Anales de la Facultad de Medicina ISSN: 1025-5583 [email protected] Universidad Nacional Mayor de San Marcos Perú

Carbonel Villanueva, Kelly Nora; Suárez Cunza, Silvia; Arnao Salas, Acela Inés Características fisicoquímicas y capacidad antioxidante in vitro del extracto de nitida Anales de la Facultad de Medicina, vol. 77, núm. 4, 2016, pp. 333-337 Universidad Nacional Mayor de San Marcos Lima, Perú

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Cómo citar el artículo Número completo Sistema de Información Científica Más información del artículo Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Página de la revista en redalyc.org Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto Características fisicoquímicas y capacidad antioxidante in vitro del extracto de Gentianella nitida Physicochemical properties and in vitro antioxidant capacity of the Gentianiella nitida extract

Kelly Nora Carbonel Villanueva1,2,a, Silvia Suárez Cunza1,b, Acela Inés Arnao Salas1,c 1 Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición "Alberto Guzmán Barrón" de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. 2 Unidad de posgrado, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. a Bachiller en Tecnología Médica; b Doctora en Farmacia y Bioquímica; c Magister en Bioquímica.

Resumen Introducción. La Gentianella nitida (hercampuri) es usada como hepatoprotector en la medicina tradicional. Objetivo. Determinar las características fisicoquímicas y capacidad antioxidante in vitro del extracto acuoso de Gentianella nitida. Diseño. Observacional, analítico. Lugar. Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. Material. Extracto acuoso al 4% p/v de la planta entera Gentianella nitida procedente de Junín. Intervenciones. Observación y análisis de las características fisicoquímicas y capacidad antioxidante in vitro. Principales medidas de resultados. Características fisicoquímicas (densidad aparente y materia soluble); capacidad antioxidante total empleando DPPH, ABTS, FRAP; contenido de fenoles totales y flavonoides. Resultados. La Gentianella nitida presentó una densidad aparente 1,032 g/mL. Con el método de DPPH y ABTS tuvo IC50=145 µg/mL y 1,49 mg/mL respectivamente. La capacidad antioxidante equivalente a ácido ascórbico (AAEAC-DPPH) fue 56 (µg AA/mg ss) y la capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC-ABTS) fue 87,7 (µg trolox/mg ss). Expresado en FRAP, fue 98,5 (µg FeSO4/mg ss) y 55,6 (µg EAA/mg ss). El contenido de fenoles totales fue 65,8 μg EAG/mg ss y de flavonoides 11,7 µg EQ/mg ss. Conclusiones. El extracto acuoso de la Gentianella nitida exhibió capacidad antioxidante que guardó correlación con el contenido de compuestos fenólicos. Palabras clave. Gentianella; Antioxidantes; Fenoles; Flavonoides. Abstract Introduction. The Gentianella nitida (hercampuri) is used as a hepatoprotective agent in traditional medicine. Objective. To determine the in vitro physiochemical properties and antioxidant capacity of the aqueous extract of Gentianella nitida. Design. Observational, analytical study. Setting. Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Material. 4% (w/v) of aqueous extract of the whole of Gentianella nitida from Junin. Interventions. Observation and analysis of the in vitro physicochemical properties and antioxidant capacity. Main outcome measures. Physicochemical properties (apparent density and soluble matter); antioxidant capacity using DPPH, ABTS and FRAP; total phenols content and flavonoids. Results. The Gentianella nitida presented an apparent density of 1,032 g/mL. With the DPPH and ABTS methods it had IC50=145 ug/mL and 1.49 ug/mL respectively; the antioxidant capacity equivalent to the ascorbic acid (AAEAC-DPPH) was 56 (ug AA/mg ss) and the antioxidant capacity equivalent to the trolox (TEAC-ABTS) was 87.7 (µg trolox/mg ss). Expressed in Frap, these were 98.5 (µg FeSO4/ mg ss) and 55.6 (µgEAA/mg ss). The total phenolic content was 65.8 ug EAG/mg soluble solid and flavonoids was 11.7 ug EQ/mg soluble solid. Conclusions. The aqueous extract of Gentianella nitida exhibited antioxidant capacity that correlated with the content of phenolic compounds. Keywords. Gentianella; Antioxidants; Phenols; Flavonoids. An Fac med. 2016;77(4):333-7 / http://dx.doi.org/10.15381/anales.v77i4.12648

INTRODUCCIÓN que es necesario destacar y poder iden- nocen 103 especies endémicas en siete tificar los de mayores potencialidades géneros; los géneros con mayor número Desde la antigüedad, las plantas medi- para prevenir o tratar enfermedades, de especies endémicas son Gentianella cinales han acompañado al ser huma- beneficiando a la humanidad, en su y Macrocarpaea. Las especies endémi- no; diversas culturas han desarrollado aplicación en los laboratorios farma- cas ocupan principalmente las regiones su propia flora medicinal, la cual es céuticos, entre otras (2). de la puna húmeda y seca, páramo y transmitida de generación a generación bosque muy húmedo montano. Se en- Una de las plantas usadas en la me- por tradición oral (1). cuentran, dentro de un área protegida, dicina tradicional es la Gentianella ni- treinta y tres especies endémicas (3). La megadiversidad del Perú se evi- tida (hercampuri) que pertenece a la dencia en la diversidad de especies, de familia . Esta familia en el Inicialmente, la Gentianella nitida recursos genéticos, y de ecosistemas, Perú, según Catillo y col. (2006) reco- (Grisebach) Fabris fue erróneamente

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identificada como de la Universidad Nacional Mayor de 220 g, d= 0,1 mg). La determina- (Glig.) Fabris (4). La Gentianella nitida San Marcos, con el código de herbario: ción se hizo por triplicado. (Griseb.) Fabris es propia de los Andes USM 283720. c. Sólidos solubles (ss): se determinó Centrales (Perú) entre 3 800 y 5 100 El estudio se realizó en el Centro de por triplicado mediante refractome- m.s.n.m. Es una hierba perenne, algo Investigación de Bioquímica y Nutri- tría. Se usó 300 µL del extracto y se cespitosa, de hasta 4 cm de alto. Hojas ción, Universidad Nacional Mayor de llevó a lectura en un refractómetro, lineales o lineal lanceoladas, muy lus- San Marcos. Los reactivos difenilpicril (ATAGO ®) de 0 a 85%. trosas, agudas en el ápice, de 1,5 a 2 cm hidrazilo (DPPH), ácido ascórbico, de largo y 2 a 3 cm de ancho. Flores so- Se determinó la capacidad antioxi- ácido 2,2- azinobis-3-etil benzotiazoli- litarias cortamente pedunculadas, erec- dante in vitro del extracto acuoso de la na-6-sulfónico (ABTS), persulfato de tas de color rosado a rojo. Fruto cápsula planta entera mediante las siguientes potasio, ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8- con numerosas semillas (5). pruebas: tetrametilcromano-2-carboxílico En la medicina tradicional peruana, (trolox), 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina a. Método de DPPH (2,2-difenil-1-pi- el extracto acuoso de la planta entera (TPTZ), ácido gálico, quercetina, re- crilhidrazilo) según Brand-Williams es usado como ‘remedio’ para la hepa- activo Folin Ciocalteu, y sulfato ferroso y col. (8) Se preparó diluciones del titis, como colagogo y en el tratamiento fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. extracto acuoso de Gentianella niti- de la obesidad; sin embargo, no existe Los reactivos carbonato de sodio, clo- da hasta obtener concentraciones de referencia científica que explique tales ruro de aluminio, acetato de sodio, áci- 0,045 a 0,225 mg/mL; después de 30 usos. do acético y etanol fueron comprados minutos en oscuridad se realizaron a Merck. las lecturas a 517 nm. Se empleó Lacaille y col.(1996) en un primer como estándar el ácido ascórbico. estudio químico identificaron 12 me- La planta entera fue lavada con agua La curva se preparó con concentra- tabolitos por HPLC-UV, entre ellos de grifería y con agua destilada, seca- ciones de 2,4 a 10,4 µg/mL, con un tres secoiridoides (1, 2, 3), flavonoide da en estufa a 37ºC y posteriormente R2= 0,9923. C-glicosidado (4), cinco xantonas gli- molida. Se pesó 20 g de planta seca y cosidadas (5, 6, 7, 8, 9) y tres xanto- preparó un extracto al 4% p/v en agua Los resultados se expresaron en ca- nas agliconas (10, 11, 12) (4). Nuevos bidestilada, mediante cocción durante pacidad antioxidante equivalente al compuestos aislados son el nitiol (6) y 15 minutos, luego se enfrió a tempera- ácido ascórbico (AAEAC-DPPH). (7) el amaronitidin . Estos metabolitos tura ambiente, se filtró en gasa. El ex- También se calculó el IC50 (μg de identificados son referidos como po- tracto obtenido se centrifugó a 10 000 sólido soluble/mL). Este valor co- tenciales sustancias antioxidantes, pero g por 15 minutos a 4°C (Sorvall modelo rresponde a la concentración del a nivel nacional hasta el momento no RC2-B®); el sobrenadante fue filtrado extracto que reduce en un 50% la se ha determinado la capacidad antio- en papel Wahtman Nº 1 y finalmente absorbancia de una solución meta- xidante de los extractos de Gentianella llevado a estufa a la temperatura de nólica de DPPH de lectura inicial nitida. 37°C hasta sequedad. Se obtuvo 5,4 g 0,6 + 0,02. de extracto seco (sólidos solubles) y se Siendo la Gentianella nitida una b. Método de ABTS (ácido 2,2- azin- resuspendió en 60 mL de agua bidesti- planta propia de la zona altoandina de obis-3-etil benzotiazolina-6-sulfó- lada. Este extracto preparado constitu- la sierra central y ante la ausencia de nico) según Re y col. (9). Se preparó yó la muestra para todos los análisis. información científica que valide su uso diluciones del extracto acuoso de tradicional, los objetivos del presente Se determinó los parámetros fisico- Gentianella nitida hasta obtener con- estudio fueron determinar algunas ca- químicos: centraciones de 0,5 a 2,3 mg/mL. Después de 7 minutos en oscuridad, racterísticas fisicoquímicas y la capaci- a. Densidad aparente: está referida al las lecturas se realizaron a 734 nm. dad antioxidante in vitro del extracto peso de 1 mL del extracto prepara- Se usó como estándar el trolox. Se acuoso de Gentianella nitida. do, se midió un mililitro y se pesó en preparó una curva con concentra- una balanza analítica (Sartorius®, ciones de 50 a 200 µg/mL, con un 220 g d= 0,1 mg). La determinación R2= 0,9826. MÉTODOS se hizo por triplicado. Los resultados fueron expresados Se utilizó la planta entera de Gentia- b. Masa seca o materia seca (ms): se en porcentaje de inhibición de la nella nitida del Distrito de Ulcumayo, determinó por diferencia del peso formación de radicales ABTS y en Provincia Junín, Departamento de del recipiente con un 1 mL de ex- TEAC-ABTS. Junín, adquirido en el mercado ‘27 de tracto (llevado a sequedad en una Octubre’, San Juan de Lurigancho. estufa a 37°C hasta peso constante) c. Método de FRAP según Benzie y La muestra fue identificada y deposi- y el peso del recipiente vacío. Se usó col. (10). Se preparó diluciones del ex- tada en el Museo de Historia Natural una balanza analítica (Sartorius®, tracto acuoso de Gentianella nitida

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hasta obtener concentraciones de Tabla 1. Resultados de la caracterización fisicoquímica del extracto acuoso de Gentianella nitida. 0,18 a 0,90 mg/mL. Las lecturas se Materia seca (mg/mL) ± DE Sólido soluble (mg/mL) ± DE realizaron después de 10 minutos a Densidad aparente una longitud de 593 nm. Se prepa- (g/mL) ± DE Gravimetría Refractometría ró una curva de FeSO4 a concen- 1,032 ± 0,017 76,6 ± 1,552a 81,6 ± 0,058a traciones de 100 a 750 µM, con un a: p = 0,005. R2= 0,987 y se usó como antioxi- dante el ácido ascórbico a concen- Tabla 2. Resultados de la evaluación de la capacidad antioxidante del extracto acuoso de traciones de 100 a 300 µM, con un Gentianella nitida. R2= 0,991. Los resultados fueron expresados en μmol equivalente Capacidad antioxidante total Capacidad antioxidante total FeSO4 por g sólido soluble y μmol (µg/mg) ± DE (µmol/mL) ± DE equivalente AA por g sólido soluble. DPPH 56 ± 6,7 1 28,6 ± 3,41 ABTS 87,7 ± 3,02 31,5 ± 1,12 La determinación de metabolitos 3 3 fenólicos se realizó de la siguiente ma- FRAP 98,5 ± 6,5 57,4 ± 3,1 nera: Fenoles totales 65,8 ± 2,14 34,8 ± 1,14 Flavonoides 11,7 ± 0,85 3,5 ± 0,25 a. Fenoles totales: se cuantificó por 1 2 el método de Singleton y col.(11) AAEAC-DPPH: Capacidad antioxidante equivalente a ácido ascórbico; TEAC-ABTS: Capacidad antioxidante equivalente a trolox; 3 AAEAC-FRAP: Capacidad antioxidante equivalente a ácido ascórbico; 4 EAG: Equivalente a usando Folin Ciocalteau. Se prepa- ácido gálico; 5 EQ: Equivalente a quercetina. ró diluciones del extracto acuoso de Gentianella nitida hasta obtener concentraciones de 0,18 a 1,2 mg/ Los resultados se expresaron como bla 2) se observó que el contenido de mL. Después de 30 minutos en os- promedio y desviación estándar. Para el flavonoides corresponde al 18% de fe- curidad, se realizaron las lecturas a análisis estadístico se aplicó la prueba t- noles totales cuando es expresado en 760 nm. Se usó el ácido gálico como student y el coeficiente de correlación unidades de masa y al 10% cuando es estándar para preparar una curva de Pearson. Los resultados analizados se expresado en unidades químicas. patrón con concentraciones de 10 a procesaron en Microsoft Excel 2010. Los resultados de coeficiente de co- 75 µg/mL, con un R2= 0,999. rrelación de la capacidad antioxidante La concentración de fenoles tota- con las tres técnicas aplicadas frente les del extracto se expresó en µg de RESULTADOS al contenido de metabolitos secunda- equivalente de ácido gálico (EAG) Sobre los resultados de la caracteriza- rios fenólicos muestran un valor de R por mg de sólido soluble. ción fisicoquímica del extracto acuoso cercano a la unidad en todos los casos (tabla 3). b. Flavonoides: El contenido de flavo- de Gentianella nitida puede observarse noides se realizó por medio de un que la densidad aparente es ligeramen- ensayo colorimétrico propuesto por te superior a la densidad del agua (tabla Geissman (12). Se preparó diluciones 1). DISCUSIÓN del extracto acuoso de Gentianella En la evaluación de la capacidad an- Los estudios en la Gentianella nitida nitida hasta obtener concentraciones en nuestro país son escasos y más aún tioxidante, el IC50, mediante la técnica de 1,2 a 6,0 mg/mL. Después de 30 de DPPH tuvo un valor de 145 ± 2,5 sobre las propiedades fisicoquímicas. minutos en oscuridad, se realizaron µg/mL y mediante la técnica de ABTS Los resultados obtenidos sobre den- las lecturas a 432 nm. Se usó como 1,49 ± 0,047 mg/mL, observándose estándar la quercetina y se preparó una mejor capacidad antioxidante con una curva con concentraciones de el método que se basa en la estabilidad 10 a 100 µg/mL, con un R2= 0,999. del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil Tabla 3. Coeficiente de correlación de Pearson La concentración de flavonoides to- frente al radical catiónico de ABTS·+. del extracto acuoso de Gentianella nitida. tales del extracto se expresó en µg de Las sustancias estándares ácido ascór- Fenoles Flavonoides equivalente de quercetina (EQ) por bico en la prueba con DPPH, tuvierom totales mg de sólido soluble. un IC50 de 8,88 ± 1,1 μg/mL y del DPPH 0,974 0,953 trolox en la prueba con ABTS·+ el IC Todos los ensayos de capacidad an- 50 ABTS 0,984 0,963 fue de 149,1 ± 6,8 μg/mL. tioxidante y de metabolitos fenólicos FRAP 1,000 0,994 fueron realizados por duplicado en 3 Con respecto al contenido de los p x,y donde, X= técnicas antioxidantes (DPPH, ABTS, determinaciones independientes. metabolitos secundarios fenólicos (ta- FRAP); Y= fenoles totales o flavonoides.

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sidad aparente, materia seca y sólidos oxidante que el extracto acuoso de la la Gentianella nitida, puede proponerse solubles son, de acuerdo a la literatura Gentianella nitida. Este menor valor de que esta última tendría mayor capaci-

revisada, iniciales, por lo que los datos IC50 podría explicarse por el medio de dad antioxidante que la Gentianella bul- reportados contribuyen a incrementar extracción usado, entendiéndose que garica, aún cuando el contenido de po- la información sobre esta planta. la mezcla de solventes puede favorecer lifenoles es menor. Puede sugerirse que una mayor extracción de metabolitos estos metabolitos oxigenados muestran En la tabla 1 se observa una dife- secundarios con actividad antioxidan- buena capacidad antioxidante o tal vez rencia significativa entre los valores de te. el extracto puede contener otros meta- materia seca y sólidos solubles. Si bien bolitos secundarios diferentes que con- estos parámetros suelen ser equivalen- La capacidad antioxidante total, ex- tribuyen a la actividad antioxidante. tes cuando se trata de soluciones trans- presado en TEAC-ABTS, del extracto parentes, en este caso el extracto tenía acuoso de Gentianella nitida fue 3,15 Doroteo y col. (2013) han reportado un aspecto homogéneo pero con ligera ± 0,11 mmol trolox/100 mL. Com- los polifenoles totales de la uña de gato turbidez, lo que explicaría un mayor parado con el estudio de Berlowski y (17,3 ± 0,01 mg/g), del maíz morado valor cuando se determina por refrac- col. (2013), en el que reportó que la (33,2 ± 3,40 mg/g) y del yacón (12,8 tometría. infusión del Geranium dielsianum tuvo ± 0,02 mg/g) (13), comparando estos un valor de TEAC-ABTS de 0,645 ± resultados con el obtenido en el extrac- La capacidad antioxidante total del 0,027 mmol trolox/100 mL y el de Un- to acuoso de la Gentianella nitida; esos extracto acuoso de Gentianella nitida caria tomentosa de 0,513 ± 0,061 mmol extractos tienen una alta capacidad tiene un IC de 145 ug/mL ± 2,5, fren- 50 trolox/100 mL, muestra una mejor ca- antioxidante aunque posean un menor te al radical DPPH. Con esta misma pacidad antioxidante. contenido de polifenoles. técnica Lock y col. (2005) demostraron que el extracto etanólico de Gentianella En los resultados del FRAP del ex- (14) tracto acuoso de Gentianella nitida se nitida tiene IC50 13,70 µg/mL . Como La capacidad antioxidante demos- en el caso comparado con la extracción obtuvo 5,74 ± 0,31 mmol Fe/100 mL, trada con DPPH, ABTS y FRAP puede de polifenoles, el uso de un solvente con el mismo método Berlowski y col. deberse al contenido de total de polife- orgánico puede haber facilitado una (2013), estudio de 10 plantas en medio noles; esto se desprende de los elevados mayor extracción de metabolitos con acuoso extraídos por infusión y 10 ho- valores del coeficiente de correlación capacidad antioxidante. Sin embargo, ras de reposo en oscuridad, de las cua- de Pearson (pX,Y) que se observa en la en el estudio de Nikolova y col. (2014) les las que obtuvieron más altos valores tabla 3. Asimismo, puede decirse que la en extracto metanólico de la Gentiane- fueron Tiquilia paronychioides 0,607 ± capacidad reductora de hierro (FRAP) 0,022 mmol Fe/100 mL, Geranium diel- lla bulgarica el valor fue IC50 422 µg / se debe al componente flavonoide de mL (15). Se observa que el extracto acuo- sianum 0,562 ± 0,017 mmol Fe/100 mL los polifenoles presentes en el extracto so de la Gentianella nitida a pesar de te- y de Uncaria tomentosa 0,507 ± 0,016 (tabla 3). (16) ner un menor contenido de polifenoles mmol Fe/100 mL . La Gentianella ni- (tabla 2) exhibe una mejor capacidad tida exhibe una mejor capacidad reduc- Finalmente, el extracto acuoso de antioxidante comparado con el extrac- tora en las condiciones de extracción. la Gentianella nitida exhibió capacidad to metanólico de Nikolova y col. Con- El contenido total de los polifenoles antioxidante in vitro con las tres téc- siderando que el solvente metanólico del extracto acuoso de la Gentianella nicas aplicadas, contuvo metabolitos es además tóxico puede postularse que nitida fue 65,8 mg/g ± 2,1 (tabla 2); secundarios fenólicos demostrado por el extracto acuoso sería un medio más estudios reportados por Nikolova y col. los fenoles totales y flavonoides. El adecuado de extracción y es la forma (2014) sobre el extracto metanólico de comportamiento antioxidante guardó como tradicionalmente se usa. la Gentianella bulgarica muestran un va- correlación con el contenido de com- puestos fenólicos. Estos compuestos Otros productos naturales estudia- lor de 110,45 mg/g ± 7,2. Este mayor fenólicos actuarían principalmente do- dos por su capacidad antioxidante y su valor igualmente podría explicarse por nando un átomo de hidrógeno y/o do- contenido de polifenoles son la uña de la mezcla de solventes usados que pue- nando un electrón. gato, el maíz morado y el yacón. Los ex- de favorecer una mayor extracción de tractos hidroalcohólicos de estos recur- metabolitos secundarios polifenólicos. sos también han sido enfrentados con Comparando los datos reportados el radical DPPH, mostrando resultados de capacidad antioxidante (IC = 422 50 AGRADECIMIENTO de IC50 para la uña de gato de 12,05 ± μg/mL) y su contenido de polifenoles 0,47 µg/mL, para el maíz morado 28,89 (110,45 mg/g) para la Gentianella bul- Un agradecimiento al personal del Mu- ± 0,81 µg/mL y para el yacón de 64,52 garica, con los datos de capacidad anti- seo de Historia Natural UNMSM por (13) ± 0,66 µg/mL . Estos resultados oxidante (IC50 = 145 μg/mL) y el con- habernos identificado el material bio- expresan una mejor capacidad anti- tenido de polifenoles (65,8 mg/g) para lógico.

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