THESE DE DOCTORAT DE

L'UNIVERSITE DE NANTES

ECOLE DOCTORALE N° 598 Sciences de la Mer et du littoral Spécialité : Biologie des organismes

Par

Daphné CHÉREL L’atrésie ovocytaire chez les bivalves Cerastoderma edule (Linné, 1758) et Tapes philippinarum (Adams et Reeve, 1850)

Thèse présentée et soutenue à Nantes le 19/10/2020 Unité de recherche : Mer Molécules Santé (EA 2160)

Rapporteurs avant soutenance :

Sandra Shumway Professor University of Connecticut Elisabeth Von Brand Professor Universitad Católica del Norte

Composition du Jury :

Président : Laurent Barillé Professeur des Université Université de Nantes Examinateurs : Claire Passarelli Chercheuse invitée University of Essex Dir. de thèse : Peter Beninger Professeur émérite Université de Nantes Co-dir. de thèse : Gaël Le Pennec Maître de conférences Université Bretagne Sud

REMERCIEMENTS

A Peter Beninger, mon directeur de thèse, vous qui ne lirez jamais ces remerciements, (vous me l’avez si souvent dit). Vous m’avez donné ma chance, à la fin d’un cours, en acceptant cette demande de stage. Qui aurait pu deviner jusqu’où cela nous mènerait. Quelques années plus tard voici la dernière thèse qui vous dirigerez

(une thèse MacGyver !), j’espère vous en serez satisfait. Ces années à mes côtés n’ont sans doute pas toujours été faciles. Jamais d’accord avec vous, pleine de doutes et de peurs, vous avez toujours été là pour moi, malgré tout. Vous m’avez poussée à toujours mieux, à ne plus me contenter du bien, à tendre vers l’excellence, quelque chose de tout nouveau pour moi. Ces années à vos côtés m’ont apporté beaucoup plus que je ne l’imaginais. Vous m’avez appris tant de choses, fait découvrir les rouages du monde scientifique, les codes de la rédaction, l’art de l’explication. Grâce à vous j’ai découvert des émotions bien plus intenses devant un microscope que dans des montagnes russes.

Vos connaissances sans fin vous permettent de voir plus grand, plus loin, au-delà de beaucoup d’entre nous. Vous m’avez embarquée dans ce voyage vers les frontières de la science, au cœur de réflexions les plus complexes. Nous avons appris au fil des années à travailler ensemble et ça aurait été avec plaisir, si la vie nous le permettait, que j’aurais continué à le faire de nombreuses années.

Je ne vous ai jamais appelé Peter, toujours Monsieur. Alors peut-être que le moment est venu : Merci Peter.

Je souhaite remercier tout particulièrement mon co-directeur de thèse, Gaël Le

Pennec. Sans vous une très grande partie de la thèse aurait été impossible. Vous m’avez initié à la microcopie électronique à transmission (MET), un domaine que je n’aurais pas pu explorer seule. Merci pour votre implication, pour les coupes à Lorient, pour le rendez-vous du samedi sur les parkings de supermarché de Concarneau. Les heures passées ensemble à Brest, devant ce microscope sont à l’origine des plus belles réalisations de cette thèse. Merci également pour votre oreille attentive dans mes moments de doutes, de découragement et parfois même de colère. Vous m’avez permis de relativiser et de prendre du recul au moment où j’en avais le plus besoin. Merci

également pour le soin dans la relecture de ce travail.

Un très grand merci au Professeur Joël Fleurence. Sans le soutien que vous avez apporté à ce projet, jamais cette thèse n’aurait pu exister, ni être financée. Si ce travail existe aujourd’hui c’est aussi grâce à votre implication dès le départ et au cours de toutes ces années, lors des comités de suivi de thèse, ou au détour des couloirs.

Merci au Professeur Tristan Renault pour avoir accepté de faire partie de mon comité de suivi de thèse. Vos conseils et remarques ont toujours été d’une grande aide.

Merci aussi et surtout pour nous avoir proposé d’utiliser le MET d’IFREMER la

Tremblade, ainsi que de nous avoir mis en contact avec Bruno Chollet. Sans cela nous aurions eu encore plus de difficultés à obtenir tous ces résultats.

Un grand merci à Bruno Chollet, Philippe Elies et Nicolas Gautier pour leur aide à tous niveaux, leurs conseils et leur soutien technique dans la réalisation du protocole

pour l’obtention des images en MET. Merci pour cette générosité, pour ce don de temps et d’énergie.

Merci au SMIDAP et à la région Pays de la Loire pour leur soutien financier au début de ce projet.

Je tiens à exprimer ma gratitude à l’entreprise Chellet-Berteau du Croisic, en particulier à Pascal et David. C’est avec une immense gentillesse et une grande générosité que vous nous avez donné le libre accès à vos concessions pour nos

échantillonnages. Sans vous pas de matériel biologique et pas de thèse. Vous avez aussi été un relais pour nous auprès des professionnels, et pour tout cela, merci.

A mes professeurs devenus mes collègues. Vous avez cru en moi, tout au long de mon cursus. Vous m’avez écouté, conseillé, autour d’un café ou d’un déjeuner. Vous m’avez fait rire et donné confiance. Je ne pourrais pas tous vous citer. Merci à Vona qui m’a aidé à comprendre que en tant que doctorant nous sommes déjà chercheur, merci à

Bruno et Priscilla qui m’ont fait partager leur expérience, merci à Paul pour sa bienveillance, merci à Bruno J., Pierre, Laurent, Vincent, Véronique, Justine, Michelle et

Alexandra.

Merci à Alexandra et Emilie, pour votre aide, votre disponibilité, pour tout, tout le temps, en travaux pratiques comme au laboratoire. Vous êtes indispensables au bon fonctionnement et donc à la réalisation de tous les travaux de recherche.

Aux doctorants, post-doctorants, Marta, Antoine, Yoran, Alexandre, Guillaume et les autres. Pour votre accompagnement au jour le jour, merci. Avec vous, j’ai trouvé une

équipe avec laquelle partager mes craintes, mes doutes, mais aussi mes joies, professionnelles et personnelles. Au-delà de collègues j’ai trouvé des amis.

Eva, mon amie depuis plus de 20 ans. Le hasard de la vie nous a menées sur le même chemin, pour finalement nous retrouver voisines de bureau. Sans toi, rien n’aurait

été pareil. Dans 50 ans, vieilles et fripées nous parlerons encore de ces années.

Coucou Marius !

A tous les stagiaires que j’ai eu la chance d’encadrer. Dans le désordre :

Clémence, Baptiste, Léonard, Gabriel, Mathilde, Anaëlle, Thibault, Tanguy, Stacy-Ann,

Lucie et Marie, devenue une amie. Vous avez participé d’une façon ou d’une autre à la bonne réalisation de cette thèse, et pour cela vous avez toute ma gratitude. Vous m’avez appris quelque chose de primordial sur moi-même : enseigner est ce que je veux faire de ma vie.

A mes amis les plus proches, promis c’est fini, je ne vous embêterai plus avec tout ça. Vous avez été ma bouffée d’oxygène à chaque fois que j’en avais besoin, toujours disponibles, me prodiguant les encouragements et les conseils indispensables toutes ces années. Merci Rico pour les relectures de dernière minute. Merci d’avoir compris mes mauvaises humeurs, mes indisponibilités et parfois mon égocentrisme.

A ma famille. A Papa pour les moments d’échange sur ma thèse, pour l’intérêt et la curiosité que tu y portais. A Maman et Marine, pour les longues discussions lors de mes coups de gueule et de mes coups de mou, vous m’avez tirée vers le haut. Merci aussi pour la relecture et la correction des fautes (surement nombreuses…).

A Simon, devenu mon mari. «♪ Faudrait qu’j’invente des mots, qu’existent pas dans le dico ♫». Ça n’a pas dû être évident pour toi de m’accompagner dans les pires et les meilleurs moments. Tu m’as permis d’accomplir chaque journée avec tes bras et tes rires en récompense tous les soirs.

RESUME

L’atrésie ovocytaire, une dégénérescence des ovocytes dans la gonade, est un phénomène commun chez les bivalves mais très souvent négligé dans les études sur les cycles reproducteurs. La présente étude propose des critères de reconnaissance de l’atrésie ovocytaire et un compte rendu de son impact sur la fécondité de deux espèces exploitées, la palourde japonaise Tapes philippinarum et la coque commune

Cerastoderma edule, ainsi qu’une réflexion sur son origine et son contexte évolutif et

écologique. L’étude a été réalisée sur plusieurs années et sur plusieurs sites de la côte atlantique française.

La caractérisation de l’atrésie ovocytaire a été réalisée grâce à des outils de microscopie optique (histologie et ovocytes in toto) et de microscopie électronique à transmission. La déformation puis la rupture de la membrane ovocytaire a été mis en

évidence, associées à une dégradation/désorganisation des organites et de la chromatine.

La quantification par stéréologie a montré que l’atrésie impactait environ la moitié du volume ovocytaire au cours de la gamétogenèse, la plupart étant émis et non résorbés par la gonade. Un lien fonctionnel entre la gangue ovocytaire muqueuse et l’atrésie a été

établi chez la coque. L’atrésie pourrait avoir des causes endogènes, accentuées par des facteurs exogènes, typiques de la stratégie reproductive dans les milieux changeants.

Mots clés : atrésie, ovocytes, bivalves, histologie, cycles reproducteurs

ABSTRACT

Oocyte atresia is a common, but very often neglected phenomenon of oocyte degeneration in reproductive studies of the Bivalvia. The present study proposed criteria for recognition of oocyte atresia, insights into its origins and evolutionary/ecological consequences, as well as an estimation of its impact on fecundity in two exploited species, the Manila clam Tapes philippinarum and the common cockle Cerastoderma edule. The study was carried out over several years, at several sites on the French Atlantic coast.

The characterization of oocyte atresia was performed using optical microscopy

(histology and whole mounts) and transmission electron microscopy tools. Deformation and subsequent rupture of the oocyte membrane were observed, associated with organelle and chromatin degradation/disorganization.

Stereological quantification showed that atresia impacted approximately half of the total oocyte volume during the gametogenesis, most of which were emitted and not resorbed by the gonad. A functional link between the hypertrophied oocyte coat and atresia was established in cockles. Atresia could have endogenous causes, accentuated by exogenous factors, typical of a reproductive strategy in highly variable environments.

Keys words: atresia, oocytes, Bivalvia, histology, reproductive cycles.

TABLE DES MATIÈRES

Introduction générale ...... 1

La mortalité des jeunes stades, clé de la gestion des stocks ...... 3

I- 1 . 1 . La gestion des stocks en aquaculture ...... 3

I- 1 . 2 . La mortalité des jeunes stades chez les bivalves ...... 5

Le phénomène d’atrésie ovocytaire ...... 7

Les espèces étudiées ...... 9

I- 3 . 1 . Les sites d’études ...... 9

I- 3 . 2 . L’importance économique et patrimoniale des espèces étudiées ...... 11

La palourde japonaise Tapes philippinarum ...... 11 La coque commune Cerastoderma edule ...... 12 La vénériculture et la cérastoculture dans les Pays de la Loire ...... 13 La pêche à pied professionnelle ...... 14 La pêche à pied de loisir ...... 15

Objectives of the thesis ...... 16

Bases biologiques de Tapes philippinarum ...... 18

Introduction ...... 20

II- 1 . 1 . Taxonomie ...... 20

II- 1 . 2 . Répartition géographique de l’espèce ...... 22

II- 1 . 3 . Eléments de biologie ...... 23

Morphologie et anatomie ...... 23

Reproduction ...... 25 II- 1 . 4 . Objectives of the histological study of oocyte atresia in clam...... 29

Les caractéristiques de l’atrésie ovocytaire et ses effets sur l’effort de reproduction de la palourde japonaise Tapes philippinarum (Adams and

Reeve, 1850) ...... 30

II- 2 . 1 . Resumé et contexte ...... 30

II- 2 . 2 . Abstract ...... 34

II- 2 . 3 . Introduction ...... 35

II- 2 . 4 . Materials and methods ...... 37

Species, sites, and sampling ...... 37 Histological techniques ...... 39 Stereology ...... 39 II- 2 . 5 . Results ...... 41

Qualitative characteristics of atresia ...... 41 Seasonal pattern of atresia ...... 44 Quantification of atresia ...... 46 II- 2 . 6 . Discussion ...... 50

Histological features of atresia ...... 50 Temporal dynamics of oocyte atresia ...... 51

Impact of atresia on Re ...... 52 II- 2 . 7 . Acknowledgments ...... 55

Conclusions sur l’atrésie ovocytaire chez la palourde, et perspectives

...... 56

Bases biologiques de Cerastoderma edule ...... 58

Introduction ...... 60

III- 1 . 1 . Taxonomie ...... 60

III- 1 . 2 . Répartition géographique de l’espèce ...... 61

III- 1 . 3 . Eléments de biologie ...... 61

Morphologie et anatomie ...... 61 Reproduction ...... 63

Objectives of the study of oocyte atresia in the cockle ...... 65

L’atrésie ovocytaire et ses effets sur l’effort de reproduction de la coque commune Cerastoderma edule...... 66

III- 3 . 1 . Résumé et contexte ...... 66

III- 3 . 2 . Abstract ...... 69

III- 3 . 3 . Introduction ...... 70

III- 3 . 4 . Materials and methods ...... 72

Species, site, and sampling ...... 72 Histological and stereological techniques ...... 72 III- 3 . 5 . Results ...... 75

Qualitative characteristics of atresia ...... 75 Periods of gametogenesis and atresia ...... 78 Quantification of atresia ...... 78 III- 3 . 6 . Discussion ...... 80

Oogenetic and atresia dynamics ...... 80 Histological features of atresia ...... 80 Impact of atresia on fecundity and reproductive effort ...... 82 III- 3 . 7 . Acknowledgments ...... 83

Conclusions on oocyte atresia in cockle and perspectives ...... 84

Comparaison entre les deux espèces etudiées ...... 85

III- 5 . 1 . Les aspects histologiques qualitatifs et quantitatifs ...... 85

Caractéristiques histologiques qualitatives de l’atrésie ovocytaire ...... 85 Caractéristiques quantitatives de l’atrésie ovocytaire ...... 86 III- 5 . 2 . Impact sur l’effort de reproduction ...... 88

Effort de reproduction effectif ...... 89 Mise en application chez Tapes philippinarum ...... 91 Mise en application chez Cerastoderma edule ...... 97 III- 5 . 3 . Conclusions et perspectives relatives aux deux espèces étudiées ...... 102

Ultrastructure des ovocytes de coques et de palourdes

...... 104

Résumé et contexte ...... 106

Introduction ...... 108

Matériels et Methodes ...... 109

Resultats...... 110

IV- 4 . 1 . Caractéristiques ultrastructurales des ovocytes sains ...... 110

IV- 4 . 2 . Caractéristiques ultrastucturales des ovocytes atrésiques ...... 113

Discussion ...... 116

Réticulum endoplasmique et mitochondries ...... 116 Myelin-like figures ...... 117 Granules corticaux ...... 117 Les vésicules de réserve ...... 118 Oolemme et débris ovocytaires...... 119

Discussion, conclusion and perspectives ...... 120

La gangue ovocytaire chez la coque ...... 122

Résumé et contexte ...... 124

La gangue ovocytaire, exemple chez Cerastoderma edule dans le contexte des connaissances scientifiques ...... 127

La gangue ovocytaire chez Cerastoderma edule et son lien avec l’atrésie ovocytaire ...... 135

V- 3 . 1 . Résumé ...... 135

V- 3 . 2 . Abstract ...... 137

V- 3 . 3 . Introduction ...... 138

V- 3 . 4 . Materials and methods ...... 140

Species, sites and sampling ...... 140 Histology and stereology ...... 141 Transmission electron microscopy ...... 142 Spawning and fertilization ...... 143 V- 3 . 5 . Results...... 144

Qualitative characteristics of oocyte coat ...... 144 Origin and development of the oocyte coat ...... 147 Cellular debris and the oocyte coat ...... 148 Features of spawned oocytes ...... 150 Oogenesis and oocyte coat quantification ...... 152 V- 3 . 6 . Discussion ...... 154

Qualitative characteristics of oocyte coat ...... 154 Origin and development of the coat ...... 154 Costs and benefits of the cockle oocyte coat ...... 156 Relation between oocyte coat and atresia: can two enigmas solve each other? ...... 157 V- 3 . 7 . Acknowledgments ...... 159

Formation et aspect de l’oolemme et de la zone pellucide chez la

palourde ...... 160

Conclusions et perspectives ...... 163

Détection de l’atrésie ovocytaire dans les emissions de gamètes ...... 166

Résumé et contexte ...... 168

La viabilité des ovocytes de bivalves révélée grâce à la coloration

vitale au Rouge Neutre ...... 170

VI- 2 . 1 . Abstract ...... 171

VI- 2 . 2 . Introduction ...... 172

VI- 2 . 3 . Material and methods ...... 175

Sampling and gamete obtention ...... 175 Staining procedure ...... 176 VI- 2 . 4 . Results...... 177

VI- 2 . 5 . Discussion ...... 183

VI- 2 . 6 . Conclusion ...... 186

VI- 2 . 7 . Acknowledgments ...... 187

Conclusions et perpectives ...... 188

General conclusion ...... 190

Characterization of oocyte atresia ...... 192

VII- 1 . 1 . Histological studies ...... 192

VII- 1 . 2 . Transmission electronic microscopy study ...... 193

VII- 1 . 3 . Vital staining ...... 194

VII- 1 . 4 . The nature of oocyte atresia ...... 195

Quantification of oocyte atresia ...... 196

VII- 2 . 1 . Quantification by stereology ...... 196

VII- 2 . 2 . Quantifiaction in gametes emissions ...... 197

VII- 2 . 3 . Tempering the usual quantification methods of reproductive effort and fecundity ...... 197

Hypothesis on the sources and roles of oocyte atresia in bivalves

...... 198

VII- 3 . 1 . The role of oocyte debris ...... 199

VII- 3 . 2 . Sweepstakes Reproductive Success (SRS) theory ...... 200

VII- 3 . 3 . Exogenous sources promoting oocyte atresia ...... 201

Assessment and perspectives ...... 202

Valorisation ...... 206

Articles ...... 208

VIII- 1 . 1 . Premier auteur ...... 208

VIII- 1 . 2 . Deuxième auteur ...... 212

Autre ...... 213

Congrès international ...... 216

Références ...... 218

LIST OF TABLES

TABLE III-1. Tapes philippinarum and Cerastoderma edule. Mean indices during active gametogenesis at the farmed site...... 87

TABLE III-2. Percentage of estimated reproductive effort (Re) actually instant effective

(ERe-i) and global effective (ERe-g)...... 90

TABLE III-3. Tapes philippinarum. Summary of observations made using various methods over the seasons 2015 and 2016...... 94

TABLE III-4. Cerastoderma edule. Summary of observations made using various methods over the year 2018...... 98

TABLE V-1. Occurrence of gelatinous oocyte coat among bivalve taxa, arranged from most primitive to most recent ...... 133

TABLE VI-1. Criteria for an optimal oocyte vital stain ...... 174

TABLE VI-2. Number of females from which gametes were obtained by induced spawning or gonad stripping. *, at least one of the spawning group per spawn ...... 176

TABLE VI-3. Cerastoderma edule mean oocyte viability counts (%). N, number of females;

NR, Neutral Red stained; TB, Trypan Blue stained...... 182

LIST OF FIGURES

Figure I-1. Location of the University of Nantes (UN) and of the study sites: in Bourgneuf

Bay, site 1 was a fished site and site 1’ was a non-impacted site. Site 2 in the Croisic

Traict was a farmed site...... 10

Figure II-1. Morphology of T.philippinarum. A, shells with various colors and patterns. B, dorsal view with the ligament (Li) posterior to the hinge (H) and the anterior dark lunule

(Lu). C, inhalent (IS) and exhalent siphons (ES) of T. philippinarum (T. p.) are fused along most of their length, unlike those of R. decussatus (R. d.)...... 24

Figure II-2. Anatomy of T. philippinarum after opening and elimination of the right valve

...... 24

Figure II-3. Tapes philippinarum. Micrographs of female (left) and male (right) gonad during gametogenesis...... 25

Figure II-4. Tapes philippinarum. Micrograph showing all principal stages of oogenesis.

OO, oogonia; YO, young oocyte; PO, pedunculated oocyte; MO, mature oocytes; AW acinal wall; AL, acinal lumen...... 26

Figure II-5. T. philippinarum spawning. Photo: Brian Edwards ...... 26

Figure II-6. Larval development stages. (FAO) ...... 28

Figure II-7. Tapes philippinarum. Percentage of male, female, and undefined gender clams from sample on clam-cockle farmed site, during the year 2018. (n= 23 for each date) ...... 31

Figure II-8. Location of the three study sites...... 38

Figure II-9. Tapes philippinarum female gonad stained with modified Masson’s trichrome.

(A) General view. AO, mature oocytes (MO), immature oocytes (IO), interacinal tissue

(IAT), acinal lumen (AL). (B) Mature healthy oocyte and (C) IO attached to the acinal wall by a peduncle (P). Nucleus (N), nucleolus (NU) and cell membrane (M) are clearly visible.

...... 40

Figure II-10. Oocytes showing various characteristics of atresia. (A C) Alteration of cytoplasmic staining, using a constant Masson’s trichrome staining protocol. (D F)

Cytoplasmic retraction. G I Altered cell shape. J L Absence of chromatin structure.

Nucleus (N), nucleolus (NU), cell membrane (M), cytoplasm (C), healthy oocytes (HO).

...... 43

Figure II-11. Seasonal histological profiles of Tapes philippinarum gonads. (A) Beginning of gametogenesis (April): small IO attached to the acinal wall, forming from interacinal tissue (IAT); prespawning, atresic mature (AMO) and atresic immature oocytes (AIO) were also observed. (B) In July, MO and larger IO were observed. (C) During the resorption phase (September) only residual AIO and AMO were visible in the acinal lumen (AL). (D)

In winter, no gametes were visible in the acini, and the acinal walls were invaded by numerous macrophage cells (M); the acinal walls themselves may disappear...... 44

Figure II-12. Atresic, mature, and immature volume fractions over the 4- and 5-mo gametogenic periods at the farmed site. REST is the resting period when there were no oocytes; N is the number of females used for counts...... 47

Figure II-13. Atresic, mature, and immature volume fraction over the 26-mo sampling period at the unfished site. REST is the resting period; N is the number of females used for counts. No sampling was possible in spring 2012...... 48

Figure II-14. Atresic, mature, and immature volume fraction during the 26-mo sampling period at the fished site. REST is the gametogenic resting period; N is the number of females used for counts. No sampling was possible in spring 2012...... 49

Figure II-15. Temporal sequence of nuclear characteristics in AO ...... 50

Figure II-16. Temporal dynamics of oocyte atresia throughout the reproductive cycle of

Tapes philippinarum...... 52

Figure II-17. Loss of reproductive investment caused by pre- and post-spawning atresia.

...... 53

Figure II-18. Condition index (CI) of Tapes philippinarum individuals sampled at the farmed site. Brackets indicate high values of CI, which also correspond to high values of atresia...... 54

Figure III-1. Morphology of Cerastoderma edule. A, Hinge (H), posterior ligament (Li) and anterior lunule (Lu) are visible in a dorsal view. Growth line (GL) and broad ribs (R) on the right valve (RV). B, C.edule during filtration: exhalent siphon (ES) is more dorsal than inhalent siphon (IS). The foot (F) may be extended to a distance similar to the dorso- ventral axis...... 62

Figure III-2...... 62

Figure III-3. Cerastoderma edule. Percentage of male, female, and undefined gender cockles from sample on clam-cockle farmed site, during the year 2018. (n= 25 for each date) ...... 67

Figure III-4. Location of the study site...... 72

Figure III-5. General view of the female gonad of Cerastoderma edule stained with Alcian blue and modified Masson’s trichrome, showing the five histological features used for

stereological counts: AO, mature oocytes (MO), IO, oocyte sheath (S) and intra-acinal lumen...... 73

Figure III-6. Healthy mature (A) and immature, pedunculated oocyte (B) of Cerastoderma edule. Note the smooth oocyte envelope (OE) and large oocyte sheath (S). The nucleus

(N), containing slightly condensed chromatin, is surrounded by a well-defined envelope comprises a double membrane (NE). Depending on the plane of section, a nucleolus (NU) is often visible...... 75

Figure III-7. Characteristics of atresia in IO of Cerastoderma edule: altered cell shape and chromatin structure (A–C), thin oocyte sheath (B, C), nuclear shrinkage, and oocyte envelope rupture (double arrows, D). Note the slightly degraded chromatin structure in B, indicating an intermediate condition between the oocytes in Figure III-7 and those in

Figure III-8 A, C, and D. N, nucleus; NU, nucleolus; S, sheath...... 76

Figure III-8. Characteristics of atresia in mature oocytes of Cerastoderma edule: altered chromatin structure (A–C) or even (D) vestigial nucleus (VN). Thin oocyte sheath (B–D), irregular nuclear envelope (B, C), and angular shape (C, D). N, nucleus; NU, nucleolus;

...... 77

Figure III-9. AVF, healthy MVF, and healthy IVF of oocytes. Error bars represent half the range of values. N is the number of females used for counts...... 79

Figure III-10. Tapes philippinarum. Percentage of male, female, and undefined gender clams from samples on clam-cockle farmed site (n= 23 for each date), and condition index

(n = 18) during the year 2018. Error bars represent standard deviation ...... 93

Figure III-11. Shell weight and size of T. philippinarum individuals sampled at the farmed site, Croisic Traict. For each date N = 18. Error bars represent standard deviation ...... 94

Figure III-12. Tapes philippinarum. Distribution of the various soft tissues in summer . 96

Figure III-13. Cerastoderma edule. Percentage of male, female, and undefined gender cockles from sample on clam-cockle farmed site (n= 25 for each date), and condition index

(n = 20) during the year 2018. Error bars represent standard deviation...... 97

Figure III-14. Shell weight and size of C. edule individuals sampled at the farmed site,

Croisic Traict. For each date N = 20. Error bars represent standard deviation...... 99

Figure III-15. Parasites found in C. edule. A, micrograph of female gonad invaded by digenean trematodes (T), reducing the place for gonade (G) development. B and C, in vivo micrograph, stained with neutral red, two species of digenean trematode parasites found in cockles, B, Meiogymnophallus sp. is more often found in cockle than C,

Bucephalus minimus...... 101

Figure IV-1. Transmission electron micrographs of Tapes philippinarum and

Cerastoderma edule oocytes. A, Tapes philippinarum and B Cerastoderma edule mature oocyte. Note round nucleus (N), thinner coat of mucous (C) around clam oolemma (OM) than around cockle oolemma, and presence of oocyte debris (OD) close to the coat. C, T. philippinarum and D, C. edule ooplasm (OP), containing yolk granules (YG) and lipid droplets (LD). Cortical granules (CG) were visible only under microvilli (MI) of clam oolemma while clear mucus vesicles (MV) and exocytosis shapes (bold arrows) were present only in cockle ooplasm. M, mitochondria...... 111

Figure IV-2. Tapes philippinarum. A, Transmission electron micrographs of cortical granules (CG) close to microvilli (MI) of oolemma. B, thin section of oocyte stained with

Toluidine blue. Note cortical granules stained in deep blue, peripheral to the oocyte. N, nucleus, NU, nucleolus, OP, ooplasm ...... 112

Figure IV-3. Transmission electron micrographs of atresic oocytes of Cerastoderma edule. A, Atresic oocyte showing chromatin degradation in nucleus (N), vacuolation of the

ooplasm (C), poorly - visible oolemma (OM) without microvilli, a thin one - layer coat (C).

OD, oocyte debris, M, mitochondria. B, Myelin-like figure...... 114

Figure IV-4. Transmission electron micrographs of Tapes philippinarum atresic oocytes.

A, atresic oocyte showing vacuolation of the ooplasm (OP), myelin-like figures (MLF), and an oolemma (OM) with small microvilli, in the process of degradation. N, nucleus. B, The oolemma is ruptured, allowing ooplasmic contents to escape (C)...... 114

Figure IV-5. Tapes philippinarum. Semi-thin section stained with Toluidine blue showing healthy mature (MO) and atresic oocytes (AO). Note disappearance of cortical granules

(CG) beneath oolemma (OM) of AO, ooplasm detachment from oolemma (bold arrow) and rupture of oolemma in AO (white arrows)...... 115

Figure V-1. Cerastoderma edule. Micrograph of female gonad, semi-thin section,

Toluidine blue stain. Healthy oocyte (HO) covered by an AMPS coat (double arrows).

Atresic oocyte (AO) with irregular shape, showing variations with stain affinities in cytoplasm, nucleus (N) and coat (dotted arrows) compared to healthy oocytes. Advanced atresic oocyte (AAO) has lost its envelope. Residual nucleus (RN) still visible. Oocyte cytoplasmic debris (OD) between other oocytes. AW, acinal wall...... 125

Figure V-2. Cerastoderma edule. (A) External view, showing both inhalant (in) and exhalant (ex) siphons. (B) Histological section of pedunculated (i.e., young) oocyte.

Nucleus (n), nucleolus (nu), peduncle (p) and jelly coat (c) stained with Alcian blue, indicating acid mucopolysaccharides (AMPS). (C) Unstained, spawned oocyte surrounded by jelly coat (c). (D) Young veliger larva (l, approximately 24 h in laboratory) developing within Alcian blue–stained jelly coat (c). Note adhering detritus particles (d).

...... 131

Figure V-3. Location of the two sampled sites ...... 140

Figure V-4. Cerastoderma edule. Mature healthy oocytes stained with (A) modified

Masson’s trichrome and (B), with Alcian blue added. Nuclear envelope (NE), nucleus (N), nucleolus (NU), oocyte coat (C), and oolemma (OM) ...... 145

Figure V-5. Cerastoderma edule oocytes. Semi-thin section stained with Toluidine blue.

Ooplasm (OP) and cellular debris (OD) stain dark blue, oocyte coats (double arrows) stain purple. Nucleus (N) ...... 145

Figure V-6. Cerastoderma edule oocytes. Transmission electron micrographs. A. Part of mature oocyte with coat. Nucleus (N), nuclear envelope (NE), ooplasm (OP) and oolemma

(OM) with short microvilli adjacent to zona pellucida (ZP). B. Inner layer (IL) and outer layer (OL) of coats from 2 oocytes separated by oocyte debris (OD). C. Oocyte debris containing mitochondria (M) and yolk granules (YG) between adjacent coat outer layers

(OL). Note similarity between the mitochondria and yolk granules in Fig. V-8 ...... 146

Figure V-7. Cerastoderma edule. A, Young oocyte (YO) and adjacent auxiliary cell (AC);

B, YO beginning growth toward acinal lumen (AL). C, D Thin coat (C) around very young oocytes. E, Thick coat around pedunculated (P) oocyte. F, Young atresic oocyte and G, mature atresic oocyte. Nucleus (N) ...... 147

Figure V-8. Cerastoderma edule. Transmission electron micrographs. A, mature oocyte

(left) with inner (IL) and outer (OL) layers of oocyte coat (OC) and zona pellucida (ZP) adjacent to oolemma (OM). Oogonia without coat (OG), with accompanying auxiliary cell

(AC). Note synaptonemal complex (SC) in nucleoplasm. Putative mucus vesicles (MV) and yolk granule (YG) in mature oocyte, oocyte debris (OD) on external surface of oocyte coat. B, Mucus vesicles and mitochondria close to oolemma, N, Nucleus. C, mucus vesicle exocytosis (bold arrows) ...... 149

Figure V-9. Cerastoderma edule. A, female cockle spawn, non-adhering oocytes (white arrows); RV, right valve; B, spawned, fertilized, unstained live oocyte surrounded by oocyte coat (C). C, veliger larva in coat (C), shell hinge (H) and velum (V) composed of ciliary tracts. S, seston particles adhering to coat ...... 151

Figure V-10. Cerastoderma edule females pooled from site 2. Total oocyte (OVF), intra- acinal lumen (LVF), and oocyte coat (CVF) volume fractions of acini. Error bars represent half the range of values. N, number of females used for counts ...... 152

Figure V-11. Cerastoderma edule pooled from site 1 and 2. Coat volume fraction (CVF) as a function of oocyte volume fraction: IVF, MVF and AVF...... 153

Figure V-12. Transmission electron micrographs of Tapes philippinarum oocytes. A.

Previtellogenic oocyte (PVO). The oocyte membrane dissociates from neighboring auxiliary cells (AC) forming microvilli on the oolemma (OM); vesicles containing fibrous mucus (MV) were observable under the neo-formed microvilli...... 161

Figure VI-1. Cerastoderma edule whole mounts. (A) unstained, spawned oocytes (B) spawned oocytes double-stained with Neutral Red and Trypan Blue. DO, dead oocyte;

MO, mature oocyte; OC, oocyte coat, *, atresic oocyte. C-E, details of oocytes from double-staining protocol: C, details of mature, atresic, and dead oocytes; D, detail of one mature and one atresic oocyte; Note ooplasmic shrinkage. E, detail of dead pedunculated oocyte...... 178

Figure VI-2. Mytilus edulis spawned oocytes double-stained with RN and BT. DO, dead oocyte; MO, mature oocyte, *, atresic/abnormal oocytes...... 179

Figure VI-3. A, Tapes philippinarum stripped oocytes stained with NR. MO, mature oocyte; DO, dead oocyte. B, Crassostrea gigas stripped oocytes stained with NR. PO, pedunculated oocyte. Most live oocytes are immature...... 180

Figure VI-4. Crassostrea gigas whole mounts. Early development of stripped, fertilized oocytes stained with NR. (A) immediately after fertilization, one polar body (PB) evident;

(B) initiation of first cytokinesis; (C) 8 - cell stage, nuclei (N) clearly visible; (D) Second day after spawning and staining, early trochophore larva. Note NR stain now concentrated in nuclei. C, cilia...... 181

INTRODUCTION

GENERALE

GENERAL INTRODUCTION

1

2

1 LA MORTALITE DES JEUNES

2 STADES, CLE DE LA GESTION DES

3 STOCKS

4 MORTALITY OF EARLY STAGES, KEY TO

5 STOCK MANAGMENT

6

7 I- 1 . 1 . LA GESTION DES STOCKS EN 8 AQUACULTURE

9 STOCK MANAGEMENT IN AQUACULTURE

10 En 2018, la production globale d’animaux aquatiques (excluant mammifères et

11 reptiles) a atteint 179 millions de tonnes. L’aquaculture est à l’origine de 46% de cette

12 production et de 52% de ce qui est consommé par l’Homme, ce qui représente environ

13 un sixième des protéines animales totales consommées chaque année (FAO, 2020). La

14 gestion des stocks captifs et l’optimisation des élevages sont devenues des enjeux

15 majeurs pour la durabilité de l’aquaculture. La gestion des stocks passe par la

16 compréhension de la dynamique des populations captives et sauvages, qui ont des bases

17 biologiques communes.

18 La diminution du nombre d’individus dans un stock donné se fait principalement par

19 les biais suivants :

20 - La mortalité naturelle ;

3

21 - L’exportation / l’émigration ;

22 - La prédation naturelle ;

23 - La prédation anthropique.

24 L’augmentation du nombre d’individus dans un stock se fait par deux biais :

25 - La reproduction ;

26 - L’importation / l’immigration ;

27 Le levier d’action principal dans la gestion des stocks sauvages est le contrôle de la

28 prédation anthropique, (la gestion de la pêche en milieu marin). Dans le cas des élevages

29 la mortalité peut être réduite grâce à des soins vétérinaires associés à une maîtrise de la

30 qualité du milieu (UV, anti/probiotiques, apport de nourriture etc.) ; il est également

31 possible, dans certains, cas d’agir au niveau de la reproduction. La compréhension de la

32 dynamique du cycle reproducteur d’une espèce permet une optimisation des élevages,

33 mais elle permet aussi d’avoir une visibilité accrue sur l’évolution des stocks sauvages.

34 De nombreuses connaissances sur le cycle reproductif des animaux marins,

35 poissons, crustacés, mollusques et en particulier des bivalves ont été accumulées au

36 cours du siècle dernier ( voir les synthèses de Lucas, 1965; Sastry et al., 1979; Mackie,

37 1984; Gosling, 2015). Ces données ont permis le développement de la pisciculture, de la

38 pénéiculture et également de la conchyliculture dans le monde, et en particulier en

39 France. Des écloseries sont spécialisées dans la reproduction des ostéichthyens,

40 crustacés et bivalves et fournissent de jeunes individus aux aquaculteurs. Dans la suite

41 de nos propos, nous nous intéresserons exclusivement aux mollusques et, plus

42 précisément, aux bivalves.

4

43 I- 1 . 2 . LA MORTALITE DES JEUNES STADES CHEZ 44 LES BIVALVES

45 EARLY STAGE MORTALITY IN BIVALVES

46 Les grandes lignes de la reproduction des bivalves sont bien connues (Lucas,

47 1965; Sastry et al., 1979; Mackie, 1984; Gosling, 2015). Néanmoins plusieurs zones

48 d’ombre persistent à ce jour. La mortalité très importante des ovocytes, des œufs, larves

49 et juvéniles en fait partie.

50 Le taux de mortalité des jeunes stades du développement et, en particulier des

51 œufs, est l’un des paramètres principaux dans la modélisation de l’évolution d’une

52 population ou d’un stock de bivalve (Saraiva et al., 2014). En effet, le taux de mortalité

53 instantané journalier est souvent estimé aux alentours de 0,1 au cours de la vie pélagique

54 chez les bivalves. (Philippart et al., 2003; Saraiva et al., 2014). Il s’agit d’un phénomène

55 très connu, la courbe de survie de type III, multifactoriel (Houde, 2008) que de nombreux

56 chercheurs essayent d’élucider, afin de mieux pouvoir le contrôler, notamment en

57 écloserie et en nurserie.

58 La majorité des études sur la mortalité des jeunes stades s’intéresse au lien entre

59 les conditions environnementales et la mortalité des larves (Brenko and Calabrese, 1969;

60 Calabrese, 1969; Davis and Calabrese, 1969; Cain, 1973; Hrs-Brenko, 1974; MacInnes

61 and Calabrese, 1979; Tettelbach and Rhodes, 1981; Wright et al., 1983; Gallager et al.,

62 1986a; Powell et al., 2002, 2004; Hofmann et al., 2004 et autres). D’autres auteurs

63 appuient sur l’importance de l’état physiologique des œufs et/ou ovocytes dans la survie

64 et le développement des futures larves (Kraeuter et al., 1981; Gallager and Mann, 1986; 5

65 Mann, 1988; Dorange et al., 1989; Le Pennec et al., 1990; Devauchelle and Mingant,

66 1991; Wilson et al., 1996; Utting and Millican, 1997; Bochenek et al., 2001; Powell et al.,

67 2002, 2004, 2011; Hofmann et al., 2004). De nombreux critères de qualité peuvent être

68 retenus (Valdez Ramirez, 1999; Valdez-Ramirez et al., 1999, 2002), la plupart en relation

69 avec les conditions de vie des géniteurs avant et pendant la gamétogenèse (Daniels et

70 al., 1973; Bayne et al., 1978; Robinson, 1992; De Severeyn et al., 2000; Li et al., 2000;

71 Caers et al., 2002; Hendriks et al., 2003; Philippart et al., 2003; Cannuel and Beninger,

72 2007).

73 De façon intuitive, il serait facile d’envisager que la qualité des ovocytes dépend

74 uniquement des conditions de vie et de croissance des géniteurs (nourriture, température,

75 polluants, maladies etc.), mais des facteurs endogènes aux ovocytes eux-mêmes

76 influencent très probablement sur leur viabilité. Plough et al. (2016) proposent une cause

77 génétique à la mortalité des œufs et des larves. Par extension, il est à supposer que les

78 ovocytes eux-mêmes puissent subir certains dommages avant l’émission.

6

79 LE PHENOMENE

80 D’ATRESIE OVOCYTAIRE

81 THE PHENOMENON OF OOCYTE

82 ATRESIA 83

84 Le terme atrésie vient du grec a- privatif et trêsis : trou. Il décrit un phénomène

85 biologique aboutissant à la disparition d’une cavité. Chez les mammifères, l’atrésie

86 folliculaire survient après l’expulsion hors de l’ovaire du cumulus oophorus. L’antrum du

87 follicule mature de De Graff va se combler de cellules pour former le corps jaune. Quand

88 il a fallu décrire la dégénérescence des ovocytes chez les autres animaux, le terme atrésie

89 ovocytaire a été conservé, en réadaptant le terme atrésie folliculaire. Il s’agit d’un abus

90 de langage, utilisé par beaucoup. Le terme dégénérescence ovocytaire est également

91 largement utilisé.

92 Trois types d’atrésie ovocytaire ont été décrits chez les invertébrés marins par

93 Motavkine et Varaskine (1989) :

94 1- L’atrésie physiologique :

95 Il s’agit d’une atrésie ponctuelle et limitée tout au long du cycle reproducteur, permettant

96 la régulation du nombre d’ovocytes au sein de la gonade. Ce type d’atrésie n’a jamais été

97 décrit avec précision chez les bivalves, mais il est supposé exister chez les moules.

98

7

99 2- L’atrésie résiduelle :

100 Il s’agit d’une atrésie qui atteint les ovocytes restés dans la gonade après les émissions

101 de gamètes. Chez les bivalves c’est un phénomène reconnu de tous.

102 3- L’atrésie écologique :

103 C’est une atrésie massive, touchant les ovocytes matures et immatures en raison de

104 conditions écologiques du milieu très défavorables. Cela a été décrit chez plusieurs

105 espèces de bivalves (Lowe and Pipe, 1985, 1986, 1987; Lowe, 1988; Paulet et al., 1992;

106 Vaschenko et al., 1997, 2013; Baba et al., 1999; Steele and Mulcahy, 1999; Dutertre et

107 al., 2009; Fearman et al., 2009; Beninger et al., 2010; Ortiz-Zarragoitia and Cajaraville,

108 2010; Camacho-Mondragón et al., 2015).

109 Quand l’atrésie ovocytaire est massive (écologique ou résiduelle), des signes

110 d’inflammation sont observés dans la gonade (infiltrations, macrophages etc.) ainsi que

111 la résorption progressive des ovocytes atrésiques (Le Pennec et al., 1991; Suárez et al.,

112 2005; Dutertre et al., 2009; Camacho-Mondragón et al., 2012, 2015; Beninger, 2017).

113 L’atrésie ovocytaire n’a été que peu décrite en microscopie optique (Beninger

114 2017). En microscopie électronique à transmission la description des ovocytes en

115 dégénération (le terme atrésie n’y est que peu utilisé) est quasi systématique dans les

116 quelques études sur l’ovogénèse. Les grandes étapes ultrastructurales semblent mettre

117 en évidence une déformation du réticulum endoplasmique aboutissant à une

118 vacuolisation de l’ooplasme, une dégénération des mitochondries et autres organelles,

119 l’apparition de phagosomes et enfin une altération de l’ooplasme (Pipe, 1987a; Dorange

120 and Le Pennec, 1989; De Gaulejac et al., 1995; Beninger and Le Pennec, 2006; Chung 8

121 et al., 2007; Chung, 2007; Chung et al., 2008; Chung, 2008; Lee and Chung, 2008; Kim

122 et al., 2014; Kim and Chung, 2014; Beninger and Le Pennec, 2016; Kim, 2016; Camacho-

123 Mondragón et al., 2019). Une quantification complète de l’atrésie ovocytaire et son impact

124 sur la reproduction n’a jamais été réalisée jusqu’alors.

125

126 LES ESPECES ETUDIEES

127 THE STUDIED SPECIES

128 Lors de la présente étude de l’atrésie ovocytaire nous nous sommes intéressés à

129 deux espèces de bivalves : la palourde japonaise Tapes philippinarum et la coque

130 commune Cerastoderma edule. Trois raisons principales ont motivé ce choix :

131 l’accessibilité du matériel biologique, l’importance économique et patrimoniale en France

132 mais aussi dans le monde entier et la continuité scientifique avec une thèse préalablement

133 réalisée sur ces espèces (Boldina 2013).

134

135 I- 3 . 1 . LES SITES D’ETUDES

136 THE STUDY SITES

137 Les deux sites d’études se trouvent sur la côte Atlantique française, à moins de

138 1h30 de route du laboratoire localisé à l’Université de Nantes où se sont déroulées ces

139 études. Cette proximité a permis un échantillonnage très régulier (Fig. I-1).

9

140 Le premier site d’étude est la baie de Bourgneuf, sur le littoral vendéen, au sud de

141 l’estuaire de la Loire. À marée basse de grandes vasières découvrent ce qui en fait un

142 haut lieu de la pêche à pied (PAP) récréative et professionnelle (Boldina 2013). Des

143 échantillonnages sur ce site très impacté par la PAP ont été réalisés entre 2010 et 2012

144 (Fig. I-1 site 1). Un site non impacté par la PAP, toujours dans la Baie de Bourgneuf,

145 accessible uniquement par bateau, a également été échantillonné sur la même période

146 (Fig I-1 site 1’).

Figure I-1. Location of the University of Nantes France (UN) and of the study Le Croisic Loire sites: in Bourgneuf Bay, Estuary Nantes site 1 was a fished site

and site 1’ was a non- Atlantic Ocean impacted site. Site 2 in Bourgneuf Bay the Croisic Traict was a N farmed site.

10 km

147

148 Le deuxième site d’étude est le Traict du Croisic qui se situe au Nord de l’estuaire

149 de la Loire (Fig. I-1 site 2). Bassin très enclavé, il se vide complètement à marée basse à

150 l’exception de quelques chenaux qui restent en eau. Au fond du Traict se trouvent les

151 marais salants de Guérande, lieu patrimonial et touristique de premier ordre en France.

152 Le Traict du Croisic est le premier lieu de vénériculture (culture de la palourde) et de

10

153 cérastoculture (culture de la coque commune) en France avec 149 ha dédiés (CRC Pays

154 de la Loire).

155

156 I- 3 . 2 . L’IMPORTANCE ECONOMIQUE ET 157 PATRIMONIALE DES ESPECES ETUDIEES

158 THE ECONOMIC AND HERITAGE IMPORTANCE OF 159 THE SPECIES STUDIED

160

161 La palourde japonaise Tapes philippinarum 162 Manila clam Tapes philippinarum

163 Originaire des côtes de l’océan Pacifique est, la palourde japonaise a été implantée

164 de façon volontaire ou non sur de nombreuses côtes de l’hémisphère nord. Cette espèce

165 est maintenant présente sur la majorité des côtes américaines et européennes. En

166 Europe, elle a largement supplanté l’espèce endémique Ruditapes decussatus.

167 Ce bivalve est l’un des plus produits dans le monde. La production aquacole en 2017,

168 selon les données de la Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO),

169 est de :

170 - 4 177 913 tonnes en Chine ;

171 - 33 500 tonnes en Italie ;

172 - 670 tonnes en France ;

173 - 16 123 tonnes pour les autres pays producteurs.

11

174 La valeur de la production aquacole mondiale de ce bivalve (4 228 206 t en 2017) a

175 été établie à 6 957 089*103 $US ce qui en fait le plus important économiquement devant

176 les huitres et les pectinidés.

177 Les chiffres de la capture par pêche sont beaucoup plus modestes ; 25 080 tonnes au

178 total et les pays concernés ne sont plus les mêmes (année 2017, FAO) :

179 - 17 261 tonnes en Corée du Sud ;

180 - 7 000 tonnes au Japon ;

181 - 33 tonnes en France ;

182 - 186 tonnes pour l’ensemble des autres pays.

183

184 La coque commune Cerastoderma edule 185 Common cockle Cerastoderma edule

186 La répartition géographique mondiale de la coque commune est beaucoup plus réduite

187 que celle de la palourde. Cerastoderma edule est présente sur les côtes Atlantiques

188 européennes et du nord de l’Afrique. Très peu de pays la cultivent (chiffre FAO 2017) :

189 - France : 1810 tonnes ;

190 - Espagne : 161 tonnes ;

191 - Portugal : 125 tonnes.

192 Ce total de 2 096 tonnes de coques produites représente une valeur marchande de

193 8 044 000 USD.

12

194 La capture par pêche concerne un plus grand nombre de pays, exclusivement

195 européens, et un volume plus important, 25 525 tonnes au total.

196 - Danemark : 7 924 tonnes ;

197 - Royaume-Uni : 5 997 tonnes ;

198 - Portugal : 5 063 tonnes ;

199 - France : 259 tonnes ;

200 - autres pays : 3282 tonnes.

201 La vénériculture et la cérastoculture dans les Pays de la Loire 202 Clam and cockle culture in Pays de la Loire.

203 Les données suivantes sont celles du Comité Régional de Conchyliculture des

204 Pays de la Loire (Dessinges et al., 2012) :

205 La vénériculture et la cérastoculture sont les activités conchylicoles dominantes du

206 Traict du Croisic. Le nombre d’hectares de concessions utilisé pour la vénériculture et la

207 cérastoculture varie légèrement d’une année à l’autre. En 2010, par exemple, 134 ha

208 étaient dédiés à la culture de la coque alors que 15 ha l’étaient pour la vénériculture. Au

209 total 15 entreprises exploitaient ces concessions, la plupart réalisant conjointement

210 culture de coques et de palourdes. En 2010, 340 tonnes de palourdes ont été produites

211 contre 1 800 tonnes de coques. Le Traict du Croisic est le premier lieu de production

212 nationale mais aussi mondiale de coque commune. Les entreprises du Traict rachètent la

213 production d’autres entreprises (pêche ou culture) et s’occupent de leur

214 commercialisation. C’est ainsi qu’en 2010, près de 2 460 tonnes de coques et 720 tonnes

13

215 de palourdes étaient commercialisées par ces entreprises. Les clients peuvent être

216 étrangers (conserveries) ou français (Marchés d’Intérêt National, vente directe). Pour

217 exemple, la plus grosse entreprise croisicaise de production et de commercialisation de

218 coques et de palourdes a réalisé un chiffre d’affaire de 3 793 300€ en 2018 et emploie

219 entre six et neuf personnes (https://www.societe.com/societe/chellet-berteau-production-

220 517865580.html).

221 En Baie de Bourgneuf, le nombre d’hectares de concessions vénéricoles et

222 cérastocoles est beaucoup plus réduit. En 2010, seuls 18 ha de concessions vénéricoles

223 et 1 ha de concessions cérastocoles étaient recensés. Ces concessions sont peu

224 exploitées et cette activité reste très marginale par rapport à l’ostréiculture mais aussi et

225 surtout par rapport à la pêche à pied beaucoup plus rentable sur ce gisement.

226 La pêche à pied professionnelle 227 Professional clam and cockle fishing

228 Dans les Pays de la Loire environ 1300 t de coquillages sont récoltés par les

229 pêcheurs à pied dont 36% de coques et 32% de palourdes. En Loire-Atlantique, 57% des

230 coquillages pêchés sont des coques, principalement issues du gisement de la Baule, alors

231 qu’en Vendée ce sont les palourdes qui dominent avec 71% des récoltes, principalement

232 issus du gisement de la Baie de Bourgneuf.

233 En 2018 les Pays de la Loire comptaient 388 pêcheurs à pied professionnels

234 licenciés (ayant une licence de pêche) pour travailler sur le littoral de la région ; à mettre

235 en perspective des 1 300 pour toute la France. En plus d’une licence générale de travail,

14

236 des timbres spécifiques à chaque espèce sont octroyés aux pêcheurs. Par exemple, en

237 Vendée, 206 timbres ont été délivrés pour la palourde contre 150 pour la coque

238 (COREPEM des Pays de la Loire).

239 La pêche à pied de loisir 240 Recreational clam and cockle fishing

241 Pour pratiquer la pêche à pied de loisir, aucun permis, licence ou timbre n’est

242 nécessaire. Afin de préserver la ressource certaines règles relatives aux outils utilisables,

243 à la taille des captures et au poids récolté sont tout de même établies. En France, la pêche

244 à pied représentait 71% de l’ensemble de la pêche récréative entre les années 2006 et

245 2008 (International Council for the exploration of the sea, 2010).

246 La France compte près de 2 millions de pêcheurs à pied récréatif chaque année

247 (données IFREMER, 2017). Pour exemple, sur le site du passage du Gois en Baie de

248 Bourgneuf, environ 46 100 pêcheurs à pied de loisir sont recensés chaque année (Hitier

249 et al., 2010; Boldina, 2013). Ce nombre varie en fonction des jours de la semaine, des

250 périodes de l’années et des coefficients de marées (Boldina, 2013). La valeur économique

251 que représente cette activité sur ce seul site, pour une année est de plus de 1,5 M€

252 (Boldina, 2013)

253 L’importance économique et patrimoniale de la palourde japonaise Tapes

254 philippinarum et de la coque commune Cerastoderma edule dans le monde et en France,

255 en particulier, accentue la nécessité des études sur ces espèces. Une connaissance fine

256 du cycle reproducteur est indispensable à une gestion efficiente des stocks cultivés ou

15

257 non. Malgré un grand nombre d’études sur la reproduction de ces deux espèces et des

258 bivalves en général, un phénomène reste très mal connu, et donc trop peu considéré dans

259 ces études : l’atrésie ovocytaire, sujet de cette thèse.

260

261 OBJECTIVES OF THE THESIS

262 The main objective of the thesis is to highlight the phenomenon of oocyte atresia,

263 often neglected in bivalve reproduction studies. The aim was be to describe the

264 phenomenon, quantify it and understand its implications in the reproductive cycle, ecology

265 and evolution of bivalves. Two economically-important species were taken as a model to

266 underscore the importance of studying this phenomenon in bivalves: the Manila clam

267 Tapes philippinarum and the common cockle Cerastoderma edule.

268 The first two chapters are dedicated to a description and quantification of oocyte

269 atresia using optical microscope tools. The impact of oocyte atresia on reproductive effort

270 were studied. One chapter is devoted to the clam, another to the cockle, to finish with a

271 comparison of the both species.

272 A preliminary study on the ultrastructure of healthy oocytes and atresia of the clam

273 and cockle is presented in the fourth chapter.

274 One chapter focus on the description of the possible functional link between oocyte

275 atresia and oocyte coat in the cockle.

276 Finally, a method to visualize and quantify the atresic oocytes present in spawns is

277 proposed. 16

17

BASES BIOLOGIQUES DE

TAPES PHILIPPINARUM

BIOLOGICAL BASES OF TAPES PHILIPPINARUM

18

19

278 INTRODUCTION

279 INTRODUCTION

280 Des connaissances générales sur l’espèce étudiée, ici la palourde japonaise, sont

281 nécessaires pour appréhender et contextualiser un phénomène précis qu’est l’atrésie

282 ovocytaire. Des notions de taxonomie, d’écologie, de biologie, en particulier de

283 reproduction chez T. philippinarum sont développés dans ce propos introductif.

284

285 II- 1 . 1 . TAXONOMIE

286 TAXONOMY

287

288 La palourde japonaise, Manila clam en anglais, appartient :

289 au phylum Mollusca

290 à la classe : Bivalvia

291 à l’ordre des Veneroida

292 à la famille : Venreridea

293 au genre : Venerupis, Tapes, Venus, ou bien encore Ruditapes.

294 Il reste de nombreuses zones d’ombre dans la taxonomie de la palourde japonaise.

295 En effet aucun consensus clair n’a été trouvé sur le nom de l’espèce. Près de 60 noms lui

20

296 ont été attribués parmi lesquels (Fischer-Piette and Métivier, 1971; Beninger and

297 Backeljau, 2019):

298 Paphia bifurcata Quayle 1938

299 Tapes denticulata G.B. Sowerby II, 1852

300 Tapes japonica Deshayes 1853

301 Tapes semidecussata Reeve 1864

302 Venus philippinarum Adams et Reeve 1850

303 Ruditapes philippinarum Adams et Reeve 1850

304 Tapes philippinarum Adams et Reeve 1850

305 Venerupis philippinarum Adams et Reeve 1850

306 Cette profusion de noms est en partie due à la description imprécise de l’espèce

307 par Linné (Fischer-Piette and Métivier, 1971; Beninger and Boldina, 2014; Beninger and

308 Backeljau, 2019). Actuellement, les trois noms de genre les plus couramment utilisés pour

309 cette espèce sont Tapes, Ruditapes et Venerupis. À la différence du nom d’espèce

310 (philippinarum), le nom de genre est encore à ce jour discuté. Pour cette étude le nom

311 Tapes philippinarum (sous l’autorité de Adams and Reeve, 1850) a été choisi au regard

312 des arguments développés dans Beninger and Boldina (2014) et des recommandations

313 de Beninger and Backeljau (2019) :

314 Venerupis : Venus + rupis = rock. De par son nom, ce genre est associé à des espèces

315 de milieu rocheux, ce qui n’est pas le cas de la palourde japonaise. Ce nom de genre est

21

316 donc éliminé des choix. Ruditapes est considéré par certains comme un sous-genre du

317 genre Tapes (Chiamenti, 1900). Pour d’autres, il est considéré comme un genre à part

318 entière (Fischer-Piette and Métivier, 1971). Le but ici n’étant pas de faire une étude

319 taxonomique, le nom de genre Tapes a été retenu dans (Beninger and Boldina, 2014) et

320 le sera ici également.

321

322 II- 1 . 2 . REPARTITION GEOGRAPHIQUE DE 323 L’ESPECE

324 GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE SPECIES

325

326 La palourde japonaise est originaire du Pacifique ouest, des côtes Asiatiques.

327 Cette espèce a été introduite dans plusieurs régions du monde. Aux Etats-Unis,

328 l’introduction a été accidentelle. Du naissain de palourde a été introduit en même temps

329 que du naissain d’huître creuse (Crassostrea gigas) dans les années 1930. Actuellement

330 la palourde est présente sur toute la côte pacifique de l’Amérique du Nord, de la Californie

331 à la Colombie-Britannique. L’introduction de naissain en Europe s’est faite volontairement

332 pour les écloseries en 1972 afin pallier la diminution de la population de l’espèce

333 endémique (Ruditapes decussatus), victime de la surpêche et de rendements aléatoires.

334 La vénériculture s’est développée de façon intensive grâce aux écloseries en Europe

335 dans les années 1980. À partir des zones conchylicoles, les individus se sont dispersés

336 et multipliées dans les milieux non cultivés. Une expansion de l’aire de répartition de cette

22

337 espèce allochtone est rapidement observée. La robustesse et les capacités reproductives

338 de la palourde japonaise lui a permis de supplanter l’espèce locale et est maintenant plus

339 densément présente en Europe que la palourde endémique (Delgado and Pérez-

340 Camacho 2007a, communication personnelle de Pascal Chellet, conchyliculteur et

341 observation directe sur le terrain).

342 Les palourdes japonaises se retrouvent principalement dans la zone intertidale. Ce

343 sont des bivalves fouisseurs, préférant un sédiment meuble, sablo-vaseux, avec de

344 nombreux cailloux et / ou débris coquillés. C’est un animal très peu mobile à l’âge adulte,

345 qui reste enfoui à 4 - 5 cm sous la surface du sédiment.

346

347 II- 1 . 3 . ELEMENTS DE BIOLOGIE

348 ELEMENTS OF BIOLOGY

349 Morphologie et anatomie 350 Morphology and anatomy

351 La coquille de Tapes philippinarum peut présenter de nombreux couleurs et motifs,

352 variant selon les individus (Fig. II-1 A). Les palourdes peuvent atteindre 7 cm sur l’axe

353 antéro-postérieur, mais en raison de la pêche, dans les aires de récolte, elles ne

354 dépassent que très rarement 4 cm. La forme de la coquille est légèrement plus globuleuse

355 que celle de la palourde européenne et la lunule est plus marquée (Fig. II-1 B).

356 Les différences morphologiques entre les deux espèces sont très subtiles et pas

357 toujours évidentes à visualiser en fonction des individus. Le moyen le plus sûr pour

23

358 différencier les deux espèces est d’observer leurs siphons au cours de la filtration. Les

359 siphons de T. philippinarum sont soudés sur les 2/3 de leur longueur, alors que les

360 siphons de R. decussatus sont individualisés (Fig. II-1 C).

361 La masse viscérale est charnue et dorsale et le pied s’insère dans la partie ventrale.

362 Il forme une languette musculeuse jaunâtre qui peut s’étirer sur plusieurs centimètres

363 permettant le déplacement et l’enfouissement de l’animal. Les deux siphons sont

364 légèrement colorés et rétractés postérieurement au repos. Le bord palléal est épais et

A B C

IS T. p.

ES

R. d. L P A R Li H Lu

Figure II-1. Morphology of T.philippinarum. A, shells with various colors and patterns. B, dorsal view with the ligament (Li) posterior to the hinge (H) and the anterior dark lunule (Lu). C, inhalent (IS) and exhalent siphons (ES) of T. philippinarum (T. p.) are fused along most of their length, unlike those of R. decussatus (R. d.)

Hinge Visceral mass Exhalent siphon Adductor muscles Foot Inhalent siphon Mantle margin

Figure II-2. Anatomy of T. philippinarum after opening and elimination of the right valve 24

365 bien visible ventralement. Les branchies sont insérées dorsalement et couvrent la masse

366 viscérale. Les palourdes japonaises possèdent deux muscles adducteurs, un antérieur et

367 un postérieur (Fig. II-2).

368 Reproduction 369 Reproduction

370 La palourde est un animal gonochorique dont les gonades présentent une grande

371 constance anatomique. En effet la gonade se développe toujours entre le manteau et

372 l’appareil digestif, en contact direct avec celui-ci. Cette proximité permet un passage

373 optimum des nutriments de l’appareil digestif à la gonade (Adachi, 1979; Lubet et al.,

374 1987; Le Pennec et al., 1991; Beninger et al., 2003, Fig. II-3). La gonade s’organise sous

375 forme de petits sacs ou acini dans lesquels les gamètes (ovocytes ou spermatozoïdes)

376 ont un développement centripète. Le tissu non gamétique comprend du tissu intra

377 (équivalent à la lumière acinale) et inter-acinal (Fig. II-3).

Digestive gland

Gametes

Intra-acinal tissu

Inter-acinal tissu Acinus Gonadal margin Mantle 500 µm Gill 500 µm

Figure II-3. Tapes philippinarum. Micrographs of female (left) and male (right) gonad during gametogenesis.

25

378 Les ovocytes se développent à partir des YO 379 parois acinales (Fig. II-4). Les ovogonies sont AW OO AL 380 accompagnées par des cellules auxiliaires très

PO 381 difficilement observables en microscopie optique. AL PO 382 Au cours de la vitellogénèse les ovocytes se YO 383 séparent progressivement de la paroi acinale et MO 50 µm 384 deviennent pédonculés. Quand l’ovocyte est Figure II-4. Tapes philippinarum. 385 mature il apparait libre dans la lumière acinale. Micrograph showing all principal

386 Après la dernière émission de gamète de la saison stages of oogenesis. OO, oogonia; YO, young oocyte; PO, 387 de reproduction, les ovocytes restant dans la pedunculated oocyte; MO, mature 388 gonade sont résorbés ; c’est la phase de oocytes; AW acinal wall; AL, acinal

389 résorption. Entre deux périodes de reproduction, lumen.

390 les acini disparaissent ainsi que les gamètes, c’est la phase de repos. L’enchainement de

391 périodes de gamétogenèse, résorption et repos, dans les gonades, est très fréquent chez

392 les bivalves des zones tempérées.

393 Les émissions de gamètes et, plus largement les phases du cycle de vie, sont

394 régies par les températures et la disponibilité en nourriture principalement. Alors que la

395 gamétogenèse peut être initiée à partir d’une température

396 de l’eau à 8-10°C, les émissions de gamètes ne se

397 déclenchent qu’à partir d’une température de 14 °C. La

398 température optimale d’émissions de gamètes est de 20- Figure II-5. T. philippinarum 399 22°C (Goulletquer, 2009). Les gamètes sont expulsés spawning. Photo: Brian Edwards 400 dans les milieux par les siphons exhalents (Fig. II-5). Sous

26

401 les latitudes des Pays de la Loire (France), les palourdes peuvent initier plusieurs cycles

402 de gamétogenèse et plusieurs émissions de gamètes entre juin et septembre, ce sont des

403 « dribble-spawners ». Dans une même population les émissions de gamètes des

404 différents individus sont simultanées, augmentant ainsi les chances de fécondation.

405 Le nombre d’ovocytes émis en une saison peut atteindre 8 millions (Helm et al.,

406 2006), ce qui représente jusqu’à 50 % du poids de tissu somatique de la palourde. Après

407 la dernière émission de gamètes à la fin de la période de reproduction, les ovocytes

408 restant dans la gonade sont résorbés grâce à l’inflammation des tissus apportant entre

409 autres de nombreux macrophages.

410 La fécondation est externe et a lieu de façon aléatoire au gré des courants. L’œuf

411 (70 µm de diamètre) (Jones et al., 1993; Pronnier, 1996) subit plusieurs mitoses pour

412 devenir, après quelques heures, une larve trochophore, soit le stade larvaire commun à

413 tous les mollusques. Le stade de larve D (100µm) est atteint en deux jours environ (FAO)

414 (Fig. II.6). Le velum apparaît et se maintiendra pendant environ deux semaines (larves

415 véligères) (Jeffroy, 2011). Cet organe particulier permet la nutrition et le déplacement de

416 la larve. La métamorphose suivante met fin à la vie planctonique de l’animal. Au stade

417 pédivéligère le velum disparaît (Jeffroy, 2011). La larve pédiveligère rejoint le benthos et,

418 à l’aide du pied, se déplace jusqu’à un endroit propice à sa fixation, par son byssus, pour

419 devenir un naissain d’environ 8 mm (Jones et al., 1993; Marin et al., 2007) (Fig. II-6). Le

420 byssus et la glande byssale disparaîtront au cours des premiers mois de la vie adulte.

27

421 Les jeunes palourdes sont très peu mobiles au cours de leur vie. La taille

422 commerciale de 4 cm est atteinte en 24 mois

423 environ en fonction des conditions

424 environnementales. La croissance est

425 accélérée pendant le printemps et l’été. Ces

426 différentes phases de croissance peuvent être

427 visibles sur la coquille, matérialisées par des

428 stries de croissances.

429 La gamétogenèse et les émissions de

430 gamètes sont donc régies par les températures

431 mais également par la disponibilité en Figure II-6. Larval development stages. (FAO) 432 nourriture (phytoplancton) dans le milieu.

28

433 II- 1 . 4 . OBJECTIVES OF THE HISTOLOGICAL 434 STUDY OF OOCYTE ATRESIA IN CLAM.

435

436 The quality of gametes, especially oocytes, is a determining factor in the

437 reproductive success of the species. Oocyte degeneration (in fact oocyte atresia) is

438 regularly cited in articles dealing with bivalve reproduction. However, no in-depth study

439 has been carried out on the subject, and oocyte atresia has never been described or

440 quantified. The following study aims to describe precisely the appearance of atresic

441 oocytes in the gonads of the Manila clam, a species of economic and heritage importance

442 in France and throughout the world. The tool used for this is optical microscopy, with

443 histological staining accessible to all, in order to allow the operation to be repeated by

444 others for other species.

445 Quantification of the oocyte volume occupied by the atresic oocytes was carried

446 out by stereology, a time-consuming method, but also accessible to all. This quantification

447 allowed a better understanding of the involvement of oocyte atresia in the reproductive

448 cycle of the Manila clam.

449

29

450 LES CARACTERISTIQUES DE

451 L’ATRESIE OVOCYTAIRE ET SES

452 EFFETS SUR L’EFFORT DE

453 REPRODUCTION DE LA PALOURDE

454 JAPONAISE TAPES PHILIPPINARUM

455 (ADAMS AND REEVE, 1850)

456 OOCYTE ATRESIA CHARACTERISTICS

457 AND EFFECT ON REPRODUCTIVE

458 EFFORT OF MANILA CLAM,

459 TAPES PHILIPPINARUM (ADAMS AND

460 REEVE, 1850)

461

462 II- 2 . 1 . RESUME ET CONTEXTE

463 ABSTRACT AND CONTEXT

464 Dans le but d’étudier les caractéristiques histologiques de l’atrésie ovocytaire chez

465 Tapes philippinarum (Adams et Reeve, 1850), un minimum de 23 individus a été prélevé

466 tous les 15 jours environ entre mars 2015 et décembre 2016 sur le site conchylicole du

467 Traict du Croisic (France). Une coloration au trichrome de Masson modifié

30

468 (trioxyhématéine, fuchsine acide, orange G – acide phosphomolybdique et vert lumière)

469 a été appliquée sur les coupes histologiques.

470 Le sexe des individus a été déterminé grâce à la présence de gamètes clairement

471 identifiables, distinguant ainsi les mâles, les femelles et les individus dont le sexe n’a pas

472 pu être déterminé (Fig. II-7). La population étudiée a montré une gamétogenèse bien

473 synchronisée entre les individus. Une période de repos a pu être établie, bien que de

474 légères variations interannuelles puissent être observées, elle s’étend d’octobre à mars

475 environ. En effet, durant cette période, la très grande majorité des individus ne

476 présentaient aucun gamète. Les rares individus qui en présentaient étaient soit en tout

477 début de gamétogenèse (gamètes très peu nombreux et très immatures), soit en fin de

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

2-Jul 6-Jul

8-Apr 5-Oct 5-Oct

2-Jun 3-Jun

3-Dec 7-Nov

21-Jul 31-Jul 19-Jul 26-Jul

6-May

30-Apr 29-Oct 11-Apr 22-Apr 19-Oct

17-Jun 12-Jan 20-Jun

23-Mar 10-Feb 10-Mar 25-Mar

17-Aug 31-Aug 17-Aug 31-Aug 15-Sep 28-Nov 19-Dec

11-May 23-May 2015 2016 % Male % Undefined % Female

Figure II-7. Tapes philippinarum. Percentage of male, female, and undefined gender clams from sample on clam-cockle farmed site, during the year 2018. (n= 23 for each date) 31

478 période de résorption (rares gamètes matures en cours de dégénérescence). C’est donc

479 au cours des périodes gamétogénétiques de 4 et 5 mois (mai - août 2015 et avril -

480 septembre 2016) que l’étude histologique qualitative et quantitative (stéréologie) a été

481 réalisée. L'atrésie a été trouvée à tous les stades de la gamétogenèse ainsi qu’en phase

482 de résorption. Elle a été caractérisée par la perte du nucléole, une dégradation nucléaire

483 (notamment l’aspect de la condensation de la chromatine), une altération des affinités de

484 coloration cytoplasmique, une rétraction cytoplasmique, et enfin la perte de tout le contenu

485 cellulaire. L’altération de la chromatine et la disparition du nucléole suggèrent une

486 réduction forte, voire un arrêt de la synthèse protéique, donc de la vitellogenèse des

487 ovocytes concernés.

488 Les observations histologiques ont indiqué que T. philippinarum a opéré des

489 émissions d’ovocytes partielles, de façon répétée pendant la période de gamétogenèse.

490 Les comptages stéréologiques ont montré qu'au moins 15 % du volume ovocytaire était

491 occupé par des ovocytes atrésiques en début de gamétogenèse, avant toute activité

492 d’émission de gamètes ; ce pourcentage passait à 30 % au milieu de la période

493 gamétogenèse (comprenant des ovocytes pré- et post-ponte), et à 80 % à la fin de la

494 période de gamétogenèse (atrésie post-ponte). Une estimation de l’impact minimum de

495 l’atrésie a été réalisée. Ainsi, grâce cet indice basé sur des fractions volumiques, nous

496 pouvons estimer qu’au cours de la période la plus active de la gamétogenèse (excluant

497 ainsi les périodes pré-ponte et les périodes de résorption), près d’un ovocyte sur deux

498 finira atrésique.

499 Des observations similaires ont été faites pour des échantillons plus petits de

500 palourdes provenant de deux autres sites dans la baie de Bourgneuf, toute proche, sur 32

501 une période de 26 mois. Des ovocytes atrésiques et non atrésiques ont été observés dans

502 les mêmes acini ce qui suggère que le processus ne s’était pas propagé et n'était pas

503 synchrone chez tous les ovocytes. Cette étude est la première à souligner l’existence

504 d’une atrésie ovocytaire chez les bivalves qui ne semble pas être due à un manque de

505 place dans les gonades ou bien à de mauvaises conditions environnementales. Les

506 causes de l’atrésie ovocytaire chez la palourde restent énigmatiques à ce stade de

507 l’avancée de la thèse, mais des hypothèses seront proposées dans le Chapitre VI.

508 La proportion considérable d'ovocytes touchés par l'atrésie chez T. philippinarum

509 souligne la nécessité de mieux reconnaître, documenter et intégrer ce processus dans

510 les modèles d'effort de reproduction et de fécondité de cette espèce. En effet, les indices

511 d'état basés sur les tissus par rapport au poids des coquilles (indice de condition, indice

512 gonadosomatique…) doivent être interprétés comme des estimations de l'investissement

513 reproductif et non comme des indications du résultat potentiel de la reproduction.

33

514 D’après un article publié dans :

515 Journal of Shellfish Research, 2017, 36(3):549-557.

516

517 OOCYTE ATRESIA CHARACTERISTICS AND EFFECT ON

518 REPRODUCTIVE EFFORT OF MANILA CLAM,

519 TAPES PHILIPPINARUM (ADAMS AND REEVE, 1850)

520

521 Daphné CHÉREL and Peter G. BENINGER

522

523 II- 2 . 2 . ABSTRACT

524

525 The histological characteristics of oocyte atresia were examined in the Manila clam,

526 Tapes philippinarum (Adams and Reeve, 1850), at Croisic Traict on the French Atlantic

527 coast, over 4- and 5–month gametogenic periods (May to August 2015 and April to

528 September 2016). Atresia was found at all stages of gametogenesis, as well as in residual

529 oocytes, and was characterized by several characteristics: loss of the nucleolus, nuclear

530 degradation, altered cytoplasmic staining affinities, cytoplasmic retraction, and finally the

531 loss of all cellular content. Histological observations indicated that T. philippinarum

532 partially spawned repeatedly over the gametogenic period. Stereological counts showed

533 that at least 15% of the oocyte volume was occupied by atresic oocytes (AO) at the onset

534 of gametogenesis before any spawning activity; this increased to 30% in the middle of the

535 gametogenic period (including both pre- and postspawning oocytes) and 80% at the end

34

536 of the gametogenic period (postspawning atresia). Of all oocytes whose fate could be

537 determined during active gametogenesis, nearly half were atresic. Similar observations

538 were made for smaller sample sizes of clams from two other sites in nearby Bourgneuf

539 Bay over a 26-mo period. Both AO and nonatresic oocytes were observed in the same

540 gonad acini, suggesting that the process was either not propagated or not synchronized.

541 The considerable proportion of oocytes affected by atresia, underscores the need for

542 better recognition, documentation, and integration of this process into models of

543 reproductive effort and fecundity in this species. In particular, condition indices based on

544 tissue : shell weights should be interpreted as estimations of reproductive investment, not

545 as indications of potential reproductive outcome.

546

547 II- 2 . 3 . INTRODUCTION

548

549 Understanding the dynamics of animal populations requires a firm knowledge of

550 biological processes, particularly reproduction (Caddy, 1989; Knights, 2012; Costa et al.,

551 2013; Delgado et al., 2013; Maunder and Deriso, 2013). Considerable knowledge

552 concerning the reproductive cycle of exploited marine bivalves has been accumulated

553 since the early studies of the 1930s, documenting gametogenesis and spawning in many

554 species of economic interest ( see Lucas, 1965; Sastry et al., 1979; Mackie, 1984;

555 Gosling, 2015 for reviews and references ). Chief among these species is the Manila clam,

556 Tapes philippinarum (family Veneridae), the top-ranking marine aquaculture species

557 worldwide (over 4 million tons of aquaculture production in 2014), with a total value three

35

558 times greater than that of the familiar Pacific oyster, Crassotrea gigas (FAO 2016).

559 Various aspects of the reproductive cycle of T.philippinarum have been studied (Adachi,

560 1979; Mann, 1979; Beninger and Lucas, 1984; Rodriguez-Moscoso et al., 1992; Robert

561 et al., 1993; Laruelle et al., 1994; Xie and Burnell, 1994; Chung et al., 2001; Park and

562 Choi, 2004; Delgado and Pérez-Camacho, 2007b; Dang et al., 2010; Uddin et al., 2010,

563 2012; Baek et al., 2014; Milani et al., 2018); however, the phenomenon of oocyte atresia

564 has not been investigated. Although this form of oocyte degeneration has been mentioned

565 and/or described in mature and residual oocytes in Pectinidae (Tang, 1941; Christiansen

566 and Olivier, 1971; Dorange and Le Pennec, 1989; Motavkine and Varaskine, 1989; Le

567 Pennec et al., 1991; Vaschenko et al., 1997; Borzone et al., 2003; Cantillanez et al., 2005;

568 Beninger and Le Pennec, 2006), Ostreidae (Lango-Reynoso et al., 2000; Dutertre et al.,

569 2009), Mytilidae (Pipe 1987a; Motavkine and Varaskine 1989; Suárez et al., 2005; Suárez

570 Alonso et al., 2007) and Pinnidae (De Gaulejac et al., 1995), it seems to be an under-

571 reported phenomenon in bivalve reproductive cycles in general (Beninger, 2017). Oocyte

572 atresia has been identified within the Veneridae, although its histological characteristics

573 have not been described (Morvan and Ansell, 1988; Meneghetti et al., 2004; Drummond

574 et al., 2006; Casas and Villalba, 2012).

575 The present study documents the phenomenon of atresia in the reproductive cycle

576 of Tapes philippinarum. Two data sets were used, a detailed 4- and 5-mo study during the

577 gametogenic period, and a longer time series (26 mo) with fewer individuals. In addition

578 to the qualitative description of this process, we use quantitative histological techniques

579 to estimate its impact on reproductive effort (Re).

36

580 II- 2 . 4 . MATERIALS AND METHODS

581

582 Species, sites, and sampling

583 For reasons unclear to most workers, Tapes philippinarum has a relatively long

584 list of competing generic names, of which Ruditapes is the most frequent in recent years.

585 The reasons for selecting Tapes are outlined in Beninger and Boldina (2014).

586 The detailed histological study was carried out at a Tapes philippinarum and

587 Cerastoderma edule culture operation, situated in an extensive mudflat aquaculture

588 region on the French Atlantic coast. Twenty-three adult clams were haphazardly sampled

589 every 2 wk (May to August 2015 and April to September 2016; 2.6–5 cm along the

590 anteroposterior axis).

591 For the longitudinal time series, one fished and one unfished site were chosen

592 on the French Atlantic coast: a recreational mudflat fishing site for Tapes philippinarum in

593 the Gois passage, and an isolated, unfished site accessible only by boat; all three

594 sampling sites were within 50 km of each other (Fig. II-8). The sediment characteristics,

595 water temperature, salinity, turbidity, and tidal regimes of the two sites were very similar

596 (Boldina and Beninger, 2013; Beninger and Boldina, 2014; Boldina et al., 2014). In the

597 course of other, unrelated manipulations, nearly commercial-size clams (≥3 cm) were

598 haphazardly sampled monthly at low tide from the unfished and fished sites (July 2010 to

599 September 2012). The sampling took place at the incoming tide, often limiting the number

600 of individuals sampled (≤15); in addition, several technical problems reduced the number

37

601 of sampling dates. The numbers of females investigated are specified in Figures. II-12 –

602 II-14.

603

Great Farmed Site Britain

France Le Croisic

Loire Estuary Spain

Atlantic Ocean

Bourgneuf Bay

N. 47°00’ Unfished Site

W. 2°20’ W. Fished Site N

10 km

Figure II-8. Location of the three study sites.

38

604 Histological techniques

605 Sampled clams were separated from their shells and fixed on-site in ice-cold

606 aqueous Bouin’s solution for at least 48 h. Three- to 4-mm-thick slices were removed

607 along the dorsoventral axis of the foot, continuing up to the dorsal extremity of the visceral

608 mass. Samples were then rinsed overnight under running tap water, dehydrated in an

609 ascending ethanol-Roti-Histol series, and embedded in paraffin. Sections were cut at 7

610 μm and stained with a modified Masson's trichrome protocol (Martoja and Martoja-

611 Pierson, 1967; Beninger et al., 2010) using trioxyhematein (3 min), acid fuschine (2 min),

612 orange G – phosphomolybdic acid (3 min), and fast green (1 min). Observations and

613 analyses of the photomicrographs were performed using an Olympus Provis light

614 microscope, and LUCIA GF 4.80 image capture and processing software. A total of 12

615 micrographs were archived for each female at the unexploited and fished sites, and nine

616 micrographs for the farmed site, for later examination and stereological counts.

617 Stereology

618 Preliminary investigations showed that the Tapes philippinarum gonad satisfied

619 the requirements for stereological analysis: constant gonad tissue anatomical localization,

620 synchronous gametogenesis throughout the gonad, sufficiently homogeneous gonad

621 tissue, and sufficiently large patches of gonad tissue were available to perform counts

622 (Beninger and Boldina, 2012). For the purposes of this study, only the oocyte types were

623 quantified using stereological counts: atresic oocytes (AO), immature healthy oocytes

39

624 (IO), and mature healthy oocytes (MO) (Beninger, 1987; Beninger et al., 2001; Valdizan,

625 2011 ; Fig. II-9 A).

626

A B M MO N NU AO IO 50 µm AL M C

AO IAT N P NU 100µm 50 µm

Figure II-9. Tapes philippinarum female gonad stained with modified Masson’s trichrome. (A) General view. AO, mature oocytes (MO), immature oocytes (IO), interacinal tissue (IAT), acinal lumen (AL). (B) Mature healthy oocyte and (C) IO attached to the acinal wall by a peduncle (P). Nucleus (N), nucleolus (NU) and cell membrane (M) are clearly visible.

627 Generally, three counts were performed on each of three sections per individual,

628 and the data were pooled to provide mean counts for each cell type for each individual,

629 date, and site. Counts were performed on all females sampled over the 26-mo study

630 period at the unexploited and fished sites (July 2010 to September 2012) and over the

631 gametogenic period at the farmed site (May to August 2015 and April to September 2016).

632 A 13 x 14 counting grid was used for the unexploited and fished site micrographs, while

40

633 an 11 x 11 grid was used for the farmed site. Given the small number of females for some

634 samples, the range was used as an indicator of dispersion about the mean (Beninger et

635 al., 2012).

636

637 II- 2 . 5 . RESULTS

638

639 Qualitative characteristics of atresia

640 Using the modified Masson’s trichrome staining protocol, healthy oocytes were

641 readily identified with a pink cytoplasm and a rounded, well-defined nucleus; depending

642 on the plane of section, a distinct nucleolus was also visible (Fig. II-9). Healthy oocytes

643 were either mature (mature healthy oocytes regular rounded shape, separated from the

644 acinal wall, Fig. II-9 B), or immature (immature healthy oocytes pear shape, attached to

645 the acinal wall with a peduncle, Fig. II-9 C).

646 Oocyte atresia in clams was characterized by the appearance of several

647 characteristics, concomitantly or not. These characteristics were observed in both mature

648 and immature oocytes; some affected the nucleus, others the cytoplasm.

649 Characteristics affecting the cytoplasm were as follows:

650 (1) Cytoplasmic discoloration (Figs. II-10 A–C). In most cases, the atresic cytoplasm

651 stained more intensely, becoming darker compared to that of healthy oocytes. More rarely,

652 the cytoplasm turned from a uniform pink-red to green and purple.

653 (2) Cytoplasmic retraction and detachment from the cell membrane (Figs. II-10 D – F, II-

654 10 I). This was visible on histological slides as a clear space between the membrane and 41

655 the cytoplasm, either on a small portion of the cell or involving most of the cell (Figs. II-

656 10 D-F, I).

657 (3) An irregular geometric shape, noticeably different from the spherical shape of healthy

658 oocytes (Figs. II-10 G - I).

659 Characteristics affecting the nucleus were:

660 (1) Disappearance of the nucleoli (Figs II-10 A–F, H–L). This characteristic is not sufficient

661 on its own, since the section plane can pass above or below a nucleolus. In many cases,

662 however, nucleoli are often histologically visible in actively-synthesizing cells; thus, their

663 absence is a clue to atresia, especially when observed in a large number of oocytes,

664 where it can indicate widespread atresia.

665 (2) Homogeneous chromatin, seen as a very uniform nucleus color, with no chromatin

666 clumping (Figs. II-10 J – L, II-11).

667 (3) Disappearance of the nucleus in medially –sectioned cells (Figs. II-10 C, I).

668 The aforementioned characteristics may be more or less pronounced based on

669 the chronological development of atresia. It is important to note that oocytes presenting

670 different characteristics can be physically close to one another, and also close to

671 apparently healthy oocytes in the same acinus (Figs. II-10 D, H, J, K). Some parts of the

672 clam gonad may be almost exclusively occupied by AO, whereas the rest of the gonad

673 may be much less affected. In the overwhelming majority of observations, areas most

674 severely affected were located in the dorsalmost region of the visceral mass.

42

A B C

N

50 µm 50 µm 50 µm D M E F HO N C M HO C C N M 50 µm 50 µm 50 µm G HO H I

NU N

50 µm 50 µm M 50 µm J HO K L

HO N N N 50 µm 50 µm 50 µm Figure II-10. Oocytes showing various characteristics of atresia. (A C) Alteration of cytoplasmic staining, using a constant Masson’s trichrome staining protocol. (D F) Cytoplasmic retraction. G I Altered cell shape. J L Absence of chromatin structure. Nucleus (N), nucleolus (NU), cell membrane (M), cytoplasm (C), healthy oocytes (HO). 675

43

676 Seasonal pattern of atresia

677 Histological observations allowed the identification of three major phases of the

678 Tapes philippinarum oogenic cycle (Table II-1). Characteristics of atresia were observed

679 in early and late vitellogenic oocytes (atresic immature oocytes), and in mature oocytes A B IO MO IAT AIO IAT IO AMO AIO AL AL AMO MO 100 µm 100 µm C D

IAT M

AIO AL AL MAO 100 µm 100 µm

Figure II-11. Seasonal histological profiles of Tapes philippinarum gonads. (A) Beginning of gametogenesis (April): small IO attached to the acinal wall, forming from interacinal tissue (IAT); prespawning, atresic mature (AMO) and atresic immature oocytes (AIO) were also observed. (B) In July, MO and larger IO were observed. (C) During the resorption phase (September) only residual AIO and AMO were visible in the acinal lumen (AL). (D) In winter, no gametes were visible in the acini, and the acinal walls were invaded by numerous macrophage cells (M); the acinal walls themselves may disappear. 44

680 (atresic mature oocytes), beginning in April and throughout gametogenesis and

681 postspawning resorption (Fig. II-11). In July (Fig. II-11 B), oocytes were predominantly

682 late vitellogenic or mature, and characteristics of atresia were again noted in both stages.

683 During the resorption phase (September to November), most oocytes showed at least one

684 characteristic of atresia, notably the disappearance of nucleoli (Fig. II-11 C), indicating

685 generalized atresia in the gonad.

686

TABLE II-1. Phases of the Tapes philippinarum oogenic cycle.

Phase Period Elements observed Other characteristics Gametogenesis April to August MO, IO, and AO (AMO Repeated declines in MO (Figs. II-11 A, B) and AIO) (Figs. II-12 14): dribble Scarce AL and IAT spawner.

Resorption September to Few oocytes, mostly (Fig. II-11 C) November identified as AO. AL and IAT

Resting phase December to AL, IAT, macrophage Inter- individual variation in (Fig. II-11 D) March cells. the degradation of residual No gametes acini. AMO = atresic mature oocytes; AIO = atresic immature oocytes; IAT= interacinal tissue; AL = acinal lumen.

45

687 Quantification of atresia

688 To assess the importance of oocyte atresia throughout the reproductive cycle of

689 Tapes philippinarum, the following oocyte volume fractions were calculated (Weibel et al.,

690 1966):

691 (1) Atresic volume fraction (AVF): the number of grid points occupied by atresic oocytes

692 divided by the total number of grid points occupied by all oocyte types.

AO 695 AVF = *100 IO + AO + MO

693 (2) Mature volume fraction (MVF): the number of grid points occupied by mature oocytes

694 divided by the total number of grid points occupied by all oocyte types.

MO 696 MVF = ∗ 100 IO + AO + MO

697 (3) Immature volume fraction (IVF): the number of grid points occupied by immature

698 oocytes divided by the total number of grid points occupied by all oocyte types.

IO 699 IVF = *100 IO + AO + MO

700 (4) Minimum atresic impact (MAI): the minimum impact of atresia on the oocyte population,

701 expressed as

AVF 702 MAI = *100 AVF + MVF

703

704 The MAI was based on three assumptions: (1) MVF (composed of healthy,

705 mature oocytes) represented the oocyte volume fraction with a high probability of being

706 spawned as healthy; (2) AVF represented the oocyte volume fraction with no probability

46

707 of being spawned as healthy oocytes; the fates of MVF and AVF were therefore known;

708 (3) The fate of IVF was unknown, as it could either remain healthy or become atresic. This

709 index therefore represents the minimum oocyte volume fraction known to be atresic,

710 compared with the total oocyte volume fraction whose fate is known.

100 AVF MVF 80 IVF

60

40

20 Volume fraction (%) fraction Volume

0 //

Sampling

2-Jul 6-Jul

REST

2-Jun 3-Jun

21-Jul 31-Jul 19-Jul 26-Jul

6-May

17-Jun 20-Jun

22-Apr

15-Sep

17-Aug 31-Aug 17-Aug 31-Aug 11-may dates 23-May N 7 11 9 10 12 10 9 11 x 10 4 7 5 2 7 9 16 12 5 4 Years 2015 2016

Figure II-12. Atresic, mature, and immature volume fractions over the 4- and 5-mo gametogenic periods at the farmed site. REST is the resting period when there were no oocytes; N is the number of females used for counts. 711 The evolution of MVF and IVF values over the sampling period at the farmed site

712 reveals several gametogenic cycles and spawns (Fig. II-12). The AVF was at least 15%

713 before the first spawn, increasing to 25% 30% in subsequent spawns. At the end of the

714 reproductive period (September 2016), all residual oocytes were obviously destined for

715 atresia. These results at the farmed sampling site in 2015 and 2016 extend and confirm

716 the longer-term observations from the fished and unfished sites (2010 to 2012; Figs. II-13

717 and II-14).

47

100 AVF MVF 80 IVF

60

40

Volume fraction (%) fraction Volume 20

0 // // //

Sampling

7-Jul

REST REST

29-Jul 15-Jul 20-Jul

Spring

2-May

16-Jun 25-Jun

25-Oct 25-Oct

20-Apr

21-Sep 27-Sep 18-Sep

August

30-Aug 15-Aug

23-Nov 24-Nov dates 20-May N 6 4 1 0 1 x 3 0 6 8 0 3 0 1 1 4 x 0 4 6 0 9 Years 2010 2011 2012

Figure II-13. Atresic, mature, and immature volume fraction over the 26-mo sampling period at the unfished site. REST is the resting period; N is the number of females used for counts. No sampling was possible in spring 2012. 718 To clearly summarize these data, only those dates corresponding to MVF ≥ 20%

719 were chosen to represent the period of active gametogenesis (Table II-2). The excluded

720 periods were thus as follows:

721 (1) The end of the gametogenic periods, when most oocytes were atresic and undergoing

722 resorption.

723 (2) The resting phase, when there was no gametogenesis

724 (3) The beginning of the gametogenic periods, when most oocytes were in early gamete

725 stages and their fate is thus unknown.

48

726 100 AVF MVF 80 IVF

60

40

Volume fraction (%) fraction Volume 20

0 // // //

Sampling

7-Jul

REST REST

22-Jul 15-Jul 19-Jul

Spring

2-May

13-Jun 22-Jun

26-Oct 24-Oct

24-Apr

24-Sep 26-Sep

August

31-Aug

24-Nov 23-Nov

20-May aout15

dates 23-mars N 1 7 5 10 0 x 1 2 9 4 6 7 0 0 0 0 5 x 0 3 10 2 Years 2010 2011 2012

Figure II-14. Atresic, mature, and immature volume fraction during the 26-mo sampling period at the fished site. REST is the gametogenic resting period; N is the number of females used for counts. No sampling was possible in spring 2012. 727

TABLE II-2. Mean oocyte status indices during the active gametogenic period at the three study sites.

Sites MAI AVF MVF IVF N Farmed 48.8 ± 5.7 33.7 ± 5.2 35.0 ± 4.4 31.4 ± 5.5 139

Unfished 44.3 ± 6.4 33.2 ± 6.4 41.2 ± 8.3 25.6 ± 10.5 49

Fished 41.9 ± 13.7 31.2 ± 11.2 37.5 ± 9.3 31.3 ± 10.6 44

Total 45 32.7 37.9 29.4 232

49

728 Over the active gametogenic period at all sites, approximately 33% of gamete volume was

729 occupied by AO and the MAI was 45% (Table II-2). No marked differences in volume

730 fractions were noted between sites.

731

732 II- 2 . 6 . DISCUSSION

733

734 Histological features of atresia

735 Histological observations of the present study establish the following indicators

736 of atresia: absence of the nucleolus (an early indicator), as well as nuclear degradation

737 (irregular nuclear envelope or chromatin degradation), cytoplasmic discoloration and

738 retraction, and cellular distortion (puzzle shape). Although it is not possible to establish a

739 firm chronological sequence at this point, certain atresic characteristics do present a

740 temporal sequence, especially for the nucleus (Fig. II-15).

741 The features described previously correspond to the categories of characteristics

742 previously outlined in the Bivalvia (Beninger, 2017). Nucleolus disappearance

743 No discernable differences were noted between pre- and

744 postspawning atresia, indicating a common process. Chromatin degradation

745 Generalization of atresia within acini has been reported

746 for several bivalve species, being easily recognized by major Nucleus disappearance

747 distortions of oocyte shape (Dorange and Le Pennec, 1989; Figure II-15. Temporal 748 Suárez et al., 2005; Beninger and Le Pennec, 2006; Dutertre sequence of nuclear characteristics in AO 749 et al., 2009). Such generalization may also occur in 50

750 Tapes philippinarum acini, but this appears to lack synchrony, and cellular distortions are

751 much less severe. Instead, clarification of the nucleus is the revealing feature.

752 Temporal dynamics of oocyte atresia

753 Based on all of the data from the different study sites and years, the temporal

754 dynamics of oocyte atresia in Tapes philippinarum are summarized in Figure II-16. Oocyte

755 atresia steadily increased in the spring, before to the first spawning. A precipitous

756 decrease in all oocyte types characterized the first spawning; from this point onward,

757 throughout the subsequent gametogenic activity, both pre-and postspawning AO were

758 present in the gonad simultaneously.

759 Of the three functional types of atresia proposed by Motavkine and Varaskine

760 (1989), it is clear that the resorption phase of the reproductive cycle corresponds to

761 residual atresia. The atresia observed prior to the resorption phase may be either

762 physiological (i.e., a regulatory mechanism) or ecological (i.e., a response to unfavorable

763 environmental conditions). Much further research will be necessary in order to refine this

764 analysis.

51

765 Impact of atresia on Re

766 To the authors’ knowledge, this is the first study to quantify oocyte atresia and its

767 effect on reproductive effort Re. Previously, Morvan and Ansell (1988) calculated a percent

768 of AO in Tapes rhomboides, using a complex estimation based on oocyte diameters and

769 the Williams’ equation (Williams, 1981); however, these authors only appear to have

770 included mature AO in their estimations. The losses of 11% fecundity in spring and 3.3%

771 in summer reported by these authors therefore represent considerable underestimations.

: Partial spawn

: Partial spawn residual oocytes

: Final spawn residual AO

: Pre-spawning atresia

: Mixture pre- and

Oocyte atresiaOocyte post-spawning atresia

1-Mar 1-Apr 1-May 1-Jun 1-Jul 1-Aug 1-Sep 1-Oct 1-Nov 1-Dec Dates Figure II-16. Temporal dynamics of oocyte atresia throughout the reproductive cycle of Tapes philippinarum.

772 The stereological technique used in this study is based on the number of counting

773 points occupied by particular cell types. This type of data does not allow precise oocyte

774 numbers to be determined, but it can obviously be used as a proxy for such numbers, in

775 addition to representing the amount of energy invested. If all oocytes are viable, the Re

776 simply equals the total volume of oocytes in the gonad at time t. If some oocytes are not

52

777 viable, the effective reproductive effort (ERe) is the total oocyte volume fraction minus the

778 volume fraction of all AO:

779 ERe = Re - AO

780 The results of the present study

Re 781 show that the minimum level of atresia in Post-spawning 782 the Tapes philippinarum reproductive AVF ~ 18 % AVF ~ 33% 783 cycle was 15%, at the beginning of Pre-spawning 784 gametogenesis; this volume fraction AVF ~ 15% 785 climbed to approximately 33% during ERe

786 active gametogenesis, when both pre- Figure II-17. Loss of reproductive investment caused by pre- and post-spawning atresia. 787 and postspawning atresia are present

788 (Figs. II-16 and II-17). Furthermore, the MAI obtained during active gametogenesis, from

789 the three sites, was approximately 45%. Thus, nearly half of the oocyte volume fraction

790 produced during active gametogenesis would be lost to atresia, reducing Re by

791 approximately 45%. It should be remembered that this is the MAI, so the figure may well

792 surpass 50%. As there was no evidence of AO resorption during active gametogenesis

793 (no empty cells or macrophage invasion), it is assumed that these cells are lost at

794 spawning; atresia, therefore, seems to represent a net loss of energy for

795 Tapes philippinarum females.

796 It is useful to place this result in the context of Re estimates, approximated by indices

797 such as the condition index (Lucas and Beninger, 1985). To illustrate this point, such a

798 condition index was calculated at the farmed site for 18 Tapes philippinarum individuals

799 concomitantly sampled biweekly over 20 mo of one study period (March 2015 to

53

800 December 2016, Fig. II-18). The high values of this index during active gametogenesis

801 are obviously misleading and should therefore be interpreted with caution because almost

802 half of the gamete volume produced was atresic. The data of the present study show that

803 although tissue:shell weight condition indices can be used to quantify reproductive

804 investment, they cannot be used to indicate reproductive outcome.

805 From the preceding, it is clear that atresia can be a major cause of oocyte mortality

806 in Tapes philippinarum; in itself, this result assists in the understanding of the high-level

14

12

10

8

6 Condition index Condition 4

2

0

2-Jul 6-Jul

2-Jun 3-Jun

5-Oct 5-Oct

8-Apr

3-Dec

21-Jul 31-Jul 19-Jul 26-Jul

7-Nov

6-May

12-Jan

17-Jun 20-Jun

29-Oct 19-Oct

30-Apr 11-Apr 22-Apr

10-Feb 15-Sep

19-Dec

17-Aug 31-Aug 17-Aug 31-Aug

28-Nov

23-Mar 10-Mar 25-Mar

11-May 23-May 2015 2016 Sampling dates

Figure II-18. Condition index (CI) of Tapes philippinarum individuals sampled at the farmed site. Brackets indicate high values of CI, which also correspond to high values of atresia.

54

807 mortalities typically found in the early life stages of this and many other bivalve species,

808 as well as allowing more realistic estimations of Re and fecundity.

809 II- 2 . 7 . ACKNOWLEDGMENTS

810

811 The authors thank M. Christophe Héry, president of the Professional Clam

812 Fishers Association of Vendée, for assistance at the unfished site, as well as Pascal

813 Chellet, vice-president of the Regional Professional Shellfish Farmer Commission, for his

814 interest and support for this project. Student interns Marie Petitguyot, Baptiste Serandour,

815 and Tanguy Moreau assisted with histological preparation. This work was financed by the

816 EPAT program of the Conseil Régional des Pays de la Loire, contract 2015 02488.

55

817 CONCLUSIONS SUR L’ATRESIE

818 OVOCYTAIRE CHEZ LA PALOURDE, ET

819 PERSPECTIVES

820 CONCLUSIONS ON OOCYTE ATRESIA IN

821 CLAMS, AND PERSPECTIVES

822 The Manila clam, found on most coasts of the northern hemisphere, is a dribble

823 spawner, capable of producing several million oocytes per female per reproductive

824 season. Qualitative histological studies have made it possible to determine the

825 characteristics of the atresic oocytes, present throughout the reproductive cycle and at all

826 stages of gametogenesis. With these recognition tools, a quantification of the impact of

827 oocyte atresia in this species was carried out. Based on oocytes volume, it has been

828 possible to determine that approximately 50% of oocytes would become atresic during the

829 reproductive cycle. No variation between study sites was observed, so anthropogenic

830 pressure was not a factor influencing oocyte atresia. These results motivated the inception

831 of a similar study in the common cockle, a species also fished and farmed in the same

832 areas as clams.

833 The question of the cytological progression of atresia also arose. In order to

834 understand the intracellular mechanisms involved in the atresic process, a transmission

835 electron microscopy study was also carried out. In addition, it was hoped that observation

836 of the spawned oocytes released would clarify their fate in Manila clams.

56

57

BASES BIOLOGIQUES DE

CERASTODERMA EDULE

BIOLOGICAL BASES OF CERASTODERMA EDULE

58

59

837 INTRODUCTION

838 INTRODUCTION

839 Des connaissances générales sur l’espèce étudiée, ici la coque commune, sont

840 nécessaires pour appréhender et contextualiser le phénomène précis qu’est l’atrésie

841 ovocytaire. Des notions de bases de taxonomie, d’écologie, de biologie, en particulier de

842 reproduction chez C. edule sont développés dans ce propos introductif.

843 III- 1 . 1 . TAXONOMIE

844 TAXONOMY 845

846 La coque commune, common cockle ou edible cockle en anglais, appartient :

847 - au phylum Mollusca ;

848 - à la classe : Bivalvia ;

849 - à l’ordre des Cardiida ;

850 - à la famille : Cardiidae ;

851 - au genre : Cardium ou Cerastoderma

852 A la différence de la palourde japonaise, le nom donné à cette espèce fait facilement

853 consensus dans la communauté scientifique. Après qu’une dizaine de noms lui ait été

854 donnée, avec le nom de genre Cardium ou Cerastoderma, c’est Cerastoderma edule

855 (Linné, 1758) qui est préféré dans la très grande majorité des études.

856 60

857 III- 1 . 2 . REPARTITION GEOGRAPHIQUE DE 858 L’ESPECE

859 GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE SPECIES

860 La coque commune est une espèce endémique des côtes atlantiques européennes

861 et du nord de l’Afrique. Elle est très présente dans la zone intertidale, du cercle polaire

862 arctique au tropique du Cancer. Cette espèce fouisseuse, très robuste, s’adapte bien à

863 de nombreux types de sédiment. Néanmoins, elle préfère les sédiments sableux à sablo-

864 vaseux. Elle est très peu mobile à l’âge adulte.

865

866 III- 1 . 3 . ELEMENTS DE BIOLOGIE

867 ELEMENTS OF BIOLOGY

868 Morphologie et anatomie 869 Morphology and anatomy

870 La coquille de Cerastoderma edule est symétrique, globulaire et claire, blanche à

871 beige, présentant des côtes prononcées et des lignes de croissances bien visibles (Fig.

872 III-1). Les coques peuvent atteindre 5 cm dans l’axe antéro-postérieur, mais dans la

873 majorité des cas elles ne dépassent que très rarement 3,5 cm en raison de la pêche

874 (observation d’individus plus grands dans des zones interdites à la pêche). Les siphons

875 sont très courts ce qui oblige la coque à rester proche de la surface du sédiment (environ

876 1-2 cm sous la surface).

61

A B ES IS Lu R H

Li RV

F GL

Figure III-1. Morphology of Cerastoderma edule. A, Hinge (H), posterior ligament (Li) and anterior lunule (Lu) are visible in a dorsal view. Growth line (GL) and broad ribs (R) on the right valve (RV). B, C.edule during filtration: exhalent siphon (ES) is more dorsal than inhalent siphon (IS). The foot (F) may be extended to a distance similar to the dorso-ventral axis.

877

878 La masse viscérale est assez ferme, blanche nacrée et de forme rectangulaire (Fig.

879 III-2). Sa partie ventrale se prolonge en un pied musculeux puissant, jaune-orange qui

880 s’éclaircit quand il est étiré, Fig III-1 B. Le bord palléal ainsi que les siphons sont

Inhalent siphon Foot Figure III-2. Anatomy of Visceral mass Exhalent Cerastoderma edule siphon Mantle margin after opening. LV, left Adductor valve muscle (posterior) Gill

V P A LV D

62

881 également colorés en jaune - orangé. Les branchies s’insèrent sur le bord dorsal de la

882 masse viscérale et recouvrent une partie de celle-ci. (Fig. III-2). La coque possède un

883 muscle adducteur postérieur et un muscle adducteur antérieur.

884 Reproduction 885 Reproduction

886 Comme la palourde, la coque est gonochorique et la gonade s’organise en acini

887 dans lesquels les gamètes ont un développement centripète. La gonade de Cerastoderma

888 edule ne présente aucune constance anatomique. Les acini peuvent se développer

889 aléatoirement de la partie la plus dorsale de la masse viscérale à la partie la plus ventrale,

890 descendant même au sein des puissants muscles du pied. Le tissu inter-acinal davantage

891 présent à l’apogée de la gamétogenèse chez la coque que chez la palourde.

892 Les émissions de gamètes, et plus largement les phases du cycle de vie, sont

893 régies par la température et la disponibilité en nourriture, entre autres. D’après

894 Dabouineau and Ponsero (2009), la maturité sexuelle est atteinte quand la coque fait

895 environ 13 mm dans l’axe antéro-postérieur, taille atteinte d’autant plus vite que les

896 conditions environnementales sont favorables à la croissance. Plusieurs observations

897 réalisées au cours de cette thèse font pressentir que la maturité sexuelle pourrait être

898 atteinte chez des individus de taille inférieure. Les températures minimales pour le

899 déclenchement de la gamétogenèse et de l’émission des gamètes sont inférieures à

900 celles de la palourde. La température optimale de ponte semble être aux alentours de 14-

901 15°C, mais plus que la température brute, c’est l’augmentation des températures qui

902 déclenche les émissions de gamètes (Desprez et al., 1987; Guillou and Tartu, 1992; 63

903 Bellamy et al., 2009). Sous les latitudes de la côte atlantique française, les coques

904 peuvent initier plusieurs émissions de gamètes dans l’année (Dabouineau and Ponsero,

905 2009). Ce sont des « dribble-spawners ». Le nombre d’émissions de gamètes et leur

906 intensité vont être conditionnés par la qualité du repos hivernal ainsi que par l’intensité

907 des pontes précédentes (Guillou et al., 1990; Guillou and Tartu, 1992; Honkoop and Van

908 der Meer, 1998; Bellamy et al., 2009; Dabouineau and Ponsero, 2009). Après la dernière

909 émission de gamètes de la saison de reproduction les gamètes restants sont résorbés,

910 c’est la phase de résorption. Entre deux périodes de reproduction, il n’y a plus d’acini ni

911 de gamètes dans la masse viscérale des individus, c’est la phase de repos.

912 L’espace occupé par les gonades (et donc par les gamètes) peut être fortement

913 diminué à cause de l’envahissement par divers parasites, en particulier des larves de

914 trématodes digéniens, de la masse viscérale (De Montaudouin et al., 2009) (Fig. III-15).

915 La production d’ovocytes dépend de la taille de l’individu. Avec une taille de 18 mm

916 une femelle produit 5 600 ovocytes, et près de 10 fois plus pour une taille de 40 mm

917 (Kristensen, 1958). Les gamètes émis dans la cavité palléale sont expulsés par le siphon

918 exhalent dans la colonne d’eau. La cellule œuf produite par fécondation externe (65 µm

919 de diamètre environ) réalise des mitoses au sein d’une gangue de mucus, jusqu’à

920 atteindre le stade véligère en 2-3 jours. La présence de cette gangue est discutée dans

921 le Chapitre V.

922 Les larves pédiveligères rejoignent le substrat, mettant fin à la vie pélagique de la

923 coque. Les larves vont se fixer au substrat grâce à leur byssus à un sédiment

64

924 préférentiellement sablo-vaseux dans la zone intertidale. La glande byssale est encore

925 observable chez l’adulte, bien qu’inactive.

926

927 OBJECTIVES OF THE STUDY OF

928 OOCYTE ATRESIA IN THE COCKLE

929

930 As in clams, the quality of the oocytes should be a determining factor in the

931 reproductive success of the common cockle Cerastoderma edule. The intriguing results

932 obtained in the clam confirmed the need to carry out the same type of study in the cockle,

933 a bivalve that lives in similar conditions. Extending this study to another species will help

934 to understand whether the presence of oocyte atresia throughout the reproductive period,

935 is a phenomenon exclusively found in clams or whether it could be a more widespread

936 phenomenon in bivalves. The same qualitative and quantitative histological methods were

937 therefore applied to the cockle.

65

938 L’ATRESIE OVOCYTAIRE ET SES

939 EFFETS SUR L’EFFORT DE

940 REPRODUCTION DE LA COQUE

941 COMMUNE CERASTODERMA EDULE.

942 OOCYTE ATRESIA AND ITS EFFECT ON

943 REPRODUCTIVE EFFORT OF THE

944 COMMON COCKLE

945 CERASTODERMA EDULE

946

947 III- 3 . 1 . RESUME ET CONTEXTE

948 ABSTRACT AND CONTEXT

949 Après les observations issues de l’étude de l’atrésie ovocytaire chez

950 Tapes philippinarum, le choix a été fait de s’intéresser à une espèce également cultivée

951 et pêchée, qui partage le même habitat : Cerastoderma edule.

952 Afin d'élucider les causes de la mortalité aux premiers stades de la vie, les

953 caractéristiques histologiques des ovocytes ont été examinées toutes les deux semaines

954 chez la coque commune, sur une période de 11 mois (janvier-novembre 2018) dans un

955 site d'élevage de la côte atlantique française, le Traict du Croisic. Le sexe des individus

956 prélevés (n=25) a été déterminé par l’examen des lames histologiques.

66

957 Le sexe de certains individus n’a pas pu être déterminé car aucun gamète n’était

958 présent (phase de repos). La gamétogenèse a été continue au niveau de la population,

959 sans synchronisme interindividuel apparent. Le printemps semble tout de même la

960 période la plus propice pour la reproduction chez cette population car tous les individus

961 étaient en gamétogenèse. Au contraire, c’est au cœur de l’été que le nombre d’individus

962 en phase de repos est le plus important (Fig. III-3). Seules les femelle gamétogénétiques

963 ont été utilisées pour cette étude.

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

3-Apr 1-Oct

5-Mar

8-Feb

7-Sep

11-Jul 25-Jul

16-Apr 30-Apr 15-Oct 29-Oct

22-Jan 13-Jun 25-Jun

22-Feb 19-Mar

12-Nov 26-Nov

10-Aug 23-Aug 21-Sep

14-May 28-May Sampling dates

Male Undefined Female Figure III-3. Cerastoderma edule. Percentage of male, female, and undefined gender cockles from sample on clam-cockle farmed site, during the year 2018. (n= 25 for each date)

67

964 L’atrésie ovocytaire a été observée tout au long de l'année, à tous les stades de

965 l'ovogénèse. Une coloration au trichrome de Masson modifié a permis de définir les

966 caractéristiques histologiques de l’atrésie ovocytaire chez la coque : la perte du nucléole,

967 la dégradation du noyau et de la chromatine et la forme angulaire de la cellule. Une

968 coloration au bleu d’Alcian a été ajoutée, révélant une gangue ovocytaire de

969 mucopolysaccharides acides, absente chez la palourde. Des ovocytes atrésiques et non

970 atrésiques ont été observés dans les mêmes acini ce qui suggère que le processus ne se

971 propageait pas ou n'était pas synchronisé. Les comptages stéréologiques ont montré que

972 les ovocytes atrésiques occupaient en moyenne, sur une année, 30 % (de 12 à 47 %) du

973 volume des ovocytes. L'estimation de l'impact atrésique minimum a montré que 50% des

974 ovocytes dont le sort pouvait être déterminé à partir de coupes histologiques, étaient ou

975 deviendraient atrésiques (approximation basée sur la fraction volumique ovocytaire),

976 réduisant en conséquence l’effort de reproduction effectif et la fécondité.

977 Les résultats issus de l’étude sur la coque, associés à ceux issus de l’étude sur la

978 palourde soulignent une fois de plus la nécessité d’une meilleure reconnaissance,

979 documentation et intégration de l’atrésie ovocytaire dans des modèle de fécondité, d’effort

980 de reproduction, de dynamique de population et de production.

68

981 D’après un article publié dans :

982 Journal of Shellfish Research, 2019, 38(3):603-609.

983 OOCYTE ATRESIA AND ITS EFFECT ON

984 REPRODUCTIVE EFFORT OF THE COMMON COCKLE

985 CERASTODERMA EDULE (LINNEAUS, 1758)

986

987 Daphné CHÉREL and Peter G. BENINGER

988

989 III- 3 . 2 . ABSTRACT

990

991 In an effort to elucidate the causes of early life stage mortality, the histological

992 characteristics of oocyte atresia were examined biweekly in the European common cockle

993 Cerastoderma edule (Linnaeus, 1758) over an 11-mo-period (January–November 2018),

994 at a farmed site on the French Atlantic coast. Gametogenesis was continuous at the

995 population level, with no apparent interindividual synchronicity. Atresia was observed

996 throughout the year, at all stages of oogenesis, characterized by loss of the nucleolus,

997 nuclear and chromatin degradation, and angular cell shape. Both atresic and nonatresic

998 oocytes were observed in the same gonad acini, suggesting that the process was either

999 not propagated or not synchronized. Stereological counts showed that atresic oocytes

1000 occupied an annual mean of 30% (range 12%–47%) of the oocyte volume. Estimation of

1001 the minimum atresic impact showed that more than 50% of the oocytes, whose fate can

69

1002 be determined from histological sections, were or would become atresic, reducing the

1003 fecundity accordingly. Together with previously reported results in other bivalve species,

1004 this underscores the need for better recognition, documentation, and integration of this

1005 process into models of fecundity, reproductive effort, population dynamics, and

1006 production.

1007

1008 III- 3 . 3 . INTRODUCTION

1009

1010 The common cockle Cerastoderma edule (Linnaeus, 1758) is found on the

1011 Northeast Atlantic coast, from Mauritania to Norway. It is an economically important

1012 species in The Netherlands, United Kingdom, and France, with a peak fishery yield of

1013 more than 100,000 metric tons in the late 1980s; annual cockle-farming production has

1014 averaged 3–5,000 metric tons since the mid-1980s

1015 http://www.fao.org/fishery/species/3535/en. The recreational fishery is also highly

1016 developed, particularly in France, with added dimensions of tourism and heritage (Boldina,

1017 2013; Beninger, 2018).

1018 A firm understanding of reproductive biology is obviously essential to the

1019 management of any exploited population. Although some data exist concerning the

1020 reproduction of Cerastoderma edule (Boyden, 1971; Kingston, 1974; Yankson, 1986;

1021 Navarro et al., 1989; Guillou et al., 1990; Iglesias and Navarro, 1991; Guillou and Tartu,

1022 1992; Martínez-Castro and Vásquez, 2012; Pronker et al., 2015), little is known

1023 concerning the actual fecundity of this species. In particular, the proportion of viable

70

1024 oocytes has not yet been determined in any population. Recent studies of oocyte atresia

1025 (the degeneration of oocytes within the gonad) have revealed that this is a widespread

1026 phenomenon among bivalves, and in the one species in which its effect has been

1027 quantified, up to half of the oocytes may be nonviable (Beninger, 2017; Chérel and

1028 Beninger, 2017). Although atresia shares common general characteristics in all species

1029 studied to date (Beninger, 2017), histological identification is often hampered by a lack of

1030 clear, detailed, species-specific criteria.

1031 The present study documents the histological characteristics of oocyte atresia in

1032 cultured Cerastoderma edule and quantifies its importance with respect to total oocyte

1033 production.

71

1034 III- 3 . 4 . MATERIALS AND METHODS

1035 Species, site, and sampling

Great 1036 The study was Sampled Site Britain

1037 carried out at a clam— France Le Croisic 1038 cockle farm on the French

1039 Atlantic coast (Fig. III-4). Loire Estuary Spain 1040 Adult cockles (30 N. 47°17’ 1041 individuals, >2 cm) were N 1042 haphazardly sampled Atlantic Ocean 1043 biweekly from January to

10 km Bourgneuf Bay W. 2°20’ 1044 November 2018. Figure III-4. Location of the study site.

1045 Histological and stereological techniques

1046 Sampled cockles were shucked and fixed in Bouins solution, embedded, and

1047 sectioned at 7 µm as per Chérel and Beninger (2017). Slides were first stained with Alcian

1048 blue to reveal the oocyte sheath (Beninger and Chérel, 2019) (acetic acid 3% 1 min, dry

1049 3 min, and Alcian blue 30 min), followed by a modified Masson’s trichrome protocol

1050 (Beninger et al., 2010; Chérel and Beninger, 2017) (trioxyhematein 2 min, acid fuschin 2

1051 min, orange G–phosphomolybdic acid 4 min, and fast green 4 min). Observations were

1052 performed using an Olympus Provis light microscope and Olympus cellSens Standard

1053 software.

72

1054 Stereological techniques are usually carried out to quantify relative gamete volume

1055 fractions for documentation of the reproductive cycle (Newell and Bayne, 1980; Lowe et

1056 al., 1982; Newell et al., 1982; Lowe and Pipe, 1986; MacDonald and Thompson, 1986;

1057 Beninger, 1987; Lee, 1988; Morvan and Ansell, 1988; Royet, 1991; Pazos et al., 1996;

1058 Chérel and Beninger, 2017); in that case, interindividual anatomical constancy is a

1059 prerequisite. An extensive preliminary histological study of the cockle showed that there

1060 is no interindividual constancy in the gonad location, with acini being found variably from

1061 the ventral extremity of the foot to the entire periphery of the digestive gland, and even

1062 between the outermost digestive tubules. The present study did not seek to quantitatively

1063 document the reproductive cycle, but rather the proportions of various oocyte types within

1064 the gonad acini, wherever they were found. To this end, nine micrographs were taken for

1065 each female in regions containing abundant acini.

Figure III-5. General view of the female gonad of Cerastoderma edule stained with Alcian blue and modified Masson’s trichrome, MO IO showing the five histological

features used for stereological IAL counts: AO, mature oocytes (MO), IO, oocyte sheath (S) and intra-

S acinal lumen.

A O 50 µm

73

1066 Stereology was carried out on gonad acini using an 11 x 11 grid. Counts were

1067 performed on five features of interest: atresic oocytes (AO), immature healthy oocytes

1068 (IO), mature healthy oocytes (MO), oocyte sheath (S), and intra-acinal lumen (Fig. III-5).

1069 The following oocyte volume fractions were calculated (Chérel and Beninger, 2017):

AO 1070 Atresic oocyte Volume Fraction : AVF = *100 AO + IO + MO

MO 1071 Mature oocyte Volume Fraction : MVF = *100 AO + IO + MO

IO 1072 Immature oocyte Volume Fraction : IVF = *100 AO + IO + MO

1073 On histological examination of the 30 individuals sampled, actively gametogenic

1074 females represented less than 15 individuals throughout the study (Fig. III-9). Given that

1075 the resulting number of females on several samplings was prohibitively low for meaningful

1076 calculation of conventional measures of dispersion (Beninger et al., 2012), means and

1077 data ranges were calculated, expressing the latter as ½ (maximum–minimum) in figure

1078 graphs.

1079 Minimum atresic impact (MAI) (Chérel and Beninger, 2017) was expressed as:

AVF 1080 MAI = *100 AVF + MVF

74

1081 III- 3 . 5 . RESULTS

1082

1083 Qualitative characteristics of atresia

1084 Healthy mature or immature oocytes (IO) presented a rounded shape, with a pink

1085 cytoplasm and a well-defined cell membrane when stained with the modified Masson’s

1086 trichrome protocol. The spherical nucleus contained a slightly condensed chromatin; in

1087 most sections, a well-defined nuclear envelope and nucleolus were visible (Fig. III-6). The

1088 oocyte sheath stained strongly with Alcian blue, indicating abundant acid

1089 mucopolysaccharides; it was much more voluminous around healthy, vitellogenic oocytes,

1090 than young, IO, and much more variable around AO (Figs. III-6–8).

A B S S

NE NE N N

NU NU

OE OE

10 µm 10 µm

Figure III-6. Healthy mature (A) and immature, pedunculated oocyte (B) of Cerastoderma edule. Note the smooth oocyte envelope (OE) and large oocyte sheath (S). The nucleus (N), containing slightly condensed chromatin, is surrounded by a well-defined envelope comprises a double membrane (NE). Depending on the plane of section, a nucleolus (NU) is often visible.

75

S A B S

N N N

20 µm NU 10 µm

S C D

S

N N

10 µm 10 µm

Figure III-7. Characteristics of atresia in IO of Cerastoderma edule: altered cell shape and chromatin structure (A–C), thin oocyte sheath (B, C), nuclear shrinkage, and oocyte envelope rupture (double arrows, D). Note the slightly degraded chromatin structure in B, indicating an intermediate condition between the oocytes in Figure III-7 and those in Figure III-8 A, C, and D. N, nucleus; NU, nucleolus; S, sheath.

1091 Oocyte atresia was characterized by several histological features, either

1092 concomitantly or not. These features were observed in both mature oocytes and IO; some

1093 affected the nucleus, whereas others affected the cell shape and membrane.

1094

76

1095 1. An irregular, angular cell shape, noticeably different from the rounded, spherical

1096 shape of healthy oocytes (Figs. III-7 B, C and III-8 C, D).

1097 2. Cell membrane rupture (Fig. III-7 D).

1098 3. Dispersed yet strongly stained chromatin, seen as a uniform or finely mottled

1099 nucleus color (Figs. III-7 A, C, D and III-8 A–C).

1100 4. Irregular nuclear envelope (Fig. III-8 B, C), a decrease in the nucleus size (Fig. III-

1101 9 D), or even a vestigial state (Fig. III-8 D).

1102 A B NE S

N N

S NE

10 µm 10 µm

C D S NE VN

N

S 10 µm 10 µm

Figure III-8. Characteristics of atresia in mature oocytes of Cerastoderma edule: altered chromatin structure (A–C) or even (D) vestigial nucleus (VN). Thin oocyte sheath (B–D), irregular nuclear envelope (B, C), and angular shape (C, D). N, nucleus; NU, nucleolus;

77

1103 The aforementioned characteristics were more or less pronounced, based on the

1104 chronological development of atresia. Interestingly, oocytes presenting advanced atresic

1105 characteristics were often observed adjacent to apparently healthy oocytes in the same

1106 acinus (Figs. III-5 and III-7 A).

1107 Periods of gametogenesis and atresia

1108 The sustained and relatively high proportion of IO (IVF) indicated a continuous

1109 gametogenic activity at the Cerastoderma edule population level (Fig. III-9), although

1110 some individuals did show evidence of a resting period (no visible acini). Gametogenesis

1111 was not entirely synchronous; individuals with mature volume fraction (MVF) >20% (active

1112 gametogenesis) were present throughout the year, with a slight predominance at the end

1113 of winter and the end of summer. Characteristics of atresia were observed at all stages of

1114 oogenesis, throughout the year (minimum atresic volume fraction (AVF): 12.63% for

1115 October 29, maximum AVF: 46.85% for February 22; Fig. III-9).

1116 Quantification of atresia

1117 The AVF, MVF, immature volume fraction (IFV), and MAI means were calculated

1118 both for all individuals and for individuals showing active gametogenesis (MVF >20%)

1119 (Table III-1). The differences in values between all individuals studied and those in active

1120 gametogenesis are less pronounced for AVF than for the other indices. During active

1121 gametogenesis, MAI was almost 53%. The higher value of MAI calculated for all

1122 individuals (57.42%), despite the lower value of AVF (27.85%), was because of the higher

78

1123 value of the IVF. In both cases, the MAI showed that more than half of the oocyte volume

1124 fraction whose fate could be determined was lost to atresia.

1125

AVF MVF IVF 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

0

3-Apr 1-Oct

5-Mar

8-Feb

7-Sep

11-Jul 25-Jul

16-Apr 30-Apr 15-Oct 29-Oct

25-Jun 22-Jan 13-Jun

19-Mar

22-Feb

10-Aug 23-Aug 21-Sep 12-Nov 26-Nov

14-May 28-May

N Dates N 13 8 13 11 14 12 13 14 10 10 5 9 7 6 4 6 6 10 5 9 13 13 8

Figure III-9. AVF, healthy MVF, and healthy IVF of oocytes. Error bars represent half the range of values. N is the number of females used for counts.

79

1126 III- 3 . 6 . DISCUSSION

1127

1128 Oogenetic and atresia dynamics

1129 The presence of gametes throughout the year, particularly the presence of IO,

1130 confirms that the common cockle is a dribble spawner at this site, as has been observed

1131 elsewhere (Kingston, 1974; Yankson, 1986; Guillou et al., 1990; Guillou and Tartu, 1992).

1132 In addition to significant interindividual heterogeneity in oogenesis, individuals showed

1133 resting states at different times of the year, with a peak during summer. It is, therefore,

1134 not possible to delimit a spawning period, and, therefore, not possible to determine

1135 whether the observed atresia occurred pre- or postspawning. These conclusions were

1136 supported by similar AVF, MVF, and IVF values obtained from an opportunistic study

1137 carried out on a reduced number of individuals over a 26-mo period at a nearby fishing

1138 site (Daphné Chérel and Inna Boldina, Université de Nantes, unpublished data). Taken

1139 together, these observations indicate that approximately half of the Cerastoderma edule

1140 oocyte production was lost to atresia; similar results were also obtained for the sympatric

1141 venerid clam Tapes philippinarum (Chérel and Beninger, 2017).

1142 Histological features of atresia

1143 The asynchronous oocyte atresia of Cerastoderma edule corresponds to the

1144 physiological type of atresia described by Motavkine and Varaskine (1989) and previously

1145 reported in the Manila clam Tapes philippinarum (Veneridae) (Chérel and Beninger,

1146 2017). This contrasts with the synchronous type of atresia, presumed to be ‘‘ecological’’ 80

1147 (i.e., triggered by ecological factors), in which all oocytes in a given acinus become atresic

1148 quasi-simultaneously, as observed in the Mytilidae (Suárez et al., 2005; Beesley et al.,

1149 2008; Suárez Alonso et al., 2010; Smolarz et al., 2017; García-Corona et al., 2018;

1150 Koagouw and Ciocan, 2018; Rouabhi et al., 2019), Pinnidae (Camacho-Mondragón et

1151 al., 2012, 2015), Pectinidae (Paulet et al., 1992; Cantillanez et al., 2005; Beninger and Le

1152 Pennec, 2006; Beninger, 2017), Pteriidae (Saucedo et al., 2001), and Ostreidae (Steele

1153 and Mulcahy, 1999; Dutertre et al., 2009; Vaschenko et al., 2013).

1154 Although differing somewhat in presentation, the histological features of oocyte

1155 atresia in Cerastoderma edule correspond to the categories of characteristics previously

1156 outlined in the Manila clam Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850) (Chérel and

1157 Beninger, 2017) and bivalves in general (Beninger, 2017). Although an altered, irregular

1158 oocyte shape is a common histological feature of all types of atresia (Beninger, 2017), this

1159 characteristic presents differently in the aforementioned atresia types. In the physiological

1160 type of atresia, the oocytes become increasingly angular, whereas in the ecological type,

1161 they assume complex ‘‘puzzle piece’’ shapes, as in Mytilus sp. (Suárez et al., 2005;

1162 Beesley et al., 2008; Suárez Alonso et al., 2010), Argopecten sp. and Pecten sp. (Paulet

1163 et al., 1992; Cantillanez et al., 2005; Beninger and Le Pennec, 2006), and Placopecten

1164 magellanicus (Beninger, 2017). In addition, the oocyte envelope becomes less distinct,

1165 and the boundaries of neighboring cells become difficult to distinguish. Although in some

1166 species, such as Tapes philippinarum (Chérel and Beninger, 2017) and Crassostrea gigas

1167 (Dutertre et al., 2009; Beninger, 2017), oocyte atresia is accompanied by cytoplasmic

1168 shrinkage away from the plasma membrane, this was not observed in the Cerastoderma

1169 edule of the present study. 81

1170 The nuclear characteristics of oocyte atresia observed in histological sections of

1171 the common cockle are very similar to those observed in most bivalves (Beninger, 2017),

1172 notably chromatin degradation, with an end point homogeneous nuclear staining. Similar

1173 observations have been made for Tapes philippinarum (Chérel and Beninger, 2017),

1174 Pecten maximus (Beninger, 2017), Atrina maura (Camacho-Mondragón et al., 2015),

1175 Mytilus galloprovincialis (Suárez et al., 2005; Suárez Alonso et al., 2010), and

1176 Crassostrea angulata (Vaschenko et al., 2013). In other species, for example, Pinctada

1177 mazatlanica (Saucedo et al., 2001) and Placopecten magellanicus (Beninger, 2017),

1178 chromatin degradation occurs in the form of clumping. In most cases, as in Cerastoderma

1179 edule, the nucleoli disappear, as may the nucleus itself in the end stages of atresia.

1180 Impact of atresia on fecundity and reproductive effort

1181 The present study shows that throughout gametogenesis in Cerastoderma edule,

1182 approximately one-third of the oocyte volume was occupied by AO, representing a 33%

1183 instantaneous oocyte mortality. When expressed as the total proportion of oocytes whose

1184 fate is known (AO/healthy mature oocytes + AO or MAI), this source of oocyte mortality

1185 represents, on average, over 50%. In other words, what is normally considered ‘‘fecundity’’

1186 is overestimated by at least 30% to over 50%. To date, such mortality can only be detected

1187 using histology, a woefully under-used tool in marine ecology.

1188 The absence of macrophage invasion in or around the gonad acini in any of the

1189 slides examined indicates that the AO are not resorbed by Cerastoderma edule. Further

1190 studies are necessary to determine whether this represents an energy loss for this species

1191 or whether the AO serve some other function in reproduction. 82

1192 After the previously published work on the Manila clam Tapes philippinarum

1193 (Chérel and Beninger, 2017), the present study represents only the second attempt to

1194 quantify the impact of oocyte atresia on bivalve reproduction. In both species, it is clear

1195 that atresia can be a major cause of oocyte mortality. These results elucidate one of the

1196 major causes of the high levels of early life stage mortality in coastal bivalves, a universal

1197 phenomenon in both wild and cultured species. Should similar studies confirm the 30%–

1198 50% oocyte mortality level due to atresia, more realistic bivalve fecundity estimations will

1199 be possible. This source of oocyte mortality should be included in revised models of

1200 bivalve reproductive effort, population dynamics, and production.

1201

1202 III- 3 . 7 . ACKNOWLEDGMENTS

1203

1204 We thank David Berteau for making his cockle farm available for sampling.

83

1205 CONCLUSIONS ON OOCYTE

1206 ATRESIA IN COCKLE AND

1207 PERSPECTIVES

1208

1209 The study of female Cerastoderma edule gonads revealed the presence of atresic

1210 oocytes throughout the reproductive cycle and at all stages of gametogenesis. The

1211 histological characteristics and impact of oocyte atresia were determined. Oocyte atresia

1212 would result in approximately 50% reduction in the expected fecundity. These findings, as

1213 well as those made previously for the clam, underscore the necessity to modify our

1214 understanding of reproductive effort, bivalve’s gamete emission and fecundity. The

1215 histological observation of a mucus coat (=sheath) around the oocytes spurred an in-depth

1216 study of this character, in order to better understand its involvement in the reproductive

1217 cycle, and its possible link with oocyte atresia.

84

1218 COMPARAISON ENTRE LES

1219 DEUX ESPECES ETUDIEES

1220 COMPARISON BETWEEN THE TWO

1221 STUDIED SPECIES

1222

1223 Des techniques identiques ont été utilisée pour décrire et quantifier l’atrésie

1224 ovocytaire chez T. philippinarum et C. edule. Une comparaison de ce phénomène ainsi

1225 que de ses implications dans leur cycle reproducteur était alors possible pour ces deux

1226 espèces de bivalves, vivants dans un même milieu ; c’est le propos de cette partie.

1227

1228 III- 5 . 1 . LES ASPECTS HISTOLOGIQUES 1229 QUALITATIFS ET QUANTITATIFS

1230 QUALITATIVE AND QUANTITATIVE HISTOLOGICAL 1231 ASPECTS

1232 Caractéristiques histologiques qualitatives de l’atrésie ovocytaire 1233 Qualitative histological characteristics of oocyte atresia

1234 Au microscope optique, l’atrésie ovocytaire observée chez Tapes philippinarum et

1235 Cerastoderma edule se caractérise par :

1236 - une déformation de l’ovocyte qui prend une forme anguleuse plutôt qu’une forme

1237 globulaire caractéristique des ovocytes sains ; 85

1238 - une altération de la chromatine avec une homogénéisation de la coloration du

1239 nucléoplasme.

1240 Ces deux caractéristiques générales peuvent se retrouver ou non chez un même

1241 ovocyte. Également repérées chez d’autres bivalves, elles présentent néanmoins des

1242 aspects différents pour chaque espèce (Beninger 2017).

1243 Pour les deux espèces étudiées ici, l’atrésie se développe indépendamment d’un

1244 ovocyte à l’autre, et ce, tout au long de la période de reproduction, avant et après les

1245 pontes.

1246 Caractéristiques quantitatives de l’atrésie ovocytaire 1247 Quantitative characteristics of oocyte atresia

1248 La stéréologie est une méthode qui estime le volume occupé par un objet / élément

1249 dans un espace donné à partir d’une image en deux dimensions. Les principes de cette

1250 technique sont explicités par Weibel et al. (1966). Pour évaluer quantitativement

1251 l’importance de l’atrésie ovocytaire au sein des gonades, des comptages manuels par

1252 stéréologie ont été réalisés. Quatre indices ont été calculés à partir de ces

1253 comptages (Chérel and Beninger, 2017, 2019):

1254 - Atresic oocyte Volume Fraction (AVF)

1255 - Mature oocyte Volume Fraction (MVF)

1256 - Immature oocyte Volume Fraction (IFV)

1257 - Minimum Atresic Impact (MAI)

86

1258 Chez les deux espèces étudiées, l’atrésie ovocytaire était présente dès les

1259 premiers moments de l’ovogenèse et se poursuivait jusqu’à la fin de la période de

1260 résorption. Il a été décidé de cibler une période particulière de la gamétogenèse, nommée

1261 « gamétogenèse active », définie dans cette étude par une fraction volumique d’ovocytes

1262 matures (MVF) supérieure à 20% du volume total des ovocytes. Ce choix a été fait afin

1263 de s’affranchir des périodes de résorption (ovocytes majoritairement atresics et en cours

1264 de résorption), du tout début de la gamétogénèse (ovocytes majoritairement très jeunes

1265 au sort trop incertain), ainsi que de la phase de repos (gamétogénèse suspendue et

1266 aucuns ovocytes présents).

TABLE III-1. Tapes philippinarum and Cerastoderma edule. Mean indices during active gametogenesis at the farmed site.

AVF MVF IVF MAI N T. philippinarum 33.82 ± 0.98 34.64 ± 0.98 31.57 ± 1.27 49.16 ± 1.08 145

C. edule 31.94 ± 1.80 27.36 ± 1.04 40.70 ± 2.08 52.98 ± 1.87 98

±95% confidence interval 1267

1268 1269 La synchronicité interindividuelle du cycle de reproduction, observée pour la

1270 population de T. philippinarum étudiée, a permis de définir une période de gamétogenèse

1271 active commune à l’ensemble cette population. La moyenne des différents indices aux

1272 différentes dates a donc été calculée (cf. II-2). En revanche, la population de C. edule

1273 étudiée ne présentait pas une telle synchronicité. Pour permettre une comparaison facile

1274 et évidente entre T. philippinarum et C. edule, AVF, IVF, MVF et MAI ont été recalculés

1275 pour tous les individus ayant un MVF > 20%, quelle que soit leur date d’échantillonnage 87

1276 (Tableau III-1). Seuls les résultats du site conchylicole du Traict du Croisic sont présentés

1277 ici (données plus complètes et homogènes).

1278

1279 Chez les deux espèces, les ovocytes atrésiques représentent environ un tiers du

1280 volume ovocytaire total. La proportion d’ovocytes immatures est légèrement plus élevée

1281 pour la coque que pour la palourde. L’impact minimum de l’atrésie est comparable pour

1282 les deux espèces, autour de 50%.

1283 III- 5 . 2 . IMPACT SUR L’EFFORT DE 1284 REPRODUCTION

1285 IMPACT ON REPRODUCTIVE EFFORT

1286 Définir les termes « effort de reproduction » et « fécondité » est nécessaire car ils

1287 ne sont pas toujours utilisés pour désigner exactement la même choses, en fonction du

1288 contexte et des auteurs (Devauchelle, 2000). Les définitions suivantes ont été choisie

1289 pour leur précision, afin d’éviter toutes confusions.

1290 Effort de reproduction (Re) : il s’agit de l’énergie investie dans la gamétogénèse.

1291 L’effort de reproduction s’approxime comme étant le total du volume/masse des gamètes

1292 présents dans la gonade. L’effort de reproduction est donc intimement lié à l’intensité de

1293 la gamétogenèse. Re correspond à 100% du volume/masse des ovocytes dans un

1294 individus femelle.

88

1295 Fécondité : Nombre de gamètes émis. La fécondité réalisée (Freal) est le nombre de

1296 gamètes viables émis. La fécondité dépend de l’effort de reproduction, mais cette relation

1297 n’est pas nécessairement proportionnelle.

1298 Effort de reproduction effectif 1299 Effective reproduction effort

1300 L’effort de reproduction effectif (ERe) est défini comme le pourcentage de l’effort de

1301 reproduction (Re) représenté par des ovocytes non atrésiques et donc, à priori, viables.

1302 L’effort de reproduction peut être estimé à l’aide de plusieurs outils chez les bivalves :

1303 - L’indice gonado-somatique. Cet indice consiste à comparer la masse de la

1304 gonade par rapport au reste du corps de l’animal. Pour appliquer cet indice il faut

1305 pouvoir dissocier avec précision la gonade du reste du corps. Cette opération est

1306 impossible pour la plupart des bivalves dont la coque et la palourde. En revanche

1307 c’est possible pour la majorité des Pectinidés.

1308 - L’indice de condition est l’un des outils les plus utilisés pour estimer l’avancée et

1309 l’importance de la gamétogenèse et par extension l’effort de reproduction (Lucas

1310 and Beninger, 1985; Bodoy et al., 1986; Guillou and Tartu, 1992). Il consiste à

1311 faire le rapport entre le poids de la coquille et le poids de chair de l’animal.

1312 L’utilisation des poids secs est plus le rependus car cela permet de s’affranchir

1313 des fluctuations des teneurs en eau dans les tissus (Lucas and Beninger, 1985).

1314

89

1315 Deux types d’efforts de reproduction effectifs ERe peuvent être calculés à partir de

1316 l’effort de reproduction Re et des indices AVF (fraction volumiques des ovocytes

1317 atrésiques) et MAI (impact minimum de l’atrésie ovocytaire), définis dans les études

1318 précédentes (Chérel and Beninger, 2017, 2019) :

1319 A un instant t, pour une ou plusieurs femelles, l’effort de reproduction effectif

1320 instantanée se calcul ainsi :

1321 ERe-i = Re – AVF

1322 En considérant l’estimation du volume global d’ovocytes perdu à cause de l’atrésie

1323 au cours de la période de reproduction, fournie par le MAI, alors l’effort de reproduction

1324 effectif global se calcul ainsi :

1325 ERe-g = Re – MAI

1326

1327 TABLE III-2. Percentage of estimated reproductive effort (Re) 1328 actually instant effective (ERe-i) and global effective (ERe-g).

1329 ERe-i ERe-g N T. philippinarum 65.36 % 50.84 % 145 1330 C. edule 68.30 % 47.02 % 98 1331

1332 La fraction volumique des ovocytes atrésiques (AVF) est similaire chez la coque

1333 et la palourde, environ 30% du volume ovocytaire total en moyenne. L’impact atrésique

1334 minimum (MAI) est également similaire, autour de 50%. Les efforts de reproduction (Re)

1335 habituellement calculés, estimés, pour ces deux espèces ne représentent donc pas l’effort

90

1336 de reproduction effectif (ERe) c’est-à-dire la quantité réelle d’ovocytes aptes à la

1337 fécondation et à l’obtention d’une larve.

1338 Le Tableau III-2 présente le pourcentage de l’effort de reproduction (estimé avec

1339 les seules méthodes usuelles comme l’IC) réellement effectif à un instant donné (ERe-i)

1340 ou bien de façon globale (ERe-g). L’effort de reproduction effectif global ne représente

1341 qu’environ 50% de l’effort de reproduction aussi bien pour la palourde que pour la coque.

1342

1343 Mise en application chez Tapes philippinarum 1344 Application to Tapes philippinarum

1345 Afin de calculer l’indice de condition (IC), 18 palourdes ont été prélevées pour

1346 chaque date d’échantillonnage sur le site conchylicole du Croisic. La chair de chaque

1347 individu a été séparée de la coquille. Les deux éléments ont été mis dans une étuve à

1348 60°C, pendant 24 h au minimum. Le rapport entre la masse de chair sèche et le masse

1349 de la coquille sèche a été calculé pour chaque individu.

Masse sèche chaire 1350 IC = * 100 Masse sèche coquille

1351 La moyenne des IC pour tous les individus d’une même date a été calculée. L’IC

1352 est présenté sur la Figure III-10 associé aux résultats du sex-ratio (cf. II-2.1). On observe

1353 des variations de l’IC au cours du temps. De façon générale l’indice de condition est bas

1354 entre la fin de l’automne et le début du printemps (≈ 4). Il augmente fortement au cours

91

1355 des mois de mai et juin pour atteindre un maximum au cœur de l’été (≈ 10). Il diminue au

1356 cours de la fin de l’été et de l’automne.

1357 Les prélèvements ont été réalisés sur un site conchylicole du Traict du Croisic, sur

1358 une même parcelle. Les pratiques culturales de la vénériculture et de la conchyliculture

1359 veulent qu’une seule cohorte soit présente sur les parcelles (communication personnelle

1360 Pascal Chellet). La taille (longueur en cm dans l’axe antéro-postérieur) et la masse (en

1361 grammes) des coquilles augmentaient donc globalement au cours de la période

1362 d’échantillonnage du fait de la croissance naturelle des individus (Fig. III-11). Plusieurs

1363 irrégularités sont néanmoins à noter dans les courbes :

1364 - une augmentation rapide des courbes en juillet qui traduit une croissance

1365 coquillère rapide. Elle correspond à la période d’abondance de nourriture dans le

1366 milieu ;

1367 - une diminution nette en août – septembre, résultat de la récolte principale des

1368 individus qui ont atteint leur taille commerciale. Une autre récolte est souvent

1369 opérée en hiver pour répondre à la demande des fêtes de fin d’année.

1370 Les variations de l’IC des palourdes ne sont pas corrélées aux variations de la

1371 croissance coquillère. L’IC est donc très majoritairement dépendant de la variation de la

1372 masse de chaire. L’augmentation de l’IC est très souvent associée à la gamétogenèse

1373 (Lucas and Beninger, 1985). Cette hypothèse est compatible avec les différentes

1374 observations réalisées chez T. philippinarum, résumées dans le Tableau III-3.

1375

92

1376

100% 14

90% 12 80%

70% 10

60%

8 ratio

- 50% 6

Sex 40%

30% 4 index Condition 20% 2 10%

0% 0

2-Jul 6-Jul

5-Oct 5-Oct

8-Apr

2-Jun 3-Jun

3-Dec 7-Nov

21-Jul 31-Jul 19-Jul 26-Jul

6-May

30-Apr 29-Oct 11-Apr 22-Apr 19-Oct

17-Jun 12-Jan 20-Jun

10-Feb 23-Mar 10-Mar 25-Mar

19-Dec 17-Aug 31-Aug 17-Aug 31-Aug 15-Sep 28-Nov

11-May 23-May 2015 2016 Sampling dates

Male Undefined Female Condition Index

Figure III-10. Tapes philippinarum. Percentage of male, female, and undefined gender clams from

samples on clam-cockle farmed site (n= 23 for each date), and condition index (n = 18) during the

year 2018. Error bars represent standard deviation

93

16 5

14 4 12

10 3 8 2 weight (g) weight 6

4 (cm) size 1 Shell weight 2 Shell size

0 0

2-Jul 6-Jul

8-Apr 5-Oct 5-Oct

2-Jun 3-Jun

3-Dec 7-Nov

21-Jul 31-Jul 19-Jul 26-Jul

6-May

30-Apr 29-Oct 11-Apr 22-Apr 19-Oct

17-Jun 12-Jan 20-Jun

10-Mar 23-Mar 10-Feb 25-Mar

31-Aug 17-Aug 17-Aug 31-Aug 15-Sep 28-Nov 19-Dec

11-May 23-May 2015 2016 Sampling dates

Figure III-11. Shell weight and size of T. philippinarum individuals sampled at the farmed site, Croisic Traict. For each date N = 18. Error bars represent standard deviation

TABLE III-3. Tapes philippinarum. Summary of observations made using various methods over the seasons 2015 and 2016.

Seasons Spring Summer Autumn Winter Tools Condition Marked Maximal Decrease more Minimal index increase or less quickly (Fig. III-10) Sex-ratio Increase in All individuals Decrease in Almost no (Fig. III-10) individuals with had gametes individuals with individuals had gametes gametes gametes

Histology and Gametogenesis Active Resorption Resting phase stereology gametogenesis (Table II-1 and IVF +++ MVF > 20 % AVF +++ Fig. II-12)

94

1377 Les conclusions issues des études histologiques et stéréologiques ainsi que du

1378 sex-ratio valident l’hypothèse selon laquelle les variations de l’IC sont corrélées à la

1379 l’intensité de la gamétogenèse chez T. philippinarum. En effet l’augmentation printanière

1380 de l’IC est à mettre en relation avec le nombre croissant d’individus possédant des

1381 gamètes, ainsi qu’avec la forte proportion d’ovocytes immatures. En été, l’IC était

1382 maximal, tous les individus étaient en gamétogenèse active. En automne, les individus

1383 étaient en phase de résorption avec une forte prévalence des ovocytes atrésiques.

1384 Certains individus étaient déjà en phase de repos. En hiver, tous les individus étaient en

1385 phase de repos, ne possédant aucun gamète.

1386 Les tissus composant la chair de palourde (tissus mous), doivent posséder des

1387 masses volumiques très similaires. Un même pourcentage de masse ou de volume

1388 représente donc la même quantité de tissu. Ce postulat permet le développement qui suit.

1389 Au regard des conclusions précédentes et des résultats de l’IC, on peut estimer qu’au

1390 moins la moitié de la masse de chair chez les palourdes est constituée de gonade en été

1391 (IC = 4 en hiver, IC = 10 en été). En moyenne 58,9 % du volume des acini étaient occupés

1392 par des ovocytes au cours des mois d’été (moyenne réalisée sur les individus prélevés

1393 en juin, juillet et août 2015 et 2016). Nous pouvons donc déduire qu’environ 30 % de la

1394 masse/volume de chair de palourde était composé d’ovocytes en été ce qui représente

1395 l’effort de reproduction (Re). Grâce au MAI, il a été estimé que l’effort de reproduction

1396 effectif global (ERe-g) ne représente qu’environ 50% de l’effort de reproduction estimé

1397 précédemment (Tableau III-2), c’est-à-dire 15% de la masse/volume de chair de palourde.

95

1398 La répartition des différents tissus chez les palourdes en été est représentée dans la

1399 Figure III-12.

Non Gonadal tissues gonadal Acinal Oocytes = Reproductive 14.97 % tissues lumen effort (Re)

Healthy oocytes Oocytes

14.45% 50.00 = Global lost to % Effective atresia = Reproductive MAI 20.55 % Effort (ERe-g)

Figure III-12. Tapes philippinarum. Distribution of the various soft tissues in summer

1400 La masse de chair sèche des palourdes prélevées sur les mois d’été 2015 et 2016 au

1401 Croisic était de 719 mg en moyenne. Si l’on extrapole au pourcentage ci-dessus, cela

1402 signifierait que seul 104 mg de chair sèche, en moyenne, seraient utiles à la reproduction

1403 chez une palourde, et presque autant ne serait ni voué à la reproduction ni à la croissance.

96

1404 Mise en application chez Cerastoderma edule 1405 Application to Cerastoderma edule

1406 L’IC a été calculé pour la coque, en suivant le même protocole que pour la

1407 palourde. Dans ce but, 20 coques ont été prélevées toutes les deux semaines sur le site

1408 conchylicole du Croisic au cours de l’année 2018. L’IC est présenté sur la Figure III-13,

1409 associé au sex-ratio réalisé sur les mêmes dates (cf. III-2.1.).

100% 20 90% 18 80% 16 70% 14

60% 12 ratio

- 50% 10

40% 8 Sex

30% 6 Condition Index Condition 20% 4 10% 2

0% 0

3-Apr 1-Oct

5-Mar

8-Feb

7-Sep

11-Jul 25-Jul

16-Apr 30-Apr 15-Oct 29-Oct

22-Jan 13-Jun 25-Jun

22-Feb 19-Mar

12-Nov 26-Nov

10-Aug 23-Aug 21-Sep

14-May 28-May 2018 Sampling Dates

Male Undefined Female Condition Index Figure III-13. Cerastoderma edule. Percentage of male, female, and undefined gender cockles from sample on clam-cockle farmed site (n= 25 for each date), and condition index (n = 20) during the year 2018. Error bars represent standard deviation.

1410 L’IC varie au cours du temps, de façon générale il est bas en hiver et jusqu’au

1411 milieu du printemps (≈ 6). Il augmente fortement au cours des mois de mai, juin et juillet 97

1412 pour atteindre un maximum (≈ 14) au cœur de l’été. Il diminue lentement à la fin de l’été

1413 et en automne.

1414 Pour les mêmes raisons qu’évoquées précédemment pour la palourde, la taille et

1415 la masse des coquilles augmentaient globalement au cours de la période

1416 d’échantillonnage. Les mêmes irrégularités dans les courbes étaient présentes à la

1417 différence près qu’elles ont été observées deux mois avant celles de la palourde (Fig. III-

1418 14).

1419 Le tableau III-4 résume les observations réalisées à l’aide de différents outils au

1420 cours de cette année d’échantillonnage.

TABLE III-4. Cerastoderma edule. Summary of observations made using various methods over the year 2018. Seasons Winter and Late spring Summer Autumn

early spring Tools Condition Minimal Increase Peaks then slow Slow decrease index decrease (Fig. III-13) Sex-ratio Almost all Almost all Decrease in Almost all (Fig.III-13) individuals had individuals had individuals with individuals had gametes gametes gametes gametes

Histology Gametogenesis Gametogenesis Gametogenesis Gametogenesis and or resting phase stereology (Fig. III-9) IVF - ; AVF+ IVF + ; MVF - MVF + ; IVF + IVF ++

1421

1422 Les variations de l’IC des coques, comme pour la palourde, ne sont pas corrélées

1423 aux variations de la croissance coquillère. L’IC est donc ici aussi très majoritairement

1424 dépendant de la variation de la masse de chair. 98

6 3,5

5 3 2,5 4 2 3 1,5

weight (g) weight 2 1 Shell weight 1 0,5 (cm) size Shell size

0 0

3-Apr 1-Oct

8-Feb 5-Mar

2-Aug 7-Sep

11-Jul 25-Jul

16-Apr 30-Apr 15-Oct 29-Oct

22-Jan 13-Jun 25-Jun

19-Mar

22-Feb

23-Aug 21-Sep 12-Nov 26-Nov

14-May 28-May 2018 Sampling dates Figure III-14. Shell weight and size of C. edule individuals sampled at the farmed site, Croisic Traict. For each date N = 20. Error bars represent standard deviation.

1425

1426 Les conclusions issues de l’étude histologique, stéréologique et du sex-ratio montrent

1427 que l’IC chez la coque n’est pas corrélé à l’importance de la gamétogenèse. En effet, alors

1428 que l’IC est maximal en été, le nombre d’individus en gamétogenèse est faible et le

1429 nombre d’individus sans gamète, c’est-à-dire en phase de repos, est maximal. Pour les

1430 individus ayant des gamètes, les proportions d’AVF, MVF et IVF étaient similaire à ce qui

1431 pouvaient être observé chez les individus en gamétogénèse le reste de l’année (Fig III-

1432 9). A contrario, en hiver, l’IC est faible alors que tous les individus possèdent des gamètes.

1433 Chez Cerastoderma edule, l’IC n’était pas corrélé à la gamétogenèse sur le site et la

1434 période étudiés. Dans ce cas, il est possible de conclure en disant que l‘IC n’est pas du

1435 tout un bon outil pour évaluer l’effort de reproduction chez la coque.

99

1436 Comme l’IC n’est pas corrélé à la taille de la coquille, comme dit précédemment, ni à

1437 la présence de gamètes, alors il est dépendant du reste du volume de chair. Les variations

1438 de l’IC suivent l’évolution des conditions du milieu, augmentant en même temps que la

1439 disponibilité en nourriture dans le milieu. Au printemps, il augmente de la même façon

1440 que la température et la présence de phytoplancton et reste très haut en été. Il diminue

1441 ensuite jusqu’à son minimum hivernal.

1442 Une hypothèse serait que les coques utilisent les ressources disponibles au printemps

1443 et en été pour constituer des réserves énergétiques au détriment de la gamétogenèse.

1444 Ces réserves seraient consommées en automne et en hiver pour la survie mais également

1445 pour la gamétogenèse.

1446 Les avantages d’une gamétogenèse hivernale seraient multiples :

1447 - éviter la compétition trophique interspécifique des larves. Cette compétition est

1448 accrue sur le site d’étude, au vu de la densité très importante de coques et de

1449 palourdes présentes ;

1450 - limiter la perte des gamètes causée par des parasites. Les parasites, notamment

1451 les trématodes, sont très présents chez la coque au printemps et en été, et peuvent

1452 se développer dans la gonade, très probablement en se nourrissant des gamètes

1453 (Fig. III-15).

1454 La production de larves en hiver pose néanmoins la question de leur alimentation.

1455 Nous verrons dans le chapitre suivant que les ovocytes de coques sont protégés par une

1456 gangue muqueuse, dans laquelle la larve se développe jusqu’au stade véligère. Il est

100

1457 possible que la larve se nourrisse de sa gangue ou bien soit autotrophe jusqu’au stade

1458 pédivéligère. A B

T

G

T

100 µm 50 µm

C Figure III-15. Parasites found in C. edule. A, micrograph of female gonad invaded by digenean trematodes (T), reducing the place for gonade (G) development. B and C, in vivo micrograph, stained with Neutral Red, two species of digenean trematode parasites found in cockles, B, Meiogymnophallus sp. is 50 µm more often found in cockle than C, Bucephalus minimus. 1459 Il est intéressant de noter que d’autres auteurs ont observé une corrélation entre l’IC

1460 et la gamétogenèse chez la coque (Hancock and Franklin, 1972; Guillou et al., 1990;

1461 Guillou and Tartu, 1992). Une étude à plus long terme ainsi que sur d’autres sites

1462 pourraient permettre de comprendre s’il s’agit d’une observation ponctuelle ou bien d’une

1463 observation durable dans le temps et l’espace. Si c’est le cas, les raisons d’un tel

1464 bouleversement (càd, l’IC non corrélé à la gamétogénèse) seront à étudier.

1465

101

1466 III- 5 . 3 . CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 1467 RELATIVES AUX DEUX ESPECES ETUDIEES

1468 CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES ON THE TWO 1469 SPECIES STUDIED

1470

1471 The characteristics of the atresic oocytes, described in detail, are similar between

1472 the two species, but also with other bivalve species (Beninger 2017). This finding

1473 reasonably suggests that the phenomenon of atresia of female gametes prior to spawning

1474 is common to all bivalves, although interspecific differences remain.

1475 Through the use of stereology on female gonads of T. philippinarum and C. edule

1476 and indices created for this purpose, it was demonstrated that oocyte atresia resulted in

1477 a reduction of at least 50% of the reproductive effort estimated by usual methods such as

1478 the condition index. It was noted in the cockle that the condition index did not correlate

1479 with periods when gametogenesis was most prevalent in the individuals of the studied

1480 population. These two conclusions lead to reconsider the use of the condition index as a

1481 direct indicator of gametogenesis in bivalves in a systematic way.

1482 In order to better understand the intracellular mechanisms involved in oocyte

1483 atresia and which would be responsible for the histological observations, a preliminary

1484 study was carried out by transmission electron microscopy on female clam and cockle

1485 gonads.

102

103

ULTRASTRUCTURE DES

OVOCYTES DE COQUES

ET DE PALOURDES

ULTRASTRUCTURE OF COCKLE AND CLAM OOCYTES

104

105

1486 RESUME ET CONTEXTE

1487 ABSTRACT AND CONTEXT

1488 Les études en histologie ont donné des caractéristiques globales de l’atrésie

1489 ovocytaire, ainsi que certains indices sur son déroulement cytologique. Ces techniques

1490 ont permis une bonne vision d’ensemble sur le processus au sein d’un acinus, d’une

1491 gonade, d’un individu et même d’une population. Cependant, beaucoup de questions

1492 restaient sans réponses avec l’utilisation de la seule microscopie optique. En dehors du

1493 noyau, le devenir de tous les autres organites restait impossible à déterminer sans la

1494 microscopie électronique à transmission (MET).

1495 Remarque :

1496 La MET est beaucoup plus technique, chronophage et couteuse que la microscopie

1497 optique. Le matériel nécessaire, ainsi que les personnes compétentes pour apporter leur

1498 aide technique ne se trouvaient pas sur le lieu de la thèse. Beaucoup d’allers-retours entre

1499 le Croisic (lieu de prélèvement), Nantes (lieu de la thèse), la Tremblade (IFREMER,

1500 ultramicrotome et MET), Lorient (ultramicrotome) et Brest (MET) ont été nécessaires.

1501 Certaines manipulations/observations ont également dû être repoussées à cause de la

1502 défaillance du matériel ou de l’impossibilité de se déplacer (manifestations, confinement).

1503 Dans ce chapitre, l’ultrastructure des ovocytes sains et atrésiques a été comparée,

1504 pour les deux espèces étudiées.

106

1505 Plusieurs éléments ont pu être signalés comme indicateurs de l’atrésie ovocytaire.

1506 Chez les deux espèces l’oolemme (membrane ovocytaire) se détériorait ; les

1507 microvillosités la composant pouvaient disparaitre. Finalement la rupture de l’oolemme

1508 libérait le contenu cytoplasmique qui se retrouvait presque intact dans la lumière acinale.

1509 Le rôle dans la reproduction de ces débris d’ovocytes atrésiques est discuté dans le

1510 Chapitre V.

1511 Certains changements ont été remarqués dans le contenu ooplasmique. Les

1512 granules corticaux sous-membranaire des ovocytes de palourde avaient disparu de

1513 l’ooplasme des ovocytes atrésiques. Ces granules ne sont pas présents dans les ovocytes

1514 de la coque. Des myelin-like figures étaient également visibles dans l’ooplasme de

1515 certains ovocytes atrésiques. De nombreux auteurs parlent de la dégénérescence des

1516 vésicules de vitellus ainsi que de l’apparitions de phagolysosomes dans l’ooplamse des

1517 ovocytes en dégénérescence, notamment chez la palourde japonaise. Ces éléments n’ont

1518 pas été formellement identifiées au cours de cette étude. Il est très probable qu’un nombre

1519 plus important de photos aurait permis de les identifier chez la palourde et peut-être

1520 également chez la coque.

1521 Ces avancées dans la compréhension du processus atrésique, sur sa nature, mais

1522 aussi et surtout sur le devenir des ovocytes atrésiques, apportées par la MET devraient

1523 être enrichies par des observations plus nombreuses. Ce chapitre est donc un préambule

1524 aux travaux de recherches dans ce domaine.

107

1525 INTRODUCTION

1526 INTRODUCTION

1527 Oocyte atresia is a common phenomenon in bivalves but surprisingly not well

1528 known. Very few quantifications or even precise descriptions have been made before the

1529 studies of Beninger (2017) and Chérel et Beninger (2017, 2019). Indeed, this

1530 phenomenon was of very little interest because its observation had only been carried out

1531 after the gamete emissions (resorption phase), thus outside the optimal reproduction

1532 period or under very unfavorable environmental conditions (destruction of all the gametes

1533 simultaneously). In both cases, the atresic gametes would not have been able to

1534 participate in the formation of viable larvae. Our previous studies have revealed the

1535 existence of oocyte atresia in the female gonads of bivalves before spawning (cf. Chapters

1536 II and III).

1537 After the first description using histological tools (Chérel and Beninger, 2019), an

1538 understanding of the ultrastructural processes leading to oocyte atresia was necessary.

1539 Several previous authors have carried out electron microscopic work to describe

1540 oogenesis in some bivalve species, including their degeneration (Pipe, 1987a; Dorange

1541 and Le Pennec, 1989; De Gaulejac et al., 1995; Eckelbarger and Davis, 1996; Chung,

1542 2007, 2008; Chung et al., 2007, 2008; Lee and Chung, 2008; Erkan, 2009; Kim and

1543 Chung, 2014; Kim et al., 2014; Camacho-Mondragón et al., 2015, 2019; Kim, 2016 and

1544 other). A transmission electron microscopy study was therefore carried out in C. edule

1545 and T. philippinarum in order to complete the study of oocyte atresia in these species. 108

1546 MATERIELS ET METHODES MATERIALS AND METHODS

1547 Des spécimens de Cerastoderma edule et de Tapes philippinarum ont été collectés

1548 au Traict Croisic, un site de culture de coques et de palourdes sur la côte atlantique

1549 française. Plusieurs campagnes d'échantillonnage ont été menées entre le printemps

1550 2018 et l'été 2019.

1551 Les observations histologiques précédentes ont indiqué que les acini gonadiques

1552 étaient plus susceptibles d'être trouvés dans la région dorsale de la masse viscérale chez

1553 les deux espèces étudiées. Dans cette région, trois morceaux de tissus d'environ 1x1x3

1554 mm chacun ont été prélevés. Avant de procéder aux étapes de traitement suivantes, la

1555 présence d'ovocytes a été vérifiée au microscope à dissection. Les échantillons ont été

1556 fixées dans du glutaraldéhyde froid à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,2

1557 M (fabriqué avec de l'eau de mer filtrée provenant des sites de prélèvement pour garantir

1558 un une osmolarité et un pH (=7,4) appropriés), pendant au moins 2 heures. Après rinçage

1559 dans le tampon de cacodylate 0,2 M, les échantillons ont été coupées pour obtenir des

1560 cubes de 1 mm3. La post-fixation a été effectuée dans un tampon de cacodylate 0,2 M /

1561 1% de tétraoxyde d'osmium à 4°C pendant 1h. Les morceaux de tissus ont ensuite été

1562 déshydratés dans un bain d'éthanol et d'oxyde de propylène (2 x 15mn) puis transférés

1563 dans une résine EPON/oxyde de propylène (1:1) à température ambiante, pendant 1h30.

1564 Après l'enrobage dans de la résine pure pendant 1h, la polymérisation a été effectuée à

1565 60°C pendant 12h.

109

1566 Des coupes ultrafines de 80-90nm ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome

1567 LEICA EMUC7. Collectées sur des grilles de cuivre/rhodium non revêtues de 300 mesh

1568 (MAXTAFORM HR25), contrastées avec de l'acétate d'uranyle (Bozzola and Russel,

1569 1992), les coupes on été examinées à l'aide d'un microscope électronique à transmission

1570 (TEM) JEOL JEM-1400.

1571 Des coupes semi-fines de 1µm ont été réalisées avec le même ultramicrotome et

1572 colorées au bleu de Toluidine pour une observation au microscope optique.

1573 RESULTATS

1574 RESULTS

1575 IV- 4 . 1 . CARACTERISTIQUES 1576 ULTRASTRUCTURALES DES OVOCYTES SAINS

1577 ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF 1578 HEALTHY OOCYTES

1579 Au microscope électronique à transmission (MET), les ovocytes sains et matures

1580 des coques et des palourdes présentaient des caractéristiques communes. Les ovocytes

1581 matures étaient de très grosses cellules, d’environ 70µm de diamètre, très difficiles à voir

1582 en entier du fait du maillage des grilles. Le noyau avait une forme ronde, une taille de

1583 25 µm de diamètre environ et possédait une chromatine homogène, (Fig. IV-1 A et B). En

1584 fonction du plan de coupe, un nucléole pouvait être visible. L’oolemme était composé de

1585 nombreuses microvillosités qui se développent au cours de la vitellogenèse, mieux

110

1586 dessinées et plus grandes chez la palourde que chez la coque (Figs IV-1 et IV-2 A). Chez

1587 les deux espèces, l’ooplasme contenait des granules de vitellus, des gouttelettes

1588 lipidiques ainsi que des mitochondries. Les mitochondries des palourdes, peu

1589 nombreuses chez les ovocytes matures, avaient une forme beaucoup plus classique que

1590 les mitochondries des coques. Les mitochondries des coques, plus nombreuses,

1591 présentaient une forme en nid d’abeille, cet aspect était commun à toutes les

A OD B OM C

N OP

C OD OM OP N

5 µm 5 µm

C MI D CG YG MV LD M MI

M 1 µm YG 2 µm

Figure IV-1 . Transmission electron micrographs of Tapes philippinarum and Cerastoderma edule oocytes. A, Tapes philippinarum and B Cerastoderma edule mature oocyte. Note round nucleus (N), thinner coat of mucous (C) around clam oolemma (OM) than around cockle oolemma, and presence of oocyte debris (OD) close to the coat. C, T. philippinarum and D, C. edule ooplasm (OP), containing yolk granules (YG) and lipid droplets (LD). Cortical granules (CG) were visible only under microvilli (MI) of clam oolemma while clear mucus vesicles (MV) and exocytosis shapes (bold arrows) were present only in cockle ooplasm. M, mitochondria.

111

1592 mitochondries observées, et n’était donc pas un signe de dégénérescence. (Fig. IV-1 C

1593 et D).

1594 Une fine couche de mucus était présente autour des ovocytes de palourde. En

1595 revanche, les ovocytes de coques présentaient une gangue de mucus complexe formée

1596 de plusieurs couches (cf. Chapitre V ; Fig. IV-1). L’origine, la structure et la fonction de ce

1597 mucus seront décrites en détail dans le Chapitre V. Néanmoins il est important de préciser

1598 dès maintenant que l’ovocyte lui-même produisait ce mucus par exocytose de vésicules

1599 claires aux électrons. Dans l’ooplasme des ovocytes matures de coque, ces vésicules

1600 ainsi que des signes d’exocytose à la base des microvillosités étaient visibles (cf. Chapitre

1601 V , Fig. IV-5 D). Dans l’ooplasme des ovocytes matures de palourdes, ces vésicules de

1602 mucus n’ont pas été observées (Fig. IV-5 C). Des granules corticaux de forme oblongue

1603 furent en revanche observés en contact avec les microvillosités de l’oolemme. Sur des

A CG B CG

N MI CG

CG NU

OP OP 50 nm CG 10 µm

Figure IV-2. Tapes philippinarum. A, Transmission electron micrographs of cortical granules (CG) close to microvilli (MI) of oolemma. B, thin section of oocyte stained with Toluidine blue. Note cortical granules stained in deep blue, peripheral to the oocyte. N, nucleus, NU, nucleolus, OP, ooplasm 112

1604 coupes semi-fines colorées au bleu de toluidine, ces granules apparaissaient bleus très

1605 foncé (Fig. IV-2 B) ; ils n’ont pas été observés chez la coque.

1606 IV- 4 . 2 . CARACTERISTIQUES 1607 ULTRASTUCTURALES DES OVOCYTES ATRESIQUES

1608 ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF 1609 ATRESIC OOCYTES

1610 L’ooplasme des ovocytes atrésiques présentait de très nombreuses vacuoles

1611 claires aux électrons, probablement issues de l’altération du réticulum endoplasmique

1612 (Figs. IV-3 A et IV-4 A). Chez la palourde, les granules corticaux n’étaient plus observés

1613 dans les ovocytes atrésiques (Fig. IV-4 A). Les microvillosités se réduisaient, se

1614 détérioraient, jusqu’à disparaître totalement, ainsi l’oolemme dégradé chez les ovocytes

1615 atrésiques de coque et de palourde finissait par se rompre (Figs. IV-3 A et IV-4 A). La

1616 libération du contenu ooplasmique dans la lumière acinale, résultant de la rupture de

1617 l’oolemme, a été observée chez la palourde (Fig. IV-4 B). L’observation de débris

1618 ovocytaires libres dans la lumière acinale aussi bien chez la palourde que chez la coque

1619 laissait supposer que ce processus existe également chez la coque, bien que cela n’a

1620 pas été observé (Figs. IV-1 A, B et IV-3 A).

1621 Chez la coque, une réduction de l’épaisseur de la gangue muqueuse a été

1622 remarquée autour des ovocytes atrésiques par rapport aux ovocytes sains (cf. Chapitre

1623 V). Des myelin-like figures (Fig. IV-3 B) ainsi qu’une dégradation de la chromatine

1624 nucléaire (Fig. IV-3 A) étaient visibles dans certains ovocytes atrésiques de C. edule.

113

A B

C M OP

OD N OM

2 µm 0.2 µm

Figure IV-3. Transmission electron micrographs of atresic oocytes of Cerastoderma edule. A, Atresic oocyte showing chromatin degradation in nucleus (N), vacuolation of the ooplasm (C), poorly - visible oolemma (OM) without microvilli, a thin one - layer coat (C). OD, oocyte debris, M, mitochondria. B, Myelin-like figure.

A B OM OM MLF

OP OP N 2 µm 2 µm

Figure IV-4. Transmission electron micrographs of Tapes philippinarum atresic oocytes. A, atresic oocyte showing vacuolation of the ooplasm (OP), myelin-like figures (MLF), and an oolemma (OM) with small microvilli, in the process of degradation. N, nucleus. B, The oolemma is ruptured, allowing ooplasmic contents to escape (C). 114

1625 Des coupes semi-fines de T. philippinarum ont permis de confirmer la dégradation

1626 et la disparition de la membrane ovocytaire chez les ovocytes atrésiques ainsi que

1627 l’absence de granules corticaux (Fig IV-5).

1628

AO OM CG

N AO N MO

20 µm

Figure IV-5. Tapes philippinarum. Semi-thin section stained with Toluidine blue showing healthy mature (MO) and atresic oocytes (AO). Note disappearance of cortical granules (CG) beneath oolemma (OM) of AO, ooplasm detachment from oolemma (bold arrow) and rupture of oolemma in AO (white arrows).

115

1629 DISCUSSION

1630 DISCUSSION

1631 Les caractéristiques ultrastructurales de l’atrésie ovocytaire chez la coque et la

1632 palourde étaient en plusieurs points semblables à ce qui avait été décrit chez d’autres

1633 espèces de bivalves. Dans la majorité des publications, les termes de dégénération ou

1634 dégénérescence ovocytaire étaient utilisés, au lieu du terme atrésie ovocytaire.

1635 Réticulum endoplasmique et mitochondries 1636 Endoplasmic reticulum and mitochondria

1637 La dégradation du réticulum endoplasmique à l’origine de la vacuolisation du

1638 cytoplasme a été signalée pour plusieurs espèces de bivalves, Mytilus edulis (Pipe,

1639 1987a), Pecten maximus (Dorange and Le Pennec, 1989), Spondylus limbatus

1640 (Camacho-Mondragón et al., 2019), Atrina maura (Camacho-Mondragón et al., 2015),

1641 Meretrix lusoria (Chung, 2007, p 200), Chlamys farreri farreri (Chung, 2008), Cyclina

1642 sinensis (Chung et al., 2007), Sinonovacula constricta (Chung et al., 2008), Pinna nobilis

1643 (De Gaulejac et al., 1995), Mactra chinensis (Kim et al., 2014) tout comme chez la

1644 palourde japonaise Tapes (=Ruditapes) philippinarum (Lee and Chung, 2008) et chez la

1645 coque commune Cerastoderma edule (présente étude). Un réticulum endoplasmique

1646 distendu était souvent le premier signe de dégénérescence remarqué par les auteurs de

1647 ces études. Le nombre limité d’électromicrographies réunies pour cette étude ne

1648 permettait pas de soutenir ni de contredire cette observation. Pour les mêmes raisons, la

116

1649 dégénérescence des mitochondries souvent signalée, n’a pas pu être confirmée chez la

1650 palourde. Chez Cerastoderma edule des mitochondries avaient le même aspect dans les

1651 ovocytes sains que dans les ovocytes atrésiques, ou dans les débris ovocytaires. La

1652 dégénérescence des mitochondries n’était donc pas un indice probant de l’atrésie

1653 ovocytaire chez la coque.

1654 Myelin-like figures 1655 Myelin-like figures

1656 Des myelin-like figures ont été observées dans les ovocytes des deux espèces

1657 étudiées. Ces structures particulières ont également été recensées chez Atrina maura

1658 (Camacho-Mondragón et al., 2015), Mactra chinensis (Kim et al., 2014), Coecella sinensis

1659 (Kim and Chung, 2014) et chez la palourde japonaise Tapes (=Ruditapes) philippinarum

1660 (Lee and Chung, 2008). L’apparition des myelin-like figures était donc un signe probant

1661 de l’atrésie des ovocytes.

1662 Granules corticaux 1663 Cortical granules

1664 Les granules corticaux, présents en grande quantité sous l’oolemme des ovocytes

1665 matures sains de palourdes, n’étaient plus visibles chez les ovocytes atrésiques, que ce

1666 soit en MET ou bien sur les coupes semi-fines colorées au bleu de toluidine. La disparition

1667 de ces granules n’a été relevée que chez une seule espèce jusqu’alors, Pecten maximus

1668 (Dorange and Le Pennec, 1989). Il a été noté chez l’huître perlière Pinctada margaritifera

1669 (Thielley, 1993), la moule Mytilus edulis (Albertini, 1985), et chez Pecten maximus

117

1670 (Dorange, 1989) que le déversement du contenu des granules corticaux dans l’espace

1671 périvitellin était probablement à l’origine de sa dégradation au cours de la

1672 dégénérescence.

1673 Il est bien évident que l’absence des granules corticaux comme indice de l’atrésie

1674 ovocytaire dépendait de leur présence préalable, ce qui n’était pas le cas chez la coque.

1675 Néanmoins, pour la plupart des autres espèces de bivalves ayant fait l’objet d’étude

1676 ultrastructurale des ovocytes, il etait fait mention de la présence de granules corticaux,

1677 sans pour autant faire état de leur devenir au cours du processus atrésique (Pipe, 1987a;

1678 Chung et al., 2007; Chung, 2007; Chung et al., 2008; Chung, 2008; Kim and Chung, 2014;

1679 Camacho-Mondragón et al., 2015; Kim, 2016; Camacho-Mondragón et al., 2019). Chez

1680 la palourde japonaise, les granules corticaux ont été mentionnés chez les ovocytes

1681 matures par Lee and Chung (2008) mais leur disparition n’a pas été pas signalée de façon

1682 formelle au cours du processus dégénératif, comme c’était le cas dans la présente étude.

1683 Il est plus que probable que l’absence de granules corticaux sous-membranaire ait été un

1684 signe certain de l’atrésie ovocytaire chez les bivalves, mais que les auteurs ne le

1685 mentionnaient pas comme tel.

1686 Les vésicules de réserve 1687 Reserve vesicles

1688 Les granules de vitellus ainsi que les gouttelettes de lipides ne présentaient pas de

1689 modifications visibles que ce soit chez la palourde ou bien chez la coque. C’est pourtant

1690 une caractéristique très souvent remarquée chez les ovocytes atrésiques de bivalves en

1691 MET. De nombreux auteurs notaient une dégénérescence de ce contenu de réserve, ainsi 118

1692 que l’apparition de phagosomes (Dorange and Le Pennec, 1989; Chung, 2007, 2008;

1693 Chung et al., 2007, 2008; Lee and Chung, 2008; Kim and Chung, 2014; Kim et al., 2014;

1694 Kim, 2016) dans les ooplasmes. L’absence de telles observations au cours de cette étude

1695 est probablement imputable au manque de temps d’observation des grilles et du faible

1696 nombre de grilles.

1697 Oolemme et débris ovocytaires 1698 Oolemma and oocyte debris

1699 La détérioration de la membrane ovocytaire était l’une des caractéristiques les plus

1700 évidente de l’avancement du processus atrésique. Chez la coque, la disparition des

1701 microvillosités puis celle de la membrane elle-même, étaient simultanée avec la réduction

1702 de l’épaisseur de la gangue de mucus. Chez la palourde, la rupture membranaire avec

1703 libération du contenu cytoplasmique était visible. La libération de ce contenu était à

1704 l’origine des débris ovocytaires observés chez la coque, entre les gangues de mucus. Cet

1705 épanchement de contenu cytoplasmique et/ou la dégradation de l’oolemme a déjà été

1706 noté chez quelques espèces étudiées (Pipe, 1987a; Dorange and Le Pennec, 1989; De

1707 Gaulejac et al., 1995; Kim et al., 2014; Camacho-Mondragón et al., 2015, 2019).

119

1708 DISCUSSION, CONCLUSION AND

1709 PERSPECTIVES

1710 This preliminary TEM study revealed two main characteristics of the ultrastructure

1711 of the atresic oocytes in the cockle and clam, itself similar to what had been described in

1712 other species. Firstly, most organelles undergo deterioration similar to that observed in

1713 other species and secondly, that there was rupture of the oolemma and release of the

1714 almost intact cytoplasmic content into the acinal lumen. This second point will be

1715 discussed in more detail in the next chapter.

1716 Membrane rupture, and thus the oocyte deformation observed in TEM, is fully

1717 compatible with observations made by light microscopy.

1718 Deterioration of organelles followed by membrane rupture is characteristic of

1719 necrosis (Kroemer et al., 2009). However, cell necrosis is known to lead to the death of

1720 neighboring cells, which is not the case here. While the internal mechanisms of the cell

1721 are suggestive of necrosis, the propagation and triggering mechanisms are suggestive of

1722 apoptosis. Could it be necroptosis, a natural phenomenon which, after initiation of the

1723 apoptotic process, is relayed by necrosis? This is a complex problem that requires very

1724 thorough investigations, particularly with the use of carefully-chosen apoptotic and

1725 necroptotic markers. This point will therefore not be investigated further in this study.

1726 Nevertheless, the TEM has provided keys to understanding what has been observed in

1727 optical microscopy. Further work in this direction would be particularly useful in refining

1728 knowledge in this field.

120

121

LA GANGUE OVOCYTAIRE

CHEZ LA COQUE

THE OOCYTE COAT IN THE COCKLE

122

123

1729 RESUME ET CONTEXTE

1730 ABSTRACT AND CONTEXT

1731

1732 Ignorant l’existence d’une quelconque structure péri-ovocytaire chez la coque, les

1733 premières lames histologiques n’ont été colorées qu’avec du trichrome de Masson

1734 modifié. A la suite d’une observation fine de ces lames, une structure translucide, presque

1735 invisible, a été repérée autour des ovocytes. Une coloration au bleu d’Alcian a alors été

1736 appliquée, révélant une gangue ovocytaire. Une coloration à l’acide périodique de Schiff

1737 a également été appliquée, avec un résultat négatif. Ces différentes colorations ont permis

1738 de déterminer que la gangue ovocytaire était composée de mucopolysaccharides (MPS)

1739 acides et non neutres.

1740 La première partie de ce chapitre aura pour but de replacer la gangue ovocytaire

1741 de la coque dans un contexte scientifique global. Il sera montré que la méconnaissance

1742 de la présence / nature / fonction de cette gangue ovocytaire est étonnante au regard du

1743 nombre d’espèces de bivalves qui en possèdent une (démontrant un caractère

1744 paraphylétique et non monophylétique). Cette méconnaissance est telle que bien

1745 souvent, la gangue ovocytaire est tout simplement ignorée et jamais étudiée.

1746 Dans la deuxième partie du chapitre, une étude approfondie de la gangue sera

1747 proposée. La nature mucopolysaccharidique acide de la gangue et sa structure en double

1748 couches seront explicitées grâce à des méthodes d’histologie et de microscopie

124

1749 électronique à transmission (MET). La création de la gangue par l’ovocyte lui-même au

1750 cours de la vitellogenèse, par exocytose de vésicules de MPS, a également été

1751 démontrée.

1752 La nature acide des MPS des gangues les rendent collantes, visqueuses (Beninger

1753 and St-Jean, 1997; Smith and Morin, 2002). Les pontes devraient donc se faire sous

1754 forme de masse gélatineuse, or les pontes en laboratoire ont montré que les ovocytes,

1755 entourés de leur propre gangue, étaient émis individuellement. Cette individualisation des

1756 ovocytes restait mystérieuse avant une étude approfondie de lames semi-fines au bleu

1757 de Toluidine et de coupes fines au MET.

AW AAO

RN HO OD OD

N N HO

AO

20 µm

Figure V-1. Cerastoderma edule. Micrograph of female gonad, semi-thin section, Toluidine blue stain. Healthy oocyte (HO) covered by an AMPS coat (double arrows). Atresic oocyte (AO) with irregular shape, showing variations with stain affinities in cytoplasm, nucleus (N) and coat (dotted arrows) compared to healthy oocytes. Advanced atresic oocyte (AAO) has lost its envelope. Residual nucleus (RN) still visible. Oocyte cytoplasmic debris (OD) between other oocytes. AW, acinal wall.

125

1758 Le bleu de Toluidine est métachromatique pour les mucopolysacharides acides

1759 (AMPS) et orthochromatique pour les composants cytoplasmiques. Ainsi, entre les

1760 gangues ovocytaires colorées en violet se distinguaient des débris bleus. En réalisant un

1761 montage de deux photos une continuité entre les débris et les résidus d’un ovocyte

1762 atrésique était visible (Fig. V-1). Ces débris semblaient donc provenir de la dispersion du

1763 contenu cytoplasmique d’ovocytes.

1764 L’étude au MET a confirmé la nature cytoplasmique de ces débris, composés

1765 principalement de mitochondries et de granules de vitellus.

1766 Les ovocytes atrésiques, présents en grande quantité chez C. edule, auraient un

1767 rôle dans le cycle reproducteur. Leur dégradation et la rupture de l’oolemme libéreraient

1768 le contenu cytoplasmique qui formerait une couche isolant les gangues les unes des

1769 autres. Le développement planctonique des jeunes stades de la coque serait rendu

1770 possible grâce à l’atrésie ovocytaire qui permettrait l’individualisation de chaque ovocyte,

1771 émis les uns à la suite des autres et non pas sous l’aspect d’une masse unique. Ces

1772 jeunes stades bénéficiraient donc des avantages protecteurs de la gangue mais aussi des

1773 avantages de la vie planctonique. Un lien fonctionnel a donc été établi entre deux

1774 phénomènes qui jusqu’à lors étaient sources de nombreux questionnements.

126

1775 LA GANGUE OVOCYTAIRE,

1776 EXEMPLE CHEZ CERASTODERMA

1777 EDULE DANS LE CONTEXTE DES

1778 CONNAISSANCES SCIENTIFIQUES

1779 THE OOCYTE COAT, EXAMPLE IN

1780 CERASTODERMA EDULE IN THE

1781 CONTEXT OF SCIENTIFIC KNOWLEDGE

1782 D’après un article publié dans :

1783 Ecology, 2019, 100(12), e02818

1784

1785 CLOAKED BIVALVE OOCYTES: LESSONS IN EVOLUTION,

1786 ECOLOGY, AND SCIENTIFIC AWARENESS

1787

1788 Peter G. BENINGER and Daphné CHÉREL

1789

1790 We have recently observed a gelatinous coat surrounding the oocytes of

1791 Cerastoderma edule within which the development of early larval stages takes place (Fig.

1792 V-2). Although variously coated oocytes are common in the wider marine world, and

1793 among other molluscs, most bivalve researchers have never encountered such a thing.

1794 And when they do, many simply ignore it, while others mislabel it as a “perivitelline space”

127

1795 (Gustafson and Reid, 1986; Kandeel et al., 2013). Of course, the immediate question is:

1796 Why should we care? We should care first because of the ecological and evolutionary

1797 lessons and perspectives this feature holds. And we should care because it tells us

1798 something very important about how the process of science funding can shape our view

1799 of the natural world.

1800 First of all, what is this cloak? Of the few authors who have actually reported its

1801 existence, most simply designate it as a “gelatinous covering” (Creek, 1960), “jelly coat”

1802 (Hodgson and Burke, 1988; Gros et al., 1997), or “adhesive gelatinous egg capsule”

1803 (Gustafson and Lutz, 1992). Unpublished data indicate that in Codakia orbicularis, the

1804 coat is composed of glycoproteins and proteoglycans (cited in Gros et al. 1997); this is

1805 consistent with the staining we recently obtained using Alcian blue, and the lack of any

1806 periodic acid–Schiff staining in the common cockle, Cerastoderma edule (Fig. V-2 B).

1807 Although some bivalve species deposit gelatinous egg masses on the substratum, these

1808 are functionally and morphologically different structures, characteristic of species with

1809 entirely benthic development (Ockelmann, 1958; Collin and Giribet, 2010).

1810 The next question is, obviously: What makes it? Because the bivalve germinal

1811 epithelium has no secretory cells, and no auxiliary cells have been observed constructing

1812 such a feature around developing oocytes, the most likely origin is the oocyte itself—and

1813 this has also been reported in unpublished work (cited in Gros et al. 1997). Histological

1814 sections show a thin cloak around young oocytes (not shown), and a very thick one around

1815 mature oocytes (Fig. V-2 B).

128

1816 With respect to evolutionary lessons, coated oocytes have been observed in

1817 species from four of the six subclasses of the Bivalvia. There appears to be no taxonomic

1818 or evolutionary pattern in their occurrence; they are found both in the primitive Cryptodonta

1819 and in the much later Heterodonta and Anomalodesmata (Table V-1). In each of these

1820 subclasses, there are also many species without coated oocytes, even within the same

1821 family (e.g., Pectinidae and Veneridae). The possibility that this is the result of multiple

1822 convergent evolutions of an identical character seems so remote as to be highly

1823 improbable. Conversely, if all bivalves possess the genetic and metabolomic equipment

1824 to produce such coats (i.e., this is a pleisiomorphic character), why have so few such

1825 examples been observed? Assuming that it is a differentially expressed pleisiomorphic

1826 character, why is there no phylogenetic or taxonomic footprint?

1827 If there is no phylogenetic relationship for the expression of this character, we might

1828 ask if there is an ecological one. There is no indication that any ecological parameter can

1829 switch this character on or off. All Cerastoderma edule, as well as its sister species

1830 Cerastoderma glaucum, present this character. Table V-1 recapitulates some of the most

1831 important ecological parameters for marine bivalves: water temperature, depth, and

1832 habitat. Again, no pattern is evident; coated oocytes are found in bivalves living at all

1833 temperatures, at all depths to the edge of the continental shelf, and in both epibenthic and

1834 endobenthic habitats. The endobenthic preponderance of the 14 coated species is easily

1835 explained by the fact that the vast majority of all bivalve species are endobenthic; similarly,

1836 the preponderance of reports from shallow depths probably represents material

1837 constraints: easily accessible bivalves are sampled more often than those which require

1838 shipboard procedures. 129

1839 Having ascertained that the presence of coated bivalve oocytes is not related to

1840 the major abiotic characteristics of the marine habitat, we naturally proceed to question

1841 what selective advantage such a character might present. We may set aside the possibility

1842 that the sheath contributes to the energy reserves necessary for the first developmental

1843 stages, because it does not decrease in size over the course of larval development (Fig.

1844 V-2 C, D). Four alternative possibilities come to mind:

1845 1) Mechanical protection. Especially in the shallow coastal habitats, currents can bring

1846 planktonic larvae into abrasive contact with topographic features. The sticky oocyte coat

1847 rapidly accumulates detrital particles (Fig. V-2 D), giving it a layer of nonliving protection,

1848 supported by a shock-absorbing mucus layer.

1849 2) Predator protection. The 50-µm oocyte becomes a 200-µm spawned oocyte/larva

1850 once the mucus coat is fully hydrated (Fig. V-2 C, D), removing it from the prey size

1851 range of many copepods, which are the most numerous and voracious planktonic

1852 predators. Larger predators are fewer in number, further reducing predation pressure.

1853 In addition, the jelly coat itself, as well as the accumulated seston particles, may be

1854 unappealing or poorly recognized visually or olfactorily, resembling detritus or inorganic

1855 particulate matter rather than living food.

1856 3) Postpredation protection. Many invertebrate oocytes are swallowed whole during

1857 spawns, for example, by fish (Fuiman et al., 2015). The acid mucopolysaccharide

1858 (AMPS) oocyte coat is undoubtedly resistant to digestion conditions (the intestine and

1859 stomach are themselves protected by a coating of AMPS), such that even if swallowed,

1860 a fertilized oocyte or larva may survive passage through the gut, as has been observed

1861 for copepod eggs (Flinkman et al., 1994). 130

1862 4) Microbial protection—AMPS is well-known as both a physical and a chemical

1863 barrier to opportunistic microorganisms (Riera Romo et al., 2016), and the marine

1864 environment is a veritable soup of hungry microorganisms. And finally, for spermatozoa

1865 which already function at low Reynolds numbers (i.e., even swimming in water is like

1866 swimming in honey for us), this thick, viscous coat will impose severe challenges to

( A ) ( B ) in

exin c

n

nu hl p

5 mm 20 µm ( C ) ( D )

I o d

c

c 20 µm 30 µm

Figure V-2. Cerastoderma edule. (A) External view, showing both inhalant (in) and exhalant (ex) siphons. (B) Histological section of pedunculated (i.e., young) oocyte. Nucleus (n), nucleolus (nu), peduncle (p) and jelly coat (c) stained with Alcian blue, indicating acid mucopolysaccharides (AMPS). (C) Unstained, spawned oocyte surrounded by jelly coat (c). (D) Young veliger larva (l, approximately 24 h in laboratory) developing within Alcian blue– stained jelly coat (c). Note adhering detritus particles (d).

131

1867 successful fertilization, opening the possibility of sperm competition and sperm

1868 selection

1869 The advantages provided by the jelly coat appear to be substantial, but all biologists

1870 know that they must have a cost. Among the angles that could be investigated, fecundity

1871 immediately comes to mind. The oocyte coat occupies a very significant amount of space

1872 in the gonad acinus, which could otherwise be occupied by more oocytes. Do species with

1873 coated oocytes produce fewer oocytes annually than species with uncoated oocytes, or

1874 do they compensate for fewer oocytes by having longer spawning periods? Larval survival

1875 is another obvious research tack. Does the oocyte coat reduce larval mortality, especially

1876 in the early, essentially endotrophic stages? Energetics is also an interesting angle—How

1877 much of the total reproductive production budget does oocyte coating represent? And

1878 finally, one is left with a sense of awe that a feature such as this could be either switched

1879 on or off, species by species, in so many distantly and closely related taxa.

1880 Perhaps the most interesting lesson provided by bivalve coated oocytes is in what

1881 they tell us about the way we conduct science itself. Just as it is obvious that nobody

1882 works for free (not counting the overtime scientists put in!), it is obvious that it is usually

1883 the species for which a budget has been allocated that will be studied. A quick check of

1884 published papers on bivalve biology will show that an overwhelming majority concern the

1885 few species that support major fishery and/or aquaculture industries. As it happens, none

1886 of them have been reported to have coated oocytes. A lack of major commercial

1887 importance is typical of the 17 species in which individually coated oocytes (as opposed

1888 to benthic egg masses) have been observed to date (Table 1). The result is that most

1889 bivalve biologists, working on the high-profile (and comparatively well-funded) major 132

TABLE V-1. Occurrence of gelatinous oocyte coat among bivalve taxa, arranged from most primitive to most recent

Genus and Habitat Subclass Family species Cold Temp Warm Shallow Shelf Epi Endo References Protobranchia Solemyidae Solemya reidi x x x Gustafson and Reid (1986) S. velum x x x Gustafson and Lutz (1992) Pteriomorphia Pectinidae Chlamys x x x Hodgson and Burke (1988) hastata Paleoheterodonta NR Heterodonta Astartidae Astarte x x x x x Saleuddin sulcata (1965) † Cardiidae Cerastoderm x x x Kingston (1974); a glaucum Kandeel et al. (2013) † C. edule x x x x Creek (1960), present study Donax vittatus x x x Frenkiel and Mouëza (1979) Lucinoma x x x Gros et al. (1999) aequizonata Codakia x x x Alatalo et al. (1984); Gros orbicularis et al. (1997) Thyasira x x x x x Blacknell and gouldi Ansell (1974)

Donacidae Scrobicularia x x x Frenkiel and Mouëza plana (1979) Lucinidae Mercenaria x x x x x Loosanoff and mercenaria Davis (1950) M. x x x Loosanoff and camechiensis Davis (1963) Thyasiridae Venus x x x x x Ansell (1961) striatula Arcticidae Arctica x x x Lutz et al. islandica (1982) Anomalodesmata Laternulidae Laternula x x x Ansell and elliptica Harvey (1997); Peck et al. (2007) Pandoridae Pandora x x x x x Allen (1961) inaequivalvis Note: Epi, epibenthic; Endo, endobenthic; NR, none reported to date; Temp, temperate; Shelf, found over the depth range of the continental shelf. † Not reported, but visible in drawings/micrographs.

133

1890 commercial species, have no idea that coated bivalve oocytes exist. The specialists have

1891 a blinkered view of their subject.

1892 There may be many more bivalve species with coated oocytes out there. As long

1893 as marine bivalve researchers focus preponderantly on the high-profile commercial

1894 species, we will simply continue not to assimilate this basic fact into our scientific

1895 consciousness. Ignoring the existence of these oocytes not only ignores the phenomenon,

1896 but also closes to scientific inquiry all of the fascinating questions it raises. It is likely that

1897 many similar situations exist with respect to orphan taxa, and, more generally, orphan

1898 scientific questions.

1899 ACKNOWLEDGMENTS

1900 We thank Professor John Pastor for his helpful text suggestions, as well as two

1901 anonymous reviewers for their constructive comments. Underscoring a key point in this

1902 paper, no funding was provided for this work.

134

1903 LA GANGUE OVOCYTAIRE CHEZ

1904 CERASTODERMA EDULE ET SON LIEN

1905 AVEC L’ATRESIE OVOCYTAIRE

1906 THE OOCYTE COAT IN

1907 CERASTODERMA EDULE AND ITS

1908 RELATIONSHIP TO OOCYTE ATRESIA

1909 D’après un article publié dans :

1910 Marine Biology, 2020, 167:104

1911

1912 TWO ENIGMAS MAY SOLVE EACH OTHER: THE OOCYTE

1913 COAT AND ATRESIA IN THE COMMON COCKLE,

1914 CERASTODERMA EDULE (LINNAEUS, 1758)

1915

1916 Daphné CHÉREL, Peter G. BENINGER and Gaël LE PENNEC

1917

1918 V- 3 . 1 . RESUME

1919 ABSTRACT

1920 Deux aspects énigmatiques de la reproduction des bivalves ont été étudiés chez

1921 la coque commune Cerastoderma edule : la gangue ovocytaire et l’atrésie ovocytaire.

1922 L'histologie qualitative et la microscopie électronique à transmission (MET) réalisées sur 135

1923 des coques collectées sur la côte atlantique française ont non seulement révélé la

1924 structure détaillée de la gangue ovocytaire mais ont également confirmé qu'elle est

1925 sécrétée par l'ovocyte lui-même et composée de mucopolysaccharides acides (AMPS),

1926 connus pour être visqueux et collants. L'histologie quantitative a montré qu'au climax de

1927 l'ovogenèse, les gangues ovocytaires occupent la plus grande fraction (environ 40 %) du

1928 volume acinal des gonades. Ceci représente à la fois une réduction importante du nombre

1929 de gamètes possiblement produit par les femelles et un investissement énergétique non

1930 lié à la production de ces gamètes. Les avantages potentiels de la gangue comprendraient

1931 la protection contre l'abrasion mécanique, la prédation et les microbes opportunistes.

1932 L'atrésie (dégénérescence physiologique des ovocytes) était une deuxième source

1933 connue de réduction de la fécondité avec un impact minimum d'environ 50 % sur

1934 l’ensemble des ovocytes produits. Il est suggéré que cette forte proportion d'ovocytes non

1935 viables est liée à la non-viabilité génétique des premiers stades de la vie post-fécondation,

1936 déjà documentée. Les observations qualitatives histologiques et MET ont révélé des

1937 débris atrésiques adhérant à la surface extérieure des couches d'ovocytes (ce travail).

1938 Une telle disposition isolerait les ovocytes de ceux adjacents, permettant aux ovocytes

1939 d’être émis individuellement, plutôt que comme une masse d'œufs, et donc de subir un

1940 développement et une dispersion planctoniques. L’atrésie et la gangue ovocytaire de

1941 Cerastoderma edule semblent donc être liées dans une fonction adaptative. Il s’agit de la

1942 première mention de ce phénomène chez les bivalves.

136

1943 V- 3 . 2 . ABSTRACT

1944

1945 Two co-occurring, enigmatic aspects of bivalve reproduction were investigated in

1946 the common cockle Cerastoderma edule: the oocyte coat and oocyte atresia. Qualitative

1947 histology and transmission electron microscopy (TEM) of cockles collected on the French

1948 Atlantic coast revealed not only the fine structure of the oocyte coat, but also confirmed

1949 that it is secreted by the oocyte itself and composed of acid mucopolysaccharides

1950 (AMPS), known to be viscous and adhesive. Quantitative histology showed that at the

1951 peak of oogenesis, oocyte coats occupy the largest fraction (approx. 40 %) of the gonad

1952 acinal volume, representing both a significant sacrifice of female gamete capacity, and a

1953 non-gamete energetic investment. Potential benefits of the coat include protection from

1954 mechanical abrasion, predation, and opportunistic microbes. Atresia (oocyte

1955 degeneration) was a known second source of reduced fecundity, with a minimum impact

1956 of approximately 50 % of all oocytes produced. It is suggested that this high proportion of

1957 inviable oocytes is related to the previously-documented genetic inviability of early post-

1958 fertilization life stages. The qualitative histological and TEM observations revealed atresic

1959 debris adhering to the exterior surface of the oocyte coats. Such an arrangement would

1960 isolate adjacent oocyte coats, enabling the oocytes to be spawned individually, rather than

1961 as an egg mass, and therefore to undergo planktonic development and dispersion. Oocyte

1962 atresia and the oocyte coat of Cerastoderma edule therefore appear to be linked in the

1963 first indication of an adaptive function in bivalves.

1964

137

1965 V- 3 . 3 . INTRODUCTION

1966

1967 The presence of a thick, non-living coat surrounding the oocytes of several marine

1968 bivalve species has been periodically reported in the scientific literature, often with

1969 astonishment, and then collectively forgotten (see Collin and Giribet [2010] and Beninger

1970 and Chérel [2019] for references). Various authors have believed themselves to be the

1971 first to document such a feature (Belding, 1931; Loosanoff and Davis, 1950; Lutz et al.,

1972 1981, 1982), while most have simply not reported/observed it; this may be partly due to

1973 its poor staining with the common topological histology stains (Martínez-Castro and

1974 Vásquez, 2012; Kandeel et al., 2013). The coat has been given different names in the

1975 relatively few studies in which it has been identified: ‘gelatinous egg capsule’ (Creek,

1976 1960; Gustafson and Reid, 1986; Gustafson and Lutz, 1992), ‘gelatinous membrane’

1977 (Ansell, 1961), ‘albuminous sheath’ (Kingston, 1974), ‘egg capsule’ (Lutz et al., 1982) or

1978 ‘jelly coat’ (Hodgson and Burke, 1988; Gros et al., 1997).

1979 Various types of oocyte coats have been reported in the Mollusca, and grouped

1980 according to their layering: primary, secondary, and tertiary (Wourms, 1987; Ponder et al.,

1981 2019). ‘Jelly-like’ primary coats have been well documented in the polyplacophoran basal

1982 group, and this character may thus be pleisiomorphic in the Bivalvia (Buckland‐Nicks and

1983 Reunov, 2010). The occurrence of this coat in Bivalvia is enigmatic, as it does not appear

1984 to be taxonomically-related, and no major ecological variable appears to explain its

1985 presence (Beninger and Chérel, 2019). Its implications for bivalve ecology, fisheries, and

1986 aquaculture are nonetheless intriguing and potentially important. Much the same has been

138

1987 written about the phenomenon of bivalve oocyte atresia (degeneration of oocytes within

1988 the gonad), very largely overlooked in the literature (Beninger, 2017).Although it has

1989 recently been brought to the fore in several papers, this phenomenon remains poorly-

1990 understood and rarely identified, despite the fact that it is responsible for most of the early

1991 life-stage mortality in both wild and cultured populations (Chérel and Beninger, 2017,

1992 2019). Its causes and exact cellular metabolomic nature remain unknown.

1993 In the course of investigating the reproductive impact of oocyte atresia in the common

1994 cockle Cerastoderma edule, a species presenting a well-developed oocyte coat (Chérel

1995 and Beninger, 2019), it became evident that atresia also impacted the formation and

1996 structure of the oocyte coat. The present study is the first to report on the detailed structure

1997 of the oocyte coat in C. edule or any bivalve, and its relationship to ongoing oocyte atresia.

139

1998 V- 3 . 4 . MATERIALS AND METHODS

1999

2000 Species, sites and sampling

2001 Cerastoderma edule is an intertidal G.B 2002 endobenthic bivalve found on the North-East Site 2 France 2003 Atlantic coast, from Mauritania to Norway. Loire Estuary Spain 2004 Fishing and farming of this species are

2005 important to the economies of the Netherlands, Atlantic Ocean 2006 the United Kingdom, and France (FAO,

2007 http://www.fao.org/fishery/species/3543/en). Bourgneuf Bay

2008 The study was carried out at two sites on the N. 47°00’ Site 1 2009 French Atlantic coast within 50 km of each N

2010 other (Fig. V-3), as part of a program to 10 km W. 2°20’ 2011 investigate the impact of oocyte atresia in this Figure V-3. Location of the two sampled sites 2012 species (Chérel and Beninger, 2019). Adult 2013 cockles (15 30 individuals, > 2 cm SL) were haphazardly sampled monthly from July 2010

2014 May 2012 at the first site, and bi-weekly from January−November 2018 at the second site.

2015 Only gametogenic females were included in this study (n = 301).

140

2016 Histology and stereology

2017 Sampled cockles were shucked and fixed in Bouin’s solution, embedded and

2018 sectioned at 7µm as per Chérel and Beninger (2017, 2019). Slides were first stained with

2019 Alcian blue in order to reveal the oocyte coat (Beninger and Chérel, 2019): acetic acid 1

2020 min, dry 3 min, Alcian blue 30 min), followed by a modified Masson’s trichrome topological

2021 protocol as per (Chérel and Beninger, 2019). Observations and photomicrographs were

2022 performed using an Olympus Provis light microscope, and Olympus cellSens Standard

2023 software. Stereological counts were carried out using an 11 x 11 grid at 100x on five

2024 features of interest: atresic oocytes (AO), immature healthy oocytes (IO), mature healthy

2025 oocytes (MO), oocyte coat (C) and intra-acinal lumen (IAL) (see Chérel and Beninger

2026 2019).

2027 A periodic acid-Schiff stain was performed, on additional histological sections, as

2028 per Cannuel and Beninger (2007), to determine whether any neutral

2029 mucopolysaccharides were also present in the oocyte coat.

2030

2031 The following volume fractions were calculated as per Chérel and Beninger (2017,

2032 2019):

AO + IO + MO 2033 Total Oocyte Volume Fraction : OVF = *100 C + IAL + AO + IO + MO

AO 2034 Atresic oocyte Volume Fraction : AVF = *100 AO + IO + MO

MO 2035 Mature oocyte Volume Fraction : MVF = *100 AO + IO + MO

141

IO 2036 Immature oocyte Volume Fraction : IVF = *100 AO + IO + MO

IAL 2037 Intra-acinal Lumen Volume Fraction: LVF = *100 C + IAL + AO + IO + MO

2038 in addition to the oocyte coat volume fraction:

C 2039 Coat Volume Fraction : CVF = *100 C + IAL + AO + IO + MO

2040 Transmission electron microscopy

2041 Three tissue pieces of approx. 3 mm3 each were removed from the dorsal region of

2042 the visceral mass, where previous histological observations confirmed that gonad acini

2043 were most likely to be found. The presence of oocytes was verified under a dissecting

2044 microscope prior to proceeding with the subsequent processing steps. The tissue pieces

2045 were immediately fixed in cold 2.5% glutaraldehyde in 0.2 M sodium cacodylate buffer

2046 (made with filtered seawater from the sampling sites to ensure appropriate pH 7.4 and

2047 osmolarity) for at least 2 h. The tissue pieces were then rinsed in 0.2 M cacodylate buffer

2048 and cut to obtain 1-mm3 pieces. Post-fixation was performed in 0.2 M cacodylate

2049 buffer/1% osmium tetraoxide at 4° for 1 h. After dehydration in a graded ethanol series

2050 and propylene oxide bath (2 x 15 min), samples were transferred to EPON resin/propylene

2051 oxide (1:1) at room temperature, for 1.5 h. After embedding in pure resin for 1 h,

2052 polymerization was effected at 60°C for 12 h.

2053 Semi-thin sections were cut at 1µm using a LEICA EMUC7 ultramicrotome and

2054 stained with Toluidine blue for light microscopic observation. Thin sections were cut at

2055 80−90 nm, collected on uncoated 300-mesh copper/rhodium grids (MAXTAFORM HR25),

142

2056 contrasted with uranyl acetate (Bozzola and Russel, 1992), and examined using a JEOL

2057 JEM-1400 transmission electron microscope (TEM).

2058 Spawning and fertilization

2059 Several spawning induction techniques were attempted and abandoned due to

2060 poor results: mechanical stimulation, temperature shock, addition of scraped/stripped

2061 gonad material, and addition of spawned spermatozoa from male cockles. Acceptable

2062 results were obtained by adapting the technique of Honkoop and Van der Meer (1998),

2063 using cockles and seawater collected during the most likely period of maximal gamete

2064 maturity (February July). Cockles were stored overnight at 4°C, out of water. Groups of

2065 three to five individuals were then placed in separate containers filled with site sea water

2066 at 15°C. Oocyte spawning occurred within 10 min to several hours, depending on the

2067 maturation state of the cockles. Additional thermal stimulation with 30°C sea water

2068 occasionally improved gamete release. Oocytes and spermatozoa were collected using

2069 Pasteur pipettes, and allowed to fertilize in a small container of site seawater.

143

2070 V- 3 . 5 . RESULTS

2071

2072 Qualitative characteristics of oocyte coat

2073 The oocyte coat may be invisible or scarcely visible using traditional methods of

2074 topological histological staining, and therefore very difficult to identify (Fig. V-4 A). This

2075 problem was solved with the Alcian blue staining step (Fig. V-4 B), which also revealed

2076 the coat to be composed of acid mucopolysaccharides (AMPS – viscous mucus).

2077 Similarly, the use of Toluidine blue, which is orthochromatic with most ooplasmic

2078 compounds, yet metachromatic with AMPS, allowed the coat to be clearly distinguished

2079 in semi-thin sections (Fig. V-5).

2080 Transmission electron microscopy revealed the oocyte coat to be formed of two

2081 distinct layers. The inner layer was more electron-dense and homogenous than the outer

2082 layer; a thin (0.5 – 2 µm) electron-lucent zone was present between the oolemma and the

2083 inner coat layer; its position, thickness, and TEM aspect corresponded to the zona

2084 pellucida (Figs. V-6 A, V-8 A).

144

A B OM C NE NU

NE NU N N C

OM 10 µm 10 µm

Figure V-4. Cerastoderma edule. Mature healthy oocytes stained with (A) modified Masson’s trichrome and (B), with Alcian blue added. Nuclear envelope (NE), nucleus (N), nucleolus (NU), oocyte coat (C), and oolemma (OM)

Figure V-5. Cerastoderma edule OP oocytes. Semi-thin section stained OD with Toluidine blue. Ooplasm (OP) N and cellular debris (OD) stain dark

OP blue, oocyte coats (double arrows) stain purple. Nucleus (N)

20 µm

145

A C OP

M NE OM OD YG

ZP IL N OL OL OL

5 µm M

B

OD

IL OL OL IL OP

YG

OD OM 5 µm 2 µm

Figure V-6. Cerastoderma edule oocytes. Transmission electron micrographs. A. Part of mature oocyte with coat. Nucleus (N), nuclear envelope (NE), ooplasm (OP) and oolemma (OM) with short microvilli adjacent to zona pellucida (ZP). B. Inner layer (IL) and outer layer (OL) of coats from 2 oocytes separated by oocyte debris (OD). C. Oocyte debris containing mitochondria (M) and yolk granules (YG) between adjacent coat outer layers (OL). Note similarity between the mitochondria and yolk granules in Fig. V-8

146

2085 Origin and development of the oocyte coat

2086 Young oocytes developed from the acinal wall, in contact with auxiliary cells (Fig.

2087 V-7 A). The oocyte peduncle formed as the young oocyte grew and began vitellogenesis

2088 (Figs. V-7 B-E). The oocyte coat was absent in very young oocytes (Figs. V-7 A-C), first

2089 appearing as a very thin layer closely appressed to ~ 20-µm diameter oocytes (Figs. V-7

2090 C, D). The oocyte coat thickened A B YO YO 2091 concomitantly with oocyte growth, AL

2092 becoming very large around late AC 2093 pedunculated and mature oocytes 10 µm 10 µm 2094 (Figs. V-7 E, V-4 B). Atresic oocytes, C D E 2095 recognizable by their irregular shape P N N 2096 and/or the change in appearance of C

C N C 2097 the chromatin (Chérel and Beninger,

10 µm 10 µm 10 µm 2098 2019) often presented a slightly F G 2099 thinner coat than that of healthy C N 2100 oocytes (Figs. V-7 F, G). Of the 301 N

2101 females sampled over the study 5 µm C 10 µm

2102 period, only 16 showed no signs of Figure V-7. Cerastoderma edule. A, Young oocyte (YO) 2103 oocyte atresia in the sections and adjacent auxiliary cell (AC); B, YO beginning growth toward acinal lumen (AL). C, D Thin coat (C) around very 2104 examined, and these individuals all young oocytes. E, Thick coat around pedunculated (P) 2105 showed a lack of gametogenetic oocyte. F, Young atresic oocyte and G, mature atresic 2106 activity. oocyte. Nucleus (N)

147

2107 Compared to the young oocyte, vitellogenic oocytes contained numerous

2108 mitochondria, electron-dense yolk vesicles, and clear vesicles in the ooplasm (Fig. V-8 A).

2109 Clear vesicles were often located close to the oolemma (Fig. V-8 B), and fusion with the

2110 envelope was observed, accompanied by exocytosis (Fig. V-8 C). These observations,

2111 together with the growing oocyte coat, strongly suggest that these vesicles are filled with

2112 AMPS, which are exocytosed to form the layers of the coat.

2113 Cellular debris and the oocyte coat

2114 Cellular debris was observed in all semithin and thin sections examined (n = 6

2115 individuals), adhering to the exterior surface of the oocyte coat (Fig. V-5), and most

2116 conspicuously between the oocyte coats of adjacent oocytes. Close examination of the

2117 debris under TEM revealed distinct, naked mitochondria and yolk granules (Fig. V-6).

2118

148

2119 A MV OD

OG OM OG YG ZP IL SC OL M OG AC

2 µm

B C

MV N

YG

MV MV

M OM 1 µm 2 µm

Figure V-8. Cerastoderma edule. Transmission electron micrographs. A, mature oocyte (left) with inner (IL) and outer (OL) layers of oocyte coat (OC) and zona pellucida (ZP) adjacent to oolemma (OM). Oogonia without coat (OG), with accompanying auxiliary cell (AC). Note synaptonemal complex (SC) in nucleoplasm. Putative mucus vesicles (MV) and yolk granule (YG) in mature oocyte, oocyte debris (OD) on external surface of oocyte coat. B, Mucus vesicles and mitochondria close to oolemma, N, Nucleus. C, mucus vesicle exocytosis (bold arrows)

149

2120 Features of spawned oocytes

2121 Spawned Cerastoderma edule oocytes were visible to the naked eye; they did not

2122 adhere to each other and were negatively buoyant (Fig. V-9 A). The newly-spawned,

2123 coated oocytes measured approximately 135 µm in diameter (oocyte 66 µm + 2 x 35 6

2124 µm coat thickness); the coat was present on both unfertilized and fertilized oocytes (the

2125 latter characterized by the disappearance of the nuclear envelope) (Fig. V-9 B). The coat

2126 increased in thickness to approximately 47 µm as the zygote developed, probably due to

2127 hydration of the mucopolysaccharides. The coat persisted up to at least the early veliger

2128 (pre-pediveliger) stage (rearing was not attempted) (Fig. V-9 C). Veligers were able to

2129 swim within the confines of the coat, whose outer reaches appeared much more viscous

2130 and resistant to the mechanical stress of the swimming (Online resource 1).

150

2131

A

RV

5 mm

B S C V

C H C 20 µm 20 µm

Figure V-9. Cerastoderma edule. A, female cockle spawn, non- adhering oocytes (white arrows); RV, right valve; B, spawned, fertilized, unstained live oocyte surrounded by oocyte coat (C). C, veliger larva in coat (C), shell hinge (H) and velum (V) composed of ciliary tracts. S, seston particles adhering to coat

2132

151

2133 Oogenesis and oocyte coat quantification

2134 Oogenesis was continuous, with no apparent inter-individual synchronicity (Fig. V-10;

2135 Chérel and Beninger 2019). At the population level, oocyte coats were observed

2136 throughout the year. The volume fraction of the coat (CVF) was at least 20–50% of the

2137 total acinal volume (Fig. V-10).

OVF LVF CVF 100

90

80

70

60

50

40

30 Volume fraction (%) Volume(%) fraction 20

10

0

1-Oct

3-Apr

8-Feb 5-Mar

7-Sep

11-Jul 25-Jul

15-Oct 29-Oct

16-Apr 30-Apr

22-Jan 13-Jun 25-Jun

22-Feb 19-Mar

21-Sep 10-Aug 23-Aug 12-Nov 26-Nov

14-May 28-May Dates

13 8 13 11 14 12 13 14 10 10 5 9 7 6 4 6 6 10 5 9 13 13 8 N

Figure V-10. Cerastoderma edule females pooled from site 2. Total oocyte (OVF), intra- acinal lumen (LVF), and oocyte coat (CVF) volume fractions of acini. Error bars represent half the range of values. N, number of females used for counts

152

2138 A CVF mean of 33.6 % ± 1.9 (95% confidence interval) was calculated for all

2139 individuals together (site 1 + 2, n = 301). During active gametogenesis, defined as MVF >

2140 20% (n = 165), the mean CVF increased to 40.5% ± 2.1 (95% confidence interval).

2141 Overall, the coat volume fraction varied directly with respect to the mature and atresic

2142 volume fraction, and inversely with respect to immature volume fraction (Fig. V-11).

2143

2144

100

80

60 CVF CVF 40

20

0 0 50 100 0 50 100 0 50 100 IVF MVF AVF Figure V-11. Cerastoderma edule pooled from site 1 and 2. Coat volume fraction (CVF) as a function of oocyte volume fraction: IVF, MVF and AVF

153

2145 V- 3 . 6 . DISCUSSION

2146

2147 Qualitative characteristics of oocyte coat

2148 The results of the Alcian blue, Toluidine blue, and PAS staining confirm the

2149 exclusively acid mucopolysaccharide composition of the oocyte coat, as was originally

2150 hypothesized for Thyasira gouldi by Blacknell and Ansell (1974), and subsequently

2151 demonstrated in Codakia orbicularis by Gros et al. (1997) and in Cerastoderma edule by

2152 Beninger and Chérel (2019).

2153 The clear space between the oolemma and the oocyte coat, visible in the histological

2154 sections, was not observed in the electron microrographs; this feature is thus most

2155 probably an artefact of the histological preparation (most likely the dehydration sequence).

2156 Within the coat itself, two AMPS layers were evident: an inner, finely-clumped layer, and

2157 an outer, more coarsely-clumped layer – this may correspond to increased clumping in

2158 the oldest AMPS secretions. The presence of such a double layer has also been shown

2159 in Codakia orbicularis under phase-contrast optics (Gros et al., 1997).

2160 Origin and development of the coat

2161 Although Raven (1966) stated that molluscan oocyte coverings external to the

2162 oolemma are secreted either by the auxiliary (‘follicle’) cells or by the oviduct, the

2163 contemporary consensus is that the primary envelope (all coats immediately exterior to

2164 the oolemma) is secreted by the oocyte itself (see Wourms 1987, Ponder et al 2019 for

154

2165 reviews). Gros et al. (1997) stated that the thick oocyte coat of Codakia orbicularis is

2166 secreted by the oocyte itself (their unpublished observations). This conclusion is

2167 supported by the thinner coat around many atresic oocytes, and by the acinus

2168 stereological data of the present study, which clearly show an inverse relationship

2169 between the immature oocyte volume fraction and the coat volume fraction. The light and

2170 electron microscopic data of the present study are also consistent with an oocytic origin

2171 for the coat secretions: Mucus (i.e. mucopolysaccharide) vesicles were present in the

2172 ooplasm of vitellogenic oocytes, but absent from the ooplasm of pre-vitellogenic oocytes,

2173 which is also consistent with this interpretation. These mucus vesicles have not been

2174 observed in bivalve species whose oocytes lack an oocyte coat (Pipe, 1987a; Dorange

2175 and Le Pennec, 1989; De Gaulejac et al., 1995; Eckelbarger and Davis, 1996; Chung et

2176 al., 2007, 2008; Lee and Chung, 2008; Camacho-Mondragón et al., 2015). The TEM

2177 micrographs of the present study show that the cellular mechanism of coat secretion is

2178 merocrine, with large membrane-bound vesicles releasing their contents at the oocyte cell

2179 surface. This mode of coat secretion is common in the Metazoa (Buckland-Nicks and

2180 Reunov 2010).

2181 The sharp distinction between the inner and outer oocyte coat layers, with no

2182 gradation, as observed in the TEM micrographs, argues for discrete secretion at different

2183 times: first the outer, and later the inner layer. The electron-lucent zona pellucida or

2184 ‘vitelline coat’ is probably the final secretion, characteristic of mature oocytes: a thin layer

2185 of glycoprotein, crucial to maturation and fertilization (Focarelli et al., 1990; Focarelli and

2186 Rosati, 1993). It is conceivable that the same secretory process is responsible for the

2187 oocyte coat layers, with qualitatively different mucopolysaccharides/glycoproteins in each 155

2188 layer (Wourms 1987). Differential expression of this character would help to explain why

2189 some bivalve species possess thick oocyte coats and others do not (Beninger and Chérel

2190 2019). The lack of merocrine secretory vesicles in the TEM micrographs of the non-coat

2191 species may be due to the fact that secretory activity is comparatively slight for the zona

2192 pellucida, and in any event terminates in the mature oocyte.

2193 Costs and benefits of the cockle oocyte coat

2194 The oocyte coat occupied a large part of the acinal volume in the cockles of the

2195 present study (~ 40% at peak oogenesis), thereby reducing the number of oocytes per

2196 acinus. Although the intra-acinal degree of hydration is unknown, secretion of the coat

2197 invariably entails energy expenditure. The possible benefits of the oocyte coat were

2198 proposed in Beninger and Chérel (2019): protection from abrasion, predation and

2199 opportunistic microbes. Other authors have variously suggested that such a coat might

2200 minimize polyspermia (in sea urchins) (Hagström, 1959) and increase the probability of

2201 an encounter with spermatozoa (Farley and Levitan, 2001; Levitan, 2006). Indeed, the

2202 coat doubles the size of the uncoated oocyte (Honkoop and Van der Meer 1998; Pronker

2203 et al. 2015; present study). Such an increase in size might also offer a size refuge from

2204 some zooplanktonic and benthic suspension-feeding predators.

156

2205 Relation between oocyte coat and atresia: can two enigmas solve each 2206 other?

2207 ‘For what purpose?’ is usually the first question that comes to mind when we learn

2208 that a large proportion of energetically costly oocytes is routinely ‘self-destroyed’. Both the

2209 causes and potential benefits of oocyte atresia are very poorly-understood. The sacrifice

2210 of healthy or impaired female gametes for nutrient transfer to vitellogenic oocytes or

2211 developing embryos is well-documented in many animal taxa, including the Mollusca

2212 (Webber, 1977; De Jong-Brink et al., 1983; Wourms, 1987; Ponder et al., 2019). Several

2213 authors have proposed that auxiliary cells resorb metabolites from oocyte degeneration

2214 for recycling in future vitellogenesis (Pipe, 1987a, 1987b; Dorange and Le Pennec, 1989;

2215 Le Pennec et al., 1991; De Gaulejac et al., 1995; Chung, 2007, 2008; Chung et al., 2007,

2216 2008; Lee and Chung, 2008; Kim and Chung, 2014; Kim et al., 2014; Kim, 2016). We have

2217 not observed such a process in Cerastoderma edule; indeed, the quantity of available

2218 oocyte debris is too great to be resorbed by the auxiliary cells alone – and no masses of

2219 macrophages have been observed in any of the individuals examined.

2220 The lack of inter-oocyte adhesion, despite the presence of a viscous and sticky acid

2221 mucopolysaccharide coat (Beninger and St-Jean, 1997; Smith and Morin, 2002), is

2222 intriguing. The cellular debris observed on the external surface of all oocyte coats within

2223 the acini would effectively isolate the mucopolysaccharides from neighboring oocytes prior

2224 to and during spawning, thus enabling the oocytes to be released individually, rather than

2225 as a large, negatively-buoyant egg mass, which would be subjected to desiccation and

2226 osmotic stress in the intertidal habitat of this species. Cockles can thus accrue the

157

2227 advantages of the oocyte coat without sacrificing the necessity of broadcast spawning in

2228 this habitat. Additionally, the non-sticky state would allow the oocytes to be spawned

2229 individually in small numbers, resulting in the extended ‘dribble spawning’ strategy

2230 previously reported for this species (Chérel and Beninger, 2019). The presence of atresic

2231 oocytes in all oogenic individuals is consistent with this interpretation.

2232 We are unaware of any other study which shows the sacrifice of germ line cells (i.e.

2233 atresia) resulting in the elaboration of a ‘non-stick’ surface on coated, healthy oocytes.

2234 The data of the present study suggest that these two otherwise unrelated processes,

2235 oocyte atresia and oocyte coat production, are functionally linked in Cerastoderma edule.

2236 High-fecundity organisms, including bivalves, are characterized by a large proportion of

2237 genetically-inviable propagules (Plough et al., 2016; Plough, 2018); oocyte atresia may

2238 thus be an early manifestation of inviability. Utilization of the debris of these inviable

2239 oocytes may be an evolutionary mitigation of a gametogenic ‘Red Queen’ state (see Strotz

2240 et al. [2018] for a review of the Red Queen hypothesis).

2241 The findings of the present study augment the already considerable avenues for

2242 future research on the consequences of both oocyte atresia and the oocyte coat in marine

2243 bivalves. It would be of immediate interest to replicate these investigations in some of the

2244 other bivalves known to have both oocyte coats and planktonic development (Beninger

2245 and Chérel, 2019).

158

2246 V- 3 . 7 . ACKNOWLEDGMENTS

2247

2248 We are grateful to Bruno Chollet (IFREMER La Tremblade) for his advice and

2249 assistance with electron microscopy processing, as well as Philippe Elies from the

2250 Plateforme d’Imagerie et de Mesures en Microscopie (UBO). We thank Thibault Besle and

2251 Stacy-Ann Gray for their help with sampling and staining; Lucie Kessler, Mathilde

2252 Clairambault and Stacy-Ann Gray for their patience and perseverance in the laboratory

2253 spawning trials. We are indebted to David Berteau and employees of Chellet-Berteau

2254 Production for their warm welcome and permission to sample on-site.

2255

2256 Funding No funds have been allocated to this study.

2257 Data availability The datasets generated during and/or analyzed during the current study

2258 are available from the corresponding author on reasonable request.

2259

2260 Compliance with ethical standards

2261 Conflict of interest The authors declare that they have no conflict of interest.

2262 Ethical approval All applicable international, national, and/or institutional guidelines for

2263 the care and use of animals were followed by the authors.

2264

159

2265 FORMATION ET ASPECT DE

2266 L’OOLEMME ET DE LA ZONE

2267 PELLUCIDE CHEZ LA PALOURDE

2268 FORMATION AND APPEARANCE OF

2269 OOLEMMA AND ZONA PELLUCIDA IN

2270 CLAMS

2271

2272 Au cours de la vitellogénèse des ovocytes de Tapes philippinarum, ces derniers se

2273 détachaient progressivement des cellules auxiliaires, des microvillosités apparaissaient

2274 alors, formant l’oolemme (Fig. V-12 A).

2275 Des vésicules claires aux électrons se groupaient sous les microvillosités

2276 néo-formées chez les ovocytes prévitellogéniques (Fig. V-12 A). Ces vésicules

2277 semblaient contenir une matière fibreuse dans les premiers temps de la vitellogenèse,

2278 puis moins fibreuse par la suite (Fig. V-12 B). Ces vésicules étaient exocytées via les

2279 microvillosités formant ainsi la zone pellucide ou membrane vitelline. Les ovocytes en fin

2280 de vitellogenèse ne présentaient plus ce type de vésicules mais présentaient des granules

2281 corticaux oblongs caractéristiques, au contact de l’oolemme (Fig. V-12 C).

2282 Ces vésicules de mucus et leur mode de sécrétion étaient très similaires à ce qui

2283 a été observé chez Cerastoderma edule. Chez la coque, le nombre de vésicules de mucus

2284 était bien supérieur, ce qui expliquerait la différence de taille de couche muqueuse autour

2285 des ovocytes. 160

2286 Certains auteurs présentaient ces vésicules comme des vésicules d’endocytose,

2287 permettant la vitellogénèse grâce à l’absorption de composés produits par les cellules

2288 auxiliaires (Pipe, 1987b, 1987a; Eckelbarger and Davis, 1996; Chung, 2007, 2008; Chung

2289 et al., 2007, 2008; Lee and Chung, 2008; Erkan, 2009; Kim and Chung, 2014; Kim et al.,

2290 2014; Kim, 2016). Cette hypothèse ne semblait pas en adéquation avec les observations

Figure V-12. Transmission electron OM AC A micrographs of Tapes philippinarum oocytes. A. Previtellogenic oocyte (PVO). The oocyte membrane dissociates from neighboring auxiliary cells (AC) forming microvilli on the AC MV oolemma (OM); vesicles containing fibrous mucus (MV) were observable under the neo- PVO 1 µm formed microvilli. B. Vitellogenic oocyte. Numerous mucus B vesicles were present in the ooplasm and at YG MV the base of the microvilli of the oolemma. Yolk M MV granules (YG) and mitochondria (M) are clearly visible. C. Mature oocyte. The ooplasm contained mitochondria, yolk vesicles, lipid droplets (LD) and cortical granules (CG) under the 2 µm OM oolemma. The zona pellucida (ZP) was well C developed. CG ZP

CG OM YG

M LD 1 µm

161

2291 réalisées chez la palourde comme chez la coque. Ces vésicules ont été observées avant

2292 le détachement des cellules auxiliaires et de l’ovocyte.

2293 La palourde est donc un exemple de bivalve avec une très fine couche,

2294 probablement muqueuse autour de chaque ovocyte, qui devrait être la zone pellucide.

2295 Des essais de coloration au bleu Alcian en histologie n’ont pas permis de révéler cette

2296 couche, surement trop fine pour être visualisée au microscope optique.

162

2297 CONCLUSIONS ET

2298 PERSPECTIVES

2299 CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES

2300 Le mode de formation de la membrane vitelline, zone pellucide, « jelly coat »,

2301 oocyte coat etc. ne fait pas consensus. Certains auteurs considèrent que cette couche

2302 est fabriquée uniquement par l’ovocyte lui-même, d’autres qu’il s’agit un travail mixte entre

2303 cellules auxiliaires et ovocyte, d’autres encore qu’elle est produite uniquement par les

2304 cellules auxiliaires (Albertini, 1985; Wourms, 1987; Dorange, 1989; Thielley, 1993; Ponder

2305 et al., 2019) . Dans tous les cas, il était décrit que cette couche était composée de mucus.

2306 Dans la présente étude, l’hypothèse retenue est que c’était l’ovocyte lui-même

2307 chez Tapes philippinarum mais aussi et surtout chez Cerastoderma edule qui produisait

2308 cette couche plus ou moins épaisse et complexe, par exocytose de vésicules de mucus.

2309 Certaines espèces comme la coque possèderaient une gangue épaisse en plusieurs

2310 couches alors que d’autres espèces comme la palourde ne possèderaient qu’une fine

2311 couche, la zone pellucide.

2312 Des débris ovocytaires issus de la dégradation des ovocytes atrésiques ont été

2313 observés en grande quantité chez la coque, mais ils étaient également présents chez la

2314 palourde (Cf. Chapitre IV) sans signe probant de résorption. Partant de ces constatations

2315 il serait intéressant de comprendre si chez la palourde, les débris ovocytaires pourraient

2316 avoir le même rôle que chez la coque, c’est-à-dire aider à l’individualisation des ovocytes

163

2317 lors de l’émission de gamètes. En parallèle, il faudrait pouvoir trouver une méthode pour

2318 nettoyer les ovocytes de coque des débris qui les entourent pour confirmer que les

2319 gangues se collent entres elle pour former une masse compacte en l’absence de débris.

2320 Après la caractérisation des ovocytes atrésiques dans les gonades, leur

2321 quantification par histologie quantitative, la définition de leurs caractéristiques

2322 ultrastructurales, il est nécessaire de s’intéresser à leur devenir après leur émission dans

2323 le milieu. L’utilisation de colorants vitaux a été choisie pour observer l’état des ovocytes

2324 in toto après leur émission hors des gonades.

164

165

DETECTION DE L’ATRESIE

OVOCYTAIRE DANS LES

EMISSIONS DE GAMETES

DETECTION OF OOCYTE ATRESIA IN GAMETE EMISSIONS

166

167

2325 RESUME ET CONTEXTE

2326 ABSTRACT AND CONTEXT

2327 La caractérisation et la quantification histologiques de l’atrésie ovocytaire chez

2328 Tapes philippinarum et Cerastoderma edule ont été des étapes majeures dans la

2329 compréhension du processus et de ses implications dans le cycle reproducteur. Certains

2330 indices sur le devenir des ovocytes atrésiques ont dès lors été accumulés. Au cours de la

2331 période de gamétogenèse, aucun signe d’inflammation (absence de macrophage et

2332 d’hématocyte) des tissus gonadiques n’a été observé, bien que des ovocytes atrésiques

2333 étaient présents en nombre. Les ovocytes atrésiques ne semblent donc pas être résorbés,

2334 exceptés les ovocytes résiduels en fin de période de reproduction (phase de résorption).

2335 Les études ultrastructurales, réalisée précédemment, ont révélé que la membrane des

2336 ovocytes atrésiques se rompait, laissant ainsi tout le contenu cytoplasmique se disperser

2337 dans la lumière acinale.

2338 Malgré ces indications, l’état des ovocytes émis par les palourdes et les coques

2339 femelles lors des pontes, n’est pas connu et seules des suppositions et extrapolations par

2340 rapport à ce qui est observé dans la gonade peuvent être faites. Le comptage du nombre

2341 d’ovocytes émis permet d’évaluer la fécondité, c’est-à-dire le nombre de gamète émis,

2342 mais pas la fécondité réalisée, c’est-à-dire e nombre d’ovocyte viables émis.

2343 Afin d’éclaircir cette question, une étude des ovocytes in toto et in vivo a été

2344 entreprise. La priorité a été donnée à l’étude des ovocytes émis, mais au vu des difficultés

2345 pour obtenir des pontes en laboratoire, la technique du stripping a également été 168

2346 appliquée en complément. Pour colorer les ovocytes, deux colorants vitaux ont été

2347 utilisés :

2348 - Le Bleu Trypan colore les cellules ayant une membrane très dégradée, et donc

2349 les cellules mortes. Ce colorant est peu soluble dans l’eau salée, ce qui a rajouté

2350 une difficulté à son utilisation dans le cadre de cette étude.

2351 - Le Rouge Neutre est réputé pour colorer les lysosomes dans les cellules vivantes,

2352 il a l’avantage d’être très simple d’utilisation et peu coûteux.

2353 En utilisant ces deux colorants, une description des ovocytes in toto, émis lors d’une

2354 ponte ou bien issus de stripping de la gonade a été réalisée. Une étude quantitative a

2355 également été menée pour quantifier les différents types d’ovocytes dans les pontes. Une

2356 seule espèce avait donné suffisamment de pontes et d’ovocytes pour permettre cette

2357 étude quantitative, C. edule. Néanmoins des colorations ont également été appliquées

2358 chez l’huître japonaise, Crassostrea gigas, la moule, Mytilus edulis, et la palourde

2359 japonaise T. philippinarum. L’application de cette méthode sur plusieurs espèces a

2360 démontré son intérêt dans l’évaluation de la qualité des pontes, et donc de la fécondité

2361 de plusieurs espèces de bivalves. En effet, l’utilisation du Rouge Reutre en particulier a

2362 permis de visualiser les ovocytes sains, mais également les ovocytes atrésiques. Ce

2363 colorant pouvait rester plusieurs heures, voire plusieurs jours dans les cellules, qui se

2364 divisaient pour atteindre les premiers stades larvaires, larves toujours colorées en rouge.

2365

169

2366 Le pourcentage très élevé d’ovocytes morts et atrésiques émis par les femelles a

2367 démontré une fois de plus, l’importance du processus atrésique dans le cycle de

2368 reproduction des bivalves, et l’intérêt de s’y intéresser de plus près.

2369 LA VIABILITE DES OVOCYTES DE

2370 BIVALVES REVELEE GRACE A LA

2371 COLORATION VITALE AU ROUGE

2372 NEUTRE

2373 EXAMINING BIVALVE FECUNDITY:

2374 OOCYTE VIABILITY REVEALED

2375 BY NEUTRAL RED VITAL STAINING 2376

2377 D’après un article soumis :

2378 Aquaculture International

2379 EXAMINING BIVALVE FECUNDITY:

2380 OOCYTE VIABILITY REVEALED

2381 BY NEUTRAL RED VITAL STAINING

2382

2383 Peter G. BENINGER, Daphné CHÉREL, Lucie KESSLER

170

2384 VI- 2 . 1 . ABSTRACT

2385

2386 Estimation of realized fecundity (Freal, number of viable oocytes produced) is an

2387 essential, yet seldom-achieved element in the understanding of marine animal production

2388 and population dynamics. We used the Neutral Red (NR) vital stain to determine oocyte

2389 viability in spawns and gonad strippings of four species of commercially-important

2390 bivalves: Cerastoderma edule (L), Crassostrea gigas Thunberg, Mytilus edulis L, and

2391 Tapes philippinarum (Adams and Reeve). Normal, live oocytes were either spherical

2392 (mature oocytes) or pedunculated (immature oocytes), and stained with NR;

2393 atresic/abnormal oocytes also stained with NR, but could be easily recognized due to their

2394 abnormal shape; and dead oocytes did not stain with NR.

2395 Across the species studied, a considerable and highly-variable proportion of

2396 spawned or stripped oocytes was either dead or non-viable (34-85%), consistent with a

2397 reproductive Red Queen dilemma, in which greater oocyte numbers do not translate to

2398 commensurately greater real fecundities, and also with a Sweepstakes Reproductive

2399 Success strategy, in which a large range of Freal confronts the considerable variability of

2400 intertidal environmental conditions. Neutral Red vital staining is a promising tool for the

2401 elucidation and optimization of crucial, yet previously intractable aspects of bivalve

2402 hatchery production, genetic improvement, restocking, stock management, and

2403 conservation.

171

2404 VI- 2 . 2 . INTRODUCTION

2405

2406 Bivalve capture fisheries and aquaculture account for approximately 15 % of global

2407 annual seafood production, registering an eightfold increase over the bivalve production

2408 levels recorded in the 1970’s (Wijsman et al., 2019). Although aquaculture is the major

2409 focus of bivalve production, fisheries management, restocking, conservation, and pollution

2410 monitoring are also important objectives (His et al., 1999; Gomez and Mingoa-Licuanan,

2411 2006; Arnold, 2008; Joaquim et al., 2008; González‐Wangüemert et al., 2018; Kreeger et

2412 al., 2018; Shantharam et al., 2019).

2413 The need to assess oocyte quality for improved bivalve production has been

2414 recognized for decades (Utting and Millican, 1997); however, this criterion has not yet

2415 been incorporated into broodstock genetic improvement efforts (Boudry, 2009; Barros et

2416 al., 2018). Similarly, the assessment of fecundity and elucidation of early life stage

2417 mortality is, either directly or indirectly, at the heart of stock-recruitment analysis (Aoyama,

2418 1989; Koslow, 1992; Jennings et al., 2001; Maunder and Thorson, 2019) yet the

2419 evaluation of oocyte quality in spawns is a missing element in this process.

2420 To date, the relatively few assessments of oocyte quality have often been performed

2421 retrospectively, through analysis of chemical composition and performance indicators

2422 (Caers et al., 1999, 2002; Massapina et al., 1999; Nevejan et al., 2003; Cannuel and

2423 Beninger, 2007; Corporeau et al., 2012; García-Corona et al., 2018). Histochemical

2424 staining of specific oocyte components, in particular lipids, may also yield information on

2425 oocyte quality (Valdez-Ramirez et al., 2002). Lipid-specific stains such as Oil Red O and

172

2426 Sudan Black have been used to evaluate the quality of spawned oocytes (Gallager and

2427 Mann, 1986; Gallager et al., 1986b; Gómez-Robles et al., 2005; Angel-Dapa et al., 2010);

2428 however, the level of a biologically-important chemical component does not signify that

2429 the organism or cell is even alive (Moens and Beninger, 2018).

2430 The criterion of viability is surely the most fundamental of all oocyte quality indicators.

2431 The presence of atresic oocytes within the gonad reduces the realized fecundity (Freal)

2432 compared to the potential fecundity (Fpot – Jennings et al., 2001); in the case of marine

2433 bivalves, this has been estimated at approximately 50% of the total gamete volume over

2434 the course of the gametogenic cycle (Chérel and Beninger, 2017, 2019; Chérel et al.,

2435 2020). It is not known what proportion, if any, of these atretic and other nonviable (dead)

2436 oocytes are spawned along with normal oocytes. Ideally, therefore, evaluation of spawn

2437 viability should yield information on the number of live, dead, and dying (atresic) oocytes.

2438 A promising candidate for bivalve oocyte viability assessment is the Neutral Red (NR)

2439 stain. First reported as a vital stain by Ehrlich (1894), various NR protocols emerged as

2440 standard tests for cell vitality, beginning late in the 20th century (Winckler, 1974; Nemes

2441 et al., 1979; Hammond et al., 1980), usually in the context of tissue cultures or single cells

2442 subjected to various challenges (Borenfreund and Puerner, 1984; Triglia et al., 1991;

2443 Lowe et al., 1992, 1995a, 1995b; Babich and Borenfreund, 1993; Weeks and Svendsen,

2444 1996; Chiba et al., 1998; Svendsen et al., 2004; Repetto et al., 2008; Aguirre-Martínez et

2445 al., 2013; Patetsini et al., 2013; Hu et al., 2015; Liu et al., 2018). The technique was used

2446 as early as 1972 by Dressel et al. to differentiate between live and dead plankton, and

2447 continues to be so used to the present (Crippen and Perrier, 1974; Horvath and Lamberti,

2448 1999; Tang et al., 2006; Elliott and Tang, 2009; Zetsche and Meysman, 2012; Da Luz et 173

2449 al., 2016). It is thus somewhat surprising that it has not yet been employed for the same

2450 purpose in bivalve oocytes.

2451

2452 Ideally, a spawn viability assessment should have the characteristics listed in Table

2453 VI-1.

2454 TABLE VI-1. Criteria for an optimal oocyte vital stain

2455 o Specificity for live oocytes

2456 o Low per-test cost

2457 o Low equipment cost

2458 o Simplicity – for routine use by hatchery workers

2459 o Rapid execution and rapid results – so that the oocytes may

2460 be either used or disposed of immediately after obtention

2461 o Low sample size (to preserve the utility of the obtained oocytes)

2462 o Universality – for use with any bivalve species

2463

2464 The present study documents the use of Neutral Red as a vital stain, to collect the

2465 first known data on the viability of oocytes obtained by induced spawning or gonad

2466 stripping in four species of commercially-important bivalves: Cerastoderma edule (L),

2467 Crassostrea gigas Thunberg, Mytilus edulis L, and Tapes philippinarum (Adams and

2468 Reeve).

2469

2470 174

2471 VI- 2 . 3 . MATERIAL AND METHODS

2472 Sampling and gamete obtention

2473 All bivalves were haphazardly collected in the Traict du Croisic, on the French

2474 Atlantic coast (47°17'26" N, 2°30'16.2" W). Cerastoderma edule and T. philippinarum

2475 were sampled on the mudflat at low tide, whereas Crassostrea gigas and M. edulis were

2476 sampled on adjacent rocky substrates. Sampling for Cerastoderma edule was performed

2477 on April 17 and May 2, 2019, because previous work had shown them to be spawning-

2478 competent at this early date in the gametogenesis season (Chérel and Beninger, 2019).

2479 Only individuals >20 mm shell length were retained, corresponding to the size at which

2480 normal gamete production is achieved (Mejuto, 1984; Pérez Camacho and Román, 1984);

2481 the actual size range was 20.80 – 35.11 mm, and the corresponding shell age rings were

2482 1 – 2.5 years.

2483 Additional sampling was performed on 11 and 25 June 2019, at which time all four

2484 species were in advanced gametogenesis, and on 31 July 2020, when spawnings were

2485 known to occur. M. edulis specimens were all > 40 mm, T. philippinarum were all > 20

2486 mm, and Crassostrea gigas were all > 20 mm; the latter to ensure that some males were

2487 sampled for spawning induction.

2488 Spawning induction was repeatedly attempted for all four species, using various

2489 thermal shock – emersion regimes, as well as the addition of spermatozoa stripped from

2490 male individuals. Successful induction was obtained for at least 8 Cerastoderma edule, 3

2491 M. edulis, and 1 Crassostrea gigas specimens. Experience showed that cockles spawned

175

2492 more readily in groups of 3-4 individuals, so it was not possible to ascertain the exact

2493 number of individuals that spawned (especially since release occurred in short ‘dribbles’

2494 of nearly-transparent oocytes). Gamete stripping was used to obtain oocytes for all other

2495 manipulations. Table VI-2 summarizes the numbers of individuals actually used for each

2496 staining assay. As Cerastoderma edule was the most oogenically advanced of the four

2497 species studied in April and May 2019, spawning induction was attempted every day up

2498 to 8 days following sampling (Table VI-2); specimens were kept in cold storage (emersion,

2499 4°C) between spawning attempts.

2500 TABLE VI-2. Number of females from which gametes were obtained by induced 2501 spawning or gonad stripping. *, at least one of the spawning group per spawn

2502 Spawn Stripping 2503 Cerastoderma edule 8* 3

2504 Mytilus edulis 3 1

Crassostrea gigas 1 3

2505 Tapes philippinarum 5

2506

2507 Staining procedure

2508 Neutral Red was used as a vital stain, and for contrast, Trypan Blue was employed

2509 as a mortal stain (Wales, 1959; Talbot and Chacon, 1981; Kwok et al., 2004; Strober,

2510 2015; Rajab and Demer, 2019). Exploratory work showed that the best staining results

2511 were obtained with Neutral Red at 5 mg ml-1, and Trypan Blue at 2 mg ml-1 of filtered

2512 seawater. Although a large amount of undissolved Trypan Blue remained at this latter

176

2513 concentration, it was nonetheless necessary in order to obtain sufficient dissolved product

2514 capable of staining dead oocytes. Oocytes transferred to a microscope slide using a

2515 Pasteur pipette could be observed under an Olympus Provis AX70 optical microscope

2516 within 3 min of addition of a drop of NR prepared stain. The TB stain necessitated at least

2517 1 h incubation time at room temperature prior to observation. Oocyte counts were

2518 performed for Cerastoderma edule at 40x on a haphazardly-chosen slide transect using

2519 Olympus cellSens Standard software; counting was stopped at 200 oocytes.

2520

2521 VI- 2 . 4 . RESULTS

2522

2523 In contrast to histological preparations, the whole mount preparations necessary for

2524 the examination of spawned oocytes do not provide sufficient cellular detail to definitively

2525 identify atresic oocytes; therefore, all live oocytes with abnormal shapes, cytoplasmic

2526 shrinkage, and ruptured cell membranes were designated as ‘atresic/abnormal’. The three

2527 oocyte viability categories were thus (1) ‘normal’ (live, normally-shaped, no cytoplasmic

2528 shrinkage or membrane rupture), (2) ‘atresic/abnormal’, and (3) ‘dead’ (unstained, little or

2529 no cytoplasm, ruptured membranes).

2530 Efficient determination of all three oocyte viability categories was not possible using

2531 unstained whole mounts (Fig. VI-1A). Neutral Red stained both normal and

2532 atresic/abnormal oocytes of all four species studied. Atresic/abnormal oocytes were

2533 easily recognized by their irregular shapes, cytoplasmic shrinkage, and ruptured cell

2534 membranes (Fig. VI-1 B-D; VI-2 A, B). Dead oocytes were either not stained, or so faintly 177

2535 stained that they were easily recognized (Figs. VI-1 – VI- 4). Only NR-stained, spherical

2536 oocytes developed into larvae (Fig. VI-4). The initial divisions produced uniformly-stained

2537 cells, whereas at the first larval stage the NR had clearly relocated to the cell nuclei (Fig.VI-

2538 4).

2539

A * B DO MO PO *

* * MO * OC 100 µm * 100 µm C MO D E * OC * OC OC * DO OC MO * 100 µm 100 µm 50 µm Figure VI-1. Cerastoderma edule whole mounts. (A) unstained, spawned oocytes (B) spawned oocytes double-stained with Neutral Red and Trypan Blue. DO, dead oocyte; MO, mature oocyte; OC, oocyte coat, *, atresic oocyte. C-E, details of oocytes from double-staining protocol: C, details of mature, atresic, and dead oocytes; D, detail of one mature and one atresic oocyte; Note ooplasmic shrinkage. E, detail of dead pedunculated oocyte.

178

A * MO * *

* * MO

50 µm B C MO MO *

DO * 50 µm 50 µm

Figure VI-2. Mytilus edulis spawned oocytes double-stained with RN and BT. DO, dead oocyte; MO, mature oocyte, *, atresic/abnormal oocytes.

2540

179

2541 The results of the Cerastoderma edule oocyte viability counts are presented in

2542 Table VI-3. The ranges of inter-individual variation were themselves quite varied, e.g. from

2543 2.7 to 79.8% for normal oocytes, and 2.6 to 48.5% for atresic/abnormal oocytes. The

2544 corresponding means presented similar strong variations among the different sampling A MO

DO

MO 20 µm

MO B PO DO DO

DO P

MO 20 µm

Figure VI-3. A, Tapes philippinarum stripped oocytes stained with NR. MO, mature oocyte; DO, dead oocyte. B, Crassostrea gigas stripped oocytes stained with NR. PO, pedunculated oocyte. Most live oocytes are immature.

180

2545 and spawning dates, from 14.3 to 66.4%, and 11.9 to 81.8%. The values for

2546 atresic/abnormal oocytes were generally superior to those of normal oocytes; dead

2547 oocytes were the smallest category except for the value obtained after 8 days of cold

2548 storage (73.9%). This being an observational study, no frequentist statistical tests were

2549 performed (Beninger et al., 2012; Beninger and Boldina, 2018).

A B C

N

20 µm 20 µm 20 µm C D

10 µm

Figure VI-4. Crassostrea gigas whole mounts. Early development of stripped, fertilized oocytes stained with NR. (A) immediately after fertilization, one polar body (PB) evident; (B) initiation of first cytokinesis; (C) 8 - cell stage, nuclei (N) clearly visible; (D) Second day after spawning and staining, early trochophore larva. Note NR stain now concentrated in nuclei. C, cilia.

181

2550

TABLE VI-3. Cerastoderma edule mean oocyte viability counts (%). N, number of females; NR, Neutral Red stained; TB, Trypan Blue stained.

NR TB

Days in Sampling cold Atresic / dates N Healthy Dead storage Range Abnormal Range Range Spawning dates

1 2/05/19 03/05/19 4 14.6 81.8 3.6 19.4 23.0 7.4

2 17/04/19 19/04/19 3 30.0 65.6 4.3 28.3 32.2 3.9

4 06/05/19 7 41.7 54.6 3.7 59.5 48.5 14.3 2/05/19 5 5 34.3 41.9 23.8 07/05/19 42.1 39.5 32.2 6 17/04/19 23/04/19 3 66.4 23.7 9.9 2.7 14.4 17.1

7 09/05/19 4 34.6 46.2 19.2 79.8 47.1 32.7 2/05/19 8 10/05/19 2 14.3 11.9 73.9 12.0 2.6 12.0

Means of pooled counts 28 34.9 48.8 15.2 Range 79.8 79.1 78.5

182

2551 VI- 2 . 5 . DISCUSSION

2552

2553 Given the diversity of cell types in which a similar result has been obtained, there

2554 was little reason to doubt that NR would also stain live bivalve oocytes (Crippen and

2555 Perrier, 1974; Triglia et al., 1991; Lowe et al., 1992, 1995a, 1995b; Babich and

2556 Borenfreund, 1993; Weeks and Svendsen, 1996; Chiba et al., 1998; Horvath and

2557 Lamberti, 1999; Svendsen et al., 2004; Tang et al., 2006; Repetto et al., 2008; Zetsche

2558 and Meysman, 2012; Aguirre-Martínez et al., 2013; Patetsini et al., 2013; Da Luz et al.,

2559 2016; Liu et al., 2018). Yet beyond the necessity to verify this, it was important to

2560 determine how atresic/abnormal - 'not dead yet’ - oocytes would react with NR. As

2561 anticipated, these oocytes also stained to a variable degree with NR; yet the stain served

2562 to facilitate the detection of the abnormal cell shapes characteristic of such oocytes, and

2563 hence, to allow their ready identification and quantification. Overall, contrasting use of

2564 Trypan Blue was deemed unnecessary in routine work, especially since it was difficult to

2565 use, due to its low solubility in seawater and lengthy staining time (introducing an oocyte

2566 mortality artefact); it is also comparatively expensive.

2567 The mechanism of NR vital staining has been the object of a great deal of iterative

2568 conjecture, which has become unverified conventional wisdom since the procedure was

2569 first presented by Ehrlich in 1894 (Jacques, 1969; Nemes et al., 1979; Hammond et al.,

2570 1980; Borenfreund and Puerner, 1985; Borenfreund et al., 1988; Triglia et al., 1991;

2571 Weeks and Svendsen, 1996; Svendsen et al., 2004; Repetto et al., 2008). Later studies

2572 proposed lysosomes as the ‘Zellen Körnchen’ (cell granules) in which Ehrlich observed

183

2573 the stain to be concentrated; the micrographs of Lowe et al. (1992) and Patetsini et al.

2574 (2013) are among the rare publications which actually support this interpretation -

2575 although not all lysosomes of a given cell appear to have this property (Winckler, 1974).

2576 Notwithstanding the conjecture concerning the exact dynamics of NR within cells, it

2577 may be confidently assumed to cross the cell and lysosomal membranes (although the

2578 mechanism is not known); it is accumulated in the lysosomes due to a much slower re-

2579 diffusion to the cytoplasm. Re-diffusion to the cytoplasm and the external medium is

2580 accelerated by physical membrane damage, and possibly impairment of the lysosomal

2581 proton pump (Winckler, 1974; Lowe et al., 1992; Patetsini et al., 2013). Our results show

2582 that after leaving the lysosome, NR enters and is retained in the nuclei of Crassostrea

2583 gigas trochophore larvae. These observations confirm that the oocytes which took up NR

2584 were viable, and some of them developed into larvae.

2585 Prior to the present study, it was not known whether the atresic oocytes, identified in

2586 the gonad by histology, were absorbed prior to spawning, or were incapable of being

2587 spawned, or if some or all of them appeared in the spawn. Our observations confirm that

2588 a large proportion of atresic/abnormal oocytes are spawned along with the normal

2589 oocytes. The high proportion of atresic and dead oocytes observed in the present study

2590 (30-85%), is entirely consistent with the previously-published quantitative histological data

2591 (Chérel and Beninger, 2017, 2019). A high proportion of inviable post-fertilization stages

2592 is typical of high-fecundity species, including bivalves (Plough et al., 2016; Plough, 2018);

2593 here we show that these high-fecundity species are also characterized by a high

2594 proportion of inviable pre-fertilization oocytes. The atresia-fraught diminishing returns of

184

2595 many bivalves’ high fecundity has been likened to a reproductive Red Queen dilemma:

2596 greater oocyte production does not translate to a commensurate increase in real fecundity

2597 (Chérel et al., 2020).

2598 The very wide range of values for inviable oocytes from different individuals and time

2599 periods observed in the bivalve species studied here, is also consistent with the

2600 Sweepstakes Reproductive Success (SRS) hypothesis for typical high-fecundity, Type III

2601 survivorship marine species. Although at the population level, this strategy enables

2602 optimal exploitation of the rapidly-changing environmental conditions of the nearshore

2603 marine environment, at the individual level it has many ‘losers’ and few ‘winners’

2604 (Hedgecock and Pudovkin, 2011). Further support for a strong genetic inviability – SRS

2605 component to the phenomenon of oocyte atresia comes from previous studies which

2606 showed that levels of atresia remain similar under widely different physical perturbation

2607 conditions (Chérel and Beninger, 2017, 2019). Environmental aggression may contribute

2608 additional effects (Beninger, 2017; Smolarz et al., 2017).

185

2609 VI- 2 . 6 . CONCLUSION

2610

2611 To our knowledge, the Neutral Red procedure outlined herein is the first and only

2612 technique which incorporates all of the criteria of Table 1, allowing the rapid, easy

2613 detection of live, atresic/abnormal, and dead oocytes in spawns or gonad strippings. Its

2614 success in all four bivalve species suggests that it may be a universal tool for the

2615 evaluation of bivalve oocyte spawn quality. It can be used expeditiously for this purpose

2616 prior to hatchery fertilization and larval rearing, and also as a phenotypic marker for

2617 genetic improvement of broodstock. Its potential contribution to aquaculture is particularly

2618 important, providing a means of assessing spawn quality in bivalve hatcheries.

2619 Application to restocking is also important, since stock production estimates are heavily

2620 dependent on determinations of Freal, i.e. the number of viable oocytes produced (Aoyama,

2621 1989; Koslow, 1992; Jennings et al., 2001; Maunder and Thorson, 2019). Other important,

2622 overlapping applications include environmental monitoring, and conservation.

2623 The oocytes of many benthic marine invertebrates are similar in overall structure and

2624 composition (Adiyodi and Adiyodi, 1983; Wourms, 1987). Future research may therefore

2625 show NR vital staining to be a valuable tool in assessing oocyte viability in diverse marine

2626 taxa, including the ecologically and commercially-important Anthozoa, Polychaeta and

2627 Gastropoda.

186

2628 VI- 2 . 7 . ACKNOWLEDGMENTS

2629

2630 We thank Mathilde Clairambault for her patience and perseverance in the laboratory

2631 spawning trials. We are indebted to David Berteau and employees of Chellet-Berteau

2632 Production for their warm welcome and permission to sample on-site.

2633 Declarations

2634 Funding No funding was allocated to this study.

2635 Data availability statement All files from this study ae available from the authors upon

2636 reasonable request.

2637 Compliance with ethical standards

2638 Conflict of interest The authors declare that they have no conflicts of interest.

2639 Ethical approval All applicable international, national, and/or institutional guidelines

2640 for the care and use of animals were followed by the authors.

187

2641 CONCLUSIONS ET PERPECTIVES

2642 CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES

2643 Au cours de cette étude il a été montré que le Rouge Neutre pouvait être utilisé

2644 pour établir la viabilité des ovocytes de bivalves à un instant t, mais également les

2645 ovocytes qui sont voués à mourir (atrésiques). L’utilisation du Rouge Neutre peut être

2646 préconisée pour la recherche, et pourquoi pas à terme pour une application par les

2647 professionnels de la conchyliculture afin d’estimer aisément la qualité des gamètes émis.

2648 La quantification des ovocytes sains, atrésiques ou morts dans les pontes de

2649 coques a confirmé les prédictions obtenues en histologie quantitative (quant à

2650 l’importance de l’atrésie ovocytaire) dans les Chapitres II et III. Le pourcentage très élevé,

2651 les variations interindividuelles relevés dans les études histologiques ainsi que les

2652 variations entre les comptages de la présente étude, sont compatibles avec l’hypothèse

2653 Sweepstakes Reproductive Success, typique des espèces à forte fécondité (stratégie

2654 reproductive r). Cette stratégie permet aux populations d’être plus résilientes aux

2655 variations environnementales, et donc offre une meilleure survie de l’espèce au cours du

2656 temps. Ces observations recoupent celle réalisées sur la sex-ratio de la coque, montrant

2657 une gamétogenèse asynchrone entre les individus, permettant d’obtenir des gamètes tout

2658 au long de l’année.

188

189

GENERAL CONCLUSION

190

191

2659 CHARACTERIZATION OF

2660 OOCYTE ATRESIA

2661

2662 Characterizing oocyte atresia in bivalves, i.e. proposing criteria for recognition, was

2663 one of the main thrusts of this thesis. Three methods were used for this purpose, taking

2664 as a model two species, the Manila clam Tapes philippinarum and the common cockle

2665 Cerastoderma edule:

2666 - Optical microscopy (qualitative histology) with a modified Masson trichrome stain;

2667 - Transmission Electron Microscopy;

2668 - Vital staining with Neutral Red.

2669

2670 VII- 1 . 1 . HISTOLOGICAL STUDIES

2671

2672 Histological studies conducted during this thesis revealed common features of

2673 oocyte atresia in the cockle and the clam. The main ones are as follows:

2674 - A deformation of the ooplasm and an irregular cell shape;

2675 - A degradation of the chromatin.

2676 Since the studies were conducted over periods covering at least one complete

2677 reproductive cycle, several observations concerning the distribution in time and space of

2678 the atresic oocytes could be made:

192

2679 - The atresic oocytes were present throughout the reproductive period, before the

2680 first and until after the last gamete release;

2681 - Oocyte atresia concerned all types of oocytes, regardless of their stage of

2682 oogenesis and vitellogenesis;

2683 - An oocyte could show characteristics of atresia without affecting neighboring

2684 oocytes.

2685

2686 VII- 1 . 2 . TRANSMISSION ELECTRONIC 2687 MICROSCOPY STUDY

2688

2689 The Transmission Electron Microcopy (TEM) study carried out during this thesis gave

2690 preliminary results that will be investigated further, thereafter. However, the following

2691 ultrastructural elements, characteristic of atresia, have been identified:

2692 - Vacuolation of the cytoplasm;

2693 - Degradation of the cytoplasmic organelles;

2694 - The appearance of a myelin-like figures;

2695 - Degradation of the ooplasm followed by its rupture with a discharge of the

2696 cytoplasmic contents into the acinal lumen;

2697 - Disappearance of cortical granules in clams;

2698 - Cessation of the mucus exocytosis responsible for the creation of the oocyte coat

2699 in the cockle.

193

2700 These characteristics have also been found in many other bivalve species, either in

2701 histology or in TEM (Pipe, 1987a; Dorange and Le Pennec, 1989; De Gaulejac et al.,

2702 1995; Chung, 2007, 2008; Chung et al., 2007, 2008; Kim and Chung, 2014; Kim et al.,

2703 2014; Camacho-Mondragón et al., 2015, 2019; Kim, 2016; Beninger, 2017). Atresia thus

2704 appears to be a very common, probably universal, phenomenon in bivalves.

2705 A previously unrecognized, and fundamental point has been underlined by this work:

2706 oocyte atresia was present before oocyte spawning and was therefore not confined to the

2707 resorption period like it is still too frequently considered by many researchers. In fact, most

2708 authors working on bivalve reproduction observed oocyte atresia only during this

2709 particular period (Beninger, 2017). It has been shown here that this phenomenon operates

2710 throughout the reproductive cycle of the bivalves and therefore has an unsuspected

2711 importance in the course of the cycle.

2712

2713 VII- 1 . 3 . VITAL STAINING

2714

2715 Optical and electronic microscopy studies have provided data on the unspawned

2716 oocytes. In order to ascertain the ultimate disposition of atresic oocytes, laboratory

2717 emissions of cockle’s gametes and gonad stripping in clams, mussels (Mytilus edulis) and

2718 oysters (Crassostrea gigas) were combined with Neutral Red vital staining. The atresic

2719 oocytes, stained with Neutral Red, i.e. still alive, showed:

2720 - An abnormal, irregular, non-spherical shape;

194

2721 - Cytoplasmic shrinkage

2722 - Ooplasm rupture in some cases.

2723 Dead oocytes are not stained with Neutral Red. The use of this dye has shown that oocyte

2724 atresia constitutes a pathway to cell death, rather than an instantaneous mortality, and

2725 this is reflected in the spawned oocytes. The lack of pre-spawning atresic oocyte

2726 resorption represents an energetic loss for the bivalve; it is possible that resorption on the

2727 scale required would compromise the ongoing gametogenesis.

2728

2729 VII- 1 . 4 . THE NATURE OF OOCYTE ATRESIA

2730

2731 There are three main types of cell death, each with its own characteristics: autophagy,

2732 necrosis and apoptosis. Atresia does not appear to belong wholly to any of them. Ooplasm

2733 rupture and discharge of the cytoplasmic contents into the acinal lumen are suggestive of

2734 necrosis. On the other hand, the triggering modes, which sometimes appear to be internal

2735 to the cell, as in this study, or linked to exogenous factors in other species, resemble the

2736 mechanisms that trigger apoptosis (cf. VII-3). The elucidation of this question would

2737 require the search for necrosis and apoptosis factors, detectable by histochemistry and

2738 perfectly chosen, which should be a logical continuation of this thesis.

2739

195

2740 QUANTIFICATION OF OOCYTE

2741 ATRESIA

2742

2743 The quantification of oocyte atresia was performed on histological sections, by

2744 stereology, and on cockle oocyte emissions.

2745

2746 VII- 2 . 1 . QUANTIFICATION BY STEREOLOGY

2747

2748 Quantification by stereology was carried out over a minimum duration of one

2749 reproductive cycle for each studied species. The volume fractions of healthy mature,

2750 healthy immature and atresic oocytes were similar for both species. Approximately one

2751 third of the oocyte volume fraction was occupied by atresic oocytes.

2752 A notable difference existed between cockles and clams. The reproductive cycle of

2753 individuals was synchronous for the clams during the year (Chérel and Beninger 2017),

2754 but it was not for the cockles; individuals undergoing active gametogenesis were mixed

2755 with resting individuals at any time of the year (Chérel and Beninger 2019).

2756 A minimum impact index of atresia was created to estimate that during

2757 gametogenesis approximately 50% of the oocyte volume would eventually be occupied

2758 by atresic oocytes, suggesting that approximately half of the oocytes was destined to

2759 become atresic (Chérel and Beninger 2017, 2019). For the population studied, atresic

196

2760 oocytes represent about 15% of the clam's wet tissue weight in summer (cf. III-5.2. and

2761 Fig. III-13).

2762

2763 VII- 2 . 2 . QUANTIFIACTION IN GAMETES EMISSIONS

2764

2765 The percentages of atresic oocytes released from cockles gave the following

2766 results: approximately 50% of the oocytes released were atresic and more than 15% were

2767 already dead. (Beninger et al., submitted). Although, characterized by high inter-individual

2768 variation, these values are consistent with the results obtained in stereology.

2769

2770 VII- 2 . 3 . TEMPERING THE USUAL QUANTIFICATION 2771 METHODS OF REPRODUCTIVE EFFORT AND 2772 FECUNDITY

2773

2774 Condition index (CI) is one of the main methods to estimate reproductive effort

2775 (Lucas and Beninger, 1985). According to the studies realized in this thesis, this use must

2776 be tempered for two reasons. First of all, because of oocyte atresia, the reproductive effort

2777 estimated with CI should be divided by two, to obtain the effective reproductive effort,

2778 which means the quantity of healthy oocytes produced. Secondly, CI was not

2779 systematically correlated to the importance of gametogenesis but was also dependent on

2780 the importance of the energy reserves constituted by the bivalve. In most species, CI was

197

2781 largely dependent on gametogenesis, as was the case for the clam population studied,

2782 but not for the cockle population (cf. III – 5 . 2, Chérel and Beninger, 2017, 2019).

2783 To estimate directly the fecundity, the usual method is to count the number of

2784 oocytes released by an individual. Again, precautions must be taken. Neutral Red staining

2785 has shown the presence of many dead or abnormal/ atresic oocytes in the oocytes

2786 emission, which further reduces fecundity (cf. Chapitre VI, Beninger et al., submitted).

2787 HYPOTHESIS ON THE SOURCES

2788 AND ROLES OF OOCYTE ATRESIA IN

2789 BIVALVES

2790

2791 The sacrifice of healthy or altered female gametes for nutrient transfer to oocytes

2792 during vitellogenesis is well documented in molluscs (Webber, 1977; De Jong-Brink et al.,

2793 1983; Wourms, 1987; Ponder et al., 2019). Several authors have proposed that auxiliary

2794 cells resorb the products of oocyte atresia in order to reuse them in the subsequent

2795 vitellogenesis processes (Pipe, 1987b, 1987a; Dorange and Le Pennec, 1989; Le Pennec

2796 et al., 1991; De Gaulejac et al., 1995; Chung, 2007, 2008; Kim and Chung, 2014; Kim et

2797 al., 2014; Kim, 2016). No evidence of resorption of atresic oocytes, either by auxiliary cells

2798 or macrophages, was observed in Cerastoderma edule or Tapes philippinarum. The

2799 atresic oocytes are not resorbed, but were indeed emitted into the environment, at least

2800 partially. The energy expenditure required to produce these atresic oocytes, which do not

198

2801 participate in the effective reproductive effort, is significant, since it constituted

2802 approximately half of the total reproductive expenditure. Several hypothesis can be put

2803 forward concerning the roles and origins of this oocyte atresia.

2804 VII- 3 . 1 . THE ROLE OF OOCYTE DEBRIS

2805

2806 Some bivalves, such as the cockle, produce a very thick acid mucopolysaccharide

2807 (AMPS) coat around each of their oocytes (Beninger and Chérel, 2019). Rupture of the

2808 ooplasm allowed the release of the cytoplasmic contents of the atresic oocytes into the

2809 acinal lumen. These oocyte debris were covering this very sticky coat, limiting the

2810 adhesion of the oocytes to each other during their emission (Chérel et al., 2020).

2811 The coat has a protective action, for oocytes and larvae, against predators and

2812 environmental stresses (Hagström, 1959; Flinkman et al., 1994; Honkoop and Van der

2813 Meer, 1998; Farley and Levitan, 2001; Levitan, 2006; Fuiman et al., 2015; Pronker et al.,

2814 2015; Riera Romo et al., 2016; Beninger and Chérel, 2019; Chérel et al., 2020). The

2815 individualized emission of the gametes allows their dispersion in the environment. The

2816 cytoplasmic debris resulting from oocyte atresia makes it possible to combine the

2817 advantages of a mucosal coat while overcoming the disadvantages that this could cause.

2818 There is a functional link between these two phenomena in C. edule (Chérel et al., 2020).

2819

199

2820 VII- 3 . 2 . RED QUEEN AND SWEEPSTAKES 2821 REPRODUCTIVE SUCCESS (SRS) THEORY

2822

2823 High mortality at early stages, from egg to juvenile, is typical of high-fecundity

2824 species (reproductive strategy r), especially bivalves (Philippart et al., 2003; Saraiva et

2825 al., 2014; Plough et al., 2016; Plough, 2018). Quantification of atresic and/or dead oocytes

2826 in the gonad (in T. philippinarum and C. edule) and after gamete emission (in C. edule),

2827 performed in the present work (Beninger et al., submitted; Chérel and Beninger, 2017,

2828 2019), showed that this mortality also involved oocytes before fertilization. This decrease

2829 in fecundity due to oocyte atresia can be likened to a Red Queen reproductive dilemma,

2830 wherein the race for oocyte numbers does not translate to a proportional increase in

2831 realized fecundity (Beninger et al., submitted; Chérel et al., 2020).

2832 Considerable inter-individual variability was observed throughout these studies,

2833 both in terms of gametogenesis periods (asynchronous and throughout the year for the

2834 cockle) and in the proportion of atresic oocytes in the gonads. These variabilities are

2835 compatible with the Sweepstakes Reproductive Success (SRS) hypothesis, typical of

2836 high-fecundity marine species with Type III survival curves. This population bet-hedging

2837 strategy optimally exploits highly-variable environments, although at the individual level,

2838 reproductive success is usually not good (Hedgecock and Pudovkin, 2011).

2839 The impact of atresia on reproductive effort appears to remain the same under very

2840 different conditions of physical disturbance (Chérel and Beninger, 2017, 2019). This

2841 observation supports the hypothesis that oocyte atresia has an endogenous, probably

200

2842 genetic origin (Plough et al., 2016; Plough, 2018), consistent with the SRS theory. It

2843 therefore seems obvious that a similar level of oocyte atresia will be observed in a

2844 controlled environment such as a hatchery.

2845

2846 VII- 3 . 3 . EXOGENOUS SOURCES PROMOTING 2847 OOCYTE ATRESIA

2848

2849 Exogenous causes accentuating oocyte atresia can also be considered. The

2850 generalization of atresia within the gonads has been observed in several species due to

2851 environmental conditions which were deleterious to gametogenesis or larval survival, such

2852 as lack of food in the environment or insufficient water temperatures (Dorange and Le

2853 Pennec, 1989; Suárez et al., 2005; Beninger and Le Pennec, 2006; Dutertre et al., 2009).

2854 This type of generalization of oocyte atresia, with the loss of a complete cohort of oocytes,

2855 has not been observed in either T. philippinarum or C. edule during the course of this

2856 thesis; however, we did not study populations subjected to extreme conditions.

2857 Previous workers have shown the impact of pollution (oil derivatives, heavy metals,

2858 hormones, etc.) on the gametogenesis of different species of bivalves, and in particular to

2859 the degree of atresia during the resorption phase (Barszcz et al., 1978; Myint and Tyler,

2860 1982; Lowe and Pipe, 1986, 1987; Sunila, 1986, 1988; Kluytmans et al., 1988; Lowe,

2861 1988; Bowmer et al., 1994; Syasina et al., 1996; Timmermans et al., 1996; Vaschenko et

2862 al., 1997; Matozzo and Marin, 2007; Liu et al., 2014; Beninger, 2017; Smolarz et al., 2017;

201

2863 Rouabhi et al., 2019). It is possible that pollution may have an effect on the proportion of

2864 pre-spawning atresic oocytes in a gonad, but no study has yet investigated this possibility.

2865 ASSESSMENT AND

2866 PERSPECTIVES

2867

2868 The present thesis has elucidated to a considerable degree the phenomenon of

2869 oocyte atresia in bivalves. The characteristics of atresia (chromatin and organelle

2870 degradation, irregular shape, ooplasmic rupture) do not allow to define whether it is

2871 apoptosis or necrosis. The search for histochemical markers specific to these cell deaths

2872 is necessary to understand the mechanism responsible for oocyte atresia.

2873 Oocyte atresia represents approximately 50% of the reproductive effort in the two

2874 bivalves studied. These atresic oocytes are not resorbed, and most of them are emitted

2875 at the same time as healthy oocytes during spawning. The Red Queen-SRS theories

2876 provide an evolutionary basis for the existence of such a large and variable degree of

2877 oocyte mortality; nevertheless, it would seem to entail a particularly important loss of

2878 energy for the animal. In Cerastoderma edule, the thick and sticky mucous coat produced

2879 by each oocyte, here again, would be a loss of energy. Nevertheless, the present work

2880 has shown that there is a functional link between oocyte atresia and the coat. The oocyte

2881 debris, resulting from the rupture of the ooplasm of the atresic oocytes, covers the coat,

2882 allowing the individualization of the oocytes during emission. Oocyte atresia, therefore,

2883 allows the protection of a mucous coat, without sacrificing the dispersal of the early stages.

202

2884 Studies on other sites, other species and over longer time frames are needed,

2885 together with genetic analyses, in order to verify whether these principles are a general

2886 attribute among the Bivalvia. At this point, oocyte atresia appears to account for a

2887 significant amount of early life stage mortality in this group.

2888 This thesis highlights an important phenomenon of the reproductive cycle of

2889 bivalves. It proposes simple recognition criteria, based on simple techniques that should

2890 help future professionals in research or shellfish culture have integrated the oocyte atresia

2891 parameter in their studies, stock management program and production of bivalves.

2892

203

204

205

VALORISATION

VALORIZATION

206

207

2893 ARTICLES

2894

2895 VIII- 1 . 1 . PREMIER AUTEUR

2896 FIRST AUTHOR

2897 Chérel, D., and Beninger, P. G. 2017. Oocyte atresia characteristics

2898 and effect on reproductive effort of Manila clam

2899 Tapes philippinarum (Adams and Reeve, 1850). Journal of

2900 Shellfish Research, 36: 549–557.

208

2901 This article has been rewarded with an award:

2902 The Best Student Paper Award published in the Journal of Shellfish

2903 Research, 2017.

209

2904 Chérel, D., and Beninger, P. G. 2019. Oocyte atresia and its effect

2905 on reproductive effort of the common cockle

2906 Cerastoderma edule (Linneaus, 1758). Journal of Shellfish

2907 Research, 38: 603–609. 2908

210

2909 Chérel, D., Beninger, P. G., and Le Pennec, G. 2020. Two enigmas

2910 may solve each other: the oocyte coat and atresia in the

2911 common cockle, Cerastoderma edule (Linnaeus, 1758).

2912 Marine Biology, 167: 104. 2913

2914

2915

211

2916 VIII- 1 . 2 . DEUXIÈME AUTEUR

2917 SECOND AUTHOR

2918 Beninger, P. G., and Chérel, D. 2019. Cloaked bivalve oocytes:

2919 lessons in evolution, ecology, and scientific awareness.

2920 Ecology, 100: e02818. 2921

2922

2923 Beninger, P. G., Chérel, D., and Kessler, L. submitted. Examining

2924 bivalve fecundity: oocyte viability revealed by Neutral Red vital

2925 staining. Aquaculture International.

212

2926 AUTRE

2927 OTHER

2928

2929 Beninger, P. G., & Chérel, D. (2019). What cloaked bivalve oocytes

2930 teach us about reproductive biology, evolution, and scientific

2931 awareness. Bulletin of the Ecological Society of America,

2932 101(1), e01626

2933

2934

2935

2936

213

214

2937 215

2938 2939 CONGRÈS INTERNATIONAL

2940 Oral presentation at the WAS and EAS meeting AQUA 2018, 2941 Montpellier France:

216

217

REFERENCES

218

219

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Titre : L’atrésie ovocytaire chez les bivalves Cerastoderma edule et Tapes philippinarum Mots clés : atrésie, ovocytes, bivalves, histologie, cycles reproducteurs

Résumé : L’atrésie ovocytaire, une optique (histologie et ovocytes in toto) et de dégénérescence des ovocytes dans la gonade, microscopie électronique à transmission. La est un phénomène commun chez les bivalves, déformation puis la rupture de la membrane mais très souvent négligé dans les études sur ovocytaire a été mis en évidence, associées à les cycles reproducteurs. La présente étude une dégradation/désorganisation des organites propose des critères de reconnaissance de et de la chromatine. l’astrésie ovocytaire, un compte rendu de son La quantification par stéréologie a montré impact sur la fécondité de deux espèces que l’atrésie impactait environ la moitié du exploitées la palourde japonaise volume ovocytaire au cours de la Tapes philippinarum et la coque commune gamétogenèse, la plupart étant émis et non Cerastoderma edule ainsi qu’une réflexion sur résorbés par l’animal. Un lien fonctionnel entre son origine et son contexte évolutif et la gangue ovocytaire muqueuse et l’atrésie a été écologique. L’étude à été réalisée sur plusieurs établi chez la coque. L’atrésie pourrait avoir des années et sur plusieurs sites de la côte cause endogènes, accentuées par des facteurs atlantique française exogènes, typiques de stratégie reproductive La caractérisation de l’atrésie ovocytaire dans les milieux changeants. a été réalisée grâce à des outils de microscopie

Title : Oocyte atresia in the bivalves Cerastoderma edule and Tapes philippinarum Keywords : atresia, oocytes, Bivalvia, histology, reproductive cycles.

Abstract: Oocyte atresia is a common, and transmission electron microscopy tools. but very often neglected phenomenon of oocyte Deformation and subsequent rupture of the degeneration in reproductive studies of the oocyte membrane were observed, associated Bivalvia. The present study proposed criteria for with organelle and chromatin recognition of oocyte atresia, insights into its degradation/disorganization. origins and evolutionary/ecological Stereological quantification showed that consequences, as well as an estimation of its atresia impacted approximately half of the total impact on fecundity in two exploited species, oocyte volume during the gametogenesis, most the Manila clam Tapes philippinarum and the of which were emitted and not resorbed by the common cockle Cerastoderma edule. The study gonad. A functional link between the was carried out over several years, at several hypertrophied oocyte coat and atresia was sites on the French Atlantic coast. established in cockles. Atresia could have The characterization of oocyte atresia endogenous causes, accentuated by was performed using optical microscopy exogenous factors, typical of a reproductive (histology and whole mounts) strategy in highly variable environments.