Criblage Phytochimique Et Etude Des Activites Anti-Oxydantes Des Plantes Medicinales Cambodgiennes Selectionnees

ROYAUME DU CAMBODGE NATION RELIGION ROI

UNIVERSITE DES SCIENCES DE LA SANTE FACULTE DE PHARMACIE

Année 2011 No 74

THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR EN PHARMACIE

CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE ET ETUDE DES ACTIVITES ANTI-OXYDANTES DES PLANTES MEDICINALES CAMBODGIENNES SELECTIONNEES

Présentée et soutenue publiquement le 3 septembre 2011 devant l’Université des Sciences de la Santé, Phnom Penh, Cambodge

par

CHANTHET Sokhadeva Née le 15 décembre 1986 à Phnom Penh

Jury de la thèse :

Madame TEP Rainsy Professeur Présidente

Madame NAM Nivanna Professeur Membre Monsieur BUN Hot Professeur Membre Monsieur KIM Sothea Docteur Directeur Monsieur CHENG Sun Kaing Professeur Co-directeur REMERCIEMENTS

Je tiens à exprimer toute ma profonde gratitude et mes sincères respects à Madame le Professeur TEP Rainsy, Doyenne de la Faculté de Pharmacie (Phnom Penh) qui m’a fait le très grand honneur d’accepter ma candidature pour la formation de D.E.S en Médicament à la Faculté de Pharmacie et d’accepter d’être Présidente du Jury de ma thèse avec beaucoup de gentillesse et de compréhension. Je suis heureuse de pouvoir vous exprimer ici ma profonde reconnaissance.

Je remercie Madame le Professeur NAM Nivanna, qui m’a fait l’honeur d’avoir bien voulu accepter de juger ce travail avec un point de vue correctif, judicieux, constructif et encourageant

J’adresse mes remerciements à Monsieur le Professeur BUN Hot, qui m’a fait l’honeur d’avoir bien voulu accepter de juger ce travail avec un point de vue correctif, judicieux, constructif et encourageant. Je tiens aussi à remercier Madame Sam Ying SOUN-BUN pour ses précieux conseils, ses constants encouragements, son humanisme et sa grande gentillesse.

J’exprime mes plus vifs remerciements, et ma reconnaissance toute particulière et gratitude, à Monsieur le Docteur KIM Sothea, enseignant de la Faculté de Pharmacie et responsable scientifique du Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF, pour accepter d’être directeur de ma thèse et pour l’aide précieuse et chaleureuse qu’il m’a offerte, sa grande disponibilité et ses qualités humaines. Il m'a guidé et conseillé tout au long de mes recherches grâce à ses compétences scientifiques.

Je ne remercierai jamais assez à Monsieur le Professeur CHENG Sun Kaing, Chef du département de Pharmacognosie de la Faculté de Pharmacie et co-directeur du Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF (Phnom Penh), d’accepter d’être co-directeur de ma thèse et de m’avoir accueillie au sein de son équipe avec la plus grande bienveillance pour mon travail de recherche. Il m’a aidé en toutes circonstances et fait profiter, tout au long de mon stage, de ses compétences, notamment dans le domaine passionnant de la botanique et de la pharmacognosie. Veuillez trouver dans ce travail le témoignage de ma reconnaissance, de mon admiration et de mon profond respect.

Je tiens aussi à témoigner mes plus vifs remerciements à Monsieur le Professeur YOUK Sophanna, Recteur de l’Université des Sciences de la Santé et à toute son équipe pour sa bienveillance et son impartialité.

Mes remerciements vont également à Monsieur le Professeur OUM Sophal, ex-Recteur de l’Université des Sciences de la Santé pour sa bienveillance et son impartialité.

Je tiens également à remercier Madame le Professeur TEA Sok Eng, ex-Doyenne de la Faculté de Pharmacie, pour m’avoir permis de suivre les formations en D.E.S du Médicament. Permettez-moi de vous exprimer ici mes profonds respects.

J’adresse également mes remerciements à Monsieur Pierre FABRE et Monsieur le Professeur Jean CROS, Professeur émérite de l’Université Paul Sabatier (Toulouse), ainsi qu’à la Fondation Pierre FABRE pour son soutien permanent au renouvellement des structures d’enseignement et de recherche de la Faculté de Pharmacie de Phnom Penh et pour sa générosité. En témoignage de ma profonde gratitude.

Je remercie très particulièrement Monsieur Mathieu LETI et Monsieur Philippe BESSIOUD, ex-chargé et chargé de Recherche, Cambodge et Asie du Sud-Est, pour m’avoir proposé ce sujet de stage interinstitutionnel. Je garderai en mémoire ses grandes qualités humaines, sa gentillesse, son soutien moral et technique, ses conseils, ses encouragements et son amitié tout au long de mon travail.

J’exprime vivement toute ma reconnaissance à Mademoiselle Natalia DROUART, ancienne V.I.E PIERRE FABRE-Médicaments, pour sa gentillesse, ses encouragements et son amitié au cours de ce travail.

Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Christophe LONG et Monsieur le Docteur Bruno DAVID pour leur gentillesse, leur soutien, leurs précieux conseils et l’aide qu’ils m’ont apportée. Je remercie beaucoup le Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF pour m’avoir accueillie.

J’adresse mes remerciements à tous mes professeurs, chefs de Département et enseignants cambodgiens de la Faculté de Pharmacie de Phnom Penh, pour leur gentillesse et leur qualité d’enseignement.

Mes remerciements vont également à tous mes professeurs de D.E.S. du Médicament de la Faculté de Pharmacie de Marseille, de Toulouse et de Phnom Penh.

J’adresse également une vive pensée à Mademoiselle YOU Vanny, Mademoiselle NIRADESAY Sengchanmany, Mademoiselle DEKHIL Myriam, Monsieur TOENG Phirom, Monsieur TY Vuthy, Monsieur CHUON Vibol qui ont contribué au bon déroulement de la vie de laboratoire et ont su instaurer une ambiance de travail chaleureuse et amicale.

J’adresse également mes remerciements à Mademoiselle NHIM Sovanvatey et Mademoiselle KHAY Mom avec qu’il est possible d’échanger de précieux conseils, opinions et suggestions. Ses conseils pertinents m’ont permis de mener à terme ce travail.

Je tiens à remercier tous mes camarades de 28ème promotion de pharmacie, mes camarades de D.E.S du médicament de 5ème, 6ème, 7ème, 8ème promotion pour les meilleurs souvenirs et les sincères sourires que je retiendrais dans mon cœur.

Je remercie également tous mes amis de l’Institut de Langues Etrangères (IFL), de lycée Preah Sisovath, de l’école primaire Preah Norodom, le tout puissant pour m’avoir donnée la force et la patience. Mes meilleurs souvenirs.

En guise de reconnaissance, je dédie encore avec émotion ce travail à mon cher père, Monsieur NHEP Chanthet et à ma chère mère, Madame EANG Sakhakhan, qui m’ont toujours donné le sourire dans les moments difficiles et décourageants, qui ont toujours su raviver en moi cette flamme de l’espoir. Sans eux, je ne serai jamais arrivée jusqu'à ce niveau d’études.

Mes remerciements vont également à mon cher frère, Monsieur CHANTHET Thanarat, sa femme, Madame HAK Chanthavy, et ses fils. Je tien aussi à remercier mon cher frère, Monsieur CHANTHET Thannarak. Veuillez trouver ici le témoignage des liens de fraternité durable, de mes remerciements et de ma profonde reconnaissance pour vos encouragements et votre amour.

III

នៅចំន ោះមុខនោករគូ អនករគូ របស់មហាវទិ ាល័យឱសថសាស្រសត និងបងបូអនរមួ វជ្ជិ ា ជីវៈ ទំងអស់ ខុំ្សូមសច្ចា ថា ៖ ១• នឹងនោរពជ្ជនិចា នូវរកមសីលធម៌ ឱសថ មិនគិតតតផលរបនោជន៍បុគគល កុនង ការរបកប វជ្ជិ ា ជីវៈឱសថ ។ ២• នឹងរបកបវជ្ជិ ា ជីវៈ នោយមនសិការ ន ើមបីសុខភាពសាធារណៈ នោយពុំនភលច

នសាោះនឡើយ នូវការទទួលខុសរតូវ និងភារកិចារបស់ខួលនចំន ោះអនកជំងឺ ។ ៣• នឹងមិនយកចំនណោះ ឹង និងតួនាទីរបស់ខួលន នៅបំផ្លល ញទំននៀមទម្លល ប់ ឬ នៅបងក ឧរកឹ ឋកមមណាមួយនឡើយ ។

៤• នឹងមិននបើកកកាយអាថ៌កំបំង ត លនគបនទុកចិតតរបប់ខុំ្ ឬ ត លខុំ្បន ឹង កុនងវជ្ជិ ា ជីវៈនៅរបប់នរណាម្លន ក់នទៀតនឡើយ ។ ៥• នឹងនោរព ឹងគុណ ល់ នោករគូ អនករគូ ត លបនខិតខំបង្ហា ត់បនរងៀនខុំ្ ។ សូម នោករគូ អនករគូ ម្លនកិតិតយសថ្ថលថាល និងនៅតតម្លនកិតិតនាមកុនងការបង្ហា ត់ បនរងៀន ។

៦• សូមឲ្យមនុសសជ្ជតិជួយោំរទខុំ្ នបើខុំ្នោរពតាមសនា ។ សូមឲ្យសហភារតៈ ទំងអស់ របម្លថម្លក់ង្ហយខុំ្ចុោះ នបើខុំ្មិននោរពតាមសនាននោះ ។

En présence des maîtres de cette Faculté et de mes chers condisciples, je promets et je jure : 1- D’être fidèle dans l’exercice de la pharmacie aux lois de l’honneur, de la probité et du désintéressement. 2- D’exercer ma profession avec conscience, dans l’intérêt de la Santé publique, sans jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et sa dignité humaine. 3- De ne jamais consentir à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels. 4- De ne dévoiler à personne les secrets qui m’auraient été confiés ou dont j’aurais eu connaissance dans l’exercice de ma profession. 5- Respectueux et reconnaissant envers mes maîtres, je jure d’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art et de rester digne de leurs enseignements. 6- Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses, que je sois méprisée de mes confrères si je manquais à mes engagements.

ABREVIATIONS

AcOEt : Acétate d’éthyle AcOH : Acétone bOH : Butanol CCM : Chromatographie sur Couche Mince DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

Et2O : Ether diéthylique KOH-Alc. : Hydroxyde de Potassium alcoolique MeOH : Méthanol Rdt : Rendement Rf : Rapport frontal USSC/IRPF : Université des Sciences de la Santé du Cambodge/Institut de Recherche Pierre Fabre UV : Ultra-violet λ : Longueur d’onde

GLOSSAIRE BOTANIQUE

Alterne : Feuilles attachées de part et d'autre de la tige, en des points différents Bractée : Petites feuilles accompagnant les fleurs Calice : Enveloppe extérieure de la fleur Corolle : Enveloppe interne de la fleur Cunéiforme : Tout organe en forme de coin ou en forme ondulaire Dichotomie : Scission du bourgeon terminal en deux parties Dicotylédone : Classe de végétaux supérieurs dont l'embryon possède deux cotylédons Dioïque : Plante dont les fleurs mâles et femelles se trouvent sur des individus- différents Elliptique : Forme d'ellipse ou dit d’ovale à grands côtés presque rectilignes et parallèles Embrassement : Division du tronc d'un arbre en branche Epiphyte : Qui croît sur d'autres plantes sans en tirer sa nourriture (opposé à parasite) Etamine : Organe mâle des fleurs Foliole : Chacune des petites feuilles qui forment une feuille composée Glabre : Sans poils Inflorescence : Ensemble de fleurs Limbe : Partie élargie d'une feuille ou d'un pétale Monoïque : Plante dont les fleurs mâles et les fleurs femelles se trouvent sur le même pied Nervure : Prolongement à travers les limbes des vaisseaux conducteurs de sève provenant de la tige Pédicelle : Ramification d'un pédoncule reliant chaque fleur à l'axe commun de l'inflorescence Pédoncule : Petite ramification d'une tige se terminant par une fleur Périanthe : Ensemble du calice et de la corolle Pétale : Elément de la corolle, seconde enveloppe florale Pétiole : Queue de la feuille, insérée sur la tige Pistil : Se dit d'une fleur qui ne possède que les organes femelles Sépale : Chaque foliole du calice d'une fleur Stigmate : Partie supérieure du pistil qui reçoit les grains de pollen Stipule : Pièce située au niveau de l'insertion des feuilles sur un rameau

TABLE DES MATIERES

I. INTRODUCTION ...... 1 II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 2 2.1- Alcaloïdes ...... 2 2.2- Stéroïdes et terpènoïdes ...... 3

2.2.1- Triterpènes (C30H48) ...... 3 2.2.2- Saponosides ...... 4 2.2.3- Caroténoïdes ...... 5 2.2.4- Huiles essentielles ...... 6 2.3- Composés phénoliques ...... 6 2.3.1- Flavonoïdes ...... 8 2.3.2- Anthocyanes ...... 8 2.3.3- Anthraquinones ...... 9 2.3.4- Tanins ...... 10 2.3.5- Coumarines ...... 11 2.4- Peptides et acides aminés...... 13 2.5- Composés réducteurs ...... 14 III. MATERIELS ET METHODES ...... 16 3.1- Matériels et Solvants ...... 16 3.2- Méthodes...... 20 3.2.1- Préparation des extraits bruts...... 20 3.2.2- Criblage phytochimique ...... 22 3.2.3- Test d’anti-oxydant ...... 38 IV. RESULTATS ...... 47 4.1- Préparation des extraits bruts ...... 47 4.2- Etudes phytochimiques ...... 53 V. DISCUSSION ...... 87 VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...... 88 VII. REFERENCES ...... 89 VIII. ANNEXES ...... 97

VII

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Différents groupes de composés phénoliques ...... 7 Tableau 2 : Liste des plantes collectées...... 18 Tableau 3 : Tableau des extraits sélectionnés pour le test d'anti-oxydants...... 40 Tableau 4 : Tableau de dilution de l'échantillon pour le premier screening...... 45 Tableau 5 : Tableau de différente gamme de concentration de chaque extrait...... 45 Tableau 6 : Rendement des extractions éthérées, méthanoliques et aqueuses pour l’ensemble des parties de plantes étudiées...... 48

VIII

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Exemple de structures alcaloïdiques...... 2 Figure 2 : Exemples de structures triterpèniques ...... 3 Figure 3 : Structure de l’acide betulinique...... 4 Figure 4 : Exemple de saponosides...... 4 Figure 5 : Exemple de structure de caroténoïdes...... 5 Figure 6 : Structure de Xanthophylles isolés du piment rouge...... 5 Figure 7 : Exemples de monoterpènes rencontrés dans les huiles essentielles...... 6 Figure 8 : Structure de flavonols...... 8 Figure 9 : Structure de base des anthocyanes...... 9 Figure 10 : Interconversion des dérivés anthracéniques...... 9 Figure 11 : Exemple de composés anthraquinones...... 10 Figure 12 : Exemples de tanins...... 11 Figure 13 : Structures de tanins isolés à partir de Terminalia arjuna et Phyllanthus amarus. . 11 Figure 14 : Formation de la Benzopyrone à partir de l’acide cinnamique...... 12 Figure 15 : Structures des coumarines isolées des plantes...... 13 Figure 16 : Structure de quelques acides aminés...... 14 Figure 17 : Structures des flavonoïdes trouvés dans la graine de Theobroma...... 15 Figure 18 : Lieux de récolte des échantillons étudiés...... 17 Figure 19 : Schéma successif sous reflux des trois extractions...... 21 Figure 20 : CCM d'huile essentielle...... 23 Figure 21 : CCM d'alcaloïde...... 24 Figure 22 : Réaction positive de tanins par réaction de précipitation à la gélatine en présence de sel...... 25 Figure 23 : Réaction positive de composés réducteurs par réaction de Fehling...... 26 Figure 24 : Réaction positive et CCM de saponine pulvérisée par vanilline sulfurique...... 27 Figure 25 : Réaction positive de peptide...... 27 Figure 26 : Réaction positive de l'amidon au réactif de Lugol...... 28 Figure 27 : Réaction positive de polysaccharides...... 29

Figure 28 : Extraction liquide/liquide de l'extrait éthéré après saponification (20 mL d'H2O /

15 mL, 10 mL, 10 mL d'Et2O)...... 30 Figure 29 : CCM de caroténoïde...... 31 Figure 30 : Acidification de la phase aqueuse saponifiable par HCl 1 N...... 32 Figure 31 : CCM de coumarine...... 34

Figure 32 : Réaction positive de C-glycosides...... 35 Figure 33 : CCM d'anthraquinone...... 35 Figure 34 : CCM de flavonoïde...... 37 Figure 35 : Réaction positive d'anthocyane ...... 38 Figure 36 : Figure de plaque CCM révélée par DPPH...... 39

Figure 37 : Exemple de détermination de CI50 d'un extrait...... 46 Figure 38 : Photo d’Aganosma marginata (Roxb.) D.J.Middleton...... 54 Figure 39 : Photo d'Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire...... 56 Figure 40 : Photo d’ Amalocalyx microlobus Pierre ex Spire...... 57 Figure 41 : Photo de Chonemorpha fragrans (Moon) Alston...... 59 Figure 42 : Photo de Chonemorpha macrantha Pit...... 60 Figure 43 : Photo de Dischidia imbricata (Bl.) Steud...... 61 Figure 44 : Photo d’ Epigynum griffithianum Wight...... 62 Figure 45 : Photo de Holarrhena curtisii King & Gamble...... 63 Figure 46 : Photo de Parameria laevigata (Juss.) Mold...... 64 Figure 47 : Photo de Spirolobium cambodianum Baill...... 66 Figure 48 : Photo de Willughbeia edulis Roxb...... 68 Figure 49 : Photo de Wrightia pubescens R.Br...... 70 Figure 50 : Photo de Dischidia hirsuta (Bl.) Decne...... 71 Figure 51 : Photo de Dischidia major (Vahl) Merr...... 72 Figure 52 : Photo de Dischidia nummularia R. Br...... 73 Figure 53 : Photo de Hoya kerrii Craib...... 74 Figure 54 : Photo de Tylophora asthmatica (L.f) Wight & Arn...... 75 Figure 55 : Photo de Atalantia citroides Pierre ex. Engl. & Prantl...... 76 Figure 56 : Photo de Feroniella lucida Swingle...... 77 Figure 57 : Photo de Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC...... 78 Figure 58 : Photo de Limonia acidissima L...... 80 Figure 59 : Photo de Micromelum falcatum (Lour.) Tanaka...... 81 Figure 60 : Photo de Micromelum minutum (Forst.) Wt. & Arn...... 82 Figure 61 : Photo de Zanthoxylum rhetsa DC...... 83 Figure 62 : Photo de Sonneratia alba Sm...... 84 Figure 63 : Photo de Sonneratia ovata Backer...... 86

LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Protocole des différents tests pratiqués...... 97 Annexe 2 : Réactifs mis en jeu dans chaque réaction...... 98 Annexe 3 : Résultats bruts du test screening phytochimique...... 103 Annexe 4 : Ensemble des résultats du test anti-oxydant et du criblage phytochimique...... 109 Annexe 5 : Confirmations du test screening phytochimique par CCM...... 116

RESUME

Le Cambodge possède une diversité végétale parmi les plus riches du monde et aujourd’hui encore, beaucoup de Cambodgiens puisent dans leur environnement proche où les plantes jouent un rôle alimentaire, utilitaire, mais également médicinal. Pour autant, les plantes utilisées pour leurs vertus curatives n’ont pas toujours fait l’objet d’études scientifiques. Une étude bibliographique a permis de sélectionner dans l’échantillothèque du Laboratoire Commun de Phytochimie de 26 espèces de plantes dont la composition chimique n’a pour l’heure pas ou très peu été étudiée. Ces espèces sont réparties dans 4 familles (Apocynaceae, Rutaceae, Asclepiadaceae, Sonneratiaceae). Notre étude consiste à réaliser le screening phytochimique de 132 extraits (Et2O, MeOH, et H2O) issue de ces 26 espèces afin de déterminer les grands groupes chimiques présents. Nous trouvons que les huiles essentielles, les alcaloïdes, les saponines, les C-glycosides, les composés réducteurs, les stérols, les tanins, les flavonoïdes, les caroténoïdes sont les groupes chimiques les plus présentés. De plus, une étude de l’activité anti-oxydante sur nos plantes a été menée et basée sur CCM et test anti- oxydants DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Sept plantes parmi les 13 (15 des extraits méthanoliques) possèdent le pouvoir anti-oxydant le plus important et intéressant dont leur

CI50 varie entre 7,64 µg/mL et 118,9 µg/mL.

Mots-clés : Screening phytochimique; Groupes chimiques; Plantes cambodgiennes; Extraits; Activité anti-oxydante; DPPH.

XII

I. INTRODUCTION

Les plantes constituent une ressource naturelle précieuse offrant de nombreux avantages à l’homme. Elles peuvent jouer un rôle alimentaire, utilitaire mais également curatif. On peut citer parmi les exemples les plus connus la morphine, la quinine, ou encore l’éphédrine, etc. Parmi des milliers de plantes disponibles dans le monde entier, seul un faible nombre (environ 10 - 15 %) a été scientifiquement étudié et analysé1 sur leurs composés biologiquement actifs. Le potentiel chimique restant à découvrir est donc d’une grande richesse. Aujourd’hui, plus de la moitié des médicaments commercialisés ont une origine naturelle. La diversité des structures chimiques d’origine végétale et des activités pharmacologiques associées est largement reconnue par les grands groupes pharmaceutiques.

Pour autant, les extraits végétaux sont des mélanges complexes de composés chimiques très divers. L’analyse de tels extraits est donc difficile et nécessite la mise au point de méthodes de séparation des grands groupes chimiques présents (alcaloïdes, terpènes, polyphénols, etc.).

L’objectif de notre travail est donc de réaliser le Screening phytochimique de 132 extraits issus de 26 espèces de plantes collectées au Cambodge et n’ayant pour l’heure pas fait l’objet d’études phytochimiques. Cette étude permettra d’identifier les grands groupes chimiques présents dans chaque extrait et ainsi de préciser la nature de l’éventuelle activité pharmacologique associée.

Ce travail est divisé en 2 parties :

 En premier lieu, l’étude bibliographique des principales familles chimiques couramment rencontrées dans les plantes telles que les alcaloïdes, les stéroïdes et terpènes (triterpènes, saponosides, caroténoïdes, huiles essentielles), les composés phénoliques (flavonoïdes, anthocyanes, anthraquinones, tanins, coumarines), les acides aminés et peptides ainsi que les composés réducteurs.  L’étude phytochimique de 26 plantes et l’évaluation de leur activité anti-oxydante constituent la deuxième partie de notre travail.

II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

2.1- Alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des molécules organiques hétérocycliques azotées d'origine naturelle possédant des activités pharmacologiques à faible dose, mais pouvant être toxique à forte dose comme la Strychnine ou la Conitine2. On retrouve des alcaloïdes, en tant que métabolites secondaires, principalement dans les végétaux, les champignons et chez quelques groupes d’animaux. Habituellement, les alcaloïdes sont des dérivés des acides aminés. Ils ont la propriété de former des sels et des bases2. La classification des alcaloïdes se fait en fonction de leur structure chimique3 (Figure 1).

Les alcaloïdes possèdent diverses activités pharmacologiques parmi lesquelles des propriétés analgésique (morphine), stimulante (strychnine et caféine), antispasmodique (atropine), antipaludique (quinine), antigoutteuse (Colchicine), et anticancéreuse (les vinca-alcaloïdes : vinblastine et vincristine)2.

CH CH CH3 O 2 H CH3O N N CH3 OH H CH O H C* N H 3 CH3O CH3O O N HO O OCH3 OH Morphine Colchicine Quinine OH N CH2 CH3 N - CH3 O CH3 N H3C N COOCH OH H 3 N N H CH - CH H 2 3 O O N N CH3O N H OCOCH3 R OHCOOCH3 O CH3 R = - CHO Vincristine Atropine Caféine R = - CH3 Vinblastine

Figure 1 : Exemple de structures alcaloïdiques2.

2.2- Stéroïdes et terpènoïdes

Élaborés à partir des mêmes précurseurs, les stéroïdes et les terpènoïdes constituent le plus vaste ensemble connu de métabolites secondaires des végétaux. Tous les stéroïdes et les terpènes sont formés par l’assemblage unités pentacarbonées et construits à partir de l’unité 2 isoprénique (C5H8) . En fonction du nombre d’atome de carbone, les terpènes sont classifiés comme monoterpènes, sesquiterpènes, diterpènes, et triterpènes4. Chaque terpénoïde résulte de la condensation d’un nombre variable d’unités isoprènes (condensation tête-à-queue)5, 2. De plus, par leurs propriétés aromatiques, les plantes riches en terpènoïdes sont souvent utilisées dans les remèdes en médicine traditionnelle et font l’objet de recherche pour leurs effets antibactériens, antinéoplasiques et autre effets pharmacologiques6.

2.2.1- Triterpènes (C30H48)

Les triterpènes, connus pour leur goût amer, sont des composés en C30 constitués de six unités isoprènes et issue de la cyclisation du squalène ou de ses dérivés2, 7 (Figure 2). Ces substances sont biochimiquement complexes et beaucoup d’entre elles présentent des propriétés pharmacologiques intéressantes telles que antivirales (VIH et Herpes), antipaludiques, hépatoprotectrices, anti-inflammatoires, et anticancéreux7.

24 21 22 27 20 25 12 23 13 17 26 19 11 18 1 14 16 9 O 2 8 15 10 H 30 3 4 7 5 6

Triterpène pentacyclique Triterpène tétracyclique Stéroïde

Figure 2 : Exemples de structures triterpèniques2, 6 .

Prenons comme exemple, l’acide Betulinique (Figure 3) il s’agit d’un composé pentacyclique triterpenoïde possédant des propriétés antirétrovirales, antipaludiques, anti-inflammatoires et anticancéreuses par inhibition de la topoisomérase6.

OH H

O H HO

Figure 3 : Structure de l’acide betulinique2.

2.2.2- Saponosides

Les saponosides (glycosides de saponine) sont des hétérocycliques complexes, appartenant aux terpènes cycliques ou aux stéroïdes. Ils sont présents dans de nombreux végétaux sous forme d’hétérosides (saponosides comportant 2 parties : glycone (sucre) et aglycone ou génine) comme la Salsepareille, la Saponaire, le Quinoa, etc. En effet, les saponosides sont classifiés en 3 catégories qui sont les saponosides triterpéniques, les saponosides stéroïdiques, et les saponosides stéroïdiques alcaloïdiques. Grâce à la multiplicité structurale des glycones et aglycones (Figure 4), les saponosides présentent une grande variété structurelle ainsi que ses caractères biologiques. Ils sont aussi caractérisés par leurs propriétés tensio-actives : ils se dissolvent dans l’eau en formant des solutions mousseuses2, 7.

H OH O O

O O H ß-D-Glu HO

HO H O OH H ß-D-Glu

Agigenin (saponine stéroïde d’aglycon) Sarsasapogenine bidesmoside (structure glycone)

Figure 4 : Exemple de saponosides7.

Les saponosides sont généralement hémolytiques en agissant sur la membrane érythrocytaire par augmentation de la perméabilité membranaire et du mouvement des ions, entrainant la fuite de l’hémoglobine4. Les diverses activités pharmacologiques des saponosides sont : cytotoxiques, anti-tumorales, anti-mutagéniques, anti-inflammatoires, antivirales2, 4 et anthel- minthiques4.

2.2.3- Caroténoïdes

Les caroténoïdes sont des pigments oranges ou jaunes, liposolubles, très répandus dans les végétaux8. Ils appartiennent à la famille chimique des terpénoïdes, sont formés à partir de huit unités isopréniques (molécules tétraterpénique)2. Dans les végétaux, ce sont des pigments nécessaires pour la photosynthèse, qui jouent deux rôles importants : collecteur de la lumière et photoprotecteur (récupération de l’énergie de la chlorophylle)8. On remarque que la molécule est un hydrocarbure, on dit Carotène, ou Xanthophylle lorsqu’elle porte des fonctions hydroxyles (Figure 5)8.

Alpha- carotène Beta- carotène

Figure 5 : Exemple de structure de caroténoïdes9.

Les caroténoïdes sont des provitamines A, substances indispensables pour la nutrition et la santé. Certains groupes de caroténoïdes tels que la Lutéine, la Zeaxanthine, et Capsenthine présentent également des activités anti-tumorales et anti-oxydantes4 (Figure 6). Le Lycopène, caroténoïde isolé à partir des tomates mûres peut réduire le risque d'artério-sclérose et les maladies du cœur ainsi que le risque de certains cancers comme le cancer de la prostate, du poumon, de la vessie, du col de l'utérus, de la peau et de l'appareil digestif. Par ailleurs, certains d’entre eux sont utilisés dans l’industrie agro-alimentaire et cosmétique pour leur propriété colorantes2, 4, 9.

OH OH O

HO HO

Lutéine Violaxanthine

OH OH O

Zeaxantine OH Capsanthine

Figure 6 : Structure de Xanthophylles isolés du piment rouge8.

2.2.4- Huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des essences volatiles extraites à partir des plantes aromatiques. Elles sont constituées de complexes composés appartenant à 2 groupes : des terpénoïdes et des composés aromatiques dérivant de phénylpropane2 (Figure 7). Elles sont très utilisées dans l’aromathérapie et ont depuis toujours été très prisées en médicine traditionnelle. Elles sont encore largement utilisées actuellement pour diverses propriétés telles que leurs propriétés antiseptiques (thym, girofle, lavande, et eucalyptus), antispasmodiques et sédatives (menthe, verveine, etc). Elles sont souvent irritantes et sont utilisés par voie externe sous forme de gels, de crèmes et de pommades2, 4, 7

OH OH

Terpinen 4-ol Thymol

Figure 7 : Exemples de monoterpènes rencontrés dans les huiles essentielles2.

2.3- Composés phénoliques

Les composés phénoliques sont constitués d’au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groups hydroxyle (C-OH), libre ou engagement dans une autre fonction (éther, ester, hétéroside)8. Il existe différentes classes de composés phénoliques présents dans la nature (Tableau 1).

Tableau 1 : Différents groupes de composés phénoliques2, 10 .

Squelette Classe Exemple Structure Origine carboné

C6 Phénols simples Hydroquinone HO OH Busserole

O Acides Acide C6-C1 Epices, fraises hydroxybenzoïques p-hydroxybenzoïque HO OH

Acides Acide HO O Tomates, aïl hydroxycinnamiques p-coumarique C6-C3 OH

Carottes, Coumarines Ombelliférone coriander HO O O O

C6-C4 Naphtoquinones Juglone Noix

OH O

HO C6-C2-C6 Stilbénoïdes Trans-resvératrol Raisin

HO O Flavonoïdes Kaempférol Fraises

OH O

HO O C6-C3-C6 Isoflavonoïdes Daidzéine Graines de soja

O OH

OH cépage HO O Anthocyanes Delphinidol OH Cabarnet- Sauvignon

OH OH OH HO OH Bactéries (C6-C3) Lignanes Entérodiol 2 intestinales

(C6-C3- Tanins condenses Procyanidol / Raisins, kaki C6)n

2.3.1- Flavonoïdes

Les flavonoïdes, pigments responsable de coloration des fleurs, des fruits, parfois des feuilles et souvent rencontrés dans les algues, sont des métabolites secondaires regroupés selon leur structure phénylbenzopyrone et normalement contiennent un groupe carbonyle. Ils sont construits à partir d’un squelette de base à 15 atomes de carbone (Figure 8). En outre, tous les flavonoïdes ont une origine commune de biosynthèse et possèdent donc le même élément structurel de base, le squelette 2-phenylchromane. Ils se répartissent en une dizaine de classes en fonction du degré d'oxydation du noyau pyranique central (peut être ouvert et recyclisé en un motif furanique) tels que 2-phénylbenzopyriliums (anthocyanines), 2-phénylchromones (flavones, flavonols et ses dimères), 2-phénylchromanes (flavanes, flavan-3-ols, flavan-3,4- diols), chalcones, dihydrochalcones (le cycle pyranique est ouvert), 2-benzylidene coumaranones (aurones)2. De plus, les flavonoïdes sont très reconnus pour leur activité anti- oxydante et antivirales2, 4, 7. Ainsi nous pouvons citer comme exemple la catéchine (+) retrouvée dans le thé vert (anti-oxydant), la catéchine (–) isolée à partir de Begonia nantoensis (inhibition de la réplication de VIH)4, la baicaline isolée à partir de Scutellaria baicalensis de chine (anti-inflammatoire et inhibition de la réplication de VIH 1). En effet, une trentaine de types de flavonoïdes ont été identifiés dans la famille des Asteraceae2. Cependant, ils sont communs dans la famille Lamiaceae, Rutaceae, et Asteraceae. En outre, les flavonoïdes sont initialement connus pour leur propriétés vasculoprotectrices et veinotoniques en réduisant la perméabilité des vaisseaux sanguins et en augmentant leur résistance. Ils sont également utilisés pour traiter les crises hémorroïdaires, la sensation de jambes lourdes et la fragilité capillaire (pétéchies)2.

OH O

OH O Figure 8 : Structure de flavonols2.

2.3.2- Anthocyanes

Les anthocyanes appartiennent au groupe des flavonoïdes, ce sont des pigments naturels hydrosolubles responsables de la coloration rouge, rose, mauve, pourpre, bleue ou violette de la plupart des fleurs et des fruits. Ces pigments hétérosides existent sous 2 formes : les

8 anthocyanosides et leurs génines (les anthocyanidols). Ils sont présents dans un certain nombre de végétaux tels que myrtille, raisin noir, aubergine, prune, bleu et mauve, etc2, 8. Un noyau «flavine» normalement glycolysé en C3 peut être considéré comme la structure de base des anthocyanes (Figure 9). Ils se différencient par leur degré d’hydroxylation et de méthylation, ainsi que la nature, le nombre et la position des oses. En outre, l’aglycone des anthocyanes, qui est aussi le chromophore, est appelé anthocyanidine. Comme les flavonoïdes, les anthocyanes jouent un rôle important dans la perméabilité des tissus capillaires et augmentent leur résistance. D’autres activités ont été trouvées étant anti- œdémateuse, anti-oxydantes. Récemment, les anthocyanes sont utilisés en ophtalmologie pour l’amélioration de la vision crépusculaire (Ex : Vaccinium myrtillus)11.

3' OH

B HO OH+ 5' R2 A

OR OH Figure 9 : Structure de base des anthocyanes2.

2.3.3- Anthraquinones

Les anthraquinones ou 9,10-dioxoanthracène sont des composés organiques dérivés des anthracènes 12. Ils sont semi-hydrosolubles et solubles dans plusieurs solvants organiques comme l’alcool, nitrobenzène et aniline. Les anthraquinones peuvent être présentes dans les plantes sous forme de glycone et d’aglycone13. Elles sont des hydrocarbures polycycliques à deux fonctions carbonyles (C=O) en position 9 et 1014 (Figure 10).

O OH O Oxydation

Anthranol Anthrone Anthraquinone

Figure 10 : Interconversion des dérivés anthracéniques2.

Les anthraquinones sont très connues pour leur activité laxative ou purgative plus ou moins violente2, 13. On trouve le danthron (1,8 dihydroxyanthraquinone) isolé à partir d’Aloe vera pour ses propriétés laxatives, anti-oxydantes, anti-tumorales et fongicides15, le chrysophanol isolé à partir de la racine de Rheum rhabarbarum et Rheum palmatum pour ses propriétés

9 laxatives, antivirales, bactéricides, anti-inflamatoires, anti-tumorales (du sein) et cytotoxique, l’hypéricine isolé à partir d’Hypericum perforatum pour son activité antivirale , l’actinorhodine pour son activité anti-bactérienne16 (Figure 11).

O H OH O OH O O

H O O

O O H O OH Chrysosplenol C Danthron

OH O OH O OH

OH OH O OH O O O OH

OH O OH O OH Actinorhodine Hypericine

Figure 11 : Exemple de composés anthraquinones4, 15, 16.

2.3.4- Tanins

Historiquement, l’importance des drogues à tanins est liée à leurs propriétés tannantes, c'est-à- dire à la propriété qu’ils ont de transformer la peau fraiche en cuir. Alors, les tanins se définissent comme des composés polyphénoliques hydrosolubles ayant une masse moléculaire compris entre 500 et 3000 et qui présentent la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine, et d’autres protéines2. Les tanins sont habituellement divisés en tannins hydrolysables (acide gallique et ellagique) et les tanins condensés (proanthocyanidines)2. Leur structure chimique est très variable, mais comporte toujours une partie polyphénolique2 (Figure 12). Ils sont obtenus à partir de différentes parties de plantes appartenant à de multiples espèces4 comme acacia (Acacia sp.), chêne (Quercus sp.), eucalyptus (Eucalyptus sp.), bouleaux (Betula sp.), saule (Salix caprea), pin (Pinus sp.), quebracho (Scinopsis balansae)17. Le théier (Camellia sinensis) ayant une haute teneur en tanin qui caractérise par une saveur astringente. Ils se trouvent principalement dans l'écorce des arbres, le bois, les fruits, les feuilles et les racines des plantes et ainsi que dans la galle. Les tanins sont utilisés pour leurs propriétés anti-diarrhéiques, antiseptiques (antibactériennes et antifongiques), antivirales et anti-inflammatoires2, 17. En outre, ils peuvent être efficaces pour protéger les 10 reins et sont utilisés en cas de maux de gorge, de dysenterie, de fatigue, d’ulcère de la peau et en tant que cicatrisant sur des blessures infectées2. Par ailleurs, les tannins peuvent réduire la taille des tumeurs déjà présentes dans les tissus, mais si l’utilisation prolongée est excessive, ils peuvent provoquer l'apparition de tumeurs dans les tissus sains4. Particulièrement, le gallotanin geraniin isolé à partir de Phyllanthus amarus possède l’activité inhibitrice de la réplication HIV1 tandis que le causuarictin obtenu de Terminalia arjuna est virucide et inhibe la pénétration de HSV-24 (Figure 13). Les tanins possèdent également des propriétés anti- oxydantes18.

OH O HO O HO O OH HO OH

OH O OH OH O Tanins condensés Acide ellagique

CO2H

HO OH HO OH OH OH Catéchol Acide gallique

Figure 12 : Exemples de tanins2.

G G O O G G O O G O O O G O O G G O

Casuarictin O O

G G Geraniin

Figure 13 : Structures de tanins isolés à partir de Terminalia arjuna et Phyllanthus amarus19.

2.3.5- Coumarines

Les coumarines tiennent leur nom «coumarou», nom vernaculaire de la fève tonka2 d’où fut isolée, en 1820, la coumarine. Elles sont présentes dans plusieurs plantes comme la lavande, la réglisse, la fraise, l’abricot, la cannelle, le trèfle, etc 20 , 21 . Les coumarines sont des

11 benzopyrones (2H-1-Benzopyran-2-one)21 biosynthétisées par hydroxylation, glycolyse, cyclisation de l’acide cinnamique20 (Figure 14).

Les coumarines possèdent diverses activités pharmacologiques parmi lesquelles des activités antimutagènes2, 4, 21 (umbelliferone, imperatorin), anticarcinogène,veinotonique et vasculoprotectrices (esculine)2, photosensibilisatrices (furanocoumarins), vasodilatatrices des coronaires (visnadin), anti- œdémateuses, anticoagulantes et cytotoxiques (Figure 15).

COOH COOH

(a) OH Acide cinnamique Acide O-Coumarique

(b)

COOH (c)

COOH O -Glucose O -Glucose Acide O-Coumarique ß-D-glucose

5 4 (d) 6 3 2 7 O 8 1 Benzo-2-pyron (Coumarine)

22 Figure 14 : Formation de la Benzopyrone à partir de l’acide cinnamique .

(a) : Ortho-hydroxylation, (b) : Glucolisation de l’hydroxyle, (c) : Tran-cis l’isomérisation de la double liaison, (d) : Lactonisation.

O O O O HO O O

Umbelliferone Imperatorin

Glc O O O O

HO O O OCOCH3

OCOCH(CH3)CH2CH3 Aesculin Visnadin

Figure 15 : Structures des coumarines isolées des plantes2, 4.

2.4- Peptides et acides aminés

En principe, le terme "acide aminé" se réfère à tout composé contenant une amine (NH2) et une fonction carboxyle (COOH) comme groupes fonctionnels8 (Figure 16). Plus de 100 acides aminés ont été isolés et identifiés, mais seulement 25 sont obtenus par l'hydrolyse des protéines. Les acides aminés sont classés en deux groupes : les acides aminés essentiels et acides aminés non essentiels. Les peptides sont des protéines de faible poids moléculaire formées par association de deux ou plusieurs acides aminés. L’étude des peptides isolés à partir de plantes est limitée. Ces peptides sont néanmoins connus pour leurs activités antivirales et antimicrobiennes. Ils sont également utilisés dans la science nutritionnelle, l’industrie agroalimentaire23.

NH2

H O H O O H H O H H H N N N N H H H OH H OH H H OH

Peptide O O os

NH2 OH O COOH N NH2 H

L-citrulline Acide L-pyroglutamique

8 Figure 16 : Structure de quelques acides aminés .

2.5- Composés réducteurs

Les composés réducteurs sont connus sous le nom de composés anti-oxydants. Les anti- oxydants se retrouvent dans plusieurs aliments comme le vin, les fruits, l’olive, le cacao, le miel, certains légumes, le thé vert, les céréales et les suppléments diététiques (Vitamines E, C, ou A). Les polyphénols, et plus particulièrement les flavonoïdes constituent la famille chimique la plus connue pour ses propriétés anti-oxydantes. Les flavonoïdes comprennent les anthocyanines, les flavonols, les flavanones, les proanthocyanidines et les isoflavones. Certains tanins et carotènoïdes possèdent également des propriétés anti-oxydantes24 (Figure 17).

Les anti-oxydants jouent un rôle important dans la prévention de l’oxydation cellulaire. Ils sont utilisés pour lutter contre diverses maladies comme le cancer, les pathologies cardiovasculaires, les arthrites, le vieillissement. Il existe de nombreux anti-oxydants avec différents mécanismes d'action9.

OH OH OH O OH OH O OH OH OH OH OH

OH OH O OH

OH OH

Epicatéchine Procyanidine dimer B2

25 Figure 17 : Structures des flavonoïdes trouvés dans la graine de Theobroma .

III. MATERIELS ET METHODES

3.1- Matériels et Solvants 3.1.1- Matériels 3.1.1.1- Matériel de laboratoires

 Agitateur magnétique, Fisher®, allemagne  Ballons en verre (PYREX®) de 500 mL  Béchers en verre de 100 mL, 250 mL  Cuve pour révélation CCM  Entonnoirs en verre  Eprouvettes graduées en verre de 5 mL, 10 mL, 25 mL et 100 mL  Erlen meyers de 200 mL  Filtre de 0,2 μm, Acrodisc® Life Sciences, lot : TP-00760661PQ ®  Genevac, pompe à vide GENEVAC® CV 100, avec Condensateur GENEVAC HT-4  Lampe UV pour révélation CCM, Camag®, REPROSTAR3 (254 et 366nm) lot : 121202, Suisse  Lyophilisateur, LABCONCO  Papier d’aluminium (7,62m x 45,7 cm), Diamond®, USA  Papiers filtres plissés de 250 mm de diamètre, Prat Dumas®, France  Pipettes automatiques Thermo® (20-100 μL et 100-1000 μL)  Pipettes graduées à usage unique de 2 mL et 5 mL, Cellstar®

 Pipettes graduées de 3 mL et 5 mL  Plaques CCM en aluminium (20 x 20 mm), Gel de silice 60 F254, Merck,  Réfrigérant à bulles ®  Rotavapor, BUCHI Rotavopor R-215 et Heating Bath B-491  Seringue en verre 1 mL, Fortuna® Optima®, Allemagne  Tubes à essai et tubes à hémolyse de 6 mL  Tubes capillaires de 50 μL, DURAN, Référence : 9600150, Allemagne  Vaporisateuse pour révélation CCM, Ecospray®, LCF L460

3.1.1.2- Matériels végétales

Le screening phytochimique sera réalisé sur 26 espèces de plantes de l’échantillothèque du Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF, Université des sciences de la Santé, Phnom Penh. Ces plantes, collectées dans différentes provinces du Cambodge, ont été sélectionnées en raison de l’absence de données phytochimiques les concernant. L’étude concerne 44 parties de plantes appartenant à 26 espèces réparties dans 4 familles (Apocynaceae, Asclepiadaceae, Rutaceae et Sonneratiaceae). Les plantes analysées sont collectées dans certaines provinces du Cambodge comme Kampong Speu, Kampot, Sihaknouk Ville, Kampong Cham, Koh Kong, Siem Reap et Mondulkiri par notre équipe dirigé par Professeur CHENG Sun Kaing (Figure 18). La liste des échantillons étudiés est donnée dans le tableau 2.

Figure 18 : Lieux de récolte des échantillons étudiés.

Tableau 2 : Liste des plantes collectées.

Lieu Code de Partie de No Nom khmer Nom de plantes Famille de plantes plante récolt Aganonerion polymorphum 015 Feuilles 1 Apocynaceae CL603 KK វលិ្ថថ្នឹង,កោតព្រហ្ម Pierre ex Spire 016 Tiges Aganosma marginata 2 Apocynaceae CL041 087 P. aériennes KS ព្រកៅរពរ (Roxb.) D.J. Middleton

036 Feuilles Amalocalyx microlobus 3 Apocynaceae CL322 037 Tiges MK / Pierre ex Spire 076 Fruits

220 Feuilles Chonemorpha fragrans 4 Apocynaceae CL460 221 Tiges MK / (Moon) Alston 222 Fruits

5 វលិ្អងគត់ព្រហ្ម Chonemorpha macrantha Pit. Apocynaceae CL128 071 Tiges KP

Dischidia imbricata 6 Apocynaceae CL522 057 Pl. entire KK វលិ្習រោរព្ងូល (Bl.) Steud.

Epigynum griffithianum 7 Apocynaceae CL525 060 P. aériennes KK / Wight 093 P. aériennes Holarrhena curtisii 8 Apocynaceae CL044 094 P.souteraines- KS ទឹរក ោះខ្លិតូច King & Gamble Racine

Parameria laevigata 094 Tiges 9 Apocynaceae CL142 KP វលិ្អងគត់រ (Juss.) Mold. 095 Feuilles 045 P. aériennes Spirolobium cambodianum 10 Apocynaceae CL514 046 P. KK រំករើរគុមពរិឹរតូច Baill. souterraines Willughbeia edulis 11 Apocynaceae CL244 065 Tiges SR វលិ្គុយ Roxb. Wrightia pubesens 016 Feuilles 12 Apocynaceae CL211 SR ពរិងគង់ R.Br. 017 Ecorces

Dischidia hirsuta 13 / Asclepiadaceae CL520 055 P. aériennes KK (Bl.) Decne.

Dischidia major 14 Asclepiadaceae CL509 037 P. aériennes KK វលិ្រងគងពរែរ (Vahl) Merr.

15 កេវ讶វវលិ្ Dischidia nummularia Asclepiadaceae CL415 168 P. aériennes MK R. Br.

Hoya kerrii 16 Asclepiadaceae CL357 089 P. aériennes MK វលិ្ព្តកចៀរដំរី Craib

វលិ្កព្គច, រុរ羶ម, Tylophora asthmatica (L.f.) 17 Asclepiadaceae CL178 164 P. aériennes KP Wight & Arn. រាលព្រំរី

142 Feuilles Atalantia citroides 18 Rutaceae CL071 143 Ecorces + KS ព្រូចព្ព្រ Pierre ex Engl. & Prantl. Tiges

Feroniella lucida 005 Feuilles 19 Rutaceae CL598 KK ព្រ羶ំង Swingle 006 Tiges

Glycosmis pentaphylla 059 Feuilles 20 Rutaceae CL638 KK ភ្ិំង, ភ្ិីងភ្ិំង (Retz.) DC. 060 Tiges

107 Feuilles Limonia acidissima 21 Rutaceae CL668 108 Tiges KK ខ្វ្ត L. 109 Fruits

Lieu Code de Partie de No Nom khmer Nom de plantes Famille de plantes plante récolt Micromelum falcatum 104 Tiges 22 Rutaceae CL147 KP រំ澶យរមង (Lour.) Tanaka 105 Feuilles

Micromelum minutum (Forst.) 008 Feuilles 23 Rutaceae CL1016 KC រកព្្ទរកឆែោះ Wt. & Arn. 009 Tiges

Zanthoxylum rhetsa 24 Rutaceae CL160 131 Tige+Ecorce KP រំាត់ DC. Sonneratia alba 093 Feuilles 25 Sonneratiaceae CL959 SV អំពាធំ, ព្រញឹរធំ Sm. 094 Tiges

Sonneratia ovata 006 Feuilles 26 Sonneratiaceae CL891 SV អំពា Backer 007 Tiges

KS : Kampong Speu; KP : Kampot; KK : Koh Kong; KC : Kampong Cham; SV : Sihaknouk Ville; SR : Siem Reap; MK : Mondulkiri.

3.1.2- Solvants/Réactifs

 4-diméthylaminobenzaldéhyde : lot 54926014817; Ref 8.22314.0250; Flacon de

250 mL; MERCK

 Acétate d’éthyle : lot 0602416; Ref 23880.368; Flacon de 5 L; PROLABO  Acide acétique : lot 0601580; Ref 20108.292; Flacon de 1 L; PROLABO  Acide chlorhydrique 37 % : lot 0603114; Ref 20252.290; Flacon de 1 mL; PROLABO  Acide sulfurique concentré : lot 0603171; Ref 20692.290; Flacon de 1 L; PROLABO  Acide trichloroacétique : lot K38566207813; Ref 1.00807.0250; Flacon de 250 g; MERCK  Anhydride acétique : K38846342.830; Ref 1.00042.1000; Flacon de 1 L; MERCK  Chloroforme : lot K38554545811; Ref 1.02445.1000; Flacon de 1 L; MERCK  Chlorure de sodium : lot O8D240027; Ref 278810.295; Flacon de 1 kg; PROLABO  Dibromo-2-6 quinonechlorimide : lot 86100208; Ref A12207L02170; Flacon de 10 g; Alfa Aeser  Dragendorff : lot O73E210512; Ref 30989.236; Flacon de 250 mL; PROLABO  Ethanol 96 degrés : lot 54926014817; Ref 8.22314.0250; Flacon de 250 mL; MERCK  Ether de pétrole : lot H15T007; Ref 038985; Flacon de 1 L; Alfa Aesar  Ether diéthylique : lot 10C080031; Ref 23811.292; Flacon de 1 L; MERCK 19

 Ethylaminodiphénylborate : lot S5317536911; Ref 8.41636.0005; Flacon de 5 g; MERCK  Hydroxyde de sodium : lot B960148148; Ref B01674M; Flacon de 500 g; BDH  Iode : lot B0217161823; Ref 1.04761.0100; Flacon de 100g; MERCK  Iodure de Potassium (solution à 10 %) : lot 54926014817; Ref 8.22314.0250; Flacon de 250 mL; MERCK  Iodure de potassium : lot B935743639; Ref 1.05043.0250; Flacon de 250 mL; MERCK  Méthanol pur : lot O9C090525; Ref 20903.290; Flacon de 1 L; PROLABO  Ninhydrine à 4 % lot K38920362; Ref 1.06762.0010; Flacon de 10 g; MERCK  Potassium sodium tartrate tétrahydraté : lot A878587909; Ref 1.08087.1000; Flacon de 1 kg; MERCK  Rhodamine : lot FN1060199812; Ref 1.07599.0025; Flacon de 25 g; MERCK  Sel de bleu B : lot 58096LJ; Ref D9805; Flacon de 10 g; Sigma-Aldrich  Toluène : lot K38850425824; Ref 1.08325.1000; Flacon de 1 L; MERCK  Vanilline : lot S4971018 917; Ref 8.18718.0100; Flacon de 100 g; MERCK

3.2- Méthodes

3.2.1- Préparation des extraits bruts

Il s’agit de réaliser une extraction répétée par sous reflux avec les solvants organiques tel que l’éther diéthylique, le méthanol et l’eau. D’abord, 20 g de poudres sèches broyées sont extraites sous reflux et agitation par 200 mL d’éther diéthylique pendant 30 minutes. Le mélange est ensuite filtré sous vide sur entonnoir Buchner muni d’un papier filtre. Le marc est encore reextrait 2 fois par 100 mL d’éther diéthylique dans les mêmes conditions et les extraits éthérés sont finalement groupés et évaporés dans le bain-marie à température 60 oC.

Le marc gardé provenant de l’extraction avec éther est extrait de la même technique (sous reflux et sous agitation) par 3 reprises par 3 x 100 mL de Méthanol. Le mélange est ensuite filtré et les filtrats alcooliques sont groupés et concentrés au Rotavapor.

Enfin, le marc est extrait successivement par 3 x 100 mL d’eau à reflux. Après la filtration, les extraits aqueux sont ensuite groupés et lyophilisés (Figure 12).

200 mL, 2 x 100 mL d’Et O 20 g de poudre 2

Marc

Extraction sous reflux et Filtration sous vide agitation (30 min) 3 fois

3x100 mL de MeOH Extrait éthéré Marc Evaporation

Dans bain-marie Extraction sous Filtration reflux et agitation sous- vide (30min)

3 fois

3x100 mL d’Eau Extrait Marc Méthanolique Evaporation

Rotavapor Extraction sous Filtration reflux et sous- vide agitation (30min) 3 fois

Extrait Aqueux Marc Evaporation Eliminer Lyophilisation

Figure 19 : Schéma successif sous reflux des trois extractions.

3.2.2- Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique permet d’identifier les grands groupes chimiques présents dans une plante. Les trois extraits préparés (éthéré, méthanolique et aqueux) pour une même partie de plante permettent d’extraire les principales familles chimiques d’intérêt. Celles-ci seront ensuite mises en évidence grâce à différentes réactions de caractérisation [réaction de Liebermann Buchard (phénols), réaction de Bornträger, test de salkowski, test Casparis et Manella (coumarine), etc.].

3.2.2.1- Recherche des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont trouvées dans les extraits éthérés et sont caractérisées par l’odeur aromatique de l’extrait et les tâches colorées sur la plaque de chromatographie sur couche mince après migration. Dans un premier temps, quelques gouttes de l’extrait éthéré sont déposées ou imbibées sur papier filtre. Après évaporation de l’éther à l’air. On relève une éventuelle odeur aromatique qui témoignerait de la présence d’huile essentielle.

La confirmation se fait par la méthode de Harborne; Ikan et Stahl (1976) en utilisant la technique de chromatographie sur couche mince.

 Silice normale 64 GF 254;  Volume déposé : 50 µL - 100 µL;  Système d’élution : hexane/acétate d’éthyle 96:4 (v/v).

Détection en UV à 254 nm, les huiles essentielles sont révélées par une extinction de la fluorescence (noire). De plus, après pulvérisation de la plaque par d’Anisaldéhyde-sulfurique suivie d’un chauffage à 110 oC pendant 5 min, les huiles essentielles donnent des taches visibles de coloration bleu foncé, vert, rose, violet et rouge et fluorescence bleu-vert en UV à 366 nm (Figure 20)

Anisaldéhyde- sulphurique UV 254 nm Anisaldéhyde- sulphurique + UV 366 nm

Figure 20 : CCM d'huile essentielle.

3.2.2.2- Recherche des alcaloïdes

Les alcaloïdes peuvent être mis en évidence par diverses méthodes (SMOLENSKI et all en 1972, méthode HARBONE 1974, EVANS 1997, etc.). Ils sont identifiés par la réaction de précipitation en utilisant des réactifs spécifiques comme les réactifs de Mayer, Dragendorff, et Wagner. Les réactions générales de précipitations sont basées sur le fait que les alcaloïdes forment des combinaisons avec des métaux et métalloïdes comme le bismuth, le mercure, l'iode et le tungstène.

Protocole : 10 mL d’extrait éthéré et d’alcool sont évaporés à sec au bain-marie et rotavapor. Les filtrats sont triturés avec 3 mL de HCl 0,5 N pendant 5 - 10 min au bain-marie. La solution acidique est ensuite filtrée si nécessaire avant d’être transférée dans un tube à essais. 5 gouttes (250 µL) de filtrat sont introduites dans 3 tubes à hémolyse numérotés et 2 à 3 gouttes de réactif Mayer, Wagner et Dragendorff sont ajoutés. La présence d’alcaloïde est indiquée par de formation d’un précipité dans au moins 2 de ces tubes 10 minutes après l’ajout du réactif. Cependant, s’il n’y a pas la formation de précipité, on peut conclure que la plante ne contient pas d’alcaloïde, ou que la teneur est en dessous de la limite de sensibilité, ou encore que des alcaloïde sont éventuellement présents mais appartiennent à un groupe ne précipitant pas par ces réactifs (groupe des purines, par exemple).

Le filtrat HCl restant (environ 2 mL), est alcalinisé par NH4OH à 10 %. Puis, les alcaloïdes précipités sous forme de bases sont extraits par 1 mL de chloroforme. La phase chloroformique inférieure est ensuite prélevée dans un tube à hémolyse. Une analyse CCM est réalisée à partir de cette solution.  Déposer 50 à 100 μL de la phase chloroformique sur une plaque de silice normal GF 254 et faire migrer dans le mélange : toluène/acétone/éthanol/ammoniaque 25 % 45:45:7:3 (v/v).  Après migration, la plaque est examinée en UV à 254 nm et à 366 nm : extinction de fluorescence ou fluorescence caractéristique, parfois accentuée par

pulvérisation d’H2SO4 0,1 N (Quinine). Les alcaloïdes, sans traitement par certains réactifs, donnent une fluorescence bleue, bleu-vert ou violet, jaune sous UV à 366 nm.  Les alcaloïdes développent une coloration jaune-orange visible après la

pulvérisation du réactif de Dragendorff suivie d’une pulvérisation de H2SO4 0,1 N (et solution Iodo-Iodurée) (Figure 21).

UV 254 nm UV 366 nm Dragendorff Figure 21 : CCM d'alcaloïde.

3.2.2.3- Recherche des tanins

Les tanins sont recherchés dans les extraits méthanoliques et aqueux par réaction de précipitation à la gélatine en présence de sel.

Protocole : 5 mL d’extrait méthanolique sont évaporés à sec et le résidu est repris par 5 mL d’eau. La solution est filtrée si nécessaire. Les extraits aqueux sont étudiés en l’état. 1 mL de chaque extrait est introduit dans 3 tubes à essais :  Ajouter au 1er tube 1 mL de solution de sel NaCl à 10 %  Ajouter au 2ème tube 1 mL de solution gélatine à 1 %  Ajouter au 3ème tube 1 mL du mélange NaCl 10 % et 1 mL du mélange gélatine 1 %

Une précipitation du 1er tube est une réaction faussement positive. La confirmation de la présence de tanins est réalisée par addition de quelques gouttes de FeCl3 à 10 %. Une coloration ou un précipité bleu-violet-noir ou vert noir indique la présence de tanin (galliques ou catéchiques) (Figure 22).

G N G + N

Gélatine (+FeCl ) NaCl Gélatine + NaCl 3

Figure 22 : Réaction positive de tanins par réaction de précipitation à la gélatine en présence de sel.

3.2.2.4- Recherche des composés réducteurs

Les composés réducteurs sont recherchés dans les extraits méthanoliques et aqueux et mis en évidence par la réaction de précipitation par liqueur de Fehling.

Protocole : 1 mL d’extrait à tester est dilué dans 10 mL d’eau dans un tube à essai. La solution est ensuite filtrée si nécessaire. Puis, 1 mL de liqueur de Fehling est additionné avant de porter à ébullition pendant 5 min. L’apparition d’une coloration ou un précipité rouge de

Cu2O indique la présence de composés réducteurs (Figure 23).

Figure 23 : Réaction positive de composés réducteurs par réaction de Fehling.

3.2.2.5- Recherche des saponines

Les saponines sont à rechercher dans les extraits méthanolique et aqueux.

Protocole : 0,5 mL d’extrait à analyser est dilué dans 10 mL d’eau. Le tube contenant du mélange est ensuite agité énergiquement. L’apparition de mousse qui persiste plus de 10 min indique la présence probable de saponines.

La confirmation se fait par CCM. Les extraits aqueux et méthanoliques sont déposés sur une plaque de silice normale GF 254 dans les systèmes chloroforme/méthanol/eau 70:30:4 (v/v).

La détection sur la plaque bien séchée après migration est réalisée par pulvérisation de l’eau jusqu’à mouillage uniforme du gel de silice. Les saponines apparaissent sous forme de spots blancs non mouillables (révélation non destructive). Après élimination de l’eau de première révélation par séchage (à l’aide d’un séchoir à cheveux), cette même plaque peut être révélée par la vanilline sulfurique et chauffé à 110 oC pendant quelques minutes. Les saponines apparaissent sous forme de spots colorés (bleu, bleu-violet et quelque fois rouge ou jaune- brun) (Figure 24).

Figure 24 : Réaction positive et CCM de saponine pulvérisée par vanilline sulfurique.

3.2.2.6- Recherche des peptides-acides aminés

Les peptides (protéines de poids moléculaire arbitrairement < 10 000) sont à rechercher dans l’extrait aqueux. L’extraction ayant eu lieu à chaud, les protéines éventuelles sont généralement précipitées et ont été en tous cas dénaturées par l’extraction méthanolique précédente. Les peptides sont caractérisés par précipitation par divers réactifs comme l’alcool, l’acétone, ou encore l’acide acétique. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide d’acide trichloracétique.

Protocole : 200 mg à 400 mg d’acide trichloracétique sont ajoutés dans un tube à essai contenant 5 mL d’extrait aqueux. Le tube est ensuite chauffé au voisinage de l’ébullition. L’apparition d’un précipité floconneux blanc (ou une louche) indique la présence de peptides (Figure 25).

Figure 25 : Réaction positive de peptide.

Les acides aminés sont à rechercher dans l’extrait aqueux et dans la phase aqueuse d’hydrolyse.

Protocole : 2 mL de réactif à la ninhydrine sont additionnés dans un tube à essai contenant 5 mL d’extrait aqueux. Le mélange est ensuite porté au bain-marie bouillant pendant 15 minutes. Il se développe une coloration bleu-violet intense en présence d’acides aminés.

L’extrait aqueux (50 à 100 µL) est déposé sur la plaque CCM (activée par passage 2 heures à l’étuve ventilée à 110 oC). Les dépôts doivent être bien séchés à l’air chaud (séchoir à cheveux). La migration est réalisée par le système : n-propanol/eau 7:3 (v/v). Les acides aminés se apparaissent sous forme de spots bleus à bleu-violacés par pulvérisation du réactif à la ninhydrine et chauffé à sec avec le séchoir à cheveux pendant 5 min à 110 oC.

3.2.2.7- Recherche de l’amidon

L’amidon soluble est décelé dans l’extrait aqueux.

Protocole : 1 mL d’extrait aqueux est dilué dans 5 mL d’eau. Au moins 2 gouttes de réactif de Lugol sont additionnées. Une coloration bleue ou un précipité bleu-noir indique la présence d’amidon (action de l’iode sur l’amidon) (Figure 26).

Figure 26 : Réaction positive de l'amidon au réactif de Lugol.

3.2.2.8- Recherche des polysaccharides

Les polysaccharides sont à rechercher dans l’extrait aqueux.

Protocole : 10 mL d’extrait aqueux sont dilués dans 60 mL d’éthanol. Le floculat foncé formé indique la présence des polysaccharides (Figure 27).

Figure 27 : Réaction positive de polysaccharides.

3.2.2.9- Saponification de l’extrait éthéré

50 mL d’extrait éthéré sont évaporés à sec dans un ballon de 100 mL. 20 mL de KOH alcoolique sont ensuite introduits et le mélange est laissé sous agitation magnétique pendant 2 heures. L’alcool présent dans le mélange est ensuite éliminé par évaporation au Rotavapor. Le résidu est transvasé dans une ampoule à décanter en le dissolvant par fractions dans 20 mL d’eau distillée. La solution aqueuse est ensuite extraite liquide/liquide par 15 mL, 10 mL, 10 mL d’éther diéthylique (extraction des insaponifiables). La fraction insaponifiable de la phase éthérée et la fraction saponifiable de la phase aqueuse sont stockées (Figure 28).

Fraction insaponifiable (Phase éthérée)

Fraction saponifiable (Phase aqueuse)

Figure 28 : Extraction liquide/liquide de l'extrait éthéré après saponification

(20 mL d'H2O/15 mL, 10 mL, 10 mL d'Et2O).

3.2.2.9.1- Recherche des caroténoïdes

Les caroténoïdes peuvent être retrouvés dans la fraction insaponifiable de l’extrait éthéré.

Protocole : D’abord, 5 mL d’extrait éthéré insaponifiable sont évaporés à sec au bain-marie (sous la hotte). Ensuite, le résidu est trituré par 5 mL d’éther de pétrole au bain-marie. Après, la solution d’éther de pétrole est refroidie à -10 oC pendent une nuit pour précipiter les éventuels stérols et triterpènes présents. Les résultats ont été évalués comme suit :  Un surnageant coloré du jaune au rouge indique la présence de caroténoïdes.  Les caroténoïdes produisent un résidu jaune orangé à rouge par évaporation de l’éther de pétrole au bain-marie (sous la hotte).

La présence de caroténoïdes est confirmée par CCM en déposant 100 µL du surnageant de l’éther de pétrole sur une plaque de silice et en faisant la migration dans le système cyclohexane/éther 80:20 (v/v). Les caroténoïdes donnent de spots colorés en jaune visible à l’œil nu (Figure 29).

Figure 29 : CCM de caroténoïde.

3.2.2.9.2- Recherche des Stéroïdes-Triterpènes (réaction de Liebermann-Burchard et test de Salkowski)

Les stérols et les terpènes sont caractérisés par les réactions de Liebermann Burchard et Salkowski.

Protocole : 5 mL de fraction insaponifiable d’extrait éthéré et hydrolysat sont séchés à sec au bain-marie sous la hotte. Le résidu ou les précipités provenant du test des caroténoïdes sont triturés par 5 mL d’éther de pétrole. Puis, le mélange est laissé au repos et le surnageant est pipetté à l’aide d’une pipette pasteur. L’opération est répétée si nécessaire pour éliminer la majorité des matières colorantes. Ensuite, le résidu est repris par 2 mL de chloroforme. Après décantation, le chloroforme est transféré dans un tube à essai. La phase chloroformique est agitée et filtrée dans 3 tubes propres et secs.  Tube No 1 pour le test de Liebermann-Burchard (stérols insaturés et triterpènes) : 3 à 5 gouttes d’anhydride acétique sont ajoutés dans le tube numéroté 1. Puis, le

mélange est agité doucement. Ensuite, 1 à 2 gouttes d’H2SO4 concentré sont ajoutées dans le premier tube en agitant doucement. L’évolution de coloration pendant une heure est observée. o La couleur de la solution vire au bleu-vert ou jaune indique la présence probablement de stéroïdes

o La couleur de la solution vire au rouge pourpre ou violet indique la présence probablement triterpènes. o  Tube N 2 pour le test de Salkowski (stérols insaturés) : 1 mL d’H2SO4 pur est introduit avec précaution dans le tube contenant la solution chloroformique. Puis, la couleur apparaissant à l’interface des 2 phases est observée. Ensuite, les 2 phases sont mélangées doucement. La variation de la couleur du milieu pendant une heure est observée. Une coloration jaune rougeâtre ou rouge indique la présence de stérols insaturés.  Tube No 3 est utilisé comme témoin.

50 à 100 μL de chloroforme du 3ème tube (concentrer si nécessaire) sont déposés sur la plaque de silice et migrés dans le système hexane/acétate d’éthyle 8:2 (v/v). Les stéroïdes et triterpènes donnent des tâches visibles de coloration rouge ou rouge-violet et bleu-violet après révélation par la vanilline sulfurique et chauffage à 110 oC quelques minutes.

3.2.2.10- Traitement de la phase aqueuse de saponification

La solution aqueuse (fraction saponifiable) est acidifiée par HCl 1 N jusqu'à pH = 2. La formation de précipité est notée (Figure 30). La solution acidique est ensuite traitée par extraction liquide/liquide à 3 reprises avec 10 mL d’éther diéthylique. La phase éthérée de la première extraction est réservée pour le test des acides gras. Les phases étherées de 2ème et 3ème extractions sont groupées pour le test des coumarines d’une part, et pour le test des anthraquinones et des flavonoïdes d’autre part.

Figure 30 : Acidification de la phase aqueuse saponifiable par HCl 1 N.

3.2.2.10.1- Recherche des acides gras- lipides

Les acides gras sont recherchés dans la fraction saponifiable de l’extrait éthéré.

Protocole : quelques gouttes de solution éthérée traitée sont déposées sur un papier filtre. Une tache transparente après évaporation du solvant indique la présence d’acide gras. 100 μL de l’extrait éthéré sont déposés sur une plaque de silice normale et migrés dans le système éther diéthylique/acide acétique 24:1 (v/v). Elles sont ensuite révélées en pulvérisant une solution Rhodamine B à 0,5 % dans l’éthanol. Des spots jaunes ou bleu-violets sur fond rose indiquent leur présence. Si la plaque est révélée par pulvérisation d’acide sulfurique à 25 % puis chauffée à 230 oC, les spots rouge-bruns indiquent la présence de glycolipides, et les autres lipides se apparaissent brun pâle.

3.2.2.10.2- Recherche des coumarines

Les coumarines sont caractérisées par le test de CASPARIS et MANELLA. Elles peuvent être recherchées dans la fraction saponifiable des extraits éthérés, dans les extraits méthanoliques ou aqueux hydrolysées.

Protocole : 5 mL d’extraits éthérés et méthanolique sont évaporés à sec. Les résidus sont repris dans 5 mL d’eau et filtrés si nécessaire. Les solutions obtenues sont réparties dans 2 tubes à essai avant d’ajouter 1 mL d’ammoniaque à 10 % à l’un des 2 tubes. La fluorescence des 2 tubes est ensuite comparée sous UV à 254 nm et à 366 nm. Une fluorescence nette apparaissant dans le tube contenant le mélange en milieu basique, indique la présence de coumarines. Par ailleurs, la présence de coumarine est également observée par alcalinisation directe de l’extrait aqueux. Notamment, il faut se rappeler que le verre ordinaire fait écran aux rayons UV à 254 nm, donc on peut réaliser la comparaison en versant les solutions dans des verres de montre. De plus, une dilution 10 ou 100 fois peut être nécessaire si la solution est trop concentrée, ce qui cause une obscurité de la fluorescence.

Les extraits sont déposés sur plaque de silice et migrés dans le système toluène/acétate d’éthyle 18:2 (v/v). Les coumarines sont ensuite détectées par fluorescence sous UV à 254 nm et à 366 nm avant et après pulvérisation de KOH alcoolique 0,5 N. Les coumarines donnent une fluorescence de coloration bleu clair, violet ou vert, parfois jaune-brun ou jaune-vert sous

UV à 366 nm avant et après pulvérisation de révélateur (Figure 31)

UV 254 nm UV 366 nm KOH alc.+ UV 366 nm

Figure 31 : CCM de coumarine.

3.2.2.10.3- Recherche des anthraquinones

Selon la réaction de Bornträger, les anthraquinones sont trouvées sous leur forme génine dans les phases organiques des fractions saponifiables de l’extrait éthéré, dans les extraits éthérés des hydrolysats des extraits méthanolique et aqueux.

Protocole : les hydrolysats de la phase éthérée sont évaporés à sec dans une capsule au bain- marie sous la hotte. Le résidu est dissous dans 5 mL d’éthanol à 50 %. 1 mL est prélevé dans 2 tubes à essai dont un sert à chercher l’Emodine et un autre sert à chercher les Anthracènes C-glycosides.

3.2.2.10.3.1- Emodine

1 mL de solution éthanolique prélevé est dilué dans 4 mL d’eau. 1 mL de chloroforme est ensuite ajouté et le mélange est agité énergiquement. Après décantation, la phase chloroformique inférieure est transférée dans un tube à essai. 1 mL d’eau et 2 gouttes d’ammoniaque sont ensuite introduits. Le mélange est agité et décanté. Une phase aqueuse surnageante rouge-violet indique la présence d’anthraquines génine après décantation.

3.2.2.10.3.2- C-glycosides

1 mL de la suspension éthanolique à 50 % est trituré par 1 mL de FeCl3 à 20 % et 0,5 mL de HCl concentré dans un tube à essai et chauffé pendant quelques minutes au bain-marie. Après refroidissement, 1 mL de chloroforme est ajouté et le mélange est agité énergiquement. Après décantation, la phase chloroformique est prélevée et lavée à l’eau pour éliminer l’excès de

FeCl3. 1 mL d’ammoniaque à 10 % est ensuite ajouté. Une coloration nettement plus intense que celle obtenue précédemment indique la présence de C-glycoside (Figure 32).

Figure 32 : Réaction positive de C-glycosides.

Les anthraquinones génines (émodines) peuvent être séparées en CCM sur plaque de silice normale dans le solvant : acétate d’éthyle/méthanol/eau 100 :13,5:10 (v/v/v). Le révéla- teur utilisé était KOH alcoolique 0,5 N. Les anthraquinones sont détectées sous UV à 254 nm - 366 nm, en fluorescence rouge ou orange rougeâtre (Figure 33).

KOH alc.+ UV 366 nm

Figure 33 : CCM d'anthraquinone. 35

3.2.2.10.4- Recherche des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont à rechercher dans les phases organiques de la fraction saponifiable de l’extrait éthéré et les hydrolysats des extraits méthanolique et aqueux.

Protocole : les extraits éthérés sont évaporés à sec au bain-marie sous la hotte. Le résidu est dissous dans 5 mL d’éthanol à 50 %. 0,5 mL de cette solution est prélevé et dilué avec l’eau jusqu’à obtention d’une solution très peu colorée. Cette solution diluée est repartie dans 2 tubes à essai et 3 à 5 gouttes de NaOH 1 N sont ajoutées dans l’un des tubes. L’apparition d’une nette coloration jaune dans ce dernier par rapport au 2ème tube témoin indique la présence probable de flavonoïdes.

Certaines réactions spécifiques peuvent mettre en évidence les différents types de flavonoïdes :

 Les Chalcones et les Aurones : Par l’addition de quelques gouttes d’acide chlorhydrique pur, ils produisent une coloration rouge immédiate.  Leucoanthocyanines : 0,5 mL d’acide chlorhydrique pur est additionné sur 1 mL de solution éthanolique à 50 % chauffée au bain-marie pendant 10 à 15 minutes (réaction lente). Une coloration rouge violet indique la présence de Leucoanthocyanines.  Catéchines peuvent être mises en évidence par addition de quelques gouttes de vanilline sulfurique dans 1 mL de solution éthanolique à 50 %. Après agitation, il se forme rapidement en contact avec le réactif une coloration rouge fugace. De

plus, avec le réactif FeCl3, il se forme également une coloration bleue à bleu-vert.

La confirmation se fait par dépôt de l’extrait éthanolique à 50 % sur plaque de silice normale

GF 254 dans le système AcOEt/MeOH/H2O 100:13,5:10 (v/v/v). Révélateurs : Réactif de Neu ou Sel de bleu solide B suivie par NaOH 1 N (réactif des fonctions phénols). Les flavonoïdes sont détectés par fluorescence de coleur orange, jaune, vert et bleu, sous lampe UV 366 nm avant et après pulvérisation des révélateurs (Figure 34).

Réactif de Neu +NaOH sur UV 366 nm Figure 34 : CCM de flavonoïde.

3.2.2.11- Hydrolyse des extraits méthanolique et aqueux

50 mL d’extrait méthanolique ou aqueux sont évaporés au rotavapor ou séchés par lyophilisation. Le résidu est repris dans 20 mL de HCl 1 N et mis sous agitation magnétique. Puis, le mélange est porté sous reflux pendant 1 heure. L’hydrolysat est transféré dans une ampoule à décanter de 100 mL et extrait liquide/liquide par 15 mL, 10 mL, 10 mL d’éther diéthylique. Les phases éthérées sont groupées et lavées une fois avec 5 mL d’eau et la phase aqueuse acide est conservée.

3.2.2.11.1- Recherche des anthocyanes

Les anthocyanes sont recherchés dans la phase aqueuse acide de l’hydrolysat des extraits méthanolique et aqueux. Premièrement, noter la couleur de la phase acide. Puis, 5 mL de phase acide sont triturés par 1 mL d’alcool isoamylique. Le mélange est ensuite agité fortement. La coloration rouge violacée de l’alcool amylique indique la présence d’anthocyane (Figure 35).

Figure 35 : Réaction positive d'anthocyane.

Les protocoles des différentes extractions et des réactions de caractérisation sont résumés en annexe 1. Les réactifs mis en jeu dans chaque réaction sont donnés en annexe 2.

3.2.3- Test d’anti-oxydant

Notre travail consiste à évaluer les propriétés anti-oxydantes de 26 plantes sélectionnées. Leur pouvoir anti-oxydant est déterminé en utilisant la méthode anti-radicalaire (anti-DPPH). L’étude est basée sur deux tests : CCM pour déterminer qualitativement la présence des propriétés des anti-oxydantes et spectrophotométrie UV-visible pour déterminer la concentration inhibitrice 50 % (CI50).

3.2.3.1- Screening préliminaire sur la CCM

Les extraits méthanoliques sont choisis pour étudier des activités anti-oxydantes grâce au nombre plus importants des composés. D’abord, les 44 d’extraits méthanoliques sont pesés et préparés pour obtenir la concentration 20 mg/mL. Après, 10 µL de ces solutions sont déposés sur la plaque CCM en verre, migrée dans le système butanol/acide acétique/H2O 50:10:20 (v/v/v). L’acide ascorbique (vitamine C), le composé de référence, est également préparé à la même concentration (20 mg/mL) et même volume à déposer (10 µL). Après la migration, la plaque CCM est révélée par la solution de DPPH à 1,2 10-4 M. La présence de tâche incoleur sur la plaque CCM indique la présence des activités anti-oxydantes (Figure 36 et Tableau 3)

bOH/CH3COOH/H2O 50:10:20

03 03 03 03

03 03 03 03 03 03 03 03 03 03

03 03 03 03 03 03 03 03

03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 03

- - 03 03 - -

------

- -

Vit C Vit

143 220 093 094

087 093 094 142 221 222 037 045 006 007

071 094 037 076 089 046 108 109

104 105 131 164 016 017 065 036 055 057 015 016 059 060 107

005

060 006

- - - -

- - - - 168 ------

------

008

------

- -

095

009

CL071 CL460 CL959 CL959

CL041 CL044 CL044 CL071 CL460 CL460 CL509 CL514 CL891 CL891

CL128 CL142 CL322 CL322 CL357 CL514 CL668 CL668

CL147 CL147 CL160 CL178 CL211 CL211 CL244 CL322 CL520 CL522 CL603 CL603 CL638 CL638 CL668

CL598

CL525 CL598

CL415

CL142

CL1016 CL1016 Extraits ayant des propriétés anti-oxydantes intéressantes

Figure 36 : Figure de plaque CCM révélée par DPPH. 39

Tableau 3 : Tableau des extraits sélectionnés pour le test d'anti-oxydants.

Code Partie de plante o CCM N Nom Khmer Nom Latin de Nom partie Famille Code Screening plantes de plante Aganosma marginata 1 CL041 087 P. aériennes Apocynaceae ព្រកៅរពរ (Roxb.) D.J. ++ Middleton

093 P. aériennes ++ Holarrhena 2 ទឹរក ោះខ្លិតូច curtisii King & CL044 Apocynaceae Gamble P. 094 souterraines- + Racines

Atalantia 142 Feuilles +/- citroides 3 ព្រូចព្ព្រ Pierre ex Engl. CL071 Rutaceae & Prantl Ecorces + 143 Tiges +/-

008 Feuilles Micromelum +/- minutum 4 CL1016 Rutaceae រកព្្ទរកឆែោះ (Forst.) Wt. & Arn 009 Tiges +

Chonemorpha 5 CL128 071 Tiges Apocynaceae វលិ្អងគត់ព្រហ្ម macrantha Pit. +++

094 Tiges ++ Parameria 6 វលិ្អងគត់រ laevigata CL142 Apocynaceae (Juss.) Mold. 095 Feuilles +

104 Tiges +/- Micromelum 7 រំ澶យរមង falcatum CL147 Rutaceae (Lour.) Tanaka 105 Feuilles +/-

Zanthoxylum 8 CL160 131 Tige+Ecorce Rutaceae រំាត់ rhetsa DC. +

Partie de plante Code CCM No Nom Khmer Nom Latin de Famille Nom Screening plantes Code partie de plante

វលិ្កព្គច, រុរ Tylophora asthamatica 9 CL178 164 P. aériennes Asclepiadaceae +/- 羶ម, រាលព្រំ (L.f.) Wight & រី Arn.

016 Feuilles - Wrightia 10 CL211 Apocynaceae ពរិងគង់ pubesens R.Br. 017 Ecorces +/-

Willughbeia 11 CL244 65 Tiges Apocynaceae វលិ្គុយ edulis Roxb. +++

036 Feuilles ++

Amalocalyx 12 / microlobus CL322 037 Tiges Apocynaceae ++ Piere ex Spire

076 Fruits +

Hoya kerrii 13 CL357 089 P. aériennes Asclepiadaceae វលិ្ព្តកចៀរដំរី Craib +

Dischidia 14 កេវ讶វវលិ្ nummularia CL415 168 P. aériennes Asclepiadaceae + R.Br.

220 Feuilles +/-

221 Tiges +

Chonemorpha 15 / fragrans CL460 Apocynaceae (Moon) Alston

222 Fruits +

Partie de plante Code CCM No Nom Khmer Nom Latin de Nom partie Famille Code Screening plantes de plante

Dischidia 16 វលិ្រងគងពរែរ major (Vahl) CL509 037 P. aériennes Asclepiadaceae ++ Merr.

045 P. aériennes +++ Spirolobium រំករើរគុមពរិឹរ 17 cambodianum CL514 Apocynaceae តូច Baill. P. 046 souterraines ++

Dischidia 18 / hirsuta (Bl.) CL520 055 P. aériennes Asclepiadaceae + Decne.

Dischidia វលិ្習រោ 19 imbricata (Bl.) CL522 057 Pl. entière Apocynaceae ++ រព្ងូល Steud.

Epigynum 20 / griffithianum CL525 060 P. aériennes Apocynaceae + Wight

005 Feuilles ++ Feroniella 21 CL598 Rutaceae ព្រ羶ំង lucida Swingle 006 Tiges +

015 Feuilles +/- Aganonerion វលិ្ថថ្នឹង,កោត 22 polymorphum CL603 Apocynaceae ព្រហ្ម Pierre ex Spire 016 Tiges +++

059 Feuilles -

Glycosmis ភ្ិំង, 23 pentaphylla CL638 Rutaceae ភ្ិីងភ្ិំង (Retz.) DC. 060 Tiges +/-

Code Partie de plante CCM No Nom Khmer Nom Latin de Famille Nom partie Screening plantes Code de plante

107 Feuilles -

Limonia 108 Tiges +/- 24 CL668 Rutaceae ខ្វ្ត acidissima L.

- 109 Fruits

006 Feuilles ++ Sonneratia 25 CL891 Sonneratiaceae អំពា ovata Backer 007 Tiges +

093 Feuilles + Sonneratia alba 26 CL959 Sonneratiaceae អំពាធំ, ព្រញឹរធំ Sm. 094 Tiges ++

er : Extraits possèdant l’activité anti-DPPH lors du 1 criblage par CCM.

+++ : Très actifs; ++ : Moyennement actif; + : Peu actif; +/- : Très peu actif; - : Non actif

3.2.3.1- Préparation de solution DPPH

Il s’agit de réaliser une solution méthanolique de DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) à 1,2.10-4 mol/L. Alors, 4,72 mg de DPPH sont pesés dans une fiole de 100 mL. Completer à 100 mL par la solution méthanol. La solution DPPH est utilisée comme le révélateur ainsi que le réactif anti-radicalaire pour déterminer l’activité-anti-oxydante de nos extraits.

3.2.3.3- Mesure du pouvoir anti-oxydant par spectrophotométrie UV-visible 3.2.3.3.1- Principe du test DPPH

Le pouvoir anti-oxydant d’un extrait est défini par la mesure de son pourcentage d’inhibition de la coloration du radical DPPH sous la formule suivante :

1 - ([Abs extrait + DPPH] – [Abs. extrait])

PI (%) = X 100

[Abs. DPPH 100 %]

La valeur du pouvoir anti-oxydant obtenue nous permet de déduire ensuite la CI50 de l’échantillon de nos plantes étudiées.

3.2.3.3.2- Protocole

Une gamme de concentration a été faite afin de mesurer les absorbances dans de différentes concentrations de chaque extrait. Pour ce fait, on est parti de la concentration de 500 µg/mL de la solution mère. Après, on procède à une dilution de la solution mère pour avoir une gamme de concentration des solutions filles. La solution DPPH est également préparée. Le temps de réaction (incubation) est de 30 min dans l’obscurité et le pic d’absorption du DPPH est lu au spectrophotomètre à longueur d’onde 517 nm. Le test de dosage a été répété en 2 fois et la moyenne et l’erreur des absorbances obtenues sont calculés. Le Trolox est utilisé comme référence et sa valeur de CI50 est à 6,15 μg/mL. La gamme de dilution est présentée dans le tableau ci-dessous (Tableau 4).

Tableau 4 : Tableau de dilution de l'échantillon pour le premier screening.

Solution mère Solution fille μg/mL 200 150 100 500 μg/mL 50 25 10

La gamme de différentes concentrations de chaque extrait est exprimée dans le tableau 5

Tableau 5 : Tableau de différentes gammes de concentrations de chaque extrait.

Gamme concentration Code d’extrait (μg/mL) CL 041-087-03 CL 044-093-03 10, 15, 25, 35, 50 CL 322-036-03 CL 322-037-03 CL 128-071-03 4, 8, 12, 15, 20 CL 244-065-03 CL 891-006-03 CL 142-094-03 10, 25, 50, 75, 100 CL 603-016-03 CL 509-037-03 50, 75, 100, 125, 150 CL 598-005-03 CL 514-045-03 8, 12, 16, 20, 25 CL 959-094-03 25, 50, 75, 100, 125 CL 514-046-03 10, 25, 50, 75, 100, 125 CL 522-057-03

Concentration Abs. extrait Abs. extrait Abs. DPPH Extrait PI % CI (µg/mL) seul + DPPH 100 % 50

1er 2ème 1er 2ème 1er 2ème 1er 2ème 1er 2ème essai essai essai essai essai essai essai essai essai essai 4 0,003 0,007 0,422 0,41 0,54 0,576 23,4 21,39 7,75 7,53 8 0,006 0,006 0,232 0,212 0,554 0,569 58,68 58,14

CL244-065-03 12 0,003 0,004 0,125 0.055 77,7 87,20

16 0,008 0,012 0,071 0.045 88,48 95,06

Moyenne 0,547 0,5725 7,64

Écart type 0,15

Valeur CI 7,64 ± 0,15 50

100.00 90.00 y = 6.252x + 2.925 80.00 R² = 0.934 70.00 y = 5.356x + 8.500 60.00 R² = 0.937 50.00 PI % PI 40.00 1er essai 30.00 2ème essai 20.00

10.00 CI50 0.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Concentration (µg/mL)

Figure 37 : Exemple de détermination de CI50 d'un extrait.

L’ensemble des résultats lors du test anti-oxydant est présenté dans l’annexe 4.

IV. RESULTATS

4.1- Préparation des extraits bruts

Trois types d’extraits sont initialement réalisés : extrait éthéré, extrait méthanolique et extrait aqueux. La composition des extraits se fait selon la polarité des solvants. Du fait, les trois extraits nous permettent de récupérer le maximum des composés. Cependant, les extraits présentant le meilleur rendement sont les extraits méthanolique et aqueux. Ces extraits permettent de mettre en évidence des composés plus polaires, tandis que le rendement de l’extrait éthéré est plus faible et contient des produits de plus faible polarité. En plus, le rendement d’extraction dépend également de la partie de plante étudiée. Par exemple, la plante Aganonerion polymorphum (codée CL 603-015/016), leur rendement obtenu est très différent entre parties de feuilles et de tiges (moyenne rendement pour la feuille est 9,6 %, bien que pour la tige est 1,4 %). En conclusion, les rendements d’extractions des principes actifs à partir de plantes dépendent de plusieurs facteurs tels que la composition de la plante, le solvant utilisé et les parties de plantes étudiées.

La masse et le rendement de chaque extrait sont présentés dans le tableau qui suit :

Tableau 6 : Rendement des extractions éthérées, méthanoliques et aqueuses pour l’ensemble des parties de plantes étudiées.

Partie de plante Extraits Code de No Nom Khmer Nom Latin Famille Masse d'extrait (mg) Rdt (%) plantes Code Nom partie de plante Code d'extrait Type d'extrait

6 Ether 377,05 1,9 Aganosma marginata 1 CL041 087 P. aériennes 3 MeOH 912,6 4,5 ព្រកៅរពរ (Roxb.) D.J. Middleton Apocynaceae 4 Eau 740,65 3,7 6 Ether 782,7 3,9 093 P. aériennes 3 MeOH 256,55 1,3 Holarrhena curtisii 4 Eau 464,35 2,3 2 King & Gamble CL044 Apocynaceae ទឹរក ោះខ្លិតូច 6 Ether 259,75 1,3

094 P. souterraines-Racines 3 MeOH 929,3 4,6 4 Eau 280,3 1,4 6 Ether 211,85 1,05 142 Feuilles 3 MeOH 1688,95 8,4 Atalantia citroides 4 Eau 1366,8 6,8 3 Pierre ex Engl. & Prantl CL071 Rutaceae ព្រូចព្ព្រ 6 Ether 77,3 0,4

143 Ecorces + Tiges 3 MeOH 299,85 1,5 4 Eau 224,85 1,5 6 Ether 1147,75 5,7 008 Feuilles 3 MeOH 1231,45 6,1 4 Eau 1980,25 9,9 Micromelum minutum (Forst.) 4 CL1016 Rutaceae រកព្្ទរកឆែោះ Wt. & Arn 6 Ether 80,5 0,4 009 Tiges 3 MeOH 797,25 4,1

4 Eau 275,65 1,4 6 Ether 156,3 0,8

CL128 071 Tiges 5 វលិ្អងគត់ព្រហ្ម Chonemorpha macrantha Pit. Apocynaceae 3 MeOH 1627,5 8,1 4 Eau 497,2 2,5

6 Ether 164,15 0,8

094 Tiges 3 MeOH 561,6 2,8

4 Eau 486,75 2,4 Parameria laevigata 6 CL142 6 Ether 399,7 2,0 វលិ្អងគត់រ (Juss.) Mold. Apocynaceae 3 MeOH 433,85 2,2 095 Feuilles 4 Eau 973,1 4,9

Partie de plante Extraits Code de o N Nom Khmer Nom Latin Famille Masse d'extrait (mg) Rdt (%) plantes Code Nom partie de plante Code extraits Type d'extrait

6 Ether 32,2 0,2 104 Tiges 3 MeOH 314,15 1,6 Micromelum falcatum 4 Eau 282,5 1,4 7 CL147 រំ澶យរមង (Lour.) Tanaka Rutaceae 6 Ether 287,1 1,4 105 Feuilles 3 MeOH 104,75 0,5 4 Eau 2392,65 12,0 6 Ether 46,6 0,2 Zanthoxylum rhetsa 8 CL160 131 Tige + Ecorce 3 MeOH 483,55 2,4 រំាត់ DC. Rutaceae 4 Eau 454,05 2,3 6 Ether 458,6 3,0 វលិ្កព្គច, រុរ羶ម, Tylophora asthmatica 9 CL178 164 P. aériennes Asclepiadaceae 3 MeOH 1205,25 6,0 (L.f.) Wight & Arn. រាលព្រំរី 4 Eau 1029,8 5,1 6 Ether 867,55 4,3 016 Feuilles 3 MeOH 659,6 3,2

Wrightia pubesens 4 Eau 1673,2 8,4 10 CL211 ពរិងគង់ R.Br. Apocynaceae 6 Ether 478,7 2,4 017 Ecorces 3 MeOH 624,35 3,1 4 Eau 739,85 3,7 6 Ether 172,7 0,9 Willughbeia edulis 11 CL244 065 Tiges 3 MeOH 1194,65 6,0 វលិ្គុយ Roxb. Apocynaceae 4 Eau 422 2,11 6 Ether 538,1 2,7 036 Feuilles 3 MeOH 2269,3 11,3 4 Eau 1976,8 9,9 6 Ether 237,75 1,2 Amalocalyx microlobus 12 / Pierre ex Spire CL322 037 Tiges Apocynaceae 3 MeOH 1205,6 6,0

4 Eau 874,9 4,4 6 Ether 739,6 3,7 076 Fruits 3 MeOH 2893,3 14,3 4 Eau 1581,45 7,9

Partie de plante Extraits o N Nom Khmer Nom Latin Code de plantes Famille Masse d'extrait (mg) Rdt (%) Code Nom partie de plante Code extraits Type d'extrait

6 Ether 778,7 3,9 Hoya kerrii 13 CL357 089 P. aériennes 3 MeOH 817,3 4,1 វលិ្ព្តកចៀរដំរី Craib Asclepiadaceae

4 Eau 1885,6 9,4

6 Ether 530,25 2,6 Dischidia nummularia 14 CL415 168 P. aériennes 3 MeOH 92,5 0,5 កេវ讶វវលិ្ R. Br. Asclepiadaceae

4 Eau 571,8 2,8

6 Ether 229,5 1,1

220 Feuilles 3 MeOH 617,8 3,1

4 Eau 852,6 4,3

6 Ether 110,05 0,5 Chonemorpha fragrans 15 / (Moon) Alston CL460 221 Tiges Apocynaceae 3 MeOH 1079,3 5,4

4 Eau 277 1,4

6 Ether 486,2 2,4

222 Fruits 3 MeOH 4152,3 20,8

4 Eau 1293,9 6,5 6 Ether 3322,55 16,6 Dischidia major 16 CL509 037 P. aériennes 3 MeOH 1358,35 6,8 វលិ្រងគងពរែរ (Vahl) Merr. Asclepiadaceae 4 Eau 1174,8 5,9

6 Ether 195 1.0

045 P. aériennes 3 MeOH 1667,6 8,3 Spirolobium cambodianum 4 Eau 1115,05 5,6 17 CL514 រកព្មើរគុមពរិឹរតូច Baill. Apocynaceae 6 Ether 173,85 0,9 046 P. souterraines 3 MeOH 1098,45 5,5 4 Eau 628,2 3,1 6 Ether 457,7 2,3 Dischidia hirsuta 18 / (Bl.) Decne. CL520 055 P. aériennes Asclepiadaceae 3 MeOH 530,1 2,7 4 Eau 3302 16,5 6 Ether 1007,1 5,0 3 MeOH 677,15 3,4 Dischidia imbricata 19 CL522 057 Pl. entière វលិ្習រោរព្ងូល (Bl.) Steud. Apocynaceae 4 Eau 1772,2 8,9

Partie de plante Extraits o N Nom Khmer Nom Latin Code de plantes Famille Masse d'extrait (mg) Rdt (%) Code Nom partie de plante Code extraits Type d'extrait 6 Ether 314,75 1,6 Epigynum griffithianum 20 / Wight CL525 060 P. aériennes Apocynaceae 3 MeOH 831,6 4,1 4 Eau 1453,1 7,3 6 Ether 171,1 0,9 005 Feuilles 3 MeOH 2622,5 13,1 Feroniella lucida 4 Eau 2954,75 14,8 21 ព្រ羶ំង Swingle CL598 Rutaceae 6 Ether 73,5 0,4 006 Tiges 3 MeOH 336,85 1,7 4 Eau 550,25 2,8 6 Ether 763,45 3,8 015 Feuilles 3 MeOH 4203,5 21,01 Aganonerion polymorphum 4 Eau 2411,1 12,05 22 Pierre ex Spire CL603 Apocynaceae វលិ្ថថ្នឹង,កោតព្រហ្ម 6 Ether 231,25 1,6

016 Tiges 3 MeOH 448,9 2,2 4 Eau 165,4 0,8 6 Ether 409,05 2,04 059 Feuilles 3 MeOH 1640 8,2 Glycosmis pentaphylla 4 Eau 2233,15 11,2 23 (Retz.) DC. CL638 Rutaceae ភ្ិំង, ភ្ិីងភ្ិំង 6 Ether 30,05 0,2

060 Tiges 3 MeOH 182,3 1,0 4 Eau 283,3 1,4 6 Ether 411,8 2,05 107 Feuilles 3 MeOH 960,7 4,8 4 Eau 3452,95 17,3 6 Ether 44,95 0,2 Limonia acidissima 24 CL668 108 Tiges Rutaceae 3 MeOH 426,05 2,1 ខ្វ្ត L. 4 Eau 464,7 2,3 6 Ether 190,65 1,0

109 Fruits 3 MeOH 1826,95 9,1 4 Eau 2036,4 10,1

Code de Partie de plante Extraits Masse d'extrait No Rdt (%) Nom Khmer Nom Latin Famille plantes Code Nom partie de plantes Code extraits Type d'extrait (mg) 6 Ether 622,65 3,1

006 Feuilles 3 MeOH 3300,1 16,5 Sonneratia ovata 4 Eau 1239,85 6,2 25 Backer CL891 Sonneratiaceae អំពា 6 Ether 69,85 0,3

007 Tiges 3 MeOH 967,1 4,8 4 Eau 850,6 4,3 6 Ether 157,95 0,8

093 Feuilles 3 MeOH 954,9 4,8 Sonneratia alba 4 Eau 591,35 3,0 26 អំពាធំ, ព្រញឹរធំ Sm. CL959 Sonneratiaceae 6 Ether 81,5 0,4 094 Tiges 3 MeOH 339,35 1,7 4 Eau 1155,8 5,8

4.2- Etudes phytochimiques

Le criblage phytochimique a été réalisé sur 44 parties de plantes issues de 26 espèces réparties dans 4 familles. Trois extraits ont été réalisés à partir de chaque partie de plante (extraits éthéré, méthanolique et aqueux). En tout, 132 extraits ont été donc étudiés.

L’extrait éthéré permet de récupérer les éventuelles huiles essentielles et alcaloïdes présents dans la partie de plante. En plus, leur saponification permet en outre de mettre en évidence la présence des caroténoïdes et des stéroïdes-triterpènes (fraction insaponifiable) ainsi que des coumarines, des anthraquinones, des acides gras et des flavonoïdes (la fraction saponifiable). En outre, l’extrait méthanolique peut contenir des alcaloïdes, des tanins, des composés réducteurs et des saponines. Son hydrolysat permet de caractériser les anthraquinones, les coumarines, les flavonoïdes et le groupe stérols-triterpènes. En effet, la phase acide sert à la recherche des anthocyanes.

Enfin, l’extrait aqueux peut contenir des alcaloïdes, des saponines, des tanins, des composés réducteurs, des peptides, des acides aminés, et de l’amidon.

Les tests de coloration et précipitation permettent d’identifier la présence des composés dans nos plantes et le test anti-oxydant DPPH (2-2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), permet de mettre en évidence la présence de l’activité anti-oxydante des extraits méthanoliques, les extraits qui possèdent le rendement importants. De ce fait, la description et les résultats obtenus lors du test de criblage phytochimique et du test anti-oxydant DPPH sont décrits dans la page qui suit.

4.2.1- Aganosma marginata (Roxb.) D.J. Middleton  Famille : Apocynaceae  Synonymes : Aganosma acuminata (Roxb.) G. Don, Amphineurion acuminatum (Roxb.) Pichon

 Nom Khmer : Krâllam’ paè , brolav’ porpaè រកឡំតព, របនៅពតព

Description botanique : Aganosma marignata est une liane à latex blanc jaunâtre ou verdâtre à 8 m hauteur avec tiges et branches lenticelles. Les feuilles simples, opposées, oblongues-lancéolées ou oblongues-elliptiques, acuminées plus ou moins brusquement au sommet de 1,5 - 2,5 cm de large, 6,5 à 8,5 cm de long. L’inflorescence en cyme terminale corymbiforme. Les fleurs blanches ou blanc crème en forme de soucoupe, odorantes, en cymes terminales axillaires, corymbiformes. Les fruits à 2 follicules, linéaires, cylindriques, faiblement divergents, grêles, pendants, souvent lenticellés. Les graines nombreuses avec comas caduques, linéaires, oblongues; aigrette de poils longs de 2 - 3,5 cm. Elle peut être trouvée dans les forêts de montagne, au bord de mer, broussailles, Guangdong, Cambodge, Inde, Indonésie, Laos, Malaisie, Philippines, Thaïlande, Vietnam26, 27, 28.

Figure 38 : Photo d’Aganosma marginata (Roxb.) D.J. Middleton

(Pris par M. Matieu LETI). 54

Usage traditionnel : Les feuilles, les fleurs et les graines sont utilisées pour la digestion, diurétique et antimicrobienne. La tige est utilisée pour le traitement des maladies de la peau et des abcès internes. En décoction, la tige est également utilisée comme antidiabétiques. La racine est utilisée comme tonifiant pour les patients convalescents de la fièvre, le traitement des dysfonctionnements des reins et du foie, augmentation de l'écoulement menstruel, la décoction de la racine est également utilisée comme laxatif. Les feuilles sont administrées pour soulager les douleurs musculaires et contre les abcès et les hémorroïdes en application directe27.

Composition chimique : Cette plante contient les alcaloïdes, les huiles essentielles, les stéroïdes, les C-glycosides, les saponines, les tanins, les composés réducteurs, les flavonoïdes et les caroténoïdes.

Activité anti-oxydante : L’extrait méthanolique de cette plante présente l’activité anti- oxydante dont la CI50 est égale à 20,70 ± 2,73 µg/mL (n = 2).

4.2.2- Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire  Famille : Apocynaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : Voër kaôt prum’, Voër thnöng វលលិនកាតរពំ, វលលិថនឹង

Description botanique : Aganonerion polymorphum est une liane à latex blanc des formations dense et secondaire d’origine d’Asie du Sud (Cambodge et Sud-Viêtnam) qui atteint 1,5 - 4 m. Les feuilles sont simples, opposées, ovales, lancéolées ou elliptiques, de 2 - 4 cm de large, et 4 - 6 cm de long. Les fleurs roses ou blanches, groupées par 2 - 5 en grappes de cymes terminales denses. Les fruits à 2 follicules, linéaires, submoniliformes, acuminés et aiguës au sommet. Les graines oblongues, tronquées ou à peine rétrécies au sommet, aplaties, velues, brunes avec comas blanchâtres28, 29.

Figure 39 : Photo d'Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire

(Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : La racine est utilisée pour soulager les crampes abdominales et des douleurs musculaires29.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les tanins, les C-glycosides, les stéroïdes, les flavonoïdes, les composés réducteurs et les polysaccharides.

Activité anti-oxydante : L’extrait méthanolique de cette plante présente une activité anti- oxydante dont la CI50 est égale à 36,94 ± 2,65 µg/mL (n = 2).

4.2.3- Amalocalyx microlobus Pierre ex Spire  Famille : Apocynaceae  Synonymes : Amalocalyx burmanicus Chaterterjee; A. yunnanensis Tsiang.  Nom Khmer : ø, kheua mak yam (en Thailand), ou mao che teng (en Chine)

Description botanique : Amalocalyx microlobus est une plante qui pousse en tant que grimpeur, 10 m - 15 m de long, ou comme un arbuste à port étalé, jusqu'à 2 m de hauteur. Les branches sont densément cheveux, et la tige parfois sécrète un latex blanc quand on les coupe. Les feuilles sont minces comme du papier, de taille 3,7 cm - 24,0 cm x 2,4 cm - 18,2 cm. Les inflorescences de plus en plus à l'extrémité des tiges de 9 cm à 25,5 cm de long, de produire 15 - 30 blanchâtre, rose-violet fleurs en grappes, chacun 2,3 cm - 3,1 cm de long. Les fruits vert est un follicule qui se divise en deux sections, chacune 8 cm - 10 cm de long et 1,2 cm - 1,8 cm de large. Les follicules sont de couleur brune et velue avec les semences à plat. Il se trouve en Thaïlande, en Birmanie, au Vietnam et en Chine du Sud. Au Laos, il pousse dans tout le centre et le nord du pays30.

Figure 40 : Photo d’Amalocalyx microlobus Pierre ex Spire (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les fruits (mûrs) sont comestibles et souvent utilisées comme épices dans les currys ou salade de papaye.

Composition chimique : Elle contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les tanins, les flavonoïdes, les C-glycosides, les saponines, les coumarines, les composés réducteurs, les anthocyanes, les polysaccharides, les peptides et les acides aminés.

Activité anti-oxydante : Elle possède un pouvoir anti-oxydant dont la CI50 est égale à 28,40 ± 2,80 µg/mL (n = 2).

4.2.4- Chonemorpha fragrans (Moon) Alston  Famille : Apocynaceae  Synonyme : ø  Nom Khmer : ø

Description botanique : Chonemorpha fragrans est un genre d'arbuste grimpant, vivace lacticifère blanc, trouvé dans les régions indo-malais. Les grandes fleurs voyantes douces parfumées. Les feuilles sont opposées simples, glabres coriaces en-dessus et en-dessous pubescent. Les fruits en capsule d'environ 25 cm de long contiennent de nombreuses graines couronnées de poils, qui l’aident par le vent la dispersion. La tige est verte fibreuse et sombre. L’écorce est brun-rouge ou gris et douce31.

Figure 41 : Photo de Chonemorpha fragrans (Moon) Alston (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : La racine et la tige sont utilisées comme laxatif, maladies de l'estomac, les maladies de poitrine, le rhumatisme. Le latex obtenu est utilisé pour purgatif32.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les tanins, les C-glycosides, les stéroïdes, les triterpènes, les saponines, les flavonoïdes, les composés réducteurs, les coumarines et les peptides.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée).

4.2.5- Chonemorpha macrantha Pit.  Famille : Apocynaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : voë âng kât’ krâhâ:m វលលិអងគត់រកហម

Description botanique : Chonemorpha macrantha est une liane vivante sur les arbres. Ils sont trouvés dans les forêts de l’Indochine. Son écorce est employée pour faire des cordages29.

Figure 42 : Photo de Chonemorpha macrantha Pit (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : La tige de cette plante est utilisée comme tonique.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les tanins, les saponines, les C-glycosides, les composés réducteurs et les anthocyanes.

Activité anti-oxydante : Elle possède un pouvoir anti-oxydant dont la CI50 égale à 10,84 ± 1,01 µg/mL (n = 2).

4.2.6- Dischidia imbricata (Bl.) Steud.  Famille : Apocyanaceae  Synonyme : Dischidia imbricata (Blume) Warb.

 Nom Khmer : voa srâka: pungru:l វលលិ習សកាពរងូល

Description botanique : Liane herbacée, fixée sur les branches ou les troncs d’arbres ou d’arbustes qui sont rencontrés dans les forêts de l’indochine, de la Malaisie et de l’Indonésie29.

Figure 43 : Photo de Dischidia imbricata (Bl.) Steud (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les racines et les tiges sont utilisées contre la toux33.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les stéroïdes, les alcaloïdes, les C-glycosides, les tanins et les saponines.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 78,87 ± 6,14 µg/mL (n = 2).

4.2.7- Epigynum griffithianum Wight  Famille : Apocynaceae  Synonyme : Legouixia amabilis Van Heurck & Müll.Arg.  Nom Khmer : ø

Description botanique : Epigynum griffithianum est des rameaux tomenteux; branches glabres et lenticelles. Les feuilles sont 0,7 à 1,5 cm, de long pétiole; limbe papyracée coriace, elliptique à obovale, cunéiforme base avec apex aigu à courtement acuminé à obtus. Les nervures secondaires ont 5 - 11 paires. L’inflorescence varie entre 3 et 6,5 cm de long, tomenteux. Sépales ovales, apex aigu à acuminé, tomenteux ou pubérulent. Corolle blanche. Les graines sont de 28 - 31 x 2,5 à 2,7 mm et coma de 3 à 3,4 cm de long34.

Figure 44 : Photo d’Epigynum griffithianum Wight (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Aucun document trouvé.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les tanins, les caroténoïdes et les polysaccharides.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée).

4.2.8- Holarrhena curtisii King & Gamble  Famille : Apocynaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : tük dâhs klâ touch ទឹកនោោះខ្លលតូច

Description botanique : Holarrhena curtisii est un arbrisseau ou arbuste de haut de 1 - 2 m, rencontrés souvent dans les forêts du Cambodge, du Laos, du Viêtnam de Sud et de la Thaïland. Les feuilles sont simples. Le pétiole est de 5 mm de long et rainuré en-dessus. Ces inflorescences sont longuement pétiolées en cymes terminales. Les fleurs sont blanches et tubulaires avec cinq tordus lobes. Les fruits sont des paires de follicules qui sont de 18,5 × 25,0 cm de long29, 35.

Figure 45 : Photo de Holarrhena curtisii King & Gamble (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les feuilles sont utilisées pour combattre les dysenteries, diurétiques, normalement pour les enfants. Les tiges, les écorces et les racines sont fréquemment utilisées sous forme de décoction et quelquefois de teinture dans l’alcool faible29, 35.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les tanins, les composés réducteurs, les saponines, les caroténoïdes.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 19,24 ± 3,28 µg/mL (n = 2).

4.2.9- Parameria laevigata (Juss.) Mold.  Famille : Apocynaceae  Synonymes : Parameria barbata (Blume) K. Schum., Parameria glandulifera (Wallich ex G. Don) Benth. ex Kurz36 .

 Nom Khmer : vor angkat’ sor វលលិអងគត់ស

Description botanique : Parameria laevigata est une plante pérenne qui atteint jusqu'à 10 m de long. Les branches sont souvent avec des lenticelles, glabres et densément couvertes de poils vers le bas. Les feuilles sont opposées, simples, elliptiques en forme d'œuf (de 1,5 à 15 cm x 0,7 - 6,3 cm). La tige est de 1 - 5 m de long, avec des glandes dans son aisselle. Les fleurs parfumées sont 5-mères et à symétrie radiale, avec des sépales en forme d'œuf. Les fleurs velues à poils sont de 0,5 à 1,3 mm x 0,4 à 0,9 mm. Ses pétales blancs sont lobés dans les bourgeons et se chevauchent à gauche. Le fruit est glabre à follicules appariés, 12 - 32 cm x 0,4 à 0,7 cm. La graine est elliptique avec une taille allant de 5,7 à 12 mm entre 1,1 à 4 mm, brun et velu29, 36, 37.

Figure 46 : Photo de Parameria laevigata (Juss.) Mold (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Toutes les parties de la plante sont utilisées pour traiter les rhumatismes, la néphrite, et les blessures. Le latex est utilisé en pharmacopée pour luter contre les maux d’estomac, la fièvre, et comme tonique. Les fragments d’écorce et de petites branches sont des préparations d’un remède contre le paludisme33, 37

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les C- glycosides, les saponines, les stéroïdes, les tanins, les triterpènes, les composés réducteurs, les flavonoïdes et les peptides.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique présente un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 47,69 ± 4,48 µg/mL (n = 2).

4.2.10- Spirolobium cambodianum Baill.  Famille : Apocynaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : Kâmrëk kum touch កនរមើកគុមពសលឹកតូច

Description botanique : Spirolobium cambodianum est un sous-arbrisseau de 30 - 60 cm, glabre, à tiges raides, peu ou pas ramifiées. Les feuilles sont elliptiques ou linéaires, plus rarement ovales ou obovales, de 2,7 à 8 x 0,3 à 3,3 cm, à sommet aigu ou acuminé à arrondies. Le pétiole et la nervure médiane sont peu pubescents. L’inflorescence avec axes pubescents, souvent avec colleter l'intérieur. Les fleurs blanches, groupées par 1 - 3 à l’aisselle des feuilles supérieures. Les fruits à 2 follicules de 8,5 à 19 cm de long, 2,2 à 3,5 mm de diamètre. Les graines nombreuses de 4 - 9 x 0,8 à 1,4 mm, aplati, pubescent minutieusement sur un côté, coma 12 - 37 mm de long28, 34, 38.

Figure 47 : Photo de Spirolobium cambodianum Baill (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : L’infusion de la racine est utilisée comme fébrifuges ou aphrodisiaques. La macération dans l’alcool sert comme lotion contre le gonflement des membres29, 33.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les tanins, les C-glycosides, les saponines, les flavonoïdes, les composés réducteurs, les coumarines, les caroténoïdes et l’amidon.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 16,51 ± 0,74 µg/mL (Pour la partie aériennes) et 83,51 ± 4,74 µg/mL (Pour la partie souterraine) (n = 2).

4.2.11- Willughbeia edulis Roxb.

 Famille : Apocynaceae  Synonymes : Ambelania edulis (Roxb.) J. Presl; Willughbeia cochinchinensis (Pierre ex Pit.) K. Schum; Ancylocladus cochinchinensis Pierre29, 39, 40 .

 Nom Khmer : vor kuy’ វលលិគុយ

Description botanique : Willughbeia edulis est une liane ligneuse grimpante d’un arbre. Les branches glabres, lenticellées. Les feuilles sont 0,8 à 1,9 cm de long. Les pétioles, les lames papyracées coriaces, elliptiques, obovales ou oblongues, de 3,7 à 14 x 1,2 à 11,5 cm, à sommet acuminé, cunéiforme à base arrondie. L’inflorescence axillaire; à 2,8 cm de long; axes au moins en partie peu pubérulent. Les sépales sont ovales, 1,8 à 2,6 x 0,8 à 1,7 mm, apex obtus à arrondis, rarement aigu; glabres, ciliées. Fruit globuleux ou ovoïde, jaune ou orange. Les graines sont glabres de 6 - 16 x 4 - 13 x 3 - 6 mm. Toutes les parties de la plante contiennent beaucoup de latex29, 33, 34.

Figure 48 : Photo de Willughbeia edulis Roxb (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : La tige est utilisée pour lombalgie. La racine est utilisée dans le traitement de la dysenterie, de l’hépatite, de l’urticaire et du post partum41.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les triterpènes, les C-glycosides, les stéroïdes, les tanins, les flavonoïdes, les anthocyanes, les composés réducteurs, les saponines, les caroténoïdes et les peptides.

Activité anti-oxydante : Elle possède un pouvoir anti-oxydant très important dont la CI50 est égale à 7,64 ± 0,15 µg/mL (n = 2).

4.2.12- Wrightia pubescens R.Br.

 Famille : Apocynaceae  Synonymes : Anasser laniti Blanco; Wrightia annamensis Eberh. & Dubard; Wrightia kwangtungensis Tsiang; Wrightia laniti (Blanco) Merr.; Wrightia pubescens subsp. Laniti. (Blanco) Ngan42

 Nom Khmer : Shaèng kuëng’ តសលងគង់

Description botanique : Wrightia pubescens est un arbre assez grand jusqu'à 35 m de haut avec surface de l'écorce profondément fissurée, rameaux glabres à densément pubérulents quand il est jeune. Les feuilles sont étroitement ovales ou ovales à oblongues-ovales ou elliptiques, de 5 - 15 cm x 2 - 7 cm, glabres à densément pubérulent en-dessus, avec 8 - 15 paires de nervures secondaires, pétioles de 0,4 à 0,8 cm de long. Les fleurs sont blanches à jaune rouge ou rose ou même sombres34.

Figure 49 : Photo de Wrightia pubescens R.Br. (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les racines et écorces sont utilisées pour soigner la furonculose et le rhumatisme29.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les caroténoïdes, les C-glycosides, les stéroïdes, les triterpènes, les saponines et les peptides.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 70

4.2.13- Dischidia hirsuta (Bl.) Decne  Famille : Asclepiadaceae  Synonyme : ø  Nom Khmer : ø

Description botanique : Dischidia hirsuta est un épiphyte ou épilithique plante rencontrée dans les forêts en Asie du Sud. Les petites feuilles et des tiges filiformes sont couvertes de petits poils. Les tiges et les branches charnues, sont généralement montées par des racines adventives, parfois aussi volubile, ou la pendaison. Les feuilles sont opposées ou en partie, en verticilles de 3 ou 4, charnue. Les inflorescences sont extra-axillaires, petites avec rachis épais, souvent ramifiée, éventuellement allongée, produisant une série de groupes souvent ombelliforme de fleurs très petites. Calice à 5 glandes basales. Corolle blanche, rouge ou violet, ovoïde à urcéolé, avec une bouche étroite, charnue; lobes valvaires dans le bourgeon, souvent velues43, 44.

Figure 50 : Photo de Dischidia hirsuta (Bl.) Decne (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : La feuille est utilisée comme la pommade pour l'eczéma et l'herpès45.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les tanins et les polysaccharides.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 71

4.2.14- Dischidia major (Vahl) Merr.  Famille : Asclepiadaceae  Synonymes : Collyris major Vahl; Dischidia rafflesiana Wallich46, 47.

 Nom Khmer : vor bankong kgéck វលលិបងគងតកអក

Description botanique : Dischidia major est un épiphyte, plante grimpante d’une tige. Les feuilles sont plates-orbiculaires, 2 - 3 cm de diamètre et 6 - 12 cm de long. L'inflorescence est 0,5 à 5 cm de long pédoncule, simple ou bifide. Le pétale est de 8 - 10 mm de long, jaune-vert et il y a des lobes à l'intérieur avec des poils courts blancs. Au fil du temps ces feuilles servent de domiciles des fourmis et pour la collecte de l'eau ou des organes de stockage48.

Figure 51 : Photo de Dischidia major (Vahl) Merr (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les racines et les tiges sont utilisées comme antitussif29.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les flavonoïdes, les saponines et les tanins.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 égale à 118,9 ± 1,69 µg/mL (n = 2). 72

4.2.15- Dischidia nummularia R. Br.

 Famille : Asclepiadaceae  Synonymes : Collyris minor Vahl; Dischidia minor (Vahl) Merr.; Dischidia orbicularis Decne49.

 Nom Khmer : lèv arv vöer កេវ讶វវលិ្

Description botanique : Dischidia nummularia est une liane herbacée, fixée sur les branches ou les troncs d’arbre. Elles sont les plus rencontrées dans les forêts claires de l’indochine, de la Malaisie et de l’Indonésie. Cette épiphyte peut atteindre une hauteur de 2,7 m. Les feuilles grises, charnues, coriaces, glabres. L’inflorescence est une ombelle de petites fleurs blanches tubulaires avec un anneau de poils à l’intérieur. Le pétiole nul ou très court de 1 - 2 mm; limbe orbiculaire, de 7 - 10 mm de diamètre; nervures latérales obsolètes. Les fleurs sont écarlates, presque sessiles, en ombelles latérales à pédoncule très court. Les graines sont en forme de flacon aplati, tronqués au sommet28, 29, 50, 51.

Figure 52 : Photo de Dischidia nummularia R. Br (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les racines et les tiges sont utilisées contre la toux. La plante entière contre la variole, tonique. Les feuilles sont utilisées pour le traitement de l’otite et de la conjonctivite29, 41.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides et les peptides.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 73

4.2.16- Hoya kerrii Craib  Famille : Asclepiadaceae  Synonyme : Hoya obovata var. kerrii (Craib) Costantin

 Nom Khmer : vor tror jeak’ damrey’ វលិ្ព្តកចៀរដំរី

Description botanique : Hoya kerrii a deux formes, l’une avec des feuilles glabres et l’autre en suède texturé de feuilles. Les feuilles sont opposées et épaisses, en forme de cœur ou plates pointues, environ 9 - 12 cm de long et 7 - 9 cm de large. La couleur est vert foncé et allume- dessous. Les fleurs sont réfléchies, rose pâle avec des couronnes très sombres rose. Chaque fleur est d'environ 1,5 cm et produit beaucoup d’orange ou marron nectar. Dans chaque ombelle, il y a 15 - 30 fleurs. La floraison peut persister pendant deux semaines qui ont une odeur chlorée52, 53.

Figure 53 : Photo de Hoya kerrii Craib (Pris par Pr. CHENG Sun Kaing).

Usage traditionnel : La partie entière est utilisée contre la leucorrhée.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les C-glycosides, les stéroïdes, les tanins, les saponines, les polysaccharides, les peptides et les coumarines.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 74

4.2.17- Tylophora asthmatica (L.f) Wight & Arn.  Famille : Asclepiadaceae  Synonyme : Tylophora indica (Burm. f.) Merr.

 Nom Khmer : vöer krich, kôksom, Kbal prambei វលលិនរគច, កុកសាម, កាលរបំបី Description botanique : Tylophora asthmatica est une liane grêle, glabre ou pubescente- tomenteuse, vivace indigène en Inde. Les feuilles sont ovales ou oblongues, arrondies ou cordiformes à la base. Les fleurs atteignent 1 cm ou plus, sont verdâtres à l’extérieur et jaune à l’intérieur, en ombelles de cymes axillaires plus courtes que les feuilles. Les tiges sont finement poilues. Les graines aigrettées, plates, ailées, rouges-brunes54, 28.

Figure 54 : Photo de Tylophora asthmatica (L.f) Wight & Arn.

(Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les feuilles et racines sont utilisés pour le traitement anti-asthmatique et anti-allergique. Il est aussi efficace dans le traitement de la bronchite, des rhumatismes, de la dermatite, du cataplasme, d’entorse et de luxation54 .

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les tanins, les saponines et les peptides.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 75

4.2.18- Atalantia citroides Pierre ex. Engl. & Prantl.  Famille : Rutaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : krô:ch préi រកូចថ្រព

Description botanique : Atalantia citroides est un arbuste, haut de 2 - 8 m, trouvé dans les formations secondaires du Cambodge et du Viêt-nam. Les feuilles sont alternes et apiculées, coriaces, oblongues, glabres. Les tiges sont finement épineuses. Les fleurs blanches odorantes, solitaires ou en grappes. Les fleurs à 5 sépales, 5 pétales blanchs. Les fruits sont sphériques, de 10 à 15 mm de diamètre, de saveur acre et acide29, 33.

Figure 55 : Photo d’Atalantia citroides Pierre ex. Engl. & Prantl. (Pris par M. Matieu LETI). Usage traditionnel : Les fruits sont utilisés comme ceux du citronnier. Les infusions de tiges seraient fortifiantes. Le bois de la tige carbonisé est utilisé comme charbon végétal33.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les saponines, les tanins et les composés réducteurs.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 76

4.2.19- Feroniella lucida Swingle  Famille : Rutaceae  Synonyme : Feronia lucida Scheff.

 Nom Khmer : Krörsang’ រកសាំង

Description botanique : Feroniella lucida est un petit arbre épineux, haut de 6 - 15 m, originaire de Java, du Viêt Nam et de Thailande. Les feuilles sont paripénnées, épaisses, vert foncé, brillantes et glabres en dessus, à 3 paires de folioles, sessiles, coriaces, ovales, arrondies au sommet, cunéiformes à la base. Il fleurit plus rarement. Les fleurs sont vertes, puis blanc grisâtre, odorantes, en bouquets assez grands, axillaires ou terminaux de cymes triflores. Les fruits sont sphériques avec un tégument mince dur et petites graines nombreuses. Ces fruits et fleurs se servent comme légumes dans la préparation de certains plats cambodgiens29, 55, 56 .

Figure 56 : Photo de Feroniella lucida Swingle (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les écorces, les fruits, les feuilles sont utilisées dans le cas tonique, la grippe, et le prolapsus utérin41.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les composés réducteurs, les tanins et les polysaccharides.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 80,9 ± 10,55 µg/mL (n = 2). 77

4.2.20- Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC.  Famille : Rutaceae  Synonymes : Glycosmis arborea (Roxb.) DC.; Glycosmis chylocarpa Wight & Arn. Glycosmis quinquefolia Griff.; Limonia arborea Roxb.; Limonia pentaphylla Retz. Myxospermum chylocarpum (Wight & Arn.) M. Roem.

 Nom Khmer : pleaing’; pling’pleaing’ ភាលំង, ភលីងភាលំង

Description botanique : Glycosmis pentaphylla est un petit arbre atteignant 6 m, à feuilles persistantes. Les branches sont glabres. Les feuilles sont alternes, pennées avec une foliole terminale non appariée avec 3 - 5 folioles soutenues par une tige. L'inflorescence est découlante de l'aisselle, particulaire, allongée jusqu'à 8 cm de long, étroite, blanches. Les fleurs sont blanches, blanc-verdâtre ou verdâtres, en grappes d’ombelles terminales ou à l’aisselle des feuilles supérieures, odorantes. Les fruits sont sphériques en inflorescences fructifères, blanc au rose ou pourpre, de 10 à 13,5 mm en diamètre, comestibles et sucrés à maturité57, 58.

Figure 57 : Photo de Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les parties utilisées sont racines, feuilles, et tiges dans le cas rhumatisme, post partum, galactagogue, haemostatique, hypertension, anthelmintique, hépatite41.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les caroténoïdes, les C-glycosides, les composés réducteurs, les flavonoïdes, les tanins, les saponines et les coumarines.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée).

4.2.21- Limonia acidissima L.  Famille : Rutaceae  Synonyme : Feronia elephantum Corrêa

 Nom Khmer : kvet ខវិត

Description botanique : Limonia acidissima est un grand arbre de plus de 9 m, rugueux, épineux écorce. Les feuilles sont pennées, à 5 - 7 folioles. Chaque foliole est 25 - 35 mm de long et 10 - 20 mm de large, avec un parfum d'agrumes quand on les écrase. Le fruit est une baie 9,5 cm de diamètre, et peut être doux ou aigre. Il a une croûte très dure qui peut être difficile à craquer et contient le collant de la pâte brune et des petites graines blanches. L’endocarpe du jeune fruit est blanc et très astringent. Il devient de plus en plus brun et sucré à maturité, avec des graines dures59 .

Figure 58 : Photo de Limonia acidissima L (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les fruits utilisés comme tonique, la dysenterie, la diarrhée, les maladies du foie, la toux chronique. Les racines sont très populaires comme un remède pour l’antivenimeux59 .

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les tanins, les triterpènes, les C-glycosides, les flavonoïdes, les coumarines, les polysaccharides, les saponines, l’amidon et les peptides.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée).

4.2.22- Micromelum falcatum (Lour.) Tanaka  Famille : Rutaceae  Synonyme : Aulacia falcata Lour.; Micromelum octandrum Turez.

 Nom Khmer : romleay smorng រំោយសមង

Description botanique : Micromelum falcatum est un arbre atteignant 1 - 3 m de haut. Les feuilles sont vertes jaunâtres, imparipennées à 5 - 11 folioles, lancéolées pétiolules de 3 - 7 mm; lames notice alternes, ovales à lancéolées, inéquilatérales à la base. Les fleurs blanches, blanchâtres ou jaunes, en inflorescences pubescentes plus courtes, ellipsoïdes ou de manière large à terminale de bourgeons. Pétales blancs, oblongs peu ou pas velue. Les fruits sont jaunes, oranges ou rouges, glabres, ellipsoïdes à obovoïdes, charnus de 8 - 10 × 7 - 9 mm, à nombreuses glandes, 2 - 3 loges. 1 ou 2 graines par loge60.

Figure 59 : Photo de Micromelum falcatum (Lour.) Tanaka (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Les tiges et les feuilles s’utilisent pour combattre la toux et pour post partum. Les feuilles sont également utilisées comme emménagogues, et sont employées pour préserver les plaies de l’infection et les piqûres d’insectes. La sève sert au laquage des dents41, 56.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les C- glycosides, les coumarines, les flavonoïdes, les tanins, les composés réducteurs, les saponines et les anthocyanes.

Activité anti-oxydante : Très peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 81

4.2.23- Micromelum minutum (Forst.) Wt. & Arn.  Famille : Rutaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : kantrok chhesh’ កន្នាទកនឆអោះ

Description botanique : Micromelum minutum est un petit arbuste avec les feuilles sans stipules imparipennées, folioles alternes, presque inégales à la base. Les inflorescences terminales ou axillaires, en panicule pyramidale, plus ou moins velues. Les fleurs sont pédicellées ou subsessiles, articulées. Les fruits glabres ou velus, sphériques, ovoïdes ou ellipsoïdes sans style persistant quand ils sont mûrs, sans pulpe. Les graines ont 1 - 2 à téguments non feutrés, cotylédons épais, non plissés61.

Figure 60 : Photo de Micromelum minutum (Forst.) Wt. & Arn. (Pris par M. Matieu LETI). Usage traditionnel : Les racines et les tiges sont utilisées pour anti-tumoral, hémostatique. Les feuilles servent dans le cas d’ulcère de la peau, d’antiseptique41.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les tanins, les flavonoïdes, les composés réducteurs, les anthraquinones (C-glycosides, Emodine), les coumarines et les polysaccharides.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée).

4.2.24- Zanthoxylum rhetsa DC.  Famille : Rutaceae  Synonymes : Fagara rhetsa Roxb.; Zanthoxylum budrunga (Roxb.) DC.

 Nom Khmer : Kamjat’ កំច្ចត់

Description botanique : Zanthoxylum rhetsa est un arbuste qui attient 12 m de haut avec des branches piquantes brunes. Les feuilles sont alternes, en bouquets à l’extrémité des rameaux, imparipennées, à 6 - 8 paires de folioles lancéolées, et ont une odeur aromatique. Les fleurs polygames, jaune verdâtre; fleurs mâles et femelles sessiles. Les fleurs femelles poussent sur un arbre séparé, avec un calice plus petit et ovaires pédicelles. Les fruits capsulaires, à une seule coque de la grosseur d’un pois, de couleur rouge, globuleux, lisses56, 62 .

Figure 61 : Photo de Zanthoxylum rhetsa DC (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : L’écorce est traditionnellement utilisée comme atidiabétique, antispasmodique, diurétique, anti-inflammatoire et dans divers maladies63, 64.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les alcaloïdes, les stéroïdes, les C-glycosides, les saponines, les polysaccharides et les acides aminés.

Activité anti-oxydante : Peu actif (La CI50 n’a pas été déterminée). 83

4.2.25- Sonneratia alba Sm.  Famille : Sonneratiaceae  Synonymes : Chiratia leucantha Montr.; Sonneratia acida Benth.; Sonneratia iriomotensis Masam.; Sonneratia mossambicensis Klotzsch ex Peters

 Nom Khmer : Ampea-thom, Krô nhep-thom អំ ធំ, រកញឹបធំ

Description botanique : Sonneratia alba est un grand arbre à plus de 15 m de haut, se produit au bord de la mangrove, dans les sols boueux, ainsi que le long des plages de sable. Les feuilles en forme de goutte sont larges et opposées et peuvent être consommées à la fois crues et cuites. Les fleurs sont assez grandes et ont de nombreuses étamines blanches et de petits pétales blancs. Les fruits sont gros (4 cm) verts, coriaces, avec en forme d'étoile et contient 100 - 150 petites graines blanches, aplaties. Les racines aériennes sont pneumatophores atteignant 30 cm à 1 m d’hauteur sous forme bambous sur le terrain pour lequel la respiration et la photosynthèse pourront avoir lieu65.

Figure 62 : Photo de Sonneratia alba Sm (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Cette plante est traditionnellement utilisée en cataplasme pour les coupures, des ecchymoses, les entorses et les enflures. Les fruits mûrs sont utilisés pour combattre les parasites intestinaux et les fruits presque mûrs sont pour la toux65.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les stéroïdes, les C- glycosides, les flavonoïdes, les caroténoïdes, les tanins, les composés réducteurs, les saponines, les polysaccharides et les peptides.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 12,54 ± 0,72 µg/mL (n = 2).

4.2.26- Sonneratia ovata Backer  Famille : Sonneratiaceae  Synonyme : ø

 Nom Khmer : Ampea អំ

Description botanique : Sonneratia ovata est un petit arbre (2 - 20 m). Les feuilles sont simples, opposées, largement ovales et vertes foncés. Le tronc est court, entouré par des minces et pointus pneumatophores (20 cm de long). L’écorce est grise et lisse. Les fleurs sont bisexuées, n’ont pas de pétales, habituellement en grappe terminale de 2 - 3, parfois solitaires, pédicelle de 1 - 2 cm de long. Les fruits indéhiscents, aplati globuleuse de couleur vert foncé quand il est jeune et vert jaunâtre quand il est mûr. Les graines sont nombreuses, arrondies, irrégulières, environ 5 mm de long, embryon droit avec les filaments blancs66.

Figure 63 : Photo de Sonneratia ovata Backer (Pris par M. Matieu LETI).

Usage traditionnel : Aucune donnée n’est documentée à l’heure actuelle.

Composition chimique : Cette plante contient les huiles essentielles, les stéroïdes, les tanins, les composés réducteurs, les C-glycosides, les flavonoïdes, les saponines et les acides gras.

Activité anti-oxydante : Son extrait méthanolique possède un pouvoir anti-oxydant dont la

CI50 est égale à 11,26 ± 2,72 µg/mL (n = 2). 86

V. DISCUSSION

Notre travail a mené sur l’identification des différents groupes chimiques, et sur la recherche de l’activité anti-oxydante de nos 26 plantes sélectionnées parmi les plantes présentes dans l’échantillothèque du Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF. Les réactions de coloration et de précipitation nous ont permis de mettre en évidence les groupes chimiques des composés chimiques : les huiles essentielles, les alcaloïdes, les composés phénoliques, les stéroïdes-terpènes, les polysaccharides, les peptides et les acides aminés, et l’amidon. Conformément au résultat attendu, on peut constater que nos plantes étudiées sont riches en composés aromatiques (huiles essentielles) ainsi qu’en alcaloïdes et stéroïdes. La majorité de plantes analysées sont dans la famille Apocynaceae, qui est connue pour sa richesse en teneur des alcaloïdes et dans la famille Rutaceae, famille riche en substances aromatiques. La présence de ces composés varie en fonction des parties et des plantes. De ce fait, les composés trouvés sont plus rencontrés dans la partie de feuilles, de tiges ainsi que de fruits, où un grand nombre de composés sont développés et formés.

Nous avons également réalisé le test anti-oxydant sur les 44 extraits méthanoliques issue de nos 26 plantes. Selon la présélection sur la plaque CCM, beaucoup de tâches anti-radicalaires sont apparues après révélation du réactif de DPPH (Figure 36). 15 extraits illustrés par le premier screening sont ensuite déterminer leur CI50. Trolox, dont la CI50 est 6,15 µg/mL, est utilisé comme référence. La CI50 (concentration inhibitrice 50 %) de ces extraits varie entre 7,64 µg/mL et 118,9 µg/mL. Parmi les 13 plantes (15 extraits) testées, 7 plantes (Aganosma marginata, Holarrhena curtisii, Chonemorpha macrantha, Willughbeia edulis, Spirolobium cambodianum, Sonneratia ovata, Sonneratia alba) présentent la CI50 inférieure à 25 µg/mL.

La plante Willughbeia édulis possède l’activité anti-oxydante la plus active (CI50 = 7, 64 ± 0,15 µg/mL). Son activité anti-oxydante semble être due à la présence des composés triterpène, flavonoïde et anthraquinone, qui sont des composés déjà connus pour leur propriété anti-oxydante. Cependant, certaines plantes possédant les faibles activités anti-oxydantes peuvent avoir d’autres propriétés pharmacologiques intéressantes. Par exemple, Limonia acidissima, la plante ne possédant pas de propriété anti-oxydante mais présente l’activité diurétique modérée 67 sur le rat ou la plante Zanthoxylum rhesta possède l’activité anti- diarrhéique et anti-nociceptive64.

L’ensemble des résultats obtenus lors du criblage phytochimique et du test anti-oxydant est consigné dans les tableaux en annexe 3 et 4.

VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Le criblage phytochimique réalisé nous a permis de caractériser les grands groupes chimiques présents dans 26 plantes jusqu’alors très peu étudiées. Les résultats obtenus sont riches et consignés dans annexe 3 ainsi qu’en annexe 4. Ils correspondent à nos attentes en considérant les familles auxquelles appartiennent les plantes étudiées (grande teneur en alcaloïdes dans les Apocynaceae et Asclepidaceae, Rutaceae riches en huiles essentielles…). L’étude approfondie de l’activité anti-oxydante donne la possibilité d’établir un lien entre les propriétés pharmacologiques et les produits majoritaires de chaque plante ainsi que leur utilisation traditionnelle. Le potentiel chimique des plantes étudiées et leurs éventuelles propriétés anti-oxydantes ont été mis en évidence grâce au test anti-oxydant DPPH réalisé à la Faculté de Pharmacie de Phnom Penh. Néanmoins, d’autres résultats sont originaux et méritent d’être approfondis.

Il pourra ensuite être envisagé d’aller plus loin dans l’identification des produits responsables des activités pharmacologiques les plus intéressantes (isolement des produits actifs par fractionnement bioguidé et détermination de leur structure).

Enfin, cette étude pourra être élargie à d’autres plantes formellement identifiées de l’échantillothèque du Laboratoire Commun de Phytochimie USSC/IRPF dont aucune étude phytochimique n’est pour l’heure recensée dans la littérature.

VII. REFERENCES

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VIII. ANNEXES Annexe 1 : Protocole des différents tests pratiqués. Quelques gouttes éther [1] sur papier filtre. Séchage à l’air  odeur Huiles essentielles 1 2 10 mL à sec. Reprise au B.M. par 3 mL liq.liq.EtHCl 0,5 N2 O(3X10)(R1). Filtrer  3 tubes  1 + MEYER ; 2 + DRAGENDORFF; 3 + WAGNER Précipité Alcaloïdes 3 Ether Ether de pétrole couleur orangé, à sec.  jaune-orangé Caroténo ïdes

(Insaponifiable) Stérols-terpènes Insoluble, séché, + 3 gttes Ac20 + 1 gtte H2SO4  bleu-vert à violet 4

Ether qq gttes évaporées sur papier tache graisseuse Acides gras 5

5 mL à sec reprise/2 mL H2O. Fluo/UV254 milieu Coumarines 6 neutre et alcalin 50 mL à sec Ether Sapo/20 mL 10 mL à sec + 5 mL EtOH 50% Liq.Liq./CHCl3 Anthraquinones 7 Saponifiable KOH N/2 (R2) + NH4OH(R4) violet liq/lig/Et20 HCl N, pH2 1mL à sec, reprise 1mL EtOH 50%. + 20 mL Flavonoïdes 8 (3 x 10) H O + 3 gttes NaOH Njaune H2O-KOH 2

Volumer à 100 mL liq.liq.Et2O (3 x 10) Phase acide éliminé

Alcaloïdes 9 Voir ligne 2 précipitation en milieu acide par Meyer (R7), Drangendorff (R8), Wagner (R9) Reflux 30’/Et2O Filtrer Filtrer sur Tanins 10 o 5 mL à sec reprise/5mL d’H2O, filtrer. Précipitation par gélatine + sel (R12) et FeCl3 (R13) Plante fritté n 2 Muni d’un 11 filtre papier (sous Composés réducteurs broyée 1 mL + 5 mL H2O. Filtrer + 1 mL Fehling (R14). Chauffer 5’  rouge (Cu2O) 200 mL + (2 x 100 mL 20 g vide) Saponines 12 0,5 mL + 10 mL H2O. Agiter fortement. Repos 10’  mousse persistante + ligne 16 positive Coumarine 13 MeOH Voir linge 6. Fluorescence milieu neutre et amoniaca l Anthraquinones 14 Et2O Voir ligne 7.NH4OH violet sur CHCl3 d’extraction liq/liq/Et2O 15 Flavonoïdes 50 mL à sec + 20 mL HCl N Voir ligne 8. Diluer + 3gttes Reflux 30’ Reflux 30’/MeOH NaOH N 15 mL + (2 x 10 mL) Marc Voir ligne 4. Ac2O+H2SO4 Stérols-terpènes 16 sur résidu 3 x 100 mL Anthocynes 17 Phase acide Couleur rouge extractible/alcool amylique Alcaloïdes 18 Voir ligne 2 Saponines 19 Voir ligne 12 Tanins 20 H2O Voir ligne 10 Peptides 21 5 mL + 200 mg ac.trichloracétique-chauffagePrécipité Acides aminés 22 5 mL +2 ml ninhydrine. Chauffer B.M 15 mincol.bleu Composés réducteurs 23 Voirviolet ligne 11 Amidon 24 1 mL +5 ml H O + 2 gttes Lugol (R17) col. ou préci. bleu Reflux 30’/H O 2 Coumarines 2 noir bleu violet 25 Marc liq/liq/Et2O Et2O Anthraquinones 50 mL + 5 mL HCl Pur. Reflux 30’ 26 3 x 100 mL 15 mL + (2 x 10 mL) Flavonoïdes 27 Triterpènes 28 H2O Marc éliminer Anthocynes 29 Acides aminés 30 97

Annexe 2 : Réactifs mis en jeu dans chaque réaction. H2O Anthocynes Acides aminés 30 R1 : HCl 0,5 N - Acide chlorhydrique pur 5 mL - Eau distillée 95 mL

R2 : KOH alcoolique 0,5 N - Hydroxyde de potassium pastilles 2,8 g - Dissoud dans le minimum d’eau distillée - Boullie refroidie (environ 2 ml) - Ethanol à 95 oC(QSP) 100 mL

R3 : HCl N - Acide chlohydrique pur 10 mL - Eau distillée 90 mL

R4 : NH4OH 10 % - Ammoniaque pure à 28 % 35 mL - Eau distillée 65 mL

R5 : NaOH N - Hydroxyde de sodium en pastilles 40 g - Eau distillée bouillie et refroidie 1 L

R6 : HCl pur - Solution commerciale d’acide chlorhydrique d = 1,18

R7 : MAYER - Chlorure mercurique 1,358 g - Iodure de potassium 5,0 g - Eau distillée 100 mL

R8 : DRAGENDORFF - solution A : + Sous-nitrate de bismuth 340 mg + Acide acétique cristallisable 4 mL + Eau distillée 16 mL - solution B : + Iodure de potassium 8 g + Eau distillée 20 mL

- Réactif : Solution A : 1 mL + Solution B : 1 mL . Acide acétique 4 mL . Eau distillée 20 mL

R9 : WAGNER - Iodure de potassium 2 g - Iode 1,27 g - Eau distillée 100 mL

R10 : CARR PRICE - Trichlorure d’antimoine 25 g - Chloroforme 50 mL - Dissoudre extemporanément

R11 : LIBERMANN - Anhydride acétique 3 gouttes (Dissolution du produit à tester) - Acide sulfurique concentré (d = 1,84) 1 à 2 gouttes

R12 : GELATINE - Gélatine 1 g - Eau distillée 100 mL

R12 bis : NaCl - NaCl 10 g - Eau distillée 100 mL

R13 : FeCl3

- Chlorure ferrique, 6H2O 10 g - Eau distillée 100 mL

R14 : FEHLING - Solution A :  Sulfate de cuivre cristallisé 34,6 g  Acide sulfurique pur (d = 1,84) 5 mL  Eau distillée (QSP) 100 mL - Solution B : . Tartrate double de sodium-potassium 200 g . Lessive de soude 10N 250 mL . Eau distillée (QSP) 100 mL . Mélanger extemporanément les solutions A et B volume à volume

R15 : GIBBS - Dibromo-2-6 quinonechlorimide 100 mg - Méthanol pur 20 mL

- Pulvériser ensuite le chromatogramme avec Na2CO3 à 10 % dans l’eau

R16 : STIASNY - Formol à 40 % (solution commerciale) 10 mL - Acide chlorhydrique pur 5 mL

R17 : LUGOL (solution iodo-iodurée) - Iode 0,2 g - Iodure de potassium 0,4 g - Eau 100 mL

R18 : ANISALDEHYDE SULFURIQUE - Anisaldéhyde 0,5 mL - Acide acétique cristallisable 50 mL - Acide sulfurique 1 mL

R19 : IODOPLATINATE DE POTASSIUM - Solution à 5 % d’acide chloroplatinique 5 mL - Solution à 10 % de KI dans l’eau 45 mL - Eau (QSP) 100 mL

R20 : MARQUIS - Formol à 40 % (solution commerciale) 3 mL - Acide sulfurique pur (QSP) 100 mL

100

R21 : EHRLICH - 4- diméthylaminobenzaldéhyde 1 g - Méthanol 75 mL - HCl pur 25 mL

R22 : NIHYDRINE - Solution tampon :  Acide citrique 4,2 g  NaOH 1N 20 mL  Eau distillée (QSP) 100 mL - Solution de ninhydrine :  Dissoudre dans 100 mL de tampon ci-dessus :

o Chlorure stanneux SnCl2, 2H2O 160 mg o ninhydrine à 4 % dans le méthylcellosolve 100 mL

R23 : VANILLINE SULFURIQUE - Vanilline 500 mg - Ethanol à 95 o 20 mL - Acide sulfurique pur 80 mL

R24 : RHODAMINE B - Rhodamine B 100 mg - Ethanol absolu 100 mL

R25 : NEU - Ethylaminodiphénylborate 200 mg - Méthanol 20 mL - Augmenter la sensibilité par pulvérisation complémentaire de P.E.G 4000 à 5 % dans l’éthanol

R26 : SEL DE BLEU SOLIDE B - Sel de bleu B 500 mg - Eau 100 mL - Pulvérisation complémentaire de NaOH 0,1 N

101

R27 : TRIM-HILL Additionner dans l’ordre : - Acide Acétique glacial 10 mL - Sulfate de cuivre à 0,2 % dans l’eau 1 mL - Eau 5 mL - Acide chlorhydrique par (R6) 0,5 mL

R28 : ACETATE BASIQUE DE PLOMB - Sous acétate de plomb 1 g - Eau distillée 2,5 mL

102

Annexe 3 : Résultats bruts du test screening phytochimique.

Anthraqui-

Stéroide-terpène Flavonoide

none

Nom de Type Nom Khmer

plantes d'extrait

Amidon

Peptides

essentielle Saponines

Acide gras Acide halcon

Coumarine

D'alcaloïdes lavonon

Test d'Huile d'Huile Test Caroténoide

Tanins

Anthocyanes

insaturé Aminés Acide

Emodine

Stéroides Stéroides F Polysacharides

Catéchine

Code de plantesCode de

Triterpène

Leucocyane

glycoside

Code partie de plante de Codepartie Composésréductuers C

Aganosma Ether + - ++ ++ ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D marginata

ព្រកៅរពរ (Roxb.) D.J. CL041 087 MeOH N/D + N/D + - - N/D - - + ------++ - N/D N/D N/D N/D Middleton Eau N/D + N/D N/D N/D - N/D - - + + - - - ++ +++ + - - - - -

Ether ++ - +/- + + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

093 MeOH N/D ++ N/D + - - N/D - - + ------+/- - N/D N/D N/D N/D

Holarrhna Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D - - + - - - - ++ +++ ------curtisii CL044 ទឹរក ោះខ្លិតូច King & Gamble Ether ++ - - +++ +++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

094 MeOH N/D +++ N/D + - - N/D - - + ------+/- - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D ------+ +++ ++ - - - - -

Ether +++ - + ++ ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

142 MeOH N/D +++ N/D + - - N/D - - + ------N/D N/D N/D N/D Atalantia citroides Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D - - + +/- - - - ++ + + - - - - -

ព្រូចព្ព្រ Pierre ex Engl. CL071 & Prantl Ether + - +/- ++ + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

143 MeOH N/D - N/D - - - N/D - - ++ ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D ------+++ - - - - -

Ether +++ - +++ - - - - + - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

008 MeOH N/D + N/D + +/- - N/D - - ++ ++ ------N/D N/D N/D N/D

Micromelum Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D +/- - - ++ - - - +++ +++ - - - ++ - - minutum CL1016 រកព្្ទរកឆែោះ (Forst.) Wt. & Ether ++ + - - + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Arn.

009 MeOH N/D - N/D + +/- - N/D - ++ - ++ - - - - - ++ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/------+ ++ - - ++ - - -

103

Anthraqui-

Stéroide-terpène Flavonoide

none

plantes Type Nom Khmer Nom de plantes

d'extrait

plante

Amidon

Peptides

essentielle Saponines

Composés

Acide gras Acide

réductuers

Coumarine

D'alcaloïdes

Test d'Huile d'Huile Test Caroténoide glycoside

Tanins

Anthocyanes

insaturé

- Chalcon Aminés Acide

Emodine

Code partie de de Codepartie Stéroides Stéroides

Flavonon Polysacharides

Catéchine

Code de

Triterpène

C Leucocyane

Ether ++ - - + + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Chonemorpha CL128 071 វលិ្អងគត់ព្រហ្ម macrantha Pit. MeOH N/D + N/D + - - N/D - - + ------++ - N/D N/D N/D N/D Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D ------++ ++ - + - - - - Ether + + - - + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D 094 MeOH N/D - N/D + +/- - N/D - - + ------+ - N/D N/D N/D N/D Eau N/D + N/D N/D N/D - N/D ------++ + - - - - + - Parameria Ether + - - - + + - - - + + - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D វលិ្អងគត់រ laevigata CL142 (Juss.) Mold. 095 MeOH N/D - N/D - - - N/D - - + ------++ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D ------++ ------

Ether +++ ------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

104 MeOH N/D + N/D + +/- - N/D - - ++ ------N/D N/D N/D N/D

Micromelum Eau N/D + N/D N/D N/D - N/D + ------++ - - - - - falcatum CL147 រំ澶យ រមង (Lour.) Tanaka Ether ++ + - + + - - ++ - + + - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

105 MeOH N/D - N/D + - - N/D +/- - + ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D +/- - - + - - - + ++ ++ ++ - - - -

Ether ++ - - - + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Zanthoxylum rhetsa CL160 131 MeOH N/D ++ N/D + - - N/D - - + ------N/D N/D N/D N/D រំាត់ DC.

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/------++ - - +/- - +/-

Ether ++ - - + + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Tylophora

វលិ្កព្គច, រុរ羶ម, រាលព្រំរី asthmatica (L.f.) CL178 164 MeOH N/D ++ N/D ++ +/- - N/D - - ++ ------N/D N/D N/D N/D Wight & arn Eau N/D ++ N/D N/D N/D - N/D - - ++ - - - - + - +/- - - - +/- -

Ether +++ + + ------+ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

016 MeOH N/D - N/D ++ - - N/D - - ++ ------N/D N/D N/D N/D

Wrightia pubesens Eau N/D + N/D N/D N/D - N/D - - ++ ------+ - - - - -

ពរិងគង់ R.Br. CL211 Ether +++ - +/- - + + - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

017 MeOH N/D - N/D ++ ++ - N/D ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D ++ N/D ------+++ - - - + -

104

Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

Nom de plantes

Nom Khmer Type d'extrait

plantes

Amidon

Peptides

essentielle

Saponines

Acide grasAcide

Coumarine

glycoside

D'alcaloïdes Tanins

Test d'Huile Test

Caroténoide

Anthocyanes

insaturé -

Chalcon

Acide AminésAcide

Emodine

Stéroides Stéroides

Flavonon

Polysacharides

Catéchine

Code de Triterpène

Leucocyane

Codepartie plante de réductuersComposés

Ether ++ - ++ - + ++ - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

Willughbeia edulis CL244 065 MeOH N/D - N/D + +/- - N/D - - ++ + - - - + - ++ +/- N/D N/D N/D N/D វលិ្គុយ Roxb.

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D ------+/- + +/- - - - + -

Ether ++ - + ------+ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D 036 MeOH N/D ++ N/D ++ ++ - N/D - - +++ +/- - - - +++ - + - N/D N/D N/D N/D Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/- - +/- ++ - - - + ++ + +/- - +/- - -

Amalocalyx Ether ++ ------+ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D microlobus / Pierre ex CL322 037 MeOH N/D + N/D ++ +/- - N/D - - + ++ - - - ++ - ++ - N/D N/D N/D N/D Spire Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - - + - - - - + + - - - + +/- Ether + + - + + - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

076 MeOH N/D + N/D ++ + - N/D - - + +/- - - - +/- - +++ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/------+ - - - - + -

Ether + + ------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

Hoya kerrii MeOH N/D + N/D +++ ++ - N/D + ------+ - ++ - N/D N/D N/D N/D វលិ្ព្ត កចៀរដំរី Craib CL357 089

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/- - +/------+ - - ++ + -

Ether ++ + - + + - - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

Dischidia nummularia MeOH N/D - N/D + + - N/D ------N/D N/D N/D N/D CL415 168 កេវ讶វ វលិ្ R. Br.

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/------+ -

105

Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

Nom de

Nom Khmer Type d'extrait

plantes

Amidon

Peptides

essentielle Saponines

Acide gras Acide

Coumarine

D'alcaloïdes

Test d'Huile d'Huile Test Caroténoide

Anthocyanes

Acide Aminés Acide

Polysacharides

glycoside

Tanins

de partie de plante de partie de

Code de plantesCode de

insaturé -

Chalcon

Séroides

Emodine

Stéroides Flavonon

Catéchine

Triterpène

Leucocyane

Co Composésréductuers

Ether +++ + ------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

220 MeOH N/D ++ N/D - - - N/D - - - + - - - - - + - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D ++ N/D ------+ - ++ - - - +/- -

Chonemorpha fragrans Ether ++ + - - ++ ++ - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D / CL460 (Moon) Alston 221 MeOH N/D ++ N/D - - + N/D - - - +/------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D + N/D N/D N/D +/- N/D - - + ------+ -

Ether ++ + - - ++ ++ - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

222 MeOH N/D +++ N/D ++ ++ - N/D - - - + - - - - + - - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/------+ +/------

Ether + + - +++ ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Dischidia major CL509 037 វលិ្រងគងពរែរ (Vahl) Merr. MeOH N/D + N/D ++ +/- - N/D - - - +/------+ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/- - - - - + ------

Ether ++ + + ------+ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

045 MeOH N/D ++ N/D + + - N/D - - - + - - - + ++ ++ - N/D N/D N/D N/D

Spirolobium Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/------++ - ++ - - - - - cambodianum CL514 រំករើរគុមពរិឹរតូច Baill. Ether ++ ------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

046 MeOH N/D ++ N/D - ++ - N/D ------++ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/------+ - +/- - - -

Ether ++ - - ++ ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Dischidia hirsuta / CL520 055 (Bl.) Decne. MeOH N/D ++ N/D + +/- - N/D ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/- - - - - + - - - - ++ - -

106

Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

Nom de

Nom Khmer Type d'extrait

plantes

plante

Amidon

Peptides

essentielle Saponines

Composés

Acide gras Acide

réductuers

s s Coumarine

e e

D'alcaloïdes

Test d'Huile d'Huile Test Caroténoide

ne C ne

Anthocyanes

ane Aminés Acide

Code partie de de Codepartie

Polysacharides

Code de plantesCode de

Tanins

Catéchi

Emodin glycosid Flavono

insaturé

Stéroide Stéroide Triterpè Chalcon Leucocy Ether + - - ++ ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Dischidia imbricata CL522 057 MeOH N/D ++ N/D + +/- - N/D ------N/D N/D N/D N/D វលិ្習រោរព្ងូល (Bl.) Steud.

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D ------++ - + - - - - -

Ether +++ - + + ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Epigynum griffithianum / CL525 060 Wight MeOH N/D ++ N/D + + - N/D ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D ------+ - - - - + - -

Ether + - - + ++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

005 MeOH N/D ++ N/D + +/- - N/D ------++ - - N/D N/D N/D N/D Feroniella lucida Eau N/D + N/D N/D N/D - N/D - - +/- - - - - ++ +/- - - - + - - CL598 ព្រ羶ំង Swingle Ether ++ - - + ++ - - - - +++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

006 MeOH N/D +/- N/D + + - N/D - - - + ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - +/------+ ++ -

Ether + ------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

015 MeOH N/D - N/D + + - N/D - - - +/- - - - - + + - N/D N/D N/D N/D

Aganonerion Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D ------+ ++ ++ - - + - - polymorphum CL603 វលិ្ថថ្នឹង, កោតព្រហ្ម Pierre ex Spire Ether + - - +++ +++ - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

016 MeOH N/D +/- N/D + + - N/D - - +/- +/- - - - - + - - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - ++ ------+ - - - - -

Ether ++ + +++ + - - - - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

059 MeOH N/D ++ N/D ++ + - N/D - - + - - - - - + - - N/D N/D N/D N/D

Glycosmis Eau N/D +++ N/D N/D N/D - N/D - - + + - - - ++ - ++ - - - - - pentaphylla CL638 ភ្ិំង, ភ្ិីងភ្ិំង (Retz.) DC. Ether ++ ------+ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

MeOH 060 N/D - N/D + ++ - N/D ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D + ------

107

Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

Nom Khmer Nom de plantes Type d'extrait

Amidon

Peptides

Saponines

Acide gras Acide

Coumarine

D'alcaloïdes

Caroténoide

glycoside Anthocyanes

Tanins

Acide Aminés Acide

insaturé -

Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Stéroides Flavonon

Code de plantesCode de

Catéchine

Triterpène

Leucocyane

Code partie de plante de Codepartie Composésréductuers Test d'Huile essentielle d'Huile Test

Ether +++ + - - +++ +++ - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

107 MeOH N/D - N/D + + - N/D - - + ------N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - ++ ++ - - - + - + - - ++ - -

Ether +/------++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D Limonia acidissima 108 MeOH N/D - N/D + + - N/D ------N/D N/D N/D N/D ខ្វ្ត L. CL668

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D +/- - + ------+/- - +/- - + -

Ether ++ - - + ++ - - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

109 MeOH N/D - N/D - - - N/D ------+ - - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D + - + - - - - - ++ + - - ++ + -

Ether + - + ------+++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

006 MeOH N/D - N/D + + - N/D - - + + - - - + + + - N/D N/D N/D N/D Sonneratia ovata Eau Backer N/D - N/D N/D N/D - N/D - - + ++ - - - + + + - - ++ + - អំពា CL891 Ether + - - + ++ - - - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

007 MeOH N/D - N/D + + - N/D - - + + - - - + + ++ - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - + + - - +/- + + + - - - - -

Ether + - ++ - - - ++ - - ++ - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

093 MeOH N/D - N/D + + - N/D - - + + - - - ++ ++ +++ - N/D N/D N/D N/D

Sonneratia alba Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - + ++ - - - ++ +/- - - - - + -

អំពាធំ, ព្រញឹរធំ Sm. CL959 Ether + - - + ++ - + - - + - - - - N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

094 MeOH N/D - N/D - - - N/D - - + - - - - + - + - N/D N/D N/D N/D

Eau N/D - N/D N/D N/D - N/D - - ++ - - - - +++ + ++ - - - - -

Les résultats ont été évalués comme suit:

+++ : Fortement positif ; ++ : Moyennement positif ; + : Faiblement positif ; +/- : Très faible positif ; - : Négatif ; N/D : Non déterminé

108

Annexe 4 : Ensemble des résultats du test anti-oxydant et du criblage phytochimique.

Activité anti- partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

o Code de

Nom aminés

N Nom Latin -

plantes partie

Famille

Amidon

Peptides

(µg/mL)

Saponines

Alcaloïdes

gras Acide Coumarine

Code de

NomKhmer

Anthocyanes

Caroténoides

glycoside Acide

Tanins

- Polysacharides

Chalcon

Emodine

Stéroides Flavonon

plante Catéchine

Triterpène

Huiles essentielles Huiles

Leucocyane

Composésréductuers

CCMScreening Stéroidesinsaturés

Aganosma marginata P. ព្រកៅ Ap 21,22 ± ++ 1 (Roxb.) CL041 087 aérienn ++ + + ++ ++ ++ - - - - + + - - - ++ ++ - - - - - . 2,00 + រពរ D.J. es Middleton

P. 22,50 ± ++ 093 aérienn ++ ++ ++ +/- + + - - - - + - - - - ++ +/------1,33 + es Holarrhen ទឹរក ោះ a curtisii Ap 2 CL044 King & . P. ខ្លិតូច Gamble souterr ++ ++ ++ ++ 094 aines- + / ++ - - - - - + - - - - + ++ - - - - - + + + + Racine s

Feuille ++ ++ 142 +/- / + ++ ++ - - - - + - - - - ++ + + - - - - - Atalantia s + + citroides Pierre ex Ru 3 CL071 ព្រូចព្ព្រ Engl. & . Prantl Ecorce ++ 143 s + +/- / + ++ +/- ++ + - - - - ++ ------+ Tiges

Micromel um Feuille ++ ++ + ++ ++ + 008 +/- / ++ + +/- - - + - ++ ------រកព្្ទរ minutum s Ru + + + + + + 4 CL1016 (Forst.) . កឆែោះ Wt. & +/ + + Arn. 009 Tiges + / ++ + - + + - - ++ + - - - + ++ ++ - - - - - + +

109

Activité anti-

Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

Code de

aminés

N Nom Latin

plantes

Famille

Amidon

Peptides

omKhmer

Saponines Alcaloïdes

Nom gras Acide

Coumarine

Anthocyanes

Caroténoides Acide

partie de Polysacharides

(µg/mL)

Huiles essentielles Huiles

Code

glycoside

Tanins 50

plante Composésréductuers

Chalcon

Emodine

insaturés

Stéroides Stéroides Flavonon

Catéchine

Triterpène

Leucocyane

CI CCMScreening

វលិ្ Chonemor- អងគត់ pha 10,84 + 5 CL128 071 Tiges Ap. +++ ++ + - + + - - - - + - - - - ++ ++ + - - - - macrantha ± 1,01 + ព្រ Pit.

ហ្ម

47,69 094 Tiges ++ + + - + + - - - - + - - - - ++ + + - - - + - ± 4,48 វលិ្ Parameria laevigata 6 CL142 Ap. អងគត់ (Juss.)

រ Moldenke + 095 Feuilles + / + ++ - - + + - - - + + - - - ++ ------+

++ + 104 Tiges +/- / + - + +/- - - + - ++ ------+ + រំ澶 Micromelum falcatum 7 CL147 Ru. យ (Lour.)

រមង Tanaka + + 105 Feuilles +/- / ++ ++ - + + - - ++ - + + - - - + ++ - - - - + +

រំ Zanthoxylum Tige+Ec + +/ + 8 CL160 131 Ru. + / ++ ++ - + + - - - - + ------rhetsa DC. orce + - /- ាត់

Tylophora P. វលិ្ asthamatica +/ +/ 9 CL178 164 aérienne As. +/- / ++ ++ - ++ + - - - - ++ - - - - + - - - - - (L.f.) Wight - - s កព្គច & Arn

110

Activité anti- Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

o Nom Code de

aminés

N -

Latin plantes Nom

Famille Amidon

partie de Peptides

(µg/mL)

Saponines

Alcaloïdes

Acide gras Acide

Code

Coumarine

NomKhmer

glycoside

Tanins Anthocyanes

Caroténoides 50

plante Acide

Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Flavonon

Catéchine

Triterpène

Leucocyane

Huiles essentielles Huiles

Composésréductuers

CCMScreening Stéroidesinsaturés

++ 016 Feuilles - / + + ++ - - - - - ++ ------+ - - - - - +

Wrigh- ពរិង tia 10 CL211 Ap. pubesen គង់ s R.Br ++ 017 Ecorces +/- / - +/- ++ ++ ++ - - - + ------+++ - - - + - +

Willugh វលិ្ beia 7,64 ± +/ 11 CL244 065 Tiges Ap. +++ ++ - ++ + + ++ - - - ++ + - - - + + ++ - - + - edulis 0,15 - គុយ Roxb.

28,40 ± ++ +/ +/ 036 Feuilles ++ ++ ++ + ++ ++ - - +/- - +++ ++ - - - ++ + - - - 2,80 + - -

Amalo calyx 30,26 ± + microlo 037 Tiges ++ ++ + - ++ +/- - - - - + ++ - - - ++ + ++ - - - + 12 / CL322 Ap. 0,13 /- bus, Piere ex Spire

076 Fruits + / + + - ++ + - - - - + +/- - - - +/- + +++ - - - + -

111

Activité anti-

Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

Code

aminés

N Nom Latin de - Nom partie

plantes Famille

Amidon

Peptides

(µg/mL)

Saponines

Alcaloïdes

Acide gras Acide Code

de plante Coumarine

NomKhmer

glycoside Anthocyanes

Tanins

Caroténoides 50

Acide

Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Flavonon

Catéchine

Triterpène

Huiles essentielles Huiles Leucocyane

Composésréductuers

CCMScreening Stéroidesinsaturés

Hoya វលិ្ព្ត កចៀ P. ++ + + + 13 kerrii CL357 089 As. + / + + - - - + - ++ - - - - + - - - + - aériennes + + + + រដំរី Craib

Dischidia កេវ讶វ P. 14 nummula CL415 168 As. + / ++ + - + + - - - - ++ ------+ - aériennes វលិ្ ria R.Br

++ + + +/ 220 Feuilles +/- / ++ ------++ + - - - + - - - - - + + + -

Chone- morpha + + +/ 15 / fragrans CL460 221 Tiges Ap. + / ++ ++ - - - - - ++ ------+ - + + - (Moon) Alston

197,3 ++ + + +/ +/ 222 Fruits + ++ - ++ - - ++ + - - - - + - - - - - 5 + + + - -

Dischidia 118,9 វលិ្រងគង major P. ++ + +/ 16 CL509 037 As. ++ 0 ± + + - - - - - + - - - + - + - - - - - (Vahl) aériennes + + - 1,69 ពរែរ Merr.

16,51 P. +/ + + + 045 +++ ± ++ ++ + + + - - - + + ------aériennes - + + + Spirolo- 0,74 bium រំករើរគុមព 17 cambodia CL514 Ap. រិឹរតូច num Baill. 83,51 P. souter- + + +/ 046 ++ ± ++ ++ ------++ ------raines + + - 4,74

112

Activité anti-

Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

lle

aminés

N Nom Latin Nom -

Fam

plantes

Code de Amidon

partie de Peptides

Composés Saponines

Alcaloïdes

Acide gras Acide

réductuers

Code Coumarine

CCM

NomKhmer

glycoside Anthocyanes

Tanins Caroténoides

plante Acide

(µg/mL) - Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Stéroides insaturés

Flavonon

Screening Catéchine

Triterpène

Huiles essentielles Huiles Leucocyane

Dischidia P. As + + 18 hirsuta CL520 055 aérienn + / ++ - ++ ++ - - - - + - - - - + ------. + + (Bl.) Decne. es

វលិ្ Dischidia Pl. Ap 78,87 + + 19 imbricata CL522 057 ++ + - ++ ++ - - - - + - - - - - + - - - - - 習រោ entière . ± 6,14 + + (Bl.) Steud. រព្ងូល

Epigynum P. Ap ++ + 20 / griffithianu CL525 060 aérienn + / + + ++ - - - - + - - - - + - - - - + - - . + + m Wight es

80,90 + + + 005 Feuilles ++ ± + - + ++ - - - - + ------+ - - + + + 10,55 Feroniella

21 ព្រ羶ំង lucida, CL598 Ru Swingle +/ + 006 Tiges + / ++ - + ++ - - - - +++ + ------+ - - +

+/ + + 015 Feuilles +/- / + - - + + - - - - ++ - - - + - - + - - - + +

Aganone- វលិ្ថថ្នឹង, rion Ap 22 polymorphu CL603 កោត . m Pierre ex ព្រហ្ម Spire 36,94 +/ ++ ++ +/ 016 Tiges +++ + - - - - - ++ - - - - + + - - - - - ± 2,65 - + + -

113

Activité anti-

Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

o Nom

aminés

N Nom - (µg

Latin

Famille

Amidon 50

partie de Peptides

Saponines

Alcaloïdes

Acide gras Acide

/mL)

Code Coumarine

NomKhmer

glycoside Anthocyanes

Tanins Caroténoides

plante Acide

Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Flavonon

Code de plantesCode de

Catéchine

Triterpène

Huiles essentielles Huiles Leucocyane

Composésréductuers

CCMScreening Stéroidesinsaturés

++ ++ + + 059 Feuilles - / ++ + - - - - + + - - - ++ + - - - - - Glycos- + + + + ភ្ិំង, mis penta- 23 CL638 Ru. ភ្ិីង phylla

ភ្ិំង (Retz.) DC. 060 Tiges +/- / ++ - - + ++ - - + - + ------

++ ++ ++ + + 107 Feuilles - / + - + - - - ++ - - - + - + - - - - + + + + +

Limonia +/ +/ +/ 24 acidissi CL668 108 Tiges Ru. +/- / +/- - - + + - - - ++ ------+ - ខ្វ្ត - - - ma, L.

+ + 109 Fruits - / ++ - - + ++ - - + - ++ - - - - - + - - + - + +

11,26 + + 006 Feuilles ++ + - + + + - - - - +++ - - - + + + - - + - ± 2,72 + +

Sonnera

25 អំពា tia ovata CL891 So. Backer +/ + 007 Tiges + / + - - + ++ - - - - ++ + - - + + ------+

114

Activité anti-

Partie de plante Stéroide-terpène Anthraquinone Flavonoide

oxydante

aminés

N Nom Latin -

Nom partie

Famille

Amidon

Peptides

(µg/mL)

Saponines Alcaloïdes

de plante gras Acide

Code Coumarine

CCM

NomKhmer

glycoside Anthocyanes

Tanins

Caroténoides

Acide

- Chalcon

Emodine Polysacharides

Stéroides Stéroides insaturés

Flavonon

Code de plantesCode de

Screening Catéchine

Triterpène

Huiles essentielles Huiles Leucocyane

CI Composésréductuers

++ 093 Feuilles + / + - ++ + + - ++ - - ++ ++ - - - ++ ++ - - - + - + អំពាធំ, Sonnera- 26 ព្រ ញឹ tia alba CL959 So. Sm. រធំ 12,54 094 Tiges ++ ± + - - + ++ - + - - ++ - - - - +++ + ++ - - - - - 0,72

Ap. : Apocynaceae Ru. : Rutaceae As. : Asclepiadaceae So. : Sonnariaceae

Les résultats ont été évalués comme suit:

+++ : Fortement positif/Très actifs;

++ : Moyennement positif/Moyennement actif;

+ : Faiblement positif/Peu actif;

+/- : Très faible positif/Très peu actif;

- : Négatif/Non actif; N/D : Non déterminé,

115

Annexe 5 : Confirmations du test screening phytochimique par CCM.

No Test Extrait depose Phase mobile Révélateur Détection Résultat

- Chauffage 5 min à - Taches rose/violet/rouge/orange/vert (visible après la Anisaldéhyde sulfurique 110 oC - Hexane/AcOEt (96:4) révélation et chauffage) - UV 254 nm (R18) 1 Huile d’essentielle Extrait ethers - Fluorescence noir (254 nm) - Toluène/AcOEt (93:7) - UV 366 nm - Fluorescence bleu-vert (366 nm)

- Chloroforme/MeOH filtrat d’acide (97:3) Dragendorff suivie - UV 254-366 nm d’extrait éthèré - Extinction de fluorescence bleu, bleu-vert ou violet, jaune (≈ 2 mL) => Basifier - Toluène/Acétone/EtOH/ NH4OH d’une H2SO4 0.1 N ou - Coloration du 2 Alcaloïdes par NH OH à 10 % sous UV à 366 nm 4 25 % (45:45:7:3) Solution iodoiodurée tache après => +1 mL CH3Cl => - Coloration jaune ou orange visible prélever phase - Toluène/AcOEt /diéthlylamine (Lugol) pulvérisation chloroformique (70:20:10)

Fraction insaponifiable 3 Carotènoïdes =>Extrait par l’éthère Cyclo/Ether (8:2) Carrprice (R10) L’œil nu Spot coloré : jaune orangé à rouge avant et apès la revélation) de pétrole pour déssager les lipides

116

No Test Extrait depose Phase mobile Révélateur Détection Résultat

- Hexane/AcOEt (4:1) Tâches visibles de coloration rouge ou rouge-violet et bleu- Vanilline sulfurique Spot coloré 4 Stéroïdes/triterpène Phase chloroformique - Hexane/AcOEt (1:4) (R23) => chauffage à violet après révélation par la vanilline sulfurique et chauffage visible à l’œil nu 110 oC o à 110 C quelques minutes

- Spot jaune ou bleu-violet sur fond rose Fraction saponifiable Ether diéthylique/Acide acétique - Rhodamine B Spot coloré 5 Acide gras - Rouge brun (glycolipide) Ethèré (24:1) - H2SO4 25 % - Brun pâle (autre lipides) Fluorescence de coloration bleu claire, violet ou vert, parfois - Benzéne /Acétone (9:1) Fluorescence UV 6 Coumarines Ether insaponifiable KOH alcoolique jaune-brun ou jaune-vert sous UV à 366 nm avant et après - Toluène/AcOEt (93:7) ou (9:1) 254-366 nm pulvérisation de révélateur

Anthraquinone génine - n-PrOH/AcOEt/H2O (4:4:3) KOH alcoolique - Taches colorés - Violettes à violet-brun visible 7 Anthraquinones (émodines) (Extrait - AcOEt/MeOH/H2O éthanolique à 50 %) (100:13,5:10) ou (20,25:2,73:2,02) - UV 254-366 nm - Fluorescence orange/rouge (à 366 nm)

117

No Test Extrait depose Phase mobile Révélateur Détection Résultat

- NaOH 1 N - Réactif de Neu (R25) - Fluorescence après et avant pulvérisation - AcOEt/Acide formique/Acide - Sel de bleu solide B - Visible - Orange/jaune/vert/bleu Extrait éthanolique à acétique/H2O (100:11:11:27) 8 Flavonoïdes puis NaOH à 10 % - Fluorescence - Tous les flavonoïdes absorbés par fluorescence à UV 254 50 % - ACOEt/MeOH/H2O - Réactif de Gibbs puis UV 366 nm nm (100:13,5:10) NaOH à - UV 366 nm : fluoresence jaune foncé, vert, ou bleu (Dépend 10 % de la différents types de leur structure)

- Chloroforme/Acide - Eau : Jusqu’à acétique/méthanol/Eau (64:32:12:8) mouillage (susceptible pour tous séparation - Après élimination de des saponines) - Blancs non mouillables (visible) l’eau de première Spot coloré - Chloroform/méthanol/eau 9 Saponine Méthanolique révélation par (70:30:4) ou (64:50:10) - Bleu, bleu-violet et quelquefois, rouge ou jaune-brun zone séchage à l’étuve, (pour Ginsenosides) (visible) cette même plaque - Ethyleacétate/EtOH/Eau/NH4OH peut être révélée par (65:25:9:1) (pour acide la vanilline sulfurique glycyrrhetique)

118

សងេ្ខប

ζរសិក្សារុក្សខஸមី និ្សិក្សាសក្សមម徶ព叒រឆ�្អុក្សសុីតក្សរ ននរុក្សខជា㾷ឱសថខ្មមរ ខ្ែល厶នងេ叒រើសងេរើស

របនទសកមុពជ្ជ ជ្ជរបនទសមួយកុនងចនណាំ មរបនទស ត លសមបូរធនធានធមមជ្ជតិចរមរោះនរចើនជ្ជងនគនៅនលើ ពិភពនោក ។ បចុាបបននរបជ្ជជនកមុពជ្ជសិថតនៅជិតសទធិន ជ្ជមួយធមមជ្ជតិ ត លរុកខជ្ជតិន ើរតួនាទីោ៉ាងសំខ្លន់ កុនងរបបចណីំ អាហារ សម្លា រៈ នរគឿងបរិកាខរ ក៏ ូចជ្ជឱសថ ។ ប៉ាុតនរត កុ ជ្ជខ តិ ត លយកមកនរបើរបស់កុងន ការពាបល ភាគនរចើនពុំរតូវបនសិកា習សាវរជ្ជវតាមតបប វទិ ាសាស្រសត នៅនឡើយ ។ រុកខជ្ជតិចំនួន ២៦ ន ើម ត ល ពុំទន់បនសិកា

習សាវរជ្ជវរតូវបននរជើសនរើស ន ើមបីនធើកាវ រសិកាកុងន និនកបខ បទននោះ ។ រកុ ជ្ជខ តិទំងននោះសិតថ នៅកុងន របនភទរគួសាររកុ ជ្ជខ តិ ចំនួន ៤ (Apocynaceae, Rutaceae, Asclepiadaceae, Sonneratiaceae) ។ ការសិកា習សាវរជ្ជវរបស់នយើងនធវើនឡើងនោយនរបើ test de criblage នលើផលិតផលចរម្លញ់ចំនួន ១៣២ ផលិតផល (នអតទរ នមតាណុល និង ទឹក ) ត លយកនចញពីរុកខជ្ជតិទំង ២៦ ន ើម ននោះ ន ើមបីរកនូវវតតម្លនរបស់រករមធាតុគីមីសំខ្លន់ ៗ ។ ការ Huiles essentielles សិកាននោះបនបង្ហាញ នូវ វតតម្លន ថ្នសារធាតុភាគនរចើន ូចជ្ជ សារធាតុនរបងរកអូប ( ) អា ល់កាឡូអីត (Alcaloïdes) សាពូនីន (Saponines) នសគលីកូសុីត (C-glycosides) សម្លសធាតុនរ ុករ (Composés réducteurs) នសតរ៉ាុល (Stérols) តាណាំង (Tanins) ហាវវូនូអុីត (Flavonoïdes) ការូនតនូអុីត (Caroténoïdes) ត លម្លនវតតម្លននរចើនជ្ជងនគ ។ នលើស ពីននោះ នៅនទៀត ការសិកានលើសកមមភាពរបឆំងអុកសុីតករ ថ្នរុកខជ្ជតិទំងននោះរតូវបននធើនវ ឡើង នោយតផកអ នលើវធិ ីសាស្រស ត រកូម្ល៉ា តូរកាហវី (Chromatographie sur Couche Mince) និងវធិ ីសាស្រសរបឆំងត រ៉ាឌីកាល់ DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ។ រុកខជ្ជតិចំនួន ៧ ចំនណាម ១៣ ន ើម (១៥ ផលិតផលចរម្លញ់ នោយនមតាណុល ) ម្លននូវ លកខណៈ របឆំ ងអុកសុីតករ ខពស់ជ្ជងនគត លម្លនកំហាប់បនថយ ៥០ % (Concentration inhibitrice 50 %) តរបរបួលពី ៧,៦៤ µg/mL នៅ ១១៨,៩ µg/mL ។

DPPH កយគនលឹោះ ៖ សិការុកខគីមី, រករមសារធាតុគីមី, ផលិតផលចរម្លញ់ថ្នរកុ ជ្ជខ តិកមុជ្ជព , របឆំងអុកសុីតករ, ។

ABSTRACT

PHYTOCHEMICAL SCREENING AND A STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF CAMBODIA’S SELECTED MEDICINAL PLANTS

Cambodia has a diversity of flora among the richest in the world and even nowadays, many Cambodians find their livelihood close to environment where plants have a crucial role to play in supplying not only food chain, utensils, but also medicines. However, many plants which can be used for medicinal purposes have not always been subjected to scientifically studies. A literature review allows us to select 26 plants species which have been slightly studied. These species concern 4 families (Apocynaceae, Rutaceae, Asclepiadaceae, Sonneratiaceae).

Our study aims to do phytochemical screening of 132 extracts (Et2O, MeOH, and H2O) from 26 species to determine the presence of the major chemical groups. We find that essential oils, alkaloids, saponins, c-glycosides, reducing compounds, sterols, tannins, flavonoids, carotenoids are the major constituents most presented. In addition, a study of the antioxidant activity on our plants has been conducted and based on TLC (Thin Layer Chromatography) and antioxidant DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) test. Seven plants among 13 (15 methanols extracts) possess the most important and interesting antioxidant activities with their IC50 ranged between 7.64 µg/mL and 118.9 µg/mL.

Keywords: Phytochemical screening; Chemical groups; Plants Cambodian extracts; Antioxidant; DPPH.

THESE : DOCTEUR EN PHARMACIE SPECIALISEE - ANNEE 2011 Université des Sciences de la Santé Faculté de Pharmacie No 73, Blvd. Monivong, Phnom Penh, Royaume du Cambodge