ANNÉE 2017

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l’Université Bretagne Loire

pour le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie et Sciences de la Santé

Ecole doctorale Ecologie, Géosciences, Agronomie ALimentation Alice GADEA Préparée dans l’unité de recherche UMR CNRS 6553 EcoBio - PHENOME Ecosystèmes, Biodiversité, Evolution - UFR des Sciences de la Vie et de l’Environnement et dans l’unité de recherche UMR CNRS 6226 ISCR - CORINT Institut des Sciences Chimiques de Rennes - Faculté de Pharmacie

Thèse soutenue à Rennes Lichens et le 11 décembre 2017 devant le jury composé de :

Gastéropode du Catherine LEBLANC Directrice de Recherche au CNRS, Station Biologique Subantarctique : de Roscoff / rapporteur Olivier GROVEL Professeur à l’Université de Nantes / rapporteur Ecologie chimique et Martin GRUBE Professeur à l’Université de Graz, Autriche / examinateur relations trophiques Luc MADEC Professeur à l’Université de Rennes 1 / examinateur Anne-Cécile LE LAMER Maître de Conférences à l’Université de Toulouse 3 / Examinatrice Françoise LOHEZIC-LE DEVEHAT Maître de Conférences à l’Université de Rennes 1 / Examinatrice Joël BOUSTIE Professeur à l’Université de Rennes 1 / Co-directeur de thèse Maryvonne CHARRIER Maître de Conférences à l’Université de Rennes 1 / Directrice de thèse

Lexique de lichnologie

Apothécie : organe produit par le mycobiote permettant la reproduction sexuée du lichen par la production de spores. Céphalodie : Petit organe bien délimité, soit à l’intérieur du thalle, soit émergent en petite excroissance à la surface de celui-ci, contenant les cyanobactéries lorsqu’elles sont présentes en tant que photosymbiote secondaire. Cordon axial : Ensemble d’hyphes très serrés parallèles à l’axe, formant un cordon très résistant dans la partie centrale du thalle (essentiellement chez les usnées). Cortex : Enchevêtrement plus ou moins dense et régulier d’hyphes, occupant les parties extérieures du thalle lichénique. Hyphes : Filaments microscopiques, de quelques micromètres de diamètre, constituant les champignons. Isidies : Petites excroissances cortiquées, de quelques dixièmes de millimètre, élaborées par un thalle lichénique. Elles contiennent le photobiote principal et le mycobiote. Elles permettent la reproduction végétative du thalle par détachement du thalle. Médulle : Enchevêtrement d’hyphes lâches de champignon. Phylloclades : Petites squamules ornant presque tous les pseudopodétions des lichens de la famille des Stereocaulaceae. Elles sont constituées d’une médulle et d’une couche algale. Pseudocyphelles : Petites ouvertures observées au niveau du cortex au fond desquelles affleure la médulle. Pseudopodétion : Thalle érigé dit secondaire provenant de l’élongation du thalle primaire initialement sous forme de granules basales. Soralie : ouverture de la face supérieure du thalle lichénique, laissant échapper les sorédies Sorédies : Granules non cortiqués, de très petite taille, formés d’enchevêtrement d’algues et d’hyphes, et qui permettent la reproduction végétative par la dispersion aisée des deux partenaires. Thalle crustacé : Thalle formant une croute fortement adhérente au substrat dans lequel pénètrent les hyphes de la médulle. Ces lichens ne possèdent pas de cortex inférieur. Thalle foliacé : Thalle en forme de lames ayant plus ou moins l’apparence de feuilles. Thalle fruticuleux : Thalle plus ou moins buissonnant, dressé ou pendant, n’adhérant au substrat que par une surface très réduite. Tomentum : couverture dense de poils située sur la face inférieure du lichen.

Rappels morphologiques

Usnea taylorii

Apothécie

Coupe’transversale’de’branche’dUsnea taylorii

Pseudocyphellaria crocata

Coupe transversale de thalle de Pseudocyphellaria crocata Argopsis friesiana

Remerciements

Remerciements

Ces’ trois’ années’ de’ thμse’ ont’ été’ une’ belle’ aventure,’ au’ cours’ de’ laquelle’ jai’ pu’ faire’ de belles rencontres et je tiens donc à remercier toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

Tout’dabord’je’tiens’δ’exprimer’toute’ma’reconnaissance’aux’différents’membres’du’jury : Catherine Leblanc et Olivier Grovel pour’avoir’accepté’dêtre’les’rapporteurs’de’ce’travail’et’Anne-Cécile Le Lamer, Martin Grube, Luc Madec et Damien Ertz (membre invité) pour avoir accepté de le juger.

Je souhaite ensuite exprimer toute ma gratitude à mes directeurs et encadrante de thèse, Maryvonne Charrier, Joël Boustie et Françoise Lohézic-Le Dévéhat pour’mavoir’soutenue’et’conseillée’tout’au’ long’de’cette’thμse.’Je’vous’remercie’également’de’mavoir’donné’lopportunité’de’participer’δ’de’ nombreux congrès et journées scientifiques afin de pouvoir présenter mes travaux. Merci de votre confiance’pour’ce’travail’pluridisciplinaire,’δ’linterface’de’la’chimie’des’substances’naturelles’et’de’ lécologie.’Deux’mondes’qui’semblent’assez’proches’et’pourtant’parfois’tellement’différents.’Jespμre’ avoir’ été’ δ’ la’ hauteur’ de’ ce’ défi.’ Je’ vous’ remercie’ également’ de’ mavoir’ fait’ confiance’ pour’ lencadrement’de’stagiaires’et’pour’mavoir’donné’lopportunité’de’participer’aux’enseignements’de’ pharmacognosie. Maryvonne,’ jai’ été’ honorée’ davoir’ pu’ partager’ lexpérience’ de’ ma’ premiμre’ campagne’dété’δ’Crozet’avec’toi’et’Damien.’Merci’pour’tes’conseils,’ta’confiance’et’ton’expérience’ que’ tu’ mas’ transmise’ dans’ le’ domaine’ de’ la’ malacologie,’ de’ lécologie’ et’ des’ études’ comportementales. Joël, merci pour vos conseils, avant même le début de la thèse lors de la préparation du’concours’jusquaux’derniers’moments’difficiles’de’la’rédaction’et’de’la’préparation’de’loral.’Enfin’ Françoise, co-encadrante officielle mais co-directrice officieuse, merci pour ton optimisme sans faille, pour les réunions crayons de couleurs dans ton bureau, pour ta disponibilité, ta présence et ton soutien dans les moments de stress et de doute.

Merci à Anne-Cécile Le Lamer,’tu’mas’accueillie’au’début’de’ma’thμse’lors’de’ton’séjour rennais et tu mas’fait’découvrir’les’secrets’de’la’phytochimie’des’lichens.’Merci’pour’les’bons’moments’passés’ ensemble et ton soutien à distance après ton départ à Toulouse. Merci à Damien Ertz,’pour’mavoir’initié’δ’la’connaissance’des’lichens’du Subantarctique, pour ta disponibilité pour répondre à toutes mes questions et tes suggestions avisées lors de la réalisation de certaines de mes expériences. Merci également pour les bons moments passés sur le Marion Dufresne et sur Crozet.

I Remerciements

Un immense merci aux techniciennes du laboratoire COrInt pour leur aide inestimable et leur gentillesse : Aurélie,’pour’mavoir’formé’sur’lHPLC’et’le’spectromμtre’de’masse,’ton’aide’sur’la’mise’ en place du protocole de quantification avec Corentin et pour ta grande disponibilité. Isabelle, merci pour ton efficacité et ton organisation, aussi bien pour la réalisation des tests biologiques que pour la gestion’de’mes’lichens’dans’lherbier.’Enfin’Solenn, merci pour ta bonne humeur, ton aide pour la réalisation’et’linterprétation des spectres RMN mais aussi pour les bons moments passés lors des sorties’champignons’et’du’traitement’des’CCM’prép.’A’Ecobio’je’remercie’également’Stéphanie et Valérie B.’pour’leur’aide’avec’mes’élevages’descargots’lors’de’mon’séjour’δ’Crozet. Merci également à toi Valérie B. pour ta disponibilité et tous les articles que tu as pu me trouver.

Merci à toutes les personnes du 4ème pour’ la’ vie’ de’ labo’ au’ quotidien,’ pour’ rendre’ le’ fait’ daller’ travailler agréable, pour les conseils cuisine et pour tous les gâteaux. Marylène et Béatrice pour votre gentillesse, votre soutien et tous vos précieux conseils sur les techniques analytiques, en particulier sur’la’mise’en’place’dune’méthode’de’quantification.’Maryse, un très grand merci pour ta disponibilité, et’tout’ce’que’tu’as’fait’pour’me’permettre’daller’en’mission’et’en’congrμs’sans’rien’oublier.’Merci’ également à toi Sophie pour tes conseils sur mon travail et sur mon futur, ta gentillesse et tes encouragements durant ces trois années. Enfin Audrey, je garde un très bon souvenir de notre présentation à Pint of Sciences et de ton intérêt pour les lichens, merci à toi pour ces moments. Je remercie’également’toutes’les’personnes’de’chimie’organique’et’chimie’analytique’de’léquipe’pour’ leur accueil lors de mes différents passages : Claudia, Gilles, Michèle, Phillipe, Nicolas (merci beaucoup pour la calycine), Marielle, Myriam, Jean-Pierre, Vianney, Benjamin, Cédric, Jaques, Jean-François, Patrice, Mickael, Christelle, Marie-Laurence, Milcart, Patricia, Morgane, Erell. Merci’également’aux’collμgues’de’léquipe’Phénome : David, Hervé et Marc pour leurs conseils. Je remercie’également’léquipe’administrative’dEcobio : Tifenn, Sandra, Fabienne, Valérie H., Valérie B., Isabelle et Bertrand pour leur aide lors des différentes formalités.

Merci à David Delmail, Sophie Tomasi et Françoise Lohézic-Le Dévéhat pour’ mavoir’ initiée’ δ’ lenseignement’de’la’pharmacognosie,’de’la’botanique’et’de’la’mycologie.’Ces’séances’de’TP’ont’été’ des’moments’agréables’qui’mont’permis’de’me’rendre’compte’que’lenseignement’est’une’partie’de’ la recherche différente mais très intéressante.

Durant’ces’trois’années,’jai’pu’être’assistée’par’plusieurs’stagiaires’dont’le’travail’a’grandement’ contribué’ δ’ lobtention’ dune’ partie’ de’ mes résultats. Merci à Morgane et Emma pour’ létude’ phytochimique préliminaire de P. crocata, Corentin pour ton incroyable travail et ton implication avec Aurélie’ pour’ la’ mise’ en’ place’ et’ la’ validation’ dune’ méthode’ de’ quantification’ des’ composés’

II Remerciements lichéniques et Grichka pour’ létude’du’ devenir’ des’ métabolites’ dans’ les’ tissus’ de’ lescargot,’ et’ta’ patience pour disséquer plus de 50 tout petits Notodiscus.

La’ bonne’ réalisation’ de’ ce’ travail’ de’ thμse’ naurait’ pas’ été’ possible’ sans’ laide’ de’ lIPEV,’ que’ je’ remercie pour son aide financière et logistique. Plus particulièrement je remercie David Renault et lensemble’des’membres’du’programme’1″6’Subanteco’qui’mont’permis’de’me’rendre’δ’deux’reprises’ sur’le’terrain’δ’Crozet.’Sur’place,’lefficacité’de’léquipe’logistique, en particulier Yann, Romu et Nina, ma’ permis’ la’ réalisation’ de’ toutes’ mes’ expériences’ sur’ le’ terrain’ dans’ les’ meilleures’ conditions’ possibles.’Lors’de’ces’campagnes,’jai’pu’également’avoir’lopportunité’de’rencontrer’de’nombreux’ scientifiques avec’qui’jai’pu’échanger’sur’leurs’expériences’australes. Je souhaite également remercier tout particulièrement les trois VSC du programme 136 à Crozet : Julien, pour le travail considérable que tu as fait en réalisant sur place les expériences de Notodromes et’pour’mavoir’permis’daller’tous’les’trois’avec’Benjamin jusquδ’Pointe’Basse,’en’dépit’de’mes’ capacités physiques � et Aude merci pour ton aide lors de la première campagne et pour nous avoir guidé’tout’autour’de’lîle’pour’collecter’des’escargots’et’des’lichens.’Pour’la’vie’sur’base,’je’remercie’ les’hivernants’et’campagnards’dété’présents’lors’de’mes’deux’séjours’δ bord du MD et sur base et en particuliers tous les VSC des missions Crozet 52,53 et 54.

Afin’dexplorer’le’plus’dhypothμses’possibles’quant’aux’métabolites’influenλant’les’choix’alimentaires’ des’ escargots,’ nous’ avons’ voulu’ explorer’ dautres’ familles’ de’ métabolites’ et’ dautres’ techniques’ analytiques, ce qui a donné lieu à de nombreuses collaborations très enrichissantes : - Laventure’ a’ commencé’ par’ la’ découverte’ des’ sucres’ et’ des’ acides’ aminés’ sur’ la’ plateforme Corsaire, sur le plateau P2M2 au Rheu, grâce à Alain Bouchereau. Je remercie tout particulièrement Nathalie Marnet et Catherine Jonard qui’mont’accueillie’δ’plusieurs’ reprises’ pour’ que’ je’ puisse’ faire’ mes’ analyses’ et’ dont’ laide’ a’ été’ précieuse’ pour’ linterprétation’des’résultats.’ - Jai’ ensuite’ découvert grâce à Daniel Catheline le’ monde’ des’ acides’ gras’ qui’ métait’ inconnu jusque-lδ.’Merci’Daniel’pour’mavoir’accueillie’et’formée’sur’les’profilages’des’ acides’gras’des’lichens.’Je’remercie’également’toute’léquipe’du’laboratoire’de’Biochimie’ de’lAgrocampus, toujours très accueillante lors de mes différents passages. - Sur la plateforme BIBS de Nantes, avec Hélène Rogniaux jai’pu’découvrir’deux’approches’ supplémentaires. Grâce Sophie Le Gall nous avons pu étudier les polysaccharides de lichens et également’réaliser’lanalyse’élémentaire’de’ces’derniers.’Puis’avec’Matthieu Fanuel nous’nous’sommes’lancés’dans’létude’de’limagerie’par’spectrométrie’de’masse’ des’lichens.’Merci’δ’tous’pour’votre’travail’dune’trμs’grande’précision,’sur’des’lichens’ pas toujours très coopératifs et votre disponibilité pour répondre à toutes mes questions.

III Remerciements

- Enfin, la dernière aventure pour tenter de résoudre les mystères de la répartition intrathalline’des’métabolites’lichéniques’sest’déroulée’sur’la’plateforme’H′P′’avec’Alain Fautrel qui’ ma’ donné’ lopportunité’ de’ faire’ de’ la’ microdissection’ laser’ de’ tissus’ lichéniques’ainsi’que’de’tester’limagerie’par’spectrométrie’Raman.’Merci’Alain’pour’le’ temps passé à la mise au point de ces analyses, ces expériences réalisées pendant la rédaction’ont’été’pour’moi’une’véritable’bouffée’dair’frais.’ - Je remercie également David Rondeau de’ la’ plateforme’ Dream,’ pour’ mavoir’ laissé’ accéder au DART-MS, aux personnes du CRMPO et du PRISM pour les analyses de spectrométrie de masse et de RMN. - Merci à Phillipe Clerc pour la description morphologique du lichen Usnea taylorii.

Merci aux membres de mes deux comités de thèse : Marion Millot, Anne-Cécile Le Lamer, Alain Bouchereau, David Renault et Luc Madec. Vos conseils et vos recommandations mont’ permis’ denrichir’mes’travaux’et’dexploiter’au’mieux’mes’résultats.

Une’partie’de’la’vie’dun’doctorant’se’passe’au’niveau’du’bureau’des’doctorants,’et’étant’sur’deux’ labos,’jai’eu’la’chance’den’avoir’deux.’A’Beaulieu,’je’remercie’tous’les’formidables membres du bureau des doctorantes (et les personnes rattachées) : Tiphaine, Maud, Youn, Thomas, Morgane, Maxime, Manon, Kevin, Elmina, Greg,’ pour’ leur’ accueil’ dans’ le’ monde’ de’ lécologie,’ malgré’ mes’ origines pharmaceutiques �. Merci pour avoir su adapter votre humour au mien, et pour mavoir offert une partie du maintenant traditionnel « mur des post-it ».’ Pour’ les’ bruits’ danimaux’ (en’ particulier le gorfou sauteur !), les débats Wikipédia, les explications statistiques, les 30 cadeaux, Chacha, la bonne humeur constante, les soirées burgers au Fox, et tout le reste merci à vous ! A Villejean, un autre très bon bureau, parfois surchargé mais avec toujours une bonne ambiance. Un grand merci en particulier à Le, pour ta gentillesse et tes attentions, Nathalie,’pour’mavoir’accueilli’δ’ Rennes lors de mon arrivée et pour tes conseils au labo, Pierre pour avoir collaboré avec moi sur plusieurs techniques analytiques que tu as développées lors de ta thèse (DART et CCM-MS notamment) et’pour’ton’aide’pour’lanalyse’de’certains’résultats,’et’surtout’Alba, pour avoir partagé pendant ces trois années les hauts et les bas de la vie de doctorant : les moments de découragement, les pauses après manger avant de replonger dans la rédaction, les mercredis piscine, nos articles acceptés célébrés par un petit verre, ton écoute et tes conseils. Merci à toi ! Je’noublie’pas’toutes’les’personnes’qui’sont’passés’par’ce’bureau : Mathilde, Damien, Alexandre, Aline, Tiffany,’…

IV Remerciements

Merci’δ’lAFERP pour’mavoir attribué une bourse qui a financé ma participation au JNPC2016 à Copenhague et au GDR Mediatec pour’avoir’pris’en’charge’mes’frais’dinscription’δ’lécole’thématique’ décologie’chimique’(ETEC)’δ’Roscoff’en’juin’′016.’

Merci’ aux’ membres’ de’ lAFL (Association Française de Lichénologie) pour leur aide lors de lobservation’et’de’lidentification’des’lichens’que’jai’étudiés.’En’particulier’je’remercie’Chantal Van Haluwyn, Danièle et Olivier Gonnet et JP Méral pour leurs précieux conseils lors de la session dinitiation’δ’la’lichénologie’de’′015’réalisée’δ’Fontainebleau.’Merci’également’aux’lichénologues’ bretons Joël Esnault et Jean-Yves Monnat.

Merci à Badia Mssassi et Anne-Joëlle Chauvin pour’leur’travail’exceptionnel’au’secrétariat’de’lécole’ doctorale VAS puis EGAAL, leur disponibilité et leur écoute dans les moments de stress aux différentes’étapes’davant’et’daprμs’thμse.’

Mon’intérêt’pour’létude’des’substances’naturelles’a’commencé’trμs’tôt,’et’cest’grâce’δ’plusieurs’ rencontres et lors de mes différentes’expériences’professionnelles’que’jai’pu’construire’mon’projet’ jusquδ’aujourdhui.’Une’pensée’tout’dabord’pour’Jean Raynaud, mon professeur de Botanique lors de’mes’deux’P1,’qui’a’su’me’passionner’et’me’faire’maccrocher’pour’obtenir’mon’concours malgré les difficultés de la première année de pharmacie. Je remercie ensuite Marie-Geneviève Dijoux-Franca pour’mavoir’accueilli’pour’mon’premier’stage’dans’le’laboratoire’de’pharmacognosie’de’la’faculté’de’ Lyon, je remercie également les relations internationales’de’lISPB’pour’mavoir’permis’de’partir’″’ mois’au’Venezuela’faire’un’stage’en’herbier.’Jadresse’également’toute’ma’reconnaissance’δ’Angèle Mambu et Marion Girardot qui’ mont’ encadrée’ lors’ de’ mon’ stage’ de’ M′’ au’ Muséum’ National’ dHistoire’Naturelle’et’qui’mont’transmis’leur’expérience.’Enfin’jexprime’toute’ma’gratitude’δ’Michel Sauvain,’dont’les’conseils’dμs’mes’premiμres’années’de’pharmacie’mont’permis’de’construire’mon’ parcours’autour’de’la’chimie’des’substances’naturelles.’Il’ma’surtout donné’lincroyable’opportunité’ de revenir dans le domaine de la recherche suite à mon M2 en me recrutant comme volontaire au service’civique’pendant’′’ans’au’sein’de’lIRD’δ’Lima’au’Pérou,’une’trμs’belle’expérience’qui’ma’ donné la confiance nécessaire pour réaliser ma thèse de doctorat. Je remercie également Mohammed Haddad et Valérie Julian que’jai’côtoyé’durant’ces’deux’années’ainsi’que’tous’les’membres’du’LMI- LAVI.

Merci également à mes amis de toujours, Vanessa, Fanny, Marie, Michaël, Thibaut, Antonin, Clarisse, Alfred, Cyril, ma BPS Kadija, Jacques et Isabelle qui malgré la distance et mon manque de disponibilité ne’moublient’pas’et’me’soutiennent.

V Remerciements

Gracias también a mis amigos peruanos, Juan-Pablo, Jason, Lourdes, André, Rubí y paraguaya Marcela para los buenos momentos que compartimos desde que llegaron a Francia. Los deseo lo mejor a todos para sus proyectos profesionales y personales.

Je remercie ma famille, pour son soutien toutes ces années, et tout particulièrement mon frère Théo et mes parents. Maman, Papa,’merci’dêtre’lδ’chaque’jour’pour’me’soutenir’et’mencourager’depuis’le’ début de mes études. Je vous aime. Agradezco también a mi familia peruana para todas sus atenciones y su apoyo a distancia.

Mes derniers mots seront pour toi, Pedro. Merci pour ton soutien, tes conseils, ta patience et ton amour au quotidien, malgré la distance. Je ne pourrais imaginer faire de la recherche sans toi et nos discussions’stimulantes’sur’nos’travaux’respectifs.’Jespμre’être’lδ’pour’toi’dans’la’finalisation de ta thμse’comme’tu’las’été’pour’moi.’Je’taime.’

VI Sommaire

SOMMAIRE

I. Contexte général ...... 1 1 A la découverte des lichens ...... 3 1.1 La symbiose lichénique ...... 3 1.1.1 Le mycobiote ...... 4 1.1.2 Les photobiotes ...... 4 1.2 Morphologie ...... 5 1.3 Reproduction des lichens ...... 6 1.4 Physiologie et métabolisme des lichens ...... 8 1.4.1 Le le de l’azote et les acides aminés lichéniques...... 9 1.4.2 Les sucres et les polyols ...... 11 1.4.3 Les polysaccharides ...... 14 1.4.4 Les métabolites spécialisés : description et rôles au sein de la symbiose ...... 16 1.4.5 Les acides gras ...... 19 2 Les Gastéropodes ...... 22 2.1 Organes sensoriels ...... 22 2.2 Mucus...... 24 2.2.1 Les différents types de mucus et leur composition...... 24 2.2.2 Rôles du mucus ...... 25 2.3 Le comportement de recherche alimentaire ...... 26 2.4 Digestion ...... 27 2.4.1 Anatomie du système digestif ...... 27 2.4.2 Digestion et métabolisme ...... 28 3 Coepts d’Eologie hiiue : interaction lichens- lichénophages ...... 30 3.1 Protection des lichens contre les lichénophages ...... 31 3.1 La Théorie de Défense Optimale (ODT) ...... 33 3.1.1 Concept général chez les végétaux supérieurs...... 33 3.1.2 L’ODT hez les lihes...... 34 3.2 L’hpothse de l’uilie aoe-azote (CNB) ...... 35 4 Objectif et organisation de la thèse ...... 38

II. Site d’tude et atiels iologiues ...... 39 1 Site de l’tude : l’île de la Possessio, Ahipel Cozet ...... 41 2 L’esagot du suatatiue Notodiscus hookeri : ote odle d’tude...... 47 2.1 Taooie, distiutio et iologie de l’espe ...... 47

I Rems

2.2 Appareil digestif de Notodiscus hookeri et rythmes alimentaires ...... 49 3 Les lichens subantarctiques étudiés ...... 50 3.1 Usnea taylorii D. Hook...... 51 3.2 Pseudocyphellaria crocata Vain...... 53 3.3 Argopsis friesiana Müll. Arg...... 55

III. Devei des taolites lihiues hez l’esagot ...... 59

Which specialized metabolites does the native subantarctic Gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata? . 63 1 Introduction ...... 63 2 Results ...... 66 2.1 Chemical profiling of the lichens and quantification of their major compounds ...... 66 2.1.1 Usnea taylorii ...... 66 2.1.2 Pseudocyphellaria crocata ...... 67 2.2 Chemical profiling of the biological tissues and quantitation of their major compounds ...... 69 2.2.1 Products of the digestion of Usnea taylorii ...... 70 2.2.2 Products of the digestion of Pseudocyphellaria crocata ...... 71 2.3 Differences in metabolite profiling according to the gut compartment of snails fed P. crocata 73 3 Discussion ...... 74 3.1 Chemical profile of Usnea taylorii and toxicity of lichen metabolites...... 74 3.2 Toxicity of the metabolites detected in Pseudocyphellaria crocata and strategies implemented by Notodiscus hookeri to cope with lichen metabolites ...... 76 4 Materials and Methods ...... 79 4.1 Snail collection and lichen material ...... 79 4.2 Feeding experiment ...... 80 4.3 Chemistry ...... 81 4.3.1 Extraction ...... 81 4.3.2 HPLC-DAD-MS analyses ...... 81 4.3.2.1 Preparation of the samples...... 81 4.3.2.2 Instrumental settings ...... 81 4.4 Statistical analyses ...... 82 5 Conclusions ...... 82

IV. Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri 87 1 Etude phytochimique des lichens ...... 90 1.1 Etatio pa içage à l’atoe et pofilage hiiue des hatillos ...... 90

II Sommaire

1.2 Quantifications des métabolites spécialisés majoritaires ...... 91 1.3 Quantification des sucres et des polyols ...... 91 1.3.1 Extractions ...... 92 1.3.2 Analyse de la teneur en sucres, polyols et acides organiques dans les lichens ...... 92 1.4 Histolocalisation des métabolites par Imagerie couplée à la Spectrométrie de Masse (MSI) .. 93 2 Psetatio des tehiues d’aalses opoteetales utilises ...... 94 2.1 Expériences de choix alimentaires en notodromes ...... 94 2.2 Expériences de non choix ...... 95 2.2.1 Etude des lichens rincés et intacts ...... 95 2.2.2 Etude des gels enrichis en métabolites ...... 96 3 Analyses statistiques ...... 97 3.1 Expériences de choix alimentaires en notodromes ...... 97 3.2 Expériences de non-choix ...... 97 3.2.1 Lichens intacts vs lichens rincés ...... 97 3.2.2 Gels enrichis en métabolites ...... 97

A. Overcoming deterrent metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study ...... 99 1 Introduction ...... 101 2 Methods and materials ...... 102 2.1 Snail Collection and Lichen Material ...... 102 2.2 Macroscopic and microscopic analysis of Usnea taylorii ...... 102 2.3 HPLC-DAD-MS analysis of specialized metabolites ...... 103 2.3.1 Instrumental settings...... 103 2.3.2 Samples and standard preparation ...... 103 2.3.3 Analytical method validation ...... 103 2.4 Sugars and polyols profiling ...... 104 2.5 Mass Spectrometry Imaging (MSI) ...... 104 2.6 Snails feeding choices ...... 105 2.7 No-choice experiments on isolated compounds ...... 106 2.8 Statistical analysis ...... 106 3 Results...... 107 3.1 Description of Usnea taylorii morphology ...... 107 3.2 Snail feeding choices ...... 108 3.3 Quantification of metabolites in the lichen U. taylorii ...... 109 3.4 Localization of the major metabolites of U. taylorii by mass spectrometry imaging (LDI-MS imaging and MALDI-MS imaging) ...... 110

III Rems

3.5 No-choices experiments ...... 112 4 Discussion ...... 113

B. Histolocalisation des métabolites spécialisés de Pseudocyphellaria crocata et étude de leur influence sur les choix alimentaires de N. hookeri...... 119

1 Roltes d’esagots et lihes ...... 119 2 Analyses chimiques ...... 119 2.1 Préparation des standards et quantification des métabolites spécialisés majoritaires dans P. crocata par HPLC-DAD ...... 119 2.2 Localisation des métabolites dans le thalle ...... 121 2.2.1 Réactions thallines ...... 121 2.2.2 Imagerie par spectrométrie de masse ...... 122 2.2.3 Récupération de la médulle par microdissection à capture laser...... 127 3 Analyses de comportement alimentaire ...... 130 3.1 Expériences de choix en Notodromes ...... 130 3.2 Expériences de non-choix : étude des préférences alimentaires des escargots vis-à-vis des lichens intacts et des lichens rincés...... 132 3.3 Influence des métabolites présents dans le lichen sur les choix alimentaires de N. hookeri : expériences de non-choix ...... 133 3.3.1 Influence des métabolites en fonction de leur famille chimique ...... 133 3.3.2 Les sucres et les polyols, de potentiels métabolites phagostimulants ? ...... 134

V. Mise e elatio des pofils hiiues des tissus d’u e lihe ave les dommages sectoriels causés par N. hookeri ...... 139

Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana shape gastropod grazing patterns...... 143 1 Introduction ...... 145 2 Methods and materials ...... 147 2.1 Biological material ...... 147 2.2 Lichen preparation ...... 148 2.3 Experimental design ...... 148 2.4 Samples preparation for chemical analyses, ...... 149 2.5 Specialized metabolites profiling ...... 149 2.6 Primary metabolite profiling ...... 150 2.7 Fatty acids profiling ...... 150 2.8 Extraction of sugar forming polysaccharides ...... 150 2.9 Total Nitrogen (TN) Measurement ...... 151

IV Sommaire

2.10 Statistical analyses ...... 151 3 Results...... 152 3.1 Snail feeding preferences...... 152 3.2 Metabolite profiling of A. friesiana ...... 154 3.3 Clustering patterns of metabolites in A. friesiana ...... 159 4 Discussion ...... 160

VI. Conclusions et perspectives ...... 169 Bibliographie ...... 185 Annexes ...... 211

V

Table des figures

Table des figures

Partie I Figure I-1 : Différents types de céphalodies...... 5 Figure I-2 : Différents types de thalles lichéniques et coupe transversale associée à chaque types de lichens...... 6 Figure I-3: Organes de reproduction sexuée des lichens...... 7 Figure I-4 : Reproduction asexuée chez les lichens...... 8 Figure I-5 : Echanges nutritionnels entre les différents partenaires de la symbiose...... 9 Figure I-6’:’Voies’du’métabolisme’de’lazote’dans le lichen Peltigera aphtosa ...... 10 Figure I-7’:’Graphique’danalyse’en’composantes’principales’(ACP)’réalisé’sur’la’composition’en’ acides aminés de 14 espèces de lichens, à partir des données de Dahlman et al. (2004)...... 11 Figure I-8 : Réaction d'oxydation du mannitol conduisant au mannose...... 12 Figure I-9 : Illustration des différentes configurations des oses sous forme cyclique...... 12 Figure I-10 : Biosynthèse simplifiée des hydrates de carbones produits au sein de la symbiose lichénique,’dans’les’cas’dune’association entre une algue verte productrice de ribitol et un mycobiote...... 13 Figure I-11’:’Polysaccharide’présentant’des’liaisons’(1 4)’et’(1 6)...... 14

Figure I-12 : Voies de biosynthèse simplifiées des métabolites → spécialis → és lichéniques et familles de composés associées...... 17 Figure I-1″’:’Illustration’des’différentes’dénominations’dun’acide’gras ...... 19 Figure I-14 : Voies de biosynthèse simplifiée des acides gras insaturés...... 20 Figure I-15 : Répartition des acides gras entre Phospholipides (PL) et Triglycérides (TG) dans le lichen Stereocaulon vesuvianum...... 21 Figure I-16 : Arbre phylogénique des Mollusques actualisé par M. HERVÉ à partir de données moléculaires...... 22 Figure I-17 : Photo de Helix pomatia montrant la position des tentacules antérieurs et postérieurs, des lèvres, des yeux et de la sole pédieuse...... 23 Figure I-18’:’Anatomie’dun’tentacule’postérieur’descargot’permettant’la’perception’des signaux olfactifs...... 23 Figure I-19 : Description de la séquence comportementale menant les Gastéropodes terrestres de la locomotion’δ’linitiation’et’δ’la’conclusion’de’la’prise’alimentaire...... 27 Figure I-20 : Anatomie du système digestif de Cornu aspersum (schéma M. Charrier) ...... 28

I Table des figures

Figure I-′1’:’Prédiction’de’lallocation des défenses chimiques de la plante, en fonction de la valeur des tissus pour la plante, selon la théorie de défense optimale (ODT)...... 34 Figure I-22 : Possibles conséquences évolutives des métabolites spécialisés lichéniques. Schéma modifié’daprμs’(Rundel’1978) ...... 36

Partie II Figure II-1 : Localisation de la zone biogéographique du subantarctique et présentation’de’lArchipel’ Crozet...... 42 Figure II-′’:’Localisation’des’sites’détudes’et’des’infrastructures’sur’lîle’de’la’Possession’(Crozet)...... 43 Figure II-3 : Les sites de fell-field de Bougainville (BOUG), du mont Branca (BRA) et du pic du Mascarin (MAS)...... 44 Figure II-4 : Site de la Tour Blanche...... 45 Figure II-5 : Les sites de plaine côtière BUS et PBAS...... 46 Figure II-6 : Morphologie et microarchitecture des coquilles chez l'escargot N. hookeri en fonction du phénotype...... 48 Figure II-7 : Appareil digestif de Notodiscus hookeri...... 49 Figure II-8 : Activité nutritionnelle de’lespμce’N. hookeri sur 48h...... 50 Figure II-9 : Observation microscopique du thalle de U. taylorii...... 52 Figure II-10 : Observation microscopique du thalle de P. crocata (G x 100)...... 54 Figure II-11 : Comparaison des spores muriformes de A. friesiana (A) et pluriseptées de S. cymosum (B)...... 56 Figure II-12 : Comparaison des chromatogrammes obtenus par HPLC-DAD’(’=’′54’nm)’des’extraits’ acétone de A. friesiana et S. cymosum...... 56

Partie III Figure III-1 : PDA chromatogram at 290 nm of U. taylorii acetone extract...... 66 Figure III-2 : PDA chromatogram at 254 nm of P. crocata acetone extract...... 67 Figure III-3 : Structures of the compounds identified in Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata collected on Possession Island (Crozet Archipelago)...... 69 Figure III- 4 : PDA chromatogram at 290 nm of acetone extracts of N. hookeri digestive gland (DG, green curves), crops (C, purple curves), intestines (I, blue curves), and feces (F, red curves) after being fed with U. taylorii (black curve)...... 70 Figure III- 5 : PDA chromatogram at 254 nm of acetone extracts of N. hookeri digestive gland (DG, green curves), crops (C, purple curves), intestines (I, blue curves), and feces (F, red curves) after being fed with P. crocata (black curve)...... 71

II Table des figures

Figure III- 6 : Levels of tenuiorin (means ± standard deviation) found in the snail gut compartments after the consumption of P. crocata, according to the snail phenotype (MP = Mineral and OP = Organic)...... 72 Figure III- 7 : Graphs of the Partial Least Square-Discriminant Analysis (PLS-DA) performed on the specialized metabolites of the lichen Pseudocyphellaria crocata...... 74 Figure III- 8 : (A) N. hookeri consuming U. taylorii thallus. U. taylorii (B) and P. crocata (C) thalli before and after snail consumption...... 76

Partie IV Figure IV-1’:’Démarche’expérimentale’entreprise’pour’létude’du’rôle’des’métabolites’lichénique’sur’ les choix alimentaires de N. hookeri...... 90 Figure IV-2 :’Principe’de’lacquisition’des’données’en’imagerie’par’spectrométrie’de’masse’LDI...... 94 Figure IV-3: Arène de choix alimentaire ou « Notodrome »...... 95 Figure IV-4 : Dispositifs expérimentaux utilisés lors des expériences de non choix...... 96 Figure IV-5 : (a) U.taylorii entire thalli; (b) apothecia in transversal and longitudinal cut; (c) branches in transversal and longitudinal cut...... 108 Figure IV-6 : Snail distribution (means + SE) in the arms of feeding choices arenas, during the nutritional phase (4h experiment, night)...... 108 Figure IV-7 : Consumed U. taylorii. Snails ate the apothecia (a) and the external layers of branches (b). Arrows designed snails grazing marks...... 109 Figure IV-8 : Distribution of usnic acid (ion [M-H]- at m/z 343.2) in samples of U. taylorii...... 111 Figure IV-9 : Distribution of arabitol (ion [M+Na]+ at m/z 175.1) in samples of U. taylorii...... 112 Figure IV-10’:’Gel’consumption’(Mean’±’SE)’by’the’organic’phenotypes’snails,’according’the’ metabolite tested on starch gel...... 113 Figure IV-11 : Spectre LDI de l'extrait acétone de P. crocata...... 123 Figure IV-12 : Possibles mécanismes de fragmentation par spectrométrie de masse des tridepsides en ionisation négative...... 124 Figure IV-13 : Distribution au sein du thalle des différents groupes de métabolites de P. crocata. ... 125 Figure IV-14 : Etapes successives conduisant au profilage spécifique des différents tissus de P. crocata ...... 128 Figure IV-15 : Représentation schématique de la microdissection laser réalisée sur les coupes transversales de P. crocata...... 129 Figure IV-16 : Comparaison des hauters des pics d'absorbance (254 nm) obtenus pour les depsidones (acide constictique et acide stictique) et les depsides (4-O-methylgyrophorate et ténuioine) dans les échantillons de médulle et de cortex...... 130

III Table des figures

Figure IV-17 : Distribution des escargots (moyenne + SE) dans les différentes branches des notodromes en fonction de leur phénotype, au bout de 4h (phase nocturne) et 24h (phase diurne)...... 131 Figure IV-18:’Nombres’dexcréments (moyenne + SE) récoltés par boîte contenant 5 escargots, en fonction du traitement infligé au lichen...... 132 Figure IV- 19 : Consommation des gels par les escargots (moyenne ± SE) obtenue en fonction du métabolite’incorporé’au’gel’damidon...... 134 Figure IV-21 : Consommation des gels par les escargots (moyenne ± SE) obtenue en fonction du métabolite’incorporé’au’gel’damidon...... 136

Partie V Figure V-1 : Morphology of the lichen Argopsis friesiana...... 142 Figure V-2 : Argopsis friesiana (Stereocaulaceae) entire thallus (a) and cephalodia (b) before and after snail consumption...... 153 Figure V-3 : Differential grazing and level of damage (LD) by the snail Notodiscus hookeri on Argopsis friesiana...... 154 Figure V-4 : Graphs of the Partial Least Squares - Discriminant Analysis (PLS-DA) performed on the chemical composition of the four lichen parts of Argopsis friesiana...... 160 Figure V-5 : Decision tree allowing to predict lichen consumption by snails...... 165

Partie VI Figure VI-1 : Image de microscopie électronique à balayage de la radula de N. hookeri, extraite de la masse buccale...... 175 Figure VI-2 : Arbre décisionnel permettant de prédire la consommation des lichens par les escargots...... 176 Figure VI-3 :’Exemple’dhistolocalisation’par’spectroscopie’Raman’de’métabolites’sur’une’coupe’de’ pseudopodétion’dArgopsis friesiana...... 179 Figure VI-4 : Modalité de transmission de la symbiose par endozoochorie...... 181 Figure VI-5 :’Images’de’microscopie’électronique’δ’balayage’dexcréments de N. hookeri...... 181

IV Table des tableaux

Table des tableaux

Partie I Tableau I-1 : Différents groupes des principaux polysaccharides retrouvés dans les lichens ...... 15

Partie IV Tableau IV-1: Conditions expérimentales des analyses LC-UV-MS ...... 91 Tableau IV-2 : Conditions expérimentales des analyses GC-FID’pour’lanalyse’des’sucres,’polyols’et’ acides organiques...... 92 Tableau IV-3 : Results of various parameters of validation studies for usnic acid quantification ..... 110 Tableau IV-4 : Résultats des différents paramètres de validation des méthodes de quantification des différents métabolites spécialisés...... 120 Tableau IV-5 : Contenu en métabolites spécialisés des thalles entiers de P. crocata ...... 120 Tableau IV-6 : Résultats des réactions thallines sur les métabolites majoritaires de chaque groupe de métabolites présents dans le lichen P. crocata...... 122 Tableau IV-7 : Quantification des sucres et des polyols dans le lichen P. crocata...... 135

Partie V Tableau V-1 : Data set of the compounds identified or detected (unidentified: Af1 to Af5) in the four parts of the lichen Argopsis friesiana (Ap= apothecia, Ce= cephalodia, Ph= phyllocladia, Pa= algal layer of pseudopodetia and Pf= fungal axis of pseudopodetia): specialized metabolites, free sugars and polyols, amino-acids, fatty acids and sugar-forming polysaccharides...... 156

I

Liste des abbréviations

Liste des abbrviations ACN Acétonitrile AcOEt Acétate’dEthyle ACP Analyse en Composantes Principales AG Acide Gras ALOU Alouette’(Site’de’la’Crête’de’lAlouette) ANOVA Analyse de Variance Ap Apothécie BAF Base Alfred Faure BOUG Bougainville (Site de Bougainville) BRA Branca (Site du Mont Branca) BUS Baie Américaine (Site de la Baie Américaine) Test C Test’δ’lhypochlorite de sodium CCM Chromatographie sur Couche Mince Ce Céphalodie

CHCl3 Chloroforme CoA Coenzyme A CPG Chromatographie en Phase Gazeuse DAD Diode Array Detector DART Direct Analysis in Real Time

DCM ou CH2Cl2 DiChloroMéthane ddl degrès de liberté df degree of freedom DM Dry Mass EMAG Ester’Méthylique’dAcide’Gras ESI ElectroSpray Ionization EtOH Ethanol

FAsat Saturated Fatty Acids

FAunsat Unsaturated Fatty Acids FID Flame Ionization Detector GABA Gamma-AminoButyrique Acid GC Gas Chromatography GLM Generelized Linear Model

H2O Eau HPLC High Performance Liquid Chromatography HRMS High Resolution Mass Spectroscopy IC Intervalle de confiance

I Liste des abbréviations

IR Infrarouge JJAP Jardin Japonais Test K Test à la potasse LDI Laser Desorption Ionization LM Linear Model LOD Limit of Detection LOQ Limite of Quantification MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation MAS Mascarin (Site du Pic du Mascarin) MSM Medullary Specialized Metabolites MEB Microscopie Electronique à Balayage MeOH Méthanol MP Mineral Phenotype MS Mass spectrometry MSI Mass spectrometry Imaging NaCl Chlorure de Sodium NMR Nuclear Magnetic Resonance OP Organic Phenotype Test P Test para-Phénylène diamine PBAS Pointe Basse (Site de Pointe Basse) PDA Photo Diode Array Pf Partie médullaire du pseudopodétion du lichen Argopsis friesiana Ph+Pa Phylloclades et couche algale du lichen Argopsis friesiana PL Phospholipides PLS-DA Partial Least Squared Discriminant Analysis ppm parties par million RDA Redondancy Discriminant Analysis Rf Rapport frontal rpm Rotation par minute RSD Relative Standard Deviation SD Standard Deviation SE Standard Error TBLA Tour Blanche (Site de la Tour Blanche) TG Triglycérides THF Tétrahydrofurane TLC Thin Layer Chromatography UV Ultraviolet Vis Visible

II Production scientifique

Production scientifique

PUBLICATIONS :

Gadea A, Le Pogam P, Biver G, Boustie J, Le Lamer AC, Le Dévéhat F, Charrier M, Which specialized metabolites does the native Subantarctic Gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphelaria crocata? Molecules ; 2017(22), 425. Publiée Chapitre III

Ertz D, Sochting U, Gadea A, Charrier M, Poulsen R, Ducatina umbilicata gen. et sp. nov. , a remarkable Trapeliaceae from the subantarctic islands in the Indian Ocean. The Lichenologist ; 2017(49): 127-140. Publiée

Vásquez-Ocmín P, Haddad M, Gadea A, Jullian V, Castillo D, Paloque L, Cerapio Arroyo JP, Bourdy G, Sauvain M, A new phtalide derivative from Peperomia nivalis, Natural Product Research ; 2017(31): 138-142. Publiée

Le Pogam P, Pillot A, Lohézic-Le Dévéhat F, Le Lamer AC, Legouin B, Gadea A, Sauvager A, Ertz D, Boustie J, Mass spectrometry as a versatile ancillary technique for the rapid in situ identification of lichen metabolites directly from TLC plates. The Lichenologist ; 2017(49): 507-520. Publiée

Gadea A, Le Lamer AC, Fanuel M, Clerc P, Daugan C, Sauvager A, Rogniaux H, Ertz D; Boustie J, Charrier M, Lohézic-Le Dévéhat F, Overcoming deterrent metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study. Phytochemistry (en préparation) Chapitre IV- A

Gadea A, Le Lamer AC, Le Gall S, Jonard C, Catheline D, Ertz D, Le Pogam P, Boustie J, Lohézic-Le Dévéhat F, Charrier M, Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana shape gastropod grazing patterns. Journal of Chemical Ecology (soumis) Chapitre V

III Production scientifique

POSTERS ET COMMUNICATONS ORALES :

Gadea A, Le Dévéhat F, Le Lamer AC, Charrier M, Boustie J. Lichens chemistry and grazing by the sub-Antarctic land snail Notodiscus hookeri. ❖ 2ème Symposium International AFERP-Stolon - Biodiversité et Substances Naturelles, Lyon, France, 15-17 Juillet 2015. Flash communication et Poster. ❖ 2ème journées du GDR MediatEC - « Médiation’ chimique’ dans’ lenvironnement’ Ecologie Chimique », Banyuls-sur-Mer, 28-30 octobre 2015. Poster

Gadea A, Le Dévéhat F, Le Lamer AC, Le Pogam P, Ertz D, Charrier M, Boustie J. Sectorial land snail damage to the lichen Argopsis friesiana could be explained by metabolite profiles. Poster ❖ Ecole’thématique’décologie’chimique (ETEC2016), Roscoff, France, 20-24 Juin 2016 ❖ 9th Join Natural Products Conference (JNPC2016), Copenhague, Danemark, 24-27 Juillet 2016 ❖ 8th International Association of Lichenology Symposium, Helsinki, Finlande, 1-5 Août 2016

Gadea A, Lohézic-Le Dévéhat F, Le Lamer AC, Boustie J, Charrier M. Chemical cues affect the feeding choices in lichen-snail trophic interactions. Communication orale ❖ sfecologie2016, Marseille, France, octobre 2016.

Gadea A, Le Lamer AC, Fanuel M, Boustie J, Charrier M, Le Dévéhat F. Overcoming specilized metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study. Flash communication et Poster ❖ 5ème Journées Internationales’de’lAFERP - « Pharmacognosy from here and there », Angers, France, 17-19 Juillet 2017 Prix de la meilleure communication Flash

IV

I. Contexte gnral

Vue sur la base Alfred Faure, le Marion Dufresne et l’île de l’Est depuis le Mont Branca

Contexte général

1 A la découverte des lichens

Les lichens sont retrouvés à toutes les latitudes, souvent comme contributeurs minoritaires (ou négligés) des écosystèmes. Cependant, ils dominent dans les habitats pauvres en nutriments, trop secs ou trop froids’pour’la’survie’dautres’types de végétation (Asplund and Wardle 2016). Ces organismes sont donc particulièrement représentés dans les milieux polaires et subpolaires (Longton 1988). Cette capacité à dominer les environnements difficiles est due à la nature symbiotique de ces organismes.

1.1 La symbiose lichénique

Les lichens sont des organismes symbiotiques associant un partenaire fongique, le mycobiote et un ou plusieurs partenaires photosynthétiques appelés photobiotes. Les photobiotes peuvent être des micro-algues ou des cyanobactéries. Les différentes associations retrouvées sont (Honegger 1991) : - Les chlorolichens, associant une ou plusieurs algues vertes à un champignon. - Les cyanolichens, associant une cyanobactérie à un champignon. - Les lichens tripartites ou céphalolichens, qui associent à la fois une algue verte et une cyanobactérie à un champignon.

Aux’partenaires’majoritaires,’vient’sajouter’toute’une’communauté’microscopique’se’ localisant’aussi’bien’δ’lextérieur’du’thalle (épilichénique)’quδ’lintérieur’(endolichénique).’Ce’ microbiote associé au lichen est constitué de vastes communautés bactériennes (Grube et al. 2009) et récemment des travaux ont également mis en évidence la présence de levures basidiomycètes spécifiques au niveau du cortex de certains lichens (Spribille et al. 2016). Ces communautés microscopiques, également appelées bactériobiote, jouent un véritable rôle au sein de la symbiose : elles sont notamment impliquées dans la lutte contre les stress biotiques et abiotiques tels que la résistance vis-à-vis’ dautres’ microorganismes et aux toxines environnementales (Grube et al. 2015; Garg et al. 2016). Certains lichens peuvent également être parasités par des champignons lichénicoles (Lawrey and Diederich 2003).

3 Contexte général

1.1.1 Le mycobiote

Les champignons lichénisés appartiennent en majorité aux Ascomycètes (98%), le second groupe est celui des Basidiomycètes (2%). Le champignon étant le seul à réaliser la reproduction sexuée, la classification des lichens se base sur celle du mycobiote. Chez les Ascomycètes, les spores se développent’δ’lintérieur’de’cellules’spécialisées’appelées’asques.’Les’champignons impliqués dans la symbiose lichénique ne sont généralement pas retrouvés seuls dans la nature. Dans la symbiose,’le’mycobiote’protμge’lalgue’de’la’déshydratation’et’des’rayonnements’UV.’

1.1.2 Les photobiotes

Plus’dune’quarantaine’despμces’dalgues’et’de cyanobactéries sont décrites comme photobiotes potentiels de lichens. Les organismes photosynthétiques impliqués dans la symbiose lichénique sont essentiellement des algues vertes unicellulaires appartenant principalement aux genres Trebouxia, Coccomyxa, Myrmecia. Le genre Trentepohlia est quelquefois retrouvé comme photobiote, chez des lichens généralement orangés du fait de la présence de caroténoïdes intracellulaires. Contrairement au mycobiote, ces algues peuvent être retrouvées seules dans la nature. Au sein de la symbiose, ce sont les photobiotes qui assurent la photosynthèse.

Les cyanobactéries les plus fréquemment impliquées dans la symbiose appartiennent au genre Nostoc, mais les genres Stigonema, Scytonema peuvent également être rencontrés. Lorsque les cyanobactéries sont présentes en tant que photobiote secondaire dans les lichens tripartites, elles sont généralement localisées dans des organes appelés céphalodies. Elles constituent’des’petites’formations’bien’délimitées’soit’δ’lintérieur’du’thalle, soit émergentes en petite excroissance à la surface de celui-ci (Figure I-1).

4 Contexte général

Figure I-1 : Différents types de céphalodies. A’gauche,’céphalodies’dArgopsis friesiana, à droite’céphalodie’dAspicilliopsis macrophthalma.

1.2 Morphologie

Le mycobiote, qui représente plus de 90% de la masse du lichen, est responsable de la morphologie du thalle. Les lichens peuvent être classés en quatre principaux groupes morphologiques (Figure I-2): - Les lichens crustacés, encroûtant sur leur substrat. Ils présentent une structure hétéromère stratifiée : le cortex supérieur (hyphes fusionnées de champignon), la couche algale (cellules de photobiote mêlées aux hyphes fongiques), la médulle (formée par les hyphes’ lâches’ du’ champignon)’ et’ parfois’ lhypothalle.’ Aspicilliopsis macrophthalma, Placopsis bicolor, Orceolina kerguelensis et Ochrolechia kerguelensis (Ertz et al. 2016) en sont des représentants. - Les lichens foliacés, possèdent des lobes, facilement séparables du substrat auquel ils sont fixés.’Certains’thalles’foliacés’nadhμrent’au’substrat’que’par’un’petit’crampon,’souvent’ situé au centre de la face inférieure, ces thalles sont dit foliacés ombiliqués (ex : Ducatina umbilicata (Ertz et al. 2017b)). Ils présentent toujours un cortex supérieur et un cortex inférieur en coupe microscopique. (Pseudocyphellaria crocata, Peltigera sp.) - Les lichens fruticuleux sont plus ou moins buissonnants et ramifiés. Ils ne sont fixés à leur substrat que par une surface très réduite. La coupe transversale met en évidence une structure hétéromère dite radiée. Les couches sont disposées de manière concentrique. Lorsque’la’médulle’est’formée’dun’réseau’dhyphes’trμs’serrées,’parallμles’δ’laxe’du’ thalle, elle constitue un cordon rigide, dit cordon axial (Usnea trachycarpa, Usnea taylorii).

5 Contexte général

- Les lichens complexes sont’ formés’ dun’ thalle’ primaire’ plus’ ou’ moins’ foliacé’ ou’ squamuleux, adhérant au substrat, sur lequel se développe un thalle secondaire dressé, de type fruticuleux. Ce thalle secondaire est appelé podétion chez les Cladoniaceae et peut’être’simple’ou’ramifié’mais’toujours’creux’et’cortiqué’(présence’dun’cortex).’Il’est’ à la base du développement des apothécies. Pour la famille des Stereocaulaceae (Argopsis friesiana, Stereocaulon cymosum), le thalle secondaire est appelé pseudopodétion. Celui- ci est toujours ramifié et non creux et il est recouvert de petites écailles à fonction photosynthétique, appelées phylloclades.

Figure I-2 : Différents types de thalles lichéniques et coupe transversale associée à chaque type de lichens. A. Aspicilliopsis macrophthalma ; B. Pseudocyphellaria crocata ; C. Usnea trachycarpa ; D. Cladonia sp. : E. Argopsis friesiana. Photographies D. ERTZ (A) et A. GADEA (B’δ’E).’Croquis’modifiés’daprμs Tiévant (2001)

Dautres’types’de’lichens,’dérivant des types précédemment décrits peuvent être rencontrés. Les lichens squamuleux forment de petites écailles (ou squamules) dispersées, qui peuvent plus ou moins se superposer. Les lichens lépreux sont des formes primitives de lichens crustacés, pulvérulents. Enfin les lichens gélatineux sont généralement des lichens à cyanobactéries de type Nostoc,’de’structure’homéomμre,’cassant’δ’létat’sec’mais’devenant’gélatineux’et’pulpeux’en’ présence’deau.’

1.3 Reproduction des lichens

Il existe deux modes de reproduction chez les lichens, la reproduction sexuée et la reproduction asexuée. Lors de la reproduction sexuée, des spores sont produites par le champignon au sein des organes reproducteurs du lichen, qui peuvent être en fonction des espèces soit des apothécies

6 Contexte général

(appelées lirelles lorsquelles’ sont’ allongées)’ soit des périthèces (Figure I-3). Les apothécies peuvent être enfouies dans le thalle ou au contraire pédicellées. En fonction de la structure de lexcipulum,’deux’types’dapothécies’peuvent se distinguer : - les apothécies lécanorines ont un bord concolore au thalle, appelé bord thallin, de même structure’que’le’thalle’(présence’de’cellules’algales’et’dhyphes).’ - les apothécies lécidéines ont un bord propre, de la même couleur que le disque apothécial.

Figure I-3: Organes de reproduction sexuée des lichens. Croquis modifiés daprμs’Tiévant (2001), photographies de gauche à droite puis de haut en bas : A. GADEA, D. ERTZ (Placopsis bicolor) et JM. SUSSEY (Acrocordia conoidea).

La reproduction asexuée (ou végétative) se produit par le détachement de propagules contenant à la fois le photobiote et le mycobiote. Elles peuvent être de deux types (Figure I-4): - Les soralies correspondent à des ouvertures de la face supérieure du thalle lichénique, laissant échapper les sorédies,’petits’granules’formés’dun’enchevêtrement’dalgues’et’ dhyphes,’et qui permettent une dispersion aisée des deux partenaires. - Les isidies, qui sont de petites excroissances’ du’ cortex’ formées’ dalgues’ et’ de’ champignon.

7 Contexte général

Figure I-4 : Reproduction asexuée chez les lichens. Schémas’ modifiés’ daprμs’ Van Haluwyn and Lerond (1993). Photographies R. DROKER (Pertusaria sp.) et A. GADEA (P. crocata).

1.4 Physiologie et métabolisme des lichens

Le métabolisme des lichens est basé sur la capacité autotrophe du photobiote et le mode

de’ vie’ hétérotrophe’ du’ mycobiote.’ Lalgue’ verte’ (ou’ la’ cyanobactérie)’ capte’ le’ CO2 atmosphérique afin de produire des polyols (ou du glucose dans le cas de la cyanobactérie) qui seront transmis au champignon comme éléments de base pour son métabolisme et comme source de’carbone.’Lactivation’de’la’photosynthμse’nest’possible’quaprμs’absorption’de’vapeur’deau’ (chlorolichens)’ou’deau’liquide’(cyanolichens)’(Lange et al. 1986). Les cyanobactéries possèdent également’la’capacité’de’fixer’lazote’atmosphérique’et’le’transmettent’au’mycobiote’sous’forme’ dions’ammonium.’Les’principaux’échanges’nutritionnels au sein de la symbiose sont résumés sur la Figure I-5.

8 Contexte général

CO2 CO2, N2 Lumière Lumière

ALGUE CYANOBACTÉRIE

Glucose Polyols Vitamine B Vitamine B + NH4 Eau Eau Sels minéraux Sels minéraux Vitamine C Vitamine C CHAMPIGNON

Eau Sels minéraux

Figure I-5 : Echanges nutritionnels entre les différents partenaires de la symbiose. Schéma’modifié’daprμs’Vu (2014)

1.4.1 Le cycle de l’azote et les acides aminés lichéniques

Les cyanobactéries filamenteuses,’ δ’ létat’ libre’ ou’ impliquées’ dans’ la’ symbiose’ lichénique, possèdent la capacité δ’fixer’lazote’de’lair’via’une nitrogénase contenue dans les hétérocystes. Le nombre de ces cellules spécialisées est plus important dans les lichens tripartites (15- 35 %) que dans les lichens bipartites (4-8 %) (Rai and Bergman 2002).’Lazote’peut’également’être’fourni’ par’les’nutriments’présents’dans’le’milieu’de’vie’du’lichen.’La’transmission’de’lazote’vers’le’ champignon’se’fait’sous’forme’dammoniac’(transport’passif)’ou’dions’ammonium’(transport’ actif), qui vont ensuite être transformés via la glutamate déshydrogénase (GDH) en glutamate, point de départ pour la synthèse entre autres des acides aminés (Figure I-6). Le cyanobiote (tout comme le photobiote de type algue verte) peut également synthétiser de la glutamine via la glutamine synthétase (GS) et du glutamate via la glutamine 2-cétoglutarate aminotransférase (GOCAT). Cependant, ces voies de biosynthèses sont réduites, afin de favoriser le relargage de lammoniac’au’mycobiote.’

9 Contexte général

Figure I-6 : Voies’du’métabolisme’de’lazote’dans’le’lichen’Peltigera aphtosa. Daprμs’ (Rai and Bergman 2002). TA = transport actif ; TP = transport passif ; GS = glutamine synthase ; GDH = glutamate déshydrogénase ; GOGAT = glutamine 2- cétoglutarate aminotransférase ; GOT = glutamate-oxoacétate transaminase ; GPT = glutamate-pyruvate transaminase ; APT = aspartate-pyruvate transaminase.

Les acides aminés produits par les lichens dérivent directement du cycle de’lazote. Les principaux’acides’aminés’quantifiés’dans’les’lichens’sont’le’glutamate,’lalanine,’laspartate.’Les’ teneurs’sont’trμs’variables’dune’espμce’δ’lautre.’Dans’la’majorité’des’lichens’étudiés’dans’la’ littérature, le glutamate (ou acide glutamique) savμre’être’le’métabolite’majoritaire’(Gorin and Iacomini 1985; Iacomini et al. 1985; Dahlman et al. 2004), rappelant son rôle essentiel dans la biosynthμse’dautres’métabolites’(Jäger and Weigel 1978). Les amides (glutamine et asparagine) ainsi’que’larginine permettent’un’stockage’de’lazote’au’sein’du’lichen’(Jäger and Weigel 1978; Legaz et al. 1986). Une accumulation de proline, métabolite jouant également un rôle dans le stockage’dénergie’et la’cryoprotection,’peut’ sobserver’en’cas’de’stress’hydrique’ (Jäger and Weigel 1978; Montiel 2000). Ces métabolites peuvent également être des chélateurs de métaux, permettant la détoxication des lichens dans les zones polluées (Bačkor’and’Loppi 2009). La nature du photobiote semble néanmoins influencer les teneurs en acides aminés retrouvées dans les lichens. Les techniques analytiques étant’ variables’ dune’ publication’ δ’

10 Contexte général lautre,’ il’ est’ difficile’ de’ pouvoir’ faire’ une’ analyse’ globale’ de’ toutes’ les’ données’ de’ la’ bibliographie. Les travaux de Dahlman et al. (2004) qui comparent les teneurs de 14 espèces de lichens (7 chlorolichens, 4 cyanolichens et 3 lichens tripartites), semblent être un bon modèle pour observer les différences en fonction’de’leur’capacité’δ’fixer’lazote.’Il’apparaît’que’les’lichens’ contenant une cyanobactérie (cyanolichens et lichens tripartites) sont les plus riches en acides aminés.’Lanalyse’multivariée’(ACP)’ que’ nous’ avons’faite’ δ’partir’ des’résultats’ obtenus’ par’ Dahlman et al. (2004)’met’en’évidence’une’discrimination’des’différents’groupes’le’long’de’laxe’ PC1, qui est définit par la teneur globale en acides aminés et en particulier en glutamate, en alanine et en glycine (Figure I-7).

Figure I-7 : Graphique’danalyse en composantes principales (ACP) réalisé sur la composition en acides aminés de 14 espèces de lichens, à partir des données de Dahlman et al. (2004). A. Dispersion des individus sur les axes 1-2 (67.02 % de la variance expliquée ; Discrimination entre les groupes P = 0.03) ; B. Diagramme des corrélations.

1.4.2 Les sucres et les polyols

Parmi les hydrates de carbones, il faut différentier les sucres (ou oses) des polyols. Les polyols’ sont’ liés’ au’ métabolisme’des’ oses’et’constituent’une’mise’ en’réserve’dénergie,’leur’ oxydation en oses conduisant à la formation de NAD(P)H (Figure I-8)

11 Contexte général

+ NAD(P)+ + NAD(P)H

Figure I-8 : Réaction d'oxydation du mannitol conduisant au mannose. NAD(P)+ = Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate) ; NAD(P)H = Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate) réduit.

Dans la nature, les oses sont présents sous forme de cycle, soit furanique (liaison 1-4) ou pyranique (liaison 1-5) qui conduit à deux formes isomères et ’en fonction de la configuration du groupement hydroxyle hémiacétalique (Figure I-9).

Pont 1 furanique 4

2

3 α-D-glucopyranose β-D-glucopyranose

4

5 4 5 2 Pont 1 pyranique 3 D-glucose α-D-glucofuranose β-D-glucofuranose

Figure I-9 : Illustration des différentes configurations des oses sous forme cyclique.

Les’hydrates’de’carbone’solubles’représentent’jusquδ’10%’de’la’masse’sμche’de’certains’ lichens (Lewis and Smith 1967; Dudley and Lechowicz 1987). La nature des métabolites transmise au’mycobiote’est’fonction’du’genre’de’photobiote’engagé’dans’la’synthμse.’Il’sagit’de’ribitol’ pour les algues vertes appartenant aux genres Trebouxia, Coccomyxa ou Myrmecia, dérythritol’ pour celles du genre Trentepohlia et de sorbitol pour celle du genre Hyalococcus (Richardson et al. 1968). Les cyanobactéries (Nostoc et Stigonema) produisent un glucane extracellulaire qui sera dégradé par des glucanases du mycobiote en glucose (Honegger 1991).

12 Contexte général

Une fois capté par le mycobiote, le polyol (ou le glucose pour les cyanobactéries) est rapidement transformé en arabitol puis en mannitol, ce dernier étant insoluble, il ne peut être recapté par le photobiote (Dahlman et al. 2003).’ La’ transformation’ de’ larabitol’ passe’ par’ plusieurs intermédiaires et la voie de biosynthèse simplifiée au sein de la symbiose lichénique dans’le’cas’dun’photobiote’du’genre’Trebouxia est présentée en Figure I-10. Ces métabolites sont’également’δ’lorigine’des’polysaccharides’de’structure’ainsi’que’des’métabolites’spécialisés’ présents dans les lichens.

Ribitol ArabitolArabinoseRibinoseFructoseMannitol ALGUE VERTE MYCOBIOTE

Figure I-10 : Biosynthèse simplifiée des hydrates de carbones produits au sein de la symbiose lichénique,’dans’les’cas’dune’association’entre une algue verte productrice de ribitol et un mycobiote. Daprμs’Dahlman et al. (2003)

Larabitol’et’le’mannitol’sont’les’principaux’polyols’rencontrés’dans’les’lichens.’Un’’rôle’ dans le maintien du thalle lichénique lors des périodes de dessiccation est supposé (Van Haluwyn and Lerond 1993). Lors’de’périodes’de’stress,’les’quantités’darabitol’diminuent’plus’rapidement’ que le’mannitol.’Ces’observations’mettent’en’évidence’que’larabitol’aurait’un’rôle en tant que polyol de réserve à court terme, facilement métabolisable alors que le mannitol, plus stable possèderait une fonction de protection contre les stress liés aux conditions environnementales (dessication,’salinité,…) (Armstrong and Smith 1994). La surhydratation joue de plus un rôle important’dans’la’gestion’du’pool’de’polyols’présents’dans’le’lichen.’Lors’dépisodes’pluvieux,’ les lichens peuvent perdre’jusquδ’10%’de’leur’pool’de’polyols,’dμs’les’15’premiμres’minutes’de’ pluie. Cependant, cette perte est très faible comparée au végétaux supérieurs dans les mêmes conditions (Dudley and Lechowicz 1987). Tearle (1987) a également mis en évidence que la concentration en polyols est trois fois plus importante pour des lichens collectés en Antarctique que ceux collectés en milieu tempéré. Une telle différence sexplique’par’le’rôle’cryoprotecteur’ décrit pour certains polyols (ribitol et mannitol notamment) et des saccharides tels que le tréhalose et le saccharose (Montiel 2000; Robinson 2001; Hájek et al. 2009).’ Lapparition’ de’ thréitol, xylitol et myo-inositol a été mise en évidence après un stockage prolongé (4 ans) de

13 Contexte général

spécimens de Sticta sp. alors que les teneurs en hydrates de carbone majoritaires (ribitol, arabitol et mannitol) tendent vers zéro au cours du temps (Da Silva et al. 1993).

1.4.3 Les polysaccharides

Les polysaccharides sont des polymères de haut poids moléculaire résultant de la condensation’de’nombreux’oses’(n’>’10).’Chaque’ose’est’lié’δ’son’voisin’par’lintermédiaire’dune’ liaison’osidique’formée’par’lélimination’dune’molécule’deau’entre’le’groupement’hydroxyle’

en C1 dun’ose’et’un’autre’groupement’hydroxyle’dun’autre’ose,’porté’le’plus’souvent’en’C4, C6

ou en C3 (Figure I-11). Dans la nomenclature, la liaison osidique est symbolisée (1 , avec

correspondant au numéro du deuxième carbone de la liaison). → � �

Liaison α(

→

14 14 1

Liaison α

→ 6

14 14 14

Liaison α(

→ Figure I-11 : Polysaccharide présentant des liaisons (1 4) et (1 6).

→ → Une grande variété de polysaccharides a pu être décrite chez les champignons et les lichens (Gorin and Barreto-Bergter 1983; Olafsdottir and Ingólfsdottir 2001; Karunaratne et al. 2012). Ces polysaccharides sont soit de type homogène (homopolysaccharides), soit de type hétérogène (hétéropolysaccharides),’pouvant’pour’chacun’deux’être’soit’linéaires’soit’ramifiés’(Tableau I- 1).’Les’glucanes’sont’constitués’dunités’glucose’liées’en’(1 3), (1 4) ou (1 6),’et’cest’le’ratio’

entre unités liée de façon identique qui permet de les différencier.→ → →

14 Contexte général

Les’polysaccharides’(-D-glucanes,’-D-glucanes et galactomannanes) pouvant être isolés en’trμs’grandes’quantités’sont’dorigine’fongique’(Olafsdottir and Ingólfsdottir 2001). En effet, des travaux sur les différents partenaires isolés du genre Ramalina mettent en évidence que le mycobiote seul biosynthétise certains des D-glucanes ainsi que des galactomannanes identiques à ceux produits dans les lichens, alors que les cultures de photobiotes fournit des polysaccharides différents (Cordeiro et al. 2003, 2004, 2005, 2008).’Par’contre,’lisolichénane’largement’isolé’des’ thalles’de’ramalinas,’nétant’pas’retrouvé dans les cultures du mycobiote ni du photobiote, les auteurs’suggμrent’que’sa’production’est’conditionnée’par’la’présence’des’deux’symbiotes’et’quil’ sagit’en’réalité’dun’métabolite’symbiotique’(Cordeiro et al. 2011).

Tableau I-1 : Différents groupes des principaux polysaccharides retrouvés dans les lichens

Famille Sous-famille Types de polysaccharides

Isolichénane α-D-glucanes Nigérane (glucopyrananes) Pseudonigérane Glucanes Pullulanes et dérivés Lichénane β-D-glucanes Pustulanes et dérivés Laminaranes et dérivés

Mannanes β-D-mannanes HOMOPOLYSACCHARIDES Xylanes β-D-xylanes

Galactomannanes 2 oses Rhamnopyranosyl- galactofurananes

3 oses Galactogluco-mannanes

4 oses Arabinogalacto-mannoglucanes HETEROPOLYSACCHARIDES

Les polysaccharides peuvent avoir un rôle de structure mais aussi de réserve (Manners and Sturgeon 1982; Gorin and Barreto-Bergter 1983). Les polysaccharides de structure, de type lichénane, isolichénane et galactomannane, sont les plus nombreux dans la littérature et entrent dans la composition de la paroi cellulaire des hyphes du mycobiote (Stocker-Wörgötter 2008).

15 Contexte général

Les polysaccharides de structure sont responsables de la résistance à la dessiccation, de la conservation’ de’ lhumidité’ ainsi’ que’ de’ lélasticité du thalle lorsque celui-ci est mouillé (Pankratov et al. 2017). Dailleurs,’ laspect’ gélatineux’ de’ certains’ lichens’ δ’ cyanobactéries’ lorsquils’sont’mouillés’est dû’δ’la’rétention’deau’induite’par’les’polysaccharides’du’photobiote’ (Prieto 2008). Les’polysaccharides’de’réserve’sont’quant’δ’eux’caractérisés’par’leur’solubilité’dans’leau’et’ sont généralement des D-glucanes (Manners and Sturgeon 1982). Cependant les études sur ces métabolites’sont’limitées’et’lidentification’des’rôles’spécifiques’des’polysaccharides’au’sein’’de’ la symbiose est complexe.

Plusieurs travaux ont également mis en évidence le rôle taxonomique des polysaccharides. A’titre’dexemple,’les’polysaccharides’décrits’sont’de’type’isolichénane’chez’les’Parmeliaceae,’ de type pustulane chez les Umbilicariaceae et de type nigérane chez les Cladoniaceae (Takahashi et al. 1981; Carbonero et al. 2002).

1.4.4 Les métabolites spécialisés : description et rôles au sein de la symbiose

Le nombre de métabolites spécialisés identifiés dans les lichens avoisine actuellement les 1050 composés (Elix 2014). Parmi ces composés, la majorité est spécifique des lichens, et seuls 10’δ’′0’%’de’ces’métabolites’sont’décrits’dans’dautres’organismes,’tels’que’des’plantes,’ des champignons non lichénisés ou encore des bactéries (Culberson and Elix 1989; Elix 1996; Parrot et al. 2013). Les’ métabolites’ spécialisés’ lichéniques’ sont’ majoritairement’ dorigine’ fongique. Ces composés hydrophobes sont pour la plupart extracellulaires et sont retrouvés sous forme de cristaux au niveau des hyphes du champignon. Il existe au moins trois voies principales de biosynthμse’(voies’de’lacide’shikimique,’voie’des’mévalonates et’voie’de’lacétate-polymalonate) conduisant à la production de la majorité des métabolites spécialisés décrits dans les lichens (Figure I-12 ; Elix and Stocker-Wörgötter 1996; Stocker-Wörgötter 2008; Nguyen et al. 2013) : - La’ voie’ de’ lacide’ shikimique’ conduit’ aux’ dérivés’ de’ lacide’ pulviniques’ (acide’ pulvinique,’calycine,’acide’vulpinique,…).’ - La voie acétate-polymalonate,’ qui’ utilise’ comme’ précurseur’ lacétyl-coenzyme A (Acétyl CoA), est la voie de la majorité des métabolites spécialisés lichéniques, en particulier des

16 Contexte général depsides’(ténuiorine,’acide’gyrophorique,’atranorine,…),’des’depsidones’(acide’stictiques’et’ses’ dérivés,’acide’fumarprotocétrarique,’caloploïcine,…)’et’des’dibenzofuranes’(acide’usnique). - A’partir’de’lAcétyl’CoA,’une’autre’voie’de’biosynthμse’existe,’la’voie’des’Mévalonates,’ δ’ lorigine’ des’ terpénoïdes’ (triterpμnes’ de’ type’ hopane’ par’ exemple),’ des’ stéroïdes’ et’ des’ caroténoïdes.

Voie Acétate-Polymalonate Photobiote(s) Polysaccharides Depsides Polyols ou Glucose Azote

Mycobiote Sucres / Polyols Acétyl CoA ténuiorine atranorine Cycle Pentose Phosphate Depsidones Voie des Mévalonates Acides aminés Terpènes Stéroïdes

acide stictique caloploïcine Dibenzofuranes Anthraquinones

Voie de l’aide Shikimique hopan-6α,7α,22-triol ergostérol Déivés de l’acide pulviniue Caroténoïdes (+)-acide usnique pariétine Acides paraconiques Xanthones Chromones Acides gras calycine β-carotène acide lichestérinique

Figure I-12 : Voies de biosynthèse simplifiées des métabolites spécialisés lichéniques et familles de composés associées. Schéma réalisé à partir des travaux de Elix and Stocker- Wörgötter (1996), Stocker-Wörgötter (2008) et Nguyen et al. (2013).

Les’concentrations’en’métabolites’spécialisés’sont’extrêmement’variables’dun’lichen’δ’ lautre.’Généralement’ils’représentent’environ’1%’de’la’masse’sμche,’mais’des’quantités’jusquδ’ 40% de la masse sèche ont pu être mesurées (Rundel 1978).’Au’sein’dune’espμce,’un’ou’deux’ composés corticaux et plusieurs composés médullaires sont retrouvés (Solhaug and Gauslaa 2012). Les métabolites spécialisés ne sont présents que dans certaines zones spécifiques du thalle (partie végétative, partie reproductrice), en fonction de leurs rôles au sein de la symbiose (Lawrey 2009). Différentes fonctions adaptatives peuvent être attribuées aux métabolites spécialisés de lichens, dont les plus couramment discutées sont :

17 Contexte général

❖ La photoprotection : Les composés corticaux (acide usnique, atranorine, caroténoïdes,’mélanines)’sont,’δ’lexception’de’latranorine, des pigments agissant comme des filtres UV, régulant le rayonnement solaire reçu par la couche algale. Cette activité peut être mise en évidence par la variation des teneurs de ces métabolites spécialisés en fonction de lexposition’δ’la’lumiμre’(Rundel 1978; Solhaug and Gauslaa 2012; Lohézic-Le Dévéhat et al. 2013).

❖ La lutte contre le stress oxydatif : Les lichens colonisent des milieux où les conditions peuvent être extrêmes (exposition aux rayonnements UV, cycle de déshydratation/réhydratation répétées, forte salinité,..) et un important stress oxydatif est induit. Par conséquent, un des rôles supposés des métabolites spécialisés au sein de la symbiose est dagir’comme’antioxydant’’(Le Devehat et al. 2014).

❖ La régulation du métabolisme du photobiote : La’localisation’de’lacide’usnique’au’ contact’ de’ la’ couche’ algale’ est’ décrite,’ via’ des’ techniques’ dimagerie,’ notamment dans Ophiopharma ventosa (par imagerie couplé à la spectrométrie de masse (Le Pogam et al. 2016)) et dans le genre Cladonia (par imagerie couplée à la spectroscopie Raman (Liao et al. 2010)). Afin’ dexpliquer’ laccumulation’ dacide’ usnique’ au’ niveau’ des’ algues,’ Bačkor’ et’ al.’ (2010) proposent’lhypothμse’dune’régulation’par’le’champignon’de’la’croissance’des’cellules’algales’ afin de maintenir un équilibre entre mycobiote et photobiote.

❖ La’ présence’ dagents allélopathiques : Compte tenu de la croissance lente des lichens, certains métabolites spécialisés peuvent agir comme des agents allélopathiques en affectant le développement et la croissance des organismes voisins (Rundel 1978). Linhibition’ de’la’croissance’de’ plantes’vasculaires,’de’bryophytes,’de’mycorhizes’ et’ dautres’ espμces de lichens est largement décrit (Lawrey 1994; Lokajová et al. 2014; Goga et al. 2016). De plus, lactivité’antibiotique’et’antifongique’de’plus’de’la’moitié’des’métabolites’testés,’en’particulier’ lacide’ usnique,’les’ dérivés’de’lacide’ pulvinique, les depsides et depsidones de type orcinol, permettent également de confirmer le rôle adaptatif de ces métabolites contre les stress biotiques, en particulier ceux liés aux microorganismes.

18 Contexte général

❖ La défense contre les lichénophages1 : De nombreux métabolites (les depsidones en particulier) possèdent également une activité contre les lichénophages (Rundel 1978; Lawrey 2009; Solhaug et al. 2009). Cet aspect sera développé en détail dans la partie 3 de cette introduction intitulée : « Concepts’dEcologie’chimique : interaction lichens- lichénophages »

1.4.5 Les acides gras

Un acide gras est un acide carboxylique à chaine aliphatique linéaire ou ramifiée et présentant’des’chaînes’dau’moins’quatre’jusquδ’′8’carbones,’avec’ou’sans’double’liaison.’Les acides gras sont normalement des monoacides δ’nombre’pair’datomes’de’carbone’puisque’la’ biosynthèse des acides gras implique lacétyl-CoA qui’permet’lajout’de’deux’atomes’de carbone à chaque étape de la synthèse. Ils se caractérisent par le nombre de carbones de la chaîne latérale et le nombre, la position et la conformation (cis ou trans) des éventuelles doubles liaisons. Les familles’dacides’gras’insaturés’se’distinguent’entre’elles’par’la’position’de’la’premiμre’double’ liaison’par’rapport’δ’lextrémité’méthyle’(dernier’carbone)’comme’expliqué dans la Figure I-13. Dans’notre’travail,’nous’avons’choisi’dutiliser’la’dénomination’n-x (x correspondant au premier carbone’portant’la’double’liaison’en’partant’de’lextrémité’méthyle)’également’appelée’oméga’ (ω).

9 6 5 4 3 2 1 premier carbone Δ9

dernier carbone 1 2 3 7 ω7 n-7

Figure I-13 : Illustration des différentes’ dénominations’ dun’ acide’ gras.

Exemple’de’lacide’palmitoléique C16:1 n-7 ou C18:1ω7 ou C18:1Δ9

Il existe quatre familles -ou séries- majeures’dacides’gras : les séries n-3, n-6, n-7 et n-9 (Figure I-14).

1 Le terme lichénophage désigne les animaux (vertébrés ou invertébrés) se nourrissant de lichens. 19 Contexte général

Figure I-14 : Voies de biosynthèse simplifiée des acides gras insaturés. Δx’=’désaturase (x correspond à la position où la double liaison cis est insérée ;’’=’élongase.’ (adapté’daprès Vu et al. 2016)

Les acides gras libres sont présents en petites quantités dans les tissus et sont dans la nature fixés à des squelettes de type glycérol (triglycérides), glycérol-3-phosphate (phospholipides), stérols’(stérides),’doses’ou’de’sucres’aminés’(glycolipides)(Vu 2014). Dans ce travail, nous nous intéresserons uniquement aux acides gras provenant de la dégradation des triglycérides et des phospholipides contenus dans les lichens étudiés. Les phospholipides sont impliqués dans la structure membranaire des lichens alors que les triglycérides’ont’un’rôle’de’réserve.’Afin’de’savoir’quelle’était’la’proportion’dacides’gras’issus’ des phospholipides et des triglycérides, nous avons réalisé une expérience préliminaire sur le lichen Stereocaulon vesuvianum (Protocole expérimental en Annexe A). Les résultats obtenus mettent en évidence que la majorité des acides gras quantifiés dans le lichen sont largement issus’de’phospholipides,’δ’lexception du C12:0 et du C16:1 n-9, où la répartition entre les 2

20 Contexte général groupes structuraux est équivalente, et du C20:4 n-6 ainsi que du C24:0, majoritairement issus de triglycérides (Figure I-15).

100% TG 80% PL

60%

40%

20%

Proportion de PL Proportion PL de TG et 0%

Acides gras

Figure I-15 : Répartition des acides gras entre Phospholipides (PL) et Triglycérides (TG) dans le lichen Stereocaulon vesuvianum. Données personnelles.

21 Contexte général

2 Les Gastéropodes

Les Gastéropodes appartiennent au clade des Mollusques et sont divisés en trois taxons (Figure I-16). Les Prosobranches et Opisthobranches regroupent des espèces aquatiques, alors que les Pulmonés comprennent des espèces dulcicoles (Basommatophores) et terrestres (Stylommatophores). Les Stylommatophores présentent la caractéristique de posséder les yeux au sommet de leurs tentacules postérieurs (Figure I-17). Nous traiterons uniquement des Gastéropodes terrestres qui incluent les escargots et les limaces.

Figure I-16 : Arbre phylogénique des Mollusques actualisé par M. HERVÉ à partir de données moléculaires. https://sites.google.com/site/systematiquemetazoaires

2.1 Organes sensoriels

Les Gastéropodes’sont’dotés’dun’nombre’trμs’importants’de’neurones’participant’δ’la’ détection de stimuli chimiques, ce nombre dépasse largement celui de toute autre fonction sensorielle et pourrait même représenter plus de la moitié de la population entière de neurone dun’individu’(Luchtel et al. 1997).’Lolfaction’est’le’sens’principal’pour’la’perception’des’signaux’ environnementaux à distance (Chase 1986). En effet, les Gastéropodes terrestres ne possèdent pas de structures capables de détecter les sons (Chase 2001). De plus ils ne peuvent généralement pas discriminer les objets par la vision. Les yeux sont utilisés pour la phototaxie négative, entraînant les cycles circadiens (Hamilton and Winter 1984). Les structures anatomiques impliquées dans la recherche alimentaire sont les tentacules postérieurs et antérieurs, les lèvres et la sole pédieuse (Figure I-17).

22 Contexte général

Figure I-17 : Photo de Helix pomatia montrant la position des tentacules antérieurs et postérieurs, des lèvres, des yeux et de la sole pédieuse. Photographie https://goo.gl/images/wu4b9H.

Les escargots possèdent quatre tentacules : deux tentacules postérieurs ou oculaires, où lorgane’olfactif’est’situé’en’dessous’de’lœil,’’et’deux’tentacules’antérieurs’ou’buccaux’(Figure I-18).’ Grâce’ δ’ ces’ tentacules,’ les’ escargots’ sont’ capables’ de’ sorienter,’ soit’ par’ des’ signaux’ olfactifs présents dans’lair’(anémotaxie)’via’les’tentacules’postérieurs,’soit’en’suivant’des’traces’ gustatives’(notamment’de’mucus)’δ’laide’de’ses’tentacules’buccaux’(Chase and Croll 1981). Les lèvres et la sole pédieuse (ou pied) sont également des structures chémosensibles qui reconnaissent des signaux chimiques par contact direct (Croll 1983).’Linformation’est’transmise’ de manière directe ou indirecte au’ganglion’cérébral’qui’va’lintégrer’et produire une réponse motrice.

Figure I-18 : Anatomie’ dun’ tentacule’ postérieur’ descargot permettant la perception des signaux olfactifs. Schéma modifié daprμs’Chase (1986)

23 Contexte général

Ce système olfactif bien développé joue un rôle important dans la recherche alimentaire (Chase et al. 2001). Les odeurs influencent le comportement locomoteur des Gastéropodes, et ces derniers se dirigent en direction des odeurs leur paraissant attractives (Kiss 2017). De nombreux travaux recensés par Kiss (2017) montrent que les Gastéropodes sont capables de distinguer une nouvelle’odeur’dune’odeur’familiμre grâce à ses tentacules postérieurs. La recherche alimentaire passe également par le suivi de trace, via les signaux chimiques pouvant être contenu dans le mucus, reçu par les tentacules antérieurs et les lèvres. Dans ce travail, nous ne nous intéresserons quaux’signaux’chimiques’liés’δ’la’gustation,’et’létude’des’composés’organiques’volatils ne sera pas abordée.

2.2 Mucus

2.2.1 Les différents types de mucus et leur composition.

Le’mucus’est’constitué’de’plus’de’85%’deau,’et’sa’composition’diffμre’selon’lespμce’étudiée,’la’ saison’et’lalimentation.’Il’en’existe’plusieurs’types,’de’composition’et de teneur variables en eau (Ng et al. 2013) : ❖ Le mucus de locomotion est produit par le pied, au niveau des cellules sécrétrices de mucus. Il permet aux Gastéropodes de se déplacer tout en restant fixés à leur substrat (Denny 1980). Il est constitué de protéoglycanes (≈10%)’et’dun’mélange’de’sucres’simples’ et complexes (≈90%). ❖ Le mucus’dadhérence, permet aux Gastéropodes une fixation sur un plan horizontal ou vertical, plus efficace que le mucus de locomotion. Il est également plus visqueux et possède la capacité de se rigidifier de manière plus marquée que le mucus locomotion. Au niveau de sa composition, la proportion de protéoglycanes est plus importante que dans mucus de locomotion, mais la différence essentielle réside dans la présence de petites protéines dites protéines’agglutinantes,’jouant’un’rôle’majeur’dans’ladhérence’ (Smith 2006). Les propriétés adhésives du mucus sont pH dépendantes, et augmentent avec la basicité (Newar and Ghatak 2015). Des ions métalliques sont également présents et responsables de ladhérence. ❖ Le mucus oral est’ produit’ par’ les’ glandes’ salivaires,’ et’ se’ compose’ denzymes’ et’ danticorps.’ Il’ joue’ un’ rôle’ dans’ la’ digestion.’ De’ nombreuses’ cellules’ de’ mucus’ sont’

24 Contexte général

observées tout le long du système digestif des Gastéropodes terrestres, permettant une lubrification du bol alimentaire (Charrier 1995). ❖ Le mucus de stress est plus fréquemment observé chez les limaces, qui ne possèdent pas de coquille. Il leur apporte un moyen de défense contre les prédateurs (Mair and Port 2002; Aguiar and Wink 2005). De plus, certaines espμces’descargots,’comme’lespμce’ Helix aperta peuvent’également’produire’une’grande’quantité’de’mucus’lorsquelles’sont’ stressées (Breure 2015). Ce mucus est enrichi en eau, ce qui entraîne une diminution de ladhérence,’permettant’ainsi’aux’Gastéropodes’daugmenter’leur’vitesse’de’déplacement’ et/ou de se dégager de leur prédateur (Ng et al. 2013).

2.2.2 Rôles du mucus

Le mucus de locomotion va fournir de nombreuses informations aux Gastéropodes. Parmi les comportements liés au mucus, le suivi de trace laissée par la sole pédieuse est très important chez les escargots et les limaces. Les tentacules antérieurs et postérieurs permettent la reconnaissance de signaux émis par des individus conspécifiques ou interspécifiques. Ces informations peuvent être à la fois chimiques et/ou physiques. Cook (2001) décrit trois types de mécanismes de suivi des traces par les gastéropodes, dont deux impliquant le mucus : - la structure même de la trace de mucus qui peut contenir des fibres (Denny 1983), apportant une information directionnelle. - la’composition’chimique’de’la’trace,’avec’lapparition’dun’gradient’au fur et à mesure de la dégradation des métabolites sécrétés. - le’chémoréception’δ’distance’dinformations’chimiques’volatiles.’

Les principales fonctions du suivi de traces peuvent être classées en quatre catégories : le retour’ δ’ la’ parcelle’ dhabitat, la localisation des partenaires,’ lagrégation,’ qui’ permet’ aux’ individus’ de’ se’ protéger’ de’ la’ dessiccation’ et’ déventuels’ prédateurs,’ et’ la’ nutrition et la conservation’de’lénergie (Ng et al. 2013). La production de mucus étant extrêmement coûteuse en énergie, les Gastéropodes doivent’léconomiser,’ce’qui’sobserve’notamment’par’le’suivi’de’ traces de mucus déjà existantes. De plus, grâce aux informations contenues dans le mucus, les Gastéropodes’ peuvent’ obtenir’ des’ informations’ sur’ la’ direction’ δ’ suivre’ lors’ de’ lactivité’ nutritionnelle’ou’la’recherche’dun’partenaire’sexuel.

25 Contexte général

La présence de substances allélochimiques dans le mucus peut également être un avantage’dans’la’recherche’trophique.’Par’exemple,’une’phytohormone,’lacide’salicylique,’est’ détectée dans le mucus de la limace grise Deroceras reticulatum, ravageur de culture (Kästner et al. 2014).’ Ce’ métabolite’ est’ un’ inhibiteur’ de’ la’ voie’ de’ lacide’ jasmonique’ chez’ les’ plantes,’ entraînant une diminution des défenses de la plante et par conséquent une augmentation de sa consommation par la limace.

2.3 Le comportement de recherche alimentaire

La séquence comportementale menant les Gastéropodes terrestres de la phase de locomotion’δ’linitiation puis à la conclusion de la prise alimentaire est schématisée dans la Figure I-19 (Speiser 2001). Au début de la phase pré-ingestive, la perception de signaux volatils va orienter le Gastéropode dans sa recherche alimentaire. Des travaux sur’lescargot’petit-gris (Cornu aspersum) mettent en évidence la perception à distance des signaux provenant de la source’ alimentaire,’ et’ que’ lescargot’ est’ capable’ den’ évaluer’ la’ qualité,’ afin’ de’ limiter’ les’ mouvements’ dexploration’ coûteux’ et’ de’ ne’ sorienter que vers des parcelles contenant des plantes appétentes (Dahirel et al. 2015). Par la suite, les Gastéropodes traitent différentes informations provenant de la source alimentaire ou de leurs besoins nutritifs, leur permettant de contrôler’ la’ quantité’ daliments’ ingérés’ durant’ la’ phase’ ingestive’ et’ dinfluencer’ leur’ comportement’ alimentaire’ lors’ dune’ rencontre’ ultérieure’ de’ laliment’ (Figure I-19 ; Speiser 2001).’ Les’ Gastéropodes’ possμdent’ des’ facultés’ dapprentissage’ (Croll and Chase 1977; Desbuquois and Daguzan 1995) qui leur permettent de diminuer leur temps de réponse et/ou de rejeter des aliments toxiques ou répulsifs (Speiser 2001).

26 Contexte général

Figure I-19 : Description de la séquence comportementale menant les Gastéropodes terrestres de’la’locomotion’δ’linitiation’et’δ’la’conclusion’de’la’prise’alimentaire.’Les modifications de comportement alimentaire par apprentissage sont représentées par les flèches et les losanges en pointillés (Speiser 2001).

2.4 Digestion

2.4.1 Anatomie du système digestif

Chez’les’Gastéropodes,’lappareil’digestif’a’subi’une’torsion’δ’180°’lors’du’développement’ embryonnaire,’plaλant’lanus’δ’proximité’de’la’bouche.’Lanatomie’du’systμme’digestif’du’petit- gris Cornu aspersum est présentée en Figure I-20 et est décrite en détail par Charrier (1995). Le bulbe’buccal,’situé’sur’la’partie’ventrale’de’lanimal’permet’lingestion’des’aliments.’La’présence’ dune’langue’râpeuse’nommée’radula permet aux Gastéropodes de brouter les végétaux ou les animaux’quils’consomment.’Le’bulbe’buccal’se’poursuit’par’lœsophage’qui’se’renfle’en’jabot,’

27 Contexte général

permettant’ le’ stockage’ des’ aliments.’ Le’ jabot’ est’ longé’ de’ part’ et’ dautre’ par’ les’ glandes’ salivaires, dont’les’conduits’débouchent’dans’le’bulbe’buccal.’Lestomac’constitue’un’carrefour’ entre’les’canaux’provenant’de’la’glande’digestive,’le’jabot’et’lintestin.’Ce’dernier’est’étroitement’ lié à la glande digestive créant une zone anoxique où peut se développer un microbiote (Charrier et al. 2006),’et’revient’vers’lavant’pour’former’le’rectum’puis’lanus’(Charrier 1995). La glande digestive’est’lorgane’le’plus’volumineux’du’corps’des’Gastéropodes’terrestres.’Elle’est’constituée’ de deux lobes communiquant avec la cavité gastrique. Elle est responsable de la production des enzymes’digestives,’de’labsorption’des’nutriments,’de’lendocytose’et’du’stockage’des’aliments,’ ainsi’que’de’lexcrétion’(Dimitriadis 2001). Charrier and Brune (2003) ont mis en évidence que le’ pH’ au’ sein’ du’ tractus’ digestif’ de’ trois’ espμces’ descargots’ (Cornu aspersum, Elona quimperiana, et Helix pomatia)’tend’vers’la’neutralité,’allant’dun’pH’acide’(5,″’- 6,1) au niveau du jabot à un pH compris entre 6,3 et 7,1 au niveau du rectum. Le pH des glandes salivaires et de la glande digestive se situe autour de 7,2 et 6,5 respectivement.

Figure I-20 : Anatomie du système digestif de Cornu aspersum. Schéma de M. Charrier

2.4.2 Digestion et métabolisme

Le bulbe buccal reçoit les sucs produits par les glandes salivaires (Charrier 1995) qui ont un rôle lubrificateur et sécrètent certaines glycanases initiant la dégradation des aliments (Charrier and Rouland 1992). Le bol alimentaire passe ensuite dans’lœsophage’et’le’jabot,’qui’ ont’un’rôle’dans’le’stockage,’la’digestion’extracellulaire’et’labsorption’des’aliments.’La’présence’

28 Contexte général de’ cellulases’ et’ destérases’ en’ quantité’ importante’ suggμre’ que’ les’ lipides’ et’ les’ sucres’ sont’ absorbés à ce niveau du tube digestif (Jeuniaux 1954; Flari and Charrier 1992). La digestion extracellulaire’ se’ poursuit’ dans’ lintestin alors que la glande digestive assure une digestion intracellulaire’des’particules’les’plus’fines’par’laction’dhydrolases’lysosomiales’(Charrier 1995). Au’niveau’de’lintestin,’des’peptidases’permettent’la’récupération’dacides’aminés.’Aux déchets intestinaux’évacués’′4h’aprμs’la’prise’alimentaire’viennent’sajouter’au’bout’de’″6h’(moyennes)’ ceux produits par la glande digestive (Charrier and Lesel 1991).

Les Gastéropodes terrestres, qui sont majoritairement phytophages, sont les seuls animaux à pouvoir dégrader la cellulose native grâce à des glycosidases (exocellulase et exo-ßD- glucosidase) sécrétées au niveau du jabot (Charrier and Rouland 1992). Le microbiote intestinal complète la dégradation des glycosides grâce à des bactéries fermentaires et acétogènes (Charrier et al. 2006).

Les Gastéropodes terrestres montrent des préférences alimentaires liées à la teneur des végétaux ou champignons en métabolites spécialisés, tels que les alcaloïdes (Chevalier et al. 2000; Aguiar and Wink 2005), les terpènes (Linhart and Thompson 1995) et les glucosinolates (Glen et al. 1990). Certains de ces métabolites sont évités par les autres phytophages, du fait de leur potentielle toxicité. La capacité à consommer ces métabolites spécialisés par les Gastéropodes est’due’δ’la’présence,’entre’autre,’dun’systμme’de’détoxication’puissant’et’inductible,’comme’ cela a été montré pour la limace Arion lusitanicus, capable de dégrader les alcaloïdes neurotoxiques retrouvés dans les végétaux supérieurs du genre Papaver, Lupinus et Solanum (Aguiar and Wink 2005).’La’capacité’δ’éliminer’les’substances’toxiques’suite’δ’lingestion’est’ assurée par des enzymes situées dans la glande digestive chez les Mollusques (Livingstone et al. 1989). Ces enzymes microsomales sont réparties en deux groupes : - les enzymes de phase I permettent une fonctionnalisation des molécules liposolubles grâce’δ’des’réactions’doxydation,’de’réduction’ou’dhydrolyse,’afin’de’faciliter’leur’élimination.’’ Un grand nombre des réactions de phase I sont catalysées par les enzymes du cytochrome P450. - les enzymes de phase II catalysent la conjugaison des métabolites issus de la dégradation de phase I, ou bien les molécules ingérées contenant déjà les groupements fonctionnels permettent la conjugaison. Les réactions de conjugaison résultent du transfert sur un groupe fonctionnel’ de’ la’ molécule’ dun’ composé’ de’ type’ glutathion,’ acide’ glucuronique’ (glucuronoconjugaison), sulfate (sulfoconjugaison), méthyle (alcylation) ou acétyle (acétylation).

29 Contexte général

3 Coepts d’Eologie hiiue : interaction lichens- lichénophages

Les lichens, bien que pauvres en protéines (2 à 3 %), peuvent fournir des ressources considérables pour les animaux lichénophages. En effet, dans certains écosystèmes ils représentent’lunique’source’de’glucides’quand’les’plantes’ne’sont’pas’accessibles,’et’certaines’ espèces lichéniques possèdent un contenu en azote important (> 5%) (Richardson and Young 1977; Rundel 1978). Les lichens constituent’par’exemple’lunique’ressource’trophique’pour’les’ rennes’et’les’caribous’lhiver’dans’les’toundra’arctiques’(Brodo et al. 2001; Hyvärinen et al. 2002; Joly et al. 2009). Un certain nombre despμces’parmi’les’Collemboles, Acariens, Coléoptères, Isopodes et Gastéropodes viennent’également’se’nourrir’de’lichens,’sen’servant’parfois’même’ comme abri (Gerson 1973; Baur and Baur 1997). Il a été mis en évidence que les préférences alimentaires des Gastéropodes sont espèces dépendantes (Baur et al. 1994; Gauslaa 2005; Černajovε’and’Svoboda’′014;’Boch’et’al.’′015b). Asplund and Wardle (2013) ont mis en relation la’consommation’par’des’gastéropodes’généralistes’et’les’traits’fonctionnels’des’lichens.’Il’savμre’ que les escargots préfèrent les lichens fruticuleux aux lichens foliacés, et au sein des lichens fruticuleux, ceux associés à une algue verte plutôt que ceux associés à une cyanobactérie (cyanolichens ou lichens tripartites). Les lichens crustacés sont également broutés par les escargots (Fröberg et al. 1993; Baur et al. 1994; Fröberg et al. 2006, 2011), et certaines espèces de gastéropodes ont su adapter leur radula à la consommation de lichens endolithiques2 (Baur et al. 2000). Lors’ dune’ attaque’ par’ un’ phytophage,’ les’ végétaux’ supérieurs’ peuvent’ émettre des phytohormones qui initient la biosynthèse de métabolites spécialisés pouvant repousser les phytophages (Kästner et al. 2014; Falk et al. 2014). Ce bouquet de métabolites émis par la plante (généralement des composés organiques volatils) est variable en fonction du phytophage consommant la plante (Danner et al. 2017). Certains Gastéropodes phytophages, inhibent cette réponse’ induite’ grâce’ δ’ la’ présence’ dans’ leur’ mucus’ dallomones’ agissant’ sur’ la voie de biosynthèse des défenses chimique de la plante (Kästner et al. 2014). Orrock (2013) a mis en évidence que des plants de moutarde (Brassica niger), non attaqués mais précédemment mis en contact avec du mucus et des fèces de Cornu aspersum sont moins appétentes que des plants

2 Le terme endolithique caractérise’un’thalle’crustacé’qui’se’développe’δ’lintérieur’dune’roche,’seules’les’structures’ reproductrices du mycobiote sont visibles à la surface de la roche. 30

Contexte général nayant’jamais’été’en’contact’avec’lescargot.’Ces’résultats’montrent’que’des’kairomones’sont’ contenues’dans’le’mucus,’et’quδ’leur’contact,’la’plante’active’ses’moyens’de’défense même lorsquelle’nest’pas’consommée. Contrairement aux végétaux supérieurs, les défenses lichéniques sont constitutives et non induites par la consommation du thalle par les lichénophages (Asplund et al. 2009; Lawrey 2009). Face au nombre important de prédateurs, les lichens, qui ont une croissance lente, ont dû sadapter’ et’ mettre’ au’ point’ une’ série’ de’ défenses’ chimiques’ que’ nous’ allons’ maintenant’ détailler.

3.1 Protection des lichens contre les lichénophages

Le rôle répulsif, voire toxique, des métabolites lichéniques est suggéré pour la première fois à la fin du XIXème siècle dans les travaux de Zukal (1895), puis quelques années plus tard, Stahl (1904) a’ mis’ en’ évidence’ une’ augmentation’ de’ lappétence’ des’ lichens’ pour’ Cepaea hortensis lorsque’les’métabolites’spécialisés’étaient’retirés’δ’laide’dune’solution’de’bicarbonate.’ Plus récemment, de nombreux autres travaux ont porté sur les interactions existant entre les lichens et les invertébrés lichénophages en particulier les insectes (Slansky 1979; Stephenson and Rundel 1979; Emmerich et al. 1993; Giez et al. 1994; Hesbacher et al. 1995b, 1996; Nimis and Skert 2006; Asplund et al. 2015; Bokhorst et al. 2015) mais aussi et surtout les Gastéropodes (Yom-Tov and Galun 1971; Lawrey 1980, 1983, Baur et al. 1994, 1995; Hesbacher et al. 1995a; Baur et al. 2000; Fröberg et al. 2001; Benesperi and Tretiach 2004; Gauslaa 2008; Asplund and Gauslaa’′010;’Asplund’et’al.’′010b;’Asplund’′011a;’Černajovε’and’Svoboda’′014;’Boch’et’al.’ 2015b; Asplund et al. 2016). Les animaux évitent généralement les sources de nourritures contenant des métabolites spécialisés lichéniques. Les lichens naturellement pauvres en métabolites spécialisés sont dans la plupart des cas préférés à ceux comptant des taux élevés de métabolites (Benesperi and Tretiach’′004;’Černajovε’and’Svoboda’′014). De même, Asplund and Gauslaa (2010) ont observé chez la limace Arion fuscus nourrie du lichen tripartite Nephroma arcticum, une consommation plus importante des céphalodies, dépourvues de métabolites spécialisés, par rapport au reste du thalle. Plus que la quantité totale en métabolites, la nature de ces derniers se révèle être le véritable facteur conduisant à la discrimination des différentes espèces lichéniques. Lors de la dégradation’accidentelle’dune’partie’de’lherbier’de’lichens’de’luniversité’de’Trieste’en’Italie,’ les lichens contenant comme métabolites’ spécialisés’ majoritaires’ lacide’ usnique’

31 Contexte général

(dibenzofurane),’latranorine’(depside)’ou’encore’de’lacide’fumarprocétrarique’(depsidone)’sont’ délaissés par le coléoptère lichénophage Lasioderma serricorne, contrairement aux lichens dépourvus de métabolites spécialisés (Nimis and Skert 2006). De même, il existe deux chémotypes3 du lichen Lobaria pulmonaria qui diffèrent’entre’eux’par’la’présence’ou’non’dacide’ stictique’ comme’ métabolite’ spécialisé’ majoritaire.’ Lorsquils’ sont’ confrontés’ aux’ deux’ chémotypes,’les’escargots’préfμrent’les’thalles’ne’contenant’pas’dacide’stictique,’suggérant’par’ conséquent un potentiel rôle répulsif de ce dernier (Asplund 2011b). Lorsque’ les’ invertébrés’ sont’ forcés’ de’ salimenter’ sur’ des’ lichens’ contenant’ des’ métabolites spécialisés, des modifications morphologiques et de longévité peuvent être observées (Slansky 1979; Giez et al. 1994; Pöykkö et al. 2010). Chez les Gastéropodes, la croissance des juvéniles de Balea perversa et Chondrina clienta, coexistant dans les mêmes milieux, diffère en fonction du lichen consommé, et pour chacune des deux espèces, le taux de croissance le plus important est observé lorsque les escargots sont nourris avec leur espèce préférée (Baur et al. 1994).

La’ mise’ au’ point’ de’ la’ technique’ de’ rinλage’ δ’ lacétone’ a’ permis’ une’ meilleure’ compréhension des interactions lichens/invertébrés. Ce protocole mis au point par Solhaug and Gauslaa (2001) permet’dextraire’facilement les métabolites spécialisés qui sont généralement retrouvés sous forme de petits cristaux extracellulaires à la surface des hyphes du champignon. Lacétone’ présente’ lavantage’ de’ ne’ pas’ traverser’ les’ membranes’ cellulaires’ du’ photobiote’ lorsque’le’lichen’est’δ’létat’sec.’Lacétone’savμre’être’le’meilleur’solvant’testé’par’les’auteurs,’ permettant’δ’la’fois’la’survie’du’lichen’et’lextraction’dun’grand’nombre’de’métabolites. En effet, entre 13 et 97 % des composés situés dans le cortex et plus de 95% des composés situés dans la médulle peuvent être extraits grâce à cette technique (Asplund et al. 2015). De plus, il a été mis en’ ’ évidence’ quun’ tel’ traitement’ naltμre’ pas’ lappétence’ éventuelle des lichens utilisés à condition’de’laisser’les’traces’de’solvant’sévaporer’complétement’(Pöykkö et al. 2005). Cette technique’permet’ainsi’dévaluer’limpact véritable des métabolites spécialisés et solubles dans lacétone’ vis-à-vis des lichénophages. La réimplantation dans les milieux naturels de lichens débarrassés de leur métabolites a entraîné une augmentation des communautés de

3 Un chémotype désigne’δ’lintérieur’dune’même’espμce’lichénique’les’groupes’dindividus’qui’diffμrent’par’la’ présence’ou’labsence’dun’ou’plusieurs’métabolites’spécialisés,’sans’quil’ny’ait’de’différences’macroscopiques ou 32 microscopiques entre eux.

Contexte général microarthropodes lichénophages ainsi que des prédateurs de ces derniers (Araignées) (Asplund et al. 2015). Les Gastéropodes terrestres sont régulièrement utilisés comme’modμles’détude’dans’ les’expériences’de’rinλage’δ’lacétone’(Gauslaa 2005, 2008; Asplund et al. 2010b; Asplund and Wardle’′01″;’Černajovε’and’Svoboda’′014; Boch et al. 2015b; Asplund et al. 2016). Dans la majorité des cas, la consommation augmente après extraction des métabolites spécialisés. Boch (2015)’nobserve’cependant’quun’impact’limité’de’cette’technique’sur’la’masse’de’lichen’mangé.’ Sur 24 lichens testés, seules cinq espèces sont plus consommées après rinçage et fait intéressant, pour deux espèces (Graphis scripta et Lecanora expallens), le lichen intact est préféré au lichen traité.

Précédemment nous avons vu que les métabolites spécialisés possédaient une localisation sectorielle au sein du thalle en fonction de leur rôle potentiel face aux stress biotiques et abiotiques (Solhaug et al. 2009). Les composés actifs contre les lichénophages sont souvent décrits comme les composés ayant une localisation médullaire (Rundel 1978; Lawrey 2009; Solhaug et al. 2009). En effet, Asplund (2011a) a démontré que les escargots consommaient perpendiculairement le thalle de Lobaria pulmonaria et L. scrobiculata (du’ cortex’ jusquδ’ la’ médulle)’aprμs’rinλage’δ’lacétone,’alors’quen’présence’de’métabolites ces derniers se limitaient au cortex et à la couche algale, laissant intacte la médulle. Une localisation spécifique de certains métabolites peut également se faire en fonction de la nature végétative ou reproductrice du thalle, en accord avec la théorie de défense optimale.

3.1 La Théorie de Défense Optimale (ODT)

3.1.1 Concept général chez les végétaux supérieurs

La’théorie’de’défense’optimale’prédit’la’répartition’des’métabolites’de’défense’dune’ plante, proportionnellement au risque pour le tissu végétal’ dêtre’ attaqué’ ,’ selon’ la’ valeur’ biologique de la partie menacée et le coût de cette défense (McKey 1974). Respectant cette théorie, les jeunes feuilles sont généralement plus protégées chimiquement car elles contribuent de manière plus importante au développement de la plante et leur probabilité’dêtre’attaquées’ par des phytophages est plus importante, comparativement aux tissus plus anciens (Figure I-21) (Meldau et al. 2012). De même, les fleurs et les fruits, qui ne peuvent pas être aussi facilement remplacés que les tissus végétatifs sont généralement plus protégés chimiquement contre les attaques de phytophages (Keith and Mitchell-Olds 2017). Cependant les fleurs et les fruits étant

33 Contexte général

en contact direct avec les polinisateurs et les disséminateurs, il peut exister un compromis entre la toxicité de ces parties et lintérêt’nutritionnel’pour’les’pollinisateurs’et’les’disséminateurs’afin’ de favoriser la dispersion tout en évitant les attaques de phytophages (Meldau et al. 2012).

Figure I-21 : Prédiction’de’lallocation’des’défenses’chimiques’de’la’plante,’en’fonction’de’la’ valeur des tissus pour la plante, selon la théorie de défense optimale (ODT). La concentration en métabolites des jeunes feuilles (en rouge) est généralement plus importante que dans les feuilles matures (en vert). Les organes reproducteurs (fleurs et fruits) ont un rôle essentiel pour le développement de la plante, cependant ils sont en contact direct avec les polinisateurs et les disséminateurs, pouvant entraîner la mise en place de défenses chimiques spécifiques. Schéma’modifié’daprμs Meldau et al. (2012).

3.1.2 L’ODT hez les lihes

Les lichens étant des organismes à croissance très lente, la théorie de la défense optimale a également été abordée dans différents travaux,’ du’ fait’ de’ limportance’ des’ parties’ reproductrices pour la valeur sélective du lichen. Hyvärinen et al. (2000) ont étudié la variation intrathalline du contenu en métabolites spécialisés entre les parties reproductrices et les parties végétatives de trois espèces de lichens foliacés. Ils ont montré que la concentration en composés phénoliques est plus importante dans les thalles sorédiés, comparativement aux thalles non sorédiés de Vulpicida pinastri et Hypogymnia physodes et que les apothécies de Xanthoria parietina contiennent également plus de métabolites que le reste du thalle lichénique. De même,

34 Contexte général le lichen Pseudocyphellaria crocata localise’spécifiquement’un’dérivé’de’lacide’pulvinique,’la’ calycine, au niveau de ses sorédies jaunes, entraînant un évitement de consommation de ces parties par certains Gastéropodes lichénophages (Gauslaa 2008). Boch et al. (2015), décrivent également une protection moins importante des parties végétatives par rapport aux parties reproductrices (apothécies et périthèces). Dans les travaux de Asplund et al. (2010b) sur le lichen Lobaria pulmonaria,’ avant’ rinλage’ δ’ lacétone’ les’ auteurs’ observent’ un’ évitement’ de’ la’ consommation par les gastéropodes des sorédies, cinq fois plus riches en m-scrobuline que le thalle végétatif. Après rinçage, les sorédies débarrassées de leurs métabolites sont significativement plus consommées que le reste du thalle. En reliant les concentrations en métabolites à la consommation par les lichénophages, ces résultats mettent en évidence que le lichen alloue’ dimportantes’ quantités’ de’ métabolites’ aux’ parties’ du’ lichen’ ayant’ le’ plus’ dimportance’dans’la’valeur’sélective’du’lichen,’et’valide’lODT’pour’les’lichens’(Asplund et al. 2016).

3.2 L’hypothèse de l’uilie aoe-azote (CNB)

Une’autre’approche’permettant’dexpliquer’une’allocation’plus’ou’moins’importante’en’ métabolites’spécialisés’est’lhypothμse’de’léquilibre’carbone-azote. Ce modèle suppose que les métabolites’ de’ défense’ dune’ plante sont produits en réponse aux variations de nutriments présents’ dans’ lenvironnement’ cest-à-dire que le ratio carbone/azote (C/N) des plantes détermine la diversité des métabolites spécialisés qui vont être synthétisés (Herms and Mattson 1992). Suivant ce modèle, une plante poussant dans un milieu riche en azote devrait produire des métabolites spécialisés azotés, contrairement à une plante poussant dans un milieu pauvre en azote. Un contenu élevé en azote est également un bon facteur prédictif des qualités nutritives dune’plante’pour’un’phytophage’ (Mattson 1980) et par conséquent une consommation plus importante est attendue sur les lichens riches en azote. Cependant Asplund and Wardle (2013) nont’observé’aucune’corrélation’entre’la’teneur’en’azote’du’thalle’et’la’consommation’par’les’ lichénophages. Selon Rundel (1978), les différents types de défense chimique du lichen sont des réponses à des variations du’niveau’de’nutriments’disponibles’dans’lenvironnement. Par exemple, un chlorolichen poussant dans des milieux pauvres en azote, va présenter une diversité importante en depsides et depsidones. Les faibles teneurs en azote et le nombre important de ses métabolites

35 Contexte général

spécialisés entraînent une faible prédation de ces espèces. Au contraire, lorsque les teneurs en azote sont élevées, notamment pour les lichens tripartites et les cyanolichens qui sont capables de’fixer’lazote’atmosphérique,’une’faible’diversité en depsides et depsidones voire une absence de ces métabolites est observée. Une forte prédation est attendue, or certaines de ces espèces lichéniques sont évitées par les lichénophages (Figure I-22). Ce phénomène peut’sexpliquer par une évolution de la chimie de ces taxons leur permettant de résister à la prédation, via par exemple la production de métabolites de type terpène ou des dérivés de’lacide’pulvinique, ces derniers ayant été classés comme de puissants répulsifs contre les lichénophages (Slansky 1979; Lawrey 1983; Gauslaa 2008).

Nature du photobiote Algue Cyanobactérie

Teneur en Elevée azote Faible Modérée ou élevée (capable de fixer l’azote) (Seuil 1%)

Diversité chimique (depsides et Elevée Faible Faible depsidones)

Dérivés de l’acide Terpènes pulvinique

Prédation Faible Faible Elevée Faible Elevée attendue Prédation observée

Figure I-22 : Possibles conséquences évolutives des métabolites spécialisés lichéniques. Schéma’modifié’daprμs’Rundel (1978)

Dans’ lespμce’ Cladina stellaris, contenant’ majoritairement’ de’ lacide’ usnique’ (dibenzofurane)’et’de’lacide’perlatolique’(depside),’les’teneurs’en’acide’usnique’sont’influencées’ par une augmentation de la fertilisation en azote, sans néanmoins de mise en évidence de corrélation linéaire, tandis que les teneurs en acide perlatolique restent inchangées (Hyvärinen et al. 2003).’Ces’observations’vont’δ’lencontre’de’lhypothμse’du’CNB.’Les’auteurs’rappellent’ cependant que ces deux métabolites sont issus de la voie des acétates-polymalonates (voir « 1.4.4 Les métabolites spécialisés : description et rôles au sein de la symbiose »), or aucun précurseur azoté’ nest’ impliqué’ dans’ cette voie. Respectant cette logique, les teneurs en composés

36 Contexte général phénoliques’ issus’ de’ la’ voie’ de’ lacide’ shikimique,’ comme’ les’ dérivés’ de’ lacide’ pulvinique’ devraient’augmenter’lors’de’laugmentation’en’azote’ce’qui’est’en’accord’avec’les’conséquences’ évolutives proposées par Rundel (1978) (Figure I-22). Ces observations sont confirmées par des expériences de rinçage δ’ lacétone. Les chlorolichens de la famille des Parmeliaceae en particulier, présentent une grande diversité en métabolites spécialisés et leur consommation augmente’significativement’aprμs’rinλage’δ’lacétone’(Gauslaa 2005), contrairement aux lichens collectés dans des milieux riches en azote, pauvres en métabolites spécialisés et dont la consommation’ par’ les’ lichénophages’ naugmente’ pas’ aprμs’ rinλage’ δ’ lacétone.’ Suivant’ la’ théorie’de’léquilibre’carbone’azote,’une’teneur’en’azote’élevée’et’un’faible taux de métabolites spécialisés carbonés implique la présence de métabolites de défenses azotés intracellulaires (Solhaug and Gauslaa 2012). Concernant la nature de ces métabolites spécialisés, plusieurs dentre’eux’ont’pu’être’isolés’de lichens telles que des lectines (Legaz et al. 2004; Silva et al. 2009) ou des mycosporines, présentes dans de nombreux cyanolichens (Roullier et al. 2011; Nguyen et al. 2015; Shukla et al. 2015).’La’pulvérisation’deau’de’pluie’enrichie’en’azote’sur’des’thalles’ lichéniques’ninduit’pas’une’diminution’de la production de métabolites spécialisés (Nybakken et al. 2009). En situation de choix entre des thalles enrichis artificiellement en azote et des thalles non’ traités,’ les’ gastéropodes’ broutent’ préférentiellement’ les’ lichens’ foliacés’ nayant’ pas’ été’ enrichis en azote (Asplund et al. 2010a).’En’sappuyant’sur’les’travaux’de’Gaio-Oliveira et al. (2005) qui’établissent’une’relation’entre’laccumulation’dazote’et’les’concentrations en polyols, Asplund et al. (2010a) suggèrent une éventuelle’diminution’de’lappétence’des’lichens’enrichis’ en’azote,’du’fait’de’la’diminution’de’laccumulation’de’polyols’au’sein’du’thalle.

37 Contexte général

4 Objectif et organisation de la thèse

Les interactions lichens/lichénophages sont guidées par la présence de métabolites au sein des lichens pouvant influencer les préférences alimentaires des lichénophages.

Pour approfondir nos connaissances sur les mécanismes mis en place lors de cette interaction,’nous’avons’choisi’détudier’les’préférences’alimentaires’de’lunique’Gastéropode terrestre endémique du Subantarctique, Notodiscus hookeri qui est lichénophage, sur lîle’de’la’ Possession (Archipel Crozet, Terres Australes et Antarctiques Françaises).

Après une description du site’détude’et’des’espμces’étudiées’(Chapitre II), la thèse se divisera en trois grandes parties. Dans la première, nous avons souhaité comprendre les mécanismes mis en place par lescargot pour gérer les métabolites spécialisés potentiellement toxiques et présents dans les lichens (Chapitre III).

Dans la deuxième partie, nous nous sommes interrogés sur la localisation des métabolites majoritaires (métabolites spécialisés et sucres-polyols) au sein du thalle des lichens. Dans cet objectif des techniques analytiques de pointe (Imagerie couplée à la spectrométrie de masse et/ou microdissection de tissus lichéniques) sont couplées à des expériences de comportement alimentaire (Chapitre IV).

N. hookeri est un lichénophage généraliste et opportuniste, capable également’dattaquer’ certaines parties des lichens de manière préférentielle. Par conséquent, dans la troisième partie le profilage global (métabolites spécialisés, sucres et polyols, polysaccharides, acides aminés, acides gras ainsi que la teneur en azote) des différentes’parties’dun’même’lichen’est réalisé. Lobjectif’est’de’distinguer’les’profils’chimiques’des’parties’consommées’de’celles’évitées par lescargot’ et’ didentifier les métabolites potentiellement phagostimulants et/ou répulsifs (chapitre V).

38

II. Site d’tude et matriels biologiques

Le Jardin Japonais et sa manchotière

Site’détude’et’matériels’biologiques

1 Site de l’tude : l’île de la Possession, Archipel Crozet

La zone subantarctique est comprise entre les latitudes 45°S et 54°S, la disparition des arbres et des arbustes correspond à la limite Nord de cette zone et la limite Sud correspond à la disparition des communautés phanérogamiques fermées (Frenot 1986). Les îles Subantarctiques’sont’généralement’dorigine’volcaniques’et de tailles variables.’Dans’locéan’ Austral, elles incluent les archipels de Crozet et Kerguelen, (France), Heard (Australie), Prince Edward et Marion (Afrique du Sud), South Georgia (Royaume-Uni) et dans’lAtlantique’Sud’ les îles Macquarie (Australie). Les îles Subantarctiques Néo-Zélandaises dans le Pacifique Sud appartiennent également à la zone biogéographique du subantarctique (Figure II-1). Larchipel’Crozet’appartient’aux’Terres’Australes’et’Antarctique’Franλaises’(TAAF)’ au’même’titre’que’larchipel’de’Kerguelen,’les’îles’de’Saint Paul et Amsterdam au sud de lOcéan’ Indien,’ la’ Terre’ Adélie’ en’ Antarctique’ et’ les’ îles’ Eparses’ autour’ de’ Madagascar.’ Laccμs’aux’districts’de’Crozet,’Kerguelen’et’Saint-Paul et Amsterdam ne se fait que par voie maritime, grâce aux 4 à 5 rotations annuelles du Marion Dufresne, au départ de la Réunion. Ces îles ne comptent aucun habitant permanent et le personnel scientifique (IPEV) ainsi que celui affecté à la base (TAAF) est renouvelé tous les ans. Les’ îles’ Crozet’ (45°68-46°′6’ S,’ 50°14-5′°15E)’ forment un ensemble de 5 îles volcaniques réparties en deux groupes :’les’îles’froides’δ’louest’(Cochon,’Pingouins’et’les’îlots’ des’Apôtres)’et’deux’grandes’îles’δ’lest,’lîle’de’la’Possession’et’lîle’de’lEst’(Frenot et al. 1989 ; Figure II-1).’ Le’ climat’ sur’ lîle’ de’ la’ Possession’ est’ caractéristique’ de’ la’ zone’ subantarctique,’cest-à-dire venteux et pluvieux, avec des températures annuelles moyennes de 5,3°C, ainsi que de légères variations saisonnières comprises entre 3,2 °C en hiver et 8,1 °C en été (Base Alfred Faure, enregistrements Météo France 1970-2010). Le vent souffle avec des rafales de plus de 100 km/h près de 120 jours par an, les précipitations annuelles enregistrées sont très importantes (2400 mm/an). Lîle’de’la’Possession’(46°′5S-51°51E)’est’une’île’stratovolcanique,’caractérisée’par’ une topographie montagneuse, dominée par le Pic du Mascarin, (930 m, deuxième sommet de lArchipel)’et’sétendant’sur’une’petite’distance’(18’km’de’longueur,’15’km de largeur, 150 km²).’Lisolement’géographique’et’les’conditions’environnementales’sont’responsables’dune’ biodiversité native’relativement’faible’mais’avec’un’certain’nombre’despμces’endémiques.’ En effet, parmi le relevé faunistique des espèces natives,’on’dénombre’une’trentaine’doiseaux’ marins’ et’ trois’ mammifμres’ marins’ qui’ viennent’ se’ reproduire’ sur’ lîle.’ Concernant’ les’

41 Site’détude’et’matériels’biologiques

invertébrés,’on’ne’dénombre’quune’trentaine’despμces’dont’lunique’Gastéropode’terrestre’ endémique’du’subantarctique,’lescargot Notodiscus hookeri (Charrier et al. 2013). Seules 24 espèces de plantes supérieures natives sont décrites à Crozet, mais il faut souligner au contraire’la’présence’de’nombreuses’espμces’dhépatiques,’de’mousses’et’de’lichens’(Frenot et al. 1989).’ Cependant,’ linstallation’ de’ la’ base’ Alfred’ Faure’ en’ 196″,’ a’ conduit’ δ’ lintroduction’de’nombreuses’despμces’invasives’(végétales’ou’animales)’pouvant’conduire’δ’ un déséquilibre de certains écosystèmes (Frenot et al. 2001).

Figure II-1 : Localisation de la zone biogéographique du subantarctique et présentation de lArchipel’Crozet.’La zone biogéographique du subantarctique est figurée en pointillés bleus. Lîle de la Possession fait partie des 5 îles’de’lArchipel Crozet. Figure modifiée daprμs’(Frenot et al. 1989).

42 Site’détude’et’matériels’biologiques

Dans’ notre’ étude,’ nous’ avons’ sélectionné’ 8’ sites,’ répartis’ sur’ lîle’ de’ la’ Possession’ (Figure II-2), qui peuvent se différencier en 2 groupes : les zones rocailleuses de fell-fields4 et les sites de plaines côtières.

Figure II-2 : Localisation’des’sites’détudes’et’des’infrastructures’sur’lîle de la Possession (Crozet). Les symboles correspondent aux infrastructures (la base (BAF) et les trois cabanes’ou’arbecs’permettant’ un’logement’temporaire’δ’ proximité’des’sites’détudes’ éloignés (BUS, PBAS, PER). Sur les sites représentés par un losange violet, les escargots collectés étaient de phénotype dit minéral alors que sur les sites représentés par un cercle vert,’le’phénotype’organique’était’présent.’ALOU’=’crête’de’lAlouette,’BAF’=’Basse’ Alfred Faure ; BRA = mont Branca ; BOUG = site de Bougainville ; BUS = Baie Américaine ; JJAP = Jardin Japonais ; MAS = pic du Mascarin ; PBAS = pointe Basse ; PER = arbec de la Pérousse ; TBLA = Tour Blanche.

Les sites de fell-fields sont’décrits’δ’partir’de’150’m,’où’laction’du’vent,’la’déficience’ en azote, entre autres, empêchent le développement de plantes vasculaires, mis à part des

4 Le terme fell-field se’ traduit’ littéralement’ par’ champ’ des’ montagnes’ rocheuses’ (Frenot’ 1986),’ et’ na’ pas’ déquivalent’en’franλais.’’ 43

Site’détude’et’matériels’biologiques

coussins’ dazorelle’ (Azorella selago) et des choux de Kerguelen (Pringlea antiscorbutica) présents’jusquδ’700’m’daltitude.’Dans’ces’milieux,’de’nombreuses’espμces’de’mousses’et’de’ lichens sont retrouvées (Ellis et al. 2012a, b, 2013b, a; Ertz et al. 2017b). Au sein des fell-fields, trois différents habitats peuvent être distingués : (a) le fell-field mésique situé au-delà de 150 m’ daltitude,’ dominé’ par’ les’ bryophytes (Sites de Bougainville, BOUG et de la crête de lAlouette,’ALOU),’(b)’les’fell-fields xériques au-dessus de 300 m (Sommet du mont Branca, BRA)’où’loccupation’par’les’lichens est maximale et (c) les fell-fields xériques’daltitudes,’ situés au-delδ’de’700’m’daltitude’(Pic’du’Mascarin,’MAS),’dépourvu’de’végétation’mis’δ’part’ certains lichens (Charrier et al. 2013).

Figure II-3 : Les sites de fell-fields de Bougainville (BOUG), du mont Branca (BRA) et du pic du Mascarin (MAS).

Le’site’de’la’Tour’Blanche’(TBLA)’présente’les’caractéristiques’dun’fell-field mésique, mais’ la’ présence’ dune’ tour’ constituée’ dorgues’ basaltiques en fait son originalité. Les escargots collectés à proximité de la tour blanche sont également différents de ceux ramassés dans les fell-fields.

44 Site’détude’et’matériels’biologiques

Figure II-4 : Site de la Tour Blanche. Les escargots et les lichens sont collectés à proximité des orgues basaltiques.

Les plaines côtières sont dominées par des plantes vasculaires (Poa cookii, Acaena magellanica) et des fougères (Blechnum penna-marina). Des bryophytes sont également présentes. Au niveau de la baie américaine (BUS), les escargots sont collectés’au’niveau’dune’ prairie à Acaena,’ alors’ quδ’ Pointe’ Basse’ (PBAS),’ les’ escargots’ sont collectés dans un affleurement’δ’proximité’dune’lande’de’Poacées’et’de’Blechnum.

45 Site’détude’et’matériels’biologiques

Figure II-5 : Les sites de plaine côtière BUS et PBAS. A droite, les escargots N. hookeri au milieu’des’tiges’dAcaena magellanica (BUS) et dans la terre sous une roche sur le site de PBAS.

Deux campagnes sur le terrain de deux mois, réalisées lors des étés austraux novembre - décembre 2015 et novembre - décembre’′016,’mont’permis’de’récolter’les’escargots’et’les’ lichens’nécessaires’δ’la’bonne’réalisation’des’expériences.’Une’partie’dentre’elles’est’réalisée’ sur’place,’soit’durant’les’campagnes’dété,’soit’avec’laide’de’Julien’Tommasino,’qui’a’passé’ un’ an’ sur’ lîle’ de’ la’ Possession’ dans’ le’ cadre’ dun’ hivernage’ scientifique,’ au’ sein’ du’ programme IPEV136 « Subanteco ».

46 Site’détude’et’matériels’biologiques

2 L’esagot du suatatiue Notodiscus hookeri : ote odle d’tude.

2.1 Taxonomie, distributio et iologie de l’espe

Phylum Mollusque

Classe Gastéropodes

Famille Charopidae

Genre Notodiscus

Espèce hookeri Photographie : J. Tommasino

Notodiscus hookeri est le seul gastéropode terrestre natif du subantarctique. Sa présence est décrite’sur’les’îles’Crozet,’Kerguelen,’Heard,’Marion’et’Prince’Edward’ainsi’quen’Géorgie’du’ Sud (Solem 1968; Smith and Steenkamp 1992; Pugh and Smith 2011). La présence limitée en Géorgie du sud à des falaises où nichent des oiseaux marins laisse supposer que la dispersion de’cette’espμce’sest’faite’par’les’oiseaux’(Pugh and Smith 2011). Cest’une’espμce’grégaire,’qui’est’présente’dans’tous’les’types’de’végétation’de’lîle’de’ la Possession, même au niveau des fell-fields’daltitude,’sous’de’petits’rochers’humides’(Solem 1968).’Sa’présence’dans’les’zones’daltitude,’où’la’végétation’vasculaire’a’disparu’indique’que’ sa principale ressource trophique doit se constituer de bryophytes et/ou de lichens (Charrier et al. 2013). Des’ expériences’ préliminaires’ ont’ démontré’ que’ lescargot’ est’ strictement’ lichénophage et que les bryophytes leur servent de refuge mais pas de ressources trophiques (Charrier, communication personnelle). Des variations morphologiques au niveau de la coquille ont été décrites pour des escargots’collectés’sur’lîle’de’la’Possession’et’δ’Kerguelen’(Madec and Bellido 2007), deux phénotypes ont été mis en évidence ; le phénotype minéral (PM) et le phénotype organique (PO) (Charrier et al. 2013).’ Ils’ se’ différencient’ par’ laspect,’ la’ forme,’ lépaisseur’ et’ la’ composition de leur coquille (Figure II-6). Dans la coquille minérale, une fine couche organique est observée au-dessus de la couche minéralisée. La coquille dite organique est plus souple et deux fois plus fine que la coquille minérale. La couche organique est constituée dune’ matrice’ protéique,’ composée’ essentiellement’ de’ glycine’ (+’ de’ 50%),’ de’ leucine,’ disoleucine et de valine.

47 Site’détude’et’matériels’biologiques

Figure II-6 : Morphologie et microarchitecture des coquilles chez l'escargot N. hookeri en fonction du phénotype. Les coupes transversales observées au microscope électronique à balayage montrent une deux couches, minérale et organique, dont les ratios différent en fonction des phénotypes.

Les lichens ne présentent pas une source de calcium suffisante pour la production dune’ coquille’ minéralisée’ mais’ il’ est’ démontré’ que’ N. hookeri puise une partie de ses nutriments par la consommation de sol (Smith and Steenkamp 1992). La répartition géographique de ces deux écophénotypes est en réalité fonction de la biodisponibilité en calcium sous forme de cations (Ca2+) dans les argiles (Charrier et al. 2013). Les escargots de phénotype organique (OP) sont retrouvés dans les fell-fields’ daltitude’où’ les’ argiles’ sont’ dépourvues de calcium alors que les escargots de phénotype minéral (MP) sont présents dans les zones de plaine, contenant des argiles riches en Ca2+ suite au lessivage des roches, mais également à proximité de la base Alfred Faure, où ils récupèrent le calcium dans le ciment de la route descendant à la Baie du Marin (Charrier et al. 2013). Le phénotype des escargots en fonction du site de collecte est précisé dans la Figure II-2. La’coquille’saccroît’durant’toute’la’vie’mais’aprμs’la’maturité’sexuelle’(diamμtre’de’ coquille’denviron’4’mm)’la’croissance’ralentit’considérablement.’Les’tailles’les’plus’grandes’ de coquilles ont été mesurées à 7,5-7,7 mm (Charrier et al. 2013).

48 Site’détude’et’matériels’biologiques

N. hookeri est’une’ espμce’hermaphrodite’ne’pondant’quun’seul’œuf’δ’la’fois’qui’ mettra près de 6 mois à éclore (Charrier and Piscart 2011).

2.2 Appareil digestif de Notodiscus hookeri et rythmes alimentaires

Lappareil’ digestif’ de’ N. hookeri montre’ quelques’ différences’ avec’ lanatomie’ du’ morphotype du système digestif des Hélicidés (Figure II-7), présenté dans le paragraphe « 2.4.1 Anatomie du système digestif »’de’ce’manuscrit.’Lœsophage’de’N. hookeri est allongé et se renfle pour former le jabot. Il est difficile de distinguer un compartiment distinct correspondant’δ’laire’de’tri’ou’« estomac ». Les glandes salivaires sont relativement grandes par’ rapport’ δ’ la’ taille’ de’ lanimal,’ mais’ la’ différence’ essentielle’ sobserve’ au’ niveau’ de’ lorganisation’de’la’glande’digestive’et’de’lintestin.’La’glande’digestive’est’massive’mais’ réduite’car’elle’nenrobe’pas’parfaitement’lintestin’par’rapport’δ’ce’qui’est’observé’pour’le’ morphotype.

Figure II-7 : Appareil digestif de Notodiscus hookeri. Dessin M. Charrier.

Des expériences préliminaires à nos travaux sur les choix alimentaires ont permis de mettre en évidence les rythmes circadiens de cette espèce. Les escargots sont observés pendant 48 heures à différent moments de la journée et leur activité (déplacement, nutrition et digestion) est reportée (Figure II-8). Les résultats montrent que N. hookeri est une espèce

49 Site’détude’et’matériels’biologiques

nocturne,’ un’ pic’ dactivité’ nutritionnelle’ étant’ observé’ la’ nuit,’ et’ au’ contraire’ un pic de digestion est observé la journée.

Figure II-8 :’Activité’nutritionnelle’de’lespμce’N. hookeri sur 48h. Expérience réalisée sur 72 escargots collectés sur le site BRA (M. Charrier, données non publiées).

3 Les lichens subantarctiques étudiés

La’biodiversité’lichénique’de’larchipel’Crozet’a’longtemps’été’peu connue. Dodge en 1948 a recensé 25 taxa appartenant à 21 genres différents (Galloway 2008). Néanmoins, une biodiversité bien plus importante est observée par Jean-Claude Massé lors de ses différentes missions sur le terrain entre 1975 et 1988. Les échantillons collectés lors de ces campagnes se trouvent’ dailleurs’ dans’ lherbier’ de’ lUniversité’ de’ Rennes’ 1.’ Malheureusement,’ Dodge’ refusant de collaborer’en’envoyant’les’échantillons’types’nécessaires’δ’lidentification’et’δ’la’ description’ déventuelles’ nouvelles’ espμces,’ ces’ informations’ nont’ pas pu être valorisées (Esnault et al. 2014). De vives critiques’ ont’ été’ formulées’ par’ la’ suite’ δ’ lencontre’ de’ lidentification’de’la’flore’lichénique’établie’par’Dodge’(Castello and Nimis 1995), rendant indispensable’ un’ nouvel’ inventaire’ des’ espμces’ de’ larchipel.’ Les’ campagne’ dété’ de’ novembre-décembre 2012 et 2015 de’Damien’Ertz’ont’permis’le’recensement’dune’centaine’ despμces’ sur’ lîle’ de’ la’ Possession’ ainsi’ que’ la’ description’ de’ nouvelles’ espμces’ pour’ la’ Science, parmi lesquelles Ducatina umbilicata, Ochrolechia kerguelensis et plusieurs Steinera (Ertz et al. 2016, 2017b, a).

50 Site’détude’et’matériels’biologiques

Les lichens crustacés représentent une grande proportion des lichens subantarctiques (Ertz et al. 2017b). Les lichens foliacés sont quant à eux généralement retrouvés dans les plaines’de’fougμres,’ou’δ’proximité’des’bryophytes.’Lobservation’dun’nombre’important’de’ lichens’tripartites’sur’Crozet’sexplique’par’la’capacité’δ’fixer’lazote’atmosphérique,’véritable’ avantage pour des lichens trouvés dans des zones pauvres en nutriments telles que les fell- fields. Parmi’ces’nombreuses’espμces’présentes’sur’lîle’de’la’Possession,’nous’avons’sélectionné’ cinq espèces pour notre étude des choix alimentaires de Notodiscus hookeri : Usnea taylorii, Pseudocyphellaria crocata, Argopsis friesiana, Aspicilliopsis macrophthalma et Placopsis bicolor. Ces lichens sont sélectionnés pour la nature de leurs photobiotes et leur occurrence sur le terrain. Une description morphologique des lichens étudiés suite à des observations macroscopiques et microscopiques est proposée ci-dessous. La présence des différents lichens sur’les’sites’détude’sera’également’précisée.’

3.1 Usnea taylorii D. Hook.

Embranchement Ascomycota Classe Lecanoramycetidae Ordre Lecanorales Famille Parmeliaceae Genre Usnea Sous-genre Neuropogon Espèce taylorii

Photobiote principal Algue verte (Trebouxia Photographie Julien Tommasino sp.)

Usnea taylorii est un chlorolichen fruticuleux saxicole5. Le thalle est rigide, pouvant atteindre une dizaine de centimètres, de couleur jaune-verdâtre tacheté de noir. Les apothécies’sont’terminales’ou’subterminales,’de’couleur’noire,’mesurant’de’′’δ’17’mm.’Laxe’ central représente plus de 70%, et contrairement à la morphologie classique des lichens fruticuleux (Figure I-2), celui-ci est ramifié. Cette morphologie particulière avec un axe rigide

5 Le terme saxicole qualifie une espèce qui se développe sur des substrats rocheux. 51 Site’détude’et’matériels’biologiques

subdivisée en branches lui confère une résistance particulières aux conditions environnementales auxquelles il est confronté, malgré sa grande taille (Ertz et al. 2017b). Le cortex est très fin (2.5-5.5%), parfois craquelé. La médulle est fine, voire très fine (2-10%) et pénètre entre les ramifications du cordon axial. La couche algale est rarement continue sous le’cortex,’et’des’cellules’algales’peuvent’sinvaginer’avec’la’médulle’entre’les’ramifications’du’ cordon axial. Dans certaines parties du thalle, les algues vertes paraissent plus orangées et lobservation’ microscopique’ de’ ces’ derniμres’ montre’ la’ présence’ dun’ pigment’ orange’ (probablement de type caroténoïde ; Figure II-9).

Figure II-9 : Observation microscopique du thalle dU. taylorii. Le cordon axial se ramifie δ’lintérieur’du’thalle.’La’médulle’et’les’cellules’algales’viennent’se’localiser’entre’les’ différentes ramifications. Les cellules algales peuvent également se situer sous le cortex. Photographies P. CLERC.

Ce lichen a pour le moment été observé uniquement au niveau du Pic du Mascarin (point’culminant’de’lîle’de’la’Possession),’sur’le’transit’permettant’de’se’rendre’au’sommet.’ Ce’lichen’a’également’été’observé’et’décrit’sur’larchipel de Kerguelen (Walker 1985). Comme toutes les Usnées du sous-genre Neuropogon,’lacide’usnique’(dibenzofurane)’ est le principal métabolite spécialisé décrit dans ce lichen. En fonction des spécimens étudiés, des’traces’dacide’fumarprotocétratique’peuvent’être’détectées.’

52 Site’détude’et’matériels’biologiques

3.2 Pseudocyphellaria crocata Vain.

Embranchement Ascomycota Classe Lecanoromyceridae Ordre Peltigerales Famille Lobariaceae Genre Pseudocyphellaria Espèce crocata

Photobiote principal Cyanobactérie (Nostoc sp.)

Pseudocyphellaria crocata est un lichen foliacé, avec un thalle marron pouvant atteindre des diamètres de 15 à 20 cm. Le thalle forme de nombreux replis, permettant la fixation du lichen sur son substrat (bryophytes ou fougères de type Blechnum penna-marina). Il possède de nombreuses sorédies sur la marge thalline de couleur jaune. La face inférieure est recouverte dun’tomentum6, et on peut observer la présence de pseudocyphelles7 jaunes. Les apothécies sont lécanorines, de couleur brun-rougeâtre, sessiles, de petites tailles (1-3 mm). Tout comme dans la description de Massé (1982) portant’sur’des’spécimens’de’lîle’de’la’Possession,’jai’pu’ rencontrer nombre de spécimens à Crozet (ALOU et PBAS) possédant un très grand nombre dapothécies, alors que ces dernières sont souvent décrites comme rares voir absentes dans des’descriptions’faites’sur’dautres’sites’(Galloway and James 1980; Galloway and Arvidsson 1990).’Ce’lichen’est’également’présent’δ’proximité’de’larbec’de’la’Pérousse’(PER)’et’sur’le’ site de la Tour Blanche (TBLA).

6 Le terme tomentum désigne la couverture dense de poils située sur la face inférieure. 7 Le terme pseudocyphelles désigne les petites ouvertures au niveau du cortex (inférieur ou supérieur), laissant affleurer la médulle jouant un rôle dans les échanges gazeux. 53

Site’détude’et’matériels’biologiques

Figure II-10 : Observation microscopique du thalle de P. crocata (G x 100). Le thalle est de structure hétéromère. Sous le cortex supérieur, des cyanobactéries de type Nostoc constituent la couche algale. Les sorédies (marge thalline et face supérieure) et les pseudocyphelles (face inférieure) sont de couleur jaune. Sur le cortex inférieur, de nombreux poils constituent le tomentum. Photographie A. GADEA.

La chimie du lichen P. crocata a’fait’lobjet’de’plusieurs’travaux.’Malgré’la’présence dun’photobiote’de’type’Nostoc, ce lichen présente une grande richesse en métabolites. La ténuiorine (depside) et ses dérivés (acide 4-O-méthylgyrophorique,’acide’gyrophorique,’…)’ sont’présent’en’grande’quantité.’La’présence’de’dérivés’de’lacide’stictique (depsidone) est également’décrite.’Enfin’la’calycine’(dérivé’de’lacide’pulvinique),’métabolite’spécialisé’se’ localise exclusivement au niveau des sorédies et des pseudocyphelles, leurs donnant une couleur jaune caractéristique. De nombreux triterpènes sont également décrits, en particulier des dérivés hopane (Maass and Neish 1967; Maass 1970, 1975; Huneck and Yoshimura 1996; Summerfield and Eaton-Rye 2006; Elix 2014).

54 Site’détude’et’matériels’biologiques

3.3 Argopsis friesiana Müll. Arg.

Embranchement Ascomycota Classe Lecanoromyceridae Ordre Lecanorales Famille Stereocaulaceae Genre Argopsis Espèce friesiana

Photobiote principal Algue verte (Trebouxia sp) Photobiote secondaire Cyanobactérie (Stigonema sp.)

Argopsis friesiana est un lichen tripartite saxicole, de structure complexe. Le thalle primaire’nest’pas’observé’et’le’thalle’secondaire’a’la’forme’de’petits’buissons’denviron’4’cm’ de haut. Ce lichen se caractérise par un pseudopodétion rigide et glabre portant les phylloclades sur la partie supérieure. Les apothécies sont terminales, abondantes et de couleur noire (diamètre : 1.5 - 3 mm). La face inférieure des apothécies est constituée de la couche algale et du cortex du pseudopodétion. Les céphalodies (diamètre : 0.4-1.4 mm) contenant les cyanobactéries sont de couleur noire également, elles sont retrouvées latéralement sur la partie’supérieure’du’pseudopodétion.’’Lorsquelles’sont’humides,’les’céphalodies’deviennent’ très visqueuses.

Un risque de confusion du lichen existe avec un autre membre de la famille des Stereocaulaceae, Stereocaulon cymosum Cromb. . La différentiation entre ces deux lichens se fait’ grâce’ δ’ lobservation’ microscopique’ des’ spores : les spores de A. friesiana sont muriformes8 alors que celles de S. cymosum sont pluriseptées de manière horizontale (Figure II-11 ; Huneck and Lamb 1975).

8 Le terme muriforme qualifie une spore plus ou moins régulièrement cloisonnée en longueur et en largeur 55 Site’détude’et’matériels’biologiques

Figure II-11 : Comparaison des spores muriformes de A. friesiana (A) et pluriseptées de S. cymosum (B). Observation microscopique (Gx400), Photographies F. LOHEZIC-LE DEVEHAT.

Une différentiation au niveau de la composition chimique de ces deux espèces est également possible :’latranorine’est’le’depside’majoritaire’dans’les’deux’espμces’mais’les’ depsidones associées diffèrent (Figure II-12).’En’effet,’lacide’lobarique’est’retrouvé’dans’S. cymosum alors quune’des’depsidones’principales’de’A. friesiana est une chlorodepsidone, largopsine’(Lamb 1974; Huneck and Lamb 1975; Galloway 1980).

254 nm

Atranorine

Argopsine Depsidone 1 Depsidone

A. friesiana

Acide lobarique Acide Absorbance

S. cymosum 20 25 30 35 40 min

Figure II-12 : Comparaison des chromatogrammes obtenus par HPLC-DAD ( = 254 nm) des extraits acétone de A. friesiana et S. cymosum. Données personnelles.

A. friesiana a pu être observé dans plusieurs fell-fields daltitudes’ alors’ que’ S. cymosum na’pour’le’moment’été’identifié’quδ’proximité’de’la’base.’

56 Site’détude’et’matériels’biologiques

Une vérification des lots de lichens récoltés a été effectuée par observation des spores de’ trois’ individus’ pris’ au’ hasard,’ afin’ de’ sassurer’ que’ le’ lichen’ étudié’ pour’ le’ profilage’ chimique et les expériences de choix alimentaire (Chapitre IV) était bien A. friesiana.

57

III. Devenir des mtabolites lichniques chez l’escargot

La baie américaine (BUS) et la vallée de Branloires

Devenir des métabolites lichéniques

Les’phytophages,’lorsquils’sont’confrontés’δ’des’métabolites’spécialisés,’ont’généralement’ trois moyens de réagir (Pöykkö et al. 2010): - Ils évitent la consommation de la plante ou de la partie de la plante contenant les métabolites spécialisés. - Ils sont capables de tolérer et par la suite excréter le métabolite dans ses excréments ou de se détoxifier. - Ils tirent des bénéfices de ces métabolites, en les réutilisant pour leur propre défense, mais également comme stimulants alimentaire.

Chez les escargots lichénophages Balea perversa, Chondrina clienta et Helicigona lapicida, une assimilation au sein des tissus de certains métabolites lichéniques (atranorine, pariétine)’et’lexcrétion’dautres’(acide’usnique)’démontre’une’absorption’sélective’de’ces’ composés (Hesbacher et al. 1995a).’Latranorine,’’séquestrée’par’lespμce’Balea perversa est retrouvée’ dans’ les’ œufs.’ Ce’ métabolite’ est’ décrit’ comme’ photoprotecteur’ dans’ le’ lichen’ (Nguyen et al. 2013),’mais’léventuel’rôle’photoprotecteur’pour’lœuf’de’na’pas’été’démontré’ dans les travaux de Hesbacher (1995a).’ Lassimilation’ des’ métabolites’ issus’ de’ la’ consommation permet leur réutilisation pour les propres bénéfices de certains Gastéropodes. De nombreux exemples sont décrits pour les espèces marines en particulier ceux appartenant à la sous-classe’des’Opistobranches,’qui’ont’perdu’leur’coquille’au’cours’de’lévolution (Putz et al. 2010; Benkendorff 2010; Bogdanov et al. 2014). La séquestration de chloroblastes de Chlorophytes,’ou’de’cnidocytes’dHydraires’au’sein’de’diverticules’digestifs’est’observée’chez’ les’Nudibranches,’qui’sont’ensuite’capables’dutiliser’ces’organites pour leur propre bénéfice (photosynthèse et défense respectivement) (Putz et al. 2010; Christa et al. 2014). Aguiar and Wink (2005) ont montré que la limace Arion lusitanicus excrète des alcaloïdes dans son mucus, provenant de son alimentation et pouvant être un mécanisme de défense en cas de stress.

Dans’ce’chapitre,’présenté’sous’forme’darticle, publié dans la revue Molécules, nous avons’voulu’mettre’en’évidence’les’stratégies’mises’en’place’par’lescargot’N. hookeri lors de sa’rencontre’avec’de’potentiels’métabolites’toxiques’et’leur’gestion’lorsquils’sont’ingérés.’ Des informations complémentaires (Supporting material) sont disponibles en Annexe B.

61 Devenir des métabolites lichéniques

62 Devenir des métabolites lichéniques

Which specialized metabolites does the native subantarctic Gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata?

Article publié dans Molecules, Mars 2017

1 Introduction

Lichens are fascinating self-sustaining partnerships consisting of a fungus and a photobiont partner (in most cases, green algae are sometimes replaced or accompanied by cyanobacteria). Owing to their nutritional autonomy, lichens tend to dominate nutrient-poor, cold and/or dry environments. As such, they stand for the major form of vegetation in polar and alpine regions and in particularly harsh climate zones (Sanders 2001) in which they often represent the dominant form of multicellular life (Sancho et al. 2007). As these extreme habitats have few and low-quantity fodder plants for herbivores, the lichens will represent a major trophic resource (Solhaug and Gauslaa 2012). The extreme resiliency of lichens partly relies on the synthesis of numerous unique specialized metabolites displaying a wide array of biological activities affecting both their biotic and abiotic interactions (Molnár and Farkas 2010). As to the former point, several publications established that the lichen diet of various insects was species, and especially lichen-chemistry, selective. For instance, studies carried out on the polyphagous coleopteran Lasioderma serricorne highlighted a negative correlation between various lichen substances and grazing phenomena (Nimis and Skert 2006). In a similar way, the land snail Cantareus aspersa and the slug Limax sp. were shown to prefer Peltigera lichens lacking secondary metabolites (Benesperi and Tretiach 2004). Due to the extracellular distribution of lichen specialized metabolites, these substances can be non-destructively extracted with acetone through the so-called acetone-rinsing technique without harming the lichen symbionts, offering a powerful experimental setup to evaluate the deterrent functions of lichen metabolites against plant-eating species (Solhaug and Gauslaa 2001). Using such

63 Devenir des métabolites lichéniques

experimental design, several authors emphasized deterrence and/or toxicity of either pure substances of various structural classes or crude lichen extracts towards insect larvae, moth larvae, bank voles, slugs, and snails (for review, see Solhaug and Gauslaa (2012).

Among plants, dietary preferences of herbivores are obviously related to chemical cues with various structural families being found to deter damages induced by terrestrial snails. Some such examples include glucosinolates (Glen et al. 1990), terpenes (Linhart and Thompson 1995), and alkaloids (Chevalier et al. 2000). However, some gastropods are able to feed on resources containing toxic secondary metabolites. Some poisonous molecules should be degraded in the gut lumen prior to being absorbed or detoxified by microsomal cytochrome P450 enzymes contained in the digestive gland (Livingstone et al. 1989). This mechanism of detoxification was evidenced for alkaloids in the slug Arion lusitanicus (Aguiar and Wink 2005).

Likewise, one can assume that the consumption of toxic lichen compounds might result in defensive strategies (i.e., sequestration of toxic compounds, biotransformation by conjugation to polar metabolites, etc.) by lichenophagic species to overcome potential intoxications. Even though data regarding lichenophagic snail species are scarce, Hesbacher and co-workers highlighted the specific uptake of two lichen polyphenolsatranorin and parietinby the snails Balea perversa, Chondrina clienta, and Helicigona lapicida whereas usnic’acid’and’-collatolic acid could not be detected in the soft bodies of the gastropods. Most interestingly, in the ovoviviparous species Balea perversa, the sequestrated parietin could be transmitted to the offspring in the reproductive tract (Hesbacher et al. 1995a).

To advance the understanding of the chemical ecology underlying lichen/snails interactions, Notodiscus hookeri, a subantarctic snail harvested in Possession Island, appeared as a relevant model organism. The Crozet Archipelago is located in the subantarctic region in the South Indian Ocean province. Among these islands, Possession Island is a strato-volcano island displaying a mountainous topography (highest peak: Pic du Mascarin at 934 m) extending over a short distance (18 km × 15 km) (Chevallier et al. 1983) . This topology is associated with a wet and windy climate (Charrier et al. 2013). As a consequence of these harsh environmental conditions, the Subantarctic islands display a low terrestrial biodiversity, resulting in relatively simple ecosystems (Convey 1997; Frenot et al. 2005). For instance,

64 Devenir des métabolites lichéniques native vascular plants account for less than 30 species, while about 50 native invertebrate species have been described so far (Solem 1968). Among them Notodiscus hookeri (Charopidae) is the only terrestrial gastropod species found in the South Indian Ocean Islands and archipelagos (Charrier et al. 2013). This litter-dwelling species includes two ecophenotypes, one of whichcalled mineral phenotype (MP)has available calcium in soil and moist stones covered by vegetation, while the other, known as organic phenotype (OP), is widespread in fell-field areas dominated by lichen species but deprived of exchangeable calcium in soil (Charrier et al. 2013). MP shells are twice as thick as OP shells (72 µm versus 35 µm in mean) and OP snails exhibit a predominantly organic skeleton made of glycine-rich proteins (Charrier et al. 2013). With a higher energetic cost being involved in protein production compared to calcification (Palmer 1992), we expected OP snails to manage more efficiently’than’MP’snails’toxic’compounds’in’lichens’in’order’to’extract’the’highest’caloric’ content, at least on species selected in their environment. Therefore, due to these environmental and phenotypic specificities, we hypothesized that N. hookeri developed detoxification mechanisms by either degradation and/or elimination of toxic secondary metabolites so that it can benefit from its unique trophic resource. During the course of this study, the consumption of two lichen species was considered, Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata, which occur abundantly in the fell-fields and the coastal plains, respectively (Figure S1). N. hookeri can feed on both of them, independently from their occurrence in the harvest site of the snails. Nevertheless, assuming that the detoxification strategies implemented by N. hookeri might depend on its previous consumption of these lichens, we hypothesized that OP snails would better cope with the toxic metabolites of U. taylorii metabolites and MP snails those of P. crocata. A further interest of these lichen species is that they differ by the nature of their photobionts: U. taylorii contains trebouxioid green algae whereas P. crocata incorporates Nostoc cyanobacteria. Additionally, both are known to contain secondary metabolites that exert documented deterrent effects and/or toxicity towards invertebrate phytophages (Solhaug and Gauslaa 2012).

In this study, we investigated the fate of lichen metabolites after their consumption by Notodiscus hookeri. For this purpose, the chemical profiles of U. taylorii and P. crocata were assessed by HPLC-DAD-MS. Their major compounds were quantified and subsequently compared with the content of the crop, digestive gland, intestine, and feces of the snails (Figure S2) fed with either one of the aforementioned lichen species. Finally, the diverse

65 Devenir des métabolites lichéniques

strategies implemented by N. hookeri to circumvent the toxicity of their lichen metabolites are discussed.

2 Results

2.1 Chemical profiling of the lichens and quantification of their major compounds

The chemical profiles of U. taylorii and P. crocata were established by HPLC-DAD-ESI-MS of their acetone extracts. Lichen metabolites were identified in the extracts based on comparison with retention times, UV/Vis, and MS spectra of pure compounds. Linear equations developed on the basis of the calibration curves were used to determine the percentage of the major compounds of these lichens.

2.1.1 Usnea taylorii

Usnea taylorii appears to be rather poor in secondary metabolites as its extraction yield is of 0.8 ± 0.2%. The PDA chromatogram of the acetone extract of U. taylorii is provided in Figure III-1.

Figure III-1 : PDA chromatogram at 290 nm of U. taylorii acetone extract. Identified compounds are: (1) fumarprotocetraric acid (traces) and (2) usnic acid.

66 Devenir des métabolites lichéniques

The chemistry of Usnea taylorii is heavily dominated by the dibenzofuran-related usnic acid (2, Rt = 30 min, m/z =’″4″’[M’−’H]−, 328 and 259) (Figure S3). Its concentration ranged between 2.54 and 4.92 mg/g Dry Mass (DM) of lichen for a mean value of 3.75 ± 1.18 mg/g DM, which stands for 0.4% of the dried lichen material. Fumarprotocetraric acid could also be detected (1, Rt = 19.6 min, m/z =’471’[M’−’H]− and 355) (Figure S4).

2.1.2 Pseudocyphellaria crocata

Pseudocyphellaria sp. displays a complex chemistry of secondary metabolites encompassing a wide structural diversity, which is in line with a higher extraction yield of 5.3 ± 1.2%. Twelve main compounds falling into three structural series of compounds could be evidenced, consistent with the literature data. The UV chromatogram recorded at 254 nm is displayed below (Figure III-2).

Figure III-2 : PDA chromatogram at 254 nm of P. crocata acetone extract. Identified compounds are (1) constictic acid; (2) cryptostictic acid; (3) Pc3; (4) stictic acid; (5) norstictic acid; (6) pulvinic acid; (7) gyrophoric acid; (8) pulvinamide; (9) 4-O- methylgyrophoric acid; (10) calycin; (11) Pc11; and (12) tenuiorin.

At first, the polar metabolites 1, 2, 4 and 5 could be identified as depsidones in a straightforward manner owing to their prevalent deprotonated molecules (Figure S9). This

67 Devenir des métabolites lichéniques

led to identifying 1 as constictic acid (Rt = 9 min; m/z =’401’[M’−’H]−), 2 as cryptostictic acid (Rt = 14.3 min; m/z =’″87’[M’−’H]−), 4 as stictic acid (Rt = 16.7 min; m/z =’″85’[M’−’H]−), and 5 as norstictic acid (Rt = 19.3 min; m/z =’″71’[M’−’H]−) (Figure S5). Compound 3, named Pc3 (Rt = 16 min; m/z = 443, 387, 339) did not match with any previous report from P. crocata and could not be identified (Figure S6). The HPLC-DAD-MS analysis also revealed the occurrence of three tridepsides: gyrophoric acid (7, Rt = 23.5 min; m/z 149, 167, 317, 468 and 489), 4-O- methylgyrophoric acid (9, Rt = 27.8 min; m/z =’149,’167,’″″1,’481’[M’−’H]−), and tenuiorin (12, Rt = 32.5 min; m/z =’149,’167,’″″1,’495’[M’−’H]−) (Figures S7 and S8). At last, 254 nm UV-detection revealed three more peaks that were tentatively identified as pulvinic acid derivatives with pulvinic acid (6, Rt = 20.3 min, m/z =’ ″07’ [M’ −’ H]−), pulvinamide (8, Rt = 24.5 min, m/z =’″06’[M’−’H]−), and calycin (10, Rt = 30.5 min, m/z = 305 [M’−’H]−) (Figure S9). UV-detection at 419 nm enabled a more sensitive detection of these signals as described elsewhere (Yoshimura et al. 1994). The 419 nm PDA chromatogram is displayed in the Supporting Material (Figure S10). Compound 11 (Pc11) did not ionize under the mass spectrometric conditions used in this study, precluding its structural assignment. One representative of each structural class was then quantified. Tenuiorin appeared to be the main metabolite of P. crocata with a concentration of 18.01 ± 6.54 mg/g DM lichen followed by stictic acid 4.09 ± 1.06 mg/g DM lichen and calycin 1.17 ± 0.37 mg/g DM lichen. The molecular formulae of the compounds identified from Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata during the course of this study are collated in Figure III-3.

68 Devenir des métabolites lichéniques

Figure III-3 : Structures of the compounds identified in Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata collected on Possession Island (Crozet Archipelago).

2.2 Chemical profiling of the biological tissues and quantitation of their major compounds

A first outcome is that higher extraction yields from biological tissues were obtained from snails fed with P. crocata compared with those having received U. taylorii (13.1 ± 5.4% vs 8.5 ± 0.6%; 14 ± 5.6% vs. 9.6 ± 2.2%; 0.4 ± 0.2% vs. 0.3 ± 0.1% and 5.7 ± 1.3% vs. 3.4 ± 1.3% for crops, intestines, digestive glands, and feces, respectively).

69 Devenir des métabolites lichéniques

2.2.1 Products of the digestion of Usnea taylorii

Two compounds were detected in U. taylorii and snail gut compartments (Figure III- 4). The lichen was characterized by usnic acid and traces of fumarprotocetraric, but only the former was found in the snail guts. Usnic acid was more abundant in the feces (mean values mg/g DM lichen ± SD = 5.70 ± 2.21 in MP snails; 11.31 ± 2.28 in OP snails), compared to the soft bodies of the snails where the levels remained below 1.40 mg/g DM. The concentrations in the feces were not statistically different between ecophenotypes (t-test, t =’−′.050,’p = 0.119). It also appeared that the concentration of this dibenzofuran derivative was very low (<0.004 mg/g DM) in the digestive glands, whatever the snail ecophenotype. U. taylorii-fed snails excreted two to three-fold more usnic acid than the level found in the lichen (mean value ±

SD = 3.75 ± 1.18 mg/g) according to the ANOVA result (F2,9 = 4.429; p = 0.046). This difference was significant between OP snails and lichen content (Tukey test, p = 0.044), while usnic acid values did not differ statistically between MP snails and lichen content (Tukey test, p = 0.747).

Figure III- 4 : PDA chromatogram at 290 nm of acetone extracts of N. hookeri digestive gland (DG, green curves), crops (C, purple curves), intestines (I, blue curves), and feces (F, red curves) after being fed with U. taylorii (black curve). These profiles are compared according to their phenotype (MP = mineral, PBAS sample; OP = organic, MAS sample).

70 Devenir des métabolites lichéniques

2.2.2 Products of the digestion of Pseudocyphellaria crocata

254-nm PDA chromatograms obtained from P. crocata and the biological compartments of N. hookeri fed on this species are collated in Figure III- 5. Stictic acid and its derivatives (i.e., constictic, cryptostictic, and norstictic acids) could not be identified in any digestive part of the snail nor its feces. Conversely, the tridepsides tenuiorin and 4-O-methylgyrophoric acid were found in the crops, intestines, and feces but remained quasi-undetected in the digestive glands (Figure III- 6).

Figure III- 5 : PDA chromatogram at 254 nm of acetone extracts of N. hookeri digestive gland (DG, green curves), crops (C, purple curves), intestines (I, blue curves), and feces (F, red curves) after being fed with P. crocata (black curve). These profiles are compared according to their phenotype (MP = mineral, PBAS sample; OP = organic, MAS sample).

71 Devenir des métabolites lichéniques

Figure III- 6 : Levels of tenuiorin (means ± standard deviation) found in the snail gut compartments after the consumption of P. crocata, according to the snail phenotype (MP = Mineral and OP = Organic).

Tenuiorin was not quantifiable in the digestive gland of the snail. Tenuiorin

concentration was dependent on the gut compartments (ANOVA, F1,18 = 7.212, p = 0.015) and

of the snail phenotype (ANOVA, F1,18 = 34.088, p < 0.001). It is noteworthy that the concentration of tenuiorin in the feces (34.76 ± 2.26 µg/mg) was two to three-fold that of its value within the crops and intestines of N. hookeri (Tuckey test, p < 0.001). It is also noteworthy that the ratio of 4-O-methylgyrophoric acid to tenuiorin increased along digestive tract of the snail. While the value of this ratio was estimated to a rough 15% in P. crocata, it reached values up to 79% in the biological samples (Figure S10). The pulvinic acid derivatives could only be detected from the feces of the snails. While the 254 nm PDA chromatogram does hardly evidence the excretion of these compounds, a 419 nm UV chromatogram better emphasizes the detection of pulvinic acid, calycin, and pulvinamide (Figure S11). In the lichen, the concentration of calycin displayed a mean value (±SD) of 1.17 ± 0.37 mg/g DM (values ranging between 0.76 and 1.57 mg/g DM). In the feces, the mean value (± SD) reached 2.09 ±

1.22 mg/g DM, which did not differ significantly from that found in the lichen (ANOVA, F2,9 = 0.776, p = 0.489).

HPLC-DAD-MS analyses revealed the occurrence of a signal at 30.9 min that did not appear in the acetone extract of P. crocata. This feature will be referred to as PcA.

72 Devenir des métabolites lichéniques

2.3 Differences in metabolite profiling according to the gut compartment of snails fed P. crocata

Twelve specialized metabolites were detected from P. crocata and gut compartments of snails fed upon this lichen. The first two-dimensional-axes of the PLS-DA extracted 94.50% of the constrained variance, the first axis (F1) accounting for 65.83% and the second axis (F2) for 28.67% (Figure III- 7). The specialized metabolites contributed significantly to discriminating the lichen and the gut compartments (ANOVA, F8,27 = 16.701, p = 0.001) and they explained 90.01% of the total variance (i.e., residual variance = 9.99). Constictic, cryptostictic, stictic, and norstictic acids were specific to P. crocata, as they were not detected in snail gut compartments, even in feces. Snail feces were grouped on the second axis, their metabolite composition being dominated by 4-O-methylgyrophoric acid and the unidentified compound PcA, not found elsewhere. The discrimination of the other snail compartments (crop, digestive gland, intestine) from snail feces was mostly due to either their low content or lack of lichen metabolites. Snail metabolism was quite similar for both phenotypes on P. crocata, a result indicated by the permutation test on the model with snail phenotype as explanatory variable (F1,24 = 1.607; p = 0.194). In this model, no interaction occurred between phenotype and gut compartment (F3,24 = 0.532; p = 0.765). Therefore, gut compartment was the only significant variable (F3,24 = 36.813; p = 0.001).

73 Devenir des métabolites lichéniques

Figure III- 7 : Graphs of the Partial Least Square-Discriminant Analysis (PLS-DA) performed on the specialized metabolites of the lichen Pseudocyphellaria crocata. (A) is the score plot obtained on the two first axes (F1, F2) that explain 94.50% of the constrained variances; (B) is the corresponding loading plots of specialized metabolites. The cross-model validation used for the discrimination of the lichen parts (8 components, 999 permutations, NMC = 0.668; p = 0.004) indicated statistically different biochemical profiles. The samples are crop (C), intestine (I), digestive gland (G), and feces (F) of organic (OP) and mineral (MP) phenotypes. The metabolites are constictic (CONS), cryptostictic (CRYPT), stictic (STICT), norstictic (NORST), pulvinic (PULV), gyrophoric (GYRO), and 4-O-methylgyrophoric (METG) acids, calycin (CALY), and pulvinamide (PulAM), Pc11 detected in the lichen but unidentified, and the unidentified PcA that only arose in the snail gut.

3 Discussion

3.1 Chemical profile of Usnea taylorii and toxicity of lichen metabolites

The extraction yield of U. taylorii displays a low value for a lichen species (Boustie and Grube 2005). Usnic acid is a chemotaxonomic marker of the Usnea genus (Prateeksha et al. 2016) (Figure S3). The determined concentration of usnic acid (0.4%) lies within the concentrations determined by Cansaran et al. in various Usnea species that encompassed a 0.2%6.9% range of dry lichen mass (Cansaran et al. 2006).

74 Devenir des métabolites lichéniques

Numerous investigations shed light on the ecological relevance of usnic acid describing its allelopathic and anti-feeding properties against plant-eating animals (Ingólfsdóttir 2002). As to this latter point, usnic acid exhibited an acute toxicity against larvae of the polyphagous insect herbivore Spodoptera littoralis with a LD50 at’8.6’µM’for’(−)-usnic acid and 90.8 µM for (+)-usnic acid (Emmerich et al. 1993) as well as towards the larvae of the house mosquito Culex pipiens with a dose-dependent larval mortality (Cetin et al. 2008). Likewise, a recent study reported on the detrimental effects of usnic acid on the growth and survival rate of the larvae of the lichen-eating moth Cleorodes lichenaria (Goga et al. 2015). Harmful effects of usnic acid were also demonstrated on vertebrate herbivores. During the winter of 2004, the poisoning and subsequent death of ~500 elks (Cervus canadensis) was reported in Wyoming and related to the consumption of Xanthoparmelia chlorochroa and more accurately to its usnic acid content (Cook et al. 2007). On the opposite, reindeer and caribou survive on a winter diet consisting exclusively of lichens (Storeheier et al. 2002). Such species might have acquired the capacity to handle toxic metabolites by a detoxification involving rumen microflora, which would house bacteria resistant to antibiotic secondary components (Sundset et al. 2008).

The role of bacteria in detoxification cannot be considered in snails because they are hindgut fermenters that harbor intestinal bacteria (Charrier et al. 2006). Although usnic acid could be detected in the different gut compartments, the concentration of this dibenzofuran derivative in the feces was shown to be about seven times as much as in the intestine. By comparison to the lichen, the OP-snail feces were enriched in usnic acid by a three-fold factor. It is assumed that focal environmental variations might favor adaptation to local conditions for nested populations such as N. hookeri that is restricted to focal habitats owing to its poor dispersal activity (Charrier et al. 2006). We hypothesized that the snail was able to sequestrate usnic acid in the digestive gland, since this organ is involved in the production of digestive enzymes (Charrier and Rouland 1992), hydrogen production, nutrient absorption (Charrier and Brune 2003) and excretion (Radwan et al. 2008). Regarding this specific example, our hypothesis was invalidated because of the low levels of usnic acid found in the digestive gland (Figure S11). Therefore, it seems that snails usually feeding on U. taylorii might have acquired the ability to eliminate usnic acid by active transport. Conversely, fumarprotocetraric acid could not be detected from any gut compartment. The observation of the consumed U. taylorii thalli revealed that N. hookeri only fed on the superficial cortex of the lichen, while the bulk

75 Devenir des métabolites lichéniques

of fumarprotocetraric acid is contained in the medulla (Figure III- 8B) (Hesbacher et al. 1995a; Hauck et al. 2010). Therefore, this depsidone may not be ingested by N. hookeri, while usnic acid is consumed because of its accumulation in the cortical layers of the lichens (Le Pogam et al. 2016b). One can also imagine that the minute amounts of fumarprotocetraric acid encountered in U. taylorii precluded its detection from the biological samples.

Figure III- 8 : (A) N. hookeri consuming U. taylorii thallus. U. taylorii (B) and P. crocata (C) thalli before and after snail consumption. The medulla remained untouched for both lichens. The specimens were dry before consumption (B-1 and C-1) and wet after snail feeding (B-2 and C-2). The inset (A) corresponds to the magnification used in B.

3.2 Toxicity of the metabolites detected in Pseudocyphellaria crocata and strategies implemented by Notodiscus hookeri to cope with lichen metabolites

The chemical profile obtained for P. crocata is in line with previous reports describing the chemistry of this species (Maass and Neish 1967; Maass 1970, 1975; Galloway et al. 1983). As to the quantification of these major metabolites, Nybakken et al. (2007) described a

76 Devenir des métabolites lichéniques comparable content in stictic acid (0.6%) but reported on a much higher tenuiorin concentration. However, as lichen specialized metabolites participate in ecological interactions, their concentration is known to vary greatly based on environmental conditions (Stocker-Wörgötter 2008). The mass spectrometric signals of the specialized metabolites of P. crocata are rationalized in supporting material, being consistent with data published elsewhere (Figures S5S9).

The compounds described from this lichen species are known to exert deterring effect and/or toxicity to phytophagic species. The repulsive effects of lichens whose chemistry is dominated by tenuiorin and methylgyrophoric acid derivatives were evidenced (Benesperi and Tretiach 2004; Nimis and Skert 2006). The deterrent effect of stictic acid was described towards the coleopteran Lasioderma serricorne (Nimis and Skert 2006) and against the generalist vertebrate Myodes glareolus (Nybakken et al. 2010). Likewise, stictic and constictic acids occurring in Lobaria pulmonaria were shown to protect this lichen from being grazed (Gauslaa 2008). Reducing the content of depsidones in Lobaria pulmonaria by acetone-rinsing caused a significant increase in mollusc grazing (Gauslaa 2005; Asplund and Gauslaa 2008). Based on their bright yellow color, the pulvinic acid derivatives are obviously ascribed to the soredia of P. crocata, i.e., symbiotic propagules occurring on the upper surface of the thallus as dust-like particles comprising a few algal and fungal cells. Such a spatial mapping refers to the optimal defense theory that predicts the allocation of the most efficient defensive compounds’to’the’most’valuable’tissues’for’lichens’fitness’(Hyvärinen et al. 2000). As to the specific example of P. crocata, Gauslaa evidenced that phytophages avoided to feed on soralia which might be significant for their survival and for the early establishment of vulnerable germinating soredia (Gauslaa 2008). The anti-feeding properties of the closely related vulpinic acid are supported by its well-documented toxicity to several vertebrates (Rundel 1978). Giez and co-workers also demonstrated the growth-retarding effects of calycin and vulpinic acid against the larvae of Spodoptera littoralis. Furthermore, the treatment of larvae with calycin resulted in an unusually high proportion of imagos with deformed wings (Giez et al. 1994).

In this study, PLS-DA revealed that the compounds described from P. crocata clustered into three main groups. The first one corresponded to depsidones. Despite being major metabolites of P. crocata, stictic acid derivatives could not be detected from any biological

77 Devenir des métabolites lichéniques

sample obtained from the snails fed with this lichen. As previously observed with U. taylorii, it appeared that the gastropods grazed the upper cortex and the photobiont layer whereas the medulla remained intact, leaving the underlying white medulla exposed, consistently with data published elsewhere on this lichen (Solhaug and Gauslaa 2012) (Figure III- 8C). As molecules of the stictic acid chemosyndrome (i.e., constictic, cryptostictic, stictic and norstictic acids) are known to display a medullary distribution (Moncada et al. 2013, 2014), it is likely that N. hookeri did not ingest these compounds. However, the feeding pattern of the snail might not necessarily reflect a deterring effect of these depsidones. Indeed, for phytophagous grazers one challenge is to gain enough dietary nitrogen in a carbohydrate- rich diet. Therefore, the photobiont layer should represent the most attractive tissue to lichenivores as it displays the highest nitrogen content in the lichen thallus (Palmqvist et al.

2002). This is especially true for cyanolichens as P. crocata that can fix atmospheric N2 thanks to their cyanobacterial biont generally resulting in high N concentration (Rundel 1978).

All the other compounds described from P. crocata display a cortical distribution: metabolites of the gyrophoric acid series (Kurokawa and Takahashi 1970) and pulvinic acid derivatives (Kauppi and Verseghy-Patay 1990; McCune and Altermann 2009) suggesting that they might have been ingested by the snail given the observed grazing pattern. A second group of compounds was plotted between the lichen and the feces groups. These metabolites were the tridepsides (tenuiorin, 4-O-methylgyrophoric acid and gyrophoric acid), the pulvinic acid derivatives (pulvinic acid, pulvinamide and calycin) and the unidentified compound Pc11. Most of these molecules were excreted in slightly lower concentration compared to that obtained from the lichen itself, except for 4-O-methylgyrophoric acid which tended to be in a slightly higher concentration in the feces instead. The compared chemical profiles of lichens and snails samples revealed a concomitant diminution of the signals associated to tenuiorin with an increase of the peaks associated to 4-O-methylgyrophoric acid, suggesting the conversion of the former into the latter. This assumption is further strengthened by the particularly reduced yield of excretion of tenuiorin compared to the other metabolites of this group on the PLS-DA plot. The ester bond of depsides is known to be easily hydrolyzed under a variety of physicochemical circumstances. Likewise, the hydrolysis of methyl esters of lichen depsides to afford the corresponding carboxylic acid was described to occur in a variety of experimental conditions (Culberson 1972). Due to the easiness of these chemical conversions, it appears more likely that such transformations rely on physicochemical

78 Devenir des métabolites lichéniques conditions rather than involving specific enzymatic systems. As such, the slightly basic pH of the crop (which we estimated to be around 8.0, maybe due to salivary glands secretions) might be sufficient to trigger the alkaline hydrolyses described herein (Zenkevich et al. 2007).

As to pulvinic acid derivatives, the yellow color of the feces produced by the group of Notodiscus hookeri fed with P. crocata indicated that the gastropod also consumed the soredia of the lichen. This is an interesting outcome as previous literature reported that snails avoided the well-defended bright yellow soralia that accumulate the pulvinic acid derivatives (Gauslaa 2008). This highly localized concentration of calycin shall provide high levels of defense in early stages of juvenile thalli and support the optimal defense theory (Hyvärinen et al. 2000). The partitioning of pulvinic acid derivatives within the thallus of Pseudocyphellaria crocata might be considered as a further example of optimal defense theory and suggests that N. hookeri developed strategies to overcome the toxicity of this suite of metabolites. The data described herein support this assumption as neither calycin, pulvinic acid, nor pulvinamide could be evidenced from the gut compartments of the snails, being only detected in its feces. For this second group of compounds, it seems that N. hookeri ingests these metabolites without absorbing them, circumventing the poisoning that might be induced by these lichen substances.

At last, PcA only arose in the feces of the snail, being absent from all other digestive compartments and also from P. crocata. This is consistent with the hypothesis that PcA might represent a metabolized lichen molecule. Nevertheless, this compound did not ionize under the mass spectrometric settings used in this study and the paucity of the biological material precluded the isolation of this metabolite for structural elucidation purposes.

4 Materials and Methods

4.1 Snail collection and lichen material

Adult individuals of N. hookeri were collected on Possession Island during 2015 austral summer (Figure S1). Habitat typology, soil composition and topography have been previously described Charrier et al. (2013a). Snails came from two coastal plains, Baie Américaine (BUS, 46°′″′6.16’S;’51°488.″1’E,’″0’m)’and’Pointe’Basse’(PBAS,’46°′′5.48’S;’51°4″′6.″9’E,’100’

79 Devenir des métabolites lichéniques

m) making up the mineral phenotype (MP) group and from two fell-fields,’Crête’de’lAlouette’ (ALOU, 46°′′55.′1’S;’51°47′0.″5’E,’″00’m)’and’Mascarin’Summit’(MAS,’46°′610.09’S;’ 51°45′0.58’E,’600’m)’constituting’the’organic’phenotype’(OP)’group.’Four’hundred’snails’ (100 × 4 sites) were brought back to mainland France on 8 December 2015. From this date until 15 January 2016, all individuals were fed with the lichen Orceolina kerguelensis, an opportunistic chlorolichen found everywhere in the island.

U. taylorii and P. crocata were harvested on Possession Island during 2015 austral summer and used as food in our feeding experiment. The foliose cyanolichen P. crocata occurred at PBAS where the snail was collected and the fruticose chlorolichen U. taylorii was encountered at MAS in the snail habitat. The former lichen specie was found in grassy coastline dominated by Poaceae (Poa cookii, Agrostis magellanica) and fernbrakes (Blechnum penna-marina) while the latter only occurred in windy and rocky areas, deprived of vegetation except lichens (Charrier et al. 2013). Both these lichens were identified by Dr. Damien Ertz (Botanic Garden, Meise, Belgium). Voucher specimens were deposited at the herbarium of the Faculty of Pharmacy of Rennes 1, Department of Pharmacognosy and Mycology, under the respective references REN000147 and REN000148.

4.2 Feeding experiment

Forty snails from BUS, PBAS, ALOU, and MAS were divided into two subgroups and each of them was fed either with P. crocata or U. taylorii. The snails had similar sizes and weights, except those from the MAS site, which were significantly bigger and heavier (Table S1, Supplementary Materials). The snails were reared by 20 in plastic boxes (7.5 × 6 × 4.5 cm) with a moist sterile gauze in the bottom. The boxes were held in a climatic chamber under a light/dark photoperiod set as follows: 10 °C day (16 h) and 6 °C night (8 h). To circumvent microbial infections, the boxes were washed regularly and sterile water was poured over them every two days to keep an appropriate level of humidity. After two months, the snails were frozen’ at’ −′0’ °C’ prior’ to’ being’ carefully dissected under stereomicroscope (Stemi 2000C, Zeiss, France) Three gut compartments were considered: crop (Cr), digestive gland (DG), and intestine (In) Figure S2. The feces (Fe, i.e., rectum contents) were harvested once a week and kept’at’−′0’°C’prior’to being lyophilized and extracted as described in the chemical section.

80 Devenir des métabolites lichéniques

4.3 Chemistry

4.3.1 Extraction

Each gastropod was carefully dissected into three parts: crop, digestive gland, and intestine. The dissected tissues and the feces were separately extracted with acetone (3 × 0.5 mL, 20 min. each) and allowed to dry at room temperature. Four pieces of Usnea taylorii (0.5 to 1.0 g) were extracted three times with acetone (5 mL, 20 min) at room temperature and were air-dried until the solvent had evaporated. The extraction yields ranged between 0.4% and 1.0% of dry mass of lichen material for a mean value of 0.8 ± 0.2%. Four pieces of Pseudocyphellaria crocata (0.5 to 2.0 g) were also subjected to the procedure described from U. taylorii. The extraction yields ranged between 3.7% and 6.5% of dry mass of lichen material for a mean value of 5.3 ± 1.2%.

4.3.2 HPLC-DAD-MS analyses

4.3.2.1 Preparation of the samples The samples corresponding to crop, intestine, digestive gland and feces extracts were prepared at a concentration of 0.50 mg/mL in distilled tetrahydrofuran (THF). Lichen extracts were resuspended at a concentration of 0.50 mg/mL (P. crocata) or 0.25 mg/mL (U. taylorii) in THF.

4.3.2.2 Instrumental settings The extracts were filtered through 0.45 mm disposable filters prior to injecting a 10 µL aliquot to the HPLC-DAD-MS device. The LC-DAD-ESI-MS analyses were performed on a

Prominence Shimadzu HPLC system (Marne La Vallée, France) equipped with a Kinetex C18 HPLC column (100 × 4.6 mm, 2.6 µm, 6A, Phenomenex) and consisting of a quaternary pump (LC20ASDP), a surveyor autosampler (SIL-20AHT), and a diode array detector (SPD-M20A). The separation was achieved using an acidic water/acetonitrile system. The gradient of the mobile was as follows: A (0.1% formic acid in water) and B (0.1% formic acid in acetonitrile); T 05 min, 20% B linear; 530 min, 80% B linear; 3035 min, 100% B linear; 3542 min, 100% B; 4245 min, 20% B linear; 4548 min, 20% B. The flow rate was 500 µL/min. The ESI-mass spectra were obtained from an Expression Advion CMS apparatus (Advion, Ithaca, NY, USA).

81 Devenir des métabolites lichéniques

The mass spectra were recorded in the negative ion-mode in a mass range of 100 to 1200 Da, applying the following parameters: detector gain 1200, ESI voltage 3.5 kV, capillary voltage 180 V, source voltage 20 V, source voltage dynamic 20 V, nebulizer gas pressure 60 psig, desolvation gas flow rate 4 L/min, capillary gas temperature 250 °C and source gas temperature 50 °C. Usnic acid was detected and quantified at 290 nm, tenuiorin and stictic acid at 254 nm and calycin at 419 nm (Yoshimura et al. 1994).

4.4 Statistical analyses

As to the main metabolites found in gut compartments (i.e., usnic acid, tenuiorin, and calycin), the calibration curves allowed to quantify these metabolites in the different samples. T-tests (one factor) or ANOVAs (two factors) followed by post-hoc Tukey tests were used to compare the values between snail ecophenotypes and between lichen and gut compartments. To compare the differences in metabolite profiling according to the gut compartment (including feces) and between P. crocata and gut compartments, a Partial Least Square- Discriminant Analysis (PLS-DA) (Indahl et al. 2009) was conducted on the normalized values of areas of specialized metabolites. Prior to PLS-DA, we proceeded to fourth-root transformation, centering, and autoscaling of the values, because null values and great differences in concentrations according to metabolite profiles were observed (van den Berg et al. 2006). A cross-model validation was applied to the PLS-DA to check for significant discrimination (function’ MVA.cmv’ and’ MVA.test,’ package’ RVaidememoire ; Hervé 2016). The percentages of constrained and residual variances were obtained by a redundancy analysis (RDA) on the transformed values. A second RDA analysis considered gut compartments, snail phenotype, and site as explanatory variables to answer whether each of these variables was significant in the model. All statistical analyses were made using R software V. 3.3.1 (Vienna, Austria) (R Core Team 2016).

5 Conclusions

As an exclusive lichen-feeder, Notodiscus hookeri depends on a trophic resource containing several series of toxic metabolites, especially towards invertebrates. N. hookeri appears as a generalist lichen feeder able to consume toxic metabolite-containing lichens, irrespective of their occurrence in its focal habitat and independently of the ecophenotype. The snail

82 Devenir des métabolites lichéniques metabolism seems to be based on four non-exclusive processes depending on the considered metabolite: (1) avoidance of potentially harmful lichen metabolites by avoidance of the lichen medulla; (2) passive transport of pulvinic acid derivatives through the digestive tract of the gastropod, resulting in feces containing a roughly similar concentration of metabolites compared to the lichen; (3) hydrolysis of esterified tridepsides, most likely due to gut lumen alkalinity; and (4) excretion of some compounds in higher yields than those present in the resource. Regarding this latter strategy, the specific example of usnic acid from Usnea taylorii suggests that this gastropod implemented an active extraction strategy to overcome potential intoxications. This versatility most likely accounts for the widespread distribution of this gastropod on Possession Island.

Supplementary Materials9: The following are available online at www.mdpi.com/link, Figure S1:’Study’sites’in’Possession’Island’that’belongs’to’Crozet’Archipelago’(45°″0’S46°″0’S;’ 50°00’E5′°″0’E)’in’the’Subantarctic’region,’Figure’S′:’The’digestive’tract’of’Notodiscus hookeri, Figure S3 : NI ESI mass spectrum of usnic acid, Figure S4: NI-ESI mass spectrum of fumarprotocetraric acid, Figure S5: NI-ESI mass spectrum of depsidones identified in P. crocata, Figure S6: NI-ESI mass spectrum of compound 3 identified in P. crocata, Figure S7: NI-ESI mass spectra of tenuiorin and 4-O-methylgyrophoric acid in NI-ESI-MS, Figure S8: NI-ESI mass spectrum of gyrophoric acid, Figure S9: NI-ESI mass spectrum of pulvinic acid derivatives identified in P. crocata, Figure S10: Evolution of the ratio of 4-O-metylgyrophoric acid and tenuiorin in P. crocata and along the digestive tract of N. hookeri, Figure S11: PDA- chromatogram at 419 nm of the acetone extract of P. crocata highlighting its pulvinic acid derivatives content, Table S1: Measurements made on the snails Notodiscus hookeri, fed on Usnea taylorii or Pseudocyphellaria crocata.

Acknowledgments: Aurélie Bernard and Solenn Ferron are acknowledged for their technical assistance. The Subantarctic field trip was funded by l'Institut Polaire Paul-Émile Victor, Plouzané, France (IPEV, programme 136). Aude Boutet and Julien Tommasino assisted in the field collection of snails and lichens. The authors are also indebted to Damien Ertz for lichen

9 Supplementary data are available in Annexe B at the end of this manuscript (page 215). 83 Devenir des métabolites lichéniques

identification. The two anonymous referees are acknowledged for their useful comments and discussion on this manuscript.

84 Devenir des métabolites lichéniques

én rsum

Notodiscus hookeri savμre’être’une’espμce’lichénophage’généraliste, capable de consommer des lichens contenant des métabolites potentiellement toxiques, quelle que soit leur occurrence dans leur habitat et indépendamment de leur phénotype. Quatre mécanismes non- exclusifs, pouvant’ être’ mis’ en’ place’ par’ lescargot’ afin’ de’ tirer’ bénéfice’ de’ sa’ ressource’ trophique, sont mis en évidence : - lévitement de certaines parties du thalle, comme la médulle, suggère la présence de certains métabolites fortement répulsifs. - lhydrolyse basique, en particulier de certains tridepsides, du fait de’lalcalinité’du’ tube digestif. - le transport passif de certains métabolites le long du tube digestif (la quantité de métabolite est la même dans le lichen que dans les excréments). - lexcrétion active,’ comme’ cela’ a’ été’ mis’ en’ évidence’ pour’ lacide’ usnique’ dU. taylorii, avec une quantité de métabolites plus importante dans les excréments que dans le lichen.

Nous’navons’cependant pas pu montrer la capacité à accumuler certains métabolites au niveau de la glande digestive. De’ plus,’ léventuelle’ séquestration’ des’ métabolites’ spécialisés’au’sein’dautres’tissus’(tégument,’appareil’reproducteur)’comme cela a été mis en évidence’ chez’ trois’ espμces’ descargots’ terrestres (Hesbacher et al. 1995a), pourrait être envisagée par le profilage chimique de ces différentes parties. En revanche, N. hookeri ne pondant’ quun’ œuf’ tous’ les’ 5’ δ’ 6’ mois,’ létude’ de la transmission à la descendance des métabolites’spécialisés’nest’pas’envisageable’pour’cette’espμce.

Dans ce travail, la localisation des métabolites spécialisés au sein du lichen se base sur des’données’de’la’littérature,’et’na’jamais’été’vérifiée pour les espèces étudiées. Afin de valider nos hypothèses, la localisation des métabolites au sein du thalle lichénique devra être par la suite envisagée.

85

IV. Rôle des mtabolites lichniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

La Tour Blanche

87

Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Dans le chapitre précédent, nous avons mis en évidence que N. hookeri est une espèce généraliste’et’opportuniste’qui’a’su’sadapter’δ’la’toxicité’éventuelle’de’certains’lichens’par’ la mise en place de mécanismes spécifiques. Certaines parties du lichen sont malgré tout évitées’par’lescargot.’Or,’les’métabolites’spécialisés sont décrits pour posséder une répartition différentielle au sein du thalle lichénique. Ces résultats nous ont conduits vers deux nouvelles problématiques : - Les métabolites spécialisés ont-ils une localisation spécifique en lien avec la consommation observée par N. hookeri ? - Les parties consommées présentent-elles’un’intérêt’nutritionnel’pour’lescargot ?

Afin’ didentifier’ les’ potentiels’ métabolites’ répulsifs’ ou’ toxiques’ ou’ au contraire appétents’voir’phagostimulants,’nous’avons’choisi’dapprofondir’notre’étude’sur’les’deux’ lichens présentés dans le chapitre précédent Usnea taylorii et Pseudocyphellaria crocata. Ces deux espèces sont sélectionnées car elles diffèrent entre elles aussi bien par leur morphologie (fruticuleux vs foliacé), par la nature de leur photobiote (algue verte vs cyanobactérie) mais aussi par le nombre et la diversité de leur métabolites spécialisés majoritaires (un seul dibenzofurane pour U. taylorii et des depsides,’ des’ depsidones’ et’ des’ dérivés’ de’ lacide’ pulvinique pour P. crocata). Nous nous sommes donc interrogés sur la localisation de ces métabolites majoritaires au sein du thalle lichénique. De plus, nous avons voulu savoir si ces métabolites spécialisés avaient’un’rôle’sur’lappétence’du’lichen’pour’lescargot.’En’plus’des’métabolites’spécialisés,’ létude des sucres et des polyols, composés étant connus comme phagostimulants pour plusieurs espèces de Gastéropodes (Clark et al. 1997), est réalisée. La démarche entreprise est identique pour les deux espèces et est schématisée dans la Figure IV-1.’Dune’part,’il’nous’a’paru’intéressant’dobserver’si’en’absence’de’métabolites’ spécialisés, retirés par rinλage’δ’lacétone (Solhaug and Gauslaa 2001), la consommation du lichen par N. hookeri augmente. Nous avons ensuite histolocalisé les métabolites étudiés afin dexpliquer’une’éventuelle’consommation’sectorielle’du’lichen.’Dautre’part,’aprμs’validation dune’méthode’de’quantification, les concentrations en métabolites spécialisés majoritaires ont été déterminées, ce qui a permis de les tester via des expériences de non-choix sur lescargot.

89 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-1 : Démarche’ expérimentale’ entreprise’ pour’ létude’ du rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de N. hookeri.

1 Etude phytochimique des lichens

1.1 Etatio pa içage à l’atoe et pofilage hiiue des hatillos

Pour chaque espèce lichénique étudiée, plusieurs thalles sont extraits’par’de’lacétone’pendant’ ′0’min’δ’température’ambiante.’Pour’chaque’thalle,’lexpérience’est répétée quatre fois. Le taux’dextraction’est’calculé’en’vue’de’la’quantification’des’métabolites’spécialisés dans le thalle. Les solvants résiduels éventuellement présents au niveau des thalles sont laissés à évaporer pendant au moins 24h pour être utilisés plus tard lors des expériences de comportement alimentaires. Les extraits acétoniques récupérés sont filtrés (Filtre de seringue en Nylon F2504-1, 0,45 µm x 4 mm 0,45 mm, Thermo scientific, Rockwood, USA)’avant’dêtre’ injectés en HPLC-DAD-MS pour obtenir le profil chromatographique des métabolites spécialisés. Les conditions expérimentales sont rapportées dans le Tableau IV-1. La quantification des sucres et des polyols présents dans chaque lichen est également réalisée.

90 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Tableau IV-1: Conditions expérimentales des analyses LC-UV-MS

Débit : 0,5 mL/min Durée’danalyse : 48 minutes Température de colonne : 40 ° C Volume’dinjection : 10 µL Détection : UV (DAD 200 à 500 nm) MS (ESI négatif) Colonne : C18 Kinetex 2.6U 100 A 100 mm x 4,6mm Phase mobile : A : Eau + Acide formique 0.1% B : Acétonitrile + Acide Formique 0.1% Gradient : T 05 min, 20% B linéaire; T 530 min, 80% B linéaire; T 3035 min, 100% B linéaire; T 3542 min, 100% B; T 4245 min, 20% B linéaire; T 4548 min, 20% B. Logiciel : Labsolution (LC) - Shimazhu Mass Express(MS) - Advion

1.2 Quantifications des métabolites spécialisés majoritaires

Une’gamme’détalonnage’de’5’points’est réalisée pour chaque métabolite spécialisé, trois fois afin de valider la méthode analytique selon les paramètres de validation recommandés par la Conférence’ Internationale’ sur’ lHarmonisation’ (ICH 2005) : la linéarité, les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ainsi que la répétabilité intra- et inter-jour. Les droites de calibration de chaque métabolite sont réalisées à sa’longueur’donde’maximale.’La limite de répétabilité de notre méthode est fixée à 10 %, valeur qui nous a paru raisonnable afin de tenir en compte de la variabilité biologique des thalles lichéniques.

1.3 Quantification des sucres et des polyols

Ces analyses ont été réalisées en collaboration avec Catherine JONARD, Nathalie MARNET et Alain BOUCHEREAU, sur la Plateforme P2M2,’δ’lINRA’du’Rheu.

91 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

1.3.1 Extractions

A 10 mg de lichen pulvérisé sont ajoutés 400 µL de solution contenant le standard interne

(adonitol 20 mM dans MeOH). Après agitation de 15 min, 200 µL de CHCl3 sont additionnés à chaque extrait. Une nouvelle agitation de 10 min est réalisée, avant de compléter le mélange avec’400’µL’deau’ultrapure,’afin’dobtenir’lapparition’de’′’phases.’Après centrifugation, (5 min, 15°C, 12000g), le surnageant polaire est récupéré et séché’pour’lanalyse’des’sucres et des polyols.

1.3.2 Analyse de la teneur en sucres, polyols et acides organiques dans les lichens

Une’dérivation’préalable’de’lextrait’polaire’est’réalisée’en’ajoutant’δ’chaque’extrait’50’µL’du’ mélange méthoxyamine (20 mg) et pyridine (1mL) et en laissant 90 min dans un bain sec à 30°C. Un ajout de 50 µL de (N-methoxy-N-trimethylsilyl) trifluoro-acétamide (MSTFA) est ensuite réalisé et le mélange est placé dans un bain sec à 37°C pendant 30 minutes. Les sucres simples, les polyols et les acides organiques sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à une détection par ionisation de flamme (GC- FID) de type Trace 2000 (Thermo-Fischer Scientific, Waltham, CA, USA). Les caractéristiques de’lanalyse’sont’reportées’dans le Tableau IV-2.’Lidentification’des’sucres,’des’polyols’et’des’ acides organiques se fait par comparaison des temps de rétention avec une solution de standards externes.

Tableau IV-2 : Conditions expérimentales des analyses GC-FID’pour’lanalyse’des’sucres,’ polyols et acides organiques.

Température’de’linjecteur : 230 °C Colonne : J&W DB5 30 m x 0,32 mm x 0,25 mm Détection : FID (250°C) Gradient de température : 5 min à 70 °C ; augmentation de 5 °C. min-1 jusquδ’′′0°C ; 2°C.min-1 jusquδ’′60’°C ; 20°C.min-1 jusquδ’″00’°C ; 5 min à 300°C

92 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

1.4 Histolocalisation des métabolites par Imagerie couplée à la Spectrométrie de Masse (MSI)

Les’analyses’dimagerie’par’spectrométrie’de’masse’(MSI)’sont effectuées au sein de la plateforme’BIBS,’δ’lINRA’de’Nantes,’en’collaboration’avec’Hélμne’ROGNIAUX’et’Mathieu’ FANUEL.

La’ MSI’ permet’ daccéder’ δ’ la’ distribution’ spatiale’ des’ métabolites’ présents’ dans’ un’ échantillon.’Dans’nos’travaux,’lionisation’des’échantillons’sest’faite’par’désorption’laser’ (LDI) assistée par une matrice (MALDI-MSI) ou non (LDI-MSI).’Lacquisition’de’ces’données’ se décompose en plusieurs étapes (Figure IV-2): - la préparation’de’léchantillon : les échantillons de lichen sont coupés manuellement δ’ laide’ dune’ lame’ de’ rasoir’ (épaisseur’ approximative’ 100’ µm).’ Les’ coupes’ sont’ ensuite déposées sur un adhésif conducteur, lui-même collé sur une lame en oxide’dindium-étain. Aucun’traitement’supplémentaire’nest’nécessaire’pour’les’analyses’LDI’alors’quune’matrice’ (solution de DHB à 20 mg.mL-1 dans 50% de méthanol) est appliquée de manière homogène sur les échantillons pour les analyses MALDI. Les métabolites spécialisés lichéniques ayant une structure se rapprochant’des’matrices’dionisation’utilisées’en’MALDI,’lusage’de’ces’ derniμres’ savμre’ non’ nécessaire’ pour’ lhistolocalisation’ des’ métabolites’ spécialisés’ lichéniques (Le Pogam et al. 2015b, 2016b).’En’revanche,’ pour’localiser’ dautres’ types’ de’ métabolites tels que des polyols, il est nécessaire de pulvériser une matrice sur la lame, afin de permettre leur ionisation. - lacquisition des données à proprement parlé :’un’quadrillage’est’défini’sur’léchantillon’ et un spectre de masse est acquis pour chaque point défini. - le traitement graphique des données :’Chaque’signal’dintérêt’est’associé’δ’une’couleur’ qui sera ensuite utilisée pour symboliser la présence du composé au niveau de la coupe étudiée.’Limage’générée’est’ensuite’superposée’δ’limage’optique’de’la’coupe’de’lichen’afin’ de’localiser’au’sein’des’tissus’les’métabolites’dintérêts.’’

93 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Etape 1 Etape 2 Définition du Collecte des Etape 3 quadrillage spectres de masse Distribution des en chaque point différents ions d’itt

Etape 4 Superposition

Poits d’iadiatio lase

Cible (MA)LDI

Spectre de masse moyen

Figure IV-2 :’Principe’de’lacquisition’des’données’en’imagerie’par’spectrométrie’de’masse’ LDI. Schéma adapté de Greer et al. (2011) par Le Pogam (2016)

2 Psetatio des tehiues d’aalses opoteetales utilisées

2.1 Expériences de choix alimentaires en notodromes

Ces expériences sont réalisées dans des arènes de choix alimentaires à six branches, appelées « notodromes » (Figure IV-3 ; Plastit,’Rennes,’France,’ daprμs’le’ concept’proposé par M. Charrier).’En’début’dexpérience,’les’escargots’(N=′1’par’notodrome)’δ’jeun’depuis’48h’sont’ placés’au’centre’de’larμne.’Les’escargots’ont’le’choix’entre’le’lichen’intact,’le’lichen’rincé’et’ une petite roche ; ces choix étant placés de manière appariée aux extrémités de chaque branche (Figure IV-3). Chaque expérience est réalisée en parallèle dans quatre notodromes.

94 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-3: Arène de choix alimentaire ou « notodrome ». Les escargots (N=21) sont placés’dans’la’zone’centrale.’Lobservation’finale’a’lieu’au’bout’de’′4h.’

Les notodromes sont placés dans une enceinte climatique avec une alternance de la photopériode programmé de la façon suivante : photophase (12h), T° = 10°C ; scotophase (12h), T° = 6°C. De la mousse synthétique humide est placée au fond de chaque arène pour maintenir’lhumidité’nécessaire’δ’lactivité’des’escargots.’

La phase expérimentale débute au début de la phase nocturne et est arrêtée au bout de 24h. Deux observations sont réalisées, la première après 4h de phase nocturne et la suivante au’bout’de’′4h’dexpérimentation.’A chaque observation, les escargots présents dans chacune des branches sont dénombrés. Lors’ de’ lobservation’ finale,’ les’ lichens’ sont’ observés’ et’ photographiés grâce à un stéréomicroscope (Stemi 2000-C, Zeiss) couplé à une caméra (AxioCam ERc5s, Zeiss). Les marques de radulas sont dénombrées et la surface de chacune dentre’elles’est mesurée grâce au logiciel Zen 2.3.

2.2 Expériences de non choix

2.2.1 Etude des lichens rincés et intacts

Les escargots à jeun depuis 48h, sont regroupés par groupes de 5 individus dans une boîte de Pétri’contenant’une’gaze’humide’afin’de’maintenir’lhumidité’et’ils’nont’pas’le’choix (Figure IV-4A). Ils sont soit confrontés à un morceau de lichen intact, soit à un morceau de lichen qui débarrassé de ses’métabolites’spécialisés’par’rinλage’δ’lacétone (= lichen rincé). Au bout de

95 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

48h, les morceaux de lichens sont retirés des boîtes de Pétri et les escargots sont laissés à excréter durant 48h supplémentaires. Le dénombrement des excréments dans chacune des boîtes est réalisé sous loupe binoculaire.

Figure IV-4 : Dispositifs expérimentaux utilisés lors des expériences de non choix. A. Cinq escargots’sont’confrontés’soit’δ’un’lichen’intact’soit’δ’un’lichen’rincé’δ’lacétone’pendant’ 48h. B. Un seul escargot est confronté soit’δ’un’gel’damidon’enrichi avec un métabolite lichénique,’soit’δ’un’gel’damidon’seul’pendant’48h.’

2.2.2 Etude des gels enrichis en métabolites

Les métabolites majoritaires des lichens étudiés sont incorporés sur des gels cylindriques damidon’ cireux de maïs (préparés à 15% ; diamètre : 6 mm, épaisseur 1 mm), afin de déterminer leur potentiel rôle appétent ou phagostimulant. Les tests de non-choix sont réalisés en boîte de Pétri à deux compartiments. Une gaze non tissée stérile humidifiée est placée au fond’de’chaque’compartiment’afin’de’maintenir’lhumidité’(Figure IV-4B). Les escargots (N=30), pris individuellement, sont soit confrontés à un gel contenant des métabolites (seuls ou en mélange), soit au contrôle positif, pendant 48 heures. Le contrôle positif’utilisé’est’le’cylindre’damidon’sur’lequel’seul’le’solvant’de’solubilisation’du’métabolite testé est déposé, lamidon’étant’décrit comme appétent pour les escargots (Senseman 1977).

A’ la’ fin’ de’ lexpérience, les gels sont observés et photographiés grâce à un stéréomicroscope (Stemi 2000-C, Zeiss) couplé à une caméra (AxioCam ERc5s, Zeiss).

96 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Lestimation’de’la’ surface’consommée’ est déterminée suite’ δ’lapplication’dune’grille de référence sur la photographie du gel, par le dénombrement des cases se superposant à une partie’de’gel’mangée.’Afin’destimer’le’volume,’un’facteur’est’utilisé’pour’différentier’les’gels’ consommés en surface (facteur = 1) de ceux consommés sur toute la hauteur du gel (facteur = 2).

3 Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques sont réalisées sous R V. 3.4.0 (R Core Team 2017).

3.1 Expériences de choix alimentaires en notodromes

La’ distribution’ des’ effectifs’ descargots’ se’ répartissant’ dans’ les’ différentes’ branches’ des’ notodromes est analysée par un modèle linéaire généralisé (GLM ; distribution : Poisson) dans lequel le site de collecte ou le phénotype est introduit. La surface de consommation des morceaux de lichen est comparée en fonction du traitement reçu par le lichen (intact ou rincé) par un modèle linéaire (LM) dans lequel le site de’collecte’ou’le’phénotype’ainsi’que’le’nombre’descargots’par’branche’sont introduits.

3.2 Expériences de non-choix

3.2.1 Lichens intacts vs lichens rincés

Le’nombre’dexcréments’récoltés’en’fonction des lichens consommés est analysé par un GLM (distribution : Poisson) dans lequel le site de collecte ou le phénotype est introduit. Un test post-hoc de Tukey est réalisé lorsque des différences significatives sont observées au sein dune’modalité, afin de les comparer deux à deux. Pour cette analyse, la fonction « glht » du package « multicomp » est appliquée (Hothorn et al. 2008).

3.2.2 Gels enrichis en métabolites

La surface consommée de chaque gel est déterminée par un score de consommation. Ce dernier’est’comparé’en’fonction’des’métabolites’présents’dans’le’gel’damidon’via’un’test’du’ rapport de vraisemblance via un modèle linéaire généralisé (GLM, distribution : binomiale négative ; fonction « glm.nb », package « MASS » (Venables and Ripley 2002)) dans lequel le

97 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

site de collecte ou le phénotype est introduit. Un test post-hoc de Tukey est réalisé lorsque des’différences’significatives’sont’observées’au’sein’dune’modalité,’afin’de’les’comparer’deux’ à deux grâce à la fonction « glht ».

∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞

Létude’des’deux’espμces’lichéniques’est faite’séparément’et’fera’lobjet’de’deux’sous- chapitres :’le’premier’sous’forme’darticle’(U. taylorii) et le second sous forme classique (P. crocata)

98 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

A. Overcoming deterrent metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study

Article en préparation pour Phytochemistry

Gadea Alice 1,2, Le Lamer Anne-Cécile 3, Fanuel Mathieu 4, Clerc Philippe 5, Daugan Corentin 1, Sauvager Aurélie 1, Rogniaux Hélène 4, Ertz Damien 6, Boustie Joël 1, Charrier Maryvonne 2† and Lohézic Le Dévéhat Françoise 1†

1 Université de Rennes 1, UMR CNRS 6553, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex, France 2 Université de Rennes 1, UMR CNRS 6226, Campus de Villejean, 35043 Rennes Cedex, France 3 Université de Toulouse; UPS-IRD; UMR 152 Pharma-DEV; Université Toulouse 3 ; Faculté des Sciences Pharmaceutiques; 35 Chemin des Maraîchers, 31062 Toulouse cedex 9, France. 4 INRA, UR 1268 Biopolymers Interactions Assemblies, 44316 Nantes, France 5 Conservatoire et Jardin Botanique, Département de la culture et du sport, chemin de’limpératrice’1,’1′9′’Chambésy,’Suisse 6 Botanic Garden Meise, Department Research, Nieuwelaan 38, B-1860 Meise, Belgium † These authors contributed equally to this paper

99

Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

1 Introduction

Optimal foraging in generalist species consists in finding the right balance between need to overcome potential toxic compounds and access to useful nutrients. Invertebrates, including Gastropods are considered as the most important lichen feeders (Gerson 1973; Hesbacher et al. 1995b; Vatne et al. 2010; Fröberg et al. 2011; Asplund et al. 2015) and because lichens are sessile and slow-growing symbiotic organisms, they must defend strongly against these predators. Lichens symbiosis is made by a fungus, the mycobiont, and a photosynthetic partner, the photobiont which can be a green algae or a cyanobacteria. The mycobiont produces hydrosoluble specialized metabolites as mycosporines (Roullier et al. 2011), lectines (Huneck and Yoshimura 1996) but also hydrophobic ones like depsides, depsidones or dibenzofuranes. These latter could be accumulated as tiny crystals on the external part of the fungus hyphae, in the cortex or the medulla of the lichen thallus (Honegger 1991). This extracellular localization allows to remove easily these metabolites using the so-called acetone-rinsing methodology, without degrading the lichen viability and palatability (Solhaug and Gauslaa 2001; Pöykkö et al. 2005). Such experiments highlight deterrent and/or toxic activity for some specialized metabolites towards invertebrates, including snails (Emmerich et al. 1993; Solhaug and Gauslaa 2001; Gauslaa 2005). Lichen tissues are a complex matrix containing an important part of carbohydrates, including structural polysaccharides and reserve carbohydrates as sugars and polyols. The photosynthetic ability and the high resiliency of these organisms bring to encounter lichens in nutrient-poor, cold and dry areas, as polar or alpine regions where they dominate the vegetation (Sancho et al. 2007). In these ecosystems, lichens are an important food source for snails lichen-feeders (Gadea et al. submitted). Indeed, snails have the full enzymatic arsenal to degrade and to assimilate sugars and polyols (Flari et al. 1995; Charrier and Rouland 2001; Charrier et al. 2006) which are known to be highly phagostimulant for Gastropods (Clark et al. 1997). The Subantarctic snail Notodiscus hookeri appears to be a relevant model to advance in the understanding of the chemical ecology of the lichen/snails interactions. It is the only native terrestrial Gastropod on Possession Island (Crozet Archipelago). This snail is a generalist lichen-feeder, able to deal with potential toxic metabolites (Gadea et al. 2017) and to select lichen parts according to their gustatory quality (Gadea et al. submitted). Two ecophenotypes are co-existing (Charrier et al. 2013) and the chlorolichen Usnea taylorii

101 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

occurs in high fell-fields areas, deprived in exangeable calcium in soil, where only snails with organic shell can be found. In this study, we investigated the role of the main metabolites of U. taylorii in the snail feeding choices. For this purpose, results of snail feeding choices experiments were coupled with in situ mass spectrometry imaging so to localize metabolites. In a second time, main metabolites were quantified and tested individually on the snails in no-choices experiments to determine their role in the snail feeding choices.

2 Methods and materials

2.1 Snail Collection and Lichen Material

Adult individuals of N. hookeri were collected on Possession Island during 2015 Austral summer. Snails belong to the organic phenotype and came from two fell-fields, Mont Branca (BRA, 46°′65.61S;’51°5010.68E, 200’m)’and’Mascarin’Summit’(MAS,’46°′610.09’ S;’ 51°45′0.58’ E,’ 600’ m)’ (a’ map’ of’ collect’ sites’ is’ available’ in (Gadea et al. submitted)). Ecophenotypes, habitat typology, soil composition and topography have been previously described (Charrier et al. 2013). The fruticose chlorolichen U.taylorii D. Hook. , encountered at MAS in the snail habitat was harvested on Possession Island during 2015 Austral summer. It was identified by Dr. Damien Ertz and confirmed by Dr. Philippe Clerc. Voucher specimens were deposited at the herbarium of the Faculty of Pharmacy of Rennes 1, Department of Pharmacognosy and Mycology, under the reference REN000141.

2.2 Macroscopic and microscopic analysis of Usnea taylorii

Thallus morphology was examined using a dissecting microscope Leica MZ6. Anatomical observation were made using a Leica DM2000 Led microscope. Sections of apothecia and thalli were made using a hand-razor blade and longitudinal sections of thalli were cut from well-developed thicker branches. The’ratio’%’of’axis’thickness/%’of’medulla’thickness’or’ ratio A/M, which is a good discriminator of Usnea species (Truong et al. 2011), was calculated. K and P spot tests according to Hale (1979) were directly applied to the medulla in longitudinal section of the branches.

102 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

2.3 HPLC-DAD-MS analysis of specialized metabolites

2.3.1 Instrumental settings

HPLC analyses and quantification of usnic acid and U. taylorii extracts were performed on a

Prominence Shimadzu HPLC system (Marne La Vallée, France) equipped with a Kinetex C18 HPLC column (100 x 4.6 mm, 2.6 µm, 6A, Phenomenex) and consisting of a quaternary pump (LC20ASDP), a surveyor autosampler (SIL-20AHT) and a diode array detector (SPD-M20A). The separation was achieved using an acidic water/acetonitrile system as previously described (Gadea et al. 2017). The ESI-mass spectra were obtained from an Expression Advion CMS apparatus (Advion, Ithaca, U.S.A.). The mass spectra were recorded in the negative ion- mode in a mass range of 100 to 1200 Da, applying the same parameters previously described (Gadea et al. 2017). The spectral data from the photodiode array detector were collected 48 min over the 200-500 nm range of the absorption spectrum and the chromatograms were plotted at the maximum wavelength of absorption (max) of main metabolites. Peaks were assigned according the retention time, UV-spectra and mass spectra for both standards and samples.

2.3.2 Samples and standard preparation

Six specimens of the whole fertile thallus of Usnea taylorii (642 to 1000 mg) were extracted three times by acetone rinsing method (5 mL, 20 min) at room temperature and were allowed to dry in air until the solvent had evaporated (Solhaug and Gauslaa 2001). Acetone extracts were used for the chemical analysis while the rinsed lichen thalli were kept for the feeding choice experiments. The yield defined as the ratio between the weights of the extracts and the dry lichen powder was calculated for each extraction. All extracts obtained from Usnea taylorii were dissolved in distilled tetrahydrofuran at a concentration of 0.5 g.L-1. Then, they were filtered through a Nylon syringe filter F2504-1 (Thermo scientific, Rockwood, USA, 0.45 µm x 4 mm) and injected into the HPLC system (10 µL aliquot).

2.3.3 Analytical method validation

All validation parameters were determined following the International Conference on Harmonization (ICH) Guidelines (ICH 2005) using HPLC analyses and the following characteristics were evaluated : linearity, limits of detection and quantification, repeatability

103 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

interday and intraday. Four stock standard solutions of (+)-usnic acid (Sigma-Aldrich ; 329967) were prepared by dissolving about 2 mg in 4 mL tetrahydrofuran to reach a concentration of 0.5 mg.mL-1. Then, six working standard solutions of usnic acid were prepared by appropriate dilution of each stock solution with acetonitrile to generate concentrations ranging from 0.07 to 0.09 g.L-1 for the external standard calibration curve and the determination of the regression line. Hence, the concentrations of usnic acid in U. taylorii were calculated, based on peak areas. Limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) were determined from the y-intercept standard deviation and the slope of the calibration curve. For the calculation of the intra-day repeatability a same dilution of usnic acid (0.05 g.L-1) was injected six times the same day. These assays were repeated on four different days for inter- day repeatability. Coefficient of variation and standard deviation were then calculated. Variation coefficients of less than 10 % for intra-day and for inter-day considered to be acceptable. Concentrations were obtained on the basis of calibration curves and were expressed in mg.g-1 DM of the lichen part.

2.4 Sugars and polyols profiling

Sugars and polyols were extracted from U. taylorii entire fertile thallus and profiled by Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (GC-FID) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, CA, USA), as previously described by Gadea et al. (2017). Adonitol (20 mM) was used as internal standard. The metabolites were identified from their retention time by comparison with external standards. Concentrations were obtained on the basis of internal standards and were expressed in mg.g-1 DM of the lichen part.

2.5 Mass Spectrometry Imaging (MSI)

Usnea taylorii samples were hand-cut’using’a’razor’blade’to’afford’slices’about’100’m’thick.’ Branches and apothecia slices were fixed on a carbon-conductive adhesive tape which was in turn fixed on an indium tin oxide (ITO) slide (Bruker Daltonics, Bremen, Germany, cat no 237001). For Laser Desorption Ionization (LDI) MSI measurement, no further preparation step is required. For Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) MSI measurements, DHB matrix solution (50 mg/mL in 50% methanol) was homogeneously applied with a home- designed spraying robot.

104 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

All MSI measurements were performed using an Autoflex-Speed MALDI-TOF/TOF spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) equipped with a Smartbeam laser (355 nm, 1000 Hz) and controlled using the Flex Control 3.4 software package. The mass spectrometer was operated in the reflectron mode with a negative polarity for LDI-MSI and a positive polarity for MALDI-MSI. Spectra were acquired in the mass range of m/z 100600 for all (x, y) coordinates corresponding to the imaged tissue.

The laser raster size was set at 35 microns. The signal was initially optimized by manually adjusting the laser power and the number of laser shots fired. Accordingly, full-scan MS experiments were run by accumulating 400 laser shots per raster position, and using the laser power leading to the best signal-to-noise ratio. Image acquisition was performed using the Flex Imaging 4.0 (Bruker Daltonics) software package. The correlation of the target plate with the optical image was performed from three distinct teaching points following the procedure of the Flex Imaging software (Bruker Daltonics).

2.6 Snails feeding choices

Each fertile thallus of U. taylorii was divided into two pieces of equal size, always containing a branche with the terminal apothecia. Half of these thalli, constituting subgroup 1, were randomly taken to extract the specialized metabolites and constituted the rinsed lichens’ (Rinsed).’ The’ other’ group, subgroup 2, was considered as the control group (Intact).’ Specialized’ metabolites were removed using the so-called acetone rinsing technique, as previously described (Solhaug and Gauslaa 2001). Residual acetone from the lichen was evaporated for at least 20 hours before the experiment.

Eighty four N. hookeri from each site were divided randomly into four subgroups of 21 snails. Two days before the experiment, snails were starved in order to enhance their feeding motivation. The snails were placed inside a feeding choice arena with six arms, manufactured on plexiglass (Plastit’supplier,’Rennes,’France,’under’the’concept’proposed’by’ M. Charrier). The same lichen samples were placed at both ends in opposite arms, giving the choice’among’three:’two’Intact,’two’Rinsed’and’two’Rocks.’The’latter’was’a’small’rock clean of any lichens or bryophytes. Feeding’choice’arena,’also’called’Notodrome’were’held’ in a climatic chamber under a light/dark photoperiod set as follows: 10 °C day (12 h) and 6 °C

105 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

night (12 h). Experiments were lead on at the same time in four Notodromes, with 21 snails both. Experiments started at the beginning of the nocturnal phase and stoped after 24 hours. Localization in Notodrome of each snail were reported, radula marks on lichens thalli were observed, and the consumed area were measured using Zen 2.3 software.

2.7 No-choice experiments on isolated compounds

One hundred and twenty snails from each sites were separated in four subgroups: control and three test-groups (usnic acid, usnic acid + arabitol and arabitol). No-choice experiments were performed in compartmented Petri dish. Wet nonwoven sterile gauze were placed in each compartment to maintain humidity. Waxy starch gels were prepared at the concentration of 15% and small disk (diameter: 6mm, thickness 1 mm) were manufactured using a home-made dispositive (Plastit’supplier,’Rennes,’France,’under’the’concept’proposed’by’M.’Charrier). Metabolites (usnic acid, arabitol and a mixture of usnic acid and arabitol) were added to each tested gel at the same concentration than those quantified in the lichen. Waxy starch gels alone were considered as positive controls. Snails had no choice, either facing gel supplied with metabolites, or control gel, during 48 hours. At the end of the experiment; gels were photographed and the snail feeding was estimated. To calculate this feeding score, the area was first estimated by a standardized grid, and then a corrective factor was applied (1 for a superficial consumption and 2 for a total consumption; Fig S1).

2.8 Statistical analysis

The snail distribution in the arms was analysed by a Generalized Linear Model (GLM) in which collect sites were added. Grazed area of each lichen piece in the feeding choice experiments was compared among the treatment (Intact or Rinsed) using GLM in which the collect site and the number of snails per branches were introduced. The consumed area of each gel was compared among the metabolites incorporated using a likelihood ration test on a Generalized Linear Model (GLM, distribution: negative binomial,’link’function:’log’;’function’glm.nb,’package’MASS’(Venables and Ripley 2002)) in which the collect site was introduced. Post-hoc Tukey pairwise comparisons were performed’ using’ the’ function’ glht’ (package’ multicomp,(Hothorn et al. 2008)). All statistical analyses were made using R software V. 3.4.0 (R Core Team 2017).

106 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

3 Results

3.1 Description of Usnea taylorii morphology

Thallus shrubby erect, rigid, 1-8 cm, yellow green with irregular to continuous (close to the apices) jet black pigmentation, with isotomic-dichotomic ramifications. Basal part single or with proliferating holdfast, brownish but not with jet black pigmentation. Branches cylindrical to slightly irregular in the first third of the thallus close to the basal part, not segmented, ± terete in cross-section, up to 2 mm diameter at their thickest parts. Lateral branches not constricted at ramification point. Papillae, tubercles, fibrils and fibercles absent. Pseudocyphellae present, following longitudinal cracks in the cortex. Maculae numerous on main branches, up to 0.3 mm width, lenticel-like ± elongated longitudinally or of irregular shape, often on small protuberances of the cortex. Soralia and isidiomorphs absent. Cortex thin to very thin (2.5-5.5%), sometimes longitudinally cracked (pseudocyphellae). Algal layer protruding together with the medulla into the central axis, seldom as a continuous layer under the cortex. In some parts of the branches the algal layer is greenish whereas in other parts it is more yellowish orangish. Under the microscope these algae appear to have orange pigment inside (carotenoids?). Medulla very thin to thin (2-10.5%) protruding into the central axis and thus dividing it into several thinner axial strands. Axis very thick (67-89%) divided in several smaller axial strand by the protuding medulla. A/M: calculated values were very variables among studied specimens (6.5-89). Apothecia absent or present, terminal to subterminal with a ± short geniculate appendage, with a jet black pigmented disc of 2-17 mm diameter, without fibrils at the edge of the disc. Branches transversal and longitudinal cuts are available in Figure IV-5. Chemistry: the studied specimens react P+ (fumarprotocetraric acid) or P- (no substances detected). This description is consistent with the previous description made by Walker (1985).

107 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-5 : (a) U.taylorii entire thalli; branches in longitudinal (b) and transversal (c) cut. Black scale bar: 5 mm; white scale bars represent 500 µm.

3.2 Snail feeding choices

The snails from MAS were smaller with mean (± SD) shell sizes of 4.85 ± 0.37 mm than snails from BRA (5.05 ± 0.34 mm). No significant diferencies were observed between snails subgroups for both site (Table S1). Snails were generally located in the arena arms containing the little rock (more than half individuals) while others equally distributed between arms with lichens (Figure IV-6).

Figure IV-6 : Snail distribution (means + SE) in the arms of feeding choices arenas, during the nutritional phase (4h experiment, night). The letters a and b indicate significant differences between arena arms containing lichens and arms containing the little rocks.

108 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Regarding’the’quantitative’results’of’consumption’between’Intact’and’Rinsed’U. taylorii, no differences were observed in these experiments, independently of the site (linear model, F = 2.119, P = 0.171) and whatever the lichen treatment (LM, F = 1.808, P = 0.204). A consumption of the cortex and the algal layer could be observed, as well as the apothecia (Figure IV-7). Lax medulla was sometimes touched but central axis of branches always remained intact.

Figure IV-7 : Consumed U. taylorii. Snails ate the apothecia (a) and the external layers of branches (b). Arrows designed snails grazing marks.

3.3 Quantification of metabolites in the lichen U. taylorii

The extraction yields ranged between 0.5 and 1.0 % for the six replicates of dried lichen material for a mean value of 0.8 ± 0.2 %. The chemical profile for U. taylorii whole fertile thalli was established by HPLC-DAD-ESI-MS analysis of their acetone extracts. The dibenzofuran (+)-usnic acid was the only specialized metabolite detected in these extracts, its amount of ranging from 2.5 to 5.4 mg.g-1 Dry Mass (DM) of lichen, with a mean value of 4.1 ± 1.1 mg.g- 1 DM (n = 6). To validate the chromatographic method used in the study, the precision and linearity of the method were determined (Tableau IV-3).

109 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Tableau IV-3 : Results of various parameters of validation studies for usnic acid quantification

Parameters Usnic acid Calibration curve equation y = 65613076x 95165 Correlation coefficient value 0.994 (R2) LOD (µgm.L-1) 0.105 LOQ (µg.mL-1) 6.900 Calibration range (µg.mL-1) 7.000 to 90.000 Intraday precision (RSD, n=6) less than 3% Interday precision (RSD, n=24) less than 2% LOD, limit of detection; LOQ, limit of quantification; RSD, relative standard deviation

Sugars and polyols profiling was also performed. A few diversity was observed, with only seven metabolites quantified. Arabitol was the most important polyol of the lichen, reaching 138.4 ± 25.8 mg.g-1. Comparatively, the others polyols and sugars were quantified in minor amounts (See Table S2).

3.4 Localization of the major metabolites of U. taylorii by mass spectrometry imaging (LDI-MS imaging and MALDI-MS imaging)

Preliminary LDI-MS analysis of an Usnea taylorii acetone extract confirmed that (+)- usnic acid was the only specialized metabolite detected through its deprotonated molecule (m/z 343) along with a fragment ion at m/z 329. Usnic acid was consequently imaged through the m/z 343 ion.

In situ LDI-MSI experiments performed on a slice of a non-rinsed branches ofU. taylorii showed that usnic acid was exclusively localized in the peripheral layer of the thallus, i.e in the cortical layer (Figure IV-8a). The same distribution was observed within the apothecia slices, showing usnic acid to be allocated to the lower cortical layer, but also to the epithecium, on the upper face above the asci (Figure IV-8c). Imaged acquired from slices of consumed lichen showed that snails ate the cortex and epithecium, both containing usnic acid (Figure IV-8b and 8d).

110 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-8 : Distribution of usnic acid (ion [M-H]- at m/z 343.2) in samples of U. taylorii. a. Intact branches; b. Consumed branches; c. Intact apothecia, d. Consumed apothecia. On each panel are side by side the optical image of the lichen section (left side) and the mass spectrometry imaging results (right side). The consumed parts (radula marks) are highlighted by blue arrows. Intensity scale was adjusted to maximize the visualization of the usnic acid.

D-arabitol, the major polyol quantified by GC, was also imaged by mass spectrometry. Since D-arabitol does not absorb at the wavelength of the laser used for LDI-MSI, a MALDI matrix solution was sprayed on the slices of U. taylorii and images were performed by MALDI-MSI. MALDI-MSI spatial mapping allocated arabitol almost everywhere in the lichen, excepted in the central axis. It is particularly distributed in the protruding medulla and in the cortical layer (Figure IV-9). Snails consumed parts of the thalli containing arabitol.

111 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

a

b

Figure IV-9 : Distribution of arabitol (ion [M+Na]+ at m/z 175.1) in samples of U. taylorii. a. Branches; b. Apothecia. On each panel are side by side the optical image of the lichen section (left side) and the mass spectrometry imaging results (right side). The consumed parts (radula marks) are highlighted by blue arrows. Intensity scale was adjusted to highlight differences in segregation of arabitol.

3.5 No-choices experiments

The snails from MAS were smaller (mean ± SD: 4.91 ± 0.36 mm) than snails from BRA (4.73 ± 0.40 mm). No significant size difference’was’observed’between’each’Test’subgroup’(Table S3). The quantity of metabolites incorporated on the waxy starch gel was determined from the data obtained by quantification of the entire whole fertile thallus (4 mg.g-1 for usnic acid and 100 mg.g-1 for arabitol). After 48 hours of feeding experiment, the molecules incorporated into the gel had an impact on the snails feeding choices’(χ2 = 57.473, df = 3, P < 0.001; Figure IV-10). Snails confronted to Test gel with usnic acid alone, mainly avoided it (Tukey, P < 0.001), while no significant differences were observed between starch gel with arabitol and

112 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri the positive control (Tukey, P = 0.795). In presence of arabitol, gel with usnic acid were more consumed than gel with usnic acid alone (Tukey, P < 0.001) but less than gel incorporating arabitol alone (Tukey, P = 0.009). No differences between collect site’were’observed’(χ2 = 0.685, df = 1, P = 0.408).

Figure IV-10 : Gel’consumption’(Mean’±’SE)’by’the’organic’phenotypes’snails,’according’ the metabolite tested on starch gel. Gel consumption was estimated by a feeding score. Positive control selected was the starch gel without metabolites. The lowercase superscript letters a, b and c indicate significant differences between positive control and usnic acid containing gels (alone or in association with arabitol). Gels with arabitol were not significantly different than positive control.

4 Discussion

Rocks appeared to have an attractive effect on the snails. So in an unknown environment, snails first look for shelter before looking for food. After 20 hours in feeding choices arenas, N. hookeri grazed intact Usnea taylorii thalli as well as rinsed ones. Acetone rinsing method is commonly used in snail-lichen trophic interactions studies (Gauslaa 2005; Asplund et al. 2010b;’Asplund’and’Wardle’′01″;’Černajovε’and’Svoboda’′014;’Boch’et’al.’′015b) to study the influence of acetone soluble specialized metabolites. Through these previous studies, the palatability of a total of 82 entire lichens was tested on Gastropods (some lichens species occurred several times). A differential consumption according to lichen species, the nature of the photobiont and the lichen morphology could be highlighted. Moreover some differences

113 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

could also occur depending on the snail species (Boch et al. 2015b). Thus, no general conclusion could be stated. Nevertheless, in most cases, a higher consumption of the lichen was observed after removing acetone soluble metabolites. Lichens previously studied were generally chlorolichens (N=70) and among them only one species of Usnea (U. dasopoga) was tested (Asplund and Wardle 2013). In this work, the consumption rate of intact U. dasopoga was about 55 mg.day-1 and this parameter significantly increases until about 95 mg.day-1 after acetone rinsing. It is however important to note that the initial rate was not so low and consequently that the intact thalli of U. dasopoga was eaten. Similarly, U. taylorii was eaten without acetone rinsing, but in our case removal of soluble metabolites did not increase the feeding. Two hypotheses may be stated: the presence in the lichen thallus of acetone soluble metabolites which did not affect the lichenivores feeding choices and/or the presence in the lichen thallus of phagostimulant compound such as sugars or polyols. It is also worth emphasizing that specialized metabolites sometimes had a sectorial localization (Gadea et al. submitted; Le Pogam et al. 2016b), which may explain a preferential grazing of some lichen parts. As an example of this statement, Asplund (2011) described a perpendicular grazing after acetone rinsing in two Lobaria species while snails avoided medulla before removal of acetone soluble metabolites. In some cases, the avoidance of the lichen did not decrease after acetone rinsing. Lichen intake by gastropod being correlated with the presence or the absence of some specialized metabolites, localization of these metabolites in U. taylorii thallus could be an interesting way to confirm their role in the snail feeding choices. Moreover, to our knowledge, no data exists of the spatial histolocalization of polyols in lichen thallus.

Mass spectrometry imaging (MSI) couples both spatial and high chemical information at the tissue level. This method is powerful for studying chemical role of specialized metabolites in lichen thalli (Le Pogam et al. 2016b). In the present work, MSI was successfully used to histolocalize usnic acid, the main specialized metabolite of the lichen U. taylorii. Fumarprotocetraric acid, sometime present in U. taylorii thalli as traces (Gadea et al. 2017) was not detected in our experiments. Usnic acid was previously described for having a cortical localization, concomitant to the algal cells of the lichen to give them a photoprotection (Nybakken and Gauslaa 2007) and regulate algal development (Bačkor’et’al.’′010;’Le’Pogam et al. 2016b). MSI confirmed the cortical localisation of usnic acid in the branches, however no usnic acid was detected in the central part of U. taylorii, where some invaginated algal cells could be observed, contrarily to the other Usnea species. Assuming a photoprotective

114 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri role of usnic acid, we hypothesize that internal algal cells could be protected by the compact ramified fungal axis and did not need more photoprotection. These observations also invalidate for this lichen the regulative role on algal cells by usnic acid since this metabolite was not always found concomitantly with the photobiont. Usnic acid was also localized in the external parts of the apothecia, in the corticated lower face as well as in the apothecial disk, where no-algae were present. One can assume that usnic acid acts as a UV filter to protect spores during their maturation within asci, avoiding a potential DNA degradation of the spores. Eaten branches and apothecia were also analysed by MSI and that revealed usnic acid to be completely absent in snails grazing areas on both branches and apothecias’ slices,’ confirming that N. hookeri consumed cortical layer enriched in usnic acid. This is in agreement with our previous results which showed that this metabolite was retrieved from faeces after U. taylorii intake by the snail (Gadea et al. 2017). However, the consumption and the excretion of the metabolite did not mean that usnic acid was appetent and/or not toxic for the snail.

In this way, snails faced usnic acid in starch gel, in no choice experiments. The first step was to quantify usnic acid in the lichen in order to incorporate the metabolite at the lichen concentration in the starch gel. The obtained concentrations in U. taylorii (4.1 ± 1.1 mg.g-1) were consistent with concentration of usnic acid in other Usnea species (Cansaran et al. 2006). We hypothesized that as a cortical compound, usnic acid had not a repulsive effect on snails (Solhaug et al. 2009). Asplund et al. (2010) did not observed significant differences in consumption of filter paper soaked with usnic acid by the snail Cochlodina laminata and filter paper alone. Snails intake of usnic acid was also confirmed by the presence of usnic acid in faeces (Hesbacher et al. 1995a; Gadea et al. 2017). Hesbacher (1995a) did not find any sequestration in snail tissues, contrarily to the moth Clereodes lichenaria larvae (Goga et al. 2015). Surprisingly, usnic acid turned out to be deterrent for N. hookeri in no-choice experiment when incorporate on waxy starch gel. Deterrent and/or toxic effect of usnic acid was previously described for arthropods (Emmerich et al. 1993; Cetin et al. 2008) and Nimis and Skert (2006) considered this metabolite as the most effective anti-lichenophage. Nevertheless, these effects have never been described for Gastropods.

Combining lichen feeding choice results to MSI data, we demonstrate that in the lichen matrix, usnic acid was consumed and it was not deterrent for the snail. These results were in

115 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

agreement with Asplund et al. (2010) who observed a snail consumption of usnic contained in vegetative thallus of Lobaria scrobiculata before and after acetone rinsing. Bearing in mind that waxy starch gel incorporated usnic acid were avoided by the snails, we hypothesized that other metabolites in the lichen have a nutritional interest for the snail. In this sense, sugars and polyols were quantified. The amounts of carbohydrates were in line with those of the Antarctic lichen Usnea antarctica (arabitol : 112,9 mg.g-1) (Tearle 1987). It is noteworthy that polar or sub-polar lichen could present higher levels of polyols (Gadea et al. submitted; Dudley and Lechowicz 1987) than temperate lichen (Tearle 1987). Arabitol is described as a short- term carbohydrate reserve and is derived from the transformation of ribitol by the mycobiont, by photosynthesis by the photobiont (Armstrong and Smith 1994; Dahlman et al. 2003). Arabitol was present everywhere in the lichen thalli, but in various concentrations i.e. in the tough medulla. The importance of arabitol in lichen-snail trophic interaction was highlighted in our previous work (Gadea et al. submitted). Arabitol was the main polyol quantified in U. taylorii, it was therefore selected for the no-choice experiments on waxy starch gels. Gels supplemented with arabitol were eaten as well as the positive control starch gel only. More interestingly snails ate more gels with arabitol and usnic acid mixed up than gels holding usnic acid alone. These results emphasized the phagostimulant properties of arabitol in lichen- snail trophic interactions. Phagostimulant activity was previously described for sugars but not for polyols. Particularly, sucrose increased the amount of agar baits ingested by the slug Deroceras reticulatum (Henderson et al. 1992) more than glucose, lactose and fructose. Sugars and polyols are consequently metabolites of high interest for the snails. Indeed, they are involved in numerous physiological processes of the snails. First, it is noteworthy than Gastropods energy is mainly provided from glycogen storage (van der Horst and Zandee 1973). Since polyols can be easily converted in sugars by an oxidative mechanism, one can assumed that arabitol acts as a nutrient metabolite. Secondly, these metabolites also lead to the mucus production, the latter being essential for the snail survival because it enables body hydration, locomotion, and food foraging among others (Ng et al. 2013).

Consequently, in nutrient poor ecosystems, lichens with high amounts of polyols like Usnea taylorii are an important food source for lichenivores as N. hookeri. These experiments demonstrated the crucial role of primary metabolites in snails feeding choices, to overcome the deterrent effect of specialized metabolites.

116 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Supplementary Materials10: Fig. S1 Different levels of snail feeding on starch gels: (a) not consumed, (b) superficially consumed and (c) totally consumed. For (b) and (c), a corrective factor (1 and 2 respectively) was applied to the feeding score. Table S1 : Measurements made on the snails N. hookeri used in feeding choice arena experiment. Shell size in mm were represented by their mean values (± Standard deviation). The two-way ANOVA values are given for the factor Site and the factor subgroup. With both variables, the interaction being not significant, the result was not shown. Table S2: Quantity of metabolites detected in the lichen Usnea taylorii (mean ± standard deviation).Table S3: Measurements made on the snails N. hookeri used in no-choice experiment. Shell size in mm were represented by their mean values (± Standard deviation). The two-way ANOVA values are given for the factor Site and the factor Test. With both variables, the interaction being not significant, the result was not shown.

Acknowledgments Subantarctic field trip was funded by l'Institut Polaire Paul-Émile Victor, Plouzané, France (IPEV, programme 136). Julien Tommasino and Grichka Biver are thanked for their contribution in producing a part of this data set. Aude Boutet, Julien Tommasino and Benjamin Ferlay are warmly thanked for their help during the fieldwork. Part of the experiments (sugars and polyols quantification) were conducted at the P2M2 Platform, thanks to Alain Bouchereau, and with the technical assistance of Catherine Jonard and Nathalie Marnet, which are warmly thanked. Authors are also indebted to Maxime Dahirel for his statistical advices and to Béatrice Legouin for her guidance on the analytical method validation.

10 Supplementary data are available in Annexe C at the end of this manuscript (page 225). 117

Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

B. Histolocalisation des mtabolites spcialiss de Pseudocyphellaria crocata et tude de leur influence sur les choix alimentaires de N. hookeri.

1 Roltes d’esagots et lihes

Les escargots adultes Notodiscus hookeri ont été récoltés sur quatre sites’ de’ lîle’ de’ la’ Possession entre les étés Austraux 2015 et 2016. Les escargots OP ont été récoltés dans les fell-fields daltitudes’du’Mont’Branca’(BRA) et du pic du Mascarin (MAS) et les escargots MP ont été récoltés sur les plaines côtières du site de Pointe Basse (PBAS) et au pied de la Tour Blanche (TBLA). Le cyanolichen foliacé P. crocata a été présent sur le site de PBAS et TBLA.

2 Analyses chimiques

2.1 Préparation des standards et quantification des métabolites spécialisés majoritaires dans P. crocata par HPLC-DAD

Lacide’ stictique’ (JB/A/141) utilisé pour la quantification a été fourni par la chimiothèque de laboratoire de pharmacognosie de de Mycologie de la faculté de Pharmacie de Rennes. La ténuiorine a été isolée à partir de Pseudocyphellaria crocata (REN000147 ; Protocole de purification en Annexe D) et la calycine a été isolée à partir du lichen Chrysotrix candelaris (Récolté en forêt de Fontainebleau ;’Protocole’disolement’en’Annexe’ D). Pour chaque métabolite, la méthode de quantification par HPLC-DAD a été validée selon les paramμtres’de’validation’recommandés’par’la’Conférence’Internationale’sur’lHarmonisation’

119 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

(ICH 2005) : la linéarité, les limites de détection (LOD11) et de quantification (LOQ12) ainsi que la répétabilité (répétabilité « intraday ») et fidélité intermédiaire (répétabilité « interday »). Les droites de calibration de chaque métabolite sont réalisées à la longueur donde’maximale’de’chaque’métabolite’(Tableau IV-4).

Tableau IV-4 : Résultats des différents paramètres de validation des méthodes de quantification des différents métabolites spécialisés.

Paramètres Ténuiorine Acide stictique Calycine Longueur’donde’maximale’(nm) 254 254 419 y = 50583626x - Equation courbe de calibration y = 82631492x - 565837 y = 54078856x - 61714 1214979 Coefficient de corrélation (R2) 0,973 0,929 0,984 LOD (µg.mL-1) 7,2 3,7 0,5 LOQ (µg.mL-1) 32,0 28,2 4,5 Intervalle de calibration (µg.mL-1) 25,0 200,0 7,8 125,0 1,9 31,3 Précision « Intraday » (RSD13, n=5) < 7 % < 2% < 7 % Précision « Interday » (RSD13, n=3) < 7 % < 2% < 9 %

Le’taux’dextraction’des’métabolites’ spécialisés dans P. crocata est de 5,3 ± 1,2 %. Aprμs’validation’de’la’méthode’de’quantification’pour’chacun’des’métabolites’dintérêt, la quantification au sein de cinq extraits acétone de thalle, obtenus’par’rinλage’δ’lacétone, est réalisée en vue de tester ces métabolites en expérience de non-choix avec N. hookeri (Tableau IV-5).

Tableau IV-5 : Contenu en métabolites spécialisés des thalles entiers de P. crocata

Ténuiorine Acide stictique Calycine Pseudocyphellaria crocata 18,0 ± 6,5 4,1 ± 1,1 1,2 ± 0,4 (mg g-1 DM14 ; N=5)

Pour des soucis d’homogénéité entre les différentes parties, nous avons fait le choix de laisser les abréviations en anglais dans les paragraphes rédigés en français. 11 LOD = Limit of Detection 12 LOQ = Limit of Quantification 120 13 RSD = Relative Standard Deviation 14 DM = Dry Mass

Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Les teneurs retrouvées diffèrent de celles décrites’pour’ce’lichen’lorsquil’est’collecté’ dans des clairières de forêts norvégiennes (Nybakken et al. 2007). Les concentrations de -1 ténuiorine sont plus faibles ([ténuiorine]Nyb = 39,0 ± 2,1 mg.g DM) alors que les teneurs -1 dacide’stictique’sont’plus’élevées’([acide’stictique]Nyb = 2,4 ± 0,2 mg.g DM). Ces différences peuvent’ sexpliquer’ par’ des’ facteurs’ environnementaux’ (exposition’ au’ soleil,’ humidité,’ températures,…)’différents’entre’lArchipel Crozet et la Norvège. Contrairement à Nybakken (2007), la calycine a pu être quantifiées dans les échantillons de thalle entiers.

2.2 Localisation des métabolites dans le thalle

Afin de localiser les métabolites spécialisés au sein du thalle lichénique, nous avons envisagé trois approches :’les’réactions’thallines,’limagerie’couplée’δ’la’ spectrométrie’de’ masse et la microdissection du thalle.

2.2.1 Réactions thallines

Les réactions thallines consistent à déposer une petite quantité de réactif directement au niveau du thalle lichénique, afin de caractériser certains métabolites spécialisés lichéniques.’Ces’tests’sappuient sur la présence de groupements spécifiques qui réagissent avec’le’réactif’utilisé.’Par’exemple,’le’test’C’(solution’saturée’dhypochlorite’de’sodium ou eau de javel commerciale) caractérise les méta-hydroxyphénols via une coloration allant du jaune au rouge alors que le test K (potasse, KOH à 10%) est spécifique de certains groupements hydroxyles. Le test P (para-phénylènediamine à 2%) quant à lui colore en jaune-orangé les depsides et depsidones contenant une fonction aldéhyde. Après avoir vérifié les colorations obtenues avec les métabolites majoritaires de chaque famille, nous avons voulu utiliser ces colorations sur des coupes de de Pseudocyphellaria crocata afin de vérifier la localisation des familles de métabolites au sein du thalle (Tableau IV-6).’Cependant,’aucune’des’réactions’na’ été positive sur les différentes parties de lichens, probablement à cause des faibles quantités de métabolites au sein du thalle ou comme le suggère Moncada et al. (2014),’δ’cause’dun’ antagonisme’avec’dautres’métabolites’spécialisés comme les pigments.

121 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Tableau IV-6 : Résultats des réactions thallines sur les métabolites majoritaires de chaque groupe de métabolites présents dans le lichen P. crocata. Le symbole « - » signifie quaucune’réaction’nest observée.

Structures Test K Test P Test C

Ténuiorine (depside) - - -

Acide gyrophorique Rouge - - (depside) sang

Orange au Acide stictique bout de Jaune - (depsidone) quelques secondes

Calycine (dérivé’de’lacide’ Rouge - - pulvinique)

Cortex de P. crocata - - -

Médulle de P. crocata - - -

2.2.2 Imagerie par spectrométrie de masse

Le’ spectre’ LDI’ de’ lextrait acétone de P. crocata est’ réalisé’ au’ préalable’ afin’ dobserver’ lionisation’des’différents’métabolites’présents’par’LDI’(Figure IV-11). Les’dérivés’de’lacide’pulvinique’(calycine,’acide’pulvinique’et’pulvinamide) sont les métabolites’sionisant’le’mieux’dans’lextrait.’Lion’pseudomoléculaire’de’la’calycine’(m/z 305) est visible ainsi que deux fragments caractéristiques des dérivés pulviniques (m/z 263 et m/z 233). En revanche, les ions pseudomoléculaires de lacide’ pulvinique’(m/z 307) et du pulvinamide (m/z ″06)’se’confondent’avec’lamas’isotopique’de’la’calycine.’ Les tridepsides sont des molécules fragiles en spectrométrie de masse, et la liaison ester entre les différents cycles aromatiques peut facilement se rompre. Les résultats du

122 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri spectre’LDI’de’lextrait’le’confirme’car’aucun’des’ions’pseudomoléculaires’correspondants aux différents tridepsides décrits dans le lichen (ténuiorine, acide 4- O-méthylgyrophorique, ′,′’di-O-méthylténuiorine’et’lacide’gyrophorique)’nest’observé’(m/z 495, 481, 523 et 467 respectivement ; Figure IV-11). En revanche, certains fragments caractéristiques de la famille peuvent être observés, en particulier le fragment m/z 149 (Figure IV-12). Enfin, les depsidones (acide stictique et ses dérivés) sont détectées, mais leur intensité relative est faible en comparaison des dérivés’de’lacide’pulvinique.’Un ion m/z 557 est détecté, mais’na’pas’été’identifié.’

x10 4 Calycine * Depside* Depside* Constictic acid 232.98 148.99 401.10 Calycine Intens. [a.u.]Intens. 1.0 Depside* 305.04 Constictic acid *

0.8 159.96 164.98 Norstictic acid

150.99 357.09 Stictic acid Cryptostictic acid Thamnolic 366.49 385.09 acid 0.6 387.09 371.07 419.05

0.4

Pulvinic acid * Pulvinamide* 263.02 0.2 248.18

401.10 117.02 192.96 357.09 556.97 148.99 284.00 385.09 0.0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

Figure IV-11 : Spectre LDI de l'extrait acétone de P. crocata. Les depsides sont représentés en bleu, les depsidones en rouge et’les’dérivés’de’lacide’pulvinique’en’jaune. Le symbole « * »’ correspond’ δ’ un’ fragment’ caractéristique’ dun’ composé’ ou’ dune’ famille’ de’ composés donnée. Les’ions’pseudomoléculaires’des’tridepsides’(ténuiorine,’lacide’4-O- méthylgyrophorique,’la’′,′-di-O-méthylténuiorine’et’lacide’gyrophorique)’nont’pas’ été détectés, ces métabolites peuvent être observés via la présence des m/z caractéristiques de certains de leurs fragments.

123 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

(1) (2)

Ténuiorine R1 = R4 = CH3 ; R2 = R3 = H m/z 595 Ténuiorine m/z 331 Acide 4-O-méthylgyrophorique R1 = CH3 ; R2 = R3 = R4 = H m/z 481 Acide 4-O-méthylgyrophorique m/z 317 Acide gyrophorique R1 = R2 = R3 = R4 = H m/z 523 Acide gyrophorique m/z 317 2’-2’’-diméthylténuiorine R1 = R2 = R3 = R4 = CH3 m/z 467 ’-’’-diméthylténuiorine m/z 359

(3) 2’ m/z 149 Réarrangement possible de (2) quand R2 = H (ténuiorine, acide 4-O-méthylgyrophotique et Adduit H20 possible m/z 167 acide gyrophorique)

(1) (4)

Si R2 = H Ténuiorine m/z 313 Ténuiorine R1 = R4 = CH3 ; R3 = H Adduit H20 possible m/z 331 Acide 4-O-méthylgyrophorique R1 = CH3 ; R3 = R4 = H Acide 4-O-méthylgyrophorique m/z 313 Acide gyrophorique R1 = R3 = R4 = H Acide gyrophorique m/z 301 Adduit H20 possible m/z 319

Figure IV-12 : Possibles mécanismes de fragmentation par spectrométrie de masse des tridepsides en ionisation négative. Le site portant la charge est arbitraire.

Les différents ions m/z de chaque famille de métabolites se superposant, nous avons sélectionné une seule espèce par famille pour’lhistolocalisation’:’m/z 149 pour les depsides, m/z ″05’(ion’pseudomoléculaire’de’la’calycine)’pour’les’dérivés’de’lacide pulvinique, et m/z ″71’(ion’pseudomoléculaire’de’lacide’norstictique,’seule’depsidone’détectée’en’LDI-MSI) pour les depsidones. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure IV-13.’Lion’non’identifié’ à m/z 557 a également été histolocalisé.

124 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-13 : Distribution au sein du thalle des différents groupes de métabolites de P. crocata. Sur chaque ligne à gauche, limage’optique’de’la’coupe’de’lichen’est’associée’aux’ résultats’dimagerie’par spectrométrie de masse. Les ions des fragments depsides (m/z 149), de la calycine (m/z ″05)’et’de’lacide’norstictique’(m/z 371) sont représentés en bleu,’jaune’et’rouge’respectivement.’Lion’non’identifié’m/z 557 est représenté en vert. Léchelle’dintensité est ajustée pour maximiser la visualisation de chaque métabolite. Les flèches bleues mettent en évidence des zones consommées par N. hookeri.

Les analyses par LDI-MSI confirment la répartition spécifique de la calycine et des autres dérivés pulviniques au niveau des sorédies et des pseudocyphelles. Ces résultats sont cohérents avec la coloration jaune observée sur les coupes de lichen, se limitant aux sorédies et aux pseudocyphelles. La localisation des dérivés pulviniques est par conséquent variable dune’espμce’δ’lautre.’En’effet,’ces’métabolites’ont’une’localisation’corticale’dans’le’lichen’ Letharia gracilis (McCune and Altermann 2009) alors’que’dans’lespμce’Pseudocyphellaria

125 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

aurata, ils sont présents dans toute la médulle et non uniquement au niveau des sorédies (Moncada et al. 2013). Ces métabolites sont décrits comme de puissant répulsifs des lichénophages (Lawrey 1983; Gauslaa 2008), et une localisation spécifique au niveau des organes responsables de la reproduction asexuée du lichen met en évidence une stratégie de défense optimale de la part du lichen (Hyvärinen et al. 2000; Asplund et al. 2010b).

Les depsides sont retrouvées au niveau de la médulle, plutôt dans la partie supérieure, à proximité de la couche algale. La ténuiorine, métabolite majoritaire de P. crocata, avait été décrite comme corticale (Moncada et al. 2014).’Les’résultats’dimagerie’viennent’contredire’ ces précédents résultats qui se basaient sur des réactions thallines réalisées sur le cortex et la médulle des lichens. Les marques de radulas observées sur la coupe de thalle de P. crocata (Figure IV-13)’ et’ les’ résultats’ obtenus’ précédemment’ lors’ de’ létude’ du’ devenir’ des’ métabolites lichéniques suite à leur ingestion par N. hookeri (Gadea et al. 2017) montrent une consommation du cortex supérieur et de la couche algale, laissant la médulle intacte. La ténuiorine est ingurgitée lors de la consommation de la couche algale, alors que la calycine est ingérée lorsque’lescargot broute des sorédies en formation situées au niveau du cortex supérieur.

Le’métabolite’correspondant’δ’lion’m/z 557 se localise sur toute la partie extérieure du’thalle,’et’labsence’de’pixels’sur’les’zones’consommées’indiquent’que’ce’métabolite’est ingéré par N. hookeri. Ce métabolite est associé aux parties de couleur sombre du thalle (cortex’ supérieur,’ cortex’ inférieur’ et’ tomentum),’ il’ pourrait’ par’ conséquent’ sagir’ dun’ pigment de type caroténoïde ou de mélanine. Ces deux types de composés sont connus pour leur rôle photoprotecteur au sein du lichen, comme cela a précédemment été décrit pour P. crocata (Nybakken et al. 2007).

Ces’analyses’nont’toutefois’pas’permis’de’localiser’les’depsidones’au’niveau’du’thalle’ de P. crocata. En effet seuls quelques pixels de faible intensité correspondant au m/z 371 de lacide’norstictique’sont imagés, et une conclusion quant à leur localisation ne semble pas pertinente.’Cette’absence’dionisation’peut’sexpliquer’par’le’cumul’de’deux’facteurs : une faible ionisation des composés comme le montre le spectre LDI’de’lextrait’acétone’(Figure IV-11) et une concentration plus faible par rapport à la ténuiorine (acide stictique 4.09 mg.g- 1 vs ténuiorine 18.01 mg.g-1). Suivant les données de la littérature, nous nous attendions à

126 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri observer les depsidones au niveau de la médulle (Asplund 2011a; Gauslaa et al. 2013; Moncada et al. 2014), et par’ces’expériences’dimagerie,’nous’voulions’confirmer’ces’informations’qui’ ne’se’basent’que’sur’dautres’données’de’la’littérature’ou’éventuellement’sur’des’réactions’ thallines faites sur le cortex ou la médulle du lichen par les lichénologues lors de la description de’lespμce. Par conséquent, afin de localiser les dérivés stictiques au sein du lichen, nous avons envisagé une autre stratégie, basée sur la récupération de la médulle par microdissection laser et profilage par LC-UV-MS.

2.2.3 Récupération de la médulle par microdissection à capture laser.

Afin de comparer les teneurs des différents métabolites dans chacune des couches, et de vérifier leur localisation, le découpage des différentes parties du thalle de P. crocata est réalisé. Cette étape est suivie’ dune’ microextraction’ afin’ de’ visualiser’ par’ LC-DAD-MS les métabolites’spécialisés’solubles’dans’lacétone.’Ces travaux sont réalisés sur la plateforme dhistopathologie’H′P′’(collaboration’avec’le’Dr’Alain’Fautrel).’

Dans un premier temps, des thalles de P. crocata sont fixés dans de leau’δ’-20°C afin de réaliser des coupes de 20 µm’dépaisseur’δ’laide’dun’cryotome (Leica). Puis dans un deuxième temps, les coupes sont déposées sur une lame fenestrée PEN Membrane FrameSlide (MicroDissect GmbH, Herborn, Allemagne), afin de réaliser la microdissection. Les coupes sont récupérées sur le bouchon CapSure LCM caps (Excilone, Elancourt, France). Les parties isolées sont ensuite extraites et analysées par LC-DAD-MS (Figure IV-14).

127 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-14 : Etapes successives conduisant au profilage spécifique des différents tissus de P. crocata

Les expériences de microdissections sont réalisées sur un appareil de type Arcturus Veritas (Applied Biosystems, Life technologies, Saint-Aubin,’France).’Les’zones’dintérêts’du’ lichen’(médulle’et’cortex)’sont’délimitées’par’lopérateur’puis’un’laser’IR,’incorporé’δ’laxe’ optique de la platine du microscope, est utilisé pour fusionner le film de polymère de la lame avec’le’polymμre’dun’bouchon’CapSure. La’découpe’des’parties’dintérêt’se’fait’δ’laide’dun’ second’laser’UV,’lui’aussi’incorporé’dans’laxe’optique’du’microscope.

Le’protocole’dextraction’des’différentes’parties’récupérées’sappuie’sur’celui décrit dans la publication de Xie et al. (2016). Les échantillons sont centrifugés pendant 5 min (12000 rpm, 20°C), puis un volume de 100 µL de THF bidistillé de qualité analytique est ajouté. Les échantillons extraits à température ambiante, sous ultrasons, puis de nouveau centrifugés pendant 10 min (12000 rpm, 20°C). Un volume de 90 µL de surnageant est transféré dans un vial’adapté’aux’analyses’et’conservé’δ’4°C’jusquδ’linjection’des’échantillons’en’HPLC-DAD- MS (ESI-). Le profilage est réalisé selon la méthode décrite en introduction de cette quatrième partie. Les différents polymères (lame et bouchon de récupération) sont également analysés afin’de’détecter’déventuels’contaminants.

128 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Une première microdissection de coupe transversale de thalle de P. crocata a permis de récupérer un échantillon de médulle et un échantillon de cortex (Figure IV-15).

Figure IV-15 : Représentation schématique de la microdissection laser réalisée sur les coupes transversales de P. crocata. Deux échantillons sont obtenus, le cortex et la médulle et ces derniers sont analysés par LC-DAD.

Lors’de’lanalyse’LC-DAD-MS, les quantités injectées étant trop faibles pour obtenir des résultats en spectrométrie de masse, seuls les chromatogrammes UV obtenus à 254 nm sont analysés.’Les’polymμres’ninterfμrent’pas’dans’lanalyse’chimique’des’échantillons.’Les résultats profilage par LC-DAD de ces échantillons est présenté dans la Figure IV-16.

129 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

4.104 5.106 Médulle 4.106 3.106 Cortex 3.104 5.105 5 2.104 4.10 3.105

Hauteur du du Hauteur pic 4 2.105

Hauteur du du Hauteur pic 1.10 1.105 0 0 Acide constictique Acide stictique Acide Ténuiorine 4-O-méthylgyrophorique Depsidones Depsides

Figure IV-16 : Comparaison des hauteurs des pics d'absorbance (254 nm) obtenus pour les depsidones (acide constictique et acide stictique) et les depsides (acide 4-O- méthylgyrophorique et ténuiorine) dans les échantillons de médulle et de cortex.

Les depsides et les depsidones se localisent partout dans le thalle mais dans des proportions’variables,’ et’dans’lexemple’des’ quatre métabolites sélectionnés, les quantités observées’ dans’ léchantillon’ de’ médulle’ sont’ largement’ supérieures’ δ’ celle’ trouvées’ dans’ léchantillon’ de cortex. Pour les depsides (ténuiorine et son dérivé lacide 4-O- méthylgyrophorique), ces premiers résultats sont en accord avec les résultats obtenus en MSI. Pour les depsidones (acide stictique et acide constictique), aucune conclusion quant à leur localisation’na’pu’être’faite’suite’aux’expériences’de’MSI.’Selon’les’données’bibliographiques,’ ces métabolites sont supposés être des composés médullaires (Solhaug et al. 2009; Asplund 2011b; Moncada et al. 2014), ce que confirme les résultats obtenus par microdissection. Il est cependant important de noter que ces résultats sont des résultats préliminaires qui devront être vérifiés sur plusieurs échantillons, afin de valider définitivement la localisation médullaire’des’depsidones’dérivant’de’lacide’stictique’au’sein’du’lichen’P. crocata.

3 Analyses de comportement alimentaire

3.1 Expériences de choix en Notodromes

Létude’des’choix’alimentaires’entre’les’thalles’intacts’et’rincés’de’P. crocata est réalisée en arènes de choix alimentaires ou notodromes.

Quelle que’ soit’ la’ phase’ dobservation’ (nocturne’ ou’ diurne), les escargots se distribuent préférentiellement dans les branches contenant une petite roche, signifiant que la

130 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri recherche’dun’abri’est’prioritaire par rapport à la recherche alimentaire, indépendamment du phénotype (Figure IV-17).

Figure IV-17 : Distribution des escargots (moyenne + SE) dans les différentes branches des notodromes en fonction de leur phénotype, au bout de 4h (phase nocturne) et 24h (phase diurne). OP : phénotype organique ; MP : phénotype minéral.

Si’ on’ ne’ sintéresse’ quaux’ thalles’ ayant’ été’ consommés,’ lanalyse’ quantitative’ (surface consommée) ne met pas en évidence de différence de consommation entre les lichens intacts’et’ceux’rincés’δ’lacétone.’Néanmoins,’lobservation’précise’des’thalles’montre’une’ attaque de la médulle de lichens rincés, alors que les escargots ne consomment que le cortex et la couche algale lorsque’ le’ lichen’ na’ pas’ été’ débarrassé’ de’ ses’ métabolites (lichen « intact »). La consommation perpendiculaire du thalle a précédemment été décrite pour les lichens du genre Lobaria,’et’les’auteurs’attribuent’ce’rejet’δ’la’présence’de’lacide stictique au niveau de la médulle. Dans P. crocata, nous avons mis en évidence la présence de depsides (ténuiorine et ses dérivés) qui se localisent dans la couche algale et la partie supérieure de la médulle et des depsidones (acide stictique et ses dérivés). Ces composés étant extraits par lacétone,’les’escargots’ne’sont’plus’repoussés’et’consomment’par’conséquent’la’médulle’des’ lichens rincés. Les depsides sont détectées en quantités importantes dans les excréments de N. hookeri contrairement aux depsidones (Gadea et al. 2017), nous faisons donc lhypothμse que ce ne sont pas les depsides qui repoussent les escargots dans la médulle mais les depsidones.

131 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

3.2 Expériences de non-choix : étude des préférences alimentaires des escargots vis-à-vis des lichens intacts et des lichens rincés.

Afin’déviter’le’biais’induit’par’le’grand’nombre’descargots’se’localisant’dans’les’branches’ de notodromes contenant les petites roches, une deuxième série’dexpériences est réalisée. Les escargots sélectionnés pour cette expérience’ont’été’collectés’sur’les’sites’dALOU,’BRA,’ BOUG et MAS pour les escargots OP et sur les sites de BUS et PBAS pour les escargots MP.

Les escargots sont placés en situation de non-choix. Après 48h, le nombre dexcréments’collectés’dans’les’boîtes ayant contenu un lichen rincé est significativement plus important que dans celles contenant un lichen intact (GLM, χ2 = 20.48, ddl =1, P < 0.001). Les escargots consomment par conséquent plus le lichen débarrassé de ses métabolites solubles dans’ lacétone, ce qui confirme la présence de métabolites répulsifs dans le lichen, probablement des depsidones (acide stictique et ses dérivés). Ces résultats sont en accord avec les observations faites lors des expériences de choix en notodrome.

10

8

6

4

Nombre d'excréments Nombre 2

0 Intacts Rincés

Figure IV-18:’ Nombres’ dexcréments’ (moyenne + SE) récoltés par boîte contenant 5 escargots, en fonction du traitement infligé au lichen. Les escargots sont soit confrontés à un’lichen’rincé’δ’lacétone,’soit’δ’un’lichen’intact.

Afin de vérifier la nature des métabolites répulsifs, ces derniers sont isolés et testés individuellement’sur’les’escargots’en’les’incorporant’δ’des’gels’damidons.’

132 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

3.3 Influence des métabolites présents dans le lichen sur les choix alimentaires de N. hookeri : expériences de non-choix

3.3.1 Influence des métabolites en fonction de leur famille chimique

Nous’avons’choisi’de’comparer’lactivité’des’métabolites’spécialisés’sur’les’choix’alimentaires’ en fonction de leur famille chimique. La’ténuiorine’(depside),’lacide’stictique’(depsidone) et la’ calycine’ (dérivé’ de’ lacide’ pulvinique)’ sont incorporés’ dans’ des’ gels’ damidon’ δ’ la’ concentration de 18 mg.g-1 de gel, 4 mg.g-1 et 1 mg.g-1 respectivement. Au bout de 48h, les scores de consommation sont calculés. Les escargots de MP se sont légèrement plus nourris que les OP (binomial négatif, χ² = 5.894, ddl = 1, P = 0.015) mais aucune interaction entre le phénotype’et’la’nature’du’métabolite’présent’sur’le’gel’nest’observé’(binomial’négatif,’χ² = 4.859, ddl = 3, P = 0.182). Les escargots ne consomment que très peu les gels enrichis en métabolites, en comparaison avec le témoin positif (binomial négatif, χ² = 129.030, ddl = 3, P < 0.001).

Les gels enrichis en calycine sont ceux qui sont le plus rejetés par les escargots, malgré la faible quantité de métabolites contenue, comparativement aux gels’contenant’de’lacide’ stictique (Tukey, P < 0.001) et de la ténuiorine (Tukey, P < 0.001). La calycine se localise au niveau des sorédies, et ces dernières sont généralement évitées par les escargots. Un comportement similaire a été observé chez Cepaea hortensis qui évite lui aussi les sorédies de P. crocata dans les forêts pluviales tempérées Scandinaves (Gauslaa 2008).’En’cas’dingestion’ du métabolite, nous avons mis en évidence précédemment que N. hookeri excrétait la calycine sans’lassimiler’(Gadea et al. 2017).

Lacide’ stictique’ et’ ses’ dérivés’ (depsidones) sont décrits comme potentiellement répulsifs pour les Gastéropodes, ces derniers évitant le chimiotype de Lobaria pulmonaria contenant ces métabolites en grande quantités (Asplund 2011b). De plus dans les expériences de choix et non-choix réalisées sur N. hookeri, nous avons observé une consommation plus importante des lichens rincés que des lichens intacts en particuliers au niveau de la médulle. Les escargots MP consomment plus les gels enrichis en acide stictique que les escargots OP (Pairewise t-test, P = 0.031). Le lichen P. crocata est présent sur les sites de vie de N. hookeri MP (TBLA’et’PBAS)’alors’quil’est’absent’sur’les’sites’MAS’et’BRA,’où’les’escargots’OP ont été’collectés.’Un’phénomμne’dhabituation’de’ces’métabolites’pourrait’être’mis’en’place’par’

133 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

les escargots déjà confrontés dans leur milieu à ces lichens. Les escargots sont en effet capables’de’retirer’des’informations’lors’de’leurs’expériences’alimentaires’précédentes’et’den’ tenir’compte’lors’dune’ nouvelle’rencontre’avec’ cet’aliment’ (Speiser 2001). Aucune autre différence’phénotypique’nest’observée’avec’les’autres’métabolites.’

Figure IV- 19 : Consommation des gels par les escargots (moyenne ± SE) obtenue en fonction’du’métabolite’incorporé’au’gel’damidon.’ La consommation des gels est estimée par’un’score’de’consommation.’Le’contrôle’positif’est’le’gel’damidon’sans’métabolite.’ Les lettres en exposant (a, b et c) indiquent des différences significatives entre le contrôle positif et les différents métabolites.

3.3.2 Les sucres et les polyols, de potentiels métabolites phagostimulants ?

La ténuiorine se localise au niveau de la couche algale du lichen qui est consommée par N. hookeri même’sans’rinλage’δ’lacétone’du’lichen.’Lorsque’le’métabolite’est’incorporé’aux’gels’ damidon,’celui-ci est cependant’évité.’Nous’faisons’lhypothμse’de’la’présence’de’métabolites’ appétents présents’dans’le’lichen,’qui’permettent’δ’lescargot’de’passer’outre’leffet’répulsif’ de la ténuiorine. Les sucres étant décrits comme de potentiels phagostimulants lors de la préparation de pièges pour protéger les cultures des Gastéropodes (Bourne et al. 1988; Henderson et al. 1992), ils sont choisis pour tester notre hypothèse. Afin de choisir le métabolite à tester, nous avons réalisé la quantification des sucres et des polyols sur la plateforme’P′M′’de’lINRA’(Le’Rheu).’Larabitol’est’le’polyol’largement majoritaire du lichen,

134 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri suivi par le mannitol (Tableau IV-7). Ces deux composés sont décrits comme les polyols principaux’des’lichens,’permettant’le’stockage’dénergie’δ’plus’ou’moins’long’terme.

Tableau IV-7 : Quantification des sucres et des polyols dans le lichen P. crocata.

Métabolites Quantité présente dans le lichen (mg.g-1 DM) Arabitol 58,15 ± 2,38 Mannitol 5,39 ± 0,15 Tréhalose 0,20 ± 0,03 Xylitol 0,18 ± 0,01 Saccharose 0,08 ± 0,01 Arabinose 0,06 ± 0,01 Mélétizose 0,06 ± 0,02 Myo-inositol 0,06 ± 0,01

En’ tant’ que’ polyol’ majoritaire,’ larabitol’ est’ sélectionné’ pour’ être’ testé’ en’ combinaison avec la ténuiorine dans des expériences de non-choix, à la concentration de 60 mg.g-1 de’gel.’Aprμs’48h’dexpérience,’la’comparaison des scores de consommation met en évidence’que’lajout’darabitol’na’pas’deffet’sur’lappétence’(binomial’négatif,’χ²= 2.264, ddl =’1,’P’=’0.1″′)’et’ces’derniers’étant’autant’consommés’que’les’gels’damidon’seuls’(Tukey,’P’ = 0.788) (Figure IV-20). La présence de ténuiorine sur les gels a un effet négatif sur la consommation par N. hookeri (binomial négatif, χ²= 50.591, ddl = 1, P < 0.001). La présence darabitol’en’mélange’avec’la’ténuiorine’augmente’significativement’la consommation des gels par rapport aux gels contenant uniquement de la ténuiorine (Tukey, P = 0.008) mais la consommation’ reste’ toutefois’ inférieure’ aux’ gels’ seuls’ et’ δ’ ceux’ contenant’ de’ larabitol’ uniquement (Tukey, P < 0.001). Ces résultats mettent en évidence le rôle phagostimulant de larabitol’ en’ présence’ de’ métabolites’ lichéniques,’ et’ par’ conséquent’ limportance’ que’ représentent les’polyols’du’lichen’pour’lescargot. Aucune’différence’nest observée entre les deux phénotypes (binomial négatif, χ²= 1.688, ddl = 1, P = 0.193).

135 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

Figure IV-20 : Consommation des gels par les escargots (moyenne ± SE) obtenue en fonction’du’métabolite’incorporé’au’gel’damidon.’La consommation des gels est estimée par un score de consommation.’Le’contrôle’positif’est’le’gel’damidon’sans’métabolites.’ Les lettres en exposant (a, b et c) indiquent des différences significatives entre le contrôle positif’et’les’gels’contenant’de’la’ténuiorine’(seule’ou’en’association’avec’de’larabitol).’ Les gels’darabitol’ne’sont’pas’significativement’différents’des’contrôles’positifs.’OP : Phénotype organique ; MP : Phénotype minéral.

136 Rôle des métabolites lichéniques sur les choix alimentaires de Notodiscus hookeri

én rsum

La localisation sectorielle des métabolites spécialisés au sein du thalle des lichens P. crocata et U. taylorii a été confirmée.’Lévitement’de’certaines’parties’peut’par conséquent être lié à la présence de certains métabolites’spécialisés’comme’les’dérivés’de’lacide’stictique’dans la médulle de P. crocata.’ En’ revanche,’ dautres’ métabolites’ nempêchent’ pas’ lescargot de consommer le lichen,’ comme’ lacide’ usnique’ contenu dans le thalle de U. taylorii ou la ténuiorine localisée au niveau de la couche algale de P. crocata.

Lorsque les métabolites spécialisés sont testés seuls, incorporés’dans’des’gels’damidon’ en expériences de non-choix,’ avec’ lescargot’ N. hookeri , ils ne sont que très faiblement consommés. Au contraire, lorsque le polyol majoritaire est ajouté (dans le cas des deux lichens étudiés,’ larabitol),’ les’ gels’ sont’ autant’ consommés’ que’ les’ témoins’ positifs. De plus la consommation’du’gel’contenant’le’métabolite’spécialisé’augmente,’en’présence’darabitol.’’ Par conséquent, lescargot’ est’ capable’ de’ faire’ un’ compromis entre les métabolites potentiellement répulsifs et/ou toxiques et les métabolites ayant un intérêt nutritif, comme les polyols et les sucres.

137

V. Mise en relation des profils chimiques des tissus d’un mme lichen avec les dommages sectoriels causs par N. hookeri

Le Mont Branca

139

Dommages sectoriels

Dans le chapitre précédent, le rôle essentiel dans les choix alimentaires’de’larabitol’a’’ été démontré. Nous avons voulu être plus exhaustifs dans cette étude, en réalisant le profilage de’tous’les’groupes’de’métabolites’ potentiellement’utiles’ δ’lescargot’ et’présents’dans’les’ lichens (acides aminés, sucres et polyols, polysaccharides, acide gras) dans chacune des parties du lichen.

En élevage et sur le terrain, un broutage par les escargots se limite quelquefois à certaines parties spécifiques du thalle. Dans leurs travaux, Asplund et Gauslaa ont ainsi mis en évidence une préférence toute particulière pour les organes pauvres en métabolites spécialisés, comme les céphalodies de Nephroma arcticum (Asplund and Gauslaa 2010). Dautre’ part,’ il’ a’ été’ mis’ en’ évidence’ que’ certaines’ espμces’ de’ lichens’ protégeaient spécifiquement leurs parties reproductrices avec la production de métabolites spécialisés spécifiques, localisés dans ces parties, suivant ainsi la théorie de défense optimale (ODT) (Hyvärinen et al. 2000; Asplund et al. 2010b).

Le lichen Argopsis friesiana est sélectionné pour cette étude car sa morphologie particulière permet une séparation aisée en plusieurs parties (Figure V-1). Ainsi les apothécies (Ap), le complexe phylloclades + cortex et couche algale du pseudopodétion (Ph+Pa), la médulle (Pf) et les céphalodies contenant les cyanobactéries (Ce) sont récupérés et leur profilage métabolique est réalisé.

141 Dommages sectoriels

Figure V-1 : Morphology of the lichen Argopsis friesiana. Pseudopodetia were separated into two parts: the cortical algal layer (Pa) and the fungal axis (Pf).

Cette’étude’est’présentée’sous’forme’darticle’soumis à « Journal of Chemical Ecology»

142 Dommages sectoriels

Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana shape gastropod grazing patterns.

Article soumis à Journal of Chemical Ecology

Alice GADEA1,2, Anne-Cécile LE LAMER3, Sophie LE GALL4, Catherine JONARD5, Solenn

FERRON1, Daniel CATHELINE6, Damien ERTZ7, Pierre LE POGAM8, Joël BOUSTIE1, Françoise

LOHEZIC LE DEVEHAT1, † and Maryvonne CHARRIER2, †

1 Université de Rennes 1, UMR CNRS 6226 (ISCR), Campus de Villejean, 2 Avenue du Professeur Léon Bernard, 35043 Rennes Cedex, France

2 Université de Rennes 1, UMR CNRS 6553, Campus de Beaulieu, 263 Avenue du Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France

3 UMR 152 Pharma Dev, Université de Toulouse, IRD, UPS, France.

4 Institut National de la Recherche Agronomique, UR 1268 Biopolymers Interactions Assemblies, 44316 Nantes, France

5 INRA, UR1268 BIA, Team « Polyphenols, Reactivity & Processes », Le Rheu, France

6 Institut National de la Recherche Agronomique, Laboratoire de Biochimie, USC 1378, Agrocampus Ouest, 35042 Rennes Cedex, France

7 Botanic Garden Meise, Department Research, Nieuwelaan 38, B-1860 Meise, Belgium.

8 Université de Rennes 1, UMR CNRS 6164 (IETR), Campus de Beaulieu, 263 Avenue du Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex

† These authors contributed equally to this paper

Corresponding authors: Françoise LOHEZIC - LE DEVEHAT ([email protected]

; +33 2 23 23 48 16) and Maryvonne CHARRIER ([email protected] ; + 33 2 23 23

50 45)

143

Dommages sectoriels

1 Introduction

Fungal symbioses with algal or cyanobacterial photobionts are often called chloro- and cyanolichens, respectively. Sometimes the mycobiont coexists with both green algae and cyanobacteria and forms tripartite lichens, referred to as cephalolichens, because cyanobacteria then are located inside specialized fungal compartments (cephalodia). In the lichen thallus, green algae produce polyols while cyanobacteria synthetize sugars. These photosynthetic carbohydrates may be metabolized by the fungus partner into mannitol and/or arabitol (Richardson et al. 1968). The mycobiont is known to produce specialized metabolites that accumulate in the cortex or in the medullar layer (Molnár and Farkas 2010). In most chlorolichens, the acetyl-polymalonyl pathway leads to the production of specialized metabolites, mainly phenolic compounds such as depsides and depsidones (Stocker-Wörgötter 2008). In most cyanolichens and cephalodia containing cyanobacteria, terpenoids and mycosporines predominate (Rundel 1978 ; Roullier et al. 2011). The co- occurrence of two photobionts in the cephalo- and cyanolichens is reflected in the diversity of metabolites produced by each partner. In addition, a higher content of nitrogen occurs in cephalo- and cyanolichens as the air nitrogen fixed by the cyanobacteria is converted into amino acids by the mycobiont (Rai and Bergman 2002).

Phenolic compounds in lichens have various roles. Some may deter lichen feeders like molluscs (Coker 1967; Asplund et al. 2010b), mammals (Richardson and Young 1977) and arthropods (Gerson 1973). Various factors may influence the attractiveness of lichen for lichenivorous organisms (Asplund and Wardle 2013). In plant-phytophagous interactions studies, different hypotheses had been addressed to explain a trade-off between the cost of operating chemical defence and the benefit of enhancing survival. In his work on plant- herbivore coevolution, McKey (1974)’was’the’first’to’develop’the’optimal’defence’theory’ (ODT) that was latter extended by Asplund et al. (2010b) for lichens and gastropods. This theory predicts that specialized metabolites in plants are allocated proportionally to the risk of attack for a specific tissue and to the value of this tissue in their fitness. In many lichens, specialized metabolites occur in higher concentrations or exclusively in reproductive parts, sexual (apothecia) or asexual (soredia), comparatively to the rest of the lichen thallus (Hyvärinen et al. 2000). Rundel (1978) conceptualized another hypothesis, suggesting that the higher the nitrogen content, the higher is the lichen palatability. Hence, lichens with low

145 Dommages sectoriels

nitrogen content and high diversity of specialized metabolites (particularly depsides and depsidones) should suffer low grazing. Rundel hypothesis was confirmed for most chlorolichens, actually more grazed (Asplund and Wardle 2013) after removal of the specialized metabolites by the so-called acetone-rinsing method (Solhaug and Gauslaa 2001). Conversely, the former theory was not validated for most of cyanolichens. These lichens, characterised by high nitrogen levels and low chemical content, are often not consumed. The presence of intracellular repulsive compounds or non-extractable metabolites by acetone (i.e. mycosporines) was hypothesized, due to the persistence of a deterrent effect of this lichen after acetone rinsing (Solhaug and Gauslaa 2012).

Lichens occur in a large geographical range, from cold to tropical habitats, from aquatic to xeric conditions and in low nutrients habitats, namely alpine and polar areas where they are widespread and dominant (Sanders 2001). In Subantarctic Islands where lichens are abundant and diversified, it could be particularly important for phytophages to exploit such an abundant resource and thus allow an expansion into new environments. The Subantarctic land snail Notodiscus hookeri, an exclusive lichen feeder, is particularly widespread on Crozet (Possession Island) and Kerguelen Archipelagos (Charrier et al. 2013). This species provides an appropriate model organism for studying lichens/snail trophic interactions. Recently, Gadea et al. (2017) demonstrated the generalist status of N. hookeri by a comparative study on the snail metabolism after the consumption of Usnea taylorii (chlorolichen) and Pseudocyphellaria crocata (cyanolichen). The authors observed several strategies implemented by the snails to overcome potential toxic metabolites-containing lichens.

Optimal foraging in generalist species, like most terrestrial gastropods, requires a balance between the access to useful nutrients and the need to overcome toxic compounds. Therefore, the snail should be able to select lichen parts according to their fodder quality and to avoid toxic compounds. In this study, a focus was made on the cephalolichen Argopsis friesiana Müll. Arg. (Stereocaulaceae), which is a tufty species (4 cm high max.), widespread in the low- nutrient fell-field areas (Lamb 1974; Galloway 1980), as those of Subantarctic Islands swept by the wind and which constitutes a locally abundant resource for N. hookeri. A. friesiana is characterized by a rigid pseudopodetium, cylindric-corraloid phyllocladia, concave- scutelliform apothecia and botryose cephalodia. Its main photobiont is the green algae Trebouxia s. lat. type and its secondary photobiont is the cyanobacteria Stigonema sp., located

146 Dommages sectoriels in the cephalodia. To understand how this snail could take benefits from this lichen, we examined the influence of lichen chemistry on snail nutrition. For this purpose, we explored how the metabolites were distributed in the different parts of the lichen A. friesiana and how this repartition influenced the snail feeding choice. Thanks to its morphology, the lichen was separated in four different parts. Three hypotheses were tested: (1) The snail avoids lichen parts with high concentrations of specialized metabolites, (2) The snail prefers lichens parts enriched in essential nutrients (sugars, amino acids, fatty acids, polysaccharides) and (3) N. hookeri prefers thallus parts rich in nitrogen.

2 Methods and materials

2.1 Biological material Argopsis friesiana, Müll. Arg. thalli were collected on Possession Island (Crozet archipelago) at « Le Donjon »’ (46°′501S,’ 51°5015E,’ ′00’ m,’ DON).’ This’ lichen’ is’ endemic’ to’ the’ Subantarctic Islands in the Indian Ocean. The identification of the species was confirmed by one of us (DE) by comparison with type material and the species sequenced for the first time: a sequence of nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) of the material used in this study was deposited in GenBank (GB number: XX will be added after article acceptation) as a reference for our material because ITS is used as a universal DNA barcode marker for fungi (Schoch et al. 2012). The species is very similar to the sympatric Stereocaulon cymosum Cromb. that differs notably by transversely septate ascospores versus muriform ascospores in A. friesiana. Voucher specimens were deposited at the herbarium of the Faculty of Pharmacy of Rennes 1, Department of Pharmacognosy and Mycology, under the references REN000140.

To investigate the palatability of A. friesiana,’150’adult’snails’(shell’size’≥’5’mm) were collected’during’′015’austral’summer’at’Mont’Branca’(46°′65.61S;’51°5010.68E,’′00’m’- ″8″m,’BRA)’and’at’Mascarin’(46°′610.09S;’51°45′0.58E,’600’m’ - 930 m, MAS) (Online Resource 1, Fig. S1). A. friesiana is abundant in these localities where the snails belong to the soft-shell ecophenotype described by Charrier et al. (2013).

147 Dommages sectoriels

2.2 Lichen preparation

A. friesiana was cut into four parts as explained in Figure V-1. The pseudopodetium consists in (i) a central axis, the medulla, made up of compact fungus hyphae (Pf) and (ii) an outer layer with fungi and green algae (Pa). Phyllocladia are the terminal branchlets of pseudopodetia containing algae (Ph). Cyanobacteria live inside numerous black cephalodia (Ce), external dark-coloured gall-like structures emerging from the pseudopodetium laterally. Apothecia (Ap), the sexual reproductive parts of the lichen, are scattered on the upper surface of the thallus. The underside of the apothecium is similar to Pa layer. For chemical analyses, Pa and Ph were grouped because of their structure similarity.

2.3 Experimental design

The snails were reared in boxes (7.5 x 6 x 4.5 cm) under a thermal cycle, 6°C during night (10h) and 10°C during day (14h). A moist synthetic foam in the bottom (5 mm thick) ensured snail activity. After four days of starvation, the snails were divided into 15 groups of five individuals from BRA and 15 groups of five individuals from MAS, falling into 75 from BRA and 75 from MAS. They were allowed to feed upon A. friesiana for two nights (48 h experiment). Each group received a fertile thallus, on which apothecia and cephalodia were counted. Snail consumption was controlled after one night and damage was measured after two nights under stereomicroscope (Stemi 2000-C, Zeiss, France).

Level of grazing (LD) was adapted from Nimis and Skert (2006) and measured as follows: LD0 intact, LD1= low grazing <25%, LD2=medium damage (>25-50% consumed) and LD3= high damage >50%. For pseudopodetia, the algae-containing cortical layer Pa was distinct from the fungus axis Pf and the levels of grazing were: LD0 = Pa and Pf remained intact, LD1 = minimum damage (Pa consumed less than 25%, Pf intact), LD2 = medium damage (Pa consumed less than 50%, Pf intact), LD3 = high damage (algal layer Pa and fungal axis Pf consumed, more than 50%). To assess the damages caused to cephalodia (Ce) and apothecia (Ap), a grazing ratio was determined as follows: Number of Ap or Ce tasted / Number of Ap or Ce available. To compare Ce and Ap grazing with Pa, Pf and Ph damages, the levels described above (LD in %) were utilized.

148 Dommages sectoriels

2.4 Samples preparation for chemical analyses,

To determine a sectorial distribution of metabolites, three samples of several A. friesiana thalli (about one gram per sample) were considered. Each thallus was cut into the four parts described above (Ap, Ce, Pf and Ph+Pa). The 12 samples were grounded separately, with a mortar and a pestle, in liquid nitrogen. To quantify specialized metabolites, primary metabolites and fatty acids, 40 mg, 10 mg and 50 mg freeze-dried samples, respectively, were used.

2.5 Specialized metabolites profiling

Each part of the air-dried lichen thalli was extracted with 100% acetone (3 x 500 µL). Acetone extracts were solubilized in tetrahydrofuran (THF), filtered and injected (10 µL at 0.5 mg.mL- 1) in Liquid Chromatography - Diode Array Detector (LC-DAD) (Shimadzu®, Marne La Vallée, France, LC-20AD SP, injector SIL-20A HI, column oven CTO-20A, diode array detector SPD-M20A) and a mass spectrometer (MS) (Advion® expression CMS, Ithaca, USA). Ionization was performed by negative-ion mode electrospray (ESI-). A gradient system was applied: A (0.1% formic acid in water) and B (0.1% formic acid in acetonitrile) for 48 min on a C18 column (Phenomenex®, Kinetex 2.6µ C18 100A, temperature 40°C) at a flow rate of 0.5 mL.min-1: initial, 20% B; T 0-5 min, 20% B linear; T 30 min 80% B; T 35-42 min, 100% B linear; T 45-48 min, 20% B linear. Linear equations developed on the basis of the calibration curve were used to quantify atranorin and the results were expressed in mg.g-1 Dry Mass (DM). For the other metabolites detected by UV on HPLC chromatograms, a relative quantification was performed, using the product obtained by multiplying the area under the curve (AUC) and the extraction yield. Full scan mass spectra were recorded in negative-ion mode in a mass range of 100 to 1200 Da, applying the following parameters: detector gain 1200, ESI voltage 3.5 kV, capillary voltage 180 V, source voltage 20 V, source voltage dynamic 20 V, nebulizer gas pressure 60 psig, desolvation flow gas rate 4 L.min-1, capillary temperature 250°C and gas temperature 20°C. Data processing and evaluation for MS measurement were performed with the Data and Mass Express 2.2.29.2 softwares (Advion).

As a complement to LC-DAD-MS experiments, in situ analyses of each part of the lichen was made using the ambient air source DART-HRMS, enabling the chemical profiling of unprocessed pieces of thallus (Le Pogam et al. 2015a, 2016a)(More detailed protocol in

149 Dommages sectoriels

Online Resource 2). The identification of metabolites was done against formerly identified compounds within the genus Argopsis sp. and Stereocaulaceae family (Bodo and Molho 1974; Lamb 1974; Huneck and Lamb 1975).

2.6 Primary metabolite profiling

Soluble carbohydrates, polyols and amino acids were extracted from each part of the lichen, following Gravot et al. (2010) methodology. Twenty mM of adonitol (soluble carbohydrates and polyols) and 10mM of 3-aminobutyric acid (BABA) (amino acids) were used as internal standards. Soluble carbohydrates and polyols were profiled by Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (GC-FID) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, CA, USA) according to Adams et al. (1999) and Lugan et al. (2009). Amino-acids were detected with an Ultra High Performance Liquid Chromatography Diode Array Detector (UPLC-DAD, Waters), by using an AccQ-Tag Ultra derivatization kit (Waters Corporation, Milford, MA, USA) following the protocol described in Gravot et al. (2010). The metabolites were identified from their retention time by comparison with external standards. Concentrations were obtained on the basis of internal standards and were expressed in mg.g-1 DM of the lichen part.

2.7 Fatty acids profiling

Samples were extracted three times in a parallel synthesis apparatus (Heidolph Parallel Synthesis Apparatus®-Instruction Synthesis 1, France), for 1 h each, with chloroform/methanol (2:1, v/v, 6 mL) at 80°C, under constant shaking at 700 rpm (Vu et al. 2016). To quantify fatty acids (FAs), 100 µg of heneicosanoic acid (C21:0) were added as an internal standard. The organic phase containing the total lipids was recovered and evaporated to dryness under a nitrogen flow. Sample derivatization and GC-FID/GC-MS (Agilent 6890N, Toulouse, France) analyses were proceeded using Vu et al. (2016) protocol. Identification of fatty acid methyl esters (FAMEs) was based on the retention times. The quantity of total FAs was calculated using the internal standard and expressed as mg.g-1 DM of lichen part.

2.8 Extraction of sugar forming polysaccharides

Alcohol-insoluble residues (AIRs) of the lichen parts were obtained using an accelerated solvent extraction’unit’ASE®’″50’(ASE™’″50,’Thermo’Scientific™’Dionex™).’Approximately’

150 Dommages sectoriels

50 mg of each dried lichen tissue were reduced to a fine powder with a pestle and transferred in 22 mL cells of the ASE® 350, dried at 40°C overnight under vacuum over P2O5, prior to weighing. AIRs were extracted using 80% ethanol at 2 mL.min-1 flow. The conditions for the ASE extraction were set at 100°C for 20 min, followed by rinse volume of 150%, and a purge time (N2) of 30 s. Cells of the ASE® 350 containing AIRs were dried at 40°C overnight under vacuum over P2O5, prior to weighing, in order to determine the extraction yield. Identification and quantification of polysaccharide neutral sugars were performed by GC after sulfuric acid degradation (Hoebler et al. 1989). Five mg of AIR were dispersed in 13 M sulfuric acid for 30 min at 30°C, then hydrolysed in 1 M sulfuric acid (2 h, 100°C). Sugars were converted to alditol acetates according to Blakeney et al. (1983) and chromatographed on a TG-′′5’GC’Column’(″0’x’0.″′’mm’ID)’using’TRACE™’Ultra’Gas’Chromatograph’(Thermo’

Scientific™;’Waltham,’CA,’USA;’temperature’′05°C,’carrier gas H2). Inositol was used as internal standard. The quantity of each sugar was determined using the calibration curves drawn from standard solutions. Concentrations were expressed in mg.g-1 DM.

2.9 Total Nitrogen (TN) Measurement

TN was determined with an automated dry combustion method (Dumas method ; Rhee 2001) using an elemental analyser (vario MICRO cube, Elementar Analysensysteme, Hanau, Germany). The results were expressed in N percent per DM.

2.10 Statistical analyses

Data on cephalodia and apothecia grazing were analysed separately using a likelihood ratio test on a generalized linear model (GLM, distribution: negative binomial, link function: logit) in order to compare the quantitative damages (LD) between BRA and MAS snails. The total number of cephalodia (Ce) or apothecia (Ap) carried out by the thallus was introduced in the model.’A’Fishers’exact’test’was’applied’to’LD’values’obtained’for’Pa,’Pf,’Ph,’ Ce and Ap damages, in order to compare the observed frequencies among lichen parts. To determine whether metabolite values vary according to lichen part (factor), Anovas were used and normality of the models was checked (homoscedasticity, Shapiro test on the residuals). When normality was rejected, the values were log-transformed prior to analysis. Post-hoc pairwise t-tests with the Bonferroni correction for P were performed. Percentage data were analysed by Anovas, following arcsine transformation.

151 Dommages sectoriels

To analyse the metabolic data, we first proceeded to fourth-root transformation of the values, centering and autoscaling, because null values and great differences in concentrations according to metabolite profiles were observed (van den Berg et al., 2006). Powered Partial Least Squares Discriminant Analysis (PPLS-DA; Indahl et al. 2009) was performed on the normalized values to discriminate the four parts of A. friesiana on the basis of their metabolic profiles’ (function’ cppls()’ ,’ package’ pls,’ (Indahl et al., 2009). The significance of the discrimination was tested using a cross-model’ validation’ (function’ MVA.cmv’ and’ MVA.test,’package’RVaidememoire(Hervé, 2016). All statistical analyses were made using R software V. 3.3.1 (R Core Team, 2016).

3 Results

3.1 Snail feeding preferences

Snails from BRA and MAS sites had mean (± SD) shell sizes of 5.0 ± 0.4 mm and 4.9 ± 0.5 mm, respectively. Snail groups (n = 30 x 5 individuals per group) did not differ in shell sizes

among them (ANOVA, F28,120 = 0.494, P = 0.984) or between sites (ANOVA F1,120 = 0.514, P = 0.475). Apothecia were completely avoided by the N. hookeri (Figure V-2a). Similarly, the fungal axis (Pf) was not consumed, while the cortical algal layer (Pa) was grazed (Figure V- 2a). Pa and Ph were grazed by the snails of both sites. The levels of damage (LD) on Ph and Pa ranged from < 25% to < 50% and did not differ, within (Fishers’exact’tests, P = 0.848 for BRA snails and P = 0.710 for MAS snails) and between (P = 0.870) snail sites (Figure V-3). Cephalodia were the preferred parts of the lichen with more than 40% of them being highly damaged (= LD3) and significant grazing differences were observed between cephalodia and the’two’other’parts’(Ph’and’Pa)’of’the’lichen’(Fishers’exact’tests,’P’<’0.001;’Figure V-2b).

152 Dommages sectoriels

Figure V-2 : Argopsis friesiana (Stereocaulaceae) entire thallus (a) and cephalodia (b) before and after snail consumption. Phyllocladia (Ph), algal layer of pseudopodetia (Pa) and cephalodia (Ce) were consumed while apothecia (Ap) and fungal axis of pseudopodetia (Pf) remained untouched. The specimens were dry before consumption (a-1 and b-1) and wet after snail feeding (a-2 and b-2). The blue line show the transversal section of pseudopodetium to discriminate between the cortical algal layer (Pa) and the fungal axis (Pf).

The number of grazed cephalodia differed for snails collected at BRA and MAS sites (GLM, χ ² = 7.839, df = 1, P = 0.005), the snails from BRA did more damage (Mean ± SD = 6.87 ± 1.51) than snails from MAS (Mean ± SD = 4.87 ± 2.03) (Figure V-3). The number of grazed cephalodia depended on the total number of cephalodia per thallus (GLM, χ ²= 4.422, df = 1, P = 0.035).

153 Dommages sectoriels

Figure V-3 : Differential grazing and level of damage (LD) by the snail Notodiscus hookeri on Argopsis friesiana. N = 15 lichen thalli given to snails from MAS (A) and from BRA (B), N = 15 x 5 snails per site. Pa = algae-containing layer of pseudopodetia, Ph = phyllocladia, Ce = cephalodia; apothecia that remained untouched are not shown. The level damage classes are LD1 = minimum damage (>0% and <25%), LD2 = medium damage (25%-50%) and LD3 = high damage (>50%).

3.2 Metabolite profiling of A. friesiana

The extraction yields (means ± SD) were calculated for the acetone extract of apothecia (1.4 ± 1%), cephalodia (1.9 ± 1.2%), fungal axis of pseudopodetia (3.6 ± 2.7%) and Ph+Pa (4.9 ± 1.9 %). The chemical profiles of each part of the lichen A. friesiana were established by LC-DAD- ESI-MS from their acetone extracts. Three main compounds were identified: the depside atranorin (m/z 373) and two chlorinated compounds (Tableau V-1). These two chlorodepsidones were identified as the dichlorinated argopsin (m/z 395) and as the trichlorinated caloploicin (m/z 401) trough isolation and spectroscopic data analysis (Purification protocol and NMR data are given in Online Resource 2, Fig. S2, Table S1). In situ DART-HRMS analysis confirmed identification of chlorinated compounds detected by LC-DAD-MS from unprocessed pieces of lichens through exact mass measurements (Online Resource 2, Table S2). Five other metabolites (Af1 to Af5) were also picked up by LC-DAD- UV-MS (Tableau V-1). Ph+Pa was the richest part in specialized metabolites, particularly true

154 Dommages sectoriels for atranorin, reaching 10.6 ± 2.3 mg.g-1 DM. In comparison, atranorin varied from 0.5 ± 0.2 mg.g-1 DM in cephalodia to 1.1 ± 0.6 mg.g-1 DM in apothecia. In pseudopodetia (Pf), the medullar caloploicin with argopsin accounted for about two-thirds of the specialized metabolites, while atranorin alone reached approximately this ratio in apothecia and in algal layers (Ph+Pa) (Table S3).

Among the twenty polyols or free sugars sought, only eight were quantified in A. friesiana thalli. They were present at low concentrations or undetected in apothecia. Conversely, qualitative and quantitative richness in free sugars and polyols characterized cephalodia. Whatever the lichen tissue, arabitol was clearly the major compound with mean concentrations ranging from 33.4 to 178.0 mg.g-1 DM (Tableau V-1). Mannitol was the second more important polyol of the lichen. Sorbitol was only present in cephalodia and Ph+Pa, while trehalose only occurred in small amounts in cephalodia.

In comparison with the high amounts in free sugars and polyols, free amino acids in A. friesiana were below the level of 0.5 mg.g-1 DM (Tableau V-1). Eleven amino acids were identified’and’three’of’them’were’found’in’the’four’parts’of’the’lichen:’GABA,’-alanine and glutamate. GABA was the most abundant amino acid in the thallus (up to 0.4 mg.g-1), except for cephalodia in which glutamate predominantly occurred (Tableau V-1). Intrathalline specificities in amino acids composition were noticeable with arginine and lysine in cephalodia (Ce), and with proline in external parts (Ph+Pa) around the fungal axis.

Fatty acids (FA) were produced at low levels, except the saturated compounds (FAsat)

C16:0, C18:0 and the unsaturated compounds (FAunsat) C18:2 n-6, C18:1 n-9 and C18:3 n-3.

FAunsat were produced at higher concentrations than FAsat (ANOVA; F1,8 = 8.896; P = 0.0175), and levels differed according to the lichen part (ANOVA; F3,8 = 9.837; P = 0.010). A lower concentration of total FA was reported in apothecia in comparison with Ph+Pa and pseudopodetia (Pairwise t-tests, P < 0.001 and P = 0.015 respectively). FAunsat (n-7) levels differed significantly among parts (ANOVA; F3,6 = 12.33; P = 0.006), cephalodia being the main supplier of monoenes n-7 (Pairwise t-tests, Ce compared to Ap P = 0.003; Ce versus Pf

P = 0.004). Some FAunsat were exclusively found in one lichen part: C16:3 n-3 in Ph+Pa, C16:2 n-6 in cephalodia.

155 Dommages sectoriels

Neutral sugars forming polysaccharides represented about 55-70% of the lichen DM. They were mainly composed of glucose, mannose and galactose (Tableau V-1). Differences in the total polysaccharides were highlighted among the four parts of A. friesiana (ANOVA;

F3,8 = 7.370; P = 0.020). The lowest proportion of neutral sugars forming polysaccharides was recorded in cephalodia in comparison with apothecia and pseudopodetia (Pairwise t-tests, P=0.009 and P=0.010 respectively). The analysis of neutral sugars showed significant

compositional discrepancies among lichen parts (ANOVA; F6,16 =73.730; P < 0.001). Glucose was the major constituent of polysaccharides in pseudopodetia, Ph+Pa and apothecia tissues (Pairwise t-tests, P < 0.001 for each part compared to Ce; Tableau V-1). Mannose and galactose were mainly identified in cephalodia (Pairwise t-tests, Ph+Pa and Pf versus Ce P < 0.001, Ce versus Ap P = 0.004 for mannose and P = 0.001 for galactose), and it is noteworthy that fucose was only detected in this tissue.

The nitrogen content differed significantly among lichen parts (ANOVA, F3,6 = 55.970; P < 0.001; Tableau V-1). Cephalodia were the richest tissue, compared to the apothecia, Ph+Pa and the fungal axis of pseudopodetia (Pairwise t-tests, P < 0.001).

Tableau V-1 : Data set of the compounds identified or detected (unidentified: Af1 to Af5) in the four parts of the lichen Argopsis friesiana (Ap= apothecia, Ce= cephalodia, Ph= phyllocladia, Pa= algal layer of pseudopodetia and Pf= fungal axis of pseudopodetia): specialized metabolites, free sugars and polyols, amino-acids, fatty acids and sugar- forming polysaccharides. Values are means (n=3 replicates) in mg.g-1 dry weight with (minimum - maximum) in brackets, except the specialized metabolites, which are expressed in Area Under the Curve (samples: 0.5 mg.ml-1) *extraction yield (x105). Total polysaccharides (Total PS) and total nitrogen (TN) are expressed’in’percentage’of’DM.’The’sign’-’means’that’the’metabolite’was’not’detected.

156 Dommages sectoriels

Specialized metabolites (Area x 105) Ap Pf Ph+Pa Ce Atranorin (Atra) 3.20 (1.23 - 6.25) 1.87 (1.16 - 2.54) 41.50 (32.12 - 52.18) 1.31 (1.08 - 1.47) Argopsin (Argo) 1.14 (0.26 - 2.41) 2.46 (0.57 - 3.69) 7.23(5.60 - 8.75) 0.40 (0.35 - 0.42) Caloploicin (Calo) 0.54 (0.21 - 1.03) 2.57 (0.86 - 4.82) 6.38 (5.47 - 7.20) 0.55 (0.47 - 0.66) Af1 0.11 (0.03 - 0.20) 0.12 (0.07 - 0.15) 0.51 (0.19 - 0.93) 0.19 (0.10 - 0.26) Af2 0.11 (0.02 - 0.26) 0.09 (0.05 - 0.16) 0.51 (0.14 - 1.02) 0.24 (0.11 - 0.36) Af3 0.02 (0.001 - 0.003) 0.03 (0.02 - 0.06) 0.13 (0.08 - 0.14) 0.25 (0.20 - 0.30) Af4 - - - 0.30 (0.25 - 0.33) Af5 0.06 (0.04 - 0.08) - 0.21 (0.10 - 0.35) 0.07 (0.06 - 0.09) Free Sugars and Polyols (mg.g-1) Ap Pf Ph+Pa Ce Arabinose (Aras) 0.31 (0 - 0.58) 5.69 (1.52 - 12.19) 2.81 (1.38 - 4.99) 0.59 (0.48 - 0.71) Arabitol (Ara) 33.41 (25.82 - 39.24) 89.70 (58.60 - 133.29) 91.86 (87.13 - 100.73) 178.02 (57.6 -399.02) Mannitol (Man) 1.08 (1.03 - 1.13) 3.50 (2.63 - 4.76) 1.97 (1.66 - 2.13) 11.13 (1.69 - 29.99) Myo-inositol (Myo) 0.02 (0 - 0.05) 0.07 (0 - 0.13) 0.10 (0 - 0.17) 0.11 (0 - 0.33) Sucrose (Sac) 0.04 (0 - 0.13) - 0.13 (0 - 0.20) 0.28 (0.24 - 0.32) Sorbitol (Sor) - - 0.16 (0 - 0.25) 0.09 (0 - 0.28) Trehalose (Tre) - - - 0.64 (0.51 - 0.82) Xylitol (Xyl) - 0.19 (0 - 0.35) 0.07 (0 - 0.22) 0.41 (0 - 1.24) Free Amino-Acids (mg.g-1) Ap Pf Ph+Pa Ce -Alanine’(Ala) 0.08 (0.04 - 0.13) 0.19 (0.10 0.29) 0.13 (0.12 - 0.15) 0.09 (0.08 - 0.09) Arginine (Arg) - - - 0.11 (0 - 0.19) GABA 0.20 (0.17 - 0.25) 0.40 (0.38 0.44) 0.44 (0.40 - 0.48) 0.27 (0.23 - 0.30) Glutamine (Gln) 0.12 (0.07 - 0.16) - 0.03 (0 - 0.10) 0.16 (0.16 - 0.17) Glutamate (Glut) 0.14 (0.11 - 0.15) 0.18 (0.06 0.30) 0.25 (0.14 - 0.33) 0.34 (0.31 - 0.37) Glycine (Gly) 0.04 (0 - 0.11) 0.02 (0 -0.05) 0.02 (0 -0.05) - Lysine (Lys) - - - 0.02 (0 - 0.04) Phenylalanine (Phe) - - 0.05 (0 - 0.16) 0.10 (0 - 0.17) Proline (Pro) - - 0.05 (0.04 - 0.05) - Serine (Ser) 0.08 (0 - 0.25) 0.01 (0 - 0.04) 0.15 (0.04 - 0.37) - Tryptophan (Trp) 0.10 (0 - 0.17) 0.11 (0 - 0.17) 0.03 (0 - 0.08) 0.15 (0.08 - 0.26)

157 Dommages sectoriels

Fatty Acids (mg.g-1) Ap Pf Ph+Pa Ce C14:0 0.01 (0.01 - 0.02) 0.03 (0.02 - 0.03) 0.03 (0.02 - 0.04) 0.05 (0.02 - 0.08) C15:0 0.01 (0 - 0.01) 0.02 (0.02 - 0.02) 0.02 (0.01 - 0.03) 0.02 (0.01 - 0.04) C16:0 0.14 (0.09 - 0.23) 0.34 (0.32 - 0.36) 0.43 (0.33 - 0.53) 0.46 (0.26 - 0.84) C17:0 0.01 (0 - 0.01) 0.02 (0.01 - 0.02) 0.02 (0.01 - 0.04) 0.02 (0.01 - 0.05) C18:0 0.09 (0.06 - 0.14) 0.25 (0.24 - 0.26) 0.29 (0.23 - 0.32) 0.24 (0.14 - 0.40) C20:0 0.01 (0.01 - 0.02) 0.03 (0.02 - 0.03) 0.03 (0.02 - 0.04) 0.03 (0.01 - 0.05) C22:0 0.02 (0.01 - 0.05) 0.05 (0.03 - 0.06) 0.07 (0.04 - 0.09) 0.05 (0.03 - 0.09) C23:0 0.01 (0 - 0.01) 0.02 (0.01 - 0.02) 0.02 (0 - 0.03) 0.01 (0 - 0.03) C24:0 0.01 (0 - 0.02) 0.03 (0.02 - 0.04) 0.05 (0.04 - 0.06) 0.03 (0.01 - 0.05)

Total Saturated (FAsat) 0.30 (0.19 - 0.51) 0.78 (0.75 - 0.81) 0.96 (0.81 - 1.14) 0.90 (0.51 - 1.63) C16:3 n-3 - - 0.01 (0.01 - 0.02) - C18:3 n-3 0.01 (0.01 - 0.01) - 0.13 (0.09 - 0.15) 0.10 (0.06 - 0.15) C16:2 n-6 - - - 0.01 (0.01 - 0.02) C18:2 n-6 0.26 (0.24 - 0.27) 0.95 (0.86 - 1.01) 1.15 (0.95 - 1.45) 0.45 (0.37 - 0.59) C16:1 n-7 0.01 (0.01 - 0.01) - 0.03 (0.02 - 0.03) 0.06 (0.05 -0.09) C18:1 n-7 0.01 (0.01 - 0.01) 0.02 (0.02 - 0.02) 0.04 (0.03 - 0.04) 0.07 (0.05 - 0.10) C16:1 n-9 0.01 (0.01 - 0.01) 0.03 (0.02 - 0.04) 0.03 (0.02 - 0.04) 0.02 (0.01 - 0.04) C18:1 n-9 0.07 (0.06 - 0.07) 0.14 (0.12 - 0.16) 0.16 (0.13 - 0.19) 0.10 (0.07 - 0.15)

Total FAunsat (n-3) 0.01 (0.01 - 0.01) - 0.14 (0.11 - 0.16) 0.10 (0.06 - 0.15)

Total FAunsat (n-6) 0.26 (0.24 - 0.27) 0.95 (0.86 - 1.01) 1.15 (0.95 - 1.45) 0.46 (0.38 -0.61)

Total FAunsat (n-7) 0.02 (0.02 - 0.02) 0.03 (0.02 -0.03) 0.07 (0.06 - 0.08) 0.13 (0.10 - 0.18)

Total FAunsat (n-9) 0.08 (0.07 - 0.08) 0.17 (0.14 - 0.18) 0.19 (0.16 - 0.22) 0.13 (0.09 - 0.19) Total Unsaturated 0.36 (0.33 - 0.38) 1.15 (1.05 - 1.18) 1.55 (1.28 - 1.90) 0.81 (0.65 - 1.13) (FAunsat) Total FA 0.66 (0.56 - 0.83) 1.93 (1.84 - 2.01) 2.50 (2.08 - 2.83) 1.71 (1.16 - 2.76) Sugars Forming Polysaccharides (mg.g-1) Ap Pf Ph+Pa Ce Arabinose (PS_Ara) 21.06 (15.64 - 24.66) 17.33 (13.04 - 23.14) 10.85 (10.06 - 11.55) 23.98 (18.00 - 30.12) Fucose (PS_Fuc) - - - 5.41 (3.63 - 7.54) Galactose (PS_Gals) 63.48 (60.25 - 68.95) 55.37 (48.63 - 61.75) 56.35 (55.56 - 57.29) 104.80 (89.72-116.90) Glucose (PS_Glc) 620.27 (580.91 - 654.66) 718.34 (678.57 - 785.53) 667.19 (630.97 - 705.97) 316.64 (290.01 - 337.77) Mannose (PS_Mans) 116.54 (112.02 - 122.58) 77.24 (66.43 - 85.07) 74.41 (73.73 - 75.31) 182.82 (150.65 - 201.89) Rhamnose (PS_Rhas) 4.15 (3.89 - 4.54) 4.02 (3.66 - 4.48) 3.62 (2.88 - 4.06) 6.53 (5.00 - 7.29) Xylose (PS_Xyls) 9.76 (7.93 - 11.16) 7.00 (4.20 - 10.39) 5.36 (4.99 - 5.78) 10.04 (8.15 - 12.60) Total PS (%) 72.39 (67.83 - 76.95) 71.94 (66.17 - 77.71) 66.55 (63.64 - 69.46) 54.27 (50.60 - 57.63) Total Nitrogen (%) Ap Pf Ph+Pa Ce Total Nitrogen (TN) 0.68 (0.57 - 0.85) 0.37 (0.36 - 0.38) 0.66 (0.63 - 0.72) 1.62 (1.46 - 1.78)

158 Dommages sectoriels

3.3 Clustering patterns of metabolites in A. friesiana

The multivariate analysis showed partitioning in the metabolite profiles among parts of the lichen A. friesiana (Figure V-4, contributions to PC1 axis, Online Resource 3 Fig. S3). A differential repartition of each morphological group was observed in the multivariate analysis. PC2 distinguished the presence or the absence of photobionts while the partner nature was discriminated on the first axis (PC1). Ph+Pa were characterized by amino acids, in particular proline and GABA and by the specialized metabolites atranorin, argopsin, caloploicin and Af1. On the opposite side of the first axis, discrimination of the cephalodia was mainly due to trehalose, FAunsat (n-7) family, galactose, mannose and rhamnose from polysaccharides, amino acids, such as lysine and arginine and by its richness in nitrogen (TN). Cephalodia were also negatively correlated with the abundance in glucose issued from polysaccharides degradation. On the second axis (contribution to PC2 axis, Online Resource Fig. S4), the position of apothecia was negatively associated with the occurrence of amino acids and polyols (especially arabitol) and a positive but limited association with some FA (FAsat and

FAunsat (n-9) families) was observed. The metabolic data did not provide any accurate picture of the fungal axis of pseudopodetia chemistry (Figure V-4).

159 Dommages sectoriels

Figure V-4 : Graphs of the Partial Least Squares - Discriminant Analysis (PLS-DA) performed on the chemical composition of the four lichen parts of Argopsis friesiana. The cross model validation used for the discrimination of the lichen parts (8 components, 999 permutations, NMC = 0.042; P = 0.001) indicated statistically different chemical profiles. A. Score plot 1-2: Ap = apothecia, Ce = cephalodia; Ph+Pa = phyllocladia + cortical algal layer, Pf = fungal layer of pseudopodetia. B. Corresponding loading plots of metabolites, including specialized metabolites, amino acids, free sugars and polyols, sugar-forming

polysaccharides, saturated and unsaturated fatty acids. Saturated fatty acids (FAsat) included C14:0, C15:0, C16:0, isoC17:0, C18:0, C20:0, C22:0, C23:0, C24:0. Abbreviations used are given in the Table V-1.’For’clarity,’in’the’presence’of’collinearity’(≥’95%),’only’ one of the two correlated variables is considered (Table S3).

4 Discussion

Three major specialized metabolites were detected in Argopsis friesiana, atranorin, argopsin and caloploicin. The depside atranorin and the chlorodepsidone argopsin have been already reported in this species (Huneck and Lamb 1975). Yosioka et al. (1973) revealed the chlorodepsidone caloploicin from lichens belonging to the genus Caloplaca, but here, for the first time, caloploicin has been isolated from the genus Argopsis with the complete NMR assignment for this compound.

160 Dommages sectoriels

When consuming A. friesiana, N. hookeri at first gets contact with external layers that concentrate specialized metabolites. Despite the abundance of atranorin in the cortex, it had no deterrent effect on the snail grazing. In phytophagous arthropods, atranorin was reported to elicit a significant avoidance (Nimis and Skert 2006) or to reduce growth of insect larvae (Pöykkö et al. 2005; Slansky, 1979) but no defensive attribute of atranorin was noticed in snails (Hesbacher et al. 1995a; Gauslaa 2005). In the soft bodies of different snail species, Hesbacher et al. (1995a) detected a compound presumably originating from atranorin hydrolysis and suggested its sequestration in snail tissues. While the body retention of lichen compounds was not analysed as part of the current study, this is consistent with the previously reported ability of N. hookeri to hydrolyse ester bonds of the tridepside tenuiorin, due to its gut lumen alkalinity (Gadea et al.2017). According to Lawrey (2009), cortical compounds (i.e. atranorin in A. friesiana) are assigned a protective role against high irradiance, whereas medullar specialized metabolites are known to play a role in phytophage defence. As caloploicin and argopsin are depsidones, they are expected to be found in the medulla. In A. friesiana, concentrations in these compounds were found much higher in the external layer Ph+Pa, but they represented less than 25% of the detected specialized metabolites. By contrast, caloploicin and argopsin reached 70% of the specialized metabolites found in the central axis Pf of the pseudopodetia. The medulla of A. friesiana remained intact after snail feeding, consistent with a deterring role of these compounds. This is in agreement with Asplund (2011a) who demonstrated that snails avoid the medulla of Lobaria species due to the presence of depsidones.

According to the Optimal Defence Theory (McKey 1974; Asplund et al. 2010b), reproductive tissues should be well defended. However, this was not supported by our results. In A. friesiana, apothecia and cephalodia had similar concentration of medullary specialized metabolites. Unlike cephalodia, apothecia were avoided by N. hookeri, suggesting that (i) other compounds, including undetected toxic compounds, are able to prevent snail grazing, or (ii) a lack of nutrients may be involved in an avoidance response or that (iii) apothecia roughness represents a physical barrier to radula motion. Therefore, the food choices made by N. hookeri cannot be fully understood in the light of the avoidance hypothesis focusing on specialized metabolites as described by Lawrey (1983). Other factors or compounds such as essential nutrients for the snail growth and reproduction might be involved.

161 Dommages sectoriels

The major free sugars and polyols observed in A. friesiana were arabitol, mannitol and’ arabinose.’They’originated’ from’the’mycobionts’transformation of glucose or ribitol provided by the cyanobacteria (Richardson et al. 1968) and the green alga Trebouxia sp. (Dahlman et al. 2003), respectively. Compared to Stereocaulon ramulosum (Baron et al. 1988) which also belongs to the Stereocaulaceae family, sugar levels were higher in A. friesiana, but the main polyols were also found to be arabitol and mannitol. N. hookeri showed an ability to select cephalodia and algal layers (Ph+Pa), when given a choice among the four parts of A. friesiana. Ce, Ph and Pa were characterized by their richness in polyols and free sugars, among which trehalose was encountered in Ce only. Lichen parts were also discriminated by the amino acid phenylalanine and by arginine and proline exclusive of Ph+Pa. Apothecia avoidance by the snail should be linked to their low content of phagostimulant compounds. However, we could wonder why the snails did not consume the fungus Pf. Although rich in arabitol, Pf was characterized by a lack of diversity in nutrients comparable to that of apothecia. Moreover, the central axis Pf made of compact hyphae, as well as apothecia, could be food items resistant to grazing action since radular teeth of N. hookeri are smooth and more or less bulging or flat, potentially sensitive to rough (Ap) and fibrous (Pf) textures (Fig. S5). By contrast, the soft and gelatinous structure of the cephalodia could promote grazing. This observation is in line with Baur et al. (2000) study on ultrastructure of snail radula, highlighting that the radula is adapted to the snail diet.

We demonstrated the high palatability of cephalodia and Ph+Pa for N. hookeri and we showed that cephalodia consumption was correlated with their abundance. Different factors could explain the snail feeding choice. Due to their low defence levels, cephalodia may be preferred by snails (Renner 1982; Asplund and Gauslaa 2010). Second, the snails in this experiment were only offered one species but intrathalline chemical specificities allow consider this species as a mixed diet. Discriminating in favour of a mixed diet would be a response to acquire a balanced intake of essential nutrients. If so, the snail would have to perceive nutrient quality and to stop feeding when any possible sub-lethal poisoning effects is perceived, particularly due to argopsin and caloploicin occurrence in A. friesiana. In support of this argument, ability to select food items that contain essential nutrients and reduce ingestion of specialized metabolites was evidenced in slugs by Cook et al. (2000). Third, the soft-shell ecophenotype exhibits a proteinaceous shell that belongs to the glycine-rich family and requires the input of amino acids, including not only glycine (55%) but also valine and

162 Dommages sectoriels leucine (Charrier et al. 2013). Although glycine was not detected in A. friesiana, it might be synthetized via serine and glutamate conversions. A. friesiana being free of valine and leucine that are essential amino acids, the snails most likely have a diverse diet in the field in order to meet these nutrients.

The abundance of glucose residues in the polysaccharides, although twice less in cephalodia’than’in’other’parts,’suggested’the’presence’of’glucans,’probably’isolichenan’(- glucan), as found for Stereocaulon ramulosum (Baron et al. 1991). Richness in galactose and mannose units in the cephalodia could reflect galactomannan synthesis, a hypothesis well supported by the description of these heteropolymers in Stereocaulon paschale (Baron et al. 1989) as well as in other cyanolichens (Gorin and Barreto-Bergter 1983). Since lichenan, mannan and galactomannan degrading-enzymes are generally found in land snails (Charrier and Rouland 2001; Flari et al. 1995), N. hookeri can probably exploit this source of glycosidic residues and thereby meet its energy needs. Indeed, gastropod metabolism is considered to be polysaccharide-orientated since energy is mainly provided by glycogen storage (van der Horst and Zandee 1973). Sugars and amino acids are also needed to synthetize mucus proteoglycans for snail locomotion, adhesion, body hydration and chemical communication (Ng et al. 2013). Because mucus production requires around 20% of ingested energy (Denny 1980), the consumption of fodder rich in potential mucin-like compounds would be beneficial to the snail survival.

Two fatty acids (C16:1 n-7 and C18:1 n-7) discriminated cephalodia. FAunsat (n-7) family is specific of cyanobacteria (Rezanka and Dembitsky 1999; Vu et al. 2016), raising the question on whether the snail feeding choice for cyanobacteria is governed by phagostimulating properties of this FAs family. Energy in terrestrial snails is provided by glycogen storage, while lipids are mainly implied in the structure of cellular membranes, phospholipids and sterols representing over 80% of the total lipids (van der Horst and Zandee

1973). In A. friesiana, linoleic acid (C18:2 n-6) is by far the most available FAunsat for N. hookeri. Yet, Arakelova et al. (2009) reported more than 10% of linoleic acid in triglycerides in the digestive gland of phytophagous pond snails. The authors showed that linoleic acid, with linolenic acid (C18:3 n-3), were provided by the algal food and acted as precursors of long-chains C22 FAs that play a role in motor activity of the pedal muscle.

163 Dommages sectoriels

Cephalodia were also discriminated by their richness in nitrogen, suggesting that N. hookeri grazing preferences were not reduced by nitrogen abundance. Asplund and Gauslaa (2010) showed that gastropods prefer cephalodia also in the foliose lichen Nephroma arcticum. Conversely, Asplund et al. (2010a) demonstrated species-specific changes in lichen palatability according to N deposition and Asplund and Wardle (2013) found that N-enriched lichens were less palatable. However, these authors explained that N-fixation ability interacted with growth form on the consumption rate. Regarding nitrogen concentration in cephalodia (1.6%), A. friesiana could be included in fruticose N-fixing species described by Asplund and Wardle (2013), which are consumed more than non-N-fixing species of the same growth form. Hence, our results do not contradict those of Asplund and Wardle (2013). Because the snail tissues contain 10% nitrogen (Speiser 2001), we hypothesize that N. hookeri should benefit from elevated N concentrations (1-2%) in the lichen.

Rundel (1978) established a relation between nitrogen content, specialized metabolites diversity and predation by lichenivores species. To complete this concept, the results obtained from chemical profiles of the four parts of A. friesiana were taken into consideration. The deterring role of specialized metabolites was supported, but we would additionally emphasis the proportion of unpalatable medullary depsidones (i.e. caloploicin and argopsin). The percentage of medullary specialized metabolites (MSM) was calculated and three levels could be determined: low (MSM < 25%), moderate (25% < MSM < 50%) and high (MSM > 50%). Additionally, a highlight was made on nitrogen content given that a high content stimulates the palatability of lichenivores species. To complement these previous statements on lichen- snails trophic interactions, concentration in arabitol was considered. In A. friesiana, cephalodia were the most palatable part, displaying a moderate MSM, a high nitrogen content (> 1%) and a high arabitol content (> 50 mg.g-1). On the contrary, apothecia with a low nitrogen (< 1%) and arabitol (< 50 mg.g-1) content were avoided. In spite of a low MSM, Ph+Pa with a low nitrogen content were less eaten than cephalodia. Finally, the high MSM of pseudopodetia was not compensated by the high arabitol content and was avoided. Based on our chemical results obtained from the different parts of A. friesiana, a model considering MSM, nitrogen and arabitol contents was proposed to predict lichen-snails trophic interactions (Figure V-5).

164 Dommages sectoriels

Figure V-5 : Decision tree allowing to predict lichen consumption by snails. The medullar specialized metabolites percentage (MSM) considers the proportion of medullar specialized metabolites in all the detected specialized metabolites. Three levels were selected (high: MSM > 50%; moderate: 25% < MSM < 50%; low: MSM < 25%). The nitrogen and arabitol contents complement the MSM parameter to have a better prediction for lichen-snails trophic relations. Threshold values for nitrogen and arabitol were fixed at 1% and 50 mg.g-1 respectively.

In future, the MSM feature of each lichen metabolite should be considered according to the main lichen predators. According to large data obtained on a variety of lichen species we could envisage to be conclusive about general trends as the supposed deterrent property of depsidones. Specific traits should be revealed but the balance between metabolites also taking into account the contents in nitrogen and carbohydrate related compounds in lichen-

165 Dommages sectoriels

snails trophic interactions. Physical criteria as the hardness of lichens thalli should not either be excluded to modulate the chemical defence strategy.

Supplementary Materials15: Online resource 1. Fig S1: Study sites on Possession Island that belongs to Crozet Archipelago (45°’″0’ 46°’″0’S;’50°’00’ 52° 30’E)’in’the’Subantarctic’region. Online Resource 2: Chemical and spectroscopic data. Fig S2: NMR spectra (1H, 500 MHz and 13 1 C, 150 MHz) of caloploicin in acetone (d6-acetone) and caloploicin formula, Table S1: H NMR (500 MHz, cryo) and 13C NMR (125 MHz) data for caloploicin. Data recorded in acetone- d6,’’in’ppm,’Table’S′:’Results’of’exact’mass’measurements’in’negative-ion mode DART- HRMS of the molecules retrieved in Argopsis friesiana, Table S3: Each specialized metabolite in the four lichen parts, calculated as a percentage of all the compounds detected in this chemical group. Online Resource 3: Multivariate analysis supplementary data. Fig S3: Projection to the axis PC1 of the metabolites analysed by PLSDA. Fig S4: Projection to the axis PC2 of the metabolites analysed by PLSDA. ; Table S3 Correlated compounds (> 95%) in the PLS-DA analysis from the data set of the compounds identified in the lichen A. friesiana. Online Resource 4: Fig S5: Scanning Electron Microscopy of the radula of Notodiscus hookeri, extracted from the buccal mass.

Acknowledgments: Aurélie BERNARD, Corentin DAUGAN and Nathalie MARNET are acknowledged for their technical assistance. The authors are also indebted to David RONDEAU for giving access to DART-HRMS (DReAM platform, IETR). This work used analytical facilities of P2M2 platform for primary metabolites (amino-acids and carbohydrates) analyses thanks to Alain BOUCHEREAU. Subantarctic field trip was funded by l'Institut Polaire Paul-Émile Victor, Plouzané, France (IPEV, programme 136). Aude BOUTET and Julien TOMMASINO are warmly thanked for their help during the fieldwork. Yngvar Gauslaa is acknowledged for his useful comments and discussions on this manuscript.

15 Supplementary data are available in Annexe E at the end of this manuscript (page 231). 166 Dommages sectoriels

én rsum

Notodiscus hookeri consomme préférentiellement les parties du lichen Argopsis friesiana contenant des photobiotes (couche algale et cyanobactéries dans les céphalodies), du fait de leur richesse en nutriments (sucres, polyols, acides aminés). Les céphalodies qui contiennent des cyanobactéries capables de’fixer’lazote’atmosphérique’sont également particulièrement riche en azote.

Le rôle des métabolites spécialisés dans les choix alimentaires est indéniable, mais leur effet sur les escargots lichénophages dépend de leur nature ainsi que de leur localisation. Dans cet article nous proposons de calculer le pourcentage métabolites médullaires (MSM) au sein lensemble’des’métabolites’spécialisés’détectés et de considérer ce paramètre comme premier critμre’dun’arbre’décisionnel’permettant’de’prédire’la’probabilité’dattaque’dun’lichen’par un lichénophage. Les deux autres critères pris en compte sont la teneur en azote et la concentration en arabitol.

167

VI. Conclusions et perspectives

A bord du Marion Dufresne

169

Conclusions et perspectives

Le’but’de’ce’travail’était’détudier’les’préférences’alimentaires’de’Notodiscus hookeri et de les mettre en relation avec la composition chimique des lichens. La consommation des lichens au laboratoire a été observée par des expériences (i) de comportement alimentaire en situation de choix et (ii) de gustation de métabolites en situation de non-choix, afin de comprendre le broutage préférentiel de certaines parties des lichens. La localisation des métabolites au sein du thalle de trois espèces (Argopsis friesiana, Pseudocyphellaria crocata et Usnea taylorii) a été’ effectuée’ par’ lintermédiaire’ de’ techniques’ dimagerie, chromatographiques et spectrométriques (LC-DAD-MS, GC-MS, (MA)LDI-MSI, microdissection couplée à la LC- DAD-MS, DART-MS). Le couplage des données chimiques et biologiques a été un élément essentiel pour la compréhension des mécanismes impliqués dans les interactions entre les lichens’et’ce’lichénophage,’mécanismes’qui’seraient’susceptibles’dêtre’élargis’δ’lensemble’ des gastéropodes lichénophages.

Les expériences de choix alimentaires en arènes (ou notodromes) ont mis en évidence des résultats non attendus sur le comportement des escargots. Lors de ces expériences, la majorité des escargots testés se sont dirigés prioritairement dans les branches contenant les roches. Les roches, utilisées en première intention comme des contrôles négatifs, se sont avérées’trμs’fortement’positives.’Ce’comportement’a’entraîné’un’biais’dans’létude’car’seule’ une’faible’proportion’dindividus’a’fait le choix de se diriger dans une branche contenant un morceau de lichen afin de se nourrir. Sur le terrain, les escargots sont toujours collectés sous des’roches’plus’ou’moins’couvertes’de’lichens.’Il’est’possible’davancer’lhypothμse’que’les’ lichens testés’ noffraient’ pas’ de’ refuge.’ De’ ce’ fait,’ il’ aurait’ été’ préférable’ de’ ne’ rien’ positionner dans les branches témoins. Des expériences sur des lichens crustacés permettraient’de’disposer’de’refuges’dans’toutes’les’branches’de’larμne’et’ainsi’de’valider’ lhypothμse.’Ces’données’nous’apportent’tout’de’même’une’donnée’essentielle’sur’lespμce’ Notodiscus hookeri : le refuge est le site de résidence des individus, à partir duquel se fera la recherche de nourriture.

❖ Tout’est’une’histoire’de’compromis…

Peu’déquipes de recherche ont travaillé sur la lichénophagie chez les gastéropodes mais’ quantité’ darticles’ ont’ été’ publiés.’ Les’ travaux’ précédents’ sur’ les’ interactions’ entre’

171 Conclusions et perspectives

Gastéropodes et Lichens se sont intéressés presque exclusivement aux métabolites spécialisés et à leur influence sur les préférences alimentaires des Gastéropodes (Baur et al. 1994; Hesbacher et al. 1995; Gauslaa 2005; Gauslaa et al. 2006; Gauslaa 2008; Asplund and Gauslaa 2010; Asplund et al. 2010b; Boch et al. 2015b). Ces métabolites se répartissent dans le thalle lichénique en fonction de leur rôle pour la symbiose lichénique, et un même métabolite peut avoir différents rôles (Lawrey 2009). Rappelons que selon la théorie de défense optimale (ODT) les apothécies, sorédies et isidies devraient être plus riches en métabolites spécialisés du fait de leur rôle dans la reproduction du lichen (McKey 1974; Hyvärinen et al. 2000; Asplund et al. 2010b). Dans le lichen P. crocata, les escargots ont tendance à éviter les sorédies contenant de la calycine (Gauslaa 2008, Chapitre IV-B). Ce métabolite, exclusivement retrouvé’au’niveau’des’sorédies,’sest’dailleurs’révélé’comme’étant’le’métabolite’le plus rejeté par les escargots dans les expériences sur les métabolites isolés (Chapitre IV-B). LODT’ne’se’ vérifie cependant pas pour tous les lichens. Dans A. friesiana, les apothécies sont évitées mais nous’navons’pas’mis’en’évidence’une’concentration en métabolites spécialisés solubles dans lacétone’ plus’ importante’ que’ dans’ le’ reste’ du’ thalle’ (Chapitre V). Il est cependant envisageable’ que’ dautres’ métabolites,’ non’ solubles’ dans’ lacétone’ et’ présents’ dans’ les’ apothécies exercent un effet répulsif sur les escargots. Dans U. taylorii,’lacide’usnique’est’ présent aussi bien dans le thalle végétatif que dans les apothécies, toujours au niveau des parties’les’plus’externes’(cortex’et’hyménium)’et’ces’parties,’en’particulier’lhyménium’des’ apothécies, sont largement consommées (Chapitre IV). Les depsidones sont régulièrement décrites comme des composés médullaires, ayant des propriétés répulsives contre les lichénophages (Solhaug et al. 2009; Asplund 2011a; Gauslaa et al. 2013). Les dérivés’de’lacide’ stictique notamment sont considérés comme de puissants répulsifs des Gastéropodes (Asplund 2011a, 2011b; Solhaug and Gauslaa 2012). Nous avons confirmé grâce à nos observations lors des expériences de microdissections que ce métabolite était essentiellement retrouvé’au’niveau’de’la’médulle’et’que’les’escargots’évitaient’les’gels’damidon’enrichis’en’ acide stictique (Chapitre IV-B).’ Nous’ avons’ observé’ quen’ réalité,’ cest’ la’ proportion’ de’ depsidones par rapport aux autres métabolites spécialisés qui prévaut sur la teneur. Dans le Chapitre V,’le’complexe’cortex’+’couche’algale’(Ph+Pa)’dA. friesiana, que consomme N. hookeri,’contient’de’grandes’quantités’dargopsine’et’de’caloploïcine,’deux’chlorodepsidones,’ mais ces parties sont largement consommées. Au contraire, le pseudopodétion qui contient quantitativement moins de métabolites spécialisés mais proportionnellement plus de depsidones,’est’évité.’Il’convient’donc’davoir’une’prise’en’compte’qualitative’et quantitative

172 Conclusions et perspectives des’métabolites’pour’analyser’lappétence’ou’non’de’lescargot.’Dans’les’expériences’de’non- choix, tous les métabolites spécialisés testés, quelles que soient les familles chimiques que nous avons testées (depsides,’depsidones,’dibenzofuranes’ou’dérivés’de’lacide’pulvinique), ont été majoritairement évités par N. hookeri. Nous avons pu montrer que ces métabolites étaient ingérés dans un lichen entier et que le pH basique des glandes salivaires et de la glande digestive’ suggéraient’ la’ capacité’ physiologique’ de’ lescargot’ dopérer’ un’ clivage’ des’ molécules potentiellement toxiques. Dautres’ mécanismes’ (évitement, métabolisation, excrétion sans absorption ni séquestration) peuvent également être mis en place par’lescargot pour permettre de passer outre la toxicité de ces métabolites (Chapitre III).

Une’des’originalités’de’ce’travail’de’thμse’a’été’de’combiner’létude’des’métabolites’ spécialisés à celle des métabolites primaires afin de mieux définir les contributions relatives des’uns’et’des’autres’aux’réponses’nutritionnelles’de’lescargot.’Ainsi, nous avons pu montrer quen’ présence’ dun’ métabolite’ appétent,’ comme’ larabitol,’ la’ consommation’ des’ gels’ damidon’augmentait’significativement’(Chapitre IV). Ces résultats expliquent pourquoi N. hookeri est capable de consommer certaines parties du thalle en dépit de la présence de métabolites initialement répulsifs (Chapitre IV).’Larabitol,’lorsquil’est’le’polyol’majoritaire,’ est présent partout dans le thalle mais dans des quantités variables comme cela a été montré dans U. taylorii et A. friesiana. Ce métabolite possède un pouvoir phagostimulant, permettant de’passer’outre’le’caractμre’répulsif’pour’lescargot’de’certains’métabolites’(Chapitre IV). Lintérêt’de’N. hookeri pour les polyols et les sucres est également mis en évidence sur A. friesiana (Chapitre V). Dans ce lichen, les phylloclades et les céphalodies sont discriminées positivement en PLS-DA par la présence de sucres et de polyols et se révèlent être les parties largement’ préférées’ par’ lescargot.’ Ces’ différentes’ observations’ confirment’ le’ rôle phagostimulant’ de’ larabitol’ et’ plus’ généralement’ des’ sucres’ et’ des’ polyols.’ Cependant,’ larabitol’nest’pas’présent’dans’toutes’les’espμces’de’lichens,’contrairement’au’mannitol’et’δ’ certains hétérosides (Loewus and Tanner 1982).’Dans’lexemple’de’deux’autres lichens étudiés (P. bicolor et A. macrophthalma),’larabitol’nest’pas’quantifié et il semble être remplacé au sein du lichen par des disaccharides tels que le saccharose et le tréhalose (Annexe F). Or, les disaccharides sont aussi décrits comme de puissants phagostimulants pour les Gastéropodes (Clark et al. 1997).

173 Conclusions et perspectives

Ayant démontré le’rôle’stimulant’dun’carbohydrate’lichénique’pour’lescargot,’il’était’ aussi’nécessaire’de’considérer’lapport’dazote’par’lalimentation.’Pour’ce’faire,’les’lichens’ constituent de bons modèles biologiques étant donné que la teneur en azote diffère selon le type’ de’ photobiote.’ Plusieurs’ études’ ont’ donc’ considéré’ ce’ paramμtre’ dans’ lanalyse’ des’ préférences alimentaires de gastéropodes lichénophages (Cleland et al. 2006; Asplund et al. 2010a; Asplund and Wardle 2012, 2013; Asplund et al. 2016). Dans le chlorolichen U. taylorii, les’teneurs’dazote’sont’inférieures’δ’1%’alors’quen’présence’dun’cyanobiote’(cyanolichens’ ou lichens tripartites), les teneurs sont supérieures à 1% (Annexe F). Ainsi, un lichen délaissé par N. hookeri ou peu appétent combinerait une pauvreté en azote et un fort ratio en métabolites’spécialisés,’comme’cest’le’cas’dans’le’pseudopodétion’dA. friesiana.

La texture du lichen consommé peut également avoir son importance. Les Gastéropodes possèdent une radula dont la forme des dents radulaires est adaptée au régime alimentaire. Celle des Gastéropodes zoophages se distingue de celle des escargots phytophages consommateurs de plantes ou de ceux capables de consommer des lichens endolithiques (Baur et al. 2000). Les dents radulaires de N. hookeri sont lisses et plus ou moins bombées (Figure VI-1).’Ces’derniμres’suseront’davantage’lors’du’broutage’daliments’rigides’ comme’ peuvent’ lêtre’ le’ cordon’ axial’ dU. taylorii ou’ la’ partie’ du’ pseudopodétion’ dA. friesiana. Par contre les céphalodies, une fois humides, prennent une texture gélatineuse (Chapitre V) chez A. friesiana et la médulle a une texture lâche chez U. taylorii. Outre les propriétés chimiques, il se pourrait donc que les caractères physiques du lichen soient une contrainte’ physiologique’ pour’ lescargot’ étant’ donné’ que les dents radulaires doivent se renouveler au fur et à mesure de leur usure.

174 Conclusions et perspectives

A back

front

B C

Figure VI-1 : Image de microscopie électronique à balayage de la radula de N. hookeri, extraite de la masse buccale. (A) Vue globale montrant environ 50 dents par rangée. (B) Les dents latérales sont plutôt étroites, lancéolées, fortement courbées et lisses ; (C) Les dents marginales sont larges, mais plus basses que les dents latérales, avec trois cuspides arrondis, les plus externes étant aplanis.’Les’barres’déchelle’représentent’100’µm’(A)’et 10 µm (B and C). Collaboration avec J. Le Lannic, Centre de Microscopie Electronique à Balayage (CMEBA), Université de Rennes 1.

Il semble donc que les choix alimentaires de N. hookeri sont avant tout un compromis entre métabolites appétents et métabolites répulsifs. N. hookeri est un escargot généraliste et opportuniste qui se nourrit de la majorité des lichens auxquels il est confronté. En revanche, au sein de ces lichens, il est capable de faire des choix en se nourrissant des parties ayant une valeur’nutritive’élevée’(présence’de’sucre’et’de’polyols,’dacides’aminés,…),’et’ce’parfois’en’ dépit de la présence de métabolites spécialisés pouvant être toxiques. Par conséquent, lévitement’de’certaines’parties’(les’apothécies’dA. friesiana par exemple) pourrait être plus lié’ δ’ labsence’ de’ métabolites’ appétents’ quδ’ la’ présence’ de’ métabolites’ spécialisés’ inappétents.’Lors’de’lalimentation,’lacquisition’de’métabolites’nutritifs’est’essentielle’au’bon’ développement’ des’ organismes.’ Lobtention’ par’ lescargot’ dune’ nourriture’ riche’ en’ carbohydrates et en acides aminés est une contrainte physiologique liée à son mode de déplacement. En effet, ces molécules sont indispensables à la synthèse des protéoglycanes constituant’le’mucus,’qui’assure’chez’les’Gastéropodes’la’locomotion,’lhydratation’tissulaire,’ ladhérence’et’la’communication’chimique’(Ng et al. 2013).

175 Conclusions et perspectives

A partir de toutes ces observations quant aux métabolites qui guident les choix alimentaires de N. hookeri, nous proposons un modèle prédictif construit à partir des données des’ différentes’ parties’ dA. friesiana (Chapitre V).’ Larabitol’ nétant’ pas’ nécessairement’ retrouvé dans tous les lichens, les teneurs globales en sucres libres et polyols sont maintenant considérées’ pour’ que’ le’ modμle’ puisse’ sadapter’ δ’ un’ plus’ grand’ nombre’ de’ lichens.’ Le’ nouveau schéma de prédiction des préférences nutritionnelles des gastéropodes sur les lichens est proposé dans la Figure VI-2. Les prédictions ont pu être validées avec les données de P. crocata et U. taylorii, deux lichens modérément consommés.

Légende : A. friesiana

Pseudopodétion (Pf) U. taylorii

-1 > 50 mg.g Phylloclades (Ph + Pa)

Céphalodies (Ce) P. crocata Sugars and < 50 mg.g-1 Apothécies (Ap) polyols

Avoided

< 1% < 50 mg.g-1

-1 Nitrogen > 1% Sugars and > 50 mg.g content polyols

MSM > 50% < 50 mg.g-1

Medullar -1 specialized 25% < MSM < 50% Nitrogen < 1% Sugars and > 50 mg.g Moderately metabolites content polyols consumed (MSM)

MSM < 25% > 1%

-1 Nitrogen > 1% Sugars and < 50 mg.g content polyols

< 1% > 50 mg.g-1 Highly consumed

Sugars and > 50 mg.g-1 polyols

< 50 mg.g-1

Figure VI-2 : Arbre décisionnel permettant de prédire la consommation des lichens par les escargots. Le contenu en métabolites spécialisés médullaires (Medullar Specialized Metabolites ou MSM) est exprimé en pourcentage des métabolites spécialisés totaux. Trois niveaux sont déterminés : contenu élevé (MSM > 50%), modéré (25% < MSM < 50%), et faible (MSM < 25%). Les résultats obtenus pour chaque lichen ou partie de lichen sont symbolisé par une photo.

176 Conclusions et perspectives

Ce modèle illustre la notion de compromis entre les métabolites nutritifs et les métabolites potentiellement répulsifs. En effet, un lichen avec peu de métabolites spécialisés médullaires’nest’pas’nécessairement’fortement’consommé,’et’la’présence’dazote’ainsi’que’ de métabolites phagostimulants comme les sucres ou les polyols induisent une consommation plus’importante.’Ce’modμle’nécessitera’cependant’dêtre’vérifié’et’validé’avec’un’nombre’plus’ important de lichens et également sur différentes espèces de Gastéropodes lichénophages.

❖ Histolocaliser’les’métabolites,’un’vrai’plus’pour’létude’des’interactions’trophiques

Une’ localisation’ précise’ des’ différents’ métabolites’ dintérêt’ au’ sein’ des’ tissus’ du’ thalle’ lichénique se révèle indispensable pour répondre à des problématiques liées à une consommation sectorielle par les lichénophages. La méthode basique est la découpe manuelle minutieuse’des’différentes’parties’dintérêt’(parties’reproductrices,’céphalodies,’…)’comme’ nous’lavons’fait’pour’Argopsis friesiana (Chapitre V).’Lapplication’de’cette’technique’nest’ cependant’possible’que’si’la’morphologie’des’lichens’sy’prête,’comme’les’lichens’fruticuleux’ (Usnea sp.), les thalles complexes (A. friesiana) ou éventuellement certains lichens foliacés ou crustacés ayant par exemple des apothécies sessiles. Pour étudier la répartition des métabolites au niveau des différentes couches de la structure hétéromère des lichens (cortex, médulle, etc.), la microdissection laser des tissus est un outil efficace. Nous avons appliqué cette technique à des coupes de P. crocata afin de vérifier la localisation sectorielle des métabolites en pratiquant des micro-extractions ciblées qui ont été analysées par LC-DAD. Ces résultats nous ont permis de confirmer la localisation médullaire des depsidones et des depsides présentes dans ce lichen.

Limagerie’couplée’δ’la’spectrométrie’de’masse’grâce’δ’lionisation’par’désorption’ laser’(LDI)’est’également’un’bon’outil’pour’lhistolocalisation’des’métabolites’au’sein’dune’ coupe de thalle. Grâce à cette technique, les composés comme les depsides, les dibenzofuranes et’les’dérivés’de’lacide’pulvinique’ont’pu’être’observés’au’niveau’de’thalles’de’lichens’(Le Pogam et al. 2016b; Chapitre IV ).’ Lusage’ dune’ matrice’ (MALDI)’ permet’ également’

177 Conclusions et perspectives

lobservation’de’composés’aliphatiques’comme’les’polyols.’En’revanche,’les’depsidones’(acide’ stictique’ et’ ses’ dérivés)’ nont’ pas’ été’ observées’ dans’ nos’ expériences.’ Un’ paramétrage’ spécifique de’ lappareil’ pour’ ces’ composés’ doit’ en’ effet’ être’ réalisé’ La’ longueur’ donde’ standard de la plupart des appareils utilisés ne convient pas pour ces composés qui nécessitent des’conditions’dionisation’plus’drastiques.’La’spectrométrie’de’masse’par’ionisation directe en temps réel (DART) a déjà démontré son intérêt pour ces composés mais la précision dans lhistolocalisation’reste’δ’optimiser.’

Les analyses de spectroscopie Raman et infrarouge (IR) sont des techniques spectroscopiques vibrationnelles. Le Raman,’ contrairement’ δ’ lIR,’ ne’ repose’ pas’ sur’ labsorbance’dun’échantillon’mais’sur’sa’capacité’δ’diffuser’de’maniμre’inélastique’la’lumiμre.’ Ces’ deux’ techniques’ danalyse’ sont’ complémentaires’ et’ elles’ permettent’ de’ repérer’ la’ présence de fonctions spécifiques qui renseignent sur la présence de certaines structures moléculaires dans des échantillons solides ou liquides. Lorsque ces données sont couplées à de’la’microscopie,’ces’techniques’permettent’une’localisation’fine’des’métabolites’au’sein’dun’ tissu (IR 10µm² et Raman 1µm²) (Thygesen et al. 2003).’Ces’techniques’couplées’δ’limagerie’ ont’précédemment’été’utilisées’pour’localiser’lacide’usnique’au’sein’du’thalle’de’plusieurs’ espèces de Cladonia (Liao et al. 2010). La spectroscopie Raman a permis de détecter des métabolites’tels’que’des’depsides,’des’depsidones,’des’dibenzofuranes,’des’dérivés’de’lacide’ pulvinique mais également des caroténoïdes dans des échantillons lichéniques (Edwards et al. 2003a, 2003b, 2004; Fernandes et al. 2015)(Figure VI-3). Cette approche présente également lavantage’ de’ donner’ des’ informations’ précieuses’ sur’ des’ métabolites,’ généralement’ non’ détectables par spectrométrie de masse comme les mélanines (Galván and Jorge 2015), présentes dans certains lichens à thalle foncé au niveau du cortex, comme P. crocata (Nybakken et al. 2007). Cette approche pourrait être envisagée dans des situations où la localisation’des’métabolites’spécialisés’nest’pas’possible’par’LDI.

178 Conclusions et perspectives

Mélange de depsidones chlorées

1 mm

Atranorine + autre molécule

Dérivé caroténoïde 200 µm

Figure VI-3 :’Exemple’dhistolocalisation par spectroscopie Raman de métabolites sur une coupe’de’pseudopodétion’dArgopsis friesiana. Les couleurs des spectres correspondent aux différentes zones du thalle imagées et sont accompagnés des structures identifiées. Ces résultats préliminaires confirment les données présentées dans le chapitre V. Latranorine’est’située’majoritairement dans le cortex, au contact de la couche algale (Pa) alors’ que’ les’ chlorodepsidones’ dominent’ laxe’ médullaire’ (Pf).’ Sur’ la’ partie’ la’ plus’ externe du cortex, le spectre caractéristique de dérivés caroténoïdes a été observé. Données personnelles, obtenues en collaboration avec le Dr A. Fautrel, plateforme H2P2.

❖ Et si la consommation par N. hookeri était avantageuse pour les lichens ?

Dans certains cas, les parties reproductrices des lichens sont mieux protégées des lichénophages par la présence de métabolites spécialisés répulsifs (Hyvärinen et al. 2000; Asplund et al. 2010b; Chapitre IV-B ). Mais existe-il des situations où les lichens pourraient tirer un avantage de la consommation par les Gastéropodes ? Il a été notamment démontré que certains lichens possèdent la capacité de se régénérer suite à la consommation par des lichénophages’ via’ lapparition’ dun’ cortex’ secondaire’ (Cornejo and Scheidegger 2013).

179 Conclusions et perspectives

Lattaque’des’lichens’par’les’Gastéropodes’lichénophages’nest’par’conséquent’pas’létale’pour’ le lichen.

La pratique’de’lendozoochorie’par’les’Gastéropodes’a’été’mise’en’évidence’sur’les’ bryophytes et les fougères (Boch et al. 2013, 2015a, 2016) mais également sur les lichens (Lücking and Bernecker-Lücking 2000; Boch et al. 2011). Dans ses travaux, Boch (2011) observe en laboratoire le développement de nouveaux thalles de Lobaria pulmonaria et de Physcia adscendens δ’partir’dexcréments’de’différentes’espμces’descargots.’Les’propagules’ dispersées par les Gastéropodes par endozoochorie peuvent être non seulement des ascospores ou des photobiotes (McCarthy and Healy 1978; Lücking and Bernecker-Lücking 2000; Fröberg et al. 2001) mais également des fragments de thalles ou des structures de reproduction végétative comme les isidies et les sorédies (Lücking and Bernecker-Lücking 2000; Boch et al. 2011). Lorsque N. hookeri a été nourri de P. crocata afin’détudier’le’transit’ alimentaire, les sorédies étaient consommées, aisément repérables dans les excréments à la couleur jaune de la calycine. La dispersion de spores et de photobiotes reste bénéfique pour le lichen car en germant, les spores donnent de nouveaux mycobiotes, qui seront en contact direct avec les photobiotes présents au sein des boulettes fécales (McCarthy and Healy 1978; Fröberg et al. 2001; Boch et al. 2011). Les excréments des Gastéropodes sont des enchevêtrements muqueux de matières organo-minérales qui constituent un milieu favorable au développement de nouveaux thalles. Les propriétés adhérentes du mucus permettent également’la’fixation’dautres’spores’disséminées’par’le’vent’qui’pourront’interagir’avec’les’ photobiotes excrétés (Peake and James 1967; Boch et al. 2011; Ng et al. 2013).

Létude’ de’ lendozoochorie par N. hookeri est une perspective qui permettrait de vérifier’ si’ linteraction’ entre’ cette’ espμce’ et’ les’ lichens’ quil’ consomme’ est’ une’ relation’ prédateur-proie ou bien plutôt une relation mutualiste. Le terme « mutualisme » se définit ici par « des relations inter-spécifiques non obligatoires à bénéfices réciproques » (Selosse 2000). La symbiose est alors un cas particulier de relations mutualistes où les partenaires sont associés’ physiquement,’ durablement’ au’ cours’ de’ leur’ vie.’ Lendozoochorie’ faciliterait’ la’ transmission horizontale des photobiotes au mycobiote (Figure VI-4).

180 Conclusions et perspectives

Transmission verticale Transmission horizontale

Lichen A Lichen A

Photobiotes de Spores de lichen B consommés mycobiote par N. hookeri du lichen A Consommation par N. hookeri

Lihe A’ Lichen B

Nouveau lichen se développe Rencontre des symbiotes dans à partir de fragments de thalle, les excréments pour formation d’isidies, ou de sodies d’u ouveau lihe

Figure VI-4 : Modalité de transmission de la symbiose par endozoochorie. Le mycobiote est représenté par un cadre noir ; les photobiotes, présents dans le lichen ou dans les excréments de N. hookeri sont représentés par des symboles colorés. Les différents symboles correspondent à différentes espèces de photobiotes. Schéma modifié et adapté à partir de Lefèvre et al. (2010).

Dans’les’conditions’de’laboratoire’de’lÎle’de’la’Possession,’il’na’pas’été’possible’de’ mettre’ en’ place’ des’ cultures’ dexcréments’ issus’ de’ lescargot,’ alors’ que’ des observations dexcréments’ au’ microscope’ δ’ balayage’ laissaient’ entrevoir’ lexistence’ dun’ tel’ processus’ (Figure VI-5).

Photobiotes Filaments du mycobiote

A B

Figure VI-5 :’Images’de’microscopie’électronique’δ’balayage’dexcréments’de N. hookeri. Des microalgues (photobiotes lichéniques) non dégradées sont observées (A) ainsi que des résidus de filaments mycéliens (B). Les’ barres’ déchelles’ représentent’ 1’ µm. Collaboration avec J. Le Lannic, Centre de Microscopie Electronique à Balayage (CMEBA), Université de Rennes 1.

181 Conclusions et perspectives

❖ Notodiscus hookeri et les lichens du Subantarctique, un modèle de co-évolution ?

Certains phytophages ont acquis au cours de l'évolution des moyens de détourner les défenses des plantes pour leur propre bénéfice, en séquestrant ces substances chimiques et en les utilisant pour se protéger eux-mêmes des prédateurs (Ehrlich and Raven 1964). Les relations entre les phytophages et leurs plantes-hôtes aboutissent souvent à des changements évolutifs réciproques, appelés « co-évolution ».’Le’rôle’des’métabolites’spécialisés’dans’lévolution’a’ été confirmé dans différents taxons (Farrell and Mitter 1998; Wahlberg 2001; Wheat et al. 2007) et’les’phytophages,’lorsquils’sont’confrontés’δ’ces’métabolites,’ont’différents’moyens’ de réagir (évitement, tolérance suivi de détoxication ou adaptation à ces métabolites) (Pöykkö et al. 2010). Cependant,’δ’notre’connaissance,’il’nexiste’aucuns’travaux’traitant’de’la’co- évolution entre des Gastéropodes terrestres lichénophages et les lichens.

Les interactions observées entre N. hookeri et’ les’ lichens’ quil’ consomme’ nous’ amènent à nous interroger sur une possible co-évolution. En effet, N. hookeri dépend des lichens pour son alimentation et il a acquis les capacités physiologiques à extraire de leur consommation les nutriments nécessaires, en dépit des différentes défenses chimiques mises en place par le lichen. La fitness (croissance et succès reproducteur) des individus peut aussi dépendre des espèces lichéniques consommées (Baur et al. 1994). De ce fait, bien quopportuniste,’une’hypothμse’avancée’au’début’de’la’thμse’suggérait’lévolution’au’cours’ du’temps’dinteractions’mutualistes’entre’N. hookeri et les lichens les plus profitables sur le plan énergétique. De plus, les lichens de fell-fields comme U. taylorii et A. friesiana ne se trouvant pas en plaines et ces dernières étant par contre les habitats privilégiés par P. crocata, la co-évolution aurait été habitat-dépendante, en accord avec la présence de deux écophénotypes’au’sein’de’la’population’de’lîle’dus’principalement’δ’la’biodisponibilité’en’ calcium dans les sols (Charrier et al. 2013).

Or,’lensemble’de’ce’travail’de’thμse’na’pas’permis de développer des arguments en faveur’dun’processus’co-évolutif.’Les’escargots’des’deux’écophénotypes’savμrent’capables’ de’consommer’des’lichens’quils’nont’jamais’pu’rencontrer’dans’leur’environnement’du’fait’ de leur capacité de dispersion limitée (moins’dun’mμtre’par’mois).’Lorsquils’sont’confrontés’ à des métabolites répulsifs, ils montrent une flexibilité comportementale illustrée par

182 Conclusions et perspectives lévitement’des’ parties’contenant’ces’métabolites’ ou’ une’flexibilité’physiologique’puisque’ lingestion’des’métabolites’est’suivie’au’cours’de’la’digestion’dune’métabolisation’et’dune’ excrétion sans absorption ni séquestration (Chapitre III). Ils réalisent également des choix au niveau’dun’même’thalle’en’consommant’les’parties’les’plus’riches’en’nutriments’(Chapitre V).

Dans cette thèse, nous nous sommes focalisés sur les interactions entre un Gastéropode lichénophage et plusieurs espèces lichéniques constituant sa ressource trophique. Nos’ résultats’ mettent’ en’ évidence’ lexistence’ dau’ moins’ trois’ paramμtres’ essentiels à considérer lors des’futures’études’dinteractions lichens-lichénophages : la nature et lhistolocalisation des métabolites spécialisés, la teneur en azote ainsi que la quantité intrathalline de sucres et polyols des lichens étudiés.

183

Bibliographie

Vue sur la baie américaine depuis la crête de l’alouette

185

Bibliographie A

Adams MA, Chen Z, Landman P, Colmer TD (1999) Simultaneous determination by capillary gas chromatography of organic acids, sugars, and sugar alcohols in plant tissue extracts as their trimethylsilyl derivatives. Anal Biochem 266:7784. doi: 10.1006/abio.1998.2906

Aguiar R, Wink M (2005) How do slugs cope with toxic alkaloids? Chemoecology 15:167 177. doi: 10.1007/s00049-005-0309-5

Alechaga É, Moyano E, Galceran MT (2016) Ion-molecule adduct formation in tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 408:12691277. doi: 10.1007/s00216-015-9237-6

Arakelova ES, Chebotareva MA, Zabelinskii SA, Ivanova VP (2009) Effect of habitat and motor activity of molluscs on fatty acid composition of triglycerides and phospholipids. J Evol Biochem Physiol 45:5158. doi: 10.1134/S0022093009010049

Armstrong RA, Smith SN (1994) The levels of ribitol, arabitol and mannitol in individual lobes of the lichen Parmelia conspersa (Ehrh. ex Ach.) ACH. Environ Exp Bot 34:253260. doi: 10.1016/0098-8472(94)90046-9

Asplund J (2011a) Snails avoid the medulla of Lobaria pulmonaria and L. scrobiculata due to presence of secondary compounds. Fungal Ecol 4:356358. doi: 10.1016/j.funeco.2011.05.002

Asplund J (2011b) Chemical races of Lobaria pulmonaria differ in palatability to gastropods. Lichenologist 43:491494. doi: 10.1017/S0024282911000387

Asplund J, Bokhorst S, Kardol P, Wardle DA (2015) Removal of secondary compounds increases invertebrate abundance in lichens. Fungal Ecol 18:1825. doi: 10.1016/j.funeco.2015.07.009

Asplund J, Gauslaa Y (2010) The gastropod Arion fuscus prefers cyanobacterial to green algal parts of the tripartite lichen Nephroma arcticum due to low chemical defence. Lichenologist 42:113117. doi: 10.1017/S0024282909990284

Asplund J, Gauslaa Y (2008) Mollusc grazing limits growth and early development of the old forest lichen Lobaria pulmonaria in broadleaved deciduous forests. Oecologia 155:93 99. doi: 10.1007/s00442-007-0891-z

Asplund J, Gauslaa Y, Merinero S (2016) The role of fungal parasites in tri-trophic interactions involving lichens and lichen-feeding snails. New Phytol 13527. doi: 10.1111/nph.13975

Asplund J, Johansson O, Nybakken L, et al (2010a) Simulated nitrogen deposition influences gastropod grazing in lichens. Ecoscience 17:8389. doi: 10.2980/17-1-3331

187

Bibliographie

Asplund J, Solhaug KA, Gauslaa Y (2009) Fungal depsidones an inducible or constitutive defence against herbivores in the lichen Lobaria pulmonaria? Basic Appl Ecol 10:273 278. doi: 10.1016/j.baae.2008.04.003

Asplund J, Solhaug KA, Gauslaa Y (2010b) Optimal defense: snails avoid reproductive parts of the lichen Lobaria scrobiculata due to internal defense allocation. Ecology 91:3100 3105.

Asplund J, Wardle DA (2016) How lichens impact on terrestrial community and ecosystem properties. Biol Rev. doi: 10.1111/brv.12305

Asplund J, Wardle DA (2013) The impact of secondary compounds and functional characteristics on lichen palatability and decomposition. J Ecol 101:689700. doi: 10.1111/1365-2745.12075

Asplund J, Wardle DA (2012) Contrasting changes in palatability following senescence of the lichenized fungi Lobaria pulmonaria and L. scrobiculata. Fungal Ecol 5:710713. doi: 10.1016/j.funeco.2012.06.004

Attygalle AB, Kharbatia N, Bialecki J, et al (2006) An unexpected ion-molecule adduct in negative-ion collision-induced decomposition ion-trap mass spectra of halogenated benzoic acids. Rapid Commun Mass Spectrom 20:22652270. doi: 10.1002/rcm.2582

Bačkor’M,’Klemovε’K,’Bačkorovε’M,’Ivanova’V’(′010)’Comparison’of’the’phytotoxic’effects’ of usnic acid on cultures of free-living alga Scenedesmus quadricauda and aposymbiotically grown lichen photobiont Trebouxia erici. J Chem Ecol 36:405411. doi: 10.1007/s10886-010-9776-4 B

Bačkor’M,’Loppi’S’(′009)’Interactions’of’lichens’with’heavy’metals.’Biol’Plant’5″:′14222. doi: 10.1007/s10535-009-0042-y

Baron M, Albert P, Gorin J, Iacomini M (1989) Structural studies on a Galactomannan isolated from the lichen Stereocaulon ramulosum. Agric Biol Chem 53:17511758.

Baron M, Gorin P, Iacomini M (1988) Isolation and identification of a linear (1-]3)-linked Beta-D-Glucan and other carbohydrate components of the lichen Stereocaulon ramulosum (sw) Rausch. Carbohydr Res 177:235239. doi: 10.1016/0008- 6215(88)85057-2

Baron M, Iacomini M, Fantat ES, Gorin PAJ (1991) Galactomannan, lichenan and isolichenan from the polysaccharide-rich lichen Newropogon aurantiaco-ater. Phytochemistry 30:31253126. doi: 10.1016/S0031-9422(00)98266-9

Baur A, Baur B, Fröberg L (1994) Herbivory on calcicolous lichens: different food preferences and growth rates in two co-existing land snails. Oecologia 98:313319. doi: 10.1007/BF00324219

188 Bibliographie Baur B, Baur A (1997) Xanthoria parietina as a food resource and shelter for the land snail Balea perversa. Lichenologist 29:99102. doi: 10.1017/S0024282997000145

Baur B, Fröberg L, Baur A, et al (2000) Ultrastructure of snail grazing damage to calcicolous lichens. Nord J Bot 20:119128. doi: 10.1111/j.1756-1051.2000.tb00741.x

Baur B, Fröberg L, Baur A (1995) Species diversity and grazing damage in a calcicolous lichen community on top of stone walls in Öland, Sweden. Ann Bot Fenn 32:239250.

Benesperi R, Tretiach M (2004) Differential land snail damage to selected species of the lichen genus Peltigera. Biochem Syst Ecol 32:127138. doi: 10.1016/S0305-1978(03)00141-8

Benkendorff K (2010) Molluscan biological and chemical diversity: secondary metabolites and medicinal resources produced by marine molluscs. Biol Rev 85:757775. doi: 10.1111/j.1469-185X.2010.00124.x

Blakeney AB, Harris PJ, Henry RJ, Stone BA (1983) A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113:291299. doi: 10.1016/0008- 6215(83)88244-5

Boch S, Berlinger M, Fischer M, et al (2013) Fern and bryophyte endozoochory by slugs. Oecologia 172:817822. doi: 10.1007/s00442-012-2536-0

Boch S, Berlinger M, Prati D, Fischer M (2016) Is fern endozoochory widespread among fern- eating herbivores? Plant Ecol 217:1320. doi: 10.1007/s11258-015-0554-9

Boch S, Fischer M, Knop E, Allan E (2015a) Endozoochory by slugs can increase bryophyte establishment and species richness. Oikos 124:331336. doi: 10.1111/oik.01536

Boch S, Fischer M, Prati D (2015b) To eat or not to eatrelationship of lichen herbivory by snails with secondary compounds and field frequency of lichens. J Plant Ecol 8:642 650. doi: 10.1093/jpe/rtv005

Boch S, Prati D, Werth S, et al (2011) Lichen endozoochory by snails. PLoS ONE 6:e18770. doi: 10.1371/journal.pone.0018770

Bodo B, Molho D (1974) Structure of argopsin, new chlorodepsidone from lichen Argopsis megalospora. CR Acad Sci C 278:625627.

Bogdanov A, Kehraus S, Bleidissel S, et al (2014) Defense in the aeolidoidean genus Phyllodesmium (Gastropoda). J Chem Ecol 40:10131024. doi: 10.1007/s10886-014- 0496-z

Bokhorst S, Asplund J, Kardol P, Wardle DA (2015) Lichen physiological traits and growth forms affect communities of associated invertebrates. Ecology 96:23942407. doi: 10.1890/14-1030.1

Bourne NB, Jones GW, Bowen ID (1988) Slug feeding behaviour in relation to control with molluscicidal baits. J Molluscan Stud 54:327338. doi: 10.1093/mollus/54.3.327

189

Bibliographie

Boustie J, Grube M (2005) Lichensa promising source of bioactive secondary metabolites. Plant Gen Resour 3:273287. doi: 10.1079/PGR200572

Breure ASH (2015) The sound of a snail: two cases of acoustic defence in Gastropods. J Molluscan Stud 81:290293. doi: 10.1093/mollus/eyu079

Brodo IM, Sharnoff SD, Sharnoff S, Nature CM of (2001) Lichens of North America. Yale University Press C

Cansaran D, Kahya D, Yurdakulola E, Atakol O (2006) Identification and quantitation of usnic acid from the lichen Usnea species of Anatolia and antimicrobial activity. Z Naturforsch C 61:773776.

Carbonero ER, Montai AV, Woranovicz-Barreira SM, et al (2002) Polysaccharides of lichenized fungi of three Cladina spp.: significance as chemotypes. Phytochemistry 61:681686. doi: 10.1016/S0031-9422(02)00363-1

Castello M, Nimis P (1995) A critical revision of Antarctic lichens described by CW Dodge. Bibliotheca Lichenologica 57:7192.

Černajovε’I,’Svoboda’D’(′014)’Lichen’compounds’of’common’epiphytic’Parmeliaceae’species’ deter gastropods both in laboratory and in Central European temperate forests. Fungal Ecol 11:816. doi: 10.1016/j.funeco.2014.03.004

Cetin H, Tufan-Cetin O, Turk AO, et al (2008) Insecticidal activity of major lichen compounds,’ (−)- and (+)-usnic acid, against the larvae of house mosquito, Culex pipiens L. Parasitol Res 102:12771279. doi: 10.1007/s00436-008-0905-8

Charrier M’ (1995)’ Particularités’ du’ métabolisme’ digestif’ dun’ Gastéropode’ pulmoné’ phytophage Helix aspersa Müller. Thèse de doctorat, Université de Rennes 1

Charrier M, Brune A (2003) The gut microenvironment of helicid snails (Gastropoda: Pulmonata): in-situ profiles of pH, oxygen, and hydrogen determined by microsensors. Can J Zool 81:928935. doi: 10.1139/z03-071

Charrier M, Fonty G, Gaillard-Martinie B, et al (2006) Isolation and characterization of cultivable fermentative bacteria from the intestine of two edible snails, Helix pomatia and Cornu aspersum (Gastropoda: Pulmonata). Biol Res 39:669681. doi: 10.4067/S0716-97602006000500010

Charrier M, Lesel M (1991) Transit of a bacterial indicator (spores of Bacillus stearothermophilus) in the alimentary tract of the snail Helix aspersa: faeces analysis according to age and temperature. CR Acad Sci C 313:61925.

Charrier M, Marie A, Guillaume D, et al (2013) Soil calcium availability influences shell ecophenotype formation in the Sub-Antarctic land snail, Notodiscus hookeri. PLoS ONE. doi: 10.1371/journal.pone.0084527

190 Bibliographie Charrier M, Piscart C (2011) New insights into population structure and length-mass relationships in Notodiscus hookeri, the single land snail native from sub-Antarctic islands. Lyon,

Charrier M, Rouland’C’(199′)’Les’osidases’digestives’de’lescargot’Helix aspersa: localisations et’ variations’ en’ fonction’ de’ létat’ nutritionnel.’ Can J Zool 70:22342241. doi: 10.1139/z92-300

Charrier M, Rouland C (2001) Mannan-degrading enzymes purified from the crop of the brown garden snail Helix aspersa Müller (Gastropoda Pulmonata). J Exp Zool 290:125135. doi: 10.1002/jez.1042

Chase JM, Wilson WG, Richards SA (2001) Foraging trade-offs and resource patchiness: theory and experiments with a freshwater snail community. Ecol Lett 4:304312. doi: 10.1046/j.1461-0248.2001.00216.x

Chase R (1986) Lessons from snail tentacles. Chem Senses 11:411426.

Chase R (2001) Sensory organs and the nervous system. In: Baker G (ed) The biology of terrestrial Molluscs, Baker GM. CAB International, UK, pp 179210

Chase R, Croll RP (1981) Tentacular function in snail olfactory orientation. J Comp Physiol A 143:357362.

Chevalier L, Desbuquois C, Papineau J, Charrier M (2000) Influence of the quinolizidine alkaloid content of Lupinus (Fabaceae) on the feeding choice of Helix aspersa (Gastropoda: Pulmonata). J Molluscan Stud 66:6168. doi: 10.1093/mollus/66.1.61

Chevallier L, Nougier J, Cantagrel J (1983) Volcanology of Possession island, Crozet archipelago (TAAF). pp 652658

Christa G, Händeler K, Schäberle TF, et al (2014) Identification of sequestered chloroplasts in photosynthetic and non-photosynthetic sacoglossan sea slugs (Mollusca, Gastropoda). Front Zool 11:15. doi: 10.1186/1742-9994-11-15

Clark SJ, Doods CJ, Henderson IF, Martin AP (1997) A bioassay for screening materials influencing feeding in the field slug Deroceras reticulatum (Müller) (Mollusca: Pulmonata). Ann Appl Biol 130:379385. doi: 10.1111/j.1744-7348.1997.tb06841.x

Cleland EE, Peters HA, Mooney HA, Field CB (2006) Gastropod herbivory in response to elevated CO2 and N addition impacts plant community composition. Ecology 87:686 694. doi: 10.1890/05-0529

Coker PD (1967) Damage to Lichens by Gastropods. Lichenologist 3:428428. doi: 10.1017/S0024282967000465

Convey P (1997) How are the life history strategies of Antarctic terrestrial invertebrates influenced by extreme environmental conditions? J Therm Biol 22:429440. doi: 10.1016/S0306-4565(97)00062-4

191

Bibliographie

Cook A (2001) Behavioural ecology: on doing the right thing, in the right place at the right time. In: Baker G (ed) The biology of terrestrial molluscs. pp 447487

Cook RT, Bailey SER, McCrohan CR, et al (2000) The influence of nutritional status on the feeding behaviour of the field slug, Deroceras reticulatum (Müller). Anim Behav 59:167176. doi: 10.1006/anbe.1999.1275

Cook WE, Raisbeck MF, Cornish TE, et al (2007) Paresis and death in elk (Cervus elaphus) due to lichen intoxication in Wyoming. J Wildl Dis 43:498503. doi: 10.7589/0090- 3558-43.3.498

Cordeiro LMC, Carbonero ER, Sassaki GL, et al (2005) A fungus-type’-galactofuranan in the cultivated Trebouxia photobiont of the lichen Ramalina gracilis. FEMS Microbiol Lett 244:193198. doi: 10.1016/j.femsle.2005.01.040

Cordeiro LMC, de Oliveira SM, Buchi DF, Iacomini M (2008) Galactofuranose-rich heteropolysaccharide from Trebouxia sp., photobiont of the lichen Ramalina gracilis and its effect on macrophage activation. Int J Biol Macromol 42:436440. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2008.02.002

Cordeiro LMC, Messias D, Sassaki GL, et al (2011) Does aposymbiotically cultivated fungus Ramalina produce isolichenan? FEMS Microbiol Lett 321:5057. doi: 10.1111/j.1574- 6968.2011.02309.x

Cordeiro LMC, Stocker-Wörgötter E, Gorin PAJ, Iacomini M (2003) Comparative studies of the polysaccharides from species of the genus Ramalinalichenized fungiof three distinct habitats. Phytochemistry 63:967975. doi: 10.1016/S0031-9422(03)00336-4

Cordeiro LMC, Stocker-Wörgötter E, Gorin PAJ, Iacomini M (2004) Elucidation of polysaccharide origin in Ramalina peruviana symbiosis. FEMS Microbiol Lett 238:79 84. doi: 10.1111/j.1574-6968.2004.tb09740.x

Cornejo C, Scheidegger C (2013) Morphological aspects associated with repair and regeneration in Lobaria pulmonaria and L. amplissima (Peltigerales, Ascomycota). Lichenologist 45:285289. doi: 10.1017/S0024282912000813

Croll RP (1983) Gasteropod chemoreception. Biol Rev 58:293319.

Croll RP, Chase R (1977) A long-term memory for food odors in the Land snail, Achatina fulica. Behav Biol 19:261268. doi: 10.1016/S0091-6773(77)91554-1

Culberson CF (1972) Improved conditions and new data for identification of lichen products by standardized thin-layer chromatographic method. J Chromatogr A 72:113125. doi: 10.1016/0021-9673(72)80013-X

Culberson CF, Elix J (1989) Lichen substances. Methods in plant biochemistry 1:509535. D

192 Bibliographie Da Silva MDLC, Iacomini M, Jablonski E, Gorin PAJ (1993) Carbohydrate, glycopeptide and protein components of the lichen Sticta sp. and effect of storage. Phytochemistry 33:547552. doi: 10.1016/0031-9422(93)85446-X

Dahirel M, Cholé H, Séguret A, et al (2015) Context dependence of the olfactory perceptual range in the generalist land snail Cornu aspersum. Can J Zool 93:665669. doi: 10.1139/cjz-2015-0001

Dahlman L, Persson J, Näsholm T, Palmqvist K (2003) Carbon and nitrogen distribution in the green algal lichens Hypogymnia physodes and Platismatia glauca in relation to nutrient supply. Planta 217:4148. doi: 10.1007/s00425-003-0977-8

Dahlman L, Persson J, Palmqvist K, Näsholm T (2004) Organic and inorganic nitrogen uptake in lichens. Planta 219:459467. doi: 10.1007/s00425-004-1247-0

Danner H, Desurmont GA, Cristescu SM, van Dam NM (2017) Herbivore-induced plant volatiles accurately predict history of coexistence, diet breadth, and feeding mode of herbivores. New Phytol n/a-n/a. doi: 10.1111/nph.14428

Denny M (1980) The role of gastropod pedal mucus in locomotion. Nature 285:160161. doi: 10.1038/285160a0

Denny M (1983) Molecular biomechanics of molluscan mucous secretions. The mollusca 1:431465.

Desbuquois C, Daguzan J (1995) The influence of ingestive conditioning on food choices in the land snail Helix aspersa Müller (Gasteropoda: Pulmonata: Stylommatophora). J Molluscan Stud 61:353360. doi: 10.1093/mollus/61.3.353

Dimitriadis V (2001) Structure and function of the digestive system in Stylommatophora. In: Baker G (ed) The biology of terrestrial Molluscs, Baker GM. CAB International, UK, pp 237257

Dudley SA, Lechowicz MJ (1987) Losses of polyol through leaching in Subarctic lichens. Plant Physiol 83:813815. E

Edwards HGM, Cockell CS, Newton EM, Wynn-Williams DD (2004) Protective pigmentation in UVB-screened Antarctic lichens studied by Fourier transform Raman spectroscopy: an extremophile bioresponse to radiation stress. J Raman Spectrosc 35:463469. doi: 10.1002/jrs.1172

Edwards HGM, Newton EM, Wynn-Williams DD, Lewis-Smith RI (2003a) Non-destructive analysis of pigments and other organic compounds in lichens using Fourier-transform Raman spectroscopy: a study of Antarctic epilithic lichens. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 59:23012309. doi: 10.1016/S1386-1425(03)00073-8

193

Bibliographie

Edwards HGM, Seaward MRD, Attwood SJ, et al (2003b) FT-Raman spectroscopy of lichens on dolomitic rocks: an assessment of metal oxalate formation. Analyst 128:1218. doi: 10.1039/b306991p

Ehrlich PR, Raven PH (1964) Butterflies and plants: a study in coevolution. Evolution 18:586 608. doi: 10.2307/2406212

Elix J, Stocker-Wörgötter E (1996) Biochemistry and secondary metabolites. In: Lichen biology. pp 154180

Elix JA (2014) A catalogue of standardized thin layer chromatographic data and biosynthetic relationships for lichen substances, Third. Rambold, G, Canberra

Elix JA (1996) Biochemestry and secondary metabolites. In: Nash III TH (ed) Lichen Biology. Cambridge University Press, New York, pp 154180

Ellis LT, Alegro A, Bansal P, et al (2012a) New national and regional bryophyte records, 32. J Bryol 34:231246. doi: 10.1179/1743282012Y.0000000019

Ellis LT, Aranda SC, Asthana AK, et al (2013a) New national and regional bryophyte records, 37. J Bryol 35:290305. doi: 10.1179/1743282013Y.0000000073

Ellis LT, Bakalin VA, Baisheva E, et al (2013b) New national and regional bryophyte records, 36. J Bryol 35:228238. doi: 10.1179/1743282013Y.0000000064

Ellis LT, Bednarek-Ochyra H, Ochyra R, et al (2012b) New national and regional bryophyte records, 33. J Bryol 34:281291. doi: 10.1179/1743282012Y.0000000030

Emmerich R, Giez I, Lange OL, Proksch P (1993) Toxicity and antifeedant activity of lichen compounds against the polyphagous herbivorous insect Spodoptera littoralis. Phytochemistry 33:13891394. doi: 10.1016/0031-9422(93)85097-B

Ertz D, Fryday A, Schmitt I, et al (2016) Ochrolechia kerguelensis sp. nov. from the Southern Hemisphere and O. antarctica reinstated from the synonymy of O. parella. Phytotaxa 280:129140. doi: 10.11646/phytotaxa.280.2.3

Ertz D, Poulsen RS, Charrier M, Søchting U (2017a) Taxonomy and phylogeny of the genus Steinera (Arctomiales, Arctomiaceae) in subantarctic islands of Crozet and Kerguelen.

Ertz D, Søchting U, Gadea A, et al (2017b) Ducatina umbilicata gen. et sp. nov., a remarkable Trapeliaceae from the subantarctic islands in the Indian Ocean. Lichenologist 49:127 140. doi: 10.1017/S0024282916000700

Esnault J, Boustie J, Chambet A, Monnat J-Y (2014) Louis Jean-Claude Massé (1937-2013). https://www.researchgate.net/publication/265652453_Louis_Jean- Claude_Masse1937-2013. Accessed 7 Aug 2017 F

194 Bibliographie Falk KL, Kästner J, Bodenhausen N, et al (2014) The role of glucosinolates and the jasmonic acid pathway in resistance of Arabidopsis thaliana against molluscan herbivores. Mol Ecol 23:11881203. doi: 10.1111/mec.12610

Farrell BD, Mitter C (1998) The timing of insect/plant diversification: might Tetraopes (Coleoptera: Cerambycidae) and Asclepias (Asclepiadaceae) have co-evolved? Biological Journal of the Linnean Society 63:553577. doi: 10.1111/j.1095- 8312.1998.tb00329.x

Fernandes RF, Spielmann AA, de Oliveira LFC (2015) Raman spectroscopy as a tool to the in situ study of three lichens species from Antarctica and Brazil. J Raman Spectrosc 46:7075. doi: 10.1002/jrs.4626

Flari V, Charrier M (1992) Contribution to the study of carbohydrases in the digestive tract of The edible snail Helix lucorum L.’ (Gastropoda :’ Pulmonata :’ Stylommatophora)’ in’ relation to its age and its physiological state. Comp Biochem Physiol A Physiol 102:363372. doi: 10.1016/0300-9629(92)90148-J

Flari’V,’Matoub’M,’Rouland’C’(1995)’Purification’and’characterization’of’a’-mannanase from the digestive tract of the edible snail Helix lucorum L. Carbohyd Res 275:207 213. doi: 10.1016/0008-6215(95)00136-H

Frenot Y (1986) Interactions between earthworm fauna and edaphic systems in a subantarctic island: Possession Island, Crozet Archipelago. Thèse de doctorat, Université de Rennes 1

Frenot Y, Chown SL, Whinam J, et al (2005) Biological invasions in the Antarctic: extent, impacts and implications. Biol Rev 80:4572. doi: 10.1017/S1464793104006542

Frenot Y, Gloaguen JC, Massé L, Lebouvier M (2001) Human activities, ecosystem disturbance and plant invasions in subantarctic Crozet, Kerguelen and Amsterdam Islands. Biol Conservation 101:3350. doi: 10.1016/S0006-3207(01)00052-0

Frenot Y, Vernon P, Bellido A (1989) A bibliography of terrestrial ecosystems on Iles Crozet, Indian Ocean. Polar Rec 25:12130.

Fröberg L, Baur A, Baur B (1993) Differential herbivore damage to calcicolous lichens by snails. Lichenologist 25:8395. doi: 10.1006/lich.1993.1015

Fröberg L, Baur A, Baur B (2006) Field study on the regenerative capacity of three calcicolous lichen species damaged by snail grazing. Lichenologist 38:491493. doi: 10.1017/S0024282906005469

Fröberg L, Björn LO, Baur A, Baur B (2001) Viability of lichen photobionts after passing through the digestive tract of a land snail. Lichenologist 33:543545. doi: 10.1006/lich.2001.0355

Fröberg L, Stoll P, Baur A, Baur B (2011) Snail herbivory decreases cyanobacterial abundance and lichen diversity along cracks of limestone pavements. Ecosphere 2:art38. doi: 10.1890/ES10-00197.1

195

Bibliographie

G

Gadea A, Le Lamer A-C, Le Gall S, et al (submitted) Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana shape gastropod grazing patterns.

Gadea A, Le Pogam P, Biver G, et al (2017) Which specialized metabolites does the native Subantarctic Gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata? Molecules 22:425. doi: 10.3390/molecules22030425

Gaio-Oliveira G, Dahlman L, Palmqvist K, et al (2005) Nitrogen uptake in relation to excess supply and its effects on the lichens Evernia prunastri (L.) Ach and Xanthoria parietina (L.) Th. Fr. Planta 220:794803. doi: 10.1007/s00425-004-1396-1

Galloway DJ (2008) Austral lichenology: 16902008. NZ J Bot 46:433521. doi: 10.1080/00288250809509781

Galloway DJ (1980) The lichen genera Argopsis and Stereocaulon in New Zealand. Bot Notiser 133:261279.

Galloway DJ (2013) The lichen genera Aspiciliopsis and Placopsis (’Trapeliales :’Trapeliaceae :’ Ascomycota ) in New Zealand. Phytotaxa 120:1194. doi: 10.11646/phytotaxa.120.1.1

Galloway DJ, Arvidsson L (1990) Studies in Pseudocyphellaria (lichens) II. Ecuadorean species. Lichenologist 22:103135. doi: 10.1017/S0024282990000081

Galloway DJ, James PW (1980) Nomenclatural Notes on Pseudocyphellaria in New Zealand. Lichenologist 12:291303. doi: 10.1017/S0024282980000291

Galloway DJ, James PW, Wilkins AL (1983) Further nomenclature and chemical notes on Pseudocyphellaria in New Zealand. Lichenologist 15:135145. doi: 10.1017/S0024282983000213

Galván I, Jorge A (2015) Dispersive Raman spectroscopy allows the identification and quantification of melanin types. Ecol Evol 5:14251431. doi: 10.1002/ece3.1453

Garg N, Zeng Y, Edlund A, et al (2016) Spatial molecular architecture of the microbial community of a Peltigera Lichen. mSystems 1:e00139-16. doi: 10.1128/mSystems.00139-16

Gauslaa Y (2008) Mollusc grazing may constrain the ecological niche of the old forest lichen Pseudocyphellaria crocata. Plant Biol 10:711717. doi: 10.1111/j.1438- 8677.2008.00074.x

Gauslaa Y (2005) Lichen palatability depends on investments in herbivore defence. Oecologia 143:94105. doi: 10.1007/s00442-004-1768-z

196 Bibliographie Gauslaa Y, Bidussi M, Solhaug KA, et al (2013) Seasonal and spatial variation in carbon based secondary compounds in green algal and cyanobacterial members of the epiphytic lichen genus Lobaria. Phytochemistry 94:9198. doi: 10.1016/j.phytochem.2013.04.003

Gauslaa Y, Holien H, Ohlson M, SOLHØY T (2006) Does snail grazing affect growth of the old forest lichen Lobaria pulmonaria? Lichenologist 38:587593. doi: 10.1017/S0024282906006025

Gerson U (1973) Lichen-Arthropod Associations. Lichenologist 5:434443. doi: 10.1017/S0024282973000484

Giez I, Lange OL, Proksch P (1994) Growth retarding activity of lichen substances against the polyphagous herbivorous insect Spodoptera littoralis. Biochem Syst Ecol 22:113120. doi: 10.1016/0305-1978(94)90001-9

Glen DM, Jones H, Fieldsend JK (1990) Damage to oilseed rape seedlings by the field slug Deroceras reticulatum in relation to glucosinolate concentration. Ann Appl Biol 117:197207. doi: 10.1111/j.1744-7348.1990.tb04207.x

Goga’M,’Antreich’SJ,’Bačkor’M,’et’al’(′016)’Lichen’secondary’metabolites’affect’growth’of’ Physcomitrella patens by allelopathy. Protoplasma 19. doi: 10.1007/s00709-016- 1022-7

Goga’ M,’ Pöykkö’ H,’ Adlassnig’ W,’ Bačkor’ M’ (′015)’ Response’ of’ the’ lichen-eating moth Cleorodes lichenaria larvae to varying amounts of usnic acid in the lichens. Arthropod Plant Interact 10:7177. doi: 10.1007/s11829-015-9409-5

Gorin PAJ, Barreto-Bergter E (1983) The chemistry of polysaccharides of fungi and lichens. In: Aspinall GO (ed) The Polysaccharides. Academic Press, pp 365409

Gorin PAJ, Iacomini M (1985) Structural diversity of d-galacto-d-mannan components isolated from lichens having ascomycetous mycosymbionts. Carbohydr Res 142:253 267. doi: 10.1016/0008-6215(85)85027-8

Gravot A, Dittami SM, Rousvoal S, et al (2010) Diurnal oscillations of metabolite abundances and gene analysis provide new insights into central metabolic processes of the brown alga Ectocarpus siliculosus. New Phytol 188:98110. doi: 10.1111/j.1469- 8137.2010.03400.x

Greer T, Sturm R, Li L (2011) Mass spectrometry imaging for drugs and metabolites. J Proteomics 74:26172631. doi: 10.1016/j.jprot.2011.03.032

Grube M, Cardinale M, Castro JV de, et al (2009) Species-specific structural and functional diversity of bacterial communities in lichen symbioses. ISME J 3:11051115. doi: 10.1038/ismej.2009.63

Grube M, Cernava T, Soh J, et al (2015) Exploring functional contexts of symbiotic sustain within lichen-associated bacteria by comparative omics. ISME J 9:412424. doi: 10.1038/ismej.2014.138

197

Bibliographie

Guan Z, Liesch JM (2001) Solvation of acylium fragment ions in electrospray ionization quadrupole ion trap and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J Mass Spectrom 36:264276. doi: 10.1002/jms.124 H

Hájek J, Váczi P, Barták M, et al (2009) Cryoproective role of ribitol in Xanthoparmelia somloensis. Biol Plant 53:677. doi: 10.1007/s10535-009-0122-z

Hale ME (1979) How to know the lichens, 2nd edn. WC Brown Publishers, Dubuque, Iowa

Hamilton PV, Winter MA (1984) Behavioural responses to visual stimuli by the snails Tectarius muricatus, Turbo castanea, and Helix aspersa. Anim Behav 32:5157. doi: 10.1016/S0003-3472(84)80323-1

Hauck M, Jürgens S-R, Leuschner C (2010) Norstictic acid: Correlations between its physico- chemical characteristics and ecological preferences of lichens producing this depsidone. Environ Exp Bot 68:309313. doi: 10.1016/j.envexpbot.2010.01.003

Henderson IF, Martin AP, Perry JN (1992) Improving slug baits: the effects of some phagostimulants and molluscicides on ingestion by the slug, Deroceras reticulatum (Miiller) (Pulmonata: Limacidae). Ann Appl Biol 121:423430. doi: 10.1111/j.1744- 7348.1992.tb03454.x

Herms DA, Mattson WJ (1992) The dilemma of plants: to grow or defend. Q Rev Biol 67:283 335.

Hervé M (2016) RVAideMemoire: diverse basic statistical and graphical functions.

Hesbacher S, Baur B, Baur A, Proksch P (1995a) Sequestration of lichen compounds by three species of terrestrial snails. J Chem Ecol 21:233246. doi: 10.1007/BF02036654

Hesbacher S, Fröberg L, Baur A, et al (1996) Chemical variation within and between individuals of the lichenized ascomycete Tephromela atra. Biochem Syst Ecol 24:603 609. doi: 10.1016/S0305-1978(96)00080-4

Hesbacher S, Giez I, Embacher G, et al (1995b) Sequestration of lichen compounds by lichen- feeding members of the Arctiidae (Lepidoptera). J Chem Ecol 21:20792089. doi: 10.1007/BF02033864

Hoebler C, Barry JL, David A, Delort-Laval J (1989) Rapid acid hydrolysis of plant cell wall polysaccharides and simplified quantitative determination of their neutral monosaccharides by gas-liquid chromatography. J Agric Food Chem 37:360367. doi: 10.1021/jf00086a020

Holzmann G, Leuckert C (1990) Applications of negative fast atom bombardment and MS/MS to screening of lichen compounds. Phytochemistry 29:22772283. doi: 10.1016/0031- 9422(90)83052-3

198 Bibliographie Honegger R (1991) Functional aspects of the lichen symbiosis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:553578. doi: 10.1146/annurev.pp.42.060191.003005

Hothorn T, Bretz F, Westfall P (2008) Simultaneous interference in general parametric models. Biometrical J 50:346363.

Huneck’ S,’ Lamb’ IM’ (1975)’ 1-Chloropannarin, a new depsidone from Argopsis friesiana: Notes on the structure of pannarin and on the chemistry of the lichen genus Argopsis. Phytochemistry 14:16251628. doi: 10.1016/0031-9422(75)85363-5

Huneck S, Schmidt J (1980) Lichen substances126 mass spectroscopy of natural products 10. Comparative positive and negative ion mass spectroscopy of usnic acid and related compounds. Biol Mass Spectrom 7:301308. doi: 10.1002/bms.1200070707

Huneck’S,’Yoshimura’I’(1996)’Identification’of’lichen’substances.’Springer,’Berlin ;’New’York

Hyvärinen M, Koopmann R, Hormi O, Tuomi J (2000) Phenols in reproductive and somatic structures of lichens: a case of optimal defence? Oikos 91:371375. doi: 10.1034/j.1600-0706.2000.910217.x

Hyvärinen M, Walter B, Koopmann R (2002) Secondary metabolites in Cladina stellaris in relation to reindeer grazing and thallus nutrient content. Oikos 96:273280. doi: 10.1034/j.1600-0706.2002.960209.x

Hyvärinen M, Walter B, Koopmann R (2003) Impact of fertilisation on phenol content and growth rate of Cladina stellaris: a test of the carbon-nutrient balance hypothesis. Oecologia 134:176181. doi: 10.1007/s00442-002-1105-3 I

Iacomini M, Schneider CL, Gorin PAJ (1985) Comparative studies on the polysaccharides of Cladonia alpestris (reindeer moss), Cladonia confusa, and Cladonia amaurocraea. Carbohydr Res 142:237251. doi: 10.1016/0008-6215(85)85026-6

ICH (2005) Validation of analytical procedures: text and methodology. International Conference on Harmonization, IFPMA, Geneva, Switzerland

Indahl UG, Liland KH, Næs T (2009) Canonical partial least squaresa unified PLS approach to classification and regression problems. J Chemometrics 23:495504. doi: 10.1002/cem.1243

Ingólfsdóttir K (2002) Usnic acid. Phytochemistry 61:729736. doi: 10.1016/S0031- 9422(02)00383-7 J

Jäger H-J, Weigel H-J (1978) Amino acid metabolism in lichens. Bryologist 81:107113. doi: 10.2307/3242274

199

Bibliographie

Jeuniaux C (1954) Sur la chitinase et la flore bacterienne intestinale des mollusques gasteropodes. Mem Acad R Belg 147.

Joly K, Jandt RR, Klein DR (2009) Decrease of lichens in Arctic ecosystems: the role of wildfire, caribou, reindeer, competition and climate in north-western Alaska. Polar Res 28:433442. doi: 10.1111/j.1751-8369.2009.00113.x K

Karunaratne DN, Jayalal RGU, Karunaratne V (2012) Lichen Polysaccharides. doi: 10.5772/51021

Kästner J, Knorre D von, Himanshu H, et al (2014) Salicylic acid, a plant defense hormone, is specifically secreted by a molluscan herbivore. PLoS ONE 9:e86500. doi: 10.1371/journal.pone.0086500

Kauppi M, Verseghy-Patay K (1990) Determination of the distribution of lichen substances in the thallus by fluorescence microscopy. Ann Bot Fenn 27:189202. doi: 10.2307/23725434

Keith RA, Mitchell-Olds T (2017) Testing the optimal defense hypothesis in nature: Variation for glucosinolate profiles within plants. PLoS ONE 12:e0180971. doi: 10.1371/journal.pone.0180971

Kiss T (2017) Do terrestrial gastropods use olfactory cues to locate and select food actively? Invert Neurosci 17:9. doi: 10.1007/s10158-017-0202-2

Kurokawa S, Takahashi K (1970) Gyrophoric acid as a chemical constituent in the cortex of lichen thallus. J Jap Bot 45:230231. L

Lamb IM (1974) The lichen genus Argopsis Th. Fr. J Hattori Bot Lab 38:447462.

Lange OL, Kilian E, Ziegler H (1986) Water vapor uptake and photosynthesis of lichens: performance differences in species with green and blue-green algae as phycobionts. Oecologia 71:104110. doi: 10.1007/BF00377327

Lawrey JD (2009) Chemical defense in lichen symbioses. In: White JF, Torres MS (eds) Defensive Mutualism in Microbial Symbiosis. CRC Press, USA, pp 167176

Lawrey JD (1994) Lichen allelopathy: a review. In: Allelopathy. American Chemical Society, pp 2638

Lawrey JD (1980) Correlations between lichen secondary chemistry and grazing activity by Pallifera varia. Bryologist 83:328334. doi: 10.2307/3242442

200 Bibliographie Lawrey JD (1983) Vulpinic and pinastric acids as lichen antiherbivore compounds: Contrary evidence. Bryologist 86:365. doi: 10.2307/3243250

Lawrey JD, Diederich P (2003) Lichenicolous Fungi: interactions, evolution, and biodiversity. Bryologist 106:80120.

Le Devehat F, Thüs H, Abasq M-L, et al (2014) Oxidative stress regulation in lichens and its relevance for survival in coastal habitats. In: Bourgougnon N (ed) Advances in Botanical Research. Academic Press, pp 467503

Le’ Pogam’ P’ (′016)’ Analyses’ de’ lichens’ par’ spectrométrie’ de’ masse :’ déréplication’ et’ histolocalisation. Thèse de doctorat, Université de Rennes 1

Le Pogam P, Le Lamer A-C, Legouin B, et al (2016a) In situ DART-MS as a versatile and rapid dereplication tool in lichenology: chemical fingerprinting of Ophioparma ventosa. Phytochem Anal 27:354363. doi: 10.1002/pca.2635

Le Pogam P, Legouin B, Geairon A, et al (2016b) Spatial mapping of lichen specialized metabolites using LDI-MSI: chemical ecology issues for Ophioparma ventosa. Sci Rep 6:37807. doi: 10.1038/srep37807

Le Pogam P, Legouin B, Le Lamer A-C, et al (2015a) Analysis of the cyanolichen Lichina pygmaea metabolites using in situ DART-MS: from detection to thermochemistry of mycosporine serinol. J Mass Spectrom 50:454462. doi: 10.1002/jms.3549

Le Pogam P, Schinkovitz A, Legouin B, et al (2015b) Matrix-free UV-Laser desorption ionization mass spectrometry as a versatile approach for accelerating dereplication studies on lichens. Anal Chem 87:1042110428. doi: 10.1021/acs.analchem.5b02531

Lefèvre T, Renaud F, Selosse M-A, Thomas F (2010) Evolution des interactions entre espèces. In: Biologie évolutive, De Boeck. Paris, pp 533616

Legaz ME, Avalos A, Torres M de, et al (1986) Annual variations in arginine metabolism and phenolic content of Evernia prunastri. Environ Exp Bot 26:385396. doi: 10.1016/0098-8472(86)90027-4

Legaz ME, Fontaniella B, Millanes AM, Vicente C (2004) Secreted arginases from phylogenetically far-related lichen species act as cross-recognition factors for two different algal cells. Eur J Cell Biol 83:435446. doi: 10.1078/0171-9335-00384

Lewis DH, Smith DC (1967) Sugar alcohols (polyols) in Fungi and green plants. New Phytol 66:185204. doi: 10.1111/j.1469-8137.1967.tb05998.x

Liao C, Piercey-Normore MD, Sorensen JL, Gough K (2010) In situ imaging of usnic acid in selected Cladonia spp. by vibrational spectroscopy. Analyst 135:32423248. doi: 10.1039/C0AN00533A

Linhart YB, Thompson JD (1995) Terpene-based selective herbivory by Helix aspersa (Mollusca) on Thymus vulgaris (Labiatae). Oecologia 102:126132. doi: 10.1007/BF00333320

201

Bibliographie

Livingstone DR, Kirchin MA, Wiseman A (1989) Cytochrome P-450 and oxidative metabolism in molluscs. Xenobiotica 19:10411062. doi: 10.3109/00498258909043161

Loewus F., Tanner W (eds) (1982) Plant Carbohydrates I, 1st edn. Springer

Lohézic-Le Dévéhat F, Legouin B, Couteau C, et al (2013) Lichenic extracts and metabolites as UV filters. J Photochem Photobiol B 120:1728. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2013.01.009

Lokajovε’ V,’ Bačkorovε’ M,’ Bačkor’ M’ (′014)’ Allelopathic’ effects’ of’ lichen’ secondary’ metabolites and their naturally occurring mixtures on cultures of aposymbiotically grown lichen photobiont Trebouxia erici (Chlorophyta). S Afr J Bot 93:8691. doi: 10.1016/j.sajb.2014.03.015

Longton RE (1988) Biology of Polar Bryophytes and Lichens. CUP Archive

Luchtel DL, Martin AW, Deyrup-Olsen I, Boer H (1997) Gastropoda: pulmonata. In: Harrison F, Kohn A (eds) Microscopic anatomy of invertebrates. John Wiley & Sons, pp 459 718

Lücking R, Bernecker-Lücking A (2000) Lichen feeders and lichenicolous fungi: do they affect dispersal and diversity in tropical foliicolous lichen communities? Ecotropica 6:2341.

Lugan R, Niogret M-F, Kervazo L, et al (2009) Metabolome and water status phenotyping of Arabidopsis under abiotic stress cues reveals new insight into ESK1 function. Plant Cell Environ 32:95108. doi: 10.1111/j.1365-3040.2008.01898.x M

Maass WSG (1970) Lichen substances. IV. Incorporation of pulvinic-14C acids into calycin by the lichen Pseudocyphellaria crocata. Can J Biochem 48:12411248. doi: 10.1139/o70- 193

Maass WSG (1975) Lichen substances. V. Methylated derivatives of orsellinic acid, lecanoric acid, and gyrophoric acid from Pseudocyphellaria crocata. Can J Bot 53:10311039. doi: 10.1139/b75-121

Maass WSG, Neish AC (1967) Lichen substances II: Biosynthesis of calycin and pulvinic dilactone by the lichen, Pseudocyphellaria crocata. Can J Bot 45:5972. doi: 10.1139/b67-004

Madec L, Bellido A (2007) Spatial variation of shell morphometrics in the subantarctic land snail Notodiscus hookeri from Crozet and Kerguelen Islands. Polar Biol. doi: 10.1007/s00300-007-0318-7

Mair J, Port GR (2002) The influence of mucus production by the slug, Deroceras reticulatum , on predation by Pterostichus madidus and Nebria brevicollis (Coleoptera: Carabidae). Biocontrol Sci Technol 12:325335. doi: 10.1080/09583150220128112

202 Bibliographie Manners DJ, Sturgeon RJ (1982) Reserve Carbohydrates of Algae, Fungi, and Lichens. In: Loewus PDFA, Tanner PDW (eds) Plant Carbohydrates I. Springer Berlin Heidelberg, pp 472514

Massé L (1982) Pseudocyphellaria crocata Vain,’lichen’nouveau’pour’lîle’de’la’Possession’ (archipel Crozet, Terres Australes et Antarctiques Françaises) Ecologie sommaire et intérêt biogéographique. Comité National Français des Recherches Antarctiques 51:1723.

Mattson WJ (1980) Herbivory in Relation to Plant Nitrogen Content. Annu Rev Ecol Syst 11:119161. doi: 10.1146/annurev.es.11.110180.001003

McCarthy PM, Healy JA (1978) Dispersal of lichen propagules by slugs. Lichenologist 10:131 132. doi: 10.1017/S002428297800016X

McCune B, Altermann S (2009) Letharia gracilis (Parmeliaceae), a New Species from California and Oregon. Bryologist 112:375378. doi: 10.2307/20485818

McKey D (1974) Adaptive patterns in alkaloid physiology. Am Nat 108:305320. doi: 10.1086/282909

Meldau S, Erb M, Baldwin IT (2012) Defence on demand: mechanisms behind optimal defence patterns. Ann Bot 110:15031514. doi: 10.1093/aob/mcs212

Molnár K, Farkas E (2010) Current results on biological activities of lichen secondary metabolites: a review. Z Naturforsch C 65:157173.

Moncada B, Lücking R, Betancourt-Macuase L (2013) Phylogeny of the Lobariaceae (lichenized Ascomycota: Peltigerales), with a reappraisal of the genus Lobariella. Lichenologist 45:203263. doi: 10.1017/S0024282912000825

Moncada B, Reidy B, Lücking R (2014) A phylogenetic revision of Hawaiian Pseudocyphellaria sensu lato (lichenized Ascomycota: Lobariaceae) reveals eight new species and a high degree of inferred endemism. Bryologist 117:119160. doi: 10.1639/0007-2745-117.2.119

Montiel P (2000) Soluble carbohydrates (trehalose in particular) and cryoprotection in polar biota. Cryo Letters 21:8390. N

Neta P, Farahani M, Simón-Manso Y, et al (2014) Unexpected peaks in tandem mass spectra due to reaction of product ions with residual water in mass spectrometer collision cells. Rapid Commun Mass Spectrom 28:26452660. doi: 10.1002/rcm.7055

Newar J, Ghatak A (2015) Studies on the adhesive property of snail adhesive mucus. Langmuir 31:1215512160. doi: 10.1021/acs.langmuir.5b03498

203

Bibliographie

Ng TPT, Saltin SH, Davies MS, et al (2013) Snails and their trails: the multiple functions of trail-following in gastropods. Biol Rev 88:683700. doi: 10.1111/brv.12023

Nguyen KH, Chollet-Krugler M, Gouault N, Tomasi S (2013) UV-protectant metabolites from lichens and their symbiotic partners. Nat Prod Rep 30:14901508. doi: 10.1039/C3NP70064J

Nguyen TTT, Chollet-Krugler M, Lohézic-Le Dévéhat F, et al (2015) Mycosporine-Like compounds in chlorolichens: isolation from Dermatocarpon luridum and Dermatocarpon miniatum, and their photoprotective properties. Planta Med Lett 2:e1e5. doi: 10.1055/s-0034-1396321

Nimis PL, Skert N (2006) Lichen chemistry and selective grazing by the coleopteran Lasioderma serricorne. Environ Exp Bot 55:175182. doi: 10.1016/j.envexpbot.2004.10.011

Nybakken L, Asplund J, Solhaug KA, Gauslaa Y (2007) Forest successional stage affects the cortical secondary chemistry of three old forest lichens. J Chem Ecol 33:16071618. doi: 10.1007/s10886-007-9339-5

Nybakken L, Gauslaa Y (2007) Difference in secondary compounds and chlorophylls between fibrils and main stems in the lichen Usnea longissima suggests different functional roles. Lichenologist 39:491494. doi: 10.1017/S0024282907007190

Nybakken L, Helmersen A-M, Gauslaa Y, Selås V (2010) Lichen compounds restrain lichen feeding by bank voles (Myodes glareolus). J Chem Ecol 36:298304. doi: 10.1007/s10886-010-9761-y

Nybakken L, Johansson O, Palmqvist K (2009) Defensive compound concentration in boreal lichens in response to simulated nitrogen deposition. Glob Chang Biol 15:22472260. doi: 10.1111/j.1365-2486.2009.01853.x O

Olafsdottir ES, Ingólfsdottir K (2001) Polysaccharides from lichens: structural characteristics and biological activity. Planta Med 67:199208. doi: 10.1055/s-2001-12012

Orrock JL (2013) Exposure of unwounded plants to chemical cues associated with herbivores leads to exposure-dependent changes in subsequent herbivore attack. PLoS ONE 8:e79900. doi: 10.1371/journal.pone.0079900 P

Palmer AR (1992) Calcification in marine molluscs: how costly is it? PNAS 89:13791382.

Palmqvist K, Dahlman L, Valladares F, et al (2002) CO2 exchange and thallus nitrogen across 75 contrasting lichen associations from different climate zones. Oecologia 133:295 306. doi: 10.1007/s00442-002-1019-0

204 Bibliographie Pankratov’ TA,’ Kachalkin’ AV,’ Korchikov’ ES,’ Dobrovolskaya’ TG’ (′017)’ Microbial’ communities of lichens. Microbiology 86:293309. doi: 10.1134/S0026261717030134

Parrot D, Jan S, Baert N, et al (2013) Comparative metabolite profiling and chemical study of Ramalina siliquosa complex using LCESI-MS/MS approach. Phytochemistry 89:114 124. doi: 10.1016/j.phytochem.2013.02.002

Peake JF, James PW (1967) Field and Study Notes. Lichenologist 3:425428. doi: 10.1017/S0024282967000453

Pöykkö’H,’Bačkor’M,’Bencúrovε’E,’et’al’(′010)’Host’use’of’a’specialist’lichen-feeder: dealing with lichen secondary metabolites. Oecologia 164:423430. doi: 10.1007/s00442-010- 1682-5

Pöykkö’H,’Hyvärinen’M,’Bačkor’M’(′005) Removal of lichen secondary metabolites affects food choice and survival of lichenivorous moth larvae. Ecology 86:26232632. doi: 10.1890/04-1632

Prateeksha, Paliya BS, Bajpai R, et al (2016) The genus Usnea: a potent phytomedicine with multifarious ethnobotany, phytochemistry and pharmacology. RSC Adv 6:21672 21696. doi: 10.1039/C5RA24205C

Pugh PJA, Smith RIL (2011) Notodiscus (Charopidae) on South Georgia: some implications of shell size, shell shape, and site isolation in a singular sub-Antarctic land snail. Antarct Sci 23:442448. doi: 10.1017/S0954102011000289

Putz A, König GM, Wägele H (2010) Defensive strategies of Cladobranchia (Gastropoda, Opisthobranchia). Nat Prod Rep 27:1386. doi: 10.1039/b923849m R

R Core Team (2016) R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria

R Core Team (2017) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria

Radwan MA, Essawy AE, Abdelmeguied NE, et al (2008) Biochemical and histochemical studies on the digestive gland of Eobania vermiculata snails treated with carbamate pesticides. Pestic Biochem Physiol 90:154167. doi: 10.1016/j.pestbp.2007.11.011

Rai A, Bergman B (2002) Cyanolichens. Biol Environ Proc R Ir Acad 102:1922. doi: http://www.jstor.org/stable/20500135

Renner B (1982) Études microspectrophotométriques sur les céphalodies de Pseudocyphellaria faveolata. Can J Bot 60:630633. doi: 10.1139/b82-083

Rezanka T, Dembitsky VM (1999) Fatty acids of lichen species from Tian Shan Mountains. Folia Microbiol 44:643646. doi: 10.1007/BF02825654

205

Bibliographie

Rhee KC (2001) Determination of Total Nitrogen. Curr Protoc Food Analyt Chem B1.2:B1.2.1- B1.2.9. doi: 10.1002/0471142913.fab0102s00

Richardson D, Hill D, Smith D (1968) Lichen physiology. New Phytol 67:469486. doi: 10.1111/j.1469-8137.1968.tb05476.x

Richardson D, Young C (1977) Lichens and vertebrates. In: Seaward MRD (ed) Lichen Ecology. London Academic Press, pp 121144

Robinson CH (2001) Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol 151:341353. doi: 10.1046/j.1469-8137.2001.00177.x

Roullier C, Chollet-Krugler M, Pferschy-Wenzig E-M, et al (2011) Characterization and identification of mycosporines-like compounds in cyanolichens. Isolation of mycosporine hydroxyglutamicol from Nephroma laevigatum Ach. Phytochemistry 72:13481357. doi: 10.1016/j.phytochem.2011.04.002

Rundel PW (1978) The ecological role of secondary lichen substances. Biochem Syst Ecol 6:157170. doi: 10.1016/0305-1978(78)90002-9 S

Salinas J, Mollinedo P, Vila J (2012) Calycin and physcion from the lichen Candelaria concolor. Rev Boliv Quim 29:9496.

Sancho LG, Allan Green TG, Pintado A (2007) Slowest to fastest: Extreme range in lichen growth rates supports their use as an indicator of climate change in Antarctica. Flora Morphol 202:667673. doi: 10.1016/j.flora.2007.05.005

Sanders’WB’(′001)’Lichens:’the’interface’between’mycology’and’plant’morphology :’whereas’ most other fungi live as an absorptive mycelium inside their food substrate, the lichen fungi construct a plant-like body within which photosynthetic algal symbionts are cultivated. Bioscience 51:10251035. doi: 10.1641/0006- 3568(2001)051[1025:LTIBMA]2.0.CO;2

Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, et al (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS 109:62416246. doi: 10.1073/pnas.1117018109

Selosse M-A (2000) La symbiose: structures et fonctions, rôle écologique et évolutif. Vuibert, Paris

Senseman DM (1977) Starch: A potent feeding stimulant for the terrestrial slug Ariolimax californicus. J Chem Ecol 3:707715. doi: 10.1007/BF00988069

Shukla V, Kumari R, Patel DK, Upreti DK (2015) Characterization of the diversity of mycosporine-like amino acids in lichens from high altitude region of Himalaya. Amino Acids 48:129136. doi: 10.1007/s00726-015-2069-z

206 Bibliographie Silva MDC, Sá RA, Napoleão TH, et al (2009) Purified Cladonia verticillaris lichen lectin: Insecticidal activity on Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae). Int Biodeterior Biodegradation 63:334340. doi: 10.1016/j.ibiod.2008.11.002

Slansky F (1979) Effect of the lichen chemicals atranorin and vulpinic acid upon feeding and growth of larvae of the yellow-striped armyworm, Spodoptera ornithogalli. Environ Entomol 8:865868. doi: 10.1093/ee/8.5.865

Smith AM (2006) The biochemistry and mechanics of Gastropod adhesive gels. In: Smith DAM, Callow DJA (eds) Biological Adhesives. Springer Berlin Heidelberg, pp 167 182

Smith VR, Steenkamp M (1992) Soil macrofauna and nitrogen on a sub-Antarctic island. Oecologia 92:201206. doi: 10.1007/BF00317365

Solem A (1968) The subantarctic land snail, Notodiscus hookeri (Reeve, 1854) (Pulmonata, Endodontidae). Proc malac Soc Lond 38:251265.

Solhaug KA, Gauslaa Y (2012) Secondary lichen compounds as protection against excess solar radiation and herbivores. In: Lüttge U, Beyschlag W, Büdel B, Francis D (eds) Progress in Botany, 73rd edn. Springer Berlin Heidelberg, pp 283304

Solhaug KA, Gauslaa Y (2001) Acetone rinsing-a method for testing ecological and physiological roles of secondary compounds in living lichens. Symbiosis 30:301315.

Solhaug KA, Lind M, Nybakken L, Gauslaa Y (2009) Possible functional roles of cortical depsides and medullary depsidones in the foliose lichen Hypogymnia physodes. Flora 204:4048. doi: 10.1016/j.flora.2007.12.002

Speiser B (2001) Food and feeding behaviour. In: Baker G (ed) The biology of terrestrial Molluscs, Baker GM. CAB International, UK, pp 259288

Spribille T, Tuovinen V, Resl P, et al (2016) Basidiomycete yeasts in the cortex of ascomycete macrolichens. Science aaf8287. doi: 10.1126/science.aaf8287

Stahl E (1904) Die Schutzmittel der Flechten gegen Tierfrass. In: Festschrift zum sibenzigsten Geburtstage von Ernst Haeckel. G. Fischer, Jena, pp 357375

Stephenson NL, Rundel PW (1979) Quantitative variation and the ecological role of vulpinic acid and atranorin in thallus of Letharia vulpina. Biochem Syst Ecol 7:263267. doi: 10.1016/0305-1978(79)90003-6

Stocker-Wörgötter E (2008) Metabolic diversity of lichen-forming ascomycetous fungi: culturing, polyketide and shikimatemetabolite production, and PKS genes. Nat Prod Rep 25:188200. doi: 10.1039/B606983P

Storeheier PV, Mathiesen SD, Tyler NJC, Olsen MA (2002) Nutritive value of terricolous lichens for reindeer in winter. Lichenologist 34:247257. doi: 10.1006/lich.2002.0394

207

Bibliographie

Sultan J (2008) Collision induced dissociation of deprotonated guanine: Fragmentation of pyrimidine ring and water adduct formation. Int J Mass Spectrom 273:5868. doi: doi.org/10.1016/j.ijms.2008.03.002

Summerfield TC, Eaton-Rye JJ (2006) Pseudocyphellaria crocata, P. neglecta and P. perpetua from the Northern and Southern Hemispheres are a phylogenetic species and share cyanobionts. New Phytol 170:597607. doi: 10.1111/j.1469-8137.2006.01701.x

Sundset MA, Kohn A, Mathiesen SD, Præsteng KE (2008) Eubacterium rangiferina, a novel usnic acid-resistant bacterium from the reindeer rumen. Z Naturforsch C 95:741749. doi: 10.1007/s00114-008-0381-0 T

Takahashi K, Kon T, Yokota I, Shibata S (1981) Chemotaxonomic studies on the polysaccharides of lichens. Polysaccharides of stereocaulaceous lichens. Carbohydr Res 89:166173. doi: 10.1016/S0008-6215(00)85241-6

Tearle PV (1987) Cryptogamic carbohydrate release and microbial response during spring freeze-thaw cycles in antarctic fellfield fines. Soil Biol Biochem 19:381390. doi: 10.1016/0038-0717(87)90027-7

Thygesen LG, Løkke MM, Micklander E, Engelsen SB (2003) Vibrational microspectroscopy of food. Raman vs. FT-IR. Trends Food Sci Technol 14:5057. doi: 10.1016/S0924- 2244(02)00243-1

Tiévant P (2001) Guide des lichens. Delachaux et Niestlé, Paris

Truong C, Bungartz F, Clerc P (2011) The lichen genus Usnea (Parmeliaceae) in the tropical Andes and the Galapagos: species with a red-orange cortical or subcortical pigmentation. Bryologist 114:477503. V

van den Berg RA, Hoefsloot HC, Westerhuis JA, et al (2006) Centering, scaling, and transformations: improving the biological information content of metabolomics data. BMC Genomics 7:142. doi: 10.1186/1471-2164-7-142

van den Wollenberg AL (1977) Redundancy analysis an alternative for canonical correlation analysis. Psychometrika 42:207219. doi: 10.1007/BF02294050

van der Horst DJ, Zandee DI (1973) Invariability of the composition of fatty acids and other lipids in the pulmonate land snail Cepaea nemoralis (L.) during an annual cycle. J Comp Physiol A 85:317326. doi: 10.1007/BF00696388

Van Haluwyn C, Lerond M (1993) Guide des lichens. Lechevalier, Paris

208 Bibliographie Vatne S, Solhøy T, Asplund J, Gauslaa Y (2010) Grazing damage in the old forest lichen Lobaria pulmonaria increases with gastropod abundance in deciduous forests. Lichenologist 42:615619. doi: 10.1017/S0024282910000356

Venables W, Ripley B (2002) Modern applied statistics with S, Fourth. Springer

Vu TH (2014) Etude des acides gras du genre Stereocaulon. Etude phytochimique de lichen S. evolutum Graewe. Thèse de doctorat, Université de Rennes 1

Vu TH, Catheline D, Delmail D, et al (2016) Gas chromatographic analysis to compare the fatty acid composition of fifteen lichen species, with a focus on Stereocaulon species. Lichenologist 48:323337. doi: 10.1017/S0024282916000141 W

Wahlberg N (2001) The phylogenetics and biochemistry of host-plant specialization in melitaeine butterflies (Lepidoptera: Nympalidae). Evolution 55:522537. doi: 10.1554/0014-3820(2001)055[0522:TPABOH]2.0.CO;2

Walker FJ (1985) The lichen genus Usnea sugenus Neuropogon. Bull Br Mus Nat Hist Bot 13:1130.

Wheat CW, Vogel H, Wittstock U, et al (2007) The genetic basis of a plantinsect coevolutionary key innovation. PNAS 104:2042720431. doi: 10.1073/pnas.0706229104 X

Xie W, Zhang H, Zeng J, et al (2016) Tissues-based chemical profiling and semi-quantitative analysis of bioactive components in the root of Salvia miltiorrhiza Bunge by using laser microdissection system combined with UPLC-q-TOF-MS. Chem Cent J 10:42. doi: 10.1186/s13065-016-0187-7 Y

Yom-Tov Y, Galun M (1971) Note on feeding habits of the desert snails Sphincterochila boissieri Charpentier and Trochoidea (Xerocrassa) seetzeni Charpentier. Veliger 14:8688.

Yoshimura I, Kinoshita Y, Yamamoto Y, et al (1994) Analysis of secondary metabolites from Lichen by high performance liquid chromatography with a photodiode array detector. Phytochem Anal 5:197205. doi: 10.1002/pca.2800050405

Yosioka I, Hino K, Fujio M, Kitagawa I (1973) The structure of caloploicin, a new lichen trichloro-depsidone. Chem Pharm Bull 21:15471553. doi: 10.1248/cpb.21.1547

209

Bibliographie

Z

Zenkevich IG, Eshchenko AY, Makarova SV, et al (2007) Identification of the products of oxidation of quercetin by air oxygenat ambient temperature. Molecules 12:654672. doi: 10.3390/12030654

Zukal H (1895) Morphologische und biologische untersuchungen über die flechten II. Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Math Naturwiss Classe 104:13031395.

210

Annexes

La roche percée et la pointe des Moines

211

Annexes

Liste des annexes

A. Données’ expérimentales’ pour’ lanalyses’ des’ triglycérides’ et’ des’ phospholipides’ du’ lichen’ Stereocaulon vesuvianum ...... 214

B. Supporting’informations’de’larticle publié dans Molecules : Which specialized metabolites does the native subantarctic gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata? ...... 217

C. Supporting’informations’de’larticle’δ’soumettre à Phytochemistry: Overcoming deterrent metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study ...... 227

D. Purifications de la ténuiorine et de la calycine ...... 231

E. Supporting’informations’de’larticle’soumis’δ’Journal of Chemical Ecology: Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana shape gastropod grazing patterns ...... 233

F. Profil chimique de quatre lichens subantarctiques ...... 245

213 Annexes

A. Donnes exprimentales pour l’analyses des triglycrides et des phospholipides du lichen Stereocaulon vesuvianum

❖ Extraction

Le lichen broyé S. vesuvianum (1g) est extrait avec 30 mL du mélange CHCl3/MeOH (2/1) à 80°C pendant 1 heure avec une agitation constante de 700 rpm.’Lextraction’est’répétée’″’fois.’ Lextrait’final’est’évaporé’et’stocké’δ’-20°C sous’atmosphμre’inerte’(N′)’en’attendant’dêtre’ purifié.

❖ Séparation des triglycérides (TG) et des phospholipides (PL) Lextrait’ est’repris’dans’du’MeOH’et’déposé’en’bande’sur’des’plaques’CCM’préparatives’ (préparées au laboratoire, plaque de verre recouvertes de gel de silice 60 PF254 (5-40 µm, Merck)).’Afin’dobtenir’une’bonne’quantité’de’TG’et’de’PL,’lextrait’est’divisé’en’deux’pour’ être’ déposé’ sur’ deux’ plaques’ différentes.’ Le’ solvant’ délution’ est’ constitué’ du’ mélange’ hexane/éther éthylique (90/10). Afin’davoir’une’meilleure’séparation’des’bandes,’les’plaques’ sont mises à migrer deux fois. Une fois sèches, les plaques sont révélées à la primuline et le contour de migration des taches correspondant aux TG et aux PL est marqué (Figure A1). Les bandes sont grattées pour récupérer séparément les TG et les PL.

Figure A1 : CCM préparative permettant la séparation des triglycérides et des phospholipides.

214 Annexes

❖ Séparation’des’esters’méthyliques’dacides’gras

Pour’la’séparation’des’esters’méthyliques’dacides’gras’δ’partir’soit’des’TG’soit’des’PL,’chaque’ extrait’est’hydrolysé’par’une’solution’dhydroxyde’de’sodium’(′’mL,’0,5’M)’dans’du’MeOH’ 0 pendant 30 minutes à 70 C, puis méthylé par BF3 14% dans du MeOH (1 mL) pendant 15 minutes’δ’la’même’température.’Les’esters’méthyliques’dacides’gras’résultants’(EMAG)’sont’ obtenus selon le schéma réactionnel ci-dessous (Figure A2).

ECHANTILLON TG ou PL

1)’Evaporation’δ’sec’sous’flux’dazote 2) 2 mL NaOH 0.5 M dans MeOH, 30 min, 700C 0 3) 1 mL BF3 14 % dans MeOH, 15 min, 70 C

Esters’méthyliques’dacides’gras’bruts

4 mL n-pentane 2 mL NaCl 0,9 % Agitation

Phase supérieure (1) Phase inférieure 2 mL n-pentane Agitation

Phase supérieure (2)

2 mL NaCl 0,9 % Agitation

Phase supérieure

1)’Evaporation’δ’sec’sous’flux’dazote ′)’Séchage’(′00’µL’déthanol’absolu) 3) Reprise n-hexane (150 µL)

Esters’méthyliques’dacides’gras’(EMAG)

Figure A2 : Préparation des esters méthyliques’dacides’gras

215 Annexes

❖ Identification par CPG-FID et CPG-MS

Les EMAG sont repris dans du n-hexane (150 µL) pour être injectés en CPG. Les analyses sont réalisées sur un chromatographe à phase gazeuse 6890NGC-FID (situé au laboratoire de Biochimie’de’lAgrocampus’Ouest,’Rennes,’France),’équipé’dune’colonne’capillaire’(″0m’x’ 0.25 mm de diamètre interne ; BPX 70 ; SGE, Villeneuve-St-Georges, France) remplie par une phase stationnaire polaire de 70% cyanopropylpolysilphenylène-siloxane’(0.′5’dépaisseur),’ pendant’ 50’ min.’ Lhélium’ est’ utilisé’ comme’ gaz’ vecteur’ (vitesse’ moyenne’ ′4’ cm/s).’ La’ température’de’la’colonne’est’dabord’fixée’δ’150°C’pour’atteindre’′′0°C’au’bout’de’10’min’δ’ raison de 2°C par minute. La température du détecteur à ionisation de flamme est de 250°C. Lidentification’des’pics’des’EMAG’se’base’sur’le’temps’de’rétention’et’une’comparaison’avec’ la base de données du laboratoire ou la base de données NIST.

216 Annexes

B. Supporting informations de l’article publi dans “Molecules” : Which specialized metabolites does the native subantarctic gastropod Notodiscus hookeri extract from the consumption of the lichens Usnea taylorii and Pseudocyphellaria crocata?

Figure’S1:’Study’sites’in’Possession’Island’that’belongs’to’Crozet’Archipelago’(45°’″0’ 46°’ ″0’ S;’ 50°’ 00’ 5′°’ ″0’ E)’ in’ the’ sub-Antarctic region. Snails were sampled Baie américaine (BUS) and Pointe Basse (PBAS) for the mineral phenotype and organic phenotype’ were’ collected’ at’ Crête’ de’ lAlouette’ (ALOU)’ and’ Mascarin’ (MAS)’ .’ Pseudocyphellaria crocata (upper photograph) occurred at Pointe Basse (PBAS) and Usnea taylorii (lower picture) was present at Mascarin (MAS). Photographs courtesy of Damien Ertz (Botanic Garden, Meise, Belgium). Scale bars on lichen photographs correspond to 1 cm.

217 Annexes

218 Annexes

Figure S2: The digestive tract of Notodiscus hookeri. Gut compartments extracted after the feeding experiment were the crop, the digestive gland, the intestine and the rectum content (i.e. feces).

219 Annexes

Figure S3: NI ESI mass spectrum of usnic acid and proposed fragmentation pathway. The mass spectrum of usnic acid reveals a fragment ion at m/z 328 that stems from the loss of a methyl radical, the driving force of which is the aromatization of cycle C to yield an energetically favoured dibenzofuran core. The formation of m/z 259 might then be explained by a retro Diels-Alder process as illustrated in Figure S3, consistently with previous reports (Huneck and Schmidt 1980; Le Pogam et al. 2016a).

Figure S4: NI-ESI mass spectrum of fumarprotocetraric acid. The loss of the fumaric acid moiety to afford m/z 355 from this depsidone side chain is consistent with previous reports (Holzmann and Leuckert 1990)

220 Annexes

Figure S5: NI-ESI mass spectrum of depsidones identified in P. crocata

All depsidones revealed a prevalent deprotonated molecule accompanied by a fragment displaying a loss of 44 mass units. This neutral loss of CO2 on the central core of the depsidone scaffold is presumed to afford a dibenzofuran moiety (Parrot et al. 2013). The structural assignments of these depsidones are further supported by the order of elution of these metabolites as displayed in the main text (Yoshimura et al. 1994; Parrot et al. 2013).

221 Annexes

Figure S6: NI-ESI mass spectrum of compound 3 (Pc3) identified in P. crocata (retention time 16.08-16.26 min).

Figure S7: NI-ESI mass spectra of tenuiorin and 4-O-methylgyrophoric acid in NI-ESI-MS and proposed dissociation pathways. Note that the sites bearing the charges are arbitrary.

222 Annexes

A first mechanism involves an electron delocalization from the phenoxyl anion followed by consecutive aromatic unit losses. A second pathway is initiated by McLafferty type rearrangements with subsequent acyl cleavages. As to tenuiorin, such fragmentation patterns account for m/z 331, 313 and 149. The interpretation of m/z 167 turned out to be difficult as it cannot derive from the [M-H]- ion by any established fragmentation mechanism. However, the fact that m/z 167 is 18 Da greater than m/z 149 seems to hint that the former might have one more H2O molecule than the latter. A likely assumption regarding this signal is that it might stem from gas phase ion-molecule reactions resulting in water adducts (Attygalle et al. 2006). The highly reactive ketene moiety has shown a tendency to covalently attach water molecules to yield the corresponding carboxylic acid (Sultan 2008; Neta et al. 2014; Alechaga et al. 2016). Such a gas phase reactivity was suggested for the lichen depside perlatolic acid (Guan and Liesch 2001). Likewise, it can be proposed that m/z 331 might indeed correspond to an H2O adduct of m/z 313 rather than being the genuine fragment ion displayed in Figure S7. This alternative fragmentation hypothesis is further strengthened by the arising of m/z 331 in the spectrum of 4-O-methylgyrophoric acid which can be explained by no logical neutral loss whereas m/z 313 can.

Figure S8: NI-ESI mass spectrum of gyrophoric acid and proposed dissociation scheme. The site bearing the charge is arbitrary.

223 Annexes

Figure S9: NI-ESI mass spectrum of pulvinic acid derivatives identified in P. crocata Pulvinic acid and pulvinamide revealed a common fragment at m/z 263, respectively through the loss of their carboxylic acid and amide groups. In the mass spectrum of calycin, m/z 633 stands for a dimerized sodium adduct.

224 Annexes

Figure S10: Evolution of the ratio of 4-O-metylgyrophoric acid (9) and tenuiorin (12) in P. crocata (black curve) and along the digestive tract of N. hookeri: crops (C, purple curves), intestines (I, blue curves) and feces (F, red curves). These profiles are compared according to their phenotype (MP = mineral, PBAS sample; OP = organic, MAS sample).

Figure S11: PDA-chromatogram at 419 nm of the acetone extract of P. crocata highlighting its pulvinic acid derivatives content.

225 Annexes

Table S1: Measurements made on the snails Notodiscus hookeri, fed on Usnea taylorii or Pseudocyphellaria crocata. Initial shell sizes in mm (A) and fresh weights in mg (B) were represented by their mean values (± Standard deviation). The two-way ANOVA values are given for the factor Site and the factor Box. With both variables, the interaction being not significant, the result was not shown. The lowercase superscript letters a and b indicate significant differences between MAS and the three other sites.

A-Shell sizes BUSa PBASa ALOUa MASb ANOVA Box U. taylorii 4.38 ± 0.41 4.16 ± 0.68 4.24 ± 0.39 5.56 ± 0.57 Factor = Box;

Box P. crocata 4.31 ± 0.48 4.14 ± 0.68 4.29 ± 0.34 5.57 ± 0.52 F1,152 =0.01, p=0.92

ANOVA Factor = Site; F3,152 = 64.2, p<0.001

B-Fresh weights BUSa PBASa ALOUa MASb ANOVA Box U. taylorii 25.52 ± 6.43 19.83 ± 9.24 17.80 ± 6.23 41.62 ± 11.26 Factor = Box;

Box P. crocata 25.21 ± 7.34 19.28 ± 8.78 18.97 ± 5.91 41.36 ± 10.96 F1,152<0.01, p=0.99

ANOVA Factor = Site; F3,152 = 60.6, p<0.001

226 Annexes

References : Alechaga É, Moyano E, Galceran MT (2016) Ion-molecule adduct formation in tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 408:1269–1277. doi: 10.1007/s00216-015-9237-6

Attygalle AB, Kharbatia N, Bialecki J, et al (2006) An unexpected ion-molecule adduct in negative-ion collision-induced decomposition ion-trap mass spectra of halogenated benzoic acids. Rapid Commun Mass Spectrom 20:2265–2270. doi: 10.1002/rcm.2582

Guan Z, Liesch JM (2001) Solvation of acylium fragment ions in electrospray ionization quadrupole ion trap and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J Mass Spectrom 36:264–276. doi: 10.1002/jms.124

Holzmann G, Leuckert C (1990) Applications of negative fast atom bombardment and MS/MS to screening of lichen compounds. Phytochemistry 29:2277–2283. doi: 10.1016/0031-9422(90)83052-3

Huneck S, Schmidt J (1980) Lichen substances—126 mass spectroscopy of natural products—10. Comparative positive and negative ion mass spectroscopy of usnic acid and related compounds. Biol Mass Spectrom 7:301–308. doi: 10.1002/bms.1200070707

Le Pogam P, Le Lamer A-C, Legouin B, et al (2016a) In situ DART-MS as a versatile and rapid dereplication tool in lichenology: chemical fingerprinting of Ophioparma ventosa. Phytochem Anal 27:354–363. doi: 10.1002/pca.2635

Neta P, Farahani M, Simón-Manso Y, et al (2014) Unexpected peaks in tandem mass spectra due to reaction of product ions with residual water in mass spectrometer collision cells. Rapid Commun Mass Spectrom 28:2645–2660. doi: 10.1002/rcm.7055

Parrot D, Jan S, Baert N, et al (2013) Comparative metabolite profiling and chemical study of Ramalina siliquosa complex using LC–ESI-MS/MS approach. Phytochemistry 89:114–124. doi: 10.1016/j.phytochem.2013.02.002

Sultan J (2008) Collision induced dissociation of deprotonated guanine: Fragmentation of pyrimidine ring and water adduct formation - ScienceDirect. Int J Mass Spectrom 273:58–68. doi: doi.org/10.1016/j.ijms.2008.03.002

Yoshimura I, Kinoshita Y, Yamamoto Y, et al (1994) Analysis of secondary metabolites from Lichen by high performance liquid chromatography with a photodiode array detector. Phytochem Anal 5:197–205. doi: 10.1002/pca.2800050405

227 Annexes

C. Supporting informations de l’article à soumettre à “Phytochemistry”: Overcoming deterrent metabolites by gaining essential nutrients: a lichen/snail case study

Fig. S1 : Different levels of snail feeding on starch gels: (a) not consumed, (b) superficially consumed and (c) totally consumed. For (b) and (c), a corrective factor (1 and 2 respectively) was applied to the feeding score.

228 Annexes

Table S1 : Measurements made on the snails N. hookeri used in feeding choice arena experiment. Shell size in mm were represented by their mean values (± Standard deviation). The two-way ANOVA values are given for the factor Site and the factor subgroup. With both variables, the interaction being not significant, the result was not shown.

Shell size BRA MAS ANOVA Subgroup A 5.10 ± 0.40 4.84 ± 0.39 Factor =subgroup;

Subgroup B 5.13 ± 0.40 4.76 ± 0.42 F3,332=0.114, P > 0.05 Subgroup C 5.19 ± 0.43 4.83 ± 0.37 Subgroup D 5.15 ± 0.38 5.01 ± 0.47

ANOVA Factor = Site; F3,332=41.67, P < 0.001

Table S2: Quantity of metabolites detected in the lichen Usnea taylorii (mean ± standard deviation)

Quantity in the lichen (in mg.g-1 DW) Metabolites (mean ± SD) Arabitol 138.39 ± 25.82 Citrate 1.08 ± 0.22 Mannitol 2.83 ± 0.67 Sucrose 0.34 ± 0.24 Usnic acid 4.09 ± 1.13

229 Annexes

Table S4: Measurements made on the snails N. hookeri used in no-choice experiment. Shell size in mm were represented by their mean values (± Standard deviation). The two-way ANOVA values are given for the factor Site and the factor Test. With both variables, the interaction being not significant, the result was not shown.

Shell size BRA MAS ANOVA Arabitol 5.05 ± 0.32 4.70 ± 0.26 Factor = Test;

Usnic acid 4.76 ± 0.37 4.69 ± 0.46 F3,232 = 2.485, P > 0.05 Arabitol + Usnic acid 4.98 ± 0.41 4.79 ± 0.43 Positive control 4.84 ± 0.34 4.74 ± 0.43

ANOVA Factor = Site; F1,232= 13.416, P < 0.001

230 Annexes

D. Purifications de la tnuiorine et de la calycine.

1 Extraction de Pseudocyphellaria crocata et isolement de la ténuiorine

Cinq grammes de Pseudocyphellaria crocata sont broyés au mortier et extraits par des solvants de polarité croissante : cyclohexane, acétone et méthanol. A’partir’de’lextrait’acétone (381 mg), après concentration sous pression réduite, un précipité est obtenu par filtration. Le précipité (100 mg) est purifié sur colonne ouverte de silice 60 (15- 40 µm MERCK). Le’solvant’délution’de’la’ténuiorine’est’un’mélange n-hexane/di-ethyl ether (80:20). La ténuiorine est obtenue après épuisement des autres métabolites élués en même temps avec le solvant n-hexane/di-ethyl ether (80:20). La quantité de ténuiorine purifiée est de 23 mg.

2 Extraction de Chrysotrix candelaris et isolement de la calycine

Le lichen Chrysotrix candelaris (m = 11,58 g) est broyé et extrait par 100 mL de n-heptane pendant 2h. L'extrait obtenu est récupéré par filtration dans un ballon et le solvant est évaporé sous vide. Le protocole d'extraction est répété deux fois et les extraits sont rassemblés pour donner 52,6 mg d'extrait brut. La purification est faite par précipitation de la calycine dans un mélange dichlorométhane

(CH2Cl2) :’acétate’déthyle (ACOEt) (1:1). Des essais de solubilisation de l'extrait n-heptane sont réalisés dans CH2Cl2. Deux fractions sont obtenues. Le précipité CcP et une partie soluble dans le CH2Cl2 CcS. Ces 2 fractions sont successivement lavées par CH2Cl2 et un mélange

CH2Cl2/ACOEt (1 :1) pour une obtention finale d'un produit pur CcP1. Après réunion des différents précipités purs, la masse finale de calycine est de 8,3 mg soit un rendement de purification de 15,9%. La calycine est identifiée par RMN 1H dans du chloroforme deutéré (spectromètre BRUKER Avance III 300 MHz équipé d'une sonde BBFO), par comparaison du spectre proton au données spectrales de la littérature (Figure D2) (Salinas et al. 2012).

231 Annexes

Figure E1 : Spectre RMN 1H de la calycine dans le chloroforme deutéré

232 Annexes

E. Supporting informations de l’article soumis à “Journal of Chemical Ecology”: Intrathalline metabolite profiles in the lichen Argopsis friesiana

shape gastropod grazing patterns

Online Resources 1

Fig S1 Study sites on Possession Island’that’belongs’to’Crozet’Archipelago’(45°’″0’ 46° ″0’S;’50°’00’ 5′°’″0’E)’in’the’Subantarctic’region.’The snails of the organic phenotype were sampled at Branca (BRA) and at Mascarin (MAS). The lichen Argopsis friesiana was’collected’in’le’Donjon’(DON).’

233 Annexes

Online resource 2: Chemical and Spectroscopic Data

Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry (DART-HRMS) Our experiments were performed on a JEOL JMS-T100CS (AccuTOF CS) orthogonal time-of- flight (TOF) mass spectrometer (Peabody, MA) equipped with an IonSense DART Source (Danvers, MA), as described previously (Le Pogam et al. 2015a, 2016a). DART-HRMS analyses were carried out in negative-ion mode. Each part of the lichen was directly analyzed, without any sample workup, by holding the sample between tweezers under the helium stream. The mass scale was calibrated using the [M-H]- ion of stearic acid (purchased from Aldrich-Sigma, St-Quentin Fallavier, France). For this purpose, the glass rod was dipped inside this powder prior to being positioned under the helium stream. To perform accurate mass measurements, the mass drift compensation procedure available on the main program that the AccuTOF CS was used to compensate for the m/z drift in the mass range of 100 to 600 Da.

Extraction and purification of chlorodepsidones argopsin and caloploicin Air dried lichen A. friesiana (4.5 g) was powdered and extracted with acetone (3x100 mL, 1 hour, under sonication) to provide 120 mg of acetone extract. This extract was submitted to a preparative TLC in the standard solvent system G (toluene/EtOAc/formic acid 139/83/8)(Culberson and Elix 1989). After two consecutive elutions, two bands were desorbed with acetone to provide: compound 1 (19.8 mg, Rf=0.81) and compound 2 (3.1 mg, Rf=0.63). Mass spectrometry and NMR analysis were performed for both compounds 1 and 2 to confirm

the structure. NMR spectra were recorded in d6-acetone using a 500 MHz spectrometer fitted with a TCI cryoprobe at the PRISM core facility (Rennes, France). Compound 1 was identified as argopsin and compound 2 as caloploicin.

References: Culberson, C.F., Elix, J., 1989. Lichen substances. Methods in plant biochemistry 1, 509535. Le Pogam, P., Le Lamer, A.-C., Legouin, B., Boustie, J., Rondeau, D., 2016. In situ DART-MS as a versatile and rapid dereplication tool in lichenology: chemical fingerprinting of Ophioparma ventosa. Phytochem. Anal. 27, 354363. doi:10.1002/pca.2635 Le Pogam, P., Legouin, B., Le Lamer, A.-C., Boustie, J., Rondeau, D., 2015. Analysis of the cyanolichen Lichina pygmaea metabolites using in situ DART-MS: from detection to

234 Annexes thermochemistry of mycosporine serinol. J Mass Spectrom 50, 454462. doi:10.1002/jms.3549

235 Annexes

Fig. S2 NMR spectra (1H, 300 MHz and 13C, 75 MHz) of argopsin (1) in acetone (CDCl3) and argopsin formula.

236 Annexes

Table S1 1H NMR (300 MHz) and 13C NMR (75 MHz) data for argopsin (1). Data recorded in’ CDCl″,’ ’ in’ ppm.’ The assignments were based on 1H, 13C, HSQC and HMBC experiments.

No. H C HMBC correlations 1 - 114.2 2 - 150.9 3 - 121.5 4 - 161.4 5 - 111.0 6 - 161.4 7 - 162.9 8 10.7, 1H, s 192.8 114.2; 121.5; 161.4 9 2.6, 3H, s 20.2 114.2; 121.5;150.9; 161.4 4-OH 12.8 - 111.0; 121.5; 161.4 1 - 126.5 ′ - 152.9 ″ - 123.4 4 - 141.6 5 - 146.1 6 - 125.8 7 3.8, 3H, s 60.6 152.9 8 2.3, 3H, s 10.5 123.4; 141.6; 152,9 9 2.4, 3H, s 14.4 125.8; 126.7; 146.1

237 Annexes

1 13 Fig S3 NMR spectra ( H, 500 MHz and C, 125 MHz) of caloploicin in acetone (d6-acetone) and caloploicin formula.

238 Annexes

Table S1 1H NMR (500 MHz, cryo) and 13C NMR (125 MHz) data for caloploicin. Data recorded in acetone-d6, in ppm. The assignments were based on 1H, 13C, HSQC and HMBC experiments.

No. H C HMBC correlations 1 - 114.2 2 - 156.1 3 - 111.5 4 - 157.6 5 - 122.0 6 - 140.2 7 - 161.9 8 2.4, 3H, s 18.9 114.2; 122.0; 111.5; 140.2 1 - 128.0 ′ - 153.2 ″ - 123.4 4 - 142.9 5 - 147.0 6 - 125.7 7 3.8, 3H, s 60.7 153.2 8 2.3, 3H, s 10.3 153.2; 142.9; 128.0; 125.7; 123.4 9 2.6, 3H, s 15.1 153.2; 147.0; 142.9; 128.0; 125.7

239 Annexes

Table S2 Results of exact mass measurements in negative-ion mode DART-HRMS of the molecules retrieved in Argopsis friesiana.

Calculated mass Compounds Measured mass Proposed formula (error in ppm)

Atranorin 373.0924 C19H17O8 373.0929 (-1.39)

195.0652 C10H11O4 195.0663 (-0.72)

163.0399 C9H7O3 163.0401 (-1.23)

151.0410 C8H7O3 151.0401 (6.36) a Argopsin 395.0104 C18H13Cl2O6 395.0099 (1.32) a Caloploicin 402.9722 C17H12Cl3O5 402.9726 (-1.12) a Exact mass measurements were retrieved for the most prevalent signal of the chlorinated isotopic pattern

Table S3 Each specialized metabolite in the four lichen parts, calculated as a percentage of all the compounds detected in this chemical group.

Ap Pf Ph+Pa Ce Atranorin 61.8 26.2 73.5 39.5 Caloploicin 10.4 36 11.3 16.6 Argopsin 22 34.4 12.8 12.1 Af1 2.1 1.7 0.9 5.6 Af2 2.2 1.3 0.9 7.4 Af3 0.5 0.5 0.2 7.5 Af4 0 0 0 9 Af5 1.1 0 0.4 2.3

240

Online Resource 3: Multivariate analysis supplementary data.

.

.

. Coelatio to PC to Coelatio -.

-.

sat

Ls

Te

TN

Gl

Tp

Se

So Af

Af

Af Gl

Ag

Po

Aa

Xli

Su

Phe

Ata

Glut

aAla

Calo

Aas

Ago

MoI

FA

Ma

GABA

PS_Xl

PS_Gl

PS_Gal

PS_Aa

PS_Rha

PS_Ma

C:-

C:-

C: -C:

C:- C:- C:-

Fig S3 Projection to the axis PC1 of the metabolites analyzed by PLS-DA. Abbreviations used are given in the Table 1.

.

.

. Coelatio to PC to Coelatio -.

-.

at

Te

Ls

TN

Tp

Gl

Se

Af So

Af Af

Po Ag

Aa

Gl

Xli

Su

Phe

Ata

Glut

Calo

Aas

αAla

Ago

MoI

FAs

Ma

GABA

PS_Xl

PS_Gl

PS_Gal

PS_Aa

PS_Rha

PS_Ma

C:-

C:-

C:- C:- C:- C:-

Fig S4 Projection to the axis PC2 of the metabolites analysed by PLS-DA. Abbreviations used are given in the Table 1

Annexes Table S3 Correlated compounds (> 95%) in the PLS-DA analysis from the data set of the compounds identified in the lichen A. friesiana. Abbreviations used are given in Table 1. Only Tre, Pro, PS-Glc, Af1 and Atra were included in the PLS-DA.

Tre Pro PS_Fuc PS_Glc Af1 Af4 Atra PS_Fuc 1.00 ------PS_Glc -0.97 - -0.97 - - - - Af4 1.00 - 1.00 -0.97 - - - C16:2 n-6 0.99 - - - - 0.99 - C16:3 n-3 - 0.99 0.98 - - - 0.97 Af2 - - - - 0.97 - -

243 Annexes

Online Resource 4

A back

front

BC

Fig S5 Scanning Electron Microscopy of the radula of Notodiscus hookeri, extracted from the buccal mass. (A) Global view showing about 50 teeth per rank; (B) Lateral teeth are rather narrow, tongue shaped, strongly curved and completely smooth; (C) Marginal teeth are wide, but lower than lateral teeth, with three rounded cusps each, the most external being flattened. Scale bars represent 100 µm (A) and 10 µm (B and C). Collaboration with J. Le Lannic, Scanning Electron Microscopy Center (CMEBA), University of Rennes 1, France.

244 Annexes F. Profil chimique de quatre lichens subantarctiques

❖ Aspicilliopsis macrophthalma (Hook.f. &Taylor) B. de Lesd.

Embranchement Ascomycota Classe Lecanoromyceridae Ordre Baemycetales Famille Trapeliaceae Genre Aspicilliopsis Espèce macrophthalma

Algue verte Photobiote principal (chlorococcoïde unicellulaire) Photobiote Cyanobactérie (Nostoc ou secondaire Scytonema)

Aspicilliopsis macrophthalma est un lichen tripartite, crustacé saxicole, endémique de lhémisphμre’Sud.’Ce’lichen’est’retrouvé’sur’tous’les’sites’détude’de’lîle’de’la’Possession,’de’ maniμre’ abondante.’ Certains’ sites’ de’ collectes’ permettent’ dimaginer une zone de ruissellement des eaux de pluie. Ce lichen encroutant possède une surface très écailleuse, craquelée’et’fendillée’aussi’bien’autour’des’apothécies’que’des’céphalodies.’Lépaisseur’du’ thalle est variable (0,37 ± 0.17 mm). Les apothécies sont de couleur noirâtre (brunâtre lorsque le lichen est humide), urcéolées, immergées dans le thalle de petite taille (1.11 ± 0.26 mm). Les asques sont facilement visibles, contenant 8 spores disposées de façon unisériée. Les céphalodies sont de couleur rose (rose-orangé lorsque le lichen est humide), de grande taille (diamètre : 4.91 ± 1.08 mm ; profondeur 450 µm). Le métabolite majoritaire décrit pour ce lichen’est’lacide’5-O-méthylhiascique’(tridepside).’Dautres’depsides’et’tridepsides’comme’ lacide’ hiascique,’ lacide’ gyrophorique’ et’ lacide’ lécanorique’ sont’ observés’ par’ CCM’ (Galloway 2013).

245 Annexes

❖ Placopsis bicolor (Tuck.) B. de Lesd.

Embranchement Ascomycota Classe Lecanoromyceridae Ordre Baemycetales Famille Trapeliaceae Genre Placopsis Espèce bicolor

Photobiote principal Algue verte Cyanobactérie (Nostoc ou Photobiote secondaire Scytonema ou Stigonema) Photographie D. Ertz

Placopsis bicolor est un lichen crustacé encroutant, saxicole, avec un thalle de couleur orange. Les marges du thalle sont bien délimitées et de même couleur que le reste du thalle. Les apothécies sont de couleur rouge-brun et de type lécanorine. Les céphalodies sont assez grandes et craquelées et de la même couleur que le thalle. Comme tous les lichens du genre Placopsis,’ lacide’ gyrophorique’ (majoritaire)’ et’ lacide’ lécanorique’ sont’ décrits’ dans’ le’ lichen. Il faut également noter la présence de depsidones’ telles’ que’ lacide’ stictique’ (majeur),’ lacide’ constictique’ (mineur),’ lacide’ norstictique (traces). Cependant des spécimens étudiés collectés sur Kerguelen ont présenté une’chimie’différente’δ’base’dacide’porphyrilique’(majoritaire)’et’dacide’pannarique’(traces)’ (Galloway 2013).

246 Annexes ❖ Profil chimique des 4 lichens

Tableau F1 : Liste des métabolites détectés dans A. macrophthalma, P. bicolor, P. crocata et U. taylorii : sucres libres et polyols, acides aminés et acides gras ainsi que les teneurs en azote total. Les valeurs sont des moyennes ± SD (n=4 échantillons) in mg.g-1 de masse sèche. Le pourcentage dazote’(TN)’est exprimé’en’%’de’DM.’Le’symbole’-’signifie’que’le’métabolite’nest’pas’détecté dans’léchantillon.

Sucres et Polyols (mg.g-1) A. macrophthalma P. bicolor P. crocata U. taylorii Arabinose (Aras) - - 0.064 ± 0.013 - Arabitol (Ara) - - 58.153 ± 2.380 138.390 ± 25.820 Dulcitol (Dul) - 7.553 ± 1.801 - - Fructose (Fru) 0.216 ± 0.200 0.211 ± 0.069 - - Galactose (Gal) 0.056 ± 0.065 0.087 ± 0.020 - - Mannitol (Man) 3.998 ± 1.339 5.028 ± 1.579 5.392 ± 0.146 2.830 ± 0.670 Melezitose (Mel) - - 0.062 ± 0.015 - Myo-inositol (Myo) - - 0.056 ± 0.008 - Saccharose (Sac) 4.112 ± 2.057 5.762 ± 2.552 0.085 ± 0.002 0.340 ± 0.240 Tréhalose (Tre) 8.835 ± 3.835 15.942 ± 6.652 0.204 ± 0.026 - Xylitol (Xyl) - - 0.183 ± 0.012 - Total sucres et polyols 17.229 ± 6.955 27.030 ± 10.368 64.199 ± 2.511 141.560 ± 14.646 Acides Aminés libres (mg.g-1) A. macrophthalma P. bicolor P. crocata U. taylorii -Alanine’(Ala) 0.231 ± 0.074 0.291 ± 0.106 0.360 ± 0.021 0.147 ± 0.017 Arginine (Arg) - - - 0.105 ± 0.081 Aspartate (Asp) - 0.158 ± 0.058 - - GABA 0.719 ± 0.115 0.063 ± 0.014 0.956 ± 0.072 0.183 ± 0.017 Glutamine (Gln) 0.105 ± 0.073 1.521 ± 1.518 0.057 ± 0.039 0.099 ± 0.016 Glutamate (Glut) 1.116 ± 0.821 1.871 ± 0.854 0.945 ± 0.054 0.395 ± 0.062 Isoleucine (Ileu) 0.042 ± 0.029 0.079 ± 0.025 - - Leucine (Leu) 0.074 ± 0.016 0.140 ± 0.043 - - Lysine (Lys) 0.231 ± 0.359 0.026 ± 0.018 0.013 ± 0.016 - Methionine (Met) 0.479 ± 0.131 0.243 ± 0.155 - - Ornithine (Orn) - 0.039 ± 0.012 - - Phenylalanine (Phe) 0.080 ± 0.070 0.087 ± 0.052 0.105 ± 0.080 - Proline (Pro) - 0.325 ± 0.153 - 0.071 ± 0.008 Serine (Ser) 0.043 ± 0.033 0.091 ± 0.024 0.093 ± 0.066 0.148 ± 0.208

247 Annexes

Thréonine (Thr) 0.043 ± 0.029 0.098 ± 0.036 0.043 ± 0.029 - Tryptophane (Trp) 0.101 ± 0.098 9.099 ± 0.774 0.160 ± 0.129 - Tyrosine (Tyr) - 0.189 ± 0.069 - - Valine 0.048 ± 0.006 0.060 ± 0.12 0.016 ± 0.019 - Total Acides Aminés 5.369 ± 1.666 12.129 ± 3.255 2.793 ± 0.207 1.148 ± 0.239 Acides Gras (mg.g-1) A. macrophthalma P. bicolor P. crocata U. taylorii C14:0 0.065 ± 0.004 0.068 ± 0.014 0.052 ± 0.042 0.027 ± 0.016 C15:0 0.034 ± 0.010 0.032 ± 0.009 0.081 ± 0.004 0.028 ± 0.002 C16:0 1.515 ± 0.060 1.118 ± 0.107 2.026 ± 0.207 0.609 ± 0.098 C17:0 0.091 ± 0.010 0.098 ± 0.028 0.085 ± 0.028 0.050 ± 0.018 C18:0 1.385 ± 0.042 0.987 ± 0.040 0.658 ± 0.050 0.382 ± 0.047 C20:0 0.073 ± 0.014 0.066 ± 0.016 0.063 ± 0.013 0.059 ± 0.028 C22:0 0.174 ± 0.014 0.184 ± 0.020 0.121 ± 0.032 0.073 ± 0.011 C23:0 0.088 ± 0.008 0.110 ± 0.010 0.108 ± 0.049 0.096 ± 0.064 C24:0 0.139 ± 0.011 0.097 ± 0.012 0.095 ± 0.020 0.042 ± 0.009

Total Saturated (FAsat) 3.564 ± 0.059 2.759 ± 0.190 3.291 ± 0.213 1.366 ± 0.157 C16:3 n-3 0.071 ± 0.037 0.073 ± 0.020 - - C18:3 n-3 0.600 ± 0.088 0.435 ± 0.040 0.272 ± 0.053 0.128 ± 0.098 C18:2 n-6 7.888 ± 0.434 2.905 ± 0.274 2.775 ± 0.373 1.197 ± 0.177 C16:1 n-7 0.062 ± 0.003 0.060 ± 0.007 0.210 ± 0.018 0.013 ± 0.011 C18:1 n-7 0.132 ± 0.019 0.147 ± 0.010 0.281 ± 0.026 0.046 ± 0.023 C16:1 n-9 0.070 ± 0.015 0.057 ± 0.010 0.052 ± 0.014 0.046 ± 0.012 C18:1 n-9 6.338 ± 0.177 3.759 ± 0.279 1.594 ± 0.060 0.500 ± 0.138

Total FAunsat (n-3) 0.671 ± 0.124 0.508 ± 0.043 0.272 ± 0.053 0.128 ± 0.098

Total FAunsat (n-6) 7.888 ± 0.434 2.905 ± 0.274 2.775 ± 0.373 1.197 ± 0.177

Total FAunsat (n-7) 0.193 ± 0.021 0.206 ± 0.017 0.491 ± 0.043 0.059 ± 0.034

Total FAunsat (n-9) 6.408 ± 0.180 3.816 ± 0.284 1.646 ± 0.060 0.546 ± 0.147 Total Unsaturated 15.160 ± 0.684 7.435 ± 0.539 5.185 ± 0.325 1.930 ± 0.291 (FAunsat) Total FA 18.724 ± 0.645 10.194 ± 0.715 8.475 ± 0.280 3.297 ± 0.440 Azote total (%) A. macrophthalma P. bicolor P. crocata U. taylorii Total Nitrogen (TN) 1.906 ± 0.042 1.976 ± 0.057 2.729 ± 0.111 0.452 ± 0.032

248

Résumé Les interactions « lichen-lichénophage » sont médiées par la présence de métabolites au sein des lichens qui peuvent influer sur les préférences alimentaires des lichénophages. Dans le contexte environnemental du Subantarctique, à faible biodiversité animale et « végétale »,’une’étonnante’richesse’lichénique’a’contribué’au’succμs’de’lunique’Gastéropode’terrestre’endémique,’ Notodiscus hookeri. Pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, nous avons analysé les préférences alimentaires de cet escargot lichénophage et tenté de cibler les traits-clés’ des’lichens’qui’modulent’linteraction’trophique.’À’partir’ dobservations’et’ de’prélμvements’réalisés’sur’lîle’ de’la’ Possession (Archipel Crozet, Terres Australes et Antarctiques’Franλaises),’deux’étapes’décisives’de’linteraction’ont’été’étudiées : (i) le comportement’alimentaire’de’lescargot’en’situation’de’choix’nutritionnel,’(ii)’sa’réponse’gustative’face’δ’des’métabolites’en situation de non choix. Le broutage préférentiel’de’certaines’parties’de’lichen’a’été’confronté’δ’lanalyse’de’la’combinaison’entre’la’teneur’des’métabolites’ secondaires et celle des métabolites primaires. La localisation des métabolites au sein du thalle de trois espèces lichéniques fréquentes sur lîle’et’consommées’par’lescargot’(Argopsis friesiana, Pseudocyphellaria crocata et Usnea taylorii)’a’été’effectuée’par’lintermédiaire’de’ techniques chromatographiques et spectrométriques (LC-DAD-MS, GC-MS, microdissection couplée à la LC-DAD-MS, DART-MS) ainsi que par’des’techniques’dimagerie’couplées’δ’la’spectrométrie’de’masse’((MA)LDI-MS). N. hookeri se révèle être une espèce généraliste et opportuniste qui se nourrit de la majorité des lichens auxquels il est confronté. Cependant, il opère des choix en se nourrissant des parties ayant une valeur nutritive élevée et ce, en dépit de la présence de métabolites secondaires’ potentiellement’ répulsifs.’ Plusieurs’ mécanismes’ permettant’ δ’ lescargot’ de’ contrer’ la’ toxicité’ de’ certains’ métabolites ont également été décrits dans ce travail. Les choix alimentaires de N. hookeri savμrent’par’conséquent’répondre’δ’un’compromis’entre’le’ bénéfice’dabsorption’de’métabolites’appétents’δ’forte’valeur’nutritive’et’le’coût’physiologique’(détoxication,’clivage,’excrétion) engendré par’lingestion’de’métabolites’répulsifs.’En’conclusion,’trois’paramμtres-clés au moins seraient à prendre en compte lors des futures études dinteractions’entre’lichens’et’lichénophages :’il’sagit’de’la’nature,’de’lhistolocalisation’et’de la teneur des métabolites secondaires, de la teneur’en’azote’ainsi’que’de’la’quantité’de’sucres’et’de’polyols.’Les’techniques’dimagerie’ont’fourni’une’voie’nouvelle’et’prometteuse pour cibler les dégâts opérés par un phytophage. En effet, cette approche permet de mieux apprécier la distribution hétérogène au sein du thalle entre les métabolites. Pour cet escargot terrestre, les ratios de composés « appétents/inappétents » semblent jouer un rôle majeur dans la sélection de nourriture. Abstract Lichen-lichenivore interactions are mediated by the presence of metabolites in lichens, which may impact lichenivore food preferences. In the’environmental’context’of’the’Subantarctic,’with’a’low’animal’and’plant’biodiversity,’the’surprisingly’rich’lichen’flora contributed to the success of a the only endemic subantarctic land Gastropod, Notodiscus hookeri. To better understand the snail-lichen interactions, we analyzed the food preferences of this lichenivore snail and tried to pinpoint key lichen traits modulating the trophic interaction. From observations and samplings realized on Possession Island (Crozet Archipelago, Terres Australes et Antarctiques Françaises), two decisive stages of the interaction were studied: (i) the snail feeding behavior in situation of nutritional choice, (ii) its gustatory response when facing isolated metabolites in no-choice situations. Preferential grazing of some lichen parts was linked to both secondary and primary metabolites concentrations. Intrathalline localization of metabolites was performed in three lichen species consumed by the snail and widespread on Possession Island (Argopsis friesiana, Pseudocyphellaria crocata and Usnea taylorii), using chromatographic and spectrometric techniques (LC-DAD-MS, GC-MS, microdissection coupled to LC-DAD-MS, DART-MS) and imaging mass spectrometry ((MA)LDI-MS). N. hookeri appears to be a generalist and opportunistic gastropod, feeding on most lichen species encountered. However, it is able to discriminate between lichen parts, preferentially grazing on parts with the highest nutrient value, in spite of the presence of potential deterrent secondary metabolites. We described several mechanisms helping snails to overcome the toxicity of some lichen metabolites. Snail feeding choices result in a trade-off between benefits of absorbing appetent metabolites of high nutritive value and the cost of physiological processes (detoxification, cleavage and excretion) caused by the ingestion of deterrent metabolites. To conclude, three main key parameters might be relevant in future to study the interactions between lichens and lichenivores. They correspond to the nature, the histolocalisation and the content of secondary metabolites balanced by the amount of nitrogen along with sugars and polyols. Imaging techniques have provided a new and promising way to visualize the heterogeneous distribution within the thallus between these metabolites. The ratios of appetent/non appetent compounds are likely to play a major role in food selection by this land snail.