UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA
DANIEL TELES ZATTA
Estudo farmacognóstico, avaliação da toxicidade aguda e da atividade antimicrobiana das folhas de Jacaranda decurrens Cham. – Bignoniaceae.
Goiânia 2008
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Daniel Teles Zatta
Estudo farmacognóstico, avaliação da toxicidade aguda e da atividade antimicrobiana das folhas de Jacaranda decurrens Cham. – Bignoniaceae.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Professor Dr. José Realino de Paula
Goiânia 2008
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (GPT/BC/UFG)
Zatta, Daniel Teles. Z38e Estudo farmacognóstico, avaliação da toxicidade aguda e da atividade antimicrobiana das folhas de Jacarandá decurrens Cham. - Bignoniaceae [manuscrito] / Daniel Teles Zatta. – 2008. 134 f. : il., color., figs. tabs., qds.
Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Faculdade de Farmácia, 2008.
Bibliografia. Inclui lista de figuras e quadros, tabelas e de abreviaturas.
1. Etnofarmacologia 2. Jacaranda 3. Morfo-anatomia - Folhas 4. Toxicidade aguda 5. Plantas medicinais I. Paula, José Realino. II. Universidade Federal de Goiás. Faculdade de Farmácia III. Título.
CDU: 615.32
Daniel Teles Zatta
Estudo farmacognóstico, avaliação da toxicidade aguda e da atividade antimicrobiana das folhas de Jacaranda decurrens Cham. – Bignoniaceae.
Dissertação defendida no Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas – Mestrado – da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás, para a obtenção do grau de Mestre, aprovada em 30 de maio de 2008, pela Banca Examinadora constituída pelos seguintes professores:
Prof. Dr. José Realino de Paula – UFG Presidente da Banca
Prof. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira – UFG
Profa. Mirley Luciene dos Santos - UEG
À Deus por ter me dado condições de realizar este sonho; à minha família, em especial à minha mãe Maria Laise Teles Miranda, e aos meus tios Hibelmon Garcia de Souza (in memorian) e Noélia Miranda de Souza, pelo auxílio e pela força que me deram até aqui. Serei sempre grato a vocês.
AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr. José Realino de Paula, orientador desta dissertação, pela paciência, dedicação, confiança e pelo exemplo de pesquisador.
À professora Leonice Manrique F. Tresvenzol, pelas orientações, incentivos e auxílios prestados durante toda a realização deste trabalho.
Aos professsores Fabiana Cristina Pimenta e Luis Carlos da Cunha, por todo o auxílio prestado na execução deste trabalho.
À Direção do Laboratório de Análises Clínicas Rômulo Rocha FF -
UFG, representada pela professora Joana D'arc Ximenes Alcanfor, pela importantíssima colaboração.
À farmacêutica Lílian de Souza (in memorian), pela valiosa colaboração.
À senhora Clélia Fróis Camarano pela valiosa ajuda durante os ensaios realizados no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de
Farmácia - UFG
Aos colegas da pós-graduação Flávia Néri Meira de Oliveira, Leslivan
Ubiratan de Moraes, Rafael Nunes Leles, Guilherme Nobre Nascimento,
Tatiana de Souza Fiúza, Alexandre Pereira dos Santos, Weuller F. de Moraes e
Lília Cristina de Souza Barbosa, inestimáveis companheiros de pesquisa e aprendizado.
À minha namorada Gilvana Cristina de Barros, pelo apoio, paciência e incentivo durante essa caminhada.
À Deus, que tornou possível a realização de mais este sonho e à minha mãe Maria Laise Teles Miranda, minha irmã Laidilce Teles Zatta, Maria Firmina da Silva e aos tios Hibelmon de Souza Garcia (in memorian) e Noélia
Miranda de Souza. À vocês o MEU MUITO OBRIGADO!
“Aprendi que quando se quer conseguir algo, tem-se que dominar a razão e não a força. Aprendi como é bom chegar quando se tem paciência. Aprendi que, acima de tudo, o importante é querer.” Amir Klink RESUMO
A flora do cerrado é bastante rica em plantas medicinais, as quais desempenham um importante papel na medicina popular. Este trabalho tomando-se como base informações etnofarmacológicas, fez o estudo farmacognóstico, avaliação da atividade antimicrobiana e da toxicidade aguda das folhas de Jacaranda decurrens Cham. No capítulo 1 foram feitas considerações sobre os aspectos gerais da família botânica, alguns gêneros importantes usados na medicina popular e características gerais da espécie em estudo. O capítulo 2 descreve a determinação de parâmetros de qualidade para a identificação da droga vegetal (folha). Tendo em vista este objetivo, foi feita a coleta do material vegetal em Senador Canedo (Herbário da UFG n. 27805). O material foi posteriormente dividido em duas partes. A primeira foi destinada às análises macro e microscópicas. A segunda foi seca, triturada e usada para a triagem fitoquímica. Pôde-se verificar que as folhas têm grande quantidade de tricomas tectores e estômatos anomocíticos na epiderme abaxial. A epiderme adaxial das folhas apresenta em vista frontal células epidérmicas de tamanhos variados com paredes anticlinais. Na triagem fitoquímica foram detectados heterosídeos flavonóides, saponinas e cumarinas. Foram encontrados os seguintes valores para os teores de umidade, cinzas totais e insolúveis em ácido: 7,43%, 7,75% e 0,53% respectivamente. Estes resultados configuram-se como importantes parâmetros para o controle de qualidade desta matéria-prima vegetal. O capítulo 4 descreve a avaliação in vitro da atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto das folhas utilizando-se o teste de difusão em ágar, para a triagem, e o método de diluição em ágar, para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Além do extrato etanólico bruto a determinação da concentração inibitória mínima foi feita também com as frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica. O extrato testado apresentou ação antimicrobiana frente a todos os microrganismos usados na avaliação. As frações só foram testadas frente aos isolados de Pseudomonas aeruginosa que se apresentaram mais sensíveis ao extrato etanólico bruto. A fração com melhor atividade foi a de acetato de etila que conseguiu inibir o crescimento microbiano com a concentração de 0,39 mg/mL. Finalmente, no capítulo 4, foi feito o estudo de toxicidade aguda em dose única. Nesse estudo foram avaliadas as dose de 2000 mg/mL e 5000 mg/mL em ratos e camundongos de ambos os sexos. Não houve a morte de nenhum animal, assim como a manifestação de sinais clínicos de toxicidade avaliados através do screening hipocrático. Estes resultados fazem desta planta uma proposta promissora ao tratamento de infecções provocadas pelos microrganismos utilizados nos testes de atividade antimicrobiana. Todavia, ainda são necessários estudos complementares de toxicidade subcrônica e crônica do extrato etanólico, acompanhados de ensaios de isolamento das moléculas responsáveis pela atividade biológica.
Palavras-chave: Etnofarmacologia, Morfo-anatomia, Concentração inibitória mínima, Toxicidade aguda. ABSTRACT
The savanna is very rich in medicinal plants, that play a important role in popular medicine. This research, based in ethnopharmacological models, made the pharmacognostic study, evaluation of the antimicrobial activity and acute toxicity of Jacaranda decurrens Cham. leaves. In the chapter 1, general aspects of the botanic family are approached, some important genus in the folk medicine and characteristic of the specie in study. The chapter 2 describes the determinations of the quality parameters for the identification of the plant material (leaf). For in such a way, the collection of botanical material was made in Senador Canedo (UFG Herbarium UFG-27.805). The material was then divided into two parts. The first was designed for macroscopic and microscopic analysis. The second, was air-dried, grinded u and used for phytochemical screening. It was found that the leaves have large amounts of tectors trichomes and anomocytic stomata in the abaxial epidermis. The adaxial epidermis of the leaves shows a view front epidermal cells of various sizes with anticlinal walls. Coumarins, saponins and flavonoids heterosides were detected in the phytochemical screening. We found the following values to the levels of humidity, total ash and acid-insoluble: 7.43%, 7.75% and 0.53% respectively. This results are important parameters for the quality control of this pant drug. The chapter 4 describes the evaluation in vitro of antimicrobial activity of crude ethanolic extract of leaves using agar diffusion test and agar dilution method for the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC). The tested extracts had presented antimicrobial action against all microorganisms used in this evaluation. The fractions were only tested against the isolates of Pseudomonas aeruginosa that was presented more sensitive to ethanolic crude extract. The fraction with better activity was the ethyl acetate that has inhibit microbial growth with a concentration of 0.39 mg/mL. Finally, in Chapter 4, was made the study of acute toxicity in a single dose. In this study were assessed the dose of 2.000 mg / mL and 5.000 mg / mL in rats and mice of both gender. It was no observed the death of any animal, as well as the manifestation of clinical signs of toxicity. These results make this plant a proposal promising the treatment of infections caused by these microorganisms used in tests of antimicrobial activity. However, further studies are still needed to subchronic and chronic toxicity of crude ethanolic extract, accompanied by tests of isolation of the molecules responsible for biological activity.
Keywords: Ethnopharmacology, Morpho-anatomy, Minimal inhibitory concentration, Acute toxicity
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
CAPÍTULO 1
Figura 1 Jacaranda decurrens Cham. 1A-1B, aspecto geral da planta. 1C, fruto. 1D, folhas...... 49
CAPÍTULO 2
Figura 2 Secções paradérmicas das folhas de Jacaranda decurrens Cham. 2A e 2B, epiderme adaxial destacada pela solução de Jeffrey e coloração com Safranina. 2C e 2D, eoiderme adaxial destacada pela solução de Jeffrey...... 51
Figura 3 Microscopia eletrônica de varredura das epidermes adaxial e abaxial do foliólulo de Jacaranda decurrens Cham. 3A e 3B, epiderme adaxial. 3C e 3D, epiderme abaxial com estômatos e tricomas tectores respectivamente..... 52
Figura 4 Secção transversal do mesofilo do foliólulo da folha de Jacaranda decurrens Cham. 4A e 4B, aspecto geral do mesofilo. 4C, tricoma tector em forma de barco na epiderme abaxial. 4D, tricoma tector globoso na epiderme inferior...... 53
Figura 5 Secções transversais da lâmina foliar de Jacaranda decurrens Cham. 5A, secção transversal da internervura. 5B, secção transversal da borda do foliólulo do ápice folha...... 54
Figura 6 Secção transversal da nervura principal dos foliólulos da folha de Jacaranda decurrens Cham. 6A, aspecto geral. 6B, detalhe do sistema vascular central. 6C, detalhe da epiderme apresentando tricomas glandulares...... 56
Figura 7 Secção transversal da raque secundária da folha de Jacaranda decurrens Cham. 7A, aspecto geral da nervura principal. 7B, detalhe do perênquima medular. 7C, detalhe do parênquima medular...... 58
Figura 8 Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. 8A, aspecto geral. 8B, detalhe dos dois primeiros feixes vasculares dos prolongamentos superiores. 8C, detalhe do terceiro feixe vascular do prolongamento superior. 8D, detalhe da epiderme abaxial até o floema...... 60
Figura 9 Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. 9A, presença de células pétreas na calota esclerenquimática. 9B, parênquima medular com pontuações. 9C, tricoma tector pluricelular achatado na epiderme lateral. 9D, tricoma tector alongado...... 61
Figura 10 Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. 10A, aspecto geral. 10B, detalhe do tricoma tector na epiderme lateral. 10C, detalhe da epiderme abaxial até parênquima medular. 10D, histoquímica com reagente de Steinmetz...... 62
Figura 11 Secção transversal da região mediana do pecíolo da folha de Jacaranda decurrens Cham. 11A – aspecto geral. 11B – detalhe do primeiro feixe vascular da projeção da face adaxial. 11C, detalhe do terceiro feixe vascular da projeção da face adaxial. 11D, detalhe do tricoma da epiderme
dd pecíolo...... 64
Figura 12 Secção transversal da região mediana do pecíolo da folha de Jacaranda decurrens Cham. 12A, detalhe da epiderme abaxial até xilema. 12B, detalhe da epiderme abaxial até perênquima medular...... 65
Figura 13 Secção transversal do pulvino da folha de Jacaranda decurrens Cham. 13A, aspecto geral. Fig. 13B, sistema vascular central. 13C, feixe vascular lateral próximo à face adaxial...... 67
Figura 14 Secção transversal do pulvino das folhas de Jacaranda decurrens Cham. 14A, detalhe da epiderme adaxial. 14B, tricoma tector da epiderme adaxial. 14C, tricoma tector enrolado da epiderme adaxial. 14D, detalhe do esclerênquima, floema, xilema e parênquima medular. 13E, detalhe do
esclerênquima, floema e idioblasto...... 68
Figura 15 Microscopia de pó das folhas de Jacaranda decurrens Cham. submetido ao reagente de Steinmetz. 15A, fragmento de epiderme adaxial. 15B, fragmento de epiderme abaxial. 15C, tricoma tector pluricelular unisseriado. 15D, célula pétrea. 15E, fragmento de fibras com bainha cristalífera..... 70
Capítulo 3
Quadro 1 Microrganismos utilizados na triagem de atividade antimicrobiana...... 93
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 Teores de umidade, cinzas totais e insolúveis em ácido clorídrico expressos em percentagem (p/p) em folhas de Jacaranda decurrens...... 71
Tabela 2 Principais classes de metabólitos secundários detectados na amostra de Jacaranda decurrens.... 71
Capítulo 3
Tabela 1 Halos de inibição (mm) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens utilizando o teste de difusão em ágar...... 97
Tabela 2 Concentração inibitória mínima (mg/mL) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre micorganismos gram-positivos e gram-negativos...... 98
Tabela 3 Concentração inibitória mínima (mg/mL) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre isolados de Pseudomonas aeruginosa...... 99
Tabela 4 Concentração inibitória mínima (mg/mL) das frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e aquosa obtidas a partir do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre isolados de Pseudomonas aeruginosa...... 101 LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC: American Type Culture Collection (USA)
IPTSP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
µL: Microlitros
mL: Mililitros
OECD: Organization for Economic Co-operation and Development
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 18
REFERÊNCIAS 23
CAPÍTULO 1 JACARANDA DECURRENS CHAM. –
BIGNONIACEAE: REVISÃO DA
LITERATURA...... 25
REFERÊNCIAS...... 29
CAPÍTULO 2 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DE
QUALIDADE DAS FOLHAS DE JACARANDA
DECURRENS CHAM. – BIGNONIACEAE...... 31
1 INTRODUÇÃO...... 32
2 METODOLOGIA...... 33
2.1 DESCRIÇÃO MORFO-ANATÔMICA...... 33
2.1.1 Material botânico...... 33
2.1.2 Descrição macroscópica...... 33
2.1.3 Descrição microscópica...... 34
2.1.4 Microscopia eletrônica de varrredura...... 35
2.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE E
CINZAS...... 36
2.2.1 Determinação do teor de umidade...... 36
2.2.2 Determinação do teor de cinzas...... 37
2.3 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA...... 38
2.3.1 Pesquisa de heterosídeos antraquinônicos...... 39
2.3.2 Pesquisa de heterosídeos digitálicos...... 39
2.3.3 Pesquisa de heterosídeos flavonóides...... 41
2.3.4 Pesquisa de heterosídeos saponínicos...... 43
2.3.5 Pesquisa de taninos...... 44
2.3.6 Pesquisa de alcalóides...... 45
2.3.7 Pesquisa de cumarinas...... 46
2.4 Doseamento de flavonóides totais...... 47
3 RESULTADOS...... 49
3.1 DESCRIÇÃO MACROSCÓPICA...... 49
3.2 DESCRIÇÃO MICROSCÓPICA...... 50
3.2.1 Lâmina foliar...... 50
3.2.2 Nervura principal...... 55
3.2.3 Raque secundária...... 57
3.2.4 Raque primária...... 59
3.2.5 Pecíolo...... 63
3.2.6 Pulvino...... 66
3.2.7 Microscopia de pó...... 69
3.3 TEOR DE UMIDADE, CINZAS TOTAIS E CINZAS
INSOLÚVEIS EM ÁCIDO CLORÍDRICO...... 71
3.4 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA...... 71
3.5 DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES TOTAIS...... 72
4 DISCUSSÃO...... 73 4.1 CARACTERES MORFO-ANATÔMICOS...... 73 4.2 TEOR DE UMIDADE, CINZAS TOTAIS E CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO CLORÍDRICO...... 75 4.3 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA...... 76 4.4 ANÁLISE QUANTITATIVA DOS FLAVONÓIDES TOTAIS...... 78 5 CONCLUSÕES...... 80 REFERÊNCIAS...... 81
CAPÍTULO 3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE JACARANDA DECURRENS CHAM. – BIGNONIACEAE...... 84 1 INTRODUÇÃO...... 85 2 METODOLOGIA...... 91 2.1 MATERIAL BOTÂNICO...... 91 2.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO 91 2.3 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ETANÓLICO... 92 2.4 TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR...... 92 2.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO E DAS FRAÇÕES...... 94 3 RESULTADOS...... 97 3.1 TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR...... 97 3.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA...... 98 4 DISCUSSÃO...... 103 4.1 TESTE DA DIFUSÃO EM ÁGAR...... 103 4.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA...... 106 5 CONCCLUSÕES 109 REFERENCIAS...... 110
CAPITULO 4 ESTUDO DE TOXICIDADE AGUDA EM DOSE ÚNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE JACARANDA DECURRENS CHAM - BIGNONIACEAE...... 113 1 INTRODUÇÃO...... 114 2 METODOLOGIA...... 118 2.1 MATERIAL BOTÂNICO...... 118 2.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO 118 2.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA SEGUNDO AS DIRETRIZES OECD 423...... 118 2.3.1 Descrição dos animais...... 118 2.3.2 Critério de definição da amostra...... 119
2.3.3 Descrição do alojamento...... 119 2.3.4 Descrição detalhada do procedimento experimental...... 120 2.4 DESTINO DOS ANIMAIS APÓS EXPERIMENTAÇÃO...... 122 3 RESULTADOS...... 123 4 DISCUSSÃO...... 124 5 CONCLUSÕES...... 128 REFERÊNCIAS...... 129
CAPÍTULO 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS 131
18
1. INTRODUÇÃO
A necessidade foi, e continuará sendo a alavanca que impulsiona a humanidade. A dor fez com que o homem buscasse o analgésico, a doença, o remédio. Portanto é fácil inferir que o uso de partes de plantas e animais no combate
às doenças seja tão antigo quanto a própria humanidade (OLIVEIRA; AKISSUE,
1993).
O estudo de plantas medicinais se remonta praticamente ao princípio da evolução do homem sobre a Terra. O homem pré-histórico observava o comportamento instintivo dos animais na hora de cuidar das feridas ou tratar suas enfermidades. Com o passar do tempo pôde-se observar que certas espécies eram propícias para o uso como alimento e outras tóxicas. Estas observações deram origem ao processo intuitivo que caracterizou os primeiros habitantes e que lhes permitiu testar diversas plantas e discernir quais possuíam efeitos medicinais daquelas que não possuíam (ALONSO, 1998).
Aproximadamente quatro milhões de pessoas no mundo fazem uso de plantas medicinais. O uso da fitoterapia nos países desenvolvidos e nos países pobres obedece a duas razões um tanto quanto contrapostas. Nos primeiros ressurge como resposta da população a uma medicina agressiva e iatrogênica; em contrapartida, nos segundos, constitui um recurso ancestral fortemente enraizado em seus costumes culturais (ALONSO, 1998).
As plantas medicinais são disponíveis em abundância nos trópicos. Elas oferecem a população destes locais e de outros também, o acesso imediato a produtos que podem ser utilizados no tratamento de suas doenças através da auto- medicação. Além disso, as plantas medicinais são importantes para a medicina 19
moderna em quatro aspectos básicos: são usadas como fontes diretas de agentes terapêuticos, servem como matéria-prima base para a elaboração de compostos químicos semi-sintéticos mais complexos, fornecem substâncias cujas estruturas químicas podem servir como modelo para novos compostos sintéticos e finalmente podem ser usadas como marcadores taxonômicos para a descoberta de novos compostos químicos (AKERELE, 1993).
Estes aspectos tornam o estudo de plantas medicinais multidisciplinar.
Contribuem para isso os conhecimentos advindos da etnobotânica, farmacognosia, botânica, química, agronomia, biologia, farmacotécnica e outras áreas afins.
Um número considerável de fármacos utilizados no arsenal terapêutico da medicina moderna é derivado de plantas. Pode-se citar a atropina (anticolinérgico), codeína (antitussígeno), colchicina (anti-gota), digitoxina e digoxina (cardiotônicos), vincristina (antitumoral), morfina (analgésico), quinina e artemisina (antimalárico) reserpina (anti-hipertensivo), fisostigmina (colinérgico) e outros mais (AKERELE,
1993).
O Brasil é um país rico pela sua enorme biodiversidade, sendo os componentes desta os responsáveis por fornecerem uma ampla gama de produtos de importância econômica. Todavia sua magnitude não é conhecida com precisão.
Sabe-se que são mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre
350.000 e 550.000 em toda a superfície do planeta (GUERRA; NODARI, 2004).
O bioma cerrado é provavelmente a maior savana do mundo e o segundo maior bioma brasileiro, ocupando aproximadamente 2.000.000 Km2 no Brasil
Central, mais áreas disjuntas nos outros biomas adjacentes (HENRIQUES, 2005;
LIMA; SILVA, 2005). 20
A flora do cerrado é bastante rica em plantas medicinais. Neto e Moraes
(2003) ao realizarem revisão bibliográfica referente a trabalhos que indicassem o uso de plantas medicinais do cerrado mato-grossense. Encontraram um total de 509 espécies, distribuídas em 297 gêneros e 96 famílias botânicas, o que resultou em uma média de cinco espécies/família. As famílias com maior número de espécies medicinais foram: Asteraceae (7%), Fabaceae (7%), Caesalpinaceae (5%),
Bignoniaceae (4,9%), Mimosaceae (3,5%), Rubiaceae (3,1%), Euphorbiaceae
(2,9%), Sapindaceae (2,5%), Sterculiaceae (2,3%), Malpighiaceae (2,1%),
Arecaceae (1,9%), Lamiaceae (1,9%), Moraceae (1,9%), Poaceae (1,9%) e
Vochysiaceae (1,9%).
Estudos etnobotânicos mostram que as populações locais têm conhecimento do potencial terapêutico da flora do cerrado. Rizzo et al. (1999) avaliaram o uso de plantas medicinais pelas populações das cidades de Pirenópolis e Goiás.
Comprovou-se que nestas cidades os usuários de plantas medicinais atingiram valores acima de 80% dos entrevistados. Vieira e Martins (1996) através da realização de entrevistas com raízeiros nas cidades de Jataí em Goiás e Correntina na Bahia, relacionaram 29 espécies vegetais, englobando 21 famílias botânicas usadas medicinalmente pela população.
Os dados das pesquisas etnobotânicas e etnofarmacológicas constituem um atalho para a exploração científica interdisciplinar dos agentes biologicamente ativos e tradicionalmente empregados ou observados pelo homem. O uso tradicional pode ser encarado como uma pré-triagem quanto à utilidade terapêutica em humanos.
Outra vantagem seria o fato de a etnofarmacologia se basear em informações de utilidade terapêutica e não em um determinado perfil químico das espécies que, em tese, indicaria a possibilidade de interação com um determinado alvo biológico. Essa 21
abordagem é particularmente útil no caso de categorias de doenças cuja patofisiologia não é bem conhecida. (ELISABETSKY; SOUZA, 2004).
A idéia predominante de as plantas atuarem apenas como medicamentos, sem haver menção de qualquer efeito adverso ou condição imprópria para a utilização das mesmas foi constatada por Trevenzol et al. (2006) através de um estudo sobre o comércio informal de plantas medicinais em Goiânia e cidades vizinhas. E de fato predomina entre os adeptos da fitoterapia o pensamento de que as plantas medicinais de uso tradicional já foram testadas e homologadas pelo seu uso prolongado na própria espécie humana. Por isso, seriam os remédios eficazes e seguros, naturalmente balanceados, sem os efeitos colaterais comuns aos produtos sintéticos, não necessitando, portanto, da avaliação exigida para este tipo de medicamento (LAPA et al., 2004).
A planta medicinal utilizada em medicamentos é um xenobiótico, isto é, um produto estranho ao organismo humano, nele introduzido com finalidades terapêuticas. Como todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser encarados até prova em contrário. De fato, não há porque, a priori, considerar inócua uma planta medicinal, se do reino vegetal são obtidas substâncias extremamente tóxicas como a estricnina, a digitoxina, os curares e os heterosídeos cianogênicos (LAPA et al., 2004).
Com intuito de colaborar com o conhecimento sobre plantas medicinais é que esse trabalho foi desenvolvido, onde a Jacaranda decurrens Cham. da família
Bignoniaceae foi eleita como objeto de estudo. Objetivou-se, desta forma, determinar parâmetros de identidade e qualidade para fins de Controle de Qualidade de amostras de folhas da referida espécie vegetal e avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto das folhas e das frações aquosa, acetato 22
de etila, diclorometano e hexânica. Para tanto foi feita a caracterização macroscópica e microscópica da folha, determinou-se os teores de cinzas e umidade; realizou-se a prospecção fitoquímica, para a verificação das classes de metabólitos secundários presentes e realizou-se os ensaios para determinação da ação antimicrobiana das folhas da Jacaranda decurrens Cham.
23
REFERÊNCIAS
AKERELE, O. Summary of WHO Guidelines for Assessment of Herbal Medicines. HerbalGram, Austin, v. 28, p. 13-18, winter 1993.
ALONSO, J. R. Tratado de Fitomedicina Bases Clínicas y Farmacológicas. ISIS Ediciones S. L. R.: Buenos Aires, 1998. 1039 p.
ELISABETSKY. E.; SOUZA, G. C. Etnofarmacologia como Ferramenta na Busca de Substâncias Ativas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 107-122.
GUARIM NETO, G.; MORAIS, R. G. Recursos Medicinais de espécies do cerrado de Mato Grosso: um estudo bibliográfico. Acta Botanica Brasílica, Porto Alegre, v. 17, p. 561-564, dez. 2003.
GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 13-28.
HENRIQUES, R. P. B. Influência da história, solo e fogo na distribuição e dinâmica das fotofisionomias no bioma cerrado. In: SCARIOT, A.; SOUZA-
LAPA, A. J. et al. Farmacologia e Toxicologia de Produtos Naturais. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 247-262.
LIMA, J. E. F. W.; SILVA, E. M. Estimativa da Produção Hídrica Superficial do Cerrado Brasileiro. In: SCARIOT, A.; SOUZA-SILVA, J. C.; FELFILI, J. M. Cerrado: ecologia, biodiversidade e conservação. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, 2005. p. 61-72.
OLIVEIRA, F; AKISSUE, G. Fundamentos de Farmacobotânica. Atheneu: São Paulo, 1993. 222 p.
RIZZO, J. A. et al. Utilização de plantas medicinais nas cidades de Goiás e Pirenópolis, Estado de Goiás. Revista de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 20, p. 431-447, dez.1999.
24
SILVA, J. C.; FELFILI, J. M. Cerrado: ecologia, biodiversidade e conservação. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, 2005. p. 73-92.
TRESVENZOL, L. M. et al. Estudo sobre o comércio informal de plantas medicinais em Goiânia e cidades vizinhas. Revista Eletrônica de Farmácia, Goiânia, v. 3, p. 23-28, jul. 2006.
VIEIRA, F. R.; MARTINS, M. V. M. Estudos etnobotânicos de espécies medicinais de uso popular no cerrado. In: SIMPÓSIO SOBRE O CERRADO, 8., 1996, Brasília. Anais... Brasília: EMBRAPA-CPAC, 1996. p. 169-171.
25
Capítulo 1
Jacaranda decurrens Cham. –
Bignoniaceae: revisão da literatura
26
1- INTRODUÇÃO
A família Bignoniaceae (Dicotyledonae), segundo a Angiosperm Phylogeny
Group II (CHASE, 2003), pertence à ordem Lamiales e subclasse Euasteridae I. Ela reúne 120 gêneros, com aproximadamente 750 espécies, geralmente tropicais espontâneas na América do Sul, incluindo árvores, lianas, arbustos e raramente ervas. Os gêneros mais importantes da família, com ampla distribuição nas regiões tropicais, são Tabebuia e Jacaranda. No Brasil, os gêneros mais comuns são
Tabebuia, que inclui os ipês e o pau d´arco; Pyrostegia, da famosa flor-de-são-joão; a medicinal unha-de–gato do gênero Bignonia, e as várias espécies do gênero
Zeyhera (HIRUMA-LIMA; DI STASI, 2002).
Nesta família os caules freqüentemente apresentam organização de lenho anômala. As folhas simples ou compostas são de posição oposta, raramente sub- alternas. As formas escandentes apresentam gavinhas de origem foliar, às vezes modificadas em fixadores semelhantes a unhas ou a ventosas. As flores são geralmente grandes, vistosas, solitárias ou reunidas em inflorescências de forma variada. São hermafroditas zigomorfas e pentâmeras. O quinto estame transformado em estamódio. Os quatro restantes são didínamos (dois mais curtos). O ovário apresenta-se assentado em cima de um disco ou imerso nele. É composto de dois carpelos, bilocular e multiovular. O fruto geralmente é seliquiforme, septicido, e às vezes em forma de cápsula loculicida. Na maioria das representantes desta família, as sementes são aladas (GEMTCHÚNICOV, 1976).
Vários estudos, com diferentes focos, têm sido realizados utilizando-se espécies da família Bignoniaceae. Muñoz-Mingarro et al. (2003) observaram as atividades antiinflamatória e antinociceptiva do extrato aquoso bruto e das frações 27
éter etílico, butanólica e aquosa das folhas e vagens de Catalpa bignoides Walt. A atividade antitumoral foi demonstrada por Pauletti e Bolzoni (2003) ao estudarem a ação das frações semi-purificadas e do extrato bruto da folhas de Arrabidaea samydoides Sandw. sobre linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisae. A atividade hipoglicemiante do extrato aquoso das frutas de Parmentiera edulis DC. foi descrita por Negri (2005). A ação tripanossomicida de Arrabidaea triplinervia (Mart. ex DC.) Baill. ex Bureau foi relatada por Leite et al. (2001) ao avaliar a ação do extrato etanólico das folhas sobre a forma tripomastigota do Trypanossoma cruzi.
Estudos fitoquímicos têm mostrado que plantas da família Bignoniaceae apresentam uma diversidade de constituintes químicos entre os quais se incluem lignanas, flavonóides, monoterpenos, triterpenos, quinonas, glicosídeos iridóides e fenólicos, ácidos cinâmicos e benzóicos; alcalóides são raramente encontrados
(OLIVEIRA et al., 1990; KANCHANAPOOM et al., 2006; MARTIN et al., 2007;
WOLLENWEBER et al., 1996).
Poucos estudos capazes de dar embasamento ao uso medicinal da
Jacaranda decurrens Cham. foram encontrados na literatura pesquisada. Dados etnobotânicos indicam o seu uso popular para o tratamento de infecções, reumatismo e depurativo do sangue (OLIVEIRA et al., 2001; VILA VERDE; PAULA;
CARNEIRO, 2003; TRESVENZOL et al., 2006).
Carrim et al. (2006) isolaram e identificaram microrganismos endofíticos a partir das folhas de Jacaranda decurrens Cham. e avaliaram a atividade enzimática dos mesmos. Carrim (2005) também avaliou a produção de bacteriocina pelos mesmos microrganismos endofíticos, observando efeito inibitório sobre o crescimento de Agrobacterium tumefasciens, Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
Corynebacterium glutamicum, Micrococcus luteus e Rodococcus equi. Em um outro 28
estudo com a mesma planta Varanda et al. (1992) isolaram o ácido ursólico e testaram o mesmo contra o inseto herbívoro Shizaphis graminum, observando efeito deletério sobre os insetos adultos e diminuição da taxa reprodutiva.
Em 2003 Oliveira et al. realizaram o estudo farmacognóstico das raízes de
Jacaranda decurrens Cham., e mais recentemente Mauro et al. (2007) realizaram estudo anatômico do limbo foliar do foliólulo, pecíolo, e caule desta mesma planta coletada no Cerrado de Botucatu, SP.
A Jacaranda decurrens Cham. também conhecida popularmente como carobinha ou caroba-do-campo é um arbusto campestre muito pouco ramoso podendo chegar até três metros de altura. A sua raiz é lenhosa e bastante globosa.
O caule é pubescente enquanto jovem e depois glabro. Apresenta ramos verde-sujo ou acizentados, pubescentes. As folhas são paribipinatifidas com 8-9 jugas ou mais, apresentando foliólulos decorrentes, estreitos, glabros na face adaxial e pilosos na abaxial, sendo também discolores. As flores são campanuladas, azuis ou roxas, grandes e dispostas em racimos. O fruto apresenta-se em cápsula, suborbicular, retuba no ápice e aguda na base com até 9 cm de comprimento e 7 cm de largura.
As sementes são elípticas, irregularmente crenuladas e ala frágil (CÔRREA, 1984).
29
REFERÊNCIAS
CARRIM, A. J. I. Bioprospecção de microrganismos endofíticos com atividade enzimmática e bacteriogênica em isolados de Jacaranda decurrens Cham. (Carobinha do Campo). 2005. 78 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2005.
CARRIM, A. J. I.; BARBOSA, E. C.; VIEIRA, J. D. G. Enzymatic activity of endophytic bacterial isolates of Jacaranda decurrens Cham. (carobinha-do-campo). Brazilian Archives of Biology and Technology, Curitiba, v. 49, p. 353-359, May 2006.
CHASE, M. et al. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: AGP II. Botanical Journal of the Linnean Society, London, v. 141, p. 399-436, 2003.
CÔRREA, M. P. Dicionário de Plantas Úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura - Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 1984. v. 2, 707 p.
GEMTCHÚNICOV, I. D. Manual de Taxonomia Vegetal. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1976. 368 p.
HIRUMA-LIMA, C. A.; DI STASI, L. C. Scrophulariales medicinais. In: Plantas Medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. São Paulo: Editora UNESP, 2002. p. 449-462.
KANCHANAPOOM, T. et al. Lignan, phenolic and iridoid glycosides from Stereospermum cylindricum. Phytochemistry, London, v. 67, p. 516-520, March 2006.
LEITE, J. P. V. et al. Isolamento biomonitorado de uma substância tripanossomicida de Arrabidaea triplinervia (Bignoniaceae), o ácido ursólico. Revista Brasileira de Farmacognosia, João Pessoa, v. 11, p. 77-87, abril/junho 2001.
MARTIN, F. et al. Iridoid glycosides from the stems of Pithecoctenium crucigerum (Bignoniaceae). Phytochemistry, London, v. 68, p. 1307-1311, May, 2007.
30
MAURO, C. et al. Estudo anatômico das espécies de cerrado Anemopaegma arvense (Vell.) Stellf. ex de Souza (catuaba), Zeyheria montana Mart. (bolsa-de- pastor) e Jacaranda decurrens Chamisso (caroba) – Bignoniaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, João Pessoa, v. 17, p. 262-265, abril/junho 2007.
MUÑOZ-MINGARRO, D. et al. Biological activity of extracts from Catalpa bignoides Walt. (Bignoniaceae). Journal of Ethnopharmacolgy, Ypsilanti, v. 87, p. 163-167, August 2003.
NEGRI, G. Diabetes melito: plantas e princípios ativos naturais hipoglicemiantes. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 41, p. 121-142, abril/junho 2005.
OLIVEIRA, A. B. et al. Estrutura química e atividade biológica de naftoquinonas de Bignoniáceas brasileiras. Química Nova, São Paulo, v. 13, p. 302-307, julho/agosto 1990.
OLIVEIRA, T. B. et al. Estudo farmacognóstico das raízes de Jacaranda decurrens Cham. (Bignoniaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, João Pessoa, v. 13, supl., p. 54-55, 2001.
PAULETTI, P. M.; BOLZANI, V. S. Constituintes químicos de Arrabidaea samydoides (Bignoniaceae). Química Nova, São Paulo, v. 26, p. 641-643, setembro/outubro 2003.
TRESVENZOL, L. M. et al. Estudo sobre o comércio informal de plantas medicinais em Goiânia e cidades vizinhas. Revista Eletrônica de Farmácia, Goiânia, v. 3, p. 23-28, jul. 2006.
VARANDA, E. M. et al. Effect of ursolic acid from epicuticular waxes of Jacaranda decurrens on Shizaphis graminum. Journal of Natural Products, Washington DC, p. 800-803, June 1992.
VILA VERDE, G. M.; PAULA, J. R.; CARNEIRO, D. M. Levantamento etnobotânico de plantas medicinais do cerrado utilizadas pela população de Mossâmedes (GO). Revista Brasileira de Farmacognosia, João Pessoa, v. 13, supl., p. 64-66, 2003.
WOLLENWEBER, E.; DÖRR, M.; GOMEZ, L. D. P. Exudate flavonoids in Godmania aesculifolia (Bignoniaceae). Biochemical Systematics Ecology, Great Britain, v. 24, p. 481-482, October/December 1996.
31
Capítulo 2
Determinação dos Parâmetros de
Qualidade das Folhas de Jacaranda decurrens Cham. – Bignoniaceae.
32
1- INTRODUÇÃO
A definição de qualidade segundo Farias (2004) é o conjunto de critérios que caracterizam a matéria-prima para o uso ao qual se destina. O mesmo autor ainda chama a atenção para o fato de que a partir do estabelecimento dos parâmetros de qualidade para a matéria-prima, e considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de produção do medicamento, a qualidade do produto final estará em grande parte assegurada.
A definição de parâmetros de controle de qualidade para matérias-primas vegetais torna-se cada vez mais importante na medida em que as populações e as indústrias de países desenvolvidos e em desenvolvimento passam a utilizar mais intensamente as plantas medicinais como fonte de princípios ativos para a produção de medicamentos (WHO, 1998).
Nesse contexto, os parâmetros de controle de qualidade juntamente com as informações sobre a segurança determinadas por ensaios farmacológicos pré- clínicos e clínicos, dos efeitos biológicos preconizados, assim como ensaios que determinem a inexistência de efeitos tóxicos bem como a ausência de contaminantes nocivos à saúde é que vão determinar a segurança e eficácia de um fitoterápico (FARIAS, 2004).
Levando-se em conta estas informações e o uso etnomedicinal da Jacaranda decurrens Cham. é que se descreve neste capítulo macro e microscopicamente a folha, assim como são apresentados os teores de umidade, cinzas e cinzas insolúveis em ácido. Também são descritos as principais classes de metabólitos secundários presentes e o doseamento de flavonóides totais, com a finalidade de estabelecer os parâmetros de qualidade deste material vegetal. 33
2- METODOLOGIA.
2.1- DESCRIÇÃO MORFO-ANATÔMICA
2.1.1. Material botânico
Para o estudo morfo-anatômico foram utilizadas folhas adultas de exemplares de Jacaranda decurrens coletadas às margens da GO-019, em Senador Canedo,
Goiás, Brasil (16º 45´ 45,2´´ Sul e 49º 07´ 0,68’’ Oeste a 762 m altitude) em outubro de 2003.
O material botânico foi coletado em região de solo vermelho bem drenado e em dia ensolarado e uma excicata foi depositada no herbário da Universidade
Federal de Goiás sob o número UFG – 27805.
A planta foi fotografada em seu habitat natural e após a coleta e preparo do material vegetal, utilizando-se uma câmera fotográfica digital Olympus modelo X-
775.
A planta coletada foi levada para o laboratório de Farmacognosia e dessecada ao ar livre. Posteriormente foi triturada em moinho de faca. O material vegetal após ter sido dessecado e triturado foi identificado, acondicionado e armazenado até a utilização nos experimentos.
2.1.2. Descrição macroscópica
A caracterização macroscópica foi feita à vista desarmada segundo parâmetros descritos por Oliveira e Akisue (1993). 34
2.1.3. Descrição microscópica
Para a análise microscópica foram utilizadas folhas livres de injúrias, com o limbo completamente expandido. Destas folhas, foram retirados folíolos medianos e destes, os foliólulos. Regiões medianas dos pecíolos, também foram retiradas. De cada foliólulo, analisou-se a nervura central, entrenervuras e bordo. O material vegetal coletado foi fixado em FAA 50% (formaldeído, ácido acético, etanol 55%) por
48 horas e posteriormente preservado em etanol 70%, até o momento de se executar os cortes (JOHANSEN, 1940).
Segundo as técnicas usuais na Microtécnica Vegetal, a confecção das lâminas histológicas foi realizada a partir de secções transversais, obtidas à mão livre. As secções foram clarificadas em hipoclorito de sódio a 10-12%, posteriormente lavadas em água destilada e submetidas à dupla coloração com azul de astra 0,3% e fucsina básica 0,1%. Após a coloração os fragamentos foram desidratados em série alcoólica crescente (30%, 50%, 70%, 90% e 100%), pós- desidratadas em xilol e álcool (1:1) e xilol puro, de acordo com Johansen (1940).
Lâminas permanentes foram montadas utilizando-se resina verniz vitral incolor
(PAIVA et al., 2006).
Os mesmos cortes descritos acima após a clarificação do material com hipoclorito de sódio 10-12% e a lavagem com água destilada, também foram submetidos ao reagente de Steinmetz, em preparações semi-permanentes utilizando-se lâminas montadas com glicerina 50% (V/V).
Para a realização dos cortes paradérmicos utilizou-se a técnica descrita por
Kraus e Arduin (1997), fazendo-se a maceração do material botânico com a mistura de ácido nítrico 10% e ácido crômico 10%, solução de Jeffrey (Johansen, 1940). Em 35
seguida foram feitas preparações semelhantes às descritas para os cortes corados com reagente de Steinmetz.
As fotomicrografias foram realizadas em fotomicroscópio ZEISS Axioskop, utilizando-se filme Kodacolor ASA 100 e as escalas que acompanham as ilustrações foram obtidas nas mesmas condições ópticas.
2.1.4. Microscopia eletrônica de varredura
Fragmentos da porção mediana dos folíolos de Jacaranda decurrens Cham. foram fixados em solução de Karnovsky modificada, composta por glutaraldeído 2%, paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio pH 7,2 0,05 M por 24 horas.
Após esse tempo, os fragmentos foram submetidos a três lavagens em tampão cacodilato 0,05 M, com duração de 10 minutos cada e depois armazenados em refrigerador, fazendo trocas temporárias quando o tampão se apresentasse escuro, até o momento do uso (BOZZOLA; RUSSEL, 1992).
Após, os fragmentos foram submetidos a tampão cacodilato de sódio e tetróxido de ósmio (1:1) por 1 hora, a seguir lavados em água destilada de 2 a 3 vezes e posteriormente, foram desidratados em série etanólica crescente (30%,
50%, 70% e 90%) com duração de 15 minutos cada e 3 vezes em etanol 100%, 10 minutos cada (BOZZOLA; RUSSEL, 1992). No Laboratório de Microscopia
Eletrônica, da Universidade de Brasília (UnB), os fragmentos foram levados à secagem ao ponto crítico de CO2, utilizando-se o Aparelho de Secagem ao Ponto
Crítico da Balzers CPD30 e logo após, metalizados em ouro, com camada de cobertura de aproximadamente 40 nm por 2 minutos, em Aparelho Metalizador Zeiss
DSM-962. A análise foi realizada em Microscópio de Varredura JEOL-JSM 840A. 36
As eletromicrografias foram obtidas em filme FUJI NEOPAN Asa 100. As escalas e feixes de elétrons encontram-se registradas nas fotos.
2.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE E CINZAS
Para a determinação destes parâmetros de qualidade das folhas de
Jacaranda decurrens foi usado o material botânico preparado como descrito anteriormente no item 2.1.1.
2.2.1. Determinação do teor de umidade
Os ensaios para determinação do teor de umidade foram realizados em triplicata segundo a Farmacopéia Brasileira IV (1988). Pesou-se em balança analítica 2 g do material botânico pulverizado e transferiu-se para um cadinho previamente pesado e dessecado a 105°C por 30 minutos. Em seguida, a amostra foi dessecada em estufa a 100-105°C por 2h, resfriada em dessecador e pesada.
Prosseguiu-se a dessecação pesando o material em intervalos de 1h. O ensaio foi considerado concluído quando duas pesagens sucessivas não diferiram entre si por mais de 5 mg. A percentagem de água foi calculada em relação à amostra seca ao ar utilizando-se a fórmula:
37
% teor de umidade = 100 x (P –p)/ P
Onde:
P – massa da amostra em gramas; p –massa da amostra dessecada.
2.2.2. Determinação do teor de cinzas
2.2.2.1. Determinação do teor de cinzas totais
Para a determinação desse parâmetro de qualidade, os ensaios foram realizados em triplicata conforme a Farmacopéia Brasileira IV (1988). Pesou-se em balança analítica, 3 g da amostra pulverizada, os quais foram transferidos para um cadinho de porcelana previamente calcinado a 500°C em mufla, resfriado e pesado.
A amostra foi distribuída de forma uniforme e incinerada até a obtenção de cinzas brancas. Em seguida, a amostra foi resfriada em dessecador e pesada. A porcentagem de cinzas totais foi calculada em relação à amostra seca ao ar conforme fórmula abaixo:
% teor de cinzas = 100 x N/ P
Onde:
N –massa de cinzas totais da amostra em gramas;
P – massa da amostra em gramas.
38
2.2.2.2. Determinação do teor de cinzas insolúveis em ácido clorídrico (HCl)
Os resíduos obtidos na determinação do teor de cinzas totais foram fervidos durante 5 minutos com 12,5 mL de HCl (SR) em cadinhos cobertos com vidros de relógio. O resíduo foi filtrado em papel de filtro quantitativo, os cadinhos e os vidros de relógio foram lavados com água quente. O papel de filtro contendo o resíduo foi lavado com água quente até o filtrado tornar-se neutro (Farmacopéia Brasileira IV,
1988).
O papel de filtro contendo o resíduo foi transferido para o cadinho original e levado à secagem e carbonização em fogareiro. Em seguida, o cadinho foi transferido para mufla pré-aquecida a 500°C, incinerando-se o resíduo por 5h até a formação de cinzas brancas. O cadinho foi resfriado em dessecador e pesado. O experimento foi realizado em triplicata
A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido clorídrico foi calculada em relação à amostra inicial (COSTA, 2001).
2.3. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
A análise qualitativa das principais classes de metabólitos secundários presentes nas folhas de Jacaranda decurrens, coletadas em Senador Canedo foi realizada na amostra pulverizada. Utilizaram-se metodologias adaptadas por Costa
(2001), Matos (1988) e, Matos e Matos (1989) descritos a seguir.
39
2.3.1. Pesquisa de Heterosídeos Antraquinônicos
Para a extração dos possíveis heterosídeos antraquinônicos, pesou-se em balança de precisão, 1g da amostra pulverizada e acrescentou-se 30mL de etanol a
75% (V/V). A mistura foi aquecida durante 3 minutos em chapa aquecedora, e em seguida filtrada ainda quente através de papel de filtro.
Para a caracterização dessa classe de metabólitos secundários transferiu- se 10 mL do filtrado para um béquer de 40 mL que foi designado (I) e 10 mL para outro béquer que foi designado (II). O conteúdo do béquer (I) foi acidificado com 0,5 mL de HCl a 10% (V/V) e levado à fervura por 2 minutos em chapa aquecedora, sendo que com o conteúdo do béquer (II) fez-se o mesmo procedimento, exceto a acidificação.
Os líquidos foram transferidos para tubos de ensaio designados de (I) e (II), respectivamente, após o resfriamento, adicionou-se, a cada um 10 mL de éter etílico
P. A., agitando-os levemente. Em seguida, separou-se 5 mL da fase etérea dos tubos (I) e (II), e acrescentou-se 4 mL da amônia 50% (V/V) em cada um, deixando- os em repouso por cinco minutos. Coloração rósea ao vermelho na fase amoniacal indica reação positiva para heterosídeos antraquinônicos.
2.3.2. Pesquisa de Heterosídeos Digitálicos
Para a extração dos possíveis heterosídeos digitálicos presentes na amostra pulverizada pesou-se, em balança de precisão, 2,5 g da amostra pulverizada, adicionou-se 25 mL de etanol a 50% (V/V) e 10 mL de solução de acetato de chumbo a 10% (p/V) e levou-se à fervura por quatro minutos. Após o 40
resfriamento, o volume foi completado para 25 mL com etanol 50% (V/V) e filtrado.
Transferiu-se o filtrado para um funil de separação e extraiu-se duas vezes com 15 mL de clorofórmio P. A. A fração clorofórmica foi utilizada nas reações de pesquisa de heterosídeos digitáicos descritas abaixo.
2.3.2.1. Reação de Liebermann-Bourchard (reação de caracterização do núcleo esteróide): transferiu-se 3 mL da fração clorofórmica para um tubo de ensaio e levou-se a secura em banho-maria. Ao resíduo do tubo adicionou-se 1,0 mL do reagente de Liebermann-Bourchard (1,0 mL de clorofórmio P. A., 1,0 mL de anidrido acético P. A. e 3-4 gotas de ácido sulfúrico concentrado) deixou-se o tubo de ensaio em repouso por 5 minutos para observação da coloração. O aparecimento de cor acastanhado ao esverdeado indica reação positiva.
2.3.2.2. Reação de Keller-Kiliani (reação para detecção de desoxi-açúcares): evaporou-se até a secura 5 mL da fração clorofórmica num tubo de ensaio em banho-maria. Ao resíduo do tubo adicionou-se um reagente recém preparado contendo 3 mL de ácido acético glacial P. A. e 0,1 mL cloreto férrico 9% (p/V). O conteúdo do tubo foi homogeneizado e lentamente vertido para um tubo de ensaio contendo 2,0 mL de ácido sulfúrico concentrado. A formação de um anel de coloração castanho-avermelhada na zona de contato, bem como o aparecimento de coloração azul-esverdeada na camada acética indica reação positiva.
2.3.2.3.Reação de caracterização do núcleo esteróide: evaporou-se 3 mL da fração clorofórmica até à secura numa cápsula de porcelana em chapa aquecedora.
Acrescentou-se ao conteúdo da cápsula, após resfriamento, 3-6 gotas de ácido fosfórico concentrado. Observando-se sob luz ultravioleta o aparecimento de florescência, que indica resultado positivo. 41
2.3.2.4. Reação de Kedde (reação específica do anel lactônico): transferiu-se 6 mL da fração clorofórmica para um tubo de ensaio e levou-se à secura em banho-maria.
Ao resíduo do tubo adicionou-se 2 mL de etanol 50% (V/V), 2 mL de água destilada,
2 mL do reagente ácido 3-5-dinitrobenzóico a 1% (p/V) recém preparado em etanol a
96% (V/V) e 2 mL de hidróxido de potássio 1 Molar. Após o repouso de 5 minutos, a formação de coloração castanho avermelhada indica reação positiva.
2.3.3. Pesquisa de Heterosídeos Flavonóides
Para a extração de possíveis heterosídeos flavonoídes presentes na amostra pulverizada, pesou-se em balança de precisão, 7 g da amostra e adicionou- se 60 mL de etanol a 70% (V/V). Essa mistura foi fervida durante 5 minutos e filtrada em papel de filtro umedecido em etanol a 70% (V/V).
Com o filtrado obtido anteriormente foram realizadas as seguintes reações a fim de caracterizar essa classe de metabólitos secundários:
2.3.3.1. Reação de Shinoda: transferiu-se 3 mL do filtrado para um tubo de ensaio.
Adicionou-se cerca de 1 cm e fita de magnésio e acrescentou-se cuidadosamente 1 mL da HCl concentrado. O aparecimento de coloração vermelha indica a presença de heterosídeos flavonóides.
2.3.3.2. Reação Oxalo-Bórica: evaporou-se 5 mL de solução extrativa em uma cápsula de porcelana. Juntou-se ao resíduo semi-seco 3 mL de solução de ácido bórico a 3% (p/V) e 1 mL de solução de ácido oxálico a 10% (p/V) evaporou-se até secura e adicionou-se ao resíduo seco 7 mL de éter etílico P. A. Observou-se sob luz ultra-violeta quanto a ocorrência ou não de fluorescência. 42
2.3.3.3. Reação com Ácido Sulfúrico Concentrado: adicionou-se 3 mL da solução extrativa numa cápsula de porcelana e deixou-se evaporar até a semi-secura.
Juntou-se 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado e observou-se sob luz ultra-violeta quanto ao aparecimento de fluorescência.
2.3.3.4. Reação com Hidróxidos Alcalinos: transferiu-se 3 mL da solução extrativa para um tubo de ensaio. Adicionou-se 1 mL de NaOH a 20% (p/V) e agitou-se o tubo. Havendo heterosídeos digitálicos na amostra será observado a o desenvolvimento de coloração amarela.
2.3.3.5. Reação com Cloreto de Alumínio: transferiu-se cerca de 5 mL da solução extrativa para um béquer ou cápsula de porcelana. Concentrou-se à metade e transferiu-se para um pedaço de papel de filtro espalhando sobre toda a superfície.
A seguir, umedeceu-se uma das regiões do papel com cloreto de alumínio a 5%
(p/V) em metanol e observou-se sob luz ultra-violeta quanto ao aparecimento de fluorescência.
2.3.3.6. Reação com Cloreto Férrico: transferiu-se 3 mL da solução extrativa para um tubo de ensaio. Juntou-se 2 gotas de cloreto férrico a 4,5% (p/V) para que fosse possível a observação de coloração azul, verde, marrom ou vermelha, o que indica reação positiva.
43
2.3.4. Pesquisa de Heterosídeos Saponínicos
Para a extração dos possíveis heterosídeos saponínicos presentes na amostra pulverizada, pesou-se em balança de precisão 1 g da amostra em pó e adicionou-se a um béquer contendo 100 mL de água destilada. Essa mistura foi levada à chapa aquecedora por 5 minutos, adicionando-se, durante a decocção, carbonato de sódio em solução até a neutralização que foi observada utilizando-se papel indicador de pH. Logo em seguida, a mistura foi filtrada em algodão e ao fluido acrescentou-se água destilada até completar um volume de 100 mL.
Para a caracterização dessa classe de metabólitos secundários montou-se uma bateria de 10 tubos de ensaio com tamanho e diâmetros iguais. Os tubos de ensaio foram marcados com duas graduações diferentes: a primeira correspondente a 10 mL e a segunda a 1 cm acima desta. Em seguida adicionou-se ao primeiro tubo
1 mL de solução extrativa e 9 mL de água destilada. Ao segundo tubo, adicionou-se
2 mL de solução extrativa e 8 mL de água destilada. Ao terceiro tubo adicionou-se 3 mL de solução extrativa e 7 mL de água destilada e assim por diante. Ao último tubo adicionou-se apenas solução extrativa (10 mL). Após essa montagem, cada tubo foi vigorosamente agitado por 20 segundos e deixado em repouso por 10 minutos.
Observou-se ou não o aparecimento de espuma persistente. Segundo Shenkel,
Gosmann e Athayde (2004), a presença de saponinas na amostra será constatada pela formação de espuma persistente, que não desaparece após a adição de um
ácido mineral diluído.
44
2.3.5. Pesquisa de Taninos
Para a extração de possíveis taninos presentes na amostra pulverizada, pesou-se em balança de precisão, 2 g da amostra. Adicionou-se 50 mL de água destilada e tal mistura foi levada à fervura durante 5 minutos. Em seguida, filtrou-se a mistura, ainda quente, utilizando papel de filtro. Completou-se o volume do filtrado obtido para 100 mL e procedeu-se a pesquisa de taninos.
Montou-se um bateria contendo 6 tubos de ensaio. A cada tubo adicionou- se 5 mL da solução extrativa e procedeu-se as seguintes reações:
2.3.5.1. Reação com Gelatina: adicionou-se ao primeiro tubo, 5 gotas de solução de gelatina a 2,5% (p/V) em solução de cloreto de sódio a 5% (p/V). A presença de taninos na amostra seria evidenciada pelo aparecimento de precipitado branco.
2.3.5.2. Reação com alcalóides: adicionou-se ao segundo tubo 5 gotas de sulfato de quinino a 1% (p/V) em ácido sulfúrico a 5% (p/V). Ao terceiro tubo, adicionou-se 5 gotas de solução de brucina a 1% em solução de ácido sulfúrico a 5% (p/V). A formação de precipitado indica a presença de taninos na amostra.
2.3.5.3. Reação com Sais Metálicos: ao quarto tubo adicionou-se 5 gotas de acetato de cobre a 4% (p/V). Ao quinto tubo acrescentou-se 2 gotas de cloreto férrico a 2%
(p/V). O aparecimento de precipitado indica a presença de taninos.
2.3.5.4. Reação com Hidróxidos Alcalinos: ao sexto tubo adicionou-se 5 gotas de solução de hidróxido de sódio (ou potássio) a 20% (p/V). a presença de taninos na amostra seria observada pelo escurecimento da solução. 45
Para cada uma destas reações foi preparado um tubo controle que continha
5mL de ácido tânico 0,5% (p/V) e os reagentes da reação correspondente, a fim de comparar o tubo teste com o tubo controle.
2.3.6. Pesquisa de Alcalóides
Para a extração dos possíveis alcalóides presentes na amostra pulverizada, pesou-se em balança de precisão, 2 g da amostra. Adicionou-se 20 mL de ácido sulfúrico a 5% (V/V). Essa mistura foi levada á fervura por 3 minutos, e em seguida, filtrada em papel de filtro e resfriada.
Esse filtrado foi submetido à pesquisa de alcalóides utilizando-se os reagentes gerais dos alcalóides de acordo com metodologias adaptadas de Costa
(2001). Abaixo estão descritos os reagentes e as respectivas técnicas de preparo segundo Assumpção e Morita (1968):
Reativo de Mayer: dissolveu-se em água 2,71 g de cloreto de mercúrio e 10 gramas de iodeto de potássio, e em seguida, completou-se o volume para 200 mL com água destilada. Agitou e filtrou-se.
Reativo de Dragendorff: dissolveu-se 8 g de subnitrato de bismuto em 20 mL de ácido nítrico a 30% (p/V). Dissolver, em separado, 22,8 g de iodeto de potássio em um volume mínimo de água destilada. Transferiu-se a primeira solução, pouco a pouco, sobre a segunda. Deixou-se em repouso durante algumas horas e filtrou-se. Completou-se volume com água destilada para 100 mL. 46
Reativo de Bouchardat: dissolveu-se 4 g de iodeto de potássio e 2 g de iodo em 100 mL de água destilada.
Reativo de Bertrand: dissolveu-se 5 g de ácido sílico-tungístico em 100 mL de água destilada.
Reativo de Hager: dissolveu-se 2 g de ácido pícrico em 100 mL de água destilada.
Ácido Tânico: dissolver 1 g de ácido tânico em 100 mL de água destilada.
A solução extrativa foi distribuída igualmente em seis tubos de ensaio, sendo que em cada tubo, respectivamente, acrescentou-se 3-9 gotas dos reativos gerais para alcalóides citados acima. Montou-se em paralelo, uma outra bateria de seis tubos de ensaio, contendo 3 mL de solução padrão de sulfato de quinino 1%
(p/V). Em cada um destes tubos adicionou-se 3-9 gostas dos respectivos reativos gerais de alcalóides a fim de servirem como padrão para comparação com a primeira bateria de tubos.
A presença de alcalóides é demonstrada pelo aparecimento de precipitado nos tubos.
2.3.7. Pesquisa de Cumarinas
Para extração de possíveis cumarinas presentes na amostra pulverizada, pesou-se 2 g da mesma em balança de precisão e adicionou-se a 30 mL de água 47
quente. Essa mistura foi filtrada, e ao filtrado adicionou-se 1mL de HCl 1N (até pH
1). Em seguida, extraiu-se com 10 mL éter etílico P. A. A fase etérea foi concentrada até a metade de seu volume.
Para a caracterização dessa classe de metabólitos secundários aplicaram- se gotas da fase etérea obtida anteriormente sobre duas regiões em um pedaço de papel de filtro. Em uma das manchas formadas adicionou-se uma gota de NaOH 1N.
O papel foi observado sobre a luz ultravioleta quanto ao aparecimento de fluorescência e desenvolvimento e coloração amarela, respectivamente.
2.3.8. Doseamento de Flavonoídes Totais
Para o doseamento de flavonóides totais contidos na droga pulverizada dos espécimes de Jacaranda decurrens, utilizou-se metodologia descrita na
Farmacopéia Brasileira IV (2001), na monografia da planta Calêndula (Calendula officinalis L.). Todo o ensaio foi realizado em triplicata
Pesou-se exatamente 0,4 g da droga pulverizada e colocou-se em balão de fundo redondo de 100 mL. Acrescentou-se 1 mL de uma solução aquosa de hexametilenotetramina a 0,5% (p/V), 20 mL de acetona P. A. e 2 mL de ácido clorídrico concentrado. Aqueceu-se em manta aquecedora, sob refluxo, por 30 minutos. Filtrou-se a mistura em algodão, para balão volumétrico de 100 mL, retornando o resíduo da droga e o algodão para o mesmo balão de fundo redondo, adicionando-se 20 mL de acetona P. A. Colocou-se em refluxo por 10 minutos. Após resfriamento à temperatura ambiente, filtrou-se a solução para balão volumétrico de 48
100 mL. Repetiu-se a operação. Após esta etapa, completou-se o volume do balão volumétrico com acetona P. A. Em funil de separação, tratou-se 20 mL desta solução com 20 mL de água destilada e após, extraiu-se com 15 mL de acetato de etila P. A., repetindo-se 3 vezes com porções de 10 mL de acetato de etila (P. A.).
Reuniram-se as fases acetato de etila e as mesmas foram lavadas em funil de separação, com duas porções de 50 mL de água destilada, transferindo-se a seguir para balão volumétrico de 50 mL, completando-se o volume com acetato de etila P.
A. esta solução passou a ser chamada de solução mãe (SM). Pipetou-se 10mL desta solução, adicionou-se 1 mL do reagente cloreto de alumínio (1 g de cloreto de alumínio dissolvido em solução metanólica de ácido acético 5% (V/V), até completar
50 mL em balão volumétrico), diluindo-se em balão volumétrico de 25 mL com solução metanólica de ácido acético a 5% (V/V). Após 30 minutos, mediu-se a absorvância da solução a 425 nm, em cubeta de 1 cm, utilizando o branco (solução mãe diluída em solução metanólica de ácido acético 5%) para ajuste do zero.
Calculou-se a porcentagem de flavonóides totais segundo a fórmula:
TFT = A x 62.500/ 500 x m x (100 – PD)
Onde:
A – Absorvância m – Massa da amostra padronizada
PD – Perda por dessecação (%; p/p)
O resultado foi fornecido por percentagem (p/p) de flavonóides calculados como hiperosídeo (C21H20O12).
49
3. RESULTADOS
3.1. DESCRIÇÃO MACROSCÓPICA:
As folhas das espécimes de Jacaranda decurrens coletadas em Senador
Canedo são radiciais, nascendo nas primeiras porções do caule; completas, paribipinatifidas com 8-9 jugas ou mais, apresentando foliólulos decorrentes, estreitos, glabros na face adaxial e pilosos na abaxial, além de discolores (Figuras
1,2 e 3)
A B
C D
Figura 1. Jacaranda decurrens Cham. Fig. 1A-1B, aspecto geral da planta. Fig. 1C, fruto. Fig. 1D, folha.
50
3.2. DESCRIÇÃO MICROSCÓPICA
3.2.1. Lâmina Foliar
A epiderme da folha adulta de Jacaranda decurrens, em secção paradérmica, evidenciou ao microscópio óptico células com paredes sinuosas, espessas e de tamanhos variados na face abaxial (Figs. 2A e 2B). Sobre as nervuras foram observadas cicatrizes deixadas pela queda de tricomas tectores
(Figs. 2A). Em microscopia eletrônica de varredura (MEV) observa-se a presença de cicatriz e tricoma tector longo (Figs. 3A e 3B).
Na face abaxial encontra-se maior quantidade de tricomas tectores longos, estômatos anomocíticos e estrias epicuticulares (Figs. 2C e 2D). Em microscopia eletrônica de varredura fica evidênciada a presença dos tricomas tectores longos e de grande número de estômatos (Figs. 3C e 3D).
Em seccão transversal, a folha de Jacaranda decurrens apresenta mesofilo dorsiventral, epiderme adaxial unisseriada com cutícula espessa apresentando franjas (Figs. 4A, 4B e 5A). A epiderme abaxial também é uniseriada apresentando estrias e tricoma em forma de barco e tector globoso (Figs. 4B, 4C e 4D). O parênquima paliçádico apresenta-se uniseriado ocupando 1/3 do mesofilo enquanto o parênquima lacunoso ocupa 2/3 (Figs. 4A, 4B, 5A e 5B). Observa-se a presença de feixes vasculares protegidos por calota esclerenquimática voltada para epiderme abaxial e extensão da bainha voltada para epiderme adaxial (Figs. 4A e 4B).
51
A B
C D
Figura 2. Secções paradérmicas das folhas de Jacaranda decurrens Cham. Figs. 2A e 2B, epiderme adaxial destacada pela solução de Jeffrey e coloração com Safranina. Fig. 2C e 2D, eoiderme adaxial destacada pela solução de Jeffrey. Legenda: Ce – célula epidérmica com parede sinuosa; Ci – cicatrizes pela queda de tricomas tectores; Tt – tricoma tector; Es – estômato anomocítico; Es – estrias epicuticulares.
52
A B
C D
Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura das epidermes adaxial e abaxial do foliólulo de Jacaranda decurrens Cham. Figs. 3A e 3B, epiderme adaxial. Figs. 3C e 3D, epiderme abaxial com estômatos e tricomas tectores respectivamente.
53
A B
C D
Figura 4. Secção transversal do mesofilo do foliólulo da folha de Jacaranda decurrens Cham. Figs. 4A e 4B, aspecto geral do mesofilo. Fig. 4C, tricoma tector em forma de barco na epiderme abaxial. Fig. 4D, tricoma tector globoso na epiderme inferior. Legenda: Epa – epiderme adaxial; Epb – epiderme abaxial; Pp – parênquima paliçádico; Pl – parênquima lacunoso.
54
A B
Figura 5. Secções transversais da lâmina foliar de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 5A, secção transversal da internervura. Fig. 5B, secção transversal da borda do foliólulo do ápice folha. Legendas: Epa – epiderme adaxial; Pp – parênquima paliçádico; Pl – parênquima lacunoso; Fv – feixe vascular.
55
3.2.2. Nervura Principal
A nervura principal dos foliólulos, em corte transversal, mostou face abaxial com formato arredondado e adaxial côncavo com epiderme uniseriada em toda a sua extenção (Fig. 6A). A epiderme da face adaxial encontra-se revestida por cutícula espessa (Figs. 6A e 6C). Na epiderme da face abaxial podem de encontrados tricomas glandulares e tectores longos (Figs. 6A, 6B e 6C).
Subajacente a epiderme evidenciou-se parênquima cortical com três camadas de células e sistema vascular envolto por uma calota esclerenquimática em forma de arco voltada para a face adaxial, com extenção de bainha até a epiderme (Figs. 6A e
6B). Na região central encontram-se os feixes vasculares, com floema externo ao xilema e parênquima medular (Fig 6B).
56
A B
C
Figura 6. Secção transversal da nervura principal dos foliólulos da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 6A, aspecto geral. Fig. 6B, detalhe do sistema vascular central. Fig. 6C, detalhe da epiderme apresentando tricomas glandulares Legenda: Esc – esclerênquima; Fl – floema; Xi – xilema; Ttg – tricoma tector globoso; Ttl – tricoma tector longo.
57
3.2.3. Raque Secundária
A secção da região mediana da raque secundária mostrou que ela apresenta formato arredondado com duas projeções na parte abaxial em forma de
“V”. A epiderme é uniseriada com cutícula espessa em toda a sua extenção (Fig.
7A).
O sistema vascular central é totalmente envolvido por uma calota esclerenquimática, com floema externo ao xilema e parênquima medular com pontuações (Figs.7A, 7B e 7C).
58
A B
C
Figura 7. Secção transversal da raque secundária da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 7A, aspecto geral da nervura principal. Fig. 7B, detalhe do perênquima medular. Fig. 7C, detalhe do parênquima medular. Legenda: Ep – epiderme; Pc – parênquima cortical. Esc – anel esclerênquimático; Fl – floema; Xi – xilema; Pm – parênquima medular.
59
3.2.4. Raque primária
A secção transversal da região mediana da raque primária mostrou a face abaxial arredondada e face adaxial com duas projeções formando uma concavidade
(Fig. 8A). Cada projeção apresenta 03 feixes vasculares, sendo o central de menor tamanho (Figs. 8A e 8B).
Observa-se a presença de tricomas glandulares e tectores pluricelulares unisseriados em toda a epiderme (Figs. 8A, 8B, 9C, 9D e 10B). Esta é unisseriada em toda a sua extenção com cutícula espessa apresentando verrucosidades (Figs.
8B e 8D). Os feixes vasculares das projeções apresentam-se envolvidos por uma calota esclerenquimática, onde no feixe de maior diâmetro são observados ninhhos de floema intercalados ao xilema e limitados internamente por fibras esclerênquimáticas (Fig. 8C).
O sistema vascular central apresenta-se envolto por uma bainha esclerenquimática em toda a sua extensão (Figs. 8A e 10A). O floema encontra-se externo ao xilema e um parênquima medular central com células isodiamétricas de tamanhos variados (Figs. 8A, 9A, 9B, 9C, 10A e 10C). Na calota esclerenquimática observa-se e presença de células pétreas (Fig. 9A).
Histoquímica com reagente de Steinmetz evidenciou cutícula espessa e material lipídico no parênquima cortical (Fig. 10D).
60
A B
C D
Figura 8. Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 8A, aspecto geral. Fig. 8B, detalhe dos dois primeiros feixes vasculares dos prolongamentos superiores. Fig. 8C, detalhe do terceiro feixe vascular do prolongamento superior. Fig. 8D, detalhe da epiderme abaxial até o floema. Legendas: Ep – epiderme; Fv – feixe vascular; Fl – floema; Xi – xilema; Esc – esclerênquima.
61
A B
C D
Figura 9. Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 9A, presença de células pétreas na calota esclerenquimática. Fig. 9B, parênquima medular com pontuações. Fig. 9C, tricoma glandular na epiderme lateral. Fig. 9D, tricoma tector alongado.
62
A B
C D
Figura 10 – Secção transversal da raque primária da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 10A, aspecto geral. Fig. 10B, detalhe do tricoma tector na epiderme lateral. Fig. 10C, detalhe da epiderme abaxial até parênquima medular. Fig 10D, histoquímica com reagente de Steinmetz. Legenda: Pm – parênquima medular; Xi – xilema; Fl – floema; Esc – esclerêqnuima; Pc – parênquima cortical; Ep – epiderme; Gl – gotículas de material lipídio.
63
3.2.5. Pecíolo.
A região mediana do pecíolo, em secção transversal, evidenciou a face abaxial arredondada e adaxial com duas projeções contendo três feixes vasculares menores em cada uma e formando uma concavidade entre ela (Fig. 11A).
Observa-se a presença de tricomas tectores pluricelulares e unisseriados em toda a epiderme (Fig. 11D). Esta é unisseriada em toda a sua extensão com cutícula espessa apresentando verrucosidades. Os feixes vasculares das projeções da face adaxial apresentam-se protegidos por uma calota esclerenquimática e ninhos de floema em volta do xilema (Figs 11A, 11B e 11C).
O sistema vascular central apresenta-se envolto por uma camada de bainha esclerenquimática em toda a sua extensão, floema externo ao xilema e um parênquima medular central com células isodiamétricas (Figs. 12A e 12B).
64
A B
C D
Figura 11. Secção transversal da região mediana do pecíolo da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 11A – aspecto geral. Fig. 11B – detalhe do primeiro feixe vascular da projeção da face adaxial. Fig. 11C, detalhe do terceiro feixe vascular da projeção da face adaxial. Fig. 11D, detalhe do tricoma da epiderme do pecíolo. Legenda: Pm – parênquima medular; Fv – feixe vascular.
65
A
B
Figura 12: Secção transversal da região mediana do pecíolo da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 12A, detalhe da epiderme abaxial até xilema. Fig. 12B, detalhe da epiderme abaxial até perênquima medular. Legendas: Ep – epiderme, Esc – esclerênquima, Fl – floema; Xi – xilema; Pm – parênquima medular.
66
3.2.6. Pulvino
A secção transversal do pulvino apresenta a face abaxial convexa e face adaxial côncava (Fig. 13A). A epiderme é uniseriada em toda a sua extensão e com tricomas tectores retos e enrolados (Fig. 14A, 14B e 14C). Observam-se dois feixes vasculares menores próximos à face adaxial (Fig. 13A). O sistema vascular central apresenta a forma de arco com abertura voltada para a epiderme adaxial (Fig. 13A).
Observa-se calota esclerenquimática envolvendo o sistema vascular central, floema externo ao xilema parênquima medular central com células isodiamétricas apresentando pontuações (Figs. 13A, 13B, 13C, 14D e 14E).
67
A
B C
Figura 13. Secção transversal do pulvino da folha de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 13A, aspecto geral. Fig. 13B, sistema vascular central, Fig. 13C – feixe vascular lateral próximo à face adaxial.
68
A B
E
C D
Figura 14. Secção transversal do pulvino das folhas de Jacaranda decurrens Cham. Fig. 14A, detalhe da epiderme adaxial. Fig. 14B, tricoma tector da epiderme adaxial. Fig. 14C, tricoma tector enrolado da epiderme adaxial. Fig. 14D, detalhe do esclerênquima, floema, xilema e parênquima medular. Fig. 13E, detalhe do esclerênquima, floema e idioblasto. Legendas: Ep – epiderme; Fv – feixe vascular; Esc – esclerênquima; Fl – floema; Xi – xilema; Pm – parênquima medular; Tt tricoma tector; Tte – tricoma tector enrolado.
69
3.2.7. Microscopia de Pó
Na microscopia de pó de Jacaranda decurrens submetido ao reagente de
Steinmetz observou-se a presença de fragmentos de epiderme superior, epiderme inferior apresentando estômatos, tricomas tectores unisseriados, plurisseriados, células e fragmentos de fibras com bainha cristalífera (Figs. 15A – 15E).
70
A B
E
C D
Figura 15. Microscopia de pó das folhas de Jacaranda decurrens Cham. submetido ao reagente de Steinmetz. Fig. 15A, fragmento de epiderme adaxial. Fig. 15B, fragmento de epiderme abaxial. Fig. 15C, tricoma tector pluricelular unisseriado. Fig. 15D: célula pétrea. Fig. 15E, fragmento de fibras com bainha cristalífera.
71
3.3.TEORES DE UMIDADE, CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
CLORÍDRICO.
Os teores de umidade, cinzas totais e insolúveis em ácido expressos em porcentagem (p/p) para a amostra de Jacaranda decurrens coletada estão descritos na tabela 1.
Tabela 1. - Teores de umidade, cinzas totais e insolúveis em ácido clorídrico expressos em percentagem (p/p) em folhas de Jacaranda decurrens Teor de Umidade Teor de Cinzas Totais Cinzas Insolúveis em HCl 7,43 7,75 0,53
3.4. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
Os resultados dos testes fitoquímicos para detecção das principais classes de metabólitos secundários presentes na amostra analisada estão expressos na
Tabela 2.
Tabela 2: Principais classes de metabólitos secundários testados na amostra de Jacaranda decurrens Classses de Metabólitos Resultados Heterosídeos antraquinônicos - Heterosídeos flavonóides + Heterosídeos digitálicos - Taninos - Saponinas + Alcalóides - Cumarinas + (+) Positivo (-) Negativo
72
3.5. DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES TOTAIS.
A porcentagem de flavonóides totais presentes na amostra de folhas de
Jacaranda decurrens foi de 0,53%.
73
4. DISCUSSÃO
4.1. CARACTERES MORFO-ANATÔMICOS
As características macroscópicas das folhas de Jacaranda decurrens do espécime analisado neste trabalho correspondem a descrição feita por Corrêa
(1984) para esta espécie e também se enquadra no conjunto de características da família Bignoniaceae apresentado por Gemtchúnicov (1976).
Vidal (1978) chama a atenção para fato de os foliólulos de organizarem-se nas folhas jovens de tal forma que dão à planta o aspecto de uma samambaia.
A epiderme adaxial é formada por células de paredes sinuosas assim como em outras espécies da mesma família. Além deste tipo celular, é possível observar a presença de estrias, muitas vezes sinuosas e irregulares, formando saliências no centro das células, conferindo em conjunto um aspecto rugoso que também foram encontradas em Jacaranda acutifolia Humb. & Bompl., Jacaranda brasiliana (Lam.)
Pers. e Jacaranda filicifolia (Anders.). A presença de tricomas tectores pluricelulares longos e unisseriados na epiderme adaxial apesar de serem menos freqüentes nesta família, aparecem na espécie estudada (VIDAL, 1978). A presença de estômatos anomocíticos na epiderme também foi observada em Arrabidaea chica (Humb. &
Bonpl.) B. Verl. por Puhl et al. (2007). O predomínio de estômatos na epiderme abaxial também foi descrito para as folhas de Tabebuia aurea (Manso) Benth. &
Hook f. ex S. Moore feitas por Cabral et al. (2004).
A folha de Jacaranda decurrens apresenta em secção transversal da folha mesofilo com simetria dorsiventral, assim como foi observado para Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers por Duarte e Jurgensen (2007) e para espécimes de 74
Jacaranda decurrens coletados no cerrado de Botucatu (MAURO et al., 2007). Esta mesma autora também observou 1-2 camadas de parênquima paliçádico e 2-3 de lacunoso no mesofilo, além de compactação dos parênquimas clorofilianos revelando adaptação da planta ao ambiente xerofitico. Deve-se chamar a atenção para o fato da presença de epiderme unisseriada ter sido uma característica também encontrada em outras espécies de Bignoniaceae (SOUZA; LOPES; ALMEIDA, 2007;
ORTOLANI, 2007; MAURO et al., 2007).
Foi observada na nervura principal a presença de cutícula espessa na face adaxial. Esta localização pode estar relacionada com a absorção de compostos orgânicos como propõe Bukovac et al. (1990).
Algumas características são comuns à nervura principal, raque primária, região mediana do pecíolo, pulvino e região mediana da haste. Todas essas estruturas foliares apresentam no feixe vascular o floema externo ao xilema, sistema vascular central totalmente envolvido por calota esclerêquimática, presença de tricomas tectores e epiderme unisseriada em toda a extensão podendo apresentar ou não cutícula espessa. O sistema vascular representado por um cilindro floemático externo ao xilemático, ocorrendo oposição de calotas esclerenquimáticas ao floema também foi descrito por Duarte e Jurgensen (2007) na descrição morfoanatômica da folha de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers.
A presença de cristais prismáticos e oxalato de cálcio, também encontradas em Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers por Duarte e Jurgensen (2006), não é observada somente nas folhas de espécies da família Bignoniaceae. Puhl et al.
(2007) também observaram estas estruturas no parênquima medular de raízes de
Arrabidae chica (Humb. & Bonpl.) Verl. Essa observação pode ser uma característica 75
unificadora para as espécies desta família botânica, porém sem efeito diagnóstico uma vez que se encontra em mais de uma espécie.
Pôde-se observar que os tricomas tectores foram predominantes nas folhas de Jacaranda decurrens em relação aos glandulares. Ainda segundo Mauro et al.
(2007) a abundância de tricomas também pode ser interpretada como uma adaptação da planta a ambientes xerofíticos.
Diante do exposto pode-se inferir que os testes de controle de qualidade de matérias-primas vegetais se complementam. Porém é necessário que existam parâmetros de qualidade bem definidos capazes de qualificar uma matéria-prima para uso medicinal. Este estudo então se propôs a contribuir com o fornecimento de dados relativos à Jacaranda decurrens considerando a possibilidade de esta planta vir a se tornar matéria-prima para a produção de medicamentos fitoterápicos.
4.2. TEORES DE UMIDADE, CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
CLORÍDRICO.
A amostra das folhas de Jacaranda decurrens coletada apresentou 7,43% de teor de umidade. Segundo Lapa et al. (2004) o excesso de umidade em matérias- primas vegetais permite a ação de enzimas, podendo acarretar a degradação de constituintes químicos, além de possibilitar o desenvolvimento de fungos, insetos e bactérias. Ainda segundo o mesmo autor, o teor máximo de umidade estabelecido nas farmacopéias varia entre 8 e 14%, com poucas exceções especificadas nas monografias. A determinação do teor de umidade deve, portanto, ser definida para 76
cada matéria-prima vegetal, principalmente se possuir características higroscópicas e se deterioram facilmente na presença de água (WHO, 1998).
O teor de cinzas totais para a amostra analisada foi de 7,75% (p/p). A determinação deste parâmetro permite verificar a presença de impurezas inorgânicas não voláteis que podem estar presentes como contaminantes na matéria-prima vegetal (FARIAS 2004). Essas impurezas não voláteis incluem tanto as cinzas ditas fisiológicas, constituídas por matéria inorgânica da própria planta, como as não fisiológicas, derivadas de impurezas de natureza inorgânica que aderem à superfície do vegetal (WHO, 1998).
O teor de cinzas insolúveis em ácido clorídrico foi de 0,53% (p/p). Esta análise permite a verificação de contaminantes como resíduo de terra e areia
(materiais silicosos) presentes na amostra (FARIAS 2004).
4.3. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
Nas análises realizadas no espécime Jacaranda decurrens, foi observado a presença das seguintes classes de metabólitos secundários: heterosídeos fenólicos, heterosídeos flavonóides, esteróides, heterosídeos triterpenos, saponinas, amido, cumarinas e resinas.
Metabólitos secundários são definidos como substâncias não necessariamente relacionadas de forma direta à manutenção da vida do organismo produtor, mas garantem a este, vantagens para sua sobrevivência e para a perpetuação de sua espécie em seu ecossistema (SANTOS; MELLO, 2004). 77
A importância dos metabólitos secundários baseia-se no fato de atualmente se saber que muitas destas substâncias estarem diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem a adequação do produtor ao seu meio. De fato, já foram reconhecidas como funções de substâncias pertencentes a esta classe de metabólitos, por exemplo, a defesa contra herbívoros e microrganismos, a proteção contra raios UV, a atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes, bem como sua participação em alelopatias. E do ponto de vista farmacêutico, o maior interesse por estes compostos deriva principalmente do grande número de substâncias farmacologicamente importantes (SANTOS; MELLO, 2004).
Todas as reações de caracterização de heterosídeos flavonóides resultaram positivas.
Na reação de Shinoda ou da cianidina os derivados que tem cor amarelada, em presença de meio ácido, reduzem-se tornando-se vermelhos, ou no caso de derivados antociânicos azulados. Chalconas e isoflavonas não desenvolvem cor nesse ensaio (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004).
Na reação oxalo-bórica, os componentes da amostra, na presença de ácido bórico e oxálico, apresentam fluorescência verde ou ligeiramente amarelada sob luz ultravioleta (COSTA, 2001).
Na presença de ácido sulfúrico concentrado os compostos flavônicos formam sais de oxônio que podem ser precipitados pela adição de água. As flavonas e flavonóis formam soluções fortemente amareladas, as flavanonas, laranja e vermelho e as chalconas e auronas coloração vermelho a carmim (ZUANAZZI;
MONTANHA, 2004).
O cloreto de alumínio forma complexos com hidroxilas vizinhas ou hidroxilas e carbonilas vizinhas nos derivados flavonóides e tais complexos apresentam 78
fluorescência que vai do amarelo ao azul-esverdeado quando observados sob a luz ultra-violeta (COSTA, 2001).
Zuanazzi e Montanha (2004) afirmam que muitos compostos fenólicos na presença de cloreto férrico desenvolvem coloração azul, verde, marrom ou vermelho. Provavelmente isto se dá pelo fato do cloreto férrico complexar-se com as hidroxilas presentes nos derivados flavonóides, formando produtos corados.
A detecção de saponinas no vegetal baseou-se em sua propriedade de diminuir a tensão superficial. Este teste é realizado com o extrato aquoso obtido a partir do decocto do vegetal. Após agitação enérgica do extrato filtrado em tubo de ensaio, a formação de espuma, que não desaparece com a adição de um ácido mineral diluído, indica a presença de saponinas (SCHENKEL; GOSMANN;
ATHAYDE, 2004).
A detecção de cumarinas na amostra tem relação com o fato desta classe de metabólitos secundários possuir um espectro ultravioleta característico, o qual é fortemente influenciado pela natureza e posição dos grupos substituintes. Isso acaba facilitando também a visualização destes compostos por cromatografia em camada delgada (KUSTER; ROCHA, 2004).
4.4. ANÁLISE QUANTITATIVA DE FLAVONÓIDES TOTAIS
O doseamento dos flavonóides totais foi feito de acordo com a monografia da Calêndula (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 2001), portanto expresso como 79
hiperosídeo. O valor de 0,53% encontrado aproxima-se daquele descrito para a matéria-prima vegetal da calêndula que não deve possuir menos de 0,4% de flavonóides totais, calculados como hiperosídeo (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV,
2001). O Folium Ginkgo (Ginkgo biloba L.) deve conter não menos que 0,5% de flavonóides calculados como flavonol glicosídeos ou 0,2 – 0,4% calculados como agliconas (WHO, 1999).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Essa classe de compostos é amplamente distribuída no reino vegetal. Quase ausente em algas, alguns representantes foram identificados em briófitas existindo somente um relato de ocorrência em fungos. Em pteridófitas também foram encontrados, mas sua variabilidade estrutural é pequena. Todavia, estão presentes em abundância em angiospermas, apresentando nesse grupo enorme diversidade estrutural.
Flavonóides foram encontrados em algumas espécies da família
Bignoniaceae. Blatt et al. (1996) isolaram os flavonóides 6-hidroxiluteolina, luteolina-
7-O-glucosídeo, quercetina-3-O-glucosídeo, quercetina-3-O-galactosídeo, rutina e 3-
O-diglicosídeo de quercetina de Tabebuia caraiba (Mart.) Bureau e Ferreira et al.
(2000) determinaram a presença de flavonóides em Pyrostegia venusta (Ker Gawl.)
Miers. e Takemura et al. (1995) descreveram o flavonóide 6,7,3´,4´-tetrahidroxi-5- metoxiflavona isolado a partir de Arrabidaea chica fo cuprea (Cham.).
Os flavonóides possuem diversas atividades farmacológicas já descritas na literatura. São elas: antitumoral, antiespasmódica, antiinflamatória, antimicrobiana, antimutagênica, antiúlcera, antiviral, antioxidante, estrogênica e tripanossomicida
(ZUANAZZI; MONTANA, 2004). 80
5. CONCLUSÕES
O presente estudo possibilitou determinar as características morfológicas do espécime de Jacaranda decurrens Cham. analisado, assim como determinar os teores de umidade, cinzas totais e insolúveis em ácido. Além disso, foram identificadas as pricipais classes de metabólitos secundários e o teor de falvonóides totais.
Os resultados obtidos apesar de não poderem ser utilizados como parâmetros definitivos de controle de qualidade, podem contribuir com estudos posteriores onde sejam avaliados esses mesmos parãmeros para espécimes coletadas em locais e em épocas do ano diferentes.
81
REFERÊNCIAS
ASSUMPÇÃO, R. M. V.; MORITA, T. Manual de soluções, reagentes e solventes: padronização, preparação, purificação. Edgard Blucher: São Paulo, 1968. 627 p.
BLATT. C. T. T.; SALATINO, A; SALTINO, M. L. F. Flavonoids of Tabebuia caraiba (Bignoniaceae). Biochemical Systematics and Ecolgy, Great Britain, v. 24, p. 89, January 1996.
BOZZOLA, J. J.; RUSSELL, L. D. Electron microscopy principles and techniques for biologists. Boston: Jones and Bartlett. Publishers, 1992. 542 p.
BUKOVAC, M. J. et al. Sorption of organic compounds by plant cuticles. Weed Science, v. 38, p. 289-298, 1990.
CABRAL, E. L.; BARBOSA, D. C. A.; SIMABUKURO, E. A. Crescimento de plantas jovens de Tabebuia áurea (Manso) Benth & Hook f. ex. S. Moore submetidas a estresse hídrico. Acta Botanica Brasílica, v. 18 (2), p. 241-251, 2004.
COSTA, A. F. Farmacognosia. 3 ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2001. 3 v.
DUARTE, M. R.; JURGENSEN, I. Diagnose morfoanatômica de Folha e Caule de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers, Bignoniaceae. Latin American Journal of Pharmacy, v. 26 (1), p. 70-75, 2007.
FARIAS, M. R. Avaliação da Qualidade de Matérias-primas Vegetais. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 263-288.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 1988. Parte 1.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4 ed. São Paulo: Atheneu, 2001. parte 2. fasc. 3.
FERREIRA, D. T. et al. Constituintes químicos das raízes de Pyrostegia venusta e considerações sobre a sua importância medicinal.Química Nova, São Paulo, v. 23, p. 42-46, janeiro/fevereiro 2000. 82
GEMTCHÚNICOV, I. D. Manual de Taxonomia Vegetal. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1976. 368 p.
JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. McGraw-Hill Book: New York, 1940. 523p.
KRAUS, J. E.; ARDUIM, M. Manual de Microtécnica Vegetal. Editora Universidade Rural: Rio de Janeiro, 1997. 194p.
KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, cromonas e xantonas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 537-556.
LAPA, A. J. et al. Farmacologia e Toxicologia de Produtos Naturais. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 247-262.
MATOS, F. J. Introdução a Fitoquímica Experimental. Edições UFC: Fortaleza, 1988. 128 p.
MATOS, J. M. D.; MATOS, M. E. Farmacognosia. Edições UFC: Fortaleza, 1989. 246 p.
OLIVEIRA, F; AKISSUE, G. Fundamentos de Farmacobotânica. Atheneu: São Paulo, 1993. 222 p.
ORTOLANI, F. A. Morfo-anatomia, citogenética e palinologia em espécies de ipês (Bignoniaceae). 2007. 95 f. Tese (Doutorado em Agronomia) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2007.
PAIVA, J. G. A.; FANK-DE-CARVALHO, S. M.; MAGALHÃES, M. P.; GRACIANO- RIBEIRO, D. Verniz Vitral incolor 500®: uma alternativa de meio de montagem economicamente viável. Acta Botanica Brasílica, v. 20, p. 257-264, abril/junho 2006.
PUHL, M. C. M. N. et al. Morfoanatomia das folhas e dos caules jovens de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl. (BIgnoniaceae). Latin American Journal of Pharmacy, v. 26 (2), p. 224-229, 2007.
83
VIDAL, M. R. R. As folhas bipenadas: suas caracteristicas e ocorrências em algumas dicotiledôneas. Rodriguésia. XXX, n. 47, p. 169-358, 1978.
SANTOS, S C.; MELLO, J. C. P. Taninos. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 615-656.
SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; ATHAYDE, M L. Saponinas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 711-740.
SOUZA, L. A.; LOPES, W. A. L.; ALMEIDA, O.J. G. Morfoanatomia da plântula e do tireodendro de Arrabidaea mutabilis Bureau & K. Shum. (Bignoniaceae). Acta Scientiarum Biological Sciences, v. 29 (2), p. 131-136, 2007.
TAKEMURA, O. S. et al. A flavone from leaves of Arrabidaea chica fo cuerea. Phytochemistry, Great Britain, vol. 38, p. 1299-1300, March 1995.
WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Geneva: World Health Organization, 1998.
WHO. Monographs on selected medicinal plants. Geneva: World Health Organization, 1999.
ZUANAZZI, J. A. S.; MONTANHA, J. A. Flavonóides. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 577-614.
84
Capítulo 3
Atividade antimicrobiana de
Jacaranda decurrens Cham.
85
1. INTRODUÇÃO
O termo antibiose foi criado em 1889, para designar o processo natural de seleção pelo qual um ser vivo destrói um outro para assegurar sua própria sobrevivência. Dez anos mais tarde Warde empregou o termo antibiose especificamente para se referir ao antagonismo microbiano. Mas, somente em 1942 surgiu a definição de antibiótico por Waksman, que assim considerava as substâncias elaboradas por seres vivos, geralmente microscópicos, capazes de agir como tóxicos seletivos, em pequenas concentrações, sobre os microrganismos. O conceito inicial envolvia a produção de substâncias por bactérias e, principalmente, fungos. Posteriormente, foi verificado que não só os microrganismos produziam antibióticos, mas que vegetais superiores eram, também, produtores. Entre eles citam-se o jacarandá, a caviúna e várias árvores e plantas existentes no Brasil e em outras partes do mundo. Com o descobrimento, em seguida, de substâncias antibióticas que tem ação citostática, o conceito inicial de tóxico seletivo teve que ser estendido para tumores. Atualmente, com a obtenção laboratorial de vários antibióticos, verificam-se que estas substâncias podem ser enquadradas no conceito de quimioterápicos (TAVARES, 2001).
Os agentes quimioterápicos são substâncias químicas utilizadas no tratamento das doenças infecciosas ou neoplásicas, em concentrações que são toleradas pelo hospedeiro. O conceito de quimioterápico abrange essencialmente as substâncias sintetizadas laboratorialmente ou de origem vegetal que apresentam toxicidade baixa para as células normais do hospedeiro e alta para o agente agressor. É por esta razão que determinados agentes não são considerados quimioterápicos, pois não tem toxicidade seletiva, mostrando-se lesivos para o 86
hospedeiro animal. Embora os antibióticos possam ser enquadrados dentro dos quimioterápicos ao lado das sulfas, nitrofurânicos, anti-helmínticos etc., é tradicional a sua separação dentro da quimioterapia antiinfecciosa, principalmente porque grande número deles ainda é obtido através de processos de fermentação a partir de fungos e bactérias (TAVARES, 2001).
A classificação mais comum dos antibióticos baseia-se na estrutura química e no mecanismo de ação proposto da seguinte maneira: (1) agentes que inibem a síntese da parede celular bacteriana; incluem as penicilinas e cefalosporinas, que são estruturalmente semelhantes, bem como agentes distintos, como a ciclosserina, vancomicina, bacitracina e os antifúgicos azóis; (2) agentes que atuam diretamente sobre a membrana celular do microrganismo, afetando sua permeabilidade e resultando em extravasamento de compostos intracelulares; incluem os detergentes, como a polimixina e os antifúngicos poliênicos, a nistatina e a anfotericina B, que se ligam aos esteróis da membrana celular; (3) agentes que afetam a função das subunidades ribossômicas 30S ou 50S, causando inibição reversível da síntese de proteínas; esses bacteriostáticos incluem o cloranfenicol, as tetraciclinas, a eritromicina, a clindamicina e as pristinamicinas; (4) agentes que se ligam a subunidade ribossômica 30S e alteram a síntese de proteínas resultando finalmente a morte celular, incluem os aminoglicosídeos; (5) agentes que afetam o metabolismo bacteriano dos ácidos nucléicos, como as rifamicinas, que inibem a RNA-polimerase, e as quinolonas, que inibem as topoisomerases; (6) os antimetabólitos, que incluem o trimetoprim e as sulfonamidas que bloqueiam enzimas essenciais ao metabolismo do folato; (7) agentes antivirais (CHAMBERS, 2003).
As características do antibiótico ideal seriam ter atividade antibacteriana sobre amplo espectro de germes; ser absorvido por via oral e parenteral; ter fácil 87
distribuição pelos tecidos e líquidos orgânicos, atingindo concentração bactericida, não sofrer destruição por enzimas tissulares, não provocar efeitos irritantes, tóxicos ou alérgicos no hospedeiro, não induzir o desenvolvimento de germes resistentes; não provocar a diminuição da resistência do organismo; não ter efeitos teratogênicos; produzir concentrações elevadas por tempo prolongado; ser facilmente obtido em escala industrial, possibilitando sua fabricação em grandes quantidades e a preços baixos. Tal antibiótico ideal ainda não foi conseguido e aqueles que mais se aproximam apresentam alto custo, o que torna problemático o seu uso pelas populações de menor poder aquisitivo (TAVARES, 2001).
O conhecimento do fenômeno da resistência a agentes químicos e físicos entre os microrganismos data do início da era microbiana. Diz-se que uma bactéria é resistente a determinado antibiótico quando o germe é capaz de crescer in vitro em presença da concentração que esta droga atinge no sangue (CLOETE, 2003).
A resistência microbiana pode ser natural ou adquirida. A resistência natural ou intrínseca faz parte das características biológicas primitivas dos microrganismos e
é observada regularmente em uma determinada espécie bacteriana em relação a diferentes antimicrobianos. Resulta de genes cromossômicos que codificam a existência na célula de estruturas ou mecanismos que impedem o antibiótico de agir em seu receptor ou que codificam a falta de sítio de ação da droga ou que determinam a existência de receptores inadequados para a ligação com uma substância específica. A resistência natural é previsível uma vez identificado o microrganismo e tem importância clínica menor na atualidade, considerando a multiplicidade de substâncias antimicrobianas disponíveis para o tratamento das infecções bacterianas (BERGER-BÄCHI, 2002; HOGAN; KOLTER, 2002). 88
A resistência adquirida é aquela que se desenvolve em uma bactéria primitivamente sensível a um dado ou a diversos antimicrobianos. Refere-se, portanto, ao surgimento em um determinado momento, de exemplares de uma espécie bacteriana que não mais sofrem a ação de drogas que são efetivas contra a população original desta bactéria. A resistência adquirida tem também uma origem genética e decorre de modificações na estrutura e funcionamento da célula que bloqueiam a ação dos antimicrobianos (MCKEEGAN; BORGES-WALMSLEY;
WALMSLEY, 2002).
Este tipo de resistência é o mais importante devido à crescente participação de microrganismos com resistência desenvolvida na gênese de quadros clínicos infecciosos. Como conseqüência, ocorre agravamento do prognóstico destas infecções e elevação do custo do tratamento, além da importância na modificação da ecologia ambiental (WALSH; AMYES, 2004).
Trabalhos têm sido realizados no sentido de se estar avaliando a resistência dos microrganismos ao arsenal terapêutico existente. Makedou et al (2005) estudaram mudanças no perfil de suscetibilidade de microrganismos gram-negativos no período de 2000 a 2002 em unidades de cuidados intensivos. Os microrganismos que foram isolados com maior freqüência foram: Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter calcoaceticus e Klebisiella pneumoniae. Mais da metade dos isolados de Pseudomonas aeruginosa mostraram-se resistentes a ciprofloxacina, imipenen, e ticarcilina/ácido clavulânico em 2000, enquanto a resistência a amicacina e piperacilina/tazobactam foi relativamente baixa. Em 2002 houve um aumento de resistência para todos os agentes antimicrobianos, observando-se taxas maiores de resistência para amicacina e tobramicina. Em relação à Acinetobacter calcoaceticus, houve no período estudado aumento no perfil de resistência para o imipenem e 89
piperacilina/tazobactam. A Klebisiella pneumoniae se tornou menos susceptível a amicacina, ticarcilina/ácido clavulânico e piperacilina/tazobactam.
Em um outro estudo Loureiro et al. (2002) ao estudarem cepas multiresistentes isoladas de culturas de sangue de recém-nascidos hospitalizados em uma unidade hospitalar no Rio de Janeiro, observaram que os microrganismos gram-negativos foram isolados com maior freqüência. Neste estudo os antimicrobianos que apresentaram maiores taxas de resistência (acima de 70%) pelos microrganismos avaliados foram cefuroxima (98,9%), cefalotina (91,1%), ceftriaxona (88%), ceftazidima (77,1%), carbenicilina (75%) e cefepima (72,9%).
Al-Tawfiq (2007) através de estudo com isolados de Pseudomonas aeruginosa de pacientes internos e ambulatoriais, mostrou que as cepas isoladas da primeira categoria de pacientes apresentaram taxa de resistência duas vezes maior que a segunda. Esta observação provavelmente está relacionada a maior exposição dos microrganismos isolados dos pacientes internados a um espectro maior de agentes antimicrobianos.
Staphylococcus aureus também tem assumido importante papel no cenário de resistência microbiana. Lee et al. (2007) ao avaliarem a prevalência de infecções hospitlares e o uso de antibióticos em um centro médico universitário em Hong
Kong, observaram que Staphylococcus aureus resistentes à meticilina foi um dos patógenos mais encontrados nos pacientes avaliados e Prado (2007) ao verificar a presença deste microrganismo na saliva de profissinais das equipes médica e de enfermagem de instituição de saúde de Goiânia, constatou que 9,7% dos investigados eram portadores de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e
8,7% à oxacilina. Orrett et al. (2007) ao estudarem os casos de bacteremia em 90
hospitalizadas em um hospital regional de Trinidad verificaram que quase 90% e cerca de metade dos Staphylococcus aureus foram resistentes à ampicilina e eritromicina, respectivamente e 11,3% eram resistentes à meticilina. Spiandorello et al. (2000) ao estudarem amostras de Staphylococcus aureus identificadas em infecções de pacientes internados no hospital Nossa Senhora Medianeira no período compreendido entre setembro de 1995 e novembro de 1999, encontraram que
32,7% das amostras eram resistentes à oxacilina, nenhuma à vancomicina e 92,6%
à penicilina.
Plantas medicinais podem representar uma rica fonte de moléculas com atividade antimicrobiana. Fukai et al. (2002) isolaram flavonóides com atividade antimicrobiana contra cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina. Em outro estudo Sanches et al. (2005) observaram a inibição do crescimento de cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa pelos extratos etanólico e aquoso da casca do caule, folhas e raízes de
Psiduim guajava (L.). Alves et al. (2000) através da avaliação da atividade antimicrobiana de 42 espécies de plantas medicinais brasileiras contra cepas de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa puderam observar que a maioria dos microrganismos foi sensível a pelo menos a uma das espécies vegetais testadas.
Considerando-se a perspectiva de uso das plantas medicinais no tratamento de infecções causadas por diversos microrganismos e o uso etnofarmacológico da
Jacaranda decurrens, é que se procurou investigar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto das folhas desta espécie vegetal, assim como das frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica frente a microrganismos gram- positivos e gram-negativos. 91
2. METODOLOGIA
2.1. MATERIAL BOTÂNICO
O material botânico usado para a preparação do extrato etanólico bruto e das frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica foi obtido conforme descrito na seção 2.1.1 do Capítulo 2.
2.2. OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
O material previamente pulverizado foi submetido a um processo de maceração a frio, com o uso de agitador mecânico por 4 horas utilizando como líquido extrator, etanol 95% (p/V) P.A. A proporção utilizada foi de uma parte do material pulverizado, para quatro partes do solvente. Após a maceração, filtrou-se em papel de filtro, e o extrato obtido foi concentrado em evaporador rotativo a uma temperatura de 40º C. O resíduo vegetal foi extraído por mais três vezes de maneira análoga à primeira, obtendo-se assim o extrato etanólico bruto das folhas de
Jacaranda decurrens (FERRI, 1996).
92
2.3. FRACIONAMENTO DO EXTRATO ETANÓLICO
O fracionamento do extrato etanólico bruto foi feito segundo metodologia descrita por Ferri (1996), a qual consistiu na dissolução do mesmo na mistura metanol/água na proporção de 7:3, que foi submetida a partições líquido-líquido sucessivas com hexano, diclorometano e acetato de etila. Desta forma, foram obtidas 4 frações: fração hexânica (FH), fração diclorometano (FD), fração acetato de etila (FAc) e fração aquosa (Faq). As frações obtidas foram empregadas nos testes de atividade antimicrobiana (NCCLS, 2003).
2.4. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR
A avaliação da atividade antimicrobiana foi feita através do teste de difusão em ágar, conforme descrito por Grove e Randal (1955), Salvador et al. (2002) e
Okeke et al. (2001). Para tanto foram utilizadas inicialmente cepas padrão American
Type Culture Collecttion (ATCC) e isolados microbianos, pertencentes à Bacterioteca do Laboratório de Bacteriologia Médica do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública – UFG, descritas no Quadro 1.
93
Microrganismos Usados na Avaliação da Atividade Antimicrobiana Bactéria Gram-Positivas Staphylococcus aureus 481 Micrococcus roseus 1740 Micrococcus luteus ATCC 9341 Bactérias Gram-Positivas Esporuladas Bacillus cereus 14756 Bacillus stearothermophylus 1262 Bacillus subtilis ATCC 6633 Bactérias Gram-Negativas Enterobacter cloaceae HMA/FTA502 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Escherichia coli ATCC 8739 Escherichia coli ATCC 11229 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Serratia marcescens ATCC 14756
Quadro 1 - Microrganismos utilizados na triagem de atividade antimicrobiana
Os microrganismos armazenados foram reativados pelo repique em caldo tioglicolato e incubados a 37º C por 24 – 48 horas. Após o crescimento, foi feito o repique em ágar simples inclinado (ASI) contido em frascos 10 mL, os quais foram incubados a 37º C por 24 horas. Após o desenvolvimento microbiano em ASI, foram preparadas suspensões adicionando-se inóculo microbiano a 2,0 mL de solução salina esterilizada 0,85% (p/V) até a obtenção de uma turvação equivalente a metade do tubo n° 1 da escala de Macfarland.
Neste ínterim foram preparadas placas de Petri esterilizadas contendo 20 mL de ágar Müeller Hinton obtendo-se assim, após a solidificação, a camada base.
Foi adicionado 100 µL da suspensão microbiana obtida conforme descrito anteriormente a 10,0 mL de ágar Müeller Hinton estéril e liquefeito (temperatura cerca de 50ºC), o qual foi homogeneizado e vertido rapidamente sobre a camada- base. As placas foram mantidas sobre superfície plana até a solidificação do ágar.
Em seguida foram confeccionados orifícios de 5,0 mm de diâmetro distribuídos circularmente em pontos eqüidistantes da placa, deixando-se o centro 94
sem orifício. Um dos orifícios da placa recebeu uma marcação para orientar a inoculação dos extratos e das frações em sentido horário.
Assim, foi inoculado 10 µL do extrato bruto diluído 1:3 (p/V) em etanol 95%
(V/V) P.A da espécime vegetal nos respectivos orifícios, iniciando-se pelo orifício marcado e seguindo-se no sentido horário. Esta etapa foi realizada em triplicata, ou seja, o extrato foi inoculado em três orifícios seguidos. No último orifício da placa foi inoculado o solvente utilizado na preparação do extrato, ou seja, etanol 95% (V/V)
P.A. O centro das placas de bactérias gram-positivas recebeu como controle um disco de penicilina (10 µg) e o das placas de bactérias gram-negativas um de eritromicina (15 µg). O experimento foi relaizado em triplicata.
As placas foram pré-incubadas à temperatura ambiente por um período de 2 horas e posteriormente incubadas a 37º C por 24 horas. Decorrido este período, com o auxílio de uma régua milimetrada, foi medido o diâmetro da área em torno dos orifícios que apresentaram ausência de desenvolvimento microbiano (halo de inibição).
A realização desta triagem teve caráter meramente qualitativo, onde foi possível observar se houve ou não alguma atividade antimicrobiana no extrato etanólico bruto.
2.5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DO EXTRATO
ETANÓLICO BRUTO E DAS FRAÇÕES
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método da diluição em ágar conforme recomendação do NCCLS (2003). 95
Primeiramente, realizaram-se diluições seriadas em duplicata com o extrato etanólico bruto da seguinte forma: pesou-se, em tubo de ensaio estéril, 1400mg do extrato etanólico bruto e completou-se o volume para 2 mL com etanol 95% (V/V), P.
A. (tubo 1). Adicionou-se 1 mL de água destilada estéril a uma seqüência de mais 8 tubos de ensaio estérelizados (tubos 2 a 9). Retirou-se uma alíquota de 1 mL do tubo 1 e adicionou-se ao tubo 2, retirou-se uma alíquota de 1 mL do tubo 2 e adicionou-se ao tubo 3 e, assim, sucessivamente, até o tubo 9 desprezando-se ao final uma alíquota de 1 mL.
Em seguida, a cada um destes tubos adicionou-se 19 mL de ágar Müller
Hinton liquefeito (aproximadamente 50ºC), homogeneizou-se e verteu-se rapidamente em placas de Petri estéreis. Desta forma obteve-se placas contendo o extrato etanólico bruto dos espécimes em análise em concentrações que variaram de 35 mg/mL até 0,135 mg/mL. Prepararam-se também placas controle contendo o solvente utilizado na extração e contendo apenas ágar Müller Hinton.
Foram utilizados, para este ensaio, os microganismos descritos no Quadro 1 além de Staphylococcus epidermidis e outros isolados de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa mantidos na bacterioteca do
Laboratório de Bacteriologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás.
Estes microrganismos foram repicados para caldo tioglicolato e incubados a
37°C por 24 – 48 horas para reativação. Em seguida, foram repicados em placas
ASI e incubados novamente a 37° C por 24 horas. Após o desenvolvimento microbiano, inóculos de cada microrganismo foram suspensos em 2 mL de solução salina esterilizada 0,85% (p/V) até obtenção de uma turvação correspondente a 96
metade do tubo n° 1 da escala MacFarland. Transferiu-se 100 µL de cada uma dessas suspensões para o inoculador de Steers (STEERS; FOLTZ; GRAAVES,
1959) e aplicou-se na superfície das placas de Petri contendo as diluições dos extratos das plantas em ágar Müller Hinton e os controles. As placas foram incubadas a 37° C por 24 horas. Foi considerada CIM a menor concentração capaz de inibir o desenvolvimento microbiano.
97
3. RESULTADOS
3.1. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR
O extrato etanólico das folhas de Jacaranda decurrens analisado neste trabalho, apresentou, pelo teste de difusão em ágar, atividade antimicrobiana para todas as bactérias analisadas. Tais resultados estão demonstrados na Tabela 1 que apresenta a média dos halos de inibição (mm) extraída das triplicatas de cada teste.
Tabela 1 - Halos de inibição (mm) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens utilizando o teste de difusão em ágar*
Microrganismos Halos médios (mm) Extrato Etanol Penicilina Eritromicina 95% (V/V) 10µg/mL 15µg/mL Staphylococcus aureus 481 20 0 44 NR Micrococcus roseus 1740 17 0 20,3 NR MIcrococcus luteus 9341 9,5 0 78,6 NR Bacillus cereus 14576 10,3 0 12 NR Bacillus stearothermophylus 1262 9,5 0 53,5 NR Bacillus subtilis ATCC 6633 17,6 0 37,3 NR Enterobacter cloaceae ATCC 11,7 0 NR 8 HMA/FT 502 Enterobacter aerogenes ATCC 14,3 0 NR 0 13048 Escherichia coli ATCC 8739 15 0 NR 11 Escherichia coli ATCC 11229 12 0 NR 18,3 Pseudomonas aeruginosa ATCC 12,6 0 NR 10,3 9027 Serratia marcescens ATCC 14756 10,6 0 NR 14,6
* Média de três repetições NR = não realizado
98
3.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
Diante dos resultados obtidos na triagem anterior decidiu-se por fazer a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato etanólico bruto e das frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica. O extrato etanólico bruto foi utilizado para a determinação da CIM frente aos microrganismos descritos anteriormente além de outros isolados e cepas de referência. A CIM das frações foi determinada utilizando-se os 25 isolados de Pseudomonas aeruginosa que foram inibidos com a menor concentração do extrato etanólico bruto. Os resultados encontram-se descritos nas Tabelas 2, 3 e 4
Tabela 2 - Concentração inibitória mínima (mg/mL) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre microrganismos gram-positivos e gram- negativos.
Microganismos CIM do Extrato (mg/mL) Bacillus cereus 14576 2,18 Bacillus stearothermophylus 1262 8,75 Bacillus subtilis ATCC 6633 4,37 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 17,5 Enterobacter cloaceae HMA/FT 502 17,5 Escherichia coli ATCC 8739 17,5 Escherichia coli ATCC 11229 17,5 Escherichia coli ATCC 25922 35 Micrococcus luteus 9341 2,18 Micrococcus roseus 1740 4,37 Serratia marcescens ATCC 14756 35 Staphylococcus aureus 481 4,37 Staphylococcus aureus 937 4,37 Staphylococcus aureus 912 4,37 Staphylococcus aureus 897 4,37 Staphylococcus aureus 934 4,37 Staphylococcus aureus ATCC 6538 4,37 Staphylococcus aureus ATCC 25923 4,37 Staphylococcus aureus 915 4,37 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 2,18
99
Tabela 3 – Concentração inibitória mínima (mg/mL) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre isolados de Pseudomonas aeruginosa.
Microrganismo CIM do Extrato (mg/mL) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 8,75 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 17,5 Pseudomonas aeruginosa 2724 17,5 Pseudomonas aeruginosa 2443 17,5 Pseudomonas aeruginosa 6 8,75 Pseudomonas aeruginosa 9 8,75 Pseudomonas aeruginosa 18 8,75 Pseudomonas aeruginosa 21 8,75 Pseudomonas aeruginosa 24 4,37 Pseudomonas aeruginosa 46 8,75 Pseudomonas aeruginosa 56 8,75 Pseudomonas aeruginosa 61 8,75 Pseudomonas aeruginosa 71 8,75 Pseudomonas aeruginosa 73 8,75 Pseudomonas aeruginosa 96 8,75 Pseudomonas aeruginosa 100 8,75 Pseudomonas aeruginosa 120 8,75 Pseudomonas aeruginosa 124 8,75 Pseudomonas aeruginosa 134 8,75 Pseudomonas aeruginosa 140 4,37 Pseudomonas aeruginosa 170 4,37 Pseudomonas aeruginosa 171 8,75 Pseudomonas aeruginosa 187 8,75 Pseudomonas aeruginosa 238 8,75 Pseudomonas aeruginosa 251 8,75 Pseudomonas aeruginosa 253 8,75 Pseudomonas aeruginosa 256 8,75 Pseudomonas aeruginosa 269 8,75 Pseudomonas aeruginosa 270 8,75 Pseudomonas aeruginosa 272 8,75 Pseudomonas aeruginosa 307 8,75 Pseudomonas aeruginosa 309 17,5 Pseudomonas aeruginosa 313 8,75 Pseudomonas aeruginosa 318 8,75 Pseudomonas aeruginosa 329 8,75 Pseudomonas aeruginosa 330 8,75 Pseudomonas aeruginosa 370 4,37 Pseudomonas aeruginosa 379 8,75 Pseudomonas aeruginosa 380 8,75 Pseudomonas aeruginosa 407 8,75 Pseudomonas aeruginosa 415 8,75 Pseudomonas aeruginosa 433 8,75 Pseudomonas aeruginosa 436 8,75 Pseudomonas aeruginosa 439 8,75 Pseudomonas aeruginosa 446 17,5 Pseudomonas aeruginosa 477 8,75 Pseudomonas aeruginosa 495 8,75 Pseudomonas aeruginosa 496 8,75 Pseudomonas aeruginosa 586 8,75 Pseudomonas aeruginosa 2919 8,75 100
Tabela 3 (Continuação) - Concentração inibitória mínima (mg/mL) do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VIH 8,75 Pseudomonas aeruginosa SPM-1 8,75 Pseudomonas aeruginosa 201 17,5 Pseudomonas aeruginosa 202 17,5 Pseudomonas aeruginosa 223 17,5 Pseudomonas aeruginosa 237 17,5 Pseudomonas aeruginosa 240 17,5 Pseudomonas aeruginosa 254 17,5 Pseudomonas aeruginosa 278 17,5 Pseudomonas aeruginosa 279 17,5 Pseudomonas aeruginosa 280 17,5 Pseudomonas aeruginosa 304 17,5 Pseudomonas aeruginosa 321 17,5 Pseudomonas aeruginosa 325 17,5 Pseudomonas aeruginosa 326 17,5 Pseudomonas aeruginosa 345 17,5 Pseudomonas aeruginosa 346 17,5 Pseudomonas aeruginosa 356 17,5 Pseudomonas aeruginosa 427 17,5 Pseudomonas aeruginosa 449 17,5 Pseudomonas aeruginosa 453 17,5 Pseudomonas aeruginosa 499 17,5 Pseudomonas aeruginosa 515 17,5 Pseudomonas aeruginosa 516 17,5 Pseudomonas aeruginosa 522 17,5 Pseudomonas aeruginosa 570 17,5 Pseudomonas aeruginosa 574 17,5 Pseudomonas aeruginosa 584 8,75 Pseudomonas aeruginosa 585 17,5 Pseudomonas aeruginosa IMP-1 8,75 Pseudomonas aeruginosa IMP-2 8,75 Pseudomonas aeruginosa VIM-2 17,5
101
Tabela 4 - Concentração inibitória mínima (mg/mL) das frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e aquosa partindo do extrato etanólico bruto das folhas de Jacaranda decurrens sobre isolados de Pseudomonas aeruginosa.
Microrganismos FH FD FAc FAq Pseudomonas aeruginosa 09 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 18 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 21 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 24 3,125 6,25 0,39 0,78 Pseudomonas aeruginosa 56 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 251 6,25 6,25 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 269 3,125 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 272 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 307 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 313 6,25 6,25 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 329 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 330 6,25 6,25 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 370 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 379 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 380 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 436 1,56 0,78 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 477 3,125 3,125 0,39 0,78 Pseudomonas aeruginosa 495 3,125 3,125 0,39 0,78 Pseudomonas aeruginosa 496 6,25 6,25 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 586 6,25 6,25 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa 2919 6,25 6,25 1,56 1,56 Pseudomonas aeruginosa 584 6,25 3,125 0,78 1,56 Pseudomonas aeruginosa IMP-1 6,25 6,25 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa IMP-2 6,25 3,125 0,78 0,78 Pseudomonas aeruginosa 140 6,25 6,25 0,78 1,56 FH = fração hexânica; FD = fração diclorometano; FAc = fração acetato; FAq = fração aquosa
Na concentração de 2,18 mg/mL, o extrato etanólico bruto das folhas de
Jacaranda decurrens inibiu o crescimento do Bacillus cereus 14576, Micrococcus luteus 9341 e Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Essas três espécies representam 23,07% do total de microrganismos gram-positivos testados. A concentração de 4,37 mg/mL do extrato foi capaz de inibir o crescimento de 100% das cepas e isolados de Staphylococcus aureus, Micrococcus roseus 1740, Bacillus subtilis ATCC 6633 e 4 isolados de Pseudomonas aeruginosa. Na concentração de
8,75 mg/mL, o extrato foi capaz de inibir Bacillus stearothermophylus 1262,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e Micrococcus roseus 1740 e 57,69% dos 102
isolados de Pseudomonas aeruginosa. A concentração de 17,5 mg/mL do extrato foi capaz de inibir Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Enterobacter cloacae HMA/FT
502, Escherichia coli ATCC 8739 e ATCC 11229, Pseudomonas aeruginosa ATCC
9027 e ATCC 27853, assim como 40% dos outros isolados desta mesma espécie bacteriana. O extrato na concentração de 35 mg/mL foi capaz de inibir Escherichia coli ATCC 25922 e Serratia marcescens ATCC 14756.
103
4. DISCUSSÃO
4.1. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR
Este trabalho mostrou a atividade antimicrobiana do extrato etanólico bruto de Jacaranda decurrens sobre três bactérias gram-positivas esporuladas: Bacillus cereus 14579, Bacillus stearothermophylus 1262 e Bacillus subtilis ATCC 6633.
Estas bactérias por serem formadoras de esporos, podem sobreviver no ambiente sob condições hostis. Os dois últimos microrganismos, que normalmente não são patogênicos e estão amplamente distribuídos na natureza, são utilizados no controle de qualidade de processos de esterilização por óxido de etileno e vapor d´água. O
Bacillus cereus é responsável por duas formas distintas de intoxicação alimentar: emética e diarréica. Ambas estão associadas a carnes e temperos. Bacillus cereus também constitui uma importante causa de infecções oculares, ceratite grave, endoftalmite e panoftalmite. Tipicamente, os microrganismos são introduzidos no olho por corpos estranhos associados a traumatismo. Esta bactéria também tem sido associada a infecções localizadas e infecções sistêmicas, incluindo endocardite, meningite, osteomielite e pneumonia (JAWETZ et al, 1998; TORTORA; FUNKE;
CASE, 2007).
O Staphylococcus aureus é a espécie do gênero de maior importância clínica. Quase todos os indivíduos apresentam algum tipo de Infecção por
Staphylococcus aureus durante a sua vida, cuja gravidade vai desde a intoxicação alimentar ou infecção cutânea de pouca importância até infecções graves 104
potencialmente fatais. A infecção de feridas cirúrgicas por Staphylococcus aureus é um problema comum em hospitais. E sua habilidade em desenvolver resistência rapidamente a antibióticos contribui para aumentar o risco de pacientes em ambientes hospitalares. Também capaz de produzir uma toxina responsável pela síndrome choque tóxico, caracterizada por uma severa infecção capaz de causar febre e vômitos e algumas vezes podendo levar à morte. Staphylococcus epidermidis é uma bactéria bastante comum na pele, podendo representar 90% da microbiota normal. É geralmente patogênica quando a barreira da pele é rompida ou invadida por procedimentos médicos, como remoção ou inserção de catéteres endovenosos (JAWETZ et al, 1998; TORTORA; FUNKE; CASE, 2007).
A ação do extrato etanólico bruto de Jacaranda decurrens sobre microrganismos gram-negativos também chama a atenção. Enterobacter cloacae e
Enterobacter aerogenes podem ser encontrado em vida livre ou no trato intestinal, podendo causar infecções das vias urinárias e sepse. Também são responsáveis por infecções hospitalares. A Escherichia coli é um membro da microbiota intestinal normal que pode estar associada a infecções do trato urinário, doenças diarréicas, sepse e meningite. Assim como outros microrganismos, também tem assumido importância no surgimento de novos casos de infecção hospitalar. A Serratia marcescens é um patógeno oportunista comum em pacientes hospitalizados. Pode estar associada ao aparecimento de pneumonias, bacteremias e endocardites. No ambiente hospitalar pode ser encontrada em catéteres, soluções salinas para irrigação, e outras soluções supostamente esterilizadas. Tais contaminações são provavelmente as causas de infecções dos tratos urinário e respiratório em hospitais
(JAWETZ et al, 1998; TORTORA; FUNKE; CASE, 2007)..
105
Pseudomonas aeruginosa distribui-se amplamente na natureza e, geralmente, é encontrada em ambientes úmidos nos hospitais. Pode colonizar o homem tornando-se saprófita, e provocar doença em indivíduos com defesas orgânicas anormais. É responsável por provocar infecção de queimaduras e feridas; meningite por punção lombar; e infecção das vias urinárias por catéteres e instrumentos ou por soluções de irrigação. O comprometimento do trato respiratório, sobretudo por respiradores contaminados, resulta em pneumonia necrotizante. Pode causar infecção ocular durante procedimentos cirúrgicos, levando à sua rápida destruição do olho. Loureiro et al (2002), Gales et al (2004) e, Freitas e Barth (2002) em seus trabalhos, chamam a atenção para o surgimento de cepas de
Pseudomonas aeruginosa resistentes aos antibióticos usados atualmente no tratamento de infecções causadas por este microrganismo.
Em um estudo conduzido por Valgas et al. (2007) foram avaliados diversos métodos para se determinar a atividade antimicrobiana de produtos naturais e constataram uma série de vantagens do teste de difusão em ágar. Em relação ao método de difusão em disco, foi observada maior sensibilidade, menor probabilidade de interferência das partículas suspensas na amostra, gasto menor de tempo e simplicidade e a ausência das influências do disco sobre a difusão das moléculas.
Moléculas polares podem ter sua difusão em ágar influenciada pelas hidroxilas livres presentes no material de que são feitos os discos.
As características morfológicas e a importância clínica dos microrganismos utilizados neste ensaio são de grande importância. Isso motivou o uso destas mesmas bactérias e de outros isolados para a determinação da CIM.
106
4.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
Os resultados observados no teste de difusão em ágar são de caráter meramente qualitativo. Apesar de este teste apresentar limitações para substâncias de baixa difusibilidade no meio de cultura, ele é capaz de fornecer importantes indícios da atividade antimicrobiana do extrato das folhas de Jacaranda decurrens. A etapa quantitativa se deu no teste de diluição em ágar, no qual se determinou a concentração inibitória mínima do extrato e das frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica frente a um conjunto de microrganismos conforme recomendado pelo NCCLS (2003).
Vale a pena ressaltar que os resultados obtidos no teste de difusão em ágar se confirmaram no teste de diluição em ágar para todos os microrganismos testados, sendo todos eles sensíveis ao extrato, onde alguns mostraram maior sensibilidade com menor CIM e outros foram mais resistentes apresentando maiores valores para a CIM.
Através da determinação da CIM foi possível observar que as cepas de
Staphylococcus aureus utilizadas no experimento mostraram a mesma sensibilidade frente ao extrato etanólico bruto. Todas as concentrações inibitórias mínimas encontradas foram de 4,37 mg/mL. Com exceção da Escherichia coli ATCC 25922, todas as Enterobacteriaceae avaliadas apresentaram CIM de 17,5 mg/mL Os microrganismos gram-positivos esporulados tiveram seu crescimento inibido com concentrações que variaram de 2,18 a 8,75 mg/mL. O grupo de microrganismos constituído por cepas padrão e isolados de Pseudomonas aeruginosa pode ser subdividido em quatro outros grupos de acordo com o padrão de sensibilidade 107
fornecido pela CIM. O grupo 1 inibido com a concentração de 4,37 mg/mL perfaz o percentual de 4,87% do total de Pseudomonas aruginosa testadas, o grupo 2 inibido com a concentração de 8,75 mg/mL corresponde a 56,09% e o grupo 3 inibido com
17,5 mg/mL representa 39,04%.
Todas as frações analisadas apresentaram atividade contra os isolados de
Pseudomonas aeruginosa testados. A fração acetato de etila foi a que apresentou menor valor para a CIM (0,39 mg/mL). Esta concentração foi capaz de inibir 12% das bactérias testadas. A maioria dos isolados (64%) foi inibida com a concentração de 0,78 mg/mL, seguindo-se da concentração de 1,56 mg/mL (24%). A fração aquosa conseguiu inibir o crescimento dos microrganismos com as concentrações de 0,78 mg/mL e 1,56 mg/mL perfazendo o total respectivamente de 40 e 60% do total e bactérias avaliadas. Três concentrações da fração diclorometano foram capazes de inibir o crescimento microbiano: 6,25, 3,125 e 0,78 mg/mL. A maioria dos isolados foi inibida com 6,25 mg/mL, representando 80% do total de microrganismos. A fração hexânica teve um perfil de inibição semelhante onde 80% dos isolados foi inibida com a concentração de 6,25 mg/mL. De uma forma geral observou-se que em relação ao extrato etanólico bruto houve uma diminuição da
CIM para a todos os isolados utilizados no teste com as frações. Observou-se de uma forma geral a diminuição da CIM pelas frações em relação ao extrato etanólico bruto. A menor concentração de extrato etanólico bruto capaz de inibir o crescimento de isolados foi de 4,37 mg/mL enquanto o menor valor para CIM das frações foi de
0,39 mg/mL.
Outros estudos têm sido realizados no sentido de se determinar a atividade antimicrobiana de espécies da família Bignoniaceae. Owolabi et al. (2007) verificaram a atividade antimicrobiana do extrato etanólico de Kigelia africana (Lam.) 108
Benth. sobre isolados clínicos de Staphylococcus aureus e Candida albicans. Contra
Pseudomonas aeruginosa, não foi observado inibição do crescimento. Haque et al.
(2006) determinaram atividade antimicrobiana dos extratos n-hexano e clorofórmico sobre bactérias gram-positivas, gram-negativas e sobre os fungos Candida albicans,
Aspergillus niger e Sacharomyces cerevisae. Em um outro trabalho semelhante,
Muñoz-Mingarro et al. (2003) observaram a atividade antimicrobiana dos extratos aquosos de sementes, folhas e vagens de Catalpa bignonioides Walt. sobre
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis e Salmonella tiphymurium.
Os resultados do estudo fitoquímico mostraram a presença de cumarinas e flavonóides que são duas classes de compostos com reconhecida atividade antimicrobiana, segundo estudos realizados por Basile et al. (1999), Ng et al (1996) e Tereschuk et al. (1997). Diante disso, é possível sugerir que a inibição do crescimento microbiano possa ter ocorrido em função da atividade de moléculas pertencentes à essas classes de compostos químicos.
109
5. CONLUSÕES
O extrato etanólico bruto e as frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica das folhas de Jacaranda decurrens Cham. apresentaram atividade antimicrobiana contra os microrganismos testados. Além disso, observou- se que as frações avaliadas apresentaram melhores concentrações inibitórias mínimas em relação ao extrato etanólico bruto. A fração acetato de etila foi a que conseguiu inibir o crescimento de Pseudmonas aeruginosa com a menor concentração inibiotória mínima (0,39 mg/mL).
110
REFERÊNCIAS
AL-TAWFIQ, J. Occurence and antimicrobial resistance pattern of inpatient and outpatient isolates of Pseudomonas aeruginosa in a Saudi Arabian hospital: 1998- 2003. Intenational Journal of infection Diseases, v. 11, p. 109-114, 2007.
ALVES, T. M. A. et al. Biological Screening of Brazilian Medicinal Plants. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, vol. 95, p. 367-373, may/jun. 2000.
BASILE, A. et al. Antibacterial Activity of Pure Flavonoids Isolated from Mosses. Phytochemistry, v. 52, p. 1479-1482, 1999.
BERGER-BÄCHI, B. Resistance mechanisms of Gram-positive bacteria. International Journal of Medical Microbiology, v. 292, p. 27-35, 2002.
CHAMBERS, H. F. Antimicrobianos – Considerações Gerais. In: GILMAN, A. G. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. McGrawHill: Rio de Janeiro, 2003. p. 859- 876.
CLOETE, T. E. Resistance machanisms of bacteria to antimicrobial compounds. International Biodeterioration & Biodegradation, v. 51, p. 277-282, 2003.
FERRI, P. H. Química de produtos naturais: métodos gerais. In: DISTASI, L. C. Plantas medicinais: arte e ciência. São Paulo: Editora da Universidade Estadual Paulista, 1996. p. 129-156.
FREITAS, A. L. P.; BARTH, A. L. Antibiotic resistanceand molecular typing of Pseudomonas aeruginosa: focus on imipenem. The Brazilian Journal of Infeccious Diseases, v. 6 (1), p. 1-7, 2002.
FUKAI, T. et al. Antimicrobial activity of licorice falvonoids against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia, v. 73, p. 536-539, 2002.
GALES, A. C. et al. Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak in an intensive care unito f a teaching hospital. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 8 (4), p. 267-271, 2004.
111
GROVE, D. C.; RANDALL, W. A. Assay methods of antibiotics: a laboraory manual. Nova York: Medical Encyclopedia Inc., 1955. p. 80 (Antibiotics monogrphs, 02).
HAQUE, M. R. et al. Antimicrobial and cytotoxic activities of Stereospermum chelonoides. Dhaka University Journal Pharmaceutical Sciences, v. 5, p. 71-72, Jun./Dec. 2006.
JAWETZ, E. et al. Microbiologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. 524p.
HOGAN, D.; KOLTER, R. Why are bacteria refractory to antimicrobials? Current Opinion in Microbiology, v. 5, p. 472-477, 2002.
LEE, M. K. et al. Prevalence of hospital infection and antibiotic use at University Medical Center in Hong Kong. Journal of Hospital Infection, v. 65, p. 341-347, 2007.
LOUREIRO, M. M. et al. Pseudomonas aeruginosa study of antibiotic resistance and molecular typing in hospital infection cases in a neonatal intensive care unit from Rio de Janeiro City, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, p. 387-394, abril 2002.
LOUREIRO, M. M. et al. Study of multi-drug resistant microorganisms isolated from blood cultures of hospitalized newborns in Rio de Janeiro City, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, p. 73-78, 2002.
MAKEDOU, K. G et al. Changes in antibiotic resistance of the most common Gram- negative bacteria isolated in intensive care units. Journal of Infection, v. 60, p. 245- 248, 2005.
MCKEEGAN, S K.; BORGES-WALMSLEY, M. I.; WALMSLEY, A. R. Microbial and viral drug resistance machanisms. Trends in Microbiology, v. 10, suppl., 2002.
MUÑOZ-MINGARRO, D. et al. Biological activity of extracts from Catalpa bignoides Walt. (Bignoniaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 87 (2003) 163-167, 2003.
NCCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Villanova, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standarts, 2003 112
NG, T. B. et al. Examination of Coumarins, Flavonoids and Polysaccharopeptide for Antibacterial Activity. General Pharmacology, v. 27, p. 1237-1240, 1996.
OKEKE, M. I. et al. Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for anibacterial activity. Ethnopharmacology, v. 78, p. 119-127, 2001. ORRETT, F. A.; CHANGOOR, E. Bacteremia in children at a regional hospital in Trinidad. International Journal of Infecctious Diseases, v. 11, p. 145-151, 2007.
OWOLABI, O. J.; OMOGBAI, E. K. I.; OBASUYI, O. Antifungal and antibacterial activities of the ethanolic and aqueous extract of Kigelia africana (Bignoniaceae) stem bark. African Journal of Biotechnology, v. 6, p. 1677-1680, July 2007.
PRADO, M. A. Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus meticilina resitentes (MRSA) em profissionais de saúde e as interfaces com as infecções nosocomiais. Revista Eletrônica de Enfermagem, v. 9, p. 879-880, 2007.
SALVADOR, M. J. et al. Bioactivity of crude extracts and some constituents of Blutaparon portulacoides (Amaranthaceae). Phytomedicine, v. 9, p. 566-571, 2002.
SANCHES, N. R. et al. An evaluation of antibacterial activities of Psidium guajava (L.). Brazilian Archives of Biology and Technology, vol. 3, p. 429-436, may 2005. SPIANDORELLO, W. P. et al. A resistência do Staphylococcus aureus à oxacilina em hospital de Caxias do Sul. Revista AMRIGS, v. 44, p. 120-125, 2000.
STEERS, E.; FOLTZ, E. L.; GRAAVES, V. S. An inocula replicatingapparatus for continue testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiotic Chemoterapy, v. 9, p. 37-311, 1959.
TAVARES, W. Manual de Antibióticos e Quimioterápicos Antiinfeciosos. Atheneu: São Paulo, 2001. 1220p.
TERESCHUK, M. L. et al. Antimicrobial activity of Flavonoids from Leaves of Tagetes minuta. Journal of Ethnopharmacology, v. 56, p. 227-232, 1997.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiology. Benjamim Cummings: San Francisco, 2007. 958p.
VALGAS, C. et al. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology, v. 38, p. 369-380, 2007.
113
WALSH, F. M.; AMYES, S. G. B. Microbiology and drug resistance mechanisms of fully resistant pathogens. Current Opinion in Microbiology, v. 7, p. 439-444, 2004.
114
Capítulo 4 – Estudo de Toxicidade
Aguda em Dose Única do Extrato
Etanólico Bruto das Folhas de
Jacaranda decurrens Cham. –
Bignoniaceae.
115
1. INTRODUÇÃO
A grande quantidade de novos produtos gerados pelos centros de pesquisa de universidades e empresas enfrenta um sério obstáculo para o uso em humanos: a necessidade de testes rigorosos de efeitos tóxicos in vivo. Esses testes devem ser realizados para qualquer tipo de produto, sejam medicamentos fitoterápicos ou não, cosméticos, ou defensivos agrícolas, sejam conservantes/germicidas de água ou alimentos (BRITO, 1994).
Em se tratando de plantas medicinais, o uso popular, e mesmo tradicional, não são suficientes para validar eticamente as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas medicinais, não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e sua preconização, ou autorização oficial do seu uso medicamentoso, devem ser fundamentadas em evidências experimentais comprobatórias de que o risco que se expõem aqueles que a utilizam é suplantado pelos benefícios que possam advir (LAPA et al., 2004).
A avaliação desta segurança, ou seja, a avaliação da relação risco/benefício, é a finalidade dos estudos farmacodinâmicos e toxicológicos pré- clínicos e clínicos de medicamentos. Progressos nesse sentido ocorreram nos
últimos 40 anos após o acidente com talidomida e, portanto, foram posteriores à
época em que muitos fitoterápicos foram introduzidos no mercado. De modo geral os protocolos propostos nestes estudos são extensos e muito presos a questões éticas, 116
mas permitem uma avaliação razoável da toxicidade e da efetividade de um medicamento (LAPA et al., 2004).
Os estudos de um novo medicamento fitoterápico seguem etapas bastante distintas que se diferenciam basicamente pelo sujeito da experimentação. A primeira delas, a etapa botânica, está relacionada à identificação do material de estudo. A etapa farmacêutica está relacionada ao preparo da forma farmacêutica para administração, com a garantia da qualidade e uniformidade da amostra, assim como com sua estabilidade durante os testes pré-clínicos e clínicos. A etapa de ensaios biológicos pré-clínicos relaciona-se aos ensaios farmacodinâmicos, farmacocinéticos e toxicológicos em animais de laboratório. A etapa clínica é a executada na espécie humana e está dividida em quatro fases seqüenciais realizadas apenas se existirem indicações seguras de que os benefícios do uso medicinal do novo produto suplantam os riscos de uma possível ação tóxica. Duas dessas fases são essencialmente acadêmicas, a terceira multicêntrica, e finalmente, a quarta fase corresponde à livre utilização do medicamento, sob vigilância dos serviços sanitários. Como não existem testes de novos fármacos in anima nobile em risco intrínseco de reações adversas, o objetivo principal da etapa pré-clínica é o de determinar experimentalmente o grau de segurança para os testes em seres humanos. A primeira preocupação desses testes pré-clínicos é a de mostrar a eficácia de material, pois sem ela não há razão para o estudo. Neste ponto, os que não envolvam alterações no comportamento ou atividade fisiológica específica da espécie humana, como seriam as manifestações sensoriais e intelectuais da ação de um fármaco. Comprovada a efetividade, quantificado o efeito principal e eventualmente as ações colaterais, os testes de toxicidade são justificados. Estes têm o objetivo de detectar reações inesperadas produzidas pelo uso continuado do 117
produto, tanto as desencadeadas pela administração acidental de doses excessivas, como as conseqüentes do acúmulo causado pelo desbalanceamento entre a administração e a eliminação do fármaco no organismo (LAPA et al, 2004).
Diante do exposto é fácil entender o quanto os estudos de toxicidade aguda são importantes no processo de desenvolvimento de novos medicamentos, sejam eles fitoterápicos ou alopáticos. Eles tiveram início há quase um século quando médicos e farmacologistas passaram a se preocupar com drogas e venenos potentes. E em 1927 foi introduzido o conceito de dose letal média para a padronização de extratos de digitálicos, insulina e toxina diftérica. É importante se conhecer o quanto uma substância é tóxica, pois uma pequena diferença na exposição pode separar uma situação segura de uma letal (HAYES; DIPASQUALE,
2001).
Toxicidade aguda pode ser definida como o efeito nefasto que se produz dentro e um curto período de tempo e que resulta da administração de uma dose
única ou de várias doses de uma substância em um período de 24 horas. Este estudo é uma avaliação estimativa preliminar das propriedades tóxicas de uma substância teste, fornecendo informações acerca dos riscos para a saúde resultantes de uma exposição de curta duração pela via escolhida. A toxicidade aguda serve de base ainda para o estabelecimento de um regime de doses para as pesquisas sobre toxicidade aguda subcrônica, crônica e com doses repetidas, além de fornecer informações iniciais sobre o modo de ação da substância-teste. (BRITO
1994; DIPASQUALE; HAYES, 2001).
Visando garantir a qualidade, eficácia e a segurança dos produtos fitoterápicos a Agência Nacional de Vigilância Sanitária publicou as resoluções RDC 118
N°. 48 de 16 de março de 2004 e a RDC N°. 116 de 8 de agosto de 1996. A primeira dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e a segunda é a publicação de uma proposta de norma para estudo da toxicidade e da eficácia de produtos fitoterápicos.
Apesar do uso popular da Jacaranda decurrens em preparações medicinais, não existe nenhuma informação a respeito de seus possíveis efeitos tóxicos para o organismo. E este tem sido um aspecto bastante negligenciado pelas pessoas que fazem uso desta planta como medicamento. Levando-se em conta este fato é que se propôs avaliar a toxicidade aguda do estrato etanólico bruto das folhas deste espécime tendo como referência as Diretrizes OECD 423.
119
2. METODOLOGIA
2.1. MATERIAL BOTÂNICO
O material botânico usado para a preparação do extrato etanólico bruto e das frações aquosa, acetato de etila, diclorometano e hexânica foi obtido conforme descrito na seção 2.1.1 do Capítulo 2.
2.2. OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
O extrato etanólico bruto foi obtido conforme descrito na seção 2.1 do
Capítulo 3.
2.3. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA SEGUNDO AS DIRETRIZES OECD 423
2.3.1. Descrição dos animais
Foram usados no experimento ratos Wistar (Ratus norvegicus) e camundongos Swiss (Mus muscullus) de ambos os sexos oriundos do biotério da
UNICEUB-Centro Universitário de Brasília. Os animais eram adultos jovens com 8 a
12 semanas de idade e o peso de cada um não excedendo 20% da média do grupo. 120
2.3.2. Critério de definição da amostra
O número de animais usado para cada dosagem e para o controle com
DMSO foi de três animais, conforme recomendado pelas Diretrizes OECD 423.
2.3.3. Descrição do alojamento
Os animais foram alojados no biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas
Tóxico-farmacológicas da Faculdade de Farmácia – UFG. Foram alimentados com ração balanceada Labina da Purina além de água filtrada. O ambiente foi climatizado com temperatura de 23 ± 2°C e umidade relativa do ar variando de 50 a 70% com monitoramento do ciclo claro e escuro de 12 horas cada. Antes do início do experimento os animais foram identificados com marcações na calda e pesados.
Cada grupo de três animais foi colocado em uma caixa de polipropileno, a qual foi forrada com maravalha e devidamente identificada com etiqueta contendo a substância teste, a dosagem, a espécie, o sexo, o peso de cada animal, a data do início e término do experimento e o responsável pelo teste. Todos os animais passaram por um período de aclimatação no biotério de cinco dias.
121
2.3.4. Descrição detalhada do procedimento experimental
Todo o procedimento experimental foi baseado no OECD Guideline for
Testing of Chemicals (OECD 423, 2001). Três animais foram usados para cada dose considerando-se a espécie e o sexo. A dose inicial foi selecionada entre as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg. Por se tratar de um extrato vegetal de uso bastante comum pela população e devido a inexistência de informações sobre casos de intoxicação pela planta, decidiu-se iniciar a triagem com a dose de 2000 mg/Kg, a qual foi considerada a mais propensa a produzir mortalidade nos animais. Se houvesse a morte de dois ou três animais a dose subseqüente seria reduzida para
300 mg/Kg. Após a avaliação da dose de 2000 mg/Kg decidiu-se administrar a dose de 5000 mg/Kg.
A quantidade de extrato a ser administrada para cada animal foi calculada segundo o peso de cada animal e pesada em balança analítica. Para a solubilização do extrato foi utilizado DMSO 3% (p/V) e o volume foi completado com água destilada tendo-se o cuidado de não exceder o volume de 1 mL/100 g de peso corporal dos animais. As doses foram administradas uma única vez por gavagem com cânula apropriada.
Antes da administração das doses do extrato os ratos foram privados da alimentação por uma noite e os camundongos por um período de 3 a 4 horas. O fornecimento de água foi mantido. Depois que a substância foi administrada, a alimentação ainda foi suspensa por mais 3-4 horas em ratos e 1-2 horas em 122
camundongos. Os animais foram observados a intervalos variados no dia de administração do extrato etanólico bruto da planta (10 min, 30 min, 1h, 2h, 4h, 6h,
12h e 24h) e, a partir de então, diariamente, até o décimo quarto dia.
Foram feitas observações comportamentais sistemáticas (screening hipocrático: atividade geral, frênito vocal, irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição trem posterior, reflexo endireitamento, tonus do corpo, força para agarrar, ataxia, reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptose, micção, defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose, hiperemia, morte). As intensidades dos eventos foram tabuladas de zero a quatro, correspondendo, respectivamente a: ausente (0), raro (1), pouco (2), moderado (3), intenso (4). As alterações encontradas na observação comportamental e exame clínico sistemático dos animais serão registrados em protocolo impresso com a lista de sinais a serem investigados. Esta lista e a pesquisa de sinais foram baseadas no modelo proposto por Malone e Robichaud (1962) e Malone (1977).
Após o período de observação os animais foram novamente pesados, anestesiados, sacrificados por deslocamento cervical e necropsiados. Durante a necropsia foram removidos o fígado, baço e rins para análise macroscópica. O sacrifício dos animais seguiu os princípios éticos de experimentação animal proposta pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA, 1991).
123
2.4. DESTINO DOS ANIMAIS APÓS A EXPERIMENTAÇÃO
Ao final do experimento os animais foram descartados em recipientes adequados localizados nas dependências do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública – IPTESP da Universidade Federal de Goiás e em seguida coletados por empresa especializada contratada por esta Universidade e a qual coube incinerar os animais mortos.
124
3. RESULTADOS
Durante todo o período de observação dos animais não ocorreu a morte de nenhum deles. Através das observações comportamentais feitas por meio do screening hipocrático atribuiu-se pontuação zero para todos os itens avaliados.
Também não foram observadas variações de sensibilidade entre as espécies de ambos os sexos em estudo.
A necropsia dos animais não evidenciou nenhuma alteração macroscópica que justificasse a o estudo histopatológico dos órgãos selecionados para análise
(rins, baço e fígado).
125
4. DISCUSSÃO
A toxicidade aguda pelo método de classe é um processo de avaliação gradual de uma substância teste com o uso de três animais de um único sexo por etapa. Dependendo da mortalidade e/ou morbidade dos animais, em média mais dois a quatro etapas poderão ser necessários para se determinar a toxicidade aguda da substância testada. Este procedimento é reprodutível, utiliza poucos animais e é capaz de classificar as substâncias de forma semelhante a outros métodos de ensaio. A toxicidade aguda pelo método de classe baseia-se em avaliações biométricas com doses fixas, devidamente separadas para permitir a classificação de uma substância quanto ao seu potencial tóxico. O método adaptado em 1996 foi extensivamente validado in vivo onde os resultados de DL50 foram comparados com dados obtidos a partir de outros trabalhos (OECD 423, 2001).
Em princípio, o método não se destina a realização do cálculo preciso da DL
50, mas sim permitir a determinação de intervalos de exposição definidos onde letalidade é esperada através da morte de uma parte dos animais O método permite a determinação de um valor DL50 somente quando, pelo menos, duas doses resultam em mortalidade superior a 0% e inferior a 100%. A utilização de uma seleção de doses pré-definidas, independentemente da substância ensaiada, com classificação explícita, vinculado ao número de animais observados nos diferentes estados favorece a consistência e a reprodutibilidade dos resultados (OECD 423,
2001). 126
O significado dos valores da DL50 foi avaliado por vários pesquisadores que chegaram a conclusões similares: os valores da DL50 são imprecisos, não representam uma constante biológica, e não devem ser aplicados para muitos materiais. O valor da DL50 por si só não representa completamente a toxicidade aguda, uma vez que outros parâmetros além da letalidade são necessários. O declive da curva dose-resposta, o tempo que os animais levaram para morrer, sinais de toxicidade e achados patológicos são mais importantes para se determinar a toxicidade aguda (HAYES; DIPASQUALE, 2001). Em seu artigo de revisão
Valadares (2006) fez uma exposição do processo evolutivo dos testes de toxicidade aguda e ressaltou, entre outras coisas, a tendência de desuso do cálculo da DL50 nesse tipo de estudo.
A metodologia descrita no OECD Guidelines 423 preconiza o uso de roedores para os testes de toxicidade aguda, com preferência para ratas. Porém, para as duas dosagens testadas foram utilizados ratos e camundongos de ambos os sexos. Isso foi feito objetivando-se verificar a sensibilidade entre machos e fêmeas e entre as duas espécies de roedores. E apesar de na literatura haver referência para a maior sensibilidade de animais fêmeas (OECD 423, 2001), na execução do experimento isso não foi observado.
O método estabelece que a dose inicial deva ser aquela mais provável de causar mortalidade em alguns dos animais testados. Quando não há nenhuma informação sobre a substância a ser testada, por motivos referentes ao bem-estar animal, recomenda-se usar como dose inicial 300 mg/Kg de peso corporal. Quando a informação disponível sugere que a mortalidade é improvável ao mais alto nível dose inicial, um teste limite deve ser conduzido em seguida (OECD 423, 2001).
Como já havia sido relatado na literatura que a Jacaranda decurrens é uma planta 127
de uso bastante comum pela população (TRESVENZOL et al.; 2006), e não foi encontrado nenhum registro de toxicidade causado por esta planta, decidiu-se adotar como dose inicial 2000 mg/Kg de peso corporal. Como não houve manifestações de sinais de toxicidade, a dose foi aumentada para 5000 mg/Kg de peso corporal. E mesmo com a aplicação desta última dose, não foi observada a morte de nenhum animal, assim como sinais de toxicidade.
Durante a necropsia foram observados todos os órgãos dos animais dando- se ênfase maior para os rins, fígado e baço. Os dois primeiros possuem papéis importantes no metabolismo e excreção de xenobióticos e o terceiro órgão é capaz de fornecer sinais de toxicidade para o sistema imune dos animais (HAYES;
DIPASQUALE, 2001).
Trabalhos têm chamado a atenção para o fato de muitos usuários de plantas medicinais não considerarem os efeitos tóxicos das mesmas. Em um estudo desenvolvido por Oliveira e Gonçalves (2006) avaliando o conhecimento sobre plantas medicinais e fitoterápicos e potencial de toxicidade por usuários de Belo
Horizonte, ficou demonstrado que a maioria dos entrevistados (60%) não acreditam que plantas medicinais e fitoterápicos possam causar efeitos tóxicos. Soma-se a isto o fato de haverem poucos estudos mostrando os efeitos tóxicos gerados por fitoterápicos e plantas medicinais. Turolla e Nascimento (2006) avaliaram dez plantas medicinais comercializadas na forma de medicamentos fitoterápicos, os quais apresentaram volume de vendas e número de unidades vendidas significativos entre os anos de 1999 e 2002, segundo informações da IMS Health. Foi observado que do total analisado existiam poucas informações sobre os efeitos tóxicos produzidos por cada espécie de planta analisada. 128
Com relação a Jacaranda decurrens não foi encontrada nenhuma informação sobre seus possíveis efeitos tóxicos. Até mesmo em relação à família
Bignoniaceae foram encontrados poucos trabalhos sobre toxicidade. Jabour et al.
(2006) avaliaram a variação da toxidez de Arrabidaea bilabiata (Sprague) Sandwith em coelhos e observaram que a planta é mais tóxica quando em brotação e coletada no mês de outubro, onde a dose letal foi de 0,5 g/Kg. Um outro trabalho também com espécie da família Bignoniaceae foi realizado por Miranda et al. (2002) onde estudaram a toxicidade aguda de Tabebuia avellanedae Lor. ex. Griseb. sobre camundongos e observaram que nas dosagens empregadas no teste não houve a manifestação de sinais de toxicidade.
Uma vez que este trabalho avalia apenas a toxicidade da Jacaranda decurrens mediante a exposição a uma única dose, tornam-se de grande importância estudos capazes de avaliarem o uso por períodos mais prolongados, tais como toxicidade subcrônica e crônica.
129
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos indicam que o extrato etanólico bruto da Jacaranda decurrens possui baixa toxicidade quando ocorre exposição aguda. Além disso, não foram observadas diferenças interespécie e entre machos e fêmeas.
130
REFERÊNCIAS
BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, RDC Nº. 48, de 16 de março de 2004. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Disponível em: http: // www.anvisa.gov.br. Acesso em: 04/2008.
BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, RDC Nº. 116, de 08 de agosto de 1996. Dispõe sobre proposta de norma para estudo da toxicidade e da eficácia de produtos fitoterápicos. Disponível em: http: // www.anvisa.gov.br. Acesso em: 04/2008.
BRITO, A. S. Manual de Ensaios Toxicológicos in vivo. Editora da UNICAMP: Campinas, 1994. 122p.
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, Princípios Éticos de Experimentação Animal, 1991.
HAYES, A. W.; DIPASQUALE, L. C. Acute Toxicity and Eye Irritancy. In: HAYES, A. W. Principles and Methods of Toxicology. Taylor & Francis: Philadelphia, 2001. 1887p.
JABOUR, F. F. et al. Variação da toxidez de Arrabidaea bilabiata (Bignoniaceae) em coelhos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26 (3), p. 171-176, 2006.
LAPA, A. J. et al. Farmacologia e Toxicologia de Produtos Naturais. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2004. p. 247-262.
MIRANDA, F. G. G. et al. Toxicidade aguda e atividade antiedematogênica e antinociceptiva do extrato aquoso da entrecasca de Tabebuia avellanadae Lor. ex Griseb. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 12, supl., p. 91-94, 2002.
OECD – Organization for Economic Co – operation and Development, Guideline 423: Acute Oral Toxicity: Modified Up – and – Down Procedure, 2001.
131
OLIVEIRA, F. Q.; GONÇALVES, L. A. Conhecimento sobre plantas medicinais e fitoterápicos e potencial de toxicidade por usuários de Belo Horizonte, Minas Gerais. Revista Eletrônica de Farmácia, vol. 3 (2), p. 36-41, 2006.
MALONE, R.H. New Natural Products anda Plant Drugs with Pharmacological, Biological or Therapeutical Activity. In: WAGNER, H.; WOLFF, P. Pharmacological Approaches to Natural Products Screening and Evalluation. Berlin: Spriger – Verlag, 1977. p. 23 – 53.
MALONE, M. H.; ROBICHAUD, R. C. A Hippocratic screen form pure or drug materials. Lloydia, 25: 30-325, 1962.
TRESVENZOL, L. M. et al. Estudo sobre o comércio informal de plantas medicinais em Goiânia e cidades vizinhas. Revista Eletrônica de Farmácia, Goiânia, v. 3, p. 23-28, jul. 2006.
TUROLLA, M. S. R.; NASCIMENTO, E. S. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos utilizados no Brasil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, p. 289-306, abr./jun. 2006.
VALADARES, M. C. Avaliação de toxicidade aguda: estratégias após a “era do teste DL50”. Revista Eletrônica de Farmácia, v. 3(2), p. 93-98, 2006.
132
Capítulo 5 – Considerações Finais
133
As características morfo-anatômicas do espécime de Jacaranda decurrens analisado estão de acordo com as descrições encontradas na literatura para esta espécie. Foi possível observar também características morfológicas comuns à família Bignoniaceae.
Cabe ressaltar a necessidade de estudos capazes de verificar a existência de diferenças entre espécies coletadas em diferentes localidades. A avaliação da influência da sazonalidade na composição e no teor dos metabólitos secundários seria outra vertente de estudos a ser empreendida.
As informações coletadas a partir do estudo morfo-anatômico são de grande importância no fornecimento de subsídios para a identificação deste espécime vegetal. Assim, os resultados obtidos neste trabalho contribuirão para o estabelecimento de parâmetros de controle de qualidade para esta matéria-prima obtida a partir das folhas de Jacaranda decurrens Cham.
Pode-se inferir do valor do teor de umidade encontrado a partir da análise das folhas de Jacaranda decurrens que se trata de uma matéria-prima vegetal fácil de ser conservada. Isto se deve ao fato de o valor médio encontrado para este parâmetro estar dentro do limite estabelecido pela Farmacopéia Brasileira IV (1988).
O valor médio encontrado para os teores de cinzas totais e insolúveis em
ácidos é importante por fornecer limites para este parâmetro de controle de qualidade.
A presença de flavonóides nas folhas de Jacaranda decurrens, em função de suas diversas atividades biológicas descritas na literatura, confere a esta planta um importante potencial fitoterápico que merece ser investigado sob o ponto de vista farmacológico. 134
É de relevante significado clínico a inibição de isolados de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus que sabidamente possuem resistência a antimicrobianos comumente usados na terapêutica.
A existência de cumarinas, flavonóides e saponinas sugerem que um ou mais compostos químicos pertencentes a estas classes de metabólitos secundários possa ser o responsável pela atividade antimicrobiana. Ensaios de purificação são necessários para se determinar quais as moléculas são capazes de inibir o crescimento microbiano.
O presente estudo confirmou o uso etnobotânico da planta no tratamento de processos infecciosos. Isso demonstra o potencial que as plantas medicinais possuem de serem fontes ricas para obtenção de novas moléculas com possíveis atividades terapêuticas.
Os resultados obtidos mostram que o extrato etanólico bruto possui baixa toxicidade quando ocorre exposição aguda. Diante do uso bastante comum da planta pela população e ausência de relatos de casos de intoxicação podiam-se esperar estes resultados. Todavia é importante que e leve em conta também os efeitos a logo prazo, ou seja, esta avaliação de toxicidade aguda deve ser complementada com estudos de toxicidade subcrônica e crônica.
É importante chamar a atenção para o fato de a metodologia empregada seguir uma tendência de uso de um número reduzido de animais. Isso torna o experimento mais prático, menos dispendioso e capaz de fornecer resultados que expressem o potencial tóxico de uma determinada substância teste.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração Baixar livros de Agronomia Baixar livros de Arquitetura Baixar livros de Artes Baixar livros de Astronomia Baixar livros de Biologia Geral Baixar livros de Ciência da Computação Baixar livros de Ciência da Informação Baixar livros de Ciência Política Baixar livros de Ciências da Saúde Baixar livros de Comunicação Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE Baixar livros de Defesa civil Baixar livros de Direito Baixar livros de Direitos humanos Baixar livros de Economia Baixar livros de Economia Doméstica Baixar livros de Educação Baixar livros de Educação - Trânsito Baixar livros de Educação Física Baixar livros de Engenharia Aeroespacial Baixar livros de Farmácia Baixar livros de Filosofia Baixar livros de Física Baixar livros de Geociências Baixar livros de Geografia Baixar livros de História Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura Baixar livros de Literatura de Cordel Baixar livros de Literatura Infantil Baixar livros de Matemática Baixar livros de Medicina Baixar livros de Medicina Veterinária Baixar livros de Meio Ambiente Baixar livros de Meteorologia Baixar Monografias e TCC Baixar livros Multidisciplinar Baixar livros de Música Baixar livros de Psicologia Baixar livros de Química Baixar livros de Saúde Coletiva Baixar livros de Serviço Social Baixar livros de Sociologia Baixar livros de Teologia Baixar livros de Trabalho Baixar livros de Turismo