Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna Electroporation versus Natural Transformation Zur Erlangung des akademischen Grades eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (Dr. rer. nat.) von der KIT-Fakultät für Chemie- und Biowissenschaften des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) genehmigte DISSERTATION von M. Sc. Fabian Nies 1. Referent/Referentin: Prof. Dr. Tilman Lamparter 2. Referent/Referentin: Prof. Dr. Peter Nick Tag der mündlichen Prüfung: 05.02.2019 Die vorliegende Dissertation wurde am Botanischen Institut des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) in der Abteilung Allgemeine Botanik im Zeitraum vom Januar 2015 bis Januar 2019 angefertigt. II III Hiermit bestätige ich, Fabian Nies, dass diese Arbeit selbstständig angefertigt wurde und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt wurden. Alle Stellen, die wörtlich und inhaltlich aus anderen Arbeiten übernommen worden sind, wurden als solche gekennzeichnet. Die Dissertation wurde in dieser oder ähnlicher Form noch nicht an anderer Stelle zur Prüfung eingereicht. ________________________ Fabian Nies (Karlsruhe, 05.01.2019) IV Danksagung An dieser Stelle möchte in mich bei allen Personen bedanken, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit unterstützt haben und ohne die diese Arbeit nicht zur Stande gekommen wäre: Mein besonderer Dank gilt Professor Dr. Tilman Lamparter, der es mir ermöglicht hat meine Promotion in seiner Arbeitsgruppe durchzuführen. Für das entgegengebrachte Vertrauen möchte ich mich an dieser Stelle bedanken. Professor Dr. Tilman Lamparter gab mir den nötigen Freiraum mein Projekt selbstständig zu bearbeiten und stand mir dennoch immer mit Rat und Anregungen unterstützend zur Seite. Besonders schätzte ich in den vergangen Jahren den freundlichen und vertrauten Umgang miteinander. Mein herzlicher Dank gilt außerdem Professor Dr. Peter Nick, in dessen Arbeitsgruppe ich viele Arbeiten durchführen konnte und der netterweise bereit war, die Zweitkorrektur dieser Arbeit zu übernehmen. Auch bei den weiteren Mitgliedern des Prüfungskomitees möchte ich mich an dieser Stelle bedanken. Mein besonderer Dank geht an die Stiftung Nagelschneider, die mich während eines Großteils der Promotion finanziell unterstützt hat und diese Arbeit damit erst ermöglicht hat. Außerdem möchte ich vielmals den technischen Assistenten und auszubildenden Laboranten danken, die einen unverzichtbaren Beitrag dazu leisten das Labor am Laufen zu halten. Insbesondere gilt mein Dank Nadja Wunsch, Ronja Kammerichs, Katrin Wöhrle und Natascha Würges, mit denen ich direkt zusammen arbeiten durfte. Ich möchte außerdem herzlich bei Ernst Heene und der Abteilung für Lebensmittelchemie bedanken, die mir die Analysen mit der Gaschromatographie ermöglicht haben. Außerdem möchte ich mich bei allen Mitarbeitern und Studenten bedanken, mit denen ich die Freude hatte in den letzten Jahren zusammen arbeiten zu dürfen und durch die diese Zeit erst so schön geworden ist, wie sie tatsächlich war. Zuletzt möchte ich mich herzlich bei meinen Freunden und meiner Familie bedanken, die mich während meiner Promotion und auf dem Weg dorthin unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt meinem Vater, Dr. Berthold Nies, der mir mit vielen Ratschlägen stets zur Seite stand. V Zusammenfassung Der Großteil der aktuellen, auf Kohlenstoff basierenden Waren wird entweder aus pflanzlichen Rohstoffen oder aus Erdöl gewonnen. Die damit verbundene Nachfrage nach Ressourcen steigt auf Grund der wachsenden Erdbevölkerung und den allgemeinen Bestrebungen zur Verbesserung des Lebensstandards. Im Gegensatz dazu sind die Verfügbarkeit von Agrarflächen und fossilen Energiereserven begrenzt. Außerdem wird der Anstieg von CO2 in der Atmosphäre seit dem Beginn der industriellen Revolution im 19. Jahrhundert als Hauptbeitrag des Menschen zur globalen Erwärmung angesehen. Es gibt einige Strategien um die Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren, wie etwa die Entwicklung von regenerativen Energien oder erhöhte Energieeffizienz. Der Einsatz von Cyanobakterien in der Biotechnologie ist eine weitere Strategie, die das Potential besitzt Landwirtschaft und Erdölindustrie als Quelle für kohlenstoffbasierte Produkte zu ersetzen. Produkte, die sich von Cyanobakterien oder Pflanzen ableiten, führen nicht zur Erhöhung des CO2 Gehalts in der Atmosphäre. Im Vergleich zu Landpflanzen ist die Kultivierung von Cyanobakterien nicht abhängig von fruchtbarem Land und viele Arten der Cyanobakterien weisen höhere Wachstumsraten als Pflanzen auf. Außerdem sind einige Cyanobakterien genetisch manipulierbar, wodurch die Synthese natürlicher Produkte verstärkt werden kann oder die rekombinante Produktion von neuen Stoffen möglich ist. Die mögliche Produktpalette reicht von preiswerten Verbindungen, wie Biokraftstoffen, bis hin zu hochwertigen Produkten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen. Auch wenn es im Bereich der rekombinanten Biotechnologie mit Cyanobakterien schon kommerzielle Anwendung gibt, befindet sich das gesamte Feld dennoch in seinen Kinderschuhen. Während im Bereich der metabolischen Optimierung, der molekularen Werkzeuge und der Bioreaktorentwicklung in den letzten Jahren und Jahrzehnten deutliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Etablierung von neuen Organismen nach wie vor eine Herausforderung. Die Forschung konzentriert sich größtenteils auf wenige, leicht transformierbare Modelorganismen der Ordnungen Synechococcales und Nostocales, da die Etablierung von Transformationsprotokollen für neue Stämme und Arten oft eine Herausforderung darstellt. Allerdings wird die rekombinante Biotechnologie mit Cyanobakterien ohne ein breites Spektrum an nutzbaren Stämmen möglicherweise hinter ihrem Potential zurück bleiben, da vorteilhafte Eigenschaften von vielversprechenden Kandidaten nicht genutzt werden können. Diese Arbeit setzt sich mit der beschriebenen Limitierung auseinander, indem ein verlässliches und effizientes Transformationsprotokoll für Phormidium lacuna etabliert wurde. Diese Art wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe als vielversprechend für die cyanobakterielle Biotechnologie charakterisiert. Da die Gattung Phormidium bislang noch nicht für genetische Manipulation zugänglich war, war es das Ziel dieser Arbeit ein Transformationsprotokoll zu entwickeln und das Potential für die Biotechnologie an Hand der rekombinanten Ethanolsynthese zu charakterisieren. Die rekombinante Produktion von Ethanol ist gut charakterisiert innerhalb der cyanobakteriellen Biotechnologie und ermöglicht den Vergleich mit anderen Cyanobakterien hinsichtlich Produktivität. VI Bei der Etablierung eines Protokolls zur Elektroporation wurde deutlich, dass Phormidium lacuna natürlich transformierbar ist. Natürliche Transformation ist bislang nur für wenige Stämme der Cyanobakterien beschrieben und dies ist der erste Bericht für die Ordnung Oscillatoriales. Natürliche Transformation erlaubt verlässlichen und effizienten Gentransfer mittels homologer Rekombination in Phormidium lacuna. Die Integration des Selektionsmarkers kanR ins Genom von Phormidium lacuna vermittelt eine deutliche Resistenz gegenüber Kanamycin (bis zu 14,3 mg/ml). Die kanR Sequenz verteilt sich sehr schnell in allen Genomkopien: Nach zwei Kulturzyklen nach der ersten Kultivierung der entsprechenden Transformanten war die kanR Sequenz in allen Genomkopien einer Zelle vorhanden. Phormidium lacuna Transformaten für die rekombinante Ethanolproduktion wurden generiert indem die codierenden Sequenzen für die Enzyme Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase ins Genom integriert wurden. Die Ethanolproduktion wurde über die Ethanolkonzentration im Kulturüberstand mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Allerdings konnte keine erhöhte Ethanolproduktion von Transformanten im Vergleich zum Wildtyp von Phormidium lacuna nachgewiesen werden. Mögliche Gründe hierfür und geeignete Schritte in Richtung einer biotechnologischen Anwendung von Phormidium lacuna wurden diskutiert. Der unerwartete Fund der natürlichen Transformation für Phormidium lacuna ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit zu natürlicher Transformation weiter unter den Cyanobakterien verbreitet ist, als bislang angenommen wurde. Um diese Fragestellung zu adressieren wurden der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit und die weiteren Beispiele, die in der Literatur beschrieben sind, mit den Cyanobakterien im Allgemeinen verglichen. Basierend auf der Homologie zu Proteinen, die an der natürlichen Transformation beteiligt sind, wurden cyanobakterielle Stämme vorgeschlagen, die potentiell transformierbar sind. Der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit hat viele Implikationen. Erstens: Phormidium lacuna ist nun effizient natürlich transformierbar, was eine essentielle Voraussetzung für die weiteren Arbeitsschritte mit diesem Organismus in Bereich der rekombinanten Biotechnologie darstellt. Zweitens: Da Phormidium lacuna leicht transformierbar ist und homozygote Transformanten in kurzer Zeit generiert werden können, bietet sich dieses Bakterium als vielversprechender Modellorganismus der filamentösen Cyanobakterien ohne Heterocysten an. Drittens: Der Fund von natürlicher Transformation in einer neuen Ordnung der Cyanobakterien weiß vermutlich daraufhin, dass natürliche Kompetenz eine weit verbreitete Eigenschaft innerhalb der Cyanobakterien ist und dass möglicherweise deutlich mehr Stämme zugängliche für rekombinante Biotechnologie sind. VII Abstract Our present consumption of organic commodities mostly relies on plant material or mineral