1 OBSAH
OBSAH...... 1 1. Úvod...... 2 2. Rešeršní část...... 3 2.1 Genom...... 3 2.2 Názvosloví jaderného obsahu...... 4 2.3 C value...... 4 2.4 Velikost genomu („Genome size“) ...... 5 2.5 Variabilita genomu...... 5 2.6 Význam velikosti genomu z hlediska fylogenetického...... 6 2.7 Korelace mezi velikostí genomu a eko geografickými parametry...... 7 2.8 Závislost velikosti genomu na délce života (typu životního cyklu) ...... 7 2.9 AT/GC poměr...... 8 2.10 Chromozomy...... 9 3. METODIKA A MATERIÁL ...... 10 3.1 Modelová čeleď Apiaceae Lindl. ...... 10 3.2 Metodika sběru dat...... 14 3.3 Průtoková cytometrie...... ...... 15 3.4 Vlastní měření...... 17 3.5 Stanovení obsahu DNA a poměru bazí ...... 18 3.6 Statistická analýza...... 19 4. Výsledky...... 20 4.1 Obsah jaderné DNA, AT/GC poměr a velikost chromozómů...... 20 4.2 Neparametrická korelace genomových parametrů a Ellenbergových hodnot...... 23 4.3 Korelace s geografickými parametry...... 24 4.5 Vztah velikosti genomu a životního cyklu...... 25 DISKUZE...... 27 ZÁVĚR...... 28 LITERATURA...... 29 2 1. ÚVOD Tato práce by měla být teoretickou přípravou pro diplomovou práci, která se bude zabývat obsahem DNA spolu s genomovým poměrem AT a GC bazí v čeledi Apiaceae. Oproti blízkým čeledím, jako jsou Asteraceae či Campanulaceae, se vyznačuje dosti vzácnou hybridizací, nízkou polyploidií a poměrně malou variabilitou v počtu chromozomů, alespoň co se týče českých druhů. Je proto taxonem značně kontrastním. Díky těmto vlastnostem je vhodným taxonem pro pozorování případných změn v genomu. Ve své bakalářské a diplomové práci se pokusím získat odpovědi na následující otázky týkající se studovaného taxonu: 1. Koreluje velikost genomu s počtem chromosomů? 2. Existuje kvantitativní rozdíl v rozsahu variability ve velikosti genomu či v chromosomovém počtu, způsobený fragmentací chromozomů či vznikem retroelementů? 3. Jsou primární velké, či malé chromozomy u primitivních rodů? 4. Koreluje velikost geonomu, AT frekvence, popř. počet chromosomů s nějakým ekologickým (eko geografický) parametrem sledovaných druhů? 5. Jaká je role velikosti genomu či AT frekvence ve fylogenetických vztazích? V rámci bakalářské práce byl změřen obsah DNA a vypočítána AT frekvence u 16 českých druhů čeledi Apiaceae, jež byly dále zpracovány do formy herbářových položek. Část každého vzorku (listu nebo květní stopky) byla zmrazena v hlubokomrazícím boxu pro případné nové měření. Literární rešerší jsou shrnuty současné poznatky o vztazích mezi velikostí geonomu a ekologickými a geografickými parametry druhů, dále význam frekvence AT bazí u organismů z hlediska fylogenetického a ekologického. Z metod využívaných při výzkumu genomu je zde popsána proudová cytometrie. V samostatné kapitole jsou uvedeny výsledky pilotní studie. 3 2. REŠERŠNÍ ČÁST
2.1 Genom Genom je souhrn dědičné informace zakódované v deoxyribonukleové (u virů ribonukleové) kyselině. Kromě genů nesoucích informaci však zahrnuje také nekódující sekvence. Tvoří ho jedna sada chromozomů (n). Genom může být chápán jednak jako jaderný obsah DNA, jednak DNA semiautonomních organel (mimojaderná DNA prokaryotického typu), případně souhrn všech genů. S pojmem „genom“ poprvé přišel roku 1920 profesor botaniky z univerzity v Hamburku, Hans Winkler, který ve své knize Verbreitung und Ursache der Parthenogenesis im Pflanzen - und Tierreiche (Verlag Fischer, Jena) spojil slova „ge ny“ a „chromoz óm “. V jeho pojetí se genom rovnal haploidní sadě chromozomů. ( www 2)
2.2 Názvosloví jaderného obsahu K popsání jaderného obsahu DNA bývá používáno několik termínů. Pojem „velikost genomu“ je často dosazován za obsah DNA monoploidního genomu nebo chromozomové sady, zatímco „DNA C value“ znamená somatický obsah DNA celého chromozomového komplementu neboli karyotypu bez ohledu na stupeň ploidie organismu. Toto tradiční označení používají ve svých pracích např. Bennett et al. (1998) a Johnston et al. (2005). Nicméně oba pojmy bývají často užívány jako synonyma (Obermayer & Greilhuber 1999, Leitch et al. 2005). Greilhuber et al. (2005) proto nabízí novou terminologii, aby se význam těchto výrazů ujednotil. Pro monoploidní obsah DNA (v případě, že známe stupeň ploidie organizmu) doporučují používat „Cx value“. U polyploidů se za Cx považuje průměrná velikost jedné chromozomové sady. Pro obsah DNA chromozomového komplementu, který je charakteristický pro konkrétní organismus, nezávisle na polyploidiích, aneuploidiích atd., přináší pojem holoploidní velikost genomu (zkráceně C value). Pro kvantitativní určení velikosti genomu se pro C value používají celá čísla, např. 1C, 2C, 1Cx, atd. Somatické buňky nereplikujících se diploidních organismů tedy mají velikost genomu 2C. Toto pojetí není ještě všeobecně používáno. Jaderný obsah DNA může být vyjádřen v pikogramech (pg) nebo v megapárech bazí (1pg = 978 Mpb) (Doležel et al. 2003). 4 2.3 C value Označení C Value pochází od Hewsona Swifta (1950), který ve své práci používal 1C value, 2C value atd., aby odlišil množství DNA v replikujících se a nereplikujících se buňkách. Vědecká komunita dlouho přesně nevěděla, co ono „C“ znamená („characteristic“, „content“, „class“ nebo „complement“). Swift tento pojem r. 1975 vysvětlil v korespondenci s Prof. Michaelem D. Bennettem. Napsal, že „C“ značí „constant“, tedy množství DNA charakteristické pro určitý genotyp. „C value“ se pak ustálilo na haploidní obsah DNA, jak se používá dodnes (Bennett & Leitch 2005a). 2.4 Velikost genomu („Genome size“)
Poprvé se tento termín objevil v článku Hinegardnera v roce 1968. V tomto kontextu byl myšlen počet genů, čili genotyp. O rok později byl již tento pojem použit v moderním pojetí (obsah DNA) autory Wolf et al. (1969). Do běžného používání se dostal pravděpodobně díky knize Evolution by Gene Duplication ( Ohno1970).
Dnes je velikost genomu díky usilovné práci vědců z celého světa známa u více než pěti tisíců druhů rostlin, z toho téměř 4500 je krytosemenných (Bennett & Leitch 2005b). Nejmenší obsah DNA u krytosemenných byl naměřen u Genlisea margaretae z čeledi Lentibulariaceae (1C = 63 Mpb ~ 0.064 pg) (Greilhuber et al. 2006), největší genom má Fritillaria assyriaca , Liliaceae (1C = 124597,2 Mpb ~ 127,40 pg) (Bennett & Leitch, 2005b). Variabilita ve velikosti genomu v rámci krytosemenných rostlin je tedy téměř 2000násobná. Proč měřit velikost genomu? Jak píšou Hanson et al. (2001): „Velikost genomu je klíčová hodnota biodiverzity a má velký význam pro studium evoluce“. Slouží k:
• Odlišení druhů se stejným počtem rozdílně velikých chromozomů (např. Dryopteris dilatata agg.) • Určení hybridů, jejichž rodiče se neliší stupněm ploidie (např. v rodu Agropyron ) • Stanovení genomového složení u allopolyploidních typů (např. Musa) • Zjištění korelací mezi velikostí genomu a dalšími vlastnosti (fenotyp, fenologické či ekologické chování) a jejich pozdější predikovatelnosti 5 odhalení agmatoploidie (neletální fragmentace chromozómů díky difúzní centroméře) (např. v čeledích Cyperaceae a Juncaceae )
2.5 Variabilita genomu
Důležitost znalosti velikosti genomu jakožto užitečného taxonomického znaku byla podtrhována při mnoha studiích rozličných skupin. Rostlinný genom je považován za celkem stabilní a je jedním z význačných znaků definujících biologický druh. Velké rozdíly v obsahu DNA, které můžou existovat mezi druhy, lze korelovat s různými vlastnostmi na jaderné, buněčné, pletivné či organismální úrovni (Bennett 1972, 1973, 1985; Cavalier Smith 1985; Price 1988a). Jsou to vlastnosti jako: minimální generační čas (Bennett 1972), růst v různých zeměpisných šířkách a ekologických podmínkách (Bennett 1976; Grime & Mowforth 1982; Grime 1990; Ohri et al. 1998), velikost semen (Thompson 1990; Ohri et al. 1998), vodní režim jehličnanů (Ohri & Khoshoo 1986; Wakamiya et al. 1993, 1996), fyziologie (Jasienski & Bazzaz 1995) a vývoj (Bharathan 1995) Také vnitrodruhová variabilita (je podstatně menší než mezidruhová) ve velikosti genomu za konstantního chromozomového počtu je v současnosti středem zájmu. Jde totiž o změny vedoucí k divergenci a evoluci druhů. Ke změnám může docházet z rozličných důvodů: kvůli heterochromatinovému polymorfismu, B chromozomům, aneuploidii, polyploidii nebo hybridizaci. Při různých experimentech se navíc ukázalo, že genom je schopen změn díky tzv. fluidním doménám, které podstupují rychlé změny v závislosti na makro nebo mikroenvironmentálních podmínkách (Ohri 1998). 2.6 Význam velikosti genomu z hlediska fylogenetického K tomu, aby byl plně pochopen evoluční význam proměnlivosti genomu, bylo třeba zhodnotit fylogenetickou složku této variability. Leitch et al. (1998) zkoumali 15 skupin vyšších řádů krytosemenných rostlin a srovnávali stará data s novými. Všimli si, že většina druhů měla malé genomy, jen dvě vzdáleně příbuzné skupiny měly genomy větší. Podobný trend byl pozorován na nejnižších taxonomických úrovních těchto dvou skupin: vysoké C values měly pouze druhy z nejodvozenějších čeledí. Z toho vyvodili závěr, že původnější krytosemenné rostliny mívají malé genomy, zatímco velké genomy jsou odvozená vlastnost, která se během evoluce objevila alespoň dvakrát, nezávisle na sobě. U nahosemenných rostlin, sesterské skupiny krytosemenných, jsou genomy větší. Ovšem i v rámci krytosemenných lze 6 objevit primitivní druhy s obrovským genomem. Tomuto fenoménu se říká „C value paradox“, což je nepoměr nebo nepravidelnost mezi organismální složitostí a velikostí genomu navzdory hlavnímu biologickému předpokladu, že komplexnější organismy mají komplexnější genom. (Thomas 1971). Je to pravděpodobně způsobeno zmnoženými sekvencemi, které nemusí nést genetickou informaci (tzv. sobecká DNA). U krytosemenných může zabírat až 99% genomu (Bennett & Leitch 1995). V roce 2005 Leitch et al. rekonstruovali ancestrální C value u různých skupin suchozemských rostlin a potvrdili, že krytosemenné rostliny měly (stejně jako mechorosty) primárně velmi malé genomy (méně než 1,4 pg). Vznik velkých genomů se zdá fylogeneticky omezen, objevuje se nezávisle jen u některých jednoděložných a Santalales (Soltis et al. 2002). Kapraďorosty a nahosemenné druhy nesly genomy střední velikosti (3,5 14 pg). Výjimkou jsou např. Gnetaceae (nahosemenné), u kterých v průběhu evoluce došlo k poklesu velikosti genomu. Bennetzen and Kellogg (1997), kteří se zabývali velikostí genomu u trav, uvádějí, že evoluce vede primárně od malých k velkým genomům díky akumulaci retroelementů a polyploidii. Ohri (1998) doplňuje, že pokles i vzrůst velikosti genomu můžou korelovat s evolučními pokroky v rámci skupiny a členění taxonů na základě C value může někdy korespondovat se schématy založenými na jiných znacích. Možnost Rredukce DNA obsahu v průběhu evoluce byla potvrzena Wendelem et al . (2002) u taxonu Gossypieae, kde dokonce pokles převažoval nad růstem jaderného genomu. Evoluční redukce genomu byly prokázány také např. v některých druzích rodu Sorghum (Price et al., 2005). Rejmanek (1996) a Bennett et al . (2000) přišli s myšlenkou, že velké genomy vedou k většímu riziku vyhynutí druhu. Vinogradov (2003) tuto teorii ověřil a navíc otestoval, že polyploidie, která jinak přináší výhody díky většímu obsahu genů a různorodosti, toto riziko nesnižuje. 2.7 Korelace mezi velikostí genomu a eko geografickými parametry Pro studium vztahu mezi obsahem DNA a faktory prostředí lze s úspěchem použít Ellenbergovy indikační hodnoty (Ellenberg et al. 1992). Byly přiřazeny k jednotlivým druhům střední Evropy na základě terénní zkušenosti a odráží ekologické chování druhu: L (závislost na světle), T (teplota), K (kontinentalita druhu), F (závislost na vlhku), R (půdní reakce), N (úživnost stanoviště), S (salinita). Jsou ordinální povahy v rozsahu 1 9 (příp. 1 12 u F), přičemž 1 značí minimální a 9 maximální závislost. Např. R = 1: druh se nachází pouze na extrémě kyselých půdách, R = 2: pouze na neutrálních až bazických půdách. V jedné 7 hodnotě je obsažen celý komplex environmentálních proměnných a je souhrnem těchto podmínek za čas. Např. N integruje několik ekologogických parametrů: dostupnost vody, aeraci půdy, pH půdy, disturbance. Některé Ellenbergovy indikační hodnoty jsou vzájemně korelované – např. negativní korelace mezi L a N (Diekmann & Dupre 1997, Ellenberg et al. 1992). Bureš et al. (2004) ve své práci uvádí signifikantní negativní korelaci velikosti genomu s hodnotami pro vlhkost (F) a kontinentalitu (K), to jest že druhy s menšími genomy upřednostňují humidnější podnebí a větší kontinentalitu. Korelace zeměpisné šířky, dostupné vlhkosti, teploty a růstové formy s jaderným obsahem DNA prokázali např. Stebbins (1966) ; Price (1988b) a Bennett et al. (2000). Bureš et al. (2004) ve studii o Cirsiích detekovali negativní korelaci velikosti genomu a rozšíření na východ, což odpovídá Ellenbergově indikační hodnotě K (v Evropě roste kontinentalita směrem k východu). Druhy s nejmenšími genomy ( C. heterophyllum, C. canum a C. oleraceum ) měly obrovskou distribuci, ale korelace nebyla signifikantně potvrzena. Korelace nebyla prokázána ani u rozšíření směrem k severu a do vyšších nadmořských výšek. Vekemans et al. (1996) ve své studii vnitrodruhové variability v obsahu DNA u 19 populací Armeria maritima zjistili rozdíl 7% mezi kalifornskými (větší genomy) a Evropskými rostlinami. V rámci Evropy se populace nelišily (srovnávány byly populace přímořské a kontinentální, populace na půdách znečištěných těžkými kovy a půdách čistých). 2.8 Závislost velikosti genomu na délce života (typu životního cyklu) Autoři, kteří studovali korelaci mezi velikostí genomu a délkou života, opakovaně zjišťovali, že jednoleté rostliny mají menší genomy než jejich příbuzné rostliny dlouhověké (Bennett 1972, Bureš et al. 2004, Price et al. 2005). Také dvouleté rostliny mají genomy větší než jednoleté. Rychlejší růst a vývoj díky malému genomu zřejmě nebudou příliš výhodné pro tyto dvouletky. Ty jsou navíc v mírném pásu závislé na ekologických a klimatických podmínkách a podle toho přepínají mezi dvouletým a víceletým cyklem. Můžeme soudit, že je tu větší ekologická podobnost mezi dvouletkami a trvalkami než mezi ročními a dvouletými rostlinami. Vzácně může být trend ve velikosti genomu u jednoletých a trvalých rostlin obrácený, než jak bylo uvedeno (Bureš et al. 2004). 8 2.9 AT/GC poměr Báze adenin a thymin jsou v nukleových kyselinách vzájemně spojeny 2 vodíkovými můstky, což vede k tomu, že oproti G C párům se třemi vodíkovými můstky jsou mnohem méně stabilní. Úseky DNA s vysokým procentuálním obsahem AT bazí se tedy mnohem snadněji rozdělí na dva řetězce (např. při transkripci), jsou méně odolné vůči UV záření a denaturují při nižších teplotách. Posun k vysokým procentům AT bazí byl zjištěn u bakterií a archeí, které žijí ve speciálních nikách, jako např. endosymbionti (kteří díky genetickému driftu ztratily opravné mechanizmy udržující AT/GC poměr na stabilní úrovni) či volně žijící mořské mikroorganismy. Tyto organismy pak využívají přednostně aminokyseliny kódované adeninem a thyminem (Wernegreen 2003). Nízký obsah GC bazí u bakterií může být výhodou díky snížené potřebě dusíku, protože pro molekulu guaninu je potřeba jeden atom dusíku navíc oproti jiným bazím (Moran & Plague 2004, Dufresne et al. 2005, Giovannoni et al. 2005). Bolhuis et al. 2006 nabízí jako další možnou příčinu vysoký obsah hořčíku v prostředí. Ten způsobuje stabilizaci DNA, což by v kombinaci s vysokým GC obsahem mohlo negativně ovlivnit replikaci či transkripci přílišnou pevností DNA struktury. Proto genom bohatý na AT báze může být evoluční odpovědí na působení hořčíku. Poměr komplementárních bazí adeninu s thyminem (AT) a guaninu s cytosinem (GC) je dalším ze znaků, kterým se odlišují druhy. Godelle et al. (1993) zjistili pozitivní korelace ve velikosti genomu, obsahu heterochromatinu a poměru AT bazí, ovšem pouze u živočichů. Příbuzné druhy tedy mají podobnou skladbu heterochromatinu s podobným AT/GC poměrem. Údaje o poměru bazí lze proto použít k posílení fylogenetických stromů (Phillips et al. 2004). Vinogradov (1994), který měřil velikost genomu a obsah GC bazí u obratlovců, došel k závěru, že GC/AT poměr pozitivně koreluje s velikostí genomu nejen u živočichů, ale i u krytosemenných rostlin. Tento svůj názor však opřel jen o malé množství rostlinných druhů. Barow & Meister (2002) jeho předpoklad ověřovali na 54 druzích a zjstili, že zde signifikantní korelace neexistuje. U čtyř populací Armeria maritima z rozdílných ekogeografických oblastí nebyly pozorovány signifikantní rozdíly v obsahu AT bazí, a to i přesto, že se jinak lišily velikostí genomu. Proto se zdá, že evoluce v AT/GC poměru v rámci druhu je u rostlin značně omezená a že změna v množství DNA nemusí být způsobena jen zmnožením heterochromatinových oblastí bohatých na GC báze.(Vekemans & al.,1996) 9 2.10 Chromozomy Jejich počet, tvar a velikost jsou znaky, které je možné spolu s dalšími (morfologickými, fytogeografickými, ekologickými, chemickými atd.) využít k charakteristice druhů a nižších taxonů. Existují rody, v jejichž rámci se druhy výrazně odlišují somatickými počty chromozomů ( Crepis ), nebo jsou naopak téměř uniformní ( Malus , Pyrus , Crataegus , Sorbus ). Zajímavá je čeleď Pinaceae obsahující jen diploidy s 2n = 24. Základní počet může být změněn polyploidizací (uvádí se, že nejméně 80% recentních krytosemenných prošlo v minulosti aspoň jedním cyklem polyploidizace), hybridizací nebo přítomností tzv. B chromozómů („nadbytečných“, akcesorických) u vyšších rostlin (časté v čeledích Poaceae , Asteraceae , Cichoriaceae , Liliaceae ) (Skalická 2005). Nejnižší známý počet chromozomů u krytosemenných rostlin se nachází u Haplopappus gracilis (2n = 4) z čeledi Asteraceae , nejvyšší (i přes 200) nalezneme u polyploidních apomiktických druhů rodu Poa . Vůbec největší karyotyp má kapradina Ophioglossum reticulatum (2n vyšší než 1200). Velikost chromozomu u rostlin se pohybuje od 0,2 m ( Cyperaceae ) do 25 m ( Lilium ). (Krahulcová 1998) 10 3. METODIKA A MATERIÁL
3.1 Modelová čeleď Apiaceae Lindl. Taxonomické začlenění: „vlastní“ dvouděložné → asteridová větev → oddělení Magnoliophyta → třída Magnoliopsida → podtřída Euasteridy II → řád Apiales (Lindl.) → čeleď Apiaceae → podčeledi: Mackinlayoideae (Plunkett & Lowry), Azorelloideae (Plunkett & Lowry), Saniculoideae (Burnett), Apioideae (Seem.) Rozšíření: Čeleď Apiaceae (miříkovité) je se svými 2850 druhy sedmnáctou nejbohatší čeledí na světě. Rodů je asi 270, jejich členění je komplikované a bývá řešeno různě. V České republice se vyskytuje 69 druhů. Tato čeleď je považována za kosmopolitní, s těžištěm rozšíření v mírných pásech severní a jižní polokoule. Do tropů zasahuje pouze ojediněle, na druhou stranu sahá areál dosti daleko do subpolárních oblastí obou polokoulí. Morfologie: Miříkovité jsou jednoleté až vytrvalé byliny, lysé nebo s chlupy, se sekrečními buňkami a kanálky ve vegetativních částech a v oplodí. Obsahují éterické oleje, kumaríny, saponiny, flavonoidy, alkaloidy, glykosidy, acetyleny a jiné aromatické látky. Lodyha je dutá a rýhovaná, listy střídavé, bez palistů, čepel bývá členěná nebo složená, výjimečně celistvá. Řapík lodyžních listů má většinou zřetelnou pochvu. Květenstvím je okolík (jednoduchý či složený) nebo strboul. Pod květenstvím může být obal, resp. obalíček pod okolíčky, z podpůrných listenů. Květy jsou zpravidla aktinomorfní, oboupohlavné, zřídka druhotně jednopohlavné, nebo dokonce různopohlavné. Kalich tvoří 5 lístků nebo cípů (případně je zakrnělý), koruna je složena z pěti volných lístků. Plodem je dvounažka rozpadající se ve 2 merikarpia. (Tomšovic 1997) Karyologie: Rody v čeledi Apiaceae jsou často charakterizovány různými základními čísly: sady chromozomů jsou tvořeny násobky čísel od 6 do 11 (Krahulcová 1998). Počet chromozomů (2n) se u českých druhů pohybuje od 12 ( Torilis japonica (Hout.) DC.) do 42 ( Aegopodium podagraria L.), což je oproti jiným, příbuzným čeledím, velmi malý rozsah (Graf 1.). U Silaum silaus (L.) Sch. et Thell. se mohou vyskytovat B chromozomy (22 + 0 1B (Lab. střed.), 22 + 0 3B (Hornomor. úv.)). Nepravidelný je počet chromozomů u Carum carvi L. (20/22 chromozómů) a Chaerophyllum temulum L. (14, 22 chromozómů ) (Tomšovic, 1997). 11 Graf 1. Počty chromozomů podle Kubáta et al. 2002
Srovnání počtu chromozómů českých druhů
168 156 144 132 120 108 96 Apiaceae 84 Campanulaceae 2n 72 Asteraceae 60 48 36 24 12 0 min. 2n max. 2n Ploidní úroveň čeledi je téměř výhradně 2n (Bennett & Leitch 2005b), jako tetraploid se občas vyskytuje Libanotis pyrenaica (L.) Bourgeau (22/44 chromozómů, uvádí se též 33) a Pimpinella saxifraga L. (20/40 chromozómů) (Tomšovic 1997). Mowforth (1986) uvádí pro Pimpinella saxifraga L. 4n=36. Hexaploidní je Daucus montanus (Humb. & Bonpl.) (Owens 1974 ). U českých druhů nejsou známy žádné hybridy (Kubát et al. 2002). Podle dostupných dat v databázi RBG Kew DNA C values (47 druhů) je průměrná velikost genomu 1C = 2,58 pg, minimum je 1C = 0,63 pg ( Oenanthe fistulosa L.) a maximum 1C = 5,48 ( Daucus montanus Humb. & Bonpl.). Zahrnu li i svá naměřená data, pak nejmenší genom má Bupleurum falcatum L. (1C = 0,38 pg). Význam: Do čeledi patří hodně užitkových rostlin pěstovaných jako zelenina nebo koření (Petroselinum crispum , Daucus carota , Carum carvi , Coriandrum sativum …), stejně jako prudce jedovaté druhy ( Conium maculatum , Chaerophyllum temulum ...). Využití nachází v kosmetice a farmakologii. Fylogenetické vztahy: Podle fylogenetických studií existují jisté podobnosti mezi čeleďmi Apiaceae , Araliaceae , Pittosporaceae , Myodocarpaceae a některými Asterales (hl. Campanulaceae s.l. a Asteraceae ), ovšem je nepravděpodobné, že by tyto podobnosti byly synapomorfiemi mezi jmenovanými skupinami.(www3) Příbuznost s jinými skupinami ukazují následující obrázky s fylogenetickými stromy (Obr. 1, Obr. 2). 12 Obr. 1: Apiales
13 Obr. 2: Krytosemnné rostliny
’ 14 3.2 Metodika sběru dat Ideálem bylo nasbírat co nejvíce druhů z území České republiky, každý ze tří lokalit. Pro bakalářskou práci se podařilo během srpna a září 2006 nashromáždit data o 16 druzích, ale cíl tří lokalit se podařilo naplnit jen u některých (Tab. 1, Tab. 2, Tab. 3). Jednalo se o lokality v okolí Brna nebo přímo v Brně. Rostliny byly sbírány pokud možno i s kořenovými baly, aby vydržely co nejdéle čerstvé, a poté byly uchovávány ve sklenici s vodou. Protože velmi rychle uvadaly, bylo potřeba je co nejrychleji změřit na cytometrech. Z rostliny bylo odebráno několik mladých listů, které mohly být uchovány v poměrně čerstvém stavu v plastových sáčcích v lednici alespoň dva dny pro opakované měření. Část listů byla uložena při 80ºC do hlubokomrazícího boxu pro případné další měření. Suda & Trávníček (2006) uvádí, že pro měření ploidní úrovně se takto mohou vzorky uchovávat až 3 roky, aniž by se snížila spolehlivost měření. Zbytek rostliny byl vylisován pro herbářovou položku. Tab. 1
2n Lokalita 1 souřadnice Bupleurum falcatum 16 Velká Klajdovka,stráň u lomu, Brno Líšeň 49°13'1.17"N,16°40'40.38"E Conium maculatum 22 břeh Svratky, V od Přízřenic 49°8'54.4"N,16°37'43.69"E Daucus carota 18 Trýbova 8a, Brno 49°11'43.13"N,16°35'35.61"E Eryngium campestre 28 zahrádky Brno Řečkovice, V od železnice 49°14'46.54"N,16°35'32.51"E Falcaria vulgaris 22 stráň u silnice z Rebešovic směr Brno 49°6'42.9"N,16°38'45.98"E Chaerophyllum aromaticum 22 zahrádky Brno Řečkovice, V od železnice 49°14'40.7"N,16°35'42.02"E Pastinaca sativa 22 trávník před kasárnami, Brno Řečkovice 49°15'3.64"N,16°34'35.57"E Petroselinum crispum 22 Troubsko,Národního odboje 70,zahrada 49°10' 0.98'' N,16°30' 57.32'' E Peucedanum alsaticum 22 hřiště ul. Koniklecova, Brno Kamenný vrch 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E Peucedanum cervaria 22 Kamenný vrch, Brno, V okraj rezervace 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E Pimpinella major 20 trávník před kasárnami, Brno Řečkovice 49°15'3.19"N,16°34'36.05"E Pimpinella saxifraga 20 Kamenný vrch, Brno, V od rezervace 49°10'50.01"N,16°33'21.78"E Sanicula europaea 16 les Vel. Klajdovka, u pom. S.K.Neumanna 49°13'45.41"N,16°41'6.9"E Seseli annuum 16 hřiště ul. Koniklecova, Brno Kamenný vrch 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E Seseli osseum 18 hřiště ul. Koniklecova, Brno Kamenný vrch 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E Torilis japonica 16 lem lesa, za Lachemou Brno Řečkovice 49°14'56.79"N,16°35'49.46"E Tab. 2
2n Lokalita 2 souřadnice Bupleurum falcatum 16 zahrádky Brno Řečkovice, V od železnice 49°14'44.84"N,16°35'37.89"E Daucus carota 18 lesní cesta, Lachema Řečkovice 49°14'52.5"N,16°35'51.74"E Eryngium campestre 28 stráň blízko Radostického mlýna 49°8'9.13"N,16°29'56.19"E Chaerophyllum aromaticum 22 les JZ od Střelic,žl. tur. zn. 250 m od silnice 49°8'34.07"N,16°31'42.85"E Pastinaca sativa 22 u silnice naproti Baumaxu, Brno Komárov 49°9'59.95"N,16°37'36.51"E Petroselinum crispum 22 Bašného 72, Brno Kohoutovice, zahrada 49°11'35.93"N; 16°32'6.11"E Peucedanum alsaticum 22 Kamenný vrch, Brno, V od rezervace 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E Peucedanum cervaria 22 Velká Klajdovka,stráň u lomu, Brno Líšeň 49°13'1.49"N,16°40'29.71"E Pimpinella major 20 cyklostezka z Rebešovic směr Brno 49°6'48.3"N,16°38'44.88"E Pimpinella saxifraga 20 trávník před areálem kasáren, Brno Řečkovice 49°15'3.19"N,16°34'36.05"E Seseli osseum 18 Hády, okraj lomu 49°13'1.37"N,16°40'24.07"E Torilis japonica 16 1km od Anenského mlýna směr Radostice 49°8'5.95"N,16°31'20.81"E 15 Tab. 3
2n Lokalita 3 souřadnice Bupleurum falcatum 16 Květnice u Tišnova, svah 49°21'19.37"N,16°24'55.21"E Daucus carota 18 podél silnice z Radostic do Střelic 49°8'13.4"N,16°28'21.55"E Eryngium campestre 28 Kamenný vrch, Brno, V od rezervace 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E Chaerophyllum aromaticum 22 Radostický mlýn, u Radostic 49°8'33.57"N,16°28'37.4"E Pastinaca sativa 22 les.cesta, Lachema, Řečkovice 49°14'52.5"N,16°35'51.74"E Petroselinum crispum 22 Charbulova 80, Brno, zahrada 49°11'7.35"N,16°38'6.75"E Pimpinella major 20 trávník za Lachemou, Řečkovice 49°14'53.59"N,16°35'29.12"E Pimpinella saxifraga 20 zahrádky V od železnice,Brno Řečkovice 49°14'44.43"N,16°35'39.49"E 3.3 Průtoková cytometrie Je to technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic v suspenzi na základě jejich průchodu paprskem ultrafialového či laserového záření. Fluorescenční barviva (fluorochromy) navázané na analyzované buňky nebo částice absorbují světlo určité vlnové délky vyzařované laserem a následně vyzařují (emitují) část takto absorbovaného světla, avšak již o odlišné vlnové délce. Původně byla tato metoda vyvinuta pro analýzu krevních buněk, v současnosti je její využití rozšířilo na základní i aplikovaný výzkum různých biologických oborů, používá se při klinických diagnózách, v lékařství i v průmyslu (ke stanovení obsahu jaderné DNA, určení ploidie, analýze buněčného cyklu, studiu genové exprese, počítání a určení typu krevních buněk, detekci a charakterizaci mikroorganismů, třídění požadovaných částic, atd.). Cytometrická analýza má oproti mikroskopické analýze tu výhodu, že s ní lze měřit prakticky neomezené množství částic (100000 i víc) ve velmi krátkém čase (řádově minuty). Také vizualizace miniaturních struktur pod mikroskopem nebývá příliš jednoduchá. V rostlinné biosystematice průtoková cytometrie slouží především k zjištění ploidní úrovně, k měření velikosti jaderného genomu, k detekci způsobu rozmnožování a fáze buněčného cyklu a k třídění chromozomů pro genetické mapování (www 4). K vlastní analýze slouží přístroje nazývané průtokové cytometry. Při měření obsahu jaderné DNA u čeledi Apiaceae v této práci byly používány cytometry Partec Ploidy Analyser I, Partec GmbH., Münster, Německo (vzorky barvené DAPI) a Partec CyFlow Green Laser, Partec GmbH. (barvení pomocí PI) z laboratoře proudové cytometrie na Katedře botaniky Masarykovy univerzity. Vzorky se měřily paralelně na obou cytometrech. (www 5, www 6) Princip průtokové cytometrie: Před samotným měřením je nutné, aby se na dvoušroubovice DNA studovaných částic navázalo fluorescenční barvivo (fluorochrom). Je potřeba, aby se vázalo specificky pouze na 16 DNA a aby jeho množství bylo úměrné množství DNA. Po ozáření světlem o vhodné vlnové délce (zdrojem může být laser nebo vysokotlaká rtuťová výbojka) je barvivo excitováno a následně se vrací do původního energetického stavu za vyzáření světla a tepla. Světlo má poté delší vlnovou délku než je původní excitační záření, protože je ochuzeno o tepelnou energii. Pomocí filtrů lze jednotlivá záření oddělit a měřit množství fluorescence (Suda 2004). Průtokový cytometr: Má tři hlavní části: fluidní, optický a elektronický systém. Ve fluidním systému jsou buňky hnány kapilárou do průtokové komůrky (flow chamber), kterou pod velkým tlakem proudí tzv. unášecí kapalina (PBS, komerční tekutiny jako FACSFlow, Bioton, Unisol). Buňky jsou pak vznikajícím zrychlením seřazeny jedna za druhou a takto prochází paprskem monochromatického laseru (nejčastější bývá argonový laser chlazený vzduchem o vlnové délce 488 nm). Tento princip se nazývá hydrodynamická fokusace. Optický systém je tvořen z excitační části (laser, soustava čoček a hranolů usměrňujících světelný paprsek) a části sběrné (zrcadla a filtry k detekci světelných kvant specifické vlnové délky. Elektronický systém převádí optický signál na elektrický a digitalizuje jej pro počítačovou analýzu. Data mohou být zobrazena např. ve formě dvourozměrného grafu („dot plot“), ve kterém je každá buňka zobrazena jako tečka, nebo jako histogram. (www 7) Fluorochromy: Jsou to chemické částice schopné absorbovat světlo a potom vyzářit fluorescenci o odlišné vlnové délce. Fluorescence samotných částic je slabá, ale vrůstá po jejich navázání se na nukleové kyseliny. Můžeme rozlišit tři typy barviv podle způsobu vazby: 1) barviva kvantitativně se vmezeřující do dvoušroubovice 2) barviva selektivně se vázající na úseky bohaté adeninem a thyminem 3) barviva selektivně se vázající na úseky bohaté cytosinem a guaninem Do první skupiny patří Propidium jodid (PI) a Ethidium bromid (EB), které jsou excitovány v modro zelené oblasti spektra a emitují červené záření. PI je rozšířenější kvůli trochu nižším koeficientům variance a menší toxicitě. Obě barviva se vážou také k dvouřetězcové RNA, proto je třeba k analyzovaným vzorkům přidávat dostatečné množství ribonukleázy, která RNA rozruší. 17 Druhá skupina zahrnuje barviva 4´,6 diamidino 2 fenylindol (DAPI), DIPI a Hoechst (excitovány v UV oblasti, emitují modré světlo). Tato barviva neumožňují přímé zjišťování absolutního množství DNA. Poslední typ fluorescenčních barviv (např. antibiotika mitramycin, chromomycin a olivomycin) není v taxonomii příliš rozšířený, neboť vyžaduje jinou kombinaci filtrů a nepodává tak kvalitní výsledky jako A T specifické fluorochromy (Suda,2004). Příprava vzorků a barvení: Postup pro současné barvení vzorku barvivy DAPI a PI: K izolaci jader pečlivě nasekáme v Petriho misce malý kousek (cca 0,5 cm 2 ) čerstvého rostlinného pletiva vzorku spolu se standardem (známá velikost genomu) v 1 ml ledově vychlazeného pufru Otto I . Přidáme další 1 ml pufru a filtrujeme přes nylonovou tkaninu (oka velikosti 42 m). Suspenzi jader rozdělíme do dvou zkumavek a do každé z nich přilijeme 1 ml pufru Otto II, který obsahuje fluorescenční barvivo (DAPI nebo PI), ß mercaptoethanol (zabrání fenolické oxidaci) a v případě PI také RNázu . Důkladně protřepeme. Zkumavky je možné krátkou dobu uchovávat v temnu.(www 8) 3.4 Vlastní měření Každá rostlina se měřila pro větší objektivitu ve třech opakováních, a to v rozmezí alespoň jednoho dne. Na PA I cytometru byl stanovován relativní obsah DNA (v arbitrálních jednotkách) a CyFlow sloužil k měření absolutního obsahu DNA (pg nebo Mbp). Postup: Po nasazení zkumavek do držáků a spuštění měření bylo nutné nastavit potřebné parametry. V případě CyFlow se nastavovaly pomocí klávesnice na monitoru počítače, na který byl připojen, u PA I, který má počítač zabudovaný uvnitř, se parametry nastavovaly na samotném cytometru. V obou případech to byly: „Gain“ posunuje pík histogramu po ose „Speed“ rychlost průchodu částic (čím je vyšší, tím bývá měření méně přesné vede k vyššímu koeficientu variance (CV)) „L L“ oříznutí grafu zleva „Clear“ toto tlačítko sloužilo po naměření každého vzorku k propláchnutí přístroje, aby se další vzorky nekontaminovaly. Také se tím připravila obrazovka pro nový histogram. 18 V histogramu se jako první pík zobrazoval standard, dalším byl pík vzorku (buňky v G1 fázi, před replikací, jaderný obsah je 2C) a v dvojnásobné vzdálenosti byl malý pík poukazující na zduplikovaný genom před dělením (4C). Na levém okraji grafu se zobrazoval nespecifický šum, který byl způsoben porušenými částicemi nebo chlorofylem vykazujícím autofluorescenci. Mohl být eliminován funkcí L L. Hodnoty naměřené cytometrem byly zapisovány do tabulky v Excelu společně se základním nastavením přístrojů (Gain, Speed, počet měřených částic (standardně 5000), hodnoty vzorku a standardu a jejich poměr, CV). Již zmíněný variační koeficient (CV) způsobený rozptylem hodnot kvůli rozdílné barvitelnosti částic nebo přístrojové nepřesnosti vypovídá o rozlišovací schopnosti konkrétního měření a platí, že za předpokladu stejné velikosti píků lze odlišit takové objekty, jejichž rozdíl v obsahu DNA odpovídá dvojnásobku CV. Vypočítá se jako podíl směrodatné odchylky a průměrné pozice píku násobený stem. Pohybuje se většinou v rozmezí 1 – 10 procent, ale ideální je jeho maximální rozpětí 3 %. Záleží samozřejmě na tom, jaká rostlina je měřena. U druhů s vysokým obsahem sekundárních metabolitů bývá CV vyšší a určitou toleranci je třeba zachovávat také u taxonů s velmi malým množstvím DNA (např. hranice přesnosti u Arabidopsis thaliana leží někde kolem 7 %) (Suda,2004). Spolehlivost měření se snižuje také při velkém rozdílu ve fluorescenci standardu a vzorku. Proto je třeba mít k dispozici více různých standardů. (www 6)
3.5 Stanovení obsahu DNA a poměru bazí DAPI barvením byly získány relativní obsahy DNA, barvením propidium jodidem se získal absolutní obsah DNA. V obou případech se jako standarda používaly listy rajčete Lycopersicon esculentum ‘Stupické polní tyčkové rané’ (2C = 1,96 pg, AT frekvence = 60 %; Marie & Brown 1993) Barow et Meister (2001) ve svém článku popisují, jak z naměřených hodnot získat údaj o jaderném obsahu DNA a AT frekvenci neznámých vzorků: Jelikož je fluorescence PI barviva přímo úměrná obsahu DNA 2C (F_PI = k *2C, kde k je konstanta), může být neznámý vzorek porovnán se známým standardem (2Cvz.= 2Cst. *R_PIvz., kde R_PIvz je poměr píku standardy a vzorku). Hodnota píku u DAPI je základem pro stanovení AT frekvence: F_DAPI=k*f(ATvz.)*2Cvz., f(ATvz.) je poměr mezi frekvencí AT bazí a AT specifickou fluorescencí neboli pravděpodobnost navázání se barviva DAPI na molekulu DNA o daném poměru AT. R_DAPIvz.= F_DAPIvz./ F_DAPIst (poměr fluorescencí vzorku a standardy) 19 Autory byl definován tzv. dye factor (DF), který má charakterizovat AT specifickou fluorescenci nezávisle na velikosti genomu: DF_DAPIvz.= R_DAPIvz./ R_PIvz.= f(ATvz.)/ f(ATst.). Frekvence bazí se konečně vypočítá pomocí rovnice f(ATvz.)= DF_DAPIvz.* f(ATst.). Barow et Meister upřednostňují DF jako faktor charakterizující AT frekvenci, protože nepotřebuje žádné zvláští předpoklady, jako hojně používaná Godellova rovnice: f(AT) = (1 – AT)*AT n/(1 – AT n) Ta předpokládá určitý počet za sebou jdoucích AT bazí (n), jež je nutný pro navázání molekuly barviva, a že jsou AT báze rovnoměrně rozmístěny v celé molekule DNA. Experimentálně bylo pro DAPI stanoveno n = 4 (Godelle et al., 1993). 3.6 Statistická analýza Naměřená data (obsah DNA a frekvence AT bazí) byla analyzována programovým balíkem „Statistica for Windows 7.0“ (StatSoft, 1984 2006). Spearmanovým koeficientem byly neparametricky testovány korelace mezi následujícími veličinami: C values, AT frekvencemi, počty chromozomů, velikostmi chromozomů, Ellenbergovými indikačními hodnotami. Také byla testována korelace mezi genomovými parametry a geografickým rozšířením. AT/GC frekvence byla vypočítána volně stažitelným excelovským programem Mgr. Petra Šmardy Ph.D.: Excell sheets for calculation of AT and CG content from flow cytometry measurements (www 9), který pracuje na základě Godelleho rovnice (viz výše). Výpočet velikosti chromozomů : 2*R_PIvz.*0,98/2n (pg)... 0,98 pg je velikost 1C standardu 2*R_PIvz.*958/2n (Mbp)...958 Mbp je velikost 1C standardu 20 4. VÝSLEDKY
4.1 Obsah jaderné DNA, AT/GC poměr a velikost chromozómů Výstupy z cytometrů byly zapsány do tabulky v Excelu a podle výše popsaného postupu dopočítány C value a DAPI faktor (Tab. 4), AT a GC frekvence a velikosti chromozomů (Tab. 5 ). Počty chromozomů byly převzaty z Květeny ČR, 5 (1997). Čísla u druhů označují lokalitu. Tab. 4
Ø R_PI Sx(ØR_PI) Ø CV(PI) CV (R_PI) C value pg ØR_ DAPI Sx(ØR_ DAPI) ØCV(DAPI) CV(R_DAPI) DF_ DAPI Bupleurum falcatum 2 0,3879 0,002 2,66 0,44 0,38 0,4128 0,002 2,75 0,41 1,064 Bupleurum falcatum 3 0,3787 0,005 2,09 1,40 0,37 0,4045 0,003 2,40 0,86 1,068 Conium maculatum 1 1,4762 0,006 1,93 0,40 1,45 1,5661 0,005 1,60 0,31 1,061 Daucus carota 1 0,5580 0,005 3,65 0,88 0,55 0,5693 0,010 3,32 1,68 1,020 Daucus carota 2 0,5281 0,004 3,16 0,72 0,52 0,5529 0,003 2,62 0,54 1,047 Daucus carota 3 0,5376 0,001 3,11 0,15 0,53 0,5535 0,003 2,14 0,56 1,030 Eryngium campestre 1 1,8153 0,010 3,67 0,54 1,78 1,9763 0,009 1,72 0,47 1,089 Eryngium campestre 2 1,8046 0,003 2,82 0,16 1,77 1,9648 0,005 2,26 0,24 1,089 Eryngium campestre 3 1,9193 0,013 2,68 0,70 1,88 2,0491 0,025 1,94 1,20 1,068 Falcaria vulgaris 1 1,4277 0,015 2,74 1,04 1,40 1,5114 0,008 1,69 0,54 1,059 Chaerophyllum aromaticum 1 0,7870 0,005 2,80 0,62 0,77 0,8211 0,002 2,53 0,29 1,043 Chaerophyllum aromaticum 2 0,8820 0,006 2,42 0,74 0,86 0,8967 0,007 2,07 0,83 1,017 Chaerophyllum aromaticum 3 0,8015 0,006 2,67 0,80 0,79 0,8136 0,005 2,02 0,60 1,015 Pastinaca sativa 1 1,7594 0,013 1,89 0,73 1,72 1,7407 0,013 1,98 0,72 0,989 Pastinaca sativa 2 1,7557 0,012 2,21 0,69 1,72 1,7525 0,015 2,06 0,85 0,998 Pastinaca sativa 3 1,7566 0,003 3,02 0,19 1,72 1,7467 0,003 1,68 0,17 0,994 Petroselinum crispum 1 2,1891 0,006 2,04 0,29 2,15 2,1621 0,004 1,86 0,20 0,988 Petroselinum crispum 2 2,2188 0,006 2,64 0,28 2,17 2,1735 0,003 1,48 0,14 0,980 Petroselinum crispum 3 2,2568 0,014 2,38 0,63 2,21 2,1817 0,006 1,82 0,27 0,967 Peucedanum alsaticum 1 3,4075 0,021 3,11 0,62 3,34 3,2650 0,009 1,58 0,29 0,958 Peucedanum alsaticum 2 3,4626 0,025 2,75 0,72 3,39 3,2940 0,029 1,93 0,88 0,951 Peucedanum cervaria 1 2,9198 0,014 2,50 0,48 2,86 2,9546 0,008 2,02 0,26 1,012 Peucedanum cervaria 2 2,9127 0,025 2,14 0,87 2,85 2,9446 0,010 2,16 0,34 1,011 Pimpinella major 1 2,7554 0,042 2,84 1,53 2,70 2,6651 0,021 1,96 0,79 0,967 Pimpinella major 3 2,7571 0,023 3,35 0,84 2,70 2,7211 0,019 1,76 0,69 0,987 Pimpinella saxifraga 1 4,2041 0,044 2,58 1,04 4,12 4,1376 0,060 2,45 1,45 0,984 Pimpinella saxifraga 2 4,1772 0,010 3,27 0,25 4,09 4,1526 0,041 1,77 0,99 0,994 Pimpinella saxifraga 3 4,1406 0,007 2,67 0,18 4,06 4,1059 0,012 1,69 0,30 0,992 Sanicula europaea 1 1,2709 0,006 2,23 0,49 1,25 1,2500 0,010 2,54 0,81 0,984 Seseli osseum 1 1,6639 0,047 3,02 2,85 1,63 1,6982 0,036 2,33 2,10 1,021 Seseli osseum 2 1,6067 0,008 2,73 0,51 1,57 1,6848 0,005 1,81 0,28 1,049 Seseli annuum 1 1,7272 0,009 2,55 0,50 1,69 1,7232 0,004 2,14 0,25 0,998 Torilis japonica 1 0,6404 0,002 2,54 0,33 0,63 0,7095 0,001 2,13 0,11 1,108 Torilis japonica 2 0,6634 0,003 2,61 0,46 0,65 0,7196 0,005 2,01 0,65 1,085 21 Tab. 5
Ø chrom 2n Mbp Ø chrom pg CG% AT%
Bupleurum falcatum 2 16 46,45 0,047 38,77 61,23 Bupleurum falcatum 3 16 45,34 0,045 38,70 61,30 Conium maculatum 1 22 128,57 0,129 38,84 61,16 Daucus carota 1 18 59,39 0,060 39,61 60,39 Daucus carota 2 18 56,21 0,056 39,10 60,90 Daucus carota 3 18 57,22 0,057 39,43 60,57 Eryngium campestre 1 28 124,22 0,125 38,32 61,68 Eryngium campestre 2 28 123,49 0,124 38,32 61,68 Eryngium campestre 3 30 122,58 0,123 38,71 61,29 Falcaria vulgaris 1 22 124,34 0,125 38,88 61,12 Chaerophyllum aromaticum 1 22 68,54 0,069 39,17 60,83 Chaerophyllum aromaticum 2 24 70,42 0,071 39,68 60,32 Chaerophyllum aromaticum 3 22 69,80 0,070 39,71 60,29 Pastinaca sativa 1 22 153,23 0,154 40,21 59,79 Pastinaca sativa 2 22 152,90 0,153 40,04 59,96 Pastinaca sativa 3 22 152,98 0,153 40,11 59,89 Petroselinum crispum 1 22 190,65 0,191 40,24 59,76 Petroselinum crispum 2 22 193,24 0,194 40,40 59,60 Petroselinum crispum 3 22 196,54 0,197 40,65 59,35 Peucedanum alsaticum 1 22 296,76 0,298 40,82 59,18 Peucedanum alsaticum 2 22 301,56 0,302 40,96 59,04 Peucedanum cervaria 1 22 254,29 0,255 39,77 60,23 Peucedanum cervaria 2 22 253,67 0,254 39,79 60,21 Pimpinella major 1 20 263,97 0,265 40,64 59,36 Pimpinella major 3 20 264,13 0,265 40,25 59,75 Pimpinella saxifraga 1 20 402,75 0,404 40,31 59,69 Pimpinella saxifraga 2 20 400,18 0,401 40,11 59,89 Pimpinella saxifraga 3 20 396,67 0,398 40,16 59,84 Sanicula europaea 1 16 152,19 0,153 40,32 59,68 Seseli osseum 1 18 177,11 0,178 39,60 60,40 Seseli osseum 2 18 171,02 0,171 39,07 60,93 Seseli annuum 1 16 206,84 0,207 40,04 59,96 Torilis japonica 1 16 76,69 0,077 37,97 62,03 Torilis japonica 2 16 79,44 0,080 38,39 61,61 Tab. 6: Neparametrická korelace genomových parametrů podle Spearmana:
Spearman Rank Order Correlations Valid Spearman t(N 2) p level Proměnné N R DF_ DAPI & C value (pg) 34 0,642475 4,74273 0,000042 DF_ DAPI & 2n 34 0,729565 6,03446 0,000001 DF_ DAPI & AT% 34 1,000000 C value (pg) & 2n 34 0,926050 13,88059 0,000000 C value (pg) & AT% 34 0,642475 4,74273 0,000042 2n & AT% 34 0,729565 6,03446 0,000001 Červeně označené korelace jsou významné na hladině pravděpodobnosti p < 0,05000. DAPI faktor je maximálně korelován s obsahem AT bazí (Graf 2.). 22 Graf 2. . AT% = 40,8854+19,1094*x 62,5
62,0
61,5
61,0 60,5 AT% 60,0 59,5 59,0 58,5 0,9513 0,9796 1,0109 1,0433 1,0848 0,9667 0,9916 1,0297 1,0586 1,1080
DF_DAPI 23 4.2 Neparametrická korelace genomových parametrů a Ellenbergových hodnot Tab. 7 Hodnoty pro studované druhy C value 0 druh se vyhýbá (pg) L T K F R N S AT% 2n zasolení (glykofyt) Bupl. falc.2 0,3801148 6 6 6 3 9 3 0 61,23 16 X druh je k Bupl. falc.3 0,3710885 6 6 6 3 9 3 0 61,3 16 příslušnému faktoru Conium. mac.1 1,4467134 8 6 5 6 x 8 0 61,16 22 indiferentní Daucus car.1 0,5468041 8 6 5 4 x 4 0 60,39 18 Daucus car.2 0,5175521 8 6 5 4 x 4 0 60,9 18 Daucus car.3 0,5268095 8 6 5 4 x 4 0 60,57 18 Eryng. camp.1 1,7790353 9 7 5 3 8 3 0 61,68 28 Eryng. camp.2 1,7685095 9 7 5 3 8 3 0 61,68 28 Eryng. camp.3 1,8808833 9 7 5 3 8 3 0 61,29 28 Falc.vulg. 1 1,3991736 7 7 6 3 9 x 0 61,12 22 Chaerop. arom.1 0,7712291 7 5 5 7 6 8 0 60,83 22 Chaerop. arom.2 0,8643937 7 5 5 7 6 8 0 60,32 22 Chaerop. arom.3 0,7854773 7 5 5 7 6 8 0 60,29 22 Pastin. sat.1 1,7242352 8 6 5 4 8 5 0 59,79 22 Pastin. sat.2 1,7205567 8 6 5 4 8 5 0 59,96 22 Pastin. sat.3 1,7214476 8 6 5 4 8 5 0 59,89 22 Peuced. als.1 3,3393398 7 7 6 4 9 3 0 59,18 22 Peuced. als.2 3,3933646 7 7 6 4 9 3 0 59,04 22 Peuced. cerv.1 2,8613798 7 6 4 3 7 3 0 60,23 22 Peuced. cerv.2 2,8544946 7 6 4 3 7 3 0 60,21 22 Pimp. major1 2,7002892 7 5 2 5 7 6 0 59,36 20 Pimp. major3 2,7019505 7 5 2 5 7 6 0 59,75 20 Pimp. saxi.1 4,1200280 7 x 5 3 x 2 0 59,69 20 Pimp. saxi.2 4,0936622 7 x 5 3 x 2 0 59,89 20 Pimp. saxi.3 4,0577468 7 x 5 3 x 2 0 59,84 20 Sanic. europ.1 1,2454940 4 5 3 5 8 6 0 59,68 16 Seseli ann.1 1,6926842 8 7 5 3 9 2 0 59,96 16 Torilis jap.1 0,6275686 6 6 3 5 8 8 0 62,03 16 Torilis jap.2 0,6501278 6 6 3 5 8 8 0 61,61 16 V tabulce č. 7 jsou pro uvedeny Ellenbergovy hodnoty pro některé mé studované druhy, počty chromozomů a C value, které byly vzájemně korelovány (Tab. 8). 24 Tab.8 Spearman Rank Order Correlations Počet Spearman t(N 2) p level Proměnné hodnot (N) R C value (pg) & Ellenberg L 29 0,137885 0,72338 0,475667 C value (pg) & Ellenberg T 29 0,502404 3,01928 0,005480 C value (pg) & Ellenberg K 29 0,109003 0,56979 0,573529 C value (pg) & Ellenberg F 29 0,335928 1,85323 0,074809 C value (pg) & Ellenberg R 29 0,017233 0,08956 0,929299 C value (pg) & EllenbergN 29 0,493891 2,95142 0,006470 C value (pg) & Ellenberg S 29 prům. 2n & Ellenberg L 29 0,564440 3,55301 0,001425 prům. 2n & Ellenberg T 29 0,172065 0,90761 0,372112 prům. 2n & Ellenberg K 29 0,188094 0,99513 0,328510 prům. 2n & Ellenberg F 29 0,076591 0,39915 0,692922 prům. 2n & Ellenberg R 29 0,358119 1,99303 0,056454 prům. 2n & EllenbergN 29 0,020680 0,10748 0,915205 prům. 2n & Ellenberg S 29 AT% & Ellenberg L 29 0,137543 0,72155 0,476771 AT% & Ellenberg T 29 0,007326 0,03807 0,969915 AT% & Ellenberg K 29 0,073065 0,38067 0,706424 AT% & Ellenberg F 29 0,109684 0,57339 0,571125 AT% & Ellenberg R 29 0,010014 0,05204 0,958882 AT% & EllenbergN 29 0,212897 1,13220 0,267504 AT% & Ellenberg S Z Ellenbergových hodnot spolu vzájemně korelovaly teplota s kontinentalitou (Spearman, R=0,4568, p=0,012737), teplota s vlhkostí (Spearman, R= 0,757427, p=0,00002), teplota s půdní reakcí (Spearman, R=0,626722, p=0,000275), teplota s živinami (Spearman, R= 0,704803, p=0,00002), kontinentalita s půdní reakcí (Spearman, R=0,462001, p=0,011633), vlhkost s živinami (Spearman, R=0,757427, p=0,000000), reakce s vlhkostí (Spearman, R= 0,403249, p= 0,030076) a reakce s živinami (Spearman, R= 0,446627, p=0,015149). 4.3 Korelace s geografickými parametry Zeměpisná šířka a délka byly odhadnuty z údajů v Květeně ČR 5 (1997). Velikost areálu byla vypočítána jako maximální rozsah zeměpisné délky ve stupních vynásobený maximálním rozsahem zeměpisné šířky (ve stupních) (Tab.10). Ani jeden z parametrů signifikantně nekoreluje (Tab. 9). Tab. 9
Valid Spearman t(N 2) p level N R 1C value & s.š.(o) 16 0,192559 0,73423 0,474927 1C value & v.d.( ) 16 0,127032 0,47919 0,639200 1C value & areál 16 0,302941 1,18939 0,254067 šířka*délka(o) 25 Tab. 10
s.š.(º) v.d.(º) areál šířka*délka 1C value Seseli annuum 1 48 23 45 1,69268419 Petroselinum crispum 1 45 34 420 2,14527372 Seseli osseum 1 56 60 784 1,63062417 Pimpinella major 1 60 40 800 2,70028922 Bupleurum falcatum 53 55 910 0,38011479 Peucedanum cervaria 1 56 60 928 2,86137976 Chaerophyllum aromaticum 1 61 60 966 0,77122909 Peucedanum alsaticum 1 56 85 984 3,33933984 Eryngium campestre 1 50 50 1500 1,77903532 Falcaria vulgaris 1 56 70 2190 1,39917361 Pastinaca sativa 1 63 90 2480 1,7242352 Pimpinella saxifraga 1 70 105 3450 4,12002797 Torilis japonica 1 62 145 4030 0,62756865 Sanicula europaea 1 70 75 4250 1,24549401 Conium maculatum 1 70 75 8840 1,44671338 Daucus carota 1 70 90 9000 0,54680407 4.5 Vztah velikosti genomu a životního cyklu Zpracována byla moje data (vyznačena žlutě) a hodnoty z RBG Kew C value databáze (Tab. 11 15, Graf 3.). Tab. 11
Annual Traditional Family Genus Species Authority Chrom. Nr. Ploidy level 1C (pg) Original Reference Paper UMBELLIFERAE Daucus aureus Desf. 22 2 1,15 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Anethum graveolens L. 22 2 1,2 Olszewska and Osiecka, 1983 1991 UMBELLIFERAE Daucus syrticus Murb. 18 2 1,25 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Artedia squamata L. 16 2 1,25 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Torilis leptophylla (L.) Reichenb.f. 12 2 1,35 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Caucalis daucoides L. 20 2 1,38 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Torilis nodosa Gaertner 22 2 1,6 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Daucus subsessilis Boiss. 22 2 1,9 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Torilis arvensis (Hudson) Link 12 2 2,05 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Coriandrum sativum L. 22 2 2,05 Olszewska and Osiecka, 1983 1991 UMBELLIFERAE Torilis japonica (Houtt.) DC. 12 2 2,28 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Daucus muricatus L. 22 2 2,53 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Daucus littoralis Sibth. & Sm. 20 2 2,98 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Turgenia latifolia (L.) Hoffm. 24 2 2,98 Le et al., 1978 1991 UMBELLIFERAE Cuminum cyminum L. 14 2 3,5 Chattopadhyay and Sharma, 1990 1995 UMBELLIFERAE Foeniculum vulgare Mill. 22 2 4,55 Das and Mallick, 1989 1995 UMBELLIFERAE Daucus blanchei Reut. 20 2 4,68 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Daucus montanus Humb. & Bonpl. 66 6 5,48 Owens, 1974 1976 Tab. 12
Biennial Traditional Chrom. Ploidy 1C Original Family Genus Species Authority Nr. level (pg) Reference Paper UMBELLIFERAE Carum carvi L. 20 2 4,78 Das AB., 1991 1995 UMBELLIFERAE Astrodaucus orientalis (L.) Drude 20 2 4,9 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Astrodaucus littoralis (Bieb.) Drude 20 2 5,18 Owens, 1974 1976 26 Tab. 13
Perennial Traditional Family Genus Species Authority Chrom. Nr. Ploidy level 1C (pg) Original Reference Paper UMBELLIFERAE Oenanthe fistulosa L. 22 2 0,63 Baum et al., 1989 1995 UMBELLIFERAE Oenanthe crocata L. 22 2 0,65 Baum et al., 1989 1995 UMBELLIFERAE Chaerophyllum aromaticum L. 22 2 0,807 UMBELLIFERAE Myrrhis odorata (L.) Scop. 22 2 0,85 Band, 1984 1991 UMBELLIFERAE Hydrocotyle vulgaris L. 0,98 Band, 1984 1991 UMBELLIFERAE Sanicula europaea L. 16 2 1,2455 UMBELLIFERAE Ferula communis L. 22 2 1,45 Olmedilla et al., 1985 1995 UMBELLIFERAE Pastinaca sativa L. 22 2 1,73 Band, 1984 1991 UMBELLIFERAE Apium nodiflorum (L.) Lag. 22 2 1,8 Band, 1984 1991 UMBELLIFERAE Eryngium campestre L. 28 2 1,8095 UMBELLIFERAE Petroselinum crispum (Mill.) A. W. Hill 22 2 2,25 Obermayer et al., 2002 2005a UMBELLIFERAE Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. 16 2 2,25 Band, 1984 1991 UMBELLIFERAE Pimpinella major (L.) Hudson 20 2 2,7011 UMBELLIFERAE Peucedanum cervaria L. 22 2 2,8579 UMBELLIFERAE Peucedanum alsaticum L. 22 2 3,3664 UMBELLIFERAE Daucus crinitus Desf. 22 2 3,88 Owens, 1974 1976 UMBELLIFERAE Pimpinella saxifraga L. 20 2 4,0905 UMBELLIFERAE Levisticum officinale Koch. 22 2 4,95 Olszewska and Osiecka, 1983 1991 Tab. 14
Annual/Perennial Traditional Family Genus Species Authority Chrom. Nr. Ploidy level 1C (pg) Original Reference Paper UMBELLIFERAE Bupleurum falcatum L. 16 2 0,3756 UMBELLIFERAE Heracleum sphondylium L. 22 2 1,9 Grime et al., 1985 1991 Tab. 15
Annual/Biennial Traditional Family Genus Species Authority Chrom. Nr. Ploidy level 1C (pg) Original Reference Paper UMBELLIFERAE Daucus carota L. 18 2 0,5304 UMBELLIFERAE Torilis japonica (Hudson) Link 12 2 0,6388 UMBELLIFERAE Conium maculatum L. 22 2 1,4467 Graf 3.
Vztah velikosti genomu (pg) a životního cyklu Annual = 18*1,0209*normal(x; 2,4533; 1,3305) Biennal = 3*1,0209*normal(x; 4,9533; 0,2053) Perennial = 18*1,0209*normal(x; 2,1277; 1,2843) Annual/Perennial = 2*1,0209*normal(x; 1,1378; 1,0779) Annual/Biennial = 3*1,0209*normal(x; 0,872; 0,5007) 7
6
5
4
3 Počet druhů
2
1 Annual Biennial Perennial 0 Annual/Perennial 0,3756 1,3965 2,4174 3,4382 4,4591 5,4800 Annual/Biennial C value (pg) 27
DISKUZE
Ačkoliv Barow & Meister (2002) nenašli žádnou korelaci mezi velikostí genomu a AT/GC poměrem, musím se spíše přiklonit k názoru Vinogradova (1994), který viděl pozitivní korelaci mezi C value a GC bázemi. I když ani moje data nejsou příliš robustní, negativní korelace genomu a AT frekvencí mi vyšla velmi signifikantní. Překvapivým není zjištění, že velikost genomu odpovídá počtu chromozomů. Svědčí to o absenci retroelementů či transpozomů. Při korelaci s Ellenbergovými hodnotami mi významná pozitivní korelace vyšla při srovnávání genomu a závislosti na teplotě T, také počet chromozomů a závislost na světle L korelovaly pozitivně. Korelaci mezi velikostí genomu a F či K, kterou popisují Bureš et al. (2004), ať pozitivní nebo negativní, jsem nezaznamenala. Negativní byla korelace C value a hodnoty N. (Tab.). Ellenbergovy indikační hodnoty většinou také vykazovaly vzájemnou signifikantní korelaci, ale výrazný vztah mezi L a N, jak o něm hovoří Diekmann et Dupre (1997) a Ellenberg et al. (1992), zjištěn nebyl. Jakákoli signifikantní závislost genomových parametrů na geografickém rozšíření nebyla nalezena, což však může být způsobeno nízkým počtem korelovaných druhů nebo nepříliš se lišícími areály. Z mého malého počtu dat se zdá, že jednoleté druhy mají stejně velký genom jako víceleté, naproti tomu dvouleté rostliny mají genom dvakrát větší. To je naprosto opačný závěr, než uvádí autoři Bennett (1972), Bureš et al. (2004) a Price et al. (2005). Rostliny, které přepínají mezi různými životními cykly, mají genomy menší. 28 ZÁVĚR
Tato bakalářská práce měla být teoretickou přípravou pro navazující diplomovou práci. Kromě shrnutí základních poznatků o velikosti genomu, AT bazích, chromozomech a související problematice a představení základních metod práce přináší některá dosud nepublikovaná data v oblasti obsahu jaderné DNA. Pokračující studie bude mít za cíl naměřit C value u všech domácích druhů čeledi Apiaceae včetně jejich AT/GC poměru, a to každý druh pokud možno ze tří různých lokalit. Pokusí se také objevit známky vzácně se vyskytující polyploidie a jiných změn genomu uvnitř studované čeledi. 29 LITERATURA www 1: http://en.wikipedia.org/wiki/Hans_Winkler 25.4.2007 www 2: http://en.wikipedia.org/wiki/Genome#_ref Fiers1978_0 1.5.2007 www 3: STEVENS P. F. 2006: Angiosperm Phylogeny Website. Version 7. http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/. 5.5.2007 www 4: http://www.nal.usda.gov/pgdic/Probe/v5n1/dev.html 20.4.2007 www 5: http://www.partec.de/partec/flowcytometry.html 21.4.2007 www 6: http://www.ibot.cas.cz/fcm/suda/presentation/ziva.pdf 6.4.2007 www 7: http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD_DS3/hypertext/AJDJU.htm 19.4.2007 www 8: http://www.ibot.cas.cz/fcm/method.html 15.4.2007 www 9: http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/smarda/ 5.3.2007 BAROW M. & MEISTER A. 2002:Lack of Correlation Between AT Frequency and Genome Size in Higher Plants and the Effect of Nonrandomness of Base Sequences on Dye Binding. Cytometry 47:1–7. BENNETT MD. 1972. Nuclear DNA content and minimum generation time in herbaceous angiosperms. Proceedings of the Royal Society of London, Series B 181: 109–135. BENNETT MD. 1973. Nuclear characters in plants. In: Basic mechanisms in plant morphogenesis. Brookhaven Symposium in Biology 25: 344 366. BENNETT MD. 1976. DNA amount, latitude and crop plant distribution. Environmental and Experimental Botany 16: 93 108. BENNETT MD. 1985. Intraspecific variation in DNA amount and the nucleotypic dimension in plant genetics. In: Freeling M, ed. Plant genetics (UCLA symposia on molecular and cellular biology). New York: Alan R Liss Inc., 283 302. BENNETT MD, BHANDOL P, LEITCH I.J. 2000. Nuclear DNA amounts in angiosperms and their modern uses—807 new estimates. Annals of Botany 86: 859–909. BENNETT M. & LEITCH IJ. 1995: Nuclearr DNA amounts in angiosperms. Annals of Botany 76: 113 176. BENNETT MD. & LEITCH IJ. 2005a: Plant Genome Size Research: A Field In Focus. Annals of Botany 95: 1–6 BENNETT MD. & LEITCH IJ. 2005b: Angiosperm DNA C values database (release 6.0, Oct. 2005). BENNETT MD., LEITCH IJ.& HANSON L. 1998: DNA amounts in two samples of angiosperm weeds. Annals of Botany 82 (Suppl. A): 121–134 BENNETZEN J L, KELLOGG EA. 1997. Do plants have a one way ticket to genomic obesity? Plant Cell 9: 1509–1514. BHARATHAN G. 1996. Reproductive development and nuclear DNA content in angiosperms. American Journal of Botany 83: 440 451. BOLHUIS H , PALM P., WENDE A , FALB M , RAMPP M, VALERA FR 4 , Friedhelm Pfeiffer 2 & Dieter Oesterhelt 2 2006: The genome of the square archaeon Haloquadratum walsbyi : life at the limits of water activity. BMC Genomics , 7:169 BUREŠ P., WANG Y F., HOROVÁ L. & SUDA J. 2004: Genome size variation in central european species of Cirsium (Compositae) and their natural hybrids. Annals of botany 94: 353 363. CAVALIER SMITH T. 1985. The evolution of genome size. Chichester: John Wiley and Sons. 30 DIEKMANN M. & DUPRÉ C. (1997): Acidification and eutrophication of deciduous forests in northwestern Germany demonstrated by indicator species analysis. Journal of Vegetation Science 8: 855 864. DOLEŽEL J., BARTOŠ H., VOGLMAYR J. & GREILHUBER J. 2003: Nuclear DNA content and genome size of trout and humane. Cytometry 51A (2): 127 128. DUFRESNE A, GARCZAREK L, PARTENSKY F: Accelerated evolution associated with genome reduction in a free living prokaryote. Genome Biol 2005, 6:R14. ELLENBERG H., WEBER H. E., DÜLL R., WIRTH V., WERNER W. & PAULIßEN D. 1944: Zeigerwerte von Pflanzen in Mitteleuropa. In: GOLTZE V. E. (ed.): Scripta geobotanica 18. Postfach, Götttingen. GIOVANNONI SJ, TRIPP HJ, GIVAN S, PODAR M, VERGIN KL, BAPTISTA D, BIBBS L, EADS J, RICHARDSON TH, NOORDEVIER M, RAPPE MS, SHORT JM, CARRINGTON JC & MATHUR EJ: Genome streamlining in a cosmopolitan oceanic bacterium. Science 2005, 309:1242 1245. GODELLE B., CARTIER D., MARIE D., BROWN SC. & SILJAK YAKOVLEV S. 1993: Heterochromatin Study Demonstrating the Non Linearity of Fluorometry Useful for Calculating Genomic Base Composition. Cytometry 14:618 626. GREILHUBER J., BORSCH T., MUELLER K., WORBERG A, POREMBSKI S. & BARTHLOTT W. 2006: Smallest angiosperm genomes found in Lentibulariaceae , with chromosomes of bacterial size. Plant Biology 8 (6): 770 777. GREILHUBER J., DOLEŽEL J., LYSAK M. & BENNET MD. 2005: The origin, evolution and proposed stabilization of the terms 'genome size' and 'C value' to describe nuclear DNA contents. Annals of Botany 95: 255 260. GRIME JP. 1990: Ecological effects of climate change on plant populations and vegetative composition with particular reference to the British flora. In: Jackson M, Ford BV, Parry ML, eds. Climatic change and plant genetic resources. London. Belhaven Press, 40 60. GRIME JP. & MOWFORTH MA. 1982: Variation in genome size, an ecological interpretation. Nature 299: 151 153. HANSON L., McMAHON KA., JOHNSON MAT. & BENNETT MD. 2001: First nuclear DNA C values for 25 angiosperm families. Annals of Botany 87: 251 258. HINEGARDNER R. 1968: Evolution of Cellular DNA Content in Teleost Fishes. American Naturalist 102: p. 517. JASIENSKI M. & BAZZAZ FA. 1995: Genome size and high CO2. Nature 376: 559 560. JOHNSTON JS., PEPPER AE., HALL AE., CHEN ZJ., HODNETT G., DRABEK R., LOPEZ R. & PRICE HJ. 2005: Evolution of genome size in Brassicaceae . Annals of Botamy 95: 229 235. KRAHULCOVÁ A. 1998: Karyologie cévnatých rostlin při aplikaci klasického barvení chromozómů. Příručka praktických cvičení pro posluchače katedry botaniky Přírodovědecké fakulty UK. KUBÁT K., GRULICH V., HROUDA L., SLAVÍK B. & ŠTĚPÁNEK J. 2002: Apiaceae Lindl. miříkovité. In: KUBÁT K. (ed.): Klíč ke květeně České republiky. Academia, Praha: 457 479. LEITCH IJ., CHASE MW. & BENNETT MD. 1998: Phylogenetic analysis of DNA C values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants. Annals of Botany 82(A): 85 94 LEITCH IJ., SOLTIS DE., SOLTIS PS. & BENNETT MD. 2005: Evolution of DNA amounts across land plants (Embryophyta). Annals of Botany 95(1): 207–217. MARIE D. & BROWN SC. 1993: A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for seventy species. Biology of the Cell 78: 41–51. MORAN NA, PLAGUE GR: Genomic changes following host restriction in bacteria. Curr Opin Genet Dev 2004, 14:627 633. 31 MOWFORTH M. 1986: Variation in nuclear DNA amounts in flowering plants: An ecological analysis. Ph. D., University of Sheffield. OBERMAYER R. & GREILHUBER J. 1999: Genome size in Chinese soybean accessions – stable or variable? Annals of Botany 84: 259–262 OHNO S. 1970: Evolution by Gene Duplication. Springer Verlag, New York OHRI D. 1998: Genome Size Variation and Plant Systematics. Annals of Botany 82 (A): 75 83. OHRI D, FRITSCH RM, HANELT P. 1998. Evolution of genome size in Allium (Alliaceae). Plant Systematics and Evolution 210: 57 86. OHRI D, KHOSHOO TN. 1987. Nuclear DNA contents in the genus Ficus (Moraceae). Plant Systematics and Evolution 156: 1 4. OWENS S. 1974. An examination of the floral biology, breeding system and cytology in species of the genus Daucus and related genera in the tribe Caucealidea (Umbelliferae). Ph. D.University of Reading. PHILLIPS MJ, DELSUC F.& PENNY D. 2004: Letter to MBE: Genome scale phylogeny and the detection of systematic biases. Molecular Biology and Evolution Advance Access. PRICE HJ. 1988a: Nuclear DNA content variation within angiosperm species. Evolutionary Trends in Plants 2: 5360. PRICE HJ. 1988b: DNA content variation among higher plants. Annals of the Missouri Botanical Gardens 75: 1249–1257. H. JAMES PRICE 1,* , SALLY L. DILLON 2, GEORGE HODNETT 1, WILLIAM L. ROONEY 1, LARRY ROSS 3 and J. SPENCER JOHNSTON 3 Genome Evolution in the Genus Sorghum (Poaceae): Annals of Botany 2005 95(1):219 227. PRYER KM, SCHNEIDER H, SMITH AR, CRANFILL R, WOLF PG, HUNT JS & SIPES SD. 2001: Horsetails and ferns are a monophyletic group and the closest living relatives to seed plants. Nature 409: 618–622. REJMANEK M. 1996. A theory of seed plant invasiveness: the first sketch. Biological Conservation 78: 171–181. SKALICKÁ K. 2005:Polyploidie dokáže s rostlinnými genomy pořádně zatřást. Živa 2: 50 52 SOLTIS DE, SOLTIS PS, ZANIS MJ. 2002: Phylogeny of seed plants based on evidence from eight genes. American Journal of Botany 89: 1670–1681. STEBBINS GL 1966. Chromosomal variation and evolution. Science 152: 1463–1469. SUDA J. 2004: An employment of flow cytometry into plant biosystematics. PhD. Disert., Univerzita Karlova, Praha. SUDA J. & TRÁVNÍČEK P. 2006: Reliable DNA ploidy determination in dehydrated tissues of vascular plants by DAPI flow cytometry : New prospects for plant research. Cytometry 69A (4): 273 280 SWIFT HH. 1950: The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington 36: 643–654 THOMAS C. A. 1971: The genetic organization of chromosomes. Annual Review of Genetics 5:237–256. THOMPSON K. 1990. Genome size, seed and germination temperature in herbaceous angiosperms. Evolutionary Trends in Plants 4: 113 116. TOMŠOVIC P., 1997: Apiaceae LINDL. miříkovité (okoličnaté). In: SLAVÍK B. (ed.): Květena České republiky 5. Academia, Praha: 269 429. VINOGRADOV AE. 2003. Selfish DNA is maladaptive: evidence from the plant Red List. Trends in Genetics 19: 609–614. VINOGRADOV AE. 1994: Measurement by flow cytometry of genomic AT/GC ratio and genome size. Cytometry 16:34 40 WAKAMIYA I, NEWTON RJ, JOHNSTON JS, PRICE HJ. 1993. Genome size and environmental factors in the genus Pinus. American Journal of Botany 80: 1235 1241. 32 WAKAMIYA I, PRICE HJ, MESSINA MG, NEWTON RJ. 1996. Pine genome size diversity and water relations. Physiologia Plantarum 96: 13 20. WENDEL JF, CRONN RC, JOHNSTON JS, PRICE HJ. 2002. Feast and famine in plant genomes. Genetica 115: 37–47. VEKEMANS X., C. LEFEBVRE’, J. COULAUD2, S. BLAISE2, W. GRUBER’, SILJAK YAKOVLEV S. & BROWN S. C (1996) : Variation in nuclear DNA content at the species level in Armeria maritima. Hereditas 124: 237 242 WERNEGREEN JJ., DEGNAN PH., LAZARUS AB., PALACIOS C. & BORDENSTEIN SR. 2003: Genome Evolution in an Insect Cell: Distinct Features of an Ant Bacterial Partnership. Biol. Bull. 204: 221–231. WOLF U., RITTER H., ATKIN N.B. & OHNO S. 1969: Polyploidization in the fish family Cyprinidae, Order Cypriniformes. I. DNA content and chromosome sets in various species of Cyprinidae. Humangenetik 7: 240 244.