T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

( YÜKSEK LİSANS TEZİ )

TRIFOLIUM PANNONICUM JACQ. SUBSP. ELONGATUM (WILLD.) ZOH. BİTKİSİ ÜZERİNDE FARMAKOGNOZİK ARAŞTIRMALAR

ECZ. F. YASEMİN BELGE

DANIŞMAN DOÇ DR. AYNUR SARI

FARMAKOGNOZİ ANABİLİM DALI

İSTANBUL-2006 2 3

T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

( YÜKSEK LİSANS TEZİ )

TRIFOLIUM PANNONICUM JACQ. SUBSP. ELONGATUM (WILLD.) ZOH. BİTKİSİ ÜZERİNDE FARMAKOGNOZİK ARAŞTIRMALAR

ECZ. F. YASEMİN BELGE

DANIŞMAN DOÇ DR. AYNUR SARI

FARMAKOGNOZİ ANABİLİM DALI

İSTANBUL-2006 4

TEZ ONAYI

5

BEYAN

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasında elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.

F. Yasemin BELGE

6

Bana her zaman destek olan anneme, babama ve nişanlıma ithaf ediyorum

7

TEŞEKKÜR

Tecrübelerinden ve Anabilim Dalımızın teknik imkanlarından faydalanmam konusundaki desteklerinden dolayı, Farmakognozi Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof. Dr. Ali H. Meriçli’ye ve Danışman hocam sayın Doç. Dr. Aynur Sarı’ya saygı ve teşekkürlerimi sunarım.

Bitki toplama ve teşhis aşamalarındaki yardımlarından dolayı Uzm. Biyolog Mustafa Keskin’e, Botanik ve Giriş bölümü konusundaki yardımlarından dolayı Prof. Dr. Kerim Alpınar’a, tezimin her aşamasında hem teknik hem de manevi desteklerini esirgemeyen Farmakognozi Anabilim Dalı’nın tüm üyelerine, özellikle Uzm. Ecz. Ulaş Sözer’e teşekkür ederim.

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından T-537/21102004 no’lu proje olarak desteklenmiştir. 8

Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh.–Rumeli Feneri (Foto: Ecz. F.Y. Belge) 9

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI...... 4 BEYAN...... 5 TEŞEKKÜR...... 7 İÇİNDEKİLER ...... 9 TABLOLAR LİSTESİ...... 12 ŞEKİLLER LİSTESİ ...... 13 SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ...... 14 ÖZET...... 17 ABSTRACT...... 18 1. GİRİŞ VE AMAÇ...... 19 2. GENEL BİLGİLER ...... 22 2.1. Botanik Bölüm ...... 22 2.1.1. Leguminosae Juss. Familyası...... 22 2.1.2. Papilionoideae DC. (Syn. Papilionaceae; ) Altfamilyası ...... 22 2.1.3. Bronn. Tribusu...... 22 2.1.4. Trifolium L. Cinsi...... 22 2.1.4.1. Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh...... 23 2.2. Kimyasal Bölüm...... 25 2.2.1. Flavonoit Yapısındaki Maddeler...... 26 2.2.2. Diğer Maddeler ...... 44 2.3. Farmakolojik Bölüm ...... 46 2.3.1. Trifolium pratense bitkisinin “PDR for Herbal Medicines” (2000) Monografı...... 46 2.3.2. T. pratense Ekstreleri ve Flavonoitleri ile Yapılmış Farmakolojik Çalışmalara Örnekler...... 47 2.3.2.1. Östrojenik Etki...... 47 2.3.2.2. Menopoz...... 48 10

2.3.2.3. Prostat Hiperplazisi ve Prostat Kanseri...... 50 2.3.2.4. Hiperlipidemi ve Hipertansiyon...... 52 2.3.2.5. Hücre Kültürleri ile Yapılan Çalışmalar ...... 54 2.3.2.6. Bağışıklık Sistemine Etki...... 55 2.3.2.7. Gebelik ve Laktasyonda Kullanım...... 56 2.3.2.8. Biyoyararlanım ve Biyotransformasyon ...... 56 2.3.2.9. Yan Etkiler...... 57 2.3.2.10. Hayvan Deneyleri...... 57 2.3.2.11. Negatif Sonuç Alınan Çalışmalar...... 58 3. GEREÇ VE YÖNTEM ...... 59 3.1. Materyal ...... 59 3.2. Metotlar...... 60 3.2.1. Fitokimyasal Ön Denemeler ...... 60 3.2.1.1. Flavon Türevleri Aranması ...... 60 3.2.1.2. Antrasen Türevleri Aranması...... 60 3.2.1.3. Saponin Aranması ...... 60 3.2.1.4. Tanen Bileşikleri Aranması...... 60 3.2.1.5. Alkaloit Aranması ...... 61 3.2.1.6. Su Miktar Tayini ...... 61 3.2.2. Kromatografik Kontroller ...... 62 3.2.2.1. Kaba Ayırım...... 62 3.2.2.2. O-Glikozitlerinin Teşhisi ...... 63 3.2.2.3. Asit Hidroliz Yöntemi...... 63 3.2.2.4. Çözücü Sistemleri...... 63 3.2.2.5. Kullanılan Belirteçler...... 64 3.2.3. Yapı Tayini...... 65 3.2.3.1. UV Spektrumu...... 65 3.2.3.2. NMR Spektrumu...... 66 3.2.4. Antioksidan Aktivite Tayini...... 66 11

4. BULGULAR...... 68 4.1. Ön Deneme Sonuçları ...... 68 4.2. Elde Edilen Ekstre Miktarları ve Verim Hesabı ...... 69 4.3. T. pannonicum subsp. elongatum Çiçeklerinin Etil Asetat Ekstresindeki Maddelerinin Teşhisi ve Ayrılması ...... 70 4.3.1. Silikajel VLC’den Elde Edilip Birleştirilen Fraksiyonların Miktarları...... 70 4.4. Teşhis Edilen Maddelerin Özellikleri ...... 75 4.4.1. Hiperozit (B4/B2’) ...... 75 4.4.2. Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) ...... 80 4.5. Aktivite Tayini Sonuçları...... 86 4.5.1. T. pannonicum subp. elongatum Çiçeğinin Antioksidan Aktivite Sonuçları 86 4.5.2. Askorbik Asit’in Antioksidan Aktivite Sonuçları...... 87 5. TARTIŞMA ...... 89 KAYNAKLAR ...... 91 ÖZGEÇMİŞ ...... 101 12

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 3-1: Kağıt Kromatografisinde kullanılan çözücü sistemleri...... 63 Tablo 3-2: İnce Tabaka Kromatografisinde kullanılan çözücü sistemleri...... 64 Tablo 4-1: T. pannonicum subsp. elongatum bitkisine ait ön deneme sonuçları...... 68 Tablo 4-2: 2004 yılında toplanan bitkiye ait ekstre miktarları ve elde edilen verimler..69 Tablo 4-3: 2005 yılında toplanan bitkiye ait ekstre miktarları ve elde edilen verimler..69 Tablo 4-4: 2004 yılına ait VLC fraksiyon miktarları...... 70 Tablo 4-5: 2005 yılına ait VLC fraksiyon miktarları...... 71 Tablo 4-6: 14-17. fraksiyondan Preparatif KK ile elde edilen ana bantlar...... 72 Tablo 4-7: Elde edilen maddelerin miktarları...... 74 Tablo 4-8: Hiperozit (B4/B2’) UV spektrumu verileri...... 75 Tablo 4-9: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) UV spektrumu verileri...... 80 Tablo 4-10: T. pannonicum subp. elongatum çiçeğinin antioksidan aktivite sonuçları. 86 Tablo 4-11: Askorbik asit’in antioksidan aktivite sonuçları...... 87

13

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 4-1: Kersetinin kromatografik olarak saptanması (İTK)...... 73 Şekil 4-2: Kersetin-3-glikozitin (izokersitrin) kromatografik olarak saptanması (KK).73 Şekil 4-3: Hiperozit (B4/B2’) MeOH / NaOMe UV spektrumu...... 76

Şekil 4-4: Hiperozit (B4/B2’) AlCl3 / AlCl3 + HCl UV spektrumu...... 77

Şekil 4-5: Hiperozit (B4/B2’) NaOAc / NaOAc + H3BO3 UV spektrumu...... 77 Şekil 4-6: Hiperozit (B4/B2’) 1H-NMR Spektrumu...... 79 Şekil 4-7: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) MeOH / NaOMe UV spektrumu...... 81

Şekil 4-8: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) AlCl3 / AlCl3 + HCl UV spektrumu...... 82

Şekil 4-9: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) NaOAc / NaOAc + H3BO3 UV spektrumu. .82 Şekil 4-10: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) 1H-NMR Spektrumu...... 84 Şekil 4-11: T. pannonicum subp. elongatum çiçeğinin antioksidan aktivite eğrisi...... 86 Şekil 4-12: Askorbik asit’in antioksidan aktivite eğrisi...... 87

14

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ

ALP: Alkali Fosfataz

Apig-7-gl: Apigenin-7-glikozit

AR: Androjen Reseptörü

Arab: Arabinozit

BPH: Benign Prostat Hiperplazisi

COX-2: Siklooksijenaz-2

DHEA-s: Dehidroepiandrosteron sülfat

DPPH: 2,2- difenil-1-pikrilhidrazil

EC50: Etkin konsantrasyon (%50)

ERα: Östrojen Reseptörü α

ERβ: Östrojen Reseptörü β

FDA: Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi

FSH: Folikül Stimüle edici Hormon

Gal: Galaktozit

GC-MS: Gaz Kromatografisi - Kütle Spektrometrisi

Gli: Glikozit

Glu: Glukuronit

GRAS: Genellikle güvenilir olarak bilinen

HRT: Hormon Replasman Tedavisi 15

IL-2: İnterlökin-2

IPSS: Uluslararası Prostat Semptom Skoru

İTK: İnce Tabaka Kromatografisi

Kemf-3-gl: Kemferol-3-glikozit

Kers-3-gl: Kersetin-3-glikozit

KK: Kağıt Kromatografisi

Ksi: Ksilozit

LH: Luteinleştirici Hormon

LPS : Lipopolisakkaritler

Mal: Malonat

Me: Metil

NSAID: Non-Steroidal Anti-Enflamatuvar İlaç

NMR: Nükleer Manyetik Rezonans

PC: Prostat Kanseri

PGE2: Prostaglandin E2

PIN: Prostatik İntraepitelyal Neoplazma

Piran: Piranozit

PR: Progestin reseptörü

PSA: Prostat-Spesifik Antijen

Ram: Ramnozit

Rut: Rutinozit 16

SHBG: Seks Hormonları Bağlayıcı Globulin

TXB2: Tromboksan B2

UV: Ultraviyole

VLC: Vakum Likit Kromatografisi

17

ÖZET

Belge, F.Y. (2006). Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh. Bitkisi Üzerinde Farmakognozik Araştırmalar. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakognozi ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul.

Bu çalışmada, Trifolium cinsinin Türkiye için endemik bir türü olan ve T. pratense ile aynı seksiyonda (sect. Trifolium) bulunan T. pannonicum subsp. elongatum bitkisinin çiçekleri, flavonoitleri açısından incelenmiştir. Etil asetat ekstresi ilk olarak vakum likit kromatografisi ile ayrılmış, elde edilen fraksiyonlardan preparatif KK ve İTK yöntemleri ile maddeler izole edilmiş ve Sephadex sütundan geçirilerek saflaştırılmıştır. İzole edilen maddelerin yapıları, UV ve 1H-NMR spektrumlarının değerlendirilmesi ve şahit maddelerle kromatografik olarak karşılaştırılması ile saptanmıştır.

Flavon glikoziti olan luteolin-7-galaktozit ve flavonol glikoziti olan kersetin-3- galaktozit elde edilmiş, kersetin ve izokersitrin ise kromatografik olarak teşhis edilmiştir.

Luteolin-7-galaktozit Fabaceae familyasından ilk defa bu çalışmada elde edilmiştir.

DPPH metodu ile yapılan antioksidan aktivite tayini sonucunda, EC50 değeri, 0,236 mg/ml olarak bulunmuş ve bitkinin çiçeklerinin güçlü antioksidan aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır.

Anahtar Kelimeler : Baklagiller, Trifolium, Yonca, Flavonoidler, Antioksidatif etki

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından T-537/21102004 no’lu proje olarak desteklenmiştir.

18

ABSTRACT

Belge, F.Y. (2006). Pharmacognosic Investigations on Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh. İstanbul University, Institute of Health Science, Department of Pharmacognosy. Postgraduate Thesis. İstanbul.

In this study, the flavonoid compounds from the flowers of Trifolium pannonicum subsp. elongatum have been investigated. T. pannonicum subsp. elongatum is an endemic species of the Trifolium genus in Turkey, and a member of the section that also harbours T. pratense.

The ethyl acetate extract was subjected to vacuum liquid chromatography. The compounds were isolated from VLC fractions with preparative paper and thin layer chromatography, and then purified over Sephadex column. The structures of the isolated compounds have been elucidated using spectral methods (UV and 1H NMR), and by comparing chromatographically with authentic samples. Quercetin-3-galactoside and Luteolin-7-galactoside have been isolated as flavonoid compounds from the flowers of the . Quercetin-3-glycoside and quercetin have been detected chromatographically.

Luteolin-7-galactoside has been isolated from the family Fabaceae for the first time. The antioxidant activity of Trifolium pannonicum subsp. elongatum flowers was determined with DPPH method. The EC50 value has been found as 0.236 mg/ml, which indicates a strong antioxidant activity.

Key Words: Fabaceae, Trifolium, , Flavonoids, Antioxidant activity

This study is supported by the Research Support Unit of İstanbul University as the project no T-537/21102004.

19

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Dünya üzerinde 300 civarında Trifolium türü bulunmaktadır (Evans 2002). Türkiye’de bu cins 96 tür ile temsil edilmektedir (Zohary 1970; Davis ve ark. 1988; Bayfield 2000).

Eski kayıtlarda Trifolium türlerinin (T. pratense, T. arvense, T. incarnatum, T. medium, T. repens), özellikle bazı kanser türlerinde (göğüs, mide, pankreas, bağırsak kanseri, karsinomatöz ülserler) ve dolama hastalığında tedavi amaçlı kullanımına (lapa, dekoksiyon, merhem, çay, alkollü ekstre, buğu şeklinde) rastlanmıştır (Hartwell 1982).

Ülkemizde ise bazı Trifolium türlerinin kullanımları kaynaklarda şu şekilde yer almaktadır: T. arvense bitkisinin kabız, T. pratense (çayır tırfılı) çiçeklerinin balgam söktürücü, antiseptik, yatıştırıcı, T. repens çiçekli dallarının kuvvet verici, romatizma ağrılarını dindirici olarak kullanımları bilinmektedir (Baytop 1984). Ayrıca, T. pratense ve T. ambiguum’un çiçek durumları Erzurum, Kars yöresinde yenmekte, T. repens ve T. nigrescens ise hayvan yemi olarak yetiştirilmektedir (Baytop 1997).

Trifolium türleri, kök nodüllerinde azot tutma özellikleri nedeniyle toprak verimliliği için faydalı olduklarından, tarım alanında tercih edilen bitkilerdendirler. T. pratense (kırmızı yonca) türünün hayvan yemi olarak kullanılmak üzere ve azot-tutucu olarak kültürü yapılmaktadır. T. hybridum (İsveç yoncası, hibrit yoncası), toprak mantarları veya solucanlar nedeniyle oluşan yonca hastalığına ve asitli ortama, kırmızı yoncadan daha dayanıklıdır. Erozyon kontrolünde kullanılır. T. repens (beyaz yonca), geniş kök sistemi sayesinde su tutucu özelliktedir, erozyon kontrolünde faydalanılır ve bal için önemli bir kaynaktır. T. amabile (Aztek yoncası), Arjantin ve Meksika’da tahıllarla birlikte yenilen bir türdür (Heywood ve Chant 1982).

Bu cinste, Trifolium pratense en yaygın kullanımına rastlanılan türdür. Avrupa ve Asya’da geniş yayılışı olup, Kuzey Amerika ve Avustralya’da tabiileşmiştir. Amerikan yerlileri tarafından, çiçek durumlarının beslenme amaçlı, merheminin ise haricen yaralarda ve dahilen cilt hastalıklarında tıbbi amaçlı kullanıldığı kayıtlıdır. Ayrıca çiçek durumlarının, antispazmodik, ekspektoran ve yara iyileştirici etkileri 20 dolayısıyla; haricen ülser, yanık, yara ve cilt şikayetlerinde; dahilen ise, psöriasis ve egzema gibi kronik cilt hastalıklarında kullanıldığı bilinmektedir. Cilt hastalıklarında, Arctium lappa, Rumex crispus gibi diğer temizleyici bitkilerle birlikte kullanımı vardır (Stuart 1984; Chavellier 1996). Sıcak suyla yapılmış infüzyonu bronşiyal öksürük ve boğmaca öksürüğünde kullanılır. Lapası kanserli bölgelere pansuman yapılarak kullanılmıştır (Grieve 1980). Kırmızı yoncanın tarihsel kullanımına baktığımızda; İşaretler Doktrini’ne göre (bu doktrine göre, bitkinin görünümünün tedavi edeceği hastalığa işaret ettiğine inanılıyordu) yapraklar üzerindeki lekelerin, kataraktı iyileştireceğine dair bir işaret olduğu düşünülmüştür. Ayrıca meme kanseri tedavisinde kullanıldığı bilinmektedir. Kayıtlarda konsantre dekoksiyonunun tümörler üzerine uygulanarak, tümörün dışa doğru gelişmesi ve vücudun temizlenmesinin sağlandığı belirtilmektedir (Chavellier 1996). British Herbal Phamacopoeia 1996’da yer alan monografta da T. pratense’nin antienflamatuvar etkili olduğu belirtilmektedir (Evans 2002).

Trifolium türleri ile daha önce yapılan kimyasal çalışmalarda, bu türlerden özellikle flavonoitler, bunun yanında saponin ve kumarin yapısında maddeler elde edilmiştir (Sachse 1974; Olescek ve Stochmal 2002; Wu ve ark. 2003). Flavonoit bitkilerinin antienflamatuvar, damar koruyucu, diüretik, karaciğeri koruyucu, antispazmodik, antibakteriyel, antifungal, antioksidan, antialerjik, tümör gelişimini önleyici, mide mukozasını koruyucu, kolesterol düşürücü, zayıf östrojenik etkili oldukları bilinmektedir (Bruneton 1995; Evans 2002).

Trifolium subterraneum ile beslenen dişi koyunlarda kısırlık meydana geldiği farkedilerek, bu durum “yonca hastalığı” olarak adlandırılmıştır ve Trifolium türlerinde östrojenik maddelerin varlığı bu şekilde dikkat çekmiştir (Bennets ve ark. 1946, Kaynak: Madej ve ark. 2002). 1950’li yıllardan itibaren fareler ile yapılan çalışmalar da östrojenik etkiyi ortaya koymuştur (Kitts 1959; Suomalainen 1958; Bickoff 1961).

Sentetik hormonlara karşı gittikçe önem kazanan fitoöstrojenler ile ilgili pek çok çalışma yapılmıştır. Fitoöstrojen grubuna mensup olan izoflavonların (özellikle daidzein ve genistein), Avrupa ve ABD’de gıda desteği olarak tüketiminde artış görülmüştür. En yaygın kullanıma sahip olan soya bitkisinin (Glycine max) yanı sıra kırmızı yonca (Trifolium pratense) da, izoflavonlar (formononetin, biyokanin A ve daha az oranda 21 daidzein ve genistein glikozitleri) içermesi nedeniyle, gıda desteği olarak kullanılabilecek ucuz ve kolay ulaşılır bir kaynaktır (Krenn ve ark. 2002).

Bu çalışmada, Türkiye’ye endemik bir takson olan ve Trifolium pratense ile aynı seksiyonda (sect. Trifolium) bulunan; Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh. bitkisinin kimyasal bileşiminin incelenmesine karar verilmiştir. T. pannonicum ile ilgili daha önce yapılmış birkaç çalışmaya rastlandıysa da, çeşitli Avrupa ülkeleri ve Rusya’da yürütülmüş bu çalışmaların T. pannonicum subsp. pannonicum alttürü ile yapıldığı düşünülmektedir, zira çalışmalarda kullanılan materyaller yine bu ülkelerden toplanmış bitkilerdir. Bu alttürün çiçekleri ile yapılan bir çalışmada, hiperozit, kemferol-3-galaktozit, mirisetin-3-galaktozit izole edilmiştir (Schultz 1971). Topraküstü kısımlarından; kersetin, kemferol, luteolin, formononetin, trifolin, hiperozit, izokersitrin, sinarozit, ononin, biyokanin A-7-glikozit; yapraklarından ise luteolin-7-glukuronit, hispidulin-7-glikozit (Agafonova ve ark. 2002), luteolin-7- glikozit, apigenin-7-glikozit ve biyokanin A-7-glikozit (Schultz 1973) elde edilmiştir. Bu çalışmada, Trifolium pannonicum subsp. elongatum alttürünün flavonoit bileşiklerinin saptanması ve antioksidan aktivite açısından değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

22

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Botanik Bölüm

2.1.1. Leguminosae Juss. Familyası

Odunsu veya otsu bitkiler. Yapraklar, alternan, genellikle stipulalı, bipennat, basit pennat, dijitat, trifoliat veya basit. Çiçekler, aktinomorf veya zigomorf, hipogin veya bazen perigin, genellikle erdişi ve salkım, başak veya şemsiye durumunda veya tek. Sepaller (4-)5. Petaller (1-)5, serbest veya nadiren kısmen tepeleri birbirine yaklaşmış. Stamenler 4-çok, genellikle 10, hepsi bir tüp şeklinde birleşik veya üstteki stamen serbest veya hepsi serbest. Ovaryum üst durumlu, 1 karpelli. Meyve legumen, bazen tek tohumlu bölümleri olan açılmayan tipte. Tohumlar 1-çok (Davis 1970).

2.1.2. Papilionoideae DC. (Syn. Papilionaceae; Fabaceae) Altfamilyası

Odunsu veya otsu türler. Yapraklar, paripennat, imparipennat, digitat, üç veya tek yaprakçıklı, nadiren fillodik. Çiçekler zigomorf. En üst petal (standart) tek ve büyük; yan petaller 2 tane ve serbest (ala), alt petaller 2 tane ve birleşik (karina), korolla nadiren tek bir petale indirgenmiş. Stamenler (5-)10, monadelf veya diadelf, nadiren serbest. Tohumlar genellikle lateral çizgisiz; embriyonun kökçüğü bazen içe doğru kıvrık.

2.1.3. Trifolieae Bronn. Tribusu

Tek veya çokyıllık otsu, bazen kumarin gibi kokan türler. Trifoliat veya nadiren dijitat; stipulalar serbest veya yaprak sapına bitişik. Çiçekler şemsiye, salkım veya başak durumunda, veya nadiren tek. Stamenler diadelf; anterler monomorfik. Stilus çıplak. Meyve, kaliksten dışarı uzamış veya kaliksin içinde, düz veya yüzeyi desenli, açılmayan, ovoid veya helezon şeklinde kıvrık, nadiren toprak altında olgunlaşan veya açılan, düz veya kıvrık legumen; tohumlar sapsız.

2.1.4. Trifolium L. Cinsi

Bir veya çokyıllık otsu türler. Yapraklar trifoliat veya nadiren 5-9 foliollü, genellikle dişli; stipulalar bariz, genellikle tam, yaprak sapı ile birleşik. Çiçekler saplı ya 23 da sapsız, baş şeklinde veya kısa rasem, nadiren tek, brakteli veya braktesiz. Kaliks bazen zamanla büyüyen, sert veya şişkin, boğazı açık veya 2-dudaklı şişkinlikle kapalı; dişler eşit veya bir diş diğerlerinden daha uzun. Korolla pembe, kırmızıdan mora, beyazdan krem rengine değişen renklerde, genellikle kalıcı. Stamenler diadelf. Legumen genellikle kaliksin içinde, çoğu zaman açılmayan, 1-2-(-10)-tohum taşır.

Dünya üzerinde 300 civarında Trifolium türü bulunmaktadır (Evans 2002). Türkiye Florası’nın 3. cildinde 94 tür kesin olarak kayıtlıdır (Zohary 1970). 10. cilt (Davis ve ark. 1988) ve 11. ciltteki (Güner ve ark. 2000) ilaveler ile birlikte Türkiye’de 16’sı endemik 96 Trifolium türü bulunmaktadır.

Türkiye’de Trifolium türleri genel olarak “yonca” adıyla bilinmektedir. Yöresel olarak, “tirfil” ve “üçgül” adlarının da kullanıldığı saptanmıştır.

Ayrıca, Erzurum’da T. pratense türü, Kars’ta ise, T. spadiceum türü, “çayır dutu” ve yine bu yörelerde T. ambiguum türü, “kuş elması”, “at elması” şeklinde isimlendirilmişlerdir (Baytop 1997).

Çalışılan türün tanıtımı aşağıdaki şekildedir:

2.1.4.1. Trifolium pannonicum Jacq. subsp. elongatum (Willd.) Zoh.

Çok yıllık, dik veya yükselici, 20-40(-60) cm uzunluğunda otsu bitki. Stipulalar uca doğru şeritsi ve sivri. Yaprakçıklar 0.5-1.2 cm, lineardan oblong lanseolata kadar değişen şekillerde. Çiçek durumu ovattan oblonga kadar değişen şekillerde, 1.5-3 cm genişlikte, saplı. Kaliks silindirikten, çan şekline kadar değişen şekillerde; tüp 10 damarlı, yayık tüylü, meyvede 2 dudaklı sert bir şişkinlik ile kapalı; dişler akut, stellat veya geriye dönük. Korolla beyazdan kreme kadar değişen renkte, 25 mm, kaliksin yaklaşık 2 katı uzunlukta, standart yaklaşık 4 mm genişlikte, tepeye doğru daralmış, ucu subakut.

Çiçekli olduğu aylar: Haziran-Ağustos.

Yetiştiği ortam ve yükseklik: Çayırlar, orman açıklıkları, stepler. 300 - 2350 m. 24

Trifolium pannonicum türünün iki alttürü vardır: subsp. pannonicum ve subsp. elongatum. Subsp. elongatum Kuzey, Güney ve İç Anadolu için endemiktir (güneyde nadir, güneydoğuda bulunmaz).

İstanbul, Bolu, Çorum, Amasya, Gümüşhane, Kütahya, Ankara, Kayseri, Tunceli, Erzurum, Isparta, Konya’da yayılış gösterdiği belirlenmiştir.

Subsp. pannonicum, Kuzey İtalya’dan Güney Rusya ve Transkafkasya’ya kadar yaygın olup, Türkiye’de bulunmamaktadır

Subsp. pannonicum ve subsp. elongatum’un ayırdedici özellikleri, yaprak, çiçek ve kalikslerinde bulunur. Subsp. pannonicum’un yaprakçıkları daha uzun ve geniş, çiçek durumu daha büyük, standart 5-6 mm (subsp. elongatum’un yaklaşık 4 mm), tepesi obtus ve kaliks tübü daha az tüylü ve daha dar lobludur (Zohary 1970).

25

2.2. Kimyasal Bölüm

Bu bölümdeki tablolarda, Trifolium türlerinde saptanan maddeler gösterilmiştir.

2.2.1. Flavonoit Yapısındaki Maddeler

3 2 3' 2' ß

Kalkon: O

Madde ismi 2 3 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Elde edildiği bitki(ler)

2’,3’,4’,5’,6’-pentahidroksikalkon H H OH OH OH OH OH T. repens (Ponce ve ark. 2004)

26

3' 4' O 5' 7

6 3 5 Flavonlar: O

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

3’,4’,7- H H H OH H H OH OH H T. repens (Livingstone ve Bickoff 1964) trihidroksiflavon

Akasetin H OH H OH H H H OMe H T. repens (Ponce ve ark. 2004)

Apigenin 7-O- H OH H O-gli H H H OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992, T. glikozit2 pannonicum (Schultz 1973)

Luteolin2,4 H OH H OH H H OH OH H T. trichocephalum (Shalashvili 1975), T. pannonicum (Miletic ve ark. 1991; Agafonova ve ark. 2002). 27

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Luteolin 7-D- H OH H O-gli H H OH OH H T. trichocephalum (Shalashvili 1975), T. glikozit2,4 (Sinarozit) arvense (Matlawska ve ark. 1992), T. pannonicum (Schultz ve ark. 1971; Agafonova ve ark. 2002).

Luteolin 7-glukuronit2 H OH H O-glu H H OH OH H T. trichocephalum (Shalashvili 1975), T. pannonicum (Schultz ve ark. 1971)

Luteolin 3’-D-glikozit H OH H OH H H O-gli OH H T. trichocephalum (Shalashvili 1975) (Drakosefalozit)

Krizoeriyol 7-O- H OH H O-gli H H OMe OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992). glikozit

Hispidulin 7-glikozit2 H OH OMe O-gli H H H OH H T. pannonicum (Schultz ve ark. 1971)

4’,5,6,7,8- H OH OH OH OH H H OH H T. repens (Ponce ve ark. 2004) pentahidroksi-flavon 28

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

5,6,7,8-tetrahidroksi- H OH OH OH OH H H OMe H T. repens (Ponce ve ark. 2004) 4’-metoksiflavon

3' 4' O 5' 7

6 OH 5 Flavonoller: O

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Kemferol4 OH OH H OH H H H OH H T. echinatum (Shalashvili 1993), T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002). 29

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Kemferol 3-glikozit O-gli OH H OH H H H OH H T. arvense (Gill 1963), T. ambiguum (Astragalin) (Shalashvili 1974)

Kemferol 3- O-β O-gal OH H OH H H H OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992), T. galaktozit1 medium (Miletic ve ark. 1989), T. repens, T. pannonicum (Schultz 1971)

Kemferol 3- O-gal- OH H OH H H H OH H T. alpinum (Torck ve ark. 1973) galaktoglikozit gli

Kemferol 3-O-(6’’- O- OH H OH H H H OH H T. repens (Foo ve ark. 2000) asetil) -β-D- asetil- galaktopiranozit gal

Kemferol 3-O- O- OH H O-ram H H H OH H T. ambiguum (Shalashvili 1974) robinozit-7-O- ram- ramnozit (Robinin, gal flaronin)

Kemferol 7-glikozit OH OH H O-gli H H H OH H T. striatum (Tarr ve ark. 1993) 30

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

6-hidroksikemferol OH OH OH OH H H H OH H T. repens (Ponce ve ark. 2004)

3,4’- OMe OH H OH H H H OMe H T. repens (Ponce ve ark. 2004) dimetoksikemferol

Kersetin4 OH OH H OH H H OH OH H T. repens (Ueda ve ark. 1973), T. montanum (Kazakov 1977), T. hybridum (Shalashvili 1974), T. arvense (Gill 1963), T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002).

Kersetin 3-O- O-gal OH H OH H H OH OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992), T. galaktozit1 (Hiperozit, striatum (Tarr 1993), T. medium (Miletic Hiperin) ve ark. 1989), T. montanum (Kazakov 1977), T. ambiguum (Shalashvili 1974), T. repens, T. pannonicum (Schultz 1971)

Kersetin 3-O- O- OH H OH H H OH OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992) arabinozit arab 3 1

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Kersetin 3-O-ksilozit O-ksi OH H OH H H OH OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992)

İzokersitrin (Kersetin O-gli OH H OH H H OH OH H T. pratense, T. sativum, T. arvense (Gill 3-glikozit)4 1963), T. alpinum (Torck ve ark. 1973), T. hybridum (Shalashvili 1974), T. echinatum (Shalashvili 1993), T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002)

İzokersitrin 6’’-O- O-gli- OH H OH H H OH OH H T. pratense (Lin ve ark. 2000) malonat mal

Kersetin 3-rutinozit O-rut OH H OH H H OH OH H T. striatum (Tarr 1993), T. alpestre, T. (Rutin) medium

Ramnetin OH OH H OMe H H OH OH H T. repens (Ponce ve ark. 2004)

Izoramnetin (3’- O-gal OH H OH H H OMe OH H T. arvense (Matlawska ve ark. 1992) metoksi kersetin) -3- O-β-galaktozit 32

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

3- metoksikersetin 7- OMe OH H O-gli H H OH OH H T. pratense (Jain ve Saxena 1986) O-β-D-glikopiranozit

Mirisetin OH OH H OH H H OH OH OH T. repens var.giganteum (Ueda ve ark. 1973)

Mirisetin 3-galaktozit1 O-gal OH H OH H H OH OH OH T. repens, T. repens var. giganteum (Ueda ve ark. 1973) , T. pannonicum (Schultz 1971)

Mirisetin 3-O-(6’’- O- OH H OH H H OH OH OH T. repens (Foo ve ark. 2000) asetil) -β-D- asetilg galaktopiranozit al

3,7-dihidroksi-4’- OH H H OH H H H OMe H T. repens (Ponce ve ark. 2004) metoksiflavon

3,5,6,7,8- OH OH OH OH OH H H OMe H T. repens (Ponce ve ark. 2004) pentahidroksi-4’- metoksiflavon 33

Madde ismi 3 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

4’,5,6,7,8- OMe OH OH OH OH H H OH H T. repens (Ponce ve ark. 2004) pentahidroksi-3- metoksiflavon

5,6,7,8-tetrahidroksi- OMe OH OH OH OH H H H H T. repens (Ponce ve ark. 2004) 3-metoksiflavon

34

O 7

6 5 O 4' İzoflavonlar:

Madde ismi 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Daidzein H H OH H H OH H T. pratense (Sachse 1984)

Daidzin-6’’-O-malonate H H O-gli- H H OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) mal

Daidzin-6’’-O-asetat H H O-gli- H H OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) asetat

Formononetin (Biyokanin B)4 H H OH H H OMe H T. pratense (Pope ve ark. 1953), T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002).

Formononetin-7-glikozit H H O-gli H H OMe H T. pratense (Schultz 1965), T. (Ononin)4 montanum (Kazakov 1977), T. striatum (Tarr 1993), T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002). 35

Madde ismi 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Formononetin-7-O-β-D- H H O-gli- H H OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) glikozit-6’’-O-malonat mal

Formononetin-7-O-β-D- H H O-gli- H H OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) glikozit-6’’-O-asetat asetat

Glisitein H OMe OH H H H H T. pratense

Kalikosin H H OH H OH OMe H T. pratense (Popravko ve ark. 1981, Huang ve Tu 2004)

Kalikosin 7-O-β-D- H H O-gal H OH OMe H T. pratense (Saxena ve Jain 1987) galaktopiranozit

Kalikosin 7-O-β-D-glikozit-6’’- H H O-gli- H OH OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) malonat mal

Teksasin-7-O-β-D-glikozit-6’’- H OH O-gli- H H OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) O-malonat mal

Afrormosin 7-O-β-D-glikozit- H OMe O-gli- H H OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) 6’’-malonat mal

Genistein OH H OH H H OH H T. pratense (Dornstauder 2001)

Genistin (Genistein 7-glikozit)2 OH H O-gli H H OH H T. pannonicum (Miletic ve ark. 1991) 36

Madde ismi 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Genistin-6’’-O-malonat OH H O-gli- H H OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) mal

Genistein 7-(2’’-p- OH H O-gli- H H OH H T. repens (Saxena ve Jain 1986) kumaroilglikozit) kumarat

Biyokanin-A OH H OH H H OMe H T. pratense (Kononenko 1983), T. echinatum, T. diffusum (Shalashvili 1993), T. alpestre (Vetter 1995) Biyokanin A-7-glikozit2,4 OH H O-gli H H OMe H T. pratense (Schultz 1965), T. pannonicum (Schultz 1973; Agafonova ve ark. 2002), T. striatum (Tarr 1993), T. medium (Miletic ve ark. 1989)

Biyokanin A-7-O-β-D-glikozit- OH H O-gli- H H OMe H T. pratense (Lin ve ark. 2000) 6’’-O-malonat mal

Biyokanin A-7-O-β-D-glikozit- OH H O-gli- H H OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001). 6’’-O-asetat asetat

Biyokanin A-7-O-β-D- OH H O-gli- H H OMe H T. diffusum (Shalashvili 1993). glikopiranozit piran

Prunetin OH H OMe H H OH H T. pratense (Huang ve Tu 2004)

Prunetin 4’-O-β-D-glikozit-6’’- OH H O-gli- H H OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) malonat mal 37

Madde ismi 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Prunetin 4’-O-β-D-glikozit-6’’- OH H O-gli- H H OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) asetat asetat

Pratensein OH H OH H OH OMe H T. pratense (Huang ve Tu 2004)

Pratensein 7-O-β-D-glikozit- OH H O-gli- H OH OMe H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) 6’’-O-malonat mal

5,7,2’-trihidroksi-6-metoksi OH OMe O-gli- OH H H H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) izoflavon-7-O-β-Dglikozit-6’’- mal O-malonat

Orobol 7-O-β-D-glikozit-6’’-O- OH H O-gli- H OH OH H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) malonat mal

5-hidroksi-7-metoksi izoflavon OH H OMe H H O-gli H T. pratense (Kattaev ve ark. 1972) 4’-O-β-D-glikopiranozit (Trifosit)

Trifosit 6’’-malonat OH H OMe H H O-gli- H T. pratense (Lin ve ark 2000) mal

5,4’-dihidoksi-6,7-metilen OH OMe OMe H H OH H T. pratense (Fraishtat ve ark. 1979) dioksiizoflavon 38

Madde ismi 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

5,4’-dihidoksi-6,7-metilen OH OMe OMe H H O-gli H T. pratense (Fraishtat ve ark. 1979) dioksiizoflavon-4’-glikozit

İrilon OH -OCH2- H H OH H T. pratense (Huang ve Tu 2004)

İrilon 4’-O-β-D-glikozit-6’’-O- OH -OCH2- H H O-gli- H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) asetat asetat

İrilon 4’-O-β-D-glikozit-6’’-O- OH -OCH2- H H O-gli- H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) malonat mal

Pseudobaptigenin H H OH H -OCH2- H T. pratense (Popravko ve ark. 1981)

Pseudobaptigenin 7-O-β-D- H H O-gli- H -OCH2- H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) glikozit-6’’-asetat asetat

Pseudobaptigenin 7-O-β-D- H H O-gli- H -OCH2- H T. pratense (Klejdus ve ark. 2001) glikozit-6’’-malonat mal

39

O 7 2

6 5 4' İzoflavanlar:

Madde ismi 2 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

Sativan H H H OH OMe H OMe H (Ingham 1978)

40

O 7 2

6 5 O 4' İzoflavanonlar:

Madde ismi 2 5 6 7 2’ 3’ 4’ 5’ Elde edildiği bitki(ler)

2,5,7,4’- OH OH H OH H H OH H T. subterraneum (Wang ve tetrahidroksiizoflavanon ark. 1998)

2,5,7,-trihidroksi-4’- OH OH H OH H H OMe H T. subterraneum (Wang ve metoksiizoflavanon ark. 1998)

4 1

Pterokarpanlar:

Madde ismi Formül Elde edildiği bitki(ler) (kökte)

Inermin (Maakiain) O O H T. pratense (Popravko ve ark. 1981), T. repens (Ingham 1978) OH O H O

4-metoksimaakiain (Ingham 1978) O H OH O OH O H O Medikarpin H O T. repens (Ingham 1978)

OH

H3C O O H

4-metoksimedikarpin H O T. repens (Fraishtat ve ark. 1981)

OH

H3C O O H OH

42

Madde ismi Formül Elde edildiği bitki(ler) (kökte)

O Homopterokarpin O T. repens (Fraishtat ve ark. 1981) H3C H

H O

CH O 3

4 O O Trifolin HO T. pannonicum (Agafonova ve ark. 2002)

OH

O

O CH3 43

44

2.2.2. Diğer Maddeler

Kumarinler (Sachse 1974; Zhan ve ark. 2003):

Kumestrol (T. repens, T. pratense)

Repensin A (7-metoksi-7’,8’-dihidroksi-8,6’-bikumarin) (T. repens)

Repensin B (7,5’-dihidroksi-3,6’-bikumarin) (T. repens)

Antosiyan (Miletic ve ark. 1989):

Pelargonidin 3-O-rutinozit-5-O-glikozit (T. medium)

Tanenler (Foo ve ark. 2000):

Gallokateşin (T. repens)

Epigallokateşin (T. repens)

Gallokateşin-(4α-8)-epigallokateşin (T. repens)

Fenolik Asitler (Gill 1963) :

Kafeik asit (T. pratense, T. arvense)

Salisilik asit (T. pratense, T. arvense)

Kumarik asit (T. pratense, T. arvense)

Stilbenik bileşikler (Ingham 1978):

Trihidroksi stilben (T. campestre, T. dubium)

Trans-resveratrol (T. campestre, T. dubium)

Uçucu yağ bileşikleri (Fleming 2000):

Metil salisilat (T. pratense)

Metil antranilat (sadece taze çiçeklerde) (T. pratense)

45

2-fenil etanol (T. pratense)

2-fenil etanol-format (T. pratense)

2-fenil etanol-asetat (T. pratense)

Benzil alkol (T. pratense)

Saponinler (tohum, kök) (Olescek ve Stochmal 2002; Sakamoto ve ark. 1992):

Soyasaponin I3 (T. pratense, T. pannonicum,T. repens, T. angustifolium)

Soyasapogenol B (T. repens)

Soyasaponin I-astragalozit VIII (T. repens)

Soyasaponin 22-O-glikozit (T. pratense, T.repens)

Soyasaponin 22-O-diglikozit (T. pratense, T. repens)

Astragalozit VIII3 (T. repens, T. pannonicum)

Siyanogenetik glikozitler (Maher ve Hughes 1971):

Lotaustralin (T. pratense, T. repens)

Linamarin (T. pratense, T. repens)

Steroidal madde (Stuart 1984):

Sitosterol (T. pratense)

Trifolium pannonicum’dan elde edilen maddelerin yanlarındaki numaralar, bitkiden elde edildikleri kısmı göstermektedir: 1-çiçek, 2-yaprak, 3-tohum, 4- topraküstü.

46

2.3. Farmakolojik Bölüm

2.3.1. Trifolium pratense bitkisinin “PDR for Herbal Medicines” (2000) Monografı

Monografta yer alan bazı bilgiler aşağıda verilmiştir:

Ticari İsim: Red Clover Liquid, Red Clover Blossom, Red Clover Herb, Promensil, EuroQuality Red Clover Blossoms, NuVeg Red Clover Concentrate.

Tanım: Tıbbi kısımlar: Kuru veya taze çiçek durumları.

Habitat: Bitki Avrupa, Orta Asya, Kuzey Afrika’da yabani olarak yetişir ve dünyanın diğer pek çok bölümünde tabiileşmiştir.

Üretim: Kırmızı Yonca çiçekleri, Trifolium pratense’nin çiçekleridir. Drog hazırlanmasında kurutulmuş çiçek tomurcukları kullanılır.

Diğer isimleri: Purple Clover, Trefoil, Wild Clover

Etki ve Farmakoloji: Kırmızı Yonca, antispazmotik ve ekspektoran etkiye sahiptir ve cildin iyileşme sürecini hızlandırır.

Endikasyonlar ve Kullanım: İspatlanmamış kullanımı: Dahilen öksürük ve solunum hastalıkları, özellikle boğmaca öksürüğü. Haricen, psöriasis ve ekzema gibi kronik deri rahatsızlıklarında kullanılır.

Önlemler ve Yan Etkiler: Belirlenen terapötik dozun uygun kullanımında herhangi bir hayati tehlike veya yan etki bilinmemektedir.

Dozaj: Uygulama yolu: Drog sıvı ekstre halinde veya tıbbi preparatlarda haricen ve dahilen kullanılır.

47

Hazırlama: % 25’lik etanolde 1:1 sıvı ekstresi hazırlanabilir.

Günlük doz: 4 g infüzyon, günde en fazla 3 kez veya, 1.5-3 ml sıvı ekstre günde 3 kez alınabilir.

2.3.2. T. pratense Ekstreleri ve Flavonoitleri ile Yapılmış Farmakolojik Çalışmalara Örnekler

2.3.2.1. Östrojenik Etki

Flavonoitlerin östrojenik etkisi ilk olarak, koyunların bazı yonca türlerini yediklerinde kısırlaştıklarının saptanması ile ortaya çıkmıştır (Shutt 1976, Kaynak: So ve ark. 1997 p. 127). Fitoöstrojenler ve östrojenler ortak bir etki mekanizmasına sahiptir. Bunun nedeninin, 17β-östradiol’ün steroit çekirdeği ile izoflavonların polifenolik halkasının yapısal benzerliği olduğu düşünülmektedir. (So ve ark. 1997).

4’ ve 7 konumlarında hidroksil bulunan flavonoitlerin östrojenik etkili olduğu, bu etkinin 5 konumunda hidroksil sübstitüenti olan flavonoitlerde arttığı belirlenmiştir (Miksicek 1995, Kaynak: So ve ark. 1997, p. 132).

Flavon ve izoflavonoitlerle yapılan bir tayinde, östojenik aktivite açısından sıralama şu şekilde bulunmuştur: genistein > kemferol > naringenin > apigenin > daidzein > biyokanin A > formononetin > luteolin > fisetin > kateşin/taksifolin > hesperetin (Miksicek 1995, Kaynak: Diane ve ark. 2001, p. 168).

So ve ark., 6 farklı flavonoitin (hesperetin, galangin, naringenin, kersetin, baikalein, genistein), östrojen reseptör pozitif MCF-7 insan meme kanseri hücrelerinin proliferasyonu üzerine etkilerini ölçmüşlerdir. Etki mekanizmalarını saptayabilmek amacıyla, fazla östrojen ilavesinin flavonoitlerin inhibe ettiği hücre proliferasyonu üzerine etkilerini incelemişlerdir.

Flavonoitlerin zayıf östrojenler olarak hareket ettikleri düşünüldüğünden, ilave edilen 17β-östradiolün, hücre proliferasyonunda meydana gelen inhibisyonu tersine çevirmesi beklenmiştir. Beklenen bu etki sadece genistein ile muamele edilen hücrelerde, ve yaklaşık % 100 oranında görülmüştür. Genisteinin in-vitro olarak östrojen reseptörlerine bağlandığı, diğer flavonoitlerin ise reseptöre bağlanmak için

48

östrojenle yarışmayıp daha farklı bir etki mekanizması ile antiproliferatif etki gösterdiği sonucuna varılmıştır (So ve ark. 1997) .

2.3.2.2. Menopoz

Menopoz östrojen eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkar ve kemik yoğunluğunun azalmasının yanı sıra, sıcak basması, terleme, huzursuzluk gibi tipik belirtilere yol açar. Sentetik östrojenlerle yapılan tedavilerin meme kanseri ve kardiyovasküler hastalıkların oluşma riskini arttırdığı yönünde iddialar bulunmaktadır. Bu nedenle alternatif tedavi yöntemleri araştırılmaya devam edilmektedir.

Soyanın 5000 yıldır bilindiği ve sürekli tüketildiği Asya ülkelerinde, meme kanseri, prostat kanseri, osteoporoz ve menopoz semptomları görülme sıklığı, batı ülkeleri ile karşılaştırıldığında, belirgin bir şekilde azdır.

Soya tüketimi ve kanser görülme sıklığı arasındaki bu ilişkiyi ortaya çıkaran çalışmaları takiben, daidzein, genistein gibi soya ve soya ürünlerinde bulunan izoflavonlar üzerinde pek çok epidemiyolojik çalışma yapılmıştır (Fukutake ve ark. 1996; Jayagopal ve ark. 2002; Krenn ve ark. 2002; Upmalis 2000). Son yıllarda, yararlı etkileri saptanan bu izoflavonların gıda desteği olarak tüketiminde artış görülmüştür.

Kırmızı yonca (Trifolium pratense) da benzer izoflavon glikozitleri içermektedir (Klejdus ve ark. 2001). Bunlar, formononetin, biyokanin A ve daha az oranda daidzein ve genistein glikozitleridir. Ancak, insan metabolizmasında bu glikozitler hidroliz olarak aglikonlarına dönüşür ve formononetin ve biyokanin A da, daidzein ve genisteine metabolize olur. Daidzein ise, bağırsaktaki mikroorganizmalar tarafından daha güçlü östrojenik etkiye sahip olan equol’e metabolize olur.

İzoflavon absorbsiyonu bireyler arasında değişkenlik göstermektedir. Soya ve kırmızı yonca, besinlerde veya besin destek ürünlerinde artarak kullanılmaya başlandığından, bu bitkilerden elde edilen izoflavonların absorbsiyonu arasında farklılık olup olmadığı 14 denek üzerinde yapılan bir çalışmayla incelenmiştir. Tek kör, randomize, plasebo kontrollü ve çapraz yapılan bu çalışmada, soya fasulyesi izoflavon glikozitleri (28,5 mg/gün izoflavon - aglikon olarak hesaplanmıştır) ve kırmızı yonca aglikonları (30 mg/gün izoflavon) içeren kahvaltılıklar hazırlanmıştır. Bu kahvaltılıklar,

49 her iki grup tarafından, 2 haftalık kontrol ve 2 haftalık arınma dönemleri arasındaki 2 hafta süresince tüketilmiştir. İdrarda 24 saatlik izoflavon atılımı ölçülmüş, her izoflavonun % 25’i idrarda saptanmıştır. Bu sonuç, izoflavonların, glikozit/aglikon yapısı veya elde edildikleri kaynaklardan bağımsız olarak (soyadaki daidzein ve genistein, kırmızı yoncadaki formononetin ve biyokanin A) benzer miktarlarda absorbe edildiklerini düşündürmektedir. Bireylerarası farklılık yüksek olsa da, 2 türden izoflavon tüketimi ile atılan miktarlar birbiriyle karşılaştırıldığında (r=0,69; P=0,007), farklılık azdır (Tsunoda ve ark. 2002).

Soya ve kırmızı yonca preparatları, hormon replasman tedavisinde (HRT) kullanılmaya yeterli östojenik etkiye sahiptir. Günlük 40 mg’lık doz tavsiye edilmektedir. Bu doz, serbest izoflavonlar içindir. Konjuge izoflavonların parçalanmasıyla bu seviye artabilir.

Yapılan bir araştırmada, günde en fazla 2 mg/kg vücut ağırlığı kadar izoflavon alınmasının güvenli olduğu sonucuna varılmıştır (Barnes. 2003).

Kırmızı yonca, Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)’nın Gıda Takviyesi Statüsü Listesinde, “genellikle güvenilir olarak kabul edilen” (GRAS) statüsündedir (FDA 2006).

Bitki ekstreleri, eksik östrojenin yerini alabilir ve ayrıca östrojen reseptörü β (ERβ)’ya, östrojen reseptörü α (ERα)’dan daha fazla ilgileri vardır. Bir hipoteze göre, endometrium ve meme hücreleri proliferasyonu, ERβ aktivasyonu ile artmaz.

Progestin reseptörü (PR) ve androjen reseptörü (AR)’ne ilgi, doğal bir equin ürünü olan ve HRT’de yaygın olarak kullanılan Premarin’in faydalı bir özelliği olarak kabul edilmektedir. Kırmızı yonca ürünleri, tamamen farklı bileşikler içermesine rağmen, benzer bir etki şekli göstermiştir (Beck ve ark. 2003).

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi ile izoflavon içeriğinin % 9 (kuru ağırlık) olduğu saptanan standardize edilmiş bir preperatla (Menoflavon®) yapılan çalışmada, östrojenik aktivite, maya iki plazmit sistemi (yeast two plasmid system) ile ERα ve ERβ kullanılarak değerlendirilmiştir. ERα için, yaklaşık 1 g kırmızı yonca ekstresi başına 18 µg 17β-östradiol ve ERβ için; 1 g kırmızı yonca ekstresi başına 78 µg 17β-östradiole

50 karşılık gelen transaktivasyonel kapasiteye bağlı östrojenik aktivite elde edilmiştir. Ortaya çıkan farklılık, ERβ’nın izoflavonlara daha yüksek ilgi göstermesi ile açıklanmıştır. Çalışmanın tartışma bölümünde; yüksek izoflavon içeriği ve ERβ’ya ERα’dan daha yüksek transaktivasyonel etkisi nedeniyle, bu tip ekstrelerin HRT için ilgi çekici adaylar olduğu ortaya konulmuş ve bu alternatif terapötik ajanın potansiyeli ile ilgili daha fazla çalışma yapılması gerekliliği belirtilmiştir (Dornstauder ve ark. 2001).

12 aydan uzun bir süredir amenoresi olan ve günde beş defadan fazla sıcak basması şikayeti olan 30 kadınla yapılan randomize, çift kör, plasebo kontrollü çalışmada, kadınlara ilk dört hafta plasebo tablet verilmiştir. Takip eden 12 hafta boyunca ise, ya plasebo ya da 80 mg kırmızı yonca izoflavonları içeren preparat (Promensil®) verilmiştir. İlk dört haftalık dönemde sıcak basmaları % 16 azalırken, daha sonraki 12 haftalık sürede, plasebo grupta daha fazla bir düşüş olmazken, izoflavon grubunda, % 44 dolayında istatistiksel olarak belirgin bir azalma gözlenmiştir (Van de Weijer ve Barentsen 2002).

2.3.2.3. Prostat Hiperplazisi ve Prostat Kanseri

Prostat kanseri (PC) sıklığında doğu ile batı arasında görülen epidemiyolojik farklılıklar, kısmen Asya’da tüketimi daha fazla olan fitoöstrojenlere bağlanmaktadır.

Yüksek miktarda pirinç, soya ürünleri, balık ve sebze ile beslenen Japonlarla yapılan bir çalışmada, gaz kromatografisi - kütle spektrometrisi (GC-MS) yöntemi ile, 10 kadın, 9 erkekte enterolakton, enterodiol, daidzein, equol, o-desmetilangolesinin idrarda atılan miktarı ölçülmüştür. Lignanların atılım oranı düşük, izoflavonoit miktarı yüksek bulunmuştur. Çalışma sonucunda, meme ve prostat kanserinden ölümlerin düşük olmasının, soya ürünlerinin yüksek oranda tüketimine bağlı olabileceği belirtilmiştir (Adlercreutz ve ark. 1991).

Yöresel gıdalarla beslenen Portekizli, Çinli ve İngiliz erkekler üzerinde yapılan karşılaştırmalı çalışmada, GC-MS ile plazma ve prostat sıvısındaki lignan ve izoflavon yapısındaki fitoöstrojen konsantrasyonları ölçülmüştür. Prostat sıvısında, enterolakton miktarı, sırasıyla Hong Kong, Portekiz ve İngiltere için ortalama 31, 162, 20,3 ng/ml, daidzein miktarı ise sırasıyla 70, 4,6 ve 11,3 ng/ml olarak saptanmıştır. Daidzein’in

51 plazma seviyeleri de yine Hong Kong’dan gelen örnekte (31,3 ng/ml), Portekiz (1,3 ng/ml) ve İngiltere (8,2 ng/ml)’ye kıyasla çok daha yüksektir. Enterolaktonun plazmadaki seviyesi ise benzer bulunmuştur (sırasıyla 6,2, 3,9 ve 3,9 ng/ml). Sonuç olarak, Hong Kong’lu erkeklerin plazma ve prostat sıvılarındaki daidzein ve equol konsantrasyonları daha yüksek bulunmuştur. Enterolakton ise Portekiz’den gelen örneklerde daha yüksek oranda saptanmıştır. Asya ve Akdeniz ülkelerinde prostat kanserinin daha az görülmesinin nedeni bu olabileceği ve dolayısıyla soyadaki izoflavonların prostat kanserine karşı koruyucu özelliğe sahip olabileceği düşünülmüştür (Morton ve ark. 1997).

Cerrahi müdahale ve ilaç tedavisinin potansiyel risk ve yan etkileri ve gıda takviyelerinin prostat sağlığına potansiyel faydalarının anlaşılması nedeniyle, doğal tedavileri tercih eden benign prostat hiperplazisi (BPH) hastalarının sayısı gün geçtikçe artmaktadır. Kırmızı yonca ekstresi, diğer bitki ekstrelerine göre 4 ana izoflavon içerir, aglikon izoflavonlar reseptör seviyesinde aktiftirler. Katz, kırmızı yonca ekstrelerinin BPH belirtilerini azalttığı yönünde çalışmalar olduğunu ve iyi tolare edildiğini belirtmektedir (Katz 2002).

97 BPH ve 97 PC hastası olan, toplam 194 erkek üzerinde yapılan bir kontrol çalışmasında amaç, BPH ve PC hastalarında serum fitoöstrojen seviyelerinin karşılaştırılması olmuştur. Serumdaki daidzein, genistein ve enterolakton seviyeleri floroimmünoassay yöntemi ile tayin edilmiş ve paralel olarak serum endokrin çalışması da yapılmıştır. Yaş ortalamaları BPH hastalarında (68+10 yıl: ortalama + standart sapma) ve PC hastalarında (64+6 yıl) karşılaştırılabilir düzeydedir. Saptanan değerler, BPH ve PC hastalarında sırasıyla; enterolakton için 50+209’a karşılık 22+34 nmol/L, daidzein için, 17+44’e karşılık 10+35 nmol/L, genistein için, 33+87’ye karşılık 19+45 nmol/L’dir. Değerler BPH hastalarında daha yüksektir ancak, istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Tüm hastalarda, fitoöstrojenler, Prostat-Spesifik Antijen (PSA) ve endokrin parametreleri ile ilişkilendirilmiş ve bu analizler yaşa göre kontrol edilmiştir. Fitoöstrojenler ile PSA, luteinleştirici hormon (LH), total testosteron ve östradiol arasında korelasyon gözlenmemiştir. Ancak, daidzein (p=0,019), genistein (p=0,002) ve tüm fitoöstrojenlerin toplamı (p=0,005), folikül stimüle edici hormon (FSH) ile pozitif olarak ilişkilidir. Bu veriler, fitoöstrojenlerin, prostat kanseri patojenezinde etkili olduğunu ve PS’yi önlemedeki potansiyelini ortaya koymuştur. FSH ve fitoöstrojenler

52 arasındaki yakın ilişki, potansiyel bir dengeleme mekanizması olduğuna işaret etmektedir. Bu konuda daha fazla çalışma yapılması gerektiği belirtilmiştir (Madersbacher ve ark. 2003).

İzoflavonların uzun süreli kullanımda prostat, hormon seviyeleri, cinsel fonksiyon ve karaciğer fonksiyonlarına etkisine ışık tutan bir çalışmaya, prostat biyopsisinde yüksek PSA ve prostatik intraepitelyal neoplazma (PIN) seviyeleri saptanan 12 hasta katılmıştır. Hastalara 6 ay boyunca günde 160 mg kırmızı yonca izoflavon ekstresi verilmiştir. Başlangıçta ve her üç ayda bir, PSA, total testosteron, östrojen, LH, FSH, Dehidroepiandrosteron sülfat (DHEA-s), karaciğer transaminazları (GOT, GPT, gGT), transrektal prostat volumetrisi, uluslararası prostat semptom skoru (IPSS) incelenmiştir.

Ortalama PSA seviyeleri, başlangıçta 3. ve 6. aylarda sırasıyla, 7,7 ng/ml, 6,9 ng/ml ve 6,5 ng/ml (-% 10) bulunmuştur. Prostat hacminde 6 aydan sonra küçük bir azalma (-% 6) görülmüş, tüm seks hormonlarında düşüş olmuştur. Testosteron % 5, DHEA-s, % 25, östrojen, % 30, LH % 5, FSH % 30 oranlarında düşmüştür. Tüm transaminazlar 3 ve 6 aydan sonra artmış, IPSS 6 aydan sonra % 15 gerilemiştir. Cinsel fonksiyonlarda bir değişiklik görülmezken, ortalama hayat kalitesinin, IPSS anketlerinden alınan cevaplara göre, 6 aydan sonra daha iyiye gittiği gözlenmiştir (Engelhardt ve Riedl 2004).

2.3.2.4. Hiperlipidemi ve Hipertansiyon

Genistein, daidzein, formononetin, biyokanin A içeren preperat (Rimostil®), 46 menopoz sonrası kadına, tek kör plasebo ve arınma dönemleri arasında, çift kör olarak verildi. Hastalar, rastgele ayrılarak 6 ay boyunca, 28,5 mg, 57 mg veya 85,5 mg fitoöstrojen almışlardır.

Altı ayın sonunda, serum yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL), artış büyüklüğü doza bağlı olmaksızın (p=0,005, p=0,043, p=0,007), % 15,7 ila % 28 oranında artmıştır. Aynı şekilde artış büyüklüğü doza bağlı olmaksızın (p=0,007, p=0,002, p=0,027), serum apolipoprotein B belirgin şekilde, % 11,5-17 arasında düşmüştür. Proksimal radius ve dirsek kemiğinde kemik mineral yoğunluğunun da; 57 mg/gün dozunda % 4,1 oranında (p=0,002), 85,5 mg/gün dozunda ise % 3,0 oranında

53

(p=0,0239) arttığı saptanmıştır. Tüm dozlarda endometriyal kalınlık artmıştır. Ancak bu sonuçlar yorumlanırken, bir kontrol grubu eşliğinde çalışılmadığı göz önünde bulundurularak temkinli olunması gerektiği belirtilmiştir (Clifton-Bligh ve ark. 2001).

Menopozla birlikte bozulan arteriyel uyum, sistolik hipertansiyona yol açar ve sol ventrikülün çalışma yükünü arttırır. İzoflavon alımının arttırılması ile menopoz döneminde artan bu kardiyovasküler riskin azaltılma olasılığı olup olmadığının araştırıldığı bir araştırmada, 40 mg ve 80 mg/gün doz uygulanarak, 17 kadındaki arteriyel uyum ölçülmüştür. 5 haftalık plasebo döneminin ardından, 5 haftalık tedavi döneminde, basınç (karotid arter) ve hacim (aorta akış) ilişkisi ultrason ile ölçülerek her dönem sonrasında arteriyel uyum saptanmıştır. Plasma lipitleri her dönemde iki kez ölçülmüştür. İzoflavonların idrarla atılım miktarı da saptanmıştır. Çalışmada 3 kadın plasebo kontrol olarak yer almıştır. Diğer kadınlar 5 hafta süresince, sırasıyla önce 40 daha sonra 80 mg kırmızı yoncadan elde edilen izoflavonlar ile tedavi edilmiş, arteriyel uyum, 80 mg dozda, plaseboya göre % 23 oranında artmıştır. 40 mg’da ise az miktarda daha düşük bulunmuştur (plasebo, 19,7±1,5, 40 mg 23,7±0,7, 80 mg, 24,4±1,4). Plazma lipitleri ise belirgin olarak değişmemiştir. Bu çalışmada elde edilen sonucun menopoz sonrası kardiyovasküler fonksiyonun tedavisi için yeni bir gelişmeye ışık tutabileceği belirtilmiştir (Nestel ve ark. 1999).

16 menopoz sonrası dönemdeki tip II diabet hastası kadın (diyet veya oral hipoglisemikle tedavi gören), rastgele, çiftkör, çapraz çalışmaya katılarak, 4 hafta boyunca günde 50 mg kırmızı yonca izoflavonu almışlardır. Her tedavi dönemi sonunda, 24 saat kan basıncı kayıtları alınmış ve asetilkolin, nitroprüsit ve L- nitromonometilarginine (L-NMMA) önkol vasküler cevap ölçülmüştür. Plasebo ile karşılaştırıldığında, günlük ortalama sistolik ve diastolik kan basıncı belirgin şekilde daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, L-NMMA’yı takiben önkol vasküler cevabındaki artışın da belirgin oranda olduğu saptanmıştır. Bu da bazal endotelyal fonksiyonların daha iyi duruma geldiğini göstermiştir. Plazma lipoproteinleri, şekere bağlı hemoglobin, asetilkolin ve nitroprüsite yanıt plaseboyla karşılaştırıldığında belirgin bir farklılık göstermemiştir. Bu verilerle, menopoz sonrası tip II diyabetli kadınlarda kırmızı yonca ile izoflavon takviyesinin, kan basıncını ve endotelyal fonksiyonu olumlu yönde etkileyebileceği sonucuna varılmıştır (Howes ve ark. 2003).

54

2.3.2.5. Hücre Kültürleri ile Yapılan Çalışmalar

Farklı kırmızı yonca ekstreleri, osteoblastik osteosarkom hücrelerini (HOS58) uyarma yeteneği açısından test edilmiştir. Osteoblastisite açısından işaretleyici olarak alkali fosfataz (ALP) akitivitesi seçilmiştir. Tüm ekstreler izoflavon içeriği açısından incelenmiştir. Butanol ve metanol ekstrelerinin ALP veya hücresel protein üretimi üzerine hiçbir etkileri olmazken, kloroform ekstresinin, inkübasyonda enzim aktivitesini belirgin ölçüde arttırdığı gözlenmiştir. Elde edilen bulgular, kırmızı yonca izoflavonoitlerinin osteoblastik hücre aktivitesini uyarmada rolü olduğunu açıkça göstermiştir (Wende ve ark. 2004).

Araştırmalarda, vejeteryanların plazmasında seks hormonları bağlayıcı globulin (SHBG) seviyelerinin daha yüksek olduğu saptanmıştır. Buna bağlı olarak seks hormonları yıkımının azaldığı ve meme ve prostat kanseri riskinin düştüğü gözlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, genisteinin, in-vitro olarak, insan hepatokarsinom (Hep-G2) hücrelerinin SHBG oluşturmasına ve hücre proliferasyonuna etkileri araştırılmıştır. Genisteinin, Hep-G2 hücrelerinin SHBG yapımını belirgin ölçüde arttırmanın yanında, bu kanser hücrelerinin proliferasyonunu da baskıladığı görülmüştür. Bu sırada SHBG yapımı da yüksek kalmaya devam etmiştir (Mousavi ve Adlercreutz 1993).

Başka bir çalışmada, izoflavonların insan meme karsinom hücre serileri, MDA- 468 (östrojen reseptörü negatif) ve, MCF-7 ve MCF-7-D-40 (östrojen reseptörü pozitif) gelişimi üzerine etkileri incelenmiştir. Genisteinin tüm hücre serilerinde güçlü inhibitör etkisi (EC50 değerleri 6,5-12,0 µg/ml) görülmüştür. Biyokanin A ve daidzein daha zayıf inhibitör etki (EC50 değerleri 20-34 µg/ml) göstermişlerdir. İzoflavon-β-glikozitleri, genistin ve daidzinin ise çok az etkili oldukları (EC50 değerleri >100 µg/ml) gözlenmiştir. İzoflavonların tümor hücresi oluşumunu inhibe etmeleri için (MDA-468 ve MCF-7 hücreleri karşılaştırılarak) östrojen reseptörü varlığı gerekmediği saptanmıştır (Peterson ve Barnes 1991).

Uzun süreli nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaç (NSAID) kullanımınının bazı kanser türlerine yakalanma riskini azalttığı ve bunun mekanizmasının da siklooksijenaz- 2 (COX-2) inhibisyonu ile olduğu düşünülmektedir. COX enzimi, prostaglandin E2 (PGE2) ve tromboksan B2 (TXB2)’yi katalizler. PGE2, enflamasyonu, TXB2 ise, kan pıhtılaşmasını uyarır. Artirit ve kanser gibi pek çok hastalıkta bu iki maddenin arttığı

55 görülmüştür. Araştırmacılar, COX’u inhibe eden ve aspirin, ibuprofen gibi NSAID’ler kadar toksisite göstermeyen maddeler bulmaya çalışmaktadırlar.

Bu amaçla izoflavonlar ile yürütülmüş bir çalışmaya da rastlanmıştır. İzoflavon içeren gıdaların uzun süreli tüketiminin kanser riskini azalttığı bilindiğinden, bu etkinin COX inhibisyonu ile ilişkili olup olmadığı incelenmiştir. Bu çalışmada, kırmızı yoncadan elde edilen izoflavonlar ayrı ayrı denenmiştir. Enflamasyonu indüklemek amacıyla, fare makrofaj hücre serisi RAW264.7 ve insan monositleri, ayrı ayrı, lipopolisakkaritler (LPS) içerisinde inkübe edilmiştir. LPS, bakteri hücre duvarında güçlü immün reaksiyonlar oluşturan bir maddedir. Hücreler inkübasyondan sonra, enflamatuvar metabolitleri azaltma yeteneklerini saptamak amacıyla, genistein, biyokanin, daidzein ve formononetin ile muamele edilmiştir. Fare makrofaj hücrelerinde PGE2, insan monositlerinde ise, PGE2 ve TXB2 oluşumu test edilmiştir.

İzoflavonların hepsi PGE2 ve TBX2’yi, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında belirgin oranda inhibe etmiştir. Murin makrofajlarında PGE2’yi en güçlü inhibe eden madde genistein olmuştur (% 62-1 mcM konsantrasyonda). Formononetin ve biyokanin ise, 10 mcM konsantrasyonda PGE2’yi sırasıyla % 60 ve % 75 oranında azaltmıştır. Daidzein ise, 40 mcM konsantrasyonla % 32 oranında inhibe etmiştir.

İnsan monositlerinde PGE2 üretimini ise, ayrı ayrı genistein ve formononetin 10 mcM, genistein, formononetin ve daidzein bir arada yine, 10 mcM konsantrasyonla inhibe etmiştir. TXB2 ise sadece formononetin tarafından anlamlı bir oranda inhibe edilmiştir (10 mcM konsantrasyonda). Formononetin, genistein ve biyokanin birlikte 100 mcM konsantrasyonda TXB2’yi azaltabilmişlerdir. Tüm hücreler, en yüksek dozlarda bile canlı kalmışlardır. Bu çalışmada kullanılan izoflavon dozları gıdalarla alınabilecek miktarlar olsa da, bu sonuçların klinik olarak geçerliliğinin in-vivo çalışmalarla doğrulanması gerektiği belirtilmiştir (Lam ve ark. 2004).

2.3.2.6. Bağışıklık Sistemine Etki

Murin modeli kullanılarak yapılan bir çalışmada, oral olarak 20-40 mg/kg vücut ağırlığı dozunda uygulanan daidzein, spesifik olmayan murin bağışıklığını uyararak, humoral bağışıklığı aktive etmiş ve hücresel bağışıklığı arttırmıştır (Zhang 1997, Kaynak: Diane 2001, p.171).

56

Başka bir çalışmada, daidzein ve genisteinin ayrı ayrı ve ikisinin birarada, mitojenler tarafından aktive edilen murin splenositlerinin proliferasyonuna ve interlökin-2 (IL-2) ve IL-3 salgılanmasına etkileri incelenmiştir. Daidzeinin, uygun fizyolojik konsantrasyonlarda (0,01-10 µM) lemfosit aktivasyonunu arttırdığı görülmüştür. Bu bağışıklığı uyarıcı etki, daidzeinin kanseri önlemede rol oynayabileceğini ortaya koymuştur. (Wang ve ark. 1997, Kaynak: Diane 2001, p.172).

2.3.2.7. Gebelik ve Laktasyonda Kullanım

Fetüsün yüksek seviyede izoflavona maruz kalmasının güvenilirliği ile ilgili çalışma yapılmamıştır. Günde 30–100 mg izoflavon tüketen toplumlarda, yüksek izoflavon alımına bağlı fetüs anomalileri ile ilgili bilinen hiçbir epidemiyolojik çalışma yoktur.

Ancak, hamile farelerde çok yüksek dozlarda genistein verildiğinde (14-70 mg/kg), doğumda düşük kilo, anogenital mesafenin azalması, ergenliğin başlamasının gecikmesi gibi sonuçlar görülmüştür. Bu çalışmada doğuma, ölü doğum oranına, ve yenidoğanda hipofizin gonadotropin serbestleştirici hormona (GnRH) yanıtına ilişkin bir etki bulunmamışsa da, bu konuda kesin veriler olmadığından izoflavon preparatlarının hamilelik süresince kullanılmaması önerilmiştir (Levy ve ark. 1995).

Emzirme döneminde ise, izoflavonların süte geçtiği bilindiğinden, günlük önerilen dozun (40 mg) aşılmaması gerekmektedir (Cruz ve ark. 1994).

2.3.2.8. Biyoyararlanım ve Biyotransformasyon

Tüm bileşikler zaman içinde vücuttan atılırlar. Atılım süresi bileşiğin suda daha fazla çözünebilen ve idrar ve safra yoluyla atılan konjugatlarına metabolize olmasına bağlıdır. Flavonoit ve izoflavonoitler su ve organik çözücülerde fazla çözünmezler. En iyi çözündükleri solvanlarda (etanol, metanol, asetonitril) bile orta derecede çözünürler. Gıdalarda genelde, aglikonlarına nazaran suda daha çok çözünen glikozit konjugatları halinde bulunurlar ve bunların şeker kısmı, emilimden önce memeli veya mikrobiyal glukozidazlar tarafından enzimatik parçalanmaya uğrarlar. Gıdalarda major olarak bulunan izoflavonoit glikozitlerinin insan plazması ve idrarında saptanmaması da bu enzimatik yıkılma ile açıklanabilir.

57

İzoflavon ve flavonoitler, genistein tüm bu fenolik bileşikler için bir model olarak düşünülürse; gastrointestinal mukozada hızla ve büyük oranda glukuronidasyona uğrayabilir. Genistein ve daidzein glukuronatları, fare rahmindeki sitosolik östrojen reseptörüne bağlanmalarından anlaşıldığı kadarıyla, aglikonlarına nazaran daha az östrojeniktirler (Zhang ve ark. 1999, Kaynak: Diane ve ark. 2001)

2.3.2.9. Yan Etkiler

Rastlanan tek yan etki kanın pıhtılaşmasını önleyici etkisidir. Terapötik indeksi dar olan warfarin için muhtemel etkileşimler önemli olduğundan, pek çok bitkisel ilaçla etkileşimleri incelenmiştir. Kırmızı yonca da, birlikte kullanıldığında kanama riskini ve warfarinin etkisini arttıran bitkiler arasında yer almaktadır (Heck ve ark. 2000; Argento ve ark. 2000; Abebe 2002).

2.3.2.10. Hayvan Deneyleri

Kırmızı yonca ile beslenen dişi koyunlar üzerinde yapılan çalışmalardan birinde tiroid bezi fonksiyonuna etki araştırılmıştır. Yumurtalıkları alınmış sekiz koyun 14 gün boyunca 3,5 kg % 100 kırmızı yonca yemi ile beslenmiştir. İlk gün ve 14. günün sonunda kan örnekleri alınmıştır. 5 ay sonra, koyunlardan 4’ü tekrar aynı şekilde 14 gün kırmızı yoncayla beslenmiş, diğer 4 koyun kontrol grubu olarak bırakılmıştır. Yine kan örnekleri alındıktan sonra, koyunlar öldürülüp tiroid bezleri ağırlık ve makroskopik değişiklikler açısından incelenmiştir. Kırmızı yonca ile beslenen grupta kandaki total T3 ve serbest T3 konsantrasyonu daha yüksek çıkmıştır. Yine tiroid foliküllerinin enine kesitlerinin kontrol grubuna göre daha büyük ve tiroid bezlerindeki ERα immunoreaktivitesinin daha güçlü olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, 14 gün boyunca günlük 81-95 mg fitoöstrojen/kg vücut ağırlığı alımı, tiroid hormonu salgısını uyarmış, folükül boyutunu ve tiroid bezlerindeki ERα immünoreaktivitesini arttırmıştır (Madej ve ark. 2002).

İstanbul Üniversitesi, Veteriner Fakültesi’nde, kırmızı yoncanın sıçan testisleri üzerine etkisi ile ilgili yapılan bir çalışmada, yemlere T. pratense ve 17β-östradiol ilave edilerek 18. gün ve 90. gündeki etkileri, kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır. T. pratense’nin, pubertadaki spermatogenezis üzerine kısa dönemde pozitif, ancak uzun dönemde negatif etkisi olduğu görülmüştür (Ulkay 2005).

58

2.3.2.11. Negatif Sonuç Alınan Çalışmalar

Yaşları 49-65 arasında değişen 205 kadınla bir yıl boyunca yapılan bir çalışmada, günde 26 mg biyokanin A, 16 mg formononetin, 1 mg genistein ve 0,5 mg daidzein alan kadınlarda mamografik meme yoğunluğunda bir artış olmamıştır. Ayrıca menopoz sonrası kadınlarda, östradiol, FSH veya LH ve sıcak basması ve diğer manopoza bağlı belirtiler üzerinde bir etki saptanmamıştır (Atkinson ve ark. 2004).

Halen menopoz sonrası dönemde olan 252 kadın çift-kör, plasebo kontrollü klinik çalışmada, kırmızı yoncadan üretilen 2 fitoöstrojen gıda destek ürününü kullanmışlardır. Yaşları 45-60 arasında olan, haftada en az 35 sıcak basması geçiren hastalardan gelişigüzel seçilen bir grup Promensil (82 mg/gün), diğer bir grup ise Rimostil (57 mg/gün) kullanmış ve plasebo grupla birlikte 12 hafta boyunca takip edilmişlerdir. Çalışmaya katılanlardan % 98’i 12 haftalık süreyi tamamlamıştır. Her üç grup arasında sıcak basmaları sıklığı açısından (Promensil grubunda 5,1 şikayet/gün, Rimostil grubunda 5,4 şikayet/gün, plasebo grubunda 5,0 şikayet/gün) bir farklılık saptanmamıştır (Jeffrey ve Tice 2003).

59

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Materyal

Trifolium pannonicum subsp. elongatum, çiçekli dönemde Mayıs 2004 ve Mayıs 2005 tarihlerinde, Sarıyer-Rumeli Feneri’nden toplanmıştır. Uzm. Biyolog Mustafa Keskin tarafından teşhis edilmiştir.

Çiçek ve yapraklar ayrılıp daha sonra, gölgede ve oda sıcaklığında kurutulmuştur.

Toplanan materyale ait örnek, İstanbul Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi herbaryumunda kayıtlıdır. Kayıt numarası ISTE 81875’dir.

60

3.2. Metotlar

3.2.1. Fitokimyasal Ön Denemeler

Kaba toz edilmiş çiçek ve yaprak ile infüzyon hazırlanmıştır. Bu infüzyonlarla fitokimyasal ön denemeler yapılmış; flavon, antrasen, saponin, tanen ve alkaloit türevleri varlığı araştırılmıştır.

İnfüzyon hazırlanması: 5 g toz edilmiş drog, 100 ml sıcak su ilave edilerek 5 dakika su banyosunda tutulmuştur. Soğuduktan sonra pamuktan süzülmüştür.

3.2.1.1. Flavon Türevleri Aranması

Bir miktar infüzyon üzerine eşit miktar Shibata belirteci (1 kısım derişik hidroklorik asit + 1 kısım etanol + 1 kısım su) ve birkaç parça Magnezyum talaşı ilave edilerek, kırmızı, turuncu veya mor renk oluşup oluşmadığı gözlenmiştir.

3.2.1.2. Antrasen Türevleri Aranması

Bir miktar infüzyon üzerine derişik sülfürik asit ilave edilip, 15 dakika sıcak su banyosunda tutularak glikozitler hidroliz edilmiştir. Soğuduktan sonra, 5 ml toluen ile çalkalanmış, toluenli tabaka bir pipet yardımıyla tüpe aktarılarak % 10’luk amonyak çözeltisi ilave edilmiştir. Pembe-kırmızı rengin oluşup oluşmadığı kontrol edilmiştir.

3.2.1.3. Saponin Aranması

Bir miktar infüzyon bir tüpe alınarak 30 saniye süreyle yatay olarak kuvvetlice çalkalanmıştır. 15 dakika dinlenmeye bırakılarak, en az 1 cm yüksekliğinde kalıcı köpük oluşup oluşmadığı gözlenmiştir.

3.2.1.4. Tanen Bileşikleri Aranması

Bir miktar infüzyon üzerine tuzlu jelatin çözeltisi (sodyum klorür ile doyurulmuş % 1’lik jelatin çözeltisi) ilave edilerek krem rengi çökelek oluşup oluşmadığı gözlenmiştir:

61

• Gallik ve kateşik tanen ayırımı için; infüzyona % 5’lik demir (III) klorür çözeltisi ilave edilmiştir. Mavi-siyah renk (gallik tanen) veya esmer zeytin yeşili renk (kateşik tanen) oluşup oluşmadığı gözlenmiştir.

• Gallik ve kateşik tanenin bir arada bulunabileceği göz önüne alınarak, Stiasny belirteci (2 k % 30 formol + 1 k derişik hidroklorik asit) ile kontrol edilmiştir:

Bir miktar infüzyon üzerine Stiasny belirteci ilave edilip yarım saat sıcak su banyosunda bekletilmiştir. Parçalar halinde yüzen çökelek oluşumu (kateşik tanen varlığına işaret eder) olup olmadığı gözlenmiştir.

Daha sonra bu karışım süzülüp, sodyum asetat ile doyurulmuş ve üzerine % 5’lik demir (III) klorür çözeltisi ilave edilmiştir. Mavi-siyah renk (gallik tanen varlığını gösterir) olup olmadığı gözlenmiştir.

3.2.1.5. Alkaloit Aranması

Bir miktar toz edilmiş drog % 3’lük sülfürik asit ile 25 dakika su banyosunda ısıtılarak tüketilmiş, soğuduktan sonra süzülmüştür. Süzüntünün pH’sı % 10’luk amonyak çözeltisi ile alkali hale getirilmiştir. Ayırma hunisinde eterle tüketilmiş, daha sonra eter uçurularak kalan bakiye % 3’lük sülfürik asit ile çözülmüştür.

Asitli çözeltide özel reaktifler ile alkaloit teşhisi yapılmıştır:

i. Dragendorf belirteci ile turuncu-kırmızı çökelek

ii. Bouchardat belirteci ile esmer kırmızı çökelek

iii. Mayer belirteci ile süt rengi çökelek

oluşup oluşmadığı gözlenmiştir.

3.2.1.6. Su Miktar Tayini

Etüvde ve desikatörde bekletilerek sabit vezne getirilip darası alınan cam tartı kabı kullanılmıştır. Cam kap içine 1 g kaba toz edilen drog alınarak tam olarak

62 tartılmıştır. 2 saat süreyle 105˚C’lik etüvde kurutulan drog, desikatörde soğutulup tartılmıştır.

3.2.2. Kromatografik Kontroller

3.2.2.1. Kaba Ayırım

Kuru çiçek ve yapraklar değirmende kaba toz edildikten sonra, ayrı ayrı kartuşlara yerleştirilmiştir. Kartuşlar, Soxhlet cihazında, öncelikle lipofil maddelerin ayrılması için petrol eteri ile tüketilmiştir. Petrol eteri hülasası rotavapor cihazında alçak baskıda yoğunlaştırılmıştır.

Yoğunlaştırılan ekstre, ayırma hunisinde % 60’lık etanolle tüketilmiş, sulu etanollü kısım alınarak rotavapor cihazında yoğunlaştırılmıştır.

Yoğunlaştırılan kısım, lipofil flavonoitlerin elde edilmesi için, ayırma hunisinde kloroform ile tüketilmiştir (A ekstresi).

Petrol eteriyle tüketilmiş olan kartuş, kurutulduktan sonra, Soxhlet apareyinde bu kez % 96’lık etanol ile tüketilmiştir.

Etanollü hülasa rotavapor cihazında yoğunlaştırıldıktan sonra su ile seyreltilerek ayırma hunisinde toluen ile tüketilmiştir.

Sulu kısım ayrılmış ve bu kısım, flavon aglikonları eldesi için ayırma hunisinde kloroform ile tüketilmiştir (B ekstresi).

Kalan sulu kısım etil asetat ile tüketilmiştir. Ayrılan etil asetatlı fazda glikozitler araştırılmıştır (C ekstresi).

Glikozitlerin ayrılabilmesi için:

• Etil asetatlı ekstrenin (C ekstresi), ön ayırım için, silikajel ile vakum likit kromatografisi (VLC) yapılmıştır.

• VLC’de, C ekstresi sırasıyla, petrol eteri-kloroform, kloroform, kloroform- metanol ve metanol ile elüe edilmiştir. Elde edilen fraksiyonlar rotavaporda

63

yoğunlaştırılmış, İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) ile karşılaştırılarak uygun görülen fraksiyonlar birleştirilmiştir.

Bu işlemler 2004 ve 2005’te toplanan materyaller için ayrı ayrı yapılmış, daha sonra her iki yılın birleştirilmiş fraksiyonları İTK’da karşılaştırılarak bazı fraksiyonlar birleştirilmiştir. İlginç bulunan fraksiyonlar preparatif KK ve İTK ile ayrılmıştır.

Son aşamada, Sephadex LH 20 sütun kromatografisi ile temizleme yoluna gidilmiştir. Çözücü olarak metanol kullanılmıştır.

3.2.2.2. O-Glikozitlerinin Teşhisi

Asit hidroliz yöntemi ile, O-glikozitlerinin aglikon ve şeker kısımları ayrılmış, bu kısımlar kromatografik yöntemlerle tayin edilmiştir.

3.2.2.3. Asit Hidroliz Yöntemi

5 mg glikozit, 2-4 ml metanolde çözüldükten sonra 5-7 ml % 6’lık hidroklorik asit ilave edilerek 4,5 saat 100ºC’lik su banyosunda, geri çeviren soğutucu altında hidroliz işlemine tabi tutulmuştur. Bu çözelti soğuduktan sonra küçük ayırma hunisine aktarılarak eterle tüketilmiştir. Eter fazı aglikonlar, sulu faz ise şekerler yönünden kromatografik olarak incelenmiştir.

3.2.2.4. Çözücü Sistemleri

Kromatografik kontroller için kullanılan çözücü sistemleri aşağıdaki tablolarda gösterilmiştir.

Tablo 3-1: Kağıt Kromatografisinde kullanılan çözücü sistemleri.

Aglikon Glikozit Şeker Çözücü Sistemleri Teşhisi Teşhisi Teşhisi

n-Butanol-Asetik Asit-Su (4:1:5) + + +

Asetik asit-Su (15:85) - + -

Asetik asit-Su (40:60) + - -

64

Tablo 3-2: İnce Tabaka Kromatografisinde kullanılan çözücü sistemleri.

Aglikon Glikozit Şeker Çözücü Sistemleri Teşhisi Teşhisi Teşhisi

Etil Asetat-Etil Metil Keton-Formik Asit-Su (5:3:1:1) - + -

Etil Asetat-Formik Asit-Su (8:1:1) - + -

Toluen-Etil Asetat-Formik Asit (5:4:1) + - -

Benzen-Etanol (1:1) + - -

Butanol – İzopropanol – Su (5:3:1) - - +

Kağıt Kromatografisinde, Whatman No.1 ve Schleicher Schüll 3469 kullanılmış ve yükselen usül tekniği uygulanmıştır.

İnce tabaka kromatografisi için, Kieselgel 60 F254 Merck plaklar kullanılmıştır.

3.2.2.5. Kullanılan Belirteçler

a) Flavonoit Belirteçleri:

1. Amonyak buharı

2. NA belirteci (100 mg 2-aminoetildifenil boratın 100 ml metanoldeki çözeltisi)

4. Demir (III) klorür (1 g demir (III) klorürün 100 ml metanoldeki çözeltisi)

3. Serik sülfat

b) Şeker belirteci:

Anilin 0.4 ml

Fosforik asit 2 ml

Timol 2 g

Etanol q.s.p. 150 ml

65

3.2.3. Yapı Tayini

Kromatografik olarak elde edilen maddelerin yapı tayini, UV ve 1H-NMR spektrumları incelenerek ve şahit maddelerle karşılaştırılarak, diğerleri ise İTK ve

KK’da Rf değerleri şahit maddelerle karşılaştırılarak yapılmıştır.

3.2.3.1. UV Spektrumu

Jasco 530 V UV-VIS ve Shimadzu UV-1601 spektrofotometre kullanılmıştır.

Flavon türevlerinin spektrumları 1 cm’lik kuvartz küvetlerde üç aşamada alınmıştır (Mabry ve ark. 1970).

Birinci aşamada :

a) Maddenin metanoldeki çözeltisinin spektrumu alınmıştır (MeOH spektrumu).

b) Maddenin metanoldeki çözeltisinin üzerine 3 damla sodyum metilat çözeltisi eklenerek spektrumu alınmıştır (MeOH + NaOMe spektrumu).

İkinci aşamada :

a) Maddenin metanoldeki çözeltisinin üzerine 6 damla aluminyum klorür

çözeltisi eklenerek spektrum alınmıştır (AlCl3 spektrumu).

b) Aluminyum klorür içeren çözelti üzerine 3 damla hidroklorik asit çözeltisi eklenerek spektrum alınmıştır (AlCl3 + HCl spektrumu).

Üçüncü aşamada:

a) Maddenin metanoldeki çözeltisi sodyum asetat ile doyurularak spektrum alınmıştır (NaOAc spektrumu).

b) Sodyum asetat içeren çözeltiye, sodyum metilat spektrumunun özelliğine göre katı (çözelti doyuncaya kadar) veya çözelti halinde (5 damla) borik asit ilave edilerek spektrum alınmıştır (NaOAc + H3BO3 spektrumu).

66

3.2.3.2. NMR Spektrumu

Spektrum, Mercury-VX 400 BB NMR spektrometresinde dötorometanol

(CD3OD) ve dimetilsülfoksit (DMSO-d6) ile hazırlanan çözeltide alınmıştır.

3.2.4. Antioksidan Aktivite Tayini

Antioksidan aktivite tayininde, T. pratense’ye uyarlanmış ve kırmızı yoncanın etkili bir antioksidan olduğunu ortaya koyan, radikal süpürücü kapasite yöntemi kullanılmıştır (Kroyer 2004). Bu yöntemde, antioksidan özelliği olan maddelerin, güçlü bir serbest radikal olan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) molekülünün eşlenmemiş elektronuna protonlarını vermesinden yararlanılır.

DPPH molekülü, eşlenmemiş elektronu nedeniyle, 515 nm’de mor renk absorpsiyon gösterir. DPPH radikali, antioksidan maddenin protonunu aldığında bu renk sarıya döner. Böylelikle DPPH, DPPH-H molekülüne redüklenmiş olur (Blois 1958, Kaynak: Sözer 2005 s. 54).

Antioksidan aktivite için kurutulmuş, kaba toz edilmiş 5 g çiçek, Soxhlet apareyinde metanol ile tüketilmiştir. Elde edilen ekstre, alçak basınçta yoğunlaştırılmıştır.

Yoğunlaştırılan ekstre, önce liyofilize edilerek kurutulmuştur. Deney yapılıncaya kadar -20˚C’de saklanmıştır.

Metanol ile taze hazırlanmış 0,025 g/l’lik DPPH çözeltisi kullanılmıştır.

Metanol ekstresi (1 g) balonjojede 100 ml’ye tamamlanmıştır (10 mg/ml). Daha sonra gerekli seyreltmeler yapılarak; 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml ve 0,01 mg/ml konsantrasyonlarda çözeltiler hazırlanmıştır. Seyreltilen bu çözeltilerden 0,1 ml alınarak, üzerlerine 2,9 ml DPPH çözeltisi ilave edilmiştir. Çalkalanan bu karışımlar bir saat karanlıkta bekletilmişlerdir.

Jasco 530 UV-VIS Spektrofotometre öncelikle metanolle sıfırlanmış ve antioksidan içermeyen DPPH çözeltisi absorbansı ölçülmüştür (kontrol). 515 nm’de antioksidan içeren, DPPH çözeltisinin absorbansındaki düşüş ölçülmüştür (antioksidan).

Deney her konsantrasyon için üç kez yapılmıştır.

67

Antioksidan etkili askorbik asitin de aynı yöntemle inhibisyonu bulunarak karşılaştırma yapılmıştır.

DPPH konsantrasyonunu % 50 azaltan antioksidan maddenin miktarını gösteren etkin konsantrasyon (EC50), MS-Office Excel programında, konsantrasyon-inhibisyon eğrisi denklemi yardımıyla hesaplanmıştır. EC50 değerinin düşük olması, antioksidan aktivitenin yüksek olduğunu göstermektedir.

DPPH molekülünün inhibisyon yüzdesi şu şekilde hesaplanmaktadır:

A − A % İnhibisyon = C(0) A(t) x100 (3.1) AC(0)

Bu denklemde, Ac(0) t =0 zamanındaki absorbansı, AA(t) ise t=1 saat sonraki absorbansı göstermektedir.

68

4. BULGULAR

4.1. Ön Deneme Sonuçları

T. pannonicum subsp. elongatum bitkisinin yaprak ve çiçek örneklerinden elde edilen fitokimyasal ön denemelerin sonuçları tablo halinde sunulmuştur (Tablo 4-1).

Tablo 4-1: T. pannonicum subsp. elongatum bitkisine ait ön deneme sonuçları.

Ön Deneme Çiçek Yaprak

Flavon + +

Antrasen - -

Saponin - +

Tanen + (Kateşik) -

Alkaloid - -

Su Miktar Tayini % 9,19 % 5,56

69

4.2. Elde Edilen Ekstre Miktarları ve Verim Hesabı

T. pannonicum subsp. elongatum bitkisinin çiçeklerinden elde edilen ekstre miktarları ve verimler, aşağıdaki tablolarda 2004 ve 2005 yılları için ayrı ayrı belirtilmiştir (Tablo 4-2 ve Tablo 4-3)

Tablo 4-2: 2004 yılında toplanan bitkiye ait ekstre miktarları ve elde edilen verimler.

Materyal A Verim B Verim C Verim Miktarı Ekstresi (%) Ekstresi (%) Ekstresi (%) (g) (g) (g) (g) T. pannonicum 73,40 0,8808 1,20 0,2406 0,328 1,4006 1,908 çiçek

Tablo 4-3: 2005 yılında toplanan bitkiye ait ekstre miktarları ve elde edilen verimler.

Materyal A Verim B Verim C Verim Miktarı Ekstresi (%) Ekstresi (%) Ekstresi (%) (g) (g) (g) (g) T. pannonicum 82,50 1,0459 1,267 0,4456 0,540 1,5757 1,910 çiçek

Her iki yılda da en yüksek verim C ekstrelerinden elde edilmiştir.

70

4.3. T. pannonicum subsp. elongatum Çiçeklerinin Etil Asetat Ekstresindeki Maddelerinin Teşhisi ve Ayrılması

Vakum likit kromatografisinde, ekstre üzerinden farklı karışım oranları ile, petrol eteri-kloroform, kloroform, kloroform-metanol ve metanol geçirilerek 150’şer ml’lik fraksiyonlar alınmıştır. Elde edilen fraksiyonlar, İTK ile, etil asetat-etil metil keton-formik asit-su (5:3:1:1) sisteminde karşılaştırılarak benzer görünenler birleştirilmiştir.

4.3.1. Silikajel VLC’den Elde Edilip Birleştirilen Fraksiyonların Miktarları

Silikajel VLC’den elde edilip birleştirilen fraksiyonların miktarları, aşağıdaki tablolarda 2004 ve 2005 yılları için ayrı ayrı belirtilmiştir (Tablo 4-4 ve Tablo 4-5).

Tablo 4-4: 2004 yılına ait VLC fraksiyon miktarları.

Fraksiyonlar Toplam Miktar (g)

1-10 0,1199

11-13 0,7002

14-17 0,2987

18-22 0,1066

23-24 0,0227

25-27 0,0256

28-31 0,0172

32-34 0,0147

35-36 0,0085

37-40 0,0142

41-43 0,0132

44-45 0,0042

46-50 0,0090

71

Tablo 4-5: 2005 yılına ait VLC fraksiyon miktarları.

Fraksiyonlar Toplam Miktar (g)

1-9 0,0629

10 0,0150

11-13 0,6581

14-17 0,6222

18-22 0,1332

23-24 0,0149

25-28 0,0316

29-31 0,0115

33-35 0,0127

36-38 0,0107

39-43 0,0191

44-46 0,0058

Birleştirilen fraksiyonlardan 14-17. fraksiyonlar üzerinde çalışılması uygun görülmüştür.

İlk ayırım preparatif kağıt kromatografisi (KK) ile yapılmıştır. Önce 4:1:5 sistemi ile 7 bant elde edilmiştir (Tablo 4-6).

72

Tablo 4-6: 14-17. fraksiyondan Preparatif KK ile elde edilen ana bantlar.

Bant Miktar UV’de 366 nm’de renk UV’de NA ile 366 nm’de renk

B1 30 mg Açık sarı Açık sarı

B2 40 mg Parlak sarı Parlak sarı

B3 370 mg Kahverengi Sarı

B4 200 mg Kahverengi Sarı

B5 150 mg Parlak mavi Parlak mavi

B6 60 mg Açık mavi Açık mavi

B7 130 mg Sarı Sarı

Daha sonra bu bantlardan B3 bandı, asetik asit-su (15:85) sisteminde preparatif KK ile temizlenmiş ve elde edilen maddenin, Luteolin-7-galaktozit olduğu belirlenmiştir. Maddenin yapısı, UV spektrumu alınarak ve asit hidroliz yapıldıktan sonra hidroliz ürünleri şahitlerle kromatografik olarak karşılaştırılarak doğrulanmıştır.

B4 bandından asetik asit-su (15:85) sistemi ile preparatif KK yapılmış, elde edilen bantlardan, B2’ bandı, Sephadex sütundan geçirilerek temizlenmiştir. Elüsyon metanol ile yapılmış, 4’er ml’lik fraksiyonlar alınmıştır. Fraksiyonlar, etil asetat-etil metil keton-formik asit-su (5:3:1:1) İTK sisteminde karşılaştırılarak, 14-22. fraksiyonlar birleştirilmiştir.

Birleştirilmiş bu fraksiyonlardan elde edilen maddenin Kersetin-3-galaktozit (Hiperozit) olduğu saptanmıştır. Maddenin yapısı UV ve NMR spektrumları alınarak ve asit hidroliz yapıldıktan sonra hidroliz ürünleri şahitlerle kromatografik olarak karşılaştırılarak doğrulanmıştır.

Etil asetat ekstresinin (C) diğer VLC fraksiyonları ise, değişik çözücü sistemleri ile KK ve İTK’da, Rf değerleri, şahitler ile karşılaştırılarak, kromatografik olarak incelenmiş, 11-13. birleştirilmiş fraksiyonda, Kersetin-3-glikozit (İzokersitrin) ve 1-

73

10. birleştirilmiş fraksiyonda, Kersetin kromatografik olarak saptanmıştır (Şekil 4-1, Şekil 4-2 ve Tablo 4-7).

1-10 kersetin luteolin apigenin

Şekil 4-1: Kersetinin kromatografik olarak saptanması (İTK). [Sistem: toluen-etil asetat-formik asit (5:4:1)]

11-13 Kers-3-gl Kemf-3-gl Apig-7-gl

Şekil 4-2: Kersetin-3-glikozitin (izokersitrin) kromatografik olarak saptanması (KK). [Sistem: n-butanol-asetik asit-su (4:1:5)]

74

Tablo 4-7: Elde edilen maddelerin miktarları.

Asit Hidroliz sonrası

Hidroliz Miktar edilen miktar Aglikon Şeker Madde (mg) (mg) (mg) (mg)

Hiperozit (Kersetin-3-galaktozit) 25 7 3,6 3,1 (B4/B2’)

Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) 25 7 3,8 2

75

4.4. Teşhis Edilen Maddelerin Özellikleri

4.4.1. Hiperozit (B4/B2’)

Görünüm:

UV 366 nm’de : mor

UV 366 nm’de amonyak buharı ile: sarı

UV 366 nm’de NA belirteci ile: turuncu

Demir (III) klorür ile: yeşil

UV spektrumu verileri:

Tablo 4-8’de verilmiştir.

Tablo 4-8: Hiperozit (B4/B2’) UV spektrumu verileri.

UV Spektrumu Bant I Bant II Yapı

MeOH 360 257 Flavonol

NaOMe ↑ 411 272 4’ OH

AlCl3 432 274 5 OH

AlCl3+HCl 405 269 Orto dihidroksi var

NaOAc 369 267 7 OH

NaOAc+H3BO3 380 263 Orto dihidroksi var

76

Formül:

OH OH

HO O

O-Galaktoz OH O

UV spektrumları:

Şekil 4-3, Şekil 4-4 ve Şekil 4-5’te gösterilmiştir.

_____ MeOH ------MeOH +NaOMe

Şekil 4-3: Hiperozit (B4/B2’) MeOH / NaOMe UV spektrumu.

77

______AlCl3 ------AlCl3 +HCl

Şekil 4-4: Hiperozit (B4/B2’) AlCl3 / AlCl3 + HCl UV spektrumu.

_____ NaOAc ------NaOAc + H3BO3

Şekil 4-5: Hiperozit (B4/B2’) NaOAc / NaOAc + H3BO3 UV spektrumu.

78

1H-NMR verileri:

Hiperozit (B4/B2’) NMR Spektrumu verileri (CD3OD)

∆ ppm 3,46-4,27 Şeker protonları

5,14 1H, d (8 Hz) Şeker H-1’’ protonu

6,18 1H, d (2,5 Hz) H-6

6,38 1H, d (2,5 Hz) H-8

6,86 1H, d (8,4 Hz) H-5’

7,6 1H, d,d (2,5 Hz; 10,5 Hz) H-6’

7,84 1H, d (2,5 Hz) H-2’

Şekil 4-6: Hiperozit (B4/B2’) 1H-NMR Spektrumu. 79

80

4.4.2. Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’)

Görünüm:

UV 366 nm’de : mor

UV 366 nm’de amonyak buharı ile: sarı

UV 366 nm’de NA belirteci ile: turuncu

Demir (III) klorür ile: yeşil

UV spektrumu verileri:

Tablo 4-9’da verilmiştir.

Tablo 4-9: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) UV spektrumu verileri.

UV Spektrumu Bant I Bant II Yapı

MeOH 350 255 Flavon

NaOMe ↑ 399 266 4’ OH

AlCl3 427 273 Orto dihidroksi var

AlCl3+HCl 388, 362 (om) 272, 295 (om) 5 OH

NaOAc 353 259 7 OR

NaOAc+H3BO3 373 259 Orto dihidroksi var

81

Formül:

OH OH

Galaktoz-O O

OH O

UV spektrumları: Şekil 4-7, Şekil 4-8 ve Şekil 4-9’da gösterilmiştir.

_____ MeOH ------MeOH +NaOMe

Şekil 4-7: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) MeOH / NaOMe UV spektrumu.

82

_____ AlCl3 ------AlCl3 +HCl

Şekil 4-8: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) AlCl3 / AlCl3 + HCl UV spektrumu.

____ NaOAc ----- NaOAc + H3BO3

Şekil 4-9: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) NaOAc / NaOAc + H3BO3 UV spektrumu.

83

1H-NMR verileri:

Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) NMR Spektrumu verileri (DMSO-d6)

∆ ppm

5.06 1H, d (7.2 Hz) Şeker H-1’ protonu

6.42 1H, d (2.0 Hz) H-6

6.71 1H, s H-3

6.76 1H, d (2.0 Hz) H-8

6.88 1H, d (8.0 Hz) H-5’

7.39 1H, d (2.0 Hz) H-2’

7.42 1H, dd (2.0, 8.0 Hz) H-6’

84

Şekil 4-10: Luteolin-7-galaktozit (B3/B2’) 1H-NMR Spektrumu.

86

4.5. Aktivite Tayini Sonuçları

4.5.1. T. pannonicum subp. elongatum Çiçeğinin Antioksidan Aktivite Sonuçları

Tablo 4-10 ve Şekil 4-11’da gösterilmiştir.

Tablo 4-10: T. pannonicum subp. elongatum çiçeğinin antioksidan aktivite sonuçları. Konsantrasyon Ortalama Absorbans İnhibisyon ( mg/ml ) ( nm ) ( % ) 2 0,02444 89,49 1 0,0267 88,51 0,5 0,05577 76,01 0,2 0,124976 46,23 0,1 0,14647 36,98 0,05 0,21698 6,65 0,01 0,22021 5,26

100 90 80 70 60 50 40 nhibisyon (%) nhibisyon

İ 30 20 10 0 00,511,5 2 2,5 Konsantrasyon (mg/ml)

Şekil 4-11: T. pannonicum subp. elongatum çiçeğinin antioksidan aktivite eğrisi.

EC50 = 0,236 mg/ml.

87

4.5.2. Askorbik Asit’in Antioksidan Aktivite Sonuçları

Tablo 4-11ve Şekil 4-12’de gösterilmiştir.

Tablo 4-11: Askorbik asit’in antioksidan aktivite sonuçları. Konsantrasyon Ortalama Absorbans İnhibisyon ( mg/ml ) ( nm ) ( % ) 2 0,01332 93,15 1 0,01341 93,06 0,5 0,01411 92,7 0,2 0,01583 91,83 0,1 0,05856 69,77 0,05 0,13287 31,46 0,01 0,17930 7,52

100 90 80 70 60 50 40 nhibisyon (%) nhibisyon İ 30 20 10 0 00,511,5 2 2,5 Konsantrasyon (mg/ml)

Şekil 4-12: Askorbik asit’in antioksidan aktivite eğrisi.

EC50 = 0,071 mg/ml.

88

Bir literatüre göre EC50 değerinin 0,50 mg/µl’den düşük olan bitkilerin kuvvetli serbest radikal süpürücü etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir (Fenglin ve ark. 2004).

Elde edilen EC50 değeri (0,236 mg/ml) T. pannonicum subsp. elongatum çiçeğinin güçlü antioksidan etkili olduğunu göstermektedir.

89

5. TARTIŞMA

Bu çalışmada, Trifolium cinsinin Türkiye’ye endemik bir taksonu olan ve T. pratense ile aynı seksiyonda (sect. Trifolium) bulunan, T. pannonicum subsp. elongatum bitkisinin çiçeklerinden elde edilen etil asetat ekstresi, flavonoitleri açısından incelenmiştir.

Sütun kromatografisi, preparatif KK ve İTK yöntemleri kullanılarak; flavon glikoziti olan luteolin-7-galaktozit ve flavonol glikoziti olan Hiperozit (Kersetin-3- galaktozit) izole edilmiştir. Kersetin ve İzokersitrin (Kersetin-3-glikozit), şahit maddelerle kromatografikv olarak karşılaştırılarak varlıkları saptanmıştır. Elde edilen maddelerin yapısı UV, 1H-NMR spektrumları incelenerek ve şahit maddelerle kromatografik olarak karşılaştırılarak tayin edilmiştir.

Madde Miktar

Hiperozit (Kersetin-3-galaktozit) 25 mg

Luteolin-7-galaktozit 25 mg

İzokersitrin (Kersetin-3-glikozit) Kromatografik teşhis

Kersetin Kromatografik teşhis

Luteolin-7-galaktozit, daha önce Capsella bursa-pastoris (Iurisson 1973; Kaynak: Health Encyclopedia 2006) ve Lonicera japonica (Jun Chen ve ark. 2005; Kaynak: Axterer ve ark. 2006) bitkilerinden elde edilmiştir. Fabaceae familyasından ilk defa bu çalışmada elde edilmiş bulunmaktadır.

Fitoöstrojenik etkili izoflavon glikozitleri ve minör olarak bunların aglikonlarını içeren T. pratense’nin aksine, T. pannonicum subsp. elongatum bitkisinden elde edilen majör maddelerin flavon ve flavonol glikozitleri yapısında olduğu görülmüştür. T. pannonicum subsp. pannonicum ile yapılan çalışmalarda da benzer sonuçlar rapor

90 edilmiştir. Bu alttürün çiçeklerinde saptanan maddeler; hiperozit, kemferol-3-galaktozit, mirisetin-3-galaktozit’tir (Schultz 1971).

DPPH metodu ile yapılan antioksidan aktivite tayini sonucunda, EC50 değeri, 0,236 mg/ml olarak bulunmuş, bitkinin çiçeklerinin güçlü antioksidan aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır.

91

KAYNAKLAR

Abebe, W. (2002). Herbal medication: potential for adverse interactions with analgesic drugs. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 27(6), 391-401.

Adlerkreutz, H., Honjo, H., Higashi, A., Fotsis, T., Hamalainen, E., Hasegawa, T. ve ark. (1991). Urinary excretion of lignans and isoflavonoid phytoestogens in Japanese men and women consuming a traditional Japanese diet. American Journal of Clinical Nutrition, 54, 1093-100.

Agafonova, O.V., Zhmud, E.V., Krogulevich, R.E., Chernikova, T.S. (2002). Flavonoid and protein content and trypsin inhibitor activity in the leaves of Trifolium pannonicum Jacq., grown in Novosibirsk. Rastitel’nye Resursy, 38(1), 86-92.

Argento, A., Tiraferri, E. ve Marzaloni, M. (2000). Oral anticoagulants and medicinal . An emerging interaction. Annali Italiani di Medicina Inerna, 15(2), 139-43.

Atkinson, C., Warren, R.M.L., Sala, E., Dowsett, M., Dunning, A.M., Healey, C.S. ve ark. (2004). Breast Cancer Research, 6, R170-R179.

Axterer M., Müller C. ve Dweck A.C. (2006). Plants presenting special anti-irritant properties. Erişim: 29.07.2006, Personal Care Magazine: http://www.personalcaremagazine.com/story.asp?id=1217

Barnes, S. (2003). Phyto-oestrogens and osteoporosis: what is a safe dose? British Journal of Nutrition, 89, Supplement 1, S101-8.

Baytop, T. (1984). Türkiye’de Bitkiler İle Tedavi. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Yayınları No:3255 – Eczacılık Fakültesi No:40, 423.

Baytop, T. (1997). Türkçe Bitki Adları Sözlüğü. Ankara: TDK Yayınları :578; s. 190, 288.

Beck, V., Unterrieder, E., Krenn, L., Kubelka, W. ve Jungbauer, A. (2003). Comparison of hormonal activity (estrogen, androgen and progestin) of standardized plant extracts for

92

large scale use in hormone replacement therapy. Journal of Steroid Biocmeistry & Molecular Biology, 84, 259-268.

Bruneton, J. (1995). Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Hempshire: Intercept Ltd.; 278.

Chavellier, A. (1996). The Encyclopedia of Medicinal Plants. Milan: New Interlitno; 275.

Clifton-Bligh, P.B., Baber, R.J., Fulcher, G.R., Nery, M.L. ve Moreton, T. (2001). The effect of isoflavones extracted from red clover (Rimostil) lipid and bone metabolism. Menopause, 8(4), 259-65.

Cruz, M.L.A, Wong, W.W, Mimouni, F., Hachey, D.L., Setchell, K.D.R, Klein, P.D. ve ark. (1995). Effects of infant nutrition on cholesterol synthesis rates. Pediatric Research, 35 (2), 135-140.

Davis, P.H., Mill, R.R. ve Tan, K. (1988). Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Vol. 10 (supplement I). Edinburgh: University Press; 126.

Deutsches Arzneibuch 10. (1997). Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag.

Diane, F.B., Hendrich, S. ve Wang, W. (2001). Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacology & Therapeutics, 90, 157-177.

Dornstauder, E., Jisa. E., Unterrieder, I., Krenn, L., Kubelka, W. ve Jungbauer, A. (2001). Estrogenic activity of two standardized red clover extracts (Menoflavon) intended for large scale use in hormone replacement therapy. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 78, 67-75.

Engelhardt, P.F. ve Riedl, C. R. (2004). The effect of an isoflavone extract from red clover on prostate, micturition, sexual function and quality of life. European Urology supplements 3, No. 2, 94.

Evans, W.C. Trease and Evans Pharmacognosy. (15th ed.). (2002). Edinburgh-London- New York-Philadelphia-St. Louis-Toronto: W. B. Saunders; 247.

93

FDA (2006). Food Additive Status List. Erişim: 27.05.2006, http://www.cfsan.fda.gov/~dms/opa-appa.html#ftnT

Fenglin, H., Ruili, L., Bao, H. ve Liang, M. (2004). Free radical scavenging activity of extracts prepared from fresh leaves of selected Chinese medicinal plants. Fitoterapia, 75, 14-23.

Fleming, T. (Chief Ed.). (2000). PDR For Herbal Medicines. (2nd ed.). Montvale, New Jersey: Medical Economics Company.

Foo, L.Y., Lu, Y., Molan, A.L., Woodfield, D.R. ve McNabb, W.C. (2000). The phenols and prodelphinidins of white clover flowers. Phytochemistry, 54(5), 539-548.

Fraishtat, P.D., Popravko, S.A. ve Vul’fson, N.S. (1979). Secondary metabolites of clover. II. Isolation of from the roots of red clover (Trifolium pratense). Bioorganicheskaya Khimiya, 5(2), 228-33.

Fraishtat, P.D., Popravko S.A. ve Vul’fson, N.S. (1981). Secondary metabolites of clover. VIII. Isolation and identification of pterocarpans from the roots of cultured clover species. Bioorganicheskaya Khimiya, 7(6), 927-36.

Fukutake, M., Takahashi, M., Ishida, K., Kawamura, H., Sugimura, T. ve Wakabayashi, K. (1996). Quantification of Genistein and Genistin in Soybeans and Soybean Products. Food and Chemical Toxicology, 34, 457-461

Gill, S. (1963). Chemical composition of Trifolium arvense. II. Paper chromatography of polyphenolic compounds. Dissertationes Pharmaceuticae, 15, 241-9.

Grieve, M. (1980). A Modern Herbal. Middlesex: Penguin Books; 207-208.

Bayfield, A.J. (2000). Trifolium İçinde Güner, A., Özhatay, N., Ekim, T. ve Başer, K.H.C. (Ed). Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Vol. 11 (supplement 2). Edinburgh: University Press; 95.

Hartwell, J.L. (1982). Plants Used Against Cancer A Survey. Massachusetts: Quaterman Publications, Lawrance; s. 115-117.

94

Health Ancyclopedia (2006). Shepherd’s Purse. Erişim: 29.07.2006, http://www.herbalgram.org/iherb/expandedcommissione/he089.asp#ChemPharm

Heck, A.M., DeWitt, B.A. ve Lukes, A.L. (2000). Potential interactions between alternative therapies and warfarin. American Journal of Health- System Pharmacy, 1;57(13),1221-7; quiz 1228-30.

Heywood, V.H. ve Chant, S.R. (Ed.). (1982). Popular Encyclopedia of Plants. Cambridge Universtiy Press; 90-91.

Howes, J.B., Tran, D., Brillante D. ve Howes L.G. (2003). Effects of dietary supplementation with isoflavones from red clover on ambulatory blood pressure and endothelial function in postmenopausal type 2 diabetes. Diabetes, Obesity and Metabolism, Vol. 5, 325.

Huang, S. ve Tu, P. (2004). Isolation and identification of isoflavones from Trifolium pratense. Beijing Daxue Xueabo, Ziran Kexueban, 40(4), 544-549.

Ingham, J.L. (1978). Isoflavonoid and stilbene phytoalexins of the genus Trifolium. Biochemical Systematics and Ecology, 6(3), 217-23.

Jayagopal, V., Albertazzi, P., Kilpatrick, E.S., Howarth, E.M., Jennings, P.E., Hepburn, D.A. ve ark. (2002). Beneficial Effects of Soy Phytoestrogen Intake in Postmenopausal Women with Type 2 Diabetes. Diabetes Care, Vol. 25, 1709-1714.

Kattaev, N.Sh., Kharmalov, I.A., Akhmedkhodzhaeva, N.M., Nikonov, G.K.ve Khalmatov, Kh.Kh. (1972). Trifoside, an isoflavone from Trifolium pratense. Khimiya Prirodnykh Soedinenii,(6), 806-7.

Katz A. (2002). Flavonoid and botanical approaches to prostate health. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 8(6), 813-821.

Kazakov, A.L. (1977). Flavonoids of Trifolium montanum. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, (3), 415-16.

95

Klejdus, B., Vitamvasova, D. ve Kuban, V. (2001). Identification of isoflavone conjugates in red clover (Trifolium pratense) by liquid chromatography-mass spectrometry after two- dimensional solid phase extraction. Analytica Chimica Acta, 450, 81-97.

Krenn, L., Unterrieder, I. ve Ruprechter, R. (2002). Quantification of isoflavones in red clover by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B, 777; 123-128.

Kroyer, G.Th. (2004). Red clover extract as antioxidant active and functional food ingredient. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 5, 101-105.

Lam, A., Demasi, M., James, M., Husband, A. ve Walker, C. (2004). Effect of red clover isoflavones on Cox-2 activity in murine and human monocyte/macrophage cells. Nutrition and Cancer, 49(1), 89-93.

Levy, J.R., Faber, K.A., Ayyash, L. ve Hughes, C.L. (1995). The effect of prenatal exposure to the phytoestrogen genistein on sexual differentiation in rats. Proceedings of the Society Experimental Biology and Medicine, 208, 60-66.

Lin, L., He, X., Lindenmaier, M., Yang, J., Cleary M. ve ark. (2000). LC-MS Study of the Flavonoid Glycoside Malonates of Red Clover (Trifolium pratense). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48(2), 354-365.

Livingstone, A.L. ve Bickoff E.M. (1964). Identification of 3’, 4’, 7-trihydroxyflavone in ladino clover. Journal of Pharmaceutical Sciences, 53(12), 1557.

Mabry, T.J., Markham, K.R. ve Thomas, M.B. (1970). The Systematic Identification of Flavonoids. New York-Heidelberg-Berlin: Springer Verlag.

Madersbacher, S., Ponholzer, A., Schatzl, G., Gsur, A., Haidinger, G., de Vries, C. ve ark. (2003). Phyto-oestrogens in BPH and Prostate Cancer Patients. European Urology Supplements 2, No.1, 36.

96

Mears, J.A. ve Mabry, T.J. (1972). A Procedure For the UV Detection of Hydroxyl and

Methoxyl Groups at C6 in Flavones and 3-O-Substituted Flavonols. Phytochemistry, Vol.11, 411-412.

Matlawska, I., Sikorska, M., Henzel-Malak, K. ve Kowalewski, Z. (1992). Flavonoids in the inflorescences of Trifolium arvense L. (Leguminosae). Herba Polonica, 38(4), 155- 61.

Miletic, S., Milosavljevic, S. ve Vidakovic, M. (1991). The isolation and identification of flavonoids from the leaves of Trifolium pannonicum L. Journal of the Serbian Chemical Society, 56(6), 307-10.

Miletic, S., Milosavljevic, S., Ristic, S. ve Vidakovic, M. (1989). Flavonoids from the flower of Trifolium medium Huds. (Fabaceae). Glasnik na Hemicarite i Tehnolozite na Makedonija, 7, 265-8.

Morton, M.S., Chan, P.S., Cheng, C., Blacklock, N., Matos-Ferreira, A, Abranches- Monterio, L ve ark. (1997). Lignans and isoflavonoids in plasma and prostatic fluid in men: samples from Portugal, Hong Kong and the United Kingdom. Prostate, 32, 122-8.

Mousavi, Y. ve Adlercreutz, H. (1993). Genistein is an effective stimulator of sex hormone-binding globulin production in hepatocarcinoma human liver cancer cells and suppresses proliferation of these cells in culture. Steroids, Vol.58, Issue 7, 301-304.

Nestel, P.J., Pomeroy, S., Kay, S., Komesaroff, P., Behrsing, J., Cameron, J.D. ve ark. (1999). Isoflavones from Red Clover Improve Systemic Arterial Compliance But Not Plasma Lipids in Menopausal Women. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol 84, 895-898

Olescek, W. ve Stochmal, A. (2002). Triterpene saponins and flavonoids in the seeds of Trifolium species. Phytochemistry, 61(2), 165-170.

Olescek, W. ve Stochmal, A. (2002). Triterpene saponins and flavonoids in the seeds of Trifolium species. Phytochemistry, 61, 165-170.

97

Peterson, G. ve Barnes, S. (1991). Genistein inhibition of the growth of human breast cancer cells: Independence from estrogen receptors and the multi-drug resistence gene. Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 179, Issue 1, 661-667.

Ponce, M.A., Scervino, J.M., Erra-Balsells, R., Ocampo, J.A. ve Godeas, A.M. (2004). Flavonoids form the shoots and roots of Trifolium repens (white clover) grown in presence and absence of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices. Phytochemistry, 65(13), 1925-1930.

Pope, G.S., Elcoate, P.V., Simpson, S.A., Andrews, D.G. (1953). Isolation of an estrogenic isoflavone (biochanin A) from red clover. Chemistry &Industry, 1092.

Popravko, S.A., Sokolava, S.A., Kononenko, G.P. (1981). Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya, 17(6), 906-11.

Sachse, J. (1974). Determination of estrogenic isoflavones and coumestrol in clover (Trifolium pratense and Trifolium repens). Journal of Chromatography, 96(1), 123-36.

Sachse, J. (1984). Quantitative high-pressure liquid chromatography of isoflavones in red clover (Trifolium pratense L.). Journal of Chromatography, 298(1), 175-82.

Sakamoto, S, Kofuji, S, Kuroyanagi, M., Ueno, A., Sekita, S. (1992). Saponins from Trifolium repens. Phytochemistry, 31(5), 1773-7.

Saxena, V.K., Jain, A.K., (1986). Genistein 7-(2’’-p-coumaroylglucoside) from Trifolium repens. Phytochemistry, 25(11), 2687-8.

Saxena, V.K., Jain, A.K., (1987). A new isoflavone glycoside from Trifolium pratense. Fitoterapia, 58(4), 262-3.

Schultz, G. (1965). Formononetin 7-glucoside and biochanin A 7-glucoside, two isoflavone glucosides of Trifolium pratense. Naturwissenschaften, 52(18), 517.

Schultz, G. (1971). Flavonol glycosides in flowers of Trifolium pannonicum. Zeitschrift fuer Naturforschung, Teil B: Anorganische Chemie, Organische Chemie, Biochemie, Biophysik, Biologie, 26(9), 972-3.

98

Schultz, G. (1973). Hispidulin-7-glucoside, a minor flavonoid of Trifolium pannonicum L. Planta medica, 23(1), 1-3.

Schultz, G., Boehrer, I., Eichler, S. (1971). Flavones of Trifolium pannonicum. Phytochemistry, 10(12), 3315.

Shalashvili, K.G. (1974). Flavonoids from Trifolium hybridum and Trifolium ambiguum. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, (5), 666.

Shalashvili, K.G. (1975). Flavonoids from Trifolium trichocephalum. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, (5), 653.

Shalashvili, K.G. (1993). Flavonoids of Trifolium echinatum and T. diffusum. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, (3), 468-9.

So, F.V., Guthrie, N., Chambers, A.F. ve Carroll, K.K. (1997). Inhibition of proliferation of estrogen receptor-positive MCF-7 human breast cancer cells by flavonoids in the presence and absence of excess estrogen. Cancer Letters, 112, 127-133.

Sözer, U. (2005). Crataegus davisii Türünün Yapraklarının Flavon Bileşikleri Yönünden Araştırılması. İstanbul Üniversitesi Sağlık bilimleri Enstitüsü, Farmakognozi ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul.

Stuart, M. (1984). Herbs and Herbalism. London: Orbis Ltd.; 274.

Tarr, F. (1993). Isoflavone glycosides and flavonol glycosides of Trifolium striatum L. Magyar Kemiai Folyoirat, 99(3), 89-92.

Tice, J.A., Ettinger, B., Ensrud, K., Wallace, R., Blackwell, T. ve Cummings, S.R. (2003). Phytoestrogen Supplements for the Treatment of Hot Flashes: The Isoflavone Clover Extract (ICE) Study: A Randomized Controlled Trial. The Journal of the American Medical Association, 290, 207-214.

Torck, M., Pinkas, M. ve Bezanger-Beauquesne, L. (1973). Flavonoid heterosides of Trifolium alpinum and T. rubens. Bulletin de la Societe de Pharmacie de Lille, (2/3), 113- 16.

99

Tsunoda, N., Pomeroy, S. ve Nestel, P. (2002). Absorption in Humans of Isoflavones from Soy and Red Clover Is Similar. Journal of Nutrition, 132, 199-201.

Ueda, M., Kasai, T., Sakamura, S. ve Sakata, K. (1973). Myricetin 3-galactoside, myricetine, and quercetin from the seeds of Ladino clover, (T. repens var. giganteum). Journal of the Collage of Dairy Agriculture. 5(1), 7-14.

Ulkay, M.B. (2005). Estradiol ve Trifolium pratense’nin (Red Clover) Sıçan Testisleri Üzerine Etkisi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilmleri Enstitüsü Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, İstanbul.

Upmalis, D.H., Lobo, R., Bradley, L., Warren, M., Cone, F.L. ve Lamia, C.A. (2000). Vasomotor symptom relief by soy isoflavone extract tablets in postmenopausal women: A multicenter, doubleblind, randomized, placebo controlled study. Menopause, 7(4), 236- 42.

Van de Weijer, P.H. ve Barentsen, R. (2002). Isoflavones from red clover (Promensil) significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared with placebo. Maturitas, 42 (3), 187-93.

Vetter, J. (1995). Isoflavones in Different Parts of Common Trifolium species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43(1), 106-8.

Wende, K., Krenn, L., Unterrieder, I. ve Lindequist, U. (2004). Red clover extracts stimulate differentiation of human osteoblastic osteosarcoma HOS58 cells. Planta Medica, 70(10), 1003-1005.

Wu, Q., Wang, M. ve Simon, J.E. (2003). Determination of isoflavones in red clover and related species by high-performance liquid chromatography combined with ultraviolet and mass spectrometric detection. Journal of Chromatography A. 1016(2), 195-209

Zhan, Q., Xia, Z., Wang, J., Lao, A. (2003). Two new bicoumarins from Trifolium repens L. Journal of Asian Natural Products Research, 5(4), 303-306.

100

Zohary, M. (1970). Trifolium İçinde Davis, P.H. (Ed.) Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Vol. 3. Edinburgh: University Press; 384-448.

Personal Care (2006). Plants presenting special anti-irritant properties. Erişim: 29.07.2006, http://www.personalcaremagazine.com/story.asp?id=1217

101

ÖZGEÇMİŞ

Kişisel Bilgiler Adı F. Yasemin Soyadı BELGE Doğ.Yeri İSTANBUL Doğ.Tar. 15.01.1976 Uyruğu T.C. TC Kim No 438 734 07 118 Email [email protected] Tel 0216 385 13 21

Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı Mez. Yılı Yük.Lis. Eczacılık Fakültesi, İstanbul Üniversitesi 2006 Lisans Eczacılık Fakültesi, İstanbul Üniversitesi 1997 Lise Hüseyin Avni Sözen Anadolu Lisesi 1993

İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın) Görevi Kurum Süre (Yıl - Yıl) 1. Ruhsatlandırma Uzmanı Wella Kozmetik San. ve Tic. A.Ş. 2003 - ...... Schering Alman İlaç ve Ecza Tic. Ltd. 2. Ruhsatlandırma Sorumlusu 1999 - 2003 Şti. Sebamed-Uçkan Medikal San. ve Tic. 3. Ürün Sorumlusu 1997 - 1998 Ltd. Şti.

(İ.Ü. Yabancı Yabancı Okuduğunu KPDS/ÜDS Diller Bölümü Konuşma* Yazma* Dilleri Anlama* Puanı Sınavı) Puanı İngilizce Çok iyi Çok iyi Çok iyi - 89 Almanca Orta Zayıf Zayıf - - *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin

Sayısal Eşit Ağırlık Sözel LES Puanı 55,755 58,240 60,725 (Diğer) Puanı - - -

Bilgisayar Bilgisi Program Kullanma becerisi MS Office Word, Power Point, Excel İyi Lotus Notes İyi

Yayınları/Tebliğleri Sertifikaları/Ödülleri: - Özel İlgi Alanları (Hobileri): Fotoğraf, Müzik

102