Сохранение И Размножение in Vitro Редких Видов Рода Fritillaria (Liliaceae) А.А
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ РАСТИТЕЛЬНЫЙ МИР АЗИАТСКОЙ РОССИИ Растительный мир Азиатской России, 2014, № 1(13), с. 64–70 h p://www.izdatgeo.ru УДК 581.143.6(504.062.4) СОХРАНЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO РЕДКИХ ВИДОВ РОДА FRITILLARIA (LILIACEAE) А.А. Эрст, А.С. Эрст, Д.Н. Шауло, Д.С. Кульханова Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, 630090, Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101, e-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected] Рассмотрены процессы морфогенеза в культуре in vitro двух эндемичных представителей рода Fritillaria – F. dagana и F. sonnikovae. Отмечено, что наибольшим регенерационным потенциалом обладают ткани луко- вичных чешуй. Для изучаемых видов возможно развитие по двум путям морфогенеза – прямого органоге- неза и непрямого соматического эмбриогенеза. Ключевые слова: Fritillaria dagana, F. sonnikovae, адвентивное побегообразование, соматический эмбриогенез, условия культивирования in vitro. CONSERVATION AND PROPAGATION IN VITRO OF RARE SPECIES FRITILLARIA (LILIACEAE) A.A. Erst, A.S. Erst, D.N. Shaulo, D.S. Kulkhanova Central Siberian Botanical Garden, SB RAS, 630090, Novosibirsk, Zolotodolinskaya srt., 101, e-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected] Th e morphogenesis in vitro culture of two endemic species of the genus Fritillaria – F. dagana and F. sonnikovae was described. It is noted that the highest regeneration potential was developed from the bulbous scales. Th e development on two ways morphogenesis – direct organogenesis and indirect somatic embryogenesis was observed. Key words: Fritillaria dagana, F. sonnikovae, adventive shoot formation, somatic embryogenesis, culture conditions in vitro. ВВЕДЕНИЕ Род Fritillaria L. (Liliaceae Juss.) включает более вели к росту исследований по разработке эффектив- 100 видов, распространенных в умеренном поясе Се- ных способов воспроизведения этих видов, в том верного полушария, многие из которых включены в числе с использованием культуры тканей и органов Красные книги различных уровней. Виды этого рода растений in vitro. имеют интересный фитохимический состав, в част- Размножение in vitro используется как альтерна- ности, содержат изостероидные алкалоиды и широко тивный метод воспроизведения для многих геофитов, используются в традиционной китайской медицине таких как Sternbergia fi scheriana (Herb.) Roem. (Mirici (Li et al., 2001). Кроме того, рябчики имеют огромный et al., 2005), Fritillaria meleagris L. (Petric et al., 2011), потенциал как декоративные растения в связи с не- Allium sativum L. (Kim et al., 2003), Lilium longifl orum обычной природной окраской цветов и ранним цве- Th unb. (Nhut et al., 2002) и др. тением. В естественных условиях произрастания, а В настоящей работе описана система размноже- также в интродукции скорость вегетативного раз- ния in vitro двух эндемичных видов рода Fritillaria – множения невысока и от одной луковицы можно по- F. dagana Turcz. ex Trautv. и F. sonnikovae Schaulo et лучить только две новые за год. Такой низкий потен- A. Erst, и рассмотрено влияние условий культивиро- циал не позволяет размножать виды рода Fritillaria вания на течение процесса морфогенеза. Данные на- традиционным делением луковицы. Семенное вос- ших исследований могут быть использованы для мас- производство рябчиков очень длительное и составля- сового размножения высокодекоративных видов рода ет 5–6 лет до цветения. Данные обстоятельства при- Fritillaria, а также для их сохранения и репатриации. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Исходным материалом для введения в культуру венных мест произрастания – Россия, Красноярский in vitro послужили луковицы и семена F. dagana и край, хребты Ергаки и Борус (рис. 1, а, в). Перед сте- F. sonnikovae, собранные в конце мая 2010 г. с естест- рилизацией луковицы промывали в мыльной воде и © А.А. Эрст, А.С. Эрст, Д.Н. Шауло, Д.С. Кульханова, 2014 64 Рис. 1. Этапы микроразмножения F. dagana и F. sonnikovae: а – семена F. sonnikovae; б – проросток F. sonnikovae, полученный в культуре in vitro; в – луковица F. dagana; г – адвентивное побе- гообразование F. dagana на части луковичной чешуи; д – эмбриогенный каллус F. dagana; е – сформированный соматический эмбриоид F. dagana; ж – развитые соматические эмбриоиды F. sonnikovae на эмбриогенном каллусе; з – растение-регенерант F. da- gana, полученное путем соматического эмбриогенеза; и – растение-регенерант F. dagana, полученное путем адвентивного побе- гообразования; СЭ – соматический эмбриоид (4 мм). 65 Варианты питательных сред, используемых температуре 3–5 °С на фотопериоде 16/8 (Ветчинки- для культивирования видов рода Fritillaria на, 2010). Регуляторы роста и физиологически Основные питательные среды – среда В5 (Gam- активные добавки borg, Eveleigh, 1968), BDS (Dunstan, Short, 1977), MS Пита- Саха- Глу та- (Murashige, Skoog, 1962), успешно применяемые для тельная роза, АУ, г/л Три - БАП, Кн, НУК, миновая среда г/л птофан, размножения луковичных растений (Вечернина, 2004; мкМ мкМ мкМ кислота, мг/л мг/л Arzate-Fernandez et al., 1997; Mohammadi-Dehchesh- MS 50 – – 4.5 1.5 – – meh et al., 2007; и др.). Эти среды дополняли регуля- 20 5 – 5 2 – – торами роста: 6-бензиламинопурином – БАП (ICN B 50 – 5.0 – 2.0 – – Biomedicals, USA) 0.5 и 5 мкМ, кинетином – Кн (ICN 5 α 30 – 0.5 – 5.0 – – Biomedicals, USA) 4.5 мкМ, -нафтилуксусной кис- 30 – 5.0 – 2.0 – – лотой – НУК (AppliChem, Germany) 1.5, 2 и 5 мкМ; 30 – 5.0 – – – – физиологически активными добавками: триптофа- 30 – – – 5.0 – – ном – 100 мг/л, глутаминовой кислотой – 200 и 50 – – – – – – 1500 мг/л; сахарозой 30 и 50 г/л; активированным уг- BDS 30 – 5.0 – 2.0 – – лем (АУ) 1.5 и 10 г/л; агаром 6 г/л (Difco, USA). Вари- 30 – – – 5.0 – – анты питательных сред приведены в таблице. pH сре- 30 – – – – 100 200 ды доводили до 5.8, затем среды автоклавировали при 30 – – – – – – 121 °С в течение 20 мин. 20 – – – – – 1500 Все эксперименты проводились в 2–3 повторнос- 20 – – – – 100 – тях. Статистическая обработка результатов осущест- 20 10 – – – – – влялась путем расчетов с использованием пакета ста- тистического анализа приложения Microsoft Excel. Расчет показан в средних арифметических величинах делили на луковичные чешуи и дочерние луковички. и доверительных интервалах. Доверительность оце- Стерилизацию проводили 70%-м этанолом (30 с), за- ниваемых показателей принимали на уровне значи- мости p < 0.05 (Лакин, 1990). Морфологические иссле- тем 0.1%-м HgCl2 с добавлением 1%-го Tween 80 (30 мин). Для семян использовали 20%-й раствор дования выполнены в ЦКП ЦСБС СО РАН (Новоси- Domestos (20 мин). После стерилизации раститель- бирск, Россия) на микроскопе Stereo Discovery V 12 с ный материал трехкратно промывали стерильной цветной цифровой камерой высокого разрешения дистиллированной водой. AxioCam MRc-5 и программой AxioVision 4.8 для Для культивирования эксплантов были подобра- получения, обработки и анализа изображений (Carl ны следующие условия: фотопериод – 16/8 часов Zeiss, Germany). свет/темнота, освещенность – 2–3 клк, температура − Учитывались следующие показатели: частота 24 ± 1 °С. Дочерние луковички после поверхностной морфогенеза – количество эксплантов с морфоген- стерилизации дополнительно выдерживали в культуре ным ответом (%); коэффициент размножения – коли- in vitro при температуре +7 °С в темноте 2 месяца (для чество развившихся побегов на эксплант (шт./экспл.); создания холодного периода покоя). Семена проращи- высота растения (мм); частота укоренения (%); коли- вали по методике Е.М. Ветчинкиной в течение 5–7 не- чество корней у одного регенеранта (шт.); средняя дель при температуре 20–22 °С, затем 12 недель при длина корней у одного регенеранта (мм). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Введение в культуру in vitro неза по M. Mohammadi-Dehcheshmeh и др. (2007), и безгормональную среду В (контроль). На данных ва- Применяемые режимы поверхностной стерили- 5 риантах сред наблюдали только набухание и позеле- зации оказались эффективными для всех типов экс- нение тканей луковичных чешуй спустя месяц куль- плантов. Выход неинфицированного растительного тивирования в условиях фотопериода. Далее эксплан- материала составил 90–100 %. ты помещали на среды В5 с 5 мкМ БАП и 2 мкМ НУК Луковичные чешуи (после поверхностной стери- и через 50 дней отмечали образование меристемати- × лизации) делили на части 5 5 мм и помещали на пи- ческих очагов на поверхности луковичных чешуй, из тательные среды различного состава (см. таблицу). которых развивались адвентивные луковички (см. На этапе введения в культуру применяли питатель- рис. 1, г). Изучаемые виды отличались по морфоген- ную среду МS, дополненную Кн 5 мкМ и НУК 2 мкМ ному ответу, так для F. dagana частота морфогенеза (для прямой регенерации побегов по K.Y. Paek, составила 100 % при коэффициенте размножения H.N. Murthy, 2002), В5, дополненную БАП 0.5 мкМ и 10.1 ± 2.2 шт./экспл., для F. sonnikovae – 12.5 % с коэф- НУК 5 мкМ (для непрямого соматического эмбриоге- фициентом размножения 12.0 ± 5.2 шт./экспл. 66 Дочерние луковички помещали на среды: 0.6 % gii (Paek, Murthy, 2002), F. meleagris (Nicolic et al., 2008; агар, 0.6 % агар + АУ 1 г/л, В5 + БАП 5 мкМ + НУК Petric et al., 2011), В5 – F. imperialis L. (Mohammadi-De- 2 мкМ, BDS, BDS + АУ 1 г/л и культивировали с ис- hcheshmeh et al., 2007) и F. meleagris (Вечернина, 2004). пользованием или без холодной предобработки. Во В нашем случае для изучения влияния минеральной всех вариантах наблюдали только позеленение тканей основы среды на процесс морфогенеза микролуко- луковичек, морфогенного ответа не выявлено в тече- вички F. dagana и F. sonnikovae переносили с целью ние двух лет наблюдений. размножения на питательные среды