1 OBSAH OBSAH..................................................................................................................................1 1.Úvod...................................................................................................................................2 2.Rešeršní část.......................................................................................................................3 2.1Genom..............................................................................................................................3 2.2Názvosloví jadernéhoobsahu...........................................................................................4 2.3C-value.............................................................................................................................4 2.4Velikost genomu(„Genomesize“)..................................................................................5 2.5Variabilitagenomu...........................................................................................................5 2.6Významvelikostigenomuzhlediskafylogenetického...................................................6 2.7Korelace mezivelikostígenomuaekogeografickými parametry..................................7 2.8Závislostvelikostigenomunadélceživota (typuživotníhocyklu)................................7 2.9AT/GC poměr..................................................................................................................8 2.10Chromozomy..................................................................................................................9 3.METODIKA AMATERIÁL.........................................................................................10 3.1Modelováčeleď - Apiaceae Lindl.................................................................................10 3.2Metodikasběrudat........................................................................................................14 3.3Průtokovácytometrie....................................................................................................15 3.4Vlastní měření...............................................................................................................17 3.5StanoveníobsahuDNAa poměrubazí .............................................................. 18 3.6Statistickáanalýza..........................................................................................................19 4.Výsledky..........................................................................................................................20 4.1ObsahjadernéDNA,AT/GC poměravelikostchromozómů.......................................20 4.2NeparametrickákorelacegenomovýchparametrůaEllenbergovýchhodnot...............23 4.3Korelacesgeografickými parametry..............................................................................24 4.5Vztahvelikostigenomuaživotníhocyklu....................................................................25 DISKUZE............................................................................................................................27 ZÁVĚR................................................................................................................................28 LITERATURA....................................................................................................................29 2 1.ÚVOD Tatopráce byměla být teoretickoupřípravoupro diplomovoupráci,která se bude zabývat obsahem DNA spolu s genomovým poměrem AT a GC bazí v čeledi Apiaceae. Oproti blízkým čeledím, jako jsou Asteraceae či Campanulaceae, se vyznačuje dosti vzácnou hybridizací, nízkoupolyploidií a poměrně malouvariabilitouvpočtuchromozomů,alespoň cose týče českýchdruhů.Je proto taxonem značně kontrastním.Díkytěmtovlastnostem je vhodným taxonem pro pozorování případných změn vgenomu. Ve své bakalářské a diplomové práci se pokusím získat odpovědi na následující otázky týkající se studovaného taxonu: 1. Korelujevelikostgenomus počtemchromosomů? 2. Existuje kvantitativní rozdíl vrozsahu variability ve velikosti genomu či v chromosomovém počtu,způsobenýfragmentací chromozomůčivznikemretroelementů? 3. Jsouprimárnívelké,či maléchromozomyuprimitivníchrodů? 4. Koreluje velikost geonomu,AT frekvence,popř. počet chromosomůsnějakým ekologickým(ekogeografický) parametremsledovanýchdruhů? 5. Jaká je role velikostigenomučiATfrekvencevefylogenetickýchvztazích? Vrámci bakalářské práce byl změřenobsahDNA a vypočítána AT frekvence u16českých druhů čeledi Apiaceae, jež byly dále zpracovány do formy herbářových položek. Část každého vzorku (listu nebo květní stopky) byla zmrazena vhlubokomrazícím boxu pro případné nové měření. Literární rešerší jsou shrnuty současné poznatky o vztazích mezi velikostí geonomua ekologickými a geografickými parametrydruhů,dále význam frekvence AT bazí u organismů zhlediska fylogenetického a ekologického. Zmetod využívaných při výzkumu genomuje zde popsána proudová cytometrie.Vsamostatné kapitole jsouuvedeny výsledkypilotnístudie. 3 2.REŠERŠNÍ ČÁST 2.1Genom Genom je souhrn dědičné informace zakódované vdeoxyribonukleové (u virů ribonukleové) kyselině. Kromě genů nesoucích informaci však zahrnuje také nekódující sekvence. Tvoří ho jedna sada chromozomů(n).Genom může být chápánjednak jakojaderný obsah DNA, jednak DNA semiautonomních organel (mimojaderná DNA prokaryotického typu), případně souhrn všech genů. S pojmem „genom“ poprvé přišel roku 1920 profesor botaniky z univerzity vHamburku, Hans Winkler, který ve své knize Verbreitung und Ursache der Parthenogenesis im Pflanzen - und Tierreiche (VerlagFischer,Jena) spojil slova „ge ny“ a „chromoz óm “.V jehopojetí se genom rovnal haploidní sadě chromozomů. ( www 2) 2.2Názvosloví jadernéhoobsahu K popsání jaderného obsahu DNA bývá používáno několik termínů. Pojem „velikost genomu“ je často dosazován za obsah DNA monoploidního genomu nebo chromozomové sady, zatímco „DNA C-value“ znamená somatický obsah DNA celého chromozomového komplementu neboli karyotypu bez ohledu na stupeň ploidie organismu. Toto tradiční označení používají ve svých pracích např. Bennett et al. (1998) a Johnston et al. (2005). Nicméně oba pojmy bývají často užívány jako synonyma (Obermayer & Greilhuber 1999, Leitchet al. 2005).Greilhuber et al. (2005) protonabízí novouterminologii,abyse význam těchto výrazů ujednotil. Pro monoploidní obsah DNA (v případě, že známe stupeň ploidie organizmu) doporučují používat „Cxvalue“. U polyploidů se za Cx považuje průměrná velikost jedné chromozomové sady. ProobsahDNA chromozomovéhokomplementu,kterýje charakteristický pro konkrétní organismus, nezávisle na polyploidiích, aneuploidiích atd., přináší pojem holoploidní velikost genomu (zkráceně C-value). Pro kvantitativní určení velikosti genomu se pro C-value používají celá čísla, např. 1C, 2C, 1Cx, atd. Somatické buňky nereplikujících se diploidních organismů tedy mají velikost genomu 2C. Toto pojetí není ještě všeobecně používáno.JadernýobsahDNA může být vyjádřenv pikogramech(pg) nebovmegapárechbazí (1pg=978Mpb)(Doleželetal.2003). 4 2.3C-value Označení C-Value pochází od Hewsona Swifta (1950), který ve své práci používal 1C- value, 2C-value atd., aby odlišil množství DNA vreplikujících se a nereplikujících se buňkách.Vědecká komunita dlouho přesně nevěděla,coono„C“ znamená („characteristic“, „content“,„class“ nebo„complement“).Swift tentopojem r.1975vysvětlil vkorespondenci sProf. Michaelem D. Bennettem. Napsal, že „C“ značí „constant“, tedy množství DNA charakteristické prourčitýgenotyp.„C-value“ se pakustálilona haploidní obsahDNA,jakse používádodnes(Bennett&Leitch2005a). 2.4Velikostgenomu(„Genomesize“) Poprvé se tentotermínobjevil včlánkuHinegardnera vroce 1968.Vtomtokontextubyl myšlenpočet genů,čili genotyp.O rokpozději byl již tento pojem použit vmoderním pojetí (obsahDNA) autoryWolf et al.(1969). Doběžnéhopoužívání se dostal pravděpodobně díky knizeEvolutionbyGeneDuplication(Ohno1970). Dnes je velikost genomudíkyusilovné práci vědcůz celéhosvěta známa uvíce než pěti tisíců druhů rostlin, ztoho téměř 4500 je krytosemenných (Bennett & Leitch 2005b). Nejmenší obsah DNA u krytosemenných byl naměřen u Genlisea margaretae zčeledi Lentibulariaceae (1C = 63 Mpb ~ 0.064 pg) (Greilhuber et al. 2006), největší genom má Fritillaria assyriaca , Liliaceae (1C = 124597,2Mpb ~ 127,40pg) (Bennett & Leitch,2005b). Variabilitavevelikostigenomuvrámcikrytosemennýchrostlinje tedytéměř2000násobná. Proč měřit velikost genomu? Jak píšou Hanson et al. (2001): „Velikost genomu je klíčováhodnota biodiverzityamávelkývýznam prostudiumevoluce“.Sloužík: • Odlišenídruhůsestejným počtemrozdílněvelikýchchromozomů(např. Dryopteris dilatata agg.) • Určeníhybridů,jejichžrodičesenelišístupněm ploidie (např.vrodu Agropyron ) • Stanovenígenomovéhosloženíuallopolyploidníchtypů (např.Musa) • Zjištěníkorelacímezivelikostígenomuadalšímivlastnosti(fenotyp,fenologické či ekologickéchování)a jejichpozdější predikovatelnosti 5 odhalení agmatoploidie (neletálnífragmentacechromozómůdíkydifúzní centroméře) (např.včeledích Cyperaceae a Juncaceae ) 2.5Variabilitagenomu Důležitostznalostivelikostigenomujakožtoužitečnéhotaxonomickéhoznakubyla podtrhována přimnohastudiíchrozličnýchskupin.Rostlinnýgenom je považovánzacelkem stabilnía je jednímzvýznačnýchznakůdefinujícíchbiologickýdruh.Velkérozdílyvobsahu DNA,kterémůžouexistovatmezidruhy,lzekorelovat srůznýmivlastnostmina jaderné, buněčné,pletivnéčiorganismálníúrovni(Bennett1972,1973,1985;Cavalier-Smith1985; Price1988a).Jsoutovlastnosti jako: minimálnígeneračníčas(Bennett1972),růstvrůzných zeměpisnýchšířkáchaekologických