Thesis

Développement d'une méthodologie et optimisation d'un test colorimétrique pour la recherche de substances antimalariques d'origine végétale

VARGAS, Sandra

Abstract

Ce travail présente une méthodologie pour la recherche de substances antimalariques d'origine naturelle. Elle implique l'utilisation des deux outils développés pour cette étude : un outil qualitatif (β-test) et une base de données (Track2nd). Le β-test est un test colorimétrique basé sur l'étude de la synthèse de la β-hématine, réaction spécifique au Plasmodium. Sa mise en place et son optimisation sur des extraits et des substances d'origine végétale permet d'avoir à disposition un test facile, rapide et peu couteux. Track2nd est un portail d'informations sur des plantes incluant des paramètres comme l'activité biologique et l'utilisation en médecine traditionnelle. Ces deux outils combinés permettent une première sélection d'extraits de plantes destinés à être testés sur le parasite par des instituts collaborateurs. Une fois la confirmation d'activité obtenue, un bioguidage avec le β-test est effectué afin d'isoler puis d'identifier le composé inhibiteur de la synthèse de la β-hématine.

Reference

VARGAS, Sandra. Développement d'une méthodologie et optimisation d'un test colorimétrique pour la recherche de substances antimalariques d'origine végétale. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2009, no. Sc. 4132

URN : urn:nbn:ch:unige-127440 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:12744

Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:12744

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1 / 1 UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DES SCIENCES Section des Sciences Pharmaceutiques Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie Prof. Kurt Hostettmann

Développement d'une méthodologie et optimisation d'un test colorimétrique pour la recherche de substances antimalariques d'origine végétale

THESE

Présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève Pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention interdisciplinaire

par Sandra Vargas de Meyrin (GE)

Thèse No4132

Atelier d’impression ReproMail – Uni Mail Genève 2009

Remerciements

Mes remerciements s’adressent tout d’abord à mon directeur de thèse, Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann, pour m’avoir accueillie dans son groupe de recherche de renommée internationale et pour les conditions de travail de grande qualité dont j’ai pu bénéficier. Je le remercie également pour m’avoir permis d’intégrer pendant deux mois le laboratoire de Madame le Dr. Livia Vivas au sein de la London School of Hygien and Tropical Medicine (LSHTM), afin de parfaire mes connaissances concernant les tests in vitro avec P. falciparum. C’est également pour la confiance qu’il m’a accordée en me permettant de présenter mes résultats à différents congrès scientifiques en Suisse mais également en Indonésie et au Botswana que je lui présente ma profonde reconnaissance.

Ma gratitude va également à mes superviseurs techniques. Ce sujet n’aurait pas vu le jour sans la détermination de Monsieur le Dr. Jean-Robert Ioset, que je remercie pour son encadrement lors de la mise en place du test, pour les nombreuses réunions et pour son optimisme. Un grand merci à Madame le Dr. Anne-Emmanuelle Hay pour son encadrement, son dynamisme, sa participation aux screenings ainsi que pour son soutien. Mes remerciements s’adressent aussi à Madame le Dr. Karine Ndjoko pour ses précieux conseils lors de la rédaction.

Mes remerciement sincères s’adressent également à mon jury de thèse : Monsieur le Professeur Drissa Diallo, Chef du Département Médecine Traditionnelle (DMT) à l’Institut National de Recherche en Santé Publique (INRSP) de Bamako au Mali, Monsieur le Professeur Louis Maes du « Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygiene (LMPH) » de l’Université d’Antwerp en Belgique et Monsieur le Dr. Jean-Robert Ioset de l’organisation « Drugs for Neglected Diseases initiative » (DNDi) pour avoir accepté de juger mon travail, pour leurs remarques pertinentes et pour leur déplacement lors de la soutenance de thèse. Je remercie sincèrement Monsieur le Professeur Pierre-Alain Carrupt pour avoir accepté d’être membre du jury interne et pour avoir présider ce jury.

Ce travail n’aurait pas pu être achevé sans les collaborations suivantes :

L’Institut Tropical Suisse (STI) à Bâle, Monsieur le Professeur Reto Brun et plus particulièrement Monsieur le Dr. Sergio Wittlin pour les résultats in vitro sur P. falciparum de toutes les plantes sélectionnées lors de ce travail.

La fondation Oswaldo Cruz (FioCruz) du Brésil, particulièrement Madame le Professeur Milena B. Soares pour avoir testé in vitro sur P. falciparum les fractions et substances pures provenant de Loiseleuria procumbens.

Madame le Dr. Livia Vivas du LSHTM qui m’a accueilli dans son laboratoire et m’a permis de pratiquer les tests in vitro sur P. falciparum. Un grand merci à Mlle Emily Bongart et Mlle Eloise Thompson pour leur aide et pour leurs conseils au laboratoire.

Monsieur le Dr. Serge Rudaz du Laboratoire d’Analyse Pharmaceutique de l’Université de Genève, qui a toujours été disponible afin de discuter du traitement des résultats.

i

Ma profonde reconnaissance va également aux deux étudiantes qui ont participé activement à ce travail dans le cadre de leur travail de Master en Pharmacie. Mlle Simone Egger et Mlle Aziza Ben Zayed qui par leur détermination ont énormément participé à la mise en place du β-test ainsi qu’au premier bioguidage.

Je remercie également mes anciens collègues du Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie : En particulier, Daphné : « Avec quelques semaines de décalage, on peut dire qu’on a vécu notre thèse en même temps ». Frédéric : « Il est vrai que certaine fois, on peut voir les choses sous un autre angle ». Sylvian : « Un véritable soutien optimiste ». Je les remercie pour les échanges scientifiques mais aussi pour nos fous rires et leur amitié. Anne- Emmanuelle pour sa bonne humeur, Martine pour le vendredi, Philippe C. pour nos discussions mais aussi Caroline, Anne-Laure, Fan, Karine, Gaetan, Trixie, Claudia, Raimana, Karin, Hakim, Aude et Nadine.

Finalement, un grand merci à mes parents, ma sœur, mon frère et mes amis pour m’avoir encouragée et soutenue tout au long de ce travail.

ii Communications scientifiques

Ce travail a été effectué d’octobre 2005 à juin 2009 au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie, Section Sciences Pharmaceutiques à l’Université de Genève-Université de Lausanne, sous la direction du Prof. Dr. Kurt Hostettmann. Certains aspects de la présente recherche ont abouti à des présentations lors de congrès internationaux sous forme de posters ou de communications orales et à la publication d’articles.

Posters

Martin, F. Hay, A.E., Vargas, S., Gupta, M.P. and Hostettmann, K., New C- glucosylxanthones forme the stem of Arrabidaea patellifera (Bignoniaceae). International Symposium by IOCD, “Biology, Chemistry, Pharmacology and Clinical studies of Asian plants”, Surabaya, Indonesia. April 2007

Vargas, S., Ioset, J.-R., Hay, A.-E, Ndjoko K., Vivas, L., Hostettmann, K., A screening assay based on inhibition of hematin polymerization for detecting new antimalarial drugs: Application to plant extracts, International Symposium by IOCD, “Biology, Chemistry, Pharmacology and Clinical studies of Asian plants”, Surabaya, Indonesia. April 2007

Vargas, S., Ioset, J.-R., Hay, A.-E, Ndjoko K., Vivas, L., Hostettmann, K., β-hematin inhibition assay: A tool for detecting new antimalarial drugs from plants, IOCD/ISDNP Symposium ‘Natural Products: Unlimited Resources for the Development of Drugs, Cosmetics and Food.’, Kasane, Botswana, February 2008.

Communications orales

Vargas, S., Recherche de composés anti-malariques, Test colorimétrique basé sur l’inhibition de la polymérisation de l’hématine, 22ème Séminaire en Sciences Pharmaceutiques, « Le potentiel des plantes dans les maladies parasitaires tropicales », Zermatt, Suisse. Octobre 2007

Publications

Simões-Pires, C., Vargas S., Marston A., Ioset J.R., Paulo M.Q., Matheeussen A. ; Maes L., Ellagic acid derivatives from Syzygium cumini stem bark: investigation of their antiplasmodial activity, Natural Product Communications, 2009 (4), Soumis

Vargas, S., Ioset, J.-R., Hay, A.-E, Ndjoko, K., Brun, R., Wittlin, S., Hostettmann, K., The adaptation and validation of use of a chemical assay based on the inhibition of the beta-hematin to the screening of natural products: a simple method for the detection and selectively isolation of novel antimalarial compounds from plant mixtures. Soumis

iii Abréviations et Symboles

[3H]-Hypoxanthine Hypoxanthine radiomarquée au tritium δ Déplacement chimique en RMN η Rendement

λmax Longueur d’onde du maxima d’absorption ABS Absorption ACN Acétonitrile

CD3OD Methanol deutéré

CI50 Concentration lorsque l’inhibition est équivalente à 50 % COSY Correlation homonucléaire d Doublet DAD Detecteur à barettes d’iodes dd Doublet de doublet DDT Dichloro-diphenyl-trichloroéthane DMSO Dimethylsulfoxide

DMSO-d6 Dimethylsulfoxide deutéré DNDi Drugs for Neglected Diseases initiative (organisation à but non-lucratif ) DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl ELISA Dosage d'immunosorption liée à enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) ESI Ionisation par électrospray et al. « et autres », abbrévitation du mot latin et alii Fe(III)PPIX Fer (III) lié à la protoporphyrine IX FT Transformée de Fourier GSH Glutathion HMBC Correlation hétéronucléaire à liaisons multiples HPLC Chromatographie liquide à haute pression HR-MS Spéctrométrie de masse à haute résolution HSQC Corrélation hétéronuclaire à liaison simple IR Spectroscopie infrarouge ITS Institut Tropical Suisse

iv J Constante de couplage LPP Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie LSMTH London School of Hygiene and Tropical Medicine m Multiplet MeOH Méthanol MMV Medicines for Malaria Venture (organisation à but non- lucratif ) MPLC Chromatographie liquide à moyenne pression MS Spectrométrie de masse m/z Rapport masse sur charge OMS Organisation Mondial de la Santé OP Organisme pathogène PPIX Protophorphyrine IX ppm Unité de δ (parties par millions) Py-Fe(III)PPIX Complexe pyridine avec Fer(III)PPIX RMN Résonnance magnétique nucléaire

RT Temps de rétention RP Phase inverse s Singulet SPE Extraction sur phase solide spp. Plusieurs espèces t Triplet TDR Programme sponsorisé par l’OMS, les Nations Unies et le World Bank Group pour combattre les maladies tropicales majeures TOF Analyseur à temps de vol UV Spectrophotométrie dans le domaine de l’ultra-violet UV-Vis Spectrophotométrie dans le domaine de l’ultra-violet et dans le domaine du visible VIH Virus de l’immunodéficience humaine

v Table des matières

Remerciements ...... i Communications scientifiques ...... iii Abréviations et Symboles ...... iv Tables des matières ...... vi

I. OBJECTIFS ...... 1

II. INTRODUCTION ...... 7

II.1. La malaria : D’hier à aujourd’hui ...... 8 II.2 La maladie ...... 12 a) Le vecteur ...... 12 b) Le parasite et son cycle de vie ...... 13 c) Symptômes...... 15 d) Diagnostique ...... 15 II.3. Recherche de nouveaux composés anti-malariques ...... 16 a) Cibles ...... 18 b) Principales familles antipaludiques d’origine naturelle...... 19 Les quinolines ...... 19 Les naphtoquinones ...... 21 Les artémisinines ...... 21

c) Familles de substances naturelles avec une activité antimalarique non-spécifique ...... 23 Les flavonoïdes ...... 23 Les tannins ...... 25 d) Substances antimalariques en cours d’investigation ...... 25 Les manzamines ...... 26 Les trioxaquines ...... 27

e) Traitements sur le marché ...... 27

vi e) Méthodologie actuelle pour la découverte de nouveaux antimalariques et test de référence ...... 30 f) Tests supplémentaires pour l’étude de l’activité antimalarique sur la croissance de P.falciparum ...... 31

II.4. Un test qualitatif pour la recherche de composés antimalariques d’origine naturelle ...... 32 a) Une alternative pour les institutions académiques spécialisées en phytochimie...... 32 b) Détoxification de l’hème : le lieu de nombreuses cibles ...... 33 c) La synthèse de l’hémozoine : une cible de choix ...... 35 d) Tests de criblage basés sur l’inhibition de la synthèse de l’hémozoine/β-hématine ...... 36 e) Choix d’une méthode de criblage ...... 37 f) Phiβ-assay ...... 38

II.5. Présentation des plantes etudiées ...... 41 a) Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae) ...... 41 La famille des Ericaceae ...... 41 Description botanique et classification systématique ...... 41

Utilisation des Ericaceae ...... 42

Le genre Loiseleuria Desv. ex Loisel...... 43 L’espèce L. procumbens L...... 43 Etudes phytochimiques antérieures ...... 44

b) Chamaesyce buxifolia Small (Euphorbiaceae) ...... 45 La famille des Euphorbiaceae Juss...... 45 Description botanique et classification systématique ...... 45

Utilisation courante et études phytochimiques antérieures ... 46

Le genre Chamaesyce Gray ...... 47

vii Le genre Euphorbia Linn...... 47 Utilisation en médecine traditionnelle ...... 48

Etudes phytochimiques antérieures et activité biologique .... 48

L’espèce C. buxifolia Small ...... 50

c) Sandoricum koetjape Merr. (Meliaceae) ...... 51 La famille des Meliaceae ...... 51 Description botanique et classification systématique ...... 51

Utilisations industrielles et en médecine traditionnelle ...... 51

Etude phytochimique antérieures et activité biologique ...... 52

Le genre Sandoricum Cav...... 54 L’espèce S. koetjape Merr ...... 54 Utilisation et études phytochimiques antérieures ...... 55

III. RESULTATS ET DISCUSSIONS ...... 57

III.1. Optimisation des conditions réactionnelles ...... 60 a) Conditions de départ pour la synthèse de la β-hématine ...... 60 b) Complexe pyridine-Fe(III)PPIX ...... 61 Association de la pyridine avec l’hématine ...... 61 Optimisation de la concentration de la solution de pyridine ...... 62 Absorption du complexe Py-Fe(III)PPIX et loi de Lambert-Beer ..... 63 c) Synthèse de la β-hématine ...... 65 Synthèse de la β-hématine ...... 65 Optimisation du temps d’incubation ...... 66 Identification de la β-hématine ...... 67 d) Sélectivité de la pyridine envers l’hématine ...... 67 e) Traitement des données ...... 69 f) Solution de solubilisation ...... 71 III.2. β-test sur substances pures ...... 72

viii a) Détermination d’une activité quantitative ...... 72 b) Traitement des résultats qualitatifs de substances pures d’origine naturelle .. 73

III.3. Criblage qualitatif de substances pures d’origine naturelle ...... 76 a) Résultats qualitatif et comparaison avec l’activité sur P. falciparum ...... 76 Les quinolines ...... 77 Les flavonoïdes ...... 78 Les tannins ...... 78 b) Discussion des résultats ...... 79

III.4. Elaboration du β-test sur des extraits de plantes ...... 81 a) Préparation d’échantillons de matrices complexes ...... 82 b) Identification et discrimination des faux-positifs et des substances indésirables ...... 83 Elimination des tannins ...... 83 Identification par HPLC-MS des faux-positifs ...... 84 c) Différentes approches pour la sélection des plantes ...... 85 d) Track 2ND : Base de donnée Access ...... 87 e) Criblage d’extraits de plantes sur le β-test ...... 91 f) Validation et mise en place de la méthodologie ...... 101

Traitement des résultats, mise en place d’une valeur ILimite,Extrait ...... 101 Comparaison β-test vs. in vitro sur P.falciparum ...... 102

III.5. Méthodologie du β-test ...... 108

III.6. Validation de la méthodologie du β-test sur des extraits de plantes ...... 111 a) Vrais-positifs : Identification des substances responsables de l’activité anti- malarique ...... 111 Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae) ...... 111 Sélection de la plante ...... 111 Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire ...... 112 Analyse des fractions SPE sur le β-test ...... 114

ix Fractionnement et β-test sur les fractions ...... 115 Identification du composé 9 ...... 117 Activité in vitro sur P. falciparum ...... 118

Chamaesyce buxifolia Small (Euphorbiaceae) ...... 119 Sélection de la plante ...... 119 Purification de l’extrait ...... 119 Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire ...... 119 Analyse des fractions SPE sur le β-test ...... 121 Fractionnement et β-test sur les fractions ...... 121 Identification des composés 6 & 10 ...... 123 Activité antimalarique ...... 124

b) Faux-positifs : Exemple d’exclusion par déréplication des faux-positifs ..... 125 Sandoricum koetjape Merr. (Meliaceae) ...... 125 Sélection de la plante ...... 125 Préparation d’échantillon ...... 125 Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire ...... 125 Analyse des fractions SPE sur le β-test ...... 126 Fractionnement et β-test sur les fractions ...... 126 Exclusion des fractions contenant des faux-positifs ...... 128 Activité antimalarique ...... 131

c) Discussion ...... 131

IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...... 133

V. MATERIELS & METHODES ...... 143

V.1. Matériels et Preparation d’extrait ...... 144 a) Matériels ...... 144 b) Préparation standard ...... 144

x c) Extraction rapide ...... 145 d) Elimination des tannins par précipitation avec la poudre de peau ...... 145 e) Elimination des tannins par précipitation avec le plomb ...... 145

V.2. Méthode physico-chimique de criblage : β-test ...... 156 a) Produits ...... 146 b) Matériels ...... 146 c) Solutions à préparer ...... 147 d) Analyse de substances pures ...... 148 Détermination qualitative de l’activité inhibtrice de la synthèse de la β-hématine...... 148 Détermination quantitative de l’activité sur la synthèse de la β-hématine ...... 149

Dilution pour la détermination IC50 ...... 149

e) Analyse d’extraits de plantes ...... 150 f) Analyse de fractions ...... 151 g) Traitement des résultats ...... 151 Substances pures & fractions ...... 151 Extraits ...... 152

V.3. Méthode biologique de criblage : Test basé sur l’incorporation de l’[3h]-hypoxanthine ...... 152 a) Culture du parasite ...... 152 b) Analyse des substances et des extraits ...... 153 V.4. Technique de séparation analytique couplée à la detection spectrométrique .. 154 a) Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV) ...... 154 Méthode d’analyse pour L. procumbens ...... 154 Méthode d’analyse pour C. buxifolia ...... 154 b) Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie UV/Vis et à la spectrométrie de masse

xi (HPLC-DAD/UV-MS) ...... 155 Méthode standard pour l’identification des témoins ...... 155 c) Chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse à temps de vol (UHPLC-TOF) ...... 156 Méthode standard d’analyse ...... 156 V.5. Techniques de séparation préparative ...... 157 a) Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) ...... 157 b) Chromatographie Flash ...... 157 Conditions pour le fractionnement de L. procumbens ...... 158 c) Chromatographie liquide semi-préparative à haute pression ...... 158 Conditions pour S. koetjape ...... 158 d) Extraction sur phase solide (SPE) ...... 159 V.6. Méthodes Spectrométriques ...... 159 a) Résonnance magnétique nucléaire (RMN) ...... 159 b) Spectrométrie Infrarouge (IR) ...... 160

V.7. Constantes physiques et données spectrales des composés isolés qui inhibent la synthèse de la β-hématine ...... 161 a) Composé actif isolé de l’extrait méthanolique de Loiseleuria procumbens (L.) Desv...... 161 Composé 9 (fraction G) ...... 161 b) Composé actif isolé de l’extrait méthanolique des parties aérienne de Chamaesyce buxifolia Small ...... 162 Composé 10 (fraction S) ...... 162 Composé 6 (Fraction O) ...... 163

IV. REFERENCES ...... 165

xii I – OBJECTIFS ______

I. OBJECTIFS

1 I – OBJECTIFS ______

La malaria, fléau causé par un protozoaire du genre Plasmodium, tue plus d’un million de personnes par année et touche principalement les femmes enceinte et les enfants âgés de moins de cinq ans. Malgré le programme d’éradication de cette maladie, lancé par l’OMS en 1955, elle sévit encore fortement dans les pays en développement, avec 95 % des cas répertoriés en Afrique subsaharienne. L’apparition de souches de P. falciparum résistantes à la chloroquine est à la source de ce problème de santé publique. Ses conséquences, désastreuses pour les populations, se répercutent également au niveau de l’économie des pays concernés, constituant ainsi un frein pour leur développement (Willcox et al., 2004).

Le règne végétal représente une source quasi-inépuisable et variée de substances naturelles, qui peuvent aussi bien être toxiques qu’offrir un intérêt thérapeutique. Bien avant que la science ne se soit dotée des outils nécessaires pour caractériser les principes actifs, l’homme, à travers les siècles, a appris à distinguer les plantes et à les utiliser pour se nourrir et pour se soigner. De nos jours, la médecine traditionnelle est délaissée en Occident au profit de la médecine moderne et des produits de synthèse. Cependant, elle fait encore ses preuves et est à l’origine d’une quantité non négligeable de médicaments actuels. La quinine, isolée autrefois de l’écorce de quinquina (Cinchona officinalis L., Rubiaceae) est utilisée pour traiter les cas de malaria sévère. De l’espèce Artemisia annua L. (Asteraceae), utilisée en médecine traditionnelle chinoise pour traiter la malaria, fut isolée l’artémisinine la molécule antimalarique déclarée par l’OMS comme étant « le plus grand espoir pour la lutte contre le paludisme ». Parmi tant d’autres qui mériteraient d’être cités, ces exemples témoignent de l’importance des plantes pour la recherche et le développement des médicaments.

La phytochimie est une science multidisciplinaire qui consiste dans un premier temps à isoler et caractériser des substances d’origine naturelle. Des nombreuses voies de recherche peuvent alors être explorées, telle que la détermination d’activités biologiques ou bien encore l’étude de l’impact de certaines espèces de plantes sur l’environnement. L’étape d’isolement fait intervenir des techniques chromatographiques préparatives qui en terme de coût sont plus ou moins abordables. L’identification, quant à elle, nécessite un investissement plus conséquent pour les

2 I – OBJECTIFS ______laboratoires académiques qui désirent disposer au sein de leur institution de la panoplie de techniques analytiques permettant la caractérisation d’une structure moléculaire (RMN, HPLC-MS, HR-MS). Le laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie (LPP), dirigé par le Pr. Hostettmann à l’Université de Genève, se distingue par l’introduction depuis une quinzaine d’année de techniques chromatographiques et spectroscopiques les plus performantes. Le laboratoire dispose également d’une batterie de tests biologiques et chimiques qui constituent d’excellents outils pour la recherche par bioguidage de substances actives antioxydantes, antifongiques et inhibitrices de l’acétylcholinestérase.

Dans le cadre de la recherche de substances antiparasitaires axées sur les maladies telles que la malaria, la leishmaniose ou encore la maladie du sommeil, le LPP, comme la plupart des laboratoires académiques, sans distinction, font face à la même problématique : l’activité biologique d’un extrait ou d’une substance sur un organisme pathogène ne peut être déterminée que par un laboratoire spécialisé en parasitologie. Les études d’activité antiparasitaire, pratiquées in vitro requièrent obligatoirement une infrastructure microbiologique, des mesures de sécurité, du personnel qualifié et des autorisations pour travailler avec des organismes pathogènes en milieu confiné. Ainsi, la collaboration entre les institutions, tel que le LPP, et les laboratoires de parasitologie est le meilleur moyen de pratiquer la recherche de substances antimalariques d’origine végétale. Dans notre cas, c’est aux travers de collaborations avec l’Institut FioCruz (Brésil), le Laboratoire de Microbiologie, de Parasitologie et d’Hygiène - LMPH - de l’Université d’Anvers (Belgique) et finalement l’Institut Tropical Suisse - ITS - à Bâle, que certaines recherches peuvent se focaliser sur la découverte de substances d’origine naturelle actives sur des parasites tels que Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi et T. brucei spp. La sélection du matériel végétal à tester sur P. falciparum est un point de départ important et peut se baser sur des critères ethnopharmacologiques ou taxonomiques. Malgré cela et malgré le grand nombre d’échantillons soumis à des analyses in vitro la proportion d’études phytochimique qui en résulte reste faible. A cela s’ajoute le temps d’attente pour obtenir le résultat d’une activité in vitro qui peut durer plusieurs semaines. Ces facteurs représentent un frein pour la poursuite de la recherche de substances d’origine naturelle avec un potentiel antimalarique.

3 I – OBJECTIFS ______

L’objectif premier de cette étude consiste à mettre en place un outil qualitatif qui permet d’optimiser la sélection du matériel végétal destinés à être testées in vitro sur P. falciparum. Notre choix s’est porté sur le Phiβ-assay. Ce test colorimétrique est basé sur la synthèse de la dimérisation de l’hématine, réaction spécifique au parasite. Il a été validé par l’étude de la corrélation des résultats quantitatifs sur quinze aminoquinolines analysées sur le Phiβ-assay et sur la croissance de P. falciparum (Ncokazi and Egan, 2005). Il répond à des critères fondamentaux soit un test facile, rapide, utilisant un matériel peu coûteux et des réactifs facilement disponibles.

La première étape comprend l’implantation du Phiβ-assay dans nos locaux et son extrapolation sur des plaques 96-puits, afin d’assurer un criblage de plusieurs échantillons en routine. Elle s’effectuera selon les études suivantes :

¾ La synthèse de la β-hématine ¾ La complexation de la pyridine avec Fe(III) de la protoporphyrine IX ¾ La sélectivité de la pyridine envers l’hématine ¾ Le traitement des données ¾ L’évaluation d’une solution de solubilisation

L’inhibition de la synthèse de la β-hématine sera vérifiée sur des substances pures connues pour inhiber la synthèse de la β-hématine en déterminant un CI50. Dans un second temps, l’évaluation qualitative de cette activité sera ensuite optimisée pour des substances pures d’origine naturelle et des extraits de plantes. A cette étape, le test est rebaptisé β-test. La préparation d’échantillon et le développement d’une méthode de traitement des résultats seront des étapes nécessaires et importantes. La fiabilité de la réponse sera étudiée puis critiquée en corroborant cette dernière avec l’activité sur P. falciparum.

Comme la question de la sélection du matériel végétal reste une problématique clef en phytochimie, parallèlement au développement d’un outil définissant une activité, le second objectif de cette étude concernera la mise en place d’une base de données des études publiées à ce jour. En effet, cela permettra d’avoir une visibilité immédiate et

4 I – OBJECTIFS ______une vue critique d’ensemble sur les substances pures d’origine naturelle et sur les plantes (famille, genre, espèce) décrites dans le domaine des maladies parasitaires (malaria, maladie du sommeil, leishmaniose).

Le dernier but de ce travail consistera au développement d’une méthodologie de travail intra muros, qui permettra l’isolement de substances d’origine naturelle, bioguidé par l’étude de l’inhibition de la synthèse de la β-hématine. Cette méthodologie de travail combinera les deux outils soit:

¾ La base de données Track2ND ¾ Le β-test

Elle sera appliquée sur des extraits de plantes dans le but d’isoler les substances actives sur la voie du β-test. La concordance avec leur activité inhibitrice de la croissance de P. falciparum sera une preuve de la validité de cette méthodologie.

5 I – OBJECTIFS ______

6 II – INTRODUCTION ______

II. INTRODUCTION

7 II – INTRODUCTION ______

II.1. LA MALARIA : D’HIER A AUJOURD’HUI

La malaria (ou paludisme) est une maladie parasitaire qui affecte l’homme ainsi que d’autres vertébrés depuis plusieurs milliers d’années (Joy D, 2003). Les premières traces écrites la concernant ont été découvertes en Chine (2700 ans avant J.-C) et décrivaient notamment des accès de fièvre mortelle. Les détails sur ses symptômes cliniques et ses conséquences sont relatés sous l’empire Romain, dans les écrits d’Hippocrate connus sous le nom de Corpus Hippocratorum (Ve siècle avant J.-C). Comme l’attestent de nombreux écrits, de Grèce jusqu’en Italie, la malaria s’est tout naturellement répandue sur le vieux continent puis avec les migrations humaines, le long des régions tropicales, subtropicales ainsi que dans les régions tempérées (Cox, 2001; Garnham, 1966; Harrison, Figure II-I Charles Louis Alphonse 1978; McGregor, 1996). Alors que la malaria n’a cessé de se répandre, les Laveran (1845-1922) ©BBC Hulton Picture Library premières études scientifiques la concernant ne voient le jour qu’à la fin du XVIIIe siècle et décrivent la présence de pigments noirs dans la rate et le sang (Sullivan, 2002). C’est avec la « théorie des germes », développée par Louis Pasteur (1822-1895) et la naissance de la microbiologie, que le lien entre la malaria et son parasite infectieux ainsi que son mode de transmission sont enfin établis. Cette découverte déclarant un protozoaire comme responsable de la malaria, développée dans le « Traité du paludisme », valut à son auteur, Charles Louis Alphonse Laveran (1845-1922, Figure II-I), le prix Nobel de médecine en 1907 (Laveran, 1898). Ensuite, la contribution de grands noms de la médecine tels que les Drs. Patrick Manson (1844-1922), Ettore Marchiafava (1847-1935), Angelo Celli (1857-1914) et Camillo Golgi (1843-1926) a permis de confirmer la responsabilité du protozoaire infectieux, baptisé Plasmodium et d’effectuer un grand pas dans la compréhension de son cycle de vie (Sullivan, 2002). La découverte du vecteur de la maladie, le moustique femelle du genre Anopheles et le mode de transmission du Plasmodium via sa piqûre sont dus aux recherches effectuées par Sir Ronald Ross (1857-1932), qui disséqua les oiseaux infectés et persista à découvrir puis étudier ces moustiques qui ne sortent que la nuit (Arrow et al., 2004). Par chance, il n’a pas fallu attendre toutes ses découvertes pour traiter la malaria. La médecine traditionnelle a permis d’épargner un grand nombre de vies. La connaissance de l’utilisation des plantes reliée aux études scientifiques sont à l’origine du développement des médicaments les plus efficaces.

8 II – INTRODUCTION ______

Le premier exemple de traitement nous provient des indiens du Pérou qui utilisaient une macération d’écorce de quinquina (Cinchona officinalis L., Rubiaceae, Figure II-II) pour soigner les fortes fièvres. Cette drogue, après avoir prouvé son efficacité contre la malaria auprès des Jésuites, fut importée en Europe au XVIIe siècle. La quinine (1) et la cinchonine (2) furent isolées de Cinchona cordifolia Mutis ex Humb pour la première fois en 1820, par Pelletier et Caventou (Cooper, 1970). En étudiant l’activité antimalarique de ces deux nouveaux alcaloïdes, le pharmacien et le chimiste français, ont découvert la quinine (Figure II-III), l’un des antimalariques les plus persistants dans le Figure II-II Illustration de Cinchona officinalis Hook (Kohler, temps n’ayant jamais été découvert. (Willcox et al., 2004). 1883-1914)

R R N S N S S OH R OH S S R S H H MeO

N N

1 2

Figure II-III Structures moléculaires de la quinine (1) et de la cinchonine (2) Néanmoins, cette molécule présente une certaine toxicité. Des symptômes tels que nausées, pertes de la mémoire, perte de l’ouïe, vertiges, sont la conséquence d’une overdose de quinine. C’est ainsi, que dès la fin de la deuxième guerre mondiale, les chercheurs se sont tournés vers le développement de dérivés synthétiques. La chloroquine (3) s’est imposée face aux autres dérivés quinoléiques grâce à sa grande efficacité, sa faible toxicité et son faible coût de production.

Cl N

HN N

3 Figure II- IV Structure moléculaire de la chloroquine (3)

9 II – INTRODUCTION ______

Dès lors, de nombreux efforts sont mis en œuvre pour éliminer la maladie. Un premier programme d’éradication mondiale de la malaria est adopté en 1955 par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Il se résume à une offensive avec un insecticide, le DDT (Dichloro-Diphenyl- Trichloroethane), sur le moustique vecteur et à l’élimination des réservoirs humains en soignant les personnes infectées. En un court laps de temps (1957-1969), les régions endémiques virent la transmission de la maladie chuter et, dans certaines régions européennes et américaines, elle disparut complètement (Willcox et al., 2004). Alors même que l’humain se sentait débarrassé de ce fléau, des moustiques résistants aux insecticides et des souches de parasites résistantes aux traitements émergèrent, interrompant le bon déroulement de ce plan d’éradication de la malaria (White, 2004). C’est en considérant les conséquences actuelles de la malaria, que l’on comprend qu’elle occupe la deuxième position des problèmes de santé publique dévastateurs, précédée du VIH. Malgré la bonne efficacité et le faible coût des thérapies à base de chloroquine ou de la combinaison sulfadoxine-pyriméthamine, la résistance à leur égard rend la malaria responsable de plus de 1 million de morts ainsi que de 350 à 500 millions de nouveaux malades par année. Le « World Malaria Report (WMR) », effectué au sein de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) en septembre 2008 (WHO/UNICEF, 2008), indique que les pays en voie de développement sont les plus touchés. Ce même rapport souligne que plus de 80% des malades résident principalement dans les régions sub-sahariennes (Figure II-V) où elle est la principale cause de mortalité chez les enfants âgés de moins de cinq ans. « En Afrique, un enfant meurt toutes les 30 secondes » est une phrase qui résume la gravité de la situation. Un autre impact important est le ralentissement de l’économie dû au coût de la malaria qui s’élève à environ 12 billions de dollars par an pour le continent africain, participant ainsi à la sous-alimentation et au sous-développement (DNDi, 2008).

Figure II-V Estimation de l’incidence de la malaria sur une population de 1000 personnes en 2006, (WHO/UNICEF, 2008)

10 II – INTRODUCTION ______

Ces chiffres accablants justifient une recherche continuelle de nouveaux traitements antimalariques actifs sur les souches résistantes aux traitements utilisés jusqu’alors. Actuellement, c’est auprès des produits naturels que cette lutte retrouve un nouveau souffle. L’Artemisia annua L. (Asteraceae, Figure II-VI), utilisée en médecine traditionnelle chinoise depuis plus de 1500 ans pour traiter la Figure II-VI Illustration de Artemisia fièvre et la malaria, permet de continuer la lutte contre le annua L., © ALAMY paludisme. Son principal composé, l’artémisinine (4), une lactone sesquiterpénique, isolée pour la première fois en Chine en 1971, a fait l’objet d’études sur son activité anti-malarique vers le début des années 80 (Zhu, 1980). Les études cliniques démontrant sa grande efficacité, son temps d’action rapide, sa faible toxicité font de ce produit la nouvelle molécule anti-malarique par excellence (Holmgren, 2006; Ibezim, 2008; Shou-zhong, 1997). Le développement de dérivés semi- synthétiques, comme l’artémether, permettent de contourner ses inconvénients majeurs, son manque de solubilité et une demi-vie très courte (Pilloy, 2006). La conférence ministérielle sur la Malaria à Amsterdam, en 1992, a eu pour objectif de définir les principaux axes de lutte contre la malaria à savoir : réduire ce fléau à un niveau qui ne constitue plus un problème publique majeur en combinant des mesures de contrôle du vecteur et l’accès aux traitements efficaces pour les patients. Actuellement les mesures plébiscitées par l’OMS sont la mise à disposition de moustiquaires imprégnées d’insecticide et la mise sur le marché de traitements antipaludiques, basés sur la combinaison de 2 voire 3 composés actifs, contenant préférentiellement des dérivés d’artémisinine (WHO/UNICEF, 2008).

R

O O S O S

O R R H S H R O & H

4

Figure II- VII La combinaison actuelle pour la lutte contre la malaria : des dérivés synthétiques de l’artémisinine (4) et des moustiquaires imprégnées d’insecticide (CDC, 2008)

11 II – INTRODUCTION ______

Néanmoins, le prix de ces mesures et la possibilité de voir ressurgir une résistance chez les souches de Plasmodium impose de poursuivre la recherche de nouveaux composés antimalariques. Ce seront peut-être, à nouveau, les plantes qui seront à l’origine des traitements à venir pour continuer la lutte active contre la malaria.

II.2. LA MALADIE a) Le vecteur

Le moustique responsable de la transmission de la malaria pullule habituellement autour d’une végétation aquatique avec de l’eau propre, stagnante et chaude. La femelle du genre Anopheles transmet les différentes espèces protozoaires du genre Plasmodium à l’homme ou à d’autres vertébrés via sa piqûre. C’est donc seulement aux heures de ses repas (aux environs de 23h Figure II-VIII Moustique Anopheles gambiae et 3h du matin) que le moustique permet la prolifération (CDC, 2008) du paludisme. Une quarantaine d’espèces du genre Anopheles sont répertoriées en tant que vecteurs de la maladie et se répartissent dans les régions géographiques décrites ci-dessous (Kiszewksi, 2004).

Figure II-IX Distribution globale des vecteurs de la malaria (Kiszewksi, 2004)

12 II – INTRODUCTION ______b) Le parasite et son cycle de vie

Le protozoaire responsable de la malaria appartient au genre Plasmodium (Marchiafava et Celli, 1895) qui répertorie 450 espèces et qui appartient à la famille des Plasmodiidae, unique famille de l’ordre Hemosporidia. On dénombre 146 espèces capable d’infecter plusieurs hôtes, parmi lesquelles quatre sont reconnues infectieuses pour l’homme : P. vivax, P. malariae, P. ovale et P. falciparum (Wéry and Paskoff, 1995). Cette dernière considérée comme la plus dangereuse entraîne le plus haut taux de mortalité et touche plus de 80% des malades. Bien qu’il diffère quelque peu d’un parasite à l’autre, leur cycle de vie peut être globalement décrit en trois cycles principaux : le cycle sporogonique dans le moustique vecteur, le cycle exo-érythrocytaire et le cycle érythrocytaire dans l’hôte humain (Figure II- X)

Cycle exo-érythrocytaire

A

Cycle C

Cycle érythrocytaire B

Figure II- X Schéma général du cycle de vie des parasites du genre Plasmodium infectieux pour l’homme

La vue plus détaillée, présentée dans la figure II – XI, met en évidence les différents sites possibles de rupture du cycle de vie du parasite sur lesquels peuvent agir des substances antimalariques. Lorsqu’une femelle Anopheles infectée pique un humain, le parasite est injecté sous forme de sporozoite. Après un bref passage dans la circulation sanguine, le protozoaire se loge dans les cellules hépatiques, pour subir une multiplication non sexuée (schizogonie hépatique), totalement asymptomatique. Cette étape, appelée cycle exo-érythrocytaire (cycle A), prend fin avec l’éclatement des cellules hépatocytes qui libèrent de nouveaux parasites sous forme de mérozoites. Comme elle diffère en durée selon l’espèce de Plasmodium, un minimum de 7 jours est requis pour P. falciparum, tandis que pour P. vivax et P. ovale, plusieurs années peuvent s’écouler avant que le parasite surgisse sous une forme hypnozoïte.

13 II – INTRODUCTION ______

Figure II- XI Schéma détaillé du cycle de vie des parasites du genre Plasmodium infectieux pour l’homme (CDC, 2008)

Le cycle de vie continue avec l’invasion des cellules érythrocytaires où les parasites se transforment en trophozoites. Lors de cette étape (cycle B), le parasite se nourrit du cytoplasme et digère plus de 70% de l’hémoglobine afin d’obtenir l’énergie et les acides aminés nécessaires à son développement et à sa prolifération (Francis et al., 1997). L’éclatement du globule rouge permet aux nombreux nouveaux parasites d’infecter à nouveau d’autres érythrocytes puis de se multiplier à répétition. Après plusieurs cycles érythrocytaires une différenciation sexuée des parasites, les gamétocytes, a lieu. Ces derniers, non pathogènes pour l’homme et d’une durée de vie de 3 semaines, sont contraints de continuer leur développement chez le moustique vecteur. C’est donc, lors d’une piqûre, que la femelle anophèle se nourrissant du sang humain aspire le parasite sous forme sexuée. Dans un intervalle de 10 à 14 jours, l’étape de développement sexuée du parasite dans l’estomac du moustique aboutit à la formation de sporozoïtes prêts à infecter d’autres humains. Cette dernière étape, dite cycle sporogonique (cycle C), s’effectue à une température supérieure à 18°C, expliquant ainsi l’absence de la maladie dans les montagnes tropicales et les régions tempérées froides (Gentilini, 1986).

14 II – INTRODUCTION ______c) Symptômes

Les symptômes cliniques de la malaria sont entièrement dus à la prolifération asexuée du parasite lors du cycle érythrocytaire. L’éclatement des érythrocytes coïncide avec les pics de fièvre, symptôme principal de la malaria. Au cours de chaque accès, se succèdent 3 phases caractéristiques: frissons (hypothermie), chaleur (la température du malade s'élève à 40.0°C-40.5°C), et enfin sueurs. En dehors des accès palustres, un syndrome grippal comme des céphalées, des fièvres ou un syndrome de gastro-entérite (troubles digestifs, vomissements, nausées) peuvent faire brouiller le diagnostic (De Gentile, 2008). Lorsque l’agent parasitaire est P. falciparum, un paludisme grave peut se manifester par certains signes biocliniques comme des défaillances neurologiques, respiratoires ou cardio-circulatoires, mais aussi par des convulsions répétées, une hémorragie et de l’anémie. Le risque de l’évolution en neuropaludisme ou paludisme cérébral se manifeste dans 40% des cas. (Willcox et al., 2004). Il se caractérise par un syndrome pernicieux dont le début est fréquemment brutal. Des troubles neurologiques comme des troubles de la conscience et de convulsions peuvent survenir et aller jusqu'au coma. Un paludisme grave non traité peut entrainer la mort dans 20-30% des cas.

d) Diagnostic

Un diagnostic complet du paludisme est notifié selon trois points : la présence des parasites, l’espèce incriminée et la parasitémie qui correspond au pourcentage d’hématies parasitées. Deux techniques de diagnostic rapide, l’analyse du frottis sanguin ou de la goutte épaisse (Thellier, 2002), se base sur la technique développée par Riekmann (Riekmann, 1978). Le frottis sanguin s’effectue avec une lame, un microscope et un colorant MGG (May-Grünwald, Giemsa). Cette technique peu onéreuse permet de distinguer l’espèce et de définir une parasitémie précise en 1 heure.

15 II – INTRODUCTION ______

Figure II-XIII Vue au microscope Figure II-XII Vue au microscope de trophozoïtes de P. falciparum de trophozoïtes de P. falciparum par la méthode au frottis sanguin par la méthode de la goutte épaisse (CDC, 2008) (CDC, 2008) La méthode d’analyse de la goutte épaisse requiert le même matériel, mais avec 1 à 2 heures de plus et un microscopiste expérimenté. Elle présente l’avantage d’être 10 fois plus sensible au détriment d’une estimation moins précise de la parasitémie (Delaunay et al., 2008).

II.3. RECHERCHE DE NOUVEAUX COMPOSES ANTI-MALARIQUES De façon générale, la recherche et le développement d’un médicament se segmente en plusieurs étapes qui s’étendent de l’isolement d’une substance active à sa mise sur le marché (Figure II-XIV). Ce processus coûteux peut prendre plus d’une dizaine d’années, d’autant plus qu’au final, sur approximativement deux millions de substances initiales, une seule sera finalement sélectionnée (Novartis, 2009).

Figure II- XIV Etapes pour le développement d’un médicament © (Novartis, 2009)

16 II – INTRODUCTION ______

Concernant le développement de traitements antimalariques, le profil optimal d’un médicament est défini en tenant compte des désavantages connus des substances antipaludiques actuelles. Idéalement, il est nécessaire que le composé soit :

¾ Efficace contre les souches de P. falciparum résistantes ¾ Sans contre-indication envers les enfants ¾ Sans contre-indication envers les femmes enceintes ¾ Efficace contre P. vivax ¾ Efficace contre les cas de malaria sévère

Par exemple, sur la base de ces informations, le portofolio 2008 de l’organisation Medicine for Malaria Venture défini six profils idéaux de traitement antimalarique qui répondent à des critères définis. Le tableau ci-dessous présente certains des paramètres requis pour le développement d’un médicament qui servira au traitement de la malaria chez un enfant ou un adulte (MMV, 2009).

Tableau II- 1 : Développement d’une combinaison thérapeutique sans dérivés d’artémisinine (NACTs) : Un schizonticide sanguin pour le traitement de la malaria non-cérébrale causée par P. falciparum, P. vivax, P. ovale and P. malariae chez un adulte ou un enfant (MMV, 2008) Paramètres Idéal Minimum requis EC contre les 4 espèces de Plasmodium 99 1 h < 4 h incluant les souches résistantes aux ACT Efficacité contre les 4 espèces de Plasmodium (après 7 jours) incluant les souches résistantes 100 % 100 % aux ACT Pas de contre-indication recommandé par Pas de contre-indication, Grossesse l’OMS Moins onéreux que le traitement recommandé Pas plus cher que le traitement recommandé Coût du traitement actuellement * actuellement * Biodisponibilité > 80 % 30% +

Durée de conservation 5 ans > 2 ans

* CoartemTM

17 II – INTRODUCTION ______a) Cibles

La cible moléculaire est une des approches importantes pour la découverte de nouveaux médicaments. Elle doit être validé, caractérisé chimiquement ou biologiquement et être sensible à une inhibition sans tendance à développer de résistance chez le parasite. Afin de tester des composés et découvrir de nouvelles activités, la cible doit être techniquement disponible pour le développement de méthodes de criblages à haut débit. A tous ces critères s’ajoutent les difficultés de valider sur le parasite, l’activité préalablement observée sur la cible. De part son statut d’étape clé du développement du Plasmodium, le cycle érythrocytaire est le site de choix de nombreuses cibles aux antipaludiques. La vacuole nutritive du parasite, résidence de l’étape de détoxification de l’hème, le cytoplasme, constitué du cytosol et de deux organites essentiels à la biosynthèse des acides nucléiques: les mitochondries et l’apicoplaste et finalement, la membrane plasmique, siège du trafic nutritionnel, sont indispensables au développement et à la prolifération du Plasmodium. Comme le démontre le tableau II-1, de nombreux médicaments antimalariques agissent sur ces cibles (Pink R, 2005). Il faut cependant ajouter qu’il existe peu de médicaments agissant au niveau hépatique, qui auraient l’avantage de prévenir à la fois les symptômes dus à l’invasion des érythrocytes et la contamination par un nouveau moustique.

Tableau II- 2 : Les principales cibles antipaludiques et les principales familles

Cibles Localisation Familles Substances pures Mécanisme Efficacité Vacuole digestive chloroquine, Detoxification de l’hème amodiaquine, quinine, (Stocks, 2002; Sullivan, méfloquine, 1996) ; Schizonticide halofantrine, Hemozoïne Quinolines sanguine & luméfantrine, tissulaire

Membrane de primaquine Transport à travers la transport membranes (Gero, 2003) Artémisinine, Schizonticide dihydroartémisinine Génération de radicaux libres sanguine & Hématine Vacuole digestive Artémisinines artésunate, (Eckstein-Ludwig, 2003) Gametocytocide artéméther, artééther Cytochrome c Mitochondrie atovaquone Transport d’électrons Schizonticide Naphthoquinones oxidoreductase (Vaidya, 2001) sanguin Dihydrofolate sulphadoxine, réductase (DHPS) ; Biosynthèse du folate Schizonticide Cytosol Antifolates (Mutabingwa, 2001; Nzila, sanguin Dihydroptéroate pyriméthamine, 2000) synthétase (DHFR) proguanil, dapsone Apicoplaste, Doxycycline, Synthèse protéique Schizonticide Apicoplaste Tétracycline ribosome tétracycline (Briolant, 2008) sanguin

18 II – INTRODUCTION ______

La caractérisation et l’importance de ces cibles présentées dans le tableau II-1 permettent de poursuivre la recherche et le développement de nouveaux médicaments.

b) Principales familles antipaludiques d’origine naturelle

Parmi les cinq familles principales présentées dans le Tableau II- 2, les quinolines et les artémisinines sont deux familles d’origine naturelle qui ont contribué à lutter de façon massive contre la malaria. Cela souligne l’importance et le potentiel que représentent les produits naturels dans la recherche de nouveaux composés antipaludiques.

Les quinolines 4 Cette famille de composés (5) comprend notamment, la quinine (1). Cet 5 6 3 alcaloïde quinoléique naturel est le composé majoritaire de l’écorce de 2 quinquina (principalement de Cinchona pubescens Vahl., Rubiaceae). Sa 7 N première extraction en 1820 et sa synthèse, un peu plus d’un siècle plus 8 1 tard, en font la molécule antipaludique la plus ancienne. Son utilisation 5 reste d’actualité dans des cas de paludisme grave et est injecté par Figure II- XV squelette quinoléique perfusion intraveineuse (Magill, 2005). Du fait de sa forte toxicité sur le système nerveux, elle a servi de modèle pour la synthèse de composés analogues. Dès les années 1920, la recherche des molécules dérivées ont abouti au développement des 4-aminoquinolines. La chloroquine (3), par exemple, s’est imposée dès les années 1940, aussi bien comme traitement prophylactique que comme traitement thérapeutique, du fait de sa grande efficacité contre les quatre espèces de Plasmodium humains, de son faible prix et des faibles effets secondaires engendrés

(Krogstad, 1996). Malheureusement, c’est au début des années 1960 que son action se trouve limitée avec l’apparition de souches de Plasmodium résistantes, nécessitant le développement d’autres dérivés analogues synthétiques comme l’amodiaquine (6) et la mefloquine (7). Cette dernière, introduite en thérapie en 1971 prouva, malgré ses effets secondaires (nausée, insomnie), une bonne efficacité sur les souches résistantes au traitement jusqu’alors utilisés de P. falciparum (Kitchen, 2006). Et ce, jusqu’à ce que des souches résistantes à son action soient également rapportées la rendant, elle aussi, inefficace dans certaines régions (Milijaona, 2000).

19 II – INTRODUCTION ______

N HN HO N HO H OH N HN H NH MeO N CF3

CF3 N Cl N Cl N 1 3 6 7 Figure II- XVI Quinine (1), Chloroquine (3), Amodiaquine (6), Mefloquine (7) De nombreux mécanismes ont été discutés afin de comprendre l’action antimalarique des quinolines et des 4-aminoquinolines. Les chercheurs sont cependant en accord sur plusieurs points. Leur accumulation dans la vacuole digestive est nocive pour le parasite. En effet, elles perturbent le processus de détoxification de l’hème par agrégation avec ce dernier (Olliaro, 1995; Yayon, 1985). Ainsi, leur action schizonticide antimalarique est principalement due à l’inhibition de la synthèse de l’hémozoine (Sullivan, 1996). La formation d’un complexe quinolines-Fe(III)protoporphyrine IX (Fe(III)PPIX) est affirmée in vitro par la présence d’une liaison de type π-π (Dorn and Ridley, 1998; Egan, 2006). Malgré ces informations, l’ensemble des mécanismes à l’origine de l’activité biologique de ces substances est encore à approfondir. Parallèlement, les 8-aminoquinolines, autre famille de composés synthétisés sur le modèle de la quinine dès les années 1920, retrouvent actuellement une certaine notoriété. Cet intérêt provient surtout du fait qu’elles n’agissent pas au niveau du cycle érythrocytaire et que leur mécanisme n’est pas entièrement résolu. La famille des 8- aminoquinolines, dont fait partie la primaquine (8), est la seule famille d’antimalariques à présenter une activité contre les stades hépatiques pour une prophylaxie secondaire et contre les stades sexués permettant ainsi une limitation de la transmission (Oliver, 2008).

MeO

N NH H2N

8 Figure II- XVII Structure de la (±)-primaquine (8)

20 II – INTRODUCTION ______

Les naphtoquinones Les naphtoquinones sont des pigments jaunes ou rouges, caractéristiques de certaines familles d’angiospermes comme les Ebenaceae, les Droseraceae et les Bignoniaceae (Bruneton, 1999). Elles font l’objet de nombreuses publications mettant en évidence leurs propriétés anticancéreuses (Verma, 2006) et antiparasitaires (Kayser, 2003). La synthèse Cl de dérivés synthétiques s’inspirant du squelette de base du lapachol, une 2-hydroxy-naphtoquinone extraite d’espèces du O genre Tabebuia (Bignonaceae) a permis le développement de l’atovaquone (9). Cet antimalarique synthétique est un OH inhibiteur sélectif du transport d’électron en se liant au O 9 cytochrome b de la chaîne respiratoire mitochondriale du Figure II- XVIII Structure de l’atovaquone (9) parasite (Ekala, 2007). Elle a peu d’impact thérapeutique lorsqu’elle est utilisée seule. En combinaison avec un antimétabolite, par exemple le proguanil, on observe une synergie intéressante d’action grâce à une inhibition séquentielle de la synthèse des pyrimidines. Une originalité de l’association atovaquone-proguanil est son action sur les stades hépatocytaires de P. falciparum (Touze et al., 2002).

Les artémisinines Artemisia annua L. (Asteraceae) est la plante qui a ouvert une nouvelle voie dans la recherche de composés antipaludiques. Bien qu’utilisée en médecine chinoise sous le nom de "Qinghaosu" depuis des millénaires, l’activité antimalarique de cette drogue a été mise à jour au début des années 1970, donnant lieu à l’isolement de son composé actif, l’artémisinine. Les nombreux Figure II- XIX Illustration de Artemisia annua L. © University of York travaux concernant ce sesquiterpène lactone mettent en évidence son activité biologique sur le Plasmodium (Wilairatana, 2002; Wright, 2002). Son action parasiticide rapide en fait le nouvel antimalarique de choix, détrônant ainsi la chloroquine et la combinaison sulfadoxine-pyriméthamine. Néanmoins, en vu de mettre sur le marché des composés actifs répondant aux normes pharmaceutiques, il a été nécessaire de synthétiser des dérivés comme la dihydroartémisinine (10), l’artéether (11), l’artésunate (12) et l’artémether (13) présentant une meilleure biodisponibilité et une meilleure efficacité.

21 II – INTRODUCTION ______

La stéréosélectivité impliquée lors de la réduction de la lactone et de la formation des dérivés de l’artémisine dépend des conditions et des solvants utilisés. Des exemples de synthèse sont présentés en figure II-XX (Walsh, 2007 ; Degani, 2008 ; Posner, 2008).

O O O O O O CH OH 3 O NaBH4, MeOH O H H H H O HO + H H Na H3B H 4 10

Et3N

O O O O O O O O O O O O H H H H HO O O H H O 10' 12

O O O O O O O + O O O H O O H H H H + H H H + C O O H H H H H 10 10'' 10'''

CH3CH2OH MeOH

O O O O O O O H H O H H O H C H 3 O H 11 13

Figure II- XX Structure de l'artemisinine et exemple de synthèse de ses dérivés : la dihydroartémisinine (10)

obtenue par réduction avec NaBH4 (Walsh, 2007), l’artéether (11) obtenue par étherification avec EtOH (Degani, 2008), l’artésunate (12) obtenus par estérification avec de l’acide succinique (Degani, 2008) et l’artémether (13) obtenue par étherification avec du MeOH (Posner, 2008). 22 II – INTRODUCTION ______

L’action rapide par élimination des parasites dans le sang en moins de 48 heures est une caractéristique des artémisinines. Cette famille agit au niveau du cycle érythrocytaire dans l’étape de digestion de l’hémoglobine, mais par un mécanisme tout à fait différent des quinolines. Le Fe2+ de l’hème agit de façon catalytique en ouvrant le pont peroxide de l’artémisinine, site clé de son activité. Cette réaction génère des radicaux libres qui réagissent avec les protéines du parasites, forment des métabolites et entraînent la mort de l’agent infectieux (Van Agtmael, 1999).

c) Familles de substances naturelles avec une activité antimalarique non-spécifique

Les flavonoïdes Le terme de flavonoïde regroupe l’ensemble des pigments quasiment universels des végétaux, avec actuellement plus de 6000 molécules d’origine naturelle décrites (Bruneton, 1999). L’enchaînement du 2-phenylchromane (14) constitue le squelette de base de cette famille de molécules composée d’une dizaine de classes nommées selon les différentes structures présentées dans la Figure II- XXI.

3'

2' 4'

8 O 5' 7 2 6' 3 6

5 4 Flavane 14

R R R R OH OH OH OH

HO O HO O HO O HO O

OH OH OH O OH O OH O OH Flavone Flavonol Flavanone Flavan-3-ol 15 16 17 18 R R R OH OH OH

HO O O HO

OH OH OH OH O OH O Flavan-3,4-diol Flavanonol Chalcone 19 20 21 R OH OH + HO O O HO O

OH O O OH

Aurone Isoflavone Anthocyanidine 22 23 24 Figure II- XXI Structure des différents types de flavonoïdes (14 – 24)

23 II – INTRODUCTION ______

La grande variété de réaction dont sont capables ce type de molécules permet d’expliquer les nombreuses activités biologiques répertoriées. Par exemple, les propriétés oxydo-réductrices qui résultent d’une oxydation du carbone en C2 avec ouverture du cycle, les propriétés acide-bases qui découlent d’un pKa variant en moyenne de 8 à 10.5 pour la plupart de ces molécule ou encore l’affinité des flavonoïdes pour les ions métalliques, accepteur d’électrons expliquée par la forte présence d’électrons π (Lehane and Saliba, 2008). Définis en général comme des inhibiteurs enzymatiques, propriétés démontrées in vitro, leur activité anti-inflammatoire et antiallergique peut être expliquée, en partie, par ce biais (Bruneton, 1999). Mais la propriété qui retient le plus d’attention est la capacité des flavonoïdes à emprisonner les radicaux, lui conférant ainsi des propriétés antioxydantes (Havsteen, 2002). Concernant l’activité antimalarique, cet intérêt est assez récent et a fait l’objet d’études confirmant l’influence de certains flavonoïdes contenus dans des extraits de plantes sur la croissance de P. falciparum (Lehane et al., 2008; Tasdemir et al., 2006). Par exemple, le fractionnement bioguidé, sur une souche K1 de P. falciparum, d’un extrait méthanolique de Satureja parvifolia (Lamiaceae) a abouti à l’extraction de la lutéoline (25) qui présentait un CI50 de 18.8 μM (Van Baren et al., 2006). Une autre étude, basée sur le même principe de recherche, démontre que la myricitine extraite des parties aériennes d’un extrait méthanolique de Euphorbia hirta Linn (Euphorbiaceae) présente une activité semblable à la lutéoline (Liu et al., 2007). L’extraction de trois nouveaux flavonoïdes présentant une inhibition sur la croissance du parasite suite au bioguidage sur un extrait des feuilles d’Hydrangeae macrophylla Ser. (Hydrangeaceae) a mené à une étude plus poussée sur la relation structure-activité (Murakami, 2001). L’incorporation de la lutéoline à différents stades du parasite dans le cycle érythrocytaire définit plus précisément son site d’action situé au niveau de jeunes trophozoites. Il s’en est suivi l’étude de l’addition de la lutéoline avec deux antimalariques connus, l’artémisinine et la chloroquine, qui n’a démontré aucun effet antagoniste de la part du flavone, ouvrant la voie sur l’étude plus approfondie de la combinaison de cette molécule avec un antimalarique (Lehane et al., 2008). Le mécanisme des flavonoïdes s’est quelque peu éclairé par le criblage mené sur une trentaine de flavonoïdes testant leur activité inhibitrice sur trois enzymes spécifiques à P. falciparum (FabG, FabZ, and FabI) impliquées dans la biosynthèse des acides gras résultant sur une inhibition intéressante de l’enzyme FabI par la lutéoline (Tasdemir et al., 2006)

24 II – INTRODUCTION ______

OH OH

HO O

OH O (25) Figure II- XXII Structure de la lutéoline (25)

Dans le cadre du développement d’une nouveau médicament, cette famille de molécules présente une activité antimalarique modérée quand on l’a compare à l’activité de la chloroquine qui est de l’ordre de 2 nM. De plus, la faible biodisponibilité et l’aspécifité de l’activité sur le Plasmodium font que le profil de cette famille de substance n’est pas en adéquation pour développer un candidat antimalarique intéressant.

Les tannins Cette famille de molécules est composée de molécules polyphénoliques ayant une masse moléculaire comprise entre 500 et 3000 kDa. Les tannins sont généralement divisés en deux classes : les tannins condensés et les tannins hydrolysables (tannin gallique et tannin ellagique). Ainsi, les tannins condensés, nommés également proanthocyanidols, sont définis par une suite d’unité de flavan-3-ol conduisant à la formation d’un polymère. Les tannins hydrolysables se reconnaissent par une molécule centrale, le plus communément un D-glucose relié par des liaisons esters à des unités d’acide gallique ou/et à une voire deux unités esters hexahydroxydiphéniques (HHDP). La capacité des tannins à former des liaisons avec les macromolécules, en particulier les protéines, explique en partie la plupart de leurs activités biologiques (Bruneton, 1999). Que se soit en usage externe pour régénérer des tissus lors de blessure, en usage interne en tant qu’antidiarrhéique, ou encore par son activité antiseptique, les tannins présentent de nombreuses propriétés. L’activité antioxydante prouvée in vitro peut expliquer le fait que les proanthocyanidols auraient un effet préventif à l’égard des maladies cardiovasculaire mettant ainsi à jour les effets bénéfiques du vin. L’inhibition de certaines enzymes est également à ajouter. Néanmoins avec ces nombreuses actions biologiques, et la facilité des tannins à se lier aux protéines, on peut se demander si chaque activité énumérée est bien sélective, tout en considérant en plus la toxicité connu des tannins. Dans le cadre de la recherche de substances antimalariques, l’activité des tannins sur la croissance de P. falciparum n’étant pas suffisamment sélective, nous les considérons, dans le cadre de cette étude, comme faux-positifs sur l’agent parasitaire.

25 II – INTRODUCTION ______

OH

OH OH HO HO O

OH HO O OH OH HO O OH OH OH O O O O HO O HO O O OH O O OH HO O OH OH OH OH HO O HO OH OH HO OH OH OH

26 27 Figure II- XXIII Exemple de structure pour un tanin condensé, le trimère de l’épicatechol-4b->8)-épicatechol-4b-8)- catéchol (26) et exemple de structure d’un tanin hydrolysable, le 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-b-D-glucose (27) d) Substances antimalariques en cours d’investigation

Les manzamines Issues de la famille des alcaloïdes, c’est dans les éponges marines comme les espèces appartenant aux genres Haliclona (Sakai, 1986), Amphimedon (Takashi, 2009) et Acanthostrongylophora (Zhang, 2009) que l’on trouve les manzamines. L’intérêt pour cette famille de molécules provient de sa grande palette d’activité : anti-neuroinflammatoire (Mayer, 2002), pesticide (Peng, 2003) antimicrobien (Nakamura, 1987) et antiparasitique (Rao, 2003) . En effet, la manzanime A, isolée pour la première fois en 1986, est fortement active in vitro contre P. falciparum avec un IC50 de 0.00102 nM (Londragan, 2006) ainsi que in vivo en inhibant la croissance de P. berhgei dans des souris infectées (Kenny, 2000). Néanmoins, à ces résultats, qui font de cette substance une molécule fort prometteuse, s’oppose sa cytotoxicité démontrée sur des cellules humaines (Ang, 2000). L’intérêt porté sur ce type de molécules vient du fait de la combinaison de son activité antineuroinflammatoire et antipaludique, qui permettrait de traiter l’infection et ses symptômes avec une seule substance. C’est pourquoi, la recherche se dirige actuellement sur la synthèse de dérivés de la manzamine A qui présenteraient peu de toxicité in vivo tout en gardant un activité semblable (Peng, 2010).

26 II – INTRODUCTION ______

Les trioxaquines Cette famille de molécule est un exemple récent de nouvelles molécules synthétiques que l’on peut définir d’hybride du fait de la combinaison de deux modes d’action. Constituées d’un groupement de type quinoléine, inspiré de la chloroquine, lié de manière covalente à un groupement endoperoxyde, typique des artémisinines, ces substances présentent un intérêt de part leur double attaque. En effet, elle inhibe à la fois la synthèse de l’hémozoine et s’attaquent à l’hémine par la génération de radicaux libres (Benoit-Vical et al., 2007; Meunier, 2008). Une récente étude présente un sélection de 120 trioxaquines testée in vivo et in vitro. Lors de ce travail, la SAR116242 a présenté une forte activité antimalarique avec un CI50 de 10 nM contre une souche résistante de P. falciparum (FcM29). Elle s’est également avérée efficace pour inhiber la croissance du parasite P. berghei sur des souris infectées. A ces résultats s’ajoute les essais cliniques afin d’évaluer la perméabilité in vitro, la stabilité métabolique ainsi que l’innocuité de cette substance qui placent cette trioxaquine en tant que bon candidat pour le développement d’un antimalarique (Coslédan, 2008). Cette molécule, en phase préclinique en 2008, fait partie d’un projet de développement mis en place par le MMV en collaboration avec Sanofi-Aventis (MMV, 2008).

e) Traitements sur le marché

On ne peut parler des médicaments actuels sans dire quelques mots sur le problème de la résistance. Elle est apparue contre toutes les classes d’antipaludiques à l’exception, jusqu’à présent, des dérivés de l’artémisinine. Son implication dans le taux d’échecs thérapeutiques constitue un frein dans la lutte contre la malaria. C’est avec une utilisation très répandue et sans discernement des antipaludiques que le développement de taux de résistance devient élevé. Cette résistance peut être évitée ou son apparition considérablement différée en associant des antipaludiques présentant des mécanismes d’action complémentaire. C’est dans ce contexte que, depuis 2001, l’OMS recommande le développement de thérapies combinées, contenant préférentiellement des dérivés de l’artémisinine (ACT) au détriment d’une utilisation en monothérapie (Falade, 2008; Guthmann, 2006; WHO, 2006). Comme sa synthèse n’est pas rentable par rapport à son isolement dans la plante, son prix élevé a énormément fluctué et constitue une barrière non négligeable pour le traitement concernant une maladie touchant en majorité des pays en voie de développement. Après de fortes variations de coût allant de 1000 $/kg en 2004 à 120 $/kg en 2006, conséquence d’une surproduction, le prix se situe aux alentours de 200 $/kg fin juin 2008 sur le marché asiatique. La stabilité du marché, basée sur un stock réellement nécessaire impliquerait de la part des industries

27 II – INTRODUCTION ______pharmaceutiques et des fournisseurs une réelle collaboration qui permettrait aux planteurs une situation économiquement stable.

Figure II- XXIV Zones de transmission du paludisme et de résistance à P. falciparum notifiées, 2004 (WHO, 2006)

Les partenariats privé-publique (PPP) faisant le lien entre la communauté internationale des chercheurs, le secteur public et l’industrie ont pour but de diminuer les coûts de recherche dans le cadre du développement de nouveaux traitements contre les maladies les plus répandues dans les pays en voie de développement. Cette voie de recherche alternative a permis la mise sur le marché de traitements antimalariques accessibles aux patients les plus pauvres de la planète. En 2007, l’introduction de l’ASAQ, formulation non-brevetée combinant l’artésunate (AS) et l’amodiaquine (AQ) à dose fixe, est l’aboutissement d’une collaboration coordonnée par le DNDi (Drugs for Negelected Diseases initiative, Organisation à but non lucratif, créée en 2003 par Médecins Sans Frontières) en partenariat avec Sanofi-Aventis, mettant à contribution plusieurs laboratoires et institutions. Un autre exemple est le partenariat entre l'organisation à but non lucratif, Medicines for Malaria Venture (MMV) et Novartis, qui a permis le lancement de Coartem® Dispersible. Il s’agit d’une association artémether–luméfantrine, introduite en 2008. Ces collaborations sont indispensables pour la recherche de nouveaux traitements efficaces contre les souches de Plasmodium multirésistantes et pour une éradication efficace de la maladie. Le tableau II-3 présente une liste des traitements antipaludiques actuels.

28 II – INTRODUCTION ______

Tableau II- 3 : Médicaments antipaludiques actuels (Boehm et al., 2007; DNDi, 2007; Documed-SA, 2009; MMV, 2009; Nau, 2007)

Indications & Effets Principes actifs Nom commercial Firme secondaires Quinine Quinimax ® Sanofi-aventis Cas de paludisme grave ; Antiarythmique de la classe IA Cas paludisme causé par P. Plaquenil® Sanofi-Aventis vivax, P. malariae, P. ovale et Chloroquine cas simple de paludisme de P. Nivaquine® Sanofi-Aventis falciparum; troubles visuels, vertiges, troubles digestifs Cas paludisme simple causé par P. falciparum ; Atovaquone-Proguanil Malarone® GSK céphalées, nausées, vomissements, diarrhées

DNDi & Sanofi - Cas paludisme simple causé Artésunate - amodiaquine Coarsucam™ par P. falciparum ; pas d’effet Aventis secondaire Riamet® Norvatis Pharma Cas paludisme simple causé Artémether - luméfantrine Coartem® MMV & Novartis par P. falciparum; vertiges, fatigue/asthénie Dispersible Pharma Artésunate- Cas paludisme simple causé Arsudar ® Sanofi Aventis sulfadoxine/pyriméthamine par P. falciparum Cas paludisme simple causé Artesunate – mefloquine Artequine™ Mepha Suisse par P. falciparum

29 II – INTRODUCTION ______

f) Méthodologie actuelle pour la découverte de nouveaux antimalariques et test de référence

La recherche de nouveaux médicaments, jusqu’à leur mise en place sur le marché, est un long et coûteux processus. La suite d’études permettant d’évaluer l’activité antimalarique peut se résumer de façon générale selon le

schéma ci-contre (Figure II- XXV). Une étude in vitro mesure, dans l’érythrocyte, l’efficacité de la substance sur la croissance de P. falciparum. Un résultat positif implique une suite d’études complémentaires in vivo, pour déboucher au final sur les études précliniques et cliniques. Cet exemple de scénario est un exemple parmi de nombreuses démarches pour l’étude de l’activité antipaludique de nouvelles substances. Les limites d’activités pour

définir un « hit », molécule présentant un CI50 d’au moins 1μM in vitro sur P. falciparum et un « lead », molécule présentant une réduction de la parasitémie d’au moins 90% in vivo sont inspirées de la méthodologie proposée par Fidock et al. (Fidock et al., 2004). Il est important de noter que l’étude sur de petits rongeurs s’effectue uniquement pour P. berghei, faute de développement de P. falciparum chez ce type d’hôte. L’identification d’un hit s’effectue à l’aide de deux tests de référence consistant à évaluer l’activité sur la croissance de P. falciparum. Le test in vitro développé par Riekmann, en 1976, consiste à étudier l’inhibition de la maturation des trophozoites en schizontes. En bref, le parasite est cultivé en présence d’une dose croissante de produits à tester durant 24 – 26 heures. Les érythrocytes Figure II- XXV Scénario colorés au Giemsa, agent colorant spécifique des chromosomes, sont étalés pour le développement d’un médicament sous forme de goutte épaisse sur une lame. La lecture au microscope permet antipaludique de comptabiliser la quantité de formes asexuées du parasite ayant subi une maturation normale (Riekmann, 1978; Wery, 1985). Le second test, complémentaire au premier, consiste à étudier l’inhibition de l’incorporation de l’hypoxanthine radiomarquée au tritium dans

P. falciparum ( Desjardins, 1979; Fidock et al., 2004). Il permet la détermination d’un CI50 précis et est plus sensible. En résumé, les parasites sont cultivés en présence du composé à analyser pendant 24 - 48h, puis le milieu de culture est remplacé par un milieu contenant de l’[3H]-hypoxanthine. 24h supplémentaires d’incubation à 37.5°C permettent la prise en charge de ce marqueur, précurseur d’acides aminés, par l’ADN du parasite. Après une congélation des cellules pendant 1h à -80°C, une lecture de l’émission beta de l’hypoxanthine est effectuée à l’aide d’un lecteur approprié pour

30 II – INTRODUCTION ______définir l’activité antimalarique du composé testé (Desjardins et al., 1979). Ces deux techniques de référence sont néanmoins longues, onéreuses et ne permettent pas d’effectuer du criblage à haut débit dans le cadre d’une recherche au niveau académique. Le réseau de centres du TDR/OMS, pilier pour la découverte de nouveaux médicaments antiparasitaires, compte une dizaine de laboratoires, dont 4 qui évaluent l’activité antiplasmodique. Chaque année, 20’000 composés peuvent être soumis in vitro et un millier environ pour une étude in vivo. (TDR, 2007).

Tableau II- 4 : Liste des centres évaluant les composés susceptibles d’avoir une activité antipaludique proposées par le TDR/OMS (TDR, 2007)

Institut Type d’analyse

Criblage in vitro pour Leishmania, Plasmodium, Trypanosoma ; Institut Tropical Suisse, Bâle (Suisse) évaluation in vitro et in vivo pour la trypanosomiase africaine

London School of Hygiene and Evaluation in vitro et in vivo pour le paludisme, la leishmaniose et Tropical Medicine (Royaume-Uni) la maladie de Chagas ; évaluation in vivo pour la schistosomiase

Institut Kitasato, Tokyo (Japon) Evaluation in vitro et in vivo du paludisme

Laboratoire de Microbiologie, Criblage in vitro à moyen débit par rapport à un ensemble de parasites Parasitologie et Hygiène, Université (Leishmania, Plasmodium, Trypanosoma). d’Anvers (Belgique)

g) Tests supplémentaires pour l’étude de l’activité antimalarique sur la croissance de P.falciparum

D’autres méthodes pour mesurer l’activité d’un composé sur la croissance de P. falciparum ont été développées. L’identification d’anticorps monoclonaux à P. falciparum a permis le développement d’un autre type de méthodes basées sur la technique ELISA (Enzyme linked ImmunoSorbent Assay) qui est une technique de détection immuno-enzymatique des anticorps à P. falciparum. Un premier anticorps, attaché au support, reconnait et se lie de façon spécifique aux antigènes du parasite. Puis un second anticorps également spécifique et porteur d’une enzyme est ensuite ajouté au mélange pour se lier à nouveau à l’antigène. L’ajout d’un substrat qui devient fluorescent en présence de l’enzyme permet la détection du parasite. Cette technique est appliquée en utilisant des gènes d’une protéine spécifique à P. falciparum, l’histidine-2-protéines, (Brockman et al., 2004) ou de la lactate déshydrogénase (Brockman et al., 2004; Kaddouri et al., 2006) avec une détection fluorimétrique ou encore colorimétrique (Druilhe et al., 2001). La sensibilité de cette technique permet de détecter

31 II – INTRODUCTION ______un érythrocyte infecté parmi un million d’érythrocytes. La reconnaissance de P. falciparum par un colorant fluorescent se fixant sélectivement sur ses acides nucléiques est une autre technique sur laquelle se basent de nombreuses méthodes (Johnson et al., 2007). Elles diffèrent néanmoins par l’utilisation de colorants tels que SYBR green I, PicoGreen et YOYO-1. (Baniecki et al., 2007; Corbett et al., 2004; Weisman et al., 2006). Que se soit dans les techniques ELISA ou les techniques utilisant des colorants, la mesure de la fluorescence ou de la colorimétrie de l’analyse en présence de quantité croissante d’un composé permet de vérifier son influence sur la croissance du parasite. Il est important de relever que ces résultats sont confirmés par les tests de référence, validant ainsi ces techniques. Il va sans dire que toutes ces méthodes in vitro requièrent non seulement une infrastructure coûteuse mais aussi du personnel qualifié, des contraintes liées principalement à la culture exigeante de P. falciparum. Le protocole de sécurité doit être suivi par un personnel qualifié protégé par une infrastructure adéquate. L’utilisation de produits radioactifs onéreux tant par leur utilisation que par le traitement des déchets, ou l’utilisation d’enzymes sont des obstacles supplémentaires pour les laboratoires qui ne sont pas spécialisés en microbiologie.

II.4. UN TEST QUALITATIF POUR LA RECHERCHE DE COMPOSES ANTIMALARIQUES D’ORIGINE

NATURELLE a) Une alternative pour les institutions académiques spécialisées en phytochimie

L’étude phytochimique des plantes présente l’avantage que l’on retrouve des laboratoires spécialisés aux quatre coins du monde. Les techniques d’analyses et de fractionnement sont nombreuses et varie pour chacun selon les finances à disposition. L’infrastructure du Laboratoire de Phytochimie et Pharmacognosie dirigé par le Pr. Hostettmann à l’Université de Genève- Lausanne (LPP) est hautement spécialisée et équipé des dernières technologies pour l’étude phytochimique et l’identification de substance naturelles. Néanmoins, lorsqu’il s’agit de déterminer une activité antimalarique, les laboratoires phytochimiques sans distinction se retrouve face au même problème : connaitre une activité sur un organisme pathogène (OP) de classe 3. La classe de risque associée aux OP s’échelonne de 1 à 4 et est proportionnelle au degré de sévérité de leurs effets et/ou au manque de moyens thérapeutiques. Il en résulte que la culture d’un parasite tel que P. falciparum requiert obligatoirement une infrastructure microbiologique, des mesures de biosécurité, un personnel qualifié dans ce domaine et des autorisations.

32 II – INTRODUCTION ______

Il en ressort que les collaborations entre laboratoires phytochimiques et parasitologiques est le meilleur investissement pour faire avancer la recherche. Dans notre cas, c’est grâce aux nombreuses collaborations établies avec des instituts spécialisés, tels que le FioCruz Institut au Brésil, la London School of Hygiene and Tropical Medicine (LSHTM), le Laboratoire de Microbiologie, Parasitologie et Hygiène de l’Université d’Anvers en Belgique et l’Institut Tropicale Suisse (STI) à Bâle que nous pouvons effectuer des études sur l’activité antiparasitaire de nombreuses espèces de plantes. Le temps d’attente d’un résultat pour la poursuite de la recherche dans ce domaine est déterminant. Ainsi, le bioguidage d’une plante pour aboutir à une substance pure active peut prendre plusieurs mois. Une présélection de plantes efficace, démontrant une activité sur une cible connue s’avère une étape cruciale dans l’optimisation du temps que requiert la recherche de substances antimalariques d’origine naturelle. Dans cette optique, plusieurs laboratoires ont développé des méthodes de criblage à haut et bas débit sur des cibles spécifiques n’incluant pas l’utilisation de P. falciparum afin de s’intercaler dans la méthodologie de recherche décrite à la figure II-XXV, sur un nouveau niveau que l’on peut baptiser « identification d’un HIT sur une cible ».

b) Détoxification de l’hème : le lieu de nombreuses cibles

Le cycle érythrocytaire, comme cité dans la partie II.2.b, est une étape importante du cycle de vie du Plasmodium, qui prend domicile dans le globule rouge afin d’y trouver la source d’énergie et d’acides aminés indispensables à son développement. Ainsi, 60-70% de l’hémoglobine est ingérée dans le cytoplasme puis transportée dans la vacuole digestive pour y être digérée par une série d’enzymes protéases (Francis et al., 1997). Cet apport indispensable au métabolisme du parasite entraine néanmoins un résidu non négligeable. L’hème, ce monomère ferrique libéré de l’enveloppe protéique est toxique pour le parasite (Orjih, 1981). Pouvant entrainer la lyse de la membrane et l’inhibition des protéases parasitiques, le Plasmodium dispose de plusieurs processus de détoxification de l’hème (Figure II-XXVI). Dans la vacuole digestive, milieu riche en oxygène et à bas pH, une partie des hèmes libres sont rapidement oxydés en hématine, pour enfin être transformés en un pigment noir, inerte et insoluble, l’hémozoine. (Kumar et al., 2007). Le mécanisme exact de cette biosynthèse longtemps considéré comme une polymérisation est définie aujourd’hui comme un processus de biocristallisation. Les molécules d’hèmes restantes passent dans le cytosol afin d’y subir un autre processus de dégradation spécifique au parasite guidées par la réaction en parallèle d’oxydation du glutathion (GSH) en glutathion disulfide (GSSG) (Garavito et

33 II – INTRODUCTION ______al., 2007). Les nombreux débats concernant la voie principale de détoxification de l’hème semblent avoir pris fin suite aux études menées par Egan et collaborateurs. La mesure du fer, par spectroscopie Mössbauer, dans la vacuole alimentaire conclue que plus de 85% de ce métal est intégré dans l’hémozoine. (Egan et al., 2002).

Figure II- XXVI Schéma des principaux processus de détoxification de l’hème

L’importance du processus de détoxification via la synthèse de l’hémozoine ajouté au fait que cette réaction est unique au Plasmodium en fait une cible de choix pour de nombreux antimalariques. D’ailleurs, la plupart des quinolines, dont la molécule phare, la chloroquine utilisée avec succès durant plusieurs dizaines d’années, agissent principalement sur cette cible (Egan and Ncokazi, 2005; Egan et al., 1994).

HO * N N Cl

O N Cl N N O * OH Cl 28 29 Figure II- XXVII Structure de Ro 06-9075 (28) et de Ro 22-8014 (29)

34 II – INTRODUCTION ______

Une autre étude présentée par Kurosawa et al. confirme l’intérêt que l’on doit porter à cette cible. En effet, une campagne de criblage menée en collaboration avec les laboratoires Roche sur plus de 100'000 composés synthétiques a aboutit à deux molécules. Ro 06-9075 (28) de la famille des triarylcarbinoles et Ro 22-8014 (29) de la famille des benzophénones, pourraient ouvrir une nouvelle voie recherche de nouveaux composés antimalariques basée sur une chimie différente des quinolines.

c) La synthèse de l’hémozoine : une cible de choix

Le mécanisme de synthèse de l’hémozoine implique aussi bien des réactions chimiques que des processus biologique. La protéine du parasite pfHRP-2 en tant qu’élément déclencheur de la réaction est le sujet de plusieurs études in vivo (Huy et al., 2003). La participation de lipides lors de la formation de l’hémozoine est également d’actualité (Fitch and Kanjananggulpan, 1999). Malgré ces observations, des études concernant la synthèse de son analogue synthétique, la β-hématine, démontrent que cette réaction a lieu spontanément en présence d’une solution d’acétate et dépend de conditions de température et de pH, similaires à celle de la vacuole alimentaire (Dorn, 1995; Egan et al., 2001; Slater et al., 1991). De par cette spécificité en partie physico-chimique, il est possible de mimer la réaction en laboratoire. Le composé synthétique, la β-hématine (30), est chimiquement, et structurellement identique à son homologue naturel, l’hémozoine (Egan, 2003). La seule différence entre ces deux analogues se trouve au niveau de la cristallisation. Cette variation morphologique peut être détectée par microscopie électronique à balayage mettant en évidence l’hémozoine, qui cristallise dans son milieu biologique avec une structure régulière et plate 20 fois plus grande que la β-hématine, aux formes moins régulières (Tekwani and Walker, 2005).

HO O O O N N Fe(III) N N

N N Fe(III) N N O O O OH

HO O O O N N Fe(III) N N

N N Fe(III) N N O O O OH 30

Figure II- XXVIII Structure de l’hémozoine/β-hématine (30)

35 II – INTRODUCTION ______

Malgré cette différence morphologique, ces deux molécules sont considérées identiques. En effet, les données obtenues par les études de solubilité, par spectroscopie infrarouge et par rayon X confirment les équivalences entre l’hémozoine et la β-hématine et définissent le cristal comme une suite de dimères reliés entre eux par des liaisons hydrogènes. La partie dimérique composée de deux unités Fe(III)-PPIX comporte deux liaisons Fer–carboxylate liant les monomères entre eux (Pagola et al., 2000), avec la spécificité de ne contenir que du Fer3+ (Bremard et al., 1993).

d) Tests de criblage basés sur l’inhibition de la synthèse de l’hémozoine/β-hématine

Les publications concernant des tests d’inhibition de la synthèse de la β-hématine ou de l’hémozoine sont nombreuses. On peut tout d’abord distinguer la biosynthèse de l’hémozoine de la synthèse de la β-hématine. La méthode de synthèse de la β-hématine s’effectue en général, avec une solution d’hématine en milieu tamponné à un pH inférieur à 5.5 avec une solution d’acétate à forte concentration, le tout étant mis en incubation (Baelmans et al., 2000). La biosynthèse diffère de la méthode chimique uniquement par l’utilisation d’initiateurs biologiques comme du lysat de P. falciparum (Pandey et al., 1999), de l’hémozoine purifiée, de la protéine PfHRP-2 (Dorn et al., 1998) ou encore des extraits lipidiques du parasite (Tripathi et al., 2001) qui requiert de plus petites concentrations d’acétates. L’influence d’un composé par inhibition de la réaction peut se détecter directement par mesure de l’hémozoine ou de la β-hématine (30). Une caractérisation par spectrométrie FT-IR de la β-hématine/hémozoine permet de les différencier de l’hématine, par la présence des bandes à 1664 et 1210 cm-1 typiques de la liaison carboxylate-Fer contenue dans le noyau porphyrine (Egan et al., 1999; Slater et al., 1991). Selon Egan et ses collaborateurs, l’analyse spectrométrique par FT-IR permet le suivi de la réaction en observant l’augmentation de l’intensité de la bande à 1210 cm-1, caractéristique de la vibration de C-O et de C=O liés au fer(III) de la protoporphyrine IX. La différence en intensité de cette bande à 1210 cm-1 et celle situé à 1229 cm-1, appelée ΔA1210 est une valeur directement proportionnelle au rapport de masse entre l’hématine et la β-hématine. La masse finale peut ainsi être calculée à l’aide de l’équation II- I (Egan et al., 2001).

m= masse d’hématine final m = masse d’hématine initiale (Equation II – 1) m ΔA 0 = 1− ΔA=A1210 – A1229 initiale m0 ΔA∞ ΔA∞= A1210 – A1229 finale

36 II – INTRODUCTION ______

Néanmoins, cette technique n’est pas suffisamment précise pour effectuer une quantification. En effet, la bande Soret, caractéristique des noyaux porphyrines située aux alentours de 400 nm (Rimington, 1960) ne permet pas de distinguer l’hématine du produit de synthèse. En effet, du fait de l’environnement semblable de leur noyau porphyrine, la différence entre les longueur d’onde des maximas d’absorption de ces deux bandes est trop faible. Ainsi, c’est en se basant sur la différence de solubilité, obtenue par un lavage avec une solution tampon de Tris/SDS et une solution de bicarbonate pour éliminer l’hème, qu’une quantification du pigment synthétisé est effectuée par détection UV-Vis (Baelmans et al., 2000; Tripathi et al., 2004). Une étape de séparation chromatographique sur une phase inverse échangeuse d’ion est également un moyen de quantifier le pigment malarique de façon sélective sans avoir à effectuer les nombreux processus de lavage (Berger et al., 1995). L’incorporation d’hématine marquée au 14C au cours de la synthèse est une autre option qui permet la détection de l’hémozoine de façon radioisotopique (Kurosawa et al., 2000). Une approche différente consiste à détecter de l’hématine non polymérisée, témoin d’une inhibition de la réaction de synthèse, pour déterminer une activité inhibitrice de la réaction. Cette approche propose un dosage indirecte de la β-hématine, par la détection UV-Vis d’un complexe pyridine-hématine (Ncokazi and Egan, 2005).

e) Choix d’une méthode de criblage

Le choix d’une méthode de criblage pour tester des plantes dans le cadre de la recherche de nouveaux composés antimalariques est le premier jalon de ce travail de thèse. Idéalement, une méthode de criblage peu coûteuse qui requiert du matériel facilement disponible et qui s’effectue en peu de temps est non seulement un avantage pour le LPP mais également pour d’autres laboratoires implantés dans des pays en voie de développement, sièges de la malaria. Notre ligne directive se base donc, sur des critères de temps, de coûts et des possibilités imposées par l’infrastructure. La réaction de synthèse de l’hémozoine est comme nous l’avons vu une cible idéale du fait qu’elle est unique au Plasmodium, qu’elle est la cible de nombreux antimalariques et qu’elle est reproductible en laboratoire. D’autre part, les résistances des souches de P.falciparum face aux quinolines proviennent de mutations de protéine des membranes de la vacuole alimentaire. Ce qui veut dire que la résistance ne s’applique pas au niveau de la formation de l’hémozoine. Cette réaction reste donc une cible de choix pour le développement de nouveaux antimalariques (de Villiers et al., 2008). C’est donc parmi les tests de criblage basés sur cette réaction et présenté précédemment qu’il a fallu faire un choix. Une bonne partie des méthodes ont été éliminées car impliquant l’utilisation

37 II – INTRODUCTION ______du parasite P. falciparum pour la biosynthèse de l’hémozoine. Ainsi, la méthode Phiβ-assay proposée par Ncokazi et Egan s’est imposé tout naturellement de part l’infrastructure à disposition et par les conditions du test qui permet l’utilisation de réactifs facilement disponibles, peu couteux et d’une détection UV-Vis, technique abordable, sans déchets radioactifs (Ncokazi et al., 2005).

f) Phiβ-assay

La synthèse de la β-hématine (30), basée sur les conditions proposée par le Phiβ-assay (Ncokazi et al., 2005), est effectuée à partir d’hémine (31) de bovin. Les études effectuées par le groupe à l’origine de ce test sont nombreuses à ce sujet. Les différents paramètres de synthèse ont été étudiés puis optimisés. Le produit de synthèse a été identifié par spectrométrie infrarouge (FT-IR), par spectrométrie Mössbauer, par diffractométrie par rayon X (XRD) ainsi que par microscopie électronique. Il en résulte que le pH du milieu réactionnel est important pour le bon déroulement de la réaction de synthèse. Il doit être tamponné à pH 4.5 avec une solution d’acétate 12.9M (pH 5). Une température optimale de 60°C est idéale pour une synthèse en 60 minutes (Egan et al., 2001; Egan et al., 2005; Egan et al., 1994). Le test se déroule alors par une mise en solution de l’hémine (31) dans une solution basique pour l’oxyder en hématine (32). Une incubation à 60°C pendant 60 minutes en présence d’une solution d’acétate (12.9 M, pH 5.0) forme le pigment synthétique (30). En présence d’un inhibiteur, la réaction de synthèse est ralentie voir même stoppée. L’ajout d’une solution de pyridine 10% dans une solution tampon d’Hepes à pH 7.5 en fin de réaction, permet de vérifier une inhibition de la réaction, par une coloration rouge de la solution.

38 II – INTRODUCTION ______

. 2H+ OH O O O O O O Cl O O O OH N N Sol. Acétate Fe(III) N 60°C N O N N 3+ NaOH N N 60 min Fe 3+ Fe O N N N N pH 5 O

31 32 O N N Fe(III) N N pH 7.5 2 N O

OH 30 O O O O N

N 3+N Fe N N N

33

Figure II- XXIX Schéma général de la méthode Phiβ-assay

Une détection sans ajout de pyridine par UV-Vis n’aurait pas permis de distinguer l’hématine du composé de synthèse, la β−hématine, à cause de la proximité des maximas de leurs bandes Soret. C’est à ce niveau que cette technique se distingue. En effet, c’est le complexe ferrihemochrome- pyridine (Py-Fe(III)PPIX) (33) de couleur rouge formé sélectivement avec l’hématine qui présente un maxima du pic d’absorption à 404 nm qui est détecté. L’affinité de la pyridine pour former un complexe avec le fer central d’une porphyrine est à la base de technique reconnue et validée pour la quantification de l’hème (Porra and Jones, 1963; Riggs et al., 1981). Dans ce sens, la distinction entre l’hématine et la β-hématine a été étudiée en profondeur par Egan et collaborateurs et a permis la mise en place du test « pyridine-hemichrome assay », baptisé Phiβ-assay. La complexation sélective du ligand avec l’hématine dépend de plusieurs facteurs. Le pH doit être en-dessous de 7.5 pour permettre la formation du complexe pyridine-Fe(III)PPIX et la concentration de pyridine ne doit pas être trop élevée afin d’éviter qu’elle ne s’insère entre les dimères de la β-hématine pour se lier au fer, perdant ainsi la sélectivité de la complexation. Dans ces conditions, deux molécules de pyridine se lient à Fe(III)PPIX entrainant un déplacement du maxima de la bande Soret de l’hématine de 15 nm, qui passe de 389 à 404 nm (Ncokazi et al., 2005). Rappelons au passage que la bande Soret, qui absorbe généralement entre 390 et 430 nm ainsi que quatre bandes de moindre

39 II – INTRODUCTION ______intensité situées entre 480 et 700 nm appelées bandes Q (notées de I à IV par ordre décroissant des longueurs d'ondes) sont caractéristiques des noyaux porphyrines. Cette distinction sélective par UV-Vis entre le réactif, l’hématine, et le produit, la β-hématine, sans avoir à effectuer de nombreux lavages est un avantage qui s’ajoute à une synthèse facilement réalisable, des produits disponibles et peu couteux. La validation de cette méthode a été effectuée sur des substances antimalariques pures faisant partie de la famille des quinolines qui ont démontré une activité sur la synthèse de l’hémozoine. La détermination des CI50 a été effectuée sur 13 quinolines et une corrélation de ces résultats avec les

CI50 obtenus sur la croissance du P. falciparum et d’autres test basés sur la même cible a fait l’objet d’une étude qui confirme la validité de ce test (Ncokazi et al., 2005). De plus, cette méthode apporte une information supplémentaire et non négligeable. En effet, elle permet de connaître l’un des processus qui est à l’origine de l’activité antimalarique d’une substance. En conclusion, ce test est un moyen rapide d’évaluer l’activité antimalarique de façon quantitative de composés purs sur une cible validée.

40 II – INTRODUCTION ______

II.5. PRESENTATION DES PLANTES ETUDIEES a) Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae)

La famille des Ericaceae La famille Ericaceae compte environ 4000 espèces, regroupées en 124 genres, qui se répartissent sur le globe de façon plutôt cosmopolite (Maberley, 1987). Leur prédominance s’étale des zones froides ou tempérées à basse altitude jusqu'aux montagnes des zones tropicales avec une forte concentration dans les régions de l’Himalaya, de la Nouvelle-Guinée et dans les Andes. C’est dans les climats de type méditerranéens, que l’on observe la plus grande diversité d’Ericaceae, comme par exemple en Australie et en Afrique du Sud (Stevens et al., 2004)

Figure II - XXX Répartition mondiale des Ericaceae (Stevens et al., 2004)

Description botanique et classification systématique On rencontre les Ericaceae sous forme d’arbustes, parfois très petits ou subherbacées, d’arbres voir plus rarement sous forme de lianes ou d’épiphytes. Leurs feuilles alternes à subopposées ou verticillées peuvent être entières, dentées ou en aiguilles appelées éricoïdes. Elles sont penninervées et dépourvues de stipules. L’inflorescence est très variable et peut parfois être réduite à une fleur. Terminales ou axillaires, souvent racémeuses ou paniculées, les fleurs, petites, sont actinomorphes pentamères et hermaphrodites. Le calice est persistant et est constitué de 4-5 sépales plus ou moins soudés à la base, parfois réduit à un anneau. Les pétales sont généralement soudées en tube. La corolle est campanulée, en forme d’urne ou sphérique, aux lobes généralement petits et distincts. L’androcée, à 8-10 étamines libres, est obdiplostémone. Les filets sont libres et soudés sur le réceptacle, les anthères sont à déhiscence poricide. Un disque nectarifère intrastaminal est parfois présent. L’ovaire est libre et souvent supère. Le fruit est une petite baie charnue et indéhiscente ou

41 II – INTRODUCTION ______une capsule sèche déhiscente parfois enfermée dans une corolle persistante. La graine est très petite, souvent ailée à albumen charnu (Maberley, 1987; Spichiger et al., 2000). La position systématique des Ericaceae selon les différentes approches phylogénétique ou morphologique est présentée dans le tableau ci-dessous (Cronquist, 1988; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998; Thorne, 1992; Thorne, 1992).

Tableau II- 5 : Position systématique des Ericaceae (Cronquist, 1988; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998; Thorne, 1992; Thorne, 1992).

Cronquist (1988) Thorne (1992) APG II (2003) Règne Plantae Plantae Plantae Embranchement Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophytae Sous- - - Angiospermae enbranchement Classe Magnoliopsida Magnoliopsida Eudicots Sous-classe Dilleniidae Magnoliidae Rosidae Ordre Ericales Ericales Asterids Sous-ordre - - Ericales Famille Ericaceae Ericaceae Ericaceae

Utilisation des Ericaceae L’utilisation courante des Ericaceae comme plantes d’ornements font que l’on rencontre facilement dans nos jardins et maisons les deux genres les plus importants de la famille : les rhododendrons (Rhododenron spp.) et les bruyères (Erica spp.) (Watson and Dallwitz, 1992). C’est également dans la vie courante, mais du côté gastronomique cette fois-ci, que certaines espèces du genre Vaccinium sont connues pour leur baies comestibles, citons la myrtille, fruit de V. myrtillus L. ou encore l’airelle pour V. vitis-idaea L. Malheureusement, la toxicité est également reconnue pour certaines espèces de Rhododendrons, mais également pour d’autres espèces du genre Pieris ou Kalmia pouvant toucher non seulement les animaux mais également l’homme. Les nausées, vomissements, hypotension ne sont que quelques uns des symptômes provoqués par des composés du type grayanotoxine, contenus dans les feuilles des espèces toxiques du genre Kalmia ou Rhododendrons (Scott et al., 1971). En médecine traditionnelle, on retrouve des espèces bénéfiques pour les femmes mentionnées pour la première fois au XIIIe siècle pour soigner les reins et les affections urinaires. Le raisin d’ours (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng) est désormais reconnu comme agissant contre les bactéries, parmi lesquelles Escherichia coli et Enterococcus faecalis, lors d’ inflammations légères des voies urinaires et de la vessie (Blumenthal, 1998; Hostettmann, 2008).

42 II – INTRODUCTION ______

L’arbutine une pro-drogue qui peut s’obtenir par une macération à froid des feuilles de raisin d’ours s’hydrolyse une fois dans l’urine en une hydroquinone, substance antiseptique agissant uniquement lorsque l’urine est alcaline. La canneberge, Vaccinium macrocarpon Aiton., agit quand à elle en inhibant l’adhésion des bactéries, notamment les colibacilles sur les muqueuses de la vessie et l’urètre (Hostettmann, 2008). Un dernier exemple est le soulagement des jambes lourdes due à une insuffisance veineuse par des préparations à base de myrtille (V. myrtillus L.), riche en anthocyanosides, qui confère également à cette plante la propriété d’améliorer la vue en lumière atténuée (Bruneton, 1999).

Le genre Loiseleuria Desv. ex Loisel. Le genre Loiseleuria ne compte qu’une seule espèce, Loiseleuria procumbens (L.) Desv. connue préalablement sous le synonyme d’Azalea procumbens L. Historiquement, le genre Azalea fut cité pour la première fois en 1753 par Linné, puis regroupé dans le genre Rhododendron, composé d’environ 1000 espèces, plus communément connu pour certaines sous les noms de rhododendron et d’azalée en tant que plantes d’ornement. C’est en 1812, que la création d’un nouveau genre baptisé Loiseleuria par Desvaux se distingue par ses feuilles opposées, persistantes, ses fleurs terminales en grappe ou en ombelle dont la corolle est subcampanulée et les anthères s’ouvrant longitudinalement. Sa capsule se distingue par 2 à 3 valves septicides (Grenier and Godron, 1852).

L’espèce L. procumbens L. Cette plante est un petit sous-arbrisseau de 10 à 30 cm couché qui forme des coussins très denses sur les croupes ventées et sur sols siliceux. Cette espèce est glabre, à tiges couchées, étalées et à rameaux diffus avec des petites feuilles persistantes, opposées. C’est en début d’été (juin, juillet) que ses fleurs roses, petites, dressées et groupées de 2 à 5 en ombelles terminales se dévoilent facilitant ainsi son Figure II – XXXI Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae) identification. La corolle est caduque, en cloche et fendue ©copyright J.-L. TASSET jusqu'au milieu en 5 lobes réfléchis. L’androcée est constituée de 5 étamines. On la retrouve dans les rochers et pelouses des hautes montagnes d’Europe centrale et boréale, d’Amérique boréale et dans les terres arctiques (Coste, 1937; Grenier et al., 1852).

43 II – INTRODUCTION ______

Etudes phytochimiques antérieures La première étude phytochimique de Loiseleuria procumbens répertoriée (Serve, 1986) relate la présence de substances de type phénoliques et acides-phénols dont le phloridzoside (34), le phloretol (35) et l’acide phloretique (36).

HO

HO R S O S S R HO O OH

HO OH OH

(34)

OH O O

HO HO OH OH OH (35) (36) Figure II- XXXII Le phloridzoside (34), le phloretol (35), and l’acide phloretique (36) isolés de L. procumbens (Serve, 1986)

Plus tard, l’activité antioxydante de L. procumbens a été mise à jour lors d’études ayant recourt soit au radical 1,1-diphényl-2-pyricylhydrazyle (DPPH) (Cuendet et al., 2000) soit en mesurant sa capacité à ralentir l’apparition de diènes conjuguée lors de la peroxydation de lipoprotéines humaines (LDL) (Fraser et al., 2007). C’est dans le cadre d’un travail de thèse effectué en 2000, au LPP (Cuendet, 1999), que l’isolement de nouvelles molécules et ainsi que leur activité antioxydante ont été effectués. Ainsi, la spectroscopie RMN et les analyses par spectrométrie de masse ont permis l’identification de deux autres hydrochalcones, l’asebotine (37) et le 6’’-acétylphloridzoside

(38), ainsi que d’un stilbène, le piceid (resvératrol-3-O-β-glucoside) (39). Parmi toutes les substances isolées, seul le dernier composé à démontré une activité antioxydante modérée(Cuendet et al., 2000).

44 II – INTRODUCTION ______

HO OH HO R HO OH S O S S R S S R AcO R S HO O O O O O OH

CH3O OH OH HO OH OH

(38) (37)

OH OH HO O E R S S

S R O HO

OH (39) HO Figure II- XXXIII Composés complémentaires isolés de L.procumbens : l’asebotine (37), le 6’’-acétylphloridzoside (38) et le piceid (resvératrol-3-O-β-glucoside) (39)

b) Chamaesyce buxifolia Small (Euphorbiaceae)

La famille des Euphorbiaceae Juss. La famille des Euphorbiaceae est la sixième plus grande famille des plantes à fleurs consistant en plus de 5000 espèces classées dans plus de 300 genres. Distribuée à travers les régions tempérées et tropicales des deux hémisphères, elle est largement présente dans les régions tropicales humides et subtropicales.

Description botanique et classification systématique Malgré sa grande diversité représentée par des arbres, des arbustes, des plantes grimpantes ou encore des herbes, elle se caractérise par des tiges parfois succulentes avec une sève laiteuse ou colorée. Les feuilles à pétioles sont alternées ou moins communément opposées avec à leur base un stipule libre parfois caduque. Le limbe se présente aux nervures pennées ou palmées, composée ou simple, lobée. L’inflorescence de type indéterminée en épi peut s’agréger. Les fleurs unisexuées, actinomorphes se définissent avec un calice comportant 3-6 sépales et la corolle est constituée de 3- 6 pétales. Le fruit en forme de capsule présente 3 fentes déhiscentes, contenant 1 à 2 graines par enveloppe (Oldfield and Carter, 1997; Woodson et al., 1967). La classification de cette famille selon les différentes approches phylogénétique ou morphologique est bien établie et présentée dans

45 II – INTRODUCTION ______le tableau II-5 (Cronquist, 1988; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998; Thorne, 1992; Thorne, 1992). Tableau II- 6 : Classification systématique de la famille des Euphorbiaceae (Cronquist, 1988; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998; Thorne, 1992; Thorne, 1992)

Cronquist (1988) Thorne (1992) APG II (2003) Règne Plantae Plantae Plantae Embranchement Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophytae Sous- - - Angiospermae enbranchement Classe Magnoliopsida Magnoliopsida Eudicots Sous-classe Rosidae Magnoliidae Rosidae Super-ordre - Malvanae Eurosidae I Ordre Euphorbiales Euphorbiales Malpighiales Famille Euphorbiaceae Euphorbiaceae Euphorbiaceae

Utilisation courante et études phytochimiques antérieures L’utilisation des plantes de la famille des Euphorbiaceae est principalement connue par le grand publique pour l’ornement, comme par exemple Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch connu sous le nom de rose de Noël. Cependant, c’est dans les procédés industriels que l’on remarque la plus grande utilisation des Euphorbes. En effet, on peut citer l’industrie du latex substance obtenu à partir de Hevea brasiliensis (Willd. ex A.Juss.) Müll.Arg. ou de Manihot glaziovii Müll.Arg. L’utilisation du Manihot esculenta Crantz, plus communément connus sous le nom de manioc, en tant que source importante d’amidon et Aleurites moluccana Willd. source d’huile pour l’industrie papetière et respectivement de la peinture sont des ressources importantes pour les pays tropicaux (Singh, 2004). Malgré cela,

Figure II– XXXIV la présence de diterpènes toxiques localisés généralement dans le latex et Récolte de latex sur Hevea brasiliensis contenus dans 14 des 300 genres que forme la famille des Euphorbiaceae (CHUV, 2009) parmi lesquels : Aleurites, Croton, Euphorbia, Jatropha rendent certaines plantes dangereuses pour les animaux et pour les hommes (Bruneton, 1999). On retrouve notamment des diterpènes de type esters du phorbol, substance cancérigène comme le phorbol 12- myristate 13-acetate (40), connu sous le nom de TPA et retrouvé dans des espèce du genre Croton L. (Bauer et al., 1983).

46 II – INTRODUCTION ______

O O

CH3(CH2)11CH2 O O R S H RH S R

S S H R O HO OH (40) Figure II – XXXV Phorbol 12-myristate-13-acétate (TPA ou PMA) (40)

Malgré cette toxicité, certaines espèces sont des sources alimentaires aussi bien pour l’homme que pour le bétail. Par exemple, le manioc, M. esculenta, source d’hydrate de carbone peu couteuse et facilement cultivable, est un aliment de base dans les pays d’Amérique du Sud, d’Afrique et d’Inde. La cuisson de ses tubercules contenant de la manihotoxoside qui, par hydrolyse, produit de l'acide cyanhydrique très toxique pour l'homme, les rend consommable pour la préparation de la farine ou encore du tapioca. On peut également citer Cnidoscolus chayamansa McVaugh qui fait office de légumes ou encore les fruits comestibles, légèrement amère d’Antidesma bunius Spreng et de Phyllanthus emblica L..

Le genre Chamaesyce Gray Le genre Chamaesyce cité pour la première fois en 1821 par Samuel F.Gray (1766-1828) fut transféré en tant que sous-genre d’Euphorbia Linn. en 1924 par Homer D. House (1878-1949) (House, 1924). Dès lors, ce transfert, source possible de confusions, est rapidement éclairé dans les bases de données qui citent au côté du genre Chamaesyce Gray, le genre Euphorbia Linn. en tant que synonyme (IPNI, 2004; Tropicos.org, 2009).

Le genre Euphorbia Linn. Euphorbia est le genre le plus important des plantes à fleurs comptant plus de 2000 espèces et distribuée dans les zones tempérées à tropicales. Avec plus de 1300 espèces herbacées, on rencontre également des arbres et des espèces frutescentes ou succulentes. Ces dernières se situent principalement dans les zones sèches du continent africain (Carter et al., 1998). Le latex contenu dans les feuilles et les tiges est généralement abondant et caustique. Il était principalement utilisé comme poison en Amérique du Sud pour imbiber les flèches lors des chasse ou en période de guerre (Bruneton, 1999).

47 II – INTRODUCTION ______

Utilisation en médecine traditionnelle Certaines espèces d’Euphorbia sont couramment sollicitées en médecine traditionnelle que ce soit en Europe, en Extrême-Orient ou en Afrique. En Europe, les recettes familiales préconisent la sève d’E. helioscopia L. pour éliminer les verrues. Au Rwanda, le latex d’E. candelabrum Tremaut ex Kotschy est utilisé pour traiter la blennorragie et le paludisme. E. pekinensis Rupr. est citée dans la pharmacopée chinoise pour ses vertus antidiarréhiques, antinauséeuses et émétiques (Boullard, 1999). E. hirta L. utilisé en Afrique du Sud pour lutter contre l’asthme, lorsque les médicaments, à cause de leur coût, sont inaccessibles. Elle est également prescrite dans les cas de rhume et lors d’infections urinaires (Ekpo and Pretorius, 2007). On retrouve également une préparation brevetée à base de cinq plantes dont E. kansui Liou ex S.B.Ho, riche en flavonoïds, pour combattre la malaria (Linggang, 2006).

Etudes phytochimiques antérieures et activité biologique Si l’on se réfère aux études phytochimiques effectuées à ce jour sur les espèces du genre Euphorbia, les premières molécules recensées sont des polyphénols de type flavonoïds. Des flavones et des flavonols et certains homologues glycosylés (Figure II-XXXV) ont été isolés de plusieurs espèces d’Euphorbia (Mueller and Pohl, 1970). L’activité antioxydante de deux espèces, E. maculata L. et E. humifusa Willd., a été reliée à la forte teneur en flavonoïdes (Dewir et al., 2006; Shuo et al., 2007). E. hirta L. est, quant à elle, utilisée en tant que source de flavonoïdes glycosylés dans le cadre d’une préparation phytothérapeutique antimalarique. Cette étude présente d’ailleurs des inhibition supérieure à 50 % de la croissance de P. falciparum due à la myricetine, la quercétine et l’afzelin à une concentration de 5 μg/ml (Hirotoshi et al., 2005). C’est dans les racines, les tiges et les feuilles de plusieurs espèces appartenant au genre Euphorbia que se répartissent d’autres polyphénols, les tannins (Abdulladzhanova et al., 2003). On les retrouve généralement sous forme de tanins hydrolysables de type gallique ou ellagique (Gvazava and Alaniya, 2005; Gvazava and Alaniya, 2000; Lee et al., 2004) conférant à certaines espèce des propriétés antiseptiques (Ekpo et al., 2007).

48 II – INTRODUCTION ______

OH OH OH OH

HO O HO O HO O OH OH

OH OH OH OH O OH O OH O

(41) (42) (43) OH

HO O OH

HO O O OH O

HO S OH O R O R S R (44) HO OH (45) Figure II – XXXVI Flavonoïds isolés d’espèces appartenant au genre Euphorbia : Kaempférol (41), Quercétine (42), Myricétine (43), Apigénine (44), Afzelin (45)

On retrouve dans le genre Euphorbia d’autres métabolites secondaires connus, tels que les diterpènes cycliques de type ester du phorbol. Leur activité en tant que substances cancérigènes agissant au niveau de la protéine kinase C pour certains composés tels que le TPA (40) présenté précédemment (Goel et al., 2007), s’oppose à l’intérêt particulier porté à l’ingénol-3-angelate (46). Cette molécule appartenant à la même classe de composés et isolé de E. peplus L. est actuellement en phase clinique II en tant qu’agent anti-tumoral pour le traitement de carcinomes et de kératoses actiniques (Ogbourne et al., 2007).

O R S O R R S S R S Z O OH OH OH

(46) Figure II – XXXVII Structure de l’ingénol-3-angelate (46)

Relevons une dernière étude intéressante où l’activité du piceatannol, un stilbène isolé des graines de E. lagascae que l’on retrouve également dans Vitis vinifera en tant que métabolite du resvératrol (Zga et al., 2009), s’est montré fort prometteur contre Leishmania donovani (Duarte et al., 2008).

49 II – INTRODUCTION ______

Cette substance a déjà prouvé des activités immunosuppressive, anti-leucémique ainsi que anti- tumorale (Larrosa et al., 2004).

L’espèce C. buxifolia Small Chamaesyce buxifolia Small. (≡Euphorbia buxifolia Lam ) croit dans le sable des côtes de la Floride, des Antilles, des Bahamas, de l’Amérique Centrales et celles du nord de l’Amérique du Sud que. Ce sous-arbrisseau pérenne à racines rameuses et rougeâtres se caractérise par une tige ligneuse, cylindrique, articulée et couverte d’une écorce un peu ridée et rougeâtre. Cette tige se divise en plusieurs rameaux, alternes, menus, ligneux, articulée droit ou montants, certains sont simples et les autres fourchus ou dichotomes. Ses nombreuses feuilles se présentent ovales, opposées, entières, glabres et vertes. Vers le sommet des rameaux naît trois ou quatre pédoncules courts et uniflores. La calice possède quatre divisions extérieures qui sont petite, entières, obtuses ou arrondies et blanchâtre (Lamarck, 1788; Woodson et al., 1967). D’après la base de donnée Scifinder Scholar (Scifinder, 2007), à ce jour, aucune étude phytochimique concernant C. buxifolia n’a été effectuée.

Acc no.: F 1640988 Family: EUPHORBIACEAE Taxon: Chamaesyce buxifolia Collection: Alston,A. 6060 Det by: D.Burch, 1967 Country: VENEZUELA: Carabobo

Figure II – XXXVIII Plantes sèches de Chamaesyce buxifolia, The Field Museum, (Museum, 1999-2009)

50 II – INTRODUCTION ______c) Sandoricum koetjape Merr. (Meliaceae)

La famille des Meliaceae Description botanique et classification systématique La famille des Meliaceae est une famille d’arbres ou d’arbustes polygames, mono ou dioïques. Les feuilles sont alternes regroupées en mouchet à l’extrémité des rameaux. Généralement, elles n’ont pas de stipule visible mais parfois il y a de grandes stipules foliacées. L’inflorescence est de type composé mixte, en racème de cymes et parfois en forme d’épi. La fleur est composée de 4-5 pétales libres ou soudés par la base ou au tube staminal, de 4-5 sépales soudés à la base, de 8-10 stigmates. Le disque intrastaminal parfois soudé à l’ovaire parfois développé en androgynophore ainsi que les filets staminaux soudés partiellement ou totalement en un tube sont parmi les caractéristiques mentionnées les principales. Le fruit généralement en capsule loculicide ou septicide est parfois sous forme de baie ou drupe. La graine souvent ailée à columelle ligneuse persistante ou arillée souvent albuminée. C’est dans les régions tropicales que l’on retrouve les 550 espèces regroupées dans 52 genres qui composent la famille des Meliaceae (Spichiger et al., 2000).

Tableau II- 7 : Classification systématique de la famille des Meliaceae (Cronquist, 1988; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998; Thorne, 1992; Thorne, 1992) Cronquist (1988) Thorne (1992) APG II (2003) Règne Plantae Plantae Plantae Embranchement Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophytae Sous- - - Angiospermae enbranchement Classe Magnoliopsida Magnoliopsida Eudicots Sous-classe Rosidae Magnoliidae Rosidae Super-ordre - Rutanae Eurosidae II Ordre Sapindales Rutales Sapindales Famille Meliaceae Meliaceae Meliaceae

Utilisations industrielles et en médecine traditionnelle C’est en premier lieu dans l’ébénisterie et dans la confection d’instrument à corde que l’on retrouve plusieurs espèces de Meliaceae. Le précieux bois d’Acajou qui regroupe un ensemble d’espèces regroupées dans les deux principaux genres suivant, Swietenia Jacq. et Khaya A.Jussieu croit respectivement en Amérique et en Afrique. Les bois obtenus également à partir des arbres des genres Cedrela P.Browne, Dysoxylum Blume, Entandrophragma C.DC. et Melia L. sont également important dans l’industrie du bois (Spichiger et al., 2000). Quand à l’utilisation des certaines

51 II – INTRODUCTION ______espèces de Meliaceae dans la médecine traditionnelle, on retrouve principalement Azadirachta indica A. Juss utilisée tant en Asie qu’en Afrique. Son écorce s’utilise en tant que remède contre les maladies de la peau, les dermatoses et la lèpre. Ses feuilles, tenues pour anti-inflammatoire, pour soigner les fièvres, les ulcères, le rhumatisme et la malaria présente les usages multiples de cette plante à des fins médicinales. L’écorce de « Touloucouna » , Carapa procera D.C., utilisée pour ses propriétés antitussives, fébrifuges et toniques, ses racines en tant que désintoxiquant, ses rameaux feuillées pour lutter contre les fièvres paludéennes, ses fruits en qualité de purgatifs sont autant d’utilisations fort communes en Afrique (Boullard, 1999). Il est important de relever que parmi les espèces précitées toutes sont préconisées pour lutter contre les pics de fièvres dus à la malaria. C’est ainsi que de nombreuses espèces du genre Khaya, telles que K. anthoteca C.DC., K. grandifolia Thompson, K. senegalensis A. Juss., K. ivorensis A. Chev., sont largement utilisées en médecine traditionnelle africaine pour lutter contre les accès fiévreux du paludisme (Agbedahunsi et al., 2004) .

Etude phytochimique antérieures et activité biologique Les métabolites les plus caractéristiques de la famille des Meliaceae sont les limonoïdes. Ces triterpènes issus du métabolisme d’un 4,4,8-triméthyl-17-furanyl-stéroïde se retrouvent également dans les espèces du genre Citrus et sont responsables de leur gout amère (Bruneton, 1999). Le squelette de base présenté dans la figure II-XXXVIII (47) se retrouve en partie dans la variété structurales de limonoïdes que l’on retrouve dans les Melicaceae. Ils sont issus de nombreux réarrangement possibles lors de l’ouverture des cycles et de réarrangement structuraux.

23 O 22 18 12 20 21 11 17 19 30 13 9 16 1 14 2 10 8 15 3 5 H 4 7 6

29 28

(47)

Figure II – XXXIX Squelette des limonoïdes (47)

52 II – INTRODUCTION ______

De nombreuses activités biologiques en tant qu’insecticides, antifongiques, bactéricides et antivirales leurs sont attribuées. C’est le cas pour la nimbolide, l’acide nimbique et la nimbine isolés de Azadirachta indica A. Juss. et Melia azedarach L. (Tringali, 2000). La gédunine (51), un limonoïde isolé de Cedrela odorata L., a montré une activité fort intéressante in vitro sur la croissance de P. falciparum (MacKinnon et al., 1997). Malheureusement, elle ne s’est pas confirmée in vivo sur P. berghei (MacKinnon et al., 1997; Omar et al., 2003).

O CH O C 3 2 CH3O2C O O O

H H O O O H O O OAc O CO2R OH H O

(49) R= H (48) (51) (50) R=CH 3

Figure II– XL Exemple de limonoïdes isolés d’espèces appartenant à la famille des Meliaceae ; Nimbolide (48) , l’acide nimbique (49), la nimbine (50) et la gédunine (51)

L’activité antimicrobienne mesurée contre une large palette de bactéries s’est révélée intéressante pour plusieurs espèces, comme par exemple Azadirachta indica A. Juss. (Helmy et al., 2007) et Pseudocedrela kotschyii (Schweinf.) Harms (Asase et al., 2008). Cette activité a d’ailleurs été approfondie lors d’une étude phytochimique sur Turraeanthus africana Pellegr. où des diterpènes isolés, ont montré une forte inhibition contre la croissance de Cryptococcus neoformans, Staphylococcus aureus et des souches de S. aureus résistantes à la méthicilline (Tatsimo et al., 2005). Cette activité a également été démontrée pour deux flavalignans provenant d’extrait de Trichilia catigua A. Juss. contre Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et S. aureus (Pizzolatti et al., 2002).

53 II – INTRODUCTION ______

Le genre Sandoricum Cav. Le genre Sandoricum Cav., mentionné pour la première fois en 1789 par Cavanilles, regroupe une vingtaine d’espèces (Cavanilles, 1785-1790). Utilisé principalement pour leur bois, ces arbres à feuilles ternées se distingue par leurs fruits acides à la forme de pomme intérieurement pulpeux et extérieurement duveteux. Leur fleurs en grappe, paniculée et axillaire ont une calice court à cinq dent, cinq pétales linéaires et dix étamines sur un tube dont le limbe est à dix dents (Buffon et al., 1806). Les études phytochimiques, répertéroriées sur la base de donnée épluchée en mai 2009 (Scifinder, 2007) et concernant ce genre se refèrent dans la majorité des cas à S. koetjape qui sera présenté dans le chapitre suivant.

Figure II– XLI Fruits de Sandoricum koetjape, ©Alonso

L’espèce S. koetjape Merr. S. koetjape connu sous le nom vernaculaire de santol est un arbre laticifère de taille moyenne qui croit dans le sud-est Asiatique. Ses feuilles vont de 30 à 45 cm de long, les jeunes feuilles (leaflets) poussent au nombre de 3, elles sont ovales, à la base du limbe en forme de cœur puis à son sommet en pointe courte. Elles sont entières ou faiblement dentées. Les fleurs sont composées de cinq pétales jaune orangées. Son fruit jaune a un diamètre de 5 à 7.5 cm. Cette espèce populaire portait également le nom spécifique indicum, baptisé ainsi par Cavanilles, qui fut remplacé plus tard par koetjape par Merrill (Freer et al., 1912).

54 II – INTRODUCTION ______

Figure II– XLII Planche botanique de Sandoricum koetjape (Blanco, 1880-1883)

Utilisation et études phytochimiques antérieures Cette espèce populaire de par son fruit comestible est utilisée pour préparer des confitures et des sucreries (Burkill, 1966). Sa racine constitue l’un des ingrédients d’une préparation traditionnelle malaysienne utilisée comme tonifiant après l’accouchement. On utilise également les décoctions des feuilles pour traiter la diarrhée, de l’écorce lors de menstruations difficiles et finalement, cette dernière mélangé au jus du fruit pour le traitement de la dysenterie (Perry, 1980). Les études phytochimique antérieures indiquent la présence de triterpènes dans les branches (Kaneda et al., 1992) et plus précisément des limonoïdes dans les graines (Powell et al., 1991) ainsi que dans les feuilles (Intan et al., 2003; Pancharoen et al., 2009). L’activité anti-inflammatoire de cette espèce a mené à la suite d’un bioguidage, à l’isolement de trois triterpènes, l’acide 3-oxo-12-oleanen-29- oique, l’acide katonic et l’acide koetjapic (Rasadah et al., 2004). D’autre part, l’acide koetjapic isolé de l’écorce de S. koetjape inhibe de façon significative in vivo la carcinogénèse sur des souris (Ismail et al., 2003).

55 II – INTRODUCTION ______

COOH COOH S R S S R R S H H R R S R R R R R H HOOC R H H R H

(53) R: O (52) (54) R: OH

Figure II – XLIII Exemple de limonoïdes rencontré dans S. koetjape Merr. (Ismail et al., 2003) ; Acide koetjapic (52) , Acide dimethyl koetjapic ester (53) et Acide 3-oxo-olean-12-en-29-oique (54)

La présence d’une procyanidine toxique pour les poissons ainsi que quatre hydroxyacides dans les feuilles ont également été démontrées (Ismail et al., 2007).

OH HO R R O OH O CO H HO 2 CH O CO H 3 S 2 OH OH O HO R HO R R OMe O OH

HO (56) OH OH 4 OH R R R HO O

OH OH (55)

Figure II – XLIV Un procyanidine (55) et un hydroxyacide, l’acide 2-O-Syringyl-L-malique (56) retrouvés dans les feuilles de S. koetjape (Ismail et al., 2007)

56 III. RESULTATS ET DISCUSSIONS III – RESULTATS ______

MISE EN PLACE DU TEST COLORIMETRIQUE Pour effectuer la mise en place d’un test destiné à la présélection d’extraits végétaux et à l’étude bioguidée de substances pures d’origines naturelle dans le cadre de la recherche de composés antimalariques, nous nous sommes basés sur le Phiβ-assay, test colorimétrique développé par Ncokazi et Egan (Ncokazi and Egan, 2005). Du fait du changement de matériels, toute transposition de méthode implique une optimisation des conditions. Ce test se déroule de la façon suivante. La synthèse de la β-hématine est effectuée, en présence d’une substance qui peut inhiber la réaction voire même la stopper. Cette activité est observée en dosant l’hématine qui n’a pas dimerisé à l’aide de la pyridine. Ce ligand se lie au monomère de façon sélective pour former un complexe coloré qui absorbe à λmax= 402 nm. La distinction entre la synthèse de la β-hématine et la formation du complexe Pyridine-Fe(III)protoporphyrine (Fe(III)PPIX) est essentielle pour la bonne compréhension de ce test. Le Phiβ-assay, testé uniquement sur des substances pures, doit être adapté pour des extraits et pour le bioguidage de substances pures. La figure III-I schématise les étapes effectuées lors de ce travail de thèse pour la mise en place du β-test.

Figure III- I : Etapes pour la mise en place du β-test, outil pour la présélection d’extraits de plante et le bioguidage de substances pures présentant une activité antimalarique

58 III – RESULTATS ______

L’optimisation du β-test sur des plaques 96-puits comprend les études concernant la synthèse de la β-hématine, la formation du complexe Py-Fe(III)PPIX ainsi que la sélectivité de la pyridine envers l’hématine. Puis, la discussion du traitement des données a impliqué la mise en place d’analyses de contrôle et le choix d’une solution de solubilisation. A partir de ce point, le Phiβ-assay modifié en tant que méthode qualitative de criblage appliquée à des extraits de plantes et à des substances pures d’origine naturelle a été baptisé « β-test ». La mise en place du test s’est d’abord déroulée sur des substances pures afin d’étudier l’inhibition quantitative de la synthèse de la β-hématine. Comme le but de ce travail est d’avoir à disposition un outil pour la présélection d’extraits et pour les études bioguidées, il a ensuite été développé dans un but qualitatif. Ceci à l’aide des résultats obtenus sur une quarantaine de substances pures d’origine naturelle. La fiabilité de ces résultats a été vérifiée par comparaison avec l’activité sur la croissance de P. falciparum, grâce à la collaboration avec l’Institut Tropical Suisse (ITS). Le passage au criblage d’extraits s’est effectué à l’aide d’une étape de préparation d’échantillon. Puis la fiabilité des résultats du β-test d’environ 200 extraits a été vérifiée par comparaison avec les résultats in vitro. En complément à cette étude, une base de données a été développée sur Access. Ce portail d’informations a été complété par l’ajout de plus 1700 entrées concernant des plantes citées à ce jour pour leur activité biologique ou leur utilisation en médecine traditionnelle en relation avec les maladies parasitaires (malaria, leishmaniose et maladie du sommeil). L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en place une méthodologie du β-test, qui a été vérifiée sur 3 extraits aboutissant à l’isolement de substances pures à l’origine de l’activité antimalarique.

59 III – RESULTATS ______

III.1. OPTIMISATION DES CONDITIONS REACTIONNELLES a) Conditions de départ pour la synthèse de la β-hématine Au vu des nombreuses publications décrites par le groupe initiateur du Phiβ−assay, les influences de la concentration des réactifs, du pH du milieu réactionnel et de la température de la réaction de synthèse de la β-hématine ont une influence capitale. Ces paramètres ont été évalués de façon systématique et optimisés. (Egan, 2002; Egan et al., 2001; Egan et al., 1994). Les conditions réactionnelles de départ ont été les suivantes: 100 μl d’une solution d’hématine à 92 mM préparée à partir d’hémine de bovin dans NaOH 0.1 M, 10 μl de HCl 1 M et 60 μl d’une solution d’acétate 12.9 M (pH 5) sont ajoutés dans chaque puits, puis chauffés à 60°C pendant 60 minutes (Figure III- II). La préparation de ces solutions est décrite en détail au point V.2.c).

100 μl d’hématine 92 mM + 10 μl HCl 1 M + 60 μl de solution d’acétate

60°C

pH 4.5

Figure III- II Schéma des conditions de synthèse de la β-hématine

60 III – RESULTATS ______b) Complexe pyridine-Fe(III)PPIX

Association de la pyridine avec l’hématine

O O OH HO OH O H O O OH N

N N 3+ Hepes 20mM N 3+N Fe + 2 Fe N N pH 7.5 N N N N

(32) (57) (33)

Figure III- III Réaction de complexation de la pyridine (57) avec l’hématine (32)

La formation du complexe coloré entre la pyridine et l’hématine, Py-Fe(III)PPIX (33), s’effectue de façon spontanée en mettant en contact l’hématine (32) avec de la pyridine (57) en excès (Figure III-III). Un balayage spectrophotométrique UV-Vis entre 280 et 500 nm permet d’observer le déplacement de 15 nm du maxima d’absorption de la bande Soret de 390 à 402 nm, du fait de la liaison entre le ligand pyridine et le fer3+ de la protoporphyrine IX. Pour cela, un mélange d’hématine à 10 mg/ml dans NaOH 0.1 M et de pyridine diluée à 5 % dans un tampon Hepes 20 mM sont analysés par spectrophotométrie, entre 280 et 500 nm, préparé à différentes proportions. L’augmentation en intensité du maxima à 402 nm provient de l’ajout de pyridine qui se complexe au fur et à mesure avec des molécules d’hématine (Figure III-IV). Comme cette association est colorée, elle peut être distinguée visuellement (Figure III-V).

Mélange 65/35 hématine : sol. Pyridine 5%

Mélange 90/10 hématine : sol. Pyridine 5%

Figure III- IV Balayage UV-Vis de 280 à 500 nm du mélange hématine : pyridine 5% à différentes proportions

61 III – RESULTATS ______

0% 5 % 10% 20% 30% de pyridine dans Hepes

Figure III- V Formation du complexe Py-Fe(III)PPIX au fur et à mesure des quantités croissantes de pyridine dans Hepes

Optimisation de la concentration de la solution de pyridine L’optimisation de la concentration de travail en pyridine s’effectue en évaluant à quelle valeur la complexation atteint son équilibre. Ainsi, la mesure des absorbances à λ = 405 nm (valeur de lecture la plus proche disponible sur le lecteur multiplaque EL-808 Witec) des mélanges contenant les réactifs de départ (Figure III- II) additionnés de 750 μl de solutions de pyridine préparées à des concentrations allant de 0.5% à 80% dans la solution Hepes 20 mM, sont mesurées en triplicat. Ces concentrations correspondent à des quantités de pyridine en excès, condition dans laquelle la complexation se fait de façon spontanée.

4

3

2 Abs

1

0 0 10 20 30 40 50 60 % pyridine

Figure III- VI Solution d’hématine en présence de concentration croissante de pyridine selon les conditions du β-test à t = 0 min

62 III – RESULTATS ______

Le graphique de l’absorbance en fonction de la proportion en pyridine montre un plateau de l’absorbance à partir d’une concentration en pyridine de 15 % (Figure III-VI). Cela indique que la réaction de complexation est à son équilibre et que la concentration du complexe a atteint sa valeur maximale. Il est important de travailler dans un état à l’équilibre car les erreurs dues aux différences entre inter-réactions (mesures en triplicata) peuvent être minimisées. D’autre part, notre choix se confirme sur la solution de pyridine 15 % du fait que le tampon Hepes 20 mM maintient le pH de la solution finale à 7.5. Ce critère est développé dans la partie III.1.d. Une vérification de la loi de Lambert-Beer s’est avérée nécessaire afin d’infirmer la présence du plateau qui serait due à un éloignement de cette même loi.

Absorbance du complexe Py-Fe(III)PPIX et loi de Lambert-Beer L’étude de la proportionnalité de l’absorbance du complexe en fonction de sa concentration confirme qu’elle suit la loi de Lambert-Beer (Equation III - 1).

A = Absorbance ε = coefficient d’extinction molaire [l·mol-1·cm-1] (Equation III - 1) A = ε ⋅l ⋅c c = concentration[mol·l-1] l = longuer de la cuve [cm]

Cette vérification s’effectue à l’aide d’un mélange contenant les réactifs de départ (Figure III- II) à des concentrations croissantes en hématine dans l’intervalle de 0 à 0.64 mM dans le mélange finale. Dans les conditions de départ du β-test, la concentration en hématine finale dans le puits est au maximum de 0.55 mM (ce qui signifie une oxydation totale de l’hémine). Une vérification à une concentration supérieure nous permet de justifier que dans les conditions de travail du β-test, la loi de Lambert-Beer est suivie. Les conditions de départ du β-test sont les suivantes : 100 μl d’une solution en hématine, 10 μl de HCl et 60 μl de la solution d’acétate, une solution de 750 μl d’une solution de pyridine 15 %. Ces solutions sont ajoutées dans tous les puits à t = 0 min, sous ces conditions, chaque puits contient une concentration différente en hématine, qui réagira de façon spontanée avec la pyridine. Après une agitation à 900 tours/minute pendant 10 minutes, des aliquots de 100 μl de ces préparations, préparées en triplicata, sont prélevées

63 III – RESULTATS ______et l’absorption est mesurée à λ = 405 nm à l’aide du lecteur multiplaques. L’absorbance du mélange contenant le complexe Py-Fer(III)PPIX en fonction de la concentration de ce dernier suit la loi de Lambert-Beer dans une gamme d’absorbance allant de 0 à 3.6 avec un coefficient de corrélation de 0.989, comme nous le montre la figure III-VII.

4

3

2 ABS

1

0 0 10 20 30 40 conc final en hématine [mM]

Figure III- VII Absorbance à λ = 405 nm du complexe Py-Fer(III)PPIX en fonction de la concentration en hématine

Cette loi implique, entre autres, que l’absorption du milieu correspond à la somme des absorptions des composés individuels (Equation III-2). En d’autres mots, l’absorbance que l’on mesure provient du complexe Py-Fe(III)PPIX mais également des autres substances contenues dans le puits absorbant à la même longueur d’onde.

(Equation III - 2) A = ∑ Ai (ε i ,l,ci )

Nous pouvons, à ce stade, intégrer la première équation concernant le traitement des données qui nous permet d’obtenir l’absorbance uniquement due au complexe Py- Fe(III)PPIX dans le cadre du β-test. Ainsi, en plus de chaque analyse mesurée à 405 nm, nommé AAnalyse, il est nécessaire d’effectuer un contrôle, baptisé AAnalyse;Blanc. Il diffère de l’analyse uniquement par le fait que la solution de pyridine est remplacée par la solution

64 III – RESULTATS ______tampon Hepes 20mM. Ce contrôle permet de déduire l’absorbance due aux composés autres que le complexe Py-Fe(III)PPIX, nommée ΔAAnalyseEquation III-3).

(Equation III - 3) ΔAAnalyse = AAnalyse − AAnalyse;Blanc

c) Synthèse de la β-hématine

Synthèse de la β-hématine

. 2H+ OH O O O O O O Cl O O O OH N N 3+ Fe Sol. Acétate 12.9M N O 60°C N N N 3+ NaOH 0.1M N N 60 min Fe 3+ Fe O N N N N pH 4.5

O

O N N (31) (32) 3+ Fe N N

O

HO (30)

Figure III- VIII Synthèse de la β-hématine selon Ncokazi et Egan (Ncokazi et al., 2005)

La synthèse de la β-hématine (30) est la seconde partie du test. Cette réaction, basée sur les conditions proposées par le Phiβ-assay (Ncokazi et al., 2005) est schématisée à la figure III-VIII. Pour la mise en place dans des plaques 96-puits, il faut effectuer 96 mini- synthèses équivalentes en parallèle, la répétabilité de la synthèse est donc le point essentiel pour obtenir des résultats fiables. La quantité des réactifs de départ est maitrisée par l’utilisation d’appareils analytiques adaptés. L’homogénéité du système de chauffage s’est révélée optimum dans une étuve (modèle, Salvis) après plusieurs essais infructueux sur des systèmes de chauffages destinés aux plaques 96-puits à air chaud ou à plaque

65 III – RESULTATS ______chauffante. Ainsi, une première synthèse de la β-hématine est effectuée avec les réactifs présentés au point III.1.a dans l’étuve pendant 60 minutes.

Optimisation du temps d’incubation La synthèse de la β-hématine est effectuée avec des temps de chauffage allant de 30 à 120 minutes dans des plaques 96-puits de 2 ml, en triplicata. Le dosage de la formation de la β-hématine est effectué de façon indirecte en dosant l’hématine, qui n’a pas polymérisé, avec la pyridine. Pour chaque série d’analyse, après le passage à l’étuve, 750 μl d’une solution de 15 % pyridine sont rajoutés et 750 μl de solution Hepes 20mM sont additionnés dans leurs blanc-analyses correspondants. Les mesures sont effectuées à

λ = 405 nm et le graphique de ΔΑnalyse en fonction du temps d’incubation est tracé (Figure III- IX).

Optimisation du temps d’incubation

1.800 1.600 1.400

1.200 1.000 0.800 Analyse Δ 0.600 0.400 0.200 0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 Temps [min]

Figure III- IX Optimisation du temps d’incubation pour la synthèse de la β-hématine

La diminution d’intensité de l’absorption à 405 nm avec le temps, provient d’une formation du dimère, la β-hématine. En effet, au fur et à mesure de la synthèse, la concentration en hématine diminue suite à la formation de la β-hématine, entraînant une concentration en complexe Py-Fe(III)PPIX de plus en plus faible. On observe que la réaction de synthèse du dimère atteint son équilibre à partir de 75 minutes. Pour être certain que la réaction ait bien atteint son équilibre, le temps d’incubation lors du β-test

66 III – RESULTATS ______est fixé à 90 minutes. Ces mesures nous permettent également de confirmer la sélectivité de la pyridine envers l’hématine, paramètre qui est traité dans le point suivant.

Identification de la β-hématine L’analyse par FT-IR d’une pastille de KBr mélangé à 1 % avec le produit de la réaction nous informe de la présence de pics caractéristiques de la β-hématine à 1663 cm-1 et à 1210 cm-1 spécifiques de la liaison fer(III)-carboxylate contenu dans le pigment malarique. La diminution du pic à 1227 cm-1 dans le spectre de l’hématine confirme également la formation du dimère.

Hématine β-hématine

53.0 50.2 52 50 49

48 48 46 47 44 1412 46 42 1227 1087 45 40 1279 1122 %T %T 44 38 36 43

34 42 1712 1279 32 41 30 1408 40 28 1210 39 26 1700 1580 25.0 38.4 1663 2000.0 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000.0 2000.0 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000.0 cm-1 cm-1 Figure III- X Comparaison des spectres FT-IR de l’hématine et de la β-hématine

d) Sélectivité de la pyridine envers l’hématine Après une incubation dans l’étuve à 60°C pendant 90 minutes des puits contenant les réactifs de départ (Figure III-I), nous avons à disposition, dans chaque puits, de la β- hématine. A ceux-ci, des solutions de pyridine à différentes proportions dans le tampon Hepes 20 mM sont ajoutés. Une mesure de l’absorbance du mélange est mesurée à λ = 405 nm avec un lecteur multiplaques UV-VIS (Modèle EL-808, Bio-tek Instruments Inc.).

67 III – RESULTATS ______

4

3

2 Abs

1

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Pyridine dans la solution Hepes

Figure III- XI Etude sur la complexation de la pyridine envers la β-hématine

Le graphique de l’intensité d’absorbance à λ = 405 nm en fonction de la proportion en pyridine montre une augmentation de l’intensité d’absorbance à partir de 20 % de pyridine (Figure III-XI). Sachant que la formation de la β-hématine atteint son équilibre après 90 minutes d’incubation, cette augmentation corrobore les remarques des initiateurs du Phiβ-assay (Ncokazi et al., 2005). En effet, ils avaient relevés qu’en présence d’une forte concentration en pyridine et d’un pH supérieur à 8, le ligand s’insère peu à peu dans la β-hématine pour former également un complexe coloré. Le but de la détection du β-test étant d’être sélectif envers l’hématine au détriment de la β-hématine, il va de soi que nous travaillerons avec une solution de pyridine à une concentration inférieure à 20 % préparée dans le tampon Hepes 20 mM. Une superposition des graphiques montrant l’effet de la concentration en pyridine envers l’hématine et la β-hématine permet de définir la concentration de pyridine optimale pour le β-test (Figure III-XII).

68 III – RESULTATS ______

Figure III- XII Comparaison de la réactivité de la pyridine envers l’hématine et la β-hématine en fonction de sa concentration

La valeur, qui présente une différence d’absorption maximale entre les deux courbes nommée Δmax, indique la meilleure sélectivité de la pyridine envers l’hématine. Selon la figure III-XII, cette valeur se situe à 15 % de pyridine dans Hepes 20 mM. e) Traitement des données Avant de passer aux analyses proprement dites, il a été nécessaire de développer une méthode de traitement des résultats afin d’obtenir une réponse quantitative ou qualitative du test. Comme nous l’avons vu, la réponse obtenue par UV-Vis du complexe Py- Fe(III)PPIX, dans le cadre du β-test, suit la loi de Lambert-Beer (Figure III- VII). Cette remarque nous permet d’impliquer des analyses de contrôle lors de chaque série de criblage. Le premier contrôle, présenté précédemment au point III.1.b tenant compte de l’absorption de la matrice complexe ou du composé, est nommé contrôle blanc-analyse

(Aanalyse,Blanc). Sa préparation diffère de l’analyse lors de sa sortie de l’étuve lorsque la solution de pyridine est remplacée par la solution tampon Hepes 20 mM.

69 III – RESULTATS ______

Son rôle est d’obtenir une valeur d’absorbance uniquement due au complexe Py-

Fe(III)PPIX lors de l’analyse (ΔAnalyse) par l’application de l’équation III-3.

(Equation III - 3) ΔAAnalyse = AAnalyse − AAnalyse;Blanc

Le contrôle blanc, ACLTblanc, qui lui contient les réactifs en absence d’inhibiteur ou d’extraits ainsi que son blanc, ACLTblanc ;Blanc, sont préparés lors de chaque série de mesures, c'est-à-dire, par plaque. La différence entre ces deux valeurs (équation III-4) concerne l’absorption provenant d’un résidu d’hématine n’ayant pas polymérisé et qui réagit également lors de l’ajout de pyridine, ΔACLTblanc. Ainsi, cette valeur nous permet non seulement de vérifier le bon déroulement de la réaction de synthèse, mais de tenir compte du fait qu’elle n’a pas un rendement de 100 %.

(Equation III - 4) ΔACLTblanc = ACLTblanc − ACLTblanc;Blanc

Cette absorbance, ΔACLTblanc, témoin d’une réaction incomplète doit être soustraite de l’absorbance de l’analyse obtenue par l’équation III-4, selon le traitement présenté ci- dessous (équation III-5).

(Equation III - 5) I Analyse = ΔAAnalyse − ΔACLTblanc

Au final, la valeur ΙAnalyse (inhibition de l’analyse) obtenue lors du traitement de l’équation III-5, provient uniquement de l’absorbance due au complexe Py-Fe(III)PPIX ayant pour seule origine une inhibition de la synthèse de la β-hématine. Par ce biais, il est donc possible d’étudier l’activité inhibitrice des substances pures et des extraits sur la synthèse de la β-hématine.

70 III – RESULTATS ______f) Solution de solubilisation Comme nous venons de le voir, sur une même plaque de criblage, la présence de contrôles est indispensable pour le traitement des résultats. Pour ce faire, il est impératif que ces contrôles soient étudiés dans les mêmes conditions que les analyses elles-mêmes avec pour unique variation, l’extrait ou la substance à analyser. Il est donc important de choisir une solution de solubilisation optimale. Si l’on se réfère au test de référence in vitro basé sur la croissance de P. falciparum, la préparation de la solution stock se fait dans le DMSO, puis les dilutions successives se font dans le milieu de culture (cf. V.5) Dans notre cas, il faut tenir compte que la réaction de synthèse a lieu en milieu aqueux. De ce fait, le risque de préparer des solutions de substances à tester dans un solvant organique, est que celles-ci précipitent lors de leur mise en place dans le β-test, d’autant plus que la réaction a lieu en milieu faiblement acide (pH 4.5). Entre autres, l’interférence possible de certains solvants sur les réactions du test est également un paramètre à vérifier. Sachant que le contrôle qui sera alors utilisé pour vérifier le bon déroulement de l’inhibition est une aminoquinoline connue pour inhiber la réaction, il faut que la solution solubilise également ce type de substance. Une fois ces paramètres pris en compte, différents mélanges de solvants ont été testés en sextuple pour vérifier leur influence sur la synthèse de la β-hématine (Figure III-XIII).

β-test : essai solutions de solubilisation

1.4 1.2 1.0 0.8

analysis 0.6 Δ 0.4 0.2 0.0 3 2 1 1 3 3 3 1 :3 : / M : / : : : : 2 3 1 1 7 7 7 9 2 : / 1 : 5 5 5 l O O O O O O H C S S S S S S H O H O S M M M M M M O e e M D D D D D D / / / / M M D / / / / / O M M O H H 2 1 1 2 O O O O H l l S H H e e S O C C e M M M M H H D D M / / / O M M 2 1 l 1 H . C 0 l H C H

Figure III- XIII : Essais du β-test en présence de différents mélanges de solvants

71 III – RESULTATS ______

L’absorbance élevée de certains solvants indique que leur présence a perturbé la réaction de synthèse de la β-hématine. Cette observation peut également expliquer les écart-types non-négligeables de certaines mesures. En effet, certains mélanges de solvants peuvent rendre le milieu non-homogène. Par exemple, les mélanges contenant uniquement des solvants organiques perturbent la solubilisation des réactifs de départ qui se trouvent en milieu aqueux. La forte réaction du système en présence de HCl 1M indique qu’un acide fort à plus de 5 % du milieu gêne la solubilisation de l’hématine pour la réaction de dimérisation. On peut expliquer cette interférence en rappelant que l’hémine est préalablement diluée dans NaOH 0.1M qui l’oxyde en hématine et solubilise ce dernier composé. De ce fait, l’adjonction d’une solution acide à forte concentration dans le réacteur risque de perturber la mise en solution de cette substance clé. Une simple solution aqueuse n’a pas été testée car elle risquait de limiter de manière trop importante notre test en ne solubilisant que les molécules très polaires. On en conclue donc qu’une solution totalement aqueuse ou entièrement organique n’est pas un choix judicieux pour mettre en solution les substances pures ou les extraits à tester. Afin de solubiliser un maximum de composés et de ne pas perturber la synthèse de la β-hématine, un mélange 1 : 1 de solvant aqueux-organique est idéal, la phase organique représentant ainsi moins de 3 % du mélange totale. Le mélange HCl 0.1M/MeOH/DMSO 5:3:2 a été choisi car il ne perturbe pas la réaction et qu’il a un bon pouvoir solubilisant, comme démontré dans la figure III-XIII.

III.2. β-TEST SUR SUBSTANCES PURES a) Détermination d’une activité quantitative Ce point comprend l’étude de l’activité inhibitrice sur la synthèse de la β-hématine de deux quinolines. La chloroquine et la quinine ont été sélectionnées sur la base de précédentes études qui confirment leur activité au niveau de la cible impliquée dans le β-test (Egan, 2006; Sullivan, 2002). L’analyse sur le β-test de la chloroquine et de la quinine, a été effectuée à l’aide de solutions préparées dans la solution de solubilisation définie au point précédent (cf. V.2.c, solution 1) à des concentrations s’échelonnant de 0 à 30 mM, qui correspond à environ soixante fois la concentration finale en hématine. Les

72 III – RESULTATS ______analyses, leurs blancs et les contrôles ont tous été effectués en triplicata. L’inhibition se présente sous la forme d’une sigmoïde obtenue par le graphique présentant la valeur

ΙAnalyses en fonction de la concentration de la substance. La valeur CI50, qui définit la concentration à laquelle il y a 50% d’inhibition de la réaction, se situe au point d’inflexion et est déterminée à l’aide du programme Prism 4.0 (GraphPad Prism Software, 1992-2003) en appliquant une analyse par modèle sigmoïdal.

Chloroquine Quinine 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 IC50 = 13 mM ± 0.12 0.3 CI50 = 13 mM ±0.12 0.3 IC50 = 8.5 mM ± 0.27

analysis CI = 8.5 mM ±0.27 analysis 2 2 50 Δ Δ R = R0.99= 0.99 2 0.2 0.2 R =R 0.992=0.99 0.1 0.1

0.0 0.0 0 10 20 30 0 10 20 30 conc [mM] conc [mM]

Figure III- XIV β-test quantitatif de la chloroquine et de la quinine

Ces résultats sont du même ordre de grandeur que ceux présentés par le Phiβ-assay à savoir 1.3 mM pour la chloroquine et 2.38 mM pour la quinine(Ncokazi et al., 2005). Ils démontrent que le β-test permet d’obtenir une valeur quantitative de l’activité inhibitrice d’une substance pure sur la synthèse de la β-hématine. La détermination quantitative de l’activité n’est néanmoins par le but en soi. En effet, l’optique de ce travail concerne le traitement des résultats pour obtenir une réponse qualitative de la part du β-test et est développée par la suite. b) Traitement pour obtenir un résultat qualitatif pour les substances pures d’origine naturelle Comme discuté au point III.2.a, nous attendons du β-test une réponse qualitative, ce qui nous mène à fixer une concentration à tester. En se basant sur les CI50 de la quinine et de la chloroquine et en sachant que ces molécules présentent une forte activité sur la réaction d’inhibition de la synthèse de la β-hématine, la concentration du test qualitatif à été fixée

73 III – RESULTATS ______

à environ cinq fois leur valeur, c'est-à-dire à 50 mM. Comme démontré au chapitre concernant le traitement des données (III.1.e), des substances pures ont été analysées puis une valeur IAnalyse est calculée pour chacune d’elles, ces résultats seront présentés en détail dans la partie criblage de substances pures au chapitre III.3.a. Le graphique ci- dessous (Figure III- XV) représente un exemple de IAnalyse obtenu pour 15 substances pures. La présence du contrôle chloroquine indique que l’inhibition de la réaction de synthèse a bien eu lieu.

Figure III- XV Exemple de criblage avec le β-test sur une série de substances pures avec leur valeur de ΙAnalyse

Afin de définir un résultat positif, une valeur d’absorbance minimale doit être définie et cela par le biais d’une valeur limite d’inhibition (équation III-8), nommée Ilimite, qui correspond à 25 % de l’inhibition de la synthèse par la chloroquine. Cette valeur est obtenue à l’aide du contrôle chloroquine, ICLQ;Chloroquine, testé à 25 mM, concentration supérieure à son CI50. Fixée à 25 % de l’inhibition, cette limite permet de distinguer une inhibition significative tout en étant modérément restrictive. L’analyse de ce contrôle

(ACLT ;Chloroquine) ainsi que de son blanc-analyse (ACLT ;Chloroquin ;,Blanc) sont préparés en triplicata. La valeur ICLT;Chloroquine est obtenue en appliquant le même traitement que pour

74 III – RESULTATS ______les analyses, c’est à dire en tenant compte de son blanc (équation III-6) et du contrôle blanc (équation III-7)

(Equation III - 6) ΔACLT ;Chloroquine = ACLT ;Chloroquine − ACLT ;Chloroquine;Blanc

(Equation III - 7) ICLT ;Chloroquine = ΔACLT ;Chloroquine − ΔACLT ;Blanc

(Equation III - 8) I Limite = 0.25× ICLT ;Chloroquine

En reprenant l’exemple de criblage présenté à la figure III-XV, la valeur de ILimite (équation III-8) calculée correspond à 0.66 ± 0.01 pour cette série de mesures. Le résultat qualitatif s’obtient en amputant cette valeur limite à la valeur ΙAnalyse, comme présenté dans l’équation ci-dessous.

Résultats qualitatifs pour (Equation III - 9) I − I > 0 → Positif Analyse Limite les substances pures

Cette fois-ci, le graphique obtenu après l’application de l’équation III-9 (Figure III- XVI) donne un meilleur aperçu des résultats pour la même série de mesures.

Figure III- XVI Exemple de criblage avec le β-test sur une série de substances pures avec amputation d’une valeur minimale à IAnalyse

75 III – RESULTATS ______

III.3. CRIBLAGE QUALITATIF DE SUBSTANCES PURES D’ORIGINE NATURELLE

Une série de 40 substances pures a été testée de façon qualitative afin d’observer leur activité sur la réaction de synthèse de la β-hématine. Ces substances pures représentent quelques grandes familles parmi les composés d’origine naturelle. a) Résultats qualitatif et comparaison avec l’activité sur P. falciparum Les résultats présentés dans le tableau III-1 sont obtenus selon le traitement de données présenté au chapitre III.2.b, impliquant l’imputation d’une valeur minimale (équation III- 9). La comparaison de l’activité de ces substances sur le β-test et sur la croissance de P. falciparum, effectuée grâce à la collaboration avec l’ITS, indique la fiabilité des résultats obtenus. Tableau III - 1 : Résultats du criblage de substances pures d’origines naturelles sur P. falciparum et sur le β-test

β- P. falciparum Test Famille Classe Substance pure souche NF54 [50 CI [ng/ml] mM] 50 Acides Acide carboxylique Acide malique - >10000 Alcaloïdes Emétine - 15 Isoquinoléino-monoterpénique Alcaloïdes Cinchonidine + 6.3 Alcaloïdes quinoléiques Quinidine sulfate + 4.7 Quinine + 10 Atropine - >10000 Alcaloïdes Tropaniques Scopolamine - >10000 Acide-phenols Acide ellagique - 173 Acide chlorogénique - >10000 Anthrone - 546

Anthraquinones Rhéine - >10000 Emodine - >10000 Coumarine Ombelliférone - >10000 Composés phénoliques Diaryl-heptanoïdes Curcumine - 1538 Apigénine + 5371 Flavones Lutéoline + 2455

Diosmine - >10000

Vitexine 2''-O-rhamnoside - >10000 Flavones glycosylés

Apigénine 7-glucoside - 2402

76 III – RESULTATS ______

β- P. falciparum Test Famille Classe Substance pure souche NF54 [50 CI [ng/ml] mM] 50 Isorhamnétine - 5921 Flavonols Quercétine + 2918 Composés phénoliques Morine + >10000 Isoquercitrine + 7165 Flavonols glycosylés Myricitrine + 6590 Rutine - >10000 Catéchine + >10000 Flavanols Epicatéchine (-) + >10000 Juglone - 4879 Naphtoquinones Lapachol - 8110 Plumbagine - 417 Phénols glycosylés Arbutine - >10000 Tannins Hamamelitanin + 630 Acide tannique + 4112 Galactose - >10000 Oses simples Glucides Glucose - >10000 Disaccharides Saccharose - >10000 Stéroïdes Hétérosides cardiotoniques Digoxine - >10000 Monoterpène Thymol - >10000 Terpènes Iridoïdes Aucubine - >10000 Saponosides (β)-Sitostérine - 7720

Dans ce tableau, plusieurs substances présentent une inhibition de la synthèse de la β-hématine. Cette activité s’est confirmée sur la croissance du parasite pour certaines mettant en évidence trois classes de substances d’origine naturelle. L’artémisinine, substance antimalarique reconnue, n’a pas été incluse dans cette étude du fait qu’elle n’agit pas au niveau de la polymérisation de l’hémozoïne.

Les quinolines L’étude des résultats obtenus pour les substances appartenant à la famille des alcaloïdes quinoléiques permet de confirmer que l’inhibition de la synthèse de la β-hématine est l’un de leurs mécanismes d’action. Cela corrobore les nombreuses études menées sur cette famille de molécules, présentées dans la partie II.3.b. Ces substances se lient à l’hématine par liaison π, inhibant ainsi la synthèse de l’hémozoïne (Egan, 2006; Fitch, 2004).

77 III – RESULTATS ______

Les flavonoïdes Les résultats obtenus pour certains flavonoïdes sont non seulement confirmés par l’activité sur le parasite. Ils complètent également en partie les investigations sur leur activité antimalarique présentées au point II.3.b. En effet, il a été relevé que certains flavonoïdes inhibent la biosynthèse des acides gras (Tasdemir et al., 2006) mais à ce jour, aucune étude ne fait mention de leur activité via l’inhibition de la synthèse de l’hémozoïne (Scifinder, 2007). Sur la base de notre étude, nous fournissons un élément de réponse sur le mécanisme d’action des flavonoïdes. Une supposition pour définir cette activité est la formation d’un complexe formé par une liaison entre les électrons π-donneurs des flavonoïdes et le fer3+, jouant le rôle d’accepteur d’électrons.

OH OH OH OH

HO O HO O OH O O OH O OH O OH O OH O

OH OH OH OH OH

55 56

Figure III- XVII Structure chimique de l’isoquercitrine (55) et la myricitrine (56)

Les tannins Comme mentionné au point II.3.b, les tannins ont une capacité à former des liaisons avec les macromolécules, en particulier les protéines (Bruneton, 1999). Cette propriété leur confère dans le cas de la recherche de substances antimalariques une activité non- spécifique comme on l’attend d’un nouveau médicament antipaludique. Dans le cas du β- test, les tannins se lient également à l’hématine inhibant ainsi la réaction. En raison de cette activité non-spécifique nous considérerons, dès lors, les tannins comme des molécules interférentes.

78 III – RESULTATS ______b) Discussion des résultats Une comparaison qualitative entre ces deux tests nous permet de vérifier la prédictivité de la réponse du β-test. La méthodologie de l’ITS consiste à réaliser un criblage à une concentration, 10 μg/ml, pour avoir une première estimation de l’influence de la substance sur la croissance de P. falciparum. Si à ce seuil de concentration, la croissance du parasite est inhibée à plus de 90 %, le CI50 est déterminé. Dans cette étude, nous considérons ces substances comme positives. En reprenant le tableau III-1, quatre types de résultats peuvent alors être distingués.

¾ Les vrais-négatifs Ils représentent la majorité et appuient la prédictivité du β-test. Ils soulignent ainsi l’utilité d’avoir cet outil de présélection. ¾ Les faux-négatifs Ils limitent la sélection des substances n’agissant que par la voie de la dimérisation de l’hématine. Ce point paraissant comme un désavantage est un avantage certain car le β-test défini une activité mais également son mécanisme. ¾ Les faux-positifs Ces inhibiteurs de la voie de dimérisation de l’hématine n’inhibent pas la croissance du parasite. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que le composé doit franchir de nombreuses barrières lorsqu’il est testé in vitro. Ainsi, d’autres facteurs non négligeables entrent en jeu. Dans le cas présent, il s’agit de la catéchine et de l’épicatéchine. Bien qu’il existe quelques rapports concernant la faible activité de ces polyphénols (Tasdemir et al., 2006), ils ne sont pas considérés comme positifs sur le test in vitro et sont donc deux faux-positifs identifiés qui nous seront utiles lors de la mise en place de la méthodologie.

79 III – RESULTATS ______

¾ Les vrais-positifs, Ils appuient la fiabilité du résultat et prouvent l’utilité du β-test. Il nous apporte une confirmation ou mieux encore, nous informe de l’un des mécanismes d’action d’une substance connue sur la croissance de P. falciparum.

La grande variété des substances naturelles n’est pas entièrement représentée dans ce criblage, néanmoins il nous donne une idée des grandes familles régulièrement présentes dans les plantes. Une comparaison chiffrée de ces quatre types de résultats est une première approche de la fiabilité du test, qui sera complétée par la suite avec les extraits. Le tableau III-2 indique le pourcentage que représente chaque groupe.

Tableau III - 2 β-test vs. in vitro P. falciparum

In vitro P. falciparum + - 10 vrais-positifs 3 faux-positifs + 25 % 8%

-test 10 faux-négatifs 17 vrais-négatifs β - 25% 42%

Rappelons que le test a été développé dans le but d’avoir à disposition un outil pour la recherche de nouveaux composés antimalariques qui nous permette d’effectuer avec nos propres moyens une étude bioguidée sur des extraits végétaux. Aux vues de ces chiffres, la fiabilité de la réponse qualitative du β-test englobant les vrais-positifs et les vrais- négatifs correspond à un total de 67%. Si l’on considère uniquement les résultats positifs, voie par laquelle le β-test sera utilisé pour le bioguidage, on peut voir que la fiabilité de la réponse est estimée supérieure à 70%.

80 III – RESULTATS ______

positifs Faux-positif 23%

Vrai-positif 77%

Figure III- XVIII Résultats de substances pures positives du β-test vs. activité sur P.falciparum

La bonne corrélation observée sur les résultats positifs du β-test peut être améliorée en discriminant les faux-positifs. Cette information se révèle indispensable pour la suite de l’étude qui consiste à élaborer une méthodologie pour la sélection d’échantillons positifs et l’identification de composés responsables de l’activité.

III.4. ELABORATION DU β-TEST SUR DES EXTRAITS DE PLANTES

L’application du β-test sur des extraits a nécessité le développement d’une méthode de préparation d’échantillon ainsi qu’une méthode de traitement des résultats. Un certain nombre d’analyses et d’essais ont été nécessaires pour mettre au point une méthodologie. La difficulté majeure dans l’inhibition de la réaction de synthèse de la β-hématine réside dans la définition des paramètres permettant de distinguer un résultat négatif d’un résultat positif. Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés sur des extraits ayant montré une inhibition significative de la réaction de synthèse et avons sélectionné une série d’échantillons. Sur cet ensemble d’extraits, des analyses in vitro sur le parasite ont été effectuées par l’ITS. En parallèle, ces extraits ont été à nouveau analysés en définissant un résultat positif par une inhibition d’au moins 50 % de la réaction de synthèse. La comparaison entre les résultats sur le parasite et les résultats dans le β-test a permis de vérifier la prédictivité des résultats obtenus et d’établir par la suite une méthodologie de travail.

81 III – RESULTATS ______a) Préparation d’échantillons de matrices complexes L’utilisation du β-test en tant que méthode de criblage sur des extraits de plantes implique une étape de préparation d’échantillon. Bien que les substances d’origine naturelle qui ont abouti au développement d’un médicament violent la première loi définie par « la règle des 5 », rédigée par Lipinski, cette règle prédit de façon générale la biodisponibilité d’une substance en voie de devenir un médicament. Cette loi édicte qu’un médicament sera peu absorbée oralement si (Voet and Voet, 2005) :

¾ Son poids moléculaire est supérieur à 500 Da ¾ Elle possède plus de 5 donneurs de liaisons hydrogènes (somme des groupements OH et NH) ¾ Elle possède plus de 10 accepteurs de liaisons hydrogènes (somme des atomes N et O) ¾ Sa valeur de Log (P) est supérieure à 5

Ainsi, les médicaments les plus efficaces sont en général le fruit d’un compromis : ils ne sont ni trop lipophiles ni trop hydrophiles. Pour cette raison, notre intérêt s’est porté sur des substances à polarité moyenne du fait qu’elles présentent, en général, une bonne biodisponibilité. Dans un premier temps, seuls les extraits méthanoliques seront testés. Le laboratoire dispose d’une large bibliothèque d’extraits préparés selon une méthode de macération au méthanol standard (cf. V.1.c). Dans le cas ou des extraits n’étaient pas à disposition, une méthode d’extraction rapide a été mise en place. Une technique alternative et rapide consiste à extraire pendant 15 minutes aux ultrasons la plante finement broyée dans du méthanol (cf. V.1.d). Après évaporation du solvant, une solution d’extrait est préparée à 25 mg/ml dans la solution de dissolution pour être testé dans le β-test. Cette concentration a été fixée en tenant compte de la concentration finale en hématine dans le puits et de la concentration du test fixée pour les substances pures.

82 III – RESULTATS ______b) Identification et discrimination des faux-positifs et des substances indésirables Comme mentionné au point III.3.b, l’étude des substances pures a démontré qu’un tiers des résultats positifs sont des faux-positifs. Il est donc nécessaire de diminuer cette proportion, par l’identification et l’exclusion des faux-positifs. Deux procédures ont élaborées pour écarter d’une part les substances indésirables telles que les tannins et d’autre part, pour identifier les faux-positifs.

Elimination des tannins Les tannins considérés comme des substances interférentes sont éliminés par extraction sur phase solide (SPE). Cette opération permet non seulement d’éliminer les interférences mais également de concentrer les autres composés. L’utilisation d’une phase polyamide est très efficace pour adsorber ce type de polyphénols (Claeson et al., 1998; Mallika and Dhar, 1980). Trois fractions SPE sont obtenues après application du protocole présenté au chapitre III point V.5.c et schématisé ci-dessous (Figure III- XIX). Elles sont ensuite testées sur le β-test afin de confirmer que l’activité obtenue par l’extrait ne provient pas de ce type de molécules.

Figure III- XIX Protocole pour l’élimination des tannins par extraction sur phase solide sur phase polyamide (cartouche Macherey-Nagel PA, 1000 mg)

83 III – RESULTATS ______

Identification par HPLC-MS des faux-positifs La sous-structure des tannins se retrouve dans la catéchine, l’épicatéchine. Ces composés représentent des faux-positifs. Une méthode de prétraitement pour l’élimination des tannins n’était pas applicable à ce type de structure de faible poids moléculaire. Une méthode d’identification par HPLC-MS s’est donc avérée nécessaire. Ceci permettra de déterminer si l’un de ces composés est contenu dans l’extrait ou dans la fraction d’intérêt. L’identification est basée sur le temps de rétention et sur la comparaison du spectre de masse de la substance pure de référence. Cette méthode a été construite avec

Figure III- XX Logo AMDIS (Kind, 2003) les trois composés phénoliques cités ci-dessus mais elle peut être extrapolée à d’autres faux-positifs qui peuvent intervenir lors des criblages. Le support du logiciel de la librairie, baptisée « témoins », est Amdis. Ce logiciel libre s’appuie sur la déconvolution des spectres de masse pour l’identification des données obtenues par GC-MS ou par LC-MS (Kind, 2003). Ainsi, à la suite de l’analyse HPLC-MS (conditions V.4.b) effectuée sous des conditions de séparation et de détection standards, Amdis traite le chromatogramme ionique total et identifie avec une certaine probabilité la présence des faux-positifs. Ce logiciel reconnaitra les spectres préalablement enregistrés dans la librairie. La figure ci-dessous montre les paramètres d’analyses sélectionnés pour l’identification de l’épicatéchine.

84 III – RESULTATS ______

Figure III- XXI : Paramètres des données HPLC-MS de l’épicatéchine pour la base de données « Témoins »

Étant donné que la sélectivité donnée par la concordance du temps de rétention et par la similitude des spectres de masse sans fragmentation peut être discutée, une confirmation est possible par un dopage de l’extrait ou de la fraction avec la substance de référence. c) Différentes approches pour la sélection des plantes La sélection des plantes impliquées dans ce travail se base sur quatre types d’approches. Tout d’abord, une sélection aléatoire, qui s’est naturellement imposée par l’introduction du β-test à la batterie de tests chimiques ou biologiques disponibles au LPP : - La recherche d’inhibiteurs de l’acétyle cholinestérase dans le cadre de la recherche de composés pour le traitement d’Alzheimer (Marston et al., 2002). - Les tests antifongiques étudiant l’inhibition de la croissance de Cladosporium cucumerinum (Homans and Fuchs, 1970) et de Candida albicans (Rahalison et al., 1991). - La mise en évidence d’une activité antioxydante en utilisant le test au DPPH (Cuendet, 1999) . Ainsi, dans le cadre de l’étude phytochimique d’une plante, un passage sur cette batterie de tests permet non seulement de définir une activité mais aussi de débuter un

85 III – RESULTATS ______bioguidage. Par ce biais, certaines plantes ont été testées sur le β-test. Une autre approche s’est faite lors du travail de diplôme de Mlle Aziza Benzayed, qui a consisté à sélectionner une quarantaine de plantes issues de la pharmacopée européenne et une quarantaine de plantes alpines. Il était dans ce cas intéressant d’étudier dans un premier temps, l’activité antimalarique de plantes largement connues issues de la pharmacopée européenne, mais n’ayant jamais fait l’objet d’une mesure d’activité antimalarique. L’intérêt pour des plantes alpines provenait également de la curiosité concernant une éventuelle activité antimalarique de plantes facilement disponibles. L’approche ethnopharmacologique s’est déroulée lors d’un screening en collaboration avec l’Université de Buea au Cameroun. A peu près 80 extraits de plantes utilisées en médecine traditionnelle contre les symptômes de la malaria ont été passés sur le β-test. Finalement, une dernière voie de sélection résultant d’une combinaison entre une approche taxonomique et une approche ethnopharmacologique, s’est déroulée grâce à la base de données, « Track2ND », développée sur Access© au cours de mon travail de thèse au sein du LPP.

86 III – RESULTATS ______d) Track 2ND : Base de donnée Access Cette base de données développée sur Access 2003 (Microsoft, 1992-2003) regroupe des plantes ayant d’une part présentés une activité antiparasitaire in vitro/in vivo et/ou ayant été citées pour leur utilisation en médecine traditionnelle dans le traitement des maladies parasitaires, comme la malaria, la leishmaniose, la maladie de Chagas ou encore la maladie du sommeil. Avec la participation du Dr. Ioset, de M. Cretton et du Dr. Hay, cette base de données regroupe actuellement 1700 entrées représentant environ 300 familles de plantes. Pour ce faire, les études biologiques ou les enquêtes ethnopharmacologiques ayant donné lieu à des publications ont été sélectionnées à l’aide de la base de données Scifinder Scholar (Scholar, 2007) avec comme critères principaux une date postérieure à 1985 et l’activité ou l’indication de maladie cités ci-dessus.

Concernant les activités biologiques, les plantes actives avec un CI50 inférieur à 50 μg/ml et les substances actives avec un CI50 inférieur à 30 μM ont été prises en compte. Pour chaque entrée, de nombreuses informations sont réparties dans six tables, qui concernent la référence bibliographique, l’espèce mentionnée, son activité, sa (ses) substance(s) active(s), son utilisation en médecine traditionnelle ou son pays. Ces informations séparées de façon explicite dans la base de données restent liées entre elles selon le schéma présenté à la figure III-XXII. Cette distribution d’informations permet d’effectuer des recherches multicritères et de tenir compte qu’une espèce peut être citée dans plusieurs publications ou encore qu’une référence peut mentionner plusieurs espèces. Ce lien que l’on nomme de « un à plusieurs » est possible pour les six tables principales. A partir de toutes ces informations, cinq fenêtres de formulaires et résultats ont été créés. Le portail de la base de données nous emmène de l’ajout des résultats à l’information statistique en passant par la recherche générale (Figure III- XXIIIII). La première fenêtre est le formulaire de recherche multicritères, où l’on peut choisir parmi: la famille, le genre, l’espèce, le parasite, l’indication en médecine traditionnelle ou encore la substance pure active selon son nom ou son N° CAS (Figure III- XXIV).

87 III – RESULTATS ______

Figure III- XXII Lien entre les tables de la base de données “Track2ND” sur Access 2003

88 III – RESULTATS ______

Figure III- XXIII Portail de Track2ND.

Figure III- XXIV Recherche multicritères sur Track2ND (BA = Activité biologique ; TM = Médecine traditionnelle)

Figure III- XXV Informations statistiques pour une famille spécifique

89 III – RESULTATS ______

Un autre volet de Track2ND est le traitement des différentes données pour en tirer des informations statistiques qu’elles soient spécifiques à une famille (Figure III- XXV) ou générales (Figure III- XXVI). Il est également possible d’avoir accès aux différents types d’activité biologique d’une famille (Figure III- XXVII). On peut ainsi, par exemple, prendre connaissance du classement des familles les plus citées en médecine traditionnelle ou connaitre dans la famille Fabaceae le genre le plus cité ayant une activité biologique sur P. falciparum.

Figure III- XXVI Informations statistiques générales concernant les citations de chaque famille en médecine traditionnelle et concernant les activités biologiques référencées

Figure III- XXVII Informations supplémentaires sur l’activité biologique et l’usage en médecine traditionnelle d’une famille de plantes spécifiques

90 III – RESULTATS ______Le choix concernant une grande majorité des plantes présentées dans cette étude a été effectuée à l’aide de Track2ND, en nous focalisant sur les familles les plus citées en médecine traditionnelle pour le traitement de la malaria, tout en tenant compte que la ou les substance(s) responsable(s) de l’activité biologique n’était, pas à ce jour, identifiée(s) (Scifinder, 2007). e) Criblage d’extraits de plantes sur le β-test La présence d’un grand nombre de substances pures indésirables comme par exemple les sucres, la chlorophylle, ou encore les tannins, qui peuvent être présents en grande quantité diminuent la proportion de substances pures intéressantes et implique de travailler à des concentrations élevées. L’analyse qualitative des extraits s’effectue en ajoutant au départ du test 10 μl d’une solution d’extrait à 25 mg/ml. De cette façon, 219 extraits répartis sur 64 familles et sélectionnés selon les différentes approches présentées au chapitre III.4.c) ont été analysés sur le β-test de façon qualitative en présence des contrôles nécessaires à chaque série d’analyses. L’application d’une valeur limite minimale fixée à 0.2 permet de distinguer dans un premier temps, les extraits inhibant la réaction de ceux qui ne l’inhibe pas ou très peu (équation III-10).

I analysis > 0.2 → Inhibiteur Résultats qualitatifs avec (Equation III - 10) large filtre I analysis < 0.2 → Non − inhibiteur

L’ensemble des résultats des 219 extraits sont présentés dans le tableau III-3.

91 III – RESULTATS ______

Tableau III - 3 Résultats qualitatifs à large filtre obtenus pour 219 extraits

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Acanthaceae Acanthus montanus T.Anderson Cameroun F + Brillantaisia nitens Lindau Cameroun F + Eremomastax speciosa (Hochst.) Cufod. Cameroun PE + * Justicia insularis T.Anderson Cameroun PE + Justicia secunda Vahl Panama F + * R - T - Amaranthaceae Aerva lanata (L.) Juss. ex Schult. Indonésie PE - Amaranthus lividus L. Indonésie PA - R - Cyathula prostrata (L.) Blume PE - Anacardiaceae Buchanania arborescens Blume Indonésie F - ET + * Lannea humilis (Oliv.) Engl. Mali F + * T + * Lannea velutina A.Rich. Mali R + * Spondias mombin L. Guinée F + Annonaceae Orophea enneandra Blume Indonésie R - T + * Popowia pisocarpa (Blume) Endl. Indonésie F + * Uvariodendron giganteum (Engl.) R.E. Fr. Cameroun F + ET - Apiaceae Centella asiatica (L.) Urb. Cameroun PE + Eryngium foetidum Walter Indonésie PE + * Heracleum mantegazzianum Sommier & Levier Suisse Fl + * F -

92 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Apiaceae Heracleum mantegazzianum Sommier & Levier Suisse T + Apocynaceae Ervatamia graciliflora Stapf Indonésie E - Odontadenia puncticulosa (Rich.) Pulle Panama F + * Rauvolfia vomitoria Afzel. Cameroun ET + Aquifoliaceae Ilex lamprophylla Standl. Panama B + * Araceae Anchomanes difformis Engl. Cameroun PE + Pistia stratiotes L. PA - PE + Araliaceae Cussonia arborea Hochst. ex A.Rich. Cameroun E - (Aubl.) Maguire, Steyerm. & Schefflera morototoni Frodin Panama F - ET - Schefflera systyla R.Vig. Panama F - Asteraceae Ageratum conyzoides L. Cameroun PE + * Ambrosia spp L. Suisse F + Anaphalis javanica Sch.Bip. Indonésie Fl + * Bidens pilosa L. Panama PA + * Blumea sessiliflora Decne. Indonésie PA - Cirsium acaule All. Suisse PE + * Conyza bonariensis (L.) Cronquist Panama PA + * T - Dichrocephala integrifolia Kuntze Cameroun PE + Emilia praetermissa Milne-Redh. Cameroun PE + Gnaphalium attenuatum DC. panama PA + * Gnaphalium domingense Lam. Panama PA + * Melanthera aspera Rich. ex Spreng. Panama F - T - Mikania leiostachya Benth. Panama PB + *

93 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Asteraceae Spilanthes iabadicensis A.H.Moore Indonésie PE - Vernonia patens Kunth Panama Fl + * F + * T + * Bignoniaceae Arrabidaea patellifera (Schlechtend.) Sandwith Panama F + * Callichlamys latifolia K.Schum. Panama T + * Mansoa hymenaea (DC.) A.H.Gentry Panama T + * Mansoa standleyi (Steyerm.) A.H.Gentry Panama R + * Pithecoctenium echinatum (Jacq.) Baill. Panama T + Pithecoctenium crucigerum (L.) A.H. Gentry Panama E + * Spathodea campanulata Buch.-Ham. ex DC. Cameroun ET + Boraginaceae Tournefortia johnstonii Standl. Panama PA - Cordia platythyrsa Baker Cameroun ET + * Buddlejaceae Buddleja davidii Franch. Suisse F + Buddleja nitida Benth. Panama F - T - Caesalpinaceae (leguminosae) Dialium guineense Willd. Guinée ET + Caesalpinaceae Senna occidentalis (L.) Link Cameroun PE + Campanulaceae Campanula rapunculoides L. Suisse PE - Centropogon coccineus (Hook.) Regel ex B.D.Jacks. Panama PE - Phyteuma hedraianthifolium R.Schulz Suisse PE + * Capparaceae Cleome rutidosperma DC. Cameroun PE + Cecropiaceae Myrianthus arboreus Beauv. Cameroun ET + * Celastraceae Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek Paraguay PA + Maytenus senegalensis (Lam.) Exell Cameroun F + Chenopodiaceae Chenopodium ambrosioides Hance Cameroun PE + Chrysobalanaceae Parinari excelsa Sabine Guinée ET -

94 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Clethraceae Clethra lanata M.Martens & Galeotti Panama F - T + * Clusiaceae Garcinia kola Heckel Cameroun F + * Marila pluricostata Standl. & L.O. Williams Panama R + * ET + * Psorospermum guineense Hochr. Mali ER + * Combretaceae Terminalia macroptera Mart. Cameroun ET + * Convolvulaceae Convolvulus tricolor L. Algérie EG - Fl - G + R - T + Fl - Ipomoea mauritiana Jacq. Cameroun PE - Maripa panamensis Hemsl. Panama Fr - F + * T + * Costaceae Tapeinochilos ananassae K.Schum. Cameroun Ri - Crassulaceae Bryophyllum pinnatum Kurz Cameroun PE + Kalanchoe crenata Raym.-Hamet Cameroun PE + Rhodiola rosea L. Italie R - Cucurbitaceae Momordica charantia L. Cameroun PE + Cyperaceae Eriophorum angustifolium Honck. Panama ET + Rhynchospora corymbosa Domin Cameroun PE + Scleria spp P.J.Bergius Cameroun PE - Scleria striationux De Wild. Cameroun R - Scleria verrucosa Willd. Cameroun F - Dioscoreaceae Dioscorea dumertorum T.Durand & Schinz Cameroun PE +

95 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Ebenaceae Diospyros abyssinica (Hiern) F.White Mali R + * Ericaceae Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliv. Cameroun E + * Euphorbiaceae Chamaesyce buxifolia Small Panama PA + * R + * Euphorbia cordifolia Elliott Cameroun PE + Euphorbia hirta L. Cameroun PE + Phyllanthus acidus (L.) Skeels F - ET + * Phyllanthus buxifolius Reinw. Indonésie PA + * Phyllanthus reticulatus Lodd. Indonésie F + * R + * Securinega virosa (Roxb. ex Willd.) Baill. Mali F + Flacourtiaceae Flacourtia flavescens Willd. Mali F - Laetia thamnia Sw. Panama F - T - Gesneriaceae Columnea crassa C.V.Morton Panama B - F + * T - Lamiaceae Clerodendrum umbellatum Poir. Cameroun F + Hyptis suaveolens (L.) Poit. Cameroun PE + Thymus vulgaris M.Bieb. Cameroun PE + Vitex doniana Sweet Cameroun ET + Leguminosae Albizia adianthifolia W.Wight Cameroun ET + (Fabaceae) Baphia nitida Lodd. Cameroun CW + Canavalia maritima Thouars Panama F - T - Crotalaria incana L. PE + Daniellia oliveri (Rolfe) Hutch. & Dalziel Mali Tr + *

96 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Leguminosae Eriosema glomeratum Hook.f. Cameroun PE + * (Fabaceae) Erythrina senegalensis A.Rich. Cameroun F + * ET + * Erythrophleum guineense G.Don Cameroun ET + Isoberlinia doka Craib & Stapf Mali CF + * Lonchocarpus chiricanus Pittier Panama F + ER + R + Mucuna pruriens (L.) DC. Cameroun F + * T + Ostryoderris stulmannii Dunn ex Baker f. Mali F - Pentaclethra macrophylla Benth. Cameroun ET + Piliostigma thonningii (Schumach.) Milne-Redh. Cameroun Fl + * Pithecellobium rufescens Pittier Panama F + * T + * Sophora tomentosa L. Indonésie Fr - Malpighiaceae Tetrapteris macrocarpa I.M.Johnst. Panama PE + * Marcgraviaceae Marcgravia affinis Hemsl. Panama PE - Melastomataceae Adelobotrys adscendens Triana Panama T + * Axinaea costaricensis Cogn. Panama F + Panama T - Melastomataceae Blakea foliacea Gleason Panama F + PB - Conostegia speciosa Naudin Panama F + * Panama T + * Henrietta fascicularis M. Gomez Panama F + * ET - Miconia argentea DC. Panama F - T + *

97 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Melastomataceae Miconia minutiflora (Bonpl.) DC. Panama F + * Miconia serrulata (DC.) Naudin Panama PA - Mouriri myrtilloides M.Gómez Panama ET - Meliaceae Dysoxylum gaudichaudianum Miq. Indonésie F + * Sandoricum koetjape Merr. Indonésie F + * ET + * Menispermaceae Cissampelos tropaeolifolia DC. Panama PA - Stephania abyssinica Walp. Cameroun PE + Monimiaceae Glossocalyx brevipes Benth. Cameroun F + * Moraceae Morus alba L. Cameroun E + * F + Nyctaginaceae Boerhavia diffusa L. Cameroun PE - Pandanaceae Pandanus conoideus Lam. Fr + Piperaceae Piper umbellatum Sieber ex Kunth Cameroun PE + * Pittosporaceae Pittosporum mannii Hook. f. Cameroun ET + Pittosporum viridiflorum Sims Cameroun ET - Poaceae Cymbopogon giganteus Chiov. cameroun SF - Eleusine indica (L.) Gaertn. Cameroun PE + Polygonaceae Polygonum cuspidatum Willd. ex Spreng. Suisse F + * T + * Reynoutria sachelinensis (F. Schmidt) Nakai Suisse Fl + * F + * R + * T + Aspleniaceae Asplenium ruta-muraria L. suisse PA - Pontederiaceae Eichhornia crassipes (Mart.) Solms Zimbabwe F + Ranunculaceae Clematis hirsuta Guill. & Perr. Cameroun PE +

98 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Ranunculaceae Ranunculus parnassifolius L. Panama PE - Thalictrum aquilegiifolium L. Suisse PE + * Rhamnaceae Gouania longispicata Engl. Cameroun R + * Rosaceae Prunus africana (Hook.f.) Kalkman Cameroun ET + Rubiaceae Isertia haenkeana DC. Panama Fr + * Hoffmannia vesciculifera Standl. Panama PE + * Mitragyna stipulosa Kuntze Cameroun ET - Sapindaceae Paullinia pinnata L. Cameroun R + Scrophulariaceae Scoparia dulcis L. Cameroun PE - Solanaceae Schizanthus grahamii Gill. ex Hooker Chili ET - Schizanthus hookeri Gill. ex Graham Chili ET + Schizanthus tricolor Grau & Gronb. Chili R - ET + Solanum aculeastrum Dunal Cameroun T + F + Solanum nigrum L. Cameroun PE - Tiliaceae Triumfetta heudelotii Planch. ex Mast. Cameroun PE + Ulmaceae Trema orientalis (L.) Blume Cameroun F - ET + Urticaceae Laportea aestuans (L.) Chew Cameroun PE - Verbenaceae Lippia multiflora Moldenke Cameroun PE + * Violaceae Viola arvensis Murray Suisse PE + Viola biflora L. Suisse PE - Viola calcarata Sibth. & Sm. Suisse PE + Viola hirta L. Suisse PE - Viola odorata Thunb. Suisse Fl - R - Viola tricolor L. Suisse PA +

99 III – RESULTATS ______

Sélectionnée Famille Nom botanique Origine Organe IAnalyse >0.2 pour mise en place du test Zingiberaceae Aulotandra kamerunensis Loes. Cameroun E - Curcuma domestica Valeton Cameroun Rh + * B = Branches ; CB = chips de bois ; CF = coquille du fruit ; E = Ecorce ; EG = Ecorce de graines ; ER = Ecorce de racines ; ET = Ecorce de tige ; F = Feuilles ; Fl = Fleurs ; Fr = Fruits ; G = Graines ; PA = Partie aérienne ; PB = Petites branches ; PE = Plante entière ; SF = Sommités fleuries ; R = Racines ; Rh = Rhizomes ; T = Tiges ; Tr = Tronc

100 III – RESULTATS ______f) Validation et mise en place de la méthodologie C’est à partir des résultats présentés dans le tableau III-3, que 81 extraits inhibiteurs de la synthèse de la β-hématine, notés d’un astérisque (*) dans la dernière colonne du tableau- III, ont été sélectionnés. Sur cette série d’extraits une valeur d’absorbance limite,

ILimite,Extrait, plus restrictive est déduite de la valeur IAnalyse, dans le but de se focaliser sur les extraits inhibant au moins 50% de la réaction. La réponse qualitative du β-test sera comparée avec les résultats in vitro sur le parasite, effectué par l’ITS. Au final, la valeur prédictive de la réponse du β-test a pu être évaluée et une méthodologie de travail a été développée.

Traitement des résultats, mise en place d’une valeur ILimite,Extrait

La valeur ILimite,Extrait porte notre intérêt sur des extraits inhibant au moins 50 % de la réaction de synthèse. Ce filtre plus restrictif que le premier, présenté dans l’équation III-

10, requiert deux contrôles. Il s’agit, en fait de tester un extrait négatif (ACLTNeg) c'est-à- dire qui n’agit pas sur la réaction de synthèse de la β-hématine et le même extrait dopé avec 1.2 % (m/m) de chloroquine (ACLTNeg+CLQ), ainsi que leurs blancs respectifs,

ACLTNeg ;Blanc et ACLTNeg+CLQ ;Blanc. Cette concentration de dopage correspond à 25 mM de chloroquine, au départ, et est supérieure à son IC50 présentée à la Figure III- XIV. On peut dès lors, en analysant ces deux contrôles supplémentaires et leur blanc respectif, définir la valeur limite d’absorbance de l’extrait, ILimite,Extrait, (équation III-13) qui correspond à la valeur centrale entre ΔACLTNeg, (équations III-11) et ΔACLTNeg+ CLQ (équation III-12).

(Equation III - 11) ΔACLTNeg = ACLTNeg − ACLTNeg;Blanc

(Equation III - 12) ΔACLTNeg +CLQ = ACLTNeg +CLQ − ACLTNeg +CLQ;Blanc

ΔA − ΔA (Equation III - 13) I = CLTNeg +CLQ CLTNeg Limite,Extrait 2

101 III – RESULTATS ______

Ainsi la réponse qualitative du β-test est donnée selon la règle suivante :

I − I > 0 → Positif analysis Limite,Extrait Résultats qualitatifs (Equation III - 14) pour les extraits I analysis − I Limite,Extrait < 0 → Négatif

Comparaison β-test vs. in vitro sur P.falciparum Sur l’ensemble des 81 extraits sélectionnés, le β-test a été appliqué avec le traitement des résultats exprimés précédemment (équations III- 11 Æ 14). Le tableau III-4 présente les résultats qualitatifs au β-test en comparaison avec l’activité sur la croissance de P.falciparum. Concernant les résultats obtenus par l’ITS, nous considérons positif un

échantillon présentant un CI50 inférieur à 10 μg/ml. Les tableaux III-5 et III-6 résument l’ensemble de ces résultats.

Tableau III - 4 : Résultats pour les 81 échantillons au β-test vs. leur activité in vitro sur P. falciparum

In vitro β-test No Genre Espèce Famille Organe P.falciparum [25 mg/ml] [10 ug/ml] 1 Heracleum mantegazzianum Apiaceae Fl - - 2 Pithecellobium rufescens Leguminosae F - - 3 Vernonia patens Asteraceae F - - 4 Tetrapteris macrocarpa Malpighiaceae PE - - 5 Phyllanthus buxifolius Euphorbiaceae PA - - 6 Sandoricum koetjape Meliaceae F - - 7 Sandoricum koetjape Meliaceae ET + - 8 Buchanania arborescens Anacardiaceae ET - - 9 Ilex lamprophylla Aquifoliaceae B - - 10 clethra lanata Clethraceae T - - 11 Orophea enneandra Annonaceae T - - 12 Vernonia patens Asteraceae Fl - - 13 Vernonia patens Asteraceae T - - 14 Dysoxylum gaudichaudianum Meliaceae F - + 15 Hoffmannia vesciculifera Rubiaceae PE - - 16 Pithecellobium rufescens Leguminosae T - -

102 III – RESULTATS ______

In vitro β-test No Genre Espèce Famille Organe P.falciparum [25 mg/ml] [10 ug/ml] 17 Conyza bonariensis Asteraceae PA - - 18 Mikania leiostachya Asteraceae PB - - 19 Gnaphalium attenuatum Asteraceae PA - - 20 Phyllanthus reticulatus Euphorbiaceae R - - 21 Popowia pisocarpa Annonaceae F - - 22 Conostegia speciosa Melastomataceae F - - 23 Conostegia speciosa Melastomataceae T - - 25 Chamaesyce buxifolia Euphorbiaceae R - - 26 Chamaesyce buxifolia Euphorbiaceae PA + + 27 Justicia secunda Acanthaceae F - - 29 Gnaphalium domingense Asteraceae PA - - 30 Isertia haenkeana Rubiaceae Fr - - 31 Maripa panamensis Convolvulaceae F - - 32 Maripa panamensis Convolvulaceae T - - 33 Miconia argentea Melastomataceae T - - 34 Miconia minutiflora Melastomataceae F - - 35 Adelobotrys adscendens Melastomataceae T - - 36 Lannea velutina Anacardiaceae R + - 37 Diospyros abyssinica Ebenaceae R + - 38 Henrietta fascicularis Melastomataceae F - - 39 Phyllanthus acidus Euphorbiaceae ET + - 40 Phyllanthus reticulatus Euphorbiaceae F - + 41 Daniellia oliveri Leguminosae Tr + - 42 Bidens pilosa Asteraceae PA - - 43 Isoberlinia doka Leguminosae CF - - 44 Marila pluricostata Clusiaceae R + - 45 Marila pluricostata Clusiaceae ET + - 46 Odontadenia puncticulosa Apocynaceae F - - 47 Cirsium acaule Asteraceae PE - - 48 Phyteuma hedraianthifolium Campanulaceae PE - - 49 Thalictrum aquilegiifolium Ranunculaceae PE - - 50 Lannea humilis Anacardiaceae F - - 51 Lannea humilis Anacardiaceae T - - 52 Polygonum cuspidatum Polygonaceae F - - 53 Reynoutria sachelinensis Polygonaceae F - - 54 Reynoutria sachelinensis Polygonaceae R - - 55 Reynoutria sachelinensis Polygonaceae Fl - - 56 Arrabidaea patellifera Bignoniaceae F + - 57 Callichlamys latifolia Bignoniaceae T - - 58 Mansoa hymenaea Bignoniaceae T - -

103 III – RESULTATS ______

In vitro β-test No Genre Espèce Famille Organe P.falciparum [25 mg/ml] [10 ug/ml] 59 Mansoa standleyi Bignoniaceae R - - 60 Anaphalis javanica Asteraceae Fl - - 61 Columnea crassa Gesneriaceae F - - 62 Psorospermum guineense Clusiaceae ER + - 63 Polygonum cuspidatum Polygonaceae T - - 64 Pithecoctenium crucigerum Bignoniaceae E - - 65 Agauria salicifolia Ericaceae E + - 66 Ageratum conyzoides Asteraceae PE - - 67 Eremomastax speciosa Acanthaceae PE - - 68 Eriosema glomeratum Leguminosae PE + - 69 Eryngium foetidum Apiaceae PE - - 70 Gouania longispicata Rhamnaceae R - - 71 Myrianthus arboreus Cecropiaceae ET - - 72 Terminalia macroptera Combretaceae ET + + 73 Mucuna pruriens Leguminosae F - - 76 Glossocalyx brevipes Monimiaceae F - - 77 Lippia multiflora Verbenaceae PE - - 78 Morus alba Moraceae E - + 79 Piliostigma thonningii Leguminosae Fl - - 80 Piper umbellatum Piperaceae PE - - 81 Cordia platythyrsa Boraginaceae ET + + 82 Curcuma domestica Zingiberaceae Rh - + 83 Erythrina senegalensis Leguminosae F - + 84 Erythrina senegalensis Leguminosae ET + + 85 Garcinia kola Clusiaceae F + - B = Branches ; CB = chips de bois ; CF = coquille du fruit; E = Ecorce ; EG = Ecorce de graines ; ER = Ecorce de racines ; ET = Ecorce de tige ; F = Feuilles ; Fl = Fleurs ; Fr = Fruits ; G = Graines ; PA = Partie aérienne ; PB = Petites branches ; PE = Plante entière ; SF = Sommités fleuries ; R = Racines ; Rh = Rhizomes ; T = Tiges ; Tr = Tronc

Tableau III - 5 Comparaison résultats qualitatifs vs. activité in vitro sur P. falciparum (NF54)

In vitro P. falciparum + - + 4 (5%) 12 (15%) β-test - 5 (6%) 60 (74%)

104 III – RESULTATS ______

Vrais- Faux- positifs positifs 5% 15%

Faux- négatifs 6%

Vrais- négatifs 74%

Figure III- XXVIII Réponse qualitative du β-test vs. activité in vitro sur P. falciparum

La figure III-XXVIII résume l’ensemble des résultats obtenus pour le set d’extraits sur le β-test comparés à leur activité sur P.falciparum. Il en résulte que la fiabilité du test est très satisfaisante avec 79 % des réponses qui sont confirmées sur la croissance du parasite. Si l’on utilise le β-test en tant qu’outil pour le bioguidage dans le but de gagner du temps, il est intéressant à présent de se focaliser sur les résultats positifs de ce test. Dans ce sens et selon la figure III-XXIX, un quart des positifs du β-test sont confirmés par une activité sur la croissance du parasite.

Vrais-positifs 25%

Faux-positifs 75%

Figure III- XXIX Activité sur P. falciparum des extraits positifs au β-test

105 III – RESULTATS ______

Ces résultats peuvent paraitre à première vue peu satisfaisants. C’est donc à ce stade, que l’efficacité des protocoles concernant l’élimination ou l’identification de substances indésirables sont appliqués afin de vérifier leur utilité.

Ainsi, l’activité sur l’inhibition de la synthèse de la β-hématine des fractions SPE obtenues après le protocole d’élimination des tannins discuté au point III.4.b (protocole V.5.d), est mesurée. Dans le cas où les fractions SPE sont négatives, l’extrait est considéré négatif au β-test du fait que l’activité observée provenait de substances interférentes. Ainsi, l’étape d’élimination des tannins a permis de confirmer l’activité inhibitrice de 12 extraits sur 16.

Tableau III - 6 Résultats du β-test après confirmation de l’activité des fractions SPE des extraits positifs

No Fractions SPE active Conclusion β-test 7 Fraction 2 & 3 Positive 26 Fraction 2 Positive 36 Aucune Negative 37 Fraction 2 Positive 41 Fraction 2 & 3 Positive 44 Aucune Negative 45 Aucune Negative 56 Fraction 2 & 3 Positive 62 Fraction 2 Positive 65 Aucune Negative 68 Fraction 2 Positive 72 Fraction 2 & 3 Positive 81 Fraction 2 & 3 Positive 84 Fraction 2 & 3 Positive 85 Fraction 2 & 3 Positive

Ainsi, 4 extraits ont été exclus du processus améliorant dans ce cas la prédictivité à 84 %. Comme le démontre la figure III-XXX, le traitement SPE a bien joué son rôle.

106 III – RESULTATS ______

Faux- Vrais- positifs positifs

Faux- 10% 5% négatifs Vrais-positifs Positifs au β-test 33%

Faux-positifs 67%

Vrais- négatifs 79%

Figure III- XXX Fiabilité de la réponse qualitative du β-test vs. activité in vitro sur P. falciparum après confirmation SPE et fiabilité de la réponse positive du β-test vs. activité in vitro sur P. falciparum

La deuxième étape consiste à identifier les faux-positifs à l’aide de la base de données développée sur AMDIS. Celle-ci contient actuellement trois faux-positifs identifiés : la catéchine, l’épicatéchine et la myricitrine. Ainsi, les 12 extraits positifs au β-test sont analysés par HPLC-DAD-MS selon les conditions présentées au chapitre V4.b. Il s’avère que la catéchine et l’épicatéchine sont contenu dans l’extrait n° 7. Si l’on considère que l’activité observée sur la synthèse de la β-hématine provient de ces deux substances, l’exclusion de cet échantillon permettrait d’améliorer la fiabilité de la réponse qualitative et de diminuer la proportion des faux-positifs (Figure III-XXXI).

Faux- Vrais- positifs positifs Faux- 9 % 5% négatifs 6% Positifs au β-test Vrais-positifs 36 %

Faux-positifs 63 %

Vrais- négatifs 80%

Figure III- XXXI Fiabilité de la réponse qualitative du β-test vs. activité in vitro sur P. falciparum après confirmation SPE et confirmation HPLC-DAD-MS et fiabilité de la réponse positive du β-test vs. activité in vitro sur P. falciparum

107 III – RESULTATS ______

Bien que cette dernière étape améliore la proportion de vrais-positifs du β-test, on ne peut pas exclure un échantillon par ce processus. Il faut souligner que malgré la présence confirmée de faux-positifs, il est tout à fait probable que l’activité provient également d’une autre substance contenue dans l’extrait d’intérêt. Cette observation sera donc prise en compte dans la suite de ce travail.

III.5. MÉTHODOLOGIE DU β-TEST Pour la mise en place de la méthodologie du β-test, quatre chemins méthodologiques suivants ont été étudiés (Figure III-XXXII). Le premier cas mime la situation dans laquelle l’ensemble des 81 extraits qui inhibent significativement la réaction de synthèse de la β-hématine sont envoyés aux laboratoires collaborateurs pour définir leur activité in vitro sur P. falciparum. Le second cas consiste à tester l’ensemble des extraits sur le β-test mais à n’envoyer à tester, que ceux qui présente une inhibition d’au moins 50 % de la synthèse de la β-hématine. Une troisième situation est d’inclure dans le test in vitro les extraits qui inhibe à 50 % au minimum la réaction et qui ont été confirmés par un résultat positif d’une de leurs fractions SPE sur le β-test. Puis dans la dernière situation, les échantillons sélectionnés à l’étape précédente sont analysés par HPLC-DAD-MS et les extraits contenant des faux-positifs sont exclus de l’envoi. Ces situations ont pu être quantifiées à l’aide des résultats obtenus par l’ITS.

La figure III-XXXII démontre que chacune des étapes, à savoir le filtre à 50 % d’inhibition minimum de la réaction, l’élimination des interférences et l’identification de faux-positifs, sont nécessaires pour augmenter les chances d’obtenir des résultats positifs via le β-test avec une confirmation in vitro.

108 III – RESULTATS ______219 extraits

IAnalyse > 0.2

1er cas : 81 extraits à tester sur P. falciparum Æ 5% de vrai-positifs

Etape de confirmation I IAnalyse – ILimite,Extrait > 0 2e cas : 14 extraits à tester sur P. falciparum Æ25% de vrai-positifs

Etape de confirmation II SPE protocole : Elimination des interférences 3e cas : 11 extraits à tester sur P. falciparum Æ 33% de vrai-positifs

Etape de confirmation III Identification des faux-positifs par HPLC-MS 4e cas : 10 extraits à tester sur P. falciparum Æ 36% de vrai-positifs

Figure III- XXXII Vérification de l’utilité des étapes de confirmation I, II et III

Cette démarche a été construite dans le but de faire du β-test un outil de présélection robuste et fiable. L’étape de détermination de faux-positifs par HPLC-DAD-MS ne peut être utilisée comme étape d’exclusion au niveau de l’extrait lui-même. Comme il en a été discuté, l’exclusion du fait de l’identification d’un composant faux-positif par HPLC- DAD-MS risque de mettre de côté un extrait qui peut également contenir un vrai-positif. En appliquant cette étape de confirmation sur les fractions positives obtenues après le bioguidage par β-test, ce risque est écarté et les avantages de cette étape de confirmation sont maintenus. C’est donc avec ces observations que la méthodologie de travail du β-test a été développée et est présentée à la figure III-XXXIII. En ce qui concerne les autres cibles érythrocytaires, il est intéressant de continuer l’analyse sur le parasite en parallèle. Tout en sachant que durant le temps d’attente, la recherche sur les extraits inhibant la voie de synthèse du pigment malarique est possible.

109 III – RESULTATS ______

SELECTION DE PLANTES Avec Track2ND

Bioguidage avec le β-test Activité in vitro Résultats d’analyse en 1 jour Résultats d’analyse en min. 3 mois

β-test Corrélation ? Activité sur P.falciparum (LLP, Unige) (ITS, Bâle ; FioCruz, Brésil ; LMPH 25 mg/ml Anvers)

Analyse préliminaire HPLC-UV/DAD et déréplication

Confirmation I Confirmation I ΙAnalyse – I Limite, Extrait<0 ΙAnalyse – I Limite, Extrait>0 Négatif Positif

Confirmation II SPE sur PA et β-test sur les fractions

ΙAnalyse < 0 ΙAnalyse > 0 Négatif Positif

Confirmation III Exclusion des fractions contenant des faux- positifs identifié par HPLC-MS-MS

Isolement Substance pure active

Identification Activité sur P.falciparum Spectroscopie RMN et spectrométrie (STI, Bâle ; FioCruz, Brésil ; LMPH de masse haute résolution Anvers)

Figure III- XXXIII Méthodologie du β-test

110 III- RESULTATS ______

III.6. VALIDATION DE LA METHODOLOGIE DU β-TEST SUR DES EXTRAITS DE PLANTES

Dans ce chapitre, trois exemples de bioguidage selon la méthodologie présentée au point III.5 sont présentés. Les techniques de chromatographie préparative impliquées dans l’étape de fractionnement ont été choisie en fonction de l’empreinte chromatographique obtenues lors de l’analyse préliminaire par HPLC-DAD/UV et de la quantitié d’extrait à disposition. L’étude sur ces extraits de plantes permettent de vérifier la cohérence de la méthodologie du β-test en aboutissant à l’identification des substances à l’origine de l’inhibition de la synthèse de la β-hématine. Dans le cas de vrais-positifs, la confirmation de cette activité est relayée par le test sur la croissance de P. falciparum. D’après les recherches bibliographiques menées à ce jour (mai 2009), aucune activité antimalarique n’a été répertoriée pour les trois espèces sélectionnées : Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae), Chamaesyce buxifolia Small (Euphorbiaceae), Sandoricum koetjape Merr. (Meliaceae) (Scifinder, 2007).

a) Vrais-positifs : Identification des substances responsables de l’activité anti-malarique

Loiseleuria procumbens (L.) Desv. (Ericaceae) La méthodologie développée au point III.5 a été appliquée pour le bioguidage de L. procumbens. Ainsi, après que l’extrait ait démontré une activité sur la synthèse de la β-hématine, une confirmation par l’analyse des fractions SPE est effectuée. Séquentiellement, un fractionnement par chromatographie flash puis les résultats au β- test des fractions obtenues ont permis d’identifier une des substances responsables de cette activité.

¾ Sélection de la plante Le criblage de plantes alpines et européennes sur le β-test pour la recherche d’antimalariques d’origine naturelle agissant au niveau de la synthèse de la β- hématine a été effectué dans le cadre du travail de diplôme de Mlle Aziza Benzayed. Parmi 115 plantes impliquées dans ce criblage, l’extrait méthanolique de la plante

111 III – RESULTATS ______

entière de Loiseleuria procumbens (L.) Desv. a démontré une inhibition significative de la synthèse de la β-hématine.

¾ Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire L’analyse HPLC/DAD-UV de cet extrait est effectuée sur une colonne à phase inverse avec une méthode chromatographique en mode gradient (conditions chapitre V.4.a). Les pics UV-majoritaires obtenus sur le chromatogramme HPLC-UV à λ = 254 nm sont numérotés de 1 à 11 (figure III - XXXIV). Leurs spectres UV-Vis ainsi que leurs maximas d’absorption sont présentés respectivement dans la figure III - XXXV et dans le tableau III-7.

Figure III - XXXIV Analyse HPLC/DAD-UV de l’extrait méthanolique de la plante entière de L. procumbens (L.) Devs. Conditions : Colonne NovaPak C18, Waters (3.9x150 mm ; 4μm) précédées d’une pré-colonne contenant la même phase (1.5 x 2.1 mm, 5 μm). Eluant A : H2O et B : MeCN. Gradient (A:B) de 90:10 à 60:40 de 0 à 30 minutes ; Vinjection : 10 μl ; Débit 1 ml/min ; Détection à λ = 254 nm, spectre UV-Vis balayé de 190 à 400 nm.

Ce même extrait, ayant fait l’objet d’une étude phytochimique lors d’un travail de thèse au sein du LPP (Cuendet, 1999) fait que la librairie des substances naturelles du LPP dispose de deux substances déjà isolées, le phloridzoside et le 6’’-acetylphloridzoside. A partir de ces substances de référence, les composés 9 et 10 ont été identifiés. La comparaison de leur temps de rétention et ainsi que le dopage de l’extrait avec ces témoins de référence permettent une identification sélective de ces deux substances dans le chromatogramme. Ces informations sont confirmées par leur spectre UV-Vis

112 III- RESULTATS ______semblables qui présentent des maximas d’absorption à 260 et à 350 nm, caractéristique des flavonoïdes, et plus précisément des flavonols ou des chalcones (Markham, 1982). En effet, la distinction des flavonoïdes par la spectrophotométrie UV-Vis s’effectue par deux maximas d’absorption situés à 240-295 nm (bande II) et à 300-560 nm (bande I) caractéristiques du type de flavonoïdes (tableau III-7).

Tableau III- 7 : Considérations spectroscopiques sur les flavonoïdes (Markham, 1982)

Bande II [nm] Bande I [nm] Type de flavonoïdes 250-280 310-350 Flavones 250-280 330-360 Flavonols (3-OH substitués) 250-280 350-385 Flavonols (3-OH libres) 245-275 310-330 (sh) Isoflavones 275-295 300-330 (sh) Flavanones ou dihydroflavonols 230-270 340-390 Chalcones 230-270 380-430 Aurones 270-280 465-560 Anthocyanidines ou anthocyanines

Figure III - XXXV Spectre UV-Vis (balayage de 190 à 400 nm) des composés 1 à 11 de l’extrait méthanolique de L. procumbens (L.) Devs.

113 III – RESULTATS ______

Tableau III - 8 Maximas d’absorption des composés 1 à 11 de l’extrait méthanolique de L. procumbens (L.) Devs. et déreplication

Informations obtenues à partir des Informations obtenues à partir des données spectrophotométriques données chromatographiques Composés Classe de composés λmax TR [min] Déréplication supposée 1 215, 275 nm Indéterminé 1.2 -- 2 215, 280 nm Indéterminé 1.6 -- 3 215, 280 nm Indéterminé 4.4 -- 4 215, 280 nm Indéterminé 9.8 -- 5 215, 310 nm Indéterminé 11.9 -- 6 260, 350 nm flavone ou flavonol 12.6 -- 7 260, 350 nm flavone ou flavonol 12.9 -- 8 265 nm Indéterminé 14.6 --

9 220, 285 nm -- 16.3 Phloridzoside (RT=16.25 min) 10 225, 285 nm -- 20.6 6’’-acetylphloridzoside

(RΤ=20.56 min) 11 225, 285 nm Indéterminé 23.5 --

¾ Analyse des fractions SPE sur le β-test Les trois fractions SPE (protocole V.5.c) ont été analysées sur le β-test à des concentrations de 15 mg/ml préparées dans la solution 1 (protocole V.2.c)

Tableau III -9 Résultats du β-test sur les fractions SPE de L. procumbens β-test Fractions SPE 15 [mg/ml] I - II + III +

Les résultats positifs de la fraction II et III indiquent que l’activité n’est pas due aux tannins, ces derniers étant adsorbés sur la phase polyamide. La cohérence de ces

114 III- RESULTATS ______

résultats pose les bases de la suite du protocole qui consiste au fractionnement bioguidé.

¾ Fractionnement et β-test sur les fractions Le fractionnement par chromatographie flash s’est déroulé sur un appareil de type Spot Liquide Chromatography Flash (Armen Instrument) équipé d’une colonne à phase inverse (RP18) et d’un détecteur UV-Vis fixé à λ = 254 nm (conditions V.5.b). En 105 minutes, la charge d’extrait de 150 mg à sec a été fractionnée sur une totalité de 70 fractions, récoltées automatiquement à chaque pic et tous les 20 ml.

Figure III- XXXVI Fractionnement de l’extrait de L. procumbens (L) Desv. par chromatographie flash. Conditions : Colonne RP18 (25-40 mm ; 17 g) ; Eluant A : H2O et B : MeOH ; Mode gradient 95 :5 à 30 :5 en 90 minutes avec palier isocratique tous les 5% pendant 5 minutes puis de 30 :70 à 2 :98 en 15 minutes ; Détection UV-Vis λ = 254 nm ; Charge d’extrait 150mg adsorbé sur 400 mg de silice ; Débit 10 ml/min

A l’aide du chromatogramme enregistré à λ = 254 nm (figure XXXVI), les fractions ont pu être regroupées en 15 fractions, nommées de A à O. Après séchage des fractions et analyse par HPLC/DAD-UV (cf. conditions V.4.a), il s’avère que certaines contiennent une seule substance UV-majoritaire. Le β-test s’est poursuivi pour les fractions qui ont présenté une masse supérieure à 1.2 mg. La figure III-XXXVII représente les fractions obtenues par chromatographie flash.

115 III – RESULTATS ______

150 mg ηfractionnement = 82 %

A B C D E F G H I J K L M N O 25.7 20.0 7.4 2.9 7.3 0.1 18.8 9.9 0.9 4.9 10.4 2.8 3.9 6.3 1.2

mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg

9 9 10 10

Figure III-XXXVII Schéma du fractionnement par chromatographie flash sur l’extrait méthanolique de L. procumbens (L) Desv. et composés UV-majoritaires.

Résultat β -test des fractions flash de L. procumbens

2.000 1.500

1.000 limite -I 0.500

0.000 Analyse I AB CDEGHJ K LMO -0.500

-1.000

Figure III-XXXVIII Résultats obtenus pour les fractions flash de L. procumbens (L) Desv. au β-test.

Les résultats obtenus au β-test des fractions flash de L. procumbens mettent en

évidence 4 fractions positives : B, C, G, H, par une valeur IAnalyse-ILimite supérieure à zéro (figure III-XXXVIII). Les fractions B et C étant des mélanges complexes, la suite de ce bioguidage s’est focalisée sur l’identification du composé 9, qui absorbe majoritairement à λ = 254 nm dans la fraction G également contenu dans la fraction H.

116 III- RESULTATS ______

¾ Identification du composé 9 C’est à l’aide des observations effectuées au début du protocole lors des analyses préliminaire sur L. procumbens que le composé 9 a pu être identifié par déréplication. En effet, son temps de rétention de 16.3 min, son spectre UV-Vis ainsi que l’analyse de la fraction dopée avec la substance témoin concorde avec le phloridzoside (33).

HO

HO R S O S S R HO O OH

HO OH OH

(34)

Figure III-XXXIX Phloridzoside (34)

L’analyse par spectrométrie RMN s’est avérée nécessaire pour indiquer la pureté de la fraction G, afin de confirmer que l’activité est reliée à cette substance uniquement. Le spectre 1H-RMN indique que la fraction G est pure en phloridzoside et une comparaison du spectre 1H-RMN à 500 mHz avec la substance témoin apporte une confirmation supplémentaire quant à son identification (figure III-XL).

117 III – RESULTATS ______

1.0 1 0.9 H-RMN Fraction G 0.8

0.7

0.6

0.5

Normalized Intensity 0.4

0.3

0.2

0.1

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Chemical Shift (ppm)

1.0 0.9 1 0.8 H-RMN phloridzoside 0.7

0.6

0.5

Normalized Intensity 0.4

0.3

0.2

0.1

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Chemical Shift (ppm) 1 Figure III - XL Comparaison des spectres H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) de la fraction G et du phloridzoside (33)

¾ Activité in vitro sur P. falciparum La dernière étape du protocole est la confirmation de l’activité sur le parasite lui- même. C’est avec la collaboration du laboratoire FioCruz situé au Brésil que l’activité de l’extrait de L. procumbens, du composé 9 ainsi que du témoin phloridzoside ont été déterminés sur Plasmodium falciparum (NF 54) (protocole V.3).

Tableau III-10 Résultats de l’activité sur P.falciparum effectué par FioCruz Institut lors du bioguidage de L.procumbens Activité In vitro sur P. falciparum

CI50 [μg/ml] Extrait de L. procumbens MeOH US 19.22

Composé 9 23.26

Phloridzoside 19.17

Ces résultats confirment les résultats du β-test et appuie la validité de la méthodologie. L’identification de la substance active sur la synthèse de la β-hématine est confirmée par l’activité sur la croissance du parasite.

118 III- RESULTATS ______

Chamaesyce buxifolia Small (Euphorbiaceae)

¾ Sélection de la plante C’est lors du criblage avec le β−test sur des plantes sélectionnées à l’aide de Track2ND, visant à focaliser notre attention sur des familles utilisées en médecine traditionnelle et sur une activité antimalarique non décelée pour l’espèce sélectionnée, que l’extrait méthanolique des parties aérienne de Chamaesyce buxifolia Small a montré une activité inhibitrice de la synthèse de la β-hématine.

¾ Purification de l’extrait Lors de l’analyse préliminaire par HPLC/DAD-UV (condition V.4.a), il s’est avéré que l’extrait de C. buxifolia Small a démontré la présence de tannins. Ces macromolécules provoquent un fort effet de matrice rendant le chromatogramme peut lisible. Une élimination de ces polyphénols a donc été effectuée par précipitation à la poudre de peaux (protocole V.1.d). Avec une masse de départ de 4.0 g d’extrait, il reste, après élimination des tannins, 1.35 g. Ce qui fait une perte de masse due à l’élimination des tannins d’environ 66%.

¾ Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire A partir de l’extrait purifié, une analyse préliminaire par HPLC/DAD-UV (conditions V.4.a) a permis de numéroter de 1 à 10 les substances UV-majoritaires à λ = 254 nm (Figure III-XLI). Des informations concernant la classe de certains composés contenus dans l’extrait de C. buxifolia ont pu être obtenues à partir de cette analyse préliminaire. Il en résulte que les spectres UV-Vis des composés 5 à 10 sont caractéristiques de la classe des flavonoïdes (Figure III-XLII). Quasi-identiques, les spectres présentent des maximas d’absorption à 255-260 nm et à 350-360 nm, qui laissent à supposer que nous avons à faire à des flavonols ou des chalcones (Markham, 1982).

119 III – RESULTATS ______

DAD1 B, Sig=254,4 Ref =550,5 (D:\MESDOC~1\RÉSULTAT\2009\HPLC-U~2\CBMPLC~1\05050902.D) mAU 10

160

140

4 120 3

1 100

2 80

60 7

6 40 9 5 8 20

0

-20 5 10 15 20 25 30 35 min

Figure III - XLI Analyse HPLC/DAD-UV de l’extrait méthanolique des parties aérienne de C. buxifolia Small. Conditions : Colonne NovaPak C18 (3.9x150 mm, 4μm ; Waters) précédées d’une pré-colonne contenant la même phase (1.5 x 2.1 mm, 5 μm). Eluant A : H2O + 0.1% acide formique et B : MeOH. Mode gradient ; Vinjection : 10 μl ; Débit 1 ml/min ; Détection à λ = 254, 210 et 360 nm, spectre UV-Vis (DAD) balayé de 190 à 400 nm.

Figure III - XLII Spectre UV-Vis (balayage de 190 à 400 nm) des composés 1 à 9 de l’extrait méthanolique de C. buxifolia Small

120 III- RESULTATS ______

Tableau III - 11 Temps de rétention et maximas d’absorption des composés 1 à 9 de l’extrait méthanolique de C. buxifolia Small Maxima Types de composés Composés TR [min] d’absorption (λmax) supposés 1 3.1 215 ; 270 Indeterminé 2 5.2 -- Indeterminé 3 6.2 215 ; 270 Indeterminé 4 7.2 215 ; 270 Indeterminé 5 13.3 255 ; 360 Chalcones ou flavonols 6 15.8 260 ; 350 Chalcones ou flavonols 7 18.1 255 ; 355 Chalcones ou flavonols 8 19.2 255 ; 360 Chalcones ou flavonols 9 20.8 255 ; 355 Chalcones ou flavonols 10 24.0 255 ; 350 Chalcones ou flavonols

¾ Analyse des fractions SPE sur le β-test

Tableau III -12 Résultats du β-test sur les fractions SPE de C. buxifolia β-test Fractions SPE 15 [mg/ml] I - II + III +

La réponse positive des fractions SPE II et III au β-test permet de continuer la suite de la méthodologie qui consiste au fractionnement bioguidé.

¾ Fractionnement et β-test sur les fractions 1.00 g de l’extrait des parties aériennes de C. buxifolia purifié a été fractionné par MPLC sur une phase ZEOPrep 60 C18 (460 x 51 mm, 40-63 μm) avec un système de

solvant H2O :MeOH en mode gradient de 75 :25 à 50 :50 avec un débit de 8 ml/min en 28 heures. 65 fractions de 180 ml chacune ont ainsi été obtenues puis analysées par HPLC/DAD-UV (conditions V.5.a) afin des les regrouper en 21 fractions nommées

121 III – RESULTATS ______

de A à U (Figure III-XLIII). Il s’avère que certaines fractions contiennent une seule substance UV-majoritaire à λ = 254 nm. L’ensemble de ces fractions ont été testées sur le β-test à une concentration de 15 mg/ml (figure III-XLIV).

mextrait 1.00 g ηfractionnement = 60 %

A C E G I K M O Q S U

217.9 48.7 11.7 14.6 65.2 15.5 10.6 17.1 3.1 22.4 25.0 mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg

B D F H J L N P R T

5.1 31.3 10.3 32.1 12.4 24.7 3.4 5.9 14.7 3.4 mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg

5 6 7 10

Figure III – XLIII Schéma du fractionnement par MPLC de l’extrait méthanolique de C. buxifolia Small et substances UV-majoritaires

Fraction MPLC de Chamaesyce buxiofolia

3.000

2.500

2.000

1.500

1.000 limite,fraction

-I 0.500

Analyse 0.000 I I A B C D E F G H J K L M N O P Q R S T U -0.500

-1.000

-1.500

Figure III - XLIV Résultats du β-test pour les fractions MPLC de l’extrait C. buxifolia Small

122 III- RESULTATS ______

D’après les résultats qualitatifs obtenus sur le β-test, les fractions O, Q, R, S et T sont positives. A partir de cette information, l’identification de la substance responsable de cette activité pour chaque fraction est effectuée. Il s’avère que la fraction O, Q et S contiennent selon les analyses HPLC/DAD-UV de chacune, une substance UV- majoritaire qui absorbe à λ = 254 qui sont les composés 6, 7 et 10 respectivement. Les fractions R et T contiennent quand à elle la même substance UV-majoritaire que la fraction S, c'est-à-dire le composé 8. Pour ces raisons et pour une quantité suffisante de matière à disposition, l’identification du composé majoritaire de la fraction O et de la fraction S sont présentés dans la suite de ce bioguidage.

¾ Identification des composés 6 & 10 Composé 6 (fraction O) Le composé 6 se présente sous l’aspect d’écailles jaunes pâles. Son spectre UV-Vis obtenu lors des analyses préliminaires suppose que ce composé est une flavone ou un flavonol, par ses maximas d’absorption à 260 nm et 350 nm. L’analyse par HPLC- UV-MS en mode ESI négatif indique qu’il ne s’agit pas d’un composé indésirable et montre un ion moléculaire [M-H]- à 463.10 avec un ion fille ayant un rapport m/z de 316.08. L’identification de ce composé est confirmée par spectrométrie RMN mono 1 13 et bidimensionnel dans CD3OD. Les spectres H et C indiquent des déplacements caractéristiques de la myricitrin qui concordent avec la littérature (Chung et al., 2004) Les corrélations hétéronuclaires et homonucléaire obtenus par la RMN à deux dimensions confirme sa structure.

Composé 10 (fraction S) Ce composé se présente sous la forme d’écailles de couleurs jaunes pâles. Comme nous l’avons vu lors de l’analyse préliminaire HPLC/UV-DAD, le composé 10 démontre un spectre UV typique des flavonoïdes et plus particulièrement soit d’une flavone soit d’un flavonol. L’analyse par UPLC-TOF en mode ESI négatif sur une méthode standard courte (condition V.4.b) présente un ion moléculaire [M-H]- à

447.0912, suggérant avec une forte probabilité une formule chimique C21H19O11. A

123 III – RESULTATS ______

cela s’ajoute l’analyse 1H-RMN qui indique qu’il s’agit d’une substance naturelle courante, la quercitrine. Une dernière confirmation de son identité est obtenue par le dopage de la fraction S avec le témoin quercitrine.

¾ Activité antimalarique L’activité antimalarique de la quercitrine, le composé 10, a déjà été démontrée sur la

croissance de P. falciparum avec un CI50 de 4 μg/ml (Liu et al., 2007) et lors d’une

étude en collaboration avec le LSTHM en juillet 2007, qui avait évalué le CI50 à 1.84 sur K1 μg/ml et à 6.64 μg/ml sur 3D7 (protocole V.3). Ayant déjà connaissance de son activité, la fraction S et le témoin de référence, la quercitrine, n’ont pas été envoyées à tester à l’ITS. Il en est de même pour le composé 6, qui s’est révelé être de la myricitrin. Lors de la mise en place du protocole du β-test avec les substances pure, la myricitrine avait été testée sur P. falciparum à l’ITS et avait démontrée une activité inhibtrice sur la croissance du parasite. Bien que ces deux substances soient déjà connues. L’étude de l’activité de l’extrait méthanolique totale de C. buxifolia sur P. falciparum permet de confirmer l’intérêt que nous avons porté à cet extrait suite à sa sélection par le β-test (tableau III-12). Au final, l’application de la méthodologie à permis d’aboutir à l’isolement et à l’identification des substances qui sont à l’origine de l’activité antimalarique.

Tableau III-13 Résultats de l’activité sur P.falciparum de l’extrait de C. buxifolia Small et des substances 6 et 8 (protocole V.3)

Activité In vitro sur P. falciparum

IC50 [μg/ml] Extrait méthanolique de C. buxifolia 6.41 (sur NF54-ITS)

Quercitrine 6.64 (sur K1-LSHTM)

Myricitrine 6.59 (sur NF54-ITS)

124 III- RESULTATS ______b) Faux-positifs : Exemple d’exclusion par déreplication des faux-positifs

Sandoricum koetjape Merr. (Meliaceae) C’est dans le cadre du travail de diplôme de Mlle Caroline Mathon que l’extrait méthanolique d’écorce de Sandoricum koetjape a été étudié via le β-test. L’étude de cette espèce a permis de mettre le point final à la méthodologie du β-test par l’introduction de l’étape de déreplication des faux-positifs basé sur l’analyse HPLC-MS suivi du traitement sur le logiciel ADMIS contenant la base de données, nommée « témoins ».

¾ Sélection de la plante Cette plante a répondu positivement lors d’un criblage du β-test basé sur une sélection de plantes choisies au travers de la base de données Track2ND.

¾ Préparation d’échantillon C’est par l’obtention d’un chromatogramme peu lisible lors de l’analyse préliminaire par HPLC/DAD-UV qu’il a été nécessaire d’effectuer une étape d’élimination des tanins. En effet, cette classe de composés provoque un fort effet de matrice. L’application du protocole d’élimination des tannins par précipitation à la poudre de peaux (protocole V.1.d) n’ayant pas suffit, il a fallu ajouter une seconde étape par précipitation au plomb (protocole V.1.e). A la fin de ce processus, il ne restait plus qu’une masse de 125 mg pour 15 g un départ de d’extrait d’écorce de S. koetjape riche en polyphénols. L’extrait purifié a, à nouveau, été testé sur le β-test à une concentration de 25 mg/ml et à répondu positivement.

¾ Analyse HPLC/DAD-UV préliminaire L’analyse préliminaire de l’extrait méthanolique d’écorce de S. koetjape, effectué avec une méthode standard, permet de déterminer sept pics UV-majoritaires numérotés de 1 à 7 (Figure III- XLV) et d’étudier leur spectre UV-Vis (Figure III- XLVI).

125 III – RESULTATS ______

DAD1 B, Sig=254,4 Ref =550,5 (D:\MESDOC~1\RÉSULTAT\TRAVAI~3\SANDOR~2\HPLC20~1\2004EX~1.D) mAU 300 7

250

200

150

100 4 5

1 50 6 2 3

0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Figure III – XLV Analyse HPLC/DAD-UV de l’extrait méthanolique de l’écorce de S. koetjape Merr. Conditions : Colonne NovaPak C18 (3.9x150 mm, 4μm ; Waters) précédées d’une pré-colonne contenant la même phase (1.5 x 2.1 mm, 5 μm). Eluant A : H2O + 0.1% acide formique et B : MeOH. Mode gradient ; Vinjection : 10 μl ; Débit 1 ml/min ; Détection à λ = 254, 210 et 360 nm, spectre UV-Vis (DAD) balayé de 190 à 400 nm.

DAD1, 7.315 (370 mAU, - ) of 2004EX~1.D DAD1, 12.848 (3614 mAU,Val) of 2004EX~1.D mAU mAU

1400 80 1, 5 1200 3,4,6,7 60 1000

800 40 600

20 400

200 0 0

-20 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 200 250 300 350 400 450 500 550 nm Figure III – XLVI Spectre UV-Vis (balayage de 190 à 400 nm) des composés 1 à 7 de l’extrait méthanolique de S. koetjape Merr

Tableau III-14 Temps de rétention et maximas d’absorption des composés 1 à 7 de l’extrait méthanolique de S. koetjape Merr Informations obtenues à partir des données Données chromatographiques spectrophotométriques Composés Classe de composés TR [min] λmax supposée 1 7.36 220 , 260 avec épaulement 295 isoflavone 2 10.08 -- 3 10.42 280 Flavanol 4 11.21 280 Flavanol 5 11.71 220 , 260 avec épaulement 295 isoflavone 6 12.23 280 Flavanol 7 12.82 280 flavanol

126 III- RESULTATS ______

¾ Analyse des fractions SPE sur le β-test

Tableau III-15 Résultats du β-test sur les fractions SPE de S. koetjape β-test Fractions SPE 15 [mg/ml] I - II + III +

L’analyse des fractions SPE de l’extrait de S. koetjape ayant répondu positivement au test, le fractionnement a pu débuter.

¾ Fractionnement et β-test sur les fractions C’est par chromatographie liquide semi-préparative équipée d’une colonne X-Terra®Prep MS C18 (5μm, 19 x 150 mm) que le fractionnement de 100 mg d’extrait purifié a été effectué. Le fractionnement a découlé sur un total de 10 fractions nommées de A à J, dont quatre contiennent une substance UV-majoritaire à λ = 254 nm.

125.4 mg

A B C D E F G H I J

0.7 mg 3.6 mg 0.5 mg 0.8 mg 2.2 mg 4.4 mg 18.4 mg 1.9 mg 0.8 mg 27.3 mg

3 4 7 5

Figure III – XLVII Schéma du fractionnement par chromatographie semi-préparative de l’extrait méthanolique de S. koetjape Merr et substances UV-majoritaires

127 III – RESULTATS ______

β -test sur les fractions MPLC de Sandoricum koetjape

1.500

1.000

0.500 Limite 0.000 - I

B E F G H J Analyse

I C+D -0.500

-1.000

-1.500

Figure III – XLVIII Résultats du β-test pour les fractions de l’extrait S. koetjape Merr

Le β-test sur les fractions a mis en évidence les fractions E, F et G. Néanmoins, avant de passer à l’identification, l’étape confirmant l’absence de faux-positifs est nécessaire.

¾ Exclusion des fractions contenant des faux-positifs L’analyse par HPLC-MS des fractions positives au β-test permet de déterminer l’éventuelle présence de faux-positifs, connus pour inhiber la synthèse de la β- hématine. L’analyse du chromatogramme ionique total (TIC) des fractions par le logiciel AMDIS permet de déterminer la présence des faux-positifs, enregistrés préalablement dans la librairie. Le schéma ci-dessous est un exemple de résultat obtenu par le logiciel AMDIS pour la fraction E de Sandoricum koetjape. La comparaison des spectres de masse par déconvolution entre la fraction et le témoin, ainsi que le temps de rétention sont les informations sur lesquelles l’identification se base. Après comparaison des spectres UV-Vis et traitement du courant ionique totale de la fraction avec la base de données, une proposition d’identification est effectuée. Dans le cas de la fraction E, AMDIS a révélé la présence de l’un de quatre énantiomère de la catéchine. L’intérêt majeur de notre étude se porte principalement sur la détection de molécules qui inhibent significativement la formation de la β- hématine et qui sont considérées inactives sur la croissance de P. falciparum. Par conséquent, la méthode chromatographique n’a pas été optimisée pour distinguer les

128 III- RESULTATS ______

énantiomères. L’information obtenues est donc la présence de la catéchine, qui malgré une faible activité sur P. falciparum (Tasdemir et al., 2006) est considéré comme un faux-négatif.

Chromatogramme ionique total (TIC) de la fraction E

Spectre de masse de la fraction E à 10.722 min

Spectre de masse de du standard catéchine-(-)

Figure III – XLIX Identification, par LC-MS et AMDIS, de la catéchine contenue dans la fraction E de l’extrait de S. koetjape

L’analyse de la fraction G a révélé le même type d’information, indiquant qu’il s’agit d’un autre isomère de la catéchine, l’epicatéchine-(-), qui se distingue, cette fois-ci,

par un temps de rétention différent de la catéchine (RT = 11.8 min) mais qui présente un spectre de masse semblable avec la fragmentation caractéristique de cette molécule

289>245 et un spectre UV-Vis avec un λmax = 280 nm, caractéristique des catéchines.

129 III – RESULTATS ______

Tableau III-16 Identification des faux-positifs contenus dans les fractions positives de S. koetjape Spectre Composé Spectrométrie de masse UV-Vis RT Identification UV-majoritaire Fractions - λmax [min] [M-H] Ions filles par la librairie (λ=254 nm) [nm] E 3 280 10.42 289.0 245 ; 205 catéchine-(±) F 4 280 11.21 576.9 -- -- G 7 280 11.82 289.0 245 ; 205 épicatechine-(±)

Par ces observations, la fraction E et la fraction G, ont été exclu du processus du β- test, qui aurait normalement consisté à la purification, si nécessaire de la substance, puis à son identification par spectrométrie RMN et spectrométrie de masse à temps de vol. Concernant la fraction F, bien que la librairie ne l’ait pas identifiée, son ion moléculaire situé à 576.9 uma correspondant à deux fois la masse de la catéchine, et

son spectre UV-Vis présentant un λmax de 280 nm, nous amène à penser qu’il s’agit d’un dimère de la catéchine ou de l’épicatéchine.

Fraction F

Catéchine-(+)

Figure III – L Spectres de masse de la fraction F de S. koetjape et de la catéchine-(+) en mode de ionisation négatif

130 III- RESULTATS ______

Ces tanins condensés, connus sous le nom de proanthocyanidols répondent fortement au β-test et sont, comme nous l’avons déjà souligné, des substances indésirables. La similarité des spectres de masse provient du fait que lors de l’ionisation, le dimère se fragmente et libère ainsi deux monomères. Ce sont l’un des 4 énantiomères de la catéchine. Ces observations nous ont incité à ne pas poursuivre le bioguidage de la fraction F.

¾ Activité antimalarique Comme cet exemple est le premier cas d’exclusion pour cause de présence de faux- positifs identifiés par AMDIS, une vérification de l’activité de l’extrait méthanolique de l’écorce de S. koetjape sur P. falciparum a été effectuée. Il en résulte que cet extrait n’a pas démontré d’inhibition sur la croissance du parasite. Les résultats confirment ainsi notre choix de l’écarter du processus méthodologique du β-test. c) Discussion

Ces exemples démontrent la validité de la méthodologie du β-test. En effet, en appliquant rigoureusement ce cheminement, la probabilité d’isoler des substances active sur la synthèse de la β-hématine et sur la croissance du parasite est améliorée. Cette méthodologie appliquée sur l’extrait méthanolique de L. procumbens a permis de mettre en évidence l’activité antimalarique de l’extrait puis d’isoler une des substances responsable de cette activité. L’isolement bioguidé du phloridzoside par le β-test permet également d’élucider en partie le mécanisme de son activité antiplasmodiale, à savoir l’inhibition de la synthèse de la β-hématine. L’exemple de l’extrait de C. buxifolia illustre également l’intérêt de cette démarche. L’étude bioguidée a mené à isoler deux substances, la quercitrine et la myricitrine, toutes les deux reconnues comme inhibitrices de la croissance de P. falciparum. De nombreux flavonoïdes, que l’on rencontre régulièrement dans les plantes, répondent positivement au β-test et sont également actifs in vitro. Pour éviter d’isoler de telle substance triviale, il sera nécessaire de les inclure dans la base de données « témoins ». Ainsi, lors de l’étape de reconnaissance de faux- positifs, il sera également possible de reconnaitre les substances actives déjà connues et

131 III – RESULTATS ______validés sur cette cible. Il est également important de souligner que la méthodologie a également été validée en présence de faux-positifs. L’extrait de S. koetjape a été exclu lors de son bioguidage à l’étape de déréplication des faux-positifs par HPLC-MS. Ces résultats ont pu être obtenus en moins de 3 semaines. En comparaison, le processus impliquant une analyse in vitro et un isolement bioguidé peut prendre plusieurs mois. Le β-test en conjonction avec le procédé développé dans ce travail est un outil de présélection et de bioguidage rapide et peu coûteux. Sur la base des résultats obtenus avec L. procumbens, C. buxifolia et S. koetjape, son efficacité et la fiabilité de sa réponse ont été démontrées dans la recherche de substances antimalariques d’origine naturelle inhibant la synthèse de la β-hématine.

132

IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

133 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

Les objectifs principaux de cette étude consistaient à mettre en place un test qualitatif, afin d’optimiser la sélection du matériel végétal destiné à être criblé in vitro sur Plasmodium falciparum et d’identifier de nouveaux antimalariques naturels. Dans la considération globale de la problématique posée en phytochimie sur le choix de la plante à étudier, une base de données sur le logiciel Access (Microsoft, 1992-2003), a également été développée. Elle regroupe les informations tirées de la littérature sur les plantes, ayant montré une activité antiparasitaire ou utilisées en médecine traditionnelle. La combinaison du test avec la base de données avait pour but final d’être impliqué dans une méthodologie pour isoler des composés antiparasitaires d’origine naturelle par fractionnement bioguidé au sein du LPP.

Dans un premier temps, notre choix s’est porté sur un test qui présente l’avantage d’utiliser des réactifs facilement disponibles et qui ne requiert pas d’infrastructure particulière. Le Phiβ-assay est un test colorimétrique basé sur la synthèse de la β- hématine, l’homologue synthétique de l’hémozoine (Ncokazi and Egan, 2005). Cette réaction indispensable à la survie du parasite a lieu suite à la digestion de l’hémoglobine et permet la détoxification de l’hème. Cette synthèse est une cible reconnue et validée pour de nombreux antimalarique et est spécifique à P. falciparum. Ainsi le Phiβ-assay étudie l’inhibition de la réaction due à certains composés par la détection indirecte de l’hématine n’ayant pas polymérisé à l’aide d’un simple détecteur UV/Vis et de la pyridine. Ce ligand se lie sélectivement à l’hématine pour former un complexe rose (Py-Fe(III)PPIX) qui absorbe à 405 nm. Ainsi, lorsqu’une inhibition a lieu, la coloration de la solution témoigne de cette activité.

Avec pour point de départ le Phiβ-assay, ce travail de thèse s’est déroulé en cinq étapes principales et est schématisé en figure IV-I :

¾ Optimisation du test pour sa mise en place au laboratoire ¾ Application sur des substances pures ¾ Application sur des extraits de plantes

134 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

¾ Création d’une base de données ¾ Développement d’une méthodologie pour la recherche et l’isolement de substances pures d’origine végétale potentiellement antimalariques.

Le test rebaptisé β-test, dérivé du Phiβ-assay, a été optimisé pour l’étude de l’activité inhibitrice de la synthèse de la β-hématine d’extraits de plantes et pour le suivi de cette activité lors du processus de fractionnement et d’isolement.

Figure IV - I : Schéma des études effectuées pour la mise en place du β-test et de sa méthodologie.

L’optimisation a consisté dans un premier temps à vérifier la synthèse de la β-hématine et à modifier certains paramètres des conditions réactionnelles. Bien que ces paramètres ont été évalués et optimisés par le groupe initiateurs du Phiβ-assay (Ncokazi et al., 2005), cette étape a été nécessaire à cause du changement de matériels et de son application dans des plaques 96-puits. Ainsi, l’homogénéité de ces 96 réactions est un point crucial qui a exigé de trouver les conditions optimales pour minimiser les erreurs inter-réactionnelles

135 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

(triplicata). L’identification de la β-hématine a été effectuée par FT-IR grâce aux pics caractéristiques à 1663 cm-1 et à 1210 cm-1. Dans un second temps, la formation du complexe entre la pyridine et l’hématine a également été étudiée en tenant compte de la concentration de pyridine, du pH de la solution finale et de la sélectivité. Le suivi de la loi de Lambert-Beer par ce complexe coloré est à l’origine de la mise en place d’analyses de contrôle et de la méthode de traitement des résultats schématisé à la figure IV-III. Toutes ces étapes ont finalement conduit à poser les conditions expérimentales de travail. La synthèse de la β-hématine se déroule en 90 minutes à 60°C dans une étuve et la formation du complexe coloré s’effectue à la sortie de l’étuve avec une solution de pyridine 15% dans un tampon Hepes (Figure IV-II)

Figure IV - II : Schéma des conditions expérimentales pour la synthèse de la β-hématine

Le β-test a pu ensuite être appliqué à des substances pures puis sur les extraits de plantes. Dans un premier temps, le test colorimétrique a permis de définir l’activité quantitative de deux substances d’origine naturelle, la chloroquine et la quinine, reconnues pour inhiber la réaction de synthèse de la β-hématine. La corrélation entre leur CI50 sur l’inhibition de la synthèse du pigment malarique et les résultats obtenus dans d’autres études, basées sur le même principe et sur la croissance de P. falciparum (Ncokazi et al., 2005), a permis d’affirmer le test en tant qu’outil quantitatif. Une série de quarante et une substances pures, représentant les classes de molécules généralement rencontrées dans le

136 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______règne végétal, ont été testées à une seule concentration. La mise en place d’une méthode de traitement des résultats qualitatifs spécifiques aux substances pures a été effectuée puis la fiabilité du résultat a été déterminée en comparant la réponse du test avec l’activité in vitro. Le procédé du β-test sur des extraits de plantes a nécessité une évaluation d’une part de la préparation d’échantillons, d’une démarche pour le traitement des résultats et finalement de l’analyse qualitative de plus de deux cents extraits de plantes. Puis, une étude a été accomplie dans le but de corroborer et discuter les résultats obtenus sur les extraits de plantes du β-test avec leur activité in vitro sur P. falciparum.

De part ces études, plusieurs points sont à retenir. Les contrôles intégrés à chaque série d’analyse sont nécessaires pour obtenir une réponse qualitative du β-test. La valeur prédictive des résultats qualitatifs incluant les substances pures et les extraits a été vérifiée par comparaison avec les études d’activités in vitro effectuées par l’Institut Tropical Suisse. Avec une valeur de 65 % pour les substances pures et d’environ 80% pour les extraits, la présélection d’extraits d’origine végétale par ce biais augmente la probabilité d’obtenir une plante active sur le parasite lui-même. Sachant que l’opérateur peut lancer deux voire trois plaques à la fois sur lesquelles on peut tester 12 échantillons, 36 tests peuvent être effectué en une journée. Ainsi, l’objectif d’avoir à disposition un outil qui permet de sélectionner des plantes destinées à l’étude in vitro sur P. falciparum ou d’effectuer un isolement bioguidé est atteint. Néanmoins, certains paramètres concernant le β-test peuvent être discutés pour être à l’avenir améliorés. Tout d’abord, le fait d’analyser uniquement des extraits méthanoliques ou aqueux, peut restreindre notre recherche à certaines classes de molécules. Il serait intéressant de comparer et d’exploiter le test sur des extraits de polarité plus faible. La mise en place de nouvelles conditions de solubilisation pour éviter que ces substances ne précipitent serait indispensable. Un autre point faible du test concerne la température de synthèse de la β-hématine. En effet, le composé/l’extrait à tester est ajouté à une synthèse qui se déroule à 60°C. Cette température élevée risque de dégrader certaines molécules d’intérêts. Lors de la mise en place de la synthèse de la β-hématine, nous avons optimisé le temps de réaction, du fait que nous changions de matériel. Nous ne nous sommes pas occupés de modifier la

137 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______température de travail qui était proposée dans le Phiβ-assay. Si l’on se réfère à d’autres études qui proposent cette synthèse, on note qu’elle peut avoir lieu à plus faible température mais en contrepartie elle dure beaucoup plus longtemps, à peu près 24h à 37°C (Basilico, 1997). Ce paramètre est également à étudier et à optimiser. Dans ce cas, le produit de synthèse devra être identifié par des techniques supplémentaires à la FT-IR. Dans le cas du β-test, nous avons uniquement modifié le temps de réaction en gardant les conditions optimales proposées pour le Phiβ-assay. Le produit de la réaction étant connu nous avons confirmé son identité par spectroscopie infrarouge et vérifier si la réaction avait bien atteint son équilibre.

La seconde étape a consisté à développer une base de données, baptisée Track2ND. A l’aide du logiciel Access, ce portail met à disposition des informations sur des plantes ayant été référencées dans la littérature pour leur utilisation en médecine traditionnelle ou pour leur activité biologique en rapport avec les maladies parasitaires telles que la malaria, la maladie du sommeil et la leishmaniose. Les nombreuses informations sont enregistrées dans plusieurs tables reliées entre elles et détaillent l’espèce végétale, la référence bibliographique, l’activité biologique et son utilisation en médecine traditionnelle. La recherche basée sur des critères multiples, les fenêtres d’informations statistiques sur une famille de plantes, un genre ou sur l’ensemble des espèces sont autant de portails d’informations dont Track2ND permet de disposer. Avec la participation du Dr. Ioset, du Dr. Hay et du Dr. Cretton, la base de données contient à ce jour plus de 1700 entrées.

Une fois ces deux outils développés, une méthodologie de travail intra muros pour la recherche de substances antimalariques dans des extraits végétaux a pu être élaborée. Une première étape a consisté à identifier les substances indésirables, qui avaient déjà été relevées lors de l’étude de substances pures. Les tannins, à cause de leur activité non spécifique sur le parasite et leur réponse positive au β-test, sont considérés comme des interférences. Il en est de même pour les catéchines, qui inhibent fortement la synthèse de la β-hématine sans entraver significativement la croissance du parasite, ce qui fait d’eux

138 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______des faux-positifs au β-test. Ainsi, un prétraitement des échantillons afin d’éliminer les tannins par SPE sur phase polyamide est une étape qui a été intégrée dans la stratégie de recherche. L’analyse des fractions SPE par le β-test permet de confirmer de façon non ambigüe que l’activité n’est pas en lien avec les tannins. La présence de faux-positifs est, quant à elle, déterminée par analyse HPLC-MS à l’aide d’une librairie mise en place sur AMDIS. Ce logiciel de déconvolution permet d’identifier une substance à l’aide du chromatogramme ionique totale et du temps de rétention des substances de référence. Cette dernière étape ne nous permet pas d’exclure un extrait, du fait qu’il peut tout à fait contenir une substance active. Elle est donc appliquée après le processus de fractionnement bioguidé. Dans cette étude, les faux-positifs témoignent d’un défaut du test que l’on ne peut malheureusement pas éviter. En effet, malgré le développement d’une méthodologie pour les reconnaître, ils sont non-négligeables. Il est donc important de continuer à identifier les substances interférentes et de les introduire dans la base de données « témoins ».

Sur la base de l’ensemble des travaux réalisés sur des substances pures et sur des extraits de plantes, en tenant compte de Track2ND, des méthodes d’identification et d’élimination des substances indésirables, la stratégie présentée à la figure IV-III a été développée.

139 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

SELECTION DE PLANTES Avec Track2ND

Bioguidage avec le β-test Activité in vitro Résultats d’analyse en 1 jour Résultats d’analyse en min. 3 mois

β-test Corrélation ? Activité sur P.falciparum (LLP, Unige) (ITS, Bâle ; FioCruz, Brésil ; LMPH 25 mg/ml Anvers)

Analyse préliminaire HPLC-UV/DAD et déréplication

Confirmation I Confirmation I ΙAnalyse – I Limite, Extrait<0 ΙAnalyse – I Limite, Extrait>0 Négatif Positif

Confirmation II SPE sur PA et β-test sur les fractions

ΙAnalysis < 0 ΙAnalysis > 0 Négatif Positif

Bioguidage Fractionnement et β-test sur les fractions

Confirmation III Exclusion des fractions contenant des faux-positifs identifié par HPLC-MS-MS

Isolement Substance pure active

Identification Activité sur P.falciparum Spectroscopie RMN et spectrométrie (STI, Bâle ; FioCruz, Brésil ; LMPH de masse haute résolution Anvers)

Figure IV - III Méthodologie pour l’isolement de composés inhibiteurs de la synthèse de la β-hématine et potentiellement antimalarique, dans des extraits de plantes

140 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______

L’efficacité de la méthodologie a été démontrée sur trois extraits méthanoliques de la plante entière de Loiseleuria procumbens, des parties aériennes de Chamaesyce buxifolia et de l’écorce de Sandoricum koetjape. Elle a conduit à l’isolement des substances à l’origine de l’activité. La quercitrine et la myricitrine, isolés de C. buxifolia, inhibent de façon significative la synthèse de la β-hématine. Leur activité sur P. falciparum étant déjà connue, elle a été confirmée sur l’extrait total. Le phloridzoside isolé de L. procumbens illustre également la stratégie par la confirmation de l’activité in vitro de l’extrait et du composé isolé. Le dernier échantillon, l’extrait méthanolique de l’écorce de Sandoricum koetjape, a été exclu du processus car les substances de type catéchines identifiées lors de l’analyse HPLC-MS étaient présentes dans les fractions actives sur le β-test. Cette démarche a été appuyée par l’analyse in vitro qui a montré que cet extrait n’agissait pas sur la croissance du parasite. D’autre part, afin d’éviter l’isolement de substances déjà connues tel que les flavonoides, il serait nécessaire d’introduire ce type de composé dans la base de données « témoins ».

Ainsi, les objectifs que nous nous sommes fixés au début de cette étude sont atteints. En effet, nous avons désormais à disposition un outil rapide, peu coûteux et facile d’utilisation qui permet d’étudier l’activité inhibitrice de substances ou d’extrait sur la synthèse de la β-hématine. Bien qu’il risque de passer à côté de substances antimalariques agissant sur une cible autre que la synthèse de la β-hématine, il est important de souligner que cet inconvénient est également un de ses avantages indéniable qui permet de définir l’un des mécanismes responsable de l’activité antimalarique de certaines substances. La combinaison de cet outil et de la base de données Track2ND a permis de construire une méthodologie intra muros pour l’isolement bioguidé de substances inhibitrices de la synthèse de la β-hématine, qui sont donc potentiellement antimalarique. Le β-test présente de nombreuses voies à approfondir et à explorer. Le criblage d’autres extraits est bien évidemment à poursuivre. Dans notre étude, d’autres extraits méthanolique de plantes ont montré des activités intéressantes comme les extraits d’écorce de branches de Marila pluricostata (Clusiaceae) et de Erythrina senegalensis (Leguminosae). Le même processus est envisageable afin d’identifier les substances à

141 IV – CONCLUSION ET PERSPECTIVES ______l’origine de l’activité antimalarique. Dans une autre perspective, il serait d’un grand intérêt d’évaluer l’activité inhibitrice de la synthèse de la β-hématine à la palette de molécules d’origine naturelle antimalariques. A ce jour, seul les quinolines ont montré une activité intéressante sur la croissance de P. falciparum et sur l’inhibition de la synthèse de l’hémozoine. Cette étude permettrait d’établir une classification des familles de molécules agissant par la voie d’inhibition de la synthèse de l’hémozoine.

142

V – MATERIELS ET METHODES ______

V. MATERIELS & METHODES

143 V – MATERIELS ET METHODES ______

V.1. MATERIEL ET PREPARATION D’EXTRAIT a) Matériel La bibliothèque végétale du LPP constituée d’échantillons de plantes s’est construite au fil des années depuis la création du laboratoire en 1981. Les plantes d’origine Suisse ou obtenues au travers des nombreuses collaborations tissées à travers le monde ont été identifiées par des botanistes qualifiés. Les extraits de chaque plantes sont stockés dans la chambre froide à + 4°C constituant ainsi la bibliothèque d’extraits, comptant plus de 7000 pièces. Le matériel végétal que nous avons utilisé dans ce travail provient de la bibliothèque du LPP.

Figure V - I Collaboration pour la récolte d’extrait végétaux du LPP, UniGe en 2009 b) Préparation standard Le broyage des extraits végétaux est la première étape de préparation de l’échantillon. Afin d’éviter que les composés d’origines naturelles ne se dégradent, cette opération se fait en présence d’azote liquide (N2). La méthode standard de préparation d’extrait s’effectue en deux temps. Une première macération de la drogue broyée est effectuée au dichlorométhane (CH2Cl2) à raison de 1,5 l de solvant pour 250 g de drogue. Après agitation sur un agitateur magnétique à 400 t/min (modèle MR 3001 K, Heidolph) à température ambiante pendant 24 h, le mélange hétérogène est filtré sur un papier plissé (Schleicher & Schuell). Cette opération est répétée sur le résidu encore 2 x 24h, puis les

144 V – MATERIELS ET METHODES ______filtrats sont réunis. Le solvant est ensuite évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif à une température de 40°C (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suisse). Le résidu sec constituant l’extrait dichlorométhane est lyophilisé, pesé et stocké dans des vials en verre teinté. Le résidu, qui n’a pas été extrait par les macérations au CH2Cl2, est à nouveau macéré dans les mêmes conditions mais avec du méthanol (MeOH) pour obtenir l’extrait méthanolique, qui sera également séché, pesé et stocké à l’abri de la lumière. c) Extraction rapide 10 g de drogue broyée sont placés dans 100 ml de MeOH. La solution est placée pendant 15 minutes dans un bain à ultrasons fixé à une fréquence de 25 kHz (L. Haldi & Fils) puis filtrée sur papier plissé. Le solvant du filtrat est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif. Le résidu est ensuite lyophilisé, pesé puis stocké dans un vial à verre teinté dans la chambre froide. d) Elimination des tannins par précipitation avec la poudre de peau Les tannins sont éliminés par complexation avec la poudre de peau. Pour ce faire, l’extrait méthanolique est solubilisé dans le méthanol et la poudre de peau est ajoutée, environ 300 ml de solvant pour 10 gr d’extrait et 100 g de poudre de peau. Après agitation à l’aide d’un agitateur magnétique à température ambiante, la solution hétérogène est filtrée sur papier plissé. Le solvant est éliminé à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40°C. L’extrait purifié qui se compose du résidu obtenu est séché à l’aide d’un évaporateur rotatif puis lyophilisé afin d’être stocké dans des vials teintés. e) Elimination des tannins par précipitation avec le plomb Une méthode alternative pour éliminer les tannins est la précipitation des tannins avec le plomb. Cette technique polluante et moins sélective est choisie lorsque la méthode à la poudre de peau n’est pas suffisante. Ainsi, l’extrait est solubilisé dans une solution d’éthanol à 15% dans l’eau. Puis, une solution d’acétate de plomb (Pb(CH3CO2)2 · 3H2O, Fluka) 10 % dans l’eau est ajouté par portions de 5 ml et le tout est agité sur un agitateur mécanique pendant 30 minutes. Lorsqu’un changement de couleur de la solution est observé, l’addition de la solution de plomb est arrêtée. Une extraction liquide-liquide

145 V – MATERIELS ET METHODES ______

(LLE) avec de l’acétate d’éthyle permet purifier l’extrait des résidus de plomb. Le solvant organique est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40°C afin d’obtenir l’extrait purifié, qui est ensuite lyophilisé puis stocké.

V.2. METHODE PHYSICO-CHIMIQUE DE CRIBLAGE : β-TEST Le β-test est le sujet principal de ce travail de thèse. Pour cette raison, les produits, le matériel et le protocole concernant les substances pures et les extraits sont détaillés. a) Produits 01. Hemin de bovin ≥ 90 %, Réf. H5533-1G, Sigma-Aldrich 02. HEPES (4-(2-Hydroxyethyl) pipérazine-1-éthane-sulfonique acide), Réf. 54455, Sigma-Aldrich 03. Quinine sulfate, Réf. 22620, Sigma-Aldrich 04. HCl, Titrisol® Ampoule standard 1 M , Réf. 109970, Merck 05. Acétate de sodium anhydre, Réf. 71180, Fluka Chemie 06. NaOH, Titrisol® Ampoule standard 0.1 M, Réf. 109956, Merck 07. Pyridine 99%, Ref. 131780010, ACROS ORGANICS 08. Acide acétique glacial, Ref. 222140010, ACROS ORGANICS 09. Dimethylsulfoxide 99.7% pure, Ref. 127790025, ACROS ORGANICS 10. Méthanol de qualité HPLC, Réf. 20864.320, Chromanorm® b) Matériels 01. Plaque 96-micropuits, Nunc MicroWell™ 200 μl, Réf. 260836, NUNCTM 02. Plaque 96-puits, Nunc DeepWell™ 2ml, Réf. 278743 , NUNCTM 03. Couvercle à plaque 96-puits, 96 Nunc Well Cap Blue, Réf. 276005, NUNCTM 04. Etuve de séchage universelle, Salvis 05. EL-808 Ultra Microplate Reader, Bio-teK INSTRUMENTS 06. Bain à ultrasons, Haldi & Fils 07. Agitateur de plaque, modèle AK 120, Infors AG

146 V – MATERIELS ET METHODES ______c) Solutions à préparer Solution 1 : Solution de dilution HCl 0.1M/MeOH/DMSO (5:3:2) Solution 2 : HCl 1 M Préparée à l’aide de l’ampoule titrisol produit n°04 Solution 3 : NaOH 0.1 M Préparée à l’aide de l’ampoule titrisol produit n°06 Solution 4 : Solution Hématine 0.94 mM 6.84 mg hémine de bovin ajusté à 10 ml de NaOH 0.1M Solution 5 : Solution d’acétate de sodium (NaOAc), pH 5

18 g de NaOAc + 23.4 ml d’acide acétique glacial + 17 ml d’H2O, Puis ajuster à pH 5 avec l’acide acétique Solution 6 : Solution Hepes 20 mM

238 mg ajusté à 50 ml avec H2O Solution 7 : Solution Py 15 % 15 ml de pyridine ajusté à 100 ml avec la solution 6 Solution 8 : Solution de Control chloroquine Une solution de 50 mM de chloroquine est préparée dans la solution 1 Solution 9 : Solution de Control négatif 25 mg/ml de l’extrait méthanolique des parties aériennes de Syringa vulgaris L. sont préparés dans la solution 1 Solution 10 : Solution de Control négatif dopé à la chloroquine 25 mg/ml de l’extrait de méthanolique des parties aérienne de Syringa vulgaris L. sont préparés dans la solution 8. Solution à analyser : 100 μl d’une solution d’extraits à 25 mg/ml ou 50 mM dans le cas d’une substance pure sont préparés avec la solution 1 dans un eppendorf. Après agitation au vortex pendant 1 minute, la solution est placée dans un bain à ultrasons (matériel 06) pendant 2 minutes. Une centrifugation pendant 5 minutes à 9000 t/min permet d’obtenir une solution à tester homogène.

147 V – MATERIELS ET METHODES ______d) Analyse de substances pures Détermination qualitative de l’activité inhibtrice de la synthèse de la β-hématine Afin de faciliter le travail nécessaire pour le traitement des résultats, les plaques se préparent selon un modèle précis représenté à la figure V-II. 10 μl de la solution à tester sont transférés dans 6 puits disposés sur une même ligne d’une plaque 96-puits de 2 ml (matériel 02). Pour chaque substance pure, six puits sont préparés afin d’avoir un triplicata de l’analyse (AAnalyse) et un triplicata de son blanc (AAnalyse ; Blanc). Sur une même plaque, il est donc possible d’analyser 14 substances, la dernière ligne étant réservée pour les deux contrôles. La détermination de ΔACLTblanc s’effectue également sur 6 puits en en analysant 10 μl de la solution 1. Sur la même ligne mais dans les 6 derniers puits, le contrôle chloroquine pour la détermination de la limite minimale d’inhibition (Ilimite) se mesure l’activité de 10 μl de la solution 8. Dès lors, dans tous les puits, 100 μl de la solution d’hématine (solution 4) fraîchement préparée puis 10 μl de HCl 1M (solution 2) sont ajoutés. La plaque 96-puits est agitée pendant 10 minutes à 900 t/min (matériel 07). Ensuite 60 μl de la solution d’acétate de sodium (solution 5) préalablement chauffée à 60°C sont additionnés et la plaque est à nouveau agitée pendant 1 min à 900 t/min. Le tout est placé dans l’étuve à 60°C sans agitation pendant 90 minutes. A la sortie de l’étuve, un temps de repos de 10 minutes est requis pour revenir à une température ambiante. Dans les colonnes 1, 2, 3, 7, 8 et 9, qui serviront aux mesures de AAnalyse ; Blanc, 750 μl de la solution 6 sont ajoutés. Dans colonnes 4, 5, 6, 10, 11 et 12, qui serviront à la mesure de AAnalyse, 750 μl de la solution de pyridine (solution 7) sont additionnés. Après agitation de la plaque à 900 t/min pendant 10 minutes, un aliquot de 100 μl de chaque puits est transféré dans une plaque 96-micropuits (matériel 01) afin de mesurer l’absorbance à λ = 405 nm dans le lecteur microplaque (matériel 05).

148 V – MATERIELS ET METHODES ______

Figure V - II Mode opératoire et modèle pour la préparation des plaques 96-puits avec des substances pures pour le β-test

Détermination quantitative de l’activité sur la synthèse de la β-hématine Pour la détermination quantitative de l’activité sur la synthèse de la β-hématine des substances pures, 12 concentrations sont préparées par dilutions successives. Le protocole du β-test présenté au point précédent pour la détermination qualitative est le même, qui consiste à mettre au départ 10 μl de la solution à tester. La détermination du CI50 s’effectue en triplicata pour chaque solution de concentration différente, par traitement des valeurs ΙAnalyse en fonction de la concentration avec le logiciel Prism 4.0 et le modèle sigmoïdal.

Dilution pour la détermination IC50 La dilution successive est schématisée dans la figure V-III et s’effectue de la façon suivante: 900 μl d’une solution mère à 50 mM dans la solution 1 sont placés dans le puits n°1. Dans les puits numérotés de 2 à 12, 300 μl de la solution 1 sont ajoutés. La dilution successive de 1.5 fois est effectuée en transférant 600 μl de solution successivement d’un

149 V – MATERIELS ET METHODES ______puits à l’autre en partant depuis le puits n°1. A chaque transfert, une agitation à l’aide de la micropipette est indispensable pour homogénéiser la solution.

Figure V - III Description du mode opératoire pour la dilution successive e) Analyse d’extraits de plantes Pour l’analyse d’extraits, les plaques 96-puits sont préparées selon le mode opératoire suivant. Pour chaque extrait, 10 μl de la solution à tester sont placés dans 6 puits d’une même ligne d’une plaque 96-puits (matériel 02). Les contrôles sont également préparés pour chaque plaque dans 6 puits d’une même ligne. Le contrôle blanc (G1 à G6) s’effectue en ajoutant à chacun 10 μl de la solution 1, le contrôle négatif (G7 à G12) se prépare en ajoutant 10 μl de la solution 9 et le contrôle négatif-dopé (H7 à H12) en plaçant 10 μl de la solution 10. Ensuite, à tous les puits, 100 μl de la solution d’hématine fraichement préparée (solution 4) suivi de 10 μl HCl 1 M (solution 2) sont ajoutés. La plaque 96-puits est agitée pendant 10 minutes à 900 t/min. Puis, 60 μl de la solution d’acétate de sodium (solution 5) préalablement chauffée à 60°C sont additionnés. Le tout agité à 900 t/min pendant 1 minute puis placé dans l’étuve à 60°C sans agitation pendant 90 minutes. A la sortie de l’étuve, 750 μl de la solution 6 sont ajoutés aux puits des colonnes 1, 2, 3, 7, 8 et 9 (AAnalyse ; Blanc). Puis dans les colonnes 4, 5, 6, 10, 11 et 12, un volume de 750 μl de la solution de pyridine (solution 7) sont ajoutés (AAnalyse). Après agitation pendant 10 minutes à 900 t/min, un aliquot de 100 μl de chaque puits est

150 V – MATERIELS ET METHODES ______transvasé dans une plaque 96-micropuits à fond plat (matériel 01) afin de mesurer l’absorbance à λ = 405 nm sur le lecteur microplaque (matériel 05). f) Analyse de fractions Les fractions sont analysées à une concentration de 15 mg/ml préparée dans la solution 1 selon le même protocole que celui présenté pour les substances pures (point V.2.d). g) Traitement des résultats Les résultats sont traités selon les équations développées dans le chapitre III. Que ce soit pour les extraits, pour les fractions ou pour les substances pures, la mesure de l’intensité d’absorbance de l’analyse-blanc (AAnalyse;Blanc) est toujours effectuée. D’autre part, sur chaque plaque, il y a obligatoirement le contrôle blanc.

Contrôle blanc

(Equation III - 1) ΔACLTblanc = ACLTblanc − ACLTblanc;Blanc

Absorbance de la substance/extrait à analyser et de leur blanc

(Equation III - 2) ΔAAnalyse = AAnalyse − AAnalyse;Blanc

(Equation III - 3) I Analyse = ΔAAnalyse − ΔACLTblanc

C’est dans les étapes de calculs suivantes que le traitement pour les fractions et les substances pures se différencie des extraits.

Substances pures & fractions

Valeur limite d’absorbance

(Equation III - 4) ΔCLT ;Chloroquine = ACLT ;Chloroquine − ACLT ;Chloroquine;blanc

(Equation III - 5) ICLT ;Chloroquine = ΔCLT ;Chloroquine − ΔACLT ;Blanc

(Equation III - 6) Ilimite = 0.25× ICLT ;Chloroquine

151 V – MATERIELS ET METHODES ______

Résultat qualitatif

(Equation III - 7) Ianalysis − I Limite > 0 → Positif

Extraits Valeur limite d’absorbance

(Equation III - 8) ΔACLTNeg = ACLTNeg − ACLTNeg;Blanc

(Equation III - 9) ΔACLTNeg +CLQ = ACLTNeg +CLQ − ACLTNeg +CLQ;Blanc ΔA − ΔA (Equation III - 10) I = CLTNeg +CLQ CLTNeg Limite,Extrait 2

Résultat qualitatif

(Equation III - 11) Ianalysis − ILimite,Extrait > 0 → Positif

V.3. METHODE BIOLOGIQUE DE CRIBLAGE : TEST BASE SUR L’INCORPORATION DE 3 L’[ H]-HYPOXANTHINE L’activité antiplasmodiale à été déterminée à l’aide de souche de P. falciparum sensible à la chloroquine, NF 54, et de souches résistantes à la chloroquine, K1. La méthode de référence basée sur l’incorporation de l’hypoxanthine radiomarquée au 3H, utilisée par le STI, le LMPH et le FioCruz Institut, a brièvement été décrite au chapitre introduction (chapitre II.3.e). Le protocole général de ce test biologique est présenté ci-dessous (Fidock et al., 2004) a) Culture du parasite Le milieu de culture est préparé de la façon suivante : RPMI 1640 additionné de L-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, Ca, USA), 50 mg/l d’ hypoxanthine, 25 mM de tampon Hepes, 10 μg/ml de gentamicine, 0.225 % de NaHCO3 et 0.5% d’Albumax II

152 V – MATERIELS ET METHODES ______

(serum de bovin riche en lipide). Ce milieu est ajusté à pH 7.4. La culture continuelle du parasite P. falciparum s’effectue à l’aide d’érythrocytes humains, obtenus après lavage du sang avec un milieu riche en phosphate (RPMI 1640) suivi d’une centrifugation à 500 g pendant 5 minutes. Les érythrocytes ainsi libérés du plasma et des leucocytes sont stockés dans le milieu de culture à 50 % d’hématocrite. Le parasite sous forme asexuée se propage à 37°C dans le milieu de culture contenant entre 3 et 5 % d’hématocrite dans un environnement appauvri en oxygène. Pour une culture optimale du parasite, la parasitémie doit être suivie régulièrement et maintenue entre 0.5 et 4 %. b) Analyse des substances et des extraits Un milieu de culture faible en hypoxanthine est préparé selon les mêmes conditions que le milieu de culture mais avec une concentration de 2.5 mg/l. Des solutions stocks d’extraits et de substances pures sont préparées à une concentration de 10 mg/ml dans le DMSO. La dilution de ces substances pour une analyse qualitative ou pour la détermination d’un IC50 s’effectue avec le milieu de culture faible en hypoxanthine. 100 μl d’une solution d’érythrocytes avec 3.2 % d’hématocrite et entre 0.6-0.9 % de parasitémie sont ajoutés en triplicata à 100 μl de la solution à tester dans des plaques 96- micropuits. Après incubation des plaques pendant 48 h à 37°C, 100 μl de surnageant sont remplacés par 100 μl du milieu pauvre en hypoxanthine contenant une concentration final de 7.5 μCi/ml de [3H]-hypoxanthine (1 mCi/ml stock, Amersham Biosciences). Après 24 heures supplémentaires d’incubation, les plaques sont placées à -80°C pendant au moins 1h. Le contenu de chaque puits est ensuite imprégné sur une filtre de verre permettant ainsi de mesurer le nombre de scintillations par minute et par puits à l’aide d’un lecteur Betaplate 1205 (Wallac) et de déterminer l’incorporation de l’[3H]-hypoxanthine. Dans le cas d’une étude quantitative, une courbe sigmoïdale présentant le pourcentage d’incorporation de l’hypoxanthine est caractéristique de l’inhibition de la croissance du parasite et permet de calculer une valeur de CI50 de la substance (Fidock et al., 2004).

153 V – MATERIELS ET METHODES ______

V.4. TECHNIQUE DE SEPARATION ANALYTIQUE COUPLEE A LA DETECTION

SPECTROMETRIQUE a) Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV) L’appareil de chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV) consiste en un modèle 1100 de chez Hewlett Packard (HP, Palo Alto, CA, USA) équipé d’une pompe binaire et d’un détecteur à barrettes de diodes. L’ensemble de l’équipement est contrôlé par le logiciel Chemstation Rev. A.10.02.

Méthode d’analyse pour L. procumbens Les analyses HPLC/UV-DAD de l’extrait méthanolique de la plante entière de L. procumbens (L.) Devs. ont été réalisées avec une colonne NovaPak C18 (3.9 x 150 mm ; 4μm, Waters) précédées d’une pré-colonne contenant la même phase (1.5 x 2.1 mm, 5 μm, Waters). La séparation à lieu avec les phases mobiles A : H2O et B : MeCN en mode gradient en augmentant la proportion d’acétonitrile de 10 à 40 % en 30 minutes avec un débit de 1 ml/min. Le chromatogramme est lu aux longueurs d’onde fixées à 210, 254 et 360 nm et par balayage de λ = 190 à 400 nm.

Méthode d’analyse pour C. buxifolia C’est avec la même colonne chromatographique (NovaPak C18, 3.9 x 150 mm ; 4 μm, Waters) utilisée précédemment que les analyses préliminaires et les analyses des fractions de C. buxifolia ont été effectuées. La méthode chromatographique avec les phases mobiles A : H2O + 0.1 % acide formique et B : MeOH débute pendant trois minutes en mode isocratique à 90 :10 (A :B). Puis un gradient en 1 min permet d’atteindre la proportion 70:30 (A :B), un second gradient effectué en 25 minutes jsuqu’à 60 :40. Un lavage pendant 8 minutes avec 100 % de MeOH termine la méthode. Le chromatogramme est lu aux longueurs d’onde fixées 210, 254 et 360 nm et par balayage de λ = 190 à 400 nm.

154 V – MATERIELS ET METHODES ______b) Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie UV/Vis et à la spectrométrie de masse (HPLC-DAD/UV-MS) Le système consiste en une unité HPLC 1100 équipé d’un détecteur à barrettes de diodes (HP, Palo Alto, CA, USA) couplé à un spectromètre de masse à trappe ionique, modèle Finnigan MAT (San Jose, CA, USA) équipé d’une interface en mode APCI ou ESI. L’ensemble est contrôlé par le logiciel XCalibur v. 1.3 et par le logiciel Chemstation Rev. A.10.02.

Méthode standard pour l’identification des témoins La méthode « témoins » permet l’identification des faux-positifs ainsi que des substances déjà connues pour inhiber la réaction du β-test et la croissance du parasite. Au fur et à mesure des analyses, cette méthode sera incrémentée. La méthode HPLC-DAD/UV se déroule sur une colonne XTerra® RP18 (4.6 x 150 mm, 3.5μm, Waters) avec la phase mobile est composé de A : H2O +0.1% acide formique et B : MeOH. La méthode chromatographique commence à 95 :5 (A :B) puis atteint 100 % de B en 25 minutes. Puis, un lavage de la colonne pendant 8 minutes à 100 % permet de terminer la méthode. La détection UV/VIS s’effectue à 210, 254 et 360 nm et un balayage est effectué de λ = 190 à 400 nm. Le débit sur l’HPLC est fixé à 0.800 ml/min. Un « split » placé après le spectrophotomètre permet à la phase mobile d’atteindre l’analyseur de masse à un débit 0.250 ml/min. L’analyse par spectrométrie de masse s’effectue avec les paramètres suivants : ionisation électrospray en mode négatif, voltage de la source à 3.5 kV, température du capillaire à 200 °C, voltage du capillaire à - 47 V, pression du gaz de nébulisation (N2) à 70 psi, courant de la source à 80 μA. L’analyse se déroule sur 36 minutes avec des balayages d’une durée de 25 ms. La fenêtre de détection se concentre sur les ions qui ont un rapport masse sur charge (m/z) compris entre 150 et 2000.

155 V – MATERIELS ET METHODES ______c) Chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse à temps de vol (UHPLC-TOF) La spectrométrie de masse à temps de vol est une technique d’analyse qui nous informe de la masse mono-isotopique du composé d’intérêt permettant ainsi son identification. La ionisation du composé en mode électrospray est suivi d’une séparation dans un analyseur qui repose sur le fait que des ions de masse différente, accélérés à une énergie cinétique uniforme, ont des vitesses différentes, et donc un temps de vol différent pour parcourir une distance donnée. Couplée à une chromatographie liquide à ultra haute performance, cette technique emploie généralement des phases qui présente un diamètre inférieur à 2 μm. Ce type d’appareillage chromatographique est capable de travailler à des pressions de l’ordre de 8000 à 15000 psi (environ 3 fois la pression rencontrée dans une HPLC conventionnelles). Les résultats sont obtenus dans un temps relativement court avec une sélectivité améliorée. Les analyses UHPLC-MS ont été effectuées sur un système Acquity UPLC de chez Waters (Milford, USA) couplé à un spectromètre de masse à temps de vol, modèle Micromass LCT Premier (Waters). Les paramètres suivants sont fixés pour toutes les analyses : ionisation électrospray en mode négatif, voltage du capillaire à 2800 eV, le voltage du cône à 40 eV, la température de la source à 120°C et la température de désolvatation à 250 °C. La phase mobile est composée de A : ACN +

0.1% Acide formique et B : H2O + 0.1% Acide formique.

Méthode standard d’analyse La chromatographie liquide à ultra performance s’est déroulée à l’aide d’une colonne Acquity UPLCTM BEH C18 (1.7 mm, 1.0 x 50 mm) et d’un gradient de phase mobile avec une concentration croissante de B allant de 5% à 95% en 3.5 minutes et d’un débit de 0.220 ml/min.

156 V – MATERIELS ET METHODES ______

V.5. TECHNIQUES DE SEPARATION PREPARATIVE a) Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) L’équipement MPLC consiste en une pompe Büchi B-681 accompagnée d’un collecteur de fractions automatique B-684 (Büchi). La phase inverse ZeoPrep 60, C18 (40-63 μm, BGB) conditionnée dans une colonne de verre à gaine plastique (5 x 45 cm) a été utilisée pour la séparation de l’extrait méthanolique de C. buxifolia. Son conditionnement s’est effectué avec deux fois sont volume en MeOH suivi de deux fois son volume du mélange binaire de départ. La chromatographie de cet extrait s’est effectuée par pas de gradient avec un mélange binaire H2O/MeOH en proportions croissante de méthanol. Le chargement à sec de l’extrait implique une adsorption préliminaire sur la phase. Pour cela, 1.00 g d’extrait et 4 g de phase ont été dissout dans du méthanol. Après évaporation du solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif, la poudre obtenue est tassée dans une pré- colonne en verre à gaine plastique puis du sable de mer (Merck) est ajouté à son sommet. Au final, 6 mélanges binaires allant de 25 % à 50 % de MeOH de 2 litres chacun, ont été passés à travers la colonne. Avec un débit de 7 ml/min, les fractions ont été collectées automatiquement tous les 180 ml dans des cylindres de verre. b) Chromatographie Flash La chromatographie Flash a permis un fractionnement des composés de l’extrait méthanolique de L. procumbens en un temps relativement rapide (2 heures). L’appareil de type SPOT Liquid chromatography Flash (ARMEN Instrument®, France) est composé d’une pompe pouvant aller jusqu’à 25 bars, d’un collecteur de fractions automatique et d’un détecteur UV-Vis. Avec un débit maximal de 500 ml/min, le système de pompe permet de travailler en mode isocratique ou en mode gradient, soit en binaire ou en quaternaire. Avec la gamme de colonnes pré-packées disponibles contenant de la phase inverse ou de la silice, il est possible de trouver les conditions optimales pour fractionner rapidement un échantillon pouvant peser jusqu’à 30 g. Ce système compact et complètement automatique est contrôlé par un PC à écran tactile incorporé et piloté par le logiciel Armen Glider Flash. Ce programme est lié au détecteur UV-Vis et donne la

157 V – MATERIELS ET METHODES ______possibilité de faire un fractionnement automatique en fonction de l’intensité des pics d’absorbances UV-Vis mesurés.

Conditions pour le fractionnement de L. procumbens Le charge de l’extrait à sec implique de préparer l’échantillon en l’absorbant sur de la phase inverse LiChroprep RP18 (15-25 μm, Merck). 150 mg d’extrait sont solubilisé dans du méthanol avec 500 mg de la phase inverse. Une fois le solvant évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif, la poudre est placée sur une cartouche (5 x 12 cm d.i., MiniVarioFlash D12, Merck) qui se placera dans l’instrument en amont de la colonne RP

18 (25-40 μm, 17g, Merck). La séparation sur un système binaire H2O/MeOH (A:B) avec un débit de 10 ml/min, s’effectue en mode gradient avec une concentration croissante de B allant de 5 à 70 % en 90 minutes par pas de 5 %, chacun maintenu pendant 5 minutes. Puis un gradient de 70 % à 100 % de B en 15 minutes clôt la méthode. La détection est fixée à λ = 254 nm et la récolte des fractions s’effectue selon l’intensité des pics d’absorption. c) Chromatographie liquide semi-préparative à haute pression Cette technique utilisée généralement pour une étape finale de purification permet de séparer des mélanges pouvant peser jusqu’à 100 mg. Par convention, les colonnes destinées à cette chromatographie présente un diamètre interne compris entre 8 et 25 mm et des particules ayant un diamètre entre 5 et 10 μm. L’appareil consiste en une pompe à deux voies, modèle Shimadzu LC-8A couplée à une détecteur UV (LKB Bromma 2151) et à un enregistreur (LKB 2210).

Conditions pour S. koetjape La chromatographie liquide semi-préparative à haute pression a été appliquée pour la séparation des composés UV-majoritaires contenus dans l’extrait d’écorce de S. koetjape du fait que son chromatogramme HPLC-DAD/UV présente peu de pics UV-majoritaires. La chromatographie liquide semi-préparative s’est déroulée sur une colonne XTerra®Prep MS C18 (19 x 150 mm, 5μm, Waters). La phase mobile a consisté en un mélange

158 V – MATERIELS ET METHODES ______

MeOH :H2O dans les proportions 14:86 durant 60 min, puis un gradient de 14 % à 100 % de MeOH a été effectuée en 10 minutes. Le débit était fixé à 15 ml/min et la détection s’est effectué aux longueurs d’onde fixées à λ = 210, 254 et 360 nm et le spectre DAD a été obtenue par balayage de 190 à 400 nm. d) Extraction sur phase solide (SPE) La purification des extraits est effectuée à l’aide de cartouches SPE contenant 1000 mg de phase polyamide 6 (CHROMABOND®, Macherey-Nagel). Le conditionnement de la cartouche s’effectue avec 3 ml de MeOH suivi de 3 ml H2O/MeOH (95/5). 40 à 100 mg d’extrait sont homogénéisé dans H2O/MeOH (95/5) et sont chargé sur la cartouche. Une première élution (SPE I) est effectué avec 6 ml de H2O/MeOH (95/5) entrainant ainsi les composés les plus polaires. Les composés moyennement polaires éluent ensuite avec

12 ml de H2O/MeOH (5/95) (SPE II). Une dernière étape avec 6 ml THF permet de décrocher les composés moins polaires (SPE III).

V.6. METHODES SPECTROMETRIQUES a) Résonnance magnétique nucléaire (RMN) La résonnance magnétique nucléaire est une technique robuste pour étudier la structure des composés chimique ou d’origine naturelle. Elle est basée sur le moment magnétique nucléaire, μ, défini par les propriétés du spin qui sont le moment angulaire, sa charge et le mouvement de cette dernière. La spectrométrie RMN ne voit que les atomes qui ont un nombre de spin non nul, comme pour les atomes 1H, 13C, 14N, 17O, 19F et 31P. Cette technique nous informe des fréquences caractéristiques des noyaux étudiés afin de déduire leur environnement chimique et par là-même la structure du composé. Les mesures par RMN ont été effectuées sur un spectromètre à impulsion UNITY Inova 500 (Varian, Palo Alto, CA, USA) piloté par le logiciel Solaris VNMR. Les spectres 1H-RMN et 13C-RMN ont été enregistrés à une radiofréquence de 499.87 MHz et 125.70 MHz respectivement. La température d’analyse est fixée à 26°C. Les échantillons sont dissous dans les solvants deutérés : MeOH-d4 et le DMSO-d6. Les séquences d’impulsions pour

159 V – MATERIELS ET METHODES ______les analyses à une dimension ainsi que les deux dimensions (gHMBC, gHSQC) proviennent de programmes fournis par Varian. b) Spectrométrie Infrarouge (IR) Cette technique utilisée essentiellement pour l’analyse qualitative des molécules nous donne des informations structurales. C’est en faisant passer une lumière infrarouge verticale dans l’échantillon, que les vibrations moléculaires sont stimulées. Cette méthode impliquant l’examen des mouvements de torsion, de courbure, de rotation et de vibration des atomes dans une molécule, permet de mettre en évidence la présence de liaisons particulières. La distinction entre l’hématine et la β-hématine s’est faite à l’aide de l’analyse FT-IR d’une pastille de KBr contenant les substances à analyser. Cet appareil "à transformée de Fourier" (FT) permet l'accumulation et le moyennage de spectres successifs d'un même échantillon, augmentant ainsi la faible sensibilité de la mesure IR seule. La pastille de KBr a été préparée en mélangeant env. 1 mg de substance à analyser avec 100 mg de KBr anhydre (Fluka). Ce mélange de poudre, broyé au mortier, a ensuite été mis sous presse hydraulique à 10 bars pour obtenir une fine pastille. Le spectre FT-IR a été obtenu par balayage entre 1000 et 2000 cm-1 à l’aide d’un spectromètre FT-IR (Spectrum 100, Perkin Elmer).

160 V – MATERIELS ET METHODES ______

V.7. CONSTANTES PHYSIQUES ET DONNEES SPECTRALES DES COMPOSES ISOLES QUI

INHIBENT LA SYNTHESE DE LA β-HEMATINE a) Composé actif isolé de l’extrait méthanolique de Loiseleuria procumbens (L.) Desv.

Composé 9 (fraction G)

Nom Phloridzoside, phlorizin Nom chimique 1-[2-(β-D-glucopyranosyloxy)-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4- hydroxyphenyl)-1-Propanone No CAS 60-81-1 Formule brute C21H24O10 Masse exacte 436.1363 Poids moléculaire 436.4162 Aspect Poudre blanche 1 RMN H-RMN δ [ppm] (DMSO-d6) 2.79 (t, J=7.5 Hz, H-3), 3.36 (m, H-2,2’’’,3’’’,4’’’,5’’’), 3.71 (d, J=11.7 Hz, H-6’’’), 4.94 (d, J=7.33 Hz, H-1’’’), 5.93 (d, J=2.2 Hz, H-5’’), 6.13 (d, J=2.2 Hz, H-3’’), 6.65 (d, J=8.4 Hz, H-3’,5’), 7.04 (d, J=8.4 Hz, H-2’,6’)

4' OH

5'' HO OH 1' 4'' 6'' 3 1'' 3'' 1 2 OH 2'' 2''' O O HO 3''' 1''' O 4''' HO 5'''

6''' HO

161 V – MATERIELS ET METHODES ______b) Composé actif isolé de l’extrait méthanolique des parties aérienne de Chamaesyce buxifolia Small Composé 10 (fraction S)

Nom commercial Quercitrine Nom chimique 3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)- 5,7-dihydroxy- 4H-1-Benzopyran-4-one No CAS 522-12-3

Formule brute C21H20O11 Masse exacte 448.100565 Poids moléculaire 448.3836 Aspect Ecailles jaunes pâles HR-MS m/z [M-H]- à 447.0912

1 H-RMN (CD3OD) δ [ppm] 0.96 (3H, d, 6 Hz, H-6’’), 3.33 (1H, m, H-4’’), 3.43 (1H, m, H-3’’), 3.78 (2H, m, H-2’’,5’’), 5.37 (1H, d, 5 Hz), 6.22 (1H, s, H-6), 6.39 (1H, s, H-8), 6.94 (1H, d, J=8.3 Hz ,C- 5’), 7.32 (1H, d, J=8.3 Hz, C-6’), 7.35 (1H, s) 13 RMN C-RMN (CD3OD) δ [ppm] 16.5 (C-6’’), 70.7-70.9 (C-2’’,3’’,5’’), 72.1 (C-5’’), 93.6 (C-8), 98.7 (C-6), 102.3 (C-1’’), 104.7 (C-10), 115.2 (C-5’), 115.8 (C-2’), 121.6 (C-6’,7’), 135.0 (C-3), 145.3 (C- 3’), 148.6 (C-4’), 157.4 (C-2), 158.1 (C-5), 162.0 (C-9), 164.8 (C-7), 178.5 (C-4)

5' 4' OH 6' 8 1' 3' HO 9 O OH 7 2 2' 6 3 10 5 4 O OH O 1'' HO S 2'' R O 3'' R S 5'' R HO 4'' 6'' OH

162 V – MATERIELS ET METHODES ______

Composé 6 (Fraction O)

Nom commercial Myricitrine (Myricetin-3-O-α-rhamnoside) Nom chimique 3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5- trihydroxyphenyl)- 4H-1-Benzopyran-4-one No CAS 17912-87-7

Formule brute C21H20O12 Masse exacte 464.09548 Poids moléculaire 464.38 Aspect Poudre jaune écaillée Ion moléculaire [M-H]- à m/z = 463.10 HPLC-ESI-MS Ion fille à m/z = 316.03 1H-RMN δ [ppm] 0.85 (3H, s, H-6’’), 3.16 (1H, m, H-4’’), 3.40 (1H, m, H-5’’), 3.59 (1H, m, H-2’’), 3.99 (1H, m, H-3’’), 5.23 (1H, d, 5 Hz), 6.22 (1H, s, H-6), 6.39 (1H, s, H-8), 6.90 (2H, s,C- 2’ et C-6’) RMN (DMSO-d6) 13C-RMN δ [ppm] 18.3 (C-6’’), 70.8 (C-2’’), 71.0 (C-3’’), 71.2 (C-5’’), 72.0 (C-4’’), 94.3 (C-8), 99.5 (C-6), 102.9 (C-1’’), 104.5 (C-10), 108.7 (C-2’,6’), 120.2 (C-1’), 134.2 (C-3), 137.4 (C-4’), 146.8 (C-3’,5’), 157.0 (C-2,9), 161.7 (C-5), 165.2 (C-7)

OH 5' 4' OH 6' 8 1' 3' HO 9 O OH 7 2 2' 6 3 10 m/z 316.03 5 4 O OH O

1'' HO S O 2'' R 3'' R S 5'' R HO 6'' 4'' OH

163 V – MATERIELS ET METHODES ______

164 VI- REFERENCES ______

VI. REFERENCES

165 VI- REFERENCES ______

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