Modyfikacje Morfogenezy Lnu Zwyczajnego (Linum Usitatissimum L.) Typu Oleistego I Włóknistego W Kulturach in Vitro
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Uniwersytet w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny Aneta Adamczuk Modyfikacje morfogenezy lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) typu oleistego i włóknistego w kulturach in vitro Rozprawa doktorska Promotor: dr hab. Iwona Ciereszko, prof. UwB Promotor pomocniczy: dr Irena Siegień Białystok, 2017 Serdecznie dziękuję: Pani Promotor, dr hab. Iwonie Ciereszko, prof. UwB oraz dr Irenie Siegień, za niewyczerpane pokłady cierpliwości, bezcenne rady w trakcie wykonywania i redagowania tej pracy. Pani dr Urszuli Kotowskiej i mgr Justynie Kapelewksiej z Zakładu Chemii Środowiska, dr Ewie Olchowik-Grabarek z Zakładu Biofizyki oraz dr Joannie Leśniewskiej za nieocenioną pomoc w trakcie prowadzenia badań oraz cenne wskazówki. Koleżankom z Zakładu Fizjologii Roślin: Bożenie, Ewie, Edycie, Irenie i Oli za pomoc i wsparcie. Rodzicom, Mężowi i Dzieciom za ogromne wsparcie i wyrozumiałość. 2 Autorka rozprawy doktorskiej, Aneta Adamczuk, była stypendystką w ramach projektu pt.: „Stypendia dla doktorantów województwa podlaskiego”, realizowanego na podstawie Umowy o dofinansowanie projektu Instytucji Pośredniczącej w ramach Programu Operacyjnego Kapitał ludzki 2007-2013,nr POKL.08.02.02-20-002/12. Działanie 8.2.Transfer wiedzy, Poddziałanie 8.2.2. Regionalne Strategie Innowacji. 3 Spis treści Wykaz stosowanych skrótów .......................................................................................... 10 1. Wstęp ................................................................................................................ 13 1.1 Morfogeneza w warunkach in vitro .................................................................. 13 1.2 Czynniki wpływające na morfogenezę ............................................................. 17 1.2.1 Rola światła w regulacji morfogenezy roślin ................................................... 17 1.2.2 Rola węglowodanów w kulturach in vitro ........................................................ 21 1.2.3 Rola hormonów i regulatorów wzrostu w procesie morfogenezy w warunkach in vitro ............................................................................................ 24 1.3 Działanie abiotycznych czynników środowiskowych na proces morfogenezy 31 1.4 Reaktywne formy tlenu (ROS) w procesie organogenezy w warunkach in vitro ................................................................................................................... 33 1.4.1 Rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro ............................................ 36 1.4.2 Sygnalna rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro ............................. 37 1.5 Regulacja procesów wzrostowych i morfogenetycznych przez tlenek azotu (NO) .................................................................................................................. 38 2 Założenia i cel pracy ......................................................................................... 43 3 Materiał i metody .............................................................................................. 46 3.1 Materiał doświadczalny .................................................................................... 46 3.1.1 Charakterystyka gatunku badawczego ............................................................. 46 3.2 Sterylizacja i kiełkowanie nasion lnu ............................................................... 48 3.2.1 Sterylizacja nasion ............................................................................................ 48 3.2.2 Warunki kiełkowania nasion ............................................................................ 48 3.3 Skład podłoży hodowlanych oraz warunki wzrostu kultur in vitro .................. 49 3.3.1 Skład i przygotowanie podłoży do wzrostu kultur in vitro .............................. 49 3.3.2 Badanie oddziaływania wybranych cytokinin i auksyn na proces organogenezy .................................................................................................... 51 3.3.3 Badanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność procesu organogenezy .................................................................................................... 51 3.3.4 Warunki wzrostu eksplantatów ........................................................................ 52 3.4 Badanie wpływu stresu osmotycznego na proces organogenezy ..................... 52 3.5 Badanie wpływu nitroprusydku sodu (SNP) na proces organogenezy ............. 54 3.5.1 Badanie wpływu SNP dodanego bezpośrednio do pożywki na organogenezę 54 3.5.2 Badanie wpływu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na organogenezę .................................................................................................... 54 3.6 Badanie wpływu c-PTIO (ang. 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide) na proces organogenezy w 4 kulturach in vitro poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP ................................................................................................... 56 3.7 Analiza wzrostu materiału doświadczalnego ................................................... 57 3.8 Analiza mikroskopowa początkowych etapów organogenezy pędowej i korzeniowej w hipokotylach lnu zwyczajnego ................................................. 58 3.9 Oznaczanie zawartości barwników fotosyntetycznych .................................... 59 3.10 Oznaczanie natężenia fotosyntezy netto i oddychania ciemniowego ............... 60 3.11 Izolacja i identyfikacja związków chemicznych przy użyciu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) .......................................................... 60 3.11.1 Izolacja lotnych związków organicznych (LZO) w kulturach pędowych lnu zwyczajnego z wykorzystaniem mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME) ............................................................................................................. 60 3.11.2 Izolacja związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur pędowych lnu zwyczajnego .............................................................................. 61 3.11.3 Identyfikacja otrzymanych związków .............................................................. 62 3.12 Oznaczanie zawartości białka w ekstrakcie enzymatycznym .......................... 62 3.13 Oznaczanie zawartości metabolitów wtórnych ................................................ 63 3.13.1 Oznaczanie zawartości antocyjanów i związków fenolowych ......................... 63 3.13.2 Oznaczanie zawartości związków polifenolowych i tanin ............................... 63 3.14 Oznaczenia parametrów stresu oksydacyjnego ................................................ 64 3.14.1 Oznaczanie zawartości H2O2 ............................................................................ 64 3.14.2 Oznaczanie zawartości produktów peroksydacji lipidów reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) ................................................................. 65 3.15 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej oraz aktywności enzymów antyoksydacyjnych ........................................................................................... 66 3.15.1 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania zdolności przeciwwolnorodnikowej na zasadzie redukcji stabilnego wolnego rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.) ............................................... 66 3.15.1.1 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej na zasadzie redukcji stabilnego wolnego rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.) . 66 3.15.2 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) ....................................... 67 3.15.2.1 Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) ............................ 67 3.15.2.2 Oznaczanie aktywności katalazy (CAT) .......................................................... 67 3.16 Analiza statystyczna wyników ......................................................................... 68 4 Wyniki .............................................................................................................. 69 4.1 Wzrost kultur oraz organogeneza pędowa w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) w zależności od rodzaju pożywki ...... 69 5 4.2 Wzrost kultur oraz organogeneza korzeniowa w kulturach in vitro lnu zwyczajnego w zależności od rodzaju pożywki ............................................... 72 4.3 Wpływ wybranych auksyn i cytokinin na proces organogenezy ..................... 75 4.3.1 Oddziaływanie wybranych cytokinin na organogenezę pędową lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) ............................................................ 75 4.3.2 Oddziaływanie wybranych auksyn na organogenezę korzeniową lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) ............................................................ 81 4.4 Wpływ wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność procesu organogenezy .................................................................................................... 87 4.4.1 Oddziaływanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność organogenezy pędowej ..................................................................................... 87 4.4.2 Oddziaływanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność organogenezy korzeniowej ............................................................................... 90 4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) w pierwszym tygodniu wzrostu kultur in vitro (analiza anatomiczna) ....... 94 4.5.1