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Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De Ciências Da Saúde

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Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De Ciências Da Saúde UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DIANA LUZIA ZUZA ALVES FATORES DE VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA AO ESTRESSE OSMÓTICO E SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE ISOLADOS DE Candida tropicalis ORIUNDOS DE AMBIENTE COSTEIRO DO NORDESTE BRASILEIRO NATAL 2015 DIANA LUZIA ZUZA ALVES FATORES DE VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA AO ESTRESSE OSMÓTICO E SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE ISOLADOS DE Candida tropicalis ORIUNDOS DE AMBIENTE COSTEIRO DO NORDESTE BRASILEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Bioanálises e Medicamentos. Orientador: Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves NATAL 2015 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Diretor do Centro de Ciências da Saúde: Prof. Hênio Ferreira de Miranda Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde: Prof. Antonio de Lisboa Lopes Costa Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Prof. Arnóbio Antônio da Silva Júnior Vice-coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Profa. Janaina Cristiana Oliveira Crispim Freitas Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia Médica e Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – Centro de Ciências da Saúde, contando com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Dedico este trabalho à minha mãe Maria Eliene Zuza Alves, primeira e eterna professora, por ser meu maior exemplo de superação e pelos seus 25 anos de excelente contribuição à educação de nosso país. “Feliz o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento; porque melhor é o lucro que ela dá do que o da prata, e melhor a sua renda do que o ouro mais fino. Mais preciosa é do que pérolas, e tudo o que podes desejar não é comparável a ela. O alongar-se da vida está na sua mão direita, na sua esquerda, riquezas e honra. Os seus caminhos são caminhos deliciosos, e todas as suas veredas, paz. É árvore de vida para os que a alcançam, e felizes são todos os que a retêm”. Provérbios de Salomão 3:13-18 Agradecimentos A Deus, terno e fiel amigo que está sempre ao meu lado e guiou todos os meus passos conforme Sua vontade agradável e perfeita. A minha família, que me motiva e apoia todos os dias com amor incondicional. Ao meu esposo Marcos, companheiro de todas as horas, pelo seu carinho, paciência e excepcional compreensão. A minha família em Cristo, por todo suporte espiritual e encorajamento. Aos colegas do Laboratório de Micologia Médica e Molecular, pelo companheirismo diário, solicitude e bom humor, tornando esse trabalho divertido e gratificante. Agradeço especialmente a Sayama Toscano e a Plínio Silva, pela contribuição significativa que me ofereceram de forma alegre, prestativa e responsável. A Profa. Christina Araújo, pela preciosa colaboração prestada na avaliação dos aspectos ambientais deste trabalho. Ao grupo do Laboratório de Imunodiagnóstico de Micoses (UFPE), em especial a Profa. Rejane Neves e ao Prof. Reginaldo Gonçalves Lima Neto, pela calorosa acolhida que me ofereceram por ocasião do treinamento nos testes de susceptibilidade a antifúngicos. Ao Prof. Antônio Oliveira, pelo auxílio com a análise estatística. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPgCF), pela oportunidade de realização desse trabalho à contento. Ao meu orientador, Prof. Guilherme Chaves, por me conceder a oportunidade de realizar o trabalho que gosto, sempre me acompanhando de perto em todas as etapas desse estudo e fazendo os ajustes necessários de maneira séria e gentil. Agradeço pela paciência, confiança e respeito com que me trata e por ser para mim um verdadeiro exemplo de pesquisador responsável e professor dedicado. “São muitas, SENHOR, Deus meu, as maravilhas que tens operado e também os teus desígnios para conosco; ninguém há que se possa igualar contigo. Eu quisera anunciá-los e deles falar, mas são mais do que se pode contar”. Salmos 40:5 SUMÁRIO DEDICATÓRIA...................................................................................................... 04 AGRADECIMENTOS........................................................................................... 05 LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ 09 LISTA DE TABELAS............................................................................................ 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS..................................................... 12 RESUMO................................................................................................................. 15 ABSTRACT............................................................................................................. 16 1.0 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 17 2.0 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................................... 21 2.1 Contaminação dos ambientes costeiros: impacto sobre a saúde pública.................. 22 2.2 Ocorrência de Candida tropicalis em solo de ambiente costeiro............................. 25 2.3 Candida tropicalis: patógeno emergente e resistente a fármacos antifúngicos........ 27 2.4 Perspectiva do agente patogênico: fatores de virulência de Candida tropicalis................................................................................................................... 36 2.4.1 Capacidade de aderência em Candida tropicalis..............................,.............. 36 2.4.2 Morfogênese em Candida tropicalis............................................................... 39 2.4.3 Formação de biofilme...................................................................................... 41 2.4.4 Enzimas líticas................................................................................................. 44 2.5 Resistência ao estresse osmótico em Candida tropicalis......................................... 48 3.0 OBJETIVOS............................................................................................................ 51 4.0 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 53 4.1 Parâmetros hidrológicos, pH, temperatura e salinidade da água e dados referentes ao solo da praia de Ponta Negra, Natal-RN.............................................................. 54 4.1.1 Altura das marés.............................................................................................. 54 4.1.2 Salinidade da água........................................................................................... 54 4.1.3 Temperatura do solo........................................................................................ 54 4.1.4 Pluviometria..................................................................................................... 54 4.2 Amostragem e coleta de areia................................................................................... 55 4.3 Processamento das amostras e isolamento primário das leveduras.......................... 56 4.4 Purificação das colônias............................................................................................ 56 4.5 Identificação das leveduras do solo.......................................................................... 57 4.5.1 Análise macroscópica das colônias.................................................................. 57 4.5.2 Análise micromorfológica de leveduras ......................................................... 57 4.5.3 Análise fisiológica e bioquímica...................................................................... 58 4.5.3.1 Testes de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (Auxanograma)............................................................................................. 58 4.5.3.2 Testes de fermentação de fontes de carbono (Zimograma).............. 59 4.5.4 Métodos comerciais semi-automatizados de identificação de leveduras................................................................................................................... 59 4.6 Manutenção das leveduras........................................................................................ 60 4.7 Seleção dos isolados................................................................................................. 60 4.8 Análise fenotípica dos fatores de virulência de Candida tropicalis......................... 60 4.8.1 Caldo NGY para padronização do inóculo...................................................... 61 4.8.2 Ensaio para determinação da capacidade de aderência de Candida tropicalis a células epiteliais bucais humanas (CEBH)............................................................ 61 4.8.3 Ensaio para avaliação da morfogênese de Candida tropicalis em meio sólido......................................................................................................................... 61 4.8.4 Ensaio de formação de biofilme em Candida tropicalis................................. 62 4.8.5 Coloração do biofilme de Candida tropicalis pelo cristal violeta................... 63 4.8.6 Ensaio para detecção de atividade de proteinase em Candida tropicalis..................................................................................................................
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