Investigação De Mecanismos Genéticos E Epigenéticos Em Distúrbios Do Crescimento Humano
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ADRIANO BONALDI Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano Investigation of genetic and epigenetic mechanisms in human growth disorders Tese apresentada ao Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Biologia/Genética. São Paulo 2016 ADRIANO BONALDI Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano Investigation of genetic and epigenetic mechanisms in human growth disorders Tese apresentada ao Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Biologia/Genética. São Paulo 2016 Orientadora: Dra. Angela M. Vianna Morgante BONALDI, ADRIANO Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano 241 páginas Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva 1. Distúrbios de crescimento 2. Imprinting genômico 3. Alterações genéticas e epigenéticas Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética de Biologia Evolutiva Comissão Julgadora _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ Profa. Dra. Angela M. Vianna Morgante Orientadora Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (CEPID FAPESP - Centro de Estudos do Genoma Humano - Proc. 2009/00898-1 e 2013/08028-1). O aluno recebeu Bolsa de Doutorado [CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FAPESP Proc. 2011/12486-0]. Aos meus pais, Pedro e Lourdes À minha irmã, Fernanda Aos meus amigos Agradecimentos Ao Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, pela possibilidade de realização deste trabalho. À Dra. Angela M. Vianna Morgante, pela orientação neste projeto, por todos os ensinamentos ao longo desses anos, pela amizade e pela confiança em mim depositada. À Dra. Carla Rosenberg e à Dra. Ana Cristina Krepischi, pelos ensinamentos sobre aCGH earray de metilação, colaboração fundamental para este estudo. À Dra. Dirce Carraro, pela colaboração na parte do projeto desenvolvida no Centro Internacional de Pesquisa (CIPE), A.C. Camargo Cancer Center, e aos colegas, Giovana, Eloisa, Elisa, Cláudia e Felipe, pelos ensinamentos sobre PSQ. À Dra. Débora Bertola e à Dra. Chong Kim, ao Dr. Guilherme L. Yamamoto, e à da equipe médica do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo, pelo encaminhamento de pacientes e pela colaboração no desenvolvimento deste estudo. À colega Ana Carolina dos Santos Fonseca, pela colaboração ao realizar experimentos de FISH e MPS e pela amizade. Ao Dr. Paulo A. Otto, pelos ensinamentos clínicos. À Dra. Regina Célia Mingroni Netto, pela colaboração ao longo desses anos da pós- graduação. À Dra. Juliana Mazzeu, pelos primeiros ensinamentos. Ao Dr. Eduardo Gorab, Coordenador da Pós-Graduação, pelos recursos colocados à disposição dos pós-graduandos. À Dra. Simone A. S. da Fonseca, pela possibilidade de dar continuidade ao seu trabalho sobre pacientes com a síndrome de Silver-Russell. À Dra. Luciana Vasques, pela colaboração e amizade. Aos funcionários da Universidade de São Paulo, particularmente Maraísa Sebastião, Laurinda de Fátima Baptista, Maria Raimunda Pinheiro, Maria Teresa Auricchio, Paulo Rogério Camargo, Meire Aguena, e Silvia Souza Costa, pela ajuda, ensinamentos e amizade. Aos amigos do Laboratório de Genética Humana e laboratórios vizinhos, José, Rafaella, Jacaré, Lala, Clarisse, Leandro, Gustavo, Renan, Juliana, Rodrigo, Lilian, Dayane, Uirá, Ana Carla, Rezinha, Karina, Daniela, Tatiane, Francine, Darine, Érika, Érica, Talita, Larissa, Felipe, Dimitrius, pela amizade e momentos de descontração ao longo desses anos. Às famílias dos pacientes, pela colaboração. Aos meus amigos que me dão apoio fora do laboratório, em especial o Thales. À minha família: meus pais, Pedro e Lourdes, e minha irmã, Fernanda, pelo amor, apoio constante e por me terem dado confiança para seguir em frente e chegar até aqui. Índice Capítulo I. Introdução ............................................................................................................ 1 I.1 ASPECTOS GENÉTICOS E EPIGENÉTICOS DOS DISTÚRBIOS DO CRESCIMENTO EM HUMANOS ....... 2 I.1.1 Os distúrbios de crescimento em humanos ............................................................................ 2 I.1.2 A genética dos distúrbios de crescimento ............................................................................. 4 I.1.3 A regulação do crescimento fetal ............................................................................................ 5 I.1.4 O imprinting genômico e seu papel no crescimento fetal ....................................................... 7 I.1.5 A regulação do imprinting genômico .................................................................................... 11 I.1.6 Estabelecimento e manutenção do imprinting genômico ...................................................... 15 I.1.7 Manifestações clínicas decorrentes da perda do imprinting em humanos ............................ 18 I.1.8 As síndromes de imprinting .................................................................................................. 19 I.1.9 O imprinting genômico e a função cerebral ........................................................................... 26 I.1.10 O imprinting genômico e o câncer....................................................................................... 27 I.2 ESTE TRABALHO ......................................................................................................................... 28 I.2.1 Objetivos ............................................................................................................................ 28 I.2.2 Casuística............................................................................................................................. 29 I.2.3 Metodologia ....................................................................................................................... 30 I.2.3.1 Extração de DNA genômico e de RNA total ................................................................. 31 I.2.3.2 Síntese de cDNA a partir de RNA total ........................................................................ 33 Capítulo II. Investigação de alterações cromossômicas submicroscópicas em distúrbios do crescimento ........................................................................................................................... 34 II.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 35 II.1.1 Aplicação de técnicas de microarray na investigação das causas de doenças genéticas ...... 35 II.1.2 A utilização de microarray na investigação das causas de distúrbios de crescimento .......... 36 II.1.3 Interpretando a patogenicidade de CNV .............................................................................. 40 II.2 OBJETIVOS................................................................................................................................. 42 II.3 PACIENTES E MÉTODOS ............................................................................................................ 42 II.3.1 Pacientes ........................................................................................................................... 42 II.3.2 Métodos ............................................................................................................................ 42 II.3.2.1 Hibridação genômica comparativa em microarray .................................................... 42 II.3.2.2 Classificação das alterações cromossômicas submicroscópicas detectadas por aCGH 44 II.3.2.3 Validação das variantes raras de novo por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ... 47 II.3.2.4 Validação de translocação por hibridação fluorescente in situ (FISH) ......................... 47 II.3.2.5 Análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) ............ 48 II.3.2.6 Avaliação do padrão de inativação do cromossomo X ............................................... 48 II.3.2.7 Análise de exoma por sequenciamento de nova geração (NGS) ................................. 49 II.3.2.8 Preparação de biblioteca mate-pair e NGS (MPS, mate-pair sequencing) ................... 50 II.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................................... 52 II.4.1 Análise de alterações cromossômicas submicroscópicas detectadas por aCGH .................... 52 II.4.1.1 Variantes raras com efeito patogênico claro ............................................................ 56 II.4.1.2 Variantes raras provavelmente patogênicas ............................................................. 67 II.4.1.3 Variantes raras com efeito clínico desconhecido (VOUS) .......................................... 71 II.4.1.4 VOUS de novo não validade por qPCR ...................................................................... 93 II.4.1.5 Variantes raras provavelmente benignas ................................................................. 98 II.4.2 Análise de perda de heterozigose e dissomia uniparental