ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

«ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ»

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Ανάλυση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων με έμφαση στη μελέτη γενετικών στοιχείων που εμπλέκονται στην οργάνωση και μεταγραφή του mtDNA στους Pezizomycotina»

Ντερτιλή Μαρία

Βιολόγος, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΑΘΗΝΑ 2016

~ II ~

HELLENIC REPUBLIC National and Kapodistrian University of Athens

SCHOOL OF SCIENCE FACULTY OF BIOLOGY

MASTER IN “BIOINFORMATICS”

Master Diploma Thesis « Analysis of mitochondrial genomes with emphasis in the study of the genetic elements that interfere with the organization and the transcription of the mtDNA in Pezizomycotina »

Ntertilis Maria

Biologist, Faculty of Biology, School of Science, National and Kapodistrian University of Athens

ATHENS 2016

~ III ~

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

«ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ»

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

« Ανάλυση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων με έμφαση στη μελέτη γενετικών στοιχείων που εμπλέκονται στην οργάνωση και μεταγραφή του mtDNA στους Pezizomycotina»

Τριμελής εξεταστική επιτροπή

Καθηγητής Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς (Επιβλέπων) Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Επίκουρη Καθηγήτρια Αικατερίνη-Μαρία Παππά Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Επίκουρη Καθηγήτρια Βασιλική Α. Οικονομίδου Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

~ IV ~

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Πρόλογος VΙ Περιεχόμενα VIΙ Περίληψη VIII Summary X

1. Εισαγωγή 1 1.1 Το Μιτοχονδριακό Γονιδίωμα 1 1.1.1 Γενικά χαρακτηριστικά 1 1.1.2 Η εξέλιξη των μιτοχονδρίων 5 1.1.3 Η οργάνωση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων 7 1.1.4 Η οργάνωση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες 8 1.2 Οι μηχανισμοί συντήρησης και ρύθμισης της έκφρασης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος 12

1.2.1 Η αντιγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος 12 1.2.2 Η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος 15 1.2.2.1 Η μεταγραφή του mtDNA στον άνθρωπο 15 1.2.2.2 Η μεταγραφή του mtDNA στις ζύμες και η ωρίμανση των πολυσιστρονικών μεταγράφων 20 1.3 Πρόβλεψη υποκινητών 27 1.4 Μύκητες 29

1.5 Η φυλογένεση και το μιτοχονδριακό γονιδίωμα των μυκήτων 32 1.6 Στόχος 35 2. Υλικά και Μέθοδοι 37 2.1 Χαρακτηρισμός μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων 37 2.2 Φυλογενετικά δέντρα 41 2.3 Στοιχίσεις διαγονιδιακών περιοχών 42 2.4 Πρόβλεψη υποκινητών 43 3. Αποτελέσματα 45

3.1 Η βάση δεδομένων MitoFun 45 3.2 Φυλογενετικά δέντρα 52 3.3 Πρόβλεψη υποκινητών 53 4. Συζήτηση 87 5. Βιβλιογραφία 97 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 120

~ VII ~

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια ζωτικής σημασίας για τις κυτταρικές λειτουργίες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τόσο στην κυτταρική ανάπτυξη όσο και στον κυτταρικό θάνατο. Θεωρείται πως έχουν προέλθει έπειτα από ενδοσυμβίωση του πρόγονου ευκαρυωτικού κυττάρου με α-πρωτεοβακτήρια. Η ενδοσυμβίωση είχε ως αποτέλεσμα η πλειοψηφία των αρχικών μιτοχονδριακών γονιδίων να μεταναστεύσουν στον πυρήνα. Τα εναπομείναντα γονίδια οργανώθηκαν στο DNA του οργανιδίου, και για αυτό το μιτοχόνδριο χαρακτηρίζεται ως ημιαυτόνομο οργανίδιο. Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν ένα σύνολο υπομονάδων των συμπλόκων για την οξειδωτική φωσφορυλίωση και την ATP συνθετάση, που ευθύνεται για το μεγαλύτερο ποσοστό της παραγωγής ΑΤΡ στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισμών. Η διατήρηση και έκφραση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (mtDNA) απαιτεί ένα πλήθος πρωτεϊνών, οι οποίες είναι πυρηνικά κωδικοποιούμενες, μεταφράζονται στο κυτταρόπλασμα και μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια.

Οι μύκητες αποτελούν μια ξεχωριστή ομάδα οργανισμών. Είναι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, ετερότροφοι, που τυπικά έχουν ένα θαλλό που λέγεται μυκήλιο και αποτελείται από διακλαδισμένα σωληνοειδή νημάτια, τις υφές. Οι μύκητες είναι αρκετά επιτυχείς οργανισμοί διότι έχουν καταφέρει να αποικήσουν σε κάθε είδος περιβάλλοντος. Εφόσον δεν φωτοσυνθέτουν, μπορούν να καταλάβουν ακόμα και σκοτεινούς βιότοπους και να αναπτυχθούν προς κάθε κατεύθυνση και σε κάθε είδος υποστρώματος. Ταυτόχρονα, παράγουν τεράστιους αριθμούς σπορίων, τα οποία απελευθερώνονται και διασπείρονται με μεγάλη αποτελεσματικότητα. Με αποτέλεσμα κάθε οικολογική θέση, είτε βρίσκεται στον αέρα, είτε στο έδαφος είτε στο νερό, όχι μόνο αποικείται από μύκητες αλλά περιλαμβάνει και εξαιρετικά μεγάλο αριθμό ειδών μυκήτων.

Σύμφωνα με τα σύγχρονα δεδομένα τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη γενετική, ταξινομική, εξελικτική και φυλογενετική μελέτη των μυκήτων. Το ενδιαφέρον του mtDNA εστιάζεται στη συνύπαρξη της συντηρητικότητας των λειτουργιών του, με τη διαφορετικότητα της δομής και σύστασης (γονιδιακή οργάνωση, εσώνια) στα διάφορα είδη μυκήτων.

Τα μυκητιακά mtDNAs φέρουν συνήθως γονίδια που κωδικοποιούν (α) 14 πρωτεΐνες για την αναπνοή και παραγωγή ΑΤΡ, (β) 2 rRNA και (γ) 25 κατά μέσο όρο tRNAs. Στην παρούσα Διπλωματική εργασία μελετήθηκαν 126 mtDNAs, εκ των οποίων τρία επισημάνθηκαν εξ’ ολοκλήρου, εμπλουτίζοντας την βάση δεδομένων MitoFun που είχε αναπτυχθεί νωρίτερα για την ολοκληρωμένη και σωστή παρουσίαση των γνωστών mtDNA των μυκήτων. Αναλύθηκαν οι αλληλουχίες, διορθώθηκαν τα λάθη και εμπλουτίστηκαν οι εγγραφές που ήταν ελλιπείς. Προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός της ρύθμισης της έκφρασης των mtDNAs, μελετήθηκαν τα γονιδιώματα που ανήκουν στο Φύλο των Ασκομυκήτων (223

~ VIII ~

γνωστά mtDNAs) και έμφαση δόθηκε στο Υπόφυλο Pezizomycotina (100 γνωστά mtDNAs).

Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες των γονιδίων όλων των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων (287) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή φυλογενετικών δένδρων που αναδεικνύουν τις εξελικτικές σχέσεις των οργανισμών που τα φέρουν. Επιβεβαιώθηκε μέσα από αυτήν την φυλογένεση η σημαντικότητα των mtDNAs στις εξελικτικές μελέτες και η περιεκτικότητα της πληροφορίας που αυτά φέρουν.

Μελετήθηκε η συνταινικότητα των γονιδιωμάτων καθώς φάνηκε πως η γονιδιακή οργάνωση μπορεί να προδιαγράφει το περιεχόμενο των πολυσιστρονικών μεταγράφων. Επίσης αξιοποιήθηκαν οι διαγονιδιακές περιοχές προκειμένου να εντοπιστούν οι ρυθμιστικές περιοχές που παίζουν ρόλο στην μεταγραφή των γονιδιωμάτων. Οι διαγονιδιακές περιοχές στην ανιούσα θέση των γονιδίων cox1, cob και nad4L από 71 επιλεγμένα στελέχη απομονώθηκαν και στοιχήθηκαν προκειμένου να εντοπιστούν οι συντηρητικές περιοχές που πιθανά να φέρουν την αλληλουχία του υποκινητή. Επιπλέον μελετήθηκαν οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA των διαγονιδιακών αυτών περιοχών και τα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που αυτές μπορεί να φέρουν.

Αποτέλεσμα των παραπάνω ήταν ο σχεδιασμός ενός αλγορίθμου σε γλώσσα προγραμματισμού perl, ο οποίος μπορεί να προβλέπει τη δυνητική θέση ενός υποκινητή σε ένα μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Μετά την δοκιμή του αλγορίθμου σε 27 γονιδιώματα οργανισμών που ανήκουν στο Υπόφυλο Pezizomycotina, διαπιστώθηκαν πιθανές θέσεις έναρξης της μεταγραφής, όπως στην ανιούσα θέση των γονιδίων rns, rnl, cox1, cob, που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία αλλά και νέες πιθανές θέσεις όπως αυτές στην ανιούσα θέση των γονιδίων nad1, nad4, nad6, atp9, cox3. Ο παραπάνω αλγόριθμος θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο που θα οδηγούσε σε γρηγορότερα και αποδοτικότερα πειραματικά δεδομένα που θα επιβεβαιώσουν τις in silico προβλέψεις που αφορούν την ρύθμιση της γονιδιακής μετάφρασης και έκφρασης των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των μυκήτων.

~ IX ~

SUMMARY

Mitochondria are vital organelles to cell growth and cellular death in all eukaryotic organisms. Their origin is proposed to be a result of the endosymbiosis of the eukaryotic ancestor with α-proteobacteria. The endosymbiosis and the consequent evolution forced the majority of the mitochondrial genes to migrate to the nucleus. The remaining genes were organized within the DNA of the organelle, and thus, mitochondria are called semiautonomous. The genes which are located within the mitochondrial genome (mt DNA), encode for a number of proteins that participate in the formation of the complexes of oxidative phosphorylation and of ATP synthase, which is responsible for the majority of the ATP production in eukaryotic cells. The maintenance and expression of the mitochondrial genome (mtDNA) require a number of proteins, who are encoded in the nucleus, translated in the cytoplasm and then transferred to the mitochondria.

Fungi are a special group of organisms. They are eukaryotic, heterotrophic organisms that typically have a thallus that it is called mycelium and consists of branched tubular filaments, the hyphae. Fungi are adaptable organisms since they have managed to inhabit in any kind of environment. They do not photosynthesize and thus, they can grow even in dark habitats, in all substrates. At the same time, they produce a large number of spores, which are spread with great effectiveness. So any habitat, whether on air, on ground or in water is inhabited by fungi which are taxonomically placed to a large number of different species.

According to many recent articles, mitochondrial genomes can provide information about the genetics, taxonomy, evolution and phylogenetic analyses of fungi. MtDNA contains genes responsible for conserved functions but also present an extreme divergence in structure and composition (gene order, introns) in different species of fungi.

Fungal mtDNAs usually carry genes that encode for (a) 14 proteins that participate in respiration and production of ATP, (b) 2 rRNAs and (c) an average of 25 tRNAs. In this master thesis, 126 mtDNAs have been analyzed, three of which have been completely annotated, enriching a database called MitoFun. MitoFun was developed earlier to this work with the aim to present all known fungal mitochondrial genomes in a complete, uniform and correct annotated manner. In order to study the regulation of mtDNA gene expression, genomes belonging to the Phylum Ascomycetes (223 known mtDNAs) were studied and emphasis was given to those belonging to the Subphylum Pezizomycotina (100 known mtDNAs).

The protein sequences derived from the protein coding genes of the known mitochondrial genomes from all Fungal Phyla (i.e., 287 mt genomes) were concatenated and used as a single matrix to construct a phylogenetic tree. This tree

~ X ~ demonstrates the evolutionary relationships of the organisms that carry the mitochondrial genes.

The synteny of the genomes was also studied in extent, since gene order may indicate information concerning the mt polysistrionic transcripts. The intergenic regions were used to locate the regulatory elements that participate in the transcription of the mt genomes. The upstream regions of cox1, cob and nad4L genes from 71 fungal species were aligned in order to identify the conserved regions that possibly carry the promoter sequence. In addition, the repetitive DNA sequences located in these intergenic regions were analysed. A search of putative open reading frames (ORFs) was performed in order to in silico locate them.

As a result of the above mentioned analyses, an algorithm (written in the programming language perl) was developed for the prediction of promoter sequences in any mt genome. The algorithm was run in 27 genomes belonging to species from the Subphylum Pezizomycotina and several possible promoter sites were identified. These putative promoters were located upstream of the rns, rnl, cox1, cob genes, in agreement to previously reported data in literature, as well as upstream to genes nad1, nad4, nad6, atp9 and cox3. This algorithm could be a useful tool that would simplify experiments which will verify the in silico predictions concerning the regulation of gene transcription and translation of fungal mitochondrial genomes.

~ XI ~

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.1 Το Μιτοχονδριακό γονιδίωμα

1.1.1 Γενικά χαρακτηριστικά

Τα μιτοχόνδρια είναι ημιαυτόνομα οργανίδια με διπλή εξωτερική μεμβράνη στην οποία εδράζονται, κατά κύριο λόγο, σύμπλοκα πρωτεϊνών που δημιουργούν την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και επιτελούν την οξειδωτική φωσφορυλίωση και την παραγωγή ΑΤP (Anderson et al., 1981). Τα οργανίδια αυτά συμμετέχουν επίσης και σε μια σειρά άλλων σημαντικών λειτουργιών, όπως είναι η ομοιόσταση των ιόντων, ο ενδιάμεσος μεταβολισμός και η απόπτωση (Paquin et al., 1997). Συναντώνται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ακόμα και σε περιπτώσεις όπως τα μικροσπορίδια, οι μεταμονάδες και τα αμοιβαδοειδή όπου θεωρούνταν ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί χωρίς μιτοχόνδρια. Τα τελευταία χρόνια βρέθηκε πως χαρακτηριστικοί πρωτόγονοι οργανισμοί όπως το αμοιβαδοειδές παράσιτο Entamoeba histolytica, το παθογόνο μικροσπορίδιο Trachipleistophora hominis και η μονοκύτταρη διπλομονάδα Giardia intestinalis εμπεριέχουν μειωμένες μορφές μιτοχονδρίων που αποκαλούνται «μιτοσώματα» (Tovar et al., 1999, Williams et al., 2002, Henze και Martin 2003, Tovar et al. 2003). Μοναδική περίπτωση αναερόβιου ευκαρυωτικού οργανισμού χωρίς καμία μορφή μιτοχονδρίου που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα, είναι το πρωτόζωο Monocercomonoides sp. (Karnkowska et al., 2016).

Τα μιτοχόνδρια είναι ημιαυτόνομα οργανίδια γιατί (α) περιέχουν το δικό τους γονιδίωμα που όμως δεν καλύπτει όλες τις ανάγκες τους, οπότε πολλές απαραίτητες πρωτεΐνες κωδικοποιούνται στον πυρήνα και (β) γιατί έχουν τη δική τους μεταφραστική μηχανή (Clark- Walker, 1992).

Τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα (mtDNAs) παρουσιάζουν ιδιαίτερη πολυπλοκότητα και ποικιλομορφία ως προς την δομή τους (Kouvelis et al., 2004, Smith και Keeling, 2015). Αν και αρχικά θεωρούνταν ότι είναι αποκλειστικά κυκλικά υπερελιγμένα μόρια υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ακόμα και γονιδιώματα που παρουσιάζουν τυπικά περιοριστικά πρότυπα κυκλικής οργάνωσης αποτελούνται από γραμμικά πολυμερή συνδεδεμένα διαδοχικά (Bendich 1993 και 1996) ή μονομερή ευθύγραμμα (Pramateftaki et al., 2006). Γραμμικά μονομερή μόρια έχουν επίσης ανιχνευτεί σε μια σειρά απομακρυσμένων φυλογενετικά ειδών που ανήκουν στα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα, τα σπορόζωα (Plasmodium), τους μύκητες, τα χλωροφύκη (Chlamydomonas) και τα κνιδόζωα (Burger et al., 2003a). Τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα επομένως, πέρα από την «κανονική» τους δομή, παρουσιάζουν σε ορισμένους οργανισμούς, ιδιαίτερες διαμορφώσεις (Εικόνα 1.1). Παράδειγμα αποτελούν ο Χυτριδιομύκητας Spizellomyces punctatus (Laforest et al., 1997) και τα Ευμετάζωα Globodera και Dicyema (Watanabe et al., 1999, Armstrong et al., 2000), όπου εντοπίζονται πολλά αντίγραφα κυκλικών

~ 1 ~

μορίων mtDNA. Επιπλέον ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι, στο πρώτιστο Amoebidium parasiticum το μιτοχονδριακό DNA συνίσταται σε μερικές εκατοντάδες διαφορετικών γραμμικών μορίων που παρουσιάζουν στα άκρα τους όμοιες ακραίες αλληλουχίες και παρόμοια οργάνωση (Burger et al., 2003b).

Εικόνα 1.1. Η ποικιλομορφία που μπορεί να διαπιστωθεί στην γονιδιωματική αρχιτεκτονική των οργανιδίων. Οι χάρτες των μιτοχονδριακών και πλαστιδιακών γονιδιωμάτων/γονιδίων δίνονται σε μωβ και πράσινο, αντ/χα. Τα γονιδιώματα παρουσιάζονται σε κλίμακα, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά στην εικόνα. (Αναδημοσίευση της εικόνας από την εργασία Smith και Keeling, 2015 – PNAS 112: 10177- 10184, Fig. 2).

Τα μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούνται στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα φαίνεται να συμμετέχουν σε πέντε βασικές διαδικασίες: στην οξειδωτική φωσφορυλίωση και παραγωγή ATP, την μεταγραφή, την ωρίμανση του RNA, την μετάφραση και την μεταφορά των πρωτεϊνών (Burger et al., 2003a).

~ 2 ~

Ο αριθμός των γονιδίων αυτών όπως και η ονοματολογία τους μπορεί να αλλάζει από Βασίλειο σε Βασίλειο. Στα ζώα και στους μύκητες το περιεχόμενο των mt γονιδιωμάτων είναι παρόμοιο με εξαίρεση τον αριθμό των tRNA γονιδίων και την ύπαρξη των εσωνίων. Τα φυτικά κύτταρα συνήθως περιέχουν περισσότερα γονίδια αλλά με παρόμοια συχνότητα ύπαρξης εσωνίων με τους μύκητες (Πίνακας 1.1).

Μιτοχονδριακό γονίδιο Θηλαστικά Μύκητες Φυτά

NADH αφυδρογονάση ND (7) nad (0-7) nad (11-12)

Αποκυτόχρωμα Cyt b (1) cob (1) cob (1)

Κυτοχρωμική οξειδάση CO I-III (3) cox 1-3 (3) cox 1-3 (3)

ΑΤP συνθετάση ATPases 6, 8, 9 (3) atp 6, 8, 9 (2-3) atp 6, 8, 9, (4)

Ριβοσωμικό RNA LrRNA, SrRNA (2) rnl, rns (2) rnl, rns (2)

Ριβοσωμικές πρωτεΐνες - rps (1) rps, rpl (16)

tRNAs (κώδικας ενός γράμματος) Χ (25) trnX (8-27) trnX (22-27)

Εσώνια (+) + + + + +

Πίνακας 1.1. Η ονοματολογία και ο αριθμός των υπομονάδων/προϊόντων (σε παρένθεση) των γονιδίων που κωδικοποιούνται στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα των θηλαστικών, μυκήτων και φυτών. Η ύπαρξη και συχνότητα των εσωνίων εμφανίζεται με σταυρό. (+) = σπάνια, ++ = συχνά, +++=πολύ συχνά. Ο πίνακας αυτός είναι τροποποιημένη παρουσίαση του αντ/χου πίνακα που υπάρχει στην αναφορά Boore (1999).

Στον άνθρωπο, κάθε μιτοχόνδριο περιέχει αρκετά αντίγραφα του κυκλικού δίκλωνου μορίου του mtDNA που αποτελείται από περίπου 16.600 ζεύγη βάσεων. Οι δύο αλυσίδες του δίκλωνου DNA διακρίνονται σε βαριά και ελαφριά ανάλογα με την πυκνότητα καθίζησης που παρουσιάζουν. Το mtDNA κωδικοποιεί για 37 γονίδια: 22tRNA, 2 rRNA και 13 πολυπεπτίδια που είναι μέρος του συστήματος της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (Anderson et al., 1981). Τα υπόλοιπα πρωτεϊνικά συστατικά του μιτοχονδρίου κωδικοποιούνται και μεταγράφονται από το πυρηνικό γονιδίωμα και ύστερα εισέρχονται στο μιτοχόνδριο (Reid et al., 1982).

~ 3 ~

Συνήθως, στους μύκητες και κατά αντιστοιχία με το γονιδίωμα του ανθρώπου και των ζώων, το mtDNA κωδικοποιεί τα δύο rRNA της μικρής (rns) και της μεγάλης (rnl) ριβοσωμικής υπομονάδας, κατά μέσο όρο 25 tRNAs, και τρεις υπομονάδες της κυτοχρωμικής οξειδάσης c (cox1, cox2, cox3) που συμμετέχουν στο σύμπλεγμα IV, το αποκυτόχρωμα b (cob) που συμμετέχει στο σύμπλεγμα III, εφτά υπομονάδες του συμπλέγματος της NADH αφυδρογονάσης (nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6) που συμμετέχουν στο σύμπλεγμα Ι, τρεις υπομονάδες της ΑΤP συνθετάσης (atp6, atp8, atp9) που συμμετέχουν στο σύμπλεγμα V. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1.2, το σύμπλεγμα Ι συμμετέχει στη μεταφορά των ηλεκτρονίων από το NADH στην ουμπικινόνη και στην άντληση των πρωτονίων από το στρώμα στη διαμεμβρανική περιοχή. Το σύμπλεγμα ΙΙΙ καταλύει την οξείδωση της ουμπικινόλης, την αναγωγή του κυτοχρώματος c και την μετάθεση των πρωτονίων. Το σύμπλεγμα ΙV είναι το τελευταίο ενζυμικό σύμπλεγμα του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων και καταλύει τη μεταφορά ηλεκτρονίων από το κυτόχρωμα c στο μοριακό οξυγόνο. Το σύμπλεγμα V μεταθέτει τα πρωτόνια από τη διαμεμβρανική περιοχή στο στρώμα και φωσφορυλιώνει ADP.

ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ

Σύμπλεγμα ΙΙ Σύμπλεγμα ΙΙΙ Σύμπλεγμα ΙV Σύμπλεγμα V Σύμπλεγμα Ι

Χώρος μεταξύ εσωτερικής NADH ATP Συνθετάση Αναγωγάση Κανάλι αφυδρογονάση (Escherichia coli) και εξωτερικής μεμβράνης φουμαρικού οξέος πρωτονίων μιτοχονδρίου

Μονάδα Εσωτερική μιτοχονδριακή F0 μεμβράνη

Μιτοχονδριακό στρώμα Μονάδα F1

Κυτοχρωμική αποκυτόχρωμα b οξειδάση C Βενζαμίδιο Φουμαρικό οξύ

NADH αφυδρογονάση

Εικόνα 1.2. Σχηματική απεικόνιση της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Φαίνονται τα συμπλέγματα I, II, III, IV και V που συμμετέχουν στην οξειδωτική φωσφορυλίωση και οι υπομονάδες τους, κάποιες από τις οποίες κωδικοποιούνται από το mtDNA. [Εικόνα από την βάση δεδομένων KEGG Pathways (http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00190.html)]

~ 4 ~

1.1.2 Η εξέλιξη των μιτοχονδρίων

Η μεγάλη ποικιλομορφία που παρουσιάζεται στην δομή των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων οδήγησε συχνά στην αμφισβήτηση της κοινής τους προέλευσης. Ωστόσο, όλες οι σύγχρονες απόψεις υποστηρίζουν την ενδοσυμβιωτική θεωρία, σύμφωνα με την οποία τα μιτοχόνδρια θεωρούνται απόγονοι ενός α-πρωτεοβακτηρίου που εδραιώθηκε ενδοκυτταρικά και συμβιωτικά σε ένα αναερόβιο και αυτότροφο πρόγονο ευκαρυωτικό οργανισμό (Martin και Muller 1998).

Η θεωρία αυτή διατυπώθηκε για πρώτη φορά το 1905 από το Mereschkowsky και ήρθε πάλι στο προσκήνιο το 1971 από την Margulis. Τα μιτοχόνδρια προήλθαν από την ενδοσυμβίωση ευβακτηρίων με πρωτόγονα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τα γονιδιώματα των αρχέγονων μιτοχονδρίων πρέπει αρχικά να περιείχαν όλα τα γονίδια που χρειάζονταν για την ανεξάρτητη διαβίωσή τους. Σταδιακά, πολλά από τα γονίδια αυτά μεταφέρθηκαν στον πυρήνα, όπου ενσωματώθηκαν στο κυτταρικό γονιδίωμα (Margulis, 1970, Adams και Palmer, 2003).

Σήμερα, είναι αποδεκτή η τμηματική ενδοσυμβιωτική θεωρία (Serial endosymbiosis theory- SET) (Margullis, 1981). Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, η εξέλιξη του ευκαρυωτικού κυττάρου από τους προκαρυώτες περιελάμβανε τη συμβιωτική ένωση πολλών προγενέστερων προγόνων. Τις προγονικές αυτές μορφές αποτελούσαν το κύτταρο-ξενιστής, που ήταν ένα αρχαιοβακτήριο και ένα ευβακτήριο, πρόγονος του μιτοχονδρίου. Το αρχαιοβακτήριο ήταν όμοιο με το σημερινό Thermoplasma (Margulis, 1996), που είναι ανθεκτικό σε υψηλές θερμοκρασίες και όξινες συνθήκες. Το κύτταρο ξενιστής δεν είχε φωτοσυνθετική ικανότητα ούτε ήταν ικανό να χρησιμοποιεί αποτελεσματικά το οξυγόνο.

Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε μία νέα εναλλακτική ενδοσυμβιωτική θεωρία για την προέλευση των μιτοχονδρίων που ονομάστηκε «υπόθεση υδρογόνου» (hydrogen hypothesis) (Martin και Μuller, 1998). Σύμφωνα με την θεωρία αυτή, το πρώτο ευκαρυωτικό κύτταρο δεν σχηματίστηκε τυχαία, αλλά ήταν αποτέλεσμα σκόπιμης ένωσης μεταξύ ενός μεθανιογόνου αρχαιοβακτηρίου (κυττάρου-ξενιστή), που κατανάλωνε υδρογόνο και διοξείδιο του άνθρακα για την παραγωγή μεθανίου και ενός α-πρωτεοβακτηρίου το οποίο ήταν ο μελλοντικός μιτοχονδριακός συμβιώτης, που απέβαλε υδρογόνο και διοξείδιο του άνθρακα ως προϊόντα του αναερόβιου μεταβολισμού (Burger et al., 2003b). Έτσι, ενώ ο συμβιώτης είχε πιθανόν ικανότητα στην αναερόβια αναπνοή, η συμβίωση άρχισε ως αποτέλεσμα των προϊόντων του αναερόβιου μεταβολισμού. Η εξάρτηση του ξενιστή από το υδρογόνο που παρήγαγε ο συμβιώτης αναγνωρίστηκε ως η αρχή επιλογής που σταθεροποίησε τον ικανό πρόγονο των ευκαρυωτικών οργανισμών.

Άσχετα από τη θεωρία, όλοι συμφωνούν πως τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα θεωρούνται εξελικτικά μονοφυλετικής προέλευσης, λόγω (α) των ίδιων μιτοχονδριακά κωδικοποιούμενων

~ 5 ~

γονιδίων και (β) του γεγονότος ότι οι πυρηνικά κωδικοποιούμενες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες εισέρχονται με τον ίδιο τρόπο στο μιτοχόνδριο (Gray et al., 1999, Lang et al., 1999, Salinas- Giegé et al., 2015). Αναλυτικότερα, οι περισσότερες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα σε πρόδρομη μορφή. Με την βοήθεια κυτταροπλασματικών συνοδών- πρωτεϊνών οι πρόδρομες μορφές μεταφέρονται στο σύμπλεγμα TOM του μιτοχονδρίου απ’ όπου στη συνέχεια ταξινομούνται σε κάποιο από τα κυτταρικά διαμερίσματα του μιτοχονδρίου. Τα πρόδρομα μόρια των πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης, που παίρνουν δομή β-βαρελιών, απαιτούν την συμμετοχή του συμπλόκου SAM. Πρόδρομες πρωτεΐνες που προορίζονται για το μιτοχονδριακό στρώμα εξαρτώνται από τα σύμπλοκα TIM23 (τρανσλοκάση) και PAM, ώστε να διαπεράσουν την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Oι πρωτεΐνες που προορίζονται για την εσωτερική μεμβράνη τοποθετούνται στην θέση τους με την βοήθεια του συμπλέγματος TIM22 (Gray et al., 1999, Lang et al., 1999, Shaw και Nunnari 2002, Andersson et al., 2003, Truscott et al., 2003).

Είναι αδιαμφισβήτητο το γεγονός πως τα περισσότερα γονίδια του συμβιωτικού α- πρωτεοβακτηρίου που αποτέλεσε τον πρόγονο των μιτοχονδρίων είτε μεταφέρθηκαν στον πυρήνα ή χάθηκαν γιατί οι αντίστοιχες ανάγκες του οργανιδίου καλύφθηκαν από ήδη υπάρχοντα γονίδια στον πρόδρομο ευκαρυώτη (Gray et al., 1999, Lang et al., 1999). Χαρακτηριστικό παράδειγμα ζωντανής απόδειξης αυτής της μετακίνησης των γονιδίων από το μιτοχόνδριο στον πυρήνα αποτελεί η έλλειψη γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες της αναπνευστικής αλυσίδας από το μιτοχόνδριο φυτικών παρασιτικών ειδών του γένους Viscum (Petersen et al., 2015).

Η μετακίνηση όμως γονιδίων από το μιτοχονδριακό γονιδίωμα στον πυρήνα, κατά την εξέλιξη των οργανισμών, δεν ήταν/είναι μονόδρομος. Ήδη στα φυτά έχει αποδειχθεί πως τα μιτοχονδριακό γονιδίωμα μπορεί να είναι μωσαϊκό με τμήματα DNA που έχουν προέλθει κυρίως από τους χλωροπλάστες αλλά κάποιες φορές και από τον πυρήνα, όπως στην περίπτωση των Αγγειόσπερμων (βλέπε ανασκόπηση Knoop, 2004 και αναφορές εντός αυτής).

Προκειμένου να γίνουν οι όποιες αλλαγές από και προς το μιτοχονδριακό γονιδίωμα είναι σαφές πως πρέπει να έχουμε κάποιας μορφής ανακατάταξη: αναστροφή, μετατόπιση, ανάστροφη μετατόπιση, τυχαίος διπλασιασμός με τυχαία απώλεια (Εικόνα 1.3, Bernt et al., 2013).

Επομένως, λόγω του φαινομένου της ενδοσυμβίωσης και της περαιτέρω εξέλιξης του γονιδιώματος μέσα στο χρόνο, είναι αναμενόμενο πως το μιτοχονδριακό γονιδίωμα παρουσιάζει ποικιλόμορφη οργάνωση από οργανισμό σε οργανισμό με χαρακτηριστικά που θα αναλυθούν παρακάτω και αποτελούν ενδιάμεσα στοιχεία ενός προκαρυωτικού και ευκαρυωτικού γονιδιώματος.

~ 6 ~

Εικόνα 1.3. Σχηματική αναπαράσταση των τύπων των βασικών ανακατατάξεων σε γενικευμένο παράδειγμα πέντε γονιδίων: από αριστερά προς τα δεξιά δίνεται η αναστροφή, η μετατόπιση, η ανάστροφη μετατόπιση και ο τυχαίος διπλασιασμός με τυχαία απώλεια. (Αναδημοσίευση της εικόνας από την εργασία Bernt et al., 2013 – Mol Phylogenet Evol 69: 328-338, Fig. 3).

1.1.3 Η οργάνωση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων

Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα στους οργανισμούς εντός της Επικράτειας Ευκάρυα μπορεί να διαφέρει τάξεις μεγέθους. Αναλυτικότερα, το μέγεθος του κυμαίνεται από τα γιγαντιαία mtDNAs των φυτών όπως του αγγουριού ( 1.6 Mb, Alverson et al., 2011) και του αγριολούλουδου Silene conica ( 11 Mb, Sloan et al., 2012) έως τα μικροσκοπικά γονιδιώματα ∼ των παρασίτων του φύλου Απικόμπλεξα (Αpicomplexans, 6 Kb, Hikosaka et al., 2010) ή του ∼ ακόμα μικρότερου κατακερματισμένου mtDNA του συγγενικού τους Chromera velia (Petersen ∼ et al., 2014).

Η ποικιλομορφία αυτή οφείλεται σε μη κωδικές διαγονιδιακές περιοχές που ποικίλλουν από το 1% έως το 99% του mtDNA (Sloan et al., 2012) και στην ύπαρξη (ή απουσία) εσωνίων (Smith και Keeling, 2015). Για παράδειγμα, τα μικρά γονιδιώματα των σπονδυλοζώων ή των απικόμπλεξα είναι πολύ πυκνά με πολύ μικρές διαγονιδιακές περιοχές χωρίς εσώνια, εν αντιθέσει με τα μεγάλα γονιδιώματα όπως αυτά των φυτών Cucumis sativus και S. conica όπου οι διαγονιδιακές τους περιοχές είναι πολύ μεγάλες (με επαναλήψεις και μεταθετά στοιχεία) και τα εσώνια είναι άφθονα. Ειδικότερα για τα μεταθετά στοιχεία, στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα ο αριθμός τους ποικίλλει από 0% (π.χ. ο άνθρωπος – Anderson et al., 1981) έως 61% (στην Podospora anserina – Cummings et al., 1990). Υπάρχουν μιτοχονδριακά γονίδια όπως στην cox1 του βασιδιομύκητα Agaricus bisporus που εμπεριέχουν μέχρι και 19 εσώνια και το καθιστούν ως το πιο πλούσιο γονίδιο σε εσώνια σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα (Férandon et al., 2013). Οι μορφές των εσωνίων μπορούν να είναι ακόμα πιο ποικιλόμορφες με την παρουσία «διδύμων εσωνίων» (twintrons) όπως στις περιπτώσεις των μυκήτων Hypomyces aurantius (Deng et al., 2016) Ophiostoma novo-ulmi (Hafez et al., 2013) ή στο εσώνιο του γονιδίου nad1 του Τραχειόφυτου Selaginella moellendorffii όπου εντοπίζεται το γονίδιο nad4L (Hecht et al., 2011).

Όσον αφορά τη σύσταση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, ήδη έχει περιγραφεί για τον άνθρωπο, τα θηλαστικά, τα φυτά και τους μύκητες νωρίτερα. Παρόλα αυτά, αξίζει να

~ 7 ~

σημειωθεί πως και για τη σύσταση μπορούμε να βρούμε ακραίες περιπτώσεις ποικιλομορφίας όπως είναι οι περιπτώσεις του πρώτιστου Andalucia godoyi με 100 γονίδια εκ των οποίων 66 κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Burger et al., 2013), των δινομαστιγωτών και των απικομπλεξα με ∼ τρία ή λιγότερα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και καθόλου tRNAs ή και rRNAs (Waller και Jackson, 2009, Hikosaka et al., 2010, Petersen et al., 2014).

Λαμβάνοντας αυτές τις ιδιαιτερότητες υπόψη μας, έμφαση θα δοθεί σε αυτή την εργασία στην ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στο Βασίλειο των μυκήτων όπου η σχετική πληροφορία μέχρι τώρα αναλύεται εν συντομία στο παρακάτω κεφάλαιο.

1.1.4 Η οργάνωση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες

Οι μεγάλες διακυμάνσεις που παρατηρούνται στο μέγεθος των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες και όχι μόνο, έρχονται σε αντίθεση με την συντηρητικότητα των κωδικοποιούμενων μορίων, ακόμα και σε κοντινές φυλογενετικά ομάδες (Burger et al., 2003a, Clark-Walker et al., 1992, Lang et al., 1999). Εντός του υποφύλου Pezizomycotina ο μύκητας Chaetomium thermophilum var. thermophilum εμφανίζει mtDNA με μέγεθος 127,2kb (Amlacher et al., 1990), ενώ στα Lecanicilium muscarium και Metarhizium anisopliae το μέγεθος περιορίζεται στις 24,4kb (Kouvelis et al., 2004) και 24,6kb αντίστοιχα (Ghikas et al., 2006). Η διακύμανση αυτή δεν αφορά σε ποιοτικές αλλαγές των γονιδίων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, καθώς το μέγεθος των γονιδίων παραμένει σχετικά όμοιο στα διάφορα είδη, αλλά κατά κύριο λόγο σε διαφορές στο μήκος και την οργάνωση των διαγονιδιακών περιοχών και στα εσώνια που είναι είτε ομάδας Ι είτε ομάδας ΙΙ. Στις διαγονιδιακές περιοχές, σε κάποιες περιπτώσεις εμφανίζονται διαδοχικές επαναλήψεις αλληλουχιών στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα (Misas et al., 2016), αλλά και δευτερογενείς δομές μίσχου-θηλειάς (Paquin και Lang, 1996).

Τα πρωτεϊνικά μόρια που κωδικοποιούνται από μιτοχονδριακά γονίδια χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο για ταυτοποιήσεις στελεχών, ενδο-ειδικές και δια-ειδικές ποικιλομορφίες και φυλογενετικές ή εξελικτικές μελέτες (Krenzer και Bruns, 1999, Yokoyama et al., 2001)

Ενδιαφέρον χαρακτηριστικό των mtDNAs των μυκήτων και των φυτών, είναι ο υψηλός αριθμός εσωνίων που φέρουν. Τα εσώνια αυτά αυτοκαταλύουν το μάτισμά τους και ανήκουν στις ομάδες Ι και ΙΙ (Michel et al., 1982, Michel et al., 1989, Cech, 1990, Michel και Ferat, 1995). Πιο αναλυτικά, τα εσώνια της ομάδας Ι αν και παρουσιάζουν σημαντική ετερογένεια ως προς την πρωτοταγή δομή τους εμφανίζουν εξαιρετικά συντηρημένες δευτεροταγείς δομές στις οποίες βασίζεται και το μάτισμα (Εικόνα 1.4). Τα εσώνια της ομάδας αυτής εμφανίζουν τα δομικά μοτίβα P, Q, R και S. Επίσης, η τελευταία βάση του εξωνίου, άμεσα ανοδικά της 5’ θέσης συρραφής του εσωνίου είναι U και η τελευταία βάση του εσωνίου που ακολουθεί τη 3’ θέση συρραφής είναι G (Pantou et al., 2003). Για την αντίδραση της αυτοκατάλυσης απαιτείται σαν

~ 8 ~

συμπαράγοντας ένα μόριο γουανοσίνης, το οποίο δεν αποτελεί μέρος της νουκλεοτιδικής αλυσίδας. Τα εσώνια της ομάδας ΙΙ παρουσιάζουν διαφορετικό μηχανισμό αναδίπλωσης και ματίσματος. Διατηρούν ακτινωτά έξι δομές μίσχου θηλειάς και περιέχουν συχνά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης για πρωτεΐνες που εμφανίζουν ομοιότητα με αντίστροφες μεταγραφάσες και συμμετέχουν στην εκτομή επιτυγχάνοντας τις διαδικασίες αυτοκατάλυσης (Michel και Lang 1985). Και τα εσώνια της ομάδας Ι έχουν βρεθεί να περιέχουν ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης για ενδονουκλεάσες κυρίως των ομάδων LAGLI-DADG και GIY-YIG (Saguez et al., 2000). H πιο χαρακτηριστική περίπτωση εσωνίου στους μύκητες, είναι αυτή του εσωνίου της rnl, που συνήθως φέρει ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που κωδικοποιεί τη ριβοσωμική πρωτεΐνη Rps3 (Cummings et al., 1990, Bullerwell et al., 2000, Kouvelis et al., 2004).

Εικόνα 1.4. Η δομή στο επίπεδο δυο εσωνίων της ομάδας Ι του Metarhizium anisopliae, a: Ma-int4 (εσώνιο 4 στο γονίδιο 18S/28S), b: Ma-int5 (εσώνιο 5 στο γονίδιο 18S/28S) (Pantou et al., 2003).

Έχει διαπιστωθεί ότι συγκεκριμένα γονίδια όπως τα cob, cox1 και rnl συγκεντρώνουν υψηλό αριθμό εσωνίων, ενώ τα nad3, atp9, και cox2 φέρουν πιο σπάνια εσώνια σε συντηρημένες αλληλουχίες εισδοχής (Kouvelis et al., 2004). Τα εσώνια του μιτοχονδριακού γονιδιώματος εμφανίζουν κοινές θέσεις εισδοχής και ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης όπως επίσης και παρόμοιο μέγεθος (Lang et al., 2007, Clark-Walker et al., 1992). Παρουσιάζουν όμως και διαφορές ιδιαίτερα χρήσιμες στην διαφοροποίηση των ειδών και την κατανόηση των εξελικτικών τους

~ 9 ~

σχέσεων (Zimmerly et al., 2001, Pantou et al., 2008, Pramateftaki et al., 2008). Το εσώνιο του rnl γονιδίου εντοπίζεται στην κεντρική θηλειά της λειτουργικής περιοχής V, στη δευτερογενή δομή της rnl (Κochel και Kuntzell 1982, Fields και Gutell 1996, Kouvelis et al., 2004). Η παρουσία παρόμοιων εσωνίων στις ίδιες θέσεις ομόλογων γονιδίων σε απομακρυσμένα είδη αποτελεί ένδειξη για οριζόντια μεταφορά γενετικού υλικού μεταξύ μιτοχονδρίων ή μεταφορά υλικού από οργανισμό σε οργανισμό (Lang, 1984), ενώ ένδειξη για την οριζόντια μεταφορά γενετικού υλικού ανάμεσα σε μιτοχονδριακό και μη μιτοχονδριακό DNA αποτελεί η ομοιότητα των αλληλουχιών εσωνίων που εντοπίζονται σε αυτές τις δύο δεξαμενές γενετικού υλικού (Lonergan και Gray 1994, Burger et al., 1999).

Στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα τόσο των ασκομυκήτων όσο και των υφομυκήτων εντοπίζονται παραδοσιακά 20-27 μόρια tRNAs, τα οποία συνήθως καλύπτουν τις απαιτήσεις για την σύνθεση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών. Υπάρχουν οργανισμοί που περιέχουν όλα τα είδη των tRNAs ώστε να καλύπτουν το σύνολο των κωδικονίων, αλλά και άλλα τα οποία δεν κωδικοποιούν ένα ή παραπάνω είδη tRNAs (π.χ. Lecanicillium muscarium - Kouvelis et al., 2004 ή Metarhizium anisopliae - Ghikas et al., 2006). Αρκετά παραδείγματα υπάρχουν επίσης σε μέλη των Χυτριδιομυκήτων που παρουσιάζουν μόνο 8 είδη tRNAs, πιθανώς λόγω απώλειας των υπολοίπων σε κάποιο κοινό πρόγονο στη βάση της εξελικτικής γραμμής των μυκήτων αυτών, γεγονός που αποδεικνύει ότι η παραπάνω ομάδα μυκήτων είναι πιο πρωτόγονη (Paquin et al., 1997). Στις περιπτώσεις αυτές τα μόρια που απουσιάζουν θεωρείται ότι εισέρχονται στο μιτοχόνδριο από το κυτταρόπλασμα (Takano et al., 2001) ή εναλλακτικά, κάποια από τα υπάρχοντα tRNAs υφίστανται μεταμεταγραφικές τροποποιήσεις, όπως στον κατώτερο μύκητα Spizellomyces punctatus στον οποίο εντοπίζονται μόνο οχτώ tRΝΑs (Laforest et al., 1997). Σημαντική είναι και η διασπορά των trn γονιδίων στο γονιδίωμα, καθώς συνήθως οργανώνονται σε ομάδες (Cummings et al., 1990, Sakito et al., 1995, Kouvelis et al., 2004). Τα διασκορπισμένα μεμονωμένα γονίδια θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στην λήξη της μεταγραφής (Breitenberger et al., 1985), ενώ ταυτόχρονα συμβάλλουν στην αλλαγή της γονιδιακής σειράς και την ποικιλομορφία μεταξύ των μυκήτων, ακόμα και συγγενικών ειδών με παρόμοιο μέγεθος mtDNA, μέσω ομόλογων γενετικών ανασυνδυασμών. Δηλαδή, τα trn γονίδια θεωρούνται ως θέσεις ανασυνδυασμού όταν βρίσκονται μεμονωμένα, εκατέρωθεν γονιδίων (Breitenberger et al., 1985, Schäfer 2003).

Η αλληλουχία του mtDNA είναι πλούσια σε Αδενίνη και Θυμίνη (>60%), μη μεθυλιωμένη, συντηρητική σε ότι έχει να κάνει με τις λειτουργίες των γονιδιακών προϊόντων και βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα (Cambell et al., 1999). Το ποσοστό αυτό (Α/Τ) αυξάνεται ακόμη περισσότερο όταν εξετάζεται η παρουσία των νουκλεοτιδίων αυτών στην τρίτη θέση του κωδικωνίου. Η τρίτη θέση του κωδικονίου παρουσιάζει έντονη προτίμηση ως προς την σύστασή της με τάση να αποφεύγεται το νουκλεοτίδιο G (Reyes et al., 1998, Saccone et al., 2002). Η εξελικτική πίεση προς αυτή τη κατεύθυνση είναι τόσο έντονη, ώστε οι τροποποιήσεις του γενετικού κώδικα των

~ 10 ~

μιτοχονδρίων να ερμηνεύονται βάσει αυτής της παρατήρησης. Ο γενετικός κώδικας των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων παρουσιάζει παρεκκλίσεις. Αυτές φαίνεται να οφείλονται στην πρωτοταγή δομή του mtDNA, δηλαδή στο αυξημένο ποσοστό των βάσεων A και T, τόσο εντός των γονιδίων όσο και στις διαγονιδιακές περιοχές (Saccone et al., 2002, Pantou et al., 2006). Αλλαγές που ισχύουν για κάποιες ομάδες μυκήτων και φαίνεται να έγιναν νωρίς στην πορεία της εξέλιξης είναι η μετατροπή του UGA από κωδικόνιο λήξης σε κωδικόνιο τρυπτοφάνης, καθώς και η αλλαγή του ΑUA από κωδικόνιο ισολευκίνης, σε κωδικόνιο μεθειονίνης. Στην πρώτη περίπτωση, λόγω σπανιότητας του κωδικονίου UGG, που κανονικά κωδικοποιεί για τρυπτοφάνη στην κωδική αλυσίδα των μιτοχονδρίων, ένα από τα κωδικόνια λήξης παίρνει την θέση του. Στην δεύτερη περίπτωση, προτιμάται το κωδικόνιο ΑUA έναντι του AUG αφού το δεύτερο παρουσιάζει στην τρίτη θέση το νουκλεοτίδιο G. Οι παραπάνω τροποποιήσεις δεν αφορούν όλους τους μύκητες. Για τους μύκητες Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomycetales) και Allomyces macrogynus (Chytridiomycota) ισχύει ο παγκόσμιος γενετικός κώδικας (Lang et al., 1987, Paquin και Lang 1996). Στους Schizosaccharomyces japonicus και Schizosaccharomyces octosporus σύμφωνα με εργασία των Bullerwell και συνεργατών το 2003 ισχύει μόνο η τροποποίηση του κωδικονίου λήξης σε τρυπτοφάνη. Στο υπόφυλο Pezizomycotina αν και πιο συχνά συναντάται η πρώτη τροποποίηση, κάποια από τα πλαίσια ανάγνωσης των εσωνίων διατηρούν σαν κωδικόνιο έναρξης το AUA (Bullerwell et al., 2003).

Μέχρι σήμερα σε μυκητιακά mtDNA σε αντίθεση με τα αντίστοιχα των φυτών, δεν έχουν βρεθεί αντίγραφα γονιδίων tRNA που να φέρουν το ίδιο αντικωδικόνιο. Εξαίρεση αποτελεί το mtDNA της Hansenula wingei το οποίο φέρει τρία tRNAs που έχουν ως αλληλουχία αντικωδικονίου CAT. Είναι πιθανό πως ένα από τα τρία tRNAs αποκωδικοποιεί το κωδικόνιο ΑUA για ισολευκίνη μέσω μετα-μεταγραφικής τροποποίησης (Sakito et al., 1995). Οι περισσότερες ζύμες έχουν διαφοροποιημένο γενετικό κώδικα, πέρα από το ότι το κωδικόνιο UGA κωδικοποιεί για το αμινοξύ Τρυπτοφάνη και δεν αποτελεί κωδικόνιο λήξης. Tο κωδικόνιο ΑUA κωδικοποιεί για Μεθειονίνη, τα κωδικόνια CUU, CUC, CUA, CUG κωδικοποιούν για Θρεονίνη και κωδικόνια CGA και CGC δεν υπάρχουν.

Τα rRNA μόρια μπορούν να σχηματίσουν παρόμοιες δευτεροταγείς δομές ακόμη και σε περιπτώσεις που οι αλληλουχίες τους δείχνουν ομοιότητα μικρότερη και από 50%. Σε όλες τις περιπτώσεις η βάση Α συμμετέχει μόνο ως ελεύθερη βάση και όχι σε έλικες ή άλλες δομές (Gutell et al., 2000). Πολλές φυλογενετικές μελέτες έχουν βασιστεί σε μιτοχονδριακά γονίδια, όπως της κυτοχρωμικής οξειδάσης 1 (cox1), του αποκυτοχρώματος b (cob) και της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας (rns). Εισδοχές/ελλείψεις αλληλουχιών σε διάφορα τμήματα της rns σε είδη του Pleurotus έδειξαν ότι οι παραπάνω αλλαγές δεν είναι τυχαίες αλλά σύμφωνα με την δευτεροταγή δομή, εντοπίζονται σε θηλιές που δεν συμμετέχουν άμεσα στη συγκρότηση της δευτεροταγούς δομής της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας (Gonzales και Labarere, 2000).

~ 11 ~

1.2. Οι μηχανισμοί συντήρησης και ρύθμισης της έκφρασης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος

Η μιτοχονδριακή έκφραση ρυθμίζεται από ένα συνδυασμό μηχανισμών όπως έχει αποδειχθεί τόσο στον άνθρωπο, όσο και στις ζύμες (Lipinski et al., 2010, Ciesielski et al., 2016, Young και Copeland, 2016). Αναλυτικότερα, ο έλεγχος του αριθμού αντιγράφων του mtDNA, η αντιγραφή αλλά και η έναρξη και τερματισμός της μεταγραφής του mtDNA, η σταθερότητα των mRNA αντιγράφων και τέλος η σταθερότητα των υπομονάδων των αναπνευστικών αλυσίδων έχουν δείξει πως είναι βασικοί παράγοντες για τη διατήρηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και κατ’ επέκταση ολόκληρου του μιτοχονδρίου (Lipinski et al., 2010).

1.2.1 Η αντιγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος

Μέχρι σήμερα, κατά κύριο λόγο, η αντιγραφή έχει μελετηθεί εκτεταμένα στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα του ανθρώπου και του Saccharomyces cerevisiae (βλέπε ανασκοπήσεις Young και Copeland, 2016 και Lipinski et al., 2010, αντίστοιχα). Οι επιστήμονες πίστευαν ότι η αντιγραφή στο μιτοχονδριακό DNA λόγω του ότι είναι συνήθως κυκλικό DNA συμβαίνει με τον μηχανισμό της θ αντιγραφής (Hiasa και Marians, 1996). Η επιμήκυνση συνεπάγεται ξετύλιγμα της διπλής έλικας του μητρικού DNA μια διαδικασία εφικτή μόνο στα γραμμικά μόρια. Στην κλειστή κυκλική δομή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος θεωρείται ότι η αντιγραφή δημιουργεί θετικές υπερέλικες στην αδιπλασίαστη περιοχή του μορίου. Όμως με βάση άλλες μελέτες το μιτοχονδριακό DNA φαίνεται να αντιγράφεται με τον μηχανισμό του κυλιόμενου κύκλου (rolling circle) (Maleszka et al., 1991, Maleszka και Clark-Walker, 1992, Bendich, 1993, Bendich, 1996, Ling και Shibata, 2002).

Στα ανθρώπινα μιτοχόνδρια, η αντιγραφή αρχίζει από ένα ειδικό σημείο του κυκλικού δίκλωνου DNA. Οι δύο αλυσίδες του mtDNA έχουν διαφορετική πυκνότητα επειδή οι βάσεις είναι άνισα κατανεμημένες σε κάθε αλυσίδα. Η μία αλυσίδα, αυτή που περιέχει περισσότερες βάσεις γουανίνης, ονομάζεται βαριά (Η, Heavy), ενώ η άλλη αλυσίδα, αυτή που περιέχει περισσότερες βάσεις κυτοσίνης, ονομάζεται ελαφριά (L, Light). Αρχικά, η έναρξη απαιτεί ξετύλιγμα των αλυσίδων του DNA (Shadel, 1999), ενώ μόνο η μία από τις προγονικές αλυσίδες (η βαριά Η αλυσίδα στο mtDNA) χρησιμοποιείται ως καλούπι για σύνθεση μίας νέας αλυσίδας (σύνθεση του πρωταρχικού τμήματος RNA από μία πριμάση και επιμήκυνση από DNA πολυμεράση γ) (Lecrenier και Foury, 2000). Η σύνθεση προχωρεί για ένα μικρό διάστημα εκτοπίζοντας τη συμπληρωματική προγονική αλυσίδα (L αλυσίδα), η οποία παραμένει σε μονόκλωνη κατάσταση. Η εικόνα που έχει το μόριο σε αυτό το στάδιο αποδίδεται με τον όρο D loop (displacement loop, θηλειά εκτόπισης, βρόχος D). Καθώς προχωρεί η σύνθεση της αλυσίδας που είναι συμπληρωματική προς την προγονική Η αλυσίδα, μεγαλώνει και η θηλειά εκτόπισης της προγονικής L αλυσίδας. Όταν έχει διανυθεί απόσταση περίπου ίση με τα δύο τρίτα του κύκλου, αποκαλύπτεται το σημείο έναρξης στην εκτοπισμένη L αλυσίδα. Σ΄ αυτό το

~ 12 ~

σημείο γίνεται έναρξη σύνθεσης μίας νέας Η αλυσίδας προς αντίθετη κατεύθυνση από αυτή της σύνθεσης της νέας L αλυσίδας (Clayton, 2003). Εξαιτίας αυτού του μηχανισμού έναρξης, η σύνθεση της νέας Η αλυσίδας τελειώνει μετά τη σύνθεση της νέας L αλυσίδας. Το μοντέλο αυτό (Εικόνα 1.5) είναι γνωστό ως «ασύμμετρη» αντιγραφή (Clayton, 2003, Brown et al., 2005).

Εικόνα 1.5. Σχηματική απεικόνιση της «ασύμμετρης αντιγραφής». Η αντιγραφή της H αλυσίδας ξεκινά

από τη θέση OH και συνεχίζεται προς τη θέση OL (A και B). Η αντιγραφή της L αλυσίδας ξεκινά (D). Η αντιγραφή της H αλυσίδας ολοκληρώνεται και έπεται ο διαχωρισμός (E). Η ατελής θυγατρική αλυσίδα αντιγράφεται και ολοκληρώνεται η αντιγραφή της L αλυσίδας (F). Η ελαφριά και βαριά αλυσίδα διαχωρίζονται από το διαφορετικό πάχος της γραμμής. Η κατεύθυνση της αντιγραφής της Η και της L αλυσίδας υποδηλώνεται με πράσινο και μπλε βέλος, αντίστοιχα. Τα μονόκλωνα τμήματα της Η αλυσίδας δείχνονται με κόκκινη γραμμή. (Bernt et al., 2013).

Ο μηχανισμός της αντιγραφής στα μιτοχόνδρια των ζυμομυκήτων είναι ακόμα μερικώς υποθετικός. Οι θέσεις έναρξης της mtDNA αντιγραφής στα θηλαστικά και οι θέσεις έναρξης της μιτοχονδριακής αντιγραφής στις ζύμες έχουν δομική ομολογία και ομολογία στην αλληλουχία, δίνοντας την εντύπωση ότι μάλλον και το mtDNA στις ζύμες αντιγράφεται με

~ 13 ~

παρόμοιο τρόπο. Πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει ότι πέρα από τις ζύμες, ο ίδιος μηχανισμός αντιγραφής φαίνεται να ισχύει και σε άλλους μύκητες του Φύλου των Ασκομυκήτων, όπως στον Schizosaccharomyces pombe και στην Neurospora crassa (Maleszka και Clark-Walker, 1992).

Η διατήρηση της λειτουργικότητας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι αναγκαία για τους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Μεταλλαγές στο μιτοχονδριακό DNA (mt DNA) μπορούν να επηρεάσουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση και να προκαλέσουν ανθρώπινες ασθένειες και γήρανση των οργανισμών (Wallace, 1992). Η συντήρηση του mtDNA κατά την διάρκεια της ζωής του κυττάρου απαιτεί μηχανισμούς αντιγραφής και επιδιόρθωσης αλλά και έκφρασης του γονιδιώματος του οργανιδίου. Οι βασικές αρχές της αντιγραφής στους μύκητες έχουν διευκρινιστεί κυρίως από τον Saccharomyces cerevisiae. Επομένως, οι ζύμες χρησιμοποιούνται για μελέτη της μιτοχονδριακής αντιγραφής ως οργανισμοί μοντέλα. Αξίζει να σημειωθεί, ότι πολλοί πυρηνικοί παράγοντες που στοχεύουν στην διατήρηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος έχουν διατηρηθεί κατά την διάρκεια της εξέλιξης.

Η ακεραιότητα του mtDNA όσον αφορά την γενετική μιτοχονδριακή πληροφορία πρέπει να διατηρείται για να διασφαλιστεί η παραγωγή ενέργειας του κυττάρου. Το λειτουργικό τμήμα του mtDNA απαιτεί ένα μεγάλο αριθμό παραγόντων που εμπλέκονται στην γενετική έκφραση, στην αντιγραφή του mtDNA, στην επιδιόρθωση και στην διατήρηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Αυτές οι διαδικασίες ελέγχονται από τον πυρήνα του κυττάρου, επειδή η πλειοψηφία των μιτοχονδριακών πρωτεινών [95-98%] κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια, όπως η DNA πολυμεράση γ και η μιτοχονδριακή RNA πολυμεράση, και εισάγονται μέσα στα μιτοχόνδρια μέσω των πεπτιδικών σινιάλων που διαθέτουν στο αμινικό άκρο τους (Neupert, 1997).

Ο Saccharomyces cerevisiae παρουσιάζει 7 με 8 ori/rep περιοχές εκ των οποίων τρείς ή τέσσερις είναι ενεργές. Μεταγραφή πραγματοποιείται στις 1,2,3 και 5. Κάθε ori/rep περιοχή αποτελείται από τις περιοχές Α,Β,C οι οποίες είναι πλούσιες σε Γουανίνη και Κυτοσίνη ενώ ανάμεσά τους υπάρχουν δύο περιοχές πλούσιες σε Αδενίνη και Θυμίνη. Η περιοχή έχει μήκος περίπου 300 νουκλεοτίδια ενώ ο υποκινητής εντοπίζεται πριν την περιοχή C. Οι αρχές (origins) της αντιγραφής του mtDNA των θηλαστικών και οι ori/rep ακολουθίες των ζυμών έχουν ομόλογες δομικές αλληλουχίες, ενισχύοντας την ιδέα ότι η αντιγραφή του mtDNA στις ζύμες γίνεται με τον ίδιο τρόπο. Η εξαρτώμενη από την μεταγραφή έναρξη της μιτοχονδριακής αντιγραφής στις ζύμες στις ori/rep ακολουθίες έχει προταθεί κατά αναλογία με αυτό που συμβαίνει στα θηλαστικά (Clayton, 1991, Chang και Clayton, 1985), ενώ το μοντέλο αυτό υποστηρίζεται και από κάποιες βιοχημικές ενδείξεις.

~ 14 ~

1.2.2. Η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος

1.2.2.1. Η μεταγραφή του mtDNA στον άνθρωπο

Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς σχεδόν όλες οι κυτταρικές διεργασίες ελέγχονται μέσα από την ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων που φέρει το πυρηνικό γονιδίωμα. Η ύπαρξη των μιτοχονδρίων που φέρουν το δικό τους γονιδίωμα το οποίο κωδικοποιεί γονίδια που συμμετέχουν σε διαδικασίες μεταβολισμού ενέργειας και βιοσύνθεσης μακρομορίων προσθέτει επιπλέον πολυπλοκότητα στο σύστημα αυτό. Από την στιγμή που οι παραπάνω διαδικασίες απαιτούν την ύπαρξη γονιδίων που κωδικοποιούνται και από τον πυρήνα και από τα μιτοχόνδρια, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς για την σύνδεση μεταξύ των δύο αλλά και δυναμικές διεργασίες εντός του κυττάρου (Blomain et al., 2012). Η ρύθμιση της μεταγραφής του μιτοχονδριακού γονιδιώματος από τον πυρήνα ενδέχεται να δίνει στο κύτταρο την δυνατότητα να συντονίζει την παραγωγή των μιτοχονδριακά και πυρηνικά κωδικοποιούμενων υπομονάδων του συστήματος της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης προκειμένου να επιτευχθεί η απαραίτητη στοιχειομετρία. Ένα άλλο παράδειγμα αποτελεί η αυξημένη βιοσυνθετική αντίδραση των μιτοχονδρίων κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου προκειμένου να παρέχουν στο κύτταρο τα απαραίτητα «δομικά υλικά».

Σε ότι έχει να κάνει με τον άνθρωπο νέα δεδομένα από κλινικές μελέτες, στις οποίες η ρύθμιση της μετάφρασης του mtDNA έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων, αναδεικνύουν την σημασία της μελέτης της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης του mtDNA (Skrtic et al., 2011). Η συμμετοχή των μιτοχονδρίων στην οξειδωτική φωσφορυλίωση μέσω της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων είναι από τις πιο καλά μελετημένες λειτουργίες του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Πέρα από τις περιοχές του mtDNA που μεταγράφονται υπάρχουν και μη κωδικές ρυθμιστικές περιοχές που έχουν μήκος 1.1 kb (Anderson et al., 1981). Η ακριβής λειτουργία της περιοχής αυτής δεν είναι πλήρως χαρακτηρισμένη είναι όμως γνωστό ότι φέρει την περιοχή του διπλασιασμού του mtDNA και περιοχές υποκινητών (Chang et al., 1984, Tiranti et al., 1997). Η μεταγραφή ξεκινάει στην μια από τις δύο θέσεις υποκινητών στην βαριά αλυσίδα (HSP1 και HSP2) και από έναν υποκινητή στην ελαφριά αλυσίδα (LSP) (Montoya et al., 1982). Όπως η πλειοψηφία των πρωτεϊνών που βρίσκονται στο μιτοχόνδριο, έτσι και οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αντιγραφή και μεταγραφή του mtDNA δεν κωδικοποιούνται από αυτό αλλά από τον πυρήνα και εισέρχονται στη συνέχεια στο οργανίδιο. Η μεταγραφή του mtDNA πραγματοποιείται από την πολυμεράση POLRMT/mtRNAP η οποία αποτελείται από μια υπομονάδα και παρουσιάζει υψηλή ομοιότητα στην αλληλουχία με τις πολυμεράσες της γενιάς των Τ- βακτηριοφάγων (Cermakian et al., 1997, Tiranti et al., 1997, Shutt et al., 2006).

~ 15 ~

Γονίδια εντοπίζονται και στην βαριά (Η) και στην ελαφριά (L) αλυσίδα. Η βαριά αλυσίδα κωδικοποιεί δύο rRNA, δώδεκα mRNA και δεκατέσσερα tRNA, ενώ η ελαφριά κωδικοποιεί ένα mRΝΑ και οχτώ tRNA (Bestwick et al., 2013). Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω η μεταγραφή του ανθρώπινου μιτοχονδριακού γονιδιώματος ξεκινά από τρείς υποκινητές και έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία πολυσιστρονικών μεταγράφων (Bonawitz et al., 2006). Τα μετάγραφα που προκύπτουν από τον HSP1 υποκινητή συνήθως τερματίζονται σε ένα tRNA γονίδιο αμέσως μετά τα rRNA γονίδια ενώ μετάγραφα από τους HSP2 και LSP έχουν μήκος περίπου όσο όλο το γονιδίωμα (Montoya et al., 1983). Από αυτά τα βασικά μετάγραφα προκύπτουν τα μοναδιαία mRNA, tRNA και rRNA μόρια μετά από την δράση RNAασών μέσα από έναν μηχανισμό που αναφέρεται ως «tRNA punctuation model» διότι η ύπαρξη tRNA γονιδίων εκατέρωθεν των mRNA και rRNA ελευθερώνει τα περισσότερα από τα 37 μόρια RNA (Ojala et al., 1981).

Επιπρόσθετα, τουλάχιστον τρεις σημαντικοί μεταγραφικοί παράγοντες (Εικόνα 1.6) έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, οι TFAM, mTERF και TFB1M (ή το παράλογο γονίδιο TFB2M) (Daga et al., 1993, Falkenberg et al., 2002). O TFAM φέρει δύο περιοχές HMG κουτιών που συνδέονται με το DNA, οι οποίες διαχωρίζονται μεταξύ τους με μια συνδετική περιοχή, και μια καρβοξυ-τελική ουρά που σχετίζεται με την ειδικότητα της μεταγραφής ως προς τον υποκινητή (Fisher et al., 1988, Parisi et al., 1991). Υπάρχουν αρκετές θέσεις πρόσδεσης του TFAM στην ρυθμιστική περιοχή του mtDNA σε ανιούσα θέση των σημείων έναρξης της μεταγραφής (Fisher et al., 1987). Λειτουργικά ο μεταγραφικός παράγοντας TFAM φαίνεται να δημιουργεί μια περιστροφή στο mtDNA (U turn) στην θέση του LSP που οδηγεί στην ενεργοποίηση της μεταγραφής (Ngo et al., 2011, Rubio-Cosials et al., 2011 ). Οι μεταγραφικοί παράγοντες TFB1M και TFB2M έχουν λειτουργία όμοια των rRNA μεθυλοτρανφερασών (O’Farell et al., 2006). Παρόλο που ο TFB2M είναι δύο τάξεις μεγέθους πιο αποδοτικός από τον TFB1M, είναι και οι δύο ικανοί να σχηματίζουν ετεροδιμερή με την POLRMT/mtRNAP και να οδηγούν σε ενεργοποίηση της μεταγραφής (Falkenberg et al., 2002). Ενώ ο TFB2M είναι απαραίτητος στην μεταγραφή ως μεταγραφικός παράγοντας, ο TFB1M εμπλέκεται στην μετάφραση με ενεργότητα μεθυλοτρανφεράσης τροποποιώντας το rRNA. Επιπλέον η έλλειψη του TFB1M δεν οδηγεί σε μείωση της μιτοχονδριακής μεταγραφής (Litonin et al., 2010).

Υπάρχουν δύο απόψεις που υποστηρίζονται σήμερα σχετικά με την μεταγραφή του ανθρώπινου mtDNA. Aυτή που θεωρεί ότι από τα τρία βασικά μόρια (POLRMT/mtRNAP, ΤFB2M και ΤFAM) τα δύο (POLRMT/mtRNAP και ΤFB2M) είναι απαραίτητα για να ξεκινήσει η μεταγραφή σε έναν υποκινητή (Shutt et al., 2010, Lodeiro et al., 2012, Zollo et al., 2012) και αυτή που υποστηρίζει πως και τα τρία μόρια είναι απαραίτητα για την έναρξη της μεταγραφής (Falkenberg et al., 2002, Litonin et al., 2010, Shi et al., 2012).

~ 16 ~

Ο παράγοντας λήξης της μεταγραφής στον άνθρωπο, mTERF δομείται από τρία φερμουάρ λευκίνης και δύο διαχωρισμένες επικράτειες πρόσδεσης στο DNA (Chomyn et al., 1992, Daga et al., 1993, Fernandez-Silva et al., 1997). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το ότι οι θέσεις πρόσδεσης

Εικόνα 1.6. Το ανθρώπινο μιτοχονδριακό γονιδίωμα απεικονίζεται με την βαριά (Η) και ελαφριά (L) αλυσίδα του σε χρώμα γκρι. Τα rRNA δίνονται με μωβ χρώμα, τα mRNA με πράσινο και τα tRNA με μπλε. Τα γονίδια της βαριάς αλυσίδας γράφονται έξω από τον κύκλο ενώ της ελαφριάς στο εσωτερικό

~ 17 ~

του κύκλου. Δίνονται οι δύο υποκινητές HSP1 και HSP2 της βαριάς αλυσίδας και ο LSP της ελαφριάς καθώς και οι θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα TFAM. Οι θέσεις αντιγραφής για την

βαριά και ελαφριά αλυσίδα δίνονται ως OH και OL αντίστοιχα (Bestwick et al., 2013).

του mTERF στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα εντοπίζονται τόσο αναρροϊκά όσο και καταρροϊκά των μονάδων μεταγραφής. Αυτό έχει οδηγήσει στην υπόθεση ότι η έναρξη και η λήξη της μεταγραφής συνδέονται λειτουργικά, με τον mTERF να μεταφέρει την POLRMT/mtRNAP από το σημείο λήξης στο σημείο έναρξης (Martinez-Azorin et al., 2005). Μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών MTERF δεν έχουν βρεθεί στους μύκητες, υποστηρίζοντας την άποψη ότι η ρύθμιση της μεταγραφής εξελίχθηκε με διαφορετικό τρόπο στους μύκητες και τα ζώα (Linder et al., 2005).

Η ανθρώπινη μιτοχονδριακή ριβοσωμική πρωτεΐνη L12 (MRPL12) αποτελεί συστατικό της μεγάλης υπομονάδας του μιτοχονδριακού ριβοσώματος. Στην ελεύθερη μορφή της, όταν δεν είναι συνδεδεμένη με το ριβόσωμα, αλληλεπιδρά απευθείας με την POLRMT/mtRNAP και ενεργοποιεί την μιτοχονδριακή μεταγραφή (Wang et al., 2007, Surovtseva et al., 2011). H MRPL12 ενεργοποιεί τόσο την μεταγραφή που εξαρτάται από τον υποκινητή όσο και την ανεξάρτητη μεταγραφή in vitro και υπάρχει σε κάποια μη ριβοσωμικά σύμπλοκα in vivo που διαχωρίζονται από το σύμπλεγμα έναρξης POLRMT-TFB2 (Surovtseva et al., 2011). Η δράση της MRPL12 δίνεται στην Εικόνα 1.7. Η MRPL12 είναι η πρώτη ανθρώπινη ριβοσωμική πρωτεΐνη που ταυτοποιήθηκε κατά την σάρωση γονιδίων του ορού του αίματος, τα οποία ενεργοποιούνται όταν μετά από στέρηση θρεπτικών υλικών επανέρχονται στον κυτταρικό κύκλο (Marty et al., 1996). Μεταλλαγές στο γονίδιο της MRPL12 βρέθηκαν κατά την μελέτη γονιδίων που καταστέλλουν αναπτυξιακά μονοπάτια στην Drosophila (Frei et al., 2005). Τέλος, η ακετυλίωση της MRPL12 μπορεί να εξαρτάται από την μιτοχονδριακή πρωτεΐνη αποακετυλάση σιρτουίνη 3 (Hebert et al., 2013). Όλα τα παραπάνω αποτελούν ενδείξεις στο κατά πόσο η MRPL12 μπορεί να ρυθμίζεται σε πολλαπλά επίπεδα ως απόκριση στην κυτταρική ανάπτυξη και ένα τέτοιο γεγονός να μεταφέρεται στο σύμπλοκο μεταγραφής του μιτοχονδρίου επηρεάζοντας την πορεία της μεταγραφής του μιτοχονδριακού γονιδιώματος.

Ο παράγοντας επιμήκυνσης της μιτοχονδριακής μεταγραφής TEFM είναι ένας ενισχυτής της μιτοχονδριακής πολυμεράσης POLRMT τόσο in vitro όσο και in vivo (Minczuk et al., 2011). Αλληλεπιδρά με την RNA πολυμεράση με έναν RNA ανεξάρτητο τρόπο και δεν σχετίζεται με τους TFB2 και TFAM. Απενεργοποίηση του παράγοντα TEFM οδηγεί σε μειωμένη απόδοση της μεταγραφής και κατά συνέπεια σε προβλήματα στο σύστημα της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (Minczuk et al., 2011). Ο πλήρης μηχανισμός με τον οποίο δρα ο TEFM δεν είναι ακόμη γνωστός.

~ 18 ~

Η φωσφορυλίωση της μιτοχονδριακής RNA πολυμεράσης POLRMT/mtRNAP από κινάσες που ενεργοποιούνται από αυξητικούς παράγοντες έχει ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της καταλυτικής της ενεργότητας, όπως ακριβώς συμβαίνει στην RNA pol-II εντός του πυρήνα (Lee et al., 1989, Zhang et al., 1991). Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός δυναμικής ρύθμισης της μιτοχονδριακής μεταγραφής θα μπορούσε να είναι η ικανότητα κάποιων ρυθμιστών της

Εικόνα 1.7. Ένα τμήμα του ανθρώπινου μιτοχονδριακού γονιδιώματος με τους cis ρυθμιστικούς παράγοντες της μεταγραφής. Με βέλος υποδηλώνεται η ενεργοποίηση ενώ με «Τ» η αναστολή. (Bestwick et al., 2013).

μεταγραφής που δρουν στον πυρήνα να μεταφέρονται εντός των μιτοχονδρίων και να ρυθμίζουν εκεί την μεταγραφή (Blomain et al., 2012). Η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος θα πρέπει να ανταποκρίνεται με έναν δυναμικό τρόπο στις αλλαγές που συμβαίνουν εντός του κυττάρου καθώς πραγματοποιείται ο κυτταρικός κύκλος αλλά και ανάλογα με τις απαιτήσεις του κυττάρου που αφορούν στην λειτουργία και τον αριθμό των μιτοχονδρίων (Attardi et al., 1988, Asin-Cayuela et al., 2007).

Η ογκοπρωτεΐνη MYC είναι ανάμεσα στους πιο ισχυρούς ενεργοποιητές της προόδου του κυτταρικού κύκλου τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα κακοήθη ανθρώπινα κύτταρα. Η πρωτεΐνη MYC ελέγχει την μεταγραφή του mtDNA και την βιογένεση των μιτοχονδρίων (Li et al., 2005, Kim et al., 2008). Επίσης η πρωτεΐνη MYC φαίνεται να εμπλέκεται στον επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων (Wise et al., 2008, Gao et al., 2009) μια διαδικασία που κατά πάσα πιθανότητα εξαρτάται από την αλλαγή στην μεταγραφή του mtDNA. Από τα 2.679 γονίδια που ανταποκρίνονται στην δράση της πρωτεΐνης

~ 19 ~

MYC είναι ταυτοποιημένα 281 γονίδια των οποίων τα προϊόντα εντοπίζονται στο μιτοχόνδριο (Li et al., 2005). Η πρωτεΐνη MYC επηρεάζει απευθείας 107 πυρηνικά γονίδια που κωδικοποιούν μιτοχονδριακές πρωτεΐνες. Η καλύτερα μελετημένη από αυτές είναι ο μεταγραφικός παράγοντας TFAM. Η RNA πολυμεράση POLRMT/mtRNAP είναι ανάμεσα στα γονίδια που ρυθμίζονται από την MYC πρωτεΐνη, η ικανότητα της οποίας να ρυθμίζει την μεταγραφή μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω τροποποίηση της μεταγραφής του mtDNA. Ποσοτική πρωτεομική ανάλυση αποδεικνύει ότι ο TFAM είναι παρών στα ανθρώπινα μιτοχόνδρια σε πολύ μεγαλύτερα επίπεδα από αυτά που χρειάζονται προκειμένου να υπάρχει στοιχειομετρική συσχέτιση με το σύστημα μεταγραφής της POLRMT/mtRNAP (Cotney et al., 2007). Η πρωτεΐνη MYC ελέγχει την λειτουργία των μιτοχονδρίων και με άλλους τρόπους. Για παράδειγμα ρυθμίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ πυρηνικά και μιτοχονδριακά κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών μέσω της αλληλεπίδρασής της με τον μεταγραφικό παράγοντα NRF-1 (Morrish et al., 2003) και αυξάνοντας την έκφραση του συμπαράγοντα PGC-1β (Zhang et al., 2007). Οι NRF-1 και PGC-1β είναι από τους πιο ισχυρούς ρυθμιστές του συστήματος πυρήνας-μιτοχόνδριο.

Ένας ακόμη μεταγραφικός παράγοντας που ελέγχει την μεταγραφή των γονιδίων που φέρει το mtDΝΑ είναι ο NRF-2 που ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών Est (Bruni et al., 2010). Αντιδρώντας στο οξειδωτικό στρες ο NRF-2 ρυθμίζει την μεταγραφή πολλών κυτταροπροστατευτικών γονιδίων (Yanaka et al., 2005, Mohammadzadeh et al., 2012). Η πρωτεΐνη NRF-2 προσδένεται απευθείας και ενεργοποιεί την μεταγραφή αρκετών γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγραφή των μιτοχονδριακών γονιδίων (Bruni et al., 2010). Κάποια από τα γονίδια στόχους αποτελούν τα γονίδια που κωδικοποιούν για τους μεταγραφικούς παράγοντες TFAM και mTERF, ενώ στην περίπτωση αλληλεπίδρασης με τα γονιδιακά προϊόντα που εμπλέκονται στον διπλασιασμό του μιτοχονδριακού γονιδιώματος ανήκουν η DNA ελικάση TWINKLE, η πρωτεΐνη πρόσδεσης σε μονόκλωνο DNA mtSSB και η B υπομονάδα της DNA πολυμεράσης γ. Όλα τα παραπάνω γονίδια και γονιδιακά προϊόντα απεικονίζονται στην Εικόνα 1.8 δίνοντας μια αναπαράσταση της αλληλεπίδρασης μεταξύ πυρήνα και μιτοχονδρίου.

1.2.2.2. Η μεταγραφή του mtDNA στις ζύμες και η ωρίμανση των πολυσιστρονικών μεταγράφων.

Είναι γνωστό ότι η μιτοχονδριακή μεταγραφή στις ζύμες μπορεί να συσχετιστεί με τα επίπεδα του κυτταρικού ATP (Gaines et al., 1987). Παρόμοιοι συσχετισμοί έχουν προταθεί και στα θηλαστικά (DasGupta et al., 2001). Λεπτομέρειες για το πώς μπορεί να λειτουργεί ένα τέτοιο μοντέλο δόθηκαν από τους Amiott και Jaehning οι οποίο χρησιμοποιώντας τον S. cerevisiae έδειξαν ότι η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι άμεσα συνδεδεμένη με τις αλλαγές στα επίπεδα του μιτοχονδριακού ATP (Amiott et al., 2006a). Στους μιτοχονδριακούς

~ 20 ~

υποκινητές όπου το πρώτο νουκλεοτίδιο είναι το ATP, η μεταγραφή είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στα επίπεδα του ATP. Αυτό επιτρέπει την διαφορική ρύθμιση του κάθε μεταγράφου, παρά το γεγονός ότι όλα τα μετάγραφα προκύπτουν από το ίδιο σύστημα πρωτεϊνών. Αξίζει να σημειωθεί ότι το σύστημα μεταγραφής του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι λιγότερο ευαίσθητο στο νουκλεοτιδικό περιεχόμενο του μεταγράφου (Amiott et al., 2006b). Σε in vitro μοντέλα έχει φανεί η συσχέτιση των επιπέδων του ATP με την μιτοχονδριακή μεταγραφή και στον άνθρωπο (Narasimhan et al., 1987). Τα παραπάνω συνηγορούν στην ύπαρξη ενός συντηρημένου μηχανισμού αλληλεπίδρασης μεταξύ του κυτταρικού μεταβολισμού και της μεταγραφής του μιτοχονδριακού γονιδιώματος.

Εικόνα 1.8. Μηχανισμοί της δυναμικής ρύθμισης της μιτοχονδριακής μεταγραφής. Η μιτοχονδριακή μεταγραφή ρυθμίζεται από πυρηνικά δεδομένα, κυτταροπλασματικά σήματα και μεταβολίτες. (Blomain et al., 2012)

Στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης του τύπου των ευβακτηρίων αντικαταστάθηκε από ένα ένζυμο που μοιάζει με αυτό των βακτηριοφάγων T3/T7. Αυτή η RNA πολυμεράση προάγει την σύνθεση του RNA οδηγώντας στον σχηματισμό πολυσιστρονικών μεταγράφων (Cermakian et al., 1997, Gray et al., 1998). Ο καλύτερος χαρακτηρισμός των μιτοχονδριακών υποκινητών έχει γίνει στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae για τον οποίο τουλάχιστον 19 μεταγραφικές μονάδες έχουν χαρακτηριστεί πειραματικά (Foury et al., 1998). Παρά τον υψηλό αριθμό των υποκινητών τα περισσότερα μετάγραφα είναι πολυσιστρονικά που αποτελούνται από δύο ή περισσότερες κωδικές περιοχές με διάφορους συνδυασμούς tRNA, rRNA και mRNA.

Η μεταγραφή ξεκινά τόσο in vivo όσο και in vitro στο τελευταίο νουκλεοτίδιο Α του συντηρημένου εννεανουκλεοτιδίου ATATAAGTA (Christianson et al., 1982, Osinga et al., 1982, Christianson et al., 1983, Osinga et al., 1984b). Ένα λίγο διαφορετικό μοτίβο υποκινητή

~ 21 ~

(ΤΤΑΤΑΑGTA) χαρακτηρίζει την μεταγραφή των tRNAs (Edwards et al., 1983, Tabak et al., 1983, Burke et al., 1987). Όμοιες ή παρόμοιες αλληλουχίες για τον υποκινητή έχουν βρεθεί στα μιτοχόνδρια των Kluyveromyces lactis (Ragnini et al., 1994), Torulopsis glabrata (Clark-Walker et al., 1985, Koszul et al., 2003), Williopsis (Hansenula) mrakii (Drissi et al., 1993, 1994), και Yarrowia lipolytica (Kerscher et al., 2001). Αντίθετα οι μιτοχονδριακοί υποκινητές του ασκομύκητα Neurospora crassa δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερες ομοιότητες με τον υποκινητή του S. cerevisiae (Kubelic et al., 1990). Παρά το γεγονός ότι αρκετές μελέτες στον S. cerevisiae έχουν δείξει ότι η ακολουθία του υποκινητή από μόνη της είναι ικανή να οδηγήσει σε έναρξη της μεταγραφής in vitro (Biswas et al., 1985, Schinkel et al., 1986) η σχετική ισχύς των υποκινητών αυτών επηρεάζεται από το περιεχόμενο των αλληλουχιών που βρίσκονται εκατέρωθεν της κάθε θέσης (Biswas et al., 1986). Κάποιοι από τους πιο γνωστούς υποκινητές στο βασίλειο των μυκήτων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.2.

Στην Candida albicans εντοπίζονται οκτώ μεταγραφικές μονάδες (ΤU: Transcription Unit). Οι μονάδες αυτές είναι οι εξής: TU1: rnl – trnA - cox2 – trnN – nad6/nad1 στο τέλος της οποίας υπάρχει μια περιοχή GC, TU2: trnK – cox3 όπου η μεταγραφή γίνεται στον ανάστροφο κλώνο, TU3: trnL – trnY – trnH – trnT – trnE, TU4: trnG – trnC - trnP – atp8 – atp6 – trnI – atp9 όπου η μεταγραφή γίνεται στον ανάστροφο κλώνο, TU5: cox1 – trnR – trnV – trnT – trnF – trnR – nad2/nad3, TU6: cob – trnM – rns, ΤU7: nad4L/nad5 – trnQ – trnD – trnS, TU8: trnL – trnM – nad4.

Ακολουθία υποκινητή (5’-3’) Οργανισμός

TTAG(A/T)(A/G)(A/G)(G/T)(G/C)N(A/T) N. crassa

AAGTATAACAAAA B. bassiana

ATATAAGTA S. cerevisiae

TTATAAGTA Yeast -trn

TTATAAGTA K. lactis

WWATAGGTA C. albicans

(Α/Τ)(Α/Τ)WTATAWGT S.pombe

Πίνακας 1.2. Συναινετικές αλληλουχίες υποκινητών για καλά μελετημένους μύκητες. Όπου W μπορεί να βρεθεί η βάση Α ή Τ.

~ 22 ~

Η αλληλουχία του υποκινητή εκφράζεται από ένα συναινετικό μοτίβο: WWATAGGTA και παρουσιάζεται συντηρητικότητα στην αρχή του μεταγράφου στις 5 πρώτες βάσεις: Α(+1)Α(+2)G(+3)C(+4) (Κolondra et al., 2015).

Στον μύκητα Candida glabrata εντοπίζονται δύο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες: 5’ ΤΑΤΑΑGTAA 3’ (9 νουκλεοτίδια) από την οποία ξεκινά η μεταγραφή των rns και rnl. Επίσης η συγκεκριμένη περιοχή εντοπίζεται πριν από την περιοχή trnM, trnF, trnL, trnY, trnG, cox2, atp9. Η δεύτερη περιοχή επαναλαμβανόμενου DNA είναι: 5’ TATAATATTCTT 3’ (12 νουκλεοτίδια) η οποία ανιχνεύεται σε όλες τις διογονιδιακές περιοχές (Kolondra et al., 2015).

Η λειτουργία της περιοχής του μιτοχονδριακού υποκινητή δεν είναι μόνο να προσελκύσει την RNA πολυμεράση αλλά και άλλους εξειδικευμένους παράγοντες προκειμένου να γίνει η εκκίνηση, η επιμήκυνση και ο έλεγχος του ρυθμού της μεταγραφής (Schäfer et al., 2005). In vitro και in vivo πειραματικά δεδομένα από τον ζυμομύκητα υποδεικνύουν την αρχική πρόσδεση του παράγοντα Mtf1p στην RNA πολυμεράση (Rpo41p), ένας μηχανισμός που ομοιάζει με την ενεργοποίηση της μεταγραφής στα ευβακτήρια από τον παράγοντα σ. Αυτό το αρχικό σύμπλοκο έναρξης προσδένεται στο DNA με έναν μη ειδικό τρόπο και σαρώνει την ακολουθία του DNA μέχρι να βρεθεί μια περιοχή υποκινητή. Μόλις προσδεθεί το σύμπλοκο έναρξης στον υποκινητή δημιουργούνται αλλαγές στην διάταξη του DNA προκειμένου να αρχίσει η μεταγραφή. Αμέσως μετά τα πρώτα βήματα επιμήκυνσης της μεταγραφής ο Mtf1p απομακρύνεται από το σύμπλοκο έναρξης (Shadel et al., 1993, Mangus et al., 1994, Cliften et al., 1997). Η επεξεργασία των πολυσιστρονικών μεταγράφων συμβαίνει ταυτόχρονα με την μεταγραφή (Dieckmann et al., 1994). Λόγω της απουσίας μηχανισμού που να ρυθμίζει την μεταγραφή στα μιτοχόνδρια η ωρίμανση του RNA και η αποδόμησή του είναι σημαντικά βήματα στην γονιδιακή ρύθμιση των μιτοχονδρίων. Επιπλέον, η αδενυλίωση του mRNA που λειτουργεί με σταθεροποιητικό τρόπο φαίνεται να απουσιάζει στον S. cerevisiae (Gagliardi et al., 1999, 2001).

Οι αλληλουχίες των υποκινητών του S. cerevisiae έχουν μελετηθεί σε λεπτομέρεια. Χρησιμοποιώντας ένα in vitro σύστημα μεταγραφής διαπιστώθηκε ότι η ευαισθησία της RNA πολυμεράσης είναι μεγαλύτερη για τα δύο πρώτα νουκλεοτίδια του υποκινητή, μεσαία για τα νουκλεοτίδια 5-11 του υποκινητή και χαμηλή για τα υπόλοιπα νουκλεοτίδια κατά την επιμήκυνση. Επιπλέον η ευαισθησία της RNA πολυμεράσης κατά την έναρξη της μεταγραφής είναι μεγαλύτερη για το δεύτερο νουκλεοτίδιο παρά για το πρώτο (Αmiott et al., 2006). Μεταλλαγές στον παράγοντα Mtf1p οδηγούν σε αλλαγή στην κινητική της μεταγραφής ενώ η κατάσταση επανέρχεται χρησιμοποιώντας μήτρα υπερελικωμένου DNA που φέρει την αλληλουχία του υποκινητή (Αmiott et al., 2006). Επομένως, τα αρχικά νουκλεοτίδια της αλληλουχίας του υποκινητή και κυρίως αυτό που βρίσκεται στην +2 θέση έχουν ιδιαίτερη

~ 23 ~

σημασία προκειμένου να αποκαλυφθεί η αλληλουχία ενός υποκινητή και στη συνέχεια για την σταθερότητα του συμπλόκου έναρξης της μεταγραφής (Αmiott et al., 2006).

Ο υποκινητής του ζυμομύκητα (9 ζ.β.) είναι μικρός όταν συγκρίνεται με αυτόν που αναγνωρίζει η RNA πολυμεράση T7 (19 ζ.β.). Υπάρχουν 28 συντηρημένοι υποκινητές στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα των ζυμών όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.3 (Desphande et al., 2012). Tα μιτοχονδριακά γονίδια μεταγράφονται με διαφορετικούς ρυθμούς και οι ισχυροί υποκινητές έχουν 15-20 φορές μεγαλύτερη ενεργότητα από τους ασθενείς (Wettstein-Edwards et al., 1986). Το νουκλεοτίδιο στην θέση +2 είναι το πιο σημαντικό στην αξιολόγηση της ισχύος ενός υποκινητή (Desphande et al., 2012). Υποκινητές που στην θέση +2 έχουν μια πουρίνη και στην θέση +3 μια πυριμιδίνη αποτελούν ισχυρούς υποκινητές ενώ υποκινητές με πυριμιδίνη στην θέση +2 και πουρίνη στην θέση +3 είναι πολύ πιο ασθενείς (Wettstein-Edwards et al., 1986, Biswas et al., 1986).

Μελέτες μεταλλαξογένεσης έχουν εντοπίσει επιτρεπτές και μη επιτρεπτές αλλαγές στην αλληλουχία του υποκινητή των ζυμών από την θέση -7 έως την θέση +1 5’ TAT(/a)AA(/g/c)GT(/a/c)N 3’ όπου τα μικρά γράμματα υποδηλώνουν επιτρεπτές αλλαγές όπως φαίνεται και στον Πίνακα 1.3 (Biswas et al., 1985, Biswas et al., 1986, Schinkel et al., 1986). Οι μη επιτρεπτές αλλαγές χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Μεταλλαγές στις θέσεις (-3, -1, +1, +2) απενεργοποιούν την μεταγραφή αλλά η ενεργότητα μπορεί να επανέλθει όταν στην αντίδραση προστεθούν οι κατάλληλοι δινουκλεοτιδικοί εκκινητές (Biswas et al., 1990, Biswas et al., 1998). Από την άλλη οι μεταλλαγές (-7C, -6G, -4A, and -2A) απενεργοποιούν την μεταγραφή αλλά αυτή δεν επανέρχεται μετά από προσθήκη δινουκλεοτιδίων. Το ζεύγος G:C στην θέση -2 είναι υποχρεωτικό να υπάρχει και οποιαδήποτε αλλαγή σε αυτό οδηγεί σε πλήρη απενεργοποίηση της μεταγραφής (Biswas et al., 1986). Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι το υψηλά συντηρημένο ζευγάρι Α:Τα στην θέση +1 μπορεί να αλλάξει σε οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο χωρίς αυτό να επηρεάσει την μεταγραφή (Biswas et al., 1987).

Οι αλληλουχίες των tRNA αποτελούν ένα από τα πιο γενικά και σημαντικά σήματα στην επεξεργασία του μιτοχονδριακού RNA. Σε πρώιμα πολυσιστρονικά RNA η 5’ και 3’ εξωνουκλεολυτική δράση των tRNA οδηγούν στην απελευθέρωση μορίων mRNA και rRNA σε μια ποικιλία οργανισμών όπως S. cerevisiae, N. crassa, A. nidulans, και τα πράσινα και κόκκινα φύκη (Burger et al., 1985, Dyson et al., 1989, Wolff et al., 1996, Richard et al., 1998). Ο παραπάνω μηχανισμός μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων είναι γνωστός ως μοντέλο «στίξης με tRNA» (tRNA punctuation model) και τα πιο χαρακτηριστικά παραδείγματα παρουσιάζονται στα μιτοχόνδρια των ζώων (Ojala et al., 1980). Αντίθετα, το 3’ άκρο των μιτοχονδριακών RNA των ζυμών χαρακτηρίζεται από ένα δωδεκαμερές μοτίβο 5’- AAUAA(U/C)AUUCUU-3’ στην 3’ αμετάφραστη περιοχή που αποτελεί στόχο του μιτοχονδριακού εξωσώματος (Osinga et al., 1984a, Hofmann et al., 1993). Το μοντέλο αυτό και

~ 24 ~

Πίνακας 1.3. Οι θέσεις από -8 έως +3 της συναινετικής ακολουθίας των υποκινητών που απαντώνται στις ζύμες. Γίνονται αλλαγές σε κάποιες βάσεις και με πράσινο χρώμα δίνονται οι επιτρεπτές αλλαγές ενώ οι αλλαγές που οδηγούν σε απενεργοποίηση της μεταγραφής δίνονται με κόκκινο χρώμα. Με κίτρινο χρώμα δίνονται οι περιπτώσεις που μια αλλαγή μπορεί να αναστραφεί με την προσθήκη δινουκλεοτιδικών εκκινητών (Desphande et al., 2012).

~ 25 ~

Εικόνα 1.9. Ειδικοί μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί στην έκφραση των πρωτεϊνικών μιτοχονδριακών γονιδίων της ζύμης S. cerevisiae. Κόκκινα κουτάκια: εξώνια, πορτοκαλί κουτάκια: εσώνια, μαύρα κουτάκια: δωδεκαμερείς αλληλουχίες, πράσινα κουτάκια: γονίδια tRΝΑs (περιλαμβάνονται μόνο αυτά μεταγράφονται μαζί με πρωτεϊνικά γονίδια). Τα εξώνια, τα εσώνια και τα μετάγραφα δεν είναι σχηματισμένα υπό κλίμακα. Με κόκκινους και μπλε κύκλους παριστάνονται πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το μιτοχόνδριο και τον πυρήνα αντίστοιχα (Lipinski et al., 2010).

η δημιουργία των τελικών προϊόντων της μεταγραφής και μετάφρασης του mt γονιδιώματος στον S. cerevisiae παρουσιάζονται στην Εικόνα 1.9.

Η επεξεργασία των πολυσιστρονικών μεταγράφων στους μύκητες δεν είναι απαραίτητο να συμβαίνει σε θέσεις παλίνδρομων αλληλουχιών (Berger et al., 1983, De Vries et al., 1983). Πιο πιθανή είναι η συμμετοχή των tRNA στην επεξεργασία της πλειοψηφίας των μεταγράφων (De Vries et al., 1985). Υπάρχουν ενδείξεις ότι ένα μεγάλο μετάγραφο μπορεί να αρχίσει να τροποποιείται πριν την λήξη της μεταγραφής (De Vries et al., 1985).

Γενικότερα οι trans παράγοντες τροποποίησης του RNA στα μιτοχόνδρια κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια, με εξαίρεση τις μιτοχονδριακά κωδικοποιούμενες ενδονουκλεάσες των εσωνίων. Στις ζύμες μόνο τρεις εξωριβονουκλεάσες συμμετέχουν στον μεταβολισμό του RNA: η ολιγοριβονουκλεάση Ynt20p (Hanekamp et al., 1999), η μη ειδική ριβονουκλεάση Nuc1p (Vincent et al., 1988) και το μιτοχονδριακό εξώσωμα (Min et al., 1993). Το εξώσωμα είναι ένα

~ 26 ~

πρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από την Dss1p με την εξωριβονουκλεοτιδική της δράση και την RNA ελικάση Suv3p (Min et al., 1993, Dziembowski et al., 1998, 2003). H ωρίμανση και η περιέλιξη του RNA ελέγχονται από πρωτεΐνες σταθεροποίησης του RNA και πρωτεΐνες ενεργοποίησης της μετάφρασης που προσδένονται στην 5’ αμετάφραστη περιοχή των μιτοχονδριακών RNA (Wiesenberger et al., 1995, Wiesenberger et al., 1997, Green-Willms N.S. et al., 1998, Chen et al., 1999, Islas-Osuna et al., 2002, 2003). Όμοια, η πρωτεΐνη DBP προσδένεται στο RNA αναγνωρίζοντας μια δωδεκαμερή περιοχή στην 3’ αμετάφραστη περιοχή (Li et al., 1999 ).

1.3 Πρόβλεψη υποκινητών

Υπάρχουν διαθέσιμα προγράμματα που προβλέπουν την ύπαρξη υποκινητών (Promoter Prediction Programs-PPPs). Η σημασία τους σχετίζεται με την in silico πρόβλεψη γονιδίων χωρίς να είναι απαραίτητα δεδομένα έκφρασης, την ανάλυση της γονιδιακής ρύθμισης και την επισήμανση των γονιδιωμάτων (Bajic et al., 2004). Κανένα από τα διαθέσιμα προγράμματα δεν επιτυγχάνουν ευαισθησία και ειδικότητα σε ποσοστό πάνω από 65%. Αλγόριθμοι που κατασκευάστηκαν με βάση μικρά σύνολα δεδομένων δεν καταφέρνουν να κάνουν αξιόλογες προβλέψεις σε ολόκληρα γονιδιώματα (Bajic et al., 2004).

Οι υποκινητές των ευκαρυωτικών οργανισμών φέρουν ορισμένα στοιχεία που χρησιμοποιούνται ως χαρακτηριστικά για την πρόβλεψή τους. Τέτοια στοιχεία είναι οι αλληλουχίες TATA, CAAT και GC. Οι περιοχές που χαρακτηρίζονται ως TATA κουτιά φέρουν την αλληλουχία ΤΑΤΑΑΑ ή κάποια παρόμοια που ακολουθείται από τρείς ή περισσότερες βάσεις αδενίνης και εντοπίζεται 25-35 νουκλεοτίδια πριν την θέση έναρξης της μεταγραφής. Οι περιοχές που χαρακτηρίζονται ως CAAT κουτιά αποτελούνται από ένα μοτίβο νουκλεοτιδίων με συναινετική ακολουθία GGGCAAATCT που εντοπίζεται 80-110 πριν την θέση έναρξης της μεταγραφής. Όμοια, τα GC κουτιά έχουν συναινετική ακολουθία GGGGGG και η θέση τους ποικίλει στην περιοχή του υποκινητή (Singh et al., 2015). Όλα τα παραπάνω δίνονται διαγραμματικά στην Εικόνα 1.10.

Κάθε πρόγραμμα πρόβλεψης βασίζεται σε διαφορετική μεθοδολογία. Κοινή αρχή αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές των υποκινητών εμφανίζουν διαφορετικές ιδιότητες από τις υπόλοιπες περιοχές του DNA. Πολλά χαρακτηριστικά έχουν χρησιμοποιηθεί, όπως η ύπαρξη CpG νησίδων (Ioshikhes et al., 2000, Davuluri et al., 2001, Hannenhalli et al., 2001, Ponger et al., 2002, Bajic et al., 2003a), η κοντινή θέση στην έναρξη της μεταγραφής, η παρουσία συγκεκριμένων θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (Knudsen et al., 1999, Ohler et al., 2000, Reese et al., 2001, Down et al., 2002, Ohler et al., 2002, Solovyev et al., 2003), στατιστικές ιδιότητες υποκινητών που έχουν βρεθεί σε άλλα γονιδιώματα (Knudsen et al., 1999, Davuluri et al., 2001, Down et al., 2002, Bajic et al., 2003a, Bajic et al., 2003b), ομολογία με ορθόλογους υποκινητές (Solovyev et al., 2003), και χρήση mRNA μετάγραφων (Liu et al., 2002). Οι

~ 27 ~

τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση των υποκινητών είναι τα νευρωνικά δίκτυα (Knudsen et al., 1999, Reese et al., 2001, Ohler et al., 2002, Bajic et al., 2003a, Bajic et al., 2003b), γραμμικές και τετραγωνικές αναλύσεις διάκρισης (Ioshikhes et al., 2000, Davuluri et al., 2001, Solovyev et al., 2003), σχετικοί φορείς μηχανής (Down et al., 2002), στατιστικές ιδιότητες των περιοχών των υποκινητών (Knudsen et al., 1999, Davuluri et al., 2001, Down et al., 2002, Bajic et al., 2003a, Bajic et al., 2003b), μοντέλα Markov (Ohler et al., 2000, 2002), ή συνδυασμοί όλων των παραπάνω. Γενικότερα τα προγράμματα που προβλέπουν υποκινητές αποδίδουν καλύτερα σε μια συγκεκριμένη κατηγορία γονιδιωματικού DNA όπως είναι οι G/C

Εικόνα 1.10. Η οργάνωση του υποκινητή σε ευκαρυωτικό DNA (Singh et al., 2015).

πλούσιες αλληλουχίες (Down et al., 2002) ενώ άλλοι εντοπίζουν τους υποκινητές που σχετίζονται με νησίδες CpG (Ioshikhes et al., 2000, Davuluri et al., 2001, Hannenhalli et al., 2001, Ponger et al., 2002, Bajic et al., 2003a).

Οι παραπάνω αλγόριθμοι είναι χρήσιμα in silico εργαλεία που μπορούν να καθοδηγήσουν την έρευνα των πειραματικών βιολόγων. Μετά την πιθανή πρόβλεψη της θέσης των υποκινητών σε ένα γονιδίωμα μπορεί να γίνει πειραματικά χρήση μεταλλάξεων που οδηγούν σε έλλειψη βάσεων προκειμένου να περιοριστούν ακόμα περισσότερο οι περιοχές με δραστικότητα υποκινητή (Bajic et al., 2004). Επίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες μέθοδοι κάλυψης του 5’ άκρου των cDNA για να εξακριβωθεί η έναρξη της μεταγραφής. Συνήθως, δύο είναι οι στόχοι ενός πειραματικού βιολόγου όταν χρησιμοποιεί ένα πρόγραμμα πρόβλεψης υποκινητών, πρώτον να εξακριβωθεί η θέση έναρξης της μεταγραφής και δεύτερον να

~ 28 ~

βρεθούν νέα γονίδια σε μη γνωστά γονιδιώματα και αλληλουχίες. Δυστυχώς η πρόβλεψη κάποιων εργαλείων έχει πολύ χαμηλή απόδοση και δεν βοηθά ουσιαστικά στα σημαντικά βιολογικά ερωτήματα (Bajic et al., 2004). Επιπλέον, σε καμία από τις εργασίες που περιγράφουν τα υπάρχοντα προγράμματα πρόβλεψης υποκινητών δεν αναφέρεται να έχουν δοκιμασθεί και αξιοποιηθεί για την πρόβλεψη και εύρεση υποκινητών σε γονιδιώματα οργανιδίων, λόγω των ιδιόμορφων χαρακτηριστικών που φέρουν αυτά τα γονιδιώματα, όπως είναι για παράδειγμα η διαφορετική Α/Τ σύσταση και τα πολυσιστρονικά μετάγραφα.

1.4 Οι μύκητες

Οι μύκητες αποτελούν μια ξεχωριστή ομάδα οργανισμών. Είναι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, ετερότροφοι, που τυπικά έχουν ένα θαλλό που λέγεται μυκήλιο και αποτελείται από διακλαδισμένα σωληνοειδή νημάτια, τις υφές, με κυτταρικό τοίχωμα τυπικά από χιτίνη, και προσλαμβάνουν τα θρεπτικά συστατικά με απορρόφηση αφού διασπάσουν τις οργανικές ύλες του υποστρώματος με εξωκυτταρικά ένζυμα που εκκρίνονται από τις υφές. Οι μύκητες αναπαράγονται αγενώς και εγγενώς και σε κάθε περίπτωση παράγουν σπόρια που είναι ποικίλης μορφολογίας, έχουν όμως ουσιώδεις διαφορές από τα σπέρματα των ανώτερων φυτών διότι δεν περιέχουν ένα προσχηματισμένο έμβρυο. Εμφανίζουν τεράστια ποικιλία και υπάρχουν παντού. Οι περισσότεροι βρίσκονται στο έδαφος και τα φυτά και διατρέφονται από οργανικά συστατικά ζώντων ή νεκρών οργανισμών γι' αυτό και θεωρούνται το "βιολογικό εργαστήριο αποδόμησης των οργανικών ουσιών".

Οι μύκητες από πολλές απόψεις μοιάζουν με τα φυτά. Δεν έχουν δυνατότητα κίνησης αν και μπορεί να έχουν κινητά αναπαραγωγικά κύτταρα. Έχουν κυτταρικά τοιχώματα παρόμοια στη δομή αλλά όχι στη χημική σύσταση με των φυτών. Αντίθετα, τα ζώα κινούνται και στερούνται κυτταρικών τοιχωμάτων. Όμως οι μύκητες είναι ετερότροφοι, ενώ τα πράσινα φυτά είναι αυτότροφα. Επομένως, από αυτή την άποψη μοιάζουν με τα ζώα. Τέλος, ο αποθηκευτικός υδατάνθρακας των μυκήτων είναι το γλυκογόνο, όπως και στους ζωικούς οργανισμούς, ενώ στους φυτικούς είναι κυρίως το άμυλο.

Από τα 50.000 - 250.000 είδη μυκήτων που έχουν περιγραφεί, λιγότερα από 300 έχουν συσχετισθεί με νόσο στον άνθρωπο. Ο αριθμός των μυκήτων που είναι σήμερα γνωστοί αποτελεί μικρό ποσοστό εκείνων που υπάρχουν στη φύση. Οι έγκυρες ταξινομικές μονάδες που έχουν περιγραφεί ανήκουν σε 80.060 είδη. H πολυπληθέστερη ομάδα είναι οι Ασκομύκητες με 32.739 είδη και ακολουθούν οι Βασιδιομύκητες με 29.914 είδη, οι Δευτερομύκητες (χωρίς εγγενείς μορφές) με 15.945 είδη και οι Ζυγομύκητες με 1.090 είδη. Είναι δύσκολο να υπολογισθεί ο αριθμός των μυκήτων που υπάρχουν στην φύση. Σύμφωνα με την τεκμηριωμένη εκτίμηση του Ηawksworth που έχει γίνει σήμερα ευρύτατα αποδεκτή, ο αριθμός των μυκήτων στην φύση θεωρείται ότι υπερβαίνει το 1,5 εκατομμύριο είδη (Hawksworth 1991, 2001).

~ 29 ~

Οι μύκητες αρχικά υπάγονταν στο βασίλειο των Φυτών. Αναδείχθηκαν ως ξεχωριστό βασίλειο το 1969 από τον Whittaker (Whittaker et al., 1969). Οι μύκητες διακρίνονται μορφολογικά σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τους ζυμομύκητες και τους υφομύκητες. Οι ζυμομύκητες είναι σφαιρικοί ή ελλειψοειδείς σχηματισμοί που αναπαράγονται δια εκβλαστήσεων σε ειδικά θρεπτικά υλικά. Αντίθετα, οι υφομύκητες ή νηματοειδείς μύκητες, αποτελούνται από κυλινδρικούς σχηματισμούς, τις υφές, που μεγαλώνουν με διακλαδώσεις και επιμηκύνσεις σχηματίζοντας χνουδωτές αποικίες. Μια άλλη κατηγορία μυκήτων, οι καλούμενοι δίμορφοι μύκητες, αναπτύσσονται στον ξενιστή ως ζυμομύκητες, ενώ σε θερμοκρασία περιβάλλοντος λαμβάνουν τη μορφή υφομυκήτων. Σύμφωνα με τα σημερινά δεδομένα το ετερογενές βασίλειο των μυκήτων χωρίζεται σε δέκα φύλα: Ασκομύκητες, Βασιδιομύκητες, Βλαστοκλαδιομύκητες, Γκλομερομύκητες, Εντομοφθορομύκητες, Ζυγομύκητες, Κρυπτομύκητες, Μονοβλεφαριδομύκητες, Νεοκαλιμαστιγομύκητες και Χυτριδιομύκητες (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=4751). Κάθε φύλο χωρίζεται σε υποφύλα, κλάσεις, οικογένειες και τάξεις. Οι Ασκομύκητες διακρίνονται σε έξι Υπόφυλα. (Εικόνα 1.11).

(B)

(A)

Εικόνα 1.11. Τα φύλα του Βασιλείου των Μυκήτων (Α) και τα υπόφυλα του φύλου των Ασκομυκήτων (Β) όπως παρουσιάζονται στο «Tree of Life» (http://tolweb.org/Ascomycota/20521)

Οι μύκητες είναι αρκετά επιτυχείς οργανισμοί διότι έχουν καταφέρει να αποικήσουν σε κάθε είδος περιβάλλοντος. Εφόσον δεν φωτοσυνθέτουν είναι ανεξαρτητοποιημένοι από την ύπαρξη φωτεινής ενέργειας και έτσι μπορούν να καταλάβουν ακόμα και σκοτεινούς βιότοπους και να αναπτυχθούν προς κάθε κατεύθυνση και σε κάθε είδος υποστρώματος. Ταυτόχρονα, παράγουν τεράστιους αριθμούς σπορίων, τα οποία απελευθερώνονται και διασπείρονται με μεγάλη αποτελεσματικότητα. Με αποτέλεσμα κάθε οικολογική θέση, είτε βρίσκεται στον αέρα, είτε στο έδαφος είτε στο νερό, όχι μόνο αποικείται από μύκητες αλλά περιλαμβάνει και εξαιρετικά μεγάλο αριθμό ειδών μυκήτων.

~ 30 ~

Σαν σαπροτροφικοί οργανισμοί, αποσυνθέτουν μαζί με τα βακτήρια τα νεκρά φυτικά και ζωικά υπολείμματα στο έδαφος. Με την αποσύνθεση οι πολύπλοκες οργανικές ενώσεις υπολειμμάτων διασπώνται σε απλούστερες ουσίες που απορροφώνται από τους μύκητες και μπαίνουν ξανά στο κύκλο της έμβιας ύλης. Χωρίς αυτή την αποσύνθεση, ένα συνεχώς αυξανόμενο μέρος νεκρής οργανικής ύλης θα συσσωρευόταν στο έδαφος και η συνέχιση της ζωής θα ήταν προβληματική. Σαν παράσιτα, ζουν σε βάρος κάποιων ζωντανών οργανισμών που καλούνται ξενιστές, από τους οποίους προσλαμβάνουν θρεπτικά συστατικά. Παρασιτούν σε ανώτερα φυτά, φύκη, άλλους μύκητες και ζωικούς οργανισμούς. Στον άνθρωπο είναι δυνατόν να προκαλέσουν είτε δερματομυκώσεις όπως η τριχοφυτίαση, είτε διασυστεμικές μυκώσεις όπως η κρυπτοκοκκίωση και η ιστοπλασμίωση.

Σαν συμβιωτικοί οργανισμοί, έχουν αναπτύξει πετυχημένες βιολογικές σχέσεις με φύκη, με ανώτερα φυτά, ή και έντομα. Από τη συμβίωση των μυκήτων (κυρίως Ασκομυκήτων) με τα φύκη (κυρίως Χλωροφύκη) σχηματίζονται οι λειχήνες. Οι μύκητες που συμβιώνουν με έντομα ζουν είτε στον εντερικό σωλήνα των εντόμων (ενδοσυμβιωτικοί), είτε στις φωλιές των εντόμων (εξωσυμβιωτικοί). Μύκητες συμβιώνουν επίσης με τις ρίζες των ανώτερων φυτών και σχηματίζουν τις λεγόμενες «μυκόρριζες». Τέλος, οι αρπακτικοί μύκητες αποτελούν μια εντυπωσιακή ομάδα μυκήτων που αιχμαλωτίζουν πρωτόζωα, νηματώδεις σκώληκες και άλλα ασπόνδυλα και τρέφονται από αυτά αφού τα θανατώσουν.

Η φυλογένεση των οργανισμών, που αντικατοπτρίζει την εξελικτική τους ιστορία και είναι ο θεμέλιος λίθος κάθε φυσικού ταξινομικού συστήματος, δεν είναι δυνατό να βασιστεί παρά μόνο σε εικασίες που στηρίζονται σε ανάλυση και σύνθεση γνωστών δεδομένων κυρίως συγκριτικής μορφολογίας καθώς και σε πληροφορίες από ανευρεθέντα απολιθώματα. Στην περίπτωση των μυκήτων, για τους οποίους έχει αμφισβητηθεί ακόμα και το είδος των οργανισμών που περιλαμβάνουν (π.χ. Μυξομύκητες), ο καθορισμός της πραγματικής θέσης τους ανάμεσα στους υπόλοιπους οργανισμούς αλλά και των μεταξύ τους εξελικτικών σχέσεων παρουσιάζει ιδιαίτερες δυσκολίες. Εκτός του ότι οι μύκητες περιλαμβάνουν ποικιλία οργανισμών πολύ διαφορετικών μεταξύ τους, τα παλαιοντολογικά ευρήματα είναι σχετικά σπάνια και δίνουν αποσπασματική μόνο εικόνα των προγονικών μορφών.

Από τον περασμένο αιώνα έχει υποστηριχθεί η καταγωγή των μυκήτων τόσο από τα φύκη όσο και από τα πρωτόζωα (Alexopoulos et al., 1996). Η πρώτη άποψη έχει επικρατήσει. Η άποψη ότι οι ανώτεροι μύκητες (Ασκομύκητες/Βασιδιομύκητες) εξελίχθηκαν από τους Ζυγομύκητες και τους Ωομύκητες οι οποίοι είχαν προέλθει από διαφορετικές ομάδες φυκών, είχε ιδιαίτερη απήχηση όταν διατυπώθηκε από τον Brefeld το 1889. Μια ακόμη θεωρία γνωστή ως Floridean theory υποστήριζε ότι οι ανώτεροι μύκητες κατάγονται από τα Ροδοφύκη. Ο Chadefau το 1975 προώθησε την ιδέα ότι τα Ροδοφύκη και οι ανώτεροι μύκητες είχαν παράλληλοι αλλά όχι την ίδια εξέλιξη από έναν κοινό πρόγονο. Ο Savile απορρίπτει την καταγωγή των ανώτερων

~ 31 ~

μυκήτων από τα Ροδοφύκη και θεωρεί πιθανή την προέλευσή τους από τους κατώτερους μύκητες μέσω ενός προγόνου που έμοιαζε με το σύγχρονο γένος Taphrina. Από το 1957 που ο Oparin διατύπωσε την θεωρία του για την προέλευση της ζωής, οι φυλογενετικές θεωρίες φαίνονται ανεπαρκείς χωρίς μια βιοχημική και μοριακή προσέγγιση (Alexopoulos et al., 1996, Moore-Landecker, 1996).

Τα τελευταία χρόνια ένα πλήθος δεδομένων λεπτής δομής, βιοχημικής σύστασης και κυρίως μοριακής ανάλυσης, οδηγούν στην εκτίμηση ότι οι μύκητες έχουν μια πολυφυλετική προέλευση. Υπάρχουν όμως πολλές προσεγγίσεις ως προς τα κριτήρια διάκρισης, με αποτέλεσμα να έχουν προταθεί διάφορες απόψεις (Alexopoulos et al., 1996, Barr 1992, Cavalier-Smith 1981, 1987, Dick 1997, Hawksworth 1991). Η ταχέως αυξανόμενη χρήση μοριακών μεθόδων στη διερεύνηση και ανάλυση ταξινομικών προβλημάτων (Hillis et al., 1996), ελπίζεται ότι θα συμβάλει στην πληρέστερη γνώση της βιολογίας των μυκήτων και στην αξιόπιστη θεώρηση της εξέλιξης και της φυλογένεσής τους.

1.5 Η φυλογένεση και το μιτοχονδριακό γονιδίωμα των μυκήτων

Στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισμών εντοπίζονται πάνω από ένα μιτοχόνδρια, και ο αριθμός των αντιγράφων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος κυμαίνεται ανάμεσα σε δέκα έως αρκετές χιλιάδες ανά κύτταρο μεταβαλλόμενος συχνά από τις συνθήκες ανάπτυξης (Burger et al., 2003a). Από την στιγμή που υπάρχουν τόσα πολλά μόρια mtDNA στο κύτταρο συνεπάγεται ότι οι μεταλλαγές που μπορεί να συμβαίνουν, μπορούν να συσσωρεύονται, χωρίς να υπάρχει άμεσο μειονέκτημα επιβίωσης του κυττάρου. Τα παραπάνω θα μπορούσαν να εξηγούν τον υψηλό ρυθμό εξέλιξης που παρουσιάζει το mtDNA .

Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα λόγω του υψηλού ρυθμού εξέλιξης που έχει σε σύγκριση με το πυρηνικό DNA (Ballard et al., 2004), αλλά και της ύπαρξης πολλών εσωνίων και μεταθετών στοιχείων και των εκτεταμένων πολυμορφισμών του, έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στη μελέτη γενετικών διαφοροποιήσεων στους μύκητες (Hegedus et al., 1993, Mavridou et al., 1998, Sugimoto et al., 2003, Kouvelis et al., 2008, Ghikas et al., 2010).

Στην φυλογένεση των μυκήτων έχουν χρησιμοποιηθεί πληθώρα πυρηνικών γονιδίων, όπως τα γονίδια της μικρής και μεγάλης υπομονάδας της RNA πολυμεράσης ΙΙ (rpb1 και rpb2) (ενδεικτικά: Pantou et al., 2005b), της β- τουμπουλίνης (benA) (ενδεικτικά: Keeling et al., 2000), του μεταγραφικού παράγοντα (EF2-1α) (ενδεικτικά: Rehner και Buckley, 2005) και άλλα, με αποτελέσματα που άλλοτε επιλύουν φυλογενετικά προβλήματα και άλλοτε δημιουργούν νέους προβληματισμούς. Ανάλογα με την φύση της μελέτης και το πυρηνικό αλλά και το μιτοχονδριακό γονιδίωμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την φυλογένεση, ταξινόμηση, ταυτοποίηση και διάκριση των μυκήτων. Για παράδειγμα, εντομοπαθογόνοι μύκητες μελετήθηκαν με βάση τόσο το mtDNA όσο και την πυρηνική περιοχή ITS (ITS1-5.8S-ITS2) με

~ 32 ~

στόχο την φυλογένεση και ταξινόμηση μυκητιακών στελεχών (Ghikas et al., 2006, Kouvelis et al., 2008, Sosa-Gomez et al., 2009). Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα μπορεί επίσης, να φανεί ιδιαίτερα χρήσιμο στην μελέτη της κατανομής μυκητιακών ειδών και στην διαλεύκανση των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ τους, δηλαδή σε μελέτες φυλογεωγραφίας (Lumbsch et al., 2008, Ghikas et al., 2010).

Η μελέτη των μιτοχονδριακών γονιδίων μεμονωμένα έχει δώσει καλά αποτελέσματα στις φυλογενετικές μελέτες εντός του είδους (για παράδειγμα Kouvelis et al., 2008, Lumbsch et al., 2008, Sosa-Gomez et al., 2009, Ghikas et al., 2010), αλλά δεν είναι η μοναδική προσέγγιση. Από τα πρώτα κιόλας βήματα της ανάλυσης ολόκληρων μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων μυκήτων, που ο αριθμός των γνωστών αλληλουχιών ήταν μικρός, έγινε προσπάθεια να αξιοποιηθεί η πληροφορία ως φυλογενετικό εργαλείο για την «βαθιά» φυλογένεση εντός του βασιλείου (Paquin et al., 1997, Kouvelis et al., 2004). Δηλαδή, έγινε προσπάθεια να διερευνηθούν οι φυλογενετικές σχέσεις των οργανισμών όχι μόνο στο επίπεδο του γένους ή/και είδους, αλλά στο επίπεδο της Τάξης ή Κλάσης συνενώνοντας όλα ή τα περισσότερα μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεϊνικές υπομονάδες που εμπλέκονται στην οξειδωτική φωσφορυλίωση και παραγωγή ATP (Εικόνα 1.12, Pantou et al., 2008, Freel et al., 2015).

Το αποτέλεσμα της φυλογένεσης σε όλες τις μέχρι τώρα εργασίες που χρησιμοποίησαν το μιτοχονδριακό γονιδίωμα ως μήτρα στους μύκητες (Bullerwell et al., 2003, Kouvelis et al., 2004, Pantou et al., 2008, Freel et al., 2015) είναι σε συμφωνία με τις αντίστοιχες αναλύσεις από πυρηνικά γονίδια και γονιδιώματα (Spatafora et al., 2006, Hibbett et al., 2007) με μόνη κύρια διαφορά τη ταξινομική τοποθέτηση των Saccharomycetes: Η κλάση αυτή υποστηρίζει τη δημιουργία ενός Υπερφύλου με τους Schizosaccharomycetes (Bullerwell et al., 2003, Pantou et al., 2008), όταν η μήτρα είναι τα μιτοχονδριακά δεδομένα, ενώ είναι πιο κοντά στα Pezizomycotina σύμφωνα με τα αποτελέσματα βασισμένα σε πυρηνικά γονίδια (Spatafora et al., 2006, Hibbett et al., 2007). Με τις φυλογενέσεις αυτές δείχνεται δηλαδή πως το mtDNA έχει άλλες εξελικτικές πιέσεις και διεργασίες σε σχέση με το πυρηνικό γονιδίωμα και επομένως με την βοήθειά του μπορεί να επιλυθεί καλύτερα η εξελικτική πορεία των οργανισμών (Kuramae et al., 2006, Freel et al., 2015).

~ 33 ~

Εικόνα 1.12. Το φυλογενετικό δέντρο που προκύπτει από τη Μπαεσιανή Ανάλυση της συνένωσης (a) των πρωτεϊνικών υπομονάδων που κωδικοποιούνται στο μιτοχόνδριο (b) των 14 mt γονιδίων αλλά με στοίχιση μόνο της 1ης και 2ης θέσης των κωδικονίων (και σε συμφωνία με το ML δένδρο). Η υποστήριξη των τοπολογιών με το MrBayes δίνεται μόνο στις περιπτώσεις που είναι κάτω από 100%. Όπου δε δίνεται ήταν 100%. Τα κουτιά υποδηλώνουν την ταξινομική θέση του κάθε είδους: A = Ascomycota, B = Basidiomycota, C = Chytridiomycota, Z = Zygomycota, P = Pezizomycotina, S = Saccharomycetes, Sc = Schizosaccharomycetes, Ho = Homobasidiomycetes, Het = Heterobasidiomycetes, So = Sordariomycetes, E = Eurotiomycetes, D = Dothideomycetes, L = Leotiomycetes, H = Hypocreales, He = Helotiales, Sor = Sordariales, Ph = Phyllachorales, Pl = Pleosporales, Eu = Eurotiales, O = Onygenales, Sa = Saccharomycetales, Sch = Schizosaccharomycetales, Ag = Agaricales, Bl = Blastocladiales, T = Tremalles, M = Monoblepharidales, Mo = Mortierellales, Mu = Mucorales. (Από άρθρο Pantou et al., 2008).

~ 34 ~

1.6 Στόχος

Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων με έμφαση στη μελέτη των γενετικών στοιχείων που εμπλέκονται στην οργάνωση και μεταγραφή του mtDNA για το υπόφυλο Pezizomycotina του φύλου των Ασκομυκήτων. Η ανάλυση των mtDNAs εμπλουτίζει τις γνώσεις μας για τα μικρά αλλά σημαντικά αυτά γονιδιώματα. Πληροφορίες για την οργάνωση του γονιδιώματος και την φύση τόσο των κωδικών αλλά και των ρυθμιστικών στοιχείων του mtDNA μπορούν να δώσουν απαντήσεις σε σχέση με την ρύθμιση της μεταγραφής αυτών των μορίων DNA. Βιοπληροφορικά στοιχεία για την μεταγραφή του mtDNA στους μύκητες, όπως μια πιθανή θέση υποκινητή, θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια σημαντική εκκίνηση για πειραματικές διαδικασίες και να εξασφαλίσουν πιο σύντομα και σίγουρα αποτελέσματα.

Ακόμα, δημιουργείται μια βάση δεδομένων που συνεχώς επεκτείνεται και ανανεώνεται, η οποία παρέχει δεδομένα για συγκριτικές μελέτες και φυλογενετικές αναλύσεις. Δίνεται η δυνατότητα κατασκευής φυλογενετικών δένδρων είτε εντός ενός γένους ή μιας τάξης, είτε εντός ενός φύλου, είτε για όλο το Βασίλειο των μυκήτων. Έτσι μπορούν να μελετηθούν τόσο οι ενδο- όσο και οι δια- ειδικές σχέσεις των μυκήτων επιλέγοντας συγκεκριμένα γονίδια ή όλα τα γονίδια του μιτοχονδριακού DNA ως μια μονάδα.

Στο πλαίσιο αυτής της εργασίας επιχειρείται να γίνει in silico ανάλυση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων και χρήση των αλληλουχιών προκειμένου να ανιχνευτούν οι γενετικοί τόποι που αυτό φέρει, τα στοιχεία του επαναλαμβανόμενου DNA, τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης, και η συνταινικότητα των γονιδιωμάτων. Όλα τα παραπάνω αποτελούν στοιχεία που βοηθούν στην χαρτογράφηση των ρυθμιστικών στοιχείων που συμμετέχουν στην ρύθμιση της έκφρασης του mtDNA. Με την εργασία αυτή γίνεται προσπάθεια να αυτοματοποιηθεί η εύρεση ρυθμιστικών στοιχείων και ειδικότερα των υποκινητών του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, προκειμένου να δοθεί η δυνατότητα στο μέλλον να μελετώνται η οργάνωση των γονιδιωμάτων αλλά και των πιθανών πολυσιστρονικών μεταγράφων αυτού. Οι πληροφορίες αυτές θα είναι χρήσιμες τόσο σε φυλογενετικό όσο και σε εξελικτικό επίπεδο, ενώ θα δώσουν τη δυνατότητα για την περαιτέρω ανάπτυξη εργαλείων ταυτοποίησης των διαφορετικών ειδών εντός του υπόφυλου των Pezizomycotina.

~ 35 ~

~ 36 ~

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 Χαρακτηρισμός μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων

Η εύρεση όλων των μέχρι σήμερα (Ιούλιος 2016) γνωστών μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων μυκήτων είναι πρωταρχικής σημασίας βήμα, προκειμένου να επιτευχθούν οι στόχοι αυτής της εργασίας. Χρησιμοποιήθηκε ως πλατφόρμα έναρξης η ήδη υπάρχουσα βάση δεδομένων MitoFun (Ntertilis M., Kirmitzoglou I., Promponas V., Kouvelis N.V., Typas M.A., manuscript in preparation - http://mitofun.biol.uoa.gr/). Έγινε εντοπισμός και ανάλυση των γνωστών μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων που δεν είχαν προστεθεί στο MitoFun από τη βάση δεδομένων Nucleotide του NCBI και από Προγράμματα Αλληλούχησης Ολόκληρων Γονιδιωμάτων (Whole Genome Projects, WGS) του BROAD Institute και του JGI. Με αυτό τον τρόπο, η βάση δεδομένων MitoFun εμπλουτίστηκε με 126 νέα γονιδιώματα. Τα δεδομένα αυξάνονται συνεχώς, γεγονός που υποδηλώνει την σημασία της συνεχούς ενημέρωσης, αλλά και την δυσκολία αποτύπωσης της παρούσας κατάστασης (Πίνακας 3.1, Αποτελέσματα). Η παραπάνω διαδικασία είχε ως αποτέλεσμα την γνώση ύπαρξης συνολικά 287 mtDNAs, και επιπλέον συγκεκριμένα σε ποιες τάξεις αυτά εντοπίζονται. Η αναλυτική λίστα με όλους τους μύκητες, των οποίων το μιτοχονδριακό γονιδίωμα είναι γνωστό δίνεται στον πίνακα ST-3.1 στα συμπληρωματικά δεδομένα.

Στην in silico ανάλυση που έγινε, χρησιμοποιήθηκαν γνωστά, χαρακτηρισμένα και κατατεθειμένα σε τράπεζες δεδομένων, μιτοχονδριακά γονιδιώματα (mtDNAs) αλλά και επιχειρήθηκε η προσπάθεια συγκρότησης και χαρακτηρισμού mtDNAs από μη επισημασμένες, αλληλουχίες που απελευθερώνονται, ως μέρος άλλων εργασιών, και δεν είναι αναλυμένες. Στην εύρεση και επιλογή των μυκήτων για τους οποίους επιχειρείται η παραπάνω διαδικασία δίνεται έμφαση στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα που είναι άμεσου ενδιαφέροντος δηλαδή στις τάξεις που δεν έχουν αντιπρόσωπο με γνωστό μιτοχονδριακό γονιδίωμα ή με ελάχιστους αντιπροσώπους, ενώ για πολυπληθείς τάξεις επιλέχθηκε μικρός αριθμός από τα είδη εντός αυτών.

Για να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν (annotation) τα άγνωστα μιτοχονδριακά γονιδιώματα που δεν είναι κατατεθειμένα στις βάσεις δεδομένων (δεν έχουν αριθμό πρόσβασης- accession number), χρησιμοποιούμε τις εξής ηλεκτρονικές τοποθεσίες:

Broad Institute (http://www.broadinstitute.org)

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)

Blast table (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi)

JGI (http://www.jgi.doe.gov/genome-projects/pages/projects.jsf?kingdom=Fungi)

~ 37 ~

Από τους παραπάνω ιστοτόπους βρέθηκαν τα αποτελέσματα αλληλούχησης ολόκληρου του γονιδιώματος των μυκήτων που μας ενδιαφέρουν (Broad Institute/PubMed/JGI) αρχικά με Blastn. Τα μιτοχονδριακά τμήματα βρίσκονται σε διάφορα κομμάτια (contigs) που με την βοήθεια των προγραμμάτων SeqMan και EditSeq τα συνενώνουμε σε μια αλληλουχία (supercontig). Τα προγράμματα EditSeq και SeqMan είναι προγράμματα διαχείρισης αλληλουχιών, που δίνουν τη δυνατότητα επεξεργασίας της αλληλουχίας, για παράδειγμα μετάφρασης μιας νουκλεοτιδικής αλυσίδας με συγκεκριμένο γενετικό κώδικα (NCBI genetic code 4: Mold Mito and Mycoplasma), αλλά και την δυνατότητα στοίχισης πολλών αλληλουχιών και την εξαγωγή μιας τελικής συναινετικής αλληλουχίας (consensus). Με το πρόγραμμα GeneQuest βρίσκουμε, εκτός των άλλων, και τις επαναλήψεις σε μια αλληλουχία όπου αυτές υπάρχουν. Τα παραπάνω προγράμματα ανήκουν στο πακέτο Lasergene (DNASTAR).

Για να βρεθεί η τελική αλληλουχία αλλά και να εντοπιστούν οι περιπτώσεις όπου υπάρχει αλλαγή πλαισίου (frameshift) χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος Blast, με την βοήθεια του οποίου στοιχίζονται είτε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες (Blastn) (μεταξύ τους ή μια έναντι της βάσης δεδομένων), είτε πρωτεϊνικά μόρια (Blastp), είτε μια νουκλεοτιδική αλυσίδα έναντι πρωτεϊνών (Blastx) για να ανιχνευτεί το κατά πόσο μια αλληλουχία DNA κωδικοποιεί για πρωτεΐνη.

Στα αποτελέσματα της στοίχισης με την βοήθεια του αλγορίθμου Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome) βλέπει κανείς τα ποσοστά ομολογίας της αλληλουχίας που υποβάλλεται (query) με αυτήν με την οποία στοιχήθηκε (Subject), το τμήμα της αλληλουχίας αλλά και τον οργανισμό από τον οποίο προήλθε. Αρχικά γίνεται Blastn και Blastx της προς χαρακτηρισμό αλληλουχίας, έναντι όλων των μυκήτων και στην συνέχεια, έναντι συγγενικού μύκητα. Ταυτόχρονα, για τον εντοπισμό των μιτοχονδριακών γονιδίων κάνουμε στοιχίσεις στο πρόγραμμα SeqMan, της άγνωστης αλληλουχίας με τα γονίδια κάποιου συγγενικού μύκητα του οποίου το γνωρίζουμε πλήρως το μιτοχονδριακό γονιδίωμα.

Στο NCBI με την επιλογή Genome ή Genome Project υπάρχουν κατατεθειμένα και τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα που είναι γνωστά. Στο Blast table βάζουμε άγνωστες (μη στοιχισμένες) αλληλουχίες και αυτές στοιχίζονται με το γονιδίωμα οργανισμών από ένα πίνακα. Με το πρόγραμμα tRNAscan (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/) υποβάλλοντας μια νουκλεοτιδική αλληλουχία εντοπίστηκε η θέση των tRNAs. Για την εύρεση των tRNAs χρησιμοποιήθηκαν οι κατάλληλοι παράμετροι του προγράμματος για ανάλυση μιτοχονδριακών tRNAs. Χρησιμοποιώντας τα παραπάνω προγράμματα δημιουργείται μια πρώτη εικόνα για την δομή ενός άγνωστου μιτοχονδριακού γονιδιώματος.

Επιπρόσθετα σημαντικό εργαλείο αποτέλεσε η εφαρμογή tblastn σε συνδυασμό με το blastx που έχει αναφερθεί παραπάνω. Με την βοήθεια του tblastn με μήτρα μια πρωτεϊνική

~ 38 ~

ακολουθία, μπορεί να εντοπιστεί από ποιο σημείο του ολικού mtDNA του οργανισμού έχει προέλθει. Ουσιαστικά στοιχίζεται μια πρωτεΐνη έναντι πολλών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και δίνεται και ο αντίστοιχος γενετικός κώδικας του οργανισμού που χρησιμοποιείται. Για παράδειγμα, με τον τρόπο αυτό, εντοπίστηκε το γονίδιο της cox3 για τον μύκητα Schizosaccharomyces pombe.

Για να εντοπιστούν τα όρια των εξωνίων (εσώνια) αλλά και οι αλλαγές στο πλαίσιο ανάγνωσης χρησιμοποιήθηκε και πάλι το SeqMan [επιλογή Μετάφραση (Translate)], σε συνδυασμό με τα προγράμματα TranSeq (https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/) και ΟRF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/). Τα δύο πρώτα δίνουν τα εναλλακτικά πρωτεϊνικά μόρια στα έξι δυνητικά πλαίσια ανάγνωσης μιας νουκλεοτιδικής αλυσίδας, και το τρίτο πρόγραμμα είναι ένα πρόγραμμα που δίνει τις θέσεις των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης μιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που υποβάλλεται, με δυνατότητα περαιτέρω ανάλυσης των πλαισίων απευθείας με Blastp.

Με το πρόγραμμα RNAweasel (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/RNAweasel /RNAweaselInterface.pl) αναγνωρίζεται αν τα εσώνια των γονιδίων είναι τύπου Ι ή τύπου ΙΙ. Γνωρίζοντας ότι εφόσον αναζητούμε εσώνιο τύπου Ι, η τελευταία βάση του εξωνίου, άμεσα ανοδικά της 5’ θέσης συρραφής του εσωνίου είναι U και η τελευταία βάση του εσωνίου που ακολουθεί τη 3’ θέση συρραφής είναι G (Pantou et al., 2003), έγινε ο εντοπισμός τους. Επιπλέον, τα εσώνια της ομάδας Ι έχουν βρεθεί να περιέχουν ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης για ενδονουκλεάσες κυρίως των ομάδων LAGLI-DADG και GIY-YIG (Saguez et al., 2000). Στα εσώνια τύπου Ι πρέπει να συμπεριληφθεί και η περίπτωση εσωνίου στους μύκητες που έχει ORF που κωδικοποιεί πρωτεΐνη διαφορετική από τις αναμενόμενες ενδονουκλεάσες ματίσματος (LAGLI-DADG και GIY-YIG). Η περίπτωση αυτή είναι του εσωνίου της rnl, που κωδικοποιεί τη ριβοσωμική πρωτεΐνη Rps3 (Cummings et al., 1990, Bullerwell et al,. 2000, Kouvelis et al., 2004).

Στον Πίνακα ST-3.2 δίνονται αναλυτικά όλες οι αλλαγές και οι διορθώσεις που έγιναν στις αλληλουχίες που μελετήθηκαν. Στον συνοπτικό Πίνακα 3.2 των Αποτελεσμάτων δίνονται τα γενικά στοιχεία των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των τριών ειδών που επισημάνθηκαν εξολοκλήρου σε αυτή την εργασία. Επιπλέον, στην εικόνα 3.1 δίνεται το παράδειγμα ενός εκ των τριών γονιδιωμάτων που επισημάνθηκαν εξολοκλήρου στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Οι αναλυτικές πληροφορίες επισήμανσης για τα υπόλοιπα δύο, για λόγους απλοποίησης του κειμένου αυτού, μπορούν να βρεθούν στη βάση δεδομένων MitoFun. Πιο συγκεκριμένα, για το Annulohypoxylon stygium και Ophiostoma novo-ulmi subsp. novo-ulmi οι αναλύσεις των γονιδιωμάτων τους βρίσκονται στις σελίδες http://mitofun.biol.uoa.gr/gb2/gbrowse /Annulohypoxylon_stygium/ και http://mitofun.biol.uoa.gr/gb2/gbrowse/Ophiostoma novo- ulmi subsp. novo-ulmi/.

~ 39 ~

Με την βοήθεια του προγράμματος Sequin η ανάλυση του κάθε μιτοχονδριακού γονιδιώματος καταχωρήθηκε με την μορφή αρχείου της GenBank. Στην συνέχεια και προκειμένου να φορτωθεί ένα γονιδίωμα στην βάση δεδομένων MitoFun μετατρέπεται το αρχείο από GenBank σε gff μορφή με την βοήθεια του ηλεκτρονικού εργαλείου Format Converter (http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/FORMAT_CONVERSION/form.html).

Επομένως, σε κάθε γονιδίωμα εξακριβώνονται τα όρια κάθε γονιδίου, η πρωτεΐνη που προκύπτει από την μετάφραση αυτού, σε περιπτώσεις που το γονίδιο κωδικοποιεί για πρωτεΐνη, η χρήση του κατάλληλου γενετικού κώδικα και επιπλέον τα όρια των εσωνίων όταν αυτά είναι παρόντα καθώς και ο χαρακτηρισμός των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης εντός των εσωνίων. Στις πιο απλές περιπτώσεις οι διορθώσεις αφορούν μόνο την ονοματολογία των γονιδίων προκειμένου στην βάση δεδομένων MitoFun να υπάρχει ομοιομορφία, και τον έλεγχο των αρχείων, και σε αυτή την περίπτωση χαρακτηρίζεται ως ελάχιστη η τροποποίηση του γονιδιώματος (minor annotation). Στις περισσότερες περιπτώσεις όπου τα όρια των γονιδίων ή των εσωνίων αλλάζουν, ή/και νέα γονίδια προστίθενται σε μια εγγραφή, τότε η τροποποίηση του γονιδιώματος χαρακτηρίζεται ως μέγιστη (major annotation).

Παρά το ότι η πληροφορία που υπάρχει κατατεθειμένη είναι αρκετή και τις περισσότερες φορές σωστή, δεν λείπουν τα λάθη και επομένως είναι χρήσιμο να μπορεί κανείς να διασταυρώνει και να γνωρίζει με ακρίβεια την εγκυρότητα κάθε δεδομένου.

Στη βάση δεδομένων MitoFun υπάρχει ενσωματωμένο εργαλείο παρουσίασης της γονιδιακής οργάνωσης. Το εργαλείο αυτό χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της συνταινικότητας και για την παρουσίαση της συγκριτικής ανάλυσης των γονιδιωμάτων προκειμένου να εντοπιστούν οι συνταινικές μονάδες. Για κάθε μιτοχονδριακό γονιδίωμα στην βάση δεδομένων υπάρχει ένας πίνακας με γενικές πληροφορίες για τον μύκητα που το φέρει όπως το περιβάλλον στο οποίο αυτός βρίσκεται, τα συνώνυμα με τα οποία απαντάται και η βασική βιβλιογραφία που αφορά στην δημοσίευση του mtDNA. Επιπλέον υπάρχει η δυνατότητα να γίνει blastn και blastx εντός της βάσης προκειμένου να ταυτοποιηθεί και να αναλυθεί μια άγνωστη αλληλουχία. Τέλος, κανείς μπορεί να επιλέξει ένα mtDNA μέσα από μια σειρά γονιδιωμάτων είτε από μια λίστα με όλα τα είδη, είτε μέσα από ένα φυλογενετικό δέντρο που παρουσιάζει τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των μυκήτων, βασισμένο στην αλληλουχία των γονιδίων του μιτοχονδριακού τους γονιδιώματος. Όλα τα παραπάνω στοιχεία της βάσης αξιοποιήθηκαν στην εργασία αυτή προκειμένου να μελετηθούν καλύτερα οι διαγονιδιακές περιοχές οι οποίες αναμένεται να εμπεριέχουν τα ρυθμιστικά υπό μελέτη στοιχεία.

~ 40 ~

2.2 Φυλογενετικά δένδρα

Για την κατασκευή των φυλογενετικών δένδρων, οι αλληλουχίες όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες της αναπνευστικής αλυσίδας (nad1-6 και nad4L, cox1-3, cob) και παραγωγής ATP (atp6, 8 και 9), χρησιμοποιήθηκαν μαζί ως μια μήτρα.

Για την κατασκευή των δένδρων χρησιμοποιούνται τα αρχεία των στοιχίσεων ΜegAllign. Αρχικά το αρχείο της στοίχισης κάθε γονιδίου αποθηκεύεται από file .meg σε file .msf. Το msf αρχείο ανοίγεται με το πρόγραμμα PAUP και αποθηκεύεται ως nex αρχείο (.nex). Αφού ανοιχθεί το nex αρχείο με το πρόγραμμα PAUP όλα τα στελέχη που είναι τοποθετημένα με συγκεκριμένη σειρά (τα συγγενικά στελέχη να βρίσκονται κοντά σε ομάδες), και οι αλληλουχίες τους είναι ήδη στοιχισμένες πρέπει να γραφτούν με συγκεκριμένο τρόπο. Για παράδειγμα, η αναγνώριση της αλληλουχίας του Χ γονιδίου για τον Aspergillus nidulans πρέπει να αναγράφεται ως «Anidulans» (χωρίς κενά και τελείες). Στην συνέχεια αφήνονται δύο κενά μετά από το όνομα κάθε στελέχους και ακολουθεί η αλληλουχία του γονιδίου όπως έχει διαμορφωθεί από την στοίχιση σε μια σειρά. Το όνομα του κάθε οργανισμού τοποθετείται κάτω από το προηγούμενο έτσι ώστε σε κάθε σειρά να υπάρχει το όνομα της αλληλουχίας και η ίδια η αλληλουχία σε μια σειρά. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να αναγνωρισθούν όλες οι αλληλουχίες ως μια μήτρα. Οποιαδήποτε παράλειψη εμποδίζει το πρόγραμμα να επιτελέσει τις εντολές που του δίνουμε.

Κατά την διαδικασία δημιουργίας της συνενωμένης αλληλουχίας που προέρχεται από τις επιμέρους στοιχισμένες αλληλουχίες κάθε γονιδίου, γίνεται και προσωπική εκτίμηση της στοίχισης, και αυτή βελτιώνεται όπου κρίνεται απαραίτητο, ιδιαίτερα στην αρχή και στο τέλος του κάθε γονιδίου. Τμήματα που κρίνεται ότι αλλοιώνουν την συνολική εικόνα διαγράφονται. Έτσι προέκυψε το δένδρο της συνενωμένης αλληλουχίας με όλα τα γονίδια ως μια μονάδα με 7018 χαρακτήρες.

Το πρόγραμμα ProtTest (ver. 1.3) (Abascal et al., 2005) χρησιμοποιήθηκε για να καθορισθεί ποιο μοντέλο ταίριαζε περισσότερο στα δεδομένα της μήτρας. Βασισμένο στο Κριτήριο AIC (Akaike Information Criterion), βρέθηκε πως το πιο κατάλληλο μοντέλο είναι το WAG+I+G με a=1.57. Η Μπαεσιανή ανάλυση έγινε με χρήση του προγράμματος MrBayes (ver. 3) (Ronquist και Huelsenbeck, 2003). Ορίστηκε να εκτελεστούν δύο ανεξάρτητα τρεξίματα. Τέσσερεις ανεξάρτητες MCMCMC αναλύσεις σε κάθε τρέξιμο έγιναν για κάθε σετ δεδομένων με τυχαίο διαφορετικό σημείο εκκίνησης κάθε φορά. Ο αριθμός των γενιών καθορίστηκε στο 1.000.000 με δειγματοληψία κάθε 100 γενιές. Η σύγκλιση ελέγχθηκε οπτικά από τις γραφικές παραστάσεις των αποτελεσμάτων πιθανοφάνειας έναντι γενιάς για τα δύο διαφορετικά τρεξίματα. Βασισμένη σε πρωταρχική ανάλυση, καθορίστηκε ως σημείο αποκοπής οι 10.000 γενιές. Η υποστήριξη των τοπολογιών που προέκυψαν εξετάστηκε με τη μέθοδο των μεταγενέστερων πιθανοτήτων (Posterior Probabilities - PPs ) μετά από 1.000.000 γενιές.

~ 41 ~

Για την απεικόνιση των δένδρων αλλά και την μορφοποίησή τους χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα FigTree και Corel. Για την πιο εύκολη παρουσίαση των δέντρων στις Εικόνες 3.2 και 3.3 των Αποτελεσμάτων χρησιμοποιούνται χρώματα στα κλαδιά αντί για νούμερα αξιοπιστίας. Τα χρώματα των κλαδιών αντιπροσωπεύουν την αξιοπιστία των κλάδων με τη μέθοδο των μεταγενέστερων πιθανοτήτων ως εξής: κόκκινο 100%, μωβ 98%, magenda 91%, μπλε 90%, γαλάζιο 83%, πράσινο 78%, ανοιχτό πράσινο 56% και ανοιχτό καφέ 54%.

2.3 Στοιχίσεις διαγονιδιακών περιοχών

Για τις in silico αναλύσεις χρησιμοποιούνται οι μιτοχονδριακές αλληλουχίες που είναι κατατεθειμένες στην GenBank και αλληλουχίες που χαρακτηρίστηκαν εξ ολοκλήρου στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Πρώτο στάδιο της επεξεργασίας είναι να στοιχηθούν οι αλληλουχίες των τριών διαγονιδιακών περιοχών που επιλέχθηκαν: οι περιοχές πριν το σημείο έναρξης των γονιδίων: cox1, cob, nad4L του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Για την στοίχιση χρησιμοποιείται το πρόγραμμα MegAlign και η στοίχιση γίνεται με τον αλγόριθμο ClustalW (Thomson et al., 1994). Οι παράμετροι μένουν όπως είναι εξ ορισμού (by default) στο πρόγραμμα MegAlign για πολλαπλή στοίχιση με ClustalW (Gap Penalty 15.00, Gap Length Penalty 6.66, Delay Divergent Seqs(%) 30, DNA Transition Weight 0.50, Protein Weight Matrix: Gonnet Series, DNA Weight Matrix: IMB). Στα Αποτελέσματα - Πίνακα 3.3 δίνονται αναλυτικά τα 71 στελέχη των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν και οι τάξεις στις οποίες ανήκουν.

Αναλυτικότερα, για κάθε τάξη των οργανισμών που χρησιμοποιήθηκαν μελετήθηκε η γονιδιακή σειρά και απομονώθηκε η συγκεκριμένη διαγονιδιακή περιοχή. Οι αλληλουχίες συγκεντρώθηκαν σε ομάδες για κάθε τάξη και δημιουργήθηκε ένας πίνακας με λεπτομερή αναφορά στον οργανισμό που μελετάται, στην περιοχή που απομονώνεται και στο μέγεθος αυτής (Συμπληρωματικά δεδομένα ST-3.3). Στόχος είναι οι αλληλουχίες αυτές να στοιχηθούν ομαδοποιημένα για κάθε τάξη και να προκύψουν 6 στοιχίσεις, για τις 6 διαφορετικές τάξεις (Hypocreales, Helotiales, Eurotiales, Onygenales, Sordariales, Saccharomycetales), για κάθε διαγονιδιακή περιοχή (Συμπληρωματικά δεδομένα – φάκελος Alignments). Πριν πραγματοποιηθεί η στοίχιση εξετάζεται αν οι διαγονιδιακές περιοχές φέρουν ORFs και επαναληπτικές αλληλουχίες.

Στην περίπτωση που υπήρξε ένα ή περισσότερα ORFs σε μια αλληλουχία τότε γίνεται εκτίμηση της περιοχής που έπρεπε να αφαιρεθεί προκειμένου να γίνει η στοίχιση. Στον πίνακα ST-3.4 των Συμπληρωματικών δεδομένων αναφέρονται τα ονόματα των στελεχών, η διαγονιδιακή περιοχή και οι θέσεις που εντοπίζονται τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης. Επίσης με μωβ χρώμα δίνεται η περιοχή που επιλέγεται να απομακρυνθεί. Για την βελτίωση της στοίχισης σε κάποιες περιπτώσεις έγινε αφαίρεση των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης και σε όλες τις περιπτώσεις

~ 42 ~

χρειάστηκε περαιτέρω επεξεργασία από το χρήστη προκειμένου ορισμένες περιοχές να στοιχηθούν καλύτερα.

Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες χωρίζονται σε τρείς τύπους, την ανεστραμένη επανάληψη (inverted repeat) όπου μια αλληλουχία DNA ακολουθείται από την ανεστραμένη μορφή της (π.χ. TGCCATGCGCATGGCA), την δυαδική επανάληψη (dyad repeat) όπου μια αλληλουχία DNA ακολουθείται μετά από κάποιες βάσεις από μια καθρεπτιζόμενη αλληλουχία (π.χ. TAGCGA…AGCGAT) και τέλος από την ευθεία επανάληψη (direct repeat) όπου μια αλληλουχία DNA επαναλαμβάνεται όμοια μετά από κάποιες βάσεις (π.χ. TAGCGTCCAgaaaatgga…gtcaattctcTAGCGTCCA). Στα αρχεία SD-3.1 και SD-3.2 των Συμπληρωματικών δεδομένων δίνονται αναλυτικά όλες οι επαναλήψεις που εντοπίστηκαν στα στελέχη που ανήκουν στην τάξη Hypocreales και Saccharomycetales αντίστοιχα.

Παρατηρώντας το αποτέλεσμα της στοίχισης (Alignment Review), φαίνονται οι περιοχές όπου οι αλληλουχίες είναι όμοιες. Εκτυπώνονται εκείνες οι σελίδες όπου οι αλληλουχίες είναι περισσότερο συντηρητικές και σε αυτές τις περιοχές εντοπίζονται με προσωπική οπτική παρατήρηση οι όμοιες/ανόμοιες βάσεις (με βάση την συναινετική αλληλουχία). Σε όλες τις στοιχίσεις η σειρά με την οποία τοποθετούνται τα μυκητιακά στελέχη μένει ίδια, και είναι μια σειρά με ταξινομική σημασία, που δίνει την δυνατότητα να εστιάσει κανείς σε μια ή δύο ομάδες αντίστοιχα, αφαιρώντας στελέχη ανά περίπτωση μελέτης ομάδας.

Η διαδικασία γίνεται για κάθε περιοχή χωριστά. Εντοπίζονται συντηρητικές περιοχές και εξετάζεται κατά πόσο φέρουν συντηρητικές ακολουθίες που φέρουν χαρακτηριστικά μοτίβα γνωστών υποκινητών.

2.4 Πρόβλεψη υποκινητών

Μετά την μελέτη της στοίχισης των διαγονιδιακών περιοχών, και την γνώση της αλληλουχίας κάποιων υποκινητών σε στελέχη μυκήτων από πειραματικά δεδομένα (βλέπε Εισαγωγή) επιχειρήθηκε να σχεδιαστεί ένα μοτίβο που θα χαρακτηρίζει την ακολουθία των υποκινητών στο Υπόφυλο Pezizomycotina. Προέκυψαν τα τρία μοτίβα της Εικόνας 3.6 των Αποτελεσμάτων. Ένα από τα μοτίβα χαρακτηρίζει αυστηρά το υπόφυλο Pezizomycotina, το δεύτερο τις ζύμες και το τρίτο αποτελεί ένα γενικό μοτίβο που περιέχει τα δύο προηγούμενα.

Γράφτηκε κώδικας σε γλώσσα προγραμματισμού perl, ο οποίος ανοίγει ένα gff αρχείο, αποθηκεύει σε μεταβλητή τον Αριθμό Πρόσβασης (Accession Number) του γονιδιώματος, διαβάζει και αποθηκεύει την αλληλουχία του γονιδιώματος που δίνεται στο τέλος του κάθε gff αρχείου. Στην συνέχεια αποθηκεύονται σε πίνακα η αρχή και το τέλος κάθε γονιδίου, και αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται και για γονίδια του συμπληρωματικού κλώνου, αν υπάρχουν. Με την βοήθεια του «μοτίβου ταιριάσματος» (pattern maching) διαβάζεται όλο το γονιδίωμα και γίνεται αναζήτηση του ενός εκ των τριών μοτίβων που σχεδιάστηκαν και χαρακτηρίζουν

~ 43 ~

την αλληλουχία του υποκινητή. Αρχικά, δοκιμάστηκε το πρώτο και εξειδικευμένο για το Υπόφυλο Pezizomycotina μοτίβο, στην συνέχεια αυτό των ζυμών που όμως έδωσε καλά αποτελέσματα σε όλες τις ομάδες μυκήτων και τέλος, και μόνο εάν δεν υπάρχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα δοκιμάζεται το γενικό μοτίβο.

Η αναζήτηση γίνεται τόσο στην αρχική ακολουθία όσο και στον συμπληρωματικό κλώνο του DNA για να καλυφθεί η περίπτωση των γονιδίων που μεταγράφονται με αντίθετη φορά. Στην περίπτωση που εντοπίζεται ένας πιθανός υποκινητής εντός τμήματος του DNA που κωδικοποιεί για ένα γονίδιο αυτό αναφέρεται στα αποτελέσματα προκειμένου να αξιολογηθεί αν πράγματι πρόκειται για πιθανό υποκινητή. Τα αποτελέσματα δίνονται σε ξεχωριστό αρχείο όπου αναφέρεται η αλληλουχία του πιθανού υποκινητή, η θέση της και αν στο σημείο αυτό υπάρχει γονίδιο, αντίστοιχες πληροφορίες δίνονται και για τον συμπληρωματικό κλώνο. Στην Εικόνα 3.7 των Αποτελεσμάτων δίνεται ο κώδικας αναλυτικά.

~ 44 ~

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1 Η βάση δεδομένων MitoFun

Η ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των μυκήτων που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina αλλά και στα υπόλοιπα Υπόφυλα είναι απαραίτητη προκειμένου να εντοπιστούν οι περιοχές εκείνες που εμπλέκονται στην οργάνωση και μεταγραφή του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA). Δηλαδή, για να γίνει επιτυχημένα η χαρτογράφηση των υποκινητών (cis γενετικά στοιχεία), είναι απαραίτητο τα γονιδιώματα που μελετώνται να είναι χαρακτηρισμένα με ακρίβεια, με ομοιογενή δομή/παρουσίαση και χωρίς όσο το δυνατόν ανακρίβειες και λάθη. Κομβικό ρόλο στην συλλογή και αξιολόγηση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων έπαιξε η βάση δεδομένων MitoFun (Ntertilis M., Kirmitzoglou I., Promponas V., Kouvelis N.V., Typas M.A., manuscript in preparation - http://mitofun.biol.uoa.gr/). Το MitoFun (Mitochondrial Fungal Genome Database) είναι μια βάση δεδομένων που περιέχει όλα τα ελεύθερα διαθέσιμα μιτοχονδριακά γονιδιώματα και επιπλέον mtDNAs που έχουν επισημανθεί εξ ολοκλήρου στα πλαίσια αυτής της βάσης, καθώς και άλλων ερευνητικών εργασιών.

Η βάση δεδομένων MitoFun δημιουργήθηκε το 2014 και έκτοτε εμπλουτίζεται και ανανεώνεται συνεχώς. Μέχρι τη συγγραφή της εργασίας αυτής έχουν αναλυθεί 223 mt γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στους Ασκομύκητες εκ των οποίων τα 100 γονιδιώματα ανήκουν σε είδη του υπό εξέταση Υπόφυλου Pezizomycotina. Στα πλαίσια της διπλωματικής αναλύθηκαν και ελέγχθηκαν 93 Ασκομύκητες και ειδικότερα 47 mt γονιδιώματα που ανήκαν σε Pezizomycotina, (συνοπτικά Πίνακας 3.1 και αναλυτικότερα Πίνακας ST-3.1). Επιπλέον και προκειμένου να υπάρχει μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα των mt γονιδιωμάτων των μυκήτων, αναλύθηκαν άλλα 33 mt γονιδιώματα που ανήκαν στα υπόλοιπα φύλα με την ακόλουθη σύσταση: είδη που ανήκουν στους Βασιδιομύκητες 18, στους Ζυγομύκητες 5, Γκλομερομύκητες 9 και Κρυπτομύκητες 1. Όπως φαίνεται ο αριθμός των mtDNAs μυκήτων που πλέον είναι διαθέσιμος αυξάνεται γρήγορα, σχεδόν διπλασιάστηκε εντός μιας διετίας. Επομένως, η ενημέρωση της βάσης καθίσταται μια πρόκληση που τονίζει ακόμα περισσότερο την ανάγκη παροχής φιλτραρισμένης πληροφορίας για περαιτέρω αναλύσεις όπως αυτής της εργασίας. Συνολικά, κατά την εκπόνηση της παρούσας εργασίας αναλύθηκαν επιπλέον 126 γονιδιώματα, τα οποία δεν θα παρουσιαστούν εκτενώς, αλλά θα περιγραφεί εντός του κειμένου αυτού με παραδείγματα η φιλοσοφία και η ανάλυση που αποτέλεσε τη βάση για το σχεδιασμό μετέπειτα της in silico εύρεσης των δυνητικών θέσεων των υποκινητών.

Είναι γνωστό πως οι μύκητες στα μιτοχόνδριά τους εμπεριέχουν γονιδιώματα που ποικίλλουν σε μέγεθος και οργάνωση (Gray et al., 1999, Burger et al., 2003a, Burger et al., 2003b, Kouvelis et al., 2004). Τα γονίδια που εμπεριέχονται εντός αυτών είναι συνήθως όπως και στα αντ/χα ζωικά mt γονιδιώματα συγκεκριμένης σύστασης, αλλά σε αντίθεση με αυτά των ζώων

~ 45 ~

περιέχουν μεγάλες διαγονιδιακές περιοχές και συνήθως ένα ή περισσότερα εσώνια εντός των συντηρημένων γονιδίων (βλέπε Εισαγωγή 1.1.3). Με την ανάλυση των mt γονιδιωμάτων διαπιστώθηκε πως όλοι οι μύκητες που ελέγχθηκαν κατά την εργασία αυτή και ανήκαν στο υπόφυλο των Pezizomycotina παρουσίαζαν την παρακάτω αναμενόμενη περιγραφόμενη σύσταση: περιέχουν τα 14 πρωτεϊνικά γονίδια που σχετίζονται με την οξειδωτική φωσφορυλίωση (7 γονίδια για υπομονάδες της NADH αφυδρογονάσης, 1 γονίδιο για μια υπομονάδα του αποκυτοχρώματος b, 3 γονίδια για υπομονάδες της κυτοχρωμικής οξειδάσης c) και την παραγωγή ATP (3 γονίδια για υπομονάδες της ATP F0 συνθετάσης), 2 γονίδια rRNA (της μικρής και μεγάλης ριβοσωμικής RNA υπομονάδας) και αριθμό γονιδίων που κωδικοποιούν tRNAs (κυμαινόμενο μεταξύ συνήθως 22-27 που αντιστοιχούν σε όλα τα αμινοξέα). Είναι αξιοσημείωτο πως εντός όλων των γονιδίων, σε σπάνιες περιπτώσεις και εντός των γονιδίων tRNA (trn), εντοπίζονται εσώνια που ο αριθμός τους μπορεί να ποικίλει από 1 (π.χ. στο γονίδιο rnl του μύκητα Lecanicillium muscarium έως 25 εσώνια (π.χ. στο γονίδιο cox1 του μύκητα Podospora anserina). Τα εσώνια εντός των μιτοχονδριακών γονιδίων μπορούν να διακριθούν σε εσώνια τύπου Ι και τύπου ΙΙ (διαφορετικός μηχανισμός αυτοκατάλυσης). Σχεδόν πάντα και σε αντίθεση με τα εσώνια που συναντώνται στα πυρηνικά γονίδια των μυκήτων βρέθηκαν ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που μπορούν να αντιστοιχούν σε γονίδια που κωδικοποιούν ενδονουκλεάσες τύπου LAGLI-DADG, τύπου GIY-YIG, αντίστροφη μεταγραφάση και ωριμάσες (maturases). Ειδικά σε ένα εσώνιο τύπου Ι, εντός του γονιδίου rnl και σε συγκεκριμένη πάντα θέση στόχο (TACGCTAGGGAT ↓ AACAGGCTAATTTGCGCAAGAGT) βρέθηκε στα mt γονιδιώματα των Pezizomycotina από την εκτενή αυτή μελέτη των γονιδιωμάτων Ανοικτό Πλαίσιο Ανάγνωσης (ORF) που πιθανά κωδικοποιεί για την ριβοσωμική πρωτεΐνη Rps3 της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας. Είναι αξιοσημείωτο πως το ίδιο Ανοικτό Πλαίσιο Ανάγνωσης στους κατώτερους Μύκητες όταν βρίσκεται, εντοπίζεται ως ανεξάρτητο γονίδιο, δείχνοντας ουσιαστικά μια πιθανή εξελικτική διαδικασία. Επιπλέον η αλληλουχία αυτή στόχος όπως και το συγκεκριμένο εσώνιο με το ORF αυτό έχει βρεθεί και στο Υπόφυλο Saccharomycotina (είχε ονομαστεί «ω (omega) transposase recognition site» – Colleaux et al. 1988).

Από τα 126 γονιδιώματα που μελετήθηκαν, τα 88 υπέστησαν μεγάλες τροποποιήσεις (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και σε 3 γονιδιώματα έγινε εξ ολοκλήρου επισήμανση από την αρχή. Συγκεκριμένα αναλύθηκαν de novo τα γονιδιώματα των Ασκομυκήτων Annulohypoxylon stygium, Ophiostoma novo-ulmi subsp. novo-ulmi και Verticillium alboatrum (Πίνακα 3.2). Στην Εικόνα 3.1 δίνεται ο γενετικός χάρτης του mtDNA του Verticillium alboatrum που αναλύθηκε και επισημάνθηκε εξ ολοκλήρου στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας. Στον Πίνακα 3.2 δίνονται επίσης, ως χαρακτηριστικά παραδείγματα των επεμβάσεων που έγιναν σε ήδη χαρακτηρισμένα γονιδιώματα, οι αλλαγές που πραγματοποιήθηκαν στους οργανισμούς: Diaporthe longicolla NC_02750: Diaporthales/Ascomycota, Sporisorium reilianum FQ311469:

~ 46 ~

Φύλο Υπόφυλο Κλάση Τάξη

Hypocreales (10/30)

Microascales (1/1)

Sordariales (6/6) Sordariomycetes (21/48) Ophiostomatales (1/3)

Glomerellales (3/7)

Xylariales (0/1)

Dothideomycetes (2/4) Pleosporales (2/3)

Capnodiales (0/1) Pezizomycotina Lecanoromycetes (2/3) Peltigerales (2/2) (53/100) Lecanorales (0/1)

Ascomycota (130/223) Leotiomycetes (3/13) Helotiales (3/11)

Diaporthlaes (0/2)

Leotiomycetes incertae sedis (0/1)

Eurotiales (13/19)

Eurotiomycetes (25/31) Onygenales (11/11)

Chaetothyriales (1/1)

Saccharomycotina Saccharomycetes (73/113) Saccharomycetales (73/113) (73/113)

Schizosaccharomycetes Schizosaccharomycetales (3/3) (3/3) Taphrinomycotina (4/10) Pneumocystidomycetes Pneumocystidiales (1/7) (1/7)

Agaricales (5/8) Agaricomycotina Basidiomycota (16/34) Cantharellales (1/3) (10/22) Agaricomycetes (7/18) Polyporales (1/5)

~ 47 ~

Corticiales (0/1)

Sebacinales (0/1)

Tremellomycetes (3/4) Tremellales (3/4)

Microbotryales (1/2) Microbotryomycetes (1/3) Pucciniomycotina (3/5) Sporidiobolales (0/1)

Pucciniomycetes (2/2) Pucciniales (2/2)

Tilletiales (2/2)

Exobasidiomycetes (2/4) Malasseziales (0/1) Ustilagomycotina (3/7) Microstromatales (0/1)

Ustilaginomycetes (1/3) Ustilaginales (1/3)

Harpellales (1/1) Kickxellomycotina (2/2) Fungi incertae cedis Zygomycota (3/8) Mortierellales (1/1) (3/8) Mucoromycotina (1/6) Mucorales (1/6)

Monoblepharidomycota Monoblephaidomycetes Monoblepharidales (4/4) N/A (4/4) (4/4)

Rhizophydiales (1/1) Chytridiomycetes (2/2) Chytridiomycota (4/4) N/A Spizellomycetales (1/1)

Blastocladiomycetes (2/2) Blastocladiales (2/2)

Diversisporales (2/2) Glomeromycota (4/13) N/A Glomeromycetes (4/13)

Glomerales (2/11)

Cryptomycota (0/1) N/A N/A N/A (0/1)

Σύνολο (161/287)

Πίνακας 3.1. Συνοπτική παρουσίαση της ταξινόμησης των μυκήτων των οποίων τα mt γονιδιώματα είναι σήμερα γνωστά και αναλύθηκαν σε αυτή την εργασία. Αναφέρονται οι τάξεις, οι κλάσεις, τα υπόφυλα και τα φύλα στα οποία ανήκουν τα mt γονιδιώματα των μυκήτων που είναι διαθέσιμα. Στην παρένθεση με μαύρο χρώμα δίνεται ο αριθμός των mtDNAs που ήταν διαθέσιμος το 2014 και με κόκκινο χρώμα ο αριθμός των mtDNAs που είναι διαθέσιμος σήμερα.

~ 48 ~

Ustilaginales/Basidiomycota και Ganoderma lucidum G.260125-1 HF570115: Polyporales/Basidiomycota. Αναλυτικά όλες οι αλλαγές που έγιναν στα γονιδιώματα που μελετήθηκαν δίνονται στον Πίνακα ST-3.2 των συμπληρωματικών δεδομένων.

Οργανισμός Θέση Διόρθωση Αριθμός πρόσβασης GenBank Annulohypoxylon 1…133782 Επισήμανση ολόκληρου του γονιδιώματος NC_023117 stygium Ophiostoma novo-ulmi 1…66357 Επισήμανση ολόκληρου του γονιδιώματος CM001753 subsp. novo-ulmi Verticillium alboatrum 1…25154 Επισήμανση ολόκληρου του γονιδιώματος MF000004 494…1864 Διόρθωση ορίων εσωνίου cob 72691…85863 Εύρεση rnl 13999…15510 Εύρεση rns Sporisorium reilianum FQ311469 53668...55054 Διόρθωση ορίων εσωνίου cox1

52191...53560 Διόρθωση ορίων εσωνίου cox1 49401...50817 Διόρθωση ορίων εσωνίου cox1 48028...49138 Διόρθωση ορίων εσωνίου cox1 217..1203 ORF εσωνίου GIY-YIG ενδονουκλεάση 27541..28503 ORF εσωνίου LAGLI-DADG ενδονουκλεάση Ganoderma lucidum 42584..43459 ORF εσωνίου LAGLI-DADG ενδονουκλεάση HF570115 G.260125-1 45410..46321 ORF εσωνίου GIY-YIG ενδονουκλεάση

36954…38498 Εύρεση rps3 46306… 47886 Διόρθωση nad4 γονιδίου καθώς ήταν Diaporthe longicolla χαρακτηρισμένο ως nad4L NC_027509 15448…16164,17204…18457 Εύρεση nad5 32065…32736 Εύρεση nad6 Πίνακας 3.2. Τα τρία mtDNA που επισημάνθηκαν εξ ολοκλήρου στο πλαίσιο αυτής της εργασίας και οι διορθώσεις και οι προσθήκες που έγιναν αναλυτικά στα παραδείγματα που παρουσιάζονται για τους μύκητες Diaporthe longicola, Ganoderma lucidum και Sporisorium reilianum. Δίνεται η θέση της κάθε αλλαγής καθώς και η περιγραφή της αλλαγής, όπως και ο αριθμός πρόσβασης στην τράπεζα GenBank.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.2 στην περίπτωση του μύκητα S. reilianum βρέθηκαν τα δύο γονίδια ριβοσωμικού RNA (rRNA) που κωδικοποιούν για την μεγάλη (rnl) και την μικρή (rns) ριβοσωμική υπομονάδα, τα οποία δεν υπήρχαν στην αρχική καταχώρηση του γονιδιώματος καθώς επίσης διορθώθηκαν και τα όρια τεσσάρων εσωνίων στο γονίδιο της cox1 και ενός εσωνίου στο γονίδιο της cob. Στον μύκητα G. lucidum χαρακτηρίστηκαν τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (Open Reading Frames-ORFs) τεσσάρων εσωνίων και βρέθηκαν οι ενδονουκλεάσες που σχετίζονται με την αποκοπή τους. Τέλος στον μύκητα D. longicolla εντοπίστηκαν τρία βασικά γονίδια (rps3, nad5, nad6) και διορθώθηκε η επισήμανση του γονιδίου nad4. Ο

~ 49 ~

γενετικός κώδικας που χρησιμοποιείται από τους υφομύκητες είναι ο κώδικας 4 (GenBank: Γενετικός κώδικας 4). Ενώ οι ζύμες χρησιμοποιούν τον κώδικα 3 (GenBank: Γενετικός κώδικας 3). Αναλυτικά στον γενετικό χάρτη του V. alboatrum στην Εικόνα 3.1 φαίνονται όλα τα tRNA γονίδια, τα rRNA γονίδια με την rnl να παρουσιάζεται με γαλάζιο χρώμα και τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες. Εντοπίστηκαν 26 tRNA γονίδια, 2 rRNA γονίδια και 14 πρωτεϊνικά γονίδια.

Εικόνα 3.1. Ο γενετικός χάρτης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του μύκητα Verticillium alboatrum όπως προέκυψε μετά από την πλήρη επισήμανσή του σε ευθύγραμμη απεικόνιση. Δίνονται τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, τα tRNA και τα rRNA γονίδια (με την rnl να παρουσιάζεται με γαλάζιο χρώμα). Με βέλη δίνεται η φορά της μεταγραφής.

Επομένως, η βάση δεδομένων MitoFun εμπεριέχει όλα τα μέχρι σήμερα γνωστά γονιδιώματα με ομοιογενή τρόπο παρουσίασης και όσο το δυνατόν περισσότερο διορθωμένα και συμπληρωμένα όλα τα στοιχεία. Αξιολογώντας τα δεδομένα αυτά έγιναν φανερά τα ακόλουθα δύο συμπεράσματα:

(α) το περιεχόμενο των γονιδιωμάτων ως προς τα γονίδια είναι σταθερό. Ελάχιστες είναι οι περιπτώσεις έλλειψης (ή αδυναμίας εντοπισμού) ενός γονιδίου που κωδικοποιεί πρωτεΐνη της αναπνευστικής αλυσίδας και της σύνθεσης ATP. Για παράδειγμα στα mt γονιδιώματα των ειδών που ανήκουν στην τάξη Pleosporales λείπει το γονίδιο της atp8. Συνηθέστερο φαινόμενο είναι η έλλειψη γονιδίου (trn) που κωδικοποιεί tRNA συγκεκριμένου αμινοξέος. Για παράδειγμα στο μιτοχονδριακό γονιδίωμa του Lecanicillium muscarium δεν είναι δυνατό να εντοπιστεί το trnC σε πλήρη συμφωνία με την εργασία ανάλυσης των Κουβέλη και συνεργατών

~ 50 ~

(Kouvelis et al., 2004), ενώ σε άλλα mt γονιδιώματα συγγενών ειδών (που ανήκουν στην τάξη Hypocreales) με παρόμοιο ενδιαίτημα και μηχανισμούς παθογένειας (εντομοπαθογόνοι μύκητες), όπως Beauveria malawiensis (NC_030635), Cordyceps militaris (NC_022834) και Hirsutella minnesotensis (NC_027660), που αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, το γονίδιο trnC είναι παρών στην ίδια γονιδιακή θέση (μεταξύ των γονιδίων cob και cox1).

(β) ενώ το περιεχόμενο είναι σταθερό με λίγες εξαιρέσεις, η γονιδιακή οργάνωση (gene order / synteny) ποικίλει από γονιδίωμα σε γονιδίωμα με μεγάλες αναδιατάξεις. Φαινόμενο το οποίο είναι γνωστό και για το λόγο αυτό έχουν προταθεί σε διάφορες εργασίες μονάδες συνταινικότητας που συντηρούνται μέσα στην εξέλιξη ακόμα και όταν τα γνωστά γονιδιώματα μυκήτων ήταν πολύ λίγα (βλέπε Εισαγωγή, Cummings et al., 1990, Sakito et al., 1995, Burger et al., 2003b, Pantou et al., 2008). Μέσα από την in silico ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων έγινε επίσης σαφές ότι υπάρχουν χαρακτηριστικά γονιδιακής οργάνωσης που διατηρούνται συντηρημένα εντός του Βασιλείου των Μυκήτων, όπως για παράδειγμα τα συνταινικά ζευγάρια: nad2-nad3, atp8-atp6, nad4L-nad5, nad6-nad1, αλλά υπάρχουν και δομές που διαφοροποιούν και διαχωρίζουν τις ομάδες μεταξύ τους όπως για παράδειγμα οι: nad4-nad6, nad1-cob ή cox3-nad4L-nad5 που χαρακτηρίζουν το φύλο των Βασιδιομυκήτων στην πλειοψηφία των τάξεων. Οι συνταινικές ομάδες: nad4L–nad5, nad2–nad3, nad1–nad4 και atp6–atp8 φαίνεται να διατηρούνται στην πλειοψηφία των στελεχών που ανήκουν στους Ασκομύκητες, αλλά και σε στελέχη πιο απομακρυσμένων ομάδων.

Μέσα από την ενημέρωση της βάσης δεδομένων που έγινε στα πλαίσια αυτής της εργασίας, βρέθηκε η ευκαιρία να διαπιστωθεί αν και πότε η συνταινικότητα συντηρείται, προκειμένου να έχουμε περισσότερα δεδομένα για το ποια γονίδια θα μπορούσαν να υπόκεινται κάτω από τον έλεγχο του ίδιου υποκινητή και επομένως να μεταγράφονται μαζί ως πολυσιστρονικά μετάγραφα. Η ανάλυση όλων των δεδομένων έδειξε πως η γονιδιακή οργάνωση των mt γονιδιωμάτων αλλάζει στους μύκητες στο επίπεδο συνήθως της τάξης. Δηλαδή, είδη που ανήκουν στην ίδια τάξη παρουσιάζουν την ίδια οργάνωση με μικρές διαφορές, όπως π.χ. την έλλειψη ενός γονιδίου trn. Προφανώς διαπιστώθηκαν και κάποιες ελάχιστες εξαιρέσεις με χαρακτηριστικότερη τα mt γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στην τάξη Sordariales. Συγκεκριμένα, η γονιδιακή σειρά στα έξι διαφορετικά είδη, των οποίων τα mt γονιδιώματα βρίσκονται εντός της Τάξης αυτής, παρουσιάζουν κοινές συνταινικές ομάδες, αλλά επουδενί την ομοιομορφία που συναντάμε στη συνταινικότητα των γονιδιωμάτων από είδη που ανήκουν σε άλλες τάξεις. Αναλυτικότερα, η Neurospora crassa (KC683708) και η Sordaria macrospora (CABT01004783) παρουσιάζουν την ίδια γονιδιακή σειρά στο mtDNA τους με εξαίρεση κάποια trn γονίδια και την ύπαρξη επιπλέον δύο ψευδογονιδίων στη N. crassa. Το mt γονιδίωμα της Madurella mycelomatis (NC_018359) παρουσιάζει μια μετατόπιση του γονιδίου cox2 έναντι των δύο προηγουμένων. Η μετατόπιση αυτή επεκτείνεται με την προσθήκη του γονιδίου atp9 στα συγγενικά είδη Chaetomium thermophilum (NC_015893) και C. globosum

~ 51 ~

(MF000005) που διαφέρουν μεταξύ τους μόνο σε κάποια trn γονίδια. Τέλος, στη Podospora anserina (NC_001329) παρατηρούμε μια τελείως ανεξάρτητη γονιδιακή οργάνωση η οποία διασπά ακόμα και γονίδια που είναι πάρα πολύ συχνά ομαδοποιημένα όπως είναι η atp8 – atp6.

Επομένως, με την ανάλυση των γονιδιωμάτων και την συγκριτική μελέτη της γονιδιακής οργάνωσης έγινε εφικτό να εντοπιστούν περιοχές οι οποίες δε θα ήταν πιθανά δυνατό να εμπεριέχουν υποκινητή, αλλά θα πρέπει να συναντώνται πάντα εντός των Pezizomycotina ως πολυσιστρονικά μετάγραφα. Η υπόθεση αυτή αφορά τις γονιδιακές ομάδες nad4L – nad5 και nad2 – nad3, όπου σχεδόν πάντα βρίσκονται μαζί και επιπλέον με επικάλυψη μιας βάσης [δηλαδή, το τελευταίο νουκλεοτίδιο του κωδικονίου λήξης (Α) του ενός γονιδίου αποτελεί το πρώτο νουκλεοτίδιο (Α) του κωδικονίου έναρξης του δεύτερου γονιδίου].

Επιπροσθέτως, η συγκριτική μελέτη της συνταινικότητας των γονιδιωμάτων βοήθησε στην απλοποίηση της ανάλυσης για εύρεση υποκινητών καθώς γονιδιώματα με την ίδια γονιδιακή σειρά θα μπορούσε να περιέχουν και τις ίδιες ρυθμιστικές περιοχές εφόσον είναι πολύ συγγενικά, καθώς κατά τη διάρκεια της εξελικτικής τους πορείας δεν αναμένεται να έχουν γίνει παρά επιπρόσθετες μικρές διαφοροποιήσεις. Για το λόγο αυτό, έπρεπε να επιβεβαιωθούν οι φυλογενετικές σχέσεις των ειδών των οποίων γνωρίζουμε το μιτοχονδριακό τους γονιδίωμα.

3.2 Φυλογενετικά δένδρα

Προκειμένου να αναλύσουμε τις φυλογενετικές σχέσεις των ειδών των οποίων το mtDNA γνωρίζουμε, χρησιμοποιήθηκε το ίδιο το γονιδίωμα και όχι πυρηνικοί δείκτες για δύο λόγους: (α) για να συνδυαστεί η πληροφορία του φυλογενετικού δένδρου με αυτή από την ανάλυση της γονιδιακής σειράς και (β) επειδή έχει αποδειχθεί πως η φυλογένεση βάσει του mtDNA δίνει εφάμιλλα και καλύτερα σε υποστήριξη δένδρα από τα αντ/χα των πυρηνικών γονιδίων (βλέπε Εισαγωγή, Hegedus et al., 1993, Mavridou et al., 1998, Sugimoto et al., 2003, Pantou et al., 2008).

Οι αμινοξικές αλληλουχίες όλων των μιτοχονδριακών γονιδίων μαζί ως μια μονάδα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή φυλογενετικών δένδρων. Μετά από στοίχιση, συνένωση και επεξεργασία από το χρήστη της μήτρας δεδομένων προέκυψε το φυλογενετικό δέντρο της Εικόνας 3.2 που δείχνει τις φυλογενετικές σχέσεις για τα 287 στελέχη μυκήτων των οποίων το mtDNA είναι διαθέσιμο. Προτιμήθηκαν οι αμινοξικές και όχι οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των γονιδίων καθώς στην πρώτη περίπτωση αναδεικνύονται οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των οργανισμών και γίνεται δυνατή η τοποθέτηση ενός άγνωστου και μη χαρακτηρισμένου οργανισμού σε μια θέση που υποδηλώνει τον βαθμό συγγένειάς του με τους υπόλοιπους μύκητες αλλά και την εξελικτική του πορεία, σε συνδυασμό πάντα με τον μορφολογικό του

~ 52 ~

χαρακτηρισμό. Κατά την φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιείται ο μύκητας Allomyces macrogynus: Blastocladiomycota, ως «εξω-ομάδα» (outgroup) καθώς από προηγούμενες μελέτες δείχνει πως παρουσιάζει στις αλληλουχίες του τέτοια διαφοροποίηση από τις αντ/χες των υπολοίπων μυκήτων ώστε να βρίσκεται πάντα στη βάση του δένδρου.

Για την κατασκευή του δέντρου χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό MrBayes. Η Bayesian Inference είναι μια στατιστική διεργασία στην οποία ενδείξεις ή παρατηρήσεις χρησιμοποιούνται για την αναθεώρηση ή εξαγωγή νέου συμπεράσματος σχετικά με το τι είναι γνωστό υπό την προϋπόθεση ορισμένων παραμέτρων ή υποθέσεων. Φαίνεται πως η τελική θέση όλων των στελεχών υποστηρίζεται κατά 100%. Κάποιες εσωτερικές σχέσεις όπως μεταξύ των ζυμών, στην σχέση μεταξύ των ζυμών και των υφομυκήτων αλλά και εντός του υποφύλου Pezizomycotina μεταξύ των κλάσεων Leotiomycetes και Eurotiomycetes υποστηρίζονται ισχυρά (80-98% – Εικόνα 3.2).

Τα παραπάνω απεικονίζονται καλύτερα στην Εικόνα 3.3 όπου οι τάξεις των ασκομυκήτων και τα φύλα των υπόλοιπων μυκήτων δίνονται σχηματικά με τρίγωνα. Το υπόφυλο Pezizomycotina οργανώνεται με συμπαγή τρόπο και οι ζύμες ακολουθούν ολοκληρώνοντας την ομάδα των ασκομυκήτων. Τα φύλα Blastoclediomycota, Monoblepharidomycota, Chytridiomycota, Cryptomycota και Glomeromycota οργανώνονται μαζί όπως αναμενόταν. Με χαμηλή υποστήριξη υπάρχει η σύνδεση μεταξύ των Βασιδιομυκήτων και όλων των υπόλοιπων μυκήτων με τους Ασκομύκητες. Οι σχέσεις μεταξύ των ειδών είναι ιδιαίτερα ξεκάθαρες δεδομένης της ποικιλομορφίας εντός του βασιλείου των μυκήτων.

3.3 Πρόβλεψη υποκινητών

Έχοντας την εικόνα όλων των γνωστών mt γονιδιωμάτων των μυκήτων, τη συγκριτική μελέτη της γονιδιακής οργάνωσης αλλά και τις φυλογενετικές τους σχέσεις ώστε να αναγνωρίζονται οι συγγενικές μορφές, θεωρήθηκε σημαντικό επόμενο βήμα για την εύρεση των υποκινητών η μελέτη των διαγονιδιακών περιοχών. Με τον τρόπο αυτό θα προσδιοριστούν in silico τα πολυσιστρονικά μετάγραφα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Έμφαση δίνεται στα είδη των μυκήτων που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina και από όλες τις διαγονιδιακές περιοχές, προκειμένου να εκτιμηθεί η θέση του υποκινητή επιλέχθηκαν τρεις περιοχές: (1) η ανιούσα θέση του γονιδίου cox1, (2) η ανιούσα θέση του γονιδίου cob και (3) η ανιούσα θέση του γονιδίου nad4L. Οι παραπάνω γενετικοί τόποι επιλέχθηκαν λόγω της βιβλιογραφικής αναφοράς στην ύπαρξη υποκινητών και ρυθμιστικών στοιχείων στις περιοχές αυτές για συγκεκριμένους μύκητες (βλέπε Εισαγωγή). Προκειμένου να γίνει η συλλογή δεδομένων για την δημιουργία ενός μοτίβου που θα χαρακτηρίζει την ακολουθία του υποκινητή χρησιμοποιήθηκαν 71 οργανισμοί (Πίνακας 3.3). 56 από αυτούς ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina, το οποίο και μελετάται, και 15 ανήκουν στην τάξη Saccharomycetales για την

~ 53 ~

Εικόνα 3.2. Το φυλογενετικό δέντρο που δημιουργήθηκε από τις αμινοξικές ακολουθίες των μιτοχονδριακών γονιδίων μετά την χρήση του λογισμικού MrBayes. Tα χρώματα των κλαδιών αντιπροσωπεύουν την αξιοπιστία των κλάδων με τη μέθοδο των μεταγενέστερων πιθανοτήτων ως εξής: κόκκινο 100%, μωβ 98%, magenda 91%, μπλε 90%, γαλάζιο 83%, πράσινο 78%, ανοιχτό πράσινο 56% και ανοιχτό καφέ 54%. Για κάθε στέλεχος δίνεται ένας αύξων αριθμός

~ 54 ~

Εικόνα 3.3. Το φυλογενετικό δέντρο που δημιουργήθηκε από τις αμινοξικές ακολουθίες των μιτοχονδριακών γονιδίων μετά την χρήση του λογισμικού MrBayes - το ίδιο δέντρο της εικόνας 3.2 σε συμπαγή αναπαράσταση που αναδεικνύει τις Τάξεις εντός των Ασκομυκήτων (κόκκινα και μπλε τρίγωνα). Τα υπόλοιπα φύλα των μυκήτων παρουσιάζονται ως τρίγωνα διαφορετικού χρώματος. Διακρίνονται οι ομαδοποιήσεις μεταξύ των συγγενικών ειδών και οι φυλογενετικές τους σχέσεις.

~ 55 ~

οποία υπάρχουν και τα περισσότερα πειραματικά δεδομένα που αφορούν στην ακολουθία και θέση των υποκινητών. Πιο αναλυτικά επιλέχθηκαν 16 στελέχη από την τάξη Eurotiales, 9 από την τάξη Onygenales, 7 από την τάξη Heliotiales, 18 από την τάξη Hypocreales και 6 από την τάξη Sordariales. Οι παραπάνω τάξεις επιλέχθηκαν καθώς είναι από τις μεγάλες και αντιπροσωπευτικές τάξεις εντός των Pezizomycotina και οι οργανισμοί επιλέχθηκαν έτσι ώστε να μην υπάρχουν όσο γίνεται όμοια μεταξύ τους στελέχη αλλά μια ποικιλία που να δώσει την δυνατότητα σχεδιασμού ενός μοτίβου που θα ανταποκρίνεται σε όλο το υπόφυλο Pezizomycotina. Τα γονιδιώματα από τα υπόλοιπα είδη εντός των Pezizomycotina θα είναι η μήτρα εξέτασης του κώδικα.

Αρχικά μελετήθηκε η περιοχή της ανιούσας θέσης της cox1. Το μέγεθος των διαγονιδιακών περιοχών έδειξε μεγάλη ποικιλομορφία, που κυμαινόταν από 24 βάσεις (Pneumocystis jirovecii: trnV-cob) έως 68407 βάσεις (Sclerotinia borealis: nad4-cob). Οι διαγονιδιακές περιοχές με μεγάλο μέγεθος συνήθως περιέχουν ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης ή διπλασιασμούς και άλλες επαναλήψεις (Συμπληρωματικά δεδομένα Πίνακας ST-3.3). Αναλυτικότερα για την τάξη Hypocreales, εντός της οποίας εμφανίζεται συντηρητικότητα στην συνταινικότητα (βλέπε αντ/χη παράγραφο συνταινικότητας), το γονίδιο πριν από την cox1 ήταν σε όλες τις περιπτώσεις ένα tRNA γονίδιο για την κυστεΐνη (trnC) με μοναδική εξαίρεση το γονιδίωμα του L. muscarium. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.4 για τα 18 στελέχη που ανήκουν στην τάξη Hypocreales η περιοχή αυτή απομονώθηκε. Επιπλέον, στην περίπτωση της συγκεκριμένης τάξης απομονώθηκε επιπλέον και η περιοχή σε ανιούσα θέση του trnC γονιδίου (cob-trnC) για να εξεταστεί η περίπτωση η αλληλουχία του υποκινητή να βρίσκεται εκεί. Οι ακολουθίες αυτές μελετήθηκαν τόσο χωριστά όσο και μετά από συνένωση μεταξύ τους.

Όπως περιγράφεται και στα Υλικά και Μέθοδοι, πριν γίνει η στοίχιση των αλληλουχιών που είναι η βασική πληροφορία μέσα από την οποία θα προκύψει ένα πιθανό μοτίβο, κάθε αλληλουχία εξετάστηκε ξεχωριστά για την ύπαρξη ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (ORFs) εντός αυτής αλλά και στοιχείων επανάληψης. Προέκυψε ένας πίνακας που αναφέρονται αναλυτικά τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που βρέθηκαν και οι περιοχές που αφαιρέθηκαν για τους οργανισμούς που ανήκουν στις τάξεις Hypocreales και Saccharomycetales (Συμπληρωματικά δεδομένα ST- 3.4).

Για τις υπόλοιπες τάξεις η διαδικασία δεν επαναλήφθηκε καθώς φάνηκε πως η στοίχιση μπορούσε να γίνει αποτελεσματικά ακόμα και όταν κάποιο ORF εμπεριέχεται στην αλληλουχία. Γενικότερα, δεν εμφάνισαν όλες οι περιοχές ORFs και συνήθως ένα ή περισσότερα ORFs εντοπίζονται στις περιοχές με μεγαλύτερο μέγεθος. Στην περίπτωση που

~ 56 ~

Order Species Chaetomium globosum CBS 148.51

Aspergillus clavatus NRRL1 Chaetomium thermophilum var. thermophilum DSM 1495 Aspergillus flavus NRRL3357 Madurella mycetomatis mm55 Sordariales Aspergillus fumigatus AF293 Neurospora crassa OR74A 6 Aspergillus kawachii IFO 4308 Podospora anserina race s Aspergillus nidulans FGSC_A4 Sordaria macrospora k-hell Aspergillus niger N909 Candida albicans CBS 562 Aspergillus oryzae RIB40 Candida labiduridarum NRRL Y-27940 Aspergillus terreus NIH2624 Candida parapsilosis CBS 7157 (SR 23) Eurotiales Aspergillus tubingensis 932 16 Candida tropicalis CBS 94 Aspergillus ustus 3.3904 Clavispora lusitaniae CBS 6936 Neosartorya fischeri NRRL181 Cyberlindnera suaveolens CBS 1670 Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 Hanseniaspora uvarum MUCL 31704 Penicillium digitatum pd01 Saccharomycetales Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140 15 Penicillium marneffei MP1 Komagataella pastoris CBS 7435 Penicillium roqueforti UASWS P1 Lachancea thermotolerans CBS 6340 Penicillium solitum 20-01 Candida glabrata CBS 138 Ajellomyces capsulatus G186AR Saccharomyces cerevisiae S288c Arthroderma obtusum ATCC42129 Starmerella bacillaris CECT 11046 Arthroderma otae ATCC36299 Torulaspora delbrueckii CBS 1146 Coccidioides immitis RS Yarrowia lipolytica CBS 599 Onygenales Epidermophyton floccosum ATCC26072 9 Microsporum gypseum CBS 118893 Paracoccidioides brasiliensis Pb18 Πίνακας 3.3. Οι 71 οργανισμοί των οποίων οι Trichophyton rubrum BMU 01672 διαγονιδιακές περιοχές χρησιμοποιήθηκαν για την Trichophyton tonsurans CBS 112818 δημιουργία μοτίβου που θα χαρακτηρίζει την ακολουθία Botryotinia fuckeliana B05.10 Glarea lozoyensis 74030 του υποκινητή στο υπόφυλο Pezizomycotina. Δίνεται η Phialocephala subalpina 70-1 τάξη και ο αριθμός των στελεχών για κάθε τάξη. Helotiales Rhynchosporium agropyri 04CH-RAC-A.6.1 7 Rhynchosporium commune UK7 Sclerotinia borealis F-4128 Sclerotinia sclerotiorum 1980 ATCC18683 Acremonium chrysogenum ATCC 11550 Acremonium implicatum TR Beauveria pseudobassiana C1010 Cordyceps bassiana Bb147 Cordyceps brongniartii IMBST95031 Cordyceps militaris EFCC-C2 Fusarium circinatum MRC 7870 Fusarium graminearum CBS 110263 Fusarium oxysporum F11 Hypocreales Fusarium solani mpVI 18 Gibberella moniliformis 7600 Gibberella zeae PH-1 Hirsutella minnesotensis 3608 Lecanicillium muscarium C42 Metacordyceps chlamydosporia 170 Metarhizium anisopliae ME1 Paecilomyces hepiali CS-4 Trichoderma reesei QM9414

~ 57 ~

Οργανισμός Από Έως Διαγονιδιακή Mήκος Από Έως Διαγονιδιακή Mήκος περιοχή περιοχή A. chrysogenum 1480 14368 trnC - cox1 289 14000 14079 cob - trnC [include trn] 80 A. imlpicatum 15817 16175 trnC - cox1 359 15687 15816 cob - trnC [include trn] 130 B. pseudobassiana 15367 15606 trnC - cox1 240 15200 15366 cob - trnC [include trn] 167 C. bassiana 16783 17022 trnC - cox1 240 16618 16782 cob - trnC [include trn] 165 C. brongniartii 17192 17430 trnC - cox1 239 17051 17191 cob - trnC [include trn] 141 C. militaris 19260 19602 trnC - cox1 343 19069 19259 cob - trnC [include trn] 191 F. circinatum 19986 21408 trnC - cox1 1423 19557 19985 cob - trnC [include trn] 429 F. graminearum 57344 58992 trnC - cox1 1649 57003 57343 cob - trnC [include trn] 341 F. oxysporum 18230 19595 trnC - cox1 1366 17931 18229 cob - trnC [include trn] 299 F. solani 30691 31811 trnC - cox1 1121 30404 30690 cob - trnC [include trn] 287 G. monilifirmis 33235 34669 trnC - cox1 1435 32862 33234 cob - trnC [include trn] 373 G. zeae 57214 58862 trnC - cox1 1649 56873 57213 cob - trnC [include trn] 341 H. minnesotensis 25845 26675 trnC - cox1 831 25452 25844 cob - trnC [include trn] 393 L. muscarium 13090 13590 cob - cox1 501 13090 13590 cob - cox1 501 M. clamydosporia 22201 22622 trnC - cox1 422 22072 22200 cob - trnC [include trn] 129 M. anisopliae 13238 13620 trnC - cox1 383 13110 13237 cob - trnC [include trn] 128 P. hepiali 13128 13412 trnC - cox1 285 12978 13127 cob - trnC [include trn] 150 T. reesei 31112 31522 trnC - cox1 411 30924 31111 cob - trnC [include trn] 188 Πίνακας 3.4. Η διαγονιδιακή περιοχή cob-trnC-cox1 για το mt γονιδίωμα των ειδών που ανήκουν στην τάξη Hypocreales. Παρουσιάζεται σε δύο τμήματα η διαγονιδιακή περιοχή και το μέγεθος καθενός εξ’ αυτών.

υπάρχει πάνω από ένα πλαίσιο τότε εξετάζεται η φορά μεταγραφής και η θέση του και αφαιρείται μια περιοχή που περιέχει τον μεγαλύτερο αριθμό των πλαισίων. Αναλυτικότερα στον Πίνακα 3.5 δίνεται ένα παράδειγμα για κάποιους από τους οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Hypocreales.Τα περισσότερα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης δεν κωδικοποιούν για κάποια συγκεκριμένη πρωτεΐνη, αλλά υπάρχουν κάποιες περιπτώσεις όπου ένα πλαίσιο ανάγνωσης μπορεί να κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη όπως μια ενδονουκλεάση. Η πιθανότητα αυτή μπορεί να υποδεικνύει την ύπαρξη κάποιου ψευδογονιδίου που δεν έχει εντοπιστεί ή και να αποτελεί την περίπτωση μιας πιθανής ενδονουκλεάσης που εμφανίζεται ως ελεύθερο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης. Μετά την αφαίρεση των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης προέκυψαν δύο σύνολα δεδομένων με τα οποία γίνονται στοιχίσεις, αυτά χωρίς ORFs και αυτά με ORFs. Το πρώτο σύνολο έδωσε πιο ευανάγνωστα αποτελέσματα αλλά στην ουσία δεν αλλάζει το αποτέλεσμα της στοίχισης.

~ 58 ~

Διαγονιδιακή Περιοχές που Oργανισμός θέση Επισήμανση περιοχή αφαιρούνται A. chrysogenum 1-101 (+1) 1-114 (-1) B. pseudobassiana 115-239 (+1) 1-114 (-1) C. bassiana 115-239 (+1) 337-453 (+1) 261-428 (+3) 261- 487 F. circinatum 362-487 (-1) 1322-1422 1322-1422 (-1) GIY-IYG ενδονουκλεάση 3-149 (+3) 816-935 (+3) 3-149 trnC-cox1 1149-1448 (+3) 1548-1648 F. graminearum 1548-1648 (+3) GIY-IYG ενδονουκλεάση 915-1043 (-1) 1253-1411 (-2) 3-131 (+3) F. oxysporum 300-518 (+3) 3-518 1252-1365 (-2) 1252-1365 241-405 (+1) E3 ουβικιτίνη 763-927 (+1) 42-405 F. solani 42-143 (+3) 1017-1120 1017-1120 (+3) GIY-IYG ενδονουκλεάση Πίνακας 3.5. Τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που βρέθηκαν σε εφτά από τους δεκαοχτώ οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Hypocreales. Δίνεται η διαγονιδιακή περιοχή που μελετήθηκε, τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που βρέθηκαν και οι περιοχές που επιλέγονται να αφαιρεθούν χρωματίζονται με μωβ. Σε κάποιες περιπτώσεις κωδικοποιούνται πιθανά πρωτεΐνες που αναφέρονται στην τελευταία στήλη του πίνακα.

Στην επεξεργασία των διαγονιδιακών περιοχών επιπρόσθετα έγινε χαρτογράφηση των επαναλήψεων που μπορεί να υπάρχουν. Ο τύπος και η θέση των επαναλήψεων μπορεί να φανούν ιδιαίτερα χρήσιμα χαρακτηριστικά καθώς ενδέχεται να έχουν ρυθμιστικό χαρακτήρα στην τελική διαμόρφωση του DNA. Η σημασία του επαναλαμβανόμενου DNA σχετίζεται με δομές που μπορεί να οδηγούν σε λήξη της μεταγραφής, με ρυθμιστικούς ρόλους ή με γεγονότα διπλασιασμού και ανασυνδυασμού ενός τμήματος του γονιδιώματος. Σε όλες τις διαγονιδιακές περιοχές των γονιδιωμάτων των στελεχών που ανήκουν στις τάξεις Hypocreales και Saccharomycetales εντοπίστηκαν όλες οι επαναλήψεις (αρχεία SD-3.1 και SD-3.2 των συμπληρωματικών δεδομένων αντίστοιχα). Στις υπόλοιπες τάξεις η διαδικασία δεν

~ 59 ~

επαναλήφθηκε καθώς υπήρχαν πλεον όλα τα στοιχεία για την εύρεση μοτίβου το οποίο θα αναζητούσε το εργαλείο (κώδικας) που αναπτύχθηκε για την εύρεση πιθανών υποκινητών.

Όπως φαίνεται στα αντίστοιχα αρχεία των συμπληρωματικών δεδομένων υπάρχουν οργανισμοί που δεν έχουν ή έχουν μικρό αριθμό επαναλήψεων ενώ υπάρχουν άλλοι που φέρουν πολλούς τύπους επαναλήψεων. Αναλυτικά στην ομάδα των Πινάκων 3.6 δίνεται η καταγραφή των επαναλήψεων για τέσσερις οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Hypocreales: Acremonium chrysogenum, Acremonium implicatum, Cordyceps brongniartii και Fusarium circinatum για την περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1. Όπως φαίνεται ο μύκητας A. chrysogenum φέρει δύο δυαδικές επαναλήψεις στην αρχή και στην μέση της διαγονιδιακής περιοχής, ενώ ο μύκητας A. Implicatum που ανήκει και στο ίδιο γένος φέρει δύο δυαδικές επαναλήψεις που δεν μοιάζουν στην αλληλουχία ή την θέση με αυτές του A. chrysogenum και τρείς ανεστραμμένες επαναλήψεις δύο εκ των οποίων είναι παλίνδρομα και μια σχηματίζει δομή μίσχου θηλιάς. Σχηματικά οι επαναλήψεις που εντοπίζονται στο A. implicatum δίνονται στην Εικόνα 3.4. όπου δίνεται η δομή του RNA της διαγονιδιακής περιοχής. Στον μύκητα C. brongniartii εντοπίζονται μια ανεστραμένη και μια δυαδική επανάληψη ενώ στον F. circinatum που η περιοχή είναι και μεγαλύτερη (1423 βάσεις) εντόπίζονται 10 ανεστραμένες επαναλήψεις εκ των οποίων οι τρείς είναι παλίνδρομες και οι υπόλοιπες σχηματίζουν μίσχους και θηλιές. Η περιοχή αυτή φέρει επιπλέον 14 δυαδικές και 7 ευθείες επαναλήψεις. Οι επαναλήψεις μελετώνται σε συνδυασμό με την δομή που του RNA στο χώρο καθώς οι μίσχοι και οι θηλιές που σχηματίζονται παίζουν ρόλο στην μεταγραφή. Μια επανάληψη μπορεί να

Α. chrysogenum

Δυαδική επανάληψη (Dyad repeats) Μήκος Θέση Αλληλουχία 12 26 CATAAAAAATAC 13 96/129 TTTCATTTTATTT

Α. implicatum

Ανεστραμμένες επαναλήψεις (Inverted repeats) Μήκος Θέση Αλληλουχία Τύπος 20 185 ATATATTTATATAAATATAT Παλίνδρομο 12 276 AATATATATATT Παλίνδρομο 12 (stem) 7 - 18 5’ AAATTTAATATA 3’ 78 (loop) 108 - 97 3’ TTTAAATTATAT 5’ Μίσχος-Θηλιά Δυαδική επανάληψη (Dyad repeats) 13 185 ATATATTTATATA 13 192 TATATAAATATAT

~ 60 ~

C. brongniartii

Ανεστραμμένες επαναλήψεις (Inverted repeats) Μήκος Θέση Αλληλουχία Τύπος 12 156 TGCTTATAAGCA Παλίνδρομο Δυαδική επανάληψη (Dyad repeats) 15 88 AATATATTTATATAA

F. circinatum

Ανεστραμμένες επαναλήψεις (Inverted repeats) Μήκος Θέση Αλληλουχία Τύπος 30 11 GTAGCACTGCCCCTTAAGGGGCAGTGCTAC Παλίνδρομο 18 84 TAGCTTGCTAGCAAGCTA Παλίνδρομο 16 285 AAAAAATATATTTTTT Παλίνδρομο 15 (stem) 248 - 262 5’TTTATAAAAAAAAAT 3’ 177 (loop) 454 - 440 3’AAATATTTTTTTTTA 5’ Μίσχος-Θηλιά 14 (stem) 353 - 366 5’ATTTTTTTTTTATA3’ Μίσχος-Θηλιά 57 (loop) 437 - 424 3’ TAAAAAAAAAATAT5’ 14 (stem) 248 - 261 5’TTTTATAAAAAAAA3’ Μίσχος-Θηλιά 93 (loop) 368 - 355 3’AAATATTTTTTTTT 5’ 13 (stem) 155 - 167 5’TATTAACTAATAT3’ Μίσχος-Θηλιά 1133 (loop) 1313 - 1301 3’ATAATTGATTATA 5’ 12 (stem) 60 - 71 5’AAAAAAAAAATA3’ Μίσχος-Θηλιά 280 (loop) 363 - 352 3’ TTTTTTTTTTAT5’ 12 (stem) 424 - 435 5’TATAAAAAAAAA3’ Μίσχος-Θηλιά 5 (loop) 452 - 441 3’ATATTTTTTTTT 5’ 12 (stem) 480 - 491 5’TATTTCATAGCA3’ Μίσχος-Θηλιά 129 (loop) 632 - 621 3’ATAAAGTATCGT5’ Δυαδική επανάληψη (Dyad repeats) 13 350 AATATTTTTTTTT 441 TTTTTTTTTATAA 12 60 AAAAAAAAAATA 425 ATAAAAAAAAAA 12 294 ATTTTTTATATA 1042 ATATATTTTTTA 18 350 AATATTTTTTTTTTATAA 16 290 ATATATTTTTTATATA 14 1171 ATTACATTACATTA 13 148 AATTATATATTAA 13 170 ATAAATATAAATA 13 439 TATTTTTTTTTAT 12 426 TAAAAAAAAAAT 12 1137 TAAAATTAAAAT Ευθείες Επαναλήψεις (Direct repeats) 17 355/441 TTTTTTTTTATAAAGCA

~ 61 ~

14 94/684 GCAAGCTAAAGCTC 13 405/688 GCTAAAGCTCTCG 13 403/704 GTGCTAAAGCTCT 12 290/1042 ATATATTTTTTA 12 304/716 TAGCTCCGCCTA 12 250/424 TATAAAAAAAAA Πίνακες 3.6. Οι επαναλήψεις που βρέθηκαν στις διαγονιδιακές περιοχές σε ανιούσα θέση της cox1 στα mt γονιδιώματα σε τέσσερις οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Hypocreales. Δίνεται η θέση και το μήκος κάθε επανάληψης. Με ροζ χρώμα παρουσιάζεται το τμήμα της αλληλουχίας που είναι παλίνδρομο σε σχέση με τις πρώτες βάσεις.

έχει κάποια συγκεκριμένη δομή στο RNA αλλά μπορεί να βρίσκεται και σε σημείο που δεν έχει συγκεκριμένη διαμόρφωση.

Κατά αντιστοιχία, μελετώντας τις αλληλουχίες των διαγονιδιακών περιοχών των ζυμών βρέθηκαν δύο μοτίβα να βρίσκονται αρκετά συχνά. Το ένα αφορά στην αλληλουχία του υποκινητή που έχει βρεθεί στον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae: ATATAAGTA (Clark- Walker et al., 1985), και το άλλο σε ένα μοτίβο που εντοπίζεται ιδιαίτερα στο γένος Candida: ATAGGTA (Kolondra et al., 2015). Εξετάστηκε αν τα 15 στελέχη που ανήκουν στην τάξη Saccharomycetales και χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία φέρουν το ένα, το άλλο ή και τα δύο μοτίβα, και σε ποια θέση. Προέκυψε έτσι ο Πίνακας 3.7 στον οποίο παρουσιάζεται η παρουσία ή όχι κάθε μοτίβου, η θέση του και αν υπάρχει κάποιο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης ή επανάληψη στο σημείο αυτό. Όπως φαίνεται το μοτίβο ATATAAGTA εντοπίζεται σε όλους τους οργανισμούς σε αντίθεση με το ATAGGTA που λείπει από 7 στελέχη. Κατά την κατασκευή του μοτίβου που θα προβλέπει την αλληλουχία του υποκινητή στο υπόφυλο Pezizomycotina επιχειρήθηκε να γίνει συνδυασμός των δύο αλληλουχιών σε συνδυασμό με τα δεδομένα που δόθηκαν και από τις υπόλοιπες τάξεις.

Όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι, ακολούθησε η στοίχιση των αλληλουχιών της κάθε διαγονιδιακής περιοχής, με αποτέλεσμα να δημιουργηθούν τρεις μήτρες: (1) για την περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1, (2) για την περιοχή σε ανιούσα θέση της cob και (3) περιοχή σε ανιούσα θέση της nad4L. Επιχειρήθηκε να βρεθούν οι περιοχές που φανερώνουν κάποια συντηρητικότητα καθώς και κάποια ομοιότητα με γνωστές αλληλουχίες που έχουν καθοριστεί πειραματικά. Τα αποτελέσματα των στοιχίσεων για τις τρεις περιοχές δίνονται στον φάκελο Alignments των συμπληρωματικών δεδομένων. Στην Εικόνα 3.5 παρουσιάζεται μέρος της στοίχισης που αφορά τους οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Hypocreales για την περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1. Επιλέχθηκε ένα τμήμα που φέρει μια εν μέρει συντηρητική περιοχή και κάποιες επαναλήψεις. Είναι φανερό πως ένα μοτίβο είναι αρκετά δύσκολο να διακριθεί και χρειάστηκαν πολλές στοιχίσεις και στοιχεία και από τις άλλες τάξεις και τις υπόλοιπες διαγονιδιακές περιοχές για να δημιουργηθεί ένα ενιαίο μοτίβο.

~ 62 ~

Μετά την εκτέλεση και αξιολόγηση όλων των στοιχίσεων και για τις τρεις διαγονιδιακές περιοχές δημιουργήθηκε ένα μοτίβο ικανό να χαρακτηρίζει την αλληλουχία του υποκινητή και κατά συνέπεια την πρόβλεψη των κύριων μεταγράφων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (Εικόνα 3.6). Βασικές κατευθυντήριες γραμμές αποτέλεσαν ο υποκινητής του S. cerevisiae, οι πληροφορίες για την αλληλουχία του υποκινητή στις ζύμες και στο υπόφυλο Pezizomycotina. Προέκυψαν ως εκ τούτου τρία μοτίβα: ένα πιο ειδικό και αυστηρό για τους μύκητες που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina, ένα που χαρακτηρίζει τις ζύμες αλλά φάνηκε από τα αποτελέσματα ότι απαντάται και σε άλλους οργανισμούς και ένα τρίτο αρκετά ελαστικό που καλύπτει όλες τις ομάδες. Ο πυρήνας του μοτίβου είναι οι εννέα πρώτες θέσεις, προστίθενται όμως και οι δύο επόμενες καθώς φαίνεται να βελτιώνουν τα αποτελέσματα.

~ 63 ~

U U A G A G A U U U A A A A A A U A A U U A A U U U A U U A U A U A U U G C A A A A G A A G A A U U U A U A U U G U A A A G U A G A C A U U G A U A A U A U A U C U U U U C C A U G U U U A G A G A A C C A U G U G C U A A U A U G C G A A U A U U A A A U A A U U A G A A A G U C A U U A U U U U A C G A A U G A U G U A A A U A A U C U U U U G U U A A A U A U A A A A A U U U U A A A U U A U U A A A C U U A U U C A U U U A A U U U U U G U A U A G U A C U C C G C U U G A U A U G A A U U A G A U G U U U A U U U A U A U G A U A C U A A U U A U A G U A A C A A U U G A U A U U U A U A U A A A A G G A A U U U A A U U U A A U U U C A U A G A U A A U G A U U C U U U A G A A U A A U A U A A U A U U A U A U U U A U A U U A A Εικόνα 3.4. Η δομή του RNA για την διαγονιδιακή περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1 για τον μύκητα A. implicatum μεγέθους 359 βάσεων. Φαίνονται οι μίσχοι και οι θηλιές που χαρακτηρίζουν το RNA και με κίτρινο πλαίσιο εντοπίζονται οι επαναλήψεις.

~ 64 ~

ATATAAGTA ATAGGTA

Οργανισμός Μέγεθος Θέση Ύπαρξη Ύπαρξη Θέση Ύπαρξη Ύπαρξη διαγ/κής μοτίβου ORF επανάλη- μοτίβου ORF επανάλη- περιοχής (πριν ψης ψης cox1) (bp)

C. albicans 518 238 - - 434  -

C. labiduridarum 557 311 - - 39 - -

C. parapsilosis 239 211 - - 161 - -

C. tropicalis 1602 1/1452 /- - 1489 - -

C. glabrata 172 117 - - ?

C. lusitaniae 376 291 - - ?

C. suaveolens 604 177 - - 395 - -

H. uvarum 48 24 - ?

K. lactis 552 267 - - ?

K. pastoris 626 ? 534 - -

L. thermotolerans 494 171 -  ?

P. jirovecii 30 ? ?

S. cerevisiae 530 62 - - 7 - -

S. bacillaris 67 30 - - ?

T. delbrueckii 596 272  - 376 - -

Y. lipolytica 664 1 - 270  -

S. pombe 220 ? 38 - -

Πίνακας 3.7. Τα δύο μοτίβα που εντοπίζονται στην τάξη Saccharomycetales και Schizosaccharomycetales ως πιθανές αλληλουχίες του υποκινητή. Παρουσιάζεται η θέση τους στα 15 στελέχη των ζυμών που μελετήθηκαν όπως και η ύπαρξη ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης ή επανάληψης στο σημείο εντοπισμού του μοτίβου. Με ? και - δηλώνεται η απουσία του μοτίβου, ORF ή επανάληψης αντίστοιχα. ~ 65 ~

Εικόνα 3.5. Τμήμα της στοίχισης για τα στελέχη της τάξης Hypocreales που αφορά στην περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1. Με πράσινο χρώμα δίνονται τα νουκλεοτίδια που διαφέρουν από την συνεναιτική ακολουθία, και με κίτρινη υπογράμιση δίνονται οι επαναλήψεις του DNA.

Εικόνα 3.6. Τα τρία μοτίβα που βρέθηκαν να χαρακτηρίζουν την πλειοψηφία των αλληλουχιών των υποκινητών που θα χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της αλληλουχίας ενός υποκινητή σε γονιδιώματα που δεν υπάρχει τέτοια πληροφορία. Με λευκό χρώμα φαίνεται το μοτίβο που αντιπροσωπεύει καλύτερα τις ζύμες, με κόκκινο αυτό που αφορά τους Pezizomycotina και με καφέ το μοτίβο που επιχειρεί να καλύψει όλες τις περιπτώσεις.

~ 66 ~

Έχοντας πλεον την πληροφορία μιας συνεναιτικής ακολουθίας με τα χαρακτηριστικά του υποκινητή γράφτηκε ένας κώδικας σε perl ο οποίος διαβάζει ένα gff αρχείο, και εντοπίζει όποιο από τα τρία μοτίβα ζητηθεί στην ακολουθία του DNA (Εικόνα 3.7 - για λεπτομέρειες βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

#!/usr/bin/perl –w open (mitoprom_results, ">>mitoprom_results.txt"); print "Give the file name of the genome you wish to analyze for putative promotor sequences\n"; $filename=<>; open (IN, "<$filename") or die ("could not open file\n"); $fastaname=0; $a=''; $dna=''; while () {if ($_=~/^>(\w\w..\d\d\d.+)\n/) {$fastaname=$1;} if ($_=~/^([ATGCN|atgcn]{0,60})\n/) {$a=$1; $dna=$dna.$a;} chomp $dna; if ($_=~/^(\w\w..\d\d\d.+)\sGenBank\sgene\s(\d+)\s(\d+)\s.\s(.)\s.+Name=(\w+)/g) {push (@genestart, $2); push (@geneend, $3); push (@genename, $5); if ($4 eq '-') {push (@rcstart, $2); push (@rcend, $3); push (@rcname, $5);}}} close IN; $length=length($dna); $dna= uc $dna; @dnatable=split('',$dna); $i=0; for ($i=0; $i<=$#dnatable; $i++) {if ($dnatable[$i] eq 'A') {push (@cdnatable, 'T');} elsif ($dnatable[$i] eq 'T') {push (@cdnatable, 'A'); } elsif ($dnatable[$i] eq 'G') {push (@cdnatable, 'C');} elsif ($dnatable[$i] eq 'C') {push (@cdnatable, 'G');} } $cdna=join('',@cdnatable); $rcdna=0; $rcdna= reverse ($cdna); $test=0; for ($test=0;$test<=$#rcstart;$test++) {$rcend[$test]=$length-$rcend[$test]+1; $rcstart[$test]=$length-$rcstart[$test]+1;} $x=0; $y=0; $k=0; $j=0;

~ 67 ~

for ($x=0;$x<=$length; $x++) {$b=substr ($dna,$x,11); if ($b=~/^(A|G|T)(A|T)(A)(A|T)(A)(A|G)(G)(A|T)(A)(A)(T)/) {$y++; $k=$x+1; print mitoprom_results "Putative promotor sequence $b found for $y time in possition $k of the genome $fastaname\n"; for ($j=0;$j<=$#genestart;$j++) {if ($k>$genestart[$j] && $k<$geneend[$j]) {print mitoprom_results "Putative promotor sequence within gene coding region $genename[$j]\n"; $j++;}}}} if ($y==0) {print mitoprom_results "No putative promotor sequence found in the genome $fastaname\n";} $xx=0; $yy=0; $kk=0; $jj=0; $rclength=length($rcdna); for ($xx=0;$xx<=$rclength; $xx++) {$c=substr ($rcdna,$xx,11); if ($c=~/^(A|G|T)(A|T)(A)(A|T)(A)(A|G)(G)(A|T)(A)(A)(T)/) {$yy++; $kk=$xx+1; print mitoprom_results "Putative promotor sequence $c found for $yy time in possition $kk of the reverse complement sequence of the genome $fastaname\n"; for ($jj=0;$jj<=$#rcstart;$jj++) {if ($kk>$rcend[$jj] && $kk<$rcstart[$jj]) {print mitoprom_results "Putative promotor sequence within gene coding region $rcname[$jj]\n"; $jj++;}}}} if ($yy==0) {print mitoprom_results "No putative promotor sequence found in the reverse complement sequence of the genome $fastaname\n";} close (mitoprom_results); Εικόνα 3.7. Ο κώδικας σε perl που γράφτηκε για να προβλέπει πιθανές αλληλουχίες υποκινητών στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα και την θέσης τους. Ο κώδικας διαβάζει gff αρχεία και τα αποτελέσματα δίνονται σε ένα αρχείο κειμένου.

Τα στελέχη των μυκήτων με γνωστό μιτοχονδριακό γονιδίωμα που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina είναι 100. Από αυτά τα 56 έχουν χρησιμοποιηθεί για να γίνουν οι στοιχίσεις και μελετηθεί για να δημιουργηθούν τα μοτίβα με τα οποία επιχειρείται η πρόβλεψη των υποκινητών. Αφαιρώντας τα όμοια είδη μένουν 27 μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina. Έγινε εκτέλεση του προγράμματος αρχικά για τα γονιδιώματα που χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρα και υπήρχαν κάποια πειραματικά δεδομένα. Με το πρόγραμμα προτάθηκαν οι αναμενόμενοι υποκινητές. Εντός αυτών βρέθηκαν και οι θέσεις που έχουν ταυτοποιηθεί με πειραματικά δεδομένα. Ακολούθως, προχωρήσαμε στην ανάλυση για τα 27 γονιδιώματα των οποίων δεν υπάρχει κανένα δεδομένο για υποκινητές και τα αποτελέσματα δίνονται στους Πίνακες 3.8-3.34. Για την καλύτερη κατανόηση, για κάθε

~ 68 ~

είδος παρουσιάζεται η γονιδιακή σειρά και η θέση του πιθανού υποκινητή (Εικόνες 3.8-3.34). Αρχικά το μοτίβο που χαρακτηρίζει το υπόφυλο Pezizomycotina εφαρμόστηκε στα γονιδιώματα και στην συνέχεια αυτό που χαρακτηρίζει περισσότερο τις ζύμες εμπλούτισε την υπάρχουσα πληροφορία. Μόνο σε λίγες περιπτώσεις όπου τα παραπάνω δύο μοτίβα δεν έδιναν κανένα αποτέλεσμα δοκιμάστηκε το γενικό μοτίβο, καθώς στην πλειοψηφία των περιπτώσεων οι προβλέψεις ήταν τόσο πολλές που έχαναν την σημασία τους.

Lecanicillium saksenae NC_028330 (Hypocreales) Πίνακας 3.8. Οι δύο πιθανοί Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος υποκινητές για τον μύκητα L. saksenae. 1 ATAAAAGAAAT 16611 cox1-trnR + 2 TAAAAAGTAAT 21716 atp6-rns +

Εικόνα 3.8. το mtDNA του μύκητα L. saksenae. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Beauveria bassiana NC_010652 (Hypocreales) Πίνακας 3.9. Οι πέντε πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα Β. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος bassiana. 1 AAATAGGAAAT 4315 rnl intron-rnl exon +

2 ATAGTAATGTA 19569 cox1-trnR +

3 TTAAAAGTAAT 21826 nad1-nad4 + Εικόνα 3.9. το mtDNA του μύκητα 4 TTAGTAAGCTA 23688 atp8-atp6 + Β. bassiana. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών 5 TAATAAGAAAT 24804 atp6-rns + όπως προβλέφθηκαν.

~ 69 ~

Cordyceps militaris KP719096 (Hypocreales) Πίνακας 3.10. Οι δύο πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα C. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος militaris.

1 TAAAAAGAAAT 2601 rnl intron-rps3 + Εικόνα 3.10. το mtDNA του μύκητα C. militaris. Με κόκκινο βέλος 2 TTAGAAGAGTA 18682 trnC-cox1 + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Epichloe festucae KF906135 (Hypocreales )

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος Πίνακας 3.11. Οι έντεκα πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα E. 1 TTAGTAGGCTA 40530 nad1-nad4 + festucae.

2 ATAGTGATGTA 46975 atp6-rns + trn cox 3 GTAAAAGAAAT 51633 N- 3 + 4 TAAAAGGAAAT 60700 trnW-trnP +

5 TTAGTAAAGTA 61111 trnW-trnP +

6 GTAAAGGTAAT 61731 trnW-trnP +

7 ATAGTAATGTA 62092 trnW-trnP +

8 TAATAAGAAAT 62807 trnW-trnP + Εικόνα 3.11. το mtDNA του μύκητα 9 TTAAAAGTAAT 73700 trnM-trnM + E. festucae. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών 10 ATAGAAGGCTA 79852 trnL-trnQ + όπως προβλέφθηκαν.

11 TTAGTAAAGTA 80600 trnL-trnQ +

x2 x5 ~ 70 ~

Fusarium gerlachii KM486533 (Hypocreales )

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος

1 AAAAAAGAAAT 16689 trnK-trnL + Πίνακας 3.12. Οι εννέα πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα F. 2 AAAAAAGAAAT 17659 trnL-trnQ + gerlachii. 3 ATAGTAGGCTA 17921 trnH-nad2 +

4 AAAAAAGAAAT 18199 trnH-nad2 +

5 TTATAGGTAAT 35204 trnR-trnR +

6 TTATAGGTAAT 35555 trnR-trnY + Εικόνα 3.12. το mtDNA του μύκητα F. gerlachii. Με κόκκινο βέλος 7 ATAGAAAACTA 43728 nad5-cob + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 8 GAATAGGAAAT 83702 atp6-rns +

9 GAATAGGAAAT 83740 atp6-rns +

x2 x2 x2

Fusarium graminearum KP966552 (Hypocreales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος

1 AAAAAAGAAAT 16701 trnK-trnL +

2 AAAAAAGAAAT 17688 trnQ-trnH +

3 ATAGTAGGCTA 17950 trnH-nad2 +

4 AAAAAAGAAAT 18177 trnH-nad2 +

5 TTATAGGTAAT 38115 trnR-trnR +

~ 71 ~

6 TTATAGGTAAT 38466 trnR-trnY +

7 ATAGAAAACTA 46648 nad5-cob + Πίνακας 3.13. Οι δέκα πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα F. 8 ATAGAAGGCTA 87650 atp8-atp6 + graminearum.

Εικόνα 3.13. το mtDNA του μύκητα 9 GAATAGGAAAT 90606 atp6-rns + F. graminearum. Με κόκκινο βέλος 10 GAATAGGAAAT 90644 atp6-rns + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

x2 x2

Fusarium culmorum NC_026993 (Hypocreales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος

1 AAAAAAGAAAT 17433 trnK-trnL + Πίνακας 3.14. Οι έντεκα πιθανοί 2 AAAAAAGAAAT 18411 trnQ-trnH + υποκινητές για τον μύκητα F. culmorum.

3 ATAGTAGGCTA 18674 trnH-trnM +

4 AAAAAAGAAAT 18962 trnH-trnM +

5 TTATAGGTAAT 40465 trnR-trnR +

6 TTATAGGTAAT 40816 trnR-trnY +

7 ATAGTAAGCTA 41110 trnR-trnY +

8 GAATAAGAAAT 41503 trnR-trnY +

9 ATAGAAAACTA 50859 nad5-cob +

~ 72 ~

10 GAATAGGAAAT 92555 atp6-rns +

11 GAATAGGAAAT 92593 atp6-rns +

Εικόνα 3.14. το mtDNA του μύκητα F. culmorum. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

x2 x3 x2

Μετά την παρουσίαση των αποτελεσμάτων για την τάξη Hypocreales παρατηρείται πως στα 7 στελέχη που παρουσιάστηκαν ο αριθμός των υποκινητών ποικίλει από δύο (L. saksenae, C. militaris) έως 11 (E. festucae, F. culmorum). Η περιοχή atp6-rns εμφανίζεται σε όλα τα αποτελέσματα πλην ενός (C. militaris) και φαίνεται να είναι αρκετά πιθανή περιοχή έναρξης της μεταγραφής. Η περιοχή cox1-trnR εμφανίζεται σε δύο περιπτώσεις (L. saksenae, B. bassiana) αλλά πιο πιθανή ίσως να είναι μια θέση σε ανιούσα θέση της cox1 ακόμα και αν μεσολαβούν και άλλα γονίδια, όπως για παράδειγμα η ανιούσα θέση της cob που εμφανίζεται σε τρεις περιπτώσεις (τα τρία είδη του γένους Fusarium). Μια επίσης πολύ πιθανή θέση είναι η ανιούσα θέση της rnl. Για το γονίδιο της rnl, παρουσιάζεται και η πρόβλεψη υποκινητή που εντοπίζεται σε εσώνιο της rnl και σε ανιούσα θέση της rps3. Ο λόγος που γίνεται αυτό είναι ότι η rnl είναι η μοναδική περίπτωση γονιδίου που το εσώνιό του κωδικοποιεί για ένα άλλο γονίδιο που δεν εμπλέκεται στην αποκοπή του ίδιου του εσωνίου.

Στους επόμενους πίνακες και εικόνες παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για την τάξη Glomerellales.

Verticillium dahliae NC_008248 (Glomerellales) Πίνακας 3.15. Οι δύο πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα V. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος dahliae.

1 ATAGAAAAGTA 2114 rnl intron-rps3 +

2 TTATAAGAAAT 21578 nad5-cob +

~ 73 ~

Εικόνα 3.15. το mtDNA του μύκητα V. dahliae. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Glomerella graminicola CM001021 (Glomerellales) Πίνακας 3.16. Οι τρείς πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα G. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος graminicola.

1 ATAGTGGTGAT 2 cox2-nad4L + Εικόνα 3.16. το mtDNA του μύκητα G. graminicola. Με κόκκινο βέλος 2 GTATTGAAATA 30 cox2-nad4L + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 3 AAATAGAACAA 36 cox2-nad4L +

x3

Verticillium alboatrum MF000004 (Glomerellales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος Πίνακας 3.17. Οι τέσσερις πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα V. 1 ATATAAGTAAT 8922 trnS-trnR + alboatrum.

Εικόνα 3.17. το mtDNA του μύκητα 2 TTATAAGAAAT 12734 nad5-cob + V. alboatrum. Με κόκκινο βέλος 3 ATATAAGAAAT 14161 cob-trnP + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 4 ATAGAAATGTA 17143 trnP-cox1 +

~ 74 ~

Colletotrichum acutatum KR349346 (Glomerellales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος Πίνακας 3.18. Οι πέντε πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα C. 1 TTAGTGATGTA 10077 atp6-rns + acutatum.

Εικόνα 3.18. το mtDNA του μύκητα 2 TTAGTAAAGTA 13035 cox3-trnG + C. acutatum. Με κόκκινο βέλος 3 TTAGTAAAGTA 13075 cox3-trnG + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 4 ATAGAAATGTA 14615 trnP-rnl +

5 TTAGTGATCTA 30403 trnK-cob +

x2

Colletotrichum lindemuthianum KF953885 (Glomerellales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος

1 ATAGAGGGCTA 3573 cob-trnC + Πίνακας 3.19. Οι δώδεκα πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα C. 2 TTAAAAGTAAT 4152 cob-trnC + lindemuthianum.

3 TTAAAAGTAAT 5976 trnC-cox1 +

4 GTATAGGTAAT 10913 trnR-rns +

5 TTAGTGATGTA 11331 trnR-rns +

6 ATAGAAATGTA 15737 trnP-rnl +

~ 75 ~

7 TTAAAAGTAAT 29664 nad5-nad4 +

8 TTAGTGATGTA 35762 nad1-trnK +

9 TTAGTGATGTA 35804 nad1-trnK +

10 ATAGTGATGTA 35892 nad1-trnK +

11 TTAGTGATGTA 35936 nad1-trnK +

12 TTAGTGGGCTA 36323 nad1-trnK +

x5 x2 x2

Εικόνα 3.19. το mtDNA του μύκητα C. acutatum. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Μετά την παρουσίαση των αποτελεσμάτων για την τάξη Glomerellales παρατηρείται πως στα 5 στελέχη που παρουσιάστηκαν ο αριθμός των υποκινητών ποικίλει από δύο (V. dahliae) έως 12 (C. lindemuthianum). Η περιοχή atp6-rns εμφανίζεται σε δύο από τα αποτελέσματα (C.lindemuthianum και C. acutatum) και φαίνεται να είναι αρκετά πιθανή περιοχή έναρξης της μεταγραφής σε συνδυασμό και με τα προηγούμενα αποτελέσματα. Η περιοχή σε ανιούσα θέση της cox1 εμφανίζεται στους μύκητες V. alboatrum και C. lindemuthianum. Ενώ αρκετά πιθανή φαίνεται να είναι η ανιούσα θέση της cob που εμφανίζεται σε όλες τις περιπτώσεις πλην μίας (G. graminicola). Και πάλι μια πιθανή θέση είναι η ανιούσα θέση της rnl. Εμφανίζονται πιθανοί υποκινητές σε ανιούσα θέση της nad4 και της nad4L, γεγονός που αποκτά σημασία καθώς εμπλουτίζονται τα αποτελέσματα με επιπλέον οργανισμούς και από άλλες Τάξεις πλην της Τάξης Hypocreales.

Στους επόμενους πίνακες και εικόνες παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για την τάξη Pleosporales.

Zymoseptoria tritici NC_010222 (Pleosporales) Πίνακας 3.20. Οι τρείς πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα Z. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος tritici.

1 TTATAAGTAAT 2141 cox3-nad1 +

~ 76 ~

2 TAAAAAGAAAT 35204 trnS-trnW +

3 ATAAAAGTAAT 19420 trnT-trnM -

Εικόνα 3.20. το mtDNA του μύκητα Z. tritici. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν

Phaeosphaeria nodorum NC_009746 (Pleosporales)

Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος Πίνακας 3.21. Οι έντεκα πιθανοί 1 ATAGTAATGTA 27 trnP-rnl + υποκινητές για τον μύκητα P. nodorum. 2 TAAAAAGAAAT 4905 trnA-trnF +

3 ATAGTAATGTA 7253 trnM-cob +

4 ATAGTAATGTA 14524 atp6-trnV +

5 TTAGTAAACTA 18858 atp6-trnV +

6 ATAGTAATGTA 43061 cox3-trnR +

7 ATAGTAATGTA 43108 cox3-trnR + Εικόνα 3.21. το mtDNA του μύκητα P. nodorum. Με κόκκινο βέλος 8 TTAGTAGTCTA 46373 trnN-nad6 + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 9 AAAAAAGAAAT 47228 nad6-trnV +

10 TTAAAGGTAAT 48509 trnS-trnW +

11 TAATAAGAAAT 2455 trnV-trnK -

x2 x2

~ 77 ~

Shiraia bambusicola NC_026869 (Pleosporales)

Πίνακας 3.22. Οι δεκατέσσερις Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα 1 ATAGTAAGCTA 57 trnR-cox1 + S. bambusicola.

2 TTAAAAGTAAT 4120 cox2-trnN +

3 ATAGTAATGTA 5779 trnV-trnG +

4 TAATAAGTAAT 5902 trnV-trnG +

5 AAAAAAGTAAT 269 trnR-cox1 -

6 TAAAAAGAAAT 279 trnR-cox1 -

7 TAAAAAGTAAT 3694 trnY-trnN -

8 AAAAAAGAAAT 3875 trnN-trnV -

9 TTAAAGGTAAT 5958 rps3-cox3 -

10 TTAAAAGTAAT 18765 cob-nad4 -

11 GTAAAAGTAAT 18821 cob-nad4 - Εικόνα 3.22. το mtDNA του μύκητα 12 ATAAAAGTAAT 18840 cob-nad4 - S. bambusicola. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών 13 AAAAAAGAAAT 18931 cob-nad4 - όπως προβλέφθηκαν.

14 TAAAAAGTAAT 19087 cob-nad4 -

x2 x2

x5

~ 78 ~

Μετά την παρουσίαση των αποτελεσμάτων για την τάξη Pleosporales παρατηρείται πως στα 3 στελέχη που παρουσιάστηκαν ο αριθμός των υποκινητών ποικίλει από τρείς (Z. tritici) έως 14 (S. bambusicola). Και στις τρεις περιπτώσεις υπάρχουν γονίδια που βρίσκονται στον αντίθετο κλώνο και μεταγράφονται με αντίθετη φορά. Σε όλες τις περιπτώσεις σημειώνονται οι αντίστοιχοι πιθανοί υποκινητές. Στην περίπτωση του μύκητα Z. tritici προβλέφθηκαν δύο υποκινητές με φορά προς τα δεξιά και ένας με φορά προς τα αριστερά. Εκτός εάν προκύπτει ένα πρωτογενές μετάγραφο που υφίσταται τροποποιήσεις μένει το τμήμα atp8-cox2 χωρίς κάποια αλληλουχία υποκινητή που να προβλέπει το μετάγραφο που δημιουργείται. Στην P. nodorum εντοπίζονται πιθανοί υποκινητές στις θέσεις σε ανιούσα θέση της rns, της cob και της rnl, και ένας υποκινητής για την αντίθετη φορά της μεταγραφής. Τέλος, στον μύκητα S. bambusicola εντοπίζονται αλληλουχίες υποκινητή σε ανιούσα θέση της cox1 και της rnl και ταυτόχρονα αρκετοί υποκινητές για τον αντίθετο κλώνο του DNA με πιο πιθανό αυτόν που βρίσκεται μεταξύ cox1 και trnR.

Στους επόμενους πίνακες και εικόνες παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για την τάξη Helotiales.

Rhynchosporium secalis NC_023128 (Helotiales) Πίνακας 3.23. Οι δύο πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα R. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος secalis.

1 AAAAAGGAAAT 46867 nad3-cox2 + Εικόνα 3.23. το mtDNA του μύκητα R. secalis. Με κόκκινο 2 ATAGAAAAGTA 67704 cob-cox1 + βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Rhynchosporium orthosporum NC_023127 (Helotiales) Πίνακας 3.24. Οι τρείς πιθανοί Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος υποκινητές για τον μύκητα R. orthosporum. 1 ATAGAAATGTA 15608 atp6-rns +

~ 79 ~

2 TTATAGGAAAT 42506 cox2-trnK + Εικόνα 3.24. το mtDNA του μύκητα R. orthosporum. Με κόκκινο βέλος 3 TTATAAGAAAT 42534 cox2-trnK + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

x2

Παρατηρείται πως οι δύο οργανισμοί που ανήκουν στην τάξη Helotiales έχουν όμοια γονιδιακή οργάνωση. Παρατηρούνται και πάλι πιθανοί υποκινητές σε ανιούσα θέση της rns και της cox1.

Ακολουθούν τα αποτελέσματα για την τάξη Eurotiales.

Aspergillus flavus KP725058 (Eurotiales) Πίνακας 3.25. Οι τρείς πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα Α. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος flavus.

1 ATAGTGGTGTA 7054 cox1-atp9 + Εικόνα 3.25. το mtDNA του μύκητα A. flavus. Με κόκκινο 2 AAAAAGGAAAT 20634 trnD-trnS + βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 3 TTATAAGTAAT 22581 rnl intron-rps3 +

Aspergillus fumigatus NC_017016 (Eurotiales) Πίνακας 3.26. Οι πέντε πιθανοί Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος υποκινητές για τον μύκητα Α. fumigatus. 1 ATATAAGAAAT 1567 trnN-nad1 +

~ 80 ~

2 AAAAAAGAAAT 4781 trnN-atp8 + Εικόνα 3.26. το mtDNA του μύκητα A. fumigatus. Με κόκκινο 3 ATATAGGTAAT 10984 trnP-rnl + βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 4 TAAAAGGAAAT 22090 cox1-atp9 +

5 AAAAAGGAAAT 23929 atp9-trnA +

Για τους δύο οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Eurotiales παρατηρείται και πάλι η πιθανή θέση σε ανιούσα θέση της rnl, αλλά εμφανίζεται και μια νέα θέση σε ανιούσα θέση της atp9. Πιθανές θα μπορούσαν να είναι και οι θέσεις σε ανιούσα θέση των γονιδίων nad1 και atp8.

Ακολουθούν τα αποτελέσματα για την τάξη Onygenales.

Arthroderma uncinatum NC_012828 (Onygenales) Πίνακας 3.27. Οι δύο πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα A. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος uncinatum.

1 ATAAAGGAAAT 5293 rnl intron-rps3 + Εικόνα 3.27. το mtDNA του μύκητα A. unconatum. Με κόκκινο βέλος 2 TAAAAGGAAAT 5509 rnl intron-rnl exon + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

~ 81 ~

Trichophyton mentagrophytes NC_012826 (Onygenales) Πίνακας 3.28. Οι δύο πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα Τ. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος mentagrophytes.

1 GAAAAGGAAAT 5452 rnl intron-rnl exon + Εικόνα 3.28. το mtDNA του μύκητα Τ. mentagrophytes. Με 2 TAATAAGTAAT 21994 atp6-rns + κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

Για τους οργανισμούς της τάξης Onygenales πιθανή αλληλουχία υποκινητή εντοπίζεται σε ανιούσα θέση της rns και στην rnl.

Ακολουθούν τα αποτελέσματα για την τάξη Peltigerales.

Peltigera malacea NC_016955 (Peltigerales) Πίνακας 3.29. Οι πέντε πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα P Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος malacea.

1 ATAAAGGAAAT 39 trnY-trnY +

2 TTAAAAGAAAT 2188 trnK-trnV +

3 TAATAGGTAAT 7278 rnl intron-rps3 + Εικόνα 3.29. το mtDNA του μύκητα 4 TTATAGGTAAT 57641 cox2-trnC + P. malacea. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών 5 AAAAAAGAAAT 57708 cox2-trnC + όπως προβλέφθηκαν.

x2

~ 82 ~

Peltigera membranacea NC_016957 (Peltigerales) Πίνακας 3.30. Οι έξι πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα P. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος membranacea.

1 TTAAAAGAAAT 1952 trnK-trnV +

2 AAAAAAGTAAT 2148 trnV-cox3 +

3 GAATAGGTAAT 7397 rnl intron-rps3 + Εικόνα 3.30. το mtDNA του μύκητα 4 TTAGAGAGCTA 47265 cox1-cob + P. membranacea. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των 5 ATAAAAGTAAT 59443 atp8-atp6 + υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

6 ATAAAGGAAAT 62583 trnY-trnY +

Οι δύο οργανισμοί που ανήκουν στην τάξη Peltigerales εμφανίζουν όμοια γονιδιακή οργάνωση. Δύο περιοχές είναι ίδιες σε σχέση με την περιοχή πρόβλεψης της αλληλουχίας του υποκινητή και αυτές είναι η περιοχή σε ανιούσα θέση της cox3 και αυτή σε ανιούσα θέση της nad6. Επίσης σε ανιούσα θέση του γονιδίου rps3 υπάρχει πιθανή ακολουθία υποκινητή γεγονός που μπορεί να δείχνει μια πιθανή εκκίνηση της μεταγραφής στο σημείο εκείνο. Η θέση του υποκινητή σε ανιούσα θέση της cob εμφανίζεται ακόμη μια φορά οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι πρόκειται για μια από τις πιο πιθανές θέσεις έναρξης της μεταγραφής.

Ακολουθούν τα τελευταία αποτελέσματα για τους τέσσερις οργανισμούς που ανήκουν στις τάξεις Xylariales, Ophiostomatales, Microascales και στην ομάδα Leotiomycetes incertae sedis.

~ 83 ~

Annulohypoxylon stygium NC_023117 (Xylariales) Πίνακας 3.31. Οι δεκατέσσερις πιθανοί υποκινητές για τον Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος μύκητα A. stygium.

1 AAAAAGGTAAT 1193 trnY-trnN +

2 AAAAAAGTAAT 2759 trnG-trnD +

3 ATAAAAGAAAT 6187 nad6-trnV +

4 ATAAAGGAAAT 16483 trnI-trnS +

5 AAATAAGTAAT 18298 rnl intron-rps3 +

6 ATATAAGTAAT 24551 rnl intron-rnl exon +

7 ATAAAGGTAAT 40322 nad3-atp9 +

8 GAAAAGGTAAT 41373 atp9-cox2 +

9 AAAAAAGTAAT 42974 atp9-cox2 +

10 ATAAAGGTAAT 49645 trnR-nad4L +

11 ATAGTGATGTA 79559 cob-trnC + Εικόνα 3.31. το mtDNA του 12 TTAGAAATCTA 79835 cob-trnC + μύκητα A. stygium. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των 13 TTATAGGAAAT 126451 atp6-rns + υποκινητών όπως προβλέφθηκαν. 14 TTATAGGTAAT 129538 atp6-rns +

x2 x2 x2

~ 84 ~

Sporothrix schenckii NC_015923 (Ophiostomatales) Πίνακας 3.32. Οι τρείς πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα S. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος schenckii.

1 TTATAAGAAAT 58 trnP-rnl +

Εικόνα 3.32. το mtDNA του μύκητα 2 ATAAAAGTAAT 2646 rnl intron-rps3 + S. schenckii. Με κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών 3 GTATAGGAAAT 13878 cob-trnC + όπως προβλέφθηκαν.

Ceratocystis cacaofunesta NC_020430 (Microascales) Πίνακας 3.33. Οι εννέα πιθανοί υποκινητές για τον μύκητα C. Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος cacaofunesta.

1 AAAAAGGAAAT 15894 trnL-trnQ +

2 TTAAAGGTAAT 17800 trnQ-trnH +

3 TTAAAAGTAAT 18324 trnM-trnM +

4 ATAGAAAAGTA 20759 nad3-atp9 +

5 TTAGAGATCTA 33460 cox2-trnR +

6 GTAAAGGAAAT 71499 trnX-trnR +

7 TTATAGGTAAT 73117 trnX-trnR + Εικόνα 3.33. το mtDNA του μύκητα C. cacaofunesta. Με 8 TTAGAGATGTA 73712 trnX-trnR + κόκκινο βέλος δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως 9 ATAAAAGTAAT 85559 atp6-trnI + προβλέφθηκαν.

x3

~ 85 ~

Pseudogymnoascus pannorum NC_027422 (Leotiomycetes incertae sedis) Πίνακας 3.34. Οι τέσσερις πιθανοί Αριθμός Αλληλουχία Θέση Γονιδιακή περιοχή Κλώνος υποκινητές για τον μύκητα P. pannorum. 1 TAAAAAGAAAT 5397 rnl intron-rnl exon +

2 TAATAGGTAAT 6232 trnT-trnE + Εικόνα 3.34. το mtDNA του μύκητα P. pannorum. 3 AAAAAAGAAAT 21260 atp6-rns + Με κόκκινο βέλος 4 TTAGAGAGGTA 22233 atp6-rns + δίνονται οι θέσεις των υποκινητών όπως προβλέφθηκαν.

x2

Στους τελευταίους οργανισμούς που μελετήθηκαν επιβεβαιώνονται κάποιες θέσεις που εμφανίστηκαν και προηγουμένως όπως σε ανιούσα θέση των γονιδίων cox1, cob, rns, rnl, αλλά εμφανίζονται και θέσεις όπως σε ανιούσα θέση των γονιδίων atp9, nad1, nad4L.

Κατά συνέπεια μελετώντας 71 γονιδιώματα μέσα από στοιχίσεις και εξετάζοντας τα αποτελέσματα του αλγορίθμου πρόβλεψης υποκινητών εντοπίζονται θέσεις αρκετά πιθανές να φέρουν μια αλληλουχία υποκινητή και άλλες πιθανών νέες θέσεις που αξίζει να μελετηθούν πειραματικά.

~ 86 ~

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Οι τεχνολογίες αλληλούχησης νέας γενιάς σχημάτισαν μια πραγματικότητα στην οποία μπορεί κανείς με ακρίβεια και ταχύτητα να μελετήσει την νουκλεοτιδική ακολουθία ολόκληρων γονιδιωμάτων. Τα πειραματικά δεδομένα που διορθώνουν, αλλάζουν και εμπλουτίζουν αυτήν την πληροφορία διατίθενται σε πολύ μικρότερο ρυθμό. Είναι λοιπόν, μια εποχή όπου η επιστήμη της Βιοπληροφορικής και τα εργαλεία που αυτή μπορεί να παρέχει, μπορούν να διευκολύνουν και να επιταχύνουν την οργάνωση και διεκπεραίωση των εργαστηριακών πειραμάτων. Σε αυτό το πνεύμα έγινε στο πλαίσιο αυτής της διπλωματικής εργασίας ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των μυκήτων και ιδιαίτερα αυτών που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina. Όπως και όλες οι αλληλουχίες έτσι και τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα αυξάνονται εκθετικά δίνοντάς μας την δυνατότητα για καλύτερη ανάλυση και συμπεράσματα που θα μπορούσαν να επιλύσουν ταξινομικά, γενετικά και φυλογενετικά ερωτήματα εντός των Μυκήτων.

Η ποικιλομορφία των mtDNAs είναι άξια προσοχής καθώς οι διαφορές μεταξύ τους αποτελούν εξαιρετικό παράδειγμα γονιδιωματικής οργάνωσης. Όπως παρατηρήθηκε, τα μεγέθη του mtDNA των μυκήτων παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές (18 kbs-Hanseniaspora uvarum MUCL 31704 - 235 kbs-Rhizoctonia solani AG3 Rhs1Ap). Μετά από τη μελέτη 126 γονιδιωμάτων σε αυτή την εργασία, επιβεβαιώθηκε πως οι μύκητες άσχετα από την Τάξη στην οποία ανήκουν, στο μιτοχονδριακό τους γονιδίωμα κατά κύριο λόγο εμπεριέχουν τον ίδιο αριθμό γονιδίων, με προϊόντα είτε πρωτεϊνικής φύσης ή RNA που εμπλέκονται στην αναπνευστική αλυσίδα, παραγωγή ATP, και τη μεταφραστική μηχανή του οργανιδίου. Από τις στοιχίσεις κάθε γονιδίου διαπιστώθηκε ότι το μέγεθος των γονιδίων είναι σχετικά όμοιο, και επομένως οι διαφορές αυτές στο μέγεθος των γονιδιωμάτων μπορούν να αποδοθούν κατά κύριο λόγο στις διαγονιδιακές περιοχές και στα εσώνια, και δευτερευόντως στην παρουσία πλασμιδίων. Η εξήγηση αυτή είναι πλήρως ταυτόσημη με την ήδη δημοσιευμένη άποψη σε πολλές εργασίες ανάλυσης μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων (για παράδειγμα Pantou et al., 2006, Ghikas et al., 2010, Freel et al., 2015). Η έκταση ορισμένων διαγονιδιακών περιοχών συνήθως αποδίδεται στην παρουσία επαναλήψεων, κάποιες από τις οποίες προτάθηκε ότι είναι κινητά στοιχεία (π.χ. περιοχές πλούσιες σε G-C στην ζύμη S. cerevisiae, Wenzlau & Perlman 1990), ενώ άλλες παίζουν ρόλο στον ανασυνδυασμό (π.χ. P. anserina, Koll et al., 1996).

Οι διαγονιδιακές περιοχές συνεισφέρουν σημαντικά στην αύξηση της ποικιλομορφίας των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, δεν υπόκεινται σε εξελικτική πίεση και μπορούν να συσσωρεύουν μεγαλύτερο ποσοστό μεταλλαγών και να εμφανίζουν υψηλότερα ποσοστά ποικιλομορφίας ακόμα και εντός του είδους (Saccone 2000, 2002, Ghikas et al., 2006, Pantou et al., 2006). Στις διαγονιδιακές περιοχές των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες υπάρχουν ειδικές επαναλήψεις [ευθείες επαναλήψεις (diect repeats), «επαναλήψεις δυάδας»

~ 87 ~

(dyad repeats) και ανεστραμμένες-παλίνδρομες επαναλήψεις (inverted repeats). Τα δομικά αυτά στοιχεία του mtDNA στους μύκητες φαίνεται ότι διαδραματίζουν πιθανότατα ρόλο σε φαινόμενα ανασυνδυασμού (Kouvelis et al., 2004). Από την ανάλυση των διαγονιδιακών περιοχών και τη συγκριτική μελέτη των γονιδιωμάτων όσον αφορά τη γονιδιακή σειρά, διαπιστώθηκε πως κατά κανόνα μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στην ίδια Τάξη παρουσιάζουν την ίδια οργάνωση που όμως διαφοροποιείται από τα μέλη κάποιας άλλης Τάξης. Η μετακίνηση συνταινικών μονάδων από Τάξη σε Τάξη μπορεί να αποδοθεί στην ύπαρξη επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και σε κάποιες περιπτώσεις στην διαφορετική θέση trn γονιδίων. Σε κάποιες περιπτώσεις όπως αναλύθηκε στην εργασία αυτή για τα είδη μυκήτων εντός της Τάξης Sordariales, οι αλλαγές στη γονιδιακή οργάνωση μπορούν να εντοπιστούν και σε είδη εντός της ίδιας Τάξης, εμπλουτίζοντας έτσι την ποικιλομορφία των γονιδιωμάτων. Η ύπαρξη αυτών των αλληλουχιών, σε συνδυασμό με την παρουσία των γονιδίων trn αυξάνει την πιθανότητα αυτές οι δομές να συμμετέχουν σε φαινόμενα ανασυνδυασμού ή στη ρύθμιση της μεταγραφής, όπως έχει ήδη προταθεί (Kouvelis et al., 2004, Pantou et al., 2007).

Αναλυτικότερα, μελετώντας τις διαγονιδιακές περιοχές στην ανιούσα θέση του γονιδίου cox1 18 μυκήτων που ανήκουν στην τάξη Hypocreales και 15 μυκήτων που ανήκουν στην τάξη Saccharomycetales παρατηρήθηκε ότι οι διαγονιδιακές περιοχές παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές τόσο στο μέγεθος όσο και στην σύστασή τους. Συγκεκριμένα, όπως δείχθηκε στα Αποτελέσματα, οργανισμοί όπως η Gibberella moniliformis διαθέτουν 44 επαναλήψεις εκ των οποίων οι 5 είναι παλίνδρομες αλληλουχίες, οι 10 σχηματίζουν δομές μίσχου-θηλιάς ενώ οι 16 αποτελούν δυαδικές επαναλήψεις και οι υπόλοιπες 13 ανήκουν στην κατηγορία των ευθειών επαναλήψεων. Επομένως φαίνεται ότι μια μεγάλη διαγονιδιακή περιοχή όπως αυτή (1435 ζ.β.), συνήθως φέρει ποικιλία επαναλήψεων, ενώ μια μικρότερη διαγονιδιακή περιοχή όπως αυτή του Cordyceps militaris (343 ζ.β.) φέρει μόνο μία δυαδική επανάληψη. Η θέση των επαναλήψεων, όπως φάνηκε από τις στοιχίσεις των διαγονιδιακών περιοχών, θα μπορούσε να σχετίζεται με την ρύθμιση της μεταγραφής. Φαίνεται (Εικόνα 3.5, Αποτελέσματα) πως δυαδικές επαναλήψεις μπορεί να εντοπίζονται σε θέσεις συντηρητικές, πριν από την έναρξη ενός γονιδίου και με αλληλουχίες που πιθανά να αποτελούν θέση υποκινητή, ενώ δομές παλίνδρομες και δομές μίσχου-θηλιάς βρίσκονται συνήθως στο τέλος ενός γονιδίου ή ομάδα γονιδίων που πιθανά αποτελούν ένα μετάγραφο.

Οι διαγονιδιακές περιοχές που μελετήθηκαν πέρα από τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που φέρουν περιέχουν και ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (Open Reading Frames-ORFs). Ο μεγαλύτερος αριθμός ORFs που βρέθηκε σε διαγονιδιακή περιοχή είναι 6 (Gibberella zeae) ενώ υπάρχουν και διαγονιδιακές περιοχές χωρίς ORFs. Συνήθως τα πλαίσια αυτά δεν κωδικοποιούν για κάποια ιδιαίτερη πρωτεΐνη και η ύπαρξή τους και πάλι σχετίζεται με το μέγεθος της διαγονιδιακής περιοχής. Υπάρχουν περιπτώσεις που κάποια πλαίσια ενδέχεται να είναι μέρος

~ 88 ~

του πολυσιστρονικού μεταγράφου και για αυτό και εξετάστηκε ολόκληρη η διαγονιδιακή περιοχή για τον εντοπισμό πιθανών υποκινητών. Επιπλέον και από την εξελικτική σκοπιά, τα γονιδιώματα που έχουν μικρές διαγονιδιακές περιοχές πιθανά παρουσιάζουν δομή που σχετίζεται με αυτή της προγονικής μορφής, ενώ γονιδιώματα με μεγάλες διαγονιδιακές περιοχές μπορούν να αποτελούν θερμά σημεία (hot-spots) για ανασυνδυασμούς, αλλαγές στην οργάνωση με επιπλέον ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που μπορούν εν δυνάμει να δώσουν την δημιουργία ή ύπαρξη ψευδογονιδίων.

Τα γονίδια που εντοπίζονται στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αναπνευστική αλυσίδα και είναι όμοια στους μύκητες που ανήκουν σε όλα τα φύλα. Εξαιρέσεις αποτελούν ορισμένες ζύμες όπου απουσιάζουν τα γονίδια που κωδικοποιούν για τις Nadh υπομονάδες 1-6 και Nadh4L (Clark-Walker, 1992). Το φαινόμενο αυτό είναι σποραδικό, όπως σπάνια είναι η απουσία στα γνωστά γονιδιώματα των Ασκομυκήτων, του λειτουργικού γονιδίου atp9 από τα mtDNAs των P. anserina και N. crassa. Το γονίδιο της atp9 βρίσκεται πιο συχνά στον πυρήνα από ότι στο mtDNA σε κάποιους μύκητες (Cummings et al., 1990), είτε βρίσκεται σε ανεξάρτητα κυκλικά μόρια (Laforest et al., 1997). Τα γονίδια που κωδικοποιούν για τις βασικές πρωτεΐνες είναι δεκατέσσερα και το μέγεθος των πρωτεϊνικών μορίων δεν επηρεάζεται σημαντικά, όταν εξετάστηκαν απομακρυσμένοι φυλογενετικά μύκητες. Συγκρίνοντας τα μεγέθη των λειτουργικών γονιδίων, από μύκητες που ανήκαν σε διαφορετικές ταξινομικά ομάδες βρέθηκε ότι το μέγεθος τους φαίνεται να μειώνεται όταν εξετάζονται μύκητες ταξινομικά απομακρυσμένοι. Οι διαφορές τόσο στο μέγεθος, όσο και στην ομολογία των πρωτεϊνικών μορίων, τουλάχιστον στους συγγενικούς μύκητες εντοπίζονται κυρίως στα καρβοξυ- και αμινο-τελικά άκρα τους. Το ίδιο ισχύει για τα γονίδια, όπου οι διαφορές μεταξύ των συγγενικών mt γονιδιωμάτων είναι μεγαλύτερες στα 5’ και 3’ άκρα τους. Οι διαφορές αυτές σε γονίδια, όπως στο 5’ άκρο του γονιδίου cox1, έχουν χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση ειδών εν είδη «ραβδωτού κώδικα»-barcoding με μεγάλη επιτυχία (Seifert et al., 2007).

Αντίθετα, στο εσωτερικό των πρωτεϊνικών μορίων και πιο συγκεκριμένα σε διαμεμβρανικές και γύρω από αυτές περιοχές, εμφανίζεται υψηλότερη συντηρητικότητα που παρατηρείται ακόμα και σε απομακρυσμένους φυλογενετικά οργανισμούς (από βακτήρια έως θηλαστικά). Η συντηρητικότητα αυτών των περιοχών κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σχετίζεται με την τοπολογία των μορίων αυτών αλλά και τη λειτουργία που επιτελούν (αναπνοή, παραγωγή ATP), καθώς είναι ζωτικής σημασίας για τους οργανισμούς (Egan et al., 1999, Sanchirico et al., 1998).

Παρατηρώντας τις εικόνες της συνταινικότητας (Εικόνες 3.8-3.34 στα Αποτελέσματα) φαίνεται ότι τα trn γονίδια παρουσιάζουν αρκετά διαφοροποιημένα πρότυπα οργάνωσης στα διάφορα είδη που εξετάστηκαν. Παρατηρείται μια ομαδοποίηση σε τρεις ομάδες κυρίως στις

~ 89 ~

διαγονιδιακές περιοχές rns-cox3, nad6-rnl, rnl-nad2 (Ghikas et al., 2006) αλλά με διαφοροποιήσεις εντός των Pezizomycotina όπως για παράδειγμα τις επιπλέον ομάδες cox3- rnl και rns-nad6. Κάποια tRNAs εμφανίζονται διάσπαρτα στο mtDNA. Για τα tRNAs για τα οποία δεν υπάρχει γονίδιο να τα κωδικοποιεί πιθανόν να εισέρχονται από το κυτταρόπλασμα (Laforest et al., 1997, Kolesnikova et al., 2000, Takano et al., 2001). Εναλλακτικά, θα μπορούσαν να γίνονται μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις σε υπάρχοντα tRNAs προκειμένου να προκύψουν τα tRNAs που δεν κωδικοποιούνται από κάποιο γονίδιο. Για παράδειγμα στο μύκητα L. muscarium έχουν βρεθεί δύο αντίγραφα του trnE, με το ίδιο αντικωδικόνιο, μια αλλαγή στην δεύτερη βάση θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα το trn να αναγνωρίζει το κωδικόνιο Ala έναντι του Glu (Kouvelis et al., 2004). Παρόμοια παρατήρηση έχει γίνει και στην P. canadensis όπου εντοπίζονται τρία tRNA με αντικωδικόνιο CAT, μια τροποποίηση, μετά την μεταγραφή, θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση του κωδικονίου AUA της ισολευκίνης (Sakito et al., 1995).

Γονίδια που έχουν εκατέρωθεν τους trn μπορούν να θεωρηθούν μεταθετά στοιχεία, όπου τον ρόλο των LTRs τον παίζουν τα tRNAs (Saccone et al., 2002). Επίσης, τα trn γονίδια θεωρούνται ως σημεία λήξης της μεταγραφής ή θέσεις ανασυνδυασμού, όταν βρίσκονται μεμονωμένα, εκατέρωθεν γονιδίων (Breitenberg et al., 1985, Shafer et al., 2003). Σε τέτοιες περιπτώσεις στα trn γονίδια μπορούν να αποδοθούν διαφορές που παρατηρούνται στην συνταινικότητα πολύ συγγενικών ειδών. Από τις πιθανές θέσεις υποκινητών που προέκυψαν από αυτήν την εργασία (Εικόνες 3.8-3.34 στα Αποτελέσματα) φαίνεται να υποστηρίζεται ο ρόλος των trn γονιδίων στον σχηματισμό των μεταγράφων. Συνήθως φαίνεται να λήγει η μεταγραφή σε θέσεις μεμονωμένων trn γονιδίων (Ojala et al., 1981), όπως για παράδειγμα στην θέση trnC/trnR- cox1, trnR/trnY-nad4L. Ένας άλλος μηχανισμός που συναντάται συχνά στις διαδικασίες αναδιάταξης γονιδίων είναι ο διπλασιασμός πιθανά μέσω ολίσθησης κατά την αντιγραφή και στην συνέχεια τυχαία απώλεια γονιδίων που βρίσκονται σε πολλά αντίγραφα (Levinson et al., 1987, Macey et al., 1998). Τέτοια περίπτωση είναι το trnP του Verticillium dahliae το οποίο είναι διπλό και ταυτόσημο, με αποτέλεσμα να επεξηγεί πιθανά αλλαγή στη συνταινικότητα του είδους αυτού και ενδιάμεσο στάδιο στην εξέλιξη.

Σημαντικός είναι ο ρόλος των διάσπαρτων tRNAs στη διαδικασία της ωρίμανσης των μεταγράφων αφού φαίνεται να καθορίζουν τα 5’ και 3’ άκρα των μεταγράφων σύμφωνα με το «μοντέλο στίξης» που εφαρμόζεται σε πληθώρα μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων διαφόρων οργανισμών όπως μύκητες (Burger et al., 1985, Dyson et al., 1989), φαιοφύκη, χλωροφύκη (Richard et al., 1998, Wolf και Kuck, 1996), και ζώα (Ojala et al., 1980). Τον ίδιο ρόλο έδειξαν να έχουν τα tRNAs στις περιοχές των γονιδιωμάτων του γένους Beauveria που μελετήθηκαν, οριοθετώντας τα 5’ και 3’ άκρα των μεταγράφων (Ghikas et al., 2010). Φαίνεται ότι σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των 3’ άκρων των μεταγράφων παίζουν τα tRNAs ή νουκλεοτιδικές αλληλουχίες, που δεν έχουν ακόμα προσδιοριστεί.

~ 90 ~

Η γονιδιακή οργάνωση εντός του φύλου των Ασκομυκήτων και ιδιαίτερα για το υπόφυλο Pezizomycotina έχει μελετηθεί αρκετά και έχουν εξαχθεί σημαντικά συμπεράσματα για τις σχέσεις μεταξύ των μυκήτων αλλά και την εξέλιξη των διάφορων ταξινομικών ομάδων (Kouvelis et al., 2004, Ghikas et al., 2006, Ghikas et al., 2010). Αντίθετα, οι πληροφορίες για μύκητες άλλων φύλων (συνήθως των κατώτερων) είναι λιγότερες και οι σχέσεις συγγένειας μεταξύ των ειδών δεν είναι πάντα εύκολο να προσδιοριστούν. Μέσα από την in silico ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων έγινε σαφές ότι υπάρχουν χαρακτηριστικά γονιδιακής οργάνωσης που διατηρούνται συντηρημένα εντός του Βασιλείου των Μυκήτων, όπως για παράδειγμα τα συνταινικά ζευγάρια: nad2-nad3, atp8-atp6, nad4L-nad5, nad6-nad1, αλλά υπάρχουν και δομές που διαφοροποιούν και διαχωρίζουν τις ομάδες μεταξύ τους όπως για παράδειγμα οι: nad4-nad6, nad1-cob ή cox3-nad4L-nad5 που χαρακτηρίζουν το φύλο των Βασιδιομυκήτων στην πλειοψηφία των τάξεων. Επομένως, μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα με μεγάλο ενδιαφέρον για την εξέλιξη των οργανισμών, καθώς η συντηρητικότητα υποδηλώνει κοινή καταγωγή και οι αλλαγές το σημείο εξελικτικού διαχωρισμού των ομάδων μυκήτων, όπως φαίνεται και στα φυλογενετικά δένδρα που κατασκευάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες των μιτοχονδριακών γονιδίων.

Οι συνταινικές ομάδες: nad4L–nad5, nad2–nad3, nad1–nad4 και atp6–atp8 φαίνεται να διατηρούνται στην πλειοψηφία των στελεχών που ανήκουν στους Ασκομύκητες, αλλά και σε στελέχη πιο απομακρυσμένων ομάδων. Το φαινόμενο αυτό θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει την εξέλιξη των στελεχών από έναν κοινό πρόγονο. Επίσης σε αρκετούς οργανισμούς μεταξύ των γονιδίων nad4L-nad5 και nad2–nad3 υπάρχει επικάλυψη μιας βάσης. Στα mtDNAs των θηλαστικών παρατηρείται επικάλυψη βάσης στα γονίδια nad4L και atp8 (nad4L-nad4 και atp8- atp6, αντίστοιχα) που έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία δισιστρονικών mRNAs (Taanman et al., 1999). Αυτό πιθανά να συμβαίνει λόγω του ότι τα μονοσιστρονικά μετάγραφα έχουν πολύ μικρό μήκος και έτσι δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν αποτελεσματικά με την μικρή ριβοσωμική υπομονάδα, με αποτέλεσμα τα πολυσιστρονικά μετάγραφα να είναι πιο κοινά στους μύκητες (Kleidon et al., 2003). Η παραπάνω υπόθεση φαίνεται να εξηγεί και τον μικρό αριθμό των υποθετικών υποκινητών στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα του L. muscarium (βλέπε Αποτελέσματα). Συνδυάζοντας τις πληροφορίες από την συνταινικότητα των οργανισμών, με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την πρόβλεψη πιθανών υποκινητών, φαίνεται κάποιες περιπτώσεις να είναι σε συμφωνία με τα ήδη γνωστά δεδομένα, ενώ κάποιες άλλες εμφανίζουν πιθανώς διαφορετικά σημεία ρύθμισης.

Πιο αναλυτικά, ακόμα και μέσα στην τάξη Hypocreales, που παρουσιάζει συντηρημένη γονιδιακή οργάνωση, πέρα από τις τρεις περιοχές υποκινητών που προβλέπουν τρία πολυσιστρονικά μετάγραφα: trnR-nad1-nad4-atp8-atp6, rns-ομάδα trn γονιδίων-nad6-ομάδα trn γονιδίων και rnl- ομάδα trn γονιδίων-nad2-nad3-atp9-cox2-nad4L-nad5-cob-cox1, υπάρχουν και άλλες πιθανές θέσεις υποκινητών που δίνουν μια διαφορετική εικόνα. Για

~ 91 ~

παράδειγμα το γονίδιο της cox1, μπορεί να βρίσκεται είτε στο τρίτο μετάγραφο όπως παρουσιάζεται πιο πάνω, είτε να αποτελεί το πρώτο γονίδιο του πρώτου μεταγράφου που αναφέρεται νωρίτερα. Εμπλουτίζοντας τα αποτελέσματα και με άλλα δεδομένα γίνεται σαφές ότι πιθανή θέση έναρξης της μεταγραφής θα μπορούσε να είναι και αυτή στην ανιούσα θέση του γονιδίου cob, είτε η ανιούσα θέση του γονιδίου nad6 στην περίπτωση που έχει γίνει μετατόπιση όλου του τμήματος της ομάδας trn και της nad6 στο γονιδίωμα (π.χ. Zymoseptoria tritici). Δίνονται λοιπόν οι πρώτες ενδείξεις για τα μετάγραφα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος των μυκήτων και επομένως μια καλή αρχή για την πειραματική εξακρίβωση των σημείων αυτών.

Σχετικά με την μιτοχονδριακή μεταγραφή στους Ασκομύκητες, ο μεταγραφικός μηχανισμός είναι πιο απλός σε σχέση με τον αντίστοιχο του πυρήνα (Masters et al., 1987, Cermakian et al., 1997, Deshpande και Patel 2012). Πρωταγωνιστικό ρόλο στον μηχανισμό της μεταγραφής έχουν δύο πρωτεΐνες, η μιτοχονδριακή RNA πολυμεράση, Rpo41p, και ο μεταγραφικός παράγοντας Mtf1p (Diffley και Stillamn, 1991). Τα πολυσιστρονικά μετάγραφα μετατρέπονται σε μονοσιστρονικά mRNAs (Lipinski et al., 2010), και ακολουθεί αποκοπή των εσωνίων (Gagliardi et al., 2004, Lipinski et al., 2010, Deshpande και Patel, 2012), ώστε να είναι έτοιμα για μετάφραση. Τα πρωτεϊνικά προϊόντα που προκύπτουν από την έκφραση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος λαμβάνουν μέρος στην αναπνευστική αλυσίδα (οξειδωτική φωσφορυλίωση) και στην μιτοχονδριακή μετάφραση (Paquin et al., 1997, Burger et al., 2003).

Το ανθρώπινο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, όντας μικρότερο σε μέγεθος διαθέτει τρείς θέσεις έναρξης μεταγραφής, ενώ μεγαλύτερα σε μέγεθος μιτοχονδριακά γονιδιώματα, όπως είναι των μυκήτων και των φυτών φέρουν περισσότερες, για να μπορέσουν να μεταγράψουν αποδοτικά το σύνολο των μιτοχονδριακών γονιδίων. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας φάνηκε πως ο αριθμός των υποκινητών μπορεί να διαφέρει από δύο, για τα πιο μικρά γονιδιώματα, έως δεκατέσσερις, για τα μεγαλύτερα. Βέβαια αξίζει να σημειωθεί ότι ακόμα και στην περίπτωση της πρόβλεψης περισσότερων υποκινητών, αυτοί συγκεντρώνονται σε περιοχές δίνοντας ουσιαστικά την πρόβλεψη για οκτώ περιοχές έναρξης της μεταγραφής το πολύ, ενώ στην πλειοψηφία των περιπτώσεων οι πιθανές περιοχές στόχοι είναι τρείς. Η απουσία πολυαδενυλίωσης των μεταγράφων, ρυθμιστικών στοιχείων ή άλλων παραγόντων συντονισμού ελέγχου της μεταγραφής δηλώνει ότι η ωρίμανση των μορίων RNA και η καταστροφή τους παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον έλεγχο της έκφρασης μιτοχονδριακών γονιδίων (Schafer, 2005b).

Ιδιαίτερη μνεία πρέπει να γίνει για τον τρόπο μεταγραφής αλληλο-επικαλυπτόμενων γονιδίων και συγκεκριμένα των ζευγών nad4L-nad5 και nad2-nad3. Τα αλληλο-επικαλυπτόμενα, κατά ένα νουκλεοτίδιο, γονίδια έχουν περιγραφεί σε μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων και ζώων. Το μικρό μέγεθος ορισμένων γονιδίων δεν επιτρέπει τη σωστή και αποδοτική πρόσδεση

~ 92 ~

της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας στο μετάγραφο και την αποδοτική του μετάφραση. Με την επικάλυψη όμως και κατ’ επέκταση με την αύξηση του μεγέθους λόγω της ύπαρξης πολυσιστρονικού μεταγράφου είναι εφικτή η μεταγραφή των γονιδίων αυτών. Τα πολυσιστρονικά μετάγραφα επιτρέπουν την αποτελεσματική μετάφραση όλων των mRNAs αφού επιτρέπουν την πρόσδεση των ριβοσωμάτων και την επακόλουθη μετάφραση των πρωτεϊνικών μορίων που κωδικοποιούνται από αυτά (Taanman, 1999).

Το περιεχόμενο των μιτοχονδριακών γονιδίων παρουσιάζει ποικιλομορφία, αλλά όχι τόσο έντονη όσο φαίνεται να είναι στη γονιδιακή σειρά των μυκήτων που μελετήθηκαν. Η μελέτη της συνταινικότητας αποτελεί σημαντικό εργαλείο για την μελέτη της εξέλιξης των οργανισμών και την ανακατασκευή του κοινού προγόνου. Γεγονότα όπως το μοναδικό φαινόμενο μετατόπισης των συνταινικών ομάδων στον μύκητα V. dahliae αντιπροσωπεύουν πρόσφατα εξελικτικά γεγονότα καθώς παρατηρείται μια αλλαγή που δεν υπάρχει σε άλλους μύκητες από την τάξη Sordariales (Kouvelis et al., 2004, Pantou et al., 2006). Η πιθανότητα το παραπάνω γεγονός, και άλλα παρόμοια, να αποτελούν φαινόμενα συναπομορφίας δεν μπορεί να αποκλειστεί.

Ο γενετικός κώδικας που χρησιμοποιείται από τους υφομύκητες είναι ο κώδικας 4 (GenBank: Γενετικός κώδικας 4). Με βάση αυτόν, το κωδικόνιο TGA κωδικοποιεί Trp και όχι κωδικόνιο λήξης. Τα κωδικόνια που χρησιμοποιούνται εμφανίζουν σαφή προτίμηση στην παρουσία της τρίτης βάσης του κωδικονίου Α ή Τ. Το ποσοστό κυμαίνεται μεταξύ 82-90%. Η προτίμηση χρήσης τέτοιων κωδικονίων προφανώς σχετίζεται με την υψηλή συγκέντρωση σε Α/Τ στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα όλων των οργανισμών (Leblanc et al., 1997). Αυτό που έχει προταθεί είναι ότι το περιεχόμενο των mtDNAs σε G/C είναι που καθοδηγεί τη χρήση των κωδικονίων και όχι το αντίθετο (Knight et al., 2001). Αυτό σημαίνει ότι η πίεση επιλογής (μεταλλαγές) υφίσταται στο επίπεδο των νουκλεοτιδίων και όχι στο επίπεδο των κωδικονίων. Παρόλα αυτά, κάποια κωδικόνια δεν χρησιμοποιούνται καθόλου ή υπο-αντιπροσωπεύονται και όλα τους περιέχουν στην τρίτη ή και στη δεύτερη βάση G/C. Στα πρωτεϊνικά γονίδια το κωδικόνιο έναρξης είναι το ATG ή εναλλακτικά τα AUA και AUU. Τα προτεινόμενα κωδικόνια έναρξης δεν σημαίνει ότι είναι και τα πραγματικά αφού σαν κωδικόνιο έναρξης μπορεί να χρησιμοποιηθεί το κωδικόνιο ATG (Met).

Ο αριθμός και η κατανομή των εσωνίων στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων που ανήκουν στην οικογένεια των Pezizomycotina ποικίλει. Η παρούσα εργασία, στην οποία έγινε μελέτη 126 μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, επιβεβαιώνει την παρατήρηση ότι τα γονίδια cox1, cob και rnl εμφανίζουν τα περισσότερα εσώνια, ενώ τα γονίδια nad3, atp9, cox2, nad2, nad6, atp8 και rns παρουσιάζουν είτε λίγα είτε καθόλου εσώνια. Αυτή η ποικιλομορφία δηλώνει τη δυναμική και την διαφορετική εξελικτική πορεία των εσωνίων και των ίδιων των οργανισμών. Η αριθμητική ποικιλομορφία εξακολουθεί να υφίσταται όταν μελετήθηκε η ενδο-

~ 93 ~

ειδική κατανομή των εσωνίων. Μελέτες στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα στελεχών του είδους P. anserina έδειξαν ότι κύρια ο αριθμός, και δευτερευόντως η θέση, των εσωνίων μπορεί να διαφέρει σημαντικά μεταξύ στελεχών του ίδιου μύκητα που προέρχονται από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές (Salvo et al., 1998). Αντίστοιχες ενδο-ειδικές μελέτες μπορούν να γίνουν για τα γονίδια που έχουν εντοπιστεί ότι περιέχουν εσώνια στους υπό μελέτη μύκητες ώστε να εκτιμηθεί το πλήθος, η εξάπλωση και η φυλογενετική σχέση των εσωνίων. Η μελέτη της ικανότητας μετάθεσης και οριζόντιας μεταφοράς των εσωνίων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν ένα επιπλέον κριτήριο διαφοροποίησης μεταξύ συγγενικών φυλογενετικά μυκήτων.

Στο γονίδιο της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας εντοπίζονται εσώνια ομάδας Ι που περιέχουν ORFs που κωδικοποιούν για πρωτεΐνη ομόλογη της Rps3 βάσει των συντηρητικών μοτίβων που εντοπίστηκαν (Bullerwell et al., 2000). Και στις τρεις περιπτώσεις τα εσώνια εισέρχονται σε συντηρημένη θέση στην κεντρική θηλειά της επικράτειας V του μορίου (Kochel και Kuntzell, 1982, Kouvelis et al., 2004, Ghikas et al., 2006). Συντηρημένες ήταν και οι θέσεις εισδοχής που ελέγχθηκαν σε όσα μιτοχονδριακά γονίδια είχαν στις αντίστοιχες θέσεις εσώνια. Οι αλληλουχίες εκατέρωθεν των εισδεχόμενων εσωνίων εμφανίζουν σχετική συντηρητικότητα ακόμα και σε φυλογενετικά απομακρυσμένους μύκητες. Η παρουσία των κοινών θέσεων εισδοχής ενισχύει την υπόθεση ότι τα εσώνια είχαν εισαχθεί στις αντίστοιχες θέσεις σε προγονικό οργανισμό πριν τον διαχωρισμό των βασιλείων σε φυτά, ζώα και μύκητες.

Έχουν προταθεί αρκετές ερμηνείες για την εμφάνιση, εξάπλωση και εξέλιξη των εσωνίων και των φερόντων ενδονουκλεασών. Η κάθετη μεταφορά των εσωνίων σχετίζεται με την ύπαρξη κοινού προγόνου από τον οποίο τα εσώνια μεταβιβάστηκαν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης (Ohta et al., 1993). Σε αυτήν την περίπτωση τα εσώνια εντοπίζονται στις ίδιες θέσεις των γονιδίων απομακρυσμένων φυλογενετικά οργανισμών. Με τη βοήθεια ενδονουκλεασών τα εσώνια μεταφέρονται οριζόντια μεταξύ συγγενικών ειδών ή σπανιότερα μεταξύ απομακρυσμένων φυλογενετικά μυκήτων (Rosewich και Kistler, 2000). Η ύπαρξη εσωνίων σε κάθε οργανισμό είναι ξεχωριστή περίπτωση και μπορεί να είναι αποτέλεσμα τόσο οριζόντιας, όσο και κάθετης μεταφοράς καθώς και μίας σειράς άλλων γεγονότων που περιλαμβάνει την εξάπλωσή τους σε ένα γονιδίωμα (Cummings et al., 1989), την απώλεια και την επανεμφάνισή τους (Haugen et al., 2005, Lang et al., 2007). Η κατανομή των εσωνίων στα δύο μιτοχονδριακά γονιδιώματα φαίνεται να επιβεβαιώνουν αυτό τον κανόνα αφού εντοπίστηκαν εσώνια που έχουν εισαχθεί στην ίδια θέση ενός γονιδίου, αποτέλεσμα κάθετης μεταφοράς από κοινό προγονικό μιτοχονδριακό μόριο στα δύο υπό μελέτη γονιδιώματα. Ταυτόχρονα, εντοπίστηκαν εσώνια που βρίσκονται σε διαφορετικές θέσεις εντός του ίδιου γονιδίου ή σε διαφορετικά γονίδια. Το γεγονός αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε σαν πρόσφατο εξελικτικό φαινόμενο οριζόντιας μεταφοράς εσωνίου ή απώλειας του εσωνίου σε ένα από τα δύο συγγενικά mt γονιδιώματα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης η παρουσία αντίστοιχων εσωνίων σε μύκητες

~ 94 ~

απομακρυσμένους εξελικτικά, που όμως σχετίζονται με τον παρασιτισμό των μυκητόφιλων μυκήτων σε άλλους μύκητες, όπου συνήθως Ασκομύκητες προσβάλουν Βασιδιομύκητες.

Το ότι το μέγεθος των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες στο mtDNA δεν αλλάζει πολύ, αποτελεί γεγονός που τα καθιστά ως μια μονάδα συγκρίσιμη μεταξύ mtDNAs διαφορετικών ή και άγνωστων στελεχών (Kouvelis et al., 2008). H κατασκευή φυλογενετικών δένδρων χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες όλων των πρωτεϊνικών γονιδίων του mtDNA ως μια μονάδα θεωρείται ότι δίνει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα σε ότι αφορά την φυλογένεση απομακρυσμένων ομάδων μυκήτων, καθώς ο συνδυασμός πολλών γονιδίων μειώνει τις στατιστικές διακυμάνσεις (Ghikas et al., 2006, Kouvelis et al., 2004, Rokas et al., 2003). Η χρήση ενός μόνο γονιδίου σε μια φυλογενετική μελέτη δεν αντιπροσωπεύει πάντα την ιστορία ολόκληρου του γονιδιώματος που το φέρει και επομένως τα συμπεράσματα που μπορεί να προκύψουν μπορεί να είναι εσφαλμένα όσον αφορά τις σχέσεις μεταξύ των μυκήτων που ανήκουν ακόμα και στο ίδιο είδος ή την ίδια τάξη (Lang et al., 1999, Kouvelis et al., 2008). Επομένως, η χρήση αλληλουχιών από ολόκληρο το mtDNA αποτελεί έγκυρο εργαλείο για φυλογενετικές αναλύσεις καθώς παρέχει άμεσες πληροφορίες για την θέση των γονιδίων, των εσωνίων, ρυθμιστικές αλληλουχίες της αντιγραφής και της μεταγραφής. Και επιπλέον η μελέτη των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων μπορεί να αποκαλύψει φαινόμενα μεταθέσεων, διπλασιασμών, αναστροφών και γενικά φαινόμενα ανασυνδυασμού που η μελέτη ενός μόνο γονιδίου δεν μπορεί να φανερώσει (Kouvelis et al., 2004). Τα παραπάνω επιβεβαιώθηκαν και στην παρούσα εργασία καθώς δοκιμάστηκε η κατασκευή φυλογενετικών δένδρων με βάση τις συνενωμένες αλληλουχίες όλων των πρωτεϊνικών μιτοχονδριακών. Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν τις πραγματικές εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των μυκήτων.

Tα μιτοχονδριακά γονιδιώματα εμφανίζουν υψηλό ρυθμό εξέλιξης, σε σχέση με το πυρηνικό DNA, οι τοπολογίες που προκύπτουν από ένα εξελικτικό μονοπάτι, όπως το mtDNA μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν σωστά τις συνολικές φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των ειδών. Ο συνδυασμός του πυρηνικού (δεύτερο εξελικτικό μονοπάτι) και του μιτοχονδριακού DNA και η σύγκριση των αποτελεσμάτων που δίνει η κάθε ανάλυση προσφέρουν την δυνατότητα σαφέστερων συμπερασμάτων (Ghikas et al., 2010).

Η αξιοποίηση όλων αυτών των στοιχείων από την ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων σε συνδυασμό με την ήδη υπάρχουσα πληροφορία για τους υποκινητές στις ζύμες και την N. crassa (Breitenberger et al., 1985, Kolondra et al., 2015) βοήθησε την εύρεση και δημιουργία τριών μοτίβων που θα μπορούσαν να λειτουργούν ως υποκινητές στο mtDNA των μυκήτων που ανήκουν στο υπόφυλο Pezizomycotina. Έχοντας στη διάθεση μας τα μοτίβα, κατά τη διάρκεια της εργασίας αυτής, δημιουργήθηκε ένα εργαλείο βιοπληροφορικής προκειμένου να εντοπίζουμε γρήγορα και εύκολα τα μοτίβα αυτά, ολοκλήρώνοντας τοιουτοτρόπως την in silico ανάλυση εύρεσης πιθανών υποκινητών. Το πρόγραμμα αυτό ελέγχθηκε σε αντιπροσώπους

~ 95 ~

όλων των Τάξεων εντός των Pezizomycotina και διαπιστώθηκε πως σε πολλές περιπτώσεις υπάρχουν σε ανιούσα θέση από την έναρξη των γονιδίων η ίδια σχεδόν αλληλουχία που αποτελούσε ένα από τα τρία μοτίβα, ισχυροποιώντας την ένδειξη πως οι περιοχή αυτή θα μπορούσε να λειτουργεί ως υποκινητής. Είναι προφανές πως η in silico αυτή ανάλυση πρέπει οπωσδήποτε να πιστοποιηθεί και επιβεβαιωθεί με πειραματικά δεδομένα, που δυστυχώς δεν ήταν δυνατόν να εκτελεστούν στο μικρό χρονικό διάστημα αυτής της εργασίας. Θα αποτελέσουν όμως παρακαταθήκη για μελλοντικές εργασίες.

Συμπερασματικά, σε αυτή την εργασία μελετήθηκαν και αναλύθηκαν όλα τα γνωστά μιτοχονδριακά γονιδιώματα των μυκήτων. Έγιναν παρατηρήσεις που αφορούν στην γονιδιακή οργάνωση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των μυκήτων και φυλογενετικές αναλύσεις με τις συνενωμένες αλληλουχίες των μιτοχονδριακών γονιδίων. Τα παραπάνω βοήθησαν στην εξακρίβωση και ανάδειξη των φυλογενετικών σχέσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των μυκήτων και στην καλύτερη γνώση της εξέλιξης των οργανισμών ενός τόσο σύνθετου Βασιλείου, όπως αυτό των Μυκήτων. Μελετήθηκαν οι διαγονιδιακές περιοχές 56 οργανισμών που ανήκουν στο υπόφυλο Peziomycotina και 15 από οργανισμούς που ανήκουν στην τάξη Saccharomycetales. Από αυτήν την μελέτη δημιουργήθηκε ένα μοτίβο που χαρακτηρίζει την συναινετική ακολουθία του υποκινητή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και με βάση το μοτίβο αυτό, σχεδιάστηκε ένας αλγόριθμος που προβλέπει πιθανές θέσεις υποκινητή σε ένα μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Το εργαλείο αυτό μπορεί να αποτελέσει μια πολύ καλή λύση για την οργάνωση των βιολογικών πειραμάτων που στόχο έχουν να απαντήσουν τα ερωτήματα που σχετίζονται με τον μηχανισμό και την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης του μυκητιακού μιτοχονδριακού γονιδιώματος.

~ 96 ~

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Abascal F., Zardoya R., Posada D. (2005). ProtTest: selection of best fit models of protein evolution. Bioinformatics 21: 2104–2105.

Adams K.L., Palmer J.D. (2003). Evolution of mitochondrial gene content: gene loss and transfer to the nucleus. Mol. Phylogenet. Evol. 29.3: 380-395.

Alexopoulos C.J., Mims C.W., Blackwell M. (1996). Introductory Mycology. 4th ed. John Wiley & Sons, New York.

Alverson A.J., Rice D.W., Dickinson S., Barry K., Palmer J.D. (2011). Origins and recombination of the bacterial-sized multichromosomal mitochondrial genome of cucumber. Plant Cell 23:2499–2513.

Amiott E.A., Jaehning J.A. (2006a). Mitochondrial transcription is regulated via an ATP "sensing" mechanism that couples RNA abundance to respiration. Mol. Cell 22: 329–338.

Amiott E.A., Jaehning J.A. (2006b). Sensitivity of the yeast mitochondrial RNA polymerase to +1 and +2 initiating nucleotides. J. Biol. Chem. 281: 34982–34988.

Amlacher S., Sarges P., Flemming D., van Noort V., Kunze R., Devos D.P., Arumugam M., Bork P., Hurt E. (2011). Insight into structure and assembly of the nuclear pore complex by utilizing the genome of a eukaryotic thermophile. Cell 146: 277-289.

Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J., Staden R., Young I.G. (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457–465

Andersson S.G., Karlberg O., Genback B., Kurland C.G. (2003) On the origin of mitochondria: a genomics perspective. Phil. Trans. of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 358: 165-177.

Armstrong M.R., Blok V.C., Phillips M.S. (2000). A multipartite mitochondrial genome in the potato cyst nematode Globodera pallida. Genetics 154: 181-192.

Asin-Cayuela J., Gustafsson C.M. (2007). Mitochondrial transcription and its regulation in mammalian cells. Trends Biochem. Sci. 32: 111–117.

Attardi G., Schatz G. (1988). Biogenesis of mitochondria. Annu. Rev. Cell Biol. 4: 289–333.

~ 97 ~

Bajic V.B., Seah S.H. (2003a). Dragon Gene Start Finder: an advanced system for finding approximate locations of the start of gene transcriptional units. Genome Res. 13: 1923– 1929.

Bajic V.B., Seah S.H., Chong A., Krishnan S.P., Koh J.L., Brusic V. (2003b). Computer model for recognition of functional transcription start sites in RNA polymerase II promoters of vertebrates. J. Mol. Graph. Model. 21: 323–332.

Bajic V.B., Tan S.L., Suzuki Y., Sugano S. (2004). Promoter prediction analysis on the whole human genome. Nature Biotechnol. 22:1467-1473.

Ballard J.W.O., Whitlock M.C. (2004). The incomplete natural history of mitochondria. Mol. Ecol. 13: 729–744.

Barr D.J.S. (1992). Evolution and Kingdoms of Organisms from the Perspective of a Mycologist. Mycologia. 84: 1-11.

Bendich A.J. (1993) Reaching for the ring: the study of mitochondrial genome structure. Curr. Genet. 24: 279-290.

Bendich A.J. (1996). Structural analysis of mitochondrial DNA molecules from fungi and plants using moving pictures and pulse-field gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 255: 564-588.

Bestwick M.L., Shadel G.S. (2013). Accessorizing the human mitochondrial transcription machinery. Trends Biochem. Sci. 6: 283–291.

Biswas T.K. (1998). Usage of non-canonical promoter sequence by the yeast mitochondrial RNA polymerase. Gene. 212:305–314.

Biswas T.K., Edwards J.C., Rabinowitz M., Getz G.S. (1985). Characterization of a yeast mitochondrial promoter by deletion mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1954–1958.

Biswas T.K., Getz G.S. (1986a). A critical base in the yeast mitochondrial nonanucleotide promoter. Abolition of promoter activity by mutation at the -2 position. J. Biol. Chem. 261:3927–3930.

Biswas T.K., Getz G.S. (1986b). Nucleotides flanking the promoter sequence influence the transcription of the yeast mitochondrial gene coding for ATPase subunit 9. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 270–274.

Biswas T.K., Getz G.S. (1990). Regulation of transcriptional initiation in yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 265:19053–19059.

~ 98 ~

Biswas T.K., Ticho B., Getz G.S. (1987). In vitro characterization of the yeast mitochondrial promoter using single-base substitution mutants. J. Biol. Chem. 262:13690–13696.

Blomain E.S., McMahon S.B. (2012) Dynamic regulation of mitochondrial transcription as a mechanism of cellular adaptation. Biochim. Biophys. Acta 1819: 1075–1079.

Bonawitz N.D., Clayton D.A., Shadel G.S. (2006). Initiation and beyond: multiple functions of the human mitochondrial transcription machinery. Mol. Cell. 24:813–825.

Boore J.L. (1999). Animal Mitochondrial Genomes. Nucleic Acids Res. 27: 1767-1780.

Breitenberger C.A., Browning K.S., Alzner-DeWeerd B., RajBhandary U.L., (1985). RNA processing in Neurospora crassa mitochondria: use of transfer RNA sequences as signals. EMBO J. 4: 185–195.

Brown T.A., Cecconi C., Tkachuk A.N., Bustamante C., Clayton D.A. (2005). Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled mechanism. Genes Dev. 19: 2466-2476.

Bruni F., Polosa P.L., Gadaleta M.N., Cantatore P., Roberti M. (2010). Nuclear respiratory factor 2 induces the expression of many but not all human proteins acting in mitochondrial DNA transcription and replication. J. Biol. Chem. 285: 3939–3948.

Bullerwell C.E., Burger G., Lang B.F. (2000). A novel motif for identifying rps3 homologs in fungal mitochondrial genomes. Trends Biochem. Sci. 25: 363–365.

Bullerwell C.E., Forget L., Lang B.F. (2003). Evolution of monoblepharidalean fungi based on complete mitochondrial genome sequences. Nucleic Acids Res. 31: 1614–1623.

Bullerwell C.E., Leigh C.E., Forget L., Lang B.F. (2003). A comparison of three fission yeast mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res. 31: 759–768.

Burger G., Forget L., Zhu Y., Gray M.W., Lang B.F. (2003b). Unique mitochondrial genome architecture in unicellular relatives of animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 892-897.

Burger G., Gray M.W., Forget L., Lang B.F. (2013). Strikingly bacteria-like and gene-rich mitochondrial genomes throughout jakobid protists. Genome Biol Evol 5: 418–438.

Burger G., Gray M.W., Lang B.F. (2003a). Mitochondrial genomes: anything goes. Trends Genet. 19: 709–716.

~ 99 ~

Burger G., Helmer Citterich M., Nelson M.A., Werner S., Macino G. (1985). RNA processing in Neurospora crassa mitochondria: Transfer RNAs punctuate a large precursor transcript. EMBO J. 4: 197–204.

Burger G., Saint-Louis D., Gray M.W., Lang B.F. (1999). Complete sequence of the mitochondrial DNA of the red alga Porphyra purpurea: Cyanobacterial introns and shared ancestry of red and green algae. Plant Cell. 11: 1675–1694.

Burger G., Werner S. (1983). Nucleo-mitochondrial Interactions. Mitochondria (eds. R.J. Schweyen et al.) pp. 331-342.

Burke J.M., Belfort M., Cech T.R., Davies R.W., Schweyen R.J., Shub D.A., Szostak J.W., Tabak H.F. (1987). Structural conventions for group I introns. Nucleic Acids Res. 15: 7217–7221.

Cambell A., Mrazek J., Karlin S. (1999). Genome signature comparisons among prokaryote, plasmid and mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 9184–9189.

Cavalier-Smith T. (1981). Eucaryote Kingdoms: seven or nine? BioSystems. 14: 461-481.

Cavalier-Smith T. (1987). The origin of Fungi and Pseudofungi. In: Evolutionary Biologu of the Fungi. Rayner A.D.M., Brasier C.M. & Moore D. (eds). Cambridge Univ. Press, Cambridge. pp. 339-353

Cech, Thomas R. "Self-splicing of group I introns." Annu. Rev. Biochem. 59.1: 543-568.

Cermakian N., Ikeda T.M., Miramontes P., Lang B.F., Gray M.W., Cedergren R. (1997). On the evolution of the single-subunit RNA polymerases. J. Mol. Evol. 45: 671–681.

Chang D.D., Clayton D.A. (1984). Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA. Cell 36: 635–643.

Chang D.D., Clayton D.A. (1985). Priming of human mitochondrial DNA replication occurs at the light-strand promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 351-355.

Chen W., Islas-Osuna M.A., Dieckmann C.L. (1999). Suppressor analysis of mutations in the 5’ untranslated region of COB mRNA identifies components of general pathways for mitochondrial mRNA processing and decay in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 151: 1315–1325.

Chomyn A., Martinuzzi A., Yoneda M., Daga A., Hurko O., Johns D., Lai S.T., Nonaka I., Angelini C., Attardi G. (1992). MELAS mutation in mtDNA binding site for transcription termination factor causes defects in protein synthesis and in respiration but no change in

~ 100 ~ levels of upstream and downstream mature transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4221–4225.

Christianson T., Edwards J.C., Levens D., Locker J., Rabinowitz M. (1982). Transcriptional initiation and processing of the small ribosomal RNA of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257: 6494–6500.

Christianson T., Rabinowitz M. (1983). Identification of multiple transcriptional initiation sites on the yeast mitochondrial genome by in vitro capping with guanylyltransferase. J. Biol. Chem. 258: 14025–14033.

Ciesielski G.L., Oliveira M.T., Kaguni L.S. (2016). Animal Mitochondrial DNA Replication. Enzymes 39: 255-92.

Clark-Walker G.D. (1992). Evolution of mitochondrial genomes in fungi. In Mitochondrial Genomes. Welstenholme D.R., Jeon K.W. (Eds). San Diego, Academic Press. pp. 89-127.

Clark-Walker G.D., Evans R.J., Hoeben P., McArthur C.R. (1985). Basis of diversity in yeast mitochondrial DNAs. Achievements and perspectives of mitochondrial research 2 (eds. E.C. Quagliariello et al.), pp. 71–78. Science Publishers, Amsterdam, New York.

Clayton D. (2003). Mitochondrial DNA replication: what we know. IUBMB life 55: 213-217.

Clayton D.A. (1991). Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA. Annu. Rev. Cell Biol. 7: 453-478.

Cliften P.F., Park J.Y., Davis B.P., Jang S.H., Jaehning J.A. (1997). Identification of three regions essential for interaction between a-like factor and core RNA polymerase. Genes & Dev. 11: 2897–2909.

Colleaux L., D’ Auriol L., Dujon B. (1988). Recognition and cleavage site of the intron- encoded omega transposase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:6022–6026.

Cotney J., Wang Z., Shadel G.S. (2007). Relative abundance of the human mitochondrial transcription system and distinct roles for h-mtTFB1 and h-mtTFB2 in mitochondrial biogenesis and gene expression. Nucleic Acids Res. 35: 4042–4054.

Cummings D.J., McNally K.L., Domenico J.M., Matsuura E.T. (1990). The complete DNA sequence of the mitochondrial genome of Podospora anserina. Curr. Genet. 17: 375-402.

Daga A., Micol V., Hess D., Aebersold R., Attardi G. (1993). Molecular characterization of the transcription termination factor from human mitochondria. J. Biol. Chem. 268: 8123–8130.

~ 101 ~

DasGupta S.F., Rapoport S.I., Gerschenson M., Murphy E., Fiskum G., Russell S.J., Chandrasekaran K. (2001). ATP synthesis is coupled to rat liver mitochondrial RNA synthesis. Mol. Cell. Biochem. 221: 3–10.

Davuluri R.V., Grosse I., Zhang M.Q. (2001). Computational identification of promoters and first exons in the human genome. Nat. Genet. 29: 412–417.

De Vries H., De Jonge J.C., Arnberg A., Peijnenburg A.A.C.M., Agsteribbe E. (1983). Nucleo- mitochondrial Interactions. Mitochondria (eds. R.J. Schweyen et al.) pp. 343-356.

Deng Y., Zhang Q., Ming R., Lin L., Lin X., Lin Y., Li X., Xie B., Wen Z. (2016). Analysis of the Mitochondrial Genome in Hypomyces aurantius Reveals a Novel Twintron Complex in Fungi. Int J Mol Sci. 17 pii: E1049. doi: 10.3390/ijms17071049.

Desphande A.P., Patel S.S. (2012). Mechanism of Transcription Initiation by the Yeast Mitochondrial RNA Polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1819: 930–938.

Dick M.W. (1997). Straminipilous Fungi. CAB International. Wallingford.

Dieckmann C.L., Staples R.R. (1994). Regulation of mitochondrial gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Int. Rev. Cytol. 152: 145–181.

Diffley J. F., Stillman B. (1992). A close relative of the nuclear, chromosomal high-mobility group protein HMG1 in yeast mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 88: 7864-7868.

Down T.A., Hubbard T.J. (2002). Computational detection and location of transcription start sites in mammalian genomic DNA. Genome Res. 12: 458–461.

Drissi R., Sor F., Fukuhara H. (1993). DNA sequences coding for the ribosomal small subunit RNA and valyl tRNA from the linear mitochondrial genome of the yeast Williopsis mrakii. Nucleic Acids Res. 21: 2947.

Drissi R., Sor F., Nosek J., Fukuhara H. (1994). Genes of the linear mitochondrial DNA of Willopsis mrakii: Coding sequences for a maturase-like protein, a ribosomal protein var1 homologue, cytochrome oxidase subunit 2 and methionyl tRNA. Yeast 10: 391–398.

Dyson N.J., Brown T.A., Ray J.A., Waring R.B., Scazzocchio C., Davies R.W. (1989). Processing of mitochondrial RNA in Aspergillus nidulans. J. Mol. Biol. 208: 587–599.

Dziembowski A., Malewicz M., Minczuk M., Golik P., Dmochowska A., Stepien P.P. (1998). The yeast nuclear gene DSS1, which codes for a putative RNase II, is necessary for the function of the mitochondrial degradosome in processing and turnover of RNA. Mol. Gen. Genet. 260: 108–114.

~ 102 ~

Dziembowski A., Piwowarski J., Hoser R., Minczuk M., Dmochowska A., Siep M., van der Spek H., Grivell L.A., Stepien P.P. (2003). The yeast mitochondrial degradosome. Its composition, interplay between RNA helicase and RNase activities and the role in mitochondrial RNA metabolism. J. Biol. Chem. 278: 1603–1611.

Edwards J.C., Christianson T., Mueller D., Biswas T.K., Levens D., Li D., Wettstein J., Rabinowitz M. (1983). Initiation and transcription of yeast mitochondrial RNA. In Nucleo- mitochondrial interactions (eds. R.J. Schweyen et al.), pp. 69–78. Walter de Gruyter, Berlin.

Egan B., Beilharz T., George R., Isenmann S., Gratzer S., Wattenberg B., Lithgow T. (1999). Targeting of tail-anchored proteins to yeast mitochondria in vivo. FEBS Letters 451: 243-248.

Falkenberg M., Gaspari M., Rantanen A., Trifunovic A., Larsson N.G., Gustafsson C.M. (2002). Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat. Genet. 31: 289–294.

Férandon C., Xu J., Barroso G. (2013). The 135 kbp mitochondrial genome of Agaricus bisporus is the largest known eukaryotic reservoir of group I introns and plasmid related sequences. Fungal Genet. Biol. 55:85–91.

Fernandez-Silva P., Martinez-Azorin F., Micol V., Attardi G. (1997). The human mitochondrial transcription termination factor (mTERF) is a multizipper protein but binds to DNA as a monomer, with evidence pointing to intramolecular leucine zipper interactions. EMBO J. 16: 1066–1079.

Fields D.S., Guttel R.R (1996). An analysis of larger RNA sequences folded by a thermodynamic method. Fold. Des. 1: 419-430.

Fisher R.P., Clayton D.A. (1988). Purification and characterization of human mitochondrial transcription factor 1. Mol. Cell. Biol. 8: 3496–3509.

Fisher R.P., Topper J.N., Clayton D.A. (1987). Promoter selection in human mitochondria involves binding of a transcription factor to orientation-independent upstream regulatory elements. Cell 50: 247–258.

Foury F., Roganti T., Lecrenier N., Purnelle, B. (1998). The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 440: 325–331.

Francois M., Feral J. (1995). Structure and activities of group II introns. Annual review of biochemistry 64.1: 435-461.

François M., Jacquier A., Dujon B. (1982). Comparison of fungal mitochondrial introns reveals extensive homologies in RNA secondary structure. Biochimie 64.10: 867-881.

~ 103 ~

François M., Kazuhiko, Haruo O. (1989). Comparative and functional anatomy of group II catalytic introns—a review. Gene 82.1: 5-30.

Freel K.C., Friedrich A., Schacherer J. (2015). Mitochondrial genome evolution in yeasts: an all-encompassing view. FEMS Yeast Res. 15: fov023.

Frei C., Galloni M., Hafen E., Edgar B.A. (2005). The Drosophila mitochondrial ribosomal protein mRpL12 is required for Cyclin D/ Cdk4-driven growth. EMBO J. 24: 623–634.

Gagliardi D., Leaver C.J. (1999). Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterility in sunflower. EMBO J. 18: 3757–3766.

Gagliardi D., Perrin R., Marechal-Drouard L., Grienenberger J.M., Leaver C.J. (2001). Plant mitochondrial polyadenylated mRNAs are degraded by a 3’ to 5’ exoribonuclease activity, which proceeds unimpeded by stable secondary structures. J. Biol. Chem. 276: 43541– 43547.

Gagliardi D., Stepien P., Temperley R., Lightowlers R., Chrzanowska-Lightowlers Z. (2004). Messenger RNA stability in mitochondria: different means to an end. Trends Genet. 20: 260- 267.

Gaines G., Rossi C., Attardi G. (1987). Markedly different ATP requirements for rRNA synthesis and mtDNA light strand transcription versus mRNA synthesis in isolated human mitochondria. J. Biol. Chem. 262: 1907–1915.

Gao P., Tchernyshyov I., Chang T.C., Lee Y.S., Kita K., Ochi T., Zeller K.I., De Marzo A.M., Van Eyk J.E., Mendell J.T., Dang C.V. (2009). c-Myc suppression of miR-23a/b enhances mitochondrial glutaminase expression and glutamine metabolism. Nature 458: 762–765.

Ghikas D.V., Kouvelis V.N., Typas M.A. (2006). The complete mitochondrial genome of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var. anisopliae: gene order and trn gene clusters reveal a common evolutionary course for all Sordariomycetes. Arch. Microbiol. 185: 393-401.

Ghikas D.V., Kouvelis V.N., Typas M.A. (2010). Phylogenetic and biogeographic implications inferred by mitochondrial intergenic region analyses and ITS1-5.8S-ITS2 of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and B. brongniartii. BMC Microbiol., 10: 174.

Gonzalez P., Labarere J. (2000). Phylogenetic relationships of Pleurotus species according to the sequence and secondary structure of the mitochondrial small subunit rRNA V4, V6 and V9 domains. Microbiol. 146: 209-211.

~ 104 ~

Gray M.W., Burger G., Lang B.F. (1999). Mitochondrial evolution. Science. 283: 1476-1481.

Gray M.W., Lang, B.F. (1998). Transcription in chloroplasts and mitochondria: A tale of two polymerases. Trends Microbiol. 6: 1–3.

Green-Willms N.S., Fox T.D., Costanzo M.C. (1998). Functional interactions between yeast mitochondrial ribosomes and mRNA 5’ untranslated leaders. Mol. Cell. Biol. 18: 1826–1834.

Gutell R.R., Cannone J.J., Shang Z., Du Y., Serra M.J. (2000). A story: unpaired adenosine bases in ribosomal RNAs. J. Mol. Biol. 304: 335-354.

Hafez M., Majer A., Sethuraman J., Rudski S.M., Michel F., Hausner G. (2013). The mtDNA rns gene landscape in the Ophiostomatales and other fungal taxa: twintrons, introns, and intron-encoded proteins. Fungal Genet Biol. 53: 71-83.

Hanekamp T., Thorsness P.E. (1999). YNT20, a bypass suppressor of yme1 yme2, encodes a putative 3’–5’ exonuclease localized in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 34: 438–448.

Hannenhalli S., Levy S. (2001). Promoter prediction in the human genome. Bioinformatics 17: S90–S96.

Haugen P., Simon D.M., Bhattacharya D. (2005). The natural history of group I introns. Trends Genet. 21: 111–119.

Hawksworth D.L. (1991). The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation. Mycol. Res. 95: 641-655.

Hawksworth D.L. (2001). The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited. Mycol. Res. 105: 1422-1432.

Hebert A.S., Dittenhafer-Reed K.E., Yu W., Bailey D.J., Selen E.S., Boersma M.D., Carson J.J., Tonelli M., Balloon A.J., Higbee A.J., Westphall M.S., Pagliarini D.J., Prolla T.A., Assadi-Porter F., Roy S., Denu J.M., Coon J.J. (2013). Calorie Restriction and SIRT3 Trigger Global Reprogramming of the Mitochondrial Protein Acetylome. Mol. Cell. 49: 186–199.

Hecht J., Grewe F., Knoop V. (2011). Extreme RNA editing in coding islands and abundant microsatellites in repeat sequences of Selaginella moellendorffii mitochondria: The root of frequent plant mtDNA recombination in early tracheophytes. Genome Biol Evol 3: 344–358.

Hegedus D.D., Khachatourians G.G. (1993). Identification of molecular variants in mitochondrial DNAs of members of the genera Beauveria, Verticillium, Paecilomyces, Tolypocladium and Metarhizium. Appl. Environm. Microbiol. 59: 4283-4288.

~ 105 ~

Henze K., Martin W. (2003). Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426: 127–128.

Hiasa H., Marians K.J. (1996). Two Distinct Modes of Strand Unlinking during u-Type DNA Replication. J. Biol. Chem. 271:21529-21535.

Hibbett D.S., Binder M., Bischoff J.F., Blackwell M., Cannon P.F., Eriksson O.E., Huhndorf S., James T., Kirk P.M., Lücking R., Thorsten Lumbsch H., Lutzoni F., Matheny P.B., McLaughlin D.J., Powell M.J., Redhead S., Schoch C.L., Spatafora J.W., Stalpers J.A., Vilgalys R., Aime M.C., Aptroot A., Bauer R., Begerow D., Benny G.L., Castlebury L.A., Crous P.W., Dai Y.C., Gams W., Geiser D.M., Griffith G.W., Gueidan C., Hawksworth D.L., Hestmark G., Hosaka K., Humber R.A., Hyde K.D., Ironside J.E., Kõljalg U., Kurtzman C.P., Larsson K.H., Lichtwardt R., Longcore J., Miadlikowska J., Miller A., Moncalvo J.M., Mozley-Standridge S., Oberwinkler F., Parmasto E., Reeb V., Rogers J.D., Roux C., Ryvarden L., Sampaio J.P., Schüssler A., Sugiyama J., Thorn R.G., Tibell L., Untereiner W.A., Walker C., Wang Z., Weir A., Weiss M., White M.M., Winka K., Yao Y.J., Zhang N. (2007). A higher-level phylogenetic classification of the fungi. Mycol. Res. 111: 509–547.

Hikosaka K., Watanabe Y., Tsuji N., Kita K., Kishine H., Arisue N., Palacpac N.M., Kawazu S., Sawai H., Horii T., Igarashi I., Tanabe K. (2010). Divergence of the mitochondrial genome structure in the apicomplexan parasites, Babesia and Theileria. Mol. Biol. Evol. 27: 1107– 1116.

Hillis D.M., Moritz B.K., Mable B.K. (1996). Molecular Systematics. 2nd edition. Sinauer Associates. Sunderland, MA.

Hofmann T.J., Min J., Zassenhaus H.P. (1993). Formation of the 3’ end of yeast mitochondrial mRNAs occurs by site-specific cleavage two bases downstream of a conserved dodecamer sequence. Yeast 9: 1319–1330.

Ioshikhes I.P., Zhang M.Q. (2000). Large-scale human promoter mapping using CpG islands. Nat. Genet. 26: 61–63.

Islas-Osuna M.A., Ellis T.P., Marnell L.L., Mittelmeier T.M., Dieckmann C.L. (2002). Cbp1 is required for translation of the mitochondrial cytochrome b mRNA of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 277: 37987–37990.

Islas-Osuna M.A., Ellis T.P., Mittelmeier T.M., Dieckmann C.L. (2003). Suppressor mutations define two regions in the Cbp1 protein important for mitochondrial cytochrome b mRNA stability in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 43: 327–336.

~ 106 ~

Karnkowska A., Vacek V., Zubáčová Z., Treitli S.C., Petrželková R., Eme L., Novák L., Žárský V., Barlow L.D., Herman E.K., Soukal P., Hroudová M., Doležal P., Stairs C.W., Roger A.J., Eliáš M., Dacks J.B., Vlček Č., Hampl V. (2016). A Eukaryote without a Mitochondrial Organelle. Curr. Biol. 26:1274-84.

Keeling P.J., Luker M.A., Palmer J.D. (2000). Evidence from beta-tubulin phylogeny that microsporidia evolved from within the fungi. Mol. Biol. Evol. 17: 23-31.

Kerscher S., Durstewitz G., Casaregola S., Gaillardin C., Brandt U. (2001). The complete mitochondrial genome of Yarrowia lipolytica. Comp. Funct. Genomics 2: 80–90.

Kim J., Lee J.H., Iyer V.R. (2008). Global identification of Myc target genes reveals its direct role in mitochondrial biogenesis and its E-box usage in vivo. PLoS One 3: e1798.

Kleidon J., Plesofsky N., Brambl R. (2003). Transcripts and transcript-binding proteins in mitochondria of Neurospora crassa. Mitochondrion 2: 345-360.

Knight R.D., Landweber L.F., Yarus M. (2001). How mitochondria redefine the code. J. Mol. Evol. 53:299-313.

Knoop V. (2004). The mitochondrial DNA of land plants: peculiarities in phylogenetic perspective. Curr Genet 46: 123-139.

Knudsen S. (1999). Promoter2.0: for the recognition of PolII promoter sequences. Bioinformatics 15: 356–361.

Kochel H.G., Kuntzell H. (1982). Mitochondrial L-rRNA from Aspergillus nidulans: potential secondary structure and evolution. Nucleic Acids Res. 10: 4795-4801.

Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Mireau H., Fox T.D., Martin R.P., Tarassov I.A. (2000). Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm. Science. 289: 1931–1933.

Koll F., Boulay J., Belcour L., D’Aubenton-Carafa Y. (1996). Contribution of ultra-short invasive elements to the evolution of the mitochondrial genome in the genus Podospora. Nucleic Acids Res. 24: 1734–1741.

Kolondra A., Labedzka-Dmoch K., Wenda J.M., Drzewicka K., Golik P. (2015). The transcriptome of Candida albicans mitochondria and the evolution of organellar transcription units in yeasts. BMC Genomics 16:827.

~ 107 ~

Koszul R., Malpertuy A., Frangeul L., Bouchier C., Wincker P., Thierry A., Duthoy S., Ferris S., Hennequin C., Dujon B. (2003). The complete mitochondrial genome sequence of the pathogenic yeast Candida (Torulopsis) glabrata. FEBS Lett. 534: 39–48.

Kouvelis V.N., Ghikas D.V., Typas M.A. (2004). The analysis of the complete mitochondrial genome of Lecanicillium muscarium (synonym Verticillium lecanii) suggests a minimum common gene organization in mtDNAs of Sordariomycetes: phylogenetic implications. Fungal Genet. Biol. 41: 930–940.

Kouvelis V.N., Sialakouma A., Typas M.A. (2008). Mitochondrial gene sequences alone or combined with ITS region sequences provide firm molecular criteria for the classification of Lecanicillium species. Mycol Res. 112: 829-844.

Kretzer A.M., Bruns T.D. (1999). Use of atp6 in fungal phylogenetics: an example from the Boletales. Mol. Phylogenet. Evol. 13: 483-492.

Kubelik A.R., Kennell J.C., Akins R.A., Lambowitz A.M. (1990). Identification of Neurospora mitochondrial promoters and analysis of synthesis of the mitochondrial small rRNA in wild- type and the promoter mutant [poky]. J. Biol. Chem. 265: 4515–4526.

Kuramae E.E., Robert V., Snel B., Boekhout T. (2006). Conflicting phylogenetic position of Schizosaccharomyces pombe. Genomics 88: 387–393.

Laforest M.J., Roewer I., Lang B.F. (1997). Mitochondrial tRNAs in the lower fungus Spizellomyces punctatus: tRNA editing and UAG ‘stop’ codons recognized as leucine. Nuc. Ac. Res. 25: 626–632.

Lang B.F. (1984). The mitochondrial genome of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe: highly homologous introns are inserted at the same position of the otherwise less conserved cox1 genes in Schizosaccharomyces pombe and Aspergillus nidulans. EMBO J. 3: 2129-2136.

Lang B.F., Cedegren R., Gray M.W. (1987). The mitochondrial genome of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Sequence of the large subunit ribosomal RNA gene, comparison of potential secondary structure in fungal mitochondrial large subunit rRNAs and evolutionary considerations. Eur. J. Biochem. 169: 527-537.

Lang B.F., Laforest M.J., Burger G. (2007). Mitochondrial introns: a critical view. Trends Genet. 23: 119-125.

~ 108 ~

Lang B.F., Sheif E., Gray M.W., OKelly C.J., Burger G. (1999). A comparative genomics approach to the evolution of eukaryotes and their mitochondria. J. Eukaryot. Microbiol. 46: 320–326.

Leblanc C., Richard O., Kloareg B., Viehmann S., Zetsche K., και Boyen C. (1997). Origin and evolution of mitochondria: what have we learn from red algae? Curr. Genet. 31:193-207.

Lecrenier N., Foury F. (2000). New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene 246: 37-48.

Lee J.M., Greenleaf A.L. (1989). A protein kinase that phosphorylates the C-terminal repeat domain of the largest subunit of RNA polymerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 3624– 3628.

Levinson G., Gutman G.A. (1987). Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Mol. Biol. Evol. 4: 203–221.

Li F., Wang Y., Zeller K.I., Potter J.J., Wonsey D.R., O'Donnell K.A., Kim J.W., Yustein J.T., Lee L.A., Dang C.V. (2005). Myc stimulates nuclearly encoded mitochondrial genes and mitochondrial biogenesis. Mol. Cell. Biol. 25: 6225–6234.

Li H., Zassenhaus H.P. (1999). Purification and characterization of an RNA dodecamer sequence binding protein from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261: 740–745.

Linder T., Park C. B., Asin-Cayuela J., Pellegrini M., Larsson N.G., Falkenberg M., Samuelsson T., Gustafsson C. M. (2005). A family of putative transcription termination factors shared amongst metazoans and plants. Curr. Genet. 48: 265–269.

Ling F., Shibata T. (2002). Recombination‐dependent mtDNA partitioning: in vivo role of Mhr1p to promote pairing of homologous DNA. EMBO J. 21: 4730-4740.

Lipinski K.A., Kaniak-Golik A., Golik P. (2010). Maintenance and expression of the S. cerevisiae mitochondrial genome--from genetics to evolution and systems biology. Biochim. Biophys. Acta 1797: 1086-1098.

Litonin D., Sologub M., Shi Y., Savkina M., Anikin M., Falkenberg M., Gustafsson C.M., Temiakov D. (2010). Human mitochondrial transcription revisited: only TFAM and TFB2M are required for transcription of the mitochondrial genes in vitro. J. Biol. Chem. 285: 18129– 18133.

Liu R., States D.J. (2002). Consensus promoter identification in the human genome utilizing expressed gene markers and gene modeling. Genome Res. 12: 462–469.

~ 109 ~

Lodeiro M.F., Uchida A., Bestwick M., Moustafa I.M., Arnold J.J., Shadel G.S., Cameron C.E. (2012). Transcription from the second heavy-strand promoter of human mtDNA is repressed by transcription factor A in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:6513–6518.

Logan David C. (2006). The mitochondrial compartment. J. Exp. Bot. 57.6: 1225-1243.

Lonergan K.M., Gray M.W. (1994). The ribosomal RNA gene region in Acanthamoeba castellanii mitochondrial DNA. A case of evolutionary transfer of introns between mitochondria and plastids? J. Mol. Biol. 239: 476–499.

Lumbsch H.T., Buchanan P.K., May T.W., Mueller G.M. (2008). Phylogeography and biogeography of fungi. Mycol. Res. 112: 423-424.

Lunt D.H., Whipple L.E., Hyman B.C. (1998). Mitochondrial DNA variable number tandem repeats (VNTRs): utility and problems in molecular ecology. Mol. Ecol. 7: 1441–1455.

Macey J.R., Schulte J.A., Larson A., Papenfuss T.J. (1998). Tandem duplication via light- strand synthesis may provide a precursor for mitochondrial genomic rearrangement. Mol. Biol. Evol. 15: 71–75.

Maleszka R., Clark-Walker G. D. (1992). In vivo conformation of mitochondrial DNA in fungi and zoosporic moulds. Curr. Genet. 22.4: 341-344.

Maleszka R., Skelly P. J., Clark-Walker G. D. (1991). Rolling circle replication of DNA in yeast mitochondria. EMBO J. 10: 3923.

Mangus D.A., Jang S.H., Jaehning J.A. (1994). Release of the yeast mitochondrial RNA polymerase specificity factor from transcription complexes. J. Biol. Chem. 269: 26568– 26574.

Margulis L. (1970). Origin of eukaryotic cells: evidence and research implications for a theory of the origin and evolution of microbial, plant, and animal cells on the Precambrian earth. New Haven: Yale University Press.

Margulis L. (1981). Symbiosis in cell evolution. New York: W.H. Freeman.

Margulis Lynn. (1996). Archaeal-eubacterial mergers in the origin of Eukarya: phylogenetic classification of life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93.3: 1071-1076.

Martin W., Muller M. (1998). The hydrogen hypothesis for the first eukaryote. Nature. 392: 7-41.

Martinez-Azorin F. (2005). The mitochondrial ribomotor hypothesis. IUBMB Life 57: 27–30.

~ 110 ~

Marty L., Fort P. (1996). A delayed-early response nuclear gene encoding MRPL12, the mitochondrial homologue to the bacterial translational regulator L7/L12 protein. J Biol Chem. 271: 11468–11476.

Masters B.S., Stohl L.L., Clayton D.A. (1987) Yeast mitochondrial RNA polymerase is homologous to those encoded by bacteriophages T3 and T7. Cell 51: 89–99.

Mavridou A., Typas M.A. (1998). Intraspecific polymorphism in Metarhizium anisopliae var. anisopliae revealed by analysis of rRNA gene complex and mtDNA RFLPs. Mycol. Res. 102: 1233-1241.

Michel F., Lang B.F. (1985). Mitochondrial class II introns encode proteins related to the reverse transcriptases of retroviruses. Nature 316: 641-643.

Min J., Heuertz R.M., Zassenhaus H.P. (1993). Isolation and characterization of an NTP- dependent 3’ exoribonuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268: 7350–7357.

Minczuk M., He J., Duch A.M., Ettema T.J., Chlebowski A., Dzionek K., Nijtmans L.G., Huynen M.A., Holt I.J. (2011). TEFM (c17orf42) is necessary for transcription of human mtDNA. Nucleic. Acids. Res. 39: 4284–4299.

Misas E., Muñoz J.F., Gallo J.E., McEwen J.G., Clay O.K. (2016). From NGS assembly challenges to instability of fungal mitochondrial genomes: A case study in genome complexity. Comput Biol Chem. 61: 258-69.

Mohammadzadeh M., Halabian R., Gharehbaghian A., Amirizadeh N., Jahanian-Najafabadi A., Roushandeh A.M., Roudkenar M.H. (2012). Nrf-2 overexpression in mesenchymal stem cells reduces oxidative stress-induced apoptosis and cytotoxicity. Cell Stress Chaperones 17: 553–565.

Montoya J., Christianson T., Levens D., Rabinowitz M., Attardi G. (1982). Identification of initiation sites for heavy-strand and light-strand transcription in human mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 7195–7199.

Montoya J., Gaines G.L., Attardi G. (1983). The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell 34:151–159.

Moore-Landecker E. (1996). Fundamentals of the Fungi. 4th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs N.J.

Morrish F., Giedt C., Hockenbery D. (2003). c-MYC apoptotic function is mediated by NRF-1 target genes. Genes Dev. 17: 240–255.

~ 111 ~

Narasimhan N., Attardi G. (1987). Specific requirement for ATP at an early step of in vitro transcription of human mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 4078–4082.

Neupert W. (1997). Protein import into mitochondria. Annu. Rev. Biochem. 66: 863-917.

Ngo H.B., Kaiser J.T., Chan D.C. (2011). The mitochondrial transcription and packaging factor Tfam imposes a U-turn on mitochondrial DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 18: 1290–1296.

Ntertilis M., Kirmitzoglou I., Promponas V., Kouvelis N.V., Typas M.A., manuscript in preparation - http://mitofun.biol.uoa.gr/.

O'Farrell H.C., Pulicherla N., Desai P.M., Rife J.P. (2006). Recognition of a complex substrate by the KsgA/Dim1 family of enzymes has been conserved throughout evolution. RNA 12: 725–733.

Ohler U., Liao G.C., Niemann H., Rubin G.M. (2002). Computational analysis of core promoters promoters in the Drosophila genome. Genome Biol. 3: RESEARCH0087. Epub 2002.

Ohler U., Stemmer G., Harbeck S., Niemann H. (2000). Stochastic segment models of eukaryotic promoter regions. Proc. Pac. Symp. Biocomput. 5: 380–391.

Ohta E., Oda K., Yamato K., Nakamura Y., Takemura M., Nozato N., Akashi K., Ohyama K., και Michel F. (1993). Group I introns in the liverwort mitochondrial genome: the gene coding for subunit 1 of cytochrome oxidase shares five intron positions with its fungal counterparts. Nucl. Acid. Res. 21: 1297-1305.

Ojala D., Merkel C., Gelfand R., Attardi G. (1980). The tRNA genes punctuate the reading of genetic information in human mitochondrial DNA. Cell 22: 393–403.

Ojala D., Montoya J. Attardi G. (1981). tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature 290:470–474.

Osinga K.A. Tabak H.F. (1982). Initiation of transcription of genes for mitochondrial ribosomal RNA in yeast: Comparison of the nucleotide sequence around the 5’ ends of both genes reveals a homologous stretch of 17 nucleotides. Nucleic Acids Res. 10: 3617–3626.

Osinga K.A., De Vries E., Van der Horst G., Tabak H.F. (1984a). Processing of yeast mitochondrial messenger RNAs at a conserved dodecamer sequence. EMBO J. 3: 829–834.

Osinga K.A., De Vries E., Van der Horst G.T., Tabak, H.F. (1984b). Initiation of transcription in yeast mitochondria: Analysis of origins of replication and of genes coding for a messenger RNA and a transfer RNA. Nucleic Acids Res. 12: 1889–1900.

~ 112 ~

Pantou M. P., Kouvelis V. N., Typas M. A. (2006). The complete mitochondrial genome of the vascular wilt fungus Verticillium dahliae: a novel gene order for Verticillium and a diagnostic tool for species identification. Curr. Genet. 50: 125-136.

Pantou M.P., Kouvelis V.N., Typas M.A. (2008). The complete mitochondrial genome of Fusarium oxysporum: insights into fungal mitochondrial evolution. Gene. 419: 7-15.

Pantou M.P., Mavridou A., Typas M.A. (2003). IGS sequence variation, group-I introns and the complete nuclear ribosomal DNA of the entomopathogenic fungus Metarhizium: excellent tools for isolate detection and phylogenetic analysis. Fungal Genet. Biol. 38: 159– 174.

Pantou M.P., Strunnikova O.K., Shakhnazarova V.Y., Vishnevskaya N.A., Papalouka V.G., Typas M.A. (2005b). A contribution towards a molecular and immunochemical phylogeny of Verticillium. Mycol. Res. 109: 889-902.

Paquin B., Lang B.F. (1996). The mitochondrial DNA of Allomyces macrogynus: the complete genomic sequence from an ancestral fungus. J. Mol. Biol. 255: 688–701

Paquin B.P., Laforest M-J., Forget L., Roewer I., Wang Z., Longcore J., Lang B.F. (1997). The fungal mitochondrial genome project: evolution of fungal mitochondrial genomes and their gene expression. Curr. Genet. 31: 380–395.

Parisi M.A., Clayton D.A. (1991). Similarity of human mitochondrial transcription factor 1 to high mobility group proteins. Science 252: 965–969.

Petersen G., Cuenca A., Møller I.M., Seberg O. (2015). Massive gene loss in mistletoe (Viscum, Viscaceae) mitochondria. Sci Rep 5: 17588.

Petersen J., Ludewig A.K., Michael V., Bunk B., Jarek M., Baurain D., Brinkmann H. (2014). Chromera velia, endosymbioses and the rhodoplex hypothesis—Plastid evolution in cryptophytes, alveolates, stramenopiles, and haptophytes (CASH lineages). Genome Biol Evol 6: 666–684.

Ponger L., Mouchiroud D. (2002) CpGProD: identifying CpG islands associated with transcription start sites in large genomic mammalian sequences. Bioinformatics 18: 631– 633.

Pramateftaki P.V., Kouvelis V.N., Lanaridis P., Typas M. (2006). The mitochondrial genome of the wine yeast Hanseniaspora uvarum: a unique genome organization among yeast/fungal counterparts. MA.FEMS Yeast Res. 6:77-90.

~ 113 ~

Pramateftaki P.V., Kouvelis V.N., Lanaridis P., Typas M.A. (2008). Complete mitochondrial genome sequence of the wine yeast Candida zemplinina: intraspecies distribution of a novel group-IIB1 intron with eubacterial affiliations. FEMS Yeast Res. 8: 311-327.

Ragnini A., Frontali L. (1994). Ordered processing of the polygenic transcripts from a mitochondrial tRNA gene cluster in K. lactis. Curr. Genet. 25: 342–349.

Reese M.G. (2001). Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila melanogaster genome. Comput. Chem. 26: 51–56.

Rehner S.A., Buckley E.P. (2005). A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia 97: 84-98.

Reid G.A., Schatz G. (1982). Import of proteins into mitochondria. Extramitochondrial pools and post-translational import of mitochondrial protein precursors in vivo. J. Biol. Chem. 257: 13062–13067.

Reyes A., Gissi C., Pesole G., Saccone C. (1998.) Asymmetrical directional mutation pressure in the mitochondrial genome of mammals. Mol. Biol. Evol. 15: 957-966.

Richard O., Bonnard G., Grienenberger J.M., Kloareg B., Boyen C. (1998). Transcription initiation and RNA processing in the mitochondria of the red alga Chondrus crispus: Convergence in the evolution of transcription mechanisms in mitochondria. J. Mol. Biol. 283: 549–557.

Rokas A., Williams B.L., King N., Carroll S.B. (2003). Genome-scale approaches to resolving incongruence in molecular phylogenies. Nature. 425: 798–804.

Ronquist F.R., Huelsenbeck J.P. (2003). MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574.

Rosewich U.L., Kistler H.C. (2000). Role of horizontal gene transfer in the evolution of fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 38: 325-363.

Rubio-Cosials A., Sidow J.F., Jimenez-Menendez N., Fernandez-Millan P., Montoya J., Jacobs H.T., Coll M., Bernado P., Sola M. (2011). Human mitochondrial transcription factor A induces a U-turn structure in the light strand promoter. Nat. Struct. Mol. Biol. 18: 1281– 1289.

Saccone C., Gissi C., Lanave C., Larizza A., Pesole G., Reyes A. (2000). Evolution of the mitochondrial genetic system: an overview. Gene 261:153-159.

~ 114 ~

Saccone S., Gissi C., Reyes A., Larizza A., Sbisa E., Pesole G. (2002). Mitochondrial DNA in metazoa: degree of freedom in a frozen event. Gene 286: 3–12.

Saguez C., Lecellier G., Koll F. (2000). Intronic GIY-YIG endonuclease gene in the mitochondrial genome of Podospora curvicolla: evidence for mobility. Nucleic Acids Res. 28: 1299-1306.

Sakito T., Okamoto K., Kitano H., Yoshida K. (1995). The complete mitochondrial DNA sequence of Hansenula wingei reveals new characteristics of yeast mitochondria. Curr. Genet. 28: 39–53.

Salinas-Giegé T., Giegé R., Giegé P. (2015). tRNA biology in mitochondria. Int J Mol Sci. 16: 4518-4559.

Salvo J., Rodeghier B., Rubin A., Troischt Τ. (1998). Optional introns in mitochondrial DNA of Podospora anserina are the primary source of observed size polymorphisms. Fung. Genet. Biol. 23: 162–168.

Sanchirico M.E., Fox T.D., Mason T.L. (1998). Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17: 5796-5804.

Schäfer B. (2003). Genetic conservation versus variability in mitochondria: the architecture of the mitochondrial genome in the petite-negative yeast Schizosaccharomyces pombe. Curr. Genet. 43: 311–326.

Schäfer Β., Hansen M., Lang B.F. (2005). Transcription and RNA-processing in fission yeast mitochondria. RNA 11:785–795.

Schinkel A.H., Groot Koerkamp M.J., Van der Horst G.T., Touw E.P., Osinga K.A., Van der Bliek A.M., Veeneman G.H., Van Boom J.H., Tabak H.F. (1986). Characterization of the promoter of the large ribosomal RNA gene in yeast mitochondria and separation of mitochondrial RNA polymerase into two different functional components. EMBO J. 5: 1041– 1047.

Seifert K.A. Samson R.A., Dewaard J.R., Houbraken J., Lévesque C.A., Moncalvo J.M., Louis- Seize G., Hebert P.D. (2007). Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 104:3901-3906.

Shadel G.S., Clayton D.A. (1993). Mitochondrial transcription initiation. Variation and conservation. J. Biol Chem. 268: 16083–16086.

~ 115 ~

Shadel, G.S. (1999). Yeast as a model for human mtDNA replication. Am. J. Hum. Genet. 65: 1230.

Shaw L.M., Nunnari J. (2002). Mitochondrial dynamics and division in budding yeast. Trends Cell. Biol. 12: 178-184.

Shi Y., Dierckx A., Wanrooij P.H., Wanrooij S., Larsson N.G., Wilhelmsson L.M., Falkenberg M., Gustafsson C.M. (2012). Mammalian transcription factor A is a core component of the mitochondrial transcription machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:16510–16515.

Shutt T.E., Gray M.W. (2006). Bacteriophage origins of mitochondrial replication and transcription proteins. Trends Genet. 22: 90–95.

Shutt T.E., Lodeiro M.F., Cotney J., Cameron C.E., Shadel G.S. (2010). Core human mitochondrial transcription apparatus is a regulated two-component system in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:12133–12138.

Singh S., Kaur S., Goel N. (2015). A Review of Computational Intelligence Methods for Eukaryotic Promoter Prediction. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 34:7, 449-462.

Skrtic M., Sriskanthadevan S., Jhas B., Gebbia M., Wang X., Wang Z., Hurren R., Jitkova Y., Gronda M., Maclean N., Lai C.K., Eberhard Y., Bartoszko J., Spagnuolo P., Rutledge A.C., Datti A., Ketela T., Moffat J., Robinson B.H., Cameron J.H., Wrana J., Eaves C.J., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E., Humphries K., Nislow C., Giaever G., Schimmer A.D. (2011). Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer Cell 20: 674–688.

Sloan D.B., Alverson A.J., Chuckalovcak J.P., Wu M., McCauley D.E., Palmer J.D., Taylor D.R. (2012). Rapid evolution of enormous, multichromosomal genomes in flowering plant mitochondria with exceptionally high mutation rates. PLoS Biol 10: e1001241.

Smith D.R., Keeling P.J. (2015). Mitochondrial and plastid genome architecture: Reoccurring themes, but significant differences at the extremes. . Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 112: 10177- 10184.

Solovyev V.V., Shahmuradov I.A. (2003). PromH: Promoters identification using orthologous genomic sequences. Nucleic Acids Res. 31: 3540–3545.

Sosa-Gomez D.R., Humber R.A., Hodge K.T., Binnek E., Silva-Brandao K.L. (2009). Variability of the mitochondrial ssu rDNA of Nomurea species and other entomopathogenic fungi from Hypocreales. Mycopathologia. 167: 145-154.

~ 116 ~

Spatafora J.W., Sung G.H., Johnson D., Hesse C., O'Rourke B., Serdani M., Spotts R., Lutzoni F., Hofstetter V., Miadlikowska J., Reeb V., Gueidan C., Fraker E., Lumbsch T., Lücking R., Schmitt I., Hosaka K., Aptroot A., Roux C., Miller A.N., Geiser D.M., Hafellner J., Hestmark G., Arnold A.E., Büdel B., Rauhut A., Hewitt D., Untereiner W.A., Cole M.S., Scheidegger C., Schultz M., Sipman H., Schoch C.L. (2006). A five-gene phylogeny of Pezizomycotina. Mycologia 98: 1018–1028.

Sugimoto M., Koike M., Hiyama N., Nagao H. (2003). Genetic, morphological, and virulence characterization of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii. .J Invertebr. Pathol. 82: 176-187.

Surovtseva Y.V., Shutt T.E., Cotney J., Cimen H., Chen S.Y., Koc E.C., Shadel G.S. (2011). Mitochondrial ribosomal protein L12 selectively associates with human mitochondrial RNA polymerase to activate transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108: 17921–17926.

Taanman J.W. (1999). The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochim. Biophys. Acta. 1410: 103– 123.

Tabak H.F., Osinga K.A., De Vries E., Van der Bliek A.M., Van der Horst G.T.J., Groot Koerkamp M.J.A., Van der Horst G., Zwarthoff E.C., MacDonald M.E. (1983). Initiation of transcription of yeast mitochondrial DNA. In Nucleo-mitochondrial interactions (eds. R.J. Schweyen et al.), pp. 79–93. Walter de Gruyter, Berlin, Germany.

Takano H., Abe T., Sakurai R., Moriyama Y., Miyazawa Y., Nozaki H., Kawano S., Sasaki N., Kuroiwa T. (2001). The complete DNA sequence of the mitochondrial genome of Physarum polycephalum. Mol. Gen. Genet. 264: 539–545.

Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680.

Tiranti V., Savoia A., Forti F., D'Apolito M.F., Centra M., Rocchi M., Zeviani M. (1997). Identification of the gene encoding the human mitochondrial RNA polymerase (h-mtRPOL) by cyberscreening of the Expressed Sequence Tags database. Hum. Mol. Genet. 6: 615–625.

Tovar J. León-Avila G., Sánchez L.B., Sutak R., Tachezy J., van der Giezen M., Hernández M., Müller M., Lucocq J.M. (2003). Mitochondrial remnant organelles of Giardia function in iron- sulphur protein maturation. Nature 426: 172–176.

Tovar J., Fischer A., Clark C. G. (1999). The mitosome, a novel organelle related to mitochondria in the amitochondrial parasite Entamoeba histolytica. Mol. Microbiol. 32: 1013–1021.

~ 117 ~

Truscott K.N., Brander K., Pfanner N. (2003). Mechanisms of protein import into mitochondria. Curr. Biol. 13: 326-337.

Vincent R.D., Hofmann T.J., Zassenhaus H.P. (1988). Sequence and expression of NUC1, the gene encoding the mitochondrial nuclease in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 16: 3297–3312.

Wallace D.C. (1992). Mitochondrial genetics: a paradigm for aging and degenerative diseases. Science 256: 628-632.

Waller R.F., Jackson C.J. (2009). Dinoflagellate mitochondrial genomes: Stretching the rules of molecular biology. BioEssays 31: 237–245.

Wang Z., Cotney J., Shadel G.S. (2007). Human mitochondrial ribosomal protein MRPL12 interacts directly with mitochondrial RNA polymerase to modulate mitochondrial gene expression. J Biol Chem. 282: 12610–12618.

Watanabe K.I., Bessho Y., Kawasaki M., Hori H. (1999). Mitochondrial genes are found on minicircle DNA molecules in the mesozoan animal Dicyema. J. Mol. Biol. 286: 645-650.

Wenzlau J.M., Perlman P.S. (1990). Mobility of two optional G1C rich clusters of the var1 gene of yeast mitochondrial DNA. Genetics 126: 53–62.

Wettstein-Edwards J., Ticho B.S., Martin N.C., Najarian D., Getz G.S. (1986). In vitro transcription and promoter strength analysis of five mitochondrial tRNA promoters in yeast. J. Biol. Chem. 261:2905–2911.

Whittaker R.H. (1969). New concepts of kingdoms or organisms. Evolutionary relations are better represented by new classifications than by the traditional two kingdoms. Science 163: 150-160.

Wiesenberger G., Costanzo M.C., Fox T.D. (1995). Analysis of the Saccharomyces cerevisiae mitochondrial cox3 mRNA 5’ untranslated leader: Translational activation and mRNA processing. Mol. Cell. Biol. 15: 3291–3300.

Wiesenberger G., Fox T.D. (1997). Pet127p, a membrane-associated protein involved in stability and processing of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial RNAs. Mol. Cell. Biol. 17: 2816–2824.

William M., Müller M. (1998). The hydrogen hypothesis for the first eukaryote. Nature 392: 37-41.

~ 118 ~

Williams B. A., Hirt R. P., Lucocq J. M., Embley T. M. (2002). A mitochondrial remnant in the microsporidian Trachipleistophora hominis. Nature 418: 865–869.

Wise D.R., DeBerardinis R.J., Mancuso A., Sayed N., Zhang X.Y., Pfeiffer H.K., Nissim I., Daikhin E., Yudkoff M., McMahon S.B., Thompson C.B. (2008). Myc regulates a transcriptional program that stimulates mitochondrial glutaminolysis and leads to glutamine addiction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105: 18782–18787.

Wolff G., Kuck U. (1996). Transcript mapping and processing of mitochondrial RNA in the chlorophyte alga Prototheca wickerhamii.Plant Mol. Biol. 30: 577– 595.

Yanaka A., Zhang S., Tauchi M., Suzuki H., Shibahara T., Matsui H., Nakahara A., Tanaka N., Yamamoto M. (2005). Role of the nrf-2 gene in protection and repair of gastric mucosa against oxidative stress. Inflammopharmacology 13: 83–90.

Yokoyama K., Wang L., Miyaji M., Nishimura K. (2001). Identification, classification and phylogeny of the Aspergillus section Nigri inferred from mitochondrial cytochrome b gene. FEMS Microbiol. Lett. 200: 241-246.

Young M.J., Copeland W.C. (2016). Human mitochondrial DNA replication machinery and disease. Curr Opin Genet Dev 38: 52-62.

Zhang H., Gao P., Fukuda R., Kumar G., Krishnamachary B., Zeller K.I., Dang C.V., Semenza G.L. (2007). HIF-1 inhibits mitochondrial biogenesis and cellular respiration in VHL-deficient renal cell carcinoma by repression of C-MYC activity. Cancer Cell 11: 407–420.

Zhang J., Corden J.L. (1991). Identification of phosphorylation sites in the repetitive carboxyl-terminal domain of the mouse RNA polymerase II largest subunit. J. Biol. Chem. 266: 2290–2296.

Zimmerly S., Hausner G., Wu X.C. (2001). Phylogenetic relationships among group II intron ORFs. Nucleic Acids Res., 29: 1238-1250.

Zollo O., Tiranti V., Sondheimer N. (2012). Transcriptional requirements of the distal heavy- strand promoter of mtDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:6508–6512.

~ 119 ~

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Στο συνημμένο CD υπάρχουν τα ακόλουθα αρχεία/φάκελοι:

SD-3.1 Οι επαναλήψεις της διαγονιδιακής περιοχής στην ανιούσα θέση της cox1 στα mt γονιδιώματα των μυκήτων της Τάξης Hypocreales SD-3.2 Οι επαναλήψεις της διαγονιδιακής περιοχής στην ανιούσα θέση της cox1 στα mt γονιδιώματα των μυκήτων της Τάξης Saccharomycetales ST-3.1 Πίνακας αναφοράς όλων των γνωστών μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες (Ιούλιος 2016) ST-3.2 Πίνακας αναφοράς των αλλαγών στις επισημάνσεις των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους μύκητες που αναλύθηκαν σε αυτή την εργασία ST-3.3 Πίνακας με την καταγραφή όλων των διαγονιδιακών περιοχών που αναλύθηκαν (Οργανισμός-θέση-μήκος-διαγονιδιακή περιοχή) ST-3.4 Πίνακας αναφοράς των Ανοικτών Πλαισίων Ανάγνωσης που βρέθηκαν στις διαγονιδιακές περιοχές των υπό μελέτη μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων για τους μύκητες των Τάξεων Hypocreales και Saccharomycetales Alignments Φάκελος με τις στοιχίσεις των διαγονιδιακών περιοχών για τις τρεις περιοχές των έξι Τάξεων που μελετήθηκαν

~ 120 ~