i

ii

iii

Dedico este trabalho

a minha família .

iv

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, em especial às Dras. Laurecir Gomes e Maria Julia Marques, coordenadoras do curso durante o período de tese, e à Líliam A. S. Panagio, pelo apoio e compreensão demonstrados.

Ao Dr. Marcos Buckeridge pela orientação, paciência e dedicação.

À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado concedida.

À Universidade Estadual de Campinas, ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt) e à Universidade de São Paulo pela indispensável infra-estrutura oferecida.

Ao Dr. Angelo Luiz Cortelazzo por ter me recebido em Campinas e me apresentado à Unicamp.

Aos Drs. Marcos P. M. Aidar e Marco A. Tiné, da Seção de Fisiologia do IBt, pelas importantes contribuições neste trabalho.

Às pesquisadoras da Seção de Anatomia e Morfologia do IBt, Dras. Solange C. Mazzoni- Viveiros, Edenise S. Alves e Agnes E. Luchi pelo apoio e disponibilidade de equipamentos e reagentes.

Aos Drs. Antonio Salatino, Maria Luíza Salatino e Gina pelas importantes contribuições aos estudos das ceras epicuticulares.

À Mourisa, Cíntia e Anary, do Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Botânica da USP, à Maria Manoel, técnica da Seção de Anatomia e Morfologia do IBt, e a Waldir Caldeira, do Instituto de Biologia da USP, pelo apoio e paciência dispensados.

Aos estagiários e pós-graduandos do IBt, em especial a Andréa, Telma e Renata pelos ensinamentos das técnicas de histologia.

À Fernanda Tresmondi pela amizade, apoio e dedicação nas horas mais difíceis.

Aos amigos Giovanna (amiga sempre presente), Mauro Marabesi, Mari Ionashiro, João Godoy, figuras que conheci nesse período, amigos pra toda vida.

v

SUMÁRIO

RESUMO ...... 1

ABSTRACT ...... 2

INTRODUÇÃO ...... 3

O estudo no contexto das mudanças climáticas: um breve histórico...... 3

Efeitos da alta [CO 2] em plantas...... 9

Fisiologia e crescimento ...... 12

Aspectos morfológicos ...... 14

Desenvolvimento estomático ...... 22

As espécies investigadas...... 28

Justificativa...... 30

Da temática ...... 30

Da metodologia...... 32

Objetivos...... 32

Gerais ...... 32

Específicos ...... 32

MATERIAL E MÉTODOS ...... 33

Cultivo das plântulas em diferentes concentrações de CO 2...... 33

Medidas de crescimento...... 35

Análises microscópicas...... 35

Diafanização...... 35

Análise histológica ...... 36

Microscopia eletrônica de varredura ...... 37

Microscopia eletrônica de transmissão ...... 37

vi

Determinação quantitativa da cera epicuticular...... 38

Determinação qualitativa da cera epicuticular...... 39

Análises estatísticas...... 40

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 40

Efeitos sobre o crescimento...... 40

Efeitos no número de estômatos...... 46

Efeitos ultra-estruturais...... 49

Efeitos sobre a cera epicuticular...... 54

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 74

ANEXO ...... 84

vii

RESUMO

A concentração atmosférica de dióxido de carbono (CO 2) aumentou de 280 ppm, à época da Revolução Industrial, para cerca de 370 ppm atualmente, e continua a aumentar cerca de 1,8 ppm ao ano. Os efeitos dessa elevação no sistema climático global têm atraído considerável atenção, mas ainda não há informações suficientes sobre como essas mudanças podem afetar as espécies arbóreas tropicais, em especial na estrutura dessas plantas, componente relevante no sucesso competitivo e fisiológico dos vegetais. Nesse estudo são apresentados dados de análises estruturais, ultra-estruturais e bioquímicas de folhas de duas espécies tropicais − o jatobá da mata

Hymenaea courbaril e o do cerrado H. stigonocarpa − expostas à elevada concentração de CO 2. Após cem dias de exposição em câmaras de topo aberto, as espécies demonstraram ser reativas ao aumento da [CO 2], especialmente H. stigonocarpa . Essa alteração atmosférica resultou em maior crescimento das plantas, com significativa redução do número de estômatos e aumento dos parênquimas fotossinteticamente ativos, especialmente do paliçádico. A análise quantitativa da cera epicuticular indicou haver variação, porém não significativa, da cera bruta total das espécies. A cromatografia gasosa e a espectrometria de massa mostraram que a cera epicuticular das duas espécies é constituída, principalmente, por nonacosanos e triterpenódes de provável função alcoólica. Os estudos ultra-estruturais evidenciaram alterações na morfologia dos cloroplastos, em decorrência do aumento na deposição de amido, nos exemplares submetidos à elevada [CO 2], mas não há evidências de que esse depósito afete o desenvolvimento do vegetal. Também houve alteração na morfologia da cera epicuticular. As técnicas microscópicas e bioquímicas adotadas mostraram-se úteis na determinação de respostas de plantas tropicais a elevadas concentrações de

CO 2, constituindo-se em ferramentas de aplicação viável em estudos de mudança climática.

1

ABSTRACT

The atmospheric concentration of carbon dioxide (CO2) increased from 280 ppm, during the Industrial Revolution period, to about 370 ppm in the nowadays. It is continuing to increase about

1.8 ppm per year. The effect of this rise in CO 2, which is leading to global warming have attracted considerable attention, generating reports on how these changes can affect vegetables, in particular tropical trees species. There are few reports on the consequences of the rise in atmospheric CO2 on plant structure, even considering its relevance for the competitive and physiological success of plants. In this study we present the data about structural , ultrastructural and biochemical analyses of seedlings from two tropical species – the jatobá Hymenaea courbaril and H. stigonocarpa – both exposed to high CO2 concentration. After one hundred days of exposure to elevated CO 2 (720 ppm) in open top chambers, the species demonstrated to be reactive, in particular the H. stigonocarpa . This atmospheric alteration resulted in slightly higher plant growth, with significant reduction of the number of stomata and increase of the photosynthetically active tissues, especially of the palissadic layer of the leaves. The quantitative analysis of the epicuticular wax indicated no variation in the species. Gas chromatography and mass spectrometry analyses have shown that the epicuticular wax of the two species is constituted mainly of nonacosans and triterpenoids of probable alcoholic function. The ultrastructural studies revealed alterations in the morphology of the epicuticular wax, and of the chloroplasts the later due to the increase in starch deposition, in the samples submitted to increased CO2 concentration. However, there were no evidences that these changes affect plant development as a whole. The microscopical and biochemical techniques used were useful in determining the responses of tropical plants to the increase of CO2 concentrations, being therefore valuable tools in studies of climatic change.

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INTRODUÇÃO

O estudo no contexto das mudanças climáticas: um breve histórico.

A expressão ‛aquecimento global’ tem aparecido com bastante freqüência nos vários tipos de mídia, chamando a atenção de leigos a especialistas, ainda que a ciência já venha alertando para o problema desde o século XVII. No plano político, falou-se da questão por ocasião da primeira

Conferência Mundial sobre o Clima, realizada em 1979 em Genebra; na década seguinte com a assinatura da convenção da ONU sobre mudança climática, a Eco-92, no Rio de Janeiro; e em

1997 com a negociação do Protocolo de Kyoto (Kandel, 2007).

Por definição, ‛clima’ e ‛sistema climático’ são diferentes. O sistema climático é mais complexo e interativo, pois consiste de elementos presentes na atmosfera, na superfície terrestre e em corpos d’água, além dos organismos que habitam o planeta, enquanto clima é usualmente descrito por variáveis de temperatura, precipitação e dinâmica dos ventos ao longo de um período que pode ser de meses a milhões de anos. Dessa forma, o sistema climático sofre influência de sua própria dinâmica interna e de fatores externos – forcings 1 –, que incluem fenômenos naturais como erupções vulcânicas e variações solares, bem como mudanças induzidas por atividades antrópicas na composição atmosférica (Le Treut et al ., 2007).

O sistema climático sofre efeito da radiação solar, sendo três os mecanismos fundamentais que podem agir: mudanças na órbita terrestre, na radiação que é refletida da superfície do planeta

(albedo), e mudanças na concentração de gases de efeito estufa, que alteram o comprimento de onda da radiação refletida da Terra de volta para o espaço. Se o planeta refletisse toda a energia

1 Forcing Radioativo (RF) – Conceito usado para comparações quantitativas da força de diferentes agentes (naturais e humanos) nas mudanças climáticas globais (Foster et al. 2007).

3

que recebe do Sol, sua superfície teria uma temperatura média de -19°C, valor bem diferente da média que conhecemos (+14°C). A razão dessa diferença está na presença de gases que agem bloqueando parcialmente a energia refletida pela superfície, evitando que esta retorne ao espaço

(Fig. 1). É o chamado ‛efeito estufa’, e seus mais importantes elementos são o dióxido de carbono

(CO 2) e o vapor d’água (Le Treut et al ., 2007).

Figura 1. Modelo esquemático do efeito estufa natural. As setas amarelas indicam radiação solar de comprimentos de onda curtos, essencialmente ultravioleta, enquanto as vermelhas a refletida pela superfície terrestre (infravermelho) (Le Treut et al ., 2007).

4

Outro componente importante são as nuvens, que absorvem a radiação infravermelha emitida pela Terra, aquecendo-a, mas também absorvem a radiação ultravioleta do Sol, contribuindo para o resfriamento do planeta. Mudanças no seu aspecto, tais como tipo, localização, conteúdo de

água, altitude, forma e tamanho das partículas afetam o grau com que as nuvens aquecem ou resfriam a superfície terrestre. Isso alerta para a complexidade do tema e reforça a necessidade de mais pesquisas para melhor compreendê-lo (IPCC, 2001).

As atividades humanas têm intensificado os efeitos desses gases ao elevar a concentração de alguns de seus componentes (Buckeridge & Aidar, 2002), principalmente após o advento da era industrial, no século XVIII (Fig. 2). Modelos de reconstrução climática de longos períodos (Fig.

3) indicam que o planeta realmente está mais quente. Primariamente, esses aumentos são devidos

à queima de combustíveis fósseis e ao desflorestamento, o que têm alterado a composição química da atmosfera com substancial implicação sobre o sistema climático global (Hugues,

2000).

Além do CO 2 e do vapor d’água, outros importantes elementos que exercem efeito estufa são o metano (CH 4), o óxido nitroso (N 2O) e os clorofluorcarbonos (CFCs) (Tabela 1), gases com alto potencial de aquecimento global (Foster et al. , 2007). A concentração de dióxido de carbono −

[CO 2] − prevista para o ano de 2100 varia de 540 ppm (partes por milhão) a 970 ppm, elevação relevante se comparada aos 280 ppm do período pré-industrial e 368 ppm do ano 2000.

Entretanto, cenários incertos, como a persistência do processo de desflorestamento e a magnitude do feedback climático na biosfera, causam variação na estimativa da [CO 2] para o ano 2100, entre

490 e 1260 ppm (75 a 350% de aumento em relação ao período pré-industrial) (Gitay et al. ,

2002). Para Prentice (2001), as previsões indicam concentrações próximas a 720 ppm para a metade do século XXI.

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Figura 2. Concentrações atmosféricas de importantes gases de efeito estufa nos últimos 2000 anos. Aumentos registrados desde 1750 são atribuídos a atividades antrópicas da era industrial (Foster et al. , 2007).

Figura 3. Reconstrução da temperatura anual média da superfície terrestre no hemisfério norte no último milênio. Tendência linear (linha branca) entre os anos 1000 e 1850. A área cinza representa erro padrão (Hugues, 2000).

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Tabela 1. Alterações recentes nas concentrações de alguns dos principais gases de efeito estufa e respectivo forcing radioativo. Os dados mostram as concentrações atmosféricas de dióxido de carbono

(CO 2), metano (CH 4), óxido de nitrogênio (N 2O) e de três tipos de clorofluorcarbonos (CFCs), suas contribuições na mudança climática ( forcing radioativo) e sua evolução de 1998 a 2005. Unidades: a ppm, b ppb, c ppt. Em parênteses, a variação percentual. (Modificado de Foster et al. , 2007).

Alterações nas concentrações Forcing radioativo

Gás 1998 2005 1998 2005 (W m -2)

a CO 2 338 379 (13%) 1,48 1,66 (13%) b CH 4 1,6 1,7 (11%) ND 0,48 c N2O 303 319 (5%) 0,14 0,16 (11%) CFC-11 c 258 251 (3%) 0,063 0,06 (5%) CFC-12 c 518 538 (4%) 0,15 0,17 (1%) CFC-113 c 83 80 (4%) 0,022 0,02 (5%)

A observação de que a atmosfera age como uma estufa, permitindo a passagem de radiação e retendo parte do calor, foi registrada no século XVII por Edme Mariotte. Dois séculos mais tarde, em 1859, John Tyndall notou que mudanças na concentração de componentes atmosféricos radioativamente ativos, como CO 2 e água, poderiam produzir as mudanças climáticas, então citadas em estudos geológicos prévios. Em 1895, o químico sueco Svante Arrhenius observou que a combustão crescente de combustíveis fósseis (carvão, gás e petróleo) aumentaria a quantidade de CO 2 na atmosfera, e formulou a hipótese de que isso reforçaria o efeito estufa e acarretaria em reaquecimento da superfície do planeta. Em 1938, por meio de cálculos matemáticos, Callendar postulou que dobrando a concentração de CO 2 atmosférico, a temperatura média global subiria em 2°C, com considerável aquecimento das regiões polares, e associou esta

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elevação da [CO 2] à queima de combustíveis fósseis e a seu efeito estufa. A partir de 1957

Charles David Keeling inicia longa série de medições sistemáticas e precisas da concentração atmosférica de CO 2, confirmando a hipótese de Arrhenius: a concentração média anual do gás passou de 315 ppm, em 1958, para 330 ppm, em 1974. Desde 2001 a concentração média de CO 2 ultrapassa 370 ppm (Le Treut et al ., 2007).

De acordo com projeções do Painel Intergovernamental de Mudanças Climáticas (IPCC), criado pela ONU em 1988, o aumento da temperatura média da superfície terrestre até 2100 estará entre 1,4°C e 5,7°C, e se essa previsão se confirmar, o planeta passará por alterações tão radicais quanto as que puseram fim ao último período glacial. Entretanto, enquanto nesse período a mudança natural levou milhares de anos para acontecer, o aquecimento observado atualmente pode ocorrer em pouco mais de um século. E uma das razões apontadas para esse rápido aquecimento seriam as atividades humanas sobre o meio, como crescimento populacional, desmatamento nos trópicos, expansão das atividades agrícolas e pecuárias, ampliação de áreas urbanas e industriais, entre outras (Kandel, 2007).

Em reuniões políticas, o atual governo norte americano coloca em dúvida a participação humana no recente aquecimento climático do planeta. Entretanto, sua Agência de Proteção

Ambiental – US Environmental Protection Agency – alerta que as atividades humanas, em especial as emissões industriais, mudaram a composição da atmosfera e, provavelmente, estão influenciando o clima da Terra, mesmo considerando que fatores naturais, como erupções vulcânicas, tiveram participação no processo (www.epa.gov/climatechange. Acesso em

20/09/2007).

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Em recente estudo que utilizou séries anuais (1980 a 2004) de emissão de CO 2, consumo de energia primária, crescimento populacional e das riquezas de países como EUA, Japão, China,

Índia, países da Comunidade Européia, entre outros, Raupach et al. (2007) afirmam que as emissões de CO 2 previstas nos relatórios do IPCC estão subestimadas. Para os autores, as taxas de emissão do gás cresceram de 1,1% ao ano na década de 90, para mais de 3% ao ano (mais de 2 ppm/ano), entre 2000 e 2004. Esse crescimento, observado em países pouco desenvolvidos e em desenvolvimento, como a China, teria sido impulsionado por expansão econômica mais expressiva, traduzida por maiores renda per capita e PIB, e ainda sustentada por demanda energética baseada em combustíveis fósseis e carvão. Outra constatação foi que tanto países em desenvolvimento como os desenvolvidos aumentaram suas emissões de CO 2, e que, portanto, nenhuma região está “descarbonizando” sua matriz energética, a despeito de todos os alertas da comunidade científica.

Efeitos da alta [CO 2] em plantas.

As evidências de que o aumento da concentração atmosférica de gases de efeito estufa, em especial o CO 2, trará efeitos para o clima do planeta têm atraído esforços em vários ramos da ciência. Climatologistas procuram identificar se as mudanças atuais são decorrentes de atividades antrópicas ou de variáveis naturais, e, dessa forma, elaborar cenários climáticos para o futuro.

Para ecologistas e fisiologistas, o desafio é prever os efeitos dessas mudanças nas espécies e comunidades, já que alterações na concentração de CO 2, na temperatura e no ciclo das chuvas podem afetar diretamente processos biológicos como fotossíntese, respiração, crescimento e a composição dos tecidos das plantas. Efeitos na distribuição das espécies e na fenologia também não são descartados. Em suma, se confirmadas, essas mudanças inevitavelmente alterarão a competição e a interação entre as espécies (Hugues, 2000).

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Diversos componentes do sistema climático, entre eles os oceanos e a biota, afetam as concentrações atmosféricas de gases de efeito estufa. Os vegetais formam um exemplo importante, pois são organismos que retiram CO 2 da atmosfera e o convertem, na presença de

água, em carboidratos (Le Treut et al ., 2007).

Fotossíntese e, por conseqüência, crescimento e produtividade, são diretamente afetados pelo

CO 2, que parece exercer efeito fertilizante nas plantas. Esse efeito é mais evidente em espécies de clima temperado, como coníferas, onde o carbono fixado é primariamente alocado no câmbio vascular. Entretanto, em espécies tropicais, eventuais adições de biomassa são mais distribuídas pela planta (Phillips et al. , 1998).

São amplamente conhecidos os efeitos diretos do CO 2 atmosférico nas atividades fotossintetizantes e de uso da água pelas plantas (Jarvis et al. , 1999; Teng et al. , 2006). Dessa forma, a elevação da concentração desse gás potencialmente afetará a vegetação e os ecossistemas, tanto florestais como agrícolas. Analisar as respostas vegetais torna-se, portanto, componente essencial para compreensão dos efeitos das mudanças globais.

Amostras de herbários e fósseis de plantas (Paleobotânica) podem oferecer indícios da atmosfera de outros séculos e de eras geológicas, respectivamente. Registros obtidos a partir de bolhas de ar aprisionado em gelo polar, particularmente na Antártica, têm mostrado que a concentração atmosférica de CO 2 oscilou entre 180 e 280 ppm em ciclos de 100 mil anos. Os estudos que determinam a concentração de gases da paleo-atmosfera são divididos em dois grupos. O primeiro é baseado em modelagem geoquímica do ciclo do carbono em milhões de anos, invocando vulcanismo e tectônica. O segundo usa indicadores geoquímicos e paleobiológicos, e é neste que segmentos de plantas fossilizadas são utilizados para estimar níveis

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milenares de CO 2. Amostras de herbário, por sua vez, permitem predizer se a atmosfera do período pré-industrial, reconhecidamente com menor concentração de CO 2, alterou aspectos das plantas, como o número dos estômatos das suas folhas, por exemplo. São, portanto, abordagens de estudo do clima de tempos passados (Beerling & Royer, 2002).

Algumas abordagens metodológicas vêm sendo aplicadas desde o início dos trabalhos sobre os efeitos da elevação do CO 2 atmosférico em plantas. No início, apenas espécies de interesse econômico, em sua maior parte hortaliças, eram submetidas a condições especiais de crescimento. Com a evolução do sistema de câmaras, espécies arbóreas passaram a ser examinadas em experimentos com parâmetros ambientais controlados (Ceulemans & Mousseau,

1994).

Essas estruturas, entretanto, limitam o estudo de árvores adultas e de áreas florestais, o que foi parcialmente resolvido com a técnica que submete individualmente ramos de árvores adultas a condições estabelecidas e controladas. A técnica (branch bag ) envolve um ramo da árvore numa bolsa, no interior da qual condições ambientais como concentração de CO 2 e temperatura podem ser controladas. Por sua vez, assume-se como válida a teoria da autonomia do ramo em relação ao restante do vegetal (Sprugel et al. , 1991), o que é questionável, em especial quando se consideram as espécies decíduas.

O sistema FACE (Free-Air CO 2 Enrichment ), outra abordagem de estudo, foi desenvolvido para excluir as limitações dos sistemas anteriores (como diferenças relativas ao solo, por exemplo), e submeter grupos de plantas a elevadas [CO 2]. Entretanto, seus custos de investimento e de manutenção são bastante altos (Okada et al. , 2001), o que pode inviabilizar sua aplicação.

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As câmaras de topo aberto (ATCs), originalmente utilizadas em estudos de poluição atmosférica, constituem o sistema de atmosfera controlada mais utilizado, ainda que seja necessário considerar diferenças com o meio, como temperatura, umidade relativa e ação dos ventos.

Fisiologia e crescimento.

Muitos dados fisiológicos foram obtidos a partir da condução de experimentos como os descritos acima. Em espécies arbóreas expostas à elevada [CO 2], observou-se uma tendência geral de aumento do crescimento, resultante de aporte extra de assimilados distribuídos em diferentes estruturas da planta, conduzindo a modificações na razão raiz/parte aérea (Poorter,

1993), e indicando haver preferência de estocagem extra nas raízes em detrimento do restante do vegetal (Rogers et al. , 1992). O maior investimento em raízes parece ser uma resposta à necessidade de maior aquisição de nutrientes minerais em solos pobres. Entretanto, Petterson et al. (1993) não encontraram associação entre alta [CO 2] e diferenças na massa seca de raiz e caule de Betula pendula .

O aumento nas taxas fotossintéticas e a melhora nas relações hídricas, observados nas plantas cultivadas em elevado teor de CO 2, normalmente geram incrementos de biomassa e altura nestas plantas, respectivamente 49% e 12% maiores do que nas plantas cultivadas em atmosfera com concentração de CO 2 ambiente (Ainsworth & Long, 2005). Aidar et al. (2002), estudando plântulas do jatobá Hymenaea courbaril , também encontraram alterações na relação raiz:parte aérea, decorrentes das mudanças no conteúdo de biomassa dos diferentes tecidos, quando as plantas foram cultivadas em ambiente com elevada [CO 2].

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Estudos de alterações de componentes da parede celular em plantas crescidas em elevada

[CO 2], em especial da celulose, são importantes na medida em que o acúmulo de celulose nos vegetais é uma forma de seqüestro de carbono (Buckeridge & Aidar, 2002). Ao estudar árvores de carvalho, Aranda et al. (2006) encontraram diferenças significativas no conteúdo de celulose em folhas, mas não observaram mudanças nos teores de lignina e hemiceluloses. Um aumento no conteúdo de celulose (aproximadamente 33% em folhas e 19% em caules) também foi observado em plântulas de jatobá crescidas em atmosfera com 720 ppm de CO 2 (Gaspar & Buckeridge, comunicação pessoal). Em folhas de Arabidopsis o aumento desse composto foi de 22% (Teng et al ., 2006).

Espécies expostas por longos períodos (semanas ou meses) a altas concentrações de CO 2 podem aclimatar, reduzindo sua atividade fotossintetizante. Prevalece o conceito de que nessa condição atmosférica aumenta a quantidade disponível de carboidratos, e a planta responde a esse aumento de diferentes formas, dependendo de sua capacidade de estocagem. Em determinadas espécies, a capacidade fotossintetizante permanece alta durante longo período de exposição em elevado teor de CO 2, em vista de sua capacidade genética em aumentar o tamanho ou o número de alguns órgãos de estocagem (Ceulemans & Mousseau, 1994). Novos drenos de carbono, como folhas, podem surgir, como no caso de Fagus sylvatica (El Kohen et al. , 1993), mas em outras espécies pode haver um modelo de crescimento determinado geneticamente que conduz ao processo de aclimatação (Mousseau & Enoch, 1989).

Smith & Stitt (2007) propõem que respostas de aclimatação ajustem o balanço entre fornecimento e consumo de carbono, coordenando a partição dos produtos da fotossíntese, sua taxa de utilização de amido no escuro e a taxa de crescimento. As respostas de aclimatação ainda permitiriam ajustes em situações de mudanças ambientais que afetassem a disponibilidade de

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carbono, de forma a otimizar o crescimento vegetal. Estas respostas requerem mecanismos que identifiquem o nível de carbono disponível na planta ( sugar sensing ), o convertam em sinal metabólico que, ligado à molécula específica, desencadeia eventos em cascata que culminam em controle do crescimento e balanço de carbono.

Aspectos morfológicos.

Dentre os órgãos da planta, a folha é o que apresenta a maior diversidade, exibindo grande plasticidade estrutural em resposta a diferentes condições ambientais (Esau, 1977). Seu desenvolvimento é crucial à planta na medida em que é responsável pela interceptação da luz, fotossíntese, uso da água e, em última instância, pela produtividade total da planta. Em outro contexto, suas características anatômicas, ultra-estruturais e bioquímicas definem o índice de produtividade de uma floresta, que pode ser, portanto, impactado pela elevação da [CO 2] na atmosfera (Pritchard et al. , 1999).

Dos parâmetros utilizados na investigação dos eventuais efeitos da alta [CO 2] em plantas, a

área foliar é um dos mais visados na medida em que é um importante componente na determinação da produtividade total dos vegetais, já que a interceptação da luz, relacionada à fotossíntese, é também determinada pelo índice de área foliar (Ewert, 2004). O crescimento das folhas envolve produção e expansão celular, e é possível que esses dois processos sejam influenciados por um aporte adicional de CO 2. Entretanto, a resposta não parece ser única para todos os grupos.

Em Ranasinghe & Taylor (1996) encontramos que o crescimento da área foliar de Phaseolus vulgaris exposto à elevada [CO 2] ocorreu como resultado de aumento da expansão celular, independentemente da produção de novas células. Em Gardner et al. (1995), encontramos a

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confirmação do efeito positivo do aumento da [CO 2] na expansão celular de clones de Populus , mas o tamanho das células epidérmicas de folhas totalmente expandidas não foi influenciado pelo alto teor de CO 2, sugerindo que a produção de novas células pode ter contribuído para o crescimento das folhas. Há evidências sugerindo que o carbono, provavelmente da sacarose, age como molécula reguladora permitindo às células um ciclo de divisão mais rápido em raízes

(Taylor et al. 1994).

Outro componente das folhas que responde a diferentes tipos de estresse é a cera cuticular, que tem em Shepherd & Griffiths (2006) uma importante revisão. O interesse por essa estrutura dos vegetais decorre principalmente da ação das ceras como barreiras protetoras contra uma ampla gama de estresses abióticos, entre eles, a elevação da concentração atmosférica de CO 2.

A cutícula, uma camada delgada que recobre as folhas (Fig. 4), é composta por polímeros de

ácidos graxos de 16 e 18 carbonos que formam uma matriz (cutina), onde são encontrados microfibrilas de celulose, oligossacarídeos e ceras. Esta camada consiste predominantemente de hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo alcanos, álcoois primários e secundários, aldeídos, cetonas, ésteres e outros compostos derivados, constituindo a primeira barreira entre a planta e o meio. Uma nova camada de cera pode ser depositada sobre a cutícula, formando a cera epicuticular (Willmer & Fricker, 1996). Dadas as suas características bioquímicas, o desenvolvimento de uma cutícula impermeável foi fundamental para o sucesso de colonização das plantas no ambiente terrestre, por ter função primordial no controle da perda de água

(Shepherd & Griffiths, 2006).

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Figura 4. Esquema de seção transversal de membrana cuticular típica de uma folha madura (Gülz, 1994).

A biossíntese e o mecanismo de deposição da cera cuticular envolvem complexas reações químicas ainda não completamente elucidadas. O passo inicial é a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, reação catalisada pelo sistema enzimático multifuncional acetil-CoA carboxilase, com a participação do CO 2. Em etapa subseqüente, cadeias acil de 16 a 18 carbonos são formadas e incorporadas aos complexos lipídicos celulares, cutina, suberina e componentes da cera; em seguida são hidrolisados por tioesterases, e os ácidos graxos resultantes são transportados através da membrana dos cloroplastos. Alongamento e modificações na cadeia acil ocorrem por meio de reações enzimáticas no citosol das células epidermais; são, portanto, sistemas enzimáticos extra-plastidiais (Gülz, 1994).

A maioria dos componentes da cera surge de reações de redução , que formam álcoois primários, ácidos graxos livres e cetoaldeídos, e de decarboxilação , formando alcanos, álcoois secundários e cetonas (Kunst & Samuels, 2003). No citosol das células epidermais, os sítios das reações químicas estão no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi e na membrana celular.

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Os compostos formados atravessam essas estruturas, provavelmente por meio de vesículas, para então se depositarem na superfície cuticular. A passagem de componentes da cera através da parede celular e da cutícula provavelmente ocorre por difusão, por meio de espaços de dimensões moleculares e canais de abertura temporária (Kunst & Samuels, 2003).

De modo geral, vistas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), as ceras epicuticulares têm estrutura microcristalina, algumas vezes surgindo de uma camada amorfa interna (Bianchi,

1995). O aspecto das ceras epicuticulares vem sendo investigado para diversos fins. Barthlott et al. (1998) fizeram uso de MEV de alta resolução para identificar e classificar 23 tipos de ceras, propondo estruturas na forma de hastes, fitas, filamentos, tubos e placas, sendo que algumas dessas podem ser relacionadas à presença de compostos específicos, como álcoois primários, secundários, ésteres entre outros.

A base química e o tamanho das ceras variam entre as espécies. Em Rubus fruticosus a cera epicuticular consiste de álcoois livres, ésteres e acetatos alcoólicos, com menor quantidade de

ácidos graxos livres e alcanos. Já em Prunus lauroceratus , a cera epicuticular consiste em compostos alifáticos, ao passo que a cuticular, primariamente, de triterpenóides (Jetter et al. ,

2000).

Intensidade luminosa, temperatura e umidade são fatores que também influenciam a morfologia das ceras, favorecendo uma ou outra forma estrutural. Altas temperaturas, por exemplo, favorecem estruturas paralelas à superfície da cutícula, como placas e escamas, enquanto baixas temperaturas, hastes e tubos. Estruturas já estabelecidas podem mudar de forma sob determinadas condições. Formas tubulares são termodinamicamente instáveis, e, sob efeito de calor excessivo, transformam-se em estruturas planares e estáveis (Shepherd & Griffiths,

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2006). Estes dados ainda são incertos, dadas as variações nas respostas dos vegetais, mas merecem atenção em estudos que investiguem os efeitos da elevação do teor de CO 2, porque tal modificação atmosférica deverá vir acompanhada de alterações na temperatura e na umidade, por afetar o ciclo das chuvas e a exposição aos raios UV-B (Long et al., 2004).

As respostas do conteúdo e da composição da cera foliar à elevação da [CO 2] são variáveis.

Vanhatalo et al. (2001) encontraram relação direta entre esse aumento e a espessura da cera em

Betula pubescens . Já em Pinus palustris (Prior et al. , 1997) e em Agave deserti (Graham &

Nobel, 1996), houve redução da cera em condições de elevação da [CO 2]. Nota-se alguma contradição nos relatos das respostas das plantas aos diferentes estresses ambientais, em especial ao alto teor de CO 2.

Outro importante elemento presente na resposta dos vegetais às variáveis ambientais são os estômatos, estruturas formadas por duas células-guarda presentes na epiderme e essenciais à sobrevivência das plantas, pois controlam a entrada de CO 2 e otimizam a eficiência do uso da

água. Embora presentes em todos os órgãos da parte aérea revestida por epiderme, são mais comuns nas folhas. Nelas, estão presentes nas faces abaxial (folhas hipostomáticas), adaxial

(epistomáticas), ou em ambas (anfiestomáticas). Cada estômato é originado por uma série de divisões que constituem um ‛modelo de espaçamento estomático’, controlando sua freqüência na epiderme e produzindo as células-guarda. Com algumas raras exceções, os estômatos são encontrados em todos os grupos vegetais, de briófitas a angiospermas (Willmer & Fricker, 1996).

A entrada de água nas células-guarda induz a abertura do estômato. Esse movimento ocorre ao longo do dia, dependendo da disponibilidade de água e de outros fatores, que podem ser

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ambientais (luz e temperatura, por exemplo) ou internos (níveis endógenos de açúcares, de potássio e de ácido abscísico) (Willmer & Fricker, 1996).

Os mecanismos envolvidos na abertura e no fechamento dos estômatos já foram bastante estudados, mas ainda não estão claros os fatores que controlam o seu funcionamento. De maneira geral, através dos estômatos as folhas das plantas que possuem fotossíntese do tipo C 3 (presente na maioria das plantas terrestres) possibilitam as trocas gasosas com o meio, ao mesmo tempo em que perdem água. Essa regulação é efetuada por controle da abertura do ostíolo, o qual, por sua vez, é regulado por modificações na morfologia das células-guarda induzidas por pressão de turgor. Coletivamente, os estômatos aumentam o desempenho da planta e influenciam os ciclos globais de carbono e água (Brownlee, 2001). Normalmente o período de abertura ocorre ao amanhecer e vai até o meio da tarde, podendo haver uma diminuição no meio do dia, dependendo das condições atmosféricas. Este processo é fundamental para o crescimento e a manutenção de todas as plantas, uma vez que este carbono, assimilado na fotossíntese, é incorporado como celulose, proteínas, ácidos nucléicos e demais compostos de carbono das plantas (Pons &

Welschen, 2003).

Os estômatos têm despertado o interesse dos pesquisadores pelas respostas das células-guarda a uma ampla variedade de estímulos ambientais, como intensidade luminosa, umidade e pressão parcial de CO 2. A resposta estomática ao CO 2 tem atraído particular interesse nas últimas três décadas porque (1) suas células respondem à concentração intercelular de CO 2 ( Ci), que é determinada pela concentração desse gás na superfície da folha e por sua taxa de assimilação no mesofilo (Mott, 1988); e, mais recentemente, (2) por seu potencial de utilização como estrutura indicadora de alterações da concentração atmosférica de CO 2 (Beerling & Woodward, 1995;

Field et al. , 1995 e Woodward et al. , 2002). As conseqüências de tais alterações para o

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crescimento vegetal, para a distribuição das espécies e para o funcionamento do ecossistema fazem da fisiologia estomática ponto central nas ciências ambientais (Morison, 1998), já que, anualmente, 40% de todo CO 2 atmosférico (cerca de 300 trilhões de toneladas de carbono) passam pelos estômatos (Cias et al. , 1997 apud Lake et al. , 2001).

Por meio de modelos de dinâmica vegetacional, Cramer et al. (2001) adicionaram dados novos a respeito da contribuição da transpiração estomática no ciclo global da água e do carbono. Por este estudo conclui-se que as maiores taxas de transpiração ocorrem nas florestas tropicais, com

32 Gt/ano de vapor d’água passando pelos estômatos, cerca de duas vezes o contido na atmosfera

(15 Gt/ano). Quanto ao ciclo do carbono estima-se que a fotossíntese fixe cerca de 120 trilhões de toneladas de carbono dos 730 trilhões presentes na atmosfera anualmente. O estudo identifica, portanto, a relação direta entre controle estomático, difusão de vapor d’água e CO 2 (Hetherington

& Woodward, 2003).

Diversos trabalhos relatam redução do número de estômatos em espécies crescidas em alto teor de CO 2 (Woodward & Kelly, 1995). Assim, plantas crescidas em reduzida concentração de

CO 2 têm maior número de estômatos que aquelas crescidas em concentrações mais altas. Futuros aumentos nessa concentração podem, portanto, resultar em decréscimo da densidade estomática de muitas espécies. Essas observações são consistentes com comparações de densidades estomáticas de plantas atuais com exemplares coletados antes da era industrial, reconhecidamente agente causador da elevação atmosférica desse gás (Brownlee, 2001).

Os primeiros experimentos que investigaram os efeitos da concentração de CO 2 no número de estômatos foram conduzidos em atmosfera enriquecida − 1000 ppm de CO 2 (Madsen, 1973 apud

Beerling & Royer, 2002). Os resultados mostraram baixa sensibilidade dos estômatos, já que

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apenas uma das espécies mostrou declínio. Entretanto, a hipótese de que o número de estômatos pode ser modificado em decorrência de alterações na pressão parcial de CO 2 foi confirmada por Woodward (1987), que comparou o índice estomático de espécies arbóreas de amostras de herbário (coletadas em 1787, na era pré-industrial) com amostras recentes, encontrando redução de 40%. Quando essas mesmas espécies foram submetidas a variações na

[CO 2], o decréscimo na densidade estomática foi de 67%.

‛Densidade Estomática’ (DE) é o número de estômatos por unidade de área (mm 2), mas pode ter seu valor influenciado pela expansão das células epidérmicas. Essa expansão é dependente de variáveis como luz, temperatura, umidade, posição da folha na planta, entre outros, podendo mascarar o sinal relativo à diferenciação estomática. Assim, foi introduzido o conceito de ‛Índice

Estomático’ (IE), que é a proporção de estômatos relativa ao número de células epidérmicas. O

IE foi sugerido para normalizar os efeitos da expansão dessas células (Royer, 2001).

Densidade e índice estomáticos foram ferramentas centrais utilizadas por Woodward e colaboradores (2002) para explicar possíveis conseqüências ecológicas do alto teor de CO 2 sobre as plantas. Os autores concluíram que disponibilidade de água, incidência luminosa e hormônios, quando atuam em conjunto com elevada [CO 2], produzem respostas distintas se comparadas às obtidas em experimentos em que somente a concentração do gás é alterada. Para os autores, a reconhecida redução do número de estômatos na maioria das espécies crescidas em alta [CO 2]

(Pritchard et al. , 1999 e Wagner et al. , 2005), tanto em experimentos de curta duração (dias a meses) como nos realizados em registros fósseis (até milhões de anos), configura-se em vantagem evolutiva que deve ser traduzida não somente por melhor eficiência do uso da água

(WUE), posto que esta redução age sobre outros efeitos fisiológicos nos vegetais.

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Em um experimento simples, porém clássico e esclarecedor, Lake et al. (2001) comprovaram que folhas maduras de Arabidopsis thaliana detectam mudanças na concentração de CO 2 atmosférico e na intensidade luminosa, e as enviam por meio de sinais químicos de longa distância às folhas em desenvolvimento. Da mesma forma, folhas em desenvolvimento parecem ser capazes de detectar esses sinais e responder a eles alterando o processo de diferenciação estomática. Como resultado, o número de estômatos nas folhas mais jovens será diferente do encontrado nas maduras, sugerindo haver uma ligação ecológica importante nas respostas induzidas por luz e CO 2.

Desenvolvimento estomático.

As divisões celulares assimétricas que definem o número e a organização dos estômatos na epiderme das folhas obedecem a sinais intrínsecos de ação local (entre células da epiderme) ou a distância (das folhas maduras para as em desenvolvimento), e por fatores extrínsecos, como luz,

água e CO 2 atmosférico. Estudos recentes têm demonstrado a presença de receptores de superfície celular e moléculas de sinalização intracelular na percepção e resposta a esses fatores

(Bergmann, 2006).

Durante o desenvolvimento da folha, um padrão de divisões celulares, regulado por sinais genéticos e ambientais, determina o aparecimento dos estômatos. Ainda que a densidade estomática seja variável, os estômatos são separados por ao menos uma célula pavimentosa − a mais numerosa das células epidérmicas, com funções variadas, como estoque de água em seus grandes vacúolos e proteção contra ataque de insetos e patógenos. Este espaçamento, referido em

Arabidopsis como ‛one-cell spacing’, é uma provável solução adaptativa para minimizar interferências mecânicas entre estômatos adjacentes, otimizando a difusão de gases. Ele surge

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quando se inicia uma nova divisão assimétrica próxima a um estômato (Bergmann & Sack,

2007).

Diversos estudos que abordam o desenvolvimento estomático vêm sendo conduzidos nos

últimos anos, em sua maior parte com células de Arabidopsis. Para formação dos estômatos, uma primeira divisão assimétrica ocorre na célula meristemóide-mãe (MMC), produzindo uma célula menor, a meristemóide (M), que é convertida em célula-guarda mãe (GMC). Posteriormente, uma divisão simétrica da GMC forma as duas células-guarda que deverão compor os estômatos

(Bergmann & Sack, 2007) (Fig. 5).

Vários reguladores do desenvolvimento estomático, como proteínas receptoras e MAP quinases, agem como inibidores no surgimento de novos estômatos, e publicações recentes (Gray,

2007) têm esclarecido esse processo ao identificar fatores de transcrição essenciais na diferenciação estomática (Fig. 6). SPEECHLESS , MUTE e FAMA são membros de uma família de proteínas de Arabidopsis thaliana com expressão distinta e função específica nessa diferenciação.

Proteínas SPEECHLESS participam da primeira divisão assimétrica, iniciando a linhagem de células estomáticas na camada da epiderme em desenvolvimento. Plantas mutantes para o gene

SPEECHLESS não produzem células meristemóides, células-guarda ou estômatos, seu crescimento é mais lento e não atingem a maturidade. O gene MUTE é requerido nos passos finais de divisão assimétrica e no início da diferenciação. Plantas mutantes que perderam a expressão desse gene produzem células meristemóides, mas não estômatos, ao passo que as que têm expressão excessiva têm a epiderme constituída, basicamente, por estômatos (Bird & Gray,

2003).

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Figura 5. Diagrama de estágios e divisões do desenvolvimento estomático em Arabidopsis thaliana (Bergmann & Sack, 2007).

O gene FAMA é especificamente expresso em células-guarda mãe, e participa diretamente da diferenciação que origina os estômatos. Plantas mutantes para esse gene possuem grupos de células-guarda imaturas, incompletamente diferenciadas e não-funcionais (Ohashi-Ito &

Bergmann, 2006; MacAlister et al. , 2007). Assim como FAMA , dois outros fatores de transcrição

– FOUR LIPS e MYB88 – parecem estar envolvidos na diferenciação das células-guarda, ainda que o primeiro atue independentemente dos demais (Gray, 2007).

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A

B

Figura 6. Controle genético do desenvolvimento dos estômatos. (A) Prováveis pontos de ação dos genes. Regulação negativa é indicada por linhas em forma de T, enquanto as positivas apenas com a abreviação do gene. (B) Diagrama de fenótipos de folha de mutantes indicando distribuição e arranjo dos estômatos (verdes) e de tipos celulares terminais (rosa). Células brancas em erecta e four lips 1; myb88 representam células de identidade não determinada (Bergmann & Sack, 2007).

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Os mais recentes progressos no campo do desenvolvimento estomático têm identificado os genes que controlam a produção e o espaçamento dos estômatos em Arabidopsis . Esses genes compreendem receptores, proteases e quinases, e agem primariamente modulando o número e a localização das divisões assimétricas da linhagem celular estomática. Bergmann & Sack (2007) descrevem a participação desses genes segundo a fase em que participam.

O gene ERECTA (ER ) codifica um receptor que contém um domínio extracelular rico em leucina (LRR), um domínio transmembrana e uma quinase citoplasmática (RLK). Esta proteína participa de diversos processos, incluindo crescimento e desenvolvimento, bem como respostas a estresses bióticos e abióticos. Diferenças na eficiência de transpiração, fenômeno diretamente ligado ao comportamento estomático, são relacionadas ao gene ER. É possível que as quinases

ER , juntamente com outras proteínas, tenham participação nos processos de desenvolvimento estomático, transpiração e fotossíntese, e que mudanças na eficiência da transpiração de mutantes er sejam conseqüências indiretas sobre o desenvolvimento estomático, isto é, morfologia da planta alterada, espessura foliar e densidade estomática (Masle et al. , 2005 e Bergmann, 2006).

TOO MANY MOUNTHS (TMM ), outro gene de ação inicial, codifica receptores de superfície presentes em células meristemóides e em células-guarda mãe, mas ausentes em células-guarda totalmente diferenciadas. Em Arabidopsis mais de 200 quinases compartilham uma estrutura comum de domínio extracelular rico em leucina, um único domínio transmembrana e uma quinase citoplasmática. Mutações desse gene provocam alterações em todos os tipos de divisões assimétricas da linhagem estomática, formando excesso de estômatos nas folhas e indicando que a função desse gene é reprimir divisões. Em mutantes tmm-1 foram observados erros na assimetria das divisões, essencial para criação do espaçamento, e nas divisões de ampliação, o que levou à conversão prematura de células meristemóides em células-guarda mãe. Portanto,

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proteínas das famílias ER e TMM controlam as divisões assimétricas do desenvolvimento estomático (Bergmann & Sack, 2007).

YODA é membro de uma classe de MAP (mitogen-actived protein) quinases que possuem extensão N-terminal longa e atividade regulatória negativa. Plantas mutantes com proteínas sem essa extensão possuem folhas com epiderme composta somente de células pavimentosas.

Após a fase inicial de divisões assimétricas e estabelecimento do modelo de espaçamento, o programa celular é direcionado para divisões simétricas e diferenciação. Os genes conhecidos que agem durante essa fase participam da proliferação celular, da citocinese das GMC e regulam a diferenciação das células-guarda (Bergmann & Sack, 2007).

O gene HIC ( HIgh Carbon dioxide), recentemente descoberto em Arabidopsis e que significou um marco nas pesquisas genéticas em estômatos, codifica um regulador negativo (inibidor) do desenvolvimento estomático que responde à concentração de CO 2. Há muitas incertezas nesse campo e ainda não está claro o mecanismo pelo qual o HIC afeta o desenvolvimento estomático em resposta ao CO 2, mas pesquisas sugerem que esse gene codifique uma 3-cetoacil CoA sintase, enzima envolvida na síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA – very long chain fatty acids). Plantas mutantes para esse gene exibem até 42% de aumento do índice estomático quando expostas ao dobro da concentração atmosférica de CO 2. A explicação estaria em alterações na permeabilidade da matriz extracelular das células-guarda, que então modificariam a difusão de uma molécula estimulada pelo alto teor de CO 2, molécula esta responsável pelo controle do desenvolvimento estomático. Com a difusão prejudicada, não haveria inibição da diferenciação da célula vizinha, originando uma nova célula-guarda. A princípio, esse foi o

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primeiro gene do desenvolvimento de plantas identificado que responde a mudanças globais da atmosfera (Gray et al. , 2000).

Estes estudos ratificam o envolvimento da cutícula na movimentação apoplástica de sinais na epiderme foliar, que determinarão o número de estômatos da planta. A elucidação mais precisa desse mecanismo deve se constituir em peça-chave da biologia de plantas nos próximos anos, já que pelos ostíolos passa um dos principais componentes do efeito estufa, evento de preocupação científica e política mundial recente, mas alertado por Arrhenius há mais de um século.

As espécies investigadas.

Há diversos gêneros de plantas que apresentam espécies muito semelhantes, mas que habitam biomas diferentes. Rizzini (1997) chama esse fenômeno de vicariância, no qual, no curso de sua especiação, certas espécies ou variedades morfologicamente afins ocupam áreas geograficamente vizinhas e que se excluem mutuamente. Além da relação estrutural e da distribuição em áreas próximas, tais formas são descendentes de um mesmo ancestral.

Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa são reconhecidas como espécies vicariantes de matas e cerrados brasileiros (Rizzini, 1997). As duas espécies pertencem à família Fabaceae (sub-família

Caesalpinoideae), à tribo Detariae e ao gênero Hymenaea, estabelecido por Linnaeus, que descreveu a espécie H. courbaril em 1753 (Lewinsohn, 1980). São reconhecidas 14 espécies e 12 variedades do gênero, sendo a maior parte de distribuição Neotropical (Lee & Langenheim,

1975).

Com exceção de H. verrucosa , encontrada exclusivamente no continente africano, as demais espécies do gênero têm distribuição Neotropical centrada na Bacia Amazônica, estendendo-se

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desde o centro do México até o norte da Argentina. A maioria das espécies está distribuída em formações florestais, mas algumas ocorrem em áreas de caatinga do nordeste brasileiro e em

áreas de cerrado do Brasil central (Lee & Langenheim, 1975).

A composição florística moderna é primariamente resultado de eventos biogeográficos.

Durante o Pleistoceno e início do Holoceno ocorreram grandes alterações climáticas, representadas pela alternância de períodos quentes e frios, que conduziram à expansão e retração de florestas úmidas e de formações vegetais de clima seco. Essa alternância provocou grandes alterações na disponibilidade de recursos e o surgimento de novos hábitats, propiciando os processos de especiação e de diversificação das angiospermas (Langenheim et al. , 1973).

O processo brevemente descrito acima ocorreu na região amazônica, centro de diversidade do gênero Hymenaea , e para Dechoum (2004), a espécie H. stigonocarpa , que é exclusiva dos cerrados brasileiros, foi originada a partir de H. courbaril , de mais ampla distribuição. Ainda segundo Dechoum (2004), que avaliou o desempenho fotossintético e de crescimento das duas espécies em diferentes condições edáficas e de luminosidade, H. courbaril parece ter maior plasticidade que H. stigonocarpa , podendo obter maior sucesso na ocupação de novos hábitats.

Hymenaea courbaril , popularmente conhecida como jatobá, é uma espécie bastante conhecida, principalmente devido à sua produção de resina no tronco e porque é indicada para uso em reflorestamentos, dada a facilidade de obtenção de mudas em viveiro. A polpa farinácea de seu fruto é muito procurada por várias espécies da fauna, que dispersam suas sementes, tornando o jatobá muito útil em plantios de áreas degradadas destinadas à recomposição da vegetação arbórea (Lorenzi, 2002).

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Vários estudos que abordam os compostos de reserva das sementes de H. courbaril vêm sendo realizados por Buckeridge e colaboradores, abrangendo desde a estrutura, o armazenamento e a mobilização destes polissacarídeos na germinação e no desenvolvimento das plântulas

(Buckeridge & Dietrich, 1990; Buckeridge et al. , 1997; Tiné et al. , 2000; Buckeridge et al.,

2000), até os efeitos da elevada concentração de CO2 sobre seu estabelecimento (Aidar et al. ,

2002; Godoy, 2007).

Hymenaea stigonocarpa , popularmente chamada de jatobá-do-cerrado, tem sua distribuição restrita a ambientes sazonais, tais como os cerrados do centro e do sudeste do Brasil. Apesar de sua ampla distribuição nos cerrados (está entre as 26 espécies que ocorrem em, pelo menos, 50% das áreas de cerrado sentido restrito), a espécie apresenta baixa densidade de indivíduos

(Dechoum, 2004). As duas espécies são morfologicamente semelhantes, mas se diferenciam principalmente pelo tamanho e forma de folhas e frutos, tamanho e coloração das flores, tamanho das sementes, além de diferenças no porte – H. stigonocarpa atinge de 5 a 12 metros de altura, enquanto H. courbaril , 12 a 20 metros.

Justificativa

Da temática

Os diversos cenários de emissões de gases de efeito estufa para os próximos 100 anos indicam a possibilidade de impactos climáticos significativos sobre ecossistemas brasileiros e de outras partes do planeta. Se as tendências de crescimento das emissões se confirmarem, os modelos climáticos indicam que poderá ocorrer aquecimento de 4 a 6 oC em partes do País (principalmente na Amazônia) até o final do século XXI. Dessa forma, é inevitável incluir as árvores no estudo

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das mudanças climáticas globais, na medida em que elas exercem claro papel no balanço global de carbono e provável participação no seqüestro desse elemento da atmosfera.

A biota global atual é adaptada às mudanças climáticas dentro das taxas de concentração de

CO 2, temperaturas e precipitações atmosféricas do Pleistoceno. Mudanças no clima não são necessariamente danosas à biodiversidade, pois as comunidades bióticas nunca estiveram estáveis por longos períodos de tempo. As espécies têm constantemente ajustado suas distribuições e abundâncias em resposta a diversos fatores, incluindo concentrações de CO 2, temperatura e precipitação. Entretanto, as taxas projetadas e magnitudes das mudanças climáticas durante o século XXI são sem precedentes, quando comparadas àquelas apresentadas nos últimos 2 milhões de anos, e a habilidade das espécies em se ajustarem às novas condições do ambiente atual é questionável.

Para o monitoramento e avaliações qualitativas e quantitativas do impacto das mudanças do clima é necessário um sistema de critérios de indicadores em todos os âmbitos – internacionais, nacionais e regionais. Segundo o PROBIO – Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da

Diversidade Biológica Brasileira, do Ministério do Meio Ambiente –, as relações entre ecossistemas naturais e as mudanças climáticas globais (MCG), no Brasil, ainda não estão estabelecidas (www6.cptec.inpe.br/mudancas_climaticas/probio.shtml. Acesso em 03/09/2007).

A partir desses fatos fica claramente identificada a necessidade de estabelecer a natureza e a profundidade dos impactos das mudanças climáticas globais sobre os ecossistemas, com o objetivo de aprimorar as políticas públicas relativas à conservação da biodiversidade, garantindo o uso sustentável deste recurso para as gerações futuras. É nesse contexto que se insere o presente trabalho.

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Da metodologia

As metodologias propostas neste trabalho têm-se mostrado eficientes na investigação dos efeitos provocados na estrutura e ultra-estrutura de células e organelas de plantas submetidas a alterações ambientais.

Objetivos

Gerais

Conhecer as alterações estruturais, ultra-estruturais e bioquímicas nas folhas de plântulas do jatobá da mata Hymenaea courbaril L. (espécie característica da floresta latifoliada semidecídua), e do jatobá do cerrado H. stigonocarpa Mart. (de formações abertas do cerrado e campo cerrado), crescidas em ambientes de 370 (controle) e 720 ppm de CO 2, visando determinar o possível efeito da elevação da pressão parcial do CO 2 sobre espécies estabelecidas em diferentes biomas.

Dados da literatura sugerem maior plasticidade fisiológica de H. courbaril em relação a H. stigonocarpa , mas ainda há escassas informações sobre suas respostas morfológicas, e como espécies que ocupam biomas distintos poderão responder a essa alteração atmosférica.

Específicos

1. Descrever a estrutura e a ultra-estrutura foliar das espécies Hymenaea courbaril e H.

stigonocarpa , de forma a oferecer subsídios a pesquisas futuras.

2. Avaliar aspectos dos eventuais efeitos da alta [CO 2] na estrutura, na ultra-estrutura e na

composição da cera epicuticular das folhas dessas espécies.

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3. Investigar as respostas das espécies à elevada concentração de CO 2, comparando seus efeitos

com dados da literatura.

4. Oferecer subsídios a estudos relacionados ao seqüestro de carbono e ao levantamento de

indicadores sensíveis a parâmetros climáticos.

MATERIAL E MÉTODOS

Cultivo das plântulas em diferentes concentrações de CO 2.

Essa etapa dos experimentos foi realizada na Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas do

Instituto de Botânica de São Paulo, no período compreendido entre os meses de junho a setembro de 2005, que teve como temperatura média 24,5°C.

As Câmaras de Topo Aberto (CTAs) (Figuras 7 e 8) possuíam sistema de injeção de CO 2 constituído por um ventilador que forçava o ar externo para dentro da câmara. O ar passava por dentro da câmara saindo pelo topo. O período de passagem foi estabelecido com um fluxo tal que permitia a renovação de todo o ar interno da câmara em aproximadamente 1 minuto, evitando turbulência e permitindo a captação do CO 2 sem causar distúrbios excessivos na camada de gases sobre as folhas.

Neste experimento foram utilizadas duas câmaras – uma recebeu injeção de ar ambiente filtrado, sem enriquecimento de CO 2 (cerca de 370 ppm), e a outra recebeu ar enriquecido, de maneira a se manter um ambiente com 720 ppm de CO 2. A [CO 2] nas câmaras foi monitorada diariamente através de um medidor Testo 535, e a temperatura foi aferida diariamente com termômetro digital.

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Figura 7. Esquema do sistema das câmaras de topo aberto utilizadas para o crescimento das plântulas: 1 – cilindro de CO 2; 2 – válvula; 3 – tubulação; 4 – tomada de ar externo; 5 – filtro de partículas em suspensão; 6 – ventilador; 7 e 8 – plântulas; 9 – termômetro; 10 – sensor de CO 2 (extraído de Aidar et al ., 2002).

A B

Figura 8. Câmaras de topo aberto (CTAs) instaladas na Seção de Fisiologia do Instituto de Botânica, com exemplares de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa , após quarenta dias de exposição. A – Plântulas das espécies expostas a 720 (esquerda) e 370 ppm (direita). B – Detalhe do sistema de injeção de CO 2 (seta).

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Foram utilizadas 120 sementes de jatobás adquiridas junto ao Instituto Florestal de São Paulo e procedentes da Estação Experimental de Itirapina (jatobá da mata) e da Floresta Estadual de

Assis (jatobá de cerrado). As sementes, 60 de cada espécie e com peso médio de 4,8 gramas para

Hymenaea courbaril e 3,7 gramas para H. stigonocarpa , foram desinfetadas em hipoclorito de sódio 1,5% por 30 minutos para evitar a contaminação por fungos, lavadas em água corrente pelo mesmo período e escarificadas mecanicamente. A germinação, caracterizada pela protrusão da raiz, foi conduzida em estufas do tipo BOD, a 25°C, em recipientes contendo substrato

(vermiculita) embebido em água destilada. Após esse período (21 dias) as sementes foram dispostas em vasos plásticos de cinco litros com areia e vermiculita (1:2), conduzidas às CTAs e regadas periodicamente com solução nutritiva (Hoagland & Arnon, 1938). Após 100 dias de exposição às condições das CTAs, as plântulas foram cuidadosamente removidas do substrato com auxílio de um jato fraco de água, lavadas e medidas.

Medidas de crescimento.

Foram realizadas medidas de crescimento das seguintes estruturas das plântulas: altura

(medida da junção caule/raiz até meristema apical caulinar), área do primeiro par de folíolos, comprimento do epicótilo, do hipocótilo e do primeiro entrenó.

Análises microscópicas.

Diafanização . Segmentos de 1cm 2 da região mediana do primeiro par de folíolos (Fig. 9) de 5 plantas de cada grupo, previamente fixados em FAA 70 (Kraus & Arduin, 1997), foram fervidos em álcool 96%, e em solução de álcool 96% e NaOH 5% (1:1), ambos por 10 minutos. Em seguida as amostras foram lavadas em água destilada, dispostas em solução de hipoclorito de sódio a 50% até tornarem-se transparentes. Lavadas novamente em água destilada (por 5 vezes, 3

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minutos cada), colocadas em cloral hidratado 5% por 10 minutos (Strittmatter, 1973), coradas em azul de astra e safranina, ambos a 1% e na proporção 9:1 (v/v), e montadas em resina Permount.

As lâminas foram observadas em fotomicroscópio BX 41 Olimpus Video Print acoplado a um microcomputador com software Image Pro ® Express. Para obtenção da densidade estomática

(DE) e do índice estomático (IE), foram realizadas contagens em dez campos de 0,04mm 2

(aumento de 200x), em cinco folhas por espécie/tratamento, sendo evitados campos que contivessem feixes vasculares e glândulas. A DE foi obtida por meio de contagem do número de estômatos/área, enquanto que o IE foi obtido por meio da aplicação da fórmula:

IE = [E / (E+C)] x 100 , sendo (IE) Índice Estomático, (E) Estômato e (C) Célula epidérmica (pavimentosa).

Análise histológica. Foram coletados segmentos da região mediana do primeiro par de folíolos

(Fig. 9). Os materiais foram fixados em FAA 70 por 24h e mantidos em etanol 70%. A desidratação ocorreu por meio de série etílica e a inclusão foi feita em historesina, conforme especificações do fabricante. Seções transversais foram efetuadas com navalhas de vidro, e cortes de 2 µm de espessura foram obtidos em micrótomo Leica RM 2155. As lâminas foram coradas em azul de metileno a 1% e montadas em resina Permount.

Para investigar eventuais efeitos da alta [CO 2] sobre a anatomia foliar, foram feitas, em cinco plantas de cada grupo, medições de espessura da epiderme das faces abaxial e adaxial, dos parênquimas paliçádico e lacunoso, além da área dos espaços intercelulares, por meio do software

Image Pro ® Express. Assim como procedido para contagem dos estômatos, essas medidas foram

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obtidas em regiões do mesofilo livres de interferências (glândulas e feixes vasculares) que pudessem comprometer os resultados.

Figura 9. Indicação da região do folíolo (aprox. 1cm 2), de 1 cm onde foram retiradas amostras para análises microscópicas.

Microscopia eletrônica de varredura. Com o objetivo de verificar eventuais efeitos da elevada

[CO 2] sobre a cera epicuticular, o primeiro par de folíolos dos jatobás foi seco em estufa a 25 °C.

Após a secagem, segmentos de 1 cm 2 da região mediana foram fixados em suportes de alumínio

(stubs ), recobertos com ouro durante 2 minutos a 40 mA em atmosfera de argônio com 1 mBar de pressão (Das & Saha, 1999), em equipamento Balzers SCD 050, e observados em microscópio eletrônico de varredura DSM 940 Zeiss, do Instituto de Biociências da Universidade de São

Paulo.

Microscopia eletrônica de transmissão. Segmentos de 1cm 2 da região mediana do primeiro par de folíolos totalmente expandidos foram fixados em solução de glutaraldeído (2,5%) e formaldeído (2,0%), em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,2, e CaCl 2 0,1M por duas horas,

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a 4°C (Karnovsky, 1965). Após isso, as amostras foram lavadas três vezes com a mesma solução tampão e pós-fixadas em tetróxido de ósmio por 2 horas. Em seguida foram novamente lavadas com a mesma solução tampão, submetidas à desidratação em série etanólica, infiltradas e embebidas em resina Spurr (resina mais óxido de propileno, overnight ), e resina pura (6h), para polimerização.

Seções de 60 nm foram feitas em ultramicrótomo Leica Ultracut-R, dispostas em telas de 200 mesh , contrastadas em acetato de uranila e nitrato de chumbo (cinco minutos em cada), observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.

Determinação quantitativa da cera epicuticular.

Para a quantificação da cera epicuticular foliar, foram coletadas folhas plenamente desenvolvidas e sem lesões, do primeiro nó de dez indivíduos/tratamento, com três repetições.

Este material foi acondicionado em sacos de papel e mantido em estufa a 25 °C por três dias. Para extração da cera, a face abaxial das folhas foi gentilmente lavada com 15 mL de clorofórmio

(Silva Fernandes, 1964), usando-se pipeta Pasteur. Por serem espécies hipoestomáticas

(informação obtida em estudos prévios), apenas a face abaxial das folhas de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa foi submetida à extração com clorofórmio.

Os extratos clorofórmicos foram reunidos, filtrados, concentrados em rotaevaporador, transferidos para frascos de vidro previamente pesados e evaporados em banho-maria.

Posteriormente os frascos foram colocados em dessecador até obtenção de massa constante. A

área foliar foi obtida utilizando-se o software “Leaf Area Measurement”, versão 1.3

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(www.shef.ac.uk/~nuocpe/), sendo que a quantidade de cera obedeceu à relação entre sua massa

(µg) e a área foliar (cm 2).

Determinação qualitativa dos componentes da cera epicuticular.

Foi realizado o mesmo procedimento para extração da cera, descrito acima. Com o objetivo de se verificar os componentes predominantes de cada amostra, foi feita uma cromatografia em camada delgada (CCD) em sílica-gel G Typ 60, impregnada com fluoresceína sódica a 0,2%. A placa foi desenvolvida nos sistemas de solventes hexano/clorofórmio (7:3) e acetato de etila/clorofórmio/metanol (4:4:3), e a visualização feita em luz ultravioleta de ondas longas.

Cada uma das frações visualizadas no cromatograma foi separada utilizando-se a cromatografia preparativa em camada delgada de sílica-gel. Essas frações foram retiradas da sílica com clorofórmio por três vezes, filtradas e concentradas em rotaevaporador. Uma nova

CCD de cada uma das frações foi realizada, a fim de se certificar da pureza do material.

Novamente ressuspensas em clorofórmio, as amostras foram misturadas à sílica-gel 60 (70 a

230 mesh), secas em banho-maria overnight e submetidas à cromatografia em coluna utilizando- se como fase móvel os solventes hexano, clorofórmio e metanol. Os eluatos foram concentrados até total secura e os resíduos obtidos dissolvidos em pequeno volume de hexano para posterior injeção no cromatógrafo a gás HP 5890, utilizando-se a coluna DB-5HT HP (30 m e 0,32 mm de diâmetro) e hélio como gás de arraste, com fluxo de 1 mL/min. A programação de temperaturas da coluna foi de 6°C/min, sendo a temperatura inicial de 100°C, e a final, mantida durante 15 min, de 300°C. A temperatura do injetor e do detector foi de 300°C. Os espectros de massas foram obtidos por ionização eletrônica no aparelho HP 5889B, e o limite das massas foi de 50 até

600 unidades de massas atômicas. As amostras cujo perfil cromatográfico sugeriu serem

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triterpenóides com função alcoólica foram metiladas segundo Vogel (1971), antes de submetidas ao espectrômetro de massas.

Os procedimentos relativos à análise das ceras foram realizados no Laboratório de Fitoquímica do Instituto de Biociências da USP, e na Seção de Fisiologia do Instituto de Botânica de São

Paulo.

Análises estatísticas.

O número de amostras foi testado no Sample Size Estimator Worksheet, e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste-t, com 0,05 e 0,001% de significância

(P < 0,05 e 0,001), pelo software Bioestat 2.0. Para avaliação estatística das ceras epicuticulares, utilizou-se de amostragem composta − 10 indivíduos/espécie/tratamento.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De forma geral os jatobás Hymenaea stigonocarpa e H. courbaril responderam de maneira semelhante à elevação da concentração atmosférica de CO 2. Entretanto, as respostas foram mais contundentes em H. stigonocarpa , que apresentou diferenças significativas em doze dos dezessete parâmetros analisados, ao passo que H. courbaril , em seis parâmetros (Tabela 2).

Efeitos sobre o crescimento.

Após 100 dias de exposição, foram obtidas medidas de altura total das plântulas, da área do primeiro par de folíolos e de segmentos do caule – epicótilo, hipocótilo e primeiro entrenó. À exceção da última estrutura, houve relação direta entre crescimento e concentração elevada de

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CO 2, mas somente em H. stigonocarpa o crescimento foi estatisticamente significativo (Tabela 2 e Figura 10).

Crescimento pode ser definido como incremento em massa seca, volume, comprimento ou em

área de um organismo ou de partes dele (Lambers et al. , 1998); em outras palavras, como medida do ganho de recursos do meio (Bloom et al. , 1985). Plantas expostas à elevada [CO 2] apresentam aumento de crescimento e de eficiência no uso da água (Amthor, 1995), além de taxas fotossintéticas maiores (Hikosaka et al. , 2005), e mudanças metabólicas, como as decorrentes de maior disponibilidade de carbono, podem conduzir a alterações estruturais.

A capacidade dos vegetais em responder a níveis elevados de CO 2 na atmosfera tem, em características fisiológicas como eficiência fotossintética e uso da água, importantes elementos de adaptação. De igual importância, entretanto, estão as adaptações estruturais, posto que elas, muitas vezes, são condição indispensável para uma resposta fisiológica efetiva.

Um exemplo que esclarece com precisão o exposto acima está na plasticidade apresentada por muitas plantas no que diz respeito a crescimento em altura e aumento de área foliar. Maior tamanho de folhas e da planta, com conseqüente melhor posicionamento das folhas para captura de luz, pode gerar efeitos positivos para a espécie no processo de competição por espaço e luminosidade, independente de maiores taxas fotossintetizantes ou de acúmulo de biomassa

(Diaz, 1995). Teugels et al. (1995) lembram que os recursos adquiridos pelas plantas, como água, nutrientes, luz e CO 2, dependem da capacidade do vegetal em aumentar o número, o tamanho e a eficiência dos órgãos pelos quais os recursos são adquiridos, definindo seu sucesso no meio.

Assim, a morfogênese vegetal, essencialmente governada pela soma dos efeitos ambientais e de

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características genéticas, define a habilidade da planta em ajustar-se metabólica e estruturalmente a esses efeitos, determinando o sucesso de determinada espécie frente a alterações do meio.

O desenvolvimento primário do caule, conseqüência dos processos de divisão, expansão e diferenciação celular do meristema, pode se dar em decorrência de programação genética e de sinais ambientais que podem interferir na sua forma, no número de ramos e em sua taxa de crescimento (Taylor, 1997). Nesse aspecto, o presente trabalho focou no crescimento em altura das plântulas, na área foliar e na extensão dos entrenós, e os resultados obtidos permitem pressupor que nas espécies Hymenaea stigonocarpa e H. courbaril (particularmente a primeira, que apresentou aumento estatisticamente significativo), o maior crescimento do caule, no início do desenvolvimento das plantas, pode ser resultado da exposição à elevada [CO 2]. Tal resposta deve conferir vantagens competitivas às espécies. Entretanto, não há consenso na literatura a respeito do(s) processo(s) que é atingido por essa mudança atmosférica (Pritchard et al. , 1999).

Para Jacobs (1997) há dois tipos de estímulo, não necessariamente excludentes, que disparam o processo de divisão celular. O primeiro seria o momento em que a célula atinge seu limiar de crescimento, duplica suas organelas e inicia a mitose, enquanto o segundo ocorre sob ação de hormônios como citocininas, auxinas e giberelinas; já se sabe que os dois primeiros aumentam a expressão de ciclinas, uma quinase cuja concentração modula o ciclo celular, algumas estimulando a divisão (Kende & Zeevaart, 1997). Também tem sido registrado que a sacarose pode exercer um controle químico na divisão celular, talvez mediando a atividade da ciclina

(Kinsman et al. , 1997). Neste artigo os autores especulam que a disponibilidade maior de sacarose nos meristemas pode aumentar a proporção de células de divisão rápida, acelerando o crescimento da planta. Por outro lado, menos defendida é a proposta de que o crescimento vegetal

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é resultado de expansão celular, sem um concomitante aumento na produção de novas células

(Ranasinghe & Taylor, 1996).

Vários estudos têm indicado que o caule responde positivamente à elevação da concentração de CO 2 (Downton et al., 1990; Rogers et al., 1992 e Slafer & Rawson, 1997). Em uma análise preliminar (dados não apresentados), observou-se, em 720 ppm de CO 2, maior presença de grânulos de amido no parênquima medular da raiz de H. stigonocarpa , em comparação com o mesmo tecido de H. courbaril. Se considerarmos como correta a premissa de que o crescimento vegetal, nessa condição atmosférica, exerce forte efeito no sistema radicular das plantas (Rogers et al. , 1994), pode-se pressupor que a produção de citocinina neste órgão, e seu conseqüente fluxo para o caule, tenha sido fator de estímulo para o maior crescimento do caule nessa espécie.

Esses resultados sugerem que eventos no nível celular constituem peça importante na compreensão de como o crescimento é controlado, e que espécies de estreita relação filogenética podem apresentar diferentes resultados de crescimento em atmosfera enriquecida de CO 2.

Dos órgãos vegetais, as folhas são os que apresentam a maior diversidade morfológica, exibindo grande plasticidade estrutural em resposta a alterações ambientais (Esau, 1977). A compreensão de sua estrutura em vegetais submetidos a concentrações elevadas de CO 2 é crucial na medida em que são órgãos vitais na captação de luz, fotossíntese, absorção de carbono, economia de água, e, em última análise, na produtividade vegetal, já que esta é diretamente dependente da eficiência funcional das folhas (Smitt & Stitt, 2007). Em parte isso explica o foco que muitos laboratórios têm dado às pesquisas em área foliar de espécies de interesse econômico submetidas a altas concentrações de CO 2.

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Seções transversais das folhas de H. stigonocarpa e H. courbaril demonstram que o órgão apresenta aspecto típico de plantas mesófitas (Apezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003), com uma camada simples de epiderme recoberta por cutícula, estômatos somente na face inferior

(hipoestomáticas), mesofilo com espaços intercelulares, parênquima paliçádico com camada

única de células colunares, enquanto as células do parênquima lacunoso possuem formas irregulares. O parênquima paliçádico, mais rico em cloroplastos que o lacunoso − o que sugere maior participação na fotossíntese −, está presente na face superior da folha, interno à camada adaxial de células epidérmicas (Figura 14). O mesofilo é totalmente permeado por numerosos feixes vasculares dispostos em padrão ramificado, arranjo conhecido como nervação reticulada

(Raven et al. , 2006).

Tanto em atmosfera ambiente de CO 2 como em elevada notou-se que as células do parênquima paliçádico de H. stigonocarpa são maiores (na extensão de seu eixo maior) do que as encontradas em H. courbaril (Tabela 2 e Figura 12). Essa diferença morfológica interespecífica encontra respaldo em experimento que comparou o desempenho fotossintético de plântulas de H. stigonocarpa e H. courbaril , no qual concluiu-se que a espécie de cerrado apresentou maior eficiência do que a de mata, pois obteve maiores valores médios de trocas gasosas nas folhas

(Dechoum, 2004). Como se observa na Tabela 2, H. courbaril parece investir maior parte dos assimilados de carbono no crescimento de caule e da área foliar, quando se compara com H. stigonocarpa . É provável que o maior investimento em maquinaria fotossintetizante observado em H. stigonocarpa seja destinado ao desenvolvimento de raízes, característica das espécies que habitam o cerrado.

Seneweera & Conroy (2005) avaliaram exemplares do trigo Triticum aestivum em CTAs e concluíram que a elevação para 700 ppm de CO 2, além de promover o aumento da área foliar em

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17%, também tornou mais rápida a expansão foliar (ação ontogênica). Dados similares foram apresentados nos momentos iniciais do desenvolvimento das folhas do arroz Oryza sativa , mas as taxas de expansão diminuíram na fase final, provavelmente decorrente de redução do estoque de carboidratos. Para o arroz, portanto, o suprimento extra de carbono parece acelerar o crescimento das folhas, mas não aumentar sua área (Seneweera et al. , 1995).

Taylor et al . (2001) submeteram híbridos de Populus a 550 e 700 ppm de CO 2 em três condições distintas (câmaras controladas, CTAs e FACE). Os autores encontraram crescimento foliar consistente com a elevação da concentração do gás, nas plantas das condições de cultivo, confirmando Taylor et al. (1994), segundo os quais essa resposta é comum a uma ampla variedade de plantas, incluindo espécies arbóreas, herbáceas, gramíneas e cultivadas. Entretanto as taxas de expansão foliar, calculadas em mm/dia, diminuíram com o tempo do experimento.

Diferenças relacionadas à variedade e à condição experimental também influenciaram nas respostas.

Ainda que aumentos na área foliar sejam atribuídos tanto à produção de novas células como à expansão celular, há ainda muita controvérsia sobre a real participação desses eventos na área foliar de espécies expostas a elevadas concentrações de CO 2. Para Ranasinghe & Taylor (1996) o tamanho celular pouco influencia no tamanho final das folhas, enquanto que Radoglou & Jarvis

(1990) acreditam numa sensibilidade maior da expansão foliar nessa condição atmosférica. Ferris

& Taylor (1994) entendem que o teor elevado de CO 2 afete a divisão meristemática e a diferenciação celular durante os estágios iniciais de desenvolvimento das folhas.

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Efeitos no número de estômatos.

A diafanização de segmentos foliares de H. stigonocarpa e H. courbaril revelou que os estômatos dessas espécies possuem células-guarda de formato reniforme, e são do tipo paracítico

(Figura 15), confirmando dados encontrados na literatura que relacionam essas características para a família a qual pertence o jatobá – Leguminosae (Lorenzi, 2002). A técnica de diafanização revelou ainda que a epiderme dos folíolos dos jatobás apresenta células comuns de parede sinuosa. Este tipo de conformação deve-se, provavelmente, às tensões ocorridas na folha ou ao endurecimento da cutícula, processos que ocorrem durante a diferenciação celular (Watson, 1942 apud Apezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003).

Mudanças em vários parâmetros ambientais podem afetar o desenvolvimento estomático, como intensidade e qualidade de luz (Lake et al. , 2001), umidade (Serna & Fenoll, 1997), disponibilidade de água (Franks & Farquhar, 2001), ozônio (Günthardt-Goerg & Vollenweider,

2007), CO 2 atmosférico (Woodward, 1987), temperatura (Pandey et al. , 2007) e altitude

(Kouwemberg & Kürschner, 2007).

O presente estudo encontrou alterações no número de estômatos foliares nas duas espécies investigadas. Tanto índice (IE) quanto densidade (DE) estomáticos tiveram redução estatisticamente significativa (Tabela 2 e Figura 11). Plântulas de H. stigonocarpa e H. coubaril expostas à elevada [CO 2] apresentaram o mesmo valor percentual de redução (14,4%) no IE e na

DE. Os valores absolutos do número de estômatos por área e suas respectivas concentrações atmosféricas de CO 2 foram os seguintes: A espécie H. stigonocarpa apresentou 462 (370 ppm) e

397 (720 ppm) estômatos/mm 2, enquanto H. coubaril 432 (370 ppm) e 370 (720 ppm) estômatos/mm 2. Já para as células epidérmicas, observou-se aumento da densidade em 6,6% para

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H. stigonocarpa , e redução em 9,8% para H. courbaril ( P < 0,05 para ambos), diferença que, segundo Pandey et al. (2007), pode ser atribuída a características genéticas específicas.

Vários estudos propõem uma relação inversa entre [CO 2] e DE e IE, ou seja, a elevação da

[CO 2] implicaria na redução da densidade e do índice estomáticos. Royer (2001) revisou estudos realizados em 176 espécies de plantas C 3 e encontrou inversão nas respostas em 40% para DE e

36% para IE, enquanto que correlações positivas ocorreram em 9% e 4% das plantas, respectivamente. Entretanto, Murray (1995) coloca em dúvida o método de correlação entre

DE/IE e [CO 2], ao alertar que o aumento da área foliar, comumente encontrado nestes experimentos, não é levado em consideração. Já Ewert (2004) acredita que pouca ênfase tem sido dada para as relações entre índice de área foliar e crescimento em ambientes de elevada [CO 2].

A DE é uma função do número de estômatos e do tamanho das células epidérmicas, e, desse modo, é afetada tanto pela formação de novas células estomáticas quanto pela taxa de expansão das epidérmicas. Como a expansão celular é dirigida por outras variáveis, como luz e temperatura, ela pode mascarar a influência da [CO 2] na formação de novas células-guarda. Para corrigir essa distorção, foi introduzido o conceito de índice estomático (IE), visando normalizar os efeitos dessa expansão (Beerling & Woodward, 1995; Royer, 2001).

Beerling & Woodward (1995) observaram, em cinco espécies ornamentais expostas a elevada

[CO 2], decréscimo na DE e no IE em regiões foliares com diferentes proporções de pigmentação

(brancas e verdes), e sugeriram que a resposta de diferenciação estomática nessa condição não está relacionada à capacidade fotossintetizante do órgão, mas à estrutura do mesofilo que, em determinadas folhas, permite maior difusão lateral de CO 2.

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Royer (2001) estabeleceu que reduções na DE e no IE associadas à elevada [CO 2] foram mais frequentemente observadas em estudos realizados em materiais fósseis e de herbário do que nos realizados em exposições em campo e em câmaras. O autor sugere que as plantas atuais nunca experimentaram atmosferas acima de 350 ppm durante todo o Quaternário, ou mesmo antes, e que exposições experimentais apenas “testam a plasticidade das plantas”. Essa tese encontra respaldo em Körner (2006) e Pagani et al . (2005), segundo os quais a [CO 2] teve, ao longo dos períodos geológicos, três fases caracterizadas por drásticas reduções de sua pressão parcial, tendo a última delas ocorrido no Terciário, quando do surgimento das plantas modernas.

Reid et al. (2003) avaliaram as respostas fenotípicas estomáticas de 15 espécies vegetais após quatro anos de exposição em estações FACE, e concluíram não haver evidências de que haverá, em atmosfera com maior pressão parcial de CO 2, redução na DE e no IE, a menos que haja mutações genéticas futuras.

Resultados contraditórios também foram encontrados em Uprety et al. (2002). Quatro variedades de arroz Oryza sativa foram submetidas a 600 ppm de CO 2 em CTAs, e foram observados redução da densidade estomática (61%) e aumento do índice estomático (33%). Os autores argumentam que o efeito na densidade foi decorrente de maior expansão da área foliar, e esta por mudanças no tamanho das células epidérmicas. Medições de comprimento e largura das células epidérmicas levaram-nos a atribuir esse aumento à expansão, e não à divisão celular.

Outra constatação relevante foram as diferentes respostas que plantas de uma mesma espécie podem apresentar quando expostas a uma mesma condição. A variedade denominada P-834 apresentou aumento da densidade e suas células epidérmicas não foram afetadas significativamente pela alta [CO 2].

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Em exemplares de Alnus glutinosa expostos a 720 ppm de CO 2 houve aumento do IE e variação não significativa da DE (Poole, 2000). Resultados semelhantes foram obtidos em

Tradescantia exposta a 670 ppm de CO 2 (Boetsch et al. , 1996). Ferris & Taylor (1994) encontraram respostas distintas quando expuseram quatro espécies de plantas herbáceas

(Sanguisorba minor , Lotus corniculatus , Anthyllis vulneraria e Plantago media ) a 600 ppm de

CO 2. Os autores registraram aumento do IE em S. minor , redução em A. vulneraria e em P. media , e nenhum efeito significativo em L. corniculatus. Quanto à DE, houve aumento em S. minor e L. corniculatus , e decréscimo em A. vulneraria e P. media. Os resultados desses trabalhos demonstram com clareza a diversidade de respostas estomáticas apresentadas pelas plantas quando expostas a elevação da [CO 2], diversidade essa que pode encontrar explicação nas características genéticas das espécies, como também na metodologia empregada e em variáveis que alteram a formação dos estômatos, como luz, disponibilidade de nitrogênio e de água.

Entretanto, trata-se de consenso na literatura de que o índice estomático é um valor que independe do crescimento foliar. Tanto plântulas de H. stigonocarpa como as de H. courbaril reduziram o IE quando foram submetidas à elevada [CO 2], o que sugere ter havido, durante o desenvolvimento das folhas analisadas, alguma sinalização de folhas maduras para folhas em desenvolvimento.

Efeitos ultra-estruturais.

A compreensão das mudanças causadas pelo aumento da [CO 2] nas árvores e nos ecossistemas requer informações sobre o funcionamento das células foliares, e, dessa forma, observações ultra- estruturais podem oferecer valiosas contribuições. Entretanto, são escassos os trabalhos que

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descrevem os efeitos ultra-estruturais do alto teor de CO 2 em plantas, e, em alguns, esses efeitos estão associados a outros componentes abióticos, como ozônio.

Em Oksanen et al. (2001) encontram-se resultados de efeito contraditório entre CO 2 e O 3.

Exemplares de Populus tremuloides foram expostos à concentração elevada de CO 2 (560 ppm) em sistema FACE, de O 3, e a uma atmosfera combinada desses dois gases. Em geral, os autores observaram que o CO 2 tendeu a aumentar a espessura das folhas, os cloroplastos, o amido em seu interior e a área do espaço intercelular, e a reduzir o número de plastoglóbulos, intimamente relacionados à senescência foliar. Em contrapartida, efeitos diametralmente opostos foram observados quando a espécie foi exposta ao O 3. O CO 2 parece, portanto, minimizar os efeitos oxidativos induzidos pelo O 3 nas células vegetais. A resposta para esse efeito protetor estaria na

(1) indução do fechamento estomático, limitando a entrada de O 3 nas folhas, na (2) maior disponibilidade de carboidratos, importante componente energético para os sistemas de reparo e de defesa, e em (3) mudanças anatômicas como aumento na espessura e na densidade do mesofilo, que também reduziriam a possibilidade de ação do O 3 nos tecidos. Isso reforça o conceito de que características morfológicas podem ser indicadoras de efeitos ambientais adversos às plantas.

Em várias espécies tem sido verificado aumento do conteúdo de carboidratos nas folhas de plantas expostas à alta [CO 2] (Ray & Jarvis, 1998). O presente trabalho investigou os efeitos do

CO 2 sobre a área dos cloroplastos e do amido em seu interior, e encontrou aumento significativo nos dois itens para as duas espécies, com exceção da área da organela em H. courbaril , que não mostrou alteração significativa (Tabela 2). O maior acúmulo de amido nos cloroplastos de jatobás

é condizente com dados da literatura, que confirmam o aumento das taxas fotossintetizantes para plantas nessa condição atmosférica (Atkinson et al. , 1997 e Teng et al. , 2006) − e com avaliações

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de medidas de fotossíntese obtidas especificamente para as espécies estudadas (Buckeridge et al.

– dados não publicados).

Há considerável número de trabalhos que relatam os efeitos do alto teor de CO 2 nas plantas, mas pouca informação sobre os efeitos ultra-estruturais nas organelas envolvidas na fotossíntese.

Nestes artigos, em particular, são raros os que investigaram sob perspectiva estatística (Teng et al. , 2006).

Arabidopsis thaliana , espécie modelo amplamente utilizada em estudos moleculares e de desenvolvimento vegetal, acumulou maior quantidade de amido nos cloroplastos (que também tiveram sua área aumentada), provavelmente em decorrência do acúmulo do carboidrato.

Resultados semelhantes, porém mais contundentes, foram observados em Hymenaea , especialmente em H. stigonocarpa (Tabela 2 e Figura 13). Nessa espécie a área média de amido presente nos cloroplastos aumentou de 0,48 para 5,82 µm 2 (um acúmulo aproximadamente 12 vezes maior), enquanto que a área média dos cloroplastos aumentou de 5,67 para 12,2 µm 2

(aumento maior que duas vezes). Tamanho aumento na quantidade de amido nos cloroplastos alterou substancialmente a morfologia da organela (Figura 16), como previamente observado em

Pinus palustris (Pritchard et al., 1997) e em Nicotiana sylvestris (Wang et al. , 2004).

Ainda que o acúmulo de amido tenha triplicado nos cloroplastos de H. courbaril em alta [CO 2]

(de 1,6 para 5,4 µm 2), não houve alteração significativa na área da organela. Essa resposta menos expressiva do jatobá da mata em relação ao de cerrado pode ter explicação no genoma das espécies, adaptadas a ambientes com diferenças na disponibilidade de água e de nutrientes, já que plantas de ecossistemas sazonais, como o cerrado, acumulam reservas que podem ser utilizadas em épocas mais propícias ao crescimento (Costa, 2003).

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O maior acúmulo de amido nos cloroplastos em elevada [CO 2] pode agir como um mecanismo de estocagem de carbono, expandindo a capacidade de dreno do órgão e, dessa forma, refletindo em sua área foliar. Como já foi descrito, a área foliar aumentou nas duas espécies, sendo o aumento estatisticamente significativo apenas em H. stigonocarpa .

Segundo Lambers et al. (1998), espécies características de ambientes pouco produtivos, como o cerrado, acumulam os nutrientes para usá-los em períodos subseqüentes, de eventual baixa disponibilidade de recursos. A conservação desses nutrientes, que podem ser acumulados nas folhas, é relevante aos vegetais que vivem nesses hábitats, na medida em que uma maior eficiência no uso dos nutrientes absorvidos diminui os altos custos necessários a sua absorção

(Bloom et al. , 1985). Desse modo, é provável que essa seja uma explicação para o fato do jatobá de cerrado H. stigonocarpa apresentar seus cloroplastos com maior diferença de acúmulo de amido em alta [CO 2], em comparação à diferença observada em H. courbaril .

O aumento do amido nos cloroplastos de células do mesofilo observado nos jatobás expostos à elevada [CO 2] encontra respaldo em Pritchard et al. (1997), Oksanen et al. (2001) e Wang et al.

(2004), mas é destoante com observações encontradas em folhas de Triticum aestivum crescidas em 650 ppm de CO 2 (Robertson & Leech, 1995), segundo as quais houve redução significativa do conteúdo de amido nos cloroplastos. Entretanto, deve-se considerar a idade das folhas, pois

órgãos mais jovens apresentam demanda energética maior que órgãos mais maduros (relação fonte-dreno), e é possível que, nessa fase do desenvolvimento, as folhas estejam trabalhando como “dreno” de carboidratos. Também não pode ser desprezada a fisiologia metabólica da espécie – T. aestivum –, de rápido crescimento e escassa reserva cotiledonar.

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A variação de respostas também ocorre quando são analisadas as membranas dos tilacóides dos cloroplastos. Na beterraba Beta vulgaris , Kutik et al. (1995) encontraram aumento no número de tilacóides por cloroplasto de folhas crescidas em alto teor de CO 2, semelhante ao observado em quatro espécies arbóreas por Griffin et al. (2001). Também observou-se aumento no grau de empilhamento dos tilacóides granares em Triticum aestivum e redução desse empilhamento em

Arabidopsis thaliana (Teng et al. , 2006).

Cloroplastos são grandes organelas celulares envolvidas por dupla membrana, caracterizados pela presença de tilacóides numa matriz denominada estroma e que criam domínios funcionais na fotossíntese. As membranas dos tilacóides delimitam seu conteúdo, que tem espessura variável entre 4 e 70 nm. Esse sistema de membranas abriga as reações fotoquímicas da fotossíntese que geram NADPH e ATP, requeridos pelo estroma para síntese das trioses-fosfato. Os tilacóides formam tanto discos de membrana empilhada, os grana (tilacóides granares), como sacos achatados que se estendem pelo estroma conectando esses grana (tilacóides estromáticos) .

Nessas membranas estão ligados os fotossistemas, que são complexos de proteínas e clorofila ligadas a diferentes proteínas e lipídios (Alberts et al. , 2004).

Já o estroma é uma matriz amorfa rica em enzimas solúveis, entre as quais as responsáveis pelas reações de redução do CO 2 atmosférico, e que geram as trioses-fosfato (fixação do carbono). Ainda no estroma, as trioses são convertidas em amido ou transportadas para o citoplasma e convertidas em sacarose, que é transportada para os demais tecidos vegetais pelo floema (Gunning & Steer, 1996).

A complexidade estrutural dos cloroplastos, exposta acima de forma bastante sucinta, alerta para a possibilidade de danos ao sistema enzimático presente no estroma e nas membranas da

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organela, em decorrência do acúmulo de amido depositado no estroma das células foliares crescidas em alta [CO 2]. Uma forte indicação é dada pelos cloroplastos dos jatobás, em especial de H. stigonocarpa , que teve substancial acúmulo de amido na organela. Essa sugestão é corroborada por Teng et al. (2006), que encontraram redução no número de tilacóides granares por conta de grandes e numerosos grãos de amido em células do mesofilo de Arabidopsis thaliana crescida em elevada [CO 2]. Danos a membranas também não devem ser descartados, com prejuízos ao processo de seleção molecular executado pela membrana interna dos cloroplastos, o que, em última instância, afetaria a síntese de ATP e de trioses-fosfato.

Entretanto, tais alterações, confirmadas pelas observações em microscopia eletrônica de transmissão, não se refletiram no crescimento das plântulas, que se mostraram mais altas, com folhas maiores e maior acúmulo de reservas quando comparadas às plantas crescidas em [CO 2] ambiente. É possível que as plântulas tenham aclimatado à nova condição atmosférica, e que o amido observado nos cloroplastos seja transitório, sendo degradado durante o período noturno e não conduzindo a danos irreversíveis à organela.

Efeitos sobre a cera epicuticular.

O interesse do presente trabalho na síntese e na composição das ceras epicuticulares deu-se por conta da reação desse componente em folhas crescidas em alta [CO 2]. A literatura científica registra alteração na quantidade das ceras e no número de estômatos, sendo essas alterações um provável efeito indireto do CO 2 sobre a sinalização molecular que dirige o processo de formação das células-guarda. Segundo Gray et al. (2000), modificações estruturais em ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA), presentes nas ceras cuticulares de Arabidopsis thaliana expostas a

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altas concentrações de CO 2, determinam o surgimento de modificações numéricas nas células- guarda.

Na Tabela 2 encontram-se os teores de cera bruta da face abaxial do primeiro par de folíolos de Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa crescidas em concentração de CO 2 ambiente (370 ppm) e alto teor de CO 2 (720 ppm). Houve variação da massa total da cera epicuticular nas duas espécies. Porém, essa variação mostrou-se estatisticamente não significativa e inversa, ou seja, H. courbaril produziu mais cera epicuticular (20%) em alto teor de CO 2, enquanto H . stigonocarpa teve reduzida (38%) sua produção. Quanto à composição da fração parafínica das ceras epicuticulares, as espécies apresentaram perfis semelhantes de distribuição e abundância dos homólogos de n-alcanos, com predominância de n-nonacosano (C 29) (Figuras 17 e 18).

O mesmo não ocorre quando são analisados os perfis cromatográficos da fração de triterpenóides. Em H. stigonocarpa , diferenças de abundância são observadas entre seus componentes (Figura 19 ), ao passo que em H. courbaril , além da abundância, a predominância de dois de seus componentes, os triterpenóides de função alcoólica eicosanol e glutin-5-en-3beta-ol

(Figura 21), variou quando a espécie foi submetida à elevada [CO 2] (Figura 20). Os resultados obtidos com as extrações de cera epicuticular não são conclusivos pois não esclarecem até que ponto essa variação contribuiu, e se contribuiu, na redução do número de estômatos das espécies.

Entretanto, as imagens obtidas a partir de microscopia eletrônica de varredura (Figuras 22 e 23) demonstram que a elevação da concentração atmosférica de CO 2 gerou efeitos na arquitetura da cera epicuticular das duas espécies de jatobás.

Observações ultra-estruturais da face abaxial dos folíolos dos jatobás confirmam os dados obtidos nas extrações quantitativas das ceras epicuticulares. Em condições de [CO 2] ambiental, a cera epicuticular de H. stigonocarpa apresentou um arranjo de cristais mais definido que o de H.

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courbaril , arranjo este que se mostrou alterado quando as plântulas das duas espécies foram expostas a 720 ppm de CO 2. A elevação da concentração de CO 2 parece, portanto, alterar de forma inversa a deposição de cera epicuticular das espécies de jatobás estudadas, a despeito de não ter havido, em nenhum dos casos, diferenças estatísticas significativas.

As reações químicas para síntese das ceras, localizada nas células epidérmicas, envolvem atividades coordenadas de um grande número de enzimas organizadas em complexos multienzimáticos. Técnicas genéticas aplicadas a mutantes de Arabidopsis e Zea mays têm conseguido identificar com sucesso genes envolvidos na síntese de ceras, os chamados CER.

Micrografias eletrônicas de varredura têm mostrado alteração ou mesmo ausência dos cristais de cera nesses mutantes. No entanto, a maioria dessas mutações não provoca acúmulo ou decréscimo de compostos intermediários da cadeia de reações, o que sugere que elas alterem o fluxo de precursores em rotas alternativas. Desse modo, torna-se difícil associar o produto do gene mutado com a alteração na composição da cera em mutantes (Kunst & Samuels, 2003).

Os efeitos do elevado teor de CO 2 na composição das ceras foliares são diversos. Vanhatalo et al. (2001) encontraram aumento na cobertura de cera em Betula pubescens exposta a essa condição atmosférica, ao passo que Prior et al. (1997) encontraram redução de cera em Pinus palustris em estudos que interagiram elevado teor de CO 2, disponibilidade de água e nitrogênio, e em Graham & Nobel (1996), redução de 40% em 720 ppm CO 2 em Agave deserti , espécie com metabolismo CAM.

A combinação do CO 2 com outros constituintes atmosféricos pode gerar resultados distintos se comparados com experimentos em que somente a concentração de CO 2 foi alterada. Em Brassica napus , Qaderi & Reid (2005) sugerem que a elevada [CO 2] pode amenizar alguns dos efeitos

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adversos da radiação UV-B, na medida em que as plantas expostas a essa condição aumentaram a deposição de cera em suas folhas, conferindo maior proteção contra essa radiação. Já em combinação com ozônio (O 3), o aumento na produção de cera observado em Populus tremuloides expostos à elevada [CO 2] – cerca de 16% – não ocorre (Percy et al. , 2002).

As ceras foliares epicuticulares formam uma barreira físico-química que auxilia na diminuição da perda de água via cutícula, além de participarem do controle térmico da folha, da permeabilidade a diferentes compostos, e de oferecerem resistência ao ataque de insetos e patógenos (Kroumova & Wagner, 1999). Atualmente é consenso que a morfologia das ceras epicuticulares é determinada por sua composição química, mas condições ambientais podem influenciar sua cristalização (Shepherd et al. , 1995). Se a elevação da concentração atmosférica de CO 2 foi capaz de modificar a morfologia e a composição da cera epicuticular dos jatobás, as plantas podem estar mais suscetíveis a desbalanço hídrico e ataque de insetos e patógenos.

Em Huttunen (1994) apud Furlan (2004) encontramos que a morfologia das ceras epicuticulares é um produto da combinação de fatores genéticos intrínsecos à espécie e fatores ambientais, especialmente quando há a presença de estruturas cristalóides. É de se esperar que modificações na estrutura da cera epicuticular causadas por alterações atmosféricas sejam acompanhadas por alterações em sua composição química (Furlan, 2004). Dessa forma, ressalta- se a necessidade de se aprofundar nas diferenças quantitativas dos diversos constituintes da cera epicuticular dos jatobás expostos à elevada [CO 2].

A biossíntese de ceras envolve a ação de um complexo de enzimas − as elongases − envolvidas primeiramente no aumento do tamanho das cadeias de ácidos graxos ainda nas membranas das células epidérmicas. A partir daí, uma série de reações em cadeia proporciona a

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redução dos ácidos graxos, gerando aldeídos e álcoois primários, descarbonilação de aldeídos para formação de alcanos, hidroxilação de alcanos a álcoois secundários, e oxidação destes para gerar cetonas. Durante este processo, as enzimas envolvidas em cada etapa estão sujeitas à regulação intrínseca e a alterações ambientais. Dessa forma, a ativação ou inibição de uma ou mais enzimas devido à presença de maior concentração de CO 2 na atmosfera pode, por exemplo, levar à alteração na composição química das ceras e/ou em sua quantidade (Shepherd & Griffiths,

2006).

Como já mencionado, as duas espécies de jatobás apresentaram respostas distintas quanto à composição quantitativa das ceras epicuticulares, aparentemente confirmadas pela observação ultra-estrutural. Se essas ceras auxiliam na proteção da planta contra a perda de água pela epiderme foliar, como proposto em Bianchi (1995), supõe-se que H. stigonocarpa estará menos apta que H. courbaril a enfrentar situações de maior estresse hídrico . Outro ponto que pode reforçar essa tese diz respeito ao aumento da espessura da epiderme adaxial (Tabela 2) dos folíolos de H. courbaril crescidos em elevada [CO 2], de certa forma, aumentando a barreira que separa o mesofilo do ambiente.

O presente trabalho encontrou indícios do envolvimento de compostos do metabolismo secundário da cera epicuticular na determinação do número de estômatos das espécies de jatobás expostas à elevada [CO 2]. Entretanto, a incoerência encontrada nos resultados quantitativos

(mesmo considerando sua insignificância estatística, o que pode pressupor deficiência de amostragem), deixa clara a necessidade de continuidade destes estudos. O aprofundamento da análise bioquímica das ceras dessas espécies crescidas em condições de atmosfera enriquecida de

CO 2, tendo como meta a identificação de componentes supostamente envolvidos na sinalização intercelular, deverá compor a continuidade deste trabalho.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

1. Os jatobás Hymenaea courbaril e H. stigonocarpa , duas espécies vicariantes, demonstraram

responder de forma similar quando expostas ao dobro da concentração atmosférica atual de

CO 2, mas as respostas da espécie encontrada no cerrado ( H. stigonocarpa ) foram

significativas em maior número de parâmetros. Sugere-se que essa espécie tenha maior

plasticidade e possa responder ao aumento da concentração atmosférica de forma mais

eficiente que H. courbaril , ainda que outros parâmetros, como temperatura e disponibilidade

de água, provavelmente alterados por conta das mudanças climáticas, não tenham sido

considerados nesse trabalho.

2. Observou-se redução no número de estômatos dos folíolos das duas espécies quando

submetidas a 720 ppm de CO 2, confirmando a maioria dos registros encontrados na literatura,

os quais afirmam haver relação inversa entre aumento da [CO 2] atmosférico e densidade

estomática.

3. As duas espécies acumularam significativamente mais amido no interior dos cloroplastos em

alto teor de CO 2. Observações ultra-estruturais indicaram alterações na estrutura

fotossintetizante da organela, ainda que não tenham sido observados prejuízos ao crescimento

das plântulas durante o período de experimentação.

4. Mesmo não significativa, houve tendência de menor produção de cera epicuticular em H.

stigonocarpa exposta à elevada [CO 2], enquanto que a produção dessa cera foi maior em H.

courbaril. Esses resultados, confirmados por observações da superfície abaxial dos folíolos,

sugerem que a espécie de mata pode vir a sofrer menor impacto em eventuais condições de

estresse hídrico, dadas as funções das ceras nessa condição ambiental.

59

Tabela 2. Análise estatística (média e desvio padrão) de algumas características anatômicas e bioquímicas de plântulas de Hymenaea stigonocarpa e H. courbaril expostas a duas concentrações de CO 2 (ppm). (*) p < 0,05; (**) p < 0,001.

Parâmetros H. stigonocarpa H. courbaril

370 720 370 720 Altura (cm) 19,8 ± 4,25 (**) 25 ± 4,79 28,3 ± 5,93 30,4 ± 5,84 Epicótilo (cm) 10,4 ± 2,57 (**) 14,5 ± 4,42 17,9 ± 5,61 20 ± 5,53 Hipocótilo (cm) 9,4 ± 1,15 (**) 10,5 ± 1,58 10,3 ± 0,88 10,3 ± 1 Primeiro Entrenó (cm) 6 ± 1,37 6 ± 1,48 5,13 ± 0,93 5,3 ± 0,72 Área foliar - 1° par de folíolos (cm 2) 11 ± 2,23 (*) 12,6 ± 3,17 33,8 ± 5,69 34,78 ± 6,17 Índice estomático 18,5 ± 1,5 (**) 15,9 ± 2,5 17,3 ± 1,9 (**) 14.8 ± 2.2 Densidade estomática (estômatos/0,04 mm 2) 10,4 ± 1 (*) 9,4 ± 1,6 11 ± 2,8 (**) 7,8 ± 1,3 Densidade de células epidérmicas (idem) 45,3 ± 3,5 (*) 48,3 ± 6,5 50,1 ± 8,1 (*) 45,6 ± 5,4 Epiderme face abaxial (µm) 15,3 ± 1,7 15,25 ± 1,9 14,2 ± 2,1 14,3 ± 2.1 Epiderme face adaxial (µm) 18,1 ± 2,1 18 ± 2,4 15,9 ± 1,9 (*) 17,2 ± 1.7 Parênquima paliçádico (µm) 49,4 ± 5,2 (**) 64,9 ± 6,5 36,9 ± 4,6 (**) 49,8 ± 4.6 Parênquima lacunoso (µm) 87,4 ± 10,6 90,6 ± 9,3 87 ± 10,6 90,2 ± 9.3 Espessura foliar (µm) 170,5 ± 10,3 (*) 189,7 ± 8,5 176,5 ± 13,7 190,2 ± 10,6 Cera epicuticular (µg/cm 2) 25 ± 4,6 18,1 ± 5,9 15,3 ± 3,8 18 ± 2,5 Área intercelular (µm 2) 8169,9 ± 1585,9 (*) 7420 ± 1388,8 7520 ± 1159,8 7287,7 ± 1160,9 Área de cloroplastos (µm 2) 5,67 ± 2,16 (**) 12,2 ± 4,83 15,94 ± 9,58 14,88 ± 5,45 Amido em cloroplastos (µm 2) 0,48 ± 0,41 (**) 5,82 ± 3,15 1,6 ± 1,22 (**) 5,43 ± 3,11

60

A B

35 NS ** NS 30 25 ** NS 20 * 15 ** NS NS 10 NS 5 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Figura 10. Médias de crescimento e desvios de plântulas de (A) H. stigonocarpa e (B) H. courbaril expostas a 370 e 720 ppm de CO 2. 1 - altura da plântula (cm), 2 - epicótilo (cm), 3 - hipocótilo (cm), 4 - primeiro 2 entrenó (cm), 5 - área foliar (cm ). Barras brancas indicam 370 ppm de CO 2, e barras cinza 720 ppm. (*) P < 0,05 e (**) P < 0,001. NS – não significativo.

A B

60 * * 50 40 30 ** ** 20 * ** 10 0 1 2 3 1 2 3

Figura 11. Médias e desvios de (1) índice estomático, (2) densidade estomática e (3) densidade de células epidérmicas em plântulas de (A) H. stigonocarpa e (B) H. courbaril expostas a 370 e 720 ppm de CO 2.

Barras brancas indicam 370 ppm de CO 2, e barras cinza 720 ppm. (*) P < 0,05 e (**) P < 0,001.

61

A B

250 NS * 200

150 NS NS * NS 100 ** ** 50 NS NS NS *

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Figura 12. Médias e desvios de 1 - espessura foliar (µm), 2 - parênquima paliçádico (µm), 3 - parênquima lacunoso (µm), 4 - epiderme abaxial (µm), 5 - epiderme adaxial (µm) e 6 - espaço inter-celular (µm 2) em plântulas de (A) H. stigonocarpa e (B) H. courbaril expostas a 370 e 720 ppm de CO 2. Barras brancas indicam 370 ppm de CO 2, e barras cinza 720 ppm. (*) P < 0,05 e (**) P < 0,001. NS – não significativo.

A B

NSNS 20 ** 15 ** 10 ** 5

0 1 2 1 2

Figura 13. Médias e desvios de 1 – área de cloroplastos (µm 2) e 2 – área ocupada por amido (µm 2) em plântulas de (A) H. stigonocarpa e (B) H. courbaril expostas a 370 e 720 ppm de CO 2. Barras brancas indicam 370 ppm de CO 2, e barras cinza 720 ppm. (**) P < 0,001. NS – não significativo.

62

Figura 14. Seções transversais de folíolos dos jatobás expostos às duas concentrações de CO 2 (ppm). Hymenaea stigonocarpa 370 (A) e 720 (B). H. courbaril 370 (C) e 720 (D). EFAd (epiderme face adaxial), PP (parênquima paliçádico), PL (parênquima lacunoso), EFAb (epiderme face abaxial), espaço inter-celular (*), estômato (seta). Escala: 30 µm.

63

Figura 15. Vistas frontais da face abaxial da epiderme foliar dos jatobás expostos às duas concentrações de CO 2 (ppm). Hymenaea stigonocarpa 370 (A) e 720 (B). H. courbaril 370 (C) e 720 (D). Notar os estômatos, corados por azul de astra, rodeados por células pavimentosas. Escala: 20 µm.

64

65

A C29

B C29

Figura 17. Perfis cromatográficos da fração de n-alcanos, com predominância de nonacosanos (C 29 ), da cera epicuticular abaxial de H. stigonocarpa . A – 370; B – 720 pm de CO 2.

66

A C29

B

C29

Figura 18. Perfis cromatográficos da fração de n-alcanos, com predominância de nonacosanos (C 29 ), da cera epicuticular abaxial de H. courbaril . A – 370; B – 720 ppm de CO 2.

67

A

6 B

5

4

7

1

2 3 * *

Figura 19. Perfis cromatográficos da fração de triterpenóides de cera epicuticular de plântulas de H. stigonocarpa exposta a 370 (A) e 720 (B) ppm de CO 2.

Legenda para os constituintes : 1. 4-metil-2,6-di-tert-butilfenol; 2. metil-palmitato; 3. metil estearato; 4. eicosanol; 5. germanicol; 6. alfa-amirina; 7. glutin-5-en-3beta-ol. * fitalato (contaminantes). Demais picos ainda não identificados.

68

10 A

8

2 8 B

10

9

3 7 6 5

1 * * 4

Figura 20. Perfis cromatográficos da fração de triterpenóides de cera epicuticular de plântulas de H. courbaril expostas a 370 (A) e 720 (B) ppm de CO 2.

Legenda para os constituintes : 1. benzoquinona; 2. 4-metil-2,6-di-tert-butilfenol; 3. metil-palmitato; 4. metil oleato; 5. metil estearato; 6. metil lignocerato; 7. metil cerotato; 8. eicosanol; 9. alfa-amirina; 10 . glutin-5-en-3beta- ol. * fitalato (contaminantes). Demais picos ainda não identificados.

69

CH3

CH3 OH OH

C15 OH 24 (2-methyl-4,6-ditert-butilfenol) C15 OH 24 (4-methyl-2,6-ditert-butilfenol) Composto fenólico. Tempo de retenção: 9,63 Composto fenólico. Tempo de retenção: 10,43

O O (CH ) (CH ) H3C 2 14 H3C 2 16 OMe OMe

C17 O2H34 (éster metílico do ácido palmítico) C19 O2H38 (éster metílico do ácido esteárico) Ácido graxo. Tempo de retenção: 17,59 Ácido graxo. Tempo de retenção: 20,73

Legenda na página seguinte.

70

CH -OH H C (CH2)18 2 3 HO

C20 OH 42 (eicosanol) C30 OH 50 germanicol (3beta-hidroxiolean-18-eno) Álcool. Tempo de retenção: 35,15 Álcool (triterpenóide pentacíclico). Tempo de retenção: 36,03

HO HO

C30 OH 50 (alfa-amirina) C30 OH 50 (glutin-5-en-3beta-ol) Álcool (triterpenóide pentacíclico). Tempo de retenção: 36,55 Álcool (triterpenóide pentacíclico). Tempo de retenção 36,70

Figura 21. Principais compostos identificados na cera epicuticular dos jatobás Hymenaea stigonocarpa e H. courbaril , e seus respectivos tempos de retenção. Os perfis cromatográficos (Figuras 19 e 20) mostram diferenças na abundância dos componentes nos dois tratamentos, particularmente do eicosanol e do glutin-5-en-3beta-ol em H. stigonocarpa . Ainda é incerto o envolvimento dessas diferenças nas alterações morfológicas encontradas.

71

Figura 22. Eletromicrografias eletrônicas de varredura da superfície abaxial de folíolos de H. stigonocarpa expostos a 370 (A e B) e 720 (C e D) ppm de CO 2. Notar mudança na conformação dos cristais de cera epiculticular, mostrados em detalhe nas figuras B e D.

72

Figura 23. Eletromicrografias eletrônicas de varredura da superfície abaxial de folíolos de H. courbaril expostos a 370 (A e B) e 720 (C e D) ppm de CO 2. Notar maior depósito de cera epiculticular nos folíolos submetidos à elevada concentração de CO 2. B e D mostram, em maior detalhamento, os cristais de cera.

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ANEXO

BUCKERIDGE MS, MORTARI LC & MACHADO MR (2007) Respostas fisiológicas de plantas às mudanças climáticas: alterações no balanço de carbono nas plantas podem afetar o ecossistema? In: Rego, GM; Negrelle, RRB & Morellato, LPC (Ed.). Fenologia: ferramenta para conservação, melhoramento e manejo de recursos vegetais arbóreos. Colombo: Embrapa Florestas, 2007. p. 213- 230. 1 CD-ROM.

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Respostas fisiológicas de plantas às mudanças climáticas: alterações no balanço de carbono nas plantas podem afetar o ecossistema?

Marcos S. Buckeridge *, Leila C. Mortari & Marcelo R. Machado Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, USP Rua do Matão, 277 - Caixa Postal 11461 - CEP 05422-970 Cidade Universitária - Butantã - SP - Brasil *correspondência para [email protected]

Resumo

Neste capítulo primeiramente revisamos a origem e os efeitos das mudanças climáticas globais de forma geral. Em seguida discutimos os efeitos destas sobre as plantas e, posteriormente, o foco é dado para algumas espécies de árvores brasileiras. Na discussão mais profunda sobre estas, revisamos os dados obtidos com jatobá em concentração elevada de CO 2, como aumento na fotossíntese, biomassa e alterações no metabolismo. O jatobá é comparado com estudos (também de nosso grupo) sobre outras espécies de árvores tropicais da família Leguminosae, adaptadas a diferentes estágios da sucessão ecológica. Os dados obtidos até o momento sugerem que a taxa de seqüestro de carbono seja significativamente maior se o processo for usado com várias espécies em conjunto. Estes dados são discutidos à luz da teoria de redes com o argumento de que o aumento de biomassa observado em geral para as espécies pode gerar alterações nas redes ecológicas. É também discutido que mecanismos de sinalização metabólica relacionados ao maior fluxo de carbono nas plantas poderiam gerar efeitos como diminuição da longevidade. Em conjunto, nossos dados permitem especular que mudanças fisiológicas nas plantas induzidas por alto CO 2 nas árvores tropicais têm o potencial de afetar as interações aos níveis de ecossistemas e comunidades.

As mudanças climáticas globais

Atualmente, identifica-se nas mudanças climáticas globais uma das maiores preocupações ao nível mundial. A queima de combustíveis fósseis e a mudança de uso ou cobertura do solo, associadas ao crescimento populacional, vêm contribuindo para a intensificação do efeito estufa de forma inesperada e indesejada, colocando em risco a biodiversidade do planeta e a própria humanidade.

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Acredita-se que o aumento da concentração atmosférica de alguns gases de efeito estufa (GEE), como dióxido de carbono (CO 2), metano, óxido nitroso entre outros, devido a ações antropogênicas, está diretamente relacionado aos aumentos de médias de temperatura em diversas regiões da Terra (Gitay et al. , 2002). Foi sugerido, já em 1985, que alterações climáticas estariam ocorrendo, tanto em nível regional como global, causando secas e enchentes, com prejuízo ainda imprevisível (Peters & Darling, 1985). Alguns estudos prevêem que a temperatura média da atmosfera terrestre aumentará de 1,8 a 4 oC neste século (IPCC, 2007), ocasionando derretimento de parte do gelo das calotas polares, elevando o nível dos mares e trazendo sérios prejuízos para a humanidade e para os ecossistemas terrestres, principalmente nas zonas litorâneas. Além disso, aumentos na temperatura média global causarão, com alta probabilidade, alterações na umidade atmosférica e nos regimes de precipitação devido a um regime hidrológico mais ativo, a mudanças na circulação atmosférica e oceânica e ao aumento na capacidade de retenção de vapor de água do ar.

Com o aquecimento médio da Terra, é provável que várias espécies animais e vegetais tenham que migrar para maiores latitudes e/ou altitudes em busca de temperaturas mais próximas da sua condição natural. Contudo, algumas não conseguirão devido à rapidez das mudanças climáticas (sobretudo as árvores, com sua lenta marcha de migração), à escassez de espaços naturais ou à falta de conexão entre as áreas. Atualmente as áreas naturais estão, na sua maior parte, fragmentadas e isoladas umas das outras, sendo invadidas por espécies exóticas e circundadas por uma matriz composta por estradas, cidades, agropecuária e indústrias, que dificultam o fluxo gênico e de indivíduos necessários à manutenção das populações (Godoy, 2007). O desmatamento e a fragmentação em florestas também podem acelerar as mudanças climáticas, tanto localmente, modificando o microclima, quanto regionalmente, aumentando o aquecimento da superfície e até mesmo diminuindo os níveis de precipitação (Malhi & Phillips, 2004).

O CO 2 é o maior contribuinte para o agravamento do efeito estufa, e está presente na atmosfera em concentrações bem maiores do que outros GEE, conseqüência principalmente da queima de combustíveis fósseis. Desde o início da Revolução Industrial, a concentração de CO 2 vem aumentando (cerca de 280 ppm na era pré-industrial, acima de 368 ppm em 2000 (Watson et al ., 2001), e mais de 380 ppm atualmente; prevê-se, ainda, que neste século atinja o dobro da concentração atual (Alcamo et al. , 1996).

Como resultado do reconhecimento de que o aquecimento global é um problema do presente e não apenas do futuro, foi realizada a Convenção das Nações Unidas Sobre Mudanças Climáticas (United Nations Framework Convention on Climate Change), quando o Protocolo de Kyoto foi elaborado com o intuito de reduzir a emissão de GEE nos países industrializados que ratificaram o acordo (países do Anexo 1). O MDL - Mecanismo de Desenvolvimento Limpo - foi criado como parte do Protocolo, permitindo aos países industrializados o investimento em projetos que evitem aumentos na emissão de GEE nos países em desenvolvimento, que não possuem metas no Protocolo, de tal forma que estes atinjam o desenvolvimento sustentável (Protocolo de Kyoto, 1997). Em troca do investimento, o país em questão receberia “créditos- carbono”, que contariam para o cumprimento de suas metas.

Ultimamente tem-se reconhecido o alto valor econômico da manutenção de ecossistemas florestais, em contraste com os benefícios do uso da terra para outros fins (Prance, 2002). Mais

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importante que o benefício econômico é o fato de que a exploração de um ecossistema de forma sustentável contribui para a manutenção da biodiversidade e do modo de vida e cultura de populações locais. O Brasil, um dos países idealizadores do MDL, já vinha estimulando o desenvolvimento de projetos que envolvessem a recuperação de áreas degradadas, a criação de corredores ecológicos e a exploração sustentável de recursos, entre outros. Por ainda possuir áreas de imensa biodiversidade, como a floresta Amazônica, com potenciais recursos exploráveis ainda pouco conhecidos, o Brasil tem atraído a atenção de uma gama de países interessados em incentivar ações ambientalmente corretas, entre eles os do Anexo 1, ansiosos por cumprir suas metas em relação às emissões de CO 2 na atmosfera.

Uma das formas de manejo da concentração atmosférica de CO 2 é a redução da utilização de combustíveis fósseis, responsáveis por aproximadamente 75% das emissões e considerados o “coração” do desenvolvimento econômico. Porém, esse é um processo que demanda mudanças radicais na economia, e políticas ambientais neste sentido têm encontrado muita resistência. Outra alternativa é o seqüestro de carbono, ou seja, a captura e estocagem do CO 2 presente na atmosfera. Os ecossistemas terrestres são essencialmente filtros biológicos naturais de CO 2, estimando-se que retirem cerca de 2 bilhões de toneladas de carbono da atmosfera por ano.

Por responder à magnitude das reduções necessárias para a estabilização da atmosfera, o seqüestro de carbono tornou-se uma ferramenta essencial para o manejo do CO 2 proveniente do uso de combustíveis fósseis. Duas abordagens básicas podem ser reconhecidas com relação ao seqüestro de carbono: (1) a proteção, manutenção e incremento dos ecossistemas que acumulam carbono; e (2) a manipulação desses ecossistemas a fim de elevar o seqüestro de carbono além das condições atuais. Pode-se elevar o seqüestro de carbono através do acúmulo em matéria viva vegetal, em carbono do solo (orgânico e inorgânico) e em materiais não vivos que contêm madeira, bem como pelo processamento de madeira em produtos de longa vida.

A fotossíntese como mecanismo para seqüestrar carbono

O principal mecanismo de seqüestro de carbono, e de longe o mais eficiente, é a fotossíntese (Buckeridge & Aidar, 2002). Ainda que a eficiência de transformação de energia solar em biomassa através da fotossíntese seja de cerca de 6% (Miyamoto, 1997), este constitui um dos mecanismos mais eficientes de produção de energia no planeta. Neste contexto, estudos sobre a fotossíntese e conseqüente biossíntese e degradação de carboidratos podem ser considerados como elementos-chave para o desenvolvimento de sistemas de seqüestro de carbono mais eficientes.

O processo de fixação de carbono na fotossíntese se dá através da carboxilação da ribulose- 1,5-bifosfato (RuBP, açúcar de 5 carbonos) pela enzima ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco). Competitivamente a Rubisco catalisa também a oxigenação da RuBP, etapa inicial da fotorrespiração. Apesar da Rubisco ter maior afinidade pelo CO 2 do que pelo O 2, este último ocorre em concentração cerca de 550 vezes maior que o primeiro, fazendo com que a competição entre os dois substratos gasosos pela enzima seja um dos fatores determinantes da eficiência da fotossíntese nas atuais concentrações de CO 2 atmosférico (Griffin & Seemann, 1996). O armazenamento do carbono assimilado na fotossíntese ocorre através da síntese de carboidratos, compostos produzidos em grande quantidade pelas plantas e que possuem

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altas proporções de carbono. As plantas apresentam reservas de carboidratos intracelulares (sacarose, compostos da série rafinósica e frutanos nos vacúolos e amido em amiloplastos do citoplasma) e extracelulares (polissacarídeos de parede celular), sendo este último o local onde ocorre a maior proporção de armazenamento. A molécula mais eficiente para compactação do carbono é a celulose, um polímero altamente condensado e de longa duração devido à dificuldade que microorganismos têm em degradá-la. Esses fatos contribuem para tornar a parede celular vegetal uma das reservas mais abundantes de carbono orgânico na natureza (Taiz & Zeiger, 2004).

O efeito do aumento da concentração atmosférica de CO 2 nas plantas é devido a três processos principais: a modulação da atividade da Rubisco; a sensitividade das células-guarda dos estômatos aos níveis de CO 2; e a modulação da respiração mitocondrial (Sage, 2002). Uma maior proporção de CO 2 na atmosfera tem o potencial de aumentar a atividade fotossintética e diminuir a fotorrespiração pela diminuição da atividade de oxigenase da Rubisco. Outros efeitos esperados são a redução da condutância estomática, o aumento da eficiência de uso da água (relação entre as quantidades de CO 2 assimilado e de H 2O perdida) e da proporção C/N (carbono/nitrogênio), e a diminuição da respiração no escuro. A conseqüência desses efeitos pode ser um aumento na taxa de crescimento, o que pode não ocorrer caso a planta apresente aclimatação fotossintética. Porém, mesmo em casos de aclimatação, a taxa de fotossíntese em elevadas concentrações de CO 2 ainda é maior do que nas condições normais (Aidar et al ., 2002).

Recentemente nosso grupo concluiu quatro teses que fazem parte de um programa de pesquisas em respostas de plantas nativas e cultivadas no Brasil às mudanças climáticas globais (Costa, 2004; Godoy, 2007; Souza, 2007 e Marabesi, 2007).

Os estudos que nortearam as teses mencionadas foram iniciados com descobertas sobre o jatobá que publicamos em Aidar et al . (2002). Vimos que a fotossíntese foi significativamente aumentada em atmosfera de CO 2 elevado (720 ppm). O trabalho foi realizado com plântulas e verificou-se que a presença de mobilização de reservas diminui o efeito do aumento no CO 2. Posteriormente vários experimentos similares foram realizados e observamos que além de aumentar a fotossíntese, há também um grande aumento nos teores de sacarose, amido e celulose nas folhas e caules do jatobá-da-mata ( Hymeneaea courbaril ). Comparações com o jatobá-do- cerrado ( Hymeneaea stigonocarpa ) mostraram que as folhas aumentam ainda mais os teores de amido em relação às de jatobá-da-mata. A espécie do cerrado em alto CO 2 apresentou cloroplastos 2 vezes maiores e grânulos de amido 12,6 vezes maiores do que em CO 2 normal, enquanto na espécie da mata estes valores foram de 5,2 vezes e 1,5 vezes respectivamente (Machado & Buckeridge, não publicados – ver Figura 2 para fotos típicas).

Os estômatos foram outra importante observação: as plantas que cresceram em CO 2 elevado apresentaram uma diminuição significativa no índice estomático. Com base nesses resultados, procuramos investigar folhas de espécies de herbário cuja coleta havia sido feita no início do século XX. Os resultados indicaram que folhas de 1919 e 1959 apresentaram o dobro do índice estomático em comparação com as folhas de plantas atuais e incubadas em alto CO 2 (Costa, 2004). Estes resultados mostraram um sinal de aclimatação da planta, que vem diminuindo sua capacidade total de entrada de CO 2 nas folhas ao longo de um período em que a concentração atmosférica de CO 2 aumentou de 280 para 380 ppm.

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Como a diminuição do número de estômatos (índice estomático) ocorreu concomitantemente com um aumento no fluxo de carbono, é provável que os dois fenômenos estejam relacionados. A Figura 1 mostra as principais vias afetadas pelo CO 2 elevado em plantas. Ao entrar pelos estômatos, o carbono é fixado em sacarose no citoplasma celular ou amido nos cloroplastos. A sacarose pode ser transportada para tecidos dreno, os quais irão utilizar os açúcares para diversos fins, como processos respiratórios ligados à manutenção da planta, produção de compostos secundários responsáveis pelos sistemas de defesa e sinalização internos (hormônios) na planta, além da síntese de compostos da parede celular (pectinas, hemicelulose e celulose) que irão compor os novos tecidos em desenvolvimento.

Acredita-se que o mecanismo responsável pela sinalização de fluxo de carbono nas plantas seja a hexoquinase (HK) (Stitt, 1990). Quando o fluxo de açúcares é muito alto, a HK sinaliza para a redução na transcrição de genes como os relacionados à fotossíntese. Hipoteticamente, entre os genes relacionados ao desenvolvimento de estômatos está um gene chamado hic ( high input of carbon), que controla o tamanho das cadeias lipídicas depositadas na superfície foliar. Segundo Lake et al . (2001) o gene hic está diretamente relacionado à definição da formação de estômatos durante o desenvolvimento das folhas. Já repetimos estes experimentos e contamos novamente os estômatos em jatobá-da-mata e jatobá-do-cerrado, e as tendências foram confirmadas.

Uma outra descoberta importante foi a de que o teor de amido das folhas dos jatobás está aumentando significativamente (Costa, 2004). Isto, além de confirmar a hipótese de que o fluxo de carbono é maior quando a planta cresce em CO 2 elevado, também pode ter efeitos negativos sobre a planta, como o “sombreamento” dos cloroplastos causado pela grande quantidade de amido. Outra questão importante está no fato dos cloroplastos serem submetidos à pressão por grânulos bastante grandes, gerando, hipoteticamente, gastos energéticos e até morte celular. A Figura 2 mostra uma comparação da ultra-estrutura de células das paliçadas de folhas de Hymeneaea courbaril que cresceram em 370 e 720 ppm de CO2 atmosférico, respectivamente.

Em conjunto, os resultados que mostram o efeito da mobilização de reservas como atenuador da resposta ao teor de CO 2 elevado, e a redução na capacidade de assimilação por diminuição do índice estomático das folhas, denotam a existência de mecanismos fisiológicos relacionados à diminuição das respostas ao aumento de CO 2 atmosférico. É possível, portanto, que estes já sejam sintomas de aclimatação fisiológica das plantas às mudanças climáticas.

Nesse contexto, pode-se supor que alterações nas respostas sazonais dos jatobás ocorram de forma diferente conforme a capacidade de armazenar carbono nas plantas nas estações favoráveis. Em plantas de cerrado, que sofrem severa restrição hídrica durante o inverno, observamos que ocorre maior acúmulo de reservas para uso na estação favorável, especialmente em alto CO 2. Neste caso é possível que os efeitos do aumento de CO 2 sejam menores do que em espécies ou variedades de jatobá crescendo em regiões onde as condições sejam mais estáveis.

Uma conseqüência disso é a possibilidade de que em situações com menores variações sazonais de condições climáticas, a taxa de seqüestro de carbono seja significativamente maior do que em condições como o cerrado ou a catinga (onde há espécies de jatobás), em que as plantas acumulam mais reservas e, portanto, reciclam carbono com maior eficiência, pois o mantém acumulado em uma forma compactada que nas plantas acredita-se ser, preferencialmente, amido.

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O CO 2 e o processo de formação da floresta

Em duas outras teses (Godoy, 2007 e Marabesi, 2007) e também com a obtenção de resultados recentes ainda não publicados, obtivemos dados sobre os padrões ecofisiológicos de respostas de 5 espécies de árvores brasileiras: Senna alata (mata pasto), Sesbania virgata (feijão- do-mato), Schyzolobium parahyba (guapuruvú) Piptadenia gonoacantha (pau-jacaré) e Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia), estudadas pela primeira vez sob este enfoque. O objetivo central foi o de compreender como o CO 2 poderá influenciar no estabelecimento das plântulas dessas espécies, escolhidas por serem de estágios distintos na sucessão ecológica. Essas espécies foram escolhidas por serem de estágios distintos da sucessão ecológica, e o objetivo foi o de compreender como o CO 2 poderá influenciar no estabelecimento das plântulas. De maneira geral, o que concluímos até agora é que as espécies pioneiras S. alata e S. virgata , que iniciam a formação da floresta no processo de sucessão ecológica, crescem rápido e seqüestram grandes quantidades de carbono rapidamente, enquanto as espécies de crescimento mais lento seqüestram menos carbono no mesmo período, porém vivem mais. Como as espécies que iniciam o processo (mata pasto e feijão-do-mato) vivem entre 5 e 10 anos, as intermediárias (guapuruvú e pau- jacaré) entre 25 a 30 anos, e as finais (jacarandá-da-bahia e o jatobá) mais de 100 anos, uma conseqüência das nossas descobertas é que uma floresta tropical em regeneração seqüestra carbono continuamente por um longo período (Figura 3).

Além disso, os dados que obtivemos nos permitiram ainda calcular o desempenho fisiológico em alto gás carbônico de forma comparada, e nossos dados sugerem que as espécies intermediárias, principalmente o pau-jacaré, têm um desempenho fisiológico melhor em relação às demais espécies. Estes resultados sugerem que o seqüestro de carbono é maior e mais consistente quando se executa o processo de sucessão em contraposição ao plantio de uma única espécie (Figura 3).

Dados sobre o desempenho fisiológico das espécies da Mata Atlântica pertencentes a diferentes estágios sucessionais (Godoy, 2007) sugerem que o aumento na concentração de CO 2 atmosférico tem o potencial de afetar o processo de sucessão ecológica através da melhora relativa do desempenho fisiológico de algumas espécies (as do estágio intermediário) em relação às demais (as iniciais e secundárias tardias).

Impacto do aumento de CO 2 para o tamanho dos organismos e nas redes de interações ecológicas.

Atualmente acredita-se que a regulação do tamanho não seja efetuada somente pelo genoma, mas pela interação entre este e o ambiente. Do ponto de vista do funcionamento do genoma, o controle de tamanho e forma dos organismos vivos é feito por uma classe de genes chamada de homeóticos. Esta é uma classe de genes “administrativos” que de algum modo informa quais devem ser os padrões de divisão celular e expansão de cada uma das células em um tecido ou órgão (Taiz & Zeiger, 2004).

A determinação do tamanho parece estar diretamente relacionada com o fluxo de energia que passa através de um organismo durante o desenvolvimento, e isto parece determinar também a longevidade. Ao se desenvolver, cada órgão irá crescer primeiro lentamente, acelerará o

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crescimento entrando numa fase exponencial e depois diminuirá drasticamente sua velocidade. O comprimento da fase de aumento exponencial está relacionado com o fluxo de energia, o que faz com que a produção de açúcares e aminoácidos em um organismo aumente consideravelmente, e uma via de sinalização informe às células para interromperem o processo de divisão e/ou de expansão (Figura 4). Isto leva a um período chamado de Intervalo de Cessação do Crescimento (ICC) (Edgar, 2006). Como conseqüência, quando o fluxo de energia em um organismo é muito maior do que o programa de sinalização que o ICC pode suportar, a única solução é “crescer para os lados”, ou seja, armazenar o excesso de carbono e nitrogênio em algum lugar, pois não há como usar para crescer normalmente. No caso dos animas, em geral isso gera obesidade, com acúmulo de gorduras, enquanto que nas plantas o armazenamento ocorre na forma de amido e celulose.

Edgar (2006) mostra em seu trabalho uma foto com insetos que foram subalimentados ao longo da vida, e que são menores devido ao tamanho menor de suas células. Contanto que a subalimentação não comprometa o estado nutricional do organismo, os subalimentados irão viver por mais tempo (ver http://www.accessexcellence.org/WN/SUA11/worm897.html). Edgar (2006) propõe ainda que a temperatura possa afetar o ICC levando a uma diminuição no tamanho dos organismos por diminuir o tamanho das células.

Como podemos interpretar isto no âmbito dos efeitos das mudanças climáticas globais sobre os organismos vivos?

Como mencionado, o aumento na concentração de gás carbônico vem fazendo com que as plantas façam mais fotossíntese e acumulem mais carbono. Com isso elas deveriam aumentar em tamanho. No entanto, se admitirmos que o aumento na temperatura contrabalance o efeito do CO 2, pois induziria a uma diminuição de tamanho, não veríamos efeitos muito aparentes das mudanças climáticas sobre plantas devido a este equilíbrio. Mas há um problema: o fluxo de carbono tem sido maior nas plantas desde o aumento de CO 2 atmosférico iniciado com a revolução industrial. Além disso, a maioria dos experimentos e observações indica que os efeitos do CO 2 e da temperatura são aditivos e afetarão os ecossistemas através de uma pressão de fluxo de carbono, mesmo com as limitações impostas pela disponibilidade de outros componentes como nitrogênio e fósforo. Como conseqüência, espera-se um aumento geral de biomassa, mas o reflexo seria maior no acúmulo de amido e não tanto no tamanho das plantas. Acima mostramos que este é o caso do jatobá que, apesar de apresentar um grande aumento no conteúdo de amido nas folhas, não ocorreram diferenças proporcionais no tamanho ao final do experimento.

Do ponto de vista ecológico, um aumento de amido leva à maior disponibilidade de carboidratos para os predadores que, por sua vez, obtêm um maior fluxo de energia em seus organismos. Como resultado, devido ao aumento de CO2 previsto com as mudanças climáticas globais, é possível que as teias alimentares estejam trabalhando com um fluxo energético significativamente maior do que era encontrado antes da Revolução Industrial.

Se a hipótese de que o maior fluxo energético conduz a uma diminuição da longevidade for estendida à maioria dos organismos vivos, poderíamos propor que a longevidade potencial venha diminuindo ao longo do período de emissões de CO 2 por combustíveis fósseis que o homem vem promovendo no planeta. Como conseqüência, as atividades do homem teriam como principal resultado uma aceleração dos processos ecológicos, aumentando o fluxo de energia através dos

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ecossistemas. Com isso, uma diminuição geral de longevidade poderia não apresentar grandes problemas, desde que as relações entre os diferentes organismos nas comunidades mantenham-se proporcionais.

As relações entre os organismos nos ecossistemas e comunidades funcionam como redes nas quais os elementos se interconectam através de processos como predação e reprodução (Buckeridge, 2007). As mudanças climáticas ocorrem normalmente em nosso planeta, mas com variações que levam milhares de anos para ocorrer. Eventos rápidos da ordem de centenas de anos, como os que estão ocorrendo desde a Revolução Industrial, são normalmente associados a catástrofes para os organismos vivos. No caso das mudanças climáticas que vivemos atualmente, é possível que, a partir de certo limite, os efeitos sejam bastante rápidos, tornando a biodiversidade mais vulnerável a instabilidades. Por outro lado, uma das características de sistemas complexos é a resiliência, através de mecanismos que fazem com que um estado de equilíbrio seja mantido, mesmo com perturbações de intensidade razoável (Souza & Buckeridge, 2004, Buckeridge, 2007).

No caso das alterações de forma e tamanho, se tudo acontecer da mesma maneira para todas as espécies, as alterações podem sequer ser percebidas, mas se houver respostas distintas nos diferentes grupos de seres vivos, então a grande rede de interações da biosfera poderia começar a perder (ou alterar) suas conexões. Considerando que estas conexões sejam moduladas pelas variações cíclicas no clima, os aspectos fenológicos são de fundamental importância para compreender o funcionamento dos sistemas complexos de relações ecológicas. Além disso, as observações de alterações fenológicas poderão servir como importantes marcadores do grau de impacto e da vulnerabilidade das redes de interações biológicas às mudanças climáticas globais.

Agradecimentos . A discussão apresentada neste capítulo inclui dados que foram obtidos em conjunto por um grupo de pesquisas constituído por Marcos P.M. Aidar, Marília Gaspar, João Godoy, Mauro Marabesi e Marina Martins. Este trabalho tem o financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT), Eletronorte e CNPq. Marcelo R. Machado é doutorando do curso de pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP, e Leila C. Mortari é aluna de graduação de Biologia do IB-USP.

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Figura 1. Principais passos do metabolismo vegetal levando ao seqüestro de carbono. HK=hexoquinase, uma das principais enzimas do metabolismo de carboidratos que além de fosforilar o açúcar e produzir o substrato principal para o metabolismo energético também é capaz de sinalizar para a célula que a intensidade do fluxo de carbono. O gene hic parece estar associado à biossíntese de lipídeos de cadeia longa que determinam quais as células da epiderme se transformarão em estômatos durante a expansão foliar.

Figura 2. Fotomicrografias eletrônicas obtidas a partir de seções transversais de folhas de Hymeneaea courbaril . Os cortes foram feitos a partir de folíolos totalmente expandidos.

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Figura 3. Padrão quantitativo hipotético de seqüestro de carbono por espécies de leguminosas pioneiras, secundárias iniciais e tardias. Neste modelo considerou-se que a longevidade média das pioneiras seria de aproximadamente 10 anos, das Secundárias iniciais de aproximadamente 20 anos enquanto as secundárias tardias apresentariam maior acúmulo de carbono e por um tempo maior do que 40 anos. A linha tracejada é a soma das taxas de seqüestro de cada grupo funcional. O intuito é mostrar que, teoricamente, o conjunto de plantas crescendo seqüestra significativamente mais carbono do que em modelos onde se usem somente as espécies secundárias tardias que apresentam maior densidade da madeira.

Figura 4. Relação entre o investimento em nutrientes (azul) e o aumento de biomassa (vermelho). O intervalo de cessação do crescimento (ICC) ocorre a partir do pico de investimento de nutrientes e determina o peso crítico, ou o máximo de biomassa que um organismo irá atingir. Genes do metabolismo de carboidratos estão relacionados com o peso crítico. Com maiores temperaturas, aumenta a taxa de divisão celular e as células ficam menores, diminuindo também o tamanho do organismo. Adaptado de Edgar (2006).

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