LE CORDON OMBILICAL HUMAIN, SOURCE DE CELLULES POUR LE GENIE TISSULAIRE Isolement, Caractérisation Et Production De Substituts Humains

LE CORDON OMBILICAL HUMAIN, SOURCE DE CELLULES POUR LE GENIE TISSULAIRE Isolement, caractérisation et production de substituts humains

Thèse

Cindy Jean Hayward

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

Résumé

Le cordon ombilical humain suscite beaucoup d’intérêt comme source de cellules à des fins de recherche et de thérapie. Quatre types cellulaires majeurs - les cellules épithéliales, stromales, musculaires lisses et endothéliales - composent les tissus solides du cordon ombilical. Quelques-uns de ces types cellulaires ont été utilisés en recherche scientifique depuis longtemps, alors que d’autres commencent à peine à dévoiler leur potentiel. Nous avons développé un protocole unique pour l’extraction séquentielle de tous ces types cellulaires d’un seul cordon ombilical, permettant ainsi la reconstruction à partir d’une même source. La combinaison des techniques de perfusion, immersion et explants a mené à la mise en culture et à l’expansion de ces cellules, dont les cellules épithéliales et les cellules stromales de la gelée de Wharton qui ont été caractérisées plus en détail par l’immunomarquage de protéines spécifiques. Leur potentiel pour la médecine régénératrice a été démontré par la production de tissus par génie tissulaire. Un vaisseau sanguin composé de cellules stromales et de cellules musculaires lisses du cordon ombilical démontra une résistance substantielle à l’éclatement. Les capacités de différenciation des cellules épithéliales ont été étudiées dans le contexte d’une peau bilamellaire reconstruite en combinaison avec des kératinocytes, des fibroblastes dermiques, et des cellules stromales de la gelée de Wharton. Les cellules épithéliales ont montré une différenciation similaire à celle des kératinocytes lorsque cultivées sur des fibroblastes dermiques et exposées à l’air, tandis que sur des cellules stromales du cordon, elles ont subi une désorganisation. Finalement, la différenciation des cellules stromales a été induite en culture vers plusieurs types cellulaires afin de compléter cette étude. L’ensemble des résultats fait ressortir l’importance non seulement de l’influence du milieu physique sur la croissance et la différenciation des cellules, mais également de l’impact de la provenance des cellules sur la qualité des tissus reconstruits.

iii

Abstract

The human umbilical cord has received increasing attention as a source of cells for both research and therapeutic purposes. Four main cell types – epithelial, stromal, smooth muscle and endothelial cells – make up the solid tissues of the umbilical cord. Some of these cell types have been used in research for decades, while the potential of others is just being recognised. We have developed a unique protocol for the sequential extraction of all four cell types from a single umbilical cord, thus allowing the reconstruction of tissues and organs with cells from the same source. A combination of perfusion, immersion and explant techniques allows the successful extraction and expansion in culture of these cells. Further characterisation of the epithelial and Wharton’s jelly cells was carried out by immunofluorescent staining of specific proteins. The potential of these cells for use in regenerative medicine was demonstrated through the production of tissue-engineered constructs, including a blood vessel composed of umbilical cord stromal and smooth muscle cells which showed a substantial burst resistance under pressure. The capacity for differentiation of cord epithelial cells was studied in the context of a bilayered reconstructed skin substitute, in combination with keratinocytes, dermal fibroblasts, and Wharton’s jelly cells. These epithelial cells differentiated in a manner similar to keratinocytes when cultured on dermal fibroblasts and exposed to air, but under the same conditions on cord stromal cells they degenerated. Finally, to complete our study the Wharton’s jelly cells were induced to differentiate in vitro into various mesenchymal cell types. Globally, this work shows the importance of not only the culture conditions on the growth and differentiation of the various cell types, but also the important effect of the cell source on the resulting reconstructed tissues.

Table des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... v Table des matières ...... vii Liste des tableaux ...... xi Liste des figures ...... xiii Liste d’abréviations ...... xv Remerciements ...... xix Avant-propos ...... xxi 1 Introduction ...... 1 1.1 Cellules et tissus, éléments de base des organes ...... 2 1.1.1 Cellules souches ...... 2 1.1.1.1 Définitions ...... 2 1.1.1.2 Cellules souches hématopoïétiques ...... 3 1.1.1.3 Cellules souches épidermiques ...... 5 1.1.1.4 Cellules souches mésenchymateuses et leur différenciation ...... 7 1.1.1.5 Cellules souches mésenchymateuses et fonction immunitaire ...... 9 1.1.2 Sources de cellules souches ...... 10 1.1.2.1 Tissus embryonnaires ...... 10 1.1.2.2 Tissus gestationnels (structures extra-embryonnaires) ...... 12 1.1.2.3 Le cordon ombilical ...... 13 1.1.2.3.1 L'épithélium ...... 14 1.1.2.3.2 La gelée de Wharton ...... 15 1.1.2.3.3 La média ...... 17 1.1.2.3.4 L'endothélium ...... 18 1.1.2.4 Tissus adultes ...... 19 1.1.2.5 Cellules reprogrammées ...... 20 1.1.3 La peau humaine en tant que source de cellules et modèle de la différenciation épithéliale ...... 23 1.1.3.1 L'épiderme ...... 24 1.1.3.2 La couche basale ...... 25 1.1.3.3 La couche épineuse ...... 28 1.1.3.4 La couche granuleuse ...... 29 1.1.3.5 La couche cornée ...... 31 1.1.3.6 La jonction dermo-épidermique ...... 32 1.1.3.7 Le derme ...... 35 1.1.4 Protéines structurales ...... 36 1.1.4.1 Les filaments intermédiaires en tant que marqueurs du stade de la différenciation ...... 36 1.1.4.1.1 Les kératines ...... 37 1.1.4.1.2 La vimentine ...... 39 1.1.4.1.3 La desmine ...... 40 1.1.4.1.4 Les neurofilaments ...... 40 1.1.4.2 L’actine, les fibres de stress, et les types cellulaires associés ...... 41

vii 1.1.4.3 L’élastine ...... 43 1.1.4.4 Les collagènes ...... 44 1.2 Le génie tissulaire ...... 48 1.2.1 Introduction et définition ...... 48 1.2.2 Approches du génie tissulaire ...... 49 1.2.2.1 Les modèles et les composants des substituts cutanés ...... 49 1.2.2.1.1 Le gel de collagène ...... 50 1.2.2.1.2 Le modèle d’éponge ...... 50 1.2.2.1.3 L’auto-assemblage ...... 50 1.2.2.2 Les modèles de vaisseaux sanguins ...... 53 1.2.2.2.1 Les modèles à base de gels ...... 55 1.2.2.2.2 Les tissus décellularisés ...... 56 1.2.2.2.3 Les tissus auto-assemblés ...... 56 1.2.2.2.4 Les échafaudages de polymères ...... 57 1.3 Problématique et objectifs de recherche ...... 59 1.3.1 Hypothèse et objectifs ...... 60 2 Harvesting the Potential of the Human Umbilical Cord: Isolation and Characterisation of Four Cell Types for Tissue Engineering Applications ...... 63 2.1 Abstract ...... 64 2.2 Résumé ...... 65 2.3 Abbreviations ...... 66 2.4 Introduction ...... 67 2.5 Materials and Methods ...... 69 2.5.1 Culture Media ...... 69 2.5.2 Enzymatic Solutions ...... 70 2.5.3 Umbilical Cords ...... 70 2.5.4 Isolation of Endothelial Cells ...... 71 2.5.5 Isolation of Epithelial Cells ...... 72 2.5.6 Isolation of Cells from Wharton's Jelly ...... 72 2.5.7 Isolation of Smooth Muscle Cells from the Media ...... 73 2.5.8 Maintenance of Cell Cultures ...... 73 2.5.9 Cryopreservation of Cells ...... 74 2.5.10 Tissue Reconstruction: Vascular Constructs ...... 74 2.5.11 Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes ...... 74 2.5.12 Adipogenic Differentiation ...... 75 2.5.13 Osteogenic Differentiation ...... 75 2.5.14 Histology ...... 76 2.5.15 Immunofluorescence Labelling ...... 76 2.5.16 FACS Analysis ...... 77 2.6 Results ...... 78 2.6.1 Extraction of Four Cell Types from a Single Umbilical Cord ...... 78 2.6.2 Epithelial Cell Culture and Characterisation ...... 78 2.6.3 Wharton's Jelly: Matrix Components and Proteins Produced by its Cells in vivo and in Culture ...... 82 2.6.4 Functional Characterisation of Wharton’s Jelly Cells ...... 88 viii

2.6.5 Establishment of Smooth Muscle Cell Populations from the Umbilical Vein . 90 2.6.6 Endothelial Cell Culture and Characteristics ...... 91 2.6.7 Tissue Engineering Applications Based on Umbilical Cord Cells ...... 93 2.7 Discussion ...... 95 2.8 Acknowledgements ...... 100 2.9 References ...... 101 3 Using Human Umbilical Cord Cells for Tissue Engineering: A Comparison With Skin Cells ...... 107 3.1 Abstract ...... 108 3.2 Résumé ...... 109 3.3 Abbreviations ...... 110 3.4 Introduction ...... 111 3.5 Materials and Methods ...... 113 3.5.1 Cell Extraction and Culture ...... 113 3.5.2 Reconstructed Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes ...... 114 3.5.3 Population Doubling Calculations ...... 115 3.5.4 Histological Analysis and Immunofluorescence Labelling ...... 115 3.5.5 Electron Microscopy ...... 116 3.6 Results ...... 117 3.6.1 Cell Differentiation within the Substitute’s Epithelial Compartment is Influenced by Cell Origin ...... 117 3.6.2 Detailed Evaluation of Keratinocyte-like Differentiation in the Epithelial Compartment ...... 121 3.6.3 Impact of the Cell Source on the Resulting Stromal Compartment ...... 123 3.6.4 Stromal Compartment Characterisation and Basement Membrane Formation ...... 125 3.7 Discussion ...... 128 3.8 Acknowledgements ...... 131 3.9 References ...... 132 4 Discussion générale ...... 135 4.1 Extraction des cellules du cordon ombilical humain ...... 136 4.1.1 Caractéristiques des cellules épithéliales du cordon ...... 140 4.1.2 Caractéristiques des cellules de la gelée de Wharton ...... 142 4.2 Reconstruction tissulaire ...... 146 4.2.1 Caractéristiques des substituts de peau reconstruite ...... 146 4.2.2 Lame basale ...... 149 4.2.3 Caractéristiques des substituts dermiques et vasculaires reconstruits ...... 150 4.3 Conclusion ...... 153 5 Bibliographie ...... 155 6 Annexe: Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Constructs Produced Using Arterial or Venous Cells ...... 199 Avant-propos ...... 199 Résumé ...... 199

Liste des tableaux

Tableau 1-1 Les kératines majeures des épithélia humains...... 38 Tableau 1-2 Une comparaison de quelques types cellulaires exprimant l’α-actine musculaire lisse ...... 43 Tableau 2-1 Epithelial Cell Yield at Extraction and at Passage 0 ...... 80 Tableau 2-2 Keratins Found in Umbilical Cord Epithelial Cells in situ and in vitro, in Comparison with Skin Biopsy Samples ...... 82 Tableau 2-3 Summary of the Observed Expression of Structural and Matrix Proteins in Umbilical Cord WJC in situ and in vitro ...... 87 Tableau 3-1 Composition of the Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes ...... 114 Tableau 3-2 Immunofluorescence Staining Results for Skin Substitutes After 21 Days of Culture at the Air-Liquid Interface ...... 123

Liste des figures

Figure 1-1 Les cellules souches...... 3 Figure 1-2 Schéma de la génération de cellules hématopoïétiques...... 4 Figure 1-3 Localisation des cellules souches dans l’épiderme et le follicule pileux...... 6 Figure 1-4 Types cellulaires produits par les cellules souches mésenchymateuses...... 7 Figure 1-5 Les voies de différenciation des cellules souches embryonnaires...... 11 Figure 1-6 Les tissus gestationnels...... 13 Figure 1-7 La structure du cordon ombilical humain...... 14 Figure 1-8 La production de cellules pluripotentes induites...... 20 Figure 1-9 La structure globale de la peau...... 23 Figure 1-10 Les couches différenciées de l’épiderme...... 25 Figure 1-11 La structure des desmosomes...... 27 Figure 1-12 Les couches différenciées de l’épiderme...... 29 Figure 1-13 Les étapes dans la formation de l’enveloppe cornifiée...... 30 Figure 1-14 La structure générale de la membrane basale...... 33 Figure 1-15 La structure des hémidesmosomes et de la membrane basale...... 34 Figure 1-16 Les sous-familles des collagènes et leur structure de base...... 45 Figure 1-17 La structure des collagènes fibrillaires...... 47 Figure 1-18 Schéma de la production des substituts cutanés par auto-assemblage...... 52 Figure 1-19 Schéma de la production des substituts vasculaires par génie tissulaire...... 55 Figure 2-1 Establishment of epithelial cell cultures from the umbilical cord...... 79 Figure 2-2 Expression of key keratins in umbilical cord epithelial cells as detected by immunofluorescence staining...... 81 Figure 2-3 Establishment of Wharton’s jelly cell cultures from the umbilical cord...... 84 Figure 2-4 Structural and extracellular matrix proteins synthesised in situ by cells in the umbilical cord Wharton’s jelly...... 85 Figure 2-5 Expression of structural and extracellular matrix proteins by Wharton’s jelly cells in culture...... 86 Figure 2-6 Stromal cells from the Wharton’s jelly show characteristics of mesenchymal stem cells...... 89 Figure 2-7 Establishment of smooth muscle cell cultures from the umbilical cord...... 91 Figure 2-8 Establishment of endothelial cell cultures from the umbilical cord...... 92 Figure 2-9 Each type of umbilical cord cell can contribute to unique reconstructed tissues produced using the self-assembly approach of tissue engineering...... 94 Figure 3-1 Histological appearance of bilayered stromal/epithelial substitutes engineered using keratinocytes and stromal cells from different sources...... 118 Figure 3-2 Histological appearance of bilayered stromal/epithelial substitutes engineered using umbilical cord epithelial cells and stromal cells from different sources...... 120 Figure 3-3 Evaluation of the epithelial differentiation of bilayered stromal/epithelial substitutes after 7 days of culture at the air-liquid interface...... 122 Figure 3-4 Expression profile of important components of the stromal compartment and basement membrane of bilayered stromal/epithelial substitutes...... 126 Figure 3-5 Ultrastructural analysis of the WJC / ucEpi substitute after 7 days of immerged culture conditions...... 127

xiii

Liste d’abréviations

ADN – Acide Désoxyribonucléique BPAG – Bullous Pemphigoid Antigen (antigène de la pemphigoïde bulleuse) BSA – Bovine Serum Albumin (albumine de sérum bovin) cADN – Acide désoxyribonucléique complémentaire CD – Cluster of Differentiation (classe de différenciation) CE – Cellules endothéliales CFU-F – Fibroblast Colony-Forming Units (unités de fibroblastes formant des colonies) CMH – Complexe Majeur d’Histocompatibilité (HLA en anglais) CML – Cellules Musculaires Lisses CSM – Cellules Souches Mésenchymateuses DF – Dermal Fibroblasts (fibroblastes dermiques) DME, DMEM – Dulbecco-Vogt modified Eagle’s medium DMSO – Dimethyl Sulfoxide (diméthylsulfoxyde) ECGF – Endothelial Cell Growth Factor (facteur de croissance endothéliale) ECM – Extracellular Matrix (matrice extracellulaire) EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid (acide éthylène diamine tétraacétique) EGF – Epidermal Growth Factor (facteur de croissance épidermique) EIF – Épiderme Interfolliculaire ES, ESC – Embryonic Stem Cell (cellule souche embryonnaire) FACS – Fluorescence-Activated Cell Sorting (cytométrie en flux) FCS – Fetal Calf Serum (sérum de veau foetal) GAG – glycosaminoglycanes GFAP – Glial FibrillaryAcidic Protein (protéine acide fibrillaire gliale) GFE – Gaine Golliculaire Externe GFI – Gaine Folliculaire Interne GvHD – Graft versus Host Disease (maladie du greffon contre l’hôte) HEPES – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulphonic acid (acide 4-(2- hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) HLA – Human Leukocyte Antigen (antigène leucocytaire humain) HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells (cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine) ICM – Internal Cell Mass (masse cellulaire interne) IF – Intermediate Filament (filament intermédiaire) IL-l – Interleukin-l (interleukine-l) iPS – induced Pluripotent Stem cells (cellules souches pluripotentes induites) K – Keratin, Keratinocytes (kératine, kératinocytes) LIF – Leukocyte Inhibiting Factor (facteur d’inhibition de la leucémie) LOEX – Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale LTBP – Latent TGF-β-Binding Protein (protéine liant le TGF-β) MAGP – Microfibril-Associated GlycoProtein (glycoprotéine associée aux microfibrilles) MB – Membrane Basale MSC – Mesenchymal Stem Cells (cellules souches mésenchymateuses) MYOD1 – Myogenic Differentiation 1 (facteur de différenciation myogénique 1) NCS – Newborn Calf Serum (sérum de veau nouveau-né)

xv ND – Not Determined; non déterminé NF-L, -M, -H – Low, Medium, High Neurofilament (neurofilaments à bas, moyen, haut poids moléculaire) NO – Nitrogen Oxide P – Passage PBS – Phosphate-Buffered Saline (tampon phosphate physiologique) PCL – Poly (ε-Caprolactone) (poly (ε-caprolactone)) PGA – Polyglycolic Acid (acide polyglycolique) pKi – point isoélectrique PLA – Polylactic Acid (acide polylactique) SEM – Standard Error of the Mean (erreur type de la moyenne) SMC – Smooth Muscle Cells (cellules musculaires lisses) SPRs – Small Proline-Rich proteins (petites protéines riches en proline) T3 – 3,3',5 triiodo-L-thyronine TGF-β – Transforming Growth Factor β (facteur de croissance transformant β) TRITC – Tetramethylrhodamine-5-(and-6)-Isothiocyanate (isothiocyanate de tétraméthylrhodamine) UC – Umbilical Cord (cordon ombilical) ucEpi – umbilical cord Epithelial cells (cellules épithéliales du cordon ombilical) UV – Ultraviolet vWF – von Willebrand factor (facteur von Willebrand) WJC – Wharton’s Jelly Cells (cellules de la gelée de Wharton)

xvi

Be humble, for you are made of earth; be noble, for you are made of stars.

– Serbian proverb

xvii

Remerciements

Cette thèse n’aurait jamais vu la lumière du jour sans l’accueil et le soutien que j’ai reçu du Dr François A. Auger au sein du LOEX. En tant que directeur de recherche, il m’a encouragé à travers tous les défis qui se sont présentés pendant mes études plutôt tardives. Je tiens à témoigner ma grande reconnaissance et gratitude envers ma co-directrice, Julie Fradette, toujours soucieuse du travail bien fait et prête à donner de bons conseils. Elle partage avec moi le goût du langage bien écrit et m’a aidé à peaufiner mon texte au niveau de perfection auquel j’aspirais dans ma deuxième langue.

Je suis très reconnaissante envers Dan Lacroix, qui a été une source inépuisable de renseignements et de conseils, et qui a examiné avec diligence mes textes d’articles et de thèse afin de cibler l’expression exacte dont nous avions besoin. Et je remercie aussi Lucie Germain, qui m’a toujours ouvert sa porte pour mes questions, ainsi que Danielle Boucher, qui a toujours eu le temps de m’aider avec les détails administratifs.

Je voudrais remercier les examinateurs de ma thèse, Mme Renée Bazin, M. Guillaume Grenier et M. Jacques P. Tremblay, qui ont pris le temps de regarder mes travaux attentivement et avec intérêt. Je remercie aussi les organismes subventionnaires qui m’ont permis de réaliser ces études, en particulier le Conseil de recherche en sciences naturelles et génie.

Un grand merci à Rina Guignard, qui m’a initiée aux techniques d’extraction et de culture cellulaire et avec qui j’ai passé de longues heures, souvent de nuit, à faire des extractions complètes de cordon ombilical. Je voudrais offrir aussi un chaleureux merci à mes autres compagnons d’extraction et de culture cellulaire à travers les années: Murielle Rémy, Kathleen Baker, Todd Galbraith, Sophie Roberge et Sébastien Thériault.

Merci aux assistants de recherche qui m’ont grandement aidé par leurs conseils, leur aide et leur assistance technique à maintes reprises. Je pense en particulier à Nathalie Tremblay, Éric Grandbois, Valérie Trottier, Cindy Perron, Véronique Racine, Israël Martel, Sébastien Larochelle et Amélie Lavoie. Je témoigne également ma reconnaissance aux autres

xix chercheurs du LOEX et aux membres de leurs équipes, qui ont été généreux avec leurs conseils et l’aide pratique lorsque j’en avais besoin.

Mes photographies n’auraient pas eu le même éclat sans l’habile assistance de Claude Marin à Saint-Sacrement, et de Richard Janvier et son équipe de microscopie électronique à l’Université Laval. Merci à vous tous!

Finalement, c’est grâce au soutien de ma famille, et aux sacrifices qu’ils ont fait, que j’ai pu mener à bonne fin ce doctorat. Mon mari, Sergio, m’a appuyée et encouragée tout au long du chemin et a pris la relève à la maison lorsque je m’occupais de mes cellules en culture tard le soir. Sa compréhension et sa patience, de même que celles de mes enfants Aidan, Adriel, Rubria, Rhodric et Meritxell, sont grandement appréciées.

Avant-propos

Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués au Centre LOEX de l’Université Laval. Des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), du Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), du Réseau ThéCell du FRQS, et de la Fondation des pompiers du Québec pour les grands brûlés ont soutenu la réalisation des projets de recherche que j’ai entrepris. J’ai aussi été récipiendaire d’une bourse de formation au doctorat du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

Cette thèse contient deux manuscrits pour lesquels je suis l’auteure principale, qui ont été publiés dans des journaux scientifiques et qui sont regroupés dans les chapitres 2 et 3. Les détails de leur publication et de la contribution des auteurs sont les suivants:

Chapitre 2: Harvesting the Potential of the Human Umbilical Cord: Isolation and Characterisation of Four Cell Types for Tissue Engineering Applications par Cindy J. Hayward, Julie Fradette, Todd Galbraith, Murielle Rémy, Rina Guignard, Robert Gauvin, Lucie Germain et François A. Auger. Cet article a été publié dans le journal Cells Tissues Organs (2013) 197 (1): 37-54 (DOI:10.1159/000341254), publié par S. Karger AG, Basel.

Les expériences d’extraction de cellules et de mise au point ont été effectuées par moi- même, Todd Galbraith, Murielle Rémy et Rina Guignard, suivant le dessein conçu par François A. Auger. J’ai également entrepris les expériences de différenciation (avec Todd Galbraith) et la fabrication des substituts de peau (avec Rina Guignard), toujours avec le soutien et les conseils de mon directeur François A. Auger et de ma co-directrice, Julie Fradette, et pour les substituts de peau, de Lucie Germain. La production et l’analyse des substituts vasculaires ont été effectuées en collaboration avec Robert Gauvin. J’ai été responsable des analyses et de la rédaction du manuscrit, ainsi que du montage des photos, sous la supervision et avec l’aide inestimable de mon directeur et ma co-directrice. Mes co- auteurs ont aussi contribué à la révision du manuscrit pour publication.

xxi Chapitre 3: Using Human Umbilical Cord Cells for Tissue Engineering: A Comparison With Skin Cells par Cindy J. Hayward, Julie Fradette, Pascal Morissette Martin, Rina Guignard, Lucie Germain et François A. Auger. Cet article a été publié dans le journal Differentiation (2014) 87 (3-4): 172-181, publié par Elsevier.

Les substituts de peau ont été construits par moi-même avec Rina Guignard, suivant les conseils très appréciés de Lucie Germain pour la conception et l’exécution des travaux. Pascal Morissette Martin a effectué les mesures d’épaisseur et a fait les analyses statistiques s’y rattachant. J’ai effectué les analyses histologiques et d’immunomarquage, la prise des photos en microscopie électronique, la rédaction du manuscrit ainsi que le montage des photos, toujours avec le soutien et les conseils de mon directeur François A. Auger et de ma co-directrice, Julie Fradette, et avec l’aide de mes co-auteurs.

xxii

1 Introduction

Le cordon ombilical humain est devenu une cible très prisée de la recherche scientifique dans les dernières années, avec l’expansion toujours croissante des travaux étudiant les processus de différenciation, ainsi que la reconstruction de tissus in vitro à partir de cette source de cellules. La possibilité de créer des tissus et des organes par génie tissulaire à des fins de recherche et de thérapie suscite un intérêt accru envers les cellules qui seraient aptes à une telle utilisation, et la perspective de pouvoir travailler avec des cellules ‘jeunes’ ayant accumulé un nombre relativement faible de divisions et qui auraient la capacité de se renouveler au long terme, est très motivante. Le cordon ombilical, une structure gestationnelle ne possédant pas de cellules souches embryonnaires, retient l’intérêt des chercheurs car il est facile à obtenir sans biopsie et sans controverse d’ordre éthique. De plus, il est une source de plusieurs types cellulaires, généralement exempts d’agents pathogènes.

Outre le sang du cordon ombilical, qui contient des cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses et qui est à lui seul un domaine complet de recherche scientifique, il y a au moins quatre types cellulaires présents dans le tissu solide et dont l’extraction est devenue courante. Ils comprennent les cellules épithéliales, les cellules stromales, les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales. Ces deux derniers types sont très utiles en recherche (Jaffe et al., 1973b; Owens, 1995; L'Heureux et al., 1998; Bachetti et Morbidelli, 2000; Stephan et al., 2006; Tsigkou et al., 2010; Gauvin et al., 2011). Le cordon ombilical est une source pratique et abondante de ces cellules, avec ses artères et sa veine relativement larges et entourées d’une épaisse média (Moore, 1989). L’extraction de grandes quantités de cellules est donc peu compliquée et facilite la culture in vitro (Jaffe et al., 1973a). En ce qui concerne les cellules stromales du cordon ombilical, en particulier les cellules multipotentes de la gelée de Wharton, la recherche sur leurs propriétés de cellules souches est en pleine effervescence. L’utilisation des cellules stromales et des cellules épithéliales dans la reconstruction tissulaire a été peu abordée dans la littérature scientifique, d’où l’intérêt de regarder de plus près leurs caractéristiques.

1 1.1 Cellules et tissus, éléments de base des organes

1.1.1 Cellules souches

1.1.1.1 Définitions

Une cellule souche est essentiellement une cellule qui se divise asymétriquement pour donner une autre cellule souche identique à la première, et une cellule fille qui peut proliférer et se différencier selon un cheminement particulier en plusieurs types cellulaires matures déterminés (Figure 1-1). Les cellules souches prolifèrent à long terme sans entrer en sénescence (Alison et al., 2002; Zuk et al., 2002). Chez l'adulte, des cellules souches se trouvent dans plusieurs tissus et organes, chaque sorte de cellule souche produisant des types cellulaires variés selon son potentiel, c’est-à-dire pluripotente, qui peut se différencier en tous les types cellulaires du corps (issus de tous les différents feuillets embryonnaires); multipotente, qui peut se différencier en plusieurs types cellulaires (du même feuillet embryonnaire); ou unipotente, qui ne se différencie qu’en un seul type cellulaire. Les plus étudiées sont peut-être les cellules souches hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses. Des cellules souches ont été également retrouvées dans la peau (Lajtha, 1979; Toma et al., 2001), le cerveau (Lendahl et al., 1990), la rétine de l'œil (Ahmad et al., 2000), l'intestin (Cheng et Leblond, 1974) et le foie (Alison et Sarraf, 1998), pour ne nommer que quelques organes.

Figure 1-1 Les cellules souches. Les cellules souches s'auto-renouvellent et peuvent en même temps produire des cellules filles ayant la capacité de proliférer et de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires selon leur hiérarchie parmi les progéniteurs. Figure adaptée de Weissman et al. (2000).

1.1.1.2 Cellules souches hématopoïétiques

Le concept d’une cellule souche hématopoïétique, origine de toutes les cellules sanguines, fut proposé et ensuite démontré par Alexander Maximow (1906; 1909), ce qui est considéré le début de « l’ère des cellules souches » (Novik et al., 2009). Leur existence, pourtant, fut démontrée pour la première fois par les canadiens James Till et Ernest McCulloch (1961). À partir de leurs expériences, les cellules souches hématopoïétiques furent reconnues comme des cellules multipotentes, source de toutes les cellules du système sanguin (Becker et al., 1963), y compris les cellules lymphoïdes, les érythrocytes, les mégacaryocytes, les granulocytes et les macrophages à travers diverses cellules progénitrices dédiées chacune à la production de types cellulaires précis (Figure 1-2) (revu dans Orkin et Zon, 2008). Les cellules souches hématopoïétiques sont à la base des greffes de moelle osseuse depuis plusieurs décennies déjà (Bongso et Richards, 2004), grâce à leur capacité de reconstituer la fonctionnalité hématopoïétique de la moelle osseuse chez un receveur irradié avec ou sans chimiothérapie préparatoire. Chez l’adulte, elles se trouvent en majorité dans la moelle osseuse (Jacobson et al., 1951; Zanjani et al., 1993), mais pour les fins de la transplantation

3 on peut en récupérer aussi du sang circulant (Niskanen et al., 1979; Zvaifler et al., 2000), et du sang de cordon ombilical (Broxmeyer et al., 1989).

Figure 1-2 Schéma de la génération de cellules hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques génèrent plusieurs types cellulaires à travers des cellules progénitrices multipotentes, chacune spécifique pour la production de certaines cellules sanguines. Figure tirée de Orkin et Zon (2008).

1.1.1.3 Cellules souches épidermiques

Les cellules souches épidermiques se trouvent principalement dans la couche basale de l’épiderme dans la peau interfolliculaire (Mackenzie et Bickenbach, 1985; Brouard et Barrandon, 2003), et dans le renflement folliculaire de la peau pileuse (Figure 1-3) (Cotsarelis et al., 1990). Ces cellules souches se divisent pour donner une cellule souche et une cellule amplificatrice transitoire (Lajtha, 1979; Lavker et Sun, 2000). Les cellules souches épidermiques entrent rarement en mitose, mais les cellules amplificatrices transitoires qui résultent de ces divisions se multiplient rapidement (Cotsarelis et al., 1990). En théorie, une cellule souche aurait la capacité de produire l’équivalent d’un épiderme adulte complet (Rochat et al., 1994). Dans la peau, les cellules amplificatrices (kératinocytes) se divisent encore un nombre limité de fois avant de se différencier et de monter vers la superficie de la peau. Les estimés de la fréquence de ces cellules souches varient de 10% des cellules basales à 0,01% (Schneider et al., 2003). Chaque cellule souche (interfolliculaire) serait la fondation d’une unité de prolifération épidermique, constituée d’environ 10 cellules basales, dont une cellule souche, et les cellules verticalement adjacentes générées par la division de ces cellules basales (Potten, 1975; 1981; Ghazizadeh et Taichman, 2001). Il est possible que des unités de prolifération plus grandes puissent dépendre de certaines cellules souches basales, mais la relation n’est pas encore bien définie (Ghazizadeh et Taichman, 2001). En général, les cellules souches sont responsables de la régénération de l’épiderme à leur proximité, mais des études ont montré que les cellules souches des follicules pileux peuvent également régénérer l’épiderme lors d’une blessure (Lavker et Sun, 2000; Taylor et al., 2000). Ces cellules souches multipotentes folliculaires sont capables de répondre aux signaux morphogénétiques en formant de l’épiderme, des follicules pileux et même des glandes sébacées (Oshima et al., 2001).

Figure 1-3 Localisation des cellules souches dans l’épiderme et le follicule pileux. À gauche, les couches de la peau stratifiée interfolliculaire, où les cellules souches (cs) se trouvent dans la couche basale adjacente à la membrane basale (MB). Les cellules souches produisent des cellules amplificatrices transitoires (at), qui se différencieront pour former les couches supérieures. Au milieu, une coupe histologique de peau de souris, colorée pour montrer les différentes parties du follicule pileux (fp). À droite, un dessin du follicule pileux montrant les cellules souches (en rouge), localisées dans la région du renflement. Ces cellules migrent par la suite pour peupler les régions du bulbe folliculaire, de la glande sébacée et de l’épiderme interfolliculaire (EIF). GFI – gaine folliculaire interne; GFE – gaine folliculaire externe. Figure adaptée de Morasso et Tomic-Canic (2005).

Les caractéristiques de la cellule souche épidermique ont été dévoilées au fur à mesure des recherches réalisées, souvent en utilisant la peau murine. Jusqu’à maintenant, il n’y a pas de marqueur spécifique qui soit unique aux cellules souches épidermiques; il y a plutôt une combinaison d’expression de plusieurs facteurs qui les distinguent des cellules amplificatrices et des cellules différenciées. Entre autres, ces cellules souches épidermiques humaines expriment la kératine 19 (Michel et al., 1996), ont une forte présence de la sous- unité intégrine β1 (Jones et al., 1995) et une adhérence accrue au collagène de type IV (Bickenbach et Chism, 1998), et sont positives pour l’intégrine α6 et négatives pour le CD71 (α6bri CD71dim) (Li et al., 1998; Tani et al., 2000). Une étude montra une sous- population de cellules épithéliales exprimant à la fois la kératine 15 et la kératine 19 dans le renflement des follicules pileux, ainsi que dans la peau interfolliculaire, qui serait importante dans le maintien de l’auto-renouvellement de la peau (Pontiggia et al., 2009).

1.1.1.4 Cellules souches mésenchymateuses et leur différenciation

On retrouve des cellules souches mésenchymateuses dans plusieurs tissus dont le plus connu est la moelle osseuse. Ces cellules seraient responsables de la production des tissus mésenchymateux - os, cartilage, muscle, tendon, ligament, et tissus adipeux, conjonctif et de la moelle - en réponse aux blessures et pour assurer l'homéostasie (Figure 1-4) (Caplan, 1994).

Figure 1-4 Types cellulaires produits par les cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses s’auto-renouvellent, et peuvent se différencier en tous les types cellulaires du squelette et du tissu conjonctif. Figure tirée de Frenette et al. (2013).

Les premières observations permettant de soupçonner l’existence de cellules souches non- hématopoïétiques dans la moelle osseuse furent celles du pathologiste allemand J. Cohnheim (1867). Il a utilisé l’injection d’un colorant insoluble dans les veines d’animaux afin d’étudier la guérison des blessures. Il a conclu que la plupart des cellules colorées, tant inflammatoires que fibroblastiques, qui se trouvaient dans la plaie en guérison étaient venues du sang, et par extension, de la moelle osseuse. Le travail d’Alexander Friedenstein et ses collègues dans les années 1960 et 1970 a mis en évidence la présence dans la moelle

7 osseuse d'une population de cellules progénitrices distinctes des cellules souches hématopoïétiques (Friedenstein, 1961; Friedenstein et al., 1968; 1976). Ces cellules, quiescentes in vivo, entraient dans le cycle cellulaire in vitro lors d'une stimulation adéquate et formaient des colonies ressemblant à des dépôts d'os ou de cartilage. Des expériences de greffe de morceaux de moelle osseuse chez la souris ont démontré que ces cellules étaient ostéogéniques et formaient du nouveau tissu osseux, et que les cellules hématopoïétiques qui l’ont colonisé par la suite ne provenaient pas du tissu greffé (Friedenstein et Kurolesova, 1971). Le même groupe de chercheurs a développé la méthode encore employée aujourd'hui pour isoler les cellules fibroblastiques de la moelle osseuse, en les sélectionnant par leur adhérence au plastique. Cette technique est utilisée en culture cellulaire puisque la plupart des cellules hématopoïétiques n’y adhèrent pas (Friedenstein et al., 1970).

Au fil des années, ces cellules ont reçu plusieurs dénominations, de CFU-F (acronyme de la terminologie anglaise pour fibroblast colony-forming units, unités de fibroblastes formant des colonies) et fibroblastes stromaux de la moelle (Kuznetsov et al., 1997) à cellules souches progénitrices (Conget et Minguell, 2000) et cellules souches mésenchymateuses (CSM, connues en anglais comme mesenchymal stem cells - MSC) (Caplan, 1994). Tous ces termes s'appliquent à des cellules d'une morphologie fibroblastique, dérivées du mésoderme (un des trois feuillets embryonnaires primaires, duquel se développent le squelette et les tissus conjonctifs (Carlson, 2014)). Une définition minimale décrit les CSM comme des cellules mononucléaires adhérentes au plastique qui peuvent se propager en culture, qui expriment les molécules CD73, CD90 et CD105 mais pas les CD34, CD45, ou CMH-DR, ni les marqueurs des monocytes ou des cellules B (CD14, CD33, CD3, CD19, entre autres), et qui ont le potentiel de se différencier en au moins les trois types cellulaires principaux du mésenchyme (Figure 1-4) (Pittenger et al., 1999; Dominici et al., 2006; Bourin et al., 2013): ostéocytes (Owen et al., 1987; Grigoriadis et al., 1988; Caplan, 1991; Haynesworth et al., 1992), chondrocytes (Johnstone et al., 1998; Majumdar et al., 2000), et adipocytes (Dennis et Caplan, 1996; Pittenger et al., 1996). D’autres études ont montré leur différenciation en ténocytes (Caplan et al., 1993) et en myotubes (Galmiche et al., 1993; Wakitani et al., 1995), et leur fonction comme stroma de soutien hématopoïétique (Dexter et al., 1977; Majudmar et al., 1998), mais non pas à partir d’une population clonale. En

effet, la plupart des techniques de culture cellulaire utilisées produisent des populations hétérogènes parmi lesquelles il est très difficile de distinguer la cellule souche 'véritable' des cellules précurseures plus ou moins déterminées vers les divers types cellulaires particuliers (Friedenstein et al., 1982; Kuznetsov et al., 1997; Phinney et al., 1999; Muraglia et al., 2000).

1.1.1.5 Cellules souches mésenchymateuses et fonction immunitaire

Il devient de plus en plus évident que les cellules souches mésenchymateuses jouissent d’un statut immunoprivilégié, et qu’elles exercent également des fonctions immunosuppressives dans le contexte de la greffe allogénique. L’hypothèse actuelle est que la régénération tissulaire lors d’une greffe de CSM a lieu non pas majoritairement par le remplacement des cellules endommagées, sinon à travers la production de facteurs de croissance et de signaux anti-inflammatoires par les CSM, ce qui stimule le processus de régénération (Caplan et Correa, 2011; Girdlestone et al., 2015). Il a été montré in vitro que les CSM suppriment de façon active la fonction ou la différenciation des monocytes, des cellules dendritiques, et des lymphocytes B, T et NK, par plusieurs moyens y compris le contact entre cellules et la sécrétion de divers facteurs solubles (Bartholomew et al., 2002; Di Nicola et al., 2002; Krampera et al., 2003; Aggarwal et Pittenger, 2005; Beyth et al., 2005; Glennie et al., 2005; Jiang et al., 2005; Corcione et al., 2006; Nauta et al., 2006; Spaggiari et al., 2006).

Le sécrétome est devenu un aspect très important dans la recherche sur les cellules et leurs interactions; c’est l’ensemble des protéines sécrétées par une cellule, qui modifient non seulement le comportement de la cellule elle-même et des cellules avoisinantes, mais aussi celui des organes situés ailleurs dans le corps (Zullo et al., 2015). Beaucoup de ces protéines sont sécrétées sous forme de microvésicules et d’exosomes (Mathivanan et al., 2010; Mukherjee et Mani, 2013). Le sécrétome des cellules et des tissus est très spécifique, et peut être modifé en fonction des fluctuations dans l’état physiologique du corps. Ce sont ces facteurs qui interagissent avec d’autres cellules pour produire leurs effets immunomodulatoires, ainsi que l’activité paracrine qui stimule la réparation tissulaire (revu dans Lavoie et Rosu-Myles, 2013). Ces influences sur le microenvironnement qui le rendent plus propice à la régénération semblent être beaucoup plus importantes que l’incorporation des cellules souches ou différenciées greffées dans les modèles selon les

9 études entreprises à ce jour (De Miguel et al., 2012; van Koppen et al., 2012; Yi et Song, 2012; Lavoie et Rosu-Myles, 2013; Konala et al., 2016).

Il est généralement accepté que les CSM expriment les complexes d’histocompatibilité majeurs de classe I (CMH-A, -B, -C) mais non pas ceux de classe II tel le CMH-DR (Reyes et al., 2001; Jiang et al., 2002; Dominici et al., 2006; Suzdal'tseva et al., 2007). Les complexes d’histocompatibilité majeurs atypiques (CMH-E, CMH-F, CMH-G) ont été impliqués dans l’induction de la tolérance des lymphocytes NK envers les cellules de soi, ainsi qu’envers le fétus (Rouas-Freiss et al., 1997; Fanchin et Ayoubi, 2009). En particulier, l’expression de CMH-G par les CSM de la moelle osseuse supprime la fonction des lymphocytes T et NK, et induit certaines cellules T régulatrices (Selmani et al., 2008).

En plus, les CSM n’expriment pas les molécules de surface CD80, CD86, CD40 et CD154 (CD40L) (Bartholomew et al., 2002; Dean et Bishop, 2003; Le Blanc et al., 2003). Les CD80, 86 et 40 sont des molécules co-stimulatrices qui activent les lymphocytes T allogéniques, et le CD40L stimule les lymphocytes B, menant à la sécrétion d’interleukines et de cytokines qui déclenchent une réponse immunitaire (Rothstein et Sayegh, 2003). L’absence de ces molécules évite cette activation, et confère un statut immunoprivilégié aux CSM.

En ce qui concerne les cellules de la moelle osseuse et du tissu adipeux, l’âge du donneur aurait des conséquences sur les propriétés immunomodulatoires des cellules greffées, et la différenciation des cellules au préalable augmenterait leur immunogénicité (Kuo et al., 2006; Caplan, 2009). Les cellules souches issues des tissus extra-embryonnaires sont préservées de cette complication des dommages accumulés au fil des années.

1.1.2 Sources de cellules souches

1.1.2.1 Tissus embryonnaires

Les cellules souches embryonnaires (abondamment connues dans les publications anglophones sous l’acronyme « ES cells » pour embryonic stem cells) proviennent de la masse cellulaire interne de l’embryon précoce. Ces cellules peuvent proliférer pendant un temps très prolongé in vitro sans perdre leurs qualités de cellules souches pluripotentes;

c’est-à-dire, qu’elles peuvent se différencier en tous les types cellulaires somatiques du corps (Figure 1-5) (Doss et al., 2004). Elles ont été isolées pour la première fois en 1981 chez la souris (Evans et Kaufman, 1981; Martin, 1981), et par la suite chez les rongeurs, les lapins, les porcs et les humains (revu dans Doss et al., 2004). Des conditions particulières sont nécessaires pour les maintenir dans un état non différencié: tout dépendant de l’espèce en question, il faut les cultiver en présence du facteur inhibiteur de la leucémie (LIF, acronyme de la terminologie anglaise pour Leukocyte Inhibiting Factor), ou bien les cultiver sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires non-réplicatifs (Williams et al., 1988). Cette dernière condition est requise par les cellules souches embryonnaires humaines (Thomson et al., 1998). Une fois en culture, ces cellules peuvent être induites à se différencier en divers types cellulaires selon les facteurs ajoutés au milieu de culture.

Figure 1-5 Les voies de différenciation des cellules souches embryonnaires. Les cellules de la masse cellulaire interne (ICM), mises en culture avec du LIF, forment des sphères caractéristiques, et peuvent se différencier en types cellulaires dérivés des trois feuillets embryonnaires primaires. Figure tirée de Doss et al. (2004).

11 Il y a plusieurs problématiques inhérentes à l’utilisation des cellules souches embryonnaires en génie tissulaire. Tout d’abord, il y a les questions d’ordre éthique concernant l’utilisation des embryons pour des fins de recherche ou de thérapie. Ces inquiétudes touchent également l’emploi des oocytes énucléés pour recevoir des noyaux somatiques afin de produire des cellules différenciées qui seraient presque identiques génétiquement au receveur de la greffe. Au niveau technique, les protocoles de différenciation courants donnent comme résultat des populations de types cellulaires mixtes qui doivent être séparés avant leur utilisation, car l’implantation de cellules non différenciées mène à la formation de tératomes chez le receveur (Thomson et al., 1995; 1998). Les cellules différenciées risquent d’être rejetées par l’hôte qui les reçoit. Il faut donc soit maintenir un état d’immunosuppression chez l’hôte, soit modifier les cellules à greffer de telle façon qu’elles ne suscitent pas le rejet par le système immunitaire (Bongso et Richards, 2004; Cheng et al., 2014).

1.1.2.2 Tissus gestationnels (structures extra-embryonnaires)

D’autres tissus gestationnels servent comme source de cellules souches, y compris le placenta, l’amnion, le liquide amniotique, le cordon ombilical et le sang de celui-ci (Figure 1-6). Des cellules isolées du placenta ont été différenciées en ostéoblastes, en adipocytes et en cellules neuronales en culture (Yen et al., 2008). Des cellules épithéliales de l’amnion ont été induites à se différencier en cellules neuronales (Elwan et Sakuragawa, 1997; Kakishita et al., 2000; Miki et al., 2005; Ilancheran et al., 2007), hépatocytes, cellules pancréatiques, et cardiomyocytes, ostéocytes, adipocytes, et myocytes, sans être tumorigènes (Miki et al., 2005; Ilancheran et al., 2007). Quant au sang du cordon ombilical, il sert depuis longtemps comme source de cellules souches hématopoïétiques pour les greffes allogéniques, avec les premiers essais publiés par les frères Ende (1972), et la première greffe réussie en 1988 (Gluckman et al., 1989; Watt et Contreras, 2005). L'avantage de cette source réside d'abord dans l'accessibilité; la collecte de sang a lieu à la naissance de façon non invasive, et le sang peut être conservé pendant des années dans une banque de sang, avec le code CMH déjà déterminé pour une greffe ultérieure. Pour qu’une greffe de cellules souches hématopoïétiques réussisse, il faut que l’histocompatibilité entre le donneur et le receveur soit la plus élevée possible; c’est à dire que les codes CMH du

donneur et du receveur soient le plus semblables possible afin d’éviter l’attaque des tissus du receveur par les cellules greffées (la maladie du greffon contre l’hôte, connu en anglais comme « graft versus host disease » – GvHD). Il semblerait que les taux de réussite des greffes de sang de cordon moins parfaitement appariées sont semblables ou supérieurs à ceux des greffes de moelle osseuse appariées (Locatelli et al., 1999; Rocha et al., 2000; Laughlin et al., 2004). La reconstitution de la moelle osseuse par les cellules de sang de cordon est en général plus lente car la quantité de cellules souches disponibles d’un seul cordon est moins grande que celle obtenue par ponction de la moelle osseuse (Rocha et Gluckman, 2009).

Figure 1-6 Les tissus gestationnels. Les tissus gestationnels, qui comprennent entre autres le placenta, la membrane et le liquide amniotiques, le cordon ombilical et son sang, sont des sources de cellules souches multipotentes. Figure tirée de Ilancheran et al. (2009).

1.1.2.3 Le cordon ombilical

Le cordon ombilical est d’abord une structure foetale d'origine allantoïque qui sert de conduit pour le transport de l'oxygène, des nutriments et des déchets entre l'embryon ou le foetus et le placenta, et donc la circulation sanguine maternelle. Physiquement le cordon ressemble à un tube blanc tordu, plus ou moins translucide et d'une longueur moyenne de 35 à 50 cm à la naissance. Sa structure est simple, comprenant deux artères et une veine

13 enveloppées dans un tissu conjonctif mucoïde, et recouverte d'un épithélium mince à l'extérieur (Figure 1-7). Les vaisseaux du cordon ombilical, tout comme les veines et artères pulmonaires du côté droit du cœur, font exception à la norme anatomique selon laquelle le sang oxygéné se trouve dans les artères et le sang appauvri en oxygène dans les veines. Ici, les artères apportent le sang désoxygéné et les déchets foetaux au côté foetal du placenta, où un échange d'éléments solubles avec la circulation maternelle a lieu. Le sang maintenant oxygéné et plein de nutriments retourne à la circulation foetale via la veine ombilicale (Padykula, 1988; Moore, 1989).

Figure 1-7 La structure du cordon ombilical humain. A gauche, une section transversale du cordon ombilical qui montre les principales structures, y compris les artères et la veine entourées de la gelée de Wharton. A droite, une coloration au trichrome de Masson montre les différentes parties du tissu solide qui sont ciblées lors de l’extraction des cellules.

1.1.2.3.1 L'épithélium

L'épithélium du cordon ombilical est composé d'une mince couche de cellules épithéliales attachées à la membrane basilaire sous-jacente. C’est la seule partie du cordon ombilical à entrer en contact avec le liquide amniotique, donc l’épithélium sert de barrière entre les tissus internes et le liquide du sac amniotique. Souvent il n'y a qu'une seule épaisseur cellulaire, quoique des régions jusqu'à cinq cellules en épaisseur peuvent être trouvées. L'épithélium du cordon est contigu avec l'épithélium amniotique, d'où il est dérivé lors du développement précoce, ainsi qu’avec le périderme embryonnaire et, ensuite, l'épithélium foetal (Hoyes, 1969). Il y a pourtant des différences structurales entre ces épithélia à la fin

de la période de gestation (Mizoguchi et al., 2000). La morphologie de l'épithélium du cordon ombilical ressemble beaucoup à celle de l'épiderme foetal précoce avant sa kératinisation. Ce processus-ci n'a pas lieu dans l'épithélium du cordon ombilical à l'exception de la région adjacente au foetus (Schramm, 1962), la majorité de cet épithélium étant simple et squameux, en contraste à l'épithélium amniotique cuboïde (Bourne, 1962). On a suggéré que l'épithélium du cordon serait impliqué dans la production des composants du liquide amniotique durant la première étape de grossesse (Hoyes, 1969). En culture, les cellules épithéliales du cordon ombilical ont un comportement et des besoins semblables à ceux des kératinocytes de la peau (Ruetze et al., 2008).

1.1.2.3.2 La gelée de Wharton

Le tissu conjonctif du cordon ombilical, décrit par Thomas Wharton pour la première fois en 1656 et appelé la gelée de Wharton, est un tissu mucoïde lâche composé surtout de fibres de collagène entrelacées, de glycosaminoglycanes (GAG) – surtout l'acide hyaluronique (Schoenberg et Moore, 1958; Schoenberg et al., 1960) – et d'un réseau de microfibrilles glycoprotéiques (Meyer et al., 1983). Ce tissu entoure et protège les vaisseaux sanguins du cordon contre la compression et la torsion qui pourraient avoir lieu dans l'utérus avec les mouvements du bébé (Figure 1-7) (Chasnoff et Fletcher, 1977). Il a été difficile de donner une classification exacte aux cellules qui peuplent la gelée de Wharton, étant donné leurs caractéristiques inhabituelles. Tout comme les fibroblastes qui produisent la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs du corps, les cellules stromales du cordon ombilical possèdent en abondance des granules de sécrétion de collagène, des appareils de Golgi, et des mitochondries. Par contre, leurs noyaux échancrés, leurs filaments contractiles, leurs vésicules pinocytotiques et leurs jonctions de type fibronexus (ou adhésions focales matures) sont des éléments typiques des cellules musculaires lisses. Les cellules de la gelée de Wharton contiennent également de l’α-actine de muscle lisse, de la vimentine, de la desmine et de la myosine non musculaire (Kasper et al., 1988; Takechi et al., 1993; Eyden et al., 1994), et donc sont semblables aux myofibroblastes quant à leur fonctionnalité (Nanaev et al., 1997; Kobayashi et al., 1998; Farias et al., 2011). Les premières observations publiées de ces cellules les identifiaient comme des cellules musculaires lisses (Chacko et Reynolds, 1954), mais Parry (1970) suggéra qu’il s’agît

15 plutôt de fibroblastes d’une morphologie distincte, qui ressemblaient à des cellules musculaires lisses. Takechi et al. (1993) ainsi que Farias et al. (2011) conclurent que les cellules étaient des fibroblastes modifiés qui pourraient participer à la régulation du flux sanguin du cordon ombilical grâce à leur contractilité, tandis que Eyden et al. (1994) proposèrent qu’elles seraient dérivées des péricytes ou cellules musculaires lisses. Ces cellules produisent activement les éléments de la matrice extracellulaire qui les entoure, et qui est essentielle pour protéger les vaisseaux sanguins contre la compression extérieure, grâce à la turgescence que cette matrice maintient (Schoenberg et Moore, 1958; Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997).

Aujourd’hui la recherche se concentre surtout sur les propriétés de cellules souches mésenchymateuses caractérisant au moins une sous-population de ces cellules, et les applications qui en découlent. Le premier rapport de la différenciation des cellules stromales du cordon ombilical humain fut un brevet de Purchio et al. (1999) qui décrivait la formation de cartilage par ces cellules. Depuis 2002, plusieurs groupes de recherche ont commencé à publier les résultats d'expériences effectuées avec les cellules du tissu solide du cordon ombilical, tant humain qu'animal. Des études chez le porc (Mitchell et al., 2003) et avec des cellules humaines (Fu et al., 2004; 2006) ont démontré la capacité des cellules de la gelée de Wharton à former des cellules de type neuronal suite à une stimulation adéquate. Des ostéocytes, des adipocytes et des cardiomyocytes ont été également obtenus par la culture appropriée des cellules de la gelée de Wharton humaine (Wang et al., 2004). En utilisant des cellules isolées de l’adventice du cordon ombilical, désignées en tant que cellules périvasculaires, l’équipe du Dr Davies a montré la différenciation en ostéoblastes de ces cellules (Sarugaser et al., 2005; 2009) ainsi que leur différenciation en adipocytes, myocytes et chondrocytes (Sarugaser et al., 2009). Des cellules isolées de la couche subendothéliale de la veine ombilicale se sont différenciées en ostéocytes et en adipocytes (Covas et al., 2003; Romanov et al., 2003). Plus récemment, la différenciation des cellules stromales en cellules exhibant des caractéristiques hépatocytaires a été mise en évidence (Campard et al., 2008; Zhang et al., 2009; Zhao et al., 2009). Du côté de la reconstruction tissulaire, un mélange de cellules du tissu solide du cordon ombilical (veine, artères et gelée de Wharton) a servi à reconstruire des artères pulmonaires faites par génie tissulaire sur un support biodégradable (Hoerstrup et al., 2002).

Tout comme les cellules souches de la moelle osseuse et autres tissus (voir les sections 1.1.1.5 et 1.1.2.4), les cellules stromales de la gelée de Wharton montrent des caractéristiques immunomodulatoires et la production d’un sécrétome qui promeut la régénération des tissus lésés, et leur utilisation comme adjuvant dans des essais cliniques ne cesse de croître (Prasanna et Jahnavi, 2011; Watson et al., 2015; ClinicalTrials.com, 2016). En particulier, les cellules du cordon ombilical n’expriment pas les CMH de type II même sous la stimulation par l’IFN, au contraire des cellules de la moelle osseuse, et elles auraient la capacité d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses (revu dans Ding et al., 2015). Elles semblent aussi supprimer la prolifération des lymphocytes d’une façon plus robuste que les CSM de moelle osseuse, tant in vitro comme dans des expériences de greffe chez les animaux (revu dans Prasanna et Jahnavi, 2011).

1.1.2.3.3 La média

Une média composée de cellules musculaires lisses entoure chacun des vaisseaux ombilicaux (Figure 1-7). La fonction primaire de ces cellules est la contraction nécessaire pour le mouvement du sang, mais elles sont aussi capables de produire de la matrice extracellulaire, et de proliférer au besoin (Schwartz et al., 1986; Owens, 1995). Les cellules musculaires lisses peuvent faire la transition entre ces deux phénotypes d’une façon réversible (Chamley-Campbell et al., 1979; Majesky et al., 2011). Les protéines contractiles les plus importantes dans ces cellules sont l’α-actine de muscle lisse et la myosine; on y trouve aussi la ß-actine non musculaire, la γ-actine non musculaire et la γ- actine de muscle lisse (Kabsch et Vandekerckhove, 1992). Des variantes de la chaîne lourde de la myosine de muscle lisse et non musculaire sont présentes dans les cellules, ainsi que des isoformes de la chaîne légère. D’autres molécules typiquement trouvées comprennent la calponine, la vinculine, la caldesmone, la tropomyosine, et les filaments intermédiaires vimentine et desmine (Tang, 2008). La régulation précise de la contraction cellulaire s’effectue à travers des canaux ioniques et des récepteurs membranaires (Owens, 1995). Les cellules musculaires lisses extraites du cordon ombilical sont abondamment employées dans la recherche sur le métabolisme et les caractéristiques des cellules musculaires lisses, ainsi que dans la reconstruction tissulaire (L'Heureux et al., 1993;

17 Owens, 1995; L'Heureux et al., 1998; Sodian et al., 2006; Stephan et al., 2006; Gauvin et al., 2011; Bourget et al., 2013); revu dans (Weber et al., 2011; Auger et al., 2013).

1.1.2.3.4 L'endothélium

La surface luminale des vaisseaux sanguins du cordon ombilical est tapissée d’une couche de cellules endothéliales qui ont de multiples fonctions dans le corps humain. Entre autres, elles sont responsables du maintien d’une surface non thrombogénique dans les lumières des vaisseaux sanguins, de la régulation de la coagulation et de la fibrinolyse, des fonctions immunologiques, du contrôle de la vasomotricité, de la régulation de la perfusion et la perméabilité à travers les parois des vaisseaux, ainsi que de la libération des agents chimiques et la réponse aux facteurs solubles. Plusieurs sentiers biosynthétiques sont spécifiques à l’endothélium, tels la synthèse du NO, du facteur von Willebrand, de la prostacycline, de l’endothéline-1, et de la thromboxane A2 (revu dans Hayoz et Silacci, 2006). Les propriétés des cellules endothéliales du cordon ombilical (et d’autres sources) ont été examinées depuis longtemps, surtout dans l’étude de l’angiogenèse et son contrôle par la pharmacologie (Jaffe et al., 1973b; Gimbrone et al., 1974; Cozzolino et al., 1990; Black et al., 1998; Bachetti et Morbidelli, 2000; Guo et al., 2000; Fassina et al., 2004; Tremblay et al., 2005a), ainsi que dans la reconstruction de tissus vascularisés, vaisseaux sanguins et autres (Black et al., 1999; Schechner et al., 2003; Gibot et al., 2010; Guillemette et al., 2010; Rochon et al., 2010; Tsigkou et al., 2010; revu dans Hendrickx et al., 2011). Les cellules endothéliales de la veine ombilicale en particulier sont souvent employées dans les modèles de recherche, en partie dû à la facilité de leur obtention. Dans les publications scientifiques, elles sont souvent appelées des ‘HUVEC’, pour ‘human umbilical vein endothelial cells’. Ces cellules ont une morphologie caractéristique de pavés ronds en culture en monocouche, et tendent à former des tubules lorsque soumises aux stimuli appropriés et ensemencées dans des gels en trois dimensions, tel le Matrigel™ (Kubota et al., 1988), et dans des éponges de collagène (Black et al., 1998).

1.1.2.4 Tissus adultes

Chez l’adulte humain, plusieurs organes et tissus ont leurs réservoirs de cellules souches spécifiques. Outre les cellules souches de la moelle osseuse et de l’épiderme que nous avons déjà citées, les muscles, le système nerveux, l’épithélium intestinal, le foie, le sein, la prostate, les poumons, le pancréas, les ovaires, et le derme ont tous leurs populations de cellules souches (Church et al., 1966; Lewis, 1968; Cheng et Leblond, 1974; Alison et Sarraf, 1998; Stingl et al., 1998; Collins et al., 2001; Giangreco et al., 2002; Li et al., 2007; Szotek et al., 2008; Biernaskie et al., 2009).

De plus en plus, les chercheurs trouvent que des populations de cellules souches chez les tissus adultes sont plus polyvalentes que soupçonnées, se prêtant à la différenciation en types cellulaires autres que ceux de leurs tissus d’origine (Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000), et même en types cellulaires d’une couche embryonnaire distincte (Kopen et al., 1999; Pittenger et al., 1999; Sato et al., 2005). Il est maintenant reconnu que des cellules progénitrices multipotentes se trouvent dans la plupart des tissus adultes (da Silva Meirelles et al., 2006). Les noms attribués à ces cellules sont variés, y compris cellules souches mésenchymateuses, cellules progénitrices multipotentes adultes, et cellules précurseurs dérivées de la peau, selon leur provenance et leurs caractéristiques démontrées. Elles ont été isolées du derme, du tissu adipeux, des tendons, des poumons, et du tissu stromal vasculaire (Toma et al., 2001; Zuk et al., 2001; Salingcarnboriboon et al., 2003; Sabatini et al., 2005; Yang et al., 2013). Plusieurs études indiquent que le compartiment périvasculaire serait un réservoir de cellules souches mésenchymateuses ou multipotentes, et que les caractéristiques spécifiques de chaque population de péricytes seraient déterminées par le tissu de résidence (Doherty et al., 1998; Bianco et al., 2001; Shi et Gronthos, 2003; Farrington-Rock et al., 2004; Dellavalle et al., 2007; Crisan et al., 2008; da Silva Meirelles et al., 2008).

19 1.1.2.5 Cellules reprogrammées

Il arrive dans certains cas que les cellules d’un patient sont atteintes par une pathologie et ne peuvent être ainsi employées pour une thérapie cellulaire. Il faut alors avoir recours à des sources alternatives de cellules, qui auraient besoin de modifications pour être aptes à l’utilisation voulue. Des cellules déjà différenciées peuvent parfois être menées à se dédifférencier ou à moduler leur état de différenciation vers celui d’un autre type cellulaire. Il y a plusieurs approches possibles: des cellules matures peuvent être induites en cellules pluripotentes (en anglais, « induced pluripotent stem cell », ou iPS; Figure 1-8), et par la suite différenciées dans un autre type cellulaire que celui d’origine, ou bien des cellules différenciées converties directement à un autre type cellulaire sans passer par une étape de dédifférenciation (reprogrammation directe, ou transdifférenciation).

Figure 1-8 La production de cellules pluripotentes induites. Ce schéma montre plusieurs stratégies employées pour la génération de cellules pluripotentes à partir de cellules somatiques ou de cellules germinales. Ces cellules pluripotentes induites peuvent par la suite se différencier en types cellulaires propres des trois feuillets embryonnaires. ES – embryonic stem; GS – germline stem. Figure tirée de Yamanaka et al. (2007).

Le transfert du noyau d’une cellule somatique dans un oocyte énucléé est à la base du clonage (Briggs et King, 1952; Wilmut et al., 1997; Gurdon et Byrne, 2003), mais le développement de l’embryon est difficilement achevé sans problèmes, et le processus est très inefficace (Gurdon et Byrne, 2003; Yamanaka, 2007). Chez les cellules somatiques adultes, l’état pluripotent a initialement été généré par la transduction rétrovirale des gènes de certains facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc), tel que montré chez les fibroblastes murins et humains (Figure 1-8) (Takahashi et Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007). La transduction lentivirale et adénovirale, ainsi que la transfection par plasmides, sont autant de façons d’introduire l’expression des gènes de ces facteurs de transcription (Brambrink et al., 2008; Okita et al., 2008; Stadtfeld et al., 2008). La transduction adénovirale et la transfection par plasmides sont temporaires et alors moins problématiques en ce qui concerne les mutations provoquées par leur insertion dans le génome, mais ces méthodes sont moins efficaces dans la reprogrammation que la transduction rétrovirale.

Une stratégie qui vise à complètement enlever les éléments introduits est celle des transposons piggyBac (Woltjen et al., 2009), où les transposons peuvent être enlevés une fois que l’état de pluripotence est établi de façon stable. Au lieu des gènes, les protéines mêmes, avec l’addition d’un peptide de pénétration, peuvent s’intégrer au noyau des cellules à partir du milieu de culture pour initier la transformation en cellules souches pluripotentes (Kim et al., 2009 (humain); Zhou et al., 2009 (souris)). Cette approche pour l’instant est moins efficace, mais évite les problèmes associés à l’ADN exogène. Finalement, des publications plus récentes ont montré que l’exposition des cellules cibles à des extraits d’oocytes mitotiques augmente l’efficacité des stratégies de dédifférenciation (Sylvestre et al., 2010 (mammifères); Ganier et al., 2011; Rathbone et al., 2013 (Xenopus)).

Théoriquement, les cellules pluripotentes obtenues par ces méthodes pourraient se différencier en n’importe lequel des types cellulaires du corps, et seraient une source polyvalente de types cellulaires spécifiques pour le génie tissulaire et la médecine régénératrice. Mais étant donné qu’aucune de ces stratégies n’est efficace à cent pourcent, une diversité de cellules reprogrammées en résulte qui doit être triée avant que les cellules

21 vraiment pluripotentes ne puissent être utilisées pour la génération de types cellulaires différenciés (Chan et al., 2009). De plus, tel que mentionné dans le cas des cellules souches embryonnaires, le risque de formation de tératomes par les cellules qui ne se différencient pas après un traitement d’induction n’est pas à négliger.

La stratégie de reprogrammation directe évite ces désavantages, car elle ne requiert pas une étape intermédiaire de dédifférenciation mais modifie un phénotype différencié à un autre, donnant ainsi un type cellulaire adulte. Le changement direct de type cellulaire fut montré lorsque l’équipe de Davis et al. a converti des fibroblastes en myocytes par la transfection du cADN d’un facteur défini, le MYOD1 (1987). Par la suite, des fibroblastes furent convertis en cardiomyocytes, neurones, chondrocytes et hépatocytes, et même des cellules hématopoiétiques (Ieda et al., 2010; Vierbuchen et al., 2010; Hiramatsu et al., 2011; Huang et al., 2011b; revu dans Takahashi, 2012). Dans une étude, des cellules épithéliales thymiques, qui sont d’origine endodermique, furent mises en culture et ensuite utilisées pour des greffes de follicules pileux, où elles ont contribué au renouvellement des follicules et même de l’épiderme (Bonfanti et al., 2010).

Cela dit, avec toutes les techniques il faut éviter de greffer des cellules qui ne sont que partiellement reprogrammées, car leurs propriétés sont inconnues et pourraient être très différentes de celles du type cellulaire ciblé. Aussi, très peu est connu de la mémoire épigénétique des cellules reprogrammées, y compris la possibilité et l’incidence de réversion qui pourrait avoir lieu (Kim et al., 2011a; Ohi et al., 2011; revu dans Takahashi, 2012).

1.1.3 La peau humaine en tant que source de cellules et modèle de la différenciation épithéliale

La peau est un organe complexe qui remplit plusieurs fonctions essentielles, telles que le contrôle de la température corporelle et de la perte d’eau, la synthèse de la vitamine D, l’exclusion des pathogènes, et la protection contre les blessures. Plusieurs récepteurs du toucher, de la température, et de la douleur se situent dans la peau, qui a également des fonctions immunologiques et excrétoires. La peau se renouvelle constamment, grâce aux cellules souches épithéliales qui remplacent les cellules perdues à la surface de l'épithélium par la desquamation (Holbrook et Wolff, 1987; Odland, 1991; Turksen et Troy, 1998).

Figure 1-9 La structure globale de la peau. Ce dessin de la peau et de l’hypoderme sous-jacent montre également la localisation des vaisseaux sanguins, des follicules pileux et des glandes sébacées. Figure modifiée de Farage et al. (2013).

La peau est un tissu idéal pour l'étude de la différenciation épithéliale, la régénération, la guérison et des cellules souches parce qu'elle est hautement différenciée et que le

23 renouvellement de l’épiderme a lieu constamment par le biais des cellules progénitrices. De telles études ainsi que des recherches pharmacologiques se font en utilisant des modèles in vitro de la peau (revu dans Groeber et al., 2011). Ces modèles furent les premiers à être produits in vitro et sont peut-être les plus avancés des tissus reconstruits à ce jour.

Les deux compartiments majeurs de la peau, le derme et l'épiderme, reposent sur l'hypoderme, un tissu adipeux qui est attaché aux muscles sous-jacents (Figure 1-9); dans le derme on retrouve les vaisseaux sanguins, les glandes et les terminaisons nerveuses, ainsi que les follicules pileux (Holbrook et Wolff, 1987).

1.1.3.1 L'épiderme

L'épiderme est un épithélium stratifié cornifié dans lequel il y a plusieurs couches distinctes (Figure 1-10). Il comprend plusieurs types cellulaires, le plus nombreux étant les kératinocytes, qui sont responsables de son intégrité cohésive, et des fonctions de barrière contre le milieu externe et les pathogènes. Parmi les kératinocytes, les cellules souches épithéliales en particulier sont responsables du renouvellement continuel de l’épiderme et des poils. Bien que les kératinocytes constituent la majorité des cellules de l’épiderme, d’autres types cellulaires spécialisés s’y trouvent: les mélanocytes, issus de la crête neurale, qui synthétisent la mélanine distribuée aux kératinocytes avoisinants pour fournir non seulement la couleur de la peau, mais aussi la protection contre les rayons UV (revu dans Cichorek et al., 2013), les cellules de Merkel qui auraient des fonctions neuroendocrines et sont impliquées dans la mécanoréception (revu dans Tachibana, 1995; Boulais et Misery, 2007), et les cellules de Langerhans et les lymphocytes épidermiques, dérivés des cellules souches hématopoïétiques, qui font partie du système immunitaire (Holbrook et Wolff, 1987; revu dans Romani et al., 2012; Chopin et Nutt, 2014).

Figure 1-10 Les couches différenciées de l’épiderme. Le dessin à droite montre les différentes couches de l’épithélium de l’échantillon histologique de peau coloré avec l’hématoxyline/éosine, à gauche. En partant de la couche basale, des kératinocytes de plus en plus différenciés se trouvent dans les couches supérieures. Figure modifiée de Simpson et al. (2011).

1.1.3.2 La couche basale

La monocouche de cellules cuboïdes adjacentes au derme s'appelle le stratum basale, ou couche basale, et contient les seules cellules de l'épiderme qui entrent en mitose (Figure 1-10). Les cellules souches épidermiques, peu nombreuses, sont situées à ce niveau et sont responsables du renouvellement constant de l’épiderme, qui est remplacé en 28 jours (Tobin, 2006). Chaque cellule souche se divise pour donner une cellule souche identique à l’originelle, et une cellule prolifératrice transitoire qui produira plusieurs cellules filles destinées à devenir des kératinocytes matures par la voie de la différenciation épidermique. Les cellules qui se différencient montent progressivement vers la surface extérieure de la

25 peau pendant leur changement en cornéocytes, et elles desquameront de la couche cornée avec le temps (Holbrook et Wolff, 1987).

Les cellules de la couche basale ont relativement peu de filaments de kératines comparativement aux cellules des couches supérieures, et ceux-ci sont plus dispersés dans la cellule (Brody, 1960; Eichner et al., 1986; Coulombe et al., 1989). Les kératines dominantes à ce stade sont les K5 et K14. D’autres kératines sont également présentes dans des cellules spécialisées, telles la K19 dans les cellules souches et les cellules de Merkel, et la K18 et la K20 également dans les cellules de Merkel (Moll et al., 1984; Michel et al., 1996). Les filaments de K5/K14 s’étendent du lamina nucléaire aux hémidesmosomes, points d’attachement de l’épiderme à la membrane basale sous-jacente, et aux desmosomes, points d’attachement des kératinocytes adjacents, et forment le cytosquelette des cellules épithéliales avec des quantités moins importantes de tubuline, dans les microtubules, et d’actine, dans les microfilaments (revu dans Candi et al., 2005).

Les desmosomes sont présents partout dans l’épithélium, et avec les jonctions intermédiaires maintiennent l’intégrité structurale du tissu en attachant solidement les kératinocytes adjacents (Figure 1-10). Trois éléments sont essentiels pour la résistance mécanique des tissus soumis aux forces physiques, et doivent être aussi solides les uns que les autres: les filaments intermédiaires qui traversent la cellule, le complexe de protéines qui relie le cytosquelette aux desmosomes, et les molécules d’adhésion du desmosome. Des mutations dans les gènes de n’importe quelle de ces structures peuvent entraîner des conséquences sévères, voire mortelles (revu dans Garrod et Chidgey, 2008).

Les kératines qui forment le réseau intracellulaire sont solidement attachées au niveau de la membrane cellulaire à la desmoplakine, qui sert de lien entre les filaments intermédiaires et la plaque desmosomale (Figure 1-11). Cette plaque est composée de plusieurs protéines, dont les desmocollines et les desmogléines, membres de la famille des cadhérines qui traversent la membrane plasmique et dont les queues extracellulaires s’associent avec leurs paires de la cellule adjacente pour former le lien d’adhésion. Également comprises dans la plaque sont les protéines plakophiline et plakoglobine, pour lesquelles les fonctions précises n’ont pas encore été complètement élucidées (revu dans Garrod et Chidgey, 2008).

Figure 1-11 La structure des desmosomes. Cette figure montre les principaux composants du desmosome. Adaptée de Uitto et al. (2007).

Une propriété des desmosomes les met à part des autres types de jonctions intercellulaires: ils acquièrent un état d’hyperadhésivité qui est indépendant du calcium. Cet état est la norme dans les tissus des mammifères et semble avoir son origine dans l’organisation des cadhérines desmosomales (les desmogléines et les desmocollines). Un arrangement ordonné des cadhérines confère l’hyperadhésivité, et un manque d’ordre est associé à la dépendance au calcium et à une cohésion affaiblie. Cette réduction dans la force des jonctions se trouve surtout lors du développement embryonnaire et de la guérison des plaies. Divers signaux cytoplasmiques pourraient réguler l’adhésivité des desmosomes, y compris la kinase protéique Cα (PKCα) et la phosphorylation des résidus de tyrosine (Wallis et al., 2000; Garrod et al., 2005; Kimura et al., 2007; Garrod et Chidgey, 2008).

27 1.1.3.3 La couche épineuse

Le stratum spinosum comprend les couches de kératinocytes immédiatement au-dessus la couche basale, qui sont attachées entre elles par de multiples desmosomes et qui sont déjà impliquées dans le processus de la différenciation terminale (Figures 1-12, 1-13). Ces cellules sont sorties du cycle cellulaire de prolifération, et n’adhèrent plus à la membrane basale. Les cellules de cette couche synthétisent les kératines 1 et 10 au lieu des kératines 5 et 14, et ces kératines commencent déjà à s’agréger en de plus grands faisceaux (Eichner et al., 1986; Coulombe et al., 1989). L’ancrage de ces faisceaux de kératines aux desmosomes donnera la résistance mécanique à la peau pour résister aux forces physiques auxquelles elle est soumise. La synthèse de certaines autres molécules nécessaires pour la formation de la couche cornée commence à cette étape, y compris l'involucrine, la périplakine et l’envoplakine, trois des protéines de l’enveloppe cornifiée, ainsi que la transglutaminase 1, enzyme responsable pour la réticulation de ces protéines (Rice et Green, 1979; Thacher et Rice, 1985; Steinert et Marekov, 1997). La synthèse des lipides débute dans la couche épineuse, comprenant surtout la formation de céramides, de cholestérol et d'acides gras, qui sont accumulés dans des granules lamellaires et qui seront libérés plus tard durant le processus de la différenciation terminale (Vielhaber et al., 2001).

Figure 1-12 Les couches différenciées de l’épiderme. Le dessin à gauche montre les différentes couches de l’épithélium et les principales molécules impliquées dans la différenciation à chaque étape. À droite, le schéma montre un agrandissement de la couche cornifiée. Figure tirée de Candi et al. (2005).

1.1.3.4 La couche granuleuse

Plus proche de la surface de la peau se trouve le stratum granulosum, composé de kératinocytes aplatis encore plus différenciés, contenant des granules de kératohyaline composés d'involucrine, de loricrine, de filaments de kératine et de profilaggrine, qui sera transformée en filaggrine, une protéine d'agrégation (Figures 1-12, 1-13). Les nombreuses molécules de filaggrine servent à aligner et à organiser les filaments de kératine dans des faisceaux, ce qui provoque l’aplanissement des cellules (Dale et al., 1997). La proportion élevée d’acides aminés hydrophiles de la filaggrine est essentielle pour la rétention de l’eau dans la couche cornée, et donc pour sa flexibilité. Les cellules à cette étape deviennent perméables, ce qui permet l’augmentation du niveau intracellulaire de calcium et l’activation subséquente des transglutaminases (Rice et Green, 1979). Les transglutaminases, enzymes dépendantes du calcium, catalysent la formation de liens covalents surtout entre les molécules de loricrine et d’involucrine, pour former un réseau résistant mais flexible en dessous de la membrane cellulaire. La loricrine, composant majeur de l’enveloppe cornifiée, semble le renforcer structuralement, et se trouve attachée aussi aux petites protéines riches en proline (en anglais, SPRs – small proline-rich proteins), ainsi qu’aux kératines et à la filaggrine (Steinert et Marekov, 1995; 1997;

29 Steinert et al., 1998). Ce réseau de protéines formera l’enveloppe cornifiée, qui est rendue insoluble en raison du niveau élevé de sa réticulation (Martinet et al., 1988; Greenberg et al., 1991).

Figure 1-13 Les étapes dans la formation de l’enveloppe cornifiée. Ce schéma montre les différentes étapes de la formation de l’enveloppe cornifiée, et les principales molécules qui sont impliquées. Ce processus commence dans la couche épineuse, à gauche, et continue avec la progression des cellules à travers les couches supérieures pour aboutir dans la couche cornée, à droite. Figure tirée de Candi et al. (2005).

En même temps, les lipides déjà synthétisés sont transportés aux appareils de Golgi où ils subissent certaines modifications, dont l’intégration de sphingolipides aux membranes des corps de Golgi. Des vésicules aplaties, appelées corps lamellaires, se forment et par la suite se détachent, dans lesquelles s’accumulent des céramides, des acides gras libres, des phospholipides, des triglycérides, et du cholestérol, ainsi que des hydrolases, des lipases et des protéases (Lampe et al., 1983; Ishida-Yamamoto et al., 2004; Perry et Ridgway, 2005). Lorsque les cellules sont rendues à l’interface stratum granulosum-stratum corneum, ces corps lamellaires fusionneront avec la membrane plasmique, et libéreront leur contenu dans

l’espace intercellulaire (Figure 1-13). Les sphingolipides s’intègrent graduellement à la membrane plasmique des kératinocytes alors énucléés, et se lient surtout à l’involucrine de l’enveloppe cornifiée, ainsi qu’à l’envoplakine et à la périplakine, pour ensuite former l’enveloppe lipidique, une couche d’une épaisseur de 5 nm qui recouvre la surface extérieure des cellules (Marekov et Steinert, 1998). Plus précisément, cette monocouche est composée en majorité de céramides ω-hydroxy-acylés (ω-hydroxyacylsphingosine), avec une quantité moins importante d’acides gras ω-hydroxy, qui sont liés de façon covalente aux résidus glutamates de l’involucrine avec l’aide de la transglutaminase 1 (Wertz et Downing, 1987; Marekov et Steinert, 1998; Kalinin et al., 2001; 2002).

Au cours de cette différenciation terminale, la membrane cellulaire, le noyau et les autres organelles des kératinocytes se désintègrent, ce qui résulte dans la formation des cornéocytes de la barrière épidermique.

1.1.3.5 La couche cornée

Le stratum corneum ou couche cornée est une barrière protectrice, composée de plusieurs couches de cornéocytes morts et énucléés liés par un ‘ciment’ riche en lipides (Figures 1-12, 1-13). Cette couche empêche l'évaporation des liquides corporels et prévient l'entrée de microorganismes, et est aussi l’endroit où l’épaisseur de la peau est maintenue par la desquamation continuelle des cornéocytes superficiels (Wysocki, 1999; Lookingbill et Marks, 2000). La dégradation des desmosomes modifiés de la couche cornée, ou cornéodesmosomes, est d’une importance majeure dans le processus de desquamation.

Les cornéodesmosomes ont une structure modifiée comparativement aux desmosomes des couches inférieures de la peau. La région extracellulaire des desmosomes devient une plaque homogène, imperméable aux électrons en microscopie électronique à transmission, et la plaque cytoplasmique s’intègre à l’enveloppe cornifiée (Serre et al., 1991; Simon et al., 2001b). La cornéodesmosine, une glycoprotéine dont la synthèse a lieu dans la partie supérieure de la couche épineuse et dans la partie inférieure de la couche granuleuse, s’incorpore dans la partie extracellulaire des desmosomes juste avant leur transformation en cornéodesmosomes. Cette protéine est transportée et relâchée par des vésicules appelées kératinosomes (Haftek et al., 1991; Serre et al., 1991; Simon et al., 1997; 2001a). Elle

31 serait impliquée dans l’adhésion des desmosomes, et en plus, sa dégradation protéolytique serait essentielle pour la desquamation des cornéocytes (Simon et al., 2001b; Jonca et al., 2002).

Des protéases extracellulaires sont importantes pour la desquamation de la couche cornée, afin de dégrader les protéines des cornéodesmosomes qui maintiennent les cornéocytes en place.

Les céramides de la couche cornée sont essentiels non seulement pour empêcher la perte d’eau à travers la peau, mais aussi pour protéger contre les infections microbiennes (Bibel et al., 1992; Arikawa et al., 2002; Zuo et al., 2008). Aussi compris dans le contenu des corps lamellaires, et par la suite libérés dans l’espace intercellulaire, on retrouve des peptides antimicrobiens (Elias et al., 2014).

1.1.3.6 La jonction dermo-épidermique

Aussi appelée la zone de la membrane basale, la jonction dermo-épidermique est une structure hautement spécialisée, à la fois séparant l’épiderme du derme et les attachant solidement ensemble. Elle sert de barrière de diffusion et d’ancrage pour les cellules de l’épiderme, et régule l’adhésion, la migration, et l’architecture tissulaire des cellules avoisinantes, y compris la stratification de l’épiderme différencié (Bohnert et al., 1986; Borradori et Sonnenberg, 1996; Green et Jones, 1996; Borradori et Sonnenberg, 1999; Hamelers et al., 2005). L’interaction des hémidesmosomes avec la membrane basale sous- jacente est essentielle pour des processus biologiques tels la guérison des plaies et la morphogenèse des tissus (revu dans Ghohestani et al., 2001). La membrane basale est aussi un réservoir de facteurs de croissance et de cytokines, qui gère l’activation locale des éléments nécessaires dans l’angiogenèse, la neurogenèse, la chondrogenèse et le développement du tissu cardiovasculaire, entre autres (revu dans Iozzo, 2005; Whitelock et al., 2008). Plusieurs maladies de la peau s’avèrent le résultat de mutations, déficiences ou ciblage auto-immunitaire des éléments de la membrane basale, y compris des cancers ainsi que plusieurs types d’epidermolysis bullosa distingués par la molécule mutée, telles les chaînes de laminines, le collagène de type VII, ou la plectine (Christiano et Uitto, 1996;

Has et al., 2011); (revu dans Masunaga, 2006; Yurchenco et Patton, 2009; Uitto et al., 2010).

Figure 1-14 La structure générale de la membrane basale. En microscopie électronique, à gauche, les structures visibles de la membrane basale comprennent la membrane cellulaire des kératinocytes avec leurs hémidesmosomes, la lamina lucida, et la lamina densa. On peut aussi distinguer les fibres de collagène dans la matrice extracellulaire sous-jacente. À droite, un schéma adapté de Breitkreutz et al. (2013) montre plus clairement l’assemblage des principales structures.

Cette structure macromoléculaire complexe paraît être composée de trois couches distinctes lorsque regardée en microscopie électronique à transmission (Figure 1-14) (Nicolas et al., 1993; Lookingbill et Marks, 2000). La première couche comprend la membrane cellulaire basale des kératinocytes de la couche basale, contenant les hémidesmosomes qui lient les cellules épithéliales au derme. L’hémidesmosome est le point de rattachement des filaments de kératine qui composent le cytosquelette des kératinocytes basaux. Ceux-ci sont liés aux protéines BPAG1 (bullous pemphigoid antigen 1) et à la plectine, qui à leur tour sont

33 attachées aux protéines transmembranaires que sont le collagène de type XVII, et les intégrines α6β4 et α3β1. Ceci nous mène à la deuxième couche visible, la lamina lucida, qui contient de fins filaments de laminine attachés aux intégrines d’un côté, et de l’autre côté aux protéoglycans tels le perlecan ou le dystroglycan, ainsi qu’au nidogène, qui complètent la connexion à la lamina densa sous-jacente, composée majoritairement du collagène de type IV avec de la fibronectine, de l'entactine et du sulfate d'héparane. D'épaisses fibres de collagène de type VII (fibres d'ancrage) complètent l'attachement de l'épiderme au derme (Figure 1-15) (Stanley et al., 1982; Hashmi et Marinkovich, 2011). La résistance mécanique de la membrane basale provient surtout du réseau très stable des fibres de collagène de type IV (Pöschl et al., 2004) tandis que le réseau de laminines non seulement peut se défaire et se refaire au besoin lors du remodelage tissulaire, mais est capable de s’auto-assembler, ce qui est primordial dans le développement embryonnaire de la membrane basale; sans la présence de ces premiers réseaux de laminines, les membranes basales ne peuvent se construire et ce défaut est létal (Yurchenco et al., 1992; Smyth et al., 1999; Miner et al., 2004; Yurchenco et al., 2004; Yurchenco et Patton, 2009).

Figure 1-15 La structure des hémidesmosomes et de la membrane basale. Cette figure montre en plus de détail les principaux composants et leur localisation dans la structure assemblée. Adaptée de Uitto et al. (2007).

La laminine-5, aussi connue comme la kalinine, joue un rôle très important dans la cohésion de la jonction derme-épiderme; les intégrines α6β4 de la surface basale des kératinocytes lient la laminine-5 de la membrane basale, organisant ainsi la structure des hémidesmosomes. La laminine-5 à son tour est fortement attachée au collagène de type VII formant les fibres d’ancrage sous-jacents à la membrane basale (Rousselle et al., 1997; Nishiyama et al., 2000; revu dans Miner et Yurchenco, 2004). Ces deux interactions sont essentielles pour l’intégrité de la peau. Des mutations dans une des trois sous-unités de la laminine-5 (α3, β3, et γ2) qui empêchent ces liaisons peuvent être mortelles, car elles causent une maladie appelée l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle d’Herlitz dans laquelle les hémidesmosomes sont absents, maladie caractérisée par des bulles cutanées dès la naissance et même de vastes décollements cutanés (revu dans Pulkkinen et al., 1994; Pulkkinen et Uitto, 1999).

1.1.3.7 Le derme

Le derme est composé d'une matrice extracellulaire dans laquelle se trouvent des cellules, majoritairement des fibroblastes, ainsi que des terminaisons nerveuses, des réseaux microvasculaires sanguin et lymphatique, des glandes et des follicules pileux. La matrice extracellulaire contient surtout du collagène (environ 80 à 90% des protéines dermiques). Des collagènes structuraux, ceux de type I et de type III sont les plus abondants, et il y a de plus petites quantités de collagènes de types V, VI, XII et XIV. Un réseau de fibres élastiques – l'élastine, les fibrillines, les fibulines et des glycoprotéines associées aux microfibrilles – entrelace les collagènes structuraux, les glycoprotéines de la matrice (la fibronectine et la laminine), et les protéoglycanes (les sulfates de dermatan et de chondroïtine, le versican), pour former une structure complexe et compacte. Ce réseau extracellulaire hautement organisé donne de la force mécanique, de la flexibilité et de l'élasticité à la peau (Aumailley et Krieg, 1994; Handford et al., 2000; Lookingbill et Marks, 2000; Hubermacher et al., 2006; Krieg et Aumailley, 2011).

35 1.1.4 Protéines structurales

1.1.4.1 Les filaments intermédiaires en tant que marqueurs du stade de la différenciation

Les filaments intermédiaires sont des protéines structurales très stables qui composent l’un des trois systèmes de cytosquelette de la cellule, les autres étant les réseaux d’actine et des microtubules. Contrairement à ces deux derniers, les filaments intermédiaires sont résistants à la dissolution par détergents ou par solution saline, mais leurs réseaux sont dynamiques et sensibles aux signaux physiologiques. Les filaments intermédiaires sont très pertinents pour la caractérisation des cellules, car leur expression varie d’une façon spécifique au cours du développement embryonnaire et de la différenciation cellulaire (Franke et al., 1978; revu dans Lazarides, 1982; Oshima, 2007; Moll et al., 2008; Dey et al., 2014). En plus, ils détiennent des rôles importants dans la signalisation, la division et la motilité cellulaires, dans l’expression des gènes, et dans la stabilisation mécanique des cellules par le biais du cytosquelette (Chang et Goldman, 2004; Helfand et al., 2004; Li et al., 2006; Kim et Coulombe, 2007); (revu dans Lazarides, 1980; Eriksson et al., 2009). Selon le type de filament et de cellule, la perte de filaments intermédiaires fonctionnels peut entraîner des effets importants sur la physiologie tant tissulaire que cellulaire (revu dans Herrmann et al., 2009). Des mutations dans les séquences des filaments intermédiaires humains sont à la base de plus de 70 maladies (Omary et al., 2004; Szeverenyi et al., 2008). À titre d’exemple, les fibroblastes de souris déficientes en vimentine ne peuvent répondre adéquatement aux blessures, et leur stabilité mécanique, leur motilité et leur capacité à diriger leur migration sont diminuées d’une façon importante (Eckes et al., 1998).

Il y a six classes de filaments intermédiaires (Eriksson et al., 2009), y compris les kératines de types I et II qui se trouvent typiquement dans les cellules épithéliales (Moll et al., 1982), ainsi que les chaînes de type III trouvées chez les cellules musculaires (la desmine, la synémine), chez les cellules neuronales (la périphérine et le GFAP), et les cellules mésenchymateuses (la vimentine) (revu dans Eriksson et al., 2009).

La structure de base des filaments intermédiaires est celle d’une zone centrale en hélice α, avec des extrémités N- et C-terminales qui varient en longueur et en composition d’acides aminés selon chaque type de filament, ce qui leur donnerait leurs propriétés spécifiques lors

des interactions avec des molécules structurales et de signalisation (Parry, 2005). Ces filaments de base s’auto-polymérisent dans des filaments de 10 nm de largeur, et d’une longueur variable.

1.1.4.1.1 Les kératines

Le cytosquelette des cellules épithéliales est essentiellement constitué de kératines, protéines intracellulaires qui s'associent pour former un réseau structurel. Elles sont classées en deux groupes, selon leur point isoélectrique et leur séquence d'acides aminés. Les kératines de type I (K9 à K23, Ha1 à Ha8) sont acides, ayant un pKi de 4,5 à 6,0 et un poids moléculaire entre 40 et 63 kDa, tandis que les kératines de type II (K1 à K8, Hb1 à Hb6) sont neutres ou basiques avec un pKi de 6,0 à 7,5 et un poids moléculaire entre 53 et 67 kDa (Moll et al., 1982; Coulombe et Omary, 2002). Les deux types de kératines s'associent spontanément dans une proportion de 1:1 pour former des hétérodimères hélicoïdaux parallèles, qui ensuite s'apparient pour former des hétérotétramères antiparallèles stables. Les tétramères s'assemblent bout à bout pour former des protofilaments; huit protofilaments constituent un filament intermédiaire de 10 nm de diamètre (Coulombe et Fuchs, 1990). Ces filaments sont ancrés dans les desmosomes et les hémidesmosomes des cellules épithéliales et constituent une partie intégrale du cytosquelette.

Le patron d'expression des kératines est souvent spécifique au type d'épithélium, et peut également être spécifique au stade de développement ou de différenciation (voir le Tableau 1-1 pour un résumé de la distribution des kératines principales). La présence de certaines kératines sert de marqueur pour des tissus ou des types cellulaires, et pour l’état de différenciation de la cellule. Par exemple, la kératine 12 caractérise les kératinocytes cornéens, la kératine 13 les épithélia muqueux; la kératine 19 présente dans les cellules souches épithéliales de la peau disparaît au cours de leur différenciation physiologique en cornéocytes (Moll et al., 2008). L’expression des kératines 6/16 est induite dans la peau lors de la guérison des plaies et lors de l’hyperprolifération, y compris en culture (Mansbridge et Knapp, 1987; Weiss, 1989). La diversité des fonctions des kératines dans la cellule est loin d'avoir été comprise en totalité, mais outre l'aspect structural du cytosquelette, les kératines participent dans la réponse cellulaire au stress, dans la

37 régulation des voies de signalisation concernant la synthèse protéique et l'apoptose, et dans la distribution des organelles et des vésicules (Gu et Coulombe, 2007).

Tableau 1-1 Les kératines majeures des épithélia humains.

Kératines Épithélium Type II Type I Distribution Cellules 9 Couches épineuse et granuleuse de l’épiderme suprabasales palmo-plantaire 1 10/11 Kératinocytes suprabasaux de l’épiderme 2e Couches épineuse supérieure et granuleuse de l’épiderme 2p Gencives, palais dur 3 12 Cornée 4 13 Épithélia squameux stratifiés non-kératinisés de la muqueuse buccale et des organes internes 6 16, 17 Couche épineuse de l’épiderme palmo- plantaire, glandes sudoripares, follicules pileux, épithélia squameux hyperprolifératifs † Épithélia squameux 5 14 Cellules basales des épithélia squameux et stratifiés glandulaires, myoépithélia, mésothélium 15 Épithélia squameux, follicules pileux 8 18, 19 Épithélia squameux stratifiés non-cornifiés, follicules pileux Épithélia simples 7 Épithélia canalaires (canaux pancréatiques et des voies biliaires, canal collecteur rénal), épithélia gastrointestinaux 8 18 Épithélia simples, la plupart des cellules sécrétoires et parenchymateuses 19 Épithélia simples, glandes sudoripares 20 Épithélia gastrointestinaux, urothélium, cellules Merkel, papilles gustatives † La K17 est aussi exprimée dans les cellules myoépithéliales des glandes sudoripares, et typiquement dans les cellules basales des épithélia complexes. Adapté de Kurokawa (2011).

L'épiderme embryonnaire exprime d'abord les kératines 8, 18 et 19, et celles-ci persistent dans la majorité des épithélia simples chez l'adulte, comme ceux des alvéoles, des glandes, et des intestins (Moll et al., 1982). Par contre, dans les épithélia stratifiés, la quantité de ces kératines diminue considérablement, et elles sont quasiment absentes de la peau (Quinlan et al., 1985). Les cellules basales de l'épiderme contiennent les kératines 5, 14 et 15 (Nelson et Sun, 1983), mais au cours de la différenciation l'expression de K5 et de K14 est grandement réduite, et K1 et K10 deviennent les kératines dominantes à partir de la couche épineuse (Fuchs et Green, 1980). Les kératines 18, 19 et 20 se retrouvent seulement dans des cellules spécialisées chez l'épithélium adulte. Les cellules de Merkel, de rares cellules localisées dans la couche basale et les follicules pileux et qui interagissent avec les neurofibres de la mécanoréception, contiennent ces trois kératines (Fradette et al., 1995; Tachibana, 1995). La K19 fait partie du cytosquelette des cellules souches de l’épiderme et des follicules pileux (Michel et al., 1996).

Les filaments formés par les différentes paires de kératines ont souvent des propriétés distinctes. Lorsque isolées par la filtration sur gel, les kératines 5 et 14 s'associent spontanément pour former des filaments de 10 nm, et les kératines 1 et 10 le font aussi, mais seuls les filaments composés des K1/K10 s'agrègent et s'entrelacent pour former de denses filaments semblables à ceux trouvés dans les couches supérieures de la peau (Eichner et al., 1986).

Les cellules épithéliales en culture ne montrent pas toujours le même patron d'expression de kératines que dans leurs tissus natifs. Tel que mentionné ci haut, les K6/K16/K17 sont souvent présentes en culture où les kératinocytes sont dans un état de prolifération quasi- constante, tandis que l'expression des K1/K10 disparaît ou est grandement réduite dans les cellules in vitro (De Luca et Cancedda, 1992; Fusenig et al., 1994). L’expression des K5/K14 est maintenue chez les kératinocytes en culture (Moll et al., 1982; Breitkreutz et al., 1984; Stark et al., 1987).

1.1.4.1.2 La vimentine

La vimentine est le filament intermédiaire typique des fibroblastes et d'autres types cellulaires mésenchymateux. Elle est souvent exprimée dans les cellules en culture, ainsi

39 que durant les étapes précoces du développement avec d'autres protéines de filaments intermédiaires d'une vaste gamme de types cellulaires (Franke et al., 1978). Ceci est l'exception parmi ces protéines qui sont normalement spécifiques au tissu et régulées durant le développement. La vimentine joue un rôle dans le positionnement du noyau dans le cytoplasme, et serait impliquée dans la mitose et le maintien des voies de communication entre le noyau et le cytoplasme (Weiss, 1989). Les filaments de vimentine s’étendent du noyau à la membrane plasmique, où ils s’attachent aux adhésions focales (Geiger et al., 2001; revu dans Ivaska et al., 2007) ou parfois aux desmosomes (Ashton et al., 1975; Kartenbeck et al., 1984). Dans les cellules musculaires lisses, le réseau de fibres de vimentine est essentiel au développement de la force de la contraction (Wang et al., 2006).

1.1.4.1.3 La desmine

La desmine se trouve chez toutes les cellules musculaires; cardiaques, lisses, et squelettiques. Elle relie les fibres et les filaments contractiles à la membrane plasmique et aux autres structures cellulaires, y compris le noyau, les mitochondries et le sarcolemme, et elle aligne les myofibrilles striées par leurs disques Z (Milner et al., 1996; Houseweart et Cleveland, 1998). Son expression est présente tôt et tard dans la myogenèse (Schultheiss et al., 1991) et conjointement avec celle de la vimentine jusqu'à la perte de celle-ci lors de la différenciation terminale (Houseweart et Cleveland, 1998). De par son organisation et stabilisation des éléments contractiles de la cellule musculaire, la desmine coordonne le processus de la contraction (Weiss, 1989).

1.1.4.1.4 Les neurofilaments

Les neurofilaments sont les filaments intermédiaires propres aux cellules neuronales, et essentielles pour la croissance des axones durant le développement, pour le maintien de l’axone et pour la conduction électrique des signaux. Ces hétéropolymères sont composés de quatre sous-unités: les protéines de bas, moyen et haut poids moléculaires (appelées NF- L, NF-M et NF-H, respectivement), ainsi que l’α-internexine dans le système nerveux central, et la périphérine dans le système nerveux périphérique (revu dans Yuan et al., 2012).

1.1.4.2 L’actine, les fibres de stress, et les types cellulaires associés

L’actine est une des protéines les plus abondantes dans la cellule eucaryote, formant un cytosquelette d’organisation souple qui s’étend à travers la cellule. Le filament d’actine (ou l’actine F), d’une épaisseur de 8 à 9 nm, est un polymère hélicoïdal à double brin composé de sous-unités globulaires (l’actine G). Les filaments d’actine peuvent s’assembler et se défaire très rapidement, ce qui est important pour le mouvement des cellules. De nombreuses protéines d’interconnexion lient les filaments pour former des réseaux et des faisceaux stables, selon leur localisation dans la cellule. Chez les vertébrés il existe 6 isoformes d’actine, dont 4 isoformes d’actine présentes dans les cellules musculaires et associées aux structures contractiles, ainsi que la β–actine et la γ–actine dans les cellules non musculaires, la première impliquée dans la migration cellulaire et la deuxième faisant partie des fibres de stress. Les filaments d’actine participent aussi au transport intracellulaire de vésicules en conjonction avec les myosines I, V et VI (Lodish et al., 2005).

Dans la cellule, les faisceaux d’actine peuvent être de nature contractile ou non-contractile. Les faisceaux contractiles sont disposés comme une ceinture ou un feuillet adjacent à la membrane plasmique, au contraire des faisceaux non-contractiles qui se trouvent dans l’axe des projections cellulaires, telles les microvillosités. Dans les cellules non musculaires, les fibres de stress sont formées par plusieurs filaments d’actine cytosolique (β ou γ) liées ensemble par l’actinine et incorporant des molécules de myosine II non musculaire pour former des structures contractiles, dont les extrémités sont le plus souvent attachées aux adhésions focales riches en intégrines (Lodish et al., 2005; Pellegrin et Mellor, 2007). Ce phénotype stable est représentatif du protomyofibroblaste. L’expression de novo de l’α- actine musculaire lisse et son incorporation aux fibres de stress surviennent surtout lors de l’activation des fibroblastes par les cytokines (principalement le TGFβ-1) et par la haute tension mécanique présentes dans un tissu endommagé (Hinz et al., 2007). Cette différenciation en myofibroblastes fut décrite pour la première fois par Gabbiani et ses collègues (1971) dans la contraction des plaies dermiques, mais ce phénomène a lieu dans d’autres tissus tels le foie, le coeur, le poumon, le rein et le système vasculaire, et à partir de divers types cellulaires comme précurseurs (revu dans Hinz, 2007; 2010). La rigidité de la

41 matrice extracellulaire détermine la taille des adhésions formées, et conséquemment la tension générée dans les fibres de stress; cette rigidité doit dépasser un certain seuil pour que l’α-actine musculaire lisse soit synthétisée et incorporée aux fibres existants. Les superficies de culture peut également susciter la formation des fibres de stress par l’activation mécanique des cellules (Hinz, 2006; Hinz et al., 2007).

Dans le corps, quelques autres types cellulaires (non musculaires) expriment l’α-actine musculaire lisse sans pour autant avoir subi une différenciation myofibroblastique, y compris les cellules stromales mésenchymateuses de la moelle osseuse et de la gelée de Wharton, et les péricytes (Tableau 1-2) (Sims, 1986; Eyden et al., 1994; Bianco et al., 2001). La distinction entre ces types cellulaires, les myofibroblastes, et les cellules musculaires lisses n’est pas toujours simple, car jusqu’à présent aucun marqueur spécifique et exclusif n’a été trouvé qui puisse les identifier sans équivoque. Il faut plutôt avoir recours à plusieurs marqueurs, à la localisation des cellules dans les tissus, et même parfois aux détails de l’ultrastructure. Chez les cellules musculaires lisses, l’α-actine musculaire lisse, en conjonction avec la myosine musculaire lisse et d’autres protéines y associées, est responsable du phénotype contractile de ces cellules, qui entourent les vaisseaux et conduits des systèmes vasculaire, lymphatique, gastrointestinal, pulmonaire et urogénital (Lodish et al., 2005). La smootheline est une protéine spécifique à ces cellules, mais ce ne sont pas toutes les cellules musculaires lisses qui l’expriment, et son expression est perdue dans le phénotype synthétique (van Eys et al., 2007). Les péricytes sont des cellules qui entourent les capillaires partout dans le corps, où elles sont souvent en contact direct avec les cellules endothéliales et s’intègrent parfois à la membrane basale. Elles régulent le flux sanguin et la pression des capillaires par leur action contractile, qui provient de la haute quantité d’α- actine musculaire lisse et de myosine qu’elles contiennent. Une population de péricytes situés à mi-chemin entre les extrémités des capillaires manque d’α-actine musculaire lisse, et serait responsable de la régulation de la perfusion entre les capillaires et le tissu environnant (Nehls et Drenckhahn, 1991; Shepro et Morel, 1993; Mills et al., 2013). Les péricytes peuvent se différencier non seulement en cellules musculaires lisses, mais aussi en chondrocytes, adipocytes, ostéoblastes, phagocytes et granulocytes, ce qui a mené à l’hypothèse que les péricytes seraient le réservoir de cellules souches mésenchymateuses du

corps (Covas et al., 2008; Crisan et al., 2008; da Silva Meirelles et al., 2008; Mills et al., 2013). Le marqueur des péricytes, l’antigène 3G5, est aussi présent chez au moins une sous-population des CSM et des cellules de la gelée de Wharton (Nayak et al., 1988; Kolf et al., 2007; Sarugaser et al., 2009).

Tableau 1-2 Une comparaison de quelques types cellulaires exprimant l’α-actine musculaire lisse Cellules de la Cellule Type cellulaire Myofibroblaste Péricyte gelée de Wharton musculaire lisse vimentine + + + + desmine + -/+ -/+ + α-actine m. l. + + + + smootheline nd - nd + myosine m. l. - -/+ -/+ + OB-cadhérine nd + nd - CD90 + - + nd CD105 + nd + + CD146 + + + + 3G5 + nd + - réticulum +++ +++ + + endoplasmique nd – données non disponibles -/+ -- présent en faibles quantités ou données contradictoires (Nayak et al., 1988; Eyden et al., 1994; Schmitt-Graff et al., 1994; van Eys et al., 2007; da Silva Meirelles et al., 2008; Eyden, 2008; Sarugaser et al., 2009; Hinz, 2010; Mills et al., 2013; Nagamura-Inoue et He, 2014, et références y comprises)

1.1.4.3 L’élastine

Les propriétés élastiques des tissus tels la peau, les tendons, les ligaments, les poumons et les vaisseaux sanguins proviennent des fibres élastiques, qui sont importantes non seulement pour la résistance et l’élasticité des tissus, mais aussi pour la régulation de l’activité des TGFβ ( (revu dans Krieg et Aumailley, 2011) et pour leurs effets sur la survie, la différenciation, l’adhésion, la migration et le chimiotactisme des cellules (Chung et al., 2006; Kielty, 2006; Muiznieks et al., 2010; Mithieux et al., 2013; Halper et Kjaer, 2014). L’élastine est un polymère insoluble formé de sous-unités de tropoélastine, un molécule soluble d’environ 70 kDa composé de domaines hydrophobes et hydrophiles qui s’alternent (Mecham et Davis, 1994; Kielty et al., 2002). Les domaines hydrophobes, riches en valine,

43 proline et glycine, sont importants pour l’élasticité du polymère, et le rend une des protéines les plus résistantes et durables du corps humain (Mithieux et Weiss, 2005). Les domaines hydrophiles contiennent des résidus de lysine qui stabilisent les fibrilles par leurs liaisons, formant des pontages covalents entre les fibres d’élastine (Csiszar, 2001; Lee et Kim, 2006; Kim et al., 2011c). L’ensemble du réseau ainsi formé peut se tendre et se replier, tout comme un élastique.

L’élastogenèse a lieu sur un échafaudage de fibrilline (Kielty et al., 2002), le composant principal des microfibrilles associés aux fibres élastiques. Ce sont de grandes glycoprotéines de 350 kDa riches en cystéine, qui adoptent une forme de bâtonnet en présence de calcium (Downing et al., 1996) et qui sont reliées entre elles par la transglutaminase pour former des microfibrilles, auxquelles sont associées plusieurs autres protéines telles les protéines liant le TGF-β (LTBP – latent TGF-β-binding protein) et les glycoprotéines associées aux microfibrilles (MAGP -- microfibril-associated glycoprotein) (Kielty, 2006; Krieg et Aumailley, 2011). Les molécules de tropoélastine sont déposées sur cet échafaudage, et des lysyl oxydases catalysent la formation des liens entres ces molécules (Csiszar, 2001; Kielty et al., 2002; Lannoy et al., 2014). Les fibres élastiques ainsi formées sont organisées de différentes manières selon le tissu dans lequel elles se trouvent, couvrant la gamme de minces fibres aux épais feuillets. Le derme réticulaire de la peau contient des fibres élastiques épaisses orientées de façon horizontale, tandis que le derme papillaire contient des fibres minces et perpendiculaires qui viennent rejoindre la jonction dermo-épidermique (Kielty et al., 2002; Mélissoupoulos et Levacher, 2012). Ce réseau continu confère ses propriétés élastiques à la peau.

1.1.4.4 Les collagènes

La plus abondante famille de protéines chez les animaux, les collagènes sont des protéines structurales fibreuses sécrétées par les cellules de tous les tissus conjonctifs, et par certains autres types cellulaires aussi. Un tiers des protéines du corps humain sont des collagènes, y compris le trois quarts du poids sec de la peau. Les collagènes sont importants non seulement dans l’architecture et les propriétés mécaniques des tissus, mais aussi dans la régulation de la croissance, la différenciation et la migration des cellules à travers leurs interactions avec divers récepteurs, y compris les intégrines (revu dans Ricard-Blum, 2011).

Figure 1-16 Les sous-familles des collagènes et leur structure de base. Cette figure montre les structures générales des différentes sous-familles de collagènes. Les collagènes fibrillaires sont de loin les plus abondants chez les animaux, mais les collagènes servent tous à renforcer physiquement les tissus du corps. Schéma adapté de Heino (2007).

45 Il existe 28 types de collagène chez les vertébrés, composés d’au moins 46 chaînes polypeptidiques distinctes. Les chaînes α qui composent la molécule de base sont toutes encodées par des gènes différents. Ces chaînes sont caractérisées par la présence de glycine à chaque trois résidus, ce qui donne une séquence répétitive XaaYaaGly, et par une forte proportion d’acides aminés de petite taille y compris la proline et l’hydroxyproline (qui composent 28% et 38% des résidus dans les positions Xaa et Yaa respectivement). Ceci permet la structure compacte et stable qui résulte de l’association de ces chaînes en homo- ou hétérotrimères, appelés tropocollagène (Steven et Jackson, 1967; Ramshaw et al., 1998). Ce sont les différents agencements de chaînes α qui déterminent le type de collagène résultant (Figure 1-16). La structure d’une molécule de tropocollagène est celle d’une longue corde formée par une triple hélice de chaînes α, assemblées en parallèle mais décalées d’un résidu (revu dans Shoulders et Raines, 2009).

Chez les collagènes fibrillaires, qui comprennent entre autres les collagènes de types I, II, III, V et XI, les molécules de tropocollagène s’associent dans de longues fibrilles dans lesquelles elles sont décalées d’un quart de leur longueur, ce qui produit la striation caractéristique des fibres de collagène lorsque vues en microscopie électronique. Le regroupement de fibrilles en fibres est la dernière étape dans la formation des types de collagène qui sont essentiels à l’intégrité structurale des tissus conjonctifs (Figure 1-17).

Le derme de la peau est composé surtout des collagènes de types I et III, et au niveau de la membrane basale se trouvent les collagènes non-fibrillaires de types VII et XVII (Junqueira et al., 1983; Giudice et al., 1992; Sakai et al., 1996; Ricard-Blum, 2011). Le premier forme les fibres d’ancrage qui solidifient la jonction dermo-épidermique; le collagène de type XVII est une molécule transmembranaire intégrée dans la structure des hémidesmosomes (Figure 1-15). Le collagène de type IV forme un réseau tridimensionnel faisant partie des membranes basales (Pöschl et al., 2004; revu dans Kooshnoodi et al., 2008). Celui de type VI se trouve dans la plupart des tissus conjonctifs du corps, y compris la peau et les muscles (revu dans Fitzgerald et al., 2013), ainsi que dans la région subendothéliale vasculaire (Ross et al., 1995).

Figure 1-17 La structure des collagènes fibrillaires. De bas en haut: les gènes des différents collagènes codent pour les diverses chaînes α, ou filaments de protocollagène, qui composeront le procollagène. Trois de ces filaments en hélice produisent le tropocollagène; les molécules de tropocollagène s’associent pour former les fibrilles striées typiques du collagène fibrillaire. Adapté de Shoulders et Raines (2009).

47 1.2 Le génie tissulaire

1.2.1 Introduction et définition

Puisque le pouvoir de régénération des tissus du corps humain est souvent limité, il y a un besoin toujours croissant de trouver des alternatives afin d’améliorer la qualité de vie des personnes qui souffrent soit de maladies génétiques ou acquises, de lésions corporelles, ou de détérioration physique. La greffe allogénique de certains tissus et organes s’effectue depuis plusieurs décennies – on peut penser aux greffes de rein, de coeur, de moelle osseuse, de poumon, de foie et de cornée – mais la pénurie majeure de donneurs d’organes pour la greffe, ainsi que les problèmes associés aux traitements immunosuppresseurs à long terme et au rejet des greffes, se traduisent par la recherche d’autres solutions pour répondre à la demande qui ne cesse d’augmenter. Les prothèses produites à partir de biomatériaux, telles les valves cardiaques et les vaisseaux sanguins, ont certainement sauvé des vies, mais leurs limites intrinsèques ne permettent pas le recours à cette option de façon courante. Les matériaux synthétiques ne peuvent jamais s’adapter aux besoins et à la physiologie changeants du corps, et leur intégration aux tissus du corps peut être problématique, avec la rigidité, la fibrose, l’inflammation chronique, l’obstruction, et la durée de vie utile étant quelques-uns des désavantages rencontrés. Alors, d’autres solutions doivent être envisagées pour combler cette nécessité de tissus de remplacement, et une des options les plus intéressantes et polyvalentes est la production de tissus adaptés au besoin par les méthodes du génie tissulaire.

Le génie tissulaire est un champ d’études qui combine plusieurs disciplines, ayant pour but le développement de produits destinés à la réparation, le remplacement, l’amélioration ou le soutien des tissus et organes des patients qui en ont besoin (Langer et Vacanti, 1993). La combinaison de cellules, de facteurs de croissance et d’échafaudages appropriés au tissu visé est à la base de la reconstruction tissulaire, et la médecine régénératrice apporte des stratégies complémentaires, y compris la thérapie cellulaire, l’immunomodulation, la thérapie génique, et les nanotechnologies (revu dans Salgado et al., 2013). Avec l’expertise qui s’accumule rapidement de nos jours dans le domaine de la différenciation dirigée des cellules, le génie tissulaire n’est plus restreint à l’utilisation de types cellulaires matures – les cellules souches embryonnaires, les cellules souches pluripotentes induites et non-

induites, les cellules souches multipotentes et unipotentes et les cellules dédifférenciées sont autant de sources à puiser pour procurer les cellules aptes à la reconstruction de l’organe ou tissu voulu. La variété de biomatériaux disponibles pour former des échafaudages s’est élargie aussi, couvrant la gamme de tissus extracellulaires décellularisés, gels et éponges de collagène, de fibrine ou d’autres polymères naturels, aux polymères synthétiques biocompatibles tels la polyuréthane et le nylon (Auxenfans et al., 2009; Badylak et al., 2011; Battiston et al., 2015; Ghasemi-Mobarakeh et al., 2015; Li et al., 2015).

1.2.2 Approches du génie tissulaire

1.2.2.1 Les modèles et les composants des substituts cutanés

Depuis la réussite de la première culture de kératinocytes humains (Rheinwald et Green, 1975), la recherche sur le développement in vitro de substituts cutanés a pris son essor, en commençant par le feuillet épithélial autologue. Ces avancées de la science ont beaucoup d'importance dans le traitement des patients grands brûlés, qui en ont bénéficié depuis 1983 (Green et al., 1979; O'Connor et al., 1981; Compton et al., 1989; Auger et al., 1995; Germain et al., 1995). Plusieurs modèles de substituts cutanés ont été proposés pour les fins de recherche pharmacologique et toxicologique, études portant sur la différenciation de la peau, et la guérison des plaies humaines. Tous ces modèles ont comme base une couche de kératinocytes humains qui, dans les bonnes conditions, proliféreront pour former un épiderme différencié de multiples couches. La portion dermique des substituts est absente, dans le cas des feuillets épithéliaux autologues, mais peut prendre la forme d’éponges biodégradables (Hansbrough et al., 1989; Boyce et al., 1991; Berthod et Damour, 1997), de membranes artificielles (Mak et al., 1991), de dermes désépithélialisés (Régnier et al., 1981; Ponec, 1991), ou de fibroblastes, soit cultivés dans un treillis de nylon (Contard et al., 1993), ensemencés dans un gel de collagène humain (Auger et al., 1995) ou bovin (López Valle et al., 1992), ou empilés dans des feuillets sans matériel exogène selon la méthode de l’auto-assemblage (Michel et al., 1999). Tous ces modèles sont employés pour la recherche en laboratoire, et certains d'entre eux ont été utilisés en clinique (revu dans Auger et al., 2009).

49 1.2.2.1.1 Le gel de collagène

Le premier modèle de substitut de peau complète (épiderme et derme) fut produit par l'ensemencement de fibroblastes dans un gel de collagène (Bell et al., 1979). La contraction très importante de ce modèle limita son utilité dans un contexte clinique (Berthod et al., 1993). Un gel de collagène ancré résout ce problème en maintenant la superficie initiale pendant la maturation du substitut cutané (López Valle et al., 1992; Auger et al., 1995). Des kératinocytes sont cultivés sur la surface supérieure du gel, et après un temps de culture immergée le substitut est soulevé à l’interface air-liquide afin de promouvoir la différenciation complète de l'épiderme (Bell et al., 1981; Régnier et al., 1981). Les limites de ce modèle sont le manque de résistance aux collagénases et le risque d'une réaction immunologique chez le patient à cause de la présence du collagène bovin.

1.2.2.1.2 Le modèle d’éponge

Un autre modèle associe les collagènes avec des glycosaminoglycanes afin de former un échafaudage ou 'éponge' qui peut être colonisé par des fibroblastes (Burke et al., 1981). Une variation plus récente utilise le chitosan, des chondroïtines et le collagène dans la production de l'éponge, ce qui évite l'utilisation du glutaraldéhyde, qui prévient la contraction de l'éponge mais est toxique pour les cellules (Berthod et al., 1993). Dans ce modèle, les fibroblastes remanient les fibres de la matrice extracellulaire et produisent d'importantes quantités de ses composants, la synthèse desquels peut être stimulée par l'ajout de l'acide ascorbique au milieu de culture (Murad et al., 1983; Hata et Senoo, 1989). Une avancée importante dans le modèle d'éponge fut la production d'un substitut cutané complet endothélialisé (Black et al., 1998), contenant des cellules endothéliales qui forment spontanément des tubules dans la matrice du derme. Ce modèle est un pas de plus vers la résolution du problème de la revascularisation des greffes, et constitue un outil additionnel pour l'étude de l'angiogenèse in vitro (Black et al., 1999).

1.2.2.1.3 L’auto-assemblage

Une technique développée au Laboratoire d’organogenèse expérimentale, l’auto- assemblage en génie tissulaire (L'Heureux et al., 1998; Michel et al., 1999; Auger et al., 2000), permet de reconstruire des tissus en culture sans l’emploi de biomatériaux exogènes,

qui pourraient provoquer des réactions immunitaires ou inflammatoires une fois les tissus reconstruits greffés chez le patient, et qui ont été associés à des problèmes de niveau mécanique et dans la distribution uniforme de cellules (revu dans Jakab et al., 2010). Cette approche est basée sur la capacité des cellules mésenchymateuses de synthétiser et assembler leur propre matrice extracellulaire en culture spontanément, formant des feuillets qui peuvent ensuite être enroulés ou empilés pour produire une structure tridimensionnelle (Auger, 2006). D’autres types cellulaires peuvent être ajoutés à ces structures, en les ensemençant dans ou sur les feuillets avec un temps de maturation approprié pour chaque tissu visé (Figure 1-18); dans le cas des substituts de peau, ceux-ci peuvent inclure des cellules endothéliales, des cellules neuronales, et des cellules provenant de tissus lésés tels la peau psoriasique. Les substituts les plus avancés à ce jour construits par cette technique sont la peau reconstruite (Michel et al., 1999; Gibot et al., 2010; Rochon et al., 2010; Lavoie et al., 2013; Ayata et al., 2014; Beaudoin Cloutier et al., 2015) et les substituts vasculaires (L'Heureux et al., 1998; Vallières et al., 2015), mais il y a aussi d’autres tissus qui ont été fabriqués par auto-assemblage, tels les valves cardiaques (Dubé et al., 2014; Tremblay et al., 2014), la cornée (Carrier et al., 2009; Proulx et al., 2010), des tissus urologiques (Bouhout et al., 2011; Cattan et al., 2011) et des tissus adipeux (Vermette et al., 2007; Vallée et al., 2009).

Idéalement, le substitut cutané destiné à être greffé ne contiendrait aucun élément immunogénique (synthétique ou exogène); ceci est un avantage du substitut cutané autologue produit par la méthode de l'auto-assemblage (Michel et al., 1999). Les cellules autologues récoltées d'un site donneur du patient sont utilisées pour reconstruire une peau contenant un épiderme complètement différencié et un derme qui produit sa propre matrice extracellulaire à base de collagènes. Des fibroblastes en monoculture en présence d’acide ascorbique produisent et assemblent davantage de matrice extracellulaire, formant ainsi un feuillet épais qui peut être manipulé. L’acide ascorbique est un co-facteur nécessaire des enzymes qui catalysent la conversion des prolines et lysines du procollagène en hydroxyprolines et hydroxylysines, qui stabilisent la triple hélice du collagène mature, et qui sont essentielles à la formation des réticulations renforçant les fibres de collagène respectivement. Dans le milieu de culture, l’acide ascorbique stimule la synthèse et la sécrétion du collagène, composant principal de la matrice extracellulaire, par les cellules

51 (Murad et al., 1981; 1983; Geesin et al., 1988; Hata et Senoo, 1989). Une fois superposés, les feuillets de fibroblastes du derme reconstruit se fusionnent (Figure 1-18) et produisent une matrice extracellulaire dense composée essentiellement des mêmes éléments dans les mêmes proportions que le derme de la peau (Michel et al., 1999; Pouliot et al., 2002). L'exposition du substitut à l'interface air-liquide in vitro stimule la formation d'un épiderme multi lamellaire, stratifié et cornifié, possédant les caractéristiques majeures de l'épiderme de la peau en tant que marqueurs de différenciation: l'expression de K1/K10 dans les couches suprabasales; la production de filaggrine, involucrine, transglutaminase et d'autres molécules impliquées dans le développement des cornéocytes; et une membrane basale complète et intacte (Michel et al., 1999; Pouliot et al., 2002).

Figure 1-18 Schéma de la production des substituts cutanés par auto-assemblage. L’assemblage des substituts peut varier selon les types cellulaires incorporés. Ici des cellules endothéliales sont ajoutées aux stroma, et les cellules épithéliales utilisées proviennent soit de la peau (K), de la cornée (C), ou du col de l’utérus (U). Figure tirée de Rochon et al. (2010).

1.2.2.2 Les modèles de vaisseaux sanguins

Il existe un besoin urgent et toujours croissant d’une source de vaisseaux sanguins pour remplacer des vaisseaux sanguins lésés principalement par des maladies cardiovasculaires et par le diabète. Plus précisément, des greffes vasculaires sont souvent requises pour le pontage des artères cardiaques bloquées et des artères périphériques oblitérées, ainsi que pour former ou remplacer des fistules artério-veineuses utilisées comme point d’accès pour la dialyse, et dans la correction des malformations cardiaques congénitales. Idéalement, un vaisseau autologue serait transplanté à l’endroit affecté, évitant ainsi des problèmes d’ordre immunologique. Cependant, seulement 40% des patients atteints de maladies cardiovasculaires ont un vaisseau sanguin convenable pour une telle greffe; plusieurs obstacles se présentent chez la majorité des patients, y compris des vaisseaux sanguins déjà atteints par la maladie, l’utilisation des vaisseaux aptes à être greffés dans des chirurgies précédentes, et le manque d’un vaisseau de taille adéquate (Schmedlen et al., 2003; Patterson et al., 2012). Qui plus est, l’enlèvement d’un vaisseau sanguin de sa position normale n’est point souhaitable.

Les substituts synthétiques sont une option acceptable seulement pour des vaisseaux à haut débit de plus de 6 mm de diamètre, et peuvent être fabriqués de polytéréphtalate d’éthylène (Dacron) ou polytétrafluoroéthylène (Teflon) (Seifalian et al., 2002; Teebken et Haverich, 2002; revu dans Chuplác et al., 2009). Lorsqu’on utilise ces substituts dans une situation de faible débit ou de petit diamètre, des problèmes de thrombogenèse ou d’hyperplasie font que le taux de réussite à 5 ans dépasse rarement 30% des vaisseaux greffés (Baguneid et al., 2006). Pour contourner ce premier problème, on a tenté de rendre la surface interne du vaisseau moins thrombogénique en la recouvrant soit de cellules endothéliales, soit d’une couche de fibrine, d’héparine, de prostaglandines, d’hirudine ou d’autres molécules (Herring et al., 1979; Seifalian et al., 2002; Nugent et Edelman, 2003; Thomas et al., 2003; Chan-Park et al., 2009). Une fois le substitut greffé, les cellules endothéliales sont fréquemment détachées de la superficie luminale par le flux sanguin (Gourevitch et al., 1988), mais le conditionnement au préalable des vaisseaux in vitro par l’exposition à un flux laminaire augmente l’adhésion et l’adaptation des cellules endothéliales (revu dans Chuplác et al., 2009). La rigidité des substituts synthétiques provoque souvent une

53 croissance indue, ou hyperplasie, du tissu aux points d’attache, ce qui peut diminuer ou altérer la circulation sanguine (Thomas et al., 2003). Et bien sûr, ces substituts n’ont aucune capacité d’adaptation ni de réparation in vivo.

Alors, les chercheurs se sont tournés vers la fabrication de vaisseaux sanguins de petit diamètre par génie tissulaire afin de combler ces besoins. Les critères pour la reconstruction d’un vaisseau sanguin sont encore plus stricts que pour la peau, car le vaisseau doit résister à la pression sanguine, il doit posséder l’élasticité qui lui permet de reprendre et de maintenir sa forme, et il doit pouvoir prévenir la thrombose par le biais d’un endothélium confluent et non activé. Il doit aussi s’intégrer au réseau vasculaire sans susciter des réponses inflammatoires ou immunitaires, et aura besoin de répondre au niveau physiologique en ce qui concerne la perméabilité et la vasoconstriction (revu dans Thomas et al., 2003; Isenberg et al., 2006). Et finalement, on doit pouvoir manipuler convenablement le substitut afin de l’incorporer au système circulatoire lors de la chirurgie.

Il y a plusieurs stratégies pour la fabrication des substituts vasculaires de petit diamètre, qui peuvent être regroupées dans trois catégories générales: des cellules cultivées dans des gels ou dans des matrices extracellulaires décellularisées; des cellules cultivées en feuillets sans support externe; et des cellules cultivées dans des échafaudages poreux (Figure 1-19) (revu dans Chan-Park et al., 2009). Les difficultés rencontrées avec ces approches incluent la thrombogenèse, des propriétés mécaniques inappropriées (surtout en ce qui concerne la résistance physique et la dégradation), un manque de vasoréactivité, et un temps de culture souvent très long. L’âge des cellules utilisées affecte aussi la qualité du tissu reconstruit, car les cellules vasculaires prélevées des personnes âgées prolifèrent moins et produisent moins de matrice extracellulaire que les cellules jeunes, ce qui est problématique aux niveaux des propriétés mécaniques et du temps de culture (revu dans Sundaram et Niklason, 2012).

Figure 1-19 Schéma de la production des substituts vasculaires par génie tissulaire. A) Les modèles à base de gels de collagène (ou autres); B) Les modèles construits à partir de feuillets cellulaires enroulés autour d’un support; C) Les modèles basés sur un échafaudage dans lequel les cellules sont ensemencées. CML – cellules musculaires lisses; CE – cellules endothéliales. Modifié de Nerem et al. (2001).

1.2.2.2.1 Les modèles à base de gels

Les gels de collagène permettent l’ensemencement de cellules directement dans le polymère liquide, qui se solidifie par la suite dans des conditions physiologiques (Weinberg et Bell, 1986). Les cellules ainsi intégrées procèderont au remodelage de la matrice selon leur type. Il est aussi possible d’appliquer des contraintes physiques aux modèles afin d’aligner les fibrilles et les cellules musculaires lisses d’une façon circonférentielle, telle que dans l’artère native (L'Heureux et al., 1993; Hirai et Matsuda, 1995; revu dans Isenberg et al., 2006). Habituellement, la suspension cellulaire est injectée dans un support tubulaire où la fibrillogenèse du collagène a lieu; ensuite les forces adéquates sont appliquées afin d’orienter les fibrilles et les cellules. La média reconstruite qui en résulte peut être endothélialisée comme étape finale. Le grand défaut de ces substituts est le manque de résistance mécanique (revu dans Isenberg et al., 2006). Un vaisseau sanguin produit par la même méthode générale, mais en utilisant un gel de fibrine avec l’ajout de TGF-β et d’insuline, a montré une résistance accrue et de l’élastogenèse ainsi qu'une production

55 cellulaire de collagène supérieure à celle des gels de collagène (Grassl et al., 2003; Long et Tranquillo, 2003).

1.2.2.2.2 Les tissus décellularisés

Le traitement de tissus avec une combinaison de détergents, d’inhibiteurs d’enzymes et de tampons produit une matrice extracellulaire exempte de cellules qui retient sa structure et sa biocompatibilité (Schmidt et Baier, 2000). Les tissus employés peuvent être d’origine vasculaire ou autre, telle la sous-muqueuse de l’intestin grêle. D’habitude ces tissus sont greffés sans cellules ajoutées pour que le repeuplement cellulaire ait lieu in situ avec les types cellulaires appropriés. Le tissu vasculaire décellularisé a l’avantage de la structure et la composition natives du vaisseau sanguin, mais le processus de décellularisation rétrécit le tissu et diminue sa résistance mécanique. Dépendamment de l’origine du tissu utilisé, il peut y avoir des problèmes de thrombose, d’infection, ou au niveau des possible antigènes présents (revu dans Isenberg et al., 2006).

1.2.2.2.3 Les tissus auto-assemblés

Tout comme décrit précédemment pour les substituts de peau, des substituts vasculaires peuvent être produits par la méthode d’auto-assemblage (L'Heureux et al., 1998; Gauvin et al., 2010; 2011). Des feuillets de cellules musculaires lisses et de fibroblastes, cultivés en présence d’acide ascorbique pour stimuler la production de matrice extracellulaire, sont enroulés autour d’un support tubulaire pour former un cylindre à la fois flexible et robuste. Après un temps de maturation et une fois le support enlevé du substitut, des cellules endothéliales ensemencées sur la surface luminale du cylindre s’y attachent et prolifèrent, tapissant ainsi la surface intérieure. Ces substituts vasculaires résistent aussi bien à la pression sanguine que les vaisseaux natifs et sont faciles à intégrer au réseau vasculaire par chirurgie (revu dans Thomas et al., 2003). Des essais cliniques ont déjà eu lieu, avec la greffe de dix substituts autologues chez des patients (L'Heureux et al., 2007; McAllister, 2009). Le temps de culture et de maturation nécessaire à la production de ces substituts limite leur utilisation à des greffes non urgentes, surtout si l’on vise une greffe autologue.

1.2.2.2.4 Les échafaudages de polymères

Une autre approche courante dans la reconstruction des vaisseaux sanguins, ainsi que d’autres tissus, utilise des échafaudages faits de polymères synthétiques ou biocompatibles, qui soutiennent le développement du nouveau tissu et qui se dégradent avec le temps. Les caractéristiques de ces polymères, telles la microstructure, la vitesse de réabsorption et les propriétés mécaniques, peuvent être contrôlées de près par leur composition chimique afin de les adapter au tissu visé. Il est également possible d’incorporer des facteurs de croissance aux polymères, qui seraient relargués graduellement avec la dégradation de l’échafaudage (Ennett et al., 2006; Guan et al., 2007). Les cellules doivent être ensemencées dans l’échafaudage après sa fabrication ou bien doivent migrer du tissu autour de la greffe. Cela peut mener à une distribution inégale de cellules et même à un manque de matrice extracellulaire produite avant la désintégration du polymère (revu dans Isenberg et al., 2006).

L’acide polyglycolique et l’acide polylactique (PGA et PLA, respectivement) sont utilisés extensivement en médecine pour les points de suture, et peuvent être mélangés en copolymères à différents ratios pour modifier la vitesse de dégradation du matériel résultant. Les fils de PGA, qui est hydrophile et hautement cristallin, maintiennent leur résistance mécanique pendant seulement 2 à 4 semaines dans le corps humain, tandis que les fils de PLA, qui est plus hydrophobe, durent plus d’un an sans perdre de résistance. Plusieurs facteurs affectent la vitesse de dégradation de ces polymères par hydrolyse, y compris le poids moléculaire initial, l’aire de surface, le degré de cristallinité, et le ratio des différents polymères (revu dans Carletti et al., 2011; Naito et al., 2011). La dégradation des polymères peut provoquer des complications dues aux produits acides de ce processus, mais ce ne semble pas être problématique chez la plupart des implants greffés (Bostman et al., 1992; Carletti et al., 2011). Le poly (ε-caprolactone) (PCL), un polymère qui reste flexible à la température du corps humain, se dégrade lentement comparé au PLA, ce qui est avantageux pour les greffes à long terme. Les polyuréthanes sont une famille de polymères ayant des liaisons uréthanes dans la chaîne du polymère; ils ont été employés dans des prothèses et dans des appareils cardiovasculaires depuis les années 50. Ceux-ci sont des polymères stables, mais des polyuréthanes dégradables ont aussi été développés

57 pour des applications en génie tissulaire telles la réparation myocardique et vasculaire (Carletti et al., 2011). Les polyhydoxyalkanoates et le polyhydroxybutyrate sont autant d’autres molécules employées en médecine et pour le génie tissulaire (revu dans Naito et al., 2011). Les essais cliniques ont montré des succès avec plusieurs modèles, tel un échafaudage de PCL/PLA ensemencé avec des cellules souches mésenchymateuses (Shin'oka et al., 2001), greffé pour remplacer une artère pulmonaire.

1.3 Problématique et objectifs de recherche

En génie tissulaire, une mise au point minutieuse doit se faire avant d’aboutir à l’organe fonctionnel visé, et dans ce dessein, il existe un besoin de cellules facilement disponibles et adéquates aux fins de recherche et d’optimisation. Le cordon ombilical humain s’avère une source abondante de plusieurs types cellulaires exempte de complications techniques pour l’extraction ou éthiques quant à son utilisation. Un autre atout que possède le cordon ombilical humain est la présence de cellules souches mésenchymateuses parmi les cellules stromales et subendothéliales, qui peuvent être menées à se différencier en plusieurs types cellulaires in vitro, selon des résultats parfois variables rapportés par diverses équipes de chercheurs (revu dans Nagamura-Inoue et He, 2014; Watson et al., 2015). Un organe destiné à la greffe ne pouvant pas être constitué de cellules provenant de plus d’une source immunogénique afin de minimiser les possibles complications au niveau immunitaire, l’unicité d’origine des cellules utilisées s’impose alors, et le cordon ombilical remplit ce besoin d’autant plus que ses cellules souches ou progénitrices semblent être hypoimmunogéniques selon les résultats de plusieurs études récentes (Liu et al., 2012); (revu dans Anzalone et al., 2010; Nagamura-Inoue et He, 2014; Watson et al., 2015).

L’interaction entre les différents types cellulaires est d’une grande importance pour la structure et qualité du tissu résultant. Il est bien établi que le développement et l’homéostasie de la peau sont en grande partie régulés par les interactions épithélio- mésenchymateuses, surtout à travers des facteurs diffusibles (McLoughlin, 1963; Rheinwald et Green, 1975; Smola et al., 1998; revu dans Werner et al., 2007). Alors dans un substitut cutané, la présence d’une couche dermique fonctionnelle est primordiale pour une différenciation normale, c’est à dire la production d’un épithélium stratifié, kératinisé et cornifié avec une membrane basale complète (Bohnert et al., 1986; Contard et al., 1993; Stark et al., 2004). Pour mieux comprendre l’impact de la source cellulaire sur le tissu résultant, la combinaison de types cellulaires de différentes provenances s’avère révélatrice, donnant non seulement des indices sur les capacités de différenciation des divers types cellulaires, mais aussi sur les facteurs qui ont une influence sur les voies de différenciation.

59 1.3.1 Hypothèse et objectifs

L’hypothèse globale à la base de nos travaux est que l’isolement simultané de plusieurs types cellulaires du cordon ombilical permettrait la reconstruction in vitro de tissus composés de types cellulaires variés provenant d’une même source. En particulier, nous avons postulé que les cellules épithéliales et stromales du cordon pourraient participer à la formation d’une peau reconstruite bilamellaire au même titre que les cellules de la peau couramment employées, et ce, sans l’ajout de matrice extracellulaire exogène pour le stroma reconstruit.

Dans un premier temps, nous avons mis au point un protocole d’extraction qui permet de récupérer les quatre types cellulaires du tissu solide d’un seul cordon ombilical. Les techniques retenues et les résultats donnés par ces protocoles, ainsi que la subséquente caractérisation des populations cellulaires, sont rapportés dans un premier manuscrit qui fait l’objet du chapitre 2. Les étapes spécifiques permettant d’atteindre ce but furent les suivants:

Objectif 1

1.1 Combiner et tester plusieurs techniques d’extraction afin d’éviter des dommages aux parties du cordon qui n’ont pas encore subi d’extraction, et optimiser le rendement cellulaire à chaque étape.

1.2 Vérifier la pureté des populations cellulaires obtenues par l’analyse de marqueurs spécifiques et par l’analyse histologique.

1.3 Caractériser les cellules épithéliales et stromales par le biais des immunomarquages à fluorescence, par la cytométrie en flux, et par l’analyse de la prolifération en culture.

1.4 Examiner les propriétés des cellules stromales en induisant leur différenciation en ostéoblastes et en adipocytes.

En deuxième lieu, nous avons eu pour objectif de produire des tissus reconstruits par la méthode d’auto-assemblage en utilisant les cellules extraites du cordon ombilical. Les

résultats de la caractérisation des peaux reconstruites ont été rassemblés et interprétés dans un deuxième manuscrit qui est le chapitre 3 de cette thèse. Les étapes poursuivies à cette fin furent les suivants:

Objectif 2

2.1 Faire des peaux reconstruites avec les cellules épithéliales et stromales du cordon ombilical, en combinaison avec des cellules de peau normale, en utilisant la méthode d’auto-assemblage.

2.2 Examiner l’état de la différenciation épidermique avec des analyses immunohistochimiques, ainsi que des observations microscopiques et ultrastructurales.

2.3 Comparer l’épaisseur des compartiments épithélial et stromal des tissus obtenus.

En conclusion, les travaux présentés visent à tirer un meilleur parti du potentiel des cellules provenant du cordon ombilical humain pour la reconstruction de tissus in vitro, que ce soit pour des applications de recherche et de mise au point de techniques de génie tissulaire, ou pour une éventuelle utilisation en clinique.

2 Harvesting the Potential of the Human Umbilical Cord: Isolation and Characterisation of Four Cell Types for Tissue Engineering Applications

Cindy J. Hayward1,2, Julie Fradette1,2,3, Todd Galbraith1,2, Murielle Rémy1, Rina Guignard1,2, Robert Gauvin1,2, Lucie Germain1,2,3, François A. Auger1,2,3 1Centre LOEX de l'Université Laval 2Axe Médecine Régénératrice - Centre de recherche FRQS du CHU de Québec-Université Laval 3Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada.

* Corresponding author:

Dr. François A. Auger, M.D., FRCP (C), CQ, FCAHS LOEX, Aile-R, Hôpital de l’Enfant-Jésus Centre de recherche du CHU de Québec 1401, 18e Rue Québec, QC, G1J 1Z4 Tel: 418-990-8255 Ext. 61662 Fax: 418-990-8248 [email protected] www.loex.qc.ca

Key words: cell isolation, epithelial cells, tissue engineering, umbilical cord, Wharton’s jelly cells

63 2.1 Abstract

The human umbilical cord has attracted interest as a source of cells for many research applications. The umbilical cord solid tissues contain four cell types: epithelial, stromal, smooth muscle and endothelial cells. We have developed a unique protocol for the sequential extraction of all four cell types from a single umbilical cord, allowing tissue reconstruction using multiple cell types from the same source. By combining perfusion, immersion and explant techniques all four cell types have been successfully expanded in monolayer cultures. We have also characterised the epithelial and Wharton's jelly cells (WJC) by the immunolabelling of specific proteins. Epithelial cell yields averaged 2.3 x 105 cells per cm of umbilical cord, and the cells expressed an unusual combination of keratins typical of simple, mucous and stratified epithelia. Stromal cells in the Wharton's jelly expressed desmin, α-smooth muscle actin, elastin, keratins 12, 16, 18 and 19, vimentin and collagens. Expression patterns in cultured cells resembled those found in situ except for basement membrane components and type III collagen. These stromal cells featured a sustained proliferation rate up to passage 12 after thawing. The mesenchymal stem cell character of the WJC was confirmed by their expression of typical mesenchymal stem cell surface markers and by adipogenic and osteogenic differentiation assays. To emphasise and demonstrate their potential for regenerative medicine, umbilical cord cell types were successfully used to produce human tissue-engineered constructs. Both bilayered stromal/epithelial and vascular substitutes were produced, establishing the versatility and importance of these cells for research and therapeutic applications.

2.2 Résumé

Le cordon ombilical humain est d’intérêt comme une source de cellules pour de multiples applications en recherche. Les tissus solides du cordon ombilical comportent quatre types cellulaires: les cellules épithéliales, stromales, musculaires lisses et endothéliales. Nous avons développé un protocole unique pour l’extraction séquentielle des quatre types cellulaires d’un seul cordon ombilical, ce qui permet la reconstruction tissulaire avec plusieurs types cellulaires de la même provenance. En combinant des techniques de perfusion, d’immersion, et d’explants, nous avons réussi l’expansion en monoculture de tous les quatre types cellulaires. Nous avons aussi procédé à la caractérisation des cellules épithéliales et stromales par l’immunomarquage de protéines spécifiques. Le rendement en cellules épithéliales était en moyenne de 2.3 x 105 cellules par cm de cordon ombilical, et ces cellules montraient un patron d’expression de kératines surprenant, comprenant des kératines typiques des épithélia simples, stratifiés et des muqueuses. Les cellules stromales de la gelée de Wharton exprimaient la desmine, l’α-actine musculaire lisse, l’élastine, les kératines 12, 16, 18 et 19, la vimentine et des collagènes. Les patrons d’expression dans les cellules en culture ressemblaient aux patrons trouvés in vivo, à l’exception des composants de la membrane basale et du collagène de type III. Ces cellules stromales ont proliféré en culture de façon soutenue pour au moins 12 passages après la décongélation. Les propriétés de cellules souches mésenchymateuses ont été confirmées dans les cellules de la gelée de Wharton par l’expression des marqueurs de surface typiques et par la différenciation en cellules adipeuses et en ostéoblastes. Afin de montrer le potentiel de ces cellules pour la médecine régénératrice, des tissus reconstruits humains ont été produits à partir des cellules extraites du cordon ombilical, soit des substituts cutanés bilamellaires et des substituts vasculaires. Ces résultats soulignent la versatilité et l’importance de ces cellules pour des applications tant en recherche que thérapeutiques.

65 2.3 Abbreviations

BSA – bovine serum albumin DMEM – Dulbecco-Vogt modified Eagle’s medium DMSO – dimethyl sulfoxide ECGF – endothelial cell growth factor ECM – extracellular matrix EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid EGF – epidermal growth factor FACS – fluorescence-activated cell sorting FCS – fetal calf serum HEPES – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulphonic acid IF – intermediate filament K – keratin NCS – newborn calf serum ND – not determined P – passage PBS – phosphate-buffered saline SMC – smooth muscle cells T3 – 3,3',5 triiodo-L-thyronine UC – umbilical cord vWF – von Willebrand factor WJC – Wharton’s jelly cells

2.4 Introduction

The human umbilical cord is a foetal structure composed of two arteries and a vein enveloped in a loose connective tissue called Wharton's jelly, and covered by a thin epithelium. The solid tissues of the umbilical cord (UC) contain four major cell types: epithelial cells, fibroblast-like stromal cells, smooth muscle cells and endothelial cells. The umbilical cord has long been a source of endothelial and smooth muscle cells for various experimental purposes. Smooth muscle cells (SMC) from the umbilical cord have been used for research on contractility as well as for tissue engineering, especially in vascular reconstruction (L'Heureux et al., 1998; Stephan et al., 2006; Gauvin et al., 2011). They are mostly responsible for the contraction of the umbilical cord blood vessels, but can also proliferate and synthesise matrix components (Owens, 1995). The endothelial cells lining the blood vessels of the umbilical cord have also been well characterised and are often used in studies of angiogenic processes (Jaffe et al., 1973b; Cozzolino et al., 1990; Black et al., 1998; Guo et al., 2000; Fassina et al., 2004; Tremblay et al., 2005a) and for vascularised tissue reconstruction (Gibot et al., 2010; Guillemette et al., 2010; Rochon et al., 2010; Tsigkou et al., 2010).

The epithelial cells form a thin, squamous, non-keratinising epithelium, and behave similarly to keratinocytes in culture (Ruetze et al., 2008). The stromal cells of the Wharton's jelly (WJC) contain abundant α-smooth muscle actin along with fibroblast- associated proteins, and are functionally related to myofibroblasts (Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997; Kobayashi et al., 1998; Farias et al., 2011). They are active in the secretion of the extracellular matrix that surrounds and cushions the blood vessels, vitally protecting them from compression via the turgor this matrix constantly maintains (Schoenberg et Moore, 1958; Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997). Due to their contractility, these cells may play a role in the regulation of blood flow through the umbilical cord (Takechi et al., 1993; Farias et al., 2011). In the last decade their mesenchymal stem cell properties have also come to light, with umbilical cord stromal cells being differentiated in vitro into chondrocytes (Naughton et al., 1997; Wang et al., 2004), adipocytes (Wang et al., 2004; Sarugaser et al., 2005), osteoblasts (Wang et al., 2004;

67 Sarugaser et al., 2005), cardiomyocytes (Wang et al., 2004; Conconi et al., 2006) and neural cells (Mitchell et al., 2003; Fu et al., 2004).

Intermediate filaments (IFs) are highly relevant to the characterisation of cells, as they are differentially expressed in the course of embryonic development and cell differentiation (Franke et al., 1978; reviewed in Lazarides, 1982; Oshima, 2007) in addition to their roles in signalling, motility, and mechanical stabilization via the cytoskeleton (Kim et Coulombe, 2007; reviewed in Eriksson et al., 2009). The loss of functional IF genes has a considerable effect on cellular and tissue physiology, according to the IF and cell type involved (reviewed in Herrmann et al., 2009). Intermediate filaments are highly stable structural proteins that assemble as polymers into 10 nm filaments. They are divided into six classes (Eriksson et al., 2009) including type I and type II keratins (K), typical of epithelial cells (Moll et al., 1982) as well as type III chains particular to muscle (desmin, synemin), neuronal (peripherin and glial fibrillary acidic protein), and mesenchymal (vimentin) cells (Eriksson et al., 2009). Thus, the specific IFs present in a cell population reflect their nature and differentiation status and are useful markers for cell characterisation.

In this study, we have developed a unique strategy to successfully isolate the four major cell types from a single human umbilical cord in order to be able to reconstruct tissues with cells from the same genetic background. We have further characterised the epithelial cells and the Wharton’s jelly cells both in situ and after expansion in culture, with particular emphasis on intermediate filament expression profiles. Wharton’s jelly cells in culture were also induced to undergo osteogenic and adipogenic differentiation. Given the extra- embryonic nature of all four cell types because of their source, they are of great interest in the field of tissue engineering and for possible future cellular therapeutic applications. To demonstrate their versatility and usefulness, we have used these cells to produce tissue- engineered vascular constructs and bilayered stromal/epithelial substitutes using the self- assembly approach to tissue engineering (L'Heureux et al., 1998), which allows the formation of three-dimensional structures without the use of exogenous materials, as the cells produce their own extracellular matrix in the presence of ascorbic acid.

2.5 Materials and Methods

2.5.1 Culture Media

Umbilical cords were stored for transport in Dulbecco-Vogt modified Eagle's medium (referred to as DMEM; Gibco BRL, Burlington, Canada), supplemented with 10% fetal calf serum (FCS; HyClone, Aurora, Canada), 0.5 µg/mL amphotericin B (Squibb Canada, Montreal, Canada) and antibiotics (100 IU/mL penicillin G (Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.), 25 µg/mL gentamicin sulphate (Schering, Pointe-Claire, Canada)).

Endothelial cells were cultured in reconstituted, buffered M199 (Sigma), supplemented with 20% newborn calf serum (NCS; Fetal Clone II, HyClone), 20 µg/mL endothelial cell growth factor (ECGF; Sigma), 2.28 mM glutamine, 0.40 IU/mL heparin (Leo Laboratories, Pickering, Canada), and antibiotics.

Smooth muscle cells were cultured in DMEM combined with Ham's F12 medium (Gibco BRL) in a 3:1 proportion (referred to as DME-Ham's) supplemented with 10% FCS (Biomedia, St-Laurent, Canada), 24.3 µg/mL adenine (Sigma-Aldrich), and antibiotics.

Wharton's jelly cells (WJC) were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS (HyClone) and antibiotics.

Epithelial cells were cultured in DME-Ham’s supplemented with 10% NCS, 24.3 µg/mL adenine, 10 ng/mL epidermal growth factor (EGF; Austral Biological, San Ramon, U.S.A.), 5 µg/mL insulin (Sigma), 1 X 10-10 M cholera toxin (ICN Biomedical, Montreal, Canada), 5 µg/mL transferrin (Boehringer Mannheim, Laval, Canada), 2 nM 3,3',5 triiodo-L- thyronine (T3; Sigma), 0.4 µg/mL hydrocortisone (Calbiochem, La Jolla, U.S.A.), and antibiotics.

Vascular construct sheets were produced in DME-Ham's supplemented with 30% FCS (HyClone), 5 µg/mL ECGF (Sigma), antibiotics, and 50 µg/mL ascorbic acid (Sigma). Rolled sheets were cultured in DME-Ham’s with 10% NCS (HyClone), antibiotics, and 50 µg/ml ascorbic acid.

69 Submerged bilayered stromal/epithelial substitutes were cultured in DME-Ham’s supplemented with 5% NCS (HyClone), 24.3 µg/mL adenine (Sigma-Aldrich), 10 ng/mL EGF, 5 µg/mL insulin, 0.1 nM cholera toxin, 5 µg/mL transferrin, 0.4 µg/mL hydrocortisone, and antibiotics.

Cells undergoing adipogenic differentiation were cultured in DME-Ham’s supplemented with 3% FCS, 100 nM insulin, 0.2 nM T3, 1 µM dexamethasone, 0.25 mM IBMX (Sigma), 1 µM rosiglitazone (Cayman Chemical, Cedarlane, Hornby, Canada), antibiotics, and 50 µg/mL ascorbic acid. Developing adipocytes were cultured in DME-Ham’s supplemented with 3% FCS, 100 nM insulin, 0.2 nM T3, 1 µM dexamethasone, antibiotics, and 50 µg/mL ascorbic acid.

Cells undergoing osteogenic differentiation were cultured in DMEM supplemented with

10% FCS, 1.8 mM CaCl2 (Sigma), 3.5 mM β-glycerolphosphate (Sigma), 50 µM ascorbate- 2-phosphate (Sigma), 10 nM dexamethasone (Sigma), 10 nM 1 α,25-dihydroxyvitamin D3 (Sigma), antibiotics, and 50 µg/mL ascorbic acid.

2.5.2 Enzymatic Solutions

Trypsin-EDTA: 0.25% trypsin (ICN) with 2.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid in buffered saline solution (0.14 M NaCl, 2.68 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.47 mM

KH2PO4, 2.78 mM glucose) at pH 7.4.

Thermolysin: 250 µg/mL thermolysin (Sigma) with 1 mM CaCl2 in 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazine ethane sulphonic acid (HEPES) buffer solution (6.7 mM KCl, 142 mM NaCl, 10 mM HEPES (Flow Laboratories, Mississauga, Canada), 0.45 mM NaOH at pH 7.4) (Germain et al., 1993).

Collagenase H: 0.125 IU/mL collagenase H (Roche Applied Science, Mannheim,

Germany) with 5 mM CaCl2 and antibiotics in HEPES buffer solution.

2.5.3 Umbilical Cords

Human umbilical cords were obtained from the obstetrics units of the Saint-Sacrement Hospital and the Centre hospitalier universitaire de Québec (CHUQ) after normal births,

with informed consent from the mothers. All protocols were approved by the Research Ethical Committee of the Centre hospitalier affilié universitaire de Québec (CHA) and the CHUQ. Complete extractions were performed on a total of 11 umbilical cords. A section of the umbilical cord was placed in cold transport medium within minutes after birth, and conserved at 4°C. The umbilical cords were handled using sterile techniques at all times to minimise the risk of contamination. At the time of extraction, the umbilical cord was gently cleansed of blood and debris on the outer surface with moist sterile gauze, and inspected for clamp marks, cuts and other anomalies that might have affected the structure of the cord, thus causing a mixing of the cell types extracted. Any such damaged sections were removed and discarded. At least two to three sections of 3 cm in length were set aside in cold transport medium for obtaining explants.

2.5.4 Isolation of Endothelial Cells

An undamaged section of umbilical cord, preferably greater than 15 cm in length, was used for the extraction of the endothelial cells, based on the method of Jaffe et al. (1973a). Briefly, the umbilical vein was cannulated on one end of the section and the vein was rinsed 3 times with 10 mL of cold sterile HEPES solution. The remaining end was then cannulated in a similar manner, and the vein rinsed again and perfused with a warm (37°C) solution of thermolysin, to separate the endothelial cells from the underlying media. The umbilical cord was incubated for 30 min at 37°C in a sterile, shallow plastic container filled with enough warm HEPES + 5 mM CaCl2 to cover the cord. This arrangement allowed for the rotation of the cord by half a turn every 5 min, to permit an even access of the enzymatic solution to all sides of the vein. At the end of the incubation period, the cord was removed from the container and very gently massaged in order to dislodge as many endothelial cells as possible. The vein was then rinsed with 30 mL of warm HEPES solution and the perfusion liquid collected in a centrifugation tube partially filled with M199 supplemented medium. The cells were then pelleted by centrifugation (10 min at 200 g), resuspended and plated at 10 000 cells/cm2 in gelatinised (0.2%) culture flasks with the same medium. The seeded cells were gently rinsed with warm medium 45 min after plating to remove any red blood cells remaining in suspension.

71 2.5.5 Isolation of Epithelial Cells

The section of umbilical cord used for the extraction of endothelial cells was subsequently used for the extraction of the epithelial cells by the method of Pelletier et al. (1986). The greatest portion possible of the cord was placed in a sterile container with slots cut in opposing sides to hold the ends of the cord out of the enzymatic solution. The container was filled with 40 mL of trypsin-EDTA, sealed and placed at 37°C with gentle agitation for 5 min. The enzymatic solution was then discarded and replaced with a fresh aliquot. Afterward, three successive incubation periods of 15, 15, and 30 min were undertaken. Following each step, serum was added as a trypsin inhibitor to the collected solution of trypsin-EDTA, and the mixture was centrifuged. The cell pellet from each fraction was resuspended in supplemented DME-Ham’s 10% NCS and all pellets were pooled in order to count the total number of cells obtained. The cells were then seeded in culture flasks with a feeder layer of irradiated Swiss 3T3 cells (20 000 cells/cm2) (Germain et al., 1993) at a density of 80 000 cells/cm2 in DME-Ham’s supplemented medium.

2.5.6 Isolation of Cells from Wharton's Jelly

The small sections of umbilical cord reserved for explants were firmly wiped with sterile damp gauze in order to remove the outer layer of epithelial cells. Thin slices of Wharton's jelly were taken from the surface of the umbilical cord with a scalpel, taking care not to cut into the vascular structures. These slices were immediately placed in cold culture medium (DME-10% FCS at 4°C). When all the explants had been taken, they were cut into small sections (4 mm2) and rinsed several times with the same medium. They were then carefully placed in gelatin-coated culture flasks with supplemented medium (1.4 mL per 25 cm2 flask). No changes of culture medium were done before a minimum of 4 days to avoid detachment of the explants.

Once a sufficient number of cells had migrated outwards from the explants, they were dissociated from the flask using a minimal amount of trypsin-EDTA. Any detached pieces of tissue were gently rinsed and the supernatant collected and pooled with the trypsin- EDTA-detached cells. The suspension was centrifuged and resuspended in culture medium

(DME-10% FCS). The cells were reseeded at a density of 10 000 cells/cm2 in standard tissue culture flasks.

Some explants were subjected to a collagenase digestion to dissociate the cells before seeding them. From two to four grams of explant tissue were placed in a trypsinisation unit with 50 mL of collagenase H solution and incubated on a magnetic stir plate for 2 h at 37°C. The cell suspension was diluted 1:10 with trypsin/EDTA and incubated for 5 min at 37°C. The suspension was then passed through a 100 µm-cell strainer and centrifuged for 20 min at 300 g. The supernatant was aspirated and the cell pellets pooled, resuspended in culture medium (DME-10% FCS) and counted before seeding in culture flasks at a density of 15-20 x 103 cells/cm2.

2.5.7 Isolation of Smooth Muscle Cells from the Media

The same reserved sections of umbilical cord were then used for the extraction of smooth muscle cell explants by the method of Ross (1971). The umbilical vein was cut open with sterile scissors on the side opposing the location of the umbilical arteries. After pinning down the opened section on a dissection board with the inner vein surface uppermost, the endothelial cells were removed with moist sterile gauze. Thin strips of smooth muscle tissue were detached and placed immediately in cold culture medium (DME-Ham's-10% FCS at 4°C). At the end of the procedure they were cut into small sections (4 mm2) and rinsed several times with the same medium. The explants were placed in gelatin-coated culture flasks with culture medium (1.4 mL per 25 cm2 flask). The subsequent steps were the same as described for explants from the Wharton’s jelly, using the appropriate culture medium.

2.5.8 Maintenance of Cell Cultures

All cell cultures were maintained in their respective media, which were changed three times per week, and cultured at 37°C in a humidified atmosphere containing 8% CO2. Cells were passaged upon attaining 80% confluence by dissociation using trypsin-EDTA and replated at 10 000 cells/cm2 in standard culture flasks. Epithelial cells were always replated at 13 000 cells/cm2 along with irradiated S3T3 cells at 20 000 cells/cm2. Endothelial cells were replated in gelatin-coated flasks.

73 2.5.9 Cryopreservation of Cells

Cells in exponential growth were detached from their culture flasks by treatment with trypsin-EDTA, frozen and stored in liquid nitrogen as previously described (Germain et al., 1993). Epithelial cells were frozen between passage (P) 0 and P2, endothelial cells between P0 and P3, WJC between P2 and P5, and SMC between P2 and P6. No alteration of cell morphology or proliferation was noted upon thawing and replating the cells.

2.5.10 Tissue Reconstruction: Vascular Constructs

Tubular vascular constructs were produced using the self-assembly method as previously described (Gauvin et al., 2010; Gauvin et al., 2011). Briefly, fresh P5 venous SMC and WJC extracted by explant from an umbilical cord were seeded in distinct compartments of gelatin-coated tissue culture plates (Corning) at 1 000 and 3 000 cells/cm2, respectively. Ascorbic acid (50 µg/mL) was added to the culture medium to promote extracellular matrix (ECM) synthesis. Twenty-four hours after seeding, the divider between the cell types was removed and the cells cultured for 14 days to form a contiguous sheet of tissue. This sheet was then divided using a scalpel blade into three rectangles, each containing SMC at one end and WJC at the other. Each section was gently detached with fine forceps, rolled onto a 4.5 mm diameter tubular polystyrene support and maintained in culture for 14 days on the mandrel at 37°C in a humidified atmosphere containing 8% CO2. The culture medium was changed three times per week. Samples were processed for histological and labelling analysis following the culture period. The experiment was repeated with cells from 3 different umbilical cords.

2.5.11 Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes

Bilayered stromal/epithelial substitutes comprising both an epidermal and a dermal layer were prepared using the self-assembly technique as previously described (Michel et al., 1999). Briefly, frozen explant-derived WJC between P3 and P7 were thawed and cultured for at least one passage before being seeded in 25 cm2 culture flasks at a density of 200 000 cells per flask in culture medium supplemented with 50 µg/mL ascorbic acid to promote ECM production by the cells. These cell sheets were allowed to mature for 14 days with medium changes thrice weekly, fresh ascorbic acid being added to the medium each time.

After being gently peeled off the culture flask surface, two WJC sheets were superposed in a culture Petri dish and cultured for an additional week in the same conditions. At this time, previously thawed and cultured UC epithelial cells were dissociated with trypsin-EDTA and seeded on the surface of the dermal substitutes at a density of 200 000 cells/cm2. The substitutes were cultured in submerged conditions for seven days in supplemented DME- Ham’s (see Materials and Methods) with ascorbic acid (50 µg/mL) added at every change of medium. Samples were processed for histological and labelling analysis following the culture period. The experiment was repeated 5 times using cells from a total of 6 different umbilical cords.

2.5.12 Adipogenic Differentiation

WJC were seeded at a density of 3 000 cells/cm2 in gelatin-coated 6-well plates containing a filter paper anchor to prevent contraction. At confluence the cultures were induced with adipogenic differentiation medium for 3 days as previously described (Vermette et al., 2007; Labbé et al., 2011), and were subsequently cultured in adipocyte maintenance medium. Control cultures were mock-induced in medium containing only 3% FCS, 0.038% DMSO (the diluant for IBMX and rosiglitazone), and antibiotics. Ascorbic acid (50 µg/mL) was added to all cultures at every change of medium. At 28 days post-induction cells were fixed with 3.7% buffered formalin and stained with 0.3% Oil Red O (Sigma) in isopropanol:water (3:2). Photographs were taken and the stain was extracted with 4% Nonidet P-40 (Sigma) and quantified at 520 nm with a SpectraMax Plus spectrometer (Molecular Devices) to quantify the intracellular accumulation of neutral lipids (Vermette et al., 2007).

2.5.13 Osteogenic Differentiation

WJC were seeded at a density of 3 000 cells/cm2 in gelatin-coated 6-well plates containing a filter paper anchor to prevent contraction. At day 3, the cultures were induced in osteogenic induction medium to which ascorbic acid (50 µg/mL) was added at every change of medium. Control cultures were maintained in DMEM supplemented only with

10% FBS, 1.8 mM CaCl2, antibiotics and ascorbic acid. After 28 days of culture in osteogenic medium, the cells were either fixed in 3.7% phosphate-buffered formalin for 15

75 min and stained with 2% alizarin red S (Sigma) (slightly modified from Gregory et al., 2004), or collected and frozen at -}#CLO>PR?PBNRBKQ@>I@FRJBUQO>@QFLK>PP>VPIFDEQIV modified from Sarkar et Chauhan, 1967; Webster et al., 2000). Briefly, the collected cells were digested overnight with 0.-(#I>Q}#4EB@>I@FRJ@LKQBKQT>P@LILROBATFQE> 0.1% O-cresolphtalein complexone (Sigma) solution and quantified at 575 nm.

2.5.14 Histology

Sections of the umbilical cord taken before and after each step in the extraction process were fixed overnight in Histochoice (Amresco, Solon, U.S.A.), embedded in paraffin and cut using a microtome (JUNG RM2035, Leica) into 5 µm-thick cross-sections, which were stained with Masson's trichrome. Similar sections were prepared for the vascular constructs. Bilayered stromal/epithelial substitute sections were fixed in Bouin (ACP, St. Léonard, Canada) and subsequently processed in the same manner.

2.5.15 Immunofluorescence Labelling

The various biological samples (UC, tissue-engineered constructs) were preserved in OCT compound (Tissue-Tek, U.S.A.) at -80°C, cut with a microtome into 5 µm sections and fixed in acetone (10 min. at -20°C). Samples of normal human skin were also prepared for comparison. Cells cultured on glass slides at various passages (P1 to P5) and from several different extractions were fixed in acetone (10 min. at -20°C). Indirect immunofluorescence assays were performed as previously described (Germain et al., 1988). Cell nuclei were subsequently labelled with Hoechst reagent (Sigma) and the samples examined under a Nikon Eclipse E600 microscope (a Nikon Eclipse E800 for vascular constructs). Negative controls were obtained by incubating samples with only the secondary antibody in order to detect non-specific binding of the fluorescent marker.

Antibodies used in the analyses include mouse monoclonal antibodies against α-smooth muscle actin (DAKO); chondroitin sulphate, desmin, desmoplakin, keratins (K) 8, 10 and 14 (all Sigma); type III and VII collagens, heparan sulphate and von Willebrand factor (Chemicon); fibronectin (ATCC); K12, K13, and vimentin (ICN); K18, K19, and K20 (ARP); type V collagen (Institut Pasteur); rabbit antibodies against type I collagen (Biodesign), type IV collagen (Chemicon), type VI collagen and elastin (Institut Pasteur),

and K16 (gift of Dr. P. Coulombe - Bernot et al., 2002). Secondary antibodies were TRITC-coupled goat anti-mouse (Chemicon) and TRITC-coupled goat anti-rabbit (Chemicon).

2.5.16 FACS Analysis

Cultured cells were detached with a brief trypsin treatment and labelled with specific fluorescent antibodies for subsequent FACS analysis. Briefly, cells were washed in PBS @LKQ>FKFKD?LSFKBPBORJ>I?RJFK"3!3FDJ> >KAFK@R?>QBACLOJFK>Q}#TFQE either a fluorochrome-conjugated monoclonal antibody or its isotype control. Labelled cells were washed by centrifugation in additional PBS and fixed with 1% formol (ACP). Analysis was carried out on a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson). WJC from four different umbilical cords were assayed in duplicate for MSC surface markers, with an accumulation of 10 000 events.

Directly coupled antibodies used for FACS analysis were mouse monoclonal anti-CD34- FITC, anti-CD73-PE (both Pharmingen), anti-CD90-FITC, and anti-CD105-PE (eBioscience). Mouse monoclonal CD45 (Becton-Dickinson) was used with PE-coupled goat anti-mouse (Jackson IRL), and sheep monoclonal anti-CD31 (R&D Systems) was used with Alexa 488-coupled donkey anti-sheep (Invitrogen). Mouse monoclonal calponin and caldesmon (Sigma) were used with TRITC-coupled goat anti-mouse (Chemicon). Control isotypes were used in parallel with the specific antibodies.

77 2.6 Results

2.6.1 Extraction of Four Cell Types from a Single Umbilical Cord

The combination of extraction techniques for obtaining all four cell types from the same umbilical cord gave good results once organised in a precise and step-by-step protocol. Out of eleven umbilical cords on which all four extraction techniques were performed, we obtained an overall 84% success rate, with established cell populations for all four cell types from seven cords, and three cell types from another two cords. The few problems encountered with the extractions were not directly related to the extraction technique itself. These included blockages in the vein due to blood clots that did not permit perfusion, weak spots in the vein wall that burst under pressure from the perfused liquid, and a lack of epithelial cells due to prior over-handling of the umbilical cord. Other particular reasons for the occasional inability to establish long-term cell cultures included explants from which no cells or very few cells migrated, and unproliferative cells.

2.6.2 Epithelial Cell Culture and Characterisation

Epithelial cell populations obtained by the method of immersion in trypsin-EDTA were generally easily propagated in culture. No fibroblast contamination was noted, and histological examination of the umbilical cord after extraction (Figure 2-1 A, B) showed an intact basal membrane and few remaining epithelial cells, mostly in deep folds or creases of the cord surface. The number of cells initially obtained varied depending on the length of the section of umbilical cord used for the extraction, the time elapsed between the birth and the extraction, and the physical state of the cord surface (Table 2-1). Histological examination of sections of the cord taken prior to the extraction revealed that some umbilical cords arrived in the laboratory with damaged epithelia, presumably due to handling of the umbilical cord during the birth and delivery process, and during the pathological examination of the cord (not shown).

Figure 2-1 Establishment of epithelial cell cultures from the umbilical cord. Masson’s trichrome staining of sections of the umbilical cord A) before extraction and B) after epithelial cell extraction. C) Typical aspect of an epithelial cell colony in culture (Passage 1), in phase contrast microscopy. D) Immunofluorescence staining of desmoplakin, indicating the presence of desmosomes between epithelial cells in culture. Scale bars: 50 µm (A, B, D); 100 µm (C).

The extraction technique proved to be reliable and gave consistent outcomes. Similarly to keratinocytes in culture, the tightly clustered colonies of small, round UC epithelial cells (Figure 2-1 C) showed great proliferative capacity, whereas larger, more flattened cells divided much more slowly and eventually stagnated in culture. The epithelial cells were initially plated at high density to allow for the elimination of non-proliferative and non- adherent cells. Only one cell population out of ten extractions failed to reach P1 in culture. Cell yields at extraction varied from 1 x 104 to 6 x 105 cells per cm of umbilical cord (Table 2-1), which translated into 2 x 104 to 6 x 105 available cells per cm after P0 culture, taking on average 6 days for expansion. The immunofluorescent staining of desmoplakin (Figure 2-1 D) shows the characteristic pattern of the desmosomes, which are cell-cell junctions particular to stress-bearing tissues, especially epithelia (reviewed in Delva et al., 2009). There was a general tendency towards fewer proliferative cells in umbilical cords that waited longer before extraction, but cell populations could still be established from cords as old as 12 h post-partum (Table 2-1).

79 Table 2-1 Epithelial Cell Yield at Extraction and at Passage 0

Age of cord Length of No. of cells Cells per cm Days to Cells per cm (hours since cord used obtained of cord confluence at end of P0 birth) (cm) x 106 x 105 (P0) x 105 1 h 50 35 4.1 1.2 6 1.1 2 h 40 18 3.9 2.2 6 0.8 3 h 30 30 8.3 2.8 6 2.8 5 h 30 16 9.6 6.0 5 6.0 5 h 45 23 14.0 6.1 7 4.6 6 h 40 27 2.7 1.0 4 0.8 8 h 00 20 2.7 1.4 ND ND 9 h 00 17 0.5 0.1 7 0.2 9 h 45 25 5.3 2.0 6 0.3 11 h 30 17 ND ND 13 3.1

The epithelial cells of the umbilical cord proved to have a very interesting pattern of keratin expression, including keratins typical of both simple and stratified cornified epithelia. Although the umbilical cord epithelium can be up to five layers thick in some regions, we detected the usual keratins of simple epithelia, K8, K18 and K19, in all its cells both in vivo and in vitro (Figure 2-2 A-D and Table 2-2). Keratins typically expressed by the human skin epidermis were also found to be present in the umbilical cord epithelium, with the exception of K20, which was not expressed by umbilical cord epithelial cells. In particular, K14 was found in all the epithelial cells, both in vivo and in vitro (Figure 2-2 E, F), and K10 appeared in mostly superficial cells in vivo (Figure 2-2 G), and in a small percentage of cultured cells, often larger or superficial cells (Figure 2-2 H). Unexpectedly, both K12 and K16 were present in the umbilical cord epithelium in vivo (Figure 2-2 I, K), as well as in cultured cells (Figure 2-2 J, L). K12 is normally found only in the corneal epithelium, whereas K16 is associated with nail beds and the hair cycle, as well as wound closure (Bernot et al., 2002; Coulombe et al., 2004; Bragulla et Homberger, 2009). The detection of all these antigens was carried out on cultured epithelial cells from several different extractions and from passages 1 to 5. No variation was noted in the pattern of expression in vitro over time with the exception of K10, which appeared more frequently in the enlarged

cells of the later passages. The results obtained by immunofluorescent labelling of umbilical cord sections, cultured cord epithelial cells and sections of human skin are summarised in Table 2-2.

Figure 2-2 Expression of key keratins in umbilical cord epithelial cells as detected by immunofluorescence staining. Staining was performed on cells in situ (photo at left of each pair) and in culture (photo at right of each pair): A, B) K18; C, D) K19; E, F) K14; G, H) K10; I, J) K12; K, L) K16; M, N) negative control for all but K16; O, P) negative control for K16. Inserts show a higher magnification of the epithelial compartment. Scale bars: 50 µm for all.

81 Table 2-2 Keratins Found in Umbilical Cord Epithelial Cells in situ and in vitro, in Comparison with Skin Biopsy Samples

Keratin Antibody Umbilical Cord Cord Epithelial Skin Epithelium (K) Epithelium Cells in Culture K8 + + -* K10 + + + K12 + + - K13 + + - K14 + + + K16 + + +** K18 + + -* K19 + + -* K20 - - -*

* in adult skin, these keratins are found in a few specialised cells only ** in hair follicle cells only

2.6.3 Wharton's Jelly: Matrix Components and Proteins Produced by its Cells in vivo and in Culture

The stromal cells of the Wharton’s jelly proved to be particularly easy to propagate in vitro. Cells began to migrate out from explants as early as day 4 post-extraction and multiplied quickly thereafter. Examination of histological sections of both explants and the umbilical cord following extraction showed no mixing of smooth muscle tissue (media) with the Wharton's jelly; thus the cultures were composed only of stromal cells (Figure 2-3 A, B). Their aspect in culture was typical of elongated fibroblastic cells (Figure 2-3 C). There is no currently known specific marker for fibroblasts, but WJC express the typical mesenchymal structural protein vimentin (Figure 2-3 D) along with several collagens. Cells in culture for 30-40 days (equivalent to passages 6 to 7) showed no signs of diminishing proliferation rates (Figure 2-3 E), and cells from various passages were successfully frozen, thawed and replated with good viability results (results not shown). Thawed cells from explants of several umbilical cords and from the collagen-digested explants of one cord were kept in culture to passage 12, showing no obvious downward trend in proliferation (Figure 2-3 E).

The Wharton's jelly tissue in situ stained positively for many of the typical fibroblast- related proteins and ECM proteins: fibronectin, chondroitin sulphate, vimentin, and type I, III, and V collagens; and also for type IV and VI collagens (Figure 2-4 A-H; summarised in Table 2-3). Type III collagen (Figure 2-4 E), which is a major component of the dermal portion of the skin (reviewed in Bruckner, 2010), was less abundant in the umbilical cord matrix than type I collagen (Figure 2-4 D). Type IV collagen (Figure 2-4 H) was especially concentrated just under the epithelial cell layer, but was present throughout the Wharton’s jelly matrix. The other basal membrane components, type VII collagen, heparan sulphate, and laminin 5, were present only in the region of the basal membrane (Figure 2-4 I-K). There was also a marked presence of α-smooth muscle actin, as well as desmin and elastin (Figure 2-4 L-N). Four keratins appeared in the cytoskeleton of WJC: K12, K16, K18, and to a lesser extent, K19 (Figure 2-4 O-R). Once the cells were seeded in culture (Figure 2-5, summarised in Table 2-3), the overall expression pattern was similar to that observed in situ with the exception of the basement membrane components type VII collagen (Figure 2-5 H) and heparan sulphate (not shown), which were absent in short-term cultures of WJC. Immunofluorescence labelling showed abundant α-smooth muscle actin fibres in vitro (Figure 2-5 I) as well as elastin (Figure 2-5 K), and desmin in a minority of cells (Figure 2-5 J). Surprisingly, although WJC in culture stained positively for type I collagen (Figure 2-5 C), they did not seem to produce type III collagen (Figure 2-5 D). Overall, the Wharton’s jelly in situ presented a complex mix of matrix proteins rich in proteoglycans, with cellular intermediate filaments that included several not typical of stromal fibroblasts.

Figure 2-3 Establishment of Wharton’s jelly cell cultures from the umbilical cord. Masson’s trichrome staining of a section of the umbilical cord A) before extraction and B) after extraction of tissue for explants. C) Typical aspect of WJC in culture (Passage 3), in phase contrast microscopy. D) Immunofluorescence staining of vimentin in cells in culture. E) Representative population growth dynamics for WJC. Fresh cells from different umbilical cords were obtained by explants (pink, n=5) and by collagenase digestion of explants (blue, n=4). Pink and blue lines with identical symbols indicate populations from the same umbilical cord. Thawed WJC (green, n=6) had been previously frozen and stored. Cumulative population doublings are shown for total days in culture; the day of thawing is considered as day 0 for cryopreserved cells. M – media (smooth muscle cells); WJ - Wharton's jelly. Scale bars 500 µm (A, B); 100 µm (C); 50 µm (D).

Figure 2-4 Structural and extracellular matrix proteins synthesised in situ by cells in the umbilical cord Wharton’s jelly. A) fibronectin, B) chondroitin sulphate, C) vimentin; D-I) collagens: D) type I, E) type III, F) type V, G) type VI, H) type IV, I) type VII; J) heparan sulphate, K) laminin 5, L) α-sm actin, M) desmin, N) elastin, O) K12 P) K16, Q) K18, R) K19, S) negative control for mouse Ab, T) negative control for rabbit Ab. Scale bar: 50 µm.

Figure 2-5 Expression of structural and extracellular matrix proteins by Wharton’s jelly cells in culture. Immunofluorescence stainings for A) fibronectin, B) chondroitin sulphate; C-H) collagens: C) type I, D) type III, E) type IV, F) type V, G) type VI, H) type VII; I) α-smooth muscle actin, J) desmin, K) elastin, L) K12, M) K18, N) K19, O) negative control for mouse Ab, P) negative control for rabbit Ab. Scale bar: 50 µm.

Table 2-3 Summary of the Observed Expression of Structural and Matrix Proteins in Umbilical Cord WJC in situ and in vitro

Wharton's WJC in Antigen Jelly Culture chondroitin sulphate ++ + type I collagen ++ + type III collagen + - type IV collagen ++ ++ type V collagen ++ ++ type VI collagen ++ ++ type VII collagen BM - fibronectin + + vimentin ++ ++ heparan sulphate + - laminin 5 BM ND α-sm actin ++ ++ elastin ++ + desmin ++ +* K12 ++ ++ K16 + ++ K18 + ++ K19 + ++

* – in a subset of cells only BM – basement membrane

87 2.6.4 Functional Characterisation of Wharton’s Jelly Cells

Several previous reports have indicated that WJC possess mesenchymal stem cell properties. In consideration of this observation, we have addressed some of these properties using four different WJC populations we isolated. FACS analysis of cells in culture showed expression of the mesenchymal stem cell markers CD73, CD90 and CD105 on at least 97% of the cells for all populations tested (Figure 2-6 A). Staining for CD34 and CD45 was less than 1% for all populations.

WJC cultured in adipogenic induction medium showed the development of neutral lipid accumulations in the cytosol of many cells (Figure 2-6 C), indicative of an adipogenic phenotype. Following Oil Red O coloration, quantification of this lipid accumulation showed an overall accumulation of about 1.6 times more lipids in the induced cell cultures as compared to controls (Figure 2-6 D), even though not all induced cells became filled with large droplets.

Osteogenic induction of WJC cultures resulted in the formation of mineralised deposits, which were subsequently stained with Alizarin Red S (Figure 2-6 E, F). Quantification of the calcium present in the extracellular matrix showed significantly higher mineralisation by the induced cells of three of the four populations tested as compared to the controls (Figure 2-6 G). A small amount of spontaneous differentiation was observed in certain control cultures (results not shown). Globally, the WJC populations we isolated presented the expected mesenchymal stem cell behaviour.

Figure 2-6 Stromal cells from the Wharton’s jelly show characteristics of mesenchymal stem cells. WJC from several different umbilical cords were analysed by flow cytometry, and cultured in appropriate media for the induction of adipogenic and osteogenic differentiation. A) Flow cytometry analysis of WJC surface markers. Control cells (isotypic antibodies) are depicted by the thinner line while the bold line represents cells incubated with the specific antibody indicated for each graph. B- D) Adipogenic differentiation of WJC in culture. Staining of neutral lipids by Oil Red O revealed no accumulation in control cultures B) whereas induced cells C) contained large lipid-filled droplets. Quantification of the extracted stain D) showed the definite increase in lipid accumulation by induced cells. E-G) Osteogenic differentiation of WJC in culture. The control culture E) showed a lack of significant accumulation of calcium after alizarin red S staining, whereas the induced culture F) stained deep red in areas of mineral deposition. Quantification of the calcium extracted from similar cultures G) showed a distinct increase in calcification by the induced cells in three of the four populations used in this experiment. Results are expressed as mean +/- SEM. Scale bars: 300 µm. * P < 0.05

89 2.6.5 Establishment of Smooth Muscle Cell Populations from the Umbilical Vein

Smooth muscle cells were slightly more difficult to establish in culture, as the migration of cells outwards from the explants varied between umbilical cords. Once cells had migrated, however, they were very easily and quickly propagated through subsequent passages. The results of histological examination of the umbilical cord before and after extraction showed the explants to consist solely of tissue from the media of the umbilical vein (Figure 2-7 A, B, red line). The adventitia and Wharton's jelly remained intact in all cases (Figure 2-7 B). The cultured cells displayed a typical elongated SMC morphology (Figure 2-7 C) and were always uniformly positive for α-smooth muscle actin, which appears as stress fibres (Figure 2-7 D). Flow cytometry analyses were >99% and >85% positive for calponin and caldesmon, respectively (data not shown). SMC were also successfully extracted and placed in culture by perfusion of the umbilical cord vein with a solution of 0.2% collagenase H after the endothelial cells had been removed (data not shown).

Figure 2-7 Establishment of smooth muscle cell cultures from the umbilical cord. Masson’s trichrome staining of sections of the umbilical cord A) before extraction and B) after extraction. The thickness of the media is shown by the red line. C) Typical aspect of smooth muscle cells in culture (Passage 3), in phase contrast microscopy. D) Immunofluorescence staining of α-smooth muscle actin stress fibres in cells in culture. Scale bars: 100 µm (A-C); 50 µm (D).

2.6.6 Endothelial Cell Culture and Characteristics

Endothelial cells were consistently isolated in single cell type culture and propagated through many passages without difficulty. No smooth muscle cell contamination was ever noted, and histological examination of the umbilical cord vein after extraction showed the underlying media layer remained intact (Figure 2-8 A, B). The cells grew in tightly organised colonies and displayed the typical cobblestone appearance in culture (Figure 2-8 C). Immunofluorescent staining for von Willebrand factor (vWF) further confirmed their identity as endothelial cells (Figure 2-8 D). VWF is a glycoprotein synthesized only in endothelial cells and megakaryocytes. In endothelial cells it is stored in Weibel-Palade bodies (the granules seen in Figure 2-8 D), from which it can be quickly released in the case of endothelium activation or damage (reviewed in Wang et Eikenboom, 2010). FACS analysis of CD31 in cultured endothelial cells showed the population to be uniformly positive (>95%), and thus uncontaminated by hematopoietic cell precursors (results not

91 shown). These umbilical cord endothelial cells, once seeded in the dermal portion of tissue- engineered skin substitutes, reorganised themselves into capillary-like structures, enabling the production of reconstructed tissues that are useful models for research on angiogenesis, as carried out by our group (Tremblay et al., 2005a; 2005b; 2008; Gibot et al., 2010; Guillemette et al., 2010; Rochon et al., 2010) and others (Jaffe et al., 1973b; Montesano et Orci, 1987; Cozzolino et al., 1990; Guo et al., 2000; Fassina et al., 2004; Tsigkou et al., 2010).

Figure 2-8 Establishment of endothelial cell cultures from the umbilical cord. Masson’s trichrome staining of sections of the umbilical cord A) before extraction and B) after extraction. The red arrows indicate the position of the endothelial layer lining the vein lumen. C) Typical aspect of endothelial cells in culture (Passage 1), in phase contrast microscopy. D) Immunofluorescence staining of von Willebrand factor expressed in cells in culture. Scale bars: 50 µm (A, B, D); 100 µm (C).

2.6.7 Tissue Engineering Applications Based on Umbilical Cord Cells

Other examples of the usefulness and versatility of the umbilical cord cells are shown in Figure 2-9. We have used the self-assembly method to construct both a vascular substitute and a bilayered stromal/epithelial substitute in vitro. This particular method of tissue engineering has the advantage of using the cells themselves to produce the ECM, rather than including exogenous biological or synthetic materials. The vascular substitute shown in Figure 2-9 A-C is a tubular construct comprising a media made from umbilical cord SMC, and an adventitia made from WJC. As can be seen in Figure 2-9 A, the structure was robust and did not collapse when removed from the support used during culture. The wall thickness of the cross-section appears in Figure 2-9 B, coloured by Masson’s trichrome. The ECM produced by the cells was rich in type IV collagen (Figure 2-9 C), desmin, type I collagen and elastin (not shown, Gauvin et al., 2011). The substitute has previously shown considerable burst strength in mechanical testing (Gauvin et al., 2011). A bilayered stromal/epithelial substitute was also produced by stacking two WJC stromal sheets generated through the self-assembly approach, on top of which UC epithelial cells were seeded (Figure 2-9 D-F). After a week of maturation time, the epithelial cells formed a uniform layer across the equivalent, usually two cell layers thick (Figure 2-9 D, E). Indirect immunofluorescent labelling revealed the presence of various keratins including K13 (Figure 2-9 F) in the epithelial layer of the substitute. Histological staining (Figure 2-9 E) showed clearly defined epithelial and stromal compartments and the presence of abundant matrix material.

Figure 2-9 Each type of umbilical cord cell can contribute to unique reconstructed tissues produced using the self-assembly approach of tissue engineering. Examples of reconstructed tissues using cell types extracted from the human umbilical cord: A- C) A tissue-engineered blood vessel with a media made from smooth muscle cells and an adventitia made from WJC. A macroscopic view of the vessel A) on the tubular support, inner diameter 4.5 mm. Masson’s trichrome staining of a cross- section of the vessel B) and immunofluorescence staining C) of type IV collagen (red) and cell nuclei (blue) in a similar section. D-F) Reconstructed bilayered stromal/epithelial substitute featuring a stroma made of WJC, overlaid with cord epithelial cells. D) A macroscopic view of the substitute (dotted line traces the circumference – 2.8 cm diameter). E) Masson’s trichrome staining of a transversal section of the substitute and F) immunofluorescence staining of K13 (red) and cell nuclei (blue). M – media; A – adventitia; S – stromal layer; Ep – epithelial layer. Scale bars: 250 µm.

2.7 Discussion

Our work demonstrates, for the very first time, that it is feasible to extract all four cell types from a single umbilical cord, and that these cells will thrive in monoculture and can be banked and thereafter used for tissue engineering applications. The extraction techniques employed are carefully planned at each step to avoid damage to the remaining tissues, and have the novelty of using thermolysin rather than collagenase for the extraction of endothelial cells from the umbilical cord vein. Thermolysin splits the dermo-epidermal junction in skin (Walzer et al., 1989; Germain et al., 1993), and here detaches the endothelial cell layer without altering the underlying basement membrane. This method thus provides an added guarantee of obtaining an unmixed cell population.

Most organs contain multiple specialised cell types, and ideally this should be reflected in tissue-engineered organs in order to better recreate tissue structure and function. It is not always simple to isolate multiple cell types from a single tissue sample in order to reproduce its structure in vitro. The umbilical cord is a readily available single source of multiple cell types. When combined with the capacity for mesenchymal progenitor cell differentiation in the cells of the Wharton’s jelly (reviewed in Wang et al., 2004; Can et Karahuseyinoglu, 2007; Troyer et Weiss, 2008) the umbilical cord cells provide the potential for the fabrication of many different tissue-engineered organs, according to the specific combination of cell types for each. The interactions between cell types are also primordial in the reconstruction of tissue-engineered organs.

As reported by other teams (Mizoguchi et al., 2000; Sanmano et al., 2005), the epithelial cells of the umbilical cord in monolayer cultures behaved very similarly to cultured keratinocytes (Pelletier et al., 1986). Viable cells in primary culture formed compact, well- defined colonies of small, proliferative cells. With culture time and passages, the cells eventually became enlarged and exhibited signs of differentiation and slowed growth. In vitro growth is also inhibited by confluence, and cells we occasionally replated after this point did not flourish. In some cases, already enlarged cells were obtained from the umbilical cord, and failed to proliferate to any great extent in culture. These cells came mostly from umbilical cords that had already spent several hours outside the uterus before the cell isolation took place. The general rule of less proliferative epithelial cells coming

95 from umbilical cords waiting longer before extraction seemed to hold true in most cases. It could be postulated that a general degeneration of the umbilical cord begins shortly after the birth, as at this point all circulatory flow to the cord is cut off and the epithelium is no longer bathed in the rich amniotic fluid. Additional factors to be considered include the fragility of the epithelial layer, which is only a few cells thick and is easily damaged by excessive handling after birth. However, in all cases but one, sufficient proliferative cells were obtained to successfully establish epithelial cell cultures.

The pattern of keratin expression in umbilical cord epithelial cells is intriguing, as it seems to combine elements of simple epithelia with those of stratified epithelia. Keratins 8, 18 and 19 were present in all cells of the umbilical cord epithelium, as they are in typical simple epithelia (Bourne, 1962; Hutton et al., 1998). This is not the case for the skin epithelium, where the number of cells expressing K19 decreases from childhood on and only a small number of basal and follicular cells contain K18 and K19 in adults (Michel et al., 1996). The latter keratin is associated with stem cells in the skin epidermis (Michel et al., 1996; Fradette et al., 1998). All umbilical cord epithelial cells expressed K19 in vitro, hinting at their less differentiated properties compared to adult cells. No umbilical cord cells expressed K20 (Table 2-2), which in combination with K18 and K19 is indicative of differentiated Merkel cells in skin (Moll et al., 1984; 1995).

Two keratins normally present in the skin were also expressed by the umbilical cord epithelial cells. The presence of K10 is noteworthy, as it suggests a capacity for differentiation similar to that of keratinocytes. More cells were K10-positive in vivo than in vitro, and a greater number of larger cells were positive than smaller ones. K14 is also typical of stratified epithelia, and was found throughout the umbilical cord epithelium as well as in culture. Similar results were found by Mizoguchi et al. (2000) for K10, K13, K14, and K18. Unexpectedly, both K12 and K16 were present in the umbilical cord epithelium (and stromal cells, as discussed below). The positive result for K12 both in situ and in vitro was unexpected, as this is a keratin usually found only in the cornea (Schermer et al., 1986), and is important for corneal differentiation and mechanical strength (Moll et al., 2008). K16 is expressed in cells during hyperproliferation, and thus its presence in epithelial cell cultures was not surprising. In vivo, K16 is characteristic of the outer root

sheath of hair and the nail bed, and is found in a subset of epithelial cells during skin morphogenesis (Bernot et al., 2002; Coulombe et al., 2004; Larouche et al., 2008). K16 marks activated keratinocytes, cells that are able to migrate and hyperproliferate (Freedberg et al., 2001; Coulombe et al., 2004). Thus the presence of this keratin may provide cells with a structure that is flexible enough for all these activities (Bernot et al., 2002).

The WJC of the umbilical cord were easily established in culture and proliferated consistently, even after being frozen and thawed. Fresh cultures were taken to passage 8 and thawed cells reached passage 12 with no significant decrease in proliferation. WJC produced the usual proteins synthesized by fibroblastic cells - vimentin, various collagens, and fibronectin - both in vivo and, with the notable exceptions of type III and VII collagens and heparan sulphate, in vitro. It is interesting to note that the components of only the basement membrane in vivo (heparan sulphate and type VII collagen) seemed not to be produced in vitro where there was no interaction with epithelial cells. The Wharton's jelly cells also displayed a number of unusual characteristics, most remarkably perhaps the presence of several keratins: K12, K16, K18, and K19. These keratins were present both in the umbilical cord stroma and in cultured cells. The presence of K18 and K19 in the umbilical cord stromal cells has been documented previously (Bader et al., 1988), and K8/K18 can be found coexpressed with other IFs, especially vimentin and desmin, in certain mesenchymal tissues (reviewed in Moll et al., 2008). Intracellular α-smooth muscle actin was present in all Wharton's jelly cells in vivo, which is in concordance with its role in the contraction of the umbilical cord (Takechi et al., 1993), and which is characteristic of functional myofibroblasts (Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997; Kobayashi et al., 1998; Farias et al., 2011). We also found desmin in Wharton's jelly cells in situ, as did Takechi et al. (1993), and in a small percentage of cells in culture, where the expression of desmin is usually lost in smooth muscle cells. Curiously, McElreavey et al. (1991) reported type I and III collagens in umbilical cord fibroblasts in culture, along with the absence of keratins and of type II, IV and V collagens. We, on the other hand, not only encountered keratins 12, 16, 18 and 19 but also elastin and type IV, V and VI collagens in WJC in vitro, but not type III. It is well accepted that culture conditions can affect the presence or absence of particular synthesised proteins, and McElreavey and his colleagues used McCOYS 5A medium with 20% FCS, whereas our cells were cultured in DME with 10%

97 FCS. Finally, it would seem apparent that these cells have a great capacity for protein synthesis, which would be expected from fibroblasts in a matrix-rich tissue.

WJC that were cultured in induction media responded by the accumulation of intracellular neutral lipids, in adipogenic differentiation, and by the production of mineralised extracellular matrix material, in the case of osteogenic differentiation. Not all populations responded to the induction media to the same degree, as can be seen in the osteogenic induction where one population failed to produce a significant amount of mineralised matrix. However, our results are in concordance with previous reports (Wang et al., 2004; Sarugaser et al., 2005; Zhang et al., 2009).

The synthetic capacity of umbilical cord cells was tested in two reconstructed tissues, one a vascular substitute and the other a bilayered stromal/epithelial substitute. The WJC and SMC produced abundant ECM material to make a cohesive and rather sturdy tissue, especially in the case of the vascular substitute where the rolled layers of SMC and WJC formed a sturdy tube. Mechanical tests showed that the vessels could sustain at least a 30% strain without failure, and that they displayed elastic attributes under cyclic strain (results detailed in Gauvin et al., 2011). When WJC were used to produce the stromal portion of a bilayered stromal/epithelial substitute, the resulting sheet was sturdy enough to be easily manipulated and was composed of thick layers of extracellular proteins surrounding the cells. UC epithelial cells seeded on the surface of the WJC sheets soon covered the foundation with a continuous layer of epithelium, generally two cell layers thick after 7 days of culture. The epithelial cells of the substitute expressed several keratins including K13, a keratin typical of stratified mucosal epithelia (Moll et al., 1982) and important in the regulation of differentiation and apoptosis in these tissues, as certain mutations in K13 or its partner K4 lead to the epithelial hyperproliferation and swelling known as white sponge nevus (reviewed in Moll et al., 2008).

Other research groups have used single types of UC cells in tissue reconstruction, including pulmonary artery and cardiovascular conduits (Hoerstrup et al., 2002; Kadner et al., 2002), as well as epithelial substitutes (Mizoguchi et al., 2004; Sanmano et al., 2005). Interestingly, the umbilical cord stromal cells have been shown to exhibit a lack of alloreactivity in vitro (Ennis et al., 2008; Weiss et al., 2008). Limited transplantation

studies have shown neither tumour induction nor acute rejection when transplanted as xenografts into mice and rats (Weiss et al., 2003; Medicetty et al., 2004; Weiss et al., 2006; Rachakatla et al., 2008). Taken together with the results obtained by our group, the umbilical cord cells show great promise for tissue engineering and transplantation.

In conclusion, for the first time to our knowledge the four cell types of the umbilical cord solid tissue have been extracted sequentially from a single umbilical cord using standard extraction techniques and successfully maintained in culture, which allowed the preparation of reconstructed tissues through tissue engineering. These can be employed for transplantation purposes and for the study of cell type interactions and differentiation in vitro. In particular, the umbilical cord epithelial cells show evidence of the ability to produce proteins typical of stratified, cornified epithelia. The Wharton's jelly cells produced many and varied stromal proteins, apart from their qualities as mesenchymal progenitor cells (reviewed in Can et Karahuseyinoglu, 2007), which were demonstrated in this study through osteogenic and adipogenic differentiation. The combination of some or all of these cell types will lead to many revealing experiments in tissue engineering and organ regeneration.

99 2.8 Acknowledgements

The authors would like to thank Kathleen Baker, Cindy Perron, Valérie Trottier and Sébastien Larochelle for their technical expertise, Claude Marin for his photographic assistance, Dr. P. Coulombe for his generous donation of anti-K16 antibodies, Dr. J. E. Davies for his much appreciated advice on osteogenic induction and Dan Lacroix for critical reading and constructive suggestions during the preparation of the manuscript. This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research, Le Fonds de la Recherche en Santé du Québec and La Fondation des Pompiers du Québec pour les Grands Brûlés. C.J.H. was the recipient of a scholarship from the National Science and Engineering Research Council. J.F. is a Fonds de Recherche du Québec - Santé (FRQS) scholar.

100

2.9 References

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106

3 Using Human Umbilical Cord Cells for Tissue Engineering: A Comparison With Skin Cells

Cindy J. Hayward1,2,3, Julie Fradette1,2,3, Pascal Morissette Martin1,2,3, Rina Guignard1,2, Lucie Germain1,2,3, François A. Auger1,2,3 1Centre LOEX de l'Université Laval 2Axe Médecine Régénératrice - Centre de recherche FRQS du CHU de Québec-Université Laval 3Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada.

* Corresponding author:

Key words: umbilical cord, tissue engineering, epithelial substitutes, epithelial differentiation, tissue interactions, epithelial cells, Wharton’s jelly cells

107 3.1 Abstract

The epithelial cells and Wharton’s jelly cells (WJC) from the human umbilical cord have yet to be extensively studied in respect to their capacity to generate tissue-engineered substitutes for clinical applications. Our reconstruction strategy, based on the self-assembly approach of tissue engineering, allows the production of various types of living human tissues such as skin and cornea from a wide range of cell types originating from post-natal tissue sources. Here we placed epithelial cells and WJC from the umbilical cord in the context of a reconstructed skin substitute in combination with skin keratinocytes and fibroblasts. We compared the ability of the epithelial cells from both sources to generate a stratified, differentiated skin-like epithelium upon exposure to air when cultured on the two stromal cell types. Conversely, the ability of the WJC to behave as dermal fibroblasts, producing extracellular matrix and supporting the formation of a differentiated epithelium for both types of epithelial cells, was also investigated. Of the four types of constructs produced, the combination of WJC and keratinocytes was the most similar to skin engineered from dermal fibroblasts and keratinocytes. When cultured on dermal fibroblasts, the cord epithelial cells were able to differentiate in vitro into a stratified multilayered epithelium expressing molecules characteristic of keratinocyte differentiation after exposure to air, and maintaining the expression of keratins K18 and K19, typical of the umbilical cord epithelium. WJC were able to support the growth and differentiation of keratinocytes, especially at the early stages of air-liquid culture. In contrast, cord epithelial cells cultured on WJC did not form a differentiated epithelium when exposed to air. These results support the premise that the tissue from which cells originate can greatly affect the properties and homeostasis of reconstructed substitutes featuring both an epithelial and stromal compartment.

108

3.2 Résumé

Les cellules épithéliales et les cellules de la gelée de Wharton (WJC) du cordon ombilical humain n’ont pas encore été étudiées de façon exhaustive en ce qui concerne leur capacité de contribuer à la production de substituts reconstruits par génie tissulaire en vue d’une application clinique. Notre stratégie de reconstruction, basée sur l’approche de l’auto- assemblage, permet de produire plusieurs tissus humains vivants d’une large gamme de types cellulaires provenant de tissus post-nataux. Ici, nous avons utilisé des cellules épithéliales et des WJC dans le contexte d’un substitut de peau reconstruit, en combinaison avec des kératinocytes et des fibroblastes de la peau. Nous avons comparé la capacité des cellules épithéliales des deux sources à produire un épithélium stratifié et différencié, tel celui de la peau, lorsque cultivées à l’interface air-liquide sur un derme reconstruit avec les deux types de cellules stromales. Inversement, nous avons aussi analysé la capacité des WJC de former un stroma dermique riche en matrice extracellulaire et qui supporte la formation d’un épithélium différencié pour les deux types cellulaires épithéliaux. Parmi les quatre types de substituts construits, la combinaison des WJC et des kératinocytes ressemblait le plus à la peau reconstruite de référence, faite de fibroblastes dermiques et de kératinocytes. Lorsque cultivées sur des fibroblastes dermiques, les cellules épithéliales du cordon se sont différenciées in vitro pour former un épithélium stratifié de plusieurs couches, et après l’exposition à l’air ont exprimé des molécules caractéristiques de la différenciation des kératinocytes tout en maintenant leur expression des kératines 18 et 19, typiques de l’épithélium du cordon ombilical. Les WJC ont soutenu la prolifération et la différenciation des kératinocytes, surtout dans les premières étapes de la culture en conditions air-liquide. En contraste, les cellules épithéliales du cordon cultivées sur les WJC n’ont pas formé un épithélium différencié en condition air-liquide. Ces résultats appuient l’hypothèse que le tissu d’origine des cellules peut avoir une grande influence sur les propriétés et sur l’homéostasie des substituts reconstruits comprenant un compartiment stromal et épithélial.

109 3.3 Abbreviations

DF – dermal fibroblasts DMEM – Dulbecco-Vogt modified Eagle's medium EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid EGF – epidermal growth factor K – keratinocytes K10 – keratin 10 NCS – newborn calf serum P – passage SEM – standard error of the mean TRITC – tetramethylrhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate UC – umbilical cord ucEpi – umbilical cord epithelial cells WJC – Wharton’s jelly cells

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3.4 Introduction

The development of reconstructed living substitutes has greatly progressed in recent years, in particular in the field of skin reconstruction, which is among the most advanced for tissue engineering applications. Achieving tissue homeostasis within reconstructed substitutes is especially important for self-renewing tissues such as skin, which features a differentiated epithelial compartment influenced by the underlying dermal compartment (McLoughlin, 1963). Tissue-engineered substitutes generated using the self-assembly method are useful tools for gaining insights into cell interactions and the regulation of tissue homeostasis. Indeed, being by nature made of cells and the native extracellular matrix they secrete and organize upon stimulation with ascorbic acid, these living tissues recreate a highly physiological tissue context (Paquet et al., 2010). Such substitutes are particularly helpful for understanding the contribution of stromal-epithelial interactions to differentiation patterns and regulation (Trottier et al., 2008; Carrier et al., 2009) in addition to being employed in the treatment of skin defects (Boa et al., 2013).

Umbilical cord-derived cells have spurred increasing interest in recent years because of their advantageous characteristics, such as a less differentiated status possibly contributing to lower immunogenicity (Ennis et al., 2008; Weiss et al., 2008). In addition to cord blood stem cells, cells derived from the umbilical cord solid tissue are of great interest. Of the four cell types that can be successfully extracted and cultured from a single umbilical cord (Hayward et al., 2013), the endothelial cells and smooth muscle cells of the vein and arteries have been extensively used in various experimental settings (Jaffe et al., 1973b; Owens, 1995; Bachetti et Morbidelli, 2000), including tissue engineering (L'Heureux et al., 1998; Stephan et al., 2006; Gibot et al., 2010; Guillemette et al., 2010; Rochon et al., 2010; Tsigkou et al., 2010; Gauvin et al., 2011). The Wharton’s jelly cells (WJC) have also become the subject of intensive research in recent years (reviewed in Marcus et Woodbury, 2008; Troyer et Weiss, 2008) with an ever-increasing number of studies demonstrating their characteristics as multipotent stem cells. The epithelial cells of the umbilical cord show an interesting pattern of keratin expression, combining characteristics of simple and stratified epithelia (Mizoguchi et al., 2000; Hayward et al., 2013). Recent studies have highlighted their similarity to neonatal keratinocytes in the pattern of K1/K10 and

111 deltaNp63 expression (Ruetze et al., 2008). They are also able to form a stratified epithelium when seeded on collagen gels populated with fibroblasts (Mizoguchi et al., 2004; Sanmano et al., 2005; Ng et al., 2008; Huang et al., 2011b). In this study, we evaluated their behaviour in combination with WJC or dermal fibroblasts in the context of a tissue-engineered skin substitute.

The aim of the present study was to evaluate the impact of epithelial and stromal cells from two different cell sources on the tissue production of bilayered substitutes by the self- assembly approach of tissue engineering. Our results show that the different combinations of skin- and umbilical cord-derived cells had a great impact on the resulting differentiation pattern of the epithelial compartment as well as on the development of a mature dermo- epidermal junction. Umbilical cord epithelial cells cultured on dermal fibroblasts differentiated in a similar fashion to keratinocytes when exposed to air, showing the presence of molecular markers characteristic of stratified, keratinised epithelia. Keratinocytes on WJC also differentiated in a similar fashion, but umbilical cord epithelial cells on WJC did not produce a multi-stratified, skin-like epithelium in air-exposed culture conditions. Thus, not all cell sources are interchangeable, and the particular combination of cells can have as much impact on the resulting tissue as culture conditions.

112

3.5 Materials and Methods

3.5.1 Cell Extraction and Culture

Human umbilical cords (N = 6 different donors) were obtained from the obstetrics unit of the Saint-Sacrement Hospital after normal births, with informed consent from the mothers. All protocols were approved by the Research Ethical Committee of the Centre hospitalier affilié universitaire de Québec (CHA). Keratinocytes were obtained from newborn foreskin as previously described (Germain et al., 1993), and epithelial cells were extracted from the human umbilical cord using a solution of 0.25% trypsin (ICN) with 2.2 mM EDTA in buffered saline solution, as described in Hayward et al. (2013). For passaging, these cells were seeded in 75 cm2 culture flasks at 1 x 106 cells per flask with a feeder layer of irradiated Swiss 3T3 cells at 2 x 104 cells/cm2 (Germain et al., 1993), and cultured as described below. Dermal fibroblasts were obtained from an adult skin biopsy (23-year-old female donor) as in a prior description (Auger et al., 1995). Umbilical cord WJC were isolated as described in Hayward et al. (2013). Both types of stromal cells were seeded in 75 cm2 culture flasks at 1 x 104 cells/cm2 and cultured as described below. All cell populations were cryopreserved in liquid nitrogen pending their use in the experiments, then thawed and cultured for at least one passage. All cell cultures and reconstructed tissues were maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 8% CO2, and media were changed three times per week.

Keratinocytes and epithelial cells were cultured in Dulbecco-Vogt modified Eagle's medium (DMEM) combined with Ham's F12 medium (both Gibco BRL, Burlington, Canada) in a 3:1 proportion (referred to as DME-Ham's), supplemented with 10% newborn calf serum (NCS; Fetal Clone II, HyClone, Aurora, Canada), epithelial additives [24.3 µg/mL adenine (Chiron Corp., Emeryville, U.S.A.), 10 ng/mL epidermal growth factor (EGF; Austral Biological, San Ramon, U.S.A.), 5 µg/mL insulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.), 0.1 nM cholera toxin (ICN Biomedical, Montréal, Canada), 5 µg/mL transferrin (Boehringer Mannheim, Laval, Canada), 2 nM 3,3',5 triiodo-L-thyronine (Sigma), 0.4 µg/mL hydrocortisone (Calbiochem, La Jolla, U.S.A.)], and antibiotics [100 IU/mL penicillin G (Sigma), 25 µg/mL gentamicin sulphate (Schering, Pointe-Claire,

113 Canada)]. Fibroblasts and WJC were cultured in DMEM (Gibco BRL), supplemented with 10% foetal calf serum (HyClone) and antibiotics.

3.5.2 Reconstructed Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes

Four different reconstructed substitutes were produced in this study, using the following combinations (Table 3-1): dermal fibroblasts with skin keratinocytes (DF / K), dermal fibroblasts with cord epithelial cells (DF / ucEpi), WJC with keratinocytes (WJC / K) and WJC with cord epithelial cells (WJC / ucEpi). For each combination of specific cell populations, up to seven substitutes were prepared, which allowed sampling of two substitutes for final analysis at each time point. A total of six umbilical cord cell populations (three epithelial and three stromal) were used in five different epithelial cell- WJC combinations, along with one dermal fibroblast cell population and one keratinocyte cell population for comparison purposes.

Table 3-1 Composition of the Bilayered Stromal/Epithelial Substitutes

DF / K DF / ucEpi WJC / K WJC / ucEpi

Keratinocytes UC Epithelial Keratinocytes UC Epithelial (K) Cells (ucEpi) (K) Cells (ucEpi) Dermal Fibroblasts (DF) Wharton’s Jelly Cells (WJC)

Bilayered stromal/epithelial substitutes comprising both an epidermal and a stromal layer were prepared using the self-assembly approach of tissue engineering as previously described (Michel et al., 1999). Briefly, dermal fibroblasts or WJC between P3 and P7 were seeded in 25 cm2 culture flasks at a density of 2 x 105 cells per flask with 50 µg/mL sodium L-ascorbate (Sigma) in the culture medium, which promotes the deposition of extracellular matrix material. Fresh ascorbic acid was added at each change of culture medium. Manipulable sheets were obtained after a maturation period of at least 14 days for WJC and 28 days for dermal fibroblasts. After being gently peeled off the culture flask surface with forceps, two sheets were superposed in a culture Petri dish and cultured for an additional week in the same conditions to ensure cohesion of this stromal compartment. At this time, keratinocytes or umbilical cord epithelial cells (ucEpi) were dissociated with trypsin-EDTA and seeded on the surface of the stromal compartment at a density of 2 x 105 cells/cm2. The

114

substitutes were cultured in submerged conditions for seven days with ascorbic acid still being added at every change of medium. Submerged bilayered stromal/epithelial substitutes were cultured in DME-Ham's, supplemented with 5% NCS, epithelial additives and antibiotics. Two substitutes per combination were processed for histological and labelling analyses at this time point, while the others were further cultured as follows.

The reconstructed bilayered stromal/epithelial substitutes were then placed on a plastic support allowing the stromal compartment to remain in contact with the culture medium while the epithelial compartment was exposed to air. Culture at the air-liquid interface is recognised to induce highly physiological skin epithelial differentiation (Pruniéras et al., 1983; Font et al., 1994; Larouche et al., 2009). Bilayered stromal/epithelial substitutes at the air-liquid interface were cultured in the same medium without EGF.

3.5.3 Population Doubling Calculations

The number of population doublings obtained at the end of each subculture was calculated with the formula x = 3.32 x (logN - logN0), where N is the number of cells obtained at the end of the subculture, and N0 is the number of viable cells originally seeded (viability being determined by the exclusion of trypan blue dye). Average doubling times were calculated by dividing the number of hours of subculture by the population doublings attained during this time. Data is represented as mean +/- SEM. For statistical comparisons, a one-way ANOVA was performed with a Dunnett’s post-test, using GraphPad Prism4 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, U.S.A.). The confidence interval was set at 95% (p < 0.05).

3.5.4 Histological Analysis and Immunofluorescence Labelling

Samples from two different constructs of each combination were taken on days 0 (immerged), 7 and 21 of culture at the air-liquid interface. A portion of each sample was fixed in Bouin's solution (ACP, St. Léonard, Canada) and embedded in paraffin. Cross- sections were mounted on slides and coloured with Masson's trichrome staining. Photographs were taken by an AxioCam ICc1 camera mounted on a Zeiss Imager M2. The thickness of the epithelial and stromal compartments was determined on histological sections using the ImageJ software (NIH) for all combinations at days 0, 7 and 21, using a

115 minimum of 18 measurements per construct for each experimental condition. Data is represented as mean +/- SEM. Significance was determined after a one-way ANOVA followed by a Tukey post-test.

Other sample portions were quick-frozen in OCT compound (Tissue-Tek, U.S.A.) and conserved at -80°C until they were cut by microtome (JUNG RM2035, Leica) into 5 µm cross-sections which were placed on glass slides for immunofluorescence staining. After fixation in acetone, indirect immunofluorescence assays were performed as previously described (Germain et al., 1988) on the reconstructed tissue cross-sections as well as on sections of whole umbilical cord, cornea and normal human skin as reference tissues. Cell nuclei were subsequently labelled with Hoechst reagent (50 µg/mL, used at 1:100; Sigma) and the samples examined under a Nikon Eclipse microscope and photographed with Kodak Tmax 400 ASA film or a Photometrics Sensys CCD camera. Film images with excessive background were adjusted using the gamma function in Photoshop.

The antibodies used include mouse monoclonal antibodies against human α-smooth muscle actin (DAKO); involucrin, keratins (K) 10 and 14 (all Sigma); type III and VII collagens and laminin 5 subunit α2 (Chemicon); filaggrin and transglutaminase (BTI); K12 and vimentin (ICN); K18 and K19 (ARP); rabbit antibodies against type I collagen (Biodesign); type IV collagen (Chemicon); and K16 (gift of Dr. P. Coulombe - Bernot et al., 2002). Secondary antibodies were TRITC-coupled goat anti-mouse and TRITC-coupled goat anti- rabbit (Chemicon). Negative controls were performed by omission of the primary antibodies.

3.5.5 Electron Microscopy

Specimens were prepared for electron microscopy by fixation in 2.5% glutaraldehyde. They were then washed with 0.2 M cacodylate buffer, postfixed with 2% OsO4 for 30 min, and embedded in LR White. Thin sections stained with uranyl acetate and lead citrate were observed with a JEOL 1230 transmission electron microscope.

116

3.6 Results

3.6.1 Cell Differentiation within the Substitute’s Epithelial Compartment is Influenced by Cell Origin

The reference substitute comprising human keratinocytes seeded on dermal fibroblast sheets formed the typical skin substitute extensively characterised in our previous work (Michel et al., 1999; Trottier et al., 2008; Lavoie et al., 2013). It features a well-developed epithelium displaying all the characteristic layers indicative of keratinocyte differentiation (Figure 3-1 A-C). After seven days of culture in submerged conditions, the keratinocytes formed one to two layers (Figure 3-1 A). However, after only seven days of culture at the air-liquid interface, the stratified epithelium consisted of seven or more layers due to proliferation of the epithelial cells, with an abundance of desmosome-like structures visible at the cell junctions under light microscopy (Figure 3-1 B). The basal cells were cuboidal in shape, with cells becoming increasingly flattened nearer the upper surface. Granules were visible in the uppermost cells just under the thin layer of cornified, flat squames at the surface. A similar structure was observed for the equivalents at day 21, except that the nucleated epithelial layers were somewhat thinner, and there were many more layers of cornified cells at the upper surface of the substitutes (Figure 3-1 C).

Human keratinocytes seeded on WJC (WJC / K substitutes) formed an average of two epithelial layers by day seven of submerged culture (Figure 3-1 D). Interestingly, the epithelium was four times as thick on average at this time point as that of the control substitute (p < 0.001; Figure 3-1 G). Once exposed to the air-liquid interface and cultured for a week, four to five epithelial layers could be observed (Figure 3-1 E). The basal cells were rounded and those closer to the surface flattened. In general the substitutes were well developed, the epithelium tending to be thinner on average than that of the reference skin substitutes at this time point (Figure 3-1 G). After 21 days of exposure at the air-liquid interface the epidermis was thinner, with most regions showing the characteristics of skin- like epithelial differentiation (Figure 3-1 F). The epithelium at this stage averaged 43% of the thickness of the control substitute (p < 0.01, Figure 3-1 G).

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Figure 3-1 Histological appearance of bilayered stromal/epithelial substitutes engineered using keratinocytes and stromal cells from different sources. (A-C) Dermal fibroblasts or (D-F) WJC were used in combination with keratinocytes. Masson’s trichrome staining of tissue cross-sections was performed at different times during tissue reconstruction. Matrix appears in blue while epithelial cells are pink: A, D) after 7 days of immerged culture (day 0 air-liquid culture); (B, E) after 7 days of culture at the air-liquid interface; (C, F) after 21 days of culture at the air-liquid interface. (G) Mean thickness of the epithelial compartment according to the type of stromal compartment. Statistical differences in thickness over time for a particular combination are indicated by the corresponding numbered Greek letters. ∂1 **; ∂2, ∂3 ***; γ1, γ 2 ***; ε1 *; ε2 **. (H) Mean thickness of the corresponding stromal compartments. γ *; ε1 *; ε2 ***. Scale bar: 100 µm. cc – cornified cell layer; white arrow – cell with granules; black arrows – cell-cell junctions with desmosomes. Results are expressed as means +/- SEM; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # - discontinuous epithelium not included in statistical analysis.

118

We next compared the proliferation and differentiation potentials of umbilical cord epithelial cells (ucEpi). All ucEpi populations proliferated well as monolayer cultures after thawing. Two of the three populations used had average doubling times which were longer than that of the reference keratinocytes (p < 0.01, Figure 3-2 G). When seeded on dermal fibroblasts (DF / ucEpi), ucEpi formed an even layer of cells by day seven of submerged culture (Figure 3-2 A). The thickness of the epithelial layer was comparable to that of the DF / K control (Figure 3-1 G). After seven days at the air-liquid interface, from three to five layers of cells covered the surface of the dermal substitute in most areas (Figure 3-2 B), with the cells being rounded in shape and attached by numerous desmosomes (Figure 3-2 I). The most superficial cells were flattened, but few granules were visible in the putative granular layer (Figure 3-2 B). The average thickness of the epithelium at day 7 was 34% of the DF / K average epithelial thickness (p < 0.001, Figure 3-1 G). After 21 days at the air-liquid interface, some five to six layers of epithelial cells covered the well-organised dermis; in some places there were up to ten layers. The basal cells were rounded or cuboidal, and the upper layers of cells were generally much flattened (Figure 3-2 C). There were some regions of desquamation, and there seemed to be granules present in isolated cells of the uppermost layer. There was no significant difference in the average epithelial thickness as compared to the DF / K combination (Figure 3-1 G). However, there was a noticeable variation in the appearance of the epithelial compartments produced by the individual ucEpi populations. The population whose mean doubling time in culture was similar to that of the control K formed a substitute whose histological appearance closely resembled that of the reference DF / K substitute. The populations whose mean doubling times were significantly longer formed substitutes which showed regions of the upper epithelium where the surface was no longer flat but indented with detaching clumps of cells (not shown).

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Figure 3-2 Histological appearance of bilayered stromal/epithelial substitutes engineered using umbilical cord epithelial cells and stromal cells from different sources. (A-C) Dermal fibroblasts or (D-F) WJC were used in combination with ucEpi. Masson’s trichrome staining of tissue cross-sections was performed at different times during tissue reconstruction: A, D) after 7 days of immerged culture (day 0 air-liquid culture); (B, E) after 7 days of culture at the air-liquid interface; (C, F) after 21 days of culture at the air-liquid interface. (G) Mean population doubling times for thawed and cultured keratinocytes and UC epithelial cells. (H) Mean population doubling times for thawed and cultured dermal fibroblasts and WJC. (I) Electron micrograph of desmosomes (white arrow) between epithelial cells in DF / ucEpi substitute. Scale bar A-F: 100 µm. Scale bar I: 1 µm. Results are expressed as means +/- SEM; * p < 0.05, ** p < 0.01.

The “native” combination of umbilical cord epithelial cells seeded on WJC from different umbilical cords (WJC / ucEpi) formed substitutes presenting uniform epithelia of two cell layers in submerged culture conditions, with rounded basal cells and somewhat flattened upper cells (Figure 3-2 D). This epithelial layer, as with the WJC / K substitute, was significantly thicker than either of the epidermal compartments on DF stroma (p < 0.001, Figure 3-1 G). However, by day seven of air-liquid culture, the epithelial cells were greatly

120

reduced in number to the point of no longer covering the entire surface of the substitute (Figure 3-2 E). There was a progressive deterioration in the condition of the substitutes from the time they were placed at the air-liquid interface. By day 21 the epithelial cells had almost disappeared from the substitute, with only scattered small clusters of cells clinging to the much-weakened stromal portion (Figure 3-2 F). The latter underwent drastic remodelling under those culture conditions, which clearly reduced its thickness (Figure 3-2 E-F and Figure 3-1 H, p < 0.05 between days 0 and 21). Thus the substitutes combining only umbilical cord cells failed to thrive in other than their native-like submerged conditions.

3.6.2 Detailed Evaluation of Keratinocyte-like Differentiation in the Epithelial Compartment

In order to provide a more specific description of the extent of epithelial differentiation achieved by each type of substitute, immunofluorescence staining was carried out on samples of substitutes cultured for 0, 7 and 21 days in air-liquid conditions. A summary of the results is presented in Table 3-2. The immunofluorescence staining results for the reference DF / K substitute after 21 days of culture at the air-liquid interface were similar to those obtained in our previous studies (Michel et al., 1999; Trottier et al., 2008); all keratinocyte layers expressed K14, with basal cells containing K19, while the upper layers were uniformly labelled for K10, filaggrin, involucrin and transglutaminase (Table 3-2). The WJC / K substitute gave similar results to the DF / K substitute at day 7 (Figure 3-3 A- D), showing K14 in all epithelial layers and K10 in suprabasal keratinocytes only (Figure 3-3 A and B), with strong staining for involucrin (Figure 3-3 C) and slightly weaker staining for transglutaminase (Figure 3-3 D) and filaggrin (not shown) in the uppermost cell layers. At day 21, the same indicators of differentiation were present (Table 3-2), but the epithelial compartment featured fewer layers of cells than at day 7 (Figure 3-1 E, F, G; p < 0.01 between days 7 and 21).

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Figure 3-3 Evaluation of the epithelial differentiation of bilayered stromal/epithelial substitutes after 7 days of culture at the air-liquid interface. (A-D) WJC / K and (E-H) DF / ucEpi substitutes were analysed for protein expression with fluorescence- coupled antibodies specific for (A, E) K14; (B, F) K10; (C, G) involucrin and (D, H) transglutaminase in red. Hoechst staining of the nuclei is in blue. Arrowheads indicate the position of the basement membrane. Scale bar: 100 µm.

The DF / ucEpi substitute showed remarkably similar development to that of the reference skin substitute insofar as markers of differentiation (Figure 3-3 E-H). The epithelium was positive for K14 in all layers, with K10 appearing in all but the basal cells by day 7 (Figure 3-3 F), along with involucrin in the upper layers and well-defined transglutaminase staining in the granular layer (Figure 3-3 G and H, respectively). The same pattern was evident at day 21 (Table 3-2). The most notable difference was the ubiquitous presence of K18 and K19 in all ucEpi cells (Table 3-2), which is consistent with the nature of ucEpi and with previously reported results (Mizoguchi et al., 2000; Hayward et al., 2013). Similarly, K12 expression was maintained in the epithelial compartment of the substitutes that contained umbilical cord cells (Table 3-2). This keratin, which is typical of the corneal epithelium, is also expressed in culture by ucEpi (Hayward et al., 2013). K16 was found to be present in three of the combinations to a certain degree (Table 3-2).

The least developed of the substitutes under air-liquid conditions, WJC / ucEpi, contained cells from only the umbilical cord; after only 7 days of exposure to air it was quite fragile in physical appearance with little epithelium (Figure 3-2 E), and showed none of the signs of advanced differentiation such as flattened cells and granules, nor even a sustained presence of K10 (not shown).

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Table 3-2 Immunofluorescence Staining Results for Skin Substitutes After 21 Days of Culture at the Air-Liquid Interface

Marker DF / K DF / ucEpi WJC / K Layer of substitute: Stroma Epi Stroma Epi Stroma Epi Keratin 10 - sb - sb - sb Keratin 12 - - - + - - Keratin 14 - ++ - ++ - ++ Keratin 16 - sb - sb+ - + Keratin 18 - - - ++ + +/- Keratin 19 - bc+ - ++ +/- + Type I Collagen ++ - ++ - ++ - Type III Collagen ++ - ++ - ++ - Type IV Collagen + bm ++ bm ++ bm Type VII Collagen - bm - bm, bc - bm Laminin 5 +/- bm +/- bm, bc +/- bm α-sm actin - - - - ++ - Fibronectin ++ - ++ - ++ - Filaggrin - sg - sg+ - sg+ Involucrin - sb - sb - sb Transglutaminase - sg - sg - sg

Epi : epidermal layer of substitute Stroma : stromal layer of substitute - : not present +/- : very faint or very few cells + : present in parts of layer or region ++ : present everywhere in layer or region bm : present in basement membrane bc : present in basal cells sb : present suprabasally sg : present in stratum granulosum

3.6.3 Impact of the Cell Source on the Resulting Stromal Compartment

The stromal portion of the substitutes was produced using the self-assembly method of tissue engineering whereby the cultured stromal cells produce their own extracellular matrix material to form sheets which can then be superposed to create thicker constructs (Auger et al., 2004; Paquet et al., 2010). Upon the seeding of epithelial cells on the surface of the stromal compartments, remodelling of the stroma occurs, which is mediated by keratinocyte-secreted factors (reviewed in Nelson et Bissell, 2006).

123 The human dermal fibroblasts formed sturdy, easily handled sheets, with no significant contraction before or after the detachment of the sheets from the flask. The two-layered stromal compartment showed a fairly even distribution of cells throughout the abundant matrix after 7 days of submerged culture (Figures 3-1 A and 3-2 A). At day 0 the average thickness of the DF stroma was significantly greater in the presence of ucEpi than in that of keratinocytes, by 71% (p < 0.05, Figure 3-1 H); the same tendency could be seen at days 7 and 21 of air-liquid culture.

After thawing, WJC populations had comparable doubling times in monolayer culture to the reference DF population (Figure 3-2 H). The WJC also formed easily manipulable sheets even after only 14 days of culture with ascorbic acid-supplemented medium. They were easily lifted with forceps without tearing. The stromal compartments derived from these cells differed noticeably in structure from those produced from dermal fibroblasts. For the most part, the WJC maintained their position between and under layers of the matrix material even after the 21 days of air-liquid incubation, and relatively few cells were found within the matrix layer. Thus the two superimposed stromal sheets were clearly distinguishable in histological samples at all time points, although adhered together, and formed a dermal compartment that did not seem to be as greatly affected by remodelling under the influence of keratinocytes insofar as cell distribution (Figures 3-1 D-F and 3-2 D- F), but the dermal thickness decreased over time (Figure 3-1 H, p < 0.05 for days 0-21). In combination with keratinocytes in air-liquid conditions, the average WJC stromal thickness was not significantly different from that of the DF / K substitutes (Figure 3-1 H) except for at day 0, where the WJC stroma was almost twice as thick on average as the DF stroma (p < 0.01).

124

3.6.4 Stromal Compartment Characterisation and Basement Membrane Formation

The stromal compartment of all substitutes was uniformly positive for type I and III collagens (Figure 3-4 A-B and I-J; summarised in Table 3-2), as well as for fibronectin (Figure 3-4 C, K). The most striking difference in protein expression was found with alpha- smooth muscle actin, expression of which was detected in the WJC but not in the dermal fibroblasts (Figure 3-4 D, L), as in the native tissues (Hayward et al., 2013). The presence of a well-developed basement membrane is suggested by the detection of laminin 5 (Figure 3-4 E, M; Table 3-2) as well as collagen types IV (Table 3-2) and VII (Figure 3-4 G, O; Table 3-2) in all types of substitutes but WJC / ucEpi (not shown).

Electron microscopy of DF / K, WJC / K, and DF / ucEpi substitutes confirmed the presence of a basement membrane comprising both a lamina densa and a lamina lucida as early as day 7 of air-liquid culture (black arrows, Figure 3-4 F, N), which was close to completely continuous by day 21 (Figure 3-4 H, P). The basement membrane was most complete in the reference DF / K skin substitute (not shown), and somewhat less continuous in the other two. Hemi-desmosomes attaching the epidermal layer to the underlying extracellular matrix could also be seen (white arrows in Figure 3-4 F, N).

125

Figure 3-4 Expression profile of important components of the stromal compartment and basement membrane of bilayered stromal/epithelial substitutes. Analyses were done at day 7 (A-F, I-N) and day 21 (G, H, O, P) of air-liquid interface culture. (A-H) WJC / K and (I-P) DF / ucEpi substitutes were stained with fluorescence-coupled antibodies specific for (A, I) type I collagen; (B, J) type III collagen; (C, K) fibronectin; (D, L) alpha-smooth muscle actin; (E, M) laminin 5; and (G, O) type VII collagen in red. Hoechst staining of the nuclei is in blue; white arrowheads indicate the position of the basement membrane. (F, N) Electron micrographs of the epithelial-stromal junction reveal the basement membrane (black arrows) and hemidesmosomes (white arrows). Scale bars: (A-E, G, I-M, O) 100 µm; (F, N) 0.5 µm; (H, P) 1 µm.

For the WJC / ucEpi combination, the submerged substitute was further investigated at the ultrastructural level by means of transmission electron microscopy. A well-structured, mostly bilayered epithelium can be seen in Figure 3-5 A, with rounded basal cells and flattened superficial cells that display microvilli at the upper surface (Figure 3-5 B). Abundant desmosomes attaching the epithelial cells together were visible (Figure 3-5 A-B, white arrows), along with bundles of keratin filaments (white asterisk). A discontinuous basement membrane was apparent, underlying the basal epithelial cells (Figure 3-5 C), with

126

regions featuring a distinct lamina lucida and lamina densa (black arrow) and electron- dense hemidesmosomes (white arrow). The WJC responsible for synthesising the extracellular matrix contained large quantities of endoplasmic reticulum and numerous mitochondria (thin white arrows, Figure 3-5 D). The abundant extracellular matrix contained masses of collagen fibrils (ecm, Figure 3-5 A; greater magnification of collagen fibres in E). The epithelium shown in Figure 3-5 is similar to that of native umbilical cord epithelia, as can be seen in Hoyes (1969).

Figure 3-5 Ultrastructural analysis of the WJC / ucEpi substitute after 7 days of immerged culture conditions. (A) Transmission electron micrographs show the full thickness of the epithelium and part of the stroma. (B) Details of the epithelial surface layer are shown, including microvilli, bundles of keratin filaments, mitochondria and desmosomes. (C) Electron-dense hemidesmosomes appear along the basement membrane, and (D) abundant endoplasmic reticulum and mitochondria are evident in the cytoplasm of the stromal cells. (E) Masses of collagen fibrils compose the extracellular matrix of the stromal compartment of the substitutes. Scale bars: (A) 4 µm; (B, C) 0.5 µm; (D, E) 1 µm. ecm – extracellular matrix; epi – epithelial cell; f – fibroblastic cell; g – Golgi body; n – nucleus; wide black arrow – basement membrane; wide white arrow – desmosomes (A), hemidesmosomes (C); thin white arrow – mitochondria; white * - keratin bundles.

127 3.7 Discussion

It is well known that epithelial-mesenchymal interactions are of the utmost importance for tissue homeostasis (McLoughlin, 1963; Boukamp et al., 1990). This has been demonstrated in previous tissue engineering studies, notably in the reconstruction of the human cornea for which the cell source is a determining factor for the transparency of the resulting tissue (Carrier et al., 2009). However, other studies show that in some cases, other stromal cell types can be substituted during tissue reconstruction without deleterious effects, as seen for skin substitutes prepared with adipose-derived stem/stromal cells instead of dermal fibroblasts (Trottier et al., 2008). In the present study, tissue reconstruction based on methods developed for skin substitute engineering proved to be an interesting approach for examining the differentiation of the epithelial cells of the umbilical cord. Their potential was best seen in the context of a dermal fibroblast-based stromal compartment, where they exhibited the markers of differentiation typical of keratinocytes as in the reference skin substitute. These included a multilayered keratinised epithelium with increasingly flattened cells near the surface, and the sustained suprabasal presence of K10, involucrin, transglutaminase and filaggrin. The development of a cornified layer was absent in the epithelial compartment, although some desquamation was evident. The basement membrane markers were well developed, with a sustained presence of laminin 5 and type IV and VII collagens along the dermo-epidermal junction. We were also able to verify the ultrastructure of the basement membrane by electron microscopy, confirming the presence of hemidesmosomes anchoring the basal epithelial cells to the stroma, and of both a lamina lucida and a lamina densa as early as day 7 of air-liquid culture. The continuity and maturity of the complete basement membrane increased with time in culture. This is in contrast to previous studies (Mizoguchi et al., 2004; Huang et al., 2011a) in which ucEpi were seeded on fibroblast-populated collagen gels, and where only intermittent type IV collagen and little to no type VII collagen were noted in the basement membrane after ten days of exposure to air. The former study found no ultrastructural evidence of basement membrane components; only by transplanting the substitutes to athymic mice were the investigators able to observe complete basement membrane structures (Sanmano et al., 2005). The very physiological nature of the self-assembled dermal compartments of our

128

substitutes is likely a contributing factor to the proper development of the basement membrane in vitro (Lavoie et al., 2013).

The connective tissues forming native skin and umbilical cord are dense, with stromal cells distributed throughout the matrix, and the dermal substitutes formed from dermal fibroblasts reproduced this pattern. The stromal cells of the Wharton's jelly, however, could not always be maintained in culture with ascorbic acid for the intended 28 days of tissue production, as they eventually retracted into a small wad after a certain time of culture, which ranged from 10 to 30 days depending on the cell population used. This is likely due to the ubiquitous presence of α-smooth muscle actin in the WJC populations, which may play a role in the contraction of the umbilical cord blood vessels in vivo (Takechi et al., 1993). Extended sheets of WJC were easily lifted, and once detached from the culture flasks and placed in submerged culture as dermal substitutes, these sheets remained stable and showed no further excessively contractile tendencies. Most unexpectedly, though, the stromal cells did not redistribute themselves throughout the matrix they had produced, but mostly remained clustered in distinct and separate layers, each underlying its band of collagen-rich matrix material. A similar result was obtained with a reconstructed adventitia made from sheets of WJC (unpublished results, see also L'Heureux et al., 1998).

Virtually all the basal cells of the reference DF / K substitute contained K19, due to the fact that newborn foreskin keratinocytes were used, which have a much higher percentage of K19-positive epithelial-stem-cell-like cells than do the keratinocytes of adult skin (Michel et al., 1996). We chose newborn keratinocytes for this experiment as being closest in gestational age to the cells of the full-term umbilical cord, and their similarity has been documented in previous publications (Ng et al., 2008; Ruetze et al., 2008). The umbilical cord epithelial cells were consistently positive for K19 in all layers of the substitutes, as well as for K12 and K13, as they are in vivo (Hayward et al., 2013).

Keratinocytes seeded on WJC dermal substitutes showed progress towards epithelial differentiation at day 7, and at day 21 most areas of these substitutes had a relatively thin stratified and differentiated epithelium with flattened, desquamating superficial cells. The basement membrane components were also present in these substitutes, although with less

129 complete coverage than in the reference DF / K substitute, demonstrating that WJC can function as a dermal substrate for skin-like differentiation where keratinocytes are concerned. Cord epithelial cells, however, developed similar skin-like differentiation patterns only when cultured on DF dermal substitutes; air exposure alone was not sufficient to promote such differentiation when only UC-derived cell types were included in the substitutes. In contrast, under submerged conditions both cord epithelial cells and keratinocytes formed thicker, more even layers on the WJC than on dermal fibroblasts. Thus, it would seem evident that both substrate (cell source and matrix) and environment (air exposure) play a role in the differentiation of a skin-like epithelium.

It is clear that not all combinations of cells would lead to the production of a human substitute suitable for grafting in a skin replacement setting. The properties shown by umbilical cord cell-containing substitutes in submerged conditions would be more effective as a replacement for mucosal tissues in a moist environment, where these cells thrive. The WJC form a supportive stroma in these conditions, where even after only 7 days of co- culture hemidesmosomes have formed along the epidermal-stromal interface.

In conclusion, these results support the premise that the tissue from which cells originate can greatly affect the properties and homeostasis of reconstructed substitutes featuring both an epithelial and a stromal compartment. The epithelial cells of the umbilical cord demonstrate an ability to adopt a multi-stratified, keratinised differentiated state when placed in adequate conditions and in the presence of stimuli from dermal fibroblasts. However, in combination with WJC, these cells produce a non-keratinised epithelium, which is unable to sustain exposure to air. In contrast, keratinocytes cultured on WJC are able to differentiate as they do on dermal fibroblasts, with a slightly diminished response. Thus, by varying the combinations of cell sources and culture conditions, substitutes featuring different degrees of epithelial differentiation could be produced, ranging from stratified, keratinised skin substitutes to replacements for epithelia in internal, moist environments.

130

3.8 Acknowledgements

The authors would like to thank Kathleen Baker, Eric Grandbois, Cindy Perron, Véronique Racine, Israël Martel and Sophie Roberge for their technical expertise, Claude Marin for his photographic assistance, Richard Janvier and the electron microscope facility staff at Laval University for sample preparation and their courteous advice for taking the micrographs, and Dan Lacroix for critical reading and constructive suggestions during the preparation of the manuscript. This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant # MOP-14364 to FAA, Les Fonds de la Recherche du Québec - Santé (FRQS) and La Fondation des Pompiers du Québec pour les Grands Brûlés (FAA), the Réseau Thécell du FRQS, and in part by the CIHR grant #111233 to JF. CJH was the recipient of a scholarship from the National Science and Engineering Research Council. PMM is the recipient of a CIHR scholarship. JF is an FRQS Junior 2 Career Award scholar.

131 3.9 References

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4 Discussion générale

Le cordon ombilical humain est un tissu qui devient superflu après la naissance de l’enfant pour qui il a servi de source de vie pendant les mois de la grossesse. Aujourd’hui, il voit son importance passer d’un tissu inutile post-partum à une précieuse source de tissu et de sang, et son utilité devient de plus en plus manifeste pour diverses applications en recherche qui se basent sur l’utilisation de ses cellules. Le cordon ombilical est en effet une source de multiples types cellulaires faciles à obtenir sans besoin de biopsie, sans conflit d’ordre éthique et généralement exempt d’agents pathogènes et de maladies. Le volume de tissu disponible est souvent plus grand que celui obtenu par une biopsie chez l’adulte, et les cellules souches sont rendues plus accessibles par ce fait. La congélation de ces cellules se fait de façon routinière, depuis quelques décennies déjà pour certains types cellulaires (Ballen et al., 1989; Broxmeyer et al., 1989), ce qui permet de maintenir une banque de cellules déjà identifiées par type immunitaire. L'utilisation des cellules du cordon ombilical évite aussi le développement de tératomes qui peut se produire avec les cellules souches embryonnaires.

Pour la réparation ou le remplacement des tissus et organes lésés ou malades, l’idéal est la greffe autologue. Celle-ci n’est pas toujours possible pour diverses raisons incluant le manque de cellules saines disponibles, une quantité insuffisante de cellules souches ou prolifératrices, et l'incapacité des cellules obtenues de proliférer suffisamment pour combler les besoins en tissu. Il faut alors avoir recours à d’autres sources de cellules aptes à l’utilisation visée. La greffe de tissus entiers allogéniques comporte la complication de l’immunosuppression à vie qui est nécessaire afin de prévenir le rejet de l’organe greffé. Les greffes de moelle osseuse doivent être strictement appariées au niveau des codes CMH pour réduire les possibilités de rejet ou de GvHD, ce qui n’est pas toujours facile pour des ethnies minoritaires et des groupes sanguins peu communs. Certaines des cellules du cordon ombilical sembleraient montrer un avantage de ce côté, les cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon n’ayant pas à être appariées aussi strictement, et les cellules souches mésenchymateuses et épithéliales se montrant immunosuppressives dans des études préliminaires (Laughlin et al., 2004; Huang et al., 2011a; Wang et al., 2011,

135 entre autres). Plusieurs équipes de recherche sont présentement en train d’élucider le possible statut immunoprivilégié de ces cellules.

L’objectif principal de cette thèse était d’examiner l’utilisation en génie tissulaire des cellules du cordon ombilical, en particulier des cellules épithéliales et stromales dans un modèle de peau reconstruite pour comparer les caractéristiques des tissus ainsi produits avec celles des tissus faits avec des cellules de la peau. L’étape fondamentale dans la poursuite de ce but était d’établir un protocole efficace pour l’extraction des types cellulaires du cordon ombilical, et de regarder de plus près les caractéristiques les cellules épithéliales et stromales, y compris les capacités de différenciation mésenchymateuse de ces dernières. L’originalité des travaux rapportés dans cette thèse réside tant dans le protocole d’extraction visant quatre types cellulaires à la fois, que dans les substituts de peaux reconstruites en utilisant des combinaisons de cellules provenant de différentes sources, permettant l’étude des effets non seulement des conditions de culture mais aussi l’apport de l’origine cellulaire. Les résultats obtenus ouvrent la voie à de futures études et perspectives qui seront abordées brièvement dans les sections suivantes.

4.1 Extraction des cellules du cordon ombilical humain

Les organes du corps sont composés de multiples types cellulaires, souvent spécialisés pour la tâche particulière à accomplir. Idéalement on vise à reproduire la structure et la fonction des tissus dans les organes reconstruits par génie tissulaire, mais il n’est pas toujours évident que d’extraire tous les types cellulaires voulus d’un seul échantillon de tissu afin de reconstituer une structure in vitro. Et même si on peut réussir à extraire et à séparer les différentes sortes de cellules, les quantités obtenues pourraient ne pas suffire, et certaines cellules différenciées ne prolifèrent pas facilement en culture. De ce point de vue, nous avons montré que le cordon ombilical offre plusieurs avantages comme une source de plusieurs types cellulaires qui sont assez abondants pour une mise en culture efficace. Déjà les quatre types cellulaires du tissu solide – les cellules épithéliales, stromales, musculaires lisses et endothéliales – permettent diverses combinaisons pour la reconstruction de tissus spécifiques. Et bien entendu, les interactions entre les différents types cellulaires sont essentielles pour la maturation et la différenciation des cellules dans l’organe reconstruit tout comme dans le corps. Lorsqu’on ajoute à ceci la capacité de différenciation des

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cellules mésenchymateuses progénitrices situées dans la gelée de Wharton, les possibilités pour la reconstruction tissulaire s’amplifient en conséquence (revu dans Wang et al., 2004; Can et Karahuseyinoglu, 2007; Troyer et Weiss, 2008). La majorité de tissus à reconstruire n’auront pas besoin de tous les types cellulaires contenus dans le cordon ombilical en même temps, mais comme ces cellules se congèlent bien et restent viables longtemps si conservées dans les conditions optimales, elles peuvent facilement être mises en banque pour une utilisation ultérieure.

L’utilisation du cordon ombilical comme source de cellules pour une application en clinique impliquerait le besoin d’introduire et de respecter les bonnes pratiques de fabrication, ce qui mènerait à la prise d’échantillons pour vérifier l’absence de tout agent pathogène, et à la manipulation du cordon dans des conditions aussi stériles que possible, tout comme les échantillons de peau destinés à la production des greffes épidermiques. L’élément le plus difficile pourrait bien être celui de nettoyer l’extérieur du cordon sans toutefois endommager les cellules épithéliales. Dans cette optique il est primordial que le cordon soit maintenu dans un milieu stérile contenant du calcium dès son prélèvement. Des changements dans les milieux de culture seraient aussi nécessaires pour éliminer le sérum bovin; de plus en plus de milieux définis sont disponibles et il serait avisé de faire des essais pour chaque type cellulaire afin de cibler les milieux les plus avantageux. Il serait aussi souhaitable de réduire au minimum la manipulation du cordon et des cellules, y compris le nombre de passages effectués pour avoir assez de cellules pour la fin visée.

L’extraction de plusieurs types cellulaires en même temps d’un seul échantillon de tissu s’avère un défi d’organisation et de planification. En plus de maximiser le rendement en quantité et qualité de cellules à chaque étape, il faut également éviter le dommage aux autres parties du tissu dans lesquelles les cellules restent à extraire. La procédure d’extraction présentée combine pour la première fois quatre étapes spécifiques qui, dans l’ordre approprié, permettent d’extraire et de mettre en culture les quatre types cellulaires du tissu solide du cordon ombilical.

Pour les fins du brevet obtenu, trois combinaisons de protocoles d’extraction retenues furent pratiquées à partir d’un même morceau de cordon. Ces combinaisons comprenaient, en plus des techniques déjà décrites dans les chapitres précédents, le grattage des cellules

137 endothéliales et la digestion de la média avec la collagénase pour obtenir les cellules musculaires lisses. L’extraction en série des types cellulaires du cordon en un seul morceau prenait plus de temps que l’extraction pratiquée sur un cordon divisé en deux parties, qui permettait d’entreprendre la récupération des cellules stromales et musculaires lisses pendant les périodes d’incubation avec les enzymes. Cela était avantageux car les cellules étaient mises en culture plus rapidement et souffraient moins longtemps d’un possible manque d’oxygène. En général, les techniques de grattage et de digestion (CML et CGW) semblaient donner un rendement de cellules inférieur à celui obtenu par la perfusion avec thermolysine et par les explants, et le temps de latence avant la prolifération des cellules semblait plus long. Une étude comparative a aussi conclut que la méthode des explants était la façon optimale d’extraire les cellules de la gelée de Wharton, avec une différence dans la taille des explants qui étaient de 10 mm, et donc plus grands que dans nos extractions (Hua et al., 2014).

L’utilisation innovatrice de la thermolysine pour l’extraction des cellules endothéliales du cordon ombilical au lieu de la collagénase habituelle permet d’éviter le problème de contamination de la population cellulaire par les cellules musculaires lisses de la média sous-jacente. Déjà employée dans l’extraction des cellules épithéliales et des fibroblastes des biopsies de la peau afin de détacher le derme de l’épiderme avant l’isolement des cellules individuelles (Germain et al., 1993), la thermolysine sépare les couches cellulaires au niveau de la membrane basale en perturbant la structure des hémidesmosomes (Walzer et al., 1989), et en conséquence, ne détache que les cellules endothéliales de la veine ombilicale. L’importance de ceci provient du fait que, en condition de culture cellulaire, les cellules musculaires lisses tendent à proliférer plus rapidement que les cellules endothéliales, et ainsi répriment la croissance de ces dernières. La séparation de deux types cellulaires une fois cultivés in vitro est rarement facile, et même un traitement différentiel à la trypsine pour détacher les cellules endothéliales, qui sont plus sensibles à cette enzyme, n’exclura pas nécessairement toutes les cellules musculaires lisses présentes dans la culture. Pour cette raison, l’emploi de la thermolysine est très utile pour l’obtention de populations homogènes.

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L’extraction des cellules musculaires lisses, déjà pratiquée depuis longtemps (Ross, 1971), ne pose généralement pas de défis particuliers car les cellules sont abondantes dans la média et elles prolifèrent bien en culture, sans besoin de facteurs de croissance additionnels à ceux du sérum. Même si des cellules endothéliales restent sur la surface luminale de la veine lors de l’extraction des cellules musculaires lisses, elles ne survivront pas dans le milieu utilisé pour la culture de ces dernières, et l’homogénéité de la population est vite rétablie.

Les cellules épithéliales, situées dans une mince couche recouvrant la superficie du cordon ombilical, sont à la fois les plus simples à extraire et les plus difficiles à protéger lors de la manipulation du cordon. Très sensibles à la friction mécanique, elles se décollent facilement lorsque frottées. Même les processus de l’accouchement et de la récupération du cordon pour l’utilisation ultérieure suffisent parfois pour détacher une portion de l’épithélium, et l’expulsion forcée du sang de cordon aurait certainement un impact sur l’intégrité de l’épithélium. Puisqu’elles sont aussi exposées à l’environnement, il est important de toujours tenir le cordon immergé dans un milieu qui non seulement les hydrate mais qui soutient leur attachement entre elles-mêmes et à la membrane basale sous- jacente. Cela s’accomplit par l’utilisation d’un milieu de transport contenant du sérum et du calcium, et lors de l’étape initiale de l’extraction des cellules endothéliales, par l’immersion du cordon dans une solution contenant aussi du calcium, et qui maintient les concentrations ioniques propices à la survie des cellules. Le calcium est un élément essentiel aux liens formés entre les cellules par les desmosomes, tel qu’expliqué dans l’introduction, et sa présence dans les milieux utilisés est un facteur important du degré de cohésion des cellules dans le tissu. Ainsi, lors de l’extraction des cellules épithéliales, le cordon est immergé dans une solution de trypsine sans calcium ajouté, et qui en plus contient du EDTA, une molécule qui séquestre les ions Ca2+, entre autres, et facilite la séparation des cellules épithéliales individuelles. La trypsine, une protéase à sérine, hydrolyse certaines liaisons peptidiques et permet alors de couper les liens protéiques qui attachent les cellules entre elles, aux membranes basales et aux surfaces de culture. L’incubation dans la trypsine est divisée en étapes séquentielles afin d’éviter le dommage aux cellules qui pourrait être causé par une exposition prolongée.

139 4.1.1 Caractéristiques des cellules épithéliales du cordon

Les cellules épithéliales du cordon sont très semblables aux kératinocytes en ce qui concerne leur comportement en culture, comme constaté par d’autres équipes (Pelletier et al., 1986; Mizoguchi et al., 2000; Sanmano et al., 2005). À la suite des extractions, les cellules épithéliales en culture primaire formaient des colonies compactes et définies composées de petites cellules prolifératives. Éventuellement, avec la cumulation de passages et de temps en culture, les cellules grossissaient et montraient une prolifération ralentie et des signes de différenciation. La croissance des cellules in vitro est inhibée par le contact entre les cellules (Rheinwald et Green, 1977), et les cultures de cellules à confluence une fois séparées et remises en culture à plus basse densité ne semblaient pas prospérer par la suite. Les cellules épithéliales sont particulièrement susceptibles à cet effet, et celles du cordon ombilical ne font pas exception. Durant nos travaux, les quelques cultures réensemencées après avoir atteintes la confluence cessaient de proliférer et devenaient des cellules larges et différenciées. Parfois les cellules en primoculture montraient déjà ces caractéristiques et ne parvenaient pas à faire plus qu’un passage ou deux. Ces cellules provenaient surtout de cordons ombilicaux qui avaient attendu longtemps avant l’extraction des cellules, jusqu’à 12 heures avant le début du processus. Dans la plupart des extractions que nous avons effectuées, les cellules les plus prolifératives provenaient des cordons traités peu de temps après la naissance. Après ce moment, le cordon n’est plus immergé dans le liquide amniotique, et le flux sanguin a été coupé, alors il n’y a plus d’apport de nutriments ni d’oxygène aux cellules que par le milieu de transport dans lequel le cordon a été placé. Il ne serait donc pas surprenant qu’une dégradation générale du tissu commence à partir de ce moment. De toute façon, il fut possible d’établir des cultures de cellules épithéliales du cordon pour toutes les extractions à une seule exception. Il serait quand même pertinent d’étudier l’effet de ces délais sur la prolifération et le potentiel pour la différenciation, afin de cibler le période de temps optimale pour l’extraction des cellules et de préciser aussi lesquels des quatre types cellulaires sont les plus sensibles à de longues attentes avant la mise en culture. Ceci pourrait se faire en regardant non seulement les niveaux d’apoptose dans les cellules au moment de l’extraction, mais aussi les niveaux des facteurs de transcription impliqués dans le maintien du phénotype prolifératif et dans la différenciation.

140

Le patron d’expression des kératines dans les cellules épithéliales du cordon est intrigant, puisqu’il semble combiner les kératines caractéristiques des épithélia simples avec celles trouvées dans les épithélia stratifiés. Partout dans l’épithélium du cordon ombilical – et dans les cellules en culture - se trouvaient les K8, K18 et K19, comme attendu d’un épithélium simple (Bourne, 1962; Hutton et al., 1998). Ceci se distingue de la peau normale humaine pour laquelle le nombre de cellules contenant la K19 diminue à partir de l’enfance, pour être exprimée seulement dans certaines cellules basales et folliculaires chez l’adulte, notamment par les cellules souches épidermiques (Michel et al., 1996; Fradette et al., 1998). La présence de la K18 est aussi limitée in vivo à certaines cellules dans la peau, y compris les cellules de Merkel (Moll et al., 1984; Fradette et al., 1995; Moll et al., 1995). La présence uniforme de la K19 dans les cellules épithéliales de cordon en culture laisse penser qu’elles pourraient également bénéficier d’un statut moins différencié et même plus polyvalent que les cellules épithéliales de peau adulte, compte tenu des autres kératines que ces cellules expriment.

Les cellules de l’épithélium ombilical expriment aussi les kératines de la peau stratifiée, soit les kératines 5/14 et 1/10. La combinaison K5/K14 se trouve dans toutes les couches de l’épiderme différencié, quoique seulement les cellules prolifératives de la couche basale la produisent, et nous l’avons trouvé partout dans l’épithélium du cordon ombilical ainsi que dans les cellules en culture. La K10, par contre, présente dans tous les kératinocytes suprabasaux, se trouvait dans seulement une portion des cellules épithéliales ombilicales in vivo, surtout dans les cellules plus larges, et dans un faible pourcentage de cellules en culture. Sa présence, néanmoins, suggère une capacité de différenciation semblable à celle des kératinocytes, capacité que nous avons mise à l’épreuve dans nos expériences de peau reconstruite.

À la différence de la peau, les kératines 12, 13 et 16 étaient présentes dans les cellules épithéliales du cordon in vivo et in vitro; des résultats semblables furent obtenus par Mizoguchi et al. (2000) en ce qui concerne les kératines 10, 13, 14 et 18. Notre résultat positif pour la kératine 12 était surprenant du fait qu’elle se trouve normalement au niveau de la cornée de l’oeil (Schermer et al., 1986), étant importante pour la différenciation de la cornée ainsi que pour sa résistance mécanique (Moll et al., 2008). Quant à la K16, son

141 expression survient chez les cellules en hyperprolifération, par exemple lors de la cicatrisation des blessures et de la prolifération des cellules en culture. Sa présence dans les cellules épithéliales in vitro n’est donc pas surprenante. In vivo elle est caractéristique de la gaine externe des poils et du lit des ongles et se retrouve également dans certaines cellules épithéliales lors de la morphogenèse de la peau (Bernot et al., 2002; Coulombe et al., 2004; Larouche et al., 2008). Ce sont les kératinocytes activés, capables de migrer et de proliférer en abondance, qui expriment les K6/16 (Freedberg et al., 2001; Coulombe et al., 2004); le réseau de fibres formé par ces kératines fournirait une structure flexible, apte à ces activités (Bernot et al., 2002). Il est certain que lors de l’embryogenèse et de la croissance du foetus, le cordon ombilical grandit aussi et son recouvrement épithélial doit croître en même temps, ce qui donnerait une raison pour la présence de ces kératines.

Les kératines K4/13 sont typiques de l’épithélium stratifié muqueux (Moll et al., 1982), un tissu qui se trouve dans un milieu humide et qui n’est pas kératinisé au cours de sa différenciation. Tel que discuté dans les sections suivantes, les cellules épithéliales du cordon en culture organotypique avec des cellules stromales de la gelée de Wharton semblaient mieux proliférer dans des conditions submergées que lorsque soulevées à l’interface air-liquide. Lors de nos expériences, le temps de culture s’est limité à seulement sept jours en immersion pour le substitut complet puisque notre but était d’examiner la différenciation en épithélium stratifié et cornifié, ce qui a lieu seulement avec l’exposition à l’air. Il serait très intéressant de suivre l’évolution à plus long terme des différents substituts dans des conditions submergées pour comparer l’effet de cette condition sur les interactions stroma-épithélium avec les résultats obtenus en air-liquide.

4.1.2 Caractéristiques des cellules de la gelée de Wharton

Les cellules de la gelée de Wharton furent aisément cultivées par la méthode des explants, et elles ont proliféré d’une manière constante pendant plusieurs passages, même après avoir été congelées et décongelées. Des cellules fraîchement isolées ont été maintenues jusqu’en P8 sans une diminution significative de leur prolifération, et les cellules décongelées ont atteint le passage 12 sans signes de vieillissement évidents. Les analyses par immunofluorescence des tissus in situ ont montré la synthèse des protéines typiques des cellules fibroblastiques – y compris la fibronectine, plusieurs collagènes, et la vimentine –

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et les mêmes molécules se retrouvèrent in vitro aussi, avec l’exception des collagènes III et VII et du sulfate d’héparane. Ces deux dernières molécules étant des composants de la membrane basale, il n’est pas surprenant qu’elles ne se trouvent pas en monoculture où il n’y a aucune interaction avec les cellules épithéliales.

Dans la littérature, les cellules stromales du cordon ombilical ont été décrites comme des myofibroblastes, des fibroblastes modifiés, des cellules dérivées des péricytes ou des cellules musculaires lisses, surtout à cause de la présence intracellulaire ubiquitaire de l’α- actine musculaire lisse. La présence de cette molécule est en concordance avec le rôle des cellules de la gelée de Wharton dans la contraction du cordon ombilical autour des vaisseaux sanguins, et est aussi caractéristique des myofibroblastes fonctionnels et des cellules souches mésenchymateuses (Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997; Kobayashi et al., 1998; Conget et al., 2001; Farias et al., 2011). En effet, les cellules de la gelée de Wharton contiennent également de la desmine ainsi que de la myosine non musculaire in vivo (Kasper et al., 1988; Takechi et al., 1993) et elles se sont montrées contractiles en culture dans nos expériences, surtout lorsque cultivées en présence d’acide ascorbique pour les périodes de temps nécessaires à la formation de feuillets cellulaires. Nous avons noté la présence de la desmine dans ces cellules in situ et aussi dans un pourcentage réduit des cellules in vitro. Pour les cellules musculaires lisses, l’expression de cette molécule est habituellement perdue en culture avec l’acquisition du phénotype prolifératif. Des études de vasoconstriction dans un modèle de substitut vasculaire auto-assemblé fait de cellules de veine saphène ont déjà montré que l’endothéline déclenche une réponse de contraction tant chez l’adventice que chez la média, et que la nitroprusside sodique induit une vasodilatation (Laflamme et al., 2006). Il serait très intéressant de regarder la réponse des cellules du cordon aux agents vasoconstricteurs dans ce même modèle, étant donné que d’autres chercheurs ont déjà suggéré que ces cellules participent à la régulation du flux sanguin du cordon ombilical (Takechi et al., 1993; Farias et al., 2011).

Loin d’être un type cellulaire fibroblastique (ou myofibroblastique) typique, les cellules de la gelée de Wharton expriment aussi des kératines. Dans notre étude, nous avons remarqué la présence des kératines 12, 16, 18 et 19 dans les cellules tant in situ que in vitro. La présence des K18 et K19 dans le stroma ombilical avaient déjà été rapportée par Bader et

143 al. (1988) et Kasper et al. (1988), et même si ces kératines sont largement distribuées dans les tissus épithéliaux simples du corps, leur expression n’est pas strictement spécifique aux épithélia, ayant lieu dans certaines cellules mésenchymateuses, musculaires et réticulaires, ainsi que chez quelques tumeurs mésenchymateuses (Franke et al., 1978; Huitfeldt et Brandtzaeg, 1985; van Muijen et al., 1987; Kuruc et Franke, 1988; Jahn et Franke, 1989; Knapp et al., 1989; Langbein et al., 1989; Jahn et al., 1993). La co-expression des K8/18 avec d’autres filaments intermédiaires, notamment la vimentine et la desmine, est retrouvée chez certains tissus embryonnaires, tels les cellules mésothéliales, le stroma ombilical et des villi placentaux, et les cellules musculaires de l’intestin, de la langue, du coeur, et des vaisseaux sanguins des poumons, du cordon ombilical et du placenta (van Muijen et al., 1987; Kasper et al., 1988). Chez l’adulte, cette triple expression de filaments intermédiaires est beaucoup moins répandue, se trouvant dans les cellules de certaines lésions prolifératives mésothéliales, et plus rarement chez les cellules mésothéliales normales (van Muijen et al., 1987). La coexpression des kératines 8/18 avec la vimentine est plus fréquente, ayant été documentée chez l’épithélium des canaux rénaux, l’endomètre, les cellules myoépithéliales, les îlots pancréatiques, les cellules folliculaires de la thyroïde, et les cellules mésothéliales, entre autres (résumé dans McGuire et al., 1989; revu dans Moll et al., 2008). Les cellules de la gelée de Wharton se démarquent par leur expression de plusieurs autres kératines en plus des autres filaments intermédiaires, possiblement une indication de leur statut non-différencié car cette coexpression de multiples types de filaments intermédiaires semble être surtout associée aux stades du développement et de la prolifération.

Le tissu conjonctif du cordon ombilical comprend une dense matrice parsemée de cellules stromales. La gelée de Wharton in situ contenait les collagènes I, III, IV, V, VI, et VII d’après nos marquages, ainsi que la laminine 5, l’élastine, et les sulfates de chondroïtine et d’héparane. Nous avons trouvé que l’expression des collagènes I, IV, V et VI, du sulfate d’héparane et de l’élastine était maintenue dans les cellules in vitro. Comme mentionné précédemment, le manque d’expression des éléments propres à la membrane basale, tel le collagène VII et la laminine 5, chez les cellules en culture n’est point surprenant, puisqu’elles ne subissent pas l’influence des autres types cellulaires nécessaires à son développement. Ce qui est curieux est le contraste entre nos résultats et ceux obtenus par

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McElreavey et al. (1991), qui ont trouvé l’expression des collagènes I et III in vitro mais qui ont constaté l’absence de kératines et des collagènes II, IV et V. Il n’est pas clair pourquoi ses résultats diffèrent des nôtres, mais il est bien connu que les conditions de culture, y compris la provenance du sérum utilisé et les additifs, peuvent affecter la synthèse des protéines par les cellules. Nos cellules ont été cultivées dans un milieu Dulbecco’s modified Eagle avec 10% de sérum tandis que McElreavey a employé un milieu McCoy’s 5A avec 20% de sérum, et des expériences spécifiques seraient requises pour déterminer l’influence particulière de ces milieux sur les cellules cultivées.

Il semblerait évident que les cellules de la gelée de Wharton ont une grande capacité pour la synthèse de protéines et pour la production de matrice extracellulaire, ce qui est primordial dans leur fonction de protection de l’apport sanguin chez le foetus. Ces capacités, ainsi que leur potentiel de différenciation mésenchymateuse, font de ces cellules des candidats prometteurs pour la reconstruction tissulaire, ce qui fut un des objectifs atteints dans l’étude des cellules du cordon ombilical. La vitesse de la production de matrice extracellulaire observée dans la production des feuillets dermiques serait un atout dans des situations telles la greffe de peau pour les patients brûlés et la production de valves cardiaques pour les nouveaux-nés atteints de malformations congénitales, où la disponibilité rapide du tissu est primordiale. Il resterait à voir comment la composition particulière de la matrice extracellulaire pourrait être dirigée vers les qualités propices à différents tissus reconstruits, par le moyen de facteurs de croissance ou autres qui auraient une influence sur la synthèse des protéines intégrées dans la matrice, ou par l’application de forces externes qui auraient un effet sur les propriétés mécaniques des tissus.

Afin de confirmer la présence des capacités de différenciation mésenchymateuse chez les cellules stromales extraites, nous les avons soumises à des protocoles d’induction en adipocytes et en ostéoblastes. Les cellules de la gelée de Wharton que nous avons cultivées dans un milieu d’induction adipogénique se sont mises à accumuler des lipides neutres intracellulaires, tel qu’attendu dans une voie de différenciation en adipocyte. Elles ont également été induites à se différencier en ostéoblastes, et à produire une matrice extracellulaire minéralisée. Le processus de différenciation est très sensible aux éléments du milieu utilisé – plusieurs sérums furent comparés pour leur capacité à appuyer les

145 inductions visées. La composition des sérums de veau varie d’un lot à l’autre, et ils ne sont pas tous aptes pour l’utilisation dans ce type d’expérience. Il y avait aussi une variation dans la réponse des différentes populations cellulaires (cellules extraites de différents cordons) aux milieux d’induction, ce qui est évident dans l’expérience d’induction ostéogénique où la quantité de matrice minéralisée déposée par une des populations cellulaires était très faible comparée aux autres populations. Toutefois, nos résultats s’alignent avec ceux rapportés par d’autres équipes (Wang et al., 2004; Sarugaser et al., 2005; Zhang et al., 2009), montrant la multipotence des cellules stromales du cordon ombilical. Il est vrai qu’une étude fonctionnelle plus poussée comprenant l’expansion clonale et les essais de différenciation de ces populations par la suite serait nécessaire pour confirmer la multipotence des cellules individuelles. En même temps, ce serait une bonne occasion pour déterminer l’efficacité clonale des cellules extraites et pour les comparer en parallèle avec une autre source de cellules souches mésenchymateuses, telles les cellules stromales dérivées du tissu adipeux. Selon les résultats rapportés dans la littérature scientifique, les cellules stromales du cordon seraient plus prolifératives que les CSM de la moelle osseuse, et elles auraient un avantage quant à l’efficacité de la différenciation en chondrocytes et en adipocytes comparativement aux cellules de la moelle osseuse, qui, elles, auraient une préférence vers la différenciation ostéoblastique (Majore et al., 2011).

4.2 Reconstruction tissulaire

4.2.1 Caractéristiques des substituts de peau reconstruite

Les cellules qui composent la majorité de la peau, soit les kératinocytes et les fibroblastes, ont été étudiées depuis longtemps in vitro afin d'analyser la physiologie, la formation et la réparation de la peau. Ces recherches ont apporté d'importants progrès dans la compréhension de la croissance, la structure et la différenciation de ces cellules, mais le comportement des cellules sur les surfaces en plastique des flacons et pétris de culture peut être très différent de celui des cellules in situ (revu dans Breitkreutz et al., 2013). Les limites de ces études deviennent évidentes lorsqu'on voudrait regarder de plus près les interactions entre le derme et l’épiderme qui ont lieu in vivo, souvent par l'entremise de la matrice extracellulaire et de la membrane basale. Évidemment, dans des monocultures sur plastique, la membrane basale ne se formera pas et la quantité de matrice extracellulaire

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produite est souvent minimale. Les co-cultures en trois dimensions permettent de reproduire plus fidèlement les conditions éprouvées par les cellules dans leur milieu naturel, et ainsi d’étudier de plus près ces interactions.

Il est bien connu que l’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est d’une importance primordiale dans l’homéostasie du tissu (McLoughlin, 1963; Boukamp et al., 1990). Les interactions paracrines entre les types cellulaires sont responsables pour le développement d’un épithélium fonctionnel avec les caractéristiques particulières à son site anatomique. Ceci a été mis en évidence dans plusieurs études, notamment dans la reconstruction par génie tissulaire de la cornée humaine, où la transparence du tissu résultant était déterminée par la provenance des cellules utilisées, tant les cellules stromales que les cellules épithéliales (Carrier et al., 2009). Les cellules épithéliales du cordon ont aussi été utilisées dans la production d’une cornée reconstruite, et ce substitut a été appliqué aux ulcères cornéennes en clinique (Reza et al., 2011; Lim et Phan, 2014). Qui plus est, ces cellules auraient aussi des propriétés immunomodulatoires, exprimant les 7 isoformes du CMH-G ainsi que le CMH-E, et survivant longtemps dans le contexte d’une greffe xénogène (Lim et Phan, 2014). Dans d’autres cas, des cellules stromales d’une source différente peuvent être substituées dans la reconstruction sans conséquences délétères, tels des substituts de peau préparés avec des cellules stromales du tissu adipeux (Trottier et al., 2008). Dans nos expériences, nous avons choisi de comparer les cellules épithéliales du cordon ombilical avec des kératinocytes de nouveau-né puisqu’elles sont très semblables quant à leur âge gestationnel, et tout comme l’épithélium du cordon, la peau de nouveau-né contient un pourcentage élevé de cellules qui expriment la K19, en contraste avec la peau d’adulte (Michel et al., 1996). Depuis des études ont aussi montré que ces cellules se ressemblent dans leurs patrons d’expression d’intégrines, de kératines et de protéines de surface cellulaire (les marqueurs CD) (Mizoguchi et al., 2000; Ng et al., 2008; Ruetze et al., 2008).

Les cellules épithéliales de cordon ensemencées sur un derme reconstruit de fibroblastes dermiques se sont différenciées essentiellement de la même façon que les kératinocytes dans les mêmes conditions, formant un épithélium stratifié et différencié avec des cellules superficielles aplaties qui se desquamaient avec le temps. Les molécules impliquées dans la

147 différenciation des kératinocytes étaient aussi présentes, y compris la transglutaminase, la filaggrine, l’involucrine et la K10. Alors, la culture à l’interface air-liquide en combinaison avec la présence des fibroblastes dermiques fut suffisante pour induire cette différenciation chez les cellules épithéliales, et adéquate pour la formation d’une membrane basale complète, tel qui sera discuté plus en détail ci-dessous. En contraste avec ces résultats, lorsque les cellules épithéliales furent ensemencées sur un derme reconstruit de cellules de la gelée de Wharton elles se sont développées seulement dans des conditions immergées. En effet, sur ce type de stroma les deux types épithéliaux ont formé des couches cellulaires plus épaisses et plus régulières que sur les fibroblastes dermiques. Ceci démontre l’influence du derme sur les cellules épithéliales dans un environnement sans exposition à l’air, et alors sans élément qui provoquerait une différenciation vers le phénotype de peau stratifiée. Une fois en culture air-liquide, les substituts composés seulement de cellules du cordon ombilical ont subi une dégénération progressive au fil des jours, les cellules épithéliales n’étant pas capables de répondre aux stimuli externes sans l’appui des fibroblastes dermiques. Ici s’ouvrent deux aspects à approfondir par des études plus poussées: la comparaison des facteurs de croissance et autres facteurs impliqués dans les différentes voies de prolifération et de différenciation; et le devenir des divers types de substituts durant une culture submergée prolongée. Les cellules épithéliales du cordon expriment la K13, kératine typique des épithélia stratifiés muqueux et importante dans la régulation de la différenciation et de l’apoptose de ces tissus (Moll et al., 1982; Moll et al., 2008), alors la production de tissus muqueux reconstruits in vitro avec ces cellules pourrait être envisagée.

Les dermes reconstruits par les cellules stromales de cordon ont, par contre, réussi à soutenir la différenciation des kératinocytes dans des conditions air-liquide. Les substituts dermiques étaient composés d’épaisses couches de matrice extracellulaire entre les couches de cellules; ils étaient plus épais dans les conditions submergées, mais leur épaisseur n’a pas changé de façon significative entre 7 et 21 jours de culture à l’interface air-liquide alors ils ont maintenu un état stable pendant la différenciation des kératinocytes. Tant les kératinocytes que les cellules épithéliales ont formé un épithélium plus épais en culture submergée sur ces stroma que sur les fibroblastes de derme, évidence de leur influence sur le compartiment épithélial. Les kératinocytes se sont différenciés en un épithélium stratifié

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et cornifié, généralement plus mince que le contrôle mais très semblable quant aux marqueurs de différenciation et au phénotype. L’analyse de plusieurs éléments du sécrétome des types cellulaires impliqués serait nécessaire afin d’expliquer en profondeur les différences dans les résultats obtenus pour les diverses combinaisons utilisées dans les reconstructions tissulaires. Le sécrétome, et le microenvironnement créé par les types cellulaires avoisinants ainsi que par le milieu physique, sont des facteurs déterminants pour le développement et la différenciation du tissu et ce serait le champs de recherche à privilégier pour l’approfondissement des connaissances apportées par ces expériences.

4.2.2 Lame basale

Une lame basale entre les compartiments épithélial et stromal est générée uniquement lorsque les deux types cellulaires sont présents, que ce soit in vivo ou in vitro. Les conditions de culture nécessaires pour maintenir une population de kératinocytes pendant plusieurs cycles de prolifération démontrent l’interdépendance des types cellulaires. Une couche de fibroblastes nourriciers (habituellement irradiés pour empêcher leur croissance) est primordiale pour conserver le phénotype des cellules souches épithéliales in vitro, et le microenvironnement ainsi créé augmente aussi la prolifération de ces cellules (Rheinwald et Green, 1975). Il est devenu apparent que les voies de communication vont dans les deux sens dans une signalisation paracrine double: la sécrétion de l’interleukine-1 (IL-1) par les kératinocytes incite la synthèse et la sécrétion de facteurs de croissance (tel le KGF, IL-5 et GM-SCF) et de cytokines par les fibroblastes, ce qui stimulent la prolifération des kératinocytes (Waelti et al., 1992; Maas-Szabowski et Fusenig, 1996; Smola et al., 1998; Maas-Szabowski et al., 1999). Ainsi, la formation d’une lame basale dépend de la communication entre les types cellulaires et d’une matrice extracellulaire bien organisée. L’organisation des éléments de la matrice extracellulaire est très importante pour l’activité, la prolifération et la différenciation des cellules du tissu, qui répondent non seulement aux facteurs de croissance contenus, et à la rigidité et l’élasticité de la matrice, mais qui en dépendent pour leur ancrage et leur migration. La présence d’une lame basale est critique pour la fonction de l’épithélium (Kim et al., 2011b; Kular et al., 2014).

Des études antérieures (Mizoguchi et al., 2004; Huang et al., 2011a) ont montré la production d'un épithélium stratifié par les cellules épithéliales du cordon ombilical humain

149 lors de leur culture sur un gel de collagène contenant des fibroblastes dermiques à la surface air-liquide. Ces études n'ont pas permis d’observer la présence d'une lame basale complète dans ces conditions; la couche de collagène de type IV était très discontinue et il y avait peu ou pas de collagène de type VII. Ce n'est qu'en greffant des épithélia reconstruits sur des souris nues que la présence d'une lame basilaire continue et comprenant des hémidesmosomes et une lamina lucida a été constatée (Sanmano et al., 2005). Dans l’étude de Huang, même après 28 jours de culture, les substituts ne montraient pas encore de collagène de type VII ni de couche cornifiée.

Dans nos peaux reconstruites, par contre, des lames basales se sont formées in vitro qui montraient la présence continue de la laminine 5 et des collagènes de types IV et VII au niveau de la jonction dermo-épidermique. La vérification ultrastructurale par microscopie électronique montrait la présence d’hémidesmosomes attachant l’épiderme à la membrane basale, et d’une lamina lucida et d’une lamina densa après seulement sept jours de culture à l’interface air-liquide. L’étendue et la maturité de la membrane basale se sont développées avec le temps en culture. Le fait que les cellules stromales de nos équivalents dermiques aient sécrété et organisé elles-mêmes la matrice extracellulaire fut un facteur propice au développement adéquat de la membrane basale in vitro, cet auto-assemblage contribuant sans doute à la nature physiologique des substituts ainsi construits (Lavoie et al., 2013).

4.2.3 Caractéristiques des substituts dermiques et vasculaires reconstruits

Les fibroblastes dermiques viennent d’un tissu très différent de celui des cellules stromales de la gelée de Wharton. Le derme est un tissu dense et résistant, composé d’une matrice extracellulaire compacte dans laquelle sont distribuées les cellules stromales qui la produisent. Étant assujetti à l’étirement du mouvement du corps, le derme est pourvu d’une certaine élasticité, grâce aux filaments élastiques contenus dans la matrice extracellulaire qui permettent au derme de maintenir sa forme et de résister à la déformation. Afin de reproduire cette structure dans un modèle in vitro, les fibroblastes dermiques sont cultivés en monocouche pendant quelques semaines dans un milieu supplémenté avec de l’acide ascorbique, qui participe à la production des éléments de la matrice nécessaires pour la formation d’un tissu solide. En empilant les feuillets obtenus de cette façon, on forme un derme reconstruit. Les substituts dermiques ainsi fabriqués se ressemblent beaucoup au

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tissu d’origine, ayant une matrice extracellulaire composée majoritairement des collagènes de type I et III avec les fibroblastes répartis uniformément.

Le cordon ombilical, par contre, doit protéger ses vaisseaux sanguins de la torsion et de la compression qu’ils pourraient subir in utero, et son tissu conjonctif épais est lâche en structure et riche en acide hyaluronique, avec un aspect macroscopique presque cartilagineux. Les caractéristiques contractiles des cellules de la gelée de Wharton ont été mises en évidence lors de l’étape de la production des feuillets. En contraste avec les fibroblastes dermiques qui se cultivaient facilement pendant de longues périodes de temps, les cellules de cordon avaient tendance à se contracter et rétrécir en amas après un certain temps à confluence. Dû à la présence ubiquitaire de l’α-actine du muscle lisse dans les cellules stromales, celles-ci sont contractiles en culture; cette propriété aurait un rôle dans la contraction des vaisseaux sanguins du cordon ombilical in vivo (Takechi et al., 1993). Il y avait une grande variation dans le temps pendant lequel les cellules stromales pouvaient être maintenues dans les conditions propices à la formation de feuillets, allant dans nos expériences de 10 à 30 jours dépendamment de la population particulière de cellules. Ce phénomène aurait probablement pu être contourné par l’utilisation d’ancrages aux bords des feuillets en devenir, afin d’empêcher leur décollement de la surface de culture. La production abondante de matrice extracellulaire par les cellules pendant ce temps nous a permis quand même d’avoir des feuillets manipulables après seulement 14 jours, en contraste avec les 28 jours nécessaires pour les fibroblastes dermiques.

Une fois détachés de la surface de culture originelle et empilés, les feuillets sont restés stables pour le temps restant de culture en substituts dermiques, mais très peu de remodelage eût lieu car la plupart des cellules stromales sont restées dans leurs couches d’ensemencement, en alternance avec les couches de matrice extracellulaire. Ceci fut un résultat inattendu, étant donné que les fibroblastes dermiques se sont distribués dans leur matrice pour former un tissu essentiellement uniforme. Des adventices roulées construites en parallèle avec des cellules de la gelée de Wharton ont montré une structure finale similaire, avec d’épaisses bandes riches en collagène mais presque libres de cellules en leur sein (résultats non publiés, voir aussi L’Heureux et al. (1998)). Il y a là une question de temps de culture, car les feuillets de fibroblastes dermiques ont un avantage de deux

151 semaines de plus, mais ce ne semble pas être le seul facteur. Dans le cas des substituts vasculaires, tant les cellules musculaires lisses que les cellules stromales du cordon ont produit une abondance de matrice cellulaire dans les feuillets, qui ont formé des structures tubulaires solides une fois enroulées. Soumis à une tension cyclique, ils montraient des qualités d’élasticité, et pouvaient supporter une tension mécanique d’au moins 30% sans rupture (c’est-à-dire que le tissu a pu être étiré à 130% de sa longueur originelle) (voir Gauvin et al., 2011 en annexe). La résistance du vaisseau reconstruit lui vient surtout de sa matrice extracellulaire, les collagènes contribuant à l’intégrité structurale et l’élastine à sa flexibilité, et la jeunesse des cellules du cordon est un avantage dans cet aspect car la déposition de matrice extracellulaire diminue en fonction de l’âge (McMahon et al., 1985). Ces substituts vasculaires ont montré une meilleure répartition de cellules dans la matrice extracellulaire que les substituts dermiques, possiblement à cause de l’épaisseur du tissu produit, ou parce que les substituts ont maturé sur un support tandis que les substituts de peau ont été soutenus par un anneau à la périphérie de leur surface. Il serait d’un grand intérêt de voir dans une future expérience si la répartition des cellules dans la matrice s’améliore avec l’exposition aux forces mécaniques ou au flux dans un bioréacteur.

La production de substituts dermiques et vasculaires est aussi propice pour l’incorporation des cellules endothéliales du cordon ombilical, du moins dans le contexte expérimental. Ensemencées dans un derme reconstruit, les cellules endothéliales du cordon forment des tubules à travers la matrice extracellulaire qui ressemblent aux capillaires, et elles servent à tapisser la surface luminale des vaisseaux reconstruits ainsi qu’à recouvrir les valves cardiaques faites par génie tissulaire afin de fournir une surface anti-thrombotique (Breymann et al., 2006; Guillemette et al., 2010; Rochon et al., 2010; Seto et al., 2010). Cette dernière application est d’actualité pour la recherche clinique, car plusieurs équipes se sont tournées vers le cordon ombilical comme une source de cellules pour la production de valves cardiaques autologues pour les nouveaux-nés (Schmidt et al., 2006; Sodian et al., 2006; Weber et al., 2011; Corrao et al., 2013). Certainement les cellules musculaires lisses du cordon mériteraient une mention pour leur utilité en reconstruction vasculaire; ce serait important et intriguant de regarder leur statut immunogénique dans un contexte allogénique, pour voir si elles aussi partagent les caractéristiques immunomodulatrices de leurs proches voisines, les cellules stromales.

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4.3 Conclusion

En résumé, nous avons développé une méthode d’extraction séquentielle qui permet de mettre en culture en même temps les quatre types cellulaires du tissu solide d’un cordon ombilical humain. Ceci donne lieu à la fabrication de tissus reconstruits composés d’un ou plusieurs types cellulaires d’une seule source, que ce soit pour la recherche in vitro sur les interactions cellulaires et la différenciation, ou pour une éventuelle greffe autologue ou allogénique. En particulier, nous avons réussi à produire des substituts de peau avec les cellules épithéliales de cordon, qui ont montré les caractéristiques typiques d’un épiderme stratifié et différencié. Il est évident que ce ne sont pas toutes les combinaisons de cellules qui mènent à la production d’un substitut de peau apte à être greffé dans un contexte clinique, car les substituts ne contenant que des cellules de cordon montraient des propriétés plus adéquates pour la formation d’un épithélium de type muqueux, non- kératinisé et dans un environnement humide. Les cellules de la gelée de Wharton ont montré beaucoup de versatilité quant à leurs capacités, étant capables de synthétiser les éléments de la matrice extracellulaire nécessaires pour la formation d’un substitut dermique permettant la différenciation de kératinocytes en un épithélium stratifié et kératinisé, et pour la production d’un substitut vasculaire robuste, en plus de pouvoir se différencier en adipocytes et en ostéoblastes lorsque exposés au milieux d’induction appropriés.

Les résultats de ces études sont un point de départ dans la recherche des façons de modifier l’environnement dans lequel les cellules et les tissus reconstruits sont cultivés, et de choisir les combinaisons de types cellulaires et de provenances de cellules qui conviennent mieux à la production de substituts aptes à différentes applications. Les études complémentaires aideront à raffiner ces choix afin d’optimiser la qualité et les propriétés des tissus ainsi produits, pour qu’ils ressemblent le plus possible à leurs homologues du corps humain.

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6 Annexe: Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Constructs Produced Using Arterial or Venous Cells Avant-propos Cet article pour lequel je suis co-auteure décrit en détail la production des substituts vasculaires par la méthode d’auto-assemblage utilisée au LOEX, et à laquelle j’ai fait référence dans les articles qui forment le corps de cette présente thèse. Les résultats de l’évaluation de la résistance mécanique de ces substituts y sont aussi présentés. Résumé Il existe un besoin pour de meilleurs substituts vasculaires en clinique, car les procédés chirurgicaux actuels sont limités par la disponibilité en vaisseaux autologues appropriés, et par les résultats infra-physiologiques obtenus avec les substituts synthétiques dans les greffes artérielles de petit calibre (< 5 mm). Cette étude vise à comparer les propriétés mécaniques des substituts vasculaires artériels et veineux, produits par l’approche d’auto- assemblage avec des cellules extraites soit de l’artère, soit de la veine, du même cordon ombilical. La production d’un substitut vasculaire comprenant une média et une adventice (TEVMA) a été effectuée en roulant sur elle-même un feuillet continu qui contenait des cellules musculaires lisses et des fibroblastes d’adventice, ensemencés sur la même surface de culture de façon contiguë. Des analyses histologiques et des marquages en immunofluorescence ont été employés pour évaluer la structure et la composition de la matrice extracellulaire des substituts vasculaires. Leur résistance mécanique fut évaluée par des tests de tension sur un axe, et leur comportement viscoélastique par des étapes de tension-relaxation et par l’analyse du chargement cyclique. Les épreuves de tension ont montré que l’utilisation de cellules artérielles produisait des substituts plus forts et plus rigides que ceux qui sont composés de cellules veineuses. En plus, les résultats du chargement cyclique ont démontré que des substituts artériels supportaient plus de charge pour la même tension, en comparaison aux substituts veineux. Ces résultats indiquent que les cellules isolées des cordons ombilicaux peuvent être utilisées dans la production de substituts vasculaires. Les substituts artériels possèdent des propriétés mécaniques supérieures à celles des substituts veineux, lorsque les cellules utilisées proviennent du même donneur. Cette étude souligne le fait que les cellules musculaires lisses et les fibroblastes originant de différentes sources cellulaires peuvent produire des tissus avec des propriétés distinctes lorsqu’employés pour des applications en génie tissulaire.

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