ΑΡΗ΢ΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗ΢ΣΖΜΗΟ ΘΔ΢΢ΑΛΟΝΗΚΖ΢ ΢ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗ΢ΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ΢ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΢ΠΟΤΓΧΝ ΔΦΑΡΜΟ΢ΜΔΝΖ ΓΔΝΔΣΗΚΖ ΚΑΗ ΒΗΟΓΗΑΓΝΧ΢ΣΗΚΖ

DNA barcoding ηαπηνπνίεζε εηδψλ ηρζχσλ ησλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Διιάδαο

Μεηαπηπρηαθή Γηπισκαηηθή Δξγαζία

Αιέμαλδξνο Σζνχπαο

Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο: Αιέμαλδξνο Σξηαληαθπιιίδεο

Θεζζαινλίθε, 2018

ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY MASTER’S DEGREE PROGRAM APPLIED GENETICS AND BIODIAGNOSIS

DNA barcoding identification of Greek freshwater fish species

MSc Diploma Thesis

Alexandros Tsoupas

Supervisor Professor: Alexandros Triantafyllidis

Thessaloniki, 2018

Πίνακας περιεχομένων ΠΡΟΛΟΓΟ΢ ...... 1 ΠΔΡΗΛΖΦΖ ...... 3 ABSTRACT ...... 5 1.ΔΗ΢ΑΓΧΓΖ ...... 7 1.1 Βηνπνηθηιφηεηα ...... 9 1.2 Ζ έλλνηα ηνπ είδνπο ζηελ ηαμηλνκία ...... 9 1.3 Γελεηηθή ηαπηνπνίεζε εηδψλ...... 10 1.3.1 Γελεηηθνί δείθηεο ...... 11 1.3.2 Μηηνρνλδξηαθφ DNA ...... 11 1.4 DNA barcoding ...... 13 1.5 Γελεηηθή απφζηαζε θαη DNA barcoding gap ...... 16 1.6 Πξνεγνχκελε έξεπλα ...... 17 1.7 ΢θνπφο ηεο εξγαζίαο ...... 19 2. ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ ...... 21 2.1 ΓΔΗΓΜΑΣΑ ...... 23 2.2 ΑΠΟΜΟΝΧ΢Ζ ΓΔΝΧΜΗΚΟΤ DNA ...... 23 2.2.1 Απνκφλσζε DNA κε ρξήζε Υισξνθνξκίνπ-CTAB ...... 23 2.2.2 Έιεγρνο απνκνλσκέλνπ DNA ...... 24 2.3 ΑΛΤ΢ΗΓΧΣΖ ΑΝΣΗΓΡΑ΢Ζ ΠΟΛΤΜΔΡΑ΢Ζ΢ (PCR) ...... 25 2.3.1 Γεληθά ...... 25 2.3.2 Δλίζρπζε ηνπ γνληδίνπ COI κε ρξήζε PCR ...... 28 2.4 ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ ...... 29 2.4.1 Γεληθά ...... 29 2.4.2 Αιιεινχρηζε ηνπ γνληδίνπ COI ...... 30 2.5 ΑΝΑΛΤ΢Ζ ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΧΝ ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ΢...... 31 2.5.1 Έιεγρνο θαη επεμεξγαζία ησλ αιιεινπρηψλ ...... 31 2.5.2 Φπινγελεηηθή αλάιπζε θαη αμηνιφγεζε ησλ DNA Barcodes ...... 32 3. ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΑ-΢ΤΕΖΣΖ΢Ζ ...... 35 3.1 ΑΠΟΜΟΝΧ΢Ζ ΓΔΝΧΜΗΚΟΤ DNA ...... 37 3.2 ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΑ PCR ΚΑΗ ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ΢ ...... 38 3.3 ΦΤΛΟΓΔΝΔΣΗΚΖ ΑΝΑΛΤ΢Ζ ...... 39 3.3.1 Γέλνο Alburnoides ...... 39 3.3.2 Γέλνο Alburnus ...... 42 3.3.3 Γέλνο Barbus ...... 46 3.3.4 Γέλνο Carassius ...... 52 3.3.5 Γέλνο Chondrostoma ...... 53 3.3.6 Γέλνο Cobitis ...... 55

3.3.7 Γέλνο Cyprinus ...... 57 3.3.8 Γέλνο Economidichthys ...... 58 3.3.9 Γέλνο Gambusia ...... 60 3.3.10 Γέλνο Gasterosteus ...... 61 3.3.11 Γέλνο Gobio ...... 62 3.3.12 Γέλνο Lepomis ...... 64 3.3.13 Γέλνο Luciobarbus ...... 65 3.3.14 Γέλνο Oxynoemacheilus ...... 67 3.3.15 Γέλνο Pachychilon ...... 69 3.3.16 Γέλνο Pelasgus ...... 70 3.3.17 Γέλνο Petroleuciscus ...... 73 3.3.18 Γέλνο Pseudorasbora ...... 74 3.3.19 Γέλνο Rhodeus ...... 74 3.3.20 Γέλνο Sabanejewia ...... 77 3.3.21 Γέλνο Salmo ...... 78 3.3.22 Γέλνο Squalius ...... 79 3.3.23 Γέλνο Telestes ...... 85 3.3.24 Γέλνο Vimba ...... 88 3.4 Μέζεο γελεηηθέο απνζηάζεηο ...... 89 3.5 Δθηίκεζε ηεο απνηειεζκαηηθφηεηαο ηνπ DNA barcoding ...... 91 4. ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ ...... 95 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Α ...... 107 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Β ...... 125 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Γ ...... 126

ΠΡΟΛΟΓΟ΢

Ζ παξνχζα δηπισκαηηθή εξγαζία πξαγκαηνπνηήζεθε θαηά ηελ πεξίνδν 2015-2017, ζηνλ ηνκέα Γελεηηθήο, Αλάπηπμεο θαη Μνξηαθήο Βηνινγίαο ηνπ ηκήκαηνο Βηνινγίαο ηνπ Αξηζηνηειείνπ Παλεπηζηεκίνπ Θεζζαινλίθεο, ππφ ηελ επίβιεςε ηνπ Αλαπιεξσηή Καζεγεηή ηνπ ηκήκαηνο, Αιέμαλδξνπ Σξηαληαθπιιίδε. Καηά ηελ δηάξθεηά ηεο, ε ζπλεξγαζία κνπ κε ηα ππφινηπα κέιε ηνπ εξγαζηεξίνπ ζεσξψ πσο ππήξμε άςνγε θαη γηα απηφ ζα ήζεια λα ηνπο επραξηζηήζσ.

Πξσηίζησο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηνλ θχξην Αιέμαλδξν Σξηαληαθπιιίδε, γηα ην γεγνλφο φηη κε επέιεμε γηα απηήλ ηελ εξγαζία θαη κνπ εκπηζηεχζεθε ηελ δηεθπεξαίσζή ηεο. Σνλ επραξηζηψ επίζεο γηα ηελ θαζνδήγεζε θαη ηηο ζπκβνπιέο ηνπ θαζ’ φιε ηελ δηάξθεηα ηεο πξαγκαηνπνίεζεο θαη ζπγγξαθήο ηεο εξγαζίαο, ηηο δηνξζψζεηο θαη ηελ θαηαλφεζή ηνπ ζε φια ηα ιάζε θαη ηηο παξαιήςεηο κνπ.

Αθφκα, επραξηζηψ ηελ θπξία Γήκεηξα Μπφκπνξε, Δπίθνπξε Καζεγήηξηα ηνπ Σκήκαηνο Βηνινγίαο ηνπ Α.Π.Θ., ηνλ θχξην Μάλν Κνπηξάθε, Σαθηηθφ Δξεπλεηή ζην Ηλζηηηνχην Αιηεπηηθήο Έξεπλαο (ΗΝΑΛΔ), ηνλ θχξην Ησάλλε Λενλάξδν, Καζεγεηή ζην Παλεπηζηήκην ησλ Ησαλλίλσλ (ΠΗ) θαη ηηο εξεπλεηηθέο ηνπο νκάδεο, κεηαμχ απηψλ ηελ Όιγα Πεηξίθε, ηνλ Μαλψιε Σζαθνχκε, ηνλ Αξγχξε ΢απνπλίδε θαη ηνλ Ηεξεκία Υνπζίδε γηα ηηο πξνζπάζεηεο πνπ θαηέβαιαλ ψζηε λα καο πξνκεζεχζνπλ κε δείγκαηα, γηα ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ δεηγκάησλ θαη γηα ην ελδηαθέξνλ πνπ έδεημαλ γηα ηελ εξγαζία θαζ’ φιε ηελ δηάξθεηά ηεο.

Δπραξηζηψ ηδηαίηεξα θαη ηελ Νηθνιέηα Καξαΐζθνπ, Γηδάθηνξα ηνπ Σκήκαηνο Βηνινγίαο ηνπ Α.Π.Θ., ηνλ Κψζηα Γθαγθαβνχδε θαη ηελ ΢ηπιηαλή Μελνχδε γηα ηηο ζπκβνπιέο ηνπο θαη ηελ πξνζπκία ηνπο λα βνεζήζνπλ ζε θάζε πξφβιεκα πνπ παξνπζηαδφηαλ.

Έλα κεγάιν επραξηζηψ νθείισ ζηε ΢νθία Παπαβαζηιείνπ, πξνπηπρηαθή θνηηήηξηα, ε νπνία πξαγκαηνπνίεζε ηε δηπισκαηηθή ηεο εξγαζία ηελ ίδηα πεξίνδν κε εκέλα, ζην ίδην εξγαζηήξην, ππφ ηελ επίβιεςε ηνπ θπξίνπ Σξηαληαθπιιίδε. Γεδνκέλνπ φηη ηα ζέκαηα ησλ εξγαζηψλ καο ήηαλ ζηελά ζπλδεδεκέλα, πνιιέο δηαδηθαζίεο ζην εξγαζηήξην πξαγκαηνπνηήζεθαλ απφ θνηλνχ θαη ε ζπλεξγαζία καο ήηαλ ζπλερήο. Σελ επραξηζηψ ινηπφλ γηα ηε ζπκβνιή ηεο ζηελ πξαγκαηνπνίεζε ηνπ εξγαζηεξηαθνχ θνκκαηηνχ ηεο εξγαζίαο κνπ θαη γηα ηελ παξέα ηεο, φιεο ηηο ψξεο πνπ πεξάζακε ζην εξγαζηήξην.

Σέινο, επραξηζηψ ηα ππφινηπα κέιε ηνπ εξγαζηεξίνπ, θαζψο ε ζπλχπαξμή καο ζην εξγαζηήξην ππήξμε αξκνληθή θαη ε παξέα ηνπο ήηαλ ηδηαίηεξα επράξηζηε.

1

ΠΔΡΗΛΖΦΖ

Ζ θαηάηαμε ησλ νξγαληζκψλ ζε είδε, έρεη απνηειέζεη ζέκα εθηελψλ ζπδεηήζεσλ, ηδηαίηεξα θαηά ηνλ 20ν αηψλα θαη γηα πνιιά ρξφληα βαζηδφηαλ ζε κνξθνινγηθνχο, αλαηνκηθνχο, εζνινγηθνχο θαη γεσγξαθηθνχο ραξαθηήξεο. Σηο ηειεπηαίεο δεθαεηίεο, κε ηε ξαγδαία αλάπηπμε ηεο κνξηαθήο βηνινγίαο ρξεζηκνπνηνχληαη θαη κνξηαθνί ραξαθηήξεο, κε ηε ρξήζε γελεηηθψλ ραξαθηήξσλ λα θεξδίδεη ζηαζεξά έδαθνο. Ζ πξνζέγγηζε ηνπ DNA barcoding πξνηείλεη ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ νξγαληζκψλ κέζσ ηεο αιιεινπρίαο κίαο ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρήο ηνπ γνληδηψκαηφο ηνπο, ε νπνία γηα ηα δψα είλαη ην κηηνρνλδξηαθφ γνλίδην ηεο ππνκνλάδαο 1 ηεο νμεηδάζεο ηνπ θπηνρξψκαηνο c (COI). Παξάιιεια νη αιιεινπρίεο πνπ πξνθχπηνπλ απφ ηελ εθαξκνγή ηνπ DNA barcoding επηηξέπνπλ θπινγελεηηθέο αλαιχζεηο, νη νπνίεο ζπρλά νδεγνχλ ζηελ επηβεβαίσζε ή ακθηζβήηεζε ηεο ηζρχνπζαο θαηάζηαζεο ζηε ζπζηεκαηηθή θαηάηαμε ησλ νξγαληζκψλ. Μέρξη ζηηγκήο ε κέζνδνο έρεη εθαξκνζηεί ζε πιήζνο εξεπλψλ, ηα απνηειέζκαηα ησλ νπνίσλ θαίλεηαη λα επηβεβαηψλνπλ ηελ απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ DNA barcoding, νδεγψληαο παξάιιεια ζε κία δηαπίζησζε: φηη γηα λα είλαη απνηειεζκαηηθή ε κέζνδνο απαηηεί φζν ην δπλαηφλ πεξηζζφηεξεο αιιεινπρίεο απφ νιφθιεξν ην εχξνο εμάπισζεο ηνπ θάζε νξγαληζκνχ.

΢ηφρνο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ήηαλ ε κειέηε εηδψλ ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηνπ Διιαδηθνχ ρψξνπ, κε ζθνπφ ηε δεκηνπξγία DNA barcodes, ζπκβάιινληαο ζηνλ εκπινπηηζκφ ησλ βάζεσλ δεδνκέλσλ θαη ζηε βειηίσζε ηεο απνηειεζκαηηθφηεηαο ηνπ DNA barcoding, αιιά θαη ζηε κειέηε ηεο βηνπνηθηιφηεηαο ησλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Διιάδαο, ειπίδνληαο πσο ηα δεδνκέλα απηά ζα θαλνχλ ρξήζηκα ζηε δηαηήξεζε θαη δηαρείξηζε ησλ πιεζπζκψλ ηνπο.

΢ηα πιαίζηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, απνκνλψζεθε DNA απφ 406 άηνκα ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ πνπ αλήθαλ ζπλνιηθά ζε 39 είδε θαη 24 γέλε. Απφ απηά αιιεινπρήζεθε έλα ηκήκα 624 βάζεσλ απφ ην 5’ άθξν ηνπ γνληδίνπ COI. Οη αιιεινπρίεο απηέο ρξεζηκνπνηήζεθαλ καδί κε 599 ήδε ππάξρνπζεο αιιεινπρίεο πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηε βάζε δεδνκέλσλ BOLD, γηα ηελ θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ γηα ην θάζε γέλνο θαη ηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κεηαμχ ησλ αηφκσλ. Μέζσ απηψλ εθηηκήζεθε θαηά πφζν κπνξνχλ ηα είδε απηά λα δηαρσξηζηνχλ κέζσ DNA barcoding θαη έγηλαλ πξνηάζεηο γηα ηελ πεξαηηέξσ κειέηε εηδψλ πνπ παξνπζίαδαλ ελδηαθέξνλ. Δλ γέλεη, ε κέζνδνο θξίζεθε απνηειεζκαηηθή γηα ην κεγαιχηεξν κέξνο ησλ ππφ κειέηε εηδψλ, παξαηεξήζεθαλ κάιηζηα πέληε πεξηπηψζεηο, φπνπ νκάδεο αηφκσλ πνπ αλήθαλ ζην ίδην είδνο, παξνπζίαδαλ κεηαμχ ηνπο κεγάιε γελεηηθή απφζηαζε πνπ ζα δηθαηνινγνχζε ην δηαρσξηζκφ ηνπο ζε δηαθνξεηηθά είδε. Δπίζεο βξέζεθαλ είθνζη δχν πεξηπηψζεηο πνπ ηα άηνκα ελφο είδνπο ζε κία ζπγθεθξηκέλε πεξηνρή παξνπζίαδαλ κφλν απινηχπνπο κνλαδηθνχο γηα απηήλ ηελ πεξηνρή, επηηξέπνληαο έηζη ηελ έληαμε ελφο αηφκνπ πνπ θέξεη ηνλ απιφηππν απηφ φρη κφλν ζε έλα είδνο, αιιά θαη ζε έλα ζπγθεθξηκέλν πιεζπζκφ. Παξαηεξήζεθαλ φκσο θαη επηά πεξηπηψζεηο ζηελά ζπγγεληθψλ εηδψλ ηα νπνία ήηαλ πην δχζθνιν λα δηαθνξνπνηεζνχλ κέζσ ησλ αιιεινπρηψλ ηνπ γνληδίνπ COI. Γηα ηα είδε απηά πξνηάζεθε ε πεξαηηέξσ κειέηε ηνπο, ηφζν ζε γελεηηθφ φζν θαη ζε κνξθνινγηθφ επίπεδν, γηα ηε δηαιεχθαλζε ησλ κεηαμχ ηνπο ζρέζεσλ, αλ δειαδή πξφθεηηαη πξάγκαηη γηα μερσξηζηά είδε ή αλ είλαη ζπλψλπκα είδε.

3

ABSTRACT

The classification of organisms into species has been the subject of extensive discussions, especially during the 20th century. This classification was based, for many years, on morphological, anatomical, ethological and geographic markers. In the last decades, with the rapid growth of molecular biology, molecular markers are also used, with genetic markers steadily gaining ground. The DNA barcoding approach suggests the identification of organisms through the sequence of a specific region of their genome, which for the animals is the cytochrome c oxidase subunit I (COI) mitochondrial gene. At the same time, the sequences resulting from the application of DNA barcoding allow phylogenetic analyzes, which often lead to the confirmation or questioning of the current status in the systematic classification of organisms. So far, the method has been applied to a number of studies, the results of which seem to confirm the effectiveness of DNA barcoding, while leading to the conclusion that, in order to be effective, the method requires as many sequences as possible from across the dispersion range of each organism.

The aim of the present study was to study the fish species of inland waters in Greece in order to create DNA barcodes for them, contributing to the enrichment of the databases and the improvement of the efficiency of DNA barcoding, as well as to study the fish biodiversity of internal waters in Greece, hoping that these data will be useful for species conservation and management.

In the context of this study, DNA was extracted from 406 freshwater fish species that consisted of 39 species and 24 genera. From these, a 624 base fragment from the 5’ end of the COI gene was sequenced. These sequences were used together with 599 already existing sequences recovered from the BOLD database, for the construction of phylogenetic trees for each genus, and the calculation of the genetic distances between individuals. Through them, it was assessed whether these species could be separated by DNA barcoding and suggestions were made to further study species of interest. In general, the method was found to be effective for most of the studied species, and five cases were observed, where groups of individuals belonging to the same species showed a large genetic distance between them that would justify their separation into different species. Also, twenty two cases were found that individuals of a species in a particular region showed only haplotypes unique to this region, thus allowing an individual whoν carries this haplotype to be placed not only in a species but also in a particular population. However, seven cases of closely related species that were more difficult to differentiate through the sequences of the COI gene were observed. For these species, further study was proposed, both on genetic and morphological level, to elucidate the relationships between them, whether they are indeed separate but closely related species or if they are synonym species.

5

1.ΔΗ΢ΑΓΧΓΖ

1.1 Βιοποικιλόηηηα

Ζ βηνπνηθηιφηεηα είλαη ε πνηθηιία ηεο δσήο ζηνλ πιαλήηε θαη πεξηιακβάλεη φινπο ηνπο νξγαληζκνχο, ηα είδε θαη ηνπο πιεζπζκνχο, ηε γελεηηθή πνηθηινκνξθία κεηαμχ απηψλ θαη ηηο ζχλζεηεο ζπλαζξνίζεηο ηνπο ζε θνηλφηεηεο θαη νηθνζπζηήκαηα H βηνπνηθηιφηεηα απνηειεί έλαλ θαζνξηζηηθφ παξάγνληα γηα ηελ ιεηηνπξγία θαη ηελ απνδνηηθφηεηα ελφο νηθνζπζηήκαηνο (Chapin 1997), ελψ παξάιιεια δηαδξακαηίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ παξαγσγή αγαζψλ θαη έρεη κεγάιεο νηθνλνκηθέο επηπηψζεηο ζηηο αλζξψπηλεο θνηλσλίεο (Gamfeldt et al. 2008). Σα ηειεπηαία ρξφληα πιεζψξα αλζξψπηλσλ δξαζηεξηνηήησλ νδεγεί ζε θαηαζηξνθή πνιιψλ νηθνζπζηεκάησλ θαη θαηά ζπλέπεηα ζηελ απψιεηα βηνπνηθηιφηεηαο κε ηελ εμαθάληζε κεγάινπ αξηζκνχ εηδψλ (Ceballos et al. 2015). Οη ζπλέπεηεο ηεο νηθνινγηθήο απηήο θαηαζηξνθήο είλαη απξφβιεπηεο θαη πηζαλφλ θαηαζηξνθηθέο γηα ην αλζξψπηλν είδνο (Jenkins 2003). Ζ δηαηήξεζε, ινηπφλ, ηεο βηνπνηθηιφηεηαο θαη ε δηαρείξηζή ηεο ραξαθηεξίζηεθαλ σο ζέκαηα δσηηθήο ζεκαζίαο (Baker 1994). Καζψο ε βηνπνηθηιφηεηα ζρεηίδεηαη άκεζα κε ηνλ αξηζκφ εηδψλ πνπ δηαβηνχλ ζε κία πεξηνρή (Gray 1997), ε δηαρείξηζε θαη ε δηαηήξεζή ηεο απαηηνχλ ηε δπλαηφηεηα δηαρσξηζκνχ ησλ εηδψλ.

Ζ Διιάδα απνηειεί κία απφ ηηο ιίγεο ρψξεο ηεο Δπξψπεο, ε νπνία δηαζέηεη ηφζν κεγάιε πνηθηιία εηδψλ ρισξίδαο, παλίδαο θαη ελδηαηηεκάησλ. ΢χκθσλα κε ηα ππάξρνληα ζηνηρεία, ε Διιάδα, παξά ηε κηθξή ηεο έθηαζε, είλαη κία απφ ηηο πινπζηφηεξεο, ζε δσηθά είδε, ρψξα ηεο Δπξψπεο, θαζψο ππνινγίδεηαη φηη ππάξρνπλ ζε απηήλ κεηαμχ 30.000 θαη 50.000 είδε δψσλ απφ ηα νπνία ηα 1.500 είλαη ελδεκηθά (Primack et al. 2004). Όζνλ αθνξά ηνπο ηρζχεο εζσηεξηθψλ πδάησλ, ζηελ Διιάδα έρνπλ πεξηγξαθεί 162 είδε (Economou et al. 2007). Ο αξηζκφο απηφο αλακέλεηαη λα απμεζεί, θαζψο ε ηαμηλνκηθή θαηάηαμε πνιιψλ εηδψλ βξίζθεηαη αθφκε ππφ ζπδήηεζε. Οη ηρζείο έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί σο δείθηεο ηεο πνηφηεηαο ησλ πδάησλ θαη γη απηφ δίλεηαη έκθαζε ζηε ζπιινγή βηνινγηθψλ δεδνκέλσλ θαη ζηε ρξήζε ηνπο ζε πξνγξάκκαηα δηαρείξηζεο, θαη πξνζηαζίαο απεηινχκελσλ εηδψλ, ηα νπνία θαζίζηαληαη απαξαίηεηα ιφγσ αζθνχκελσλ πηέζεσλ, φπσο ε ξχπαλζε ησλ πδάησλ, ν επηξνθηζκφο θαη ε εκθάληζε εηζβνιηθψλ εηδψλ.

1.2 Ζ έννοια ηος είδοςρ ζηην ηαξινομία

Σν εξψηεκα ηη απνηειεί είδνο έρεη απνηειέζεη αληηθείκελν εθηελψλ ζπδεηήζεσλ, θαζ’ φιε ηε δηάξθεηα ηνπ 20νπ αηψλα, κε απνηέιεζκα λα έρνπλ δνζεί πεξηζζφηεξνη απφ δέθα νξηζκνί γη’ απηφ (Claridge et al. 1997). Σα είδε πξνθχπηνπλ κέζσ ηεο ειδογζνεσης, η οποία πξνζδηνξίδεηαη σο ε εμειηθηηθή δηαδηθαζία θαηά ηελ νπνία έλαο πιεζπζκφο απνθιίλεη θαη ζρεκαηίδεη δηαθνξεηηθνχο θαη θαηλνχξηνπο θιάδνπο, ψζπνπ ηειηθά δεκηνπξγνχληαη δηαθνξεηηθά είδε (Staley 2009). ΢ήκεξα επηθξαηήο νξηζκφο γηα ην είδνο είλαη ν βηνινγηθφο νξηζκφο, ζχκθσλα κε ηνλ νπνίν είδνο απνηεινχλ νκάδεο θπζηθψλ πιεζπζκψλ πνπ κπνξνχλ λα αλαπαξαρζνχλ κεηαμχ ηνπο θαη είλαη αλαπαξαγσγηθά απνκνλσκέλεο απφ άιιεο ηέηνηεο νκάδεο (Dobzhansky 1937; Mayr 1942). Δμαηηίαο ηεο αδπλακίαο εθαξκνγήο ηνπ νξηζκνχ απηνχ ζηνπο αθπιεηηθά αλαπαξαγφκελνπο νξγαληζκνχο έρεη πξνηαζεί γη απηνχο ν κνξηαθφο νξηζκφο, ζχκθσλα κε ηνλ νπνίν είδνο ζεσξείηαη έλα ζχλνιν αηφκσλ κε φκνηεο βαζηθέο γνληδησκαηηθέο αιιεινπρίεο DNA.

9

Ζ έλλνηα ηνπ είδνπο ζρεηίδεηαη άκεζα κε ηελ ηαμηλνκία, ηελ θαηάηαμε δειαδή ησλ νξγαληζκψλ ζε έλα ζχζηεκα πνπ εθθξάδεη ηηο κεηαμχ ηνπο ζρέζεηο (Simpson 1961), θαζψο έλαο απφ ηνπο βαζηθνχο ζθνπνχο ηεο ηαμηλνκίαο είλαη ε θαηάηαμε ησλ νξγαληζκψλ ζε είδε. Ζ θαηάηαμε απηή γίλεηαη κε βάζε ηνπο «ηαμηλνκηθνχο ραξαθηήξεο», ραξαθηεξηζηηθά ησλ νξγαληζκψλ πνπ ππνδεηθλχνπλ ηε θπινγελεηηθή ηνπο ζρέζε (Eadie et al. 1953). Οη θχξηεο θαηεγνξίεο ηαμηλνκηθψλ ραξαθηήξσλ είλαη νη κνξθνινγηθνί ραξαθηήξεο, νη θπζηνινγηθνί, νη εζνινγηθνί, νη νηθνινγηθνί, νη γεσγξαθηθνί θαη νη κνξηαθνί (Mayr and Aslock 1992).

Γηα πνιιά ρξφληα ε θαηάηαμε ησλ νξγαληζκψλ ζε είδε γηλφηαλ θπξίσο κε βάζε κνξθνινγηθνχο θαη γεσγξαθηθνχο ραξαθηήξεο. Με ηε ξαγδαία εμέιημε ηεο κνξηαθήο βηνινγίαο ηηο ηειεπηαίεο δεθαεηίεο, φκσο ε ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ πεξηιακβάλεη νινέλα θαη πεξηζζφηεξν κνξηαθνχο ραξαθηήξεο (Wheeler 2004), νη νπνίνη πεξηιακβάλνπλ ηε κειέηε ηφζν πξσηετλψλ φζν θαη λνπθιετθψλ νμέσλ (Hillis et al. 1996). Καηά θαηξνχο έρεη εθθξαζηεί ε άπνςε φηη ε ρξήζε κνξηαθψλ ραξαθηήξσλ ππνλνκεχεη ηελ θιαζζηθή ηαμηλνκία θαη ηείλεη λα ηελ αληηθαηαζηήζεη (Wheeler 2004; Ebach and Holdrege 2005), κε ηνπο ππέξκαρνπο ηεο ρξήζεο ησλ κνξηαθψλ ραξαθηήξσλ λα ππνζηεξίδνπλ φηη ε κνξηαθή ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ φρη απιψο ζπκπιεξψλεη ηελ θιαζηθή ηαμηλνκία, αιιά έρεη αλάγθε ηνπο παξαδνζηαθνχο ραξαθηήξεο ηαμηλφκεζεο (Hebert et al. 2005; Hajibabaei et al. 2007).

Δηδηθά ε απμαλφκελε απφδνζε θαη ην ειαηηνχκελν θφζηνο ησλ ηερληθψλ αιιεινχρηζεο DNA (Chan 2005), επέηξεςαλ ηε ρξήζε ζε φιν θαη κεγαιχηεξε θιίκαθα γελεηηθψλ δεηθηψλ ζηνλ θαζνξηζκφ θαη ζηελ ηαπηνπνίεζε εηδψλ.

1.3 Γενεηική ηαςηοποίηζη ειδών

Χο γελεηηθφο δείθηεο νξίδεηαη έλαο θιεξνλνκήζηκνο ραξαθηήξαο πνπ απαληά ζε πνιιέο θαηαζηάζεηο, κία αιιεινπρία DNA, ε νπνία παξνπζηάδεη δηαθνξνπνίεζε κεηαμχ αηφκσλ, πιεζπζκψλ ε εηδψλ (Sunnucks 2000). Ο βαζκφο πνιπκνξθηζκνχ ησλ δεηθηψλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη πνηθίιεη αλάινγα κε ηηο απαηηήζεηο ηεο εθάζηνηε έξεπλαο.

Ζ ηαπηνπνίεζε εηδψλ κέζσ γελεηηθψλ δεηθηψλ βαζίδεηαη ζηελ παξαδνρή φηη νκάδεο νξγαληζκψλ πνπ έρνπλ απνθιίλεη εμειηθηηθά αλακέλεηαη λα έρνπλ θαη δηαθνξεηηθνχο πνιπκνξθηζκνχο ζην γνληδίσκά ηνπο, ελψ αληίζεηα πεξηζζφηεξν ζπγγεληθέο νκάδεο ζα έρνπλ φκνηεο αιιεινπρίεο DNA (Hillis et al. 1996). Ζ γελεηηθή ηαπηνπνίεζε απνδείρηεθε φηη έρεη πνιιά πιενλεθηήκαηα. Πξψηνλ, ηφζν ε θαηλνηππηθή πιαζηηθφηεηα φζν θαη ε γελεηηθή κεηαβιεηφηεηα ησλ ραξαθηήξσλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ αλαγλψξηζε εηδψλ κπνξνχλ λα νδεγήζνπλ ζε εζθαικέλεο αλαγλσξίζεηο. Γεχηεξνλ, ε κνξθνινγηθή πξνζέγγηζε παξαβιέπεη κνξθνινγηθά θξππηηθά είδε, ηα νπνία είλαη θνηλά ζε πνιιέο νκάδεο νξγαληζκψλ (Knowlton 1993; Jarman and Elliott 2000; Bickford et al. 2007). Σξίηνλ, νη κνξθνινγηθέο θιείδεο είλαη ζπρλά απνηειεζκαηηθέο κφλν γηα έλα ζπγθεθξηκέλν ζηάδην δσήο ή θχιν, θαη θαηά ζπλέπεηα πνιιά άηνκα δελ κπνξνχλ λα αλαγλσξηζζνχλ. Σέηαξηνλ, ε ρξήζε θιεηδψλ ζπρλά απαηηεί έλα ηφζν πςειφ επίπεδν εκπεηξνγλσκνζχλεο πνπ νη ιαλζαζκέλεο ηαπηνπνηήζεηο κέζσ κνξθνινγηθψλ ραξαθηήξσλ είλαη θνηλέο. Σέινο, κε ηε γελεηηθή ηαπηνπνίεζε θαζίζηαηαη πην εθηθηή ε απηνκαηνπνίεζε ηεο αλαγλψξηζεο (Gaston and O’Neill 2004), θαζψο κπνξεί λα αλαιπζεί κεγάινο αξηζκφο δεηγκάησλ ζε κηθξφ ρξνληθφ δηάζηεκα, ρσξίο λα είλαη απαξαίηεηε ε γλψζε ηεο κνξθνινγηθήο ηαπηνπνίεζεο απφ ηνλ εξεπλεηή.

10

Έηζη ε ηαπηνπνίεζε κέζσ αιιεινπρηψλ DNA έρεη εθαξκνζηεί επξέσο ζε πιεζψξα δηαθνξεηηθψλ νξγαληζκψλ, φπσο βαθηήξηα (Versalovic et al. 1991; McCabe et al. 1999; Janda and Abbott 2007), κχθεηεο (Makimura et al. 1999; Hsu et al. 2003; Schoch et al. 2012), πνπιηά (Hebert et al. 2004b; Rudnick et al. 2007; Aliabadian et al. 2009), ςάξηα (Partis and Wells 1996; Pepe et al. 2005; Ward et al. 2005; Teletchea 2009) θαη ζειαζηηθά (Wolf et al. 1999; Karlsson and Holmlund 2007; Pun et al. 2009).

1.3.1 Γενεηικοί δείκηερ

Πξνθεηκέλνπ λα ππάξρεη κεγαιχηεξε πηζαλφηεηα λα δηαιεπθαλζεί ην εξψηεκα πνπ ηίζεηαη ζε κία έξεπλα πνπ πεξηιακβάλεη αλάιπζε αιιεινπρηψλ DNA, ζα πξέπεη λα επηιερζεί ν θαηάιιεινο γελεηηθφο δείθηεο (Wan et al. 2004), ζα πξέπεη δειαδή λα παξνπζηάδεη πνιπκνξθηζκφ ζε επίπεδα πνπ επηηξέπνπλ ηαπηφρξνλα λα δηαρσξηζηνχλ θαη λα ζπζρεηηζηνχλ άηνκα θαη νκάδεο αηφκσλ. Αλ παξνπζηάδνληαη κεγάια επίπεδα πνιπκνξθηζκνχ δελ είλαη δπλαηή ε εχξεζε ζρέζεο κεηαμχ ησλ αιιεινπρηψλ, ελψ αλ ηα επίπεδα πνιπκνξθηζκνχ είλαη πνιχ ρακειά δελ είλαη δπλαηφο ν δηαρσξηζκφο ησλ αιιεινπρηψλ (Sunnucks 2000).

Γηα ηνλ ιφγν απηφ, έρεη ρξεζηκνπνηεζεί θαηά θαηξνχο πιεζψξα γελεηηθψλ δεηθηψλ, νη νπνίνη ζηελ πεξίπησζε ησλ επθαξπσηηθψλ νξγαληζκψλ, εληνπίδνληαη ηφζν ζην γνληδίσκα ηνπ ππξήλα (Nybom 2004; Pampoulie and Danielsdottir 2008; Luca et al. 2009; Schoch et al. 2012), φζν θαη ζην γελεηηθφ πιηθφ ησλ νξγαληδίσλ (κηηνρνλδξηαθφ θαη ρισξνπιαζηηθφ DNA) (Harrison 1989; Powell et al. 1995; Provan et al. 2001; Birecikligil et al. 2016). Δηδηθφηεξα ην κηηνρνλδξηαθφ DNA απνηειεί έλα κφξην DNA ην νπνίν έρεη ρξεζηκνπνηεζεί θαηά θφξνλ ζε γελεηηθέο κειέηεο (Galtier et al. 2009).

1.3.2 Μιηοσονδπιακό DNA

Σα κηηνρφλδξηα είλαη κεκβξαλψδε νξγαλίδηα πνπ εληνπίδνληαη ζην θπηηαξφπιαζκα φισλ ησλ αεξφβησλ επθαξπσηηθψλ θπηηάξσλ θαη ζπκκεηέρνπλ ζε πνιιέο δηεξγαζίεο, δηαδξακαηίδνληαο ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ θπηηαξηθή αλαπλνή (Russell 2009). Κάζε θχηηαξν πεξηιακβάλεη απφ κεξηθέο δεθάδεο έσο κεξηθέο ρηιηάδεο κηηνρφλδξηα (Lang et al. 1999).

Σα κηηνρφλδξηα απνηεινχλ κία απφ ηηο ζέζεηο εθηφο ηνπ ππξήλα φπνπ εληνπίδεηαη γελεηηθφ πιηθφ, πεξηέρνπλ δειαδή δηθφ ηνπο γνληδίσκα, ην νπνίν αλαθέξεηαη σο κηηνρνλδξηαθφ DNA (mtDNA). Σν κηηνρνλδξηαθφ DNA είλαη έλα απινεηδέο δίθισλν θπθιηθφ κφξην, ην νπνίν δελ ζπλδέεηαη κε ηζηφλεο. Παξνπζηάδεη κεηξηθή θιεξνλφκεζε θαη δελ πθίζηαηαη αλαζπλδπαζκφ (Russell 2009). Κάζε κηηνρφλδξην θέξεη πνιιαπιά αληίγξαθα ηνπ mtDNA, ην νπνίν αληηγξάθεηαη αλεμάξηεηα απφ ην γνληδίσκα ηνπ ππξήλα (Lewin 2004). Σν κέγεζφο ηνπ πνηθίιεη επξέσο αλάκεζα ζηνπο δηάθνξνπο νξγαληζκνχο. ΢ηα πεξηζζφηεξα δψα νη δχν αιπζίδεο ηνπ mtDNA έρνπλ δηαθνξεηηθή ππθλφηεηα, ιφγσ άληζεο θαηαλνκήο ησλ βάζεσλ. Ζ κία πεξηέρεη πεξηζζφηεξεο βάζεηο γνπαλίλεο θαη νλνκάδεηαη βαξηά (H), ελψ ε άιιε πεξηέρεη πεξηζζφηεξεο βάζεηο θπηνζίλεο θαη νλνκάδεηαη ειαθξηά (L) (Russell 2009).

Σν mtDNA φισλ ησλ ζπνλδπισηψλ πεξηέρεη 37 γνλίδηα ηα νπνία θσδηθνπνηνχλ 2 rRNA, 22 tRNA θαη 13 mRNA, ηα νπνία κεηαθξάδνληαη ζε πξσηεΐλεο (Boore 1999). Έμη απφ ηηο πξσηεΐλεο απηέο ζπκκεηέρνπλ ζηελ νμεηδσηηθή θσζθνξπιίσζε ελψ νη ππφινηπεο επηά απνηεινχλ ππνκνλάδεο ηεο αθπδξνγνλάζεο ηνπ NADH (Lewin 2004). Δπηπιεφλ ην mtDNA θέξεη κία κε θσδηθνπνηνχζα πεξηνρή ε νπνία νλνκάδεηαη

11

πεξηνρή D-loop, ζηελ νπνία εληνπίδεηαη ε ζέζε έλαξμεο ηεο αληηγξαθήο ηνπ (Δηθφλα 1.1).

Δικόνα 1.1 Απεηθφληζε ηνπ κηηνρνλδξηαθνχ DNA (http://www.nature.com)

Σν κηηνρνλδξηαθφ DNA απνηειεί έλαλ απφ ηνπο ζεκαληηθφηεξνπο θαη ζπρλφηεξα ρξεζηκνπνηνχκελνπο γελεηηθνχο δείθηεο γηα κία πιεζψξα ιφγσλ (Beebee and Rowe 2004):

• Παξνπζηάδεη πςειφ βαζκφ πνιπκνξθηζκνχ, ιφγσ ηνπ πςεινχ ξπζκνχ κεηαιιαμηγέλεζήο ηνπ (Brown et al. 1979). • Λφγσ ηεο χπαξμεο αθφκα θαη ρηιηάδσλ αληηγξάθσλ ηνπ αλά θχηηαξν είλαη επθνιφηεξε ε απνκφλσζε επαξθνχο πνζφηεηαο DNA γηα αλαιχζεηο, γεγνλφο πνπ επηηξέπεη ηε κε παξεκβαηηθή ιήςε δεηγκάησλ ή ηελ απνκφλσζε DNA απφ πνιχ παιηά δείγκαηα. • Ζ απινεηδήο θχζε θαη ε κεηξηθή θιεξνλφκεζε ηνπ mtDNA ην θαζηζηνχλ πην επηξξεπέο ζε θαηλφκελα γελεηηθήο παξέθθιηζεο, κε απνηέιεζκα λα δεκηνπξγείηαη γελεηηθή πνηθηινκνξθία ζε ζχληνκν ρξνληθφ δηάζηεκα. • Ζ απνπζία αλαζπλδπαζκνχ (Hurles and Jobling 2001) θαη ε ζπαληφηεηα ησλ κεηαζέζεσλ θαζηζηνχλ επθνιφηεξε ηε δηαζαθήληζε ησλ ζπγγεληθψλ ζρέζεσλ κεηαμχ αηφκσλ, πιεζπζκψλ ή αθφκα θαη εηδψλ (Soares et al. 2013) • ΢ην mtDNA εληνπίδνληαη γνλίδηα θαη πεξηνρέο κε δηαθνξεηηθνχο ξπζκνχο κεηαιιαμηγέλεζεο (Arias et al. 2006), πξνζθέξνληαο ηε δπλαηφηεηα λα επηιεγεί κνξηαθφο δείθηεο πνπ λα αληαπνθξίλεηαη ζηηο απαηηήζεηο ηεο εθάζηνηε έξεπλαο.

Σν κεηνλέθηεκά ηνπ σο γελεηηθφο δείθηεο ζπλίζηαηαη ζην γεγνλφο φηη ιφγσ ηεο απινεηδνχο θχζεο ηνπ δελ επηηξέπεη ηνλ εληνπηζκφ πβξηδίσλ, παξά κφλν ζε ζπλδπαζκφ κε κνξθνινγηθά ραξαθηεξηζηηθά ή ππξεληθνχο γελεηηθνχο δείθηεο, ελψ ζε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο ε παξνπζία ςεπδνγνληδίσλ ηνπ mtDNA ζηνλ ππξήλα δπζρεξαίλεη ηηο αλαιχζεηο. Δπίζεο, ην γεγνλφο φηη ην δξαζηηθφ πιεζπζκηαθφ κέγεζνο ηνπ mtDNA είλαη ην έλα ηέηαξην ζπγθξηηηθά κε απηφ ησλ ππξεληθψλ απηνζσκηθψλ

12

αιιεινπρηψλ κπνξεί λα έρεη σο απνηέιεζκα λα ππεξαπινπζηεπζνχλ νη εμειηθηηθέο ζρέζεηο κέζσ ησλ mtDNA δεδνκέλσλ, λα ππνηηκεζεί ε γελεηηθή πνηθηιφηεηα ή λα απμεζεί ε αβεβαηφηεηα ζηε γελεαινγηθή αλάιπζε εμαηηίαο ηεο κε χπαξμεο δεζκψλ αλάκεζα ζηνπο κηηνρνλδξηαθνχο απιφηππνπο (Zhang and Hewitt 2003) .

Απφ ην mtDNA, νη γελεηηθνί ηφπνη πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη επξέσο ζε κειέηεο είλαη ην 12S rDNA, ην16S rDNA, ην γνλίδην ηνπ θπηνρξψκαηνο b (cytb), ην γνλίδην ηεο ππνλνκάδαο 1 ηνπ θπηνρξψκαηνο c (COI) θαη ε κηηνρνλδξηαθή πεξηνρή ειέγρνπ (CR ή D-loop). Σν 12S rDNA είλαη πνιχ ζπληεξεκέλν θαη έρεη ρξεζηκνπνηεζεί θπξίσο ζηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο θπινγέλεζεο ζε αλψηεξα ηαμηλνκηθά επίπεδα, φπσο ηα θχια θαη ηα ππνθχια (Wan et al. 2004). Σν 16S rDNA ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο γηα θπινγελεηηθέο κειέηεο φζνλ αθνξά ζε κεζαία ηαμηλνκηθά επίπεδα, π.ρ. νηθνγέλεηεο θαη ζπάληα γέλε. ΢πγθξηηηθά κε ην 12S θαη ην 16S rDNAs, ηα κηηνρνλδξηαθά γνλίδηα πνπ θσδηθνπνηνχλ πξσηεΐλεο εμειίζζνληαη πην γξήγνξα θαη είλαη ηζρπξφηεξνη δείθηεο ζηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο εμειηθηηθήο ηζηνξίαο ζε θαηψηεξα επίπεδα, φπσο π.ρ. νη νηθνγέλεηεο, ηα γέλε θαη ηα είδε (Wan et al. 2004). Ζ κηηνρνλδξηαθή πεξηνρή ειέγρνπ (CR ή D-loop) είλαη ε θχξηα κε κεηαγξαθφκελε πεξηνρή ηνπ mtDNA κνξίνπ. ΢πλήζσο, ε D-loop ησλ ζπνλδπισηψλ ππνδηαηξείηαη ζε ηξία ηκήκαηα, ηα νπνία δηαθέξνπλ κεηαμχ ηνπο ηφζν ζηε λνπθιενηηδηθή ζχζηαζε φζν θαη ζην ξπζκφ εμέιημήο ηνπο. Σν θεληξηθφ ηκήκα, πνπ πεξηέρεη ην ζεκείν έλαξμεο αληηγξαθήο ηεο βαξηάο αιπζίδαο, είλαη αξθεηά ζπληεξεκέλν. Αληίζεηα, ηα δχν πιεπξηθά ηκήκαηα απηήο ηεο πεξηνρήο είλαη ζπλήζσο ππεξκεηαβιεηά φζνλ αθνξά ζηηο λνπθιενηηδηθέο ππνθαηαζηάζεηο θαη ζηνλ αξηζκφ ησλ πξνζζεθψλ θαη ειιεηκκάησλ. Έλα άιιν ραξαθηεξηζηηθφ πνπ παξαηεξείηαη ζηελ D-loop πνιιψλ εηδψλ, είλαη ε παξνπζία κηθξψλ επαλαιακβαλφκελσλ αιιεινπρηψλ (Sbisà et al. 1997). Δμαηηίαο ηνπ απμεκέλνπ ξπζκνχ εμέιημεο ησλ δχν πιεπξηθψλ ηκεκάησλ, ε D-loop ζεσξείηαη θαηάιιειε θπξίσο γηα κειέηεο ζην επίπεδν ηνπ είδνπο.

Όζνλ αθνξά ηα γνλίδηα πνπ θσδηθνπνηνχλ πξσηεΐλεο, ην γνλίδην γηα ην θπηφρξσκα b (cytb) θαη γηα ηελ ππνκνλάδα 1 ηεο νμεηδάζεο ηνπ θπηνρξψκαηνο c (COI) είλαη ηα πιένλ ρξεζηκνπνηνχκελα ζε θπινγελεηηθέο κειέηεο. Σν cytb εμαηηίαο ηνπ ζρεηηθά αξγνχ ξπζκνχ εμέιημήο ηνπ, έρεη ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ θπινγελεηηθψλ ζρέζεσλ αλάκεζα ζε δηάθνξα taxa (Meyer et al. 1990; Castresana 2001; Pepe et al. 2005; Tang et al. 2011), ελψ πεξηέρεη αξθεηή πνηθηιφηεηα ζηελ αιιεινπρία ηνπ ψζηε λα απνηειεί ρξήζηκν δείθηε γηα ηελ εθηίκεζε ησλ θπινγελεηηθψλ ζρέζεσλ ζηα ςάξηα θαη ζε άιια ζπνλδπισηά ζε ελδνεηδηθφ επίπεδν, αιιά θαη εληφο ηνπ γέλνπο θαη ησλ νηθνγελεηψλ (Hillis et al. 1996; Yang et al. 2006). Όζνλ αθνξά ην γνλίδην COI, ε ρξήζε ηνπ σο γελεηηθφ δείθηε πεξηιακβάλεη αξθεηά πιενλεθηήκαηα ηα νπνία ζα αλαθεξζνχλ παξαθάησ.

1.4 DNA barcoding

Σν γεγνλφο φηη νη δηάθνξεο κειέηεο ρξεζηκνπνηνχλ ζπρλά δηαθνξεηηθνχο γελεηηθνχο δείθηεο ε θάζε κία, γηα ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ θαη ηε κειέηε ησλ κεηαμχ ηνπο ζρέζεσλ, δπζρεξάλεη ηελ άκεζε ζχγθξηζε ησλ απνηειεζκάησλ ηνπο (Costa and Carvalho 2007). Γηα ηνλ ιφγν απηφ πξνηάζεθε απφ ηνπο Hebert et al. ην 2003, ην DNA barcoding, δειαδή ε ρξήζε κίαο κηθξήο ζρεηηθά αιιεινπρίαο DNA, απφ κία ζπγθεθξηκέλε πεξηνρή ηνπ γνληδηψκαηνο γηα ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ (Hebert et al. 2003a). Σν DNA barcoding βαζίδεηαη ζηελ αξρή φηη κία ζχληνκε, ηππνπνηεκέλε αθνινπζία DNA κπνξεί λα δηαθξίλεη ηα άηνκα ελφο είδνπο εθφζνλ ε γελεηηθή πνηθηινκνξθία ηεο κεηαμχ ησλ εηδψλ ππεξβαίλεη ηελ πνηθηινκνξθία κέζα ζηα είδε (Hebert et al. 2003a). Πιήζνο εξεπλψλ έρεη δηαπηζηψζεη ηελ απνηειεζκαηηθφηεηα απηήο ηεο πξνζέγγηζεο ζε αξθεηέο κεγάιεο νκάδεο δψσλ, φπσο ηα πηελά (Hebert et

13

al. 2004b), ηα ςάξηα (Ward et al. 2005), νη θππξαίεο (Meyer and Paulay 2005), νη αξάρλεο (Barrett and Hebert 2005) θαη αξθεηά ιεπηδφπηεξα (Hebert et al. 2004a; Janzen et al. 2005). Δπηπιένλ, ζπζηήκαηα DNA barcoding δεκηνπξγνχληαη ηψξα γηα άιιεο νκάδεο νξγαληζκψλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ θπηψλ (Kress et al. 2005), ησλ καθξνθπθψλ (Saunders 2005), κπθήησλ (Summerbell et al. 2005), πξσηίζησλ (Scicluna et al. 2006) θαη βαθηεξίσλ (Welch and Huse 2011).

Ζ επηινγή ηεο πεξηνρήο ηνπ γνληδηψκαηνο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη σο DNA barcode δηαθέξεη κεηαμχ ησλ δηαθφξσλ νκάδσλ νξγαληζκψλ. Γηα ηνπο κχθεηεο ρξεζηκνπνηείηαη ε πεξηνρή Internal transcribed spacer (Guillamön et al. 1998; Schoch et al. 2012) πνπ εληνπίδεηαη κεηαμχ ησλ γνληδίσλ ησλ rRNA ηεο κηθξήο θαη κεγάιεο ξηβνζσκηθήο ππνκνλάδαο. Γηα ηα θπηά έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί ηα γνλίδηα rbcl (Newmaster et al. 2006; Kress and Erickson 2007) θαη matk (CBOL Plant Working Group et al. 2009; Chase and Fay 2009).

Γηα ηα δψα, ην γνλίδην πνπ έρεη επηιεγεί λα ρξεζηκνπνηεζεί σο DNA barcode είλαη ην γνλίδην ηεο ππνκνλάδαο 1 ηεο νμεηδάζεο ηνπ θπηνρξψκαηνο c (COI) (Hebert et al. 2003a). Ζ ρξήζε ηνπ σο DNA barcode έρεη αξθεηά πιενλεθηήκαηα. Αξρηθά, ε δηαζεζηκφηεηα παγθφζκησλ εθθηλεηψλ γηα ην ζπγθεθξηκέλν ηκήκα δίλεη ηε δπλαηφηεηα ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ ηνπ ζηα πεξηζζφηεξα, αλ φρη φια, ηα δσηθά θχια (Zhang and Hewitt 1997). Όπσο ζπκβαίλεη θαη κε ηα ππφινηπα γνλίδηα πνπ θσδηθνπνηνχλ πξσηεΐλεο, ηα λνπθιενηίδηα ηεο ηξίηεο ζέζεο έρνπλ απμεκέλν πνζνζηφ ππνθαηαζηάζεσλ, γεγνλφο πνπ θαζηζηά ην ξπζκφ κνξηαθήο εμέιημεο πεξίπνπ ηξεηο θνξέο πςειφηεξν απηνχ ησλ 12S ή 16S rDNA (Knowlton and Weigt 1998). ΢ηελ πξαγκαηηθφηεηα, ε εμέιημε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ γνληδίνπ είλαη αξθεηά ηαρεία ψζηε λα κπνξεί λα επηηεπρζεί ε δηάθξηζε φρη κφλν θνληηλψλ εηδψλ, αιιά θαη θπινγελεηηθψλ νκάδσλ εληφο ελφο είδνπο (Cox and Hebert 2001; Wares and Cunningham 2001; Hebert et al. 2003b). Δπηπξφζζεηα, παξφιν πνπ ην γνλίδην ηεο COI κπνξεί λα ζπλδπαζηεί κε άιια γνλίδηα ψζηε λα δηαιεπθαλζνχλ νη θπινγελεηηθέο ζρέζεηο ζε πεξηπηψζεηο πνπ αθνξνχλ πξφζθαηα θαηλφκελα απφθιηζεο, ην γνλίδην απηφ είλαη ηθαλφ λα παξέρεη βαζχηεξε θπινγελεηηθή δηάθξηζε ζπγθξηηηθά κε θάπνην ελαιιαθηηθφ γνλίδην, φπσο γηα παξάδεηγκα ην θπηφρξσκα b (Simmons and Weller 2001), θαζψο αιιαγέο ζηελ ακηλνμηθή ηνπ αιιεινπρία ζπκβαίλνπλ κε βξαδχηεξν ξπζκφ ζε ζρέζε κε νπνηνδήπνηε άιιν κηηνρνλδξηαθφ γνλίδην πνπ θσδηθνπνηεί πξσηεΐλεο (Lynch and Jarrell 1993). Να ζεκεησζεί φηη σο DNA barcode δελ είλαη απαξαίηεην λα ρξεζηκνπνηεζεί ε αιιεινπρία νιφθιεξνπ ηνπ γνληδίνπ COI, αιιά ζπλήζσο ρξεζηκνπνηείηαη έλα ηκήκα 650 βάζεσλ απφ ην 5’ άθξν ηνπ, ελψ απνδεθηφ κπνξεί λα γίλεη αθφκα θαη ηκήκα 500 βάζεσλ (http://boldsystems.org/).

Κάζε έξεπλα barcoding πεξηιακβάλεη ηέζζεξα ζηνηρεία (Hajibabaei et al. 2007):  Σα δείγκαηα, νη νξγαληζκνί δειαδή πνπ ζα κειεηεζνχλ θαη γηα ηνπο νπνίνπο ζα παξαρζνχλ ηα DNA barcodes. Θα πξέπεη λα ζπγθεληξψλνληαη άηνκα ηα νπνία ζα αλαγλσξηζηνχλ θαη ηνπνζεηεζνχλ ζε είδε κε βάζε θιαζζηθνχο ηαμηλνκηθνχο ραξαθηήξεο, φπσο είλαη νη κνξθνινγηθνί. Σα δείγκαηα ζα πξέπεη κεηά ηελ αλάιπζε DNA λα θπιαρηνχλ, σο «δείγκαηα εγγπεηέο», ηα νπνία ζα είλαη δηαζέζηκα ζην κέιινλ, αλ παξαζηεί αλάγθε επαλεμέηαζεο.  Ζ εξγαζηεξηαθή αλάιπζε, θαηά ηελ νπνία απνκνλψλεηαη DNA απφ ηα δείγκαηα θαη αιιεινπρείηαη ην γνλίδην πνπ ρξεζηκνπνηείηαη σο ζηφρνο ηνπ barcoding. Σα αθξηβή πξσηφθνιια ησλ αλαιχζεσλ πνηθίινπλ αλάινγα κε ην εξγαζηήξην πνπ δηεμάγεη ηελ έξεπλα.  Ζ βάζε δεδνκέλσλ, ζηελ νπνία θαηαηίζεληαη νη αιιεινπρίεο καδί κε ην φλνκα ηνπ είδνπο ζην νπνίν αλήθνπλ θαη άιια ζηνηρεία ηνπ δείγκαηνο, φπσο ε πεξηνρή πξνέιεπζεο ηνπ.

14

 Ζ αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ. Ζ αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ αλαθνξάο ελφο αηφκνπ πνπ ρξεηάδεηαη λα ηαπηνπνηεζεί κπνξεί λα ζπγθξηζεί κε ηηο θαηαηεζεηκέλεο ζηε βάζε δεδνκέλσλ αιιεινπρίεο θαη λα γίλεη θαηάηαμή ηνπ ζε έλα είδνο κε βάζε ηελ νκνηφηεηα ησλ αιιεινπρηψλ. Δπίζεο νη θαηαηεζεηκέλεο αιιεινπρίεο κπνξνχλ λα αλαθηεζνχλ θαη λα ρξεζηκνπνηεζνχλ ζε δηάθνξεο άιιεο αλαιχζεηο, φπσο ε θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ ή ν ππνινγηζκφο γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κεηαμχ ησλ αιιεινπρηψλ.

Όπσο γίλεηαη θαλεξφ παξαπάλσ, ε ηαπηνπνίεζε εηδψλ κέζσ DNA barcoding, ρξεηάδεηαη ηελ θιαζζηθή ηαμηλνκία, γηα ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ αηφκσλ απφ ηα νπνία ζα εμαρζνχλ ηα DNA barcodes. Ζ ζσζηή αξρηθή ηαπηνπνίεζε ησλ αηφκσλ επηηξέπεη ηελ δεκηνπξγία θαιχηεξσλ βάζεσλ δεδνκέλσλ θαη έηζη απμάλεη ηελ απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ DNA barcoding (Hebert et al. 2005). Δπίζεο, θαζψο ε ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ γίλεηαη κε ζχγθξηζε αιιεινπρηψλ DNA, ε απνηειεζκαηηθφηεηα ηεο κεζφδνπ απμάλεηαη κε ηελ παξαγσγή νινέλα θαη πεξηζζφηεξσλ αιιεινπρίσλ θαη ηελ θαηάζεζή ηνπο ζε βάζεηο δεδνκέλσλ (Hebert et al. 2005). Κάζε κειέηε δειαδή πνπ παξάγεη DNA barcodes ζπκβάιεη ζηελ βειηίσζε ηνπ DNA barcoding θαη παξέρεη θαιχηεξε αθεηεξία γηα επφκελεο έξεπλεο.

Χο ζηφρνο απφ ηνπο εκπλεπζηέο ηνπ DNA barcoding έρεη ηεζεί ε παξαγσγή απφ ην ζχλνιν ηεο επηζηεκνληθήο θνηλφηεηαο, φζν ην δπλαηφλ πεξηζζφηεξσλ DNA barcodes, κε ηδεαηή θαηάιεμε ηελ απφθηεζε αιιεινπρηψλ απφ φια ηα ππάξρνληα είδε (Stoeckle and Hebert 2008). Γηα ηνλ ζθνπφ απηφ ζπζηάζεθε ην 2004 ην Consortium for the Barcode of life, κε ζηφρν ηελ ππνζηήξημε θαη ηελ πξνψζεζε ηνπ DNA barcoding ζε παγθφζκην επίπεδν. ΢ε απηφ ζπκκεηέρνπλ πιένλ πεξηζζφηεξνη απφ δηαθφζηνη νξγαληζκνί, απφ πεξηζζφηεξεο απφ πελήληα ρψξεο.

Πιένλ DNA barcodes βξίζθνληαη θαηαηεζεηκέλα ζε φιεο ηηο κεγάιεο βάζεηο γελεηηθψλ δεδνκέλσλ, φπσο ε GenBank ηνπ National Center for Biotechnology Information (NCBI), ην European Molecular Biology Laboratory (EMBL) θαη ε DNA Data Bank of Japan (DDBJ) (Costa and Carvalho 2007). Παξάιιεια δεκηνπξγήζεθε ε BOLD (Barcode of Life Data Systems), ε νπνία απνηειεί κία βάζε δεδνκέλσλ απνθιεηζηηθά γηα DNA barcodes (http://boldsystems.org/).

΢ηελ BOLD κπνξεί λα θαηαηεζεί νπνηαδήπνηε αιιεινπρία γνληδίνπ COI, αξθεί λα αλαθέξεηαη ε ζπζηεκαηηθή ηνπ θαηάηαμε ηνπιάρηζηνλ ζε επίπεδν θχινπ. Πξνθεηκέλνπ φκσο λα ραξαθηεξηζηεί σο DNA barcode ζα πξέπεη λα πιεξνί θάπνηα θξηηήξηα, κεηαμχ απηψλ λα αλαθέξεηαη ε ζπζηεκαηηθή ηνπ θαηάηαμε κέρξη ην επίπεδν ηνπ είδνπο, θαη ν νξγαληζκφο απφ ηνλ νπνίν πξνέθπςε ε αιιεινπρία λα έρεη ζπληεξεζεί γηα λα ρξεζηκεχζεη σο «δείγκα εγγπεηήο», λα ππάξρεη δειαδή ε δπλαηφηεηα επαλεμέηαζεο ηνπ δείγκαηνο αλ πξνθχςεη αλάγθε (Ratnasingham and Hebert 2007). Σν ηειεπηαίν δείρλεη θαη ηε ζεκαζία πνπ δίλεη ην DNA barcoding ζηελ θιαζζηθή ηαμηλνκία. Πέξα απφ βάζε δεδνκέλσλ, ε BOLD απνηειεί έλαλ πιεξνθνξηθφ πάγθν εξγαζίαο, θαζψο επηηξέπεη ηελ εηζαγσγή κίαο αιιεινπρίαο θαη ηε ζχγθξηζή ηεο κε ηηο θαηαηεζεηκέλεο ζηελ BOLD αιιεινπρίεο, θαζψο θαη ηε ρξήζε ησλ θαηαηεζεηκέλσλ αιιεινπρηψλ ζε βηνπιεξνθνξηθέο αλαιχζεηο, φπσο ε θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ θαη ν ππνινγηζκφο γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κεηαμχ ησλ αιιεινπρηψλ .

Σνλ ΢επηέκβξην ηνπ 2017 ζηελ BOLD βξίζθνληαλ θαηαηεζεηκέλα 5,728,245 δείγκαηα κε barcodes, ηα νπνία αλήθνπλ ζε 266,853 είδε (http://boldsystems.org/). Ο αξηζκφο ησλ εηδψλ κνηάδεη πνιχ κηθξφο ζε ζρέζε κε ηα 10,000,000 είδε πνπ ππνινγίδεηαη πσο ππάξρνπλ ζηνλ πιαλήηε. Παξαηεξψληαο, φκσο, ηελ εμέιημε ηνπ αξηζκνχ ησλ DNA barcodes γηα ην δσηθφ βαζίιεην ηα ηειεπηαία ρξφληα (Πίλαθαο 1.1), παξαηεξνχκε κία ξαγδαία αχμεζή ηνπ.

15

Πίνακαρ 1.1 Αξηζκφο DNA barcodes πνπ βξίζθνληαλ θαηαηεζεηκέλα ζηελ BOLD θάζε έηνο θαη αξηζκφο εηδψλ ζηα νπνία αλήθνπλ

Απιθμόρ barcodes Απιθμόρ barcodes με ζςζηημαηική ανεξαπηήηωρ επιπέδος Έηορ καηάηαξη ζε επίπεδο Απιθμόρ ειδών ζςζηημαηικήρ καηάηαξηρ είδοςρ 2009 595,095 529,228 75,909 2010 843,514 739,235 102,284 2011 1,161,439 964,112 132,667 2012 1,498,406 1,222,423 164,829 2013 1,977,283 1,445,868 189,425 2014 2,775,275 1,753,663 205,031 2015 3,733,819 2,189,264 230,234 2017 5,199,569 2,896,953 249,569

Απηφ αληηθαηνπηξίδεη ηελ δπλακηθή πνπ απνθηά κε ηνλ θαηξφ ην DNA barcoding θαη πξνκελχεη αθφκα κεγαιχηεξε εμέιημε ζην κέιινλ, θαζψο φιν θαη πεξηζζφηεξνη επηζηήκνλεο θαίλεηαη λα πηζηεχνπλ ζηηο δπλαηφηεηέο ηνπ, ελψ ζπγρξφλσο νη εμειίμεηο ζηνλ ρψξν ηεο αιιεινχρηζεο DNA αιιά θαη ζηνλ ρψξν ηεο πιεξνθνξηθήο επηηξέπνπλ ηελ δηεμαγσγή εξεπλψλ ζε πνιχ κεγαιχηεξε θιίκαθα απ’ φηη ζην παξειζφλ.

1.5 Γενεηική απόζηαζη και DNA barcoding gap

Ζ γελεηηθή απφζηαζε απνηειεί κέηξν ηεο εμειηθηηθήο απφθιηζεο πνπ παξνπζηάδνπλ δχν νκφινγεο αιιεινπρίεο DNA. Γηα ηνλ ππνινγηζκφ ηεο έρνπλ πξνηαζεί δηάθνξεο ζπλαξηήζεηο (Cavalli-Sforza and Edwards 1967; Nei 1972; Johns and Avise 1998; Cooper et al. 1999), κε δηαθνξεηηθέο παξαδνρέο ε θάζε κία. Μία ζπλάξηεζε πνπ ζήκεξα ρξεζηκνπνηείηαη επξέσο είλαη απηή πνπ πξνηάζεθε απφ ηνλ Kimura (Kimura 1980), ε νπνία ππνινγίδεη ηελ γελεηηθή απφζηαζε κε βάζε ηνλ αξηζκφ λνπθιενηηδηθψλ αληηθαηαζηάζεσλ κεηαμχ δχν αιιενπρίσλ θαη έρεη ην πιενλέθηεκα φηη ζπλππνινγίδεη ην γεγνλφο φηη νη κεηαπηψζεηο ζπκβαίλνπλ κε πην γξήγνξν ξπζκφ απφ ηηο κεηαζηξνθέο.

Ζ γελεηηθή απφζηαζε έθηνηε έρεη ρξεζηκνπνηεζεί ζηελ εθηίκεζε ησλ θπινγελεηηθψλ ζρέζεσλ κεηαμχ νξγαληζκψλ ζε δηάθνξα ηαμηλνκηθά επίπεδα (Johns and Avise 1998). Παξάιιεια κειεηήζεθε ε πηζαλφηεηα λα κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ νη γελεηηθέο απνζηάζεηο ζηνλ δηαρσξηζκφ εηδψλ, θαζψο ήηαλ αλακελφκελν νη νξγαληζκνί πνπ εληάζζνληαη ζε έλα είδνο λα παξνπζηάδνπλ κηθξφηεξε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ηνπο, απφ φηη κε άηνκα άιισλ εηδψλ. Σν δεηνχκελν εδψ ήηαλ ε επηινγή ηνπ γελεηηθνχ ηφπνπ πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζεί ζηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ θαζψο θαη ν νξηζκφο κίαο ηηκήο σο φξην γηα ηνλ δηαρσξηζκφ ησλ εηδψλ.

Με ηελ θαζηέξσζε ηνπ DNA barcoding θαη ηελ επηινγή ηνπ γνληδίνπ COI σο γελεηηθνχ δείθηε γηα ηα δψα, ην ίδην γνλίδην ρξεζηκνπνηείηαη θαη ζηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ. Απφ ηνπο Hebert et al (2004b) πξνηάζεθε σο φξην γηα ηνλ δηαρσξηζκφ δχν εηδψλ ην εμήο: αλ ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ δχν νκάδσλ νξγαληζκψλ

16

είλαη ηνπιάρηζηνλ δέθα θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηηο νκάδεο, νη δχν απηέο νκάδεο κπνξνχλ λα νξηζηνχλ σο πηζαλψο δηαθνξεηηθά είδε. Σν φξην ηεο δεθαπιάζηαο απφζηαζεο φκσο δελ είλαη απφιπην, αιιά πξέπεη λα πξνζαξκφδεηαη θάζε θνξά ζηελ ππφ κειέηε ηαμηλνκηθή νκάδα (Candek and Kuntner 2015). Παξάιιεια ην φξην απηφ ζπκπιεξψλεηαη απφ ην barcoding gap (Meyer and Paulay 2005), ην νπνίν ζεσξνχκε φηη ππάξρεη αλ δελ αιιειεπηθαιχπηνληαη νη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κεηαμχ ησλ νκάδσλ κε ηηο ηηκέο ησλ απνζηάζεσλ κέζα ζηηο νκάδεο. Δπίζεο, έρεη πξνηαζεί λα ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηνλ νξηζκφ πηζαλψλ λέσλ εηδψλ, αληί γηα ηηο κέζεο γελεηηθέο απνζηάζεηο, ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ θαη ε κέγηζηε απφζηαζε πνπ ζπλαληάηαη κέζα ζηηο νκάδεο (Meier et al. 2008), θαζψο ε ρξήζε ηεο κέζεο απφζηαζεο κπνξεί λα νδεγήζεη ζε ππνεθηίκεζε ηνπ barcoding gap.

1.6 Πποηγούμενη έπεςνα

΢ηα πιαίζηα ηνπ Consortium for the Barcode of life έρνπλ μεθηλήζεη θαη ζπλερίδνπλ λα εμειίζζνληαη πξνγξάκκαηα γηα ην DNA barcoding δηαθφξσλ θιάζεσλ δψσλ, φπσο ην iBOL (International Barcode of Life), ην Mammalia BOL γηα ηα ζειαζηηθά, ην Fish- BOL γηα ηνπο ηρζχεο θαη ην ABBI (All Birds Barcoding Initiative) γηα ηα πηελά (Costa and Carvalho 2007).

Πην ζπγθεθξηκέλα ην πξφγξακκα Fish-BOL, ην νπνίν μεθίλεζε ην 2004 έρεη σο ζηφρν ην DNA barcoding φισλ ησλ εηδψλ ηρζχσλ πνπ ππνινγίδνληαη ζε 35000 είδε (Costa and Carvalho 2007). Γηα ηνλ ζθνπφ απηφ αξρηθή πξφζεζε είλαη ε απφθηεζε ηνπιάρηζηνλ πέληε DNA barcodes απφ θάζε είδνο θαη ζηε ζπλέρεηα πέληε ηνπιάρηζηνλ DNA barcodes απφ θάζε πεξηνρή φπνπ απαληάηαη ην είδνο (Ward et al. 2009).

Απφ ηελ έλαξμε ηεο ρξήζεο ηνπ DNA barcoding κέρξη ζήκεξα έρεη πξαγκαηνπνηεζεί κεγάινο αξηζκφο εξεπλψλ ζε πνιιέο ρψξεο ηνπ θφζκνπ πνπ εθαξκφδνπλ ηελ κέζνδν απηή ζε ηρζχεο, κε έλα ζεκαληηθφ θνκκάηη απηψλ λα αθνξά ηνπο ηρζχεο ησλ εζσηεξηθψλ πδάησλ.

΢ε φιεο ηηο κειέηεο έρεη επηβεβαησζεί ε απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ DNA barcoding, θαζψο ζε φιεο, πεξηζζφηεξα απφ ην 90% ησλ ππφ κειέηε εηδψλ κπνξνχλ λα ηαπηνπνηεζνχλ κέζσ DNA barcoding (Becker et al. 2011). Tα είδε πνπ δελ κπφξεζαλ λα ηαπηνπνηεζνχλ απνηεινχζαλ πνιχ ζπγγεληθά είδε, κε απνηέιεζκα νη εξεπλεηέο λα πξνηείλνπλ επαλεμέηαζε ή θαη αιιαγέο ζηε ζπζηεκαηηθή θαηάηαμε ησλ εηδψλ απηψλ. Παξάιιεια απνθαιχθζεθε ε χπαξμε πνιιψλ θξππηηθψλ εηδψλ, ηα νπνία δελ ήηαλ γλσζηά κέρξη ζήκεξα θαη δελ ζα κπνξνχζαλ λα βξεζνχλ ρσξίο ηε ρξήζε κνξηαθψλ δηαγλσζηηθψλ ραξαθηήξσλ.

΢ε κειέηε DNA barcoding, πνπ έγηλε ζε ηρζχεο εζσηεξηθψλ πδάησλ ηνπ Καλαδά (Hubert et al. 2008), κειεηήζεθαλ 194 είδε, κε ηε κέζε ελδνεηδηθή γελεηηθή απφζηαζε λα είλαη 0,003 θαη ηε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε 0,083.

΢ε αληίζηνηρεο κειέηεο ζηηο ΖΠΑ (April et al. 2011), ζην Μεμηθφ θαη ηε Γνπαηεκάια (Valdez-Moreno et al. 2009), ηε Βξαδηιία (de Carvalho et al. 2011), ηε Νηγεξία (Nwani et al. 2011), ηελ Αξγεληηλή (Mabragaña et al. 2011), ηελ Ηλδνλεζία (Hubert et al. 2015) θαη ηελ Κίλα (Chen et al. 2015; Yang et al. 2016), νη κέζεο ελδνεηδηθέο

17

απνζηάζεηο θπκαίλνληαλ απφ 0,0017 κέρξη 0,0073, ελψ ε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε κεηαμχ 0,040 θαη 0,14. Όπσο αλαθέξζεθε ζε φιεο ηηο κειέηεο απηέο ε κέζνδνο DNA barcoding θξίζεθε αξθεηά απνηειεζκαηηθή.

Να ζεκεησζεί φηη νη έξεπλεο πνπ αλαθέξζεθαλ παξαπάλσ, θαζψο θαη απηέο πνπ αλαθέξνληαη παξαθάησ είλαη κειέηεο πνπ πεξηειάκβαλαλ ηελ αλάιπζε κεγάινπ αξηζκνχ γελψλ θαη εηδψλ. Τπάξρεη πιήζνο εξγαζηψλ πνπ αθνξά ηε ρξήζε DNA barcodes γηα ηελ κειέηε ηεο θπινγέλεζεο ζε έλα γέλνο ή ζε ιίγα ζπγγεληθά γέλε (Trontelj et al. 2005; Toffoli et al. 2008; Javonillo et al. 2010).

΢ε κειέηε ζηελ Σνπξθία πνπ αθνξνχζε ην DNA barcoding κε γεγελψλ εηδψλ ηρζχσλ ε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε βξέζεθε 0,009 (Keskin et al. 2013), κε ηε κέζνδν λα πεηπραίλεη λα ηαπηνπνηήζεη ην ζχλνιν ησλ αηφκσλ.

Όζνλ αθνξά ηελ Δπξψπε, ζε κειέηε DNA barcoding ηρζχσλ εζσηεξηθψλ εηδψλ ζηε Γεξκαλία, ε νπνία πεξηειάκβαλε 92 είδε (Knebelsberger et al. 2015), ε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε βξέζεθε 0,0026, κε κφιηο ην 7,3% ησλ εηδψλ λα παξνπζηάδεη ελδνεηδηθή απφζηαζε κεγαιχηεξε ηνπ 0,002. Σν ελδηαθέξνλ ζηνηρείν ζε απηή ηελ έξεπλα είλαη φηη ε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε βξέζεθε 0,03, ε νπνία είλαη αξθεηά ρακειή ζε ζρέζε κε ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο πνπ βξέζεθαλ ζε άιιεο εξγαζίεο. Οη ιάζνο ηαπηνπνηήζεηο απνδφζεθαλ ζε κεγάιν βαζκφ ζε ιάζνο αξρηθέο κνξθνινγηθέο ηαπηνπνηήζεηο ησλ αηφκσλ θαζψο θαη ζηελ χπαξμε ζπλψλπκσλ εηδψλ, ελψ γηα νξηζκέλα είδε ζηα νπνία παξαηεξήζεθε ε χπαξμε κεγάισλ ή κηθξψλ γελεηηθψλ. απνζηάζεσλ κεηαμχ νκάδσλ ηνπο, πξνηάζεθε ε πεξαηηέξσ κειέηε ηνπο ηφζν ζε κνξθνινγηθφ, φζν θαη ζε γελεηηθφ επίπεδν γηα ηνλ πηζαλφ πξνζδηνξηζκφ λέσλ εηδψλ ή γηα ηνλ ραξαθηεξηζκφ εηδψλ σο ζπλψλπκα αληίζηνηρα.

Οη Geiger et al δηεμήγαγαλ έξεπλα κε ζηφρν ηελ θαηαζθεπή κίαο DNA barcode βηβιηνζήθεο γηα φια ηα είδε εζσηεξηθψλ πδάησλ ηελ Μεζνγείνπ (Geiger et al. 2014), θαηνξζψλνληαο ηειηθά λα ζπγθεληξψζνπλ αιιεινπρίεο απφ 498 είδε, ηα νπνία αληηπξνζσπεχνπλ ην 98% ησλ εηδψλ ησλ κεζνγεηαθψλ ρσξψλ. Ζ κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε βξέζεθε 0,0059,ε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε 0,029 θαη κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο 0,0645. Καη ζε απηήλ ηελ κειέηε ε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε βξέζεθε ρακειή, δείρλνληαο φηη ζηελ Δπξψπε ηα γέλε παξνπζηάδνπλ κηθξφηεξεο γελεηηθέο απνζηάζεηο ζε ζρέζε κε ηα γέλε ζε άιιεο πεξηνρέο ηνπ θφζκνπ. Με βάζε ηα DNA barcodes θαη ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο νη εξεπλεηέο πξφηεηλαλ αξθεηέο αιιαγέο ζηελ ηαμηλφκεζε ησλ εηδψλ, πξνηείλνληαο κάιηζηα ηε δηάζπαζε θάπνησλ ππαξρφλησλ εηδψλ ζε επηκέξνπο είδε. Ζ έξεπλα απηή πεξηειάκβαλε θαη ηελ Διιάδα απφ ηελ νπνία ζπγθεληξψζεθαλ ζπλνιηθά 657 δείγκαηα. Οη αιιαγέο πνπ πξνηάζεθαλ ζηελ ζπζηεκαηηθή θαηάηαμε δχν εηδψλ πνπ κειεηήζεθαλ θαη ζηελ παξνχζα εξγαζία είλαη: 1. Ο δηαρσξηζκφο νκάδαο ηνπ Alburnoides bipunctatus ζε μερσξηζηφ είδνο, γηα ην νπνίν πξφηεηλαλ ην φλνκα Alburnoides strymonicus 2. Ο δηαρσξηζκφο νκάδαο ηνπ Gobio bulgaricus ζε μερσξηζηφ είδνο, γηα ην νπνίν πξφηεηλαλ ην φλνκα Gobio balcanicus

Παξάιιεια πξνηάζεθε ε πεξαηηέξσ κειέηε ησλ εμήο εηδψλ πνπ κειεηήζεθαλ θαη ζηελ παξνχζα εξγαζία: 1. Alburnus volviticus θαη Alburnus vistonicus 2. Alburnus thessalicus θαη Alburnus macedonicus 3. Cobitis hellenica θαη Cobitis arachthosensis 4. Squalius platyceps θαη Squalius prespensis 5. Salmo spp 6. Rhodeus amarus θαη Rhodeus meridionalis

18

Γηα ηηο πεξηπηψζεηο 1 έσο 5 αλαθέξεηαη φηη απνηεινχλ ζηελά ζπγγεληθά είδε ηα νπνία θαίλεηαη λα κπνξνχλ λα δηαρσξηζηνχλ κφλν κέζσ κνξθνινγηθψλ ραξαθηήξσλ, ελψ γηα ηελ πεξίπησζε 6 πηζαλψο ππάξρεη δηεηζδπηηθφο πβξηδηζκφο κεηαμχ ησλ δχν εηδσλ.

Οη Geiger et al ρξεζηκνπνίεζαλ σο φξην, γηα ηνλ ραξαθηεξηζκφ πηζαλψλ λέσλ εηδψλ, ηελ χπαξμε γελεηηθήο απφζηαζεο κεγαιχηεξεο ηνπ 0,020 κεηαμχ δχν νκάδσλ.

Οη Triantafyllidis et al κειέηεζαλ ηα είδε ηρζχσλ ζε ηέζζεξηο ιίκλεο ηεο βφξεηαο Διιάδαο κε ζηφρν ηελ απφθηεζε DNA barcodes γηα ηα είδε απηά (Triantafyllidis et al. 2011). Ζ κέζε ελδνεηδηθή γελεηηθή απφζηαζε ππνινγίζηεθε πεξίπνπ 0,001, ελψ ε κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε ππνινγίζηεθε 0,047. Καη ζε απηή ηελ πεξίπησζε ε εθαξκνγή ηνπ DNA barcoding γηα ηελ ηαπηνπνίεζε ηρζχσλ θξίζεθε απνηειεζκαηηθή. ΢ε θάπνηα είδε παξαηεξήζεθαλ νκάδεο κε κεγάιε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ηνπο, νη νπνίεο πξνηείλεηαη λα κειεηεζνχλ πεξαηηέξσ γηα ηνλ πηζαλφ δηαρσξηζκφ ηνπο ζε επηκέξνπο είδε. Δπίζεο παξαηεξήζαλ κηθξή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ Rhodeus amarus θαη Rhodeus meridionalis, ε νπνία επίζεο παξαηεξήζεθε αξγφηεξα απφ ηνπο Geiger et al (Geiger et al. 2014).

1.7 ΢κοπόρ ηηρ επγαζίαρ

΢θνπφο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ήηαλ ε κειέηε ηεο δπλαηφηεηαο ηαπηνπνίεζεο ησλ εηδψλ ηρζχσλ ησλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Διιάδαο κε DNA barcoding θαη ε παξαγσγή DNA barcodes γηα ηα είδε απηά. Απψηεξνο ζηφρνο ήηαλ ε κειέηε ηεο βηνπνηθηιφηεηαο ησλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Διιάδαο. Σειηθφο ζθνπφο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ήηαλ ν εκπινπηηζκφο ηεο ππάξρνπζαο βηβιηνγξαθίαο θαη πην ζπγθεθξηκέλα ηεο BOLD, κε αθφκα πεξηζζφηεξα DNA barcodes, ζπκβάιινληαο έηζη ζην εγρείξεκα ηνπ DNA barcoding θαη γεληθφηεξα ζηελ πξνζπάζεηα ηεο Βηνινγίαο λα θαηαηάμεη ηνπο νξγαληζκνχο ζε είδε θαη λα κειεηήζεη ηηο κεηαμχ ηνπο θπινγελεηηθέο ζρέζεηο. Ζ βειηίσζε ηεο ηθαλφηεηάο καο λα δηαρσξίδνπκε ηα είδε ζα καο δψζεη ηε δπλαηφηεηα λα κειεηήζνπκε πεξαηηέξσ θαη λα απνθηήζνπκε θαιχηεξε εηθφλα ηεο ειιεληθήο βηνπνηθηιφηεηαο, θάηη ην νπνίν είλαη απαξαίηεην γηα ηε δηαρείξηζή ηεο.

Όπσο αλαθέξζεθε γηα ηελ θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ θαη ηνλ ππνινγηζκφ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ δελ ρξεζηκνπνηήζεθαλ κφλν νη αιιεινπρίεο πνπ πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία αιιά θαη νη δηαζέζηκεο αιιεινπρίεο απφ ηα αληίζηνηρα είδε πνπ πξνέξρνληαλ απφ ηελ Διιάδα θαη βξίζθνληαη θαηαηεζεηκέλεο ζηελ BOLD. Απηφ έγηλε κε ζθνπφ ηελ άκεζε ζχγθξηζε ησλ αιιεινπρηψλ καο κε απηέο ηεο BOLD αιιά θαη ηε κειέηε ησλ εηδψλ ηνπ ειιαδηθνχ ρψξνπ ζε φζν ην δπλαηφλ κεγαιχηεξε θιίκαθα, θαζψο ε κέζνδνο DNA barcoding βειηηψλεηαη κε ηε δηαζεζηκφηεηα πεξηζζφηεξσλ αιιεινπρηψλ θαη επηηξέπεη ζε πνιιέο πεξηπηψζεηο ηελ επίιπζε πεξηπηψζεσλ πνπ ήηαλ ακθηζβεηνχκελεο ιφγσ ειιηπνχο αξηζκνχ DNA barcodes (Knebelsberger et al. 2015).

19

2. ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ

2.1 ΓΔΗΓΜΑΣΑ

Γηα ηελ πξαγκαηνπνίεζε ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ζπγθεληξψζεθαλ ζπλνιηθά 544 δείγκαηα ηρζχσλ, απφ ηα νπνία ηα 269 παξαζρέζεθαλ απφ ηελ θ. Γήκεηξα Μπφκπνξε, Δπίθνπξε Καζεγήηξηα ζην Αξηζηνηέιεην Παλεπηζηήκην Θεζζαινλίθεο, ηα 123 απφ ηνλ θ. Μάλν Κνπηξάθε, Σαθηηθφ Δξεπλεηή ζην Ηλζηηηνχην Αιηεπηηθήο Έξεπλαο (ΗΝΑΛΔ) θαη ηα 152 απφ ηνλ θ. Ησάλλε Λενλάξδν, Καζεγεηή ζην Παλεπηζηήκην ησλ Ησαλλίλσλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ηα δείγκαηα απφ ην Αξηζηνηέιεην Παλεπηζηήκην Θεζζαινλίθεο θαη ην Παλεπηζηήκην ησλ Ησαλλίλσλ αθνξνχζαλ νιφθιεξα άηνκα, ελψ απφ ην ΗΝΑΛΔ ηκήκαηα πηεξπγίσλ. ΢ε θάζε πεξίπησζε ηα δείγκαηα ήηαλ ζπληεξεκέλα ζε απφιπηε (99%) αηζαλφιε θαη ζπλνδεχνληαλ απφ έγγξαθν πνπ αλέθεξε ην είδνο ζην νπνίν αλήθε θάζε είδνο θαζψο θαη ηελ πεξηνρή ζπιινγήο. Ζ ζπζηεκαηηθή αλαγλψξηζε ησλ δεηγκάησλ είρε γίλεη κε βάζε κνξθνινγηθνχο ραξαθηήξεο. Σα δείγκαηα αξηζκήζεθαλ, κε ηνλ αξηζκφ ηνπ θαζελφο λα ζπλνδεχεηαη απφ έλα γξάκκα ην νπνίν δήισλε ην ηλζηηηνχην απφ ην νπνίν ζηάιζεθε ην δέηγκα. Γηα ην Αξηζηνηέιεην Παλεπηζηήκην Θεζζαινλίθεο ρξεζηκνπνηήζεθε ην γξάκκα Α, γηα ην Παλεπηζηήκην ησλ Ησαλλίλσλ ην γξάκκα L θαη γηα ην ΗΝΑΛΔ ην γξάκκα Κ. Ζ αθξηβήο αξίζκεζε θαη ε πεξηνρή πξνέιεπζεο ηνπ θάζε δείγκαηνο δίλνληαη ζην Παξάξηεκα (Πίλαθαο Α.1).

2.2 ΑΠΟΜΟΝΧ΢Ζ ΓΔΝΧΜΗΚΟΤ DNA

Γηα ηελ απνκφλσζε γελεηηθνχ πιηθνχ ρξεζηκνπνηήζεθε ην πξσηφθνιιν πνπ αλαθέξεηαη απφ ηνπο Hillis et al. (Hillis et al. 1996), ην νπνίν ζηεξίδεηαη ζηε ρξήζε ρισξνθνξκίνπ θαη CTAB (hexacyl-trimethyl-ammonium bromide) θαη θαηά ηελ εθαξκνγή ηνπ, έγηλαλ ζε απηφ θάπνηεο ηξνπνπνηήζεηο.

΢πλνιηθά, επηρεηξήζεθε απνκφλσζε DNA θαη απφ ηα 544 δείγκαηα.

2.2.1 Απομόνωζη DNA με σπήζη Υλωποθοπμίος-CTAB

1ε Ζκέξα

1. Πξνζζήθε, ζε ζσιήλεο Eppendorf ησλ 1,5 ml, 500 κl δηαιχκαηνο 2x CTAB.

2. Πξνζζήθε ζηνπο ζσιήλεο Eppendorf 60-70 κg ηζηνχ. Σν ηκήκα ηνπ ηζηνχ θφβεηαη κε μπξάθη θαη ζηε ζπλέρεηα ηεκαρίδεηαη ζε κηθξά θνκκάηηα, ψζηε λα επηηεπρζεί θαιχηεξε νκνγελνπνίεζή ηνπ θαηά ην επφκελν βήκα ηεο δηαδηθαζίαο.

3. Πξνζζήθε 10κl πξσηετλάζεο Κ (10 mg/ml) ζε θάζε ζσιήλα. Οη ζσιήλεο αλαθηλνχληαη θαη ηνπνζεηνχληαη ζε πδαηφινπηξν ζηνπο 55νC, κέρξη ηελ επφκελε εκέξα.

4.

23

2ε Ζκέξα

1. Πξνζζήθε 500 κl δηαιχκαηνο θαηλφιεο-ρισξνθνξκίνπ/ηζνακπιηθήο αιθνφιεο (1V δηαιχκαηνο θαηλφιεο : 1V δηαιχκαηνο ρισξνθνξκίνπ/ηζνακπιηθήο αιθνφιεο 24:1) ζε θάζε ζσιήλα θαη αλάδεπζε γηα 5 ιεπηά κε ηε ρξήζε πεξηζηξεθφκελνπ αλαθηλεηή.

2. Φπγνθέληξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηηο 12.000 rpm γηα 3 ιεπηά. Ζ ππεξθείκελε πδαηηθή ζηηβάδα κεηαθέξεηαη ζε λένπο ζσιήλεο Δppendorf.

3. Πξνζζήθε 500 κl δηαιχκαηνο ρισξνθνξκίνπ/ηζνακπιηθήο αιθνφιεο 24:1 ζε θάζε ζσιήλα θαη αλάδεπζε γηα 5 ιεπηά κε ηε ρξήζε πεξηζηξεθφκελνπ αλαθηλεηή.

4. Φπγνθέληξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηηο 12.000 rpm γηα 3 ιεπηά. Ζ ππεξθείκελε πδαηηθή ζηηβάδα κεηαθέξεηαη ζε λένπο ζσιήλεο Δppendorf.

5. Πξνζζήθε 1 ml παγσκέλεο 99% αηζαλφιεο. Οη ζσιήλεο αλαδεχνληαη ειαθξψο γηα ηελ θαηαθξήκληζε ηνπ DNA.

6. Φπγνθέληξεζε ησλ ζσιήλσλ γηα 15 ιεπηά ζηηο 12.000 rpm γηα ηελ θαζίδεζε ηνπ DNA ζε ίδεκα.

7. Πξνζεθηηθή απνκάθξπλζε ηνπ ππεξθεηκέλνπ απφ θάζε ζσιήλα, ψζηε ην ίδεκα λα παξακείλεη κέζα θαη αθνινπζεί πξνζζήθε 1 ml 70% αηζαλφιεο. Σα δείγκαηα αλαδεχνληαη γηα 1 ψξα κε ηε ρξήζε πεξηζηξεθφκελνπ αλαθηλεηή.

8. Φπγνθέληξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηηο 12.000 rpm γηα 3 ιεπηά. Ζ αηζαλφιε πνπ απνηειεί ην ππεξθείκελν απνκαθξχλεηαη απφ ηνπο ζσιήλεο κε ηελ ρξήζε κηθξνπηπέηαο.

9. Πξνζζήθε 50-100 κl δηαιχκαηνο ΣΔ ψζηε λα δηαιπζεί ην ηδεκαηνπνηεκέλν DNA. Σα δείγκαηα δηαηεξνχληαη ζηνπο 4νC εψο ηελ επφκελε εκέξα, πξνθεηκέλνπ λα επαλαδηαιπζεί πιήξσο ην DNA. Ύζηεξα, ηα δείγκαηα κπνξνχλ λα απνζεθεπηνχλ ζηνπο -20νC.

2.2.2 Έλεγσορ απομονωμένος DNA

Μεηά ηελ απνκφλσζε ηνπ DNA θξίλεηαη απαξαίηεηε ε εμαθξίβσζε ηεο επηηπρίαο ή κε ηεο απνκφλσζεο θαη ν έιεγρνο ηεο πνηφηεηαο ηνπ απνκνλσκέλνπ DNA. Απηφο ν έιεγρνο γίλεηαη κε ειεθηξνθφξεζε ηνπ απνκνλσκέλνπ DNA.

Ζ ειεθηξνθφξεζε βαζίδεηαη ζην γεγνλφο φηη πνιιά βηνινγηθά καθξνκφξηα είλαη ειεθηξηθά θνξηηζκέλα θαη θαηά ζπλέπεηα φηαλ βξεζνχλ κέζα ζε ειεθηξηθφ πεδίν θηλνχληαη κε θαηεχζπλζε πνπ εμαξηάηαη απφ ην θνξηίν ηνπο (Berg et al, 2007). Σν DNA είλαη θνξηηζκέλν αξλεηηθά ιφγσ ησλ θσζθνξηθψλ νκάδσλ ησλ λνπθιενηηδίσλ θαη θαηά ηελ ειεθηξνθφξεζε θηλείηαη πξνο ηνλ ζεηηθφ πφιν ηεο ζπζθεπήο ειεθηξνθφξεζεο κε ηαρχηεηα πνπ εμαξηάηαη απφ ην κέγεζνο ηνπ κνξίνπ.

Γηα ηνλ έιεγρν ηεο πνηφηεηαο ηεο απνκφλσζεο ρξεζηκνπνηήζεθε νξηδφληηα ειεθηξνθφξεζε ζε πεθηή αγαξφδεο. Ζ πεθηή ήηαλ ζπγθέληξσζεο 1% w/v ζε

24

αγαξφδε θαη πξνζηέζεθε επίζεο βξσκηνχρν αηζίδην ζε ηειηθή ζπγθέληξσζε 0,5 κg/ml. Σν βξσκηνχρν αηζίδην έρεη ηελ ηδηφηεηα λα παξεκβάιιεηαη αλάκεζα ζε δεχγε βάζεσλ ηνπ δίθισλνπ DNA θαη λα θζνξίδεη φηαλ εθηεζεί ζε ππεξηψδε αθηηλνβνιία (Watson et al. 2007). Ο θζνξηζκφο απηφο είλαη εληνλφηεξνο φηαλ ην βξσκηνχρν αηζίδην βξίζθεηαη ζε ζχκπινθν κε DNA (Berg et al. 2007).

3-5 κl απφ θάζε δείγκα απνκνλσκέλνπ DNA ηνπνζεηνχληαη ζηελ πεθηή αγαξφδεο, ε νπνία ζηε ζπλέρεηα ειεθηξνθνξείηαη γηα 30 ιεπηά ζηα 120 Volt θαη 100 mA, κέζα ζηελ εηδηθή ζπζθεπή ειεθηξνθφξεζεο, ε νπνία πεξηέρεη δηάιπκα TBE ζε ζπγθέληξσζε 1x.

Μεηά ηελ ειεθηξνθφξεζε, ε πεθηή ηνπνζεηείηαη ζε ηξάπεδα ππεξηψδνπο θσηφο, φπνπ ην DNA θαίλεηαη σο θσηεηλέο δψλεο. Έηζη, ε χπαξμε ηέηνησλ θσηεηλψλ δσλψλ θαη ε ζέζε ηνπο ζηελ πεθηή θαηαδεηθλχνπλ ηελ επηηπρία ηεο απνκφλσζεο θαη ηελ πνηφηεηα ηνπ απνκνλσκέλνπ DNA.

2.3 ΑΛΤ΢ΗΓΧΣΖ ΑΝΣΗΓΡΑ΢Ζ ΠΟΛΤΜΔΡΑ΢Ζ΢ (PCR)

2.3.1 Γενικά

Ζ αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (PCR) απνηειεί κία βηνρεκηθή ηερληθή γηα ηελ ελίζρπζε DNA αθνινπζηψλ in vitro. Αλαπηχρζεθε ζηα κέζα ηεο δεθαεηίαο ηνπ 1980 θαη επηηξέπεη ηε δεκηνπξγία κεγάινπ αξηζκνχ αληηγξάθσλ κίαο ζπγθεθξηκέλεο αιιεινπρίαο DNA κε βάζε ιίγα αξρηθά κφξηα DNA.

Ζ PCR βαζίδεηαη ζηε δξάζε ηνπ ελδχκνπ DNA πνιπκεξάζε θαη απνηειείηαη απφ δηαδνρηθνχο ζεξκηθνχο θχθινπο. ΢ηε δηάξθεηα θάζε θχθινπ ε DNA πνιπκεξάζε αληηγξάθεη ηελ επηιεγκέλε αιιεινπρία θαη θάζε αληίγξαθν ρξεζηκνπνηείηαη ζηνλ επφκελν θχθιν σο εθκαγείν γηα ηε ζχλζεζε επηπξφζζεησλ αληηγξάθσλ, επηηξέπνληαο έηζη ηε δεκηνπξγία αληηγξάθσλ κε εθζεηηθνχο ξπζκνχο (Δηθφλα 2.1) (Saiki et al. 1988).

Έλα ηππηθφ κείγκα αληίδξαζεο PCR πεξηιακβάλεη:

 Αξρηθά κφξηα DNA. ΢ε απηά πεξηέρεηαη ε πξνο ελίζρπζε αθνινπζία θαη απνηεινχλ ην εθκαγείν κε βάζε ην νπνίν ε DNA πνιπκεξάζε ζπλζέηεη ηα αληίγξαθα.

 Δθθηλεηέο. Εεχγνο ζπλζεηηθψλ νιηγνλνπθιενηηδίσλ. Ο θάζε έλαο είλαη ζπκπιεξσκαηηθφο πξνο ηνλ έλαλ απφ ηνπο δχν θιψλνπο ηνπ αξρηθνχ κνξίνπ DNA θαη ζπγθεθξηκέλα πξνο ην 3΄ άθξν ηεο αθνινπζίαο πνπ πξφθεηηαη λα εληζρπζεί. Oη εθθηλεηέο επηηεινχλ δηηηφ ξφιν. Δπηηξέπνπλ ζηελ DNA πνιπκεξάζε λα αληηγξάςεη ην DNA, θαζψο δελ κπνξεί λα ζπλζέζεη de novo ηκήκαηα DNA ελψ ζπγρξφλσο “θαηεπζχλεη” ηελ DNA πνιπκεξάζε λα αληηγξάςεη κφλν ηελ επηζπκεηή αθνινπζία DNA. Οη εθθηλεηέο ραξαθηεξίδνληαη απφ κία ζεξκνθξαζία ηήμεο (Tm). Ζ ζεξκνθξαζία ηήμεο είλαη απηή, ζηελ νπνία ηα κηζά κφξηα ηνπ εθθηλεηή είλαη ζπλδεδεκέλα κε ηελ αιιεινπρία ζηφρν

25

θαη εμαξηάηαη απφ ην κήθνο θαη ηε λνπθιενηηδηθή ζχζηαζε ηνπ εθθηλεηή. ΢ε θάζε δεχγνο, νη δχν εθθηλεηέο είλαη πξνηηκφηεξν λα έρνπλ παξαπιήζηεο Σm, ψζηε θαηά ηελ PCR λα πβξηδίδνληαη απνηειεζκαηηθά κε ηηο αιιεινπρίεο ζηφρνπο ζηελ ίδηα ζεξκνθξαζία (Watson et al. 2007). Καηά ηνλ ζρεδηαζκφ ησλ εθθηλεηψλ ηδηαίηεξε πξνζνρή ζα πξέπεη λα δίλεηαη, ψζηε νη εθθηλεηέο λα κελ πβξηδίδνληαη ζε κε επηζπκεηέο ζέζεηο ηνπ DNA, θαζψο επίζεο θαη λα κελ ζρεκαηίδνληαη νκνδηκεξή θαη εηεξνδηκεξή.

 Θεξκναλζεθηηθή πνιπκεξάζε. Ζ πνιπκεξάζε είλαη ππεχζπλε γηα ηε ζχλζεζε ησλ λέσλ κνξίσλ DNA ζε θάζε θχθιν ηεο PCR. Ζ απηνκαηνπνίεζε ηεο PCR θαηέζηε δπλαηή κε ηελ απνκφλσζε απφ ζεξκφθηια βαθηήξηα DNA πνιπκεξαζψλ νη νπνίεο δελ θαηαζηξέθνληαη απφ ηηο πςειέο ζεξκνθξαζίεο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη θαηά ηελ αληίδξαζε γηα ηελ απνδηάηαμε ηνπ δίθισλνπ DNA. Μία απφ ηηο ζπρλφηεξα ρξεζηκνπνηνχκελεο ζεξκναλζεθηηθέο πνιπκεξάζεο είλαη ε Taq πνιπκεξάζε ε νπνία απνκνλψζεθε απφ ην βαθηήξην Thermus aquaticus (Chien et al. 1976).

 Σξηθσζθνξηθά δενμπλνπθιενηίδηα (dNTPs). Υξεζηκνπνηνχληαη απφ ηελ DNA πνιπκεξάζε γηα ηε ζχλζεζε ηνπ DNA θαη είλαη ηεζζάξσλ ηχπσλ (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

 Ρπζκηζηηθφ δηάιπκα. Γεκηνπξγεί ηηο θαηάιιειεο ζπλζήθεο γηα ηε βέιηηζηε δξάζε θαη ζηαζεξνπνίεζε ηεο πνιπκεξάζεο.

 Καηηφληα καγλεζίνπ (Mg+2). Δίλαη απαξαίηεηα γηα ηε ιεηηνπξγία ηεο πνιπκεξάζεο, θαζψο ρξεζηκνπνηνχληαη απφ απηήλ σο “κεηαιιηθφο ζπκπαξάγνληαο”.

Σν κείγκα γηα ηελ PCR εηνηκάδεηαη απφ ηνλ εξεπλεηή, ελψ ε αληίδξαζε πξαγκαηνπνηείηαη ζε εηδηθφ κεράλεκα, ηνλ ζεξκηθφ θπθινπνηεηή. Ο ζεξκηθφο θπθινπνηεηήο πξαγκαηνπνηεί θπθιηθέο κεηαβνιέο ηεο ζεξκνθξαζίαο, νη νπνίεο επηηξέπνπλ ηελ πξαγκαηνπνίεζε ησλ αληηδξάζεσλ ζην κείγκα.

Ζ PCR πεξηιακβάλεη επαλαιακβαλφκελνπο θχθινπο ησλ εμήο ζηαδίσλ (Σξηαληαθπιιίδεο 2010):

Θεξκηθή απνδηάηαμε (denaturation). Καηά ην ζηάδην, απηφ ην κείγκα ζεξκαίλεηαη ζηνπο 91-95 νC γηα πεξίπνπ 30 δεπηεξφιεπηα, ψζηε ηα δίθισλα κφξηα DNA λα απνδηαηαρζνχλ ζε κνλφθισλα θαη λα θαηαζηεί δπλαηή ε ζχλδεζε ησλ εθθηλεηψλ θαη ε αληηγξαθή ηνπο απφ ηελ πνιπκεξάζε.

Τβξηδηζκφο ησλ εθθηλεηψλ (annealing). Ζ ζεξκνθξαζία κεηψλεηαη ζηνπο 45-65 νC γηα 20-60 δεπηεξφιεπηα. Καηά ην ζηάδην απηφ νη εθθηλεηέο ζπλδένληαη ζηηο πεξηνρέο ηνπ DNA πξνο ηηο νπνίεο είλαη ζπκπιεξσκαηηθνί. Ζ ζεξκνθξαζία πνπ επηιέγεηαη είλαη ζπλήζσο κεξηθνχο βαζκνχο Κειζίνπ ρακειφηεξε απφ ηελ Tm ησλ εθθηλεηψλ.

26

Δπηκήθπλζε (elongation). Καηά ην ζηάδην απηφ ε DNA πνιπκεξάζε επηκεθχλεη ηνπο εθθηλεηέο πνπ είλαη ζπλδεδεκέλνη ζηα αξρηθά κφξηα DNA, πξνζζέηνληαο λνπθιενηίδηα ζπκπιεξσκαηηθά ζην θιψλν εθκαγείν κε θαηεχζπλζε 5΄ πξνο 3΄. Ζ δηάξθεηα ηνπ ζηαδίνπ απηνχ εμαξηάηαη απφ ην κέγεζνο ηεο εληζρπφκελεο αιιεινπρίαο, ελψ ε ζεξκνθξαζία ζηελ νπνία πξαγκαηνπνηείηαη εμαξηάηαη απφ ηελ πνιπκεξάζε. Γηα ηελ Taq πνιπκεξάζε ε βέιηηζηε ζεξκνθξαζία είλαη 72 νC.

Δικόνα 2.1 ΢ρεκαηηθή απεηθφληζε ηεο δηαδηθαζίαο PCR (wikipedia.org)

Σα παξαπάλσ ζηάδηα, ηα νπνία απνηεινχλ έλαλ θχθιν ηεο PCR, επαλαιακβάλνληαη ζπλήζσο 25-40 θνξέο, αιιά ν αξηζκφο ηνπο κπνξεί λα πνηθίιεη αλάινγα κε ηελ αξρηθή πνζφηεηα DNA, ηελ απφδνζε ηεο πνιπκεξάζεο ή ηνλ ηειηθφ αξηζκφ αληηγξάθσλ πνπ απαηηνχληαη.

΢ην ηέινο ησλ θχθισλ απηψλ, ην κείγκα παξακέλεη γηα 5-7 ιεπηά ζηνπο 72 νC, δηάζηεκα θαηά ην νπνίν ε πνιπκεξάζε νινθιεξψλεη ηε ζχλζεζε ζπγαηξηθψλ αιπζίδσλ DNA πνπ είλαη εκηηειείο.

Ζ πξνεηνηκαζία ηνπ κείγκαηνο αληίδξαζεο ηεο PCR γίλεηαη πάληνηε κε κεγάιε πξνζνρή θαη ζε φζν ην δπλαηφλ απνζηεηξσκέλεο ζπλζήθεο, ψζηε λα κελ ππάξμεη επηκφιπλζε κε μέλν γελεηηθφ πιηθφ, ε νπνία κπνξεί λα έρεη σο απνηέιεζκα ηελ ελίζρπζε κε επηζπκεηψλ αιιεινπρηψλ (Powledge 2007). Γηα ηνλ ιφγν απηφλ ζε θάζε PCR κία πνζφηεηα ηνπ κείγκαηνο αληίδξαζεο ρξεζηκνπνηείηαη σο ηπθιφ, πξνζηίζεληαη δειαδή φια ηα αληηδξαζηήξηα εθηφο απφ DNA, ψζηε θαηά ηνλ έιεγρν γηα ηελ επηηπρία ηεο αληίδξαζεο λα εληνπηζηνχλ πηζαλέο επηκνιχλζεηο.

27

Μεηά ηελ νινθιήξσζε ηεο PCR ειέγρεηαη ε επηηπρία ηεο, επίζεο κε ειεθηξνθφξεζε ζε πεθηή αγαξφδεο.

2.3.2 Δνίζσςζη ηος γονιδίος COI με σπήζη PCR

Σελ απνκφλσζε ηνπ νιηθνχ γελεηηθνχ πιηθνχ ησλ δεηγκάησλ ηρζχσλ αθνινχζεζε ε ελίζρπζε κε PCR ελφο ηκήκαηνο ηνπ γνληδίνπ COI ηνπ κηηνρνλδξηαθνχ DNA, κε κέγεζνο πεξίπνπ 650 bp. PCR επηρεηξήζεθε θαη ζηα 544 δείγκαηα, αλεμαξηήησο ηεο εηθφλαο πνπ έδεημε ε απνκφλσζε DNA θάζε δείγκαηνο θαηά ηνλ έιεγρν ηεο επηηπρίαο ησλ απνκνλψζεσλ. Υξεζηκνπνηήζεθαλ νη εθθηλεηέο πνπ αλαθέξνληαη απφ ηνπο Ward et al. (Ward et al. 2005). Πην ζπγθεθξηκέλα ρξεζηκνπνηήζεθαλ νη εθθηλεηέο FishF1 θαη FishR1 γηα φια ηα είδε ηρζχσλ κε εμαίξεζε ην είδνο Gambusia holbrooki γηα ην νπνίν ρξεζηκνπνηήζεθαλ νη εθθηλεηέο FishF2 θαη FishR2. Ζ αιιεινπρία ηνπ θάζε εθθηλεηή, ην κέγεζφο ηνπ θαη ε ζεξκνθξαζία ηήμεο ηνπ δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 2.1. Σα ζπζηαηηθά ηνπ κίγκαηνο αληίδξαζεο ηεο PCR θαη νη αλαινγίεο ηνπο δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 2.2. Οη ζπλζήθεο ηεο PCR δίλνληαη ζηνλ πίλαθα 2.3

Πίνακαρ 2.1 Δθθηλεηέο γηα ελίζρπζε ηνπ γνληδίνπ COI

Δκκινηηήρ Αλληλοςσία Μέγεθορ (βάζειρ) Tm (oC) FishF1 5’ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3’ 26 76 FishR1 5’ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3’ 26 76 FishF2 5’ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC 3’ 26 72 FishR2 5’ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 3’ 26 76

Πίνακαρ 2.2 ΢χζηαζε ηνπ κείγκαηνο αληίδξαζεο ηεο PCR

Ανηιδπαζηήπιο Ποζόηηηα (μl) Σελική ζςγκένηπωζη Qiagen Taq DNA polymerase 5 units/μl 0,176 0,04 units/κl QIAGEN PCR Buffer 2,2 x1 dNTPs (ζςγκένηπωζη 10 mM για κάθε 0,2 mM γηα θάζε 0,44 νοςκλεοηίδιο) λνπθιενηίδην Primer F 0,132 1 pmol/κl Primer R 0,132 1 pmol/κl DNA template 1,1 H2O 17,82 Σελικόρ όγκορ 22

Πίνακαρ 2.3 ΢πλζήθεο αληίδξαζεο PCR

΢ηάδιο Θεπμοκπαζία (oC) Γιάπκεια Απσική αποδιάηαξη 94 oC 5 min Αποδιάηαξη 94 oC 45 sec Τβπιδιζμόρ εκκινηηών (annealing) 60 oC 45 sec 35 θχθινη Δπιμήκςνζη 72 oC 90 sec Σελική επιμήκςνζη 72 oC 7 min

28

Καηά ηελ πξνεηνηκαζία ησλ κεηγκάησλ PCR, ζε έλα δείγκα εηζάγεηαη λεξφ ζηε ζέζε ηνπ DNA. Απηφ ην κείγκα νλνκάδεηαη ηπθιφ θαη ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηνλ εληνπηζκφ επηκνιχλζεσλ ησλ ππνινίπσλ κεηγκάησλ κε μέλν DNA. Παξάιιεια, θάζε θνξά πνπ εθαξκνδφηαλ PCR ζε δείγκαηα DNA γηα πξψηε θνξά, επηιεγφηαλ καδί ηνπο θαη έλα δείγκα DNA ζην νπνίν ε αληίδξαζε PCR είρε ήδε πεηχρεη, ψζηε λα απνηειέζεη κέηξν ζχγθξηζεο γηα ηελ επηηπρία ή απνηπρία ζηε PCR ησλ λέσλ δεηγκάησλ DNA.

Μεηά ηελ νινθιήξσζε ησλ αληηδξάζεσλ PCR, ειέγρζεθε ε επηηπρία ηνπο, κε ειεθηξνθφξεζε ζε πεθηή αγαξφδεο. ΢ηελ πξνθεηκέλε πεξίπησζε, ιφγσ ηνπ κηθξφηεξνπ κεγέζνπο ηεο εληζρπκέλεο αιιεινπρίαο ζε ζρέζε κε ην νιηθφ γνληδίσκα, ρξεζηκνπνηήζεθε πεθηή κε ζπγθέληξσζε αγαξφδεο 1,5 % w/v θαη βξσκηνχρν αηζίδην ζε ηειηθή ζπγθέληξσζε 0,5 κg/ml.

΢ηελ πεθηή, παξάιιεια κε ηηο αληηδξάζεηο PCR, ηνπνζεηείηαη θαη έλαο ladder. Ο ladder είλαη έλα κείγκα κνξίσλ DNA κε δηαθνξεηηθφ θαη γλσζηφ κήθνο. Υξεζηκνπνηείηαη σο δείθηεο αλαθνξάο γηα ηνλ ππνινγηζκφ ηνπ κεγέζνπο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ εληζρχζεθαλ θαηά ηελ PCR. Βαζίδεηαη ζηελ αξρή φηη κφξηα DNA κε ην ίδην κήθνο ζα θηλεζνχλ κε ηελ ίδηα ηαρχηεηα θαηά ηελ ειεθηξνθφξεζε (Watson et al. 2007). ΢πγθξίλνληαο ηε ζρεηηθή ζέζε ησλ θσηεηλψλ δσλψλ πνπ ζρεκαηίδνληαη ζηελ πεθηή απφ ηα πξντφληα ηεο PCR κε ηε ζέζε ησλ δσλψλ πνπ ζρεκαηίδνληαη απφ ηα κφξηα DNA γλσζηνχ κεγέζνπο ηνπ ladder, κπνξεί λα εθηηκεζεί πξνζεγγηζηηθά ην κέγεζνο ησλ πξντφλησλ ηεο PCR. ΢ηελ πξνθεηκέλε πεξίπησζε ρξεζηκνπνηήζεθε ladder 100 bp, δειαδή ladder πνπ πεξηείρε κφξηα DNA δηέθεξαλ κεηαμχ ηνπο θαηά 100 bp.

Μεηά ηελ ειεθηξνθφξεζε ε πεθηή αγαξφδεο παξαηεξνχληαλ ζε ηξάπεδα ππεξηψδνπο θσηφο. Σα πξντφληα ηεο PCR θαίλνληαλ σο θσηεηλέο δψλεο κεηαμχ ησλ δσλψλ ησλ 600 bp θαη 700 bp ηνπ ladder. Σν ηπθιφ δελ έδηλε θακία θσηεηλή δψλε, πνπ ζεκαίλεη φηη απνθεχρζεθε νπνηαδήπνηε επηκφιπλζε.

2.4 ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ

2.4.1 Γενικά

Ο φξνο αιιεινχρηζε αλαθέξεηαη ζηελ εχξεζε ηεο πξσηνηαγνχο αθνινπζίαο ελφο ηκήκαηνο DNA (Watson et al. 2007). Γηα ηελ αιιεινχρηζε ηνπ DNA έρνπλ αλαπηπρζεί δηάθνξεο κέζνδνη, κε κία εδξαησκέλε θαη επξέσο ρξεζηκνπνηνχκελε λα είλαη απηή πνπ αλαπηχρζεθε απφ ηνλ Sanger, ην 1975 (Sanger and Coulson 1975), ε νπνία κε ην πέξαζκα ησλ ρξφλσλ ηξνπνπνηήζεθε θαη βειηηψζεθε. Ζ αιιεινχρηζε ρξεζηκνπνηείηαη ζήκεξα επξέσο ζηελ έξεπλα θαη έρεη παίμεη πνιχ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ εμέιημε ηεο γελεηηθήο (Mardis 2008).

Ζ κέζνδνο θαηά Sanger βαζίδεηαη ζηελ αλαζηνιή ηεο επηκήθπλζεο ησλ αιπζίδσλ DNA (Sanger and Coulson 1975). Πην ζπγθεθξηκέλα ην πξνο αιιεινχρηζε DNA κνηξάδεηαη ζε ηέζζεξα κείγκαηα αληίδξαζεο, θαζέλα απφ ηα νπνία πεξηέρεη έλαλ εθθηλεηή, κία DNA πνιπκεξάζε, ηα 4 δενμπλνπθιενηίδηα θαη κηθξή πνζφηεηα απφ έλα

29

δηδενμπλνπθιενηίδην. Σα δηδενμπλνπθιενηίδηα (ddNTPs) είλαη λνπθιενηίδηα, ηα νπνία δελ κπνξνχλ λα ζρεκαηίζνπλ θσζθνδηεζηεξηθφ δεζκφ ζηνλ 3΄ άλζξαθά ηνπο θαη θαηά ζπλέπεηα φηαλ πξνζηίζεληαη ζε κία επηκεθπλφκελε αιπζίδα DNA, θαζίζηαηαη αδχλαηε ε πεξαηηέξσ επηκήθπλζε ηεο. Καζψο ε πνιπκεξάζε ζπλζέηεη λέεο αιπζίδεο DNA κέζα ζην κείγκα, ζε ηπραίεο ζηηγκέο πξνζζέηεη ζηηο αλαπηπζζφκελεο αιπζίδεο δηδενμπλνπθιενηίδηα, νπφηε ε επηκήθπλζε ηεο εθάζηνηε αιπζίδαο ζηακαηά. Όηαλ νινθιεξσζεί ε αληίδξαζε, ην θάζε κείγκα πεξηέρεη αιπζίδεο δηαθνξεηηθψλ κεγεζψλ πνπ φιεο ηειεηψλνπλ κε ην ίδην λνπθιενηίδην. Σα πξντφληα ησλ ηεζζάξσλ αληηδξάζεσλ ειεθηξνθνξνχληαη ζε δηαθνξεηηθέο ζηήιεο ηεο ίδηαο πεθηήο (ζπλήζσο πνιπαθξπιακίδεο). Δθηηκψληαο έηζη ην κέγεζνο ησλ δηαθφξσλ κνξίσλ DNA θαη γλσξίδνληαο ην ηειεπηαίν λνπθιενηίδην ηνπ θαζελφο, ν εξεπλεηήο κπνξεί λα “ζπλαξκνινγήζεη” ηελ αιιεινπρία ηνπ αξρηθνχ κνξίνπ DNA.

2.4.2 Αλληλούσιζη ηος γονιδίος COI

Σν επφκελν βήκα ζηελ εξγαζία ήηαλ ε αιιεινχρηζε ηνπ ηκήκαηνο ηνπ γνληδίνπ ηνπ COI πνπ εληζρχζεθε κε ηελ PCR.

Tα πξντφληα PCR ησλ δεηγκάησλ ζηα νπνία είρακε επηηπρή ελίζρπζε ηνπ γνληδίνπ COI, ζηάιζεθαλ ζηελ εηαηξία Genewiz (πξψελ Beckman Coulter Genomics) γηα αιιεινχρηζε. ΢ηελ εηαηξία, καδί κε ηα δείγκαηα ζηέιλνληαη θαη πνζφηεηεο ησλ εθθηλεηψλ κε ηνπο νπνίνπο επηζπκνχκε λα γίλεη ε αιιεινχρηζε.

Σν επξσπατθφ παξάξηεκα ηεο Genewiz εδξάδεηαη ζηελ Αγγιία θαη γηα ηηο αιιεινπρίζεηο ρξεζηκνπνηεί ηνπο απηφκαηνπο αλαιπηέο ABI 3730xl DNA Analyzers (www.genewiz.com). Ζ ιεηηνπξγία ησλ αλαιπηψλ απηψλ βαζίδεηαη ζηελ κέζνδν ηνπ Sanger κε νξηζκέλεο ηξνπνπνηήζεηο (Huang et al. 1992). Οη αληηδξάζεηο κε ηα ηέζζεξα δηδενμπλνπθιενηίδηα πξαγκαηνπνηνχληαη ζην ίδην κείγκα αληίδξαζεο (αληί ζε ηέζζεξα δηαθνξεηηθά, φπσο ζηελ πξσηφηππε κέζνδν). Σν θάζε έλα απφ ηα ηέζζεξα δηδενμπλνπθιενηίδηα είλαη ζεκαζκέλν κε δηαθνξεηηθή θζνξίδνπζα ρξσζηηθή. Μεηά ηελ νινθιήξσζε ηεο αληίδξαζεο, ηα πξντφληα ειεθηξνθνξνχληαη απφ ηνλ ίδην ηνλ αλαιπηή ζε πγξφ κέζν εληφο ηξηρνεηδψλ ζσιελαξίσλ θαη δηέξρνληαη δηαδνρηθά, αλάινγα κε ην κέγεζφο ηνπο, κπξνζηά απφ κία δεζκίδα laser. Ζ δεζκίδα απηή πξνθαιεί θζνξηζκφ ησλ ρξσζηηθψλ νπζηψλ, δίλνληαο ζηνλ αλαιπηή έλα θσηεηλφ ζήκα, ραξαθηεξηζηηθφ ηνπ ηειεπηαίνπ λνπθιενηηδίνπ ηεο αιιεινπρίαο. Ο αλαιπηήο, ζπλδπάδνληαο ηα ζήκαηα απηά ζε έλα ρξσκαηνγξάθεκα, ζπλζέηεη ηελ αιιεινπρία ηνπ αλαιπφκελνπ ηκήκαηνο DNA. Πξηλ ηελ αιιεινχρηζε ηνπ DNA γίλεηαη θαζαξηζκφο ησλ πξντφλησλ ηεο PCR. Ο θαζαξηζκφο απνζθνπεί ζηελ απνκάθξπλζε νπζηψλ πνπ κπνξεί λα δεκηνπξγήζνπλ πξνβιήκαηα θαηά ηελ αιιεινχρηζε, φπσο άιαηα ή λνπθιενηίδηα απφ ηελ PCR ή θαηάινηπα νπζηψλ απφ ηελ απνκφλσζε ηνπ DNA

Μεηά ηελ νινθιήξσζε ηεο αιιεινχρηζεο, ηα απνηειέζκαηα απνζηέιινληαη ζηνλ εξεπλεηή κέζσ ειεθηξνληθνχ ηαρπδξνκείνπ ζε δηάθνξεο ειεθηξνληθέο κνξθέο πνπ πεξηιακβάλνπλ ηφζν ηελ αιιεινπρία ηνπ DNA, φζν θαη ηα ρξσκαηνγξαθήκαηα πνπ παξάρζεθαλ απφ ηνλ απηφκαην αλαιπηή.

30

΢ε φια ηα δείγκαηα πνπ ζηάιζεθαλ γηα αιιεινχρηζε, ε αιιεινχρηζε έγηλε θαη κε ηνπο δχν εθθηλεηέο ηνπ δεχγνπο κε ην νπνίν είρε γίλεη θαη ε PCR.

2.5 ΑΝΑΛΤ΢Ζ ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΧΝ ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ΢

2.5.1 Έλεγσορ και επεξεπγαζία ηων αλληλοςσιών

Σν πξψην βήκα ζηελ αλάιπζε ησλ απνηειεζκάησλ ήηαλ ν έιεγρνο ησλ αιιεινπρηψλ. Γηα ην ζθνπφ απηφ ρξεζηκνπνηήζεθε ην πξφγξακκα Geneious 10, ην νπνίν αμηνπνηεί πνιιά βηνπιεξνθνξηθά εξγαιεία θαη επηηξέπεη ηε δηεμαγσγή ελφο κεγάινπ εχξνπο αλαιχζεσλ (Kearse et al. 2012). Οη αιιεινπρίεο εηζήρζεζαλ ζην Geneious θαη κέζσ ησλ ρξσκαηνγξαθεκάησλ ειέγρζεθε ε πνηφηεηα ησλ αιιεινπρηψλ. Σα ρξσκαηνγξαθήκαηα επηηξέπνπλ ζηνλ εξεπλεηή λα θξίλεη ηελ πνηφηεηα ηεο αιιεινχρηζεο θαη λα απνθαζίζεη εάλ ην απνηέιεζκα είλαη αμηφπηζην (Δηθφλα 2.2). Γηα παξάδεηγκα ηα ρξσκαηνγξαθήκαηα κε θαζαξέο θαη πςειέο θνξπθέο θαηαδεηθλχνπλ θαιή πνηφηεηα αιιεινχρηζεο.

Δικόνα 2.2 Υξσκαηνγξαθήκαηα απνηειεζκάησλ αιιεινχρηζεο

Αξρηθά, απφ ηα άθξα ησλ αιιεινπρηψλ αθαηξέζεθαλ ηα ηκήκαηα πνπ αληηζηνηρνχλ ζηνπο εθθηλεηέο, θαζψο θαη θάπνηα ηκήκαηα κε ρακειή πνηφηεηα αιιεινχρηζεο. Οη δχν αιιεινπρίεο πνπ πξνέθπςαλ γηα θάζε δείγκα απφ ηελ αιιεινχρηζε ηνπ κε ηνπο δχν εθθηλεηέο ηνπ δεχγνπο ζηνηρήζεθαλ, ψζηε λα πξνθχςεη ε ζπλαηλεηηθή (consensus) αιιεινπρία ηκήκαηνο ηνπ γνληδίνπ COI θάζε δείγκαηνο

Ζ ζηνίρηζε αλαθέξεηαη ζηε δηεπζέηεζε ησλ αιιεινπρηψλ θαηά ηέηνην ηξφπν ψζηε λα εληνπηζηνχλ νη νκφινγεο ζέζεηο ηνπο. Μέζσ ηεο ζηνίρηζεο κπνξεί λα εθηηκεζεί πνηεο πεξηνρέο ησλ αιιεινπρηψλ είλαη ζπληεξεκέλεο θαη λα εληνπηζηνχλ νη ζέζεηο ζηηο νπνίεο έρνπλ γίλεη αιιαγέο, δειαδή νη πνιπκνξθηζκνί (Hall 2004). Γηα ηε ζηνίρηζε κεγάινπ αξηζκνχ αιιεινπρηψλ ή αιιεινπρηψλ κεγάινπ κεγέζνπο ρξεζηκνπνηνχληαη ζήκεξα εηδηθνί αιγφξηζκνη. ΢ηελ πξνθεηκέλε πεξίπησζε, ε ζηνίρηζε ησλ αιιεινπρηψλ έγηλε κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο Geneious 10, ην νπνίν επηηξέπεη ηελ πνιιαπιή ζηνίρηζε αιιεινπρηψλ. Αθνχ ινηπφλ, βξέζεθε ε ζπλαηλεηηθή αιιεινπρία ηνπ ηκήκαηνο ηνπ γνληδίνπ COI γηα θάζε δείγκα, ηα δείγκαηα ρσξίζηεθαλ ζε νκάδεο αλάινγα κε ην γέλνο ζην νπνίν αλήθαλ, κε θάζε γέλνο λα απνηειεί κία νκάδα θαη έγηλε ζηνίρηζε ησλ αιιεινπρηψλ θάζε γέλνπο κε ην πξφγξακκα Geneious 10.

31

2.5.2 Φςλογενεηική ανάλςζη και αξιολόγηζη ηων DNA Barcodes

Σν πξψην ζηάδην ηεο θπινγελεηηθήο αλάιπζεο ήηαλ ε θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ. Πξνθεηκέλνπ λα απνθηήζνπκε κία θαιχηεξε εηθφλα ησλ θπινγελεηηθψλ ζρέζεσλ κεηαμχ ησλ αηφκσλ θάζε είδνπο θαη κεηαμχ ησλ εηδψλ, απνθαζίζηεθε λα ρξεζηκνπνηεζνχλ γηα ηελ θαηαζθεπή ησλ θπινγελεηηθψλ δέληξσλ, ηφζν νη αιιεινπρίεο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, φζν θαη αιιεινπρίεο απφ άιιεο έξεπλεο. Γηα ην ζθνπφ απηφ, αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (http://boldsystems.org/) θαηαηεζεηκέλεο αιιεινπρίεο γηα θάζε γέλνο, ν αξηζκφο ησλ νπνίσλ, νη θσδηθνί αλάθηεζεο ηνπο απφ ηελ BOLD θαη ε πεξηνρή πξνέιεπζεο ηνπ θάζε δείγκαηνο παξνπζηάδνληαη ζην παξάξηεκα Α. Οη αιιεινπρίεο πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD, πξνέξρνληαλ απφ δείγκαηα ηνπ ειιαδηθνχ ρψξνπ, κε εμαίξεζε ηα γέλε Alburnoides θαη Gobio γηα ηα νπνία αλαθηήζεθαλ θαη αιιεινπρίεο δεηγκάησλ απφ άιιεο ρψξεο θαη ην γέλνο Pseudorasbora γηα ην νπνίν αλαθηήζεθε θαη κία αιιεινπρία απφ ηελ Σνπξθία. Οη αιιεινπρίεο θάζε γέλνπο πνπ αλαθηεζήθαλ απφ ηελ BOLD ζηνηρίζηεθαλ κε ηηο αιιεινπρίεο ηνπ ίδηνπ γέλνπο πνπ πξνέθπςαλ απφ ηε δηθή καο έξεπλα, ρξεζηκνπνηψληαο ην πξφγξακκα Geneious 10. Οη ηειηθέο απηέο ζηνηρίζεηο ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηελ θαηαζθεπή ελφο θπινγελεηηθνχ δέληξνπ γηα θάζε γέλνο.

Ζ θαηαζθεπή ησλ θπινγελεηηθψλ δέληξσλ έγηλε κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEGA7 (Kumar et al. 2016) θαη έγηλε κε ηε κέζνδν Maximum Likelihood (Μέγηζηε Πηζαλνθάλεηα), ε νπνία αλαδεηεί ην εμειηθηηθφ κνληέιν πνπ έρεη ηε κεγαιχηεξε πηζαλφηεηα λα παξάγεη ηα παξαηεξνχκελα δεδνκέλα (Baxevanis and Ouellette 2001), κε εμαίξεζε ηα γέλε Gambusia θαη Lepomis, γηα ηα νπνία ρξεζηκνπνηήζεθε ε κέζνδνο UPGMA, θαζψο ζηα γέλε απηά παξαηεξήζεθε κφλν έλαο απιφηππνο.

Καηά ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ σο εμειηθηηθφ κνληέιν επηιέρζεθε ην Kimura’s two-parameter model (Kimura 1980), ην νπνίν ππνινγίδεη ηνλ ξπζκφ κε ηνλ νπνίν ζπκβαίλνπλ αιιαγέο ζε κία αθνινπζία DNA, ζεσξψληαο φηη νη κεηαπηψζεηο (αληηθαηάζηαζε πνπξίλεο απφ πνπξίλε ή ππξηκηδίλεο απφ ππξηκηδίλε) ζπκβαίλνπλ κε δηαθνξεηηθή ζπρλφηεηα ζε ζρέζε κε ηηο κεηαζηξνθέο (αληηθαηάζηαζε πνπξίλεο απφ ππξηκηδίλε ή αληίζηξνθα) (Hall 2004). Σν κνληέιν απηφ επηιέρζεθε κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEGA7, ην νπνίν έρεη ηε δπλαηφηεηα λα αλαιχζεη ηα δεδνκέλα πνπ εηζάγνληαη κε δηάθνξα κνληέια θαη λα πξνηείλεη ην θαηαιιειφηεξν γηα ηα δεδνκέλα απηά, ην κνληέιν δειαδή πνπ πεξηγξάθεη θαιχηεξα ην πξφηππν ησλ αιιαγψλ ζηηο ζπγθεθξηκέλεο αιιεινπρίεο. Παξάιιεια, γηα ηνλ έιεγρν ηεο θπινγέλεζεο εθαξκφζηεθε ε δηαδηθαζία bootstrap. Ο αξηζκφο επαλαιήςεσλ ηεο δνθηκαζίαο νξίζηεθε ζε ρίιηεο θνξέο (Hedges 1992). Ζ δηαδηθαζία bootstrap απνηειεί κία κέζνδν επαλαδεηγκαηνιεπηηθήο αμηνιφγεζεο δέληξσλ (Baxevanis and Ouellette 2001). Καηά ηελ δηαδηθαζία bootstrap δεκηνπξγνχληαη λέα ζχλνια δεδνκέλσλ απφ ην αξρηθφ ζχλνιν κε ηελ δεηγκαηνιεςία ηπραίσλ ζηειψλ δεδνκέλσλ κε αληηθαηάζηαζε. ΢ηε ζπλέρεηα θαηαζθεπάδνληαη δέληξα κε ηα λέα ζχλνια δεδνκέλσλ θαη εμάγεηαη ν αξηζκφο bootstrap, ν νπνίνο δείρλεη πφζεο θνξέο πξνέθπςαλ, θαηά ηελ παξαπάλσ δηαδηθαζία, νη ίδηνη θιάδνη κε απηνχο ηνπ ππφ ειέγρνπ δέληξνπ. Οη πςειέο ηηκέο bootstrap ζεσξείηαη φηη αληηζηνηρνχλ ζε κεγαιχηεξε πηζαλφηεηα λα βξέζεθε ε ζσζηή θπινγέλεζε (Soltis and Soltis 2003). Πην ζπγθεθξηκέλα ηηκέο bootstrap κεγαιχηεξεο

32

ηνπ 70 ζεσξείηαη φηη αληηζηνηρνχλ ζε πηζαλφηεηα 95% λα είλαη πξαγκαηηθφο ν θιάδνο ζηνλ νπνίν αληηζηνηρεί ε ηηκή απηή (Hillis and Bull 1993).

΢ηε ζπλέρεηα ππνινγίζηεθαλ, κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEGA7 (Kumar et al. 2016), νη θαηά δεχγε γελεηηθέο απνζηάζεηο, κεηαμχ ησλ αηφκσλ θάζε είδνπο θαη θάζε γέλνπο, ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο, γέλνο θαη νηθνγέλεηα, θαη ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ εηδψλ, γελψλ θαη νηθνγελεηψλ. ΢ε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο, ππνινγίζηεθαλ θαη νη γελεηηθέο απνζηάζεηο κεηαμχ δηαθνξεηηθψλ νκάδσλ ηνπ ίδηνπ είδνπο, φπνπ απηφ θξίζεθε απαξαίηεην. Δπίζεο ππνινγίζηεθαλ, ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε ζην ζχλνιν ησλ αιιεινπρίσλ, θαζψο θαη ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο απφ ηηο νπνίεο είρακε πεξηζζφηεξα απφ δχν γέλε, νη νπνίεο είλαη νη νηθνγέλεηεο Cyprinidae θαη Cobitidae, θαη ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηα γέλε, ηα νπνία πεξηειάκβαλαλ πεξηζζφηεξα απφ έλα είδε. Απφ ηηο θαηά δεχγε απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ αηφκσλ ηνπ θάζε είδνπο θαη θάζε γέλνπο, καο ελδηέθεξε ε κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο θαη ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ. Γηα ηνλ ππνινγηζκφ ησλ απνζηάζεσλ ρξεζηκνπνηήζεθε ην κνληέιν Kimura’s two-parameter model, ην νπνίν φπσο αλαθέξζεθε επηιέρζεθε κέζσ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEGA7, θαη γηα ηνλ έιεγρφ ηνπο ρξεζηκνπνηήζεθε ε δνθηκαζία bootstrap ζε ρίιηεο επαλαιήςεηο.

Δπίζεο, κέζσ ησλ αιιεινπρίσλ DNA, βξέζεθαλ γηα θάζε είδνο νη πεξηνρέο ζηηο νπνίεο απαληψληαη κφλν κνλαδηθνί απιφηππνη, δειαδή πεξηνρέο νη πιεζπζκνί ησλ νπνίσλ έθεξαλ ζπλδπαζκνχο απιψλ λνπθιενηηδηθψλ πνιπκνξθηζκψλ πνπ δελ ζπλαληψληαλ ζε θακία άιιε πεξηνρή. Απηφ ζεκαίλεη φηη, αλ έρεη αλαιπζεί επαξθήο αξηζκφο αηφκσλ απηνχ ηνπ είδνπο, ψζηε λα απνθεπρζεί ην ιάζνο ιφγσ ειιεηπνχο δεηγκαηνιεςίαο, ε αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ COI κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ έληαμε ελφο αηφκνπ ζε απηφ ην είδνο, αιιά ζε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο κπνξνχκε επηπιένλ λα βξνχκε ηελ πεξηνρή πξνέιεπζεο απηνχ ηνπ αηφκνπ.

Σέινο, ε εθηίκεζε ησλ DNA barcodes έγηλε ζπλδπάδνληαο ηελ ηνπνινγία ησλ θπινγελεηηθψλ δέληξσλ κε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο πνπ ππνινγίζηεθαλ. ΢ηα θπινγελεηηθά δέληξα παξαηεξήζεθε θαηά πφζν ηα άηνκα ηνπ ίδηνπ είδνπο ηνπνζεηνχληαη ζηνλ ίδην θιάδν ηνπ δέληξνπ θαη δηαθξηηά απφ ηα άιια είδε θαη θαηά πφζν νη γελεηηθέο απνζηάζεηο ζπκθσλνχλ κε ηνλ δηαρσξηζκφ ησλ αηφκσλ ηνπ γέλνπο ζηα ηαπηνπνηεκέλα είδε. ΢ηελ πεξίπησζε πνπ έλα είδνο δηαρσξίδεηαη ζε δχν δηαθξηηνχο θιάδνπο, ρξεζηκνπνηήζεθαλ νη γελεηηθέο απνζηάζεηο γηα λα εθηηκεζεί αλ πξάγκαηη είλαη δχν θιάδνη ηνπ ίδηνπ είδνπο ή αλ ζα κπνξνχζαλ νη δχν θιάδνη λα απνηεινχλ δχν δηαθνξεηηθά είδε. Οη εθηηκήζεηο απηέο έγηλαλ, ρξεζηκνπνηψληαο σο φξην ηελ ηηκή γελεηηθήο απφζηαζεο 0,020, ε νπνία ρξεζηκνπνηήζεθε θαη ζε άιιε εξγαζία πνπ αθνξνχζε ηρζχεο εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Μεζνγείνπ (Geiger et al. 2014). Οκάδεο δειαδή πνπ παξνπζίαδαλ κέζε γελεηηθή απφζηαζε κεγαιχηεξε απφ 0,020 πξνηάζεθαλ σο πηζαλψο δηαθνξεηηθά είδε, ελψ γηα νκάδεο πνπ παξνπζίαδαλ απφζηαζε κηθξφηεξε απφ απηήλ, πξνηάζεθε ε θαηάηαμή ηνπο ζε έλα είδνο, έρνληαο φκσο σο πξνυπφζεζε, λα παξαηεξείηαη barcoding gap ζηηο πεξηπηψζεηο πνπ πξνηάζεθε ν δηαρσξηζκφο εηδψλ θαη λα κελ παξαηεξείηαη barcoding gap ζηηο πεξηπηψζεηο πνπ πξνηάζεθε ε έληαμε νκάδσλ ζε θνηλφ είδνο.

Οη αιιεινπρίεο, ζπλνδεπφκελεο απφ φια ηα απαξαίηεηα ζηνηρεία πνπ απαηηνχληαη γηα ηνλ ραξαθηεξηζκφ ηνπο σο DNA barcodes, θαηαηέζεθαλ ζηελ BOLD.

33

3. ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΑ-΢ΤΕΖΣΖ΢Ζ

3.1 ΑΠΟΜΟΝΧ΢Ζ ΓΔΝΧΜΗΚΟΤ DNA

Όπσο αλαθέξζεθε, πξνζπάζεηεο απνκφλσζεο DNA έγηλαλ θαη ζηα 544 δείγκαηα. Δπηηπρή απνκφλσζε είρακε ζε 406 δείγκαηα ηα νπνία αλήθαλ ζπλνιηθά ζε 39 είδε θαη 24 γέλε (Πίλαθαο 3.1).

Πίνακαρ 3.1 Οηθνγέλεηεο, είδε θαη αξηζκφο δεηγκάησλ απφ ηα νπνία απνκνλψζεθε επηηπρψο DNA

Απιθμόρ Οικογένεια Δίδορ δειγμάηων Centrarchidae Lepomis gibossus 2 Cobitis vardarensis 5 Cobitidae Cobitis strumicae 10 Sabanejewia balcanica 1 Alburnoides bipunctatus 27 Alburnus thessalicus 1 Alburnus cf scoranza 1 Alburnus sp. Volvi 8 Alburnus vistonicus 28 Barbus balcanicus 10 Barbus cyclolepis 23 Barbus peloponnesius 29 Barbus prespensis 25 Barbus strumicae 11 Carassius gibelio 15 Chondrostoma vardarense 4 Cyprinus carpio 1 Gobio bulgaricus 18 Cyprinidae Gobio skadarensis 2 Luciobarbus albanicus 5 Pachychilon macedonicum 1 Pachychilon pictum 3 Pelasgus thesproticus 1 Petroleuciscus borysthenicus 4 Pseudorasbora parva 1 Rhodeus amarus 23 Squalius orpheus 28 Squalius pamvoticus 5 Squalius peloponensis 1 Squalius sp. 11 Squalius vardarensis 14 Telestes pleurobipunctatus 18 Vimba melanops 9 Gasterosteidae Gasterosteus sp. 1 Gobiidae Economidichthys pigmaeus 7 Oxynoemacheilus bureschi 33 Nemacheilidae Oxynoemacheilus pindus 2 Poeciliidae Gambusia holbrooki 14 Salmonidae Salmo farioides 4 ΢ύνολο 406

37

΢ηελ Δηθφλα 3.1 θαίλεηαη ελδεηθηηθά ν έιεγρνο απνκφλσζεο DNA έμη δεηγκάησλ. ΢ηα πξψηα ηέζζεξα δείγκαηα θαίλεηαη ςειά ζηελ πεθηή κία θσηεηλή δψλε πνπ αληηζηνηρεί ζην απνκνλσκέλν νιηθφ DNA, θάηη πνπ δελ παξαηεξείηαη ζηα δχν ηειεπηαία δείγκαηα θαη θαηαδεηθλχεη ηελ απνηπρία απνκφλσζεο DNA απφ ηα δείγκαηα απηά.

Δικόνα 3.1 Έιεγρνο απνκφλσζεο DNA ζε πεθηή αγαξφδεο

3.2 ΑΠΟΣΔΛΔ΢ΜΑΣΑ PCR ΚΑΗ ΑΛΛΖΛΟΤΥΗ΢Ζ΢ Με ηελ ηερληθή ηεο PCR εληζρχζεθε έλα ηκήκα ηνπ γνληδίνπ COI κεγέζνπο 650 βάζεσλ (Δηθφλα 3.2), ζε 406 δείγκαηα απφ ηα νπνία απνκνλψζακε επηηπρψο DNA.

Δικόνα 3.2 Δπηηπρήο PCR. Οη θσηεηλέο δψλεο ζηηο ζέζεηο 1-3 αληηζηνηρνχλ ζε επηηπρείο αληηδξάζεηο PCR. Ζ ζέζε Σ απνηειεί αληίδξαζε ρσξίο DNA γηα ηνλ έιεγρν επηκφιπλζεο θαη ε ζέζε L ζηνλ ladder

Σα πξντφληα ησλ αληηδξάζεσλ PCR ζηάιζεθαλ γηα αιιεινχρηζε, ηα απνηειέζκαηα ηεο νπνίαο ειέγρζεθαλ κέζσ ησλ ρξσκαηνγξαθεκάησλ. Απφ ηηο αξρηθέο αιιεινπρίεο κήθνπο πεξίπνπ 650 βάζεσλ αθαηξέζεθαλ ηα άθξα, ηα νπνία αληηζηνηρνχλ ζηνπο εθθηλεηέο, θαζψο θαη έλα ηκήκα ην νπνίν θξίζεθε ρακειήο πνηφηεηαο, κε απνηέιεζκα λα πξνθχςνπλ αιιεινπρίεο κήθνπο 624 βάζεσλ, νη νπνίεο ήηαλ θαη απηέο νη νπνίεο ρξεζηκνπνηήζεθαλ ζηελ θπινγελεηηθή αλάιπζε.

38

3.3 ΦΤΛΟΓΔΝΔΣΗΚΖ ΑΝΑΛΤ΢Ζ

Έρνληαο, πιένλ, ζηνηρηζκέλεο ηηο αιιεινπρίεο θαη νκαδνπνηεκέλεο ζε 24 γέλε θαηαζθεπάζηεθαλ 24 θπινγελεηηθά δέληξα, έλα γηα θάζε γέλνο, ρξεζηκνπνηψληαο θαη ηηο αιιεινπρίεο γηα θάζε γέλνο πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD. ΢πλνιηθά ρξεζηκνπνηήζεθαλ 1002 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 406 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 596 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD.

΢ηε ζπλέρεηα παξνπζηάδνληαη ηα θπινγελεηηθά δέληξα πνπ θαηαζθεπάζηεθαλ θαη νη γελεηηθέο απνζηάζεηο πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα θάζε γέλνο, θαηά αιθαβεηηθή ζεηξά ησλ γελψλ.

3.3.1 Γένορ Alburnoides

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Alburnoides ρξεζηκνπνηήζεθαλ 86 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 27 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 59 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο B.1) Σν δέληξν παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.3.

΢ην δέληξν παξαηεξνχληαη ηέζζεξηο δηαθξηηνί θιάδνη, απφ ηνπο νπνίνπο ν έλαο πεξηέρεη ηα δείγκαηα A. bipunctatus απφ ηηο άιιεο επξσπατθέο ρψξεο, ν δεχηεξνο πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο A. thessalicus θαη ηα άηνκα ηνπ A. bipunctatus απφ ηνλ Αψν θαη ηηο γχξσ πεξηνρέο, ν ηξίηνο πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο A. strymonicus θαη ηα άηνκα A. bipunctatus απφ ηνλ ΢ηξπκφλα, ελψ ν ηέηαξηνο, ηα άηνκα ηνπ είδνπο A. prespensis θαη ηα άηνκα A. bipunctatus απφ ηνλ Αμηφ.

Λφγσ ηεο χπαξμεο ησλ θιάδσλ απηψλ, γηα ηνλ κεηέπεηηα ππνινγηζκφ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ, ηα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Alburnoides ρσξίζηεθαλ ζε ηέζζεξηο νκάδεο, ε θάζε κία απφ ηηο νπνίεο πεξηέρεη ηα δείγκαηα πνπ αλήθνπλ ζε έλαλ θιάδν.

Οη ηέζζεξηο νκάδεο νλνκάζηεθαλ Bipunctatus, Thessalicus, Strymonicus θαη Prespensis θαη ηα δείγκαηα πνπ πεξηέρεη ε θάζε κία δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα A.1 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.2 θαη 3.3.

Πίνακαρ 3.2 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Alburnoides θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ 0,034 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Thessalicus 0,004 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Strymonicus 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Prespensis 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Bipunctatus 0,003 (0,001)

39

Πίνακαρ 3.3 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Thessalicus Strymonicus Prespensis Bipunctatus Thessalicus 0,010 (0,004) 0,022 (0,006) 0,055 (0,010) 0,061 (0,011) Strymonicus 0,026 (0,006) 0,003 (0,002) 0,059 (0,010) 0,061 (0,011) Prespensis 0,062 (0,010) 0,061 (0,010) 0,008 (0,003) 0,029 (0,007) Bipunctatus 0,067 (0,011) 0,064 (0,011) 0,034 (0,007) 0,007 (0,003)

Παξαηεξνχκε φηη, νη κέζεο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ νκάδσλ είλαη αξθεηέο θνξέο κεγαιχηεξεο απφ ηηο απνζηάζεηο κέζα ζηηο νκάδεο, πνπ ζεκαίλεη φηη νη νκάδεο είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλεο. Οη κέγηζηεο απνζηάζεηο κέζα ζηηο νκάδεο είλαη κηθξφηεξεο απφ ηηο ειάρηζηεο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ νκάδσλ, δελ παξαηεξείηαη δειαδή αιιεινεπηθάιπςε, άξα ππάξρεη barcoding gap. Οη ηηκέο ηεο κέζεο θαη κέγηζηεο απφζηαζεο κέζα ζε θάζε νκάδα, ζπκθσλνχλ κε ηηο αληίζηνηρεο πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα είδε ηνπ γέλνπο Alburnoides ηεο πεξηνρήο ηνπ Καπθάζνπ απφ ηνπο Levin et al, φπνπ ε κεγαιχηεξε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε είλαη 0,008, ελψ ε κέγηζηε απφζηαζε πνπ παξαηεξήζαλε κέζα ζε έλα είδνο είλαη 0,018 (Levin et al. 2016).

Σν ελδηαθέξνλ ζηνηρείν ζε απηφ ην γέλνο είλαη φηη νη απνζηάζεηο κέζα ζηηο νκάδεο είλαη κηθξέο θαη ζα κπνξνχζακε λα ηζρπξηζηνχκε φηη θάζε νκάδα απνηειεί μερσξηζηφ είδνο. Απηφ ζεκαίλεη μεθάζαξν δηαρσξηζκφ ησλ εηδψλ A. bipunctatus, A. thessalicus, A. strymonicus θαη A. prespensis, αιιά επίζεο θη φηη ηα άηνκα ηνπ είδνπο A. bipunctatus πνπ κειεηήζεθαλ ζηελ παξνχζα εξγαζία ζα κπνξνχζαλ λα εληαρζνχλ ζε έλα απφ ηα άιια είδε. Γειαδή ζηνλ Αψν, ηελ Κφληηζα, ηε Βνβνχζα θαη ηνλ ΢αξαληάπνξν απαληάηαη ην A. prespensis, ζηνλ Αμηφ ην A. thessalicus θαη ζηνλ ΢ηξπκφλα ην A. strymonicus. Να ζεκεησζεί εδψ φηη ην είδνο A. thessalicus απνηειεί λέν είδνο πνπ πξνηάζεθε απφ ηνπο Geiger et al. (Geiger et al. 2014).

Σέινο, νη πιεζπζκνί A. thessalicus απφ ηνλ Πελεηφ θαη ηα άηνκα A. prespensis απφ ηηο Πξέζπεο έρνπλ κφλν απιφηππνπο κνλαδηθνχο ζε απηέο ηηο πεξηνρέο.

40

41

Δικόνα 3.3 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Alburnoides. Με ζρήκα ίδηνπ ρξψκαηνο ζεκεηψλνληαη ηα δείγκαηα πνπ εληάζζνληαη ζηελ ίδηα νκάδα. Με θχθιν ζεκεηψλνληαη νη αιιεινπρίεο πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD, ελψ κε θπθιηθφ δίζθν νη αιιεινπρίεο πνπ πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία.

3.3.2 Γένορ Alburnus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Alburnus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 69 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 38 πξνέθπςαλ απφ ηελ

42

παξνχζα εξγαζία θαη νη 31 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.2) Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.4.

΢ην θπινγελεηηθφ δέληξν παξαηεξνχληαη πέληε θιάδνη, νη νπνίνη απνηέιεζαλ θαη ηηο νκάδεο κε ηηο νπνίεο ππνινγίζηεθαλ νη γελεηηθέο απνζηάζεηο. Ο πξψηνο πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα πνπ αλαθέξνληαη σο A. sp θαη νλνκάζηεθε νκάδα Sp., ν δεχηεξνο πεξηέρεη ηα είδε A. thessalicus θαη A. macedonicus θαη νλνκάζηεθε νκάδα Thessalicus-Macedonicus, ν ηξίηνο ην είδνο A.scoranza θαη νλνκάζηεθε νκάδα Scoranza, ν ηέηαξηνο ην είδνο A. belvica θαη νλνκάζηεθε νκάδα Belvica, θαη ν πέκπηνο ηα είδε A. vistonicus θαη A. volviticus θαη νλνκάζηεθε νκάδα Vistonicus- Volviticus. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα παξαζέηνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.2 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.4 θαη 3.5.

Πίνακαρ 3.4 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Alburnus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Alburnus 0,030 (0,004) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Sp. 0,007 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Thessalicus- 0,003 (0,001) Macedonicus Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Scoranza 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Belvica 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Vistonicus- 0,001 (0) Volviticus

Παξαηεξψληαο ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο, βιέπνπκε φηη δχν νκάδεο πεξηέρνπλ δχν είδε ε θάζε κία. Βιέπνληαο ηηο κέγηζηεο απνζηάζεηο κέζα ζε θάζε κία απφ ηηο δχν νκάδεο απηέο, παξαηεξνχκε φηη ην είδνο A. thessalicus είλαη ζηελά ζπγγεληθφ κε ην A. macedonicus θαη ην A. vistonicus είλαη ζηελά ζπγγεληθφ κε ην A. volviticus. Ζ ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ απηψλ γίλεηαη κε κνξθνινγηθνχο ραξαθηήξεο (Geiger et al. 2014) θαη δελ είλαη δπλαηφο ν δηαρσξηζκφο ηνπο κε βάζε ην γνλίδην COI. Λακβάλνληαο ππ’ φςηλ φηη ζε άιια είδε ηνπ γέλνπο Alburnus, ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ εηδψλ έρεη βξεζεί λα είλαη 0,051 (Birecikligil et al. 2016), πξνηείλεηαη ε πεξαηηέξσ δηεξεχλεζε ησλ εηδψλ απηψλ ηφζν ζε γελεηηθφ θαη κνξθνινγηθφ επίπεδν θαη επίπεδν θπζηνινγίαο, ψζηε λα εθηηκεζεί ε πηζαλή θαηάηαμε ησλ A. thessalicus θαη A. macedonicus ζε θνηλφ είδνο θαη ησλ A. vistonicus θαη A. volviticus ζε θνηλφ είδνο.

Δπηπιένλ, βιέπνπκε φηη, ελψ κεηαμχ ησλ ππφινηπσλ νκάδσλ ηνπ γέλνπο δελ ππάξρεη αιιεινεπηθάιπςε ησλ γελεηηθψλ ηνπο απνζηάζεσλ, ε κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζηελ νκάδα Sp. είλαη ίζε κε ηελ ειάρηζηε απφζηαζε απηήο ηεο νκάδαο κε ηελ νκάδα Thessalicus-Macedonicus. Αλ ζπλππνινγίζνπκε ην γεγνλφο φηη ε κέζε απφζηαζε κεηαμχ ησλ δχν νκάδσλ είλαη κφιηο 0,021, δειαδή νξηαθά κεγαιχηεξε απφ ην φξην πνπ ζέζακε γηα ην δηαρσξηζκφ εηδψλ θαη κφιηο ηξεηο θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηελ κέζε απφζηαζε κέζα ζηελ νκάδα Sp., ππάξρεη πηζαλφηεηα νη δχν απηέο νκάδεο λα αλήθνπλ ζε έλα είδνο. Πξνηείλεηαη, ινηπφλ, ε πεξαηηέξσ κειέηε αηφκσλ πνπ ηαπηνπνηνχληαη σο Alburnus sp. γηα ηελ πηζαλή έληαμή ηνπο ζε άιιν είδνο.

43

44

Δικόνα 3.4 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Alburnus

Πίνακαρ 3.5 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηε δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Thessalicus- Vistonicus- Sp. Scoranza Belvica Macedonicus Volviticus Sp. 0,014 (0,002) 0,014 (0,005) 0,022 (0,006) 0,038 (0,008) 0,042 (0,009) Thessalicus- 0,021 (0,005) 0,007 (0,003) 0,022 (0,006) 0,035 (0,008) 0,036 (0,008) Macedonicus Scoranza 0,026 (0,006) 0,023 (0,006) 0 0,034 (0,008) 0,042 (0,009) Belvica 0,044 (0,008) 0,036 (0,008) 0,035 (0,008) 0,002 (0,002) 0,057 (0,010) Vistonicus- 0,047 (0,009) 0,038 (0,008) 0,042 (0,005) 0,058 (0,010) 0,005 (0,003) Volviticus

45

΢χκθσλα κε ηνπο Kottelat θαη Freyhof ηα άηνκα Alburnus απφ ηνλ Φηιηνχξε θαη ηνλ Κνκςάην αλήθνπλ πηζαλφηαηα ζην είδνο A. vistonicus (Kottelat and Freyhof 2007). Με βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο πνπ ππνινγίζηεθαλ εδψ, απηφ επηβεβαηψλεηαη.

3.3.3 Γένορ Barbus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Barbus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 143 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 98 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 45 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.3). Σν κεγαιχηεξν κέξνο ησλ αλαιχζεσλ πάλσ ζην γέλνο Barbus πξαγκαηνπνηήζεθε ζηα πιαίζηα ηεο δηπισκαηηθήο εξγαζίαο ηεο πξνπηπρηαθήο θνηηήηξηαο ηνπ εξγαζηεξίνπ ηνπ θ. Σξηαληαθπιιίδε, Παπαβαζηιείνπ ΢νθίαο (Παπαβαζηιείνπ 2017). Οη αιιεινπρίεο αλήθαλ ζηα είδε B. strumicae, B. balcanicus, B. cyclolepis, B. peloponnesius, B. euboicus, B. sperchiensis, B. macedonicus θαη B. prespensis. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.5.

Με βάζε ηελ ηνπνινγία ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ, ηα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Barbus ρσξίζηεθαλ ζε 8 νκάδεο. Ζ νκάδα Balcanicus πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο B. balcanicus απφ ηνλ Πελεηφ, ηνλ Αιηάθκνλα θαη ηα πεξηζζφηεξα απφ ηα άηνκα ηνπ είδνπο πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αμίν, κε εμαίξεζε δχν άηνκα. Ζ νκάδα Strumicae πεξηιακβάλεη φια ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο B. strumicae, θαζψο θαη ηα ηξία άηνκα ηνπ είδνπο B. balcanicus απφ ηε Γντξάλε θαη ηα δχν άηνκα B. balcanicus απφ ηνλ Αμηφ πνπ δελ εληάρζεθαλ ζηελ νκάδα Balcanicus. Ζ νκάδα Cyclolepis πεξηιακβάλεη φια ηα άηνκα ηνπ είδνπο B. cyclolepis. Ζ νκάδα Peloponnesius-Euboicus πεξηιακβάλεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο B. euboicus θαζψο θαη άηνκα ηνπ είδνπο B. peloponnesius απφ ηνλ Καιακά θαη ηνλ Αρειψν. Ζ νκάδα Sperchiensis πεξηέρεη φια ηα άηνκα ηνπ είδνπο B. sperchiensis ελψ ε νκάδα Macedonicus φια ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο B. macedonicus. Ζ νκάδα Peloponnesius πεξηέρεη δείγκαηα ηνπ είδνπο B. peloponnesius απφ ηνλ Άξαρζν θαη ηνπο Μηιηνηάδεο. Σέινο ε νκάδα Peloponnesius-Prespensis πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο B. prespensis θαζψο θαη δείγκαηα ηνπ είδνπο B. peloponnesius απφ ηνλ Καιακά.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.6 θαη 3.7.

Σα είδε B. cyclolepis, B. sperchiensis θαη B. macedonicus θαίλνληαη λα είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα θαη λα κπνξνχλ εχθνια λα ηαπηνπνηεζνχλ κέζσ ηεο αιιεινπρίαο ηνπ γνληδίνπ COI, θαζψο φρη κφλν ηα άηνκα ηνπ θαζελφο νκαδνπνηνχληαη καδί ζηνπο θιάδνπο ηνπ δέληξνπ, αιιά παξνπζηάδνπλ θαη κεγάιεο απνζηάζεηο κεηαμχ ηνπο.

Ζ κηθξή γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηελ νκάδα Strumicae θαη ε κεγάιε απφζηαζή ηεο απφ ηηο ππφινηπεο νκάδεο ππνδειψλεη φηη ε νκάδα απηή απνηειεί έλα είδνο, φπσο θαη ε νκάδα Balcanicus. Σν γεγνλφο φηη ε νκάδα Strumicae πεξηέρεη θαη δείγκαηα ηνπ είδνπο B. balcanicus, νθείιεηαη πηζαλφηαηα είηε ζε ιάζνο κνξθνινγηθή ηαπηνπνίεζε ησλ αηφκσλ. Καηά ζπλέπεηα, ελψ ηα δχν είδε θαίλεηαη λα είλαη γελεηηθά αξθεηά απνκαθξπζκέλα κεηαμχ ηνπο, πξνηείλεηαη επαλεμέηαζε ησλ δεηγκάησλ B. balcanicus

46

ηεο νκάδαο Strumicae, γηα λα δηαπηζησζεί πνχ νθείιεηαη ην γεγνλφο φηη πέληε δείγκαηα νκαδνπνηήζεθαλ καδί κε ηα B. strumicae.

Πίνακαρ 3.6 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Barbus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Σιμή (Σςπικό Γενεηική απόζηαζη ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Barbus 0,038 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Balcanicus 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Strumicae 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Cyclolepis 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Peloponnesius 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Peloponnesius- 0,001 (0,001) Prespensis Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Peloponnesius-Euboicus 0,008 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Sperchiensis 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Macedonicus 0,001 (0,001)

Σα άηνκα ηνπ είδνπο B. euboicus νκαδνπνηνχληαη κελ ζε έλα θιάδν, ν νπνίνο φκσο βξίζθεηαη κέζα ζε έλαλ κεγαιχηεξν θιάδν ηνπ είδνπο B. peloponnesius. Γεδνκέλεο θαη ηεο κηθξήο γελεηηθήο απφζηαζεο κέζα ζηελ νκάδα Peloponnesius-Euboicus, πξνηείλεηαη ε πεξαηηέξσ κειέηε ηνπ είδνπο B. euboicus ζε ζρέζε κε ην είδνο B. peloponnesius, γηα λα δηεπξηληζηεί αλ έρεη πξάγκαηη βάζε ν δηαρσξηζκφο ηνπο ζε δχν είδε θαη ε πηζαλή έληαμε ηνπ B. euboicus ζην B. peloponnesius.

Πίνακαρ 3.7 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 0,006 0,069 0,065 0,051 0,072 0,051 0,065 0,047 1. Balcanicus (0,003) (0,011) (0,011) (0,009) (0,011) (0,002) (0,011) (0,009) 0,071 0,003 0,040 0,037 0,031 0,043 0,059 0,046 2. Strumicae (0,011) (0,002) (0,008) (0,008) (0,007) (0,008) (0,009) (0,009) 0,067 0,042 0,005 0,047 0,054 0,049 0,058 0,062 3. Cyclolepis (0,011) (0,008) (0,003) (0,009) (0,009) (0,009) (0,010) (0,010) 4. 0,052 0,037 0,049 0,025 0,013 0,033 0,039 0 (0) Peloponnesius (0,009) (0,008) (0,009) (0,006) (0,005) (0,008) (0,008) 5. 0,075 0,036 0,057 0,027 0,015 0,031 0,049 0,053 Peloponnesius- (0,010) (0,007) (0,009) (0,006) (0,005) (0,007) (0,010) (0,010) Euboicus 6. 0,056 0,045 0,053 0,014 0,036 0,003 0,040 0,044 Peloponnesius- (0,009) (0,009) (0,009) (0,005) (0,007) (0,002) (0,008) (0,008) Prespensis 7. 0,067 0,056 0,063 0,034 0,050 0,039 0,005 0,056 Sperchiensis (0,011) (0,009) (0,010) (0,007) (0,009) (0,008) (0,003) (0,008) 8. 0,049 0,046 0,063 0,039 0,059 0,045 0,058 0,002 Macedonicus (0,009) (0,009) (0,010) (0,008) (0,010) (0,008) (0,010) (0,002)

Όζνλ αθνξά ηηο νκάδεο Peloponnesius, Peloponnesius-Prespensis θαη Peloponnesius-Euboicus, βάζεη ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ, ε νκάδα Peloponnesius-Euboicus θαίλεηαη λα απνηειεί μερσξηζηφ είδνο απφ ηηο άιιεο δχν, ελψ νη νκάδεο Peloponnesius-Prespensis θαη Peloponnesius θαίλνληαη πεξηζζφηεξν

47

λα είλαη απνκαθξπζκέλεο νκάδεο ηνπ ίδηνπ είδνπο, παξά μερσξηζηά είδε. Σν γεγνλφο φηη έρεη παξαηεξεζεί εμάπισζε ηνπ είδνπο B. prespensis πέξα απφ ηε ιίκλε Πξέζπα (Marková et al. 2010), αιιά θαη φηη πεξηγξάθεθαλ άηνκα ηνπ είδνπο απηνχ ζηνλ Καιακά ζε άιιεο εξγαζίεο (Geiger et al. 2014), ζε ζπλδπαζκφ κε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο πνπ ππνινγίζηεθαλ εδψ, καο νδεγνχλ ζην ζπκπέξαζκα φηη φια ηα άηνκα ησλ νκάδσλ Peloponnesius-Prespensis θαη Peloponnesius αλήθνπλ ζην είδνο B. prespensis, ελψ ην είδνο B. peloponnesius αληηπξνζσπεχεηαη απφ ηελ νκάδα Peloponnesius-Euboicus. Απηφ ζεκαίλεη φηη, ζηνλ Καιακά θαη ζηνλ Αρειψν, απαληνχλ, ηφζν ην είδνο B. prespensis, φζν θαη ην B. peloponnesius.

Ο πιεζπζκφο Barbus απφ ηελ Δχβνηα θαη νη πιεζπζκνί B. peloponnesius απφ ηνλ Αιθεηφ θαη ηνλ Βνπξατθφ έρνπλ κφλν απιφηππνπο κνλαδηθνχο ζηηο πεξηνρέο απηέο.

48

49

50

Δικόνα 3.5 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Barbus

51

3.3.4 Γένορ Carassius

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Carassius ρξεζηκνπνηήζεθαλ 32 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 15 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 17 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.4) θαη φιεο αλήθαλ ζην είδνο Carassius gibelio. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.6.

Δικόνα 3.6 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ είδνπο Carassius gibelio

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.8.

52

Πίνακαρ 3.8 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο Carassius gibelio

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Carassius gibelio 0,004 (0,001) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Carassius 0,008 (0,004) gibelio

Παξφηη ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο Carassius gibelio νκαδνπνηνχληαη ζε δχν θιάδνπο, ε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ αηφκσλ είλαη πνιχ κηθξή. Ζ κέζε γελεηηθή ηηκή πνπ ππνινγίζηεθε κάιηζηα, ζπκθσλεί κε ηελ αληίζηνηρε ηηκή ζε δείγκαηα ηνπ είδνπο Carassius gibelio απφ ηελ Σνπξθία φπνπ ε κέζε απφζηαζε ππνινγίζηεθε ζε 0,005 (Keskin et al. 2013).

3.3.5 Γένορ Chondrostoma

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Chondrostoma ρξεζηκνπνηήζεθαλ 35 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 4 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 31 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.5). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.7.

΢ην δέληξν παξαηεξνχληαη δχν κεγάινη θιάδνη, απφ ηνπο νπνίνπο ν έλαο πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα πνπ αλήθνπλ ζην είδνο Chondrostoma vardarense θαη ν άιινο φια ηα δείγκαηα πνπ αλήθνπλ ζην είδνο Chondrostoma prespense. Καηά ζπλέπεηα ζηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ, ηα δείγκαηα δελ ρσξίζηεθαλ ζε νκάδεο, αιιά ηα άηνκα ηνπ θάζε είδνπο κειεηήζεθαλ φια καδί.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.9 θαη 3.10.

Πίνακαρ 3.9 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Chondrostoma θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Chondrostoma 0,010 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ C. vardarense 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ C. prespense 0,002 (0,001) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,002 (0,001)

Πίνακαρ 3.10 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

C. vardarense C. prespense C. vardarense 0,008 (0,004) 0,020 (0,006) C. prespense 0,024 (0,006) 0,003 (0,002)

Ζ κέζε απφζηαζε κέζα ζην γέλνο δελ είλαη κεγάιε αιιά ηα δχν είδε παξνπζηάδνπλ κηθξή ελδνεηδηθή γελεηηθή απφζηαζε, κηθξφηεξε απφ απηήλ πνπ έρεη ππνινγηζηεί γηα

53

άιια είδε ηνπ γέλνπο Chondrostoma, ζηα νπνία ε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε βξέζεθε 0,005 (Behrens-Chapuis et al. 2015). Ζ κέζε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ είλαη δψδεθα θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηελ κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε, ελψ ε κέγηζηε ελδνεηδηθή απφζηαζε είλαη δπφκηζε θνξέο κηθξφηεξε απφ ηελ ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ. Απηφ ζεκαίλεη φηη ππάξρεη barcoding gap θαη φηη ηα δχν είδε κπνξνχλ λα ηαπηνπνηεζνχλ κέζσ DNA barcoding.

Δικόνα 3.7 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Chondrostoma

54

3.3.6 Γένορ Cobitis

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Cobitis ρξεζηκνπνηήζεθαλ 40 αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο νη 15 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 25 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.6). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.8.

΢ην δέληξν παξαηεξνχληαη έμη θχξηνη θιάδνη. Γηα ηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ ηα δείγκαηα ρσξίζηεθαλ ζε έμη νκάδεο, θάζε κία απφ ηηο νπνίεο πεξηέρεη ηα δείγκαηα ελφο απφ ηνπο θχξηνπο θιάδνπο. Ζ νκάδα Strumicae πεξηείρε φια ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο C. strumicae, ηα νπνία θαη πξνέξρνληαη απφ ηελ Βηζησλίδα θαη ηνλ ΢ηξπκφλα, ε νκάδα Punctilineata πεξηείρε ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο C. punctilineata, ε νκάδα Meridionalis πεξηείρε ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο C. meridionalis, ε νκάδα Hellenica-Arachthosensis πεξηείρε φια ηα δείγκαηα ησλ εηδψλ C. hellenica θαη C. arachthosensis, ε νκάδα Trichonica πεξηείρε ην κφλν δείγκα ηνπ είδνπο C. trichonica θαη ε νκάδα Vardarensis πεξηείρε ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο C. vardarensis. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.3 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.11 θαη 3.12.

Βιέπνληαο ηελ κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο (0,087), παξαηεξνχκε φηη είλαη πνιχ κεγαιχηεξε απφ ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο άιισλ γελψλ, νη νπνίεο θπκαίλνληαη κεηαμχ 0,03 θαη 0,06. Δπίζεο ε κέζε θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ είλαη πνιιέο θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηελ κέζε θαη κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα αληίζηνηρα, θαζψο ζε πνιιέο πεξηπηψζεηο μεπεξλάεη ην δεθαπιάζην. Απηφ ζεκαίλεη φηη παξαηεξείηαη barcoding gap κεηαμχ ησλ νκάδσλ. Δπίζεο νη κηθξέο ηηκέο κέζεο θαη κέγηζηεο απφζηαζεο κέζα ζε θάζε νκάδα ζεκαίλνπλ φηη ηα άηνκα θάζε νκάδαο είλαη ζηελά ζπγγεληθά κεηαμχ ηνπο. Ζ κεγάιε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ ηνπ γέλνπο Cobitis έρεη παξαηεξεζεί θαη ζε άιιεο εξγαζίεο πάλσ ζην γέλνο απηφ (Ludwig et al. 2001; Eagderi et al. 2017; Jouladeh-Roudbar et al. 2017).

Πίνακαρ 3.11 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Cobitis θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα θαη είδνο ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Cobitis 0,087 (0,009) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Strumicae 0,008 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Punctilineata 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Meridionalis 0,014 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Hellenica- 0,002 (0,001) Arachthosensis Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Trichonica n/c Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Vardarensis 0,004 (0,001)

55

Δικόνα 3.8 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Cobitis

Σα είδε C. strumicae, C. punctilineata, C. meridionalis, C. trichonica θαη C. vardarensis θαίλνληαη λα είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα κεηαμχ ηνπο.

56

Με βάζε ηηο απνζηάζεηο ζπκπεξαίλνπκε φηη ηα είδε C. hellenica θαη C. arachthosensis είλαη ζηελά ζπγγεληθά κεηαμχ ηνπο, θαζψο παξνπζηάδνπλ κηθξή κεηαμχ ηνπο απφζηαζε θαη κεγάιε απφζηαζε απφ ηα άιια είδε ηνπ γέλνπο, θάηη πνπ έρεη παξαηεξεζεί θαη ζε άιιεο κειέηεο (Geiger et al. 2014). Όζνλ αθνξά ην είδνο C. strumicae, ε κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζην είδνο νξηαθά μεπεξλά ην 0,02 πνπ έρεη ηεζεί σο φξην γηα ηνλ ραξαθηεξηζκφ νκάδσλ σο πηζαλά λέα είδε. Λακβάλνληαο ππφςηλ θαη ηηο κεγάιεο απνζηάζεηο πνπ παξαηεξνχληαη κεηαμχ ησλ εηδψλ ζην γέλνο Cobitis, ηα άηνκα ηνπ είδνπο C. strumicae πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ ΢ηξπκφλα δελ θαίλεηαη λα απνηεινχλ μερσξηζηφ είδνο, αιιά έλαλ απνκαθξπζκέλν πιεζπζκφ ηνπ είδνπο.

Πίνακαρ 3.12 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Punctili Meridi- Hellenica- Tricho- Varda- Strumicae -neata onalis Arachthosensis nica rensis 0,022 0,055 0,075 0,116 0,106 Strumicae 0,112 (0,014) (0,006) (0,010) (0,012) (0,016) (0,014) Punctili- 0,057 0,005 0,093 0,120 0,115 0,127 (0,016) neata (0,010) (0,003) (0,013) (0,015) (0,015) 0,090 0,095 0,013 0,108 0,092 Meridionalis 0,086 (0,012) (0,013) (0,013) (0,004) (0,014) (0,013) Hellenica- 0,112 0,128 0,089 0,120 0,118 Arachthos- 0,007 (0,003) (0,015) (0,016) (0,013) (0,016) (0,015) ensis 0,126 0,123 0,107 0,103 Trichonica 0,121 (0,015) n/c (0,016) (0,016) (0,014) (0,014) 0,116 0,119 0,098 0,103 0,013 Vardarensis 0,118 (0,015) (0,015) (0,015) (0,013) (0,013) (0,005)

Πξνηείλεηαη, ινηπφλ, ε πεξαηηέξσ κειέηε ησλ εηδψλ C. hellenica θαη C. arachthosensis, ψζηε λα επαλεθηηκεζεί ε θαηάηαμε ησλ εηδψλ απηψλ σο μερσξηζηά είδε θαη ε πηζαλή ζπλέλσζή ηνπο ζε έλα είδνο.

Όζνλ αθνξά ηνπο απιφηππνπο, νη πιεζπζκνί C. strumicae απφ ηε Βηζηνλίδα θαη ηνλ ΢ηξπκφλα, έρνπλ ν θαζέλαο κνλαδηθνχο απιφηππνπο, νη νπνίνη πεξηνξίδνληαη ζηηο πεξηνρέο απηέο. Δίλαη, θαηά ζπλέπεηα, δπλαηφλ, κέζσ ηεο αιιεινπρίαο ηνπ γνληδίνπ COI λα βξνχκε θαη ηελ πεξηνρή πξνέιεπζεο αηφκσλ πνπ θέξνπλ ηνπο ζπγθεθξηκέλνπο απιφηππνπο.

3.3.7 Γένορ Cyprinus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Cyprinus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 12 αιιεινπρίεο νη νπνίεο αλήθαλ φιεο ζην είδνο Cyprinus carpio, απφ ηηο νπνίεο ε 1 πξνέθπςε απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 11 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.7). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.9.

57

Δικόνα 3.9 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Cyprinus

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.13. Οη ηηκέο απηέο ήηαλ ζρεηηθά ρακειέο, ην νπνίν έρεη παξαηεξεζεί θαη γηα ην γνλίδην ηνπ θπηνρξψκαηνο β ζην είδνο απηφ (Zhou et al. 2004).

Πίνακαρ 3.13 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο Cyprinus carpio

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Cyprinus carpio 0,001 (0) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Cyprinus carpio 0,003 (0,002)

3.3.8 Γένορ Economidichthys

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Economidichthys ρξεζηκνπνηήζεθαλ 18 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 7 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 11 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.8). Απφ ηηο 18 αιιεινπρίεο νη 13 αλήθνπλ ζην είδνο E. pygmaeus θαη νη 5 ζην είδνο E. trichonis. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.10.

58

Δικόνα 3.10 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Economidichthys

΢ην θπινγελεηηθφ δέληξν παξαηεξνχκε φηη ηα δχν είδε ηνπ γέλνπο Economidichthys νκαδνπνηνχληαη ζε δχν δηαθνξεηηθνχο θαη δηαθξηηνχο κεηαμχ ηνπο θιάδνπο. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη Οη ηηκέο ησλ απνζηάζεσλ δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.14 θαη 3.15

Πίνακαρ 3.14 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Economidichthys θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Economidichthys 0,053 (0,007) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ E. pygmeus 0,002 (0,001) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ E. trichonis 0,003 (0,001) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,0025 (0,001)

Πίνακαρ 3.15 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

E. pygmeus E. trichonis E. pygmeus 0,003 (0,002) 0,119 (0,015) E. trichonis 0,121 (0,015) 0,005 (0,003)

59

Ζ κέγηζηε ελδνεηδηθή απφζηαζε είλαη πεξίπνπ 24 θνξέο κηθξφηεξε απφ ηελ ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ, ππάξρεη δειαδή barcoding gap. Απηφ ζεκαίλεη φηη ηα είδε είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα θαη κπνξνχλ λα ηαπηνπνηεζνχλ κε αθξίβεηα κέζσ DNA barcoding.

3.3.9 Γένορ Gambusia

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Gambusia ρξεζηκνπνηήζεθαλ 19 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 14 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 5 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.9). Καη νη 19 αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο G. holbrooki. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.11.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.16.

Πίνακαρ 3.16 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο Gambusia holbrooki

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Gambusia 0 (0) holbrooki Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Gambusia 0 (0) holbrooki

Ζ γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ φισλ ησλ δεηγκάησλ βξέζεθε 0, δειαδή ε αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ COI δελ παξνπζηάδεη πνιπκνξθηζκνχο, ηνπιάρηζηνλ ζηα δείγκαηα πνπ κειεηήζεθαλ, δειαδή νη πιεζπζκνί ηνπ G. holbrooki απφ ηηο δηαθνξεηηθέο πεξηνρέο είλαη ζηελά ζπγγεληθνί κεηαμχ ηνπο.

Δικόνα 3.11 Φπινγελεηηθφ δέληξν (UPGMA) ηνπ γέλνπο Gambusia

60

3.3.10 Γένορ Gasterosteus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Gasterosteus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 20 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο ε 1 πξνέθπςε απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 19 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.10). Καη νη 20 αιιεινπρίεο ηαπηνπνηήζεθαλ σο Gasterosteus sp. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.12.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.17

Πίνακαρ 3.17 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Gasterosteus

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Gasterosteus 0,004 (0,002) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Gasterosteus 0,008 (0,003)

Οη ηηκέο ηεο γελεηηθήο απφζηαζεο είλαη κηθξέο, θαηά ζπλέπεηα φια ηα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Gasterosteus θαίλεηαη φηη αλήθνπλ πξάγκαηη ζε έλα είδνο.

Οη πιεζπζκνί Gasterosteus sp. απφ ηνλ Λνχξν, ηνλ Αρέξνληα θαη ηνλ Άξη έρνπλ απινηχπνπο κνλαδηθνχο ζηηο πεξηνρέο απηέο, θαηά ζπλέπεηα κπνξεί λα βξεζεί αλ έλα άηνκν Gasterosteus sp. πξνέξρεηαη απφ κία απφ ηηο ηξεηο απηέο πεξηνρέο.

Δικόνα 3.12 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Gasterosteus

61

3.3.11 Γένορ Gobio

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Gobio ρξεζηκνπνηήζεθαλ 37 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 20 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 17 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.11). Γηα ην γέλνο Godio, αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD, πέξα απφ ηηο αιιεινπρίεο πνπ πξνέξρνληαλ απφ ηελ Διιάδα, θαη αιιεινπρίεο απφ άιιεο ρψξεο. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.13.

Παξαηεξνχκε φηη ην είδνο G. bulgaricus ρσξίδεηαη ζε δχν δηαθξηηνχο θιάδνπο. ΢ηνλ έλα θιάδν εληάζζνληαη ηα άηνκα πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αμηφ θαη ηε Γντξάλε, ελψ ζην δεχηεξν θιάδν εληάζζνληαη ηα άηνκα G. bulgaricus απφ φιεο ηηο ππφινηπεο πεξηνρέο. Δλδηαθέξνλ παξνπζηάδεη ην γεγνλφο φηη ν έλαο θιάδνο ηνπ G. bulgaricus θαίλεηαη λα είλαη πεξηζζφηεξν ζπγγεληθφο κε ην G. skadarensis παξά κε ην δεχηεξν θιάδν ηνπ ίδηνπ είδνπο. Σα είδε G. skadarenis θαη G. feraeensis εληνπίδνληαη ζε μερσξηζηφ θιάδν ην θαζέλα, δειαδή ην θαζέλα απφ ηα είδε απηά είλαη δηαρσξηζκέλν απφ ηα ππφινηπα.

Έηζη γηα ηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ, ηα είδε G. skadarenis θαη G. feraeensis ηνπνζεηήζεθαλ ζε κία νκάδα ην θαζέλα, νη νπνίεο θέξνπλ ην φλνκα ηνπ είδνπο πνπ ηηο απνηειεί (νκάδα Skadarensis θαη Feraeensis αληίζηνηρα). Σν είδνο G. bulgaricus ρσξίζηεθε ζε δχν νκάδεο, κε ηελ θάζε νκάδα λα πεξηιακβάλεη ηα άηνκα ηνπ ελφο θιάδνπ απφ ηνπο δχν δηαθξηηνχο θιάδνπο ηνπ είδνπο πνπ παξαηεξνχληαη ζην θπινγελεηηθφ δέληξν. Οη νκάδεο νλνκάζηεθαλ Axios θαη Vistonida θαη ηα δείγκαηα πνπ πεξηέρεη ε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.5 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.18 θαη 3.19.

Πίνακαρ 3.18 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Gobio θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Gobio 0,031 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Axios 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Feraeensis 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Skadarensis 0,004 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Vistonida 0,004 (0,001)

Πίνακαρ 3.19 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Axios Feraeensis Skadarensis Vistonida Axios 0,003 (0,002) 0,023 (0,006) 0,032 (0,007) 0,044 (0,009) Feraeensis 0,025 (0,006) 0,005 (0,003) 0,042 (0,008) 0,050 (0,009) Skadarensis 0,033 (0,007) 0,043 (0,008) 0,007 (0,003) 0,041 (0,008) Vistonida 0,046 (0,008) 0,050 (0,009) 0,043 (0,008) 0,008 (0,004)

62

Παξαηεξψληαο ηηο κέζεο γελεηηθέο απνζηάζεηο ηνπ είδνπο G. bulgaricus, βιέπνπκε φηη ε κέζε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ είλαη πεξηζζφηεξν απφ 12 θνξέο κεγαιχηεξε απφ ζηελ απφζηαζε κέζα ζηηο νκάδεο, ελψ ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ είλαη 5,5 θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηελ κέγηζηε απφζηαζε πνπ παξαηεξείηαη κέζα ζε κία απφ ηηο νκάδεο, ππάξρεη δειαδή barcoding gap.

Δικόνα 3.13 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Gobio.

63

΢ε έξεπλα πάλσ ζηε θπινγέλεζε ηνπ γέλνπο Gobio ζηελ Κεληξηθή Δπξψπε, ε νπνία έγηλε κε βάζε ηε κηηνρνλδξηαθή πεξηνρή ειέγρνπ, αιιά δελ πεξηειάκβαλε ην είδνο G. bulgaricus, ε παξαηεξνχκελε ελδνεηδηθή γελεηηθή απφζηαζε θπκαίλεηαη απφ 0,007 εψο θαη 0,100 (Takács et al. 2014). ΢ηελ έξεπλα απηή ππνζηεξίδεηαη ε ζπλερηδφκελε εηδνγέλεζε ζην γέλνο Gobio, θαζψο θαη ε χπαξμε θξππηηθψλ εηδψλ. Παξάιιεια, νη Barbieri et al. αλαθέξνπλ φηη ππάξρεη πηζαλφηεηα ηα άηνκα Gobio ηνπ Αμηνχ λα απνηεινχλ μερσξηζηφ είδνο (Barbieri et al. 2015). Λακβάλνληαο ππ’ φςηλ καο ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο θαη ην θπινγελεηηθφ δέληξν ηεο Δηθφλαο 3.13, φπνπ θάζε νκάδα ηνπ G. bulgaricus είλαη πεξηζζφηεξν ζπγγεληθή κε δηαθνξεηηθφ είδνο Gobio, πξνηείλεηαη ε έληαμε ησλ αηφκσλ Gobio ηνπ Αμηνχ ζε έλα λέν είδνο.

Όζνλ αθνξά ηα είδε G. skadarenis θαη G. feraeensis δελ παξαηεξείηαη αιιεινεπηθάιπςε ησλ ειάρηζησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κε ηηο κέγηζηεο ελδνεηδηθέο απνζηάζεηο. Τπάξρεη θαη ζε απηήλ ηελ πεξίπησζε δειαδή barcoding gap θαη ηα είδε απηά κπνξνχλ λα δηαθξηζνχλ ρσξίο πξφβιεκα.

Σα άηνκα G. bulgaricus απφ ηε Βηζηνλίδα έρνπλ απιφηππνπο κνλαδηθνχο ζηελ πεξηνρή απηή, επνκέλσο κπνξνχλ λα δηαρσξηζηνχλ απφ πιεζπζκνχο άιισλ πεξηνρψλ.

3.3.12 Γένορ Lepomis

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Lepomis ρξεζηκνπνηήζεθαλ 8 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 2 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 6 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.12). Καη νη 8 αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο L. gibbosus. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.14.

Δικόνα 3.14 Φπινγελεηηθφ δέληξν (UPGMA) ηνπ γέλνπο Lepomis

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.20.

64

Πίνακαρ 3.20 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο Lepomis gibbosus

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ L. gibbosus 0 (0) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ L. gibbosus 0 (0)

Ζ κεδεληθή γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ δεηγκάησλ ηνπ είδνπο L. gibbosus δείρλεη φηη δελ ππάξρνπλ πνιπκνξθηζκνί ζην γνλίδην ηνπ COI ηνπ είδνπο απηνχ, ζηα δείγκαηα πνπ κειεηήζεθαλ.

3.3.13 Γένορ Luciobarbus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Luciobarbus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 38 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 5 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 33 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.13). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.15.

Παξαηεξνχκε φηη ηα είδε L. albanicus θαη L. graecus νκαδνπνηνχληαη ζε δηαθνξεηηθνχο θιάδνπο ηνπ δέληξνπ.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.21 θαη 3.22.

Πίνακαρ 3.21 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Luciobarbus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Luciobarbus 0,024 (0,004) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ L. albanicus 0,007 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ L. graecus 0 (0) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,0035 (0,001)

Πίνακαρ 3.22 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

L. albanicus L. graecus L. albanicus 0,017 (0,005) 0,045 (0,008) L. graecus 0,049 (0,009) 0 (0)

Παξαηεξνχκε φηη ε κέζε απφζηαζε κεηαμχ ησλ δχν εηδψλ είλαη 14 θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε ηνπ γέλνπο Luciobarbus, ελψ ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ είλαη 3 θνξέο πεξίπνπ κεγαιχηεξε απφ ηε κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζηα είδε, παξαηεξείηαη δειαδή barcoding gap. ΢ε εξγαζία πάλσ ζην θπηφρξσκα β ζην γέλνο Luciobarbus, ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ εηδψλ ππνινγίζηεθε κεηαμχ 0 θαη 0,006, ελψ κεηαμχ εηδψλ ηνπ γέλνπο ε απφζηαζε είλαη κεγαιχηεξε ηνπ 0,03 (Casal-Lopez et al. 2015). Φαίλεηαη δειαδή φηη ηα είδε ηνπ γέλνπο Luciobarbus κπνξνχλ λα δηαθξηζνχλ κε αθξίβεηα κέζσ γελεηηθψλ ραξαθηήξσλ.

65

Δικόνα 3.15 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Luciobarbus

66

3.3.14 Γένορ Oxynoemacheilus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Oxynoemacheilus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 50 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 35 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 15 αλαθηήζεθαλ απφ ηε BOLD (Πίλαθαο Β.14). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.16. Οη αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο αλήθνπλ ζε ηξία είδε, ηα O. bureschi, O. pindus θαη O. theophilii.

Παξαηεξνχκε φηη θάζε είδνο νκαδνπνηείηαη ζε δηαθνξεηηθφ θιάδν ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.23 θαη 3.24.

Μεηαμχ θαη ησλ ηξηψλ εηδψλ παξαηεξείηαη barcoding gap, θαζψο νη κέγηζηεο απνζηάζεηο κέζα ζε θάζε είδνο είλαη πνιιέο θνξέο κηθξφηεξεο απφ ηηο ειάρηζηεο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ αληίζηνηρσλ εηδψλ. ΢ε κειέηε πάλσ ζε είδε ηνπ γέλνπο Oxynoemacheilus, ε κέζε απφζηαζε κε βάζε ην γνλίδην COI κεηαμχ ησλ εηδψλ θπκαηλφηαλ απφ 0,02 έσο 0,16 (Sayyadzadeh et al. 2017). ΢ηελ παξνχζα εξγαζία, κε ηηο κέζεο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ εηδψλ λα πξνζεγγίδνπλ ή λα μεπεξλνχλ ην 0,1, ηα ηξία είδε ηνπ γέλνπο θαίλεηαη λα είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα κεηαμχ ηνπο.

Πίνακαρ 3.23 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Oxynoemacheilus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Oxynoemacheilus 0,036 (0,004) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ O. bureschi 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ O. pindus 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ O. theophilii 0 (0) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,0007 (0,0003)

Πίνακαρ 3.24 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

O. bureschi O. pindus O. theophilii O. bureschi 0,008 (0,004) 0,094 (0,013) 0,140 (0,013) O. pindus 0,098 (0,009) 0,002 (0,002) 0,165 (0,018) O. theophilii 0,142 (0,016) 0,167 (0,018) 0 (0)

67

Δικόνα 3.16 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Oxynoemacheilus

68

3.3.15 Γένορ Pachychilon

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Pachychilon ρξεζηκνπνηήζεθαλ 19 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 4 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 15 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.15). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.17.

΢ην θπινγελεηηθφ δέληξν παξαηεξείηαη φηη ηα δχν είδε ηνπ γέλνπο Pachychilon, ηα είδε P.macedonicum θαη P. pictum νκαδνπνηνχληαη ζε δηαθνξεηηθνχο θιάδνπο. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.25 θαη 3.26.

Ζ ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ δχν εηδψλ είλαη 42 θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηελ κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζηα είδε. Τπάξρεη δειαδή έλα κεγάιν barcoding gap κεηαμχ ησλ εηδψλ, ηνπιάρηζηνλ ζηα δείγκαηα πνπ κειεηήζεθαλ, επνκέλσο ηα είδε κπνξνχλ λα ηαπηνπνηεζνχλ κε αθξίβεηα. Δπηπιένλ, ηα άηνκα ηνπ είδνπο P. macedonicum απφ ηε Γντξάλε έρνπλ απιφηππνπο πνπ απαληνχλ κφλν ζηελ πεξηνρή απηή.

Δικόνα 3.17 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Pachychilon

69

Πίνακαρ 3.25 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Pachychilon θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Pachychilon 0,029 (0,004) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. Pictum 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. macedonicum 0,003 (0,001) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,0015 (0,0005)

Πίνακαρ 3.26 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ εηδψλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

P. Pictum P. macedonicum P. Pictum 0 (0) 0,076 (0,011) P. macedonicum 0,077 (0,012) 0,018 (0,005)

3.3.16 Γένορ Pelasgus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Pelasgus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 43 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο ε 1 πξνέθπςε απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 42 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.16). Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.18. Οη αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζηα είδε P. thesproticus, P. stymphalicus, P.marathonicus, P. laconicus, P. prespensis θαη P. sp.

΢ην θπινγελεηηθφ δέληξν παξαηεξείηαη φηη ηα είδε P. stymphalicus, P. marathonicus, P. laconicus θαη P. prespensis νκαδνπνηνχληαη ζε δηαθνξεηηθνχο θιάδνπο. Σα άηνκα Pelasgus sp. ρσξίδνληαη ζε δχν δηαθξηηνχο θιάδνπο, απφ ηνπο νπνίνπο ν έλαο πεξηιακβάλεη φια ηα δείγκαηα πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Καιακά, ελψ ν άιινο φια ηα άηνκα πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αρέξνληα. Σα άηνκα ηνπ είδνπο P. thesproticus βξίζθνληαη φια ζε έλαλ θιάδν, κε εμαίξεζε έλα δείγκα ην νπνίν πξνέξρεηαη απφ ηνλ Καιακά θαη ηνπνζεηείηαη ζηνλ ίδην θιάδν κε ηα ππφινηπα δείγκαηα ηνπ Καιακά ηα νπνία έρνπλ ηαπηνπνηεζεί σο sp.

Γηα ηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ ηα δείγκαηα ρσξίζηεθαλ ζε νκάδεο αλάινγα κε ηνλ θιάδν ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ζηνλ νπνίν αλήθαλ. Έηζη, πξνέθπςαλ νη νκάδεο Kalamas, ε νπνία πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα Pelasgus sp. απφ ηνλ Καιακά θαη έλα άηνκν ηνπ είδνπο P. prespensis, Acherontas ε νπνία πεξηέρεη ηα δείγκαηα Pelasgus sp. απφ ηνλ Αρέξνληα θαη Thesproticus, Marathonicus Stymphalicus, Laconicus θαη Prespensis, νη νπνίεο πεξηέρνπλ, ε θάζε κία ηα δείγκαηα ηνπ αληίζηνηρνπ είδνπο. Δμαίξεζε απνηειεί ε νκάδα Prespensis πνπ πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα ηνπ P.prespensis εθηφο απφ έλα, ην νπνίν ηνπνζεηήζεθε ζηελ νκάδα Kalamas. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.6 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.27 θαη 3.28.

Βιέπνπκε φηη κέζα ζηηο νκάδεο ππάξρνπλ κηθξέο γελεηηθέο απνζηάζεηο, νη νπνίεο είλαη πνιιέο θνξέο κηθξφηεξεο απφ ηηο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ νκάδσλ. Μεηαμχ ησλ νκάδσλ ππάξρεη επνκέλσο barcoding gap. Ζ κηθξφηεξε δηαθνξά κεηαμχ ησλ

70

απνζηάζεσλ παξαηεξείηαη ζηηο νκάδεο Kalamas θαη Thesproticus, φπνπ ε ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ είλαη έμη θνξέο κεγαιχηεξε απφ ηε κέγηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ. ΢πκπεξαίλνπκε ινηπφλ φηη ηα είδε P. stymphalicus, P.marathonicus, P. laconicus θαη P. prespensis είλαη δηαρσξηζκέλα κεηαμχ ηνπο. Οη δχν νκάδεο Pelasgus sp. ζα κπνξνχζαλ κε βάζε ηελ ηνπνινγία ηνπ δέληξνπ θαη ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο λα ραξαθηεξηζηνχλ σο μερσξηζηφ είδνο ε θάζε κία. Σν γεγνλφο φηη έλα άηνκν ηεο νκάδαο Kalamas ηαπηνπνηήζεθε σο P. thesproticus, νθείιεηαη πηζαλφηαηα ζην γεγνλφο φηη ζηνλ Καιακά αλαθέξεηαη ε χπαξμε κφλν απηνχ ηνπ είδνπο (Barbieri et al. 2015). Όκσο, φπσο αλαθέξζεθε, ν πιεζπζκφο Pelasgus απφ ηνλ Καιακά ζα κπνξνχζε λα ραξαθηεξηζηεί σο μερσξηζηφ είδνο.

Ο δηαρσξηζκφο ησλ εηδψλ ηνπ γέλνπο Pelasgus ηνπ ειιαδηθνχ ρψξνπ κε βάζε ην γνλίδην COI, ζπκθσλεί κε ην δηαρσξηζκφ ηνπο κε βάζε ην γνλίδην ηνπ θπηνρξψκαηνο β, φπνπ επίζεο παξαηεξήζεθαλ κηθξέο γελεηηθέο απνζηάζεηο κέζα ζηα είδε θαη πνιιέο θνξέο κεγαιχηεξεο κεηαμχ ησλ εηδψλ (Rodríguez 2016).

Πίνακαρ 3.27 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Pelasgus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Pelasgus 0,045 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Kalamas 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Thesproticus 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Acherontas 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Marathonicus 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Stymphalicus 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Laconicus 0,003 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Prespensis 0,014 (0,004)

Πίνακαρ 3.28 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Kalama Thespr- Achero- Marath- Stym- Laconi- Prespe

s οticus ntas onicus phalicus cus -nsis 0,002 0,019 0,033 0,026 0,035 0,071 0,090 Kalamas (0,002) (0,005) (0,008) (0,006) (0,008) (0,011) (0,012) 0,020 0,003 0,028 0,028 0,033 0,066 0,085 Thesproticus (0,005) (0,002) (0,007) (0,007) (0,008) (0,011) (0,012) 0,034 0,030 0,003 0,031 0,031 0,067 0,071 Acherontas (0,008) (0,007) (0,002) (0,007) (0,007) (0,011) (0,011) 0,026 0,028 0,032 0,022 0,066 0,077 Marathonicus 0 (0) (0,007) (0,007) (0,007) (0,006) (0,011) (0,012) 0,037 0,035 0,034 0,024 0,005 0,062 0,073 Stymphalicus (0,008) (0,008) (0,007) (0,006) (0,003) (0,011) (0,011) 0,073 0,068 0,071 0,067 0,065 0,008 0,079 Laconicus (0,012) (0,011) (0,012) (0,011) (0,011) (0,004) (0,013) 0,098 0,093 0,080 0,083 0,079 0,091 0,019 Prespensis (0,013) (0,013) (0,011) (0,011) (0,011) (0,013) (0,013)

71

Δικόνα 3.18 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Pelasgus

72

Οη πιεζπζκνί Pelasgus sp. απφ ηνλ Καιακά θαη ηνλ Αρέξνληα, θαζψο θαη νη πιεζπζκνί Pelasgus laconicus απφ ηνλ Αιθεηφ θαη ηνλ Δπξψηα έρνπλ απινηχπνπο πνπ είλαη πεξηνξηζκέλνη ζηηο πεξηνρέο απηέο θαη θαηά ζπλέπεηα κπνξνχκε λα μερσξίζνπκε ηα άηνκα ησλ πεξηνρψλ απηψλ κεηαμχ ηνπο.

3.3.17 Γένορ Petroleuciscus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Petroleuciscus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 5 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 4 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη ε 1 αλαθηήζεθε απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.17). Καη νη 5 αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο Petroleuciscus borysthenicus. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.19.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.29. Οη κηθξέο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ αηφκσλ, δείρλνπλ φηη ηα δείγκαηα απηά πξάγκαηη αλήθνπλ ζην ίδην είδνο.

Δικόνα 3.19 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Petroleuciscus

73

Πίνακαρ 3.29 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο P. borysthenicus

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. borysthenicus 0,004 (0,002) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. borysthenicus 0,010 (0,004)

3.3.18 Γένορ Pseudorasbora

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Pseudorasbora ρξεζηκνπνηήζεθαλ 9 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο ε 1 πξνέθπςε απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 8 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.16). Καη νη 9 αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο Pseudorasbora parva. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.20.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.30. Οη ηηκέο πξνζεγγίδνπλ ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο πνπ βξέζεθαλ θαη γηα ηα είδε ζηα άιια γέλε ηεο παξνχζαο εξγαζίαο.

Δικόνα 3.20 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Pseudorasbora

Πίνακαρ 3.30 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο P. parva

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. parva 0,005 (0,002) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ P. parva 0,008 (0,003)

3.3.19 Γένορ Rhodeus

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Rhodeus ρξεζηκνπνηήζεθαλ 35 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 23 πξνέθπςαλ απφ ηελ

74

παξνχζα εξγαζία θαη νη 12 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.19). Οη αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζε δχν είδε, ην R. amarus θαη ην R. meridionalis. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.21.

Σα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Rhodeus ρσξίδνληαη ζε 4 θπξίσο θιάδνπο. Με βάζε ηνπο θιάδνπο απηνχο ρσξίζηεθαλ ζε ηέζζεξηο νκάδεο. Ζ νκάδα Am. Strymonas πεξηέρεη ηα δείγκαηα R. amarus απφ ηνλ ΢ηξπκφλα, Βφιβε θαη Κεξθίλε, κε εμαίξεζε έλα δείγκα απφ ηελ Κεξθίλε. Ζ νκάδα Am. Vistonida πεξηέρεη ηα δείγκαηα R. Amarus απφ ηελ Βηζησλίδα, ε νκάδα Mer. Strymonas πεξηέρεη δχν άηνκα ηνπ είδνπο R. meridionalis απφ ηνλ ΢ηξπκφλα, ελψ ε νκάδα Mer. Doirani άηνκα ηνπ είδνπο R. Meridionalis απφ ηελ Γντξάλε, ηνλ ΢ηξπκφλα θαη έλα δείγκα R. amarus απφ ηελ Κεξθίλε. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.7 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α.

Σν ελδηαθέξνλ ζηνηρείν ζε απηφ ην θπινγελεηηθφ δέληξν είλαη φηη νη δχν νκάδεο ηνπ θάζε είδνπο είλαη πεξηζζφηεξν ζπγγεληθέο κε κία νκάδα ηνπ άιινπ είδνπο, παξά κεηαμχ ηνπο φπσο ζα ήηαλ αλακελφκελν. Δπίζεο παξάδνμν απνηειεί ε παξνπζία ελφο δείγκαηνο R. amarus ζηελ ίδηα νκάδα κε άηνκα ηνπ είδνπο R. meridionalis.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.31 θαη 3.32.

Πίνακαρ 3.31 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Rhodeus θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Rhodeus 0,011 (0,003) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Rhodeus 0,023 (0,006) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Mer. Doirani 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Mer. Strymonas 0,008 (0,004) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Am. Vistonida 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Am. Strymonas 0,001 (0,001)

Πίνακαρ 3.32 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Mer. Doirani Mer. Strymonas Am. Vistonida Am. Strymonas Mer. Doirani 0,003 (0,001) 0,015 (0,005) 0,017 (0,005) 0,010 (0,004) Mer. Strymonas 0,019 (0,005) 0,008 (0,004) 0,012 (0,004) 0,012 (0,004) Am. Vistonida 0,018 (0,005) 0,014 (0,004) 0,005 (0,003) 0,013 (0,005) Am. Strymonas 0,012 (0,004) 0,015 (0,004) 0,017 (0,005) 0,003 (0,002)

75

Δικόνα 3.21 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Rhodeus

Με βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο, φια ηα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Rhodeus ζα κπνξνχζαλ λα θαηαηαρζνχλ ζε έλα είδνο, θαζψο ε κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζην γέλνο είλαη 0,023, δειαδή νξηαθά μεπεξλάεη ην φξην ηνπ 0,020 πνπ ηίζεηαη ζπλήζσο γηα ην δηαρσξηζκφ εηδψλ θαη ελψ δελ ππάξρεη αιιεινεπηθάιπςε ησλ απνζηάζεσλ κέζα ζηηο νκάδεο κε ηηο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ νκάδσλ, ε δηαθνξά ηνπο είλαη πνιχ κηθξή. ΢ην γέλνο Rhodeus φκσο, έρεη παξαηεξεζεί ζε πνιιέο πεξηπηψζεηο δηεηζδπηηθφο πβξηδηζκφο, ηφζν κεηαμχ ησλ εηδψλ R. amarus θαη R. meridionalis (Geiger et al. 2014), φζν θαη κεηαμχ άιισλ εηδψλ ηνπ γέλνπο (Bryja et al. 2010). Πξνηείλεηαη ινηπφλ, ε πεξαηηέξσ δηεξεχλεζε ηνπ γέλνπο Rhodeus ψζηε λα απνζαθεληζηεί ε ζρέζε κεηαμχ ησλ εηδψλ ηνπ θαη λα δηαπηζησζεί αλ ην πεξίπινθν

76

θπινγελεηηθφ δέληξν αληηθαηνπηξίδεη πξαγκαηηθά ηηο ζρέζεηο κεηαμχ ησλ δχν εηδψλ ή αλ νθείιεηαη ζε ιαλζαζκέλεο αξρηθέο ηαπηνπνηήζεηο.

Ο δηαρσξηζκφο, φκσο, ηνπ γέλνπο Rhodeus ζηα δχν απηά είδε είλαη πξφζθαηνο, ελψ παξάιιεια ηα είδε απηά είλαη αξθεηά φκνηα κνξθνινγηθά (Barbieri et al. 2015). Καηά ζπλέπεηα, αλ νη παξαπάλσ γελεηηθέο απνζηάζεηο θαη ε ηνπνινγία ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ δελ νθείινληαη ζε δηεηζδπηηθφ πβξηδηζκφ θαη αληηθαηνπηξίδνπλ ηελ πξαγκαηηθή ζρέζε ησλ δχν εηδψλ, ηα δχν είδε ζα κπνξνχζαλ λα μαλαεληαρζνχλ ζε έλα θνηλφ είδνο.

Ο πιεζπζκφο Rhodeus ηεο Βηζηνλίδαο έρεη απιφηππνπο κνλαδηθνχο ζηελ πεξηνρή απηή, ηα άηνκα δειαδή πνπ πξνέξρνληαη απφ ηε Βηζησλίδα κπνξνχλ λα δηαρσξηζηνχλ απφ άηνκα ηνπ ίδηνπ γέλνπο ή είδνπο πνπ πξνέξρνληαη απφ άιιεο πεξηνρέο.

3.3.20 Γένορ Sabanejewia

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Sabanejewia ρξεζηκνπνηήζεθαλ 7 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο ε 1 πξνέθπςε απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 6 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.20). Οη αιιεινπρίεο αλήθνπλ φιεο ζην είδνο S. balcanica. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.22.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.33.

Παξφιν πνπ ζην θπινγελεηηθφ δέληξν δηαθξίλνληαη δχν θιάδνη, νη γελεηηθέο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ αηφκσλ είλαη πνιχ κηθξέο, θαηά ζπλέπεηα φια ηα δείγκαηα αλήθνπλ πξάγκαηη ζην ίδην είδνο.

Δικόνα 3.22 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Sabanejewia

77

Πίνακαρ 3.33 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο S. balcanica

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ S. balcanica 0,001 (0,001) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ S. balcanica 0,002 (0,002)

3.3.21 Γένορ Salmo

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Salmo ρξεζηκνπνηήζεθαλ 26 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 4 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 22 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.21). Οη αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζηα είδε, ην S. lourosensis, S. peristericus, S. farioides θαη Salmo sp. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.23.

Σα δείγκαηα ηνπ γέλνπο Salmo ρσξίδνληαη ζε 4 θπξίσο θιάδνπο. Παξά ην γεγνλφο φηη γηα ηα είδε S. lourosensis θαη S. peristericus, ηα δείγκαηά ηνπο ηνπνζεηνχληαη ζηνλ ίδην θιάδν κεηαμχ ηνπο, ηα δείγκαηα ησλ S. farioides θαη Salmo sp. βξίζθνληαη κνηξαζκέλα ζε δηαθνξεηηθνχο θιάδνπο.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ πίλαθα 3.34.

Πίνακαρ 3.34 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Salmo θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Salmo 0,004 (0,001) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Salmo 0,008 (0,004)

Ζ κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο είλαη 0,008, πνιχ κηθξφηεξε απφ ηελ κέγηζηε απφζηαζε πνπ παξαηεξείηαη ζε άιια γέλε αιιά θαη ην φξην ηνπ 0,02 πνπ ρξεζηκνπνηείηαη ζπρλά γηα ηνλ θαζνξηζκφ εηδψλ. Με βάζε ηε γελεηηθή απηή απφζηαζε δελ δηθαηνινγείηαη ν δηαρσξηζκφο ησλ δεηγκάησλ ζε επηκέξνπο είδε. Σα άηνκα ηνπ γέλνπο Salmo είλαη ζηελά ζπγγεληθά θαη ν δηαρσξηζκφο ησλ εηδψλ γίλεηαη κε βάζε κνξθνινγηθνχο ραξαθηήξεο (Geiger et al. 2014), θαζψο ηα είδε ηνπ γέλνπο Salmo έρνπλ πξνθχςεη πξφζθαηα (Pustovrh et al. 2014). Απηφ, ζε ζπλδπαζκφ κε ην γεγνλφο φηη, ηα δηάθνξα είδε ηνπ γέλνπο πβξηδίδνληαη κεηαμχ ηνπο (Barbieri et al. 2015), δπζρεξαίλεη ηε γελεηηθή ηαπηνπνίεζή ηνπο. Πξνηείλεηαη ινηπφλ ε πεξαηηέξσ κειέηε ηνπ γέλνπο, ηφζν ζε κνξθνινγηθφ, φζν θαη ζε γελεηηθφ επίπεδν, γηα ηελ απνζαθήληζε ησλ ηαμηλνκηθψλ ζρέζεσλ κέζα ζε απηφ.

Ο πιεζπζκφο Salmo farioides απφ ηνλ Αψν, δηαζέηεη κφλν έλαλ απιφηππν, ν νπνίνο κάιηζηα δελ απαληά ζε άιιε πεξηνρή, κπνξνχλ δειαδή ηα άηνκα πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αψν λα δηαρσξηζηνχλ απφ ηα άηνκα άιισλ πεξηνρψλ.

78

Δικόνα 3.23 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Salmo

3.3.22 Γένορ Squalius

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Squalius ρξεζηκνπνηήζεθαλ 185 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 59 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 126 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.22). Οη αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζηα είδε S. orpheus, S. fellowesii, S. prespensis, S. platyceps,S. pamvoticus, S. peloponensis, S. moreoticus, S. vardarensis, S. keadicus θαη Squalius sp. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.24.

Με βάζε ηελ ηνπνινγία ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ, ην γέλνο ρσξίζηεθε ζε επηά νκάδεο. Ζ νκάδα Orpheus πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα ηνπ είδνπο S. orpheus, ηα άηνκα Squalius sp. απφ ηε Θάζν, ηνλ ΢ηξπκφλα θαη ηελ Δχβνηα, θαζψο θαη κεξηθά άηνκα Squalius sp. απφ ηε Λέζβν. Ζ νκάδα Fellowesii πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. fellowesii θαη άηνκα Squalius sp. απφ ηε Λέζβν. Ζ νκάδα Prespensis-Platyceps

79

πεξηέρεη ηα άηνκα ησλ εηδψλ S. prespensis θαη S. platyceps, ηα άηνκα Squalius sp. Aoos απφ ηνλ Αψν θαη ηελ Κφληηζα. Ζ νκάδα Pamvoticus πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. pamvoticus, ηα άηνκα Squalius sp. απφ ηνπο Μειησηάδεο θαη έλα δείγκα S. peloponensis απφ ηνλ Άξαρζν. Ζ νκάδα Moreoticus πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. moreoticus, ηα άηνκα Squalius sp.απφ ηνλ Αρειψν, ηνλ Μφξλν θαη ηνλ Πελεηφ, άηνκα Squalius sp. απφ ηε Λέζβν θαη ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. peloponensis απφ ηνλ Αιθεηφ. Σέινο ε νκάδα Vardarensis πεξηέρεη ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. vardarensis θαη ε νκάδα Keadicus ηα άηνκα ηνπ είδνπο S.keadicus. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ πίλαθα Α.8 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.35 θαη 3.36.

Πίνακαρ 3.35 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Squalius θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ γέλνπο

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Squalius 0,033 (0,005) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Orpheus 0,003 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Fellowesii 0,006 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Prespensis-Platyceps 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Pamvoticus 0,002 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Moreoticus 0,005 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Vardarensis 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Keadicus 0,001 (0,001)

Πίνακαρ 3.36 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Prespensis- Orpheus Fellowesii Pamvoticus Moreoticus Vardarensis Keadicus Platyceps 0,007 0,018 0,043 0,036 0,039 0,034 0,089 Orpheus (0,003) (0,006) (0,008) (0,008) (0,009) (0,007) (0,013) 0,024 0,012 0,050 0,050 0,055 0,050 0,093 Fellowesii (0,006) (0,004) (0,010) (0,010) (0,010) (0,009) (0,014) Prespensis- 0,047 0,055 0,003 0,020 0,030 0,029 0,083 Platyceps (0,009) (0,009) (0,002) (0,005) (0,007) (0,007) (0,012) 0,040 0,053 0,022 0,005 0,015 0,022 0,079 Pamvoticus (0,008) (0,009) (0,006) (0,002) (0,005) (0,006) (0,012) 0,045 0,062 0,032 0,018 0,017 0,027 0,079 Moreoticus (0,009) (0,010) (0,007) (0,005) (0,005) (0,007) (0,012) 0,038 0,054 0,030 0,023 0,030 0,007 0,074 Vardarensis (0,008) (0,009) (0,007) (0,006) (0,007) (0,003) (0,011) 0,091 0,096 0,085 0,080 0,081 0,074 0,002 Keadicus (0,013) (0,013) (0,013) (0,012) (0,012) (0,012) (0,002)

Με βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο ηα δείγκαηα Squalius sp. θάζε νκάδαο κπνξνχλ λα εληαρζνχλ ζην είδνο πνπ δίλεη ην φλνκα ηνπ ζε θάζε νκάδα.

Όζνλ αθνξά ηελ νκάδα Prespensis-Platyceps ε νπνία πεξηέρεη ηα είδε S. sp. Aoos, S. prespensis θαη S. platyceps, ε κέγηζηε απφζηαζε κεηαμχ ηνπο είλαη 0,003, θάηη

80

πνπ ζεκαίλεη φηη γελεηηθά δελ δηθαηνινγείηαη ν δηαρσξηζκφο ηνπο ζε ηξία είδε. Σα άηνκα Squalius απφ ηνλ Αψν, εληάρζεθαλ απφ ηνπο Geiger et al. ζην είδνο S. platyceps (Geiger et al. 2014), ελψ νη Barbieri et al. (2015) ηα ραξαθηεξίδνπλ σο μερσξηζηφ είδνο κε ην φλνκα S. sp. Aoos. Λφγσ, φκσο, ηεο κηθξήο γελεηηθήο απφζηαζεο ησλ αηφκσλ απηψλ απφ ηα άηνκα ηνπ είδνπο S. prespensis, πξνηείλεηαη ε πεξαηηέξσ κειέηε αηφκσλ απφ ηνλ Αψν θαη ηηο Πξέζπεο θαη ε έληαμε ησλ πιεζπζκψλ Squalius ησλ πεξηνρψλ απηψλ ζε έλα είδνο.

Ζ νκάδα Moreoticus επίζεο θαίλεηαη λα απνηειεί έλα είδνο. ΢χκθσλα φκσο κε ηνπο εξεπλεηέο πνπ θαηέζεζαλ ηηο αιιεινπρίεο ηνπ S. moreoticus ζηελ BOLD, ππάξρεη πηζαλφηεηα ηα άηνκα λα αλήθνπλ ζηελ πξαγκαηηθφηεηα ζην είδνο S. peloponnensis (Geiger et al. 2014). Καηά ζπλέπεηα νιφθιεξε ε νκάδα Moreoticus ππάξρεη πηζαλφηεηα λα αληηπξνζσπεχεη ην είδνο S. peloponnensis. ΢ηελ πεξίπησζε απηή ζα πξέπεη λα ζπιιερζνχλ δείγκαηα πνπ λα ηαπηνπνηεζνχλ νξζά σο S. moreoticus ψζηε λα κειεηεζεί ε θπινγελεηηθή ζρέζε ησλ δχν απηψλ εηδψλ.

Πέξα απφ ηηο δχν παξαπάλσ πεξηπηψζεηο ηα είδε ηνπ γέλνπο θαίλεηαη λα κπνξνχλ λα δηαρσξηζηνχλ κε βάζε ηελ αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ COI, θαζψο ππάξρεη δηαθνξά αλάκεζα ζηηο κέγηζηεο ελδνεηδηθέο θαη ειάρηζηεο δηαεηδηθέο απνζηάζεηο. Σν δείγκα L112 πνπ κνξθνινγηθά ηαπηνπνηήζεθε σο S. peloponnensis, αιιά ζην δέληξν νκαδνπνηείηαη καδί κε ηα S. pamvoticus, απνηειεί πηζαλφηαηα ιαλζαζκέλε κνξθνινγηθή ηαπηνπνίεζε. Xακειέο ελδνεηδηθέο απνζηάζεηο έρνπλ παξαηεξεζεί ζην γέλνο απηφ θαη ζε έξεπλα πάλσ ζε εηδε ζηελ Ηηαιία (Lucentini et al. 2014), φπνπ ε κεγαιχηεξε κέζε ελδνεηδηθή απφζηαζε πνπ παξαηεξήζεθε ήηαλ 0,012.

Ο πιεζπζκφο Squalius sp. Απφ ηελ Δχβνηα παξνπζηάδεη κφλν έλαλ απιφηππν, κνλαδηθφ γηα ηελ πεξηνρή απηή, είλαη δειαδή δηαρσξηζκέλνο απφ ηνπο πιεζπζκνχο ησλ άιισλ πεξηνρψλ.

81

82

83

84

Δικόνα 3.24 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Squalius

3.3.23 Γένορ Telestes

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Telestes ρξεζηκνπνηήζεθαλ 48 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 18 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 30 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.23). Οη 45 αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο T. pleurobipunctatus θαη νη 3 ζην είδνο T. beoticus. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Eηθφλα 3.25.

Παξαηεξνχκε φηη ηα άηνκα ηνπ είδνπο T. beoticus ηνπνζεηνχληαη ζηνλ ίδην θιάδν, ελψ ηα άηνκα ηνπ είδνπο T. pleurobipunctatus ρσξίδνληαη ζε ηέζζεξηο θιάδνπο. Γηα

85

ηνλ ιφγν απηφ, γηα ηνλ ππνινγηζκφ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ, ηα άηνκα ηνπ είδνπο T. pleurobipunctatus ρσξίζηεθαλ ζε ηέζζεξηο νκάδεο αλάινγα κε ηνλ θιάδν ηνπ δέληξνπ ζηνλ νπνίνλ άλεθαλ.

Πξνέθπςαλ έηζη νη νκάδεο Acheloos, ε νπνία πεξηέρεη φια ηα δείγκαηα απφ ηνλ Αρειψν, ε νκάδα Pinios, ε νπνία πεξηέρεη ηα δείγκαηα απφ ηελ Πελεηφ, ηνλ Αιθεηφ θαη ηνλ Δχελν, ε νκάδα Kalamas, ε νπνία πεξηέρεη ηα δείγκαηα απφ ηνλ Καιακά, ηνλ Παξαθάιακν θαη ηνλ Αρέξνληα θαη ε νκάδα Arachthos, ε νπνία πεξηέρεη ηα δείγκαηα απφ ηνλ Άξαρζν θαη ηνλ Λνχξν. Σα αθξηβή δείγκαηα πνπ πεξηέρνληαη ζε θάζε νκάδα δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα Α.9 ηνπ Παξαξηήκαηνο Α. Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνπο Πίλαθεο 3.37 θαη 3.38.

Πίνακαρ 3.37 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην γέλνο Telestes,κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε είδνο θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα ηνπ έηδνπο Τ. pleurobipunctatus

Σιμή (Σςπικό Γενεηική απόζηαζη ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο γένορ Telestes 0,020 (0,003) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Τ. pleurobipunctatus 0,016 (0,003) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ Τ. pleurobipunctatus 0,030 (0,007) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ T. beoticus 0,002 (0,001) Μέζη ενδοειδική απόζηαζη 0,009 (0,0025) Μέζη γενεηική απόζηαζη μεηαξύ ηων ειδών Τ. pleurobipunctatus 0,048 (0,008) και T. beoticus Δλάσιζηη γενεηική απόζηαζη μεηαξύ ηων ειδών Τ. 0,036 (0,008) pleurobipunctatus και T. beoticus Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Pinios 0,005 (0,002) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Acheloos 0 (0) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Kalamas 0,001 (0,001) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην ομάδα Arachthos 0 (0)

Με βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο θαίλεηαη φηη ηα είδε T. pleurobipunctatus θαη T. beoticus είλαη δηαρσξηζκέλα θαη κπνξνχλ λα δηαθξηζνχλ κε βάζε ην γνλίδην COI.

Όζνλ αθνξά ην είδνο T. pleurobipunctatus, νη νκάδεο Arachthos θαη Kalamas θαίλεηαη λα αλήθνπλ πξάγκαηη ζην ίδην είδνο θαζψο ε απφζηαζε ηνπο είλαη 0,011. Ζ νκάδα Acheloos παξνπζηάδεη απφζηαζε κεγαιχηεξε απφ 0,02 θαη απφ ηηο ηξεηο άιιεο νκάδεο, θαίλεηαη έηζη λα απνηειεί μερσξηζηφ είδνο, ελψ ην ίδην θαίλεηαη λα ηζρχεη θαη γηα ηελ νκάδα Pinios. Ζ χπαξμε, κάιηζηα, μερσξηζηνχ είδνπο Telestes ζηνλ Πελεηφ θαη ηνλ Αιθεηφ έρεη πξνηαζεί θαη ζε άιιε έξεπλα, ε νπνία ην αλαθέξεη σο T. alfiensis (Dubut et al. 2012). Με βάζε ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, ινηπφλ, εληζρχεηαη ε άπνςε ηεο χπαξμεο ηνπ είδνπο T. alfiensis ζηνλ Πελεηφ θαη ηνλ Αιθεηφ θαη πξνηείλεηαη επηπιένλ, ε έληαμε ησλ αηφκσλ ηνπ γέλνπο Telestes ηνπ Αρειψνπ ζε μερσξηζηφ είδνο.

86

Δικόνα 3.25 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Telestes

87

Πίνακαρ 3.38 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε κεηαμχ ηνπ είδνπο T. beoticus θαη ησλ νκάδσλ ηνπ είδνπο Τ. pleurobipunctatus (θάησ απφ ηελ δηαγψλην), κέγηζηε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα (δηαγψληνο) θαη ειάρηζηε απφζηαζε κεηαμχ ησλ νκάδσλ (πάλσ απφ ηελ δηαγψλην). ΢ηηο παξελζέζεηο δίλεηαη ην ηππηθφ ζθάικα.

Pinios Acheloos Kalamas Arachthos T. beoticus 0,015 0,020 0,017 0,023 0,052 Pinios (0,005) (0,006) (0,005) (0,006) (0,009) 0,022 0,020 0,027 0,054 Acheloos 0 (0) (0,005) (0,006) (0,007) (0,009) 0,019 0,021 0,003 0,010 0,036 Kalamas (0,005) (0,006) (0,006) (0,004) (0,008) 0,025 0,027 0,011 0,045 Arachthos 0 (0) (0,006) (0,007) (0,004) (0,008) 0,054 0,055 0,038 0,046 T. beoticus 0,003 (0,002) (0,009) (0,009) (0,008) (0,009)

Σέινο, ζηνλ Αρειψν παξαηεξνχληαη κφλν απιφηππνη πνπ είλαη κνλαδηθνί ζε απηήλ ηελ πεξηνρή θαη καο επηηξέπνπλ έηζη λα βξνχκε αλ έλα άηνκν Telestes πξνέξρεηαη απφ ηνλ Αρειψν. Δπίζεο ηα άηνκα Telestes απφ ηνλ Αιθεηφ αλήθνπλ ζε έλαλ κνλαδηθφ απιφηππν, αιιά θαζψο είλαη κφλν δχν δελ κπνξνχκε λα πνχκε κε ζηγνπξηά αλ ζηελ πεξηνρή απηή απαληψληαη κφλν κνλαδηθνί απιφηππνη ή αλ ππάξρνπλ θαη απιφηππνη θνηλνί κε άιιεο πεξηνρέο.

3.3.24 Γένορ Vimba

Γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέληξνπ ηνπ γέλνπο Vimba ρξεζηκνπνηήζεθαλ 18 αιιεινπρίεο, απφ ηηο νπνίεο νη 9 πξνέθπςαλ απφ ηελ παξνχζα εξγαζία θαη νη 9 αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD (Πίλαθαο Β.24). Όιεο νη αιιεινπρίεο αλήθνπλ ζην είδνο V. melanops. Σν δέληξν πνπ πξνέθπςε παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 3.26.

Οη ηηκέο ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ην γέλνο απηφ, δίλνληαη ζηνλ πίλαθα 3.39.

Οη κηθξέο απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ αηφκσλ δείρλνπλ φηη πξάγκαηη ηα άηνκα αλήθνπλ ζην ίδην είδνο.

Πίνακαρ 3.39 Μέζε θαη κέγηζηε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζην είδνο Vimba melanops

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ΢θάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ είδορ V. melanops 0,003 (0,001) Μέγιζηη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηο είδορ είδορ V. melanops 0,007 (0,003)

Σα άηνκα V. melanops πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αμηφ αλήθνπλ φια ζε απιφηππνπο πνπ δελ απαληνχλ ζε άιιεο πεξηνρέο, είλαη δειαδή πιεζπζκνί πνπ κπνξνχκε λα ηνπο μερσξίζνπκε απφ ηνπο ππφινηπνπο πιεζπζκνχο ηνπ είδνπο.

88

Δικόνα 3.26 Φπινγελεηηθφ δέληξν (ML) ηνπ γέλνπο Vimba

3.4 Μέζερ γενεηικέρ αποζηάζειρ

Καηά ηε δηαδηθαζία αλάιπζεο ησλ απνηειεζκάησλ, ε θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέληξσλ πξνεγήζεθε ηνπ ππνινγηζκνχ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ. Με ηνλ ηξφπν απηφ απνθηήζεθε κία γεληθή εηθφλα ησλ ζρέζεσλ ησλ αηφκσλ θάζε γέλνπο, πνπ καο επέηξεςε ζηελ ζπλέρεηα λα ρσξίζνπκε ζε επηκέξνπο νκάδεο ηα είδε πνπ παξνπζίαδαλ κεγάιεο απνζηάζεηο κεηαμπ ησλ αηφκσλ ηνπο ή λα ελψζνπκε ζε θνηλέο νκάδεο είδε κε κηθξή απφζηαζε κεηαμχ ηνπο.

Ζ κέζε απφζηαζε γελεηηθή απφζηαζε ζην ζχλνιν ησλ αιιεινπρίσλ, ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο Cyprinidae θαη Cobitidae, ε κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηα γέλε ηα νπνία πεξηειάκβαλαλ πεξηζζφηεξα απφ έλα είδε θαη ε κέζε ηηκή ησλ κέζσλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κέζα ζηα είδε θαη ηηο νκάδεο πνπ νξίζηεθαλ δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 3.40.

89

Πίνακαρ 3.40 Μέζε γελεηηθή απφζηαζε ζην ζχλνιν ησλ αιιεινπρίσλ, κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο Cyprinidae θαη Cobitidae θαη κέζε απφζηαζε κέζα ζηα γέλε

Γενεηική απόζηαζη Σιμή (Σςπικό ζθάλμα) Μέζη γενεηική απόζηαζη ζηο ζύνολο ηων αλληλοςσίων 0,171 (0,012) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην οικογένεια 0,141 (0,011) Cyprinidae Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηην οικογένεια Cobitidae 0,122 (0,010) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηιρ οικογένειερ 0,1315 (0,0105) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηα γένη 0,032 (0,0043) Μέζη γενεηική απόζηαζη μέζα ζηα είδη 0,0029 (0,0013)

Ζ κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηα είδε βξέζεθε 0,0029 θαη πξνζεγγίδεη ηηο αληίζηνηρεο κέζεο ηηκέο πνπ έρνπλ ππνινγηζζεί γηα ηρζχεο εζσηεξηθψλ πδάησλ ζε πνιιέο άιιεο κειέηεο. Ζ αληίζηνηρε ηηκή γηα ιίκλεο ηεο βφξεηαο Διιάδαο βξέζεθε 0,0066 (Triantafyllidis et al. 2011), ζε κειέηε ζε ρψξεο ηεο Μεζνγείνπ βξέζεθε 0,0059 (Geiger et al. 2014), ζηνλ Καλαδά βξέζεθε 0,0027 (Hubert et al. 2008), ζηελ Γεξκαλία 0,0026 (Knebelsberger et al. 2015), ζηελ Νηγεξία 0,0017(Nwani et al. 2011), ζε πνηάκηα ηηο Κίλαο έρεη βξεζεί κεηαμχ 0,0030 θαη 0,0036 (Chen et al. 2015; Yang et al. 2016), ελψ ζε ρψξεο ηεο Ακεξηθήο νη ηηκέο θπκαίλνληαη κεηαμχ 0,0017 θαη 0,0073 (Valdez-Moreno et al. 2009; April et al. 2011; de Carvalho et al. 2011; Mabragaña et al. 2011). Παξαηεξείηαη δειαδή φηη ζε παγθφζκηα θιίκαθα ε κέζε ελδνεηδηθή γελεηηθή απφζηαζε δελ μεπεξλά ην 0,010, ππάξρεη δειαδή κία ζπλέπεηα ζηηο ηηκέο απηέο, ε νπνία κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί σο επηρείξεκα ζην δηαρσξηζκφ εηδψλ κε βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο.

Ζ κέζε γελεηηθή απφζηαζε κέζα ζηα γέλε πνπ πεξηειάκβαλαλ πεξηζζφηεξα απφ έλα είδε βξέζεθε 0,034. Οη αληίζηνηρεο ηηκέο ζηηο εξγαζίεο πνπ αλαθέξζεθαλ παξαπάλσ είλαη 0,038 γηα ηηο ιίκλεο ηεο βφξεηαο Διιάδαο, 0,029 γηα ηηο ρψξεο ηεο Μεζνγείνπ, 0,030 γηα ηελ Γεξκαλία, 0,084 γηα ηνλ Καλαδά, 0,060 θαη 0,02 γηα δχν πνηάκηα ηεο θίλαο, 0,103 γηα ηελ Νηγεξία θαη κεηαμχ 0,04 θαη 0,138 γηα ηηο ρψξεο ηεο Ακεξηθεο. Παξαηεξνχκε ινηπφλ, φηη ππάξρεη δηαθνξά κεηαμχ ησλ κέζσλ ελδνεηδηθψλ απνζηάζεσλ θαη ησλ κέζσλ απνζηάζεσλ κέζα ζε θάζε γέλνο, ε νπνία κπνξεί επίζεο λα ρξεζηκνπνηεζεί σο επηρείξεκα ζηνλ δηαρσξηζκφ εηδψλ κε βάζε ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο.

Παξαηεξνχκε φηη ε κέζε απφζηαζε ζην ζχλνιν ησλ αιιεινπρηψλ είλαη κεγαιχηεξε απφ ηελ κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε γέλνο, φπσο είλαη αλακελφκελν. Ζ ηηκή ηεο κέζεο γελεηηθήο απφζηαζεο κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο πνπ πεξηειάκβαλαλ πεξηζζφηεξα απφ έλα γέλε είλαη 0,1315, πξνζεγγίδεη δειαδή ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο πνπ ππνινγίζηεθαλ γηα ηηο νηθνγέλεηεο ζε άιιεο εξγαζίεο πάλσ ζε ηρζχεο εζσηεξηθψλ πδάησλ, φπσο ησλ Triantafyllidis et. al (Triantafyllidis et al. 2011), φπνπ ε γελεηηθή απφζηαζε ζε νηθνγέλεηεο ηρζχσλ απφ ιίκλεο ηεο Βφξεηαο Διιάδαο ππνινγίζηεθε ζε 0,1534, θαη ησλ Knebelsberger et al. (Knebelsberger et al. 2015), φπνπ ε γελεηηθή απφζηαζε ζε νηθνγέλεηεο ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηεο Γεξκαλίαο ππνινγίζηεθε ζε 0,1573. Ζ αληίζηνηρε ηηκή ζε κειέηε ζε ρψξεο ηεο Μεζνγείνπ είλαη 0,0644 (Geiger et al. 2014), ζηνλ Καλαδά 0,2 (Hubert et al. 2008), ζηελ Βφξεηα Ακεξηθή 0,16 (April et al. 2011), ζηελ Κεληξηθή Ακεξηθή 0,136 (Valdez-Moreno et al. 2009), ζηελ Βξαδηιία 0,21 (de Carvalho et al. 2011) θαη ζε πνηακνχο ηεο Κίλαο κεηαμχ 0,125 θαη 0,163 (Chen et al. 2015; Yang et al. 2016). Παξαηεξνχκε δειαδή φηη αθφκα θαη ε

90

ρακειφηεξε ηηκή ησλ κέζσλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ κέζα ζηηο νηθνγέλεηεο (0,0644) είλαη πνιιέο θνξέο κεγαιχηεξεο απφ ηηο κέζεο γελεηηθέο απνζηάζεηο κέζα ζηα γέλε, ην νπνίν ζεκαίλεη φηη ηα γέλε είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα.

Σν πφζεο θνξέο κεγαιχηεξε πξέπεη λα είλαη ε κέζε απφζηαζε κεηαμχ δχν νκάδσλ νξγαληζκψλ απφ ηελ κέζε απφζηαζε κέζα ζε θάζε νκάδα γηα λα ραξαθηεξηζηνχλ νη δχν νκάδεο σο μερσξηζηά είδε πνηθίιιεη αλάινγα κε ηελ ππφ κειέηε ηαμηλνκηθή νκάδα (Candek and Kuntner 2015), αλ θαη νη Hebert et al είραλ πξνηείλεη ηελ δεθαπιάζηα δηαθνξά (Hubert et al. 2008) . Παξαηεξψληαο ηηο γελεηηθέο απνζηάζεηο πνπ αλαθέξζεθαλ παξαπάλσ, παξαηεξνχκε φηη ελψ νη κέζεο ελδνεηδηθέο απνζηάζεηο ζηελ Δπξψπε θπκαίλνληαη ζηα ίδηα επίπεδα κε ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο ζε άιιεο επείξνπο, νη επξσπατθέο κέζεο απνζηάζεηο κέζα ζηα γέλε είλαη ζαθψο ρακειφηεξεο απφ απηέο ζε άιιεο επείξνπο. Απηφ ζεκαίλεη φηη ηα γέλε ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ζηελ Δπξψπε παξνπζηάδνπλ κηθξφηεξε γελεηηθή δηαθνξνπνίεζε ζε ζρέζε κε ηνλ ππφινηπν θφζκν, θαηά ζπλέπεηα ην φξην γηα ην δηαρσξηζκφ ησλ εηδψλ κέζσ ησλ γελεηηθψλ απνζηάζεσλ ζα πξέπεη λα είλαη ρακειφηεξν.

Barcoding gap παξαηεξήζεθε ζηα πεξηζζφηεξα είδε πνπ κειεηήζεθαλ ζηελ εξγαζία απηή, ην νπνίν αλ θαη ζε ιίγεο πεξηπηψζεηο μεπέξαζε ην δεθαπιάζην ηεο κέγηζηεο ελδνεηδηθήο απφζηαζεο, καο επηηξέπεη λα ζπκπεξάλνπκε φηη ηα είδε απηά είλαη ζαθψο δηαρσξηζκέλα. Σα ρακειφηεξα φξηα barcoding gap γηα ηνλ δηαρσξηζκφ ησλ εηδψλ ζηελ Διιάδα επηηξέπνληαη, φπσο αλαθέξζεθε παξαπάλσ, απφ ηε κηθξφηεξε γελεηηθή δηαθνξνπνίεζε ησλ ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ πνπ έρεη παξαηεξεζεί ζηελ Δπξψπε ζε ζρέζε κε ηνλ ππφινηπν θφζκν. ΢ε φζα είδε δελ παξαηεξήζεθε barcoding gap, έγηλε πξφηαζε γηα πεξαηηέξσ κειέηε ηνπο γηα ηελ πηζαλή ζπλέλσζή ηνπο ζε έλα είδνο, ελψ ζε πεξηπηψζεηο πνπ παξαηεξήζεθε barcoding gap κεηαμχ νκάδσλ ηνπ ίδηνπ είδνπο, πξνηάζεθε ν δηαρσξηζκφο ησλ νκάδσλ απηψλ ζε δηαθνξεηηθά είδε.

3.5 Δκηίμηζη ηηρ αποηελεζμαηικόηηηαρ ηος DNA barcoding

Οη 406 αιιεινπρίεο πνπ πξνέθπςαλ θαη αλαιχζεθαλ ζηελ παξνχζα εξγαζία, θαηαηέζεθαλ ζηε βάζε δεδνκέλσλ BOLD. Οη θσδηθνί πνπ δφζεθαλ ζε απηέο είλαη GFFB001-17 έσο θαη GFFB055-17, GFFB057-17 έσο θαη GFFB097-17 θαη GFFB098-18 έσο θαη GFFB407-18. Ζ αληηζηνηρία κεηαμχ ησλ θσδηθψλ πνπ δφζεθαλ ζηηο αιιεινπρίεο θαηά ηηο αλαιχζεηο θαη ησλ θσδηθψλ πνπ δφζεθαλ απφ ηελ BOLD παξνπζηάδεηαη ζην Παξάξηεκα Γ.

Ζ εθαξκνγή ηνπ DNA barcoding γηα ηελ ηαπηνπνίεζε εηδψλ ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ζηελ Διιάδα θξίλεηαη ηθαλνπνηεηηθή, κε βάζε ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, ρσξίο φκσο λα ιείπνπλ πξνβιήκαηα. Σα πξνβιήκαηα αθνξνχζαλ είηε νκάδεο ηνπ ίδηνπ είδνπο πνπ είλαη πνιχ απνκαθξπζκέλεο κεηαμχ ηνπο, είηε δηαθνξεηηθά είδε πνπ νκαδνπνηνχληαλ καδί, θαη δίλνληαη ζπλνπηηθά ζηνλ Πίλαθα 3.41.

91

Πίνακαρ 3.41 Πεξηπηψζεηο πνπ ρξήδνπλ πεξαηηέξσ κειέηεο θαη πξνηάζεηο ηαμηλνκηθψλ αιιαγψλ κε βάζε ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο έξεπλαο

Δίδη Ππόηαζη ηαξινομικήρ αλλαγήρ Έληαμε ησλ αηφκσλ ηνπ ζε άιια ππάξρνληα Alburnoides bipunctatus είδε Alburnus thessalicus – Alburnus Έληαμε ζε έλα, θνηλφ είδνο macedonicus Alburnus volviticus – Alburnus vistonicus Έληαμε ζε έλα, θνηλφ είδνο Δλζσκάησζε ζην είδνο Barbus Barbus euboicus peloponnesius Έληαμε νξηζκέλσλ νκάδσλ ηνπ ζην είδνο Barbus peloponnesius Barbus prespensis Cobitis hellenica – Cobitis arachthosensis Έληαμε ζε έλα, θνηλφ είδνο Gobio bulgaricus Γηαρσξηζκφο κίαο νκάδαο ηνπ ζε λέν είδνο Pelasgus sp. Γηάζπαζε ζε δχν είδε Rhodeus amarus – Rhodeus meridionalis Έληαμε ζε έλα, θνηλφ είδνο Salmo spp. Έληαμε ζε έλα, θνηλφ είδνο Squalius sp. Aoos – Squalius platyceps Έληαμε ζην είδνο Squalius prespensis Telestes pleurobipunctatus Γηαρσξηζκφο δχν νκάδσλ ηνπ ζε λέα είδε

Πην ζπγθεθξηκέλα, παξαηεξήζεθαλ ηέζζεξηο πεξηπηψζεηο φπνπ νκάδεο πνπ αλαθέξνληαη σο νκάδεο ηνπ ίδηνπ είδνπο ζα κπνξνχζαλ λα απνηεινχλ μερσξηζηά είδε:

i. Σα άηνκα ηνπ είδνπο Alburnoides bipunctatus πνπ κειεηήζεθαλ ζηελ παξνχζα εξγαζία ζα κπνξνχζαλ λα εληαρζνχλ ζηα είδε A. thessalicus, A. prespensis θαη ζην είδνο A. strymonicus ην νπνίν απνηειεί λέν είδνο πνπ πξνηάζεθε απφ ηνπο Geiger et al (Geiger et al. 2014).

ii. Σα άηνκα ηνπ είδνπο Gobio bulgaricus, πνπ πξέξρνληαη απφ ηνλ Αμηφ θαη ηε Γντξάλε, ζα κπνξνχζαλ λα απνηειέζνπλ έλα λέν είδνο.

iii. Σα άηνκα Pelasgus sp. απφ ηνλ Καιακά θαη ηνλ Αρέξνληα ζα κπνξνχζαλ λα απνηειέζνπλ δχν δηαθνξεηηθά είδε.

iv. Σα άηνκα ηνπ είδνπο Telestes pleurobipunctatus, πνπ πξνέξρνληαη απφ ηνλ Αρειψν, ηνλ Πελεηφ θαη ηνλ Αιθεηφ, ζα κπνξνχζαλ λα δηαρσξηζηνχλ απφ ην αξρηθφ είδνο, κε ηα άηνκα ηνπ Αρειψνπ λα απνηεινχλ έλα είδνο θαη ηα άηνκα ηνπ Πελεηνχ θαη ηνπ Αιθεηνχ έλα άιιν είδνο.

Δπίζεο παξαηεξήζεθαλ νθηψ πεξηπηψζεηο φπνπ νκάδεο πνπ ηαπηνπνηήζεθαλ αξρηθά σο δηαθνξεηηθά είδε ζα κπνξνχζαλ εληαρζνχλ ζε έλα θνηλφ είδνο:

i. Σα είδε Alburnus thessalicus θαη Alburnus macedonicus ζα κπνξνχζαλ λα εληαρζνχλ ζε έλα είδνο.

ii. Σα είδε Alburnus volviticus θαη Alburnus vistonicus ζα κπνξνχζαλ λα απνηειέζνπλ έλα είδνο.

iii. Σν είδνο Barbus euboicus ζα κπνξνχζε λα ελζσκαησζεί ζην είδνο Barbus peloponnesius.

92

iv. Σα άηνκα Barbus peloponnesius απφ ηνλ Άξαρζν θαη ηνπο Μηιηνηάδεο, θαη κεξηθά άηνκα ηνπ είδνπο απηνχ απφ ηνλ Καιακά θαη ηνλ Αρεισν, ζα κπνξνχζαλ λα εληαρζνχλ ζην είδνο Barbus prespensis, ην νπνίν ζεκαίλεη φηη ζηνλ Καιακά θαη ηνλ Αρειψν απαληνχλ, ηφζν Barbus peloponnesius, φζν θαη Barbus prespensis.

v. Σα είδε Cobitis hellenica θαη Cobitis arachthosensis ζα κπνξνχζαλ λα απνηειέζνπλ έλα είδνο.

vi. Σα άηνκα ησλ εηδψλ Rhodeus amarus θαη Rhodeus meridionalis θαίλνληαη λα απνηεινχλ έλα είδνο, γηα ην νπνίν φκσο δηαηεξνχληαη επηθπιάμεηο θαζσο, πέξαλ ηνπ δηεηζδπηηθνχ πβξηδηζκνχ πνπ έρεη παξαηεξεζεί κεηαμχ ησλ δχν απηψλ εηδψλ, δελ απνθιείεηαη θαη ε ιαλζαζκέλε αξρηθή ηαπηνπνίεζε θάπνησλ αηφκσλ. vii. Όια ηα άηνκα ηνπ γέλνπο Salmo θαίλνληαη λα αλήθνπλ ζε έλα είδνο, ην νπνίν φκσο πηζαλφηεηα δελ ηζρχεη, θαζψο πξφθεηηαη γηα ζηελά ζπγγεληθά είδε πνπ δηαρσξίζηεθαλ πξφζθαηα. viii. Σα άηνκα Squalius απφ ηνλ Αψν ζα κπνξνχζαλ λα εληαρζνχλ ζην είδνο Squalius prespensis.

΢ηελ πξψηε πεξίπησζε πξνηάζεθε ν δηαρσξηζκφο ησλ νκάδσλ απηψλ ζε δηαθνξεηηθά είδε, ελψ ζηελ δεχηεξε πεξίπησζε πξνηάζεθε ε πεξαηηέξσ κειέηε ησλ εηδψλ απηψλ ψζηε λα δηαπηζησζεί αλ πξφθεηηαη γηα δχν δηαθνξεηηθά είδε πνπ δηαρσξίζηεθαλ πνιχ πξφζθαηα ή αλ κπνξνχκε λα ηα εληάμνπκε ζε έλα θνηλφ είδνο.

Ζ πεξαηηέξσ κειέηε ησλ πξναλαθεξζέλησλ πεξηπηψζεσλ κπνξεί λα πεξηιακβάλεη ηελ επαλεμέηαζε ησλ αηφκσλ γηα ηα νπνία ππάξρεη δηαθσλία κεηαμχ ηεο κνξθνινγηθήο ηαπηνπνίεζεο θαη ηνπ DNA barcoding, ψζηε λα γίλεη αξρηθά βέβαην φηη ε δηαθσλία δελ νθείιεηαη ζε ιάζνο αξρηθή κνξθνινγηθή ηαπηνπνίεζε ησλ αηνκψλ απηψλ. Δπίζεο κπνξεί λα γίλεη ηαπηνπνίεζε πεξηζζνηέξσλ αηφκσλ ησλ εηδψλ απηψλ ηφζν κε βάζε ηηο θιαζηθέο κεζφδνπο ηαπηνπνίεζεο, φζν θαη κε DNA barcoding θαη θπξίσο λα ζπιιερζνχλ θαη λα ηαπηνπνηεζνχλ άηνκα απφ πεξηζζφηεξεο πεξηνρέο ζηηο νπνίεο απαληψληαη ηα είδε απηά, κε ηδαληθφ ζηφρν ηελ ζπιινγή αηφκσλ απφ φιν ην εχξνο εμάπισζεο ηνπ είδνπο. Δπίζεο ζε πεξηπηψζεηο ζηελά ζπγγεληθψλ ή ζπκπάηξησλ εηδψλ, ζα κπνξνχζε λα γίλεη αιιεινχρηζε γελεηηθψλ δεηθηψλ ηνπ ππξεληθνχ γνληδηψκαηνο, ψζηε λα εληνπηζηνχλ πβξίδηα θαη πεξηπηψζεηο δηεηζδπηηθνχ πβξηδηζκνχ κεηαμχ ησλ εηδψλ. Ζ κειέηε κεγαιχηεξνπ αξηζκνχ αηφκσλ απφ θάζε είδνο ζε ζπλδπαζκφ κε ππξεληθνχο γελεηηθνχο δείθηεο θαη ηα ππάξρνληα DNA barcodes, ζα ζπκβάιεη ζηελ δηειεχθαλζε φισλ ησλ θαηλνκεληθά πξνβιεκαηηθψλ πεξηπηψζεσλ.

Καηά ηε δηάξθεηα ηεο εξγαζίαο εληνπίζηεθαλ 22 πεξηπηψζεηο, φπνπ ν πιεζπζκφο ελφο είδνπο ζε κία ζπγθεθξηκέλε πεξηνρή παξνπζίαδε κφλν απιφηππνπο κνλαδηθνχο γηα απηελ ηελ πεξηνρή, δειαδή νη απιφηππνη ηεο θάζε κίαο απφ απηέο ηηο πεξηνρέο απηέο δελ απαληνχλ ζε θακία άιιε πεξηνρή. Οη πεξηπηψζεηο απηέο παξαηίζεληαη ζηνλ Πίλαθα 3.42. ΢ηηο πεξηζζφηεξεο απφ απηέο ηηο πεξηπηψζεηο, νη γελεηηθέο απνζηάζεηο δελ δηθαηνινγνχλ ηελ θαηάηαμε ησλ πιεζπζκψλ απηψλ ζε λέα είδε, απνηεινχλ δειαδή απιά απνκνλσκέλνπο πιεζπζκνχο ηνπ είδνπο ζην νπνίν αλήθνπλ. Απηφ

93

ζεκαίλεη φηη αλ δηαζέηνπκε ηελ αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ COI ελφο αηφκνπ κπνξνχκε φρη κφλν λα ηαπηνπνηήζνπκε αλ αλήθεη ζε έλα απφ απηά ηα είδε, αιιά θαη αλ πξνέξρεηαη ή φρη απφ κία απφ απηέο ηηο πεξηνρέο. Απηφ δείρλεη ηελ δπλαηφηεηα ηνπ DNA barcoding λα πάεη, ζε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο, έλα βήκα πέξα απφ ηελ ηαπηνπνίεζε ησλ εηδψλ, ζηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο γεσγξαθηθήο πξνέιεπζεο ησλ αηφκσλ.

Πίνακαρ 3.42 Δίδε θαη πεξηνρέο ζηηο νπνίεο ηα είδε απηά παξνπζηάδνπλ κνλαδηθνχο απιφηππνπο. Με αζηεξίζθν ζεκεηψλνληαη νη πεξηπηψζεηο γηα ηηο νπνίεο έρεη πξνηαζεί ν ζπγθεθξηκέλνο πιεζπζκφο λα απνηειέζεη λέν είδνο ή λα ελζσκαησζεί ζε άιιν είδνο.

Δίδορ Πεπιοσή Δίδορ Πεπιοσή Alburnoides Pachychilon Πελεηφο Γντξάλε thessalicus macedonicum Alburnoides Πξέζπεο Καιακαο* prespensis Barbus euboicus Δχβνηα* Pelasgus sp. Αρέξνληαο* Barbus Αιθεηφο Δπξψηαο peloponnesius Βνπξατθφο Αιθεηφο Βηζησλίδα Rhodeus amarus Βηζησλίδα Cobitis strumicae ΢ηξπκφλαο Salmo farioides Αψνο Λνχξνο Squalius sp. Έπβνηα Gasterosteus sp. Αρέξνληαο Telestes Αρειψνο* Άξηο pleurobipunctatus Αιθεηφο* Gobio bulgaricus Βηζησλίδα Vimba melanops Αμηφο

Με ηε ζπγθέληξσζε ζηηο βάζεηο δεδνκέλσλ φιν θαη πεξηζζφηεξσλ DNA barcodes είλαη δπλαηή ε ζπλερήο αλαζεψξεζε ησλ πξνεγνχκελσλ barcodes, ζα απνθαιχπηνληαη θαη ζα δηνξζψλνληαη έηζη ιάζε πνπ νθείινληαη ζηελ πεξηνξηζκέλε δηαζεζηκφηεηα αιιεινπρηψλ θαηά ηα πξψηα ρξφληα εθαξκνγήο ηεο κεζφδνπ, ελψ παξάιιεια ν ζπλδπαζκφο ηνπ barcoding κε ηελ θιαζηθή ηαμνλνκία ζα έρεη ζπρλά σο απνηέιεζκα ηελ αιιαγή ηεο ζπζηεκαηηθήο θαηάηαμεο πνιιψλ εηδψλ θαη αηφκσλ. Σα φπνηα πηζαλά πξνβιήκαηα ζηελ ηαπηνπνίεζε εηδψλ ζηελ παξνχζα εξγαζία πηζηεχνπκε φηη νθείινληαη αθξηβψο ζηελ ειιεηπή χπαξμε barcodes γηα ηα είδε πνπ απαληψληαη ζηελ Διιάδα θαη ζηνλ δηαρσξηζκφ ησλ εηδψλ κέρξη ζήκεξα κε βάζε θπξίσο κνξθνινγηθά θαη γεσγξαθηθά ραξαθηεξηζηηθά.

Πηζηεχνπκε ινηπφλ, φηη ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ζα επηηξέςνπλ ηελ αλαζεψξεζε ηεο ζπζηεκαηηθήο θαηάηαμεο νξηζκέλσλ εηδψλ, ζε ζπλδπαζκφ πάληα κε ηελ εθαξκνγή ησλ θιαζηθψλ κεζφδσλ ηαπηνπνίεζεο ησλ εηδψλ φπσο ε κνξθνινγία θαη φηη νη φπνηεο αιιαγέο πξνηαζνχλ ζα επηβεβαηψζνπλ πεξαηηέξσ ηελ απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ DNA barcoding σο εξγαιείνπ γηα ηελ ηαπηνπνίεζε εηδψλ.

Παξάιιεια ειπίδνπκε φηη ηα λέα δεδνκέλα πάλσ ζηηο ζρέζεηο κεηαμχ ησλ εηδψλ θαη ησλ δηάθνξσλ πιεζπζκψλ ηνπο, ζα επεθηείλνπλ ηε γλψζε καο πάλσ ζηελ βηνπνηθνιφηεηα ηεο Διιάδαο θαη ζα ζπκβάιινπλ φρη κφλν ζηηο πξνζπάζεηεο δηαηήξεζήο ηεο αιιά θαη ζηελ αμηνπνίεζή ηεο.

94

4. ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ

Παπαβαζηιείνπ ΢ (2017) Γελεηηθή αλάιπζε ησλ ηρζχσλ εζσηεξηθψλ πδάησλ ηνπ γέλνπο Barbus κε πξνζέγγηζε barcoding. Αξηζηνηέιεην Παλεπηζηήκην Θεζζαινλίθεο

Σξηαληαθπιιίδεο Α (2010) Δηδηθά ζέκαηα γελεηηθήο, εξγαζηεξηαθέο ζεκεηψζεηο. Αξηζηνηέιεην Παλεπηζηήκην Θεζζαινλίθεο, Θεζζαινλίθε

Aliabadian M, Kaboli M, Nijman V, Vences M (2009) Molecular identification of birds: Performance of distance-based DNA barcoding in three genes to delimit parapatric species. PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0004119

April J, Mayden RL, Hanner RH, Bernatchez L (2011) Genetic calibration of species diversity among North America’s freshwater fishes. Proc Natl Acad Sci U S A 108:10602–7. doi: 10.1073/pnas.1016437108

Arias MC, Brito RM, Francisco F de O, et al (2006) Molecular markers as a tool for population and evolutionary studies of stingless bees. Apidologie 37:259–274. doi: 10.1051/apido:2006021

Baker RJ (1994) Some thoughts on conservation, Biodiversity, museums, molecular characters, systematics, and basic research. J. Mammal. 75:277–287.

Barbieri R, Zogaris S, Kalogianni E, et al (2015) Freshwater Fishes and Lampreys of Greece: An Annotated Checklist. Hellenic Centre for Marine Research, Athens

Barrett RDH, Hebert PDN (2005) Identifiying spiders through DNA barcodes. Can J Zool 83:481–491. doi: 10.1139/Z05-024

Baxevanis AD, Ouellette BFF (2001) Bioinformatics : a practical guide to the analysis of genes and proteins, Second. John Wiley & Sons, Inc., New York

Becker S, Hanner R, Steinke D (2011) Five years of FISH-BOL: Brief status report. Mitochondrial DNA 22:3–9. doi: 10.3109/19401736.2010.535528

Beebee T, Rowe G (2004) An Introduction to Molecular Ecology.

Behrens-Chapuis S, Herder F, Esmaeili HR, et al (2015) Adding nuclear rhodopsin data where mitochondrial COI indicates discrepancies – can this marker help to explain conflicts in cyprinids? DNA Barcodes 3:187–199. doi: 10.1515/dna-2015-0020

Berg J, Tymoczko J, Stryer L (2007) Biochemistry. Biochemistry 117–144.

Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, et al (2007) Cryptic species as a window on diversity and conservation. Trends Ecol. Evol. 22:148–155.

Birecikligil SS, Yücel ŞY, Çiçek E (2016) A taxonomic evaluation of Alburnus sellal heckel, 1843 and Alburnus adanensis battalgazi, 1944 based on morphological characters and mitochondrial DNA sequences. Pak J Zool 48:465–473.

Boore JL (1999) Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res 27:1767–1780. doi: 10.1093/nar/27.8.1767

Brown WM, George M, Wilson AC (1979) Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 76:1967–1971. doi: 10.1146/annurev.es.18.110187.001413

Bryja J, Smith C, Konečný A, Reichard M (2010) Range-wide population genetic structure of the European bitterling (Rhodeus amarus) based on microsatellite and mitochondrial DNA analysis. Mol Ecol 19:4708–4722. doi: 10.1111/j.1365-294X.2010.04844.x

Candek K, Kuntner M (2015) DNA barcoding gap: Reliable species identification over morphological and geographical scales. Mol Ecol Resour 15:268–277. doi: 10.1111/1755-0998.12304

Casal-Lopez M, Perea S, Yahyaoui A, Doadrio I (2015) Taxonomic review of the genus

97

Luciobarbus Heckel, 1843 (Actinopterygii, Cyprinidae) from northwestern Morocco with the description of three new species. Graellsia 71:e027. doi: 10.3989/graellsia.2015.v71.135

Castresana J (2001) Cytochrome b phylogeny and the taxonomy of great apes and mammals. Mol Biol Evol 18:465–471. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a003825

Cavalli-Sforza LL, Edwards AWF (1967) Phylogenetic analysis: model and estimation procedures. Evolution (N Y) 21:550 570.

CBOL Plant Working Group, Hollingsworth PM, Forrest LL, et al (2009) A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci U S A 106:12794–7. doi: 10.1073/pnas.0905845106

Ceballos G, Ehrlich PR, Barnosky AD, et al (2015) Accelerated modern human-induced species losses: Entering the sixth mass extinction. Sci Adv 1:e1400253–e1400253. doi: 10.1126/sciadv.1400253

Chan EY (2005) Advances in sequencing technology. Mutat. Res. - Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 573:13–40.

Chapin FS (1997) Biotic Control over the Functioning of Ecosystems. Science (80- ) 277:500– 504. doi: 10.1126/science.277.5325.500

Chase MW, Fay MF (2009) Ecology. Barcoding of plants and fungi. Science 325:682–683. doi: 10.1126/science.1176906

Chen W, Ma X, Shen Y, et al (2015) The fish diversity in the upper reaches of the Salween River, Nujiang River, revealed by DNA barcoding. Sci Rep 5:17437. doi: 10.1038/srep17437

Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976) Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 127:1550–1557. doi: 10.1016/S0146- 6380(96)00133-7

Claridge MF, Dawah HA, Wilson MR, Systematics Association. (1997) Species : the units of biodiversity. Syst Assoc Spec Vol Ser xvi, 439 .

Cooper G, Amos W, Bellamy R, et al (1999) An Empirical Exploration of the (Γκ)2 Genetic Distance for 213 Human Microsatellite Markers. Am J Hum Genet 65:1125–1133. doi: 10.1086/302574

Costa FO, Carvalho GR (2007) The Barcode of Life Initiative : synopsis and prospective societal impacts of DNA barcoding of Fish. Genomics Soc Policy 3:29–40. doi: 10.1186/1746-5354-3-2-29

Cox AJ, Hebert PDN (2001) Colonization, extinction, and phylogeographic patterning in a freshwater crustacean. Mol Ecol 10:371–386. doi: 10.1046/j.1365-294X.2001.01188.x de Carvalho DC, Oliveira DAA, Pompeu PS, et al (2011) Deep barcode divergence in Brazilian freshwater fishes: the case of the São Francisco River basin. Mitochondrial DNA 22:80–86. doi: 10.3109/19401736.2011.588214

Dobzhansky T (1937) Genetic nature of species differences. Am Nat 71:404–420. doi: 10.2307/2457293

Dubut V, Fouquet A, Voisin A, et al (2012) From late miocene to holocene: Processes of differentiation within the telestes genus (actinopterygii: Cyprinidae). PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0034423

Eadie WR, Mayr E, Linsley EG, Usinger RL (1953) Methods and Principles of Systematic Zoology.

Eagderi S, Jouladeh-Roudbar A, Nasri M, et al (2017) Taxonomic status of the genus Cobitis

98

(Teleostei: Cobitidae) in the Namak Lake basin, Iran. Iran J Ichthyol 4:131–139. doi: 10.7508/iji.2016.

Ebach MC, Holdrege C (2005) DNA barcoding is no substitute for taxonomy. Nature 434:697. doi: 10.1038/434697b

Economou AN, Giakoumi S, Vardakas L, et al (2007) The freshwater ichthyofauna of Greece - An update based on a hydrographic basin survey. Mediterr. Mar. Sci. 8:91–166.

Galtier N, Nabholz B, Glemin S, Hurst G (2009) Mitochondrial DNA as a marker of molecular diversity: a reappraisal. Mol Ecol 18:4541–4550. doi: 10.1111/j.1365- 294X.2009.04380.x

Gamfeldt L, Hillebrand H, Jonsson PR (2008) Multiple functions increase the importance of biodiversity for overall ecosystem functioning. Ecology 89:1223–1231. doi: 10.1890/06- 2091.1

Gaston KJ, O’Neill MA (2004) Automated species identification: why not? Philos Trans R Soc B Biol Sci 359:655–667. doi: 10.1098/rstb.2003.1442

Geiger MF, Herder F, Monaghan MT, et al (2014) Spatial heterogeneity in the mediterranean biodiversity hotspot affects barcoding accuracy of its freshwater fishes. Mol Ecol Resour 14:1210–1221. doi: 10.1111/1755-0998.12257

Gray JS (1997) Marine Biodiversity Patterns, Threats and Conservation Needs. Biodivers Conserv 6:153–175. doi: 10.3354/meps311175

Guillamön JM, Sabaté J, Barrio E, et al (1998) Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Arch Microbiol 169:387–392. doi: 10.1007/s002030050587

Hajibabaei M, Singer GAC, Hebert PDN, Hickey DA (2007) DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends Genet 23:167–172. doi: 10.1016/j.tig.2007.02.001

Hall BG (2004) Phylogenetic Trees Made Easy: A How-To Manual, 2nd edition, 2nd edn. Sinauer Associates, Sundeland

Harrison RG (1989) Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology. Trends Ecol. Evol. 4:6–11.

Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR (2003a) Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci 270:313–21. doi: 10.1098/rspb.2002.2218

Hebert PDN, Gregory TR, Savolainen V (2005) The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Syst Biol 54:852–859. doi: 10.1080/10635150500354886

Hebert PDN, Penton EH, Burns JM, et al (2004a) Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci 101:14812–14817. doi: 10.1073/pnas.0406166101

Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR (2003b) Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci 270 Suppl:S96–S99. doi: 10.1098/rsbl.2003.0025

Hebert PDN, Stoeckle MY, Zemlak TS, Francis CM (2004b) Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biol. doi: 10.1371/journal.pbio.0020312

Hedges SB (1992) The number of replications needed for accurate estimation of the bootstrap P value in phylogenetic studies. Mol Biol Evol 9:366–369. doi: 10.1016/j.jvoice.2011.12.007

Hillis DM, Bull JJ (1993) An Empirical Test of Bootstrapping as a Method for Assessing

99

Confidence in Phylogenetic Analysis. Syst Biol 42:182–192. doi: 10.2307/2992540

Hillis DM, Moritz C, Mable BK (1996) Molecular Systematics. Mol Syst 2nd:655. doi: 10.1006/mpev.2000.0880

Hsu MC, Chen KW, Lo HJ, et al (2003) Species identification of medically important fungi by use of real-time LightCycler PCR. J Med Microbiol 52:1071–1076. doi: 10.1099/jmm.0.05302-0

Huang XC, Quesada M a, Mathies R a (1992) DNA sequencing using capillary array electrophoresis. Anal Chem 64:2149–54. doi: 10.1021/ac00042a021

Hubert N, Hanner R, Holm E, et al (2008) Identifying Canadian freshwater fishes through DNA barcodes. PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0002490

Hubert N, Kadarusman, Wibowo A, et al (2015) DNA Barcoding Indonesian freshwater fishes: challenges and prospects. DNA Barcodes. doi: 10.1515/dna-2015-0018

Hurles ME, Jobling MA (2001) Haploid chromosomes in molecular ecology: Lessons from the human Y. Mol. Ecol. 10:1599–1613.

Janda JM, Abbott SL (2007) 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. J. Clin. Microbiol. 45:2761–2764.

Janzen DH, Hajibabaei M, Burns JM, et al (2005) Wedding biodiversity inventory of a large and complex Lepidoptera fauna with DNA barcoding. Philos Trans R Soc B Biol Sci 360:1835–1845. doi: 10.1098/rstb.2005.1715

Jarman SN, Elliott NG (2000) DNA evidence for morphological and cryptic cenozoic speciations in the Anaspididae, “living fossils” from the triassic. J Evol Biol 13:624–633. doi: 10.1046/j.1420-9101.2000.00207.x

Javonillo R, Malabarba LR, Weitzman SH, Burns JR (2010) Relationships among major lineages of characid fishes (Teleostei: Ostariophysi: Characiformes), based on molecular sequence data. Mol Phylogenet Evol 54:498–511. doi: 10.1016/j.ympev.2009.08.026

Jenkins M (2003) Prospects for Biodiversity. Science (80- ) 302:1175–1177. doi: 10.1126/science.1088666

Johns GC, Avise JC (1998) A comparative summary of genetic distances in the vertebrates from the mitochondrial cytochrome b gene. Mol Biol Evol 15:1481–1490. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a025875

Jouladeh-Roudbar A, Eagderi S, Sayyadzadeh G, Esmaeili HR (2017) Cobitis keyvani, a junior synonym of Cobitis faridpaki (Teleostei: Cobitidae). Zootaxa 4244:118–126. doi: 10.11646/zootaxa.4244.1.6

Karlsson AO, Holmlund G (2007) Identification of mammal species using species-specific DNA pyrosequencing. Forensic Sci Int 173:16–20. doi: 10.1016/j.forsciint.2007.01.019

Kearse M, Moir R, Wilson A, et al (2012) Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics 28:1647–1649. doi: 10.1093/bioinformatics/bts199

Keskin E, Ağdamar S, Tarkan AS (2013) DNA barcoding common non-native freshwater fish species in Turkey: Low genetic diversity but high population structuring. Mitochondrial DNA 24:276–287. doi: 10.3109/19401736.2012.748041

Kimura M (1980) A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16:111–120. doi: 10.1007/BF01731581

100

Knebelsberger T, Dunz AR, Neumann D, Geiger MF (2015) Molecular diversity of Germany’s freshwater fishes and lampreys assessed by DNA barcoding. Mol Ecol Resour 15:562– 572. doi: 10.1111/1755-0998.12322

Knowlton N (1993) Sibling Species in the Sea. Annu Rev Ecol Syst 24:189–216. doi: DOI 10.1146/annurev.ecolsys.24.1.189

Knowlton N, Weigt L a. (1998) New dates and new rates for divergence across the Isthmus of Panama. Proc R Soc B Biol Sci 265:2257–2263. doi: 10.1098/rspb.1998.0568

Kottelat M, Freyhof J (2007) Handbook of European freshwater fishes. Copeia 2008:646.

Kress WJ, Erickson DL (2007) A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region. PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0000508

Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, et al (2005) Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci U S A 102:8369–8374. doi: 10.1073/pnas.0503123102

Kumar S, Stecher G, Tamura K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol 33:msw054. doi: 10.1093/molbev/msw054

Lang BF, Gray MW, Burger G (1999) Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes. Annu Rev Genet 33:351–397. doi: 10.1146/annurev.genet.33.1.351

Levin BA, Simonov E, Matveyev MP, et al (2016) DNA barcoding of the fishes of the genus Alburnoides (Actinopterygii, Cyprinidae) from Caucasus. Mitochondrial DNA Part A 0:1– 7. doi: 10.1080/24701394.2016.1238900

Lewin B (2004) Genes VIII. Pearson Education, Upper Saddle River

Luca M, Andrew W, Emer R, et al (2009) Population structure of short-beaked common dolphins (Delphinus delphis) in the North Atlantic Ocean as revealed by mitochondrial and nuclear genetic markers. Mar Biol 156:821–834. doi: 10.1007/s00227-008-1120-y

Lucentini L, Chiesa S, Giannetto D, et al (2014) Integrative taxonomy does not support the occurrence of two species of the Squalius squalus complex (Actinopterygii, Cypriniformes, Cyprinidae) in Italy. Biochem Syst Ecol 56:281–288. doi: 10.1016/j.bse.2014.07.005

Ludwig a, Bohlen J, Wolter C, Pitra C (2001) Phylogenetic relationships and historical biogeography of spined loaches (Cobitidae, Cobitis andSabanejewia ) as indicated by variability of mitochondrial DNA. Zool J Linn Soc 131:381–392. doi: 10.1006/zils.2000.0250

Lynch M, Jarrell PE (1993) A method for calibrating molecular clocks and its application to animal mitochondrial DNA. Genetics 135:1197–1208.

Mabragaña E, de Astarloa JMD, Hanner R, et al (2011) DNA barcoding identifies argentine fishes from marine and brackish waters. PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0028655

Makimura K, Tamura Y, Mochizuki T, et al (1999) Phylogenetic classification and species identification of dermatophyte strains based on DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 regions. J Clin Microbiol 37:920–924.

Mardis ER (2008) The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends Genet 24:133–141. doi: 10.1016/j.tig.2007.12.007

Marková S, Šanda R, Crivelli A, et al (2010) Nuclear and mitochondrial DNA sequence data reveal the evolutionary history of Barbus (Cyprinidae) in the ancient lake systems of the Balkans. Mol Phylogenet Evol 55:488–500. doi: 10.1016/j.ympev.2010.01.030

Mayr E (1942) Systematics and the Origin of Species. Genome Biol. 102 Suppl:334.

101

Mayr E, Aslock P (1992) Principles of systematic zoology. Syst Biol 41:264–266.

McCabe KM, Zhang YH, Huang BL, et al (1999) Bacterial species identification after DNA amplification with a universal primer pair. Mol Genet Metab 66:205–211. doi: 10.1006/mgme.1998.2795

Meyer A, Kocher TD, Basasibwaki P, Wilson AC (1990) Monophyletic origin of Lake Victoria cichlid fishes suggested by mitochondrial DNA sequences. Nature 347:550–553. doi: 10.1038/347550a0

Meyer CP, Paulay G (2005) DNA barcoding: Error rates based on comprehensive sampling. PLoS Biol 3:1–10. doi: 10.1371/journal.pbio.0030422

Nei M (1972) Genetic Distance between Populations. Am Nat 106:283–292. doi: 10.1086/282771

Newmaster SG, Fazekas AJ, Ragupathy S (2006) DNA barcoding in land plants: evaluation of rbcL in a multigene tiered approach. Can J Bot 84:335–341. doi: 10.1139/b06-047

Nwani CD, Becker S, Braid HE, et al (2011) DNA barcoding discriminates freshwater fishes from southeastern Nigeria and provides river system-level phylogeographic resolution within some species. Mitochondrial DNA 22:43–51. doi: 10.3109/19401736.2010.536537

Nybom H (2004) Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants. Mol Ecol 13:1143–1155. doi: 10.1111/j.1365- 294X.2004.02141.x

Pampoulie C, Danielsdottir AK (2008) Resolving species identification problems in the genus Sebastes using nuclear genetic markers. Fish Res 93:54–63. doi: 10.1016/j.fishres.2008.02.007

Partis L, Wells RJ (1996) Identification of fish species using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Mol Cell Probes 10:435–441. doi: 10.1006/mcpr.1996.0060

Pepe T, Trotta M, di Marco I, et al (2005) Mitochondrial cytochrome b DNA sequence variations: an approach to fish species identification in processed fish products. J Food Prot 68:421–425.

Powell W, Morgante M, Andre C, et al (1995) Hypervariable microsatellites provide a general source of polymorphic DNA markers for the chloroplast genome. Curr Biol 5:1023–1029. doi: 10.1016/S0960-9822(95)00206-5

Powledge TM (2007) The polymerase chain reaction The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ 44–50. doi: 10.1152/advan.00002.2004

Primack R, Diamantopoulos I, Arianoutsou M, et al (2004) A primer for Conservation Biology, 3rd edn. Sinauer Associates, Sunderland

Provan J, Powell W, Hollingsworth PM (2001) Chloroplast microsatellites: new tools for studies in plant ecology and evolution. Trends Ecol Evol 16:142–147. doi: 10.1016/S0169-5347(00)02097-8

Pun K-M, Albrecht C, Castella V, Fumagalli L (2009) Species identification in mammals from mixed biological samples based on mitochondrial DNA control region length polymorphism. Electrophoresis 30:1008–1014. doi: 10.1002/elps.200800365

Pustovrh G, Snoj A, Bajec S (2014) Molecular phylogeny of Salmo of the western Balkans, based upon multiple nuclear loci. Genet Sel Evol 46:7. doi: 10.1186/1297-9686-46-7

Ratnasingham S, Hebert PDN (2007) BOLD: The Barcode of Life Data System: Barcoding. Mol Ecol Notes 7:355–364. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01678.x

102

Rodríguez NV (2016) Phylogeny and phylogeography of the cyprinid fish genus Pelasgus ( Teleostei : Cyprinidae ). Charles University in Prague

Rudnick JA, Katzner TE, Bragin EA, DeWoody JA (2007) Species identification of birds through genetic analysis of naturally shed feathers. Mol Ecol Notes 7:757–762. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01796.x

Russell PJ (2009) iGenetics - Μηα Μεληειηθή Πξνζέγγηζε. In: iGenetics. A Mendelian approach. pp 979–1021

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487–491. doi: 10.1126/science.2448875

Sanger F, Coulson AR (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 94:441–448. doi: 10.1016/0022- 2836(75)90213-2

Saunders GW (2005) Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1879–88. doi: 10.1098/rstb.2005.1719

Sayyadzadeh G, Eagderi S, Esmaeili HR (2017) A new loach of the genus Oxynoemacheilus from the Tigris River drainage and its phylogenetic relationships among the nemacheilid ... 3:236–250. doi: 10.7508/iji.2016.A

Sbisà E, Tanzariello F, Reyes A, et al (1997) Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: Identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications. In: Gene. pp 125–140

Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, et al (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proc Natl Acad Sci 109:6241–6246. doi: 10.1073/pnas.1117018109

Scicluna SM, Tawari B, Clark CG (2006) DNA barcoding of Blastocystis. Protist 157:77–85. doi: 10.1016/j.protis.2005.12.001

Simmons RB, Weller SJ (2001) Utility and Evolution of Cytochrome b in Insects. Mol Phylogenet Evol 20:196–210. doi: 10.1006/mpev.2001.0958

Simpson GG (1961) Principles of animal taxonomy.

Soares P, Abrantes D, Rito T, et al (2013) Evaluating Purifying Selection in the Mitochondrial DNA of Various Mammalian Species. PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0058993

Soltis PS, Soltis DE (2003) Applying the Bootstrap in Phylogeny Reconstruction. Stat Sci 18:256–267. doi: 10.1214/ss/1063994980

Staley JT (2009) Universal species concept: Pipe dream or a step toward unifying biology? J Ind Microbiol Biotechnol 36:1331–1336. doi: 10.1007/s10295-009-0642-8

Stoeckle MY, Hebert PDN (2008) Barcode of life. Sci Am 299:82–86, 88. doi: 10.3200/SRCH.20.2.36-42

Summerbell RC, Lévesque C a, Seifert K a, et al (2005) Microcoding: the second step in DNA barcoding. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1897–1903. doi: 10.1098/rstb.2005.1721

Sunnucks P (2000) Efficient genetic markers for population biology. Trends Ecol. Evol. 15:199–203.

Takács P, Bihari P, Eros T, et al (2014) Genetic heterogeneity reveals on-going speciation and cryptic taxonomic diversity of stream-dwelling gudgeons (Teleostei, Cyprinidae) in

103

the Middle Danubian hydrosystem (Hungary). PLoS One. doi: 10.1371/journal.pone.0097278

Tang KL, Agnew MK, Chen WJ, et al (2011) Phylogeny of the gudgeons (Teleostei: Cyprinidae: Gobioninae). Mol Phylogenet Evol 61:103–124. doi: 10.1016/j.ympev.2011.05.022

Teletchea F (2009) Molecular identification methods of fish species: Reassessment and possible applications. Rev Fish Biol Fish 19:265–293. doi: 10.1007/s11160-009-9107-4

Toffoli D, Hrbek T, de Araújo MLG, et al (2008) A test of the utility of DNA barcoding in the radiation of the freshwater stingray genus Potamotrygon (Potamotrygonidae, Myliobatiformes). Genet Mol Biol 31:324–336. doi: 10.1590/S1415-47572008000200028

Triantafyllidis A, Bobori D, Koliamitra C, et al (2011) DNA barcoding analysis of fish species diversity in four north Greek lakes. Mitochondrial DNA 22 Suppl 1:37–42. doi: 10.3109/19401736.2010.542242

Trontelj P, MacHino Y, Sket B (2005) Phylogenetic and phylogeographic relationships in the crayfish genus Austropotamobius inferred from mitochondrial COI gene sequences. Mol Phylogenet Evol 34:212–226. doi: 10.1016/j.ympev.2004.09.010

Valdez-Moreno M, Ivanova N V., Elías-Gutiérrez M, et al (2009) Probing diversity in freshwater fishes from Mexico and Guatemala with DNA barcodes. J Fish Biol 74:377– 402. doi: 10.1111/j.1095-8649.2008.02077.x

Versalovic J, Koeuth T, Lupski R (1991) Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to finerpriting of bacterial enomes. Nucleic Acids Res 19:6823–6831. doi: 10.1093/nar/19.24.6823

Wan QH, Wu H, Fujihara T, Fang SG (2004) Which genetic marker for which conservation genetics issue? Electrophoresis 25:2165–2176.

Ward RD, Hanner R, Hebert PDN (2009) The campaign to DNA barcode all fishes, FISH- BOL. J Fish Biol 74:329–356. doi: 10.1111/j.1095-8649.2008.02080.x

Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, et al (2005) DNA barcoding Australia’s fish species. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1847–1857. doi: 10.1098/rstb.2005.1716

Wares JP, Cunningham CW (2001) Phylogeography and historical ecology of the North Atlantic intertidal. Evolution 55:2455–2469. doi: 10.1111/j.0014-3820.2001.tb00760.x

Watson JD, Meyers RM, Caudy AA, Witkowski JA (2007) Recombinant DNA: Genes and Genomes - A Short Course, 3rd edn. W. H. Freeman

Welch DBM, Huse SM (2011) Microbial Diversity in the Deep Sea and the Underexplored “Rare Biosphere.” In: Handbook of Molecular Microbial Ecology II: Metagenomics in Different Habitats. pp 243–252

Wheeler QD (2004) Taxonomic triage and the poverty of phylogeny. Philos Trans R Soc B Biol Sci 359:571–583. doi: 10.1098/rstb.2003.1452

Wolf C, Rentsch J, Hübner P (1999) PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. J Agric Food Chem 47:1350–1355. doi: 10.1021/jf9808426

Yang J, He S, Freyhof J, et al (2006) The phylogenetic relationships of the Gobioninae (Teleostei: Cyprinidae) inferred from mitochondrial cytochrome b gene sequences. Hydrobiologia 553:255–266. doi: 10.1007/s10750-005-1301-3

Yang T, Meng W, Zhang R, et al (2016) DNA barcoding of fishes in Irtysh River China. Russ J Genet 52:969–976. doi: 10.1134/S1022795416090167

104

Zhang D-X, Hewitt GM (1997) Assessment of the universality and utility of a set of conserved mitochondrial COI primers in insects. Insect Mol Biol 6:143–150. doi: 10.1111/j.1365- 2583.1997.tb00082.x

Zhang D-X, Hewitt GM (2003) Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations: practice, problems and prospects. Mol Ecol 12:563–584. doi: 10.1046/j.1365- 294X.2003.01773.x

Zhou J, Wu Q, Wang Z, Ye Y (2004) Molecular phylogeny of three subspecies of common carp Cyprinus carpio, based on sequence analysis of cytochrome b and control region of mtDNA. J Zool Syst Evol Res 42:266–269. doi: 10.1111/j.1439-0469.2004.00266.x

105

ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Α

Πίνακαρ Α.1 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Alburnoides θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A039 GFFB127-18 A040 GFFB128-18 A041 GFFB129-18 A042 GFFB130-18 A043 GFFB131-18

FFMBH2164-14 FFMBH2165-14 FFMBH2166-14 FFMBH2167-14 FFMBH492-14 FFMBH493-14 Thessalicus FFMBH494-14 FFMBH495-14 FFMBH496-14 FFMBH497-14 FFMBH498-14 FFMBH630-14 FFMBH636-14 FFMBH637-14 FFMBH780-14 FFMBH781-14 FFMBH782-14 FFMBH787-14

A203 GFFB257-18 A204 GFFB258-18 A205 GFFB259-18 A206 GFFB260-18 A207 GFFB261-18 A208 GFFB262-18 A209 GFFB263-18 Strymonicus A210 GFFB264-18 A211 GFFB265-18 A212 GFFB266-18 FFMBH2168-14 FFMBH2169-14 FFMBH2170-14 FFMBH773-14 FFMBH783-14

FFMBH419-14 FFMBH427-14 FFMBH431-14 GRFRF169-10 GRFRF170-10 GRFRF171-10 Prespensis L059 GFFB342-18 L060 GFFB343-18 L077 GFFB350-18 L078 GFFB351-18 L117 GFFB366-18

109

L118 GFFB367-18 L162 GFFB376-18 L163 GFFB377-18 L164 GFFB378-18 L172 GFFB381-18 L206 GFFB397-18 L207 GFFB398-18 ANGBF1037-12 FFFR349-11 FFMBH1565-14 FFMBH2477-14 FFMBH2478-14 FBPIS012-10 FBPIS013-10 FBPIS014-10 FBPIS015-10 FBPIS016-10 FBPIS017-10 GERFW130-13 GERFW252-13 GERFW253-13 GERFW412-13 Bipunctatus GERFW421-13 IFCZE020-10 IFCZE021-10 IFCZE022-10 IFCZE035-10 IFCZE036-10 IFCZE149-10 IFCZE446-10 IFCZE447-10 IFCZE448-10 IFCZE449-10 IFCZE450-10 IFCZE525-10 IFCZE526-10 IFCZE552-10

110

Πίνακαρ Α.2 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Alburnus θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A233 GFFB287-18 A234 GFFB288-18 A259 GFFB311-18 A260 GFFB312-18 A261 GFFB313-18 A262 GFFB314-18 A263 GFFB315-18 A264 Sp. GFFB316-18 FFMBH2005-14 FFMBH2006-14 FFMBH2007-14 GRFRF0122-08 GRFRF0123-08 GRFRF0124-08 GRFRF044-08 GRFRF045-08 GRFRF046-08 A001 GFFB098-18 FFMBH2008-14 FFMBH2009-14 FFMBH474-14 Thessalicus- Macedonicus FFMBH475-14 FFMBH476-14 FFMBH477-14 GRFRF060-08 GRFRF061-08 GRFRF062-08 FFMBH391-14 Scoranza L173 GFFB382-18 ANGBF1040-12 FFMBH418-14 FFMBH425-14 Belvica FFMBH426-14 GRFRF189-10 GRFRF190-10 GRFRF191-10 A089 GFFB173-18 A090 GFFB174-18 A091 GFFB175-18 A101 GFFB183-18 A102 GFFB184-18 A117 GFFB197-18 A118 GFFB198-18 Vistonicus- Volviticus A119 GFFB199-18 A127 GFFB205-18 A128 GFFB206-18 A129 GFFB207-18 A150 GFFB223-18 A151 GFFB224-18 A152 GFFB225-18 A153 GFFB226-18

111

A154 GFFB227-18 A169 GFFB237-18 A170 GFFB238-18 A171 GFFB239-18 A172 GFFB240-18 A173 GFFB241-18 A181 GFFB246-18 A182 GFFB247-18 A183 GFFB248-18 A188 GFFB253-18 A189 GFFB254-18 A190 GFFB255-18 A191 GFFB256-18 FFMBH241-14 FFMBH245-14 GRFRF095-08 GRFRF096-08 GRFRF097-08

Πίνακαρ Α.3 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Barbus θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A099 GFFB011-17 A100 GFFB012-17 A114 GFFB013-17 A120 GFFB014-17 A121 GFFB015-17 A136 GFFB016-17 A137 GFFB017-17 A138 GFFB018-17 A139 GFFB019-17 A140 GFFB020-17 A155 GFFB021-17 A156 GFFB022-17 Cyclolepis A157 GFFB023-17 A158 GFFB024-17 A178 GFFB025-17 A179 GFFB026-17 A180 GFFB027-17 FFMBH600-14 FFMBH603-14 FFMBH606-14 K064 GFFB043-17 K067 GFFB044-17 K090 GFFB039-17 K094 GFFB040-17 K096 GFFB041-17 K099 GFFB042-17 A059 GFFB009-17 Doirani A060 GFFB010-17

112

GRFRF072-08 GRFRF073-08 GRFRF074-08 A192 GFFB028-17 A193 GFFB029-17 A194 GFFB030-17 A195 GFFB031-17 A196 GFFB032-17 A197 GFFB033-17 A198 GFFB034-17 A199 GFFB035-17 A200 GFFB036-17 Strumicae A201 GFFB037-17 A202 GFFB038-17 FFMBH428-14 FFMBH429-14 FFMBH430-14 FFMBH437-14 FFMBH438-14 GRFRF130-08 GRFRF131-08 GRFRF132-08 GRFRF144-10 GRFRF145-10 L098 GFFB066-17 L099 GFFB067-17 Kalamas L100 GFFB068-17 L193 GFFB095-17 FFMBH756-14 FFMBH757-14 Euboicus FFMBH758-14 FFMBH766-14 FFMBH607-14 FFMBH744-14 FFMBH753-14 FFMBH754-14 FFMBH759-14 Peloponnesius FFMBH760-14 FFMBH761-14 L150 GFFB079-17 L151 GFFB080-17 L152 GFFB081-17 L157 GFFB082-17 FFMBH634-14 FFMBH635-14 Sperchiensis FFMBH788-14 FFMBH789-14 A020 GFFB001-17 A021 GFFB002-17 A022 GFFB003-17 Axios A023 GFFB004-17 A024 GFFB005-17 A036 GFFB006-17

113

A037 GFFB007-17 A038 GFFB008-17 FFMBH777-14 FFMBH778-14 FFMBH779-14 FFMBH396-14 FFMBH406-14 FFMBH633-14 Macedonicus FFMBH466-14 FFMBH467-14 FFMBH468-14 L022 GFFB048-17 L023 GFFB049-17 L032 GFFB050-17 L033 GFFB051-17 L034 GFFB052-17 L035 GFFB053-17 Arachthos L044 GFFB054-17 L079 GFFB061-17 L080 GFFB374-18 L114 GFFB071-17 L180 GFFB089-17 L181 GFFB090-17 FFMBH582-14 FFMBH706-14 FFMBH707-14 FFMBH708-14 FFMBH795-14 L013 GFFB045-17 L014 GFFB046-17 L015 GFFB047-17 L061 GFFB055-17 L064 GFFB097-17 L065 GFFB057-17 L066 GFFB407-18 L067 GFFB058-17 L073 GFFB059-17 Peloponnesius- L074 GFFB060-17 Prespensis L081 GFFB062-17 L082 GFFB063-17 L083 GFFB064-17 L084 GFFB065-17 L110 GFFB069-17 L111 GFFB070-17 L119 GFFB072-17 L120 GFFB073-17 L121 GFFB074-17 L122 GFFB075-17 L134 GFFB076-17 L138 GFFB077-17 L139 GFFB078-17 L159 GFFB083-17

114

L160 GFFB084-17 L161 GFFB085-17 L171 GFFB086-17 L178 GFFB087-17 L179 GFFB088-17 L184 GFFB091-17 L189 GFFB092-17 L191 GFFB093-17 L192 GFFB094-17 L194 GFFB096-17

Πίνακαρ Α.4 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Cobitis θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A084 GFFB168-18 A092 GFFB176-18 A093 GFFB177-18 A108 GFFB190-18 A135 GFFB213-18 Strumicae A160 GFFB228-18 A161 GFFB229-18 A162 GFFB230-18 A163 GFFB231-18 A174 GFFB242-18 FFMBH2822-14 FFMBH2823-14 FFMBH448-14 FFMBH458-14 FFMBH712-14 Punctilineata FFMBH713-14 FFMBH714-14 FFMBH715-14 FFMBH2883-14 Meridionalis FFMBH2884-14 FFMBH632-14 FFMBH638-14 FFMBH639-14 FFMBH640-14 Arachthosensis- Hellenica FFMBH641-14 FFMBH642-14 FFMBH643-14 FFMBH649-14 FFMBH653-14 Trichonica FFMBH011-14 A063 GFFB148-18 A064 GFFB149-18 Vardarensis A065 GFFB150-18 A066 GFFB151-18 A067 GFFB152-18

115

FFMBH683-14 FFMBH684-14 FFMBH685-14 GRFRF087-08 GRFRF088-08

Πίνακαρ Α.5 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Gobio θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A014 GFFB110-18 A015 GFFB111-18 A016 GFFB112-18 A017 GFFB113-18 A018 GFFB114-18 Axios A019 GFFB115-18 A048 GFFB136-18 A049 GFFB137-18 A051 GFFB138-18 GRFRF078-08 GRFRF079-08 GRFRF080-08 FFMBH479-14 FFMBH483-14 FFMBH484-14 Feraeensis FFMBH485-14 FFMBH486-14 FFMBH487-14 FFMBH488-14 FFMBH1763-14 FFMBH1824-14 FFMBH1825-14 FFMBH1827-14 Skadarensis FFMBH1829-14 FFMBH255-14 FFMBH256-14 L174 GFFB383-18 L182 GFFB386-18 A072 GFFB157-18 A073 GFFB158-18 A074 GFFB159-18 A107 GFFB189-18 Vistonida A110 GFFB191-18 A111 GFFB192-18 A187 GFFB252-18 A255 GFFB307-18 K205 GFFB322-18

116

Πίνακαρ Α.6 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Pelasgus θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD FFMBH681-14 FFMBH682-14 FFMBH686-14 Kalamas FFMBH687-14 FFMBH688-14 FFMBH689-14 L140 GFFB370-18 FFMBH2181-14 FFMBH650-14 FFMBH651-14 Thesproticus FFMBH652-14 FFMBH658-14 FFMBH659-14 FFMBH2173-14 FFMBH2174-14 FFMBH2175-14 Acheloos FFMBH2182-14 FFMBH2183-14 FFMBH2184-14 FFMBH661-14 FFMBH668-14 FFMBH669-14 Marathonicus FFMBH670-14 FFMBH677-14 FFMBH678-14 FFMBH679-14 ANGBF8146-12 FFMBH631-14 FFMBH796-14 Stymphalicus FFMBH805-14 FFMBH846-14 FFMBH847-14 ANGBF8147-12 FFMBH732-14 FFMBH740-14 FFMBH741-14 Laconicus FFMBH742-14 FFMBH750-14 FFMBH751-14 FFMBH752-14 ANGBF1057-12 Prespensis FFMBH697-14 GRFRF172-10

Πίνακαρ Α.7 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Rhodeus θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A223 GFFB277-18 A224 GFFB278-18 Am. Strymonas A225 GFFB279-18 A226 GFFB280-18 A227 GFFB281-18

117

A228 GFFB282-18 A229 GFFB283-18 A230 GFFB284-18 A231 GFFB285-18 A232 GFFB286-18 GRFRF037-08 GRFRF039-08 GRFRF126-08 GRFRF127-08 FFMBH2465-14 FFMBH2466-14 GRFRF038-08 Mer. Doirani-Strymonas GRFRF066-08 GRFRF067-08 GRFRF068-08 FFMBH2467-14 Mer. Strym FFMBH2468-14 A081 GFFB165-18 A082 GFFB166-18 A083 GFFB167-18 A094 GFFB178-18 A095 GFFB179-18 A112 GFFB193-18 Am. Vistonida A113 GFFB194-18 A123 GFFB201-18 A124 GFFB202-18 A141 GFFB214-18 A142 GFFB215-18 A143 GFFB216-18 A144 GFFB217-18

Πίνακαρ Α.8 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Squalius θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD A087 GFFB171-18 A088 GFFB172-18 A103 GFFB185-18 A104 GFFB186-18 A105 GFFB187-18 A106 GFFB188-18 A115 GFFB195-18 A116 GFFB196-18 Orpheus A122 GFFB200-18 A145 GFFB218-18 A146 GFFB219-18 A147 GFFB220-18 A148 GFFB221-18 A149 GFFB222-18 A168 GFFB236-18 A184 GFFB249-18 A185 GFFB250-18

118

A186 GFFB251-18 A237 GFFB290-18 A238 GFFB291-18 A239 GFFB292-18 A240 GFFB293-18 A241 GFFB294-18 A242 GFFB295-18 A243 GFFB296-18 A244 GFFB297-18 A245 GFFB298-18 A246 GFFB299-18

FFMBH1841-14 FFMBH1842-14 FFMBH1844-14 FFMBH1845-14 FFMBH2185-14 FFMBH2186-14 FFMBH2187-14 FFMBH2188-14 FFMBH2189-14 FFMBH2190-14 FFMBH439-14 FFMBH442-14 FFMBH443-14 FFMBH444-14 FFMBH445-14 FFMBH535-14 FFMBH541-14 FFMBH542-14 FFMBH543-14 FFMBH544-14 FFMBH558-14 FFMBH559-14 FFMBH560-14 FFMBH568-14 FFMBH572-14 FFMBH573-14 FFMBH574-14 FFMBH613-14 FFMBH616-14 FFMBH617-14 FFMBH618-14 FFMBH619-14 FFMBH851-14 GRFRF133-08 GRFRF138-09 GRFRF139-09

119

FFMBH536-14 FFMBH545-14 FFMBH546-14 FFMBH547-14 FFMBH548-14 FFMBH549-14 FFMBH550-14 FFMBH551-14 FFMBH552-14 FFMBH553-14 FFMBH554-14 FFMBH555-14 FFMBH556-14 FFMBH557-14 FFMBH561-14 FFMBH562-14 FFMBH563-14 FFMBH564-14 Fellowesii FFMBH565-14 FFMBH566-14 FFMBH567-14 FFMBH569-14 FFMBH570-14 FFMBH571-14 FFMBH575-14 FFMBH576-14 FFMBH577-14 FFMBH578-14 FFMBH579-14 FFMBH580-14 FFMBH584-14 FFMBH585-14 FFMBH586-14 FFMBH587-14 FFMBH588-14 FFMBH589-14

ANGBF1094-12 FFMBH375-14 FFMBH383-14 FFMBH387-14 FFMBH388-14 FFMBH389-14 FFMBH407-14 FFMBH409-14 Prespensis- Platyceps FFMBH410-14 GRFRF 187-10 GRFRF 188-10 GRFRF186-10 L085 GFFB352-18 L165 GFFB379-18 L183 GFFB387-18 L197 GFFB390-18 FFMBH366-14 FFMBH367-14 Pamvoticus FFMBH368-14 FFMBH799-14 FFMBH800-14

120

L020 GFFB335-18 L021 GFFB336-18 L071 GFFB348-18 L106 GFFB360-18 L112 GFFB364-18 L133 GFFB368-18 L214 GFFB405-18 L215 GFFB406-18 FFMBH307-14 FFMBH312-14 FFMBH313-14 FFMBH314-14 FFMBH343-14 FFMBH344-14 FFMBH349-14 FFMBH350-14 FFMBH598-14 FFMBH599-14 FFMBH762-14 FFMBH763-14 FFMBH764-14 Moreoticus FFMBH765-14 FFMBH831-14 FFMBH832-14 FFMBH838-14 FFMBH839-14 FFMBH848-14 FFMBH849-14 L057 GFFB340-18 L154 GFFB371-18 L155 GFFB372-18 L156 GFFB373-18 L158 GFFB375-18 A008 GFFB104-18 A009 GFFB105-18 A011 GFFB107-18 A012 GFFB108-18 A013 GFFB109-18 A032 GFFB123-18 A033 GFFB124-18 Vardarensis A034 GFFB125-18 A052 GFFB139-18 A054 GFFB141-18 A057 GFFB144-18 A061 GFFB146-18 A062 GFFB147-18 A010 GFFB106-18

121

FFMBH2161-14 FFMBH2162-14 FFMBH2163-14 FFMBH2171-14 FFMBH2172-14 FFMBH2176-14 FFMBH2177-14 FFMBH2178-14 FFMBH2179-14 FFMBH2180-14 FFMBH506-14 GRFRF069-08 GRFRF070-08 GRFRF071-08 FFMBH733-14 Keadicus FFMBH734-14 FFMBH743-14

Πίνακαρ Α.9 Οκάδεο ηνπ γέλνπο Telestes θαη θσδηθνί δεηγκάησλ πνπ αλήθνπλ ζηελ θάζε κία.

Ομάδα Κωδικόρ Κωδικόρ BOLD FFMBH351-14 FFMBH354-14 FFMBH355-14 FFMBH356-14 L045 GFFB338-18 Acheloos L046 GFFB339-18 L208 GFFB399-18 L209 GFFB400-18 L210 GFFB401-18 L211 GFFB402-18 FFMBH583-14 FFMBH591-14 FFMBH604-14 FFMBH605-14 FFMBH611-14 Pinios FFMBH612-14 FFMBH830-14 FFMBH840-14 FFMBH844-14 FFMBH845-14 ANGBF8101-12 L072 GFFB349-18 L088 GFFB355-18 L089 GFFB356-18 Kalamas L090 GFFB357-18 L091 GFFB358-18 L101 GFFB359-18 L135 GFFB369-18 L187 GFFB389-18

122

FFMBH353-14 FFMBH361-14 FFMBH362-14 FFMBH363-14 FFMBH364-14 FFMBH365-14 FFMBH369-14 FFMBH370-14 Arachthos FFMBH371-14 FFMBH372-14 FFMBH376-14 FFMBH377-14 L200 GFFB392-18 L201 GFFB393-18 L202 GFFB394-18 L203 GFFB395-18 FFMBH726-14 Beoticus FFMBH727-14 FFMBH728-14

123

ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Β

Πίνακαρ Β.1 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Alburnoides πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH2164-14 Αμηφο FFMBH2165-14 Αμηφο FFMBH2166-14 Αμηφο FFMBH2167-14 Αμηφο FFMBH787-14 Αμηφο FFMBH492-14 Πελεηφο FFMBH493-14 Πελεηφο FFMBH494-14 Πελεηφο FFMBH495-14 Πελεηφο Alburnoides thessalicus FFMBH496-14 Πελεηφο FFMBH497-14 Πελεηφο FFMBH498-14 Πελεηφο FFMBH630-14 Πελεηφο FFMBH636-14 Πελεηφο FFMBH637-14 Πελεηφο FFMBH780-14 Αιηάθκνλαο FFMBH781-1 Αιηάθκνλαο FFMBH782-14 Αιηάθκνλαο FFMBH2168-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2169-14 ΢ηξπκφλαο Alburnoides strymonicus FFMBH2170-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH773-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH783-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH419-14 Πξέζπα FFMBH427-14 Πξέζπα FFMBH431-14 Πξέζπα Alburnoides prespensis GRFRF169-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF170-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF171-10 Μηθξή Πξέζπα ANGBF1037-12 Γαιιία FFFR349-11 Γαιιία FFMBH1565-14 Γαιιία FFMBH2477-14 Γαιιία FFMBH2478-14 Γαιιία FBPIS012-10 Γεξκαλία FBPIS013-10 Γεξκαλία FBPIS014-10 Γεξκαλία FBPIS015-10 Γεξκαλία FBPIS016-10 Γεξκαλία FBPIS017-10 Γεξκαλία GERFW130-13 Γεξκαλία Alburnoides bipunctatus GERFW252-13 Γεξκαλία GERFW253-13 Γεξκαλία GERFW412-13 Γεξκαλία GERFW421-13 Γεξκαλία IFCZE020-10 Σζερία IFCZE021-10 Σζερία IFCZE022-10 Σζερία IFCZE035-10 Σζερία IFCZE036-10 Σζερία IFCZE149-10 Σζερία IFCZE446-10 Σζερία IFCZE447-10 Σζερία

127

IFCZE448-10 Σζερία IFCZE449-10 Σζερία IFCZE450-10 Σζερία IFCZE525-10 Σζερία IFCZE526-10 Σζερία IFCZE552-10 Σζερία ΢ύνολο 59

Πίνακαρ Β.2 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Alburnus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ ANGBF1040-12 Πξέζπα FFMBH418-14 Πξέζπα FFMBH425-14 Πξέζπα Alburnus belvica FFMBH426-14 Πξέζπα GRFRF189-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF190-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF191-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF060-08 Γντξάλε Alburnus macedonicus GRFRF061-08 Γντξάλε GRFRF062-08 Γντξάλε FFMBH2005-14 Βφιβε Alburnus sp. FFMBH2006-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2007-14 ΢ηξπκφλαο GRFRF044-08 Κεξθίλε GRFRF045-08 Κεξθίλε GRFRF046-08 Κεξθίλε Alburnus sp. Volvi GRFRF122-08 Βφιβε GRFRF123-08 Βφιβε GRFRF124-08 Βφιβε FFMBH245-14 Βφιβε GRFRF095-08 Βφιβε Alburnus volviticus GRFRF096-08 Βφιβε GRFRF097-08 Βφιβε FFMBH2008-14 Πελεηφο FFMBH2009-14 Πελεηφο FFMBH474-14 Αμηφο Alburnus thessalicus FFMBH475-14 Αμηφο FFMBH476-14 Αμηφο FFMBH477-14 Αμηφο Alburnus vistonicus FFMBH241-14 Βηζησλίδα Alburnus scoranza FFMBH391-14 Αψνο ΢ύνολο 31

Πίνακαρ Β.3 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Barbus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH396-14 Αιηάθκνλαο FFMBH406-14 Αιηάθκνλαο FFMBH466-14 Αμηφο Barbus macedonicus FFMBH467-14 Αμηφο FFMBH468-14 Αμηφο FFMBH633-14 Πελεηφο FFMBH428-14 ΢ηξπκφλαο Barbus strumicae FFMBH429-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH430-14 ΢ηξπκφλαο

128

FFMBH437-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH438-14 ΢ηξπκφλαο GRFRF130-08 Βφιβε GRFRF131-08 Βφιβε GRFRF132-08 Βφιβε GRFRF144-10 Βφιβε GRFRF145-10 Βφιβε FFMBH582-14 Πξέζπα FFMBH706-14 Αψνο Barbus prespensis FFMBH707-14 Αψνο FFMBH708-14 Αψνο FFMBH795-14 Καιακάο FFMBH600-14 Έβξνο Barbus cyclolepis FFMBH603-14 Έβξνο FFMBH606-14 Έβξνο FFMBH607-14 Αρειψνο FFMBH744-14 Αιθεηφο FFMBH753-14 Αιθεηφο Barbus peloponnesius FFMBH754-14 Αιθεηφο FFMBH759-14 Βνπξατθφο FFMBH760-14 Βνπξατθφο FFMBH761-14 Βνπξατθφο FFMBH634-14 Πελεηφο FFMBH635-14 Πελεηφο Barbus sperchiensis FFMBH788-14 ΢πεξρεηφο FFMBH789-14 ΢πεξρεηφο FFMBH756-14 Δχβνηα FFMBH757-14 Δχβνηα Barbus euboicus FFMBH758-14 Δχβνηα FFMBH766-14 Δχβνηα FFMBH777-14 Αιηάθκνλαο FFMBH778-14 Αιηάθκνλαο FFMBH779-14 Αιηάθκνλαο Barbus balcanicus GRFRF072-08 Γντξάλε GRFRF073-08 Γντξάλε GRFRF074-08 Γντξάλε ΢ύνολο 45

Πίνακαρ Β.4 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Carassius πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH447-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH451-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH453-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH454-14 Αμηφο FFMBH455-14 Αμηφο FFMBH456-14 Αμηφο FFMBH490-14 Πελεηφο GRFRF001-08 Κεξθίλε Carassius gibelio GRFRF002-08 Κεξθίλε GRFRF003-08 Κεξθίλε GRFRF051-08 Γντξάλε GRFRF052-08 Γντξάλε GRFRF053-08 Γντξάλε GRFRF110-08 Βφιβε GRFRF111-08 Βφιβε GRFRF112-08 Βφιβε

129

GRFRF179-10 Μηθξή Πξέζπα ΢ύνολο 17

Πίνακαρ Β.5 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Chondrostoma πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH244-14 Πελεηφο FFMBH248-14 Πελεηφο FFMBH250-14 Πελεηφο FFMBH772-14 Πελεηφο FFMBH776-14 Πελεηφο FFMBH384-14 Αιηάθκνλαο FFMBH385-14 Αιηάθκνλαο FFMBH386-14 Αιηάθκνλαο FFMBH392-14 Αιηάθκνλαο FFMBH393-14 Αιηάθκνλαο FFMBH394-14 Αιηάθκνλαο Chondrostoma vardarense FFMBH395-14 Αιηάθκνλαο FFMBH449-14 Αμηφο FFMBH450-14 Αμηφο FFMBH459-14 Αμηφο FFMBH462-14 Αμηφο FFMBH463-14 Αμηφο FFMBH464-14 Αμηφο FFMBH465-14 Αμηφο GRFRF048-08 Κεξθίλε GRFRF049-08 Κεξθίλε GRFRF050-08 Κεξθίλε FFMBH398-14 Πξέζπα FFMBH690-14 Πξέζπα FFMBH693-14 Πξέζπα FFMBH694-14 Πξέζπα Chondrostoma prespense FFMBH695-14 Πξέζπα FFMBH696-14 Πξέζπα GRFRF183-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF184-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF185-10 Μηθξή Πξέζπα ΢ύνολο 31

Πίνακαρ Β.6 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Cobitis πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ Cobitis trichonica FFMBH011-14 Σξηρσλίδα FFMBH2822-14 ΢ηξπκφλαο Cobitis strumicae FFMBH2823-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2883-14 Πξέζπα Cobitis meridionalis FFMBH2884-14 Πξέζπα FFMBH448-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH458-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH712-14 ΢ηξπκφλαο Cobitis punctilineata FFMBH713-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH714-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH715-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH632-14 Άξαρζνο Cobitis arachthosensis FFMBH638-14 Άξαρζνο FFMBH641-14 Άξαρζνο

130

FFMBH642-14 Άξαρζνο FFMBH643-14 Άξαρζνο FFMBH639-14 Λνχξνο FFMBH640-14 Λνχξνο Cobitis hellenica FFMBH649-14 Λνχξνο FFMBH653-14 Λνχξνο FFMBH683-14 Πελεηφο FFMBH684-14 Πελεηφο Cobitis vardarensis FFMBH685-14 Πελεηφο GRFRF087-08 Γντξάλε GRFRF088-08 Γντξάλε ΢ύνολο 25

Πίνακαρ Β.7 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Cyprinus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH397-14 Πξέζπα FFMBH457-14 Αμηφο GRFRF014-08 Κεξθίλε GRFRF015-08 Κεξθίλε GRFRF084-08 Γντξάλε Cyprinus carpio GRFRF085-08 Γντξάλε GRFRF086-08 Γντξάλε GRFRF113-08 Βφιβε GRFRF114-08 Βφιβε GRFRF115-08 Βφιβε GRFRF195-10 Μηθξή Πξέζπα ΢ύνολο 11

Πίνακαρ Β.8 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Economidichthys πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH654-14 Λνχξνο FFMBH655-14 Λνχξνο Economidichthys FFMBH656-14 Λνχξνο pygmaeus FFMBH657-14 Λνχξνο FFMBH672-14 Κεθηζφο FFMBH680-14 Κεθηζφο FFMBH009-14 Σξηρσλίδα FFMBH010-14 Σξηρσλίδα Economidichthys trichonis FFMBH012-14 Σξηρσλίδα FFMBH2868-14 Σξηρσλίδα FFMBH2869-14 Σξηρσλίδα ΢ύνολο 11

Πίνακαρ Β.9 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Gambusia πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH858-14 Αρέξνληαο FFMBH859-14 Αρέξνληαο Gambusia holbrooki GRFRF075-08 Γντξάλε GRFRF076-08 Γντξάλε GRFRF077-08 Γντξάλε ΢ύνολο 5

131

Πίνακαρ Β.10 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Gasterosteus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH592-14 Άξηο FFMBH593-14 Άξηο FFMBH594-14 Άξηο FFMBH601-14 Άξηο FFMBH602-14 Άξηο FFMBH644-14 Λνχξνο FFMBH645-14 Λνχξνο FFMBH646-14 Λνχξνο FFMBH647-14 Λνχξνο Gasterosteus sp. FFMBH648-14 Λνχξνο FFMBH663-14 Αρέξνληαο FFMBH664-14 Αρέξνληαο FFMBH665-14 Αρέξνληαο FFMBH666-14 Αρέξνληαο FFMBH667-14 Αρέξνληαο FFMBH723-14 ΢πεξρεηφο FFMBH724-14 ΢πεξρεηφο FFMBH725-14 ΢πεξρεηφο FFMBH842-14 Πάκηζνο ΢ύνολο 19

Πίνακαρ Β.11 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Gobio πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ GRFRF078-08 Διιάδα (Γντξάλε)

GRFRF079-08 Διιάδα (Γντξάλε) Gobio bulgaricus GRFRF080-08 Διιάδα (Γντξάλε) FFMBH479-14 Διιάδα (Πελεηφο) FFMBH483-14 Διιάδα (Πελεηφο) FFMBH484-14 Διιάδα (Πελεηφο)

FFMBH485-14 Διιάδα (Πελεηφο) Gobio feraeensis FFMBH486-14 Διιάδα (Πελεηφο) FFMBH487-14 Διιάδα (Πελεηφο) FFMBH488-14 Διιάδα (Πελεηφο) FFMBH1763-14 Μαπξνβνχλην FFMBH1824-14 Μαπξνβνχλην FFMBH1825-14 Μαπξνβνχλην

FFMBH255-14 Μαπξνβνχλην Gobio skadarensis FFMBH256-14 Μαπξνβνχλην FFMBH1827-14 Αιβαλία FFMBH1829-14 Αιβαλία ΢ύνολο 17

Πίνακαρ Β.12 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Lepomis πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH2708-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2709-14 ΢ηξπκφλαο GRFRF029-08 Κεξθίλε Lepomis gibbosus GRFRF180-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF181-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF182-10 Μηθξή Πξέζπα ΢ύνολο 6

132

Πίνακαρ Β.13 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Luciobarbus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH315-14 Αρειψνο FFMBH316-14 Αρειψνο FFMBH317-14 Αρειψνο FFMBH346-14 Αρειψνο FFMBH347-14 Αρειψνο FFMBH348-14 Αρειψνο FFMBH352-14 Άξαρζνο FFMBH357-14 Άξαρζνο FFMBH358-14 Άξαρζνο FFMBH359-14 Άξαρζνο FFMBH360-14 Άξαρζνο Luciobarbus albanicus FFMBH595-14 Πελεηφο FFMBH596-14 Πελεηφο FFMBH731-14 Αρειψνο FFMBH735-14 Αρειψνο FFMBH736-14 Αρειψνο FFMBH737-14 Καιακάο FFMBH738-14 Καιακάο FFMBH739-14 Καιακάο FFMBH786-14 Καιακάο FFMBH841-14 Πελεηφο FFMBH843-14 Πελεηφο FFMBH500-14 Κεθηζφο FFMBH501-14 Κεθηζφο FFMBH507-14 Κεθηζφο FFMBH510-14 Κεθηζφο FFMBH521-14 Κεθηζφο Luciobarbus graecus FFMBH529-14 Κεθηζφο FFMBH530-14 Κεθηζφο FFMBH531-14 Κεθηζφο FFMBH532-14 Κεθηζφο FFMBH533-14 Κεθηζφο FFMBH534-14 Κεθηζφο ΢ύνολο 33

Πίνακαρ Β.14 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Oxynoemacheilus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ Oxynoemacheilus FFMBH539-14 Δπεξγέηνπιαο theophilii FFMBH540-14 Δπεξγέηνπιαο FFMBH608-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH609-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH698-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH699-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH700-14 ΢ηξπκφλαο Oxynoemacheilus FFMBH701-14 Αψνο bureschi FFMBH702-14 Αψνο FFMBH703-14 Αψνο FFMBH704-14 Αψνο FFMBH705-14 Αψνο FFMBH793-14 Αμηφο FFMBH802-14 Κφζπλζνο

133

FFMBH803-14 Κφζπλζνο ΢ύνολο 15

Πίνακαρ Β.15 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Pachychilon πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ Pachychilon pictum ANGBF1055-12 Αψνο ANGBF8148-12 Πελεηφο FFMBH242-14 Πελεηφο FFMBH243-14 Πελεηφο FFMBH247-14 Πελεηφο FFMBH480-14 Πελεηφο FFMBH481-14 Πελεηφο Pachychilon FFMBH489-14 Πελεηφο macedonicum FFMBH491-14 Πελεηφο FFMBH499-14 Πελεηφο FFMBH502-14 Πελεηφο FFMBH503-14 Πελεηφο GRFRF063-08 Γντξάλε GRFRF064-08 Γντξάλε GRFRF065-08 Γντξάλε ΢ύνολο 15

Πίνακαρ Β.16 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Pelasgus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH2181-14 Άξαρζνο FFMBH650-14 Άξαρζνο FFMBH651-14 Άξαρζνο Pelasgus thesproticus FFMBH652-14 Άξαρζνο FFMBH658-14 Άξαρζνο FFMBH659-14 Άξαρζνο ANGBF1057-12 Πξέζπα Pelasgus prespensis FFMBH697-14 Πξέζπα GRFRF172-10 Μηθξή Πξέζπα ANGBF8146-12 ΢ηπκθαιία FFMBH631-14 Σξηρσλίδα FFMBH796-14 Πελεηφο Pelasgus stymphalicus FFMBH805-14 Πελεηφο FFMBH846-14 Πελεηφο FFMBH847-14 Πελεηφο ANGBF8147-12 Δπξψηαο FFMBH750-14 Δπξψηαο FFMBH751-14 Δπξψηαο FFMBH752-14 Δπξψηαο Pelasgus laconicus FFMBH732-14 Αιθεηφο FFMBH740-14 Αιθεηφο FFMBH741-14 Αιθεηφο FFMBH742-14 Αιθεηφο FFMBH2173-14 Αρέξνληαο FFMBH2174-14 Αρέξνληαο FFMBH2175-14 Αρέξνληαο Pelasgus sp. FFMBH2182-14 Αρέξνληαο FFMBH2183-14 Αρέξνληαο FFMBH2184-14 Αρέξνληαο FFMBH681-14 Καιακάο

134

FFMBH682-14 Καιακάο FFMBH686-14 Καιακάο FFMBH687-14 Καιακάο FFMBH688-14 Καιακάο FFMBH689-14 Καιακάο FFMBH661-14 ΢πεξρεηφο FFMBH668-14 ΢πεξρεηφο FFMBH669-14 ΢πεξρεηφο Pelasgus marathonicus FFMBH670-14 ΢πεξρεηφο FFMBH677-14 ΢πεξρεηφο FFMBH678-14 ΢πεξρεηφο FFMBH679-14 ΢πεξρεηφο ΢ύνολο 42

Πίνακαρ Β.17 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Petroleuciscus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ Petroleuciscus ANGBF8145-12 Φνηνιίβνο borysthenicus ΢ύνολο 1

Πίνακαρ Β.18 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Pseudorasbora πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ ANGBF1078-12 Σνπξθία FFMBH691-14 Πξέζπα FFMBH692-14 Πξέζπα GRFRF033-08 Κεξθίλε Pseudorasbora parva GRFRF035-08 Κεξθίλε GRFRF174-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF175-10 Μηθξή Πξέζπα FFMBH1852-14 Πξέζπα ΢ύνολο 8

Πίνακαρ Β.19 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Rhodeus πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ GRFRF037-08 Κεξθίλε GRFRF038-08 Κεξθίλε Rhodeus amarus GRFRF039-08 Κεξθίλε GRFRF126-08 Βφιβε GRFRF127-08 Βφιβε GRFRF066-08 Γντξάλε GRFRF067-08 Γντξάλε GRFRF068-08 Γντξάλε Rhodeus meridionalis FFMBH2465-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2466-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2467-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH2468-14 ΢ηξπκφλαο ΢ύνολο 12

135

Πίνακαρ Β.20 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Sabanejewia πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH709-14 Αμηφο FFMBH716-14 Αμηφο FFMBH717-14 Αμηφο Sabanejewia balcanica FFMBH718-14 Αμηφο FFMBH774-14 Αμηφο FFMBH775-14 Αμηφο ΢ύνολο 6

Πίνακαρ Β.21 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Salmo πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH373-14 Λνχξνο FFMBH374-14 Λνχξνο FFMBH378-14 Λνχξνο Salmo lourosensis FFMBH379-14 Λνχξνο FFMBH380-14 Λνχξνο FFMBH381-14 Λνχξνο FFMBH382-14 Λνχξνο FFMBH610-14 Νέζηνο FFMBH721-14 Νέζηνο Salmo sp. FFMBH722-14 Νέζηνο FFMBH784-14 Νέζηνο FFMBH794-14 Νέζηνο FFMBH432-14 Πξέζπα FFMBH433-14 Πξέζπα Salmo peristericus FFMBH434-14 Πξέζπα FFMBH435-14 Πξέζπα FFMBH436-14 Πξέζπα FFMBH597-14 Άξαρζνο FFMBH785-14 Αψνο Salmo farioides FFMBH798-14 Αρειψνο FFMBH801-14 Αρειψνο FFMBH804-14 Δχελνο ΢ύνολο 22

Πίνακαρ Β.22 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Squalius πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ FFMBH1841-14 Θάζνο FFMBH1842-14 Θάζνο FFMBH1844-14 Θάζνο FFMBH1845-14 Θάζνο FFMBH2185-14 Δχβνηα FFMBH2186-14 Δχβνηα FFMBH2187-14 Δχβνηα Squalius sp. FFMBH2188-14 Δχβνηα FFMBH2189-14 Δχβνηα FFMBH2190-14 Δχβνηα FFMBH307-14 Αρειψνο FFMBH312-14. Αρειψνο FFMBH313-14 Αρειψνο FFMBH314-14 Αρειψνο FFMBH343-14 Αρειψνο

136

FFMBH344-14 Αρειψνο FFMBH349-14 Αρειψνο FFMBH350-14 Αρειψνο FFMBH439-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH442-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH443-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH444-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH445-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH535-14 Λέζβνο FFMBH536-14 Λέζβνο FFMBH541-14 Λέζβνο FFMBH542-14 Λέζβνο FFMBH543-14 Λέζβνο FFMBH544-14 Λέζβνο FFMBH545-14 Λέζβνο FFMBH546-14 Λέζβνο FFMBH547-14 Λέζβνο FFMBH548-14 Λέζβνο FFMBH549-14 Λέζβνο FFMBH550-14 Λέζβνο FFMBH551-14 Λέζβνο FFMBH552-14 Λέζβνο FFMBH553-14 Λέζβνο FFMBH554-14 Λέζβνο FFMBH555-14 Λέζβνο FFMBH556-14 Λέζβνο FFMBH557-14 Λέζβνο FFMBH558-14 Λέζβνο FFMBH559-14 Λέζβνο FFMBH560-14 Λέζβνο FFMBH561-14 Λέζβνο FFMBH562-14 Λέζβνο FFMBH563-14 Λέζβνο FFMBH564-14 Λέζβνο FFMBH565-14 Λέζβνο FFMBH566-14 Λέζβνο FFMBH567-14 Λέζβνο FFMBH568-14 Λέζβνο FFMBH569-14 Λέζβνο FFMBH572-14 Λέζβνο FFMBH573-14 Λέζβνο FFMBH574-14 Λέζβνο FFMBH575-14 Λέζβνο FFMBH598-14 Μφξλνο FFMBH599-14 Μφξλνο FFMBH613-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH616-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH617-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH618-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH619-14 ΢ηξπκφλαο FFMBH831-14 Πελεηφο FFMBH832-14 Πελεηφο FFMBH570-14 ΢άκνο FFMBH571-14 ΢άκνο FFMBH576-14 ΢άκνο Squalius fellowesii FFMBH577-14 ΢άκνο FFMBH578-14 ΢άκνο FFMBH579-14 ΢άκνο

137

FFMBH580-14 ΢άκνο FFMBH584-14 ΢άκνο FFMBH585-14 ΢άκνο FFMBH586-14 ΢άκνο FFMBH587-14 ΢άκνο FFMBH588-14 ΢άκνο FFMBH589-14 ΢άκνο ANGBF1094-12 Πξέζπα FFMBH407-14 Πξέζπα FFMBH409-14 Πξέζπα Squalius prespensis FFMBH410-14 Πξέζπα GRFRF186-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF187-10 Μηθξή Πξέζπα GRFRF188-10 Μηθξή Πξέζπα FFMBH2161-14 Πελεηφο FFMBH2162-14 Πελεηφο FFMBH2171-14 Πελεηφο FFMBH2163-14 Αιηάθκνλαο FFMBH2172-14 Αιηάθκνλαο FFMBH2176-14 Αιηάθκνλαο FFMBH2177-14 Αμηφο Squalius vardarensis FFMBH2178-14 Αμηφο FFMBH2179-14 Αμηφο FFMBH2180-14 Αμηφο FFMBH506-14 ΢πεξρεηφο GRFRF069-08 Γντξάλε GRFRF070-08 Γντξάλε GRFRF071-08 Γντξάλε FFMBH366-14 Άξαρζνο FFMBH367-14 Άξαρζνο Squalius pamvoticus FFMBH368-14 Άξαρζνο FFMBH799-14 Καιακάο FFMBH800-14 Καιακάο FFMBH375-14 Αψνο FFMBH383-14 Αψνο Squalius platyceps FFMBH387-14 Αψνο FFMBH388-14 Αψνο FFMBH389-14 Αψνο FFMBH733-14 Δπξψηαο Squalius keadicus FFMBH734-14 Δπξψηαο FFMBH743-14 Δπξψηαο FFMBH762-14 Βνπξατθφο FFMBH763-14 Βνπξατθφο FFMBH764-14 Βνπξατθφο Squalius cf. moreoticus FFMBH765-14 Βνπξατθφο FFMBH848-14 Βνπξατθφο FFMBH849-14 Βνπξατθφο FFMBH838-14 Αιθεηφο Squalius peloponensis FFMBH839-14 Αιθεηφο FFMBH851-14 Κφζπλζνο GRFRF133-08 Βφιβε Squalius orpheus GRFRF138-09 Κεξθίλε GRFRF139-09 Κεξθίλε ΢ύνολο 126

138

Πίνακαρ Β.23 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Telestes πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ ANGBF8101-12 Καιακάο FFMBH351-14 Αρειψνο FFMBH354-14 Αρειψνο FFMBH355-14 Αρειψνο FFMBH356-14 Αρειψνο FFMBH353-14 Άξαρζνο FFMBH361-14 Άξαρζνο FFMBH365-14 Άξαρζνο FFMBH362-14 Λνχξνο FFMBH363-14 Λνχξνο FFMBH364-14 Λνχξνο FFMBH369-14 Λνχξνο FFMBH370-14 Λνχξνο FFMBH371-14 Λνχξνο Telestes FFMBH372-14 Λνχξνο pleurobipunctatus FFMBH376-14 Λνχξνο FFMBH377-14 Λνχξνο FFMBH583-14 Πελεηφο FFMBH591-14 Πελεηφο FFMBH844-14 Πελεηφο FFMBH845-14 Πελεηφο FFMBH604-14 Δχελνο FFMBH605-14 Δχελνο FFMBH611-14 Δχελνο FFMBH612-14 Δχελνο FFMBH726-14 Κεθηζφο FFMBH727-14 Κεθηζφο FFMBH728-14 Κεθηζφο FFMBH830-14 Αιθεηφο FFMBH840-14 Αιθεηφο ΢ύνολο 30

Πίνακαρ Β.24 Αιιεινπρίεο ηνπ γέλνπο Vimba πνπ αλαθηήζεθαλ απφ ηελ BOLD

Δίδορ Κωδικόρ Πεπιοσή πποέλεςζηρ ANGBF1109-12 ΢ηξπκφλαο FFMBH1869-14 Αμηφο FFMBH2866-14 Αμηφο GRFRF008-08 Κεξθίλε Vimba melanops GRFRF012-08 Κεξθίλε GRFRF013-08 Κεξθίλε GRFRF098-08 Βφιβε GRFRF099-08 Βφιβε GRFRF100-08 Βφιβε ΢ύνολο 9

139

ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Γ

Πίνακαρ Γ.1 Αληηζηνίρηζε ησλ θσδηθψλ πνπ δφζεθαλ ζηα δείγκαηα απφ ηνπο εξεπλεηέο κε ηνπο θσδηθνχο πνπ δφζεθαλ ζε απηά απφ ηελ BOLD

Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD AUTH 001 GFFB098-18 AUTH 054 GFFB141-18 AUTH 002 GFFB099-18 AUTH 055 GFFB142-18 AUTH 003 GFFB100-18 AUTH 056 GFFB143-18 AUTH 004 GFFB101-18 AUTH 057 GFFB144-18 AUTH 006 GFFB102-18 AUTH 058 GFFB145-18 AUTH 007 GFFB103-18 AUTH 059 GFFB009-17 AUTH 008 GFFB104-18 AUTH 060 GFFB010-17 AUTH 009 GFFB105-18 AUTH 061 GFFB146-18 AUTH 010 GFFB106-18 AUTH 062 GFFB147-18 AUTH 011 GFFB107-18 AUTH 063 GFFB148-18 AUTH 012 GFFB108-18 AUTH 064 GFFB149-18 AUTH 013 GFFB109-18 AUTH 065 GFFB150-18 AUTH 014 GFFB110-18 AUTH 066 GFFB151-18 AUTH 015 GFFB111-18 AUTH 067 GFFB152-18 AUTH 016 GFFB112-18 AUTH 068 GFFB153-18 AUTH 017 GFFB113-18 AUTH 069 GFFB154-18 AUTH 018 GFFB114-18 AUTH 070 GFFB155-18 AUTH 019 GFFB115-18 AUTH 071 GFFB156-18 AUTH 020 GFFB001-17 AUTH 072 GFFB157-18 AUTH 021 GFFB002-17 AUTH 073 GFFB158-18 AUTH 022 GFFB003-17 AUTH 074 GFFB159-18 AUTH 023 GFFB004-17 AUTH 075 GFFB160-18 AUTH 024 GFFB005-17 AUTH 077 GFFB161-18 AUTH 025 GFFB116-18 AUTH 078 GFFB162-18 AUTH 026 GFFB117-18 AUTH 079 GFFB163-18 AUTH 027 GFFB118-18 AUTH 080 GFFB164-18 AUTH 028 GFFB119-18 AUTH 081 GFFB165-18 AUTH 029 GFFB120-18 AUTH 082 GFFB166-18 AUTH 030 GFFB121-18 AUTH 083 GFFB167-18 AUTH 031 GFFB122-18 AUTH 084 GFFB168-18 AUTH 032 GFFB123-18 AUTH 085 GFFB169-18 AUTH 033 GFFB124-18 AUTH 086 GFFB170-18 AUTH 034 GFFB125-18 AUTH 087 GFFB171-18 AUTH 035 GFFB126-18 AUTH 088 GFFB172-18 AUTH 036 GFFB006-17 AUTH 089 GFFB173-18 AUTH 037 GFFB007-17 AUTH 090 GFFB174-18 AUTH 038 GFFB008-17 AUTH 091 GFFB175-18 AUTH 039 GFFB127-18 AUTH 092 GFFB176-18 AUTH 040 GFFB128-18 AUTH 093 GFFB177-18 AUTH 041 GFFB129-18 AUTH 094 GFFB178-18 AUTH 042 GFFB130-18 AUTH 095 GFFB179-18 AUTH 043 GFFB131-18 AUTH 096 GFFB180-18 AUTH 044 GFFB132-18 AUTH 097 GFFB181-18 AUTH 045 GFFB133-18 AUTH 098 GFFB182-18 AUTH 046 GFFB134-18 AUTH 099 GFFB011-17 AUTH 047 GFFB135-18 AUTH 100 GFFB012-17 AUTH 048 GFFB136-18 AUTH 101 GFFB183-18 AUTH 049 GFFB137-18 AUTH 102 GFFB184-18 AUTH 051 GFFB138-18 AUTH 103 GFFB185-18 AUTH 052 GFFB139-18 AUTH 104 GFFB186-18 AUTH 053 GFFB140-18 AUTH 105 GFFB187-18

143

Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD AUTH 106 GFFB188-18 AUTH 158 GFFB024-17 AUTH 107 GFFB189-18 AUTH 160 GFFB228-18 AUTH 108 GFFB190-18 AUTH 161 GFFB229-18 AUTH 110 GFFB191-18 AUTH 162 GFFB230-18 AUTH 111 GFFB192-18 AUTH 163 GFFB231-18 AUTH 112 GFFB193-18 AUTH 164 GFFB232-18 AUTH 113 GFFB194-18 AUTH 165 GFFB233-18 AUTH 114 GFFB013-17 AUTH 166 GFFB234-18 AUTH 115 GFFB195-18 AUTH 167 GFFB235-18 AUTH 116 GFFB196-18 AUTH 168 GFFB236-18 AUTH 117 GFFB197-18 AUTH 169 GFFB237-18 AUTH 118 GFFB198-18 AUTH 170 GFFB238-18 AUTH 119 GFFB199-18 AUTH 171 GFFB239-18 AUTH 120 GFFB014-17 AUTH 172 GFFB240-18 AUTH 121 GFFB015-17 AUTH 173 GFFB241-18 AUTH 122 GFFB200-18 AUTH 174 GFFB242-18 AUTH 123 GFFB201-18 AUTH 175 GFFB243-18 AUTH 124 GFFB202-18 AUTH 176 GFFB244-18 AUTH 125 GFFB203-18 AUTH 177 GFFB245-18 AUTH 126 GFFB204-18 AUTH 178 GFFB025-17 AUTH 127 GFFB205-18 AUTH 179 GFFB026-17 AUTH 128 GFFB206-18 AUTH 180 GFFB027-17 AUTH 129 GFFB207-18 AUTH 181 GFFB246-18 AUTH 130 GFFB208-18 AUTH 182 GFFB247-18 AUTH 131 GFFB209-18 AUTH 183 GFFB248-18 AUTH 132 GFFB210-18 AUTH 184 GFFB249-18 AUTH 133 GFFB211-18 AUTH 185 GFFB250-18 AUTH 134 GFFB212-18 AUTH 186 GFFB251-18 AUTH 135 GFFB213-18 AUTH 187 GFFB252-18 AUTH 136 GFFB016-17 AUTH 188 GFFB253-18 AUTH 137 GFFB017-17 AUTH 189 GFFB254-18 AUTH 138 GFFB018-17 AUTH 190 GFFB255-18 AUTH 139 GFFB019-17 AUTH 191 GFFB256-18 AUTH 140 GFFB020-17 AUTH 192 GFFB028-17 AUTH 141 GFFB214-18 AUTH 193 GFFB029-17 AUTH 142 GFFB215-18 AUTH 194 GFFB030-17 AUTH 143 GFFB216-18 AUTH 195 GFFB031-17 AUTH 144 GFFB217-18 AUTH 196 GFFB032-17 AUTH 145 GFFB218-18 AUTH 197 GFFB033-17 AUTH 146 GFFB219-18 AUTH 198 GFFB034-17 AUTH 147 GFFB220-18 AUTH 199 GFFB035-17 AUTH 148 GFFB221-18 AUTH 200 GFFB036-17 AUTH 149 GFFB222-18 AUTH 201 GFFB037-17 AUTH 150 GFFB223-18 AUTH 202 GFFB038-17 AUTH 151 GFFB224-18 AUTH 203 GFFB257-18 AUTH 152 GFFB225-18 AUTH 204 GFFB258-18 AUTH 153 GFFB226-18 AUTH 205 GFFB259-18 AUTH 154 GFFB227-18 AUTH 206 GFFB260-18 AUTH 155 GFFB021-17 AUTH 207 GFFB261-18 AUTH 156 GFFB022-17 AUTH 208 GFFB262-18 AUTH 157 GFFB023-17 AUTH 209 GFFB263-18

144

Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD AUTH 210 GFFB264-18 AUTH 263 GFFB315-18 AUTH 211 GFFB265-18 AUTH 264 GFFB316-18 AUTH 212 GFFB266-18 AUTH 265 GFFB317-18 AUTH 213 GFFB267-18 AUTH 266 GFFB318-18 AUTH 214 GFFB268-18 AUTH 268 GFFB319-18 AUTH 215 GFFB269-18 AUTH 269 GFFB320-18 AUTH 216 GFFB270-18 AUTH 270 GFFB321-18 AUTH 217 GFFB271-18 INALE 064 GFFB043-17 AUTH 218 GFFB272-18 INALE 067 GFFB044-17 AUTH 219 GFFB273-18 INALE 090 GFFB039-17 AUTH 220 GFFB274-18 INALE 094 GFFB040-17 AUTH 221 GFFB275-18 INALE 096 GFFB041-17 AUTH 222 GFFB276-18 INALE 099 GFFB042-17 AUTH 223 GFFB277-18 INALE 205 GFFB322-18 AUTH 224 GFFB278-18 UOI 001 GFFB323-18 AUTH 225 GFFB279-18 UOI 002 GFFB324-18 AUTH 226 GFFB280-18 UOI 003 GFFB325-18 AUTH 227 GFFB281-18 UOI 004 GFFB326-18 AUTH 228 GFFB282-18 UOI 006 GFFB327-18 AUTH 229 GFFB283-18 UOI 007 GFFB328-18 AUTH 230 GFFB284-18 UOI 008 GFFB329-18 AUTH 231 GFFB285-18 UOI 009 GFFB330-18 AUTH 232 GFFB286-18 UOI 010 GFFB331-18 AUTH 233 GFFB287-18 UOI 011 GFFB332-18 AUTH 234 GFFB288-18 UOI 012 GFFB333-18 AUTH 236 GFFB289-18 UOI 013 GFFB045-17 AUTH 237 GFFB290-18 UOI 014 GFFB046-17 AUTH 238 GFFB291-18 UOI 015 GFFB047-17 AUTH 239 GFFB292-18 UOI 018 GFFB334-18 AUTH 240 GFFB293-18 UOI 020 GFFB335-18 AUTH 241 GFFB294-18 UOI 021 GFFB336-18 AUTH 242 GFFB295-18 UOI 022 GFFB048-17 AUTH 243 GFFB296-18 UOI 023 GFFB049-17 AUTH 244 GFFB297-18 UOI 024 GFFB337-18 AUTH 245 GFFB298-18 UOI 032 GFFB050-17 AUTH 246 GFFB299-18 UOI 033 GFFB051-17 AUTH 247 GFFB300-18 UOI 034 GFFB052-17 AUTH 249 GFFB301-18 UOI 035 GFFB053-17 AUTH 250 GFFB302-18 UOI 044 GFFB054-17 AUTH 251 GFFB303-18 UOI 045 GFFB338-18 AUTH 252 GFFB304-18 UOI 046 GFFB339-18 AUTH 253 GFFB305-18 UOI 057 GFFB340-18 AUTH 254 GFFB306-18 UOI 058 GFFB341-18 AUTH 255 GFFB307-18 UOI 059 GFFB342-18 AUTH 256 GFFB308-18 UOI 060 GFFB343-18 AUTH 257 GFFB309-18 UOI 061 GFFB055-17 AUTH 258 GFFB310-18 UOI 062 GFFB344-18 AUTH 259 GFFB311-18 UOI 066 GFFB407-18 AUTH 260 GFFB312-18 UOI 064 GFFB097-17 AUTH 261 GFFB313-18 UOI 065 GFFB057-17 AUTH 262 GFFB314-18 UOI 067 GFFB058-17

145

Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD Κωδικόρ Γείγμαηορ Κωδικόρ BOLD UOI 068 GFFB345-18 UOI 154 GFFB371-18 UOI 069 GFFB346-18 UOI 155 GFFB372-18 UOI 070 GFFB347-18 UOI 156 GFFB373-18 UOI 071 GFFB348-18 UOI 157 GFFB082-17 UOI 072 GFFB349-18 UOI 158 GFFB375-18 UOI 073 GFFB059-17 UOI 159 GFFB083-17 UOI 074 GFFB060-17 UOI 160 GFFB084-17 UOI 077 GFFB350-18 UOI 161 GFFB085-17 UOI 078 GFFB351-18 UOI 162 GFFB376-18 UOI 079 GFFB061-17 UOI 163 GFFB377-18 UOI 080 GFFB374-18 UOI 164 GFFB378-18 UOI 081 GFFB062-17 UOI 165 GFFB379-18 UOI 082 GFFB063-17 UOI 166 GFFB380-18 UOI 083 GFFB064-17 UOI 171 GFFB086-17 UOI 084 GFFB065-17 UOI 172 GFFB381-18 UOI 085 GFFB352-18 UOI 173 GFFB382-18 UOI 086 GFFB353-18 UOI 174 GFFB383-18 UOI 087 GFFB354-18 UOI 176 GFFB384-18 UOI 088 GFFB355-18 UOI 177 GFFB385-18 UOI 089 GFFB356-18 UOI 178 GFFB087-17 UOI 090 GFFB357-18 UOI 179 GFFB088-17 UOI 091 GFFB358-18 UOI 180 GFFB089-17 UOI 098 GFFB066-17 UOI 181 GFFB090-17 UOI 099 GFFB067-17 UOI 182 GFFB386-18 UOI 100 GFFB068-17 UOI 183 GFFB387-18 UOI 101 GFFB359-18 UOI 184 GFFB091-17 UOI 106 GFFB360-18 UOI 185 GFFB388-18 UOI 107 GFFB361-18 UOI 187 GFFB389-18 UOI 108 GFFB362-18 UOI 189 GFFB092-17 UOI 109 GFFB363-18 UOI 191 GFFB093-17 UOI 110 GFFB069-17 UOI 192 GFFB094-17 UOI 111 GFFB070-17 UOI 193 GFFB095-17 UOI 112 GFFB364-18 UOI 194 GFFB096-17 UOI 113 GFFB365-18 UOI 197 GFFB390-18 UOI 114 GFFB071-17 UOI 199 GFFB391-18 UOI 117 GFFB366-18 UOI 200 GFFB392-18 UOI 118 GFFB367-18 UOI 201 GFFB393-18 UOI 119 GFFB072-17 UOI 202 GFFB394-18 UOI 120 GFFB073-17 UOI 203 GFFB395-18 UOI 121 GFFB074-17 UOI 204 GFFB396-18 UOI 122 GFFB075-17 UOI 206 GFFB397-18 UOI 133 GFFB368-18 UOI 207 GFFB398-18 UOI 134 GFFB076-17 UOI 208 GFFB399-18 UOI 135 GFFB369-18 UOI 209 GFFB400-18 UOI 138 GFFB077-17 UOI 210 GFFB401-18 UOI 139 GFFB078-17 UOI 211 GFFB402-18 UOI 140 GFFB370-18 UOI 212 GFFB403-18 UOI 150 GFFB079-17 UOI 213 GFFB404-18 UOI 151 GFFB080-17 UOI 214 GFFB405-18 UOI 152 GFFB081-17 UOI 215 GFFB406-18

146