés en utilisant un ensemble de quatre amorces qui ont produit un polymorphisme élevé et ont montré la meilleure reproductibilité et la répétabilité d'amplification. Les amorces étaient les motifs microsatellites di- et tri- nucléotides ancrés avec une élongation de nucléotides dégénérées à l'extrémité 3 ': (GTG)3,

(GGA)7, (AG)8YT et (TG)8RT. Les réactions PCR ont été menées en utilisant le DreamTaq PCR Master Mix (2 ×) (Thermo Scientific, Vilnius, Lituanie) dans le logiciel Biometra de contrôle à distance de Thermocycleurs TGradient, (Biometra, Göttingen, Allemagne). Chaque réaction a été effectuée dans un volume final de 25 μl contenant 1 μl (100 ng) de matrice d'ADN, 0,4 μM de chaque amorce et 1 x Tampon DreamTaq PCR Master Mix, qui comprenait 1,5 mM de MgCl2 et 0,2 mM de chaque dNTP. Les conditions de cyclage thermique étaient les suivantes: température de dénaturation de 94°C pendant 2 min, une

température d'annelage de 53°C pendant 1 min et une température d'élongation de 72°C pendant 1 min pour un total de 40 cycles, suivis d'une extension finale pendant 10 min à 72°C. L'analyse par PCR de chaque ADN a été effectuée en double. Les réactions de contrôle négatif ont été réalisées en l'absence de l'ADN génomique. Les produits amplifiés ont été chargés sur un gel d'agarose à 2% contenant 0,5 µg/ml et du bromure d'éthidium 0,5 x TBE et de tampon de migration puis soumis à une électrophorèse à 5 V/cm. Les fragments d'ADN ont été visualisées en utilisant le Gel Imaging System VersaDoc (Bio-Rad, USA).

Pour l'analyse des données, un numéro de poste et une marque de 1 ou 0 en fonction de la présence ou de l'absence de la bande a été attribué à chaque bande avec une mobilité électrophorétique différente. Seulement les bandes reproductibles ont été considérées pour l'analyse. Les bandes communes à tous les isolats ont été exclues de l'analyse.

Les individus ont été regroupés sur la base de leurs profils dans un dendrogramme construit en se basant sur une taxonomie numérique et une analyse multi-variée (NTSYSpc-Version 2.02) en utilisant le coefficient DICE et la méthode de Neighbour-Joining (NJ). En plus de l'analyse de cluster par NJ, la méthode de „UPGMA‟ par les moyennes arithmétiques a été appliquée sur les mêmes ensembles de données.

Les observations morphologiques et la caractérisation moléculaire ont été réalisées à l‟INIAV-IP, Oeiras, Portugal.

3.3. Résultats

3.3.1. Caractérisation morphologique

L'observation microscopique des mycangia a confirmé la présence de plusieurs structures ovoïdes chez les deux sexes des insectes des deux pays (Figures 18, 19).

Figure 18. Photos de microscope électronique à balayage des mâles de Platypus cylindrus du Portugal (A) et de la Tunisie (B); le mycangia est signalé par un cercle blanc. 76

Figure 19. Photos de microscope optique de mycangia de Platypus cylindrus adultes tunisiens et portugais montrant de multiples cavités sphéroïdes: (a) femelle tunisienne; (b) femelle portugaise; (c) mâle tunisien; (d) mâle portugais.

Le comptage des cavités sphéroïdes a montré que les mycangia sont plus développés chez les femelles que chez les mâles, pour les deux pays, respectivement [F (98,1) = 5,034; P < 0,0001;

F (98,1) = 8,343; P < 0,0001]. Aucune différence statistiquement significative entre les populations tunisiennes et portugaises n‟a été trouvée pour les mâles (F (98,1) = 1,47; P = 0,2269) et les femelles (F (98,1) = 0,85; P = 0,3589) (Figure 20). Ces résultats ont été validés puisque les hypothèses d'analyse de la variance (ANOVA) ont été remplies.

Figure 20. Comparaison entre le nombre de mycangia chez Platypus cylindrus mâle et femelle au Portugal et en Tunisie.

3.3.2. Caractérisation moléculaire

 Séquences de gène COI

L'amplification de l'ADN pour le gène COI, en utilisant des amorces LCO1490 et TL2-N- 3014 a généré un fragment d'environ 1,5 Kb (Figure 21). Ces bandes ont été séquencées et analysées. De haute qualité des chromatogrammes d'ADN, sans ambiguïtés de bases ont été observées dans toutes les séquences du COI. Ainsi, les produits de PCR n‟ont pas été clonés.

Figure 21: Révélation sur gel d‟agarose des produits d‟amplification par PCR spécifique à la région COI. M : Marqueur d‟ADN (GeneRuler 1kb DNA Ladder, Fermentas) ; C : Témoin ; 1-7 : produits du PCR.

Les séquences obtenues ont une longueur totale de 1418 pb et ont été soumises à la base de données NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) sous les numéros de dépôts de KP297967 à KP297974. L'alignement des séquences COI a montré un pourcentage élevé de sites identiques (99%) indiquant une variation très faible de la composition nucléotidique, sans insertion ou suppression, mais uniquement des substitutions. L‟arbre phylogénétique basée sur les séquences COI a été obtenue et les distances évolutives entre 9 séquences de P. cylindrus, dont une de la séquence de référence et trois autres séquences d'autres espèces du même genre, ont été conçues (figure 22).

Le phylogramme a révélé un groupe principal avec une valeur de bootstrap de 100%, contenant tous les individus d'espèces P. cylindrus.

Figure 22. Arbre phylogénétique des séquences COI de Platypus cylindrus. L'histoire de l'évolution a été déduite en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle Tamura-3-Paramètres.

Le pourcentage d'arbres répétés dans lesquelles les espèces regroupées dans la procédure d'amorçage (1000 réplicats), est indiqué à côté des branches. L'analyse a porté sur 12 séquences nucléotidiques. Il y avait un total de 728 postes dans l'ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été menées dans MEGA6.

L'analyse phylogénétique a également montré que le groupe principal peut être divisé en trois sous-groupes, un premier comprenant tous les individus en provenance du Portugal, un deuxième groupe contenant les individus des sites Mzara et Babouch et un troisième groupe ne comprenant que les individus d‟Ain Beya. La divergence de séquence a varié de 0 à 1% entre les individus.

 Analyse des ISSR-PCR

En se basant sur les profils des ISSR-PCR (simple répétition de séquence interne de réaction de chaîne polymérase), des profils de bandes distinctes entre 0,2 et 2,0 kb ont été obtenus pour les quatre amorces, résultant en un total de 39 positions différentes de bandes. Un dendrogramme de consensus a été obtenu à partir de l'analyse des profils générés par les quatre amorces (Figure 23). L'analyse de regroupement (UPGMA) au niveau de 56% des 79

similitudes génétiques partage les individus en deux grands groupes. Le premier groupe est composé des individus de P. cylindrus de la Tunisie alors que le second est constitué de ceux du Portugal. Cette analyse permet un regroupement cohérent des individus en fonction de la situation géographique.

Figure 23. Analyse ISSR-PCR de Platypus cylindrus: Consensus dendrogramme avec les

amorces (GTG)3, (GGA)7, (AG)8YT et (TG)8RT effectuée dans NTSYSpc2 utilisant le coefficient de corrélation de DICE et UPGMA.

3.4. Discussion

Aucune différence significative n'a été observée entre le nombre de puits de mycangia chez les adultes de P. cylindrus mâles et femelles des deux pays, Portugal et Tunisie comme déjà obtenus dans de précédentes études (Cassier et al., 1996; Sousa et al., 2005; Inácio et al., 2011a; Belhoucine et al., 2013), les femelles abritent plus de puits dans leur mycangia que les mâles.

Compte tenu de leur importance comme structures spécialisées pour le stockage et le transport des champignons symbiotiques (Batra, 1963; Berryman et al., 1989), la similitude morphologique des mycangia des insectes des deux pays peut correspondre à une potentielle similitude pour la dispersion et l'inoculation des champignons.

Etant donné que les champignons symbiotiques servent à la fois pour la nourriture des larves qu‟a vaincre la défense des arbres par les agents pathogènes de bois, la quantité de propagules fongiques sera décisive dans la colonisation de l'arbre hôte. En outre, le mycobiota associé à P. cylindrus dans les peuplements de chêne-liège portugais et tunisiens a été révélé similaire, même si les divers genres ont été isolés dans des proportions différentes dans les deux régions (Inácio et al., 2012a; Bellahirech et al., 2014). Les champignons Ophiostomatales ont été identifiés comme les principaux champignons symbiotiques associés à P. cylindrus dans les deux pays, ce qui confirme la stabilité de cette association et le rôle clé de transport dans les mycangia (Inácio et al., 2012b; Bellahirech et al., 2014).

Ces résultats rejettent l'hypothèse que les différences morphologiques possibles dans le mycangia des populations notamment concernant le nombre de petits puits expliqueraient la différence d‟agressivité des insectes dans les deux pays.

Les relations génétiques entre les populations de différentes localisations géographiques ont été analysées par simple répétition de séquence interne de réaction de chaîne polymérase (PCR-ISSR) et en utilisant les marqueurs de gène de la sous-unité I du cytochrome oxydase mitochondriale de (COI). Les deux marqueurs moléculaires ont été largement utilisés dans l‟étude de la variabilité génétique, de la structure de la population et des études de phylogénie des différents ordres d'insectes (Borba et al., 2005; Taylor et al., 2011; Velonà et al., 2011). Le haut degré de polymorphisme des marqueurs ISSR-PCR, qui sont rapidement et efficacement sensibles, permet une bonne différenciation entre des individus étroitement liés (Zietkiewicz et al., 1994).

La capacité élevée de substitution de nucléotides dans le gène mitochondrial COI a été utilisée pour évaluer les populations génétiquement hétérogènes au sein d'une espèce donnée et elle est fréquemment utilisée pour le profil des organismes en raison de la disponibilité des amorces universelles pour ce gène et une grande variété d‟indicateurs phylogénétiques (Folmer et al., 1994; Simon et al., 1994; Hebert et al., 2003). Ces avantages permettent la distinction non seulement des espèces étroitement liées, mais aussi des groupes phylogéographiques au sein d'une même espèce.

Dans divers groupes d'insectes, des informations de séquences nucléotidiques de plusieurs régions du gène de l'ADN mitochondrial ont été utilisées pour évaluer les relations phylogénétiques soit entre des espèces étroitement liées ou entre des populations

génétiquement hétérogènes d'une seule espèce car ces régions présentent des taux suffisamment élevés de substitution nucléotidique (Ito et al., 2011).

De ces régions de gènes, COI en particulier, a été le plus fréquemment utilisé dans l'analyse phylogénétique (Smith, 2005). Dans ce contexte, le présent travail représente une étude innovante sur les populations de P. cylindrus du Portugal et de la Tunisie, où la séquence nucléotidique de la région COI des individus a été déterminée et un alignement de 1420 paires de base a été obtenu.

Les différences entre les séquences étudiées de COI obtenus à partir de P. cylindrus provenant des deux pays ne sont pas significatives. Comme l'a déclaré Ptaszyńska et al. (2012), la diversité génétique au sein ou entre les populations en comparaison avec celles qui se produisent parmi les espèces, est généralement très faible et le degré de divergence est indépendant de la localisation des échantillons, à savoir, la similitude entre toutes les populations ne pouvait pas être liée à l'origine géographique. D‟autres auteurs ont montré que la phylogéographie de la population d‟insectes ravageurs est clairement liée à l‟historique de la plante hôte (Burban et al., 1999). Dans notre étude, les 1420 nt de long de fragment de COI indiquent une similarité de séquence de 99% parmi les populations. De ces résultats, nous pouvons conclure que les polymorphismes dans la région COI sont très faibles et conservés entre les populations.

Basé sur les différents profils de bandes observées pour les quatre amorces, un dendrogramme a été obtenu et montre que les populations tunisiennes et portugaises sont regroupées en deux groupes séparés avec un pourcentage de similitude de 56% ca. Les résultats obtenus ici contribuent à la connaissance de la variation génétique de P. cylindrus et sa corrélation avec les distributions géographiques, cependant la relation possible avec le déclin de l'hôte n'a pas pu être révélée. En effet, comme mentionnés par certains auteurs (Ploetz et al., 2013), lorsque les infestations des insectes „ambrosia‟ sont associées à un dépérissement de l'arbre hôte, un large éventail d'interactions est évident. De nombreux paramètres liés à la dynamique de population des insectes, l'état sanitaire et les stratégies de gestion des plantes hôtes doivent être analysés.

La récolte de liège est une pratique forestière spécifique aux forêts méditerranéennes qui est un facteur contraignant pour l'arbre, en particulier parce qu'elle est effectuée pendant la période la plus stressante de l'année où les températures quotidiennes augmentent, et aussi parce que les arbres démasclés deviennent plus vulnérables à des agents pathogènes et des 82

insectes ravageurs et aux accidents environnementaux, tels que les incendies (Oliveira et Costa, 2012). Au Portugal, le coefficient d'écorçage du bois est supérieur à celui observé en Tunisie (Pereira et Tomé, 2004; Chaar et al., 2009).

Au Portugal, les subéraies sont soumises à une exploitation intense, caractérisée par la pratique de l‟agriculture céréalière essentiellement pour l‟alimentation du cheptel. Les labours conduisent à une perturbation au niveau du sol (élagage excessif, section des racines). Ces pratiques réduisent la densité des arbres à l‟hectare, soumettant le sol à un ensoleillement intense créant une atmosphère sèche et nocive au chêne-liège (Ben Jamâa et Piazzetta, 2010). Le déliégeage excessif au Portugal avec l‟augmentation du coefficient de déliégeage et le démasclage des grosses branches (Pereira et Tomé, 2004) en plus de la densité des peuplements de chêne-liège (Tableau 10) induisent d‟importantes perturbations physiologiques de l‟arbre (Sousa et Kadiri, 2005) et une diminution des meilleurs conditions de son développement. En Tunisie, c‟est surtout le phénomène de surpâturage qui entraine le disfonctionnement de l‟écosystème naturel, en induisant une diminution de la régénération naturelle, un compactage du sol et une réduction de sa perméabilité (Stiti et al., 2005). Bien que le coefficient de déliégeage soit inférieur à la valeur théorique (2,5) recommandée dans les cas des subéraies humides (Boudy, 1955; Chaar et al., 2009), les arbres de chêne-liège sont toujours réceptifs à l‟attaque par l‟insecte. Dans ce cas, c‟est l‟opération de démasclage qui est mal effectuée par manque de main d‟œuvre qualifiée, ce qui place l‟arbre sous stress et favorise l‟attaque des insectes xylophages (Ben Jamâa, 2014). Une gestion sylvicole adéquate doit être entreprise pour assurer le rajeunissement et la durabilité des peuplements de chêne- liège.

En outre, le changement climatique pourrait aussi avoir un effet déterminant sur le comportement des insectes, en particulier les températures extrêmes et le manque de précipitations au Portugal, ce qui n‟est pas le cas en Tunisie où les conditions sont plus douces dans les forêts de chêne-liège et le climat est humide avec un hiver tempérée.

3.5. Conclusion

Le but de ce chapitre était de comparer les traits morphologiques et génétiques des populations tunisiennes et portugaises de P. cylindrus afin de comprendre leur rôle dans la différence de comportement de l‟insecte dans les pays. L'information pourrait être utilisée comme un nouvel outil pour mettre en œuvre des mesures de protection. Les résultats ont montré un niveau très faible de polymorphisme intraspécifique et de diversité génétique. 83

L'alignement des séquences COI a montré un pourcentage élevé de similitude entre les sites (99%) indiquant une variation très faible de la composition nucléotidique. D‟autre part, les traits morphologiques des mycangia femelles et mâles ont été déterminés, mais aucune différence significative n'a été trouvée entre les populations des deux pays.

D'autres variables liées à l'écologie de l'insecte et les champignons qui lui sont associés doivent être étudiés pour une meilleure compréhension des différences dans le comportement (agressivité) de l'insecte dans les pays méditerranéens.

Chapitre 4 :

Etude des champignons associés à Platypus cylindrus dans les subéraies tunisiennes

4.1. Introduction

Les champignons jouent un rôle clé dans le fonctionnement des écosystèmes. Leur présence peut être bénéfique, mais peut aussi conduire à des conséquences dévastatrices à d'autres organismes et à l'environnement. Certains peuvent êtres pathogènes tandis que d‟autres établissent des relations de mutualisme avec des plantes ou des animaux. Les champignons peuvent jouer le rôle de décomposeurs de la matière organique, d‟alimentation pour les insectes et d‟autres animaux ainsi que d‟agents de lutte biologique contre certains ravageurs (Sace, 2010).

Durant les dernières décennies, l‟insecte Platypus cylindrus a été observé sur des arbres sains de chêne-liège au Portugal (Ferreira et Ferreira, 1989; Sousa et Débouzie, 2002; Inácio et al., 2012a), au Maroc (Villemant et Fraval, 1993; Sousa et al., 2005) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011), entrainant la dépréciation de l‟état phytosanitaire de l‟arbre et conduisant ainsi à sa mort. Etant un insecte ambrosia, il est capable d‟établir des relations symbiotiques avec des champignons qu‟il inocule dans l‟arbre. L‟importance et le rôle de ces champignons sont très variables. Certains peuvent jouer le rôle d‟alimentation, d‟autres peuvent être pathogènes pour le chêne-liège alors que d‟autres sont antagonistes à d‟autres champignons ou simplement des saprotrophes qui sont présents en commensalisme avec l‟arbre hôte (Inácio et al., 2011a). Les insectes ambrosia peuvent toujours être associés à plus d‟une espèce de champignons qui forment un complexe fongique et peuvent présenter une variation dans l‟espace et dans le temps dépendant de plusieurs facteurs (Klepzig et Six 2004; Lieutier et al., 2009). C‟est dans ce contexte que s‟inscrit ce chapitre dont l‟objectif est l‟étude des champignons associés à l‟insecte en mettant l‟accent sur les champignons connus phytopathogènes pour éclaircir leur rôle dans le dépérissement du chêne-liège.

4.2. Matériel et méthodes

4.2.1. Sites d’étude

Le matériel biologique pour l‟étude des champignons a été collecté dans les forêts qui ont fait l‟objet de l‟étude du comportement de P. cylindrus (Chapitre 2). Sur un total de 15 forêts, l‟étude des champignons associés au platype a été réalisée pour dix sites. Les trois sites de l‟année 2010 et uniquement sept sites (parmi douze) de l‟année 2011 (Figure 24). Les sites choisis ont été démasclés l‟année qui précède l‟échantillonnage.

Figure 24. Sites d‟échantillonnage pour l‟étude de la mycétophagie de Platypus cylindrus dans la région du Nord Ouest de la Tunisie.

4.2.2. Collecte du matériel biologique

De chaque site, un arbre fortement infesté a été abattu et la partie démasclée à été coupée en tronçons de 50 cm et ramenés au laboratoire.

Une couche de paraffine a été appliquée sur les surfaces des tronçons afin d‟éviter leur dessèchements.

 Collecte des insectes

Pour capturer les insectes nous avons procédé de deux manières. Pendant l‟année 2010, cinq trous de pénétration dans chaque tronçon ont été sélectionnés au hasard pour y installer un petit tube fermé à l‟une de ses extrémités par une pochette en tissu laissant passer l'air, afin de maintenir l'humidité et la température constantes (Figure 8.a). La surface de contact est isolée par un joint en silicone (Sousa et Débouzie, 2002) (Figure 8.a). Pendant l‟année 2011, nous

avons mis tout le tronçon dans un sac en tissu pour pouvoir capturer le maximum d‟insectes qui peuvent émergés (Figure 8.b).

Tous les insectes collectés ont été observés sous une loupe binoculaire, mâles et femelles ont été séparés et leurs mycangia ont été délicatement isolés en suivant la méthode adaptée par Sousa et al. (1997) et Inácio et al. (2008) (Figure 25).

Figure 25. Isolement des mycangia de Platypus cylindrus (Photos personnelles, 2011).

 Collecte des galeries

Les tronçons de 50 cm ont été coupés en rondelles de 5 cm puis découpées en petits morceaux cubiques et les galeries sont ainsi isolées (Figure 26).

1 2 3 4

Figure 26. Collecte des galeries de Platypus cylindrus. 1. Tronçons infestés par l‟insecte. 2. Rondelles de 5 cm. Galeries transversales de P. cylindrus. 4. Morceaux de bois contenant les galeries (Photos personnelles, 2011).

4.2.3. Isolement des champignons

Les fragments de galeries et les mycangia des insectes ont été stérilisés pendant une minute dans une solution d‟hypochlorite de sodium (1%), puis rincés à l‟eau distillée et placés par la

suite individuellement sur un papier filtre (Cassier et al., 1996). Le matériel végétal est placé par la suite dans un milieu de culture PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) dans une boite de Pétri contenant de la streptomycine de sulfate et de la cycloheximide (500 mg/l). Le dernier a été utilisé pour distinguer les champignons appartenant à l‟ordre des Ophiostomatales (Raffaelea/Ophiostoma) (Harrington, 1981; Harrington et al., 2010). Les boites de Pétri ont , ensuite, été placées à l‟obscurité dans un incubateur à 25 °C.

4.2.4. Identification des champignons

Les champignons obtenus ont été groupés selon leurs caractères macroscopiques (aspect des colonies, couleur, texture). L‟identification jusqu‟au niveau du genre a été effectuée en se basant sur les caractéristiques culturales et microscopiques selon Ellis (1971, 1976), Kiffer et Morelet (1997) et Barnett et Hunter (1998). L‟identification spécifique des champignons appartenant à l‟ordre des Ophiostomatales, par une analyse moléculaire a été réalisée et sera détaillée dans le chapitre qui suit.

4.2.5. Analyse statistique

Une analyse ANOVA a été appliquée pour étudier les champignons isolés pendant l‟année 2010. Par contre, les champignons isolés à partir des galeries et des insectes pour l‟année 2011 on été étudiés par l‟analyse en composantes principales (ACP) et leur diversité a été évaluée par l‟indice de Shannon-Weaver (H‟). L‟indice combine deux composantes relatives à la richesse et à l‟abondance. Il a été calculé à l‟aide de l‟équation H‟= -∑ ρi ln ρi, où ρi est l‟abondance relative des champignons du ième genre comparé avec les autres genres identifiés dans un échantillon. Les données des fréquences des différents champignons isolés aussi bien des insectes que des galeries (en pourcentage) on été transformées par la formule arc-sinus de la racine carrée avant l‟analyse ANOVA. Le logiciel utilisé était Statistica 6.0 software (Tulsa, USA).

4.3. Résultats

4.3.1. Principaux genres de champignons isolés

De nombreux champignons appartenant aux Ascomycota et aux Zygomycota, ont été obtenus à partir de l‟insecte et des galeries. La majorité de ces champignons, à l‟exception des Mucorales, ont été classés dans les ordres des Botryosphaeriales, Eurotiales, Hypocréales, Ophiostomatales et Xylariales. Les observations microscopiques de quelques champignons sont présentées dans la figure 27. 89

Acremonium sp. (x400) Trichoderma sp. (x400) Penicillium sp. (x400)

Gliocladium sp. (x400) Aspergillus sp. (x600) Raffaelea sp. (x400)

Figure 27. Conidies et conidiophores de quelques champignons isolés à partir du mycangia et des galeries de Platypus cylindrus.

La plupart des champignons isolés, présentent une structure morphologique qui permet de les identifier. Dans le tableau 11, nous présentons les principaux caractères culturaux des champignons isolés.

Tableau 11. Caractéristiques culturales des champignons identifiés.

Genre fongique Aspect Densité Couleur Zonation

blanc, jaune, Aspergillus poudreux importante plusieurs nuances faible ou absent de vert ou noir

Penicillium poudreux importante vert au marron radial

jaune sulfureux légèrement Gliocladium feutré importante au jaune clair concentrique

déversé, crémeux, couleur de la légèrement avec un peut de crème, vert Raffaelea moyenne concentrique ou mycélium feutré dans d‟olive pale ou absent le centre de la colonie éclatant

Fusarium Cotonneux, déversé importante blanche absent

Vert jaunâtre, Trichoderma Déversé, floconneux moyenne avec des flocons concentrique blancs

Acremonium déversé, feutré importante blanchâtre absent

Mucorales cotonneux importante blanchâtre radial

Le tableau 12 représente les champignons isolés des galeries, des larves et des mycangia.

Tableau 12. Champignons isolés à partir de l‟insecte et des galeries.

Isolats Mycangia de P. Larves de P. Galeries cylindrus cylindrus Ordre Genres

Botryosphaeriales Botryosphaeria x - x

Aspergillus x x x

Eurotiales Penicillium x x x

Paecilomyces x x x

Acremonium x x x

Gliocladium x x x Hypocreales Trichoderma x x x

Fusarium - - x

Raffaelea x x x Ophiostomatales Ophiostoma x x x

Xylariales Biscogniauxia x x x

4.3.2. Etude des champignons isolés au niveau des sites

Un total de 595 isolats a été obtenu des sites échantillonnés pendant l‟année 2010 (El Jouza, Tabouba et Ain Drahem). La figure 28 représente les proportions des champignons qui ont été isolés aussi bien des galeries que des insectes pour tous les sites.

Acremonium

Trichoderma Aspergillus

Botryosphaeria

Raffaelea Gliocladium

Penicillium

Figure 28. Pourcentage des genres de champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries pendant l‟année 2010.

L‟analyse statistique n‟a pas montré de différence significative entre les sites. Tous les genres identifiés se trouvent dans tous les sites. D‟après la figure 28, le genre le plus présent est celui Raffaelea (29%) suivi des genres Penicillium, Trichoderma et Botryosphaeria.

L‟ordre des Ophiostomatales représenté par le genre Raffaelea est plus présent dans la forêt de El Jouza que celles de Tabouba et Ain Drahem avec des pourcentages respectivement de 22,6; 11,4 et 6,25%. Toutefois, c‟est la forêt d‟Ain Drahem qui présente plus d‟isolats (320) que Tabouba et El Jouza dont le nombre d‟isolats est respectivement est 40 et 35 (Figure 29).

Ain Drahem Tabouba El jouza

35 40

320

Figure 29. Répartition des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries pendant l‟année 2010 dans les trois forêts de chêne-liège étudiées. 93

Durant l‟année 2011, les analyses des résultats sont en revanche plus détaillées et portent sur sept sites (Annexe 3). Les champignons isolés (n = 249) ont été étudiés par site et par lieu d‟isolement (galeries (34) et insectes (508).

L‟Analyse en Composantes Principales (ACP) a permis d‟expliquer 65% de la variabilité entre les différents sites pour les champignons isolés. Trois „groupes‟ sont ainsi apparus (Figure 30):

 Un premier groupe formé par les genres: Acremonium et Fusarium.  Un deuxième groupe formé par les genres: Aspergillus, Biscogniauxia, Gliocladium, Mucorales, Ophiostoma et Raffaelea (ordre des Ophiostomatales), Paecilomyces et Penicillium.  Un troisième groupe formé uniquement par le genre Trichoderma.

Figure 30. Distribution des champignons isolés à partir de Platypus cylindrus et de ses galeries sur les sept sites étudiés pendant l‟année 2011.

 Diversité des champignons entre les sites

La figure 31 montre la diversité des champignons isolés et leurs proportions dans chaque site.

Nous remarquons aussi que les sites d‟Ain Sarouia, Ain Beya, Oued Zen et Mzara présentent une diversité majeure (H‟ ≥ 2), avec plus de genres de champignons que les autres sites, et particulièrement le site de Séjnène (H‟ = 1) (Figure 31).

Ain Beya Ain Sarouia

Babouch Belif

Oued Zen Mzara Sejnène

Figure 31. Diversité des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries dans chaque site.

 Distribution des champignons entre les sites

L‟analyse de la variance de tous les champignons pour tous les sites a montré qu‟il n‟y a pas de différence significative entre les sites (F(301,6) = 0,9098; P = 0,488034) de point de vue fréquence de présence de chaque espèce. De même, il n‟y a pas de différence significative entre les sites pour les différents champignons isolés à partir des galeries (F (70,6) = 1,2316; P

= 0,3008) et même pour ceux isolés à partir des insectes (F(224,6) = 0,2915; P = 0,9406). Par contre, il existe une différence hautement significative dans l‟ensemble des sites pour la fréquence de présence de chaque espèce de champignon (F(297,10) = 7,6010; P < 0,0001 ***). L‟analyse LSD pour ces champignons a mis en exergue la dominance du genre Penicillium (Figure 32).

d a c ab bc ab a bc ab

Figure 32. Fréquences des champignons associés à Platypus cylindrus et à ses galeries isolés de sept forêts de chêne-liège en Tunisie en 2011. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

En éliminant le genre Penicillium, qui est un champignon cosmopolite, les analyses ont révélé une différence hautement significative entre le reste des champignons (F(270, 9) = 4,1946; P < 0,0001***), avec une distinction des champignons Ophiostomatales (Raffaela et Ophiostoma) qui se montrent aussi fréquents que le genre Aspergillus (Figure 33).

Figure 33: Fréquence des champignons associés à Platypus cylindrus et à ses galeries, en éliminant le genre Penicillium. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les champignons suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

100%

75%

50%

Pourcentage de présence Pourcentage 25%

male

larve

gallerie

femelle

femelle femelle

Ain Beya Ain Sarouia Babouch Belif Mzara Oued Zen Sejnène Lieu d'isolement des champignons

Figure 34. Répartition des champignons Ophiostomatales sur les sites étudiés.

Les champignons Ophiostomatales sont présents dans tous les sites (Figure 34). Les sites de Babouch, Oued Zen et Mzara présentent plus d‟effectifs d‟Ophiostomatales contrairement aux sites de Ain Beya et Ain Sarouia où la présence des Ophiostomatales est plus faible.

La figure 34 montre que ces champignons ont été isolés aussi bien des galeries que de l‟insecte avec des proportions différentes entre les sites. En effet, c‟est à la forêt de Babouch que 100% des galeries et le plus d‟insectes adultes (mâle et femelle) contiennent des champignons Ophiostomatales. C‟est uniquement dans le site de Ain Beya, que ces champignons ont été isolés à partir des larves.

4.3.3. Etude des champignons selon le lieu d’isolement (galeries et insectes)

Après avoir étudié les champignons isolés dans l‟ensemble des sites, nous avons ensuite analysé les différents genres obtenus du point de vue fréquence et diversité selon le lieu d‟isolement notamment le bois et les insectes (mâles, femelles et larves).

 Diversité des champignons selon le lieu d’isolement

Du point de vue diversité, le calcul de l‟indice de Shannon-Weaver de diversité écologique à montré que les champignons isolés à partir des insectes sont légèrement plus diversifiés (H‟ = 1, 5) que ceux isolés à partir des galeries (H‟ = 0,9) (Figure 35).

Trichoderma Acremonium TrichodermaStreptomyces AspergillusAcremonium Acremonium

Trichoderma BiscogniauxiaAspergillus Acremonium Fusarium Streptomyces Acremonium Trichoderma Aspergillus FusariumBiscognirauxia Fusarium Aspergillus Trichoderma Aspergillus Biscognirauxia Fusarium Gliocladium Fusarium Gliocladium Gliocladium Mucorales Mucorales GliocladiumMucorales Gliocladium Ophiostomatales Ophiostomatales Penicillium Mucorales Ophiostomatales Penicillium Mucorales Penicillium Penicillium Ophiostomatales Penicillium Ophiostomatales

Paecilomyces A A B B PaecilomycesPaecilomyces

Figure 35. Diversité des champignons isolés à partir de Platypus cylindrus (A) et de ses galeries (B) dans l‟ensemble des forêts étudiées.

D‟après la figure 35, les insectes présentent 11 genres de champignons isolés alors que dans les galeries, nous avons noté l‟absence des genres Biscogniauxia et Paecilomyces.

Du point de vue fréquence, les analyses statistiques ont montré une différence hautement

significative (F(304,3) = 28,0543; P < 0,0001 ***) entre les galeries et les insectes avec une distinction des galeries (Figure 36).

100

40%

35% a

30%

25%

20%

15%

Fréquence des champignons des Fréquence 10% b bc 5% c 0% gallerie femelle male larve Lieu d'isolement

Figure 36. Répartition des champignons isolés de Platypus cylindrus et de ses galeries dans sept forêts de chêne-liège en Tunisie en 2011. Les lettres sur les histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes ayant la même lettre appartiennent au même groupe.

Les champignons isolés à partir des galeries sont plus fréquents que ceux isolés à partir des différents stades de l‟insecte.

 Champignons isolés à partir des galeries

Une différence hautement significative entre les champignons isolés à partir des galeries a été observée (F(66,10) = 9,3152; P < 0,0001 ***), avec une distinction du genre Penicillium (Figure 37).

101

Figure 37. Champignons isolés à partir des galeries de P. cylindrus en Tunisie. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

La figure 37 montre l‟absence des genres Biscogniauxia et Paecilomyces dans les galeries. Les genres Trichoderma, Gliocladium et Aspergillus en plus de l‟ordre des Ophiostomatales forment un groupe qui se maintient même si on élimine le genre Penicillium.

 Champignons isolés à partir des insectes

A partir des insectes, entre mâles, femelles et larves, il y a une différence significative pour les champignons isolés (F(228,2) = 6, 7886; P < 0,0001 ***), en faveur des adultes par rapport aux larves (Figure 38).

102

Figure 38. Fréquence de présence des champignons isolés à partir des adultes et larves de Platypus cylindrus. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

La figure 38 montre que les champignons sont beaucoup plus présents au niveau des adultes que sur les larves. D‟autre part, il existe une différence hautement significative entre les champignons isolés à partir des insectes (F(220, 10) = 5, 2511; P < 0,0001 ***) avec une forte abondance du genre Penicillium (Figure 39).

103

Figure 39. Les champignons isolés à partir de Platypus cylindrus. Les lettres à coté des histogrammes représentent les groupes homogènes d‟après l‟analyse post-hoc LSD. Les histogrammes suivis par la même lettre appartiennent au même groupe.

En éliminant, le genre Penicillium, ce sont les Ophiostomatales ainsi que le genre Aspergillus qui sont les plus abondants et qui présentent une différence hautement significative par rapport aux autres genres isolés. Nous constatons une différence significative entre les insectes en faveur des adultes par rapport aux larves (F(207,2) = 5, 7211; P = 0,0038**).

En considérant uniquement les champignons appartenant à l‟ordre des Ophiostomatales, nous avons remarqué qu‟il existe une différence significative entre les mâles, les femelles et les larves (F(18,2)= 3, 6956; P = 0,0452*) (Figure 40).

104

Figure 40. Fréquence des champignons Ophiostomatales isolés à partir de Platypus cylindrus des différents sites étudiés.

La figure 40 montre que les Ophiostomatales ont été plus isolés à partir des femelles que des mâles et encore moins chez les larves.

4.4. Discussion

L‟étude de la faune fongique en association avec Platypus cylindrus a permis d‟obtenir différents genres notamment : Acremonium, Aspergillus, Biscogniauxia, Botryosphaeria, Fusarium, Gliocladium, Paecilomyces, Penicillium et Trichoderma en plus des Mucorales et des Ophiostomatales.

Les analyses ont montré qu‟il n‟y a pas de différences significatives entre les sites du point de vue fréquence de leur présence. Cependant, l‟indice de Shannon-Weaver a révélé qu‟il existe des sites renfermant plus de genres que d‟autres. En effet, c‟est le site de Ain Beya avec 9 genres qui se présente en tête suivi par le site de Mzara avec 6 genres et Ain sarouia et Bellif avec chacun 5 genres.

L‟isolement à partir du bois (galeries des insectes) a permis d‟obtenir plus d‟isolats qu‟à partir des insectes, alors que du point de vu diversité ce sont les insectes qui sont plus riches en isolats. Les genres obtenus à partir des mâles, femelles et larves de P. cylindrus sont plus

105

nombreux (11genres) que ceux à partir du bois (8 genres). Ces résultats corroborent ceux trouvés au Portugal (Inácio et al., 2011a).

Nos résultats ont montré que les femelles transportent plus de champignons que les mâles et les larves de point de vue fréquences et diversité. Cette observation a été, également, rapportée au Portugal (Inácio et al., 2010a) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011). Ceci peut être dû au fait que le mycangia est plus développé chez les femelles que chez les mâles (Cassier et al. 1996; Sousa et Inácio, 2005; Bellahirech et al., 2016). Dans cette étude, les isolements à partir des larves n‟ont pas permis d‟avoir des fréquences importantes de champignons ce qui est dû aux faibles effectifs de larves récupérées à partir des tronçons.

L‟analyse en composantes principales a permis de classer les champignons en trois groupes dont un premier qui contient les genres Acremonium et Fusarium, un deuxième renferme les genres Aspergillus, Biscogniauxia Gliocladium, Paecilomyces et Penicillium ainsi que les Mucorales et des espèces de l‟ordre des Ophiostomatales, et un troisième groupe formé par le genre Trichoderma.

Le genre le plus abondant était Penicillium isolé aussi bien à partir du bois que des insectes dans tous les sites. Ce genre a été déjà rapporté en association avec P. cylindrus et ses galeries en France (Cassier et al., 1996), au Portugal (Sousa et al., 1997, Henriques et al. 2009) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011). Le genre se rencontre plus dans les galeries plus que sur l‟insecte. En Tunisie, ce genre a été antérieurement rapporté sur chêne-liège (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996). Malgré qu‟il soit connu comme champignon saprotrophe, le genre Penicillium peut contenir des espèces entomopathogènes. En effet, des extraits et des métabolites secondaires purifiés de plusieurs isolats de Penicillium ont été examinés pour leur effet insecticide contre Drosophila melanogaster et Spodoptera littoralis (Paterson et al., 1987). De plus, l‟effet de P. corylophilum a été examiné dans la recherche d‟un agent de lutte biologique contre des Triatominae, vecteurs de la maladie de Chagas (Costa et al., 2003). Cependant, une étude plus récente a été menée pour estimer l‟effet entomopathogène de quatre espèces de Penicillium sur Platypus quercivorus au Japon, elle n‟a pas permis de confirmer l‟effet insecticide de ces champignons (Hong-ye et al., 2011).

Un autre champignon connu comme saprotrophe a aussi été isolé aussi bien à partir des galeries que des insectes dans tous les sites étudiés à savoir Aspergillus. Ce genre a été déjà rapporté sur chêne-liège en Tunisie (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996) et aussi isolé sur P. cylindrus et ses galeries au Portugal (Sousa et Inácio, 2005; Henriques, 2007), au Maroc 106

(Sousa et al., 2005) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011). En plus de son aspect cosmopolite, ce champignon pourrait contribuer à l‟alimentation des insectes à l‟intérieur des galeries étand donné que la différence entre les fréquences de ce genre entre galeries et insectes n‟est pas considérable.

Parmi les genres entomopathogènes, Fusarium est un genre important de champignons, et la plupart des espèces sont saprotrophes omniprésentes dans le sol (Majumdar et al., 2008.). Cependant, plusieurs espèces sont des pathogènes de plantes et d'animaux. Fusarium oxysporum et F. solani sont généralement reconnues comme agents pathogènes des plantes, mais les deux sont également entomopathogènes (Majumdar et al., 2008). Cependant, F. merismoides est considéré le seul entomopathogène ou même saprotrophe des insectes (Vahabi et al., 2009). Des essais sur F. oxysporum, F. solani et d‟autres espèces de Fusarium ont permis de raccourcir la vie de P. quercivorus (Hong-ye et al., 2011). Ce genre a été déjà isolé sur chêne-liège en Tunisie (Ben Jamâa et Hasnaoui, 1996) et à partir de P. cylindrus au Portugal (Sousa et Inácio, 2005 ; Inácio et al., 2011a).

Le genre Trichoderma a été rapporté en association avec P. cylindrus et ses galeries (Cassier et al., 1996) au Portugal (Inácio et al., 2011a) et l‟espèce T. viride a été majoritairement isolée à partir des galeries de chêne-liège et d‟autres espèces de chêne (Baker, 1963; Sousa et al., 1997). Dans cette étude, ce genre a été obtenu uniquement dans le site de Bellif, essentiellement à partir du bois et très rarement sur les insectes. Nos résultats corroborent les travaux réalisés au Portugal (Henriques et al., 2009) et antérieurement en Tunisie où ce genre a été isolé sur différentes provenances de chêne-liège (Khouja et al., 2010). Le champignon pourrait avoir un rôle antagoniste (Papavizas, 1985) permettant ainsi de réguler la faune fongique à l‟intérieur des galeries (Henriques et al., 2007). Ce genre est capable de produire une enzyme qui pourrait intervenir dans le processus de colonisation de l‟hôte en facilitant la construction de galeries par l‟insecte (Samuels, 1996), qui pour faire face aux mécanismes de défense de l‟arbre fait intervenir des champignons phytopathogènes.

Le genre Acremonium a été, également, isolé dans tous les sites et plus fréquemment à partir des galeries que des insectes. Comme Trichoderma, le genre Acremonium est connu pour son activité antagoniste et est utilisé comme agent de lutte biologique (Papavizas, 1985). Cependant, certains représentants de ce genre peuvent être considérés comme phytopathogènes (Vicente et al., 1999). En effet, au Portugal (Inácio et al., 2010a, 2010b) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011), Acremonium crotocinigenum a été isolé à partir de P.

107

cylindrus et ses galeries, ce qui renforce l‟hypothèse que ce champignon est également lié au déclin du chêne liège ou au moins servant comme pionnier pour la colonisation de l‟hôte (Inácio et al., 2010b).

Un autre champignon appartenant au genre cosmopolite est obtenu, en plus de Penicillum et Aspergillus, qui est Gliocladium. Ce genre a été isolé dans tous les sites à l‟exception de Mzara. Il est associé à l‟insecte ainsi qu‟à ses galeries. Au Portugal, deux espèces de Gliocladium à savoir G. roseum et G. solani ont été rapportées par Sousa et al. (1997) sur P. cylindrus et ses galeries. Comme Trichoderma, Gliocladium est connu pour son action antagoniste ce qui lui attribue un rôle de régulateur à l‟intérieur de la galerie en contrôlant le développement des autres champignons (Inácio et al., 2010a).

En association avec P. cylindrus, le genre Scytalidium a été isolé à partir des insectes et de ses galeries dans les sites étudiés en 2010. Il a été recensé uniquement à partir des insectes au Portugal (Sousa et al., 1997; Inácio et al., 2011a) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011). Ce genre a une forte action de dégradation du bois (Kiffer et Morelet 1997; Szakacs et Tengerdy, 1997) et peut-être en mesure de jouer un rôle pionnier dans la colonisation de l'hôte et de l'établissement des insectes (Henriques et al., 2009). Quelques biotypes de Scytalidium lignicola sont connus phytopathogènes (Oren et al., 2001).

D‟autres champignons appartenant à des genres saprotrophes tels que Paecilomyces ont été isolés. Ce genre a été, également, rapporté en association avec P. cylindrus et ses galeries au Portugal (Inácio et al., 2010a). Cependant en Tunisie c‟est uniquement sur insectes que ce genre a été isolé dans le site de Ain Beya. Paecilomyces comprend de nombreuses espèces saprotrophes qui sont régulièrement isolées du sol et de l'air et dont certaines sont assez communes dans les aliments et d'autres matériaux (Aguilar et al., 1998).

Les champignons connus phytopathogènes et qui sont rapportés en association avec P. cylindrus et ses galeries dans cette étude sont ceux appartenant aux genres Biscogniauxia, Botryosphaeria et les champignons de l‟ordre des Ophiostomatales.

Le genre Biscogniauxia, dans la présente étude, a été isolé uniquement à partir des femelles de P. cylindrus dans le site de Ain Beya. B. mediterranea a été rapporté en association avec P. cylindrus et ses galeries aussi bien en Algérie (Belhoucine et al., 2012) qu‟au Portugal (Inácio et al., 2010a). Une forte corrélation existe entre la maladie et le dépérissement des peuplements de chêne-liège (Santos, 2003 ; Inácio et al., 2011b). Ce champignon est

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considéré comme un champignon endophyte dans les tissus du chêne-liège (Henriques et al., 2012) et une fois à l‟intérieur de l‟hôte, il est capable de se propager très rapidement (Mazzaglia et al., 2001). Le champignon est très fréquent en association avec le chêne-liège et a été rapporté comme l‟un des facteurs de dépérissement aussi bien en Tunisie (Franceschini et al., 2005; Khouja et al., 2010) que dans les autres pays du bassin méditerranéen notamment en Algérie, Portugal, Italie et Maroc (Bouhraoua, 2003; Franceschini et al., 2005; Jiménez et al., 2005; Assali et Falki, 2006; Sousa et al., 2007; Khouja et al., 2010).

L'association du champignon du genre Biscogniauxia avec P. cylindrus pourrait contribuer à la propagation de la maladie du charbon de la mère (Vannini et Valentini, 1994; Inácio et al., 2011b) dans les forêts de chêne-liège en Tunisie.

Les isolats du genre Botryosphaeria ont été obtenus à partir des insectes des forêts de Ain Drahem et Tabouba. Ce résultat confirme des études antérieures qui ont rapporté que ce genre a été isolé à partir de plants très affaiblis de chêne-liège en Tunisie dans la région de Tebaba (Khouja et al., 2010). D‟autre part, l‟espèce B. corticola a été recensée en Algérie (Belhoucine et al., 2012) en association avec P. cylindrus et est considérée parmi les facteurs de dépérissement du chêne-liège dans la région méditerranéenne (Erbilgin et al., 2008).

Des champignons de l‟ordre des Ophiostomatales sont aussi présents et ont montré leur dominance en éliminant les genres saprotrophes tels que Penicillium et Aspergillus.

Deux genres principaux sont des représentants de cet ordre notamment Ophiostoma et Raffaelea. Ces champignons ont été isolés aussi bien à partir des insectes que des galeries et étaient plus importants en association avec les insectes qu‟au niveau des galeries. Les femelles semblent transporter plus d‟Ophiostomatales que les mâles ce qui est dû aux mycangia plus développés chez les femelles que chez les mâles (Cassier et al., 1996; Sousa et Inácio, 2005; Bellahirech et al., 2016). Ces champignons ont été isolés de toutes les forêts prospectées aussi bien en 2010 qu‟en 2011 avec des proportions différentes.

La proportion de champignons de l‟ordre des Ophiostomatales pendant l‟année 2010, représenté par le genre Raffaelea, est plus importante à El Jouza que dans les deux autres forêts, Tabouba et Ain Drahem avec respectivement 22,5, 11,42 et 6,24%, malgré que l‟infestation et son intensité par P. cylindrus soient plus importantes à Ain Drahem (100% et 19 trous par arbre) que Tabouba (88% et 4 trous par arbre) et ElJouza (68% et 4 trous par arbre) (cf. Chapitre 2). En effet, le site de Tabouba présente un maquis dense et diversifié

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contrairement aux deux autres sites où il est très peu dense, ce qui représente un des facteurs prédisposant l‟arbre hôte à un stress physiologique, qui le rend plus sensible aux attaques de P. cylindrus (Sousa et al., 1995) qui inocule par la suite les champignons Ophiostomatales, en plus de la mauvaise opération de la levé du liège.

Les champignons Ophiostomatales sont plus fréquents dans la forêt de Babouch que Mzara et Oued Zen. Dans les forêts de Mzara et Oud Zen, les champignons ont été obtenus à partir des mâles, des femelles et des galeries contrairement à celle de Mzara où ces champignons ont été isolés à partir des galeries et des femelles. Les forêts de Bellif et Séjnène présentent des fréquences moins importantes d‟Ophiostomatales isolés uniquement des galeries. Dans les sites d‟Ain Sarouia et Ain Beya la présence de ces champignons, isolés uniquement à partir des insectes (femelles et mâles pour Ain Sarouia, et femelle et larves pour Ain Beya) est encore plus faible.

L‟observation des pourcentages d‟attaques et des taux d‟infestation de P. cylindrus dans les trois sites présentant plus de champignons Ophiostomatale révèle une relation entre ces champignons et la présence de l‟insecte. En effet le site de Babouch est le plus infesté des trois avec 54% d‟attaque et 8 trous/arbre, suivi de Wed Zen (47,1% et 6 trous/arbres) et de Mzara (15,4% et 2 trous/arbres). Le nombre moyen de cicatrices occasionnées sur tronc d‟arbre suite à l‟opération de démasclage, a montré que les trois sites représentent un taux identique d‟environ 24 cicatrices par arbre. Ainsi, il semble que les champignons associés à P. cylindrus exercent une action indirecte dans le processus d‟affaiblissement et d‟attaque de l‟arbre hôte qui est d‟autant plus réceptif que l‟opération de démasclage est mal effectuée (Bellahirech et al., 2016) et que les caractéristiques écologiques et phytosanitaires ne sont pas significativement différentes entre les sites (cf. Chapitre 2).

Pour les sites Ain Beya, Ain Sarouia et Bellif, la fréquence des Ophiostomatales ne suit ni le taux d‟infestation des arbres qui est respectivement de 4,4 ; 1,3 et 0,4 trous/arbre, ni le nombre moyen de cicatrices par arbre qui est de 32, 27 et 23 respectivement. De plus dans la forêt de Sejnène, c‟est uniquement à partir de plus de 50% de galeries que les Ophiostomatales ont été isolés. L‟insecte est présent à 8% dans ce site avec un taux d‟infestation de 4 trous/arbre. Ainsi, la liaison entre la fréquence de ces champignons et l‟insecte n‟est pas aussi claire.

De nombreux travaux ont mis en exergue la relation entre certains genres de l‟ordre des Ophiostomatales, à savoir Ophiostoma et Raffaelea, en association avec des insectes 110

ambrosia, à l‟affaiblissement et à la mortalité des arbres. Ils sont considérés comme des champignons ambrosia primaires jouant un rôle considérable dans l‟alimentation de l‟insecte (Batra, 1967, 1985). En effet, le genre Raffaelea renferme 25 espèces dont la majorité sont associées à des insectes ambrosia (Kubono et Ito, 2002; Anonyme 12, 2016).

Raffaelea canadensis a été répertorié en association avec P. wilsonii sur Pseudotsuga (Funk, 1970) et avec le scolyte Xyleborus glabratus sur avocatier en Californie (Eskalen et McDonald, 2011). De même, au Japon R. quercivora, champignon ambrosia primaire associé à P. quercivorus a été directement lié aux mortalités massives de Fagacées, notamment Q. serrata, Q. mongolica et Q. Crispula (Kubono et Ito, 2002; Kinuura et Kobayashi, 2006). Une espèce de Raffaelea qui est R. lauricola récemment identifiée associée au scolyte X. glabratus est responsable d‟une nouvelle maladie dévastatrice des plantes Lauraceae en Caroline du Sud (Etats-Unis) (Fraedrich et al., 2008 ; Harrigton et al., 2008). Au Portugal, des études récentes ont rapporté l‟association de R. montetyi et R. canadensis avec P. cylindrus et ses galeries (Inácio et al., 2010a) et la pathogénie de la première espèce a été prouvée sur jeune plants de chêne-liège. En Algérie, R. montetyi a été également signalé dans une étude similaire (Belhoucine et al., 2011, 2012).

Des études sur le dépérissement des chênes en Europe montrent que les champignons du complexe Ophiostoma/Ceratocystis sont des agents pathogènes fréquents de différentes espèces de Quercus (Badler, 1992; Degreef, 1992; Delatour et al., 1992). Sur Q. suber, Santos et al. (1999) ont noté la présence d‟Ophiostoma sp. au Portugal.

En Amérique du Nord et en Europe, O. ulmi et O. novo-ulmi ont été signalés comme responsables de la maladie hollandaise de l‟orme et entrainent la mortalité des arbres. Ces champignons sont transportés et dispersés par le scolyte européen de l'orme Scolytus multistriatus (Humble et Allen, 2006). Les genres O. quercus et O. stenoceras ont été rapportés en Algérie en association avec P. cylindrus sur chêne-liège (Behoucine et al., 2012).

Le cortège des champignons associés à l‟insecte répertorié au Portugal et en Algérie, notamment ceux pathogènes, semble refléter le comportement de l‟insecte qui est plus ou moins similaire à un comportement primaire, mais différent de celui de la Tunisie où l‟insecte est secondaire.

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4.5. Conclusion

P. cylindrus s‟est montré transporteur de champignons diversifiés en Tunisie, en conformité avec des études similaires dans le bassin méditerranéen notamment au Portugal et en Algérie (Sousa, 1995; Sousa et al., 1997; Inácio et al., 2011a; Belhoucine et al., 2011).

Les champignons isolés à partir des insectes sont plus diversifiés que ceux isolés à partir des galeries malgré que les isolats obtenus à partir des galeries étaient plus nombreux que ceux obtenus à partir des insectes.

C‟est essentiellement les champignons tels qu‟Aspergillus et Penicillium qui ont fait la différence en nombre. D‟autre part, nous avons remarqué que les champignons de l‟ordre des Ophiostomatales ont été isolés aussi bien des galeries que des insectes (adultes et larves).

La majorité des champignons rapportés dans ce travail a été isolée aussi bien à partir de l‟insecte que de ses galeries. Le rôle de la mycoflore associée à P. cylindrus est variable. Alors que certains peuvent agir comme des champignons ambrosia secondaires tels que Aspergillus et Penicillium, d‟autres comme Paecilomyces, Gliocladium et Trichoderma, connus pour leurs activités antagonistes, peuvent jouer le rôle de modérateurs et contrôlent le développement mycélien à l‟intérieur de des galeries (Inácio et al., 2010a). En plus des champignons qui sont directement liés à l‟alimentation de l‟insecte, d‟autres champignons associés à P. cylindrus connus pathogènes tels que Ophiostoma et Raffaelea peuvent jouer un rôle important dans le phénomène de dépérissement de l‟hôte.

Dans le présent travail, des genres de champignons de l‟ordre des Ophiostomatales sont rapportés pour la première fois en Tunisie à savoir Raffaelea et Ophiostoma. Compte tenue de la probabilité de leur association avec le déclin du chêne-liège, une analyse moléculaire en vue de caractérisation spécifique de ces isolats ainsi qu‟une estimation de leur pathogénie se montrent indispensables et feront l‟objet du chapitre qui suit.

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Chapitre 5:

Caractérisation moléculaire des champignons Ophiostomatales associés à Platypus cylindrus et évaluation de leur pathogénie sur jeunes plants de chêne-liège

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5.1. Introduction

Les champignons des genres Raffaelea et Ophiostoma sont des champignons ambrosia présentant une relation directe avec la mortalité des arbres (Inácio et al., 2012b). En effet, au Japon, Raffaelea quercivora s‟est montré responsable de la mortalité des chênes attaqués par Platypus quercivorus depuis les années 1980 (Kubono et Ito, 2002; Murata et al., 2005; Matsuda et al., 2010). De plus, R. lauricola transporté par Xyleborus glabratus au sud des Etats Unis est actuellement l‟agent causal du flétrissement vasculaire létal sur les Lauraceae (Fraedrich et al., 2008; Harrington et Fraedrich, 2010; Harrington et al., 2010). La grande majorité des relations entre les insectes et les champignons impliquent le groupe des ophiostomatoïdes. Selon des études plus récentes en taxonomie et en systématique des champignons ophiostomatoïdes, le genre Ophiostoma a été scindé en trois genres, Ceratocystiopsis, Grosmannia et Ophiostoma qui sont classés dans l'ordre des Ophiostomatales (Zipfel et al., 2006; De Beer et al., 2013). Ophiostoma sensu stricto (s.str) est le centre des Ophiostomatales et comprend plusieurs complexes d'espèces telles que le complexe O. ulmi, le complexe O. luriannulatum et le complexe O. ips. Ophiostoma s. str. fait partie d‟Ophiostoma sensu lato qui est un contingent n‟est pas bien définie à ce stade, et comprend des groupes comme le complexe Sporothrix schenckii – O. stenoceras (De Beer et al., 2013).

En plus d'être largement distribués géographiquement, ces champignons peuvent utiliser une grande variété de substrats, incluant les plantes cultivées, les plantes ornementales et les arbres forestiers (Upadhyay, 1993; Halfeld-Vieira et Nechet, 2006; Roets et al., 2009). Ces champignons qui possèdent une place primordiale dans les écosystèmes forestiers, sont classés parmi les premiers organismes à coloniser les arbres stressés ou récemment morts (Kàârik, 1975; Gibbs, 1993).

C‟est dans ce contexte que s‟inscrit l‟objectif du présent chapitre qui vise à identifier les champignons de l‟ordre des Ophiostomatales associés à P. cylindrus en Tunisie et d‟évaluer leur pathogénie sur des plants de chêne-liège.

Dans le chapitre précédent, la caractérisation des champignons était basée sur des aspects morphologiques et microscopiques. Affin de clarifier les ambiguïtés d'identification, la reconnaissance phylogénétique des espèces se montre indispensable.

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En général, pour bien identifier une espèce les résultats d'analyses phylogénétiques sont combinés à des résultats des observations de caractères morphologiques, écologiques et si c'est possible, des tests de croisement (Harrington et Rizzo, 1999; Taylor et al., 2000; Kim et al., 2005).

5.2. Matériel et Méthodes

5.2.1. Isolement des champignons

Les champignons Ophiostomatales ont été isolés à partir de l‟insecte et de ses galeries lors de l‟étude du cortège de champignons associés à Platypus cylindrus (cf. Chapitre 4). Ces champignons ont pu être isolés dans les sites suivants: Ain Beya, Ain Drahem, Ain Sarouia, Babouch, Bellif, El Jouza, Mzara, Oued Zen, Sejnène et Tabouba.

D‟un total de 24 isolats obtenus des Ophiostomatales, cinq représentants des présumées différentes espèces ont été considérées pour la suite de l‟étude, et ont été codées comme suit : TN11.001, TN12.002, TN12.003, TN12.004 et TN12.005. Ces isolats ont fait l‟objet de caractérisations morphologique, moléculaire et phylogénétique, et sont actuellement déposés dans la collection mycologique à la « Micoteca de la Estação Agronómica Nacional» (MEAN) de l‟INIAV (Oeiras, Portugal). Ces isolats ont, également, fait l‟objet de test de pathogénie sur des jeunes plants de chêne-liège.

5.2.2. Identification morphologique

L‟identification des champignons a été basée sur les caractéristiques culturales et morphologiques selon Ellis (1971 et 1976), Lanier et Burns (1978), Kiffer et Morelet (1997) et Barnett et Hunter (1998). Les caractères macroscopiques de colonies ont été décrits après 21 jours de croissance sur milieu malt agar (MEA, Difco). La caractérisation culturale des champignons s‟est basée sur l‟observation de la surface de la culture ainsi que le verso de la boite de Pétri selon Inácio et al. (2008). Les noms des couleurs ont été adoptés de Saccardo (1891).

La majorité des descriptions d'espèces de champignons Ophiostomatales est établie sur la morphologie de la forme du téléomorphe, incluant les périthèces et les ascospores (Hunt, 1956; Griffin, 1968; Olchowecki et Reid, 1974; Upadhyay, 1981).

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5.2.3. Identification moléculaire

Pour la caractérisation et l'identification moléculaires des champignons, l'ADN ribosomique (ADNr ou rDNA) est la région la plus souvent ciblée. L‟ADNr est constitué d‟une unité répétée qu'on retrouve chez tous les êtres vivants, puisqu'il entre dans les mécanismes de traduction des ARNm en protéines. Les avantages à utiliser cette région sont qu'elle est bien caractérisée et documentée (White et al., 1990; Gardes et Bruns, 1993; Kim et al., 1998) et les gènes de l'ADNr sont présents en plusieurs copies répétées en tandem dans un ou plusieurs chromosomes, ce qui facilite l'amplification. Les gènes de l'ADNr possèdent des locus évoluant à des taux différents. Ce sont des gènes extrêmement conservés codant pour des ARNr et des régions intergéniques plus variables, appelés l‟espaceur intergénique transcrit (ITS, Internal Transcribed Spacer), et l‟espaceur intergénique non transcrit (IGS). Les gènes de cette unité sont la petite sous-unité 18S, une grande sous-unité 28S et une très petite région 5.8S, et deux régions non transcrites et plus variables ITS1 et ITS2 qui séparent les trois gènes (Alvarez et Wendel, 2003).

Comme les gènes des sous-unités ribosomiques sont plus conservés, ils sont ciblés pour la fabrication d'amorces spécifiques à cette région. Les amorces les ciblant sont généralement universelles (Figure 41).

Figure 41. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité répétée de l'ADN ribosomique chez les champignons. Les flèches représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées (Tedersoo et al., 2007).

Tandis que les régions ITS sont habituellement assez variables, c'est dans ces régions qu'on y trouve des marqueurs permettant de distinguer les espèces (Vilgalys et Hester, 1990; White et al., 1990; Bruns et al., 1991; O' Donnell, 1992; Gardes et Bruns, 1993; Bertini et al., 1998).

L‟identification moléculaire des champignons Ophiostomatales se base essentiellement sur les ADNr nucléaire (ITS2 et la région partielle LSU) (Jacobs et al., 2001; Hausner et al., 1993). Etant donné que la région ITS possède de forte variabilité interspécifique et de faible variabilité intra-spécifique, elle peut être utilisée pour identifier les champignons jusqu‟à 116

l‟espèce. La région ITS2 contient une sous-région à fort degré de conservation et semble la mieux appropriée pour comparer les isolats à l‟échelle de la famille, l‟ordre et même des niveaux plus élevés (Coleman, 2003; Hershkovitz et Zimmer, 1996). La région LSU de l‟ADNr est aussi suffisamment conservée pour déterminer les relations entre les familles ou les genres, et parfois entre les espèces (Kurtzman et Robnett, 1991; Wingfield et al., 1993). Jacobs et al. (2001) ont suggéré que la région d'ADNr (ITS2 et partiellement la région LSU) soit utile pour identifier et distinguer morphologiquement entre les espèces semblables de Leptographium.

Par contre, dans certains cas, les régions ITS ne sont pas suffisamment variables pour permettre de distinguer les espèces (Atkins et Clark, 2004; Rakeman et al., 2005). Les gènes codant pour des protéines très conservés comme, par exemple, les gènes de la β-tubuline et du facteur d‟élongation peuvent être séquencés (Balajee et al., 2009), puisque les protéines pour lesquelles ils codent sont essentielles à la survie des cellules donc ils offrent des informations additionnelles pour la distinction entre des espèces très proches (Tarkka et al., 2000).

Le gène de la β-tubuline fait partie de la famille des tubulines. Il code pour la fabrication d'une protéine essentielle au bon fonctionnement de la machinerie cellulaire des eucaryotes, lors de la mitose (Einax et Voigt, 2003). Ce gène peut être présent en quelques copies dans le génome (Keeling et al., 2000) (Figure 42). Malgré que la protéine β-tubuline possède de nombreuses copies (Schardl et al., 1994), ses introns et exons possèdent d‟excellentes informations phylogéniques du genre Leptographium et d‟autres champignons ascomycètes (Schardl et al., 1994; O‟Donnell et Cigelnik,1997 ; O‟Donnell et al., 2000; Lee et al., 2003).

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Le gène du facteur d'élongation code pour une protéine qui contrôle le taux et la fidélité de la synthèse protéique. Il est généralement présent en une copie dans le génome des champignons (Baldauf, 1999) (Figure 43).

Figure 43. Représentation schématique du gène du facteur d‟élongation. Les flèches représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées (Rehner, 2001).

 Extraction d’ADN

Le mycélium des champignons a été collecté pour l‟extraction de l‟ADN en grattant la surface de l‟agar des colonies âgées de deux semaines, à l‟aide d‟un scalpel stérilisé.

Pour broyer le mycélium, les tubes contenant les échantillons ont été trempés dans l'azote liquide et les échantillons sont macérés en poudre fine avec un micro-pilon. Cette dernière étape a été répétée deux fois. Par la suite, le mycélium broyé a été suspendu au vortex dans le tampon d'extraction du Dneasy Plant Mini kit (Qiagen, Germany) en suivant les instructions du laboratoire fabriquant le kit.

La quantification et la vérification de la pureté de l‟ADN ont été réalisées en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000 UV-VIS (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

 Amplification par PCR

Les isolats ont été caractérisés au moyen d'analyses phylogénétiques et moléculaires sur les gènes de l'ADNr, de la β-tubuline et du facteur d'élongation, développés à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction). Pour la région ITS1-ITS2, les amorces utilisées étaient ITS1-F (Gardes et Bruns, 1993) et ITS4 (White et al., 1990) qui couvrent les deux régions intergéniques ITS, la sous-unité 5.8S et une portion en 5' de la grande sous-unité 28S. Pour le gène de la β-tubulin, les amorces utilisées étaient T1 et BT2b (Glass et Donaldson 1995;

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O‟Donnell et Cigelnik 1997) et pour le gène du facteur d'élongation 1-α les amorces utilisées étaient EF1 728F et EF1 986R (Carbone et Kohn, 1999).

Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant le DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Qiagen, Allemagne) dans un thermocycleur Biometra TGradient (Biometra, GmbH). La solution réactionnelle de chaque échantillon contenait un volume final de 25 µl contenant 1 µl (50 à 150 ng) de matrice d'ADN, 0,4 µM de chaque amorce et 1 x tampon de PCR Master

Mix, qui comprenait 1,5 µM de MgCl2 et 0,2 µM de chaque dNTP. Les conditions de PCR appliquées pour la région ITS et pour le gène du facteur d'élongation 1-α étaient les suivantes: un cycle de 2 min à 94°C, suivi par 35 cycles de 1 min à 95°C, puis 1 min à 55°C et 1 min à 72°C, suivi par un cycle de 10 min à 72°C.

Pour le gène β-tubuline le protocole d'amplification était le suivant: dénaturation initiale pendant 4 min à 95°C à raison de 35 cycles de dénaturation à 95°C pendant 1 min, hybridation à 50°C pendant 1,5 min, élongation à 72°C pendant 1 min et une étape de terminaison de 10 min à 72°C.

Pour vérifier que les réactions ont bien fonctionné, les produits amplifiés ont été chargés sur un gel d'agarose à 2% avec un tampon standard TBE 0,5x (4,5 mM Tris, 4,5 mM d‟acide borique et 1mM EDTA, pH 8) contenant 0,5 mg/ml de bromure d‟éthidium.

Cinq µl de l‟échantillon PCR ont été mélangés avec 1 µl de tampon de charge sur une feuille de parafilm. Les échantillons et un marqueur de poids moléculaire ont été chargés séparément dans les puits du gel. L‟électrophorèse a été effectuée à 5 V/cm. Les produits d‟amplification ont été visualisés sous lumière UV en utilisant le système d'imagerie Gel VersaDoc (Bio-Rad, USA). Les fragments de PCR ont été purifiés en utilisant le kit de purification PCR QIAquick (Qiagen, Allemagne) selon le protocole du fabricant.

 Séquençage et analyse phylogénique

Les amplicons ont été séquencés dans les deux directions en utilisant les mêmes amorces au laboratoire de séquençage STABVida (Lisbonne, Portugal) sur un analyseur d'ADN ABI PRISM 3730xl (Applied Biosystems).

Les séquences nucléotidiques ont été initialement alignées et corrigées à l'aide du programme BioEdit v7.2.0 (Hall, 2007). Les séquences consensus ont étés comparées avec la base de données GenBank (NCBI), en utilisant l'outil de recherche d'alignement local (BLAST) algorithme de base. 119

Les séquences ITS d'espèces relatives aux champignons Ophiostoma s.str ainsi que ceux représentant déposées dans GenBank ayant le plus de similarité aux espèces obtenues dans cette étude ont été inclues au niveau de l'analyse (Tableau 13).

Selon les résultats morphologiques de ces isolats, seules les séquences ITS pour Ophiostoma sp., Raffaelea monteyti et R. canadensis ont été téléchargés à partir de la base de données GenBank. Taphrina pruni et T. wiesneri font partie du groupe externe (outgroup) selon les études d‟Inácio (2011).

Toutes les séquences ont été soumises à des alignements multiples en utilisant ClustalW. Les relations phylogénétiques entre les isolats ont été déterminées par l‟analyse des distances à l‟aide de MEGA v.6.0 (Tamura et al., 2013). Les analyses phylogénétiques ont été construites en utilisant des méthodes de Neighbour-joining (NJ) et de maximum de vraisemblance (ML) et supportées par 1000 réplicats de bootstraps pour estimer les niveaux de confiance des points de ramification.

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Tableau 13. Les séquences de champignons puisées de la banque des gènes (Genbank) des champignons inclus dans le travail.

N° d’accession (GennBank) Espèces identiques par des caractères Pays Insectes associés Référence morphologiques ITS BT Raffaelea montetyi Portugal Platypus cylindrus JF946764 Inácio, 2011 JF946763 JF909514 JF909513 JF909512 JF909541 JF909529 JF909543 JF909542 JF909540 JF909527 JF909526 Japan Platypus quercivorus AB496432 Matsuda et al., 2010 Allemagne Xleborus monographus AY497522 Gebhardt et al., 2004 X. dryographgus AY497520 P. cylindrus AY497521 Canada Trypodendron rufitarsus EU984301 EU977475 Massoumi Alamouti et al., 2009 Trypodendron lineatum Dendroctonus ponderosae Californie Xyleborus glabratus EU177461 Harrington et al.,2010 EU170283 Japan P. quercivorus AB496431 Matsuda et al., 2010 R. canadensis Canada P. wilsonni EU977473 Massoumi Alamouti et al., 2009 D. ponderosae EU984299 EU977473 Corée P. koryoensis GQ225699 GQ225693 Kim et al., 2009 Californie X. glabratus JF327799 Eskalen et McDonald., 2011 JF327800 JF327801 121

N° d’accession (GennBank) Espèces identiques par des caractères Pays Insectes associés Référence morphologiques ITS BT

Californie X. glabratus EU177459 Harrington et al., 2010 EU177458 EU170270 Allemagne Amasa sp. AY858665 Gebhardt et al., 2005 Louisiana (USA) - U44480 Jones et Blackwell, 1998 Ophiostoma sp Norvège - GQ249329 Nkuekam et al., 2010 GQ249327 GQ249330 GQ249316.1 Afrique de Sud - EU660457 Roets et al., 2009 Afrique de Sud - EU660476.1 Afrique de Sud - EU660474.1 Afrique de Sud - EU660477.1 Corée - KR012455.1 Suh et al., 2005 (non publié) Ophiostoma quercus Corée et Nouvelle Zélande - AY789156.1 Kim et al., 2005 Corée et Nouvelle Zélande AY789157.1 Corée - FJ573040.1 Hyun et al., 2008 Corée - JQ886709.1 Hyun et al., 2012 (non publié) Corée - DQ868381.1 Kim et Kim, 2007 Afrique du Sud - AY466648.1 Grobbelaar et al., 2009 Canada - AF081132 Kim et al., 1999 Italie EF429089 Carresi et al., 2008 EF429090

122

5.2.4. Etude de la pathogénie des Ophiostomatales associés à Platypus cylindrus

Afin de mieux comprendre le rôle des champignons Ophiostomatales isolés à partir du platype en Tunisie et leur relation dans le dépérissement du chêne-liège, un test de pathogénie se montre indispensable. Il fera l‟objectif du présent paragraphe.

Cent douze (112) plants de chêne-liège âgés d‟une année ont été importés de la pépinière de Ouchteta (Nord-Ouest de la Tunisie) pendant le mois de mars 2013. A la pépinière de l‟INRGREF (Figure 44), les plants ont été transposés dans des pots de 2,5 litres, dans un mélange de terreaux et de sable et arrosés périodiquement (2 jours par semaine). Les plants ont été par la suite caractérisés par la mesure du diamètre du tronc et de sa hauteur et par le dénombrement du feuillage.

Figure 44. Plants de chêne-liège dans la pépinière de l‟INRGREF.

Les champignons Ophiostomatales identifiés lors du précédent paragraphe ont fait l‟objet du test de pathogénie à savoir Raffaelea et Ophiostoma (Tableau 14).

Tableau 14. Les espèces de champignons utilisées pour le test de pathogénie et leurs codes.

Champignons Isolats Ophiostoma sp. TN11.001 PC86 Ophiostoma tsotsi TN12.002 PC96 Ophiostoma quercus TN12.003 PC92 Raffaelea montetyi TN12.004 PC64 Raffaelea canadensis TN12.005 PC84

123

Les plants ont été numérotés de 1 à 112. Chaque champignon a été inoculé seize fois (16 répétitions) et deux types de témoins ont été considérés (un témoin avec inoculation de MEA sans champignons et un témoin qui ne présente pas de blessure d‟inoculation) (Inácio, 2011). Les plants inoculés par le même champignon ont été placés d‟une manière aléatoire afin d‟annuler les variabilités physique et environnementale. La technique d‟inoculation est effectuée en réalisant les opérations suivantes (Figure 45): 1. Désinfection de l‟écorce par du coton stérile imbibé d‟alcool, 2. Réalisation d‟une petite incision dans l‟écorce en forme de cône à l‟aide du bistouri stérile, 3. Emplacement d‟un disque d‟agar de 3 mm de diamètre contenant le mycélium de champignon (Figure 46) (ou de gélose pour les témoins), 4. Protection de la zone d‟inoculation par du coton stérile imbibée d‟eau distillée stérilisée et entourée par du parafilm.

Figure 45. Schéma d‟inoculation des plants de chêne-liège par les champignons.

Figure 46. Disques de 3 mm du mycélium de Raffaelea.

124

Quinze jours après l‟inoculation, le suivi des symptômes de flétrissement et de mortalité des plants est effectué quotidiennement pendant 4 mois. L‟isolement à partir de la partie décolorée de l‟aubier de chaque plant nouvellement flétri a été réalisé. Les analyses statistiques (ANOVA) ont été réalisées en utilisant le logiciel Statistica 6.

5.3. Résultats

5.3.1. Caractérisation morphologique

Les isolats fongiques, obtenues à partir de P. cylindrus, ressemblaient morphologiquement à des membres de l‟ordre des Ophiostomatales (Figure 47). En se basant sur les caractéristiques micro-morphologiques et la colonie, ces isolats ont été regroupés en deux unités taxonomiques opérationnelles (UTO). Une première UTO ressemblait à des espèces du genre Raffaelea et une deuxième semblait appartenir au genre Ophiostoma. La description des caractéristiques macroscopiques est récapitulée dans le tableau 15.

125

TN11.001 TN12.002 TN12.003 TN12.004 TN12.005 Isolats

Surface Ophiostoma sp1 Ophiostoma sp2 Ophiostoma sp3 Raffaelea sp1 Raffaelea sp2 observée

Face de la culture

Verso de la boite de Pétri

Figure 47. Aspects culturaux représentants les différents isolats d‟Ophiostomatales isolés à partir de Platypus cylindrus.

126

Tableau 15. Description macroscopique des différents isolats de l‟ordre des Ophiostomatales.

Surface de la culture Isolat de champignon Aspect cultural Densité Couleur Contour

Aspect du type levure à farineux avec de longs Fulgurant, jaunâtre TN11.001 moyenne absent filaments, mycélium claire vigoureux et aérien

Aspect type levure à farineux avec de longs filaments, mycélium Fulgurant, vert TN12.002 moyenne claire vigoureux et aérien olive avec une colonie centrale

Aspect type levure à farineux avec de longs filaments, mycélium Pas très TN12.003 Vert olive clair claire vigoureux et aérien dense avec une colonie centrale

Aspect type levure à farineux avec de longs Pas très TN12.004 Brun claire absent filaments, mycélium dense vigoureux et aérien

Aspect type levure à farineux avec de longs Jaunâtre avec une TN12.005 filaments, mycélium et moyenne colonie centrale absent aérien, avec une blanchâtre colonie centrale

127

L‟observation microscopique des conidies et des conidiophores des genres obtenus est représentée dans la figure 48.

Figure 48. Conidies et conidiophores des Ophiostomatales isolés à partir de Playpus cylindrus et de leurs galeries: A) Ophiostoma sp1 (x400), B) Ophiostoma sp2 (x200), C) Ophiostoma sp1 (x400), D) Raffaelea sp2 (x400), E) Raffaelea sp3 (x400).

Pour les isolats appartenant potentiellement au genre Ophiostoma, des observations à l‟aide de la loupe optique ont permis de distinguer des structures très caractéristiques du genre, pour l‟isolat TN12.002 qui sont les corémies et périthèces (Figure 49).

1 2 3

Figure 49. Structures de l‟isolat Ophiostoma sp 2: 1, 2. Corémies (synnema) du champignon sur milieu de culture; Conidiophores illustrant la structure anamorphique bien adaptée au transport par les insectes (x5); 3. Périthèce (x6, 5).

5.3.2. Caractérisations moléculaire et phylogénique

Initialement, c‟est la région ITS qui a été considérée pour réaliser des analyses de phylogénie moléculaire. Ensuite, dans le cas où le fragment total n‟était pas amplifié avec succès, ce sont les gènes β-tubuline et EF1-α qui ont été utilisés.

L'électrophorèse sur gel de segments de PCR a montré une bande unique pour chaque isolat qui varie en taille correspondant aux différentes paires d'amorces utilisées. L‟analyse PCR en 128

utilisant des paires d'amorces ITSF1/ITS4 T1/BT2b et EFCF1/EF1728F ont donné respectivement des produits spécifiques d'environ 650 pb (ITS-produits de PCR) et 1000 pb (β-tubuline) et 400 pb (EF1-α). Pour chaque paire d'amorces utilisées dans les amplifications par PCR, aucune bande secondaire n‟a été obtenue à l'exception des produits spécifiques. En outre, aucun produit PCR n‟a été obtenu pour les témoins.

 Phylogénie de la région ADNr

La comparaison des séquences avec les séquences de nucléotide de GenBank nous montre que la similarité de certaines séquences n‟est pas très élevée, mais certaines d'entre elles peuvent être assignées à une espèce. Cependant, pour le gène EF1-α aucune similarité n‟a pu être trouvée.

La comparaison des séquences obtenues avec les séquences de nucléotide de Raffaelea dans la base de données des séquences GenBank aussi bien pour la Région ITS que β-tubuline, a confirmé l'identité des deux espèces de champignons Raffaelea avec un degré élevé d'identité de séquence à R. canadensis et à R. montetyi. La position des deux espèces de Raffaelea était conforme, car elles ont été placées dans le clade Ophiostomatales (Massoumi Alamouti et al., 2009, Harrington et al., 2010; Matsuda et al., 2010). D‟autre part, une similitude de 100% de l‟isolat TN12.002 avec Ophiostma tsosti et de 96% de l‟isolat TN12.003 avec O. quercus a été notée pour la région nucélotidique β-tubuline.

L'analyse phylogénétique a été menée séparément uniquement pour les deux régions (ITS et β-tubuline) avec des séquences correspondantes listées dans le tableau 13 et les séquences de Taphrina pruni et Taphrina wiesneri font partie du groupe externe (outgroup) (Inácio, 2011).

L‟analyse phylogénétique basée sur la région ITS a confirmé les deux unités taxonomiques opérationnelles. Cet arbre phylogénétique a souligné une division des isolats et a permis de détecter deux groupes. Un groupe phylogénétique englobant les isolats TN12.002 et TN12.003, très apparentés entre eux et avec les souches d'Ophiostoma tandis que les isolats TN11.001, TN12.004 et TN12.005 sont plus semblables aux souches proches de Raffaelea (Figure 50).

129

GQ249329.1| Ophiostoma sp. GQ249327.1| Ophiostoma sp. GQ249330.1| Ophiostoma sp.

AF081132.1| Ophiostoma quercus EF429089.1| Ophiostoma quercus EF429090.1| Ophiostoma quercus

TN12.003 PC92 TN12.002 PC96 EU660457.1| Ophiostoma sp. JF946764.1| Raffaelea montetyi

JF946763.1| Raffaelea montetyi JF909527.1| Raffaelea montetyi JF909526.1| Raffaelea montetyi JF946764.1| Raffaelea montety

GQ225699.1| Raffaelea canadensis TN11.001 PC86 TN12.004 PC64

TN12.005 PC84 AB505449.1| Taphrina pruni AB505446.1| Taphrina wiesneri

0.1

Figure 50. Arbre phylogénétique basé sur 20 séquences nucléotidiques de l‟ADNr (5.8S- ITS2-28S) d‟Ophiostomatales isolés à partir de Platypus cylindrus sur les peuplements de chêne-liège en Tunisie construit par la méthode du maximum de vraisemblance (ML) basé sur le modèle Tamura à 3 paramètres (Tamura et Nei, 1993) et supporté par 1000 réplicats de bootstraps. Il y avait un total de 247 locations dans l'ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été menées avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Les analyses phylogénétiques basées sur la région ITS ont montré l'UTO Ophiostoma comme associé à Ophiostoma quercus. L'autre UTO Raffaelea a été associé à R. canadensis et R. montetyi (Figure 51).

130

Cependant, la région ITS n'a pas fourni une résolution claire pour toutes les espèces. L‟identification spécifique à l‟aide de cette région n‟a pas pu être complètement achevée. Ainsi, l‟utilisation du gène β-tubuline peut se révéler utile. Dans cette étude, nous avons comparé les performances de la région ITS et de la protéine β-tubuline comme moyen d'amplification pour l'analyse comparative des séquences.

 Phylogénie de la région codante par la protéine β-tubuline

La comparaison des séquences partielles de ß-tubuline à des séquences déjà présentes dans la base des données à l'aide de la recherche BLAST des séquences d‟Ophiostoma sp., Raffaelea montetyi et R. canadensis a permis d‟obtenir l‟arbre phylogénétique ci-dessous (Figure 51). La séquence de Taphrina virginica a été utilisée comme groupe externe (outgroup).

131

FJ573040.1| Ophiostoma quercus TN12.004 KU534880 EU977475.1| Raffaelea montetyi GQ225691.1| Raffaelea quercivora GQ225692.1| Raffaelea quercivora

GQ225690.1| Raffaelea sp. GQ225689.1| Raffaelea sp. KR012455.1| Ophiostoma sp. GQ249316.1| Ophiostoma sp. TN12.002 KU534878

EU660477.1| Ophiostoma sp. GQ225693.1| Raffaelea canadensis EU977473.1| Raffaelea canadensis TN12.005 TN11.001 AF170969.1| Taphrina virginica

0,5

Figure 51. Arbre phylogénétique d‟Ophiostomatales isolés de Platypus cylindrus sur les peuplements de chêne-liège en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance (ML) basée sur le modèle Tamura 3- paramètres. L'analyse a consisté en 27 séquences de nucléotides codant pour le gène de la protéine ß-tubuline. Il y avait un total de 213 postes dans l'ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été menées à l‟aide du logiciel MEGA v.6.0.

L‟arbre phylogénétique montre que l‟isolat TN12.005 se présente comme R. canadensis tandis que TN12.004 est plus attribué à l‟espèce R. montetyi. Les autres isolats de l‟unité 132

taxonomique Ophiostoma se sont montrés comme trois espèces différentes dont deux ont pu être identifiées, et un troisième portera le nom d‟Ophiostoma sp.. L‟isolat TN12.003 présente plus d‟homologie avec O. quercus tandis que TN12.002 se montre identique à O. tsotsi. L‟isolat TN11.001 est Ophiostoma sp. puisque sa position sur l‟arbre phylogénétique n‟a pas permis de trancher pour le nom de l‟espèce.

Les séquences des isolats ont été soumises au GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) et des numéros d‟accession ont été attribués à chaque espèce. Ces numéros sont de KU534878 à KU534880 pour ß-tubuline et de KU355868 à KU355872 pour la région ITS (Figure 51).

L‟étude moléculaire des champignons de l‟ordre des Ophiostomatales a permis d‟identifier cinq espèces différentes à savoir Ophiostoma sp., O. tsotsi, O. quercus, Raffaelea montetyi et R. canadensis.

La répartition des espèces identifiées dans les forêts faisant objet de l‟isolement, a été étudiée.

En effet, les champignons ne sont pas tous présents dans toutes les forêts (Figure 52).

Site Wed Ain Ain Ain El Babouch Mzara Tabouba Bellif Sejnène Zen Sarouia Beya Drahem Jouza Champignon Raffaelea montetyi Raffaelea canadensis Ophiostoma quercus

Ophiostoma tsotsi

Ophiostoma sp.

Figure 52 : Répartition des champignons Ophiostomatales dans les forêts étudiées.

Le champignon R. montetyi est présent dans sept forêts et absent de Babouch et Mzara alors que R. canadensis n‟est présent que dans trois forêts à savoir Ain Beya, Bellif et Sejnène. Le genre Ophiostoma représenté par 3 espèces est moins présent. O. quercus a été isolé des forêts de Babouch et Mzara, qui en plus de la forêt d‟Ain Sarouia révèle la présence de O. tsotsi.

133

Quand à l‟espèce d‟Ophiostoma non encore identifiée, elle a été isolée des forêts de Wed Zen et Ain Beya.

5.3.3. Evaluation de la pathogénie des espèces

Une différence significative a été notée entre les isolats concernant le nombre de jours nécessaires pour l‟apparition des symptômes de flétrissement (F (1, 113) = 90,7; P < 0,001).

Les symptômes de dépérissement sur les plants inoculés par R. montetyi ont apparu environ 45 jours après l‟inoculation. Pour les 3 espèces d‟Ophiostoma, les symptômes se sont manifestés plus tardivement environ 65 jours de la date de l‟inoculation. Aucune mortalité n‟a été recensée sur les plants inoculés par R. canadensis jusqu'à la fin de l'expérience (Tableau 16).

Tableau 16. Nombre de jours avant le dépérissement ou la mortalité des plants inoculés : n. nombre de plants total, N. nombre de plants présentant des symptômes.

Signe d‟attaque Mortalité Espèce n N/(%) Jours N/(%) Jours

Raffaelea montetyi 16 9/(56,25) 27 9/(56,25) 37

Raffaelea canadensis 16 4/(25) 54 0/(0) -

Ophiostoma quercus 16 8/(50) 65 5/(31,25) 78

Ophiostoma sp. 16 14/(87,5) 62 10/(71,4) 80

Ophiostoma tsotsi 16 10/(62,5) 60 8/(50%) 75

Tous les isolats ont induit des signes d‟attaque sur les plants inoculés. L‟espèce R. canadensis présente le plus faible degré d‟attaque (25%) et n‟induit pas à la mortalité des plants contrairement aux autres espèces dont les délais de mortalité des plants varient entre 37 et 80 jours de la date d‟inculation. Tous les plants de chêne-liège présentant des symptômes de présence de R. montetyi ont fini par mourir au bout de 37 jours contrairement aux trois espèces d‟Ophiostoma dont le nombre de plants morts est inferieur à celui présentant des signes d‟affaiblissement, dûs aux champignons, et leur mortalité était bien retardée d‟environ trois mois après l‟inoculation.

134

Les symptômes sur les plants inoculés par R. montetyi sont représentés dans la figure 53. Des signes de jaunissement de feuilles et de tige ont été observés.

1 2 3

Figure 53. Effet de l‟inoculation de jeunes plants de chêne-liège par le champignon Raffaelea montetyi : 1. Témoin, 2. Jaunissement des feuilles, 3. Dessèchement des feuilles et de la tige.

La partie de l‟écorce qui a été isolée des plants inoculés et présentant des symptômes de flétrissement, n‟a pas permis d‟obtenir les champignons, donc le champignon n'a pas pu être ré-isolé.

5.4. Discussion

L‟isolement de cinq espèces de champignons appartenant à l‟ordre des Ophiostomatales et à la famille des ophiostomatacées (Kirisits, 2004) à partir de Platypus cylindrus et de ses galeries est une première en Tunisie. L‟identification moléculaire a révélé la présence de Raffaelea montetyi, R. canadensis, Ophiostoma sp., O. tsotsi et O. quercus. Des numéros d‟accession ont pu être attribués après soumission dans le GenBank pour uniquement trois d‟entre eux. Cependant, pour les deux autres champignons qui sont R. canadensis et Ophiostoma sp., il n‟était pas possible de faire la bonne annotation de la part de GenBank car les introns et exons n‟étaient pas aussi faciles à différencier. Ainsi, un nouveau séquençage de ces deux isolats vient d‟être relancé dont les résultats seront rapportés dans de prochaines publications.

Raffaelea montetyi était l‟espèce prédominante du genre Raffaelea isolée de P. cylindrus en Tunisie, en accord avec les résultats de Morelet (1998), Gebhardt et al. (2004) et Inácio et al. (2008, 2011b). Ce champignon croît rapidement et il est capable de coloniser le système des galeries beaucoup plus rapidement que les autres champignons symbiotiques (Inácio et al., 135

2012b). En tenant compte des études antérieures sur P. cylindrus au Portugal (Henriques, 2007; Inácio et al., 2011a, 2012b) et en Algérie (Belhoucine et al., 2011) où R. montetyi été identifié, sa présence en Tunisie confirme bien la relation symbiotique avec l‟insecte qui semble constituer une adaptation écologique visant la colonisation de l'hôte de manière la plus rapide et la plus efficace. Raffaelea montetyi a été noté dans les forêts de Ain Beya, Ain Drahem, Ain Sarouia, El Jouza, Tabouba et Wed Zen qui se caractérisent par un bioclimat humide à hivers doux et tempéré ainsi que par la présence de maquis (dense à très dense), qui sont des conditions qui semblent être favorables à la présence de cette espèce. D‟autre part, ces forêts sont aussi caractérisées par des pourcentages d‟infestation par P. cylindrus variant entre 100 et 2 % (cf. Chapitre 2).

En plus de son association avec P. cylindrus en Algérie et au Portugal, R. montetyi a été décrit en relation symbiotique avec d‟autres insectes ambrosia à savoir Xyleborus monographus et X. dryographus sur Quercus robur (Morelet, 1998; Gebhardt et al., 2004). Dans notre étude sur Quercus suber, dans la forêt de Ain Beya, R. montetyi a été isolé et d‟où nous avons collecté aussi bien P. cylindrus que X. monographus (cf. Chapitre 2).

Des études antérieurs ont montré que P. cylindrus a une association avec d‟autres champignons ambrosia primaires notamment R. ambrosiae (Arx et Hennebert, 1965; Morelet, 1998). Sousa (1996), Sousa et Inácio (2005) et Belhoucine et al. (2012) ont pu isoler le champignon de l‟insecte et de ses galeries sur chêne-liège respectivement au Portugal et en Algérie. L‟absence de ce champignon dans les subéraies tunisiennes, aussi important pour l‟alimentation et la survie de l‟insecte, peut expliquer en partie la différence de comportement de l‟insecte dans les trois pays. En effet, l‟insecte n‟est pas aussi agressif en Tunisie qu‟au Portugal et en Algérie.

Dans le genre Raffaelea, plusieurs espèces ont été liées à la mortalité massive de chênes au Japon (Kubono et Ito, 2002; Matsuda et al., 2010) et de flétrissement du laurier (Fraedrich et al., 2008) ainsi que l'avocat (Persea americana ) aux Etats-Unis (Eskalen et McDonald, 2011). Au Portugal, les espèces R. montetyi et R. canadensis, ont été démontrées pathogènes sur chêne-liège (Inácio et al., 2012a), ce qui pourrait donc avoir un rôle important dans le déclin du chêne-liège. En association avec P. cylindrus sur chêne-liège, R. canadensis a été isolé au Portugal (Inácio et al., 2012b) et pour la première fois en Tunisie et en Afrique du Nord, dans le présent travail où il a été répertorié uniquement dans la forêt de Ain Beya avec un pourcentage de présence de l‟ordre de 10%.

136

La contamination des champignons symbiotiques peut se produire lorsque plus d‟une espèce d‟insecte peut servir comme habitat (Gebhardt et al., 2004; Kim et al., 2011). En effet, en plus de son association avec P. wilsonii sur Pseudotsuga (Funk, 1970), R. canadensis a été également répertorié en association avec X. glabratus sur avocatier en Californie (Eskalen et McDonald, 2011). C‟est dans ce contexte que l‟hypothèse que R. montetyi et R. canadensis peuvent provenir aussi bien de P. cylindrus que de X. monographus, peut être avancée. Ce dernier était trouvé sur les arbres de chêne-liège attaqués par le platype (cf. chapitre 2) où R. montetyi et R. canadensis ont été isolés. Ainsi, un échange de champignons ambrosia peut se réaliser entre les galeries de P. cylindrus et de X. monographus lorsque les tunnels se croisent (Inácio, 2011).

De nos jours, uniquement Raffaelea sp. et Ambrosiella sp. sont d‟importantes sources alimentaires en association avec les mycangia des insectes (Harrington, 2005, Harrington et al., 2010).

Concernant les études moléculaires, la région ITS a été largement utilisée pour le diagnostic des champignons et proposée comme marqueur universel des codes à barres de l‟ADN des champignons (Schoch et al., 2012). Malheureusement, le locus est particulièrement difficile à utiliser pour les champignons Raffaelea (Harrington et al., 2011; Jeyaprakash et al., 2014). C‟est grâce à l‟association des résultats des analyses par ß-tubuline et ITS que la différenciation entre les espèces de Raffaelea a pu être réalisée dans le présent travail.

Les observations microscopiques des isolats ont montré la présence du téléomorphe chez les champignons du genre Ophiostoma à travers l‟observation des périthèces. Les espèces du genre Ophiostoma sont caractérisées par la formation d‟ascospores dans des structures spécialisées appelées asques (Kirisits, 2004).

Le genre Ophiostoma est caractérisé par un périthèce avec ostiole, des ascospores non allongées, une cellulose et rhamnose dans les parois des cellules (Upadhyay, 1981). Les stades anamorphes appartiennent à plusieurs genres d‟Hyphomycètes, incluant Leptographium, Pesotum, Sporothrix et Hyalorhinocladiella (De Hoong et Scheffer, 1984).

Le groupe de champignons Ophiostoma sensu lato est un genre variable renfermant des lignées monophylétiques d'espèces qui partagent des caractères morphologiques similaires (Zipfel et al., 2006, Zanzot et al., 2010).

137

L'utilisation des régions ITS pour cerner les espèces de champignons étroitement liées notamment aux Ophiostomatales est récurrente (Kim et al., 1999, De Beer et al., 2003, Zhou et al., 2006). Malheureusement, le séquençage de la région ITS chez les champignons Ophiostomatales présente un défi technique en raison de la teneur élevée en GC (Mullineux et Hausner, 2009). L‟utilisation du gène de ß-tubuline a fourni des informations phylogénétiques plus robustes pour la distinction entre les cinq isolats d‟Ophiostoamatales en prouvant que l'identification des espèces était possible.

Dans le présent travail, nous avons identifié deux espèces du genre Ophiostoma notamment O. quercus et O. tsotsi. O. quercus a été isolée pour la première fois en Yougoslavie à partir de Quercus pedunculata (Georgévitch, 1927). Ce champignon a été impliqué dans le déclin de diverses chênes en Europe centrale (Cech et al., 1990). En Espagne, Luque et al. (2000) ont isolé O. quercus du chêne-liège, et a été considéré comme l‟agent du bleuissement et de la décoloration du xylème de nombreux autres arbres (De Beer et al., 2003; Geldenhuis et al., 2004; Nkuekam et al., 2008). O. quercus est associé à de nombreux insectes plus particulièrement des scolytes (Zhou et al., 2004, 2006; Kirisits, 2007). En Norvège, O. quercus a été associée à Scolytus rafzeburgi dans les galeries de Betula sp. (Linnakoski et al., 2009) et il a été trouvé également en Finlande et en Russie (Linnakoski et al., 2008). En outre, O. quercus fait partie de nombreux agents pathogènes des arbres tels que la maladie hollandaise de l'orme, réputés pour la dévastation qu'ils ont causés aux forêts d'ormes dans l'hémisphère nord (Brasier, 1990, 1991; Lin et al., 2003, Zhou et al., 2004).

En association avec P. cylindrus, O. quercus a été signalé en Algérie sur chêne-liège (Behoucine et al., 2011) et pour la première fois en Tunisie dans le présent travail, dans les forêts de Babouch et Mzara avec des pourcentages de présence de 16,6 et 8,3 %, respectivement. Ces forêts sont caractérisées par des conditions climatiques, édaphiques et phytosanitaires similaires et un sous bois dense. Les analyses phylogénétiques par β-tubuline ont confirmé que l‟isolat TN12.002 en association avec P. cylindrus et de ses galeries présente 100% de similitude avec l‟espèce O. tsotsi. Ce champignon se trouve dans un groupe étroitement proche d‟O. quercus et les agents pathogènes de la maladie hollandaise, O. ulmi et O. novo-ulmi, dans le clade du complexe O. piceae (Grobbelaar et al., 2010). Ceci est en concordance avec nos résultats qui montrent à travers l‟arbre phylogénétique de la région ITS un assemblage de ces deux espèces sous une lignée monophylegénique (O. quercus) et

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qu‟uniquement avec des analyses de β- tubuline que la résolution était meilleure et qu‟il était possible de les différencier.

Il est intéressant que cette nouvelle espèce soit fréquemment trouvée en association avec O. quercus et qu‟il ne soit pas surprenant qu'elle est restée cachée de la reconnaissance comme une entité discrète. Les connaissances disponibles sont limitées pour ce champignon, mais il semble que sa gamme d'hôtes et la distribution se confondent avec ceux de O. quercus (Harrington et al., 2001; De Beer et al., 2003; Grobbelaar et al., 2010).

O. tsotsi a été repéré sur des arbres feuillus en Afrique du Sud (Grobbelaar et al., 2010) et est considérée comme une espèce d'origine de l'hémisphère nord (Brasier, 1990). Sa présence en Tunisie suggère qu'elle a été introduite à partir de cette région qui représente également l'ensemble des pays industrialisés (Europe, Asie, Amérique du Nord). Cela pourrait facilement avoir lieu avec l‟échange et le transport du bois et ses produits de l'hémisphère nord à l'Afrique (Grobbelaar et al., 2010) notamment la Tunisie. D‟autre part ce champignon a été identifié sur Eucalyptus en Chine (Grobbelaar et al., 2011) et en Australie (Nkuekam et al. 2011). Il est important de noter qu‟O. tsotsi a été toujours isolé en association avec O. quercus (Grobbelaar et al., 2010, 2011; Nkuekam et al. 2011). Cette observation est bien confirmée dans notre étude où les deux espèces ont été isolées dans la même forêt de Mzara qui représente un pourcentage d‟attaque par P. cylindrus de l‟ordre de 13% et dont la situation phytosanitaire des arbres est bonne (ch. Chapitre 2).

À l'heure actuelle, même si on ne sait rien au sujet de la pathogénie d‟O. tsotsi, il est fort probable qu‟il ne soit pas un agent pathogène, comme O. quercus, sur les arbres (Geldenhuis et al., 2004). De plus, Grobbelaar et al. (2011) ont avancé qu‟il est probable que ce champignon soit transporté par un insecte qui a colonisé le bois frais. Cette hypothèse peut être confirmée dans notre étude étant donné que nous avons pu isoler cette espèce aussi bien à partir de l‟insecte que de ses galeries.

D‟autre part, O. tsotsi se trouve au sein du clade du complexe O. picea (Harrington et al., 2001; Grobbelaar et al., 2009) étroitement lié à O. novo-ulmi Brasier et O. ulmi (Buisman) Nannf. qui sont les agents responsables de la maladie dévastatrice de l‟orme au cours du dernier siècle. Ainsi, la possibilité qu‟O. tsotsi pourrait constituer une menace pour les arbres vivants ne doit pas être négligée. En dehors de sa pathogénie, de nombreuses questions restent sans réponse sur la biologie et le rôle écologique de ce champignon (Grobbelaar et al., 2011). Ces questions doivent être adressées pour assurer une évaluation précise des risques posés par 139

l'introduction possible d‟O. tsotsi dans de nouveaux environnements par le biais des 'importations et exportations du bois' (Grobbelaar et al., 2010).

L‟étude de la génétique des populations d‟O. quercus et O. tsotsi contribueront à une meilleure compréhension de la distribution et de l'origine de ces champignons. En tenant compte de la relation d‟O. tsotsi avec l‟agent causal de la maladie hollandaise de l‟orme O. ulmi, des études sur son écologie méritent une sérieuse considération.

En Tunisie, ces espèces sont nouvellement rapportées en relation symbiotique avec le platype sur chêne-liège. Les espèces trouvées d‟Ophiostoma et de Raffaelea ont été également obtenues aussi bien à partir du mycangia de l‟insecte que du bois. Sans P. cylindrus comme vecteur, il serait impossible pour ces espèces fongiques, d'une part, d‟infecter de nouveaux hôtes car, les champignons Ophiostomatales exigent des blessures préexistantes pour infecter leurs hôtes (Nkuekam et al., 2012) et d'autre part, de poursuivre leur cycle de vie et les insectes auraient d'énormes difficultés à coloniser de nouveaux arbres. Il existe ainsi une relation obligatoire de symbiose comme défendu par Lieutier (2007). De plus, il y a plusieurs études qui ont montré qu'une ou quelques espèces de champignons sont en association avec certains insectes ambrosia (Batra, 1963; Funk, 1970). Cependant d'autres études ont souligné que les relations symbiotiques sont plus diversifiées, plus prometteuses et plus compétitives que précédemment et que les espèces de Raffaelea sont en concurrence entre elles pour l'entrée à la croissance au sein du mycangia (Harrington et al., 2011).

L‟étude de la pathogénie des espèces identifiées de l‟ordre des Ophiostomatales était indispensable puisque cet ordre contient des phytopathogènes dans la famille des Ophiostomatacées, qui renferme des pathogènes de plantes principalement dans le genre Ophiostoma (Nasraoui, 2015) notemment O. ulmi, agent responsable de la maladie hollandaise de l‟orme.

D‟autre part, des espèces de Raffaelea, qui sont des anamorphes d‟Ophiostomatacées (Anonyme 12, 2016) ont récement été liées à la mortalité massive de chênes au Japon (Kubono et Ito, 2002; Matsuda et al., 2010) et le flétrissement du laurier (Fraedrich et al., 2008) ainsi que l'avocat (Persea americana ) aux Etats-Unis (Eskalen et McDonald, 2011). De même, la pathogénie de R. montetyi et celle de R. canadensis a été étudiée au Portugal (Inácio et al., 2012a) et pourront donc avoir un rôle important dans le déclin du chêne-liège.

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Un mois après les inoculations les symptômes ont pu être observés sur les jeunes plants de chêne-lièges inoculés par R. montetyi et deux semaines plus tard sur les plants inoculés par R. canadensis, alors qu'il a fallu 2 mois pour que les symptômes apparaissent sur les plants inoculés par les espèces d‟Ophiostoma. La mortalité des jeunes plants inoculés par les espèces d‟Ophiostoma a été constatée tardivement à environ trois mois après inoculation. Cependant les deux espèces de Raffaelea ont présenté deux réponses différentes pour la mortalité. Alors que R. montetyi pourrait être la cause de mortalité au bout d‟environs 6 semaines, R. canadensis n‟a pas causé de mortalité.

Malgré l‟observation des symptômes et de quelques mortalités, le ré-isolement des champignons n‟a pas permis d‟obtenir les isolats inoculés, ce qui laisse les postulats de Koch incomplets et ne permet pas par la suite de confirmer la pathogénie des souches.

Des études similaires ont été réalisées au Portugal et ont montré la pathogénie de R. montetyi sur des jeunes plants de chêne-lièges, mais aucune mortalité n'a été observée sur les plants inoculés avec R. canadensis (Inácio et al., 2012a).

Il est donc possible de poser une hypothèse soit, que les souches de champignons testés lors d‟estimation de la pathogénie sont réellement non pathogènes, soit ils le sont mais leur pathogénie n‟a pas pu être démontrée. En effet, la performance des champignons est en étroite relation avec l‟insecte qui les transporte étant donnée que l‟inoculation se produit passivement pendant la construction des galeries: le processus de perforation par les femelles provoque une augmentation des sécrétions glandulaires du mycangia, stimulant les spores à se développer et sortir des puits inter-tégumentaires (Francke-Grossmann, 1967; Farris et Funk, 1965). Une fois à l'intérieur de l'hôte, le champignon peut se propager rapidement à partir de plusieurs points d'infection (Mazzaglia et al., 2001). Donc, l'inoculation directe de l'agent pathogène dans de nouveaux hôtes par l‟insecte peut augmenter l'incidence des maladies dans les peuplements de chêne-liège. Ainsi, l‟inoculation des champignons réalisée par les insectes est plus efficace que tout test de pathogénie.

5.5. Conclusion

Les résultats du présent chapitre permettent d‟avancer que P. cylindrus est associé à des champignons Ophiostomatales à savoir R. montetyi, R. canadensis, O. quercus, O. tsotsi et une autre espèce d‟Ophiostoma dans les subéraies tunisiennes, dont la finalisation des identifications est en cours en collaboration avec l‟équipe portugaise de l‟INIAV et l‟équipe

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sud africaine de FABI (Institut de Bioltechnologie Agricole et Forestières) avec Pr. Michael Wingfield et Pr. Wilhelm De DeBeer.

Toutes les forêts étudiées, présentent au moins une espèce de l‟ordre des Ophiostomatales. L‟espèce la plus présente est R. montetyi rencontrée dans sept sites parmi les dix étudiés. Les autres espèces ne sont apparues que dans deux sites.

La pathogénie des espèces d‟Ophiostomatales n‟a pas pu être prouvée étant donnée qu‟il n‟était pas possible d‟obtenir les isolats lors du ré-isolement, comme le suggère les postulats de Koch, malgré l‟apparition des symptômes, donc il fort probable qu'ils soient réellement de faibles pathogènes ou qu‟ils soient des phytopathogènes dont la pathogénie n‟a pa pu être démontrée sur jeunes plants de chêne-liège.

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Conclusion générale

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Conclusion générale

Les objectifs principaux du présent travail de recherche étaient l‟étude du comportement de l‟insecte Platypys cylindrus dans les forêts de chêne-liège dans le Nord-Ouest de la Tunisie, région 'subéricole' du pays, la compréhension des facteurs contribuant à son installation, l‟inventaire du cortège de champignons associés à l‟insecte et à ses galeries, la compréhension du degré de pathogénie de certaines espèces de champignons et l‟approfondissement de nos connaissances sur la relation Quercus suber / Platypus cylindrus / champignons associés.

Cette étude a montré que P. cylindrus est présent dans toutes les subéraies tunisiennes prospectées avec des pourcentages d'infestation différents variant de 1 à 100%. La partie nord et sud de la subéraie présente un degré faible d‟infestation (moins de 5%), notamment les forêts de Sejnène, Bellif, Ain Soltan, Adissa et Ain Sarouia. La partie centrale de la subéraie qui couvre la région de Ain Drahem, Tabarka et Nefza montre des infestations plus importantes allant de 10 à 100%. Pour expliquer ces différences, les paramètres dendrométriques, phytosanitaires ainsi que ceux relatifs à l‟exploitation du liège ont été analysés et ont permis d‟avancer que la présence de l‟insecte en Tunisie n‟est pas ultimement corrélée à un unique paramètre mais c‟est plus-tôt l‟association de certains facteurs qui favorisent l‟installation de l‟insecte. C‟est la situation phytosanitaire du tronc qui est la plus corrélée au taux d‟infestation. Les attaques de l‟insecte sont en effet plus fréquentes sur les arbres sévèrement blessés, lors de l‟opération de démasclage, que sur les arbres sains. Les blessures occasionnées sur tronc ont été observées dans toutes les forêts avec une moyenne variant de 1 à 42 cicatrices par arbre.

Malgré la vigueur et la bonne situation phytosanitaire des arbres, les blessures occasionnées sur tronc demeurent un paramètre important dans le phénomène de colonisation de l‟hôte par P. cylindrus. La forêt de Ain Drahem est un bon exemple. En effet, malgré que les arbres de cette forêt se montrent plus vigoureux et sains, cette forêt présente 100% d‟attaque avec un taux d‟infestation de 20 trous/arbre. C‟est le site qui présente le plus grand nombre moyen de blessures par arbre qui est de l‟ordre de 42 et où 7 arbres présentent entre 60 et 90 cicatrices. Quel que soit son intensité, l‟opération de la levée du liège met l‟arbre en situation de stress physiologique étant donné que les tissus vivants sont totalement non protégés contre les agents pathogènes et les insectes (Sousa et Débouzie, 1999). Ces derniers sont plus favorisés par les blessures occasionnées sur tronc (Moreira et al., 2007) ce qui diminue la régénération 144

du liège et accélère le dépérissement de l‟arbre (Oliveira et Costa, 2012). Cette observation a été également rapportée en Tunisie par des études antérieures préliminaires (Ben Jamâa et al., 2005, 2010) et plus récemment par Bellahirech et al. (2015).

L‟opération de démasclage mal effectuée constitue donc un facteur prédisposant les arbres à l‟attaque des insectes xylophages et des agents pathogènes (Ben Jamâa et al., 2008) et c‟est aussi une cause de perte de 40% de croissance du liège (Ben Jamâa et al., 2005), principal produit forestier qui provient de la subéraie. Cette opération est par ailleurs très ancienne en Tunisie (1893) et beaucoup de parcelles sont déjà levées 5 fois et plus (Mejbri, 2005).

Les attaques de P. cylindrus semblent être donc plus liées à une mauvaise opération d‟écorçage qu‟à la vigueur et la situation phytosanitaire des arbres et aux conditions pédoclimatiques du milieu. Le cas de la Tunisie est actuellement différent de celui d'autres pays où l'insecte attaque des arbres sains notamment au Portugal (Sousa et al., 2005) et en Algérie (Belhoucine et Bouhraoua, 2012).

Une plus grande prise de conscience des enjeux de la bonne gestion de la levée du liège doit être mise en œuvre pour les professionnels du domaine forestier, car l‟insecte pourrait devenir un ravageur primaire si le problème des blessures par une mauvaise opération de démasclage s‟accentue dans le futur. Ainsi, l'amélioration de la gestion des forêts doit être nécessairement prise en compte dans le but de diminuer les attaques de P. cylindrus.

La comparaison des populations de P. cylindrus en Tunisie et au Portugal, affin de comprendre la différence de comportement de l‟insecte dans les deux pays, a montré une similitude et aucune différence morphologique ou moléculaire n'a été observée (Bellahirech et al., 2015). La gestion sylvicole intense des subéraies 'système Montado', pratiquée au Portugal, pourrait être déterminante dans le processus d‟attaque et peut expliquer en partie la différence de comportement de l‟insecte dans les deux pays (Bellahirech et al., 2015). En effet, les subéraies portugaises sont soumises à une exploitation intensive caractérisée par la pratique de l‟agriculture céréalière et des labours conduisant à une perturbation au niveau du sol (Sousa et Kadiri, 2005). De plus, le coefficient moyen de démasclage en Tunisie est de l‟ordre de 2 et l‟écorçage des arbres se fait tous les 12 à 14 ans (Gharchi et Sghaier, 2008; Chaar et al., 2009 ) pendant les mois de juillet et août alors qu‟au Portugal le coefficient de déliégeage est de 3 et les arbres sont démasclés tous les 9 à 11 ans (Pereira et Tomé, 2004; AFN, 2010) et la levée du liège s‟effectue entre les mois de mai et août. De plus, les conditions climatiques dans les zones subéricoles au Portugal sont plus sévères que celles en 145

Tunisie. En effet la moyenne de précipitation au Portugal est de 700 mm alors qu‟en Tunisie, elle est entre 900 et 1400 mm.

Pour approfondir les connaissances sur la relation entre les traits phylogénétiques et le comportement des ravageurs, des séquences supplémentaires doivent être ajoutées et des spécimens provenant de plus de forêts du Portugal et de la Tunisie, et même d'autres pays méditerranéens, doivent être collectés pour réaliser une analyse multi-génique.

L‟étude de la flore fongique associée à P. cylindrus et à ses galeries a été réalisée pour la première fois en Tunisie dans 10 forêts de chêne-liège entre 2010 et 2011. Nous avons isolé plus de champignons à partir des galeries qu‟à partir des insectes. Cependant, les isolats obtenus à partir des insectes sont plus diversifiés (11 genres) que ceux à partir du bois (8 genres). Ces résultats corroborent ceux trouvés au Portugal (Inácio et al., 2010a).

Les résultats de l‟étude des champignons ont révélé la présence des genres Acremonium, Aspergillus, Biscogniauxia, Botryosphaeria, Fusarium, Gliocladium, Paecilomyces, Penicillium, et Trichoderma en plus des Mucorales et des champignons de l‟ordre des Ophiostomatales (Bellahirech et al., 2014). Il n‟y a pas de différences significatives entre les forêts étudiées.

Le rôle du mycobiota associé à P. cylindrus est variable. Alors que certains peuvent agir comme des champignons ambrosia secondaires tels qu‟Aspergillus et Penicillium, d‟autres comme Gliocladium et Trichoderma, connus pour leurs activités antagonistes, peuvent jouer le rôle de modérateur et contrôlent le développement mycélien à l‟intérieur des galeries (Henriques, 2007). D‟autres genres sont des champignons ambrosia primaires indispensables pour l‟alimentation et la survie de l‟insecte (Batra, 1965; Inácio et al., 2011a), notamment les champignons de l‟ordre des Ophiostomatales (De Beer et al., 2003).

Comme rapporté au Portugal (Inácio, 2011), et également en Tunisie, une meilleure compréhension de l'écologie et de la dynamique des populations des champignons associés à P. cylindrus est désormais importante pour la surveillance et la gestion du complexe insecte/champignon ce qui pourrait améliorer la gestion des attaques de l‟insecte. Ce sont les champignons Ophiostomatales qui ont suscité un intérêt particulier, étant donné qu‟ils sont connus comme pathogènes d‟arbres forestiers, dans l‟objectif de comprendre leur relation avec les taux d‟infestation.

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La proportion de ces champignons Ophiostomatales est différente d'une forêt à une autre. Elle est plus importante à El Jouza que dans Tabouba et Ain Drahem avec respectivement 22,5, 11,4 et 6,2%, malgré que les intensités d'infestation par P. cylindrus soient plus importantes à Ain Drahem (100% et 19 trous/arbre) que Tabouba (88% et 4 trous/arbre) et El Jouza (68% et 4 trous/arbre). D‟autre part, la forêt de Babouch contient plus d‟Ophiostomatales que Mzara et Oued Zen et avec des fréquences plus faibles dans les forêts de Bellif et Séjnène. Ces deux dernières forêts ont été classées comme saines avec de très faibles infestations. Ainsi, l‟hypothèse de la corrélation entre la présence des champignons Ophiostomatales et le taux d‟infestation des sites par l‟insecte ne peut pas être confirmée. Ce résultat est en concordance avec la situation des forêts tunisiennes où P. cylindrus est un ravageur secondaire (Ben Jamâa et al., 2005; Bellahirech et al., 2015) et que son rôle dans le phénomène de dépérissement des arbres n‟est pas associé aux champignons qu‟ils transportent.

C‟est dans un contexte préventif que l‟identification moléculaire des isolats de l‟ordre des Ophiostomatales et leur pathogénie ont été étudiées. Cinq espèces ont été identifiées pour la première fois en Tunisie notamment Ophiostoma sp., O. tsotsi, O. quercus. Raffaelea montetyi et R. canadensis. La première espèce d‟Ophiostoma fait actuellement l‟objet d‟analyses moléculaires plus approfondis en collaboration avec l‟Institut National d‟Investigation Agronomique et Vétérinaire (INIAV) au Portugal et l‟Institut de Biotechnologie Agricole et Forestière (FABI) en Afrique de Sud.

Au niveau du test de pathogénie des champignons, malgré l‟observation des symptômes d'attaques et de quelques mortalités des plants de chêne-liège, on n‟a pas pu ré-isoler les champignons inoculés, ce qui laisse le postulat de Koch incomplet et ne permet pas par la suite de confirmer la pathogénie des souches. Il est donc possible de poser une hypothèse soit, que les souches de champignons testées lors de l‟estimation de la pathogénie sont réellement de faibles pathogènes, soit elles sont pathogènes mais leur pathogénie n‟a pas pu être démontrée. Des études similaires ont été réalisées au Portugal et ont montré la pathogénie de R. montetyi sur des jeunes plants de chêne-liège (Inácio et al., 2011a), mais aucune mortalité n'a été observée sur les plants inoculés avec R. canadensis (Inácio et al., 2012a).

Cette étude qui aborde pour la première fois en Tunisie la relation entre un insecte ambrosia et son arbre hôte d‟une part et les microorganismes qui lui sont associés d‟autre part a permis d‟avoir des résultats prometteurs dans la compréhension d‟interaction tri-trophique. Le statut de P. cylindrus est actuellement un insecte secondaire parce que les infestations sont plus liées

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aux pratiques sylvicoles notamment l‟opération de déliégeage, qu‟aux caractéristiques dendrométriques et phytosanitaire des arbres. Ce sont les blessures occasionnées sur tronc en plus de la situation de stress subit par l‟arbre lors de la levée du liège (Sousa et Kadiri, 2005) qui se fait généralement pendant les périodes estivales (hautes températures), qui contribuent à l‟installation de P. cylindrus. C‟est donc la conjonction de plusieurs facteurs écologiques et environnementaux en plus de l‟action de l‟Homme qui peuvent expliquer le comportement non agressif du platype dans nos forêts.

Ainsi, une formation adéquate et une sensibilisation des ouvriers peuvent améliorer la gestion sylvicole et la qualité de la levée du liège de manière significative. Il serait donc possible de préserver notre patrimoine forestier de valeurs économique, sociale et environnementale indéniables.

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178

Annexes

179

Annexe 1. Pluviométrie et températures des régions étudiées

40 250 45 300 pluie mensuelle cumulée en mm température min en °C pluie mensuelle cumulée en mm température min en °C température max en °C température moyenne en °C température max en °C température moyenne en °C 35 40 250 200 35 30 30 200 25

150 C) ° 25 20 150 20 100 15

15 100

Température ( Température Température (ºC) Température

10 Pluie mensuelle cumulée (mm) mensuelle Pluiecumulée 50 (mm) mensuellePluie cumulée 10 50 5 5

0 0 0 0 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012 Période d'observation Période d'observation

Pluviométrie et température de la région de Bizerte Pluviométrie et température de la région de Béja

40 400 45 160 pluie mensuelle cumulée en mm température min en °C pluie mensuelle cumulée en mm température min en °C température max en °C température moyenne en °C température max en °C température moyenne en °C 35 350 40 140 35 30 300 120

25 250 100

C) ° ° 25 20 200 80 20 15 150 60

Température ( Température Température ( Température

10 100 (mm) mensuellecumulée Pluie 40 10 (mm) mensuellePluie cumulée

5 50 5 20

0 0 0 0 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11 01 03 05 07 09 11

2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012 Période d'observation Période d'observation

Pluviométrie et température de la région de Tabarka Pluviométrie et température de la région de Jandouba Annexe 2. Suivi de l’émergence de Platypus cylindrus au laboratoire

Date d'observation Site Total de Platypus cylindrus 02/02/2012 Ain Beya 2 03/07/2012 Ain Beya 1 04/04/2012 Ain beya 12 05/06/2012 Ain Beya 2 06/03/2012 Ain Beya 8 07/02/2012 Ain Beya 10 11/02/2012 Ain Beya 6 12/01/2012 Ain Beya 7 12/04/2012 Ain beya 6 13/03/2012 Ain Beya 11 14/05/2012 Ain Beya 7 16/02/2012 Ain Beya 3 16/07/2012 Ain Beya 0 17/03/2012 Ain Beya 10 18/01/2012 Ain Beya 2 19/04/2012 Ain Beya 8 21/06/2012 Ain Beya 2 22/02/2012 Ain Beya 5 23/03/2012 Ain Beya 13 24/01/2012 Ain Beya 4 29/02/2012 Ain Beya 6 07/01/2012 Ain Beya 29 26/04/2012 Ain Beya 2 02/02/2012 Ain Sarouia 1 05/06/2012 Ain Sarouia 1 06/03/2012 Ain Sarouia 4 07/02/2012 Ain Sarouia 1

Date d'observation Site Total de Platypus cylindrus 12/01/2012 Ain Sarouia 1 12/04/2012 Ain Sarouia 5 18/01/2012 Ain Sarouia 2 19/04/2012 Ain Sarouia 6 22/02/2012 Ain Sarouia 4 23/03/2012 Ain Sarouia 2 24/01/2012 Ain Sarouia 4 07/01/2012 Ain Sarouia 11 26/04/2012 Ain Sarouia 4 03/07/2012 Babouch 1 07/02/2012 Babouch 1 13/03/2012 Babouch 2 19/04/2012 Babouch 3 23/03/2012 Babouch 1 26/04/2012 Babouch 1 07/01/2012 Babouch 6 02/02/2012 Bellif 1 03/07/2012 Bellif 1 04/04/2012 Bellif 0 05/06/2012 Bellif 2 06/03/2012 Bellif 0 07/02/2012 Bellif 1 12/04/2012 Bellif 0 13/03/2012 Bellif 0 16/07/2012 Bellif 0 17/03/2012 Bellif 3 18/01/2012 Bellif 1 19/04/2012 Bellif 6 21/06/2012 Bellif 5

Date d'observation Site Total de Platypus cylindrus 24/01/2012 Bellif 3 29/02/2012 Bellif 0 06/12/2011 Bellif 1 07/01/2012 Bellif 2 03/07/2012 Bellif 1 12/01/2012 Bellif 1 23/03/2012 Bellif 0 03/07/2012 Hamdiya 1 04/04/2012 Hamdiya 1 05/06/2012 Hamdiya 1 16/07/2012 Hamdiya 0 21/06/2012 Hamdiya 1 07/01/2012 Hamdiya 2 02/02/2012 Mzara 1 03/07/2012 Mzara 5 04/04/2012 Mzara 3 05/06/2012 Mzara 3 06/03/2012 Mzara 0 07/02/2012 Mzara 3 12/04/2012 Mzara 1 13/03/2012 Mzara 13 14/05/2012 Mzara 5 17/03/2012 Mzara 4 18/01/2012 Mzara 3 19/04/2012 Mzara 1 22/02/2012 Mzara 0 26/04/2012 Mzara 5 06/12/2011 Mzara 1 07/01/2012 Mzara 3

Date d'observation Site Total de Platypus cylindrus 03/07/2012 Mzara 7 05/06/2012 Mzara 1 12/01/2012 Mzara 4 16/07/2012 Mzara 1 19/04/2012 Mzara 3 21/06/2012 Mzara 1 23/03/2012 Mzara 3 26/04/2012 Mzara 2 06/03/2012 Oued Zen 1 11/02/2012 Oued Zen 1 12/01/2012 Oued Zen 3 17/03/2012 Oued Zen 1 18/01/2012 Oued Zen 1 22/02/2012 Oued Zen 1 24/01/2012 Oued Zen 1 29/02/2012 Oued Zen 1 07/01/2012 Oued Zen 8 06/12/2011 Sejnène 1

site Endroit n Acremonium Aspergillus Biscognirauxia Fusarium Gliocladium Mucorales Ophiostomatales Paecilomyces Penicillium Trichoderma mâle 65 2 3 2 8 15 Ain femelle 91 3 2 1 5 1 7 2 34 55 Beya larve 89 1 1 1 1 12 16 galerie 7 2 1 5 3 11 mâle 24 2 1 2 5 Ain femelle 22 2 1 3 1 7 Sarouia larve 0 0 galerie 7 1 4 2 7 mâle 7 1 2 3 Babouc femelle 8 1 2 1 4 h larve 0 0 galerie 3 1 2 3 3 2 11 mâle 17 2 3 5 femelle 11 1 2 8 1 12 Bellif larve 66 0 galerie 4 1 3 3 3 2 4 3 19 mâle 35 1 3 4 femelle 38 3 2 3 11 21 Mzara larve 16 0 galerie 7 1 1 1 6 7 2 18 mâle 1 1 1 2 femelle 0 0 Sejnène larve 0 0 galerie 3 3 2 3 2 3 1 14 mâle 11 1 1 2 4 Oued femelle 7 1 1 1 3 Zen larve 0 0 galerie 3 2 2 2 2 3 2 13

249 Totale insectes: 508 Totale galeries: 34

Articles Scientifiques

Liste des publications

1. Bellahirech A., Inácio M.L., Nóbrega F., Bonifácio L., Sousa E., Ben Jamâa M.L., 2016. Can differences of Platypus cylindrus (Coleoptera: Platypodinae) in Portugal and Tunisia be explained by genetic and morphological traits? Bulletin of Entomological Research. 106, 1–8.

2. Bellahirech A., Bonifácio L., Inácio M.L., Sousa E., Ben Jamâa M.L. 2015. A Contribution to the Knowledge of Platypus cylindrus in Tunisian Cork Oak Forests. Tunisian Journal of Plant Protection: 10 (2), 141-150.

3. Bellahirech, A., Inácio M.L., Bonifácio, L., Nóbrega F., Sousa E., Mohamed Lahbib Ben Jamâa M.L., 2014. Comparison of fungi associated with Platypus cylindrus (Coleoptera: Platypodidae) in Tunisian and Portuguese cork oak stands. IOBC-WPRS Bulletin. 101, 39-46.

4. Bellahirech A., Sousa E., Pedro Naves P., Ben Jamâa M.L. 2012. Behavior of Platypus cylindrus F. (Coléoptera: Platypodidae) in Tunisian cork oak forests. Annales de l‟INRGREF (2012), 17, Numéro spécial MedInsect 3, 91-99.

5. Bellahirech A., Zouaoui M., Lurdes Inacio M.L, Ben Jemaa M.L. 2012. Preliminary study of fungi associated with Platypus cylindrus (Coleoptera: Platypodidae) on cork oak in Tunisia. Annales de l‟INRGREF (2012), 17, Numéro spécial MedInsect 3, 17-27.