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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS OFIDISMO NO ESTADO DE PERNAMBUCO: UMA ABORDAGEM EPIDEMIOLÓGICA HISTÓRICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA METALOPROTEASE DA GLÂNDULA DE PEÇONHA DE VIPERÍDEOS SUL AMERICANOS Juliana Mendes Correia Recife – PE 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS OFIDISMO NO ESTADO DE PERNAMBUCO: UMA ABORDAGEM EPIDEMIOLÓGICA HISTÓRICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA METALOPROTEASE DA GLÂNDULA DE PEÇONHA DE VIPERÍDEOS SUL AMERICANOS Tese de doutoramento apresentada em qualificação como parte dos requisitos necessários para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas. Juliana Mendes Correia Orientador: Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Co-Orientador: Prof. Dr. Gandhi Rádis Baptista Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Alves Recife – PE 2011 Juliana Mendes Correia OFIDISMO NO ESTADO DE PERNAMBUCO: UMA ABORDAGEM EPIDEMIOLÓGICA HISTÓRICA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA METALOPROTEASE DA GLÂNDULA DE PEÇONHA DE VIPERÍDEOS SUL AMERICANOS Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor, pelo Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE APROVADO:03/03/2011 Banca Examinadora: ________________________________________________________________ 1. Dr. José Luiz de Filho (Universidade Federal de Pernambuco) ________________________________________________________________ 2. Dra. Maria Elizabeth Cavalcanti Chaves (Universidade Federal de Pernambuco) ________________________________________________________________ 3. Dra. Danyelly Bruneska (Universidade Federal de Pernambuco) ________________________________________________________________ 1. Dr. Paulo Eleutério (Universidade Federal Rural Pernambuco) ________________________________________________________________ 4. Dra. Rosângela Frade (Universidade Federal de Pernambuco) À Deus, À minha mãe, Marlene e tia, Maria José Aos meus filhos Vitor, Fábio e Vitória À Diego As minhas irmãs e sobrinhos, Pollyana, Tatiana, Mirella, Miguel e embrião À Roberto “in memorian” DEDICO AGRADECIMENTOS “Senhor a ti toda Honra e toda Glória!” À minha família por todos os momentos, amo vocês! Mãe (Marlene) obrigada por tudo, minha grande guerreira! Tia (Maria José) por todo apoio e estrutura, meu exemplo! Meus filhos amados e queridos (Vitor, Fábio e Vitória) é por vocês e pra vocês todo o meu esforço, amados da minh’Alma! Obrigada meu Deus! Minhas queridas irmãs, como é maravilhoso saber que vocês existem e estão ao meu lado! Ao meu esposo, Diego, pelo amor que temos um ao outro! Meus sobrinhos, Mirella, Miguel e você bebezinho em fase de formação, como amo vocês!!! Meus tesourinhos!! Queridos cunhados e padastro (Ulisses, Jorge e Roberto), pelos momentos de descontração. Vocês são Mara... rsrsrs Aos meus amigos de trabalho! Muito obrigada José Luiz pelo apoio e confiança!!! A você Gandhi que mesmo distante foi e será essencial! Meus queridos Fábio e Luiz obrigada por segurarem essa bomba! Sei que foi e está sendo difícil, mas seremos vitoriosos, pois Deus nunca nos desamparou! E nada como o tempo para que o sentimento fale mais do que palavras!!! Amo vocês!!! Marília, Rafael, Guilherme, Diana, Ana Paula, Adriana, Esmeralda, Yara, Alessandra, Fernando, Lânia, Thiaguinho, Elverson e Gladston... Gente obrigada por tudo pois sei que o melhor de Deus ainda está por vir!!! E que prevaleçam as melhores lembranças!! Amigos do Lika e Aggeu, obrigada pelo apoio, companheirismo, orientação, disponibilidade!!! Galera do BioMol... Cinthia, Nathália, Klecia, Nath Nemo, Conceição, Chirleane, Erick, Monique, Elaine, Eliane, Júlia, Maíra, Michel, Nathaly, Milena, Laís, Maíra, Lizandra, Carlos, Liane, Dalila, Enfim a todos meu muito obrigada! Aos meus colegas de turma... Obrigada pelos momentos! Em especial a você, Lidy que não é só amiga é também irmã em Cristo!!! Ei eu quero um sobrinho, visse! Aos meus pesquisadores... Ô gente como vocês me ajudaram a desarnar... Como é bom trabalhar com vocês... Pedro, não tenho dúvidas que você chegará a lugares altos, mas ande reto perante ao Senhor. Escobar, quem te viu e quem te vê, né! Baseada nisso posso até imaginar como te verei! Me lembro bem como te conheci e hoje vejo o quanto Deus é bom contigo. Milena, agora mamãe! Estás completa né! rsrsr Junto a vocês tenho hoje mais uma lição de vida... “Medo porque pois as horas em que mais errei foram as que mais me ensinaram” Moraes Moreira Amigos do LAPTx.. Gente não poderia deixar de agradecer a vocês... Pois são minha história científica. Sei que ainda estou distante de onde quero chegar, mas o que vocês me ensinaram certamente deixou-me mais próxima dos meus objetivos!!! Míriam que Deus continue te iluminando, pois você nasceu para irradiar o amor de Deus! Pois eu sei os planos que tenho para vós, diz o Senhor, planos de paz, e não de mal, para vos dar uma esperança e um futuro (Jr 29:11) Renata, Marliete, Claíne, Milena, Lidiany, Ilca, Escobar, Márcia, Júnior, Thayza, Carla, Eneida, Clara, Chirlane, Lucas... Enfim a todos que fizeram e fazem o LAPTx. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Tereza, obrigada por confiar em mim e em meu trabalho! Pode ter certeza que sempre antes de pensar em mim pensei no programa e em meus orientadores!!! Adê maravilhosa, o que seria desse programa sem sua competência e dedicação, obrigada por tudo!!! Aos meus professores que fazem a diferença em nossa formação... A todos do CEATOX... Américo, Lucineide, Vilma... Enfim a todos que se doam em prol da vida humana. Ao CNPq, LIKA e Aggeu por dar suporte a realização desse trabalho. Obrigada! Juliana Mendes Correia “Eu me deitei e dormi; acordei, porque o SENHOR me sustentou.” Salmos 3 Este projeto foi realizado no Laboratório de Imunopatologia Keizo Assami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco e no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), com auxílio financeiro do CNPq. RESUMO As peçonhas ofídicas são constituídas de enzimas (fosfolipases, fosfodiesterases, fosfomonoesterases, L-aminoácido oxidases, acetilcolinesterases, enzimas proteolíticas das classes serinoproteases e metaloproteases, arginina esterases, 5’-nucleosidases, hialuronidases e NAD nucleosidases), de peptídeos (miotoxinas, cardiotoxinas, potenciadores de bradicina e desintegrinas), também cátions metálicos (Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Co e Zn), carboidratos (freqüentemente na forma de glicoproteínas), nucleosídeos, aminas biogênicas, lipídeos e aminoácidos livres. Estas enzimas têm despertado interesse devido ao seu potencial biomédico e por serem responsáveis pela maioria dos efeitos tóxicos nos envenenamentos ofídicos, que constituem um problema de saúde pública em todo o Brasil, devido a ocorrência de 20.000 acidentes por ano. O presente estudo teve como objetivo caracterizar o perfil epidemiológico dos acidentes ofídicos na região metropolitana do Recife (RMR) e verificar a ocorrência de genes codificantes de uma metaloprotease indutora de apoptose vascular (VLAIPs) da glândula de peçonha de Viperídeos sul americanos. Para a caracterização do perfil epidemiológico da RMR foram analisados todos os prontuários de atendimento ao acidente ofídico do Centro de Atendimento Toxicológico do Hospital da Restauração (CEATOX-HR), Recife-Pe. Os dados foram analisados com o auxílio do software Package for the Social Sciences (SPSS) versão 14.0. No período de 1992-2009 foram atendidos 821 casos de importância médica, média de 45,6 casos/ano. Os acidentes crotálicos predominaram nas cidades abrangidas pela I Gerência Regional de Saúde (GERES), enquanto os acidentes botrópicos aumentam em frequência nas cidades distantes da Zona da Mata, em regiões áridas. Mais da metade dos casos atendidos no CEATOX-HR foram oriundos de cidades abrangidas por outras GERES. Os casos de óbito se deveram principalmente a fatores como o tempo levado desde o acidente ao atendimento, à distância de deslocamento e a faixa etária, do que pelo gênero de serpente envolvida no acidente. Para a verificação da ocorrência e expressão da(s) VLAIPs foram realizadas as técnicas de clonagem molecular e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa. Utilizamos um gene calibrador de Crotalus durissus terrificus homólogo a VAP1, nomeado crotastatin, e demais genes homólogos VAP1/crotastatin- like da glândula de veneno de Bothrops atrox, Crotalus durissus cascavella e Lachesis muta foram expressos em diferentes níveis. O batroxstatin, o precursor crotastatin-like de B. atrox, é expresso 87 vezes mais que crotastatin-1, de C. d. cascavella, e 7.5 vezes mais que lachestatins, de L. muta. Além do mais, análises estruturais in silico das sequências de aminoácidos indicam que batroxstatin-2, crotastatin and lachestatin-1 and -2 apresentam domínios estruturais e sítio de ligação ao metal iguais aos de VAP1, sendo dessa forma incluídos em um ramo filogenético que compreende as toxinas indutoras de apoptose. Diante o exposto podemos concluir que o gênero Crotalus sempre foi responsável pela maioria dos acidentes ofídicos na RMR e que em seu genoma há expressão de um gene indutor de apoptose vascular como também nos genomas de Bothrops atrox e Lachesis muta sendo todos expressos em níveis diferentes. Palavras-Chave: Acidente ofídico; Epidemiologia; Viperídeos da América do Sul; Metaloproteases; Clonagem molecular; PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR). ABSTRACT The snake venoms are composed of enzymes (phospholipases,