UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA FARMACÉUTICA

Estudio Farmacognósico de las Especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana

Trabajo de Titulación (modalidad Proyecto de Investigación) previo a la obtención del título profesional de Química Farmacéutica

Autor: Valenzuela Mena Jazmín Carolina Tutor: Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD.

Quito, 2020 DERECHOS DE AUTOR Yo, Valenzuela Mena Jazmín Carolina en calidad de autora y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: Estudio farmacognósico de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita , transferible y no inclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académico. Conservamos a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando la Universidad de toda responsabilidad.

Firma: ______Valenzuela Mena Jazmín Carolina C.C. 171860122-0 [email protected]

ii APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi calidad de tutor del Trabajo de Titulación, presentado por la señorita Jazmín Carolina Valenzuela Mena, para optar por el Título Profesional en Química Farmacéutica; cuyo título es: “Estudio Farmacognósico de las Especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes, incluido las páginas preliminares, para ser sometido a la publicación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 02 días del mes de diciembre del 2020

Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD. DOCENTE TUTOR C.C. 1707216527

iii CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL

El tribunal constituido por: MSc. Trosky Yánez, MSc. Dayana Borja y Dr. Fernando Novillo, luego de revisar el Trabajo de Investigación titulado “Estudio Farmacognósico de las Especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana” previo a la obtención del Título (o grado académico) de Química Farmacéutica presentado por la señorita Valenzuela Mena Jazmín Carolina, APRUEBA el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

MSc. Trosky Yánez D. MSc. Dayana Borja E. CC.1802537728 CC. 1710993849

------Dr. Fernando Novillo L. CC. 1707216527

iv DEDICATORIA

A Dios por ser quien ha iluminado mi camino, me ha dado fortaleza y ha permitido que llegue hasta donde estoy hoy, es él quien decidió que hoy esté por terminar mi carrera.

A mis papis Aníbal y Anita, a mis hermanos Andrés y Nao, a quienes amo y agradezco por su ejemplo, apoyo incondicional, amor, regaños y consejos que han forjado mi camino. Gracias por ser mi pilar fundamental, mi guía y fuente de perseverancia e inspiración a lo largo de mi carrera profesional y de mi vida ¡Todos mis logros se los debo a ustedes!

A toda mi familia en especial a mi tía Mylo y abuelita Hortencia, que con sus enseñanzas, apoyo y consejos han estado presentes siempre.

A mi novio David, un hombre muy especial, que con su amor y entrega ha sido una persona incondicional en mi vida, ha sido mi soporte, mi mejor amigo y mi animador número uno en los momentos más difíciles, alentándome a seguir adelante y no abandonar mis metas y sueños.

A mi pequeño primito Isaac quien, con su alegría, sencillez, ocurrencias y sus travesuras hicieron de estos últimos años los más alegres y divertidos. Es él, el más interesado en que terminara la tesis para poder jugar.

v AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias Químicas y a sus profesores, por abrir sus puertas y proporcionarme las enseñanzas que hoy por hoy son mi esencia.

A mi tutor, Dr. Fernando Novillo, por su apoyo, paciencia y voluntad para con el trabajo de titulación, así como por todos sus conocimientos impartidos

A todos mis profesores que a lo largo de la Carrera impartieron todo su conocimiento, incentivándome a seguir aprendiendo

A mis amigos y compañeros que formaron parte de este trayecto universitario y llenaron de experiencias esta etapa enriquecedora

vi Índice de contenido

DERECHOS DE AUTOR...... ii APROBACIÓN DEL TUTOR...... iii CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL...... iv DEDICATORIA...... v AGRADECIMIENTOS...... vi Índice de contenido...... vii Lista de Tablas ...... xi Lista de Figuras ...... xiii Lista de Anexos...... xv RESUMEN...... xvi ABSTRACT ...... xvii Introducción ...... 1 Capítulo I...... 2 El problema...... 2 1.1. Planteamiento del problema...... 2 1.2. Formulación del problema ...... 3 1.3. Preguntas directrices...... 3 1.4. Objetivos...... 3 1.4.1. Objetivo general ...... 3 1.4.2. Objetivos específicos ...... 3 1.5. Justificación e importancia ...... 4 Capítulo II...... 5 Marco teórico ...... 5 2.1. Antecedentes...... 5 2.2. Fundamento teórico...... 5 2.2.1. Farmacognosia...... 5 2.2.2. Etnobotánica y etnofarmacología...... 6 2.2.3. Generalidades de la familia Crassulaceae...... 6 2.2.4. Generalidades del género Kalanchoe...... 7 2.2.4.1. Generalidades Kalanchoe daigremontiana Raym.-Hamet & H.Perrier Ann...... 7 2.2.4.2. Generalidades de Kalanchoe gastonis-bonnieri ...... 9 2.2.5. Técnicas de extracción...... 11

vii 2.2.5.1. Extracción con solventes ...... 11 2.2.5.2. Maceración...... 11 2.2.5.3. Extracción Soxhlet ...... 11 2.2.6. Tamizaje Fitoquímico...... 11 2.2.7. Metabolitos secundarios ...... 12 2.2.7.1. Terpenos o terpenoides...... 12 2.2.7.2. Alcaloides...... 12 2.2.7.3. Flavonoides...... 13 2.2.7.4. Taninos...... 13 2.2.7.5. Heterósidos cardiotónicos...... 14 2.2.7.6. Compuestos fenólicos...... 14 2.2.8. Actividad antioxidante...... 15 2.2.9. Toxicidad...... 16 2.2.9.1. Toxicidad aguda...... 16 2.2.9.2. Toxicidad subaguda o subcrónica...... 16 2.2.9.3. Toxicidad crónica ...... 16 2.2.10. Bioensayo de toxicidad en Artemia salina ...... 16 2.3. Marco legal ...... 17 2.3.1. Constitución de la República del Ecuador...... 17 2.3.2. Normativa sanitaria para la obtención del Registro sanitario...... 17 2.4. Hipótesis ...... 17 2.5. Conceptualización de las variables...... 18 2.5.1. Etapa I: Control de calidad y análisis fitoquímico de las especies en estudio...... 18 2.5.2. Etapa II: Cuantificación de flavonoides totales ...... 18 2.5.3. Etapa III: Cuantificación de fenoles totales ...... 18 2.5.4. Etapa IV: Capacidad antioxidante...... 18 2.5.5. Etapa V: Toxicidad ...... 18 Capítulo III...... 19 Marco metodológico ...... 19 3.1. Diseño de Investigación...... 19 3.2. Población y Muestra...... 19 3.2.1. Población ...... 19 3.2.2. Muestra ...... 19 3.3. Materiales y Método ...... 19

viii 3.3.1. Materiales...... 19 3.3.2. Método...... 21 3.3.2.1. Primera etapa: Recolección, identificación taxonómica de la muestra y control de calidad. 21 3.3.2.1.1. Tratamiento de muestra vegetal ...... 22 3.3.2.1.2. Determinación de humedad de muestra vegetal ...... 22 3.3.2.1.3. Determinación de cenizas totales...... 22 3.3.2.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido...... 23 3.3.2.1.5. Determinación de grasas totales...... 23 3.3.2.2. Segunda etapa: Preparación de extractos de las especies en estudio...... 24 3.3.2.2.1. Desengrasado de hojas secas por extracción Soxhlet ...... 24 3.3.2.2.2. Extracción vegetal por el método de maceración ...... 24 3.3.2.2.3. Extracción vegetal por infusión ...... 24 3.3.2.2.4. Extracción vegetal por trituración con solvente ...... 25 3.3.2.3. Tercera etapa: Tamizaje fitoquímico...... 25 3.3.2.3.1. Identificación de Alcaloides...... 25 3.3.2.3.2. Identificación de Esteroides y triterpenos...... 25 3.3.2.3.3. Identificación de Nafto y antraquinonas...... 25 3.3.2.3.4. Flavonoides...... 26 3.3.2.3.5. Taninos/fenoles...... 26 3.3.2.3.6. Glicósidos cardiotónicos ...... 27 3.3.2.3.7. Saponinas...... 27 3.3.2.4. Cuarta etapa: Cuantificación de metabolitos secundarios de los extractos vegetales. 27 3.3.2.4.1. Cuantificación de flavonoides totales...... 27 3.3.2.4.2. Cuantificación de Fenoles Totales...... 28 3.3.2.5. Quinta etapa: Determinación de la capacidad antioxidante...... 28 3.3.2.6. Sexta etapa: Determinación de la toxicidad de los extractos por Bioensayo en Artemia salina...... 30 3.4. Consideraciones éticas ...... 31 3.5. Operacionalización de las variables...... 32 3.6. Técnicas e instrumentos de recolección ...... 32 3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos...... 32 Capítulo IV ...... 33 Análisis y discusión de resultados ...... 33

ix 4.1. Primera etapa: Recolección, identificación taxonómica de la muestra y control de calidad. 33 4.1.1. Tratamiento de muestra vegetal...... 33 4.1.2. Determinación de humedad de muestra vegetal...... 33 4.1.3. Determinación de cenizas totales ...... 34 4.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido...... 35 4.1.5. Determinación de grasas totales...... 36 4.2. Segunda etapa: Preparación de extractos de las especies en estudio...... 38 4.2.1. Determinación del porcentaje de rendimiento...... 38 4.3. Tercera etapa: Tamizaje fitoquímico...... 40 4.4. Cuarta etapa: Cuantificación de metabolitos secundarios de los extractos vegetales...... 42 4.4.1. Cuantificación de flavonoides totales...... 42 4.4.2. Cuantificación de fenoles totales ...... 45 4.5. Quinta etapa: Determinación de la capacidad antioxidante...... 48 4.6. Sexta etapa: Determinación de la toxicidad de los extractos por Bioensayo en Artemia salina 60

4.6.1. Construcción de la ecuación de la recta y determinación de la CL50 ...... 61 Capítulo V ...... 67 Conclusiones y Recomendaciones...... 67 5.1. Conclusiones...... 67 5.2. Recomendaciones...... 68 REFERENCIAS ...... 69

x Lista de Tablas

Tabla 1. Taxonomía de Kalanchoe daigremontiana...... 8 Tabla 2. Taxonomía de Kalanchoe gastonis bonnieri ...... 9 Tabla 3. Materiales y reactivos...... 19 Tabla 4. Equipos...... 21 Tabla 5. Curva de calibración de Quercetina...... 27 Tabla 6. Datos de la curva de referencia con BHT estándar...... 29 Tabla 7. Consideraciones éticas...... 31 Tabla 8. Variables, dimensiones e indicadores del material vegetal...... 32 Tabla 9. Porcentaje de humedad en muestra vegetal ...... 34 Tabla 10. Porcentaje de cenizas totales...... 35 Tabla 11. Porcentaje de cenizas solubles en ácido ...... 35 Tabla 12. Porcentaje de grasas totales...... 37 Tabla 13. Porcentaje de rendimiento...... 38 Tabla 14. Tamizaje fitoquímico...... 40 Tabla 15. Datos de la curva de calibración de Quercetina ...... 42 Tabla 16. Concentración de flavonoides totales...... 44 Tabla 17. Datos de la curva de calibración del ácido gálico ...... 45 Tabla 18. Concentración de Fenoles Totales...... 47 Tabla 19. Datos de la curva de referencia con el estándar butil hidroxitolueno (BHT) ...... 48 Tabla 20. % de Inhibición del estándar de referencia BHT...... 49 Tabla 21. Datos de absorbancia para porcentajes de Inhibición de la especie Gastonis-Bonnieri...... 50 Tabla 22. Datos de absorbancia para porcentajes de Inhibición de la especie Kalanchoe daigremontiana ...... 50 Tabla 23. Resultados del Porcentaje de inhibición de la especie Gastonis-Bonnieri ...... 51 Tabla 24. Comparación del IC50 de los extractos de las hojas de la especie Gastonis-Bonnieri con el BHT como estándar de referencia|...... 53 Tabla 25. Resultados del Porcentaje de inhibición de la especie Daigremontiana...... 54

Tabla 26. Comparación del IC50 de los extractos de las hojas de la especie K. daigremontiana con el BHT como estándar de referencia...... 56

Tabla 27. Determinación de CL50 del AM1 a las 24 horas de exposición ...... 61

Tabla 28. Determinación de CL50 del BM1 a las 24 horas de exposición ...... 61

Tabla 29. Determinación de CL50 del AM2 a las 24 horas de exposición ...... 62

Tabla 30. Determinación de CL50 del BM2 a las 24 horas de exposición ...... 63

xi Tabla 31. Determinación de CL50 del AM3 a las 24 horas de exposición ...... 64

Tabla 32. Determinación de CL50 del BM3 a las 24 horas de exposición ...... 64

Tabla 33. Determinación de CL50 del AM4 a las 24 horas de exposición ...... 65

Tabla 34. Determinación de CL50 del BM4 a las 24 horas de exposición ...... 65

xii Lista de Figuras Figura 1. Fórmula estructural del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil...... 15 Figura 2. Comparación de los porcentajes promedio de humedad de las muestras vegetales..... 34 Figura 3. Comparación de los porcentajes promedio de Cenizas totales y solubles en ácido ..... 36 Figura 4. Comparación de los porcentajes de Grasas Totales...... 37 Figura 5. Comparación de los porcentajes de rendimiento ...... 39 Figura 6. Curva de calibración de la Quercetina ...... 43 Figura 7. Comparación de concentración de Flavonoides ...... 44 Figura 8. Curva de calibración del ácido Gálico ...... 46 Figura 9. Comparación de concentración de Fenoles Totales ...... 47 Figura 10. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración ...... 49

Figura 11. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del macerado CH2Cl2- Metanol de las hojas desengrasadas de la especie Gastonis-Bonnieri ...... 51 Figura 12. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración de la Infusión de las hojas Gastonis-Bonnieri ...... 52 Figura 13. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Jugo de las hojas Gastonis-Bonnieri ...... 52 Figura 14. Comparativa del % de inhibición de los tres extractos analizados en la especie Gastonis-Bonnieri ...... 53

Figura 15. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Extracto CH2Cl2-Metanol de las hojas Daigremontiana ...... 55 Figura 16. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración de la Infusión de las hojas Kalanchoe Daigremontiana...... 55 Figura 17. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Jugo de las hojas Kalanchoe Daigremontiana...... 56 Figura 18. Comparativa del % de inhibición de los tres extractos analizados en la especie K. daigremontiana ...... 57

Figura 19. Comparativa del % de inhibición vs Concentración del macerado CH2Cl2-Metanol en relación al estándar ...... 58 Figura 20. Comparativa del % de inhibición vs Concentración de la infusión de hojas en relación al estándar ...... 58 Figura 21. Comparativa del % de inhibición vs Concentración del Jugo de las hojas en relación al estándar...... 59

Figura 22. Comparativa del IC50 de las especies en estudio ...... 60 Figura 23. Representación de unidades Probit vs. Log concentración en la AM1 y BM1 ...... 62 Figura 24. Representación de unidades Probit vs. Log10 concentración en AM2 y BM2 ...... 63

xiii Figura 25. Representación de unidades Probit vs. Log en AM3 y BM3 ...... 64 Figura 26. Representación de unidades Probit vs. Log10 concentración en AM4 y BM4 ...... 65

xiv Lista de Anexos

ANEXO A: Árbol de problemas...... 76 ANEXO B: Categorización de variables ...... 77 ANEXO C: Marcha fitoquímica Preliminar ...... 78 ANEXO D: Instrumento de recolección de Datos ...... 79 ANEXO E: Certificado de identificación taxonómica...... 80 ANEXO F: Evidencia fotográfica de colecta y tratamiento del material vegetal ...... 81 ANEXO G: Evidencia fotográfica de Control de Calidad...... 82 ANEXO H: Evidencia fotográfica de Preparación de extractos ...... 85 ANEXO I: Evidencia fotográfica de Tamizaje fitoquímico ...... 86 ANEXO J: Evidencia fotográfica de Cuantificación de flavonoides y fenoles ...... 87 ANEXO K: Evidencia fotográfica de Bioensayo en Artemia salina...... 88

xv Tema: Estudio Farmacognósico de las Especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana

Autora: Jazmín Carolina Valenzuela Mena Tutor: Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño

RESUMEN En Ecuador existe escasa información de las especies vegetales consumidas por la población, es por ello que el presente estudio se enfocó en el análisis farmacognósico de dos especies conocidas popularmente como dulcamaras, debido a que se menciona tienen propiedades anticancerígenas y antioxidantes. Se utilizaron plantas de invernadero recolectadas en la Provincia de Pichincha, las cuales posteriormente se identificaron taxonómicamente como las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, pertenecientes a la familia Crassulaceae. Se realizó un control de calidad, para lo cual se evaluó el contenido de cenizas, humedad y grasas totales. Se preparó el extracto total de las hojas con una mezcla de solventes diclorometano-metanol (1:1). En el extracto preparado se identificó los principales grupos de Productos Naturales, mediante el tamizaje fitoquímico, determinándose la presencia de flavonoides, esteroles, terpenos, taninos y glúcidos cardiotónicos, en ambas especies. Se cuantificó flavonoides totales, a partir del método espectrofotométrico, la especie Kalanchoe daigremontiana presentó mayor contenido (11.04±0.50 mg QE/g extracto seco). En la muestra de Kalanchoe daigremontiana se encontró la mayor proporción de fenoles totales (55.74 ±1.06 mg GAE/g extracto), la cual se determinó por el método de Folin-Ciocalteu. Además, mediante el método del radical DPPH, se evaluó su actividad antioxidante, en donde se estableció que la especie Kalanchoe daigremontiana presenta mayor porcentaje de inhibición (57.04±0.48%) con una IC50 de 8.43 ppm. Finalmente, mediante el bioensayo en Artemia salina, se halló que la infusión de la Kalanchoe daigremontiana y el jugo de Kalanchoe gastonis-bonnieri son inocuas.

PALABRAS CLAVES: KALANCHOE GASTONIS-BONNIERI, KALANCHOE DAIGREMONTIANA, FLAVONOIDES, FENOLES, DPPH, DULCAMARA.

xvi Tema: Pharmacognostic study of the Species Kalanchoe gastonis-bonnieri and Kalanchoe daigremontiana

Author: Jazmín Carolina Valenzuela Mena Tutor: Fernando Augusto Novillo Logroño, M.D.

ABSTRACT

In Ecuador, there is little information on the plant species consumed by the population; that is why the present study focused on the pharmacognostic analysis of two species popularly known as dulcamaras, because it is believed these plants have anticancer and antioxidant properties. Greenhouse plants collected in the province of Pichincha were used, which were later taxonomically identified as the species Kalanchoe gastonis-bonnieri and Kalanchoe daigremontiana, belonging both to the family Crassulaceae. A quality control was performed, for which the ash, moisture and total fat content were evaluated. The total extract of the leaves was prepared with a mixture of dichloromethane-methanol solvents (1:1). In the prepared extract, the main groups of natural products were identified by phytochemical screening, and the presence of flavonoids, sterols, terpenes, tannins, and cardiotonic carbohydrates was determined in both species. Total flavonoids were quantified using the spectrophotometric method, the Kalanchoe daigremontiana species had a higher content (11.04±0.50 mg QE/g dry extract). The highest proportion of total phenols (55.74 ±1.06 mg GAE/g extract) was found in the Kalanchoe daigremontiana sample, which was determined by the Folin-Ciocalteu method. In addition, using the DPPH radical method, its antioxidant activity was evaluated, and it was established that the species Kalanchoe daigremontiana has a higher percentage of inhibition (57.04±0.48%) with a IC50 of 8.43 ppm. Finally, by Artemia salina bioassay, it was found that the infusion of Kalanchoe daigremontiana and the Kalanchoe gastonis-bonnieri juice are harmless.

KEY WORDS: KALANCHOE GASTONIS-BONNIERI, KALANCHOE DAIGREMONTIANA, FLAVONOIDS, PHENOLS, DPPH, DULCAMARA.

I hereby certify that this document was translated to the best of my knowledge and ability from the original in Spanish language and following the international standards for translation of documents.

xvii Introducción El Ecuador presenta una variedad de plantas con propiedades terapéuticas, cuya composición química varía por muchos factores, entre ellos la especie y la localización geográfica. Es allí cuando se denota la importancia de generar información específica de cada especie vegetal que se encuentra en un país, para tener la certeza indiscutible que al consumirla va a generar mejoras en el organismo y no perjuicios al mismo. En las últimas décadas, ha aumentado el interés en la búsqueda de nuevos componentes activos provenientes de extractos vegetales que posean actividad antitumoral y antioxidante, debido al incremento de patologías degenerativas. Según la OMS, el 80% de la población mundial utiliza las plantas como medicina natural, siendo esta otra de las razones por las cuales la investigación científica ha puesto hincapié en sus estudios. El género Kalanchoe pertenece a la familia Crassulaceae tiene alrededor de 200 especies. Algunas de las especies reportadas se utilizan para el tratamiento de dolencias. Las plantas pertenecientes a este género han sido tradicionalmente conocidos por su valor farmacéutico y han sido estudiadas por los científicos desde hace mucho tiempo (Kamboj Anjoo & Ajay Kumar, 2007). Por ello se condujo al planteamiento de una nueva investigación que permita realizar un estudio farmacognósico comparativo de dos especies de Kalanchoe comunes en el país. En el capítulo I se explica las razones por las cuales se propone el proyecto de investigación, la formulación del problema, las preguntas directrices que dan lugar a los objetivos y por último se resalta la justificación e importancia del estudio. En el capítulo II se aborda los antecedentes bibliográficos que se analizaron y sirvieron como base del estudio. Además, incluye el fundamento teórico de la investigación y la hipótesis de trabajo que dirigirá el estudio con su correspondiente conceptualización de las variables. En el capítulo III se establece la metodología, el diseño experimental, operacionalización de las variables analizadas y se detallan los reactivos, materiales y equipos utilizados durante la investigación. Adicionalmente, se menciona la técnica de procesamiento y análisis de datos recolectados. Finalmente, en el capítulo IV se presenta el marco administrativo, donde se detallan los recursos materiales y humanos, el presupuesto y se adjunta el cronograma de actividades.

1 Capítulo I El problema 1.1.Planteamiento del problema En las últimas décadas, el uso la medicina tradicional se ha difundido ampliamente por todo el mundo debido a que las personas están en busca de nuevos tratamientos por lo que es muy común el uso popular de una gran variedad de plantas; incluso se viene utilizando preparados con concentraciones mínimas de extractos vegetales y minerales para el tratamiento de patologías. Adicionalmente, su consumo es elevado en pacientes que presentan una gran variedad de enfermedades crónicas, sin cura (cáncer, diabetes, artritis, entre otras) o enfermedades agudas que se tratan fácilmente de forma hogareña. Según (Gallardo, 2007), es una ciencia terapéutica milenaria que ha sobrevivido a lo largo de los tiempos por su lógica indiscutible al valor terapéutico y a su gran aceptación. La medicina tradicional ha contribuido enormemente en el campo científico pues ha proporcionado conocimientos y prácticas basadas en las creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas como lo menciona la OMS (“OMS | Medicina tradicional: definiciones,” 2010), impulsando el mantenimiento de la salud así como también la prevención y el tratamiento de enfermedades. Existen tres aspectos importantes que no se tienen en cuenta al momento de consumirla: la especie, toxicidad y localización geográfica. Para mucha gente existe la creencia que "el uso de un producto natural no ocasionan ningún daño", olvidando que si una planta tiene un potencial medicinal, también tiene un potencial tóxico debido a que ejerce un efecto biológico (Villalta, 2015). Bussmann & Sharon mencionan en su estudio que los ensayos de toxicidad están disponibles para un gran número de países pero no existen datos sobre la toxicidad potencial de las especies medicinales en Ecuador (Bussmann & Sharon, 2015). Por esta razón es necesario continuar con los estudios farmacognósicos en países que no disponen de esta información, con la finalidad de proporcionar datos que sean la base fundamental de próximos estudios que tengan relación con el margen terapéutico idóneo para el organismo del individuo. En la literatura se menciona que puede existir variación y/o ausencia de uno o más componentes entre especies del mismo género causando diversificación sobre el posible efecto terapéutico atribuido a esta especie. Dadas las consideraciones que anteceden, es motivo de alerta para las autoridades de salud el considerar la investigación de las especies vegetales presentes en un país y en la implementación de normas para los Productos Naturales, así como también la promoción del uso racional de las mismas. En el tratamiento de muchas patologías se utiliza plantas medicinales, cuyos conocimientos han estado presentes durante siglos, como es el caso del género Kalanchoe, la cual se ha venido utilizando en el tratamiento de diversas enfermedades por sus propiedades antitumorales y antifúngicas, por mencionar las más relevantes. Los compuestos bufadienolides han demostrado ser un potente anticancerígeno debido a que se ha estudiado su eficacia para

2 controlar células de cáncer de pulmón, cuello de útero y en carcinoma hepatocelular. (Saz-Peiró & Tejero-Lainez, 2016). Por esta razón, es de suma importancia el estudio farmacognósico de las especies existentes en el país para contribuir de esta manera con bibliografía que proporcione un punto de partida para posteriores estudios de formulaciones de productos naturales que contengan la especie del género Kalanchoe en cantidades adecuadas. 1.2.Formulación del problema ¿Existe diferencia farmacognósica entre las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana? 1.3.Preguntas directrices  ¿Cómo recolectar e identificar las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana?  ¿Qué porcentaje de humedad, cenizas y grasas tienen las hojas de la Kalanchoe gastonis- bonnieri y Kalanchoe daigremontiana?  ¿Cómo extraer los compuestos fitoquímicos de las hojas de la Kalanchoe gastonis bonnieri y Kalanchoe daigremontiana  ¿Cómo identificar y cuantificar los principales grupos químicos extraídos de las hojas de Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana?  ¿Cuál es la CL50 de las especies en estudio? 1.4.Objetivos 1.4.1. Objetivo general Realizar el Estudio Farmacognósico de las Especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana. 1.4.2. Objetivos específicos  Recolectar las especies vegetales a estudiar para su posterior identificación taxonómica.  Determinar la humedad, cenizas y grasas en las hojas de las especies Kalanchoe gastonis- bonnieri y Kalanchoe daigremontiana.  Preparar el extracto CH2Cl2-Metanol (1:1) de las hojas de cada una de las especies en estudio mediante maceración.  Realizar el tamizaje fitoquímico en los extractos totales preparados de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana  Cuantificar flavonoides totales, fenoles totales y actividad antioxidante de los extractos de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana.  Evaluar la toxicidad de los extractos preparados mediante el bioensayo en Artemia salina.

3 1.5. Justificación e importancia

Según (Bussmann & Sharon, 2015), estudios de flora medicinal ecuatoriana no se han desarrollado entre los tiempos coloniales, tempranos y tardíos, dando lugar a que exista una mínima proporción de información botánica de las especies existentes en el país, he allí la importancia de plantear estudios de las especies vegetales más importantes y comunes del país con la finalidad de plasmar información que sirva como sustento bibliográfico que permita indagar en los posibles beneficios terapéuticos para posteriores investigaciones y creación de productos naturales. Al ser plantas que se encuentran en boga por los beneficios que dicen tener, es importante su estudio para corroborarlo. Existen casos en los que ha generado toxicidad su consumo, un ejemplo claro fue identificado por (Smith, 2004) quien acotó que hubo casos en los cuales la presencia de glucósidos cardiotónicos generó intoxicaciones de animales domésticos después de alimentarse accidentalmente de plantas de uso ornamental del género Kalanchoe. Por otro lado, existen componentes a los cuales los animales, como las hormigas, no han dudado en aprovecharlos, pues se ha evidenciado que las hormigas fueron más atraídas por el néctar de Kalanchoe gastonis-bonnieri que, por soluciones de diversos tipos de azúcares, sugiriendo la ocurrencia de otros compuestos químicos, responsables de la atracción; son metabolitos secundarios, utilizados por la planta con fines de estímulo a la atracción de insectos polinizadores. (Koptur & Truong, 1998). El uso popular de estas especies fue evidenciado por curanderos latinoamericanos que viven y trabajan en la ciudad de Nueva York, cuidando de problemas relacionados con la salud de la mujer (fibrosis uterina, ola s de calor y menorragia) recomendando la utilización de K. gastonis-bonnieri, principalmente en el caso de fibrosis uterinas (Balick, Kronenberg, Ososki, Marian, & O'Connor, 2000). Los curanderos de la República Dominicana residentes en la ciudad de Nueva York utilizan esta planta en el tratamiento de fibrosis uterina siendo una de las 4 plantas más prescritas para esa finalidad (Ososki, y otros, 2002). Los flavonoides son metabolitos secundarios que pueden presentar buena actividad antifúngica, así como taninos, terpenoides y alcaloides (Cowan, 1999); (Arif, y otros, 2009). En la literatura se evidencia que los flavonoides son bioactivos, tanto en las hojas como en las flores de plantas del género Kalanchoe (Ferreira, Rosenthal, & Carvalho, 2000), de modo que pueden ser estudiadas como posibles fuentes de principios activos contra levaduras y mohos. Con todo lo mencionado, se ve reflejada la importancia de comparar farmacognósicamente las especies de Kalanchoe más comunes en el Ecuador con la finalidad de dejar plasmada información relevante que pueda ser utilizada para la formulación y preparación de productos naturales con la especie más adecuada y con menor toxicidad en el organismo de quien la consume.

4 Capítulo II Marco teórico 2.1. Antecedentes En la Universidad de Salamanca se realizó la caracterización química de tres especies de Kalanchoe, de la cuales se determinó su valor nutricional y energético mediante el análisis de proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos, particularmente azúcares por HPLC-RI y ácidos grasos por GC-FID, y la determinación de otros fitoquímicos como tocoferoles por HPLC- Fluorescencia y ácidos orgánicos por UFLC-DAD. También se evaluó de los extractos de diferentes polaridades (hexano, DCM, AcOEt, MeOH y agua), infusiones y decocciones, la actividad citotóxica frente a las mismas líneas celulares (Maisterra Udi, 2016). En el trabajo de investigación de Soares, Peresqui, & Marques (2015), se identificó dos flavonoides de las hojas de K. gastonis-bonnieri: vicenina-2, una conocida C-glicosilflavona y un producto derivado de la quercetina del flavonoide 3-O-L-ramnopiranosido-7-O-D- glucopiranosil- (1 → 3) -L-ramnopiranosido. Esta es la primera vez que una C-glicosilflavona ha sido reportada en una especie de la familia Crassulaceae. Además, este es el primer estudio en el que se ha demostrado atropoisomerismo para vicenina-2, dando lugar a proporcionar información a posteriores estudios que quieran formular productos anticancerígenos. En el 2011 Pella Víctor, realizó un estudio de las características anatómicas e histoquímicas con la finalidad de diferenciar entre la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe pinnata. Se reportó presencia de diversas clases de metabolitos secundarios, los cuales demostraron poseer efectos biológicos de interés. Adicional, se determinó la presencia de glicósidos y cardiotónicos en la Kalanchoe pinnata por lo que deben ser vistos con cautela pues pueden ser un indicio de toxicidad. Al existir poca información en el Ecuador respecto a esta familia herbaria Kalanchoe, se llegó a la conclusión que el presente trabajo de investigación es innovador pues va a aportar con información real y específica para las especies consumidas hoy en día en el país. 2.2. Fundamento teórico 2.2.1. Farmacognosia Esta ciencia se enfoca particularmente al estudio de los principios activos de origen vegetal, animal y mineral, así como de los derivados que pudieran tener una aplicación terapéutica, comercial o industrial. En un sentido más amplio la farmacognosia abarca el estudio de la historia, el cultivo, la recolección, preparación, preservación, comercialización, distribución, identificación y evaluación de los componentes químicos de origen natural, la farmacología y el uso tradicional de esos compuestos o sus derivados para mejorar la salud y el bienestar del ser humano. En el presente artículo revisamos de manera somera algunas de las aportaciones históricas de las culturas asiáticas, africanas, europeas y americanas que propiciaron el progreso de la farmacognosia como una ciencia establecida, destacando su importancia en el desarrollo de

5 productos naturales con aplicación en la industria farmacéutica, la farmacología y la medicina, así como su relación con las ciencias médicas. (Vieyle Cortez-Gallardo, Macedo-Ceja, & Arroyo, 2004) 2.2.2. Etnobotánica y etnofarmacología. La evolución del conocimiento científico sobre las plantas en su utilización por el hombre, se ha producido a través del tiempo. Civilizaciones primitivas percibían la existencia de plantas comestibles y tóxicas que, al ser utilizadas para combatir dolencias, revelaban empíricamente su potencial curativo. En este contexto, la etnobotánica surge para comprender el estudio de las sociedades humanas y sus interacciones con las plantas, ya sean ecológicas, genéticas, evolutivas, simbólicas o culturales (Fonseca-Kruel & Peixoto, 2004). No existe una definición general de etnobotánica, ya que se ha ido modificando según épocas y autores. Los primeros trabajos que se llevaron a cabo bajo el término consistían en realizar listas o catálogos de plantas con especificación de sus respectivos usos (Harshberger, 1896).Cuando los investigadores provenientes de la etnografía comenzaron a interesarse por la disciplina, el objeto de estudio se fue ampliando a la totalidad de las relaciones ser humano- planta, incluyéndose los aspectos etnográficos y simbólicos. Aunque las plantas se inmiscuyen en todos los aspectos de cualquier cultura, el trabajo etnobotánico suele centrarse en los grupos humanos cuya relación con la naturaleza es más directa. Los más importantes son los pueblos indígenas y las culturas rurales (Pardo de Santayana & Gómez, 2003). 2.2.3. Generalidades de la familia Crassulaceae.

Las plantas objeto de este estudio pertenecen a la familia Crassulaceae. Son generalmente perennes, de herbáceas a subarbustivas. Hojas generalmente crasas y enteras, alternas, opuestas o verticiladas, frecuentemente agrupadas en roseta basal, aunque a veces ubicada en el ápice de los tallos estériles. Inflorescencias cimosas o cerradas, terminales o axilares. Flores hermafroditas, raramente dioicas, actinomorfas, típicamente pentámeras, raramente 3-4 o 6-32 meras, a veces solitarias o agrupadas en parejas axilares. Cáliz de sépalos libres o soldados en la base, generalmente carnosos y poco llamativos. Pétalos libres o soldados en diferente grado. Androceo con 1-2 verticilos de estambres. Ovario súpero, carpelos en igual número que sépalos o pétalos, libres o, con menor frecuencia, más o menos soldados; estilo de longitud variable. Fruto en poli folículo; semillas numerosas en cada folículo (Maire, 1976). Es una familia cosmopolita integrada por cerca de 35 géneros (número que puede variar dependiendo de los criterios de clasificación) y aproximadamente 1500 especies. Muchas de las especies de esta familia se han adaptado a vivir en hábitats extremadamente secos, para lo que las plantas han desarrollado estructuras que permiten evitar la deshidratación, como pruina, pelos, espinas; además sus tallos y hojas se hicieron carnosas para acumular agua. Para sobrevivir en esas condiciones, han desarrollado diferentes métodos de reproducción vegetativa, éste es el caso de ciertas especies del género Kalanchoe Adans., que, gracias a sus gémulas foliares, se difunden con mucha facilidad (Castroviejo, 1997).

6 2.2.4. Generalidades del género Kalanchoe.

Kalanchoe es un género controvertido y pertenece a la familia Crassulaceae. En 1907 el botánico estadounidense especialista en Crasuláceas Raymont-Halmet publicó una monografía del género Kalanchoe incluyendo al género Bryophyllum dentro del mismo (Sánchez de Lorenzo, 2016)), pero algunos de los estudios moleculares que se están llevando a cabo, los consideran géneros distintos y varias especies del género Kalanchoe han pasado ahora al género Bryophyllum. Las plantas pertenecientes a este género son herbáceas perennes, subarbustos o arbustos carnosos. Las hojas son opuestas, raramente verticiladas o alternas. Inflorescencias terminales en cimas o panículas de cimas. Flores tetrámeras. Cáliz formado por 4 sépalos, más o menos concrescentes en la base. Corola gamopétala, generalmente con divisiones muy cortas. Androceo formado por dos verticilos de estambres 4 + 4, glabros, insertos en el tubo de la corola. Nectarios en forma de escamas. Ovario formado por 4 carpelos, ligeramente concrescentes en la base, glabros, atenuados en 4 estilos más o menos largos además de su fruto formado por 4 folículos polispermos (Maire, 1976). Las sustancias más notables biosintetizadas por las diferentes especies de este género pertenecen a los glucósidos de flavonoides, un conjunto de pigmentos vegetales y a las bufadienolidas, grupo de esteroides cardioactivos (García, 2009). En este proyecto se ejecutará la caracterización fitoquímica y el estudio de la actividad tóxica de dos plantas del género Kalanchoe: K. daigremontiana y K. gastonis-bonnieri. 2.2.4.1. Generalidades Kalanchoe daigremontiana Raym.-Hamet & H.Perrier Ann. Sinónimos. Bryophyllum daigremontianum (Raym.-Hamet & H.Perrier). Nombres vernáculos. Es conocida vulgarmente en castellano como: Espinazo del Diablo, Aranto, Siempreviva, Dulcamara; portugués: Mãe de milhares; ingles: Mother of Thousands, Palm tree Bryophyllum, Mexican Hat Plant, Alligator Plant, Devil's backbone, Chandelier Plant, Mother of Millions (LLIFLE, 2020)

7 Taxonomía. Tabla 1. Taxonomía de Kalanchoe daigremontiana Reino Plantae Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Rosidae Orden Saxifragales Familia Crassulaceae Género Kalanchoe Subgénero Bryophyllum Especie Kalanchoe daigremontiana Nota. tomado de (Maire, 1976)

K. daigremontiana es nativa del valle del río Fiherenana y las montañas Androhibolava en el suroeste de Madagascar. Ha sido introducido en numerosas regiones tropicales y subtropicales, como Florida y en la costa sur de Texas, Puerto Rico, las islas del Pacífico (Galápagos, Hawai, Fiji, Marshal, Nueva Caledonia, Niue) África subtropical y África del Sur, Australia (Queensland), India, Pakistán, china, Nueva Zelanda, y partes de las Islas Canarias. Se cultiva ampliamente en los jardines en los países tropicales. Está bien establecida y se considera una maleza agresiva que naturalizada casi en todas partes y por lo general se encuentra en la difusión de los bordes de caminos. Los exudados de las raíces pueden inhibir el crecimiento de las plantas cercanas (LLIFLE, 2020). Puede sobrevivir largos periodos de sequía con poco o nada de agua. Sin embargo, no es resistente a las heladas y típicamente muere si se somete a temperaturas bajo cero (Información taxonómica sobre Kalanchoe daigremontiana, 2019). Composición química. Estudios anteriores han confirmado varios tipos de compuestos como 11-oxo-epi-β- amirina, 21-deshidrodesmosterol, ácido 3,4-dihidroxi-cis-cinámico y p-hidroxibenzaldehído (Kulka, 2006) ,glut-5(6)-en-3β-ol, mezcla de α-amirina y β-amirina y estigmasterol (Rashid, y otros, 2013). Al igual que K. pinnata, también contiene un grupo de bufadienolidas muy activas (Supratman, 2001). Actividad biológica. Varios estudios de diferentes extractos de K. daigremontiana confirman actividades tales como actividad antimicrobiana, determinada por el método de difusión de disco (Bauer et al., 1966), esto se probó frente a varias bacterias Gram positivas y Gram negativas y en diferentes hongos (Kamrun, Mohammad, Mohammad, Bilkis, & Mohammad, 2008). Actividad trombolítica, evaluada mediante el método de Prasad (Sikder et al., 2011; Prasad et al., 2006) y

8 actividad hemolítica, evaluada mediante una prueba de eritrocitosis (Anisimov, Gerasimenko, Chaikina, & Serebryakov, 2009). Otras actividades farmacológicas importantes son la actividad antioxidante, esta fue evaluada mediante la actividad captadora de radicales DPPH utilizando terc-butil-4- hidroxitolueno (BHT) como estándar de referencia (Rashid, y otros, 2013) y actividad antitumoral, evaluada mediante el método de determinación de los efectos inhibidores sobre el virus de Epstein-Barr (EBV) (Supratman, 2001). Se hizo un ensayo conjunto de la Kalanchoe daigremontiana y Kalanchoe pinnata para determinar sus efectos inhibidores sobre el virus de Epstein-Barr (EBV) mediante la activación del antígeno temprano en las células Ranji, inducido por el promotor de tumores descrito anteriormente. Para ello se aislaron cinco bufadienólidas de las hojas de estas dos especies (Supratman, 2001). Toxicidad. Se ha determinado que las hojas de K. daigremontiana son tóxicas en pollitos a una dosis de 8-12 mg/g de peso corporal. Los signos tóxicos incluyen depresión, falta de coordinación muscular, espasmos, temblores, convulsiones, parálisis y la muerte (Williams & Smith, 1984). 2.2.4.2. Generalidades de Kalanchoe gastonis-bonnieri. Sinónimos. Bryophyllum gastonis-bonnieri (Raym. -Hamet & H.Perrier) Lauz.-March. y Kalanchoe adolphi-engleri Raym.-Hamet (1955) (Conservatoire et Jardin botaniques & South African National Biodiversity Institute, 2019). Nombres vernáculos. Es conocida vulgarmente en castellano como: Oreja de burro, Hojerilla, Ojaransín, en inglés como: Donkey ears, Sprouting Leaf, Sprout Leaf Plant, Palm Beachbells, Miracle Leaf, Leaf of Life, Good Luck Leaf, Giant Kalanchoe, Tree of Life, Donkey ear plant, Donkey’s ear, Life Plant y en portugués como: Perrier planta-da-vida (LLIFLE, 2020). Taxonomía. Tabla 2. Taxonomía de Kalanchoe gastonis bonnieri

Reino Plantae Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Rosidae Orden Saxifragales Familia Crassulaceae Género Kalanchoe Especie Kalanchoe gastonis-bonnieri

Nota. tomado de (CJB,2012)

9 Descripción botánica. Planta verde-pruinosa. Tallos, en su mayoría, simples, cilíndricos, de 70 x 1,5 cm. Hojas simples, opuestas, de lanceoladas a espatuladas, pruinosas, gris-verdosas con manchas púrpuras, de 15-50 x 5-10 cm, márgenes crenados de los que surgen gémulas foliares que forman raíces, ápices agudos; pecíolos anchos, poco diferenciados de los limbos. Flores colgantes en cimas agrupadas en panículas terminales. Cáliz glabro, campanulado-urceolado, verde rojizo, tubo de 13-15 mm, lóbulos triangulares de 5-10 mm. Corola amarilla o verde rojiza, con tubo cilíndrico de 30-40 mm, lóbulos triangular-ovados de 6-10 mm, ápice acuminado. Estambres más cortos que la corola con los filamentos insertos por debajo de la mitad del tubo de ésta. Carpelos conniventes, atenuados en estilos largos y delgados. Florece a lo largo del verano, pero puede hacerlo en otras épocas también (Flora of North America, 2019). Distribución y ecología. K. gastonis-bonnieri es originaria del noroeste de Madagascar. Introducida como planta de jardín, ahora se ha naturalizado en las zonas tropicales de la Amazonia, África, Asia, Australia y otros lugares en los trópicos. Se encuentra en las rocas calcáreas en bosques bajos abiertos (Maisterra Udi, 2016). Composición química. Estudios realizados a K. gastonis-bonnieri han confirmado la presencia de compuestos terpénicos y fenólicos, entre ellos flavonoides como, 3-O-α-ramnopiranosil-7-O-β-D- glucopiranosil (1->3)-α -L-ramnopiranósido de quercetina y 6-C-β-D-glucopiranosil-8-C-β-D- glucopiranosido de apigenina (vicenin-2) (Costa et al., 2015; Legramandi, 2011). Actividad biológica. El extracto acuoso en crudo de K. gastonis-bonnieri presenta actividad anticonceptiva, esto se ha probado in vivo en el epidídimo de ratas (Miranda-Beltrán et al., 2003). La actividad antifúngica también ha sido evaluada mediante la técnica de dilución en microplaca, esto ha sido probado en diferentes extractos (Legramandi, 2011). Precauciones Los estudios de toxicidad revelaron que 13 g/kg peso corporal induce un 80% de letalidad y la dosis letal está estimada en 11,0 g/kg de peso. En todos los casos los animales desarrollaron mal estar general, con los siguientes síntomas: espasmos abdominales, erizado de pieles, letargo, postración, la inactividad y la pérdida de peso. Tres de las seis ratas murieron a las 24 horas, y las otras tres sobrevivieron recuperándose por completo en 8 días después del (Miranda-Beltrán, Puebla-Pérez, Guzmán-Sánchez, & Huacuja Ruiz, 2003). Por otro lado, no se han encontrado estudios que evalúen la actividad antitumoral de los extractos de K. gastonis-bonnieri.

10 2.2.5. Técnicas de extracción 2.2.5.1. Extracción con solventes La extracción consiste en la separación de los diferentes componentes presentes en la matriz vegetal por medio de un solvente (polar o apolar). Son utilizadas diferentes técnicas como maceración, percolación, infusión, digestión, decocción, extracción Soxhlet, extracción alcohólica acuosa por fermentación, extracción contracorriente, extracción con ultrasonido, extracción con fluidos supercrítico, entre otros. (Handa, Khanuja, Longo, & Rakesh, 2008) 2.2.5.2. Maceración Es una técnica de extracción sólido/líquido siendo un procedimiento simple y ampliamente utilizado, el cual implica dejar la planta (pulverizado) para remojar en un solvente adecuado en un contenedor cerrado a temperatura ambiente. El método es adecuado tanto para la extracción inicial como a granel, puede aumentar la velocidad de la extracción realizando agitación ocasional o constante de la preparación (usando agitadores o mezcladores para garantizar una mezcla homogénea). La extracción finalmente se detiene cuando se produce un equilibrio alcanzado entre la concentración de metabolitos en el extracto y el material vegetal. Después de la extracción, el material vegetal residual (orujo) tiene que estar separado del solvente. Esto implica una clarificación por decantación, que generalmente es seguido por un paso de filtración (Sarver, Latif, & Gray, 2006). 2.2.5.3. Extracción Soxhlet En este método de extracción, el material vegetal se coloca en el dedal en el cuerpo del extractor que se ajusta con el balón y el condensador. Se agrega un solvente adecuado y el montaje se calienta por un tiempo de 2 a 3 h. El solvente evaporado se condensa y cae sobre la muestra y cuando alcanza el nivel hace el sifón y retorna al balón (Sarver, Latif, & Gray, 2006). 2.2.6. Tamizaje Fitoquímico El tamizaje fitoquímico o "screening" fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyente químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. El tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración. Debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo. Los resultados del tamizaje fitoquímico constituyen únicamente una orientación y deben interpretarse en conjunto con los resultados del "screening" farmacológico. Así, cuando una planta re ve la acción sobre el sistema nervioso central durante el tamizaje farmacológico y presencia de alcaloides en el tamizaje fitoquímico, es bastante probable que la acción farmacológica se deba a la fracción alcaloide. De la misma manera, el hecho de evidenciarse la presencia de flavonoides en el "screening" fitoquímico y una acción antiinflamatoria en el "screening" farmacológico, esta última puede asociarse a la fracción de

11 flavonoides. Esta fracción puede, entonces, ser aislada y sometida a pruebas más específicas (Sherapin, 2000). 2.2.7. Metabolitos secundarios Los metabolitos secundarios presentan gran diversidad química, y se han identificado más de 200 000 estructuras químicas diversas (Tsanko, y otros, 2014). En comparación con los metabolitos primarios, que son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas, los metabolitos secundarios tienen funciones internas en las plantas y también participan en la comunicación de estas con el ambiente (Quinn, Kessell, & A.Weston, 2014). Esta interacción puede ocurrir de múltiples formas e.g. la acumulación de pigmentos en los pétalos de las flores, o la liberación de productos químicos volátiles por las flores para atraer a los polinizadores (Karppinen, Zoratti, Nguyenquynh, Häggman, & Jaakola, 2016) por la liberación de compuestos volátiles por una hoja dañada por una oruga de pastoreo para atraer avispas depredadoras en una interacción tritrófica, o la producción de compuestos químicos amargos o tóxicos que sirven como antialimentadores (Moore, Andrew,, ulheim, & Foley, 2014). 2.2.7.1. Terpenos o terpenoides Se han descrito aproximadamente 30 000 terpenoides, los cuales presentan una enorme variabilidad estructural, pero tienen en común su origen biosintético. Se derivan a partir de la unión de unidades de cinco carbonos de isopentano y también son referidos como isoprenoides y como terpenos. Este grupo se clasifica según sus unidades de carbono. De esta forma, se designan como hemiterpeno al terpenoide de cinco carbonos, monoterpeno al terpenoide de 10 carbonos, sesquiterpeno al terpenoide de 15 carbonos, diterpeno al terpenoide de 20 carbonos y como triterpeno al terpenoide de 30 carbonos. (Moses, Pollier, Thevelein, & Goossens, 2013). 2.2.7.2. Alcaloides Durante gran parte de la historia humana, los extractos de las plantas que contienen alcaloides se han utilizado como ingredientes en pociones y venenos (Ojito Ramos & Portal, 2017). El término alcaloide, acuñado en 1819 en Halle (Saale) Alemania, encuentra su origen en el nombre árabe alqali, la planta de la cual la soda se aisló por primera vez (Buchanan, Gruissem, & Jones, 2015). Los alcaloides se definieron originalmente como compuestos básicos farmacológicamente activos y nitrogenados de origen vegetal. Después de 200 años de investigación, esta definición ya no abarca todo el campo de alcaloides, pero en muchos casos sigue siendo apropiado. Muchos de los alcaloides que se han descubierto no son farmacológicamente activos en mamíferos, y algunos son neutros en vez de básicos, a pesar de la presencia de un átomo de nitrógeno en la molécula (Kim, Estrada, & Chavez, 2016). Más de 20 000 alcaloides se han aislado de varios organismos desde el descubrimiento de la morfina. Se estima que el número de géneros de plantas es superior a 20 000. Aproximadamente, el 9% de los géneros de las plantas tienen especies acumuladoras de alcaloides, y estas plantas abundan en los géneros pertenecientes a las angiospermas (plantas con flores) (Ncube & Staden, 2015).

12 2.2.7.3. Flavonoides Los flavonoides pertenecen a un grupo de compuestos naturales arreglados bajo un sistema C6-C3-C6, en el cual dos anillos aromáticos llamados A y B están unidos por una unidad de tres carbonos que pueden o no formar un tercer anillo, que en caso de existir es llamado anillo C. Se conoce como 10 clases de flavonoides, los cuales pueden encontrarse como aglicona o bajo la forma de glicósidos con una o tres unidades de azúcar, generalmente en los carbonos 3 y 7, siendo los azúcares más comunes, la glucosa, galactosa, ramnosa, xilosa y arabinosa. (Lock, Cabello,, & Doroteo, 2006)

“Se hallan presentes en todas las partes de la planta, algunas clases se encuentran más ampliamente distribuidas que otras, siendo más comunes las flavonas y flavonoles, pero, más restringidas en su ocurrencia, las isoflavonas, las chalconas y auronas”. (Lock, Cabello,, & Doroteo, 2006)

“Estos compuestos poseen también importancia farmacológica, resultado de algunas propiedades importantes atribuidas a algunos representantes de las diferentes clases, como antiinflamatorio, antialérgico, antiulcerogénico, antiviral, anticarcinogénico; asimismo, son utilizados para el tratamiento de la fragilidad capilar, de la diabetes y de las afecciones cardiacas, entre otras”. (Lock, Cabello,, & Doroteo, 2006) Como características generales de estos compuestos debemos señalar su solubilidad en agua y etanol, su carácter fenólico y su intensa absorción en la región ultravioleta y visible del espectro, debido a la presencia de sistemas aromáticos conjugados. Una clasificación preliminar del tipo de flavonoide en un extracto de planta, puede hacerse basado inicialmente en un estudio de sus propiedades de solubilidad y de comportamiento ante reacciones de color; esto, seguido por un examen cromatográfico directamente del extracto o del extracto hidrolizado. (Lock, Cabello,, & Doroteo, 2006) 2.2.7.4. Taninos Los taninos son compuestos químicos de carácter fenólico de alto peso molecular, no cristalizables, que forman con el agua soluciones coloidales de reacción ácida y de sabor muy astringente. Aunque su constitución química sea diferente entre un tipo de tanino y otro existen propiedades semejantes, por la presencia de grupos fenólicos en todos ellos. Se distinguen clásicamente dos grupos de taninos que difieren por su estructura y por su origen biogenético (Paternina, 2018): a. Taninos hidrolizables: la hidrólisis se puede realizar por medio de ácido diluido y caliente o por la acción de una diastasa especial, producida por el Aspergillus Niger llamada tanasa. Según los productos que se obtengan en la hidrólisis, este grupo de taninos se divide en 2 subgrupos: - Aquellos que producen azúcares (generalmente glucosa) y ácidos fenólicos. Pueden ser heterósidos o ésteres, de la glucosa con los ácidos fenólicos o con sus dépsidos (Delporte, 2010).

13 - Taninos hidrolizables en ácidos fenólicos o dépsi-taninos: Los dépsi-taninos se diferencian de los taninos glicosídicos en que por desdoblamiento hidrolítico no producen azúcares, sino únicamente ácidos fenólicos o sus dépsidos. Este tipo de taninos cumplen en general con las propiedades de estos compuestos: son reductores, se colorean de verde con FeCl3, precipitan con acetato de Pb o con los alcaloides. En cambio, la propiedad de coagular la gelatina o de curtir la piel sólo aparece cuando la molécula del dépsido es tan grande que produce soluciones coloidales (Delporte, 2010). b. Taninos no hidrolizables, condensado o catéquico: Se trata de principios curtientes que no se pueden hidrolizar porque contienen un esqueleto carbonado continuo (Paternina, 2018). 2.2.7.5. Heterósidos cardiotónicos Los glucósidos o heterósidos son compuestos que están formadas por dos partes: una es un azúcar y la otra de no-azúcar o aglucona, aglicón o genina. Estas moléculas constituyen los principios activos de muchas plantas y su actividad farmacológica se debe fundamentalmente a la parte no glucídica (Cañete, 2010). A este grupo pertenecen una serie de principios activos que actúan directamente sobre el músculo cardíaco y, por tanto, ejercen su acción terapéutica en la insuficiencia cardíaca congestiva o en las alteraciones del ritmo cardíaco. Sin embargo, precisamente por la gravedad de esta patología y las características especiales de estos principios activos, cuyo margen terapéutico es sumamente estrecho, muchas de las drogas que los contienen, no se emplean en la actualidad directamente como productos fitoterapéuticos, aunque sus principios activos aislados siguen siendo indispensables en la terapéutica. Los heterósidos cardiotónicos también se denominan digitálicos, debido al nombre de la especie. (Cañete, 2010). Su característica principal es que tienen acción específica sobre el corazón y algunos de ellos no han podido ser sustituidos por fármacos de síntesis. Las drogas con cardiotónicos son muy tóxicas (10 gr de hoja desecada, 40 gr de hoja fresca son mortales). Antiguamente, los estrofantos fueron utilizados como venenos para la caza o guerra. (Cañete, 2010) Se utiliza la reacción de Liebermann-Burchard, para determinar esteroides que cumplan con lo siguiente: un sustituyente -OH en posición 3 y un doble enlace preexistente en el anillo A o en el B, o bien que puedan formar este doble enlace, por la deshidratación generada por el H2SO4 durante la reacción, conjugándose con el originado en C3=C4 o C3=C2. La aparición de un color verde que varía con el tiempo que va hasta azul petróleo, lo que indica una reacción positiva. Para el reconocimiento del grupo cardenólido, se utiliza la reacción de Kedde, la cual es positiva con color azulado, rosa y hasta violeta (Paternina, 2018). 2.2.7.6. Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos vegetales varían mucho en tamaño y complejidad, pero todos generalmente poseen (o se derivan de compuestos que poseían) un anillo aromático de areno

14 (fenilo) con al menos un grupo hidroxilo unido (Caretto, Linsalata, Colella, Mita, & Lattanzio, 2015). El grupo hidroxilo fenólico es ácido en comparación con otros grupos hidroxilo porque reside en un anillo de areno, que puede estabilizar fácilmente un sustituyente de oxígeno desprotonado. Como resultado, los compuestos fenólicos son reactivos y adecuados para construir bloques de grandes polímeros, como ligninas o suberinas, y en la formación de un gran número de compuestos que desempeñan papeles importantes en muchos aspectos de la biología vegetal (Ncube & Staden, 2015) . 2.2.8. Actividad antioxidante Según Clarkson, (1995), la medición de una muestra oxidante, pueden usarse intermediarios o productos finales para valorar la actividad antioxidante. (Ovar del río, 2013) La actividad antioxidante de una muestra no puede ser determinada basándose solo en un ensayo de prueba. En la práctica se realizan muchos modelos de test in vitro para evaluar la actividad antioxidante de la muestra de interés; sin embargo, es necesario considerar que los modelos presenten diferentes variaciones puede dificultar un poco la comparación de los resultados entre un método y otro. (Ovar del río, 2013) Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías: - Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno - Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones (ET) (Huang, Ou, & Prior, 2005). La molécula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), cuya fórmula estructural es la siguiente: Figura 1. Fórmula estructural del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

Fuente: (Sagar, 2011) Es conocida como un radical libre estable debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del electrón también intensifica el color

15 violeta intenso típico del radical, el cual absorbe en metanol a 517 nm. Cuando la solución de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar un átomo de hidrógeno como se muestra en la figura 8, el color violeta se desvanece. El cambio de color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de los parámetros para las propiedades antioxidantes. Después de aproximadamente tres décadas este ensayo comenzó a utilizarse rutinariamente para la caracterización de las propiedades antioxidantes. (Ovar del río, 2013). 2.2.9. Toxicidad Los estudios toxicológicos ofrecen a los investigadores información sobre la dosis a partir de las cuales los efectos tóxicos comienzan a aparecer. Es imprescindible establecer los efectos tóxicos de las drogas y sus principios activos y para ello se realizan estudios de toxicidad aguda, toxicidad subaguda, y toxicidad crónica sobre animales de experimentación. Se debe de realizar como mínimo en dos especies animales y una de ellas no debe de ser roedores. (Novillo, 2018). 2.2.9.1. Toxicidad aguda Son ensayos que se realizan a corto plazo de forma prácticamente inmediata, generalmente por la administración de una dosis a animales de experimentación. Se puede determinar el parámetro dosis letal 50 (DL50), que es la cantidad de droga o de principio activo necesaria para producir la muerte de la mitad de los animales de experimentación a los que se ha administrado la dosis. La determinación de la DL50 sirve como orientación para el cálculo de la Dosis Efectiva DE50). La diferencia entre las DL50 y la DE50 debe ser en lo mínimo, 1.5 a 2.0 veces. (Novillo, 2018). 2.2.9.2. Toxicidad subaguda o subcrónica Son ensayos que se realizan a medio plazo, generalmente a 30 días (un mes) pero también en muchos casos a 90 días. Se administran dosis terapéuticas y transcurrido el periodo de tiempo se evalúan los posibles casos de intoxicación. (Novillo, 2018). 2.2.9.3. Toxicidad crónica Son ensayos que se realizan a largo plazo, y el periodo de tiempo puede oscilar entre varios meses y 3 años (generalmente 1-2 años). Se administran dosis terapéuticas de forma continua. La principal finalidad es evaluar posibles efectos teratogénicos (capacidad para producir alteraciones en el feto), efectos carcinógenos (capacidad para desarrollar canceres) y efectos mutagénicos (capacidad para producir mutaciones). (Novillo, 2018). 2.2.10. Bioensayo de toxicidad en Artemia salina En la actualidad muchos de los medicamentos empleados para el tratamiento de diversas enfermedades incluyendo el cáncer son obtenidos de especies vegetales (Koehn & Carter, 2005). La metodología para la búsqueda de estas nuevas sustancias con actividad citotóxica es muy variada, sin embargo, existen algunos reportes donde se propone el método de nauplios de

16 Artemia salina, como un estudio inicial para dirigir la búsqueda de compuestos citotóxicos a partir de extractos vegetales (Meyer, 1982). Una de las estrategias generales de la búsqueda de nuevos citotóxicos consta en hacer un escrutinio inicial de los extractos vegetales selectos en base a información recopilada de libros históricos mediante el empleo de un bioensayo sencillo, en este caso se hace mención al crustáceo Artemia salina. Los extractos positivos al bioensayo se someten al estudio químico detallado para llegar a compuestos puros o mezcla de compuestos, los cuales se someten de nuevo al bioensayo, para hacer la selección en base a la concentración letal 50 (%CL50). Los compuestos puros o mezcla de compuestos seleccionados en el escrutinio preliminar como se menciona anteriormente, se evalúan empleando un panel de líneas celulares derivadas de tumores primarios humanos.

2.3. Marco legal El presente estudio de investigación se sustenta en la siguiente reglamentación: 2.3.1. Constitución de la República del Ecuador. Régimen del buen vivir. Art. 363.- El Estado será responsable de: Garantizar la disponibilidad y acceso a medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover la producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las necesidades epidemiológicas de la población. En el acceso a medicamentos, los intereses de la salud pública prevalecerán sobre los económicos y comerciales (Ministerio de Salud, 2017). 2.3.2. Normativa sanitaria para la obtención del Registro sanitario Capítulo XIII De la vigilancia y control Art. 54.- Las acciones de vigilancia y control postregistro en los establecimientos donde se fabrican, almacenan, distribuyen y comercializan Productos Naturales Procesados de Uso Medicinal, se ejecutarán periódicamente con el objeto de verificar el cumplimiento de las especificaciones técnicas del producto con las cuales se otorgó el Registro Sanitario, así como ante denuncias presentadas al ARCSA y alertas sanitarias (ARCSA, 2016). 2.4. Hipótesis

Hi: El extracto diclorometano-metanol de la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri presenta las mismas propiedades farmacognósicas que el extracto diclorometano-metanol de la especie Kalanchoe daigremontiana

H0: El extracto diclorometano-metanol de la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri no presenta las mismas propiedades farmacognósicas que el extracto diclorometano-metanol de la especie Kalanchoe daigremontiana

17 2.5. Conceptualización de las variables 2.5.1. Etapa I: Control de calidad y análisis fitoquímico de las especies en estudio No existen variables independientes ni dependientes al no presentar un diseño experimental, se aplica únicamente estadística básica 2.5.2. Etapa II: Cuantificación de flavonoides totales Variables independientes Especies vegetales

Variables dependientes Concentración de flavonoides 2.5.3. Etapa III: Cuantificación de fenoles totales Variable independiente Especie vegetales

Variable dependiente Concentración de fenoles totales 2.5.4. Etapa IV: Capacidad antioxidante Variables independientes Especies vegetales

Variable dependiente % de inhibición del radical DPPH 2.5.5. Etapa V: Toxicidad Variables independientes Especies vegetales

Variable dependiente CL50

18 Capítulo III Marco metodológico

3.1. Diseño de Investigación

El enfoque de esta investigación se centra en un paradigma cuantitativo ya que su desarrollo estuvo envuelto en perfiles cromatográficos que permiten la recolección de datos y el análisis de los mismos con la finalidad de aceptar o rechazar las hipótesis establecidas. El nivel de investigación es descriptivo, ya que según (Hernández, 2014), se busca especificar propiedades y características importantes de cualquier fenómeno que se analice, en este caso correspondería a los extractos vegetales. Además, es explicativo porque determina las causas que generan la toxicidad de las especies en estudio con la ayuda de Artemia salina. El tipo de investigación corresponde al bibliográfico debido a que permite recopilar información mediante una observación sistemática que sirva de sustento en posteriores estudios en el país. 3.2. Población y Muestra

3.2.1. Población El estudio no involucra población pues corresponde a una investigación experimental. 3.2.2. Muestra Para este estudio la muestra analítica corresponde a las hojas de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, las cuales fueron adquiridas en el huerto “Plantas Ecuador” ubicado en el valle de los Chillos, cantón Rumiñahui y en “Geo Natural” ubicado en el sur de Quito, cantón Quito pertenecientes a la Provincia de Pichincha. 3.3. Materiales y Método

3.3.1. Materiales Tabla 3. Materiales y reactivos

Materiales Reactivos Aguja Balones aforados de 10 mL, 20mL, 25 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL y 1000mL Acetato de plomo Bureta Ácido acético glacial Cajas Petri Ácido ascórbico Capilares Ácido clorhídrico © Capuchones de celulosa Ácido clorhídrico 3M Celdas de cuarzo Ácido clorhídrico 5% Crisoles Ácido gálico Desecador Ácido sulfúrico ©

19 Embudo de Büchner Ácido sulfúrico 1N Embudos Agua destilada Embudos de separación Agua de mar artificial Equipo soxhlet Alcohol 96% Espátulas Amoniaco Frascos ámbar varios tamaños Anhídrido acético Gradilla BHT Hilo de coser blanco Bicarbonato de sodio Lámparas Cloroformo Manguera Cloruro de aluminio 10% Matraces Erlenmeyer Cloruro de sodio Matraz Kitasato Cloruro férrico (2% y 5%) Micropipetas Diclorometano Microplaca de 96 pocillos Diclorometano Papel aluminio Éter de petróleo Papel empaque Éter de petróleo Papel filtro Éter dietílico Pera de succión Éter dietílico Pecera Gelatina salada Pinzas de crisoles Gelatina salada Pipetas Pasteur Hexano Pipetas volumétricas Hidróxido de sodio 20% Piseta Hidróxido de potasio 5% Placa de porcelana Hipoclorito de sodio 0,5% Placas de sílica gel Limaduras de Magnesio Plástico film Metanol grado analítico Probetas Nitrato de plata 0.1N Puntas para micropipeta Quercetina Soporte universal Reactivo de Dragendorff Termómetro Reactivo de Folin-Ciocalteu Tiras pH Reactivo Mayer Tubos de ensayo Reactivo Wagner Varilla de agitación Vasos de precipitación Vidrio reloj Elaborado por Valenzuela J.

20 Tabla 4. Equipos

Nombre Descripción

Balanza analítica OHAUS A±0.0001 Bomba de oxígeno Binder Estufa Cámara cromatográfica CARBOLITE, modelo RHF1400 Mufla CIMAREC Plancha de calentamiento CIMAREC Agitador magnético Bomba al vacío Genie 2 TM Vortex IKA® RV10 Control Rotavapor Lámpara de luz UV 254nm y 396nm BioteK, modelo Synergy H1 Lector de microplacas híbrido modelo SP2100 UV-PC Espectrofotómetro UV-visible Equipo de extracción soxhlet Potenciómetro VELP SCIENTIFICA, modelo SER148 Extractor de grasa METTLER TOLEDO, modelo HX204 Analizador de Humedad

Elaborado por Valenzuela J. 3.3.2. Método El estudio de investigación se dividió en cinco etapas, ejecutadas en los laboratorios de la facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, las cuales se detallan a continuación: 3.3.2.1. Primera etapa: Recolección, identificación taxonómica de la muestra y control de calidad. Consecutivamente a la recolección de hojas de ambas especies se corroboró la identificación taxonómica de cada una de ellas con la ayuda del Herbario Alfredo Paredes de la

21 Universidad Central del Ecuador, el mismo que emitió un certificado de identificación taxonómica. 3.3.2.1.1. Tratamiento de muestra vegetal Una vez recolectada las muestras de hojas de la Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, se procedió a seleccionar y retirar partículas extrañas para su posterior lavado con agua destilada seguido de la desinfección con hipoclorito de sodio al 0,5% por dos minutos, finalmente se volvió a lavar con agua para eliminar trazas del hipoclorito de sodio que quedan en la superficie de las hojas. Posteriormente, se secaron en una estufa a 40 °C por 24 h para luego ser triturada con la ayuda de un mortero, teniendo precaución de no llegar a polvo debido a que se logra mayor contacto con el solvente y se evita que se apelmace el material vegetal, mejorando la extracción. Completado el tratamiento de las muestras, se almacenó en frasco herméticamente sellados, alejados de la luz directa y en un ambiente fresco y seco con la finalidad que se mantengan en óptimas condiciones para al momento del análisis. 3.3.2.1.2. Determinación de humedad de muestra vegetal Para la determinación de la pérdida por secado, se utilizó un analizador de humedad Metler Toledo HX204, en el cual se colocaron 2 g de muestra seca y triturada, la misma que se distribuyó uniformemente por toda la superficie del plato dejando una capa fina, con la finalidad de que mejore la repetibilidad de las mediciones. Se realizó por triplicado. 3.3.2.1.3. Determinación de cenizas totales Se procedió en base al método de determinación de cenizas totales propuesto por la (Farmacopea argentina, 2003). En un crisol previamente tarado, se pesaron 2g de muestra seca, triturada y tamizada (Tamiz N°20). Se sometió a calcinación en una placa de calentamiento a 540°C hasta que dejara de emanar residuos carbonosos, posteriormente se introdujo en la mufla subiendo gradualmente la temperatura desde 550°C, por 30minutos, hasta 675°C, manteniendo esta temperatura por dos horas. Una vez disminuida la temperatura de la mufla, se tomaron los crisoles y se dejaron en desecadores hasta su total enfriamiento para luego pesarlos. Se repitió la calcinación gradual hasta que el peso se mantuviera constante. Se calculó con la siguiente ecuación:

− % = × Ecuación N°1: Porcentaje de −cenizas totales Donde: m: Masa del crisol vacío m1: Masa del crisol con la muestra seca m2: Masa del crisol con cenizas

22 3.3.2.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido Al contenido de cenizas totales obtenidas en el procedimiento anterior, se le sometió a ebullición con 25 mL de ácido clorhídrico 3M durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, se filtró con papel filtro libre de cenizas y se lavó los residuos con agua caliente hasta que no existan trazas de ácido clorhídrico; para comprobar su ausencia se colocaron gotas de nitrato de plata 0.1N en el vaso contenedor pues genera precipitados blanquecinos en presencia de cloruros. El papel filtro con los residuos se colocó nuevamente en el crisol para someterlo a calcinación en una placa de calentamiento a 540°C hasta consumir la mayor parte del papel, inmediatamente se introdujo en la mufla a 675°C por 2h. Transcurrido este tiempo, se enfriaron los crisoles en el desecador para luego ser pesados. Este proceso se repitió hasta que los pesos permanecieran constantes. Con los datos recolectados se determinó el porcentaje de cenizas insolubles en ácido a partir del peso de la droga empelada según se indica en la Ecuación N°2.

− % á = × Ecuación N°2: Porcentaje de cenizas insolubles− en HCl

Donde: m: Masa del crisol vacío m1: Masa del crisol con la muestra seca m2: Masa del crisol con cenizas insolubles en HCl 3.3.2.1.5. Determinación de grasas totales Este proceso se ejecutó, en base a los protocolos establecidos en la OSP laboratorio de alimentos en la Facultad de Ciencias Químicas. En principio, se pesó 5g de hojas secas previamente trituradas hasta obtener partículas finas y homogéneas. Estas fueron introducidas en la estufa por una hora, con la finalidad de eliminar trazas de humedad que aun estuvieran en las muestras, una vez transcurrido este tiempo se dejó enfriar en un desecador para luego ser colocadas en papel filtro y estos a su vez dentro de capuchones de celulosa previamente pesados. Se los colocó en el equipo extractor. Por otro lado, se tararon (por 1h en la estufa) y pesaron vasos de vidrio propios del equipo, a los cuales se añadieron aproximadamente 50 mL de éter dietílico. Posteriormente, se encendió el equipo, el cual funciona como un Soxhlet, cumpliendo tres etapas: Extracción de grasas, lavado y recuperación del solvente. Extraída la grasa se pesó el vaso con grasa y se calculó el porcentaje según la siguiente ecuación: − ) × ( Ecuación% N°3: Porcentaje= de grasa total

Donde:

23 A: Peso en gramos de la muestra B: Peso en gramos del vaso de extracción después de secado C: Peso en gramos del vaso de extracción vacío 3.3.2.2. Segunda etapa: Preparación de extractos de las especies en estudio. 3.3.2.2.1. Desengrasado de hojas secas por extracción Soxhlet Se utilizó aproximadamente 55 gramos de hojas secas trituradas y tamizadas (tamiz N°20), las mismas que fueron colocadas en capuchones de peso conocido para posteriormente ser colocadas en el equipo. Se realizó un reflujo en equipo Soxhlet con aproximadamente 300mL hexano por 6h tal y como lo indica (Kuklinski, 2003). Posteriormente, se secó los capuchones, asegurándose que todo el hexano se haya evaporado para luego ser pesado y macerado en una mezcla Diclorometano-metanol 1:1. Adicionalmente se concentró en el rotavapor el extracto hexánico a 40°C y 100 rpm y se almacenó herméticamente en refrigeración, protegido de la luz con papel Aluminio, el concentrado para posteriores ensayos. 3.3.2.2.2. Extracción vegetal por el método de maceración Se pesó aproximadamente 50 g de hojas secas desengrasadas y trituradas, las mismas que se colocaron en un envase de vidrio hermético y cubierto con papel aluminio para evitar el paso de la luz, conjuntamente con la mezcla Diclorometano-metanol 1:1 hasta cubrir por completo la muestra. Se dejó en maceración por 48h, agitando 5 minutos por día. Una vez transcurrido este tiempo, se filtró y concentró en el rotavapor a 40°C y 80 rpm hasta evaporar la mayor cantidad de solvente. Los extractos concentrados se colocaron en cajas Petri de vidrio, previamente pesadas, para completar la evaporación del solvente. Una vez concluida, se sellaron las cajas Petri y protegieron de la luz con papel aluminio para ser almacenadas en refrigeración hasta los ensayos pertinentes. Por último, se pesó la muestra seca para la determinación del porcentaje de rendimiento mediante la siguiente ecuación:

% = ×

Ecuación N°4: Porcentaje de rendimiento

3.3.2.2.3. Extracción vegetal por infusión Se pesó aproximadamente 25 g de hojas secas trituradas, las mismas que se colocaron en un envase de vidrio hermético y cubierto con papel aluminio para evitar el paso de la luz, conjuntamente con agua destilada hirviendo hasta cubrir las hojas por completo (50 mL). Se dejó en reposo por 10 minutos, transcurrido este tiempo, se filtró y se dejó enfriar la solución. Se pesaron las hojas secas para obtener el porcentaje de rendimiento. − % = ×

Ecuación N°5: Porcentaje de rendimiento en infusión y jugo

24 3.3.2.2.4. Extracción vegetal por trituración con solvente Se pesó aproximadamente 25 g de hojas frescas, las mismas que se trituraron conjuntamente con agua destilada hasta cubrir las hojas por completo (50 mL). Se dejó en reposo por 10 minutos, transcurrido este tiempo, se filtró, almacenándola en un recipiente hermético y protegido de la luz. Se utilizó el mismo día de su preparación. El porcentaje de rendimiento se calculó en base a la ecuación N°5 3.3.2.3. Tercera etapa: Tamizaje fitoquímico. El tamizaje fitoquímico aplicado siguió la metodología de (Sherapin, 2000) y (Carvajal Rojas, Hata Uribe, Sierra Martínez, & Rueda Niño, 2009). 3.3.2.3.1. Identificación de Alcaloides. Se diluyó 15 g del extracto concentrado en 10mL de etanol al 96%. Una vez disuelto, se colocó HCl 5% hasta llegar un pH ácido de 3, sometiéndolo a calentamiento por un par de minutos a 60°C. Posteriormente se filtró y se colocó 0.5 mL del filtrado en 3 tubos de ensayo para las pruebas de identificación con gotas de los reactivos de Mayer, Dragendorff y Wagner. Al filtrado sobrante, se le llevó a un pH 8 con NaOH al 20%, se transfirió el extracto alcalinizado a un embudo para luego ser extraído con cloroformo en proporción 1:1. Se separó la fase acuosa A1 de la clorofórmica C1; a la fase A1 se le agregó Cloroformo-etanol 3:2, generando nuevamente dos fases: A2 y C2, a las cuales también se les realizó identificación de alcaloides, pero previo a ello se les llevó a un pH 2, se evaporó restos de solvente y se filtró. Por otro lado, en la fase C1 se redujo por calentamiento el solvente y se extrajo el residuo con 3 mL de HCl 5%, seguido de la filtración, finalmente se realizó pruebas de precipitación en tubos de ensayo. Finalmente, para confirmar, se realizó la CCF, para ello se saturó la cámara por 30 minutos con la fase móvil correspondiente a Cloroformo-metanol-amoniaco (80:40:15) según (Wagner, 2001), utilizando como referencia la atropina 1%, luego se dejó secar las placas y se las observó en lámpara UV. 3.3.2.3.2. Identificación de Esteroides y triterpenos. Reacción de Liebermann-Burchard: se diluyó 0.2 g del extracto hexánico seco con 1 mL de cloroformo, una vez disuelto se adicionó 1 mL de anhidrido acético y mezcló para luego agregar por las paredes del tubo 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Se observó y registró los resultados. Para confirmar, se realizó la CCF, para ello se saturó la cámara por 30 minutos con la fase móvil correspondiente a diclorometano-metanol (95:5), se reveló con reactivo de KOM (0.5 mg de 4-hidroxibenzaldehido,90 mL de etanol y 10 mL de ácido sulfúrico). 3.3.2.3.3. Identificación de Nafto y antraquinonas. Con la ayuda de la reacción Bornträger-Krauss se realizó la identificación de este tipo de metabolitos secundarios. Para ello, se diluyó 0.5 g del extracto desengrasado seco en una solución etanólica en agua (1:7), a la misma que se le adicionó agua oxigenada y ácido sulfúrico 1N para luego someterlo a calentamiento por 10 minutos. Una vez fría la solución, al filtrado se le agregó tolueno, hidróxido de amonio 2% y se procedió a agitar. Finalmente, se dejó en reposo

25 hasta la separación completa de las fases. Se observó si hubo un cambio de coloración de la capa acuosa. 3.3.2.3.4. Flavonoides. Las reacciones de identificación se realizaron en el extracto hexánico y el extracto diclorometano-metanol, para ello se siguió un tratamiento específico para cada una de ellas, explicadas a continuación: Reacción de Shinoda: - Se tomó 5mL del extracto hexánico concentrado y se lo llevó a evaporación, luego de ello se disolvió el residuo en 2 mL de etanol caliente. Una vez fría la solución se adicionó limaduras de Mg y 1 mL de HCl ©. - Se evaporó 5 mL del extracto concentrado Diclorometano-metanol y se disolvió los residuos con 10 mL etanol. En un embudo de separación, se acidificó el extracto etanólico con 4 mL HCl 20% y se le agregó 3x10 mL de éter de petróleo, posteriormente se separó la fase etérea FE1 de la fase acuosa FA1 y se concentró. Se tomó 10 del concentrado y se evaporó el solvente, para luego disolver el residuo con etanol al 50%. Finalmente, se adicionó limaduras de Mg y 1 mL de HCl ©. Identificación de antocianidinas - A la fase acuosa acidificada FA1, obtenida para la reacción de Shinoda, se le agregó gotas de HCl© y se dejó en reposo una vez agitado. Se observó si hubo un cambio de coloración, si fuere positivo se adicionó amoníaco para elevar su pH a 9-10 con la finalidad de observar nuevamente un cambio coloración en la solución. Este procedimiento se realizó de igual manera en el jugo de las hojas de cada especie estudiada. Finalmente, para confirmar, se realizó la CCF, para ello se saturó la cámara por 30 minutos con la fase móvil correspondiente a Acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético glacial, agua (100:11:11:26) según (Wagner, 2001), utilizando como referencia la quercetina, luego se dejó secar las placas y se las observó en lámpara UV. 3.3.2.3.5. Taninos/fenoles. Se empleó tres pruebas para la identificación de este grupo de metabolitos secundarios: - Reacción con gelatina salada Se tomó 2 mL del extracto etanólico a los cuales se agregó una solución de gelatina salada 10% (1% Gelatina: 10% NaCl). Se observó la presencia de precipitado blanco.

- Reacción con FeCl3 2%

Se tomó 5 mL del extracto etanólico y se adicionó 2 mL de agua, seguido se agregó 5 gotas de FeCl3 2% y se observó si hubo cambios de coloración tales como azul, verde o negro.

26 3.3.2.3.6. Glicósidos cardiotónicos Se realizó el test de Keller-Killiani, el cual consistió en pesar 0.1 g del extracto, se le añadió agua destilada y se agitó por cinco minutos, posteriormente se le agregó 2 mL de ácido acético glacial, gotas de FeCl3 y 1 mL de H2SO4 por las paredes del tubo de ensayo. Se observó la presencia de un anillo café. 3.3.2.3.7. Saponinas. Se tomó 1 g de hojas secas, se las dejó macerar por 24h en etanol al 96%, luego de ello se filtró y se colocó en un embudo de separación en donde se agregó una cantidad igual de éter de petróleo. En la fracción acuosa, se realizaron las siguientes reacciones: - En un tubo de ensayo se agregó 5 mL del extracto etanólico y 1 mL de agua, se agitó vigorosamente por 5 minutos y se dejó reposar, tomando el tiempo en el que la espuma formada permaneció estable. 3.3.2.4. Cuarta etapa: Cuantificación de metabolitos secundarios de los extractos vegetales. 3.3.2.4.1. Cuantificación de flavonoides totales Preparación de la curva de calibración Se preparó 25 mL de una solución madre etanólica de Quercetina a una concentración de 200 ppm. A partir de esta solución, se prepararon diluciones a diferentes concentraciones: 1.5, 2, 4.5,6,7.5 y 9 ppm. En tubos de ensayo cubiertos con papel aluminio, se adicionó los volúmenes de solución madre detallados en la Tabla 5. conjuntamente con 200μL de Tricloruro de aluminio al 10% y con la ayuda de una bureta se llevó a un volumen de 5 mL con etanol al 96%. Una vez preparadas las soluciones, se almacenaron en oscuridad total, a temperatura ambiente por 30 minutos para luego leerlos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 425 nm. Las lecturas se realizaron por triplicado. Tabla 5. Curva de calibración de Quercetina

Estándar Volumen AlCl3 10% solución madre (μl) Volumen Concentración Quercetina etanol 96% (ppm) (μl) (mL) Blanco 0.0 0 5,000 0.0 1 37.5 200 4,763 1.5 2 50.0 200 4.750 2.0 3 112.5 200 4,688 4.5 4 150.0 200 4,650 6.0 5 187.5 200 4,613 7.5 6 225.0 200 4,575 9.0 Elaborado por Valenzuela J.

27 Preparación de las muestras vegetales Se pesó 0.1 g de muestra y se aforó a 10 mL con etanol 96%. Una vez preparada la solución madres, se tomó 500 μL de esta solución y se agregó 200 μL de AlCl3 10%, llevando al aforo con etanol 96% en un balón aforado de 5 mL. Una vez preparada la solución, se almacenó en oscuridad total, a temperatura ambiente por 30 minutos para luego leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 425 nm. Se utilizó este ensayo en extracto hexánico, extracto desengrasado, infusión y jugo de las hojas de Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana. El blanco utilizado fue etanol. Las lecturas se realizaron por triplicado. 3.3.2.4.2. Cuantificación de Fenoles Totales Se determinó mediante el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu Preparación de la curva de calibración Se preparó 10 mL de una solución madre etanólica de ácido Gálico a concentraciones de 100, 200,300,500 y 600 ppm. En tubos de ensayo cubiertos con papel aluminio, se colocó 0.1mL de las soluciones madre y 0.5 mL del reactivo Folin-Ciocalteu, posteriormente se aforó a 10 mL con agua destilada. En cuanto al blanco, se preparó una solución con 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y 9.5 mL de agua destilada. Finalmente, se almacenaron en oscuridad total, a temperatura ambiente por 2 horas para luego leerlos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 765 nm. Preparación de las muestras vegetales Se pesó 0.1 g de muestra y se aforó a 10 mL con etanol 96%. Una vez preparada la solución madre, se tomó 0.1 mL de esta solución y 0.5 mL del reactivo Folin-Ciocalteu, posteriormente se aforó a 10 mL con agua destilada. Una vez preparada la solución, se almacenaron en oscuridad total, a temperatura ambiente por 2 horas para luego leerlos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 765 nm. Se utilizó este ensayo en extracto hexánico, extracto desengrasado, infusión y jugo de las hojas de Kalanchoe gastonis- bonnieri y Kalanchoe daigremontiana. Las lecturas se realizaron por triplicado. El mismo procedimiento se aplicó en la infusión de hojas secas y el jugo de hojas frescas. Partiendo de una solución madre, preparada con 10 g de hojas y 250 mL de agua destilada. En el caso de la infusión, las hojas se dejaron en reposo por 5 minutos en agua a 90°C para posteriormente filtrar y enfriar a 25°C. 3.3.2.5. Quinta etapa: Determinación de la capacidad antioxidante Se tomó en cuenta los extractos hidroalcohólicos para determinar la capacidad antioxidante. Dicho procedimiento se realizó por triplicado. Preparación del DPPH

28 En un balón aforado ámbar de 20 mL, se preparó una solución metanólica de 200 ppm de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo, para su elaboración, se utilizó metanol grado HPLC. Previo a su uso, se realizó un barrido espectral de la solución preparada, el cual determinó que la longitud de onda máxima fue de 519 nm. Preparación de la curva de referencia con el BHT En un balón aforado, se preparó una solución metanólica estándar de BHT de 100 ppm, la misma que se utilizó para realizar la curva de calibración. Para la determinación, se utilizaron micropocillos, en los cuales se colocaron volúmenes de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla 6. Datos de la curva de referencia con BHT estándar

Concentración Volumen Volumen DPPH Metanol HPLC Estándar BHT solución BHT (μL) (μL) (ppm) (μL) Blanco 0 0 60 140 1 2 4 60 136 2 4 8 60 132 3 6 12 60 128 4 8 16 60 124 5 10 20 60 120 Elaborado por Valenzuela J. Una vez preparada las soluciones en los micropocillos, se almacenaron en un ambiente oscuro por 30 minutos, transcurrido el tiempo se leyeron en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 519 nm. El mismo procedimiento se realizó con el estándar ácido ascórbico. Preparación de las muestras vegetales Se pesaron 10 mg de del extracto y se aforó a 10 mL con metanol HPLC. A partir de esta solución madre, se realizaron diluciones para llegar a concentraciones de 2,4,6,8 y 10 ppm. Dichas diluciones se colocaron en una placa de micropocillos conjuntamente con 60 μL de DPPH y se completó con metanol HPLC hasta los 200 μL. Posteriormente, se agitó de manera orbital por 30s, seguido, se almacenaron en oscuridad y temperatura ambiente por 30 minutos. Al cabo de este tiempo se leyó a una longitud de onda de 519 nm, valor obtenido del barrido espectral.

Una vez obtenido las absorbancias se procedió a determinar % de inhibición y IC50.

29 3.3.2.6. Sexta etapa: Determinación de la toxicidad de los extractos por Bioensayo en Artemia salina En el ensayo se empleó agua de mar artificial preparada según la fórmula desarrollada por (Dietrich & Kalle, 1963), la cual contiene 1 L de agua destilada, 23 g de NaCl, 11 g de MgCl2 × 6H2O, 4 g de Na2SO4, 1,3 g de CaCl2 × 2H2O y 0,7 de KCl; se ajustó el pH de la solución entre 7 y 8 con Na2CO3. Preparación de las muestras vegetales Se prepararon cuatro muestras madre a partir de: - Infusión con 100 mL de agua hirviendo y 5 g de material vegetal seco y pulverizado. Se mantuvo en reposo por 20 minutos. Posteriormente se filtró la preparación. - Jugo con 100 mL de agua y 5 g de hojas frescas. Se licuó y filtró el zumo obtenido - Extracto desengrasado seco - Extracto hexánico seco

Para la determinación de la CL50 se hicieron 5 grupos, donde se establecieron 3 réplicas por tratamiento, incluyendo el grupo control. Para la solución madres, se mezcló un proporcional de 60 mg de extracto y se llevó a un volumen de 6mL con agua artificial. A partir de estas, se probó un rango de concentraciones de 1500, 1000, 500,100 y 10 ppm. El tiempo de exposición fue de 24 h, transcurrido éste, se contaron las sobrevivientes y se anotó cualquier comportamiento anormal (dificultades en la natación). Se preparó el blanco, correspondiente al medio artificial conjuntamente con la Artemia salina. Incubación de Artemia salina Una vez preparado el agua marina artificial para el cultivo de la Artemia salina, se oxigenó el agua por medio de una bomba de burbujeo, durante una hora, con la finalidad de saturar el medio con este elemento. Posteriormente, en una cámara de vidrio llenó con agua marina artificial, a la cual se le adicionó 45 mg de huevos de Artemia Salina. Esta cámara consta de una zona oscura y una iluminada permanentemente (para el efecto se colocó una lámpara de 110 Watios a 40 cm de distancia) con la finalidad que, al eclosionar los huevos, estos se dirijan hacia la luz y así sean fácilmente identificables. La lámpara estuvo encendida durante toda la experimentación. Adicionalmente, se controló y mantuvo la temperatura a 25°C con la ayuda de un termostato. Al cabo de 24 h, eclosionaron los nauplios, los cuales se dejaron madurar por 48 horas para luego ser utilizados en el bioensayo. Ensayo de toxicidad en Artemia salina

30 En un tubo de ensayo, con la ayuda de una pipeta Pasteur, se colocaron 10 nauplios y el extracto correspondiente en la proporción adecuada, con una bureta se completó los 5mL con medio artificial en un tubo de ensayo previamente codificado. Los tubos preparados se dejaron a una temperatura de 25°C y expuestos a la luz durante 24h. Una vez transcurrido el tiempo, se contabilizó el número de nauplios muertos y se calculó el porcentaje de letalidad para cada una de las concentraciones determinadas. 3.4. Consideraciones éticas

Tabla 7. Consideraciones éticas

Nombre Descripción Respetar a la persona No aplica debido a que los resultados se obtendrán de extractos vegetales. Autonomía El permiso para realizar la investigación se solicitará a la dirección de carrera de la facultad de Ciencias Químicas. Beneficencia Este estudio proporcionará información base para posteriores investigaciones gracias a la cuantificación de los componentes químicos de cada uno de las especies en estudio

Confidencialidad No aplica

Aleatorización equitativa de la muestra No aplica Protección de población vulnerable No aplica

Riegos potenciales del estudio No aplica Beneficios potenciales del estudio Proporcionar información real de dos de las especies existentes en el país para que sirva como sustento para la formulación de productos naturales y para ejecutar posteriores estudios Competencias éticas y experiencia del Los docentes de la facultad de Ciencias investigador Químicas han proporcionado sus conocimientos para realizar proyectos de investigación Declaración de conflicto de intereses No aplica Elaborado por Valenzuela J.

31 3.5. Operacionalización de las variables Tabla 8. Variables, dimensiones e indicadores del material vegetal

Variable Dimensiones Indicadores Control de calidad Pérdida por secado <12% de las especies Cenizas totales ≤ 20% Kalanchoe Cenizas insolubles ≤ 4% gastonnis –bonieri en HCl y Kalanchoe daigremontiana

Toxicidad Artemia salina CL50 viable Elaborado por Valenzuela J. 3.6. Técnicas e instrumentos de recolección

Al ser una investigación experimental, se tomará nota de los resultados en el instrumento de recolección de datos en el laboratorio. 3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos

El tratamiento estadístico de la información que se obtuvo se realizó mediante cálculos de la media y desviación estándar de los parámetros físicos y CL50.

32 Capítulo IV Análisis y discusión de resultados

4.1. Primera etapa: Recolección, identificación taxonómica de la muestra y control de calidad.

Las especies Kalanchoe Gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana son originarias del noroeste y suroeste de Madagascar respectivamente (Maisterra Udi, 2016), sin embargo se ha introducida en zonas tropicales y subtropicales de la Amazonía. Hoy por hoy las podemos encontrar en jardines e invernaderos en cualquier zona del país. La identificación taxonómica de las especies en estudio se realizó en el Herbario Alfredo Paredes de la Universidad Central del Ecuador, el mismo que emitió un certificado donde se confirma que pertenecen a las especies Kalanchoe Gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana. 4.1.1. Tratamiento de muestra vegetal Una vez recolectada la muestra, se las trasladó al laboratorio y se realizó el proceso de selección, limpieza y desinfección, tomando en cuenta las directrices BPAR (Buenas prácticas agrícolas y de recolección) de la OMS y las establecidas por la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, con la finalidad de eliminar toda partícula que pueda interferir en los resultados. Posteriormente, en condiciones adecuadas para que no exista contaminación cruzada ni pérdida de muestra, se realizó el proceso de secado y molienda, tomando la precaución de no llegar a tamaño de partícula menor a 200 μm pues el que sea polvo genera apelmazamiento y por tanto existe menor superficie de contacto sólido-líquido. En última instancia, se almacenó las muestras secas en envases herméticos y cubiertos con papel aluminio, alejados de la luz y en un ambiente seco. 4.1.2. Determinación de humedad de muestra vegetal Las especies en estudio y en general todo el género Kalanchoe, son consideradas como suculentas y por tal razón la proporción de agua eliminada luego de un proceso de secado es aproximadamente del 90% según lo menciona (Garcia, 2018). Por tal razón, los extractos se realizaron con muestras secas ya que el alto contenido de agua podría afectar el rendimiento de la extracción, alterar la composición de la muestra, permitir el crecimiento de microorganismos y la acción de enzimas degradarían la muestra. El porcentaje de humead se determinó mediante el método LOD (pérdida de humedad por secado), el cual calcula el contenido de agua perdida en la muestra luego de ser sometida a altas temperaturas por un par de minutos. Es útil para comprobar la calidad del producto vegetal seco en relación al contenido de humedad. En la Tabla 9. se reporta la media y la desviación estándar de las tres repeticiones efectuadas por cada especie evaluada. La especie Kalanchoe gastonis-bonnieri presenta un

33 porcentaje menor (2.06%) en relación a la especie Kalanchoe daigremontiana cuyo porcentaje es del 4,46% lo que indica que esta última tiene un mayor contenido de agua en su composición. Tabla 9. Porcentaje de humedad en muestra vegetal

%Humedad Especie ± S Repeticiones Kalanchoe gastonis-bonnieri 2.20 1.80 2.19 2.06 ± 0.23 Kalanchoe daigremontiana 4.38 4.81 4.20 4.46 ± 0.31 Elaborado por Valenzuela J. Figura 2. Comparación de los porcentajes promedio de humedad de las muestras vegetales

% Humedad

4,46

4,5

4

3,5

3 2,06 2,5

2

1,5

1

0,5

0 K. gastonis-bonnieri K. daigremontiana

Elaborado por Valenzuela J. 4.1.3. Determinación de cenizas totales Se procedió en base al método de determinación de cenizas totales propuesto por la (Farmacopea argentina, 2003).

− % = × −

Donde: m: Masa del crisol vacío m1: Masa del crisol con la muestra seca m2: Masa del crisol con cenizas

34 Tabla 10. Porcentaje de cenizas totales

m m m % Cenizas Especie Repeticiones 1 2 ̅ ± S (g) (g) (g) totales 1 33.9239 35.9784 34.3438 20.44 Kalanchoe gastonis- 20.26± 0.29 2 35.4016 37.4775 35.8254 20.42 bonnieri 3 38.178 40.2354 38.5878 19.92 1 32.5462 34.6036 32.9395 19.12 Kalanchoe 19.05± 0.07 2 27.622 29.6787 28.0122 18.97 daigremontiana 3 14.5967 16.1549 14.8935 19.05 Elaborado por Valenzuela J. 4.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido

− % = × −

Donde: m: Masa del crisol vacío m1: Masa del crisol con la muestra seca m2: Masa del crisol con cenizas insolubles en HCl

Tabla 11. Porcentaje de cenizas solubles en ácido

m m1 m2 % Cenizas Especie Repeticiones ± S (g) (g) (g) totales 1 33.9239 35.9784 33.9296 0.28 Kalanchoe 0.25± 0.04 2 35.4016 37.4775 35.3986 0.27 gastonis-bonnieri 3 38.178 40.2354 38.1821 0.20 1 32.5462 34.6036 32.5554 0.45 0.44± 0.04 Kalanchoe 2 27.622 29.6787 27.6317 0.47 daigremontiana 3 14.5967 16.1549 14.6028 0.39 Elaborado por Valenzuela J.

35 Figura 3. Comparación de los porcentajes promedio de Cenizas totales y solubles en ácido

% Cenizas totales y solubles en ácido

25 20,26 19,05 20

15 Cenizas Totales Cenizas solubles en ácido 10

5 0,25 0,44

0 Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe daigremontiana

Elaborado por Valenzuela J. Las cenizas totales indican la cantidad de minerales acumulados por la planta para su crecimiento mientras que las cenizas insolubles en ácido comprenden casi en su totalidad, sílice procedente de la tierra adherida a la droga como lo indica (Solís, Guerrero, Gatusso, & Cáceres, 2005) por tanto determina la presencia de sustancias extrañas presentes en la muestra. En el presente estudio, se obtuvieron cenizas totales de las hojas de ambas especies, se determinó un valor promedio de 20.26% para la Kalanchoe gastonis-bonnieri mientras que para la Kalanchoe daigremontiana el valor promedio fue de 19.05%, lo que revela la presencia de componentes inorgánicos como carbonatos, silicatos, oxalatos, etc. Adicionalmente, se realizó cenizas solubles en ácido, donde el valor de la especie Kalanchoe daigremontiana es mayor que en Kalanchoe gastonis-bonnieri, con valores de 0.44% y 0.25% respectivamente, sin embargo, son muy bajas lo que indican que el proceso postcosecha fue correcto y se encuentra dentro del parámetro indicado por la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, el cual debe ser del 10% como máximo. Los resultados no se pueden comparar con especificaciones debido a que las especies en estudio no se encuentran estandarizados en monografías. 4.1.5. Determinación de grasas totales ( − ) % = × ( . − . ) % = × . % = . %

36 Donde: A: Peso en gramos de la muestra B: Peso en gramos del vaso de extracción después de secado C: Peso en gramos del vaso de extracción vacío 0.0524 Tabla 12. Porcentaje de grasas totales

Peso vaso Peso muestra Peso vaso % Grasa Frascos vacío ± S (g) con grasa (g) total (g) Hojas de Kalanchoe gastonis-bonnieri 1 76.4221 5.0452 76.5496 2.5271 2.48±0.09 2 76.0004 5.0400 76.1204 2.3809 3 76.4200 5.0433 76.5480 2.5380 Hojas de Kalanchoe daigremontiana 1 70.9768 5.0442 71.0292 1.0388 1.07±0.04 2 72.5860 5.0440 72.6420 1.1102 3 70.8875 5.0439 70.9405 1.0508 Elaborado por Valenzuela J. Figura 4. Comparación de los porcentajes de Grasas Totales

Porcentaje de Grasas Totales

2,48

2,5

2

1,07 1,5

1

0,5

0

Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe daigremontiana

Elaborado por Valenzuela J. El simple hecho de ser una planta suculenta, nos indica que tiene una cierta proporción de grasas con la finalidad de no dejar escapar el agua de su interior, es así que hay estudios como el realizado por (Pérez M. , 2015), el cual identificó ácidos grasos, carotenoides, esteroles, triacilgliceroles y fosfolípidos en la especie Kalanchoe daigremontiana.

37 El estudio de (Jaramillo, 2007) indica que la especie Kalanchoe daigremontiana contiene 2.03% de grasas mientras que (Maisterra, 2016) obtuvo 3.01%, al compararlos con los resultados obtenidos, se observa que no son similares pues el valor experimental fue de 1.07%. En relación a la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri, estudios como el de (Maisterra, 2016) muestra un contenido de grasas del 2.66% el mismo que es significativo en comparación al conseguido, el cual fue del 2.48%. Si se contrasta las grasas totales de ambas especies en estudio, se revela que la Kalanchoe gastonis-bonnieri tiene una mayor cantidad que Kalanchoe daigremontiana. A pesar que el contenido de grasas totales es relativamente bajo, fue de gran importancia al momento de realizar el análisis fitoquímico pues influyó considerablemente en el análisis de los metabolitos secundarios ya que se evidenció interferencias cuando no se estaba desengrasada la muestra; un ejemplo claro fue la generación de emulsiones y coloraciones inadecuadas al agregar los reactivos pertinentes en la identificación cualitativa de los metabolitos. 4.2. Segunda etapa: Preparación de extractos de las especies en estudio.

4.2.1. Determinación del porcentaje de rendimiento

% = ×

. % = × . % = . % Tabla 13. Porcentaje de rendimiento

Volumen Masa final Peso extracto © % Método solvente hojas secas (g) Rendimiento (mL) (g) Peso muestra inicial de hojas de Kalanchoe gastonis-bonnieri: 58.13g Extracción soxhlet 300 0.5013 54.60 0.86 (Desengrasado) Maceración estática 300 5.7974 48.78 10.62 Peso muestra inicial de hojas de Kalanchoe gastonis-bonnieri: 25g Infusión 50 - 23.13 7.48 Jugo 50 - 21.95 12.2 Peso muestra inicial de hojas de Kalanchoe daigremontiana: 55.30g Extracción soxhlet 300 0.6404 52.59 1.15 (Desengrasado) Maceración estática 300 3.9572 48.60 7.52 Peso muestra inicial de hojas de Kalanchoe daigremontiana: 25g Infusión 50 - 22.08 11.68 Jugo 50 - 21.50 14 Elaborado por Valenzuela J.

38 Figura 5. Comparación de los porcentajes de rendimiento

Porcentaje de rendimiento

14

14 12,2 10,62 11,68 12

10 7,52 7,48 8

6

4 0,86 1,15 2

0 Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe daigremontiana

Extracción Soxhleth Maceración estática Infusión Jugo

Elaborado por Valenzuela J. De acuerdo a la Tabla 13., en relación a la maceración estática, hubo un mayor rendimiento en las dos especies en estudio, alcanzando un 10.62% para la muestra correspondiente a la Kalanchoe gastonis-bonnieri y 7.52% para la muestra Kalanchoe daigremontiana. Normalmente el rendimiento obtenido siempre será mayor en la maceración ya que hubo mayor tiempo de contacto del disolvente con las muestras, facilitando su extracción. De igual manera, el jugo arrojó porcentajes altos, una vez más acertando en que existe mayor afinidad a solventes polares. En relación a la extracción Soxhlet, la especie Kalanchoe daigremontiana tuvo un mayor rendimiento, el cual fue de 1.15% mientras que la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri alcanzó un 0.86%, sin embargo, no hay una diferencia significativa entre ambas especies. Como se aprecia en la Figura 5, en general, todos los rendimientos fueron muy bajos y una de las razones es por el alto contenido de agua de estas plantas. En cuanto al extracto graso, es muy probable que su bajo rendimiento se deba a que existe una alta cantidad de compuestos polares, haciendo muy difícil su extracción con hexano. En cuanto a la extracción por maceración estática, hubo un mayor porcentaje de rendimiento, lo que nos indica que la mayoría de los compuestos son bastante polares sin embargo es posible que la proporción 1:1 de la mezcla diclorometano-metanol no fuera la idónea para su extracción, generando los porcentajes ya mencionados pues en los extractos por infusión y jugo se aprecia un incremento.

39 4.3. Tercera etapa: Tamizaje fitoquímico.

Un screening preliminar, mostró que el extracto de las hojas contiene metabolitos como flavonoides, terpenos, grasas, taninos y glúcido cardiotónicos. Estos metabolitos contribuyen significativamente y justifican los usos terapéuticos que se le atribuye a las hojas en la medicina tradicional. Los resultados se detallan a continuación: Tabla 14. Tamizaje fitoquímico

Metabolitos secundarios Reacciones Hojas GB Hojas D Alcaloides Fase 1 Fase 2 Fase 1 Fase 2 Dragendorff - - - - Mayer - - - - Wagner - - - - Esteroles Lieberman-Bouchard ++ N/A +++ N/A Terpenoides Salkowski +++ N/A +++ N/A Flavonoides Shinoda N/A ++ N/A +++ Medio alcalino N/A ++ N/A +++ Cianidina N/A +++ N/A +++ Antocianos N/A ++ N/A +++ Antraquinonas Borntrager N/A - N/A - Taninos Cloruro férrico 2% N/A - N/A - Gelatina salada N/A +++ N/A +++ Saponinas Con agua N/A - N/A - Glúcidos Cardiotónicos Keller-Killiani ++ N/A ++ N/A Elaborado por Valenzuela J. Fase1: Extracto hexánico Fase 2: Extracto dicloromentano-metanol -: No existe metabolito +: Poco ++: Moderado +++: Abundante N/A: No aplica El análisis fitoquímico mostró variaciones en ambos extractos a pesar de que se realizaron las mismas pruebas de identificación cualitativa. Por ejemplo, hubo diferencias en la intensidad de color al momento de las reacciones, a lo cual se le atribuye la cantidad de componentes presentes en los extractos. Se encontró que las especies seleccionadas contienen taninos, los cuales son conocidos por acelerar la cicatrización de heridas y mucosas inflamadas. Los flavonoides los cuales son populares por su potente capacidad antioxidante al prevenir el daño celular oxidativo y por posees una fuerte actividad anticancerígena tal y como lo menciona (Rio, Obdulio, Castillo, &

40 Marin, 1997) y (Salah, y otros, 1995) se encuentran presentes en ambas especies. Se ha descubierto que los terpenoides son útiles en la prevención y tratamiento de varias enfermedades entre ellas el cáncer, así como también tiene propiedades antibacteriales, antifúngicas, antivirales y antiparasitarias (Rabi & Bishayee, 2009). Además, las reacciones de identificación de esteroles fueron extremadamente visibles dando lugar a confirmar su presencia y una vez más se denota el porqué de ser conocidas como “Plantas de la vida”, cabe mencionar que son responsables de regular el colesterol y la respuesta inmune (Shah, Qazi, & Taneja, 2009). Numerosos estudios indican que el género Kalanchoe, en su gran mayoría de especies, contiene alcaloides en cantidades moderadas, el cual es causante de numerosas afecciones si su consumo es indiscriminado. Es una de los factores que impulsaron a realizar este estudio, pero sorprendentemente, este metabolito no se encontró en ninguna de las dos especies. En un principio, se atribuyó el resultado negativo a las bajas concentraciones y al tratamiento previo de la muestra (se probó creando sales y alcaloides libres) sin obtener resultados positivos, además se desengrasó la muestra con la finalidad de eliminar las interferencias que pudiere existir, pero aun así los resultados seguían arrojando datos desfavorecedores. En última instancia, se utilizó un método analítico muy sensible, estable y con escasas interferencias denominado “Método Shamsa”, el cual consiste en la reacción de alcaloides con verde de Bromo cresol (BCG), dando lugar a la formación de un complejo de transferencia de carga, a un pH 4.7, de color amarillo, susceptible a determinación espectrofotométrica a 470 nm (Shamsa & Monsef, 2008). El mencionado procedimiento no dio resultado favorable alguno, llegando una vez más a la conclusión de que no existían alcaloides en las muestras estudiadas y recolectadas en la provincia de Pichincha. Analizando los resultados conjuntamente con investigación bibliográfica, se encontraron las posibles razones por las cuales las plantas suculentas en estudio tenían proporciones muy bajas y/o ausencia total. Primeramente, es necesario recordar que el papel de los alcaloides en las plantas es regular su crecimiento, y defenderse frente a los distintos depredadores, por indicar las funciones más relevantes, una vez dicho esto se concluye que, al ser plantas recolectadas de invernaderos, en donde se encuentran a una temperatura agradable, con el suficiente sustrato nutritivo y alejadas de insectos y posibles parásitos, no necesitan generar una cantidad exacerbada y significativa de alcaloides. Por último, es necesario destacar que los pigmentos (especialmente los pigmentos clorofílicos) pudieron interferir en la identificación de alcaloides. Mediante la reacción de Lieberman-Bouchard se identificó la presencia de grupos esteroides pues se generó una coloración verde sin embargo hubo una variación entre ambas especies pues la Kalanchoe daigremontiana generó una coloración de azul a verde oscura, en cuestión de segundos, mientras que la Kalanchoe gastonis-bonnieri verde amarillenta, como se visualiza en la Fotografía N°26. Esta respuesta de color se debe a que la mezcla de ácido sulfúrico en conjunto con el anhidro acético y el cloroformo convierte a los componentes grasos en derivados de acetato, sulfatos y otras especies insaturadas, los mismos que lentamente se convierten en ácidos sulfónicos monoinsaturados y poliinsaturados, tal y como lo menciona (Xiong, 2007). La presencia de estos metabolitos, incluyendo a los triterpenos, atribuye a pensar

41 por qué estas especies se las conoce por su efecto antimicrobianos, antiulcerosos y anti carcinogénico. Según (Lock Sing de Ugaz, 1997), reacciones coloridas pueden orientar a determinar a qué tipo de flavonoides corresponde, como es el caso de la reacción de Shinoda, la misma que genera diferentes coloraciones dependiendo de la molécula de la cual se trate, por ejemplo flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavonas (rojo, magenta, violeta azul), isoflavonas (amarillo); isoflavanonas, chalconas y auronas no dan coloración. La presencia de flavonoides fue notoria, pues la reacción de Shinoda generó espuma además de una coloración rosácea. En la especie Kalanchoe daigremontiana, la espuma generada fue abundante y se visualizó una coloración rosácea intensa en relación a la Kalanchoe gastonis-bonnieri, la cual generó espuma, pero en menor proporción al igual que la tonalidad rosada fue tenue, tal y como se observa en la Fotografía N°26 d. En cuanto a la reacción de Antocianidinas, en primera instancia se generó una coloración rosácea, mucho más intensa en la especie Kalanchoe daigremontiana. Al paso de unos segundos cambió a azul verdoso, coloración que desapareció transcurrido unos minutos. La presencia de los taninos es común en las especies en estudio y dicha particularidad se confirma con la prueba de identificación. presentaron un precipitado blanco, con la reacción de acetato de plomo. 4.4.Cuarta etapa: Cuantificación de metabolitos secundarios de los extractos vegetales.

4.4.1. Cuantificación de flavonoides totales Tabla 15. Datos de la curva de calibración de Quercetina

Concentración Absorbancia Estándar (ppm) (425nm) Blanco 0.0 0.000 1 1.5 0.473 2 3.0 0.516 3 4.5 0.664 4 6.0 0.759 5 7.5 0.855 6 9.0 0.914 Elaborado por Valenzuela J.

42 Figura 6. Curva de calibración de la Quercetina

Elaborado por Valenzuela J. Una vez obtenida la curva de calibración, se obtiene la siguiente ecuación que permite calcular las concentraciones de flavonoides en los extractos: A = mC ± B A = 0.0649C + 0.3767 − . = . Ecuación N°6: Concentración de flavonoides

0.619 − 0.3767 C = = 3.733μg QE/mL 0.0649 Para expresar por gramo de extracto seco: 3.733μgQE 10 mL 10 mL EET 1000mg 1000mg C = × × × × mL solución 0.5mL EET 100 mg extracto seco 1 g 10 μg

C =7.467

43 Tabla 16. Concentración de flavonoides totales

Concentración Concentración Especie Repetición Absorbancia mg QE/g ± S QE/mL μg extracto seco Kalanchoe 1 0.619 3.733 7.467 7.81±0.53 gastonis- 2 0.621 3.764 7.529 bonnieri 3 0.650 4.211 8.422 1 0.753 5.798 11.596 Kalanchoe 2 0.722 5.320 10.641 11.04±0.50 daigremontiana 3 0.730 5.444 10.888 Elaborado por Valenzuela J. Figura 7. Comparación de concentración de Flavonoides

Concentracion flavonoides

11,04

12 7,81 10

8

6

4

2

0

Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe daigremontiana

Elaborado por Valenzuela J. La tabla 18. y la figura 8. indican que la muestra correspondiente a la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri contiene 7.81±0.53 mg QE/g extracto seco, cuyo valor es menor en relación a la especie Kalanchoe daigremontiana, la cual obtuvo 11.04±0.50 mg QE/g extracto seco. Es así que una vez más, se confirma que las especien en estudio difieren significativamente una de la otra, atribuyéndole la mayor cantidad de beneficios a la Kalanchoe daigremontiana.

44 Las especies pertenecientes a la familia Crassulaceae se las considera predominantemente productoras de flavonoides, en especial de flavonol; estudios como el de (Soares Costa & Paresqui, 2015), ha informado de la presencia de flavonas, vicenina-2 (C-glicosilflavona), flavonoles de O-glucósidos, quercetina 3-O--L-ramnopiranósido-7-O--D-glucopiranoil-(1-3)- -L-ramnopiranosido, agliconas de patuletina, eupafolinia y kaempferol. Si bien los resultados obtenidos de las dos especies en estudio revelan que contienen una proporción considerable de flavonoides, no es significativo a los resultados esperados pues se encontraron estudios tales como (Asiedu, 2012) o (Shruti & Bhavita, 2018), los cuales obtuvieron valores entre 30 mg/g a 178 mg/g. Una de las posibles razones, por no decir la más importante, es la influencia de la luz en la producción de flavonoides, este aspecto es discutido ampliamente en la literatura, como es el caso de (Cruz & Chedier, 2011), quien indica en su estudio que los flavonoides actúan en la protección contra la foto destrucción al absorber y/o disipar la energía solar, por lo que obstaculiza el daño de los tejidos internos a casusa de los rayos UV-B. Si recapitulamos, las especies en estudio fueron recolectadas de los invernaderos, en donde hubo una exposición controlada de la luz solar, por tanto, la intensidad de luz afectó directamente a ambas especies con respecto a la producción y contenido del metabolito generando concentraciones bajas en relación a otros estudios. 4.4.2. Cuantificación de fenoles totales Como resultado del tamizaje fitoquímico, se determinó la presencia de grupos fenólicos por lo que se realizó la cuantificación de fenoles totales de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana. Para la cuantificación, se realizó una curva de calibración partiendo del ácido gálico como activo de referencia. Tabla 17. Datos de la curva de calibración del ácido gálico

Concentración Absorbancia Estándar (ppm) (765nm) Blanco 0 0.000 1 1 0.053 2 2 0.078 3 3 0.102 4 5 0.162 5 6 0.197 Elaborado por Valenzuela J.

45 Figura 8. Curva de calibración del ácido Gálico

Absorbancia vs. Concentración 0,25 y = 0,0287x + 0,0207 R² = 0,996 0,2

0,15

0,1

ABSORBANCIA NM ABSORBANCIA 0,05

0 0 1 2 3 4 5 6 7 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J.

En base a la curva de calibración se obtiene la ecuación N°5 A = mC ± B A = 0.0287C + 0.0207 − . = . Ecuación N°5: Concentración de fenoles totales 0.055 − 0.0207 C = = 1.20μg GAE/mL 0.0287 Para expresar por gramo de extracto:

1.20μg GAE 10 mL 10 mL EET 1000mg 1000mg C = × × × × mL solución 0.1mL EET 100 mg extracto 1 g 10 μg

C = 11.95

46 En la Tabla 18. se encuentran los valores de las absorbancias y las concentraciones de fenoles totales corregidas con el factor de dilución.

Tabla 18. Concentración de Fenoles Totales

Concentración Concentración Absorbancia mg GAE/g GAE/mL ± S Especie Muestra μg extracto r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 Maceración Kalanchoe DM-MeOH 0.055 0.052 0.055 1.20 1.09 1.20 11.95 10.91 11.95 11.60±0.60 gastonis- desengrasado bonnieri Infusión 0.057 0.054 0.053 1.27 1.16 1.13 12.65 11.60 11.25 11.84±0.73 Jugo 0.055 0.060 0.065 1.20 1.37 1.54 11.95 13.69 15.44 13.69±1.74 Maceración DM-MeOH 0.180 0.178 0.184 5.86 5.62 5.76 58.64 56.20 57.60 55.74±1.06 Kalanchoe desengrasado daigremontiana Infusión 0.066 0.063 0.065 1.58 1.47 1.54 15.78 14.74 15.44 15.32±0.53 Jugo 0.073 0.081 0.078 1.82 2.10 2.0 18.22 21.01 19.97 19.73±1.41 Elaborado por Valenzuela J. Figura 9. Comparación de concentración de Fenoles Totales

Concentración de Fenoles Totales

55,74 60

50

40

30 19,73 15,32 11,84 13,69 20 11,6

10

0 Kalanchoe gastonis-bonnieri Kalanchoe daigremontiana

Maceración DM-MeOH desengrasado Infusión Jugo

Elaborado por Valenzuela J. Gracias al método Folin-Ciocalteau, se evaluó los grupos fenólicos presentes en cada uno de los extractos obtenidos a partir de las dos especies de Kalanchoe. Las muestras con mayor contenido de Fenoles totales (expresados en mg GAE/g extracto) correspondieron al extracto

47 desengrasado, infusión y jugo de la especie Kalanchoe daigremontiana, con concentraciones de 55.74±1.06, 15.32±0.53 y 19.73±1.41, respectivamente. La capacidad antioxidante está relacionada con la cantidad de fenoles que presenta una muestra (Garro, Cardona, Rojano, & Robledo, 2015) esto se ve reflejado en el extracto desengrasado y macerado en Diclorometano- metanol , coincidiendo con numerosos estudios a los que se le atribuye el sinnúmero de beneficioso que presenta la especie Kalanchoe en general; Los antioxidante fenólicos son moléculas que en pequeñas concentraciones protegen a las biomoléculas del daño por los radicales. Lo cierto es que la naturaleza de los radicales libres los hace muy reactivos, sin embargo, son capaces de colisionar entre ellos, de cederles un electrón o un hidrógeno, estabilizándolos y evitando así el inicio o propagación del daño oxidativo (Giraldo & Ramírez, 2013). Con la finalidad de comparar la cantidad de fenoles existentes en extractos que usualmente son los más consumidos por la comunidad, se realizó la cuantificación en la infusión y el jugo de las hojas, cuyos resultados muestran que la infusión presenta menor contenido de fenoles totales en relación al jugo, dando lugar a pensar que la temperatura a la que fueron expuestas las hojas influyó en la descomposición y destrucción del metabolito; esto da lugar a que se proponga su consumo en su estado bruto. Debo mencionar que, para determinar el contenido de fenoles en el jugo, se optó por tomar un mayor volumen de muestra para que se encontrara en el rango detectable de la curva ya que tiene gran contenido de agua. El entorno en el cual se desarrolla cada una de las plantas influye en el contenido de metabolitos y por ende en sus propiedades, es por ello que no se encontró estudios de las dos especies en mención realizadas en la ciudad de Quito, por lo que no se lo puede comparar sus datos con otros estudios. 4.5. Quinta etapa: Determinación de la capacidad antioxidante Con la ayuda del estándar de referencia BHT, se determinó la actividad antioxidante mediante la captación de los radicales libres DPPH, para ello se construyó una curva de calibración. Cabe mencionar que, para realizar las mediciones de las absorbancias, fue necesario realizar un barrido, del cual se obtuvo una longitud de onda de 519 nm, la misma que se utilizó en las muestras problema. Tabla 19. Datos de la curva de referencia con el estándar butil hidroxitolueno (BHT)

Concentración Estándar Absorbancias ppm r1 r2 r3 1 2 0.469 0.468 0.450 2 4 0.396 0.392 0.398 3 6 0.333 0.357 0.355 4 8 0.292 0.294 0.299 5 10 0.243 0.251 0.267 Elaborado por Valenzuela J.

48 Una vez obtenido las absorbancias se procedió a determinar el %inhibición del estándar de referencia con la siguiente ecuación: A − A % = 1 − A Ecuación N°7: %Inhibición radical DPPH Donde:

AM: Absorbancia de la muestra

AB: Absorbancia del blanco

APR: Absorbancia del patrón de referencia

Tabla 20. % de Inhibición del estándar de referencia BHT

Concentración % Inhibición IC50 ppm r1 r2 r3 2 43.62 43.76 46.17 44.52 4 52.35 52.62 53.15 52.71 6 57.45 57.18 60.40 58.34 3.44 8 65.77 64.83 65.50 65.37 10 72.08 71.01 68.86 70.65 Elaborado por Valenzuela J. Figura 10. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración

% Inhibición del DPPH vs. Concentración BHT 80,00 y = 3,2461x + 38,841 R² = 0,9949 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00

% INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J.

49 Partiendo de los datos obtenidos, se obtuvo una ecuación, que permitió verificar la dependencia lineal del porcentaje de captación del radical en relación a la concentración del BHT, generando un R2 de 0.9949.

La actividad antioxidante fue evaluada en tres extractos obtenidos de diferente manera: Maceración, infusión y jugo, a las concentraciones de 2,4,6,8 y 10 mg por litro de metanol, con la aplicación del método de decoloración del radical DPPH.

Tabla 21. Datos de absorbancia para porcentajes de Inhibición de la especie Gastonis- Bonnieri

Método de Repetición Absorbancias extracción Concentración, ppm 2 4 6 8 10 r1 0.440 0.429 0.422 0.421 0.409 Maceración r2 0.444 0.427 0.422 0.404 0.397 DM-MeOH r3 0.437 0.433 0.415 0.406 0.401 r1 0.460 0.459 0.450 0.410 0.397 Infusión r2 0.462 0.436 0.448 0.452 0.418 r3 0.460 0.460 0.446 0.434 0.425 r1 0.385 0.379 0.376 0.371 0.369 Jugo r2 0.384 0.376 0.375 0.372 0.365 r3 0.374 0.377 0.375 0.373 0.367 Elaborado por Valenzuela J. Tabla 22. Datos de absorbancia para porcentajes de Inhibición de la especie Kalanchoe daigremontiana

Método de Repetición Absorbancias extracción Concentración, ppm 2 4 6 8 10 r1 0.462 0.452 0.408 0.391 0.346 Maceración r2 0.465 0.453 0.394 0.407 0.351 DM-MeOH r3 0.462 0.426 0.416 0.393 0.350 r1 0.411 0.389 0.377 0.366 0.365 Infusión r2 0.421 0.381 0.374 0.367 0.364 r3 0.399 0.381 0.376 0.367 0.361 Jugo r1 0.382 0.377 0.371 0.366 0.325

50 r2 0.388 0.379 0.374 0.368 0.328 r3 0.389 0.377 0.370 0.365 0.330 Elaborado por Valenzuela J. Tabla 23. Resultados del Porcentaje de inhibición de la especie Gastonis-Bonnieri

Método de Repetición % Inhibición extracción Concentración, ppm 2 4 6 8 10 r1 10.85 12.47 14.32 16.4 19.86 r2 9.93 12.93 14.32 17.55 19.40 Maceración r3 11.55 11.55 15.94 17.09 17.78 DM-MeOH ± S 10.78±0.81 12.32±0.71 14.86±0.93 17.01±0.58 19.01±1.09 IC50 39.26 r1 17.81 18.83 21.46 25.10 34.82 r2 17.61 21.66 21.05 24.29 34.01 Infusión r3 17.21 18.62 21.46 24.49 33.81 ± S 17.54±0.20 19.70±0.99 21.32±0.23 24.63±0.42 34.21±0.54 IC50 18.99 r1 24.55 25.89 27.23 29.02 29.91 r2 23.88 26.56 27.46 28.79 30.80 Jugo r3 24.11 26.34 27.46 28.57 30.36 ± S 24.18±0.34 26.26±0.34 27.38±0.13 28.79±0.22 30.36±0.45 IC50 36.38 Elaborado por Valenzuela J.

Figura 11. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del macerado CH2Cl2- Metanol de las hojas desengrasadas de la especie Gastonis-Bonnieri

% Inhibición del DPPH vs. Concentración 20,00 y = 1,0585x + 8,445 R² = 0,9957 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 % INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0,00 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J.

51 Figura 12. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración de la Infusión de las hojas Gastonis-Bonnieri

% Inhibibción del DPPH vs. Concentración 40,00 y = 2,0682x + 10,722 35,00 R² = 0,8954 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00

% INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J.

Figura 13. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Jugo de las hojas Gastonis-Bonnieri

% Inhibición del DPPH vs. Concentración

35,00 y = 0,744x + 22,932 R² = 0,9914 30,00

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00 % INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0,00 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J. Con base en las curvas de concentración vs. Porcentaje de captación obtenidos de los extractos, se obtuvieron las ecuaciones de las curvas, las cuales se utilizaron para calcular el IC50

52 de cada una de las muestras. En la tabla N°23 se observa los IC50 para los extractos evaluados, evidenciándose que el extracto proveniente de la infusión tiene mejor concentración inhibitoria 50. La capacidad antioxidante significa la captación que tiene un miligramo por litro de metanol para atrapar radicales libres, para ello se comparó el IC50 del BHT con cada IC50 muestra. En la tabla 24 se evidencia que la infusión es la más activa pues necesita una menor cantidad de extracto para inhibir el 50% del radical DPPH empleado en la evaluación, no obstante, no se compara con la generada por el BHT, pero es lógico que sea así pues el estándar es un compuesto puro a diferencia de los extractos, los mismos que son una mezcla de compuestos.

Tabla 24. Comparación del IC50 de los extractos de las hojas de la especie Gastonis-Bonnieri con el BHT como estándar de referencia|

IC50 MUESTRA IC50 BHT Maceración 39.26 Infusión 18.99 3.44 Jugo 36.38 Elaborado por Valenzuela J. Figura 14. Comparativa del % de inhibición de los tres extractos analizados en la especie Gastonis-Bonnieri

34,21 35 30,36 28,79 27,38 30 26,26 24,18 24,63 25 21,32 19,7 19,01 20 17,54 17,01 14,86 15 12,32 10,78 10

% Inhibición% del radical DPPH 5

0 2 4 6 8 10 Concentración ppm Maceración Infusión Jugo

Elaborado por Valenzuela J.

53 El porcentaje de inhibición del radical DPPH es dependiente de la concentración, tal y como se observa en la Tabla N°23 y N°25, donde se denota que conforme se incrementa la concentración de los extractos, el porcentaje de inhibición también aumenta.

En el caso de la especie Kalanchoe Gastonis-Bonnieri, las muestras presentaron mayor porcentaje a una concentración de 10ppm. El extracto proveniente del Jugo de hojas frescas muestra un mayor % de inhibición dando lugar a aseverar que es la mejor forma de aprovechar los beneficios que ofrece el consumo de sus hojas mientras que el extracto proveniente de una infusión, muestra un porcentaje menor en las diferentes concentraciones. Por último, el extracto proveniente del macerado en CH2Cl2-Metanol de las hojas secas obtuvo los valores más bajos, atribuyendo sus resultados a dos factores; en primer lugar, estuvo expuesto por 24h a 40°C para eliminar toda el agua de la hoja, esto pudo generar la descomposición de los metabolitos, tales como los flavonoides y fenoles, por otro lado, las hojas secas fueron desengrasadas con la ayuda de hexano, por medio del equipo de extracción sólido-liquido Soxhlet, durante este procedimiento puede que se consiguiera transferir metabolitos afines al solvente utilizado, generando valores bajos en relación a lo que se esperaba respecto al extracto CH2Cl2-Metanol.

Tabla 25. Resultados del Porcentaje de inhibición de la especie Daigremontiana

Método de Repetición % Inhibición extracción Concentración, ppm 2 4 6 8 10 r1 27.24 31.99 40.04 48.08 57.59 r2 26.69 31.81 41.68 46.62 56.67 Extracto r3 27.24 32.36 40.22 47.71 56.86 DM-MeOH ± S 27.06±0.32 32.05±0.28 40.65±0.90 47.47±0.76 57.04±0.48 IC50 8.43 r1 7.97 11.83 15.68 20.31 22.62 r2 7.20 13.11 16.45 20.05 22.62 Infusión r3 8.48 13.37 15.94 20.05 23.14 ± S 7.88±0.65 12.77±0.83 16.02±0.39 20.14±0.15 22.79±0.3 IC50 24.33 r1 17.58 20.67 23.04 26.84 33.97 r2 17.81 20.19 22.8 26.13 33.25 Jugo r3 17.58 20.67 22.57 25.65 32.78 ± S 17.66±0.14 20.51±0.27 22.80±0.24 26.21±0.6 33.33±0.6 IC50 19.97 Elaborado por Valenzuela J.

54 Figura 15. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Extracto CH2Cl2- Metanol de las hojas Daigremontiana

% Inhibición del DPPH vs. Concentración

60,00 y = 3,769x + 18,239 R² = 0,9907 50,00

40,00

30,00

20,00

10,00 % INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0,00 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J.

Figura 16. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración de la Infusión de las hojas Kalanchoe Daigremontiana

% Inhibición del DPPH vs. Concentración

25,00 y = 1,8595x + 4,7644 R² = 0,991 20,00

15,00

10,00

5,00 % INHIBICIÓN DEL RADICAL RADICAL DEL% INHIBICIÓN DPPH 0,00 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN DPPH

Elaborado por Valenzuela J.

55 Figura 17. Porcentaje de Inhibición en relación a la concentración del Jugo de las hojas Kalanchoe Daigremontiana

% Inhibición del DPPH vs. Concentración

35,00 y = 1,8527x + 12,985 R² = 0,9417 30,00

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00 % INHIBICIÓN RADICAL DPPHRADICAL % INHIBICIÓN 0,00 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACIÓN PPM

Elaborado por Valenzuela J. En base en las curvas de concentración vs. Porcentaje de captación obtenidos de los extractos, se obtuvieron ecuaciones, las cuales se utilizaron para calcular el IC50 de cada una de las muestras. En la tabla N°26 se observa los IC50 para los extractos evaluados, evidenciándose que el extracto proveniente de la maceración tiene mejor concentración inhibitoria 50. La capacidad antioxidante significa la captación que tiene un miligramo por litro de metanol para atrapar radicales libres, para ello se comparó el IC50 del BHT con cada IC50 muestra. En la tabla 26 se evidencia que la maceración es la más activa pues necesita una menor cantidad de extracto para inhibir el 50% del radical DPPH empleado en la evaluación, el mismo que es el único que se acerca al valor IC50 del BHT. En segundo lugar, se encuentra el jugo, con un IC50 de 19.97 y, por último, pero no menos importante, la infusión.

Tabla 26. Comparación del IC50 de los extractos de las hojas de la especie K. daigremontiana con el BHT como estándar de referencia

IC50 MUESTRA IC50 BHT Maceración 8.43 Infusión 24.33 3.44 Jugo 19.97 Elaborado por Valenzuela J.

56 Figura 18. Comparativa del % de inhibición de los tres extractos analizados en la especie K. daigremontiana

57,04 60

47,47 50 40,65 40 32,05 33,33 27,06 30 26,21 22,8 22,79 20,51 20,14 17,66 20 16,02 12,77 7,88

% Inhibición% del radical DPPH 10

0 2 4 6 8 10 Concentración ppm

Maceración Infusión Jugo

Elaborado por Valenzuela J. Los resultados muestran que la infusión presentó menor porcentaje de captación de radicales en todas las concentraciones evaluadas. El extracto proveniente de la maceración es el que muestra los mayores porcentajes de inhibición, evidenciándose buena actividad antioxidante como se demuestra en la tabla N°25, seguido del jugo de hojas crudas.

En este caso, el IC50 de la infusión no es la más activa y esto se ve reflejado en el porcentaje de inhibición (7.88%,12.77%, 16.02%, 20.14% y 22.79% respectivamente), siendo el jugo de hojas frescas el que se encuentra en una proporción inhibitoria intermedia.

57 Figura 19. Comparativa del % de inhibición vs Concentración del macerado CH2Cl2-Metanol en relación al estándar % Inhibición en Macerado DM-MeOH

80 70,65 65,37 70 58,34 57,04 60 52,71 47,47 44,52 50 40,65 40 32,05 27,06 30 19,01 14,86 17,01 20 10,78 12,32 10 0 2 4 6 8 10

Gastonis-Bonnieri Daigremontiana BHT

Elaborado por Valenzuela J.

Figura 20. Comparativa del % de inhibición vs Concentración de la infusión de hojas en relación al estándar

% Inhibición en Infusión de Hojas

80 70,65 70 65,37 58,34 60 52,71

50 44,52

40 34,21

30 24,63 22,79 19,7 21,32 20,14 17,54 16,02 20 12,77 7,88 10

0 2 4 6 8 10

Diagremontiana Gastonis-Bonnieri BHT

Elaborado por Valenzuela J.

58 Figura 21. Comparativa del % de inhibición vs Concentración del Jugo de las hojas en relación al estándar

% Inhibición en Jugo de Hojas

80 70,65 70 65,37 58,34 60 52,71

50 44,52

40 33,33 28,79 30,36 26,26 27,38 26,21 30 24,18 20,51 22,8 17,66 20

10

0 2 4 6 8 10

Diagremontiana Gastonis-Bonnieri BHT Elaborado por Valenzuela J. La capacidad antioxidante está relacionada con la cantidad de fenoles que presenta la muestra, lo cual no se ve reflejado en el caso de la infusión y jugo, esto puede ser consecuencia de interacciones con los constituyentes del tejido de la planta o por el grado de polimerización de los compuestos fenólicos tal y como lo ratifica (Garro, Cardona, Rojano, & Robledo, 2015). Adicionalmente, es necesario denotar que la diferencia en la estructura química de cada uno de los fenoles presentes en las diferentes muestras los pude hacer reaccionar como donadores de electrones o no, característica que puede influir en el poder reductor. Es muy probable que la actividad antioxidante involucre compuestos del tipo flavonoides, antocianinas, vitaminas como la C, entre otros (Moo, Estrada, Estrada, & Cueva, 2014). Por otro lado, las fracciones evaluadas a cualquier concentración, presentan en su mayoría porcentajes de captación menor al 30%. Existen diferencias en los resultados de las especies analizadas y los de otros estudios, esto puede deberse a diversos factores ya que no es solo sus componentes sino el ambiente en el que se hallan, por ejemplo, los flavonoides y fenoles pueden variar por la altitud y el grado de exposición a la radicación en el lugar en el que se encuentren.

59 Figura 22. Comparativa del IC50 de las especies en estudio

IC50

39,26 36,38 40 35 24,33 30 19,97 25 18,99 20 15 8,43 10 5 0 K. gastonis-bonnieri K. Daigremontiana

Maceracion Infusión Jugo

Elaborado por Valenzuela J. Según la Figura 22., se puede apreciar que la especie K. Gastonis-bonnieri presenta un IC50 mayor que la otra especie estudiada, lo que nos permite probar que la K.Daigremontiana posee mayor capacidad antioxidante. Los resultados evidencian claramente la presencia de componentes activos antioxidantes, los cuales se pueden sustentar en estudios tales como el de (Supratman, 2001), quien aisló cinco bufadienólidos del extracto metanólico de las hojas de la Kalanchoe pinnata y Kalanchoe daigremontiana además (Wu, 2006) descubrió tres nuevos bufadienólidos, es por eso que se le atribuye la actividad antioxidante y su acción positiva frente al sistema inmune, beneficios que han sido utilizados para formular productos renombrados como es el caso de BIRM.

Especie Tipo de muestra

A: Kalanchoe gastonis-bonnieri M1: Infusión B: Kalanchoe daigremontiana M2: Jugo hojas cruda M3: extracto desengrasado M4: extracto hexánico 4.6. Sexta etapa: Determinación de la toxicidad de los extractos por Bioensayo en Artemia salina

Los datos correspondientes a la concentración letal media de los diferentes extractos sobre Artemia salina expuestos durante 24 horas son detallados a continuación. Cabe destacar que el pH de las diferentes soluciones preparadas, incluyendo el blanco, no tuvieron una variación que pudiera incidir en los resultados del estudio.

60 Para la determinación de la concentración letal media de las muestras frente a la Artemia salina fue utilizado el análisis Probit. En las Figuras 23.,24.,25. y 26. se puede distinguir las gráficas correspondientes a las unidades Probit en relación a las concentraciones a las 24h de exposición, la misma que permitió obtener una ecuación, de la cual por regresión lineal se obtuvo la CL50. Esta es la primera vez que los extractos obtenidos de las especies en estudio son sometidos a pruebas de toxicidad en nuestro país.

4.6.1. Construcción de la ecuación de la recta y determinación de la CL50

Tabla 27. Determinación de CL50 del AM1 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 83 17 4.03 100 2.000 70 30 4.48 1610.76 AM1 500 2.699 57 47 4.87 1000 3.000 50 50 5.00 1500 3.176 40 60 5.17 Elaborado por Valenzuela J. = 0.5091log CL + 3.3673 5 − 3.3673 Log CL = 0.5091 Log CL = 3.2070 CL = 10 . mg CL = 1610.76 L

Tabla 28. Determinación de CL50 del BM1 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 87 13 3.89 100 2.000 73 27 4.38 878.99 BM1 500 2.699 60 37 4.70 1000 3.000 57 43 4.92 1500 3.176 43 57 5.00 Elaborado por Valenzuela J.

61 Figura 23. Representación de unidades Probit vs. Log concentración en la AM1 y BM1

Unidades Probit vs. Log concentración 6

5,5

5 AM1 y = 0,5091x + 3,3673 4,5 R² = 0,9968

4 BM1 Unidades Unidades Probit 3,5 y = 0,5106x + 3,4968 R² = 0,9929 3 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Log10 concentración, ppm

Elaborado por Valenzuela J. En la muestra AM1, la mortalidad mayor al 50% se obtuvo a 1500 ppm tal y como se observa en la Tabla 27, mientras que en la Tabla 28, la muestra BM1 lo superó a partir de los 1000 ppm. Esto atribuye a acotar que, a concentraciones bajas, se inhibe la ingesta de alimentos mientras que, al superar la concentración, existe una acción tóxica en la Artemia salina tal y como lo menciona (Simmons, 1983) en su investigación. En un principio se arrojó la hipótesis de que eran uno o varios componentes apolares presentes en la muestra los posibles causantes de la toxicidad en las especies en estudio; Gracias a la experimentación, esta proposición se ve sustentada en las tablas obtenidas, puesto que AM1 es relativamente inocua y AM2 ligeramente tóxica, dando lugar a proponer que, al encontrarse las hojas secas en contacto con agua, no permitió la dilución de los causantes de mencionada toxicidad.

Tabla 29. Determinación de CL50 del AM2 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 40 60 5.08 100 2.000 37 63 5.43 6.93 AM2 500 2.699 30 70 5.73 1000 3.000 17 83 5.84 1500 3.176 7 93 5.97 Elaborado por Valenzuela J.

62 Tabla 30. Determinación de CL50 del BM2 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 93 7 3.49 100 2.000 87 13 3.89 61917.46 BM2 500 2.699 80 20 4.16 1000 3.000 77 23 4.27 1500 3.176 73 27 4.38 Elaborado por Valenzuela J. Figura 24. Representación de unidades Probit vs. Log10 concentración en AM2 y BM2

7

6

5 AM2 y = 0,3978x + 4,6655 4 R² = 0,994 3

2 BM2 Unidades Unidades Probit y = 0,3982x + 3,0919 1 R² = 0,9984 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Log10 concentración, ppm

Elaborado por Valenzuela J. En la Tabla 29. y Tabla 30. se observa que la muestra AM2 presenta una CL50 6.93 mientras que la CL50 de BM2 es de 61917.46, por lo que se puede aducir que existen componentes que, gracias a la fragmentación de la hoja al momento de preparar el extracto, se logró incorporar en el agua. En la muestra AM2, la mortalidad mayor al 50% se obtuvo desde la concentración más baja, 10 ppm, tal y como se observa en la Tabla 29, mientras que la muestra BM2 no superó el 50% en ninguna de las concentraciones propuestas. Es prácticamente inócua la muestra BM2 y la facilidad de preparación y solubilidad en agua de este extracto, es una característica interesante, puesto que su uso en ambientes naturales no provocaría un efecto tóxico importante. En la Tabla 29, la muestra AM2 generó un alto porcentaje de mortalidad en las concentraciones más bajas por lo cual se la puede considerar tóxica, esto pudo haber generado en los nauplios una alteración exorbitante a nivel del sistema nervioso dado que existen estudios en los cuales hubo una sobre estimulación del sistema a dosis altas, como es el caso de la investigación desarrollada por (Rates SMK & Bridi, 1999), quien experimentó con ratones y

63 detectó que a dosis altas se generan convulsiones, las cuales están correlacionadas con los heterósidos cardiotónicos sin embargo (Nguelefack, y otros, 2004) en su estudio reportó que en dosis bajas, el extracto es anticonvulsivo. Acotando a todo lo dicho, es necesario mencionar que estos compuestos a altas dosis, inhiben la síntesis del GABA y por ende se dan las convulsiones, por el contrario, el neurotransmisor se acentúa en dosis bajas del mismo.

Tabla 31. Determinación de CL50 del AM3 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 93 7 3.50 100 2.000 80 20 4.16 587.51 AM3 500 2.699 63 37 4.66 1000 3.000 60 43 4.79 1500 3.176 50 50 5.00 Elaborado por Valenzuela J. Tabla 32. Determinación de CL50 del BM3 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 90 10 5.43 100 2.000 73 27 5.08 1719.63 BM3 500 2.699 53 47 4.92 1000 3.000 47 53 4.38 1500 3.176 33 67 3.72 Elaborado por Valenzuela J. Figura 25. Representación de unidades Probit vs. Log en AM3 y BM3

Unidades Probit vs. Log Concentración 6

5 AM3 4 y = 0,7468x + 2,9321 R² = 0,9838 3 BM3 2 y = 0,6728x + 2,8232

Unidades Unidades Probit R² = 0,9963 1

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Log10 concentración, ppm

Elaborado por Valenzuela J.

64 La CL50 de la muestra AM3 dio lugar a clasificarla como ligeramente tóxica, puessu porcentaje de mortalidad alcanzó el 50% en la concentración más alta planteada en tanto que BM3 es prácticamente no tóxica tal y como se observa en la Tabla 32., adicionalmente, superó el 50% de mortalidad en los 1000 ppm.

Tabla 33. Determinación de CL50 del AM4 a las 24 horas de exposición

Log10 Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 47 52 5.05 100 2.000 37 63 5.34 8.67 AM4 500 2.699 27 73 5.62 1000 3.000 23 77 5.73 1500 3.176 20 80 5.84 Elaborado por Valenzuela J.

Tabla 34. Determinación de CL50 del BM4 a las 24 horas de exposición

Log Concentración %Nauplios %Nauplios Unidades Muestra concentración CL50 ppm vivos muertos probit ppm Blanco 0 0.000 100 0 0.00 10 1.000 63 37 4.66 84.06 100 2.000 50 50 5.00 BM4 500 2.699 43 57 5.27 1000 3.000 33 67 5.43 1500 3.176 30 70 5.52 Elaborado por Valenzuela J. Figura 26. Representación de unidades Probit vs. Log10 concentración en AM4 y BM4

Unidades Probit vs. Log Concentración 7

6 AM4 5 y = 0,3586x + 4,6636 R² = 0,99 4

3 BM4 2 y = 0,3926x + 4,2444 Unidades Unidades Probit R² = 0,9922 1

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Log10 concentración, ppm

Elaborado por Valenzuela J.

65 De las cuatro muestras planteadas, fue la AM4 y BM4 las más tóxicas, denotando que los compuestos extraídos por el solvente orgánico poseen mayor probabilidad de ser tóxico que los extraídos por el agua.

En cada una de las Tablas de Determinación de CL50, se observa que el efecto tóxico sobre la Artemia salina luego de la exposición al extracto, se ve reflejado en los porcentajes de mortalidad en las 5 concentraciones planteadas, en donde se resalta el hecho de que cuanto mayor es su concentración mayor es la mortalidad generada. Tal es el caso de la muestra AM4, pues se observa que a una concentración de 1500 ppm, la mortalidad es del 80% por lo que una vez más nos permite inferir que concentraciones altas de AM4, el producto puede llegar a ser tóxico para los nauplios y por ende podría ser la especie menos adecuada para consumo humano sin embargo, es una excelente noticia para el tema agronómico, puesto que existen estudios que mencionan los beneficios que tiene la especie para el control de plagas en cultivos por lo que podría ser usado en beneficio de la agricultura y ornamenta. Resulta comprensible la alta toxicidad de los extractos AM4 Y BM4 debido a la gran variedad de componentes que puede contener, esto es sustentable con ensayos tal y como es el caso del estudio de (Smith, 2004), quien informa de efectos tóxicos promovidos por la presencia de compuestos Bufadienólidos pertenecientes al grupo de los esteroides cardiotónicos, de los cuales se conoce su acción sobre el sistema nervioso central además de los efectos evidentes sobre el sistema cardiovascular (Supratman, 2001), en virtud de ello, los efectos nocivos pueden ser una consecuencia a la presencia de mencionados compuestos prevalentes en el género Kalanchoe. Con relación a la Concentración letal media, se planteó la siguiente secuencia de mayor a menor toxicidad a 24h de exposición en la especie K. gastonis-bonnieri: AM2, AM4, AM3 y AM1, en tanto que la especie K. daigremontiana mostró el siguiente orden de mayor a menor mortalidad en términos de CL50: BM4, BM1, BM3 y BM2. El investigador (Meyer, 1982) estableció una relación entre el grado de toxicidad y la dosis letal media de los extractos de plantas en nauplios de Artemia en solución salina. Desde entonces, se considera que cuando los valores superan los 1000 g/mL, estos se consideran no tóxicos. Por lo tanto, según los valores obtenidos para el jugo de la especie K. daigremontiana, esta podría considerarse no tóxica. Por otro lado, la especie K. gastonis-bonnieri presenta alta toxicidad en especial en el extracto apolar y en el jugo. En la literatura ecuatoriana no se encuentra valores de CL50 por lo que no fueron comparadas sin embargo es un hallazgo que confirma variaciones en el nivel tóxico de estas especies y sirve como punto de referencia para próximos estudios.

66 Capítulo V Conclusiones y Recomendaciones 5.1. Conclusiones

En el Herbario “Alfredo Paredes” de la Universidad Central del Ecuador, se realizó la identificación taxonómica de las dos muestras vegetales, en el cual se determinó que las especies corresponden a Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana, las mismas que pertenecen a la familia Crassulaceae, y son especies introducidas en el Ecuador. Se determinó los parámetros de calidad del material vegetal, evaluándose la humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en HCl y grasas totales. Para la especie Kalanchoe gastonis- bonnieri, los resultados fueron de 2.06 ± 0.228%, 20.26± 0.29%, 0.25± 0.04% y 2.48±0.09% respectivamente, mientras que para la especie Kalanchoe daigremontiana los valores son de 4.46 ± 0.313%, 19.05± 0.07%, 0.44± 0.04 %y 1.07±0.04 %.

Se preparó los extractos CH2Cl2-Metanol (1:1) de las hojas de cada una de las especies en estudio mediante maceración estática, obteniéndose un porcentaje de rendimiento de 10.62% y 11.68 % respectivamente. Por otro lado, tomando en cuenta el modo de consumo de las hojas, se preparó la infusión y el jugo de las mismas, obteniéndose un mayor rendimiento en el jugo en relación a la infusión. En los extractos totales de las hojas, según el tamizaje fitoquímico se identificó los siguientes grupos de Productos Naturales: esteroles, terpenos, flavonoides, taninos y glúcidos cardiotónicos; en adición los alcaloides estuvieron ausentes en ambas especies. Se evaluó el contenido de flavonoides totales y mediante los resultados obtenidos se determinó que la especie Kalanchoe daigremontiana presenta un mayor contenido correspondiente a 11.04±0.50 mg QE/g extracto seco en relación a la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri, la cual contiene 7.81±0.53 mg QE/g extracto seco. La cuantificación de compuestos fenólicos se realizó mediante el método de Folin- Ciocalteu y se estableció que el extracto CH2Cl2-Metanol (1:1) de la especie Kalanchoe daigremontiana posee un porcentaje de 55.74±1.06 mgGAE/g extracto. Sin embargo, los resultados variaron en función de la forma de extracción, de las cuales, el jugo de hojas crudas generó de igual manera un porcentaje considerable en ambas especies en relación a la infusión. Se evaluó el porcentaje de inhibición del radical DPPH en los diferentes extractos, determinándose que la especie Kalanchoe daigremontiana presenta mayor capacidad antioxidante a una concentración de 10 ppm, con un porcentaje de inhibición del 57.04±0.48 % y un IC50 8.43. Por otro lado, la infusión de la especie Kalanchoe gastonis-bonnieri obtuvo un porcentaje de inhibición de DPPH del 34.21±0.54% a una concentración de 10 ppm y un IC50 del 18.99%. Cabe recalcar que los datos obtenidos no superaron al estándar BHT.

67 En base a las CL50 determinadas, las muestras AM1 (1610.76 ppm) y BM2 (61917.46 ppm) se las puede considerar como inocuas, mientras que en las muestras AM4 (8.67 ppm) y BM4 (84.06 ppm) la toxicidad es eminentemente considerable.

5.2. Recomendaciones Realizar un estudio en las plantas silvestres de esta especie con la finalidad de comparar con las obtenidas de un invernadero, como es el caso de este proyecto.

Aislar los componentes químicos presentes en el extracto y evaluar la toxicidad (CL50) de cada uno de ellos no solo en Artemia salina sino con otras especies, cuya información sirva de base en la formulación de productos naturales comerciales. Utilizar otro tipo de solventes más polares (etanol) y realizar el estudio Farmacognósico en los extractos preparados. Determinar la actividad antimicrobiana del extracto de la especie Kalanchoe daigremontiana, la cual presentó menor toxicidad y un mayor porcentaje de metabolitos beneficiosos.

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75 ANEXO A: Árbol de problemas Desconocimiento de los metabolitos presentes en ambas especies

Consumo excesivo e Al no existir sustento científico Dificultad en los métodos de inadecuado de las especies en avalado de dichas especies en el Bajo aprovechamiento de sus extracción de las especies cuestión sin saber los posibles país, se puede generar beneficios efectos tóxicos sobre el publicidad engañosa en vegetales organismo Productos naturales

Ecuador no cuenta con suficientes estudios farmacognósicos de las especies Kalanchoe gastonis-bonnieri y Kalanchoe daigremontiana

Desconocimiento y falta de Desinterés de los investigadores Desinterés científico Falta de recursos y/o interés de la población en relación a identificar la razón relacionado a analizar las inversiones que permitan relacionado a conocer la por la que son consumidas especies que encontramos en apoyar este tipo de composición y los posibles ampliamente por considerarse nuestro país investigaciones beneficios de dichas especies “Plantas de la vida”

76

Uso inadecuado de las plantas ANEXO B: Categorización de variables Farmacognosia

Especie vegetal

Control de Calidad Extractos obtenidos de las hojas

Rendimiento Cenizas totales Cenizas insolubles en HCl Tamizaje fitoquímico Cuantificación Toxicidad Humedad Grasas totales CL50

Flavonoides Fenoles totales Actividad antioxidante Metabolitos secundarios

Concentración mg Concentración mg Porcentaje de QE/g extracto seco GAE/g extracto inhibición del radical DPPH

77 ANEXO C: Marcha fitoquímica Preliminar

Muestra seca y molida

Etanol 96° Macerar 48h Filtrar al vacío

EET

Equivalente a 15g Equivalente a 10 g Extraer HCl 5% Equivalente a 9 g Precipitar con Alcalinizar NaOH de éter de petróleo Acetato Pb 5% 20% Extraer cloroformo y con CH2Cl2: ETOH (3:2)

Concentrado EEES F. F. POLAR F. APOLAR F. POLAR Desechar FILTRADO APOLAR precipitado Agregar Comprobar Filtrar con EtOH-H2O Na2SO4 y C Agregar HCl 5% alcaloides C (1:7) concentrar C C - R. Lieberman-Burchard F - R. Zack F ESCC - R. Mayer - R. Shinoda - R.Wagner - R. Borntrager - R. Dragendorff - R. Gelatina - R. Espuma - CCF - R. Baljet - R. Kedde - R. Lieberman-Burchard

78 ANEXO D: Instrumento de recolección de Datos

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAAS QUÍMICAS

INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS

ETAPA A EJECUTARSE:……………………………………………………………………….. FECHA DE ESTUDIO:…………………………………………………………………………... DATOS OBTENIDOS:

OBSERVACIONES:……………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………

79 ANEXO E: Certificado de identificación taxonómica

80 ANEXO F: Evidencia fotográfica de colecta y tratamiento del material vegetal

Kalanchoe Daigremontiana Kalanchoe Gastonis-Bonnieri Selección

N°1 N°2 Limpieza

N°3 N°4 Secado

N°5 N°6

81 Molienda

N°7 N°8

Muestras envasadas

N°9

ANEXO G: Evidencia fotográfica de Control de Calidad Kalanchoe Daigremontiana Kalanchoe Gastonis-Bonnieri Determinación de porcentaje de humedad

N°9 N°10

82 Determinación de cenizas totales

N°11 Tarado de los crisoles N°15. Enfriamiento

N°12 Homogenización de la muestra N°16. Cenizas insolubles en HCl 3M

N°13 Carbonización de la muestra N°17. Calcinación de cenizas insolubles en HCl

N°14 Carbonizacion en mufla

N°18. Enfriamiento y pesado de muestras

83 Determinación de grasas totales

N°19. Muestra inicial

N°20. Capuchunes de celulosa (previamente pesados)

N°21. Extracción de grasas

N°22. Grasa totales

84 ANEXO H: Evidencia fotográfica de Preparación de extractos

N°23. Desengrasado de la muestra por M. Soxhlet

N°24 Macerado diclorometano - metanol

N°25 Concentrado de las muestras

85 ANEXO I: Evidencia fotográfica de Tamizaje fitoquímico

b

a

c a. Alcaloides b. Esteroles c. Triterpenos N°26 Tamizaje Fitoquímico

d e f

d. Flavonoides e. Taninos f.Antraquinonas N°26 Tamizaje Fitoquímico

86 ANEXO J: Evidencia fotográfica de Cuantificación de flavonoides y fenoles

N°27 Preparación de soluciones para cuantificación de flavonoides y fenoles

N°28 Inhibición del radical DPPH

87 ANEXO K: Evidencia fotográfica de Bioensayo en Artemia salina

a b

b

c

d e a. Huevos de Artemia Salina b. Eclosión de huevos c. Preparación de soluciones d. Solución + nauplios por 24h e. Conteo de nauplios N°29 Bioensayo en Artemia Salina

88

d e