VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSL Ų FAKULTETAS

BIOLOGIJOS KATEDRA

Irma P ūrait ė

ELNINI Ų GENETIN Ė ĮVAIROV Ė BEI J Ų PERNEŠAMŲ ERKI Ų UŽSIKR ĖTIMAS BORRELIA BURGDORFERI S.L. IR ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM

Magistro baigiamasis darbas

Molekulin ės biologijos ir biotechnologijos studij ų programa, 62401B107

Biologijos studij ų kryptis

Vadovas prof. Algimantas Paulauskas (parašas) (data) Apginta prof. habil. dr. Gintautas Kamuntavi čius (parašas) (data)

KAUNAS, 2010 Darbas atliktas: 2008 – 2010 m. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje, Kaune, Lietuvoje ir 2009.07.01 – 2009.09.30 LLP Erasmus student ų praktikos metu, Telemark University College, Department of Environmental and Health Studies, Bø i Telemark, Norvegijoje.

Recenzentas: dr. J.Radzijevskaja, fiziniai mokslai, biochemija.

Darbas ginamas: viešame magistr ų darb ų gynimo komisijos pos ėdyje 2010 met ų birželio 3d. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje, 801 auditorijoje, 10 val. Adresas: Vileikos g. 8, LT-44404 Kaunas, Lietuva.

Protokolo Nr.

Darbo vykdytojas: I.P ūrait ė

Mokslinis vadovas: prof. A.Paulauskas

Biologijos katedra, ved ėjas: prof. A.Paulauskas

2

TURINYS

SANTRAUKA ...... 4 SUMMARY ...... 5 ĮVADAS ...... 6 I. LITERAT ŪROS APŽVALGA ...... 8 1.1. Tauriojo elnio (Cervus elaphus) bendroji charakteristika ...... 8 1.2. Stirnos (Capreolus capreolus) bendroji charakteristika ...... 13 1.3. Iksodini ų erki ų (Ixodes ricinus) bendroji charakteristika ...... 19 1.3.1. Erki ų platinama Borrelia burgdorferi ...... 22 1.3.2. Erki ų platinama Anaplasma phagocytophilum ...... 23 1.4. Elnini ų tyrimai ...... 23 1.4.1 Elnini ų monitoringas Lietuvoje ...... 23 1.4.2. Elnini ų genetiniai tyrimai ...... 25 1.4.3. Elnini ų užsikr ėtimas Ixodes ricinus erk ėmis ir j ų pernešamais patogenais ...... 30 II. MEDŽIAGA IR METODIKA ...... 33 2.1. Tyrimo medžiaga ...... 33 2.2. Elnini ų DNR išskyrimas, koncentracijos ir švarumo nustatymas ...... 35 2.3. Erki ų ir j ų endoparazit ų DNR išskyrimas ...... 36 2.4. Elnini ų AAPD – PGR eiga ...... 36 2.5. Borrelia burgdorferi s.l. PGR ...... 38 2.5.1. Borrelia burgdorferi s.l. genotipavimas ...... 39 2.6. Anaplasma phagocytophilum PGR ...... 40 2.7. Elektroforez ė agaroz ės gelyje. Fragment ų vizualizavimas ...... 41 2.8. Matematinis APPD rezultat ų įvertinimas ...... 42 III. REZULTATAI IR J Ų APTARIMAS ...... 43 3.1. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų genetin ė įvairov ė pagal AAPD analiz ę ...... 43 3.2. Erki ų užsikr ėtimas Borrelia burgdorferi s.l ...... 55 3.2.1. Borrelia burgdorfferi s.l. genotip ų identifikacija ...... 56 3.3. Erki ų užsikr ėtimas Anaplasma phagocytophilum ...... 57 IŠVADOS ...... 58 LITERAT ŪROS ŠALTINIAI ...... 59 PRIEDAI ...... 65

3

SANTRAUKA

Darbo autorius: Irma P ūrait ė Pilnas darbo pavadinimas: Elninių genetin ė įvairov ė bei j ų pernešam ų erki ų užsikr ėtimas Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phagocytophilum Darbo vadovas: prof. Algimantas Paulauskas Darbas ginamas: Vytauto Didžiojo Universitete, Gamtos moksl ų fakultete, Kaunas, 2010, birželio 3d. Puslapi ų skai čius: 64 Lenteli ų skai čius: 13 Paveiksl ų skai čius: 40 Pried ų skai čius: 10

Elninių genetinei įvairovei nustatyti buvo tiriami 27 tauri ųjų elni ų ir 36 stirn ų individai. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų pavyzdžiai surinkti 2006-2009 metais Lietuvoje ir 2007 m. Norvegijoje. Individai tirti naudojant AADP (atsitiktinai amplifikuotos DNR polimorfizmo) ir PGR (polimeraz ės grandinin ė reakcija) metodik ą. Tyrimams naudoti kepen ų ir raumen ų pavyzdžiai. Stirn ų ir tauri ųjų elni ų individai buvo analizuojami naudojant dešimt pradmen ų: ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-06, ROTH-180-07, ROTH-180-08, ROTH-180-09, ROTH-180-10. Elektroforez ės geli ų rezultatai parod ė, kad polimorfini ų lokus ų skai čius yra 79, o fragment ų dydis - nuo 150 iki 3000 bazi ų por ų. Nusta čius fragment ų dydžius ir skai čius, gauti duomenys buvo suvesti į „TREECON for Windows“ kompiuterin ę program ą, kuria remiantis įvertintas genetinis kintamumas. Genetinis kintamumas tarp tirtų tauri ųjų elni ų individ ų varijavo nuo 0,08 iki 0,80, tarp stirn ų – nuo 0,04 iki 0,76. Buvo įvertintas ir 75 Ixodes ricinus erki ų, surinkt ų nuo elnini ų, užsikr ėtimas Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phacytophilum . 2,7% tirt ų erki ų buvo infekuotos Borrelia burgdorferi s.l., o 1,3% erki ų – Anaplasma phagocytophilum .

4

SUMMARY

Author of term paper: Irma P ūrait ė Full title of term paper: Genetic diversity of deer and identification of Borrelia burgdorferi s.l. and Anaplasma phagocytophilum in ticks collected from deer Term paper adviser: prof. Algimantas Paulauskas Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Naturas Sciences, Kaunas, 2010, June 3. Number of pages: 64 Number of tables: 13 Number of pictures: 40 Number of appendixes: 10

The Red deer ( Cervus elaphus ) 27 individuals from Lithuania and Norway and the Roe deer ( Capreolus capreolus ) 36 individuals from Lithuania were analyzed by RAPD (random amplified polymorphic DNA) polymerase chain reaction (PCR). The liver and muscle tissues samples were used for the investigations. Cervid individuals were analyzed using ten primers (ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-06, ROTH-180-07, ROTH-180-08, ROTH-180-09, ROTH-180-10). Electrophoresis gels showed that the number of polymorphic loci are 79 and fragments size are from 150 to 3000. „TREECON for Windows“ programm was used for the estimation of genetic variability. Genetic variability among the Red deer separate individual varied from 0,08 to 0,80 and among the Roe deer varied from 0,04 to 0,76. A total 75 Ixodes ricinus ticks collected from cervids were examined for Borrelia burdorferi s.l. and Anaplasma phagocytophilum . Borrelia burgdorferi s.l. were detected in 2 ticks (2,7%) and Anaplasma phagocytophilum in 1 tick (1,3%).

5

Įvadas Lietuvos kanopini ų žv ėri ų fauna, susiformavusi po ledynme čio, iki ši ų dien ų smarkiai pakito. Tai įvyko d ėl gamtos ir klimato s ąlyg ų kitimo, v ėliau – dėl žmoni ų tiesiogin ės ir netiesiogin ės veiklos. Ištirpus paskutiniam ledynui, šalto klimato s ąlygomis, Lietuvos teritorijoje gyveno tundros ir miškatundr ės žv ėrys – avijau čiai, šiauriniai elniai, kurie v ėliau, klimatui atšilus, išnyko arba pasitrauk ė toliau į šiaur ę. XVI-XVII a. Lietuvoje išnyko stumbrai ir taurieji elniai (v ėliau šie žv ėrys mūsų krašte vėl buvo prad ėti auginti) (Baleišis ir kt., 1998). Šiandien Lietuvoje gyvenantiems elniniams (stirnoms ir tauriesiems elniams) pavojus išnykti negresia, j ų populiacijos gausios ir paplitusios beveik visuose Lietuvos miškuose. Ši ų žv ėri ų populiacijos yra puikus modelis genetinių padarini ų tyrimams. Lietuvos tauri ųjų elni ų gen ų fondas paveiktas reintrodukcijos, perk ėlimo, gyv ūnų laikymo aptvaruose, fragmentacijos bei medžiokl ės. Stirn ų populiacijos gen ų fondas paveiktas fragmentacijos ir medžiokl ės. Pastaraisiais dešimtme čiais Lietuvoje buvo tiriama kanopini ų biologija, morfologija bei ekologija ir j ų reikšm ė kult ūriniam kraštovaizdžiui (Baleišis ir kt., 2003). Elnini ų genetin ės įvairov ės tyrimai prad ėti vykdyti neseniai ir kol kas n ėra pakankamai duomen ų apie ši ų Lietuvoje gyvenan čių žv ėri ų genetin į kintamum ą. Filogenetini ų ryši ų, toki ų, kaip genetin ės medžiagos ir jos element ų formavimasis, kitimas, vystymasis bei mutacinis kintamumas evoliucijos eigoje, nustatymas tarp įvairi ų organizm ų iki šiol daugiausiai r ėmėsi morfometrinių duomen ų, baltym ų ir izofermentini ų sistem ų tyrimais bei įvertinimu. Dabartiniu metu, filogenetini ų ryši ų įvertinimui, yra naudojami DNR tyrimu pagr įsti metodai, kurie, d ėl tikslumo ir platesnio pritaikymo spektro, suteikia detalesn ę ir patikimesn ę informacij ą apie organizmus, molekulin ės ekologijos, sistematikos, populiacin ės ir evoliucin ės genetikos tyrim ų srityse. Pagrindiniai DNR tyrimo pranašumai, lyginant juos su anks čiau naudotais metodais yra tokie, kad šiuo atveju yra tiriama tiesiogiai genetin ė medžiaga, o ne jos produktai, o patys DNR tyrimo metodai pasižymi dideliu specifiškumu ir gauti rezultatai yra labai tiksl ūs. Be to, tyrimus galima atlikti bet kokio amžiaus ar fiziologin ės b ūkl ės organizmui, netgi jam nebesant gyvam. DNR galima išskirti iš nedidelio kiekio kraujo, audinio ar plauk ų, o kadangi DNR molekul ės yra gana stabilios ir ilg ą laik ą nesuyra, išskirt ą DNR galima užkonservuoti ir saugoti ilg ą laik ą (Miceikien ė ir kt., 2002). Molekuliniai metodai pla čiai naudojami genetini ų skirtum ų tarp populiacij ų identifikacijai. Suteikia galimyb ę atskirti r ūšis ir por ūšius ne tik pagal morfologinius požymius, ta čiau ir pagal genetinio kintamumo ypatybes. Elnini ų genetinio kintamumo tyrimai – aktuali tema. B ūtina nagrin ėti ši ų žv ėri ų genetik ą, steb ėti poky čius, kurie vyksta populiacijose, gautas žinias panaudoti veisiant bei atkuriant r ūšis. Atlikta daug tyrim ų, įrodan čių, kad elniniai - vienas svarbiausi ų erki ų gausos faktori ų, nes yra pagrindiniai maitintojai. Žarnose arba seili ų liaukose erk ės gali tur ėti pavojing ų bakterij ų arba 6 virus ų, kuriuos, siurbdamos krauj ą, perneša į aukos organizm ą. Kadangi pastaraisiais metais pastebimas elnini ų skai čiaus did ėjimas, b ūtina tirti ir erki ų pernešamas ligas – anaplazmoz ę (suk ėlėjas - Anaplasma phagocytophilum ) ir Laimo lig ą, dar vadinam ą borelioze (suk ėlėjas - Borrelia burgdorferi s.l.). Erk ės įsisiurbia žmogui ar gyv ūnui ir siurbia jo krauj ą. Siurbdamos krauj ą, erk ės gali užsikr ėsti Borrelia burgdorferi s.l. ar Anaplasma sp. arba perduoti jas, jei jau yra užsikr ėtusios. Dažniausiai erk ės minta peli ų, nedideli ų paukšteli ų bei elni ų krauju, ta čiau įsisiurbia ir žmon ėms, kat ėms, šunims, arkliams. Darbo tikslas:

• Ištirti tauri ųjų elni ų (Cervus elaphus) ir stirn ų (Capreolus capreolus) genetin ę įvairov ę ir j ų pernešam ų Ixodes ricinus erki ų užsikr ėtim ą Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phagocytophilum . Darbo uždaviniai:

• Atlikti tauriojo elnio ( Cervus elaphus ) ir stirnos (Capreolus capreolus) DNR analiz ę naudojant AAPD – PGR metodik ą. • Nustatyti tirt ų individ ų DNR gaut ų fragment ų dydžius ir skai čių. • Įvertinti tirt ų individ ų genetin ę įvairov ę. • Įvertinti erki ų užsikr ėtim ą Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phagocytophilum . • Identifikuoti Borrelia burgdorferi s.l. genotipus.

7

I. LITERAT ŪROS APŽVALGA

1.1. Tauriojo elnio ( Cervus elaphus ) bendroji charakteristika Karalyst ė: Gyv ūnai (Animalia); Tipas: Chordiniai (Chordata); Potipis: Stuburiniai (Vertebrata); Klas ė: Žinduoliai (Mammalia); Būrys: Porakanopiai (Artiodactyla); Pob ūris: Atrajotojai (Rumminantia); Šeima: Elniniai (Cervidae); Gentis: Tikrieji elniai (Cervus); Rūšis: Taurusis elnias (Cervus elaphus); Por ūšis: Vidurio Europos taurusis elnias (Cervus elaphus hipelaphus). Gentis Cervus prad ėjo formuotis Centrin ėje Azijoje, pliocenui pereinant į pleistocen ą (prieš 1 mln. met ų). V ėlyvojo pleistoceno elni ų ragai panaš ūs į dabartini ų, vadinasi, tuo laiku r ūšis visiškai susiformavo (Wagenknecht, 1989). Lietuvoje gyvena trys r ūšys tikr ųjų elni ų ( Cervus ):
Taurusis elnias ( Cervus elaphus );
Dėmėtasis elnias ( Cervus nippon );
Danielius ( Cervus dama ). Taurusis elnias – elnini ų (Cervidae) porakanopini ų atrajotoj ų žinduoli ų šeimos žv ėris, kurio k ūnas proporcingas ir tvirtas. Patin ų galvas puošia įvairaus dydžio ir formos šakoti ragai, kuriuos kasmet kei čia. Šiandien suskai čiuojama 22 tauriojo elnio por ūšiai (priedas nr. 1, 1 lentel ė). Lietuvoje gyvena Vidurio Europos taurusis elnias (Cervus elaphus hippelaphus) (1 pav.). Du tauriojo elnio por ūšiai sutinkami Sibire. Tai Altajaus maralas (C. e. sibiricus) , gyvenantis Altajuje, Sajanuose, Pabaikal ėje ir šiaur ės vakar ų Mongolijoje ir iziubris (C. e. xanthopygus) , paplit ęs Užbaikal ėje, Tolimuosiuose rytuose, šiaur ės ir šiaur ės ryt ų Kinijoje, Turkm ėnijoje ir šiaur ės Afganistane sutinkamas Bucharos elnias (C. e. bachtrianus) , o šiaur ės Amerikoje – vapitis (C. e. nelsoni) (Baleišis ir kt., 1998). Dabar taurieji elniai paplit ę Europoje (2 pav.), Azijoje ir Šiaur ės Afrikoje, tarp 25 – 30° ir 55 – 60° š. pl., ir Šiaur ės Amerikoje, tarp 25 – 30° ir 50 – 60° š. pl. Aptinkmai miškuose, step ėse, miškastep ėse, kalnuose ir net dykumose. Aklimatizuoti Naujojoje Zelandijoje, Argentinoje, Australijoje ir Čil ėje (Baleišis ir kt., 1998).

8

1 pav. Tauriojo elnio (Cervus elaphus hippelaphus) patinas (Aperavičius) ir patel ė (Williams).

2 pav. Tauri ųjų elni ų paplitimas Europoje (Yalden).

Europoje suskai čiuojama apie 1 milijonas tauri ųjų elni ų. Daugiausia j ų yra Didžiojoje Britanijoje (270 t ūkst.), Austrijoje (146 t ūkst.). Rusijoje yra apie 130 – 160 t ūkstan čių maral ų ir iziubri ų. Subfosilin ės liekanos rodo, kad taurieji elniai Ryt ų Pabaltijyje gyveno jau ankstyvajame holocene ir čia buvo itin išplit ę viduriniame holocene. V ėlyvajame holocene ši ų žv ėri ų šiaurin ė

9 išplitimo riba pradeda atsitraukti į pietus, bet Lietuvoje j ų dar gausu iki antrojo t ūkstantme čio vidurio. V ėliau elniai išnyko, ir kada Lietuvoje – tiksliai nežinoma (Ivanauskas ir kt., 1964). Taurieji elniai prad ėti reaklimatizuoti Žagar ės miškuose. Manoma, kad čia pirmin ė laisv ėje gyvenan čių elnių banda susiformavo iš grafo Naryškino aptvar ų per Pirm ąjį pasaulin į kar ą pab ėgusi ų arba valstie čių išleist ų žv ėri ų. Yra ir kita versija, kad elniai atklydo iš Latvijos (XX a. Pradžioje jie buvo reaklimatizuoti Kurše). Remiantis G.Skribos duomenimis (1975), 1914 m. vakar ų Latvijoje laisv ėje gyveno 9 elni ų bandos (mikropopuliacijos). Vienos bandos užimama teritorija buvo prie pat Lietuvos sienos, už keli ų kilometr ų nuo Žagar ės mišk ų. Pirmosios Lietuvoje žv ėri ų apskaitos metais (1934) Žagar ės miške suskai čiuota 18 tauri ųjų elni ų. Iki 1938 met ų tauri ųjų elni ų šiaur ės Lietuvoje buvo tik Joniškio ur ėdijos miškuose. 1938 m. šios ur ėdijos Žagar ės miškuose (2728 ha) suskai čiuota 36 elniai, o kituose miškuose (14952 ha) – 61. V ėliau elniai paplito ir kitose vietov ėse. Iki 1982 m. iš pirminio Žagar ės tauri ųjų elni ų reaklimatizavimo židinio žv ėrys išplito į 8 administracini ų rajon ų (Akmen ės, Joniškio, Kelm ės, Mažeiki ų, Pakruojo, Radviliškio, Šiauli ų ir Telši ų) miškus. Pavieni ų elni ų arba nedideli ų j ų grupi ų buvo pasteb ėta ir kituose rajonuose (3 pav.).

3 pav. Introdukuot ų ir atklydusi ų tauri ųjų elni ų paplitimas Lietuvoje 1951-1982 m.: 1 - rajon ų ribos; 2 - pirminis elni ų reaklimatizavimo židinys; 3 - susiformavusi ų iš žv ėri ų imigrant ų band ų lokalizacija; 4 – atvežt ų iš Voronežo rezervato elni ų išleidimo vieta ir paplitimas; 5 – pavieni ų elni ų arba nedideli ų j ų grupi ų pasteb ėjimo vieta (Baleišis ir kt., 1998).

Prieš Antr ąjį pasaulin į kar ą tauri ųjų elni ų reaklimatizavimas buvo nenuoseklus. 1935 m. 2 elniai buvo išleisti į Trak ų ur ėdijos miškus ir 1939 m. du elniai, sugauti Latvijoje, atvežti į Kaišiadori ų ur ėdijos miškus. Po karo taurieji elniai buvo introdukuojami iš Voronežo rezervato. 1956 m. 37 elniai paleisti į Padauguvos mišk ą (Kauno raj.), Punios šil ą (Alytaus raj.) ir į Verškaini ų – Šešuoli ų mišk ą (Širvint ų ir Ukmerg ės raj.). 1972 m. į Trošk ūnų miškus (Anykš čių raj.) išleista dar

10

14 elni ų. Iš Voronežo rezervato atvežti elniai s ėkmingai reaklimatizavosi, bet į kaimynines teritorijas plito l ėtai (Baleišis ir kt, 1998). Į piet ų Lietuvos miškus elniai atkeliavo iš Lenkijos ir Karaliau čiaus krašto. Po karo susiformavo trys pastovios ši ų žv ėri ų kaimen ės Jurbarko, Lazdij ų ir Vilkaviškio rajonuose. Į Jurbarko miškus elniai atklydo per Antr ąjį pasaulin į kar ą arba pirmaisiais metais po karo iš Karaliau čiaus krašto, kur, remiantis V.Beliakovo ir kt. (1978) duomenimis, 1946 – 1947 m. gyveno apie 1500 ši ų žv ėri ų. 1951 m. Jurbarko rajone suskai čiuota 15 elni ų. Iš tikr ųjų j ų buvo du kartus daugiau, nes dar tiek pat elni ų buvo palaikyti (tai paaišk ėjo v ėliau) danieliais. Iš Jurbarko rajono elniai išplito į kaimyninius Taurag ės ir Šilut ės rajonus ir iki 1982 met ų j ų skai čius ši ų trij ų rajon ų miškuose išaugo iki 500. Nuo 1954 m. taurieji elniai iš Karaliau čiaus krašto užeidavo ir į Šaki ų rajon ą, bet čia pastovi banda iš atklydusi ų žv ėri ų nesusiformavo. Iš Lenkijos pirmieji elniai į Lazdij ų rajon ą užklydo tik 1967 m., o į Vilkaviškio – 1972 m. 1984 m. ši ų rajon ų miškuose priskai čiuota atitinkamai 73 ir 64 elniai (Baleišis ir kt., 1998). Norint pagreitinti tauri ųjų elni ų plitim ą, nuo 1969 m. respublikoje prad ėti j ų gaudymo ir perk ėlimo į naujas vietas darbai. 1969 – 1983 m. aptvaruose ir distancinio imobilizavimo b ūdu buvo sugauta 800 elni ų, kurie išleisti į respublikos 28 rajon ų miškus. Daugiausia elni ų išleista Var ėnos (75) ir Trak ų (63) rajonuose. 1984 – 1985 m. į Alytaus, Anykš čių, K ėdaini ų, Šven čioni ų ir Vilniaus rajon ų miškus dar paleista 97 elniai. Elniai buvo gaudomi ir perkeliami Lietuvoje į naujas vietas iki 1987 met ų. Iš viso sugauta ir perkelta į 29 administracini ų rajon ų miškus 1030 tauri ųjų elni ų. Be to 38 elniai išvežti į Estij ą (1979, 1980 ir 1987 m.) ir 23 žv ėrys į Rusijos Kaligulos srit į (1988 m.). (4 pav.)

4 pav. Tauri ųjų elni ų perk ėlimas Lietuvoje 1969-1987 m.: 1 – iki 10 individ ų grupi ų išleidimo vieta; 2 – 10 ir daugiau individ ų grupi ų išleidimo vieta; 3 – žym ėtų elni ų jud ėjimo kryptis (Baleišis ir kt., 2003).

11

Dėl introdukavimo, perk ėlimo ir imigravimo iš kaimynini ų teritorij ų taurieji elniai v ėl tapo svarbiu Lietuvos mišk ų biocenozi ų komponentu. Elni ų populiacijos dinamika Lietuvoje 1995 - 2004 m. pagal oficialios medžiojamos faunos apskaitos duomenis pateikta 5 pav. Tauri ųjų elni ų, sumedžiot ų 2007 – 2008 m. medžiokl ės sezono metu, suvestin ė pateikta priede nr.2, 2 lentel ėje.

Tauriųjų elnių populiacijos dinamika Lietuvoje 1995-2004m. 18000 16000 14000 12000 sk.

ų 10000 8000

Individ 6000 4000 2000 0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Metai

5 pav. Tauri ųjų elni ų populiacijos dinamika Lietuvoje 1995-2004 m. Pagal oficialios medžiojamos faunos apskaitos duomenis.

Tauriesiems elniams tinkamiausias biotipas – pla čialapiai miškai. Šie žv ėrys prisitaiko gyventi ir blogesn ėmis sąlygomis. Šiaur ės Škotijoje elniai gyvena net bemiškiuose kaln ų viržynuose. M ūsų šalyje tinkamiausi elniams yra derlingo dirvožemio lapuo čių ir mišrieji miškai. Visais met ų laikais elniai naktimis ateina ir į miško aplinkinius žem ės ūkio naudmen ų plotus, o vasar ą – į žem ės ūkio kult ūras, ypa č į kukur ūzų pas ėlius ( čia j ų b ūna ir dien ą). Atlikt ų tyrim ų duomenys rodo, kad ši ų žv ėri ų pasiskirstymas teritorijoje priklauso nuo medyn ų sud ėties, met ų laiko, žv ėri ų tankumo, žem ės ūkio kult ūrų išsid ėstymo pamišk ėse, augal ų fenofazi ų ir kt. (Petružis, Padaiga, 1979). Pavojingiausias tauriojo elnio priešas m ūsų šalyje - vilkas. Elniai žūva ir po transporto priemon ėmis, nuo įvairi ų traum ų, sužeidim ų medžiokl ėje, o patin ų - turnyrin ėje kovoje. Pavojingiausios infekcin ės ligos - snukio ir nag ų liga, tuberkulioz ė, pasiutlig ė. Elniai taip pat serga aktinomikoze. Nuo šios ligos dažniausiai išakija žandikauli ų kaulinis audinys, iškrinta dantys. Šios ligos suk ėlėja - bakterija Actinobacillus lignieresi. Anks čiau buvo manoma, kad aktinomikoz ė - gryb ų sukelta liga. Grybai sukelia kv ėpavimo tak ų aspergilioz ę ir trichofitij ą (nuplikim ą): dažniausiai nuplinka galva ir kaklas.

12

Invazini ų lig ų suk ėlėjai yra įvair ūs parazitai. Elni ų odoje parazituoja briedmus ės (Lipoptena cervi), niežus sukelian čios erk ės (Sarcoptes scabei), elnin ės ut ėlės (Pediculiaris cervi), plaukagraužiai (Trichodectes), o poodžio sluoksnyje randama gyli ų (Hypoderma) lerv ų. Žv ėri ų šnerv ėse ir kv ėpavimo takuose parazituoja gyli ų Cephanomya rufibarbis ir Pharyngomia pieta lervos, kepenyse - kepenin ė siurbik ė (Fasciola hepatica), echinokoko (Echinococcus granulosus) lervos, plonojoje žarnoje - avinis kaspiniuotis (Moniezia expansa), žarnos raištyje, pilvapl ėvėje - hidatidinio kaspinuo čio (Taenia hydatigena) lervos. Iš apvali ųjų kirm ėli ų elni ų skrandžio paskutiniame skyriuje (šliuže) dažnas parazitas Haemonchus contortus, plonojoje žarnoje -Bunastomum trigonocephalum, plau čiuose Dictyocaulus viviparus (Baleišis ir kt., 1998).

1.2. Stirnos ( Capreolus capreolus ) bendroji charakteristika Karalyst ė: Gyv ūnai (Animalia); Tipas: Chordiniai (Chordata); Potipis: Stuburiniai (Vertebrata); Klas ė: Žinduoliai (Mammalia); Būrys: Porakanopiai (Artiodactyla); Pob ūris: Atrajotojai (Rumminantia); Šeima: Elniniai (Cervidae); Gentis: Stirnos (Capreolus); Rūšis: Stirna (Capreolus capreolus). Stirn ų gentis iš elnini ų šeimos yra viena seniausi ų ir neturi kit ų artimos giminyst ės šiuolaikini ų gen čių. Artimos jai formos Europoje ir Azijoje atsirado pliocene, maždaug prieš 10-20 mln. met ų (Гептнер ir kt., 1961). Prasid ėjus ledynme čiams, Vidurio Europoje jau gyveno stirnos, labai panašios į dabartines. Kaip r ūšis stirna (6 pav.) Europoje visiškai susiformavo po paskutinio apled ėjimo. Traukiantis ledynui į šiaur ę, stirnos kartu su kitais miškastepi ų faunos atstovais išplito dabartin ėje Lietuvos teritorijoje. Manoma, kad tai buvo prieš 8-9 t ūkst. met ų (Baleišis, 1987). Stirna yra mažiausias ir grakš čiausias m ūsų krašto kanopinis žv ėris. Ilgos kojos, plonas liemuo, lieknas kaklas ir nedidel ė galva su ilgomis judriomis ausimis. Uodega trumpa, pasisl ėpusi plaukuose ir iš toliau ne įži ūrima. Užpakalin ės kojos ilgesn ės už priekines, j ų kulnai stipriai išsišov ę atgal, o užpakalin ė k ūno dalis kiek aukštesn ė už priekin ę, kas b ūdinga gerai šuoliuojantiems žv ėrims. Stirna b ėga šuoliais daug dažniau negu kiti m ūsų kanopiniai žv ėrys. Jos šuoliai labai lengvi ir ilgi, neretai iki 5 metr ų (Baleišis, 1987).

13

Dėl didelio morfologinio įvairumo areale (7 pav.) stirnos sistematika yra sudėtinga. Tod ėl iki šiol n ėra vienos nuomon ės, kiek stirn ų gentis turi r ūši ų. Pra ėjusio amžiaus pirmoje pus ėje dažniausiai buvo išskiriamos trys r ūšys ir keliolika por ūši ų. V ėliau įsivyravo nuomon ė, kad yra tik viena r ūšis Capreolus capreolus L. , turinti tris por ūšius: europin ę stirn ą ( C. capreolus capreolus ); sibirin ę stirn ą ( C. capreolus pygargus ) ir mandži ūrin ę stirn ą ( C. capreolus bedfordi ) (Grzimek‘s, 1972). Ta čiau naujausi stirn ų hibridizacijos bei kitokie tyrimai rodo, kad europin ė ir sibirin ė stirnos grei čiausiai yra skirtingos, bet labai artimos r ūšys, neseniai atsiskyrusios nuo bendro kamieno (Штуббе ir kt., 1979).

6 pav. Stirnos (Capreolus capreolus) patinas (Belchev ) ir patel ė (Virbila).

7 pav. Stirnos (Capreolus capreolus) paplitimo arealas (Raesfeld).

Rašytiniai šaltiniai rodo, kad XV-XVI a. stirna buvo įprastas ir visur paplit ęs gyv ūnas, XVI-XIX a., pašalt ėjus klimatui, stirn ų gerokai sumaž ėjo Estijoje, Latvijoje ir Lietuvoje (Паавер ir

14 kt., 1965). XIX a. antroje pus ėje, vis intensyviau medžiojant, daugelyje viet ų stirna tapo reta arba nykstanti. Pirmojo pasaulinio karo ir pokario metais, privisus daug vilk ų ir paplitus brakonieriavimui, stirn ų Lietuvoje katastrofiškai sumaž ėjo. Tik ketvirtajame dešimtmetyje inteligentijos ir gamtos myl ėtoj ų pastangomis imtasi efektyvi ų priemoni ų medžiojamiesiems žv ėrims, iš j ų ir stirnai, pagausinti. 1935 m. buvo priimtas įstatymas, draudžiantis kanopini ų žv ėri ų medžiokl ę (Baleišis, 1987). Stirn ų gausum ą Lietuvoje nuo seno l ėmė tiek gamtiniai, tiek antropogeniniai veiksniai. Svarbu buvo ir klimato s ąlygos. Klimatui atšilus – stirn ų pagaus ėdavo, o atšalus – sumaž ėdavo. Išryšk ėjo tiesiogin ė priklausomyb ė – kuo didesnis stirn ų kaimen ės tankumas, tuo didesn ė jos netektis žiem ą. Tinkamai organizavus papildom ą stirn ų š ėrim ą bei naudojant kitas biotechnijos priemones, ši ą netekt į iš dalies galima sumažinti, bet visai jos išvengti sunki ą žiem ą ne įmanoma. Kitas svarbus stirn ų gausum ą reguliuojantis veiksnys yra pl ėšr ūnai, ypa č vilkai. Ta čiau pra ėjusiais dešimtmečiais vilk ų skai čius Lietuvoje neviršijo 200 – 300, tod ėl didelio poveikio stirnoms jie netur ėjo. Tiesioginis žmogaus poveikis stirn ų kaimenei yra jų medžiokl ė. Neribojama arba nekontroliuojama medžiokl ė anks čiau ne kart ą gr ėsė stirnai visišku išnaikinimu. Ta čiau kult ūrinio kraštovaizdžio s ąlygomis, kur stambi ų pl ėšr ūnų lik ę nedaug, per didelis medžiokl ės ribojimas stirn ų kaimenei taip pat žalingas (Baleišis, 1987). Šiuo metu Lietuvoje gyvena daugiau nei 80000 stirn ų. Stirn ų populiacijos dinamika Lietuvoje 1994 – 2005m. pagal oficialios medžiojamos faunos apskaitos duomenis pateikiama 8 pav. Stirn ų, sumedžiot ų 2007 – 2008m. medžiokl ės sezono metu, suvestin ė pateikta 3 priede.

Stirnų populiacijos dinamika Lietuvoje 1995-2004m. 80000 70000 60000 50000 40000 30000 Individų sk. Individų 20000 10000 0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Metai

8 pav. Stirn ų populiacijos dinamika Lietuvoje 1995-2004 m. Pagal oficialios medžiojamos faunos apskaitos duomenis.

15

Vienas iš tobuliausi ų stirnos jutimo organ ų – klausa, kuria stirna daugiausia vadovaujasi. Uosl ė, kaip ir kit ų elnini ų šeimos atstov ų, vidutin ė. Reg ėjimas palyginti blogas, abiej ų aki ų reg ėjimo laukai beveik nedengia vienas kito, tod ėl erdvinio vaizdo stirna nemato ir reaguoja daugiausia į judes į. Stirninai yra truput į stambesni už pateles, bet iš išvaizdos šis skirtumas neryškus. Gamtoje patin ą lengviausia atpažinti iš rag ų, kol jie n ėra numesti. Stirnos plauk ų danga ir kailio spalva kinta sezoniškai. Kaklas, nugara ir šonai vienspalviai, kūno apa čia kiek šviesen ė. Pasturgalyje į šonus ir žemiau uodegos yra ovalinis balt ų plauk ų „veidrod ėlis“, ypa č ryškus žiem ą. Tai lyg optinis signalizatorius, kuris padeda stirnai geriau orientuotis b ūryje. Skirtingose vietov ėse gyvenan čių stirn ų kailio spalva gali skirtis. Kai kur Vidurio Europoje gyvena tamsios, kartais beveik juodos stirnos – melanistai. Daug re čiau aptinkama balt ų (albinos ų) (9 pav.) arba baltai marg ų stirn ų (j ų pasitaiko ir Lietuvoje). Šeriasi du kartus per metus – pavasar į ir ruden į.

9 pav. Balta stirna (albinos ė) (Randolph). Stirna turi nemažai specifini ų odos liauk ų (Raesfeld, 1965). Užpakalini ų koj ų išorin ėje pus ėje žemiau kulno ryškus tamsesnis pasišiaušusi ų plauk ų šepet ėlis, dengiantis metatarsalin ę liauk ą. Stirnai einant, šepet ėlis kli ūva už žoli ų, palikdamas ant j ų specifin į kvap ą, pagal kur į kitoms stirnoms b ūna lengviau atpažinti arba susirasti savo gentainius. Panaši paskirtis ir tarpupirštini ų liauk ų, esan čių koj ų kanopas jungian čioje odos raukšl ėje. Ši ų liauk ų sekretas suteikia kvap ą stirnos pėdsakams bei sutepa besitrinan čių kanop ų vidin ę pus ę. Stirninai turi kaktin ę odos liauk ą, esan čią žemiau rag ų. Trindami kakta medži ų kamienus, šakas, kr ūmus, stirninai liaukos kvapu pažymi savo teritorij ą. Stirn ų k ūno mas ė ir didumas smarkiai skiriasi. Nuo 59 kg sverian čių patin ų bei 52 kg sverian čių pateli ų iki 16 – 20 kg sverian čių stirn ų. Lietuvos stirn ų masei ir didumui nustatyti 1967 -

16

1975 m. buvo ištirta daugiau kaip t ūkstantis stirn ų, sumedžiot ų įvairiuose respublikos rajonuose (Блузма , 1975). Gauti duomenys rodo, kad svoris varijuoja tarp 15-40 kg. Stirn ų mas ė ir didumas gali pastebimai skirtis ne tik tolimose arealo vietose, bet ir gretimuose rajonuose. Šis reiškinys seniai pasteb ėtas Europos šalyse ir aiškinamas vietos populiacij ų paveldimomis savyb ėmis, skirtingo kaimen ės tankumo, mitybos s ąlyg ų poveikiu ir kt. (Baleišis, 1987). Lietuvoje stirnos gyvena miškuose. Labiausiai m ėgsta nedidelius, šviesius lapuo čių bei mišriuosius miškus su gausiu pomiškiu ir traku, apsuptus dirbam ųjų lauk ų. Juo miškas įvairesnis, juo daugiau jame pelku čių, kr ūmuot ų piev ų, retmi ų, atžalyn ų, kirtim ų, tuo jis tinkamesnis stirnai. Be mišk ų, svarbus stirnos biotopas yra agroželdiniai, t.y. laukuose esantys maži miškeliai, gojeliai, kr ūmai, augalijos apsaugin ės juostos, sodai, sodybvie čių želdiniai ir pan. Stirna yra tipiška pamišk ės gyventoja ir jai b ūtina biotop ų įvairov ė. Pagrindinis stirnos maistas – įvair ūs žoliniai bei sumed ėję augalai. M ūsų šalyje žinoma apie 250 stirnos ėdam ų augal ų r ūši ų. Įvairiose arealo vietose ėdam ų augal ų rūšin ė sud ėtis ir j ų mėgstamumas labai skiriasi. Čia svarbu augalijos tipas ir gyvenam ų plot ų strukt ūra. Stirn ų veisimosi laikas – ruja – vasaros pabaiga. Ruja prasideda liepos antroje pus ėje ir tęsiasi apie m ėnes į. Per ruj ą stirnos, ypa č patinai, tampa labai aktyv ūs ir agresyv ūs, daug b ėgioja, smarkiai sulies ėja. Stirnos embrionas vystosi su latentine stadija. Apvaisinta kiaušial ąst ė besidalydama per kelet ą dien ų nusileidžia į gimd ą. Čia ji ilgam laikui nustoja augti (iki gruodžio m ėnesio). Gruodžio pabaigoje – sausio viduryje stirnos embrionas jau įži ūrimas paprasta akimi. Kovo m ėnes į sveria iki 60 g, o balandžio m ėnes į – 130-200 g (Priedytis, Bambe 1983). Likusios bergždžios per ruj ą patel ės vasaros pabaigoje gali v ėl rujoti ir b ūti apvaisintos lapkri čio – gruodžio m ėnesiais, per vadinam ą antr ąją ruj ą. Šiuo atveju embrionas pradeda vystytis iš karto, be latentin ės stadijos, ir jaunikliai gimsta tuo pat laiku, kaip ir normaliai rujojusi ų pateli ų. Taigi stirnos n ėštumas trunka nuo 6 iki 10 mėnesi ų, bet dažniausiai truput į daugiau kaip 9 m ėnesius. Stirniukai gimsta geguž ės pabaigoje arba biržel į. Patel ė paprastai veda po 2, re čiau po 1 ir dar re čiau po 3 jauniklius. Stirnos yra vislios (Baleišis, 1987). Patin ų ir pateli ų skai čiaus santykis bei j ų pasiskirstymas pagal amži ų lemia stirn ų kaimen ės produktyvum ą bei gausumo dinamik ą. Abiej ų ly čių stirniuk ų gimsta maždaug po lygiai (Strandgaard, 1972). Ta čiau stirnin ų d ėl įvairi ų priežas čių ž ūva dažniau negu pateli ų, tod ėl su amžiumi pateli ų daug ėja. Stirnos gyvena nelabai ilgai, literat ūroje nurodoma (Raesfeld, 1965), kad stirna gyvena iki 17-20 met ų. Stirn ų kaimen ė pagal amži ų paprastai skirstoma į keturias grupes: ši ųmetukus (iki 1 met ų), jaunus (1-2 met ų), vidutinio amžiaus (3-5met ų) ir senus (6 ir daugiau met ų) žv ėris. Stirn ų pasiskirstymas kaimen ėje pagal amži ų n ėra pastovus.

17

Gamtoje stirnos ž ūva d ėl įvairi ų priežas čių. Dažniausiai nat ūralios priežastys – pl ėšr ūnai, ligos, parazitai. Dalis žv ėri ų ž ūva miške d ėl traum ų, pask ęsta vandens telkiniuose įlūžus ledui arba pavasar į per potvyn į. Sunkiomis žiemomis nuo bado, šal čio, išsekimo ž ūva iki tre čdalio stirn ų kaimen ės. Nemaža ir žmogaus kalt ė. Neskaitant sumedžiot ų žv ėri ų, tam tikra dalis stirn ų ž ūva vėliau, nuo žaizd ų. Kur yra svarbi ų keli ų, nemažai stirn ų papuola po automobili ų ratais. Vasara stirniukai ž ūva per šienapj ūtę ir derliaus nu ėmim ą laukuose nuo dirban čių žem ės ūkio mašin ų. Kai kuriose arealo vietose stirnai b ūdingos gan tolimos (iki 200-300 km) sezonin ės migracijos (Гептнер ir kt., 1961), ta čiau ši r ūšis yra s ėsli. Didel į stirnos prisirišim ą prie gyvenamosios vietos rodo žym ėtų žv ėri ų steb ėjimai. Daugiausia migruoja jauni patinai, neturintys individualios teritorijos. Genami senesni ų stirnin ų, jie ieško neužimt ų plot ų. Juo didesnis kaimen ės tankumas, tuo daugiau stirn ų priverstos palikti gimtas vietas (Strandgaard, 1972). Per metus stirn ų gyvenimo b ūdas smarkiai kinta. Vis ą vasar ą maždaug nuo geguž ės iki rugs ėjo, stirnos gyvena pavieniui ir nuolatin ėse vietose. Suaug ę patinai tuo laiku užima individuali ą teritorij ą, kurioje nuolatos gyvena ir saugo nuo kit ų patin ų. Teritorij ą rodo ir specialios žym ės, paliekamos ant medži ų ir kr ūmų visame teritorijos plote ir ypa č gausiai jos pakraš čiuose ir palei takus (Соколов ir kt. 1981). Stirninas savo teritorijoje paken čia tik pateles, jauniklius ir jaunus, 1-2 met ų amžiaus, patin ėlius. Suaug ę stirninai kasmet užima tas pa čias teritorijas, bet j ų ribos iš dalies gali keistis. Subrendusios patel ės vasar ą taip pat dažniausiai gyvena pavieniui, kartais su praeit ų met ų jaunikliais. Skirtingai nuo patin ų jos nežymi ir negina savo teritorijos. Ruden į stirnos palieka pam ėgtas vietas, pradeda klajoti, grupuotis. Grup ės pagrind ą sudaro patel ės su jaunikliais, prie kurios dažnai prisijungia pernykš čiai jaunikliai, bergždžios patel ės, o dar v ėliau – patinai. Vienoje grup ėje paprastai b ūna iki 5-7 stirn ų. Grup ės išsilaiko per vis ą žiem ą iki pavasario. Grupei b ūdinga tai, kad, ištikus pavojui, visi jos nariai seka paskui lyder į, kuriuo dažniausiai b ūna sena patel ė. Grup ės gali susijungti, sudaryti keliolikos ar net keliasdešimties stirn ų b ūrius. Tiek m ūsų respublikoje, tiek visame areale didžiausias stirnos priešas yra vilkas. Tose vietose, kur vilk ų daug, stirn ų kaimen ė visuomet išret ėjusi. Smarkiai padaug ėjus vilk ų kar ų ir suiru čių metais, stirn ų visada katastrofiškai sumaž ėdavo. Šiuo metu Lietuvoje vilk ų skai čius reguliuojamas ir n ėra didelis, tod ėl j ų daroma žala stirnoms nedidel ė. L ūšys žiem ą taip pat gali papjauti stirn ą, ta čiau l ūši ų yra dar mažiau negu vilk ų. Lap ė gali b ūti pavojinga tik žiem ą nusilpusioms ar nesveikoms stirnoms ir mažiems stirniukams. Yra žinoma, kad stirna patel ė sugeba apginti savo jauniklius nuo lap ės. Literat ūroje nurodoma (Гептнер ir kt., 1961), kad stirna gali sirgti pavojingomis žmogui ir naminiams gyvuliams ligomis: snukio ir nag ų liga, brucelioze, tuberkulioze, pasiutlige. Aptikta 27 stirnos helmint ų r ūšys: 2 trematod ų, 3 – cestod ų, 22 – nematod ų. Stirnos helmint ų faunai formuotis

18 turi įtakos žv ėri ų amžius, mitybos s ąlygos, helmint ų paplitimas tarp namini ų gyvuli ų ir stirn ų kaimen ės tankumas (Baleišis ir kt., 2003).

1.3. Iksodini ų erki ų (Ixodes ricinus) bendroji charakteristika Karalyst ė: Gyvūnai (Animalia); Tipas: Nariuotakojai (Arthropoda); Potipis: Cheliceriniai (Chelicerata); Klas ė: Voragyviai (Arachnida); Būrys: Erk ės (Acari); Šeima: Iksodin ės erk ės (Ixodidae); Gentis: Ixodes; Rūšis: I.ricinus. Ixodidae šeimos erk ės – krauju mintantys nariuotakojai, parazituojantys kiekvienoje stuburini ų klas ėje ir paplit ę beveik visuose pasaulio regionuose. J ų savyb ės (ilgas maitinimosi periodas, neskausmingas įsisiurbimas, nepastebimas šliaužiojimas po k ūną, kiekvienoje stadijoje maitinimasis tik vien ą kart ą, platus maitintoj ų ratas) padidina užkre čiam ųjų lig ų suk ėlėjų platinimo potencial ą. Nors erk ės buvo tiriamos ilg ą laik ą, ta čiau j ų sugeb ėjim ą perduoti ligos suk ėlėją įrod ė Smith ir Kilbourne tik 19 a. pabaigoje. 20 a. pradžioje erk ės įtrauktos į bakterini ų lig ų platintoj ų sąraš ą. Po II Pasaulinio karo buvo aprašyta daug virus ų, pirmuoni ų ir bakterij ų sukelian čių žmoni ų ir gyv ūnų ligas, kurias platina erk ės. 1980 m. nustatyta, kad Laimo lig ą sukelia Borrelia burgdorferi . Šiuo metu tai viena pla čiausiai paplitusi ų Europoje ir JAV transmisini ų lig ų. V ėliau suaktyv ėjus tyrimams visame pasaulyje aprašytos erki ų platinamos riketsiaz ės, erlichiaz ės. Šie nariuotakojai gali b ūti ne tik patogen ų platintojai, bet ir bakterij ų rezervuaru: d ėmėtosios karšin ės grup ės riketsij ų, gr įžtamosios karštin ės borelij ų, Francisella tularensis (Parola ir kt., 2001, Oehme ir kt. 2002). Iksodin ės erk ės – pagrindiniai žmoni ų užkre čiam ųjų lig ų platintojai. Europoje ir Lietuvoje labiausiai paplitusios Ixodes ricinus erk ės (10 pav.). Jos randamos v ėsiose, santykinai dr ėgnose, kr ūmokšniais apaugusiose vietov ėse, parkuose ar miškuose. Dr ėgm ė ir temperat ūra yra svarbiausi faktoriai, darantys įtak ą ši ų erki ų aktyvumui ir išgyvenimui. J ų egzistencijai b ūtina gausiai augalais apaugusi suirstan čios augmenijos danga, teritorija, kur dr ėgm ė sausiausiu sezono periodu siekia ne mažiau 80 proc. Esant sausrai ar šal čiui, erk ės pasitraukia po paklote tam, kad apsisaugot ų nuo išdži ūvimo ar sušalimo. Geografin į paplitim ą į šiaur ę apriboja žema temperat ūra, o į pietus – dr ėgm ės stoka. D ėl priklausomyb ės temperat ūrai ir dr ėgmei stebima aktyvumo sezono įvairov ė skirtingose teritorijose. Centrin ėje Europoje visoms šios r ūšies erki ų vystymosi stadijoms b ūdingi

19 du aktyvumo pikai: maksimumas – geguž ės ir birželio bei rugs ėjo ir spalio m ėnesiais. Šiaur ės Europoje šie pikai susilieja į vien ą ir stebimi vasar ą. Ta čiau erki ų aktyvumo modeliai gali kasmet skirtis netgi toje pa čioje teritorijoje. Erki ų k ūnas nugarin ėje dalyje padengtas sklerotizuotu skydeliu, daugelis r ūši ų neturi aki ų, aplinkoje orientuojasi daugybe išorini ų jautrumo organ ų pagalba (plaukeliai, receptoriai, burnos organai, Haller‘io organas, turintis uosl ės ir skonio receptorius). Jautros organai užtikrina erki ų galimyb ę surasti maitintoj ą ir ryš į su kitais genties atstovais (Parola ir kt., 2001).

10 pav. Ixodes ricinus erk ės patel ė (Schou) ir patinas (Doering).

Erk ėms b ūdingas 3-jų vystymosi stadij ų ciklas (11 pav.) (lerva, nimfa, suaug ėlis), kiekvienoje stadijoje būtinas vienkartinis maitinimasis (ieškomas šeimininkas, prisitvirtinama ir maitinamasi kelet ą dien ų). Prisisotin ęs parazitas palieka maitintoj ą, nukrenta ant dirvos paviršiaus ir tinkamoje vietoje virškina krauj ą bei neriasi į sekan čią vystymosi stadij ą arba įpuola į diapauz ę (sumaž ėja medžiag ų apykaita, sustoja vystymasis). Patinai maitinasi trumpai ir negausiai arba visai nesimaitina. Poravimasis paprastai vyksta ant maitintojo. Patel ė, suvirškinusi krauj ą, sudeda kiaušinius į palanki ą jiems aplink ą ir žūsta. Gyvenimo ciklas gali užtrukti 2-3 metus, bet gali trump ėti arba ilg ėti priklausomai nuo aplinkos s ąlyg ų, t. y. temperat ūros, santykin ės dr ėgm ės, fotoperiodo. Iksodin ės erk ės daugiau nei 90 proc. Savo gyvenimo praleidžia išorin ėje aplinkoje be maitintojo. Aktyvumui b ūdingas sezoniškumas maitintojo pradeda ieškoti, esant tinkamoms aplinkos s ąlygoms. Erk ės geb ėjimas jautriai reaguoti į fenol į, dr ėgm ę, aromatines chemines medžiagas, oro vibracij ą užtikrina šeimininko suradim ą. Priklauso tykojan čių grobio erki ų grupei, jos ropoja augalu ir laukia praeinan čio šiltakraujo gyv ūno. Prieš įsisiurbdama į šeimininko k ūną, erk ė gali ilgai klaidžioti ieškodama tinkamos vietos. Straubliukui besiskverbiant į od ą, iš seili ų liauk ų išskiria skys čio lašelius, turin čius įvairi ų medžiag ų (cement ą formuojan čios,

20 nuskausminan čios, kraujagysles ple čian čios, priešuždegimin ės, kraujo kreš ėjim ą mažinan čios, imunitet ą slopinan čios), užtikrinan čių kraujo siurbim ą. Per pirm ąsias 24-36 valandas yra pasisavinamas nedidelis kraujo kiekis, vyksta prisitvirtinimo į od ą procesas. Maitinimasis trunka 2- 15 dien ų priklausomai nuo erk ės vystymosi stadijos ir r ūšies, šeimininko tipo ir įsisiurbimo vietos. Po l ėto kraujo siurbimo pirmomis dienomis seka godus 1-3 dien ų maitinimosi periodas.

11 pav. Erk ės vystymosi ciklas [76]. Klimatas tiek tiesiogiai, tiek netiesiogiai turi įtakos erk ėms, j ų buvein ėms, gyv ūnams ir j ų šeimininkams – infekcij ų šaltiniams. Klimatas kei čiasi ir tik ėtina, kad šie poky čiai gali b ūti susij ę su žmoni ų užkre čiamomis, erki ų platinamomis ligomis. Lietuvoje, kaip ir visoje Europoje, stebimas bendras klimato savybi ų kontinentalumo maž ėjimas. Prognozuojama, kad iki XXI a. vidurio m ūsų šalyje klimatas tur ėtų atšilti 1,5-1,7°C (Bukantis, 2001). Klimatas netiesiogiai paveikia erkes bei daro įtak ą j ų maitintojams. Yra atlikta daug tyrim ų, įrodan čių, kad stirnos – vienas svarbiausi ų erki ų gausos faktori ų, nes yra pagrindinis maitintojas. Pastaraisiais dešimtme čiais stebimas ir miško žv ėri ų gausos padid ėjimas. Šveicarijoje 1960 m. registruota 95 000, o 2004 m. jau 130 000 danieli ų ir dvigubai padid ėjus į (25 000) per t ą pat į laikotarp į stirn ų skai čius (Huss). Aplinkos apsaugos ministerijos duomenimis Lietuvos miškuose 1960 m. buvo 140 danieli ų, 26540 stirn ų, 1100 briedži ų, o 2003 m. atitinkamai 351, 72945, 4092. Europoje labiausiai paplitusios erki ų platinamos transmisin ės ligos (PSO 2004). Be Laimo ligos, erkinio encefalito, erk ės platina ir daug kit ų lig ų suk ėlėjų. Daugelyje šali ų per pastar ąjį dešimtmet į stebimas ne tik erkinio encefalito sergamumo padidėjimas, bet ir nesuprantamas kit ų erki ų platinam ų lig ų pagaus ėjimas. Klimatas – vienas iš labiausiai lemian čių erki ų platinam ų lig ų

21 faktori ų. Klimato poky čiai, ypa č žemos temperat ūros sumaž ėjimas, susij ęs su platintoj ų išplitimu į Europos šiaur ę (Huss). Erki ų gausa Lietuvos stacionaruose stebima nuo 1986 m. Tyrim ų duomenimis nustatyta, kad per paskutin į dešimtmet į erki ų daug ėja. 2005 – 2007 m. vidutinis metinis rodiklis siek ė 20 – 25 erk ės 1 km maršruto , tik 2002 m. steb ėta išskirt inai maža erki ų gausa (11 erki ų/1 km.), kuri ą nul ėmė oro s ąlygos (ypatingai karšta ir sausa vasara). Ilg ėja ir erki ų aktyvumo trukm ė. 2006 m. Klaip ėdoje aktyvios erk ės gamtoje buvo steb ėtos nuo kovo iki gruodžio m ėnesio (Žygutien ė, 2008).

1.3.1. Erki ų plat inama Borrelia burgdorferi

Borrelia burgdorferi sensu lato bakterij ų komplekso spirochetos sukelia Laimo borelioz ę (Laimo lig ą) žmogui. Ixodes ricinus erk ės yra pagrindiniai vektoriai, galintys pernešti ši ą zoonoz ę. Borrelia mikr oparazitai pasižymi didele genetine įvairove. Vis ų Borrelia rūši ų genom ą sudaro linijin ė chromosoma, susidedanti iš ~9 -9,2 x 10 5 bp, kartu su žiedine ir linijine plazmid ėmis. Šiuo metu identifikuota dvylika r ūši ų arba genomini ų grupi ų – genotip ų, priklausan čių B.burgdorferi s.l. kom pleksui. Ta čiau tik trys r ūšys yra patogeniškos žmogui: B.burgdorferi s.s. (paplitusi Europoje ir vienintel ė Š.Amerikoje), B.afzelli ir B.garinii (paplitusi Vakar ų, Centrin ėjeEuropoje, Rusijoje, Šiaurin ėje Azijoje ir Japonijoje). (Ambrasien ė, 2008) Laimo l igos metu dažniausiai pažeidžiami s ąnariai, ta čiau pažeidžiama ir oda, centrin ė nerv ų sistema, širdis, akys ir kiti organai. Odoje atsiranda migru ojanti eritema, t.y. raudonas bėrimas erk ės įkandimo vietoje. Kartais negydomas Laimo artritas gali progresuoti ir pažeisti centrin ę nerv ų sistem ą. Erki ų platinama Laimo liga daugiausiai žmoni ų sirgo 2003 m., kai 100 000 gyvent oj ų registruota 106 Laimo ligos . 2007 m. šis rodiklis buvo 41. Sergamumo Laimo liga 2007 – 2009 m dinamika pateikta 12 pav.

Sergamumas Laimo liga Lietuvoje 2007 - 2009 m.

3600 4000 3000 1395 2000 1153 1000 0 2007 2008 2009

12 pav. Serg amumo Laimo liga 2007 – 2009 m. Lietuvoje dinamika (informacijos šaltinis – Užkre čiam ųjų lig ų profilaktikos ir kontrol ės centras ).

22

Dažniausiai erki ų pernešamomis ligomis Lietuvos gyventojai užsikre čia didži ųjų miest ų apskri čių miškuose. 2007 m. 257 sirgusieji Laimo liga nurod ė, kad erk ė įsisiurb ė Vilniaus, 217 – Kauno, 113 – Šiauli ų apskrities miškuose. 2007 m. daug užsikr ėtimo vietovi ų liko neišaiškint ų. Daugiausiai – 91 neišaiškintas Laimo ligos atvejis Vilniaus apskrityje. Laimo ligos epidemiologin ė situacija Lietuvoje panaši į bendr ą situacij ą Europoje. Ixodes ricinus erki ų populiacijos gaus ėjimas sietinas su erki ų platinam ų lig ų atvej ų padid ėjimu regione. Klimatin ės s ąlygos apsprendžia erki ų aktyvumo dinamik ą sezono metu ir j ų gaus ą. (Žygutien ė, 2008)

1.3.2. Erki ų platinama Anaplasma phagocytophilum

Anaplasma phagocytophilum – vidul ąstelin ės, gramneigiamos bakterijos, kurios sukelia žmogaus granuliocitin ę anaplazmoz ę (HGA). Anaplazmoz ės simptomai primena erkinio encefalito pradin ę stadij ą. Ligai b ūdinga karš čiavimas, galvos, nugaros, raumen ų skausmai, silpnumas. Daugeliu atvej ų ligos eiga švelni ar užsikr ėtimas praeina visai be simptom ų, pasveikstama savaime. Retais atvejais anaplazmoz ė gali pasireikšti sunkesniais simptomais. Liga diagnozuojama iš kraujo tyrim ų, gydoma antibiotikais, ta čiau negydoma gali komplikuotis – pakenkti vidaus organams. Manoma, kad Lietuvoje apie 10% erki ų nešioja šios ligos suk ėlėjus. Anaplasma phagocytophilum pavojinga ne tik žmogui, ta čiau infekuoja ir arklius, graužikus, paukš čius, šunis ir atrajotojus. Anaplazmoz ė – pasaulin ė infekcija paplitusi Šiaur ės Amerikoje, daugomoje Europos ir Ryt ų Azijos šali ų. Anaplazmoz ės perneš ėjas Europoje – Ixodes ricinus erk ės. (Šikutova ir kt. 2007) Susir ūpinimas d ėl lig ų suk ėlėjų pernešimo tarp laukini ų ir namini ų gyv ūnų did ėja, ypatingai tose vietose, kur laisvai besiganantys laukiniai gyv ūnai ir galvijai dalinasi ta pa čia teritorija (Chomel ir kt. 1994). Anaplazma infekcija buvo aiškiai apib ūdinta atlikus tyrimus su naminiais gyv ūnais ir erk ėmis Ispanijoje (Garcı´a Ferna´ndez, Huelli, 1984 ).

1.4. Elnini ų tyrimai

1.4.1 Elnini ų monitoringas Lietuvoje

Nuo 1999 met ų prad ėta vykdyti išpl ėstin ė elnini ų monitoringo programa, joje numat ė dalyvauti daugelio regionini ų bei nacionalini ų park ų specialistai, j ų parengimui 1998 met ų rugs ėjo mėnes į Birštone buvo surengtas seminaras, kurio metu monitoringo dalyviai išklaus ė atitinkamus pranešimus bei atliko praktinius užsi ėmimus.

23

Aplinkos apsaugos agent ūra kaip naujausius pateikia 2004 met ų duomenis, kuomet buvo ištirta 17 monitoringo stacionar ų, kuriuose apskaitos juostos bendras ilgis sudar ė 289 km. Elnini ų monitoringo lauko tyrimus vykd ė 16 VU Ekologijos instituto ir saugom ų teritorij ų darbuotoj ų. Elnini ų monitoringo lauko tyrimai buvo vykdomi pavasarį (balandžio m ėnes į) nutirpus miške sniegui iki žol ės suž ėlimo. Suprojektuotuose maršrutuose buvo registruojamos stirn ų, tauri ųjų elni ų ir briedži ų nevegetacinio periodo ekskrement ų kr ūvel ės 3 metr ų plo čio ir 100 metr ų ilgio apskaitos juostos atkarpose. Kiekvienoje atkarpoje be to buvo nustatytas joje vyraujantis biotopas, registruojant duomenis specialiuose pirmini ų duomen ų lapuose. Apjungus mažus fizinius-geografinius rajonus su stambesniais, buvo sudaryta 16 regionini ų vienet ų. Juose, atsižvelgiant į esam ą “miško kvadrat ų” skai čių ir naudojant atsitiktini ų skai čių lentel ę, buvo parinkta 40 monitoringo stacionar ų. Tais atvejais, kai parinktos vietos savo ekologin ėmis s ąlygomis buvo tapa čios su netoli esan čių regionini ų park ų miškais arba su iki šiol vykdyto elnini ų monitoringo miškais stacionarais, tyrimams parinkti pastarieji miškai. Tai palengvina monitoringo vykdym ą saugom ų teritorij ų darbuotojams, leidžia naujus duomenis palyginti su ankstesni ų tyrim ų rezultatais. Vidutinis stirn ų populiacijos tankis 2004 metais tirtuose stacionaruose buvo lygus 14,1 ± 0,5 ind./1000 ha miško. Didžiausias populiacijos tankis nustatytas Žemaitijos nacionaliniame parko, Kurtuv ėnų regioninio parko ir Višty čio regioninio parko miškuose, o mažiausias – Pagraman čio regioniniame parke. Ryšk ūs populiacijos tankio skirtumai nustatyti atskirose žem ėvaizdži ų grup ėse. Didžiausias stirn ų populiacijos tankis buvo kalvot ų morenini ų aukštum ų tirtuose miškuose, o mažiausias – sm ėlingose lygumose. Vidutinis tauri ųjų elni ų populiacijos tankis tirtuose stacionaruose buvo lygus 3,9 ± 0,2 ind./1000 ha miško. Didžiausias populiacijos tankis nustatytas Višty čio regioninio parko miškuose, o mažiausias – Var ėnos rajono Pir čiupi ų miškuose ir Taurijos ornitologiniame draustinyje. Vilniaus rajone Gegužin ės ir Var ėnos rajone Matuiz ų miškuose taurieji elniai 2004 metais neužregistruoti. Lyginant elnini ų žv ėri ų populiacij ų gausos kitim ą 1999 – 2004 metais tirtuose tuose pa čiuose monitoringo stacionaruose, nustatytas stirn ų populiacij ų tankio padid ėjimas 42,9%, o tauri ųjų elni ų populiacijos tankis sumaž ėjo 24,4 %. Stirn ų populiacijos tankis statistiškai patikimai padid ėjo molingose lygumose ir kalvotose morenin ėse aukštumose. Tauri ųjų elni ų populiacijos tankio pakitimai visuose žem ėvaizdžiuose statistiškai nepatikimi išskyrus statistiškai patikim ą tauri ųjų elni ų populiacijos tankio sumaž ėjim ą kalvotose morenin ėse aukštumose. Monitoringo rezultatai rodo, kad šiuo metu Lietuvoje stirn ų populiacijos b ūkl ė ger ėja (ryškus stirn ų populiacijos tankio did ėjimo trendas), o tauri ųjų elni ų populiacija išlieka depresijos būkl ėje (aišk ūs populiacijos tankio maž ėjimo trendai).

24

Siekiant pagausinti elnini ų žv ėri ų bandas iki optimalaus dydžio bei suformuoti perspektyvias ir geros kokyb ės ši ų žv ėri ų populiacijas, rekomenduotina limituoti ir kontroliuoti elnini ų žv ėri ų medžiokl ę, nemedžiojant stirn ų, kur j ų tankis mažesnis kaip 5 ind./1000 ha, tauri ųjų elni ų, kuri ų tankis mažesnis kaip 3 ind./1000 ha. Tikslinga medžioti laikantis selekcin ės medžiokl ės reikalavim ų, nepažeisti populiacijos ly čių santykio ir amžiaus strukt ūros, griežčiau kovoti su brakonieriavimu (Bal čiauskas, 2004).

1.4.2. Elnini ų genetiniai tyrimai

Molekulinis žymuo – specifin ė lengvai identifikuojama DNR nukleotid ų seka, susijusi su tam tikrus požymius s ąlygojan čiais genais. Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR, dauguma tradicini ų žymen ų sistem ų žymi nekoduojama sekas, kurios nepriklausomos nuo atrankos (žymenys neutral ūs atrankai). Žymen ų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo. Siekiant įvertinti genetin ę įvairov ę ar skirtumus, neutral ūs žymenys yra tinkamiausi. Vertinant populiacijos dyd į, mirtingum ą, veisim ąsi, ly čių santyk į, inbryding ą, migracij ą bei efektyv ų populiacijos dyd į – molekuliniai žymenys yra itin svarb ūs. (Wan ir kt., 2004) Populiacij ų genetiniai tyrimai per pastaruosius du dešimtme čius tapo produktyv ūs, kadangi buvo atrasta polimeraz ės grandinin ės reakcijos (PGR) technologija. Kuehn R. ir bendraautoriai (2002) tyr ė genetin į kintamum ą, gen ų sraut ą ir dreif ą Bavarijos elni ų populiacijoje. Buvo ištirti 395 taurieji elniai, skirtingo amžiaus ir ly čių. Bavarijos tauri ųjų elni ų populiacija 19 a. metu buvo kelis kartus sumaž ėjusi d ėl intensyvios medžiokl ės. R ūšis, steb ėtoje teritorijoje, atsistat ė. Tolimesn ė arealo fragmentacija pakeit ė Bavarijos elni ų populiacijos strukt ūrą. Nor ėdami įvertinti genetin į kintamum ą, tyr ėjai analizavo pavyzdžius paimtus iš 9 skirting ų Bavarijos ir 2 kaimynini ų (Toringijos ir Čekijos) tauri ųjų elni ų populiacij ų. Buvo genotipuojama 19 mikrosatelitų lokus ų. Analiz ė atskleid ė vidutinius ir žymius skirtumus elni ų genetiniame kintamume. Bavarijos tauri ųjų elni ų genetin ė diferenciacija buvo pakankama, kad b ūtų įmanoma priskirti atskir ą individ ą tam tikrai populiacijai (patikimumas – 91,6%). Koreliacija tarp genetin ės ir geografin ės distancij ų matricos parod ė, kad atstumas elni ų populiacijai n ėra izoliuojantis veiksnys. Tiktais 3 tirtos populiacijos parod ė mažesn ę nei 10% tikimyb ę, kad du genai

šiose populiacijose dalinasi bendru prot ėviu (F TS ). Dvi populiacijos tur ėjo aukšt ą F ST vert ę, parodan čią gen ų dreifo įtak ą. Vidupopuliacinis indeksas parod ė maž ą kintamum ą šiose populiacijose. Apskai čiuotas efektyvus populiacijos dydis (N e) buvo toje pat srityje kaip ir tikrasis populiacijos dydis. Inbrydingo dažnis, paremtas apskai čiuotu N e, ir inbrydingo koeficientas (prielaida) Bavarijos tauri ųjų elni ų populiacijoje yra stabilios b ūsenos. Vidupopuliaciniai indeksai pateikti 1 lentel ėje.

25

1 lentel ė. Vidupopuliaciniai indeksai. (Kuehn R. ir kt., 2003)

Populiacija N na ne He H0 NP Berchtesgaden 46 6.6 2.9 0.654 0.558 NP Bayerischer Wald 42 6.8 2.8 0.640 0.610 Isarau 34 4.3 2.1 0.527 0.497 Fichtelgebirge 75 6.2 2.7 0.636 0.599 Grafenwoehr 73 5.8 2.6 0.610 0.580 Ammergebirge 44 6.4 2.8 0.641 0.551 Spessart 16 5.2 2.8 0.648 0.502 Hassberge 12 4.2 2.4 0.581 0.503 Rhoen 10 4.2 2.8 0.645 0.574 Thueringer Wald 26 6.4 3.0 0.666 0.586 Boehmerwald 16 5.3 2.8 0.641 0.500

Hartl G.B. ir bendraautoriai (2005) tyrin ėjo Europos tauriojo elnio populiacijas remiantis alozim ų, mikrosatelit ų ir mtDNR sekomis. Kok į poveik į populiacijai daro antropogeniniai veiksniai: laikymas aptvaruose, rinktin ė medžiokl ė, elni ų perk ėlimas iš vienos vietos į kit ą. Aptvaruose auginami elni ų tyrimai atskleid ė žym ų aleli ų dažni ų nukrypim ą nuo kit ų elni ų, kurie gyveno toliau ir buvo izoliuoti, ta čiau neprarado genetin ės įvairov ės. Tam tikri alozim ų genotipai buvo susieti su rago morfologija, ir tyrimo metu nustatyta, kad selektyvi medžiokl ė pakeit ė alelini ų gen ų dažnius laukta linkme. Nat ūralios aplinkos fragmentacija yra įvairi ų genetini ų žymen ų r ūši ų atspindys, bet d ėl informacijos tr ūkumo apie elni ų populiacijos strukt ūrą, aiškus antropogenin ės veiklos įrodymas nebuvo gautas. Ludt C.J. su bendraautoriais (2003) atliko tauri ųjų elni ų mitochondrin ės DNR filogeografin ę analiz ę. Norint sužinoti elni ų kilm ę, filogenez ę ir filogeografij ą, buvo tiriami DNR sek ų variant ų mitochondrij ų citochromo b genai iš 51 populiacijos, visame papltimo areale Europoje ir Azijoje. Buvo taikomi keli metodai: maksimalus tik ėtinumas, NCA ( Nested clade analysis), kurie parod ė, kad taurieji elniai yra kil ę vietov ės tarp Kirgiztano ir Šiaur ės Indijos (13 pav.). Buvo aptiktos dvi skirtingos grup ės: vakarin ė grup ė, kuri ą sudar ė keturios subgrup ės, ir rytin ė grup ė, kuri ą sudar ė trys subgrup ės. Šio mtDNR tyrimo duomenys nepar ėmė tradicin ės elni ų klasifikacijos, kad tai yra tik viena r ūšis. Neatitikimai tarp geografinio modelio, paremto mtDNR citochromo b diferenciacija tyrimais ir egzistuojančių r ūši ų ir specifin ės taksonomijos paremtos pagal morfologija yra diskutuotini.

26

13 pav. Tauriojo elnio kolonizacijos kelias Europoje ir Azijoje remiantis citochromo b sekomis (Ludt ir kt., 2004). Geografiniai barjerai žymimi ryškiais br ūkšniais. Br ūkšnin ės rodykl ės rodo nustatytus kolonizacijos kelius, taškuotos – galimus kolonizacijos kelius.

Buvo tirti rag ų audini ų pavyzdžiai, surinkti iš 37 laukini ų populiacij ų. Papildomai buvo įtrauktos trys sekos iš NCBI nukelotid ų duomen ų baz ės, duomen ų palyginimui. Sek ų nukrypimai ir skirtumai mtDNR citochromo b sekose skirtingose grup ėse, yra informatyv ūs ir gali b ūti naudojami kaip žym ė apib ūdinant r ūšį, nustatant por ūšį, nustatant geografin ę kilm ę neidentifikuotiems pavyzdžiams. Šis tyrimas parod ė, kad yra didel ė tikimyb ė, jog egzistuoja dvi skirtingos tauri ųjų elni ų r ūšys ir 3 por ūšiai Azijoje ir Amerikoje, ir keturi por ūšiai Eurazijoje ir papildomai 1 ar 2 pirmykš čiai por ūšiai Centrin ėje Azijoje (Tarim grup ė). Nustatyta, kad elniai kil ę iš Centrin ės Azijos. Kuehn R. ir bendraautoriai (2004) tyr ė rytin ės Šveicarijos elni ų populiacij ą. 17 a. antrojoje pus ėje d ėl pernelyg intensyvios medžiokl ės elniai Šveicarijoje buvo išnaikinti. Nat ūrali elni ų rekolonizacija prasid ėjo gerokai v ėliau, pirmieji elniai buvo pasteb ėti 1870 metais. Pagal istorinius duomenis, trys skirtingos populiacijos buvo pagrindinis šaltinis formuojantis naujai elni ų populiacijai. Norint išsiaiškinti Švecarijos elni ų kilm ę, buvo atlikti tyrimai. Mokslininkai ištyr ė 207 tauri ųjų elni ų pavyzdžius iš 5 skirting ų subpopuliacij ų Grisone bei iš kaimynini ų populiacij ų Vokietijoje, Lichtenšteine, Austrijoje bei Italijoje. Tyrimams naudotas širdies audinys. Pavyzdžiai buvo analizuojami genotipuojant 18 mikrostaelit ų lokus ų. F ST vert ė (2 lentel ė), pasiskirstymo testo rezultatai, mokslinink ų bendravimo laiškais duomenys, grupavimo metodas parod ė, kad Lichtenšteino populiacija buvo šaltinis susiformuojant naujai Šveicarijos populiacijai. Taip pat šis tyrimas parod ė, kad tirtose elni ų populiacijoje yra aukštas gen ų kintamumas. Buvo tiriami skirting ų ly čių, amžiaus elniai, sumedžioti 1997-1998 metais.

27

2 lentel ė. FST vert ės ir geografinis atstumas kilometrais tarp populiacij ų.

AG FL ME MU OE PR PZ UE VI Ammergebirg 11 e (AG) 128 124 122 154 127 92 106 0 Fuerst. Liechtenstein 11 (FL) 0.0644*** 65 91 74 26 56 70 0 Mittelengadin (ME) 0.0605*** 0.0091** 27 30 40 35 19 51 Muestair 0.0140** (MU) 0.0896*** * 0.0097*** 46 66 47 24 27 Oberengadin 0.0197** 0.0305** (OE) 0.0361*** * 0.0035 * 49 63 49 73 Praettigau 0.0269** 0.0498** (PR) 0.0369*** * 0.0132*** * 0.0015** 41 48 88 0.0221** 0.0317** 0.0434** Paznaun (PZ) 0.0892*** * 0.0253*** * * 0.0647*** 23 58 Unterengadin 0.0127** 0.0299** 0.0240** (UE) 0.0822*** * 0.0058** 0.0014* * 0.0455*** * 40 Vinschgau 0.0416** 0.0194** 0.0458** 0.0439** 0.0361** (VI) 0.0999*** * 0.0280*** * * 0.0645*** * * P reikšm ė populiacij ų aleli ų diferenciacijai: * P < .05, ** P < .001, *** P < .0001.

Zachos F. su bendraautoriais (2009) ištyr ė 25 Mesolos tauriųjų elni ų pavyzdžius, kurie priklauso vienintelei gimtajai elni ų populiacijai. Tyrimams naudota 20 mikrosatelitinių pradmen ų. Taip pat buvo atlikta populiacijos gyvybingumo analiz ė (PVA), imituojant skirtingus valdymo scenarijus. Genetinis kintamumas lyginant su kitais Europos elniais buvo labai mažas (išmatuotas ir tik ėtinas heterozigotiškumas atitinkamai 0,50 ir 0,61). Perteklinis homozigot ų skai čius nurodo inbryding ą. Populiacijos gyvybingumo analiz ės duomenys parod ė, kad ši ų elni ų populiacijos perspektyvos itin prastos, ta čiau tuo pat metu PVA parod ė, kad valdymo priemones, kuri ų jau imtasi iš esm ės padidina tauri ųjų elni ų populiacijos gyvybingum ą. Nielsen E.K. ir bendraautoriai (2008) tyr ė Danijos tauri ųjų elni ų populiacijos genetin ę strukt ūrą. Senais laikais, d ėl neribojamos medžiokl ės Danijos taurieji elniai buvo beveik beišnykst ą. Ta čiau r ūšis atsistat ė, kai į Danij ą buvo įvežti individai iš kit ų šali ų ir paleisti skirtingose vietose. Buvo išanalizuoti 349 m ėginiai iš 11 geografiškai atskir ų sri čių ir 3 uždar ų teritorij ų. Tyrime

naudota 11 mikrosatelitini ų pradmen ų. Buvo nustatytas žymus tik ėtino heterozigotiškumo (H E) skirtumas tarp uždar ų teritorij ų ir atvir ų plot ų. Genetin ė diferenciacija tarp vis ų tirt ų viet ų buvo

reikšminga (F ST =0,09, P<0,01). Slate J. su bendraautoriais (1998) tikrino 174 galvij ų mikrosatelitinius pradmenis, naudodami juos avi ų ir dviej ų r ūši ų elniams tirti. 129 iš 174 žymen ų (74,1%) buvo tinkami tauriesiems elniams tirti, 72 žymenys (55,8%) buvo polimorfiški. Buvo ištirta, kad taurieji elniai turi didesn į skai čių aleli ų, nei avys ar dėmėtieji elniai. Galb ūt tam tur ėjo įtakos, kad buvo tiriamas didesnis skai čius tauri ųjų elni ų negu kit ų r ūši ų. Taip pat reikt ų pažym ėti, kad priešingai nei tauri ųjų elni ų, kit ų r ūši ų populiacijos susiformavo iš mažesnio skai čiaus individ ų.

28

Frantz A.C. ir bendraautoriai T. (2006) atliko tyrim ą, kurio metu buvo bandoma parodyti kaip nelegalus tauri ųjų elni ų perk ėlimas, tur ės įtakos tolimesn ėms populiacijoms. 412 tauri ųjų elni ų plauk ų pavyzdži ų, surinkt ų Belgijoje, Liuksemburge, Vokietijoje ir Pranc ūzijoje, buvo tiriami naudojant 13 mikrosatelitini ų pradmen ų. Naudodami dalin ę Mantel analiz ę, aptiko gen ų srauto barjerus (neskaitant atstumo): miest ų zonos, greitkeliai, upi ų sl ėniai naudojami vynuogininkystei. 4 gyv ūnai ženkliai išsiskyr ė iš laisvai gyvenan čių subpopuliacij ų, tod ėl tik ėtina, kad šie elniai buvo paleisti nelegaliai. Nustatyta, kad 98,8% tirt ų elni ų genotip ų atsiskyr ė teisingai, patvirtindami koherentiškum ą pagal BAPS klasterius. Pasak Haanes H. (2009), Norvegijos taurieji elniai genetiškai skiriasi nuo Europos tauri ųjų elni ų, d ėl jų istorinio išplitimo. Nors prieš 100 met ų į Norvegijos sal ą Otteroya iš Europos ir buvo įvežta tauri ųjų elni ų, ta čiau taip susidar ė hibridin ė Europos ir Norvegijos tauri ųjų elni ų populiacija gyvenanti šioje saloje. Goodman S.J. ir bendraautoriai (1999) publikavo straipsn į apie vietini ų tauri ųjų ir introdukuot ų d ėmėtųjų elni ų hibridus Argyll, Škotijoje. Buvo ištirti 246 individai. Genetin ė analiz ė atlikta naudojant 11 mikrosatelitini ų sek ų ir mitochondrin ę DNR. Skirtingai nuo ankstesni ų tyrim ų, daryt ų su ta pa pa čia populiacija, mokslininkai nustat ė, kad elnius pagal j ų fenotip ą galima suskirstyti panašius į d ėmėtuosius arba į tauriuosius elnius. Introgresija yra reta bet kuriame lokuse, ta čiau yra ir toki ų lokus ų, kur 40% takson ų gali persidengti. Nors dauguma tiriam ų hibrid ų yra heterozigotiški tik pagal vien ą lokus ą, yra ir kelios retos heterozigotin ės formos, kurios atspindi reikšming ą pusiausvyros nebuvim ą tarp d ėmėtųjų ir tauri ųjų elni ų populiacij ų. Apskai čiuotas gr įžtamasis kryžminimasis d ėmėtųjų elni ų populiacijoje – H = 0.002 per vien ą kart ą, tauri ųjų elni ų - H = 0.001. Tyrim ų duomenys pateikti 14 pav.

14 pav. Diagramos (a) tauri ųjų elni ų introgresija į d ėmėtųjų elni ų populiacij ą, (b) d ėmėtųjų elni ų introgresija į tauri ųjų elni ų populiacij ą (Goodman ir kt., 1999).

Barbosa M.A. ir Carranza J. (2010) publikavo straipsn į apie tauri ųjų elni ų Y-chromosmos intron ų geografines variacijas. Tyrimams naudoti tauri ųjų elni ų m ėginiai buvo surinkti iš

29

Norvegijos, Škotijos, Ispanijos, Irano ir Vengrijos. Rūšiai specifini ų Y-chromosom ų sek ų variacijos yra naudingos analizuojant patin ų įnaš ą į r ūšies genetin ę strukt ūrą. Tauri ųjų elni ų populiacijoje tai yra ypatingai svarbu, nes gen ų sklaid ą lemia daugiausiai patinai. Ta čiau Y-chromosom ų žymenys laukiniams organizmams yra reti ir dažnai ne polimorfiški r ūšiai. Buvo įvertintos dviej ų Y- chromosom ų intron ų variacijos: DBY (DDX3Y) genas ir UBE1Y genas. Nors tirt ų elni ų imties dydis buvo mažas, ta čiau kiekvienas individas buvo paimtas iš skirtingo por ūšio bei skirtingos valstyb ės. Buvo nustatyta, kad variacija tarp ši ų por ūši ų egzistuoja, ta čiau žymen ų reikšm ė filogeografiniams tauri ųjų elni ų populiacij ų tyrimams yra ribota. Irena Jakubanis (2008) mikrosatelitini ų DNR sek ų metodu ištyr ė 24 tauriuosius elnius iš 4 rajon ų, 8 skirting ų Lietuvos mišk ų. Pagrindinis tyrimo objektas buvo nustatyti tauri ųjų elni ų DNR mikrosatelit ų kintamum ą Lietuvoje. Elni ų audini ų bei kepen ų pavyzdžiai surinkti 2003 – 2005 met ų medžiokl ės sezonuose iš medžiotoj ų nušaut ų individ ų. Ištyrus 7 mikrosatelitinius lokusus (RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73, BM888) nustatyta, kad lokusai BM888, NVHRT48 bei NVHRT21 nepilnai tinka Lietuvos tauriųjų elni ų populiacinei analizei, kadangi po amplifikacijos ne pas visus tirtus individus buvo matoma pradmen ų amplifikacija. Panev ėžio rajone aptiktas vienas retas alelis (0,042 dažnumas) RT1 lokuso alelyje esan čiam 224 bp srityje. Pasteb ėta, kad Lietuvoje gyvenan čių tauri ųjų elni ų teorinis ir faktinis heterozigotiškumas artimas į kit ų šali ų tauriųjų elni ų populiacij ų heterozigotiškumus. Jurbarko rajono populiacija pasižymi didžiausiu faktiniu heterozigotiškumu, kuris siek ė 0,75. Didžiausias efektyvus aleli ų skai čius (N e=3,45) pasteb ėtas Panev ėžio rajono elni ų populiacijoje. Tiek pagal DNR, tiek pagal izofermentin ę analiz ę labiausia genetiškai artimos populiacijos yra Min čios ir Ažvin čių, labiausiai nutolusios paga tirtus polimorfinius lokusus yra Mantvili ų ir Sipailiški ų mišk ų tauri ųjų elni ų populiacijos. Lietuvos tauriųjų elni ų populiacija yra vienoje šakoje su Vengrijos bei Škotijos tauriųjų elni ų populiacijomis, ta čiau nutolusi nuo Švedijos tauriųjų elni ų populiacijos.

1.4.3. Elnini ų užsikr ėtimas Ixodes ricinus erk ėmis ir j ų pernešamais patogenais

Juricova Z. Su bendraautoriais (2000) tyr ė 673 gyv ūnų kraujo serumus d ėl Borrelia burgdorferi užkrato: 55 stirnas, 209 danielius, 55 tauriuosius elnius, 80 muflon ų, 150 šern ų ir 124 fazanus. Tyrimas buvo atliktas naudojant IHA (inhibition hemagglutination) ir IFA (indirect immunofluorescence) metodus. IHA metodu, B.burgdorferi antik ūnų (titrai nuo 1:80 iki 1:320) buvo rasta 30,9% stirn ų, 50,7% danieli ų ir 37,5% muflon ų kraujo m ėginių. IFA reakcijos rezultatai: antik ūnų rasta 25,3% šern ų ir 13,7% fazan ų kraujo m ėginiuose (titrai nuo 1:64 iki 1:256). Kraujo serumo pavyzdžiai buvo paimti iš 55 tauri ųjų elni ų 1993-1997 met ų laikotarpiu. Užsikr ėtimas nepriklauso nuo lyties, ta čiau priklausomas nuo gyv ūno amžiaus, daugumoje vyresni ų nei 2 met ų elni ų kraujyje rasta Borrelia burgdorferi s.l. antik ūnų.

30

Pichon B. ir bendraautoriai (1999) tyrin ėjo Rambouillet mišk ą Pranc ūzijoje, kuris yra Laimo ligos paplitimo vietoje netoli Paryžiaus. Tyrimo pradžia 1994 m. – rugs ėjį, pabaiga – 1995 spalio m ėnes į, norint nustayti kuris periodas žmon ėms pavojingiausias. Ixodes ricinus erki ų nimfos yra aktyviausios pavasar į. Buvo stebimos tos zonos, kuriose didelis elnini ų tankumas. Tyrimui naudota PCR reakcija, tirta 461 nimfa. 38 nimfos (8,2%) buvo užsikr ėtusios Borrelia burgdorferi sensu lato. 11,5% teigiam ų nimf ų tur ėjo dvigub ą infekcij ą. Laimo liga tiesiogiai susijusi su nimf ų aktyvumu ir ja susergama nuo pavasario iki rudens. Panašiu bakterij ų pernešimo dažniu pasižym ėjo ir erki ų nimfos iš gausiai elni ų apgyvendint ų teritorij ų bei iš teritorij ų, kuriose elni ų skai čius nesiek ė net 20 gyv ūnų 100 ha plote. Pasak ši ų autori ų, elnini ų gausumas įtakoja didesn ę erki ų populiacij ą, tod ėl vietov ės, kuriose yra gausu šių žv ėri ų, tur ėtų b ūti laikomos padidintos rizikos zonomis. Biadun W. su bendraautoriais (2007) ištyr ė 169 Ixodes Ricinus pateles: 28 iš j ų buvo rastos pas elnius, 141 erk ė surinkta nuo stirn ų. 11 Dermacentum reticulatus erki ų patelės rastos nušaut ų elni ų odoje. Viso užsikr ėtusi ų erki ų buvo 49 (29%). Užsikr ėtusios erk ės, kurios buvo surinktos nuo elni ų, sudar ė 32,1% tirt ų erki ų. Spirochet ų buvo rasta 31,3% erkių surinkt ų nuo stirnin ų ir 21,4% - nuo stirn ų. Borrelia burgdorferi buvo rasta 5 (45,4%) Dermacentor reticulatus erk ėse. Tai pirmas atvejis Lenkijoje, kai nustatoma, kad ši erki ų r ūšis gali platinti borelioz ę. Borrelia burgdorferi spirochetos erk ėse buvo aptinkamos naudojant PCR metod ą. Tyrimo duomenys pateikti 15 pav.

15 pav. Borrelia burgdorferi PGR amplifikacijos produktai agaroz ės gelyje. M – molekulinis žymuo; 3, 6, 7, 8, 10, 11 ir 18 šulin ėliai – teigiama reakcija, KP – teigiama kontrol ė (442 bp), KN – neigiama kontrol ė.

Robinson M.T. ir bendraautoriai (2009) publikavo straipsn į apie elnini ų užsikr ėtim ą Anaplasma phagocytophilum Anglijoje. Buvo tiriami 80 elnini ų kraujo pavyzdžiai. DNR amplifikacija buvo atliekama naudojant r ūšiai specifin ę realaus laiko PGR, adaptuot ą pagal

Courtney et al. (2004). M ėginiai buvo laikomi teigiamais, kai fluorescencija viršijo ribin ę vert ę (C t). 23 elnini ų kraujyje (29%) buvo rasta Anaplasma phagocytophilum infekcija. Ta čiau paplitimas

31 labai skyr ėsi tarp elnini ų r ūši ų. Šio tyrimo rezultatai parod ė, kad anaplazmoz ė yra nat ūraliai paplitusi visose tirtose laisvai gyvenan čiose elnini ų r ūšyse. Fuente J. su bendraautoriais (2008) tyr ė Anaplasma stirnose iš piet ų Ispanijos. Iš 17 tirt ų stirn ų, 14 (82%) ir 5 (29%) tur ėjo antik ūnų Anaplasma spp . Ir Anaplasma phagocytophilum . Tyrimai buvo atliekami naudojant ELISA ir netiesiogin į fluorescensin į antik ūnų testavimo metodus. Polimeraz ės grandinin ė reakcija ir sekos analiz ė Anaplasma didelio paviršiaus baltymo 4 (msp4) genui aptikti, buvo atlikti visiems stirn ų kraujo m ėginiams. 9 (53%) gyv ūnai buvo infekuoti A.ovis , o 3 (18%) stirnos – A.phagocytophilum . Šie rezultatai rodo, kad stirnos yra užsikr ėtusios A.ovis ir A.phagocytophilum . Stirn ų populiacija – nat ūralus bakterij ų rezervuaras, kuris platina šiuos suk ėlėjus naminiams ir laukiniams gyv ūnams. Rosef O. ir bendraautoriai (2009) tyr ė Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phagocytophilum paplitim ą Ixodes ricinus erk ėse priklausomai nuo elnini ų tankumo. Erki ų pavyzdžiai buvo surinkti vakarin ėje Norvegijos pakrant ėje, 2 salose: Hitra ir Fjelloyver. Abiej ų sal ų augmenija viržynai, maišyti su lapuo čių ir puš ų miškais. Šiose salose n ėra lapi ų, ta čiau j ūrų kirai ir pl ėšr ūs paukš čiai dažnai sutinkami, taip pat didelis tankumas stirn ų ir tauri ųjų elni ų. Kit ų erki ų pavyzdžiai buvo surinkti pietin ėje Norvegijos pakrant ėje: 1.Tjore (žemynin ė Norvegijos dalis, kurioje vystomas žem ės ūkis, yra tauri ųjų elni ų ferma), šios vietov ės augmenija mišr ūs lapuo čių miškai, pušynai ir eglynai. 2. Hinnebu, vietov ė nutolusi apie 30 km nuo pakrant ės, su mišriais miškais, ta čiau šioje vietoje nevystomas žem ės ūkis. 3. Jomfruland, vietov ė kurioje gausu migruojan čių paukš čių, ganomos avys ir galvijai, ta čiau n ėra laukini ų elnini ų. Erk ės buvo renkamos naudojant „v ėliavos“ metod ą. Atlikus PGR reakcijas ir elektroforez ę, gauti tokie rezultatai: vietov ėse, kuriose yra didelis elnini ų tankumas Borrelia burgdorferi s.l. paplitimas labai mažas. A.phagocytophilum paplitimas vietov ėse, kuriose didelis elnini ų tankumas, buvo ženkliai didesnis, palyginus su vietov ėmis, kuriose elnini ų tankumas mažesnis. Buvo padaryta išvada, kad didelis elnini ų tankumas įtakoja ir didel į erki ų tankum ą, ta čiau elnini ų kraujo serumas sumažina tikimyb ę, kad erk ė bus infekuota ir perneš Laimo lig ą. A.phagocytophilum , priešingai nei Borrelia burgdorferi s.l., elni ų kraujo serumas neveikia, tod ėl šie gyv ūnai yra svarbus Anaplasma phagocytophilum rezervuaras.

32

II. MEDŽIAGA IR METODIKA

2.1. Tyrimo medžiaga

Elnin ų genetinei įvairovei nustatyti buvo tiriami 27 tauri ųjų elni ų ir 36 stirn ų individai (3 lent). Tauri ųjų elni ų ir stirn ų pavyzdžiai surinkti 2006-2009 metais Lietuvoje (16 pav.) ir 2007 m. Norvegijoje. 3 lentel ė. Tirti taurieji elniai ir stirnos. Individo Individo Rūšis Lytis Amžius Sugavimo/radimo vieta Data Nr. kodas 1 Taurusis elnias EA2 - - Avižieniai, Ignalinos raj. 2007.12.20 2 Taurusis elnias EA3 - - Avižieniai, Ignalinos raj. 2007.12.20 3 Taurusis elnias EA4 - - Avižieniai, Ignalinos raj. 2007.12.20 4 Taurusis elnias EM1 - - Mol ėtai 2007.12.20 5 Taurusis elnias EM2 - - Mol ėtai 2007.12.20 6 Taurusis elnias EP1 - - Panev ėžys 2007.12.02 7 Taurusis elnias EP2 - - Panev ėžys 2007.12.02 8 Taurusis elnias EP3 - - Panev ėžys 2007.12.02 9 Taurusis elnias EP5 - - Panev ėžys 2007.12.02 10 Taurusis elnias EP7 - - Panev ėžys 2007.12.02 11 Taurusis elnias EP8 - - Panev ėžys 2007.12.02 12 Taurusis elnias EP9 - - Panev ėžys 2007.12.02 13 Taurusis elnias EP10 - - Panev ėžys 2007.12.02 14 Taurusis elnias EP11 - - Panev ėžys 2007.12.02 15 Taurusis elnias ET1 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2008.12.29 16 Taurusis elnias ET2 Patinas 1m Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2008.12.29 17 Taurusis elnias ED/P - - - - 18 Taurusis elnias EN1 - - Norvegija 2007.02.04 19 Taurusis elnias EN2 - - Norvegija 2007.02.04 20 Taurusis elnias EN3 - - Norvegija 2007.02.04 21 Taurusis elnias EN4 - - Norvegija 2007.02.04 22 Taurusis elnias EN5 - - Norvegija 2007.02.04 23 Taurusis elnias EN6 - - Norvegija 2007.02.04 24 Taurusis elnias EN7 - - Norvegija 2007.02.04 25 Taurusis elnias EN8 - - Norvegija 2007.02.04 26 Taurusis elnias EN9 - - Norvegija 2007.02.04 27 Taurusis elnias EN10 - - Norvegija 2007.02.04 28 Stirna SA1 Patinas - Kaunas-Alytus,20km 2008.02.20 29 Stirna SC1 Patinas - Cinkišk ės, 2008.04.23 Vilnius-Klaip ėda,128km 30 Stirna SJ1 Patinas - Jonavos raj. 2009.12.13 31 Stirna SJ2 Patel ė 2-3m Jonavos raj. 2009.11.15 32 Stirna SJ3 Patel ė 1m Jonavos raj. 2009.11.15 33 Stirna SJ4 Patel ė 1-2m Jonavos raj. 2009.12.06 34 Stirna SJ5 Patel ė 1m Jonavos raj. 2009.12.06 35 Stirna SJ6 Patel ė 0,5m Jonavos raj. 2009.12.06 36 Stirna SKe1 - - Kėdaini ų raj. 2008.11.29 37 Stirna SKu1 Patel ė - Kupiškio raj. 2007.11.17 38 Stirna SKu2 Patel ė - Kupiškio raj. 2007.11.17 39 Stirna SKr1 Patinas - Kryžkalnis 2008.05.09

33

3 lentel ės t ęsinys. Tirti taurieji elniai ir stirnos. Individo Individo Rūšis Lytis Amžius Sugavimo/radimo vieta Data Nr. kodas 40 Stirna SR1 Patel ė - Rumšišk ės, Vilnius-Kaunas,77km 2009.11.03 41 Stirna ST1 Patinas - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.11.07 42 Stirna ST2 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.11.07 43 Stirna ST3 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.11.07 44 Stirna ST4 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.11.07 45 Stirna ST5 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.11.07 46 Stirna ST6 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.12.19 47 Stirna ST7 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.12.19 48 Stirna ST8 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.10.24 49 Stirna ST9 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.10.24 50 Stirna ST10 Patinas - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.10.24 51 Stirna ST11 Patinas - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2009.10.24 52 Stirna ST12 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2007.11.11 53 Stirna ST13 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2007.11.11 54 Stirna ST14 Patinas - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2007.11.03 55 Stirna ST15 Patinas - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2007.11.03 56 Stirna ST16 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2006.12.30 57 Stirna ST17 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2007.11.03 58 Stirna ST18 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2006.12.30 59 Stirna ST19 Patel ė - Tauj ėnai, Ukmerg ės raj. 2006.12.30 60 Stirna SN1 Patel ė - Kaunas – Klaip ėda 122km, ties 2008.05.23 Nev ėžiu 61 Stirna SV1 Patel ė - Vilkaraistis 2009.12.27 62 Stirna SV2 Patinas - Vilkaraistis 2009.12.27 63 Stirna SZ1 Patinas - Vilnius – Kaunas 67km, 2007.06.07 ties Žiežmariais

Norvegijoje 2007-2008m. Nuo elni ų ir stirn ų buvo surinktos 75 Ixodes ricinus erk ės (priedas nr. 4, 4 lentel ė), kurios patikrintos d ėl užsikr ėtimo Borrelia burgdorferi s.l. ir Anaplasma phacytophilum .

16 pav. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų sugavimo/radimo vietos.

34

2.2. Elnini ų DNR išskyrimas, koncentracijos ir švarumo nustatymas

Tauriojo elnio ir stirnos tyrimams naudota iš raumens bei iš kepen ų audini ų išskirta genomin ė DNR. DNR išskyrimui naudotas „Genomin ės DNR išskyrimo rinkinys“ (MBI „Fermentas“, Lietuva). DNR koncentracija ir švarumas nustatyti spektrofotometriškai panaudojant „Eppendorf BioPhotometer“ prietais ą. DNR išskyrimo iš raumens ir kepen ų audini ų etapai: 1. Paimamas 10 mg audinio m ėginys, užpilama 200 µl TE homogenizacijos buferio ir audinys sutrinamas. 2. Gerai išmaišyt ą m ėgin į užpilti 400 µl liz ės buferio ir inkubuoti 65 ºC temperat ūroje 30 minu čių kas 2 min. Mėginius pavartant. 3. Mėgin į užpilti 600 µl chloroformo ir sumaišyti, kad gaut ųsi emulsija. M ėgin į centrifuguoti 2 min 10 000 aps/min grei čiu. 4. Centrifugat ą nusiurbti su pipete ir pernešti į kit ą m ėgintuv ėlį, jei nusiurbtas centrifugatas dar n ėra skaidrus, reikia pakartoti valym ą chloroformu. 5. Gaut ą DNR vandenin į tirpal ą užpilti tokiu pat t ūriu DNR išsodinimo tirpalo. Išsodinimo tirpalas paruošiamas 80 µl išsodinimo tirpalo sumaišant su 720 µl distiliuoto vandens. Tirpalas švelniai pavartomas 3-5 kartus. M ėginys centrifuguojamas 3 min 10 000 aps/min grei čiu. Gaut ą tirpal ą nupilti nuo nuos ėdų. Nuos ėdas užpilti 100 µl NaCl tirpalo ir visiškai jas ištirpinti. 6. Tirpal ą užpilti 300 µl 96% etanolio, švelniai pavartyti ir palikti -20 ºC 10 min. 7. Mėgin į centrifuguoti 5-6 min 10 000 aps/min grei čiu. Spirit ą nupilti nuo gaut ų DNR nuos ėdų ir visiškai nudžiovinti (palaikant termostate), tačiau negalima perdžiovinti. Mėginys užpilamas 100 µl distiliuoto vandens. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas: 1. Į eppendorf m ėgintuv ėlį įpilama 10 µl DNR tirpalo ir 90 µl distiliuoto vandens (skiedžiama 10 kart ų), gerai išmaišoma maišykle ir paliekama kambario temperat ūroje vienai valandai. 2. Mėginiai matuojami spektrofotometru, esant 260 nm bangos ilgiui. Kontrolei naudojamas distiliuotas vanduo. Matavimo duomenys pateikiami priede nr. 5, 5 lentel ėje.

35

2.3. Erki ų ir j ų endoparazit ų DNR išskyrimas

DNR išskyrimui iš erk ės buvo naudojamas 2,5% amoniako tirpalas. 2,5% amoniako tirpalo paruošimas. 100 ml 2,5% amoniako tirpalui paruošti reikia: 10ml

25% NH 4OH ir 90 ml dH 2O. Paruoštas tirpalas galioja m ėnes į, laikant kambario temperat ūroje. DNR skyrimo etapai: 1. Erk ės ištraukiamos iš etanolio, padedamos ant popieriaus lapo ir džiovinamos kambario temperat ūroje. 2. Po vien ą erk ę įdedama į 0,5 ml m ėgintuv ėlius. 3. Mikrodozatoriumi su vienkartiniu antgaliu įpilama po 100µl 2,5% amoniako tirpalo. Mėgintuv ėlis sandariai užkemšamas. 4. Mėgintuv ėliai patalpinami į termostat ą, kur inkubuojami +99°C temperat ūroje 25 minutes. 5. Mėgintuv ėliai centrifuguojami 1 min kambario temperat ūroje 13000 aps./min. grei čiu. 6. Mėgintuv ėliai atkemšami ir inkubuojami termostate 99°C temperat ūroje 15 min, kad išgaruot ų amoniakas. 7. Mėgintuv ėliai uždaromi ir iš karto dedami į ledo pad ėkl ą 2-3 min. Centrifuguojama 1 min kambario temperat ūroje 13000 aps./min. Grei čiu. 8. Paruoštas m ėginys laikomas šaldytuve +4°C temperat ūroje ne ilgiau kaip savait ę, ilgesniam laikui -20°C temperat ūroje. Gauta DNR yra paruošta gausinimui. (Ambrasienė, 2008) 2.4. Elnini ų AAPD – PGR eiga

PGR reakcija buvo atlikta naudojant „Mastercycler gradient“ amplifikatori ų (17 pav.), PGR reakcij ų mišinius „2X PCR Master Mix K0171“ (MBI „Fermentas“, Lietuva) ir „10X Taq buffer with KCl Set“ su įvairiais priedais bei su šiais prikibimo pradmenimis (4 lent.), kuri ų kiekvienam b ūdinga specifin ė prikibimo temperat ūra.

17 pav. Tyrimuose nauotas „Mastercycler gradient“ amplifikatorius

36

4 lentel ė. AAPD tyrimuose naudoti pradmenys.

Pradmuo Nukleotid ų seka Prikibimo temperat ūra ROTH-180-01 5‘-GCACCCGACG-3‘ 54,7 ºC ROTH-180-02 5‘-CGCCCAAGC-3‘ 50,5 ºC ROTH-180-03 5‘-CCATGGCGCC-3‘ 58,9 ºC ROTH-180-04 5‘-CGCCGATCC-3‘ 49,9 ºC ROTH-180-05 5‘-ACCCCAGCCG-3‘ 56,4 ºC ROTH-180-06 5‘-GCACGGAGGG-3‘ 53 ºC ROTH-180-07 5‘-GCACGCCGGA-3‘ 60,1 ºC ROTH-180-08 5‘-CGCCCTCAGC-3‘ 53,6 ºC ROTH-180-09 5‘-GCACGGTGGG-3‘ 54,4 ºC ROTH-180-10 5‘-CGCCCTGGTC-3‘ 53 ºC

Bendras PGR t ūris 25 µl = 21 µl Mix + 4 µl DNR. 21 µl reakcijos mišinio komponentai (5 lent. ir 6 lent.):

5 lentel ė. AAPD-PGR mišinio komponentai.

Reagentai 1 m ėginiui

10X Taq buferis + KCl + MgCl 2 2,5 µl dNTP 2,5 µl Taq DNR polimeraz ė 5u/µl 0,2 µl Pradmuo (10pmol) 2 µl

dH 2O 13,8 µl

6 lentel ė. AAPD-PGR mišinio komponentai:

Reagentai 1 m ėginiui 2X PCR buferis 12,5 µl Pradmuo (10pmol) 2 µl

dH 2O 6,5 µl

Tauri ųjų elni ų ir stirn ų genetin ės įvairov ės tyrimui buvo naudojamas 5 lentel ėje nurodytas AAPD-PGR mišinys. Naudojant 2X PCR bufer į (6 lent.), tirt ų individ ų DNR nesiamplifikavo.

37

Mėginiai amplifikuoti pagal 2 programas: Pirmoji programa: 1. 94 ºC – 4 min. 2. 94 ºC – 30 s. 3. Pradmens prikibimas – 1min. 4. 72 ºC – 2 min. 5. Cikl ų skai čius – 45 6. 72 ºC – 5 min. 7. Inkubacija – 4 ºC. Antroji programa: 1. 94 ºC – 3 min. 2. 94 ºC – 1 min. 3. Pradmens prikibimas – 1min. 4. 72 ºC – 1 min. 5. Cikl ų skai čius – 35 6. 72 ºC – 3 min. 7. Inkubacija – 4 ºC.

2.5. Borrelia burgdorferi s.l. PGR

Borrelia burgdorferi s.l. aptikimui gausinamas OspA geno 307 bp fragmentas, naudojant specifinius SL-F ir SL-R pradmenis (7 lent.). Naudojama teigiama ir neigiama kontrol ės.

7 lentel ė. Specifini ų pradmen ų SL-F ir SL-R sekos. Pradmuo Nukleotid ų seka

SL-F 5’AAT AGG TCT AAT AAT AGC CTT AAT AGC 3’ (21 → 47) SL-R 5’CTA GTG TTT TGC CAT CTT CTT TGA AAA 3’ (302 ← 328) Bendras PGR t ūris 25 l: 22,5 l mišinio + 2,5 l DNR. Reakcijos mišinio sud ėtis pateikta 8 lentel ėje: 8 lentel ė. Borrelia burgdorferi s.l. PGR mišinio sud ėtis. Reagentai 1 m ėginiui 2x PCR Mix 12,5 l SL-F (0,1 l/100pmol/ l) 2 l (10 pmol/ l) / 1 l (20 pmol/ l) SL-R (0,1 l/100pmol/ l) 2 l (10 pmol/ l) / 1 l (20 pmol/ l) ddH2O 6 l / 8 l

38

Mėgini ų amplifikacija buvo vykdyta pagal ši ą program ą: 1. 95°C – 5min. 2. 94°C – 20 s. 3. 61°C – 20 s. 4. 72°C – 30 s. 5. Cikl ų skai čius – 40 6. 72°C – 2min. 7. Inkubacija - +4°C.

2.5.1. Borrelia burgdorferi s.l. genotipavimas

Skirting ų Borrelia burgdorferi rūši ų nustatymui, naudojamos trys OspA geno sekos, kurios amplifikuojamos su šiais pradmenimis (9 lent.). 9 lentel ė. Pradmenys ir j ų sekos, naudojamos Borrelia burgdorferi s.l. genotipavimui B.burgdorferi r ūšis ir Pradmuo Nukleotid ų seka fragmento dydis GI-L 5’-AACAAAGACGGCAAGTACGATCTAATT-3’ B.burgdorferi sensu stricto 5-TTACAGTAATTGTTAAAGTTGAAGTGCC-3’ GI-R 544 bp GII-L 5’-TGATAAAAAC AACGGTTCTG GAAC-3’ B.garinii 5’-GTAACTTTCAATGTTGTTTTGCCG-3’ GII-R 345 bp B.afzelii GIII-L 5’-TAAAGACAAAACATCAACAGATGAAATG-3’ 5’-TTCCAATGTTACTTTATCATTAGCTACTT-3’ 189 bp GIII-R

Bendras PGR t ūris 30 l: 27 l mišinio + 3 l DNR. Reakcijos mišinio sud ėtis pateikta 10 lentel ėje.

10 lentel ė. B.burgdorferi s.l. genotipavimo mišinio sud ėtis. Reagentai 1 m ėginiui Multiplex Master Mix x 2 15 l (with HotStart Taq Polymerase) GI-L 2 l (10 pmol/ l) GI-R 2 l (10 pmol/ l) GII-L 2 l (10 pmol/ l) GII-R 2 l (10 pmol/ l) GIII-L 2 l (10 pmol/ l) GIII-R 2 l (10 pmol/ l)

39

Mėginiai amplifikuoti pagal ši ą program ą: 95 – 15 min. 95 – 30 s. 63 – 1 min 30 s. 72 – 1 min. Cikl ų skai čius – 40 72 – 2 min. Inkubacija - +4

2.6. Anaplasma phagocytophilum PGR

Anaplasma phagocytophilum aptikimui gausinamas 849 bp fragmentas, naudojant specifinius MAP4AP5 ir MSP4AP3 pradmenis (11 lent.). Naudojama teigiama ir neigiama kontrol ės.

11 lentel ė. Specifini ų MAP4AP5 ir MSP4AP3 pradmen ų sekos. Pradmuo Nukleotid ų seka (5’ – 3’) MAP4AP5 5’ ATGAATTA-CAGAGAATTGCTTGTAGG 3’ MSP4AP3 5’ TT-AATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTATG 3’

Bendras PGR t ūris 25 l: 22,5 l mišinio + 2,5 l DNR. Reakcijos mišinio sud ėtis pateikta 12 lentel ėje: 12 lentel ė. Anaplasma phagocytophilum PGR mišinio sud ėtis. Reagentai 1 m ėginiui 2X PCR Master Mix 12,5 l MAP4AP5 (10 pmol) 2 l MSP4AP3 (10 pmol) 2 l

dd H 2O 6 l

Mėginiai amplifikuoti pagal ši ą program ą: 1. 94°C – 5min. 2. 94°C – 20 s. 3. 58°C – 20 s. 4. 72°C – 50 s. 5. Cikl ų skai čius – 40 6. 72°C – 5min. 7. Inkubacija - +4°C.

40

2.7. Elektroforez ė agaroz ės gelyje. Fragment ų vizualizavimas.

1,7 % agaroz ės gelio ruošimas:

• Buferio paruošimas: 10 ml buferio (50XTAE buferis) + 990 ml distiliuoto vandens. • 1,7 g agaroz ės milteli ų „Top Vision LE GQ Agaroze R0491“ (MBI „Fermentas“, Lietuva) ištirpinti 100 ml buferio kaitinant mikrobang ų krosnel ėje kelis kartus po 1-2 min kol tirpalas pasidairo skaidrus ir vientisos konsistencijos. • Į atv ėsusi ą agaroz ę (~60 ºC) įlašinti 10 µl etidžio bromido. Gel į supilti į form ą ir įstatyti „šukutes“. Forma paliekama 30-40 min kambario temperat ūroje, kad gelis sustingt ų.

Elektroforez ė 1,7 % agaroz ės gelyje:

• Geliui sustingus, atsargiai ištraukiamos „šukut ės“. Gelis įstatomas į elektroforez ės vonel ę, užpildyt ą buferiu, kad gelis b ūtų apsemtas. DNR m ėginiai įvedami į susidariusius „šulin ėlius“. • Į kiekvien ą „šulin ėlį“ įvedama po PGR produkt ą (18 pav.) (DNR m ėgin į, sumaišyt ą su bromfenolio m ėlio dažais – 25 µl DNR m ėginio + 2,0 µl dažo). Pasiruošti molekulin ės mas ės žymekl į (19 pav.) „Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus SM0322“ (MBI „Fermentas“, Lietuva). • Elektroforez ė vykdoma leidžiant elektros srov ę per gel į 2 valandas, esant 100 V srov ės stipriui.

18 pav. PGR produkto įvedimas į „šulin ėlį“.

41

19 pav. Elnini ų genetin ės įvairov ės tyrimuose naudotas molekulin ės mas ės žymeklis „Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus“ • Rezultatai įvertinami UV šviesoje transiliuminatoriuje, kur specialios kompiuterin ės video dokumentavimo sistemos pagalba gelis yra fotografuojamas, o gautas vaizdas perkeliamas į kompiuter į, kur yra analizuojamas ir išsaugojamas duomen ų baz ėje.

2.8. Matematinis APPD rezultat ų įvertinimas

Nusta čius fragment ų dyd į bei skai čių gauti rezultatai buvo suvesti į „TREECON for Windows“ (Van de Peer ir kt., 1994) kompiuterin ę program ą. Pirmin ė duomen ų suvestis TREECON programoje pateikta 6 priede. Tam tikro fragmento buvimas žymimas – 1, o nebuvimas – 0. TREECON for Windows programa sudar ė dendrogramas tarp atskir ų individ ų pagal UPGMA klasterin ės analiz ės tip ą.

42

III. REZULTATAI IR J Ų APTARIMAS

3.1. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų genetin ė įvairov ė pagal AAPD analiz ę Amplifikuojant tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR su pradmenimis (ROTH-180-01, ROTH-180- 02, ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-06, ROTH-180-07, ROTH-180-08, ROTH-180-09, ROTH-180-10) gauti 79 fragmentai, kurių dydis svyruoja nuo 150 iki 3000 bazi ų por ų (13 lent.).

13 lentel ė. Fragment ų pasiskirstymas 1,7% agaroz ės gelyje.

Pradmuo Fragment ų skai čius Fragment ų dydis (bp)

T. elniai Stirnos T. elniai Stirnos ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-06, 0 0 - - ROTH-180-07 ROTH-180-04 11 14 350-1500 300-3000 ROTH-180-05 10 5 250-2000 500-2000 ROTH-180-08 10 15 200-1200 250-3000 ROTH-180-09 15 15 150-3000 150-3000 ROTH-180-10 17 8 250-2000 300-2000

Iš viso: 63 57 150-3000 150-3000

Atlikus tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR amplifikacij ą su ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-06, ROTH-180-07 (9 ir 10 priedai atitinkamai) pradmenimis fragment ų nesusidar ė. Galima daryti išvad ą, kad šie pradmenys netinkami tauri ųjų elni ų ir stirn ų genetin ės įvairov ės tyrimuose. Buvo ir toki ų individ ų (tiek stirn ų, tiek elni ų), kuri ų DNR nesiamplifikavo nei su vienu pradmeniu, net ir pakartojus DNR skyrim ą iš naujo. Buvo padaryta išvada, kad ši ų individ ų DNR degradavusi, d ėl netinkam ų medžiagos laikymo s ąlyg ų. DNR amplifikacija su ROTH-180-04 pradmeniu (20 pav.) pavyko, buvo gauta 11 tauri ųjų elni ų individ ų ir 14 stirn ų individ ų fragment ų, kuri ų dydis skirtingose r ūšyse atitinkamai buvo 350 – 1500 ir 300 – 3000. Naudojant „TREECON for Windows“ program ą, buvo sudarytos dendrogramos tarp atskir ų individ ų pagal UPGMA klasterin ės analiz ės tip ą.

43

A B 20 pav. ROTH-180-04 pradmens PGR amplifika cijos elektroforezinis spektras 1,7% agaroz ės gelyje. M – Gene Ruler 100bp DNA Lader Plus. A – tauri ųjų elni ų individai, B – stirnos (žr. Prieduose).

Remiantis tauri ųjų elni ų dendrograma pagal ROTH -180-04 pra dmen į (21 pav.), individai susigrupavo į 4 kl asterius. Susidar ė dvi grup ės identišk ų individ ų: 2 elniai iš Tauj ėnų (Ukmerg ės raj.) ir po 1 elni ą iš Ignalinos bei Panev ėžio rajon ų, bei antroji grup ė – du elniai iš Norvegijos. Elniai EN1 ir EN2 buvo labiausiai genetiškai nutol ę nuo kit ų individ ų. D kla steris skilo į dvi puses, kuriose atsiskyr ė lietuviški ir norvegiški elni ų individai.

D

C

B

A

21 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH -180-04 pradmen į.

Naudojant „ TREECON for Windows “ program ą, buvo nubraižy ta dendograma tarp stirn ų (22 pav.). Šioje dendrogramoje išsiskyr ė 4 stamb ūs klasteriai, kuriuos dar galima dalinti į smulkesnius. D klasteris a pjungia Jonavos, Raseini ų, Kauno rajonuose sugautos stirnas, ta čiau tarp jų yra ir kelios stirnos iš Tauj ėnų. A klasteryje atsiskiria labai panaši ų indivi dų grup ė, visos šios stirnos yra iš tos pa čios vietov ės – Tauj ėnų, Ukmerg ės raj. Pagal ROTH -180-04 pradmen į iš vis ų individ ų labiausiai išsiskiria SV2, kuris yra labiausiai nutol ęs nuo likusi ų individ ų. Pagal ši ą 44 dendrogram ą matome, kad genetinis atstumas tarp daugumos individ ų yra nedidelis, tod ėl galima daryti išvad ą apie ši ų stirn ų subpopuliacij ų panašumus.

D

C B

A

22 pav. Stirn ų dendrograma pagal ROTH-180-04 pradmen į.

Amplifikuojant tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR su ROTH-180-05 pradmeniu (23 pav.) susidar ė atitinkamai 10 ir 5 fragmentai, kuri ų dydis svyruoja nuo 250 iki 2000 ir nuo 500 iki 2000 bazi ų por ų.

A B 23 pav. ROTH-180-05 pradmens PGR amplifikacijos elektroforezinis spektras 1,7% agaroz ės gelyje. M – Gene Ruler 100bp DNA Lader Plus. A – tauri ųjų elni ų individai, B – stirnos (žr. Prieduose).

Naudojant „TREECON for Windows“ program ą buvo nubraižytos atskiros dendrogramos. Tauri ųjų elni ų dendrogramoje, pagal ROTH-180-05 pradmen į (24 pav.), individai buvo sugrupuoti į 3 klasterius. Tiek lietuviški, tiek norvegiški elniai išsibarst ė po klasterius ir buvo genetiškai panaš ūs. Vienintelis EP11 individas atsiskyr ė nuo vis ų kit ų, ir buvo genetiškai tolimiausias. C klasteris apjung ė 3 grupes genetiškai identišk ų individ ų. 45

C

B

A

24 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH-180-05 pradmen į.

Stirn ų dendrogramoje pagal ROTH-180-05 pradmen į (25 pav.), buvo nubraižyti 3 klasteriai. A klasteryje buvo tik vienas individas – SC1, kuris labiausiai nutol ęs nuo vis ų kit ų

C

B

A

25 pav. Stirnų dendrograma pagal ROTH-180-05 pradmen į. tirt ų individ ų. B klasteryje išsiskyr ė 2 individai: vienas iš Kauno, kitas iš Raseini ų raj. C klasteris buvo sudarytas iš dviej ų grupi ų identišk ų individ ų, bei vieno individo iš Alytaus, kuris nepateko nei į vien ą iš ši ų grupi ų, nors buvo ir labai genetiškai panašus.

46

26 pav. Pateiktas ROTH-180-08 pradmens PGR amplifikacijos elektroforezinis spektras. Amplifikuojant elni ų ir stirn ų DNR buvo gauta 10 ir 15 fragment ų atitinkamai, kuri ų dydis svyravo nuo 200 iki 1200 ir nuo 250 iki 3000.

A B 26 pav. ROTH-180-08 pradmens PGR amplifikacijos elektroforezinis spektras 1,7% agaroz ės gelyje. M – Gene Ruler 100bp DNA Lader Plus. A – tauri ųjų elni ų individai, B – stirnos (žr. Prieduose).

„TREECON for Windows“ programa pagal pateiktus duomenis nubraiž ė tauri ųjų elni ų dendrogram ą (27 pav.). Dendrogramoje aiškiai matosi trys klasteriai. A ir B klasteris turi tik po vien ą individ ą, kurie gerokai genetiškai nutol ę nuo likusi ų individ ų. C klasteris apima genetiškai artimus individus, tarp kuri ų genetin ė distancija neviršija 0,3, nors šiame klasteryje individai yra ir iš Lietuvos, ir iš Norvegijos.

C

B A

27 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH-180-08 pradmen į.

47

Stirn ų dendrogramoje pagal ROTH-180-08 pradmen į (28 pav.), „TREECON for Windows“ programa nubraižyti 4 klasteriai: A ir C klasteryje yra tik po vien ą individ ą. A klasteryje esantis individas, labiausiai genetiškai nutol ęs nuo likusi ų individ ų. B klasteris apima abu individus iš Kupiškio raj bei po stirn ą iš Žiežmari ų ir Jonavos raj. D klaster į daugiausiai sudaro individai iš Tauj ėnų, Ukmerg ės raj., kuri ų genetin ės distancijos labai mažos, o dauguma individ ų, remiantis ROTH-180-08 pradmeniu, netgi identiški.

D

C B

A

28 pav. Stirn ų dendrograma pagal ROTH-180-08 pradmen į.

Atlikus tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR amplifikacij ą su ROTH-180-09 pradmeniu (29 pav.), susidar ė po 15 fragment ų, kuri ų dydis nuo 150 iki 3000 bazi ų por ų. Naudojant „TREECON for Windows“ program ą, buvo nubraižytos 2 atskiros dendrogramos tarp tauri ųjų elni ų ir stirn ų. Tauri ųjų elni ų dendrogramoje pagal ROTH-180-09 (30 pav.) išsiskyrė 3 klasteriai. A klasteryje 2 individai: ED/P ir EP11, labiausiai nutol ę nuo kit ų individ ų. B klasteryje grupuojasi individai iš Mol ėtų, Panev ėžio ir Ignalinos raj. C klasteryje yra visi individai iš Norvegijos, ta čiau taip pat ir du individai iš Tauj ėnų, Ukmerg ės raj.: ET1 ir ET2. Pagal ši ą dendrogram ą matome, kad Lietuviška populiacijos dalis atsiskiria nuo Norvegiškos, ta čiau tuo pat metu yra ir genetiškai artimos.

48

A B 29 pav. ROTH-180-09 pradmens PGR amplifikacijos elektroforezinis spektras 1,7% agaroz ės gelyje. M – Gene Ruler 100bp DNA Lader Plus. A – tauri ųjų elni ų individai, B – stirnos (žr. Prieduose).

Panaudojus „ TREECON for Windows “ program ą, nubraižyta ir stirn ų dendrograma (31 pav.) , kurioje išsiskiria 5 klasteriai. A ir B klasteriai turi tik po vien ą individ ą – SKu1 ir SZ1 atitinkamai ir kurie yra labiausiai genetiškai nutol ę nuo kit ų individ ų. C klasteryje sugrupuoti individai iš Jonavos, K ėdaini ų ir Kauno raj. D klasteryje tik du individai: vienas iš Alytaus, ki tas iš Jonavos raj. E klasterio pagrind ą sudaro individai iš Tauj ėnų, kurie tarpusavyje yra itin genetiškai artimi.

C

B

A

30 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH -180-09 pradmen į.

49

E

D

C

B A

31 pav. Stirn ų dendrograma pagal ROTH-180-09 pradmen į.

Amplifikuojant tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR su ROTH-180-10 pradmeniu (32 pav.), buvo gauta 17 elni ų ir 8 stirn ų fragmentai, kuri ų dydis svyravo nuo 250 iki 3000 ir nuo 300 iki 3000 bp atitinkamai.

A B

32 pav. ROTH-180-10 pradmens PGR amplifikacijos elektroforezinis spektras 1,7% agaroz ės gelyje. M – Gene Ruler 100bp DNA Lader Plus. A – tauri ųjų elni ų individai, B – stirnos (žr. Prieduose).

Išanalizavus tauri ųjų elni ų dendrogram ą pagal ROTH-180-10 pradmen į (33 pav), gauti 3 klasteriai. Pirmajame klasteryje (A) yra tik vienas individas – EP1, kuris yra genetiškai nutol ęs nuo

50 kit ų individ ų. B ir C klasteriai apima individus ir iš Lietuvos, ir iš Norvegijos, ryški ų skirtum ų tarp ši ų dviej ų populiacij ų remiantis ROTH-180-10 pradmeniu n ėra. Genetin ė distancija tarp C klasteryje esan čių individ ų neviršija 0,4.

C

B

A

33 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH-180-10 pradmen į.

Stirn ų dendrogramoje pagal ROTH-180-10 pradmen į (34 pav.), naudojant „TREECON for Windows“ program ą, buvo nubraižyti 4 klasteriai. A ir B klasteryje atsiskyr ė po vien ą individ ą – SA1 ir ST15 atitinkamai. Šie du individai buvo labiausiai genetiškai nutol ę nuo kit ų tirt ų individ ų. C klasteryje individai buvo sugrupuoti į dvi grupes, kurios buvo identiškos: pirmoji grup ė – ST6, SKe1 ir SKu1 bei antroji grup ė – SJ1, SJ4 ir SC1. Pastarosios grup ės genetin į panašum ą galima paaiškinti tuom, kad individai buvo sugauti nedideliu atstumu vienas nuo kito. Didžioji dauguma individ ų, sugaut ų Tauj ėnuose, sudar ė D klaster į ir pagal ROTH-180-10 pradmen į buvo genetiškai identiški, išskyrus 2 individus, kuri ų genetin ė distancija neviršijo 0,15.

51

D

C

B A

34 pav. Stirn ų dendrograma pagal ROTH-180-10 pradmen į.

Susumavus vis ų informatyvi ų pradmen ų duomenis (ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-08, ROTH-180-09 ir ROTH-180-10) ir naudojant „TREECON for Windows“ program ą, buvo nubraižyta bendra tauri ųjų elni ų dendrograma (35 pav.). Šioje dendrogramoje išsiskyr ė 3 klasteriai. A klasteryje susigrupavo du individai iš Norvegijos EN2 ir EN9. Šie du individai buvo labiausiai genetiškai nutol ę nuo kit ų tirt ų tauri ųjų elni ų individ ų, kuri ų audini ų pavyzdžiai buvo surinkti tiek Norvegijoje, tiek ir Lietuvoje. B klasteris apima individus, kurie buvo sugauti Panev ėžio ir Ignalinos rajonuose. Kurioje vietoje sugautas individas ED/P duomen ų nebuvo, ta čiau pagal dendrogram ą galima daryti išvad ą, kad šis elnias gal ėjo priklausyti Panev ėžio arba Ignalinos rajonuose besiganan čių tauri ųjų elni ų b ūriams. C klasteryje susigrupavo daugiausiai individ ų, tarp kuri ų genetin ė distancija n ėra didel ė. Šį klaster į galima padalinti į dvi grupes: 1 – ąją sudaro elniai iš Norvegijos, ta čiau tarp j ų yra ir vienintelis elnias iš Ignalinos raj. 2 – oje grup ėje išsid ėst ė 6 elniai: genetiškai artimiausi ET1 ir ET2 individai iš Tauj ėnų, Ukmerg ės raj, 2 elniai iš Mol ėtų ir po vien ą iš Norvegijos ir Ignalinos raj. Remiantis šiuo pradmeniu, Norvegijos ir Lietuvos tauri ųjų elni ų populiacijos atsiskyr ė. Tauri ųjų elni ų genetini ų distancij ų lentel ė pateikta 4 priede.

52

- Norvegiška populiacija

- Lietuviška populiacija

C

B

A

35 pav. Elni ų dendrograma pagal ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-08, ROTH-180-09 ir ROTH-180-10 pradmenis.

Susumavus vis ų informatyvi ų pradmen ų duomenis (ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-08, ROTH-180-09 ir ROTH-180-10) ir naudojant „TREECON for Windows“ program ą buvo nubraižyta stirn ų dendrograma (36 pav.). Šioje dendrogramoje išsiskyr ė 5 klasteriai. A, B ir C klasteriuose atsiskyr ė po vien ą individ ą: atitinkamai – SA1, SJ3 ir ST15. Šie individai labiausiai genetiškai nutol ę, nuo likusi ų individ ų. D klasteryje atsiskyr ė stirnos iš Jonavos, K ėdaini ų, Ukmerg ės ir Kauno rajon ų. Šios vietov ės geografiškai arti viena kitos, tod ėl toks stirn ų genetinis panašumas gali b ūti įtakotas migracijos. E klaster į sudaro dvi grup ės individ ų: pirm ąją grup ę sudaro 12 individ ų iš Tauj ėnų (Ukmerg ės raj) bei du iš Vilkarais čio, ši ų individ ų genetin ės distancijos nesiekia 0,25, antr ąją – stirnos iš Jonavos, Raseini ų ir Ukmerg ės rajon ų. Šioje grup ėje yra ir du automobili ų užmušti gyv ūnai – SR1 ir SKr1, kuri ų ž ūties viet ą skyr ė ~30km. Dendrogramoje išsiskyr ė trys stirn ų subpopuliacijos, kuri ų maišym ąsi riboja antropogenin ės kilm ės barjerai (keliai, užtvarai). Tauj ėnų ir Vilkarais čio subpopuliacij ų individai atskirti nuo Jonavos, Kėdaini ų ir Kauno subpopuliacij ų magistraliniu keliu Vilnius – Panev ėžys. Didelis individ ų iš Taujėnų genetinis panašumas, gali b ūti paaiškintas tuom, jog stirnos buvo sumedžiotos tos pa čios medžiokl ės metu. Tik ėtina, kad labai artimi individai – patel ės ir j ų jaunikliai. K.P ėtelio iškelt ą hipotez ę, kad lauk ų stirnos pagal morfologij ą skiriasi nuo miško stirn ų, patvirtino ir magistrinio darbo metu atlikti genetiniai tyrimai.

53

- 2009.10.24 - 2009.11.07 - 2009.12.06 LAUK Ų STIRNOS

E

D MIŠK Ų STIRNOS

C B A

36 pav. Stirn ų dendrograma pagal ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH-180-08, ROTH-180-09 ir ROTH-180-10 pradmenis.

Suvedus bendrus tauri ųjų elni ų ir stirn ų duomenis, naudojant „TREECON for Windows“ program ą, buvo nubraižyta bendra dendrograma (37 pav.). Šioje dendrogramoje aiškiai atsiskiria tauri ųjų elni ų ir stirn ų populiacijos. Lyginant elektroforezi ų duomenis tarp atskir ų r ūši ų, buvo aptikti r ūšims specifiniai fragmentai, kuriuos galima naudoti kaip br ūkšninius kodus r ūšies identifikacijai.

54

STIRNOS

C

A

B

T.ELNIAI

37 pav. Bendra tauri ųjų elni ų ir stirn ų dendrograma.

3.2. Erki ų užsikr ėtimas Borrelia burgdorferi s.l.

Atlikus Borrelia burgdorferi s.l. OspA geno 307 bp fragmento gausinim ą, naudojant specifinius SL-F ir SL-R pradmenis ir elektroforez ę 2% agaroz ės gelyje (38 pav.), gauti erki ų, surinkt ų nuo elnini ų, užsikr ėtimo B.burgdorferi s.l . duomenys. Iš 75 tirt ų erki ų 2 (2,7%) erk ės (patel ės) buvo infekuotos Borelia burgdorferi s.l.

55

38 pav. Borrelia burgdorferi s.l. OspA geno 307 bp fragmento vizualizavimas . M – molekulin ės mas ės žymuo, 1 – K+, 2 – K-, 3 – Hin 2-7, 4 – K 4-3.

3.2.1. Borrelia burgdorfferi s.l. genotipavimas

2 Borrelia burgdorferi s.l. užsikr ėtusios erk ės, buvo genotipuotos (39 pav.). Pirmosios teigiamos erk ės B.burgdorferi s.l. r ūšies identifikuoti nepavyko. Antrosios teigiamos erk ės B.burgdorferi s.l. DNR amplifikavosi , kur susidar ė 189 bp fragme ntas, pagal kur į buvo nustatyta, kad tai B.afzelii .

39 pav. Erki ų užsikr ėtusi ų Borrelia burgdorfer i s.l. genotipavimas. M – molekulinis žymuo, 1 – Hin2-7, 2 – K4-3.

56

3.3. Erki ų užsikr ėtimas Anaplasma phagocytophilum

Anaplasma phagocytophilum aptikimui buvo gausinamas 849 bp fragmentas, naudojant specifinius MAP4AP5 ir MSP4AP3 pradmenis. Naudojama teigiama ir neigiama kontrol ės. Iš 75 tirt ų Ixodes ricinus erki ų - 1 (1,3%) buvo infekuota Anaplasma phagocytophilum (40 pav.).

40 pav. Erki ų užsikr ėtimas Anaplasma phagocytophilum. M – molekulinis žymuo, 1 eil ė: 14 – K3-1 (teigiama erk ė), 2 eil ė: 18 – K+.

57

IŠVADOS

1. Atlikus AAPD – PGR metodu paremtus tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR tyrimus, panaudojant ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-04, ROTH-180-05, ROTH- 180-06, ROTH-180-07, ROTH-180-08, ROTH-180-09, ROTH-180-10 pradmenis buvo nustatyti 79 skirtingi DNR fragmentai, kuri ų dydis svyravo nuo 150 iki 3000 bazi ų por ų. ROTH-180-01, ROTH-180-02, ROTH-180-03, ROTH-180-06 ir ROTH-180-07 pradmenys buvo neinformatyv ūs, tirt ų individ ų DNR nesiamplifikavo. Lyginant elektroforezi ų duomenis, buvo aptikti r ūšiai specifiniai fragmentai, kuriuos galima naudoti kaip br ūkšninius kodus r ūšies identifikacijai. 2. Tauri ųjų elni ų populiacijoje genetinis atstumas varijavo tarp 0,08 ir 0,80. Stirn ų genetinis panašumas tarp atskir ų individ ų skiriasi nuo 0,04 iki 0,76. Lauk ų ir mišk ų stirnos skiriasi ne tik morfologiškai, bet ir genetiškai. 3. Iš 75 tirt ų Ixodes ricinus erki ų, 2 erk ės (2,7%) buvo infekuotos Borrelia burgdorferi s.l. ir 1 erk ė (1,3%) – Anaplasma phagocytophilum . 4. Atlikus erki ų, užsikr ėtusi ų Borrelia burgdorferi s.l. genotipavim ą nustatyta, kad Ixodes ricinus erk ė buvo infekuota B.afzelii .

58

LITERAT ŪROS S ĄRAŠAS

1. Ambrasien ė D. „Molekulin ės biologijos praktikumas“. 2008, Kaunas.

2. Aperavi čius D. http://www.efoto.lt/node/258427 3. Bal čiauskas L., Elnini ų žv ėri ų populiacij ų b ūkl ės ir dinamikos monitoringas. Aplinkos apsaugos agent ūra, 2004.

4. Baleišis R., Pasaulio kanopiniai žv ėrys,Vilnius, 2006 5. Baleišis R., Bluzma P., Bal čiauskas L. Lietuvos kanopiniai žv ėrys (2-as papildytas leidimas). Vilnius, 1998, psl. 1-220 (lietuvi ų k.). 6. Baleišis R., Bluzma P., Bal čiauskas L. Lietuvos kanopiniai žv ėrys (3-as papildytas leidimas). Vilnius, 2003 m. 7. Barbosa M.A.,Carranza J., 2010. Lack of geographic variation in Y-chromosomal introns of red deer ( Cervus elaphus ). Ecology & Evolutionary Biology Vol. 7: 1–4 • Helsinki, 26 March 2010.

8. Belchev B. http://www.efoto.lt/node/343478 9. Biadun W., Rzymowska J., Rukasz H., Niemczyk M., Chybowski J. Occurrence of Borrelia Burgdorferi Sensu Lato in Ixodes Ricinus and Dermacentor Reticulatus Ticks collected from Roe Deer and Deer shot in the South-East Poland. Bull Vet Inst Pulawy 51, 213-217, 2007. 10. Bluzma P., Baleišis R., 1999. Kanopini ų žv ėri ų populiacij ų b ūkl ė ir dinamika Lietuvoje. VU, Ekologijos institutas. 11. Bukantis A. Climatic fluctations in Lithuania against a background of global warming. Acta zoologica Lithuanica. 2001; 11(2):113-119. 12. Courtney J.W., Kostelnik L.M., Zeidner N.S.,Massung R.F., (2004). Multiplex real- time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi . J Clin Microbiol 42:3164–3168 . 2004.

13. Doering B. http://home.arcor.de/bjoern.doering/makrofoto.htm 14. Feulner P., Bielfeldt W., Zachos F.E., Bradvarovic J., Eckert I. And Hartl G.B., 2004. Mitochondrial DNA and microsatellite analyses of the genetic status of the presumed subspecies Cervus elaphus montanus ( Carpathian red deer ). Heredity (2004) 93, 299– 306. 15. Frantz A.C., Pourtois J.T., Heuertz M., Schley L., Flamand C., Krier A., Bertouille S., Chaumont F., Burke T., 2006. Genetic structure and assignment tests demonstrate illegal translocation of red deer ( Cervus elaphus ) into a continous population. Molecular

59

Ecology (2006) 15, 3191-3203.

16. Fuente J., Ruiz-Fons F., Naranjo V., Torina A., Rodrı´guez O., Gorta´zar Ch., Evidence of Anaplasma infections in European roe deer (Capreolus capreolus ) from southern Spain. Veterinary Science 84 (2008) 382–386. 17. Garcı´a Ferna´ndez, P., Huelli, L.E., 1984. Garrapatas para´sitas del ganado bovino en el Sur de Espan˜ a. Identificacio´n, distribucio´n geogra´fica y estacional. Revista Ibe´rica de Parasitologı´a 44, 129–138. 18. Goodman S.J., Barton N.H., Swanson G., Abernethy K., Pemberton J.M., 1999. Introgression Through Rare Hybridization: A Genetic Study of a Hybrid Zone Between Red and Sika Deer (Genus Cervus ) in Argyll, Scotland. Genetics 152: 355–371 (May 1999).

19. Grzimek‘s Animal life Encyclopedia. New York, 1972, vol 13. 20. Haanes H., 2009. Genetic variation and structure in Norwegian red deer. Doctoral thesis, Norwegian School of Veterinary Science, 2009. 21. Haanes H., Røed K.H., Flagstad O., Rosef O., 2008. Genetic structure in an expanding cervid population after population reduction. Conserv Genet (2010) 11:11-20. 22. Haanes H., Rosef O., Veiberg V., Roed K.H., 2005. Microsatellites with variation and heredity applicable to genetic studies of Norwegian red deer ( Cervus elaphus atlanticus ). Animal Genetics, 36, 435-462. 23. Hajji G.M., Zachos F.E., Charfi-Cheikrouha F., Hartl G.B. 2006. Conservation genetics of the imperilled Barbary red deer in Tunisia. Animal Conservation 10 (2007) 229–235. 24. Hartl G., Zachos F., Nadlinger K., 2003. Genetic diversity in European red deer (Cervus elaphus L.): anthropogenic influences on natural populations. C. R. Biologies 326 (2003) S37-S42. 25. Hartl G. B., Zachos F.E., Nadlinger K., Ratkiewicz M., Klein F., Lang G., 2005. Allozyme and mitochondrial DNA analysis of French red deer ( Cervus elaphus ) populations: genetic structure and its implications for managment and conservation. Mamm.biol. 70 (2005) 1· 24-34. 26. Huss A., Braun-Fahrlander C. Tick-borne diseases in Switzerland and climate change. Institute of Social and Preventive Medicine, University of Basel, Switzerland. 27. Ivanauskas T., Linkevi čien ė N., Maldži ūnait ė S. Vadovas Lietuvos žinduoliams pažinti. 1964m.

28. Yalden D., Mammals of the British Isles: Handbook, 4th Edition (2008) and the

60

British Deer Society‘s 2007 survey maps. http://www.wildlifeonline.me.uk/red_deer.html#distribution 29. Jakubanis I., DNR mikrosatelitinio polimorfizmo panaudojimas Lietuvos tauri ųjų elni ų ( Cervus elaphus ) genetin ės įvairov ės tyrimuose, magistro darbas, 2008. 30. Juricova Z., Halouzka J., Hubalek Z. Prevalence of Antibodies to Borrelia Burgdorferi in Game Animals in South Moravia, Czech Republic. Vet.Med. – Czech, 45, 2000 (5): 145-148. 31. Kuehn R., Haller H., Schroeder W., Rottmann O., 2004. Genetic Roots of the Red Deer ( Cervus elaphus ) Population in Eastern Switzerland. Journal of Heredity 2004:95(2): 136-143. 32. Kuehn R., Schroeder W., Pirchner F., Rottmann O., 2002. Genetic diversity, gene flow and drift in Bavarian red deer populations ( Cervus elaphus ). Conservation Genetics 4: 157-166, 2003. 33. Lorenzini R., Fico R., Mattioli S., 2004. Mitochondrial DNA evidence for a genetic distinction of the native red deer of Mesola, northern Italy, from the Alpine populations and the Sardinian subspecies. Mamm. Biol. 70 (2005) 3 · 187–198. 34. Ludt Ch., Schroeder W., Rottmann O., Kuehn R., 2003. Mitochondrial DNA phylogeography of red deer ( Cervus elaphus ). Molecular Phylogenetics and Evolution 31 (2004) 1064-1083. 35. Mahmut H., 2001. Studies on Genetic and Morphological Characteristics and Conservation of Red Deer ( Cervus elaphus ) in Xinjiang, China. J. Vet. Res., 49:231-237 (2001), and Zool. Sci. 19:485-495. 36. Maudet F., Maillard J.C., Chardonnet P., Sauzier J., 1998. Study of genetic diversity in a Rusa deer ( Cervus timorensis russa ) population in Mauritius using derived bovine microsatellites. AMAS 1998. Food and Agricultural Research Council, Réduit, Mauritius. 37. McDevitta A.D., Edwards C.J., O’Tooled P., O’Sullivand P., O’Reillya C., Cardene R.F., 2009. Geneti structure of,and hybridisation between red (Cervus elaphus ) and sika (Cervus nippon ) deer in Ireland. Mamm. Biol. 74 (2009) 263–273. 38. Miceikien ė I, Paulauskas A. ir kt., „DNR polimorfizmo tyrimo metodai“, 2002, Kaunas 39. Nielsen E.K., Olesen C.R., Pertoldi C., Gravlund P., Barker J.S.F., Mucci N., Randi E., Loeschcke V., 2008. Genetic structure of Danish red deer ( Cervus elaphus ). Biological Journal of the Linnean Society, 2008, 95, 688-701.

61

40. Nussey D.H., Wilson A.J., Morris A., Pemberton J., Clutton-Brock T., Kruuk L., 2008. Testing for genetic trade-offs between early- and late-life reproduction in a wild red deer population. Proc. R. Soc. B 2008 275, 745-750. 41. Oehme R., Hartelt K., Backe H., Brockmann S., Kimming P. Foci of tick-borne diseases in southwest Germany. Int J Med Microbiol. 2002; 291 (33):22-29. 42. Parola P., Raolt D. Ticks and ticks borne diseases in humans: an emerging infectious threat. Clinical Infectious Diseases. 2001; 32:897-928. 43. Pichon B., Mousson L., Figureau C., Rodhain F., Perez-Eid C., 1999. Density of deer in relation to the prevalence of Borrelia burgdorferi s.l. in Ixodes ricinus nymphs in Rambouillet forest, France. Experimental & Applied Acarology, 23 (1999) 267–275. 44. Pitraa Ch., Fickela J., Meijaardb E., Groves P.C., 2004. Evolution and phylogeny of old world deer. Molecular Phylogenetics and Evolution 33 (2004) 880–895 45. Poetsch M., Seefeldt S., Maschke M., Lignitz E., 2001. Genetic variability and differentiation in Spanish roe deer ( Capreolus capreolus ): A phylogeographic reassessment within the European framework. Forensic Science International 116 (2001) 1-8. 46. Polziehn O.R., Strobeck C., 2002. A Phylogenetic Comparison of Red Deer and Wapiti Using Mitochondrial DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution (2002) Vol. 22, No. 3, March, pp. 342–356. 47. Polziehn R.O., Strobeck C., 1998. Phylogeny of Wapiti, Red Deer, Sika Deer, and Other North American Cervids as Determined from Mitochondrial DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution (1998) Vol. 10, No. 2, October, pp. 249–258.

48. Priedytis A., Bambe L. Stirn ų populiacijas stavoklis Latvijas PSR. Riga, 1983. 49. Raesfeld, Das Rehwild, Parey; ISBN 3-490-40612-5. Hamburg – Berlin, 1965. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6c/Areale_Capreolus_capreolus.jpg

50. Randolph V. http://urngarden.com/images/blog/albino-deer.jpg 51. Robinson M.T., Shaw S.E., Morgan E.R., 2009. Anaplasma phagocytophilum infection in a multi-species deer community in the New Forest, England. Eur J Wildl Res (2009) 55:439–442. 52. Røed K.H., 1998. Microsatellite variation in Scandinavian Cervidae using primers derived from Bovidae . Hereditas 129: 19-25 (1998). 53. Royo L.J., Pajares G., A´lvarez I., Ferna´ndez I., Goyache F., 2006. Genetic variability and differentiation in Spanish roe deer ( Capreolus capreolus ): A phylogeographic reassessment within the European framework, Molecular Phylogenetics

62 and Evolution 42 (2007) 47–61.

54. Rosef O., Paulauskas A., Radzijevskaja J., 2009. Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato and Anaplasma phagocytophilum in questing Ixodes ricinus ticks in relation to the density of wild cervids. Acta Veterinaria Scandinavica, (2009) 51:47.

55. Schou J.C. http://www.biopix.com/Temp/JCS%20Ixodes%20ricinus%2033242.jpg 56. Slate J., Coltman D.W., Goodman S.J., MacLean I., Pemberton J.M., Williams J.L., 1998. Bovine microsatellite loci are highly conserved in red deer ( Cervus elaphus ), sika deer ( Cervus nippon ) and Soay sheep ( Ovis aries ). Animal Genetics, 1998, 29, 307-315. 57. Strandgaard H. The Roe Deer (Capreolus capreolus) Population at Kal and the factors regulating its size. Dan. Rev. Game Biol., 1972, N7. 58. Stuen S., 2007. Anaplasma Phagocytophilum - the Most Widespread Tick-Borne Infection in Animals in Europe. Veterinary Research Communications, 31(Suppl. 1) (2007) 79–84. 59. Szabolcsi Z., Egyed B. , Zenke P., Borsy A., Pa´da´r Z. , Zolda´g L., Buza´s Z., Rasko I., Orosz L., 2007. Genetic identification of red deer using autosomal STR markers. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1 (2008) 623–624. 60. Šikutová S, Rudolf I., Golovchenko M., Rudenko N., Grubhoffer L., Hubálek Z., 2007. Detection of Anaplasma DNA in Ixodes ricinus ticks: pitfalls. FOLIA PARASITOLOGICA 54: 310–312, 2007. 61. Tamate H.B., Shibata K., Tsuchiya T., Ohtaishi N., 1995. Assessment of Genetic Variations within Populations of Sika Deer in Japan by Analysis of Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Molecular Ecology 8:12, 2105-2114. 62. Tsenka G., Chassovnikarova G., Markov G.G., Muller P., 2003. DNA fingerprinting analysis of red deer ( Cervus elaphus L., 1758) populations from Bulgaria. Mamm. Biol. 68 (2003) 394-399. 63. Van de Peer, Y., De Wachter, Y. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. 10, 569-70.

64. Virbila S. http://www.efoto.lt/node/396482 65. Zachos F.E., Althoff C., Steynitz Y., Eckert I., Hartl G.B., 2006. Genetic analysis of an isolated red deer ( Cervus elaphus ) population showing signs of inbreeding depression. Eur J Wildl Res (2007) 53:61–67. 66. Zachos F.E., Hajji G., Hmwe S.S., Hartl G.B., Lorenzini R., Mattioli S., 2009. Population viability analysis and genetic diversity of the endangered red deer population

63 from Mesola, Italy. Wildlife Biology 15(2):175-186. 2009.

67. Žygutien ė M. Ixodes ricinus erk ės ir j ų platinamos ligos. Užkre čiam ųjų lig ų profilaktikos ir kontrol ės centras. Informacinis biuletenis. Nr. 6, 2008 m. Kovas.

68. Wagenknecht E. Rotwild. Berlin, 1989. 69. Wan Q.H., Wu H., Fujihara T., Fang S.D. Which genetic marker for whitch conservation genetics issue? Electrophoresis 2004; 25:1-12. 70. Williams T. http://pbc.codehog.co.uk/bhs/pics/200505/roe_deer_female_29may05_800.jpg 71. Блузма П. П. Косуля в Литве ( эколого – морфологическая характеристика ): Автореф . дис . ... канд . биол . наук . – M., 1975. 72. Гептнер B. Г., Hac имович A. A., Бaнников A., Г. M лекопитающие Co ветского Co юза . – M. 1961, т. 1. 73. Паавер K. Л. Формирование териофауны и изменчивость млекопитающих Прибалтики в голоцене . Таллин , 1965.

74. Co кoлов B. E. Данилкин A. A. Сибирская косуля . – M., 1981. 75. Штуббе Г., Брухгольц З. O пыты по гибридизации европейской и сибирской косуль . Зoo л. журн ., 1979, т. 58, No 9.

76. http://www.erkes.lt/txt/text/2/erkes_vystymosi_ciklas ži ūrėta 2010.05.23.

64

PRIEDAI

Priedas Nr. 1 1 lentel ė. Tauri ųjų elni ų por ūšiai. Geografin ė Haplotipo Nr. Por ūšio pavadinimas Bendrinis pavadinimas kilm ė pavadinimas Šiaur ės Afrikos taurusis Cervus elaphus 1 Cervus elaphus barbarus elnias (angl. Barbary Red Tunisas barbarus Deer) Cervus elaphus Korsikos taurusis elnias Cervus elaphus 2 Sardinija corsicanus (angl. Sardinian Deer) barbarus Kaukazo taurusis 3 Cervus elaphus maral elnias/maralas (angl. Iranas Cervus elaphus maral Maral) (angl. Rocky Mountain Cervus elaphus 4 Cervus elaphus nelsoni Šiaur ės Amerika Wapiti) canadensis Cervus elaphus Amerikos vapitis (angl. Cervus elaphus 5 Šiaur ės Amerika canadensis American Wapiti) canadensis Vakar ų Europos taurusis 6 Cervus elaphus elaphus Švedija Cervus elaphus elaphus elnias (angl. Red Deer) Cervus elaphus Ispanijos taurusis elnias 7 Ispanija Cervus elaphus elaphus hispanicus (angl. Spanish Red Deer) Škotijos taurusis elnias 8 Cervus elaphus scoticus Škotija Cervus elaphus elaphus (angl. Scottish Red Deer) Sibirietiškas vapitis (angl. Cervus elaphus 9 Cervus elaphus sibericus Kinija, Mongolija Siberian Wapiti) sibericus Cervus elaphus Tian Šanio vapitis (angl. Cervus elaphus 10 Kinija, Tian Šanis songaricus Tein Shan Wapiti) sibericus Kašmyrinis elnias (angl. 11 Cervus elaphus hanglu Indija - Kashmir Red Deer) Cervus elaphus Kinija, Dong Da Cervus elaphus 12 (angl. Kansu Red Deer) kansuensis Shan kansuensis Cervus elaphus 13 Cervus elaphus macneili (angl. M‘Neill‘s Deer) Kinija, Qinghai kansuensis Cervus elaphus 14 Cervus elaphus wallichi (angl. Shou) Kinija, Tibetas kansuensis Cervus elaphus Baktrijaninis elnias (angl. 15 Tadžikistanas Cervus elaphus elaphus bachtrianus Bactrian Red Deer) Cervus elaphus 16 (angl. Yarkand Red Deer) Kinija Cervus elaphus elaphus yarkandensis Norvegijos taurusis elnias 17 Cervus elaphus atlanticus Norvegija Cervus elaphus elaphus (angl. Red Deer) 18 Cervus elaphus brauneri (angl. Krim Red Deer) Ukraina Cervus elaphus elaphus Vidurio Europos taurusis Cervus elaphus Cervus elaphus 19 elnias (angl. Middle- Bulgarija hippelaphus hippelaphus Europe Red Deer) Karpat ų taurusis elnias Cervus elaphus 20 Cervus elaphus montanus Rumunija (angl. Eastern Red Deer) hippelaphus Cervus elaphus Cervus elaphus 21 (angl. Alashan Red Deer) Kinija alashanicus xanthopygus Cervus elaphus Cervus elaphus 22 (angl. Isubra) Rusija xanthopygus xanthopygus

65

Priedas Nr. 2

1. lentel ė. Tauri ųjų elni ų, sumedžiot ų 2007- 2008m. medžiokl ės sezono metu, suvestin ė. (Žurnalas “Medžiotojas ir medžiokl ė”, 2008)

Alytaus RAAD Elnias Klaipėdos RAAD Elnias Alytaus 27 Klaipėdos 3 Druskininkų 2 Kretingos 2 Lazdijų 18 Neringos 0 Prienų 3 Skuodo 3 Varėnos 9 Šilalės 7 Iš viso RAAD 59 Šilutės 3 Kauno RAAD Elnias Pagėgių 4 Jurbarko 57 Tauragės 30 Jonavos 8 Iš viso RAAD 52 Kaišiadorių 31 Marijampolės RAAD Elniai Kauno 19 Kalvarijos 2 Kėdainių 77 Kazlų Rūdos 8 Raseinių 20 Marijampolės 4 Iš viso RAAD 212 Šakių 3 Šiaulių RAAD Elniai Vilkaviškio 6 Akmenės 16 Iš viso RAAD 23 Joniškio 59 Panevėžio RAAD Elniai Kelmės 24 Biržų 26 Mažeikių 6 Kupiškio 19 Pakruojo 28 Panevėžio 130 Plungės 17 Pasvalio 19 Radviliškio 43 Rokiškio 29 Šiaulių 87 Iš viso RAAD 223 Telšių 13 Vilniaus RAAD Elniai Iš viso RAAD 29 3 Elektrėnų 7 Utenos RAAD Elniai Šalčininkų 0 Anykščių 33 Širvintų 14 Ignalinos 7 Švenčionių 13 Molėtų 16 Trakų 4 Utenos 20 Ukmergės 23 Zarasų 12 Vilniaus 16 Iš viso RAAD 88 Iš viso RAAD 77 Iš viso Elnias Respublikoje 1027

66

Priedas Nr. 3

3 lentel ė. Stirn ų, sumedžiot ų 2007- 2008m. medžiokl ės sezono metu, suvestin ė. (Žurnalas “Medžiotojas ir medžiokl ė”, 2008)

Alytaus RAAD Stirna Klaipėdos RAAD Stirna Alytaus 285 Klaipėdos 351 Druskininkų 56 Kretingos 319 Lazdijų 273 Neringos 0 Prienų 28 8 Skuodo 193 Varėnos 378 Šilalės 301 Iš viso RAAD 1280 Šilutės 372 Kauno RAAD Stirna Pagėgių 125 Jurbarko 367 Tauragės 382 Jonavos 256 Iš viso RAAD 2043 Kaišiadorių 286 Marijampolės RAAD Stirnos Kauno 417 Kalvarijos 80 Kėdainių 805 Kazlų Rūdos 211 Raseinių 543 Marijampolės 162 Iš viso RAAD 2674 Šakių 459 Šiaulių RAAD Stirnos Vilkaviškio 241 Akmenės 139 Iš viso RAAD 1153 Joniškio 342 Panevėžio RAAD Stirnos Kelmės 563 Biržų 493 Mažeikių 243 Kupiškio 349 Pakruojo 323 Panevėžio 738 Plungės 455 Pasvalio 427 Radviliškio 446 Rokiškio 907 Šiaulių 577 Iš viso RAAD 2914 Telšių 350 Vilniaus RAAD Stirnos Iš viso RAAD 3438 Elektrėnų 90 Utenos RAAD Stirnos Šalčininkų 192 Anykščių 760 Širvintų 225 Ignalinos 290 Švenčionių 394 Molėtų 353 Trakų 349 Utenos 525 Ukmergės 375 Zarasų 442 Vilniaus 366 Iš viso RAAD 2370 Iš viso RAAD 1991 Iš viso Stirna Respublikoje 17863

67

Priedas Nr. 4

4 lentel ė. Erki ų surinkt ų nuo tauri ųjų elni ų ir stirn ų s ąrašas .

Nr. Vietov ė Elninis Erk ės Lytis Borellia Borrelia Anaplasma kodas sensu lato rūšis 1 Norvegija Stirna K1-1 Patel ė - - 2 Norvegija Stirna K1-2 Patel ė - - 3 Norvegija Stirna K1-3 Patel ė - - 4 Norvegija Stirna K2-1 Patel ė - - 5 Norvegija Stirna K2-2 Patel ė - - 6 Norvegija Stirna K2-3 Patel ė - - 7 Norvegija Stirna K2-4 Patel ė - - 8 Norvegija Stirna K2-5 Patel ė - - 9 Norvegija Stirna K2-6 Patinas - - 10 Norvegija Stirna K2-7 Patinas - - 11 Norvegija Stirna K2-8 Patinas - - 12 Norvegija Stirna K2-9 Patinas - - 13 Norvegija Stirna K2-10 Patinas - - 14 Norvegija Stirna K3-1 Patel ė - + 15 Norvegija Stirna K3-2 Patel ė - - 16 Norvegija Stirna K3-3 Patinas - - 17 Norvegija Stirna K4-1 Patel ė - - 18 Norvegija Stirna K4-2 Patel ė - - 19 Norvegija Stirna K4-3 Patel ė + B.afzelii - 20 Norvegija Stirna K4-4 Patel ė - - 21 Norvegija Stirna K4-5 Patel ė - - 22 Norvegija Stirna K4-6 Patinas - - 23 Norvegija Stirna K5-1 Patel ė - - 24 Norvegija Stirna K6-1 Patel ė - - 25 Norvegija Stirna K6-2 Patel ė - - 26 Norvegija Stirna K6-3 Patinas - - 27 Rosef, Norvegija Stirna RH1-1 Patel ė - - 28 Rosef, Norvegija Stirna RH1-2 Patel ė - - 29 Rosef, Norvegija Stirna RH1-3 Patel ė - - 30 Rosef, Norvegija Stirna RH1-4 Patinas - - 31 Rosef, Norvegija Stirna RH2-1 Patel ė - - 32 Rosef, Norvegija Stirna RH2-2 Patel ė - - 33 Rosef, Norvegija Stirna RH2-3 Patel ė - - 34 Rosef, Norvegija Stirna RH2-4 Patel ė - - 35 Rosef, Norvegija Stirna RH2-5 Patel ė - - 36 Rosef, Norvegija Stirna RH2-6 Patel ė - - 37 Rosef, Norvegija Stirna RH2-7 Patinas - - 38 Rosef, Norvegija Stirna RH2-8 Patinas - - 39 Rosef, Norvegija Stirna RH2-9 Patinas - - 40 Hinnebu, Norvegija T.elnias H1-1 Patel ė - - 41 Hinnebu, Norvegija T.elnias H1-2 Patel ė - - 42 Hinnebu, Norvegija T.elnias H1-3 Patel ė - - 43 Hinnebu, Norvegija T.elnias H1-4 Patel ė - - 44 Hinnebu, Norvegija T.elnias H1-5 Patinas - - 45 Hinnebu, Norvegija T.elnias H2-1 Patel ė - - 68

Priedo Nr. 4 t ęsinys 4 lentel ės t ęsinys. Erki ų surinkt ų nuo tauri ųjų elni ų ir stirn ų s ąrašas .

Nr. Vietov ė Elninis Erk ės Lytis Borellia Borrelia Anaplasma kodas sensu lato rūšis 46 Hinnebu, Norvegija T.elnias H2-2 Patel ė - - 47 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-1 Patel ė - - 48 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-2 Patel ė - - 49 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-3 Patel ė - - 50 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-4 Patel ė - - 51 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-5 Patel ė - - 52 Hinnebu, Norvegija T.elnias H3-6 Patinas - - 53 Hinnebu, Norvegija T.elnias H4-1 Patel ė - - 54 Hinnebu, Norvegija T.elnias H4-2 Patinas - - 55 Hinnebu, Norvegija T.elnias H4-3 Patinas - - 56 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-1 Patel ė - - 57 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-2 Patel ė - - 58 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-3 Patel ė - - 59 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-4 Patel ė - - 60 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-5 Patel ė - - 61 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin1-6 Patinas - - 62 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-1 Patel ė - - 63 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-2 Patel ė - - 64 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-3 Patel ė - - 65 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-4 Patel ė - - 66 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-5 Patel ė - - 67 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-6 Patel ė - - 68 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-7 Patel ė + ? - 69 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-8 Patel ė - - 70 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-9 Patinas - - 71 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-10 Patinas - - 72 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-11 Patinas - - 73 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-12 Patinas - - 74 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-13 Patinas - - 75 Hinnebu, Norvegija T.elnias Hin2-14 Patinas - -

69

Priedas Nr.5

5 lentel ė. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas.

Individo kodas DNR koncentracija 260/280 Baltymin ės priemaišos EA2 674,29 1,82 0,060 EA3 621,48 1,92 0,002 EA4 71,47 1,98 0,001 EM1 495,44 1,93 0,001 EM2 178,53 1,94 0,001 EP1 1271,80 1,81 0,018 EP2 555,52 1,93 0,004 EP3 797,70 1,77 0,108 EP5 610,26 1,87 0,018 EP7 562,05 1,92 0,004 EP8 826,60 1,75 0,096 EP9 1102,60 1,82 0,042 EP10 1460,30 1,68 0,038 EP11 513,66 1,89 0,013 ET1 149,67 1,91 0,000 ET2 183,92 1,93 0,001 ED/P 1469,10 1,65 0,043 EN1 114,41 1,90 0,001 EN2 76,45 1,90 0,002 EN3 62,90 1,96 0,001 EN4 29,21 1,99 0,000 EN5 50,29 1,93 0,000 EN6 117,13 1,88 0,000 EN7 150,01 1,91 0,000 EN8 208,00 1,92 0,000 EN9 68,14 1,83 0,000 EN10 48,17 1,83 0,000 SA1 639,58 1,91 0,000 SC1 613,53 1,91 0,000 SJ1 673,37 1,92 0,003 SJ2 655,17 1,93 0,004 SJ3 977,27 1,93 0,008 SJ4 340,84 1,91 0,000 SJ5 384,19 1,92 0,000 SJ6 428,03 1,88 0,000 SKe1 502,03 1,90 0,000 SKu1 860,69 1,84 0,017 SKu2 944,03 1,85 0,019 SKr1 247,52 1,87 0,004 SR1 467,69 1,94 0,007 ST1 407,22 1,86 0,009 ST2 129,80 1,89 0,005 ST3 119,36 1,81 0,001 ST4 232,37 1,88 0,001 ST5 243,91 1,85 0,004 ST6 534,23 1,92 0,005 70

Priedo Nr. 5 tęsinys 5 lentel ės t ęsinys. Tauri ųjų elni ų ir stirn ų DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas.

Individo kodas DNR koncentracija 260/280 Baltymin ės priemaišos ST7 400,67 1,87 0,005 ST8 232,37 1,94 0,001 ST9 320,55 1,92 0,008 ST10 451,61 1,92 0,006 ST11 135,04 1,94 0,001 ST12 316,47 1,94 0,002 ST13 1163,80 1,83 0,050 ST14 224,79 (10x Skiedimas) 1,82 0,001 ST15 401,53 1,77 0,012 ST16 277,81 1,86 0,005 ST17 371,84 1,91 0,011 ST18 453,37 1,88 0,016 ST19 325,58 1,91 0,003 SN1 1050,00 1,85 0,025 SV1 255,98 1,87 0,009 SV2 439,55 1,89 0,010 SZ1 395,23 1,88 0,011

71

Priedas Nr. 6

Pradin ė duomen ų suvestis į TREECON for Windows program ą.

79 EA2 0000010001100000011101011010110000000000000000000000000000000000000000010000000 EA3 0000010001100000001101011011110100000100010001011010000000100001000110010000000 EA4 1011111111101101101101011011110100011101010101011010000001101001000110110001100 EM1 0000010001100000001101011010110100000001010000001010000000100001000000000000000 EM2 0001010011100001101101011011111100010101010001011010000001101001000100010000000 EP1 0000010110100101001101011010110000000000000000000000000000000000000000000000000 EP2 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 EP3 1001010001100001101101011010101100000000000000000000000000000000000000010001000 EP5 0000010001100001101101011010111100000000000000000000000000000000000000010000000 EP7 0000000000000000000101000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 EP8 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 EP9 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 EP10 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 EP11 0000110001100000000001000010010000000000010000000000000000000001000000000000000 ET1 0000110001100000001110010010110100010101010101001010000001101001000000010000000 ET2 0000000001100000001110010010100000010101010101001010000001101001000000010000000 ED/P 0101110001100000110001001010110100100000000000000000000001111000100001010000000 EN1 1001001111111111101110000010110100000101010000001010000000101001000000000000000 EN2 0000000101100000001110000010110100000000000000000000000000101001000000000000000 EN3 1001110011100010101110000111111100011101010001001010001101101001000000110100100 EN4 1001110011100010101110000111110100011101010000001010001111111011000000110000000 EN5 1001110011100010101110010111110100011101010001001010001111111011000000110000100 EN6 0001110011100010101110000011110100000101010000000010000000101001001000111110100 EN7 0001110011100010001110000011110100010101010001001010000001101001000000010000100 EN8 0000010000100000001110000010110000000101010001001010000000100001000000000000000 EN9 0000000000000000001110000010110000000000000000000000000000000000000000000000000 EN10 0000001001100000001110000010110100000101010001001010000000100001001011111110100 SA1 0001000010010010011010110100111100000011001010100010000000001110001101010011011 SC1 0000010010000100000000100100010010000000100000000101100000000000101011010110010

72

Priedo Nr. 6 tęsinys

SJ1 0000010010000100000000100100010010000000100000000001100000000110000000010111010 SJ2 0000010010000100111010100100010110000000110000000001110000000110000000010111010 SJ3 0000010000000100101010100100010010000000010000000000100000000000000000000000000 SJ4 0000010010000100000010100100010010000000110000000101110000000110001010111111010 SJ5 0000010000010100100000100100010110000000110000000101110000000110001000110111011 SJ6 0000010000010100100010100100010111100000110000000101110000000110001000110110010 SKe1 0000010000000100000000100100100010000000110000000101100000000110011101100010010 SKu1 0000010000000100000001101000000010000000000000000000100000000000000000000000000 SKu2 0000000000000000000000000000000000000000010000000000100000000000000000000000000 SKr1 0000010000010100100010100100100111000000110001010101110000000110001000110101011 SR1 0000010000010100100010100100100111000000100001010101110000000100001000111111011 ST1 0000010000010100100010100100100111000000110001010101110000000110000000010110000 ST2 0100010000010100100010100100111111000000110001010101110001000110011010011011010 ST3 0100010000010100100010100100100111000000100001010101110001000110000110011011011 ST4 0000010000010100100000100100100111000000110001010101110000000110000000011111010 ST5 0000010000010100100010100100101111000000110001010101110001000110000000010111010 ST6 0000010000000100000010100100111111000000100000000001110000000110011100110010010 ST7 0000010000010100100010100100111111000000100001010101110000000110000000011110001 ST8 0000010000010100100010101100110111000000110001010101110001000110000000010110001 ST9 0000010000010100100010101100111111000000100001010101100000000110000000010100000 ST10 0000010000010100101010101100101111000000110001010101110000000110000000010100000 ST11 0000010000010100100010101100111111000000110001010101110001000110000000010011001 ST12 0000010000010100101010101100111111000000100001010101110000000110000000010100000 ST13 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ST14 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ST15 0000010000000000001010101100110010000000010001010101000000000000001000010110101 ST16 0000010000010100100010101100111101100000100001010101110000000110000000010100000 ST17 0000010000010100100010100100100101100000110000000101110000000110000000010100000 ST18 0000010000010100100010100100100101100000110000000001110000000110001000110110011 ST19 0000010000010100100010100100100100100000110001010101110000000110000000010100000

73

Priedo Nr. 6 tęsinys

SN1 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000010000000000000000 SV1 0000010000010100100010100100100101100000110001010101110000000110000000010011011 SV2 0000010000000100100010100100100101100000100001010101110000000110000000010000010 SZ1 0000000000000000000000100100000001000000010000000000100000000110000100000000000

74

Priedas Nr. 7

6 lentel ė. Tauri ųjų elni ų genetini ų distancij ų lentel ė.

Ind. EP1 EP1 EP3 EP5 ET1 ET1 ET2 EA2 EA2 EA3 EA4 EN1 EN2 EN3 EN4 EN5 EN6 EN7 EN8 EN9 EM1 EM1 EM2 ED/P ED/P EN10 EN10

EA2 0,00 0,35 0,58 0,29 0,47 0,26 0,29 0,17 0,47 0,53 0,43 0,66 0,46 0,64 0,63 0,62 0,58 0,56 0,52 0,47 0,60 EA3 0,35 0,00 0,29 0,19 0,18 0,47 0,43 0,35 0,27 0,33 0,52 0,46 0,46 0,41 0,43 0,40 0,41 0,31 0,30 0,67 0,33 EA4 0,58 0,29 0,00 0,42 0,18 0,52 0,45 0,50 0,30 0,38 0,52 0,31 0,58 0,26 0,30 0,25 0,35 0,28 0,50 0,80 0,41 EM1 0,29 0,19 0,42 0,00 0,28 0,38 0,39 0,29 0,26 0,33 0,50 0,39 0,35 0,45 0,44 0,44 0,42 0,35 0,24 0,58 0,38 EM2 0,47 0,18 0,18 0,28 0,00 0,48 0,36 0,33 0,23 0,28 0,44 0,33 0,51 0,25 0,29 0,27 0,32 0,20 0,38 0,74 0,42 EP1 0,26 0,47 0,52 0,38 0,48 0,00 0,38 0,27 0,59 0,66 0,61 0,52 0,48 0,69 0,68 0,66 0,64 0,62 0,53 0,50 0,71 EP3 0,29 0,43 0,45 0,39 0,36 0,38 0,00 0,12 0,53 0,59 0,45 0,52 0,55 0,53 0,56 0,54 0,54 0,57 0,65 0,67 0,64 EP5 0,17 0,35 0,50 0,29 0,33 0,27 0,12 0,00 0,46 0,57 0,42 0,55 0,45 0,55 0,58 0,56 0,52 0,55 0,56 0,55 0,58 ET1 0,47 0,27 0,30 0,26 0,23 0,59 0,53 0,46 0,00 0,09 0,49 0,36 0,37 0,26 0,28 0,25 0,31 0,13 0,22 0,61 0,31 ET2 0,53 0,33 0,38 0,33 0,28 0,66 0,59 0,57 0,09 0,00 0,63 0,39 0,41 0,34 0,37 0,33 0,41 0,22 0,24 0,63 0,33 ED/P 0,43 0,52 0,52 0,50 0,44 0,61 0,45 0,42 0,49 0,63 0,00 0,60 0,54 0,53 0,48 0,51 0,50 0,48 0,68 0,79 0,63 EN1 0,66 0,46 0,31 0,39 0,33 0,52 0,52 0,55 0,36 0,39 0,60 0,00 0,37 0,32 0,31 0,34 0,31 0,29 0,36 0,65 0,38 EN2 0,46 0,46 0,58 0,35 0,51 0,48 0,55 0,45 0,37 0,41 0,54 0,37 0,00 0,52 0,51 0,54 0,44 0,41 0,38 0,37 0,45 EN3 0,64 0,41 0,26 0,45 0,25 0,69 0,53 0,55 0,26 0,34 0,53 0,32 0,52 0,00 0,10 0,08 0,19 0,14 0,40 0,72 0,34 EN4 0,63 0,43 0,30 0,44 0,29 0,68 0,56 0,58 0,28 0,37 0,48 0,31 0,51 0,10 0,00 0,04 0,24 0,19 0,42 0,71 0,43 EN5 0,62 0,40 0,25 0,44 0,27 0,66 0,54 0,56 0,25 0,33 0,51 0,34 0,54 0,08 0,04 0,00 0,25 0,16 0,42 0,73 0,39 EN6 0,58 0,41 0,35 0,42 0,32 0,64 0,54 0,52 0,31 0,41 0,50 0,31 0,44 0,19 0,24 0,25 0,00 0,17 0,39 0,67 0,23 EN7 0,56 0,31 0,28 0,35 0,20 0,62 0,57 0,55 0,13 0,22 0,48 0,29 0,41 0,14 0,19 0,16 0,17 0,00 0,27 0,65 0,31 EN8 0,52 0,30 0,50 0,24 0,38 0,53 0,65 0,56 0,22 0,24 0,68 0,36 0,38 0,40 0,42 0,42 0,39 0,27 0,00 0,45 0,30 EN9 0,47 0,67 0,80 0,58 0,74 0,50 0,67 0,55 0,61 0,63 0,79 0,65 0,37 0,72 0,71 0,73 0,67 0,65 0,45 0,00 0,64 EN10 0,60 0,33 0,41 0,38 0,42 0,71 0,64 0,58 0,31 0,33 0,63 0,38 0,45 0,34 0,43 0,39 0,23 0,31 0,30 0,64 0,00

75

Priedas Nr. 8

7 lentel ė. Stirn ų genetini ų distancij ų lentel ė.

Ind. ST19 ST19 SV1 SV2 SA1 SA1 SC1 SJ1 SJ2 SJ3 SJ4 SJ5 SJ6 SKe1 SKr1 SR1 ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 ST6 ST7 ST8 ST9 ST10 ST11 ST12 ST15 ST16 ST17 ST18

SA1 0,00 0,64 0,58 0,49 0,76 0,57 0,54 0,58 0,61 0,56 0,56 0,64 0,53 0,54 0,61 0,56 0,49 0,55 0,59 0,60 0,61 0,53 0,58 0,61 0,61 0,65 0,54 0,66 0,54 0,65 SC1 0,64 0,00 0,22 0,35 0,53 0,23 0,32 0,33 0,33 0,45 0,40 0,44 0,42 0,47 0,42 0,45 0,40 0,43 0,45 0,44 0,51 0,50 0,47 0,44 0,50 0,50 0,45 0,51 0,51 0,50 SJ1 0,58 0,22 0,00 0,17 0,50 0,19 0,24 0,30 0,35 0,38 0,38 0,37 0,40 0,40 0,30 0,33 0,32 0,36 0,38 0,37 0,44 0,39 0,40 0,51 0,43 0,42 0,38 0,44 0,40 0,42 SJ2 0,49 0,35 0,17 0,00 0,37 0,18 0,18 0,20 0,41 0,27 0,31 0,25 0,30 0,33 0,24 0,23 0,29 0,29 0,27 0,33 0,28 0,28 0,28 0,45 0,35 0,29 0,27 0,30 0,28 0,33 SJ3 0,76 0,53 0,50 0,37 0,00 0,50 0,50 0,46 0,55 0,54 0,59 0,49 0,55 0,61 0,57 0,54 0,54 0,53 0,49 0,49 0,46 0,50 0,46 0,48 0,56 0,50 0,56 0,52 0,57 0,56 SJ4 0,57 0,23 0,19 0,18 0,50 0,00 0,16 0,18 0,29 0,25 0,25 0,31 0,24 0,31 0,25 0,28 0,27 0,31 0,32 0,39 0,37 0,33 0,37 0,42 0,40 0,35 0,28 0,36 0,33 0,39 SJ5 0,54 0,32 0,24 0,18 0,50 0,16 0,00 0,10 0,29 0,13 0,17 0,22 0,24 0,27 0,18 0,21 0,27 0,23 0,21 0,31 0,29 0,22 0,29 0,42 0,32 0,26 0,16 0,28 0,22 0,35 SJ6 0,58 0,33 0,30 0,20 0,46 0,18 0,10 0,00 0,30 0,15 0,19 0,16 0,22 0,29 0,19 0,19 0,20 0,21 0,19 0,24 0,23 0,24 0,23 0,43 0,22 0,15 0,10 0,21 0,19 0,23 SKe1 0,61 0,33 0,35 0,41 0,55 0,29 0,29 0,30 0,00 0,33 0,38 0,36 0,36 0,40 0,35 0,38 0,23 0,45 0,42 0,45 0,43 0,43 0,48 0,50 0,51 0,41 0,33 0,43 0,39 0,41 SKr1 0,56 0,45 0,38 0,27 0,54 0,25 0,13 0,15 0,33 0,00 0,07 0,12 0,18 0,17 0,11 0,11 0,27 0,16 0,14 0,19 0,15 0,16 0,19 0,38 0,21 0,18 0,13 0,16 0,11 0,18 SR1 0,56 0,40 0,38 0,31 0,59 0,25 0,17 0,19 0,38 0,07 0,00 0,15 0,18 0,14 0,11 0,14 0,27 0,13 0,18 0,23 0,22 0,19 0,22 0,38 0,25 0,27 0,17 0,24 0,15 0,22 ST1 0,64 0,44 0,37 0,25 0,49 0,31 0,22 0,16 0,36 0,12 0,15 0,00 0,19 0,19 0,08 0,08 0,29 0,10 0,08 0,13 0,08 0,13 0,12 0,36 0,14 0,11 0,18 0,09 0,12 0,16 ST2 0,53 0,42 0,40 0,30 0,55 0,24 0,24 0,22 0,36 0,18 0,18 0,19 0,00 0,11 0,15 0,11 0,23 0,17 0,18 0,23 0,22 0,13 0,22 0,43 0,24 0,30 0,28 0,27 0,19 0,26 ST3 0,54 0,47 0,40 0,33 0,61 0,31 0,27 0,29 0,40 0,17 0,14 0,19 0,11 0,00 0,14 0,14 0,30 0,16 0,17 0,26 0,25 0,15 0,25 0,48 0,27 0,29 0,27 0,27 0,14 0,22 ST4 0,61 0,42 0,30 0,24 0,57 0,25 0,18 0,19 0,35 0,11 0,11 0,08 0,15 0,14 0,00 0,07 0,32 0,13 0,15 0,20 0,15 0,16 0,19 0,43 0,22 0,19 0,22 0,17 0,12 0,19 ST5 0,56 0,45 0,33 0,23 0,54 0,28 0,21 0,19 0,38 0,11 0,14 0,08 0,11 0,14 0,07 0,00 0,27 0,13 0,11 0,15 0,11 0,09 0,15 0,42 0,17 0,18 0,21 0,16 0,11 0,18 ST6 0,49 0,40 0,32 0,29 0,54 0,27 0,27 0,20 0,23 0,27 0,27 0,29 0,23 0,30 0,32 0,27 0,00 0,25 0,31 0,29 0,32 0,28 0,28 0,50 0,31 0,33 0,22 0,39 0,32 0,29 ST7 0,55 0,43 0,36 0,29 0,53 0,31 0,23 0,21 0,45 0,16 0,13 0,10 0,17 0,16 0,13 0,13 0,25 0,00 0,09 0,10 0,13 0,11 0,09 0,36 0,12 0,21 0,23 0,18 0,17 0,21 ST8 0,59 0,45 0,38 0,27 0,49 0,32 0,21 0,19 0,42 0,14 0,18 0,08 0,18 0,17 0,15 0,11 0,31 0,09 0,00 0,12 0,11 0,05 0,11 0,29 0,13 0,18 0,21 0,16 0,15 0,22 ST9 0,60 0,44 0,37 0,33 0,49 0,39 0,31 0,24 0,45 0,19 0,23 0,13 0,23 0,26 0,20 0,15 0,29 0,10 0,12 0,00 0,08 0,13 0,04 0,36 0,06 0,20 0,31 0,17 0,24 0,20 ST10 0,61 0,51 0,44 0,28 0,46 0,37 0,29 0,23 0,43 0,15 0,22 0,08 0,22 0,25 0,15 0,11 0,32 0,13 0,11 0,08 0,00 0,13 0,04 0,35 0,10 0,15 0,25 0,13 0,19 0,19 ST11 0,53 0,50 0,39 0,28 0,50 0,33 0,22 0,24 0,43 0,16 0,19 0,13 0,13 0,15 0,16 0,09 0,28 0,11 0,05 0,13 0,13 0,00 0,13 0,35 0,15 0,24 0,26 0,22 0,13 0,24 ST12 0,58 0,47 0,40 0,28 0,46 0,37 0,29 0,23 0,48 0,19 0,22 0,12 0,22 0,25 0,19 0,15 0,28 0,09 0,11 0,04 0,04 0,13 0,00 0,35 0,06 0,19 0,29 0,17 0,23 0,19 ST15 0,61 0,44 0,51 0,45 0,48 0,42 0,42 0,43 0,50 0,38 0,38 0,36 0,43 0,48 0,43 0,42 0,50 0,36 0,29 0,36 0,35 0,35 0,35 0,00 0,42 0,51 0,47 0,43 0,43 0,51 ST16 0,61 0,50 0,43 0,35 0,56 0,40 0,32 0,22 0,51 0,21 0,25 0,14 0,24 0,27 0,22 0,17 0,31 0,12 0,13 0,06 0,10 0,15 0,06 0,42 0,00 0,13 0,24 0,11 0,18 0,13 ST17 0,65 0,50 0,42 0,29 0,50 0,35 0,26 0,15 0,41 0,18 0,27 0,11 0,30 0,29 0,19 0,18 0,33 0,21 0,18 0,20 0,15 0,24 0,19 0,51 0,13 0,00 0,13 0,07 0,15 0,14 ST18 0,54 0,45 0,38 0,27 0,56 0,28 0,16 0,10 0,33 0,13 0,17 0,18 0,28 0,27 0,22 0,21 0,22 0,23 0,21 0,31 0,25 0,26 0,29 0,47 0,24 0,13 0,00 0,19 0,14 0,22 ST19 0,66 0,51 0,44 0,30 0,52 0,36 0,28 0,21 0,43 0,16 0,24 0,09 0,27 0,27 0,17 0,16 0,39 0,18 0,16 0,17 0,13 0,22 0,17 0,43 0,11 0,07 0,19 0,00 0,13 0,12 SV1 0,54 0,51 0,40 0,28 0,57 0,33 0,22 0,19 0,39 0,11 0,15 0,12 0,19 0,14 0,12 0,11 0,32 0,17 0,15 0,24 0,19 0,13 0,23 0,43 0,18 0,15 0,14 0,13 0,00 0,11 SV2 0,65 0,50 0,42 0,33 0,56 0,39 0,35 0,23 0,41 0,18 0,22 0,16 0,26 0,22 0,19 0,18 0,29 0,21 0,22 0,20 0,19 0,24 0,19 0,51 0,13 0,14 0,22 0,12 0,11 0,00 76

Priedas Nr. 9

A B

C D

E

1 pav. Tauri ųjų elni ų elektroforezi ų spektrai su ROTH-180-01 (A), ROTH-180-02 (B), ROTH-180- 03 (C), ROTH-180-06 (D) ir ROTH-180-07 (E) pradmenimis.

77

Priedas Nr. 10

A B

C D

E

2 pav. Stirn ų elektroforezi ų spektrai su ROTH-180-01 (A), ROTH-180-02 (B), ROTH-180-03 (C), ROTH-180-06 (D) ir ROTH-180-07 (E) pradmenimis.

78