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UFR des sciences et Université Nangul Abrogoua Teclmologles des Aliments

Année Universitaire MEMOIRE

2014-2015 Présentée pour l'obtention de l'UE de stage de MASTER en Sciences et Technologies des Aliments

Spécialité : Microbiologie et Biologie Moléculaire

Par:

MOUROUFIE ABO KOUADIO JEROME

Numéro d'ordre THEME: Evaluation de la qualité microbiologique et physico-chimique de l'escargot (Cymbium souliei) fermenté vendu dans deux communes d'Abidjan (Côte d'Ivoire)

Directeur Scientifique:

Professeur DJE Koffi Marcellin

Directeur Technique : Soutenu publfque~nt le 15/12/2015 Docteur KOUAKOU Clémentine

COMMISSION D'EXAMEN :

-Professeur KOUAME Lucien Patrice : -Professeur KOFFI Rose Nevry

-Professeur GBOGOURI Albarin

-Docteur KAKOU Célah DEDICACE

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Tout d'abord, je bénis DIEU TOUT PUISSANT, Maître du ciel et de la terre qui m'a guidé sur le droit chemin tout au long de ce travaiJ et qui m'a inspiré les bons pas et Jes réflexes justes sans sa miséricorde, ce travail n'aurait pu aboutir. Je dédie ce travail à: • Ma mère ABDOULA YE A.ma Kra Anne-Marie • Ma mère adoptive NADRO Céline, • Mon père KOUAKOU Koffi Mouroufié, • Mes frères «L' Abbé Nestor, Jacques, Marc et Marcel» • Mes sœurs « Blandine, Géneviève, Odile et Cécile» Qui n'ont ménagé aucun effort pour ma réussite. Trouvez dans ce travail. la concrétisation de vos vœux.

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page I C

REMERCIEMENTS

Au terme de la rédaction de ce mémoire, je remercie le Seigneur Dieu grâce à qui ce travail a été possible. A travers ce mémoire, je tiens particulièrement à adresser mes remerciements les plus sincères : • Au Professeur BOHOUA Guichard, Doyen de )'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologies des Aliments (UFR-STA) ·

• A mon Directeur scientifique, Professeur DJE Koffi Marcellin. Directeur du Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie des aliments, pour les suggestions pertinentes les conseils pratiques et la patience dont il a fait preuve tout au long de l'exécution de ce travail. Professeur, votre rigueur scientifique; votre disponibilité nous ont apporté une aide précieuse tout au long de ce travail, dans l'élaboration et la présentation de ce document. Veuillez trouver ici l'expression de nos sincères remerciements et toute notre reconnaissance ;

• A Docteur KOUAKOU A. Clémentine, pour avoir accepté de diriger ce travail et pour le soutien scientifique et moral qu'il n'a cessé de m'apporter. J'ai été particulièrement touché par sa rigueur scientifique et l'attention qu'il m'a accordée malgré ses multiple obligations. Un grand merci pour l'apport matériel à l'aboutissement de ce travail de recherche·

• Ainsi qu'aux enseignants de l'UFR-STA qui ont chacun à un moment ou à un autre contribué efficacement à ma formation. Je témoigne aussi, ma grande reconnaissance aux Professeurs et Docteurs membres du jury qui ont bien voulu me faire l'honneur de juger ce travail.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page II C

RESUME

Le Cymbium (Cymbium souliei) fermenté constitue une source importe de protéines animale pour les populations d'Abidjan (Côte d'Ivoire). Dans le but d'évaluer la qualité microbiologique et physico-chimique du Cymbium fermenté vendu dans deux communes à savoir Treichville et Yopougon. Une étude microbiologique a porté sur 12 échantillons de Cymbium souliei fermenté en Côte d'Ivoire. Les analyses microbiologiques ont montré que les bactéries lactiques sont spécifiquement les plus prépondérantes, suivis des levures dans l'ensemble des échantillons. Les charges des Coliformes fécaux et anaérobies sulfita-réducteurs (ASR) sont faibles. Des Salmonelles ont été également détectées dans tous les échantillons de Cymbium fermentés. Ces résultats ont permis de noter que la qualité microbiologique du Cymbium fermenté vendu dans ces marchés n'est satisfaisante au regard des critères microbiologiques. La présence de germes pathogènes indique que des efforts doivent être poursuivis pour améliorer la qualité microbiologique du Cymbium Souliei fermenté vendu dans les marchés de la Commune de Treichville et de Yopougon. L'analyse physico-chimique a révélé des teneurs sensiblement différentes en en sel (Nacl) en acidité et en cendres au niveau des deux marchés. Cependant, le pH est autour de la basicité. La caractérisation moléculaire a permis d'identifier deux (2) espèces différentes de levures à savoir Kluyveromyces aestuarii et Candida apicola inégalement réparti dans les échantillons de Cymbium fermenté ....

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page III TABLE DE MATIERES DEDICACE 1 REMERCTEM-ENTS...... Il RESUM-E Ill

LJSTE DES FIGURES ETTABLEAUX...... VI LISTE DES SIGLES ET ABREVTATTONS...... VITI INTRODUCTION...... l REVUE BIBLIOGRAPHIQUE...... 3 I - Généralité...... 4 l. Composition et valeur nutritive de l'escargot et du Cymbium ...... 5 2. Consommation et valorisation de l'escargot...... 6 3. Consommation du Cymbium...... 6 4. Aspect économ.ique...... 6 4.1. Aspect économique de l'escargot...... 6

4.2. Aspect économique du Cymbium...... 7

5. Transformation du Cymbium., ...... 7 5. l. Transformation industrielle du Cymbium...... 7 5.2. Transformation artisanale...... 8 5.3. Microorganismes intervenant dans la fermentation de produits de pêche...... 8 5.4. Flore de contamination ...... 9 5.5.Rôle du sel dans la fermentation...... 10 6. Levures...... 10 6. 1. Identification moléculaire levures...... 10

7. Aspect physico-chimique des produits de pêche fermenté...... 11

Il-MATERIEL ET METHODES...... 13 1. Matériel...... 14 1.1 Matériel biologique...... 14 2. Méthodes...... 14 2.1. Echantillonnage...... 14 2.2. Méthodes d'analyse microbiologique...... 14 2.2.l. Préparation de la suspension mère...... 15

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page TV 2.2.2. Détermination des germes ...... 16 2.2.2. 1 Levures...... J 6 2.2.2.2 Bactéries lactique...... 16 2.2.2.3 Coliformes totaux...... 17 2.2.2.4. Anaérobie sulfito-reducteur...... 17 2.2.2.4 Salmonella...... 18

2.2.2.5-Evaluation de la qualité microbiologique ...... 19

2.2.3 Caractérisation moléculaire des levures...... 19 2.2 .3 .1 Extraction de I 'ADN...... 19 2.2.3.2 Quantification d'ADN extrait...... 19

2.2.3.3 Amplification par PCR de la séquence lTS l-5.8S-ITS2...... 20

2.2.3 .4 Digestion de 1' ADN amplifié ...... 21

2.3. Analyse physico-chimique . 22 2.3. l Détermination du pH . 22 2.3.2 Détermination de l'acidité titrable...... 22

2.3.3. Dosage des cendres...... 23

2.3.4 Dosage du chlorure de sodium...... 23 2.4 Traitement des données et analyses statistique...... 24 fi-DISCUSSION ET RESULTATS 25 Résultats...... 26 1. l Flore microbienne du Cymbium fermenté ...... 26 l. l .1 Charge microbienne...... 26 1.2 Résultat de l'évaluation de la qualité microbiologique ...... 27 1.3 Résultat du test d'identification présorn ptive des souches de levures...... 28 1.4 Identification moléculaire des levures...... 29 1.4. l Profil PCR-ITS ...... 29 1.4.2-Prédominance des espèces de levures ...... 3 1 J .5- Paramètres physico-chimique du Cvmbium fermenté ...... 32 2-DISCUSSION...... 33 CONCLUS TON ET PERSPECTIVES...... 36 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...... 38

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page V C

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Composition du mélange réactionnel (volume final 50 µI)...... 21

Tableau 2: Composition du milieu réactionnel de la RFLP (volume final 20µ1)...... 22

Tableau 3: Moyenne des Charges des différents microorganismes du Cymbium fermenté en UFC/g 27

Tableau 4 : Identification présomptive sur milieu candida cbromogénique et lysine des levures...... 28

Tableau 5 : Tailles des produits PCR et pourcentages des groupes de levures identifiés...... 31

Tableau 6: Profil de la digestion enzymatique des espèces de levures...... 32

Tableau 7 : Paramètres physicochimiques du Cymbium fermenté...... 33

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page VI LISTE DES FIGURES

Figure 1: Photographie de Cymbium avec coquille...... 14

Figure 2: Photographie de Cymbium sans la coquille...... 14

Figure 3: Photographie de l'identification des levures sur milieu candida chromogénique...... 29

Figure 4: Photographie de l'identification des levures sur milieu candida chromogénique...... 29

Figure 5: Produits d'amplification par les amorces ITS 1 et ITS 4 de la région 5,8S-ITS de l'ADNr des souches de levures isolées du Cymbium fermenté...... 30

Figure 6: Produits d'amplification par les amorces ITS l et ITS 4 de la région 5,8S-ITS del' ADNr des souches de levures isolées du Cymbium fermenté...... 30

Figure 7: Fragments de restriction des différents produits PCR obtenus à partir de l'hydrolyse enzymatique par CfoI . 31

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page VII SIGLES ET ABREVIATIONS

ADN: Acide désoxyribonucléique

ADNr : acide désoxyribonucléique ribosomal

ANOVA :Analysis of Variance ou analyse des variance

ARNr: acide ribonucléique ribosomal d.XTP: désoxynucléotide triphosphate

EDTA : éthylène diamine tétra-acétate

EPT: Eau peptonée tamponnée

ETS : External Transcribed Spacers ou espaceurs externes transcrit g: Gramme

ITS : Internai Transcribed Spacers ou espaceurs internes transcrits

MgCh: Chlorure de Magnésium mL: millilitre

MRS: Man Rogosa et Sharpe

NTS : Non Transcribed Spacers ou espaceurs non transcrits

OIV : Organisation Internationale de la Vigne et du Vin

Pb: Paires de bases

PCR : Polymérisation Chain Réaction ou réaction de polymérisation en chaîne

PE: Prise d'Essai pH: potentiel d'Hydrogène

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorpbism ou polymorphisme de la longueur des fragments de restriction

RV: Rappaport -Vassiliaclis

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page Vlll TBE: Tris-Base, acide borique, EDTA

UFC: Unité Formant Colonie

VRBL: Milieu lactosé bilié au cristal violet

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page IX INTRODUCTION

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 La chair de l'escargot, eu égard à sa valeur nutritionnelle avec un taux de protéines compri entre 37% et 51 % de matière sèche et à sa qualité organoleptique fort appréciée par les populations locales, constitue une ressource alimentaire à laquelle certaines communautés, aussi bien des villes que des milieux ruraux sont fort attachées (Codjia et Noumonvi, 2002· Sodjinou, 2002). Ainsi, le genre Cymbium pour sa grande taille et sa valeur nutritionnelle devient également un produit de pêche de plus en plus consommé. Toutefois. la conservation des produits de pêche pour éviter les pertes post pêche reste un véritable problème en Afrique. Alors pour une longue conservation, des procédés traditionnels et industriels tels que le séchage, la salaison, la congélation et la fermentation ont été développés. A l'instar du Sénégal, l'escargot (Cymbium) fermenté est consommé chez les population quelques soient les couches sociales. En effet, cette consommation du Cymbium fermenté devient de plus en plus importante en Côte d' 1 voire, vue la croissance démographique galopante et l'évolution des habitudes alimentaires. Par ailleurs, la pêche et la fermentation du Cymbium deviennent des secteurs importants qui emploient de nombreuses personnes. Toutefois, si plusieurs travaux scientifiques ont été réalisés sur les autres produits halieutiques en Côte d'Ivoire, les volutes (genre Cymbium), restent encore peu connus. Notre étude portera donc sur l'espèce Cymbium souliei rencontrée en Côte d'Ivoire précisément à Grand-Bassam, ainsi qu'au Ghana par MARCHE-Marchad (1974). Le Cymbium fermenté comme tous les autres produits de la fermentation artisanale, vendu dan les marchés pourrait porter une diversité microbienne et même des espèces pathogènes. L'activité de ces microorganismes et la présence de certaines espèces pathogènes pourraient influencer la qualité microbiologique et sanitaire du Cymbium fermenté. Cependant ce produit nest jusqu'aujourd'hui à notre connaissance objet d'aucune étude scientifique en Côte d'Ivoire. L'objectif de cette étude est d'évaluer la qualité microbiologique et physico-chimique du Cymbium fermenté vendu dans les marchés de deux communes de la ville d'Abidjan. De façon spécifique, nous ferons d'abord : L'inventaire et l'isolement de la diversité de microorganismes de fermentation présents dans le Cymbium fermenté, ainsi que quelques pathogènes. Ensuite l'identification présomptive des microorganismes de fermentation précisément les levures sur la base des tests biochimiques et de biologie moléculaire. Enfin, l'analyse de quelques paramètres physico-chimiques de l'escargot (Cymbium) fermenté.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 2 REVUE BIBLIOGRAPIDQUE

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 1- GENERALITES L'Amérique du Nord et l'Europe regroupent plus de 20 espèces d'escargots comestibles. Parmi les plus connues, il y a le petit-gris, Helix aspersa, l'escargot de Bourgogne: H. pomatia et J 'escargot turc : H. lucorum. Outre ces espèces comestibles vendues sous Je nom d'escargots, il y a aussi les escargots achatines, en provenance d'Afrique. Les plus connus viennent d'Afrique de l'Ouest; l'escargot géant: Achatina achatina et le grand noir: Achatina margina/a (Richard, 2003). Quatre espèces d'escargots existent en Côte d'lvoire et appartiennent à deux genres dont Achatina et Archatina. li s'agit des espèces de: Archatina degneri, Archatina marginata, Achatina achatina et Achatina fulica. La dernière espèce est la plus rare de toutes les espèces. On l'appelle communément «fulica» (Ekoué et al., 2002). Les Cymbium sont des mollusques gastéropodes marins de la famille des volutidae dont la classification a fait l'objet de plusieurs études. cette classification s'établit comme suit: Embranchement: Mollusque Classe: Gastéropode Sous classe: Prosobranche Ordre: Néogastéropodes Sous-ordre: Sténogastéropode Super famille: Volutoïdes Famille: Volutidae Sous famille: Yolut:inae Genre: Cymbium. La diagnostique des espèces du Cymbium se fait à l'aide de la coquille. La forme de la coquille, l'aspect dusommet, de la surface et la coloration permettent de distinguer les espèces de volute. La coquille du Cymbium est de taille grande à moyenne. Sa protocoque est généralement grande, bulbeuse, jamais spiralée. Elle peut être entièrement recouverte par le dernier tour dont la partie spiralée forme un sillon plus ou moins large autour de la protocoque qui peut devenir obsolète. Le périostracum est parfois recouvert d'une couche d'aspect émaillé. Le pied très volumineux ne peut se rétracter totalement dans la coquille. Le ganglion supra intestinal est séparé du ganglion droit par un long connectif. Leurs sexes sont séparés (SOW, 1994). En effet, les Cymbium vivent généralement sur les fonds meubles où ils se trouvent enfouis, ne laissant apparaître que leur siphon et une partie de leur coquille. ils se déplacent surtout la nuit et se nourrissent essentiellement de bivalves el de gastéropodes qu'ils capturent dans l'épaisseur du sédiment. Ces mollusques prosobranches sont essentiellement rencontrés

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 4 sur les côtes ouest africaines et au sud de la péninsule ibérique au Cameroun. Le genre Cymbium. typiquement ouest-africain, comporte onze (11) espèces et deux (2) sous-espèces. MARCHE-Marchad et Rosso (1978) ont distingué suivant la forme de la coquille, de la couJeur et des pieds des Cymbium, cinq espèces et sous espèce au Sénégal. Ce sont : Cymbium Cymbium (coloration de l'animal est brun jaunâtre, longueur d'environ 15 cm); Cymbium glans (longueur d'environ 35 cm ; coloration de la peau est brun grisâtre et pouvant atteindre 11 kg) ; Cymbium marmoratum (longueur 20 cm; coloration de l'animal est jaunâtre avec des marbrure fouge brunâtre) ; Cymbium pepo (longueur 27 cm ; coloration est orange ou noire, pouvant atteindre 10 kg); Cymbium tritonissub sp. Senegalensis (coquille ovale, assez haute, coloration de l'animal est rouge brique uniforme). Marche-Marchad, (1974) a noté la présence de l'espèce Cymbium souliei en Côte d'lvoire dans la localité de Grand-Bassam dans l'océan Atlantique.

1- Compositions et valeur nutritive de l'escargot (Cymbium)

Les escargots géants africains contribuent de façon substantielle à l'alimentation des populations des pays en voie de développement. En termes de protéines, la chair d'escargot est comparable aux sources traditionnelles de protéines comme La viande de volaille, de porc ou de bœuf. Une étude sur la composition en minéraux de la viande d'escargot montre que les valeurs en fer, magnésium, calcium, potassium et sodium étaient Légèrement élevés; en revanche aucune trace de cobalt, plomb ou cuivre indicateurs de pollution dangereuse n'a été détectée.

La viande d'escargot apporte un complément aux oligoéléments nécessaires à une bonne croissance chez les Homme. Sa consommation régulière est donc recommandée (Cobbioah et al, 2006). Au plan nutritionnelle, la chair fraiche de l'escargot est composée de: 81,6 % d'eau · Sodium: 63mg; 16,3 % de protéine; valeur énergétique: 81 calories; 0,8 % de matière grasse · 1,3% de matière minérale. L'escargot est aussi riche en protéines et en eau que les viande rouges et très pauvre en graisse saturée d'où son caractère diététique. De plus, il est riche en minéraux, en caJcium et en magnésium à des concentrations supérieures par rapport aux autres viandes.

Le Cymbium est également de haute valeur nutritive à l'image des autres espèces d'escargots. Par ailleurs, selon Diouf, (2008), le taux de protéines augmente avec la fermentation entrainant ainsi chez le Cymbium des modifications biochimiques et enzymatiques favorables à une production de protéines. Ainsi, la composition moyenne du Cymbium est de 15,33 % de protéines, 0,54% de lipides, 11,01 % de cendres, L88 % de NaCl et un taux

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 5 d'humidité de 69,08 % (Biralvie, 2003). Sept (7) acides aminés sont présent dans le Cymbium fermenté et sont: la leucine, l'isoleucine, la valine, la lysine, la glycine, la méthionine et la phénylalanine. Seul le tryptophane est absent (Diouf, 2008).

2- Consommation et valorisation de l'escargot L'escargot est utilisé outre dans la consommation humaine dans divers domaines. Des essais d'incorporation de farine d'Achatinafulica cuit, décoquillé, séché et broyé, ont été utilisés pour des rations de poulets "pondeuses " et de poulets de "chair". li faut aussi signaler que l'industrie pharmaceutique occidentale utilise une enzyme, la 13-glucuronidase présente dans le foie de mammifères (bovins notamment) ainsi que dans la glande digestive d'escargots terrestres (Helicidae, Acbatinidae) ou aquatiques (Ampullaria) (Stiévenart et al., 1990). Une étude du Nigeria a établi la faisabilité de l'utilisation de la farine d'escargot géant africain Achatina marginata en tant que substitut partiel de la farine de poisson pour l'élevage de poisson (Clarias gariepinus)(Oyelese, 2007). En Côte d'Ivoire, la consommation de l'escargot s'élève à environ 30 tonnes pour une valeur marchande estimée à 12 624 000 FCFA. Et 74.62% de la population consomment les escargots parmi ceux-ci : 46, 39% en consomment occasionnelle, et 4,12% disent en consommer tous Ies jours (Yao, 2001). L'escargot est de plu en plus demandé pour ses qualités nutritionnelles, gastronomiques et gustatives. La chair d'escargot consommée peut être : frite, blanchie, séchée et fermentée. La chair d'escargot échée se retrouve plus dans les villages pour l'autoconsommation alors que les frites sont plu représentées et vendues sur les marchés sous forme de brochettes d'escargots (Ekoué et al. 2002).

3- Consommation du Cymbium Les consommateurs du Cymbium sont souvent les ménagères organisées parfois en groupe d'individus qui s'approvisionnent quotidiennement auprès des détaillants pour leur consommation personnelle (Diouf, 2008). Les Cymbium fermentés puis séchés sont utilisé quotidiennement pour leur arôme comme condiment dans de nombreuses recettes à base de riz (riz au poisson, à la viande ou à la sauce) (Sembene, 2002).

4- Aspects économiques 4.1- Aspect économique de l'escargot n 2002, les importations mondiales ont atteint, environ 25.000 tonnes pour une valeur de 52 millions de dollars. Les principaux pays importateurs, à savoir la Chine, la France, la Grèce,

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 6 l'Espagne et l'Italie, cumulant ensemble 77% des importations mondiales. Ces grands consommateurs d'escargots s'accaparent des parts de marchés individuels respectivement de 30%, 23%, 10%, 8% et 6%. Le commerce d'escargot est une activité très rentable, car génératrice de revenu. Selon Adou (2007), le commerce d'escargot en Côte d'Ivoire permet de réaliser un bénéfice brut moyen de 184000 FCF A par mois par un producteur semi• professionnel. Ce gain est supérieur à celui obtenu sur les poulets de chair (168.904 FCFA) par un fermier semi-professionnel. Aussi, un commerçant réalise un revenu mensuel qui s'élève à environ 160 .166 FCF A. Une enquête sur la commercialisation des escargots a été conduite sur les marchés de 8 communes d'Abidjan (Côte d'Ivoire). Les résultats montrent que le commerce des escargots est animé par trois acteurs (collecteurs, grossistes et détaillants). Ce sont plus de 1 700 tonne d'escargots Achatina achatina qui sont vendus sur les marchés d'Abidjan. C'est donc un secteur d'activité à haut rendement financier pour le monde rural qui mérite beaucoup d'attention (Otchoumou et al., 2007).

4.2- Aspect économique du Cymbium Traditionnellement destiné à la consommation locale, le Cymbium est aujourd'hui un produit d'exportation fortement rémunératrice réalisant un chiffre d'affaire d'environ 3.5 milliards de FCFA en 1996 au Sénégal. Les sociétés achètent le produit auprès des mareyeuses à 225 FCF A/kg puis, après traitement et congélation, l'exportent en Asie surtout en chine. Dans le secteur artisanat Les hommes et les femmes producteurs achètent le produit frais chez le mareyeuses à raison de 90 FCF A/kg. Après transformation, ils vendent le produit séché à de grossistes qui assurent la distribution dans les différents marchés de l'intérieur et de la sous• région où le prix au détail revient à 600 et 750 FCFNkg (Sembene, 2002). L'exploitation du Cymbium est devenue une activité importante dans l'économie des productrices dans la commune d'Abidjan à Vridi en Côte d'Ivoire.

5- Transformation du Cvmbium 5.1-Traosformation industrielle du Cymbium Au niveau industriel, le Cymbium est traité sous deux formes principales : crue congelée et la forme cuite-congelée. Concernant la forme crue-congelée, il y a trois types : Cymbium avec peau, Cymbium pelé, et organes de Cymbium (Diouf, 2008). Les énormes profits générés par cette activité attirent de grandes unités de transformation.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 7 5.2- Transformation artisanale Au niveau artisanal, la transformation est essentiellement occupée par les femmes avec la présence de quelques anciens mareyeurs reconvertis dans ce métier. En milieu artisanal. la seule technique de transformation réellement connue est la fermentation combinée au séchage, avec des spécificités selon les localités (Diouf, 2008). ), Fermentation Les méthodes utilisées pour faire la fermentation artisanale du Cymbium peuvent varier d'une localité à une autre (Ayessou, 1991). Dans certains endroits par exemple, La masse pédieuse du Cymbium est mise dans des sachets en plastique puis enfouie dans le sable pendant 48 heures; et dans d'autres endroits elle est mise pendant 48 heures dans des bacs remplis d'eau de puits salé ou de sel sec. Après fermentation, la masse pédieuse est lavée à l'eau puis séchée au soleil. Au Sénégal, Le produit est parfois, après lavage, mis dans une solution à base d'benné pour le rendre doré (Gaye et al, 1996). Cependant, la production du Cymbium fermenté est aujourd'hui fortement limitée par la concurrence exercée par les mareyeurs qui achètent le produit frais à de meilleurs prix pour le revendre aux usines qui, après traitement et congélation, l'exportent vers l'Asie. L'essentiel de bactéries responsables de La fermentation se développent de façon optimale à des pH acides. à des températures relativement élevées (40-45°C), et en milieu anaérobie (Sembene, 2002). La fermentation du Cymbium, comme celle des autres produits halieutiques (et des denrées d'origine animale en général), ne se résume pas en une simple dégradation des glucides en milieu anaérobie. C'est un processus complexe au cours duquel plusieurs types de macromolécules, notamment les protéines, les Lipides et les glucides, sont dégradés en molécules simples (Diouf, 2008).

5.3 -:Microorganismes intervenant dans la fermentation de produits de pêche La fermentation est l'une des technologies les plus anciennes utilisées pour la conservation des aliments qui au cours des siècles, s'est affinée et diversifiée. Il existe de nombreux types de produits fermentés. Quels que soient les produits, il se déroule une fermentation naturelle due au développement d'une flore microbienne qui est fonction de la contamination initiale et des conditions de préparation. La fermentation des produits de La pêche est une pratique très ancienne et Largement répandue dans le monde. Dans des conditions aérobies, les microcoques les levures dominent surtout sur les surfaces exposées à l'air. Par contre, dans les conditions anaérobies, les bactéries produisant de l'acide lactique dominent (BO Thi Nguyet Tbu, 2008).

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 8 n Asie, les produits de la fermentation se présentent sous forme de pâtes ou de liquide « ouocnam ». Certains procédés font intervenir un ensemencement en ferments ou l'addition d'un source de carbone (Paludan-Muller et al., 2002). Par contre, en Afrique il s'agit généralement de fermentations spontanées, réalisées par simple incubation des poissons crus, parfois ajouté de sel, aux températures ambiantes (Kouakou et al., 2012). Les acteurs essentiels de la fermentation en sont les bactéries. les levures et les moisissures. li s'agit d'un processus strictement anaérobie (Baliarda, 2003). La fermentation des produit de la pêche est liée à l'activité des enzymes produites par les microorganismes de fermentation comme Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Escherichia co/i, Bifidobacterium, Enterococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Staphylococcus spp et bien d'autres (Dissaraphong et al., 2006). Ainsi, Sani et al.,(2002) ; Anihouvi et al., (2005) ont révélé respectivement dans le momoni et le lahouin, La présence de bactéries lactique ; des genre Bacillus ; Pseudomonas, Pediococcus et Aspergillus. De même Nevry et al., (2011) et Kouakou et al., (2012) ont mentionné la présence d'une grande diversité d'espèces lactiques participeraient dans la fermentation de l'adjuevan. Kuda et al., (2009) ont montré la présence de levures dans les échantillons de poisson fermenté d'Afrique et d'Asie. Plusieurs espèces de levures dont Debaryomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Candida, Pichia, Hanseniaspora et Rhodotorulaont été également identifiées dans l'adjuevan. Ces espèces varient selon la méthode de fermentation (Kouakou et al, 2012). Les bactérie lactiques pourraient être utilisées comme ferment au cours de la préparation du poisson pour rendre ce dernier résistant à la croissance des bactéries indésirables par la production in situ d'acides organiques et de bactériocines (Diop, 2007). Les analyses microbiologiques effectuées sur le Cymbium fermenté à Mbour et à Joal ont montré que la fermentation traditionnelle de Cymbium pepo ou " yeet " est !'oeuvre de plusieurs microorganismes tels que des levures, des germes lactiques, sporulés et acétiques avec une dominance des lactiques (Sembene, 2002).

5.4-Flore de contamination Des flores pathogènes incriminent également plusieurs aliments fermentés. Les travaux de Sembene, (2002) ont montré la présence de bactéries sporulées comme Bacillus, Staphylococcus et de Clostridium dans le Cymbium fermenté au Sénégal. De même Nevry et al., (2011) et Kouakou et al., (2012) ont signalé la présence des coliformes thermotolérants, Streptocoques fécaux, Staphylococcus aureus et de Clostridium sulfita-réducteurs dan l'adjuevan. Selon, ces auteurs les contaminations seraient d'origine fécale en raison des

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 9 conditions d'insalubrité des matériel de production et cutané. Les clostridies sont anaérobie trictes, sulfito-réductrices, tolérant une concentration de sel (NaCL) de 2,5 à 6,5 %. Ils sont fortement protéolytiques et incriminées dans les intoxications alimentaires. Ces germes sont typiques de déjections animales ou telluriques des produits aquatiques (Maiwore et al., 2009). Quant aux coliformes fécaux, ils sont souvent d'origine humaine et reflètent de ce fait l'hygiène des manipulations du produit et pouvant provoquer des intoxications (Sembene, 2002). Par contre les travaux de Sow, (1994) ont montrés une absence de salmonella sur des échantillon de Cymbium fermentés.

5.5-Rôle du sel dans la fermentation Le sel est utilisé au cours de La fermentation des produits halieutiques à des degrés divers. Le sel permet aussi de diminuer la teneur en eau du produit. Enfin, le sel agit par une modification plus ou moins importante de la texture du produit fermenté, tout en conférant à ce dernier un certain goût (Diouf, 2008).

6-Levures Les levures sont des champignons unicellulaires sur une partie ou sur l'ensemble de leur cycle végétatif. Dans la nature, les levures se retrouvent principalement sur les végétaux riche en sucres directement assimilables. Pour leur métabolisme. les levures utilisent des sucre comme source principale de carbone et par conséquent d'énergie. De plus, la plupart des levure sont capables d'assimiler différentes sources d'azote organique et inorganique. Elles utilisent les sels minéraux et les vitamines (par exemple 1.a biotine et la thiamine) pour assurer un développement adéquat. La biotine est essentielle dans les réactions de carboxylation et de décarboxylation et aussi intervient dans la production d'alcools et d'esters. La thiamine favorise la synthèse de l'isoleucine et de la valine (Merabti, 2006). Les levures se développent entre 25°C et 30°C avec un pH variant de 2,4 à 8,6 en général. Elles sont toutes capables de se développer en présence d'oxygène.

6.1-Identification moléculaire des levures L'apparition de la biologie moléculaire basée sur l'analyse directe de I' ADN a permis de développer des méthodes d'identification des micro-organismes plus fiables et plus spécifiques. Ces méthodes moléculaires sont universellement applicables et permettent d'explorer le polymorphisme à différents niveaux (genres, espèces, souches). Les avantages de ce techniques sont les suivants: rapidité, discrimination et reproductibilité, certaines permettent

Mémoire Master li, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 10 même une quantification des micro-organismes (Diguta, 2010). Parmi ces méthodes, l'analyse par PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de la région ITS-5.8S rDNA est l'une des méthodes prédominantes utilisées pour l'identification des levures du vin. Cette méthode est le résultat de la combinaison d'une digestion par des enzymes de restriction à nombre élevé de site de coupure et d'une électrophorèse simple (Kheir, 2012). La PCR-RFLP est une méthode indépendante bien qu'elle peut nécessiter l'extraction d l'ADN d'une culture pure. Elle peut se réaliser directement sur des colonies jeunes (moins de 5 jours) ou directement à partir d'échantillon environnemental. Son principe tel que décrit par l'OIV (2011) repose sur l'amplification de régions spécifiques des unités de répétition de J'ADNr (telles que les espaceurs internes transcrits, Fl'Sl et ITS2, et le gène imbriqué codant pour l' ARNr 5.8S, ou le gène de I' ARNr 26S). Ces régions comportent des séquences fortement conservées et des séquences qui présentent un fort degré de variabilité génétique entre de

ouches d'espèces différentes.

L' ADNr est une région d'environ 1 à 2 Mégabases consistant en une répétition de 100 à 200 copies d'une séquence de 9,137 Kilobases. Chaque unité de répétition contient les gènes codant pour les ARN ribosomiques (ARNr) 5S, 5.8S, 25-28S et J 8S ainsi que trois types de régions qui séparent les gènes. Ces régions sont nommées internai transcribed spacers (ITS1 et ITS2), externat transcribed spacers (ETS 1 et ETS2) et non transcribed spacers (NTS 1 et NTS2).

Dans la majorité des cas, les produits amplifiés par PCR issus de souches de la même espèce et du même genre ont des tailles moléculaires identiques, et les espèces du même genre présentent des tailles similaires. La différence de séquence est mise en évidence par l'analyse de restriction en utilisant plusieurs endonucléases de restriction, dont Cfo I et Hae m. Les profils de restriction diffèrent suivant les espèces.

Plusieurs amorces ont été décrites pour l'amplification de la région ITS mais le couple d'amorces rrs 1 et ITS4 est le plus couramment utilisé. Les études menées par Esteve-Zarzeso et al., (1999) utilisant la technique de I' ADNr PCR-RFLP a permis d'identifier environ 132 espèces de levures appartenant à 25 genres de levures différents,

7- Aspect physico-chimique des produits de pêche fermenté

Les composés physico-chimiques des produits de pêche fermentés d'Afrique varient suivant les méthodes de productions. Toute fois le pH varie très faiblement d'un produit à l'autre. Ainsi,

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 11 le pH des poissons fermentés Africain tel que le lahouin et le momoni, est environ 6 (Sanni et al., 2002; Anihouvi et al,. 2005). Il en est de même pour l'adjuevan avec un pH compris entre 6,5 et 5,6 avec la teneur en sel comprise entre 2,2 et 5, 1 % de NaCL (Kouakou et al, 2012). Les travaux de Sembene, (2002) sur le Cymbium fermenté à différents endroits ont montré que dans la matière première du Cymbium cru, il y a II ,01 % de cendres. 1.88 % de NaCL. Dans le Cymbium fermenté de Mbour, nous avons 8,J J à 5,56% de cendres. Dans le Cymbium fermenté de Joal, il a été mentionné 3,37 à 3,96 % de cendres, 0,48 à 0,97 % de NaCL. Toute fois la matière première est plus riche en cendres que les produits transformées aussi bien à Mbour qu'à Joal. Ces différences de qualités chimiques obtenues sur du Cymbium fermenté sont liées certainement aux techniques de transformation. Elle pourrait être due, de la saumure utilisée et de la durée de fermentation et/ou de séchage. II apparaît dès lors que la qualité chimique d'un produit fermenté dépend des techniques utilisées pour faire la fermentation. Le pH moyen du Cymbium fermenté est soit de 7,6 donc proche de celui du mollusque vivant, soit Légèrement acide entre 6,3 et 6,4 (Diouf, 2008). Les résultats obtenus dans le cadre du suivi des paramètres de transformation artisanale du Cymbium le pH du produit fini évolue entre 6 et 8 selon la méthode de transformation artisanale.

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 12 MATERIEL ET METHODES

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 1-MATERlEL

1.1-Matériel biologique Le matériel biologique a été l'escargot (Cymbium souliei) fermenté traditionnellement prélevés à Treichville et à Yopougon.

Figure 1: Photographie de Cymbium avec Figure 2: Photographie de Cymbium coquille (5 x 10 cm) fermenté (10 x 15 cm)

2-METHODES

2.1- Echantillonnage

Une enquête a été déjà effectuée pour identifier deux marchés dans le district d'Abidjan à savoir le marché de Yopougon et de Treichville, très fréquentés tant par les vendeuses (grossistes et détaillantes) que par des populations de toutes les classes sociales. Deux (2) commerçantes ont été choisies en fonction de leur régularité par marché. En effet, des prélèvements de trois (3) échantillons d'escargot (Cymbium soulieïï fermentés ont été faites de façon aseptique par commerçante d'où un tota I de douze ( 12) échantillons, dont V l et V2 correspondent respectivement à la vendeuse numéro 1 et numéro 2. Par ailleurs, les douze échantillons ont été prélevés sur une période de quatre semaines en raison de trois prélèvements par semaine. Après chaque prélèvement, les échantillons ont été étiquetés, mis dans une glacière contenant de la glace, transportés au laboratoire et analysés immédiatement.

2.2- Méthodes d'analyses microbiologiques

Les milieux utilisés pour la réalisation de cette étude ont été préparés selon les prescriptions des fabricants.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014·2015 Page 14 •!• Le milieu MRS (Man Rogosa and Sharp; Biokar Diagnostics, France) : Verser 62 g de poudre dans un litre d'eau distillée. Porter à ébullitionjusqu'à dissolution complète.

Répartir et stériliser 15 minutes à 121°C à l'autoclave.

•!• La gélose de SABOURAUD au chloramphénicol : Mettre en suspension 45,5 g de milieu SABOURAUD dans 1 litre d'eau distiUée. Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l'y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution.

Répartir et stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant J 5 minutes.

•!• Gélose VRBL (gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre ; Biokar Diagnostics, France) : Mettre en suspension 38.5 g de milieu VRBL dans l litre d'eau distillée. Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l'y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution. Ne pas surchauffer. Ne pas autoclaver.

•:. La gélose TSN (gélose Tryptone-Sulfite-Néomycine; Biokar Diagnostics, France) : Mettre en suspension 40,0 g de milieu TSN dans 1 litre d'eau distillée. Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l'y maintenir durant le temps nécessair à sa dissolution. Répartir en tubes. Stériliser à l'autoclave à J 21 °C pendant 15 minutes.

•!• La gélose Hektoen (Biokar Diagnostics, France) : Mettre en suspension 75,1 g de milieu Hektoen dans I litre d'eau distillée. Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l'y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution. Ne pas autoclaver. Refroidir et maintenir le milieu à 44-47°C. Couler en boîtes de Pétri stériles. Laisser solidifier sur une surface froide. Et faire sécher les boîtes ( couvercle entrouvert),

à l'étuve. •!• Le bouillon RV (Rappaport-VassiUadis ; Biokar Diagnostics, France) : Mettre en olution 26,6 g du bouillon RV dans 1 litre d'eau distillée. Agiter lentement jusqu'à dissolution complète. Répartir en tubes ou en flacons. Stériliser à l'autoclave à l l 5°C

pendant 15 minutes.

2.2.1- Préparation de la suspension mère et des dilutions (Nonne NF EN ISO 6887-1 1999 relative à La suspension mère et dilutions décimales)

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 15 Dix (10) g du prélèvement ont été mis dans 90mL d'EPT (Eau Peptonée Tamponnée) BioMérieux, France stérilisée. Le mélange a été broyé au stomacher puis le surnageant a été récupéré dans un flacon. En effet, le surnageant récupéré constitue la suspension mère. Ensuite 2 1 mL de la suspension mère est mélangé à 9 mL d'EPT conduit à la dilution 1.0- . Un (1) mL de cette solution donne avec 9 mL d'EPT, la solution 10-3 et ainsi de suite jusqu'à la dilution 10-

9

2.2.2-Détermination des germes 2.2.2.1-Levures (Normes XP-VOS-059-oct 1996)

L'ensemencement de lmL des dilutions 10-1 à 10-3 de chaque échantillon a été réalisé de façon aseptique dans la masse. Environ 15 mL de milieu Sabouraud au chloramphénicol en surfusion (47°C±2°C) ont été coulés au-dessus de l'inoculum. Après homogénéisation, chaque boîte de pétri a été laissée se solidifier à La température ambiante du laboratoire. Les boîtes de Pétri ont été incubées pendant 5 jours à 25°C, suivie de la Lecture au bout de 3, 4 et 5 jours. Les colonies lenticulaires ; rondes, en profondeur de la gélose et généralement blanche pour les levures ont été notées. Par échantillon et par boîte de péri, cinq colonies d'aspect différentes ont été isolées de façon au hasard sur le même milieu de culture pour la suite des analyses.

•!• Identification présomptives de levures Isolement pour l'identification de Candida a été fait sur milieu spécifique « milieu Candida ch.romogénique agar » puis incubé à 30°C pendant 72 heures. La lecture a été faite selon la coloration des colonies (bleu, rose, blanche, verte, violette) correspondant à différentes espèce de Candida. Pour la recherche des saccharomyces, les colonies ont été isolées sur milieu gélose à la lysine puis incubées à 30°C pendant 72 h. Les colonies de levures ne pourront pas y croître, seront considérées comme des saccharomyces.

2.2.2.2- Bactéries Lactique (NF ISO 15214 Septembre 1998) Le dénombrement et l'isolement des bactéries lactiques a été fait sur milieu MRS. En effet. le milieu MRS (Man Rogosa and Sharp) a été utilisé pour l'ensemencement des bactérie lactiques. Un volume de 0,1 mL des dilutions 10-3 à 10-7 a été utilisé pour ensemencer les boîtes de pétri contenant le milieu MRS préalablement coulé et solidifié. Celles-ci ont été incubées à 30°C pendant 72h en anaérobiose. Au terme de la durée d'incubation les colonies blanchâtres et naines ont été comptées suivie d'isolement.

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 16 •!• Coloration de Gram La coloration de Gram permet de distinguer deux types de bactéries : celles dont la paroi cellulaire est riche en lipide (Gram négatif) et celles dont la paroi en est pauvre (Gram positif). Un frottis de culture bactérienne est réalisé sur une lame puis fixé rapidement à la flamme. Il a été ensuite recouvert de violet de gentiane et après 30 à 60 secondes. l'excès de colorant a été éliminé puis la préparation a été rincée avec de l'eau distillée stérile. Ensuite du lugol a été ajouté pendant 60 secondes. L'alcool a été étalé sur la préparation puis lavée à l'eau distillée stérile. Enfin, la fuchsine a été ajoutée pendant 60 secondes puis lavée à nouveau avec l'eau distillée, puis séchée et observée à l'immersion. Les bactéries à Gram positif apparaissent violettes et les bactéries à Gram négatif sont rouges ou roses.

2.2.2.3- Coliformes totaux (37°C/ 24 -48h), (NFVOS-060-mars 1996)

La numération des coliformes fécaux a été réalisée par ensemencement de l mL des di lutions 2 3 10-1, 10-2, 10-3 dans la gélose VRBL. A partir des dilutions 10-1, 10- et 10- aseptiquement 1 mL a été porté dans des boîtes Pétri stérile, ensuite 15 ml environ de V:RBL y ont été coulé. L'ensemencement se fait en double couche. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 h puis 48 h. Le développement des coliformes sur milieu VRBL s'exprime par l'apparition de colonies rouges foncées, rondes lenticulaire avec un diamètre de moins de 0,5 mm.

•!• Recherche d' E. coli sur milieu Rapid 2 d' E.coli: L'ensemencement par incorporation

de l ml des dilutions 10-1, l 0-2, l 0-3 ont été portées aseptiquement dans des boîtes Pétri stérile. Ensuite, 15 mL de Rapid 2 E.coli y ont été coulés. Après ensemencement et homogénéisation, chaque boîte a été laissée se solidifier à la température ambiante du laboratoire. Enfin, les boites de pétri ont été incubés à 37°C pendant 24 h. Le développement des E.coli sur milieu Rapid 2 E.coli s'exprime par l'apparition de colonies violettes.

2.2.2.4- Anaérobies sulfite-réducteurs (ASR) (spores de Clostridium; NFV 08-061-oct 1996) L'ensemencement par incorporation de l ml a été réalisé en tubes (ensemencement en gélose profonde). Un (1) ml des dilutions 10-1 et 10-2 ont été transférés dans les tubes. Ensuite, le milieu TSC (Trypticase Sulfite Néomycine) en swfusion (47°C) a été reparti dans chaque tube (environ 10 ml). Le mélange inoculum-milieu a été homogénéisé rapidement par un mouvement de rotation de poignet, sans créer des turbulences qui pourraient provoquer une aération du milieu de culture. La gélose a été laissée refroidir rapidement et solidifiée puis le

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 17 tubes ont été incubés dans une étuve à 37°C pendant 24h. Les colonies noires caractéristiques, anaérobie sulfito-reducteur ont été comptées.

2.2.2.5-Salmonelles (NFVOS-052-mai 1997) Elle a été recherchée selon la méthode NFVOS-052-mai 1997 pour la recherche des Salmonella. Notons qu'une analyse pour la recherche des Salmonella a été un caractère qualitatif et non quantitatif. La recherche de Salmonella nécessite quatre étapes successives :

1- Pré-enrichissement non sélectif. La prise d'essai 10 g d'échantillon sera additionnée de 90 mL d'EPT c'est à dire diluée au 1/10 pour une incubation de 16 à 20 h à 37°C.

2- Enrichissement sélectif environ 10 ml de bouillon sélectif Rappaport -Vassiliadis (RV) ont été ensemencés avec 1 ml du milieu de pré enrichissement puis incubés à 37°C pendant l 8 à 24h .

3- Isolement : A partir du milieu d'enrichissement incubé, l'inoculum est prélevé à l'oëse. L'inoculum est ensuite déposé sur les boîtes de Pétri puis étalé sur le milieu Hektoën sous forme de stries d'épuisement à la surface de la gélose. Le milieu sélectif est incubé à 37°C pendant 24h. Les colonies présentant les caractéristiques macroscopiques des salmonelles (colonies verdâtre ou bleuâtres avec ou sans centre noir sur Hektoen) sont ensuite comptées.

Traitement des résultats des dénombrements : Le taux de germes recherchés (N) contenus dans l g d'escargot est déterminé par la formule mathématique utilisée pour tous les dénombrements

• .1: Nombre d'UFC par g ou par mL de produit initial • L colonies. Somme des colonies des boites interprétables • VmL: volume de solution déposée (1 ml) • 'lh: nombre de boites considéré à la première dilution retenue • 't2: nombre de boite considéré à la seconde dilution retenue • di: facteur de la première dilution retenue

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 18 2.2.2.5-Evaluation de la qualité microbiologique

Les échantillons prélevés ont été évalués en recherchant par des méthodes standards Le paramètres microbiologiques de qualité. Tl s'agit des coliformes totaux. Escherichia coli (NF ISO 4831), des Salmonelles (NF V 08 - 052), des levures (ISO 7954) et des spores d 'Anaérobie Sulfito-réducteurs (NF V 08-061 ). Cette évaluation a été réalisée en utilisant comme supports, les techniques standards d'analyses rapportées par Joffin et Joffin (2003). L'interprétation de résultats a été faite suivant un plan à deux classes en référence aux critères microbiologique pour les produits animaux et dérivés (guide législatif et réglementaire français, N°8 l 55 du 12 décembre 2000), fixant le seuil de tolérance à M = 103 UFC/g ou mJ pour les coliformes thennotolérants (E.coli, 44°C) ; à M = l 02 UFC/g ou /ml à l'absence dans 25 mJ de produit analysé pour les salmonelles.

2.2.3-Caractérisation moléculaire des levures 2.2.3.J-Extraction d'ADN Une colonie de souche pure de levure est prélevée à l'aide d'une pipette Pasteur stérile et barbotée dans I ml d'eau stérile. La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 85000 rpm pendant dix (10) minutes. Le culot de levures recueilli a été ensuite suspendu dans 200 µI de Chelex l 00 (Bio-Rad) préalablement préparé selon les instructions du fabricant. Le Chelex 100 est une résine échangeuse d'ions qui empêche la dégradation de l'ADN par chélation des ions métalliques pouvant agir en tant que catalyseurs dans la dégradation de l'ADN lors de la phase de dénaturation. La nouvelle suspension obtenue est homogénéisée à l'aide d'un vortex pendant dix (J 0) secondes. Un chauffage au bain-marie à 100°C pendant dix (10) minutes est réalisé suivi d'un refroidissement brusque dans la glace. Ce choc thermique permet la lyse des cellules et la libération de l' ADN. Une nouvelle étape d'homogénéisation à partir d'un vortex pendant dix (10) secondes est réalisée suivie d'une centrifugation à 12000 rpm pendant dix (10) minutes. Dans Le culot se trouve les protéines capturées par le Chelex 100 et dans le surnageant se trouve l' ADN des levures. La conservation del' ADN se fait à -20°C.

2.2.3.2- Quantification del' ADN extrait Le dosage et Je contrôle de la qualité d'ADN extrait sont réalisés par spectropbotométrie à l'aide d'un spectrophotomètre (Ray Leigh, Chine). La quantification del' ADN et des protéines est réalisée à l'aide de cuves en quartz de cinq (5) centimètres. La lecture de l' ADN se fait à

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 19 260 nm contre un échantillon appelé« blanc» contenant de l'eau stérile en lieu et place de la suspension contenant de l' ADN, tandis que celle des protéines se fait à 280 nm. Les rapports des DO (260 nm/280 nm) sont déterminés afin d'évaluer Ja pureté des échantillons. Ainsi un rapport de DO 26o/DO zso égal à 1,7 indique qu'il n'y a pas une contamination en protéines. Auquel cas un traitement phénol chloroforme (v/v) suffit pour éliminer cette contamination en protéines. Le rapport DO 26o/DO zso supérieur à 2 indique une contamination par l'ARN. Dans ce cas, un traitement à la RNase permet de se débarrasser de !'ARN contaminant. L' ADN a une absorbance maximale à une densité optique (DO) de 260 nm. Cela permet de calculer la concentration des ADNs sachant qu'une unité DO à 260 nm correspond à une solution d'ADN double brin de 50 µg/ml (Kheir, 2012).

2.2.3.3-Amplification par PCR de la séquence ITS1-S.8S-ITS4 L' ADN extrait est prélevé et amplifié par PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Pour ce faire, les amorces universelles: JTS 1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') et [TS4 (5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') ont été utilisées. Les conditions de PCR retenues ainsi que la réalisation du mélange réactionnel (tableau 1) sont données ci-dessous.

L'amplification est réalisée dans le thermocycleur (Techne® Prime Thermal Cycler Range, USA) selon Le programme décrit par Esteve-Zarzoso et al., (1999):

• Première étape : Dénaturation initiale à 95°C pendant 5 minutes • Deuxième étape: (35 cycles) Dénaturation à 94°C pendant l minute Hybridation à 55,5°C pendant 2 minute Elongation à 72°C pendant 2 minutes • Troisième étape: Elongation finale à 72°C pendant 10 minutes.

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 20 Tableau 1 : Composition du mélange réactionnel (volume final 50 ul)

Concentration finale dans Volume prélevé Produits Je mélange réactionnel EauMiWQ 23,25 µl PerfectTaq DNA PCR Buffer 2,5 µI 1 OX (Sprime) MgCh, 6 H20 (Promega) 3 µI l,5mM dXTP (Promega) 0,5 µ) 0,2Mm TTS l (Promega) 0,25 µ) 0,5 µM ITS4 (Promega) 0,25 µ1 0,5 µM PerfectTaq DNA polymerase(5 0,25 µI 0,025 U/µI prime) ADN 20 µ] 10-30ng/µ1

Les produits de PCR sont contrôlés par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5 %). Pour la préparation du gel, l'agarose est suspendu dans 50 ml de tampon TBE 0,5X [45 mM Tris• Base (Sigma), 45 mM acide borique (Sigma), 1 mM EDTA (Sigma)]. La suspension est chauffée jusqu'à ébullition. Le gel liquide est laissé refroidi à température ambiante pendant 5 minutes puis une goutte de bromure d'éthidium y est incorporée avant de le couler dans un support de gel. Une fois solidifié, le gel est immergé dans une cuve à électrophorèse contenant du TBE 0,5X. Des aliquotes de 10 µI de fragments amplifiés sont mélangés à 2 µl de tampon de charge (50 % TE, pH 8; 50 % glycérol; bleu de bromophénol) avant d'être déposés dans les puits du gel. Le gel est visualisé à l'aide d'un transilluminateur (Vilber Lourmat) sous illumination UV après une migration à 90 Volts pendant 90 minutes. La taille des fragments d'ADN est déterminée à partir du marqueur de taille moléculaire Reddy Run Superladderlow 100 bp (Thermo Scientific) utilisé comme référence. Les produits de PCR sont conservés par la suite à-20°C pour d'autres utilisations.

2.2.3.4-Digestioo de l' ADN amplifié L'enzyme utilisée pour la digestion de I' ADN amplifié est la suivante : Cfo I. Elle a été choisie d'après la littérature (Esteve-Zarzoso et al., 1999).

La digestion a été réalisée dans des tubes eppendorf contenant chacun 20 µI d'un mélange réactionnel (tableau 2). Ces tubes sont placés au Bain-Marie à 37 °C pendant 6 heures. Les fragments de restriction sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel d'agarose 3 % (p/v) contenant du BET immergé dans une cuve à électrophorèse contenant du TBE 0.5X. Des

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 21 aliquotes de 20 µl de fragments digérés sont mélangés à 2 ~LI de tampon de charge (50 % TE pH 8; 50 % glycérol; bleu de bromophénol) avant d'être déposés dans les puits du gel. Le gel est visualisé à l'aide d'un transilluminateur (Vilber Lourmat) sous illumination UV après une migration à 80 Volts pendant 180 minutes pour I' ADN digéré. La taille des fragments d'ADN est déterminée à partir du marqueur de taille moléculaire Reddy Run Superladderlow l 00 bp (Thermo Scientific) utilisé comme référence.

Tableau 2: Composition du milieu réactionnel de la RFLP (volume final 20µ1).

Produits Volume prélevé

ProduitPCR 10 µl

EauMilliQ 7 µ)

Tampon d'Enzyme (Promega) 2 µ)

Enzyme 10 U.µL-1 (Promega) 1 µ)

2.3- Analyses physicochimiques Les analyses chimiques sont effectuées sur du Cymbium fermenté. Les méthodes du CNERNA (Gautier et al, 1961) pour le dosage des cendres et celle de Mohr pour le chlorure de sodium ont été utilisées.

2.3.1- Détermination du pH Le pH été a déterminé en plongeant l'électrode d'un pH-mètre (pH/ORP Meter HI 2211) dans 50 ml de la suspension mère. La valeur du pH est directement lue sur l'écran de l'appareil.

2.3.2- Détermination de l'acidité titrable Le taux d'acidité titrable a été obtenu par dosage de 10 ml de la suspension mère avec une olution d'hydroxyde de sodium 0, 1 N après ajout au préalable de deux à trois gouttes de phénolphtaléine. La fin du dosage est marquée par une coloration rose pâle. Pour chaque échantillon, deux essais ont été réalisés. Le taux d'acidité titrable exprimé en pourcentage d'acide lactique a été calculé à l'aide de la formule suivante:

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 22 Vol NAOH x NNAOH x 0,09 x 100 %Acidité titrable = PE

Vol NAOH = volume de la solution d'hydroxyde de sodium

NAOII = Normalité de la solution d'hydroxyde de sodium ; PE = Prise d'essai 0,09 = milliéquivalent gramme d'acide lactique

2.3.3- Dosage des cendres Il s'agit de déterminer les matières minérales totales en pesant les cendres obtenues après incinération d'une quantité donnée de produit. Cinq (5) g d'échantillon de Cymbium ont été introduits dans une capsule préalablement tarée en la répartissant en une couche uniforme non tassée. La capsule a été ensuite placée pendant 2 heures dans un four électrique à une température allant de 550 à 650°C. Elle a été ensuite refroidie dans un dessiccateur puis pesée avec précision. Soit P le poids en gramme du résidu, la teneur en cendres en gramme pour 100 g d'échantillon est: 20P. La teneur en cendres exprimée en grammes pour 100 g d'échantillon èche est: 20P/l 00-B (H est Je pourcentage d'humidité).

2.3.4- Dosage du chlorure de sodium Un (1) g d'échantillon de Cymbium et 50 ml d'eau distillée sont introduits dans un bécher et portés au bain marie pendant 15 mn. 5mL d'acétate de zinc à 15 % et 5 mL de ferrocyanure de potassium à 30 % Y ont été ensuite ajoutés. Après refroidissement, Je contenu du bécber a été complété avec de l'eau distillée jusqu'à 100 ml dans une fiole jaugée. 10 ml de filtrat ont été prélevés et mélangés à 1 mL de bichromate de potassium à 5 % puis titrer avec AgN0(0,1 N). Le taux en chlorure de sodium est donnée par la formule suivante: % de NaCL = V x 0.00585 x 100/PE x 10 V= volume nécessaire pour titrer; PE = prise d'essai

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 23 2.4-Traitement des données et analyses statistiques L'analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée avec le logiciel R pour comparer les variables mesurées sur les différents échantillons de Cymbium fermenté. Les différences sont considérées comme significatives pour des valeurs de P < 0,05. Ce logiciel a permis également de calculer les moyennes et les écarts types des paramètres analysés.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 24 RESULTATS ET DISCUSSION

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 1-Résultats 1.1-Flore microbienne du Cymbium fermenté 1.1.1-Charge microbienne Les résultats des dénombrements des germes réalisés sur des échantillons de Cymbium fermenté, prélevés dans les communes de Treichville et de Y opougon sont consignées dans le tableau 4. La charge de bactéries lactiques est en générale la plus importante suivie de celle des levures dans l'ensemble des échantillons. Les charges sont donc comprises respectivement entre 2,27 106 ± 0,05 104et 7,92 106 ± 2,6 103 UFC/gpour les bactéries lactiques, entre 1,47103 4 ± 0,5 102 et 7,19 104 ± 1,2 102 UFC/g pour les levures, entre 1,52. 102 ± 0,6 102 et 5,27 10 ± lA 103UFC/gpourles Coliformestotauxetentre 1,91 102±0,1102 et5,85102±0,6 lü2 UFC/ g pour les aérobie Sulfito-Reducteur (ASR). Les charges de bactéries lactiques des échantillons des vendeuses 2 de chaque commun sont significativement plus importantes (p<0,05) que celles des échantillons des vendeuses 1. Ces analyses microbiologiques du Cymbium fermenté ont montré que la charge de levures des 2 échantil.lons prélevés chez la vendeuse l de Treichville (7,19 105 ± 1,2 10 UFC/g) est significativement plus importante que celle de la vendeuse 2 de Yopougon (1,47 103 ± 0,5 102 UFC/g) au seuil (p<0,05). Au même seuil, les charges de coliformes totaux observées sur les échantillons de la vendeuse 2 de Yopougon sont significativement plus fortes que celles des échantillons de la vendeuse 2 de Treichville. A l'exception de ces différences de charge si dessus, aucune différence significative n'a été observée dans les charges de coliformes totaux et ASR au sein d'une même commune et d'une commune à une autre. L'analyse microbiologique a aussi révélé sur l'ensemble des échantillons. une forte présence de Salmonelles. n ressort également que les échantillons de la vendeuse 2 de Y opougon portent les plus importantes charges de flores pathogènes Salmonelles, anaérobie• sulfito-réducteur).

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 26 Tableau 3: Moyenne des Charges des différents microorganismes du Cymbium fermenté en UFC/gde

Bactéries 1~s lactiques Levures Coliformes totaux ASR Salmonelles 2 2,69 .106± 1,7 7,19.104 ± 4,02.10 ± 3,12. 102± 1,1 101b 1,2 102b l 0101 b l o> ' Yl + Treichville 3 2 2 7,92106 ± 2,6 2,55.10 ± 1,52. l 0 ± 0,60 1,91.10 ± 103b 28 102 a 0 11028 + V2 1,010 ' 2,27. 106 ± 0,05 l,87.103 ± 2,98. 102 ± 0,3 3,89.1<>2 ± 104a 0,4l02a 102b 0 31Q2•b + Vl ' Yopougon 2 6,95.106 ± 1,7 1,47.103 ± 5,27.102 ± 1,4 5,85.10 ± 2 2 Y2 103b 0 5 10 a 102 C 0 , 6 10 C + '

+ : Présence de Salmonelles VI, V2: Vendeuse 1 et 2; ASR: Anaérobie Sul:fito-Reducteur Sur une même ligne, les valeurs moyennes portant des lettres (a, b et c) différentes sont significativement différentes (p < 0,05)

1.2- Résultat de l'évaluation de la qualité microbiologique

La présence des Salmonella spp dans tous les échantillons de Cymbium souliei analysés n'est pas conforme aux prescriptions normatives qui recommandent une absence de ce microorganisme pathogènes dans les produits alimentaires (norme codex pour les produits de la pêche: le règlement (CE) n°2073/2005 et guide législatif et réglementaire français, N° 8155 du 12 décembre 2000). En effet, les bactéries du genre Salmonella et principalement Suiphy et S. paratiphy possèdent de nombreux facteurs de virulence : présence de pili, production de toxines, capacité à survivre dans les macrophages et présence de plasmide de virulence (Sutra et al., 1998) et sont associées principalement aux toxiinfections Alimentaires collectives (TIAC). Les ASR sont utilisés comme indicateurs de contamination fécale, d'origine humaine ou animale dû aux contaminations par les matières fécales, manipulations par personnel ayant une mauvaise hygiène et le contact avec matériel soui lié.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 27 1.3- Résultat du test d'identifications présomptives des souches de levures

Le test présomptif sur les milieux candida chromogénique a servi à l'isolement et à la différentiation par la couleur de différentes souches de levures. Ainsi donc sur les quarante ( 40) souches de levures isolées, le test d'identification présomptive sur le milieu candida chromogénique a permis de distinguer cinq (5) couleurs différentes de colonies qui sont: Rose pâle (17 colonies), couleur naturelle crème (3colonies), Vert moyen (2colonies), Bleu métallisé (13 colonies), Violette (5 colonies) (Tableau 5, Figures 3 et 4). Ces germes de différente couleurs seraient probablement: C. albicans (vert moyen); C. tropicalis (Bleu métallisé) ; C. krusei, C. apicola (Rose pâle).

Les souches de couleur Violette et de couleur naturelle (crème) sont soit d'autres candidas ou soit d'autres levures. Ce test est positif et confirme la présence de plusieurs espèces de levure du genre candida participant dans la fermentation du Cymbium.

Le second test d'identification présomptive sur la gélose à la lysine a servi à l'isolement des souches pour l'identification de saccharomyces, incapable de croitre sur ce milieu de culture. Toutes les souches isolées sur ce milieu dans cette étude ont pu croitre. Cela démontre l'absence de Saccharomyces parmi toutes les souches isolées.

Tableau 4 : Identification présomptive des levures isolées sur milieu candida chromogénique et la gélose à la lysine des levures.

Milieu Milieu candida chromozênique Lysine

Coloration Rose Couleur Couleur Couleur CouJeur souches/échan~ pâle crème Violette Verte Bleu Vl 6 2 2 0 2 + Treichville V2 2 0 0 0 l Vl 4 l 3 2 7 Yopougon V2 5 0 0 0 3 Total souches 17 3 5 2 13

Vl, V2: Vendeuse J et 2; échant: échantillon +: Croissance

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 28 r

Figure 3 : Photographie de 1 'identification des Figure 4 : Photographie de l'identification levures sur milieu candida chromogénique (5 x 5cm) des levures sur milieu candida chromogénique (5 x 5 cm)

1.4-Identification moléculaire des levures 1.4.1-Pro.fil PCR-ITS L'amplification de la région 5,8S-ITS de I 'ADNr après révélation par électrophorèse en gel d'agarose a été positive pour 33 isolats sur les 40 souches de levures présomptives soumises à cette analyse. Les 33 isolats positifs sont composés de 8 isolats provenant des échantillons des vendeuses de Treicbville et de 25 isolats provenant de celles de Yopougon. En fonction de la taille des amplicons générés (Figures 5 et 6) les isolats positifs ont été classés en 4 groupes (I, Il, ID, IV) (Tableau 6). Les isolats du groupe I (15 isolats) ont tous donné un produit d'amplification de 750 pb alors que ceux du groupe II (9 isolats) et du groupe ill (5 isolats) ont généré un amplicon de 600 pb et 550 pb respectivement. La taille de l' amplicon des isolats du groupe IV ( 4) a été estimée à 480 pb. Les groupes de levures isolées sont inégalement répartis dans les deux zones d'étude. Les levures du groupe I représentent 45,5 % de l'ensemble des isolats soit 44 % des isolats de Yopougon et 50 % de ceux de Treichville, Les levures du groupe Il représentent 27,3 % des isolats soit 28 % des isolats de Y opougon et 25 % de ceux de Treichville. Les isolats du groupe III représentent 15,12 % des isolats soit 12 % des isolats de Yopougon et 25 % de ceux de Treichville. Les levures du groupe IV sont spécifiques du Cymbium fermenté de Yopougon et représentent 16% des isolats soit 12,12 % des isolats de la commune.

Mémoire Master li, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 29 Figure 5 : Produits d'amplification par les amorces ITS 1 et ITS 4 de la région 5,8S-ITS de I' ADNr des souches de levures isolées du Cymbium fermenté.

SIS Sl6Sl7 SIR Sl9 M S20 S21 S22 S2.l S24 S2S S26 S27

Figure 6: Produits d'amplification par les amorces ITS 1 et ITS 4 de la région 5,8S-ITS de l'ADNr des souches de levures isolées du Cymbium fermenté.

M : marqueur de taille moléculaire Reddy RunSuperladderlow 100 bp (Thermo Scientific) Sl, S2, S3, S4, SS, S6, S7, SS, S9, SlO, SU .... : pistes contenant des amplicons des different isolats.

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 30 Tableau 5 : Tailles des produits PCR et pourcentages des groupes de levures identifiés

Taille du Nombre Nombre Ratio total produit d'isolats à d'isolats à d'isolats Groupe PCR Yopougon Treichville Total (%) (Ratio en %) (Ratio en%) Groupe! 750 pb 11 (44%) 4 (50%) 15 45,45 Groupell 600pb 7 (28%) 2 (25%) 9 27,3 Groupelll 550 pb 3 (12%) 2(25%) 5 15,12

GroupelV 480pb 4(16%) 0 4 12,12

Total 25 (100%) 8 (100%) 33 100

1.4.2-Prédomioaoce (variation) des espèces de levures Le profil RFLP des produits PCR est obtenu après hydrolyse enzymatique. Les produits PCR des 33 souches positives ont été digérés par une (1) enzyme de restriction : Cfo I. L'amplicon de chaque levure du groupe I a donné un profil RFLP caractéristique de Candida Apicola. En effet, l'hydrolyse enzymatique de l' amplicon de chacune des levures du groupe I a permis d'obtenir deux fragments de 250 pb et 500 pb après digestion par CfoI. A l'exception des levures du groupe I, les amplicons des levures des autres groupes n'ont pas été digérés par l'enzyme C/olutilisée dans cette étude (Tableau 7; Figure 7).

850pb

750pb - SOOpb ,,.,_ 2S8pb

Figure 6: Fragments de restriction des différents produits PCR obtenus à partir de 1 'hydrolyse enzymatique par C/ol

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 31 Tableau 6: Profil de digestion enzymatique et espèces de levures isolées dans les échantillons de vin de raphia collectés à Treichville et Yopougon. ~=---d -!

Profil Fragment de Espèces restrictions Cfol Identifiées Candida apicola ; I 250+500 Kluyveromyces Aestuarii

Il 600 Non Identifiée ID 550 Non Identifiée

IV 480 Non Identifiée

l.5- Paramètres physico-chimique du Cymbium fermenté

Les échantillons prélevés avec des vendeuses dans les communes de Treichvillc et de Yopougon ont été soumis à quelques analyses physico-chimiques dont la mesure du pH, la détermination de l'acidité titrable, les cendres et le chlorure de sodium. Les valeurs moyenne de ces paramètres par commune (site) d'échantillonnage sont présentées dans le tableau 7.

La mesure du pH a révélé une très faible variation autour de la neutralité (7) dans l'ensemble des échantillons. Ainsi les échantillons de Cymbium fermenté de TreichviUe ont un pH variant de 6,56 ± 0,55 et 8,26 ± 0,36 contre une valeur comprise entre 6,56 ± 0,55 et 7, 14 ± 0, 12 pour ceux de Yopougon. Mais en comparant les échantillons par vendeuse. Il est noté une différence significative au seuil p<0.05 entre les échantillons de la vendeuse 2 de Treicbville avec un pH basique de 8,26 ± 0,36 et les autres échantillons.

Le pourcentage d'acidité titrable exprimé en pourcentage d'acide lactique est très faible et sensiblement identique dans l'ensemble des échantillons. li est en moyenne de 0.04 et 0,05 % pour les échantillons de Treicbville et de 0,03 à 0,04 % pour les échantillons de Yopougon.

Concernant les cendres, la valeur maximale est de 6,41 ± 0,32 pour les échantillons de vendeuses de Treichville donc significativement plus importante (p<0,05) que celle 4,94 ± 0.87 des vendeuses de Y opougon.

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page32 Enfin, quant aux chlorures de sodium, les taux sont significativement différents avec de moyennes variant de 3,75 à 4,39 ± l,60 % dans les échantillons des vendeuses de Treichville contre celles comprises entre 2,29 ± 0,19 et de 1,79 ± 0,05 % pour ceux des vendeuses de Yopougon.

Les résultats des paramètres analysés sont consignés dans le tableau 7 ci-dessous.

Tableau 7 : Paramètres physicochimiques du Cymbium fermenté

pH Nacl(%) Cendres Acidité p~ s (g/100) titrable (%) Treichv ille VJ 6,61 ± L,05 a 4,39 ± 1,60 b 4,94 ± 1,29a 0,05 ± 0,01 b

1 V2 8,26 ±0,36 C 3,75 ± 1,50 b 6,41 ± 0,32b 0,04 ±0,01

Yopougon Vl 7,14±0,I2b 2,29 ± 0,19 ab 4,48 ± 1,61· 0,03 ± 0,01 a

V2 6,56 ± 0,55 a 1,79 ± 0,05 a 4,94 ± 0,87· 0,04 ± 0,01 a

Vl, V2 : Vendeuse 1 et 2

Sur une même ligne, les valeurs moyennes portant des lettres (a, b et c) différentes sont significativement différentes (p < 0,05)

2- DISCUSSION

L'étude microbiologique du Cymbium fermenté montre une microflore composée de bactéries lactiques, de Coliformes totaux, de Clostridies, des Salmonella ainsi que de levures. Il ressort donc la fermentation du Cymbium est assurée par une flore mixte dominée par des bactéries lactiques et les levures. En effet, l'étude microbiologique quantitative de la microflore du Cymbium Souliei après la fermentation montre une flore très variée composée de bactéries lactiques plus importante avec 7,92.106 UFC/g, suivie de la charge des Levures puis de Coliformes totaux, aux Clostridies et Salmonella. Les bactéries lactiques ont aussi été signalée à forte charge dans certains produits de pêche fermenté comme le momoni du Ghana (Sanni et al., 2002), Le plaa-soon en Thailand (Paludan-Muller et al., 2002). Ces résultats obtenus sont

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 33 en accord avec ceux des travaux effectués sur le Cymbium fermenté (Sembene, 2002) qui souligné également une forte charge de bactéries lactiques au cours de la fermentation. La charge maximale en levures sur tous les échantillons de Cymbium fermenté de Treicbville et de Yopougon est 7,19 105 UFC/g. L'analyse microbiologique montre un différence entre les charges en levures de Treicbville et de Yopougon. Ces résultats sont en conformité avec les travaux effectués sur le Cymbium fermenté « yet » (Sembène, 2002 · Diouf, 2008) et sur le poisson fermenté « adjuevan » (Kouakou et al., 2012) qui ont respectivement signalé la présence de levures à des charges très variables sur ces produits fermentés. Selon ces auteurs, la variation des populations de levures est plus influencée par les méthodes de traitement que par les concentrations en sel utilisées. Or nos échantillons sont tous à faible taux de sel et de plus ils ont été produits selon plusieurs productions par différentes productrices. Ces facteurs justifient la forte présence des levures et la variation de leur charge uivant les sites de prélèvement. Ces ferments bactéries lactiques et levures produisent prioritairement au cours de leur croissance, l'acide lactique qui est nécessaire au bon déroulement du processus de fabrication et qui contribue à inhiber les flores microbiennes indésirables (Labadie, 2006). Cependant l'analyse microbiologique a aussi révélé la présence de germes pathogènes tels que les Coliformes totaux, Clostridium sulfita-réducteurs et de salmonelles quelque soient le échantillons des communes. Ces germes seraient issus d'une forte contamination depuis l'origine du poisson par l'eau, le personnel et matériel de production et de commercialisation. L'analyse statistique a montré existence une différence significative à un seuil de 5% entre les moyennes des microflores suivant les sites (communes) de vente. Les échantillons de la commune de Yopougon portent plus de germes pathogènes que ceux de Treichville. Ces résultats montre mauvaise la qualité microbiologique du Cymbium fermenté vendu dans ces marchés. Le test de candida chromogénique a permis d'observer diverses couleur avec des couleurs ; rose ; bleu ; crème, verte et violette. Or selon Bauters (2002) les colonies de C. albicans, de C. tropicalis et de C. krusei y produisent des couleurs distinctes, permettant ainsi de détecter directement ces espèces de levure. Ainsi, les colonies de C. albicans sont d'un vert clair à moyen, celles de C. tropicalis sont bleu verdâtre à bleu métallisé. et celles de C. krusei, C. apicola sont rose pâle, blanchâtres en périphérie. Les autres Candida spp. et les autre levures ont une couleur mauve clair à foncé (rose à violet), si aucun substrat chromogène n'est utilisé, présentent leur couleur naturelle (crème à blanc).

Mémoire Master II, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 34 Le Cymbium fermenté porte donc une diversité de levures et précisément de genre Candida. La caractérisation moléculaire a permis d'identifier deux espèces de levures dans le Cymbium fermenté. L'une des espèces identifiées est Candida apicola et ! 'autre est Kluyveromyces aestuarii. Les études menées par (Sembène, 2002) sur le Cymbium fermenté ont confirmé la présence de levure du genre Candida sp dans le Cymbium fermenté. Kluyveromyces sp a été également isolé dans le Cymbium fermenté par Diouf, (2008). Ces levures participeraient donc à la fermentation du Cymbium.

Concernant les paramètres physico-chimiques, les Cymbium de (Treichville et de Yopougon) ont des pH, qui tends vers la neutralité et parfois pH basique (8,26 ± 0,36) avec un taux d'acidité titrable très faible variant entre 0,05% et 0,03%. La hausse du pH est probablement dû à la formation de composés azotés basique à La suite de l'activité protéolytique microbienne comme il a été rapporté par Anihouvi et al, (2007) au cour de la fermentation du lanhouin. Selon Diouf, (2008) le pH moyen de celui du mollusque vivant est de 7 et 6, tandi que Le pH moyen du produit fini est légèrement acide et se situe entre 6,3 et 6.4. En effet l'activité des bactéries lactiques baissent le pH du milieu qui tend vers l'acidité dans le aliments (fermentés) riche en sucres fermentescibles. Or le Cymbium est un produit carné dont la chair est pauvre en sucre fermentescibles, ce qui justifie donc la faible baisse du pH autour de 6 et 7. Kouakou et al., (2012) ont également montré la faible variation du pH du poisson fermenté« adjuevan » qui est un produit camé fermenté comme le Cymbium. La caractérisation physicochimique a révélé une teneur en sel maximale de 4,39 % (NaCL) et des taux de cendres de 6,4l(g/100) dans l'ensemble des échantillons. Ces résultats sont contraires à ceux de Biralvie, (2003) qui a trouvé 11,01 % de cendres et 1,88 % de NaCL dans le Cymbium fermenté (yeet) du Sénégal. Cette variation serait dû à la différence des méthodes de production.

Mémoire Master 11, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 Page 35 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Mémoire Master Il, Université Nangui Abrogoua 2014-2015 IV. Conclusion et Perspectives L'objectif de cette étude a été d'évaluer la qualité microbiologique et physico-chimique du Cymbium souliei fermentés vendu dans Jes marchés de deux communes d'Abidjan (Treichville et Yopougon). L'analyse des paramètres physico-chimique du Cymbium souliei fermenté montre un pH très peu acide et parfois basique pour certains Cymbium fermenté d'où une faible acidité titrable. Le taux de sel est également très faible et un taux de cendre moyen. L'analyse statistique avec ANOVA et le test turkey montrent qu'il n'y a pas de différence significative au niveau des échantillons provenant des deux commune• ... Quant à l'évaluation de la qualité microbiologique du Cymbium fermenté vendu dans ces deux marchés, elle a révélé la présence de germes très variés renfermant aussi bien des germes de fermentation avec les bactéries et les levures, dominés par les bactéries lactiques et quelques rares pathogènes tels que les coliformes totaux, Clostridium et Salmonella. Les coliforme totaux. les Clostridies et les Salmonelas sont des germes dont la présence est témoin de mauvaise manipulation et de contaminations fécaJes. La présence de ces germes pathogènes dans tous les échantillons que nous avons analysés traduit les mauvaises conditions d'hygiène au cours de la fermentation, du conditionnement et de la commercialisation du Cymbium fermenté. Par ailleurs, la caractérisation moléculaire des levures isolées, a révélé la présence d'une diversité d'espèce de levures dont les espèces Kluyveromyces aestuarii et Candida apicola. Ces deux espèces participeraient à la fermentation du Cymbium . )> Cependant, toutes les souches de levures isolées du Cymbium fermenté dans le cadre

du présent travail n'ont pas été toutes identifiées. Par conséquent, il nous paraît nécessaire de

faire une identification complète de ces germes de fermentation. En perspective, nous

envisageons de continuer ce travail en utilisant d'une part les techniques d'analyse

biochimiques (Galerie API) et biologie molécuJaire (PCR) suivi d'un séquençage afin de

mieux identifier les microorganismes déjà isolés de nos échantillons.

Nous envisageons aussi de faire des fermentations contrôlées en faisant varier d'une part le temps de fermentation et d'autre part, les concentrations de sel au niveau de la saumure. Ce pour arriver à connaître, les flores de fermentation, le meilleur temps de fermentation et la meilleure dose de sel pour obtenir un bon produit.

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