VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOLOGIJOS KATEDRA

Irena JAKUBANIS

DNR MIKROSATELITINIO POLIMORFIZMO PANAUDOJIMAS LIETUVOS TAURIŲJŲ ELNIŲ (CERVUS ELAPHUS) GENETINĖS ĮVAIROVĖS TYRIMUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Molekulinės biologijos ir biotechnologijos programa, 62101B180 Biologijos studijų kryptis

Vadovas: prof. A.Paulauskas ______(Parašas) (Data) Apginta: prof. habil. dr. G. Kamuntavičius ______(Parašas) (Data)

KAUNAS, 2008 Darbas atliktas : 2007 – 2008 m. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje, Kaunas, Lietuva ir Telemark University College, Department of Environmental and Health Studies, Bø i Telemark, Norvegija

Recenzentas: dr. Daiva Ambrasienė, Vytauto Didžiojo Universitetas

Darbas ginamas: viešame magistrų darbų gynimo komisijos posėdyje 2008 metų birželio 5 d. Vytauto didžiojo universitete, Biologijos katedroje, 101 auditorijoje 9.00 valandą. Adresas: Vileikos 8, 3035 Kaunas, Lietuva.

Protokolo Nr.

Darbo vykdytojas: I. Jakubanis Mokslinis vadovas: prof.A.Paulauskas Biologijos katedra, vedėjas: prof. A.Paulauskas Padėka

Norėčiau nuoširdžiai padėkoti savo darbo vadovui prof. Algimantui Paulauskui už visokeriopą pagalbą, medžiagos surinkimą, moralinę paramą ir vertingas pastabas atliekant šį darbą. Dėkoju prof. Olav‘ui Rosef‘ui už suteiktą galimybę atlikti tyrimus Telemark universitete, bei moralinį palaikymą, Monai Sabo už tyrimo metodinės pusės paaiškinimą. Už tyrime naudotos medžiagos surinkimą esu dėkinga medžiotojams: doc.dr. Egidijui Bubelskui ir Robertui Išganaičiui. Taip pat nuoširdus ačiū dr. Vykintui Baubliui už vertingus patarimus. Dėkoju savo tėvams ir sesėms už paskatinimą ir tvirtą palaikymą, bei Julijai už moralinį ir psichologinį palaikymą.

3 Turinys

Santrauka...... 5 Abstract...... 6 Įvadas...... 7 1. Literatūros apžvalga...... 9 1.1.Tauriojo elnio (Cervus elaphus) bendra charakteristika...... 9 1.2. DNR žymenų polimorfizmas bei taikomi metodai populiacijų genetikoje...... 14 1.2.1. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)...... 14 1.2.2. Mikrosatelitinės sekos...... 17 1.3. Genetiniai tauriųjų elnių tyrimai...... 19 1.3.1. Mikrosatelitai ir jų panaudojimas tauriųjų elnių genetiniuose tyrimuose...... 20 1.3.2. „Konservatyvų“kanopinių mikrosatelitinių lokusų panaudojimas tauriųjų elnių genėtinuose tyrimuose...... 22 2. Medžiagos ir metodika...... 25 2.1. Tyrimo medžiaga...... 25 2.1.1. DNR iškyrimas, koncentracijos nustatymas...... 25 2.2. Mikrosatelitų amplifikacija...... 29 2.2.1. Elektroforezė poliakrilamido gelyje...... 30 3. Rezultatai ir jų aptarimas...... 33 3.1. Naudotų mikrosatelitinių pradmenų amplifikacijos optimizavimas...... 33 3.2. Lokusų charakteristika...... 34 3.3. Lietuvos tauriųjų elnių genetinė įvairovė ...... 36 3.4. Lietuvos taurųjų elnių populiacijų genetinė diferenciacija...... 42 3.4.1. Taurųjų elnių DNR mikrosatelitinio ir izofermentinio genetinio kintamumo palygimas ...... 44 3.5. Lietuvos tauriųjų elnių populiacijų palygimas su kitomis Europos populiacijomis...... 46 Išvados...... 53 Magistrinio darbo tema publikuoti I. Jakubanis darbai ...... 54 Literatūra...... 55 Priedai...... 59

4 Santrauka

Šiame darbe mikrosatelitinių DNR sekų metodu buvo ištirta 24 taurieji elniai iš 4 rajonų, 8 skirtingų Lietuvos miškų. Pagrindinis tyrimo objektas buvo nustatyti tauriųjų elnių DNR mikrosatelitų kintamumą Lietuvoje. Elnių audinių bei kepenų pavyzdžiai surinkti 2003 - 2005 metų medžioklės sezonuose iš medžiotojų nušautų individų. Ištyrus 7 mikrosatelitinius lokusus (RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73, BM888) nustatyta, kad lokusai BM888, NVHRT48 bei NVHRT21 nepilnai tinka Lietuvos taurųjų elnių populiacinei analizei, kadangi po amplifikacijos ne pas visus tirtus individus buvo matoma pradmenų amplifikacija. Panevėžio rajone aptiktas vienas retas alelis (0,042 dažnumas) RT1 lokuso alelyje esančiam 224 bp srityje. Pastebėta, kad Lietuvoje gyvenančių taurųjų elnių teorinis ir faktinis heterozigotiškumas artimas į kitų šalių taurųjų elnių populiacijų heterozigotiškumus. Jurbarko rajono populiacija pasižymi didžiausiu faktiniu heterozigotiškumu, kuris siekė 0,75. Didžiausias efektyvus alelių skaičius (ne=3,45) pastebėtas Panevėžio rajono elnių populiacijoje. Tiek pagal DNR tiek pagal izofermentine analizę labiausia genetiškai artimos populiacijos yra Minčios ir Ažvinčių, labiausiai nutolusios pagal mūsų tirtus polimorfinius lokusus yra Mantvilių ir Sipailiškių miškų tauriųjų elnių populiacijos. Lietuvos taurųjų elnių populiacija yra vienoje šakoje su Vengrijos bei Škotijos taurųjų elnių populiacijomis, tačiau nutolusi nuo Švedijos taurųjų elnių populiacijos.

5 Abstract

Author of term paper: Irena Jakubanis Full tittle of term paper: The application of microsatellite polymorphism for the genetical variability research of Lithuanian Red Deer (Cervus elaphus). Term paper advisor: prof. A. Paulauskas Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Nature Sciences, Kaunas, 2008, June Number of pages: 58 Number of tables: 16 Number of pictures: 25 Number of appendixes: 4

We investigated tissue and liver of 24 red deers (Cervus elaphus). Samples for analysis were collected from 4 localities, 8 different forests of Lithuania during 2004-2005 hunting seasons. We used 7 microsatellite primers (RT1, RT23, BM888, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73) derived from reindeer (Rangifer tarandus) to find out which of them is the best suitable for genetical investigations of red deer. BM888, NVHRT48 and NVHRT21 did not appeared suitable for whole population analysis because not in all samples was detected amplification. The analysis of alleles showed the rarest alleles is RT1 locus 224 bp alleles (0,042). Lithuanian red deers observed and expected heterozygosities are within the range of values previously found for reed deers.

It was estimated that the biggest observed heterozygosity were Jurbarko localities forest (Ho=

0,75). The biggest effective number of alleles (ne=3,45) was observed in Panevėžio locality red deer population. According to our DNA and antedate done isoenzyme investigation the most genetically similar were Minčios and Ažvinčių red deer subpopulations; the most different were Sipailiškių and Mantvilių ones. Lithuanian red deer are in one cluster with Hungarian and Scottish red deers populations, they are in separate cluster with Swedish red deer population.

6 Įvadas

Filogenetinių ryšių, tokių kaip genetinės medžiagos ir jos elementų formavimasis, kitimas bei mutacinis kintamumas evoliucijos eigoje, nustatymas tarp įvairių organizmų iki šiol daugiausiai rėmėsi morfometrinių duomenų, baltymų ir izofermentinių sistemų tyrimais bei įvertinimu. Dabartiniu metu, filogenetinių ryšių įvertinimui, yra naudojami DNR tyrimu pagrįsti metodai, kurie, dėl tikslumo ir platesnio pritaikymo spektro, suteikia detalesnę ir patikimesnę informacija apie organizmus, molekulinės ekologijos, sistematikos, populiacinės ir evoliucinės genetikos tyrimų srityse. Pagrindinai DNR tyrimo pranašumai, lyginant juos su anksčiau naudotais metodais yra tokie, kad šiuo atveju yra tiriama tiesioginė medžiaga, o ne jos produktai, o patys DNR tyrimo metodai pasižymi dideliu specifiškumu ir gauti rezultatai yra labai tikslūs. Molekulinei metodai kuo toliau tuo plačiau yra naudojami sėkmingai identifikuoti genetinius skirtumus tarp populiacijų. Jau šiuo metu jie yra naudojami apibrėžti padėtį bei pobūdį genų srautų barjerams. Tai turi įtaka natūralių populiacijų ūkininkavime, veiksmingam rūšies apsaugos planavime, invazinių rūšių kontrolėje. Taip pat duoda kita žvilgsnį į populiacijos sampratą. Teikę galimybę atskirti porūšius ne tik pagal morfologinius požymius, bet ir pagal genetinio kintamumo ypatumus. Pastaraisiais metais daug dėmesio skiriama gyvūnijos įvairovės išsaugojimui. Nuo ilgo laiko orientuojamasi į laukinių gyvūnų išsaugojimą, nes tai svarbi bioįvairovės dalis. Metodai ir duomenys, kuriais remiamasi atliekant populiacijų genetinius tyrimus yra gana skirtingi. Iki praeito dešimtmečio dažniausiai buvo analizuojama pagal Mendelio dėsnius paveldimi baltymų polimorfizmai (serumo baltymai bei fermentai). Nuo praeito dešimtmečio pradėti tyrinėti įvairūs DNR polimorfizmai, dažniausiai panaudojant mikrosatelitinės DNR žymenis bei mitochondrinės DNR tyrimus. Taurusis elnias yra vienas iš didžiausių laisvai gyvenančių Centrinėje Europoje žinduolių. Nors, vertinant pagal populiacijų skaičių, taurusis elnias nėra nykstanti rūšis, tačiau yra puikus modelis populiacijos genetinių padarinių tyrimams, kuriuos sukelia ilgalaikė antropogeninė veikla natūraliose populiacijose. Tauriojo elnio genų fondas yra paveiktas natūralios aplinkos skilimo (fragmentacijos), gyvūnų laikymo aptvaruose, perkėlimo, reintrodukcijos, ir trofėjų medžiojimo. Daug autochtoninių veislių buvo kryžmintos su introdukuotais individais, tokiu būdu buvo „sutrypiamos“ istorines sienas tarp pirminių natūralių populiacijų (Hartl ir kt., 2003; Zachos ir kt., 2003).

7 Lietuvoje yra tiriama tauriųjų elnių morfologija ir morfometrija, populiacijos struktūra, paplitimas, skaitlingumas, gyvenamosios vietos, bioekologines ypatybės. Kadangi elniai į Lietuvą yra reintrodukuoti iš įvairių vietovių, be to šiuo metu gali būti pabėgę iš komercinių aptvarų, svarbu ištirti šiuolaikinę tauriųjų elnių genetinę struktūrą, kad būtų galima įvertinti kokybinę vystymosi perspektyvą. Nežiūrint į tai, kad veisimo programos turi didžiulę ūkinę reikšmę yra svarbu atsižvelgti ir į genetinius reintrodukcijos efektus. Natūralios ir naujai reintrodukuotos (arba išleistos iš komercinių aptvarų) rūšių tarpusavio kryžminimasis gali pakeisti natūralia genetinę struktūrą. Genetinės šios sąveikos pasekmės dažniausiai būna neigiamos. Mokslininkai apie elnių genetinę įvairovę prabilo palyginus neseniai, todėl ši sritis yra vystymosi stadijoje. Nėra pakankamai duomenų apie tyrimus, parodančius jų genetinį kintamumą. Lietuvoje šie tyrimai kol kas preliminarūs, todėl nėra tikslios informacijos apie elnių genetinę struktūrą ir kintamumą skirtingose gyvenamosiose vietose. Elnių genetinė įvairovė yra aktuali tema, kadangi kai kurių elnių populiacijos yra nykstančios, auginamos komerciniuose aptvaruose, iš kurių gali pabėgti ir susimaišyti su laukinę populiaciją. Svarbu išnagrinėti jų genetiką, kad būtų galima pastebėti pokyčius, kurie vyksta jų populiacijoje ir ją panaudoti atkuriant ir veisiant rūšis. Žinodami tauriųjų elnių genetinę įvairovę, galėsime pastebėti ar vyksta hibridizacijos procesai, įvertint populiacijos kitimą, ir nustatyti ar Lietuvoje išlaikomas elnių grynumas. Darbo tikslas: Išanalizuoti tauriųjų elnių genetinį kintamumą Lietuvoje panaudojant DNR mikrosatelitinių sekų metodą. Darbo uždaviniai: 1. Išanalizuoti tauriųjų elnių genetinę struktūrą panaudojant RT1, RT23, BM888, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73 mikrosatelitų pradmenis skirtingose Lietuvos vietovėse; 2. Palyginti tauriųjų elnių populiacijų genetinį kintamumą skirtingose Lietuvos vietovėse; 3. Įvertinti Lietuvos elnių populiacijos genetinę įvairovę lyginat su kitomis europinėmis populiacijomis.

8 1. Literatūros apžvalga

1.1. Tauriojo elnio (Cervus elaphus) bendra charakteristika Tauriojo elnio mokslinė klasifikacija: Karalystė: Gyvūnai (Animalia); Tipas: Chordiniai (Chordata); Potipis: Stuburiniai (Vertebrata); Klasė: Žinduoliai (Mammalia); Būrys: Porakanopiai (Artiodactyla); Pobūris: Atrajotojai (Rumminantia); Šeima: Elniniai (Cervidae); Gentis: Tikrieji elniai (Cervus); Rūšis: Taurusis elnias (Cervus elaphus); Porūšis: Vidurio Europos taurusis elnias (Cervus elaphus hippelaphus) Elnias - elninių (Cervidae) porakanopių (Artiodactyla) atrajotojų žinduolių šeimos žvėris. Gyvūnai proporcingi, ilgomis, lieknomis kojomis. Patinų galvą puošia įvairios formos ir dydžio šakoti ragai, kuriuos kasmet, rudenį arba žiemą numeta, o iki rujos užauga nauji. Galūnės su keturiais pirštais, bet šoniniai menkiau išlavėję ir iškelti aukštyn. Elniai laibi, grakštūs gyvūnai, stipraus kaklo, į priešakį susmailėjusios galvos ir didelių akių (Burne, 2002). Tikrųjų elnių Lietuvoje gyvena trys rūšys:  Taurusis elnias (lot. Cervus elaphus, angl. Red deer)  Danielius (lot. Cervus dama, angl. Fallow deer)  Dėmėtasis elnias (lot. Cervus nippon, angl. Sika deer)

1 pav. Tauriojo elnio (Cervus elaphus) patinas ir patelė.

Taurusis elnias tai gražus ir harmoningas žvėris. Kūnas proporcingas, tvirtas. Nugaros linija už šiek tiek iškilusio gogo kiek įlinkusi. Kojos santykiškai plonos, bet tvirtos. Kaklas iš šonų plokščias. Vyresnių patinų jis storesnis, todėl atrodo vizualiai trumpesnis. Uodega trumpa, ausys

9 didelės, judrios. Lietuvoje gyvenančių suaugusių patinų kūno masė (be vidaus organų, kojų apatinės dalies ir galvos) siekia 142,8 (129 – 162) kg, patelių vidutiniškai – 69 kg. Taigi patino kūno masė yra beveik dvigubai didesnė negu patelės. Vasarą elnių kailis rausvai rudas. Galva, kojų priekinė ir išorinė pusės pilko, vidinė – šviesiai pilka. Žiemos kailis pilkai rudas (pilkšvų durpių spalvos). Patinai tamsesni už pateles, jų papilvė juoda, priekinių kojų išorinė pusė rudai pilka, vidinė šviesesnė (Lietuvos fauna, 1988). Šiuo metu taurieji elniai paplitę Eurazijoje ir Šiaurės Afrikoje, tarp 25-30 ir 55-60 šiaurės platumos, ir dalyje Šiaurės Amerikoje, tarp 25-30 ir 50-60 šiaurės platumos. Paplitę visuose žemynuose, išskyrus Antarktidą. Aptinkami miškuose, stepėse, miškastepėse, kalnuose ir net dykumose. Taurieji elniai sėkmingai aklimatizuoti Naujojoje Zelandijoje, Argentinoje, Australijoje ir Čilėje (Lietuvos fauna, 1988).

2 pav. Tauriojo elnio kolonizacijos kelias Azijoje ir Europoje remiantis citochromo b sekomis (Ludt et al., 2004). Geografiniai (genėtinai) barjerai žymimi ryškiais brūkšniais. Jų pavadinimai atitinka nūdienos geografinių regionų pavadinimus. Brūkšninės rodyklės rodo nustatytus kolonizacijos kelius, taškuotos – galimus (tikėtinus) kolonizacijos kelius.

Europinis taurusis elnias (Cervus elaphus L. 1758), yra labiausiai paplitusi ir žinomiausia elnio rūšis pasaulyje. Šiandien, yra iki 22 žinomų porūšių (priedas 2 lentelė 2). Dabartinė tauriųjų elnių klasifikacija į porūšius yra pagrįsta morfologinėmis charakteristikomis pvz. kailio spalvos ir morfologine kaukolės bei ragų charakteristikomis (Mahmut ir kt., 2002; Ludt ir kt., 2004). Tačiau, naujausi mitochondrinės DNR tyrimai (Mahmut ir kt., 2002; Polziehn ir Strobeck, 2002; Randi ir kt.., 2001; Ludt ir kt., 2004) iškėlė abejonių dėl porūšių skaičiaus bei siūlo tauruosius elnius

10 klasifikuoti į dvi skirtingas tauriųjų elnių rūšis: Rytų ir Vakarų tauriuosius elnius. Remiantis mitochondrinės DNR tyrimais pirmai rūšiai priklauso trys porūšiai Azijoje ir Amerikoje, antrai rūšiai keturi porūšiai Eurazijoje nei bei viena pirmykštė porūšis Centrinėje Azijoje (Tarim grupe) (Ludt ir kt., 2004). Elninių gentis (Cervus) pradėjo formuotis Centrinėje Azijoje (Tarim grupė) prieš 1 mln. metų (2 pav.). Porūšius atskyrė tam tikros gamtinės ribos, kartu sudarydamos genetinius skirtumus (Ludt ir kt,, 2004). Europos tauriojo elnio biogeografinė istorija per daugelį šimtmečių buvo įtakojama žmogaus veiklos. Buvo vykdomi perkėlimai, natūralios aplinkos fragmentacija ir rinktiniai medžiojimai, kurie potencialiai turėjo poveikį jų genetiniai struktūrai (Hartl ir kt., 2003). Lietuvoje aptinkamas Vidurio Europos taurusis elnias (Cervus elaphus hippelaphus) priklausantis hippelaphus porūšiui. Subfosilinės liekanos rodo, kad taurieji elniai Rytų Pabaltijyje gyveno jau ankstyvajame holocene ir čia buvo itin išplitę viduriniame holocene. Vėlyvajame holocene šių žvėrių šiaurinė išplitimo riba pradeda atsitraukti į pietus, bet Lietuvoje jų vis dar gausu iki antrojo tūkstantmečio vidurio. Vėliau čia elniai išnyko. Lietuvoje manoma, kad šie nuostabūs žvėrys išnyko XIX a. pradžioje, nes Lenkijos ir Lietuvos žvėrių sąrašuose ir aprašymuose, pateiktuose S. Ladovskio 1783 metais, minima, kad taurieji elniai yra įprasti žvėrys, o jau 1830 metais E. Eichvaldas nurodo, kad šių žvėrių Lietuvoje neaptinkama (Baleišis, Bluzma, 2003) . Taurieji elniai pradėti reaklimatizuoti Žagarės miškuose. Manoma, kad čia pirminė laisvėje gyvenančių elnių banda susiformavo iš grafo Naryškino aptvarų per Pirmąjį pasaulinį karą pabėgusių arba valstiečių išleistų žvėrių. Yra ir kita versija, kad elniai atvyko iš Latvijos. Remiantis G. Skribos duomenimis (1975m.), 1914 metais vakarų Latvijoje laisvėje gyveno devynios elnių bandos. Vienos bandos užimama teritorija buvo prie pat Lietuvos sienos, už kelių kilometrų nuo Žagarės miškų. Šių elnių į Lietuvą atvežta ir iš Rusijos Voronežo srities Usmanės rezervato (1956 ir 1972 m.). Pirmosios Lietuvoje žvėrių apskaitos metais (1934 m.) Žagarės miške priskaičiuota 18 tauriųjų elnių. Iki 1938 metų taurųjų elnių šiaurės Lietuvoje buvo tik Joniškio urėdijos miškuose. Iki 1982 metų iš pirminio Žagarės tauriųjų elnių reaklimatizavimo židinio gyvūnai išplito į aštuonis administracinių rajonų (Akmenės, Joniškio, Kelmės, Mažeikių, Pakruojo, Radviliškio, Šiaulių ir Telšių) miškus. Pavienių elnių arba nedidelių jų grupių buvo pastebėta ir kituose rajonuose (3a pav.). Vėliau elniai paplitę ir kitose vietovėse. Į pietų Lietuvos miškus elniai atkeliavo iš Lenkijos ir

11 Kaliningrado srities, kurioje, remiantis V. Beliakovo ir kt. (1978 m.) duomenimis, 1946 – 1947 metais gyveno apie 1500 šių žvėrių. Norint pagreitinti tauriųjų elnių plitimą, nuo 1969 metais Lietuvoje pradėti vykdyti jų gaudymo ir perkėlimo į naujas gyvenamąsias vietas darbai. 1969-1987 metais aptvaruose ir distancinio imobilizavimo būdu buvo sugauta 1030 elnių, kurie išleisti į 29 administracinių rajonų miškus. Daugiausiai elnių išleista Trakų (99), Vilniaus (84), ir Varėnos (82) rajonuose. Be to, sugauti 38 elniai išvežti į Estiją (1979, 1980 ir 1987 metais) ir 23 žvėrys į Rusijos Kalugos sritį (1988 m.).

3 a pav. Introdukuotų ir atklydusių tauriųjų elnių 3 b pav. Tauriųjų elnių tankis (1000 ha) rajonų paplitimas Lietuvoje 1951-1982 metais (Baleišis, miškuose (2001 m.) (Baleišis, Bluzma,2003) Bluzma , 1998): 1 – pirminis elnių reaklimatizavimo židinys; 2 - iš žvėrių imigrantų paplitimas; 4 – pavienių arba nedidelių jų grupių pastebėjimo vieta. susiformavusių bandų lokalizacija; 3 – atvežtų iš Voronežo rezervato elnių išleidimo vieta ir Dėl introdukavimo, perkėlimo ir migravimo iš kaimyninių teritorijų taurieji elniai vėl tapo svarbiu Lietuvos miškų biocenozių komponentu. 2001 metais mūsų šalyje buvo 12,6 tūkstančio elnių.Jų vidutinis tankis 1000 ha miško yra 6,5, bet atskiruose rajonuose labai skirtingai. Didžiausias elnių tankis Joniškio (22,9) ir Pakruojo (21,4) rajonų miškuose (Baleišis, Bluzma, 2003) (3 b pav.).

12 2004 m. balandžio mėnesį 17 monitoringo stacionaruose Ekologijos instituto ir saugomų teritorijų darbuotojų atliktų tauriųjų elnių stebėjimai parodė, kad vidutinis tauriųjų elnių populiacijos tankis lygus 3,9 ± 0,2 ind./1000 ha miško. Didžiausias populiacijos tankis nustatytas Vištyčio regioninio parko miškuose, o mažiausias - Varėnos rajono Pirčiupių miškuose ir Taurijos ornitologiniame draustinyje. Vilniaus rajone Gegužinės ir Varėnos rajone Matuizų miškuose taurieji elniai 2004 metais neužregistruoti. Atskirose žemėvaizdžių grupėse tai pat nustatyti žymūs tauriųjų elnių populiacijos tankio skirtumai. Didžiausias populiacijos tankis nustatytas tirtuose kalvotų moreninių aukštumų miškuose (8,3 ± 0,6 ind./1000 ha). Molingų lygumų miškuose nustatytas 3,5 ± 0,4 ind./1000 ha tankis, o smėlingose lygumose tik 0,4 ± 0,1 ind./1000 ha tankis. Analizuojant tauriųjų elnių populiacijos tankio kaitą buvo palyginti 5 tų pačių stacionarų tirtų 1993-2004 metais duomenys lyginant juos su dar ankstesnių tyrimų (1976-1986 m.) duomenimis iš tų pačių miškų. Daugiamečiai tyrimai 5 stacionaruose rodo elnių populiacijos vidutinio tankio mažėjimą nuo 1998 metų (lyginant su 1996- 1997 metais). Tankio mažėjimas tęsėsi iki 2002 metų. Labai mažas tankis 2001-2002 metais galėjo būti sąlygotas tauriųjų elnių lokalinių migracijų. Per paskutiniuosius šešis metus tuose pačiuose stacionaruose elnių tankis sumažėjo 24,4%. Elnių santykinio tankio dinamikos 24 stacionaruose trendas rodo populiacijos mažėjimą (Balčiauskas, 2004). Visoje Europoje priskaičiuojama apie 1 milijonas taurųjų elnių. Bendrai Lietuvoje, Latvijoje, Estijoje gyvena per 20 tūkstančių tauriųjų elnių. Aplinkos apsaugos ministerijos duomenimis, 1996 metais vasario mėnesį iš viso Lietuvoje buvo 13900 elniai. Deja, 2000-2001 metų apskaitos rodo, kad tauriųjų elnių Lietuvoje sumažėjo iki 12864 elnių. Tai įtakoja brakonieriavimas, gyvenamosios vietos transformavimas neigiama linkme, padidėjusi rekreacija. 2004–2005 metų medžioklės sezono žvėrių apskaitą parodė, kad Lietuvos miškuose priskaičiuojama 12599 tauriųjų elnių. Tai 1400 individų daugiau nei 2003-2004 metų apskaitoje (11199 tauriųjų elnių), o 2005-2006 metų apskaitą rodo jų padidėjimą iki 14400 individų (remiantis Aplinkos ministerijos šaltiniais). Taurusis elnias yra svarbus medžiojamasis žvėris. Lietuvoje elnius medžioti buvo leista nuo 1938 m. Po Antrojo pasaulinio karo elniai Lietuvoje pradėti medžioti nuo 1971 m. 2005 - 2006 metų medžioklės sezone buvo sumedžioti 766 elniai, tai 165 individais daugiau nei 2004-2005 metų medžioklės sezone (Lietuvos Respublikos aplinkos ministerijos duomenimis). Ūkiškai leistinas elnių tankis mūsų šalies miškų įvairių tipų medynuose (1000 ha) yra nuo 5 iki 20. Jei tauriųjų elnių skaičius sureguliuotas, tai kasmet galima sumedžioti apie 15-20% kaimenės žvėrių.

13 1.2. DNR žymenų polimorfizmas bei taikomi metodai populiacijų genetikoje Molekuliniai DNR žymenys yra labai tikslus įrankis vertinant populiacijos dydį, lyčių santykį, mirtingumą, veisimąsi, efektyvų populiacijos dydį, įvaisą (inbrydingą) bei migraciją (Wan ir kt, 2004). Per pastarąjį dešimtmetį populiacijų genetiniai tyrimai buvo nepaprastai produktyvūs ir sėkmingi pradedant PGR (polimerazinės grandinės reakcijos) technologijos išradimu bei mitochondrinės ir mirosatelitinių DNR žymeklių atsiradimu.

1.2.1. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) Tikrą revoliuciją sukėlė polimerazinės grandininė reakcija (PGR, angl. – polymerase chain reaction, PCR), 1985 metais pirmą kartą aprašyta R. K. Saiki ir bendraautorių (grupės vadovas K. Mullisas). Už PGR metodo sukūrimą K. Mullisui (JAV) 1993 metais priskirta Nobelio premija. Žurnalas „Science“ 1989 metais pavadino PGR svarbiausiu metų mokslo įvykiu. Šio metodo idėja paprasta. PGR yra greitas ir lankstus fermentinis in vitro metodas norimam genominės DNR arba kDNR fragmentui pagausinti (amplifikuoti). Jos principas iš esmės tas pats kaip ir DNR dvigubėjimo (replikacijos), kai ląstelė rengiasi dalytis. DNR molekulę sudaro dvi komplementarios antilygiagrečios dezoksiribonukleotidų grandinės: 5’->3’ ir 3’->5’. DNR dvigubėjant šios grandinės atiskiria (DNR denatūracija) ir tampa matricomis dviejų naujų komlementarių grandinių sintezei. Naujas DNR molekulės grandines sintetina fermentas DNR polimerazė. Ir gyvoje ląstelėje, ir PGR metu mėgintuvėlyje (t.y. in vitro) DNR polimerazė veikia „skaidydama“ viengrandę DNR matricą ir prijungdama naują komplementarų matricai nukleotidą prie sintetinamos grandinės 3’ galo (t.y. 5’->3’ kryptimi). DNR sintezei ant viengrandžio šablono pradėti būtinas pradmuo: trumpas viengrandės DNR fragmentas su laisvu 3’ galu, komplimentariai prisijungęs prie matricos. Ląstelėje juo „pasirūpina“ replikacijos komplekso fermentas praimazė, o DNR sintezės reakcijoje, vykdomoje in vitro, tokių pradmenų, reikia įdėti į reakcijos mišinį. Kad priversti DNR polimerazę dvigubinti ne visą DNR, o tik tam tikrą fragmentą, pakanka parinkti specifinę oligonukleotidinių pradmenų porą, komplementarią nukleotidų sekoms, „įrėminančioms“ norimą aplifikuoti DNR fragmentą. Čia keliami tam tikri reikalavimai:

14 1. Pradmenys turi būti specifiški būtent DNR taikiniui, t.y. tam fragmentui, kurį norima sintetinti. 20 nukleotidų ilgio fragmentų dažniausiai pakanka, kad atsitiktinio jų sekų komplimentarumo su kitomis tiriamos DNR (matricos) vietomis tikimybė būtų minimali. 2. Pradmenų sekose neturi būti komplimentarių fragmentų,dėl kurių susiformuotų antrinė paties pradmens struktūra, trukdanti jam komplimentariai sąveikauti su atitinkama DNR matricos nukleotidų seka, ypač 3’ gale. 3. Pradmenys neturi būti komplimentarūs viens kitam, ypač 3’ dalyje, kad nesudarytų dupleksų vienas su kitu. 4. Abiejų pradmenų dupleksų su DNR matrica lydymosi temperatūra turi būti tokia pati, t.y. abiejų pradmenų nukleotidų G/C ir A/T santykis turi būti labai artimas Tinkamai parinkus pradmenų poras, viename mėgintuvėlyje galima amplifikuoti iš karto kelis skirtingus DNR fragmentus (multiplex PCR). Atskyrę dvigrandės DNR grandinės taikinio „užsodinę“ specifinius pradmenis ir pridėję DNR polimerazės, visų keturių dezoksiribonukleotrifosfatų (dNTP) mišinį bei reakcijos terpei būtinų cheminių medžiagų, nukopijuojame mus dominantį nedidelį DNR fragmentą. Tačiau susintetinama tik viena jo kopija. 1984 metais R.K. Saiki ir bendradarbiai pirmieji pradėjo šią reakciją vykdyti ciklais: DNR denatūravimas – pradmens prisijungimas- pradmens pratesimas (DNR sintezė). Taip vis sintetinamas norimas DNR fragmentas, kas kartą kaip matricas naudojant ne tik pradinę DNR, bet ir ankstesniuose cikluose susintetintus DNR fragmentus. Taigi DNR sintezės in vitro reakcija tapo ne tik ciklinė, bet ir grandininė: susintetintų fragmentų skaičius dvigubėja, t.y. didėja geometrine progresija. PGR yra ciklinė, o kiekvieną jos ciklą sudaro trys etapai: 1. DNR denatūravimas, 2. pradmens prijungimas 3. pradmens pratęsimas (komplemantarios DNR grandinės sintezė) Dvigrandė DNR denatūruojama inkubuojant 0,5-2 min. 92-96°C temperatūroje. Pradedant PGR, tenka denatūruoti didelius dvigrandžius genominės DNR ar kDNR fragmentus, todėl pradinis denatūravimas trunka 3-5 minutes. Sumažinus temperatūrą, reakcijos mišinyje esantys viengrandės DNR fragmentai vėl pradeda komplimetariai jungtis į dvigrandžius (angl. annealing). Kuo žemesnė temperatūra, tuo greičiau sąveikauja viendrandžiai fragmentai, tuo mažiau „išrankūs“ pradmenys, t.y. didelė tikimybė susidaryti atsitiktiniams nevisiškai komplimentariems dupleksams. Kad

15 oligonukleotidiniai pradmenys kuo specifiškiau ir tiksliau prisijungtų prie matricinės DNR grandinių, būtina labai tiksliai parinkti temperatūrą. Šio PGR etapo metu ji esti 37-68°C intervale ir priklauso nuo pradmens nukleotidų sekos: turi būti 3-10 laipsniais žemesnė už duplekso (pradmuo - viengrandė DNR matrica) lydymosi temperatūrą Tm. Tokioje temperatūroje reakcijos mišinys inkubuojamas 0,5-2 min. Iš tikrųjų optimali pradmens prisijungimo temperatūra priklauso ne tik nuo Tm bet ir nuo reakcijos mišinio sudėties, etapo trukmės, todėl kiekvienai PGR šia temperatūrą dažniausiai dar reikia pasirinkti eksperimentuojant. Pradmens pratesimo etape sintetinam komplementai amplifikuojamo DNR fragmento grandinė. Terpės temperatūra parenkama optimali naudojamai DNR polimerazei. Taq polimerazės atveju komplementarios DNR grandinės sintezė vyksta maždaug 70-75°C (dažniausiai 72°C) temperatūroje. Kad DNR sintezė vyktų veiksmingai, reakcijos mišinyje turi būti pakankama pradmenų, visų keturių dNTP ir Mg+ jonų koncentracija. Kiekvienai oligonukleotidinių pradmenų porai optimalios sąlygos (įskaitant temperatūros režimą) parenkamos eksperimentuojant. DNR sintezė vyksta 2-4 kb/min. Greičiu, taigi 1 min. Pakanka iki 2 kb ilgio PGR produktui susintetinti. Jei reikia amplifikuoti didesnius DNR fragmentus, kiekvienam 1000 bp DNR sintezės trukmė pailginama 1 min. Vidutiniškai šis PGR etapas trunka 0,5-2 min. Pasibaigus paskutiniam DNR sintezės ciklui, mėginai papildomai inkubuojami 5-15 min., kad Taq polimerazė užpildytų likusius viengrandžius amplifikuoto produkto galus. DNR analizė yra labai svarbi evoliuciniams, populiacijų genetikos ir sistematikos tyrimams. Šis metodas turi keletą pranašumų lyginat su baltymų polimorfizmo analize. DNR analizės dėka yra: 1. Tiesiogiai tiriama genotipinė, o ne fenotipinė išraiška 2. Viena ar daugiau sekų gali būti pasirinkta spręsti problemą atsižvelgiant į evoliucine tiriamo objekto padėtį ar paveldėjimo būdą 3. Pagrindinai tyrimo metodai vienodi visiems DNR tipams 4. DNR gali būti išskirta iš nedidelio audinio ar kraujo kiekio ir palyginti stabili, net neužšaldytuose audiniuose. Tai reiškiam, kad galim tirti retus gyvūnus jų nežudant, bei atlikti jau išnykusių rūšių analizę. Mitochondrinės (pradėtas taikyti nuo 1980 metų dešimtmečio) ir branduolinės (mikrosatelitinės, taikomas nuo 1990 metų dešimtmečio) DNR polimorfizmas teikia labai vertingus genetinius žymenis daugeliui tyrimų sričių, pavyzdžiui, rūšies genėtinai struktūrai tirti, jos evoliucijos kelio nustatymui. Tokie DNR žymenys praplečia tyrimų akiratį ir galimybes.

16 1.2.2. Mikrosatelitinės sekos SSR – Paprastos pasikartojančios (mikrosatelitinės) sekos (angl. Simple Sequence Repeats/ Microsatellites) žinomos kaip trumpi grupiniai pasikartojimai (angl. STR – Short Tandem Repeats) dar vadinamos mirosatelitais. Jos susideda iš grupėmis pasikartojančių trumpų sekų (di-, tr-, arba tetranukleotidų). Tokie pasikartojimai plačiai paplitę eukariotų genomuose ir SSR dažnai yra polimorfiški dėl širtingo pasikartojimų skaičiaus. Šie žymenys yra plačiausiai naudojami rūšių genolapių sudarymui, genų paieškai, genotipų identifikavimui, populiacijų genetinės įvairovės ir filogenijos tyrimams. Mikrosatelitų lokusų egzistavimas eukariotų organizmuose buvo žinomas nuo 1970 –ųjų. Mikrosatelitų polimorfiškumu pradėta naudoti nuo 1989 m., kai buvo paskelbta apie mikrosatelitų izoliavimą ir jų alelinio kintamumo įvertinimą, panaudojant PGR. Šiuose darbuose mikrosatelitai arba buvo klonuojami ir sekvenuojami, arba nustatomi iš sekų duomenų bazių ir susintetinami. PGR pradmenys atitinka DNR sekas, iš abiejų pusių apribojančias mikrosatelitų grandinę, o amplifikacijos produktai – tai paprastos pasikartojančios sekos, kurie atskiriami poliakrilamido gelyje. Šis metodas leidžia atskirti alelius besiskiriančius, net vienintele 1bp ir keli lokusai gali būti analizuojami kartu ant to pačio gelio. Mikrosatelitų metodas susideda iš šių etapų: 1. DNR izoliavimas 2. PGR būdu pagausinamos pasikartojančių trumpų nukleotidų sekų DNR atkarpos 3. PGR produktai atskiriami elektroforezės pagalba arba išanalizuojami ABI genetinio analizatoriaus pagalba 4. Atliekama statistinė analizė Mikrosatelitines sekas sudaro trumpi, vienas paskui kitą išsidėstę, pasikartojantys fragmentai. Pasikartojančių fragmentų ilgis yra 2-5 bazių porų, o visos mikrosatelitinės sekos ilgis yra 300 ir mažiau bazių porų. Privalumai:  pakanka sąlyginai nedaug ir ne labai aukštos kokybės DNR,  efektyvus polimorfizmo atskleidimas,  kodominavimas, dažnai tinkami giminingų rūšių analizei,  aukštas rezultatų pakartojamumas,  efektyvus automatizuotas darbas,  aiškiai atskiriamos segmentų bangos, aukštas rezultatų pakartotinumas.

17 Trūkumai:  kartotinių sekų regioną identifikuojančių DNR atkarpų nustatymo poreikis,  santykinai aukšti kaštai. Panaudojimas: genotipų („pirštų antspaudų“) identifikacija, QTL žymenų paieškos tyrimai ir identifikacija, evoliucinių procesų studijos (rūšių emigracija, genų migracija). Mikrosatelitai yra aptinkami visų tyrinėtų ligi šiol organizmo genomuose ir yra dažnai randami žymiai didesniuose dažniuose, negu būtų numatoma dėl bazinės sudėties (Epplen et al. 1993). Mikrosatelitai gali būti labai polimorfiniai, ypač jei yra ilgi ir „nepertraukiami“. Dėl tos priežasties jie yra naudingi genetiniai žymenys. Didelis mikrosatelitų privalumas yra tai jog vienai rūšiai sukurti mikrosatelitinai pradmenys gali amplifikuoti tą patį paprastos pasikartojančios sekos regioną kitoje filogenetiškai artimoje rūšyje (Maudet, et al., 2002; Slate, et al., 1998). Labiausiai polimorfiniai, ir tokiu būdu daugeliu tikslų naudingiausi, yra nepertraukiami rinkiniai. Tačiau daugelis mikrosatelitinių lokusų, pagausintų PGR būdu iš tikrųjų, turi savyje „pertraukimą“. Mikrosatelitų įvairovė yra DNR sekoje pasikartojančių fragmentų kiekyje. Šie skirtumai atsiranda pasitaikančių DNR replikacijos klaidų metu. Mikrosatelitinės DNR sekos labai greitai kinta – jų mutacijų dažnis svyruoja nuo 2,5*10-5 ir 10-2 mutacijų per generaciją. Didelis mutacijų dažnis lemia didelį mikrosatelitinių DNR sekų polimorfizmą (natūraliose populiacijose vidutinis mikrosatelitinių sekų heterozigotiškumas dažnai būna daugiau nei 50%). Todėl šios sekos ypač naudingos tiriant rūšis, kurioms būdingas nedidelis genetinės įvairovės lygis, taip pat tiriant populiacijas, kuriose pasireiškia inbrydingas bei tiriant genetiškai artimas populiacijas, tarp kurių genetiniai skirtumai yra nedideli. Tarp rūšies yra pastebimi skirtumai mikrosatelitų struktūroje, ilgyje ir skaičiuje. Mikrosatelitų aleliai yra analizuojami amplifikuojant tiriamą regioną PGR metodu, po to išskirstomi poliakrilamido elektroforezės metodu pagal savo dydį. Tačiau egzistuoja ir neigiami šios analizės aspektai. Kadangi mutacijų pasekoje gali įvykti ir delecijos, ir elongacija mikrosatelitinės analizės produktai gali būti vienodi savo ilgiu, bet skirtingi pagal nukleotidų sudėtį. Netgi sekos nustatymas, dėl galimų tolimesnių delecijų, gali neišspręsti šios problemos (pvz. viena sekos atkarpa pakinta iš (CA)15 į (CA)16, o po to vėl į (CA)15, kai kita sekos atkarpa lieka nepakitusi). Kita mikrosatelitinės analizės problema tai neamplifikuojami nulinei aleliai. Jų atsiradimo priežastis yra geno taktinės mutacijos, kurios neleidžia produktui amplifikuotis. To pasekoje mes amplifikuotam produkte matysime tik homozigotas ir dėl to mes matome per didelį

18 heterozigotų deficitą palyginus su Hardy-Weinbergo pamiksime populiacija (Shariflou, Moran, 2000). Jie vaidina reikšmingą vaidmenį genomo vystymesi, kurdami ir palaikydami kiekybinį genetinį pakitimą. Manoma, kad pagausėjimas ar iškrita vieno ar kelių pasikartojimų motyvų, DNR replikacijos metu, yra predominantinis mutacinis mechanizmas, dėka kurio mikrosatelitiniuose lokusuose yra kuriami naujo ilgio alelinie genai. Mikrosatelitų DNR sekos yra taip pat naudojamos tauriųjų elnių genėtinuose tyrimuose. Mikrosatelitai naudojami, nes: 1. Yra variabilūs (kintantys) bei atskleidžia aukštą alelių kintamumo lygį (lyginat su kitais metodais) 2. Yra kodominantiškai paveldimi, individuose visi aleliai gerai matomi 3. Turi platų panaudojimą populiacijų genetiniuose tyrimuose, kadangi leidžia: − įvertinti genų tėkmę tarp populiacijų − apibūdinti genetinį kintamumą populiacijos viduje bei tarp populiacijų − ištirti hibridizacijos efektus − atlikti kilmės (veislės) analizę 4. Lengvai analizuojami. Molekuliniai metodai kuo toliau tuo plačiau yra naudojami sėkmingai identifikuoti genetinius skirtumus tarp populiacijų. Jau šiuo metu jie yra naudojami apibrėžti padėtį bei pobūdį genų srautų barjerams. Tai turi įtaka natūralių populiacijų ūkininkavime, veiksmingam rūšies apsaugos planavime, invazinių rūšių kontrolėje. Taip pat duoda kita žvilgsnį į populiacijos sampratą. Teikę galimybe atskirti porūšius ne tik pagal morfologinius požymius, bet ir pagal genetinio kintamumo ypatumus. Statistinė mikrosatelitinių žymenų galia priklauso nuo panaudotų lokusų skaičiaus, polimorfiškumo laipsnio lokuse ir imties dydžio.

1.3. Genetiniai tauriųjų elnių tyrimai 1961 metais „Nature“ žurnale buvo publikuotas pirmas elnių genetikos tyrimas panaudojant molekulinės biologijos technologijas (baltymų elektroforezės metodą) (Dratch, Pemberton, 1992). Nuo to laiko parašyta šimtai straipsnių šia tema. Tarprūšiniai tyrimai padėjo atpažinti skirtingus elnių specifinius baltymų markerius. Sukaupti vidurūšinių tyrimų rezultatai atskleidė kintamumą tarp rūšių. Baltauodegis (Odocoileus virgineanus) bei šiaurinis (Rangifer tarandus) elniai yra

19 labiausiai polimorfinės rūšys, tuo tarpu europinis danielius (Dama dama) ir Dovydo elnias (Elaphurus davidianus) pasižymi mažiausiu kintamumu. Rastas polimorfiškumas, patvirtintas genų dažniu, rodo, kad elnių rūšys retai būna pamiksinės. Dauguma elektroforezinių tyrimų patvirtina, kad polimorfinai lokusai susidaro natūralios atrankos pasekoje. Dabartinėse sąlygose žmogaus ingerencija į natūralia aplinką grubiai pažeidžia evoliuciškai susiklosčiusius natūralius mechanizmus, o svarbiausia tuos, kurie saugo ir palaiko genetinę įvairovę. Netinkamas ūkininkavimas ir reintrodukcjos valdymas gali lemti ties išnykimo riba esančių rūšių skaičiaus padidėjimą. Yra žinoma, kad vietinės rūšys yra svarbios istoriniu požiūriu, kadangi kiekviena rūšis turi savo unikalų kelią evoliucijos eigoje. Pastaraisiais metais daug dėmesio yra skiriama gyvūnijos genetinės įvairovės išsaugojimui. Mokslininkai A. Bruce ir D.Banwell (2003 metais) savo straipsnyje “Santrauka apie dabartine 23 tauriųjų elnių porūšių būklę“ pažymi, kad tauriojo elnio genetinis grynumas kelia susirūpinimą. Jie atliko tyrimą 23 atpažintų tauriojo elnio (Cervus elaphus) (įskaitant Atlantik, Maraoid ir Wapitoid grupes) porūšių. Tyrimai atlikti Holartic regione parodė, kad tame regione nėra išlaikytas tauriojo elnio genetinis grynumas. Pagal IUCN „Red List“ („Raudona knygą“, atnaujinta 1996 metais), devyniems iš dvidešimt trijų porūšių gresia išnykimas, o pagal D. Banwell atliktus tyrimų mažiausiai penkiolika yra grėsmėje dėl pernelyg didelės ir nekontroliuojamos medžioklės bei dėl tauriojo elnio rūšies „užteršimo“ neapgalvotai introdukuotomis rūšimis. Jo straipsnyje keliama prielaida, kad jei nebus imtasi tarptautinio masto veiksmų, mažiausiai dešimt porūšių gali išnykti iš savo natūralių arealų arba prarasti genetinį grynumą.

1.3.1. Mikrosatelitai ir jų panaudojimas tauriųjų elnių genetiniuose tyrimuose Siekiant išsaugoti natūralias populiacijas yra būtina išaiškinti reintrodukuotų naujų rūšių įtaką natūralioms populiacijoms. Pasaulyje, dėka izofermentinio kintamumo bei molekulinės genetikos (naudojant mitochondrine bei branduoline (mikrosatelitų) technologijas) pradėta atskleisti daug vertingos informacijos apie tauriųjų elnių genetinę įvairovę. Nors adaptacija prie pakitusių sąlygų sukelia populiacijose genotipų pakitimus, pakankamai sudėtinga juos aptikti ir užfiksuoti. Jei norima sužinoti ar populiacija yra vienalytė ir nepakitusi, ar kažkokių sąlygų poveikyje adaptavosi ir diferencijavosi į atskiras grupes, ieškoma žymenų, galinčių tuos pakitimus užfiksuoti. Naujų ir galingų DNR technologijų panaudojimas (mtDNR ir mikrosatelitų) gali atskleisti įvairius procesus vykstančius tauriųjų elnių populiacijose. Vienas iš jų yra hibridizacija.

20 Reindukavimas naujos rūšies į naują ekosistemą yra dažnai lydimas hibridizacijos proceso tarp introdukuotos rūšies ir giminingos vietinės rūšies. Kai egzistuoja maži barjerai genų mainams dažnai vyksta greitas genotipinis ir fenotipinis introgreso procesas iš vienos rūšies į kitą (Abbot, 1992). Remiantis paskutiniais duomenimis yra manoma, kad taurusis elnias gali hibridizuotis su dėmėtaisiais elniais, kurie pabėga iš komercinių aptvarų, tuo pačiu kinta tauriojo elnio genetika. Šis procesas buvo pastebėtas Argyll vietovėje (Škotijoje) jau 1950 metais. Dėl kūno dydžio skirtumų tarp šių dviejų rūšių (dėmėtasis elnias yra mažesnis už taurąjį elnią) buvo manoma, kad šios rūšys nesikryžmins. Mokslininkai savo tyrimus atliko naudodami 11 mikrosalelitinius žymenis (angl. microsatellite markers) ir mitochondrijų DNR. Lygindami ankstesniu tyrimus tos pačios populiacijos, jie priėjo išvados, kad elniai pasidalijo į dvi skirtingas genetines klases atitinkančias dėmėtojo arba tauriojo elnių fenotipus. Hibridų fenotipas yra geriausias įrodymas, kad hibridizacijos procesas vyksta tarp šių rūšių. Gyvūnai turi matomų bruožų vienos ir kitos rūšies. Fenotipas yra gera rodyklis (indikatorius) rodantis, kad hibridizacija yra galima, tačiau nėra pakankamas rodiklis nurodantis hibridizacijos mastą. Mikrosatelitinai lokusai kartu su mitochondriniu kontroles regionu gali būti naudojami taurųjų elnių porūšių vietinių (indigeninių) porūšių identifikavime. Feulner ir bendradarbiai 2004 metais, naudodami 9 polimorfinius mikrosatelitų lokusus bei mitochondrinės DNR kontrolės regioną, atliko 120 taurųjų elnių individų iš 10 Serbijos ir Rumunijos skirtingų vietovių tiriamą analizę siekdami genetiškai charakterizuoti Karpatijos tauruosius elnius, kurie yra priskiriami Cervus elaphus montanus porūšiui ir nustatyti jų genetinį integralumą.Jų gauti rezultatai patvirtino šio porūšio genetinį integralumą ir parodė kad jie yra istoriškai indigeninai. Šio porūšio tyrimo metu buvo rasta 16,6 % privačių mikrosatelitinių lokusų (1/6 alelių yra apriboti keturiems regionams iš 10 tirtų). Mikrosatelitai taip pat yra naudojami rūšies išsaugojimo tyrimuose dėka jų didelio jautrumo. Šie žymenys, kartu su mitochondriniais žymenimis buvo naudojami Sardinijos ir Mesola (vienintele Italijos indigeninė (vietinė) taurųjų elnių populiacija) (Hmwe, 2005) populiacijų genetinio kintamumo bei išsaugojimo tyrimuose. Mikrosatelitinai žymenys atskleidė žemą šių populiacijų kintamumą lyginat su kitomis europinėmis populiacijomis ir bei indikavo poreikį imtis populiacijų išsaugojimo darbų. Esant izoliuotai populiacijai, efektyvaus populiacijos dydžio sumažėjimui bei genetinės įvairovės praradimui dėl atsitiktinio dreifo, populiacija gali atsidurti pavojuje. Tokiais atvejais imamasi populiacijos valdymo planų. Tačiau neapgalvota introdukcija gali privesti prie

21 originalios populiacijos genų pulo „užteršimo“ ir tuo pačiu paskutinės Mesola indigeninės rūšies genetinio išnykimo. Mirkosatelitinai lokusai buvo taip pat naudojami siekiant išsiaiškinti kaip demografiniai procesai, veikiantys varijuojantį laiko tarpą, įtakojo nūdienos Bavarijos taurųjų elnių populiacijos genetinį kintamumą. Buvo ištirta 11 populiacijų (viso ištirta 395 taurieji elniai) panaudojant 19 mikrosatelitinių lokusų (dauguma gauti iš galvijų ir avių). Tyrimas parodė Bavarijos taurųjų elnių populiacijų sub-struktūrizaciją bei diferenciaciją. Mažai tikėtina, kad jos priežastimi yra izoliacija per atstumą (angl. isoliation by distance), nes ryškių koreliacijų tarp geografinio atstumo ir genetinio atstumo nerasta. Manoma, kad šia diferenciacija sukėlė kiti evoliuciniai bei demografiniai faktoriai (gyvenamosios vietos fragmentacija, dramatiškas populiacijos sumažėjimas, atsitiktinis genų dreifas). Stebint Bavarijos elnių populiacija iš genetinės pusės nustatyta, kad ji yra gan stabili, tik 2 populiacijos pasižymėjo labai mažu genetiniu kintamumu, todėl, kad išvengti inbrydingo depresijos rekomenduojama sukurti tauriesiems elniams „migracijos koridorius“.

1.3.2. „Konservatyvių“ kanopinių mikrosatelitinių lokusų panaudojimas tauriųjų elnių genėtinuose tyrimuose Mikrosatelitinai lokusai dažnai yra pasirenkami kaip laukinių populiacijų genėtinai žymenys, tačiau problema kelia tinkamų polimorfinių žymenų suradimas, kadangi tai gali būti daug laiko atimantis bei brangus metodas jei tiriamoji rūšis neturi dar savo genetinio žemėlapio. Atlikti tyrimai rodo, kad kai kurie mikrosatelitinai lokusai tarp rūšių yra išsaugomi (konservatyvūs) (Maudet, ir kt., 2002; Moore, ir kt.,1991; Stacia, ir kt., 1996). Tarprūšinių mikrosatelitinių lokusų panaudojimas ne tik sutaupo laiko bei išlaidų laboratorijoje, bet taip pat suteikia galimybę kurti palyginamuosius genetinius žemėlapius tarp giminingų rūšių (Slate, ir kt., 1998). 1 lentelė. Naminės avies, tauriojo elnio bei dėmėtojo elnio amplifikuotų galvijų mikrosatelitinių lokusų skaičius, polimorfizmas, vidutinis alelių skaičius lokuse (Slate, ir kt., 1998). Lokusai duodantys Procentinis Procentinė Polimorfiniai Vidutinis alelių Rūšis mikrosatelitinius mikrosatelitų polimorfinių lokusai skaičius lokuse produktus skaičius lokusų išraiška Naminė avis 127/173 73.4 54/127 42.5 1.8 ± 1.2 Taurusis 129/174 74.1 72/129 55.8 3.4 ± 2.9 elnias Dėmėtasis 126/171 73.7 47/126 37.3 1.6 ± 1.0 elnias

22 Stale ir kiti ištyrė 174 galvijų mikrosatelitinių pradmenų porų panaudojimą avių bei dviejų elnių rūšių (tauriojo ir dėmėtojo elnių) tyrimuose. Pas namines avis iš 173 žymenų 127 (73,4%) davė amplifikacijos produktus, iš jų 54 (42,5%) buvo polimorfinai, taurių elnių iš 174 pradmenų 129 (74,1%) davė produktus (priedai, lentelė 1), o net 74 (55,8%) buvo polimorfinai, tuo tarpu pas dėmėtąjį elnią iš 171 žymens produktai gauti 126 iš kurių 47 (37,3%) buvo polimorfinai. M. Poetsch ir kiti jo benrdradabiai tauriųjų elnių, stirnų bei danielių tyrimams naudojo šiaurinio elnio (Rangifer tarandus) mikrosatelitinius lokusus. Pradmenis buvo pasirenkama pagal sekančius kriterijus: a) PGR reakcijos amplifikacijos patikimumas, b) „mikčiojančių“ ryšių nebuvimas, c) alelių buvimas bent dviejose tirtose rūšyse. Šeši iš dvylikos tirtų mikrosatelitinių lokusų (RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73) parodė didžiausia tinkamumą nustatant tauriųjų elnių bei stirnų rūšis. Todėl yra tikslinga tauriųjų elnių tyrimams jau ištirtus kanopinių gyvūnų mikrosatelitų lokusus, kadangi yra pastebimas tam tikrų lokusų konservatyvumas. DNR mikrosatelitinės sekas gali būti naudojamos ne tik taurųjų elnių įvairovei tirti bet ir ekotipų identifikavime. Niemczewski C., Rutkowski J., Żurkowski M., 2002 savo straipsnyje pristatė tauriųjų elnių mikrosatelitų polimorfizmo tyrimą Mozūrijos regione. Jų tikslas buvo ištiri Mozūrijos tauriųjų elnių mikrosatelitų polimorfizmą panaudojant 27 galvijų mikrosatelitinius lokusus, kadangi yra žinoma mikrosatelitinių šoninių sekų konservatyvumas. Šio tyrimo tikslas buvo pritaikyti galvijų mikrosatelitinį polimorfizmą ir panaudoti atpažįstant tauriojo elnio rūšis, kadangi remiantis tik morfologinėmis savybėmis (pvz. ragų šakų dydžiu ir forma bei kūno mase) yra sunku atskirti nuo kitų tauriųjų elnių ekotipų. Tyrime buvo ištirta 19 Lenkijos taurųjų elnių iš Piska miško, Mozūrijos regiono. Tyrimo metu buvo atlikta 27 galvijų mikrosatelitinių DNR lokusų amplifikacija, penkiuose multiplekso PGR blokuose. Dvylikoje lokusų buvo identifikuota 42 aleliai. Didžiausias polimorfizmas buvo pastebėtas TGLA53 (10 alelių), BM1818 (8 aleliai) ir CSSM66 (8 aleliai) lokusuose. Penki lokusai pasirodė monomorfinai. Didžiausias heterozigotiškumas pastebėtas BM1818 (H=0,84), TGLA53 (H=0,81) ir CSSM66 (H=0,76). Mokslininkai priėjo išvados, kad tam tikri galvijų mikrosatelitų žymenys gali būti naudojami taurųjų elnių genetiniam tipavime bei apibūdinimui, o taip pat Cervidae filogenetinei analizei. Mikrosatelitų lokusų atsitiktinis pasiskirstymas genome veikia kaip efektyvus genetinis markeris. Ligi šiol, pas elnius buvo aptikta 200 mikrosatelitų lokusų perkeliant mikrosatelitų PGR pradmenis kilusius iš galvijų bei avių. Tai pat yra sukurti keli elnių mikrosatelitinai lokusai

23 tiesiogiai iš elnių mikrosatelitų bibliotekos. Šie lokusai yra naudojami tėvystės nustatymui, nustatant genetinę įvairovę bei populiacijos struktūrą, populiacijos introgresui (angl. introgression) nustatyti ir pan. (Yan-chun et al., 2001). Tačiau šiuo metu ištirti lokusai „neapčiuopę“ reikiamų pritaikymų, todėl tikslinga yra išskirti kuo didesnį elninių mikrosatelitų lokusų skaičių bei kurti jų genetinius ir fizinius žemėlapius, siekiant sukurti stiprių pagrindą elnių genetinių tyrimų pritaikymui.

24 2. Medžiagos ir metodika

2.1. Tyrimo medžiaga Šiame darbe mikrosatelitinių DNR sekų metodu buvo ištirta 24 taurieji elniai iš 4 rajonų, 8 skirtingų Lietuvos miškų bei 2 danieliai (iš Vokietijos miškų bei Minčios miško (Lietuva)) . Pagrindinis tyrimo objektas buvo nustatyti tauriųjų elnių DNR mikrosatelitų kintamumą Lietuvoje. Elnių audinių bei kepenų pavyzdžiai surinkti 2003 - 2005 metų medžioklės sezonuose iš medžiotojų nušautų individų (žr. Priedas1, 1 lentele.). Pavyzdžiai surinkti iš Ažvinčiu girios ir Minčios miško - Ignalinos rajono savivaldybė, Sipailiškės, Kalnelio, Prievačkos ir Birželių miškų – Panevėžio rajono savivaldybė, Taujėnų miško – Ukmergės rajono savivaldybė, Mantvilių miško – Jurbarko rajono savivaldybė.

4 pav. Tauriųjų elnių tankio (1000 ha) rajonų miškuose žemėlapis su pažymėtomis pavyzdžių rinkimo zonomis

2.1.1. DNR iškyrimas, koncentracijos nustatymas DNR išskyrimas buvo atliekamas dviems metodais: DNR ekstrakcija organinių tirpiklių pagalba (proteinazė K, chloroformas) bei DNR gryninimas silikagelio kolonėlių pagalba.

25 DNR išskyrimas organinių tirpiklių pagalba susideda iš trijų pagrindinių etapų:  Ląstelių lizavimo  Baltymų ir likusių priemaišų pašalinimo fenolio – chloroformo mišiniu  DNR išsodinimas alkoholiu TE (Tris-EDTA) buferis, pH 8,0: Galutinė koncentracija 1M Tris, pH 8,0 10 ml 10mM 0,5M EDTA (pH 8,0) 2 ml 1mM

H2O iki 1 l Medžiagos : 1M Tris; 0,5M EDTA; dejonizuotas vanduo; chloroformas; 96 % etanolis, Genomic DNA Purification Kit #KO512 (MBI Fermentas, Lietuva), kurį sudaro: o tirpalas lizei (40ml paruošto naudoti tirpalo), o precipitacijos (išsodinimo) buferis (8 ml 10 x tirpalo koncentratas), o NaCl tirpalas (10 ml 1,2M natrio chlorido) Darbo eiga: 1. 25 -30 mg audinių (užšaldytų ir saugomų -70° C temperatūroje) sutrinami grūstuve ir suberiami į 1,5 ml tūrio mėgintuvėlį, suspenduojama 200 µl TE buferio, 2. Sumaišome 200 µl pavyzdžio ir 400 µl tirpalo lizei ir 5 minutes inkubuojame 65 °C temperatūroje. Jei naudojame užšaldytą pavyzdį, tai tirpalą lizei užpilame ant užšaldyto pavyzdžio ir inkubuojame 65 °C temperatūroje 10 minučių. Karts nuo karto inkubuojamą pavyzdį pamaišome, pavartydami mėgintuvėlį, 3. Iš karto įpilame 600 µl chloroformo ir po to mėgintuvėlį švelniai pavartome 3-5 kartus, kad susimaišytų emulsija. Mėginį centrifuguojame 2 minutes esant 10000 apsisukimų per minutę, 4. Kol pavyzdys centrifuguojamas, paruošiamas tirpalas išsodinimui. Sumaišomą 720 µl sterilaus dejonizuoto vandens su 80µl DNR rinkinyje esančio koncentruoto išsodinimo tirpalo, 5. Po centrifugavimo mėgintuvėlyje atsiskiria du sluoksnai. Viršutinis (vandeninis) sluoksnis, kuriame yra ištirpusi DNR, nusiurbiamas ir perpilamas į naują mėgintuvėlį ir įpilama 800µl šviežiai paruošto išsodinimo tirpalo. Tirpalas maišomas, švelniai vartant mėgintuvėlį, kambario temperatūroje 1-2 minutes. Po to mėgintuvėlį 2 minutes centrifuguojame esant 10000 apsisukimų per minutę,

26 6. Tirpalą nuo nuosėdų visiškai pašaliname, bet nedžiovimame. DNR nuosėdos ištirpinamos 100µl 1,2M NaCl tirpalo (angl. Na solution) švelniai pamaišant. Įsitikiname, kad nuosėdos visiškai ištirpo, 7. Užpilame 300 µl šalto etanolio ir palaikome mėgintuvėlį apie 10 minučių - 20°C temperatūroje, kad išsėstų DNR. Po to mėgintuvėlis centrifuguojamas 3-4 minutes 10000 apsisukimų per minutę greičiu. Nupilame etanolį bei kruopščiai nusausiname (nugariname). DNR ištirpinamas 100 µl steriliame dejonizuotame vandenyje. DNR gryninimas silikagelio kolonėlių pagalba yra naudojama specialios kolonėlės įtvirtintų filtrų pavidalu (DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen’s DNeasy kit, Norvegija)). Darbo eiga: 1. 25 -30 mg audinių (užšaldytų ir saugomų -70° C temperatūroje) sukarpoma į smulkius gabalėlius į 1,5 ml tūrio mėgintuvėlį ir suspenduojama 180 µl ATL buferio, užrašomas kodas. 2. Pridedama 20 μl proteinazės K. Sandarai uždaroma. Ląstelių lizatą labai intensyviai suraišiome „votrex“ tipo prietaisu. Inkubuojame 56°C termomikserį 2 valandas. 3. Maišome „vortex“ tipo prietaisu 15 sek. Įpilama 200 μl AL buferio ir sumaišoma. Įpilama 200 μl etanolio (96-100%) ir vorteksuojame 20 sek. 4. Su mikrodozatoriumi mišinį supilame į DNeasy Mini spin kolonėles patalpintas į 2 ml tūrio mėgintuvėlius. Centrifuguojama kambario temperatūroje 1 min. esant 8000 apsisukimų per minutę. 5. Surinkimo mėgintuvėlį keičiame į naują.. Ant kolonėlės filtro įpilame 500 μl plovimo buferio AW1 ir centrifuguojame kambario temperatūroje 1 min. esant 8000 apsisukimų per minutę. 6. Surinkimo mėgintuvėlį keičiame į naują.. Ant kolonėlės filtro įpilame 500 μl plovimo buferio AW2 ir centrifuguojame kambario temperatūroje 3 min. esant 14000 apsisukimų per minutę, kad išdžiovinti membraną.

27 7. Surinkimo mėgintuvėlį keičiame į naują, atitinkamai pažymėtą, 1,5 ml mėgintuvėlį. Ant kolonėlės filtro pilame 200 μl AE buferio. Inkubuojame 1 min. kambario temperatūroje. Centrifuguojama 1 min. esant 8000 apsisukimų per minutę (gaunama eluatas 1). 8. Kad gauti maksimalų švarumą rekomenduojama pakartoti eluaciją iš 7 žingsnio (eluatas 2). Išskirtos DNR kiekis nustatomas spektrofotometru (Eppendorrf BioPhotometer). Nukleino rūgščių tirpalai sugeria 260 nm ultravioletinis spindulius. Optinių tankių santykis 260nm/280nm rodo DNR tirpalų švarumą: švarių DNR tirpalų optinių tankių santykis yra 1,8-2,0. Jei santykis mažesnis, tai DNR tirpale yra baltymų arba fenolio priemaišų. Švariame mėginyje sugertis prie 320 nm turi būti artima 0. 2 lentelė. Mūsų tyrime tirtų elnių gautos DNR koncentracijos bei švarumas Bendras DNR DNR Individo 260/2 išskirtos DNR koncentracija, švarumas kodas 30 kiekis, KB cDNR (µg/ml) 260/280 A230 A260 A280 A320 (µg) EL1 1020,2 1,9 2,1 0,97 2,042 1,077 0,014 120,02 EL2 304,11 1,79 1,88 0,324 0,608 0,34 0,024 30,411 EL3 728,85 1,9 2 0,429 0,858 0,518 0,079 102,885 EL4 1424,8 1,8 2 1,427 2,85 1,579 -0,02 142,48 EL5 1276,9 1,8 1,99 1,302 2,554 1,421 0,039 127,69 EL6 236,6 1,8 0,93 0,57 0,0053 0,046 0,025 52,66 EL7 1170,5 1,83 2,05 1,14 2,341 1,28 0,022 117,05 EL8 577,75 1,9 2,05 0,565 1,155 0,607 0,015 57,775 EL9 638,08 1,83 1,85 0,691 1,276 0,699 0,054 63,808 EP1 979,08 1,86 2,03 0,965 1,958 1,051 0,03 97,908 EP2 497,95 1,82 2,16 0,46 0,996 0,548 0,011 49,795 EP3 699,7 1,89 2,04 0,686 1,399 0,742 0,026 69,97 EP4 1383 1,81 1,97 1,4 2,766 1,532 0,059 138,3 EP5 792,89 1,84 2,22 0,715 1,586 0,863 0,012 79,289 EP6 191,48 1,74 2,14 0,179 0,383 0,22 0 19,148 EP7 198,23 1,82 1,77 0,224 0,396 0,218 0,016 19,823 EP8 364,49 1,81 2,13 0,342 0,729 0,403 0,013 36,449 EP9 319,87 1,86 1,95 0,328 0,64 0,363 0,025 31,987 EP10 1277 1,83 2,03 1,259 2,554 1,393 0,044 127,7 EP11 722,8 1,85 1,88 0,77 1,446 0,781 0,044 72,28 EM1 764,33 1,83 1,72 0,89 1,529 0,837 0,072 76,433 EA2 848,31 1,91 1,88 0,501 1,694 0,889 0,044 84,831 EM2 455,84 1,92 1,96 0,464 0,912 0,474 0,017 45,584 DM3 400,18 1,81 1,91 0,42 0,8 0,441 0,035 40,018 DVO1 303,25 1,84 1,68 0,36 0,607 0,329 0,033 30,325

28 Darbo eiga: 1. Įjungiamas BioPhotometeras. Pasiruošiama matuojamą DNR tirpalą: išimami iš šaldytuvo (tirpalas turi būti kambario temperatūros), švelniai pamaišomas, centrifuguojamas 15 sekundžių 10000 apsisukimų per minutę greičiu, 2. Paruošiami 0,5 ml mėgintuvėliai, užrašomi kodai. Į mėgintuvėlį įpilama 90 µl dejonizuoto vandens 3. Į paruoštą 0,5 ml mėgintuvėlį įpilama 10µl DNR tirpalo (praskiedimas 10 kartų). Gerai išmaišoma. Reikalui esant centrifuguojamas 15 sekundžių 10000 apsisukimų per minutę greičiu. Tirpinama 10-15 minučių, Matuojamą koncentracija bei paskaičiuojam DNR koncentraciją ir bendrą kiekį bei nustatom švarumą.

2.2. Mikrosatelitų amplifikacija Tyrime buvo naudojami 7 mikrosatelitų pradmenų poros (lentelė 3), kurių pažangusis (Forward) pradmens 5‘ galas yra fluorescenciškai pažymėtas 6-FAM (phosphoramidites) modifikacija.

3 lentelė. Pasikartojantis motyvas bei PGR sąlygos 7 mirosatelitinių lokusųa (a RT1 ir RT23 sistemos ir ciklai buvo paimti iš Wilson et al.; NVHRT16 - NVHRT73 pradmenų sekos ir sistemos paimti iš Røed and Midthjell, o BM888 Bishop et al.)

Pradmenų Pradmens seka MgCl Žymuoa prisijungimo 2 koncentracija (mM) temperatūra (°C) 5'TGCCTTCTTTCATCCAACAA RT1 54 2.0 5'CATCTTCCCATCCTCTTTAC RT23 5'GGCCATTGGGTAGTCTCC 54 1.5 5'AGCCTCCCTGAGTGCTCT 5'ATTCTAAGCCCAAATAATCTT 1.5 NVHRT16 54 5'TCTAAGGGGTCTGTGTCTT 5'GCAGCGGAGAGGAACAAAAG 1.5 NVHRT21 54 5'GGGGAGGAGCAGGGAAATC 5'CGTGAATCTTAACCAGGTCT NVHRT48 52 2.0 5'GGTCAGCTTCATTTAGAAAC 5'CTTGCCCATTTAGTGTTTTCT 1.5 NVHRT73 54 5'TGCGTGTCATTGAATAGGAG 5’AGGCCATATAGGAGGTGGGCTT 1.5 BM888 55 5’CTCGGTCAGCTCAAAACGAG

29 RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48 bei NVHRT73 mikrosatelitinių žymenų amplifikacijai naudojama buvo 19 μl PGR mišinio, kurį sudarė: 0,3 pmol/µl kiekvieno pradmens; 1 x PGR Buferis; 0,1 mM dNTP; 1,5-2,0 mM MgCl2 (žiūrėti 3 lentelė.); 1U AmpliTaq (bei taip pat 1 U AmpliTaq Gold ) (Applied Biosystems) bei 1 μl matricinės DNR. Pradmens BM888 analizei buvo naudojama 9 μl PGR mišinys, kurį sudarė: 2 pmol/µl kiekvieno pradmens; 1 x PCR Buferio;

0,2 mM dNTP; 1,5 mM MgCl2, and 0,5 U AmpliTaq Gold, bei 1μl matricinė DNR RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48 bei NVHRT73 pradmenų gradientinė amplifikacija su AmpliTaq Gold DNR polimėraze buvo vykdoma šiose sąlygose (Ependorf Mastercycler gradient): 10 min. pradinė denatūracija 95°C temperatūroje, vėliau vykdoma 30 ciklų: 30 s 95°C denatūracijos, 60 s pradmenų prijungimas naudojant gradientinę temperatūrą (51, 54, 57, 60, 63, 66, 69°C), bei 90 s 72°C temperatūroje pradmenų pratęsimas. Pasibaigus paskutiniam DNR sintezės ciklui, mėginiai inkubuojami 10 min. 72°C temperatūroje. BM888 pradmens gradientinė amplifikacija vykdoma sekančiose sąlygose: 5 min. denatūracija 94°C temperatūroje, po to sekantys 30 ciklų: 60 s 95°C denatūravimas, 30 s pradmenų prijungimas naudojant gradientinę temperatūrą, bei 60 s 72°C pradmenų pratęsimas su paskutiniu PGR amplifikacijos žingsniu inkubavimu 10 min. 72°C temperatūroje.

2.2.1. Elektroforezė poliakrilamido gelyje Elektroforezė poliakrilamido gelyje vykdoma vertikalioje padėtyje. Skirtingo dydžio DNR fragmentai elektriniame lauke juda nevienodu greičiu, todėl per tam tikrą laiką jie išsifrakcionuoja gelyje skirtingu atstumu nuo pradinio taško – „šulinėlio“. PAAG bloko paruošimas: PGR mišinio amplifikacijos produktai išskirstyti 6% poliakrilamido gelyje, kurio sudėtis buvo: 7ml 20% AKA 10μl TEMED 80 μl APS Elektroforezės formą atsargiai užpilama ir įstatoma „šukutes“ bei paliekama polimerizuotis (20-40 min.) dienos šviesoje. 20 % AKA tai monomerų tirpalas naudojamas akrilamido linijų polimerų susiuvimui. Nuo jo santykio priklauso gelio elastingumas ir poringumas. TEMED (N,N,N,N'-

30 tetrametiletilendiamidas) naudojamas kaip polimerazinės reakcijos katalizatorius. APS naudojamas kaip polimerizacijos iniciatorius. Darbinis buferis:

Tris- EDTA-H3BO3 buferis, pH 8,3 -8,4 200 ml

H2O dist. iki 2000 ml

Elektroforezės paruošimas: Kamera elektroforezei buvo paruošta sekant nurodymus instrukcijoje. Elektrodiniai indai užpilami atitinkamu elektrodiniu buferiu. Prieš eksperimentą buvo pasiruošiama aštuoni PCR produktai. Imama 5 µl PGR produkto bei 2,5 μl dažo(load dye) (tai vadinamas lyderinis dažas, kurio migracijos greitis yra didesnis nei frakcionuojamų sistemų, todėl pagal jį stebima elektroforezės eiga) ir 7 μl mišinio užnešama individualiai į jam skirtą „kišenę“, o į vieną kišenių užnešama 2,5 μl žymens (Θx174 Hae III digest (72 bp) ladder). Elektroforezė vykdoma 45 min. esant 150 V srovės stiprumui. Rezultatai vizualizuojami naudojant etidžio bromidą. Dažymo principas: Elektroforezės formą išimti iš elektroforezės aparato, atsargiai vienas nuo kito atskiriami stiklai. Gelis pamerkiamas į vonele, kurioje yra 300 ml distiliuoto H2O ir 30μl etidžio bromidas ir laikomas ten 15 min. Vėliau perkeliamas 10 minučių į vonele su distiliuoto H2O. Rezultatai įvertinami UV šviesoje. Dažymo metu DNR ir etidžio bromidas sudaro ultravioletinėje šviesoje fluorescuojantį kompleksą. PGR produktai buvo išskirstyti naudojant ABI 3130 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) bei dydžiai nustatyti naudojant ROX-500 standartą. Mišinio tinkamo ABI 3130 XL genetiniai analizei paruošimas: 1. Paruošiamas miksas, kuris susideda iš: 10,5 μl dejonizuoto formamido bei 0,5 ROX- 500 (vienam pavyzdžiui analizuoti) 2. Po 11 μl mikso užnešama į analizine plokštele, įpilama po 1 μl analizuojamo PGR mišinio. Uždedama apsauginė guma. Centrifuguojama 3. Dedama į termociklerį 5 min. 95 °C temperatūroje. 4. Iš termociklerio pavyzdžiai iš karto sudedami 1 min. į ledo vonią. Centrifuguojama. Plokštele dedama į genetinį analizatorių. Alelių dydžių gauti naudojant GeneMapper v.3.5. (Applied Biosystems) programą.

31 5 pav. ROX – 500 dydžio standartas yra skirtas DNR fragmentų dydžių nustatymui 35 -500 bp ribose (fragmentai išryškėja bazėse: 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500). Raudoni pikai rodo ROX – 500 dydžio standartą.

6 pav. Taurojo elnio NVHRT16 lokuso elekroforeograma gauta naudojant GeneMapper v 3.5 programą (mėlynas pikas rodo lokuso sritį, raudoni pikai ROX – 500 dydžio standartas).

Statistinė analizė buvo atlikta panaudojus GenePop v 3.3 bei PopGene32 kompiuterines programas. Buvo įvertinta skirtingų rajonų tauriojo elnio populiacijų alelių dažnumai bei genetinis kintamumas.

32 3. Rezultatai ir jų aptarimas

Naudotų mikrosatelitinių pradmenų amplifikacijos optimizavimas. Mikrosatelitų genetinėje analizėje yra taikoma DNR amplifikacija naudojant oligonukleotidinius pradmenis komplementarius šoniniams regionams duotų mikrosatelitinių lokusų bei PGR produktų dydžių išfrakcionavimas poliakrilamidiniame gelyje. PGR metodas yra jautrus daugeliui parametrų, įskaitant: magnio chlorido koncentraciją, šabloninę DNR, pradmenų koncentraciją, bei anilinimo temperatūrą pradmenų prisijungimo etape. Norint išvengti nespecifinės pradmenų amplifikacijos, PGR sąlygos turi būti optimizuotos. Mikrosatelitinių pradmenų amplifikacijos optimizavimas buvo atliktas parenkant tinkama pradmenų prisijungimo temperatūrą amplifikacijos metu bei atitinkama magnio chlorido koncentraciją.

M 51 57 54 60 63 66 69 °C

7 pav. NVHRT21 pradmens PGR gradientinės amplifikacijos elektroforezinis spektras. M – žymuo (72 bp), 51-69 skirtingos pradmenų prijungimo temperatūros naudojamos amplifikatoriuje.

M 69 66 63 54 57 60 1°C

8 pav. NVHRT16 pradmens PGR gradientinės amplifikacijos elektroforezinis spektras. M – žymuo (72 bp), 54-69 skirtingos pradmenų prijungimo temperatūros naudojamos amplifikatoriuje

33 69 66 60 57 54 51 50 M °C

9 pav. RT1 pradmens PGR gradientinės amplifikacijos elektroforezinis spektras. M – žymuo (72 bp), 51-69 skirtingos pradmenų prijungimo temperatūros naudojamos amplifikatoriuje.

Tyrime buvo naudojamos dviejų rūšių Taq polimerazės: AmpliTaq bei AmpliTaq Gold (kuri yra AmpliTaq DNR polimerazės modifikacija). Atlikus bandymus amplifikatoriuje bei vizualizavus produktus PAGE gelyje buvo pasirinkta AmpliTaq Gold DNR polimerazė, kadangi ši polimerazė sumažina nespecifinių produktų susidarymo riziką (joje esantis fermentas aktyvuoja polimerazės veikimą tik esant „hot start“ PGR (10 min. inkubacija 95°C temperatūroje)). RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT73 bei BM888 pradmenų grandininė amplifikacija buvo vykdoma Medžiagos ir metodika nurodytose sąlygose ir nustatyta, kad pradmenims RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21 bei NVHRT73 buvo optimaliausia 54°C temperatūra, pradmeniui NVHRT48 geriausia frakcijos išryškėjo esant 52°C temperatūrai, o pradmeniui BMM888 tinkamiausia temperatūra buvo 55°C (žiūrėti 3 lentelė). Tyrimo metu nustatyta, kad galvijams bei šiaurės elniams sukurti mikrosatelitiniai pradmenys pasižymi tarprūšiniu specifiškumu ir kažkurie gali būti naudojami Lietuvoje aptinkamų tauriųjų elnių genetinės įvairovės tyrimuose.

Lokusų charakteristika Ištyrus 7 mikrosatelitinius lokusus nustatyta, kad lokusai BM888, NVHRT48 bei NVHRT21 nepilnai tinka Lietuvos taurųjų elnių populiacinei analizei, kadangi po amplifikacijos ne pas visus tirtus Panevėžio rajono populiacijos individus buvo matoma pradmenų amplifikacija. Tyrimo metu buvo ištirta 26 tauriojo elnio individai iš keturių skirtingų Lietuvos rajonų iš aštuonių skirtingų miškų ir 2 danieliai. Danieliai buvo tiriami palyginimui ir į tolimesne analizę yra neįtraukiami.

34 10 pav. RT1 pradmens PGR gradientinės amplifikacijos elektroforezinis spektras. M – žymuo (72 bp), em1, em2, ep11- taurieji elniai, dvo1- danielius (Cervus dama) . Kaip matome iš paveikslėlio 10 taurieji elniai, lyginant su danieliais pasižymi didesniu alelių skaičiumi. Pas danielių rastas tik vienas alelis, o pas tauruosius elnius aptikti keli. Mūsų gauti rezultatai yra panašūs su gautais rezultatais gautais Poetsch ir bendradarbių (su tais pačiais pradmenimis). 4 lentelė. Taurųjų elnių populiacijos alelių dydžiai Alelių dydžiai (bp) Alelių Alelių dydžiai (bp) Alelių straipsniai Lokusas mūsų tyrime skaičius iš straipsnių skaičius NVHRT73 175-234 7 219-231 7 Poetsch ir kiti, 2001 NVHRT21 160-175* 5* 151-175 4 Haanes ir kiti, 2005 NVHRT48 94-110* 8* 94-110 8 Poetsch ir kiti, 2001 NVHRT16 157-163 4 152-154 4 Poetsch ir kiti, 2001 RT23 134-138 3 136-140 2 Poetsch ir kiti, 2001 RT1 208-224 5 213-223 5 Poetsch ir kiti, 2001 BM888 - - 202-233 9 Haanes ir kiti,2005 *po amplifikacijos ne pas visus tirtus individus buvo matoma pradmenų amplifikacija Kartais analizes metu gali pasitaikyti genotipavimo nesklandumai, kurie gali sukelti nuokrypį nuo Hardy – Weinbergo pusiausvyros (heterozigotų deficitą). Genotipavimo klaidos gali būti dėl: mažos DNR koncentracijos aleliai nesiamplifikuoja (angl. allelic dropout) ir frakcijos yra nematomos; amplifikacijos metu pirmenybė suteikiama mažiems aleliams, o dideli nesiamplifikuoja (angl. large allele dropout arba short allele dominace); pradmenų atitrūkimas (vėlavimas) PGR amplifikacijos metu gali produkuoti „mikčiojančius“ produktus, kurie skiriasi nuo originalios grandinės kartotinais (daugybiniais) segmentų pasikartojimais. Tokie „mikčiojimai“ yra dažni dinukleotidinuose lokusuose ir sukelia sunkumus atskiriant heterozigotas nuo homozigotų, taip pat esant „nuliniams aleliams“ yra matomas netikras homozigotinis individas (Van Osterhout ir kiti,

35 2004). Kad įsitikinti genotipavimo teisingumu buvo naudota MicroChecker programa, kuri neparodė nuokrypių nuo Hardy – Weinbergo pusiausvyros.

Lietuvos taurųjų elnių genetinė įvairovė Dar XIX amžiuje Darvinas teigė, kad kovos už būvį priežastis yra individų ir populiacijų heterogeniškumas. Nors populiacijos ekologiškai, genetiškai, ir morfologiškai yra vieningos, tačiau atskiri individai savo genotipu ir fenotipu visos populiacijos genofondo ribose varijuoja. Vienos rūšies populiacijos tarpusavyje skiriasi statistiškai, pagal įvairių požymių dažnių kompleksą (genų dažniais ir atitinkamai vieno ar kito fenotipo aptinkamumo dažniais). Paskaičiavus duomenis „GenePop v 3.3“ bei „PopGene32“ programomis įvertinta skirtingų rajonų bei miškų tauriojo elnio populiacijų alelių dažnumai. Nagrinėjant gautus duomenis (5 lentelė) matome, kad Ignalinos rajono taurųjų elnių alelių dažnumas varijuoja nuo 0,05 iki 0,5 (5 lentelė). Aukštu dažniu pasižymi RT23 lokuso alelis esantis 136 bp srityje bei NVHRT21 lokuso alelis 172 bp srityje, kurie atitinkamai lygūs 0,5. Mažiausiu dažnumu (0,05) pasižymi RT1 lokuso 210 bei 220 bp srityje aleliai, RT23 lokuso alelis randamas 134 bp srityje, NVHRT16 lokuso alelis 157 bp srityje, NVHRT73 lokuso aleliai 184 bei 194 bp srityje, taip pat NVHRT48 lokuso aleliai 94 bei 104 bp srityje. Retų alelinių genų (kurių dažnis yra mažesnis už 0,05) neaptikta. Kaip matome iš lentelės tirtai Ignalinos elnių imčiai nebūdingas yra NVHRT21 lokuso alelis 160 bp srityje. Stebint individus pagal Ignalinos rajono atskirus miškus matome, kad Ažvinčių ir Minčios miškų subpopuliacijoje alelių dažnumas varijuoja nuo 0,1 iki 0,6. Ažvinčių miško subpopuliacijoje aukščiausiu dažnumu pasižymi RT23 lokuso alelis 136 bp srityje, o Minčios miško subpopuliacijoje aukščiausias dažnis aptiktas NVHRT16 lokuso alelyje 161 bp srityje. Šių alelių dažnis yra 0,6. Ažvinčių miško subpopuliacijoje mažiausio dažnumo aleliai yra: RT1 lokuso 220 bp, NVHRT16 lokuso 157 bei 159 bp srityje (159 bp srityje mažiausias dažnumas pastebėtas ir Minčios miško subpopuliacijoje), NVHRT73 lokuso 175 bei 185 bp ir NVHRT48 lokuso 102, 104 bei 108 bp srityje (108 bp srityje mažiausias dažnumas pastebėtas ir Minčios miško subpopuliacijoje). Minčios subpopuliacijoje mažiausi alelinių genų dažnumai pastebėti RT1 lokuso 208 ir 210 bp srityse, NVHRT 73 lokuso 164, 224 bei 234 bp srityse, bei taip pat NVHRT48 lokuso alelyje esančiam 94 bp srityje. 5 lentelė. Skirtingų rajonų ir miškų tauriųjų elnių populiacijų alelių dažnumai (*po amplifikacijos ne pas visus populiacijos individus buvo matoma pradmenų amplifikacija

36 Ukmergės Jurbarko Ignalinos raj. (N=10) Panevėžio raj. (N=12) raj. raj. Bendras visų tirtų Lietuvos elnių Ažvinčių Minčios Kalnelio Birželių alelių dažnis miškas miškas miškas Prievačkos miškas Sipailiškės Taujėnų Mantvilių (N=24) Lokusas Alelis (N=5) (N=5) (N=5) miškas (N=5) (N=1) miškas (N=1) miškas (N=1) miškas (N=1) RT1 208 0,250 0,400 0,100 0,292 0,400 0,000 1,000 0,500 0,000 0,000 0,250 210 0,050 0,000 0,100 0,250 0,200 0,300 0,000 0,500 1,000 0,000 0,188 218 0,300 0,200 0,400 0,292 0,200 0,500 0,000 0,000 0,000 0,000 0,271 220 0,050 0,100 0,000 0,125 0,100 0,200 0,000 0,000 0,000 0,500 0,104 224 0,350 0,300 0,400 0,042 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000 0,500 0,188 RT23 134 0,050 0,000 0,100 0,333 0,300 0,400 0,500 0,000 1,000 0,500 0,250 136 0,500 0,600 0,400 0,417 0,600 0,300 0,000 0,500 0,000 0,000 0,417 138 0,450 0,400 0,500 0,250 0,100 0,300 0,500 0,500 0,000 0,500 0,333 NVHRT16 157 0,050 0,100 0,000 0,167 0,000 0,300 0,500 0,000 0,000 0,000 0,104 159 0,100 0,100 0,100 0,250 0,400 0,100 0,000 0,500 0,500 0,000 0,188 161 0,450 0,300 0,600 0,333 0,500 0,200 0,500 0,000 0,000 1,000 0,396 164 0,400 0,500 0,300 0,250 0,100 0,400 0,000 0,500 0,500 0,000 0,313 NVHRT21 160 0,000 0,000 0,000 0,1* 0,25* 0* - 0,000 - 0,000 0,05* 164 0,200 0,167 0,250 0,3* 0,25* 0,5* - 0,000 - 0,500 0,3* 168 0,200 0,167 0,250 0* 0* 0* - 0,000 - 0,500 0,15* 172 0,500 0,500 0,500 0,3* 0,5* 0* - 0,500 - 0,000 0,35* NVHRT73 175 0,150 0,100 0,200 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,500 0,083 185 0,050 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,021 194 0,050 0,000 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,500 0,042 205 0,100 0,200 0,000 0,083 0,200 0,000 0,000 0,000 0,500 0,000 0,104 214 0,450 0,400 0,500 0,417 0,400 0,600 0,000 0,000 0,000 0,000 0,417 224 0,100 0,000 0,100 0,333 0,200 0,300 0,500 1,000 0,500 0,000 0,208 234 0,150 0,200 0,100 0,167 0,200 0,100 0,500 0,000 0,000 0,000 0,125 NVHRT48 94 0,050 0,000 0,100 0* 0* 0* - 0,000 0,000 1,000 0,1* 96 0,200 0,200 0,200 0,1* 0* 0* - 0,500 0,000 0,000 0,133* 100 0,250 0,300 0,200 0,4* 0,75* 0,25* - 0,000 0,500 0,000 0,333* 102 0,150 0,100 0,200 0,2* 0* 0,5* - 0,000 0,000 0,000 0,133* 104 0,050 0,100 0,000 0,1* 0,25* 0* - 0,000 0,500 0,000 0,067* 110 0,100 0,000 0,200 0,1* 0* - 0,000 0,000 0,000 0,1* NVHRT73 lokuso alelių dažnai tirtose rajonų populiacijose

0,600 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 , , , , 0 0 0 0 0 0,500 5 4 7 , 1 0 4 , 0

0,400 3 3 s 3

i , Ignalinos 0 n ž

a Panevėžio

d 0,300

o Jurbarko i l e 7 l Ukmergės 6 0 0 A 1 5 5

0,200 , 1 1 0 , , 0 0 0 0 0 0 3 1 1 8 , , 0 0 0 0 0 , 5 5 0,100 0 0 0 , , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 , , , , , , , , , , , , , 0,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 175 bp 185 bp 194 bp 205 bp 214 bp 224 bp 234 bp Alelis

Panevėžio rajono elnių populiacijoje alelių dažnai svyruoja nuo 0,042 iki 0,417. Vienas retas alelis (0,042 dažnumas) buvo aptiktas RT1 lokuso alelyje esančiam 224 bp srityje. Mažas alelinis dažnumas pastebėtas taip pat NVHRT73 lokuso 205 bp alelyje ir jo dažnis buvo 0,083. Didžiausias alelinis dažnumas pastebėtas NVHRT73 lokuso 214 bp srityje. Stebint individus pagal Panevėžio rajono atskirus miškus matome, kad Kalnelio ir Prievačkos miškų subpopuliacijų mažiausias dažnis yra 0,100, o didžiausias 0,6 atitinkamai RT23 lokuso 136 bp srityje bei NVHRT73 lokuso 214 bp srityje. NVHRT21 bei NVHRT78 lokusuose ne pas visus populiacijos individus buvo matoma pradmenų amplifikacija, todėl į šios populiacijos analize lokusai yra neįtraukiami. Jurbarko ir Ukmergės rajonuose elnių alelių dažnumai svyravo nuo 0,500 iki 1,000. Reikia paminėti, kad iš Jurbarko ir Ukmergės rajonų buvo tiriama tik po viena individą (dėl medžiagos stokos), todėl lyginant su kitais Ignalinos ir Panevėžio rajonais kai kurie aleliai galėjo būti neaptikti atsitiktinai. Populiacijų ir atskirų individų heterogeniškumas lemia skirtingas galimybes prisitaikyti prie kintančių sąlygų bei išgyventi. Būdingiausias genetinės įvairovės matas yra vidutinis heterozigotiškumas ir alelių įvairovė (t.y. alelių skaičius, tenkantis vienam lokusui).

Tirtų taurųjų elnių populiacijos tikėtinas (He) bei stebėtinas (Ho) heterozigotiškumas kiekviename lokuse, vidutinis heterozigotiškumas ir alelių, tenkančių vienam lokusui, skaičius nurodytas 6 lentelėje . 6 lentelė. Lietuvos taurųjų elnių populiacijos stebėtinų bei efektyvių alelių skaičius lokuse, faktinis (Ho) ir teorinis (He) heterozigotiškumas tenkantis vienam lokusui.

Efektyvus Alelių sk. alelių sk. Vidutinis heterozigotiškumas Lokusai lokuse lokuse (H) Faktinis Teorinis RT1 5 4,6 0,54 0,79 RT23 3 2,88 0,54 0,67 NVHRT16 4 3,4 0,71 0,72 NVHRT73 7 3,96 0,71 0,76 Vidutiniškai 4,75 (1,7)* 3,72 (0,74)* 0,63 (0,09)* 0,74 (0,06)* *santykinė paklaida

Stebimas ir efektyvus alelių skaičius tirtuose lokusuose

8 7 7

6 5 s 4,75

u 5 4,6 i č i 4 a 3,96

k 4 3,72 s

3,4 ų

i 3 l 2,88 e

l 3 A 2

1

0 RT1 RT23 NVHRT16 NVHRT73 Vidutiniškai Lokusai

Stebimas alelių skaičius lokuse Evektyvus alelių skaičius lokuse

11 pav. Lietuvos taurųjų elnių populiacijos stebimas ir efektyvus alelių skaičius lokuse

Didžiausias efektyvus alelių skaičius pastebėtas RT1 lokuse ir siekė 4,6, mažiausias alelių skaičius tirtuose individuose pastebėtas RT23 lokuse ir tesiekė 2,88. Beveik dvigubas skirtumas tarp stebimų ir efektyvių alelių skaičiaus lokuse pastebėtas lokuse NVHRT73 iš 7 alelių tik 3,96 buvo sutinkami su vienodu dažniu. To priežastis gali būti individų homozigotiškumo padidėjimas, kadangi mažas efektyvus alelių skaičius atspindi genetinės įvairovės sumažėjimą, populiacijos vienalytiškumo padidėjimą.

39 Populiacijos hetrozigotiškumas pagal tirtus lokusus

0,9

0,8

0,7 s

a 0,6 m u k

š 0,5

i Ho t o

g He i 0,4 z o r e

t 0,3 e H 0,2

0,1

0 RT1 RT23 NVHRT16 NVHRT73 Vidutiniškai Lokusas

12 pav. Lietuvos taurųjų elnių populiacijos heterozigotiškumas pagal tirtus lokusus

Didžiausias heterozigotiškumas pastebėtas NVHRT73 bei NVHRT16 lokusuose ir siekė 0,71, rasti atitinkamai 7 ir 4 aleliai. Mažiausias heterozigotiškumas pastebėtas lokuse RT1 bei RT23 ir tesiekė 0,54, tuo pačiu lokusas RT23 turėjo mažiausia alelių skaičių (3 aleliai). Žymiausias skirtumas tarp faktinio (0,54) ir teorinio heterozigotiškumo (0,79) stebimas lokuse RT1.

7 lentelė. Skirtingų rajonų tauriojo elnio populiacijų genetinis kintamumas pagal 4 lokusus Tauriojo elnio skirtingų Vidutinis Efektyvus Polimorfinių rajonų alelių sk. alelių sk. lokusų sk. Vidutinis heterozigotiškumas populiacijos lokuse lokuse (P%) (H) Faktinis Teorinis Jurbarko raj. 1,75 (0,5)* 1,75 (0,5)* 3 (75%) 0,75 (0,5)* 0,75 (0,5)* Ignalinos raj. 4,75(1,7)* 3,13 (0,7)* 4 (100%) 0,6 (0,1)* 0,7 (0,09)* Panevėžio raj. 4 (0,8)* 3,45 (0,5)* 4 (100%) 0,65 (0,1)* 0,74 (0,05)* Ukmergės raj. 1,5 (0,6)* 1,5 (0,6)* 2 (50 %) 0,5 (0,6)* 0,5 (0,6)* *santykinė paklaida

Lyginant populiacijas tarpusavį pagal 4 lokusus pastebėta, kad Jurbarko rajono populiacija pasižymi didžiausiu faktiniu heterozigotiškumu, kuris siekė 0,75 (tačiau, dėl mažos individų imties pastebima didelė santykinė paklaida). Mažiausias vidutinis faktinis heterozigotiškumas (Ho=0,5) bei efektyvius alelių skaičius (ne=1,5) rastas Ukmergės raj. tauriųjų elnių populiacijoje, tačiau taip pat dėl mažos individų imties matoma didelė santykinė paklaida. Bendras visų populiacijų vidutinis faktinis heterozigotiškumas yra lygus 0,625, o teorinis heterozigotiškumas 0,673.

40 Didžiausias efektyvus alelių skaičius (ne=3,45) pastebėtas Panevėžio rajono elnių populiacijoje. Galima manyti, kad šioje populiacijoje, lyginant su kitomis yra didelė genetinė įvairovė ir populiacija yra nevienalytė. 8 lentelė. Skirtingų miškų tauriojo elnio subpopuliacijų genetinis kintamumas pagal 4 lokusus

Tauriojo elnio Vidutinis Efektyvus Polimorfinių skirtingų rajonų alelių sk. alelių sk. lokusų sk. Vidutinis subpopuliacijos lokuse lokuse (P%) heterozigotiškumas (H) Faktinis Teorinis Mantvilių 1,75 (0,5)* 1,75 (0,5)* 3 (75%) 0,75 (0,5)* 0,75 (0,5)* Ažvinčių 4 (1,6)* 3,05(0,94)* 4 (100%) 0,55 (0,3)* 0,72 (0,1)* Minčios 4 (0,8)* 2,7 (0,38)* 4 (100%) 0,65 (0,1)* 0,69 (0,06)* Kalnelio 3,75 (0,9)* 2,99 (0,8)* 4 (100%) 0,6 (0,2)* 0,7 (0,1)* Prievačkos 3,25 (0,5)* 2,8 (0,5)* 4 (100%) 0,65 (0,1)* 0,7 (0,07)* Birželių 1,75 (0,5)* 1,75 (0,5)* 3 (75%) 0,75 (0,5)* 0,75 (0,5)* Sipailiškių 1,75 (0,5)* 1,75 (0,5)* 3 (75%) 0,75 (0,5)* 0,75 (0,5)* Taujėnų 1,5 (0,6)* 1,5 (0,6)* 2 (50 %) 0,5 (0,6)* 0,5 (0,6)* *santykinė paklaida

Atlikus skirtingų miškų taurųjų elnių subpopuliacijos genetinio kintamumo analizę pagal 4 lokusus, matome, kad didžiausias efektyvus alelių skaičius yra Ažvinčių miško subpopuliacijoje ir siekia 3,05, taip pat didelis ne pastebėtas Kalnelio miško subpopuliacijoje (2,99). Šiose subpopuliacijose, yra didelė genetinė įvairovė ir ji yra nevienalytė. Mažiausias efektyvus alelių skaičius pastebėtas Taujėnų miško elnių subpopuliacijoje, tačiau dėl mažos individų imties sunku daryti išvadas apie viso šio miško subpopuliacijos genetinį kintamumą.

Skirtinų rajonų tauriojo elnio populiacijų vidutinis heterozigotiškumas 0,8 0,7 s

a 0,6 m u

k 0,5 š i

t Ho 0,4 o g

i He

z 0,3 o r e

t 0,2 e

H 0,1

)0 ) . k k . . . j. . . . š š j k k . k a k k ra š k m m r š š š š š ų s m m io m m m m ų li o ž s n i n ių s io ių ių ė tv i o e l o l j l č i v e k e k u n a in č e n č ž iš a a n v in n l a r il g ž a a v i a (T (M I M K e B p . A P ri i j j. S a a P r r s o ė rk rg a e rb m u k J U Elnių populiacijos 13 pav.. Skirtingų Lietuvos taurųjų elnių subpopuliacijų vidutiniai faktiniai ir teoriniai heterozigotiškumai Didelis vidutinis stebimas ir teorinis heterozigotiškumas pastebėtas Mantvilių, Birželių,

41 Sipailiškės miškuose (Ho=0,75 ir Ht=0,75), o mažiausias vidutinis faktinis heterozigotiškumas rastas Taujėnų miško tauriųjų elnių populiacijoje (Ho=0,5). Didžiausias skirtumas tarp faktinio

(Ho=0,55) ir teorinio (Ht=0,72) heterozigotiškumo yra pastebimas Ažvinčių miško subpopuliacijoje.

3.4. Lietuvos taurųjų elnių populiacijų genetinė diferenciacija Tauriųjų elnių populiacijos diferenciacijos įvarčiams pagal visus tiriamus lokusus buvo panaudota genetinio panašumo (angl. identity, I) ir genetinio atstumo (angl. distance, D) skaičiavimai pagal Nei (1978) bei Rogers (1972). Genetinis panašumas (I) įvertinantis struktūrinių genų dalį, kurie identiški populiacijose bei genetinis atstumas (D) įvertinantis vidutinišką alelių pokyčių skaičių kiekviename lokuse, įvykusių šių populiacijų genetinės diferenciacijos metu, atskleidžia taurųjų elnių populiacijų genetinius skirtumus. 9 lentelė. Skirtingų rajonų tauriųjų elnių populiacijų genetinis panašumas ir genetinis atstumas pagal Rogers (1972 )įvertį Populiacija Jurbarko Ignalinos Panevėžio Ukmergės Jurbarko - 0.6270 0.4732 0.2165 Ignalinos 0.4668 - 0.8848 0.3258 Panevėžio 0.7483 0.1224 - 0.6267 Ukmergės 1,5301 1,1215 0.4673 -

10 lentelė. Skirtingų rajonų tauriųjų elnių populiacijų genetinis panašumas ir genetinis atstumas pagal nepaslinktąjį Nei (1978) įvertį Populiacija Jurbarko Ignalinos Panevėžio Ukmergės Jurbarko - 0.5464 0.4123 0.1826 Ignalinos 0.6045 - 0.8398 0.2993 Panevėžio 0.8860 0.1746 - 0.5756 Ukmergės 1,2065 0.8860 0.5523 -

Lyginant skirtingų rajonų tauriųjų elnių populiacijas matome, kad pagal Nei (1978) (I=0,8398 D=0,1746) bei pagal Rogers (1972) (I=0,8848, D=0,1224) įverčius (lentelė 5 ir 6) labiausiai genetiškai panašios yra Ignalinos ir Panevėžio rajonų tauriųjų elnių populiacijos Genetinio atstumo medžio (12 pav.) dėka galime pastebėti vaizdžiai tauriųjų elnių genetinį atstumą. Pagal Nei bei Rogers įverčius sutampa, kad labiausiai nutolusios pagal mūsų tirtus polimorfinius lokusus yra Ukmergės bei Jurbarko rajonų tauriųjų elnių populiacijos (atitinkamai pg. Nei I=0,1826, D=1,2065 pg. Rogers I=0,2165, D=1,5301.

42 Jurbarkas

Ignalina

Panevėžys

Ukmergė

0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 Genetinis atstumas

14 pav. Skirtingų rajonų tauriųjų elnių populiacijų genetinis panašumas pagal nepaslinktąjį Nei (1987) įvertį 11 lentelė. Skirtingų miškų tauriųjų elnių subpopuliacijų genetinis panašumas ir genetinis atstumas pagal Rogers (1972) įvertį

Subpopuliacija Mantvilių Ažvinčių Minčios Kalnelio Prievačkos Birželių Sipailiškių Taujėnų Mantvilių - 0,3981 0,6455 0,4246 0,3379 0,4 0,1 0,1826 Ažvincių 0,9212 - 0,8359 0,7887 0,6868 0,4777 0,5838 0,2907 Minčios 0,4377 0,1792 - 0,7537 0,7517 0,4389 0,4131 0,2828 Kalnelio 0,8566 0,2373 0,2828 - 0,6967 0,5573 0,5838 0,5087 Prievačkos 1,0849 0,3713 0,2854 0,3614 - 0,4159 0,5199 0,5932 Birželių 0,9163 0,7388 0,8234 0,5847 0,8773 - 0,5 0,1826 Sipailiškių 2,3026 0,5382 0,884 0,5382 0,6542 0,6931 - 0,3651 Taujėnų 1,7006 1,2355 1,2629 0,6758 0,5222 1,7006 1,0075 -

12 lentelė. Skirtingų miškų tauriųjų elnių subpopuliacijų genetinis panašumas ir genetinis atstumas pagal DNR nepaslinktąjį Nei (1978) įvertį

Subpopuliacija Mantvilių Ažvinčių Minčios Kalnelio Prievačkos Birželių Sipailiškių Taujėnų Mantvilių - 0,468 0,7556 0,4992 0,396 0,5 0,125 0,2165 Ažvincių 0,7593 - 0,9203 0,8721 0,7602 0,5616 0,6864 0,3242 Minčios 0,2803 0,083 - 0,8298 0,8248 0,5138 0,4836 0,3141 Kalnelio 0,6948 0,1368 0,1866 - 0,7678 0,6552 0,6864 0,5674 Prievačkos 0,9264 0,2741 0,1926 0,2642 - 0,4873 0,6092 0,6595 Birželių 0,6931 0,577 0,6659 0,4229 0,7188 - 0,625 0,2165 Sipailiškių 2,0794 0,3763 0,7265 0,3763 0,4957 0,47 - 0,433 Taujėnų 1,5301 1,263 1,1581 0,5667 0,4163 1,5301 0,837 -

43 Lyginant skirtingų miškų tauriųjų elnių subpopuliacijas matome, kad labiausia genetiškai artimos subpopuliacijos yra Minčios ir Ažvinčių miškų (Nei (I=0,9203, D=0,083), Rogers (I=0,8359, D=0,1792)). Nemažu genetiniu panašumu pasižymi ir Ažvinčių bei Kalnelio miškų subpopuliacijos (Nei I=0,8721, D=0,1368). Evoliucijos teorija numato, kad genetinė divergencija tarp vietinių (lokalių) populiacijų koreliuoja tarpusavį per geografinį atstumą, kaip atsitiktinių procesų (pvz. migracija, dreifas) paseka, taip pat įtakos turi ekologiniai skirtumai, kaip natūraliosios atrankos paseką.

Euklidinis atstumas

Mantvili

Ažvinči

Minčios

Kalnelio

Prievačkos

Birželi

Sipailiškės

Taujėn

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Genetinis atstumas

15 pav. Skirtingų miškų tauriųjų elnių subpopuliacijų genetinis panašumas pagal DNR nepaslinktąjį Nei (1987) įvertį. Pagal Nei bei Rogers įverčius sutampa, kad labiausiai nutolusios pagal mūsų tirtus polimorfinius lokusus yra Mantvilių ir Sipailiškių miškų tauriųjų elnių subpopuliacijos (atitinkamai pg. Nei I=0,125, D=2,0794 pg. Rogers I=0,1, D=2,3026). Tarp Taujėnų ir Mantvilių (pg. Nei I=0,2165, D=1,5301 pg. Rogers I=0,468, D=0,532) bei tarp Birželių ir Taujėnų (pg. Nei I=0,2165, D=1,5301) miškų tauriųjų elnių subpopuliacijų yra toks pats genetinis atstumas. Analizės parodymai sutampa su geografiniu atstumu tarp šių miškų, kadangi Mantvilių miškas yra labiausiai nutolęs nuo likusiu miškų, todėl tauriųjų elnių populiacija pasižymi dideliu genetiniu skirtumu.

3.4.1. Taurųjų elnių DNR mikrosatelitinio ir izofermentinio genetinio kintamumo palyginimas Palyginus ankstesniuose tyrimuose gauta taurųjų elnių vidutinį heterozigotiškumą pagal 24

44 polimorfinius izofermentinius lokusus (žiūrėti 13 lentelė) su mikrosatelitinių lokusų (žiūrėti 8 lentelė) duomenimis pastebėta, kad didžiausiu vidutiniu faktiniu heterozigotiškumu pagal 24 izofermentinius lokusus pasižymi Taujėnų miško populiacija (Ho=0,417) (tačiau, dėl mažos individų imties pastebima didelė santykinė paklaida), o mažiausias vidutinis faktinis heterozigotiškumas rastas Minčios miško tauriųjų elnių populiacijoje (Ho=0,240). Tuo tarpu didžiausias vidutinis teorinis heterozigotiškumas aptiktas Minčios miško tauriųjų elnių populiacijoje (Ht=0,478), o mažiausias Birželių miško populiacijoje (Ht=0,333).

13 lentelė. Skirtingų miškų tauriojo elnio subpopuliacijų genetinis kintamumas pagal 24 lokusu

Tauriojo elnio Vidutinis Vidutinis Polimorfinių Vidutinis heterozigotiškumas skirtingų miškų pavyzdžiu alelių lokusų sk.(P (H) subpopuliacijos sk. lokuse sk.lokuse %) Faktinis Teorinis Ažvinčių giria 5 2,0 (0,1)* 87,5 0,300 (0,059)* 0,393 (0,042)* Minčios miškas 4 2,0 (0,1)* 87,5 0,240(0,063)* 0,478(0,042)* Sipailiškių miškas 1 1,4 (0,1)* 37,5 0,375 (0,101)* 0,375 (0,101)* Kalnelio miškas 5 2,2 (0,2)* 87,5 0,325 (0,061)* 0,450 (0,044)* Prievačkos miškas 5 2,1 (0,1)* 87,5 0,275 (0,069)* 0,416 (0,038)* Birželių miškas 1 1,3 (0,1)* 33,3 0,333 (0,098)* 0,333 (0,098)* Mantvilių miškas 1 1,4 (0,1)* 37,5 0,375 (0,101)* 0,375 (0,101)* Taujėnų miškas 1 1,4 (0,1)* 47,7 0,417 (0,103)* 0,417 (0,103)* *santykinė paklaida Naudojant DNR mikrosatelitinį polimorfizmą buvo gautas didesnis vidutinis heterozigotiškumas lyginat su izofermentais, tai galima paaiškinti tuo, kad mikrosatelitai yra labiau variabilūs (kintantys) bei atskleidžia aukštą alelių kintamumo lygį lyginat su izofermentais. 14 lentelė. Skirtingų miškų tauriųjų elnių populiacijų genetinis panašumas ir genetinis atstumas pagal nepaslinktąjį Nei (1978) įvertį pagal 24 polimorfinius izofermentinius lokusus.

Populiacija Ažvinčių Minčios Sipailiškių Kalnelio Prievačkos Birželių Mantvilių Taujėnų Ažvinčių — 0,057 0,283 0,161 0,124 0,453 0,182 0,456 Minčios 0,945 — 0,291 0,071 0,138 0,347 0,194 0,289 Sipailiškių 0,753 0,748 — 0,266 0,368 0,519 0,368 0,452 Kalnelio 0,851 0,932 0,767 — 0,039 0,25 0,337 0,156 Prievačkos 0,883 0,871 0,692 0,962 — 0,204 0,329 0,287 Birželių 0,635 0,707 0,595 0,779 0,815 — 0,68 0,506 Mantvilių 0,833 0,823 0,692 0,714 0,72 0,506 — 0,606 Taujėnų 0,634 0,749 0,636 0,856 0,751 0,603 0,546 —

Žemiau įstrižainės genetinis panašumas (I) Virš įstrižainės genetinis atstumas (D)

45 Palyginus ankstesniuose tyrimuose gauta taurųjų elnių genetinį panašumą naudojant 24 polimorfinius izofermentinius lokusus (žiūrėti 14 lentelė) su mikrosatelitinių lokusų duomenimis (žiūrėti 13 lentelė) sutampa, kad labiausiai genetiškai panašios yra Ažvinčių ir Minčios miškų subpopuliacijos, esančios Ignalinos rajone. Stebint genetinį panašumą gauta naudojant izofermentų polimorfizmą matome, kad Kalnelio ir Prievačkos miškų subpopuliacijos atsiduria vienam klasteryje, o rezultatai gauti naudojant DNR mikrosatelitinį polimorfizmą šias dvi subpopuliacijas priskiria į artimus, tačiau atskirus klasterius.

Euklidinis nuotolis

Azvinciu

Mincios

Kalnelio

Prievackos

Mantviliu

Sipailiskiu

Taujenu

Birzeliu

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Genetinis atstumas

16 pav. Skirtingų miškų tauriųjų elnių populiacijų genetinis panašumas pagal nepaslinktąjį Nei (1987) įvertį pagal 24 polimorfinius izofermentinius lokusus

3.5. Lietuvos taurųjų elnių populiacijų palygimas su kitomis Europos populiacijomis Palyginus mūsų tyrimo metu gautus taurųjų elnių faktinius ir teorinius heterozigotiškumus su kitomis europinėmis taurųjų elnių populiacijomis galime pastebėti, kad Lietuvoje gyvenančių taurųjų elnių teorinis ir faktinis heterozigotiškumas telpa į kitų šalių taurųjų elnių populiacijų heterozigotiškumo intervalus. Lietuvoje gyvenančių taurųjų elnių heterozigotiškumas yra panašus į Šiaurės Vokietijos populiacijos gautus rezultatus. Mažiausiu faktiniu bei teoriniu heterozigotiškumais pasižymi Mesolos saloje gyvenanti populiacija lyginat su kitomis populiacijomis (priedas 2, 4 lentelė).

46 Lietuvos taurųjų elnių heterozigotiškumų palyginimas su kitomis europinėmis taurųjų elnių populiacijomis

Ho He 1 6 s

0.9 7 . a 0 0.8 3 m 6 . u 3 5 1 2 5 4 0.7 0 5 4 9 8 5 k 5 7 5 8 6 7 . 7 5 7 . 7 . 4 . 9 . . 4 . . š 7 6 . .

0.6 . 0 6 i . . 7 0 0 0 8 8 0 0 0 . 0 . 0 0 t . 0 5 0 0 6 7 0 0

0.5 . 0 o 8 6 . . 0 g 0 i 0.4 0 z 2

o 0.3 6 . r t 0.2 0 e

H 0.1 0

j. j. j. . a a a a a a a j la ij ij ij ij r r r ra o n r n b . l. . . s i a u r b a v r e rd lg e r n e e M a u m S u g n m u J I a k S B R P U

Populiacijos

17 pav. Lietuvos taurųjų elnių heterozigotiškumo palyginimas su kitomis europinėmis taurųjų elnių populiacijomis (Lietuvos populiacijos: Jurbarko, Ignalinos, Panevėžio bei Ukmergės rajonai; likusiųjų populiacijų tyrimo duomenys pagal Hmwe, 2005 (žiūrėti priedai 4 lentelė))

Tirtų lokusų alelių dažnių palyginimui buvo naudota bendras visų Lietuvos taurųjų elnių populiacijų (24 individai) bei Šiaurės rytų Vokietijos populiacija ((Vorpommern) (Poetsch et al., 2001) 30 tirtų individų (žiūrėti priedas2, 3 lentelė)).

Lie tuvos ir š iaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų lokuso NVHRT16 alelių dažniai

Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Vokietijos populiacija 0,700 0,600 s

i 0,500 n ž

a 0,400 7 6 , d 9 0 3 ų 0,300 , i 3 l 4 0 3 1 e 0 l 8 3

0,200 1 3 , 8 A , 3 0 0 3 , 0 8 0 8 0 0 0 1 , 1 ,

0,100 , 0 , 0 0 0 0,000 0 157 bp 159 bp 161 bp 163 bp 164 bp Alelių dydis 0

18 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų NVHRT16 lokuso alelių dažniai

Kaip matome iš grafiko NVHRT16 lokuse Lietuvos taurųjų elnių populiacijoje aptiktas

47 alelis 164 (dažnis 0,313), kuris buvo nebūdingas Vokietijos taurųjų elnių populiacijai, tačiau Vokietijos populiacijoje aptiktas alelis 163 su dažnumu 0,083. Šis skirtumo priežastimi gali būti genotipavimo klaida, Lietuvos populiacijoje. Vokietijos populiacijoje su labai dideliu dažniu buvo aptiktas lokusas 161, kuris ir Lietuvos populiacijoje buvo dažniausiai pasitaikantis.

Lietuvos ir šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų lokuso RT1 alelių dažniai

Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Voketijos populiacija 0,320 0,300 3 1

0,280 , 7 0,260 0 0 s 2

i 0,240 , 5 7

0,220 0 n 2 8 , 3 1

ž 0,200 8 8 0 8 2

a 0,180 , 8 2 1 1 , , , 0 d

0,160 1

, 0 0 0,140 0 ų 0 4 i 0,120 l 0 1

e 0,100 1 , l 0,080 , 0 0 A 0,060 0,040

0,020 0 0 0 0 0,000 208 bp 210 bp 213 bp 215 bp 218 bp 220 bp 224 bp Alelių dydis

19 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų RT1 lokuso alelių dažniai

Lyginant populiacijas pagal lokusą RT1, matome, kad Lietuvos populiacijai su gan dideliu dažniu yra būdingi aleliai 208 (0,25 dažnumu) ir 210 (0,188), kurie neaptikti Vokietijos populiacijoje. Lietuvos populiacijai pagal RT1 lokusą yra nebūdingi aleliai 213 ir 215, Vokietijos populiacijoje aptikti su 0,2 ir 0,1 dažniu atitinkamai. Panašus alelių dažnis pastebėtas 224 lokuse.

Lietuvos ir šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų lokuso RT23 alelių dažniai Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Vokietijos populiacija 0,80 0,75 0,70

0,65 7 0,60 1 s 8 i 0,55 , n 0

ž 0,50

a 0,45 d

0,40 ų

i 0,35 l 0,30 7 e 1 l 3

0,25 4 , 3 0 A 3 3 0

0,20 5 , 8 2 0

0,15 , 1 , 0,10 0 0

0,05 0 0,00 134 bp 136 bp 138 bp Alelių dydis

20 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų RT23 lokuso alelių dažniai

48 Iš 16 pav. matyti, kad Lietuvos populiacijai pagal lokusą RT23 būdingi 3 alelai, o Vokietijos populiacijoje aptikti tik 2 aleliai 136 ir 138. Alelis 134 yra nebūdingas tirtai Vokietijos populiacijai. Abiejose tirtose populiacijose dažniausias alelis buvo 136.

Lietuvos ir šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų lokuso NVHRT73 alelių dažniai

Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Vokietijos populiacija

0,450

0,400 7 1 4 0,350 , 0 8

s 0,300 0 i 3 3 n 2 8 8 ž 2 ,

0,250 , a 1 1 0 , , 5 5 d 0 7

4 0 0 1 2 ų 1 i 0,200 , l 3 0 1 1 e 0 , 7 l 8 , 1 1 , 0 6 A 2 ,

0,150 0 0 , 1 0 0 4 0 , 0 2 0 0 0 0 0

0,100 0 , 0 0 0 0 0 , 0 0 0 0 0

0,050 0 , , , , 0 0 0 0 0 0 0 0 0,000 175bp 185 bp 194 bp 205 bp 214 bp 220 bp 224 bp 230 bp 234 bp 240 bp 242 bp

Alelių dydžiai

21 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų NVHRT73 lokuso alelių dažniai

Palyginus tirtas Vokietijos ir Lietuvos populiaciją matome, kad Lietuvos populiacijoje lokuse NVHRT73 yra nebūdingi 230, 240 bei 242 lokusai, tuo tarpu Vokietijos populiacijoje nerasti aleliai: 175, 185, 194, 205. Alelis 214 abiejose populiacijose buvo dažniausias. Lyginant populiacijas pagal lokuso NVHRT48 alelių dažnumus (22 pav.) matome, kad visi aleliai aptikti abiejose populiacijose. Vokietijos populiacijoje pats dažniausias alelis buvo 104 (0,35), o Lietuvos populiacijoje alelis 100 (0,333). Tačiau Lietuvos populiacijoje ne pas visus individus vyko NVHRT48 lokuso amplifikacija.

Lietuvos ir šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiaciju lokuso NVHRT48 alelių dažniai Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Vokietijos populiacija 0,400 0,350 0,300 i a 3 3

n 0,250 8 3 ž 1 3 , a , 0 d 0,200 0

ų i l 3 3 3

e 0,150 1 7 8 7 7 8 l 3 , 5 3 6 0 6 6 0 1 A 0 , , , 3 5 3 0 5 0 0 5 , 0 0 , 0 , , 0

0,100 0 0 1 0 0 0 0 0 , , 0 , 0 0 , 1 1 0 0 0 0 , ,

0,050 0 0 0,000 94 bp 96 bp 98 bp 100 bp 102 bp 104 bp 108 bp 110 bp Alelių dydžiai

49 22 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų NVHRT48 lokuso alelių dažniai

Lokuse NVHRT21 170 alelis (23 pav.) buvo būdingas tik Vokietijos populiacijai, Lietuvos populiacijoje jis neaptiktas, tačiau šio lokuso amplifikacija ne pas visus 24 Lietuvos elnių populiacijos individus vyko, todėl šis alelis gali būti neaptiktas atsitiktinai.

Lietuvos ir šiaurė s rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų lokuso NVHRT21 alelių dažniai

Lietuvos populiacija Šiaurės rytų Vokietijos populiacija 0,400 0,350 0,300 s i

n 0,250 ž a d 0,200 0

5 ų i 2 3 l , ,

e 0,150 6 0 l 0 0 7 0 6 A 0 7 6 0 5 0 , 6 3

0,100 2 0 , 5 0 , , 0 3 5 0 1 , 0 0 , 0 1 0 0 1 , 0 0,050 , 0 0 , 0 0,000 0 0 160 bp 164 bp 168 bp 170 bp 172 bp 175 bp Alelių dydis

23 pav. Lietuvos ir Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių populiacijų NVHRT21 lokuso alelių dažniai

Hannes ir bendradarbiai (nepublikuotas darbas) atliko 5 Europos taurųjų elnių populiacijų analizę panaudojant 14 dinukleotidinių polimorfinių lokusų (CSSM03, OarCP26, RT5, SRCRSP10, NVHRT73, NVHRT48, McM58, OarFCB193, OarFCB304, BM5004, BM888, BMC1009, BM4208, BM4107) bei mitochondrinės D-kilpos 463 bp regioną. Penkių tirtų populiacijų tarpe buvo ir Lietuvos taurųjų elnių populiacija (pavyzdžiai surinkti iš dviejų Lietuvos regionų), kitos tirtos populiacijos tai: Norvegijos, Švedijos, Škotijos bei Vengrijos taurieji elniai. 15 lentelė. Europinio taurojo elnio populiacijų genetinis kintamumas ir individų skaičius (n)

14 mikrosatelitinių lokusų; stebimų (AObs) ir privačių (APr) alelių skaičius, alelinis gausumas (AR) ir objektyvi genų įvairovė (H).

50 Mikrosatelitinai lokusai Populiacija n AObs Apr AR (SE) H(SE) Vengrijos 20 121 22 7.0 (.6) 0.81 (.02) Lietuvos 20 99 13 6.0 (.5) 0.76 (.03) Švedijos 19 67 4 4.1 (.3) 0.60 (.03) Norvegijos 20 63 3 4.1 (.3) 0.64 (.05) Škotijos 20 120 28 6.9 (.5) 0.80 (.03) Kaip matome iš lentelės Lietuvos populiacijoje ištyrus 14 mikrosatelitinių lokusų buvo rasti 99 aleliai iš kurių 13 buvo privatūs. Alelinis gausumas buvo 6, o nustatyta objektyvi genų įvairovė siekė 0,76. Lyginant su Škotijos bei Vengrijos populiacijomis Lietuvos populiacijoje buvo rasta atitinkamai 2,2 ir 1,6 karto mažiau privačių alelių, tačiau 4 kartus daugiau nei Norvegijos populiacijoje. Tai rodo, kad Norvegijos populiacija alelius galėjo prarasti vykstant butelio kaklelio efektui.

16 lentelė. Europinio taurojo elnio populiacijų diferenciacija (Fst) pagal 14 mikrosatelitinių lokusų (įstrižainės viršuje) bei mtDNR kontrolės regioną (įstrižainės apačioje). Patikimumas p<0,001, išimtis* (p=0.04).

Vengrijos Lietuvos Švedijos Norvegijos Škotijos Vengrijos 0.09 0.20 0.18 0.09 Lietuvos 0.79 0.21 0.18 0.08 Švedijos 0.87 0.54 0.28 0.17 Norvegijos 0.83 0.51 0.64 0.18 Škotijos 0.78 0.39 0.42 0.09* Iš kaimyninių šakų genetinio atstumo medžio (24 pav.) bei populiacijų diferenciacijos lentelės (14 lentelė) matome, kad Lietuvos taurųjų elnių populiacija yra vienoje šakoje su Vengrijos bei Škotijos taurųjų elnių populiacijomis. Lietuvos taurųjų elnių populiacija yra labiausiai nutolusi nuo Švedijos taurųjų elnių populiacijos. Šia tendencija taip pat patvirtina faktorinė analizė (FCA) (25 pav.) iš kurios matyti, kad Švedijos ir Norvegijos populiacijos yra labiausiai nutolusios, o Škotijos populiacija yra artimiausia iš visų tirtų populiacijų.

51 24 pav. Kaimyninių šakų genetinio atstumo medis tarp europinių taurųjų elnių populiacijų remiantis mikrosatelitų duomenimis.

25 pav.Vengrijos (Hu), Lietuvos (Li), Švedijos (Sw), Norvegijos (No) ir Škotijos (Sc) taurųjų elnių mikrosatelitinių lokusų faktorinė analizė (angl. Factorial Corespondance Analysis (FCA)).

52 Išvados

1. Ištyrus 7 mikrosatelitinius lokusus (RT1, RT23, NVHRT16, NVHRT21, NVHRT48, NVHRT73, BM888) nustatyta, kad lokusai BM888, NVHRT48 bei NVHRT21 nepilnai tinka Lietuvos taurųjų elnių populiacinei analizei, kadangi po amplifikacijos ne pas visus tirtus Panevėžio rajono populiacijos individus buvo matoma pradmenų amplifikacija. Panevėžio rajone aptiktas vienas retas alelis (0,042 dažnumas) RT1 lokuso alelyje esančiam 224 bp srityje 2. Lyginant populiacijas tarpusavį pagal 4 lokusus pastebėta, kad Jurbarko rajono populiacija pasižymi didžiausiu faktiniu heterozigotiškumu, kuris siekė 0,75. Mažiausias vidutinis faktinis heterozigotiškumas (Ho=0,5) bei efektyvius alelių skaičius (ne=1,5) rastas Ukmergės raj. tauriųjų elnių populiacijoje. Didžiausias efektyvus alelių skaičius (ne=3,45) pastebėtas Panevėžio rajono elnių populiacijoje. Galima manyti, kad šioje populiacijoje, lyginant su kitomis yra didelė genetinė įvairovė ir populiacija yra nevienalytė. 3. Tiek pagal DNR tiek pagal izofermentine analizę labiausia genetiškai artimos populiacijos yra Minčios ir Ažvinčių, labiausiai nutolusios pagal mūsų tirtus polimorfinius lokusus yra Mantvilių ir Sipailiškių miškų tauriųjų elnių populiacijos. 4. Pastebėta, kad Lietuvoje gyvenančių taurųjų elnių teorinis ir faktinis heterozigotiškumas artimas į kitų šalių taurųjų elnių populiacijų heterozigotiškumus. Lietuvos taurųjų elnių populiacija yra vienoje šakoje su Vengrijos bei Škotijos taurųjų elnių populiacijomis, tačiau nutolusi nuo Švedijos taurųjų elnių populiacijos.

53 Magistrinio darbo tema publikuoti I. Jakubanis darbai

1. Jakubanis I., Paulauskas A., 2007: Allozyme variability investigation of red deer (Cervus elaphus) in Lithuania. International young scientist conference, The Vital Nature Sing, Kaunas, p. 20-23

2. Jakubanis I., Paulauskas A., variability of Red Deer (Cervus elaphus) in Lithuania. // 4th International Conference "Research and conservation of biological diversity in Baltic Region": book of abstracts, Daugavpils, Latvia, 25-27 April, 2007. Daugavpils, 2007. p. 46

54 Literatūros sąrašas

1. Abbott R. J., 1992: Plant invasions, interspecific hybridization and the evolution of new plant taxa. Tree 7:401-405, 2. Balčiauskas L., 2004: Elninių žvėrių populiacijų būklės ir dinamikos monitoringas, Aplinkos Apsaugos Agentūra.Vilnius 3. Baleišis R., Bluzma P., Balčiauskas L., 2003: Lietuvos kanopiniai žvėrys. Akstis 4. Baleišis R., Bluzma P., Lekavičius A., Merkys A.,1998: Taurieji elniai ir augmenija Žagarės draustinyje. Vilnius 5. Banewll D., Bruce A., 2003: Summary of the current status of the twenty-three subspecies of the red deer family, Cervus elaphus, embracing the Atlantic, maraloid and wapitoid groups, New Zealand 6. Bishop M. D., Kappes S. M., Keele J. W., Stone R. T., et.al, 1994: A Genetic Linkage Map for Cattle, Genetics, Vol 136, 619-639

7. Bluzma P., Baleišis R., 1999: Kanopinių žvėrių populiacijų būklė ir dinamika Lietuvoje. Vilnius: Ekologijos institutas

8. Burne D. , 2002: Gyvūnai. Vilnius, Alma litera 9. Van Osterhout C., Hutchinson W., F., Wills D., D, Shipley P. (2004): MICRO – CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4, 535–538 10. Feulner P. G., Bielfeldt W., Zachos F. E., Bradvarovic J., Eckert I., Hartl G.B., 2004: Mitochondrial DNA and microsatellite analyses of the genetic status of the presumed subspecies Cervus elaphus montanus (Carpathian red deer), Heredity 93, 299-306 11. Gyllensten U, Ryman N, Reuterwall C, Dratch P (1983). Genetic differentiation in four European subspecies of red deer (Cervus elaphus L.). Heredity 51: 561–580. 12. Haanes H., Rosef O., Veiberg V., Roed K. H., 2005: Microsatellites with variation and heredity applicable to genetic studies of Norwegian red deer (Cervus elaphus atlanticus), Anilam genetics, 36, 435-462 13. Hartl, GB; F. Zachos; K. Nadlinger, 2003: Genetic diversity in European red deer (Cervus elaphus L.): anthropogenic influences on natural populations. CR Biologies 326:S37-S42

55 14. Hmwe S. S., Zachos F. E., Sale J. B., Rose H. R., Hartl G. B., 2006: Genetic variability and differentiation in red deer (Cervus elaphus) from Scotland and England, Journal of Zoology, Vol. 270, No. 3, pp. 479-487 15. Yan-chun Z., Zi-chen Pan , Zhi-ru Xu, Shu-hui Yang , Jin Yu and Bai Su-ying, 2001: Status of microsatellites as genetic markers in cervids, Journal of Forestry Research, Volume 12, Number 1, (Abstract) 16. Jakubanis I. Paulauskas A., 2007: Allozyme variability investigation of red deer (Cervus elaphus) in Lithuania. The vital nature sing, International young scientist conference proceedings, 20-24 17. Lietuvos fauna. , 1988: Žinduoliai. Vilnius 18. Lietuvos Respublikos aplinkos ministerija, Žvėrių ir paukščių, sumedžiotų per 2005-2006 m. Medžioklės sezoną, apskaita. 19. Linnell J.C., Cross T.F., 1991: The biochemical systematics of red and sika deer (genus Cervus) in Ireland., Department of Zoology, University College, Cork, Ireland, Hereditas.;115(3):267-73 20. Liu, Z.J., Cordes J.F., 2004: DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture 238: 1 –37 21. Ludt, Christian J., Schroeder W., Rottmann O., Kuehn R., 2004: Mitochondrial DNA phylogeography of red deer (Cervus elaphus). Molecular Phylogenetics and Evolution 31 1064–1083. Elsevier 22. Mahmut, H.; R. Masuda; M. Onuma; M. Takahashi; J. Nagata; M. Suzuki and N. Ohtaishi (2002): Molecular Phylogeography of the Red deer (Cervus elaphus) Populations in Xinjiang of China: Comparison with other Asian, European, and North American Populations. Zol. Sci. 19:485-495. 23. Maudet C., Miller C., Bassano V., 2002, Microsatellite DNA and recent statistical methods in wildlife conservation management: applications in Alpine ibex [Capra ibex (ibex)],Molecular Ecology (2002), 11, 421-436 24. Moore SS, Sargeant LL, King TJ, Mattick JS, Georges M, Hetzel DJ., (1991), The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species, Genomics;10(3):654-60. 25. Nevo E., Beiles A., Ben-Shlomi R., 1984: The evoliutionary signitificance of genetic diversity: ecological, demografphic, and life history corelates

56 26. Niemczewski C., Rutkowski J., Żurkowski M., 2002: Preliminary investigation on the polymorphism of microsatellite markers in Mazurian red deer (Cervus elaphus), Animal Science Papers and Reports, vol 20, no 3. 169-174 27. Perez T., Albornoz J., Nores C., Dominguez A., 1998: Evaliution of genetic variability in introduced popoliations of red deer (Cervus elaphus) using DNA fingerprinting, Heriditas 129: 85-89 28. Pitra, C.; J. Fickel; E. Meijaard and PC. Groves (2004): Evolution and phylogeny of old world deer. Mol. Phy. Evo.33: 880-895. 29. Poetsch M. , Seefeldt S., Maschke M., Lignitz E., 2001, Analysis of microsatellite polymorphism in red deer, roe deer, and fallow deer - possible employment in forensic applications, Forensic Science International 116, 1-8 30. Polziehn R. O., Strobeck C., 2002: Phylogeny of wapiti, red deer, sika deer, and other North American cervids as determined from mitochondrial DNA., Department of Biological Sciences, University of Alberta, Edmonton, Alberta, T6G 2E9, Canada , PMID: 9878235 31. Rahman M., H., Jaquish B., Khasa P., D., 2000, Optimization of PCR Protocol in Microsatellite Analysis with Silver and SYBR® Stains. Plant Molecular Biology Reporter 18: 339–348. 32. Randi, E., Mucci, N., Claro-Herguetta, F., Bonnet, A., Douzery, E.J.P., 2001. A mitochondrial DNA control region phylogeny of the Cervinae: speciation in Cervus and its implications for conservation. Anim. Conserv. 4, 1–11. 33. Ratkiewicz M., 2006: Wpływ barier genetycznych i środowiskowych oraz czynników historycznych na przeplyw genów i strukturę populiacji u zwierząt., Kosmos problemy nauk biologicznych, nr 2-3, psl 165-176, Białystok 34. Røed KH and Midthjell L. (1998) Microsatellites in reindeer, Rangifer tarandus, and their use in other cervids. Mol Ecol 7:1771–88. 35. Scandura M., 2004: The use of microsatellites in the study of social structure in large mammals: Italian wolf and fallow deer as case studies., University of Bielefeld, Faculty of Biology 36. Shariflou1 M. R., Moran Ch., 2000, Conservation Within Artiodactyls of an AATA Interrupt in the IGF-I Microsatellite for 19–35 Million Years, Mol. Biol. Evol. 17(4):665– 669.

57 37. Simon J., Goodman, Nick H., 1999: Introgression Through Rare Hybridization: A Genetic Study of a Hybrid Zone Between Red and Sika Deer (Genus Cervus) in Argyll, Scotland , Genetics, Vol. 152, 355-371 38. Slate J.; Coltman D.W.; Goodman S.J.; MacLean I.; Pemberton J.M.; Williams J.L., (1998) Bovine microsatellite loci are highly conserved in red deer, sika deer and Soay sheep. Animal Genetics 29:307-315 39. Stacia R. Engel, Rebecca A. Linn, Jeremy F. Taylor, Scott K. Davis, (1996), Conservation of Microsatellite Loci across Species of Artiodactyls: Implications for Population Studies, Journal of Mammalogy, Vol. 77, No. 2, 504-518 40. Valstybinė miškotvarkos tarnyba, Kanopinių žvėrių apskaitos ir medžioklės duomenys, 1992-2006 m. medžioklės sezonai 41. Wan, Q-H., Wu, H., Fujihara T. FAng, S-D. (2004): Which genetic marker for which conservation genetics issue?, Elecrophoresis 25:1-12 Nepublikuoti darbais: 1. Haanes H., Røed K.H., Perez-Espona S., Paulauskas A., Rosef O.: Bottlenecks in Scandinavian red deer populations. (nepublikuotas rankraštis) 2. Hmwe S.S., 2005: Populiation genetics and phylogeography of European Red Deer (Cervus elaphus) and Roe Deer (Capreolus caprelus). Dissertation, Zoologisches Institute, Christian Albrechts University in Kiel.

58 Priedai Priedas 1 1 lentelė. Lietuvos skirtingų miškų tauriųjų elnių mėginių aprašymas Pavyzdžio Surinktų Rūšies Rajonas Miško pavadinimas Lytis surinkimo individų Viso pavadinimas data skaičius 1. Ažvincių giria Cervus elaphus neaiški 2004.12.05 5 5 Cervus elaphus neaiški 2003.11.22 3 Ignalinos 5 2. Minčios miškas Cervus elaphus patelė 2005.12.31 2 Cervus dama patelė 2005.12.31 1 1 3.Kalnelio miškas Cervus elaphus patelė 2005.12.13 5 5 Cervus elaphus patelė 2005.12.11 2 4.Prievačkos miškas 5 Panevėžio Cervus elaphus patinas 2005.12.11 3 5. Birželių miškas Cervus elaphus patelė 2005.12. 1 1 6.Sipailiškių miškas Cervus elaphus patelė 2005.12.03 1 1 Jurbarko 7. Mantvilių miškas Cervus elaphus patelė 2004 1 1 Ukmergės 8. Taujėnų miškas Cervus elaphus patelė 2005.12. 1 1 Vokietija 9.Vokietija Cervus dama patinas 2005 1 1 26

Priedas 2 2 lentelė. Šiuo metu žinomi dvidešimt du tauriojo elnio porūšiai (Geist, 1999) palyginimui su 10 haplotipų linijų rastų tyrime (Ludt,, 2004).

Porūšio Nr pavadinimas Bendrinis pavadinimas Geografinė kilmė Haplotipo pavadinimas Barbary taurusis elnias/šiaurės Afrikos taurusis Cervus elaphus elnias (angl.Barbary Red 1 barbarus Deer) Tunisas Cervus elaphus barbarus Cervus elaphus Korsikos taurusis elnias (angl. 2 corsicanus Sardinian Deer) Sardinija Cervus elaphus barbarus Vidurio Europos taurusis Cervus elaphus elnias (angl. Middle-Europe 3 hippelapus Red Deer) Bulgarija Cervus elaphus hippelapus Cervus elaphus Karpatų taurusis elnias (angl. 4 montanus Eastern Red Deer) Rumunija Cervus elaphus hippelapus Cervus elaphus 5 alashanicus (angl. Alashan Red Deer) Kinija Cervus elaphus xanthopygus Cervus elaphus 6 xanthopygus (angl. Isubra) Rusija Cervus elaphus xanthopygus

59 Rytų Europos taurusis elnias Cervus elaphus arba Kaukazo taurusis 7 maral elnias/maralas (angl. Maral) Iranas Cervus elaphus maral Cervus candensis (angl. Rocky Mountain 8 nelsoni Wapiti) Šiaurės Amerika Cervus candensis Cervus 9 canadensis (angl. American Wapiti) Šiaurės Amerika Cervus candensis Cervus elaphus 10 sibericus (angl. Siberian Wapiti) Kinija, Mongolija Cervus elaphus sibericus Cervus elaphus 11 songaricus (angl. Tein Shan Wapiti) Kinija, Tian Šanis Cervus elaphus sibericus Cervus elaphus Kašmirinis elnias (Kashmir 12 Hanglu Red Deer) Indija ns Cervus elaphus Kinija, Dong Da 13 kansuensis (angl. Kansu Red Deer) Shan Cervus elaphus kansuensis Cervus elaphus 14 macneili (angl. M'Neill's Deer) Kinija, Qinghai Cervus elaphus kansuensis Cervus elaphus 15 wallichi (angl. Shou) Kinija, Tibetas Cervus elaphus kansuensis Cervus elaphus Baktrijaninis elnias (angl. 16 bactrianus Bactrian Red Deer) Tadžikistanas Cervus elaphus elaphus Cervus elaphus 17 yarkandensis (angl. Yarkand Red Deer) Kinija Cervus elaphus elaphus Cervus elaphus Norvegijos taurusis elnias 18 atlanticus (angl. Red Deer) Norvegija Cervus elaphus elaphus Cervus elaphus 19 brauneri (angl. Krim Red Deer) Ukraina Cervus elaphus elaphus Vakarų Europos taurusis elnias arba švediškasis Cervus elaphus taurusis elnias (angl. Red 20 elaphus Deer) Švedija Cervus elaphus elaphus

Cervus elaphus Ispanijos taurusis elnias (angl. 21 hispanicus Spanish Red Deer) Ispanija Cervus elaphus elaphus Cervus elaphus Škotijos taurusis elnias (angl. 22 scoticus Scottish Red Deer) Škotija Cervus elaphus elaphus

60 3 lentelė. Šiaurės rytų Vokietijos tauriųjų elnių alelių dažnis (Poetsch ir kt., 2001)

Lokusas Alelis Dažnis 213 0,200 215 0,100 RT1 217 0,300 219 0,183 223 0,217

RT23 136 0,817 140 0,183 157 0,033 NVHRT16 159 0,183 161 0,700 163 0,083 160 0,267 164 0,066 NVHRT21 168 0,367 172 0,100 175 0,200 94 0,050 96 0,100 98 0,050 NVHRT48 100 0,183 102 0,083 104 0,350 108 0,083 110 0,050 214 0,200 220 0,183 224 0,183 NVHRT73 230 0,150 232 0,100 240 0,067 242 0,117

61 4 lentelė. Tauriųjų elnių iš skirtingų Europos šalių vidutinis teorinis ir faktinis heterozigotiškumas (Hmwe, 2005).

Europos populiacijos Ho He Šiaurės Vokietija 0,63 0,77 Mesola 0,51 0,62 Sardinija 0,48 0,66 Bulgarija 0,76 0,85 Škotija 0,49 0,78 Rumunija 0,5 0,89 Serbija 0,53 0,82

Priedas 3 Tauriojo elnio skirtingų miškų F-statistika Populiacijos susiskirstymo įtaka jos genetinei struktūrai

Pagal rajonų populiacijas Lokusas Fis Fit Fst Nm* RT1 -0.0491 0.3342 0.3653 0.4343 RT23 -0.2369 0.1743 0.3324 0.5021 NVHRT16 -0.2955 0.0939 0.3006 0.5816 NVHRT73 -0.3909 -0.0621 0.2364 0.8077 Vidutinis -0.2487 0.1368 0.3087 0.5598 Pagal miškų subpopuliacijas Lokusas Fis Fit Fst Nm* RT1 -0.129 0.3231 0.4005 0.3742 RT23 -0.3298 0.0602 0.2932 0.6026 NVHRT16 -0.45 -0.0162 0.2992 0.5857 NVHRT73 -0.381 0.0826 0.3357 0.4947 Vidutinis -0.325 0.1185 0.3347 0.4969

Priedas 4 Tauriųjų elnių heterozigotų deficitas pagal populiacijas (multi- lokusinis) Populiacija p S.E. Ignalinos 0.08 0.0011 Panevežio 0.1456 0.0041 Jurbarko - - Ukmergės - -

62 Tauriųjų elnių heterozigotų deficitas pagal lokusus (multi- populiacinis)

Lokusas p S.E. RT1 0.016 0.002 RT23 0.249 0.004 NVHRT16 0.407 0.007 NVHRT73 0.066 0.005

Tauriųjų elnių heterozigotų deficitas pagal subpopuliacijas (multi- lokusinis) Subpopuliacija p S.E. Azvinčių 0.021 0.0018 Minčios 0.236 0.0055 Kalnelio 0.256 0.0065 Prievačkos 0.298 0.0043 Birželių - - Sipailiškių - - Taujėnų - - Mantvilių - -

Tauriųjų elnių heterozigotų deficitas pagal lokusus (multi- populiacinis) Lokusas p S.E. RT1 0.200 0.002 RT23 0.130 0.003 NVHRT16 0.590 0.007 NVHRT73 0.202 0.007

63