PACLOBUTRAZOL NO CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO in VITRO E NA ACLIMATIZAÇÃO DE Sophronitis Cernua (LINDL.) LINDL

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL

PACLOBUTRAZOL NO CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO E NA ACLIMATIZAÇÃO DE Sophronitis cernua (LINDL.) LINDL. E Brassavola flagellaris BARB. RODR. (ORCHIDACEAE)

Juliana Garcia dos Santos Ichinose Engenheira Agrônoma

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Abril de 2012 i

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL

PACLOBUTRAZOL NO CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO E NA ACLIMATIZAÇÃO DE Sophronitis cernua (LINDL.) LINDL. E Brassavola flagellaris BARB. RODR. (ORCHIDACEAE)

Juliana Garcia dos Santos Ichinose

Orientadora: Profa. Dra. Kathia Fernandes Lopes Pivetta Co-Orientador: Prof. Dr. Ricardo Tadeu de Faria

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia (Produção Vegetal).

Jaboticabal – SP Abril de 2012

Ichinose, Juliana Garcia dos Santos I16p Paclobutrazol no crescimento e desenvolvimento in vitro e na aclimatização de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. e Brassavola flagellaris Barb. Rodr. (Orchidaceae)./ Juliana Garcia dos Santos Ichinose. – – Jaboticabal, 2012 iv, 79 f. : il. ; 28 cm

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2012 Orientadora: Kathia Fernandes Lopes Pivetta Banca examinadora: Roberto Jun Takane, Claudia Fabrino Machado Mattiuz, Marcelo Vieira Ferraz, Antonio Baldo Geraldo Martins Bibliografia

1. Orquídeas. 2. Micropropagação. 3. Retardante de crescimento de plantas. 4. Triazol. 5. Floricultura I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.

CDU 635.9:631.532

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

DADOS CURRICULARES DA AUTORA

JULIANA GARCIA DOS SANTOS ICHINOSE – nascida em 24 de março de 1982, em Jaboticabal – São Paulo. Filha de Jose dos Santos Filho e Sueli Garcia. Cursou o segundo grau na Escola Estadual “Aurélio Arrobas Martins” na cidade Jaboticabal – SP. Ingressou no curso de Agronomia em 2001, na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp), Campus de Jaboticabal. Foi bolsista PET (Programa de Educação Tutorial) de Julho de 2002 a Julho de 2005. Desenvolveu trabalhos diversos nas áreas de floricultura e plantas ornamentais, tecnologia e entomologia. Obteve o título de Engenheira Agrônoma em Janeiro de 2006. Em Agosto de 2006 ingressou, como bolsista CAPES (Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), no curso de Mestrado em Agronomia (Produção Vegetal) pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp), Campus de Jaboticabal. Em março de 2009 ingressou, como bolsista CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico), no curso de Doutorado em Agronomia (Produção Vegetal) pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp), Campus de Jaboticabal. É autora e co-autora de várias publicações científicas. Participou em banca examinadora de trabalho de graduação.

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Mensagem: Tenha em mente que tudo que você aprende na escola é trabalho de muitas gerações. Receba essa herança, honre-a, acrescente a ela e, um dia, fielmente, deposite-a nas mãos de seus filhos. Albert Einstein

Dedico:

Especialmente ao meu amado filho Gabriel, luz na minha vida, fonte de força e inspiração. A você, André, meu grande amor, amigo, esposo e companheiro. Aos meus amados pais Jose e Sueli. Aos meus queridos irmãos Alan e José Henrique,

Amo todos vocês! v

Agradecimentos especiais

Agradeço, em primeiro lugar, a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por todas as bênçãos que tenho recebido no decorrer da minha vida. Ao meu filho Gabriel pela compreensão nos momentos de ausência (foram muitos...), pelo apoio, carinho... Pelos momentos de grande felicidade que você me proporcionou. Pelo sorriso sempre presente em sua linda face. Este olhar maroto e este jeitinho encantador que me desmontam. Ao meus pais José e Sueli, aos meus irmãos Alan e José Henrique e à minha cunhada Lucimara, pelo apoio e incentivo, que me permitiram superar as muitas dificuldades. Em especial à minha mãe pela dedicação e o carinho a mim e ao meu filho. Mãe, se não fosse a senhora eu não teria conseguido. À minha avó Alzira e à minha tia Zilda, com quem sempre pude e posso contar. À minha cadelinha Minnie, minha filha, companheira de muitos anos, pelo imenso carinho dedicado a mim durante todos estes anos (desde a graduação). Enfim, à toda a minha família e amigos.

Muito obrigada, amo todos vocês!

Agradecimentos

À UNESP-FCAV, pela excelência do ensino e oportunidade de cursar o doutorado em Agronomia/Produção Vegetal. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudo. À Professora Dra. Kathia Fernandes Lopes Pivetta, minha orientadora, pela orientação, incentivo e amizade. Sou muito grata à Deus pela oportunidade de ter convivido com esta pessoa tão especial. Aos membros da banca examinadora de qualificação e de defesa: Prof. Dr. Antonio Baldo Geraldo Martins, Profa. Dra. Ruchele Marchiori Coan, Profa. Dra. Regina Maria Monteiro de Castilho, Profa. Dra. Claudia Fabrino Machado Mattiuz, Prof. Dr. Marcelo Vieira Ferraz e Prof. Dr. Roberto Jun Takane pelas valiosas contribuições no aprimoramento deste trabalho. Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal. Aos funcionários do Viveiro Experimental. Ao Prof. Dr. Ricardo Tadeu de Faria pela Co-orientação. A todos os professores que contribuíram pra a minha formação pessoal e profissional. A todos os meus amigos, em especial à: Renata Mazzini, Ruchele, Gisele, Renata Gimenes, Gustavo, Breno, Marcos, Juliana, Aluízio, Marilza ... , muito obrigada pela amizade, apoio e por todos os momentos que passamos juntos. Aprendi muito com cada um de vocês... E, finalmente, a todas as pessoas, que direta ou indiretamente, contribuíram para a execução deste trabalho.

SUMÁRIO

Página RESUMO...... iii SUMMARY...... iv

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS...... 1 1.1. REVISÃO DE LITERATURA ...... 3 1.1.1 Aspectos econômicos da floricultura e comercialização de orquídeas...... 3 1.1.2. Família Orchidaceae...... 5 1.1.2.1. Sophronitis cernua ...... 7 1.1.2.2. Brassavola flagellaris ...... 7 1.1.3. Propagação de orquídeas...... 8 1.1.4. Reguladores de crescimento vegetal...... 9 1.1.5 Efeitos fisiológicos dos reguladores vegetais inibidores da biossíntese de giberelinas...... 11 1.1.6. Paclobutrazol...... 12 1.1.7. Reguladores de crescimento em plantas ornamentais...... 13 1.1.8. Anatomia de plantas micropropagadas...... 15 1.1.9. Aclimatização...... 17 1.1.10. Ambiente de cultivo...... 18

CAPÍTULO 2 - DESENVOLVIMENTO INICIAL (IN VITRO) DE PLÂNTULAS DE Sophronitis cernua EM PRESENÇA DE PACLOBUTRAZOL E SEUS EFEITOS NA ACLIMATIZAÇÃO ...... 20 RESUMO...... 20 Palavras-chave...... 20 INTRODUÇÃO...... 21 ii

MATERIAL E MÉTODOS...... 23 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 26 CONCLUSÕES...... 32

CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DO PACLOBUTRAZOL NO DESENVOLVIMENTO INICIAL DE Brassavola flagellaris (IN VITRO) E ACLIMATIZAÇÃO...... 33 RESUMO...... 33 Palavras-chave...... 33 INTRODUÇÃO...... 34 MATERIAL E MÉTODOS...... 37 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 41 CONCLUSÕES...... 49 REFERÊNCIAS...... 50

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PACLOBUTRAZOL NO CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO E NA ACLIMATIZAÇÃO DE Sophronitis cernua (LINDL.) LINDL. E Brassavola flagellaris BARB. RODR. (ORCHIDACEAE)

RESUMO – Sophronitis cernua e Brassavola flagellaris são orquídeas epífitas, nativas do Brasil. O cultivo in vitro é uma técnica que permite produzir grande número de indivíduos, entretanto ocorrem muitas perdas durante o período de aclimatização (ex vitro). Em razão disto, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de cultura Murashige e Skoog com paclobutrazol, no crescimento e desenvolvimento de plântulas de Sophronitis cernua e Brassavola flagellaris (in vitro), visando aumentar a taxa de sobrevivência das plântulas ex vitro. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado. Foram quatro tratamentos (três concentrações de paclobutrazol: 0,5; 1,0 e 1,5 mg i.a. L-1 e controle) e 10 repetições com 12 plântulas. Após cultivo em meio sem suplementação, as plântulas foram inoculadas nos tratamentos, onde permaneceram por mais 90 dias. Após este período, cinco repetições foram separadas para as análises destrutivas e as outras cinco foram transplantadas para bandejas contendo fibra de coco (S. cernua) e mistura de fibra de coco e esfagno (B. flagellaris). Verificou-se que as diferentes concentrações de paclobutrazol promoveram alterações nas características morfológicas das plântulas das duas espécies. Para S. cernua foi verificada redução do número de folhas, área foliar, massa seca e comprimento da parte aérea; aumento no diâmetro e massa seca de raízes e redução na taxa de sobrevivência das plântulas. Para B. flagellaris houve incrementos no acúmulo de massa seca de todas as partes (exceto na maior concentração para parte aérea), no número de folhas, na área foliar (0,5 mgL-1), no diâmetro no comprimento de raízes e no número de raízes; redução no número de brotos e comprimento da parte aérea e maiores taxas de sobrevivência da plântulas.

Palavras-chave: Orquídea, floricultura, plantas ornamentais, retardante de crescimento de plantas, triazol e micropropagação. iv

PACLOBUTRAZOL ON GROWTH AND DEVELOPMENT IN VITRO AND IN THE ACCLIMATIZATION Sophronitis cernua (LINDL.) LINDL. AND Brassavola flagellaris BARB. RODR. (ORCHIDACEAE)

SUMMARY - Sophronitis cernua and Brassavola flagellaris are orchids epiphytes, native of Brazil. The in vitro propagation is a technique that allows to produce large numbers of plants, however many losses occur during the period of acclimatization (ex vitro). For this reason, this work aimed to study the effect of supplementation of the Murashige and Skoog medium with paclobutrazol on growth and development of plants of Sophronitis cernua and Brassavola flagellaris (in vitro) to increase the survival rate of seedlings ex vitro. The experimental design was completely randomized. There were four treatments (three concentrations of paclobutrazol: 0.5, 1.0 and 1.5 mg ai L-1 and control) and 10 repetitions with 12 plants. After cultivation in medium without supplementation, the seedlings were inoculated on treatments, where they remained for another 90 days. After this period, five replicates were separated for destructive analysis and the other five were transplanted into trays containing coir (S. cernua) and a mixture of coconut fiber and sphagnum moss (B. flagellaris). It was found that paclobutrazol induced changes in the morphological characteristics of both species. To S. cernua: reducing the number of leaves, leaf area, dry weight and shoot length and increase in diameter and dry mass of roots. Reduction in the rate of seedling survival. To B. flagellaris: increases in dry mass of all parties, except at the highest concentration (aerial part), the number of leaves, leaf area (0.5 mgL-1), diameter, length of roots and more roots. Reduction in the number of shoots and shoot length. Highest survival rates of seedlings.

Key words: Orchid, Floriculture, ornamental plants, plant growth retardant, triazole and micropropagation. 1

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS

As orquídeas estão entre as plantas ornamentais mais apreciadas e exploradas comercialmente, apresentando potencial alimentício, cosmético e medicinal. São consideradas importantes bioindicadoras do grau de preservação de uma determinada área, o que possibilita inferir a respeito do estágio sucessional em que um ambiente se encontra apenas observando a densidade de orquídeas presentes no local (PELÚZIO & SOARES, 2004). Em razão da velocidade da degradação do meio ambiente, do extrativismo predatório, e, a importância das orquídeas na manutenção da biodiversidade, a preocupação de conservar esta família têm incentivado a realização de projetos visando reintrodução, conservação e manejo de orquídeas na natureza (PEREIRA et al., 2003; PELÚZIO & SOARES, 2004). As plantas da família Orchidaceae apresentam desenvolvimento lento, requerendo maior período de cultivo antes de serem comercializadas. Isso tem contribuído para o elevado valor unitário de suas plantas no mercado. Assim sendo, existe grande interesse na diminuição do tempo de formação da muda de orquídea, principalmente, para a diminuição dos custos de produção. A cultura de tecidos vegetais é uma técnica que permite melhor controle dos fatores de produção, possibilitando a obtenção de mudas em larga escala, com alta qualidade genética e sanitária a preços mais acessíveis, o que viabiliza uma produção padronizada exigida pelo mercado consumidor, evitando assim, a degradação do meio ambiente (REDENBAUGH, 1991; TOMBOLATO & COSTA, 1998). As condições ambientais para o crescimento ex vitro são bastante diferentes das utilizadas para o cultivo in vitro (KOZAI et al., 1997 e HAZARIKA, 2006). A adaptação das plantas procedentes do cultivo in vitro para o ambiente ex vitro é denominada aclimatização. Esta fase é um dos fatores chaves na produção de mudas saudáveis. Em geral, a adaptação ocorre gradativamente e tem como objetivo minimizar as dificuldades submetidas às plantas durante a transferência para a casa de vegetação. A temperatura, a luminosidade, a umidade, os substratos e os nutrientes são alguns dos 2

fatores que podem dificultar o desenvolvimento e sobrevivência das mudas durante esse processo (DEBERG & ZIMMERMAN, 1991; SOUZA et al., 2007). Morfologicamente, as plantas cultivadas in vitro podem apresentar diferenças quando comparadas àquelas que se desenvolvem em ambiente natural. Esse fato pode ser responsável pela baixa sobrevivência das mudas quando transferidas do cultivo in vitro para a casa de vegetação. No ambiente ex vitro maior taxa de transpiração é exigida às plantas, pois frequentemente plantas cultivadas in vitro apresentam estruturas, que controlam a perda de água, pouco desenvolvidas (PREECE & SUTTER, 1991; ROCHA, 2007). Para aumentar o índice de sobrevivência das mudas durante a aclimatização, alguns autores têm relatado a importância do desenvolvimento de determinadas características morfológicas ainda durante o crescimento in vitro (CARVALHO et al., 1999; SOUZA et al., 2007). Os retardadores de crescimento vegetal têm sido relatados como agentes eficazes na redução do tamanho das plantas, proporcionando folhas verde-escuras e raízes grossas, o que as define como mudas saudáveis; e, permite também redução na perda de água pelas plantas, levando a uma melhor sobrevivência e crescimento em condições ex vitro (HAZARIKA, 2006; KOZAK, 2006 e THAKUR et al., 2006). O paclobutrazol (PBZ) é um retardante de crescimento de plantas de amplo espectro, que apresenta grande potencial de utilização (TONGUMPAI, 1991). É largamente utilizado por induzir tolerância leve ao estresse em plântulas e plantas adultas (FLETCHER et al., 2000). A ação é em função da inibição da biossíntese das giberelinas (SILVA, 2000) pela inibição da oxidação de caurene para ácido carenóico, reduzindo o nível de divisão celular sem causar citoxicidade (DAZIEL & LAWRENCE, 1984). As conseqüências fisiológicas são: redução do crescimento vegetativo e maior disponibilidade de substâncias assimiláveis para a planta (GENÚ & PINTO, 2002). O modo de ação do PBZ tem sido associado com decréscimo na transpiração, altura da planta, biomassa e área foliar e incremento à resistência estomatal (TE- CHATO et al., 2009). Estas características podem indicar que a planta teria melhores condições adaptativas ao ambiente ex vitro. 3

Em virtude da grande importância do cultivo in vitro para a propagação das orquídeas, e da necessidade da redução de custos de produção, por meio da otimização das etapas do processo produtivo, este trabalho objetivou: i) avaliar o efeito da suplementação do meio de cultura Murashige e Skoog com um regulador de crescimento vegetal (paclobutrazol) no crescimento e desenvolvimento in vitro de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. e Brassavola flagellaris Barb. Rodr. ii) verificar se a suplementação do meio de cultivo com paclobutrazol reduz as perdas de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. e Brassavola flagellaris Barb. Rodr. durante a fase de aclimatização (ex vitro) em casa de vegetação, nas condições de Jaboticabal, São Paulo.

1.1. REVISÃO DE LITERATURA

1.1.1 Aspectos econômicos da floricultura e comercialização de orquídeas

A floricultura abrange o cultivo de plantas ornamentais desde flores de corte e plantas envasadas, floríferas ou não, até a produção de sementes, bulbos e mudas de árvores de grande porte (CASTRO, 1998). O cultivo de plantas ornamentais é considerado uma atividade econômica de grande relevância no agronegócio nacional e internacional, principalmente devido à criação de um grande número de empregos diretos e indiretos e, também, ao valor de sua produção e comercialização (CANÇADO JÚNIOR et al., 2005). Segundo dados de 2010, o setor de floricultura ocupa uma área estimada em torno de 190 mil ha e movimenta mundialmente cerca de US$ 18 bilhões (base mercado produtor) e US$ 54 bilhões (base mercado consumidor). No Brasil, os números no varejo giram em torno de R$ 2,6 bilhões. O mercado produtor movimenta cerca de R$ 700 milhões e o atacadista R$ 1,1 bilhão. A média anual de consumo de 4

flores e plantas ornamentais no Brasil é de cerca de R$ 13,00 a R$ 15,00 por pessoa, muito abaixo do consumo per capita europeu, que é em torrno de US$ 70,00 por habitante/ano. O Brasil possui cerca de 5,1 mil produtores de plantas e flores de todos os tamanhos responsáveis pelo cultivo de quase oito mil hectares (ABCSEM, 2010). Segundo JUNQUEIRA & PEETZ (2011a) houve uma redução nas exportações brasileiras de flores e plantas ornamentais em 2009 e 2010 devido à conjuntura economicamente depressiva nos principais mercados importadores mundiais (zona do Euro, EUA e Japão), além da sustentada valorização da política cambial do real, que induz à perda de competitividade das flores e plantas ornamentais no mercado mundial; no entanto, o mercado interno tem permitido não apenas manter-se a salvo da crise internacional de demanda, como também, sustentar o escoamento para os volumes crescentes de sua produção. Tradicionalmente, os meses de maio e junho concentram as duas mais importantes datas para o comércio de flores e plantas ornamentais no mercado brasileiro: o Dia das Mães e o Dia dos Namorados. O comércio brasileiro de flores e plantas ornamentais confirmou resultados excepcionalmente bons para o Dia das Mães em 2011, sendo a composição das vendas baseada no binômio: rosas vermelhas (corte) e orquídea do gênero Phalaenopsis (vaso), que tradicionalmente domina o mercado (JUNQUEIRA & PEETZ, 2011b). As orquídeas mais comercializadas no Brasil pertencem aos gêneros: Cattleya, Laelia, Oncidium, Miltonia, Dendrobium, Vanda, Epidendrum e Paphiopedilum (PASQUAL et al., 2005) sendo que, para corte, as principais produzidas e comercializadas são espécies ou híbridos dos gêneros Cattleya, Cymbidium, Dendrobium (Denphal), Oncidium e Phalaenopsis; alguns gêneros, como Epidendrum, Paphiopedilum e Vanda estão despontando nesta área (PIVETTA et al., 2012). A orquidocultura obteve expressivo acréscimo de produtividade, principalmente pela introdução de novas tecnologias associadas a novas espécies e variedades disponibilizadas no mercado refletindo no incremento do comércio destas plantas dentro e fora do Brasil (TAKANE & YANAGISAWA, 2007).

1.1.2. Família Orchidaceae

A família Orchidaceae é uma das maiores e mais diversificadas famílias dentre as Angiospermas, com várias espécies registradas no mundo inteiro, dentre terrestres, epífitas e rupícolas (CRONQUIST, 1981; DRESSLER, 1993). É constituída por cerca de 850 gêneros, 25.000 espécies e representam por volta de 10% de todas as plantas com flores no mundo inteiro, sem considerar a quantidade de híbridos que tem sido criada (por volta de 100.000), superior a qualquer outro cultivo ornamental (ROBERTS & DIXON, 2008). As orquídeas ocupam praticamente todos os habitats, principalmente nos trópicos, as floras mais ricas são encontradas nas Américas Central e do Sul e na Ásia equatorial, ocupando também regiões de climas temperados e árticos (DRESSLER,1993). O Brasil dispõe de grande diversidade de espécies da família Orchidaceae, principalmente as epífitas, representadas por cerca de 200 gêneros e aproximadamente 2350 espécies; apresentando inúmeros híbridos de variadas formas, tamanhos, aromas e cores de folhas e flores. Destacando-se como importante planta ornamental, de interesse econômico, botânico e inclusive de importância para a indústria medicinal, cosmética e alimentícia (SILVA, 2003; ARAÚJO, 2004). As espécies de orquídeas tropicais, possuem muitos indivíduos em vias de extinção, havendo, portanto, necessidade urgente de retirá-las desta condição (FARIA et al., 2001). Segundo a última listagem divulgada pelo Ministério do Meio Ambiente, significativo número de orquidáceas (34) estão ameaçados de extinção e outras 24 espécies ainda não foram somadas a lista por deficiência de dados (BRASIL, 2008). Atribui-se a esta diminuição a coleta predatória e ao aumento das fronteiras agrícolas que retiram a floresta, seu hábitat natural, para pecuária ou cultivos agrícolas (COLOMBO et al., 2005). Morfologicamente, a família Orchidaceae apresenta crescimento monopodial (ereto) ou simpodial (prostrado). São constituídas de raiz, caule (bulbo/pseudobulbo), folha, inflorescência, flor e fruto do tipo cápsula (DRESSLER, 1993). Apresentam raízes 6

fasciculadas e compostas por câmbio vascular, córtex e velame, composto por duas a três camadas de células lignificadas. Esse órgão pode servir como fonte de reserva (água e nutrientes) e proteção (mecânica e reflexão da radiação solar), principalmente para raízes de orquídeas epífitas, as quais não possuem a proteção física do solo como as espécies terrestres (ARDITTI, 1992; ARDITTI & ERNST, 1993). Importantes na manutenção da biodiversidade, a família Orchidaceae é composta por indivíduos bioindicadores ambientais do estado de conservação das florestas, sensíveis às interferências em matas primárias, em virtude da ocupação de nichos especializados (PELÚZIO & SOARES, 2004; MARRARA et al., 2007) e de sua complexa interação ecológica com polinizadores e microorganismos (ROBERTS & DIXON, 2008). Devido à beleza de suas flores, extremamente variadas em tamanho, forma, cor e fragrâncias, o cultivo de orquidáceas evoluiu para uma atividade economicamente importante, destacando-se os gêneros Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis, Cattleya, Laelia e Oncidium (HEW & YONG, 1997). Este grupo de plantas, além do grande valor ornamental e comercial, são apreciadas na medicina tradicional, e, diversos estudos farmacológicos validaram a sua utilização etnobotânica. O extrato de Cyrtopodium cardiochilum apresenta propriedades imunológicas importantes no tratamento da tuberculose (BARRETO & PARENTE, 2006). Os caules de Dendrobium spp., empregados como alimentos saudáveis e medicinais na China, são ricos em ésteres e ácidos aromáticos simples com atividades antioxidantes, antitumorais e antimutagênicas (FAN et al., 2001; CHEN et al., 2008). A baunilha comercial, uma conhecida essência aromatizante e condimentar, é obtida a partir do fruto processado da orquídea Vanilla planifolia Andrews (DIVAKARAN et al., 2006). Salep, extrato obtido de tubérculos da orquídea terrestre Orchis mascula, é utilizado na manufatura de sorvetes, na Turquia (ROBERTS & DIXON, 2008).

1.1.2.1. Sophronitis cernua

O gênero Sophronitis ocorre em florestas úmidas ou matas secas do Brasil oriental, Paraguai e nordeste da Argentina; foi descrito tendo como espécie tipo Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl.; o gênero possui 9 espécies e tem como características principais o fato de suas plantas serem de pequeno porte, os pseudobulbos agrupados, o labelo séssil na base da coluna, pequenas asas nas laterais da cavidade estigmática e a coluna pequena com 8 políneas (ARAÚJO, 2011a). Segundo o mesmo autor, em hibridações, a importância da Sophronitis se prende ao fato de reduzir drasticamente o tamanho da planta resultante e sua capacidade de transmitir o seu intenso colorido. A espécie mais utilizada é a Sophronitis coccinea seguida, com menos intensidade, da Sophronitis cernua e da Sophronitis brevipenduculata. As espécies brasileiras do gênero Sophronitis vivem, quase que exclusivamente, na floresta primitiva, acima da linha de 1200 metros até o pico das montanhas mais altas. É aceito que se forem encontradas plantas do gênero Sophronitis nas árvores, então a floresta é considerada original, ou é um remanescente da floresta primitiva (MILLER & WARREN, 1996). Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. cresce em árvores, em rochas, As flores possuem coloração laranja-avermelhada, ocorrem em número de 2 a 7, em hastes de até 5cm de comprimento; apresentam diâmetro que varia de 2 a 3 cm e florescem no outono e no inverno (ARAÚJO, 2011a).

1.1.2.2. Brassavola flagellaris Barb. Rodr.

O gênero Brassavola é composto por espécies epífitas, eventualmente rupícolas, de crescimento cespitoso ou subcespitoso, ascendente ou pendente, ocorrendo da América Central e Caribe ao sul do Brasil. A espécie tipo é Brassavola culullata R. Brown. São plantas de pseudobulbos cilíndricos quase imperceptíveis, pois, a única 8

folha, constitui-se em um prolongamento roliço deste pseudobulbo e com ele se confunde, esta folha é mais ou menos longa e acuminada, ereta ou pendente. Da base das folhas, e mais curta que estas, brota a inflorescência com uma a muitas flores brancas ou de tons pálidos de creme ou verde, de labelo branco com ou sem mancha amarela ou esverdeada junto à base, que abrem simultaneamente, algumas muito perfumadas durante o fim da tarde e início da noite, vagamente lembrando limão (ARAÚJO, 2011b). Segundo o mesmo autor, Brassavola flagellaris Barb. Rodr. é epífita de crescimento simpodial, apresenta rizoma rastejante, que produz pseudobulbos eretos, cilíndricos, encimados por uma única folha enrugada carnuda, verde escuro. O tamanho da planta é de médio a grande porte. A inflorescência de 15 cm é ramificada e apresenta de uma a várias flores. Tem pétalas e sépalas muito estreitas, de cor verde. O labelo é largo, arredondado e de cor branca. As flores são perfumadas. É nativa do Brasil e pode ser encontrada crescendo sobre rochas ou árvores.

1.1.3. Propagação de orquídeas

A propagação de orquídeas, em condições naturais, se dá pela proliferação de mudas laterais (brotações); ou pela disseminação natural das sementes, que pode ser baixa ou nula na ausência de micorrizas, dificultando a sua propagação. Após ocorrer a deiscência das cápsulas, as sementes são lançadas no ambiente e, ao entrarem em contato com as micorrizas, nas raízes das plantas adultas da mesma espécie, se associam e germinam (RAMOS & CARNEIRO, 2007). A obtenção de mudas de orquídeas pode ser de forma assexuada ou sexuada. Em razão do baixo rendimento apresentado pelos métodos de propagação vegetativa convencionais, outros métodos, como o cultivo in vitro de células e tecidos tem sido excelente alternativa a ser empregada para a propagação das orquidáceas. Este método apresenta vantagens únicas sobre os métodos convencionais de propagação, como multiplicação rápida e eficiente, grande número de plantas com alta qualidade 9

genética e fitossanitária, em pequeno espaço físico e em curto espaço de tempo (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). As primeiras tentativas de cultivo assimbiótico de orquídeas foram realizadas, com sucesso, por Lewis Knudson em 1922 e desde então em muito se expandiu o comércio das espécies nativas ornamentais, como também a produção de novos híbridos (VACIN & WENT, 1949). No Brasil, esta técnica tem sido utilizada, principalmente, para aumentar a produção de mudas e é responsável pela redução do custo de produção de diversas plantas, contribuindo decisivamente para salvar muitas espécies de orquídeas da extinção (STANCATO et al., 2001), constituindo-se, portanto, técnica bastante relevante do ponto de vista comercial e também ecológico (MARTINI et al., 2001). A demanda crescente por plantas e flores de orquídeas tem obrigado os produtores a comprar mudas de laboratórios especializados. Os investimentos em material, infra-estrutura e mão-de-obra especializada, obrigam esses laboratórios a minimizar as perdas e a maximizar a utilização dos fatores envolvidos na produção (STANCATO et al., 2001).

1.1.4. Reguladores de crescimento vegetal

O desenvolvimento e crescimento das plantas são regulados pela interação entre hormônios, incluindo giberelinas, auxinas, citocininas, ácido abscisico e etileno, além dos brassinosteróides, ácidos jasmônicos, dentre outros. A eficiência da aplicação de hormônios exógenos depende da espécie e idade fisiológica do vegetal, bem como da concentração, freqüência e intervalo de aplicação (FLECHTER et al., 2000). Os hormônios controlam muitos processos bioquímicos e fisiológicos; são produzidos em um sítio da planta e translocados para outros, alterando seu crescimento e desenvolvimento. Substâncias quimicamente similares, e com as mesmas funções regulatórias dos hormônios, são sintetizadas na indústria e comercializadas com o objetivo de promover mudanças no metabolismo das plantas, promovendo ou inibindo o 10

desenvolvimento destas. Essas substâncias são denominadas de reguladores de crescimento e diferem dos fitohormônios apenas pelo fato destes últimos serem produzidos de forma natural pelas plantas e, as substâncias sintéticas, serem empregadas em concentrações mais elevadas que as presentes nos tecidos (HARTMANN et al., 1988). Os vegetais produzem moléculas sinalizadoras, os hormônios, que em concentrações bastante pequenas, são responsáveis por efeitos marcantes no desenvolvimento. Para CASTRO & VIEIRA (2001), biorreguladores vegetais são substâncias sintetizadas que, aplicadas exogenamente, possuem ações similares aos grupos de hormônios vegetais conhecidos. RADEMACHER (2000) definiu retardantes vegetais como compostos sintéticos, utilizados para reduzir o crescimento longitudinal indesejável da parte aérea das plantas, sem reduzir a produtividade. Compostos orgânicos de ocorrência natural, produzidos nas plantas, os fitohormônios, em baixas concentrações, promovem, inibem ou modificam processos morfológicos e fisiológicos do vegetal. Já os reguladores vegetais, possuem as mesmas propriedades, sendo, porém, exógenos (CASTRO, 2005). Os reguladores de crescimento atuam como sinalizadores químicos na regulação do crescimento e desenvolvimento de plantas; atuam, normalmente, ligando- se a receptores na planta e desencadeando uma série de mudanças celulares, as quais podem afetar a iniciação ou modificação do desenvolvimento de órgãos ou tecidos. Os reguladores que reduzem a estatura das plantas são, na maioria dos casos, antagonistas das giberelinas, e agem modificando o metabolismo destas (RODRIGUES et al., 2003). O crescimento, segundo KAUFMANN (1990), é definido como um aumento irreversível no tamanho e número de células, o desenvolvimento é a transformação das diferentes células nos órgãos das plantas. Os reguladores vegetais podem influenciar bastante o crescimento, podendo alterar diferentemente os órgãos das plantas, influenciando o seu porte final. Em razão das alterações de crescimento nas diferentes partes da planta, podem afetar a produção de massa seca e consequentemente a produtividade (MARTINS et al., 1999). 11

1.1.5 Efeitos fisiológicos dos reguladores vegetais inibidores da biossíntese de giberelinas.

O efeito dos reguladores de crescimento depende de diversos fatores, como dose usada, época de aplicação, condições do ambiente, estado fitossanitário da cultura (RODRIGUES et al., 2003). A ação dos reguladores de crescimento pode se dar diretamente, provocando mudanças físicas nas estruturas celulares ao interagir com elas, ou, indiretamente, interferindo na rota metabólica que conduz a um determinado tipo de estrutura (HERTWIG, 1977). Os reguladores vegetais podem atuar diretamente nas diferentes estruturas celulares e nelas provocar alterações químicas, físicas e metabólicas, assim os hormônios agem primeiro na membrana plasmática, na qual encontram-se as proteínas (SALISBURY & ROSS, 1994). Pesquisas têm demonstrado que as mudanças estruturais ocorridas na planta estão associadas a mudanças metabólicas, ou então que o estado nutricional da planta tem um importante efeito nas mudanças morfológicas induzidas por reguladores vegetais (MARTINS et al., 1999). Entre os hormônios de plantas, as giberelinas são o grupo que mais influenciam na altura das plantas (SRIVASTAVA, 2002), promovendo alongamento celular (DAVIES, 1995). Os reguladores de crescimento, normalmente atuam no metabolismo de giberelinas e podem reduzir o alongamento de entrenós de plantas de acordo com o estádio fenológico de aplicação e da dose empregada (TREHARNE et al., 1995). Também podem afetar outras características de plantas, como: número (GROSS et al., 2002) e crescimento de afilhos (PELTONEN-SAINIO et al., 2003), número de estruturas reprodutivas (ZAGONEL et al., 2002) e comprimento de raízes (FAGERNESS & PENNER, 1998). Os inibidores da biossíntese de giberelina (GA) inibem a atividade geral de muitas classes de enzimas (monooxigenases, dioxigenases), consequentemente não são inibidores específicos da biossíntese de GA. As monooxigenases P450, por exemplo, são uma família muito grande de enzimas que catalizam oxidações de muitas outras rotas metabólicas, além da biossíntese de GA, e, possivelmente, os compostos 12

tipo triazol, possam inibir isoformas específicas da enzima. Os triazóis são conhecidos por afetar o metabolismo do ácido abscísico e brassinoesteróides (RADEMACHER, 2000).

1.1.6. Paclobutrazol

A fórmula do paclobutrazol é C15H20CIN3O (Figura 1) e o nome químico (2RS, 3RS) -1-(4 chlorophenyl) -4,4 -dimethyl-2- (1H-1,2,4 triazol-1y1) pentan-3-o1, é um composto do grupo químico dos triazóis, que são caracterizados por possuírem estrutura em anel contendo três átomos de nitrogênio, clorofenil e cadeias laterais de carbono (FLETCHER et al., 2000).

Figura 1. Representação da estrutura química do paclobutrazol. Fonte: Randemacher (2000).

citoxicidade (HAZARIKA, 2006). Os triazóis podem também alterar os níveis de ácido abscísico, etileno e citocininas (FLETCHER et al., 2000) e auxinas (DAVIS & CURRY, 1991). A consequencia morfológica direta da inibição da biossíntese de GA é a redução do crescimento vegetativo; os efeitos secundários refletem na alteração da força-dreno dentro da planta, ocorrendo, como consequência, maior partição de assimilados (LEVER, 1986). O paclobutrazol também atua na inibição da biossíntese de esterol; reduz a quantidade de ácido abscísico, etileno e ácido indol-3-acético; e aumenta a quantidade de citocininas (ARTECA, 1995). Pode ser absorvido pelas folhas, caules e raízes, sendo translocado via xilema até os meristemas subapicais de crescimento, onde irá inibir a biossíntese de giberelinas e, conseqüentemente, a elongação celular (TOMLIN, 1995). BEROVA & ZLATEV (2000) constataram que o paclobutrazol reduz a altura e aumenta a espessura da haste da planta jovem de tomateiro, como, também, acelera a formação de raiz, o que se torna uma vantagem, pois melhora a qualidade das mudas para o plantio.

1.1.7. Reguladores de crescimento em plantas ornamentais

TORRES & MOGOLLÓN (2002) utilizaram o paclobutrazol em Cattleya mossiae, in vitro, para estabelecer seu efeito sobre o desenvolvimento da espécie durante a fase anterior à aclimatização e, concluíram que houve redução no comprimento dos brotos e das raízes, mas não afetaram o seu número. Seguimentos de caule (2 a 3 cm), com 3 a 4 gemas da orquídea Dendrobium Friederick, foram inoculados em meio Murashige e Skoog suplementado com 3% de sacarose, e quatro concentrações de paclobutrazol (0,025, 0,05, 0,075 e 0,1 mgL-1). As concentrações de 0,025 a 0,075 mgL-1 promoveram brotações em todas as gemas. A maior porcentagem de indução de gemas florais foi obtida com 0,05 mgL-1. A morfologia das flores não foi afetada pelos tratamentos (TE-CHATO et al., 2009). 14

MINEA et al. (2004), em estudo realizado com orquídeas do gênero Spathoglottis, verificaram que a adição de paclobutrazol ao meio de cultivo “Vacin e Went” modificado, nas concentrações: 0; 0,01; 0,1 e 1 mgL-1, não teve efeito significativo no desenvolvimento das plântulas. HOLLICK et al. (2001) estudaram os efeitos do paclobutrazol sobre os fungos micorrízicos e a produção de orgãos de reserva em três espécies de orquídeas terrestres do sudoeste da Austrália. Mudas de Diuris laxiflora Lindley, Microtis midia R. Br. e Pterostylis sanguinea D. Jones & M. Clements foram cultivadas em simbiose com fungos micorrízicos específicos in vitro. Os fungos micorrízicos, das espécies em estudo, foram cultivados em meios contendo paclobutrazol a 0, 0,5, 1,0, 3,0, ou 5,0 mgL-1. As taxas de crescimento de todos os fungos micorrízicos das espécies M. midia e P. sanguinea diminuiu em todas as concentrações de paclobutrazol, em relação ao controle. No entanto, o paclobutrazol não afetou o crescimento do fungo micorrízico de D. laxiflora, e baixas concentrações (0,5 ou 1,0 mgL-1) estimularam o crescimento do fungo. Todas as concentrações de paclobutrazol testadas proporcionaram aumento da produção de orgãos de reserva em D. laxiflora, mas não tiveram efeito sobre as duas outras espécies. Permitindo concluir, então, que, quando o paclobutrazol não tem qualquer efeito fungicida sobre fungos micorrízicos, tem potencial para estimular a tuberização precoce e eficiente de mudas de orquídeas simbióticas. CORDEIRO et al. (2010) inocularam plântulas de Cattleya labiata em meio MS (in vitro) acrescido de diferentes concentrações de paclobutrazol (0, 1 e 2 mgL-1). Após 45 dias verificaram que o paclobutrazol atuou diretamente no diâmetro radicular das microplantas, principalmente na maior concentração (2 mgL-1), onde se observou a maior porção de tecido cortical em detrimento ao vascular, o que representa uma característica positiva para a aclimatização. Utilizando paclobutrazol, daminozide e uniconazole via foliar, WANG & HSU (1994) verificaram que a emergência das inflorescências, de híbridos da orquídea Phalaenopsis, não foi afetada pelo daminozide, mas foi progressivamente atrasada pelo aumento da concentrações de paclobutrazol e uniconazole. Todas as plantas tratadas, excetuando-se as tratadas com daminozide, tiveram as hastes mais curtas do que as 15

plantas controle, mas nem o número de aplicações, nem as concentrações de paclobutrazol tiveram efeito sobre o número e o tamanho das flores produzidas. O paclobutrazol e o uniconazole controlaram o comprimento da inflorescência, sem afetar a qualidade visual das flores. Estudando o efeito de quatro reguladores de crescimento em Epidendrum radicans, PATELI et al. (2004) verificaram que o paclobutrazol e o triapenthenol, aplicados via solo, demonstraram os melhores efeitos, o daminozide (via foliar) só restringiu o crescimento do broto principal, e cloreto de chlormequat (via foliar) teve efeito similar, porém causou toxicidade nas folhas. O paclobutrazol foi o mais eficiente na redução do comprimento da haste. Todos os reguladores afetaram o tamanho das folhas. KAMINSKI (1989) verificou efeito do paclobutrazol como redutor de crescimento, estimulante do florescimento em plantas jovens, brotações mais curtas e firmes, folhas verdes mais escuras em rosas, como comprovado por RUTER (1994) e MATSOUKIS & CHRONOPOULOS-SERELI (2000).

1.1.8. Anatomia de plantas micropropagadas

O processo de micropropagação induz a um grande número de mudanças anatômicas, morfológicas e fisiológicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro de algumas espécies (DESJARDINS, 1995; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998, LOURO & SANTIAGO, 2000). A heterogeneidade de respostas das mudas durante a micropropagação é promovida não só por fatores inerentes ao explante (genéticos e fisiológicos), mas também por modificações do ambiente in vitro. Estas modificações são determinantes na morfogênese, no crescimento e no desenvolvimento de plântulas in vitro (SHACKEL et al., 1990; GEORGE, 1996), interferindo no número de folhas, no teor de clorofila, na densidade estomática (PREECE & SUTTER, 1991; LIAN et al., 2002) e na fotossíntese, determinando a taxa de sobrevivência das mudas na fase de aclimatização (DESJARDINS et al., 1995; SINHA et al., 2002). 16

Estudos histológicos demonstram que os órgãos vegetativos de plantas desenvolvidas in vitro apresentam tecidos e estruturas pouco diferenciadas, se comparados às plantas cultivadas em casa de vegetação (BRAINERD et al., 1981; SUTTER & LANGHANS, 1982; SANTOS, 2001; FRÁGUAS, 2003; ALBERT, 2004; LOURO et al., 2003; ARIGITA et al., 2005). O ambiente de cultivo pode afetar e conduzir a diferentes atividades enzimáticas, resultando em várias mudanças nos processos metabólicos da planta (ALBERT, 2004). Segundo ZIV (1991), desordens anatômicas, morfológicas e fisiológicas nos tecidos de plantas cultivadas in vitro têm sido descritas, principalmente vitrificação ou hiperhidricidade. A desorganização no desenvolvimento de meristemas e folhas causada pela hiperhidricidade resulta em plantas frágeis, translúcidas e hiperhidratadas. As modificações manifestadas, principalmente nas folhas, afetam a fotossíntese e as trocas gasosas, que apresentam características intermediárias com relação àquelas que cresceram em casa de vegetação ou campo. As plântulas apresentam estrutura e fisiologia modificadas devido a algumas condições como baixa irradiância, altos níveis de sacarose e baixo teor de CO2 disponível, dificultando a transição do metabolismo heterotrófico para o autotrófico e afetando a sobrevivência ex vitro (SERRET, 1996) O mesofilo de plantas micropropagadas apresenta-se não organizado e consiste de parênquima esponjoso, rico em espaços intercelulares (FIDELIS, 1998). As folhas das plantas, cultivadas in vitro, tornam-se modificadas para uma forma de crescimento heterotrófica, deste modo, não são fotossinteticamente competentes quando transferidas para um ambiente sem suprimento de carboidratos, com umidade mais moderada e maior incidência luminosa, que são fatores que caracterizam um ambiente ex vitro, resultando em baixa porcentagem de sobrevivência (PASQUAL, 2001). Em angiospermas, a cutícula delgada, os estômatos não funcionais e o parênquima pouco desenvolvido são citados como a principal causa da mortalidade de plantas transferidas de um ambiente in vitro para um ex vitro (DÍAZ-PÉREZ et al., 1995). 17

Também pode haver redução no número de elementos condutores, como registrado por ALBARELLO et al. (2001) em Rollinia mucosa. Ainda, segundo o mesmo autor, essas alterações anatômicas nas plantas cultivadas in vitro podem inviabilizar a aclimatização das mesmas.

1.1.9. Aclimatização

A propagação assimbiótica (in vitro) é rápida e gera um grande número de plântulas uniformes e livres de patógenos, entretanto, a fase seguinte, aclimatização (ex vitro), é caracterizada pela alta mortalidade de plântulas, ao se adaptarem às condições ex vitro (MELLO et al., 2002; WEBER et al., 2003), fator que contribui para a redução da quantidade produzida e, consequentemente, encarecimento da técnica. Muitas espécies que crescem in vitro, necessitam de um processo de aclimatização para assegurar a sua sobrevivência e o seu crescimento no ambiente externo. A aclimatização tem por objetivo reduzir o estresse causado pela enorme diferença entre as condições de cultivo in vitro e as condições externas de crescimento (PASQUAL ,2001). Na fase de cultivo in vitro, as plantas são mantidas em ambiente com alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas gasosas restritas, o que resulta em taxa de transpiração reduzida (MAYER et al., 2008). Quando são transferidas para a etapa ex vitro, sofrem uma fase de adaptação climática extremamente delicada principalmente devido aos fatores de luminosidade, taxa de fotossíntese, absorção de nutrientes e fitossanidade. Durante esse processo, ocorre a conversão da condição heterotrófica para autotrófica e um gradual retorno às características naturais da planta (DÍAZ-PÉREZ et al., 1995). Plântulas cultivadas in vitro geralmente apresentam características morfofisiológicas diferentes quando comparadas àquelas que cresceram diretamente no campo ou em casa de vegetação. No ambiente ex vitro uma maior taxa de transpiração é exigida às plantas, pois frequentemente plantas cultivadas in vitro apresentam as 18

estruturas que controlam a perda de água pouco desenvolvidas e, portanto são muito mais sensíveis e suscetíveis aos diferentes fatores já citados anteriormente, daí a taxa de sobrevivência ex vitro ser relativamente baixa (ROCHA, 2007). As folhas das plantas, cultivadas in vitro, tornam-se modificadas para uma forma de crescimento heterotrófica, deste modo, podem não ser fotossinteticamente competentes quando transferidas para um ambiente sem suprimento de carboidratos, com umidade mais moderada e maior incidência luminosa, que são fatores que caracterizam um ambiente ex vitro, resultando em baixa porcentagem de sobrevivência (PASQUAL, 2001). A otimização de todas as fases do cultivo pode garantir um processo de aclimatização muito bem sucedido, pois justamente pelo baixo rendimento esperado, já se produz, preventivamente, grande número de plantas micropropagadas em sala de crescimento, já esperando perdas significativas quando há a transferência para um ambiente com condições climáticas naturais. Além disso, outros fatores podem aperfeiçoar essa etapa crítica, como a adição de reguladores de crescimento ao meio de cultura em que as sementes serão germinadas.

1.1.10. Ambiente de cultivo

MACIEL et al. (2000) afirmam que a manutenção da umidade relativa do ar alta e de temperaturas do ar amenas são imprescindíveis na fase de aclimatização. A umidade relativa alta no início da aclimatização faz com que a planta retome o crescimento e passe a realizar fotossíntese em níveis suficientes para estimular o desenvolvimento de um sistema radicular mais funcional, na absorção de água e de nutrientes. Embora a elevada umidade relativa seja fundamental, o seu excesso deve ser evitado, pois é extremamente favorável ao desenvolvimento de algas, fungos ou microrganismos patogênicos. TORRES et al. (1998) mostram que é comum o uso de pequenos telados, túneis plásticos ou até mesmo casas de vegetação, para a 19

manutenção de temperaturas mais amenas e redução da incidência direta de luz sobre as plantas. O cultivo protegido tem a função de proteger as plantas da influência de intempéries climáticas, principalmente, no que diz respeito à radiação solar, temperatura e umidade relativa do ar. Também é eficiente na redução da incidência de precipitações pluviométricas e ventos fortes (ROCHA, 2007). Para PAULA (2000), o túnel alto de cultivo forçado, também conhecido como viveiro, são instalações de fácil construção e de alta durabilidade. Suas estruturas podem ser de concreto, ferro ou madeira, revestidas com telas de sombreamento, que podem proporcionar diferentes luminosidades, ou seja, distintos níveis de sombreamento.

CAPÍTULO 2 - PACLOBUTRAZOL NO DESENVOLVIMENTO INICIAL (IN VITRO) DE PLÂNTULAS DE Sophronitis cernua E NA ACLIMATIZAÇÃO

RESUMO - Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. é uma orquídea epífita, nativa do Brasil. O cultivo in vitro é uma técnica que permite produzir grande número de indivíduos, entretanto ocorrem muitas perdas durante o período de aclimatização (ex vitro). Em razão disto, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de cultura Murashige e Skoog com paclobutrazol, no crescimento e desenvolvimento de plântulas de Sophronitis cernua (in vitro), visando aumentar a porcentagem de sobrevivência das plântulas ex vitro. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado. Foram utilizados quatro tratamentos (três concentrações de paclobutrazol: 0,5; 1,0 e 1,5 mg i.a. L-1 de meio MS e ausência de paclobutrazol no meio MS – controle) e 10 repetições; cada parcela foi representada por um recipiente de plástico (com 10,5cm de diâmetro e 6 cm de altura) contendo 12 plântulas. Após 90 dias de cultivo em meio sem suplementação, as plântulas foram inoculadas nos tratamentos, onde permaneceram por mais 90 dias. Após 180 dias, cinco repetições foram separadas para as análises destrutivas e as outras cinco foram transplantadas para bandejas contendo fibra de coco. Verificou-se que as diferentes concentrações de paclobutrazol promoveram alterações nas características morfológicas das plântulas, redução do número de folhas, área foliar, massa seca e comprimento da parte aérea e, aumento no diâmetro e massa seca de raízes. A suplementação do meio nutritivo com paclobutrazol não promoveu incremento na taxa de sobrevivência das plântulas.

Palavras-chave: Floricultura, Orchidaceae, plantas ornamentais, retardante de crescimento de plantas.

INTRODUÇÃO

As orquídeas estão entre as plantas ornamentais mais apreciadas e exploradas comercialmente, apresentando potencial, alimentício, cosmético e medicinal. São consideradas importantes bioindicadoras do grau de preservação de uma determinada área, o que possibilita inferir a respeito do estágio de sucessão em que um ambiente se encontra, apenas observando a densidade de orquídeas presentes no local. Em razão da velocidade da degradação do meio ambiente e a importância das orquídeas na manutenção da biodiversidade, a preocupação de conservar esta família têm incentivado a realização de projetos visando reintrodução, conservação e manejo de orquídeas na natureza (PELÚZIO & SOARES, 2004). O gênero Sophronitis ocorre em florestas úmidas ou matas secas do Brasil oriental, Paraguai e nordeste da Argentina; foi descrito tendo como espécie tipo Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl.; o gênero possui 9 espécies e tem como características principais o fato de suas plantas serem de pequeno porte, os pseudobulbos agrupados, o labelo séssil na base da coluna, pequenas asas nas laterais da cavidade estigmática e a coluna pequena com 8 políneas (ARAÚJO, 2011a). Segundo o mesmo autor, Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. cresce em árvores, em rochas, em terras baixas próximas ao mar e, também, um pouco mais para o interior. As flores possuem coloração laranja-avermelhada, ocorrem em número de 2 a 7, em hastes de até 5 cm de comprimento; apresentam diâmetro que varia de 2 a 3 cm e florescem no outono e no inverno. As plantas da família Orchidaceae apresentam desenvolvimento lento, requerendo maior período de cultivo antes de serem comercializadas. Isso tem contribuído para o elevado valor unitário de suas plantas no mercado. Assim sendo, existe grande interesse na diminuição do tempo de formação da muda de orquídea, principalmente, para a diminuição dos custos de produção. A cultura de tecidos vegetais é uma técnica que permite melhor controle dos fatores de produção, possibilitando a obtenção de mudas em larga escala, com alta qualidade genética e sanitária a preços mais acessíveis, o que viabiliza uma produção 22

padronizada exigida pelo mercado consumidor, evitando, assim, a degradação do meio ambiente (TOMBOLATO & COSTA, 1998). As condições do ambiente para o crescimento ex vitro são bastante diferentes dos utilizados para o cultivo in vitro (HAZARIKA, 2006). A adaptação das plantas procedentes do cultivo in vitro para o ambiente ex vitro é denominada aclimatização, um dos fatores chave para a sobrevivência e produção de mudas saudáveis. Durante o processo de aclimatização em casa de vegetação das plantas crescidas in vitro, ocorrem mudanças morfológicas, anatômicas e fisiológicas, tornando- as capazes de crescer nesse novo ambiente. Esse processo pode causar estresse para as plantas, sendo o fator limitante no processo da micropropagação (SUTTER, 1988). Em angiospermas, a cutícula delgada, os estômatos não funcionais e o parênquima pouco desenvolvido são citados como a principal causa da mortalidade de plantas transferidas de um ambiente in vitro para um ex vitro (DÍAZ-PÉREZ et al., 1995). Também pode haver redução no número de elementos condutores, como registrado por ALBARELLO et al. (2001) em Rollinia mucosa. Ainda, segundo o mesmo autor, essas alterações anatômicas nas plantas cultivadas in vitro podem inviabilizar a aclimatização das mesmas. As folhas das plantas, cultivadas in vitro, tornam-se modificadas para uma forma de crescimento heterotrófica, deste modo, podem não ser fotossinteticamente competentes quando transferidas para um ambiente sem suprimento de carboidratos, com umidade mais moderada e maior incidência luminosa, que são fatores que caracterizam um ambiente ex vitro, resultando em baixa porcentagem de sobrevivência (PASQUAL, 2001). Os retardadores de crescimento vegetal, como, uniconazole (UCZ), paclobutrazol (PBZ), triapenthenol (TPN), triadimefon (TDM) e hexaconazol (HCZ) têm sido relatados como agentes eficazes na redução do tamanho das plantas mas, também, tem proporcionado plântulas com folhas verde-escuras e raízes grossas, que pode conferir mudas saudáveis e permitir também redução na perda de água pelas plantas, levando a 23

melhor sobrevivência e crescimento em condições ex vitro (HAZARIKA, 2006; KOZAK, 2006 e THAKUR et al., 2006). O paclobutrazol é um retardante de crescimento de plantas de amplo espectro, que apresenta grande potencial de utilização. É largamente utilizado por induzir tolerância leve ao estresse em plântulas e plantas adultas (FLETCHER et al., 2000).

A fórmula desse produto é C15H20CIN3O e o nome químico (2RS, 3RS) -1-(4 chlorophenyl) -4,4 -dimethyl-2- (1H-1,2,4 triazol-1y1) pentan-3-o1. É um composto do grupo químico dos triazóis, que são caracterizados por possuírem estrutura em anel contendo três átomos de nitrogênio, clorofenil e cadeias laterais de carbono (FLETCHER et al., 2000). Os triazóis inibem a biossíntese de giberelina pelo bloqueio da atividade das enzimas monooxigenases P450 no retículo endoplasmático. Essas enzimas promovem oxidação de ent-caureno a ácido ent-caurenóico e, por consequencia GA12-aldeído, que é a primeira giberelina formada em todas as plantas, sendo a precursora de todas as outras (KENDE & ZEEVART, 1997), reduzindo o nível de divisão celular sem causar citoxicidade (HAZARIKA, 2006). O modo de ação do PBZ tem sido associado ao decréscimo na transpiração, altura da planta, biomassa e área foliar e ao incremento da resistência estomatal (TE- CHATO, 2009). Estas características podem indicar que a planta teria melhores condições adaptativas ao ambiente ex vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação do meio de cultura MS, com um regulador de crescimento vegetal (paclobutrazol), no crescimento e desenvolvimento in vitro de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl., visando aumentar a porcentagem de sobrevivência das plântulas ex vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram conduzidos no período de novembro de 2010 a setembro de 2011, em dois estágios; o primeiro, in vitro, no Laboratório de Micropropagação do Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias 24

do Campus de Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista (Unesp/FCAV) e o segundo, ex vitro (aclimatização), em ambiente protegido, no município de Jaboticabal, SP. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado. Foram quatro tratamentos (três concentrações de paclobutrazol: 0,5; 1,0 e 1,5 mg i.a. L-1 de meio MS e ausência de paclobutrazol no meio MS – controle) e 10 repetições, totalizando 40 parcelas sendo, cada parcela, representada por um recipiente de plástico (com 10,5cm de diâmetro e 6 cm de altura) contendo 12 plântulas. O primeiro estágio, in vitro, da semeadura até o 180º dia, foi conduzido em condições de intensidade luminosa incidente nos frascos de, aproximadamente, 40 Pmol m-2 s-1 utilizando lâmpadas fluorescentes de 20W; fotoperíodo de 16 horas; temperatura controlada de 25 +/- 2,0 ºC. Na fase inicial, compreendida entre a semeadura até 90 dias, foi utilizado como meio nutritivo a formulação do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) completo, solidificado com ágar (6 gL-1). A cada 30 dias realizou-se a troca de meio nutritivo (subcultivos, no total de dois). Aos 90 dias, as plântulas foram selecionadas (1,5 +/- 0,5cm) e reinoculadas nos seus respectivos tratamentos. O meio nutritivo e os frascos foram, previamente, esterilizados por autoclavagem a 121°C (104 kPa) durante 20 minutos (CALDAS et al., 1998) e, posteriormente, foram vertidos 100 mL de meio nutritivo em cada frasco em câmara asséptica. Aos 120 e 150 dias foram feitas as trocas do meio nutritivo mantendo os mesmos tratamentos. Após 180 dias, cinco repetições foram separadas para as análises destrutivas e as outras cinco foram transplantadas. Foram anotados, os dados das seguintes características: A) massa seca da parte aérea, das raízes (após a lavagem, o material foi seco em estufa de circulação forçada de ar a 70ºC, até que as amostras atingiram massa constante na pesagem em balança digital - precisão 0,01g); B) número de folhas; C) número de brotos; D) comprimento da parte aérea (régua graduada); E) número de raízes; F) comprimento médio de raízes (régua graduada); G) diâmetro médio de raízes (com paquímetro digital Digimess®, 25

amplitude 0,01mm-300 mm); H) área foliar (obtido por meio de medidor de área foliar eletrônico - Li-Cor, modelo L1-3100® - dados expressos em dm2); Foi aplicada análise de regressão polinomial a fim de verificar o comportamento das variáveis em função do aumento da concentração de paclobutrazol. No segundo estágio, fase ex vitro (aclimatização das plântulas), os tratamentos foram mantidos em telado coberto por filme de polietileno (150 micra) e tela preta tipo Sombrite® com retenção de 70% da luminosidade. As reposições de água foram realizadas após pesagens dos recipientes de cultivo, visando manter condições de 80% da capacidade de vaso. Foi mantido o delineamento inteiramente casualisado e 5 repetições. Foram transplantadas nove plântulas, de cada parcela, para bandejas de plástico (14 cm de comprimento, 9 cm de largura e 4 cm de altura - 500 cm3) contendo furos na superfície inferior. Como substrato foi utilizado fibra de coco (tamanho médio das partículas 1,5 x 1 x 0,2 cm; pH = 6 e CE = 100 PS cm-1), que foi desinfetado em solução de hipoclorito de sódio 2% por, 2 horas. Após este período o substrato foi lavado por três vezes, deixando o material imerso em água por 10 minutos, na segunda e terceira vez. As plantas foram adubadas semanalmente (aplicação no substrato) com solução nutritiva completa de Sarruge, composta por: 225 N; 31 P; 234 K; 200 Ca; 48 Mg; 64 S; 0,5 B; 0,5 Mn; 0,05 Zn; 0,02 Cu; 0,01 Mo; 5 Fe - mg L-1 (SARRUGE, 1975). Os recipientes foram mantidos por duas semanas dentro de sacos de polietileno de 50 micra, que gradualmente foram abertos, até a sua completa retirada. Foram avaliadas as taxas de sobrevivência aos 30, 60, 90 e 120 dias após o transplante. Estes dados, para fins de análise estatística foram transformados em arc sen (x/100)1/2. Foi aplicada análise de regressão a fim de verificar o comportamento das variáveis em função do aumento da concentração de paclobutrazol.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Verificou-se redução no número de folhas (Figura 1A) e na área foliar (Figura 1B) com a aplicação de doses crescentes de paclobutrazol. Este efeito do paclobutrazol, em meio de cultivo, já tem sido relatado em outros estudos. NEPOMUCENO et al. (2007) também verificaram redução no número de folhas em plântulas de Anadenanthera colubrina tratadas com diferentes concentrações de paclobutrazol. ZIV (1995) observou que o uso deste retardante de crescimento promoveu redução da área foliar e, verificou também, aumento da resistência ao estresse de várias espécies micropropagadas, como crisântemo, rosa e videira. A perda de água por transpiração pode ser menor em razão da redução da área foliar, da temperatura das folhas e também da quantidade de radiação absorvida (MORAES, 2002). O diâmetro médio das raízes teve incremento significativo (Figura 2A e 3 ). O engrossamento das raízes promovido pelo paclobutrazol também foi observado para outras plantas como orquídeas do gênero Dendrobium (TE-CHATO et al., 2009), plântulas de Anadenanthera colubrina (NEPOMUCENO et al., 2007) e Lilium longiflorum (THAKUR et al., 2006). O aspecto de engrossamento das raízes pode ser benéfico na etapa de aclimatização, pois raízes mais vigorosas tendem a facilitar maior pegamento das mudas (NEPOMUCENO, 2006).

3,1 A 3 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 Número de folhas de Número 2,4 2,3 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y = 3,0574 - 0,4531778 x, R2=0,90** (Dados transformados em (x+0,50)1/2).

) B 2 4 3 2 1 Área foliar (dm foliarÁrea 0 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 0,34596-0,14148 x R2=0,90** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 1. Número de folhas (A) e área foliar (B) de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

1,8

1,6

1,4

1,2 (mm) 1 A 0,8

Diâmetro médio de raízes médio Diâmetro 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 1,047860 +0,45492 x R2=0,78**

1,9 B 1,8

1,7

1,6 aérea (cm) aérea (cm) 1,5

Comprimento da parte Comprimento 1,4 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 1,854 -0,292 x , R2=0,85** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 2. Diâmetro médio de raízes (A) e comprimento da parte aérea (B) de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

As respostas, aqui observadas, podem estar relacionadas a um dos efeitos do paclobutrazol, que, ao inibir a biossíntese de giberelina, que é um hormônio responsável pelo alongamento das células, proporciona, então, redução do crescimento do órgão. Desta forma, com o uso de paclobutrazol inibindo a biossíntese de giberelina, embora ocorra a divisão celular, as novas células não se alongam e, como 29

consequência, têm-se o crescimento reduzido, sendo provável que as raízes tenham aumento de diâmetro devido a ocorrência de divisões celulares radiais, conforme explica NEPOMUCENO et al. (2007). Houve redução no comprimento da parte aérea (Figura 2B). De forma semelhante, TORRES & MOGOLLÓN (2002) também relataram redução no comprimento dos brotos de orquídeas do gênero Cattleya. Este menor alongamento, do entrenó em plantas, pode ser explicado pela inibição da biosíntese de giberelina, como comenta KERBAUY (2004).

Figura 3. Plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl.: (A) após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol (in vitro) e (B) 120 dias após o cultivo em fibra de coco (ex vitro), no município de Jaboticabal, SP.

Em relação ao acúmulo de massa seca (Figura 4), verificou-se redução no acúmulo pela parte aérea, e, em contrapartida, incremento no acúmulo pelo sistema radicular, o mesmo foi verificado por NEPOMUCENO et al. (2007). KITITRAKUNYANUN (1999) também mostrou que, quando a concentração de paclobutrazol aumentou, a altura, a massa fresca e seca das plantas de Dendrobium cruentum diminuíram. Estes resultados indicam que o paclobutrazol contribuiu para a 30

incorporação de carbono, uma vez que na ausência deste retardante de crescimento houve menor incorporação de massa seca das raízes. MINEA et al. (2004) em estudo realizado com orquídeas do gênero Spathoglottis, verificaram que a adição de paclobutrazol ao meio de cultivo “Vacin e Went” modificado, nas concentrações: 0; 0,01; 0,1 e 1 mgL-1, não teve efeito significativo no desenvolvimento das plântulas.

25 20 15 10 5

Massa seca Massa (mg) 0 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Parte Aérea Raízes

Parte aérea - Y=9,978-1,744 x R2=0,82** Raízes - Y=11,294 +6,848 x R2=0,68** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 4. Massa seca da parte aérea e de raízes de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

Há relatos de sucesso na aclimatização de plantas, cultivadas in vitro, utilizando triazóis com elevada porcentagem de sobrevivência em condições ex vitro e rápida adaptação (KOZAK, 2006; THAKUR et al., 2006). O sucesso obtido por outros pesquisadores, na aclimatização das plantas com o uso de paclobutrazol, não foi verificado neste ensaio. Em todas as avaliações, a porcentagem de sobrevivência com o uso do paclobutrazol foi inferior ao controle; na 31

última observação, aos 120 dias, as porcentagens de sobrevivência para todos os tratamentos foram inferiores a 50% (Figura 5).

100 80 60 40 20

plântulas (%) 0 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1) Taxa de sobrevivência de sobrevivência de Taxa

30 dias 60 dias 90 dias 120 dias

30 dias -Y= 90,02541-12,62278x R2= 0,93** 60 dias - Y= 73,46223-26,28125x R2=0,94** 90 dias - Y= 53,877-17,68057x R2= 0,98** 120 dias - Y= 48,65918-17,6203x R2= 0,95** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 5. Taxa de sobrevivência de plântulas de Sophronitis cernua (Lindl.) Lindl., nas diferentes concentrações de paclobutrazol aos 30, 60, 90 e 120 dias de observação.

Estes resultados podem indicar que, talvez, a dose utilizada não tenha sido adequada para promover as alterações necessárias nas plântulas para que estas tivessem maior resistência às condições de cultivo ex vitro. O estresse hídrico é causado pela transpiração excessiva de partes da planta, principalmente nas folhas, ou absorção inadequada de água pelas raízes e, em geral, é o maior problema no processo de transplante e aclimatização. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa a taxa de transpiração aumenta, surgindo um déficit hídrico na planta (COSTA, 1998). Como a taxa de sobrevivência foi diminuindo ao longo do período de aclimatização, também para o controle, provavelmente a baixa umidade relativa do ar 32

verificada no período (Tabela 1), principalmente nos meses de agosto e setembro, tenha interferido de forma negativa nos resultados do presente ensaio.

Tabela 1. Média das temperaturas e umidade relativa do ar máxima e mínima no período compreendido entre Junho e Setembro de 2011, no orquidário localizado no município de Jaboticabal, SP.

Temperaturas (oC) Umidade relativa do ar (%) Meses máxima mínima máxima mínima Junho 22,8 15,1 74,7 52,1 Julho 25,4 16,9 71,4 44,4 Agosto 26,3 17,1 53,9 29,5 Setembro 28,4 18,6 57,7 25,6

CONCLUSÕES

As alterações morfofisiológicas promovidas nas plântulas, pela suplementação do meio nutritivo com paclobutrazol, não implicaram em melhores taxas de sobrevivência em Sophronitis cernua, nas condições apresentadas neste trabalho.

CAPÍTULO 3 - INFLUÊNCIA DO PACLOBUTRAZOL NO DESENVOLVIMENTO INICIAL DE Brassavola flagellaris (IN VITRO) E ACLIMATIZAÇÃO

RESUMO - Brassavola flagellaris Barb. Rodr. é uma espécie de orquídea epífita, nativa do Brasil. A semeadura in vitro é uma técnica que permite a obtenção de grande número de indivíduos, entretanto, na etapa de transição do ambiente in vitro para o ex vitro (aclimatização) há grande mortalidade de indivíduos. Este trabalho teve, portanto, como objetivo, estudar o efeito da suplementação do meio de cultura Murashige e Skoog com paclobutrazol, no crescimento e desenvolvimento de plântulas de Brassavola flagellaris (in vitro), visando aumentar a porcentagem de sobrevivência das plântulas ex vitro. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado. Foram utilizados quatro tratamentos (três concentrações de paclobutrazol: 0,5; 1,0 e 1,5 mg i.a. L-1 de meio MS e ausência de paclobutrazol no meio MS – controle) e 10 repetições, sendo, cada parcela, representada por um recipiente contendo 12 plântulas. Após 150 dias de cultivo em meio sem suplementação, as plântulas foram inoculadas nos tratamentos, onde permaneceram por mais 90 dias. Após 240 dias, cinco repetições foram separadas para as análises destrutivas e as outras cinco foram transplantadas para bandejas contendo a mistura de fibra de coco e esfagno (1:1). Verificou-se que as diferentes concentrações de paclobutrazol promoveram alterações nas características morfológicas das plântulas; incrementos no acúmulo de massa seca de todas as partes, exceto na maior concentração, onde observou-se redução no acúmulo da parte aérea, no número de folhas, na área foliar (0,5 mgL-1), no diâmetro, no comprimento de raízes e no número de raízes, além de redução no número de brotos e no comprimento da parte aérea. A suplementação do meio nutritivo com paclobutrazol promoveu incremento na taxa de sobrevivência das plântulas.

Palavras-chave: Floricultura, Orchidaceae, plantas ornamentais, triazol. 34

INTRODUÇÃO

A família Orchidaceae é composta por um grande número de indivíduos (cerca de 850 gêneros e 25.000 espécies) que representam por volta de 10% de todas as plantas com flores no mundo inteiro, sem considerar a quantidade de híbridos que tem sido criada (por volta de 100.000), superior a qualquer outro cultivo ornamental (ROBERTS & DIXON, 2008). No Brasil existe grande diversidade de espécies de Orchidaceae, principalmente as epífitas, representadas por cerca de 200 gêneros e aproximadamente 2350 espécies; apresentando inúmeros híbridos de variadas formas, tamanhos, aromas e cores de folhas e flores. Destacando-se como importante planta ornamental, de interesse econômico, botânico e inclusive de importância para a indústria medicinal, cosmética e alimentícia (SILVA, 2003; ARAÚJO, 2004). Importantes na manutenção da biodiversidade, a família Orchidaceae é composta por indivíduos bioindicadores ambientais do estado de conservação das florestas, sensíveis às interferências em matas primárias, em virtude da ocupação de nichos especializados (PELÚZIO & SOARES, 2004; MARRARA et al., 2007) e de sua complexa interação ecológica com polinizadores e microorganismos (ROBERTS & DIXON, 2008). Brassavola flagellaris Barb. Rodr. é uma orquídea epífita, nativa do Brasil, pode ser encontrada crescendo sobre rochas ou árvores. Apresenta crescimento simpodial, rizoma rastejante, que produz pseudobulbos eretos, cilíndricos, encimados por uma única folha enrugada carnuda, verde escuro. O tamanho da planta é de médio a grande porte. A inflorescência de 15 cm é ramificada e apresenta de uma a várias flores perfumadas, com pétalas e sépalas muito estreitas, de cor verde, o labelo é largo, arredondado e de cor branca (ARAÚJO, 2011b). As orquídeas podem ser propagadas de forma assexuada ou sexuada. Os métodos convencionais de propagação vegetativa apresentam baixo rendimento e, o cultivo in vitro de células e tecidos tem sido excelente alternativa a ser empregada para a propagação das orquidáceas. Este método apresenta vantagens únicas sobre os 35

métodos convencionais de propagação, como multiplicação rápida e eficiente para a obtenção de grande número de plantas, com alta qualidade genética e fitossanitária em pequeno espaço físico e em curto espaço de tempo (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998); o que viabiliza uma produção padronizada exigida pelo mercado consumidor, evitando, assim, a degradação do meio ambiente (TOMBOLATO & COSTA, 1998). A demanda crescente por plantas e flores de orquídeas tem obrigado os produtores a comprar mudas de laboratórios especializados. Os investimentos em material, infra-estrutura e mão-de-obra especializada, obrigam esses laboratórios a minimizar as perdas e a maximizar a utilização dos fatores envolvidos na produção (STANCATO et al., 2001). A propagação assimbiótica (in vitro) é rápida e gera grande número de plântulas uniformes e livres de patógenos, entretanto, a fase seguinte, aclimatização (ex vitro), é caracterizada pela alta mortalidade de plântulas, ao se adaptarem às condições ex vitro (MELLO et al., 2002; WEBER et al., 2003), fator que contribui para a redução da quantidade produzida e, consequentemente, encarecimento da técnica. Na fase de cultivo in vitro, as plantas são mantidas em ambiente com alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas gasosas restritas, o que resulta em taxa de transpiração reduzida (MAYER et al., 2008). Quando são transferidas para a etapa ex vitro, sofrem uma fase de adaptação climática extremamente delicada principalmente devido aos fatores de luminosidade, taxa de fotossíntese, absorção de nutrientes e fitossanidade. Durante esse processo, ocorre a conversão da condição heterotrófica para autotrófica e um gradual retorno às características naturais da planta (DÍAZ-PÉREZ et al., 1995). As condições do ambiente para o crescimento ex vitro são bastante diferentes dos utilizados para o cultivo in vitro (HAZARIKA, 2006). A adaptação das plantas procedentes do cultivo in vitro para o ambiente ex vitro é denominada aclimatização, tem por objetivo reduzir o estresse causado pela enorme diferença entre as condições de cultivo in vitro e as condições externas de crescimento (PASQUAL, 2001); esta etapa é considerada um dos fatores chave para a sobrevivência e produção de mudas saudáveis. 36

As características morfológicas das plântulas cultivadas in vitro, geralmente, são diferentes, quando comparadas àquelas que cresceram diretamente no campo ou em casa de vegetação. Frequentemente, plantas cultivadas in vitro, apresentam as estruturas, que controlam a perda de água, pouco desenvolvidas (ROCHA, 2007), as folhas tornam-se modificadas para uma forma de crescimento heterotrófica, deste modo, podem não estar fotossinteticamente competentes quando transferidas para um ambiente ex vitro, sem suprimento de carboidratos, com umidade mais moderada (exigindo maior taxa de transpiração das plântulas) e maior incidência luminosa, resultando em baixa porcentagem de sobrevivência ex vitro (PASQUAL, 2001). Entre os fitohormônios, as giberelinas são as que mais influenciam na altura das plantas (SRIVASTAVA, 2002), promovendo alongamento celular (DAVIES, 1995). Os reguladores de crescimento, normalmente atuam no metabolismo de giberelinas e podem reduzir o alongamento de entrenós de plantas de acordo com o estádio fenológico de aplicação e da dose empregada (TREHARNE et al., 1995). Também podem afetar outras características de plantas, como: número (GROSS et al., 2002) e crescimento de afilhos (PELTONEN-SAINIO et al., 2003), número de estruturas reprodutivas (ZAGONEL et al., 2002) e comprimento de raízes (FAGERNESS & PENNER, 1998). Os inibidores da biossíntese de giberelina como, uniconazole (UCZ), paclobutrazol (PBZ), triapenthenol (TPN), triadimefon (TDM) e hexaconazol (HCZ) têm sido relatados como agentes eficazes na redução do tamanho das plantas, mas, também, tem proporcionado plântulas com folhas verde-escuras e raízes grossas, que pode conferir mudas saudáveis e permitir também redução na perda de água pelas plantas, levando a melhor sobrevivência e crescimento em condições ex vitro (HAZARIKA, 2006; KOZAK, 2006 e THAKUR et al., 2006). O paclobutrazol (PBZ) é um triazol, retardante de crescimento de plantas, de amplo espectro, que apresenta grande potencial de utilização (TONGUMPAI, 1991). É largamente utilizado por induzir tolerância leve ao estresse em plântulas e plantas adultas (FLETCHER et al., 2000). 37

Os triazóis inibem a biossíntese de giberelina pelo bloqueio da atividade das enzimas monooxigenases P450 no retículo endoplasmático. Essas enzimas promovem oxidação de ent-caureno a ácido ent-caurenóico e, por consequência, GA12-aldeído, que é a primeira giberelina formada em todas as plantas, sendo a precursora de todas as outras (KENDE & ZEEVART, 1997), reduzindo o nível de divisão celular sem causar citoxicidade (HAZARIKA, 2006). Os triazóis podem também alterar os níveis de ácido abscísico, etileno e citocininas (FLETCHER et al., 2000) e auxinas (DAVIS & CURRY, 1991). A consequencia morfológica direta, da inibição da biossíntese de GA, é a redução do crescimento vegetativo; os efeitos secundários refletem na alteração da força-dreno dentro da planta, ocorrendo, como consequência, maior partição de assimilados (LEVER, 1986). Segundo TE-CHATO et al. (2009), o modo de ação do paclobutrazol tem sido associado com decréscimo na transpiração, altura da planta, biomassa, área foliar e incremento à resistência estomatal; estas características podem indicar que a planta teria melhores condições adaptativas ao ambiente ex vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação do meio de cultura MS, com um regulador de crescimento vegetal (paclobutrazol), no crescimento e desenvolvimento in vitro de plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. visando aumentar a porcentagem de sobrevivência das plântulas ex vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram conduzidos em dois estágios; o primeiro, in vitro, no Laboratório de Micropropagação do Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias do Campus de Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista (Unesp/FCAV) e o segundo, ex vitro (aclimatização), em ambiente protegido, no município de Jaboticabal, SP. 38

Jaboticabal situa-se a 21º14’05” de latitude sul, 48º17’09” de longitude oeste e em altitude média de 600 m. O material vegetal constou de plântulas de uma espécie nativa de orquídea (Brassavola flagellaris Barb. Rodr.), advindas da germinação in vitro. As sementes foram germinadas em meio de cultivo MURASHIGE & SKOOGE (1962) acrescido de 2g de carvão ativado, com pH ajustado para 5,8 e solidificado com ágar (6 gL-1), onde permaneceram por 3 meses; após este período, a cada dois meses, foram realizados 2 recultivos. Aos 150 dias após a semeadura foram selecionadas 12 plântulas (1,5 +/- 0,5 cm) que foram inoculadas nos seus respectivos tratamentos. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado. Foram utilizados quatro tratamentos (três concentrações de paclobutrazol: 0,5; 1,0 e 1,5 mg i.a. L-1 de meio MS e ausência de paclobutrazol no meio MS – controle) e 10 repetições, totalizando 40 parcelas sendo, cada parcela, representada por um recipiente de plástico (com 10,5cm de diâmetro e 6 cm de altura) contendo 12 plântulas. O ambiente de cultivo, do primeiro estágio, foi sala de crescimento com iluminação artificial fornecida por lâmpadas fluorescentes do tipo luz do dia especial (OSRAM 20W), com intensidade luminosa incidente nos recipientes de plástico de, aproximadamente, 40 Pmol m-2 s-1; fotoperíodo de 16 horas; temperatura controlada de 25 +/- 2,0 ºC. O meio nutritivo e os recipientes de plástico foram, previamente, esterilizados por autoclavagem a 121°C (104kPa) durante 20 minutos (CALDAS et al., 1998) e, posteriormente, foram vertidos 100 mL de meio nutritivo em cada recipiente em câmara asséptica. Aos 180 e 210 dias foram feitas as trocas do meio nutritivo mantendo os mesmos tratamentos. Após 240 dias, cinco repetições foram separadas para as análises destrutivas e as outras 5 foram transplantadas. Foram anotados, os dados das seguintes características: A) massa seca da parte aérea, das raízes e total (após a lavagem, o material foi seco em estufa de circulação forçada de ar a 70ºC, até que as amostras atingiram massa constante na pesagem em 39

balança digital - precisão 0,01g); B) número de folhas; C) número de brotos; D) comprimento da parte aérea (régua graduada); E) número de raízes; F) comprimento médio de raízes (régua graduada); G) diâmetro médio de raízes (com paquímetro digital Digimess®, amplitude 0,01mm-300 mm); H) área foliar (obtido por meio de medidor de área foliar eletrônico - Li-Cor, modelo L1-3100® - dados expressos em dm2). Foi aplicada análise de regressão polinomial a fim de verificar o comportamento das variáveis em função do aumento da concentração de paclobutrazol. No segundo estágio, fase ex vitro (aclimatização das plântulas), os tratamentos foram mantidos em telado, 3m de pé direito, coberto por filme de polietileno (150 micra) e tela preta tipo Sombrite® com retenção de 70% da luminosidade (no topo e nas laterais). Durante a realização do experimento, no interior do ambiente protegido, as temperaturas média, média da mínima e média da máxima foram respectivamente, 26,5°C, 23,7°C e 29,2°C (Figura 1A) e a umidade relativa média do ar foi 58,5%, média da mínima de 45% e média da máxima de 72% (Figura 1B). A reposição de água foi feita após pesagens dos recipientes de cultivo, visando manter condições de 80% da capacidade de vaso. Foi mantido o delineamento inteiramente casualisado e 5 repetições. Foram transplantadas nove plântulas, de cada parcela, para bandejas de plástico (14 cm de comprimento, 9 cm de largura e 4 cm de altura - 500 cm3) contendo furos na superfície inferior. Como substrato (pH = 5,8 e CE = 100 PS cm-1)foi utilizada a mistura (1:1, v:v) de fibra de coco (tamanho médio das partículas 1,5x1x0,2cm) e esfagno, que foi desinfetado em solução de hipoclorito de sódio 2% por, 2 horas. Após este período o substrato foi lavado por três vezes, deixando o material imerso em água por 10 minutos, na segunda e terceira vez. As plantas foram adubadas semanalmente (aplicação no substrato) com solução nutritiva completa de Sarruge, composta por: 225 N; 31 P; 234 K; 200 Ca; 48 Mg; 64 S; 0,5 B; 0,5 Mn; 0,05 Zn; 0,02 Cu; 0,01 Mo; 5 Fe - mg L-10 (SARRUGE, 1975). Os recipientes foram mantidos por duas semanas dentro de sacos de polietileno 40

(50 micra), que gradualmente foram abertos, até a sua completa retirada.

35 30 25 20 15 10

Temperatura (ºC) Temperatura 5 A 0 0 15 30 45 Dias após o transplante

mínima máxima média

90 80 70 60 50 40 30 20

Umidade relativa (%) relativaUmidade 10 B 0 0 15 30 45 Dias após o transplante

mínima máxima média

Figura 1. Variação da temperatura do ar mínima, máxima e média (A); e, umidade relativa do ar mínima, máxima e média (B) no local do experimento. Jaboticabal, SP, 2012. Foram avaliadas as taxas de sobrevivência aos 15, 30 e 45 dias após o transplante. Estes dados, para fins de análise estatística foram transformados em arc sen (x/100)1/2. 41

Foi aplicada análise de regressão a fim de verificar o comportamento das variáveis em função do aumento da concentração de paclobutrazol.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Verificou-se incrementos de 62,2; 521,6 e 107,1%, respectivamente, no acúmulo de massa seca da parte aérea, raízes e total (Figura 2) na concentração de 0,5 mgL-1. Em todas as concentrações o acúmulo de massa seca de raízes e total foi superior ao controle. Na maior concentração (1,5 mgL-1) verificou-se redução de 8,5% no acúmulo de massa seca da parte aérea em relação ao controle, possivelmente, concentrações mais elevadas sejam fitotóxicas. NEPOMUCENO et al. (2007) em trabalho com Anadenanthera colubrina também observou redução de 32,9% na massa seca da parte aérea na maior concentração de paclobutrazol (13,6 μM). Resultados semelhantes foram verificados em cultura de Chrysanthemun morifolium com redução de 49% em 10,2 μM, maior concentração (RITCHIE et al., 1991). KITITRAKUNYANUN (1999) também mostrou que, quando a concentração de paclobutrazol aumentou, a altura, a massa de matéria fresca e seca das plantas de Dendrobium cruentum diminuíram. Estes resultados indicam que o paclobutrazol contribuiu para a incorporação de carbono, uma vez que na ausência deste retardante de crescimento houve menor incorporação de massa seca da raíz (NEPOMUCENO et al., 2007). Maior área foliar, 27,3% (Figura 3A) e número de folhas, 18,4% (Figura 3B) foram verificadas na concentração 0,5 mgL-1 de paclobutrazol, em relação ao controle. Todas as concentrações de paclobutrazol propiciaram maior número de folhas em relação ao controle, o mesmo não foi verificado para área foliar nos tratamentos com 1 e 1,5 mgL-1, já que este retardante promoveu grande redução no tamanho das folhas. 42

35 )

-1 30 25 20 15 10 5 0 0 0,5 1 1,5 Massa seca Massa (mg.planta Concentrações de paclobutrazol (mgL-1) Parte aérea Raízes Total

Parte aérea - Y = 14,314 + 45,98x - 68,92x2 + 25,152x3 R2=1** Raízes - Y = 1,558 + 40,16x - 58,924x2 + 22,216x3 R2=1** Total - Y = 15,8922 + 86,10193x - 127,8232x2 + 47,365x3 R2=1** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 2. Massa seca de plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

NEPOMUCENO et al. (2007) verificaram redução no número de folhas em plântulas de Anadenanthera colubrina tratadas com diferentes concentrações de paclobutrazol. ZIV (1995) observou que o uso deste retardante de crescimento promoveu redução da área foliar e, verificou também, aumento da resistência ao estresse de várias espécies micropropagadas, como crisântemo, rosa e videira. A perda de água por transpiração pode ser menor em razão da redução da área foliar, da temperatura das folhas e também da quantidade de radiação absorvida (MORAES, 2002).

) 1,9 A 2 1,7 1,5 1,3 Área foliar (dm foliar Área 1,1 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y = 1,516 + 2,99x-5,404x2 + 2,16x3 R2= 1*

5,4 B 5,2 5 4,8 4,6 Número de folhas de Número 4,4 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y = 4,4471 + 4,271024x – 6,519066x2 + 2,509462x3 R2=1** (Dados transformados (x+1)0,5 ) ** significativo a 1% e * a 5% de probabilidade pelo teste F.

Figura 3. Área foliar (A) e número de folhas (B) de plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

O sistema radicular também sofreu influência do paclobutrazol. Todas as concentrações promoveram incrementos médios de 76,2% no diâmetro (Figura 4A e 5), e 26% no comprimento das raízes (Figura 4B) em relação ao controle. Maior número de raízes (Figura 4C) foi verificado nos tratamentos de 0,5 e 1 mgL-1, sendo que a maior concentração promoveu redução de 3%.

2,8 A 2,3

1,8

raízes (mm) raízes 1,3 Diâmetro médio de 0,8 0 0,5 1 1,5 -1 Concentrações de paclobutrazol (mgL )

Y = 1,2998 + 1,9196x - 0,796x2 R2= 0,99** 0,8 0,75 B 0,7 0,65 0,6

raízes (cm) raízes 0,55 0,5

Comprimento médio das 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 0,5616 +0,4212 x -0,236x2 R2=0,84* 2,6 2,5 C 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9

Número de de Número raízes 1,8 1,7 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 1,918062 + 1,515159x – 1,036719x2, R2=0,99** (Dados transformados (x+1)0,5) ** significativo a 1% e * a 5% de probabilidade pelo teste F. Figura 4. Diâmetro médio de raízes (A), comprimento médio das raízes (B) e número de raízes de plântulas (C) de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol. 45

Figura 5. Plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr.: (A) após 90 dias de incubação (in vitro) em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol (0; 0,5; 1,0 e 1,5mgL-1) e (B) 45 dias após o cultivo em mistura (1:1) de fibra de coco e esfagno (ex vitro), no município de Jaboticabal, SP.

O engrossamento das raízes promovido pelo paclobutrazol também foi observado para outras plantas como Chrysanthemum morifolium e Vitis vinfera (SMITH et al., 1990; ROBERTS et al., 1992; SMITH et al., 1992), Lilium longiflorum (THAKUR et al., 2006), plântulas de Anadenanthera colubrina (NEPOMUCENO et al., 2007) e orquídeas do gênero Dendrobium (TE-CHATO et al., 2009). CORDEIRO et al. (2010) inocularam plântulas de Cattleya labiata em meio MS (in vitro) acrescido de diferentes concentrações de paclobutrazol (0, 1 e 2 mgL-1). Após 45 dias verificaram que o paclobutrazol atuou diretamente no diâmetro radicular das microplantas, principalmente na maior concentração (2 mgL-1), onde se observou a maior porção de tecido cortical em detrimento ao vascular, o que representa uma característica positiva para a aclimatização. 46

O aspecto de engrossamento das raízes pode ser benéfico na etapa de aclimatização, pois raízes mais vigorosas tendem a facilitar maior pegamento das mudas (NEPOMUCENO, 2006). Um dos efeitos do paclobutrazol é a inibição da biossíntese de giberelina, que é um hormônio responsável pelo alongamento das células, proporcionando, então, o crescimento do órgão. Desta forma, com o uso de paclobutrazol inibindo a biossíntese de giberelina, embora ocorra a divisão celular, as novas células não se alongam e, como consequência, têm-se o crescimento reduzido, sendo provável que as raízes tenham aumento de diâmetro devido a ocorrência de divisões celulares radiais, conforme explicam NEPOMUCENO et al. (2007). O número de brotos (Figura 6A) e o comprimento da parte aérea (Figura 6B) foram menores em todos os tratamentos com paclobutrazol, com reduções médias de 6,6 e 77,7%, respectivamente, em relação ao controle. WANDERLEY (2010) também verificou que a aplicação de paclobutrazol em orquídeas terrestres, cultivadas em vaso, promoveu redução no número de brotações novas em Epidendrum radicans e redução na altura de plantas de Arundina graminifolia em todas as doses. TORRES & MOGOLLÓN (2002) também relataram redução no comprimento dos brotos de orquídeas do gênero Cattleya. Este menor alongamento do entrenó em plantas, pode ser explicado pela inibição da biosíntese de giberelina, como comenta KERBAUY (2004). Em plantas de girassol ornamental BARBOSA et al. (2008) observaram efeito linear e inversamente proporcional entre as doses de paclobutrazol (0, 2, 4 e 6 mg por vaso) e a altura das plantas, não observando sintomas de toxidez. MINEA et al. (2004), em estudo realizado com orquídeas do gênero Spathoglottis, verificaram que a adição de paclobutrazol ao meio de cultivo “Vacin e Went” modificado, nas concentrações: 0; 0,01; 0,1 e 1 mgL-1, não teve efeito significativo no desenvolvimento das plântulas.

2,3 2,25 A 2,2 2,15 2,1 2,05 2

Número de brotos de Número 1,95 1,9 0 0,5 1 1,5 -1 Concentrações de paclobutrazol (mgL )

Y=2,198931 -0,1445375x2 R2=0,86**, Dados transformados (x+1)0,5 5,0 B 4,0 3,0 2,0

aérea (cm) aérea (cm) 1,0 0,0

Comprimento da parte Comprimento 0 0,5 1 1,5

Concentrações de paclobutrazol (mgL-1)

Y= 4,734 -13,24133 X +14,412X2 -4,834667 X3 R2=1** ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.

Figura 6. Número de brotos (A) e comprimento da parte aérea (B) de plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr. após 90 dias de incubação em meio MS suplementado com diferentes concentrações de paclobutrazol.

Todos os tratamentos propiciaram maior taxa de sobrevivência das plântulas (Figura 7). Aos 45 dias após o transplante verificou-se que os incrementos na taxa de sobrevivência, dos tratamentos (0,5; 1,0 e 1,5 mgL-1) em relação ao controle, foram, respectivamente, 67,9; 29 e 18,2%. Estes dados indicam que o paclobutrazol em baixa concentração (0,5 mgL-1) foi eficiente na redução da mortalidade das plântulas durante a fase de aclimatização, concordando com outros autores que também obtiveram sucesso na aclimatização de plantas, cultivadas in vitro, utilizando triazóis (PBZ) com 48

elevada porcentagem de sobrevivência em condições ex vitro e rápida adaptação (KOZAK, 2006; THAKUR et al., 2006).

100 80 60 40 20

plântulas (%) 0 0 0,5 1 1,5 Concentrações de paclobutrazol (mgL-1) Taxa de sobrevivência de sobrevivência de Taxa

15 dias 30 dias 45 dias

15 dias - Y= 50,45033 + 26,69193x - 19,50231x2 R2=0,81* 30 dias - Y= 38,32019 + 124,2351x - 189,6484x2 + 74,00372x3 R2=1,00** 45 dias - Y= 35,16426 + 118,9877x - 176,0604x2 + 67,28688x3 R2=1,00** ** significativo a 1% e * a 5% de probabilidade pelo teste F.

Figura 7. Taxa de sobrevivência de plântulas de Brassavola flagellaris Barb. Rodr., submetidas a diferentes concentrações de paclobutrazol, aos 15, 30 e 45 dias de observação. Jaboticabal, SP, 2012.

RITCHIE et al. (1991) e ROBERTS & MATHEWS (1995) reportaram maior resistência à perda de água de vitroplantas de crisântemo que foram tratadas com paclobutrazol durante a fase de enraizamento in vitro. KUCHARSKA & ORLIKWOSKA (2008) concluíram que o meio de cultivo para enraizamento de crisântemo contendo 1 mgL-1de paclobutrazol promoveu incrementos nas variáveis responsáveis pela sobrevivência às condições ex vitro, durante a fase de aclimatização. Verificando, também, que estas plantas puderam crescer mais rápido e floresceram mais precocemente.

CONCLUSÕES

A suplementação do meio de cultivo "Murashige e Skooge", com paclobutrazol, promoveu alterações morfofisiológicas nas plântulas, implicando em maiores taxas de sobrevivência em Brassavola flagellaris.

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