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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS II

Actividad antiplasmodial in vitro de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus

incarnatus y Clinanthus ruber

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

AUTORA:

HORNA PINEDO, Madeleine Vanessa

ASESORA:

Dra. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana

TRUJILLO – PERÚ

2020 Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

DEDICATORIA

A Dios por permitirme estar aquí, por la familia que me ha dado y por ser mi guía en el sendero de la vida. A mis padres

A la unión cuyas enseñanzas han sido lumbre en el camino de mi formación. A mi madre, Aurora P. V, porque al igual que su nombre, al llegar cada día la encuentro presente para brindarme su apoyo y consejos, haciendo de mí una persona con valores y principios que orientan mi accionar; a ella por ser ejemplo de fortaleza, valentía, cariño y paciencia.

A mi padre, Andrés H. V, porque a pesar de los infortunios, ha sabido cómo salir adelante y dar lo mejor a su familia, enseñándonos que con esfuerzo, constancia y disciplina A mis hermanos mayores podemos superar las dificultades, para alcanzar así nuestras metas. María, Omar, Paola y Liliana, por su apoyo en los buenos y malos momentos; a ustedes por cada hora, minuto, segundo compartido, llenos de risas, peleas, travesuras y más, ahora cada uno ha tomado su camino, pero aun así siempre estamos unidos por lazos inquebrantables.

A mis sobrinos Biblioteca de FarmaciaRodrigo B. H. y M oyre lBioquímicaia V.H, por llegar a iluminar nuestras vidas y llenar de alegría a nuestra familia.

“No está en las estrellas mantener nuestro destino, sino en nosotros mismos” – William Shakespeare Madeleine Vanessa Horna Pinedo

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AGRADECIMIENTO

A Dios

por ser base de nuestra moral, por permitirnos despertar cada día con salud, fuerzas y empeño para que cada momento sea de aprendizaje, de crecimiento personal y el tiempo necesario para que alcancemos las metas trazadas en nuestras vidas.

A mi asesora

Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez, que con su amplia experiencia y conocimientos ha orientado al correcto desarrollo y culminación exitosa del presente trabajo de investigación.

Quiero expresar mi más grande y sincero agradecimiento al Dr. Jaume Bastida, de la Universidad de Barcelona (España), por su valioso aporte durante todo éste proceso, permitiendo el desarrollo de este trabajo. Biblioteca de Farmacia y Bioquímica

Al proyecto N° 110-2018-FONDECYT-CONCYTEC.

“Proyectos de Investigación Básica y Aplicada 2018 – 01: «Bulbos Silvestres del Perú: Una Nueva Fuente de Productos Naturales Alcaloidales con Actividad Antiprotozoaria», por el apoyo económico brindado para el desarrollo del presente trabajo de investigación.

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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra honorable consideración y justo criterio el presente informe de Tesis II que lleva de título:

Actividad antiplasmodial in vitro de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber.

Es propicia ésta oportunidad para manifestar mi más sincero reconocimiento a mi alma máter y toda su plana docente, que con sus enseñanzas contribuyen en nuestra formación profesional de manera positiva y sólida.

Señores miembros del jurado, dejo a vuestra consideración la respectiva calificación del presente trabajo y de antemano muy agradecida por el tiempo brindado.

Trujillo, octubre del 2020

Biblioteca de Farmacia y Bioquímica

HORNA PINEDO, Madeleine Vanessa DNI: 48509480

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JURADO DICTAMINADOR

Dr. ZARI GIL, Gilmer

(Presidente)

Dr. RUIZ REYES, Segundo Guillermo

(Miembro)

Biblioteca de Farmacia y Bioquímica

Dra. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana

(Miembro)

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RESUMEN

El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar la actividad antiplasmodial in vitro de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber. Las plantas en estudio fueron recolectadas de los distritos de Pataz y Otuzco, respectivamente, en la región de La Libertad. A partir del extracto blando obtenido por maceración de los bulbos con metanol y mediante extracciones sucesivas basadas en cambios de pH y uso de solventes orgánicos se obtuvo el extracto de alcaloides totales. Luego se realizó la identificación cualitativa de los alcaloides mediante reacciones de coloración y precipitación, dando positivo a los reactivos de Dragendorf, Wagner y Mayer, mostrando precipitados de color anaranjado, marrón y blanco, respectivamente. Además, se realizó la cromatografía en capa fina, dando positivo al reactivo de Dragendorff. Para los extractos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber se obtuvo un porcentaje de rendimiento de alcaloides del 0,71% y 0,81%, respectivamente. La identificación y cuantificación de los alcaloides presentes en los bulbos se realizó mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM), usando Galantamina como compuesto de referencia, la CG-EM mostró un total de 7 alcaloides identificados presentes en el bulbo de Clinanthus incarnatus siendo el más abundante licorina (19,73 ug gal/100 mg PS), seguido de galantina (10,36 ug gal/100 mg PS ), vitatina/crinina (10,22 ug gal/100 mg PS ), hipamina (10,16 ug gal/100 mg PS), 3-O-acetilpowellina (10,14 ug gal/100 mg PS), 11,12-deshidroanhidrolicorina (10,04 ug gal/100 mg PS) y 1-O-acetillicorina (9,85 ug gal/100 mg PS). En los bulbos de Clinanthus ruber se identificaron 8 alcaloides, siendo el más abundante licorina (70,2 ug gal/100 mg PS), seguido de anhidrolicorina (18 ug gal/100 mg PS), 11,12-deshidroanhidrolicorina (5,81 ug gal/100 mg PS), 2,4-didehidro-2- deshidroxilicorina (4,15 ug gal/100 mg PS), 8-O-dimetilmaritidina (3,45 ug gal/100 mg PS) e hipamina (Biblioteca0,1 ug gal/100 mg PdeS); a Farmaciasu vez se encontr ayro nBioquímica 2 alcaloides aun no identificados (m/z 125 tipo homolicorina y m/z 201, M=273). Los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber presentaron actividad antiplasmoidal frente a Plasmodium falciparum (cepa FCR3 resistente a Cloroquina), con una inhibición de 90.1%

y 94% y con CI50 de 0.375ug/mL y 0.241ug/mL respectivamente.

Palabras Clave: Plasmodium falciparum, actividad antiplasmodial, Clinanthus incarnatus, Clinanthus ruber

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ABSTRACT

The objective of this research work was to evaluate the in vitro antiplasmodial activity of the total alkaloids of the bulbs of Clinanthus incarnatus and Clinanthus ruber. The plants under study were collected from the districts of Pataz and Otuzco, respectively, in the La Libertad region. The extract of total alkaloids was obtained from the soft extract obtained by maceration of the bulbs with methanol and by successive extractions based on changes in pH and use of organic solvents. Then the qualitative identification of the alkaloids was carried out by means of coloration and precipitation reactions, giving positive to the Dragendorf, Wagner and Mayer reagents, showing precipitates of orange, brown and white color, respectively. In addition, thin layer chromatography was performed, testing positive for Dragendorff's reagent. For the extracts of Clinanthus incarnatus and Clinanthus ruber, a percentage of alkaloid yield of 0.71% and 0.81%, respectively, was obtained. The identification and quantification of the alkaloids present in the bulbs was carried out by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS), using Galantamine as a reference compound, the GC-MS showed a total of 7 identified alkaloids present in the bulb of Clinanthus incarnatus being the most abundant liquorine (19.73 ug gal / 100 mg PS), followed by galantin (10.36 ug gal / 100 mg PS), vitatin / crinine (10.22 ug gal / 100 mg PS), hypamine (10.16 ug gal / 100 mg PS), 3-O-acetylpowellin (10.14 ug gal / 100 mg PS), 11,12- dehydroanhydrolichorin (10.04 ug gal / 100 mg PS) and 1-O -acetylicorin (9.85 ug gal / 100 mg PS). In the Clinanthus ruber bulbs, 8 alkaloids were identified, the most abundant being liquorine (70.2 ug gal / 100 mg PS), followed by anhydrolichorin (18 ug gal / 100 mg PS), 11,12-dehydroanhydrolichorin (5.81 ug gal / 100 mg PS), 2,4-didehydro-2-dehydroxylicorin (4.15 ug gal / 100 mg PS), 8-O-dimethylmaritidine (3.45 ug gal / 100 mg PS) and hyipamine (0, 1 ug gal / 100 mg PS); in turn, 2 alkaloids were found not yet identified (m / z 125 homolicorinBiblioteca type and m / z 20 de1, M Farmacia= 273). The total aylk aBioquímicaloids of the bulbs of Clinanthus incarnatus and Clinanthus ruber showed antiplasmoidal activity against Plasmodium falciparum (FCR3 strain resistant to Chloroquine), with an inhibition of 90.1% and 94% and an IC50 of 0.375ug / mL and 0.241ug / mL respectively.

Key Words: Plasmodium falciparum, antiplasmodial activity, Clinanthus incarnatus, Clinanthus ruber

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ÍNDICE

Página

DEDICATORIA………………………………………...... ………...... …...... i

AGRADECIMIENTNO...……………………………...... ………...…...... ii

PRESENTACIÓN...... …………………………………...... iii

JURADO DICTAMINADOR……………………………………...... ……...... iv

RESUMEN……………………………………………………...... v

ABSTRACT……………………………………...... vi

I. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………...... 1

II. MATERIAL Y MÉTODO………………………………………...... 9

III. RESULTADOS…………………………………………………………………...... 20

IV. DISCUSIÓN………………………………………………………………...... 26

V. CONCLUSIONES……………………………………………………………...... 34 Biblioteca de Farmacia y Bioquímica VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………...... 35

ANEXOS ………………………………………………………...... 43

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I. INTRODUCCIÓN

La malaria (o paludismo) es una enfermedad causada por parásitos del género Plasmodium, el encargado de transmitir la enfermedad es el mosquito Anopheles hembra. Los seres humanos son infectados por 4 especies distintas de estos parásitos: P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale; siendo los dos primeros los de mayor prevalencia, y la infección por P. falciparum la más grave. Según el último informe publicado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el año 2019, a nivel mundial, se calcula que en el año 2018 hubo 228 millones de casos, la mayoría de ellos ubicados en África (93%), seguido de Asia Sudoriental (3,4%) y el Mediterráneo Oriental (2,1%). Además, se estima que hubo 405 000 muertes por malaria. El parásito más frecuente en África es Plasmodium falciparum, representando el 99.7% de casos, mientras que en América es Plasmodium vivax, representando el 75% de casos. La situación de la malaria en América, entre enero y mayo del 2020, se caracteriza por una disminución en el número de casos confirmados con relación al mismo periodo del año anterior, debido principalmente a la reducción de casos reportados en Venezuela, como consecuencia de las restricciones de transporte hacia las áreas endémicas de ese país, debido a la falta de combustible y más recientemente, a la pandemia de COVID-19. Sin embargo, algunos países (Haití, Nicaragua, Panamá, República Dominicana, Honduras, Costa Rica y Surinam) registraron un incremento de casos, mientras que otros países reportaron aumentos en zonas dentro de su propia nación, tal es el caso del Perú1-3.

En el Perú la malaria es una enfermedad endémica, con la mayoría de casos ubicados en las regiones de Loreto y Amazonas. Desde la Semana Epidemiológica 1 hasta la 37 del 2020 (correspondiente al mes de setiembre), se notificaron 10359 casos, siendo menor cantidad en comparación con el 2019 (16689 casos); sin embargo, se reporta un incremento en los departamentBibliotecaos de Amazonas (dede 9 1Farmacia1 casos a 1385), Sya nBioquímica Martín (de 79 casos a 1385) y Tumbes (de16 casos a 72). El 81.75% de los casos se atribuyen a Plasmodium vivax (8468 casos) y el 18.25% a Plasmodium falciparum (1890 casos), más 1% correspondiente a Plasmodium malariae (1 caso). Por otro lado, el 44.46% de los casos se reportan en el grupo de 0 -11 años, el 19,52 % en el grupo de 18-29 años y el 18,15% en el grupo de 30-59 años. En el departamento de La Libertad hasta la semana epidemiológica 32 del 2017 se notificaron un total de 74 casos confirmados de malaria por Plasmodium vivax, encontrándose entre los distritos de Bambamarca, Bolívar, Condormarca y Ucuncha en la

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provincia de Bolívar; en los distritos de Chugay, Cochorco, Huamachuco y Sartibamba en la provincia de Sánchez Carrión; en los distritos de El Porvenir y Laredo, en la provincia de Trujillo; y en el distrito de Pataz ubicado en la provincia del mismo nombre. Por otro lado, hasta la Semana Epidemiológica 37 del 2020, la tasa de incidencia acumulada de malaria (TIA por cada 1000 habitantes) en el departamento de La Libertad se ubicó en la categoría de bajo riesgo (0.01-0.99) El “Plan Malaria Cero (2017)” se implementó en el departamento de Loreto, con el motivo de lograr reducir la cantidad de casos notificados, sin embargo esto no exime la aparición de brotes en otros departamentos, tales como los vistos en La Libertad y más recientemente en Amazonas, en el distrito de Río Santiago donde se notificaron el 100% del total de casos de la zona en el mes de enero del año 2020. Éste distrito cumple con determinados factores de receptividad y vulnerabilidad para la transmisión de malaria, descrita por la OMS4-6.

La receptividad es entendida como la habilidad del ecosistema de permitir la transmisión de la malaria. La vulnerabilidad se refiere al riesgo de importación del parásito. Entre los factores que inciden en la receptividad de la malaria tenemos: cambios climáticos (como variaciones en el régimen de lluvias y temperatura), cambios ecológicos (como urbanización y desarrollo económico), cambios en el uso de la tierra (modificación de extensiones de cultivos, deforestación, embalses, drenajes, etc.) que pueden afectar la distribución y densidades de los mosquitos Anopheles de una manera u otra. Entre los factores que inciden en el riesgo de importación del parásito, tenemos: Cambios sociodemográficos y socioeconómicos que implican movilidad de la población desde zonas endémicas. Por ejemplo, zonas con riesgo de importación del parásito son aquellas que reciben turismo o migraciones de zonas endémicas hacia zonas que no lo son, para trabajar en ciertas actividades, que, de ser ilegales, son difíciles de identificar. A estos cambios se puede unir la falta de cBibliotecaonocimiento de l ade pob laFarmaciación del riesgo d ye mBioquímicaalaria, el comportamiento de la población respecto a buscar servicios de salud y una capacidad insuficiente de los servicios de salud para detectar y manejar la malaria. Esto explica la re-emergencia de la enfermedad en el país; en zonas como la costa norte y valles interandinos es atribuida a los cambios de temperatura causados por el fenómeno “El Niño” y a migraciones masivas, como la ocurrida en el año 2018 en el departamento de Tumbes, donde se notificaron 34 casos de los cuales 18 fueron importados, es decir notificados en migrantes procedentes de Venezuela (país con transmisión de malaria) 7, 8. 2

El principal reservorio de la enfermedad son los seres humanos. El modo de transmisión de la malaria puede ser vectorial, mediante la picadura del mosquito Anopheles infectado; por transmisión vertical, de una madre infectada al feto; por inoculación directa de glóbulos rojos por vía transfusional o por pinchazos con jeringas contaminadas. El período de incubación para P. falciparum es de 9 a 14 días, para P. malariae es de 18 a 40 días y de 12 a 18 días para P. vivax y P. ovale. Por otro lado, el período de transmisibilidad, que es el tiempo en el cual los humanos pueden infectar a los mosquitos, es variable según las especies y se da mientras existan gametocitos infectantes en sangre. A diferencia de P. falciparum, P. vivax logra persistir en estado latente durante meses o incluso años en el hígado de personas infectadas y causar una recaída. En general, las manifestaciones clínicas son fiebre, escalofríos y dolor de cabeza, al progresar la enfermedad se presenta ictericia, anemia y visceromegalia, entre otras. Las características clínicas más específicas y la gravedad de la enfermedad dependen de la especie de Plasmodium involucrado en su transmisión9-12.

El ciclo de vida de todas las especies de parásitos de la malaria humana comienza por una fase sexual exógena (ciclo esporogónico) y una fase asexual endógena (ciclo esquizogónico) que tiene lugar en el huésped vertebrado. El mosquito se alimenta con la sangre del hospedero infectado que tiene los parásitos sexualmente diferenciados en gametocitos macho (microgametocito) y hembra (macrogametocito). En el estómago del mosquito los microgrametocitos comienzan un proceso de exflagelación originando formas flageladas móviles (microgametos); mientras que los macrogametocitos maduran y se transforman en macrogametos que son fecundados por los microgametos originando un cigoto. El cigoto se transforma en oocineto (cigoto móvil), éste invade el epitelio intestinal del mosquito hasta llegar a la lámina basal, allí crece y forma un ooquiste, para luego dar origen a los esporozoítos. Los esporozoítos entran en la hemolinfa y se distribuyen en todo el cuerpo del mosquito haBibliotecasta invadir las glá ndedula s Farmaciasalivales donde p eyrm Bioquímicaanecen hasta ser inoculados, con la saliva, en la piel del hospedador mamífero. Cuando el mosquito infectado pica a una persona, le inyecta esporozoítos los cuales alcanzan el hígado, invaden los hepatocitos y se convierten en esquizontes y después en merozoítos, la siguiente fase invasiva, dotada de organelos secretores que les permiten invadir eritrocitos. Dentro del eritrocito, los parásitos se encuentran en una vacuola parasitófora donde pueden seguir dos vías de desarrollo: crecer y diferenciarse en esquizontes productores de nuevos merozoítos, que invaden a otros eritrocitos, o producir formas sexuales: gametocitos macho y hembra. Cuando los 3

merozoítos penetran en los eritrocitos forman los trofozoítos, y cuando el núcleo del trofozoíto tardío se divide en varios fragmentos (esquizogonia eritrocítica) se constituye un esquizonte. Luego de que culmina el proceso de maduración se produce la rotura del eritrocito y se liberan los merozoítos en el torrente sanguíneo. Esta fase del parásito invade de nuevo otros eritrocitos y se continúa desarrollando la esquizogonia eritrocítica. El ciclo se reinicia cuando el mosquito pica a la persona infectada. En P. vivax y P. ovale se da una fase latente llamada hipnozoíto, ésta es la causa de las recaídas tardías, que se presentan en infecciones por las mismas especies mecionadas.13, 14, 15.

El tratamiento de la malaria por P. falciparum adoptado por el Ministerio de Salud del Perú (MINSA) a finales de los 90 estuvo conformado por dos esquemas diferentes combinados con artesunato, convirtiéndose en el primer país en las Américas en adoptar la terapia combinada. En la costa norte Sulfadoxina-Pirimetamina/ Artesunato (SP/AS) y en la amazonia, Mefloquina/Artesunato (MQ/AS). Esta decisión se basó en estudios previos de eficacia, donde se halló diferentes patrones de resistencia, mientras que, en la costa norte había resistencia del P. falciparum sólo a la Cloroquina (CQ), en la amazonia había resistencia a ambos CQ y SP16.

El desarrollo de resistencia de P. falciparum a los medicamentos disponibles se debe a la capacidad del parásito para mutar genes específicos, a la alta frecuencia de recombinación génica que da origen a poblaciones de parásitos con nuevos determinantes antigénicos y con modificaciones en los sitios blanco para la acción de medicamentos, a los sistemas de transporte activo específicos para compuestos antimaláricos y a las prácticas clínicas inadecuadas como el uso de antimaláricos profilácticos, tratamientos inconclusos o con dosis sub-terapéuticas17. Por otro ladoBiblioteca, se realiza el con tderol d eFarmacia los vectores med iyan tBioquímicae la utilización de insecticidas de primera línea, que son los organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides, de los cuales, los últimos son los más utilizados en todo el mundo y desempeñan un papel importante en el control. Sin embargo, en el año 2018, el INS (Instituto Nacional de Salud) detectó resistencia a los piretroides alfacipermetrina, deltametrina y permetrina por parte del mosquito Anopheles darlingi, vector principal de la malaria en el Perú. La resistencia es entendida como la conducta de los insectos frente a la acción de un insecticida; si el mosquito muere se define como “susceptible” y si sobrevive se define como “resistente”18.

A lo largo de los años, el control y la erradicación de la malaria se han visto obstaculizados por la aparición y el resurgimiento de la resistencia de los parásitos a varias generaciones de medicamentos antipalúdicos. Esta tendencia ha motivado varios estudios de investigación que intentan descubrir agentes antipalúdicos nuevos, eficaces y seguros con mecanismos de acción únicos para combatir el patrón de resistencia del parásito. Sabiendo que más del 50% de los fármacos, actualmente utilizados en el mundo, tienen su origen en los productos naturales y sus derivados, es que se vienen realizando estudios de plantas como fuente de recursos terapéuticos para la obtención de compuestos utilizados para el tratamiento de diversas enfermedades, entre ellas la malaria19, 20. Así tenemos a la familia Amaryllidaceae, la cual agrupa alrededor de 860 especies en 50 géneros, siendo una de las familias más interesantes por la presencia de varias especies con adaptaciones a ambientes séricos. En el Perú es reconocida con 24 géneros y 138 especies, todas herbáceas. Las plantas de la familia Amaryllidaceae contienen una clase especial de alcaloides isoquinolínicos, especialmente en los bulbos. A este grupo de compuestos se les atribuyen propiedades medicinales potentes, entre ellas las antimaláricas21, 22. El género Clinanthus es miembro de la familia Amaryllidaceae . En 2000, Alan Meerow et al. publicó un artículo en el que, entre otros hallazgos, reconoció que lo que antes se conocía como la tribu Stenomesseae consistía en dos grupos separados, uno de estos con hojas pecioladas (acechadas) relacionado con Eucharideae. El otro, con hojas lorate (en forma de correa), forma un grupo hermano de otra tribu, las Hymenocallideae (los géneros Hymenocallis , Ismene y Leptochiton ). Se propuso que este grupo de hojas en forma de correa se transfiriera a una nueva tribu, Clinantheae, y resucitó el género Clinanthus Herbert (1821), dentro de esta tribu. El nombre Clinanthus proviene del griego kline=inclinado y anthos=flor, por la disposición de las flores. En Perú fueron halladas 22 dBibliotecae éstas especies23 , de24. Farmacia y Bioquímica La especie Clinanthus incarnatus es originaria de los Andes desde Ecuador hasta Perú. Crece a gran altitud en suelos pobres y rocosos, tiene flores de varios colores que varían desde rojos hasta amarillo pálido, y de formas tubulares con puntas más o menos verdes. Las flores individuales miden alrededor de 3"de largo y se encuentran en una umbela de aproximadamente cuatro. La planta mide aproximadamente 30" (75 cm) de alto y crece en suelo arenoso con granito descompuesto. Las hojas tienen forma de correa de color verde grisáceo y en invierno pueden ser semi o totalmente caducas. En otro artículo publicado en 5

setiembre del 2019, Meerow y Cano reconocieron que la especie conocida hasta ahora como Stenomesson rubrum Herb. se transfiere a Clinanthus en función de su morfología foliar estrechamente lorate, asignándole la denominación de Clinanthus ruber, se caracteriza por encontrarse extendida en el norte del Perú y puede tener flores rojas o rosadas, pero nunca más de cinco. Las flores carecen de zona apical verde y tienen hojas relativamente estrechas de <1 cm de ancho23 25. Han sido reportados diversos estudios en los cuales se ha determinado que algunas especies de Amaryllidaceae poseen efecto antiplasmodial, tal es el caso de Nair, et al (2019), en su artículo de revisión titulado “Antiplasmodial Lycorane Alkaloid Principles of the Plant Family Amaryllidaceae” examinó las propiedades antiparasitarias de la familia Amaryllidaceae a través de las actividades demostradas por su alcaloide licorano. Se evaluaron 52 compuestos, de estos, 24 eran naturales identificados en 20 especies de 11 géneros de la familia Amaryllidaceae, mientras que los 28 restantes eran entidades derivadas sintéticamente basadas en el esqueleto de licorano contra 10 cepas diferentes del patógeno de la malaria; además, consideraron estudios de relación estructura-actividad. Concluyeron que el compuesto original licorina era el más potente con una CI50 de 0,029 µg / ml frente a la cepa FCR-3. Los estudios de relación estructura-actividad revelaron los elementos del farmacóforo antiplasmodial, demostrando que gira en torno a un núcleo tetracíclico intacto, con cierta tolerancia para la sustitución en los diversos anillos. En otro estudio realizado por Hao, et al (2013), titulado “Cytotoxic and antimalarial alkaloids of Amaryllidaceae from Lycoris radiata bulbs”, se realizó una investigación fitoquímica del extracto etanólico al 80% de los bulbos de Lycoris radiata para el aislamiento de alcaloides y se realizó la elucidación estructural de los compuestos mediante espectroscopía de RMN además de la espectrometría de masas de alta resolución. Como resultados se obtuvo el aislamiento Bibliotecade cinco nuevos a lcdealoi dFarmaciaes: 5,6-deshidroli cyor inBioquímicaa, 3α-6β-diacetil bulbispermina, 3α-hidroxi-6β-acetil-bulbispermina, 8,9-metilendioxylhomolycorine-N-óxid y 5,6-dihidro- 5- metil-2-hidroxifenantridina, junto con dos compuestos conocidos, 3α-metoxi-6β-acetil- bulbispermina y homolicorina-N-óxido. El compuesto 5,6-deshidrolicorina exhibió actividad antipalúdica con valores de IC (50) de 2.3 μM para la cepa de Plasmodium falciparum. En un tercer trabajo perteneciente a Sener, et al (2003), que lleva por título: “Antimalarial activity screening of some alkaloids and the plant extracts from Amaryllidaceae”, se investigó el potencial antipalúdico de tres especies de Amaryllidaceae 6

recolectadas de Turquía (Pancratium maritimum L, Leucojum aestivum L. y Narcissus tazetta L. ssp. Tazetta), así como sus alcaloides (licorina, crinina, hemantamina, 6- hidroxihemantamina, 3 epihidroxibulbispermina, galantamina y tazettina) contra dos cepas de Plasmodium falciparum, cloroquina sensible (T9.96) y cloroquina resistente (K1). Los bulbos secos y en polvo (10 g) de cada planta se extrajeron (10%, p / v) con etanol (50%) mediante maceración a temperatura ambiente durante 2 días y se evaporaron al vacío a 50ºC hasta sequedad. Los extractos evaporados se disolvieron en medio de cultivo que contenía DMSO al 10% a la concentración de 1 mg/mL. Las elucidaciones estructurales se realizaron utilizando técnicas espectroscópicas. Las cepas utilizadas en este estudio se mantuvieron en un cultivo continuo en etapas eritrocíticas asexuales, se sincronizaron utilizando el método de lisis de sorbitol. El medio de cultivo fue RPMI-1640 suplementado con 25 mM de HEPES, 40 µg / ml de gentamicina y 10% de suero humano inactivado. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición del crecimiento. Se usó un cultivo en forma de anillo sincronizado para realizar la prueba de sensibilidad al fármaco. Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando 0.5-1% de parasitemia. Se descubrió los alcaloides antes mencionados tienen actividad dosis dependiente, siendo más activos a dosis de 1 y 5 µg/ml; además, se determinó que la 6-hidroxihemantamina, la hemantamina y la licorina eran los alcaloides más potentes contra P. falciparum (T9.96) y la galantamina y la tazetina tenían la actividad menos potente contra P. falciparum (K1). En otro estudio realizado por Likhitwitayawuid, et al (1993), que lleva por título “Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the bulbs of Crinum amabile”, se encontró que los alcaloides licorina, augustina y crinamina son los principales componentes citotóxicos y antipalúdicos26-29.

La malaria es una enfermedad parasitaria que continúa representando un serio problema de salud pública a nivel mundial, particularmente en países subdesarrollados con zonas tropicales eBibliotecan su geografía, cdeomo Farmaciaes el caso de S uyd aBioquímicamérica. Existen dos obstáculos principales que agudizan la situación, uno de ellos es el surgimiento y expansión de cepas resistentes a los fármacos utilizados como tratamiento de elección para la enfermedad, y otro es el desarrollo de resistencia por parte del mosquito a los insecticidas que se utilizan para su eliminación. Es por ello que surge la necesidad de buscar nuevas alternativas de tratamiento para enfrentar la amenaza que representan éstos hechos. Un enfoque actual consiste en el descubrimiento de nuevos fármacos a partir de plantas medicinales. Las plantas de la familia Amaryllidaceae poseen alcaloides los cuales les confieren actividad 7

para tratar diversas enfermedades, entre ellas la malaria. De éste modo, se ha decidido estudiar a dos de las especies, denominadas Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber, para determinar si sus alcaloides totales poseen o no efecto antimalárico in vitro sobre el parásito Plasmodium, pues hasta la actualidad no se han reportado estudios en nuestro país y en el mundo sobre dicha actividad en éstas especies, sólo se conoce las propiedades de la familia Amaryllidaceae a la cual pertenecen. Así pues, la utilidad de ésta investigación radica en la generación de evidencia científica que pueda servir como base para trazar el camino de estudios posteriores y sobre todo para hacer como alternativa para enfrentar la resistencia a los antimaláricos.

Con base en lo anteriormente expuesto, se ha planteado el siguiente problema:

¿Presentarán actividad antiplasmodial in vitro los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber?

Postulándose la siguiente hipótesis:

Los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber si presentan actividad antiplasmodial in vitro.

En relación con esto, se ha propuesto cumplir los siguientes objetivos:

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar la actividad antiplasmoidal in vitro de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Identificar los alcaloides mediante reacciones de coloración y precipitado y cromatogBibliotecarafía de capa fina ddee lo s Farmacia bulbos de Clinan yth uBioquímicas incarnatus y Clinanthus ruber 2. Identificar y cuantificar los alcaloides presentes en los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). 3. Determinar el porcentaje de inhibición y CI50 de los alcaloides totales frente a Plasmodium falciparum.

II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. MATERIALES Y EQUIPOS

2.1.1. MATERIAL BOTÁNICO

Se utilizaron 2 kilogramos de bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber provenientes de las provincias de Pataz y Otuzco, respectivamente, del departamento de La Libertad.

2.1.2. MATERIAL DE VIDRIO

- De uso común en el laboratorio

2.1.3. EQUIPOS E INSTRUMENTOS

- Balanza analítica OHAUS GA 200 (precisión 0.0001g)

- Lámpara UV 254-366nm DESAGA

- Cocina eléctrica Finely

- Refrigeradora Coldex

- Estufa Memmert

- Bomba al vacío Gast Model Nº107Cb18 (Cole-Parmer)

- Rotavapor marca HEIDOLPH

- Incubadora Microbiológica Binder

- Sonicador Transsonic Elma - BBibliotecaalanza triple braz ode OH AFarmaciaUS 700/800 seri eys Bioquímica - Cámara de Bioseguridad Nivel II

- Cromatógrafo de Gases Agilent, modelo 6890, acoplado a un espectrómetro de masas de impacto electrónico (modelo 5975)

- Microscopio binocular con cámara H.W.Kessel

- Baño de ultrasonido Branson

2.1.4. REACTIVOS

- Bicarbonato de sodio 4%

- Sulfato de sodio anhidro Q.P. (Merck)

- Hidróxido de amonio Q.P. (Merck)

- Ácido sulfúrico Q.P. (Merck)

- Formalina 10% marca Gamma

- Hematoxilina

- Eosina

2.1.5. SOLVENTES

-Agua destilada.

-Etanol Q.P. Merck

-Éter etílico Q.P. Merck

-Metanol Q.P. Merck

2.1.6. MEDIO DE CULTIVO

- Medio RPMI 1640 suplementado con HEPES (25 mM)

2.1.7. FÁRMACO

- Cloroquina Merck

2.1.8. OTROS Biblioteca de Farmacia y Bioquímica - Colorante de Giemsa

- Espátulas Papel filtro Whatman # 40

- Placas Petri descartables.

- Guantes látex descartable N° 6 ½ y 7

- Mascarillas descartables Prosemedic.

- Gorra descartable Prosemedic.

- Torunda de algodón

- Disco de metilcelulosa (Millipore) de 5 mm

- Rollo de papel film

- Laminas portaobjeto

- Laminillas cubreobjetos

2.2. MÉTODOS Y TÉCNICAS

2.2.1. RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

Se recolectaron 2 kilogramos de bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber en el distrito de Otuzco y Pataz, respectivamente, pertenecientes a la provincia de Otuzco, región La Libertad. Luego se trasladaron las muestras en un cooler hasta el Laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo.

2.2.2. IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA

Las identificaciones botánicas de las plantas fueron realizadas por el Dr. Mostacero, responsable del Herbarium Truxillense.

2.2.3. EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES30

Los bulbos de Clinanthus ruber y Clinanthus incarnatus fueron seleccionados, lavados y desinfectados con hipoclorito de sodio al 0.5%. Luego, se cortaron en láminas finas de aproximadamente 2 centímetros y se llevaron a secar a una estufa deBiblioteca convección forza ddea a 4Farmacia0º C. Una vez se cayd oBioquímicas los bulbos se procedió a moler con ayuda de un molino hasta obtener polvo semifino. Posteriormente se pasó a través de un tamiz Nº 0.75.

Se pesó el polvo para su posterior maceración con 1L de metanol durante 72 horas. Posteriormente, se filtró el extracto metanólico y el solvente se evaporó a presión reducida empleando un rotavapor a una temperatura de 40°C. El extracto bruto

obtenido, fue sometido a acidificación con H2SO4 (2% v/v) y se limpió con éter 11

de petróleo, logrando así separar la fase orgánica compuesta por materias neutras como clorofilas, ceras y mucílagos de la fase acuosa, rica en alcaloides.

La fase acuosa ácida, se sometió a basificación con NH4OH (10% v/v) hasta conseguir un pH 10, posteriormente se realizó la extracción de los alcaloides mediante el uso repetido de cloroformo, de manera que los alcaloides quedaron retenidos en la fase orgánica. Luego se evaporó el solvente a presión reducida en el rotavapor a una temperatura de 45 °C, obteniendo así el extracto de alcaloides totales.

Finalmente, el extracto rico en alcaloides se disolvió con un pequeño volumen de metanol, para facilitar su traspaso a un nuevo envase; posteriormente, el solvente se evaporó con ayuda de una estufa de secado durante 24 horas.

Identificación por reacciones de precipitación 35,36

Ensayo de Dragendorff, Mayer y Wagner: Se pesaron 10 mg de alcaloides totales de cada especie vegetal, agregando luego 10 ml de HCl al 1%, y 1 ml de esta solución fue colocado en tres tubos de ensayo. Al primer tubo, se le añadió 2 gotas del reactivo de Dragendorff; tubo 2 gotas del reactivo Mayer y al tercer tubo 2 gotas del reactivo Wagner. La formación de precipitado de color anaranjando, blanco y marrón en los respectivos tubos fue considerado como positivo.

Identificación por cromatografía de capa fina (CCF)31

Para la identificación de alcaloides totales por CCF, se trabajó con muestras los extractos de los alcaloides totales de cada especie vegetal; utilizando como fase estacionaria cromatofolios de aluminio con sílica gel 60F254, que fueron cortados 12Biblioteca cm de largo x 10 decm d eFarmacia ancho y activado sy e nBioquímica una estufa a 100 °C durante una hora. En las placas activadas se marcó con un lápiz la línea de inicio de la corrida, a 1 cm de distancia del borde de la placa y otra línea de fin de la corrida, a 10 cm de la línea inicial; empleando como fases móviles: I. CHCl3-EtOH (9.5:0.5), II: CHCl3-EtOH (9.5-0.5) saturado con NH3, III.CHCl3-EtOH (9:1), IV. CHCl3- EtOH (9:1) saturado con NH3. Fase estacionaria: Sílica gel 60F254. Revelador Dragendorff.

El solvente es dejado correr hasta llegar a la línea final (10 cm), para luego secar las placas a temperatura ambiente, y ser revelado con el reactivo de Dragendorff, considerándose reacción positiva la aparición de manchas color anaranjado. Posteriormente los Rf (Factor de Retención) de los compuestos de las muestras y de los estándares, son medidos y se utilizó la siguiente fórmula:

distancia recorrida por el soluto 푅푓 = distancia recorrida por la fase móvil

2.2.5. IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM) 30

A partir del extracto de alcaloides disuelto en metanol, se procedió a la realización de la Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas.

Se empleó un Cromatógrafo de Gases Agilent, modelo 6890, acoplado a un espectrómetro de masas de impacto electrónico (modelo 5975) que operó a 70eV a una temperatura de 230ºC en la fuente iónica. El cromatógrafo disponía de una columna SAPIENS-X5-MS (30m x 0,25mm x 0,25μm), siendo su fase estacionaria la fenilmetilsilicona al 5%.

El programa de temperatura utilizado fue:

-Aumento inicial desde 55 º C a 100 º C (60 º C/min).

-2 minutos a 100 º C.

-Aumento desde 100 º C a 180 º C (15 º C/min).

-1 minuto a 180 º C.

-ABibliotecaumento desde 18 0de º C a Farmacia300 º C (5 º C/mi ny) Bioquímica

Se trabajó a una temperatura de 280 º C en el inyector y el flujo de He fue de 0,8 mL/min y se usó el modo splitless. Como alcaloide estándar de referencia para todos los análisis se empleó 0.5 µg de codeína.

Para la obtención y el análisis de los datos espectrales se utilizó el software AMDIS 2.71 (NIST), el cual permitió verificar la pureza de las señales y el cálculo de índices de retención. 13

2.2.6. EVALUACIÓN ANTIMALÁRICA32,33,34

2.2.6.1. Preparación de medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-1640 para cultivo a) Se abrió el medio RPMI GIBCO (500 ml) dentro de la cabina de flujo laminar, se tomó 30 ml que se colocó en un tubo de centrífuga de 50 ml. b) Se pesó 10 mg de hipoxantina y se disolvió en los 30 ml de RPMI del tubo de centrífuga de 50 ml. c) Dentro de la cabina de flujo laminar se añadió 250 μl de gentamicina 50mg/ml. d) Se filtró la solución con un filtro millipore de 0,22μm en otro tubo de centrífuga de 50 ml. e) Se mezcló la solución filtrada con el frasco de medio RPMI restante, se homogenizó y se almacenó a 4ºC. 2.2.6.2. Preparación de Solución Stock de Albumax II a) Se pesó 2.5 g. de Albumax II en un tubo de centrífuga de 50 ml. b) Se adicionó 30 ml de agua destilada y filtrada y se disolvió con la ayuda del ultrasonido y completo el volumen a 50 ml con agua destilada y filtrada. c) Dentro de la cabina de flujo laminar se filtró la solución con un filtro Millipore de 0,22μm en otro tubo de centrífuga de 50 ml y almacenó a + 4ºC. 2.2.6.3. Preparación de Medio Completo (50ml) En un tubo de centrífuga de 50 ml se añadió 2.5 ml de Solución stock de BibliotecaAlbumax y c odempl eFarmaciató el volumen a 5 0y m lBioquímica con medio RPMI incompleto 2.2.6.4. Lavado de glóbulos rojos no parasitados a) Se tomó la sangre total extraída del donante, previo consentimiento informado, y se transfirió a un tubo de centrífuga de 15 mL. b) Se centrifugó a 2200 r.p.m. por 5 minutos. c) Se descartó el plasma sobrenadante y la capa de células blanca con una pipeta serológica.

d) Se adicionó medio incompleto en proporción 1:1, se mezcló cuidadosamente y centrifugó a 2200 r.p.m. por 5 minutos. e) Se descartó el sobrenadante y se repitió el paso anterior 2 veces más. f) Se resuspendió los glóbulos rojos con medio completo y se almacenó a - 4ºC hasta su uso. 2.2.6.5. Descongelamiento de Cepas de Plasmodium falciparum a) Se tomó el criovial con la cepa a descongelar, se colocó en baño maría (37° C) y se incubó por 5 min. b) Se roció el criovial con mucho etanol y dentro de la cabina de flujo laminar lentamente se añadió 4 gotas de NaCl 12 % (200 μl por 1 ml de sangre) y se agitó suavemente entre gotas para mezclar. c) Se dejó reposar por 3 minutos. d) Se transfirió todo a un tubo de centrífuga de 15 ml y se añadió gota a gota 8 ml de NaCl 1,6 % (SD) mientras se agitó suavemente el tubo para mezclar. e) Se centrifugó a 1750 rpm por 5 min. Se descartó el sobrenadante y se añadió gota a gota 8 ml NaCl 0,9 % Glucosa 0,2 % agitando suavemente para mezclar. f) Se centrifugó por 5 min a 1750 rpm y removió el sobrenadante. g) Se transfirió el precipitado de eritrocitos a un frasco de cultivo, se completó a 500 μl con eritrocitos no parasitados y se añadió 9,5 ml de medio RPMI completo. h) Se añadió la mezcla de gases (5 % O2, 5 % CO2, 90 % N2) por 30 segundos y se incubó el frasco a 37 ºC. Bibliotecai) Se registró dela p aFarmaciarasitemia del cu lytiv oBioquímica desde el momento que fue descongelada, información que sirvió para determinar la tasa de crecimiento del parasito y la viabilidad del parásito. 2.2.6.6. Mantenimiento del cultivo in Vitro de Cepas de Plasmodium falciparum Se utilizó el método in vitro, desarrollado por Trager y Jensen Para mantener el cultivo en constante crecimiento es necesario cambiar el medio de cultivo con medio completo cada 24 horas ya que la producción 15

del ácido láctico producida por el parásito, disminuye el pH del medio de cultivo, también es necesario el control de la parasitemia del cultivo. El cambio de medio y control de la parasitemia se hace de la siguiente manera: Dentro de la cámara de flujo laminar inclinar el frasco de cultivo y con la ayuda de una micropipeta con tips estériles de 1000 μl o una pipeta serológica estéril se retira el medio de cultivo obsoleto sin perturbar los eritrocitos. Se realizó un frotis tomando una pequeña cantidad del sedimento de eritrocitos (menor 5 μl) que fue teñido con giemsa al 10 % para el control de la parasitemia. Después de descartar el medio obsoleto y de realizar láminas para el control de la parasitemia, se agregó medio completo (RPMI + albumax 0,25 %) y se añadió la mezcla de gases por 1 minuto. 2.2.6.7. Medición del Grado de Parasitemia por el Método Óptico Pasado este tiempo de incubación, se eliminó completamente la fase superior del cultivo, se realizó un frotis del sedimento de cada alveolo, luego se fijó con metanol y se realizó la tinción con Giemsa al 10%, estas placas fueron observadas en el microscopio, con lente de inmersión x100, contando glóbulos rojo no infectados (GRL) y glóbulos rojos infectados (GRI), y se determinó la parasitemia: 퐺푅푃 % parasitemia= x 100 퐺푅퐿+퐺푅푃

Donde: BibliotecaGRP: Glóbu ldeos ro jFarmaciaos parasitados y Bioquímica GRL: Glóbulos rojos libres 2.2.6.8. Sincronización de Cultivos in Vitro de Plasmodium falciparum La gran permeabilidad de los eritrocitos infectados por P. falciparum a las hexosas es una característica que se aprovecha en cultivo in vitro para lisar de manera selectiva los GRI con parásitos maduros y concentrar formas jóvenes de P. falciparum, realizando un tratamiento del cultivo con sorbitol. El cultivo de P. falciparum (con mayor porcentaje del estadio 16

anillo), se centrifugó a 600 g durante 5 min, luego se eliminó el sobrenadante y añadió 10 partes de sorbitol al 5% al sedimento, se incubó durante 10 min a 37ºC, se centrifugó nuevamente a 600 g por 5 min, se descartó el sobrenadante y cultivó con medio completo. 2.2.6.9. Evaluación de la Sensibilidad in Vitro de Plasmodium falciparum frente a los Alcaloides totales de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber a. Preparación de la droga de referencia, alcaloides totales Se utilizó como droga de referencia al Difosfato de Cloroquina (C18H26C1N3 • 2H3PO4) (Sigma, PM= 515.86), las concentraciones evaluadas fueron preparadas a partir de una solución madre de 10 mM de la que se realizó diluciones seriadas en concentraciones de 10 a 1000 nM, que fueron distribuidas por duplicado en la microplaca de titulación en

orden creciente. Se determinó el IC50 y se corroboró la resistencia de la cepa FCR3 a esta droga. Se prepararon soluciones madres de los alcaloides totales disolviéndolos con DMSO a una concentración de 10 mg/mL, (2 mg de alcaloides totales en 200 μL de DMSO). A partir de esta solución se realizaron diluciones de 1, 2.5, 5, 10, 25 y 50 μg/mL, distribuidas de menor a mayor concentración y también por duplicado. b. Preparación de la Placa de 96 alveolos Se colocó 200 μL de agua destilada estéril en todos los bordes superiores e inferiores de la placa de 96 pozos, para evitar el “efecto borde” (Posible perturbación del crecimiento parasitario debido a la proximidad del borde Bibliotecade la placa). Eden ca dFarmaciaa alvéolo se colo cyó 1Bioquímica00 μL de glóbulos rojos con un hematocrito del 2 % (para esto se utilizó RPMI con suero al 20 %), además de una parasitemia del 1 % en estadio anillo, se añadió 100 μL de las concentraciones seriales crecientes de las drogas, lo que resultó un volumen final de 200 μL, se incubó la placa a 37 ºC por el lapso de 48 horas, después de este tiempo se evaluó la actividad de los extractos por el método visual.

c. Preparación del colorante Giemsa Se disolvió 0,76 g de polvo Giemsa en 50 mL de glicerina, sometiendo a esta solución a 60 ºC para su solubilización completa, luego se enrasó a 100 mL con Metanol, se dejó en la oscuridad por 5 días, y se llevó a filtrar.

d. Solución Tampón fosfato PBS, se disolvió 0,2 g de KH2PO4 y 0,5 g de

Na2HPO4 (2H2O), en 980 mL de agua destilada, luego se ajustó el pH a 7,4 con HCl 0,1 N o NaOH 0,1 N, y se enrasó a 1000 mL. Para preparar la tinción de los glóbulos sobre un porta objetos, se colocó 0.4 mL de colorante Giemsa y agregó 1.6 mL de Tampón fosfato PBS para completar un volumen de 2 mL. e. Preparación de los frotis Luego de las 48 horas de incubación se eliminó completamente de la placa de 96 alvéolos, la fase superior del cultivo, se realizó un frotis del sedimento de cada alvéolo sobre un porta-objeto, se fijó con metanol y realizó la tinción x 15 min, con la solución de Giemsa (al 20 % con PBS), se lavó con chorro de agua y dejó secar a medio ambiente. Finalmente, al observar en el microscopio, con el objetivo de inmersión x100, se contó tanto glóbulos rojos no infectados (GRL) como infectados (GRI), para tener el % de inhibición, el cual se calculó con la siguiente fórmula: 푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푑푒푙 푡푒푠푡𝑖푔표 − 푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푐표푛 푙푎 푑푟표푔푎 % 𝑖푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 = 푥100 푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푑푒푙 푡푒푠푡𝑖푔표

El valor de IC50 se calculó por una curva de actividad: Porcentaje de Bibliotecainhibición v sde. log aFarmaciaritmo de la conc eyn trBioquímicaación de la droga, a través del cálculo de interpolación lineal:

퐿표푔 (퐼퐶50) = 퐿표푔(푋1) + 50 − 푌1푌2 −푌1[퐿표푔(푋2) − 퐿표푔(푋1)]

Donde: X1 = Concentración de la droga que da una inhibición de la parasitemia Y1> 50%; 49 X2= Concentración de la droga que da una inhibición de la parasitemia Y2< 50%; Y1 =Porcentaje de inhibición de X1 Y2 = Porcentaje de inhibición de X2

El nivel de actividad de las muestras se clasificó según la Tabla 1 bajo los criterios de Research Initiative on Traditional Antimalarial Methods - RITAM Tabla 1.-Criterios de clasificación en nivel de actividad en el modelo in vitro (Adoptado de Willcox. M., et al. 2004)

CI50 (µg/mL) Nivel de actividad < 0.1 Muy bueno 0.1-1.0 Bueno 1.1-10 Bueno a moderado 11-25 Moderado 26-50 Poco activo 51-100 Débil >100 Inactivo

2.2.6.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados fueron procesados usando el programa estadístico SPSS Bibliotecav. 23 y, ex pderesad oFarmacias como mediana ayri tBioquímicamética ± desviación estándar. Se determinó la relación entre los grupos mediante el test de ANOVA de una vía, en el cual p0,05 fueron considerados como estadísticamente significativos.

III. RESULTADOS Tabla 1. Identificación de alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber

Especie vegetal Ensayo Resultado Observación

Clinanthus Dragendorff ++ Precipitado anaranjado

incarnatus Mayer ++ Precipitado blanco

Wagner ++ Precipitado marrón

Clinanthus ruber Dragendorff +++ Precipitado anaranjado

Mayer +++ Precipitado blanco lechoso

Wagner +++ Precipitado marrón

Resultado positivo: + Intensidad: ++ Moderada Resultado negativo: – +++ Alta

Tabla 2. Identificación de alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber por cromatografía de capa fina (CCF)

N° Especie vegetal Coloración Rf I II III IV 1 Clinanthus Anaranjado - 0.12 0.19 - incarnatus claro anaranjado 0.15 - - - anaranjado - 0.48 - - 2 BibliotecaClinanthus ru bdeer Farmaciaanaranjado - y 0Bioquímica.21 0.25 - claro anaranjado 0.18 - 0.29 - Rojo - 0.71 0.78 - ladrillo

Fases móviles: I. CHCl3-EtOH (9.5:0.5), II: CHCl3-EtOH (9.5-0.5) saturado con NH3, III.CHCl3- EtOH (9:1), IV. CHCl3-EtOH (9:1) saturado con NH3. Fase estacionaria: Sílica gel 60F254. Revelador Dragedorff.

Tabla 3. Rendimiento de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber

Descripción ESPECIE VEGETAL Clinanthus incarnatus Clinanthus ruber Peso del bulbo 5 g 5 g Peso de extracto metanólico seco 1.1836 g 1.2542 g Peso de alcaloides totales 35.48 mg 40.48 mg Rendimiento 0.71%. 0.81% Fuente: Elaboración propia

Biblioteca de Farmacia y Bioquímica

Tabla 4. Alcaloides identificados por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas de los bulbos de Clinanthus incarnatus

Alcaloide Clinanthus incarnatus

Rt RI µg gal/100 mg PS Vittatina/crinina 23.6601 2518.7 10.22

3-O-acetilpowellina 25.3705 2630.8 10.14

11,12- deshidroanhidrolicorina 25.7120 2653.2 10.04

Hippamina 26.5144 2705.8 10.16 Galantina 26.8839 2730 10.36 1-O-Acetillicorina 27.1420 2747.0 9.85 Licorina 27.6930 2783.1 19.73 Interpretación: Rt: tiempo de retención; RI: índice de retención; PS: peso seco Realizado por Jaume Bastida Fuente: Universidad de Barcelona

Licorina 19.73

1-O-Acetillicorina 9.85

Galantina 10.36

Hippamina 10.16

11,12- deshidroanhidrolicorina 10.04

3-O-acetilpowellina 10.14

Vittatina/crinina 10.22 Biblioteca de Farmacia y Bioquímica 0 5 10 15 20 25

Gráfico 1: Alcaloides totales del bulbo de Clinanthus incarnatus (µg gal/100mg PS).

Tabla 5. Alcaloides identificados por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas de los bulbos de Clinanthus ruber

Alcaloide Clinanthus ruber Rt RI µg gal/100 mg PS Anhidrolicorina 23.962 2501.6 18.0 2,4-didehidro-2-deshidroxilicorina 24.451 2534.4 4.15 11,12- deshidroanhidrolicorina 25.508 2605.2 5.81

m/z 201; [M= 273] 23.904 2497.8 0.1 Hippamina 26.383 2663.9 0.1 Licorina 27.605 2745.8 70.2 8-0-dimetilmaritidina 28.327 2794.2 3.45 m/z 125; [Tipo-homolicorina] 29.419 2867.4 6.8 Interpretación: Rt: tiempo de retención; RI: índice de retención; PS: peso seco Realizado por Jaume Bastidas. Dato proporcionado por la Universidad de Barcelona

m/z 125; [Tipo-homlicorina] 6.8

8-0-dimetilmaritidina 3.45

Licorina 70.2

Hippamina 0.1

m/z 201; [M= 273] 0.1

11,12- Bibliotecadeshidroanhidroli cdeorina Farmacia5.81 y Bioquímica

2,4-didehidro-2-deshidroxilicorina 4.15

Anhidrolicorina 18

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Gráfico 2: Alcaloides totales del bulbo de Clinanthus ruber (µg gal/100mg PS).

Tabla 6. Porcentaje de Inhibición de los Alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber

Concen tración Porcentaje de Inhibición

Clinanthus incarnatus Clinanthus ruber

1µg/mL 23.5±0.46 31.5±0.1 2.5 µg/mL 35.8± 0.1 45.8± 0.17 5 µg/mL 61.5± 0.36 70.1± 0.36 10 µg/mL 78.5±0.1 82.3±0.61 25 µg/mL 84.2±0.06 85.6±0.53 50 µg/mL 90.1±0.1 94±0.56

100 90 80

70 n

ó C. incarnatus

i 60

i b

i 50 C.ruber

n i

40 % 30 20 10 0 0 0.5 1 1.5 2 Log concentración (ug/mL) Biblioteca de Farmacia y Bioquímica Gráfico 3: Porcentaje de Inhibición vs Log concentración de alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber.

IC 50

0.375 ug/mL 0.4

0.35

0.3 0.241 ug/mL 0.25

0.2

0.15

0.1 0.046 ug/mL 0.05

0 C.incarnatus C.ruber Cloroquina

Gráfico 4: CI50 de alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber y Cloroquina.

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IV. DISCUSIÓN

El objetivo principal de éste estudio consistió en evaluar la actividad antiplasmodial in vitro de los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber, para lo cual se procedió a seguir la metodología antes descrita.

Los alcaloides totales fueron obtenidos a partir de la maceración y extracción en medio ácido/básico de los bulbos, que previamente fueron seleccionados, lavados, desinfectados, secados, molidos y tamizados. Durante la selección se desecharon los bulbos que estaban deteriorados y que presentaban señales de ataque por insectos u hongos. Para retirar la tierra adherida se realizó el lavado con agua corriente y, para eliminar la carga microbiana se realizó la desinfección con hipoclorito de sodio. Luego se cortaron los bulbos en láminas finas y se llevaron a secar, operación mediante la cual se produce la pérdida del carácter de tabique impermeable de la pared celular vegetal y se transforma en un tabique poroso, además se interrumpe la degradación causada por enzimas o fermentos, impidiendo así el desarrollo de microorganismos y reacciones de oxidación e hidrólisis. Teniendo en cuenta la ley de Fick en donde se enuncia que a menor tamaño de partícula mayor será la superficie de contacto con el solvente, se realizó la molienda, operación mediante la cual se produjo la destrucción parcial de las membranas celulares vegetales ahora porosas, con lo que se aumentó la difusión de sus constituyentes hacia el medio. Se tomó cuidado en no obtener fragmentos muy gruesos, pues durante la extracción la penetración del solvente en el tejido vegetal sería muy lenta y la salida de las sustancias extraíbles difícil. También se evitó la obtención de polvos muy finos que se compactarían más en presencia del solvente, dificultando el proceso de difusión. Se realizó el tamizado para asegurar que el tamaño de partículas obtenido sea uniforme. Una vez obtenido el tamaño de partícula adecuado se procedió a rBibliotecaealizar la macerac ióden, q uFarmaciae es una técnica d ey e xBioquímicatracción sólido/líquido en donde el material vegetal previamente fragmentado se pone en contacto con un determinado solvente (menstruo) y se guarda dentro de un recipiente ámbar para evitar posibles reacciones y, a temperatura ambiente para evitar la degradación de metabolitos termolábiles, pues se sabe que la basicidad de los alcaloides es un factor de inestabilidad en las moléculas, haciéndoles especialmente sensibles al calor y la luz. Para extraer la mayor parte de los constituyentes químicos de los bulbos, como los alcaloides, se utilizó un solvente de alta polaridad, en éste caso el metanol. No se usó sólo agua porque podría propiciar la 26

fermentación o la formación de mohos. El mecanismo por el cual se produjo la maceración inició con un proceso opuesto al del secado, el solvente al penetrar en la célula vegetal tiende a reconstituir su estado, al ingresar induce un momento dipolar en las moléculas de los compuestos que van a ser extraídos produciéndose la adhesión de las sustancias extraíbles a las moléculas del solvente, ésta capacidad de asociación se expresa en términos de constante dieléctrica. Cuanto más polar sea un solvente mayor será su respectiva constante dieléctrica; al igual que compuestos apolares se disolverán en solventes de baja constante dieléctrica. Los procesos extractivos interfieren en la constante de equilibrio desplazando el complejo “droga-solvente” hacia el exterior de la célula. Durante el período de almacenamiento se agitó el macerado con el fin de aumentar la velocidad de extracción, haciendo que nuevas cantidades del solvente, pobre en las sustancias extraíbles, entren en contacto con el sólido y un nuevo punto de equilibrio de saturación sea alcanzado; también para evitar el aumento de la viscosidad por un aumento en la concentración de la capa límite entre la célula del tejido vegetal y el menstruo; también se realizó para romper las paredes celulares, ayudando a mejorar la capacidad del disolvente para penetrar en las células y obtener un mayor rendimiento de extracción. Para garantizar la homogeneidad de la mezcla, se utilizó un baño de ultrasonido. Finalmente, se sabe que la extracción se detiene cuando se alcanza un equilibrio entre la concentración de metabolitos en el material vegetal y el solvente. La velocidad con la que se obtiene está en función del tamaño de partícula del material vegetal molido, así como, del grado de hinchamiento de las células (aumenta la permeabilidad de la pared celular y la difusión del solvente) y de las propiedades del solvente, como, por ejemplo, su viscosidad y polaridad. Una vez concluido el tiempo de maceración se procedió a filtrar el extracto y evaporar el solvente a presión reducida en un rotavapor, obteniéndose el extracto bruto, que por su consistencia es clasificado como un extracto blando35-40.

Un extractoBiblioteca es un preparado deconc eFarmaciantrado de consis tyen cBioquímicaia sólida, líquida o intermedia, derivado generalmente de material vegetal desecado. El extracto blando se define como el extracto fluido correspondiente a 4-6 kg de la droga, concentrado con vacío a una temperatura inferior a 60ºC hasta el peso de 1 kg de extracto. Para el caso del extracto seco, tiene una consistencia seca se obtiene por evaporación del disolvente y desecación del residuo, caracterizado por presentar una concentración muy superior de principio activo con respecto a la droga original, son bastante estables. El rotavapor es de gran importancia, ya

que con la rotación que produce aminora el peligro de ebullición y acelera la evaporación mediante el aumento de la superficie de la solución. El extracto bruto contiene además de la totalidad de los alcaloides presentes en la droga vegetal, impurezas, entre las cuales podemos citar: grasas, ceras vegetales, resinas, colorantes, taninos y otros. Para la obtención de los alcaloides totales se tomó en cuenta las propiedades que presentan los pertenecientes a la familia Amaryllidaceae, tales como: son bases débiles, su estructura base es C6-C1-N-C2- C6 donde la fracción C6-C1 deriva de L-fenilalanina (L-Phe) y la fracción N-C2-C6 deriva de L-tirosina (L-Tyr), generalmente contienen un solo átomo de nitrógeno que puede ser secundario, terciario o cuaternario, el número de átomos de carbono oscila entre 16 y 20 dependiendo de los sustituyentes del sistema anillado, tienen la propiedad de formar sales solubles en agua con ácidos orgánicos e inorgánicos, mientras que sus bases libres son solubles en los solventes orgánicos. Su solubilidad en los diferentes solventes está influenciada por el pH al que se encuentren, ya que pueden formar sales. En particular los alcaloides se ven favorecidos por la adición de ácidos al menstruo de extracción. En los vegetales el estado natural de los alcaloides es en forma de sal y normalmente se sintetizan en los cloroplastos y almacenan en las vacuolas celulares. La extracción de productos naturales progresa a través de las siguientes etapas: (1) el solvente penetra en la matriz sólida; (2) el soluto se disuelve en los solventes; (3) el soluto se difunde fuera de la matriz sólida; (4) se recogen los solutos extraídos. Sabiendo todo esto, se procedió a redisolver los extractos secos con una solución de ácido sulfúrico al 2% v/v, produciéndose la solubilización de los alcaloides en forma de sales (las bases orgánicas como las aminas forman sales de alcaloides solubles en agua) también se pueden remover todas las demás sustancias solubles en agua, como almidón, saponinas y proteínas. Luego se colocó el paso anterior en un embudo de separación y se agregó bencina, solvente encargado de la limpieza del extracto,Biblioteca dividiéndolo en d odes fase sFarmacia. En la fase orgán iyca sBioquímicae encontraron las materias grasas (pigmentos lipófilos, esteroles que pueden formar emulsiones) y materias neutras (clorofilas, ceras, mucílagos); mientras que en la fase acuosa se encontraron los alcaloides, mayormente neutros o ácidos; se realizó la limpieza tres veces. Por lo tanto, la fase orgánica fue desechada después de haber verificado con el reactivo de Dragendorf la ausencia de alcaloides. La fase acuosa ácida obtenida se basificó con Hidróxido de amonio hasta obtener un pH de 10 aproximadamente, al ser un solvente orgánico básico, permitió al alcaloide base separarse de las impurezas presentes en el medio, posteriormente se realizaron tres extracciones 28

sucesivas utilizando cloroformo, hasta conseguir que los alcaloides disueltos queden retenidos en la fase orgánica, obteniéndose así una fase acuosa alcalina, la cual se desechó. Para comprobar la presencia/ausencia de alcaloides se tomó una alícuota de la fase de interés, se acidificó con ácido clorhídrico concentrado, para luego agregarle el reactivo de Dragendorf que detecta los alcaloides por la formación de un precipitado naranja rojizo, éste precipitado es un compuesto de coordinación que está formado por tres moléculas de alcaloides en coordinación electrostática con el bismuto del reactivo de Dragendorff; también se utilizaron los reactivos de Mayer y Wagner. Una vez obtenidos los alcaloides totales se prepararon las concentraciones respectivas con dimetilsulfóxido36-45.

En la tabla 1, se observan los resultados de la identificación cualitativa de los alcaloides totales (AT) de las especies de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber, con los reactivos de Dragendorff, Mayer y Wagner, los cuales, al reaccionar con las sales de estos compuestos, muestran precipitados de color anaranjado, blanco y marrón respectivamente; hallándose una alta intensidad en los bulbos de Clinanthus ruber. Estos alcaloides se encuentran distribuidos en especies de la familia Amaryllidaceae. Hasta ahora, se conocen alrededor de unos 300 alcaloides de Amaryllidaceae con estructuras que varían notablemente entre sí, pero se consideran que están relacionados biogenéticamente46, 47. Asimismo, mediante la cromatografía de capa fina (CCF o en inglés Thin layer chromatography-TLC) se lograron separar los alcaloides totales de ambas especies, utilizando como fases móviles: I: CHCl3-EtOH (9.5:0.5), II: CHCl3-EtOH (9.5-0.5) saturado con NH3, III: CHCl3-EtOH (9:1), IV: CHCl3-EtOH (9:1) saturado con NH3 y fase estacionaria: Sílica gel 60F254. Estos alcaloides al ser revelados con el reactivo de Dragendorff, presentaron manchas de color anaranjado, los cuales, al medir los valores de Rf (factor de retención) se obtuvieron para Clinanthus incarnatus mayor cantidad de manchas (2 Bibliotecamanchas) en la fas ede II c oFarmacian Rfs de 0.12 y 0 .y48 ,Bioquímica en comparación a las otras fases I, III y IV; para Clinanthus ruber se obtuvo mejor separación en la fase III con 3 manchas con Rfs de 0.25, 0.29 y 0.78 lo que evidencia la presencia de alcaloides. Ésta técnica consiste en una cromatografía de "adsorción sólido-líquido", un procedimiento simple, rápido y económico en el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases inmiscibles, una de ellas es estacionaria, mientras que la otra es una fase móvil líquida que viaja hacia arriba a través de la fase estacionaria por medio de la acción capilar. La fase estacionaria es un adsorbente, frecuentemente gel de sílice, sus partículas contienen grupos 29

hidroxilo en su superficie que forman puentes de hidrógeno con moléculas polares. La fase móvil está constituida por el solvente cuyo poder eluyente aumenta al incrementar su polaridad. Los componentes de la muestra suben por la placa a diferentes velocidades que dependen de su solubilidad y de su grado de retención por la fase estacionaria. Así se consigue la separación de analitos, que se basa en la polaridad con algunos compuestos que se unen fuertemente al adsorbente y migran menos que otros. Los compuestos polares, tienen una fuerte afinidad por un adsorbente polar como la sílice y permanecen cerca del origen (OR), mientras que los compuestos menos polares, cerca del frente del solvente (SF), se dividen más fácilmente en los solventes (que son menos polares que la sílice a menos que se incluyan agua, ácidos o bases) y migran más arriba en la placa. Finalmente, la posición de cada molécula en la mezcla se puede medir calculando la relación entre las distancias recorridas por la molécula y el disolvente. Este valor de medición se denomina movilidad relativa y se expresa con un símbolo 푅푓, el valor se utiliza para la descripción cualitativa de las moléculas, además se emplean agentes cromatogénicos que ayudan a revelar algunas cromatografías, entre ellos el reactivo de Dragendorff. Con los resultados antes expuestos y los valores de 푅푓, se pudo inferir que Clinanthus incarnatus presenta la mayoría de alcaloides de tipo polar, pues se retienen más cerca al origen; mientras que Clinanthus ruber tendría principalmente alcaloides de tipo menos polares, pues presenta la mayoría de manchas retenidas en la marca del frente del solvente45, 48-50. En la tabla 3, se observa el rendimiento de alcaloides totales de los bulbos de las especies de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber, siendo estos de 0.71% y 0.81% respectivamente. Estos valores al compararlos con otras especies de la misma familia a la que pertenece (Amaryllidaceae) se encuentran dentro de los valores que reportan como: Phaedranassa glauciflora 0.3 %, Phaedranassa dubia 0.2 %, Phaedranassa narcissiflora 0.248 % y EBibliotecaucharis formosa 0de.079 %Farmacia, C. amabile 0.6 9y% ,Bioquímica Hymenocallis sp. 1.634%51-54. La cromatografía de gases es una técnica de separación de mezclas complejas volátiles, en donde todos los componentes de la muestra son separados, detectados e incluso cuantificados, pero no pueden ser identificados, debido a que muchos de estos compuestos tienen tiempos de retención similares para cada uno de los picos cromatográficos. Por otro lado, con la espectrometría de masas se puede identificar cualquier sustancia pura, pero no compuestos individuales de una mezcla sin separación previa, debido a la complejidad del espectro obtenido por la superposición de los espectros de cada componente, además mide 30

la relación masa/carga (m/z) de iones en fase gaseosa, proporcionando información sobre la abundancia de cada especie iónica. Por lo tanto, el acoplamiento de la cromatografía de gases con la espectrometría de masas permite la separación e identificación de mezclas complejas. Básicamente el procedimiento consiste en inyectar la mezcla de compuestos en el cromatógrafo de gases, que luego se separa en la columna cromatográfica obteniéndose eluciones sucesivas de los componentes individuales aislados, que pasan inmediatamente al espectrómetro de masas. Cada uno de los componentes corresponde a un pico cromatográfico que es identificado mediante su respectivo espectro de masas. En este proceso, el espectrómetro de masas no solo proporciona los espectros, sino que actúa también como un detector cromatográfico al registrar la corriente iónica total generada en la fuente iónica, cuya representación gráfica constituye el cromatograma o TIC (total ion current). Cuando se desea identificar uno o varios compuestos específicos, con mayor rapidez o con la mayor sensibilidad posible se utiliza la técnica de detección SIR (selected ion recording), de modo que se aumenta la selectividad del método y se reducen las interferencias. La identificación de los compuestos se realiza mediante comparación con compuestos de referencia. Los resultados del contenido alcaloideo se reportan teniendo en cuenta los patrones de fragmentación y los índices de retención de Kovats (RI), el tiempo de retención (RT) del metabolito y la cantidad porcentual referida al TIC (total ion current) de la mezcla y no del extracto crudo; los compuestos no identificados se reportan como relación masa/carga (m/z). En este estudio los alcaloides fueron identificados comparando sus espectros GC-MS y los valores del índice de retención de Kovats (RI) con los de alcaloides de Amaryllidaceae auténticos previamente aislados e identificados por métodos espectrométricos en el Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad de Barcelona44, 55-59.

En la tabla 4Biblioteca y en el gráfico 1 ,de se m uFarmaciaestran los resulta dyo sBioquímica obtenidos mediante CG-EM del bulbo de Clinanthus incarnatus, donde se observa que esta especie presenta 7 alcaloides, siendo la licorina el más abundante con una cantidad de 19.73 µg gal/100mg PS, seguido de galantina con una concentración de 10.36 µg gal/100mg PS, vittatina/crinina con una concentración de 10.22 µg gal/100mg PS, Hippamina 10.16 µg gal/100mg PS,3-O- acetilpowellina 10.14 µg gal/100mg PS, 11,12- deshidroanhidrolicorina 10.04 µg gal/100mg PS y en menor cantidad se encuentra 1-O-Acetillicorina con una concentración de 9.85 µg gal/100mg PS. 31

En la tabla 5 y en el gráfico 2, se muestran los resultados obtenidos mediante CG-EM del bulbo de Clinanthus ruber, donde se observa que esta especie presenta 6 alcaloides identificados y 2 sin identificar. De los 6 alcaloides identificados figuran en mayor concentración la licorina con una concentración de 70.2 µg gal/100mg PS, seguido de Anhidrolicorina con una concentración de 18.0 µg gal/100mg PS, 11,12- deshidroanhidrolicorina con una concentración de 5.87µg gal/100mg PS, 2,4-didehidro-2- deshidroxilicorina con una concentración de 4.15µg gal/100mg PS, 8-0-dimetilmaritidina con una concentración de 3.45 µg gal/100mg PS y en menor cantidad Hippamina con una concentración de 0.1 µg gal/100mg PS y 2 alcaloides sin identificar m/z 201;[M=273] Y m/z 125; [Tipo-homolicorina] con concentraciones de 0.1y 6.8 µg gal/100mg PS respectivamente. En ambas especies se ha encontrado como alcaloide mayoritario a la Licorina, el cual se encuentra presente en mayor cantidad en la especie de Clinanthus ruber, esto se explicaría porque las condiciones climáticas tales como temperatura, humedad relativa, radiación solar, fotoperiodo, disponibilidad de agua y nutrientes, entre otras, influyen sobre el desarrollo de las plantas y así mismo en la producción de sus metabolitos secundarios como los alcaloides, los cuales se generan mayormente en situaciones de estrés54.

En general, los alcaloides de las Amaryllidaceae están clasificados en nueve grupos distintos representados por norbelladina, licoriae, homolicorina, crinina, haemanthamina, narcilasina, tazettina, montanina y galantamina. En la biosíntesis de estos alcaloides participa el aminoácido aromático fenilalanina (L-Phe) como el precursor primario del fragmento C6- C1, que corresponde al anillo A y a la posición bencílica, mientras que la tirosina (L-Tyr) es el precursor del anillo C, de la cadena lateral de carbonos y del nitrógeno, fragmento C6-C2- N. A partir de éstos aminoácidos y a través de la ruta de los ácidos cinámicos y acoplamientos orto-para’, pBibliotecaara-para’ y para- oderto’, sFarmaciae derivan los alc aylo iBioquímicades existentes. Así tenemos a la licorina, pertenece a la clase de alcaloides isoquinolínicos y es uno de los principales componentes de los alcaloides anticancerígenos presentes en las plantas de la familia Amaryllidaceae, también tiene propiedades antiangiogénicas, antivíricas, antibacterianas, antiinflamatorias y antipalúdicas, además ejerce otras funciones biológicas, como la inhibición de la acetilcolinesterasa y la topoisomerasa, la supresión de la biosíntesis del ácido ascórbico y el control de la duración del período circadiano. La 1-O-acetil-licorina es otro alcaloide de tipo licorina que posee actividad inhibitoria muy efectiva de la 32

acetilcolinesterasa. La galantina también corresponde al tipo estructural de la licorina, además anhidrolicorina presenta actividad como antineoplásico potente sobre la leucemia linfocítica. Estos presentan su actividad inhibitoria gracias a la presencia de un anillo aromático C junto con el nitrógeno cuaternario. Por otro lado, los alcaloides de tipo crinina inhiben las líneas celulares tumorales, por ejemplo, la powelina ha sido reconocida por sus efectos citotóxicos, pero además como un potente inhibidor de acetilcolinesterasa, además de presentar efectos citotóxicos y de propiedades antimaláricas44,54, 60-62.

En la tabla 6 y el gráfico 3, se observa los porcentajes de inhibición de los alcaloides totales de las especies de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber frente a Plasmodium falciparum observándose que existe una relación directamente proporcional, es decir a mayor concentración, mayor es el porcentaje de inhibición del Plasmodium falciparum con diferencias estadísticamente significativa (p<0.05).

En el gráfico 4, se puede observar la concentración de inhibición media (CI 50), donde los alcaloides totales de las especies Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber, presentaron valores de 0.375ug/mL y 0.241 ug/mL respectivamente y estos al comparar con Cloroquina 0.046 ug/mL se encuentran por encima, con diferencias estadísticamente significativa. Asimismo, estos valores reportados al comprar con la Tabla 1 de los criterios de clasificación en nivel de actividad en el modelo in vitro (Adoptado de Willcox. M., et al. 2004) presentan actividad antimalárica con nivel de actividad bueno. Numerosas investigaciones manifiestan que la Licorina posee muchas propiedades como antiinflamatoria, antibacteriana, antitumoral, antiviral y antimalárica, se descubrió que la licorina es el alcaloide más potente contra Plasmodium falciparum. El análisis de la estructura química y la actividad antipalúdica de la licorina muestra que el mejor efecto antipalúdico se consigue con derivados deBiblioteca la licorina que pr edesent aFarmacian grupos hidroxil oy li bBioquímicares en C-1 y C-2, o esterificados como acetatos o isobutiratos. Además, el doble enlace C-2-C-3 también juega un papel importante en el efecto antiplasmodial de los derivados de la licorina 63, 64.

V. CONCLUSIONES

1. Mediante reacciones de coloración y precipitación y cromatografía de capa fina se logró identificar la presencia de alcaloides en los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber.

2. Mediante la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), se identificaron 7 alcaloides y 8 alcaloides en los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber respectivamente, siendo la licorina el alcaloide mayoritario en ambos con 19.73 ug gal/100 mg PS para Clinanthus incarnatus y 70,2 ug gal/100 mg PS.

3. Los alcaloides totales de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber presentan actividad antiplasmoidal frente a Plasmodium falciparum. con una inhibición de

90.1% y 94% y con CI50 de 0.375ug/mL y 0.241ug/mL respectivamente.

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ANEXOS

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ANEXO Nº 01

CONSTANCIA DE IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA

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ANEXO Nº 02

A B

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Figura Nº01. A. Recolección del material vegetal B. Clinanthus ruber-Otuzco C. Clinanthus incarnatus-Pataz.

ANEXO Nº03: EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES I. Preparación del material vegetal

B C

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D E

Figura Nº02. Preparación del material vegetal. A. Selección. B. Lavado C. Corte de los bulbos en láminas finas para secado D. Secado E. Molienda y Tamizado. 46

II. Preparación del Macerado

A B

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C D

Figura Nº03. Preparación del Extracto Metanólico A - B. Pesada del polvo de los bulbos C. Colocación del polvo de los bulbos para macerado D. Adición de metanol para maceración.

III. Obtención del extracto blando

A B

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Figura Nº04. Preparación de los Extractos blandos A. Filtración del macerado con Equipo de filtración al vacío B. Filtrado de los macerados de los bulbos de Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber D. Extracto blando, después de rotaevaporar. 48

IV. Extracción de alcaloides totales

A B C

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D E

Figura Nº05. A. Preparación de H2SO4 al 2% v/v B. Dilución de los extractos con la solución ácida C. Extractos diluidos se colocan en embudo de decantación y con papel tornasol se verifica la acidez del medio D - E. Adición de Bencina y observación de separación en dos fases (superior: fase orgánica, se descarta; inferior: fase acuosa).

A B

C Biblioteca de FarmaciaD y Bioquímica

Figura Nº06. A-B. Basificación de la fase acuosa ácida con NH4OH y comprobación del medio alcalino con papel tornasol. C. Extracción de alcaloides mediante uso repetido de Cloroformo y observación de separación en dos fases (superior: fase acuosa; inferior: fase orgánica). D. Se separa la fase orgánica rica en alcaloides y luego prepara las distintas concentraciones con Dimetilsulfóxido.

ANEXO Nº04

REACCIONES DE COLORACIÓN Y PRECIPITACIÓN

Figura Nº07. Reacciones con reactivos generales para identificar alcaloides en los bulbos de Clinanthus incarnatus. 1. Reacción con el reactivo de Dragendorff (precipitado anaranjado ++) 2. Reacción con Wagner (precipitado marrón ++) 3. Reacción con Mayer (precipitado blanco ++)

Biblioteca de Farmacia y Bioquímica

Figura Nº08. Reacciones con reactivos generales para identificar alcaloides en los bulbos de Clinanthus incarnatus. 1. Reacción con Dragendorff (precipitado anaranjado ++) 2. Reacción con Wagner (precipitado marrón ++) 3. Reacción con Mayer (precipitado blanco ++)

ANEXO Nº05

CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA (TLC) DE LOS ALCALOIDES TOTALES DE LOS BULBOS DE Clinanthus incarnatus y Clinanthus ruber

Figura Nº09. Aplicación de la muestra de los alcaloides totales en los cromatofolios de sílica gel 60F254

Figura Nº10. Separación e identificación de alcaloides de Clinanthus incarnatus por TLC.

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Figura Nº11. Separación e identificación de alcaloides de Clinanthus incarnatus por TLC. 52

ANEXO Nº06

ACTIVIDAD ANTIPLASMODIAL

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ANEXO Nº07

ANÁLISIS ESTADÍSTICO: ANOVA Y HSD TUKEY

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Nombrada

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