Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De Ciências Da Saúde

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DIANA LUZIA ZUZA ALVES

FATORES DE VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA AO ESTRESSE OSMÓTICO E SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE ISOLADOS DE Candida tropicalis ORIUNDOS DE AMBIENTE COSTEIRO DO NORDESTE BRASILEIRO

NATAL 2015

DIANA LUZIA ZUZA ALVES

FATORES DE VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA AO ESTRESSE OSMÓTICO E SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE ISOLADOS DE Candida tropicalis ORIUNDOS DE AMBIENTE COSTEIRO DO NORDESTE BRASILEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Bioanálises e Medicamentos. Orientador: Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves

NATAL

2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Diretor do Centro de Ciências da Saúde: Prof. Hênio Ferreira de Miranda Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde: Prof. Antonio de Lisboa Lopes Costa Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Prof. Arnóbio Antônio da Silva Júnior Vice-coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Profa. Janaina Cristiana Oliveira Crispim Freitas

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia Médica e Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – Centro de Ciências da Saúde, contando com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Dedico este trabalho à minha mãe Maria Eliene Zuza Alves, primeira e eterna professora, por ser meu maior exemplo de superação e pelos seus 25 anos de excelente contribuição à educação de nosso país.

“Feliz o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento; porque melhor é o lucro que ela dá do que o da prata, e melhor a sua renda do que o ouro mais fino. Mais preciosa é do que pérolas, e tudo o que podes desejar não é comparável a ela. O alongar-se da vida está na sua mão direita, na sua esquerda, riquezas e honra. Os seus caminhos são caminhos deliciosos, e todas as suas veredas, paz. É árvore de vida para os que a alcançam, e felizes são todos os que a retêm”. Provérbios de Salomão 3:13-18

Agradecimentos

A Deus, terno e fiel amigo que está sempre ao meu lado e guiou todos os meus passos conforme Sua vontade agradável e perfeita. A minha família, que me motiva e apoia todos os dias com amor incondicional. Ao meu esposo Marcos, companheiro de todas as horas, pelo seu carinho, paciência e excepcional compreensão. A minha família em Cristo, por todo suporte espiritual e encorajamento. Aos colegas do Laboratório de Micologia Médica e Molecular, pelo companheirismo diário, solicitude e bom humor, tornando esse trabalho divertido e gratificante. Agradeço especialmente a Sayama Toscano e a Plínio Silva, pela contribuição significativa que me ofereceram de forma alegre, prestativa e responsável. A Profa. Christina Araújo, pela preciosa colaboração prestada na avaliação dos aspectos ambientais deste trabalho. Ao grupo do Laboratório de Imunodiagnóstico de Micoses (UFPE), em especial a Profa. Rejane Neves e ao Prof. Reginaldo Gonçalves Lima Neto, pela calorosa acolhida que me ofereceram por ocasião do treinamento nos testes de susceptibilidade a antifúngicos. Ao Prof. Antônio Oliveira, pelo auxílio com a análise estatística. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPgCF), pela oportunidade de realização desse trabalho à contento. Ao meu orientador, Prof. Guilherme Chaves, por me conceder a oportunidade de realizar o trabalho que gosto, sempre me acompanhando de perto em todas as etapas desse estudo e fazendo os ajustes necessários de maneira séria e gentil. Agradeço pela paciência, confiança e respeito com que me trata e por ser para mim um verdadeiro exemplo de pesquisador responsável e professor dedicado.

“São muitas, SENHOR, Deus meu, as maravilhas que tens operado e também os teus desígnios para conosco; ninguém há que se possa igualar contigo. Eu quisera anunciá-los e deles falar, mas são mais do que se pode contar”. Salmos 40:5

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA...... 04 AGRADECIMENTOS...... 05 LISTA DE FIGURAS ...... 09 LISTA DE TABELAS...... 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...... 12 RESUMO...... 15 ABSTRACT...... 16 1.0 INTRODUÇÃO...... 17 2.0 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...... 21 2.1 Contaminação dos ambientes costeiros: impacto sobre a saúde pública...... 22 2.2 Ocorrência de Candida tropicalis em solo de ambiente costeiro...... 25 2.3 Candida tropicalis: patógeno emergente e resistente a fármacos antifúngicos...... 27 2.4 Perspectiva do agente patogênico: fatores de virulência de Candida tropicalis...... 36 2.4.1 Capacidade de aderência em Candida tropicalis...... ,...... 36 2.4.2 Morfogênese em Candida tropicalis...... 39 2.4.3 Formação de biofilme...... 41 2.4.4 Enzimas líticas...... 44 2.5 Resistência ao estresse osmótico em Candida tropicalis...... 48 3.0 OBJETIVOS...... 51 4.0 MATERIAIS E MÉTODOS...... 53 4.1 Parâmetros hidrológicos, pH, temperatura e salinidade da água e dados referentes ao solo da praia de Ponta Negra, Natal-RN...... 54 4.1.1 Altura das marés...... 54 4.1.2 Salinidade da água...... 54 4.1.3 Temperatura do solo...... 54 4.1.4 Pluviometria...... 54 4.2 Amostragem e coleta de areia...... 55 4.3 Processamento das amostras e isolamento primário das leveduras...... 56 4.4 Purificação das colônias...... 56 4.5 Identificação das leveduras do solo...... 57 4.5.1 Análise macroscópica das colônias...... 57 4.5.2 Análise micromorfológica de leveduras ...... 57 4.5.3 Análise fisiológica e bioquímica...... 58 4.5.3.1 Testes de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (Auxanograma)...... 58 4.5.3.2 Testes de fermentação de fontes de carbono (Zimograma)...... 59 4.5.4 Métodos comerciais semi-automatizados de identificação de leveduras...... 59 4.6 Manutenção das leveduras...... 60

4.7 Seleção dos isolados...... 60 4.8 Análise fenotípica dos fatores de virulência de Candida tropicalis...... 60 4.8.1 Caldo NGY para padronização do inóculo...... 61 4.8.2 Ensaio para determinação da capacidade de aderência de Candida tropicalis a células epiteliais bucais humanas (CEBH)...... 61 4.8.3 Ensaio para avaliação da morfogênese de Candida tropicalis em meio sólido...... 61 4.8.4 Ensaio de formação de biofilme em Candida tropicalis...... 62 4.8.5 Coloração do biofilme de Candida tropicalis pelo cristal violeta...... 63 4.8.6 Ensaio para detecção de atividade de proteinase em Candida tropicalis...... 63 4.8.7 Ensaio para determinação da atividade hemolítica em Candida tropicalis...... 64 4.9 Ensaio para avaliação da resistência osmótica de Candida tropicalis...... 64 4.10 Padronização dos testes de susceptibilidade a antifúngicos...... 65 4.11 Análise estatística...... 67 5.0 RESULTADOS...... 68 5.1 Parâmetros hidrológicos, temperatura do solo e salinidade da água do mar... 69 5.2 Seleção dos isolados utilizados neste estudo e confirmação da identificação taxonômica...... 70 5.3 Avaliação fenotípica dos isolados ambientais quanto aos fatores de virulência...... 77 5.3.1 Determinação da capacidade de aderência de Candida tropicalis a células epiteliais bucais humanas (CEBH)...... 77 5.3.2 Determinação da capacidade de morfogênese de Candida tropicalis em meio sólido...... 80 5.3.3 Determinação da capacidade de formação de biofilme de Candida tropicalis...... 81 5.3.4 Determinação da produção de proteinase de Candida tropicalis...... 83 5.3.5 Determinação da atividade hemolítica de Candida tropicalis...... 85 5.4 Avaliação da resistência de Candida tropicalis ao estresse osmótico...... 88 5.5 Compilação dos resultados obtidos da avaliação dos fatores de virulência e da capacidade de resistência ao estresse osmótico de Candida tropicalis...... 88 5.6 Avaliação do perfil de susceptibilidade dos isolados de Candida tropicalis aos antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo...... 88 6.0 DISCUSSÃO...... 91 7.0 CONCLUSÕES...... 104 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 107 ANEXOS...... 126 ANEXO I...... 127 ANEXO II...... 129 ANEXO III...... 133 APÊNDICE...... 144

LISTA DE FIGURAS

Fig.1 Esquema de demarcação dos seis pontos de coleta de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN...... 55 Fig.2 Distribuição numérica e percentual dos isolados de Candida tropicalis obtidos de amostras de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN, em 2012 e 2013, de acordo com os diferentes pontos de coleta. Em 2012 as coletas foram realizadas apenas nos pontos de 1 a 3, e em 2013 foram obtidas amostras dos seis pontos...... 72 Fig.3 Características das colônias de Candida tropicalis. A) Aspecto brilhante com borda levemente franjada do isolado 658 de Candida tropicalis após 48 h de incubação a 30°C em ágar Sabouraud dextrose; B) Isolado 658 exibindo típica coloração azul petróleo no meio CHROMagar Candida®; C) Aspectos micromorfológicos do isolado 658 de Candida tropicalis após microcultivo em ágar fubá acrescido de Tween 80. Evidencia-se blastoconídios em cadeia simples ou ramificada, hifas verdadeiras e abundantes pseudo-hifas...... 72 Fig.4 Células de Candida tropicalis aderidas em célula epitelial bucal humana após incubação a 37°C por 1 h a 200 rpm de rotação, fixadas em formalina a 10%. Microscopia de luz, 400 x de magnificação...... 78 Fig.5 Valores médios do número de células de levedura aderidas em 150 CEBH para os isolados ambientais de Candida tropicalis e para as cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis. O número de células aderidas foi determinado por microscopia de luz com 400 x de magnificação após incubação a 37°C por 1 h a 200 rpm de rotação, e fixação em formalina a 10%. Destaque para o isolado LMMM707 (menos aderente) e para os isolados LMMM672 e LMMM688 (mais aderentes)...... 79 Fig.6 Aspectos macromorfológicos de colônias crescidas em ágar Spider, após sete dias de incubação a 30ºC. A) Candida tropicalis ATCC13803 (fenótipo filamentoso); B) Candida albicans ATCC90028 (fenótipo filamentoso); C) Candida tropicalis LMMM655 (fenótipo rugoso); D) Candida parapsilosis ATCC22019 (fenótipo liso)...... 80 Fig.7 Produção de biofilme dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de

Candida tropicalis, expressa pelos valores médios de absorbância 570nm do cristal violeta usado na coloração. A formação de biofilme foi induzida em placas de poliestireno contendo meio YNB acrescido de glicose, a 37°C, durante 66h sob agitação 75 rpm. Destaque para o isolado LMMM658 (menor produção de biofilme) e para o isolado LMMM711 (maior produção de biofilme)...... 83

Fig.8 Atividade de proteinase dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803

de Candida tropicalis, expressa pela DO280nm em função da DO600nm da cultura com 72 h de crescimento em meio YCB + ASB. Destaque para o isolado LMMM687 (menor atividade proteolítica) e para os isolados LMMM693 e LMMM704 (maior atividade proteolítica)...... 85 Fig.9 Produção de beta hemólise em ASD adicionado de sangue de carneiro (suplementado com 3% de glicose), induzida por espécies de Candida, após 48h de incubação a 37 ° C em atmosfera com 5% de CO2. A) Candida parapsilosis ATCC 22019 (controle negativo); B) Candida tropicalis ATCC 13803; C) Candida tropicalis LMMM710...... 86 Fig.10 Índice de hemólise (IH) dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis. O IH foi calculado dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia + o diâmetro da zona de hemólise, que foi induzida em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose. Destaque para o isolado LMMM653 (menor IH) e para o isolado LMMM661 (maior IH)...... 87

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Distribuição dos isolados de Candida oriundos de amostras de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN, obtidas em março e julho de 2012...... 27 Tabela 2 Valores de ponto de corte (µg/mL) sugeridos para interpretação dos testes de susceptibilidade dos isolados de Candida tropicalis...... 67 Tabela 3 Parâmetros hidrológicos, temperatura do solo e salinidade da água do mar da praia de Ponta Negra, Natal – RN, de acordo com o período do ano e os pontos de coleta...... 70 Tabela 4 Identificação das cepas de Candida tropicalis isoladas nos diferentes pontos de coleta e períodos climáticos de 2012 e suas características morfológicas em ágar Sabouraud Dextrose (macromorfologia), coloração no meio CHROMagar Candida® e micromorfologia em ágar fubá + Tween 80...... 73 Tabela 5 Identificação das cepas de Candida tropicalis isoladas nos diferentes pontos de coleta no verão de 2013 e suas características morfológicas em ágar Sabouraud Dextrose (macromorfologia), coloração no meio CHROMagar Candida® e micromorfologia em ágar fubá...... 75 Tabela 6 Comparação da capacidade de aderência de isolados de Candida tropicalis à CEBH em relação às cepas de referência...... 78 Tabela 7 Comparação da capacidade de formação de biofilme de isolados de Candida tropicalis em relação às cepas de referência...... 83 Tabela 8 Comparação da atividade de proteinase de isolados de Candida tropicalis em relação às cepas de referência...... 85 Tabela 9 Comparação do índice de hemólise de isolados de Candida tropicalis em relação às cepas de referência...... 86

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

®: Marca registrada ABC: ATP-binding cassete AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Als: Agglutinin-like sequence ASB: Albumina de Soro Bovino ASD: Ágar Sabouraud Dextrose ATCC: American Type Culture Collection BCR: Biofilm and Cell Wall Regulator BNDO: Banco Nacional de Dados Oceanográficos C.: Candida CDC: Cell Division Cycle CDR: Candida Rrug Resistance CEBH: Célula Epitelial Bucal Humana CIM: Concentração Inibitória Mínima CLSI: Clinical Laboratory Standards Institute CNCA: Candida não-Candida albicans

CO2: Gás carbônico CSA 2: Surface Antigen Protein 2 CVV: Candidíase Vulvovaginal DNA: Ácido Desoxirribonucléico DO: Densidade Óptica EDTA: Ácido Etileno Diaminotetracético ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMPARN: Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte ENA: Exitus NAtru EPS: Exopolissacarídeos ERG: ERGosterol Biosynthesis et al.: Colaboradores EUA: Estados Unidos da América FKS: FK506 Sensitivity g/Kg: Grama por kilograma g/l: Grama por litro GDP: Guanosine-5'-diphosphate GPI: Glicofosfatidilinositol GPS: Global Position System h: Hora HGC: Hypha‐Specific G1 Cyclin‐Related Protein HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana HLP: Hemolysin-Like Protein HOG: High Osmolarity Glycerol

HWP: Hyphal Wall Protein IH: Índice Hemolítico INMET: Instituto Nacional de Meteorologia KCl: Cloreto de Sódio

KH2PO4: Fosfato de Potássio Monobásico LMMM: Laboratório de Micologia Médica e Molecular M: Molar MDR: Multidrug Resistance Gene MFS: Major Facilitator Superfamily mg/mL: Miligrama por Mililitro MG: Minas Gerais

MgCl2: Cloreto de Magnésio min: Minuto mL/L: Mililitro por Litro mL: Mililitro mm: Milímetro mM: Milimolar MOPS: Ácido Morfolinopropanossulfônico

Na2HPO3: Fosfato de Sódio Dibásico NaCl: Cloreto de Sódio ng/μL: Nanograma por Microlitro NGY: Neopeptone – Yeast Extract - Glucose nm: Nanômetro Nº: Número NRG: Negative Regulator of Glucose-Repressed Genes ºC: Grau Celsius OMS: Organização Mundial da Saúde PBS: Phosphate Buffered Saline PCR: Polymerase Chain Reaction pH: Potencial Hidrogeniônico PHR: PHotoreactivation Repair deficient QS: Quorum Sensing RBT5: Repressed by TUP1 Protein 5 rDNA: DNA Codificador do RNA Ribossomal RHO: Ras HOmolog RN: Rio Grande do Norte RNA: Ácido Ribonucléico Rpm: Rotações por Minuto RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium rRNA: RNA Ribossomal SAP: Secreted Aspartyl Proteinase SDD: Susceptibilidade Dose Dependente SETUR: Secretaria de Turismo do Rio Grande do Norte

spp.: Espécies T.A: Temperatura Ambiente TAE: Tris Acetato EDTA TCA: Ácido Tricloroacético TM: Trade Mark U/mL: Unidade por Mililitro UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFC/g: Unidade Formadora de Colônia por Grama UME: Unscheduled Meiotic Gene Expression UV: Ultravioleta WHO: World Health Organization WOR: White-opaque regulator YCB: Yeast Carbon Base YNB: Yeast Nitrogen Base YPD: Yeast Peptone Dextrose μg/mL: Micrograma por mililitro μL: Microlitro μM: Micromolar

RESUMO

Vários estudos têm sido desenvolvidos com relação aos riscos à saúde humana associados ao uso recreativo de praias contaminadas com esgotos domésticos. Esses resíduos contêm vários micro-organismos, incluindo Candida tropicalis, agente etiológico tanto de infecções superficiais quanto sistêmicas, além de indicador de contaminação fecal do meio ambiente. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de C. tropicalis oriundos da areia da Praia de Ponta Negra, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil, quanto a expressão de fatores de virulência in vitro, a adaptação ao estresse osmótico e a susceptibilidade às fármacos antifúngicos. Foram analisados 62 isolados ambientais de C. tropicalis, observando-se grande variação entre os mesmos para os diversos fatores de virulência avaliados. Em geral, os isolados ambientais foram mais aderentes a células epiteliais bucais humanas (CEBH) do que a cepa de referência de C. tropicalis ATCC13803, além de serem altamente produtoras de biofilme. Em relação à morfogênese, a maioria dos isolados exibiu fenótipo rugoso em meio Spider (34 isolados, 54,8%). Na avaliação da atividade enzimática, a maioria dos isolados teve maior produção de proteinase do que a cepa de referência de C. tropicalis ATCC13803. Adicionalmente, 35 isolados (56,4%) tiveram alta atividade hemólitica (índice de hemólise > 55). Com relação à resistência de C. tropicalis ao estresse osmótico, 85,4% dos isolados foram resistentes em meio contendo 15% de cloreto de sódio, o que corrobora com a alta capacidade de sobrevivência descrita para essa levedura no ambiente marítimo. Finalmente, no que diz respeito à sensibilidade aos antifúngicos foi observada elevada resistência aos azólicos testados (fluconazol, voriconazol e itraconazol), com ocorrência do fenômeno “Low-high” e de efeito semelhante ao crescimento paradoxal que ocorre para as equinocandinas. As cepas resistentes aos três azólicos testados foram 15 (24,2%). Para a anfotericina B também ocorreu resistência (14 isolados, 22,6%), ao passo que para as equinocandinas todas as cepas foram sensíveis. Portanto, nossos resultados demonstram que isolados de C. tropicalis oriundos da areia de praia do nordeste brasileiro podem expressar plenamente atributos de virulência e apresentam alta capacidade de persistência no ambiente costeiro, além de serem significativamente resistentes aos antifúngicos mais empregados na prática clínica atual. Isso constitui potencial risco à saúde dos frequentadores desse ambiente, especialmente indivíduos imunocomprometidos e em extremos etários.

Palavras-chave: Candida tropicalis, ambiente costeiro, fatores de virulência, susceptibilidade antifúngica.

ABSTRACT

Several studies have been developed regarding health risks associated with the recreational use of beaches contaminated with domestic sewage. These wastes contain various microorganisms, including Candida tropicalis, etiologic agent of both superficial infections such as systemic, as well as indicator of fecal contamination for the environment. In this context, the objective of this study was to characterize C. tropicalis isolates from the sandy beach of Ponta Negra, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil, regarding the expression of in vitro virulence factors, adaptation to osmotic stress and susceptibility to antifungal drugs. We analyzed 62 environmental isolates of C. tropicalis and observed a great variation between them for the various virulence factors evaluated. In general, environmental isolates were more adherent to CEBH than C. tropicalis ATCC13803 reference strain, besides the fact they were also highly biofilm producers. In relation to morphogenesis, most isolates presented wrinkled phenotype in Spider medium (34 isolates, 54.8 %). When assessing enzyme activity, most isolates had higher proteinase production than C. tropicalis ATCC13803 reference strain. In addition, 35 isolates (56.4 %) had high hemolytic activity (hemolysis index > 55). With regard to C. tropicalis resistance to osmotic stress, 85.4% of the isolates were able to grow in a liquid medium containing 15% sodium chloride, corroborating to high survival capacity described for this yeast at marine environment. Finally, with regard to sensitivity to antifungal drugs, it was observed high resistance to the azoles tested, with the occurrence of the "Low-high" phenomenon and similar effect to the paradoxical growth which occurs to the echinocandins. For the three azoles tested we verified that 15 strains were resistant (24.2 %). Some strains were also resistant to amphotericin B (14 isolates, 22.6 %), while all of them were sensitive for the echinocandins tested. Therefore, our results demonstrate that C. tropicalis isolated from the sand of northeast of Brazil can fully express virulence attributes and showed a high persistence capacity on the coastal environment, in addition of being significantly resistant to most applied antifungals in current clinical practice. This constitutes a potential health risk to visitors of this environment, especially immunocompromised individuals and those with extreme age range.

Keywords: Candida tropicalis, coastal environment, virulence factors, antifungal susceptibility.

1.0 INTRODUÇÃO ______

A qualidade da água e da areia das praias recreativas está diretamente ligada às condições de saneamento básico local, sendo que os recursos hídricos são alvos frequentes de esgotos clandestinos. Portanto, a poluição das praias é uma condição causada pela falta de saneamento, onde esgotos sem tratamento são despejados no mar, contaminando também a areia devido ao fluxo e refluxo das marés (VIEIRA et al, 2007). Este fato constitui um risco importante para a saúde das pessoas que frequentam esses ambientes. Em regiões tropicais, as condições climáticas de calor e alta umidade, aliadas ao contato com areia, animais e a falta de higiene, estão intimamente relacionadas com o aumento da demanda em ambulatórios de dermatologia nos últimos anos (PELEGRINI et al, 2009). A qualidade microbiológica das praias ainda tem sido avaliada apenas pelos coliformes fecais encontrados na água do mar, não considerando, em certa medida, o impacto que os fungos presentes na areia exercem sobre a saúde dos banhistas (MAIER et al, 2003). As principais leveduras de interesse médico além de Candida albicans são Candida tropicalis, o complexo de espécies Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida guilliermondii, e Candida lusitaniae. C. tropicalis é uma levedura comensal do trato gastrintestinal de aves como gaivotas e andorinhas (BUCK, 1977), bem como peixes (ROTH e AHEARN et al, 1962). Também tem sido isolada de águas residuais poluídas (PHAFF et al, 1960; ROTH et al, 1962) e de praias e águas costeiras (VOGEL et al, 2007). Além disso, esta levedura pertence à microbiota humana normal, estando relacionada com infecções superficiais e sistêmicas (BASU et al, 2003). C. tropicalis é a segunda espécie mais patogênica do gênero Candida (GODOY et al, 2003), o que envolve a expressão de vários atributos de virulência. Dentre eles, a adesão às células hospedeiras é considerada o primeiro passo necessário para o estabelecimento de infecção, sendo mediada por proteínas e polissacáridos variavelmente encontrados na parede celular de diferentes espécies de Candida (CANNON et al, 2001). C. albicans é a espécie com maior capacidade de aderência, seguida por C. tropicalis, que tem sido descrita como a mais aderente a células epiteliais dentre as espécies de Candida não-Candida albicans (CNCA; CALDERONE, 2002; LYON et al, 2006; BIASOLI et al, 2010). Subsequentemente à ligação fúngica, a transição morfológica de blastoconídio à hifa é um importante fator de virulência em vários fungos patogênicos, incluindo leveduras do gênero Candida, sendo um dos mecanismos mais importantes na patogênese da candidíase (LAKEY et al, 2013). Estudos relativos à morfogênese já estão bem estabelecidos para C. albicans

(GUSTIN, 1998; KUMAMOTO e VINCES, 2005; LAKEY et al, 2013). No entanto, existem poucas investigações sobre morfogênese em espécies de CNCA (LAKEY et al, 2013). Os micro-organismos podem ainda formar agregados denominados biofilmes, que são estruturas complexas onde os mesmos aderem a superfícies sólidas bióticas ou abióticas e secretam uma densa substância polimérica extracelular sobre si, proporcionando sobrevivência ao ataque de células fagocíticas hospedeiras, bem como resistência a fármacos antifúngicos (DONLAN e COSTERTON, 2002, FANNING e MITCHELL, 2012). Estudos realizados por vários autores relatam aumento da produção de biofilme em isolados clínicos de C. tropicalis (PAIVA et al, 2012; PANNANUSORN et al, 2013; UDAYALAXMI et al, 2014) . A secreção de enzimas líticas é outro importante atributo de virulência de Candida spp. Essas enzimas são capazes de destruir, danificar ou alterar a integridade das membranas das células hospedeiras, conduzindo a danos ou disfunções nas estruturas de acolhimento (SILVA et al, 2012; SANITÁ et al, 2014). As proteinases aspárticas secretadas (Saps) são um grupo de isoenzimas codificados pela família de genes SAP, tendo sido extensivamente investigadas em C. albicans e associadas com a hidrólise de várias proteínas (HUBE & NAGLIK, 2001). Um estudo anterior sugeriu a existência de uma família de genes SAPT no genoma de C. tropicalis (ZAUGG et al, 2001), o que levou à clonagem de quatro genes desta família (SAPT 1-4). No entanto, apenas uma enzima chamada Sapt1p foi purificada a partir de sobrenadante de cultura e caracterizada bioquimicamente (ZAUGG et al, 2001). Outro grupo enzimático importante é o das hemolisinas, que contribuem significativamente para a patogênese da candidíase disseminada, especialmente por facilitar a penetração de hifas (LUO et al, 2004; TSANG et al, 2007). Fatores hemolíticos secretados pelos fungos resultam na liberação de hemoglobina dos eritrócitos para posterior utilização pelo micro- organismo como fonte de ferro (GIOLO et al, 2010). Luo et al. (2001) foram os primeiros a avaliar a atividade hemolítica em espécies de CNCA, incluindo C. tropicalis, cujo fator hemolítico consiste de uma manoproteína liberada no sobrenadante da cultura (TANAKA et al, 1997). Muitos atributos de virulência são expressos ou têm sua expressão modulada em resposta a condições de estresse promovidas pelo ambiente (BROWN et al, 2014). C. tropicalis é capaz de crescer em meio com concentração acima de 10-15% de cloreto de sódio, o que explica a razão pela qual esta espécie é muitas vezes isolada a partir de ambientes salinos (BUTINAR et al, 2005). A halotolerância permite a sobrevivência prolongada de C. tropicalis no ecossistema marítimo, o que pode constituir importante fonte de contaminação para a população que

frequenta as praias. Por outro lado, leveduras com essa característica apesentam potencial para utilização em processos industriais e biotecnológicos, incluindo a biorremediação sustentável (LEITÃO et al, 2007). Do ponto de vista clínico, C. tropicalis está envolvida em infecções que vão desde o âmbito superficial, como candidíase vulvovaginal (VIJAYA et al, 2014) e onicomicose (KIM et al, 2013), até infecções sistêmicas (GIRI e KINDO, 2012). A alta incidência de infecções graves por essa levedura tem chamado atenção, principalmente considerando-se o aumento evidente na resistência a fármacos antifúngicos (GUINEA et al, 2014; LIU et al, 2014). A resistência em isolados clínicos de C. tropicalis aos azólicos tem sido extensivamente relatada (SANTHANAM et al, 2013; GUINEA et al, 2014; LIU et al, 2014). Contudo, ainda há relativamente poucos estudos referentes à resistência dessa espécie a outros medicamentos, como a anfotericina B, apesar de que resistência a essa fármaco tem aumentado progressivamente (SILVA et al, 2012). Também tem sido descrita resistência às equinocandinas em C. tropicalis, ainda de baixa significância em função da efetividade dessas fármacos e de seu uso recente (GARCIA- EFFRON et al, 2010; ESHENAUER et al, 2014) Entretanto, a despeito do número de estudos realizados com amostras clínicas em diferentes partes do mundo e do crescente interesse social pelas questões ambientais, não há até o momento nenhum estudo referente à caracterização fenotípica de isolados ambientais de C. tropicalis, importante patógeno humano presente no ambiente costeiro.

2.0 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ______

2.1. Contaminação dos ambientes costeiros: impacto sobre a saúde pública

Nas últimas décadas as questões ambientais têm progressivamente se tornado alvo de atenção e de importantes discussões pelas entidades governamentais e científicas, refletindo uma preocupação da sociedade em todo o mundo (PINTO et al, 2011). Este fator é devido aos evidentes efeitos das ações deletérias do homem sobre o meio ambiente, que tem resultado em expressivo desequilíbrio dos ecossistemas, afetando a manutenção da vida nos mesmos. Em se tratando de ações prejudiciais ao meio ambiente promovidas pelo homem, é fundamental considerar os efeitos da ocupação desordenada e indevida que é frequentemente observada nas áreas urbanas, desencadeada por questões sociais e/ou lucrativas. Nesse sentido, a atividade turística tem participação significativa, principalmente em cidades costeiras, nas quais motiva modificações estruturais nos espaços praianos, alterando o cotidiano da população ali residente e afetando ecossistemas locais (VIEIRA et al, 2007). As regiões costeiras são complexas do ponto de vista conceitual e incluem baías, estuários e extensas áreas semifechadas, onde se concentram o desenvolvimento populacional das principais cidades do mundo (PINTO et al, 2011). Este crescimento populacional nas cidades litorâneas nem sempre é acompanhado de melhora de infraestrutura no saneamento básico (PINTO et al, 2011). Dessa forma, a qualidade das águas e areias de recreação se torna comprometida, uma vez que está diretamente ligada às condições de saneamento, e os recursos hídricos são destinos frequentes de esgotos clandestinos (VIEIRA et al, 2007). Por conseguinte, a poluição das praias é uma condição desenvolvida pelo saneamento precário, no qual esgotos sem tratamento desembocam no mar, contaminando também a areia, tanto em virtude do movimento da maré como do seu trajeto até a água. Este fato constitui importante risco à saúde dos frequentadores desses ambientes, que ficam expostos a variados micro-organismos, incluindo fungos e outros patógenos. A qualidade microbiológica das praias foi, durante muito tempo, avaliada somente pelos coliformes fecais encontrados na água do mar, desconsiderando-se até certo ponto a areia como passível de contágio por micro-organismos patogênicos (MAIER et al, 2003). Este fato tem mudado recentemente, uma vez que tem se considerado que as atividades de lazer praticadas nas praias proporcionam vasto contato entre areia e pessoas, contribuindo para a contaminação do substrato praiano, o qual se dá tanto pela transmissão, pelo homem e

animais, de micro-organismos de que são portadores, como também pelo fato destes produzirem resíduos que servem de substrato ideal ao crescimento de diferentes fungos, como as leveduras (SOUSA et al, 1968; BOLTON et al, 1999; REGNIER e PARK, 1972; PHILIPP et al, 1994; EFSTRATIOU et al, 2009). Estes micro-organismos ubíquos estão relacionados com diferentes habitats aquáticos, como rios, lagos e ambientes costeiros, interagindo com a fauna e a flora ali presentes. Conforme descrito por Fell e van Uden (1963), no oceano aberto a água pode conter entre 10 e 100 células de levedura por litro, enquanto que perto do continente a água comporta uma população ainda maior de leveduras, até vários milhares de células por litro, uma vez que a mesma entra em contato com fungos terrestres, que, por sua vez, contribuem substancialmente para a biomassa microbiana e a diversidade genética de micro-organismos no solo (EKELUND et al, 2001). A areia da praia mantem estreita relação com esses micro- organismos pelo contato com a água proveniente dos ciclos de maré e pela lavagem do solo com águas pluviais (VOGEL et al, 2007). Trabalhos científicos realizados em várias partes do mundo têm comprovado a existência de leveduras de relevância clínica no ambiente costeiro. Estudo feito por Arvanitidou et al. (2002) em ambientes marítimos de uso recreativo na costa da Grécia constatou que espécies do gênero Candida foram as leveduras mais frequentemente isoladas, identificadas em 11,2% das amostras examinadas. Dentre esses isolados, as espécies mais prevalentes foram Candida albicans, Candida inconspicua, Candida guilliermondi, Candida colliculosa, leveduras do complexo Candida rugosa e Candida zeylanoides. Mancini et al. (2005) também verificaram a presença de leveduras na areia de praias do litoral da Itália. Novamente destacam-se as espécies do gênero Candida como as mais prevalentes, seguidas do gênero Trichosporon. As espécies de Candida mais encontradas foram C. albicans, C. tropicalis, leveduras do complexo Candida parapsilosis, C. guilliermondii, complexo C. rugosa e Candida krusei. Outro estudo, realizado por Pereira et al. (2013) analisou 146 amostras de areia coletadas de 15 praias de área vulcânica de Portugal. Leveduras foram detectadas em 23, 7 % das amostras, sendo que 23,7% dos fungos isolados pertenciam ao gênero Candida. Em estudo sobre a qualidade sanitária de água e areia das praias da Baía de Guanabara, no estado do Rio de Janeiro, foram encontrados fungos em 88,3% das amostras de areia úmida e de areia seca, sendo que para as leveduras a ocorrência foi de 43,98%, das quais 60% foram encontradas nos pontos de areia seca e 40% encontradas nos pontos de areia

úmida (REGO, 2010). Este fator poderá advir do fenômeno de bioacumulação, descrito por Mancini et al. (2005), que descreve que restos de alimentos deixados pelos banhistas, peixes mortos e grande quantidade de resíduos sólidos favorecem a sobrevivência dos fungos. Na água do mar, as leveduras ocorreram em 57(14 %) das amostras. As leveduras do gênero Candida ocorreram em 29,3% dos isolados, sendo todas espécies de Candida não-Candida albicans (CNCA). Trabalho realizado em duas praias recreacionais de Olinda, Pernambuco, reporta o isolamento de micro-organismos d água e da areia do mar (LOUREIRO et al,2005). Foram encontradas 31 espécies de leveduras, sendo que destas, 19 pertenciam ao gênero Candida. Os autores sugerem que as leveduras provavelmente foram trazidas às praias não somente por lixiviação, mas também por águas pluviais e resíduos domésticos liberados ao longo do ambiente costeiro. Candida catenulata, Candida fennica, Candida sake, Brettanomyces bruxelensis e Rhodotorula mucilaginosa foram as espécies mais comumente encontradas em ambas as praias. Todos esses estudos demonstram que a areia de praias recreativas pode abrigar uma grande população de leveduras, oferecendo riscos para a saúde dos banhistas, uma vez que muitos desses fungos possuem capacidade de colonizar e infectar o homem, e em se tratando de regiões tropicais, as condições climáticas de calor e umidade elevada, aliadas ao contato com areia e animais e maus hábitos de higiene, possuem estreita relação com o aumento da demanda em ambulatórios de dermatologia nos últimos anos (PELEGRINI et al, 2009). Nesse sentido, é pertinente destacar as infecções causadas por leveduras do gênero Candida, que têm grande relevância devido à elevada incidência de colonização e infecção do homem (NAKAMURA et al, 2013). Esses micro-organismos passam da forma comensal à patogênica por ocasião de alterações no sistema imunológico do hospedeiro ou por meio de lesões nas barreiras anatômicas (ferimentos, queimaduras, procedimentos médicos invasivos, etc.). C. albicans é a espécie isolada com maior frequência de infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos e em estudos de todas as partes do mundo, sendo considerada a espécie mais virulenta do gênero (MORAN et al, 2011 ; PAPON et al, 2013; WILSON et al, 2014; CORZO-LEON et al, 2014). A Organização Mundial da Saúde recomenda a análise de águas e areias de uso recreativo apenas para fungos de potencial patogênico reconhecido, como C. albicans (WHO, 1989). Entretanto, nos últimos anos, uma série de fatores tem contribuído para o aumento do número de infecções superficiais e invasivas cujos agentes etiológicos são espécies de CNCA,

como o aumento da sobrevida de pacientes portadores de doenças degenerativas e neoplasias, a pressão seletiva exercida pelo uso de antifúngicos, a maior utilização de procedimentos médicos invasivos, além de medicamentos quimioterápicos e imunossupressores e da melhoria evidente nas técnicas de identificação de leveduras (KOTHAVADE et al, 2010; ORTEGA et al, 2011; PFALLER et al, 2014; WANG et al, 2014). Calado et al. (2011) realizaram estudo epidemiológico que objetivou investigar a frequência de micoses superficiais e cutâneas e seus agentes etiológicos entre os pacientes atendidos no Hospital Giselda Trigueiro, centro de referência para estudo de doenças infecciosas, na cidade de Natal, Rio Grande do Norte. No estudo, 59,9% das micoses superficiais foram causadas por fungos leveduriformes, dentre os quais 32,1% eram espécies de CNCA, 12,5% de C. albicans, 9,4% do gênero Malassezia, 5,3%, de Trichosporon e 0,4% de Geotrichum. Semelhantemente, Silva et al. (2012) realizaram estudo no qual avaliaram a epidemiologia de dermatomicoses em 314 crianças frequentadoras de creches públicas nesta mesma cidade. Como resultado, 32,8% dos isolados obtidos pertenciam ao gênero Candida, sendo 20% de espécies de CNCA, destacando-se leveduras do complexo C. parapsilosis e C. tropicalis. Consequentemente, tais resultados sugerem que espécies de CNCA são os agentes etiológicos mais isolados em micoses superficiais e cutâneas na cidade de Natal.

2.2 Ocorrência de Candida tropicalis em solo de ambiente costeiro

Desde que Adametz isolou os primeiros fungos do solo em 1886, vários estudos tem sido realizados com esse material, visando analisar a ocorrência de uma grande variedade de micro-organismos, em diferentes tipos de solo e áreas geográficas (WARCUP, 1957). Contudo, há relativamente poucos trabalhos que descrevem o isolamento de C. tropicalis a partir de amostras de solo, e ainda menos relatos associados à presença desta levedura no ambiente costeiro. Um dos primeiros estudos realizados nesse sentido foi conduzido por Fell et al.(1960) com 179 isolados de levedura obtidos de solo sedimentar da Baía de Biscayne, Flórida. O gênero Candida foi o mais prevalente, destacando-se o alto isolamento de C. tropicalis (42 isolados) deste ambiente costeiro, bem como do complexo C. parapsilosis e C. guilliermondii.

Estudo publicado por Papadakis et al. (1997) avaliou a presença de leveduras na areia úmida de duas praias recreativas da Grécia, tendo isolado predominantemente C. tropicalis, precedendo C. albicans e Trichosporon spp. Em Fortaleza, no estado do Ceará, estudo avaliou a presença de micro-organismos patogênicos em areia seca e úmida de três praias. As leveduras encontradas em todas as amostras de areia pertenciam ao gênero Candida, mais abundantes na areia seca do que na areia úmida, tendo sido evidenciada a presença de C. tropicalis em todas as três praias (VIEIRA et al, 2001). Vogel et al. (2007) analisaram a prevalência e distribuição de espécies de leveduras presentes em 102 amostras de areia úmida e seca de três praias recreativas do sul da Flórida, coletadas entre agosto de 2001 e julho de 2002. Foram identificadas 21 espécies de levedura, sendo C. tropicalis a mais frequentemente isolada, predominantemente a partir de areia seca coletada acima da marca da maré alta. A presença de C. tropicalis também foi detectada na areia de duas praias do Marrocos, em estudo feito por Abdallaoui et al. (2007). Nesse estudo todas as leveduras isoladas pertenciam ao gênero Candida, sendo 52,63 % de C. albicans e 47,37% de espécies de CNCA, destacando-se C. tropicalis, C. glabrata e leveduras do complexo C. parapsilosis. Mais recentemente, trabalho realizado por Shah et al. (2011) investigou a presença de leveduras e de outros micro-organismos na areia de uma praia subtropical em Miami, Flórida (EUA). C. tropicalis foi a levedura do gênero Candida mais isolada, apresentando uma média de 143 UFC/g. Resultado semelhante foi encontrado em estudo realizado no ano de 2012 na praia de Ponta Negra, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil (artigo em preparação). Um total de 145 leveduras foram obtidas de amostras de água da praia e da areia seca, sendo que 114 pertenciam ao gênero Candida, distribuídas em 26 espécies distintas, incluindo algumas de interesse médico. C. tropicalis foi a levedura mais prevalente nesse estudo, com 31 isolados (27,2%) obtidos somente a partir das amostras de areia. Os resultados desse estudo estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Distribuição dos isolados de Candida oriundos de amostras de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN, obtidas em março e julho de 2012

Espécie de Candida Nº de Espécie de Candida Nº de Isolados isolados Candida albicans 9 Candida lactis-condensi 3

Candida atlantica 2 Candida maltosa 3

Candida bombicola 3 Candida maritima 2

Candida catenulata 4 Candida melibiosica 5

Candida diddensiae 2 Candida mogii 3

Candida fennica 4 Candida quercitrusa 2

Candida geochares 2 Candida palmioleophila 2

Candida glabrata 4 Candida parapsilosis 1

Candida guilliermondii 2 Candida rhagii 9

Candida haemulonii 1 Candida rugopelliculosa 2

Candida intermedia 2 Candida sake 1

Candida kefyr 4 Candida tropicalis 31

Candida krusei 3 Candida versatilis 8

Fonte: a autora.

2.3 Candida tropicalis: patógeno emergente e resistente a fármacos antifúngicos

C. tropicalis é uma levedura que faz parte da microbiota humana normal, estando presente na pele e nos tratos gastrintestinal, genito-urinário e respiratório do homem (BASU et al, 2003; OKSUZ et al, 2007; NEGRI et al, 2010), e também no trato gastrintestinal de outros animais como aves (BUCK, 1983) e peixes (ROTH e AHEARN 1962). Foi originalmente isolada de um paciente com bronquite fúngica em 1910 e denominada Oidium tropicale (CASTELLANI, 1912). Desde então, essa levedura tem sido associada a infecções superficiais e sistêmicas em todo o mundo, principalmente em pacientes com déficit de

neutrófilos, com redução da microbiota bacteriana pelo uso de antimicrobianos de largo espectro ou com danos na mucosa gastrintestinal (COLOMBO et al, 2006). C. tropicalis está classificada como a terceira ou quarta espécie de CNCA mais comumente isolada na prática clínica (PFALLER et al, 2010; PEMÁN et al, 2012), embora seja considerada a mais prevalente na Ásia (CHAKRABARTI et al, 2009; KOTHAVADE et al, 2010; ADHIKARY e JOSHI, 2011) e a segunda ou terceira espécie mais isolada no Brasil e restante da América Latina (20,9% e 13,2%, respectivamente; PFALLER et al, 2010). O aumento expressivo no isolamento dessa levedura em casos de infecções desde superficiais a sistêmicas, em casuísticas de todo o mundo, deixa claro seu caráter emergente. Os aspectos clínicos das infecções por Candida variam conforme o sítio de infecção. Candidíase orofaríngea, candidíase vulvovaginal e onicomicose são exemplos de infecções superficiais causadas por leveduras desse gênero. Já a candíase sistêmica envolve o sangue e órgãos internos como pulmões e trato gastrintestinal (JACOBS e NALL, 1990). Trabalho realizado por Silva-Rocha et al. (2014) ivestigou a distribuição de espécies de Candida isoladas da cavidade oral de pacientes transplantados renais de duas regiões geográficas do Brasil. C. tropicalis foi a segunda espécie mais prevalente, correspondendo a 4,5% dos isolados. No estudo realizado por Mulu et al. (2013), que analisou a distribuição de espécies de Candida e a susceptibilidade aos azólicos de 215 isolados da cavidade oral de pacientes portadores de HIV/AIDS no noroeste da Etiópia, C. tropicalis foi a terceira espécie mais prevalente, com uma porcentagem de isolamento igual a 14,1%. Destes, 8% apresentaram resistência ao fluconazol, e 4% apresentaram resistência ao cetoconazol, ao itraconazol e à fluocitosina. Com relação à candidíase vulvovaginal (CVV), C. tropicalis é geralmente descrita como a terceira espécie de Candida mais prevalente, precedida de C. albicans e C. glabrata (DIAS et al, 2011; KANAGAL et al, 2014; RAGUNATHAN et al, 2014). Estudo desenvolvido na Índia por Vijaya et al, (2014) com 300 mulheres em idade reprodutiva e com suspeita clínica de CVV, entranto, relatou que C. tropicalis foi a segunda espécie de Candida mais prevalente, com 26,4% dos isolados. Destes, 42,9% apresentaram resistência ao fluconazol e 14,3% ao voriconazol. Outro estudo foi conduzido no Irã por Salehei et al, (2012) analisando-se 67 isolados de Candida obtidos a partir de amostras de secreção vaginal de pacientes com CVV; observou-se um isolamento de C. tropicalis de 5,9% em relação às demais espécies do gênero,

sendo também observado 100% de resistência ao fluconazol, 50% de resistência ao clotrimazol, 25% para o cetoconazol e 75% frente à terbinafina. Além disso, todos os isolados apresentaram susceptibilidade dose depende (SDD) para o itraconazol. C. tropicalis é relatada em menor grau em casos de onicomicose em relação à outras espécies do gênero como C. albicans e complexo C. parapsilosis, promovendo infecção do tipo paroníquia principalmente em pacientes imunossuprimidos e indivíduos em extremos etários (idosos e crianças; AGHAMIRIAN e GHIASIAN, 2009; CAMBUIM et al, 2011). Trabalho desenvolvido na Coréia do Sul por Kim et al. (2013) reporta a prevalência do gênero Candida em 59% dos casos de onicomicose em pacientes pediátricos; foram obtidos 39 isolados desse gênero, sendo apenas 2,6% de C. tropicalis. Trabalho desenvolvido no México por Manzano-Gayasso et al. (2011), analisando 166 amostras de unhas distróficas reporta C. tropicalis como uma das espécies menos prevalente do gênero Candida em onicomicose, com 4,2% dos isolados. Entretanto, 14,2% apresentaram resistência ao fluconazol, ao itraconazol e ao cetoconazol. Contudo, no Brasil, Figueiredo et al. (2007) realizaram estudo em Belo Horizonte (MG) com 200 isolados de Candida obtidos de infecções de unha, e reportaram prevalência de 26% para C. tropicalis. Esses autores observaram uma elevada resistência aos antifúngicos testados nesses isolados, com 30,6% de resistência ao fluconazol, 25% para o itraconzaol, 9,6% para o cetoconazol e 96,2% de resistência para a terbinafina. Trabalho realizado por Chang et al. (2013) com isolados oriundos de 152 casos de candidemia em Taiwan reportou prevalência de 19,7% para C. tropicalis, bem como relatou maior ocorrência de trailing nessa espécie do que em C. albicans. WANG et al. (2013) também reportaram elevada ocorrência desse fenômeno em estudo com 1083 isolados de Candida, sendo 258 (23,8%) de C. tropicalis. Em se tratando de candidemia, C. tropicalis apresenta maior associação a petéquias na pele do que as demais espécies de Candida (BODEY e LUNA, 1974), sendo que na Índia é a causa mais comum de infecção invasiva associada ao ambiente hospitalar (GIRI e KINDO, 2012). No Brasil, estudo realizado por Oliveira et al. (2011) investigou a ocorrência de fungemia por espécies de Candida em hospital pediátrico de São Paulo, no período de 2007 a 2010. C. tropicalis foi a segunda espécie de Candida mais isolada (24%), sendo precedida apenas por C. albicans. De acordo com Kontoyiannis et al. (2001), C. tropicalis produz infecções mais persistentes que C. albicans, levando a uma maior permanência dos indivíduos acometidos no

ambiente hospitalar. Outros estudos têm associado infecções por C. tropicalis a uma maior taxa de mortalidade quando comparada com outras espécies de CNCA e até mesmo C. albicans (KRCMERY, 1999; KONTOYIANNIS et al, 2001; EGGIMANN et al, 2003; COLOMBO et al, 2007) . Este fator pode estar relacionado com a virulência diferenciada dessas duas espécies bem como com uma maior resistência antifúngica por C. tropicalis. Recentemente, importante estudo multicêntrico foi realizado por GUINEA et al. (2014) em 29 hospitais espanhóis. C. tropicalis foi isolada em 7,6% de um total de 781 casos de candidemia, sendo que 20% dos isolados apresentaram resistência aos azólicos. Estudo multicêntrico realizado na China analisou 389 isolados provenientes de pacientes com candidemia internados em unidades de terapia intensiva; C. tropicalis foi a terceira espécie mais isolada (17,2%), sendo que resistência ao fluconazol foi observada em 37,3% dos isolados desta espécie, bem como 10% de resistência ao voriconazol (LIU et al, 2014). Investigação realizada na Malásia a partir de 82 isolados de hemocultura e de fluido peritonial reporta C. tropicalis como responsável por 18,3% dos isolados obtidos. Resistência ao cetoconazol foi observada em 20,9% das cepas clínicas desta levedura, além de apresentarem 13,4% de resistência ao itraconazol (SANTHANAM et al, 2013). A alta incidência de infecções invasivas e o evidente problema com a resistência aos antifúngicos indicam a necessidade de estudos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos compostos azólicos, fundamentais à prática clínica atual. O alvo de ação desses fármacos é a 14 α-lanosterol demetilase (Erg11p), produto do gene ERG11, o qual faz parte da via de biossíntese do ergosterol (LUPETTI et al, 2002). O ergosterol é o componente predominante da membrana celular dos fungos, e influencia várias funções celulares como a fluidez e a integridade da membrana, bem como a atividade adequada de várias enzimas ancoradas a ela, como proteínas relacionadas com o transporte de nutrientes e síntese de quitina. Logo, o mecanismo de ação dos azólicos contra a 14 α-lanosterol demetilase resulta no esgotamento do ergosterol e acúmulo de 14 α-metil esterois nocivos às células, inibindo o crescimento das células fúngicas (LUPETTI et al, 2002). Sanglard e Odds (2002) reportam que há pelo menos quatro caminhos diferentes que podem acarretar resistência aos azólicos. O primeiro é a resistência decorrente da ação de transportadores multidrogas ou bombas de efluxo, que levam à diminuição da concentração de fármaco dentro da célula fúngica (PFALLER, 2012). Há pelo menos duas famílias de transportadores envolvidas na resistência aos azólicos, que são a ABC (ATP-binding cassete)

e a MFS (“major facilitator superfamily”; MARIE e WHITE, 2009). A regulação positiva dos genes MDR1(“multidrug resistence gene”) e CDR1 (“Candida drug resistance”), que codificam para proteínas de efluxo das duas famílias, estão relacionadas com o efluxo ativo de azólicos em várias espécies de Candida, incluindo C. tropicalis (MARIE e WHITE, 2009; MORSCHHÄUSER, 2010). O gene MDR1 é o membro mais estudado da família de transportadores MFS, estando também presente em células humanas e em muitos tipos de carcinomas resistentes ao tratamento quimioterápico (KOHNO et al, 1989); os produtos desse gene são proteínas transmembranas envolvidas no transporte dependente de energia de um largo espectro de moléculas, sendo que a principal proteína codificada é a Mdr1p. Já o gene CDR1 faz parte da família de transportadores ABC e codifica Cdr1p, detectada em altos níveis nas espécies de Candida resistentes aos azólicos (MORSCHHÄUSER, 2010). A indução do efluxo causado pelos genes CDR tende a afetar todos os azólicos e é muitas vezes sufuciente para a resistência total a estes antifúngicos. Em contrapartida, as bombas de efluxo codificadas pelos genes MDR em Candida são normalmente seletivas para o fluconazol (PFALLER, 2012). Um segundo caminho que conduz à resistência aos azólicos é a ocorrência de substituições de aminoácidos na Erg11p, que é o alvo dessas fármacos, gernado alterações na conformação da proteína (FORASTIERO et al, 2013). Estudo conduzido por Forastiero et al. (2013) investigou os mecanismos de resistência a fármacos em C. tropicalis, testando as respostas antifúngicas no modelo Galleria mellonella. Para uma das cepas isoladas de candidemia incluídas nesse estudo, foi evidenciado que a presença de fenilalanina na posição 132 da Erg11p produz a perda de uma ponte de hidrogênio que se forma normalmente entre o grupamento heme e a tirosina. Tal modificação impossibilita a interação entre o nitrogênio dos azólicos e o grupo heme, sem modificar a atividade desta enzima. Também demonstrou-se que a deleção de 44 aminoácidos na Erg11p corresponde à excisão da “hélice I” da molécula da proteína, sendo este o sítio de ligação dos azólicos. Essa alteração provoca a perda de funcionalidade da proteína, evidenciada pela ausência de ergosterol e acúmulo de 14 α-metil esterois (FORASTIERO et al, 2013). O mesmo mecanismo de resistência foi relatado em estudo realizado na China (THAN et al, 2014). Outra rota que leva à resistência aos azólicos é resultante do aumento da expressão de ERG11, que codifica para a Erg11p. Esse incremento na expressão gênica resulta na produção de grande quantidade de 14 α-lanosterol demetilase, favorecendo a síntese contínua de

ergosterol e a manutenção da integridade celular, o que permite ao fungo resistir à ação das fármacos (MANASTIR et al, 2011). Este fator pode ocorrer em função de uma mutação genética pontual no ERG11 (KELLY et al, 1993). Pam et al. (2012) utilizaram “primer” customizado para detectar essa mutação pontual em um isolado de C. tropicalis com susceptibilidade dose dependente para o fluconazol, e demonstraram a expressão aumentada de ERG11. Outro estudo desenvolvido por Henry et al. (2000) examinou a capacidade de regulação deste gene em isolado de C. tropicalis que apresentava o fenômeno “trailing” para o fluconazol, sendo que ERG11 foi 1,7 a 2,4 vezes mais expresso, após tratamento de 3 a 5 h com fluconazol (9 ug / ml), e 1,8 a 2,5 vezes mais expresso em resposta ao tratamento com itraconazol (0,1 ug / ml durante 3 a 5 h). Este tipo de resistência tem sido associada ao uso generalizado e contínuo de fluconazol como profilaxia. Finalmente, a resistência aos azólicos pode ser resultante de desvio na via biossintética do ergosterol como resultado de mutações que inativem a 5,6-esterol desnaturase (Erg3p), codificada pelo gene ERG3, que catalisa a introdução de uma ligação dupla carbono-carbono nas moléculas do substrato, um dos passos finais desta via (VALE-SILVA et al, 2012). O bloqueio do crescimento celular correlaciona-se com o acúmulo de 14α-metil-ergosta-8,24- dien-3β-6α-diol; nessa situação, os esteróis 14α - metilados são convertidos em derivados tóxicos 3,6-diol por dessaturação realizada pela enzima Erg3p. Por conseguinte, alterações nessa proteína podem acarretar alto nível de resistência ao permitir que os fungos sobrevivam à toxicidade promovida pelos azólicos (VALE-SILVA et al, 2012). Eddouzi et al. (2013) estudaram os mecanismos moleculares de resistência à fármacos em isolado clínico de C. tropicalis com resistência cruzada entre fluconazol, voriconazol e anfotericina B, obtida de hospital da Tunísia. A análise da produção de esteróis por espectrometria de massa e cromatografia gasosa revelou acúmulo de 14α-metilfecosterol, 4,14α- dimetilzimosterol e 14α-metil-3β,6α-diol, indicando alteração em Erg3p. Vincent et al. (2013) reportaram a ocorrência de mutação em ERG3 de isolado de C. tropicalis, com substituição de uma fenilalanina por serina na porção 258, um resíduo que é absolutamente conservado nesta proteína. As mutações combinadas em ERG11 e ERG3 foram relacionadas com a resistência cruzada entre anfotericina B e fluconazol apresentada por esse isolado. A anfotericina B é o terceiro antifúngico mais empregado na prática clínica (SILVA et al, 2012). Faz parte da classe dos polienos, e sua atividade fungicida advém da capacidade de se ligar seletivamente ao ergosterol da célula fúngica, induzindo a formação de poros na

membrana plasmática, resultando em intenso desequilíbrio osmótico e rápido colapso da célula (BRAJTBURG et al, 1990). Em recente estudo, Forastiero et al. (2014) relataram que a produção de espécies reativas de oxigênio também faz parte do mecanismo de ação fungicida da anfotericina B. Leveduras resistentes à ação da anfotericina B são supostamente raras, contudo estudo realizado por Woods e Bard em 1974 já demonstrava o desenvolvimento de resistência a essa fármaco em dois isolados de C. tropicalis obtidos a partir de urina de paciente com pielonefrite (WOODS e BARD, 1974). Estudo posterior dessas cepas revelou a existência de uma mutação no ergosterol da membrana celular, exatamente no sítio de ligação da anfotericina B (DRUTZ e LEHRER, 1978). Ainda na década de 70, Merz e Sandford reportaram o isolamento de oito cepas de C. tropicalis resistentes à anfotericina B, obtidas de urina de pacientes transplantados, apresentando a mesma mutação no ergosterol (MERZ e SANDFORD, 1979). Os relatos de isolamento de C. tropicalis resistente a esse medicamento vêm aumentando progressivamente ao longo dos anos. Em 1988, Powderly et al relataram que o desenvolvimento de resistência à anfotericina B é mais observado em pacientes com algum tipo de imunossupressão e que fazem uso frequente da fármaco (POWDERLY et al, 1988). Acredita-se que a resistência a esse polieno resulte de alterações no ergosterol (redução ou ausência dessa molécula na membrana plasmática ou mutações em sua estrutura), ou de alterações na própria membrana plasmática (SILVA et al, 2012). Lupetti et al. (2012) postularam que resistência a anfotericina B nas espécies de Candida ocorre geralmente devido a defeitos na biossíntese do ergosterol e, muito provavelmente resulta de mutações no gene ERG3, que produz alterações na Erg3p. Além do gene ERG3, mutações no ERG11 e em ERG6, que codifica a 24-esterolmetiltransferase necessária para a função normal da membrana, pode gerar resistência aos poliênios, tendo sido descritas em C. tropicalis (VANDEPUTTE et al, 2007). Estudo conduzido por Forastiero et al. (2013) mostrou que mutações concomitantes nos genes ERG11 e ERG3 levam à resistência cruzada entre anfotericina B e azólicos (fluconazol e itraconazol) em C. tropicalis, como também foi mostrado por VINCENT et al. (2013) em trabalho anteriormente citado. Além da anfotericina B, as equinocandinas são medicamentos cada vez mais utilizados no tratamento de infecções invasivas, sendo a primeira nova classe de anfúngicos que têm como alvo de ação a parede da célula fúngica, bloqueando a β-1,3-D-glucano sintetase (PERLIN, 2007). Tem sido descrito que esses fármacos apresentam excelente espectro de

ação contra as principais espécies do gênero Candida, incluindo C. tropicalis (PFALLER et al, 2008), destacando-se a utilização para isolados com resistência intrínseca ou dose dependente para o fluconazol e também em casos de resistência à anfotericina B (BEYDA et al, 2012). Estudo de vigilância realizado em 2008 por Pfaller et al com 5.346 isolados de Candida sp obtidos de infecção hemagênica demonstrou prevalência de 12% para C. tropicalis, sendo que todos os isolados dessa espécie apresentaram 100% de sensibilidade para as três equinocandinas testadas (caspofungina, anidulafungina e micafungina). Apesar da extensa utilização desses medicamentos por mais de uma década, a incidência de resistência no gênero Candida continua a ser muito baixa (BEYDA et al, 2012). Estudos de vigilância mais recentes indicaram uma incidência de 2,9 a 3,1% de resistência às equinocandinas no gênero Candida (CASTANHEIRA et al, 2010; ARENDRUP et al, 2011). Garcia-Effron et al. (2010) reportaram isolamento de três cepas de C. tropicalis resistentes à caspofungina obtidas de pacientes com malignidades hematológicas. Estudo realizado por Eschenauer et al. (2014) com 185 isolados de C. tropicalis relata que 1,4% dessas cepas apresentaram resistência para caspofungina, anidulafungina e micafungina. Um estudo descreveu a presença de efeito paradoxal (ou crescimento paradoxal) em 15 isolados de C. tropicalis na presença de altas concentrações desses três medicamentos (SÓCZÓ et al, 2007). Esse fenômeno foi documentado pela primeira vez por Stevens et al. (2004) para caspofungina em C. albicans, e tem sido descrito como o crescimento fúngico na presença de concentrações de equinocandina acima da CIM nos testes de susceptibilidade de microdiluição em caldo realizados, de acordo com as diretrizes do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente NCCLS; MELO et al, 2007). De acordo com Beyda et al. (2012), a glucana sintetase compreende pelo menos duas subunidades, que são a Fksp1 (codificada pelos genes FKS1, FKS2 e FKS3) e a Rho1p. Fks1 tem ação catalítica e Rho1p é uma proteína reguladora de vários processos celulares, incluindo a bissíntese de β-1,3-D-glucana (CHEN et al, 2011). De modo geral, a redução da susceptibilidade de C. tropicalis às equinocandinas ocorre mediante resposta ao estresse adaptativo ou mutações no gene FKS. Com relação às respostas adaptativas, sabe-se que a parede da célula fúngica é uma estrutura dinâmica que apresenta um mecanismo compensatório para aumentar a produção de um ou mais componentes que sejam eventualmente inibidos, como o que ocorre pela ação das equinocandinas (WALKER et al, 2010).

Estudo realizado por Chen et al. (2014) investigou o papel da calcineurina em C. tropicalis, sendo esta uma das principais vias de sinalização para o aumento compensatório da síntese de quitina em C. albicans. A calcineurina é uma fosfatase que regula numerosos processos de resposta ao estresse nos fungos, incluindo o estresse promovido na parede celular (COWEN et al, 2009). O estudo demonstrou que, de fato a calcineurina é responsável por esse efeito em C. tropicalis frente à micafungina, ou seja, essa proteína desempenha importante papel na resistência de C. tropicalis a essa fármaco, uma vez que promove o espessamento da camada de quitina da parede celular em função da depleção de β-1,3-D- glucana. Em se tratando de mutações no gene FKS1, já está bem estabelecido que substituições em regiões gênicas específicas ocasionem susceptibilidade reduzida as equinocandinas, estando bastante associada à falha terapêutica (PERLIN, 2007). Mutações no gene FKS1 em C. tropicalis foram descritas por Park et al. (2005). Garcia-Effron et al. (2008) demostrou que 7,5% (3/40) de isolados clínicos de C. tropicalis apresentaram resistência à caspofungina devido a substituições de aminoácidos na Fks1p. Jensen et al. (2013) também realizaram trabalho investigando alterações em FKS1, com isolados de C. tropicalis oriundos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda; após 8 a 8,5 semanas de tratamento com caspofungina, dois isolados apresentaram resistência às três equinocandinas. O sequenciamento multilocus de FKS1 revelou progressivo desenvolvimento de heterozigose, e por fim, a presença de mutação homozigótica, conduzindo a substituições dos aminoácidos S80P e S80S (JENSEN et al, 2013). A despeito da quantidade de estudos sobre resistência às fármacos antifúngicos envolvendo isolados clínicos de C. tropicalis, ainda há pouco interesse em relação a este fenômeno em isolados ambientais desta espécie. Nesse sentido, estudo pioneiro foi recentemente realizado em Taiwan descrevendo o surgimento de resistência ao fluconazol em isolados de C. tropicalis derivados de solo agrícola exposto a pesticidas contendo este antifúngico, demonstrando que alguns desses isolados estão geneticamente relacionados com isolados clínicos da mesma espécie (YANG et al, 2012). Em se tratando de resistência antifúngica de isolados de C. tropicalis oriundos de ambiente costeiro, até o presente momento nenhum trabalho foi encontrado.

2.4 Perspectiva do agente patogênico: fatores de virulência de Candida tropicalis

A capacidade da levedura em aderir, infectar e causar doença, em conjunto é definida como potencial de virulência ou patogenicidade. Os fatores de virulência são condicionados geneticamente, mas expressos pelos micro-organismos quando submetidos às condições específicas (TAMURA et al, 2007). C. tropicalis é a segunda espécie mais virulenta do gênero Candida, e acredita-se que a imunidade do hospedeiro seja o principal fator regulador do status desta espécie no organismo (ZAUGG et al, 2001). Os principais fatores de virulência desta levedura incluem a capacidade de aderência às células epiteliais e endoteliais humanas, a secreção de proteinase e a capacidade de formação de biofilme (BIZERRA et al, 2008). Vários estudos de deleção de genes específicos in vivo foram relatados na literatura, sendo que para ser considerado fator de virulência, o gene em estudo ao ser nocauteado deve resultar em atenuação da virulência da cepa mutante quando inoculado em animais em modelo de infecção experimental (NAVARRO-GARCIA et al, 2001).

2.4.1 Capacidade de aderência em Candida tropicalis

A adesão dos blastoconídios das leveduras às células hospedeiras é considerada o primeiro passo necessário tanto para a colonização como para o estabelecimento de infecção, e envolve interações entre as células fúngicas e as superfícies do hospedeiro (CANNON et al, 2001). É um processo complexo e multifásico, englobando uma série de váriáveis, incluindo o micro-organismo envolvido, a composição da superfície de adesão e vários fatores ambientais (SILVA-DIAS et al, 2012). Há uma fase primária reversível que é altamente dependente de interações físico- químicas, relacionadas com o grau de hidrofobicidade da célula fúngica (TRONCHIN et al, 2008) Posteriormente, dá-se a segunda fase, irreversível e mediada por adesinas específicas, ocorrendo interações moleculares especificamente entre o micro-organismo e a superfície aderente (TRONCHIN et al, 2008). Ambas as interações são fortemente influenciadas pelo proteoma da parede celular das leveduras (SILVA-DIAS et al, 2012).

A estrutura da parede comporta proteínas hidrofóbicas embutidas em sua matriz, o que favorece a interação inicial, uma vez que partículas hidrofóbicas tendem a ligar-se a uma grande variedade de materiais plásticos e proteínas do hospedeiro como laminina, fibrinogênio e fibronectina (TRONCHIN et al, 2008). Galán-Ladero et al. (2013) realizaram estudo com 29 isolados de C. tropicalis e reportaram o potencial de hidrofobicidade dos mesmos. Há outra importante classe de proteínas da parede celular envolvidas no processo de adesão, que são as proteínas glicofosfatidilinositol, denominadas adesinas (SILVA-DIAS et al, 2012). As adesinas fúngicas diferem quanto a sua capacidade de interagir com uma superfície específica, e são variáveis nas diferentes espécies de Candida, apesar de possuírem a mesma estrutura básica (um grupamento N-terminal e outro C-terminal, separados por uma região de sequências repetidas em cadeia; SILVA-DIAS et al, 2012). Os genes que codificam as proteínas de adesão são diferencialmente expressos, de acordo com os variados hospedeiros e condições ambientais (VERSTREPEN e KLIS, 2006; SOHN et al, 2006). Os genes ALS (“Agglutinin-like sequence”) codificam a família de proteínas Als, amplamente relacionada com o processo de adesão no gênero Candida e que consiste de pelo menos nove glicoproteínas de superfície celular, com elevado grau de similaridade (PIET et al, 2013). Apesar destes genes estarem sumariamente relacionados com adesão em C. albicans, tem sido reportado que várias espécies de Candida tem capacidade de aderir a células epiteliais bucais humanas, bem como a células do epitélio vaginal humano, epitélio gastrintestinal de camundongos e diferentes materiais plásticos, o que motivou estudos de adesão em espécies de CNCA (KLOTZ et al, 1983). Para C. tropicalis, HOYER et al. (2001) relataram a identificação de três sequências parciais de ALS, que codificam o domínio amino-terminal da proteína. Essas sequências não apresentam correspondência direta com qualquer um dos nove genes de C. albicans, exibindo entre 53% e 86% de homologia entre os nucleótidos (42-85% de aminoácidos) das sequências ALS desta espécie. A análise de hibridação cruzada indicou que os genes ALS em C. tropicalis tendem a ter domínios 3’ originais, em grande parte independentes aos encontrados em C. albicans. Punithavathy e Menon (2012) realizaram estudo para detectar a presença de genes ALS por PCR em 48 isolados de C. tropicalis obtidos de pacientes com HIV e sem HIV; os resultados mostram que em 12 isolados (25%) houve expressão de ALS1, em 24 isolados (50%) houve expressão de ALS2 e em 23 (48%) foi detectada expressão de ALS3.

O gene HWP1 (“Hyphal wall protein”) expressa outra importante adesina, uma proteína de parede celular de hifas com similaridade a pequenas proteínas ricas em prolina, também inicialmente descrita em C. albicans. Trata-se de um substrato para transglutaminases de mamíferos, enzimas encontradas no epitélio e endotélio de tecidos humanos, com as quais se liga covalentemente e funciona como uma importante adesina para a patogênese da candidíase (STAAB et al, 2013; ORSI et al, 2014). Estudos in vitro demonstraram a presença de grande quantidade de Hwp1p na parede celular de hifas, e quantidade pequenas ou imperceptíveis nos blastoconídios (NAGLIK et al, 2006) e pseudo- hifas (SNIDE e SUNDSTROM, 2006). O gene HWP1 está envolvido na formação de ligações covalentes entre leveduras e proteínas presentes nas células epiteliais bucais humanas (CEBH), codificando a primeira proteína de superfície necessária para a formação de biofilme (SUNDSTROM et al, 2002; NOBILE et al, 2008). A expressão desta adesina foi recentemente reportada em C. tropicalis, em trabalho realizado na Malásia (WAN HARUN, 2013) que investigou a presença de HWP1 em espécies de CNCA mediante expressão de mRNA. Nas condições de crescimento oferecidas, a transcrição de mRNA de HWP1 foi regulada positivamente para C. tropicalis, indicando a capacidade dessa levedura de apresentar esta adesina, que é covalentemente ligada ao glucano da parede celular por meio de glicofosfatidilinositol (GPI), induzindo a adesão. O estudo ainda sugere que HWP1 em C. tropicalis compartilha sequência idêntica em C. albicans (WAN HARUN, 2013). Este dado contradiz um estudo anterior realizado por Ten- Cate et al. (2009), que descreve a presença de HWP1 apenas em C. albicans. De fato, é descrito na literatura que C. albicans é mais aderente que as espécies de CNCA, dentre as quais C. tropicalis é a que tem maior capacidade de adesão (CALDERONE, 2002; LYON et al, 2006; BIASOLI et al, 2010). Costa et al. (2010) avaliaram a capacidade de aderência de isolados de Candida obtidos da cavidade oral de pacientes com HIV, pacientes com candidemia e de isolados de ponta de cateter; os resultados demonstraram maior capacidade de aderência em C. albicans (média de 227,5 células/100 CEBH) do que para as espécies de CNCA, sendo que C. tropicalis teve capacidade de aderência de 123,5 células/100 CEBH. Entretanto, estudo realizado por Costa et al. (2012) investigando a capacidade de adesão de isolados orais de C. albicans e de C. tropicalis à laminina e à fibronectina por

ELISA, reportou que os isolados de C. tropicalis apresentaram capacidade de adesão significativamente maior que C. albicans. Menezes et al. (2013) avaliaram a capacidade de adesão de isolados clínicos de Candida spp. à lamínulas de vidro; os autores também relataram maior capacidade de aderência de C. tropicalis do que para C. albicans e leveduras do complexo C. parapsilosis. Estudo com isolados de cavidade oral de pacientes transplantados renais conduzido por Chaves et al. (2013) também demonstrou elevada capacidade de aderência às células epiteliais bucais humanas por C. tropicalis. Nesse estudo, os isolados de C. albicans apresentaram cerca de 237 células/150 CEBHs, enquanto que um dos isolados de C. tropicalis testados teve capacidade de aderência de 335 células/150 CEBHs, ressaltando o importante papel da adesão como fator de virulência em C. tropicalis.

2.4.2 Morfogênese em Candida tropicalis

Subsequentemente à fase de adesão às células do hospedeiro, a transição levedura-hifa tem grande relevância para a virulência de muitos fungos patogênicos, incluindo o gênero Candida (CALDERONE e GOW, 2002). Trata-se de um dos mecanismos mais importantes no estabelecimento da candidíase, pois é necessária em vários processos de virulência, incluindo invasão das camadas do epitélio hospedeiro, rompimento do endotélio, sobrevivência ao ataque fagocitário, formação de biofilme e tigmotropismo (LAKEY et al, 2013). Os estudos concernentes à morfogênese já estão bem estabelecidos para C. albicans, onde se conhece os sinais ambientais, reguladores de transcrição e genes-alvo associados à filamentação (GUSTIN, 1998; KUMAMOTO e VINCES, 2005; LAKEY et al, 2013). Contudo, há consideravelmente poucos estudos envolvendo morfogênese em espécies de CNCA. Muitas espécies de Candida podem produzir pseudo-hifas, mas poucas formam hifas verdadeiras, incluindo C. albicans, C. dubliniensis e C. tropicalis. Essas últimas não apresentam filamentação robusta como C. albicans, mas como estão envolvidas frequentemente em processos infecciosos, certamente têm mecanismos de adaptação que favorecem a filamentação em condições ambientais específicas (LAKEY et al, 2013).

Com relação à C. tropicalis, os estudos sobre esse fator de virulência são escassos, e em se tratando de amostras ambientais, são praticamente ausentes. Galán-Ladero et al. (2013) avaliaram a capacidade de filamentação de 29 isolados de C. tropicalis obtidos de vários sítios anatômicos de pacientes internados em um hospital terciário na Espanha. Os autores reportam alto nível de filamentação em 76,6% dos isolados nas condições ambientais fornecidas. Wapinski et al. (2007) afirmaram que dos 105 genes envolvidos na filamentação de C. albicans estudados até o momento da pesquisa, pelo menos 75 estão conservados em C. tropicalis . Lakey et al. (2013) realizaram estudo induzindo a filamentação em C. tropicalis e analisaram a expressão gênica nessa condição. Verificou-se significativa filamentação em meio contendo soro e glicose, a 37°C, sem peptona ou outros nutrientes. Na microscopia, evidenciou-se a presença de células leveduriformes alongadas, pseudo-hifas e hifas verdadeiras menores que em C. albicans. Em relação à expressão gênica, os autores mostraram que o regulador negativo NRG1 tem papel importante inibindo a filamentação de espécies de CNCA, o que se relaciona com a menor produção de hifas nestas espécies. O gene UME6 foi transcricionalmente induzido durante a filamentação de C. tropicalis, semelhantemente ao que ocorre em C. albicans (BANERJEE et al, 2013). Trata-se de um regulador positivo de transcrição, responsável pela morfologia e extensão das hifas, e foi super expresso em C. tropicalis nas condições de indução de estudo (LAKEY et al, 2013). O gene UME6 também induz a transcrição de HGC1, gene específico de filamentação que codifica uma proteína relacionada com ciclina (CARLISLE e KADOSH, 2010). Hcg1p forma um complexo entre ciclina/Cdk e CDC28 quinase, que, por sua vez, é importante na inibição da separação celular e ativação do regulador Cdc42 (envolvido no transporte vesicular para as extremidades das hifas e na polimerização de actina; ZHENG et al, 2007; GONZALEZ-NOVO et al, 2008). Gene ortólogo de HGC1 foi encontrado no genoma de C. tropicalis (ZHENG e WANG, 2004; LAKEY et al, 2013). Outros genes envolvidos com a filamentação dessa levedura encontrados no estudo de LAKEY et al. (2013) foram PHR1 e CDC12. O primeiro codifica proteína ligante de GPI, em meio com valores de pH superiores a 5,5 (CALDERONE et al, 2010); Phr1p é uma enzima de remodelação da parede celular, necessária na manutenção da forma e crescimento das hifas, na adesão às superfícies abióticas e na invasão do epitélio (CALDERONE et al, 2010). CDC12 é um gene essencial na morfogênese de C. albicans que codifica a septina cdc12p,

proteína relacionada com a formação do citoesqueleto durante o crescimento celular na filamentação (LI et al, 2012), estando ainda envolvida com a profilina cdc3p, proteína de ligação com actina (CHANG et al, 1997). Porman et al. (2013) relataram expressão elevada do regulador transcricional WOR1 em células de C. tropicalis cultivadas em ágar Spider. A análise micromorfológica dos isolados com fenótipo rugoso nesse meio confirmou que cepas que tiveram expressão aumentada de WOR1 exibiram significativamente mais filamentação, sendo observada maior porcentagem de hifas e pseudo-hifas que nos demais isolados. Este gene codifica o fator de transcrição Wor1p, um dos principais reguladores do “phenotypic switching” em C. albicans e também em C. tropicalis (PORMAN et al, 2013). Homólogos de Wor1p foram encontrados em Saccharomyces cerevisiae (CAIN et al, 2012) e em Histoplasma capsulatum (NGUYEN e SIL, 2008), controlando o processo de transição morfológica nesses fungos, o que pode sugerir a existência de um gene ancestral comum com o encontrado no genoma de C. tropicalis (PORMAN et al, 2013).

2.4.3 Formação de biofilme

A capacidade de formação de biofilmes é um importante determinante de virulência para Candida spp, uma vez que os mesmos são a principal forma de crescimento microbiano (DONLAN e COSTERTON, 2002, FANNING e MITCHELL, 2012). Os biofilmes são estruturas complexas formadas por uma comunidade de micro-organismos aderidos a superfícies sólidas de natureza biótica ou abiótica. Assim, a formação de biofilme in vitro pode ser organizada em três etapas fundamentais, que são: adesão e colonização das células de levedura em uma superfície; crescimento e proliferação das células, formando uma camada basal; e crescimento de pseudo-hifas e hifas verdadeiras, com subsequente secreção de uma matriz extracelular exopolimérica que envolve os micro-organismos, cujas células possuem taxas de crescimento e fenótipos alterados (HAWSER e DOUGLAS, 1994; BAILLIE e DOUGLAS,1999; CHANDRA et al, 2001; RAMAGE et al, 2001; DOUGLAS,2003). A matriz exopolimérica (EPS) pode ser composta de populações que se desenvolvem a partir de uma única espécie ou de uma comunidade derivada de múltiplas espécies microbianas (ADAM et al, 2002). Algumas vantagens na formação de biofilme incluem:

proteção dos micro-organismos contra as agressões geradas pelo meio ambiente, disponibilidade de nutrientes, cooperação metabólica e aquisição de modificações genéticas (DOUGLAS, 2002). De acordo com Nobile e Mitchell (2009), a formação da comunidade microbiana envolve uma cascata de mecanismos moleculares geneticamente controlados, ainda pouco estudados em C. tropicalis. Moléculas de sinalização que ocorrem naturalmente nas células fúngicas em resposta a estímulos ambientais fazem parte deste processo em leveduras do gênero Candida (RAMAGE et al, 2002). Esta regulação é denominada “quorum sensing” (QS), e é a principal forma de comunicação entre vários micro-organismos, ocorrendo em função da densidade celular (ALBUQUERQUE e CASADEVALL, 2012). A concentração de moléculas de sinalização aumenta proporcionalmente ao tamanho da população microbiana, e ao atingir determinado ponto, uma resposta reguladora é disparada, conduzindo a expressão ou repressão de genes alvo QS-dependente (ALBUQUERQUE e CASADEVALL, 2012). Uma das moléculas auto-reguladoras é o farnesol. O farnesol é um sesquiterpeno com capacidade de inibir a formação de biofilme, alterando a expressão de 274 genes em C. albicans, sobretudo genes envolvidos na filamentação. Estudo realizado por Weber et al. (2010) investigou a relação desta molécula com a formação de biofilme em cepas de referência do gênero Candida, incluindo dois isolados de C. tropicalis. Os resultados mostram que, apesar de inibir a agregação celular, as células do biofilme maduro de C. tropicalis foram resistentes ao farnesol, o que pode influenciar a dispersão das mesmas para o ambiente (RAMAGE et al, 2002; NICKERSON et al, 2006). O mesmo foi evidenciado por Zibafar et al. (2009) em estudo com cinco isolados clínicos de C. tropicalis. O início da formação do biofilme depende da adesão das células ao substrato e da formação de uma camada celular basal, processos que são particularmente dependentes de adesinas (NOBILE e MITCHELL, 2006). As moléculas de adesão expressas em C. tropicalis citadas anteriormente (Als1, Als2, Als3 e Hwp1) estão, de fato, envolvidas na produção de biofilme (PUNITHAVATHY e MENON, 2012; WAN HARUN, 2013), sendo reguladas pelo gene BCR1(biofilm and cell wall regulator). Adicionalmente, o gene RBT5 codifica proteína de superfície celular relacionada com a filamentação das células no biofilme de C. albicans (NOBILE e MITCHELL, 2006), e também foi encontrado no genoma de C. tropicalis (FITZPATRICK et al, 2010). Outros genes envolvidos na formação de biofilme desta espécie são WOR1, UME6, NRG1, ERG11 e MDR1, comentados previamente. WOR1 é um dos fatores de transcrição que

promovem a formação de biofilme em C. tropicalis, além de induzir a filamentação e também estar envolvido no “phenotypic switching” (XIE et al, 2012; PORMAN et al, 2013). UME6 e NRG1 são reguladores de transcrição relacionados com a morfogênese de C. tropicalis e também estão envolvidos na produção de biofilme em espécies de Candida (FINKEL e MITCHELL, 2011). O aumento da expressão de UME6 reduz a liberação de células do biofilme maduro, enquanto que a diminuição na expressão de NRG1 promove aumento da dispersão de células (UPPULURI et al, 2010) Os genes ERG11 e MDR1, por sua vez, estão relacionados com mecanismos de resistência ao fluconazol. Bizerra et al. (2008) reportaram expressão diminuída desses genes em células sésseis de biofilme de C. tropicalis isoladas de CVV e de urocultura, mas também detectaram super expressão nas células planctônicas, altamente resistentes ao fluconazol. Punithavaty et al. (2012) também demonstraram maior resistência ao fluconazol nas células liberadas do biofilme maduro de C.tropicalis do que nas células sésseis, em estudo realizado com 50 isolados desta levedura, obtidos de vários sítios anatômicos de pacientes imunocomprometidos. Dessa forma, fica claro que há mecanismos genéticos de resistência a fármacos antifúngicos nos biofilmes de C. tropicalis, o que constitui grande problema terapêutico. Há evidências de que as células do biofilme formado sobre materiais implantados estejam sendo constantemente liberadas para a corrente sanguínea, garantindo o sucesso do estabelecimento da infecção bem como sua gravidade, em função da expressão de genes de resistência nas células plactônicas. Esse fator também é favorecido pela complexidade da organização estrutural dos biofilmes, a espessura da matriz extracelular e a heterogeneidade metabólica que é intrínseca a essas células (FANNING e MITCHELL, 2012). Espécies do gênero Candida diferem entre si quanto à habilidade de formação de biofilme, bem como na composição do mesmo, com variações na morfologia, composição da matriz de EPS e resistência aos antifúngicos (SENEVIRATNE et al, 2008). Marcos-Zambrano et al. (2014) realizaram trabalho para investigar a expressão deste fator de virulência em espécies de Candida obtidas de fungemia. Os isolados de C. tropicalis testados foram mais eficientes na produção de biofilme que as demais espécies do gênero, incluindo C. albicans, evidenciada por medição da biomassa fúngica formada. Entretanto, os autores mostraram que a atividade metabólica nas células do biofilme dessa espécie é muito baixa. De fato, estudo conduzido por Alnuaimi et al. (2013) relatou que os biofilmes de C. tropicalis produzem camada de EPS muito espessa, o que prejudica a difusão de nutrientes e

oxigênio para as células, e pode ser responsável pela redução da atividade metabólica das mesmas. Estudo realizado por Pannanusorn et al. (2013) também analisou a formação de biofilme em isolados de candidemia. C. tropicalis foi a espécie de CNCA com maior formação de biofilme, produzido por todos os isolados testados, sendo constituído de um denso emaranhado de células leveduriformes e filamentosas. Paiva et al. (2012) avaliaram a formação de biofilme in vitro por isolados de candidíase vulvovaginal, sendo que C. tropicalis foi a espécie que teve maior produção de biofilme, superior a C. albicans, leveduras do complexo C. parapsilosis, C. glabrata e C. guilliermondii. Resultado semelhante foi descrito por Udayalaxmi et al. (2014) em trabalho realizado com isolados oriundos do trato urogenital (amostras de fluido vaginal e urina) de pacientes de um hospital terciário no sul da índia. C. tropicalis foi a segunda espécie de fungos mais prevalente (23%) desse estudo, precedida apenas por C. albicans, sendo ainda a espécie mais produtora de biofilme, uma vez que 63% de todos os isolados dessa espécie foram classificados como fortemente produtores. Contrapondo-se a esses trabalhos, estudo conduzido por Sánchez-Vargas et al. (2013) com isolados de cavidade oral de pacientes internados em hospital mexicano reportou que C. tropicalis foi moderadamente produtora de biofilme, sendo precedida por isolados de C. glabrata, C. albicans e C. krusei.

2.4.4 Enzimas líticas

Para auxiliar a invasão de tecidos do hospedeiro, muitos micróbios patogênicos secretam enzimas líticas como proteinases e hemolisinas, com o objetivo de destruir, alterar ou danificar a integridade das membranas do hospedeiro, levando à disfunção ou ruptura de estruturas de acolhimento (SILVA et al, 2012; SANITÁ et al, 2014). Espécies patogênicas do gênero Candida produzem uma grande variedade de hidrolases, dentre elas as proteinases aspárticas secretadas (Saps). Essas proteínas têm sido intensamente investigadas, possuindo um amplo espectro de especificidade de substrato, incluído colágeno, queratina e mucina. Possuem capacidade de degradar barreiras epiteliais,

anticorpos, complemento e citocina (HUBE & NAGLIK, 2001), sendo codificadas por uma grande família gênica. A família de genes SAP, contendo 10 genes, foi descrita inicialmente em C. albicans (HUBE & NAGLIK, 2001). São genes diferencialmente regulados e expressos sobre várias condições de laboratório e também durante infecções in vivo, sendo ativados em diferentes estágios da infecção. Além disso, sabe-se que alguns genes SAP são mais importantes para infecções superficiais ou sistêmicas e em outros processos patogênicos de C. albicans, tais como aderência, invasão de tecidos hospedeiros e evasão do sistema imunológico (HUBE & NAGLIK, 2001). Sabe-se desde 1983 que C. tropicalis secreta proteinases e que este é um dos mais importantes determinantes de virulência nessa espécie (RÜCHELL et al, 1983; MACDONALD e ODDS, 1983). Ainda em 1991, Togni et al. relataram a sequência nucleotídica de um gene envolvido na secreção extracelular de proteinases nessa levedura, e em 1996 os mesmos autores reportaram a secreção de Sapt1p por C. tropicalis. (TOGNI et al, 1991; TOGNI et al, 1996). Symersky et al. (1997) apresentaram a estrutura cristalográfica dessa proteína, verificando grandes semelhanças com Sap2p de C. albicans. Estudo realizado por Zaugg et al. (2001) sugeriu a existência de uma família de genes SAPT no genoma de C. tropicalis, levando à clonagem de quatro genes SAPT (1-4). No entanto, apenas Sapt1p foi purificada a partir do sobrenadante da cultura e caracterizada bioquimicamente. Silva et al. (2010) investigaram infecção epitelial por C. tropicalis utilizando epitélio bucal humano reconstituído. Todos os isolados testados foram capazes de colonizar esse tecido. Após 12 h de infecção, verificou-se alto potencial invasivo por microscopia confocal de varredura, ocorrendo grande dano tecidual após 24 h. A PCR em tempo real mostrou que transcritos de SAPT2-4 foram frequentemente detectados ao longo do processo, enquanto que os de SAPT1 foram raramente detectados. Além disso, os autores concluíram que no decorrer da infecção não houve aumento da expressão do gene SAPT1, sugerindo que a elevada capacidade invasiva de C. tropicalis pode não estar correlacionada com a expressão específica desse gene, diferentemente do que é descrito para C. albicans. De fato, Togni et al. (1996) relataram em estudo anterior, que a deleção de gene SAPT1 em C. tropicalis pareceu ter pouco efeito sobre a virulência dessa levedura, em experimentos com camundongos (TOGNI et al, 1996).

A presença de proteinases nesta levedura também foi demonstrada por imunofluorescência direta na superfície dos elementos fúngicos que penetram os tecidos durante a infecção disseminada e escapando de macrófagos após fagocitose (ZAUGG et al, 2001). Marcos-Arias et al. (2011) verificaram alta atividade de proteinase em 2 de 10 isolados de C. tropicalis obtidos de pacientes com e sem estomatite proteica, sendo que os demais foram classificados como moderadamente produtores. Costa et al. (2012) compararam a atividade de proteinase de 15 isolados de C. albicans e 15 de C. tropicalis oriundos de saliva de pacientes odontológicos da Escola de Odontologia de Ribeirão Preto. A atividade de proteinase foi avaliada por método quantitativo, e todos os isolados de C. tropicalis tiveram elevada produção enzimática, sendo significativamente maior que a atividade proteolítica de C. albicans. Esses resultados se opõem ao que é descrito em muitos trabalhos, que sugerem que C. albicans possui maior produção de proteinase que C. tropicalis (ZAUGG et al, 2001; SACHIN et al, 2012; SILVA et al, 2012). Mais recentemente, Sanitá et al. (2014) avaliaram a capacidade proteolítica in vitro de 51 isolados de CNCA obtidos de candidíase oral; todos os isolados de C. tropicalis analisados tiveram elevada atividade de proteinase, sendo evidenciada a expressão de Sap. Resultados similares foram observados por Deorukhkar et al. (2014), que demonstraram produção de proteinase em isolados de C. tropicalis obtidos de vários sítios corporais humanos, sendo que maior atividade proteolítica foi observada em isolados vaginais. Esse mesmo trabalho também reporta elevada atividade hemolítica desses isolados. As hemolisinas são outro grupo de proteínas que contribuem significativamente para a disseminação das infecções por Candida, especialmente por facilitar a penetração das hifas nos tecidos hospedeiros (LUO et al, 2004; TSANG et al, 2007). Fatores hemolíticos secretados pelos fungos acarretam a liberação de hemoglobina das hemácias do hospedeiro para posterior utilização pela levedura como fonte de ferro (GIOLO et al, 2010). Esse elemento químico é um cofator essencial para um grande número de processos metabólicos, como transporte de oxigênio, regulação da expressão gênica e síntese de DNA (FRANÇA et al, 2010). Portanto, a habilidade de aquisição de ferro é de fundamental importância para a sobrevivência dos micro-organismos e estabelecimento do processo infeccioso (GIOLO et al, 2010). Manns et al. (1994) relataram a utilização de ferro dos eritrócitos por C. albicans como decorrente da produção de um fator proteico que promoveu a lise dessas células hospedeiras. Em 1997, Tanaka et al reportaram que esse fator é liberado no sobrenadante do

meio de cultivo, e posteriormente concluíram se tratar de uma manoproteína componente da parede celular (TANAKA et al, 1999). O mesmo foi verificado para C. tropicalis (FAVERO et al, 2014), e embora esse fator seja conhecidamente envolvido com a patogenicidade dessa levedura, é ainda pouco compreendido (FAVERO et al, 2011). Estudo conduzido por Luo et al, (2001) foi o primeiro a mostrar diferenças na expressão de hemolisinas nas várias espécies de Candida, em ensaio utilizando placas de ágar Sabouraud Dextrose (ASD) acrescido de sangue de carneiro. Os autores também sugeriram que a hemólise induzida por esse método poderia ser categorizada de acordo com a nomenculatura microbiológica convencional, incluindo: hemólise total (beta), hemólise incompleta ou parcial (alfa) ou ausência de hemólise (gama). Nesse estudo foram analisados 80 isolados de 14 espécies desse gênero, incluindo cinco cepas de C. tropicalis. Após 48 h de incubação a 37°C em atmosfera com 5% de CO2, todos os isolados desta espécie apresentaram largo halo claro ao redor das colônias, o que evidencia a capacidade de C. tropicalis de produzir hemólise tipo beta. De modo semelhante, Favero et al. (2011) analisaram as condições de cultura nas quais C. tropicalis produz fator hemolítico. Os ensaios utilizaram placas contendo ASD suplementado com sangue de carneiro e também com sangue humano, bem como avaliaram a secreção dessas proteínas em meio líquido. A secreção enzimática no meio líquido foi observada em todos os 16 isolados testados, que também produziram beta hemólise nos dois tipos de meio de cultura. Estudo conduzido por Rossoni et al. (2013) avaliou a atividade hemolítica em diferentes espécies de Candida obtidas da cavidade oral de pacientes portadores de HIV. Forte produção hemolítica foi observada em 75% dos isolados de C. tropicalis analisados, sendo inferior somente a C. albicans. Resultado semelhante foi encontrado por de Melo- Riceto et al. (2014) analisando isolados de Candida obtidos de diferentes materiais clínicos (sangue, líquido sinovial e peritoneal). Novamente C. albicans precedeu C. tropicalis na produção de hemolisinas. Em oposição a esses trabalhos, Favero et al. (2014) analisando isolados clínicos oriundos de infecção hematogênica, reportaram fraca atividade hemolítica em C. albicans, sendo que C. tropicalis foi a espécie testada com maior produção de hemolisinas. A regulação genética da produção de hemolisinas no gênero Candida é ainda pouco estudada (ANIL et al, 2014). Sabe-se que em C. glabrata o gene HLP (hemolysin-like protein) codifica proteína associada à atividade hemolítica (LUO et al, 2004). Em C. albicans

a proteína Csa2 está envolvida na utilização de ferro dos eritrócitos do hospedeiro durante o crescimento das hifas (OKAMOTO-SHIBAYAMA et al, 2014). Essa enzima é membro da família proteica Rbt5, também sido descrita em C. tropicalis, como anteriormente citado. Entretanto, ainda não consta na literatura corrente nenhum estudo de elucidação genética da atividade hemolítica em C. tropicalis.

2.5 Resistência ao estresse osmótico em Candida tropicalis

Muitos atributos de virulência são expressos pelos fungos em resposta a condições de estresse induzidas pelo ambiente (BROWN et al, 2014), e várias leveduras podem tolerar altas concentrações salinas, desenvolvendo mecanismos físicos e genéticos para neutralizar os dois principais efeitos deletérios do estresse osmótico, que são a toxicidade iônica e a perda de água e turgidez celular (GARCÍA et al, 1997; BEALES, 2003). O principal mecanismo utilizado pelas leveduras para neutralizar a toxicidade iônica nas células é a extrusão de íons sódio por proteínas que atuam como bombas iônicas (SERRANO, 1996). Saccharomyces cerevisiae é considerado micro-organismo modelo para o estudo da osmorregulação fúngica (SERRANO et al, 1998), e um dos principais determinantes da tolerância ao sal nessa levedura é a presença de ENA – ATPases na superfície celular (RODRIGUEZ et al, 1996). Essas proteínas são bombas de extrusão Na+/K+ codificadas pelo gene ENA1, cuja expressão, por sua vez, é modulada pelo gene HAL3, que codifica a proteína Hal3p. Essa enzima contém uma longa sequência ácida no domínio C- terminal que é essencial para sua função regulatória, não apenas para proteínas, mas também para micromoléculas. Estudo conduzido por Rodriguez et al. (1996) reportou o isolamento de gene envolvido com a adaptação osmótica em C. tropicalis, sendo homólogo verdadeiro de HAL3, o CtHAL3. De fato, C. tropicalis é capaz de crescer em meio com concentração acima de 10- 15% de cloreto de sódio, tendo sido isolada de ambiente hipersalino pela primeira vez a partir de amostras de água do mar Morto (BUTINAR et al, 2005). Bastos et al. (2000) relataram o isolamento dessa levedura a partir de amostra de solo da floresta Amazônica enriquecido com elevada concentração de sal. García et al. (1997) realizaram um dos poucos trabalhos investigando os mecanismos de adaptação osmótica de C. tropicalis, analisando a extrusão de

íons. Os resultados mostraram que em C. tropicalis os transportadores Na+/ K+-ATPase são ativados imediatamente após a exposição a ambiente hipersalino, promovendo rápido efluxo de íons e restabelecendo o equilíbrio osmótico intracelular. Essas bombas de efluxo Na+K+- ATPase são semelhantes às encontradas em S. cerevisiae. Outro mecanismo de extrusão de sódio intracelular é mediado pelos transportadores Na+/ H+ (Nha1p), que são codificados pelo gene NHA1 (KRAUKE e SYCHOVA, 2008). Este tem 12 domínios transmembrana e longa cadeia C-terminal hidrofílica (KINCLOVA et al, 2001), estando envolvido na remoção de Na+ tóxico e em outras funções celulares, como regulação do pH intracelular, volume celular e potencial da membrana plasmática (KRAUKE e SYCHOVA, 2008). CtCnh1p é ortólogo de Nha1p encontrado em C. tropicalis e caracterizado por expressão heteróloga em S. cerevisiae, mostrando mesma especificidade de substrato que a enzima dessa levedura (KINCLOVA et al, 2001). A exposição ao cloreto de sódio (NaCl) acarreta grande estresse osmótico nas células fúngicas, promovendo rápida perda de água que gera redução do tamanho e perda da turgidez celular (KÜHN e KLIPP, 2012). Para sobreviver, os micro-organismos desenvolveram a capacidade de produzir e/ou acumular solutos não iônicos como trealose, glicerol, manitol e sacarose, que ajudam a equilibrar a pressão osmótica e preservar as funções celulares (BEALES, 2003). Em leveduras do gênero Candida, a perda de água intracelular, mesmo em baixas concentrações salinas, promove rápida ativação da via de sinalização do gene HOG (“high osmolarity glycerol”). Esse processo leva a fosforilação e acúmulo de Hog1 nos núcleos das células, desencadeando a ativação de genes alvo que incluem aqueles que codificam enzimas da biossíntese do glicerol (SMITH et al ,2004; ENJALBERT et al ,2006). O consequente acúmulo de glicerol restaura a pressão de turgor e a retomada do crescimento celular (BROWN et al ,2014). Esse mecanismo de resistência ao estresse osmótico é denominado Hog1 dependente, sendo essa proteína um ativador de mitose da via de sinalização MAP quinase envolvida na adaptação osmótica de várias outras leveduras (NIKOLAOU et al, 2009; SMITH et al, 2010). Com relação à C. tropicalis, García et al. (1997) realizaram estudo no qual relatam que esse mecanismo de adaptação foi menos proeminente do que em S. cerevisiae, uma vez que a produção de glicerol foi lenta em C. tropicalis e não atingiu níveis aceitáveis até que as células chegassem na fase estacionária. O acúmulo de glicerol necessário para o restabelecimento da fisiologia celular normal ocorreu somente após a fase estacionária, ressaltando diferenças na adaptação ao estresse entre essas duas espécies.

Sendo um micro-organismo osmófílico, C. tropicalis pode crescer bem em ambientes com elevada pressão osmótica, tendo sobrevivência prolongada no ecossistema marítimo, e pode assim proporcionar maior possibilidade de colonização e infecção de indivíduos suscetíveis que eventualmente frequentem ambientes costeiros balneáveis como as praias (WOOLARD, 1995). Contudo, há ainda poucos estudos concernentes à adaptação ao estresse osmótico ambiental nesta levedura.

3.0 OBJETIVOS ______

3.1 Objetivo geral

Caracterizar isolados de Candida tropicalis oriundos da areia da Praia de Ponta Negra, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil, quanto a expressão de fatores de virulência in vitro, a adaptação ao estresse osmótico e a susceptibilidade às fármacos antifúngicos.

3.2 Objetivos específicos:

3.2.1 Realizar coletas de amostras de areia em seis diferentes pontos da praia de Ponta Negra, Natal-RN, em dois diferentes períodos dos anos de 2012 e 2013 (verão e inverno);

3.2.2 Realizar o isolamento e purificação de leveduras isoladas da areia da praia de Ponta Negra, Natal-RN, com triagem das cepas sugestivas de C. tropicalis;

3.2.3 Proceder a identificação laboratorial dos isolados de leveduras purificadas, utilizando-se a metodologia clássica;

3.2.4 Caracterizar fatores de virulência de C. tropicalis (aderência a células epiteliais bucais humanas, morfogênese em meio sólido, formação de biofilme produção de proteinases e produção de hemolisinas);

3.2.5 Avaliar a adaptação ao estresse osmótico de C. tropicalis;

3.2.6 Testar as cepas de C. tropicalis isoladas da praia quanto à sensibilidade aos antifúngicos Fluconazol, Voriconazol, Itraconazol, Anfotericina B, Micafungina, Caspofungina e Anidulafungina.

4.0 MATERIAIS E MÉTODOS ______

4.1 Parâmetros hidrológicos, temperatura e salinidade da água da praia de Ponta Negra, Natal-RN

4.1.1 Altura das marés

Todas as amostras foram coletadas durante maré baixa, previamente verificada na Tábua de Marés do Banco Nacional de Dados Oceanográficos (BNDO), para o porto de Natal, RN.

4.1.2 Salinidade da água

A salinidade da água foi determinada por refratômetro manual (ATAGOEEQ9030), segundo recomendações do fabricante.

4.1.3 Temperatura do solo

A temperatura do solo foi determinada através de termômetro digital infravermelho (MT-360) segundo recomendações do fabricante.

4.1.4 Pluviometria

Os dados pluviométricos da cidade de Natal, Rio Grande do Norte, foram fornecidos pela Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte (EMPARN) e pelo Instituto Nacional de Meteorologia (INMET).

4.2 Amostragem e coleta de areia

As amostras foram obtidas de forma asséptica, seguindo rigorosa observação das Boas Práticas de Laboratório e de Biossegurança. As coletas foram realizadas em março (verão) e julho (inverno) de 2012 e em março (verão) de 2013, em seis pontos distintos da praia de Ponta Negra, previamente demarcados com o auxílio do programa “Google Earth”, por meio do qual foram obtidas as coordenadas geográficas dos locais desejados (Fig. 1).

Fig. 1: Esquema de demarcação dos seis pontos de coleta de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN

As seguintes coordenadas foram posteriormente utilizadas para a localização desses pontos, com o auxílio de equipamento de GPS (“Global Positioning System”; GARMIN e Trex Vista HCx):

 Ponto 1: 5°53’2.10”W 35°9’54.05”S  Ponto 2: 5°53’00,1”W 35°10’06,8”S  Ponto 3: 5°52’35,0”W 35°10’08,7”S  Ponto 4: 5°52’35,0”W 35°10’30,9”S  Ponto 5: 5°52’27.91”W 35°10’34.57”S  Ponto 6: 5°52’19.77”W 35°10’38.43”S O material para análise consistiu-se de amostras de 50 g de areia seca coletadas a 15 centímetros de profundidade em relação à superfície do solo, com espátula estéril, e transferidas para coletores universais estéreis com volume de 80 ml, devidamente etiquetados e mantidos à temperatura ambiente (T. A.=28 + 2 ºC; LOUREIRO et al 2005), sendo transportados ao Laboratório de Micologia Médica e Molecular (LMMM), do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN, para o processamento laboratorial.

4.3 Processamento das amostras e isolamento primário das leveduras

O processamento laboratorial das amostras foi realizado imediatamente após a coleta. Em condições rigorosas de assepsia, as amostras de areia foram pesadas e transferidas dos frascos plásticos, com espátula estéril, para Erlenmayers de 250 mL de capacidade, previamente esterilizados. As amostras de 50 gramas de areia foram diluídas em 90 ml de solução salina 0,9% (w/v) estéril e homogeneizadas por 1 minuto, em agitador de tubos (Vortex Genie 2). A partir da suspensão resultante, alíquota de 1 ml foi retirada e posteriormente semeada na superfície de placas de Petri de 155 mm de diâmetro contendo Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) com cloranfenicol (100 mg/L), com auxílio de alça de Drigalski.. Após o plaqueamento, as placas de Petri foram incubadas à T.A., por um período de até 15 dias (LOUREIRO et al, 2005).

4.4 Purificação das colônias

Para a purificação dos isolados obtidos a partir da semeadura primária das amostras de areia, cada colônia com aspecto macroscópico de levedura isolada em ASD, foi repicada para placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo o meio CHROMagar Candida®, sendo semeadas por esgotamento e incubadas a 30 ºC por 72 horas. As colônias de C. albicans apresentam coloração verde, C. tropicalis desenvolve cor azul, e C. glabrata, cor púrpura (MIOTTO et al, 2004). Colônias com tons intermediários de rosa representam variadas espécies de leveduras. As colônias que cresceram isoladamente no CHROMagar Candida®, com aspecto e coloração azul petróleo características de C. tropicalis foram repicadas para placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo ASD + cloranfenicol e incubadas a 30 ºC por 48 horas, para dar sequência às provas de identificação. As demais leveduras, após identificação pela metodologia clássica (YARROW et al, 1998) foram incorporadas à coleção de culturas do LMMM.

4.5 Identificação das leveduras do solo

Para a identificação das leveduras foram observadas as características macroscópicas e micromorfológicas das colônias que foram isoladas.

4.5.1 Análise macroscópica das colônias

A partir do crescimento fúngico no meio para isolamento primário foi realizada a caracterização macroscópica das colônias obtidas, observando as características referentes ao aspecto, coloração do verso e do reverso, textura e tamanho.

4.5.2 Análise micromorfológica de leveduras

Após observação do crescimento das colônias nas placas de Petri contendo ASD com cloranfenicol, foi realizado o microcultivo de cada colônia. Cada amostra foi semeada com o

auxilio de alça em anel de níquel-cromo em três estrias paralelas sobre a placa de Petri de 90 mm de diâmetro contendo ágar fubá com Tween-80. As estrias realizadas sobre o ágar foram cobertas com lamínulas estéreis e a placa incubada à T.A., durante 48-96h. As leituras foram realizadas diariamente, em microscopia de luz com 400x de magnificação (Olympus, CX21).

4.5.3 Análise fisiológica e bioquímica

4.5.3.1 Testes de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (Auxanograma)

Para identificação das leveduras em nível de espécie foi utilizado o meio básico C, para o teste de assimilação de fontes de carbono, e o meio básico N, para o teste de assimilação de fontes de nitrogênio. Para realização dos mesmos, inicialmente foi preparada uma suspensão com a levedura obtida de dois repiques com 48 horas de incubação a 30 ºC em placa de Petri contendo ASD com cloranfenicol. Para a suspensão, utilizou-se tubos de ensaio com 2 ml de água destilada estéril para o meio C, e tubos com 1 ml de água estéril para o meio N, sendo o inóculo adicionado a esses tubos de ensaio com alça de níquel-cromo flambada, de modo a obter uma suspensão de micro-organismos compatível com o padrão da escala 5 de MacFarland. Subsequentemente, a suspensão de levedura foi adicionada ao meio de cultura ainda líquido, à temperatura de 50 ºC (meios básico C e N) e a suspensão distribuída em placas de Petri de 155 mm de diâmetro. Seguido à solidificação do meio de cultivo, sobre a superfície do meio básico C, foram adicionados 14 diferentes fontes de carbono em pequenas concentrações, em posições previamente marcadas na placa de Petri. As fontes de carbono utilizadas foram: celobiose (Vetec®), dulcitol (Vetec), galactose (Vetec), glicose (Cinética), inositol (Vetec), lactose (Queel), maltose (Reagen), manitol (Vetec), melibiose (Vetec), rafinose (Vetec), ramnose (Vetec), sacarose (Reagen), trealose (Vetec) e xilose (Reagen). De modo semelhante, sobre a superfície do meio básico N, foi adicionado nitrato de potássio (KNO3) (Reagen), como fonte de nitrogênio. Peptona (Himedia) foi utilizada como controle positivo.

As placas foram incubadas à T.A., por 72 horas. Após esse período observou-se em quais fontes de nutriente havia presença de halo de crescimento fúngico, indicando a utilização de fontes de carboidrato e ou/nitrogênio pela via oxidativa (YARROW et al, 1998).

4.5.3.2 Testes de fermentação de fontes de carbono (Zimograma)

Para avaliar a capacidade fermentativa de diferentes carboidratos pelas leveduras, foram utilizados tubos de ensaio contendo tubos de Duhram invertidos. Os tubos de ensaio continham 6 ml do meio básico para fermentação, com peptona, extrato de levedura e diferentes açúcares. À semelhança do auxanograma, primeiramente foi preparada uma suspensão com a levedura obtida de dois repiques com 48 horas de incubação à T.A. em placa de Petri contendo ASD com cloranfenicol. Para a suspensão utilizou-se tubos de ensaio com 2 ml de água destilada estéril. O inóculo foi adicionado a esses tubos de ensaio com alça de níquel-cromo flambada, para se obter uma suspensão de leveduras compatível com o padrão da escala 5 de MacFarland. Foram utilizados para cada cepa de levedura isolada 7 tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos, sendo que cada um continha uma fonte de carboidrato distinta. Os carboidratos utilizados foram galactose (Vetec), glicose (Cinética), lactose (Queel), maltose (Reagen), rafinose (Vetec) e trealose (Vetec). Adicionou-se 200 µl da suspensão de levedura em cada tubo de ensaio, seguido de homogeneização e incubação à temperatura ambiente. As leituras foram realizadas diariamente entre 7 e 21 dias, sendo que considerou-se resultado positivo quando 1/3 a 3/3 do tubo de Durham estava preenchido com gás, produzido pela fermentação dos carboidratos. O teste foi considerado negativo quando não foi observada produção de gás dentro do tubo de Durham. (YARROW et al, 1998).

4.5.4 Métodos comerciais semi-automatizados de identificação de leveduras

Foram utilizadas cartelas do kit ID32C da marca bioMériuex® , quando a identificação pelo método clássico foi inconclusiva. Para tanto, foram observadas as recomendações do fabricante.

4.6 Manutenção das leveduras

Todas as cepas de levedura obtidas foram semeadas em tubos cônicos (Falcon) contendo 6mL de caldo YPD, com auxílio de alça em anel de níquel-cromo. Os tubos foram, então, incubados “overnight”, à T.A., 200 rpm (Tecnal, TE-420). Um volume de 800 µL do crescimento fúngico foi adicionado a 200 µL de glicerol em criotubos de 2mL de volume. Os criotubos foram incubados em freezer a -80°C (Termo Scientific). As cepas de leveduras congeladas foram reativadas por dois repiques sucessivos em placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo ágar Sabouraud Dextrose com Cloranfenicol (100 mg/mL) à T.A., previamente à realização dos experimentos.

4.7 Seleção dos isolados

Foram avaliados 62 isolados de C. tropicalis obtidos da areia da praia de Ponta Negra, Rio Grande do Norte, Brasil, pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Micologia Médica e Molecular (LMMM), Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Duas cepas de referência foram utilizadas como organismos controle em todos os testes, a saber: Uma cepa ATCC (“American Type Culture Collection”) de C. albicans (90028) e a cepa de C. tropicalis ATCC 13803.

4.8 Análise fenotípica dos fatores de virulência de Candida tropicalis

4.8.1 Caldo NGY para padronização do inóculo

Para a caracterização fenotípica dos diferentes fatores de virulência, os isolados de C. tropicalis foram inicialmente crescidos em meio NGY (Neopeptona Difco 1g/L; dextrose 4g/L; Extrato de leveduras Difco 1g/L). Quando as células são inoculadas por “wet looping” neste meio (com uma alça em anel carregada por um filme de suspensão de leveduras rapidamente imersa no meio e removida) e incubadas por 18-24 h em shaker a 30 °C, 200 rpm, um inóculo de aproximadamente 2 x 108 células/mL é produzido (CHAVES et al, 2007).

4.8.2 Ensaio para determinação da capacidade de aderência de Candida tropicalis a células epiteliais bucais humanas (CEBH)

Foi utilizado o método de Bates et al. (2005). Células de C. tropicalis foram crescidas

“overnight” em NGY, com posterior medição da absorbância em DO 600nm dos isolados. Amostras de células epiteliais bucais humanas (CEBH) foram coletadas dos mesmos voluntários saudáveis com swab estéril friccionado por 2 min na cavidade oral e transferidos para tubos Falcon contendo 5 mL de PBS e mantidas refrigeradas até o momento de experimentação. Suspensões de levedura e CEBH foram centrifugadas a 1200 g (4 °C) por 5 min e lavadas três vezes com PBS. O inóculo foi padronizado para 5 X 106 células/mL (levedura) e 5 x 105 células/mL de CEBH. Os dois tipos de células foram misturados em iguais proporções (100 µl de cada suspensão) em frascos de vidro estéreis, sendo os mesmos incubados em shaker a 37 °C por 1h. Subsequentemente, as células foram fixadas em 200 µl de formalina a 10% em PBS e o número de células de levedura aderidas por cada CEBH determinado. Foram contadas 150 CEBH, utilizando-se microscópio óptico (Olympus, CX21) em 400 vezes de magnificação. O ensaio foi realizado em triplicata.

4.8.3 Ensaio para avaliação da morfogênese de Candida tropicalis em meio sólido

Para indução da formação de hifas em meio sólido, as células foram cultivadas em meio NGY e obteve-se um inóculo padronizado contendo 2 x 108 células/mL. Desse inóculo, alíquotas de 5 µL foram semeadas em triplicata na superfície do meio Spider (10g de ágar nutriente (Himedia), 10g de manitol (Vetec), 2g de KH2PO4 (Reagen), 14,5g de ágar (Himedia), 1000 mL de água destilada – Liu et al, 1994). As placas foram incubadas a 30°C durante 7 dias para posterior observação dos aspectos macromorfológicos das colônias.

4.8.4 Ensaio de formação de biofilme em Candida tropicalis

Para a indução de biofilme seguiu-se o protocolo de Jin et al. (2003) adaptado por Melo et al. (2007). Células de C. tropicalis foram cultivadas em SDA a 35°C por 18 horas. Os isolados foram inoculados utilizando-se a técnica de “wet-looping” em 5 mL do meio YNB (Yeast Nitrogen Base) acrescido de 50 mM de glicose (Difco), e incubados durante 18 horas a 200 rpm. Após o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a uma velocidade de 5.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente, sendo o pellet formado lavado duas vezes em 5 mL de PBS (solução salina de tampão fosfato, pH 7,2, Ca2+ e Mg2+ livres), em iguais condições de centrifugação. Para ajustar a concentração celular em 107 células/mL, o pellet foi ressuspenso em 5 mL de PBS, e a suspensão celular ajustada para uma densidade óptica de

0,38 de absorbância a 520 nm. Subsequentemente, para a fase de adesão, a suspensão do inóculo padronizado foi transferida para placas de microtitulação de poliestireno estéreis com 96 poços. Em cada poço foram adicionados 100µL da suspensão, sendo a placa posteriormente incubada por 1,5 h A 37°C sob agitação mecânica de 75 rpm. Como controle negativo, 8 poços foram tratados de maneira idêntica, excluindo-se os conteúdos celulares. Após a fase de adesão, a suspensão de células não aderidas foi aspirada, sendo os poços lavados duas vezes com 150 uL de PBS. Imediatamente, um total de 100 µL de meio YNB (Yeast Nitrogen Base) acrescido de 50 mM de glicose (Difco) foi adicionado em cada um dos poços e a placa foi incubada por 66 horas a 37°C sob agitação de 75 rpm. Após este período, o biofilme foi quantificado utilizando-se coloração de cristal violeta (Vetec). Todos os ensaios foram realizados em quintuplicata.

4.8.5 Coloração do biofilme de Candida tropicalis pelo cristal violeta

Após a indução de biofilme, o meio YNB (Yeast Nitrogen Base) acrescido de 50 mM de glicose (Difco) foi removido por pipetação, sendo cada poço da placa lavado duas vezes com 150 uL de PBS. Depois de retirado o PBS, a placa foi mantida por 45 minutos à temperatura ambiente para secagem. Em seguida, foram adicionados 110 uL de solução aquosa de cristal violeta 0,4% (Sigma Chemical Corporation, St Louis, MO, EUA) em cada poço com incubação por 45 minutos, seguido de três lavagens com 300 uL de água milli-Q. Em sequência, as amostras foram descoradas com 200 uL de etanol 95% por um período de 45 minutos. Cerca de 100 uL da solução descorante foram transferidos para uma nova placa e submetidos à quantificação em leitor espectrofotométrico de placas, com filtro de 570 nm. Os valores de absorbância dos controles negativos foram subtraídos das amostras teste para normalização dos resultados. Os isolados foram classificados conforme o grau de intensidade de formação de biofilme, de acordo com os critérios propostos por Stepanovic et al. (2000):

 Isolado com fraca produção de biofilme: Absorbância média ≤ 0,42  Isolado com moderada produção de biofilme: Absorbância média entre 0,43 e 0,84

 Isolado com forte produção de biofilme: Absorbância média > 0,85

4.8.6 Ensaio para detecção de atividade de proteinase em Candida tropicalis

A atividade de proteinase foi determinada utilizando-se a metodologia de Chaves et al. (2007). Amostras contendo 200 µL de células crescidas em NGY foram transferidos para tubos de ensaio contendo 5 mL de meio YCB+ BSA (Yeast Carbon Base Difco 11.7 g/L; dextrose 10 g/L; Bovine Serum Albumine Fraction V Sigma 5g/L) e incubadas em shaker a

30 °C por 72 h. A turbidez da cultura (DO 600 nm) foi determinada em espectrofotômetro. A atividade proteolítica foi determinada pelo aumento de produtos solúveis em ácido tricloroacético (TCA; Himedia) medida a DO 280 nm de absorbância em triplicata. Um volume de 250 µL do sobrenadante das culturas foi adicionado a 1 mL de tampão citrato de sódio acrescido de 1% BSA, pH 3.8. Tubos controle contendo apenas os sobrenadantes das

culturas foram incluídos. Os tubos teste foram incubados em banho-maria a 37 °C por 1 h. A reação foi interrompida pela adição de 2,5 mL de TCA 5% (w/v) a cada tubo e 1 mL do tampão citrato de sódio acrescido de 1% BSA foi adicionado aos tubos controle. Os tubos foram incubados no gelo por 10 minutos, e após isso posteriormente os precipitados foram removidos por centrifugação à 4°C, 3000 rpm por 10 minutos. A absorbância em DO 280nm dos sobrenadantes dos tubos teste foi determinada utilizando-se os sobrenadantes dos tubos controle como branco.

4.8.7 Ensaio para determinação da atividade hemolítica em Candida tropicalis

Para avaliação da produção de hemolisinas seguiu-se a metodologia proposta por Luo et al. (2011) com algumas adaptações. Células de C. tropicalis foram cultivadas em ASD a 35°C por 18 horas. Obteve-se crescimento “overnight” em meio NGY, de modo que o inóculo foi padronizado para 2 x 105 células/mL. De cada amostra padronizada foi retirada alíquota de 10 µL, semeada em triplicata na superfície de ASD acrescido de 7% de sangue de carneiro fresco (Ebe-farma) e 3% de glicose, contido em placas de Petri de 155 mm de diâmetro.

Procedeu-se incubação por 48 h a 37°C em ambiente com 5% de CO2. Ao final desse período, a presença de um halo claro definido em torno do inóculo indica atividade hemolítica positiva. Como controle positivo utilizou-se uma cepa de Streptococcus pyogenes (Grupo A), beta hemolítico. A cepa de referência ATCC 22019 de C. parapsilosis foi utilizada como controle negativo do teste. Os diâmetros da zona de hemólise e da colônia foram medidos com a finalidade de obter o índice de hemólise para cada amostra.

푑𝑖â푚푒푡푟표 푑푎 푧표푛푎 푑푒 ℎ푒푚ó푙𝑖푠푒 Índice de hemólise (IH) = 푑𝑖â푚푒푡푟표 푑푎 푧표푛푎 푑푒 ℎ푒푚ó푙𝑖푠푒+푑𝑖â푚푒푡푟표 푑푎 푐표푙ô푛𝑖푎

4.9 Ensaio para avaliação da resistência osmótica de Candida tropicalis

Na avaliação da resistência dos isolados de C. tropicalis ao estresse osmótico foi utilizada a técnica adaptada de microdiluição em caldo (CHAVES et al, 2007). Para tanto,

utilizou-se placas de microtitulação de poliestireno estéreis com 96 poços, aos quais foram adicionados 100 µL de caldo Sabouraud Dextrose (Himedia) com diluições decrescentes de Cloreto de Sódio (NaCl; Reagen), a saber: 30%, 15%, 7,5%, 3,75%, 1,88%, 0,94%, 0,47%, 0,23%, 0,12%, 0,06% e 0,03%. Foram adicionados 10 µL do inóculo padronizado em meio NGY em cada um dos poços, excetuando-se os controles negativos. Procedeu-se incubação estática a 35°C por 48 h. Ao final desse período, a leitura foi realizada visualmente observando-se crescimento celular (turvação do meio de cultura).

4.10 Padronização dos testes de susceptibilidade a antifúngicos

Os testes de susceptibilidade a antifúngicos foram realizados pelo método de micro diluição em caldo, conforme a norma de padronização publicada no documento M27-A3 pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). Além dos isolados ambientais selecionados para o presente estudo, as cepas de referência ATCC13803 de C. tropicalis, ATCC22019 de C. parapsilosis e ATCC6258 de C. krusei foram incluídas como micro- organismos controle. Utilizou-se meio de cultivo líquido, RPMI 1640 (Angus Buffers e Biochemical, Niagara Falls, NY, EUA). Foram adicionados 10,4 g de RPMI e 34,53g de ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS) em 1 L de água destilada. O pH do meio foi acertado para 7,0 com solução de hidróxido de sódio 10M, e a solução esterilizada por filtração em filtro biológico de 0,22 micra (Corning Incorporated Costar, Corning, NY, EUA). Os antifúngicos testados foram diluídos em dez diferentes concentrações seriadas, a saber: fluconazol (Pfizer Incorporated, NY, EUA) para 0,125 a 64 µg/mL; voriconazol (Pfizer Incorporated, NY, EUA), itraconazol (Pfizer Incorporated, NY, EUA), caspofungina (Merck, Rahway, N.J., EUA), micafungina (Merck, Rahway, N.J., EUA) e anidulafungina (Merck, Rahway, N.J., EUA) para 0,03 a 16 µg/mL; e anfotericina B (Sigma Chemical Corporation, St Louis, MO, EUA) para 0,015 a 8 µg/mL. As fármacos foram diluídas em meio RPMI 1640, e alíquotas de 100µL destas concentrações foram dispensadas nas placas de micro titulação, utilizando-se pipeta multicanal. Concentrações progressivas de fármacos foram dispensadas sequencialmente nos poços pertencentes às colunas numeradas de um a dez. Os poços pertencentes à coluna identificada com o número 11 foram utilizados como controles de crescimento, sendo

dispensados 100 µL do meio RPMI 1640 sem nenhum antifúngico, mais 100 µL de meio de cultura contendo o inóculo. Os poços da coluna 12 foram os controles de esterilidade, contendo apenas o meio RPMI 1640. As placas foram mantidas a -70°C até sua utilização por período máximo de 5 meses. No dia do experimento, as placas foram mantidas à temperatura ambiente por 30 minutos antes de serem utilizadas. A partir de um cultivo de 24 horas da levedura a ser testada, realizado em ASD, foi preparada uma suspensão de inóculo inicial com transmitância de 90% determinada por espectrofotometria, utilizando-se comprimento de onda a 530 nm. Em seguida, foram realizadas duas diluições seriadas, sendo a primeira em solução salina (1:100) e a segunda em meio RPMI (1:20), com a finalidade de se obter concentração final de 103 células/mL (cultura monospórica). Alíquotas de 100 µL da solução do inóculo final foram dispensadas nos poços contendo 100 µL de diferentes concentrações dos antifúngicos testados. Ao final, as placas foram transferidas para estufa a 37°C, sendo a leitura do teste realizada após 24 h de incubação para equinocandinas e após 48 horas de incubação para os ensaios com anfotericina B; para os azólicos a leitura foi feitas nesses dois períodos de tempo. Foi considerado como CIM para azólicos e equinocandinas a menor concentração da fármaco que apresentou cerca de 50% de redução em sua turbidez comparativamente ao poço controle positivo. Para a anfotericina B, a concentração inibitória mínima foi definida como a menor concentração capaz de inibir qualquer crescimento visualmente perceptível (CLSI, 2008). Os critérios para a definição de susceptibilidade e ponto de corte para o fluconazol, voriconazol e equinocandinas estavam de acordo com o documento M27 – S4 (CLSI, 2012); os critérios de leitura para o itraconazol foram os sugeridos pelo M27 – A2 (2002), e os critérios para a anfotericina B foram sugeridos pelo M27-A3 (2008). A tabela 1 ilustra os valores dos pontos de corte utilizados para a interpretação dos testes de susceptibilidade neste estudo.

Tabela 2: Valores de ponto de corte (µg/mL) sugeridos para interpretação dos testes de susceptibilidade dos isolados de Candida tropicalis

ANTIFÚNGICO SENSÍVEL SDD* I** RESISTENTE REFERÊNCIAS (S) (R)

Fluconazol ≤ 2 4 - ≥ 8 M27 – S4/2012

Itraconazol ≤ 0,125 0,25-0,5 - ≥ 1 M27 – A2/2002

Voriconazol ≤ 0,12 0,25-0,5 - ≥ 1 M27 – S4/2012

Anfotericina B ≤ 1 - - ≥ 2 M27-A3/2008

Anidulafungina ≤ 0,25 - 0,5 ≥ 1 M27 – S4/2012

Micafungina ≤ 0,25 - 0,5 ≥ 1 M27 – S4/2012

Caspofungina ≤ 0,25 - 0,5 ≥ 1 M27 – S4/2012

*Susceptibilidade Dose-Dependente: categoria exclusiva para azólicos **Susceptibilidade Intermediária. Fonte: CLSI, 2012.

4.11 Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando o software estatístico '' Graph Pad, Prism'' versão 6.0 e o "Stata" versão 11.0. Os resultados foram apresentados como média + desvio padrão, e as diferenças foram analisadas pelo teste T para uma amostra. Para todas as análises, foi considerado P ˂ 0,05 e intervalo de confiança de 95%.

5.0 RESULTADOS ______

5.1 Parâmetros hidrológicos, temperatura do solo e salinidade da água do mar

De acordo com informações disponibilizadas pela EMPARN, em relação ao ano de 2012 a precipitação pluviométrica na cidade de Natal foi de 146,1 mm no mês de março (verão) e 302,1 mm no mês de junho (inverno). A pluviosidade relativa ao mês de junho de 2012 tem maior relevância para esse estudo do que a do mês de julho, no qual a coleta foi realizada, tendo em vista que esta ocorreu no segundo dia deste mês (02/07/2012). Com respeito ao mês de março de 2013, a precipitação pluviométrica acumulada foi de 35,1 mm (verão). Todas as coletas foram realizadas em período de maré baixa, sendo que a altura da maré foi previamente disponibilizada pelo Banco Nacional de Dados Oceanográficos, conforme apresentado na Tabela 3. Com relação à temperatura, segundo dados fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), em 2012 o valor mínimo registrado foi de 20,3 °C no mês de julho (inverno), e a temperatura máxima foi de 31,2 °C no mês de março (verão), para a cidade de Natal-RN. A Tabela 3 apresenta a temperatura registrada para a areia da praia em cada ponto de coleta realizada em 2012. No verão, a temperatura do solo variou de 30 a 31, 5°C entre os pontos, enquanto que no inverno essa faixa foi de 26 a 29 °C. A máxima temperatura registrada pelo INMET para o ano de 2013 foi de 31,8 °C no mês de março, período em que foi feita a terceira coleta. A temperatura da areia variou de 28°C a 41°C entre os seis pontos de coleta. A salinidade da água do mar foi medida para auxiliar a avaliação da resistência dos isolados de C. tropicalis ao estresse osmótico, e variou de 35 g/kg a 37 g/kg, no inverno e no verão de 2012, respectivamente. Na coleta de março de 2013 a salinidade se manteve a 37 g/kg em todos os seis pontos (Tabela 3).

Tabela 3: Parâmetros hidrológicos, temperatura do solo e salinidade da água do mar da praia de Ponta Negra, Natal – RN, de acordo com o período do ano e os pontos de coleta.

Março/2012 Julho/2012 Março/2013

Precipitação 146,1 302,1* 35,1 pluviométrica (mm)

Altura da maré (m) 0,9 0,2 0,4

Salinidade da água 37 35 37 (g/Kg)

Temperatura (°C) P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P4 P5 P6

30 30 31,5 26 29 29 28 30,5 31 36,5 37 41

*Precipitação pluviométrica relativa ao mês de junho (de maior relevância, uma vez que a coleta foi realizada em 02/07/2012; P = Ponto).

5.2 Seleção dos isolados utilizados neste estudo e confirmação da identificação taxonômica

Para o presente estudo foram selecionados 62 isolados de C. tropicalis, obtidos de amostras de areia coletadas em 2012 e 2013 na praia de Ponta Negra, Natal- RN. As coletas foram realizadas em diferentes meses do ano, com o objetivo de avaliar possíveis diferenças no isolamento das leveduras em função de condições climáticas distintas. Trinta e um isolados foram obtidos no ano de 2012, sendo 23 (37,1%) obtidos de coleta realizada em março deste ano (período correspondente ao verão) e 8 isolados(12,9%) obtidos em julho (período correspondente ao inverno). No ano de 2013 apenas uma coleta foi realizada, por isso todos os 31 isolados selecionados desse grupo foram obtidos em março (período corresponde ao verão). Os isolados foram obtidos a partir de amostras coletadas em seis diferentes pontos previamente demarcados ao longo da praia. Portanto, a seleção dos mesmos foi realizada de

maneira proporcional ao isolamento de C. tropicalis frente às demais espécies de levedura obtidas de cada ponto. A Figura 2 ilustra a distribuição dos isolados deste estudo de acordo com os pontos de coleta. Com relação à identificação dos isolados, todos estes foram identificados fenotipicamente como C. tropicalis pela metodologia clássica de identificação de leveduras, que utiliza os testes de auxanograma, zimograma e teste de microcultivo em ágar fubá acrescido de Tween 80, No ágar Sabouraud dextrose a maioria dos isolados apresentou textura lisa e aspecto brilhante, que são características das leveduras do gênero Candida, com bordas levemente franjadas (Fig. 3). Alguns isolados exibiram aspecto opaco e levemente rugoso (Tabelas 4 e 5). No meio cromogênico CHROMagar Candida®, os isolados exibiram coloração azul petróleo típica de C. tropicalis, enquanto que na micromorfologia evidenciou- se a presença de blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas abundantes (Tabelas 4 e 5, Fig.3)

Figura 2: Distribuição numérica e percentual dos isolados de Candida tropicalis obtidos de amostras de areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN, em 2012 e 2013, de acordo com os diferentes pontos de coleta. Em 2012 as coletas foram realizadas apenas nos pontos de 1 a 3, e em 2013 foram obtidas amostras dos seis pontos.

Figura 3: Características das colônias de Candida tropicalis. A) Aspecto brilhante com borda levemente franjada do isolado 658 de Candida tropicalis após 48 h de incubação a 30°C em ágar Sabouraud dextrose; B) Isolado 658 exibindo típica coloração azul petróleo no meio CHROMagar Candida®; C) Aspectos micromorfológicos do isolado 658 de Candida tropicalis após microcultivo em ágar fubá acrescido de Tween 80. Evidencia-se blastoconídios em cadeia simples ou ramificada, hifas verdadeiras e abundantes pseudo-hifas.

Tabela 4: Identificação das cepas de Candida tropicalis isoladas nos diferentes pontos de coleta e períodos climáticos de 2012 e suas características morfológicas em ágar Sabouraud Dextrose (macromorfologia), coloração no meio CHROMagar Candida® e micromorfologia em ágar fubá + Tween 80

Isolado Ponto Estação Sabouraud 48h CHROMagar Micromorfologia coleta 30°C 48h 30°C

LMMM652 1 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM653 1 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM654 1 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM655 1 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM656 2 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM657 3 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM658 3 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM659 3 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM660 1 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM661 1 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM662 1 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM663 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM664 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM665 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM666 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM667 2 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM668 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM669 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM670 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM671 2 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM672 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM673 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM674 2 Verão Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM675 2 Verão Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira

Continuação da Tabela 4

LMMM676 1 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM677 1 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM678 1 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM679 1 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM680 1 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM681 2 Inverno Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira

Tabela 5: Identificação das cepas de Candida tropicalis isoladas nos diferentes pontos de coleta no verão de 2013 e suas características morfológicas em ágar Sabouraud Dextrose (macromorfologia), coloração no meio CHROMagar Candida® e micromorfologia em ágar fubá

Isolado Ponto Sabouraud 48h CHROMagar 48h Micromorfologia coleta 30°C 30°C

LMMM682 1 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM683 1 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM684 2 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM685 2 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM686 3 Rugosa/Opaca Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM687 3 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM688 3 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM689 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM690 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM691 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM692 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM693 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM694 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM695 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM696 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM697 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM698 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM699 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM700 4 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM701 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM702 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM703 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM704 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM705 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira

Continuação da Tabela 5

LMMM706 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM707 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM708 5 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM710 6 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM711 6 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM712 6 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira LMMM713 6 Lisa/Brilhante Azul petróleo Blastoconídio, pseudo-hifa hifa verdadeira

5.3 Avaliação fenotípica dos isolados ambientais quanto aos fatores de virulência

Para efeitos comparativos, todos os fatores de virulência avaliados in vitro para os isolados de C. tropicalis do presente estudo foram avaliados segundo os valores obtidos para as cepas de referência ATCC13803 de C. tropicalis e ATCC90028 de C. albicans.

5.3.1 Determinação da capacidade de aderência de Candida tropicalis a células epiteliais bucais humanas (CEBH)

Com a finalidade de avaliar a capacidade de adesão dos isolados de C. tropicalis às células epiteliais, as células de levedura foram co-incubadas com CEBH coletadas de um mesmo voluntário saudável, incubadas a 37°C por 1 h. Posteriormente, as células foram fixadas e o número de células de Candida aderidas em 150 CEBH foi determinado. Todos os isolados testados foram capazes de aderir à CEBHs (Figs. 4 e 5). O isolado LMMM707 foi o menos aderente a CEBH, sendo a média das triplicatas igual a 107,7+ 5,9 células aderidas/150 CEBH. Por outro lado, os isolados com maior capacidade de aderência foram o LMMM672, obtido da coleta de março de 2012, e LMMM688, obtido da coleta de março de 2013, ambos com média das triplicatas igual a 194,3 + 5,5 células aderidas/150 CEBH (Fig.5). Por conseguinte, a variação do número de células do isolado com menor capacidade de aderência para os de maior capacidade foi de 86,6 células aderidas/150 CEBH, evidenciando grande variabilidade nos resultados. O valor médio de aderência de todas as cepas de C. tropicalis foi de 147,5 + 8,7 células aderidas/150 CEBH. Todos os isolados ambientais testados tiveram capacidade de aderência estatisticamente superior à cepa de referência de C. tropicalis ATCC13803 (96 + 10 células aderidas/150 CEBH; Tabela 6). Entretanto, em relação à cepa ATCC90028 de C. albicans, o valor médio de adesão das cepas ambientais (147,5 + 8,7), foi estatisticamente inferior à capacidade de adesão desta cepa de referência (192,7 + 3,1; Tabela 6). Apenas os dois isolados ambientais de C. tropicalis com maiores valores de aderência, LMMM672 e LMMM688, foram mais aderentes que cepa de referência de C. albicans (Fig. 5).

Fig.4: Células de Candida tropicalis aderidas em célula epitelial bucal humana após incubação a 37°C por 1 h a 200 rpm de rotação, fixadas em formalina a 10%. Microscopia de luz, 400 x de magnificação.

Tabela 6: Comparação da capacidade de aderência de isolados de Candida. tropicalis à CEBH em relação às cepas de referência

Grupo Nº de células de Candida P-valor aderidas em 150 CEBH

Média dos isolados de Candida tropicalis versus 147,5 + 8,7 versus 192,7 + 3,1 ˂0,0001* Candida albicans ATCC90028

Média dos isolados de Candida tropicalis versus 147,5 + 8.7 versus 96,0 + 10,0 ˂0,0001* Candida tropicalis ATCC13803 * P ˂ 0, 05 para Teste T para uma amostra.

Fig. 5: Valores médios do número de células de levedura aderidas em 150 CEBH para os isolados ambientais de Candida tropicalis e para as cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis. O número de células aderidas foi determinado por microscopia de luz com 400 x de magnificação após incubação a 37°C por 1 h a 200 rpm de rotação, e fixação em formalina a 10%. Destaque para o isolado LMMM707 (menos aderente) e para os isolados LMMM672 e LMMM688 (mais aderentes).

5.3.2 Determinação da capacidade de morfogênese de Candida tropicalis em meio sólido

Para indução da formação de hifas em meio sólido, inóculo padronizado contendo 2 x 108 células de Candida/mL foi semeado em duplicata na superfície do meio Spider, com posterior incubação a 30°C, durante 7 dias. Ao final deste período, observaram-se os aspectos macromorfológicos das colônias, sendo estas classificadas como pertencentes aos fenótipos liso, rugoso e filamentoso. As cepas de referência ATCC13803 de C. tropicalis e ATCC90028 de C, albicans foram utilizadas como controle positivo do teste, e ambas exibiram fenótipo filamentoso, enquanto que a cepa de referência ATCC22019 de C. parapsilosis foi utilizada como controle negativo do teste, apresentando fenótipo liso (Fig. 6). Observou-se que 19 isolados ambientais de C. tropicalis (30,6%) apresentaram fenótipo filamentoso e 34 (54,8%) apresentaram fenótipo rugoso. Desta forma, 53 isolados (85,4%) foram capazes de exibir algum grau de filamentação no meio Spider. Apenas 9 isolados (14,6%) não exibiram filamentação, sendo portanto classificados como do fenótipo liso.

Fig. 6: Aspectos macromorfológicos de colônias crescidas em ágar Spider, após sete dias de incubação a 30ºC. A) Candida tropicalis ATCC13803 (fenótipo filamentoso); B) Candida albicans ATCC90028 (fenótipo filamentoso); C) Candida tropicalis LMMM655 (fenótipo rugoso); D) Candida parapsilosis ATCC22019 (fenótipo liso).

5.3.3 Determinação da capacidade de formação de biofilme de Candida tropicalis

A formação de biofilme foi avaliada para todos os isolados de C. tropicalis selecionados para este estudo, utilizando-se uma adaptação da metodologia proposta por Jin et al. (2003). As leveduras foram crescidas em placas de poliestireno contendo meio YNB acrescido de glicose, a 37°C, durante 66h. A formação do biofilme foi determinada em função da absorbância a 570nm do cristal violeta impregnado sobre o mesmo. Todos os isolados foram capazes de produzir biofilme em placas de poliestireno, embora os resultados tenham sido bastante variáveis entre as cepas (Fig. 7). O isolado com menor produção de biofilme foi o LMMM658, com média das absorbâncias570nm igual a 0,24

+ 0,022; já o isolado mais produtor foi o LMMM711, com médias das absorbâncias570nm igual a 3,57 + 0,003. (Fig. 7). Assim, percebe-se uma variação nos valores médios de 3,33. Foi observado que 42 isolados (67,%) foram altamente produtores de biofilme. Dentre estes, os isolados LMMM679, LMMM 684, LMMM701 e LMMM711 apresentaram os valores mais elevados de produção, com absorbância 570nm acima de 3,0. Apenas três isolados apresentaram baixa produção de biofilme, sendo estes: LMMM658, LMMM704 e LMMM708 (Fig. 7). A absorbância média dos isolados ambientais foi igual a 1,45 + 0,023, resultado estatisticamente superior à capacidade de formação de biofilme das cepas de referência ATCC13803 de C. tropicalis (0,21 + 0,006) e ATCC90028 de C. albicans (0,13 + 0,006;

Tabela 7). Portanto, o menor valor de absorbância 570nm apresentado pelos isolados ambientais (0,24 + 0,022 para o isolado LMMM658) foi ainda superior aos valores verificados para as cepas de referência testadas, ressaltando a alta capacidade de formação de biofilme pelos isolados do presente estudo.

Fig. 7: Produção de biofilme dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis, expressa pelos valores médios de absorbância 570nm do cristal violeta usado na coloração. A formação de biofilme foi induzida em placas de poliestireno contendo meio YNB acrescido de glicose, a 37°C, durante 66h sob agitação 75 rpm. Destaque para o isolado LMMM658 (menor produção de biofilme) e para o isolado LMMM711 (maior produção de biofilme).

Tabela 7: Comparação da capacidade de formação de biofilme de isolados de C. tropicalis em relação às cepas de referência

Grupo Produção de biofilme P-valor (absorbância570 nm)

Média dos isolados de C. tropicalis versus C. 1,45 + 0,023 versus 0,13 + 0,006 ˂0,0001* albicans ATCC 90028

Média dos isolados de C. tropicalis versus C. 1,45 + 0,023 versus 0,21 + 0,006 ˂0,0001* tropicalis ATCC 13803 * P ˂ 0, 05 para Teste T para uma amostra.

5.3.4 Determinação da produção de proteinase de Candida tropicalis

Para induzir a produção de proteinase pelos isolados, células de C. tropicalis foram cultivadas durante 72h em meio YCB + ASB. Foram quantificados os produtos solúveis dissolvidos em TCA, resultantes da degradação de proteínas, após o período de incubação do sobrenadante das culturas em ASB preparado em tampão citrato por 1 h. A atividade de proteinase foi expressa pela DO280nm em função da DO600nm da cultura. Atividade de proteinase foi observada em todos os isolados testados. A cepa LMMM687 teve atividade de proteolítica igual a 0,02 + 0,002, sendo este o menor valor obtido. Os isolados com maior atividade enzimática foram LMMM693 e LMMM704, com valores de 0,09 + 0,004 e 0,09 + 0,002 respectivamente. Alta atividade proteolítica foi observada nos isolados ambientais, uma vez que 22 isolados de C. tropicalis (35,55%) apresentaram valores superiores a 0,090 (Fig. 8). O valor médio de atividade de proteinase dos isolados ambientais de C. tropicalis foi de 0,077, sendo estatisticamente superior à produção da enzima pela cepa de referência ATCC13803 de C. tropicalis (0,06 + 0,005) e pela ATCC90028 de C. albicans (0,03 + 0,002; Tabela 8).

Fig.8: Atividade de proteinase dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis, expressa pela DO280nm em função da DO600nm da cultura com 72 h de crescimento em meio YCB + ASB. Destaque para o isolado LMMM687 (menor atividade proteolítica) e para os isolados LMMM693 e LMMM704 (maior atividade proteolítica).

Tabela 8: Comparação da atividade de proteinase de isolados de Candida tropicalis em relação às cepas de referência

Grupo D.O 280 nm/ D.O600nm P-valor

Média dos isolados de Candida tropicalis versus Candida 0,077 + 0,003 versus ˂0,0001* albicans ATCC 90028 0,032 + 0,002

Média dos isolados de Candida tropicalis versus Candida 0,077 + 0,003 versus ˂0,0001* tropicalis ATCC 13803 0,057 + 0.005 * P ˂ 0, 05 para Teste T para uma amostra.

5.3.5 Determinação da atividade hemolítica de Candida tropicalis

Para indução da produção de hemolisinas, células de C. tropicalis foram semeadas em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose, e incubadas a 37 °C por 48 h em

atmosfera com 5% de CO2. Após esse período, foi observado padrão beta-hemolítico para todos os isolados de C. tropicalis (Figs. 9 e 10). Trinta e cinco isolados (56,4%) apresentaram forte produção de hemolisinas, com índice de hemólise maior que 0,55. Os demais 27 isolados (43,6%) apresentaram produção moderada, com índice de hemólise entre 0,56 e 0,85. Convém ressaltar que o índice de hemólise é inversamente proporcional ao nível de atividade hemolítica (Fig. 10). Como mostra a Figura 10, o isolado LMMM653 teve menor índice de hemólise (0,33 + 0,03), enquanto que o isolado LMMM661 teve o maior índice de hemólise (0,70 + 0,00). O índice de hemólise médio dos isolados ambientais foi 0,54 + 0,02, o que evidencia uma atividade hemolítica estatisticamente superior à capacidade de expressão deste fator de virulência pela cepa ATCC90028 de C. albicans (0,65 + 0,06). Entretanto, a atividade hemolítica dos isolados ambientais foi estatisticamente inferior à da cepa ATCC13803 de C. tropicalis (0,45 + 0,06; Tabela 9).

A B C

Figura 9: Produção de beta hemólise em ASD adicionado de sangue de carneiro (suplementado com 3% de glicose), induzida por espécies de Candida, após 48h de incubação a 37 ° C em atmosfera com 5% de CO2. A) Candida parapsilosis ATCC 22019 (controle negativo); B) Candida tropicalis ATCC 13803; C) Candida tropicalis LMMM710.

Tabela 9: Comparação do índice de hemólise de isolados de C. tropicalis em relação às cepas de referência

Grupo Índice de hemólise P-valor

Média dos isolados de C. tropicalis versus C. albicans 0,54 + 0,02 versus 0,65 ˂0,0001* ATCC 90028 + 0,06

Média dos isolados de C. tropicalis versus C. 0,54 + 0,02 versus 0,45 ˂0,0001* tropicalis ATCC 13803 + 0,06 * P ˂ 0, 05 para Teste T para uma amostra.

Fig. 10: Índice de hemólise (IH) dos isolados ambientais de Candida tropicalis e das cepas de referência ATCC90028 de Candida albicans e ATCC13803 de Candida tropicalis. O IH foi calculado dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia + o diâmetro da zona de hemólise, que foi induzida em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose. Destaque para o isolado LMMM653 (menor IH) e para o isolado LMMM661 (maior IH).

5.4 Avaliação da resistência de Candida tropicalis ao estresse osmótico

Para avaliar a resistência dos isolados ambientais de C. tropicalis ao estresse osmótico as leveduras foram crescidas em caldo ASD adicionado de concentrações crescentes de NaCl. Todos os isolados ambientais foram capazes de crescer nas condições hipersalinas fornecidas. Cinquenta e três isolados ambientais (85,4%) conseguiram crescer em meio de cultura contendo 15% de NaCl, e o mesmo foi observado para a cepa de referência de C. tropicalis (ATCC 13803). Os demais 9 isolados (23,4%) ainda foram capazes de crescer em meio contendo 7% de NaCl. Entretanto, a cepa de referência de C. albicans (ATCC 90028) teve ainda menor capacidade de resistência ao estresse osmótico, uma vez que foi capaz de crescer em meio contendo apenas 3,75% de NaCl dissolvido.

5.5 Compilação dos resultados obtidos da avaliação dos fatores de virulência e da capacidade de resistência ao estresse osmótico de Candida tropicalis

De maneira geral, pode-se observar grande variabilidade nos resultados obtidos, não sendo possível estabelecer nenhuma correlação direta entre os fatores de virulência avaliados. Convém destacar a alta expressão dos fatores de virulência pelos isolados ambientais de C. tropicalis, que apresentaram, na maioria dos testes, resultados estatisticamente superiores aos das cepas de referência utilizadas nesse estudo, o que sugere significativo potencial patogênico destes isolados (ANEXO I).

5.6 Avaliação do perfil de susceptibilidade dos isolados de Candida tropicalis aos antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo

Os testes de susceptibilidade aos antifúngicos fluconazol, voriconazol, itraconazol, anfotericina B, caspofungina, anidulafungina e micafungina foram realizados pelo método de

microdiluição em caldo, conforme a norma de padronização publicada no documento M27 – A3 pelo CLSI (2008). Além dos isolados ambientais avaliados neste estudo, foram incluídas as cepas de referência ATCC13803 de C. tropicalis, ATCC90028 de C. albicans, ATCC22019 de C. parapsilosis e ATCC6258 de C. krusei em todos os dias de experimento. Todos os valores de concentração inibitória mínima (CIM) obtidos pelos micro-organismos controles foram compatíveis com os valores esperados pela metodologia do CLSI (2012), assegurando a confiabilidade dos valores obtidos para os isolados testados. Vinte e sete isolados ambientais de C. tropicalis (43,5%) apresentaram resistência frente ao fluconazol, ou seja, exibiram valores de CIM superiores a 8 µg/mL após 24 h de incubação. Além disso, 10 isolados (16,1%) apresentaram susceptibilidade dose dependente a esse antifúngico. Apenas 25 isolados (40,4%) foram sensíveis ao fluconazol (MIC ≤ 2 µg/mL). Foi possível observar a ocorrência do fenômeno “Low-high” em 5 isolados ambientais (8%). Os mesmos exibiram sensibilidade ao fluconazol após 24 h de incubação (CIM do fluconazol ≤ 2 µg/mL), mas apresentaram resistência após 48 h de incubação (CIM do fluconazol ≥ 8 µg/mL). Considerou-se a CIM obtida após 24 h de incubação. Outro fenômeno interessante foi observado nos isolados ambientais frente a este antifúngico. Em baixas concentrações do antifúngico (de 0,5 a 2 µg/mL), alguns isolados apresentaram inibição de 50 % de crescimento em relação ao controle positivo. Entretanto, estes isolados voltaram a crescer nos micro poços seguintes, que continham concentrações mais altas do antifúngico (de 4 a 16 µg/mL), sendo observado crescimento similar ao do controle positivo. Este fato foi observado em 20 isolados ambientais (32,2%), sendo, então, classificados como resistentes ao fluconazol. Interessantemente, fenômeno similar também ocorreu para os mesmos isolados crescidos em presença do voriconazol. Em relação a essa fármaco, 38 isolados (61,3%) foram resistentes (CIM ≥ 1 µg/mL) e outros 16 isolados (25,8%) tiveram susceptibilidade dose dependente (CIM entre 0,25 e 0,5). Apenas 8 isolados (13,1%) foram sensíveis ao voriconazol. Para o itraconazol, foi verificado um número ainda menor de isolados sensíveis, com apenas 2 isolados (3,3%; LMMM680 e LMMM689). Já os isolados resistentes totalizaram 36 (58%); enquanto que 24 isolados (38,7%) tiveram susceptibilidade dose dependente frente a este antifúngico. O fenômeno de crescimento atípico anteriormente descrito para fluconazol e

voriconal também ocorreu frente ao itraconazol em apenas 2 isolados (LMMM665 e LMMM672). O número de cepas resistentes aos três azólicos testados foi 15 (24,2%). Sendo assim, evidenciou-se elevado nível de resistência aos antifúngicos azólicos nos isolados ambientais de C. tropicalis. Com relação à anfotericina B, 14 isolados (22,6%) foram resistentes, isto é, tiveram valores de CIM superiores a 1µg/mL. Os isolados sensíveis totalizaram 48 cepas (77,4%). Dois isolados resistentes à anfotericina B também tiveram esse perfil frente a todos os azólicos testados, sendo estes LMMM662 e LMMM665. Em relação às equinocandinas, todos as cepas foram sensíveis às três fármacos testadas dessa classe. Apenas o isolado LMMM708 apresentou sensibilidade intermediária à micafungina (CIM = 0,5 µg/mL). Os valores de CIM para todas as fármacos testadas são apresentados no ANEXO II.

6.0 DISCUSSÃO ______

Vários estudos têm sido desenvolvidos com relação aos riscos à saúde associados ao uso recreativo de praias (MANCINI et al, 2005; PINTO et al, 2011; PEREIRA et al, 2013). Os usuários desse ambiente mantém estreito contato com água e areia, que, uma vez poluídas, podem causar várias enfermidades, previamente descritas em muitos trabalhos, como distúrbios gastrintestinais, doenças respiratórias e doenças dermatológicas, principalmente micoses. Sendo assim, a detecção de micro-organismos patogênicos em ambientes marítimos recreacionais é de grande valor para o conhecimento científico e para a saúde pública (CAMPOS, 2004). A literatura corrente tem chamado atenção para a alta incidência de infeções causadas por C. tropicalis em todo o mundo, principalmente em indivíduos com alguma condição imunossupressora (CHAKRABARTI et al, 2009; PFALLER et al, 2010; PEMÁN et al, 2012). Estudo realizado na cidade de Natal (RN) em 2012 pelo nosso grupo de pesquisa analisou a prevalência de leveduras na areia da praia de Ponta Negra, e verificou ser esta a espécie mais frequentemente isolada desse substrato (artigo em preparação). Desta forma, foram selecionadas 62 cepas de C. tropicalis oriundas da areia do referido ambiente costeiro, para análise do potencial de virulência, resistência ao estresse osmótico e susceptibilidade a fármacos antifúngicos. Semelhantemente aos achados do presente estudo, o isolamento de C. tropicalis de ambientes costeiros foi anteriormente reportado em algumas investigações (PAPADAKIS et al, 1997; VIEIRA et al, 2001; ABDALLAOUI et al, 2007). Entretanto, dados relativos à prevalência desta espécie nestes ambientes ainda são bastante escassos. Destaca-se o estudo conduzido por Vogel et al. (2007), que reportaram elevada incidência de C. tropicalis em ambientes costeiros no sul da Flórida (EUA), tendo sido a levedura mais prevalente. O mesmo foi demonstrado por Shah et al. (2011) investigando a ocorrência de vários micro-organismos também em praias da Flórida (EUA). No presente estudo, o mês de março, em que foram realizadas as coletas de verão, é o período de maior visitação turística na cidade de Natal (SETUR/RN). Desta forma, a maior concentração turística nesta época do ano pode ter influenciado o isolamento de C. tropicalis da areia sazonalmente. Semelhantes achados têm sido reportados em literatura. Em um estudo realizado com amostras de areia de duas praias da Grécia, houve correlação direta entre a quantidade de isolados de leveduras de origem humana obtidos de areia das praias com a quantidade de banhistas (PAPADAKIS et al, 1997). Desta forma, evidencia-se a influência significativa que os usuários da praia exercem sobre a contaminação

da areia, pelo descarte de lixo orgânico, incluindo lixo de pesca, que oferece nutrição e umidade necessárias para a conservação e o crescimento de micro-organismos, como relatado por alguns autores (PAPADAKIS et al, 1997; BRANDÃO et al, 2002). Ainda com relação à influência da temperatura com a adaptação de C. tropicalis aos ambientes costeiros, os resultados do presente trabalho corroboram com o proposto por Kwon-Chung e Bennett em 1992, onde destacou-se a alta prevalência de C. tropicalis em solo de locais quentes. De fato, em alguns pontos de coleta do presente estudo, a temperatura da areia foi superior a 35°C. Consequentemente, maior risco à saúde está associado à exposição à areia contaminada no verão, especialmente para crianças e jovens, que tendem a permanecer mais tempo em contato com esse substrato (SATO et al, 2005). A permanência dos usuários também pode estar envolvida com as variações significativas observadas na frequência de isolamento de C. tropicalis em relação aos seis pontos de coleta. A quantidade de isolados foi muito variável entre os pontos, o que pode se relacionar tanto com a distribuição diferencial de banhistas ao longo da orla, bem como com o escoamento heterogêneo de dejetos oriundos da rede hoteleira e comercial. Na praia de Ponta Negra são visíveis as descargas de esgotos lançadas ao mar ao longo da costa, o que também contribui para a alta prevalência dessa importante levedura patogênica, bem como para a sua persistência no ambiente costeiro. A contaminação da areia ocorre durante o trajeto dos esgotos para mar e também pelo movimento das marés. Segundo Pinto et al. (1992) o processo das marés faz com que propágulos fúngicos presentes na água sejam depositados no solo, sendo estes posteriormente dispersos para a água do mar. Além disso, a areia tem a capacidade de “filtrar” micro-organismos presentes na água circulante, pois suas partículas possuem em seu formato rachaduras e fendas que podem funcionar como micro habitats protegidos, ricos em nutrientes, sendo assim locais propícios para sobrevivência e crescimento de leveduras (VOGEL et al, 2007). A OMS recomenda a utilização de C. albicans como indicador de contaminação fecal de ambientes costeiros, por ser esta uma levedura exclusiva do trato gastrintestinal do homem e de outros animais de sangue quente (WHO, 1989). Entretanto, C. albicans é pouco resistente às condições elevadas de temperatura e salinidade típicas desses ambientes, o que a torna adequada apenas como indicador de contaminação fecal imediata (VOGEL et al, 2007). Por outro lado, sabe-se que a presença de C. tropicalis, no ambiente pode ser um confiável e preciso indicador de contaminação fecal de longo prazo, uma vez que esse micro-organismo

pode sobreviver por mais tempo que muitos outros em condições de elevada temperatura e salinidade (VOGEL et al, 2007). Em média, a água do mar contêm de 3,5 a 3,7% (p/v) de sais dissolvidos, dos quais o NaCl é o mais abundante devido ao seu alto grau de solubilidade (WEBER, 1992). Neste sentido, os isolados ambientais de C. tropicalis do presente estudo foram testados quanto à capacidade de resistência ao estresse osmótico induzido em concentrações crescentes de NaCl adicionado ao meio de cultura. A menor concentração de NaCl onde se observou crescimento dos isolados ambientais foi de 7%, concentração salina superior ao descrito para a água do mar. Além disso, a maioria dos isolados e também a cepa de referência ATCC13803 de C. tropicalis conseguiram crescer em meio contendo até 15% de NaCl dissolvido. Para a cepa de referência ATCC90028 de C. albicans foi observada menor capacidade de resistência ao estresse osmótico, uma vez que suportou apenas 3,75% de NaCl presente no meio de cultura. Estes resultados, portanto, concordam com outros achados na literatura, que descrevem a capacidade de C. tropicalis de maior resistência a condições hipersalinas em relação à C. albicans (DESMARAIS et al, 2002; VOGEL et al, 2007). Os mecanismos de osmorregulação em C. tropicalis ainda são pouco conhecidos. Tem sido demonstrado o papel das bombas de efluxo de íons nesse processo, destacando-se os sistemas de transporte Na+/ K+ e Na+/ H+. Em S. cerevisiae, as proteínas Na+/ K+ - ATPases são codificadas por ENA1, cuja expressão é modulada por HAL3, sendo o gene CtHAL3 seu homólogo em C. tropicalis (Rodriguez et al, 1996). Dentre os transportadores de Na+/ H+, destaca-se a proteína Nha1p, codificada pelo gene NHA1 (KRAUKE e SYCHOVA, 2008). O ortólogo encontrado em C. tropicalis é CtCnh1p (KINCLOVA et al, 2001). García et al. (1997) descreveram o papel preponderante das bombas de efluxo na adaptação osmótica de C. tropicalis em detrimento dos mecanismos compensatórios não iônicos de perda de água e turgor. Esta levedura também possui capacidade de acumular glicerol no interior das células, contudo tal mecanismo de adaptação é menos eficiente que a ativação das bombas de efluxo de íons (GARCÍA et al, 1997). C. tropicalis, portanto, é uma levedura osmofílica ou osmotolerante, uma vez que pode crescer bem em ambientes com elevada pressão osmótica, mas essa condição não é essencial à sua sobrevivência (TOKUOKA, 1993). Tal propriedade é frequentemente associada com sua utilização em práticas industriais e biotecnológicas. Rao et al. (2006) utilizaram cepa de C. tropicalis em solução hipersalina para melhorar a produção de xilitol a partir de fibra de

milho e bagaço de cana de açúcar. O xilitol é uma rara molécula utilizada como adoçante, de alto custo, e algumas leveduras podem produzi-lo por conversão a partir de xilose (RAO et al, 2006). Outra aplicação de cepas osmofílicas de C. tropicalis é a utilização em processos de biorremediação. Chang et al. (1998) descreveram a capacidade dessa levedura metabolizar compostos fenólicos presentes em solos contaminados. Neste sentido, Bastos et al. (2000) reportaram incremento na degradação de compostos fenólicos em solo contaminado da Amazônia brasileira por C. tropicalis em presença de elevada concentração salina (15%). Micro-organismos com essa capacidade são denominados biossorbentes, fundamentais para corrigir processos de poluição sem causar danos aos ecossistemas (LEITÃO, 2007) Resíduos hipersalinos são produzidos em diversas atividades industriais, como fábricas de insumos químicos, petróleo e gás natural e nas práticas de minimização de resíduos, que são vulgarmente denominados águas de poluição, constituídos de altas concentrações de sais, óleos, ácidos orgânicos, metais pesados e radionuclídeos (WOOLARD e IRVINE, 1995; LEITÃO, 2007; SILVA et al, 2013). Realmente, Al-Araji et al. (2007) reportam a utilização de C. tropicalis na recuperação comercial de petróleo do ambiente e também no processo de limpeza marítima em caso de derramamento, descrevendo a secreção de manoproteína com propriedade biossurfactante na parede celular dessa levedura, presente no ambiente marítimo. Adicionalmente, os fungos são micro-organismos menos sensíveis às variações de nutrientes, aeração, pH e temperatura, oferecendo ainda facilidade de separação da biomassa micelial por filtração (SILVA et al, 2013). Portanto, os resultados do presente estudo apontam para a possibilidade de utilização de C. tropicalis, como micro-organismo halotolerante, para o tratamento biológico de poluentes. A halotolerância também proporciona maior permanência de C. tropicalis no ambiente costeiro, possibilitando maior oportunidade de contaminação dos banhistas. A persistência prolongada no ambiente marítimo também pode conduzir a adaptação a concentrações elevadas de outros íons e à luz (ultravioleta) UV. Todo esse processo pode se refletir em alterações genéticas que proporcionem alguma vantagem à essa levedura, uma vez que a expressão da virulência de muitas espécies de Candida, bem como a resistência a fármacos antifúngicos, dependem de condições ambientais, que de alguma forma refletem em pressão de seleção (KRAUKE e SYCHORVA, 2008).

Com relação aos fatores de patogenicidade, C. tropicalis, é a segunda espécie mais virulenta do gênero Candida, e, ao contrário de C. albicans que é comensal da pele e mucosas, a detecção de C. tropicalis é mais frequentemente associada com o desenvolvimento de infecções fúngicas profundas (ZAUGG et al, 2001). Com relação aos fatores de virulência analisados, todos os isolados ambientais de C. tropicalis foram capazes de aderir às CEBH, sendo mais aderentes que a cepa de referência ATCC13803 de C. tropicalis e menos aderentes que a cepa de referência ATCC90028 de C. albicans. Esses resultados corroboram com vários estudos encontrados na literatura atual, onde C. albicans é citada como a espécie mais aderente do gênero, seguida de C. tropicalis (LYON et al, 2006; BIASOLLI et al, 2010). Silva et al. (2014) avaliaram a adesão de espécies de Candida a células epiteliais bucais humanas obtidas de 30 crianças entre 5 e 12 anos, concluindo que C. albicans foi a espécie mais aderente do gênero. O mesmo foi observado para isolados obtidos da cavidade oral de pacientes portadores de HIV, com infecção hematológica e para isolados obtidos de ponta de cateter, nos quais a aderência média de C. albicans foi de 227,5 células/100 CEBH, enquanto que a média para C. tropicalis foi de 123,5 células/100 CEBH (COSTA et al,2010). O alto grau de adesão observado nos isolados ambientais do presente estudo é consistente com dados anteriormente encontrados por Chaves et al. (2013) em estudo realizado no Rio Grande do Norte com isolados oriundos de cavidade oral de pacientes transplantados renais. Além disso, destaca-se o fato de C. albicans também ter sido encontrada como mais aderente ao epitélio que C. tropicalis. Tal fato reforça a ideia de que os isolados ambientais de C. tropicalis podem ter capacidade de aderir a CEBH in vitro semelhantemente a isolados clínicos desta mesma espécie. Além disso, foi observada grande variação na capacidade de adesão entre os isolados. Tal variabilidade pode refletir um possível processo de adaptação particular em cada cepa às condições diferenciadas do ambiente costeiro, com temperatura, salinidade e umidade elevadas, bem como alta incidência de radiação ultra-violeta (UV), com respostas diferentes quando colocadas em contato com células epiteliais. Certamente é necessário o emprego de técnicas de genotipagem, com a finalidade de identificar isolados de C. tropicalis mais adaptados às condições da areia da praia, possivelmente aptos para colonizar e infectar os frequentadores desse ambiente. Contudo, os mecanismos envolvidos nesse processo ainda não estão devidamente esclarecidos (COSTA, 2009; JACOBSEN et al, 2012).

A transição morfológica é outro fator de virulência que tem grande relevância na patogenicidade de leveduras gênero Candida. A maioria dos trabalhos concernentes à morfogênese tratam de C. albicans, havendo consideravelmente poucos estudos envolvendo a morfogênese em espécies de CNCA (KOHLER e FINK, 1996). Não encontramos nenhum trabalho na literatura referente à capacidade de filamentação de isolados ambientais de C. tropicalis. Dentre os isolados analisados no presente estudo, a maioria produziu estruturas filamentosas no meio Spider (85,4%). Semelhantemente, estudo realizado por Galán-Ladero et al. (2013) avaliou a filamentação de 29 cepas de C. tropicalis isoladas de pacientes internados em um hospital terciário na Espanha, oriundas dos tratos urinário e respiratório, bem como de cateter e infecção abdominal. Os autores reportaram alto nível de filamentação em 76,6% dos isolados. As estruturas micelianas facilitam a invasão tecidual, uma vez que aumentam a capacidade de aderência da levedura aos tecidos hospedeiros, proporcionando maior superfície de contato com os mesmos (ODDS, 1994; CALDERONE e FONZI, 2001). Dessa forma, a filamentação significativa observada nos isolados de C. tropicalis indica potencial de invasão desta levedura, possivelmente influenciadas pelo estresse ambiental. O papel das condições estressantes na filamentação de C. albicans já está bem estabelecido. Ocorre perturbação da progressão do ciclo celular para estimular o crescimento filamentoso, interferindo nos mecanismos de reparo do DNA através de vias de sinalização específicas (GOW et al, 2011). Claramente, a morfogênese é controlada por uma extensa rede regulatória que coordena uma série de fatores ambientais, resultando no fato de que nem todas as hifas são formadas de forma idêntica, apresentando variações na superfície fúngica a depender do microambiente ocupado pela célula. Isso certamente influencia a resposta imunológica do hospedeiro, sendo ainda interessante assinalar que a presença de pseudo-hifas também tem relevância patogênica (GOW et al, 2011). A formação de biofilme faz parte do ciclo ecológico de muitos micro-organismos no meio ambiente e nos processos infecciosos, incluindo as leveduras do gênero Candida (HALL-STOODLEY e STOODLEY, 2002). Em contraste com a extensa literatura encontrada para C. albicans, pouca atenção tem sido dada à C. tropicalis. Alguns trabalhos tem relatado a capacidade dessa espécie de formar biofilmes complexos in vitro, sobre PVC (RAMAGE et al, 2006), poliestireno (DOUGLAS, 2004) e outros materiais plásticos (SANTA et al, 2013).

A produção de biofilme foi bastante significativa para maioria dos isolados avaliados no presente trabalho. Tumbarello et al. (2007) relataram elevada produção de biofilme em isolados de C. tropicalis oriundos de infecção hematogênica, entretanto os valores de produção de biofilme do presente trabalho ainda foram superiores aos descritos por esse autores. Pannanusorn et al. (2013) reportaram que essa levedura foi a espécie de CNCA com maior formação de biofilme em estudo com isolados de candidemia. A maioria dos isolados foi altamente produtora de biofilme (67%). Alguns estudos afirmam que diferentes cepas dentro de uma mesma espécie de Candida podem ter diferentes níveis de capacidade de formação de biofilme, o que justifica a existência de isolados de C. tropicalis com "forte" ou "fraca" produção (JIN et al, 2003; THEIN et al, 2007). Todos os isolados ambientais de C. tropicalis apresentaram maior produção de biofilme do que as cepas de referência utilizadas, corroborando com os achados de JIN et al. (2003), o qual relata que linhagens selvagens de espécies de Candida demonstraram maior produção de biofilme do que cepas laboratoriais de referência. Muitos autores têm reportado que espécies de CNCA produzem mais biofilme do que C. albicans (GASPARETTO et al, 2005; KUMAR e MENON, 2006), o que é condizente com nossos resultados. O mesmo foi evidenciado por Paiva et al. (2012) e Marcos-Zambrano et al. (2014) em isolados de candidíase vulvovaginal e fungemia, respectivamente, demonstrando produção de biofilme em C. tropicalis maior do que em C. albicans. Outro fator de virulência muito importante para leveduras do gênero Candida é a secreção de enzimas líticas. Espécies desse gênero produzem uma grande variedade de hidrolases secretadas, sendo as aspartil proteinases secretadas (Saps) as mais investigadas (NAGLIK et al, 2004). Sabe-se que C. tropicalis secreta essas enzimas (RÜCHELL et al, 1983; MACDONALD e ODDS, 1983), contudo, até o presente momento não havia relatos acerca da secreção de proteinase para C. tropicalis isolada de ambiente costeiro. No contexto clínico, a atividade proteolítica de C. tropicalis tem sido muito descrita. Estudo realizado na Espanha caracterizou a atividade de proteinase de isolados oriundos de cavidade oral de 100 usuários de prótese total, sendo que 44 pacientes apresentavam estomatite protética. Os autores relataram alta atividade proteolítica em isolados de C. tropicalis, sendo a maioria classificada como moderadamente produtores (MARCOS-ARIAS et al, 2011). A capacidade proteolítica in vitro dessa levedura também foi demonstrada em trabalho realizado em São Paulo, Brasil, no qual isolados de CNCA obtidos de cavidade oral

foram submetidos a ensaio de placa; todos os isolados de C. tropicalis foram altamente produtores de proteinase. Muitos estudos relatam que C. albicans produz altos níveis de proteinase in vitro, enquanto que espécies de CNCA apresentam pouca produção dessas enzimas (ZAUGG et al, 2001; SACHIN et al, 2012; SILVA et al, 2012). Estes dados são contraditórios aos resultados encontrados no presente estudo, pois os isolados ambientais de C. tropicalis tiveram maior atividade de proteinase do que a cepa de referência ATCC90028 de C. albicans. Vale ressaltar, no entanto, que este dado foi obtido com uma única cepa de C. albicans mantida em laboratório. Semelhantemente, estudo realizado em Ribeirão Preto (SP) utilizando o método quantitativo constatou elevada produção dessa enzima em 15 isolados de C. tropicalis oriundos de saliva, sendo significativamente maior que a atividade proteolítica de C. albicans (COSTA et al, 2012). A secreção de Saps por C. tropicalis também tem sido demonstrada por imunofluorescência direta na superfície dos elementos fúngicos que penetram os tecidos durante a infecção disseminada e escapando de macrófagos após a fagocitose de células de levedura (ZAUGG et al, 2001). Dessa forma, a alta atividade de proteinase dos isolados de C. tropicalis oriundos da areia da praia de Ponta Negra constitui importante dado para avaliação da virulência dessas cepas. Com relação à atividade hemolítica, há ainda poucos estudos aplicados às diferentes espécies do gênero Candida. Os eritrócitos são degradados pelas hemolisinas produzidas pelas leveduras como parte do processo de obtenção de ferro para estabelecimento do processo infeccioso. Assim, a atividade hemolítica expressa a capacidade da levedura em degradar hemácias para obter ferro (GIOLO et al, 2010). A maioria dos isolados ambientais analisados neste estudo teve forte produção de hemolisinas, sendo evidenciada hemólise total em todos os isolados. Luo et al. (2001) reportaram resultado semelhante em estudo pioneiro para espécies de CNCA com 80 isolados de Candida de 14 diferentes espécies, obtidas de amostras clínicas e regiões geográficas distintas. Rossoni et al. (2013) também relataram forte produção de hemolisinas em 75% de isolados de C. tropicalis obtidos de cavidade oral, todos com hemólise tipo beta. Esses autores ainda verificaram maior atividade hemolítica em C. albicans do que em C. tropicalis, sendo que o mesmo foi descrito também por de Melo-Riceto et al. (2014) analisando isolados

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de Candida obtidos de diferentes materiais clínicos (sangue, líquido sinovial e peritoneal). Em contraposição, os resultados do presente trabalho mostram que os isolados ambientais de C. tropicalis tiveram atividade hemolítica superior a cepa de referência ATCC90028 de C. albicans, concordando com recente estudo realizado por Favero et al. (2014), no qual isolados clínicos de C. albicans tiveram fraca atividade hemolítica enquanto que C. tropicalis foi a espécie testada com maior produção de hemolisinas. Além do elevado potencial de virulência demonstrado nos isolados ambientais de C. tropicalis, a resistência a medicamentos antifúngicos também merece especial atenção, em razão de se tratar de problema sério para o tratamento de infecções causadas por Candida spp (JIANG et al, 2013). No presente estudo, observou-se resistência significativa dos isolados ambientais de C. tropicalis aos azólicos testados, principalmente ao fluconazol (resistência em 43,5% dos isolados). Vijaya et al. (2014) obtiveram resultado muito semelhante analisando isolados de C. tropicalis obtidos de secreção vaginal de pacientes na Índia, no qual 42,9% foram resistentes a essa fármaco. Anil e Samaranayake (2003) afirmam que o crescente uso global de fluconazol é uma das principais causas para a tendência dominante das infecções causadas por espécies de CNCA em detrimento de C. albicans. Cada vez mais tem aumentado o número de relatos de resistência ao fluconazol em isolados clínicos de Candida spp. de vários sítios anatômicos (ASSIS-SANTOS et al, 2007; CHANG et al, 2013). Sabe-se que há muitos fatores envolvidos no desenvolvimento de resistência a antifúngicos por Candida spp. em quadros clínicos, dentre eles o emprego terapêutico indiscriminado da fármaco nas instalações hospitalares (JOSEPH-HORNE & HOLLOMON, 1997). Entretanto, com relação a isolados ambientais de C. tropicalis, os estudos são extremamente escassos. Vale ressaltar que dificilmente isolados ambientais tenham sido previamente expostos a antifúngicos. Entretanto, não se pode descartar completamente esta hipótese, uma vez que estes micro-organismos podem ter sido oriundos de contaminação pela ocupação humana neste ambiente costeiro. Yang et al. (2012) publicaram estudo que descreve o surgimento de resistência ao fluconazol em isolados de C. tropicalis oriundos de solo agrícola contaminado com esse antifúngico, previamente empregado como pesticida na China. Os autores ainda reportam a existência de similaridade genética desses isolados com cepas de origem clínica, o que reforça a necessidade de aprofundamento no estudo dos mecanismos de resistência à fármacos em leveduras ambientais, associado a estudos de genotipagem e patogênese da candidíase causada por C. tropicalis.

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Os mecanismos genéticos de resistência aos azólicos compreendem principalmente mutações genéticas, redução da expressão do alvo das fármacos e aumento da regulação de transportadores de efluxo, além de mecanismos alternativos como a formação de biofilme e alterações mitocondriais (JIANG et al, 2013). Kothavade et al. (2010) relacionaram o alto nível de resistência de isolados clínicos de C. tropicalis ao fluconazol com a regulação positiva de bombas de efluxo em concentrações crescentes da fármaco. Outros estudos têm reportado que a expressão aumentada dos genes MDR1 e CDR1, que codificam proteínas de efluxo, têm relação positiva com o incremento da resistência em várias espécies de Candida em concentrações elevadas de fármacos (MARIE et al, 2009; MORSCHHÄUSER, 2010). Portanto, existe a possibilidade de bombas de efluxo estarem mais expressas nestes micro- organismos em ambientes costeiros, como resposta à adaptação de C. tropicalis em condição de estresse ambiental. Tal mecanismo pode estar envolvido nos isolados ambientais do presente estudo, nos quais foi observado tanto o fenótipo “Low-high” como um crescimento atípico semelhante ao efeito paradoxal relatado para as equinocandinas (MELO et al, 2007). Cepas com o fenótipo “Low-high” são sensíveis após 24 h de incubação, mas aparecem como resistentes após 48 h nas mesmas condições (REVANKAR et al, 1998; MARR et al, 1999). Entretanto, Rex et al. (1998) inocularam em cobaias cepas de C. tropicalis com essa característica e observaram que os animais apresentaram resposta terapêutica ao fluconazol semelhante aos isolados sensíveis. Já o efeito paradoxal se relaciona com resistência a medicamentos, tendo sido inicialmente descrito para a caspofungina em C. albicans (STEVENS et al, 2004). Bizerra et al. (2011) avaliaram esse fenômeno em dois isolados de cada uma das seguintes espécies de Candida: C. albicans, C. tropicalis, C. orthopsilosis e C. parapsilosis, investigando os componentes da parede celular e modificações ultraestruturais nas células. As quatro espécies diferentes de Candida exibiram alterações semelhantes nos componentes da parede celular e na ultraestrutura associadas ao crescimento paradoxal. O teor de β-1,3-glucana diminuiu, enquanto que a quantidade de quitina na parede celular aumentou, sendo isso também evidenciado mediante microscopia eletrônica. Efeito semelhante ao crescimento paradoxal foi observado nos isolados ambientais de C. tropicalis do presente trabalho; entretanto, com relação aos antifúngicos azólicos testados, tal fenômeno nunca foi antes descrito. Como mencionado, para as equinocandinas, o efeito paradoxal acontece como resposta adaptativa ao dano promovido por essas moléculas na

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estrutura da parede celular fúngica, a qual desenvolve mecanismos para compensar a inibição da produção de glucanas (WALKER et al, 2010), como a produção acessória de quitina pela via de sinalização da calcineurina (CHEN et al , 2014). Semelhante mecanismo poderia parcialmente explicar a redução de crescimento fúngico em baixa concentração da fármaco e retomada desse crescimento em concentração acima da CIM. Sendo assim, estudos futuros de microscopia eletrônica e ultra-estrutra serão necessários para a elucidação deste fenômeno ocorrido em C. tropicalis frente aos azólicos, uma vez que estudos acerca dos mecanismos de resistência em C. tropicalis ainda são insatisfatórios (FORASTIERO et al, 2013). O nível de resistência aos azólicos nos isolados ambientais de C. tropicalis foi realmente muito notável. Jiang et al. (2013) investigaram resistência a esses fármacos em 52 isolados clínicos de C. tropicalis obtidos de cinco hospitais da China. Resistência ao fluconazol foi observada em 18 isolados (34,6%), enquanto que 21 (40,4%) foram resistentes ao itraconazol e apenas 4 (7,7%) ao voriconazol. Os autores sugerem, portanto, que o voriconazol tem atividade mais potente contra os isolados clínicos de C. tropicalis que as outras fármacos testadas, o que se contrapõe aos resultados do presente estudo, no qual 38 isolados ambientais (61,3%) foram resistentes a esse medicamento, número superior à quantidade de isolados resistentes as outras duas fármacos. Além disso, o número de isolados resistentes a esses três antifúngicos foi de apenas 4 (7,7%) no estudo de Jiang et al. (2013) com 52 isolados, contrastando novamente com nosso resultado, no qual 15 cepas (24,2%) foram resistentes aos três azólicos testados. Adicionalmente, um significativo número de isolados ambientais foi resistente a anfotericina B, o que é supostamente raro (FORASTIERO et al, 2013). Os relatos de isolamento clínico de C. tropicalis resistente a essa fármaco vem aumentando nos últimos anos, frequentemente associada a pacientes imunossuprimidos (POWDERLY et al, 1988). Devido ao seu largo espectro de ação, a anfotericina B tem sido amplamente empregada em pacientes portadores de HIV com quadros graves de infecções fúngicas, e que, por sua condição imunossuprimida, fazem uso constante desse medicamento. Tal fato pode influenciar o surgimento de micro-organismos resistentes, com mutações no gene ERG3 e consequente dano na síntese de ergosterol (LUPETTI et al, 2012). Mutações nos genes ERG11 e ERG6 também já foram encontradas em isolados de C. tropicalis com resistência à anfotericina B. Além disso, tem sido proposto que mutações concomitantes nos genes ERG11 e ERG3 levam à resistência cruzada entre anfotericina B e azólicos em C. tropicalis (FORASTIERO et al, 2013; VINCENT et al, 2013). No presente estudo, dois isolados

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tiveram esse perfil de resistência, o que pode sugerir a ocorrência dessas alterações genéticas também em cepas de origem ambiental. As equinacandinas são os medicamentos de uso mais recente no tratamento de infecções fúngicas, tendo como alvo a parede celular, o que lhes confere excelente nível de especificidade no mecanismo de ação, aumentando a eficácia medicamentosa e diminuindo a possibilidade de efeitos adversos (PERLIN, 2007). A utilização dessa classe de medicamentos tem se mostrado vital em casos de resistência ao fluconazol e à anfotericina B, com amplo espectro de ação contra C. tropicalis (PFALLER et al, 2008). De fato, todos os isolados ambientais de C. tropicalis foram sensíveis a essas fármacos, mesmo os que foram resistentes aos azólicos e à anfotericina B. O mesmo foi observado por Pfaller et al. (2008), que relataram 100% de sensibilidade de isolados de C. tropicalis oriundos de infecção hematogênica para caspofungina, anidulafungina e micafungina.

7.0 CONCLUSÕES ______

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O presente estudo proporcionou as seguintes conclusões:

1. O alto isolamento de C. tropicalis do ambiente costeiro pode estar relacionado com a temperatura do ambiente, uma vez que C. tropicalis foi mais isolada de solo mais quente. 2. Todos os isolados ambientais foram altamente aderentes às CEBHs, sendo, entretanto menos aderentes que C. albicans, corroborando com estudos anteriores. 3. A grande maioria dos isolados exibiu algum nível de filamentação em meio Spider, indicando o potencial invasivo dessas cepas, possivelmente influenciado por condições de estresse ambiental. 4. Observou-se elevada produção de biofilme, com valores muito superiores aos das cepas de referência utilizadas. 5. Os isolados ambientais são altamente produtores de proteinase, com valores também superiores aos encontrados para as cepas de referência utilizadas neste estudo. 6. Isolados ambientais de C. tropicalis são beta hemolíticos, e a maioria teve forte produção de hemolisinas. 7. Isolados ambientais de C. tropicalis demonstraram alta capacidade de resistência ao estresse osmótico, quando crescidos em meio de cultura adicionado de diferentes concentrações salinas. 8. Os isolados ambientais de C. tropicalis apresentaram significativa resistência antifúngica, alguns deles com resistência cruzada aos azólicos e a anfotericina B. 9. Todos os isolados de C. tropicalis inclusos no presente estudo foram sensíveis às equinocandinas testadas, demonstrando satisfatória atividade antifúngica desta classe de antimicrobianos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ______

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ANEXOS ______

127

ANEXO I

Fatores de virulência e resistência ao estresse osmótico de isolados de Candida tropicalis oriundos da areia da praia de Ponta Negra, Natal – RN, e das cepas de referência. Cepa Nº de células Fenótipo em meio Formação de Atividade de Índice de Resistência aderidas em Spider biofilme proteinase hemólise (IH) ao estresse

150 CEBH DO570nm DO280/DO600 osmótico

Candida albicans 192.7 + 3.1 Filamentoso 0.13 + 0.006 0.03 + 0.002 0.65 + 0.06 3.75% ATCC90028

Candida tropicalis 96.0 + 10.0 Filamentoso 0.21 + 0.006 0.06 + 0.005 0.45 + 0.05 15% ATCC13803 LMMM652 120 + 5.6 Rugoso 0.66 + 0.012 0.08 + 0.003 0.66 + 0.04 15%

LMMM653 148.3 + 5.7 Rugoso 0.55 + 0.043 0.08 + 0.005 0.33 + 0.02 15% LMMM654 153.7 + 14.7 Rugoso 2.41 + 0.082 0.09 + 0.003 0.38 + 0.02 15%

LMMM655 146 + 6.6 Rugoso 1.15 + 0.049 0.09 + 0.004 0.54 + 0.03 7.5% LMMM656 122 + 12.6 Filamentoso 1.61 + 0.167 0.08 + 0.002 0.51 + 0.04 15% LMMM657 137 + 12.8 Filamentoso 0.61 + 0.081 0.07 + 0.002 0.61 + 0.02 15% LMMM658 140.7 + 7.0 Filamentoso 0.24 + 0.022 0.07 + 0.004 0.51 + 0.01 15% LMMM659 155.3 + 3.2 Rugoso 1.68 + 0.107 0.09 + 0.002 0.57 + 0.04 15% LMMM660 128 + 9.2 Rugoso 0.55 + 0.007 0.08 + 0.004 0.63 + 0.03 15% LMMM661 151.7 + 6.4 Liso 0.68 + 0.031 0.08 + 0.001 0.70 + 0.00 15% LMMM662 141.3 + 12.5 Liso 1.15 + 0.006 0.08 + 0.003 0.62 + 0.00 15% LMMM663 143 + 15.6 Rugoso 1.66 + 0.205 0.08 + 0.002 0.40 + 0.00 15% LMMM664 165 + 5.6 Filamentoso 1.39 + 0.036 0.08 + 0.002 0.41 + 0.00 15% LMMM665 154.3 + 3.2 Filamentoso 2.25 + 0.074 0.08 + 0.003 0.41 + 0.03 15% LMMM666 154.7 + 5.7 Rugoso 1.62 + 0.041 0.08 + 0.001 0.52 + 0.02 15% LMMM667 144.3 + 13.2 Rugoso 2.10 + 0.012 0.08 + 0.001 0.53 + 0.01 15% LMMM668 129 + 6.0 Rugoso 1.69 + 0.018 0.09 + 0.003 0.50 + 0.00 15% LMMM669 130.7 + 14.2 Rugoso 1.24 + 0.020 0.09 + 0.001 0.51 + 0.01 15% LMMM670 159.7 + 5.5 Liso 1.55 + 0.020 0.09 + 0.002 0.60 + 0.00 7.5% LMMM671 141 + 7.5 Rugoso 1.14 + 0.050 0.09 + 0.001 0.65 + 0.00 7.5% LMMM672 194.3 + 5.5 Rugoso 1.98 + 0.022 0.09 + 0.002 0.58 + 0.01 15% LMMM673 155.3 + 13.2 Filamentoso 2.67 + 0.003 0.08 + 0.002 0.44 + 0.01 7.5% LMMM674 132.3 + 9.0 Rugoso 2.15 + 0.015 0.09 + 0.01 0.55 + 0.00 15% LMMM675 122 + 12.6 Liso 2.02 + 0.005 0.07 + 0.001 0.43 + 0.01 15% LMMM676 124.7 + 15.1 Liso 0.64 + 0.018 0.09 + 0.003 0.52 + 0.03 7.5% LMMM677 125.3 + 17.4 Rugoso 1.64 + 0.010 0.09 + 0.002 0.46 + 0.01 15% LMMM678 155.7 + 4.7 Rugoso 2.26 + 0.065 0.08 + 0.002 0.56 + 0.00 15% LMMM679 141.7 + 6.0 Rugoso 3.07 + 0.007 0.08 + 0.004 0.54 + 0.01 15% LMMM680 187.3 + 12.1 Rugoso 1.71 + 0.007 0.07 + 0.001 0.61 + 0.01 15% LMMM681 116 + 6.0 Filamentoso 0.83 + 0.002 0.08 + 0.003 0.49 + 0.01 15% LMMM682 133.3 + 10.0 Filamentoso 0.54 + 0.004 0.09 + 0.003 0.46 + 0.03 15% LMMM683 149.7 + 9.7 Rugoso 1.29 +0.004 0.09 + 0.04 0.61 + 0.01 7.5% LMMM684 152.7 + 11.7 Rugoso 3.25 + 0.171 0.02 + 0.001 0.52 + 0.02 15% LMMM685 116 + 6.0 Rugoso 2.39 + 0.050 0.03 + 0.002 0.47 + 0.02 15% LMMM686 124.7 + 5.5 Rugoso 0.70 + 0.055 0.05 + 0.004 0.52 + 0.00 15% LMMM687 176 + 4.6 Rugoso 0.61 + 0.006 0.02 + 0.002 0.55 + 0.00 15% LMMM688 194.3 + 5.5 Rugoso 0.87 + 0.093 0.06 + 0.004 0.55 + 0.00 15% LMMM689 180.7 + 11.8 Liso 1.72 + 0.006 0.06 + 0.002 0.55 + 0.00 15% LMMM690 143.3 + 4.5 Rugoso 1.19 + 0.003 0.07 + 0.001 0.52 + 0.03 15%

128

Continuação

LMMM691 152.3 + 3.5 Rugoso 2.59 + 0.007 0.06 + 0.001 0.66 + 0.00 15% LMMM692 174.3 + 5.8 Filamentoso 0.74 + 0.005 0.06 + 0.003 0.58 + 0.00 15% LMMM693 146 + 13.7 Filamentoso 0.68 + 0.005 0.09 + 0.004 0.65 + 0.00 15% LMMM694 123.7 + 24.6 Filamentoso 1.85 + 0.006 0.07 + 0.004 0.65 + 0.00 15% LMMM695 161.3 + 8.0 Filamentoso 0.89 + 0.004 0.08 + 0.006 0.55 + 0.01 7.5% LMMM696 147.3 + 15.6 Liso 1.60 + 0.090 0.08 + 0.003 0.52 + 0.00 15% LMMM697 187.3 + 2.1 Liso 1.59 + 0.128 0.09 + 0.002 0.65 + 0.00 15% LMMM698 133.3 + 10.0 Rugoso 0.69 + 0.009 0.09 + 0.001 0.69 + 0.02 15% LMMM699 131.7 + 3.1 Rugoso 1.96 + 0.005 0.09 + 0.002 0.49 + 0.01 15% LMMM700 185 + 3.6 Rugoso 2.79 + 0.008 0.09 + 0.002 0.60 + 0.01 15% LMMM701 153 + 8.5 Rugoso 3.01 + 0.002 0.08 + 0.004 0.63 + 0.03 15% LMMM702 164 + 13.7 Filamentoso 0.65 + 0.010 0.08 + 0.004 0.62 + 0.01 15% LMMM703 150 + 7.2 Filamentoso 0.73 + 0.008 0.08 + 0.003 0.66 + 0.00 15% LMMM704 179 + 10.8 Rugoso 0.37 + 0.007 0.09 + 0.002 0.66 + 0.03 15% LMMM705 130.7 + 14.2 Rugoso 1.51 + 0.003 0.06 + 0.004 0.64 + 0.01 7.5% LMMM706 135.7 + 15.9 Rugoso 0.95 + 0.004 0.06 + 0.004 0.60 + 0.00 15% LMMM707 107.7 + 5.9 Rugoso 0.51 + 0.003 0.06 + 0.001 0.61 + 0.04 15% LMMM708 154.7 + 5.7 Rugoso 0.28 + 0.007 0.08 + 0.004 0.61 + 0.01 15% LMMM709 115.3 + 5.5 Filamentoso 0.87 + 0.004 0.09 + 0.002 0.41 + 0.03 7.5% LMMM710 184.7 + 4.2 Filamentoso 2.78 + 0.007 0.09 + 0.001 0.42 + 0.02 15% LMMM711 122 + 2.6 Filamentoso 3.57 + 0.003 0.06 + 0.003 0.39 + 0.00 15% LMMM712 163.3 + 8.8 Filamentoso 0.64 + 0.005 0.08 + 0.001 0.61 + 0.04 15% LMMM713 155.3 + 3.2 Filamentoso 1.45 + 0.004 0.09 + 0.001 0.44 + 0.00 15% Livro de Regitro do Laboratório de Micologia Médica e Molecular, UFRN.

129

ANEXO II

Resultados dos testes de susceptibilidade de isolados de Candida tropicalis oriundos da areia da Praia de Ponta Negra, Natal – RN

Valores de CIM (µg/ml) para os antifúngicos testados

Cepa Fluconazol Voriconazol Itraconazol Anfotericina B Caspofungina Anidulafungina Micafungina

C. krusei ≥ 64 (R) 2,0 (R) 4 (R) 1,0 (S) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ATCC6258 C. tropicalis 0,25 (S) 1,0 (R) 0,5 (SDD) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ATCC13803 C. parapsilosis 1,0 (S) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 1,0 (S) 0,25 (S) ≤ 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ATCC22019 LMMM652 1,0 (S) 1,0 (R) 0,5 (SDD) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM653 1,0 (S) 0,25 (SDD) 4,0 (R) 2,0 (R) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM654 ≥ 64 (R) 2,0 (R) 4,0 (R) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM655 1,0 (S) 0,125 (S) 1,0 (R) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM656 0,5 (S) 2,0 (R) 1,0 (R) 2,0 (R) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM657 0,5 (S) 4,0 (R) 1,0 (R) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM658 0,5 (S) 4,0 (R) 1,0 (R) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM659 ≥ 64 (R) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM660 4,0 (SDD) 2,0 (R) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM661 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM662 8,0 (R) 2,0 (R) 8,0 (R) 2,0 (R) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S)

130

Continuação

LMMM663 2,0 (S) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 0,25 (S) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM664 ≥ 64 (R) 2,0 (R) 2,0 (R) 1,0 (S) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM665 ≥ 64 (R) 4,0 (R) ≥ 16 (R) 2,0 (R) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM666 1,0 (S) 2,0 (R) 1,0 (R) 1,0 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM667 0,5 (S) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 2,0 (R) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM668 4,0 (SDD) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM669 8,0 (R) ≥ 16 (R) 8,0 (R) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM670 2,0 (S) 2,0 (R) 8,0 (R) 1,0 (S) 0,25 (S) 0,125 (S) 0,06 (S) LMMM671 2,0 (S) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 0,25 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM672 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 1,0 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM673 ≥ 64 (R) 0,25 (SDD) ≥ 16 (R) 2,0 (R) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM674 ≥ 64 (R) 0,5 (SDD) 0,25 (SDD) 1,0 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM675 2,0 (S) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM676 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) 0,5 (SDD) 1,0 (S) 0,03 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM677 2,0 (S) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 1,0 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM678 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) 0,5 (SDD) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM679 ≥ 64 (R) 1,0 (R) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM680 4,0 (SDD) ≥ 16 (R) 0,125 (S) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM681 4,0 (SDD) ≥ 16 (R) 0,25 (SDD) 0,25 (S) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM682 4,0 (SDD) ≥ 16 (R) 0,25 (SDD) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S)

131

Continuação

LMMM683 4,0 (SDD) 8,0 (R) 2,0 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM684 8,0 (R) ≥ 16 (R) 2,0 (R) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM685 ≥ 64 (R) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM686 0,5 (R) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM687 4,0 (SDD) 0,125 (S) ≥ 16 (R) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM688 4,0 (SDD) 0,125 (S) ≥ 16 (R) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM689 0,5 (S) 0,25 (SDD) 0,125 (S) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM690 8,0 (R) 4,0 (R) ≥ 16 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM691 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 0,125 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM692 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM693 2,0 (S) 0,25 (SDD) 0,5 (SDD) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM694 8,0 (R) ≥ 16 (R) 1,0 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM695 1,0 (S) 0,125 (S) 0,25 (SDD) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM696 1,0 (S) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM697 ≥ 64 (R) ≥ 16 (R) 1,0 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM698 2,0 (S) ≥ 16 (R) 0,5 (SDD) 0,25 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM699 2,0 (S) 2,0 (R) 4,0 (R) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM700 ≥ 64 (R) 0,125 (S) ≥ 16 (R) 2,0 (R) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM701 0,25 (S) 0,25 (SDD) 1,0 (R) 0,5 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM702 8,0 (R) 0,5 (SDD) 0,5 (SDD) 1,0 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S)

132

Continuação

LMMM703 2,0 (S) 1,0 (R) 2,0 (R) 2,0 (R) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM704 2,0 (S) 1,0 (R) 0,25 (SDD) 2,0 (R) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM705 8,0 (R) ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 0,25 (S) 0,06 (S) 0,06 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM706 8,0 (R) 8,0 (R) 1,0 (R) 0,25 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM707 4,0 (SDD) 1,0 (R) 1,0 (R) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM708 0,25 (S) 0,5 (SDD) 2,0 (R) 1,0 (S) 0,06 (S) 0,125 (S) 0,5 (I) LMMM709 8,0 (R) 4,0 (R) 0,5 (SDD) 0,25 (S) 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM710 0,125 (S) 0,125 (S) 0,25 (SDD) 0,5 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM711 32 (R) 0,25 (SDD) 0,5 (SDD) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM712 4,0 (SDD) 4,0 (R) 0,5 (SDD) 0,25 (S) 0,25 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) LMMM713 2,0 (S) 0,125 (S) 0,5 (SDD) 1,0 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S) ≤ 0,03 (S)

S = Sensível R= Resistente SDD= Susceptibilidade Dose-Dependente: categoria exclusiva para azólicos I = Susceptibilidade Intermediária. Fonte: CLSI, 2012.

133

ANEXO III

NORMAS DA REVISTA PARA SUBMISSÃO DO ARTIGO

MEDICAL MYCOLOGY – Guide for Authors

Medical Mycology

Manuscript Preparation

SUBMISSION

All submissions must be uploaded as Word files to the Medical Mycology ScholarOne Manuscripts site at mc.manuscriptcentral.com/tmmy. Users who have not previously submitted work through this site must create an account from the link on the login page. Assistance with this and all other areas of the site is available in the User Guide, which is accessed via the ‘Get Help Now’ button at the top right corner of all ScholarOne Manuscript web pages. If you need additional help, please contact [email protected].

Permissions

Written permission should be obtained to adapt a part of or reprint an entire table, graph, or illustration that has been previously published. Authors are responsible for obtaining permission from the copyright holder to use copyrighted material prior to submission, and are responsible for paying any associated fees. Click here for more information on permissions.

HOW TO CONTACT THE EDITORIAL OFFICE The Editorial Office can be contacted as follows: Carlene Rummery

Email: [email protected]

LANGUAGE EDITING PRE-SUBMISSION

If your first language is not English, language editing—to ensure that the academic content of your paper is fully understood by journal editors and reviewers—is optional. Language editing does not guarantee that your manuscript will be accepted for publication. For further information on this service, please click here. Several specialist language editing companies offer similar services and you can also use any of these. Authors are liable for all costs associated with such services.

134

ARTICLE TYPES

Papers may be submitted in the following categories.

Original Papers

Manuscripts must have: (a) a Cover-Page that includes the full title and a short title, name(s) and affiliation(s) of all author(s), the name, telephone/ fax numbers and email address of the designated corresponding author, and a list of up to five keywords; (b) a separate page for a Summary or Abstract of up to 250 words prepared without sub-headers; (c) text consisting of Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion and References; (d) References must be cited sequentially in the order in which they first appear in the text as superscript Arabic numerals and included in the same numerical order in the Reference section; (e) each Table should be submitted as a separate page and should have footnoted descriptions of all abbreviations contained in the Table (see section below on Tables for more detailed information); (f) each Figure should be submitted as a separate file (page), with appropriate figure legends allowing a reader to understand their contents without reference to the text (see section below on Figures for more detailed information). Manuscripts MUST be in English, double-spaced, in no less than size 12 point, without line numbering and up to approximately 30 manuscript pages (10-12 print pages) including cover-page, abstract, text, references, and tables/figures.

Reviews

Authors must first electronically submit an outline of their proposed article for evaluation by the journal. The outline should be no more than two, double-spaced pages in 12 point, in which the authors describe the objectives and contents of the report. The outline must be submitted to the Reviews Editor, Riina Richardson: [email protected]. Once the proposal has been evaluated, the authors will be informed of the results of the Review Editor’s initial consideration of their proposal. Reviews are NOT restricted by the formatting or length requirements of Original Papers.

135

Case Reports

Such articles should be submitted to Medical Mycology Case Reports via www.ees.elsevier.com/mmcr from which all information pertaining to this on-line, open access ISHAM journal may be obtained.

Short Communications

These manuscripts are to provide an opportunity for the presentation of preliminary or brief observations that do not warrant an original paper. The manuscript should be prepared as an original paper, except they may be no more than 12–15 manuscript pages (approximately 5–7 print pages) including cover-page, abstract, text, references, and tables/figures.

Letters to the Editor

Letters are to allow readers the opportunity to discuss issues related to previously published original articles, short communications, and reviews in Medical Mycology. Letters are NOT to be used for the presentation of the authors’ preliminary data from their own investigations. Letters should be no more than 5 double-spaced manuscript pages including references (approximately 2 print pages), in no less than size 12 point.

MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE

Please refer to a recent issue of Medical Mycology for guidance on style and layout of articles. Also refer to the Article Types section for guidance on relevant information for each article type.

File Formats

All manuscripts must be submitted as Microsoft Word documents (.doc files).

Manuscript Preparation

Manuscripts MUST be in English, double-spaced, in no less than size 12 point, organized as appropriate for the manuscript type and have one inch margins all around. Statistics and measurements should be given in numerals when followed by a unit, e.g., mg, ml, etc. In contrast, numerals employed in other circumstance, e.g., two patients, should be

136 spelled out if less than ten (10). ALL abbreviations, even those commonly used in medical mycology, e.g., Sabouraud glucose agar (SGA), must be defined when first used in the abstract and text. Please NOTE that the inability of authors to clearly present the contents of their submissions in English may constitute grounds for the immediate rejection of the papers or their return to authors so that they can correct their English usage prior to assignment to an associate editor. For authors who require professional assistance with English usage, there are companies that will provide assistance for a fee. For more information, see our language services page here.

References

Authors are responsible for the accuracy and completeness of their references and for correct text citation. In preparing your citations please follow the AMA Manual of Style, 10th Edition. For detailed information, please check here under References.

Some key style points that Medical Mycology articles must follow:

• Number references in the order they appear in the text; do not alphabetize. • In text, tables, and legends, identify references with superscript Arabic numerals. • When listing references, follow AMA style and abbreviate names of journals according to the journals listed in PubMed. The abbreviation should be in italic font and a period inserted after the final abbreviation, e.g., J Clin Microbil.↓see period • List all authors up to 6, but if more than 6, list the first 3 by name and the rest by “et al.” * • Journal references should include the issue number in parentheses after the volume number and before page numbers which should be inclusive (685-692, NOT 685-2).

Examples of reference style:

Journal article Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if more than six authors] Title of paper. J Title Abbrev. 1995; 00 (1): 000–000.

• If the title is in a language other than English, the authors should provide the English translation. The name of the original language should be included within a bracket, e.g., [in

137

Spanish], after pagination at the end of the citation. For example, Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if more than six authors] Title of paper. J Title Abbrev 1995; 00 (1): 000– 000 [in Spanish].

Book chapter Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if more than six] Chapter title. In: Editor AB, Editor CD, eds. Book Title With Initial Uppercase Letters (as indicated here and in italic font), 5th edn. Place: Publisher, 1995: 000–000.

Book Author AB, Author CD (eds). Book Title With Initial Uppercase Letters (as indicated here and in italic font), 5th edn. Place: Publisher, 1995.

Thesis Author AB. Paper title with lowercase initials to all words, except the first word. PhD thesis, University of X, 1995.

Conference proceedings/Supplements Author AB. Paper title. In: Editor AB, ed. Proceedings Title, place, date. Place: publisher, 1995: 000–000.

Meeting abstracts Abstracts of works presented at scientific meetings should be cited in brackets within the text of the manuscripts rather than in the Reference sections. The citations should be formatted as: Author AB. Abstract title. Name of meeting, its location, the date and abstract number.

Personal communications, Unpublished results etc. References to personal communications, unpublished results and papers submitted for publication (but not yet accepted) should only appear in brackets in the text, and in the following form: [A. B. Author, unpublished results] or [C. D. Author, personal communication].

138

Tables

Tables should present only essential data, must be numbered sequentially in the order in which they are first referenced in the text, and all MUST be referred to in the text. Each table should be supplied as a separate page at the end of the main document and not imbedded within the body of the text. The table header should be brief and self-explanatory. If it contains generic and species names, these must be spelled out in full, e.g., Candida albicans, not C. albicans. Column headings should be brief and include units in parentheses where applicable. Only horizontal rule lines should be used and then only for headers and footers. Tables should be considered as “stand alone” documents through which data are summarized for presentation to readers. As such, all abbreviations employed in the tables MUST be defined by footnotes included directly below the tables.

Figures/Images

Images should be submitted as TIF, EPS, PDF, or JPG (preferred) files. Scanned images should be of a sufficient resolution, i.e., 300 dpi for halftones/color, 500 dpi for combination halftones and 1000–1200 dpi for line art. Illustrations should be submitted as individual files, separate from the manuscript text file. For more information about preparing figures, see our Figures page here. Authors will be charged USD 600 for each figure reproduced in color in the print version of the journal (for more information about charges, see the Medical Mycology Charges page here). However, any figure submitted as a color original may appear in color in the journal's online edition, without any charges being assessed to the authors. NO part of any image may be enhanced, removed, relocated, introduced or manipulated in any manner after the capture of the original image unless the authors provide the editor with a clear and accurate description of the nature of the image manipulation. Figures, like tables, should be considered as “stand alone” components of the manuscript. As such, authors should provide legends at the end of the text, following the Reference section, which clearly describe the significant features of the illustrated objects. In addition, authors may employ, as warranted, arrows or similar indi

139

Supplementary Files

Supplementary information, including extensive data sets, large figures, audio and DVD/video material, can be made available as part of the online version of your manuscript. Please do not include supplementary information within the main manuscript file, but upload the material as separate file(s), labeled as “Supplemental Digital Content”. Please include a sequential number (S1, S2, etc.) for each file and a brief description of the content at the appropriate position in the text and a list of the files at the end of the discussion. Please note that supplementary files are not copy-edited and will be presented as submitted.

Nomenclature

Proposals of new fungal taxa MUST conform to the requirements outlined in the International Code of Nomenclature for Algae, Fungi, and Plants. Some of the provisions are effective as of January 1, 2012, while others will subsequently become effective. The proposed taxon must be supported by deposition of cultures and/or the unique nucleotide and/or amino acid sequences in appropriate collections or databases, along with the new binomial. The identifier assigned to the taxon by these recognized repositories, e.g., Mycobank, must be included in the text, tables and figures. In addition, binomials should appear in italics, must be spelled out in full when first used in the abstract, text, figures/tables. Thereafter, a generic name may be abbreviated to the first initial only, e.g., Candida albicans when first cited and C. albicans in the remainder of the abstract and text, except at the beginning of a sentence where the genus should be spelled out in entirety. Species names may NEVER be used without the generic full name or abbreviation combined with the full name of the species. For example, it must be Candida albicans or C. albicans, but never albicans, or C. neoformans var. grubii but never var. grubii. The use of abbreviations of generic and species names, e.g., (Ca) for C. albicans, in the text is NOT permitted.

Nucleotide and/or Amino Acid Sequence Data

Nucleotide and/or amino acid sequence data must be deposited in a freely accessible database. The GenBank/EMBL/DDBJ accession numbers should be included in the Materials and Methods Section of the manuscript. However, in a figure of a phylogenetic tree, the numbers should be shown along with species names (e.g., Malassezia globosa AB099880) (No descriptions are needed in the Materials and Methods Section in this case).

140

Acknowledgments

The work of other individuals who assisted in the studies or in the preparation of the submission must be specifically indicated in the Acknowledgments section of the paper.

FUNDING

Details of all funding sources for the work in question also should be given in the Acknowledgments section. The following rules shold be followed: • The sentence should begin: “This work was supported by …” • The full official funding agency name should be given, i.e. “the National Cancer Institute at the National Institutes of Health” or simply “National Institutes of Health” not “NCI” (one of the 27 sub-institutions) or “NCI at NIH.” Please see here for a full RIN-approved list of UK funding agencies.

• Grant numbers should be complete and accurate and provided in brackets as follows: “[grant number ABX CDXXXXXX]”

• Multiple grant numbers should be separated by a comma as follows: “[grant numbers ABX CDXXXXXX, EFX GHXXXXXX]”

• Agencies should be separated by a semi-colon (plus “and” before the last funding agency) • Where individuals need to be specified for certain sources of funding the following text should be added after the relevant agency or grant number “to [author initials].”

An example is given here: “This work was supported by the National Institutes of Health [P50 CA098252 and CA118790 to R.B.S.R.] and the Alcohol & Education Research Council [HFY GR667789].”

DECLARATION OF INTEREST

This section should appear after the Acknowledgments and should include any conflicts of interest.

141

Although there is no standard definition of Conflict of Interest, the United States National Institutes of Health has published the following statement:

It is the sole responsibility of authors to disclose any affiliation with any organization with a financial interest, direct or indirect, in the subject matter or materials discussed in the manuscript (such as consultancies, employment, expert testimony, honoraria, speakers bureaus, retainers, stock options or ownership) that may be perceived as potentially affecting the conduct or reporting of the work submitted. All sources of funding are to be explicitly stated. If uncertain as to what might be considered a potential conflict of interest, authors should err on the side of full disclosure (i.e., when in doubt, provide full disclosure).

In addition, a conflict of interest may be perceived to exist in such situations as when authors are affiliated with or employed by a private enterprise whose product or competitor’s product, e.g., drug, device or diagnostic kit, is the focal point of the paper.

Information about potential conflict of interest must be clearly stated at the point of submission. This may be made available to reviewers and may be published with the manuscript at the discretion of the Editors and Publisher. The journal recommends that you and your co-authors include the sub header, ‘Conflict of Interest’, in the Acknowledgment section at the end of your manuscript. If no such conflict exists, simply respond ‘None’. If you or your co-authors have received funding that meets the criteria described in the paragraph above, the source(s) of the funds must be declared (NOTE – you are NOT required to disclose the amounts of funding that you or your co-authors have received). Furthermore, authors must indicate their employment if describing their or other companies products.

The intent of this policy is not to prevent authors with these relationships from publishing work, but rather to adopt transparency such that readers can make objective judgements on conclusions drawn.

Further guidance on conflicts of interest is available here.

JOURNAL COPYEDITING STYLE

Authors are referred to this document and the AMA Manual of Style, 10th Edition.

142

PERMISSION TO REPRODUCE THIRD-PARTY MATERIAL

All copyright permission must be cleared and, if necessary, paid for by the author; this includes applications and payments to DACS (Data Access Control System), ARS (Artists Rights Society), and similar licensing agencies where appropriate. It is also the author’s responsibility to include acknowledgements as stipulated by particular institutions. For more information, see the Rights and Permissions page here.

COPYRIGHT AND LICENSE [email protected] is a condition of publication in Medical Mycology that the authors grant an exclusive license to the journal’s sponsoring society, the International Society for Human and Animal Mycology. This ensures that all of the necessary rights needed for publication of the article are in place including provision for any requests from third parties to reproduce the content to be as widely disseminated as possible. No article will be published unless the signed license has been received at Oxford Journals. Once your article is received into production at Oxford Journals, you will receive a “Welcome” email that contains the link to your online license. If it is not possible for you to complete your license online, please email [email protected]. Any queries about the license form should be sent as soon as possible to Rights and Permissions so that any issues can be resolved quickly and to avoid any delay in publication.

As part of the license agreement, authors may use their own material in other publications, provided that the journal is acknowledged as the original place of publication and Oxford University Press is acknowledged as the publisher. Work submitted for publication must be original, previously unpublished, and not under consideration for publication elsewhere. If previously published figures, tables, or parts of text are to be included, the copyright-holder’s permission must have been obtained prior to submission. For more information on how to obtain permissions, please consult Rights and Permissions.

PROOFS

Authors are sent page proofs by email. To avoid delays in publication, proofs should be checked immediately and corrections, as well as answers to any queries, returned to the publishers as an annotated PDF within 2 working days. Further details are supplied with the

143 proof. It is the author’s responsibility to check proofs thoroughly. Excessive alterations in the proof stage may delay publication of the article to a subsequent issue. Authors who make extensive amendments to the text at the page-proof stage will be charged an additional fee.

OFFPRINTS

The journal will provide a URL to authors for free electronic access to the published version of the article. Offprints and reprints may be purchased in multiples of 50, either through the Author Services site or using this order form.

ADVANCE ACCESS

Advance Access allows for papers to be published online soon after they have been accepted for publication—reducing the time between submission and publication. Articles posted for Advance Access have been copyedited and typeset but have not yet paginated for inclusion in a specific issue of the journal. Appearance in Advance Access constitutes official publication, with full-text functionality, and the Advance Access version can be cited by a unique DOI (Digital Object Identifier). The final manuscript is then paginated into an issue, at which point it is removed from the Advance Access page. Both versions of the paper continue to be accessible and citable.

APÊNDICE

144

APÊNDICE A - ARTIGO A SER SUBMETIDO NA REVISTA MEDICAL MYCOLOGY

Virulence factors of Candida tropicalis isolated from the coastal environment of Northeast Brazil

Short Title: Virulence factors of Candida tropicalis isolated of Northeast Brazil Diana Luzia Zuza Alves1, Sayama Samara Toscano Queiroz de Medeiros1, Walicyranison Plinio Silva-Rocha1, Maria Christina Barbosa de Araújo2, Guilherme Maranhão Chaves1.

1 Natal city, Rio Grande do Norte state, Brazil; Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Rio Grande do Norte. 2 Natal city, Rio Grande do Norte state, Brazil; Department of Oceanography and Limnology, Federal University of Rio Grande do Norte.

* Author responsible for correspondence Name: Guilherme Maranhão Chaves Address: Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Laboratório de Micologia Médica e Molecular. Rua. Gal. Gustavo Cordeiro de Faria S/N. Petrópolis. Natal, RN – Brasil. CEP: 59012-570 Phone number: 00 55 (84) 3342-9801 Email address: [email protected] Keywords: Candida tropicalis, coastal environment, virulence factors.

ABSTRACT

Several studies have been conducted regarding the health risks associated with recreational use of beaches contaminated with domestic sewage. These wastes contain several microorganisms, including Candida tropicalis, an etiologic agent of both

145 superficial and systemic infections, and an indicator of fecal contamination of the environment. In this context, the objectives of this study were: (1) To confirm the identification of yeasts present in the sand of Ponta Negra Beach, Natal city, Rio Grande do Norte State, Brazil; (2) To evaluate the major virulence factors of C. tropicalis, namely: ability to adhere to human buccal epithelial cells (HBEC), morphogenesis on solid medium, biofilm formation, proteinase secretion, hemolytic activity and halotolerance. Sixty two environmental strains of C. tropicalis were analyzed, which showed widely varying results for the various virulence factors evaluated. In general, isolates showed adhesiveness to HBEC higher than the reference strain C. tropicalis ATCC 13803, besides being highly biofilm producer. Regarding morphogenesis, most isolates showed wrinkled phenotype on Spider agar (34 isolates; 54. 8%). With regard to enzymatic activity, most of the isolates produced more proteinase than the reference strain C. tropicalis ATCC 13803. In addition, 35 isolates (56.4%) showed high hemolytic activity (index of hemolysis > 0.55). Finally, 85.4% of the strains were resistant to 15% sodium chloride, which corroborates to the high survival rate of C. tropicalis in marine environment. Our results demonstrate that C. tropicalis isolates derived from a sandy beach in Northeastern Brazil are able to fully express virulence attributes and show high capacity for persistence in the coastal environment. This pathogenic potential highlights health risk for the population who are exposed during tourism practices.

Key Words: Candida tropicalis, coastal environment, virulence factors.

INTRODUCTION

The quality of water and sand recreational beaches are directly linked to the conditions of sanitation, while water resources are frequent targets of clandestine sewers1. Therefore, the pollution of beaches is a condition caused by poor sanitation, where untreated sewage systems are dumped into the sea, also contaminating the sand, due to the ebb and flow of tides. This fact constitutes an important risk for the health of those who attend these environments. In tropical regions, the climatic conditions of heat and high humidity, together with the contact with sand, animals and poor hygiene, is closely related to the increased demand for outpatient dermatology in recent years 2.

146

The microbiological quality of the beaches has long been evaluated only by fecal coliform bacteria found in seawater, disregarding to some extent the impact that the fungi present in the sand of that environment have on public health 3.The most important species of yeasts of medical interest, in addition to Candida albicans are Candida tropicalis, the Candida parapsilosis species complex, Candida glabrata, Candida krusei, Candida guilliermondii, and Candida lusitaniae. C. tropicalis is a commensal yeast of the gastrointestinal tract of birds such as seagulls and terns, as well as fishes 4. C. tropicalis has also been isolated from polluted wastewater 5, sandy beaches 6 and coastal waters of Miami 7. In addition, this yeast belongs to the normal human microbiota, and has been isolated from superficial and systemic infections 8-10. C. tropicalis is the second most pathogenic Candida species 11. Adhesion to host cells is considered the first step necessary for the establishment of infection, being mediated by proteins and polysaccharides found on the cell wall of different Candida strains of each species 12. According to the most recent data found in the literature, C. albicans is the most highly adherent species, followed by C. tropicalis, which has been described as more adherent to epithelial cells than other Non-Candida albicans Candida (NCAC) species 13-15. Subsequently to fungal attachment, the morphological transition from bud to hyphal cells is an important virulence attribute of many pathogenic fungi, including the genus Candida, being one of the most important mechanisms found in the pathogenesis of candidiasis 16. Studies concerning morphogenesis are already well established for C. albicans, where environmental signals, transcription regulators and target genes associated with filamentation have been described 17, 18. Nevertheless, there are considerably few studies investigating morphogenesis in NCAC species. While some of them can produce pseudohyphae, only C. albicans, C. dubliniensis and C. tropicalis are able to produce true hyphae 12. Biofilms are a complex structure where microorganisms adhere to biotic or abiotic solid surfaces and secrete a dense extracellular polymeric substance, leading to survival to phagocytic attack of white blood cells and resistance to antifungal drugs 19- 21. Studies performed by several authors have reported an increased biofilm production in clinical isolates of C. tropicalis22. The secretion of hydrolytic enzymes is another important virulence factor of Candida spp. These enzymes are able to destroy, change or damage the integrity of host cell membranes, leading to dysfunction or receptors damage 23. The secreted aspartic

147 proteinases (Saps) are a group of isoenzymes encoded by the SAP gene family, having been extensively investigated in C. albicans and associated with the hydrolysis of various proteins such as collagen, laminin and keratin 24. A previous study suggested the existence of a family of SAPT genes in the genome of C. tropicalis 11, which led to the cloning of four genes of this family (SAPT 1-4). However, only an enzyme called Sapt1p was purified from culture supernatants and biochemically characterized 11. Hemolytic activity significantly contributes for the pathogenesis of disseminated candidiasis, especially for facilitating the penetration of hyphae 25,26, because hemolytic factors secreted by the fungus result in the release of hemoglobin from the erythrocytes of the host for later use by the microorganism as a source of iron 27-28. Luo et al. (2001) were the first to evaluate hemolytic activity in NCAC species, including C. tropicalis 29. The hemolytic factor of C. tropicalis consists of a mannoprotein that is released into the supernatant culture 29, 30. C. tropicalis is also able to grow above 10-15% sodium chloride, which explains the reason why this species is often isolated from saline environments 31. Halotolerance allows the prolonged survival of C. tropicalis in the maritime ecosystem, and may be an important source of contamination of the population who attend beaches. Despite the large number of studies carried out in different parts of the world with regard to microbiological aspects of coastal environments and the growing interest of the society toward environmental issues, there are no currently studies investigating the ability to express different virulence factors in vitro by environmental strains of C. tropicalis, an important human pathogen well known to survive in hyper osmotic environments. Therefore, the present study aimed to characterize isolates of C. tropicalis obtained from the sand of Ponta Negra Beach, Natal, Rio Grande do Norte state, Brazil, regarding to: adhesion to human buccal epithelial cells, proteinase activity, biofilm formation, production of hemolysins and hypha formation. In addition, we also investigated the susceptibility of these isolates to high salt concentrations.

MATERIALS AND METHODS

Strain and culture conditions We evaluated a total of 62 C. tropicalis isolates obtained from the sand of Ponta Negra beach, Rio Grande do Norte state, Brazil, belonging to the culture collection of

148 the Medical and Molecular Mycology Laboratory, Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio Grande do Norte. Two references strains, C. albicans ATCC 90028 and C. tropicalis ATCC 13803 were used as control organisms. Of note, strain collections were conducted in different periods: two in the summer (March, 2012 and 2013) and one in the winter season (July, 2012), at six different points of Ponta Negra beach, namely: point 1 (5°53’2.10”W 35°9’54.05”S), point 2 (5°53’00,1”W 35°10’06,8”S), point 3 (5°52’35,0”W 35°10’08,7”S), point 4 (5°52’35,0”W 35°10’30,9”S), point 5 (5°52’27.91”W 35°10’34.57”S) and point 6 (5°52’19.77”W 35°10’38.43”S). The isolates were stored at -80 °C under YPD liquid medium (dextrose 20 g/L, peptone 20 g/L, yeast extract 10 g/L) added 20% glycerol. The strains were thawed on ice and 100mL of each strain were added to 5 ml of YPD liquid medium (and incubated in a shaker (Tecnal, TE-420, São Paulo, Brazil), at 35°C for 48 h for the reactivation and verification of viability. Subsequently, 100µL of cell suspensions was inoculated on the surface of Sabouraud Dextrose Agar (SDA; Oxoid, UK) added 300µg/mL of chloramphenicol (Park–Davis), using a Drigalsky loop. The plates were incubated at 37°C for 48 h. Yeast colonies were plated on CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology, Paris, France) to check for purity and screening for different color colonies. Species identification was based on the characteristics of the cells observed microscopically after cultivation on corn meal agar added Tween 80, as well as classical methodology Yarrow (1998)32 and ID32C System (bioMerieux Marcy l’Etoile, France), whenever it was necessary.

Inoculum standardization for Candida tropicalis virulence factors evaluated “in vitro”

For all the virulence factors evaluated in vitro, the samples were initially grown in NGY medium (Difco Neopeptone 1g/L, Dextrose 4 g/L; Difco yeast extract 1g/L). C. tropicalis cells were incubated for 18-24h in a rotatory shaker (Tecnal, TE-420, São Paulo, Brazil) at 30°C, 200 rpm. This culture medium produces an inoculums size of about 2 x 108 cells/mL, measured at a wavelength of 600 nm (Biochrom Libra S32)33. Subsequently, C. tropicalis cells were diluted to obtain the specific inoculum needed for each attribute of virulence evaluated in vitro.

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Candida tropicalis adherence to human buccal epithelial cells (HBEC)

Candida cells were grown overnight to the stationary phase in NGY liquid medium at 37°C and were mixed with HBEC from healthy volunteers at a ratio of 10 yeast cells per HBEC. The mixtures were incubated at 37°C for 45 min with shaking. Subsequently, cells were formalin-fixed, vortexed and transferred to a microscope slide. The number of Candida cells adhering to 150 HBEC was determined with the operator blinded to the nature of the material on the slide 34. Tests were done in triplicate.

Candida tropicalis biofilm formation

Biofilms were performed according to Jin et al. (2003) 35. At first, 100µL aliquots of a standardized cell suspension (107cells/mL) were transferred to flat bottom 96-well microtiter plates and incubated for 1.5 h at 37°C in a shaker at 75 rpm. As controls, eight wells of each microtiter plate were handled in an identical fashion, except that no Candida suspensions were added. Following the adhesion phase, the cell suspensions were aspirated and each well was washed twice with 150 µL of PBS to remove loosely adherent cells. A total of 100µL of YNB medium (“Yeast Nitrogen Base”, DifcoTM) with 50mM of glucose (D-glucose monohidratada P.A., Cinética) was added to each of the washed wells and incubated at 37°C in a shaker at 75 rpm. Biofilms were allowed to develop for 66h, and then the yeasts were quantified by the crystal violet assay. Briefly, the biofilm-coated wells of microtiter plates were washed twice with 150µL of PBS and then air dried for 45 min. Subsequently, each of the washed wells was stained with 110µL of 0.4 % aqueous crystal violet solution for 45 min. Afterwards, each well was washed four times with 350µL of sterile distilled water and immediately destained with 200 µL of 95 % ethanol. After 45 min of destaining, 100µL of destaining solution was transferred to a new well and the amount of the crystal violet stain in the destaining solution was measured with a microtiter plate reader (SpectraMAX 340 Tunable Microplate Reader; Molecular Devices Ltda.) at 570 nm. The absorbance values for the controls were subtracted from the values for the test wells to minimize background interference. Interpretation of biofilm production was according to the criteria described by Stepanovic et al. (2000)36. Based on these criteria,

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ODc (optical density cut-off value) is defined as: average OD of negative control + 3 × SD (standard deviation) of negative control, and the biofilms producers are categorized as: no biofilm producer ≤ ODc, low biofilm producer ODc< ~ ≤ 2 × ODc, moderate biofilm producer ODc< ~ ≤ 4 × ODc and strong biofilm producer > 4 × ODc. While “~ “stands for average of sample ODs.

Morphogenesis of Candida tropicalis on solid media

For the induction of hypha formation on solid media, the cells were grown in NGY broth, centrifuged and washed three times in distilled water. From the cells suspensions, 5 µL was spotted on the surface of Spider medium (Nutrient agar 10g, 37 Mannitol 10g, KH2PO4 2g, agar 14.5g, Distilled water 1000mL-Liu et al. 1994) . The plates were incubated at 30°C for seven days for subsequent observation of macromorphological aspects of the colonies. The assay was performed in triplicate.

Candida tropicalis proteinase production

Proteinase activity was determined by a method modified from MacDonald and Odds (1980) 38. Fifty-microliter samples from NGY cultures (1 g/L Neopeptone, 4 g/L glucose and 1 g/L yeast extract) were grown in 5 mL Yeast Carbon Base (Difco) added bovine serum albumin (BSA), rotated in a gyratory shaking at 200 rpm at 30°C for 72 h. Proteolytic activity was determined by measuring the increase in trichloroacetic acid soluble products absorbing at 280 nm in triplicate after 1-h incubation of the culture supernatant with BSA substrate at 37°C. Specific activity was expressed as OD 280/OD600nm of the culture. The assay was performed in triplicate.

Candida tropicalis hemolysin production

In order to evaluate hemolysin production, we followed the methodology proposed by Luo et al. (2001) 29 with some adaptations. C. tropicalis cells were initially cultured on SDA at 35 ° C for 18 hours. Strains were grown overnight in NGY broth. Ten microliters of cell cultures was seeded in triplicate on the surface of SDA added 7% fresh sheep blood (Ebe-Farma) added 3% glucose, contained in Petri dishes of 155 mm diameter. The plates were incubated for 48 h at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2.

151

After incubation period, the presence of a clear halo around the inoculum indicated positive hemolysis. The diameter of colonies and zones of hemolysis were measured in order to obtain the hemolysis index for each strain, which allowed classification of isolates in highly producers, moderate producers and low producers, according to Linhares et al. (2007) 39. As a positive control we used a beta hemolytic strain of Streptococcus pyogenes (Group A). The reference strain Candida parapsilosis ATCC 22019 was used as a negative control 29.

Sensitivity of Candida tropicalis to osmotic stress in sodium chloride

The method of Chaves and Silva (2012)40 was used with some modifications to determine the sensitivity of C. albicans to NaCl. Ten microliters volumes of NGY- grown yeasts were transferred to 100 µL of Sabouraud Dextrose broth, with addition of NaCl (0.03-30%) in 96-wells microtiter plates (TPP, 92096), incubated at 35°C for 48 h. Growth determination was visually observed with turbidity within each well.

Statistical analysis

Data were analyzed using the statistical software ‘‘Graph Pad, Prism’’ version 6.0 and “Stata” version 11.0. Results were presented as mean + standard deviation, and differences were analyzed by the One-sample T test. For all the analyses, P was considered a default value of 0.05 and the confidence interval of 95 %.

RESULTS

Microbiological profiling

We randomly selected 62 strains of Candida tropicalis, in a manner that half of the strains were collected in the first period of the study, while the others were collected in the second period of the study (2012 and 2013, respectively). Of note, all the strains showed pure cultures, had blue color on CHROMagar Candida. They also presented blastochonidia, pseudo-hyphae and true hyphae on Cornmeal added tween 80 agar

152 slides microcultures and a pattern of auxanogram and zymogram compatible with C. tropicalis.

Adherence of Candida tropicalis to human buccal epithelial cells (HBEC)

The ability of isolates of C. tropicalis to adhere to HBEC was determined by the number of blastoconidia of each strain adhered to 150 HBEC observed with optical microscopy. All the strains were able to adhere to HBEC. However, the isolates showed variable expression of this specific virulence factor in vitro (Table 1). The numbers ranged from 107.7 + 5.9 (strain LMMM707) to 194.3 + 5.5 adhered cells/ 150 HBEC (strains LMMM 672 and LMMM 688). All the strains tested showed higher adherence ability to HBEC than the control strain of C. tropicalis ATCC 13803 (96 + 10.0 adhered cells /150 HBEC).This difference was considered statistically significant (Table 2). Nevertheless, a comparison of the average values for adhesion assays of all the strains (147 + 6.7 adhered cells/ 150 HBEC), revealed that they were statistically less adherent than the control strain of C. albicans ATCC 90028 (192.7 + 3.1 adhered cells/ 150 HBEC; Table 2).

Evaluation of biofilm formation in Candida tropicalis

Biofilm formation was induced in microtiter plates and quantified by spectrophotometry at 570 nm, after crystal violet staining. All the strains were able to form biofilm on polystyrene plates. Of note, a remarkable variation was observed, with the values ranging from 0.24 + 0.007 (strain LMMM 658) to 3.57 + 0.003 (strain LMMM 711). Forty-two strains (67.7%) showed high values of biofilm formation (˃ 0.85), and four strains showed values of biofilm formation ˃ 3.0.Only three strains showed low production of biofilm (0.21 to 0.42 of absorbance), which were LMMM 658, LMMM 704 and LMMM 708. However the value of OD readings presented by C. tropicalis ATCC 13803 (0.21 + 0.006) is still inferior to the lower producing isolates of our study. Statistically significant difference was observed for the average production of biofilm of all the isolates (1.45 + 0.023) and both reference strains used in this study, as shown in Tables 1 and 3.

153

Evaluation of Candida tropicalis morphogenesis on solid medium

In order to induce filamentation of C. tropicalis strains on solid medium, all the isolates were grown on the surface of plates containing Spider medium, incubated at 30°C. Macromorphological aspects of the colonies were observed after seven days of incubation and classified in different phenotypes (Fig.1) As shown in Table 1, the majority of the isolates were classified as wrinkled (34 isolates, 54. 8%). Among the others, 19 (30.6%) samples were considered of fluffy phenotype and 9 samples (14.6%) presented smooth phenotype, that is, they did not present filamentation (Fig. 1).

Determination of proteinase production in Candida tropicalis

Proteolytic activity was determined by the increase in trichloroacetic acid (TCA) soluble products absorbing at 280 nm in triplicate, after 1 h incubation of culture supernatant with BSA substrate at 37 °C. Specific activity was expressed as

OD280nm/OD600nm of the culture. Isolates tested showed widely varying results, with LMMM 684 and LMMM 687 as lower producers (0.02) while 22 isolates (35.5%) showed proteinase maximum production (0.09). The lower proteinase producing strains were LMMM 684, LMMM 685, LMMM 686 and LMMM 687, but they still had higher proteinase activity than C. tropicalis ATCC 13803 (0.06 of proteinase activity; Table 1). The average value of proteinase production of the isolates (0.08) was considered statistically significant higher than the control strains of both C. albicans and C. tropicalis, (Table 4).

Determination of production of hemolysins in Candida tropicalis

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In order to assess e hemolytic ability, the standardized inoculum was seeded on the surface of ASD supplemented with 7% sheep blood added 3% glucose (Fig. 2). All the strains analyzed promoted beta hemolysis, wherein hemolytic index varied from 0.33 + 0.02 (LMMM 653) to 0.70 + 0.0 (LMMM 661). Thirty five isolates (56.4%) presented strong production of hemolysins (HI ≤0.55), while 27 (43.6%) presented moderate production (0.56 ≤ HI ≤ 0.85). The average value for hemolysin production (0.54 + 0.01) was statistically higher than the HI presented by Candida albicans ATCC 90028, but was considered lower producer than Candida tropicalis ATCC 13803 (Table 5).

Evaluation of resistance to osmotic stress (halotolerance) in Candida tropicalis

To evaluate resistance to osmotic stress C. tropicalis cells were plated on Sabouraud dextrose broth with increasing concentrations of NaCl. Of note, 53 samples (85.4) resisted to 15% NaCl of concentration, including the reference strain C. tropicalis ATCC13803. The other nine samples resisted 7. 5% NaCl. All the strains were more resistant to osmotic than C. albicans ATCC9028, which was still able to grow only in 3.75% of NaCl concentration (Table 1).

DISCUSSION

Several studies have been performed regarding health risks associated with recreational use of beaches 41-45. Users of these environments maintain close contact with water and sand, which, once polluted, may cause various health problems, previously described by other authors, such as gastrointestinal disorders, respiratory infirmities and skin diseases, especially fungal infections. Therefore, the detection of pathogenic microorganisms in this specific environment is of great value for scientific knowledge and public health45.

The present work investigated the pathogenic potential of isolates of C. tropicalis obtained from the Ponta Negra beach, Natal city, Rio Grande do Norte State of Brazil. Adhesion to the host cells is considered the first step necessary for the

155 establishment of infection, being mediated by proteins and polysaccharides found on the cell wall and may be variable among Candida strains of the same species 12. All the isolates tested were more adherent than C. tropicalis ATCC13803. Nevertheless, the average number of C. tropicalis cells adherent to 150 HBECs was significantly lower than the results found for C. albicans ATCC90028. These results corroborate with the most current data found in the literature, where C. albicans is cited as the most adherent species, followed by C. tropicalis 46, 13-15. High adhesion properties found in the environmental isolates of the present study is consistent with data found for isolates of C. tropicalis in the study performed in Rio Grande do Norte by Chaves et al. (2013) 13. Of note, the strains were isolated from the oral cavity of kidney transplant recipients, reinforcing the idea that environmental isolates may express the ability to adhere to HBEC in vitro as much as clinical isolates of the same species. The results of the present study were considerably variable between the isolates. This variability may reflect a process of adaptation of each particular strain to the coastal environmental conditions (temperature, salinity, humidity and UV incidence rates,). Genotypic techniques employment is mandatory to search for “substrains” of C. tropicalis better adapted either to the sand environment or to colonize and infect the human host who attend the beaches. However, the mechanisms of the harms suffered by C. tropicalis cells in its specific scenario are not completely understood 47-48.

Biofilm formation is part of the ecological cycle of various microorganisms in the environment and during the infectious processes, including yeasts belonging to the genus Candida 49. In contrast to the extensive literature found investigating C. albicans biofilms50-52 less attention has been given to C. tropicalis regarding the expression of this specific virulence factor. Some studies have reported the ability of this species to form complexes biofilms in vitro, on PVC, polystyrene and other plastic materials 21, 53- 54. Nevertheless, there is a relative paucity of data on environmental isolates. Most of the isolates of the present study were considered strong biofilm producers. The same trend for high biofilm production in C. tropicalis was already reported by Tumbarello et al. (2007)55 in a study performed with clinical isolates obtained from hematogenic infections. Some studies state that different strains of same Candida species may have different capacity levels of biofilm formation, suggesting the existence of isolates with "strong" or "weak" production, within same species35, 56. In addition, Bizerra et al. (2008) 57 described mature C. tropicalis biofilms as a dense network of yeast cells and

156 filamentous forms highly resistant to fluconazole and amphotericin B 11. All the strains showed higher biofilm production than both reference strains of C. albicans and C. tropicalis used, corroborating with the study of Jin et al. (2003)35 that found that recently isolated strains of Candida species showed higher production of biofilm than some reference laboratory strains. Several studies have reported that NCAC species are able to produce more biofilm than C. albicans 58, 59, which is consistent with our results.

Morphological transition has great relevance in the virulence of many pathogenic fungi, including the Candida genus, being one of the most important mechanisms found in the pathogenesis of candidiasis. The studies concerning morphogenesis are already well established for C. albicans. However, there are considerably few studies investigating morphogenesis in NCAC species, because they usually do not produce well developed true hyphae as C. albicans, but are still responsive to a wide variety of environmental stimuli 60. Several Candida species may produce pseudohyphae, but only a few species may form true hyphae, such as C. albicans, C. dubliniensis and C. tropicalis. Therefore, literature upon filamentation in C. tropicalis is scarce, specifically regarding to environmental strains. Among the isolates included in the present study, only 14.6% did not present filamentation, forming smooth colonies. The production of mycelial structures facilitates tissue invasion, since it increases yeast adhesion to host tissues, providing greater surface of contact with them 61, 62. Therefore, the significant percentage of filamentous and wrinkled colonies of C. tropicalis tested reinforces the pathogenicity of the environmental isolates that may have been possibly influenced by environmental stresses to adapt and survive on the beach sand.

Other mechanism required for the invasion of host tissues is the secretion of hydrolytic enzymes. Pathogenic species of the genus Candida produce a wide variety of secreted hydrolases and among the several virulence factors studied, Saps has been intensely investigated 63. Until the present moment, there were no reports about proteinase secretion by C. tropicalis isolated from coastal environments. Studies report that C. albicans produces high levels of proteinases in vitro, while NCAC species show low production of these enzymes 64. This is contradictory to the results found in the present study, where the strains tested showed higher proteinase activity than C. albicans ATCC 90028. The presence of Saps in C. tropicalis has also been demonstrated by direct immunofluorescence on the surface of the fungal elements that

157 penetrate tissues during disseminated infection and escaping of macrophages after phagocytosis of blastochonidia 26. Therefore, the high proteinase activity of the isolates of C. tropicalis from the beach sand is again an important data for assessment of the expression of virulence factors in vitro by these strains.

Hemolysins are another group of lytic enzymes whose production was evaluated. Erythrocytes are degraded by hemolysins produced by yeasts as part of the process of obtaining iron for the establishment of the infectious process. Thus, the hemolytic activity expressed by yeasts is linked to the ability to degrade red blood cells to obtain iron 65. The majority of the isolates analyzed in this study presented strong hemolytic activity, similar to the results obtained by Luo et al. (2001) 29 and Favero et al. (2014) 30 analyzing clinical isolates of C. tropicalis. All environmental isolates of C. tropicalis showed total hemolysis, corroborating with the results reported everywhere 29-30.

The current literature also describes that C. tropicalis is able to grow in culture media with a concentration above 10-15% NaCl. The majority of the strains tested were resistant to a concentration up to 15% NaCl. The ability to resist to conditions of high salinity is called halotolerance; this ability allows the prolonged survival of C. tropicalis in the maritime ecosystem, and may provide greater possibility of contamination and further colonization of the users of these environments. In addition, halotolerance is an important characteristic of bio sorbent microorganisms, fundamental to combat pollution processes, since hypersaline waste is generated by various industrial activities 66. These residues, commonly designated as production wastes, are made up of high concentrations of salts, oils, organic acids, heavy metals and radionuclides 66-68. Additionally, fungi are less sensitive to variations in nutrients, aeration, pH and temperature, offering easy mycelia biomass separation by filtration 68. Thus, our data suggest the possibility of using C. tropicalis as a halotolerant microorganism, for the biological treatment of pollutants, which may be a beneficial alternative to minimize the losses of industrial practices in the environment.

CONCLUSION

158

This study contributed to extend the knowledge about the virulence of C. tropicalis, a yeast of great prevalence in the coastal environment of a major tourist town in northeastern Brazil. To the best of our knowledge, this was the first essay to investigate the virulence of strains of C. tropicalis obtained from beach sands, where there is still little information in this regard. The significant expression of virulence attributes analyzed indicates the potential of pathogenicity of great health risk which beach users are exposed during fishing and tourist practices. In addition, environmental strains of sand from the beach present potential use in bioremediation, being a less harmful alternative for the decontamination of polluted environments.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Brazilian Ministry of Education, on behalf of CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) and the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). This work was also supported by the Postgraduate Program of Pharmaceutical Sciences, from the Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil. We are very grateful to Professor Arnaldo Colombo for the donation of Candida spp. reference strains and to Professor Antonio Manuel Gouveia de Oliveira for the help with statistical analysis.

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Table 1: Virulence factors of Candida tropicalis isolates obtained from Ponta Negra beach sand, Natal city, Rio Grande do Norte State, Northeast Brazil

Strain Nº of Candida Spider medium Biofilm Proteinase Hemolysis Resistence to number cells adhered colony formation activity Index (HI) osmotic to 150HBEC phenotype (OD280nm/OD stress 600nm) OD 570 nm Candida albicans 192.7 + 3.1 Fluffy 0.13 + 0.006 0.03 + 0.002 0.65 + 0.06 3.75% ATCC 90028 Candida tropicalis 96.0 + 10.0 Fluffy 0.21 + 0.006 0.06 + 0.005 0.45 + 0.05 15% ATCC 90028 LMMM 652 120 + 5.6 Wrinkled 0.66 + 0.012 0.08 + 0.003 0.66 + 0.04 15%

LMMM 653 148.3 + 5.7 Wrinkled 0.55 + 0.043 0.08 + 0.005 0.33 + 0.02 15% LMMM 654 153.7 + 14.7 Wrinkled 2.41 + 0.082 0.09 + 0.003 0.38 + 0.02 15%

LMMM 655 146 + 6.6 Wrinkled 1.15 + 0.049 0.09 + 0.004 0.54 + 0.03 7.5% LMMM 656 122 + 12.6 Fluffy 1.61 + 0.167 0.08 + 0.002 0.51 + 0.04 15% LMMM 657 137 + 12.8 Fluffy 0.61 + 0.081 0.07 + 0.002 0.61 + 0.02 15% LMMM 658 140.7 + 7.0 Fluffy 0.24 + 0.022 0.07 + 0.004 0.51 + 0.01 15% LMMM 659 155.3 + 3.2 Wrinkled 1.68 + 0.107 0.09 + 0.002 0.57 + 0.04 15% LMMM 660 128 + 9.2 Wrinkled 0.55 + 0.007 0.08 + 0.004 0.63 + 0.03 15% LMMM 661 151.7 + 6.4 Smooth 0.68 + 0.031 0.08 + 0.001 0.70 + 0.00 15% LMMM 662 141.3 + 12.5 Smooth 1.15 + 0.006 0.08 + 0.003 0.62 + 0.00 15% LMMM 663 143 + 15.6 Wrinkled 1.66 + 0.205 0.08 + 0.002 0.40 + 0.00 15% LMMM 664 165 + 5.6 Fluffy 1.39 + 0.036 0.08 + 0.002 0.41 + 0.00 15% LMMM 665 154.3 + 3.2 Fluffy 2.25 + 0.074 0.08 + 0.003 0.41 + 0.03 15% LMMM 666 154.7 + 5.7 Wrinkled 1.62 + 0.041 0.08 + 0.001 0.52 + 0.02 15% LMMM 667 144.3 + 13.2 Wrinkled 2.10 + 0.012 0.08 + 0.001 0.53 + 0.01 15% LMMM 668 129 + 6.0 Wrinkled 1.69 + 0.018 0.09 + 0.003 0.50 + 0.00 15% LMMM 669 130.7 + 14.2 Wrinkled 1.24 + 0.020 0.09 + 0.001 0.51 + 0.01 15% LMMM 670 159.7 + 5.5 Smooth 1.55 + 0.020 0.09 + 0.002 0.60 + 0.00 7.5% LMMM 671 141 + 7.5 Wrinkled 1.14 + 0.050 0.09 + 0.001 0.65 + 0.00 7.5% LMMM 672 194.3 + 5.5 Wrinkled 1.98 + 0.022 0.09 + 0.002 0.58 + 0.01 15% LMMM 673 155.3 + 13.2 Fluffy 2.67 + 0.003 0.08 + 0.002 0.44 + 0.01 7.5% LMMM 674 132.3 + 9.0 Wrinkled 2.15 + 0.015 0.09 + 0.01 0.55 + 0.00 15% LMMM 675 122 + 12.6 Smooth 2.02 + 0.005 0.07 + 0.001 0.43 + 0.01 15% LMMM 676 124.7 + 15.1 Smooth 0.64 + 0.018 0.09 + 0.003 0.52 + 0.03 7.5% LMMM 677 125.3 + 17.4 Wrinkled 1.64 + 0.010 0.09 + 0.002 0.46 + 0.01 15% LMMM 678 155.7 + 4.7 Wrinkled 2.26 + 0.065 0.08 + 0.002 0.56 + 0.00 15% LMMM 679 141.7 + 6.0 Wrinkled 3.07 + 0.007 0.08 + 0.004 0.54 + 0.01 15% LMMM 680 187.3 + 12.1 Wrinkled 1.71 + 0.007 0.07 + 0.001 0.61 + 0.01 15% LMMM 681 116 + 6.0 Fluffy 0.83 + 0.002 0.08 + 0.003 0.49 + 0.01 15% LMMM 682 133.3 + 10.0 Fluffy 0.54 + 0.004 0.09 + 0.003 0.46 + 0.03 15% LMMM 683 149.7 + 9.7 Wrinkled 1.29 +0.004 0.09 + 0.04 0.61 + 0.01 7.5% LMMM 684 152.7 + 11.7 Wrinkled 3.25 + 0.171 0.02 + 0.001 0.52 + 0.02 15% LMMM 685 116 + 6.0 Wrinkled 2.39 + 0.050 0.03 + 0.002 0.47 + 0.02 15% LMMM 686 124.7 + 5.5 Wrinkled 0.70 + 0.055 0.05 + 0.004 0.52 + 0.00 15% LMMM 687 176 + 4.6 Wrinkled 0.61 + 0.006 0.02 + 0.002 0.55 + 0.00 15% LMMM 688 194.3 + 5.5 Wrinkled 0.87 + 0.093 0.06 + 0.004 0.55 + 0.00 15% LMMM 689 180.7 + 11.8 Smooth 1.72 + 0.006 0.06 + 0.002 0.55 + 0.00 15% LMMM 690 143.3 + 4.5 Wrinkled 1.19 + 0.003 0.07 + 0.001 0.52 + 0.03 15% LMMM 691 152.3 + 3.5 Wrinkled 2.59 + 0.007 0.06 + 0.001 0.66 + 0.00 15%

167

Continuation

LMMM 692 174.3 + 5.8 Fluffy 0.74 + 0.005 0.06 + 0.003 0.58 + 0.00 15% LMMM 693 146 + 13.7 Fluffy 0.68 + 0.005 0.09 + 0.004 0.65 + 0.00 15% LMMM 694 123.7 + 24.6 Fluffy 1.85 + 0.006 0.07 + 0.004 0.65 + 0.00 15% LMMM 695 161.3 + 8.0 Fluffy 0.89 + 0.004 0.08 + 0.006 0.55 + 0.01 7.5% LMMM 696 147.3 + 15.6 Smooth 1.60 + 0.090 0.08 + 0.003 0.52 + 0.00 15% LMMM 697 187.3 + 2.1 Smooth 1.59 + 0.128 0.09 + 0.002 0.65 + 0.00 15% LMMM 698 133.3 + 10.0 Wrinkled 0.69 + 0.009 0.09 + 0.001 0.69 + 0.02 15% LMMM 699 131.7 + 3.1 Wrinkled 1.96 + 0.005 0.09 + 0.002 0.49 + 0.01 15% LMMM 700 185 + 3.6 Wrinkled 2.79 + 0.008 0.09 + 0.002 0.60 + 0.01 15% LMMM 701 153 + 8.5 Wrinkled 3.01 + 0.002 0.08 + 0.004 0.63 + 0.03 15% LMMM 702 164 + 13.7 Fluffy 0.65 + 0.010 0.08 + 0.004 0.62 + 0.01 15% LMMM 703 150 + 7.2 Fluffy 0.73 + 0.008 0.08 + 0.003 0.66 + 0.00 15% LMMM 704 179 + 10.8 Wrinkled 0.37 + 0.007 0.09 + 0.002 0.66 + 0.03 15% LMMM 705 130.7 + 14.2 Wrinkled 1.51 + 0.003 0.06 + 0.004 0.64 + 0.01 7.5% LMMM 706 135.7 + 15.9 Wrinkled 0.95 + 0.004 0.06 + 0.004 0.60 + 0.00 15% LMMM 707 107.7 + 5.9 Wrinkled 0.51 + 0.003 0.06 + 0.001 0.61 + 0.04 15% LMMM 708 154.7 + 5.7 Wrinkled 0.28 + 0.007 0.08 + 0.004 0.61 + 0.01 15% LMMM 709 115.3 + 5.5 Fluffy 0.87 + 0.004 0.09 + 0.002 0.41 + 0.03 7.5% LMMM 710 184.7 + 4.2 Fluffy 2.78 + 0.007 0.09 + 0.001 0.42 + 0.02 15% LMMM 711 122 + 2.6 Fluffy 3.57 + 0.003 0.06 + 0.003 0.39 + 0.00 15% LMMM 712 163.3 + 8.8 Fluffy 0.64 + 0.005 0.08 + 0.001 0.61 + 0.04 15% LMMM 713 155.3 + 3.2 Fluffy 1.45 + 0.004 0.09 + 0.001 0.44 + 0.00 15% Book of record of the Medical Mycology and Molecular laboratory, UFRN

Table 2: Comparison of adhesion to the HBEC of isolates of Candida tropicalis in relation to the reference strains.

Group N° of cells of Candida adhered to 150 P-Value HBEC

Average of the strains of Candida tropicalis 147,5 + 8,7 versus 192,7 + 3,1 ˂0,0001* versus Candida albicans ATCC 90028

Average of strains of Candida tropicalis 147,5 + 8.7 versus 96,0 + 10,0 ˂0,0001* versus Candida tropicalis ATCC 13803

* P ˂ 0, 05 through the One-sample T-test

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Table 3: Comparison of biofilm production of isolates of Candida tropicalis in relation to the reference strains.

Group Biofilm formation P-Value (Absorbance at 570 nm)

Average of the strains of Candida tropicalis versus ˂ 0.0001* 1,45 + 0,023 versus 0,13 + Candida albicans ATCC 90028 0,006

Average of strains of Candida tropicalis versus 1,45 + 0,023 versus 0,21 + ˂ 0.0001* Candida tropicalis ATCC 13803 0,006

* P ˂ 0, 05 through the One-sample T-test

Table 4: Comparison of proteinase activity of isolates of Candida tropicalis in relation to the reference strains.

Group D.O 280 nm/ D.O600nm P-Value

Average of the strains of Candida tropicalis versus 0,077 + 0,003 versus 0,032 + ˂0,0001* Candida albicans ATCC 90028 0,002

Average of strains of Candida tropicalis versus 0,077 + 0,003 versus 0,057 + ˂0,0001* Candida tropicalis ATCC 13803 0.005

* P ˂ 0, 05 through the One-sample T-test

Table 5: Comparison of hemolysis index of isolates of Candida tropicalis in relation to the reference strains.

Group Hemolysis index P-Value

Average of the strains of Candida tropicalis versus 0,54 + 0,02 versus 0,65 + 0,06 ˂0,0001* Candida albicans ATCC 90028

Average of strains of Candida tropicalis versus 0,54 + 0,02 versus 0,45 + 0,06 ˂0,0001* Candida tropicalis ATCC 13803

* P ˂ 0,05 through the One-sample T-test

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Figure 1: Macromorphological aspects of colonies grown on Spider medium agar, after seven days of incubation at 30ºC. A) Candida tropicalis ATCC 13803 (fluffy phenotype); B) Candida albicans ATCC 90028 (fluffy phenotype); C) Candida tropicalis LMMM 655 (wrinkled phenotype); D) Candida parapsilosis ATCC22019 (smooth phenotype).

A B C

Figure 2: Photographs depicting the hemolysis on SDA added sheep blood (supplemented with 3% glucose) induced by Candida species after 48h of incubation at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2 °C. A) Candida parapsilosis ATCC 22019 (negative control); B) Candida tropicalis ATCC 13803; C) Candida tropicalis LMMM7010.