НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ РАСТИТЕЛЬНЫЙ МИР АЗИАТСКОЙ РОССИИ

Растительный мир Азиатской России, 2014, № 1(13), с. 64–70 h p://www.izdatgeo.ru

УДК 581.143.6(504.062.4)

СОХРАНЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO РЕДКИХ ВИДОВ РОДА () А.А. Эрст, А.С. Эрст, Д.Н. Шауло, Д.С. Кульханова Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, 630090, Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101, e-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected] Рассмотрены процессы морфогенеза в культуре in vitro двух эндемичных представителей рода Fritillaria – F. dagana и F. sonnikovae. Отмечено, что наибольшим регенерационным потенциалом обладают ткани луко- вичных чешуй. Для изучаемых видов возможно развитие по двум путям морфогенеза – прямого органоге- неза и непрямого соматического эмбриогенеза. Ключевые слова: Fritillaria dagana, F. sonnikovae, адвентивное побегообразование, соматический эмбриогенез, условия культивирования in vitro.

CONSERVATION AND PROPAGATION IN VITRO OF RARE FRITILLARIA (LILIACEAE) A.A. Erst, A.S. Erst, D.N. Shaulo, D.S. Kulkhanova Central Siberian Botanical Garden, SB RAS, 630090, Novosibirsk, Zolotodolinskaya srt., 101, e-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected] Th e morphogenesis in vitro culture of two endemic species of the Fritillaria – F. dagana and F. sonnikovae was described. It is noted that the highest regeneration potential was developed from the bulbous scales. Th e development on two ways morphogenesis – direct organogenesis and indirect somatic embryogenesis was observed. Key words: Fritillaria dagana, F. sonnikovae, adventive shoot formation, somatic embryogenesis, culture conditions in vitro.

ВВЕДЕНИЕ Род Fritillaria L. (Liliaceae Juss.) включает более вели к росту исследований по разработке эффектив- 100 видов, распространенных в умеренном поясе Се- ных способов воспроизведения этих видов, в том верного полушария, многие из которых включены в числе с использованием культуры тканей и органов Красные книги различных уровней. Виды этого рода растений in vitro. имеют интересный фитохимический состав, в част- Размножение in vitro используется как альтерна- ности, содержат изостероидные алкалоиды и широко тивный метод воспроизведения для многих геофитов, используются в традиционной китайской медицине таких как Sternbergia fi scheriana (Herb.) Roem. (Mirici (Li et al., 2001). Кроме того, рябчики имеют огромный et al., 2005), Fritillaria meleagris L. (Petric et al., 2011), потенциал как декоративные растения в связи с не- Allium sativum L. (Kim et al., 2003), Lilium longifl orum обычной природной окраской цветов и ранним цве- Th unb. (Nhut et al., 2002) и др. тением. В естественных условиях произрастания, а В настоящей работе описана система размноже- также в интродукции скорость вегетативного раз- ния in vitro двух эндемичных видов рода Fritillaria – множения невысока и от одной луковицы можно по- F. dagana Turcz. ex Trautv. и F. sonnikovae Schaulo et лучить только две новые за год. Такой низкий потен- A. Erst, и рассмотрено влияние условий культивиро- циал не позволяет размножать виды рода Fritillaria вания на течение процесса морфогенеза. Данные на- традиционным делением луковицы. Семенное вос- ших исследований могут быть использованы для мас- производство рябчиков очень длительное и составля- сового размножения высокодекоративных видов рода ет 5–6 лет до цветения. Данные обстоятельства при- Fritillaria, а также для их сохранения и репатриации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Исходным материалом для введения в культуру венных мест произрастания – Россия, Красноярский in vitro послужили луковицы и семена F. dagana и край, хребты Ергаки и Борус (рис. 1, а, в). Перед сте- F. sonnikovae, собранные в конце мая 2010 г. с естест- рилизацией луковицы промывали в мыльной воде и

© А.А. Эрст, А.С. Эрст, Д.Н. Шауло, Д.С. Кульханова, 2014

64 Рис. 1. Этапы микроразмножения F. dagana и F. sonnikovae: а – семена F. sonnikovae; б – проросток F. sonnikovae, полученный в культуре in vitro; в – луковица F. dagana; г – адвентивное побе- гообразование F. dagana на части луковичной чешуи; д – эмбриогенный каллус F. dagana; е – сформированный соматический эмбриоид F. dagana; ж – развитые соматические эмбриоиды F. sonnikovae на эмбриогенном каллусе; з – растение-регенерант F. da- gana, полученное путем соматического эмбриогенеза; и – растение-регенерант F. dagana, полученное путем адвентивного побе- гообразования; СЭ – соматический эмбриоид (4 мм). 65 Варианты питательных сред, используемых температуре 3–5 °С на фотопериоде 16/8 (Ветчинки- для культивирования видов рода Fritillaria на, 2010). Регуляторы роста и физиологически Основные питательные среды – среда В5 (Gam- активные добавки borg, Eveleigh, 1968), BDS (Dunstan, Short, 1977), MS Пита- Саха- Глу та- (Murashige, Skoog, 1962), успешно применяемые для тельная роза, АУ, г/л Три - БАП, Кн, НУК, миновая среда г/л птофан, размножения луковичных растений (Вечернина, 2004; мкМ мкМ мкМ кислота, мг/л мг/л Arzate-Fernandez et al., 1997; Mohammadi-Dehchesh- MS 50 – – 4.5 1.5 – – meh et al., 2007; и др.). Эти среды дополняли регуля- 20 5 – 5 2 – – торами роста: 6-бензиламинопурином – БАП (ICN B 50 – 5.0 – 2.0 – – Biomedicals, USA) 0.5 и 5 мкМ, кинетином – Кн (ICN 5 α 30 – 0.5 – 5.0 – – Biomedicals, USA) 4.5 мкМ, -нафтилуксусной кис- 30 – 5.0 – 2.0 – – лотой – НУК (AppliChem, Germany) 1.5, 2 и 5 мкМ; 30 – 5.0 – – – – физиологически активными добавками: триптофа- 30 – – – 5.0 – – ном – 100 мг/л, глутаминовой кислотой – 200 и 50 – – – – – – 1500 мг/л; сахарозой 30 и 50 г/л; активированным уг- BDS 30 – 5.0 – 2.0 – – лем (АУ) 1.5 и 10 г/л; агаром 6 г/л (Difco, USA). Вари- 30 – – – 5.0 – – анты питательных сред приведены в таблице. pH сре- 30 – – – – 100 200 ды доводили до 5.8, затем среды автоклавировали при 30 – – – – – – 121 °С в течение 20 мин. 20 – – – – – 1500 Все эксперименты проводились в 2–3 повторнос- 20 – – – – 100 – тях. Статистическая обработка результатов осущест- 20 10 – – – – – влялась путем расчетов с использованием пакета ста- тистического анализа приложения Microsoft Excel. Расчет показан в средних арифметических величинах делили на луковичные чешуи и дочерние луковички. и доверительных интервалах. Доверительность оце- Стерилизацию проводили 70%-м этанолом (30 с), за- ниваемых показателей принимали на уровне значи- мости p < 0.05 (Лакин, 1990). Морфологические иссле- тем 0.1%-м HgCl2 с добавлением 1%-го Tween 80 (30 мин). Для семян использовали 20%-й раствор дования выполнены в ЦКП ЦСБС СО РАН (Новоси- Domestos (20 мин). После стерилизации раститель- бирск, Россия) на микроскопе Stereo Discovery V 12 с ный материал трехкратно промывали стерильной цветной цифровой камерой высокого разрешения дистиллированной водой. AxioCam MRc-5 и программой AxioVision 4.8 для Для культивирования эксплантов были подобра- получения, обработки и анализа изображений (Carl ны следующие условия: фотопериод – 16/8 часов Zeiss, Germany). свет/темнота, освещенность – 2–3 клк, температура − Учитывались следующие показатели: частота 24 ± 1 °С. Дочерние луковички после поверхностной морфогенеза – количество эксплантов с морфоген- стерилизации дополнительно выдерживали в культуре ным ответом (%); коэффициент размножения – коли- in vitro при температуре +7 °С в темноте 2 месяца (для чество развившихся побегов на эксплант (шт./экспл.); создания холодного периода покоя). Семена проращи- высота растения (мм); частота укоренения (%); коли- вали по методике Е.М. Ветчинкиной в течение 5–7 не- чество корней у одного регенеранта (шт.); средняя дель при температуре 20–22 °С, затем 12 недель при длина корней у одного регенеранта (мм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Введение в культуру in vitro неза по M. Mohammadi-Dehcheshmeh и др. (2007), и безгормональную среду В (контроль). На данных ва- Применяемые режимы поверхностной стерили- 5 риантах сред наблюдали только набухание и позеле- зации оказались эффективными для всех типов экс- нение тканей луковичных чешуй спустя месяц куль- плантов. Выход неинфицированного растительного тивирования в условиях фотопериода. Далее эксплан- материала составил 90–100 %. ты помещали на среды В5 с 5 мкМ БАП и 2 мкМ НУК Луковичные чешуи (после поверхностной стери- и через 50 дней отмечали образование меристемати- × лизации) делили на части 5 5 мм и помещали на пи- ческих очагов на поверхности луковичных чешуй, из тательные среды различного состава (см. таблицу). которых развивались адвентивные луковички (см. На этапе введения в культуру применяли питатель- рис. 1, г). Изучаемые виды отличались по морфоген- ную среду МS, дополненную Кн 5 мкМ и НУК 2 мкМ ному ответу, так для F. dagana частота морфогенеза (для прямой регенерации побегов по K.Y. Paek, составила 100 % при коэффициенте размножения H.N. Murthy, 2002), В5, дополненную БАП 0.5 мкМ и 10.1 ± 2.2 шт./экспл., для F. sonnikovae – 12.5 % с коэф- НУК 5 мкМ (для непрямого соматического эмбриоге- фициентом размножения 12.0 ± 5.2 шт./экспл.

66 Дочерние луковички помещали на среды: 0.6 % gii (Paek, Murthy, 2002), F. meleagris (Nicolic et al., 2008; агар, 0.6 % агар + АУ 1 г/л, В5 + БАП 5 мкМ + НУК Petric et al., 2011), В5 – F. imperialis L. (Mohammadi-De- 2 мкМ, BDS, BDS + АУ 1 г/л и культивировали с ис- hcheshmeh et al., 2007) и F. meleagris (Вечернина, 2004). пользованием или без холодной предобработки. Во В нашем случае для изучения влияния минеральной всех вариантах наблюдали только позеленение тканей основы среды на процесс морфогенеза микролуко- луковичек, морфогенного ответа не выявлено в тече- вички F. dagana и F. sonnikovae переносили с целью ние двух лет наблюдений. размножения на питательные среды различного со- Семена. Прорастание семян отмечали через 3 ме- става (см. таблицу). сяца культивирования в световом термостате при На средах B5 и BDS, дополненных БАП или БАП +7 °С на 0.6%-м агаре. Далее растения переносили в в сочетании с НУК, к концу пассажа у F. dagana до- культуральную комнату (+24 °С), наблюдали развитие полнительно развивались 2–3 адвентивные лукович- луковичек. По достижении 2–3 мм в диаметре их по- ки. Таким же способом, т. е. из луковичных чешуй мещали на среды для размножения (см. рис. 1, а, б). путем прямого геммогенеза, были получены побеги Факторы, влияющие на введение в культуру у F. tunbergii (Paek, Murthy, 2002), F. camtschatcensis различных типов эксплантов рода Fritillaria (Otani, Shimada, 1997) и F. meleagris (Вечернина, 2004). Регуляторы роста. Морфогенез тканей расте- Массовое заложение луковичек другого исследу- ний in vitro зависит от сочетания как экзогенных, так емого нами вида – F. sonnikovae, получили только при и эндогенных регуляторов роста. Высокий регенера- культивировании эксплантов на среде BDS, дополнен- ционный ответ многих луковичных в культуре in vitro свидетельствует о достаточно большой концентрации ной триптофаном 100 мг/л и глутаминовой кислотой эндогенных фитогормонов (Maesato et al., 1994). В свя- 200 мг/л. Наблюдали разрастание тканей луковичных зи с этим экзогенное сочетание регуляторов роста, чешуй, образование плотной каллусной массы, на ко- вызывающее морфогенез, может быть смещено как в торой происходило образование соматических эмб- сторону цитокининов, так и в сторону ауксинов (Han риоидов. Соматический эмбриогенез из вегетативных et al., 2004; Fennell, van Staden, 2004; Rice et al., 2011). тканей отмечен также у F. meleagris (Subotic et al., При культивировании луковичных чешуй и дочерних 2010). Заложившиеся луковички F. sonnikovae имели луковичек F. dagana и F. sonnikovae на свету наблюда- зеленый цвет, при увеличении срока пассажа до двух ли разрастание и позеленение тканей независимо от месяцев происходили рост луковичек и развитие кор- невой системы (см. рис. 1, ж). Культивирование экс- применяемых питательных сред (MS, B5, BDS). Мор- фогенный ответ получен только на средах, дополнен- плантов проводили группами по 7–10 шт. с частью ных цитокининами, или при преобладании концент- каллуса, так как на нем находились побеги на разной рации цитокининов над ауксинами. стадии развития. На среде В5 наблюдали прямую ре- Покой семян. Семена видов рода Fritillaria име- генерацию луковичек из тканей луковичных чешуй на ют глубокий морфофизиологический тип покоя этапе введения в культуру, но пересадка образовав- шихся луковичек на среды того же состава приводила (БВ-В3), который характеризуется действием физио- логического механизма торможения прорастания к угнетению их роста. Скорее всего, прямая регене- (ФМТ), сочетающегося с сильным недоразвитием за- рация луковичек на среде В5 объясняется высоким родыша (Николаева и др., 1999). Для окончательной эндогенным содержанием фитогормонов в исходных дифференцировки и формирования зародыша, а так- луковичных чешуях, возможно, образовавшиеся же для нарушения ФМТ необходима длительная стра- микролуковички таким гормональным балансом не тификация, включающая в себя чередование теплых и обладали. холодных этапов. По нашим данным высокий про- Таким образом, F. dagana можно культивировать цент прорастания семян F. dagana и F. sonnikovae на средах В5 и BDS, на которых исследуемый вид про- был получен только после трех месяцев холодной явил схожие показатели роста и развития. Высокой стратификации. морфогенной активностью характеризовалась плот- ная каллусная масса F. sonnikovae только на среде Собственно микроразмножение BDS. В своих дальнейших исследованиях мы использо- вали части луковичных чешуй как оптимальный экс- Роль регуляторов роста и физиологически актив- плант для размножения исследуемых видов. Высокий ных добавок в получении морфогенного ответа регенерационный потенциал луковичных чешуй от- Культивирование in vitro F. dagana и F. sonniko- мечен и у других представителей рода Fritillaria – vae выявило два направления морфогенеза: адвентив- F. camtschatcensis (L.) Ker-Gawl. и F. thunbergii Miq. ное побегообразование и непрямой соматический (Otani, Shimada, 1997; Paek, Murthy, 2002). эмбриогенез (рис. 2). Возможность развития по тому Влияние минеральной основы питательной сре- или иному пути морфогенеза зависит от видовой ды. Для культивирования видов рода Fritillaria при- принадлежности, типа экспланта и условий культиви- меняют различные питательные среды: MS – F. tunber- рования.

67 Рис. 2. Пути морфогенеза F. dagana и F. sonnikovae в культуре in vitro: а – адвентивное побегообразование из тканей луковичных чешуй; б – непрямой соматический эмбриогенез.

Прямую регенерацию (адвентивное побегообра- Такой же эффект описан для F. ruthenica Wikstr., ис- зование) наблюдали на среде для введения в культуру пользование углеводов в среде более 4 % привело к В5, дополненную БАП 5 мкМ и НУК 2 мкМ, и на сре- формированию неморфогенного каллуса этого вида дах для побегоообразования из тканей луковичных (Ветчинкина, 2010). чешуй – В5, дополненной БАП или БАП в сочетании с Другой путь получения каллусной культуры – ис- НУК (см. рис. 2). У F. dagana адвентивное побегообра- пользование ауксинов. Нами отмечено, что при дли- зование удалось стимулировать на всех этапах куль- тельном культивировании F. dagana (более трех меся- тивирования, как из тканей исходных луковичных цев) на среде В5 с 5 мкМ НУК формируется каллус, чешуй, так и из тканей адвентивных микролуковичек, который проявляет морфогенную активность (сома- полученных in vitro. Прямую регенерацию луковичек тический эмбриогенез) (см. рис. 1, д, е, з). F. sonnikovae из луковичных чешуй наблюдали только Вид F. sonnikovae образует плотную каллусную на стадии введения в культуру. культуру на среде BDS, характеризующуюся высокой По нашим данным, оптимальным сочетанием ре- эмбриогенной активностью, в том числе на безгормо- гуляторов роста на этапе размножения для F. dagana нальных средах. Способность тканей и клеток пере- оказалось БАП 5 мкМ или БАП 5 мкМ и НУК 2 мкМ ходить на тот или иной путь развития определяется (Эрст А.А., Эрст А.С., 2011). Невысокий коэффициент многими физическими и химическими факторами. размножения (3–5 шт./экспл.) в данном случае спо- Для F. sonnikovae удалось получить стабильную мор- собствует хорошему росту и развитию луковичек и фогенную каллусную культуру на среде BDS, допол- позволяет включать их в дальнейшие этапы микро- ненной аминокислотами – триптофаном 100 мг/л и размножения. глутаминовой кислотой 200 мг/л. Такое сочетание компонентов среды обеспечило массовое заложение Непрямой соматический эмбриогенез соматических эмбриоидов. При изучении эффектив- Получение каллусной культуры. В наших иссле- ности аминокислот в питании растительных тканей дованиях отмечено, что при повышении содержания нужно различать два аспекта этого процесса, а имен- сахарозы в среде до 5 % у F. dagana происходит каллу- но возможность использования аминокислот в ка- сообразование. При этом каллус теряет свою морфо- честве единственного источника азота и действие генную активность за 2–3 пассажа, характеризуется аминокислот на метаболизм и рост тканей на фоне активным ростом, в том числе на безгормональной основного нитратного питания (Бутенко, 1964). Ами- среде. Морфогенная активность такого каллуса (еди- нокислота триптофан является предшественником ничные соматические эмбриоиды) сохраняется толь- ауксинов и проявляет ростостимулирующую актив- ко в течение 1–2 пассажей при условии дальнейшего ность (Nickerson, 1980; Nalawade et al., 2003). Глутами- его культивирования на среде с пониженным содер- новую кислоту использовали для многих видов рас- жанием углеводов и наличия АУ в среде (1–5 г/л). тений, в том числе для стимуляции побегообразо-

68 вания и развития соматических эмбриоидов (Шалаев, при культивировании в условиях пониженной темпе- Третьякова, 2011; Sudhersan et al., 2001; Anis et al., 2003; ратуры. Сходные особенности ризогенеза отмечались Chalupa, 2003). В наших исследованиях показано, что и для других видов рода Fritillaria, например F. meleag- внесение аминокислот способствовало массовому за- ris L. (Nikolic et al., 2008; и др.). Согласно нашим наб- ложению и развитию соматических эмбриоидов на людениям, для укоренения необходимо выдерживать начальных этапах культивирования. микролуковички при температуре +7 °С в течение Таким образом, каллус F. dagana, полученный пу- 5 дней или культивировать в условиях с температур- тем повышения содержания углеводов в питательной ным режимом +18 ± 2 °С. Оба режима укоренения среде (до 5 %), теряет способность к соматическому оказались успешными и через три недели культиви- эмбриогенезу за 2–3 пассажа. Для развития сомати- рования на среде с 5 мкМ НУК получили растения- ческих эмбриоидов этого вида необходимо дальней- регенеранты с развитой корневой системой (5–6 кор- шее культивирование каллуса на среде с АУ и пони- ней на побег). При дальнейшем культивировании на женным содержанием углеводов. Морфогенный кал- данной среде у регенерантов развивался побег с дву- лус F. dagana, полученный с использованием ауксинов, мя листьями, луковички увеличивались в размере необходимо в дальнейшем культивировать на средах (см. рис. 1, и) (Эрст А.А., Эрст А.С., 2011). с БАП. F. sonnikovae формирует плотную каллусную Луковички F. sonnikovae проявили способность к массу на среде BDS, сохраняющую высокую способ- укоренению на среде для размножения через 2–3 ме- ность к морфогенезу в течение нескольких лет. сяца культивирования. Быстрее луковички укореня- Укоренение in vitro лись на безгормональной среде с 1 мг/л АУ после вы- Для укоренения микролуковичек F. dagana ис- держивания двух недель при +7 °С на фотопериоде пользовали среду В5, дополненную 5 мкМ НУК. При (количество корней 1.3 ± 0.4, средняя длина корней этом установлено, что укоренение наступает только 7.5 ± 1.7 мм, диаметр луковицы 3.0 ± 0.4 мм).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, для размножения F. dagana опти- го созревания соматических эмбриоидов необходимо мальным является прямая регенерация луковичек на увеличить период пассажа до 2–3 месяцев. Определя- среде В5 + БАП 5 мкМ + НУК 2 мкМ, позволяющая в ющим фактором в развитии корневой системы иссле- короткие сроки получить полностью сформирован- дуемых видов является температурный режим. ные растения-регенеранты. Массовая регенерация Исследования выполнены при финансовой под- луковичек F. sonnikovae получена путем непрямого со- держке Программы Президиума РАН “Живая природа: матического эмбриогенеза на среде BDS + триптофан современное состояние и проблемы развития”, проект 100 мг/л + глутаминовая кислота 200 мг/л. Для полно- № 30.3.

ЛИТЕРАТУРА Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физио- Arzate-Fernandez A.-M., Nakazaki T., Okumoto Y., Tanisa- логия морфогенеза у растений. М., 1964. С. 32–33. ka T. Efficient callus induction and regeneration Ветчинкина Е.М. Биологические особенности культи- from filaments with anther in lily (Lilium longiflorum вирования in vitro семян и зародышей редких видов Th unb.) // Plant Cell Rep. 1997. V. 16, No. 12. P. 836–840. растений: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2010. Chalupa V. In vitro propagation of Tilia platyphyllos by axil- 20 с. lary shoot proliferation and somatic embryogenesis // J. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, раз- Forest Sci. 2003. V. 49(12). P. 537–543. множении и сохранении генофонда растений. Барна- Dunstan D.J., Short K.C. Improved growth of tissue cultures ул, 2004. 205 с. of the onion Allium cepa // Physiol. Plant. 1977. V. 41, Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с. No. 1, P. 26–34. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биоло- Fennell C.W., Van Staden J. Biotechnology of southern Af- гия семян. СПб., 1999. 232 с. rican // S. Afr. J. Bot. 2004. V. 70. P. 37–46. Шалаев Е.А., Третьякова И.Н. Индукция соматическо- Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detec- го эмбриогенеза у ели саянской в культуре in vitro // tion of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. Хвойные бореальной зоны. 2011. Т. 28, № 1–2. J. Biochem. 1968. V. 46, No. 5. P. 417–421. С. 69–71. Han B.H., Yu H.J., Yae B.W., Paek K.Y. In vitro micropropa- Эрст А.А., Эрст А.С. Размножение in vitro редкого ви- gation of Lilium longifolium ‘Georgia’ by shoot formation да – Fritillaria dagana Turcz. ex Trautv. из луковичных as infl uenced by addition of liquid medium // Sci. Hort. чешуй // Turczaninowia. 2011. № 14(4). С. 90–93. 2004. V. 103. P. 39–49. Anis M., Faisal M., Singh S.K. Micropropagation of mul- Kim E.K., Hahn E.J., Murthy H.N., Paek K.Y. High fre- berry (Morus alba L.) through in vitro culture of shoot tip quency of shoot multiplication and bulblet formation of and nodal explants // Plant Tissue Cult. 2003. V. 13(1). garlic in liquid cultures // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2003. P. 47–51. No. 73. P. 231–236.

69 Li S.L., Lin G., Chan S.W., Li P. Determination of the major Nickerson N.L. Promotion by tryptophan of growth and isosteroidal in bulbs of Fritillaria by high-performance root formation in lowbush blueberry pericarp callus cul- liquid chromatography coupled with evaporative light tures // Can. J. Bot. 1980. V. 58(8). P. 881–885. scattering detection // J. Chromatogr. 2001. V. 909. Nikolic M., Misic D., Maksimovic V., Jevremovic S., Trifu- P. 207–214. novic M., Subotic A. Eff ect of low temperature on roo- Maesato K., Sharada K., Fukui H., Hara T., Sarma K.S. In ting rate and carbohydrate content of Fritillaria meleagris vitro bulblet regeneration from bulbscale explants of Lili- bulbs formed in culture in vitro // Arch. Biol. Sci. 2008. um japonicum Th umb. Eff ect of plant growth regulators No. 60(1). P. 5–6. and culture environment // J. Hort. Sci. 1994. V. 251. Otani M., Shimada T. Micropropagation of Fritillaria camt- P. 199–204. schatcensis (L.) Ker-Gawl., “Kuroyuri” // Bull. RIAR, Ishi- Mirici S., Parmaksiz I., Ozcan S. Effi cient in vitro bulblet kawa Agr. Coll. 1997. No. 5. P. 39–44. regeneration from immature embryos of endangered Paek K.Y., Murthy H.N. High frequency of bulblet regene- Sternbergia fi scheriana // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2005. ration from scale sections of Fritillaria thunber- No. 80. P. 239–246. gii // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2002. V. 68, Issue 3. Mohammadi-Dehcheshmeh M., Khalighi A., Naderi R., P. 247–252. Ebrahimie E., Sardari M. Inderect somatic embryoge- Petric M., Subotic A., Jevremovic S., Trifunovic M. Soma- nesis from petal explant of endangered wild population tic embryogenesis and bulblet regeneration in snakehead of Fritillaria imperialis // Pak. J. Biol. Sci. 2007. No. 10(11). fritillary (Fritillaria meleagris L.) // Afr. J. Biotech. 2011. P. 1875–1879. V. 10(72). P. 16181–16188. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth Rice L.J., Finnie J.F., Van Staden J. In vitro bulblet produc- and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. tion of Brunsvigia undulate from twin-scales // S. Afr. J. 1962. V. 15, No. 2. P. 473–497. Bot. 2011. V. 77. P. 305–312. Nalawade S.M., Sagare A.P., Lee Ch.-Y., Kao Ch.-L., Subotic A., Trifunovic M., Jevremovic S., Petric M. Mor- Tsay H.-Sh. Studies on tissue culture of Chinese medici- pho-histological study of direct somatic enbryogenesis in nal plant resources in Taiwan and their sustainable utili- endangered species Fritillaria meleagtis // Biol. Planta- zation // Bot. Bull. Acad. Sin. 2003. V. 44. P. 79–98. rum. 2010. V. 54(3). P. 592–596. Nhut D.T., Le B.V., Minh T., de Silva J.T., Fukai S., Tana- Sudhersan C., AboEl-Nil M., Hussain J. In vitro propaga- ka M., Van K.T.T. Somatic embryogenesis through pseu- tion of Ziziphus mauritiana cultivar Umran by shoot tip dobulblet thin cell layer of Lilium longifl orum // Plant and nodal multiplication // Curr. Sci. 2001. V. 80, No. 2. Growth Regul. 2002. No. 37. P. 193–198. P. 290–292.

70