Thesis
Isolement de xanthones et coumarines inhibitrices de l'acétylcholinestérase, respectivement à partir de "Gentianella campestris" (L.) Börner et "Gentianella amarella" (L.) Börner ssp. "acuta" (Michx.) J.M. Gillett (Gentianaceae), et "Peucedanum ostruthium" (L.) Koch (Apiaceae)
URBAIN, Aurélie
Abstract
Lors d'un criblage visant à détecter des extraits végétaux présentant une activité inhibitrice de l'acétylcholinestérase, trois espèces se sont révélées significativement actives; deux Gentianaceae: "Gentianella campestris" et "Gentianella amarella" ssp. "acuta", et une Apiaceae: "Peucedanum ostruthium". Les composés d'intérêt ont été isolés essentiellement par chromatographie de partage centrifuge. Dix xanthones - dont deux nouvelles, notamment une xanthone dimérique - ainsi qu'un flavonoïde C- glycosylé ont été caractérisés à partir des deux espèces de gentiane. De la même manière, le fractionnement bioguidé de l'extrait de racines de "Peucedanum ostruthium" a conduit à l'obtention de cinq coumarines et d'une chromone. Parmi les dix-sept composés isolés, une xanthone - le triptexanthoside C - et trois coumarines ont montré une inhibition de l'enzyme particulièrement intéressante. L'ostruthol s'est notamment révélé dix fois plus puissant que la galanthamine lors de tests "in vitro", activité confirmée " in vivo" chez la souris.
Reference
URBAIN, Aurélie. Isolement de xanthones et coumarines inhibitrices de l'acétylcholinestérase, respectivement à partir de "Gentianella campestris" (L.) Börner et "Gentianella amarella" (L.) Börner ssp. "acuta" (Michx.) J.M. Gillett (Gentianaceae), et "Peucedanum ostruthium" (L.) Koch (Apiaceae). Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2007, no. Sc. 3934
URN : urn:nbn:ch:unige-5159 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:515
Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:515
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1 / 1 UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DES SCIENCES Section des Sciences Pharmaceutiques Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie Professeur Kurt Hostettmann
Isolement de xanthones et coumarines inhibitrices de l’acétylcholinestérase, respectivement à partir de Gentianella campestris (L.) Börner et Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett (Gentianaceae), et Peucedanum ostruthium (L.) Koch (Apiaceae)
THESE présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention interdisciplinaire
par Aurélie Urbain de Reims (France)
Thèse N° 3934
GENEVE Atelier de reproduction de la Section de Physique 2007
REMERCIEMENTS
Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann, mon directeur de thèse, pour la confiance qu’il m’a accordée en m’accueillant au sein de son équipe ; d’une part pour mener à bien le sujet de recherche qu’il m’a confié, mais également pour assurer l’enseignement et l’encadrement des étudiants en Pharmacie. J’ai apprécié son dynamisme et son enthousiasme communicatifs, ainsi que la liberté qu'il m’a accordée. Je le remercie également pour m’avoir donné l’opportunité de présenter mes travaux lors de congrès internationaux et pour m’avoir encouragée à les publier.
Je remercie chaleureusement mon responsable technique, Monsieur le Docteur Andrew Marston, pour sa disponibilité, ses précieux conseils, et pour m’avoir initiée aux joies de la CPC. J’ai apprécié sa gentillesse et ses encouragements tout au long de ce travail.
Ma reconnaissance va également aux membres du jury : Monsieur le Docteur Bruno David – des Laboratoires Pierre Fabre, Monsieur le Professeur Robert Anton – du Laboratoire de Pharmacognosie de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg, Monsieur le Docteur Laurent Décosterd – du Service de Pharmacologie clinique du CHUV, et Monsieur le Professeur Jean-Luc Veuthey – du Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique de l'Université de Genève. J’ai apprécié l’attention et l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail. Je remercie également Monsieur le Professeur Pierre-Alain Carrupt pour avoir présidé ce jury.
Ce travail aurait été incomplet sans la mise en place de collaborations essentielles, permettant notamment d’approfondir la partie pharmacologique de cette étude. Pour cela, je remercie vivement le Professeur Pierre-Alain Carrupt du Laboratoire de Chimie Thérapeutique – groupe Pharmacochimie, de l’Université de Genève, ainsi que son équipe ; Saviana di Giovanni et Liliana Sintra Grilo, qui ont effectué les tests d’inhibition de l’acétylcholinestérase en solution, ainsi que Juan Bravo pour la mesure de l’inhibition des monoamine oxydases. Toute ma gratitude va au Professeur Elaine Elisabetsky et au Docteur Ionara Siqueira du Département d’Ethnopharmacologie de l’Université Fédérale de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brésil, pour avoir réalisé les essais in vivo sur les souris. Merci également au Docteur Emma Marsden-Edwards, de la société Waters, à Manchester, Royaume-Uni, pour avoir développé les conditions d’analyse par UPLC/TOF. Je remercie également les diplômants qui ont contribué de près ou de loin à cette étude : Dounia et Valentin pour leur travail sur l’impératoire, Sophie et Line pour avoir entrepris avec beaucoup de ténacité l’investigation de Pancratium littorale , ainsi que Céline, ma “disciple”, pour sa bonne humeur permanente.
Pour leur aide précieuse tout au long de ce travail, leurs conseils, leurs encouragements, mais aussi leur sympathie, je tiens vivement à remercier le Professeur Jean-Luc Wolfender et le Docteur Emerson Ferreira Queiroz. Merci également au Docteur Karine Ndjoko-Ioset pour m’avoir assistée lors de mes premiers pas avec la RMN et la spectrométrie de masse.
Ces quatre années de thèse ont été l’occasion de nombreux échanges scientifiques avec mes collègues de l’Institut, mais également de souvenirs mémorables lors des congrès et sorties. Aussi je tiens à les remercier pour tout cela. Un merci tout spécial aux membres du “labo des blondes”, et à Aline avec qui j’ai partagé la dernière ligne droite. Je tiens aussi à remercier particulièrement Elia et Gaétan, non seulement pour leur aide technique et scientifique, mais également pour leur sympathie et leur soutien. Merci Gaétan pour les instants de complicité que nous avons partagés, et aussi pour avoir été là dans les moments, disons, “moins faciles”.
Un grand merci à mes amis et collègues du LCAP pour leur bonne humeur et tous les bons moments passés ensemble. Sans vouloir froisser ceux que je ne cite pas, je souhaite remercier plus particulièrement Myriam, Laurent et Davy pour leur amitié.
Pour m’avoir supportée durant ces longues années, je tiens sincèrement à remercier ma sœur Alexandra, ainsi que Benoît, Pascal et Camille. La vie ici aurait été différente sans vous.
Merci aussi à tous mes amis de Haute-Savoie, de Reims et d’ailleurs pour leur soutien et leurs encouragements. Dans le désordre : Houda, Leïla, Cédric, Julian, Sébastien, Jérôme, Jean-Michel, Olivier, Hanan, Tim, Pierre-François, …
Enfin je ne saurais oublier mes parents, qui m’ont soutenue et fait confiance tout au long des mes études.
COMMUNICATIONS ET PUBLICATIONS
Ce travail de thèse a été réalisé à l’Institut de Phytochimie et Pharmacognosie de l’Université de Lausanne d’octobre 2003 à août 2004, et au Laboratoire de Phytochimie et Pharmacognosie de l’Université de Genève de septembre 2004 à septembre 2007. Une partie des résultats obtenus a été présentée sous forme de posters dans différents congrès, et fait l’objet de plusieurs publications scientifiques.
Publications
Urbain A., Marston A., Queiroz E.F., Ndjoko K., Hostettmann K. Xanthones from Gentiana campestris as new acetylcholinesterase inhibitors. Planta Medica 2004, 70: 1011-1014. Urbain A., Marston A., Hostettmann K. Coumarins from Peucedanum ostruthium as inhibitors of acetylcholinesterase. Pharmaceutical Biology 2005, 43: 647-650. Hostettmann K., Borloz A., Urbain A., Marston A. Natural product inhibitors of acetylcholinesterase. Current Organic Chemistry 2006, 10: 825-847. Di Giovanni S., Borloz A., Urbain A., Marston A., Hostettmann K., Carrupt P.A., Reist M. In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: Thin layer chromatography versus microplate methods. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2008 . Sous presse. Urbain A., Marston A., Sintra Grilo L., Bravo J., Purev O., Purevsuren B., Batsuren D., Reist M., Carrupt P.A., Hostettmann K. Xanthones from Gentianella amarella ssp. acuta with acetylcholinesterase and monoamine oxidase inhibitory activities. Journal of Natural Products 2008. Sous presse. Urbain A., Marston A., Batsuren D., Purev O., Hostettmann K. Preparative isolation of closely-related xanthones from Gentianella amarella ssp. acuta by centrifugal countercurrent chromatography. Phytochemical Analysis . Soumis. Urbain A., Marsden-Edwards E., Marston A., Hostettmann K. UPLC/ESI-TOF-MS as a chemotaxonomic tool for the analysis of Gentianaceae species. Phytochemical Analysis . Soumis.
Posters
Urbain A., Marston A., Queiroz E.F., Ndjoko K., Hostettmann K. New acetylcholinesterase inhibitors from Gentiana campestris L. 15 th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Florence, Italie, 2004. Urbain A., Marston A., Hostettmann K. Coumarins from Peucedanum ostruthium as inhibitors of acetylcholinesterase. International Congress and 53 rd Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research, Florence, Italie, 2005. Di Giovanni S., Reist M., Borloz A., Urbain A., Marston A., Hostettmann K. Carrupt P.A. Comparison of two in vitro tests for the screening of acetylcholinesterase inhibitors. 4 th International Conference on Natural Products, Leysin, Suisse, 2006.
i Urbain A., Marston A., Purev O., Batsuren D., Hostettmann K. Preparative isolation of xanthones from Gentiana acuta by centrifugal partition chromatography. 5 th International Symposium on Chromatography of Natural Products, Lublin, Pologne, 2006. Urbain A., Marston A., Hostettmann K. Xanthones with acetylcholinesterase inhibitory activity from Gentianella species. 50 Years of the Phytochemical Society of Europe, Cambridge, Royaume-Uni, 2007. Urbain A., Marston A., Hostettmann K. Inhibitors of acetylcholinesterase from Gentianella and Peucedanum species. First Collaborative Meeting on Phytomedicine, Ascona, Suisse, 2007.
ii
ABREVIATIONS, SYMBOLES ET CONVENTIONS
1, 2, 3, … Symboles utilisés pour les composés mentionnés dans cette étude A, B, C, … Symboles utilisés pour les composés isolés dans le cadre de ce travail
[a]D Pouvoir rotatoire spécifique à la longueur d’onde D du sodium Aβ Protéine β-amyloïde
acétone-d6 Acétone deutérée ACh Acétylcholine AChE Acétylcholinestérase AcOEt Acétate d’éthyle ADN Acide désoxyribonucléique amu Unité de masse atomique APCI Ionisation chimique à pression atmosphérique APP Précurseur de la protéine β-amyloïde ATCI Iodure d’acétylthiocholine BEH Bridged ethyl-siloxane/silica hybrid (phase UPLC) BPI Base Peak Intensity BuOH n-butanol CC Chromatographie sur colonne ouverte CCM Chromatographie sur couche mince CPC Chromatographie de partage centrifuge d Doublet δ Déplacement chimique Da Dalton DAD Détecteur à barrette de diodes dd Doublet dédoublé DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO Diméthyle sulfoxyde
DMSO-d6 Diméthyle sulfoxyde deutéré DTNB Acide 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoïque) ESI Ionisation par électrospray
Et 2O Ether diéthylique FA Acide formique FDA Food and Drug Administration gDQF-COSY Gradient Double Quantum Filter Correlation Spectroscopy gHMBC Gradient Heteronuclear Multiple Bond Correlation gHSQC Gradient Heteronuclear Single Quantum Coherence or Correlation Glc Glucose
H2O Eau HPLC Chromatographie liquide à haute performance HRMS Spectrométrie de masse à haute résolution
iii
Hz Hertz
IC 50 Concentration nécessaire pour inhiber 50% de l’activité enzymatique i.d. Diamètre interne int. rel. Intensité relative IT Analyseur à trappe ionique kDa Kilo Dalton
λmax Maximum d’absorption dans l’UV/Vis
λmin Minimum d’absorption dans l’UV/Vis m Multiplet m/z Rapport masse/charge électrique min Minute MA Maladie d’Alzheimer MAO-A Monoamine oxydase A MAO-B Monoamine oxydase B mAU Milli unité d’absorbance MeCN Acétonitrile MeOH Méthanol MS Spectrométrie de masse NaOAc Acétate de sodium NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy ppm Partie par million pQMI Logarithme négatif de la quantité minimale inhibitrice QMI Quantité minimale inhibitrice qq Quadruplet de quadruplet Rf Rapport frontal RMN Résonance magnétique nucléaire rpm Rotations par minute s Singulet sh Epaulement sp. Espèce ssp. Sous-espèce syn. Synonyme t Triplet t BuMe éther Tertio-butylméthyl-éther TFA Acide trifluoroacétique TMS Tétraméthylsilane TOF Analyseur à temps de vol
Tr Temps de rétention UPLC UPLC ® : Chromatographie liquide à ultra performance UV Ultraviolet UV/Vis Ultraviolet / visible
iv
Concernant la nomenclature des composés isolés dans cette étude, les noms triviaux ont été utilisés pour les produits connus. Pour ce qui est de la numérotation des xanthones, celle-ci a été établie d’après les schémas biogénétiques, et non d’après les règles de nomenclature IUPAC. En effet, la biosynthèse des xanthones chez les végétaux supérieurs entraîne la formation de xanthones trioxygénées possédant systématiquement un hydroxyle en position 1 et en position 3. Ainsi le noyau aromatique possédant un substituant OR 1 en position péri (C-1) du carbonyle et un
substituant OR 3 en méta par rapport au C-1 a été désigné comme étant le noyau A.
OR 5 5 4 O OR 3 6 4b 4a 3 BC A 7 8a 8b 2 8 9 1
OR 8 O OR 1
Dans ce travail, le schéma de substitution de chaque xanthone isolée a été précisé de manière univoque.
v
TABLE DES MATIERES
1. BUTS DE CETTE ETUDE 1
2. INTRODUCTION 5
2.1. La maladie d’Alzheimer 7 2.1.1. Neuropathologie 7 2.1.1.1. Peptide β-amyloïde et plaques séniles 7 2.1.1.2. Dégénérescence neurofibrillaire 9 2.1.1.3. Perte neuronale et déficit cholinergique 9 2.1.2. Symptômes 10 2.1.3. Causes 11 2.1.3.1. Les facteurs génétiques 11 2.1.3.2. Les facteurs environnementaux ou facteurs de risque 13 2.1.4. Les traitements pharmacologiques 14 2.1.4.1. Les traitements disponibles sur le marché 15 2.1.4.2. Les nouvelles approches 19
2.2. Les méthodes de détection des inhibiteurs de l’acétylcholine estérase 21 2.2.1. Méthode d’Ellman 21 2.2.2. Test bioautographique au Fast Blue B 22 2.2.3. Autres méthodes de détection 23
2.3. Les plantes étudiées 24 2.3.1. La famille Gentianaceae 24 2.3.1.1. Présentation 24 2.3.1.2. Aspects pharmacologiques et phytochimiques 25 2.3.1.3. Le genre Gentianella 29 2.3.1.4. Gentianella campestris (L.) Börner 30 2.3.1.5. Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett 33 2.3.2. La famille Apiaceae 34 2.3.2.1. Présentation 34 2.3.2.2. Aspects pharmacologiques et phytochimiques 36 2.3.2.3. Peucedanum ostruthium (L.) Koch 40
3. RESULTATS ET DISCUSSION 45
3.1. Criblage biologique 47
vii
3.2. Investigation phytochimique des extraits méthanoliques de Gentianella campestris et Gentianella amarella ssp. acuta 50 3.2.1. Investigation phytochimique de l’extrait méthanolique de parties aériennes de Gentianella campestris 50 3.2.1.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de G. campestris 50 3.2.1.2. Fractionnement de l’extrait de G. campestris et isolement des composés A-E 51 3.2.1.3. Détermination de structure des composés A-E 52 3.2.2. Investigation phytochimique de l’extrait méthanolique de plantes entières de Gentianella amarella ssp. acuta 64 3.2.2.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de G. amarella ssp. acuta 64 3.2.2.2. Fractionnement de l’extrait de G. amarella ssp. acuta et isolement des composés B-K 65 3.2.2.3. Détermination de structure des composés F-K 71 3.2.3. Comparaison phytochimique des extraits méthanoliques de G. campestris et G. amarella ssp. acuta par LC/UV et UPLC/TOF-MS 90 3.2.4. Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase 96 3.2.4.1. Test bioautographique au Fast Blue B 96 3.2.4.2. Test en solution par la méthode d’Ellman 97
3.3. Investigation phytochimique de l’extrait dichlorométhanique de racines de Peucedanum ostruthium 98 3.3.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de Peucedanum ostruthium 98 3.3.2. Fractionnement de l’extrait de Peucedanum ostruthium et isolement des composés L-Q 99 3.3.3. Détermination de structure des composés L-Q 100 3.3.3.1. Détermination de structure du composé L 100 3.3.3.2. Détermination de structure du composé M 104 3.3.3.3. Détermination de structure du composé N 106 3.3.3.4. Détermination de structure du composé O 110 3.3.3.5. Détermination de structure du composé P 111 3.3.3.6. Détermination de structure du composé Q 113 3.3.4. Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase 117 3.3.4.1. Test bioautographique au Fast Blue B 117 3.3.4.2. Test en solution par la méthode d’Ellman 117 3.3.4.3. Tests in vivo 119
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 123
5. PARTIE EXPERIMENTALE 131
5.1. Matériel végétal et extraction 133 5.1.1. Gentianella campestris (L.) Börner 133 5.1.2. Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M. Gillett 133
viii
5.1.3. Peucedanum ostruthium (L.) Koch 134
5.2. Méthodes chromatographiques analytiques 134 5.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) 134 5.2.2. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/UV/Vis-DAD) 134 5.2.3. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS) 135 5.2.4. Chromatographie liquide à ultra performance couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC ®/HRMS) 135
5.3. Méthodes chromatographiques séparatives 135 5.3.1. Partage liquide-liquide 135 5.3.2. Chromatographie liquide à haute performance semi-préparative 136 5.3.3. Chromatographie liquide sur colonne ouverte (CC) 136 5.3.3.1. Chromatographie d’adsorption 136 5.3.3.2. Chromatographie d’exclusion 136 5.3.4. Chromatographie de partage centrifuge (CPC) 136 5.3.4.1. CPC semi-préparative 136 5.3.4.2. CPC préparative 137
5.4. Méthodes physico-chimiques 137 5.4.1. Point de fusion 137 5.4.2. Pouvoir rotatoire 137 5.4.3. Spectrométrie ultraviolet (UV) 138 5.4.4. Spectrométrie de masse (MS) 138 5.4.5. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 139
5.5. Méthodes biologiques 139 5.5.1. Test d’inhibition de l’acétylcholinestérase (AChE) 139 5.5.1.1. Méthode bioautographique au Fast Blue B 139 5.5.1.2. Méthode d’Ellman en microplaques 140 5.5.1.3. Essais in vivo 140 5.5.2. Hydrolyse enzymatique 141
5.6. Constantes physiques et données spectrales des composés isolés 142
6. RÉFÉRENCES 161
ix
Buts de cette étude
CHAPITRE 1
1. BUTS DE CETTE ETUDE
1 Chapitre 1
2 Buts de cette étude
Ce que l’on nomme assez péjorativement “sénilité” a longtemps été perçu comme une conséquence naturelle du vieillissement chez certaines personnes âgées. Avec la découverte de la maladie d’Alzheimer au début du 20 e siècle, il est apparu que la plupart des troubles associés à la sénescence – tels que la perte de mémoire et la confusion mentale – étaient en réalité les conséquences d’une réelle pathologie. La maladie d’Alzheimer, avec 24 millions de personnes touchées à travers le monde dont 20% des plus de 85 ans, est devenue l’un des principaux problèmes de santé publique. Un nouveau cas est diagnostiqué toutes les sept secondes, et il est probable que cette fréquence augmente dans les années à venir à cause du vieillissement de la population. A l’heure actuelle, il n’existe pourtant aucun traitement curatif. Seules des stratégies destinées à atténuer les symptômes de la maladie sont proposées. L’une d’elles consiste à augmenter le taux d’acétylcholine dans le cerveau en inhibant l’acétylcholinestérase, enzyme responsable de la dégradation de ce neurotransmetteur. Parmi les trois inhibiteurs actuellement disponibles sur le marché suisse, deux sont d’origine végétale : la galanthamine isolée du perce-neige, et la rivastigmine dérivée d’un alcaloïde présent dans les fèves de Calabar, la physostigmine. Les plantes sont en effet à l’origine de grandes découvertes pharmaceutiques : le saule et la reine des prés ont conduit à l’aspirine, l’if et la pervenche de Madagascar sont sources de médicaments anticancéreux, et un des principaux agents anti-malariques provient de l’armoise annuelle. Concernant la maladie d’Alzheimer, l’un des traitements les plus prometteurs à ce jour est un inhibiteur de l’acétylcholinestérase issu d’un lycopode, l’huperzine A. Cependant, ce composé est un alcaloïde, tout comme la galanthamine et la rivastigmine ; or les alcaloïdes ne sont pas des molécules sans risque. En attendant que d’autres voies de recherches aboutissent, telles que la mise au point de vaccins, il y a donc un réel intérêt à identifier de nouveaux inhibiteurs de l’acétylcholinestérase présentant à la fois une forte activité, une toxicité moindre, ainsi qu’une demi-vie plus longue. C’est sur la base de ce constat que repose cette étude, dédiée à la recherche de nouveaux composés actifs. Au-delà de cet objectif principal, le travail entrepris permet en outre de contribuer à la connaissance phytochimique des plantes étudiées.
3 Chapitre 1
4 Introduction
CHAPITRE 2
2. INTRODUCTION
5 Chapitre 2
6 Introduction
2.1. La maladie d’Alzheimer
Au début du 20 ème siècle, le neuropsychiatre allemand Aloïs Alzheimer (1864-1915) étudia le cas d’une femme d’une cinquantaine d’années internée à l'Hôpital Psychiatrique de Francfort. Celle-ci présentait entre autres des troubles de la mémoire et du comportement, des problèmes d’orientation, des hallucinations et des signes de paranoïa. Après la mort de cette patiente, Alzheimer pratiqua l'autopsie du cerveau et mit alors en évidence dans le cortex cérébral deux types de lésions caractéristiques : des plaques séniles à la surface des neurones et une dégénérescence neurofibrillaire intraneuronale. En 1906, lors de la 37 ème Conférence des psychiatres allemands à Tübingen, il présenta publiquement ses observations cliniques et histologiques (Alzheimer, 1907). L’un de ses confrères, le psychiatre Emil Kraepelin, proposa par la suite que cette pathologie cérébrale porte le nom de son découvreur. La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise principalement par une dégénérescence graduelle et irréversible des fonctions intellectuelles telles que la mémoire, l’orientation, le jugement, le langage, et la capacité à acquérir de nouvelles connaissances (Alzheimer, 1911). Un siècle après sa découverte, la MA est la forme de démence sénile la plus répandue (80% des cas) et touche 24 millions de personnes à travers le monde. Ce chiffre pourrait atteindre les 81 millions en 2040, notamment à cause du vieillissement de la population (Ferri et al. , 2005). En effet, bien qu’elle ne soit pas directement causée par l’âge, cette pathologie concerne 3% des gens âgés de plus de 65 ans, et 20% des plus de 85 ans. Ainsi, 60% des personnes touchées par la MA vivent dans les pays développés, où l’espérance de vie est plus longue.
2.1.1. Neuropathologie
Bien qu’il existe de nombreux tests permettant de mettre en évidence les démences séniles, le diagnostic de la maladie d'Alzheimer ne peut se faire avec certitude que par l’examen histopathologique post mortem du cerveau, révélant une atrophie marquée, ainsi que des lésions caractéristiques qui sont les plaques séniles et la dégénérescence neurofibrillaire (Alzheimer, 1897).
2.1.1.1. Peptide β-amyloïde et plaques séniles
L’ amyloid protein precursor (APP) est une protéine transmembranaire neuronale. Son rôle devient capital lorsqu’elle est clivée au niveau de son extrémité extracellulaire par une
7 Chapitre 2 protéase : l’ α-sécrétase. L’APP libère alors un fragment neuroprotecteur soluble appelé sAPP α (Barger et Mattson, 1996) et le segment restant, ancré au niveau de la membrane, confère au neurone une forme déterminée. Le clivage de l’APP par l’ α-sécrétase est donc essentiel à la fois pour la structure et le bon fonctionnement du neurone. Il existe en parallèle une voie protéolytique minoritaire, via la β- et la γ-sécrétases, qui conduit à la production d’un peptide insoluble appelé peptide β-amyloïde (A β) (Haass et al. , 1992; Shoji et al. , 1992). Dans certains cas, tels que la maladie d’Alzheimer ou le syndrome de Down, cette substance est anormalement produite en grandes quantités et se dépose sous forme de plaques à la surface des neurones, entraînant leur mort (Masters et al. , 1985). En 1984, Glenner et Wong l’ont identifiée comme étant un peptide de 4 kDa environ, qui existe sous différentes formes composées de 39 à 43 acides aminés, et l’ont appelé peptide ou protéine β-amyloïde à cause de sa structure en feuillets bêta (Glenner et Wong, 1984a, 1984b). Les plaques séniles ainsi formées génèrent alors des radicaux libres qui entraînent des lésions au niveau du neurone et une entrée massive de calcium dans la cellule (Mattson et Goodman, 1995; Mark et al. , 1996). De plus, elles activent anormalement la microglie qui, au lieu de phagocyter le peptide A β, provoque des réactions inflammatoires ainsi qu’une augmentation des radicaux libres (Kawakami et al. , 2004; Wilkinson et Landreth, 2006) ( Figure 2.1 ).
voie neuro-protectrice voie pathologique / cascade amyloïde
sAPP α sAPP β APP plaque sénile inflammation
activation Aβ microglie complexe complexe complexe Ca 2+ α-sécrétase β-sécrétase γ-sécrétase
radicaux libres compartiment intra-neuronal
Figure 2.1 Schéma de la cascade amyloïde.
Le résultat de cette cascade de réactions est la mort des neurones par apoptose (Floden et al. , 2005). Cette hypothèse de réactions en chaîne, dont le point de départ est le peptide A β, est couramment admise et appelée cascade amyloïde (Hardy et Higgins, 1992).
8 Introduction
2.1.1.2. Dégénérescence neurofibrillaire
Le deuxième type de lésion caractéristique est appelée dégénérescence neurofibrillaire : les neurones qui dégénèrent se remplissent de filaments pathologiques, constitués d’une forme hyperphosphorylée de la protéine tau ( τ) (Figure 2.2 ). En temps normal, cette phosphoprotéine est impliquée dans la polymérisation des microtubules du cytosquelette et contribue ainsi au transport axonal, mais lorsqu’elle est anormalement phosphorylée elle s’agrège en paires de fragments en hélice insolubles à l’intérieur des neurones (Wisniewski et al. , 1976; Goedert et al. , 1989). Cette anomalie n’est pas propre à la MA et s’observe dans de nombreuses autres maladies neurodégénératives (Gong et al. , 2005).
A B
Figure 2.2 Dégénérescence neurofibrillaire. A) enchevêtrement neurofibrillaire au niveau d’une section d’hippocampe (révélation à l’argent - Copyright © Department of Pathology, Virginia Commonwealth University, USA). B) dessins originaux d’Aloïs Alzheimer.
2.1.1.3. Perte neuronale et déficit cholinergique
La mort des neurones intervient principalement au niveau de l'hippocampe, zone impliquée dans la mémoire épisodique et spatiale ainsi que dans l’apprentissage, au niveau du cortex entorhinal impliqué dans la mémoire associative, et au niveau du noyau basal de Meynert (Whitehouse et al. , 1982; Jessen et al. , 2006). Il en résulte une atrophie marquée du cerveau chez les patients au stade avancé de la maladie ( Figure 2.3 ). Ces zones situées dans la partie basale du cerveau antérieur sont les principales sources d’innervation cholinergique (Schliebs et Arendt, 2006), ce qui entraîne un déficit en acétylcholine chez les personnes atteintes par la MA (Richter et al. , 1980). Or l’acétylcholine est un neurotransmetteur essentiel, impliqué aussi bien dans les processus d'apprentissage, de concentration, de mémorisation à court ou long terme, que dans le système nerveux périphérique (Drachman et Leavitt, 1974). Par ailleurs, il a été démontré que l’enzyme catalysant la synthèse de l’acétylcholine, la choline acétyltransférase, est nettement
9 Chapitre 2 déficitaire chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer (Perry et al. , 1977; Rossor et al. , 1982; Rinne et al. , 1988). Ces observations ont conduit à l’hypothèse cholinergique (Bartus et al. , 1982). Celle-ci admet que les troubles cognitifs de la maladie sont principalement dus à un déficit cholinergique, et que ces disfonctionnements peuvent être atténués par l’utilisation d’agonistes cholinergiques (Cummings et Back, 1998; Francis et al. , 1999).
A
B
Figure 2.3 Atrophie cérébrale. A) cerveau d’une personne âgée saine. B) cerveau d’une personne atteinte de la maladie d’Alzheimer (Tyas, 2001).
2.1.2. Symptômes
La maladie d’Alzheimer est une maladie progressive assez lente. Les premières manifestations de la maladie sont le plus souvent des troubles de la mémoire (75 % des cas). Le sujet a alors des difficultés à se souvenir des noms, des faits récents, à trouver ses mots et à mettre en place ses idées, et ce de manière régulière. Puis, à ces troubles de la mémoire et du langage viennent s’ajouter des problèmes de motricité et d’orientation dans l’espace et le temps. Le patient atteint de MA peut se perdre dans sa propre rue, sans savoir comment il est arrivé là ni comment rentrer chez lui. L’intensité de ces symptômes évolue avec la maladie, et la personne atteinte d’Alzheimer finit par avoir des difficultés à accomplir les tâches de la vie quotidienne, comme se laver ou s’habiller. De nombreux patients présentent également des troubles psycho-comportementaux plus ou moins marqués : brusques sautes d’humeur, agressivité, anxiété, dépression, voire hallucinations ou paranoïa (Lanari et al. , 2006). Au stade le plus avancé de la maladie, le patient ne reconnait plus ses proches, peut devenir
10 Introduction incontinent, grabataire, et doit souvent être admis dans un centre d’accueil spécialisé. En moyenne, la maladie d’Alzheimer évolue sur une dizaine d’années à compter du diagnostic. Cependant, bien que la progression de la maladie suive le même schéma, son intensité peut varier d’une personne à l’autre en fonction des conditions de vie, de l’âge et de l’état de santé général du sujet. La maladie se termine invariablement par le décès de la personne.
2.1.3. Causes
Les causes de la maladie d’Alzheimer restent inconnues. Toutefois, l’âge est le facteur de risque le plus évident ; en effet, bien que cette neuropathologie ne s’inscrive pas dans le processus normal du vieillissement, les différentes études sur la prévalence de la maladie indiquent que le risque de développer la MA augmente avec l’âge. D’une manière générale, les nombreuses études entreprises ces dernières années mettent en avant l’influence de deux types de facteurs : les facteurs héréditaires et les facteurs de risque dits aussi environnementaux. Alors que les premiers sont pour la plupart bien identifiés, les seconds sont souvent sujets à controverse.
2.1.3.1. Les facteurs génétiques
Plusieurs gènes impliqués dans l’apparition ou le développement de la maladie d’Alzheimer ont désormais été identifiés (Morishima-Kawashima et Ihara, 2002). Ils sont classés en deux catégories : d’une part les gènes impliqués dans la forme héréditaire de la maladie qui survient avant la soixantaine, d’autre part ceux favorisant l’apparition de la forme tardive, appelés facteurs de susceptibilité génétique.
2.1.3.1.1. Gènes impliqués dans la forme héréditaire de la maladie Il existe une forme héréditaire de la maladie d’Alzheimer, à transmission autosomique dominante, qui concerne moins de 5% des sujets atteints de la MA. Les gènes concernés sont situés sur les chromosomes 1, 14 et 21. Un individu dont un des parents est atteint court un risque sur deux d’hériter d’un gène anormal, et donc de développer la maladie. Celle-ci apparaît alors assez tôt, entre 30 et 60 ans. La forme héréditaire, dite aussi familiale, peut être causée par des mutations au niveau du gène codant pour l’APP, situé sur le chromosome 21 (Goate et al. , 1991). Il en résulte une augmentation de la production de peptide A β, le plus souvent sous sa forme de 42 acides aminés (A β1-42 ) ; cette forme accélère l’amyloïdogenèse et prédomine dans les plaques séniles (Jarrett et al. , 1993). La position du gène de l’APP sur le chromosome 21 explique également
11 Chapitre 2 les symptômes et la neuropathologie caractéristiques de la MA observés chez les personnes atteintes du syndrome de Down, également appelé trisomie 21 (Glenner et Wong, 1984a). La majorité des cas héréditaires proviennent de mutations sur deux autres gènes qui, lorsqu’ils sont mutés, entraînent une surproduction du peptide A β1-42 et par conséquent une apparition précoce de la maladie ; ce sont les gènes préséniline 1 et 2 (PS-1 et PS-2), respectivement situés sur les chromosomes 14 et 1, qui codent pour des enzymes constitutives du complexe protéolytique impliquant la γ-sécrétase (Wolfe et al. , 1999; Shizuka-Ikeda et al. , 2002; Lai et al. , 2003). Près de 80% des cas de la forme familiale sont causés par une mutation du gène PS-1 (Tilley et al. , 1998).
2.1.3.1.2. Facteurs de susceptibilité génétique La forme la plus courante de la maladie, qui représente plus de 90% des cas, est dite sporadique. Bien que ses causes ne soient pas d’origine génétique, certains gènes appelés facteurs de susceptibilité génétique peuvent influencer son déroulement. Des études ont montré que le gène codant pour l’apolipoprotéine E (ApoE) est déterminant. Cette protéine est impliquée dans le transport du cholestérol et intervient normalement dans la régénération de la membrane neuronale. Toutefois, son activité est variable suivant sa structure ; en effet, le gène correspondant situé sur le chromosome 19 présente un polymorphisme représenté principalement par trois allèles : ε2, ε3, ε4. Alors que l’isoforme ε2 semble avoir un effet protecteur, la présence de l’allèle ε4 en revanche augmente le risque de développer la maladie d’Alzheimer (sous sa forme sporadique), sans que son rôle soit clairement défini ; outre son incapacité à redistribuer les lipides, l’ApoE ε4 serait à la fois cofacteur de l’amyloïdogenèse et constituant des plaques séniles (Borgaonkar et al. , 1993; Ohm et al. , 1995; Pirttilä et al. , 1997; Gdovinová et al. , 2006). L’isoforme ε4 de l’ApoE est également impliquée directement dans le développement de la forme anormale de la protéine τ (Poirier et al. , 1993; Thaker et al. , 2003; Brecht et al. , 2004). Ces observations soulignent l’impact du métabolisme lipidique dans le développement de la maladie d’Alzheimer. Le chromosome 12 quant à lui porte un gène codant pour un récepteur membranaire : la low density lipoprotein-receptor related protein (LRP). Ce récepteur, en se liant à l'ApoE, entraîne le développement neuritique, et ce de manière différente selon l’isoforme de l’ApoE. Certaines anomalies de ce gène seraient directement impliquées dans le développement de la maladie (D'Introno et al. , 2006). Le chromosome 12 porte en outre le gène A2M codant pour l’alpha-2 macroglobuline, un inhibiteur de protéases qui, associé à la LRP, permet la dégradation de la protéine Aβ par endocytose. Les personnes atteintes d’Alzheimer présentent
12 Introduction davantage d’anomalies au niveau de ce gène que les témoins. L’une des hypothèses suggère que la compétition entre ApoE et A2M en cas de mutations au niveau de l’un ou l’autre de ces gènes pourrait empêcher la dégradation naturelle de la protéine A β (Poduslo et Yin, 2001; Panza et al. , 2006).
2.1.3.2. Les facteurs environnementaux ou facteurs de risque
Outre l’implication génétique, de plus en plus d’études tendent à mettre en avant l’importance de facteurs environnementaux sur l’apparition et le développement de la MA. Une grande étude épidémiologique a notamment été entreprise en France sur 4000 sujets de plus de 65 ans afin d’étudier le vieillissement du cerveau (Dartigues et al. , 1991). Cette étude nommée PAQUID (Quid sur les Personnes Agées) a pour objectif de mettre en évidence d’éventuelles corrélations entre certains facteurs et l’apparition de démences séniles. Elle a notamment confirmé l’importance de l’âge dans le développement de la forme sporadique de la maladie (Letenneur et al. , 1993) ( Figure 2.4 ).
60 53%
50
40 32%
30
18% 20 prévalence (%) prévalence
9% 10 5% 1% 2%
0 65 70 75 80 85 90 95 et plus âge Figure 2.4 Prévalence de la maladie d’Alzheimer selon l’âge.
L’étude PAQUID a également montré une différence entre les hommes et les femmes : les hommes seraient plus susceptibles de développer une démence de type Alzheimer avant 80 ans, la tendance s’inversant au delà de cet âge (Letenneur et al. , 1999). Ces données peuvent être liées aux différences d'espérance de vie et de pathologies associées, différentes chez les deux sexes, ainsi qu’à la prise d’un traitement hormonal de substitution. En effet, d’après
13 Chapitre 2 certaines études, la prise d’œstrogènes pour réduire les effets de la ménopause pourrait avoir un effet protecteur (Tang et al. , 1996; Norbury et al. , 2003). Au-delà de ces facteurs intrinsèques que sont l’âge et le sexe, d’autres déterminants externes sont à l’étude, tel que la consommation de tabac ou d’alcool, ou l’influence de l’aluminium. Il est cependant difficile d’analyser ces paramètres indépendamment les uns des autres, et les résultats sont parfois contradictoires d’une étude à l’autre. Ainsi, d’après certaines études, les fumeurs seraient moins enclins à développer la maladie d’Alzheimer car la nicotine présente un effet protecteur en agissant sur le déficit cholinergique et les lésions de la maladie (Reza Zamani et Allen, 2001; Ono et al. , 2002; Yamazaki et al., 2002). Cependant, les travaux qui tiennent également compte d’autres paramètres tels que le niveau d’éducation ou d’occupation infirment ces résultats (Dartigues et al. , 1991; Hebert et al. , 1992; Letenneur et al. , 2004). En effet, le niveau d’éducation et l’activité intellectuelle seraient des facteurs influençant le développement de la MA, avec toutefois des observations contradictoires (Letenneur et al. , 1999; Fritsch et al. , 2002; Wilson et al. , 2004; Caamano-Isorna et al. , 2006). Là encore, l’importance des corrélations entre les différents facteurs est soulignée (Garcia Garcia et al. , 2001). En ce qui concerne la consommation d’alcool, celle-ci semble n’avoir pas ou peu d’incidence sur le risque de développer une démence de type Alzheimer (Hebert et al. , 1992; Ruitenberg et al. , 2002; Letenneur et al. , 2004). L’aluminium suscite également des débats depuis que des traces ont été identifiées dans les zones du cerveau lésées (Shin et al. , 1995). Des études ont montré une corrélation entre l’ingestion d’aluminium présent dans l’eau et une diminution des facultés cognitives (Rondeau et al. , 2001) ; il semblerait que l’aluminium, tout comme d’autres ions métalliques tels que le fer, favorise l’apparition des lésions caractéristiques de la maladie (Banksa et al. , 2006; Exley, 2006; Miu et Benga, 2006). Des traumatismes crâniens pourraient également engendrer des démences de type Alzheimer (Macfarlane et al. , 1999; Schmidt et al. , 2001). Les habitudes alimentaires et certaines pathologies telles que le diabète ou l’hypercholestérolémie sont également incriminées et en cours d’investigation (Otsuka, 2000; Sjoegren et al. , 2006; Xu et al. , 2007).
2.1.4. Les traitements pharmacologiques
A ce jour, la maladie d’Alzheimer reste incurable. Il existe cependant des traitements permettant d’atténuer les troubles cognitifs, sans toutefois empêcher la progression de la maladie. La plupart agissent sur l’activité cholinergique (Pepin et Delwaide, 1999), mais
14 Introduction d’autres voies d’action sont à l’étude, visant notamment à empêcher la production de peptide Aβ (Wolfe, 2002).
2.1.4.1. Les traitements disponibles sur le marché
2.1.4.1.1. Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase L’acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme présente dans le tissu neuronal qui permet la régulation de l’influx nerveux : en dégradant l’acétylcholine résiduelle issue d’une neuro- transmission, elle libère la fente synaptique en vue d’une éventuelle nouvelle transmission, permettant ainsi le passage des informations. Chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer, le taux d’acétylcholine est particulièrement bas, ce qui explique les troubles cognitifs observés. L’une des solutions pour augmenter le taux d’acétylcholine au niveau synaptique consiste alors à diminuer sa dégradation, ceci en inhibant l’action de l’acétylcholinestérase ( Figure 2.5 ).
récepteur vésicule nicotinique synaptique acétylcholine
Neurone Neurone pré-synaptique AChE post-synaptique CoA choline acétate récepteur muscarinique mitochondrie AChEI x AChE = acétylcholinestérase acétyl-CoA AChE inhibée AChEI = inhibiteur
Figure 2.5 Schéma d’une synapse et mécanismes de neurotransmission cholinergique.
C’est sur la base de cette hypothèse que sont apparus sur le marché les inhibiteurs de l’AChE (Grossberg, 2003; Recanatini et Valenti, 2004). Depuis, il a été mis en évidence que cette enzyme, en plus de son rôle dans la dégradation cholinergique, accélère la formation des plaques amyloïdes (Alvarez et al. , 1995; Inestrosa et al. , 1996) ; ceci renforce l’intérêt de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l’acétylcholinestérase. Le premier inhibiteur de l’AChE à avoir été testé dans le cadre de la MA est un alcaloïde naturel : la physostigmine ( 1), issu des fèves de Calabar ( Physostigma venenosum Balf., Fabaceae) ; ces fèves étaient traditionnellement administrées au Nigeria et dans d’autres pays de l’Afrique de l’Ouest aux personnes accusées de crime ou sorcellerie : on considérait
15 Chapitre 2 que l’accusé était coupable s’il succombait à l’ingestion de cette graine et que le châtiment était donc mérité, ou qu’il était innocent dans les rares cas où la fève était rejetée par vomissement (Dworacek et Rupreht, 2002). Cette forte toxicité est due majoritairement à la physostigmine : son affinité pour l’AChE est 10 000 fois supérieure à celle de l’acétylcholine, ce qui en fait un parasympathomimétique très puissant qui entraîne bradycardie, vomissements et paralysie respiratoire (Robinson et Robinson, 1968; Bruneton, 1999). Dans le cadre du traitement des symptômes de la MA, les études cliniques ont le plus souvent montré une action positive légère de la physostigmine sur la mémoire (Drachman et Leavitt, 1974; Mohs et Davis, 1982; Shu, 1998), mais les essais in vivo ont finalement été abandonnés du fait de sa courte demi-vie et de sa toxicité au profit d’analogues synthétiques (Iijima et al. , 1992; Moriearty et Becker, 1992; Iijima et al. , 1993; Al-Jafari et al. , 1998). Néanmoins, la physostigmine reste très souvent utilisée comme substance de référence dans les tests in vitro du fait de son fort pouvoir inhibiteur.
CH3 HN O
H3C O N CH3 N H
CH3 physostigmine ( 1)
La tacrine (Cognex ®) ( 2) a été le premier inhibiteur commercialisé dans le cadre du traitement symptomatique de la MA, en 1993, mais a été abandonnée depuis à cause de ses nombreux effets secondaires (toxicité hépatique, troubles digestifs et cutanés) et d’une demi-vie courte qui nécessitait quatre prises par jour, ce qui est problématique pour des personnes souffrant de pertes de mémoire (Augry et al. , 1997). Le donépézil (Aricept ®) ( 3) est apparu trois ans plus tard, présentant moins d’effets secondaires et surtout une demi-vie plus longue, ce qui facilite considérablement la prise du traitement (Rogers et Friedhoff, 1997). De plus le donépézil interagit peu avec d’autres médicaments, ce qui permet de le combiner avec d’autres traitements tels que des psychotropes. En 1998, la Commission Européenne a autorisé la mise sur le marché de la rivastigmine (Exelon ®) ( 4), un dérivé de la physostigmine, pour le traitement symptomatique des formes légères à modérément sévères de la MA (Agid et al. , 1998; Spencer et Noble, 1998). Sa sélectivité pour la cholinestérase cérébrale ainsi que son
16 Introduction métabolisme indépendant du système enzymatique hépatique permettent une action ciblée tout en limitant les effets secondaires et les interactions médicamenteuses (Polinsky, 1998).
O O NH2
O N N O H3C H3C H3C CH3 N H3C O N CH3 CH3 tacrine ( 2) donépézil ( 3) rivastigmine ( 4)
En 2000 est apparu sur le marché un alcaloïde naturel : la galantamine (Reminyl ®) ( 5), issu du perce-neige commun ( Galanthus nivalis L., Amaryllidaceae). A la différence des précédents inhibiteurs, la galanthamine présente un double mécanisme d’action : en plus d’inhiber l’AChE, elle provoque une modulation allostérique des récepteurs nicotiniques pré- synaptiques, ce qui augmente la libération de neuromédiateurs (Maelicke et al. , 2001). Des études récentes ont par ailleurs démontré un effet favorable de la galanthamine sur la production du peptide neuroprotecteur sAPP α (Lenzken et al. , 2007). OH
CH3 O O
N
CH3 galanthamine ( 5)
L’huperzine A ( 6) est également un alcaloïde autorisé dans le traitement des symptômes de la maladie d’Alzheimer, mais pour l’instant uniquement en Chine, où il a fait l’objet de nombreuses études (Zhu et al. , 2006) ; il provient en effet d’un lycopode chinois : Huperzia serrata (Thunb.) Trevis (Lycopodiaceae) (Liu et al. , 1986; Ashani et al. , 1992).
CH3 CH3
NH H2N
O
huperzine A ( 6)
17 Chapitre 2
Cet inhibiteur réversible spécifique de l’AChE présente une demi-vie relativement longue et améliore les capacités cognitives des patients sans provoquer d’effets secondaires lourds (Zhang et al. , 2006). En plus d’une action directe sur l’AChE, l’huperzine A agit comme antagoniste des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) (Wang et al. , 1999; Gordon et al. , 2001) : chez les personnes atteintes de la MA, les récepteurs glutamatergiques NMDA présentent en effet une activité excessive qui entraîne une entrée massive de calcium à l’intérieur du neurone ; ce phénomène, appelé excitotoxicité, contribue à la mort neuronale. L’huperzine A réduirait également le stress oxydatif ainsi que la production du peptide A β, et aurait un effet neuroprotecteur contre l’apoptose (Xiao et al. , 2002; Zhang et Tang, 2006). En Amérique du Nord et en Europe, on trouve l’huperzine A commercialisée sous forme de compléments alimentaires. Le métrifonate (7) est un organophosphate utilisé dans le traitement de la schistosomiase. Des études ont montré que cette substance, après conversion naturelle non-enzymatique, génère une molécule présentant une activité inhibitrice de l’AChE : le 2,2-dichlorovinyl diméthyl phosphate ( 8), encore appelé dichlorvos ou DDVP (Williams, 1999). Les études cliniques ont montré une amélioration des troubles cognitifs associés à une bonne tolérance (Cummings et al. , 1998). Toutefois ce médicament n’a pas encore obtenu d’autorisation de mise sur le marché pour le traitement symptomatique de la maladie d’Alzheimer. O O
Cl Cl 3C P CH P CH O 3 O O 3 O O OH Cl CH3 CH3
métrifonate ( 7) DDVP ( 8)
De nombreuses molécules d’origine naturelle se sont révélées inhibitrices de l’activité de l’AChE lors de tests in vitro , que ce soit des alcaloïdes ou d’autres classes de composés ; ces molécules proviennent en grande partie de plantes, mais également d’organismes marins tels que des coraux ou des éponges, ou encore de microorganismes (Hostettmann et al. , 2006). Néanmoins, peu de ces métabolites ont fait l’objet de tests sur des modèles animaux.
2.1.4.1.2. Les antagonistes du N-méthyl-D-aspartate Il existe pour l’instant un seul médicament approuvé par la Commission Européenne et la FDA qui ne soit pas un inhibiteur de l’AChE. Cette molécule, la mémantine (Axura ®, Ebixa ®) (9), est un antagoniste non compétitif des récepteurs NMDA du glutamate à l'état ouvert. En
18 Introduction limitant le phénomène d’excitotoxicité, la mémantine présente ainsi un effet neuroprotecteur qui ralentit la progression de la maladie (Lipton, 2005; Bullock, 2006).
NH2
CH3
H3C mémantine ( 9)
2.1.4.1.3. Les nootropes Les nootropes sont des substances censées stimuler l’activité cérébrale. Elles améliorent les facultés cognitives, mais leur intérêt dans le traitement des symptômes de la MA est parfois controversé (Nicholson, 1989). On peut citer entre autres le piracétam (Flicker et Grimley Evans, 2001; Tsolaki et al. , 2001) et l’extrait de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) standardisé EGb 761 ®. De nombreuses études ont été entreprises sur cet extrait : d’un point de vue clinique, il semblerait qu’il soit aussi efficace que les inhibiteurs de l’AChE pour le traitement des formes modérées de la maladie (Wettstein, 2000; Mazza et al. , 2006). Il agirait notamment en inhibant le processus d’amyloïdogenèse (Yao et al. , 2004). Parmi les différents composés présents dans cet extrait, les ginkgolides et le bilobalide ( 10 ) seraient en partie responsables de l’effet neuroprotecteur observé (Ahlemeyer et Krieglstein, 2003). Un extrait de Ginkgo biloba , le Tavonin ®, est commercialisé en Belgique pour le traitement des formes légères à modérées de la maladie d’Alzheimer.
O H O O O O O OH C(CH 3)3 H OH bilobalide ( 10 )
2.1.4.2. Les nouvelles approches
2.1.4.2.1. Les agonistes des récepteurs muscariniques Les récepteurs muscariniques assurent la transmission post-synaptique de l’influx nerveux en se liant à l’acétylcholine. Des études cliniques sont en cours sur des agonistes des récepteurs
19 Chapitre 2
M1 afin de mimer l’action de l’ACh pour améliorer les performances cognitives (Clader et Wang, 2005), notamment sur la xanoméline ( 11) (Bymaster et al. , 1997) et la talsaclidine ( 12) (Wienrich et al. , 2002).
H C O N 3 HC S O N
N N
CH3 xanoméline ( 11) talsaclidine ( 12 )
2.1.4.2.2. Les inhibiteurs de sécrétases Le peptide A β est généré par clivage séquentiel de l’APP par la β- et la γ-sécrétase. L’une des stratégies thérapeutiques consiste à inhiber l’une ou l’autre de ces enzymes (Roberts, 2002; Evin et al. , 2006). Des études ont en effet démontré que des souris dépourvues de β-sécrétase produisaient très peu de protéines A β tout en présentant un phénotype tout à fait normal (Luo et al. , 2001). De nombreuses molécules, de natures très variées, montrent une activité inhibitrice ou modulatrice de la β-sécrétase ou de la γ-sécrétase. Cependant, peu de composés font actuellement l’objet d’essais cliniques (Vardy et al. , 2006).
2.1.4.2.3. Les vaccins L’une des nouvelles approches consiste à s’attaquer au premier point de la cascade amyloïde,
à savoir le peptide A β. Des essais de vaccins à base du peptide A β1-42 ont été réalisés sur des souris mutées ainsi que sur des patients, conduisant à la production d’anticorps sélectifs vis-à- vis des protéines A β pathologiques et à une amélioration notable des fonctions cognitives (Janus et al. , 2000; Hock et al. , 2002). En revanche, lors d’une étude en phase clinique II, des cas de méningo-encéphalite ont été rapportés (Orgogozo et al. , 2003). De nouvelles stratégies sont en cours, notamment en ce qui concerne les adjuvants ou les modes d’administration, dans l’espoir d’arriver à un vaccin sûr et efficace (DaSilva et al. , 2006). Plusieurs brevets ont d’ores et déjà été déposés (Yao, 2003; Garsky et al. , 2006).
20 Introduction
2.2. Les méthodes de détection des inhibiteurs de l’acétylcholine estérase
Afin de détecter de nouveaux inhibiteurs potentiels de l’acétylcholinestérase, plusieurs méthodes sont disponibles. Les principales reposent sur des tests colorimétriques, telles que la méthode d’Ellman et la méthode bioautographique au Fast Blue B.
2.2.1. Méthode d’Ellman
La méthode d’Ellman est la méthode standard utilisée pour détecter et surtout quantifier une inhibition de l’AChE (Ellman et al. , 1961). Elle est basée sur le clivage de l’acétylthiocholine par l’AChE ; cette réaction produit de la thiocholine qui réagit alors à son tour avec le 5,5'- dithiobisnitrobenzoate (DTNB) pour former un anion de couleur jaune ( Figure 2.6 ).
AChE + + - - + (CH 3)3N CH 2CH 2SCOCH 3 + H 2O (CH 3)3N CH 2CH 2S + CH 3COO + 2 H acétylthiocholine thiocholine acétate
O2N S S NO 2
- - O OC COO dithiobisnitrobenzoate (DTNB)
- (CH ) N+CH CH S S NO O2N S + 3 3 2 2 2
- - O OC COO 5-thio-2-nitrobenzoate 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine (jaune)
Figure 2.6 Réaction colorimétrique d’Ellman.
Cette méthode, en plus de quantifier l’inhibition sous forme d’IC 50 (concentration diminuant l’activité enzymatique de moitié), permet également d’étudier les paramètres cinétiques et par conséquent le type d’inhibition. De nombreuses adaptations ont été apportées à la méthode originelle. Initialement utilisée dans des cuves, cette réaction a été adaptée depuis pour un usage en microplaques à 96 puits, permettant l’analyse simultanée d’un grand nombre d’échantillons tout en réduisant la quantité de réactifs. La méthode a également été adaptée
21 Chapitre 2 pour une détection on-line après séparation chromatographique par HPLC, les limitations étant liées à la présence de solvants organiques qui peuvent dénaturer l’enzyme (Ingkaninan et al. , 2000). Le réactif d’Ellman peut également être utilisé sur couche mince : après migration des extraits, un premier mélange de réactifs est vaporisé sur la plaque, puis une solution contenant l’enzyme est appliquée. Les inhibiteurs apparaissent alors sous forme de taches incolores sur fond jaune (Kiely et al. , 1991). Ceci pose toutefois problème pour les composés de couleur jaune tels que les flavonoïdes ou les xanthones. De plus, les faux-positifs sont assez nombreux avec cette méthode bioautographique (Rhee et al. , 2003b).
2.2.2. Test bioautographique au Fast Blue B
Selon le principe de test colorimétrique sur couche mince, une autre méthode de détection a été développée afin de faciliter le criblage d’extraits végétaux potentiellement actifs. Celle-ci est basée sur le clivage de l’acétate de naphtyle par l’AChE (Marston et al. , 2002). Tout comme pour la méthode d’Ellman, un premier composé est formé qui réagit à son tour avec le sel de Fast Blue B pour conduire à un composé de couleur pourpre ( Figure 2.7 ). Les inhibiteurs empêchent cette réaction et sont alors détectés sous la forme de taches incolores. Le contraste avec le fond pourpre est nettement plus net que dans le cas de la méthode d’Ellman.
COCH 3 O OH AChE
+ CH 3COOH
acétate de naphtyle α-naphtol acide acétique
- H3CO 2 Cl
+ + N N N N
OCH 3 Fast Blue B salt
OH H3CO OH
N N N N
OCH composé azo 3 (pourpre)
Figure 2.7 Réaction colorimétrique au Fast Blue B.
22 Introduction
Les réactions en micropuits et sur couches minces présentent chacune des avantages et inconvénients. Les techniques bioautographiques sont très sensibles et permettent le criblage rapide d’un grand nombre d’extraits végétaux. Elles apportent en outre des informations préliminaires sur la nature des composés actifs (Rf, comportement sous lumière UV, etc.). Les tests sur plaques permettent donc une détection qualitative d’inhibiteurs et peuvent être utilisés comme outil de fractionnement bioguidé. Une fois les composés actifs isolés, le test d’Ellman en microplaques permet alors de quantifier l’activité de la molécule sous forme d’IC 50 .
2.2.3. Autres méthodes de détection
Outre les méthodes colorimétriques, il existe d’autres modes de détection plus ou moins usités. Des réactions ont été développées sur la base d’une détection fluorimétrique : ainsi le clivage enzymatique de l’acétylthiocholine est mesuré grâce à une réaction de la thiocholine formée avec un dérivé fluorogénique (Parvari et al. , 1983). Il existe également des réactions plus directes où les substrats deviennent fluorescents après clivage par les cholinestérases, tels que le butyrate de résorufine, l’acétate d’indoxyle et l’acétate de 2-naphtyle (Guibault et Kramer, 1965; Navas Diaz et al. , 1997). Certains de ces tests ont également été adaptés pour une détection post-colonne en sortie d’HPLC (Hadd et al. , 1999; Rhee et al. , 2003a). Une autre méthode utilise la radiométrie (Guilarte et al. , 1983). L’activité enzymatique, et donc l’inhibition potentielle par des composés, est mesurée via le taux de conversion de [14 C]acétylcholine en [ 14 C]acide acétique, qui réagit alors avec du [ 14 C]bicarbonate de sodium pour donner du [ 14 C]dioxyde de carbone, qui est finalement dosé. L’utilisation d’enzyme immobilisée sur un support permet également d’étudier l’activité inhibitrice de l’AChE. Cette technique consiste à incuber les inhibiteurs potentiels avec l’enzyme immobilisée, puis à mesurer l’activité résiduelle. Celle-ci peut se faire notamment à l’aide du réactif d’Ellman ou par détection électrochimique (Kindervater et al. , 1990; Kumaran et Tran-Minh, 1992; Andrisano et al. , 2001). Diverses adaptations ont été réalisées afin d’optimiser cette méthode : en sortie d’HPLC (Leon-Gonzalez et Townshend, 1991), sur support monolithique (Bartolini et al. , 2004, 2005), ou à l’aide d’immunoessais enzymatiques impliquant des interactions anticorps-antigène (Lee et al. , 2000). Dans l’ensemble des cas, l’enzyme peut être régénérée, ce qui fait de ces méthodes par immobilisation des outils rapides, relativement simples et économiques pour le criblage d’inhibiteurs.
23 Chapitre 2
2.3. Les plantes étudiées
2.3.1. La famille Gentianaceae
2.3.1.1. Présentation
Les Gentianaceae sont une vaste famille de dicotylédones comprenant plus de 1600 espèces réparties dans 87 genres cosmopolites ( Tableau 2.1 , Figure 2.8), décrite par Jussieu en 1789.
Tableau 2.1 Position de la famille Gentianaceae dans les systèmes de classifications évolutives.
Auteur Engler Cronquist Thorne Dahlgren Takhtajan APG II Super- Tricolpées
classe (Eudicotylédones) Tricolpées Classe Dicotyledonae Magnoliopsida évoluées Sous- Sympetalae Asteridae Magnoliidae Lamiidae Asteridae classe Super- Euastéridées I ou Gentiananae ordre Lamidées Ordre Gentianales Famille Gentianaceae
Les Gentianaceae sont le plus souvent des plantes herbacées annuelles ou pérennes, plus rarement des arbustes ( Macrocarpaea spp.). Il existe quelques rares plantes saprophytiques dépourvues de chlorophylle ( Voyria , Voyrella ). La plupart sont rhizomateuses. Les feuilles sont habituellement opposées-décussées, rarement alternes ( Swertia ) ou verticillées, pétiolées ou sessiles, parfois connées, sans stipule, simples à marges généralement entières, parfois disposées en rosettes. L’inflorescence est sous forme de cymes terminales ou axillaires, ou de fleurs solitaires. Les fleurs sont régulières, actinomorphes, rarement zygomorphes, hermaphrodites ou unisexuées. Le calice est formé de 4 à 5 sépales soudés entre eux, plus rarement libres. Les pétales, au nombre de 4 ou 5, sont également soudés, et forment une corolle en forme de cloche ou de plateau plus ou moins profondément fendue. Les étamines sont insérées à la base du tube de la corolle ; elles sont aussi nombreuses que les lobes et alternent avec eux. Le gynécée est formé de deux carpelles soudés avec un disque glanduleux à la base. L’ovaire est supère, généralement à une seule loge avec deux placentas pariétaux, rarement biloculaire avec un placenta axile dans chaque loge. Les ovules sont généralement anatropes, parfois orthotropes, et nombreux. Le style est simple, le stigmate simple ou bilobé.
24 Introduction
Le fruit est généralement une capsule déhiscente, rarement une baie, avec de petites graines albuminées. L’embryon est petit et droit. Les endomycorhizes sont communes. La classification phylogénétique rattache les Gentianaceae à la sous-classe des Asteridae et distingue 6 tribus : les Chironieae, les Exaceae, les Helieae, les Potalieae, les Saccifolieae et les Gentianeae. Parmi les Gentianeae, on distingue une vingtaine de genres, notamment Gentiana , Gentianella , Swertia , Halenia .
Figure 2.8 Distribution des Gentianaceae (Heywood, 1996).
2.3.1.2. Aspects pharmacologiques et phytochimiques
L’étymologie du nom Gentiana viendrait du roi d’Illyrie, Gentius (2ième siècle avant J.-C.), qui aurait découvert les propriétés fébrifuges des gentianes (Corneliuson, 1997). Les racines sont toujours utilisées à cet effet dans certaines régions montagnardes, sans qu’aucun effet antipyrétique n’ait été cependant clairement mis en évidence. Les Gentianaceae présentent d’autres activités pharmacologiques, dues essentiellement à la présence de xanthones et d’iridoïdes, ainsi qu’à des flavonoïdes C-glycosylés (Jensen et Schripsema, 2002).
2.3.1.2.1. Les xanthones Les xanthones sont des pigments jaunes dont la distribution est relativement limitée. Elles ont été identifiées dans une vingtaine de familles de plantes supérieures, ainsi que dans des fougères (Richardson, 1983; Imperato, 1991), mais c’est essentiellement dans les Clusiaceae (ex Guttiferae) et les Gentianaceae qu’on les retrouve (Mandal et al. , 1992; Vieira et Kijjoa, 2005). Quelques xanthones ont également été isolées à partir de champignons (Ondeyka John et al. , 2006; Pornpakakul et al. , 2006) et de lichens (Santesson, 1969; Elix et al. , 1991; Elix et al. , 1994; Rezanka et al. , 2003).
25 Chapitre 2
Les xanthones sont des composés hétérocycliques caractérisés par un noyau dibenzopyrone dont la biosynthèse diffère selon les organismes. Chez les végétaux supérieurs, les xanthones résultent de la condensation du 3-hydroxybenzoyl-CoA issu de la voie de l’acide shikimique avec 3 molécules de malonyl-CoA, précurseur de la voie acétate-malonate (Lewis et Gupta, 1971; Beerhues et al. , 1999; Wang et al. , 2003) ( Figure 2.9). Cette biosynthèse conduit à deux schémas de substitution de base, selon que l’hydroxyle sur le cycle issu du shikimate est en position ortho ou para au moment du couplage oxydatif : on obtient alors des xanthones tri- substituées en 1,3,5 et 1,3,7. Chez les fougères, les lichens et les champignons, la biosynthèse se fait en revanche uniquement à partir d’acétate (Hill et al. , 1982; Carter et al. , 1989).
OH O SCoA
- + 3 O SCoA O O 3-hydroxybenzoyl-CoA 3 malonyl-CoA (voie shikimate) (voie acétate-malonate)
benzophénone synthase
3 CO + 4 coenzyme A OH 2 HO OH HO OH = HO OOH OOH 2,3',4,6-tétrahydroxybenzophénone
+ NADPH + H + O 2 xanthone synthase xanthone synthase NADP + + 2 H O OH 2 5 O 4 OH 5 O 4 OH 6 4b 4a 3 6 4b 4a 3 BC A 7 8a 8b 2 7 8a 8b 2 8 9 1 HO 8 9 1
O OH O OH 1,3,5-trihydroxyxanthone 1,3,7-trihydroxyxanthone
Figure 2.9 Biosynthèse des trihydroxyxanthones chez les végétaux supérieurs.
Les xanthones rencontrées dans les plantes sont souvent O-glycosylées, mais il existe également des C-glycosides, dont le principal représentant est la mangiférine ( 13), identifiée pour la première fois chez Mangifera indica L. (Anacardiaceae). Toutefois, ces xanthones C-
26 Introduction glycosylées sont issues d’une voie de biosynthèse légèrement différente, apparentée à celle des flavonoïdes (Fujita et Inoue, 1980, 1981). La glycosylation aurait lieu au niveau de la benzophénone, avant l’étape de cyclisation (Tanaka et al. , 1984). Les xanthones possèdent de nombreuses propriétés pharmacologiques et biologiques (Hostettmann et Hostettmann, 1989; Fotie et Bohle, 2006). Elles ont notamment une action bénéfique sur le système nerveux central (Bhattacharya et al. , 1972), due à leur action inhibitrice des monoamine oxydases (MAO) qui leur confère un effet antidépresseur (Suzuki et al. , 1981; Ohishi et al. , 2000). Ainsi la mangiférine a montré une forte activité inhibitrice in vivo (Bhattacharya et al. , 1972) et la bellidifoline s’est révélée être un puissant inhibiteur sélectif de la MAO A in vitro (Schaufelberger et Hostettmann, 1988).
HO O OH
HO Glc OOH
mangiférine ( 13 )
La plupart des xanthones sont également antioxydantes et anti-inflammatoires (Lee et al. , 2005; Jung et al. , 2006; Park et al. , 2006) ; ces propriétés sont particulièrement intéressantes dans la prévention de certaines maladies, notamment celle d’Alzheimer (voir chapitre 2.1.1.1.), ou encore dans le cadre des maladies cardiovasculaires, les xanthones possédant en plus des activités anti-thrombotiques, vasorelaxantes et inhibitrices de l'agrégation plaquettaire (Jiang et al. , 2004). Elles sont également hépatoprotectrices (Hase et al. , 1997), cytotoxiques et antitumorales (Lin et al. , 1996; Lee et al. , 2005), ou encore hypoglycémiques (Basnet et al. , 1994). Les xanthones possèdent de nombreuses propriétés antifongiques (Gopalakrishnan et al. , 1997; Ioset et al. , 1998) et antimicrobiennes. Leur spectre d’activité antibactérienne est très large, elles agissent notamment sur les Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline, responsables de nombreuses contaminations telles que les infections nosocomiales (Rukachaisirikul et al. , 2003; Sukpondma et al. , 2005). Depuis une dizaine d’années, les xanthones sont également reconnues comme des agents anti-malariques et font d’ailleurs l’objet de brevets (Winter et al. , 2001) ; elles possèdent en effet une activité antiplasmodiale contre Plasmodium falciparum (Dua et al. , 2004; Hay et al. , 2004). Elles agiraient selon le même mode d’action que la chloroquine, en inhibant la formation d’hémozoïne par le parasite, mécanisme lui permettant de détoxifier l’hème. Les xanthones
27 Chapitre 2 agissent aussi sur les virus, notamment sur le VIH (Groweiss et al. , 2000) ; certaines inhibent la transcriptase inverse du VIH-1 en plus d’une action directe sur le virus (Reutrakul et al. , 2006).
2.3.1.2.2. Les iridoïdes Les iridoïdes sont des monoterpènes caractérisés par un squelette cyclopenta[c]pyranique appelé iridane, très répandus chez les Gentianaceae. Ceux rencontrés dans les gentianes sont principalement des sécoiridoïdes glycosylés, issus de la rupture de la liaison 7,8 du noyau cyclopentanique (Rodriguez et al. , 1998; Bruneton, 1999). Les iridoïdes sont responsables de l’amertume des gentianes : en activant les récepteurs gustatifs correspondants, ils favorisent les sécrétions salivaires et gastriques, et stimulent ainsi l’appétit. De plus, ils facilitent la digestion grâce à leur activité cholagogue. Ces propriétés expliquent que les gentianes, notamment la gentiane jaune ( Gentiana lutea L.), soient principalement utilisées sous forme d’apéritifs et de liqueurs. Les iridoïdes possèdent de nombreuses autres activités pharmacologiques : ils sont hépato- et cardio-protecteurs, antispasmodiques, anti-inflammatoires, antiviraux et antitumoraux (Ghisalberti, 1998). Le gentiopicroside ( 14), le swéroside ( 15) et la swertiamarine ( 16) isolés de G. lutea présentent des effets cytoprotecteurs, ainsi qu’une action positive sur le système nerveux central (Ozturk et al. , 2002; Ozturk et al. , 2006), bien que certaines études indiquent le contraire (Bhattacharya et al. , 1976). Par ailleurs, le gentipicroside protégerait des hépatites en inhibant la production de TNF ( tumor necrosis factor ) (Kondo et al. , 1994). Le swéroside et la swertiamarine présentent quant à eux une activité antibactérienne marquée (Kumarasamy et al. , 2003). O O O
OO OO OO Glc Glc Glc O O O H OH
H2C H2C H2C gentiopicroside ( 14 ) swéroside ( 15) swertiamarine ( 16 )
2.3.1.2.3. Les flavonoïdes Bien qu’il existe des flavonoïdes O-glycosylés chez les Gentianaceae, ceux rencontrés sont souvent des C-glycoflavones, tels que l’isoorientine ( 17 ), l’isovitexine ( 18) et leurs dérivés (Hostettmann-Kaldas et al. , 1981; Chulia et al. , 1996). Ces flavonoïdes C-glucosylés ont été
28 Introduction détectés dans près de 80 espèces réparties dans 9 genres, notamment Gentiana , Gentianella et Swertia (Jensen et Schripsema, 2002).
OH OH
HO O HO O OH
Glc Glc OH O OH O isoorientine ( 17 ) isovitexine ( 18)
Des fractions enrichies en isoorientine et isovitexine ont montré des activités antioxidantes, anti-inflammatoires, et antinociceptives (Kuepeli et al. , 2004; Tunalier et al. , 2007; Yesilada et Küpeli, 2007). Des propriétés sédatives (Cheng et al. , 2000) ainsi qu’hypoglycémiantes ont également été notées (Sezik et al. , 2005).
2.3.1.3. Le genre Gentianella
Le genre Gentianella a été décrit par Moench en 1794. Il comprenait alors une seule espèce, Gentianella tetrandra , anciennement Gentiana campestris (aujourd’hui Gentianella campestris ), qu’il avait ségrégé du genre Gentiana décrit par Linné en 1753 (Moench, 1794). Deux ans plus tard, Borckhausen décrivait de son côté son propre genre Gentianella , auquel il incluait les gentianes frangées qui constituent aujourd’hui le genre Gentianopsis (Borckhausen, 1796). Cette discrimination a longtemps été ignorée, et c’est seulement un siècle plus tard que le terme Gentianella a été repris par Kusnezow, mais en tant que sous- genre du genre Gentiana (Kusnezow, 1896). Il incluait toutes les gentianes dont les nectaires étaient situés sur la corolle plutôt qu’à la base de l’ovaire. Le genre a été révisé récemment (Gillett, 1957), et malgré cela, de nombreux travaux font toujours référence aux gentianelles comme un sous-genre de Gentiana L. Les genres Gentiana et Gentianella appartiennent tous deux à la tribu des Gentianeae, cependant ils sont rattachés à deux sous-tribus distinctes : les Gentianella , tout comme les Swertia , appartiennent à la sous-tribu des Swertiinae, tandis que la sous-tribu des Gentianinae englobe les espèces du genre Gentiana . Le genre Gentianella comprend aujourd’hui environ 250 espèces cosmopolites, avec une grande diversité en Amérique du Sud ainsi qu’en Australie et en Nouvelle-Zélande (von Hagen et Kadereit, 2001).
29 Chapitre 2
Les gentianelles sont des plantes à port érigé, plus rarement tombant, dont les tiges sont peu ramifiées. Les fleurs tétra- ou pentamères forment des cymes terminales ou axillaires, ou sont portées individuellement. Le calice a un tube très court à bien développé, parfois fendu à la base, la membrane intracalycine est absente. La préfloraison est convolutée. La corolle peut être sous forme de cloche, d’entonnoir, de tube, ou de plateau, peu profondément divisée. Il peut y avoir des fimbriae (franges), vascularisées ou non ; lorsqu’elles sont présentes, elles peuvent être disposées en cercle ou en rangée à la base de chaque lobe, ou bien dispersées. Les plicae (fins plis entre les lobes de la corolle) sont absents. Les étamines sont insérées dans la partie inférieure du tube de la corolle, de même que les nectaires, au nombre de un ou deux, au niveau de chaque lobe. Les filaments sont filiformes et parfois barbus. L’ovaire est sessile ou porté par un court gynophore. Le style est indistinct ou absent. Les graines ne sont généralement pas ailées. Le genre Gentianella diffère du genre Gentiana par l’absence de plicae , de membrane intracalycine au niveau du calice, de disque à la base de l’ovaire, et par la position des nectaires sur les pétales (Struwe et al. , 2002).
2.3.1.4. Gentianella campestris (L.) Börner
2.3.1.4.1. Description botanique, distribution et habitat Gentianella campestris (L.) Börner, la gentiane champêtre, est une plante vivace bisannuelle, haute de 10 à 20 cm. Ses racines sont grêles et la tige dressée est ramifiée dès la base. Les feuilles sont ovales lancéolées, de 3 à 5 nervures. Les feuilles à la base sont disposées en rosette, obtuses à la base, plus étroites le long de la tige. Les feuilles sont opposées ou verticillées, exstipulées. La préfloraison est tordue, ce qui donne à la fleur la forme d'une turbine ( Figure 2.10 ). Les fleurs sont nombreuses, solitaires, de couleur bleu violacé, de petite taille (de 15 à 30 mm). Le calice est formé de 4 sépales soudés à la base, la paire extérieure élargie au-dessous du milieu, recouvrant presque totalement l'autre paire. La corolle en cloche présente 4 lobes courts et obtus, et est barbue à la gorge. Les fleurs sont actinomorphes et hermaphrodites en général, hétérochlamydées le plus souvent, hypogynes. L’androcée est généralement isostémone, et les étamines épipétales ; il arrive rarement que les étamines sont remplacées par des staminodes, voire absentes. Le gynécée est supère, bicarpellé, uniloculaire à placentation pariétale en général ou parfois centrale, rarement biloculaire à placentation axile. Le disque nectarifère est souvent présent. Les ovules sont nombreux, anatropes, uniteguminés. Le fruit est une capsule septicide, rarement une baie.
30 Introduction
A B
Figure 2.10 Gentianella campestris (L.) Börner. A) combe de Tardevant, Haute-Savoie, France, août 2005. B) col de Tavaneuse, Haute-Savoie, France, septembre 2005.
La gentiane champêtre se rencontre en Europe et en Amérique du Nord. Elle est assez commune en moyenne montagne, jusqu'à 2700 m. Elle pousse sur les pentes herbeuses et les pâturages humides sur calcaire. Elle est plus rare en plaine. Sa floraison a lieu de mai à octobre.
2.3.1.4.2. Aspects phytochimiques Les études phytochimiques entreprises sur G. campestris ont conduit à l’isolement de six xanthones tétra-O-substituées en 1,3,5,8 : la bellidine (19) et la bellidifoline ( 20 ), ainsi que leur glycoside respectif : la norswertianoline (21 ) et la swertianoline (22 ), et l’isobellidifoline (23) et la swerchirine ( 24) (Kaldas et al. , 1974; Carbonnier et al. , 1977).
OR 2 5 O OR 1 3 19 : R1 = R 2 = R 3 = H 22 : R1 = CH 3, R 2 = H, R 3 = Glc 20 : R = CH , R = R = H 23 : R = R = H, R = CH 1 3 2 3 8 1 1 3 2 3 21 : R = R = H, R = Glc 24 : R = R = CH , R = H 1 2 3 OR 3 O OH 1 2 3 3
Deux xanthones penta-O-substituées en 1,3,4,5,8 ont également été identifiées : la corymbiférine (25 ) et le corymbiférine-1-O-β-D-glucoside (26 ), ainsi que la décussatine ( 27 ) substituée en 1,3,7,8 (Kaldas et al. , 1975; Carbonnier et al. , 1977).
31 Chapitre 2
H3C CH3 O O 5 O 4 OH O O 3 3 CH3 7 H3C 8 1 O 8 1
OH O OR 1 O O OH H3C
25 : R1 = H 26 : R1 = Glc décussatine ( 27 )
Le campestroside ( 28), présent chez la gentiane champêtre, est la première tétrahydroxanthone identifiée (Kaldas et al. , 1978). Depuis, d’autres xanthones de ce type ont été isolées : la tetrahydroswertianoline chez la Gentianaceae Swertia japonica Makino (Hase et al. , 1997), ou encore la zeyloxanthonone chez Calophyllum zeylanicum Kosterm. et Calophyllum wightianum Wall. (Guttiferae) (Karunanayake et al. , 1979). OH O OH
O OOH Glc campestroside ( 28)
Trois C-glucosides ont également été isolés à partir de G. campestris : une xanthone C- glucosylée, la mangiférine, ainsi que deux flavonoïdes C-glucosylés en C-6 : l’isoorientine et la swertisine (Kaldas et al. , 1974, 1975). En ce qui concerne les iridoïdes, Mpondo Mpondo a isolé six sécoiridoïdes glycosylés à partir de la gentiane champêtre : le gentiopicroside ( 14), la swertiamarine ( 16), l’eustoside ( 29 ), l’eustomorusside ( 30 ), l’eustomoside ( 31 ) et le 5-désoxyeustomoside ( 32 ) (Mpondo Mpondo et al. , 1990).
O O
OO OO Glc Glc O O OH R HO 29 : R = Cl 31 : R = OH O R 30 : R = OH 32 : R = H
32 Introduction
2.3.1.5. Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett
2.3.1.5.1. Description botanique, distribution et habitat Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett, parfois appelée à tort Gentiana acuta , est une gentiane assez variable, notamment au niveau de la densité de l’inflorescence, de la taille et de la forme des lobes du calice, de la longueur du tube de la corolle et des lobes, de la couleur des fleurs, ainsi qu’au niveau du nombre des entrenœuds (Gillett, 1957). Cependant les différentes observations permettent d’extraire des caractères généraux. Ainsi G. amarella ssp. acuta est une gentiane de 5 à 40 cm de hauteur, dont la tige dressée est simple à faiblement ramifiée, avec des tiges secondaires plus longues à la base (Figure 2.11 ). Les feuilles basales sont nombreuses, oblancéolées, inférieures à 4 cm, tandis que les caulinaires sont plus longues (jusqu’à 6 cm) et larges (jusqu’à 3 cm), sessiles, opposées, ovales-lancéolées ou oblongues-oblancéolées. Le calice mesure environ 1/3 de la taille de la corolle, et possède 4 à 5 lobes linéaires à lancéolés de taille inégale. Les fleurs sont portées par des pédicelles de 1 à 20 mm de long, et ce quasiment dès la base de la tige. Elles sont petites, de 5 à 18 mm, nombreuses, de couleur rose-violet à bleu, plus rarement jaune pâle. La corolle est tubulaire, avec 5 lobes triangulaires à la moitié du tube, rarement 4, chacun présentant une rangée de longues fimbriae . Les étamines sont attachées à la base du tube de la corolle. L’ovaire est supère, le fruit est une capsule déhiscente. Cette gentiane est commune en Amérique du Nord, surtout à l’ouest, où elle pousse entre 1500 et 3500 m. On la rencontre également en Asie et plus rarement en Europe. Elle pousse dans les prairies humides et à proximité des marais, et fleurit de juillet à septembre.
A B
Figure 2.11 Gentianella amarella ssp. acuta J.M.Gillett. A) Siskiyou County, Californie, USA, septembre 1995. Copyright © 1995 Julie Kierstead Nelson. B) Gumboot Lake, Californie, USA, septembre 2003. Copyright © 2003 Penn Martin II.
33 Chapitre 2
2.3.1.5.2. Aspects phytochimiques Peu d’études ont été réalisées sur G. amarella ssp. acuta , ni même sur l’espèce G. amarella . Une investigation de G. amarella ssp. acuta a été entreprise en 1997, conduisant à l’isolement de 5 xanthones précédemment identifiées chez Gentianella campestris : la bellidine ( 19), la bellidifoline ( 20 ), la norswertianoline ( 21), la swertianoline ( 22), ainsi que la corymbiférine (25) (Kojima et al. , 1998). Aucune information n’est disponible concernant une éventuelle composition en sécoiridoïdes ou en flavonoïdes. Gentiana amarella ssp. acuta est traditionnellement utilisée en Mongolie pour traiter les désordres de la vésicule biliaire ainsi que la fièvre (Boldsaikhan, 2004). Elle serait également l’un des ingrédients constituant les Fleurs de Bach, remède traditionnel censé traiter les états émotionnels. L’extrait de gentiane aiderait à lutter contre le découragement en apportant confiance et persévérance (Chancellor, 1971). Cette indication peut s’expliquer par l’effet bénéfique sur le système nerveux central des xanthones et des sécoiridoïdes présents dans les gentianes.
2.3.2. La famille Apiaceae
2.3.2.1. Présentation
Les Apiaceae (ex Ombéllifères) sont une famille de plantes dicotylédones de l’ordre des Apiales qui comprend plus de 3000 espèces réparties dans près de 450 genres ( Tableau 2.2 ).
Tableau 2.2 Position de la famille Apiaceae dans les systèmes de classifications évolutives.
Auteur Engler Cronquist Thorne Dahlgren Takhtajan APG II Super- Tricolpées classe (Eudicotylédones) Tricolpées Classe Dicotyledonae Magnoliopsida évoluées Sous- Archichlamydae Rosidae Magnoliidae Cornidae Asteridae classe Super- Euastéridées II ou Cornanae Aralianae ordre Campanulidées Ordre Umbelliflorae Apiales Araliales Apiales Famille Umbelliferae Apiaceae
C’est une famille cosmopolite, très commune en montagne mais toutefois assez rare dans les régions tropicales ( Figure 2.12 ).
34 Introduction
Figure 2.12 Distribution des Apiaceae (Heywood, 1996).
Les Apiaceae sont majoritairement des plantes herbacées annuelles, bisannuelles, ou vivaces, plus rarement des arbustes ou des arbres. La tige est souvent creuse, cannelée et noueuse. Les feuilles sont alternes, sans stipules, généralement engainantes, et exstipulées. Elles sont le plus souvent composées, pennées ou ternées, plus rarement entières (chez les buplèvres par exemples) ou palmées ou phyllodiales. Elles peuvent être épineuses comme chez les panicauts (Eryngium spp.). Les Apiaceae sont caractérisées par leur inflorescence en ombelles, ce qui a valu à la famille l’ancien nom d’ombellifères. Les ombelles sont le plus souvent composées, plus rarement sous forme d’ombelles simples ou de capitules (chez certaines espèces d’ Azorella et d’ Hydrocotyle , l’ombelle est parfois réduite à une fleur). Les pédicelles partent d’un même point sur les pédoncules et sont de longueurs différentes afin d’élever les fleurs à la même hauteur, ce qui confère une forme “plate” à l’inflorescence. Les ombelles sont souvent munies à leur base d'un involucre de bractées. Les fleurs sont le plus souvent blanches ou de couleur pâle (jaune, rose). Elles sont petites, épigynes, actinomorphes, à l’exception parfois de celles se trouvant en périphérie de l'inflorescence : elles présentent alors des pétales externes plus grands, donnant ainsi à l’ombelle une forme de fleur. Les fleurs présentent 5 pétales, habituellement inégaux, et 5 étamines. Le calice est ordinairement réduit à de simples dents au sommet de l'ovaire, voire absent. Les pétales sont réduits, à préfloraison valvaire. Les étamines sont alternes aux pétales et fixées sur le disque nectarifère. Les anthères sont à déhiscence longitudinale. Les deux carpelles sont soudés pour former un ovaire infère biloculaire, très rarement uniloculaire par avortement d'un carpelle, surmonté de deux styles distincts, parfois réduits. La base des styles peut être renflée pour former un stylopode qui conflue avec le disque nectarifère situé au sommet de l'ovaire. Les ovules sont solitaires dans chaque loge, pendants, anatropes et unitéguminés. Les fruits sont des
35 Chapitre 2 schizocarpes secs qui se scindent en deux méricarpes à maturité, chaque partie contenant une graine. Le carpophore est rarement réduit ou absent. Les fruits peuvent présenter des crochets ou des épines, des protubérances ou des poils, parfois des ailes. Le tégument de la graine est souvent adhérent au péricarpe. L'embryon est droit, petit, inclus dans un albumen oléagineux. La famille des Apiaceae est subdivisée en trois sous-familles selon les caractéristiques morphologiques du fruit : les Apioideae, qui représentent la sous-famille la plus vaste, les Saniculoideae et les Hydrocotyloideae (Drude, 1897-1898).
2.3.2.2. Aspects pharmacologiques et phytochimiques
Les Apiaceae sont le plus souvent des plantes aromatiques : elles sécrètent des huiles essentielles qui leurs confèrent des odeurs et saveurs caractéristiques, ce qui explique leur emploi à la fois comme aliments et condiments, mais aussi en médecine traditionnelle. Plusieurs espèces sont en revanche toxiques, comme la grande ciguë ( Conium maculatum L.), connue pour avoir entraîné la mort de Socrate. Les toxines responsables, notamment la coniine ( 33 ), s'attaquent au système nerveux et provoquent une paralysie progressive de tous les muscles du corps pour aboutir à la mort. Une fois sèche, la plante perd ses propriétés létales. La petite ciguë ( Aethusa cynapium L.) est quant à elle vénéneuse, mais non mortelle. D’un point de vue phytochimique, ces toxines restent rares chez les Apiaceae qui sont en revanche généralement riches en coumarines.
NH
coniine ( 33 )
2.3.2.2.1. Les huiles essentielles Les Apiaceae se distinguent par de forts arômes et saveurs dus à la présence de canaux sécréteurs d'essences ou de gommes-résines. Ces propriétés organoleptiques font que de nombreuses espèces sont largement utilisées comme légumes ou condiments. Parmi les plantes alimentaires, on trouve notamment la carotte ( Daucus carota L.) et le céleri ( Apium graveolens L.). Les principales plantes condimentaires sont le persil ( Petroselinum sativum Hoffm.), la coriandre ( Coriandrum sativum L.), l'aneth ( Anethum graveolens L.), l'anis (Pimpinella anisum L.), et le cumin ( Cuminum cyminum L.). Le fenouil, quant à lui, est à la fois utilisé comme légume ( Foeniculum vulgare Mill. var. azoricum ) et comme condiment
36 Introduction pour parfumer les alcools anisés ( Foeniculum vulgare Mill. var. dulce ). Les huiles essentielles des Apiaceae sont riches en dérivés phénylpropaniques tels que l’anéthole et l’eugénol, et en terpènes comme le β-caryophyllène, le limonène, ou la carvone (Bruneton, 1999). La plupart des Apiaceae utilisées comme condiments sont également réputées pour leurs nombreuses propriétés médicinales. Parmi les plus importantes, on peut citer l'anis vert (Pimpinella anisum L.) relaxant (Tirapelli et al. , 2007) et utilisé dans les troubles digestifs, l'angélique officinale ( Angelica archangelica L.) hépatoprotectrice (Yeh et al. , 2003), ou encore le fenouil commun qui possède en plus de ses propriétés diurétiques et carminatives des activités antioxydantes et anti-inflammatoires (Choi et Hwang, 2004).
2.3.2.2.2. Les coumarines Les coumarines sont des molécules dérivées du phénylpropane, très répandues chez les Apiaceae. On rencontre majoritairement des furanocoumarines, linéaires ou angulaires, dont le noyau de base est le psoralène ( 35 ) ( Figure 2.13). Les coumarines simples sont moins répandues, de même que les pyranocoumarines, dont la forme linéaire est absente chez les Apiaceae (Murray et al. , 1982).
5 4 3' 5 4 6 4a 3 6 4a 3 2' 7 8a 2 7 8a 2 8 O O O 8 O O 1 1' 1
coumarine ( 34 ) psoralène ( 35 )
Figure 2.13 Structures de la coumarine, noyau de base des coumarines simples, et du psoralène, noyau de base des furanocoumarines linéaires.
Chez les végétaux supérieurs, les coumarines sont biosynthétisées à partir de l’acide shikimique via l’acide cinnamique, et après lactonisation spontanée ( Figure 2.14). La plupart des coumarines simples sont substituées par un groupement hydroxyle en C-7, comme l’ombelliférone ( 36 ). La prénylation de ces coumarines en C-6 ou en C-8 conduit alors respectivement à la formation de furanocoumarines linéaires ou angulaires (Bourgaud et al. , 2006). Cette biosynthèse est stimulée par des stress externes tels que des attaques pathogènes (Tietjen et al. , 1983) ou des blessures (Zangerl et Berenbaum, 1990).
37 Chapitre 2
O COOH COOH COOH HOOC PEP chorismate mutase CH2
ATP HO OH O COOH OH OH OH acide shikimique acide chorismique acide préphénique
CO 2 COOH NH2 O H2O
HOOC HOOC phénylalanine ammonia-lyase transaminase
NH 3 acide cinnamique phénylalanine acide phénylpyruvique
NADPH + O 2 cinnamate 2-hydroxylase COOH + isomérisation NADP + H 2O
cis/trans COOH OH OH OO H2O acide 2-coumarique coumarine hydroxylase
prényltransférase prényltransférase CH3 HO OO 6 ombelliférone ( 36) H3C 7 7 HO 8 OO HO OO osthénol déméthylsubérosine
NADPH + O 2 NADPH + O 2 marmésine synthase columbianétine synthase H3C CH3 + + NADP + H 2O NADP + H 2O
H3C HO O O O O H3C OO columbianétine marmésine NADPH + O H3C 2 NADPH + O 2 psoralène synthase HO angélicine synthase CH3 + + NADP + H 2O NADP + H 2O
O OO O OO angélicine psoralène (furanocoumarine angulaire) (furanocoumarine linéaire)
Figure 2.14 Biosynthèse de la coumarine et des furanocoumarines chez les végétaux supérieurs.
38 Introduction
D’une manière générale, les coumarines sont considérées comme des phytoalexines produites en réponse à des attaques pathogènes ou des stress abiotiques (Masuda et al. , 1998). Des études ont d’ailleurs confirmé l’activité insecticide et larvicide des furanocoumarines (Hadacek et al. , 1994; de Oliveira et al. , 2005). Chez les humains, les furanocoumarines sont à l’origine de problèmes de photosensibilisation : à leur contact et en présence de soleil (ou d’irradiations UV), la peau se recouvre d’érythèmes et de vésicules, suivis d’une hyperpigmentation. En effet, sous l’action de la lumière, le psoralène et ses dérivés se lient à l’ADN par un phénomène de cyclo-addition sur la thymine ( Figure 2.15). Les composés photosensibles ainsi formés absorbent le rayonnement ultraviolet, ce qui altère la structure de l’ADN ainsi que sa réplication (Murray et al. , 1982). O O H N CH CH3 hν O 3 HN + NH O O N OO H O OO thymine psoralène photo-adduit
Figure 2.15 Photo-addition du psoralène sur la thymine.
Bien que ce phénomène de photosensibilisation soit incommodant pour les personnes saines, il est en revanche mis à profit dans le traitement de certaines pathologies de la peau telles que le vitiligo ou le psoriasis (Bedi et al. , 1996) : en augmentant la production de mélanine, les furanocoumarines entraînent en effet une repigmentation de la peau. Cette photochimio- thérapie appelée PUVAthérapie (Psoralène Ultra Violets A) consiste en l’administration orale de psoralènes suivie d’une exposition sous contrôle médical à un rayonnement UV autour d’une longueur d’onde de 360 nm (Lavery et Burrows, 1980). Toutefois ce traitement est à utiliser avec précaution car il augmenterait le risque de développer des cancers cutanés (Raiss et al. , 2004). Les coumarines sont également à l’origine d’une famille d’agents anticoagulants : les dicoumariniques. Ceux-ci ont été découverts à la suite d’accidents hémorragiques survenus dans des troupeaux de bétail en Amérique du Nord en 1920 (Broerman, 1925), dont le point commun était l’ingestion de foin contenant du mélilot moisi ( Melilotus officinalis (L.) Pallas, Fabaceae). Lors de l’ensilage, les microorganismes convertissent le mélilotoside en une molécule anticoagulante : le dicoumarol ( Figure 2.16). Cette dernière est antagoniste de la
39 Chapitre 2 vitamine K (Miller et al. , 1950; Hsu, 1986) et est utilisée dans le traitement des maladies thromboemboliques. Elle est également utilisée comme rodonticide (“mort aux rats”). OH OH OH
O métabolisation Glc microbienne O O O O O mélilotoside dicoumarol
Figure 2.16 Conversion microbienne du mélilotoside en dicoumarol.
Outre ces applications, les coumarines présentent d’autres activités pharmacologiques et biologiques (Hoult et Payá, 1996) : elles sont antioxydantes (Piao et al. , 2004), antimicrobiennes (Lu et al. , 2001; Schinkovitz et al. , 2003), elles inhibent l’agrégation plaquettaire (Chen et al. , 1996) ainsi que l’activité de l’acétylcholinestérase (Kang et al. , 2001; Kim et al. , 2002). Les coumarines synthétisées par des microorganismes, telles que la novobiocine ( 37 ) ou la coumermycine A 1 produites par des souches de Streptomyces , présentent essentiellement des activités antibiotiques (Kominek et Sebek, 1974). O OH O NH2 OH
OOH NH CH3 H3C
H3C O CH3 OOOO H3C CH3
novobiocine ( 37 )
2.3.2.3. Peucedanum ostruthium (L.) Koch
2.3.2.3.1. Description botanique, distribution et habitat Peucedanum ostruthium (L.) Koch (syn. Imperatoria ostruthium L.), plus familièrement connu sous le nom d’impératoire, est une plante haute de 30 à 100 cm, à racine tubéreuse, brun rougeâtre, rugueuse, divisée en de nombreuses ramifications en forme de tubercule. La tige est creuse, striée, et rameuse dans le haut. Les feuilles alternes vert clair sont caractéristiques : les feuilles inférieures sont tripennées, divisées en folioles ovales ou oblongues, pétiolulées, souvent lobées, dentées en scie, les supérieures sessiles sur une gaine
40 Introduction renflée. Les fleurs blanches, plus rarement roses, regroupées en ombelles ouvertes assez grandes, s'épanouissent de juin à août. Chaque ombelle dépourvue d'involucre, à involucelles caduques, à une à trois bractées, compte de 20 à 40 rayons très inégaux. Le fruit, petit, est entouré de deux grandes ailes. Chacune des deux graines est bordée par une aile large et arrondie, échancrée aux deux bouts. L'impératoire est une plante répandue en Europe Centrale, que l’on rencontre également dans certains états de l’est des Etats-Unis où elle a été introduite. C’est une plante vivace qui pousse dans les régions montagneuses (de 1400 à 2000 m d’altitude, parfois jusqu’à 2700 m), plus rarement en plaine, de préférence sur sol siliceux. Elle est caractéristique des mégaphorbiaies et apprécie les sols riches et humides : on la rencontre fréquemment au bord des sources et des torrents ( Figure 2.17).
Figure 2.17 Peucedanum ostruthium (L.) Koch. La Breya, Valais, Suisse, juillet 2005 (photo Jean-Luc Wolfender).
2.3.2.3.2. Aspects pharmacologiques et phytochimiques Les origines du nom de la plante sont à la fois latines et grecques : o struthium est une déformation du latin médiéval astranthia : étoile, en allusion à l'involucre étalée en étoile, et Peucedanum viendrait du grec peukedanos : amer. Le rhizome contient en effet des substances aromatiques amères qui possèdent des propriétés apéritives, mais également eupeptiques et carminatives. Il est également utilisé contre les états fébriles, la grippe et la bronchite grâce à ses propriétés antipyrétiques, antiphlogistiques et expectorantes (Hiermann et Schantl, 1998). En Suisse, on observe toujours certains usages traditionnels du rhizome : cuit dans le vin pour soigner les morsures de chien, ou sucé pour calmer les maux de dents.
41 Chapitre 2
L’impératoire, dont la saveur est proche du céleri, est également utilisée comme aromate en cuisine. Cet arôme particulier est dû essentiellement à la sécrétion d’huiles essentielles. Celles-ci sont synthétisées à la fois dans la partie aérienne et le rhizome, mais leur composition diffère selon l’organe : leur étude par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a montré la prédominance de monoterpènes dans l’huile essentielle obtenue par hydrodistillation des rhizomes (notamment sabinène et 4-terpinéol), alors que les parties aériennes sont plus riches en sesquiterpènes (principalement β-caryophyllène (38 ) et α- humulène) (Cisowskia et al. , 2001). D’autres molécules, les phtalides, seraient en partie responsables de l’odeur de céleri qui se dégage de l’impératoire ; trois de ces composés ont été isolés des rhizomes de P. ostruthium : la cnidilide ( 39 ), la Z-ligustilide, et la senkyunolide (Gijbels et al. , 1984).
CH3 CH3
H
O H H3C CH H 2 H H3C O β-caryophyllène ( 38 ) cnidilide ( 39 )
Plusieurs chromones ont également été isolées à partir des fruits et des rhizomes de l’impératoire, notamment la peucénine ( 40 ) et l’hamaudol (41 ) (Reisch et al. , 1975a; Varga et al. , 1979). H C HO O CH3 3 O O CH3 H3C H3C HO CH3 OH O OH O
peucénine ( 40 ) hamaudol ( 41)
L’impératoire, comme la majorité des Apiaceae, contient également un grand nombre de coumarines : des coumarines simples telles que l’ombelliférone ( 36 ) ont été identifiées, mais l’espèce est surtout riche en furanocoumarines linéaires, telles que l’ostruthol (42 ) et l’impératorine ( 43 ) ( Tableau 2.3 ). Bien que des furanocoumarines angulaires aient été identifiées dans d’autres espèces du genre Peucedanum , aucune n’a été isolée jusqu’à présent dans l’espèce ostruthium .
42 Introduction
CH CH3 HO 3 O O H3C O O O CH3 O O
CH3
O O O CH3
ostruthol ( 42 ) impératorine ( 43 )
Tableau 2.3 Coumarines identifiées chez Peucedanum ostruthium (L.) Koch.
type de composé composé organe référence auraptène (Varga et al. , 1978) ombelliférone fruit scopolétine (Varga et al. , 1976) ostruthine (Späth et Klager, 1934) coumarine simple 6-(3-carboxy-2-butényl)-7- rhizome (Hiermann et al. , 1996) hydroxycoumarine osthol fruit, rhizome (Khaled et al. , 1975) scopoline anhydrobyakangélicine (Varga et al. , 1978) byakangélicine (Varga et al. , 1976) néobyakangelicol (Varga et al. , 1979) pabulénol hydrate d’oxypeucédanine (Reisch et al. , 1975b) tert-O-méthylé hydrate d'oxypeucédanine (Hiermann et al. , 1996) 3'-acétate fruit furanocoumarine hydrate d'oxypeucédanine linéaire glucosylé impératorine (Khaled et al. , 1975) isoimpératorine oxypeucédanine ostruthol (Späth et von Christiani, 1933) pabulénone (Reisch et al. , 1975b) isooxypeucédanine (Reisch et al. , 1975b) fruit, rhizome hydrate d'oxypeucédanine (Späth et von Christiani, 1933) dihydrofurano- marmésine fruit (Varga et al. , 1976) coumarine marmésinine fruit, rhizome (Khaled et al. , 1975)
Parmi les autres composés détectés dans l’espèce, on peut citer la présence de stérols (Khaled et al. , 1975), d’acides gras (Cisowski et al. , 1977), et de flavonoïdes, notamment l’hespéridine (Cisowski, 1974, 1975; Varga et al. , 1976).
43 Chapitre 2
44 Résultats et discussion
CHAPITRE 3
3. RESULTATS ET DISCUSSION
45 Chapitre 3
46 Résultats et discussion
3.1. Criblage biologique
Afin de détecter des extraits végétaux présentant une activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE), un criblage a été réalisé par test bioautographique (Marston et al. , 2002). Parmi les extraits sélectionnés, certains ont été choisis car ils présentaient une activité insecticide lors d’une étude antérieure réalisée pour la firme Syngenta. En effet, certains insecticides agissent sur le système nerveux central, en particulier en inhibant la cholinestérase, comme les organophosphorés et les carbamates (Sultatos, 2006). Il était intéressant de vérifier si les composés actifs présents dans ces extraits étaient ou non des inhibiteurs de l’acétylcholinestérase. Les autres espèces inclues dans le criblage faisaient partie des différents programmes de recherche alors en cours au sein du Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie. Au total, ce sont 42 extraits provenant de 28 espèces appartenant à 17 familles différentes qui ont été sélectionnés pour cette étude. Les extraits ont été déposés sur couche mince à raison de 10, 20, 30, 40 et 50 g. Sur les 42 extraits élués, 15 ont révélé au moins un composé actif sur plaque à la quantité maximale testée (Tableau 3.1 ), et 8 d’entre eux étaient nettement actifs à 10 g ( Figure 3.1 ). Ces 8 extraits proviennent de 5 espèces : trois Gentianaceae, Gentianella campestris (L.) Börner, Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett, et Chironia krebsii Griseb ; une Apiaceae : Peucedanum ostruthium (L.) Koch, et Pancratium littorale Jacq. de la famille des Amaryllidaceae.
Rf A B C D Quantité d’extrait déposé : 10 g Détection : test bioautographique au Fast Blue B 1 (Marston et al ., 2002)
A1 : extrait MeOH de Gentianella campestris A2 : extrait CH 2Cl 2 de Gentianella campestris A3 : extrait MeOH de Gentianella amarella ssp. acuta A4 : extrait CH 2Cl 2 de Gentianella amarella ssp. acuta CHCl -MeOH-H O (20:8:1) 0.5 3 2 B1 : extrait CH 2Cl 2 de racines de Chironia krebsii B2 : extrait CH 2Cl 2 de parties aériennes de Chironia krebsii hexane-AcOEt (1:1)
C : extrait CH 2Cl 2 de racines de Peucedanum ostruthium hexane-AcOEt (1:1) 0 D : extrait MeOH de tiges de Pancratium littorale 1 2 3 4 1 2 CHCl -MeOH-H O (65:35:5) 3 2
Figure 3.1 Détection bioautographique de l’activité inhibitrice de l’AChE des extraits actifs à 10 g.
47 Chapitre 3
Tableau 3.1 Résultats du criblage biologique des extraits bruts.
famille espèce organe a) extrait AChE b) Pancratium littorale Jacq. T MeOH ++ R 0 Amaryllidaceae MeOH Scadoxus multiflorus Raf. 0 F CH 2Cl 2 0 Peucedanum ostruthium (L.) Koch R CH Cl ++ Apiaceae 2 2 Steganotaenia araliacea Hochst. R CH 2Cl 2 0 Acanthospermum ammanioides F CH 2Cl 2 0 Artemisia genepi Weber PE MeOH 0 Asteraceae CH Cl + Gnaphalium norvegicum Gunn. PE 2 2 MeOH 0 Vernonia amygdalina Delile T MeOH 0
Brassicaceae Arabis alpina L. PE CH 2Cl 2 + Bromeliaceae Ananas comosus (L.) Merr. F CH 2Cl 2 0 Campanula barbata Lapeyr. PE CH 2Cl 2 0 Campanulaceae CH Cl 0 Campanula rapunculoides Pall. ex Steud. PE 2 2 MeOH 0 CH Cl 0 Clusiaceae Garcinia livingstonei T. Anders . ER 2 2 MeOH 0 Commelinaceae Commelina diffusa Willd. ex Kunth PA MeOH 0 PA ++ Chironia krebsii Griseb. CH Cl R 2 2 ++ Gentianella amarella (L.) Börner ssp . CH Cl ++ PE 2 2 acuta (Michx.) J.M.Gillett MeOH ++ Gentianaceae MeOH ++ Gentianella campestris (L.) Börner PA CHCl 3 ++ Gentiana sedifolia H.B. & K. PE MeOH 0 Halenia asclepiadea Griseb. PE MeOH 0 Urginea sanguinea Schinz PE MeOH 0 CH Cl 0 Hyacinthaceae F 2 2 Ledebouria floribunda (Baker) Jessop MeOH 0
R CH 2Cl 2 0 Plumbaginaceae Armeria alpina Willd. PE CH 2Cl 2 + Poaceae Sporobolus pyramidalis Beauv. PA CH 2Cl 2 0 CH Cl + PA 2 2 MeOH 0 Polygalaceae Polygala nyikensis Exell CH Cl + R 2 2 MeOH 0 Pteridaceae Pteris multifolia PE MeOH 0
Ranunculaceae Clematis brachiata Ker Gawl. R CH 2Cl 2 0 ET MeOH + Rubiaceae Nauclea latifolia Blanco T MeOH +
Solanaceae Physalis angulata L. F CH 2Cl 2 0 a) T : tiges, R : racines, F : feuilles, PE : plantes entières, PA : parties aériennes, ET : écorces de tiges, ER : écorces de racines. b) 0 : pas d’inhibition à 50 g + : inhibition entre 10 g et 50 g ++ : inhibition < 10 g
48 Résultats et discussion
Les extraits des deux Gentianella sont très similaires : quatre zones d’inhibition ressortent clairement dans les extraits méthanoliques, les deux composés les plus lipophiles se retrouvant dans les extraits apolaires. Concernant Chironia krebsii , les extraits apolaires provenant des parties aériennes et des racines montrent le même profil d’activité, avec deux zones d’activité qui ressortent nettement. L’extrait apolaire de racines de Peucedanum ostruthium semble particulièrement riche en molécules actives. Toutes les zones d’inhibition enzymatique correspondent à des composés visibles sous lumière UV à 366 nm, caractéristique des coumarines omniprésentes chez les Apiaceae, dont l’activité inhibitrice de l’AChE a d’ailleurs été mise en évidence pour certaines molécules (Kang et al. , 2001; Kim et al. , 2002). L’extrait méthanolique de tiges de Pancratium littorale donne quant à lui trois taches d’inhibition très nettes, qui pourraient être dues à des alcaloïdes ; en effet, plusieurs études ont montré la forte activité inhibitrice des alcaloïdes présents dans les Amaryllidaceae, à l’image de la galanthamine (López et al. , 2002; Orhan et Sener, 2003; Elgorashi et al. , 2004). Concernant l’origine géographique des plantes actives, seules deux espèces poussent naturellement en Suisse : la gentiane champêtre (Gentianella campestris ) et l’impératoire (Peucedanum ostruthium ). Chironia krebsii est une plante originaire d’Afrique, et l’extrait utilisé ici provient de plantes récoltées au Malawi. Or, aucune collaboration avec ce pays n’était en cours lors de cette étude. Le lot de Pancratium littorale , Amaryllidaceae commune en Amérique Centrale, provient du Panama avec qui le Laboratoire de Phytochimie et Pharmacognosie collabore. Quant à Gentianella amarella ssp. acuta , elle a été récoltée en Mongolie. Une collaboration était alors en cours avec le Laboratoire des Substances Naturelles de l’Académie Mongole des Sciences (Oulan-Bator, Mongolie) ; de plus, le profil bioautographique de l’extrait de G. amarella ssp. acuta étant très semblable à celui de G. campestris , il était intéressant de comparer ces deux espèces entre elles.
Les extraits méthanoliques de Gentianella campestris et Gentianella amarella ssp. acuta – plus riches en composés actifs que les extraits apolaires – et l’extrait dichlorométhanique de Peucedanum ostruthium ont donc été sélectionnés pour une investigation phytochimique plus approfondie. Le fractionnement de Pancratium littorale a été entrepris par des diplômants au sein du Laboratoire, mais la composition de l’extrait était tellement complexe qu’aucun produit pur n’a pu être isolé en quantité suffisante pour permettre une élucidation structurale ainsi que des tests d’activité biologique complémentaires.
49 Chapitre 3
3.2. Investigation phytochimique des extraits méthanoliques de Gentianella campestris et Gentianella amarella ssp. acuta
3.2.1. Investigation phytochimique de l’extrait méthanolique de parties aériennes de Gentianella campestris
3.2.1.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de G. campestris
Afin d’obtenir des informations préliminaires sur la nature des principaux constituants de l’extrait méthanolique de parties aériennes de Gentianella campestris , celui-ci a été analysé par HPLC couplée à un détecteur UV ainsi qu’à un spectromètre de masse à trappe ionique (IT) équipé d’une source APCI (Figure 3.2).
A B C Tr : 14.33 min T : 17.96 min Tr : 15.02 min r m/z 449 m/z 423 m/z 437
200 250 300 350 400 450 nm 200 250 300 350 400 450 nm 200 250 300 350 400 450 nm
D B E 1600 T : 26.35 min Tr : 23.97 min r 1200 C 200 250 300 350 400 450 nm 200 250 300 350 400 450 nm 800
400 A D E Intensité (mAU) relative 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min)
Figure 3.2 Profil chromatographique HPLC/UV à 254 nm de l’extrait MeOH de Gentianella campestris . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min -1.
Le chromatogramme HPLC/UV à 254 nm fait apparaître deux composés majoritaires B et C, ainsi que deux autres composés plus apolaires D et E. Un cinquième composé élue juste avant le composé B. Ce composé A présente un spectre UV caractéristique des flavonoïdes ; plus précisément, ses maxima d’absorption à 263 et 351 nm le classent dans les flavones ou les flavonols (Mabry et al. , 1970). Les composés B à E présentent quant à eux des spectres d’absorption typiques des xanthones, avec trois bandes intenses entre 230 et 340 nm et une
50 Résultats et discussion plus faible dans les plus hautes longueurs d’onde (Afzal et al. , 1979). Les composés B et C possèdent un spectre semblable, avec des maxima autour de 252, 274, 326 nm et un épaulement vers 374 nm, et un minimum d’absorption à 288 nm. Les composés D et E présentent également le même spectre. Comparé à celui des composés B et C, il n’y a que peu de différences avec les deux bandes de faibles longueur d’onde ( λmax 254 et 278 nm) ; en revanche la troisième bande présente un déplacement bathochrome plus important ( λmax 334 nm) et un quatrième maximum d’absorption ressort nettement à 388 nm. L’analyse de masse par HPLC/APCI-IT en mode positif n’a permis d’obtenir aucune information sur les deux composés les plus apolaires D et E ; il semblerait qu’ils ne s’ionisent pas dans ces conditions. Le composé A en revanche présente un ion pseudo-moléculaire à m/z 449 [M+H] +, d’où un poids moléculaire de 448 Da. D’après la littérature, un flavonoïde de même masse, l’isoorientine, a été précédemment isolé de G. campestris , laissant supposer que le composé A pourrait être ce flavonoïde (Kaldas et al. , 1974). De la même manière, les masses moléculaires des composés B et C sont déterminées comme étant respectivement 422 et 436 Da. Or Kaldas et al. ont également isolé de la gentiane champêtre deux xanthones de poids moléculaires 422 et 436 Da, la norswertianoline et son équivalent méthylé la swertianoline. Si l’on compare la CCM de détection de l’activité anti-acétylcholinestérase avec le profil chromatographique obtenu par HPLC/UV, il semble que les quatre zones d’activité observées sur couche mince correspondent aux composés B à E. Une étude conduite par Brühlmann et al. a d’ores et déjà mis en évidence le potentiel inhibiteur des xanthones sur l’AChE (Brühlmann et al. , 2004). Afin de confirmer l’identité des composés A-E et surtout leur activité anticholinestérasique, le fractionnement de l’extrait méthanolique de G. campestris est entrepris.
3.2.1.2. Fractionnement de l’extrait de G. campestris et isolement des composés A-E
Les conditions d’analyse HPLC ont été transposées à l’échelle semi-préparative afin de fractionner l’extrait méthanolique des parties aériennes de G. campestris . Un total de 30 mg d’extrait a été injecté et les cinq pics majoritaires correspondant aux composés A à E ont été récoltés à la sortie du détecteur UV/Vis (Figure 3.3 ). Des fractions contenant les composés A (2.7 mg), B (7.5 mg), C (2.3 mg), D (0.9 mg), et E (1.1 mg) ont ainsi pu être obtenues. La pureté de ces fractions a été mise en évidence par HPLC/UV-DAD.
51 Chapitre 3
0 5 10 15 2025 30 35 Temps (min) Figure 3.3 Profil chromatographique HPLC/UV semi-préparative à 254 nm de l’extrait méthanolique de Gentianella campestris . Colonne PrepLC 25 mm Waters Bondapak C 18 (10 m, 100 × 25 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 35 min. Débit 10 mL/min. Les zones grisées correspondent aux fractions collectées.
3.2.1.3. Détermination de structure des composés A-E
3.2.1.3.1. Détermination de structure du composé A Le composé A se présente sous forme d’une poudre jaune amorphe. Son spectre UV est caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol. Les spectres de masse obtenus par LC/APCI- MS n en mode positif donnent un ion pseudo-moléculaire à m/z 449 [M+H] + ainsi qu’une fragmentation complexe caractéristique des flavonoïdes C-glycosylés (Wu et al. , 2004) (Figure 3.4).
+ 2 APCI-IT-MS 449.0 [M+H] APCI-IT-MS de 449.0 383.0 100 100
80 80 353.1 395.0 413.0 60 60 431.0
40 40 329.2
20 20 299.1 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 431.1 0 0 200 300 400 500 100 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.4 Spectres HPLC/APCI-IT-MS n du composé A en mode positif.
52 Résultats et discussion
Les flavonoïdes C-glycosylés identifiés jusqu’à présent chez G. campestris sont l’isoorientine et la swertisine, tous deux glucosylés en C-6 ; la swertisine présente une masse moléculaire de 446 Da alors que celle de l’isoorientine est de 448 Da, ce qui en accord avec l’ion pseudo- moléculaire observé. Par ailleurs, le schéma de fragmentation de l’ion pseudo-moléculaire à m/z 449 est identique à celui observé pour l’orientine ou l’isoorientine (Waridel et al. , 2001; Pereira et al. , 2005) ( Figure 3.5).
OH 449 : [M+H] + OH 431 : [M+H-18] + 413 : [M+H-36] + HO O 395 : [M+H-54] + + 2,3 + 383 : [M+H-30-36] : X - 2 H 2O HOH 2C 5 O 0 359 : [M+H-90] + : 0,3 X+ 4 1 + 0,4 + OH O 353 : [M+H-96] : X - 2 H 2O 0,4 X+ HO 3 2 OH 329 : [M+H-120] + : 0,2 X+ 0,1 X+ + 0,2 + OH 311 : [M+H-120-18] : X - 2 H 2O 0,3 + 0,2 + 299 : [M+H-150] + : 0,1 X+ X X Figure 3.5 Fragmentation CID-MS-MS de l’ion pseudo-moléculaire à m/z 449 [M+H] + de l’isoorientine (les fragments obtenus sont identiques pour l’orientine) (d’après Waridel et al., 2001).
L’analyse du spectre RMN du proton et des corrélations 1H-13 C permettent de confirmer la structure du composé A comme étant celle de l’isoorientine ( Figure 3.6). Les résonances entre 6.8 et 7.5 ppm correspondent aux protons aromatiques du cycle B, le proton H-6’ ( δH
7.42 ppm, J = 8.3, 2.4 Hz) couplant à la fois en ortho avec le proton H-5’ ( δH 6.89 ppm, J =
8.3 Hz) et en méta avec le proton H-2’ ( δH 7.40 ppm, J = 2.4 Hz).
H2O H-1’’ H-6’’b, 3’’, 5’’ H-3 J=9.3 Hz
OH H-8 H-2’ Glc J=2.4 Hz H-6’ OH H-4’’ J=8.3, 2.4 Hz H-5’ Glc J=8.3 Hz H-6’’a OH aromatiques H-2’’
10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 ppm Figure 3.6 1 Spectre RMN H du composé A (500 MHz, DMSO-d6).
53 Chapitre 3
Le déplacement du proton H-3 à δH 6.66 ppm est en accord avec la littérature (Kumazawa et al. , 2000). La valeur de déplacement du singulet observé à δH 6.48 ppm est caractéristique du proton H-8 lorsque le cycle A est substitué en position 5 et 7 par des groupements hydroxyles (Mabry et al. , 1970). 2 Par ailleurs, l’analyse hétéronucléaire gHMBC indique clairement les corrélations JHC avec 3 les carbones 7 et 9, et JHC avec les carbones 6 et 10, ce qui confirme la position du proton en C-8, et par là même celle du sucre en C-6. La nature du sucre est confirmée comme étant le 1 glucose sur la base des signaux caractéristiques observés avec les spectres H ( δH entre 3.1 et
5.0 ppm) et gHSQC (C-2’’-5’’ entre δC 70 et 78 ppm, C-6’’ à δC 62.3 ppm) ; la liaison β-C- glucosidique est confirmée par les valeurs de déplacement du proton et du carbone anomériques ( δH 4.59 ppm, J = 9.3 Hz, δC 73.9 ppm). L’isoorientine est une C-glucoflavone particulièrement répandue chez les Gentianaceae (Jensen et Schripsema, 2002) ( Figure 3.7).
OH 3' OH H 2' 4' B 8 1' 5' OH HO O H 7 9 6' HO O A C H 610 3 H HO 5 OH H H OH O Figure 3.7 Structure du composé A : l’isoorientine, et corrélations gHMBC du proton H-8.
3.2.1.3.2. Détermination de structure du composé B Le composé B est obtenu sous forme d’une poudre amorphe jaune. Le spectre de masse haute résolution ESI-TOF-MS en mode négatif permet de déterminer sa formule brute comme étant - C19 H18 O11 , sur la base de l’ion pseudo-moléculaire observé à m/z 421.0730 [M-H] (calculée pour 421.0771). Par ailleurs, le spectre de masse APCI-MS présente un fragment correspondant à la perte d’un hexose ( m/z 261 [M+H-162] +) (Figure 3.8).
54 Résultats et discussion
- ESI-TOF-MS 421.0730 [M-H] APCI-IT-MS 422.7 [M+H] + 100 100
80 - 162
60
40 463.0
+ 20 261.3 [M+H-Glc] abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 422.0823 0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.8 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé B.
Le spectre RMN du proton confirme la présence d’un glucose sur la molécule ; la valeur
élevée de la constante de couplage du proton anomérique ( δH 4.78 ppm, J = 7.8 Hz) implique un angle dièdre important et donc une position axiale du proton anomérique. En plus des signaux liés au β-glucose, le spectre 1H met en évidence quatre protons aromatiques, dont deux couplent en ortho ( δH 7.25 ppm, J = 9.3 Hz ; δH 7.13 ppm, J = 8.8 Hz) et les deux autres en méta ( δH 6.18 ppm et 6.38 ppm, J = 1.4 Hz), ce qui implique que le composé B est une xanthone tétra-O-substituée ( Figure 3.9).
H2O H-2’, 5’, 3’ H-4 OH J=1.4 Hz Glc H-7 H-6 J=8.8 Hz H-2 H-1’ J=9.3 Hz J=1.4 Hz J=7.8 Hz
OH H-6’b Glc H-4’ H-6’a J=11.2, 4.4 Hz
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm Figure 3.9 1 Spectre RMN H du composé B (500 MHz, DMSO-d6).
Les schémas de tétrasubstitution observés jusqu’à présent dans les espèces du genre Gentianella sont 1,3,5,8, 1,3,4,7, et 1,3,7,8 (Jensen et Schripsema, 2002). Compte-tenu de ces
55 Chapitre 3 données, les protons en méta ne peuvent être que les protons H-2 et H-4 du cycle A, et les protons en ortho l’un de l’autre sont par conséquent liés au cycle B, soit en position 5 et 6, soit en position 6 et 7. Le spectre RMN de corrélations hétéronucléaires à courtes distances gHSQC indique que le proton à δH 7.25 ppm est rattaché au carbone à δC 122.1 ppm, valeur de déplacement qui est caractéristique du carbone C-6 (Westerman et al. , 1977). Par ailleurs, l’analyse des corrélations 1H-13 C à longues distances gHMBC démontre que le glucose est rattaché au carbone à δC 150.3 ppm, et que les protons δH 7.13 ppm et δH 7.25 ppm couplent 2 3 respectivement en JHC et en JHC avec ce même carbone (Figure 3.10 ). Ceci n’est donc possible que dans le cas où le proton δH 7.13 ppm est en position 7 et le glucose en C-8.
C-8b C-8 C-5 C-3 C-4b C-1 C-2 C-8a C-4a C-4
H-1’ 5.0
5.5
6.0 (ppm)
H-2 H H-4 δ 6.5
H-7 7.0 H-6
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96
δC (ppm)
Figure 3.10
Principales corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé B (500 MHz, DMSO-d6).
Finalement, l’hydrolyse du composé B par la β-D-glucosidase entraîne la libération d’un aglycone, ce qui confirme la nature du sucre comme étant le β-D-glucose. Le composé B isolé est par conséquent le 1,3,5-trihydroxyxanthone-8-O-β-D-glucopyranoside ou norswertianoline ( Figure 3.11 ), une tétrahydroxyxanthone précédemment identifiée chez Gentianella campestris (Kaldas et al. , 1974; Carbonnier et al. , 1977).
56 Résultats et discussion
OH 5 O 4 OH 6 3 OH 7 2 8 1 HO O HO O OOH OH Figure 3.11 Structure du composé B : la norswertianoline.
3.2.1.3.3. Détermination de structure du composé C Le composé C se présente sous la forme d’une poudre amorphe jaune crème, et possède un spectre UV semblable à celui du composé B. Son analyse par spectrométrie de masse à haute résolution permet de déduire sa formule moléculaire C 20 H20 O11 d’après l’ion pseudo- moléculaire observé à m/z 435.0923 [M-H] - (calculée pour 435.0927). Tout comme pour le composé B, l’analyse APCI-MS met en évidence la perte d’un hexose avec le fragment m/z 275 [M+H-162] + ( Figure 3.12 ).
435.0923 [M-H] - ESI-TOF-MS APCI-IT-MS + 100 436.7 [M+H] 100
80 - 162
60
40 275.2 [M+H-Glc]+ 20
abondance relative (%) relative abondance (%) relative abondance 491.9
0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z
Figure 3.12 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé C.
Ces données laissent supposer que le composé C a une structure proche de celle du composé B. La formule moléculaire indique un carbone et deux hydrogènes supplémentaires par rapport à la norswertianoline, ce qui permet de suspecter la présence d’un groupement méthyle sur la molécule. Plus précisément, il est probable que le composé C est une xanthone tétraoxygénée glycosylée et substituée par un groupement méthoxyle. Le spectre RMN 1H confirme cette hypothèse en mettant en évidence un singulet caractéristique des groupements méthoxyles à 3.89 ppm ( Figure 3.13 ).
57 Chapitre 3
OCH 3-3
H-6’b H-5’, 3’, 2’ H-7 H-4 J=11.7, 5.9 Hz H-6 J=8.8 Hz J=2.4 Hz H-1’ J=8.8 Hz H-6’a H-2 J=7.8 Hz J=11.7 Hz J=2.4 Hz H-4’
OH Glc
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
Figure 3.13 1 Spectre RMN H du composé C (500 MHz, DMSO-d6).
De plus, le spectre présente également deux protons aromatiques qui couplent en position ortho ( δH 7.26 et 7.13 ppm, J = 8.8 Hz) et deux aromatiques couplés en méta ( δH 6.57 et 6.36 ppm, J = 2.4 Hz). Les signaux du sucre sont caractéristiques d’un β-glucose (proton anomérique δH 4.79 ppm, J = 7.8 Hz). L’analyse hétéronucléaire 1H-13 C à longue distance gHMBC indique une corrélation des protons du groupe méthoxyle avec un carbone à δC 167.2 ppm ( Figure 3.14 ). C-4’ C-5’ C-2’ C-1 C-3 C-3’ C-1’ C-7 C-2 C-4 C-6 C-8b C-8a C-4a C-8 C-5 C-4b
3.0 H-5’,3’,2’,4’ H-6’a, b 3.5 OCH 3-3 4.0
4.5 H-1’ 5.0 (ppm) H
5.5 δ
6.0 H-2 H-4 6.5
H-7 7.0 H-6 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 δ C (ppm) Figure 3.14 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé C (500 MHz, DMSO- d6).
58 Résultats et discussion
Cette valeur de déplacement à 167 ppm est caractéristique du carbone C-3 (Westerman et al. , 1977), ce qui indique que la xanthone C est méthoxylée à cette position. Par ailleurs, l’ensemble des corrélations observées pour les protons aromatiques, ainsi que pour les protons du sucre, sont identiques à celles observées avec la norswertianoline. L’hydrolyse enzymatique du sucre permet en outre de confirmer la présence d’un β-D-glucose. L’identité du composé C est ainsi établie comme étant le 1,5-dihydroxy-3-méthoxyxanthone- 8-O-β-D-glucopyranoside ou swertianoline (Figure 3.15 ). Cette molécule, qui a été isolée pour la première fois d’une autre Gentianaceae, Swertia japonica Makino (Sashina et al. , 1942), a été identifié chez G. campestris conjointement avec la norswertianoline (Kaldas et al. , 1974; Carbonnier et al. , 1977). OH
5 4 O OCH 3 6 3
OH 7 2 8 1 HO O O OOH HO OH Figure 3.15 Structure du composé C : la swertianoline.
3.2.1.3.4. Détermination de structure du composé D Le composé D est obtenu sous forme de fins cristaux jaunes. Son spectre de masse haute résolution présente un ion pseudo-moléculaire à m/z 259.0239 [M-H] - qui correspond à la formule moléculaire C 13 H8O6, calculée pour 259.0243 ( Figure 3.16 ).
ESI-TOF-MS 259.0239 [M-H] - 100
260.0267 abondance relative (%) relative abondance 0 100 200 300 400 500 600 m/z
Figure 3.16 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif du composé D.
59 Chapitre 3
L’analyse par LC/APCI-MS ne donne aucun fragment significatif, ce composé ne s’ionise pas en APCI en mode positif. En revanche, sa différence de masse de -162 par rapport au composé B, ainsi que sa faible polarité déduite de ses caractéristiques chromatographiques (rétention en HPLC et CCM) laisse à penser que le composé D est une xanthone tétraoxygénée aglycone, ce que confirme le spectre RMN du proton. Outre l’absence de signaux osidiques caractéristiques, l’analyse dans le DMSO permet de faire apparaître quatre signaux entre 9 et 12 ppm correspondant aux hydroxyles aromatiques ( Figure 3.17 ). Les groupements OH en position 1 et 8 établissent des ponts hydrogène intramoléculaires avec l’oxygène du carbonyle ; l’environnement électronique particulier qui en résulte se traduit sous forme de singulets étroits et très intenses.
H-4 J=1.9 Hz OH-8 H-6 H-2 H-7 J=8.8 Hz J=1.9 Hz J=8.8 Hz OH-1
OH OH
12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figure 3.17 1 Spectre RMN H du composé D (500 MHz, DMSO-d6).
La zone des protons aromatiques présente deux protons couplant en ortho ( δH 7.24 et 6.63 ppm, J = 8.8 Hz) et deux autres en para ( δH 6.41 et 6.22 ppm, J = 2.4 Hz). Là encore, la connaissance des schémas de substitution des xanthones permet d’attribuer les positions 2 et 4 aux protons δH 6.22 et 6.41 ppm. Les deux protons en ortho sont identifiés comme les protons
H-6 ( δH 7.24 ppm) et H-7 ( δH 6.63 ppm) sur la base des données gHMBC ( Figure 3.18 ). La forte densité électronique des hydroxyles adjacents au carbonyle permet de visualiser les couplages des protons avec les carbones voisins, et donc d’attribuer les signaux à δH 11.14 et 11.90 ppm aux hydroxyles OH-8 et OH-1.
60 Résultats et discussion C-4 C-5 C-8b C-2 C-7 C-3 C-1 C-4a C-8 C-4b C-8a
H-2 6 H-4 H-7 7 H-6
8
9 (ppm) H
OH δ 10
OH-8 11 OH-1 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 δ C (ppm) Figure 3.18 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé D (500 MHz, DMSO- d6).
L’ensemble de ces données permet d’affirmer que le composé D est la bellidine ou 1,3,5,8- tétrahydroxyxanthone ( Figure 3.19 ), isolée pour la première fois à partir de Gentianella bellidifolia (Hook) Holub (Markham, 1964) et identifiée chez Gentianella campestris en 1974 (Kaldas et al. , 1974). OH 5 O 4 OH 6 3
7 2 8 1
OH OOH
Figure 3.19 Structure du composé D : la bellidine.
3.2.1.3.5. Détermination de structure du composé E Le composé E, de couleur jaune vif, est obtenu sous forme cristallisée. Tout comme le composé D, il ne s’ionise pas en APCI en mode positif. Son analyse par ESI-TOF en mode négatif permet en revanche de déterminer sa formule moléculaire C14 H10 O6 sur la base de l’ion pseudo-moléculaire m/z 273.0395 [M-H] -, calculée pour 273.0399 ( Figure 3.20 ).
61 Chapitre 3
ESI-TOF-MS 273.0395 [M-H] - 100
547.0911 [2M-H] -
319.0476 [M+HCOO] - abondance relative (%) relative abondance 0 100 200 300 400 500 600 m/z Figure 3.20 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif du composé E.
La différence de masse de 162 Da observée par rapport à la swertianoline, et de 14 Da par rapport à la bellidine, laisse penser qu’il s’agit d’une xanthone aglycone tétraoxygénée et méthylée. 1 Le spectre RMN H fait apparaître un signal à δH 3.90 ppm caractéristique d’un groupement méthoxyle, ainsi que trois signaux spécifiques aux phénols, dont les plus déblindés présentent les mêmes valeurs de déplacement que ceux observés pour la bellidine et qui peuvent donc être attribués respectivement aux hydroxyles OH-1 et OH-8 ( Figure 3.21 ).
OCH 3-3
H-7 H-4 J=8.8 Hz J=2.4 Hz H-6 OH-8 H-2 J=8.8 Hz OH-1 OH-5 J=2.4 Hz
12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 ppm
Figure 3.21 1 Spectre RMN H du composé E (500 MHz, DMSO-d6).
Le spectre de corrélations gHMBC permet d’identifier clairement les protons en méta H-2 ( δH
6.40 ppm, J = 8.8 Hz) et H-4 ( δH 6.62 ppm, J = 8.8 Hz) ainsi que les protons en ortho H-6 ( δH
7.26 ppm, J = 2.4 Hz) et H-7 ( δH 6.65 ppm, J = 2.4 Hz, et de positionner le groupement méthoxyle en C-3 ( Figure 3.22 ).
62 Résultats et discussion C-7 C-2 C-6 C-8 C-5 C-1 C-3 C-8a C-4a C-4b C-8b C-4
OCH 3-3 4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
H-2 (ppm)
6.5 H
H-4 δ H-7 7.0 H-6
OH-8 11.0
11.5 OH-1 12.0 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 δC (ppm)
Figure 3.22
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé E (500 MHz, DMSO-d6).
Le composé E est la 1,5,8-trihydroxy-3-méthoxyxanthone ou bellidifoline ( Figure 3.23 ), dont le nom vient de Gentianella bellidifolia d’où elle a été isolée la première fois (Markham, 1964). Elle a été identifiée chez Gentianella campestris en même temps que son équivalent déméthylé, la bellidine (Kaldas et al. , 1974). Ce composé présente une activité hypoglycémique intéressante chez les rats à diabète induit par la streptozotocine (Basnet et al. , 1994; Basnet et al. , 1995; Ninosca Callo et al. , 2001).
OH
O OCH 3
OH OOH
Figure 3.23 Structure du composé E : la bellidifoline.
Le fractionnement de l’extrait méthanolique de parties aériennes de Gentianella campestris a donc conduit à l’isolement des composés majoritaires ; un flavonoïde C-glycosylé : l’isoorientine, ainsi que quatre xanthones 1,3,5,8-tétra-O-substituées : la bellidine et la bellidifoline et leur équivalent 8-O-glucosylé (Kaldas et al. , 1974).
63 Chapitre 3
3.2.2. Investigation phytochimique de l’extrait méthanolique de plantes entières de Gentianella amarella ssp. acuta
3.2.2.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de G. amarella ssp. acuta
L’extrait MeOH de Gentianella amarella ssp. acuta est analysé par HPLC/UV/APCI-IT-MS en mode positif. L’extrait présente quatre pics majoritaires, qui d’après les informations obtenues, à savoir temps de rétention, spectres UV et spectres de masse, seraient les mêmes molécules B à E que celles identifiées chez G. campestris (Figure 3.24 ). La bellidine, la bellidifoline, la norswertianoline et la swertianoline ont été effectivement déjà identifiées chez cette espèce (Kojima et al. , 1998). D B 1000 C 800 G. amarella ssp. acuta E 600 Plantes entières 400
200 0 0 5 10 15 20 25 30 B 1600
1200 G. campestris C
Intensité relative (mAU) Intensité relative 800 Parties aériennes A 400 D E 0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min) Figure 3.24 Profils chromatographiques HPLC/UV à 254 nm des extraits méthanoliques de Gentianella amarella ssp. acuta et G. campestris . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm -1 i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min .
D’un point de vue quantitatif, les xanthones D et E sont en proportions nettement supérieures chez G. amarella ssp. acuta . L’extrait contient également d’autres composés UV-actifs de plus faible intensité. Ceux qui éluent dans les 15 dernières minutes d’analyse présentent un spectre UV caractéristique des xanthones.
Le fractionnement de l’extrait méthanolique de G. amarella ssp. acuta est entrepris afin de confirmer l’identité des composés majoritaires et surtout de les obtenir en quantités suffisantes pour pouvoir effectuer des tests d’activité biologique plus approfondis.
64 Résultats et discussion
3.2.2.2. Fractionnement de l’extrait de G. amarella ssp. acuta et isolement des composés B-K
3.2.2.2.1. Partage liquide-liquide L’extrait méthanolique, après dissolution dans l’eau, est soumis à une suite de partages liquide-liquide avec des solvants de polarité croissante : éther diéthylique (Et 2O), acétate d’éthyle (AcOEt) et finalement n-butanol (BuOH). Il en résulte quatre phases dont une phase aqueuse résiduelle (Aq.) qui contient, en plus des composés B et C, les composés les plus polaires. Ce premier fractionnement permet de séparer les xanthones glycosides des aglycones (Figure 3.25 ).
600 B C D 400 MeOH E 200 35 g
0 D 2000 Et 2O E 1000 4.76 g
0 E 2000 AcOEt D 1000 2.39 g
0 1200 B
800 BuOH C Intensité(mAU) relative 7.56 g 400
0 B 2000 C Aq. 1000 20.16 g
0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min)
Figure 3.25 Profil chromatographique HPLC/UV à 254 nm des différents extraits obtenus par partage liquide-liquide à partir de l’extrait méthanolique de Gentianella amarella ssp. acuta . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min -1.
3.2.2.2.2. Fractionnement des extraits apolaires et isolement des composés D-F
Afin d’obtenir les composés d’intérêt en quantités suffisantes, les extraits AcOEt et Et 2O sont fractionnés par chromatographie de partage centrifuge (CPC). Cette technique basée sur le
65 Chapitre 3 partage des composés entre deux phases liquides non-miscibles permet de supprimer les problèmes habituellement rencontrés avec les phases solides, à savoir les éventuels phénomènes de dégradation et surtout les pertes qui peuvent résulter de l’adsorption sur les phases solides. Cette technique est une bonne alternative pour la séparation des xanthones ; en effet, ces composés s’adsorbent assez fortement sur la silice, et posent en outre des problèmes de solubilisation, ce qui limite la quantité injectable. Or dans le cas de la CPC, le volume d’injection peut atteindre 10% du volume de la colonne, ce qui permet de charger de grandes quantités d’échantillons (Renault et Zèches-Hanrot, 1995). De plus, les xanthones sont le plus souvent structurellement très proches au sein d’une même espèce et sont par conséquent difficilement séparables (Bo et Liu, 2004).
Les phases solides étant inexistantes en CPC, la qualité de la séparation va donc dépendre exclusivement du système de solvant utilisé. Le choix d’un système adapté repose sur différents critères : le mélange des solvants doit idéalement entraîner la formation rapide de deux phases de volume équivalent ; de plus, les composés à séparer doivent se répartir de manière relativement équivalente dans les deux phases, les coefficients de partage K des différents composés devant être voisin de 1 tout en étant les plus différents les uns des autres pour permettre la séparation des molécules. Le partage des solutés entre les deux phases peut être testé par HPLC – ce qui permet également de déterminer le coefficient de partage de chaque composé – ou par CCM, en utilisant comme solvant d’élution la phase organique (Hostettmann et al. , 1997).
De nombreux systèmes de solvant à base de n-hexane-acétate d’éthyle-méthanol-eau ont été développés avec succès pour la séparation de composés naturels (Oka et al. , 1991; Degenhardt et al. , 2000; Chen et al. , 2007). Quelques essais ont été réalisés sur la base de ce système en modifiant les proportions. Finalement, le système biphasique cyclohexane-AcOEt-
MeOH-H2O 5:5:3:3 a été retenu pour la séparation de l’extrait AcOEt, la phase aqueuse étant utilisée comme première phase mobile ( Figure 3.26 ). Avec ce système, quatre principaux pics sont collectés et analysés par HPLC/UV. Le premier, qui sort vers 100 min d’élution, est un mélange des composés les plus polaires présents dans l’extrait initial. D’après le spectre UV obtenu, le deuxième pic contiendrait une xanthone F relativement apolaire, et les deux derniers pics récoltés correspondent respectivement à la bellidine ( D) et à la bellidifoline ( E).
66 Résultats et discussion
3 mL.min -1 4 mL.min -1 3 mL.min -1
Inversion de phase
E D F
0 100 200 300 400500 600 Temps (min)
Figure 3.26 Profil chromatographique CPC/UV à 254 nm du fractionnement de l’extrait AcOEt issu de G. amarella ssp. acuta . Système de solvant : cyclohexane-AcOEt-MeOH-H2O 5:5:3:3. Début d’élution avec la phase aqueuse. Quantité injectée : 220 mg. Le débit est modifié en cours d’analyse afin d’accélérer la séparation.
La phase Et 2O est fractionnée avec le même système de solvant pour donner un profil semblable, le premier pic correspondant aux composés polaires étant naturellement moins intense, alors que celui correspondant à la bellidine ( D) l’est nettement plus.
La similarité de profil entre les extraits Et 2O et AcOEt, ainsi que la répétabilité de la séparation, permettent de réitérer les séparations afin d’accumuler les fractions, et ainsi d’augmenter la masse de composés obtenus. En tout, ce sont près de 2.4 g d’extraits apolaires qui sont séparés par CPC. Après analyse des fractions, celles correspondant aux composés D et E sont regroupées entre elles et laissées à cristalliser à 4°C. Cette dernière étape de purification permet d’obtenir de grandes quantités de cristaux de bellidine (470 mg) et de bellidifoline (192 mg). L’identité des composés est confirmée par comparaison des données spectrales avec celles obtenues pour la bellidine et la bellidifoline isolées de G. campestris . Les fractions contenant le composé F sont réunies et purifiées par chromatographie d’exclusion pour donner 8.1 mg de produit.
3.2.2.2.3. Fractionnement de l’extrait butanolique et isolement des composés B-K Afin d’isoler les xanthones glycosides, la phase butanolique est également séparée par CPC, cette fois avec le système de solvant ternaire CHCl3-MeOH-H2O 45:30:25 ( Figure 3.27 ). Ce mélange de solvant est couramment utilisé dans diverses proportions en chromatographie à contre-courant, et a été notamment appliqué à la séparation de flavonoïdes glycosylés ou de monoterpènes (Osorio et al. , 2000; Oliveira et al. , 2003).
67 Chapitre 3
Alors que l’analyse de la phase butanolique par HPLC/UV présentait deux principaux pics, le profil chromatographique obtenu par CPC à la même longueur d’onde en révèle davantage. Les pics sont récoltés sous la forme de huit fractions principales, sept étant obtenues lors de l’élution avec la phase organique, auxquelles s’ajoute une fraction b contenant le grand pic qui sort dès l’inversion de phase.
b j
Inversion de phase e g c d h i
0 100 200 300 400 500 600 700 Temps (min)
Figure 3.27 Profil chromatographique CPC/UV à 254 nm du fractionnement de l’extrait BuOH issu de G. amarella ssp. acuta . Système de solvant : CHCl 3-MeOH-H2O 45:30:25. Début d’élution avec la phase organique. Quantité injectée : 600 mg.
Les fractions récoltées sont analysées par HPLC/UV/MS, ce qui permet tout d’abord de constater qu’elles sont relativement pures. La fraction b contient essentiellement le composé B. De la même manière, les deux premiers pics élués correspondent respectivement aux composés E et D, et le dernier pic collecté lors de l’élution en phase organique semble être le composé C. L’analyse des fractions g, h, i et j conduit à un profil HPLC relativement similaire, avec un temps de rétention équivalent à celui du composé C, et un spectre UV propre aux xanthones, ce qui indique que le pic qui élue autour de 17 min dans le chromatogramme de la phase butanolique ne correspond pas uniquement à la swertianoline mais contient d’autres xanthones ( Figure 3.28 ). Les fractions g et j présentent des spectres de masse identiques, avec un ion pseudo-moléculaire à m/z 467 [M+H] + et un fragment à m/z 305 [M+H-162] +. L’analyse de la fraction h révèle un ion à m/z 481 [M+H] + ainsi qu’un fragment à m/z 319 [M+H-162] +. Concernant la fraction i, le spectre de masse donne un ion pseudo-moléculaire à m/z 451 [M+H] +, et deux fragments, l’un à m/z 289 [M+H-162] +, l’autre à m/z 273 [M+H-
68 Résultats et discussion
162-16] +. Tous les composés présentent donc dans leur spectre de masse, en plus de l’ion parent, un fragment [M+H-162] + indiquant la perte d’un hexose.
300 g m/z 467
0 0 10 20 30
800 h m/z 481
0 0 10 20 30
200 i m/z 451
0 0 10 20 30
200 j m/z 467
0 0 10 20 30
30 c m/z 437
0 0 10 20 30 Figure 3.28 Profils chromatographiques HPLC/UV à 254 nm des fractions g, h, i, j et c obtenues par CPC de l’extrait butanolique de Gentianella amarella ssp. acuta . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min -1.
L’ensemble de ces données permet d’émettre quelques hypothèses quant à la structure des xanthones G-J. Concernant les composés G et J, leur masse moléculaire de 466 Da indiquerait qu’il s’agit de xanthones pentaoxygénées diméthylées substituées par un hexose. Le composé I, avec une masse moléculaire inférieure de 16 Da, correspondant à un atome d’oxygène, pourrait être une xanthone tétraoxygénée substituée par un hexose et deux méthyles. Quant au composé H, avec une masse de 480 Da, il pourrait s’agir d’une xanthone pentaoxygénée substituée par un hexose et trois méthyles ; jusqu’à ce jour, seule une xanthone avec un tel schéma de substitution a été identifiée (Ghosal et Biswas, 1979).
Afin de pouvoir obtenir les produits en quantité suffisante pour déterminer leur structure et étudier leur activité biologique, mais également afin de vérifier la répétabilité de la méthode, d’autres séparations de l’extrait butanolique ont été effectuées dans les mêmes conditions, puis les fractions équivalentes (correspondant aux pics e à b) ont été regroupées après analyse
69 Chapitre 3 chromatographique. Un total de 3 g d’extrait butanolique a ainsi été fractionné. Les fractions ont ensuite été soumises à différentes techniques séparatives, essentiellement par CPC et chromatographie d’exclusion sur gel Sephadex® LH-20 afin de conduire aux composés G (10.4 mg), H (2.3 mg), I (12.3 mg) et J (8.9 mg) (Figure 3.29 ).
Extrait BuOH de Gentianella amarella ssp. acuta 3 g
CPC
CHCl 3-MeOH-H2O 45:30:25
f g f h f i f j f c f b 30.9 mg 50.0 mg 20.4 mg 26.0 mg 33.8 mg 1.5 g
CPC CPC Cristallisation Cristallisation CPC CC CHCl 3-MeOH-H2O CHCl 3-MeOH-H2O cyclohexane- LH-20 45:22:33 45:22:33 AcOEt-MeOH-H2O 1:5:1:5 f 1 f 2 f 3 f 1 f 2 f 3 I f 3 f 4 f 5 CC 3.8 mg LH-20 CC G I G I J C B LH-20 7.6 mg 0.8 mg 1.4 mg 7.6 mg 8.9 mg 9.0 mg 23.4 mg f 1 f 2 f 3 K CPC CPC 4.1 mg cyclohexane- cyclohexane- CPC AcOEt-MeOH-H O 2 AcOEt-MeOH-H2O cyclohexane- 1:5:1:5 1:3:1:3 AcOEt-MeOH-H2O 5:5:3:3
G H G H I H 0.9 mg 0.3 mg 0.5 mg 0.8 mg 0.1 mg 1.2 mg
Figure 3.29 Schéma du fractionnement de l’extrait butanolique de G. amarella ssp. acuta .
Le composé C (9.0 mg) a été purifié par CPC à partir de la fraction correspondante. La fraction b a été soumise à une chromatographie d’exclusion pour donner le composé B (23.4 mg) ainsi qu’une fraction contenant un composé majoritaire présentant un temps de rétention de 18.6 min ; ce composé K (4.1 mg) a été purifié par chromatographie d’exclusion.
Ainsi, bien que les analyses par HPLC/UV/MS laissaient penser que les fractions issues de la CPC étaient relativement pures, il s’avère que chacune contenait en réalité plusieurs composés. C’est surtout le cas des fractions g, h et i, qui renfermaient un mélange des trois composés correspondants, en proportions différentes. La similitude de leur comportement chromatographique et leur spectre UV relativement semblable ne permettaient donc pas de les distinguer dans ces conditions d’analyse. Ce sont les séparations par CPC qui ont permis de mettre en évidence l’hétérogénéité de composition des fractions.
70 Résultats et discussion
L’ensemble des chromatographies de partage a été effectuée en gardant les deux systèmes de solvant utilisés pour les fractionnements initiaux, à savoir cyclohexane-AcOEt-MeOH-H2O ou CHCl 3-MeOH-H2O, en faisant varier les proportions de chaque solvant de manière à optimiser la séparation des différents composés à isoler. Ainsi, le système cyclohexane-
AcOEt-MeOH-H2O 1:3:1:3 entraîne une bonne séparation des composés G, H et I, permettant ainsi leur isolement (Figure 3.30 ). H
G I
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Temps (min)
Figure 3.30 Profil chromatographique CPC/UV à 254 nm du fractionnement de la fraction 2 issue de la CPC sur la fraction h. Système de solvant : cyclohexane-AcOEt-MeOH-H2O 1:3:1:3. Début d’élution avec la phase organique. Quantité injectée : 2.7 mg.
L’utilisation de la chromatographie de partage centrifuge a donc permis d’isoler six xanthones F-K à partir de l’extrait méthanolique de plantes entières de G. amarella ssp. acuta , en plus des xanthones B à E précédemment identifiées chez G. campestris .
3.2.2.3. Détermination de structure des composés F-K
3.2.2.3.1. Détermination de structure du composé F Le composé F est obtenu sous la forme d’une poudre amorphe de couleur jaune orangé. Tout comme les xanthones D et E, il ne s’ionise pas en APCI, ce qui peut laisser supposer que c’est une xanthone aglycone. Il s’ionise en revanche en électrospray, et l’analyse HRMS en mode négatif indique un ion pseudo-moléculaire à m/z 517.0392 [M-H] - ( Figure 3.31 ). Ceci permet de déduire sa formule moléculaire comme étant C 26 H14 O12 (calculée pour 517.0407).
Il est intéressant de noter que la formule moléculaire du composé F (C26 H14 O12 ) est à deux atomes d’hydrogène près le double de la formule de la bellidine (C13 H8O6), ce qui laisse penser que la molécule F pourrait être un dimère de xanthone.
71 Chapitre 3
ESI-TOF-MS 517.0392 [M-H] - 100 abondance relative (%) relative abondance 0 200 400 600 800 1000 m/z Figure 3.31 Spectre UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif du composé F.
Le spectre RMN du proton révèle six signaux correspondant à des protons aromatiques, ainsi que cinq singulets caractéristiques de groupements hydroxyles, intégrant au total pour huit protons (Figure 3.32 ). Ces observations confortent l’idée de deux xanthones tétraoxygénées reliées entre elles par une liaison carbone-carbone. Parmi les protons aromatiques, on distingue nettement deux protons qui corrèlent en ortho à 6.64 et 7.26 ppm ( J = 8.8 Hz), deux qui corrèlent en méta à 6.24 et 6.45 ppm ( J = 2 Hz), ainsi que deux singulets à 6.60 et 7.15 ppm. Les valeurs de déplacement observées pour les protons en ortho sont identiques à celles des protons H-6 et H-7 observées pour la bellidine et la bellidifoline. De la même manière, les valeurs de déplacement des protons couplant en méta sont semblables à celles des protons H-2 et H-4 ; le composé F semble donc être un dimère de xanthone 1,3,5,8-tétraoxygénée.
H-6 H-4’
H-6’ H-4 H-2 H-7’ J= 8.8 Hz J= 2.4 Hz J= 2.0 Hz J= 8.8 Hz
OH OH OH OH OH
12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm Figure 3.32 1 Spectre RMN H du composé F (500 MHz, DMSO-d6).
72 Résultats et discussion
Les corrélations gHSQC permettent d’obtenir davantage d’informations sur la position des protons. Les valeurs de déplacements des carbones porteurs des protons δH 6.24, 6.45, 7.26 et 6.64 ppm sont identiques à celles des carbones C-2, C-4, C-6 et C-7 des xanthones 1,3,5,8- tétraoxygénées, ce qui renforce l’hypothèse émise précédemment. Par ailleurs, le déplacement du carbone porteur du proton δH 7.15 ppm est de δC 126.6 ppm, ce qui est une valeur caractéristique du carbone C-6, et le proton δH 6.60 ppm est porté par un carbone à δC 93.9 ppm, ce qui indique une position en C-4. Ces observations, associées à celles des corrélations 1H-13 C à longues distances, permettent de confirmer que le composé F est bien une bisxanthone, dimère de la bellidine, liée par une liaison 7-2’ ( Figure 3.33 ). Cette molécule, la swertiabisxanthone-I, a été identifiée jusqu’à présent uniquement chez Swertia macrosperma C.B.Clarke, une autre Gentianaceae (Zhou et al. , 1989).
δ H 6.60 δ OH H OH H H 7.15 H O OH H O OH
2' 7 H H OH O OH OH O OH Figure 3.33 Principales corrélations gHMBC et structure du composé F : la swertiabisxanthone-I.
Etonnamment, le carbone C-7 impliqué dans la liaison entre les deux monomères n’est pas décelable par RMN avec la séquence impulsionnelle gHMBC utilisée. Les auteurs ayant précédemment identifié la swertiabisxanthone-I ont rencontré le même problème, mais cette fois lors de la mesure d’un spectre APT ( Attached Proton Transfer ), et ont émis l’hypothèse que ce phénomène était attribuable à un temps de relaxation particulièrement long. La mesure effectuée sur un autre instrument avec un programme de pulse modifié a permis d’observer ce carbone à une valeur de déplacement de 124.9 ppm (Zhou et al. , 1989).
3.2.2.3.2. Détermination de structure du composé G Le composé G est une poudre amorphe jaune, dont le spectre UV est caractéristique des xanthones. Toutefois, les valeurs des maxima et minima d’absorption sont nettement hypsochromes comparées à celles des xanthones B à E (λmax 236, 266, 340 nm ; λmin 286), et la deuxième bande à 266 nm est nettement plus intense.
73 Chapitre 3
La formule moléculaire du composé G, C 21 H22 O12 , est déduite sur la base de l’ion pseudo- moléculaire à m/z 465.0994 [M-H] - obtenu en masse haute résolution ESI-TOF en mode négatif (calculée pour 465.1033). Son spectre de masse en mode positif par APCI-IT confirme un poids moléculaire de 466 Da, et indique la présence d’un sucre par un fragment résultant de la perte d’un hexose ( Figure 3.34).
ESI-TOF-MS 465.0994 [M-H] - APCI-IT-MS 466.8 [M+H] + 100 100
80 - 162 60
40
20 305.2 [M+H-Glc]+ abondance relative (%) abondance relative (%) 483.1
0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.34 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé G.
La présence d’un β-glucose est confirmée par le spectre RMN du proton ( δH entre 3.2 et 5.1 ppm) ( Figure 3.35). Le spectre 1H met en évidence deux protons du cycle B couplant en ortho
(δH 6.99 et 7.60 ppm, J = 8.8 Hz) ainsi qu’un singulet à δH 6.59 ppm.
OCH 3-4 OCH -3 H2O 3 H-3’, 5’, 2’
H-6’a J=11.2 Hz
H-1’ H-6’b J=7.3 Hz J=11.0, H-2 5.1 Hz OH Glc H-4’ H-6 OH H-5 J=8.8 Hz Glc J=8.8 Hz
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
Figure 3.35 1 Spectre RMN H du composé G (500 MHz, DMSO-d6).
74 Résultats et discussion
L’ensemble de ces informations permet d’affirmer que le composé G est une xanthone penta- oxygénée, substituée par deux hydroxyles libres, deux méthoxyles, ainsi qu’un hexose. L’hydrolyse enzymatique permet d’identifier ce dernier comme étant le β-D-glucose. Le spectre RMN de corrélations hétéronucléaires à longue distance gHMBC indique que le glucose est rattaché à un carbone dont la valeur de déplacement est δC 140.4 ppm ( Figure 3.36). Les deux protons en ortho corrèlent avec ce carbone, ce qui signifie que le glucose est positionné sur le cycle B, et qu’il est respectivement en position méta et ortho de ces deux protons. -4 3 OCH C-5’ C-8b C-1’ C-6’ C-3’ C-4’ C-1 C-2’ C-4a C-2 C-6 C-4 C-8 C-5 C-7 C-4b C-8a C-3
3.0 H-2’-6’ 3.5 OCH 3-4 4.0 OCH 3-3 4.5 H-1’ 5.0 (ppm)
5.5 H δ 6.0
H-2 6.5 H-5 7.0
H-6 7.5 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 δ C (ppm)
Figure 3.36 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé G (500 MHz, DMSO- d6).
La valeur de déplacement du carbone porteur permet d’exclure d’ores et déjà les positions 6 et 8, dont les valeurs seraient alors autour de 150 ppm. Le glucose est donc soit en position 5 avec les protons en 6 et 7, soit en position 7 avec les protons en 5 et 6. Le proton à δH 6.59 ppm corrèle avec les carbones à δC 160.1 et 128.1 ppm, qui sont les carbones porteurs des groupements méthoxyles, ce qui indique que les deux groupements OCH 3 sont situés sur le cycle A. De plus, le spectre RMN de corrélations hétéronucléaires à courte distance gHSQC donne une valeur de déplacement δC 56.5 ppm pour l’un des méthoxyles et δC 60.9 ppm pour le second ( Figure 3.37).
75 Chapitre 3
-4 3 -3 3 OCH OCH C-3’ C-5’ OCH C-1’ C-4’ C-8b C-2’ C-6’ C-5 C-2 C-6 C-8a C-4
3.0 H-2’-6’ 3.5 OCH 3-4 4.0 OCH 3-3 4.5 H-1’ 5.0
5.5 (ppm) H δ 6.0
H-2 6.5
H-5 7.0
H-6 7.5
128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 δC (ppm) Figure 3.37
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHSQC du composé G (500 MHz, DMSO-d6).
Cette différence de déplacement d’environ 4 ppm vers les bas champs est caractéristique d’un méthoxyle situé en position ortho de deux oxygènes (Miura et al. , 1978) (Figure 3.38).
CH3 δC ≈ 61 ppm O O O CH3 δC ≈ 56 ppm
Figure 3.38 Valeurs de déplacements d’un carbone d’un groupe méthoxyle selon son environnement chimique.
L’analyse des valeurs de déplacement des carbones des méthoxyles et des carbones porteurs permet de positionner les méthoxyles en position 3 ( δC 160.1 ppm ; δC OCH 3 56.5 ppm) et 4
(δC 128.1 ppm ; δC OCH 3 60.9 ppm), et donc d’attribuer la position 2 au proton à δH 6.59 ppm. L’ensemble de ces données conduit alors à deux hypothèses en accord avec les déplacements et corrélations observés : l’une avec le glucose en position 7 et l’autre avec le glucose en position 5 (Figure 3.39).
76 Résultats et discussion
δ H 6.99 CH3 CH3 H O OGlc O
δ 107 δ 141 H 7.60 H O O H 7.60 H O O 125 153 125 149 CH3 CH3
141 107 107 107 149 δ 153 GlcO H 6.99 H OH O OH OH O OH Figure 3.39 Hypothèses de substitution du cycle B et principales corrélations hétéronucléaires gHMBC.
Kaldas a remarqué que les xanthones pentasubstituées en 1,3,4,5,8 – à la manière de celles tétrasubstituées en 1,3,5,8 – présentaient systématiquement un maximum d’absorption aux alentours de 275 nm, en plus d’une bande intense vers 255 nm, ce qui n’est pas le cas chez les xanthones substituées en 1,3,7,8 (Kaldas, 1977). Cette constatation s’applique également aux xanthones 1,3,4,7,8 pentasubstituées (Wolfender, 1993). Or cette bande aux environs de 275 nm est absente dans le spectre UV du composé G (Figure 3.40 ), et se retrouve en revanche dans le spectre de la 1,5,8-trihydroxy-3,4-diméthoxyxanthone (Tan et al. , 2003).
1.0 composé G 1,3,5,8-tétrahydroxyxanthone
278 0.5 absorbance
0 200 300 400 500 nm Figure 3.40 Spectres UV du composé G et de la 1,3,5,8-tétrahydroxyxanthone (MeOH).
Le glucose est par conséquent en position 7, ce qui permet d’identifier le composé G comme étant le 1,8-dihydroxy-3,4-diméthoxyxanthone-7-O-β-D-glucopyranoside ou triptexanthoside C, identifié jusqu’à présent uniquement chez Tripterospermum japonicum Maxim. de la famille des Gentianaceae (Figure 3.41).
77 Chapitre 3
CH3 O OH 5 O 4 O 6 3 HO O CH3 HO 7 2 OH O 8 1 OH OOH Figure 3.41 Structure du composé G : le triptexanthoside C.
3.2.2.3.3. Détermination de structure du composé H Le composé H est obtenu sous forme de poudre amorphe jaune pâle. Son analyse par APCI- MS en mode positif indique une masse moléculaire de 466 Da ainsi que la présence d’un hexose ( Figure 3.42). L’analyse en haute résolution confirme cette masse par l’observation d’un adduit formiate à m/z 511.1080 [M+HCOO] - et permet de déduire la formule moléculaire comme étant C 21 H22 O12 (calculée pour 511.1088). Cette formule est identique à celle du composé G et laisse présager un isomère de position.
ESI-TOF-MS 511.1080 [M+HCOO] - APCI-IT-MS 466.7 [M+H] + 100 100
80
- 162 60
40
20 + abondance relative (%) 305.2 [M+H-Glc] abondance relative (%) 181.7 0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z
Figure 3.42 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé H.
L’analyse par HPLC/APCI-MS de la fraction h indiquait pourtant un ion pseudo-moléculaire à m/z 481 [M+H] +. Il est possible que cette masse corresponde à un produit minoritaire mais facilement ionisable présent dans la fraction.
Le spectre RMN du proton confirme la présence de deux groupements méthoxyles ( δH 3.86 et
3.91 ppm), de deux hydroxyles ( δH 11.18 et 11.64 ppm), d’un glucose, et de trois protons, dont deux liés au cycle B qui corrèlent en ortho à δH 6.75 et 7.50 ppm ( J = 8.8 Hz), ainsi
78 Résultats et discussion
qu’un singulet à δH 6.68 ppm lié par conséquent au cycle A (Figure 3.43). Les signaux correspondant aux hydroxyles aromatiques sont caractéristiques de groupements OH établissant un pont hydrogène avec la cétone, et sont donc situés en positions 1 et 8.
OCH 3-4 H2O, OCH 3-5 H-5’, 2’, 3’
H-6’b H-7 J=8.8 Hz H- H-1’ OH 6’a H-2 H-4’ H-6 OH Glc J=8.8 Hz Glc
OH OH
12 11 8 7 6 5 4 3 ppm Figure 3.43 1 Spectre RMN H du composé H (500 MHz, DMSO-d6).
Le spectre de corrélations gHMBC indique que le groupement OCH 3 à δH 3.91 ppm est rattaché au cycle B par le carbone δC 140.0 ppm, et que le OCH 3 à δH 3.86 ppm est quant à lui rattaché au cycle A par le carbone δC 129.2 ppm (Figure 3.44). Le spectre indique par ailleurs que le glucose est également rattaché au cycle A par le carbone à δC 158.3 ppm. C-4 C-8a C-8b C-3 C-1 C-8 C-4b C-5
OCH 3-4 OCH 3-5 4.0
4.5
H-1’ 5.0
5.5 (ppm)
6.0 H δ δ
6.5 H-2 H-7 7.0
H-6 7.5
160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 δ (ppm) C Figure 3.44 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé H (500 MHz, DMSO- d6).
79 Chapitre 3
Le spectre de corrélations à courtes distances gHSQC donne une valeur de déplacement de δC 60.8 ppm pour le méthoxyle situé sur le cycle A, ce qui signifie qu’il est en position ortho de deux atomes d’oxygène. Il est par conséquent soit en position 2, en ortho de l’hydroxyle en C- 1 et du glucose en C-3, soit en position 4, où il serait alors en ortho de l’oxygène du cycle C et du glucose, toujours en C-3. Ces deux hypothèses permettent d’ores et déjà de confirmer la position du glucose sur le carbone 3. Par ailleurs, la corrélation observée entre le proton à δH
6.68 ppm avec le carbone 1 à δC 156.9 ppm permet de positionner définitivement le proton en C-2 et par conséquent le méthoxyle en C-4.
Concernant le cycle B, les deux protons corrèlent avec le carbone à δC 153.1 ppm, qui correspond au carbone 8 porteur du groupement OH. Ceci implique que les protons sont en position 6 ( δH 7.50 ppm, δC 121.7 ppm) et 7 ( δH 6.75 ppm, δC 109.1 ppm), et que le méthoxyle est par conséquent en position 5. Finalement, l’hydrolyse enzymatique confirme que le composé H isolé est le 1,8-dihydroxy- 4,5-diméthoxyxanthone-3-O-β-D-glucopyranoside (Figure 3.45). Ce composé est un nouveau glycoside de la corymbiférine.
H3C CH3 OH O O HO OH 5 O 4 O 6 3 O OH 7 2 8 1 OH OOH Figure 3.45 Structure du composé H : le corymbiférine-3-O-β-D-glucopyranoside.
3.2.2.3.4. Détermination de structure du composé I Le composé I se présente sous forme de cristaux jaunes dont le spectre UV présente quatre maxima très nets caractéristiques des xanthones. Son spectre de masse en APCI positif donne un ion pseudo-moléculaire à m/z 451 [M+H] +, indiquant une masse moléculaire de 450 Da, et un fragment caractéristique de la perte d’un hexose à m/z 289 [M+H-162] +. Le spectre de masse haute résolution ESI-TOF-MS en mode négatif permet de déterminer sa formule brute - comme étant C 21 H22 O11 , sur la base de l’adduit formiate observé à m/z 495.1139 [M+HCOO] (calculée pour 495.1139) ( Figure 3.46). Cette formule diffère d’un atome d’oxygène par rapport aux composés G et H, ce qui peut laisser supposer une structure tétraoxygénée substituée par un hexose et deux groupements méthyles.
80 Résultats et discussion
ESI-TOF-MS 495.1139 [M+HCOO] - APCI-IT-MS 451.0 [M+H] + 100 100
80 - 162 60
40
20 289.2 [M+H-Glc]+ 467.7 abondance relative (%) abondance relative (%) 445.0 234.0 347.0 0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.46 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé I.
Le spectre RMN du proton exhibe effectivement deux signaux relatifs à des groupements méthoxyles à δH 3.81 et 3.94 ppm, ainsi que des signaux correspondant au β-glucose (proton anomérique δH 4.96 ppm, J = 7.3 Hz) ( Figure 3.47).
H-8 H2O J= 2.9 Hz OCH 3-4 H-2’, 5’, 3’
H-5 OCH 3-3 J= 8.8 Hz H-6 J= 9.3, 2.9 Hz
H-6’a J=12.7 Hz
H-6’b H-2 H-1’ J=11.2, J=7.3 Hz 5.4 Hz H-4’ OH Glc OH Glc
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm Figure 3.47 1 Spectre RMN H du composé I (500 MHz, DMSO-d6).
La zone des protons aromatiques fait apparaître un singulet à δH 6.60 ppm, et un ensemble de signaux regroupés entre δH 7.5 et 7.7 ppm. Ce groupe se compose en fait de deux doublets ( δH
7.70 ppm, J = 2.9 Hz, et δH 7.66 ppm, J = 8.8 Hz) et d’un doublet dédoublé qui couple donc
81 Chapitre 3
avec les deux précédents signaux ( δH 7.58 ppm, J = 9.3, 2.9 Hz). Ceci implique un système ABX, avec un hydrogène situé d’une part en position ortho d’un proton et d’autre part en position méta d’un autre. Compte-tenu des schémas de substitution biosynthétiques, cette disposition implique que le composé I dérive d’une 1,3,7-trihydroxyxanthone et que les protons soient en positions 5, 6 et 8 du cycle B. Par conséquent, le singulet à δH 6.60 ppm correspond à un proton situé soit en C-2, soit en C-4. Le spectre RMN de corrélations hétéronucléaires à longues distances gHMBC indique que le glucose est porté par le carbone δC 153.8 ppm ; or ce carbone corrèle également avec les protons du cycle B ( Figure 3.48). Par conséquent le glucose est fixé en C-7. Les deux méthoxyles sont donc sur le cycle A, ce que confirme le spectre gHMBC. C-9 C-3 C-1 C-7 C-4b C-4 C-6 C-8a C-8b
OCH 3-4 4.0 OCH 3-3 4.5
H-1’ 5.0
5.5
6.0 (ppm) H δ H-2 6.5 7.0
7.5
184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 7.55 H-6 7.60
7.65 (ppm) H
H-5 δ H-8 7.70
180 170 160 150 140 130 120 δ (ppm) C Figure 3.48
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé I (500 MHz, DMSO-d6).
Par ailleurs, le spectre gHSQC indique une valeur de déplacement de δC 56.5 ppm pour l’un des méthoxyles et de δC 60.9 ppm pour le second. Ils sont donc en ortho l’un de l’autre, soit en position 3 et 4, soit en position 2 et 3. Or le proton à δH 6.60 ppm corrèle avec le carbone
C-1 à δC 159.8 ppm, ce qui implique qu’il soit en position 2. L’hydrolyse enzymatique confirme l’identité du sucre comme étant le β-D-glucose.
82 Résultats et discussion
Par conséquent, le composé isolé est le vératriloside ou 1-hydroxy-3,4-diméthoxyxanthone-7- O-β-D-glucopyranoside ( Figure 3.49).
H3C H O H 5 O 4 O OH 6 3 H CH3 O 7 2 HO H 8 1 HO H O H OH H H H O OH Figure 3.49 Structure du composé I : le vératriloside, et principales corrélations gHMBC.
Cette molécule tient son nom de Veratrilla baillonii Franch., Gentianaceae d’où elle a été isolée pour la première fois (Yang et Zhou, 1980). Elle a depuis été identifiée chez quatre espèces de Gentianella balkaniques (Jankovic et al. , 2005). C’est la première fois qu’elle est identifiée chez G. amarella ssp. acuta .
3.2.2.3.5. Détermination de structure du composé J Le composé J est obtenu sous forme de cristaux jaunes. Son spectre de masse haute résolution permet de déduire sa formule moléculaire C 21 H22 O12, d’après l’ion pseudo-moléculaire à m/z 465.0997 [M-H] - (calculée pour 465.1033). L’ionisation par APCI en mode positif entraîne la perte d’un hexose, caractérisée par un fragment à m/z 305 [M+H-162] + ( Figure 3.50 ).
- APCI-IT-MS ESI-TOF-MS 465.0997 [M-H] 466.7 [M+H] + 100 100
80 - 162
60
40 305.2 [M+H-Glc]+
20 abondance relative (%) abondance relative (%) 181.8 223.9 449.0 0 0 100 200 300 400 500 600 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.50 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé J.
83 Chapitre 3
Le spectre RMN du proton confirme la présence d’un β-glucose (proton anomérique δH 4.90 ppm, J = 7.8 Hz), et présente deux signaux caractéristiques de groupes méthoxyles ( δH 3.87 et
3.90 ppm), ainsi que trois signaux de protons aromatiques : un singulet à δH 6.77 ppm, et deux doublets couplant en ortho δH 6.68 et 7.42 ppm, J = 8.8 Hz) ( Figure 3.51 ).
OCH -4 OCH 3-5 3
H-1’ H O J=7.8 Hz 2 H-2 H-7 H-2’, H-6 OH Glc OH-8 J=8.8 Hz 5’, 3’ J=8.8 Hz OH OH-3 H-6’b Glc H-6’a H-4’
12.0 11.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm Figure 3.51 1 Spectre RMN H du composé J (500 MHz, DMSO-d6).
Dans les bas champs, deux signaux correspondant à des hydroxyles aromatiques apparaissent également : l’un sous forme de singulet large, et l’autre sous forme de fin singulet, ce qui signifie qu’il est stabilisé par un pont hydrogène avec la cétone et qu’il se trouve donc en position 1 ou 8.
L’analyse du spectre de corrélations hétéronucléaires à longues distances permet de confirmer la position du groupement hydroxyle en C-8 ( δC 153.8 ppm) par la corrélation observée avec le carbone 8a ( δC 108.6 ppm) ( Figure 3.52). Par ailleurs, les deux protons en ortho couplent avec le carbone 8, ce qui signifie qu’ils sont en position 6 et 7. Ils corrèlent également tous les deux avec un carbone dont le déplacement chimique est de 139.3 ppm, qui correspond par conséquent au carbone 5. Ce carbone couple avec les protons du méthoxyle à δH 3.90 ppm, ce qui signifie que ce méthoxyle est rattaché au cycle B en C-5. Le second méthoxyle et le glucose sont donc rattachés au cycle A.
84 Résultats et discussion C-8a C-1 C-5’ C-7 C-8 C-5 C-2 C-3’ C-2’ C-4’ C-4a C-4b C-4 C-1’ C-6 C-8b C-3
3 OCH 3-4 4 OCH 3-5 H-1’ 5
6 H-7 H-2 7 H-6 8 (ppm) H
9 δ
10
11
12 OH-8
160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 δC (ppm) Figure 3.52
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé J (500 MHz, DMSO-d6).
Le spectre de corrélations à courtes distances indique que le carbone du méthoxyle à δH 3.87 ppm a une valeur de déplacement de δC 60.7 ppm, ce qui signifie qu’il est en ortho de deux oxygènes, donc soit en position 2, soit en position 4. L’hydroxyle libre qui apparaît à δH 10.98 ppm ne peut pas être en C-1 car il établirait alors une liaison hydrogène avec la cétone et se présenterait par conséquent sous forme de fin singulet ; il ne peut par conséquent être qu’en position 3. Dès lors le glucose ne peut être rattaché qu’en C-1, ce qui est confirmé par la valeur de déplacement observé (δC 154.4 ppm). De plus, le proton à δH 6.77 ppm corrèle avec le carbone C-1, ce qui implique qu’il est en position 2.
Par conséquent, le composé J isolé est le 3,8-dihydroxy-4,5-diméthoxyxanthone-1-O-β-D- glucopyranoside ou corymbiférine-1-O-β-D-glucopyranoside ( Figure 3.53 ). Ce composé, répandu chez les gentianes du genre Gentianella (Kaldas et al. , 1975; Carbonnier et al. , 1977; Hostettmann-Kaldas et Jacot-Guillarmod, 1978; Massias et al. , 1981; Jankovic et al. , 2005), est identifié pour la première fois chez G. amarella ssp. acuta .
85 Chapitre 3
H3C CH3 O O H 5 O 4 OH 6 3
7 2 8 1 H H H H OH OH O O HO OH H O OH H H Figure 3.53 Principales corrélations gHMBC et structure du composé J : le corymbiférine-1-O-β-D- glucopyranoside.
3.2.2.3.6. Détermination de structure du composé K Le composé K est obtenu sous la forme d’une poudre amorphe de couleur orange. Son spectre UV est similaire aux spectres observés pour les xanthones 1,3,5,8-tétrasubstituées. Sa formule moléculaire est déduite comme étant C 32 H24 O17 sur la base de l’ion pseudo-moléculaire observé à m/z 679.0891 [M-H] - en UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif (calculée pour 679.0877) ( Figure 3.54).
ESI-TOF-MS 679.0891 [M-H] - APCI-IT-MS 681.1 [M+H] + 100 100
80 - 162
60
40 519.1 [M+H-Glc]+
20 561.1 662.9 735.8 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 513.3 181.6 315.1 413.2 591.1 621.1 0 0 200 400 600 800 1000 200 300 400 500 600 700 800 m/z m/z Figure 3.54 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS en mode négatif et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé K.
Le spectre de masse par APCI-MS permet par ailleurs d’observer la perte d’un hexose par un fragment à m/z 519 [M+H-162] +. Il est intéressant de constater que cette masse de 519 correspond à une unité près à deux xanthones tétraoxygénées non substituées (masse
86 Résultats et discussion moléculaire de 260 Da chacune), ce qui pourrait laisser supposer que la xanthone K est en fait une bisxanthone. Par ailleurs, la fragmentation par APCI-MS n’entraîne aucun fragment pouvant correspondre à la perte d’un monomère de xanthone. Ces observations permettent de penser que le composé K pourrait être une bisxanthone O-glycosylée dont les deux unités seraient reliées entre elles par une liaison carbone-carbone.
Le spectre RMN du proton confirme la présence d’un β-glucose (proton anomérique δH 4.75 ppm, J = 7.8 Hz) et présente six signaux correspondant à des protons aromatiques : deux doublets qui corrèlent en méta ( δH 6.16 et 6.36 ppm, J = 1.4 Hz), deux doublets qui corrèlent en ortho ( δH 7.13 et 7.24 ppm, J = 9.3 Hz), ainsi que deux singulets, l’un à 6.45 ppm et l’autre à 7.15 ppm ( Figure 3.55).
H2O H-2’’, 5’’, 3’’
H-6 H-4’’
H-6’b J=11.5, 5.6 Hz
H-6’ H-7’ H-4 H-2 J=9.2 Hz J=9.2 Hz H-1’’ J=1.5 Hz J=1.5 Hz J=7.8 Hz H-6’a OH J=11.2 Hz H-4’ Glc OH Glc
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm Figure 3.55 1 Spectre RMN H du composé K (500 MHz, DMSO-d6).
Les corrélations héréronucléaires 1H-13 C à courtes distances permettent d’obtenir davantage d’informations sur la position des protons aromatiques ( Figure 3.56). En effet, les valeurs de déplacement des carbones porteurs des protons δH 6.16 ppm ( δC 98.6 ppm), δH 6.36 ppm ( δC
95.0 ppm), et δH 6.45 ppm (δC 94.4 ppm) sont caractéristiques des carbones 2 ou 4 du cycle A. De la même manière, les trois autres protons sont portés par des carbones dont les valeurs de déplacement sont courantes au niveau du cycle B ( δC entre 112 et 127 ppm). Ces observations confortent l’idée d’une bisxanthone.
87 Chapitre 3
C-4 C-2 C-2’’ C-4’’ C-6’’ C-4’ C-6 C-6’ C-7’ C-5’’ C-3’’ C-1’’
3.5
4.0
4.5 H-1’’ 5.0
5.5 (ppm) H δ H-2 6.0 H-4 H-4’ 6.5 H-7’ H-6 7.0 H-6’ 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 δC (ppm) Figure 3.56
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHSQC du composé K (500 MHz, DMSO-d6).
Les données gHMBC permettent de tracer des ébauches de la molécule. Tout d’abord le proton anomérique du glucose corrèle avec un carbone à δC 151.0 ppm, lui-même impliqué 1 dans des corrélations avec les protons δH 7.13 et 7.24 ppm. L’ensemble des corrélations H- 13 C de ces deux protons permet de définir l’ébauche d’un cycle B. De la même manière, les corrélations observées pour les protons δH 6.16 et 6.36 ppm permettent de définir un cycle A (Figure 3.57).
δ R1 H 6.36 δ 140 H H 7.24 H 122 O 146 95 OH B O 158 168 114 108 δ A H 7.13 H 151 102 100 H δ HHOO O O 162 H 6.16 H O O OH H OH H HHOO H HOH Figure 3.57 Ebauches de cycles B et A d’après les corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé K.
88 Résultats et discussion
Les corrélations du proton δH 6.45 ppm permettent de le positionner en C-4 d’un second cycle
A, et celles observées pour le proton à δH 7.15 ppm le place en C-6 d’un second cycle B (Figure 3.58). δ H 6.45
H R3 94 δ 137 O 156 167 OH H 7.15 H 128 O 144 A B 113 102 R2 R4 152 113 O R O OH 5
Figure 3.58 Ebauches de cycles B et A d’après les corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé K.
De plus, le proton à δH 7.15 ppm corrèle avec le carbone à δC 113.2 ppm, qui a été identifié comme le carbone 2 du second cycle A. Ceci permet donc de reconstituer les deux monomères et d’identifier la liaison entre les deux xanthones entre le C-7 et le C-2’. Le composé K est par conséquent la forme 8’-O-glucosylée du composé F précédemment identifié ( Figure 3.59).
OH OH
5' O 4' OH 5 O 4 OH 6' 3' 6 3
7' 2' 7 2 OH 8' 1' 8 1
HO O O O OH OH OOH HO OH Figure 3.59 Structure du composé K : le swertiabisxanthone-I-8’-O-β-D-glucopyranoside.
Cette molécule, le swertiabisxanthone-I-8’-O-β-D-glucopyranoside, est identifiée pour la première fois.
L’investigation phytochimique de Gentianella amarella ssp. acuta a donc permis d’isoler dix xanthones. Deux sont des nouveaux glycosides : le corymbiférine-3-O-glucoside ( H) et le swertiabisxanthone-I-8’-O-glucoside (K) ; quatre sont identifiées pour la première fois chez cette espèce : la swertiabisxanthone-I (F), le triptexanthoside C ( G), le vératriloside (I) et le
89 Chapitre 3 corymbiférine-1-O-glucoside ( J) ; enfin quatre autres ont été précédemment identifiées par Kojima et al. (1998) : la bellidine (D), la bellidifoline (E), la norswertianoline (B) et la swertianoline ( C). Quatre schémas de substitution sont représentés, issus des deux formes biosynthétiques de base. Les xanthones issues de la forme 1,3,5-trioxygénée sont toutefois prépondérantes : la plupart sont tétrasubstituées en 1,3,5,8, et deux présentent un schéma de type 1,3,4,5,8. Deux xanthones proviennent de la forme 1,3,7-trioxygénée : le composé I, avec une substitution de type 1,3,4,7, ainsi que le composé G pentasubstitué en 1,3,4,7,8 ( Tableau 3.2 ).
Tableau 3.2 Substitution des xanthones B-K isolées dans cette étude.
schéma positions substituées composé d’oxydation 1 2 3 4 5 6 7 8 B OH OH OH OGlc C OH OMe OH OGlc D OH OH OH OH E OH OMe OH OH 1,3,5,8 OH OH OH OH F OH OH OH OH OH OH OH OH K OH OH OH OGlc H OH OGlc OMe OMe OH 1,3,4,5,8 J OGlc OH OMe OMe OH 1,3,4,7 I OH OMe OMe OGlc 1,3,4,7,8 G OH OMe OMe OGlc OH
Alors que le profil HPLC/UV de l’extrait méthanolique de G. amarella ssp. acuta présentait quatre pics majoritaires, ce sont finalement dix xanthones qui ont été isolées. Le profil HPLC/UV de l’extrait méthanolique de Gentianella campestris étant extrêmement similaire, celui-ci est de nouveau étudié afin de déterminer si les xanthones B-K y sont présentes.
3.2.3. Comparaison phytochimique des extraits méthanoliques de G. campestris et G. amarella ssp. acuta par LC/UV et UPLC/TOF-MS
Un nouvel extrait de G. campestris est préparé, cette fois-ci à partir de plantes entières et non de parties aériennes, afin de comparer les deux espèces de manière plus exacte ( Figure 3.60 ).
90 Résultats et discussion
B 1600
1200 G. campestris C 800 Parties aériennes A 400 D E 0 0 5 10 15 20 25 30 B C 160
120 G. campestris
Intensité(mAU) relative Plantes entières D 80 E
40 A 0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min) Figure 3.60 Profils chromatographiques HPLC/UV à 254 nm des extraits MeOH de G. campestris . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min -1.
Le profil HPLC/UV de l’extrait de plantes entières indique une composition légèrement différente par rapport à l’extrait de parties aériennes. Alors que le pic correspondant à l’isoorientine (A) est nettement diminué, ceux correspondant à la bellidine (D) et à la bellidifoline (E) sont plus intenses. D’autres composés UV-visibles de diverses polarités apparaissent également sur le chromatogramme.
Le profil HPLC/UV de l’extrait de plantes entières de G. campestris est ensuite comparé à celui de G. amarella ssp. acuta ; pour cela, chaque xanthone est analysée séparément afin d’être identifiée sur le chromatogramme (Figure 3.61). Dans les conditions chromatographiques utilisées, les composés C, H, I et J co-éluent sous un seul et même pic à 17.9 min. Le pic correspondant à la xanthone G est peu résolu et sort à 18.1 min. Les composés F et K quant à eux sont en proportions tellement faibles dans l’extrait méthanolique qu’ils n’apparaissent pas sur le chromatogramme. Bien que le profil HPLC/UV de l’extrait de G. campestris soit assez similaire à celui de G. amarella ssp. acuta , il est donc difficile dans ces conditions de statuer sur la présence ou non des xanthones F à K dans la gentiane champêtre. Si tel était le cas, il est probable que lors du fractionnement de l’extrait de G. campestris par HPLC semi-préparative, le pic collecté correspondant au composé C contenait également les composés H, I et J. Toutefois, ceux-ci devaient être minoritaires, au vu de la qualité des spectres RMN et MS obtenus.
91 Chapitre 3
D B 1000 C, H, I, J 800 G. amarella ssp. acuta E 600 Plantes entières G 400 200 K F 0 0 5 10 15 20 25 30
160 G. campestris 120 Plantes entières
Intensité(mAU) relative 80
40
0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min)
Figure 3.61 Profils chromatographiques HPLC/UV à 254 nm des extraits MeOH de plantes entières de G. campestris et G. amarella ssp. acuta . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm -1 i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 95-5 à 0-100 en 30 min. Débit 1 mL.min .
Afin de séparer les dix xanthones B-K par HPLC, un nouveau système de solvant est mis au point, en modifiant la nature des solvants ainsi que le gradient (Figure 3.62).
B 800 G. amarella ssp. acuta C D 600 Plantes entières J E K F 400 I H 200 G
0 0 5 10 15 20 25 30 B E C D 400 G. campestris 300 Plantes entières J K F Intensité(mAU) relative 200 I H 100 G
0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min) Figure 3.62 Profils chromatographiques HPLC/UV à 254 nm des extraits MeOH de plantes entières de G. campestris et G. amarella ssp. acuta . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeCN + 0.1% de FA : 95-5 à 70-30 en 20 min, puis 70-30 à 0-100 en 10 min, puis 100% de MeCN pendant 5 min. Débit 1 mL.min -1.
92 Résultats et discussion
Le nouveau gradient permet de séparer les dix xanthones. On constate alors une grande similitude de composition entre les deux espèces : les xanthones B-E et G-J semblent être dans des proportions identiques ; les xanthones K et F étant en dessous du seuil de détection UV, il est délicat de conclure à leur présence dans la gentiane champêtre.
Afin de pallier ces problèmes de détection, une méthode d’analyse par UPLC/ESI-TOF-MS est envisagée. En effet, l’UPLC ® (chromatographie liquide à ultra performance) est basée sur l’utilisation de très hautes pressions (supérieures à 400 bars) et de particules de petites tailles (inférieures à 2 m), ce qui améliore l’efficacité tout en diminuant les temps d’analyses (Jerkovich et al. , 2003). Par ailleurs, la spectrométrie de masse est nettement plus sensible et sélective que l’UV. Un gradient est donc développé afin de séparer au mieux les différents constituants de l’extrait de G. amarella ssp. acuta puis de comparer par UPLC/ESI-TOF-MS les profils des deux extraits de gentianes (Figure 3.63).
D 100 G. amarella ssp. acuta E B A J K C I G H F
0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 100 G. campestris D E
abondance relative (%) abondancerelative B A C J K G I H F
0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 Temps (min) Figure 3.63 Profils chromatographiques UPLC/ESI-TOF-MS en mode d’ionisation négatif (BPI) des extraits MeOH de plantes entières de G. amarella ssp. acuta et G. campestris . Colonne Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 µm, 150 × 2.1 mm i.d.). Gradient H 2O-MeCN + 0.1% de FA : 95-5 à 45-55 en 15 min, puis 2-98 pendant 1 min. Débit 300 L.min -1.
La séparation par UPLC améliore la résolution tout en réduisant le temps d’analyse de moitié, et la détection par spectrométrie de masse permet de visualiser davantage de composés, ce qui
93 Chapitre 3 facilite la comparaison entre les deux espèces de gentianes. De plus, l’ESI permet d’ioniser et donc de détecter les xanthones aglycones, contrairement à l’APCI. Les chromatogrammes des deux extraits sont extrêmement similaires. Même si l’abondance relative de certains pics diffère, d’un point de vue qualitatif on retrouve les mêmes composés ionisables chez les deux gentianes. Concernant les xanthones B à K, on retrouve leur trace chez G. campestris dans des proportions identiques, excepté la xanthone H qui n’est pas détectable. Toutefois, lorsque l’on sélectionne la trace de l’ion m/z 465 [M-H] -, un pic est révélé au temps de rétention 10.60 min, en plus des composés G et J à 9.68 et 9.00 min. Pour ce qui est des autres pics, les différences les plus notables se situent au niveau des signaux à 5.27 min (m/z 419 [M-H] -) et 5.79 min ( m/z 401 [M-H] -), nettement prépondérants chez G. campestris , alors que l’ion à 7.67 min (m/z 523 [M-H] -) absent chez cette dernière est en revanche présent chez G. amarella ssp. acuta . Si l’on s’attache à retrouver les autres composés précédemment identifiés chez G. campestris sur la base des traces ioniques obtenues, à savoir le campestroside (426.1162 Da), la mangiférine (422.0849 Da), la swerchirine (288.0634 Da), la décussatine (302.0790 Da), ou encore l’isobellidifoline (274.0477 Da), on détecte effectivement des ions dont les masses correspondent, sans toutefois pouvoir certifier leur identité, à cause de la présence éventuelle d’isomères de position.
Ainsi, l’analyse des extraits méthanoliques des deux gentianes par UPLC/ESI-TOF-MS permet de confirmer la présence des composés F-K chez Gentianella campestris , et de mettre en évidence la similitude de composition phytochimique entre ces deux gentianes. Cette étude, qui montre le fort lien taxonomique existant entre ces deux espèces, permet en outre de clarifier la position de ces gentianes dans la classification évolutive. En effet, plusieurs auteurs soutiennent la ségrégation faite par Moench des genres Gentiana et Gentianella , en s’appuyant notamment sur des observations morphologiques et phylogéniques (Fabris, 1955; Gillett, 1957; Chassot et al. , 2001). La récente classification de Struwe sépare même ces espèces dans deux sous-tribus distinctes (Figure 3.64 ) (Struwe et al. , 2002). Cependant, de nombreux travaux présentent toujours Gentianella campestris et Gentianella amarella ssp. acuta comme appartenant au genre Gentiana , sous-genre Gentianella , sous les dénominations respectives Gentiana campestris L. et Gentiana acuta Michx.
94 Résultats et discussion
De la même manière, les espèces Gentianella bellidifolia (Hook.f.) Holub ou Gentianella corymbifera (Kirk) Holub sont présentées le plus souvent comme appartenant au genre Gentiana .
Gentianaceae famille
Saccifolieae Exaceae Chironiae Helieae Gentianeae Potalieae incertae sedis tribu (16-20) (144-184) (159) (184) (939-968) (154) (1 : Voyria Aubl.)
Gentianinae Swertiinae sous-tribu (3 genres) (14 genres)
Gentiana L. (360) Gentianella Moench (250)
Tripterospermum Blume (24) Swertia L. (135) genre Crawfurdia Wall. (16-19) Halenia Borkh. (80)
Gentianopsis Ma (16-24)
Figure 3.64 Classification des Gentianaceae d’après Struwe. Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d’espèces (Struwe et al. , 2002).
Dans ce contexte, il devient très difficile de réaliser une étude chimiotaxonomique fiable si la classification même des Gentianaceae demeure problématique. Certains auteurs s’y sont essayés, mais en se fondant sur des systèmes cladistiques obsolètes, ce qui ne leur a pas permis de discriminer les genres selon le schéma d’oxydation des xanthones, mais seulement de constater le degré d’évolution de certains genres par rapport aux autres en se référant au nombre d’étapes d’oxydation ou de réduction (Carbonnier et al. , 1977; Mészáros, 1994). Si l’on se tient à la classification proposée par Struwe, des différences se dégagent pourtant quant à la phytochimie des genres Gentianella et Gentiana , plus précisément au niveau de l’oxygénation des carbones en positions 4 et 6. En effet, contrairement au genre Gentiana , le genre Gentianella contient des xanthones substituées en C-4 mais pas en C-6 (Mészáros, 1994; Jensen et Schripsema, 2002). L’investigation phytochimique menée ici conforte cette observation ; en effet, des dix xanthones isolées, aucune n’est substituée ni en C-6 ni en C-2, et quatre d’entre elles sont méthoxylées en position 4. De plus, concernant les composés connus, la plupart ont été précédemment identifiés à partir d’espèces de la sous-tribu Swertiinae ( Swertia sp., Gentianella sp., Veratrilla sp.). De la même manière, les deux nouveaux glucosides, le corymbiférine-3-O-β-D-glucoside (H) et le swertiabisxanthone-I-8’-O-β-D-glucoside (K),
95 Chapitre 3 sont des dérivés de xanthones rencontrées dans cette sous-tribu. Seul le triptexanthoside C ( G) a été identifié jusqu’à présent uniquement dans une espèce appartenant à la sous-tribu Gentianinae : Tripterospermum japonicum Maxim. Cependant, plusieurs xanthones présentant ce même schéma de pentaoxygénation 1,3,4,7,8 se retrouvent dans des espèces de la sous- tribu des Swertiinae (Markham, 1965; Ghosal et al. , 1975; Prakash et al. , 1982; Tan et al. , 2002). Ces observations phytochimiques soutiennent donc les classifications proposées par Gillett et Struwe, ainsi que les constats phylogéniques, qui rapprochent davantage Gentianella Moench du genre Swertia L. que du genre Gentiana L. (Chassot et al. , 2001; von Hagen et Kadereit, 2001; Glenny, 2004).
3.2.4. Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase
3.2.4.1. Test bioautographique au Fast Blue B
L’activité anti-AChE des xanthones B-K est testée par bioautographie à l’aide de la méthode au Fast Blue B. Les xanthones sont tout d’abord déposées à la quantité de 1 g. A cette valeur, les bisxanthones F et K ne montrent aucune inhibition sur plaque, et sont donc considérées comme inactives. Les autres xanthones présentent des quantités minimales inhibitrices comprises entre 0.01 et 0.5 g. Afin de pouvoir comparer plus justement ces valeurs, les QMI sont rapportées en moles, puis exprimées en pQMI (logarithme négatif de la QMI) ( Figure 3.65 ).
11
10 pQMI 9
8 galanthamine G EIHDCJB Figure 3.65 Quantité minimale inhibitrice de l’acétylcholinestérase (pQMI) des composés B-E et G-J.
96 Résultats et discussion
Les xanthones dont la pQMI est inférieure à 10 sont considérées comme trop faiblement inhibitrices pour être intéressantes. Quatre composés sont donc considérés comme actifs, la bellidifoline ( E), le triptexanthoside C ( G), le vératriloside (I) et le nouveau dérivé glycosylé de la corymbiférine (H) ; les xanthones E, G et I présentent dans ce test un pouvoir inhibiteur similaire à celui de la galanthamine, substance de référence. Les quatre molécules actives possédant des schémas de substitution différents, il est difficile à ce stade d’émettre des hypothèses quant à la relation entre structure et activité.
3.2.4.2. Test en solution par la méthode d’Ellman
Les xanthones B-E et G-J sont également testées selon la méthode d’Ellman en solution, d’une part afin de confirmer l’activité observée sur plaque, et d’autre part afin de déterminer la valeur d’IC 50 (Figure 3.66 ).
100
75
50
40
25 inhibition de l'AChE de inhibition (%)
0 galanthamine G IHDCJE B Figure 3.66 Inhibition de l’acétylcholinestérase (%) des composés B-E et G-J.
Bien que le profil global d’activité reste assez semblable entre les différentes xanthones, les résultats sont différents de ceux obtenus par bioautographie. Toutes les xanthones présentent une inhibition de l’AChE nettement inférieure à celle de la galanthamine. Il est possible que ces différences soient liées à une différence de conformation de l’enzyme en solution et sur silice, et donc à un accès réduit au site actif enzymatique (Di Giovanni et al. , 2007).
Avec la méthode d’Ellman, seul le triptexanthoside C ( G), avec un taux d’inhibition supérieur
à 40%, est toujours considéré comme actif. Il présente une IC 50 de 13.8 ± 1.6 M. Par comparaison, l’IC 50 du témoin galanthamine est de 0.29 ± 0.02 M.
97 Chapitre 3
3.3. Investigation phytochimique de l’extrait dichlorométhanique de racines de Peucedanum ostruthium
3.3.1. Analyse LC/UV/MS de l’extrait de Peucedanum ostruthium
Afin d’obtenir des informations sur la nature de ses principaux constituants, l’extrait CH 2Cl 2 obtenu à partir des racines d’impératoire a été analysé par HPLC/UV/APCI-MS en mode positif. Le chromatogramme enregistré à 254 nm montre six pics principaux ( Figure 3.67 ).
L Tr : 11.53 min M Tr : 16.77 min N Tr : 17.96 min m/z 305 m/z 271 m/z 387
200 250 300 350 400 nm 200 250 300 350 400 nm 200 250 300 350 400 nm
O Tr : 18.36 min P Tr : 19.00 min Q Tr : 22.36 min m/z 261 m/z 271 m/z 299
200 250 300 350 400 nm 200 250 300 350 400 nm 200 250 300 350 400 nm
1200 L N Q 1000 M
800 P
600 O
400
200
Intensité (mAU) relative 0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min) Figure 3.67
Profil chromatographique HPLC/UV/MS à 254 nm de l’extrait CH 2Cl 2 de racines de Peucedanum ostruthium . Colonne Nova-Pak Waters RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.). Gradient H2O-MeOH + 0.05% de TFA : 75-25 à 0-100 en 25 min, puis 100% MeOH pendant 5 min. Débit 1 mL.min -1.
Les composés majoritaires de l’extrait ont des masses moléculaires comprises entre 260 et 386 Da. Les composés L, M, N et P ont des spectres UV très similaires avec quatre bandes d’absorption à 218-222, 248-250, 263-268 et 302-312 nm, et un minimum autour de 278 nm ; ces bandes sont caractéristiques des furanocoumarines linéaires (Lee et Soine, 1969). Le spectre UV du composé Q, avec deux maxima à 224 et 334 nm et un minimum à 268, laisse penser à une coumarine simple 7-oxygénée (Murray et al. , 1982). Le composé O présente quant à lui un spectre UV typique des chromones (Griffiths et Ellis, 1972; Preat et al. , 2007).
98 Résultats et discussion
3.3.2. Fractionnement de l’extrait de Peucedanum ostruthium et isolement des composés L-Q
Le fractionnement de l’extrait CH 2Cl 2 de Peucedanum ostruthium a été entièrement réalisé par CPC en suivant l’activité des fractions par test bioautographique. Un premier fractionnement de l’extrait CH 2Cl 2 de racines de P. ostruthium (3 g) a été effectué avec le système biphasique n-hexane-AcOEt-MeOH-H2O 10:5:5:1 pour conduire à 11 fractions I-XI (Figure 3.68 ).
Extrait CH 2Cl 2 de racines de Peucedanum ostruthium 3 g
CPC
hexane-AcOEt-MeOH-H2O 10:5:5:1
f I f II f III f IV f V f VI f VII f VIII f IX f X f XI 0.96 g 0.19 g 0.13 g 0.40 g 0.24 g
CPC hexane-AcOEt-MeOH-H O 2 CPC 10:5:5:1 hexane-t BuMe éther-MeCN 5:2:4 f 1 f 2 f 3 Cristallisation hexane / AcOEt 370 mg
CPC
hexane-MeCN-CH 2Cl 2 10:7:3
Q M O N L 22 mg 56 mg 4 mg 67 mg 6 mg
Figure 3.68 Schéma du premier fractionnement de l’extrait dichlorométhanique de P. ostruthium .
Une seconde CPC avec le même système de solvants a permis de fractionner la fraction III en trois sous-fractions. Le composé Q (22 mg) a été obtenu suite à une CPC sur la fraction III-2 avec le système n-hexane-MeCN-CH 2Cl 2 10:7:3. Le composé M (56 mg) a été isolé lors du fractionnement de la fraction IV avec le système ternaire n-hexane-t-BuMe éther-MeCN 5:2:4. Enfin les composés O (4 mg), N (67 mg) et L (6 mg) ont été obtenus par cristallisation des fractions VI, VII et IX.
Un second fractionnement sur 7 g d’extrait CH 2Cl 2 avec le système n-hexane-AcOEt-MeOH-
H2O 2:1:2:1 a conduit à l’obtention de 11 fractions (Figure 3.69 ). Les composés P (22 mg) et Q (600 mg) ont été obtenus à l’aide d’une CPC sur la fraction IV avec le système n-hexane-
99 Chapitre 3
MeCN-CH 2Cl 2 10:7:3, suivi d’une cristallisation. La fraction IX est été séparée sur silice pour conduire à l’obtention du composé N (25 mg).
Extrait CH 2Cl 2 de racines de Peucedanum ostruthium 7 g
CPC
hexane-AcOEt-MeOH-H2O 2:1:2:1
f I f II f III f IV f V f VI f VII f VIII f IX f X f XI 1.8 g 1.7 g
CPC CC silice hexane-MeCN-CH 2Cl 2 10:7:3 hexane-AcOEt 1:1
f 1 f 2 f 3 f 4 f 5 f 6 f 7 N Cristallisation hexane / AcOEt 25 mg
P 22 mg
Q 600 mg
Figure 3.69 Schéma du second fractionnement de l’extrait dichlorométhanique de P. ostruthium .
Tout comme pour les extraits de gentianes, le fractionnement par CPC de l’extrait apolaire de racines d’impératoire a conduit à l’obtention de fractions enrichies, voire pures. L’utilisation consécutive de différents systèmes de CPC associée à un suivi bioguidé a permis d’isoler les composés d’intérêt en grandes quantités, et qui plus est sous forme cristallisée.
3.3.3. Détermination de structure des composés L-Q
3.3.3.1. Détermination de structure du composé L
Le composé L a été obtenu sous la forme de cristaux incolores. Son spectre UV indique que c’est une furanocoumarine linéaire. Son analyse par spectrométrie de masse à haute résolution
UPLC/ESI-TOF-MS en mode positif indique une formule moléculaire C 16 H16 O6, basée sur l’observation de l’ion pseudo-moléculaire à m/z 305.1024 [M+H] + (calculée pour 305.1025). L’analyse par APCI-MS confirme cette masse et exhibe en outre un fragment à m/z 203
100 Résultats et discussion
+ [M+H-C5H10 O2] caractéristique d’un noyau furanocoumarinique hydroxylé, tel que le bergaptol ( Figure 3.70 ).
ESI-TOF-MS 305.1024 [M+H] + APCI-IT-MS 305.0 [M+H] + 100 100
80
- 102 60
40
20 322.7 abondance relative (%) relative abondance 291.1224 (%) relative abondance 203.1 267.1 335.8 232.0 287.1 444.8 0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 500 m/z m/z
Figure 3.70 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé L.
Le spectre RMN du proton présente des signaux caractéristiques du noyau psoralène ( Figure 3.71 ). D’après l’étude systématique des spectres 1H des coumarines naturelles conduite par
Steck et Mazurek, la présence de deux doublets à δH 6.24 et 8.35 ppm couplant à 9.8 Hz permet de conclure à un noyau 1,2 benzopyrone substitué en C-5 par un oxygène (Steck et
Mazurek, 1972). Par ailleurs, la présence d’un doublet à δH 7.75 ppm ( J = 2.4 Hz) et d’un doublet dédoublé à δH 7.18 ppm ( J = 2.4, 0.1 Hz) confirme la structure d’une furanocoumarine, les signaux correspondant respectivement aux protons H-2’ et H-3’. Le 5 couplage à J = 1.0 Hz observé entre le proton H-3’ et celui à δH 7.12 ppm indique la présence d’un proton en position 8 ( δH 7.12 ppm, d, J = 1.0 Hz).
MeOH H-4’’ H-5’’
H-3’ H-1’’a J=2.4, 1.0 Hz H-3 J=9.8, 2.4 Hz H-2’ J=9.8 Hz H-4 H-8 H-1’’b H-2’’ J=2.4 Hz MeOH J=9.8 Hz J=1.0 Hz J=9.8, J=8.3, 8.3 Hz 2.4 Hz
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm
Figure 3.71 1 Spectre RMN H du composé L (500 MHz, CD 3OD).
101 Chapitre 3
Le spectre présente également deux signaux à δH 1.25 et 1.30 (3 H, s) caractéristiques de groupements méthyles peu déblindés, et trois doublets dédoublés dans la zone entre 3.8 et 4.8 ppm, dont les constantes indiquent qu’ils couplent entre eux. Les protons à δH 4.37 et 4.76 ppm sont en fait géminés et portés par le carbone à δC 75.8 ppm, comme indiqué par le spectre de corrélations directes gHSQC. Les données à longues distances permettent de confirmer la structure d’un noyau psoralène 5-
O-substitué, le carbone 5 présentant un déblindage de 32 ppm ( δC 150.8 ppm) (Figure 3.72 ).
Par ailleurs, ce carbone corrèle avec les protons à δH 4.37 et 4.76 ppm, ce qui indique que le méthylène δC 75.8 ppm est en alpha de la liaison éther ; ceci explique le déblindage observé pour les protons géminés.
C-8 C-1’’ C-2’ C-3’ C-4 C-4’’ C-5’’ C-5 C-7 C-3 C-2’’ C-6 C-2 C-8a C-3’’ C-4a
H-5’’ 1 H-4’’ 2
3 H-2’’ H-1’’b 4 (ppm)
H-1’’a 5 H δ
H-3 6 H-8 H-3’ 7 H-2’ H-4 8
160 140 120 100 80 60 40 20 δC (ppm)
H RH
3' 5 4 H 6 4a 3 H 2' 7 8a 2 O 8 O O 1' 1 H Figure 3.72
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé L (500 MHz, CD 3OD) et corrélations observées pour le noyau psoralène du composé L.
102 Résultats et discussion
La corrélation observée entre le proton δH 4.37 ppm avec le carbone δC 78.1 ppm, porteur du proton δH 3.82 ppm, ainsi que les couplages entre les protons du méthylène avec le proton δH
3.82 ppm ( J = 8.3 Hz avec δH 4.37 et 2.4 Hz avec δH 4.76 ppm) indiquent que le carbone tertiaire δC 78.1 ppm est en alpha du méthylène. Par ailleurs, la valeur de son déplacement laisse penser qu’il est également lié à un atome d’oxygène. Les données bidimensionnelles permettent également d’identifier un gem-diméthyle sur le carbone quaternaire à δC 72.7 ppm, et de positionner ce carbone en alpha du carbone à δC 78.1 ppm ( Figure 3.73).
CH3 4'' HO OH 3''
H3C 2'' 5'' H
1'' H O H C 5 Figure 3.73 Principales corrélations homonucléaires gDQF-COSY ( ) et hétéronucléaires gHMBC ( ) observées pour la chaîne latérale en C-5.
L’ensemble de ces données, associées à celles obtenues par spectrométrie de masse, permettent d’identifier le composé L comme étant l’hydrate d’oxypeucédanine ( Figure 3.74). Cette molécule, obtenue à l’origine par hydrolyse ou modification de coumarines structurellement proches, a été isolée pour la première fois à l’état naturel à partir d’ Angelica sylvestris L. (Apiaceae) (Caporale et Rodighiero, 1961).
CH HO 3 OH 2'' H3C *
O
O O O
Figure 3.74 Structure du composé L : l’hydrate d’oxypeucédanine.
103 Chapitre 3
Le carbone 2’’ est un centre asymétrique. La valeur du pouvoir rotatoire du composé L est
22 -1 [a]D = -18.15° (c = 2 mg.mL , acétone). Jusqu’à présent, seule la forme (R)-(+), avec un
24 pouvoir rotatoire [a]D = +18°, avait été isolée de l’impératoire (Nielsen et Lemmich, 1964). L’isomère optique isolé dans cette étude est donc le (S)-(-) hydrate d’oxypeucédanine, également présent dans une autre Apiaceae : Angelica furcijuga Kitag. (Baba et al. , 1990). Il est étonnant que la forme (R)-(+) n’ait pas été isolée dans cette étude. Le fractionnement ayant été suivi par bioguidage, il est légitime de se demander si la forme (R)-(+) de l’hydrate d’oxypeucédanine présente ou non une activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase. Aucune information à ce sujet n’existe dans la littérature ; de plus, la plupart des études pharmacologiques sur les coumarines omettent de préciser l’isomérie des molécules, que ce soit au niveau de l’énantiomérie ou de la diastéréoisomérie.
3.3.3.2. Détermination de structure du composé M
Le composé M se présente sous forme de fines aiguilles incolores. L’ion pseudo-moléculaire observé en masse haute résolution à m/z 271.0966 [M+H] + permet de déterminer sa formule moléculaire comme étant C 16 H14O4 (calculée pour 271.0970). La présence du fragment à m/z 203.0350 [M+H-68] +, caractéristique du noyau furanocoumarinique hydroxylé, indique le départ d’un groupement isoprène C5H8, et le fragment à m/z 215 observé par ailleurs en
APCI-MS montre la perte d’un groupement C4H8 (Figure 3.75).
ESI-TOF-MS 271.0966 [M+H] + APCI-IT-MS 270.9 [M+H] + 100 100
80 - 68 - 68 60
203.0350 40 334.1052 + [M+H-C5H8] 287.7 312.1234 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 20 244.0630 203.0 288.1263 214.9
0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 m/z m/z Figure 3.75 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé M.
Le spectre RMN du proton exhibe les signaux caractéristiques du noyau psoralène, deux doublets couplant à 9.8 Hz ( δH 8.01 et 6.35 ppm) correspondant aux protons H-3 et H-4, et
104 Résultats et discussion
deux autres doublets couplant à 2 Hz ( δH 7.95 et 6.99 ppm) correspondant aux protons du noyau furane ( Figure 3.76).
H-4’’ H-5’’
H-2’ J=2.4 Hz H-1’’ H-4 H-5 J=9.8 Hz H-3’ J=6.8 J=2.0 Hz H-3 J=9.8 Hz H-2’’ J=7.1 Hz
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
Figure 3.76 1 Spectre RMN H du composé M (500 MHz, acétone- d 6).
1 Le spectre H présente également un singulet à δH 7.57 ppm. D’après la table de Steck et
Mazurek, la présence d’un triplet à δH 5.57 ppm (1 H, J = 7.1 Hz), d’un doublet à δH 4.97 ppm
(2 H, J = 6.8 Hz) et de deux singulets à δH 1.70 et 1.71 ppm (3 H chacun) impliquerait la présence d’un groupement O-prényle (Steck et Mazurek, 1972). Le spectre de corrélations gHMBC confirme cette hypothèse et permet de le placer en position 8 ( Figure 3.77). C-3 C-4 C-4’’ C-5 C-1’’ C-8a C-2’ C-3’ C-2’’ C-5’’ C-6 C-2 C-8 C-3’’ C-4a C-7
H-5’’ H-4’’ 2
3
4
H-1’’ 5 (ppm) H H-2’’ δ 6 H-3
H-3’ 7 H-5 H-2’ 8 H-4 160 140 120 100 80 60 40 20 δC (ppm) Figure 3.77 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé M (500 MHz, acétone- d6).
105 Chapitre 3
La molécule M est donc l’impératorine ( Figure 3.78), dont le nom provient justement de l’impératoire dont elle fut isolée en 1933 (Späth et Holzen, 1933).
O O O O
CH3
CH3
Figure 3.78 Structure du composé M : l’impératorine.
L’impératoire a montré lors de tests in vitro une forte inhibition de l’agrégation plaquettaire (Chen et al. , 1996).
3.3.3.3. Détermination de structure du composé N
Le composé N a été obtenu sous la forme de cristaux incolores. Le spectre de masse haute résolution montre un ion pseudo-moléculaire à m/z 387.1447 [M+H] +, ce qui permet de déterminer sa formule moléculaire : C 21 H22 O7 (calculée pour 387.1444). L’analyse en APCI révèle différents fragments, notamment un ion à m/z 185 correspondant au psoralène, un ion à + m/z 203 correspondant au psoralène hydroxylé, une perte d’eau à m/z 369 [M+H-H2O] , ainsi qu’un fragment à m/z 287 [M+H-C5H8O2] ( Figure 3.79 ).
+ + ESI-TOF-MS 387.1447 [M+H] APCI-IT-MS 387.0 [M+H] 100 100
80
60
40 369.1
20 185.0 403.2 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 203.2 287.1 167.0 219.7 243.4 269.2 305.7 0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.79 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé N.
106 Résultats et discussion
Le spectre RMN du proton confirme la structure d’une furanocoumarine linéaire 5-O- substituée, avec les protons H-3 et H-4 couplant en ortho ( δH 6.23 et 8.13 ppm, J = 9.8 Hz), les protons H-2’ et H-3’ couplant à 2.44 Hz ( δH 7.88 et 7.30 ppm), et le proton H-8 à δH 7.17 ppm ( Figure 3.80).
H-4’’ H-5’’
H-10’’ H-1’’b J=1.7 Hz H-3’ H-8’’ H-1’’a J=10.5, H-9’’ H-4 J=2.4 Hz J=7.2, 1.5 Hz J=10.5, J=9.8 Hz 8.5 Hz J=7.1, 1.7 Hz H-3 2.4 Hz H-2’ J=9.8 Hz H-2’’ OH-3’’ acétone J=2.4 Hz H-8 J=8.3, 2.4 Hz H2O
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 ppm
Figure 3.80 1 Spectre RMN H du composé N (500 MHz, acétone-d6).
Tout comme pour l’hydrate d’oxypeucédanine, le spectre présente trois doublets dédoublés dont les constantes indiquent qu’ils couplent entre eux, ainsi que deux signaux méthyliques à
δH 1.33 ppm. Un singulet est également présent à δH 4.10 ppm, ainsi que trois autres signaux qui couplent entre eux : un quadruplet de quadruplet à δH 6.12 ppm ( J = 7.2, 1.46 ppm), un doublet dédoublé à δH 1.96 ppm ( J = 7.1, 1.71 ppm) et un triplet à δH 1.86 ppm ( J = 1.7 ppm), ces deux derniers signaux intégrant pour trois protons chacun. D’après la table d’interprétation de Steck et Mazurek, la présence d’un quadruplet de quadruplet aux alentours de 5.9-6.2 ppm, avec des constantes de couplage J = 7, 1 ppm, laisse supposer la présence d’un ester angélate (Steck et Mazurek, 1972).
Le spectre de corrélations gHSQC indique que les protons δH 4.76 et 5.06 ppm sont portés par le même carbone δC 72.9 ppm, et que l’on a bien quatre carbones primaires à δC 15.9, 20.7, 25.8 et 27.6 ppm. Le spectre de corrélations gHMBC permet de définir la structure de l’hydrate d’oxypeucédanine : on retrouve les protons géminés en beta du carbone 5, et en alpha du carbone primaire δC 78.2 ppm porteur du proton H-2’’ δH 5.46 ppm. Le groupement gem-diméthyle est sur le carbone quaternaire 3’’ à δC 71.1 ppm ( Figure 3.81). Bien que le solvant d’analyse soit différent entre l’hydrate d’oxypeucédanine et le composé N (CD 3OD et acétone-d6), la majorité des déplacements chimiques δH et δC sont similaires, excepté pour le proton H-2’’ qui est fortement déblindé ( shift de 1.6 ppm). Par ailleurs, ce proton corrèle avec
107 Chapitre 3
un carbone à δC 167.6 ppm, ce qui indique que l’oxygène en position 2’’ est impliqué dans une liaison ester. C-4a C-5 C-4’’ C-5’’ C-2’ C-3’ C-8 C-1’’ C-4 C-8’’ C-2’’ C-3 C-3’’ C-2 C-6 C-6’’ C-7 C-7’’ C-8a H-5’’ H-4’’ H-10’’ H-9’’ 2
3
OH-3’ 4 H-1’’b H-1’’a 5 (ppm) H
H-2’’ δ H-8’’ 6 H-3 H-8 7 H-3’ H-2’ 8 H-4 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 δC (ppm) Figure 3.81 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé N (500 MHz, acétone- d6).
Le spectre de corrélations homonucléaires gDQF-COSY confirme le voisinage du proton δH
6.12 ppm avec les protons du méthyle à δH 1.96 ppm ( J = 7.1 Hz) ( Figure 3.82). H-5’’ H-4’’ H-10’’ H-9’’ H-8 H-3 H-1’’b OH-3’’ H-3’ H-4 H-1’’a H-2’ H-2’’ H-8’’ H-5’’ H-4’’ 1
H-10’’ 2 H-9’’ 3
OH-3’ 4 H-1’’b H-1’’a 5 (ppm) H
H-2’’ δ H-8’’ H-3 6
H-8 7 H-3’ H-2’ H-4 8 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
δH (ppm) Figure 3.82 Spectre RMN de corrélations homonucléaires gDQF-COSY du composé N (500 MHz, acétone-d6).
108 Résultats et discussion
Par ailleurs, ces protons subissent également l’influence du voisinage des protons méthyliques
à δH 1.86 ppm, qui dédoublent les signaux avec une constante de couplage autour de 1.5 Hz. 3 La corrélation JHC observée entre les protons méthyliques δH 1.86 ppm avec le carbone δC 167.6 ppm de la liaison ester permet finalement de confirmer l’estérification de l’hydrate d’oxypeucédanine avec un acide 2-méthyl-2-butènoïque. Le composé N est donc l’ostruthol ( Figure 3.83), identifié entre autres chez P. ostruthium et Angelica archangelica L. (Späth et von Christiani, 1933; Chatterjee et Dutta, 1968).
CH3 H C 10'' 3 4'' OH H 7'' O 3'' 8'' 6'' 2'' H CH3 1'' 5'' CH3 O 9'' O H H
O O O Figure 3.83 Structure du composé N : l’ostruthol, et principales corrélations gHMBC de la chaîne latérale.
L'expérience de corrélation à travers l'espace par effet Overhauser (NOESY) permet de confirmer que l’acide 2-méthyl-2-butènoïque est bien sous forme d’acide angélique (Z) et non d’acide tiglique (E).
CH3 HO CH3 H Z O
CH3 CH3 O O
O O O
22 -1 Le pouvoir rotatoire du composé N est [a]D = + 7.02° (c = 5 mg.mL , acétone). Le composé isolé est donc le (R)-(+)-(Z)-ostruthol, seule forme optique identifiée jusqu’à présent (Späth et von Christiani, 1933).
109 Chapitre 3
3.3.3.4. Détermination de structure du composé O
Le composé O est obtenu sous la forme de cristaux incolores. Son spectre UV indique qu’il s’agit d’un dérivé de chromone. Sa formule moléculaire C 15 H16 O4 est déterminée sur la base de l’ion pseudo-moléculaire à m/z 261.1123 [M+H] + obtenu par UPLC/ESI-TOF-MS (calculée pour 261.1127) ( Figure 3.84). L’analyse en APCI révèle un fragment à m/z 205 + [M+H-C4H8] .
APCI-IT-MS ESI-TOF-MS + 261.1123 [M+H] + 261.0 [M+H] 100 100
80
-56 60
40 205.1 + 387.0 20 [M+H-C4H8] 181.7 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.84 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé O.
La littérature indique qu’une chromone de masse 260 Da, la peucénine, a été précédemment isolée des racines de P. ostruthium (Späth et Eiter, 1941; Reisch et al. , 1975a). La comparaison des données physico-chimiques et spectrales de cette molécule avec celles du composé O permet d’identifier la chromone isolée comme étant la peucénine ( Figure 3.85).
CH 3-2 CH3 5' OH O
3' 1' 5 4 2' 6 3 H3C 4' CH -4’ H 7 2 3 8 CH 3-5’ HO O CH3 1 acétone H-8 H-1’ J=7.3 Hz H-3 H2O H-2’
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
Figure 3.85 1 Spectre RMN H du composé O et structure de la peucénine (500 MHz, acétone-d6).
110 Résultats et discussion
3.3.3.5. Détermination de structure du composé P
Le composé P a été obtenu sous la forme de cristaux incolores. Sa formule moléculaire est identique à celle du composé M : C 16 H14O4. Elle a été déterminée sur la base de l’ion pseudo- moléculaire observé en HRMS à m/z 271.0955 [M+H] + (calculée pour 271.0970). Comme + pour le composé M, on observe également un fragment à m/z 203.0350 [M+H-C5H8] correspondant au psoralène hydroxylé. L’analyse en APCI-IT donne également ce fragment, + ainsi qu’un ion à m/z 215 [M+H-C4H87 8] ( Figure 3.86).
APCI-IT-MS ESI-TOF-MS 271.0955 [M+H] + 270.9 [M+H] + 100 100 - 68 80 - 68 60 203.3
334.1043 40 203.0353 215.2 + 312.1236 258.9 [M+H-C5H8] 20 287.0 243.2 469.1 244.0616 219.6 403.1 abondance relative (%)
abondance relative (%) 187.4 350.4 0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.86 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé P.
Le spectre du proton est également assez semblable à celui de l’impératorine ( Figure 3.87).
Outre les signaux du psoralène ( δH-4 8.15 ppm, J = 9.8 Hz ; δH-3 6.26 ppm, J = 9.8 Hz ; δH-2’
7.59 ppm, J = 1.9 Hz ; δH-3’ 6.95 ppm, J = 2.4 Hz), on retrouve les signaux indiquant la présence d’un groupement prényle : triplet à δH 5.54 ppm ( J = 7.1 Hz), doublet à δH 4.92 ppm
(J = 6.8 Hz) et deux singulets à δH 1.70 et 1.80 ppm.
H-4’’ H-5’’
H-8 H-3 H-1’’ H-2’ J=9.8 Hz H-4 J=1.9 Hz H-3’ J=6.8 Hz J=9.8 Hz J=2.4 Hz H-2’’ J=7.1 Hz
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 ppm Figure 3.87 1 Spectre RMN H du composé P (500 MHz, acétone-d6).
111 Chapitre 3
Le spectre de corrélations 1H-13 C à longues distances permet de visualiser la corrélation entre les protons H-1’’ à δH 5.54 ppm avec le carbone 5 à δH 149.2 ppm, et par conséquent de positionner le groupement O-prényle en C-5 ( Figure 3.88).
C-3’ C-3’’ C-2’’ C-8 C-5’’ C-1’’ C-2’ C-3 C-4 C-4’’ C-7 C-8a C-5 C-2 C-4a C-6
H-5’’ H-4’’ 2
3
4 H-1’’ 5 (ppm)
H-2’’ H δ H-3 6 H-3’ H-8 7 H-2’ H-4 8
160 140 120 100 80 60 40 20 δC (ppm) Figure 3.88
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé P (500 MHz, acétone-d6).
L’ensemble des données spectrales permet d’identifier le composé P comme étant l’isoimpératorine ( Figure 3.89 ), isolée de P. ostruthium en même tant que son isomère, l’impératorine (Späth et Kahovec, 1933).
CH3
H3C
O
O O O Figure 3.89 Structure du composé P : l’isoimpératorine.
112 Résultats et discussion
3.3.3.6. Détermination de structure du composé Q
Le composé Q se présente sous la forme de cristaux blanc-crème. Le spectre de masse obtenu en ESI-TOF montre un ion pseudo-moléculaire à m/z 299.1648 [M+H] +, ce qui correspond à la formule moléculaire C 19H22 O3 (calculée pour 299.1647) (Figure 3.90).
+ ESI-TOF-MS 299.1648 [M+H] + APCI-IT-MS 299.1 [M+H] 100 100
80
60
40 359.1516
340.1927 315.7 20 abondance relative (%) relative abondance abondance relative (%) relative abondance 371.8 438.8 0 0 100 200 300 400 500 200 300 400 500 m/z m/z Figure 3.90 Spectres UPLC/ESI-TOF-MS et HPLC/APCI-IT-MS en mode positif du composé Q.
Le spectre UV du composé Q est celui d’une coumarine simple, ce que confirme son analyse par résonance magnétique nucléaire. En effet, on retrouve bien les signaux correspondant aux protons H-3 et H-4 du noyau coumarine ( δH 6.16 et 7.83 ppm, J = 9.3 Hz), mais pas les deux doublets caractéristiques du noyau furane ( Figure 3.91 ). Le spectre présente en revanche deux singulets dans la zone des aromatiques, trois signaux caractéristiques de groupements méthyles entre 1.60 et 1.75 ppm, ainsi que deux multiplets intégrant chacun pour deux protons à δH 2.08 et 2.14 ppm.
H-10’ H-8’ H-9’
H-1’ H-8 H-5 H-3 J=7.3 Hz H-4 J=9.3 Hz H-2’ H-4’ J=9.3 Hz J=7.3, 1.4 Hz H-5’ H-6’ J=6.8, 1.4 Hz
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 ppm Figure 3.91 1 Spectre RMN H du composé Q (500 MHz, acétone-d6).
113 Chapitre 3
Les deux quadruplets de triplet à δH 5.14 ppm ( J = 7.3, 1.4 Hz) et 5.40 ppm ( J = 6.8, 1.4 Hz) sont caractéristiques de groupements prényles ; par ailleurs, le doublet à 3.39 ppm (2 H, J = 7.3 Hz) indique un C-prényle sur la molécule (Steck et Mazurek, 1972). Ceci laisse penser qu’au moins deux prényles sont rattachés au composé Q. L’analyse du spectre de corrélations direct 1H-13 C gHSQC et des spectres DEPT permet d’obtenir des informations sur la multiplicité des carbones et d’attribuer les protons correspondants ( Figure 3.92).
2 2 C CH CH 2 3 3 CH CH 3 CH CH CH CH C CH CH CH C CH C H-9’ H-8’ H-10’ H-4’ 2 H-5’ 3 H-1’ 4
H-6’ 5 (ppm) H H-2’ δ H-3 6 H-8 7 H-5 H-4 140 120 100 80 60 40 20
δC (ppm) Figure 3.92
Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHSQC du composé Q (500 MHz, acétone-d6) et multiplicité des carbones obtenue par l’expérience DEPT.
Le spectre gHMBC fait apparaître deux principales zones de corrélations, l’une correspondant aux corrélations observées à l’intérieur du noyau coumarinique et l’autre liée aux interactions des substituants ( Figure 3.93). Le proton à δH 3.39 ppm corrèle avec ces deux zones et doit donc se situer en position alpha du noyau benzène.
114 Résultats et discussion C-5’ C-6 C-1’ C-5 C-4’ C-9’ C-8’ C-4 C-4a C-2’ C-3 C-6’ C-3’ C-10’ C-8a C-2 C-7 C-7’ H-9’ H-8’ H-10’ H-4’ 2 H-5’ 3 H-1’ 4
H-6’ 5 (ppm) H
H-2’ δ H-3 6 H-8 7 H-5 H-4 8 160 140 120 40 20
δC (ppm) Figure 3.93 Spectre RMN de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé Q (500 MHz, acétone- d6).
L’ensemble des données obtenues par gHMBC et gDQF-COSY permet dans un premier temps de déterminer la structure du noyau coumarinique du composé Q (figure 3.94).
δ 7.37 δ 7.83 δ H H H 3.39 H H H H 1' 5 4 δ H H 6.16 R1 6 3
7 2 8 R2 O O 1 H δ H 6.79
Figure 3.94
Principales corrélations gHMBC du noyau coumarine du composé Q (500 MHz, acétone-d6).
Les méthyles à δH 1.61 et 1.67 ppm présentent les mêmes corrélations en gHMBC et gDQF- COSY, ce qui permet de définir un prényle terminal, les deux méthyles étant rattachés au carbone δC 131.1 ppm, lui-même en alpha du carbone tertiaire δC/H 124.4 / 5.14 ppm et en beta du carbone secondaire δC/H 26.7 / 2.14 ppm. Les protons à δH 2.14 ppm corrèlent pour leur part avec le carbone secondaire δC/H 38.8 / 2.08 ppm et avec le carbone quaternaire δC 136.5
115 Chapitre 3
ppm. Les protons δH 3.39 et 5.40 corrèlent également avec ce carbone avec 136.5 ppm, ainsi que les protons du méthyle à 1.75 ppm, ce qui permet de définir un second groupement prényle connecté au précédent ( Figure 3.95).
CH3 CH3 17 15
131 27 136 28 124 39 122 126 H3C 25
HOO O Figure 3.95
Principales corrélations gHMBC de la chaîne géranyle du composé Q (500 MHz, acétone-d6) et valeurs de déplacements des carbones.
Le composé obtenu est donc l’ostruthine, un constituant majeur de l’impératoire (Späth et Klager, 1934). L'expérience NOESY permet de confirmer l’isomérie E de la double liaison 2’-3’ ( Figure 3.96).
2' 3'
Figure 3.96
Principales corrélations homonucléaires NOESY du composé Q (500 MHz, acétone-d6).
Ce composé a montré lors de tests in vitro une forte inhibition de la croissance des mycobactéries, organismes à l’origine de maladies telles que la tuberculose et la lèpre (Schinkovitz et al. , 2003). Le fractionnement bioguidé de l’extrait de racines d’impératoire a conduit à l’isolement de six composés majoritaires, dont cinq coumarines et une chromone. La majorité des ces composés avait été précédemment identifiée chez P. ostruthium , à l’exception de l’isomère optique (S)- (-) de l’hydrate d’oxypeucédanine ; une seule étude antérieure avait montré l’existence de cette forme dans les végétaux (Baba et al. , 1990).
116 Résultats et discussion
3.3.4. Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase
3.3.4.1. Test bioautographique au Fast Blue B
Les composés isolés des racines d’impératoire sont testés par bioautographie afin d’évaluer leur pouvoir d’inhibition sur l’AChE. Les quantités minimales inhibitrices sont exprimées en pQMI ( Figure 3.97). La peucénine ( O), avec une pQMI de 8.41, est la moins active des molécules isolées. Les coumarines, en revanche, présentent une pQMI comprise entre 9.0 et 11.5. Si l’on se réfère à l’activité par mole, l’ostruthol ( N) présente un pouvoir d’inhibition près de dix fois supérieur à celui de la galanthamine, inhibiteur de référence.
12
11
10 pQMI
9
8 N galanthamine QMPLO Figure 3.97 Quantité minimale inhibitrice de l’acétylcholinestérase (pQMI) des composés L-Q.
3.3.4.2. Test en solution par la méthode d’Ellman
Afin de déterminer exactement le taux d’inhibition enzymatique des composés L-Q, ceux-ci sont testés selon la méthode d’Ellman en solution (Figure 3.98). On retrouve une assez bonne corrélation entre les deux méthodes en ce qui concerne les composés Q, M, P, L et O. En revanche, l’ostruthol qui était la molécule la plus active sur couche mince ne présente quasiment aucune activité dans le test d’Ellman. L’ostruthine ( Q), avec un taux d’inhibition de 77.5%, est particulièrement intéressante. L’impératorine ( M) et l’isoimpératorine ( P) sont également considérées comme actives avec un taux d’inhibition supérieur à 40%.
117 Chapitre 3
100
75
50 40
25 inhibition de l'AChE de inhibition (%)
0 N galanthamine QMPLO Figure 3.98 Inhibition de l’acétylcholinestérase (%) des composés L-Q.
La valeur de l’IC 50 , exprimée ici en pIC 50 , est alors définie pour les composés présentant un taux d’inhibition de l’AChE supérieur à 40% ( Figure 3.99 ).
7
6
5
50 4
pIC 3
2
1
0 galanthamine Q M P Figure 3.99
Inhibition de l’acétylcholinestérase (pIC 50 ) des composés Q, M et P.
Dans les deux tests de mesures d’activité, l’ostruthine ( Q) apparaît donc comme un composé intéressant. En revanche, en ce qui concerne l’ostruthol ( N), les deux tests donnent des résultats opposés.
La comparaison de ces deux méthodes – test bioautographique au Fast Blue B et méthode d’Ellman en solution – a été entreprise à travers une collaboration entre le Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie et le Laboratoire de Chimie Thérapeutique - groupe de Pharmacochimie de l’Université de Genève. Les conclusions de cette étude indiquent que sur près de 140 composés testés, 90% d’entre eux donnent le même résultat, à savoir qu’ils sont
118 Résultats et discussion considérés dans la même classe d’activité (actifs ou non-actifs) par les deux méthodes (Borloz, 2007). Seulement 3% des composés étudiés sont actifs par bioautographie et inactifs en microplaques. L’ostruthol se comporte donc comme cette dernière classe de molécules, et il est par conséquent difficile de conclure quant à son réel potentiel inhibiteur.
Afin de déterminer si l’ostruthol est effectivement un inhibiteur de l’acétylcholinestérase, des tests sur animaux sont entrepris. L’ostruthine est également testée afin de confirmer l’inhibition observé in vitro.
3.3.4.3. Tests in vivo
Les coumarines Q et N sont administrées par voie orale à des souris. Suite à l’administration, toutes les souris montrent une légère somnolence qui peut être attribuée à l’éthanol, utilisé comme co-solvant de dissolution. Au-delà de ces effets légers, l’ostruthine s’est révélée toxique : des cyanoses ont été observées, entraînant même la mort chez les souris traitées à la dose de 100 mg/kg. Aucun signe de toxicité n’a en revanche été observé avec l’ostruthol. Les différentes zones du cerveau ont ensuite été prélevées et l’activité de l’AChE a été mesurée pour trois zones cérébrales distinctes : au niveau du cortex frontal, siège des fonctions cognitives supérieures, de l’hippocampe, lié principalement à la mémoire épisodique, et du striatum impliqué dans les mouvements volontaires ( Figure 3.100 ).
L’ostruthine, en plus d’être toxique, ne présente aucune inhibition in vivo dans les trois zones cérébrales étudiées. L’ostruthol s’est révélé actif au niveau du cortex frontal et de l’hippocampe à la plus haute dose testée. Son activité est similaire à celle de la galanthamine administrée en quantité dix fois moins importante. La dose de 100 mg/kg reste toutefois une valeur raisonnable pour le mode d’administration per os . Au niveau du striatum, aucun composé n’est actif, pas même la galanthamine. Ceci peut s’expliquer par la distribution inégale des isoformes de l’enzyme dans les diverses zones du cerveau, et par le fait que les inhibiteurs présentent une certaine sélectivité vis-à-vis de ces isoformes (Zhao et Tang, 2002). L’administration de l’ostruthine ( Q) et de l’ostruthol ( N) à des souris a donc permis de tester in vivo l’efficacité réelle de ces coumarines, et par conséquent de confirmer ou non les effets observés in vitro .
119 Chapitre 3
140 120 Cortex frontal 100 80
60 40 20
Activité AChE (% contrôle) 0 DMSO/EtOH Q Q N N galanthamine galanthamine 30 100 30 100 5 15 160 Hippocampe 120
80
40
Activité AChE (%contrôle) 0 DMSO/EtOH Q Q N N galanthamine galanthamine 30 100 30 100 5 15 160 Striatum 120
80
40
Activité AChE (% contrôle) 0 DMSO/EtOH Q Q N N galanthamine galanthamine 30 100 30 100 5 15 Figure 3.100 Activité de l’acétylcholinestérase dans les différentes zones cérébrales des souris après administration orale des composés Q et N.
Contre toute attente, l’ostruthine, qui montrait pourtant une activité intéressante à la fois dans la méthode au Fast Blue B et dans le test d’Ellman, s’est révélée inactive chez les souris, et même toxique. Il est peu probable que cette absence d’activité soit liée à un problème de passage de la barrière hémato-encéphalique, les coumarines Q et N présentant une lipophilie relativement équivalente (log P Q = 5.70 ; log P N = 4.06). Les différences de conformation de l’AChE in vitro et in vivo pourraient éventuellement expliquer cette inactivité, de même que la présence d’isoformes au sein du cerveau. La métabolisation de l’ostruthine est une autre hypothèse envisageable.
120 Résultats et discussion
Quant à l’ostruthol, les mesures d’activités in vivo ont permis de conforter les résultats obtenus par bioautographie. Administré à raison de 100 mg/kg, l’ostruthol diminue en effet l’activité enzymatique de 20 à 25 % au niveau de l’hippocampe et du cortex frontal, qui plus est sans signe de toxicité apparent.
121 Chapitre 3
122 Conclusions et perspectives
CHAPITRE 4
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
123 Chapitre 4
124 Conclusions et perspectives
Lors d’un criblage visant à détecter des extraits végétaux présentant une activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE), cinq espèces se sont révélées significativement actives dans un test enzymatique sur couche mince, dont trois Gentianaceae, une Apiaceae et une Amaryllidaceae. Dans cette étude, le fractionnement bioguidé a été entrepris pour trois de ces espèces : la gentiane champêtre ( Gentianella campestris (L.) Börner) et la gentiane amère (Gentianella amarella ssp. acuta J.M.Gillett), qui présentaient un profil d’activité similaire, ainsi qu’une Apiaceae : l’impératoire ( Peucedanum ostruthium (L). Koch).
Le fractionnement de l’extrait méthanolique de parties aériennes de Gentianella campestris a été réalisé par HPLC semi-préparative et a conduit à l’obtention de cinq composés majoritaires, dont un C-glucoflavonoïde : l’isoorientine ( A), ainsi que quatre xanthones 1,3,5,8-tétra-O-substituées : la norswertianoline ( B), la swertianoline ( C), la bellidine ( D) et la bellidifoline ( E) ( Figure 4.1 ), précédemment identifiées par Kaldas et al . en 1974.
OH OH
HO O O OH OH
Glc OH O O OOH Glc A B
OH OH OH O O O OH O O CH3 CH3
O OOH OH OOH OH O OH Glc CDE
Figure 4.1 Composés A-E isolés de Gentianella campestris .
Le fractionnement de l’extrait méthanolique de Gentianella amarella ssp. acuta a quant à lui été réalisé essentiellement par chromatographie de partage centrifuge, et a permis l’isolement de dix xanthones appartenant à quatre schémas de substitutions différents (Figure 4.2 ) : - des xanthones 1,3,5,8-tétra-O-substituées : les mêmes que celles isolées à partir de G. campestris ( B-E) ainsi que deux bisxanthones, la swertiabisxanthone-I ( F) et son équivalent 8’-O-glucosylé ( K),
125 Chapitre 4
- deux xanthones 1,3,4,5,8-penta-O-substituées dérivées de la corymbiférine : la corymbiférine-1-O-glucoside ( J) et la corymbiférine-3-O-glucoside ( H), - une xanthone 1,3,4,7-substituée, le vératriloside (I), - et une xanthone présentant le schéma de substitution 1,3,4,7,8 : le triptexanthoside C ( G).
OH OH OH O OH O O O OH CH3
O OOH O OOH OH OOH Glc Glc BCD
OH OH OH O O O OH O OH CH3
OH O OH OH O OH OH OOH E F
CH3 H3C CH3 CH3 O O O O O O O O O O CH 3 Glc CH 3
O O Glc OH O OH OH OOH Glc OOH GHI
H3C CH3 O O OH OH O OH O OH O OH
OH OO O OOH OH OOH Glc Glc J K
Figure 4.2 Composés B-K isolés de Gentianella amarella ssp. acuta .
Les composés H et K sont des nouveaux glucosides ; quant aux xanthones F, G, I et J, elles n’avaient jamais été identifiées auparavant chez G. amarella ssp. acuta . De plus, c’est la première fois que des bisxanthones sont identifiées dans le genre Gentianella . Relativement répandues chez les champignons (Isaka et al. , 2005; Ondeyka et al. , 2006), les xanthones dimériques sont plus rares chez les végétaux supérieurs. On les
126 Conclusions et perspectives rencontre principalement dans la famille des Clusiacées, notamment dans les genres Hypericum , Garcinia et Mesua (Sordat-Diserens et al. , 1992; Singh et al. , 1993; Zhang et al. , 2007). Chez les Gentianaceae en revanche, les bisxanthones ont été identifiées jusqu’à présent uniquement dans des espèces du genre Swertia (Tan et al. , 1991; Tan et al. , 1992; Bian et al. , 1999).
La chromatographie de partage centrifuge, qui repose sur des phénomènes physico- chimiques différents de ceux de la chromatographie liquide utilisant une phase stationnaire solide, a ainsi permis la séparation de molécules qui co-éluaient en HPLC avec le premier gradient employé. L’utilisation de la CPC a révélé des composés dont la présence ne pouvait être suspectée sur la base de l’analyse par HPLC, notamment à cause de la similitude des spectres UV et des faibles quantités. Par ailleurs, la grande capacité de charge des systèmes utilisés a permis de fractionner des quantités importantes d’extraits et d’isoler par conséquent les composés minoritaires. Une méthode associant un système UPLC ® couplé à un spectromètre de masse à haute résolution a été utilisée afin de comparer la composition phytochimique des deux gentianes. L’usage de ces deux techniques a permis d’améliorer la vitesse de séparation, la résolution et surtout la sensibilité de détection, permettant ainsi de visualiser les xanthones minoritaires. La similarité des profils métaboliques des deux espèces est frappante. L’analyse par UPLC/ESI-TOF-MS a donc permis l’identification en ligne dans l’extrait de G. campestris des dix xanthones B-K isolées de G. amarella ssp. acuta ; les xanthones glucosylées G, H et I et les bisxanthones F et K sont identifiées pour la première fois chez G. campestris . De la même manière, l’analyse par UPLC/TOF-MS a permis de déterminer la présence de l’isoorientine ( A) dans l’extrait méthanolique de G. amarella ssp. acuta .
Les travaux de Kaldas en 1977 avaient déjà mis en évidence la similarité de composition polyphénolique entre G. campestris et deux autres espèces du genre Gentianella : Gentianella ramosa (Hegetschw.) Holub et Gentianella germanica (Willd.) E.F. Warb. (Kaldas, 1977). En revanche, l’étude soulignait l’absence de xanthones 1,3,4,7,8-O- substituées dans ces espèces, et les différenciait donc de Gentianella bellidifolia et G. corymbifera chez qui ce schéma de substitution est présent. Or, la déréplication de l’extrait de G. campestris effectuée ici par UPLC/TOF-MS indique bien la présence d’une xanthone 1,3,4,7,8-O-substituée, le triptexanthoside C ( G), ce qui confirme le lien phytochimique étroit entre les différentes espèces du genre Gentianella .
127 Chapitre 4
Les schémas de substitutions xanthoniques rencontrés dans les Gentianaceae semblent donc être une clé dans la distinction des genres. Les différentes observations phytochimiques confirment la ségrégation des genres Gentiana et Gentianella , et tendent à rapprocher ce dernier du genre Swertia , chez qui l’on retrouve globalement les même formes substituées. Il serait alors intéressant de réaliser une étude chimiotaxonomique des gentianes du genre Gentianella en utilisant le couplage UPLC/TOF-MS, et également des genres Gentiana et Swertia , afin de comparer les profils métaboliques obtenus, et le cas échéant d’appuyer ainsi les récentes classifications phylogéniques établies. L’utilisation du couplage LC/RMN ou de la spectrométrie de masse en tandem MS/MS pourrait également permettre d’obtenir en ligne des informations sur la structure des xanthones ; très peu d’études ont en effet été réalisées sur la fragmentation des xanthones – les seules concernent les dérivés C-glycosidiques, tels que la mangiférine, dont la fragmentation est comparable à celle des flavonoïdes C- glycosylés (Conceicao et al. , 2006; Suryawanshi et al. , 2006).
Le fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique de racines de Peucedanum ostruthium a conduit à l’isolement de cinq coumarines majoritaires : l’ostruthol ( N), l’ostruthine ( Q), l’impératorine ( M), l’isoimpératorine ( P) et l’hydrate d’oxypeucédanine (L), et d’une chromone : la peucénine ( O) ( Figure 4.3 ).
HO CH3 HO CH3 CH3 HO O O CH3 O O CH3 H3C O O O O
CH3 M O O O O CH3 O O L N
CH3
CH OH O 3 CH3 P CH3 CH3
H3C O H3C
HO O CH3 HOO O O Q O O O
Figure 4.3 Composés L-Q isolés de Peucedanum ostruthium .
128 Conclusions et perspectives
La majorité des molécules isolées – à l’exception de l’isoorientine et des bisxanthones – a révélé une activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase dans un test enzymatique sur couche mince. L’ostruthol ( N) s’est révélé particulièrement puissant avec une activité dix fois supérieure à celle de la galanthamine. Les essais en solution par la méthode d’Ellman ont confirmé une activité modérée pour la plupart des composés ; en revanche, l’ostruthol s’est montré inactif en solution. Les différences observées pourraient éventuellement s’expliquer par des variations de conformation enzymatique ou de polymorphisme. Au final, trois coumarines : l’ostruthine ( Q), l’impératorine ( M), l’isoimpératorine ( P), et une xanthone : le triptexanthoside C ( G), ont été considérées comme actives dans le test d’Ellman, avec des
valeurs d’IC 50 respectives de 1.99, 9.33, 15.8 et 13.8 M. Deux molécules ont été sélectionnées pour faire l’objet de tests in vivo sur des souris : l’ostruthine, afin de confirmer le fort pouvoir d’inhibition observé dans les deux essais enzymatiques, ainsi que l’ostruthol, dans le but de trancher sur son réel potentiel inhibiteur. L’ostruthine s’est révélée non seulement inactive dans les différentes zones cérébrales étudiées, mais surtout fortement toxique, induisant la mort des animaux à la dose de 100 mg/kg. En revanche, ces analyses in situ ont confirmé l’activité inhibitrice de l’ostruthol observée par bioautographie, et ce sans toxicité apparente : administré à raison de 100 mg/kg, l’ostruthol diminue l’activité enzymatique de 20 à 25 % au niveau de l’hippocampe et du cortex frontal. Cette activité est similaire à celle de la galanthamine testée à 15 mg/kg.
Le cas de l’ostruthol et de l’ostruthine illustre l’absence de corrélation qui peut parfois exister entre les résultats obtenus in vitro et in vivo . Les essais sur animaux sont donc des étapes cruciales pour la confirmation de l’activité pharmacologique des composés ; toutefois, les tests in vivo restent lourds à mettre en place et nécessitent de plus une grande quantité de molécule à tester, ce qui n’est pas toujours évident dans le cas des métabolites minoritaires. Ainsi, de nouvelles étapes de fractionnement sont nécessaires afin d’obtenir l’impératorine, l’isoimpératorine et le triptexanthoside C en quantités suffisantes pour étudier leur activité chez la souris. Il faut cependant souligner que les criblages initiaux par tests bioautographiques restent un outil de choix dans la recherche de composés biologiquement actifs.
Outre l’étude de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase, il serait intéressant de vérifier si les composés isolés inhibent également les monoamine oxydases. En effet, les xanthones et les coumarines sont des classes de composés connues pour cette propriété (Ohishi et al. ,
129 Chapitre 4
2000; Brühlmann et al. , 2001). Or, l’inhibition de la monoamine oxydase B (MAO-B) se révèle utile dans le traitement de la maladie d’Alzheimer : chez les personnes atteintes de la MA, l’activité de la MAO-B est en effet nettement supérieure, ce qui entraîne une production élevée de radicaux libres dans le cerveau accélérant le processus de mort neuronale (Nakamura et al. , 1990). Les inhibiteurs de MAO-B peuvent donc être utilisés comme agents neuroprotecteurs, tout en diminuant les symptômes dépressifs associés à la maladie (Sowa et al. , 2004).
Les travaux effectués ont donc permis de mettre en évidence la présence de composés inhibant l’activité de l’acétylcholinestérase dans des plantes communes de montagne : la gentiane champêtre, la gentiane amère et l’impératoire. Les molécules isolées appartiennent toutes à des classes de composés autres qu’alcaloïdes : xanthones, coumarines et chromones. Il est envisageable que ces composés soient mieux tolérés par l’organisme, et qu’ils possèdent éventuellement un mode d’action multiple, à l’image de la galanthamine ou de l’huperzine A. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives quant à l’utilisation de molécules naturelles non alcaloïdiques dans le traitement de la maladie d’Alzheimer.
130 Partie expérimentale
CHAPITRE 5
5. PARTIE EXPERIMENTALE
131 Chapitre 5
132 Partie expérimentale
5.1. Matériel végétal et extraction
Les extraits bruts utilisés dans cette étude – à l’exception de ceux provenant du deuxième lot de Gentianella campestris – étaient déjà à disposition au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie.
5.1.1. Gentianella campestris (L.) Börner
Le premier lot de plantes entières de Gentianella campestris (L.) Börner a été récolté à Châtel, au Col de Mollendruz, Vaud, Suisse, en septembre 1997. Un échantillon de référence (n° 97067) a été déposé au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève. Les parties aériennes ont été séparées des racines, puis pulvérisées ; la poudre obtenue (100 g) a été extraite successivement avec de l’éther de pétrole 60-80 (3 x 500 mL,
24 h), du CHCl 3 (3 x 500 mL, 24 h) et du MeOH (3 x 500 mL, 24 h) à température ambiante, pour donner respectivement 1.8 g (2%), 2.2 g (2%), et 12.0 g (12%) d’extrait sec. Le deuxième lot de G. campestris (plantes entières) a été récolté en septembre 2005, également à Châtel, au Col de Mollendruz, Vaud, Suisse. Un échantillon de référence (n° 2005004) a été déposé au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève. Les plantes pulvérisées (152 g) ont été extraites à température ambiante, successivement avec du CH 2Cl 2 (3 x 1.5 L, 24 h), puis du MeOH (3 x 1.5 L, 24 h), pour donner respectivement 7.70 g (5%) et 39.03 g (26%) d’extrait sec. 35 g d’extrait MeOH ont été suspendus dans 200 mL d’eau, puis extraits successivement à
température ambiante avec Et 2O (3 × 100 mL), AcOEt (3 × 100 mL) et BuOH saturé en eau (3 × 100 mL) pour conduire respectivement à l’obtention de 2.30 g (7%), 3.27 g (9%) et 7.51 g (21%) d’extrait sec. La phase aqueuse résiduelle représentait 14.09 g (40%).
5.1.2. Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M. Gillett
Les plantes entières de Gentianella amarella (L.) Börner ssp. acuta (Michx.) J.M.Gillett ont été récoltées en Mongolie en 1993 dans les environs d’Oulan-Bator et identifiées par le Dr. Sanchir (Herbarium de l’Institut Botanique, Oulan-Bator, République de Mongolie). Un échantillon de référence (n° 93013) a été déposé au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève.
133 Chapitre 5
Les plantes pulvérisées (287 g) ont successivement été extraites à température ambiante avec du CH 2Cl 2 (3 x 1.5 L, 24 h), puis du MeOH (3 x 1.5 L, 24 h), pour donner respectivement 14.3 g (5%) et 44.0 g (15%) d’extrait sec. 35 g d’extrait MeOH ont été suspendus dans 200 mL d’eau, puis extraits successivement à
température ambiante avec Et 2O (3 × 100 mL), AcOEt (3 × 100 mL), et BuOH saturé en eau (3 × 100 mL) pour conduire respectivement à l’obtention de 4.76 g (14%), 2.39 g (7%) et 7.56 g (22%) d’extrait sec. La phase aqueuse résiduelle représentait 20.16 g (58%).
5.1.3. Peucedanum ostruthium (L.) Koch
Les racines de Peucedanum ostruthium (L.) Koch ont été récoltées à Champex, Valais, Suisse, en juin 2001. Un échantillon de référence (n° 2001034) a été déposé au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève. Les racines pulvérisées (200 g) ont été extraites successivement avec de l’hexane (3 x 1.2 L,
24 h) et du CH 2Cl 2 (3 x 1.2 L, 24 h), à température ambiante, pour donner 6.9 g (3%) et 8.6 g (4%) d’extrait sec.
5.2. Méthodes chromatographiques analytiques
5.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
Les analyses par chromatographie sur couche mince ont été effectuées sur des plaques de
Silicagel 60 F 254 sur feuille d’aluminium (Merck). Après développement dans des cuves en verre (Camag), les plaques ont été observées à la lumière du jour, et sous lampe UV à 254 et 366 nm. Selon les cas, elles ont ensuite été soumises à différents tests chimiques ou bioautographiques.
5.2.2. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/UV/Vis-DAD)
Les analyses ont été réalisées avec un système Hewlett-Packard 1100 équipé d’un détecteur à barrettes de diodes pour l’enregistrement des spectres UV/Vis. Les extraits ont été injectés sur une colonne Nova-Pak RP-18 (4 µm, 150 × 3.9 mm i.d.) (Waters). Le gradient utilisé pour les extraits de P. ostruthium était le suivant : H 2O-MeOH contenant 0.05% de TFA, à un débit de 1 mL.min -1, 75-25 à 0-100 en 25 min, puis 100% de MeOH pendant 5 min. Le
premier système pour les extraits de gentianes était : H2O-MeOH contenant 0.05% de TFA, à
134 Partie expérimentale un débit de 1 mL.min -1, 95-5 à 0-100 en 30 min, puis 100% de MeOH pendant 5 min ; le -1 second système était : H2O-MeCN contenant 0.1% de FA, à un débit de 1 mL.min , 95-5 à 70-30 en 20 min, puis 70-30 à 0-100 en 10 min, puis 100% de MeCN pendant 5 min.
5.2.3. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS)
Les analyses des extraits par HPLC/MS ont été réalisées dans les conditions chromatographiques décrites ci-dessus. Le système HPLC a été couplé à un spectromètre de masse LCQ (Finnigan MAT) à trappe ionique équipé d’une source d’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Les analyses ont été effectuées en mode positif. Les ions moléculaires protonnés [M+H] + ont été choisis comme ions parents pour la fragmentation.
5.2.4. Chromatographie liquide à ultra performance couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC ®/HRMS)
Les conditions d’analyse ont été développées au sein de la société Waters, à Manchester, Royaume-Uni. Les analyses des extraits et des composés purs ont été effectuées à l’aide d’un ® système UPLC Acquity et d’une colonne Acquity UPLC BEH C 18 (1.7 µm, 150 × 2.1 mm i.d.) (Waters), en utilisant un gradient de solvants H 2O-MeCN contenant 0.1% de FA, à un débit de 300 L.min -1 (5 à 55% de MeCN en 15 min, puis 98% de MeCN pendant 1 min). Le système UPLC ® a été couplé à un spectromètre de masse Micromass LCT-Premier (Waters) équipé d’une source de type électrospray (ESI) et d’un analyseur à temps de vol (TOF). Les analyses ont été effectuées en mode positif ou négatif.
5.3. Méthodes chromatographiques séparatives
5.3.1. Partage liquide-liquide
Les extraits méthanoliques de gentianes (35 g) ont été suspendus dans l’eau (200 mL), puis partagés successivement avec Et 2O (3 × 100 mL), AcOEt (3 × 100 mL) et BuOH saturé en eau (3 × 100 mL), conduisant ainsi à l’obtention de quatre fractions de polarité croissante :
Et 2O, AcOEt, BuOH, et aqueuse résiduelle.
135 Chapitre 5
5.3.2. Chromatographie liquide à haute performance semi-préparative
Le fractionnement de l’extrait méthanolique de parties aériennes de G. campestris a été réalisé à l’aide d’un module de compression radiale PrepLC 25 mm équipé d’une colonne
PrepLC 25 mm Bondapak C 18 (10 m, 100 × 25 mm i.d., Waters). Les solvants (H2O- MeOH contenant 0.05% de TFA) ont été distribués par deux pompes LC-8A (Shimadzu) équipées d’un dégazeur DG-4413 (Degasys), le débit étant de 10 mL.min -1, et le gradient (de 5 à 100% de MeOH) se faisant sur 35 minutes. Plusieurs injections ont été effectuées via une vanne d’injection Rheodyne équipée d’une boucle de 300 L, de manière à injecter une quantité totale de 30 mg d’extrait. Les pics d’intérêt ont été collectés manuellement.
5.3.3. Chromatographie liquide sur colonne ouverte (CC)
5.3.3.1. Chromatographie d’adsorption
La séparation de la fraction IX (1.7 g) issue de la seconde CPC sur l’extrait de P. ostruthium a été effectuée sur gel de silice 60 (0.040-0.063 mm, Merck) à l’aide d’un mélange hexane- AcOEt en proportions égales. L’échantillon a été introduit sous forme solide en le mélangeant avec 4 g de silice. Le suivi de la séparation et le rassemblement final des fractions ont été effectués sur la base d’analyses par CCM.
5.3.3.2. Chromatographie d’exclusion
La purification finale des composés a été réalisée sur Sephadex® LH-20 (G.E. Healthcare). Les échantillons ont été introduits après dissolution totale dans un minimum de MeOH, puis élués avec du MeOH. Le suivi de la séparation et le rassemblement des fractions ont été effectués sur la base d’analyses par CCM.
5.3.4. Chromatographie de partage centrifuge (CPC)
5.3.4.1. CPC semi-préparative
Les fractionnements par CPC ont été effectués sur un chromatographe DE Mini Centrifuge (Dynamic Extractions) équipé d’une bobine d’un volume de 17 mL, réglé à une vitesse de rotation de 2000 rpm. Deux pompes Scientific Systems Inc. (SSI) modèle 300 ont été utilisées pour délivrer la phase mobile à un débit de 1 mL.min -1. Les échantillons ont été injectés dans le système via une boucle de 10 mL. Les chromatogrammes ont été enregistrés à 254 nm (détecteur UV-visible Knauer) avec un intégrateur Tarkan modèle 600. Les
136 Partie expérimentale fractions ont été recueillies à l’aide d’un collecteur automatique de fractions LKB Bromma 2070 Ultrorac® II, et rassemblées selon les résultats des analyses par CCM.
5.3.4.2. CPC préparative
Les fractionnements ont été réalisés soit à l’aide d’un chromatographe à contre courant planétaire CCC-1000 (Pharma-Tech Research Corp.) équipé d’un jeu de bobines d’une capacité totale de 650 mL, soit avec un chromatographe Quattro CCC Mk 5 LabPrep 1000 (AECS) équipé d’un jeu de bobines d’une capacité totale de 904 mL. La vitesse de rotation a été réglée à 870 rpm. Les phases liquides ont été délivrées en proportions égales par deux pompes Scientific Systems Inc. (SSI) modèle 300 à un débit de 3 mL.min -1 (le débit a pu être modifié occasionnellement afin d’accélérer la séparation). Les échantillons ont été injectés dans le système par une boucle de 70 mL. L’élution a été suivie par un détecteur UV-visible Knauer réglé à 254 nm et les chromatogrammes ont été enregistrés avec un intégrateur Tarkan modèle 600. Les fractions ont été recueillies à l’aide d’un collecteur automatique de fractions LKB Bromma 2070 Ultrorac® II, et rassemblées selon les résultats des analyses par CCM. Suivant les cas, la phase organique ou la phase aqueuse des systèmes sélectionnés a d’abord été utilisée comme phase mobile, puis au cours du fractionnement le sens d’élution a été inversé et l’autre phase utilisée comme éluant.
5.4. Méthodes physico-chimiques
5.4.1. Point de fusion
Les intervalles de fusion des composés cristallisés ont été mesurés à l’aide d’un microscope polarisant et d’une platine chauffante FP-82 Hot Stage contrôlée par un processeur central FP-800 (Mettler).
5.4.2. Pouvoir rotatoire
Le pouvoir rotatoire des composés présentant un centre d’asymétrie et des nouveaux composés a été mesuré avec un polarimètre Perkin Elmer 241 MC. La raie D (589 nm) d’une lampe à sodium a été utilisée comme source de lumière incidente. La rotation α de la lumière polarisée par les produits dissous dans de l’acétone ou du méthanol a été mesurée dans une
137 Chapitre 5 cuve de 10 cm de long. Le standard utilisé est une solution éthanolique de (1R,2S,5R)-(-)- -1 α 25 menthol à 100 mg.mL ( [ ]D = -50°). α Le pouvoir rotatoire spécifique [ ]D est défini comme suit (en degrés): α ×1000 [α]t = D D c×l α avec D = valeur mesurée (moyenne de 20 lectures) c = concentration de la solution (mg.mL -1) l = longueur de la cuve (dm) t = température lors de la mesure
5.4.3. Spectrométrie ultraviolet (UV)
Les spectres UV des composés ont été mesurés lors des analyses HPLC/UV grâce au détecteur à barrettes de diodes du système HP 1100. Le spectre UV des nouveaux composés a été mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis Lambda 20 (Perkin Elmer).
5.4.4. Spectrométrie de masse (MS)
Les spectres de masse ont été enregistrés en mode positif par un spectromètre LCQ (Finnigan MAT) à trappe ionique équipé d’une source d’ionisation chimique à pression atmosphérique
(APCI). Les analyses ont été effectuées dans les conditions suivantes : gaz réactant : N 2 à un débit de 77 unités, température du vaporisateur : 450 °C ; température du capillaire : 150 °C ; voltage de la source: 6 kV ; courant de la source : 5 A ; voltage du capillaire : 16 V. Les spectres de masse (150-1000 amu) ont été enregistrés toutes les 2 secondes. Les ions moléculaires protonnés [M+H] + ont été choisis comme ions parents pour la fragmentation. Les analyses HPLC/MS n ont été réalisées dans les conditions suivantes : gaz de collision : He à une pression de 0.5 mTorr ; énergie de collision : 40% ; temps de fragmentation : 200 ms. Les spectres ont été enregistrés toutes les secondes et la fenêtre spectrale a été réduite à 50- 500 amu. Les spectres de masse haute résolution ont été enregistrés en mode positif et négatif par un spectromètre Micromass LCT-Premier (Waters) à temps de vol (TOF) équipé d’un électrospray (ESI). Les analyses ont été effectuées dans les conditions suivantes : gaz de
désolvatation : N2 ; voltage du capillaire : 2800 V ; voltage du cône : 40 V ; voltage du détecteur MCP : 2650 V ; voltage du tube de vol : 7200 V ; température de la source : 120 °C ; température de désolvatation : 250 °C ; débit du cône gazeux : 10 L.h -1 ; débit du gaz de
138 Partie expérimentale désolvatation : 550 L.h -1. Les spectres de masse (100-1000 amu) ont été enregistrés toutes les 0.25 secondes.
5.4.5. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres RMN 1H et 13 C ont été mesurés à 500 MHz et 125 MHz respectivement, avec un spectromètre Unity Inova 500 (Varian) contenant une sonde multi-nucléaire (5 mm i.d.). Les spectres DEPT, ainsi que les expériences bidimensionnelles gDQF-COSY (gmqfcops), gHSQC, gHMBC et NOESY, ont été enregistrés à l’aide de séquences impulsionnelles spécifiques fournies par Varian. Les échantillons ont été solubilisés dans des solvants
deutérés (DMSO-d6 pour les xanthones et l’isoorientine, acétone-d6 pour la peucénine et les
coumarines, excepté pour l’hydrate d’oxypeucédanine qui a été dissoute dans du CD 3OD). Les déplacements chimiques δ ont été exprimés en ppm par rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS), utilisé comme référence interne.
5.5. Méthodes biologiques
5.5.1. Test d’inhibition de l’acétylcholinestérase (AChE)
5.5.1.1. Méthode bioautographique au Fast Blue B
L’inhibition de l’acétylcholinestérase par les extraits bruts, les fractions, et les produits purs, a été testée par bioautographie sur couche mince selon la méthode développée par Marston et al. (2002). Les extraits et les composés ont été déposés sur des plaques Silicagel 60 F 254 sur feuille d’aluminium (Merck). Les extraits et les produits purs ont été élués avec un système de solvants approprié. Après avoir été soigneusement séchées, les plaques ont été pulvérisées avec une solution d’AChE (isolée d’ Electrophorus electricus , Sigma, C3389, type VI-S) dans un tampon Tris-HCl 0.05 M à pH 7.8 contenant de l’albumine sérique bovine pour stabiliser l’enzyme (1000 U/150 mL). Après 20 min d’incubation à 37°C dans une atmosphère humide, les plaques ont été pulvérisées avec un mélange d’une solution éthanolique de naphtyl-1- acétate (2.5 mg.mL -1) et d’une solution aqueuse de sel Fast Blue B (2.5 mg.mL -1) dans les proportions 1:4. Les composés actifs apparaissent sous forme de taches claires sur fond pourpre. La quantité minimale inhibitrice (QMI) a été définie comme la quantité minimale requise pour détecter à l’œil nu une tache blanche d’inhibition (moyenne de 4 mesures). La galanthamine (QMI de 0.01 g) a été utilisée comme substance de référence.
139 Chapitre 5
5.5.1.2. Méthode d’Ellman en microplaques
Les mesures de l’inhibition en solution ont été effectuées au Laboratoire de Chimie Thérapeutique – groupe Pharmacochimie du Professeur Carrupt, Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne, Université de Genève. Les mesures ont été effectuées selon la méthode d’Ellman modifiée (Ellman et al. , 1961). Les réactions ont été faites dans des microplaques à 96 puits (Evergreen Scientific), remplis avec 227.5 L de réactif d’Ellman (DTNB à 0.15 mM dans du tampon phosphate 0.1 M à pH 7.4), 20 L de solution d’ATCI et 2.7 L de solution contenant le composé à étudier dans du DMSO. La réaction enzymatique a été initiée par ajout de 20 L d’une solution d’AChE (isolée d’ Electrophorus electricus , Sigma, C2888, type V-S) (concentration finale 0.074 U/mL) dans du tampon phosphate 0.1 M à pH 7.4. Les microplaques ont été agitées durant 2 secondes et l’augmentation d’absorbance à 412 nm a été mesurée à 25 °C pendant 3 minutes en utilisant un lecteur de microplaques PowerWaveX (BioTek Instrument). Les - valeurs d’IC 50 ont été déterminées pour les composés qui, testés à une concentration de 10 5 M, inhibaient l’AChE à au moins 40%.
5.5.1.3. Essais in vivo
Les tests d’inhibition in vivo de l’acétylcholinestérase ont été réalisés au Département d’Ethnopharmacologie du Professeur Elisabetsky, Université Fédérale de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brésil, selon les normes d’éthique en vigueur. Trois souris mâles CF-1, âgées de deux mois et demi, ont été utilisées par échantillon. Les composés ont été dissous dans un mélange DMSO/EtOH 1:1, puis administrés par voie orale, à raison de 30 et 100 mg/kg. Les souris ont été décapitées 90 min après l’administration orale, le cerveau retiré immédiatement et lavé avec un tampon glacé de phosphate de sodium 0.5 M, pH 7.5. Le cortex frontal, l’hippocampe et le striatum ont été prélevés rapidement, homogénéisés respectivement dans 40, 40 et 100 volumes de tampon, et centrifugés à 900 g pendant 10 min. Les supernageants ont été utilisés. Toutes les étapes ont été réalisées à 4°C. L’activité de l’AChE a été déterminée grâce à la méthode d’Ellman modifiée (Ellman et al. , 1961), en utilisant une solution d’ATCI comme substrat. Le volume total des milieux réactionnels était de 300 L (5 L d’enzyme, 235 L de tampon, 30 L de réactif d’Ellman [DTNB à 0.01 M]). Chaque échantillon a été mesuré en triplicat. Le blanc a été mesuré pour chaque milieu réactionnel après 10 min d’incubation, avant l’addition d’ATCI (75 mM). L’absorbance à 412 nm a été notée toutes les 30 sec durant 4 min. L’activité de
140 Partie expérimentale l’acétylcholinestérase a été estimée via les différences d’absorbance par minute, et les taux d’inhibition pour chaque zone du cerveau ont été calculés par comparaison avec le contrôle et exprimés en pourcentages du contrôle.
5.5.2. Hydrolyse enzymatique
Les xanthones glycosylées (1 mg) ont été dissoutes dans 1 mL de tampon acétate pH 5.0 avec 1 mg de β-D-glucosidase d’amande (Sigma, G4511) et incubées à 37 °C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel a ensuite été extrait par 1 mL d’AcOEt. La phase organique a été
lavée avec 3 × 1 mL d’H 2O pour éliminer toute trace d’enzyme, de sucre et de tampon. La qualité de l’hydrolyse a été contrôlée par CCM avec le système hexane-AcOEt 1:1 en déposant le glycoside de départ ainsi que la phase organique correspondante.
141 Chapitre 5
5.6. Constantes physiques et données spectrales des composés isolés
Composé A
Isoorientine
5' OH 6' 4'
8 1' 3' OH HO O 7 9 1 2 2' OH HO O 6 10 3 HO 5 4 OH OH O
2-(3,4-dihydroxyphényl)-6-β-D-glucopyranosyl- Nom chimique 5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one Aspect poudre jaune amorphe
Formule moléculaire C21 H20 O11
Poids moléculaire 448.3832 Da
Masse exacte 448.1006 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 263, 351 nm
+ 2 + 449 [M+H] ; MS 449 : 299 [M+H-150] (12), 329 [M+H- 120] + (32), 353 [M+H-96] + (52), 383 [M+H-30-36] + (100), APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 395 [M+H-54] + (26), 413 [M+H-36] + (30), 431 [M+H-18] + (59)
ESI-TOF-MS m/z 447.0905 [M-H] -
δ 3.18 (1 H, m, H-4’’), 3.26 (1 H, m, H-5’’), 3.34 (1 H, m, RMN 1H H-3’’), 3.41 1 H, m, H-6’’b), 3.69 (1 H, m, H-6’’a), 4.04 (1 H, m, H-2’’), 4.59 (1 H, d, J=9.3 Hz, H-1’’), 6.48 (1 H, s, H- (500 MHz), acétone-d6 8), 6.66 (1 H, s, H-3), 6.89 (1 H, d, J=8.3 Hz, H-5’), 7.40 (1 H, d, J=2.4 Hz, H-2’), 7.42 (1 H, dd , J=8.3, 2.4 Hz, H-6’) δ 62.3 (C-6’’), 71.1 (C-2’’), 71.3 (C-4’’), 73.9 (C-1’’), 77.8 RMN 13 C (C-3’’), 79.8 (C-5’’), 94.2 (C-8), 103.7 (C-3), 104.1 (C-10), 109.6 (C-6), 114.1 (C-2’), 116.9 (C-5’), 119.8 (C-6’), 122.2 (125 MHz), acétone-d6 (C-1’), 146.5 (C-3’), 150.5 (C-4’), 157.0 (C-9), 161.5 (C-5), 164.0 (C-7), 164.5 (C-2), 182.6 (C-4)
142 Partie expérimentale
Composé B
Norswertianoline 1,3,5-trihydroxyxanthone-8-O-β-D-glucopyranoside
OH 5 O 4 OH 6 3 OH 7 2 8 1 HO O HO O OOH OH
8-(β-D-glucopyranosyloxy)-1,3,5-trihydroxy- Nom chimique 9H-xanthèn-9-one Aspect poudre amorphe jaune
Formule moléculaire C19H18O11
Poids moléculaire 422.3453 Da
Masse exacte 422.0849 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 251, 273, 327 nm
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 423 [M+H] + (100), 261 [M+H-162]+ (15)
ESI-TOF-MS m/z 421.0730 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
143 Chapitre 5
Composé C
Swertianoline 1,5-dihydroxy-3-méthoxyxanthone-8-O-β-D-glucopyranoside
OH
5 4 O OCH 3 6 3
OH 7 2 8 1 HO O O OOH HO OH
8-(β-D-glucopyranosyloxy)-1,5-dihydroxy- Nom chimique 3-méthoxy- 9H-xanthèn-9-one Aspect poudre amorphe jaune crème
Formule moléculaire C20 H20 O11
Poids moléculaire 436.3722 Da
Masse exacte 436.1006 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 253, 275, 325 nm
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 437 [M+H] + (100), 275 [M+H-162]+ (25)
ESI-TOF-MS m/z 435.0923 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
144 Partie expérimentale
Composé D
Bellidine 1,3,5,8-tétrahydroxyxanthone
OH 5 O 4 OH 6 3
7 2 8 1
OH OOH
Nom chimique 1,3,5,8-tétrahydroxy-9H-xanthèn-9-one
Aspect aiguilles jaunes
Formule moléculaire C13 H8O6
Poids moléculaire 260.2029 Da
Masse exacte 260.0321 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 254, 278, 334, 388 nm
APCI-IT-MS m/z /
ESI-TOF-MS m/z 259.0239 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
145 Chapitre 5
Composé E
Bellidifoline 1,5,8-trihydroxy-3-méthoxyxanthone
OH
5 4 O OCH 3 6 3
7 2 8 1
OH OOH
Nom chimique 1,5,8-trihydroxy-3-méthoxy-9H-xanthèn-9-one
Aspect aiguilles jaunes
Formule moléculaire C14H10 O6
Poids moléculaire 274.2298 Da
Masse exacte 274.0477 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 254, 278, 334, 388 nm
APCI-IT-MS m/z /
ESI-TOF-MS m/z 273.0395 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
146 Partie expérimentale
Composé F
Swertiabisxanthone-I
OH OH
5' O 4' OH 5 O 4 OH 6' 3' 6 3
7' 2' 7 2 8' 1' 8 1
OH OOH OH OOH
Nom chimique 1,1',3,4',5,6',8,8'-octahydroxy-[2,2'-bi-9H-xanthène]-9,9'-dione
Aspect poudre amorphe jaune orangée
Formule moléculaire C26 H14 O12
Poids moléculaire 518.3900 Da
Masse exacte 518.0485 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 246, 314, 364 nm
APCI-IT-MS m/z /
ESI-TOF-MS m/z 517.0392 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
147 Chapitre 5
Composé G
Triptexanthoside C 1,8-dihydroxy-3,4-diméthoxyxanthone-7-O-β-D-glucopyranoside
CH3 O
OH 5 O 4 O 6 3 CH3 HO O HO 7 2 8 1 OH O OH OOH
2-(β-D-glucopyranosyloxy)-1,8-dihydroxy- Nom chimique 5,6-diméthoxy-9H-xanthèn-9-one Aspect poudre amorphe jaune
Formule moléculaire C21 H22 O12
Poids moléculaire 466.3985 Da
Masse exacte 466.1111 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 236, 266, 340 nm
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 467 [M+H] + (100), 305 [M+H-162]+ (17)
ESI-TOF-MS m/z 465.0994 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
148 Partie expérimentale
Composé H
Corymbiférine-3-O-glucoside 1,8-dihydroxy-4,5-diméthoxyxanthone-3-O-β-D-glucopyranoside
H3C CH3 OH O O HO OH 5 O 4 O 6 3 O OH 7 2 8 1
OH OOH
3-(β-D-glucopyranosyloxy)-1,8-dihydroxy- Nom chimique 4,5-diméthoxy-9H-xanthèn-9-one Aspect poudre amorphe jaune pâle
Formule moléculaire C21 H22 O12
Poids moléculaire 466.3985 Da
Masse exacte 466.1111 Da
230 (sh 3.81), 258 (3.97), 276 (sh 3.73), 346 (3.51) UV (MeOH) λ (log ε) max nm
30 -1 [a]D (c = 1 mg.mL , MeOH) +66.0 ± 9.0
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 467 [M+H] + (100), 305 [M+H-162] + (16)
ESI-TOF-MS m/z 511.1080 [M+HCOO] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
149 Chapitre 5
Composé I
Vératriloside 1-hydroxy-3,4-diméthoxyxanthone-7-O-β-D-glucopyranoside
H3C O 5 O 4 O OH 6 3 CH3 HO O 7 2 8 1 HO O OH OOH
7-(β-D-glucopyranosyloxy)-1-hydroxy- Nom chimique 3,4-diméthoxy-9H-xanthèn-9-one Aspect aiguilles jaunes
Formule moléculaire C21 H22 O11
Poids moléculaire 450.3991 Da
Masse exacte 450.1162 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 234, 264, 314, 380 nm
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 451 [M+H] + (100), 289 [M+H-162]+ (8)
ESI-TOF-MS m/z 495.1139 [M+HCOO] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
150 Partie expérimentale
Composé J
Corymbiférine-1-O-glucoside 3,8-dihydroxy-4,5-diméthoxyxanthone-1-O-β-D-glucopyranoside
H3C CH3 O O 5 O 4 OH 6 3
7 2 OH 8 1 HO OH OH O O O OH H
1-(β-D-glucopyranosyloxy)-3,8-dihydroxy- Nom chimique 4,5-diméthoxy-9H-xanthèn-9-one Aspect aiguilles jaunes
Formule moléculaire C21 H22 O12
Poids moléculaire 466.3985 Da
Masse exacte 466.1111 Da
UV (MeOH aq. ) λmax 232, 254, 278, 332 nm
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 467 [M+H] + (100), 305 [M+H-162]+ (32)
ESI-TOF-MS m/z 465.0997 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
151 Chapitre 5
Composé K
Swertiabisxanthone-I-8’-O-glucoside
OH OH
5' O 4' OH 5 O 4 OH 6' 3' 6 3
7' 2' 7 2 8' 1' 8 1
OH O OH OH OOH HO O O HO OH
8’-(β-D-glucopyranosyloxy)-1,1',3,4',5,6',8,'- Nom chimique heptahydroxy-[2,2'-bi-9H-xanthène]-9,9'-dione Aspect poudre amorphe orange
Formule moléculaire C32 H24 O17
Poids moléculaire 680.5324 Da
Masse exacte 680.1013 Da
UV (MeOH) λmax (log ε) 226 (sh 4.12), 255 (4.16), 280 (4.08), 334 (3.97) nm
30 -1 [a]D (c = 1 mg.mL , MeOH) -32.5 ± 1.0 681 [M+H] + (100), 663 [M+H-18]+ (10), 561 [M+H- APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 120]+ (9), 519 [M+H-162]+ (27), 513 [M+H-168]+ (12) ESI-TOF-MS m/z 679.0891 [M-H] -
RMN 1H voir Tableau 5.1 p. 153
RMN 13 C voir Tableau 5.2 p. 154
152 Partie expérimentale
s m m m m ; ; 8.8 ; ; 9.3 ; 7.8 ; 11.2 d d d ; ; 11.5,5.6
d 7.13(7’) 7.24(6’) 6.45(2’) 3.31(5’’) 3.18(4’’) 3.28(3’’) 3.35(2’’) 4.75(1’’) 3.74(6’’a) 3.50(6’’b) K dd
s ; ; 1.4 ; 1.4 6.16 6.36 7.15 d d
s s s J m m m m m ; ; 8.8 ; 8.8 ; ; 7.8 3.55 3.74 3.37 7.42 6.68 3.87 3.25 6.77 3.90 3.34 4.90 3.41 d d d ; ; 11.9,3.2 dd . a
s s I m m m m m ; ; 2.9 ; ; 7.3 ; ; 8.8 ; ; 12.7 3.70 3.53 3.36 3.22 3.31 7.70 3.94 4.96 3.28 3.81 6.60 7.66 7.58 ; ; 9.2, 2.9 d d d ; ; 11.2,5.4 d , 500 MHz) , 500 dd dd 6 d
s s s m m m m m m H ; ; 7.3 ; 8.8 ; 8.8 3.48 3.70 3.47 7.50 6.75 3.86 3.20 6.68 3.91 3.30 5.12 3.31 d d d
s s s m m m m G ; ; 8.8 ; ; 8.8 ; ; 7.3 ; ; 11.2 3.69 3.47 3.31 3.18 3.35 6.99 7.60 3.94 6.59 4.90 3.31 3.79 d d d ; ; 11.0,5.1 d dd
s ; ; 8.8 ; ; 8.8 d d 7.26(6’) 6.60(2’) 6.64(7’) F F
s ; ; 1.9 ; ; 2.4 6.24 6.45 7.15 age Hz. en d d
s E ; ; 1.4 ; ; 1.4 ; 8.8 ; ; 8.8 6.39 6.60 7.26 6.64 3.90 d d d d , multiplicités et constantes de couplage (DMSO-
K D D ; ; 1.9 ; ; 1.9 ; 8.8 ; ; 8.8 - 6.22 6.41 7.24 6.63 d d d d B
s m m m m C C ; ; 7.8 ; ; 8.8 ; ; 8.8 ; ; 2.4 ; ; 2.4 3.73 3.51 3.38 3.20 3.35 3.30 4.79 3.89 7.13 7.26 6.57 6.36 ; 11.7 d d d d d ; ; 11.7,5.8 d dd H des xanthonesH 1
m m m m B ; ; 7.8 ; ; 8.8 ; ; 9.3 ; ; 1.4 ; ; 1.4 3.50 3.74 3.33 3.20 3.30 3.37 4.78 7.13 7.25 6.38 6.18 ; ; 9.3, 4.9 d d d d d ; ; 11.2, 4.4 d dd -3 -3 -4 -5 3 3 3 2 4 5 6 7 8 H H 1’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’a 6’a 6’b 6’b Valeurs Valeurs de déplacements en ppm, constantes de coupl OCH OCH OCH Tableau 5.1 Déplacements RMN a
153 Chapitre 5
95.0(4’) 73.5(2’’) 76.0(3’’) 69.8(4’’) 77.4(5’’) 60.9(6’’) 184.1 (9’) 137.4 (5’) 122.7 (6’) 112.7 (7’) 151.0 (8’) 160.5 (1’) 113.2 (2’) 167.2 (3’) b 103.4 (1’’) 107.3 (8a’) 155.6 (4a’) 100.9 (8b’) 144.8 (4b’) K
98.6 94.4 162.2 167.8 157.5 142.8 137.8 126.7 149.5 107.2 101.8 181.1
J 60.7 57.3 73.3 76.2 69.4 77.3 60.6 154.4 101.9 157.3 129.9 151.0 144.1 139.3 120.6 108.7 153.8 108.6 104.6 180.7 100.8
I 76.3 73.2 69.5 77.1 60.5 95.0 56.5 60.9 101.2 159.8 159.8 128.1 148.7 150.8 119.3 125.7 153.8 110.2 120.0 102.2 180.0
C (500 MHz). H 99.2 60.9 57.2 99.9 73.1 76.6 69.5 77.2 60.5 13 156.9 158.3 129.2 151.3 147.2 140.0 121.7 109.1 153.1 108.5 104.0 183.1 H- 1
G 73.2 76.6 69.6 77.1 60.7 95.1 56.5 60.7 101.5 157.7 160.1 128.1 149.1 153.0 107.4 125.2 140.4 148.7 107.4 101.3 184.0
93.9(4’) 137.5 (5’) 123.6 (6’) 109.4 (7’) 151.8 (8’) 159.7 (1’) 107.2 (2’) 165.0 (3’) b 107.3 (8a’) 156.5 (4a’) 101.1 (8b’) 183.82 (9’) 143.3 (4b’) F .
a 98.5 94.3 ) ) 162.2 168.0 157.5 142.9 137.2 126.6 150.2 107.0 102.4 183.8 6 d s utilisées. C (125 MHz) ouC corrélations par 13
E 57 97.4 92.9 161.9 167.0 157.3 143.3 137.3 123.8 109.5 151.8 107.4 102.1 184.0 (DMSO- K K - B
D 99.5 95.4 163.3 167.5 158.5 144.3 138.3 124.7 110.5 152.9 108.4 102.3 184.9
C 74.2 76.8 70.5 78.2 61.6 97.9 92.9 56.8 103.9 163.4 167.0 157.2 145.8 141.8 121.8 112.6 150.1 113.1 104.2 181.8 C des xanthonesC 13
B 99.1 94.4 74.5 76.8 70.5 78.5 61.8 163.9 167.2 157.3 146.1 142.8 122.1 113.4 150.3 112.7 104.3 182.2 104.4 -3 -3 -4 -5 3 3 3 9 5 6 7 8 1 2 3 4 C 1’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 8a 8a 4a 4a 8b 4b OCH OCH OCH Le carbone 7 n’est pasLe détectable avecles séquence Valeurs en ppmen obtenuesValeurs mesure par directe du Tableau 5.2 Déplacements RMN a b
154 Partie expérimentale
Composé L
S-(-)- hydrate d’oxypeucédanine
H3C 4'' OH HO 3'' 2'' CH3 1'' 5'' O
3' 5 4 6 3 2' 7 2 O 8 O O 1' 1
4-[(2R)-2,3-dihydroxy-3-méthylbutoxy]- Nom chimique 7H-furo[3,2-g][1]benzopyran-7-one Aspect cristaux incolores
Formule moléculaire C16 H16 O6
Poids moléculaire 304.2994 Da
Masse exacte 304.0947 Da
UV (MeOH) λmax 222, 250, 268, 312 nm
Point de fusion 131-134 °C
22 -1 [a]D (c = 2 mg.mL , acétone) -18.15° APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 305 [M+H] + (100), 203 [M+H-102]+ (7)
ESI-TOF-MS m/z 305.1024 [M+H] + δ 1.24 (3 H, s, H-5’’), 1.29 (3 H, s, H-4’’), 3.83 (1 H, dd , J = 8.3, 2.4 Hz, H-2’’), 4.40 (1 H, dd , J = 9.8, 8.3 Hz, H- 1 RMN H 1’’b), 4.58 (1 H, , dd , J = 9.8, 2.4 Hz, H-1’’a), 6.30 (1 H, (500 MHz), CD 3OD d, J = 9.8 Hz, H-3), 7.21 (1 H, s, H-8), 7.24 (1 H, d, J = 2.4 Hz, H-3’), 7.81 (1 H, d, J = 2.4 Hz, H-2’), 8.44 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-4) δ 24.83 (C-5’’), 27.24 (C-4’’), 72.68 (C-3’’), 75.85 (C- RMN 13 C 1’’), 78.14 (C-2’’), 94.69 (C-8), 106.31 (C-3’), 108.36 (C- 4a), 112.99 (C-3), 115.40 (C-6), 141.72 (C-4), 146.83 (C- OD (125 MHz), CD 3 2’), 150.81 (C-5), 153.92 (C-8a), 159.86 (C-7), 163.30 (C- 2)
155 Chapitre 5
Composé M
Impératorine
3' 5 4 6 3 2' 7 2 O 8 O O 1' 1 O 1''
2'' CH3 3'' 5''
CH3 4''
9-[(3-méthyl-2-butén-1-yl)oxy]-7H-furo[3,2-g] Nom chimique [1]benzopyran-7-one Aspect aiguilles incolores
Formule moléculaire C16 H14 O4
Poids moléculaire 270.2848 Da
Masse exacte 270.0892 Da
UV (MeOH) λmax 218, 248, 302 nm
Point de fusion 98-100 °C
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 271 [M+H] + (100), 215 [M+H-56]+ (8), 203 [M+H-68]+ (9)
ESI-TOF-MS m/z 271.0966 [M+H] +
δ 1.70 (3 H, s, H-5’’), 1.71 (3 H, s, H-4’’), 4.97 (2 H, d, J = 1 RMN H 7.3 Hz, H-1’’), 5.57 (1 H, m, H-2’’), 6.34 (1 H, d, J = 9.8 Hz, (500 MHz), acétone-d6 H-3), 6.99 (1 H, d, J = 2.4 Hz, H-3’), 7.60 (1 H, s, H-5), 7.95 (1 H, d, J = 2.4 Hz, H-2’), 8.02 (1 H, d, J = 9.3 Hz, H-4) δ 17.43 (C-5’’), 25.52 (C-4’’), 69.77 (C-1’’), 107.11 (C-3’), 13 RMN C 114.12 (C-5), 114.58 (C-3), 116.94 (C-4a), 120.30 (C-2’’), (125 MHz), acétone-d6 126.21 (C-6), 131.50 (C-8), 139.13 (C-3’’), 144.26 (C-8a), 144.87 (C-4), 147.42 (C-2’), 148.80 (C-7), 159.81 (C-2)
156 Partie expérimentale
Composé N
[(+)-R-(Z)]-ostruthol
CH3 10'' HO 4'' CH3 7'' O 3'' 8'' 6'' 2'' CH3 1'' 5'' CH3 O 9'' O
3' 5 4 6 3 2' 7 2 O 8 O O 1' 1
(2Z)-2-acide buténoïque, 2-méthyl-(1R)-2-hydroxy-2- Nom chimique méthyl-1-[[(7-oxo-7H-furo[3,2-g][1]benzopyran-4-yl)oxy] méthyl]propyl ester Aspect cristaux incolores
Formule moléculaire C21 H22 O7 Poids moléculaire 386.4015 Da Masse exacte 386.1366 Da
UV (MeOH) λmax 220, 250, 268, 312 nm Point de fusion 134-137 °C 22 -1 [a]D (c = 5 mg.mL , acétone) + 7.02 ° 387 [M+H] + (100), 369 [M+H-18]+ (28), 287 [M+H-100]+ APCI-IT-MS m/z (int. rel.) (7), 269 [M+H-118]+ (3), 203 [M+H-184]+ (6), 185 [M+H-202]+ (15) ESI-TOF-MS m/z 387.1447 [M+H] + δ 1.32 (3 H, s, H-5’’), 1.33 (3 H, s, H-4’’), 1.86 (3 H, m, H-10’’), 1.97 (3 H, dd , J = 6.8, 1.4 Hz, H-9’’), 4.10 (1 H, s, OH-3’’), 4.75 (1 H, dd , J = 10.5, 8.5 Hz, H-1’’b), 5.05 1 RMN H (1 H, dd , J = 10.5, 2.4 Hz, H-1’’a), 5.46 (1 H, dd , J = 8.3, (500 MHz), acétone-d6 2.4 Hz, H-2’’), 6.13 (1 H, qd , J = 14.1, 6.8, 1.4 Hz, H-8’’), 6.23 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 7.17 (1 H, s, H-8), 7.30 ( d, J = 2.4 Hz, H-3’), 7.88 (1 H, d, J = 2.4 Hz, H-2’), 8.13 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-4) δ 15.91 (C-10’’), 20.69(C-9’’), 25.78 (C-4’’), 27.78(C- 5’’), 71.12 (C-3’’), 72.94 (C-1’’), 78.22 (C-2’’), 94.21 (C- 13 RMN C 8), 106.10 (C-3’), 107.36 (C-4a), 113.29 (C-6), 113.98(C- (125 MHz), acétone-d6 3), 128.59 (C-7’’), 138.94 (C-8’’), 139.86 (C-4), 146.40 (C-2’), 149.87 (C-5), 153.66 (C-8a), 159.04 (C-7), 160.67 (C-2), 167.62 (C-6’’)
157 Chapitre 5
Composé O
Peucénine
CH3 5' OH O
3' 1' 5 4 2' 6 3 H3C 4' 7 2 8 HO O CH3 1
5,7-dihydroxy-2-méthyl-6-(3-méthyl-2-butényl)- Nom chimique 4H-1-benzopyran-4-one Aspect cristaux incolores
Formule moléculaire C15 H16 O4
Poids moléculaire 260.2896 Da
Masse exacte 260.1049 Da
UV (MeOH) λmax 212, 232, 258, 298 nm
Point de fusion 207-211 °C
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 261 [M+H] + (100), 205 [M+H-56]+ (13), 181 [M+H-80]+ (9)
ESI-TOF-MS m/z 261.1123 [M+H] + δ RMN 1H 1.63 (3 H, d, J = 0.97, H-5’), 1.76 (3 H, s, H-4’), 2.35 (3 H, s, CH3-2), 3.31 (2 H, d, J = 7.32, H-1’), 5.25 (1 H, m, H-2’), 6.05 (500 MHz), acétone-d6 (1 H, s, H-3), 6.43 (1 H, s, H-8)
158 Partie expérimentale
Composé P
Isoimpératorine CH3 4''
3'' 2'' H3C 5'' 1'' O
3' 5 4 6 3 2' 7 2 O 8 O O 1' 1
4-[(3-méthyl-2-butén-1-yl)oxy]-7H-furo[3,2-g] Nom chimique [1]benzopyran-7-one Aspect aiguilles incolores
Formule moléculaire C16 H14 O4
Poids moléculaire 270.2848 Da
Masse exacte 270.0892 Da
UV (MeOH) λmax 222, 250, 312 nm
Point de fusion 107-109 °C
271 [M+H] + (100), 259 [M+H-12]+ (20), 243 [M+H-28]+ APCI-IT-MS m/z (int. rel.) (15), 219 [M+H-52]+ (11), 215 [M+H-56]+ (28), 203 [M+H- 68]+ (54) ESI-TOF-MS m/z 271.0955 [M+H] +
δ 1.70 (3 H, s, H-4’’), 1.80 (3 H, s, H-5’’), 4.92 (2 H, d, J = RMN 1H 7.32 Hz, H-1’’), 5.54 (1 H, t, J = 7.1 Hz, H-2’’), 6.26 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 6.95 (1 H, d, J = 1.95 Hz, H-3’), 7.15 (1 H, (500 MHz), acétone- d6 s, H-8), 7.59 (1 H, d, J = 2.44 Hz, H-2’), 8.15 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-4) δ 18.46 (C-5’’), 26.05 (C-4’’), 69.98 (C-1’’), 94.43 (C-8), 13 RMN C 105.29 (C-3’), 107.74 (C-4a), 112.78 (C-3), 114.42 (C-6), (125 MHz), acétone-d6 119.34 (C-2’’), 139.80 (C-4), 140.04 (C-3’’), 145.11 (C-2’), 149.19 (C-5), 152.90 (C-8a), 158.36 (C-7), 161.51 (C-2)
159 Chapitre 5
Composé Q
(E)-ostruthine
CH3 CH3 9' 10' 7' 5' 3' 1' 5 4 6' 4' 2' 6 3 H3C 8' 7 2 HOO 8 O 1
6-[(2E)-3,7-diméthyl-2,6-octadiényl]-7-hydroxy-2H-1- Nom chimique benzopyran-2-one
Aspect cristaux blanc-crème
Formule moléculaire C19H22 O3
Poids moléculaire 298.3819 Da
Masse exacte 298.1569 Da
UV (MeOH) λmax 224, 258, 334 nm
Point de fusion 117-118 °C
APCI-IT-MS m/z (int. rel.) 299 [M+H] +
ESI-TOF-MS m/z 299.1648 [M+H] +
δ 1.60 (3 H, s, H-9’), 1.66 (3 H, s, H-8’), 1.75 (3 H, s, H-10’), RMN 1H 2.07 (2 H, m, H-4’), 2.14 (2 H, m, H-5’), 3.38 (2 H, d, J = 7.3 Hz, H-1’), 5.13 (1 H, m, H-6’), 5.40 (1 H, m, H-2’), 6.15 (1 H, (500 MHz), acétone-d6 d, J = 9.8 Hz, H-3), 6.79 (1 H, s, H-8), 7.37 (1 H, s, H-5), 7.83 (1 H, d, J = 9.8 Hz, H-4) δ 15.56 (C-10’), 17.10 (C-9’), 25.22 (C-8’), 26.69 (C-5’), RMN 13 C 27.61 (C-1’), 39.82 (C-4’), 102.13 (C-8), 112.02 (C-4a), 112.16 (C-3), 122.13 (C-2’), 124.43 (C-6’), 126.05 (C-6), (125 MHz), acétone-d6 128.68 (C-5), 131.13 (C-7’), 136.52 (C-3’), 144.11 (C-4), 154.53 (C-8a), 158.98 (C-7), 160.56 (C-2)
160 Références
CHAPITRE 6
6. RÉFÉRENCES
161 Chapitre 6
162 Références
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