(Rodentia, Muridae, Mus) : Rôle Des Remaniements Chromosomiques Dans La Spéciation Et Évolution Des Systèmes De Déterminisme Du Sexe

UNIVERSITE MONTPELLIER II SCIENCES & TECHNIQUES DU LANGUEDOC

THESE

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER II Discipline: Biologie des Populations & Écologie Formation Doctorale: Biologie de l’Évolution & Écologie École Doctorale: Biologie Intégrative

Présentée et soutenue publiquement par Frédéric VEYRUNES Le 12 décembre 2005

Radiation évolutive des souris naines Africaines, Nannomys (Rodentia, Muridae, Mus) : rôle des remaniements chromosomiques dans la spéciation et évolution des systèmes de déterminisme du sexe. -Approches phylogénétiques, cytogénétiques et cytogénomiques-

JURY: Mme. BRITTON-DAVIDIAN Janice, Dir. de Recherche CNRS, Univ. Montpellier II Directrice de thèse M. CAPANNA Ernesto, Professeur, Université « La Sapienza », Rome (Italie) Rapporteur Mme. CHEVRET Pascale, Chargé de Recherche CNRS, Université Montpellier II Invitée M. FREDGA Karl, Professeur émérite, Université d’Uppsala (Suède) Rapporteur M. MITCHELL Michael, Directeur de Recherche INSERM, Marseille Examinateur Mme. OLIVIERI Isabelle, Professeur, Université Montpellier II Présidente Mme. RICHARD Florence, Maître de Conférences, MNHN Paris Examinatrice . UNIVERSITE MONTPELLIER II

SCIENCES & TECHNIQUES DU LANGUEDOC

THESE

Présentée et soutenue publiquement par Frédéric VEYRUNES Le 12 décembre 2005

Radiation évolutive des souris naines Africaines, Nannomys (Rodentia, Muridae, Mus) : rôle des remaniements chromosomiques dans la spéciation et évolution des systèmes de déterminisme du sexe. - Approches phylogénétiques, cytogénétiques et cytogénomiques -

Rattus rattus Apodemus sylvaticus Mus (P.) platythrix Mus (M.)cervicolor Mus (M.) musculus Mus (M.) spretus Mus (C.) pahari Mus (C.) crociduroides Mus (N.) sp.

Mus (N.) minutoides

Mus (N.) musculoides Mus (N.) indutus Mus (N.) mattheyi

Mus (N.) a haussa Mus (N.) 0.1 setulosus

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 X Y

SOMMAIRE

INTRODUCTION p.1 1. EVOLUTION CHROMOSOMIQUE p.3 A. Les différents types de réarrangements p.3 B. Moteur de spéciation p.6 a) Modèles de « disfonctionnement hybride » p.9 b) Modèles de « supression de la recombinaison » p.11 c) Les critiques des modèles de spéciation chromosomique p.12 2. LES CHROMOSOMES SEXUELS p.14 A. Evolution des chromosomes sexuels p.14 B. Inactivation du chromosome X p.18 C. Remaniements impliquant les chromosomes sexuels p.19 a) Chromosomes sexuels asynaptiques p.19 b) Translocations chromosome sexuel-autosome p.22 c) Modifications du déterminisme du sexe p.29 3. PRESENTATION DU MODELE BIOLOGIQUE NANNOMYS p.38 A. Etat des connaissances p.39 B. Systématique morphologique et chromosomique p.43 C. Le genre Mus,Phylogénie & place des Nannomys au sein du genre p.44 4. PROBLEMATIQUE – APPROCHE MULTIDISCIPLINAIRE p.45 5. LES METHODES p.47

RESULTATS & DISCUSSION p.57 1ère partie : PHYLOGENIE DU GENRE MUS p.59 Article 1 : Molecular phylogeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochondrial and nuclear data. p.61 Article 2 Extensive genome repatterning in the genus Mus (Rodentia; Muridae) inferred from multidirectional cross-species chromosome painting. When chromosomes come to the help of molecular phylogeny and vice versa. p.63

2ème partie: HISTOIRE EVOLUTIVE DES NANNOMYS ET EVOLUTION CHROMOSOMIQUE p.99 A. Diversité chromosomique p.99 Article 3 : Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Muridae; Mus). p.101 B. Phylogénie moléculaire p.103 Article 4 : Molecular phylogeny of the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Rodentia, Murinae, Mus): implications for chromosomal evolution. p.105 C. Localisation des séquences télomériques (TTAGGG)n p.107 D. Etude de la méiose p.113 E. Présence d’un WART à l’état hétérozygote p.117 F. Evolution chromosomique p.121 a) Les réarrangements chromosomiques, confrontations avec les données moléculaires p.121 b) Les fusions Rb entre autosomes p.123 c) Les fusions Rb sexe-autosome p.129

3ème partie : DETERMINISME DU SEXE p.137 A. Identification de nouveaux systèmes de déterminisme du sexe p.137 a) Femelles XX – XY, Mâles XY p.137 b) Femelles XO, Mâles XY p.139 B. Recherche du gène Sry dans le génome p.141 C. Nouveaux systèmes de déterminisme du sexe : implications évolutives p.143 a) Système sexuel XX, XY / XY chez M. minutoides Kuruman p.143 b) Système sexuel XO / XY chez M. minutoides de Caledon p.147 c) Implications évolutives p.149

4ème partie : GENOME DE NANNOMYS : HOTSPOT POUR LES REARRANGEMENTS RARES IMPLIQUANT LES CHROMOSOMES SEXUELS p.155

5ème partie : CONCLUSION p.161

REFERENCES p.165

ANNEXES p.191

I. INTRODUCTION

. Introduction

I. INTRODUCTION

Une radiation évolutive est la diversification rapide, à partir d’un ancêtre commun, de plusieurs espèces dans des niches écologiques différentes (Futuyma, 1986 ; Schluter, 1996). Les exemples les plus célèbres correspondent à la colonisation de milieux insulaires caractérisés par l’isolement géographique, l’absence de compétiteurs et l’existence de niches vacantes (e.g. drosophiles sur les îles d’Hawaï, pinsons de Darwin aux Galapagos, lézards Anolis aux Caraïbes, etc …). Cependant, c’est l’acquisition d’adaptations clés, c’est-à-dire de grandes innovations du Vivant, qui a mené aux radiations les plus spectaculaires et les plus prolifiques en terme de biodiversité. De fait, elles sont à l’origine des grands groupes taxonomiques qui représentent la très grande majorité des organismes actuels et fossiles, tels que les Angiospermes (apparition de l’organe sexuel floral), les Arthropodes (acquisition d’un exosquelette et d’un nouveau plan de développement) ou encore les Rongeurs (acquisition de la croissance continue des incisives ; Jaeger, 1996). L’ordre des rongeurs contient presque la moitié de la diversité spécifique mammalienne totale. En particulier, la famille des Muridae renferme à elle seule plus de 1390 espèces, soit presque 30% de cette diversité (Wilson & Reeder, 1993). Contrairement à certains exemples bien documentés de radiations évolutives comme celles des Angiospermes (Davies et al., 2004), ou des poissons Cichlidés des grands lacs africains (Kornfield & Smith, 2000), le succès évolutif des Rongeurs (et en particulier des Muridae) ne s’est pas accompagné de profondes modifications morphologiques. L’homogénéité morphologique a rendu la caractérisation des espèces très délicate ; cette formidable diversité est donc longtemps passée inaperçue et reste aujourd’hui largement sous-estimée. Par contre, contrastant de façon étonnante avec ces stases morphologiques, les Rongeurs ont subi et subissent encore d’importantes modifications et réorganisations de leur génome. Ainsi, c’est encore chez les Muridae que sont aujourd’hui identifiées la plupart des nouvelles espèces biologiques de mammifères (Wilson & Reeder, 1993 ; Patterson, 2000). L’essor de la cytogénétique a notamment grandement participé à la description de nouvelles espèces de Muridae, révélant une diversité caryologique inter- et intra-spécifique insoupçonnée, palliant ainsi la faible différentiation morphologique. Ainsi, un grand nombre de groupes de Muridae africains constituent des complexes d’espèces biologiquement distinctes, bien différenciées d’un point de vue génomique (contenu et organisation) alors qu’elles sont parfaitement indiscernables d’un point de vue morpho-anatomique. On les

1 appelle espèces jumelles ou cryptiques. A titre d’exemple, le genre Taterillus renferme au moins sept espèces cryptiques en Afrique de l’Ouest (Dobigny et al., 2002a, 2003a) que ni la morphologie, ni la morphométrie traditionnelle ou géométrique n’ont permis de distinguer (Dobigny et al., 2002b). Pourtant, leurs caryotypes sont extrêmement divergents et confèrent à coup sûr un isolement reproductif post-zygotique (Dobigny et al., 2002a). De même, plusieurs nouvelles espèces du genre Arvicanthis ont été décrites sur la base de l’étude de leurs caryotypes (Volobouev et al., 2002 ; Ducroz et al., 1997, 1998), alors que la morphologie géométrique ne permet pas de les discriminer (Fadda & Corti, 2001). Les études chromosomiques permettent ainsi de réévaluer et de reconsidérer la biodiversité spécifique ; ce genre d’investigations constitue une des tâches fondamentales de la systématique moderne à une époque où la biodiversité est un concept omniprésent, aussi bien au centre de nombreuses thématiques de recherche que de nombreux problèmes de société (conservation, ressources génétiques, etc…). En outre, ces espèces jumelles peuvent parfois présenter des différences biologiques importantes telles que des dynamiques de populations ou des réponses immunitaires à un agent pathogène spécifique. La connaissance de ces complexes d’espèces peut alors se révéler d’un très grand intérêt public pour définir des stratégies adéquates en terme de lutte biologique, protection des cultures contre des ravageurs ou épidémiologie humaine. Ainsi, le moustique Anopheles gambiae, agent du paludisme, constitue en fait un complexe d’espèces morphologiquement similaires, mais génétiquement et caryologiquement distincts. En outre, ces espèces présentent des différences éco-éthologiques, notamment dans la transmission de Plasmodium falciparum, parasite vecteur du paludisme (della Torre et al., 2002 ; Coluzzi et al., 2002 ; Hoffman et al., 2002 ; Ayala & Coluzzi, 2005). Il en est de même pour de nombreux genres de rongeurs qui véhiculent et transmettent des virus, bactéries et parasites problématiques en santé humaine. Ainsi, le genre Mastomys représente un complexe d’au moins huit espèces identifiées sur la base de leur caryotype et confirmées par des marqueurs moléculaires. Parmi ces espèces, Mastomys erythroleucus (2n = 38) est un réservoir important du virus de la fièvre de la Vallée du Rift au Sénégal, alors que ce dernier se réplique peu dans l’espèce jumelle M. huberti (2n = 32) (Gora et al., 2000). En Afrique du Sud, M. natalensis (2n = 32) souffre peu d’une infection de la peste transmise par Yersinia pestis et joue donc un rôle de réservoir, alors que M. coucha (2n = 36) en meurt rapidement (Arntzen et al., 1991). Enfin, M. natalensis (2n = 32) est le réservoir principal de la fièvre hémorragique de Lassa en Guinée, alors que M. erythroleucus (2n = 38) n’est pas du tout infecté (E. Calvet, comm. pers.).

2 Introduction : Evolution chromosomique

1. EVOLUTION CHROMOSOMIQUE

A. Evolution chromosomique : Les différents types de

réarrangements.

L’évolution chromosomique est le passage d’un caryotype à un autre. Deux paramètres permettent de décrire sommairement les caractéristiques de chaque caryotype : le nombre diploïde (2n) qui représente le nombre de chromosomes, et le nombre fondamental (NF) indiquant le nombre de bras chromosomiques (voir Figure 1). En règle générale, chaque espèce possède un caryotype stable, dont le nombre et la forme des chromosomes lui sont propres. Chez les mammifères, le nombre diploïde varie de 6 chez la femelle du cerf muntjac Muntiacus muntjak (mâle : 2n = 7 ;Yang et al., 1995) à 118 chez un rongeur Echimyidae, Dactylomys boliviensis (Dunnum et al., 2001), mais la très grande majorité des espèces ont un nombre de chromosomes compris entre 30 et 60 (King, 1993 ; voir aussi Fig. 4 dans Pardo- Manuel de Villena & Sapienza, 2001). A noter que l’unique cas de tétraploïdie chez les mammifères, Tympanoctomys barrerae (Rodentia, Octondontidae), a récemment été démenti ; il s’agit donc d’un diploïde à 2n = 102 (Svartman et al., 2005). Certaines lignées de mammifères présentent une organisation génomique très conservée, alors que d’autres semblent subir de profondes modifications caryotypiques. Ainsi dans l’ordre des Carnivores, les Felidae ont tous un caryotype très similaire (2n = 38), alors que chez les Canidae, le nombre de chromosomes varie de 36 (renard roux) à 78 (loup d’Europe). De même chez les Primates, les singes anthropoïdes ont un taux d’évolution chromosomique relativement lent à l’inverse des Lémuriens, Gibbons ou Platyrrhiniens. Enfin chez les Rongeurs, les Sciuridae présentent une organisation très conservée de leur génome, alors que les Muridae et les Echimyidae ont un génome très remanié (revues dans O’Brien et al., 1999 ; Wienberg, 2004). Dans cette dernière famille, le 2n varie de 14 à 118 (Dunnum et al., 2001). A une autre échelle temporelle et taxonomique, certaines populations de souris domestique Mus musculus domesticus, n’ont que 22 chromosomes au lieu de 40 (revue dans Pialek et al., 2005). Une étude a montré que cette diminution du nombre de chromosomes s’était fixée sur l’île de Madère en à peine 500 ans (Britton-Davidian et al., 2000) !

3 chromosome chromosome acrocentrique métacentrique

centromère

bras chromosomique

NF = 1 NF = 2 2n = 1 2n = 1

Figure 1: Schéma des deux types de chromosomes selon la position du centromère, distal pour l’acrocentrique et médian pour le métacentrique. NF = nombre fondamental; 2n = nombre diploïde

Encadré 1. Principaux types de remaniements chromosomiques et incidence sur le nombre diploïde (2n) et le nombre fondamental (NF)

Inversion péricentrique Ce remaniement fait intervenir une cassure dans le bras chromosomique et une inversion impliquant le centromère. Dans ce cas le 2n reste inchangé, mais le NF diminue ou augmente d’une unité.

Fusion Robertsonienne ou centrique fusion Il s’agit d’une fusion par le centromère de deux chromosomes résultant en un seul chromosome métacentrique. La fission fission représente le processus inverse. Ce remaniement modifie le 2n en laissant le NF inchangé.

Fusion en tandem fusion Il s’agit d’une fusion bout à bout de deux chromosomes acrocentriques résultant en un chromosome acrocentrique. Ce fission réarrangement modifie à la fois le 2n et le NF.

Translocation réciproque Deux chromosomes échangent du matériel chromosomique. Ce remaniement peut être non-réciproque, dans ce cas un fragment d’un bras chromosomique est transloqué sur un autre chromosome. Ce réarrangement ne modifie ni le 2n ni le NF.

Addition d’hétérochromatine H +

H -

4 Introduction : Evolution chromosomique

L’évolution chromosomique met en jeu des évènements que l’on appelle remaniements chromosomiques, dont les différents types sont passés en revue par King (1993) et résumés dans l’encadré 1. L’inversion consiste en un « retournement » d’une partie de chromosome qui peut impliquer le centromère (dans ce cas on l’appelle péricentrique) ou non (alors appelée paracentrique). La fusion centrique ou Robertsonnienne -Rb- (du nom de son découvreur) est la fusion par le centromère de deux chromosomes non-homologues acrocentriques résultant en un seul chromosome métacentrique (voir aussi Figure 1). La fusion en tandem est la fusion « télomère-centromère » de deux chromosomes non- homologues acrocentriques formant un seul chromosome acrocentrique. Comme pour la fusion Rb, le chromosome néo-formé comprend alors deux centromères, dont l’un est désactivé, puis dégénère. Ce type de remaniement est plutôt rare. L’événement contraire, la fission d’un chromosome acrocentrique pour former deux chromosomes acrocentriques existe (e.g. Kolnicki, 2000 ; Perry et al., 2004), mais est théoriquement plus problématique que la fusion car elle nécessite la génération d’un nouveau centromère et de télomères, structures indispensables à l’intégrité, stabilité et fonction du chromosome (Moyzis et al., 1988 ; Blackburn, 1991 ; Zakian, 1995). De même, Garagna et al. (1995) et Nanda et al. (1995) ont montré chez la souris domestique que la fusion Rb conduisait à la perte de matériel génétique (la totalité des télomères et d’une partie des satellites mineurs) en région péricentromérique ; le mécanisme inverse (fission Rb) apparaît donc improbable chez cette espèce. Les translocations se produisent lorsqu’un fragment de chromosome passe sur un autre, généralement à la suite de cassures ou de crossing-overs illégitimes. Lorsque les échanges de fragments interviennent entre deux chromosomes, on les appelle translocations réciproques. Un échange de bras complet entre deux chromosomes métacentriques ou entre un métacentrique et un acrocentrique est un cas spécial de translocation appelé WART (Whole Arm Reciprocal Translocation) ; cet événement a été identifié plusieurs fois chez la souris domestique (Capanna & Redi, 1995 ; Castiglia & Capanna, 1999 ; Catalan et al., 2000). Enfin, l’addition/délétion d’hétérochromatine est la modification quantitative de l’ADN non-codant (e.g. séquences répétées, ADN satellites, transposons, etc…) sur un chromosome. Les remaniements sont issus de mutations chromosomiques ; King (1993) évoque des taux d’apparition compris entre 10-4 et 10-1 par gamète et par génération chez différentes espèces animales. D’après King (1993) et Qumsiyeh (1994), le remaniement le plus répandu chez les mammifères est la fusion Rb. Les réarrangements chromosomiques ne modifient pas le contenu génétique d’un génome (hormis lorsque la cassure d’un bras chromosomique se produit au milieu d’un gène le rendant ainsi inactif), mais engendrent une réorganisation de

5 celui-ci en modifiant les groupes de liaison et les interactions épistasiques entre gènes, car certaines associations de gènes sont créées et d’autres détruites. Certains groupes taxonomiques accumulent préférentiellement un type de remaniements au cours de leur évolution. Ce phénomène est appelé orthosélection caryotypique (White, 1975). Par exemple, la souris domestique M. m. domesticus (e.g. Capanna, 1982 ; Hauffe & Searle, 1993, Britton-Davidian et al., 2000 ; Pialek et al., 2005), les musaraignes du genre Sorex (revue dans Searle, 1988), esl chauves-souris (e.g. Baker et al., 1985), les antilopes (e.g. Vassart et al., 1995) ou les lémuriens (e.g. Rumpler et al., 1983 ; Ishak et al., 1992) accumulent préférentiellement des fusions Robertsoniennes. Tandis que les rongeurs des genres Peromyscus (e.g. Robbins & Baker, 1981) et Mastomys (e.g. Britton- Davidian et al., 1995) accumulent en majorité des inversions péricentriques. Enfin, l’évolution chromosomique des cerfs muntjac ou des rongeurs Sigmodon se fait majoritairement par fixation de fusions en tandem (King, 1993 ; Yang et al., 1997). Les processus régulant les patrons (et non pas les taux) d’évolution chromosomique sont très peu connus, mais il semblerait qu’ils soient à rechercher dans les facteurs d’expression géniques, moléculaires et biochimiques, les mécanismes méiotiques et/ou dans la structure du noyau interphasique plutôt que dans des facteurs populationnels (i.e. tailles des dèmes, structure sociale) (in Baker et al., 1988 ; Redi et al., 1990 ; Pardo-Manuel de Villena & Sapienza, 2001).

B. Evolution chromosomique : Moteur de spéciation.

L’apparition des espèces a depuis des siècles suscité l’intérêt et la curiosité des hommes, et c’est donc naturellement qu’elle est encore aujourd’hui au cœur des grandes questions de la biologie évolutive. La spéciation est le processus par lequel de nouvelles espèces apparaissent. Il conduit à la séparation d’un seul taxon en deux entités qui sont potentiellement ou réellement isolées reproductivement les unes des autres [d’après le concept biologique de l’espèce énoncé par Mayr en 1942]. De façon globale, la spéciation se définit par l’interaction de deux types de processus : des phénomènes de divergence et la mise en place d’un isolement reproducteur. Chacun de ces deux types de processus peut avoir des causes et des effets variés, et leur relation a mené à l’élaboration de nombreuses théories de spéciation, qui sont elles-même imbriquées les unes dans les autres. En effet :

6 Introduction : Evolution chromosomique

- La spéciation peut se produire en allopatrie : des populations initialement interfécondes évoluent en espèces distinctes par isolement géographique -montagnes, îles, fleuves peuvent être des barrières infranchissables- ayant acquis suffisamment de différences génétiques par dérive ou sélection pour devenir incompatibles. C’est le mode de spéciation le plus fréquent chez les animaux. A l’inverse, la spéciation peut se produire en sympatrie : dans ce cas l’isolement n’est pas géographique, mais survient suite à des divergences (génétiques et/ou écologiques) conduisant à un isolement reproducteur. Le concept de sélection disruptive est central dans ce mode de spéciation et implique une spécialisation dans des niches écologiques différentes et/ou des différences dans le choix et la rencontre des partenaires sexuels. Ce phénomène reste controversé, mais semble être admis chez les poissons Cichlidés des grands lacs Africains ou des insectes phytophages Aphididae (revue dans Via, 2001). - La spéciation peut être générée par un isolement reproducteur pré- ou post-zygotique. Le premier est atteint si les différences génétiques accumulées par les deux populations modifient un comportement ou un trait reproductif (i.e. décalage de saison de reproduction) susceptible de faire échouer la rencontre ou l’accouplement des partenaires sexuels. Le second intervient après la fécondation, mais implique un mauvais développement de l’embryon, la stérilité ou la non-viabilité des hybrides suite à une trop grande incompatibilité génomique. - Enfin, les modèles de spéciations peuvent être dits génétiques : lorsque l’isolement reproducteur est dû à une accumulation de mutations génétiques, ces mutations peuvent aussi n’affecter qu’un faible nombre de gènes majeurs, voire un seul, régulant un trait fondamental pour la reconnaissance du partenaire sexuel – il s’agit du concept le plus couramment admis (revues dans Coyne & Orr, 1989 ; Orr, 1995, 2001 ; Wu, 2001) ou chromosomiques : lorsque les remaniements chromosomiques sont à l’origine de la différenciation des espèces (revues dans White, 1968 ; King, 1993 ; Ayala & Coluzzi, 2005).

Dans ce chapitre, nous allons nous intéresser plus particulièrement aux modèles de spéciation chromosomique qui présentent eux aussi de nombreuses variantes (voir Rieseberg, 2001). L’hypothèse de la spéciation chromosomique a été énoncée par White dès 1968, et a été reprise et développée longuement par King (1993) dans son ouvrage « Species evolution. The role of chromosome change ». Par la suite, plusieurs auteurs ont à leur tour développé et diversifié cette théorie (e.g. Searle, 1993 ; Sites, 1995 ; Spirito, 1998). Néanmoins, la

7 Gamète Gamète Méiose F1 paternel maternel

OK OK

Pas de perturbation: formation d’un bivalent, chaque chromosome ségrège ensuite vers une cellule-fille.

aneuploïdie

OK OK OK

aneuploïdie

Formation d’un trivalent: risque d’aneuploïdie ~5% (Capanna, 1982)

* ** * * * * *

L’augmentation du nombre de trivalents accroît dramatiquement de façon non-linéaire le taux d’aneuploïdie. Au-delà de 5 trivalents, l’hybride subit une très forte baisse de la fertilité.

La présence de fusions Rb avec homologie monobrachiale entraîne des configurations complexes: ici une chaîne de 5 chromosomes

… ici un anneau de 4 chromosomes

Figure 2: Les différents aspects de la ségrégation méiotique chez des hybrides hétérozygotes pour des fusions Rb.

8 Introduction : Evolution chromosomique spéciation chromosomique a subi un certain nombre de critiques, notamment par les ardents défenseurs du « tout génétique » (voir plus loin) et fut évoquée de façon marginale voire même occultée dans certaines revues qui font pourtant référence (e.g. Coyne & Orr, 1989 ; Wu, 2001). Toutefois, ces modèles ont trouvé un regain d’intérêt ces dernières années (Noor et al., 2001 ; Rieseberg, 2001 ; Navarro & Barton, 2003 ; Delneri et al., 2003 ; Butlin, 2005 ; Ayala & Coluzzi, 2005) et ont notamment reçu l’appui d’une approche empirique expérimentale (Delneri et al., 2003). On distingue deux catégories majeures de modèles dans lesquels les remaniements chromosomiques jouent un rôle prépondérant : d’une part, les modèles de « disfonctionnement hybride » où les réarrangements agissent directement sur la valeur sélective des hybrides, et d’autre part, les modèles de « suppression de la recombinaison » où les réarrangements influent sur les flux de gènes ou les groupes de liaisons (Ayala & Coluzzi, 2005).

a) Modèles de « disfonctionnement hybride » Ces modèles développés essentiellement par White (1968, 1978), Capanna (1982) et King (1993) s’appuient sur les propriétés délétères des remaniements chromosomiques et la baisse de valeur sélective associée chez les porteurs hétérozygotes. Les effets délétères des fusions Rb à l’état hétérozygote ont été abondamment étudiés chez plusieurs espèces, et notamment chez la souris domestique et la musaraigne Sorex araneus. La présence d’une fusion Rb hétérozygote entraîne la formation d’un trivalent à la méiose (les deux chromosomes acrocentriques s’apparient à leurs homologues fusionnés). La ségrégation méiotique des chromosomes peut alors être perturbée du fait qu’elle soit asymétrique : à l’anaphase I, les deux chromosomes acrocentriques devant se diriger vers un pôle de la cellule et le chromosome métacentrique vers l’autre. Cela engendre plusieurs conséquences non- exclusives : mauvaise disjonction méiotique des chromosomes (formation de gamètes aneuploïdes) qui se traduit par diminution du succès reproducteur ou des tailles de portées (Figure 2), et/ou une perturbation de la gamétogénèse qui peut mener jusqu’à la mort des cellules germinales ou même son interruption entraînant une stérilité totale (Capanna, 1982 ; Gropp et al., 1982 ; Redi & Capanna, 1988 ; Garagna et al., 1990 ; Saïd et al., 1993 ; Hauffe & Searle, 1998 ; Castiglia & Capanna, 2000). Il a été montré que le degré de disruption de la gamétogénèse dépendait de la nature et du nombre de trivalents impliqués. En règle générale, chez la souris, la présence d’un seul trivalent a des effets limités sur la fertilité des hybrides

Gène majeur de reconnaissance du partenaire sexuel Inversion Zone de suppression paracentrique de la recombinaison

Évolution indépendante de ce gène entre les deux populations

Isolement pré-zygotique

Figure 3: Schéma récapitulatif du modèle de spéciation chromosomique par « suppression de la recombinaison ».

10 Introduction : Evolution chromosomique

(Capanna, 1982, a estimé la formation de ~5% de gamètes aneuploïdes) ; en revanche, les effets de l’accumulation de trivalents ne sont pas additifs, puisque au-delà de cinq trivalents, les hybrides subissent une forte baisse de la fertilité allant jusqu’à une stérilité complète, favorisant la mise en place d’un isolement reproductif entre populations (Saïd et al., 1993 ; Hauffe & Searle, 1998 ; Castiglia & Capanna, 2000 ; Figure 2). La fixation de fusions Rb peut dans certains cas aboutir à un isolement reproductif rapide ; il s’agit de la spéciation par homologie monobrachiale (Capanna, 1982 ; Baker & Bickham, 1986). Ceci se produit lorsque deux populations fixent indépendamment des fusions Rb impliquant les mêmes chromosomes, mais dans des combinaisons différentes, les chromosomes métacentriques qui en résultent ont alors un seul bras en commun. Ce type d’homologie engendre à la méiose des configurations complexes lors de l’appariement des chromosomes homologues, appelées chaîne ou anneau selon que la configuration est ouverte ou fermée (e.g. Johannisson & Winking, 1994 ; Figure 2). Ces configurations entraînent des niveaux variables de subfertilité hybride, mais lorsqu’elles impliquent plus de 6 chromosomes, elles affectent très sérieusement la gamétogénèse (stérilité), contribuant ainsi à un isolement reproductif important entre races (Gropp et al., 1982 ; Redi & Capanna, 1988 ; Garagna et al., 1990 ; Johannisson & Winking, 1994 ; Hauffe & Searle, 1998 ; Banaszek et al., 2000, 2002 ; Pialek et al., 2001). Cependant, il semblerait que les phénomènes de disruption méiotique soient en partie génome-spécifique. En effet, Sorex araneus supporte davantage les configurations méiotiques complexes que Mus m. domesticus, puisque des individus porteurs d’anneaux de 6 ou 7 chromosomes restent suffisamment subfertiles pour maintenir un flux génique entre les populations (Mercer et al., 1992 ; Andersson et al., 2004). Les hybrides sont toutefois contre-sélectionnés ayant une valeur sélective bien moindre, ainsi l’isolement se parachèverait par la mise en place de renforcement (Ritchie et al., 1992 ; Benzekri et al., 2002).

b) Modèles de « suppression de la recombinaison » Récemment, un autre effet des remaniements sur le flux de gènes entre populations chromosomiquement différentes a été mis en lumière (Noor et al., 2001 ; Rieseberg, 2001 ; Navarro & Barton, 2003 ; Delneri et al., 2003 ; Butlin, 2005 ; Ayala & Coluzzi, 2005). Il s’agit d’une réduction voire une interruption de flux de gènes, non plus entre individus, mais entre portions de génomes. En effet, chez la souris, l’apparition de fusions Rb à l’état hétérozygote (e.g. Davisson & Akeson, 1993) ou homozygote (e.g. Dumas & Britton-

11 Davidian, 2002) a pour conséquence, entre autres, une nette diminution du nombre de crossing-over (et donc de la recombinaison). De façon encore plus drastique, un événement d’inversion entraîne une interruption totale de la recombinaison entre les segments chromosomiques inversé et non-inversé ; en effet, si un événement de recombinaison se produit dans la boucle d’inversion, alors les chromosomes recombinants ont une partie de leur génome dupliquée et un autre délétée , donnant lieu à des gamètes ou embryons non-viables ; voir Rieseberg, 2001). Ces deux pools de gènes liés vont alors évoluer indépendamment (voir Figure 3). Si ces derniers contiennent un gène majeur du développement (e.g. « Speciation genes » sensu Orr et al., 2004) ou intervenant dans la reconnaissance du partenaire sexuel, on peut alors envisager la mise en place rapide d’un isolement reproducteur respectivement post- zygotique (rupture de co-adaptation des gènes) ou pré-zygotique (e.g. Rieseberg, 2001 ; Navarro & Barton, 2003 ; Delneri et al., 2003). Par ailleurs, Noor et al. (2001) constatent un nombre plus important de gènes dits « de stérilité » dans les parties du génome inversées que colinéaires et proposent que ces gènes sont en fait éliminés des régions colinéaires par la recombinaison.

c) Les critiques des modèles de spéciation chromosomique Les modèles de « disfonctionnement hybride » ont été les plus violemment critiqués, ceux de « suppression de la recombinaison », au contraire, bénéficient d’une certaine popularité tant ils sont compatibles avec (et s’inscrivent même dans) les modèles de spéciation génétique. Ces derniers sont les modèles les plus couramment admis, soutenus par les principaux leaders des théories de spéciation. La principale critique du modèle de sous-dominance est qu’il est difficile de concevoir qu‘une mutation très délétère à l’état hétérozygote puisse se fixer dans une population. Pourtant, ce problème n’a en quelque sorte pas lieu d’être. En effet, les différences caryotypiques entre espèces existent (rappelons qu’au sein des mammifères, le 2n varie de 6 à 118) ; des mutations chromosomiques ont donc été incontestablement fixées au cours de l’évolution des organismes. Il s’agit plutôt d’évaluer la probabilité que leur fixation soit effectivement à l’origine de l’isolement reproducteur. Différentes études théoriques ont montré que la fixation d’une mutation chromosomique provoquant une sous-dominance élevée pouvait se produire dans des populations de petites tailles efficaces où la dérive génétique est intense et la consanguinité forte (Lande, 1979, 1985 ; Hedrick, 1981 ; Hedrick & Levin, 1984 ; Michalakis & Olivieri, 1993). Des épisodes répétés d’extinction-

12 Introduction : Evolution chromosomique recolonisation locales peuvent répondre à la condition de petite taille exigée et favoriser la fixation de mutations chromosomiques. Deux autres facteurs peuvent théoriquement favoriser la fixation de mutations chromosomiques. Il s’agit d’une part de la sélection : si le remaniement procure un avantage sélectif au porteur homozygote (une nouvelle combinaison favorable de gènes par exemple ; e.g. Charlesworth & Charlesworth, 1980 ; Searle, 1993). Pour Nevo et al. (1994), le caryotype des rats-souterrains Spalax est assimilé à une stratégie adaptative ; ces auteurs montrent une corrélation entre le nombre diploïde et l’habitat, le 2n augmentant avec le gradient d’aridité et l’instabilité climatique. Le second facteur est une distorsion méiotique en faveur de la nouvelle forme remaniée, c’est-à-dire la formation préférentielle de gamètes porteurs de la mutation (Pardo Manuel de Villena & Sapienza, 2001). Inversement, une seconde critique remet en question le pouvoir délétère de certains réarrangements chromosomiques. En effet, il existe des polymorphismes populationnels stables (exemples chez des sauterelles ; Colombo, 1989 ; des rongeurs ; Nachman & Myers, 1989) qui suggèrent que les réarrangements chromosomiques ne sont pas toujours suffisamment délétères pour affecter la valeur sélective des hétérozygotes et ainsi initier à eux seuls un isolement reproducteur. Cependant, on l’a vu, l’accumulation de fusions Rb, si peu délétères soient-elles, ou la fixation de fusions Rb ayant des homologies monobrachiales avec les chromosomes de la population en contact peuvent entraîner de graves perturbations de la gamétogenèse de l’hybride et engendrer un isolement reproducteur. De plus, chaque espèce réagit différemment aux remaniements, certaines les tolérant mieux que d’autres (e.g. plantes vs. animaux ; Rieseberg, 2001 - Mus vs. Sorex ; voir ci-dessus). Il conviendrait donc de vérifier systématiquement l’effet des remaniements pour chaque lignée.

Ainsi, il est certain que les réarrangements chromosomiques ne sont pas à l’origine de tous les événements de cladogénèse (certaines lignées comme les félins ou les marsupiaux ont des caryotypes très conservés, et à l’inverse d’autres espèces présentent un polymorphisme chromosomique important). Il est également difficile de savoir si le remaniement initie le processus de spéciation ou s’il est subséquent. Néanmoins, le rôle des mutations chromosomiques dans l’évolution des espèces ne peut être ignoré. En effet, suffisamment de données cytologiques montrent que les remaniements chromosomiques peuvent être très délétères (disruption méiotique, interruption de la recombinaison, absence d’hétérozygotie pour les translocations en tandem par exemple, etc…). On peut donc raisonnablement prédire qu’au moins dans certains cas, les remaniements chromosomiques puissent se fixer en

13 induisant une baisse de fertilité suffisante pour initier un isolement reproducteur, donc un processus de spéciation.

Enfin, d’autres changements brutaux de l’organisation du génome peuvent engendrer des événements de spéciation rapides, tels les processus de polyploïdisation et d’hybridation bien connus des plantes et des animaux inférieurs (e.g. revues dans Otto & Whitthon, 2000 ; Rieseberg, 1997). Chez les mammifères, les changements brutaux du génome sont très rares, et de ce fait, ils sont systématiquement occultés des théories de spéciation. Il s’agit notamment des changements du déterminisme du sexe (Marshall Graves, 2002b), et des réarrangements chromosomiques affectant les génomes des chromosomes sexuels (e.g. règle de Haldane ; Barton & Charlesworth, 1984 ; Coyne, 1992 ; Turelli & Orr, 1995), dont les translocations chromosome sexuel-autosome (King, 1993 ; voir plus loin). Ces derniers sont considérés comme des événements fortement délétères et pourraient donc être à l’origine de spéciation.

2. LES CHROMOSOMES SEXUELS

A. Evolution des chromosomes sexuels.

Le sexe, une des grandes énigmes de l’évolution, a fasciné la génétique des populations dès le début de sa conceptualisation (Fisher, 1930 ; Muller, 1932) et encore aujourd’hui (e.g. revues dans Charlesworth, 1996, 2002 ; Barton & Charlesworth, 1998 ; Otto & Lenormand, 2002 ; Otto, 2003 ; voir aussi numéro spécial de Science vol. 281, septembre 1998). En effet, la sexualité engendre de nombreux coûts qui sont absents de l’asexualité : recherche d’un partenaire et risque de ne pas le trouver, investissement dans la parade nuptiale et/ou l’accouplement, risque de transmission de maladies et de prédation pendant l’accouplement, conflits entre sexes etc… Plus paradoxal encore, la reproduction sexuée ne transmet aux descendants que la moitié du génome parental versus la totalité dans le cas de la reproduction asexuée, et détruit des associations géniques (recombinaison) qui se sont accumulées au cours du temps en réponse à la sélection. Pourtant la reproduction sexuée est apparue indépendamment dans de nombreux groupes d’animaux et de plantes (e.g. Bull,

14 Introduction : Le modèle biologique

1983 ; Werren & Beukeboom, 1998 ; Vyskot & Hobza, 2004 ; Charlesworth et al., 2005 ; pour les avantages du sexe se rapporter aux références citées ci-dessus). Ces systèmes sexuels possèdent des caractéristiques communes (e.g. revue dans Charlesworth et al., 2005). En effet, la mise en place récurrente de chromosomes morphologiquement et génétiquement distincts, appelés X et Y lorsque le sexe hétérogamétique est mâle, ou Z et W quand il s’agit de la femelle, suggère que des forces évolutives communes opèrent dans ces différentes lignées. Toutefois, hormis chez les mammifères et les oiseaux (le mécanisme génétique reste encore mal connu chez ce dernier ; Yamada et al., 2004), la plupart des autres groupes sont très plastiques quant au déterminisme du sexe (e.g. Charlesworth, 1991 ; Volff & Schartl, 2001 ; Saccone et al., 2003 ; Ogata et al., 2003 ; Schartl, 2004 ; Nicolas et al., 2005). A titre d’exemple, les poissons Poeciliidae ont un déterminisme de base XX / XY, mais on rencontre aussi des femelles avec des génotypes XY, YY, ZW, XW, YW et des mâles YY, XX, ZZ, XW, YW, WW (Volff & Schartl, 2001). De même, chez les reptiles et amphibiens, la grenouille Rana rugosa présente des populations XX / XY et d’autres ZZ / ZW (Ogata et al., 2003), certains lézards sont parthénogénétiques (e.g. Kearney, 2003) et le sexe des crocodiles et de la plupart des tortues est déterminé par la température d’incubation des oeufs. Au long de ce chapitre, nous nous intéresserons uniquement à l’évolution des chromosomes sexuels et du déterminisme du sexe des mammifères, chez lesquels le déterminisme est très conservé, ayant une origine unique et syngamique, c’est-à-dire fixé à la fertilisation par les chromosomes et non pas influencé par des facteurs environnementaux (température, hormones, salinité, environnement social, etc…).

Bien que les chromosomes X et Y soient aujourd’hui très différents par leur taille et leur contenu génétique, ils ont une origine unique et dérivent d’une même paire d’autosomes (Ohno, 1967; revue dans Graves et al., 2002). Il y a plus de 300 millions d’années (MA), un des deux autosomes a acquis un gène déterminant la fonction mâle (TDF = Testis Determining Factor, voir encadré 2) et devint de ce fait un proto-Y entraînant l’accumulation successive d’autres gènes spécifiques et avantageux chez les mâles. Pour préserver cette association de gènes liés à la fonction mâle, la recombinaison génique entre le X et le Y a été sélectivement interrompue sur une grande partie de leur génome conduisant à leur évolution indépendante, à l’exception de la région pseudoautosomale (PAR). Dans cette région l’appariemment du X et du Y conduit à la formation d’un chiasma obligatoire pour assurer une bonne ségrégation des chromosomes à la méiose mâle (Charlesworth, 1991 ;

Encadré 2: à la recherche du TDF (Testis Determining Factor) et des gènes impliqués dans le déterminisme du sexe. Classiquement, il y a deux étapes dans le déterminisme du sexe, la première allant des chromosomes vers la formation des gonades, la secondes allant des gonades vers le phénotype. La première étape est contrôlée par les gènes du déterminisme du sexe, la seconde par la production d’hormones des gonades (revue dans Vaiman & Pailhoux, 2000). A la fin des années 1950, le gène déterminant le sexe mâle ou TDF (Testis Determining Factor) a été localisé sur le chromosome Y d’après les phénotypes aberrants des femelles XO et mâles XXY chez les humains et les souris. Quel que soit le nombre de chromosomes X, en l’absence du chromosome Y, l’individu ne se masculinise pas, les gonades se développent en ovaires. De nombreuses équipes se sont alors lancées dans la localisation et l’identification du TDF, notamment en analysant les individus au sexe reversé possédant dans leur génome des fragments du chromosome Y. C’est ainsi que le TDF a été localisé dans la partie distale du bras court du Y humain. L’antigène HY (un antigène mineur d’histoincompatibilité mâle- spécifique), candidat potentiel au TDF, fut alors écarté quand il fut localisé sur le bras long du Y (Simpson et al., 1987). Les espoirs se sont alors tournés vers Zfy, gène présent dans la partie distale du bras court du Y, mais fut exclu lorsque des mâles XX dépourvus de Zfy ont été identifiés (Palmer et al., 1989). En 1990, Sinclair et al. mettent fin à toutes spéculations, le TDF est enfin identifié, il s’agit du gène Sry, participant auparavant à l’ontogenèse du cerveau et recruté il y a 130-170 MA dans le déterminisme du sexe en acquérant une nouvelle fonction (néofonctionalisation) (Marshall-Graves, 2002). Le facteur de transcription encodé par le gène Sry (protéine composée de 204 acides aminés) possède un domaine HMG (High Mobility Group) très conservé chez les mammifères, incorporé entre des queues 5’ et 3’ très peu conservées. La plupart des réversions de sexe sont provoquées par des mutations affectant le HMG (Harley et al., 2002). Le développement du phénotype mâle est un processus complexe qui fait intervenir une cascade d’activations géniques dont Sry est le précurseur, certains de ces gènes ne s’exprimant que pendant une période très courte chez l’embryon, entraînant l’activité d’autres gènes-cibles et ainsi de suite (Lovell-Badge & Hacker, 1995; O’Neill & O’Neill, 1999). Parmi ces gènes-cibles, ceux de la famille multigénique SOX (à laquelle Sry appartient) ont un rôle majeur, et notamment Sox9 qui a la capacité d’initier un développement mâle et ce, en l’absence de Sry (Canning & Lovell-Badge, 2002; Knower et al., 2003; Koopman, 2005). La régulation de cet ensemble de gènes et dans certains cas leurs fonctions précises restent encore mal connues.

16 Introduction : Le modèle biologique

Charlesworth & Charlesworth, 2000 ; Marshall Graves, 2002a, 2004). En comparant la divergence de séquences entre 19 paires de gènes homologues ayant une copie sur le X et une sur le Y (paires de gamétologues) par rapport à leur position physique sur les chromosomes, Lahn & Page (1999) identifient quatre groupes de gamétologues qui diffèrent par leur taux de divergence sur les sites synonymes (Ks). Ainsi, ces auteurs proposent que l’arrêt de la recombinaison se serait fait en quatre strates successives par une série de quatre inversions sur le Y (voir aussi Sandstedt & Tucker, 2004). Mais le mécanisme apparaît plus complexe, car une inversion n’est probablement pas responsable de la formation de la quatrième strate puisque (i) un intron fonctionnel du gène AMELX est à l’intersection entre la troisième et quatrième strate (Iwase et al., 2003), et (ii) la suppression de la recombinaison dans cette partie du génome semble plus graduelle que sous l’hypothèse de l’inversion (Marais & Galtier, 2003). L’arrêt de la recombinaison entre le X et le Y a deux incidences évolutives majeures : la dégradation du Y et l’inactivation aléatoire d’un des X chez la femelle. La recombinaison est un mécanisme assurant le brassage génétique entre chromosomes homologues, et favorisant la purge des allèles délétères. De ce fait, la supression de la recombinaison du chromosome Y (alors que le X recombine avec son homologue chez les femelles) a entraîné l’accumulation d’accidents génétiques – mutations, délétions, invasions d’éléments répétés – qui le dégradent progressivement (Charlesworth & Charlesworth, 2000 ; Marshall Graves, 2000, 2002, 2004). Ainsi, alors que le chromosome X est l’élément le plus conservé du génome humain et porte 1438 gènes, le chromosome Y n’en possède plus que 45, ayant donc perdu 1393 gènes en 300 MA ! A cette vitesse de dégénérescence, certains auteurs prévoient que le chromosome Y perdra son dernier gène dans moins de 10 MA et disparaîtra (Marshall Graves, 2002a, 2004). Les mâles vont alors disparaître et l’espèce humaine s’éteindre ? Pas si sûr… En effet, au sein des mammifères, il existe deux espèces de rongeurs Ellobius lutescens et Tokudaia osimensis qui ont indépendamment perdu leur chromosome Y (mâles et femelles ayant un seul chromosome X). De surcroît, la recherche dans leur génome du gène Sry, qui initie le développement des testicules et donc du sexe mâle chez les mammifères (Sinclair et al., 1990), s’est révélée infructueuse (Soullier et al., 1998 ; Just et al., 1995). Ainsi, ces rongeurs ont vraisemblablement acquis un nouveau déterminisme du sexe sans passer par une crise d’identité sexuelle, probablement grâce à un gène ayant remplacé la fonction de Sry.

17 B. Inactivation du chromosome X.

Les femelles de mammifères possèdent deux copies du chromosome X, alors que les mâles n’en ont qu’une seule. Le déséquilibre de dosage des produits des gènes liés à l’X qui devrait en résulter est compensé par l’inactivation d’un des deux chromosomes X chez la femelle (phénomène appelé compensation de dosage). Ainsi, une seule copie active de la majorité des 1438 gènes portés par le X est présente dans les cellules somatiques femelles (comme chez le mâle). L’inactivation se met en place très tôt au cours du développement de l’embryon femelle. Une fois établi, cet état inactif est stable et hérité de façon clonale au cours des divisions des cellules somatiques. Dès le stade 4-cellules de l’embryon, le X paternel est préférentiellement inactivé (empreinte paternelle) dans les cellules qui donneront les tissus extra-embryonnaires, puis il est réactivé. Vers le 5ème jour après fécondation, au moment de l’implantation du blastocyte dans l’utérus, l’inactivation à proprement parler se met en place et est aléatoire entre le X paternel et maternel (pour plus de détails, voir par exemple Goto & Monk, 1998 ; Vasques et al., 2002 ; Migeon, 2002 ; Chaumeil & Heard, 2004). Le chromosome X est extrêmement conservé car une modification affecterait probablement le processus d’inactivation du X (Ohno, 1967 ; Marshall Graves, 2002a). La mise en place de l’inactivation est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux processus et qui reste encore aujourd’hui très mystérieux. Elle est contrôlée par un locus unique appelé centre d’inactivation du chromosome X (Xic). Le Xic contient plusieurs éléments génétiques qui permettent de compter et de choisir le nombre de chromosomes X à inactiver (ou à garder actif) (Heard et al., 1997). Le Xic produit également le signal qui permet la propagation en cis de l’inactivation. L’élément central de cette fonction est le gène Xist qui produit, à partir du chromosome X choisi pour être inactivé, un ARN Xist. Cet ARN vient recouvrir la quasi-totalité du chromosome et déclencher une cascade d’évènements dont le plus important est la méthylation des histones, aboutissant à la « mort transcriptionnelle » du chromosome. En effet, la méthylation, entre autres, induit une modification de la structure du chromosome, passant d’un état euchromatique actif à un état hétérochromatique inactif (voir numéro spécial de Cytogenetics & Genome Research vol. 99(1), 2002). Le gène Xist du X actif est quant à lui progressivement réprimé. Malgré le rôle indiscutable de l’ARN Xist dans l’initiation de l’inactivation, son mode d’action reste encore inconnu. Plusieurs études ont montré récemment que les éléments répétés LINE-1 pourraient être impliqués dans la

18 Introduction : Le modèle biologique propagation de l’inactivation le long du chromosome X, en tant que médiateurs ou propulseurs (Bailey et al., 2000 ; Parish et al., 2002 ; Hansen, 2003). Certains gènes, 15% environ, échappent à l’inactivation. La plupart de ces gènes possèdent un homologue sur le chromosome Y, les deux copies du X doivent donc être actives pour fonctionner correctement. En revanche d’autres n’ont pas de copie homologue sur le Y et échappent pourtant à l’inactivation par un processus encore inconnu (Disteche, 1995 ; Disteche et al., 2002 ; Brown & Greally, 2003 ; Carrel & Willard, 2005). Une étude récente a montré que ces gènes étaient inactivés ou non aléatoirement, et étaient donc associés à une importante hétérogénéité d’expression (une ou deux doses) aussi bien inter- (généralement comparaison homme-souris) que intra-spécifique (Carrel & Willard, 2005). L’inactivation du X est un mécanisme unique, puisqu’il met en jeu une répression transcriptionnelle à l’échelle d’un chromosome entier (un des cas les plus frappants de régulation de l’activité des gènes), et qu’il implique le traitement différentiel de deux chromosomes homologues au sein d’un même noyau. Ce processus a été identifié pour la première fois par Lyon en 1961. Depuis, deux autres mécanismes comparables de compensation de dosage ont été décrits de la nature. Chez la Drosophile, l’unique X porté par les mâles a un niveau de transcription deux fois supérieur à ceux des deux X de la femelle, et à l’inverse, chez Caenorhabditis elegans, l’expression des gènes du X des hermaphrodites (XX) est deux fois inférieur comparé aux mâles (XO) (dans Huynh & Lee, 2005).

C. Remaniements impliquant les chromosomes sexuels. a) Chromosomes sexuels asynaptiques. Les trois grands ordres de Mammifères ont acquis indépendamment des mécanismes différents pour palier aux problèmes inhérents à la disjonction méiotique des chromosomes sexuels. Chez les placentaires (Euthériens), on l’a vu, les chromosomes sexuels ont évolué « indépendamment » à la suite de l’arrêt de la recombinaison sur la quasi-totalité du X et du Y, à l’exception d’une toute petite partie appelée Région Pseudo-Autosomale, ou PAR. A la méiose, cette région homologue entre le X et le Y forme une synapse (appariement) et recombine intensément puisque la formation d’un chiasma est nécessaire pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes sexuels dans les gamètes, chacun se dirigeant vers un pôle de la cellule germinale à l’anaphase I (comme pour les bivalents autosomaux).

19 Chez les Métathériens, Toder et al. (1997) ont montré chez le Wallaby Tammar, Macropus eugenii, que le bras long du chromosome Y partageait en commun des séquences répétées avec le bras court du X. Toutefois, ces séquences ne jouent pas le rôle de PAR puisqu’aucun chiasma n’est observé entre les chromosomes sexuels des marsupiaux (Sharp, 1982). En revanche, les chromosomes X et Y sont associés par une de leurs extrémités (association « end-to-end », ce qui signifie qu’ils sont associés mais ne forment pas de synapse) et rattachés à une structure basale plate (Page et al., 2003, 2005), assurant ainsi une ségrégation correcte des chromosomes sexuels à la méiose. Enfin, les Monotrèmes sont uniques parmi les vertébrés puisque le génome des mâles comprend plusieurs chromosomes n’ayant pas d’homologues et formant une chaîne de chromosomes à la métaphase I de la méiose (9 éléments chez les échidnés, et 10 chez l’ornithorynque ; Watson et al., 1992 ; Rens et al., 2004 ; Grützner et al., 2004). Une étude récente a montré par que la chaîne méiotique de l’ornithorynque était en fait constituée de cinq chromosomes X et cinq Y (X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5, la femelle ayant dix chromosomes X formant cinq bivalents). Cette chaîne se serait mise en place par une succession d’événements rares impliquant des translocations non-réciproques ou des fusions Rb avec homologie monobrachiale entre chromosomes sexuels et autosomes (Rens et al., 2004 ; Grützner et al., 2004 ; Grützner & Marshall Graves, 2004 ; Ashley, 2005).

Au sein des Euthériens, le mécanisme décrit précédemment est très conservé, mais implique une PAR relativement variable. En effet, la PAR de l’homme a une taille de 2.6 Mb et contient 13 gènes, plus la région 5’ d’un quatorzième (XGA) à cheval entre la PAR et la zone X spécifique (revue dans Waters, 2002). Chez la souris par contre, la PAR (~700 Kb ; Perry et al., 2001) ne contient qu’un seul gène, Sts (Salido et al., 1996), un second (Fxy) étant lui aussi tronqué entre la PAR et la région non-recombinante du Y (e.g. Montoya-Burgos et al., 2003). Les gènes de la PAR de l’homme PGPL, DHRSXY, CSF2RA et IL3RA sont autosomaux chez la souris, tandis que les autres n’ont pas d’orthologues dans le génome du rongeur (revue dans Waters, 2002). Ceci suggère que le contenu génique de la PAR des Euthériens n’est pas crucial pour sa fonction. D’autant plus qu’il y a des évidences selon lesquelles la PAR ancestrale des Euthériens était plus large que la PAR humaine actuelle. Il y a donc eu au cours de l’évolution une érosion de la PAR, liée à l’expansion de l’arrêt de la recombinaison le long des chromosomes sexuels. En effet, la PAR des carnivores, cétartiodactyles et même de certains primates, contient des gènes homologues à ceux de l’homme, situés chez ce dernier dans la région X spécifique proximale à la PAR. Ces gènes

20 Introduction : Le modèle biologique représentent probablement une PAR ancestrale commune avant la radiation des Euthériens il y a 80 MA. Cette PAR ancestrale devait comprendre également les gènes ZFX/Y et AMELX/Y localisés près de la PAR actuelle de l’homme et qui possèdent une copie X et une copie Y qui n’ont pas encore eu le temps de diverger l’une de l’autre (revue dans Waters, 2002). Enfin, il est important de noter la présence chez l’homme d’une deuxième région pseudo-autosomale, PAR2, localisée à l’extrémité Xq et Yq (Freije et al., 1992). PAR2 est le résultat récent d’un échange illégitime entre le X et le Y ; elle contient quatre gènes et forme occasionnellement une synapse à la méiose. Des études ont montré chez l’homme et la souris que la délétion de la PAR entraînait une absence d’appariement entre le X et le Y conduisant à un arrêt de la méiose et donc une stérilité complète (e.g. Mohandas et al., 1992 ; Burgoyne et al., 1992). Ainsi, malgré la variabilité de la PAR chez les placentaires, elle semble nécessaire au bon fonctionnement de la méiose. Pourtant certains rongeurs ne semblent pas avoir de PAR et leurs chromosomes sexuels ne forment pas de chiasma (Ashley & Fredga, 1994). Au sein des Euthériens, il existe au moins cinq types de comportements méiotiques des chromosomes sexuels, quatre d’entre eux ne s’observant que chez quelques espèces de rongeurs :

(i) Chez la très grande majorité des mammifères Euthériens, les chromosomes X et Y forment une synapse à la méiose et recombinent (formation de chiasma) au sein de la PAR. (ii) Le X et le Y de Lemniscomys barbarus forment un chiasma dans la PAR, mais s’apparient aussi dans les régions hétérochromatiques riches en cistrons ribosomaux, ces derniers pouvant être impliqués dans les processus d’appariement et de recombinaison comme chez la drosophile (Stitou et al., 2000). (iii) Les chromosomes sexuels peuvent s’apparier sur toute leur longueur, sans qu’il y ait échange de matériel entre le X et le Y (exemple chez certains rats ; Nanda & Raman, 1981). (iv) Les chromosomes sexuels sont asynaptiques (pas de chiasma), mais présentent une association « end-to-end » pour assurer une bonne disjonction et ségrégation des chromosomes dans les gamètes (exemple chez Psammomys obesus ; Solari & Ashley, 1977 ; Ashley & Moses, 1980). (v) Enfin, chez quelques espèces, il n’y a pas d’association ou de contact physique entre le X et le Y sans qu’il y ait pour autant une augmentation de l’aneuploïdie

21 (gerbilles – Ratomponirina et al., 1989 ; et les campagnols – e.g. Borodin et al., 1995 ; Megias-Nogales et al., 2003).

Ainsi, en l’absence de chiasma, des mécanismes alternatifs ont dû se mettre en place pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes sexuels. Certains auteurs ont proposé plusieurs hypothèses qui restent à vérifier. Les substituts au chiasma pourraient être l’association terminale des chromosomes sexuels par des fragments de l’enveloppe nucléaire, l’existence de fibrilles joignant les deux chromosomes ou encore la formation de la vésicule sexuelle qui maintiendrait associés les chromosomes X et Y (Carnero et al., 1991 ; Jimenez et al., 1991 ; Stitou et al., 2000 ; Megias-Nogales et al., 2003). b) Translocations chromosome sexuel-autosome Les translocations chromosome sexuel-autosome (translocations sexe-autosome*) sont un des remaniements les plus rares chez les mammifères car très délétères (revues dans King, 1993 ; Ashley, 2002, 2005 ; Dobigny et al., 2004). En effet, alors que la plupart des fusions entre autosomes sont généralement associées à un faible coût sur la fertilité (Capanna, 1982), les fusions sexe-autosome génèrent de graves perturbations de la gamétogenèse, ce qui les fait considérer comme un mécanisme d’isolement reproductif conséquent. D’une part, à l’instar des autres remaniements chromosomiques, elles peuvent être source de malségrégation et/ou de mort des lignées germinales lors de la gamétogenèse. D’autre part, s’ajoutent les difficultés inhérentes au phénomène d’inactivation du X, tels que la propagation de l’inactivation sur la partie autosomale (ou inversement réactivation de X), et/ou conflits entre les compartiments sexuel et autosomal dû à des patterns de réplication différents (réplication précoce pour les autosomes et le X activé, et tardive pour le X inactivé) ou à l’intrusion de matériel autosomal dans la vésicule sexuelle entraînant des interférences de l’inactivation. Ceci a pour conséquences l’interruption de l’expression des gènes portés par l’autosome transloqué (gènes devenus silencieux si inactivés) et d’importantes perturbations du processus d’inactivation et/ou du mécanisme de déterminisme du sexe (si réactivation du X et/ou réplication défectueuse) (e.g. King, 1993 ; White et al., 1998 ; Ashley, 2002, 2005 ; Dobigny et al., 2004).

* Le terme « translocation » rassemble ici tous les événements d’échange de matériel chromosomique entre les chromosomes sexuels et les autosomes ; cela peut être des fusions Rb, en tandem ou des translocations à proprement parler.

22 Introduction : Le modèle biologique

La littérature médicale rapporte de nombreux cas cliniques qui corroborent ces résultats. Chez l’homme, les translocations Y-autosome engendrent généralement une stérilité complète du patient (azoospermie; e.g. Matsuda et al., 1989 ; Delobel et al., 1998 ; Lee et al., 2003) ; les translocations X-autosomes provoquent généralement les mêmes effets, mais sont aussi associées à d’autres symptômes plus graves, tels que des retards de croissance, malformations congénitales, perturbations du cycle hormonal, déficiences mentales, hémophilies, dystrophies de Duchenne, neurofibromatoses, etc. (e.g. Bodrug et al., 1991; Schroder et al., 1998; White et al., 1998 ; Kalz-Fuller et al., 1999; Waters et al., 2001a; Prueitt et al., 2002 ; Bovie et al., 2003; Fritz et al., 2005). Chez les autres espèces qui bénéficient d’un suivi génétique, c’est-à-dire les cheptels et les animaux de laboratoire, des pathologies à la suite de translocations sexe-autosome ont également été détectées : par exemple, azoospermie chez le taureau (Iannuzzi et al., 2001) ou diminution du nombre de spermatozoïdes efficaces, augmentation très importante de la fréquence de descendants aneuploïdes, voire stérilité totale chez des souches de souris porteuses d’une fusion Rb sexe- autosome (Adler et al., 1989 ; Tease & Fisher, 1991, 1993). Pourtant, les translocations sexe-autosome sont apparues et se sont fixées indépendamment au cours de l’évolution dans plusieurs lignées de mammifères, suggérant par voie de conséquence, que les effets délétères ont pu être réduits voire surmontés, et que notamment l’activité génétique du fragment autosomal transloqué a pu être préservée de l’inactivation du X. Nous avons aujourd’hui une vision assez précise de la diversité chromosomique actuelle des mammifères, sur les milliers de remaniements chromosomiques détectés (à l’exception des cas pathologiques), une quarantaine seulement concerne des translocations sexe-autosome, et sont répertoriées ci-dessous.

Monotrèmes Comme vu précédemment, l’ornithorynque et les deux espèces d’échidnés ont un génome à leur image : unique et bizarre. A la méiose mâle, une chaîne de 10 chromosomes chez l’ornithorynque et de 9 chez les échidnés se forme issue de translocations entre les chromosomes sexuels et les autosomes (Rens et al., 2004 ; Grutzner et al., 2004 ; Grutzner & Marshall Graves, 2004).

23 Marsupiaux D’après la littérature, au moins trois espèces de marsupiaux ont un système XX /

XY1Y2 suite à une fusion X-autosome : Wallabia bicolor, Potorous tridactylus et Macrotis lagotis (in White, 1973 ; Sharp, 1982 ; Toder et al., 1997 ; Ashley, 2002). Une quatrième espèce Lagorchestes conspicillatus se distingue par les fusions d’une paire d’autosomes sur le X et Y et une fusion supplémentaire entre un autre autosome et le chromosome Y (in White, 1973).

Xénarthres A ma connaissance, le paresseux à deux doigts, Choloepus hoffmanni, est la seule espèce de xénarthres à posséder une fusion Rb Y-autosome ; en outre cette espèce présente également un déterminisme du sexe particulier puisque les femelles n’ont qu’un seul chromosome X (Corin-Frédéric, 1969).

Cétartiodactyles Chez les Bovidae, au sein de la sous-famille des Bovinae, le nigault, Boselaphus tragocamelus, possède les fusions Rb(X.14) et Rb(Y.14) et l’élan du Cap, Taurotragus oryx, la Rb(Y.13) (Gallagher et al., 1998, 1999). En revanche, Ianuzzi et al. (2001) ont rapporté un cas d’azoospermie chez un taureau Bos taurus suite à la fusion Rb(Y.9). Chez les Antilopinae, la fusion Rb(X.5) caractérise les genres Gazella et Antilope, tandis que Rb(Y.16) est propre aux espèces Gazella rufifrons, G. thomsoni, G. soemmerringi et G. dama révélant ainsi une signature cladistique forte (Vassart et al., 1995). Dans la famille des Cervidae, le cerf élaphode, Elaphodus cephalophus possède une fusion Rb X-autosome (Shi et al., 1991) et une lignée de cerfs muntjacs (Muntiacus sp.) se caractérise par une forte réduction du nombre diploïde notamment par fusions en tandem et qui ont impliqué le chromosome X (Yang et al., 1997 ; Wang & Lan, 2000).

Carnivores Au moins sept espèces de mangoustes du genre Herpestes (Fredga, 1972) et Atilax paludinosus (Pathak & Stock, 1976) ont acquis un système dérivé X1X1X2X2 / X1X2Y suite à la fusion Rb du Y et d’un autosome.

24 Introduction : Le modèle biologique

Chiroptères De nombreux genres de chauve-souris néo-tropicales de la famille des Phyllostomidae possèdent des fusions Rb sexe-autosome : Carollia, Artibeus, Choeroniscus, Chiroderma, Sturnira, Vampyressa, Vampyrops et Mesophylla (e.g. Baker & Hsu, 1970 ; White, 1973 ; Baker et al., 1979 ; Kasahara & Dutrillaux, 1983 ; Tucker, 1986 ; Tucker & Bickham, 1986, 1989 ; Solari & Pigozzi, 1994 ; Rodrigues Norhonha et al., 2001). La plupart ont un système

XX / XY1Y2, qui d’après White (1973) est apparu au moins deux fois indépendamment. De même, certains représentants de ces genres ont acquis au moins à deux reprises au cours de l’évolution un système néo- XX / XY suite à la fusion du Y1 avec le Y2 (Tucker, 1986). Enfin,

Mesophylla macconnelli présente un système sexuel différent, X1X1X2X2 / X1X2Y, suite à la fusion du Y avec un autosome (Baker & Hsu, 1970). Aussi, il est important de noter que dans le genre Carollia où les quatre espèces ont le même système dérivé XX / XY1Y2, il existe une population de C. castanea du Pérou où la fusion X-autosome est absente, suggérant un événement de réversion (i.e. fission Rb sexe- autosome) (Tucker & Bickham, 1989).

Eulipotyphla (anciens « Insectivores ») Seules les quatre espèces de musaraignes du complexe Sorex araneus-arcticus présentent un système de chromosome sexuel XX / XY1Y2 suite à la fusion Rb du X et d’un autosome (Volobouev, 1989).

Primates Le génome des primates semble avoir une certaine propension à accepter les translocations Y-autosome, en particulier dans le sous-ordre des Platyrrhiniens (primates du Nouveau Monde) où de tels événements sont apparus et se sont fixés plusieurs fois indépendamment au cours de l’évolution. Ainsi, Cacajao calvus et Callimico goeldii possèdent respectivement la translocation Y-chromosome 10 (Y-10), et Y-23 (Dutrillaux et al., 1981, 1988). Au sein du genre Aotus, les comparaisons sont difficiles du fait des changements dans la nomenclature des chromosomes mais aussi des espèces (d’une seule espèce dans les années 70, aujourd’hui la taxonomie en recense une dizaine) ; cependant il en ressort qu’au moins deux translocations Y-14 et Y-17 sont apparues dans ce genre (Ma et al., 1976, 1980, 1989 ; Ma, 1981 ; Torres et al., 1998 ; Ruiz-Herrera et al., 2005). De même, bien que la systématique du genre Alouatta soit également confuse, certaines populations/espèces

X Y A5 A5 X A5 Y+A5 X+A5 Y+A5 A18 A18 X+A5 (Y+A5)+A18 A18 D.t.chionopaes D.t.chionopaes D.t.chionopaes D.t.torquatus (Chaunsk) (Chukotka) (Yakutia) (Oural)

Figure 4 : Evolution des chromosomes sexuels de quatre cytotypes de D.torquatus (d’après Fredga, 1983). A = autosome

26 Introduction : Le modèle biologique ont un système sexuel normal XX / XY, mais la plupart présentent une translocation Y-7 et sont donc de type X1X1X2X2 / X1X2Y, voire X1X1X2X2 / X1X2Y1Y2 à la suite d’une probable translocation réciproque entre le chromosome Y (Y1) et l’autosome nommé Y2 (Ma et al., 1975 ; Lima & Seuanez, 1991 ; Vassart et al., 1996 ; Rahn et al., 1996 ; de Oliviera et al., 1998, 2002 ; Mudry et al., 1998 ; Bonvicino et al., 2001 ; Torres & Ramirez, 2003). En revanche, alors que la diversité spécifique et les traits d’histoire de vie sont comparables, une seule espèce de Catarrhiniens, ou primates de l’Ancien Monde, possède une translocation Y-autosome ; Il s’agit de Presbytis cristatus (Y-5) (Dutrillaux et al., 1984).

Rongeurs Au sein des Sigmodontinae, une seule espèce connue, Deltamys kempi, présente un système sexuel X1X1X2X2 / X1X2Y (Sbalqueiro et al., 1984). Au moins trois espèces d’Arvicolinae ont des translocations sexe-autosome. Thanou et al. (2005) rapportent l’existence d’une population de Microtus thomasi ayant fixée une fusion en tandem impliquant le chromosome X et un autosome. De même, une population de M. mandarinus semble être polymorphe (i.e. réarrangement non fixé) pour une fusion en tandem X-autosome (Wang et al., 2003). Quant au lemming à collier, Dicrostonyx torquatus, il présente une évolution des chromosomes sexuels assez complexe : outre un système de déterminisme du sexe particulier (voir plus loin), cette espèce possède quatre cytotypes, chacun spécifique d’une région de Sibérie (Figure 4). L’un d’entre eux possède des chromosomes sexuels non-fusionnés, un second a une fusion en tandem entre le Y et un autosome de la paire 5, un troisième possède la même fusion Y-5, plus une fusion Rb entre le X et l’autosome 5 homologue, enfin D. t. torquatus possède le caryotype le plus dérivé avec les mêmes fusions associées à une fusion Rb entre le Y et un chromosome 18 (Fredga, 1983, 1988). Au sein des Murinae, trois lignées possèdent des translocations sexe-autosome. Deux d’entre elles sont des genres de gerbilles : Gerbillus, dont au moins neuf espèces ont un système XX / XY1Y2 (Viegas-Pequinot et al., 1982; Volobouev et al., sous presse) et Taterillus, qui a acquis indépendamment un système équivalent. Chez ce dernier une lignée monophylétique comportant sept espèces d’Afrique de l’Ouest se distingue des Taterillus d’Afrique de l’Est par une double translocation sexe-autosome, c’est-à-dire une paire d’autosome fusionnée en tandem au X et Y, tandis que ce dernier est aussi impliqué dans une autre fusion en tandem avec un autre autosome (revue dans Dobigny et al., 2004). Enfin, les

Références

10, 11, 12, 14, 15, 21, 22, 23, 28 2, 3, 8, 11, 12, 19, 20, 22, 23, 27 7 9, 11, 12, 13, 22 19, 20, 22, 23 6, 11, 12, 22 29 1, 12, 25, 26 18 30 30 24 4, 5, 16, 17

F XX / M

, 2001 , 1988

., 1981 ., 2003 ., 1998 Hoekstra ., 1988 ., 2001 F XO / M Bellomo , 2003 F XO / M F XO / M & Edwards, 2000 & ., 1995 et al ., 2002 - ., 1998 et al

et al , 1965 et al et al et al et al. et al et al Soullier Hoekstra Hoekstra Liu Zhu Jotterand Just Just Matthey Sutou Winking F XO / M XY 25: 29: 30: cette thèse F XO / M XY F XO / M XY F XO / M XY 16: 17: 18: 19: 20: 21: 22: Marchal 23: Marshall Graves, 2002 24: 27: Vogel 28: 26:

Systèmes sexuels

atypique

F XX, XO / M XY

F XX, XY / M F XX, XY / M F XX, XY / M F XX, XY / M

Caledon Kuruman (Paresseux) ., 2001 ., 2005 ., 2002 & Dempsey, 2001 ., 1976 ., 1999 ., 1993 ., 1976 ., 1986 et al et al triton et al et al et al et al & Fedorov, 1991 et al , 1988 , 1983 , 2002 et al , 1983 Frédéric, 1969 sp. (9 espèces)

- Fredga Fredga Gileva Gropp Fredga Gileva Baumstark Baumstark Bianchi Bianchi Charlesworth Djalali Arakawa Espèces Choloepus hoffmanni Myopus schisticolor Ellobius tancrei Microtus oregoni Microtus mandarinus Nannomys 2: 3: 4: 5: 6: 7: Corin 8: 9: Fedorov 10: 12: 14: 15: Dicrostonyx torquatus Ellobius lutescens Tokudaia osimensis Nannomys minutoides Nannomys minutoides Acomys selousi Akodon 1: 11: 13: )

Muridae : Liste des espèces de mammifères ayant un déterminisme du sexe

Arvicolinae Murinae Sigmodontinae XENARTHRA Tableau 1 RODENTIA (

28 souris naines africaines, Nannomys, présentent plusieurs translocations sexe-autosome (Matthey, 1966a ; Jotterand-Bellomo, 1986, 1988 ; cette thèse). c) Modifications du déterminisme du sexe Chez l’Homme, comme chez les autres mammifères, le sexe est déterminé par une paire hétéromorphique de chromosomes appelés chromosomes sexuels, les femelles étant XX et les mâles XY. Il s’agit d’un système très conservé, toute variation du nombre de chromosomes sexuels entraînant inévitablement une stérilité totale, comme l’attestent les patients atteints des syndromes de Klinefelter (XXY) ou de Turner (XO). Toutefois, quelques lignées de mammifères échappent à la règle et ont des systèmes sexuels atypiques (Tableau 1). Dans sa revue sur les mécanismes de déterminisme du sexe aberrants, Fredga (1970, 1983) décrivit quatre grands groupes : (i) les espèces ayant un déterminisme XX / XY, mais avec la fusion d’une paire d’autosomes sur le X et le Y, (ii) les espèces avec un déterminisme

XX / XY1Y2 impliquant une fusion X-autosome, (iii) les espèces X1X1X2X2 / X1X2Y (fusion Y-autosome), enfin (iv) les espèces ayant un mécanisme compliqué ou inconnu, s’écartant de

XX / XY. Il est important de noter que dans les trois premiers groupes, les chromosomes X2 et

Y2 correspondent à des autosomes et qu’ils n’interviennent pas dans le déterminisme du sexe per se ; le déterminisme du sexe étant toujours XX / XY, il ne s’agit donc pas d’un déterminisme du sexe aberrant à proprement parler. Ces trois premiers groupes se réfèrent donc au chapitre précédent (Translocations sexe-autosome). Nous nous intéresserons uniquement au quatrième groupe qui comprend au minimum 21 espèces de mammifères dont 9 d’Akodon (Tableau 1 ; liste la plus exhaustive possible). Je n’ai pas pris en compte le rongeur Vandelauria oleracea qui aurait un système X1X1X2 / X1X2Y suite à une fission du chromosome X (Raman & Sharma, 1976) ; mais l’explication n’étant pas satisfaisante et le système paraissant plus compliqué, je préfère l’écarter en l’absence de nouvelles études plus approfondies. De même, ne sont pas pris en compte le rongeur Nesokia indica chez lequel ont été décrites des femelles XY (Kamali, 1975), qui correspondrait en fait à une variation de la distribution et de la quantité d’hétérochromatine sur le chromosome X (Fredga, 1988), ni le singe Aotus sp. du Pérou, abusivement décrit comme ayant un système XX / XO (Ma et al., 1980), alors qu’il s’agit d’une espèce du groupe (iii) avec une translocation Y-autosome. Enfin, sont écartés les individus aberrants issus d’accidents chromosomiques, ceux-ci font l’objet d’une littérature abondante chez l’homme (syndromes de Klinefelter, de Turner, et

` a

soma XY X0

cellules germinales Y0 XX

gamètes Y 0 X X

descendants XY XO XY XO ` a ` a

Figure 5: Déterminisme du sexe et formation des embryons chez Microtus oregoni. Une non-disjonction systématique se produit dans les cellules germinales primordiales du mâle et de la femelle.

30 Introduction : Le modèle biologique autres), mais aussi chez le chien, chat, cochon, cheval, souris et certaines espèces sauvages (revues dans Fredga, 1988 ; Vaiman & Pailhoux, 2000). A titre d’exemple, dans une population de taupe ibérique (Talpa occidentalis), Jimenez et al. (1988) ont rapporté la présence de deux mâles XX et huit hermaphrodites XX sur 54 individus. De même, dans une population de campagnol Microtus cabrerae, la présence de deux femelles XY a été décrite, ces femelles donnant naissance à des mâles XY et des femelles XX et XY (Burgos et al., 1988a). Malheureusement, depuis cette date aucune nouvelle femelle XY n’a été découverte, suggérant qu’une mutation d’un gène du Y (Sry ?) entraînant la réversion de sexe a été définitivement perdue malgré la fertilité de ces individus. Les Monotrèmes (tel l’ornithorynque possédant dix chromosomes sexuels, 5X et 5Y) ne sont pas traités dans ce chapitre car ils correspondent à un cas extrême de translocations entre les chromosomes sexuels XY et les autosomes, et se rapportent donc au groupe (i) définit par Fredga (1970, 1983).

Les systèmes sexuels des espèces appartenant au groupe (iv) sont de deux types : ceux où un des deux chromosomes est absent dans un ou les deux sexes, et ceux où le déterminisme du sexe est réversé, femelles XY ou mâles XX (Tableau 1).

Choloepus hoffmanni Une étude chromosomique sur une dizaine de paresseux à deux doigts (Choloepus hoffmanni) en provenance du Costa Rica, Panama et Equateur, a révélé que le nombre de chromosomes est impair, égal à 49, tant chez les femelles que les mâles. Les femelles sont de type XO et les mâles X1X2Y dû à la translocation du chromosome Y sur un autosome (Corin- Frédéric, 1969). Malgré cette translocation, les mâles n’en sont pas moins de véritables XY, au même titre que les autres mammifères mâles.

Microtus oregoni Ce campagnol a un remarquable système de déterminisme du sexe : mâles et femelles sont des mosaïques gonosomaux (Ohno et al., 1963, 1966 ; revues dans Fredga, 1983 ; Charlesworth & Dempsey, 2001 ; Marchal et al., 2003). Ce qui signifie que les femelles ont des cellules somatiques XO et des cellules germinales XX, tandis que les mâles ont un caryotype XY dans le soma et des cellules germinales YO. Ces changements s’opèrent grâce à un mécanisme de non-disjonction sélective lorsque les cellules primordiales se différencient en oogonies et spermatogonies, respectivement chez la femelle et le mâle. Chez la femelle, les

femelle (XX) femelle (X*X) femelle (X*Y)

double non-disjonction méiotique, seulement X* est transmis dans les ovules. X X X X* X* X*

X X X a a a a a a

Y ` ` Y ` a Y a a

Mâle (XY)

sex-ratio (a:`) = 2 : 2 3 : 1 4 : 0

b. femelle (X*Y) Figure 6: Formation des embryons et sexe-ratio chez les lemmings Myopus schisticolor (a) et Dicrostonyx X* Y torquatus (b). Le schéma est identique entre les deux espèces pour les femelles XX et X*X; en revanche il est différent pour les femelles X*Y suite à une double non- X a `

disjonction qui ne se produit que chez les femelles M. schisticolor, ce qui évite la production d’embryons YY Y a non-viables. Mâle (XY) sex-ratio (a:`) = 2 : 1

32 Introduction : Le modèle biologique cellules germinales OO sont éliminées et seules se maintiennent les XX. Chez le mâle, deux types de spermatogonies sont produits, XXY et YO, mais seuls les derniers se développent en gamètes. Ainsi, les femelles produisent des oocytes X et les mâles des spermatozoïdes Y et O qui forment des zygotes XY (mâle) et XO (femelle) (voir Figure 5). Par ce système, il n’y a pas formation de combinaisons létales et donc de perte d’embryons.

Microtus mandarinus Dans une population de la province de Henan, Chine, près de 43% des femelles de M. mandarinus ont un caryotype XO (Zhu et al., 2003). En outre, le chromosome X est hétéromorphe ; Il existe deux types de X discriminés par leur pattern de bandes -G et -C, et par leur morphologie : métacentrique, noté Xm et sub-métacentrique, noté Xsm. Xsm résulterait de Xm à la suite d’un événement de fission (Zhu et al., 2003). Seuls quatre types de combinaisons des chromosomes sexuels sont observés, mâle XsmY et femelles XmXsm, XsmXsm, XmO, ce qui signifie que les autres sont létales (XmY, XmXm, XsmO). Des études supplémentaires sont nécessaires pour clarifier le système.

Acomys selousi Matthey décrivit en 1965 chez cette espèce un système équivalent à celui mis en place chez Microtus oregoni et Choloepus hoffmanni: les femelles ont un seul X, les mâles étant XY. Malheureusement, à ma connaissance, aucune autre étude n’a tenté de confirmer ces résultats avec des techniques de marquages différentiels des chromosomes (Banding-G ou hybridation in situ fluorescente -FISH-). Cependant, malgré les moyens matériels de l’époque, R. Matthey était un cytogénéticien d’un grand talent et ses observations sont suffisamment circonstanciées.

Myopus schisticolor Le lemming des forêts (M. schisticolor) est le premier mammifère découvert à avoir des femelles fertiles XY (Fredga et al., 1976). De nombreuses études ont analysé différents aspects du déterminisme du sexe chez cette espèce (Gropp et al., 1976 ; Winking et al., 1981 ; Fredga, 1983, 1988 ; Gileva & Fedorov, 1991 ; Liu et al., 1998 ; Marchal et al., 2003). Les femelles sont de trois types, XX, XX* et X*Y, tous les mâles étant XY. L’astérisque (*) désigne une délétion affectant le bras court du chromosome X normal (Xp21- 23) correspondant à 1Mb dans des régions hétérochromatiques et euchromatiques (Liu et al., 1998). Les femelles homozygotes pour cette délétion ne sont pas viables et les individus XY

33 porteurs de cette délétion ne se masculinisent pas. L’hypothèse la plus vraisemblable est qu’un gène encore inconnu présent dans cette partie du génome (Xp21-23) est un des gènes- cibles intervenant dans la cascade de gènes (dont Sry est le précurseur) du développement du sexe mâle. De plus, chaque type de femelles produit des mâles et femelles dans différentes proportions (Figure 6). Le biais le plus important est attribué aux femelles X*Y qui ne produisent que des femelles à cause d’une double non-disjonction méiotique empêchant la formation d’ovules porteurs d’un Y (Fredga, 1983, 1988, voir Figure 6). Cette double non- disjonction peut être vue comme une adaptation évolutive permettant d’éviter une baisse de fertilité des femelles X*Y (évitement de la formation d’embryons YY létaux). Cependant, le mécanisme de non-disjonction n’est pas parfait, et un nombre exceptionnel d’individus aneuploïdes (jusqu’à 3% dans des populations naturelles) est produit : XO, X*XY, X*YY (Gropp et al., 1976 ; Winking et al., 1981).

Dicrostonyx torquatus Le lemming à collier (D. torquatus) a un système de déterminisme du sexe relativement similaire à celui du lemming des forêts (Myopus schisticolor), bien qu’ils soient phylogénétiquement éloignés (Galewski et al., en prep.). En revanche, à l’inverse de Myopus, les deux types de chromosome X de Dicrostonyx ne peuvent pas être discriminés par les méthodes classiques de cytogénétique, et le chromosome Y n’est pas facilement distinguable suite à une série de translocations entre les chromosomes sexuels et les autosomes. Ceci a entraîné une mauvaise interprétation de Gileva (1980) qui caractérisait le système de type XX, XO / XO. Il s’agit en fait d’un système XX, XY / XY (Gileva, 1983 ; Fredga, 1983, 1988 ; Marchal et al., 2003). Il a été postulé par ces auteurs qu’une mutation liée au X (X*) empêchait la formation de mâle en présence du chromosome Y ; les femelles seraient donc XX, XX* ou X*Y et les mâles XY, système qui se rapproche de celui de Myopus schisticolor. Mais contrairement à ce dernier, les femelles X*Y ne subissent pas de double non-disjonction précédant la méiose ; il en résulte la formation d’ovules X* et Y, qui génèrent une diminution de la taille des portées due à la perte des embryons YY (dans Fredga, 1983 ; voir Figure 6). On observe également un biais dans le sexe-ratio en faveur des femelles dans les progénitures des individus XX* et X*Y.

34 Introduction : Le modèle biologique

Akodon sp. Plusieurs espèces du genre Akodon sont connues pour avoir une proportion importante de femelles fertiles XY (Bianchi et al., 1993 ; Hoekstra & Edwards, 2000 ; Bianchi, 2002). Au moins neuf espèces sur 25 possèdent des femelles XY dans des proportions variant de 10 à 66% de l’ensemble des femelles d’une population. En revanche, aucune femelle XY n’a jamais été identifiée parmi les centaines analysées de A. azarae et A. varius (Bianchi, 2002). Hoekstra & Edwards (2000) ont montré par une analyse phylogénétique et chromosomique que ce système sexuel était apparu au moins six fois indépendamment dans la lignée des Akodon. Les femelles XY ont ¾ de leur descendance viable (mâle XY, femelles XX et XY) et ¼ non-viable (YY), comme dans le cas de Dicrostonyx torquatus (voir Figure 6). Le développement d’ovaires fonctionnels chez certains individus XY n’est a priori pas dû à une délétion du gène Sry, ni à une mutation sur la séquence de ce gène (Bianchi et al., 1993). Ces auteurs émettent l’hypothèse qu’une homozygotie pour une mutation récessive autosomale ou pseudoautosomale inhiberait l’expression de Sry (Bianchi, 2002).

Ellobius lutescens Mâles et femelles d’Ellobius lustescens ont un caryotype similaire : les deux sexes ont un seul X (2n = 17, XO) (Matthey, 1953 ; revues dans Just et al., 1995, 2002). Dès les années 50, plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer un tel système (revue dans Fredga, 1983), les plus vraisemblables étant la translocation du facteur déterminant le sexe mâle sur le chromosome X unique. La recherche de Sry dans le génome d’E. lutescens s’est révélée infructueuse (Just et al., 1995). Ainsi, E. lutescens a vraisemblablement acquis un nouveau déterminisme du sexe qu’il reste à identifier, probablement grâce à un gène ayant remplacé la fonction de Sry. Il a été montré que des événements de mutation ou de duplication du gène SOX9 pouvaient induire une différentiation des testicules en l’absence de Sry (cas des mâles XX chez l’homme ou la souris ; revue dans Canning & Lovell-Badge, 2002 ; Knower et al., 2003). Ce gène était donc un bon candidat pour remplacer la fonction de Sry, mais a été écarté par Baumstark et al. (2001). A la suite, plusieurs autres gènes impliqués dans la cascade de processus du déterminisme du sexe des mammifères tels Zfy, Dmrt1, Nr5a1, Pisrt1, Foxl2 ont été testés, mais sans succès (Just et al., 2002 ; Baumstark et al., 2005). Le déterminisme du sexe de cette espèce est toujours inconnu. De plus, l’existence d’un tel système de détermination du sexe pose un autre problème : celui de l’implication d’un énorme coût à la reproduction (Figure 7), puisque 50% des embryons sont létaux et éliminés ! Ainsi, outre les problèmes de régulation, expression génique, etc…, ce système devrait être contre-sélectionné. Ce coût pourrait toutefois être réduit ou compensé par un plus fort investissement reproductif. En effet, il a été montré que

Femelle (XO)

X 0

X ☺

0 ☺

Mâle (XO)

Figure 7: Formation des embryons de Ellobius lutescens. Sans distorsion de la ségrégation, la moitié des embryons sont non-viables.

36 Introduction : Le modèle biologique

E. lutescens produisait un large excès d’ovules : le nombre moyen de corps jaunes étant 12.9 ± 1.67 et le nombre d’embryons 4.8 ± 0.38 (dans Fredga, 1983).

Ellobius tancrei Dans le genre Ellobius, une autre espèce, E. tancrei, a également un déterminisme du sexe étrange : mâles et femelles ont aussi le même caryotype, mais cette fois ils possèdent deux chromosomes X (2n = 34-54, XX), alors qu’une troisième espèce, E. fuscolapillus, a un déterminisme sexuel normal XX / XY (Just et al., 1995, 2002). Là encore, le gène Sry est absent du génome (Just et al., 1995). Ainsi, il est raisonnable de penser que les bases génétiques des deux systèmes sexuels rencontrés chez ces deux espèces-sœurs d’Ellobius (XO / XO et XX / XX) sont communes, s’étant mises en place à la suite de la perte du chromosome Y.

Tokudaia osimensis Le rat épineux des îles Ryukyu est confiné à trois petites îles isolées du Sud du Japon, chacune abritant une espèce/sous-espèce, deux d’entre-elles ayant un déterminisme du sexe XO / XO, alors que la troisième possède un système sexuel normal, XX / XY (Soullier et al., 1998 ; Sutou et al., 2001 ; Arakawa et al., 2002). Comme pour le genre Ellobius, le gène Sry a été perdu au cours de l’évolution (Soullier et al., 1998) ; en revanche deux gènes spécifiques du chromosome Y (Tspy et Zfy) ont quant à eux été transloqués sur la partie distale du chromosome X (Arakawa et al., 2002).

Mus (Nannomys) triton Jotterand-Bellomo (1988) a rapporté un troisième cas de déterminisme du sexe XO / XO chez Nannomys triton du Burundi. Mâles et femelles ne possèdent qu’un seul chromosome X (délétion du second X et du Y) qui, en outre, fusionne avec un autosome de la paire 12. D’autres déterminismes du sexe singuliers rencontrés lors de ma thèse au sein des Nannomys seront traités dans la partie Discussion : Déterminisme du sexe.

Il est important de noter qu’à l’exception du paresseux à deux doigts (Choloepus hoffmanni), toutes les autres espèces ayant un système de déterminisme du sexe atypique sont des rongeurs de la famille des Muridae. Il est vrai que cette famille renferme à elle-seule près de 30% de la diversité spécifique mammalienne décrite ; cependant ces 20 espèces de

37 Muridae n’appartiennent qu’à huit genres répartis dans trois sous-familles seulement (Arvicolinae, Murinae, Sigmodontinae). Ceci suggère que certaines lignées de mammifères et notamment de rongeurs aient acquis des caractères génomiques ou des traits d’histoire de vie spécifiques, les autorisant à évoluer vers de nouveaux systèmes sexuels. En effet : - Les rongeurs tolèrent relativement bien les accidents chromosomiques impliquant les chromosomes sexuels (Fredga, 1983, 1988). Alors que les monosomies et trisomies autosomales sont toutes létales chez la souris domestique, les femelles XO, XY et les mâles XYY, XYYY sont viables et parfois même fertiles (e.g. Turner et al., 2000 ; Rodriguez & Burgoyne, 2001 ; Burgoyne et al., 2002). - L’écologie et la biologie reproductive de la plupart des rongeurs favorisent la fixation de remaniements chromosomiques. Les rongeurs ont un taux de reproduction très élevé, un temps de génération très bref, et un comportement social favorisant la consanguinité et la dérive génétique (e.g. Nachman & Searle, 1995). - Les chromosomes sexuels de ces rongeurs ont, semble-t-il, une certaine propension à subir des changements structuraux (e.g. chromosomes sexuels géants des campagnols Microtus par addition d’hétérochromatine ; Burgos et al., 1988b ; Marchal et al., 2004), des translocations X-autosomes (e.g. chez les Nannomys ; Veyrunes et al., 2004) ou des mutations (e.g. délétion Xp21-23 chez Myopus schisticolor ; Liu et al., 1998). - Enfin, certains de ces rongeurs ont mis en place une plus forte capacité reproductive ou dans d’autres cas une distorsion méiotique de la ségrégation des gamètes pour réduire les coûts engendrés par une perte systématique d’embryons (e.g. Charlesworth & Dempsey, 2001 ; Bianchi, 2002).

3. PRESENTATION DU MODELE BIOLOGIQUE NANNOMYS

Les souris naines africaines appartiennent au sous-genre Nannomys, anciennement appelé Leggada (e.g. Matthey, 1966a ; Meester et al., 1986), et sont incluses dans le genre Mus avec trois autres sous-genres (Coelomys, Pyromys et Mus sensu stricto ; e.g. Marshall, 1981 ; Musser & Carleton, 1993). Elles n’ont fait l’objet que de rares études systématiques et chromosomiques réalisées majoritairement dans les années 60 et 70, alors qu’elles apparaissent pourtant comme un modèle biologique unique. Il s’agit d’un complexe d’espèces

38 Introduction : Le modèle biologique jumelles remarquable par sa diversité spécifique, probablement encore largement sous- estimée, mais surtout par sa diversité chromosomique. Les modèles de spéciation chromosomique suggèrent qu’il pourrait y avoir un lien de cause à effet entre ces deux phénomènes. Mais surtout, plus extraordinaire encore, cette diversité chromosomique implique notamment les chromosomes sexuels. En effet, alors que les chromosomes sexuels correspondent à la partie du génome de loin la plus conservée chez les mammifères (contenu génétique très conservé -en particulier du X- et remaniements chromosomiques rares) (e.g. Ohno, 1967 ; Graves et al., 2002), les Nannomys présentent trois types de remaniements chromosomiques normalement extrêmement rares chez les mammifères : (i) la nature asynaptique des chromosomes sexuels à la méiose, (ii) l’apparition mutiple de translocations sexe-autosomes, associées parfois à (iii) des délétions partielles voire totales des chromosomes sexuels. Ainsi, cette accumulation de réarrangements rares et délétères impliquant les chromosomes sexuels offre une opportunité unique de rechercher les bases moléculaires de leur apparition et les conséquences évolutives sur la spéciation et les mécanismes de déterminisme du sexe. De plus, ce modèle a un autre avantage, il est très proche de la souris domestique (inclus dans le même genre) pour laquelle le génome complet est disponible (Waterston et al., 2002) et bénéficie ainsi de comparaisons directes et d’une abondante quantité de données moléculaires et génomiques.

A. Etat des connaissances

Les souris naines africaines (Figure 8) sont un groupe de rongeurs de très petite taille (de 3,5g* à 12g) appartenant à la famille des Muridae, sous-famille Murinae, répandus dans toute l'Afrique sub-saharienne. Elles occupent une large gamme d’habitats, du désert du Kalahari (Mus indutus) aux forêts pluviales du grand Rift à plus de 2500m d’altitude (Mus bufo; Kasangaki et al., 2003) en passant par des milieux anthropisés (villages et cultures). Mais la majorité des espèces préfèrent les savanes et steppes herbeuses plus ou moins arborées (Genest-Villard, 1973). Les Nannomys constituent un complexe d’espèces morphologiquement très similaires (Petter, 1963, 1981 ; Macholan, 2001), ce qui a entraîné la description (et la confusion) de 5 à 30 espèces selon les auteurs (voir Marshall, 1981). Plus récemment, Musser & Carleton (1993) ont reconnu 19 espèces mais d’après ces mêmes auteurs, le statut de certaines d’entre

* dont Mus minutoides, le plus petit mammifère africain qui peut parfois même devenir la proie de mante-religieuses (vu à la TV ! dans un reportage animalier).

Figure 8: Mus mattheyi (photos: Johan Michaux). La coque de cacahuète de la photo du bas donne l’échelle.

40 Introduction : Le modèle biologique elles mériterait d’être confirmé par des marqueurs chromosomiques et/ou moléculaires en raison du faible pouvoir diagnostic des caractères morphologiques et l’existence a priori d’espèces cryptiques (Tableau 2). En effet, dans la littérature, nombreux spécimens sont décrits comme Mus sp. ou assignés à des complexes d’espèces, tels Mus minutoides/musculoides (e.g. Matthey, 1966a ; Jotterand-Bellomo, 1986 ; Aniskin et al., 1998 ; Castiglia et al., 2002). Contrastant de façon étonnante avec l’homogénéité morphologique, des études cytogénétiques ont montré une extraordinaire diversité chromosomique. A partir des années 60, les travaux pionniers de Matthey et Jotterand sur la cytogénétique des mammifères et notamment des Murinae africains, ont apporté beaucoup d’éléments nouveaux à la connaissance des Nannomys (Matthey, 1966a, 1966b, 1966c, 1967, 1970a, 1970b ; Jotterand, 1970, 1972, 1975). Ces travaux ont mis en évidence une véritable radiation chromosomique dans le sous-genre. La poursuite de ces travaux par les techniques de marquage chromosomique permettant d’identifier individuellement les chromosomes, ont largement confirmé les études précédentes (Jotterand-Bellomo, 1984, 1986, 1988 ; Aniskin et al., 1998 ; Castiglia et al., 2002). Ainsi, le nombre diploïde (2n) varie de 16 à 36 chromosomes et le nombre fondamental de 30 à 38 selon les espèces. A partir d’un caryotype ancestral à 36 chromosomes acrocentriques (2n = 36 ; NF = 36), la différenciation chromosomique se serait effectuée majoritairement par fixation de remaniements de type fusion centrique, appelée aussi fusion Robertsonnienne -Rb-. Par ailleurs, de façon plus inattendue, plusieurs de ces mutations concernent les chromosomes sexuels, et sont appelées translocations sexe-autosome (Matthey, 1966a, Jotterand, 1972, 1975 ; voir aussi Annexe 1 : Veyrunes & Happold, sous presse). En effet, les chromosomes X et Y sont fusionnés à la paire 1 chez Mus minutoides, à la paire 15 chez M. oubanguii et le chromosome X est fusionné à la paire 12 chez M. triton (Jotterand-Bellomo, 1986, 1988). Le nombre de translocations sexe-autosome observé chez les Nannomys contraste avec leur rareté habituelle chez les mammifères due à leur effet fortement délétère (King, 1993 ; Dobigny et al., 2004). En outre, elles sont souvent associées dans ce groupe à des délétions partielles voire totales des chromosomes sexuels. En effet, sur 21 femelles de Mus triton capturées en République Démocratique du Congo, la moitié ont un X métacentrique normal, tandis que le second X présente une délétion totale du bras court, l’autre moitié des femelles ayant deux X normaux. Aucune femelle n’a été trouvée homozygote pour le X délété, ni même aucun mâle (n=18) porteur d’un tel chromosome X (Matthey, 1967). Si ces deux combinaisons sont létales, comment concevoir le maintien dans de telles proportions du chromosome X délété dans la population ? D’autant plus que Matthey (1970b) retrouve un système équivalent (délétion

Tableau 2: Liste des espèces de Nannomys indiquant leur distribution géographique succincte et leur caryotype (lorqu'il est connu). Espèce Distribution succincte Réf. 2n NF PR/TR Réf. baoulei de Guinée au Togo a, b bufo endémique des montagnes du rift a 36 36 PR e, f callewaerti Zaïre, Angola a goundae République Centre Africaine a 16-19 30 TR g haussa du Sénégal au Tchad a, c, d 28-34 38 PR h indutus d'Afrique du Sud au Zimbabwe et à l'Angola a, d 36 36 PR e, h kasaicus Zaïre a mahomet Ethiopie, Ouganda, Kenya a 36 36 PR i mattheyi du Sénégal au Niger et au Togo d 36 36 PR e, h, j minutoides* d'Afrique du Sud à la Guinée et au Kenya d 18-36 36 TR e, h, j musculoides Afrique de l'Ouest, au moins Mali a, d 18-19 36 TR h naevei d'Afrique du Sud à la Tanzanie a orangiae Afrique du Sud a oubanguii République Centre Africaine a 28 36 TR j setulosus du Sénégal au Gabon et au Kenya a 36 36 PR e, j setzeri Namibie, Botswana, Zambie a sorella du Cameroun au Kenya a tenellus du Soudan à la Tanzanie a triton* Afrique de l'Est a 20-32 32-34 TR e, f Les espèces soulignées ne sont connues que de la localité type, celles suivies d'une astérisque représentent à coup sûr un complexe de plusieurs espèces cryptiques. Réf = références; 2n = nombre diploïde; NF = nombre fondamental; PR/TR se rapporte à la morphologie des chromosomes sexuels: PR = primitif = acrocentrique, TR = transloqué = métacentrique

a: Musser & Carleton, 1993 f: Jotterand-Bellomo, 1988 b: Robbins & Van der Straeten, 1996 g: Jotterand, 1970 c: Granjon & Dobigny, 2003 h: Veyrunes et al., 2004 d: Veyrunes et al., 2005 i: Aniskin et al ., 1998 e: Matthey, 1966 j: Jotterand-Bellomo, 1986

42 Introduction : Le modèle biologique partielle de l’un des X) chez quatre femelles sur 14 au sein d’une population ivoirienne de M. musculoides et chez une femelle musculoides/minutoides de République Centre Africaine. De même, Castiglia et al. (2002) capturent en Zambie trois spécimens de M. minutoides : les deux femelles sont hétérozygotes pour une délétion partielle d’un de leurs X, tandis que le mâle a un X normal. Enfin, Jotterand-Bellomo (1988) rapportent le cas extraordinaire de Mus triton du Burundi où mâles et femelles ne possèdent qu’un seul X, en outre fusionné à un chromosome de la paire 12 (délétion totale du second X chez les femelles et du chromosome Y chez les mâles !!). Ce type de déterminisme du sexe XO / XO n’est connu que de deux autres espèces de mammifères : Ellobius lutescens et Tokudaia osimensis (Just et al., 1995 ; Soullier et al., 1998 ; pour plus de détails voir chapitre « Chromosomes sexuels »). Enfin, les chromosomes sexuels de Nannomys sont atypiques à plus d’un titre, puisqu’ils sont également de nature achiasmatique, c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’appariement (formation de chiasma) entre le X et le Y à la méiose (Matthey, 1966a, 1966c ; Jotterand- Bellomo, 1981). Cet appariement est pourtant considéré comme nécessaire pour assurer la ségrégation correcte des chromosomes dans les gamètes.

B. Systématique morphologique et chromosomique.

Sur la base de critères anatomiques fondés sur l’étude du pelage, du crâne et des dents, une quarantaine de formes de souris naines africaines ont été décrites. En 1941, Ellerman a tenté un regroupement dans lequel il distingue trois groupes de formes et quatorze espèces. En 1963, Petter reprend cette étude et confirme dans ses grandes lignes la conception d’Ellerman. Toutefois, la dentition et le pelage varient individuellement dans des conditions telles, qu’il envisage une importante réduction du nombre d’espèces tout en maintenant la classification en trois groupes morphologiques : (i) le groupe bufo-triton, dont la caractéristique principale est une taille relativement grande, réunit deux espèces, Mus triton dont l’aire de distribution s’étend dans toute l’Afrique de l’Est, et Mus bufo confinée aux régions forestières à l’est du fleuve Congo; (ii) le groupe minutoides réunit une série de petites formes dont les caractères dentaires sont identiques (présence de 4 cupsides antérieures à la première molaire supérieure -M1/-) ; toutefois, Petter (1963) note l’absence de critère discriminant les différents taxons au sein de ce groupe; enfin (iii) le groupe tenellus, propre aux habitats de savanes et de steppes, se caractérise par une taille réduite et 3 cupsides antérieures à la M1/. Parmi les nombreuses formes décrites, Petter (1963) ne retient qu’une seule espèce valide : Mus haussa, à laquelle il ajoute une autre espèce quelques années plus tard : Mus mattheyi (Petter, 1969).

43 Alors que la morphologie est très conservée, des études cytogénétiques ont montré que les réarrangements chromosomiques pouvaient être de bons caractères discriminants entre espèces. Ainsi, l’occurrence répandue des translocations sexe-autosome a incité Matthey à proposer une classification basée sur la morphologie des chromosomes sexuels (Matthey, 1966a, 1970). Cet auteur a décrit deux groupes dont le premier, caractérisé par des chromosomes sexuels de type « primitif » (PR) rassemble les espèces ayant des chromosomes sexuels acrocentriques, semblables à ceux de la souris domestique. Le second groupe dit « transloqué » (TR), comprend les taxons chez lesquels le X et/ou le Y sont impliqués dans des fusions Rb avec des autosomes (voir Tableau 2). Ces deux classifications basées sur des caractères morphologiques ou chromosomiques n’ont jamais été testées par des marqueurs moléculaires, puisque au mieux, les études génétiques ont pris en compte deux espèces sur les 19 décrites (Bonhomme et al., 1982 ; Catzeflis & Denys, 1992 ; Sourrouille et al., 1995 ; Chevret et al., 2003).

C. Le genre Mus – Phylogénie et place des Nannomys au sein

du genre.

Les données paléontologiques indiquent que le genre Mus est originaire d’Asie, avec le plus vieux fossile de Mus, Mus actor, rapporté du Pakistan et daté à 5.7 MA (Jacobs & Downs, 1994). Les données moléculaires sont en accord avec les fossiles, puisqu’elles suggèrent que le berceau de différentiation des souris est en Asie, avec une apparition et une rapide divergence des différentes lignées au Miocène supérieur (Bonhomme, 1992 ; Guénet & Bonhomme, 2003 ; Chevret et al., 2003 ; Suzuki et al., 2004). Par la suite, le genre Mus est très peu représenté dans les faunes fossiles du Pliocène, avec toutefois des mentions en Afghanistan et Russie (dans Auffray et al., 1990). Les fossiles les plus anciens rapportés aux Nannomys sont quant à eux identifiés dans deux gisements d’Ethiopie du Pliocène, datés respectivement à 3.3 et 3.0 MA (Sabatier, 1982 ; Wesselman, 1984). Le genre Mus (Rodentia, Muridae, Murinae) comprend au moins 40 espèces réparties en quatre sous-genres que certains auteurs proposent d’élever au rang de genre (Bonhomme, 1992 ; Aniskin et al., 1998): Mus sensu stricto, Nannomys, Coelomys et Pyromys (Musser & Carleton, 1993). Le sous-genre Palearctique Mus est composé de douze espèces dont trois ont été très récemment intégrées : Mus fragilicauda de Thaïlande (Auffray et al., 2003), Mus famulus auparavant incluse dans le sous-genre Coelomys (Chevret et al., 2003), et enfin une

44 Introduction : Problématique nouvelle espèce en cours de description, endémique de Chypre (Bonhomme et al., 2004). Les trois autres sous-genres dont Nannomys sont moins connus. Les deux autres sous-genres sont restreints au sub-continent indien et à l’Asie du Sud-Est : Pyromys, les souris épineuses avec cinq espèces, et Coelomys, les souris-musaraignes avec quatre espèces (Musser & Carleton, 1993 ; Chevret et al., 2003). Le genre Mus est d’un très grand intérêt en recherche biologique et médicale car il comprend la souris domestique Mus musculus, taxon commensal cosmopolite adopté comme le principal modèle biologique expérimental utilisé et vecteur potentiel de nombreux pathogènes humains (e.g. Childs et al., 1992; Matthias and Levett, 2002 ; Berry & Scriven, 2005). Naturellement, ce genre a été l’objet de très nombreuses études phylogénétiques (Bonhomme, 1986, 1992; Jouvin-Marche et al., 1988; She et al., 1990; Catzeflis & Denys, 1992; Boursot et al., 1993; Sourrouille et al., 1995; Lundrigan et al., 2002; Chevret et al., 2003; Suzuki et al., 2004). Pourtant, malgré la quantité d’études réalisées, la présentation d’une phylogénie du genre Mus reste encore problématique, et ce, malgré la variété de marqueurs moléculaires utilisés : allozymes, RFLPs, hybridation ADN/ADN, séquences d’ADN nucléaire et mitochondrial (voir références citées ci-dessus). Même le séquençage de six gènes transmis par voie paternelle, maternelle ou bi-parentale n’a pas permis de résoudre de façon robuste les relations phylogénétiques entre les quatre sous-genres (Lundrigan et al., 2002). Le consensus actuel est donc une représentation phylogénétique des quatre sous-genres par une polytomie. Ce manque de résolution est lié à une séparation quasi-simultanée et une diversification rapide des quatre sous-genres. De plus, alors qu’il représente la moitié de la richesse spécifique du genre Mus, le sous-genre Nannomys reste paradoxalement un des moins étudiés. En effet, les Nannomys sont toujours sous-représentées dans toutes les phylogénies moléculaires du genre, en incluant tout au plus une voire deux espèces. Ainsi, la monophylie des souris naines africaines n’a jamais été prouvée en raison du faible échantillonnage intra-Nannomys. De même, la diversité taxonomique et les relations phylogénétiques de ce groupe restent très mal connues.

4. PROBLEMATIQUE – APPROCHE MULTIDISCIPLINAIRE

A la lumière de ces données, il apparaît que le sous-genre Nannomys constitue un excellent candidat à l’étude des modalités d’évolution chromosomique et mérite donc une étude élargie et approfondie.

45 Comprendre les mécanismes à l’origine de la biodiversité est devenu un des défis majeurs de la biologie évolutive moderne, pour cela nous devons intégrer patrons et processus. Je comparerai par le biais d’analyses cytogénétiques et cytogénomiques variées l’architecture et l’organisation de génomes issus d’une radiation évolutive récente. Les différences observées seront interprétées dans un cadre phylogénétique et temporel précis obtenu par la mise en œuvre d’études phylogénétiques réalisées en parallèle. Au delà, je m’intéresserai plus particulièrement à l’évolution des chromosomes sexuels et des mécanismes de déterminisme du sexe et replacerai ces observations dans un contexte plus général.

Ainsi, une approche pluridisciplinaire en combinant différents moyens d’investigation, i.e. moléculaire, cytogénétique et génomique, a permis de répondre aux objectifs principaux de cette thèse :

P Résoudre les relations de parenté entre les quatre sous-genres de Mus grâce à des méthodes de phylogénie moléculaire et phylogénomique.

P Retracer l’histoire évolutive du complexe d’espèces Nannomys, clarifier tout au moins en partie sa systématique et préciser la connaissance des aires de distributions spécifiques.

P Etudier dans un cadre phylogénétique, temporel et spatial l’évolution chromosomique des Nannomys.

P Amorcer une réflexion sur les processus chromosomiques et génomiques associés aux

événements de spéciation inférés.

P Proposer des hypothèses quant à (i) l’apparition et la fixation de translocations sexe- autosome, (ii) la mise en place de nouveaux systèmes de déterminisme du sexe, et (iii) leurs implications dans l’évolution générale du sous-genre.

P Evaluer les relations possibles entre les trois événements rares impliquant les chromosomes sexuels (i.e. X et Y asynaptiques, translocations sexe-autosome, déterminismes du sexe atypiques). Sont-ils corrélés ? et si oui, quel est l’ordre d’apparition ? Différentes hypothèses seront alors émises.

46 Introduction : Les méthodes

5. LES METHODES

Un résumé des approches et des méthodes utilisées au cours de cette thèse est donné ci-dessous. Les protocoles sont détaillés soit dans les articles, soit résumés dans les chapitres qui y font référence. La plupart des individus en notre possession ont été piégés par l’intermédiaire de collaborations mises en place essentiellement en Afrique de l’Ouest (Mali, Guinée, Sénégal, Niger) et Afrique du Sud. D’autres spécimens étaient conservés dans les collections du laboratoire. Quelques autres enfin ont été collectés au cours de ma thèse grâce à des missions de piégeage (Afrique du Sud et Tanzanie). L’annexe 2 récapitule la liste des spécimens utilisés, leur origine géographique, le sexe, les données chromosomiques de base, ainsi que les types d’analyses appliquées.

Approche phylogénétique Les analyses de phylogénie moléculaire ont étaient réalisées à partir des séquences du gène mitochondrial cytochrome b et du gène nucléaire IRBP (Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein). Un second marqueur mitochondrial, l’ARN ribosomal 12s (ARNr 12s) a également été utilisé dans certaines analyses. Le choix s’est porté sur ces trois marqueurs complémentaires, car ils ont depuis longtemps fait leur preuve dans la résolution des phylogénies des rongeurs et notamment à bas niveaux taxonomiques (intra-générique voire intra-spécifique) (e.g. Ducroz et al., 1998 ; Michaux et al., 2002 ; Montgelard et al., 2002 ; Weksler, 2003 ; Suzuki et al., 2004). En outre, ils font partie des marqueurs les plus utilisés en phylogénie moléculaire, ce qui permet de disposer d’une base de données comparative conséquente et d’amorces nécessaires à leur amplification relativement bien identifiées. Toutes les reconstructions phylogénétiques ont été réalisées par deux approches probabilistes : le maximum de vraisemblance (Maximum Likelihood) réalisé par les programmes PAUP* 4b10 (Swofford, 1999) et/ou PHYML (Guindon & Gascuel, 2003) et une approche bayésienne avec le logiciel MrBayes (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). Certaines analyses ont également été conduites par la méthode du maximum de Parsimonie sous PAUP. Les méthodes probabilistes fondées sur la fonction de vraisemblance apparaissent aujourd’hui comme les plus performantes puisqu’elles se basent sur des modèles explicites d’évolution des séquences moléculaires, alors que seuls les caractères partagés observés sont pris en compte dans les méthodes de parcimonie.

a. b.

c. d.

Y X

Figure 9: a: Coloration standard au Giemsa de Mus musculus, 2n = 40. b: banding-G de M. indutus , 2n = 36. c: banding-C de M. musculoides, 2n = 18, on observe de gros bloc d’hétérochromatine centromérique au niveau d’une paire de chromosome. d: méiose (métaphase I) de M. matttheyi colorée au DAPI, 2n = 36, avec la formation de 17 bivalents + les chromosomes X et Y.

48 Introduction : Les méthodes

Les datations moléculaires ont été réalisées soit par la méthode classique d’horloge moléculaire (si le test du Likelihood ratio ne rejette pas l’hypothèse d’un taux d’évolution moléculaire constant à tous les échantillons ; Felsenstein, 1981) soit par une méthode bayésienne (qui permet d’estimer un taux d’évolution moléculaire spécifique pour chaque branche de l’arbre) d’après la procédure de Yoder & Yang (2004) avec le logiciel MULTIDIVTIME (Thorne & Kishino, 2002). Les points de calibration utilisés sont la divergence Mus/Rattus datée par la paléontologie à 10-14 MA (Jacobs & Pilbeam, 1980 ; Jaeger et al., 1986) et/ou la séparation du mulot rupestre (Apodemus mystacinus) des espèces du sous- genre Sylvaemus (A. sylvaticus) à ~7 MA (Michaux et al., 1997).

Approche cytogénétique L’obtention des préparations chromosomiques a été effectuée à partir de deux méthodes : - de cellules de la moelle osseuse (Lee & Elder, 1980). Les chromosomes sont obtenus à partir des lymphocytes de la moelle osseuse dont le nombre de divisions peut être augmenté par une injection de levure. Il s’agit d’une méthode relativement rapide, peu coûteuse, qui requiert surtout peu d’équipements et qui peut donc être menée sur le terrain ; en revanche, elle est invasive, nécessitant le sacrifice de l’animal. - de cellules en cultures cellulaires réalisées dans le laboratoire du Professeur Terry J. Robinson, Evolutionary Genomics Group, à l’Université de Stellenbosch, Afrique du Sud. Les fibroblastes sont prélévés au niveau des oreilles, de l’extrémité de la queue ou du tissu intercostal de l’animal. Les cellules sont déposées dans un flacon avec du milieu de culture, entretenu en conditions stériles et conservé dans une étuve à CO2 qui permet de conserver un pH constant et maintenir une température de 37°C. Les lignées de fibroblastes se développent ainsi pendant plusieurs jours à plusieurs semaines. Lorsque la majorité des cellules en division sont en métaphase (étape du cycle où la chromatine est condensée et les chromosomes visibles), le cycle cellulaire est alors bloqué à l’aide de colchicine. A ce stade, les cellules sont récoltées, fixées et conservées. La culture cellulaire est une technique lourde, qui demande de gros moyens techniques et personnels (entretien des cultures tous les deux jours), et en outre, ne peut être réalisée qu’en laboratoire équipé spécifiquement pour ce genre de manipulations. En revanche, les avantages certains sont que cette méthode n’oblige pas à tuer l’animal (utile dans le cas d’espèces protégées, etc…) et qu’elle permet de maintenir des tissus vivants qui peuvent servir à de nombreuses expérimentations (e.g. tests de substances chimiques,

49 modification de l’activité cellulaire etc…). Enfin, les lignées cellulaires peuvent être cryopréservées, et par voie de fait décongelées puis recongelées, et sont donc théoriquement exploitables à l’infini.

Les extraits de cellules obtenus sont ensuite conservés dans du fixateur à –20°C, puis déposés sur une lame, les chromosomes métaphasiques étalés sont alors colorés dans une solution de Giemsa (coloration standard) qui permet aisément de déterminer le nombre et la morphologie des chromosomes du caryotype (voir un exemple Figure 9a). En revanche, certains traitements physico-chimiques préalables à la coloration au Giemsa permettent de faire apparaître le long des chromosomes des bandes sombres et claires, de largeur et d’intensité variable, caractéristiques de chaque paire de chromosome. Ce marquage, ou « Banding », apporte des informations fondamentales sur le contenu et les propriétés de chaque chromosome. Ainsi, le Banding-G (Seabright, 1971) qui consiste en une dénaturation protéique à l’aide de Trypsine fait apparaître un profil de bandes le long des chromosomes (voir un exemple Figure 9b). Les zones sombres correspondent à des zones euchromatiques du génome généralement pauvres en gènes et riches en Adénine et Thymine, et inversement pour les bandes claires. Le marquage en Banding-G fournit un profil de bandes très stables sur lequel nous nous sommes largement appuyés pour l’identification des paires de chromosomes homologues, ainsi que leur comparaison entre individus de la même espèce ou d’espèces différentes. Le Banding-C (Sumner, 1972) est quant à lui obtenu après un traitement de dénaturation acido-basique de l’ADN. Il met en évidence les zones d’hétérochromatine constitutive (voir un exemple Figure 9c). Ces régions sont généralement très compactes et riches en séquences répétées. L’observation des plaques métaphasiques est effectuée à l’aide d’un microscope Zeiss Axioplan 2 muni d’un objectif 100x à immersion. Le caryotype est réalisé en utilisant le logiciel Cytovision (Applied Imaging).

De plus, des analyses méiotiques ont été réalisées chez quelques individus mâles. Le but est d’observer l’appariement des chromosomes homologues à la métaphase I et la formation des chiasmas - crossing-over - (voir un exemple Figure 9d). Les testicules sont prélevés, broyés dans du Trisodium Citrate, puis placés dans un bain-marie à 37°c pendant 20 minutes. Après trois centrifugations, l’extrait est conservé dans du fixateur (1/4 acide acétique 100%, 3/4 méthanol 100%). Quelques gouttes sont déposées sur des amesl et colorées au

50 Introduction : Les méthodes

DAPI (Vector Laboratories). L’observation est réalisée au microscope optique en lumière ultraviolette.

Approche cytogénomique L’hybridation in situ par fluorescence (ou FISH) repose sur le principe d’hybridation homologue ou hétérologue d’une sonde marquée avec la région génomique cible. Elle permet de localiser des séquences d’ADN données dans le génome. Une sonde peut-être spécifique à des séquences particulières, par exemples les télomères qui sont des clusters de séquences répétées (TTAGGG)n, ou spécifique à des paires de chromosomes en entier, i.e. sonde chromosomique.

Une sonde spécifique aux séquences télomériques a été entièrement synthétisée, puis hybridée sur les métaphases des différents taxa de Nannomys suivant la procédure légèrement modifiée décrite dans Garagna et al. (1997). Les télomères correspondent à des complexes ADN-protéines qui caractérisent l’extrémité de tous les chromosomes d’Eucaryotes. De nombreuses études ont montré que des signaux télomériques interstitiels ou au niveau du centromère de chromosomes métacentriques étaient les traces de réarrangements chromosomiques passés (e.g. Meyne et al., 1990, Lee et al., 1993, Fagundes & Yonenaga- Yassuda, 1998, Metcalfe et al., 1998, 2002, Dobigny et al., 2003b). Certaines auteurs suggèrent même que les télomères seraient directement impliqués dans les fusions Rb (Slijepcevic, 1998). Ainsi, cette analyse permet d’appréhender en partie les mécanismes de l’évolution chromosomique, et notamment la dynamique évolutive des fusions/fissions Rb chez les Nannomys.

Le Chromosome Painting (ou ZOO-FISH) est une des avancées techniques majeures de la fin du XXième siècle, fournissant des résultats très puissants en établissant les homologies chromosomiques à partir du contenu génétique. Le principe est relativement simple. Après marquage par deux fluorochromes, chaque paire de chromosomes d’un caryotype est triée par cytométrie à flux selon les gradients des deux fluorescences qui reflètent la quantité et qualité de l’ADN de chaque chromosome (Figure 10). Ensuite, chaque pic obtenu est isolé, amplifié par DOP-PCR (PCR avec des amorces très dégénérées qui s’accrochent en théorie tous les ~4Kb permettant d’amplifier par petits bouts la totalité du chromosome ; Telenius et al., 1992), puis marqué par un fluorochrome (la Biotine) par une deuxième DOP-PCR. Enfin,

1000

Rb(X.1) 800 Rb(5.8) Rb(4.7) Rb(2.13) 600

Fluorescence Rb(10.14) Rb(3.9)

Rb(12.17) Rb(6.11) Hoechst 400

Rb(Y.1)

200 Rb(15.16)

200 400 600 800 1000 Chromomycin Fluorescence

Figure 10: Caryotype en flux d’un mâle de M. minutoides de Caledon. Les 10 paires chromosomiques ont pu être isolées en fonction de leur contenu d’ADN et du ratio AT/GC après coloration au Hoeschst (axe vertical) et à la chromomycine (axe horizontal).

52 Introduction : Les méthodes

chaque sonde (= pic) est hybridée sur des métaphases de l’espèce étudiée afin d’identifier la correspondance des sondes avec les paires de chromosomes. Chaque sonde chromosomique de mammifères placentaires peut ainsi être hybridée sur n’importe quel autre placentaire (marsupiaux et monotrèmes étant trop divergents) et permet de révéler les remaniements chromosomiques intervenus entre ces deux taxons (e.g. sondes de chromosomes humains hybridées sur l’Oryctérope ; Yang et al., 2003). Le pouvoir de résolution est très puissant, et permet aisément de comparer des caryotypes, d’étudier des vitesses d’évolution chromosomique, d’extrapoler des cartes génétiques, d’identifier les patterns de révolutions génomiques, etc…(e.g. Muller et al., 2003 ; Stanyon et al., 2003 ; Yang et al., 2003). Le but de notre démarche est triple : - J’ai hybridé les sondes chromosomiques (commercialisées) de la souris domestique sur le caryotype de Nannomys, ce qui permet de comparer l’organisation des génomes, et ainsi d’étudier l’évolution chromosomique survenue depuis la divergence Mus/Nannomys. En outre, puisque les homologies chromosomiques correspondent à des homologies de contenu génique, il est possible d’extrapoler la carte génétique bien documentée de la souris domestique (Waterston et al., 2002) à celles des Nannomys, ce qui constituera une base de données importante pour inférer des processus d’évolution génomique/génétique. Pour cela, il faut réaliser du Chromosome Painting réciproque (principe donné en Figure 11). Ainsi, les chromosomes de Nannomys ont été triés (Flow sorting) par Patricia CM O’Brien et Fengtang Yang du laboratoire Centre for Veterinary Science, Cambridge, UK. Par la suite, lors de deux séjours à l’Université de Stellenbosch (Afrique du Sud) dans le laboratoire de TJ Robinson, Evolutionary Genomics Group (avril-mai 2003, mai-juillet 2004), j’ai identifié les sondes chromosomiques de Nannomys, puis les ai hybridées sur le caryotype de Mus musculus. D’autres comparaisons génomiques ont été réalisées par la méthode du Chromosome Painting et vous seront présentées tout au long de ce travail. - De réaliser une phylogénie chromosomique du genre Mus (Mus sensu stricto, Nannomys, Coelomys, Pyromys) en utilisant les données d’homologie issues du ZOO-FISH ; il s’agit d’un nouvel axe d’investigation appelé Phylogénomique qui correspond à une des grandes avancées conceptuelles en matière de reconstruction phylogénétique (revues dans Murphy et al., 2004 ; Delsuc et al., 2005). La phylogénomique s’est développée parallèlement aux études comparatives des génomes des organismes qui connaissent actuellement un formidable essor. Elle se base sur des changements génomiques rares qui sont

.2 l’esp .1 l’esp 2 ?? .2 correspond à quelle Espèce 2 1 .1 hybride la paire 2 en entier l’esp esp Sonde paire 1 1 de partie du chromosome 2 de Mais la bande proximale de paire réciproque Sonde 2 de et une bande proximale de la paire 1 Painting - .2 l’esp .1 HYBRIDATION HYBRIDATION l’esp : Principe du Chromosome La bande proximale du Figure 11 chromosome 1 de distale du chromosome 2 de 2 correspond donc à une bande Sonde paire 2 Espèce 1 Paire 1

54 Introduction : Les méthodes donc peu soumis à convergence apportant des signatures cladistiques fortes, donnant ainsi une image robuste des relations phylogénétiques. Ces caractères peuvent être les positions des introns, les insertions de rétrotransposons ou les réarrangements chromosomiques (O’Brien et al., 1999 ; Rokas & Holland, 2000 ; Murphy et al., 2004).

- Au cours de cette thèse, nous avons déterminé de nouveaux cas de systèmes de déterminisme du sexe atypiques. Les chromosomes sexuels ont été identifiés sur la base de leur profil de bandes en Banding-G et -C. Afin de confirmer ces résultats, nous avons hybridé les sondes chromosomiques X et Y de la souris domestique et de Nannomys sur ces différents taxa. Pour certains, nous avons également recherché par PCR la présence du gène Sry dans leur génome et séquencé ce gène pour vérifier son état fonctionnel (e.g. insertions, délétions, codons-stop).

II. RESULTATS & DISCUSSION

58 résumés articles 1 & 2 1ère partie : Phylogénie du genre Mus

II. RESULTATS & DISCUSSION

1ère partie : PHYLOGENIE DU GENRE MUS.

Le genre Mus a fait l’objet de très nombreuses études de phylogénies moléculaires (Bonhomme, 1986, 1992 ; Jouvin-Marche et al., 1988 ; She et al., 1990 ; Catzeflis & Denys, 1992 ; Boursot et al., 1993 ; Sourrouille et al., 1995 ; Lundrigan et al., 2002 ; Chevret et al., 2003 ; Suzuki et al., 2004). Pourtant, malgré la quantité d’études réalisées, la présentation d’une topologie du genre Mus reste encore problématique, le consensus actuel est donc une représentation phylogénétique des quatre sous-genres (Mus sensu stricto, Coelomys, Nannomys et Pyromys) par une polytomie. Ce manque de résolution est lié à une séparation quasi-simultanée des quatre sous-genres, mais pourrait être également lié à un biais de l’échantillonnage (Lundrigan et al., 2002). En effet, dans toutes ces études, le biais est en faveur du sous-genre Mus qui comprend la souris domestique, taxon commensal cosmopolite adopté comme le principal modèle biologique expérimental (Berry & Scriven, 2005) ; en revanche, les trois autres sous-genres (beaucoup moins étudiés et aux aires de répartition moins vastes) sont toujours sous-représentés avec tout au plus une voire deux espèces. Ce déséquilibre d’échantillonnage peut entraîner des erreurs de reconstruction phylogénétique dû en partie à l’artéfact d’attraction des longues branches (Lecointre et al., 1993 ; Delsuc et al., 2002).

Ø Dans le but de clarifier la phylogénie du genre Mus, nous avons réalisé une première étude (Article 1 : Chevret, Veyrunes & Britton-Davidian, 2005), (i) en se concentrant sur un effort d’échantillonnage dans les sous-genres habituellement sous-représentés (Coelomys, Pyromys et surtout Nannomys -le plus diversifié -) afin de subdiviser les longues branches et ainsi s’abroger du phénomène d’attraction des longues branches et (ii) en incluant l’analyse de nouvelles séquences d’un gène nucléaire (IRBP) associé à deux gènes mitochondriaux (cytochrome b et ARNr 12s) pour augmenter le signal phylogénétique. Les résultats montrent que les monophylies du genre Mus et des quatre sous-genres sont fortement soutenues (celle des Nannomys est confirmée pour la première fois) et que les radiations de Mus et de Nannomys coïncident avec des événements climatiques majeurs. En revanche, l’augmentation de l’échantillonnage au sein des Nannomys et l’addition du nouveau marqueur nucléaire ne permettent toujours pas d’améliorer notre connaissance des relations de parenté entre les quatre sous-genres.

Ø Ainsi, il apparaît que l’utilisation de nouveaux marqueurs génétiques est nécessaire pour résoudre la phylogénie du genre Mus. Les réarrangements chromosomiques se révèlent être de bons

59 candidats puisqu’ils représentent des Changements Génomiques Rares sensu Rokas & Holland (2000), et sont donc peu soumis à convergence apportant des signatures cladistiques fortes (au même titre que les Indels ou les insertions de SINEs / LINEs) (revues dans O’Brien et al., 1999 ; Wienberg, 2004 ; Murphy et al., 2004). Nous avons donc réalisé une seconde étude (Article 2 : Veyrunes et al., soumis) en comparant l’organisation des génomes des quatres sous-genres par Chromosome Painting (ou ZOO-FISH). Ce nouvel axe d’investigation, appelé phylogénomique (Murphy et al., 2004), constitue une élégante et performante méthode pour (i) détecter avec précision les homologies chromosomiques entre espèces très éloignées, ce que ne permettaient pas les comparaisons par banding-G et (ii) résoudre des phylogénies controversées (par exemple au sein des carnivores ; Nie et al., 2002 - des singes hurleurs ; de Oliviera et al., 2002 - des gibbons ; Muller et al., 2003 - ou des écureuils ; Li et al., 2004). Les réarrangements chromosomiques survenus au cours de l’évolution du genre Mus, déduits du Chromosome Painting, ont donc été codés dans une matrice de caractères afin de reconstruire une phylogénie chromosomique par maximum de parcimonie. La phylogénie chromosomique obtenue apporte pour la première fois une représentation robuste des relations de parenté entre les quatres sous-genres, à savoir : Coelomys est le premier sous- genre à diverger, suivi de Nannomys branché à la base du clade Mus – Pyromys. En outre, les comparaisons génomiques révèlent un taux d’évolution chromosomique très élevé comparé à la plupart des autres lignées de mammifères y compris au sein des Muridés connus pour leur vitesse d’évolution rapide (e.g. O’Brien et al., 1999 ; Stanyon et al., 1999, 2003 ; Bourque et al., 2004). Cette vitesse s’avère également être non-constante au cours du temps, puisque nous notons des accélérations des taux d’évolution chromosomique importantes qui correspondent aux évènements de cladogénèse. L’évolution chromosomique du genre Mus s’est faite majoritairement par fixation de translocations (mais aussi de fissions, fusions en tandem et inversions). Parmi ces réarrangements, nous avons pu en identifier 16 qui ont nécessité la mise en place de nouveaux centromères : 14 correspondent à la formation d’un néocentromère, et deux à la réactivation possible d’anciens centromères latents. La formation de néocentromères au cours de l’évolution du genre Mus semble donc être un phénomène beaucoup plus répandu que ce que les prédictions théoriques pouvaient nous suggérer. Cette étude de Chromosome Painting est un cas d’école puisque non seulement elle permet de résoudre sans ambiguïté une phylogénie longtemps débattue, mais elle permet aussi de retracer avec précision l’histoire évolutive du génome de la souris. En effet, la comparaison des génomes des quatre sous-genres permet la découverte et l’interprétation de modifications chromosomiques à petites échelles évolutives, ce que ne permettent pas les comparaisons habituelles entre les trois « mammifères modèles » pour lesquels le génome complet est connu, souris - rat - homme.

Article 1 :

Molecular phylogeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochondrial and nuclear data.

Chevret P, Veyrunes F, Britton-Davidian J. 2005.

Biological Journal of the Linnean Society 84: 417-427.

Blackwell Science, LtdOxford, UKBIJBiological Journal of the Linnean Society0024-4066The Lin- nean Society of London, 2005? 2005 843 417427 Original Article

MOLECULAR PHYLOGENY OF MUS P. CHEVRET Et al. Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427. With 3 figures

The genus Mus as a model for evolutionary studies Edited by J. Britton-Davidian and J. B. Searle

Molecular phylogeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochondrial and nuclear data

PASCALE CHEVRET1*, FRÉDÉRIC VEYRUNES2 and JANICE BRITTON-DAVIDIAN2

1Institut des Sciences de l’Evolution (UMR 5554), Paléontologie, Paléobiologie & Phylogénie, cc064, and 2Institut des Sciences de l’Evolution (UMR 5554), Génétique & Environnement, cc065, Université Montpellier II, Place E. Bataillon, 34095 Montpellier cedex 5, France

Received 7 November 2003; accepted for publication 7 October 2004

The genus Mus encompasses at least 38 species divided into four subgenera: Mus, Pyromys, Nannomys and Co- elomys. The subgenus Mus, which comprises the house mouse and related species, is by far the most extensively studied, although the subgenus Nannomys is the most speciose. Although the relationships within the subgenus Mus are rather well characterized, those between subgenera are still unclear. In the present study, phylogenetic analyses of the whole genus were performed using a larger species sample of Nannomys than in previous studies, and a nuclear gene (IRBP) in addition to mitochondrial data (cytochrome b and 12S rRNA). Members of the Acomyinae and Muri- nae were used as outgroups. Separate and combined analyses were performed with maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian methods, and divergence times were estimated. The results showed that the monophyly of the genus Mus and of each subgenus was strongly supported by the three genes and the combined analysis. The phylogenies derived from the three genes were on the whole congruent; however, several conﬂicting topologies were observed such as the relationships between the three Asian species of the subgenus Mus (caroli, cervicolor and cookii). Increasing the taxonomic sampling of Nannomys did not satisfactorily improve the resolution of relationships between the four subgenera. In addition, molecular calibrations indicate that the Mus and Nannomys radiation coincided with major environmental changes. © 2005 The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427.

ADDITIONAL KEYWORDS: 12S rRNA – Coelomys – cytochrome b – IRBP – molecular clock – Nannomys – Pyromys.

INTRODUCTION itan commensal Mus musculus, and other species com- monly used in the laboratory (Marshall, 1986; Berry, The genus Mus encompasses at least 38 species 1995; Berry & Scriven, 2005, this issue). Until divided into four subgenera: Mus, Pyromys, Nanno- recently, this subgenus consisted of nine species, to mys and Coelomys (Musser & Carleton, 1993). Each of which two additional species have been added; the these taxa is characterized by discrete morphological, newly described Mus fragilicauda from Thailand (Auf- biochemical and chromosomal traits and has been con- fray et al., 2003), and Mus famulus, which was previ- sidered either as a subgenus or a distinct genus (Mar- ously included in the subgenus Coelomys (Chevret, shall, 1977, 1986; Bonhomme et al., 1984; Jotterand- Jenkins & Catzeflis, 2003). The three other subgenera Bellomo, 1984; She et al., 1990; Matsubara et al., are less well known. The subgenus Nannomys, the 2003). The Palaearctic subgenus Mus is by far the African pygmy mice, has a sub-Saharan distribution most extensively studied, as it harbours the cosmopol- with a number of species varying from five up to 30, according to different authors (Marshall, 1981). This *Corresponding author. E-mail: [email protected] taxonomical conflict is partly due to their low morpho-

418 P. CHEVRET ET AL. logical differentiation (Petter, 1963, 1981; Macholán, RNA and the protein coding cytochrome b, and the 2001). Musser & Carleton (1993) recognized 19 spe- third involved the nuclear IRBP gene coding for the cies, making the Nannomys the most speciose subge- Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein. These nus of Mus. The last two subgenera are restricted to new sequences complete the Mus mitochondrial South-East Asia: Coelomys, the shrew mice with four sequences already published in Sourrouille et al. species, and Pyromys, the spiny mice with five species (1995), Lundrigan et al. (2002) and Chevret et al. (Musser & Carleton, 1993; Chevret et al., 2003). (2003). We used the same primers as Sourrouille et al. Although the relationships within the subgenus (1995) to amplify and sequence the complete 12S Mus are rather well characterized, the relationship rRNA gene. The complete cytochrome b was amplified between the four subgenera is still unclear and with primers L7 and H6 (Montgelard et al., 2002). The varies according to the marker used (Lundrigan, 5¢ third of the IRBP exon 1 (1227 positions) gene was Jansa & Tucker, 2002; Chevret et al., 2003; Guénet & amplified using the PCR primers I1, J1, I2 and J2; two Bonhomme, 2003). This may be indicative of rapid fragments with 300 overlapping base pairs (bp) were radiation events. Conversely, such results may be amplified: I1/J2 (827 bp) and I2/J1 (931 bp) (Poux & biased by the low resolution of the markers used and/ Douzery, 2004). or an unbalanced taxonomic sampling among the dif- The amplification reactions were carried out in ferent lineages (Lecointre et al., 1993; Delsuc et al., 50-ml volumes including 12.5 ml of each 2 mM primer, 2002). Attempts to improve phylogenetic performance 5 ml of 2 mM dNTP, 5 ml of 10¥ reaction buffer, 10 ml of using analyses of additional markers have so far not purified water and 0.2 ml of 5 U ml-1 Promega taq been conclusive in the genus Mus (Lundrigan et al., DNA polymerase. Approximately 200 ng of DNA 2002; see also Tucker, Sandstedt & Lundrigan, 2005, extract was used per PCR amplification; for the this issue). However, in all previous studies, the non- nuclear gene, water was replaced by 10 ml of 5 M Mus subgenera have often been represented by a sin- Betaine. Amplifications were performed in a Labover gle species, even the highly speciose Nannomys. The PTC100 thermal cycler and consisted of an initial aim of this study was to clarify the phylogeny of the 2 min of denaturation (94 ∞C) followed by 35 cycles genus Mus (i) by increasing the number of species (45 s at 94 ∞C, 45 s at 50 ∞C and 90 s at 68 ∞C) with a studied in the under-represented subgenera (Pyromys, final extension cycle of 10 min at 68 ∞C. PCR products Coelomys and particularly Nannomys), and (ii) by were purified using the Ultra-free DNA Amicon kit including the sequence analysis of a nuclear gene (Millipore) and directly sequenced. Both strands were (IRBP) in addition to two mitochondrial loci (cyto- sequenced using a Bigdye terminator (Perkin Elmer) chrome b and 12S rRNA). The choice of this nuclear sequencing kit and run on an ABI 310 (Perkin Elmer) marker was based on its usefulness in resolving automated sequencer. The 32 new nucleotide seq- intrageneric relationships within another murine uences reported in this paper are deposited in the genus: Apodemus (Serizawa, Suzuki & Tsuchiya, EMBL nucleotide sequence databases with accession 2000; Michaux et al., 2002). numbers AJ698868–99.

MATERIAL AND METHODS Phylogenetic analyses The sequences were manually aligned using the ED MATERIAL program (MUST package, Philippe, 1993). The align- DNA samples were extracted from 95% ethanol- ment of 12S rRNA was refined in order to minimize preserved tissues housed in the collection of Preserved the number of indels (insertions–deletions) in stems Mammalian Tissues of the Institut des Sciences de (Springer & Douzery, 1996) using the model of Gutell l’Evolution, Montpellier (Catzeflis, 1991). Table 1 lists for Mus (published in Sullivan, Holsinger & Simon, all the taxa involved in the molecular study, their acces- 1995). There were no indels in cytochrome b and IRBP. sion numbers and references, geographical origin and Following Hassanin, Lecointre & Tillier (1998), we collector’s name. We included in our analyses seven examined the IRBP, cytochrome b and 12S rRNA species of the subgenus Mus, five of Nannomys, two of datasets for saturation, using the matrices of patristic Coelomys and two of Pyromys (but see below). Other and adjusted character distances calculated by PAUP Murinae (Rattus and Apodemus) and Acomyinae ver. 4b10 (Swofford, 1999). The pairwise numbers of (Acomys and Lophuromys) were used as outgroups. observed differences were plotted against the corresponding values for inferred substitutions, and the slope of the linear regression (S) was used to evaluate METHODS the level of saturation. When no saturation is present DNA amplification and sequencing in the dataset, the slope equals one, whereas the slope Three molecular markers were sequenced; two were tends towards zero as the level of saturation increases. mitochondrial genes: the non-coding 12S ribosomal We performed this analysis for transversions (TV) and

© 2005 The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427 MOLECULAR PHYLOGENY OF MUS 419 ., 1984). The species 1984). ., w sequences registered et al e scribed in Potter, 1986) are housed scribed in Potter, . . . (2002) (2002) . . et al et al et al et al et al (2000) (2000) (1992) AB032860, Serizawa Serizawa AB032860, AJ698893 Laboratory strain PAH Thailand, AJ698887 Laboratory strain COK Thailand, AJ429134, Huchon Huchon AJ429134, AJ698886 Laboratory strain CR Thailand, IRBP Origin . . . . (2001) AJ698898 Catzeflis F. Arabia, Saudi (2000) Serizawa AB032863, (2000) AJ698885 Laboratory strain KAR Thailand, (2000) AJ698883 Laboratory strain SEI Spain, (2000) Michaux AJ311158, (2000) AJ698882 Laboratory strain ZYD Yugoslavia, ...... et al et al et al et al et al (1981) Stanhope AF126968, et al et al et al et al et al . et al b (2000) (2002) (2002) (1982) (2002) Y057814, Lundrigan Y057814, Y057813, Lundrigan Y057813, AJ698878 AJ698894 Ruedi M. Sumatra, AJ698873A AJ698888 Nancé V. Gabon, AJ012023, Barome (1998)AJ012023, AJ698899 Granjon L. Congo, A AJ698880 AJ698895 Laboratory strain PTX Thailand, AJ698879 AJ698896 Catzeflis F. India, (2002) Martin AF159394, (2002) Serizawa AB032853, (2002) Suzuki AB033695, (1981) Goertz & Feldmann V01556, (2003) AJ698872 AJ698884 Catzeflis F. India, (2003)(2003) Suzuki AB033698, Lundrigan AY057811, (2003)(2003) Martin AF159397, Suzuki AB033700, ...... (1995) Barome AJ233953, (1995) AJ698881 AJ698897 Sung Van Cao Vietnam, et al et al et al et al et al et al et al et al . . et al et al et al et al et al et al (1981) Bibb V00711, . et al et al et al (1995) (1995) Catzeflis (1995) & Michaux (2001) (1995) (1995) (1995) aits formal taxonomic identification AJ311141, Michaux Michaux AJ311141, AJ311164, Michaux Michaux AJ311164, X85951, Sourrouille X85951, AJ698868AJ698869AJ698870AJ698871 Laudet & Hänni, X84383, AJ698876 AJ698875 AJ698877 AJ698874 AJ698889 AJ698890 AJ698891 AJ698892 Sicard B. Mali, Sicard B. Mali, Sicard B. Mali, Robinson T. South Africa, AJ250349, Chevret, Catzeflis Chevret, AJ250349, X84387, Hänni X84387, AJ311126, Michaux Michaux AJ311126, AJ279442, Chevret AJ279442, Bibb V00711, X85949, Sourrouille X85949, X84386, Hänni X84386, V00680, Kobayashi V00680, X85946, Sourrouille X85946, Sourrouille X85947, AJ279437, Chevret AJ279437, Chevret AJ279441, 12S rRNA Cytochrome AJ279439, Chevret AJ279439, Chevret AJ279438, Sourrouille X85948, aw

saxicola cf. cf.

Coelomys Nannomys Mus Pyromys List of taxa involved in the study with accession number sequences and their references (when published). the ne For Mus saxicola cf. cf. Apodemus mystacinus Apodemus ﬂavicollis M. crociduroides M. M. mattheyi M. musculoides M. haussa M. indutus M. pahari M. Lophuromys sikapusi Acomys cahirinus Apodemus sylvaticus M. famulus M. musculus M. M. setulosus M. Leopoldamys edwarsi Rattus norvegicus M. cookii M. platythrix M. M. caroli M. cervicolor M. M. spicilegus M. spretus M. M. able 1. Subgenus Subgenus in EMBL (AJ698868–99), the collector’s name and the geographical origin of the sample are indicated. The laboratory strains (de name and the geographical origin of sample are indicated. the collector’s in EMBL (AJ698868–99), Adaptations (UMR5171) (Bonhomm at the University of Montpellier II, France Interactions Populations, in the Laboratoire Génome, Subgenus T Subgenus name of

© 2005 The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427 420 P. CHEVRET ET AL. transitions (TS), treating loops and stems separately rise to the two lineages leading to Mus and Rattus, the for 12S rRNA, as well as for the three codon positions divergence of which took place at about 12 Mya for the cytochrome b and IRBP. We also considered the (Jacobs & Pilbeam, 1980; Jaeger, Tong & Denys, 1986; Consistency Index excluding uninformative charac- Jacobs & Downs, 1994). In Europe, fossils of ters (CI) calculated by PAUP on each partition. Apodemus are well known and calibrated; the diver- The phylogenetic analyses were conducted on each gence between A. mystacinus and all the ‘small’ Syl- gene separately, on both mitochondrial genes and vaemus species is estimated at approximately 7 Mya, ﬁnally on the combined dataset. Prior to combining which constitutes our second calibration point (Agui- the data, the topological congruence of the three lar & Michaux, 1996; Michaux et al., 1997). datasets was evaluated with the incongruence length difference (ILD) test (Farris et al., 1995) using PAUP RESULTS (option hompart). We used maximum parsimony (unweighted and weighted) and two probabilistic GENE EVOLUTION AND SATURATION ANALYSIS approaches: maximum likelihood (ML) with PAUP v. The base composition and the result of the saturation 4b10 (Swofford, 1999), and Bayesian approaches with analyses for each gene are presented in Table 2. The MrBayes (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). Weighted complete alignment of the 12S rRNA comprises parsimony (wMP) was performed using the stepma- 997 bp. The ﬁnal alignment is 890 bp long after trix option of PAUP with the product CI ¥ S values removal of positions containing indels as well as sites multiplied by 1000. Branch supports (BS, Bremer, that could not be unambiguously aligned. It includes 1988) were calculated as described in Hassanin, Pas- 204 variable sites with 136 informative sites, and can quet & Vigne (1998). The program Modeltest (Posada be divided into stems (445 nt) and loops (445 nt). The & Crandall, 1998) indicates that the most appropriate level of saturation is of the same order of magnitude model is GTR+G8 distribution of rate heterogeneity for TS in stems and loops and TV in loops (S = 0.41– among sites with a fraction of invariable sites. With 0.43, CI = 0.42–0.52), whereas the TV in stems are MrBayes the parameters were estimated for each of the least saturated events. The full cytochrome b the eight partitions: the stems and loops for the 12S comprises 1140 bp, 495 of which are variable (416 rRNA and the three codon positions for the protein informative). The least saturated events are the TV coding genes. The robustness of the nodes was evalu- at position 1 (S = 0.63, CI = 0.55) and 2 (S = 0.44, ated by bootstrap percentage (BP) for MP (1000 iter- CI = 0.86), and the most saturated are the TS at third ations) and ML (500 iterations), BS and Posterior codon position (S = 0.11, CI = 0.21). All the other Probabilities (PP) for MrBayes. Alternative hypothe- events show similar levels of homoplasy (S = 0.27– ses were evaluated in an ML framework, using the 0.43, CI = 0.32–0.50). The partial IRBP sequence non-parametric SH test (Shimodaira & Hasegawa, yielded 1276 bp with 340 variable positions, 208 of 1999). which were informative. This gene is less saturated The molecular clock hypothesis was tested with a than the two mitochondrial loci with a moderate likelihood ratio test (Felsenstein, 1981). We used two (S = 0.45–0.56, CI = 0.55–0.67) to low (S = 0.86–0.99, palaeontological calibration points, based on the fossil CI = 0.73–0.89) level of saturation for the different records of Murinae in Eurasia. The oldest known events and codon positions. The product of S and CI murine fossils are dated at about 14 Mya, and gave multiplied by 1000 was used in the weighted parsi-

Table 2. Base composition, slope of saturation and consistency index for the 12S rRNA (partitioned into stems and loops), cytochrome b and IRBP (according to codon position) sequences used

12S rRNA Cytochrome b IRBP

Loops Stems Position 1 Position 2 Position 3 Position 1 Position 2 Position 3

Base composition A 46.9 26.4 29.8 20.4 43.4 20.5 26.7 14.4 C 18.7 22 24 24.1 31.7 28.5 24.5 34.8 G 11.2 23.8 21.6 12.8 2.6 38.2 18.4 34 T 23.2 27.8 24.6 42.7 22.3 12.8 30.4 16.8 Slope (S)/CI TS 0.43/0.45 0.41/0.52 0.27/0.32 0.43/0.50 0.11/0.21 0.86/0.73 0.56/0.63 0.45/0.55 TV 0.41/0.42 0.61/0.9 0.63/0.55 0.44/0.86 0.38/0.33 0.93/0.78 0.99/0.89 0.55/0.67

© 2005 The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427 MOLECULAR PHYLOGENY OF MUS 421 mony analysis. The incongruence length difference Within the subgenus Mus, the three genes support a test indicated that there was no incongruence between division into two clades, the ﬁrst one with musculus, the three genes (P = 0.36). The concatenation of these spicilegus, spretus and famulus, the second one with three genes yielded 3306 bp for 23 taxa, and 1039 vari- caroli, cervicolor and cookii. Cytochrome b and IRBP able positions (760 informative). provide congruent topologies in which cervicolor and cookii are closely related, whereas the 12S rRNA supports a cookii–caroli grouping. Within the Eurasian MOLECULAR PHYLOGENY Mus, musculus and spicilegus are sister-taxa for the The results of the analyses for each gene are presented 12S rRNA and the cytochrome b, whereas the relation- in Figure 1. All three genes support the monophyly of ships of these two species and spretus remain unre- the genus Mus and of each of the four subgenera. They solved with IRBP. The IRBP appeared to be a good also support a closer association between Mus and marker for the most basal nodes (see the high values Apodemus than between Mus and Rattus. The main of support for the monophyly of Mus and Apodemus), difference between the three topologies concerns the whereas the cytochrome b performed best for the rela- relationships between the subgenera, and within Mus tionships between closely related species, the 12S and Nannomys. The three genes provide different rRNA being on the whole the least powerful. arrangements for the four subgenera, none of which is The ML tree resulting from the combined analysis of robustly supported (Fig. 1). Within Nannomys, the the three markers is presented in Figure 2. Its topol- cytochrome b and IRBP genes provide the same topology is congruent with the consensus trees derived ogy with high support values: setulosus is rooted at the from the MP and the Bayesian analyses. Most of the most basal position, mattheyi is grouped with haussa, nodes are robustly supported by all methods with the and indutus with musculoides. The alternative topol- exception of the basal divergence within the genus ogy shown by the 12S rRNA is poorly supported. Mus. Within the Murinae, the genus Mus is more

12S rRNA Cytochrome b IRBP

Acomys cahirinus Acomys cahirinus Acomys cahirinus Lophuromys sikapusi Lophuromys sikapusi Lophuromys sikapusi Mus M. famulus Mus M. famulus Mus M. famulus Mus M. spretus Mus M. spretus Mus M. musculus Mus M. musculus Mus M. musculus Mus M. spicilegus Mus M. spicilegus Mus M. spicilegus Mus M. spretus Mus M. cervicolor Mus M. caroli Mus M. caroli Mus M. caroli Mus M. cervicolor Mus M. cervicolor Mus M. cookii Mus M. cookii Mus M. cookii Mus C. crociduroides Mus P. cf. saxicola Mus N. setulosus Mus C. pahari Mus P. platythrix Mus N. mattheyi Mus N. setulosus Mus N. setulosus Mus N. haussa Mus N. musculoides Mus N. indutus Mus N. musculoides Mus N. mattheyi Mus N. musculoides Mus N. indutus Mus N. haussa Mus N. mattheyi Mus C. pahari Mus N. indutus Mus N. haussa Mus C. crociduroides Mus P. platythrix Mus C. pahari Mus P. platythrix Mus P. cf. saxicola Mus C. crociduroides Mus P. cf. saxicola Apodemus mystacinus Apodemus mystacinus Apodemus mystacinus Apodemus flavicollis Apodemus flavicollis Apodemus sylvaticus Apodemus sylvaticus Apodemus sylvaticus Apodemus flavicollis Leopoldamys edwarsi Rattus norvegicus Leopoldamys edwarsi Rattus norvegicus Leopoldamys edwarsi Rattus norvegicus

0.1 0.1 0.1

Figure 1. Maximum likelihood tree for each gene. A black circle indicates a node that is supported by BP (maximum likelihood and maximum parsimony) > 90%, and PP > 0.90, and an empty circle BP and PP values between 50 and 90%. The double slash on the branch leading to the outgroups indicates that its length has been divided by two. Names of the subgenera are abbreviated as follows: M., Mus; P., Pyromys; C., Coelomys; N., Nannomys.

Lophuromys sikapusi

Acomys cahirinus Mus famulus 93/94/+11 91/1.00 Mus spretus

86/100/+24 100/100/+34 Mus musculus 95/84/+4 100/ 1.00 100/ 1.00 96/0.98 Mus spicilegus Mus

Mus caroli 35/38/0 31/0.86 73/65/+3 Mus cervicolor 62/78/+5 72/0.99 86/1.00 Mus cookii 41/36/0 40/0.96 Mus platythrix 100/100/+91 Pyromys 100/0.96 Mus cf saxicola

Mus crociduroides 100/100/+67 100/100/+68 Coelomys 100/ 1.00 100/ 1.00 Mus pahari

Mus setulosus

Mus haussa 92/99/+14 95/92/+10 100/100/+68 99/1.00 68/0.99 100/ 1.00 Mus mattheyi Nannomys 99/100/+22 Mus indutus 100/1.00 50/83/+6 87/1.00 Mus musculoides

Apodemus mystacinus 100/100/+47 100/ 1.00 Apodemus flavicollis 100/100/+67 100/ 1.00 Apodemus sylvaticus

Leopoldamys edwarsi 99/99/+35 100/1.0 Rattus norvegicus 0.1

Figure 2. Maximum likelihood tree based on the combined analysis of 12S rRNA, cytochrome b and IRBP. The topology is the same as the consensus tree obtained by the Bayesian and maximum parsimony methods. Subgeneric names within Mus are indicated on the right. The double slash on the branch leading to the outgroups indicates that its length has been divided by two. The robustness of each node is indicated as follows: BPMP/BPwMP/BS (above), BPML/PP (below). closely related to Apodemus than to the Rattus/Leopol- The two mitochondrial cytochrome b sequences (this damys group. The genus Mus as well as the subgenera study) are similar to that published by Lundrigan Mus, Coelomys and Nannomys are robustly supported et al. (2002) under the name saxicola. A more thor- (BP = 86–100, BS = +24–68, PP = 1.00). Within the ough morphological re-examination of the specimens, genus Mus, the early offshoot is Nannomys, then if available, might be necessary for a definitive Coelomys and Pyromys branch off, Pyromys being the identification. most closely related to Mus. It is of note that the support values for the relationships between the subgenera all fall below 50% except for the Bayesian PP. In DIVERGENCE TIME ESTIMATES addition, none of the alternative topologies is rejected As the likelihood ratio test did not reject the molecular by the Shimodaira–Hasegawa test (P = 0.38–0.84). clock hypothesis (2DLnL = 29.8, d.f. = 21, P = 0.09), we Thus, if the monophyly of each of the subgenera is reconstructed a phylogeny under this hypothesis strongly supported by our analyses, the relationships (Fig. 3). Using both calibration points, we obtained a between the four subgenera cannot be resolved with timescale for the different divergence events, the strong support. dates provided by the two calibration points being con- The subgenus Mus is split into a Eurasian clade gruent. The genus Mus diverged from Apodemus with musculus, spicilegus and spretus grouped with about 11 Mya, and the divergence between the four famulus, and an Asian clade comprising cervicolor, subgenera within Mus took place between 7.8 and cookii and caroli. Within Nannomys, setulosus is at the 6.8 Mya. The two lineages within the subgenus Mus base of the clade, mattheyi grouped with haussa and diverged 5 Mya with subsequent divergences giving indutus with musculoides. The two samples of the sub- rise to extant taxa occurring 4.4–4.2 Mya. The split genus Pyromys that were classified as two different between the two Coelomys species occurred 3.0 Mya, species may in fact be members of the same species. whereas the radiation within Nannomys started

Mus famulus Mus spretus Mus musculus Mus Mus spicilegus Mus caroli Mus cervicolor Mus cookii Mus platythrix Pyromys Mus cf. saxicola Mus crociduroides Coelomys Mus pahari Mus setulosus Mus haussa Mus mattheyi Nannomys Mus indutus Mus musculoides Apodemus mystacinus Apodemus flavicollis Apodemus sylvaticus Leopoldamys edwarsi Rattus norvegicus Lophuromys sikapusi Acomys cahirinus Million years 15 10 5 0

Figure 3. Maximum likelihood tree reconstructed with a molecular clock hypothesis. Subgeneric names within Mus are indicated on the right. The divergence time estimates derived from the two calibration points (stars) are similar.

5 Mya with additional divergence events dated Our analyses indicate that the genus Mus is more between 4 and 3 Mya. closely related to Apodemus than to Rattus. This relationship is in agreement with DNA–DNA hybridization (She et al., 1990; Catzeﬂis & Denys, 1992) and DISCUSSION other sequence data (Michaux et al., 2002). However, THE GENUS MUS WITHIN MURINAE the taxonomic sampling within Murinae needs to be The monophyly of the genus Mus, comprising Mus, improved, as a recent study based on IRBP sequences Pyromys, Coelomys and Nannomys, is robustly sup- (Jansa & Weksler, 2004) has indicated that Mus is even ported with respect to Apodemus, Rattus and non- more closely related to species of the Mastomys group murine outgroups. Previous studies using smaller than to Apodemus, represented in their analyses by datasets, with fewer nucleotides and/or taxa, have also Tokudaia, the sister taxon of Apodemus (Suzuki, supported the monophyly of this genus (Catzeﬂis & Tsuchiya & Takezaki, 2000; Michaux et al., 2002). Denys, 1992; Lundrigan et al., 2002; Chevret et al., 2003). However, the generic status of the four subgenera has been questioned (Bonhomme et al., 1984). Our PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS WITHIN MUS results indicate that each of these four taxa consti- In agreement with the morphological data (Marshall, tutes a monophyletic group, and that the molecular 1977, 1986; Musser & Carleton, 1993), our analyses divergence between them is not larger than that provide strong support for the recognition of the four observed among the Apodemus species included in our subgenera within Mus: Mus, Pyromys, Coelomys and analyses (Figs 2, 3). Thus, we propose to conserve a Nannomys. Our results are congruent with previous subgeneric status for these four taxa. studies supporting the monophyly of the subgenus

Mus, based on allozymes (Bonhomme et al., 1984), Downs, 1989; Jacobs & Downs, 1994), and the oldest DNA–DNA hybridization (She et al., 1990; Chevret Nannomys fossil from East Africa dated at 3.3 Mya et al., 2003) and DNA sequencing (Lundrigan et al., (Sabatier, 1982; Wesselman, 1984) or perhaps earlier 2002; Chevret et al., 2003). Similarly, the relation- (cf. Mus at 4.5 Mya, Winkler, 2002). Our datings are ships within the subgenus Mus are concordant with older than those provided by DNA–DNA hybridization the phylogeny shown in previous analyses (She et al., (She et al., 1990; Catzeflis & Denys, 1992; Chevret 1990; Lundrigan et al., 2002; Chevret et al., 2003; et al., 2003), which may be partly due to the use of Guénet & Bonhomme, 2003). As in Lundrigan et al. 10 Mya as calibration point for the Mus/Rattus diver- (2002), we observed the same discrepancies between gence time in She et al. (1990) and Catzeflis & Denys nuclear and mitochondrial data for the relationships (1992). In her study of chromosomal diversity among within the Asian group. The IRBP dataset supports a Nannomys, Jotterand (1972) estimated that, due to cervicolor–cookii association, as did the nuclear genes the dispersal capacities of these mice, this subgenus sequenced by Lundrigan et al. (2002); in contrast, the started to colonize Africa at least 5 Mya. 12S rRNA gene indicates a close association between The radiation of the four subgenera took place caroli and cookii, the cytochrome b being less informa- between 7.8 and 6.8 Mya; interestingly, this is contem- tive with conflict between the MP and ML analyses, as poraneous with the extension of open habitats that observed in Lundrigan et al. (2002). These authors has led to numerous faunal changes in mammals suggested that this incongruence may reflect different (Flynn et al., 1995; Cerling et al., 1997; Patnaik, histories between the mitochondrial and nuclear 2003). Our timescale indicates that the migration of genomes. The monophyly of Coelomys had already the ancestor of the extant Nannomys from Asia to been demonstrated with a 12S rRNA dataset by Sour- Africa might have taken place between 8 and 6 Mya. rouille et al. (1995), and is here confirmed by the inclu- Palaeontologists suggest that this period coincides sion of additional nucleotides. However, these authors with the existence of a palaeobiogeographical province found no strong support for the monophyly of Nanno- at the Mio-Pliocene limit extending from East Africa mys represented in their analyses by only setulosus to India, which could have favoured such migrations and mattheyi (Sourrouille et al., 1995), whereas Chev- through the Arabian peninsula (Brandy, Sabatier & ret et al. (2003) with a larger Mus sampling and ML Jaeger, 1980; Tchernov, 1992; Flynn & Jacobs, 1999). analyses of 12S rRNA provide higher support for that In effect, between 7 and 5 Mya, an important faunal subgenus with values between 70 and 87%. Previous turnover in mammals occurred in Africa (Thomas, analyses have also supported a grouping of the African 1984; Winkler, 1994; Leakey et al., 1996; Hill, 1999), species in the separate subgenus Nannomys within which is interpreted to be the result of exchanges with the genus Mus (Bonhomme et al., 1982; Catzeflis & Asia and environmental modifications due to the ele- Denys, 1992), but the inclusion of five species of Nan- vation of the East African rift (Partridge, Wood & nomys has led to an even stronger support for the deMenocal, 1995). Regarding murine rodents, palae- monophyly of this subgenus. ontological evidence indicates that the fossil genus At the subgeneric level, the combined analysis indi- Saidomys migrated from Asia to Africa through the cates, although with low support, that Mus is most Arabian peninsula before 6 Mya (Brandy et al., 1980; closely related to Pyromys, an association that was Winkler, 1994, 1997, 2002), suggesting that the ances- also present in DNA–DNA hybridization analyses tor of Nannomys could have gone the same way. Envi- (She et al., 1990; Catzeflis & Denys, 1992; Chevret ronmental modifications may have been involved in et al., 2003) and the nuclear genes dataset of Lund- the important radiation within Nannomys between 6 rigan et al. (2002). However, these latter authors also and 3 Mya, as observed in other African Murinae such found (nuclear dataset and combined analyses) that as the Mastomys–Praomys complex (Lecompte, Nannomys, instead of Coelomys (this study) was more Granjon & Denys, 2002). closely related to the Mus–Pyromys grouping. It must be noted that the different genes independently sup- CONCLUSION port different topologies with low bootstrap values, as Our analyses indicate that adding more taxa and more in the analyses of Lundrigan et al. (2002), with the nucleotides did not satisfactorily improve the resolu- exception of one gene (Tcp-1) that strongly supported tion of the relationships between subgenera. Such dif- the topology (((Mus,Pyromys),Nannomys),Coelomys). ficulties may be inherent to the rapid radiation of these subgenera, which would result in a poorly sup- TIMESCALE ported phylogenetic signal. However, this study also Our datings within Mus do not contradict the palae- suggests that a switch to other types of molecular ontological data as they pre-date the oldest true Mus markers such as repetitive elements would be worth- fossil that appeared 5.7 Mya in Asia (Jacobs, Flynn & while given that they have proved to be very useful in

© 2005 The Linnean Society of London, Biological Journal of the Linnean Society, 2005, 84, 417–427 MOLECULAR PHYLOGENY OF MUS 425 analysing the recent radiation within another murine Brandy LD, Sabatier M, Jaeger JJ. 1980. Implications phy- genus: Rattus (Verneau, Catzeflis & Furano, 1997, logénétiques et biogéographiques des dernières découvertes 1998). A good knowledge of the phylogeny of Mus is de Muridae en Afganistan, au Pakistan et en Ethiopie. Geo- necessary to provide a robust framework for subse- bios 13: 639–643. quent chromosomal and morphological studies as well Bremer K. 1988. The limits of amino acid sequence data in as for palaeozoogeographical interpretations. angiosperm phylogenetic reconstruction. Evolution 42: 795– 803. Catzeflis FM. 1991. Animal tissue collections for molecular ACKNOWLEDGEMENTS genetics and systematics. Trends in Ecology and Evolution 6: We thank all the people who collected or donated the 168. tissue samples used in this study: François Bonho- Catzeflis FM, Denys C. 1992. The African Nannomys (Muridae) an early offshoot from the Mus lineage – Evidence mme, François Catzeflis, Jean-Marc Duplantier, Lau- from scnDNA hybridization and compared morphology. rent Granjon, Conrad Matthee, Claudine Montgelard, Israel Journal of Zoology 38: 219–231. Valérie Nancé, Annie Orth, Terry Robinson, Manuel Cerling TE, Harris JM, MacFadden BJ, Leakey MG, Ruedi, Bruno Sicard and Cao Van Sung. This work Quade J, Eisenmann V, Ehleringer JR. 1997. Global veg- benefited from the financial support of the Génopole etation change through the Miocene/Pliocene boundary. Montpellier Languedoc-Roussillon, and the Action Nature 389: 153–158. Bioinformatique inter-EPST [2000–2002] of the CNRS Chevret P, Catzeflis F, Michaux JR. 2001. ‘Acomyinae’: new as well as a CNRS-NRF collaboration with T. Robinson molecular evidences for a muroid taxon (Rodentia: Muridae). (South Africa). This is contribution ISEM 2004-026 of In: Denys C, Granjon L, Poulet A, eds. Proceedings of the 8th Institut des Sciences de l’Evolution de Montpellier ASM Symposium. Paris: IRD Editions, 109–126. (UMR 5554–CNRS). Chevret P, Jenkins P, Catzeflis F. 2003. Evolutionary systematics of the Indian mouse Mus famulus Bonhote, REFERENCES 1898: molecular (DNA/DNA hybridization and 12S rRNA sequences) and morphological evidences. Zoological Journal Aguilar J-P, Michaux J. 1996. The beginning of the age of of the Linnean Society 137: 385–401. Murinae (Mammalia: Rodentia) in southern France. Acta Delsuc F, Scally M, Madsen O, Stanhope MJ, de Jong Zoologica Cracovia 39: 35–45. WW, Catzeflis FM, Springer MS, Douzery EJ. 2002. Auffray J-C, Orth A, Catalan J, Gonzalez J-P, Desmarais Molecular phylogeny of living xenarthrans and the impact of E, Bonhomme F. 2003. Phylogenetic position and descrip- character and taxon sampling on the placental tree rooting. tion of a new species of subgenus Mus (Rodentia, Mammalia) Molecular Biology and Evolution 19: 1656–1671. from Thailand. Zoologica Scripta 32: 119–127. Farris JS, Källersjö M, Kluge AG, Bult C. 1995. Testing sig- Barome P-O. 1998. Phylogéographie du genre Acomys nificance of incongruence. Cladistics 10: 315–319. (Rodentia, Muridae) fondée sur l’ADN mitochondrial. D Phil Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: Thesis, Paris XI University. a maximum likelihood approach. Journal of Molecular Evo- Barome P-O, Lymberakis P, Monnerot M, Gautun J-C. lution 17: 368–376. 2001. Cytochrome b sequences reveal Acomys minous Flynn LJ, Barry JC, Morgan ME, Pilbeam D, Jacobs LL, (Rodentia, Muridae) paraphyly and answer the question Lindsay EH. 1995. Neogene Siwalik mammalian lineages; about the ancestral karyotype of Acomys dimidiatus. Molec- species longevities, rates of change, and modes of speciation. ular Phylogenetics and Evolution 18: 37–46. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology 115: Berry RJ. 1995. An animal weed – man’s relationship with 249–264. the house mouse. In: Macdonald D, ed. The encyclopedia of Flynn LJ, Jacobs LL. 1999. Late Miocene small mammal mammals. New York: Facts on files, 664–665. faunal dynamics: the crossroads of the Arabian peninsula. Berry RJ, Scriven PN. 2005. The house mouse: a model and In: Whybrow PJ, Hill A, eds. Fossil vertebrates of Arabia. motor for evolutionary understanding. Biological Journal of New Haven: Yale University Press, 412–419. the Linnean Society 84: 335–347. Goertz G, Feldmann H. 1982. Nucleotide sequence of the Bibb MJ, Van Etten RA, Wright CT, Walberg MW, Clay- cytochrome b gene and adjacent regions from rat liver mito- ton DA. 1981. Sequence and gene organization of mouse chondrial DNA. Current Genetics 5: 221–225. mitochondrial DNA. Cell 26: 167–180. Guénet J-L, Bonhomme F. 2003. Wild mice: an ever-increas- Bonhomme F, Catalan J, Britton-Davidian J, Chapman ing contribution to a popular mammalian model. Trends in VM, Moriwaki K, Nevo E, Thaler L. 1984. Biochemical Genetics 19: 24–31. diversity and evolution in the genus Mus. Biochemical Hänni C, Laudet V, Catzeflis F. 1995. Evolutionary relation- Genetics 22: 275–303. ships of Acomys and other murids (Rodentia, Mammalia) Bonhomme F, Catalan J, Gautun JC, Petter F, Thaler L. based on complete 12S rDNA mitochondrial gene sequence. 1982. Caractérisation biochimique de souris africaines Israel Journal of Zoology 41: 131–146. référables au sous-genre Nannomys Peters, 1876. Mammalia Hassanin A, Lecointre G, Tillier S. 1998. The ‘evolutionary 46: 110–113. signal’ of homoplasy in protein-coding gene sequences and its

consequences for a priori weighting in phylogeny. Comptes netic implications. Journal of Zoological Systematics and Rendus de l’Académie ses Sciences, Paris – Série III 321: 611– Evolutionary Research 40: 8–25. 620. Lundrigan BL, Jansa SA, Tucker PK. 2002. Phylogenetic Hassanin A, Pasquet E, Vigne J-D. 1998. Molecular system- relationships in the genus Mus, based on paternally, mater- atics of the subfamily Caprinae (Artiodactyla, Bovidae) as nally, and biparentally inherited characters. Systematic Biol- determined from cytochrome b sequences. Journal of Mam- ogy 51: 410–431. malian Evolution 5: 217–236. Macholán M. 2001. Multivariate analysis of morphometric Hill A. 1999. Late Miocene sub-saharan African vertebrates, variation in Asian Mus and sub-saharan Nannomys (Roden- and their relation to the Baynunah fauna, Emirate of Abu tia: Muridae). Zoologischer Anzeiger 240: 7–14. Dhabi, United Arab Emirates. In: Whybrow PJ, Hill A, eds. Marshall JT. 1977. A synopsis of Asian species of Mus (Roden- Fossil vertebrates of Arabia. New Haven: Yale University tia, Muridae). Bulletin of the American Museum of Natural Press, 420–429. History 158: 175–220. Huchon D, Madsen O, Sibbald MJ, Ament K, Stanhope Marshall JT. 1981. Taxonomy. In: Foster HL, Small JD, Fox MJ, Catzeflis F, de Jong WW, Douzery EJ. 2002. Rodent JG, eds. The mouse in biomedical research, Vol. 1. New York: phylogeny and a timescale for the evolution of Glires: evi- Academic Press, 17–26. dence from an extensive taxon sampling using three nuclear Marshall JT. 1986. Systematics of the genus Mus. In: Potter genes. Molecular Biology and Evolution 19: 1053–1065. M, Nadeau JH, Cancro MP, eds. The wild mouse in immu- Huelsenbeck JP, Ronquist F. 2001. MrBAYES: Bayesian nology. Berlin: Springer Verlag, 12–18. inference of phylogenetic trees. Bioinformatics 17: 754–755. Martin Y, Gerlach G, Schlotterer C, Meyer A. 2000. Molec- Jacobs LL, Downs WR. 1994. The evolution of murine ular phylogeny of European muroid rodents based on com- rodents in Asia. In: Tomida Y, Li CK, Setoguschi T, eds. plete cytochrome b sequences. Molecular Phylogenetics and Rodent and lagomorph families of Asian origins and their Evolution 16: 37–47. diversification. Tokyo: National Science Museum Mono- Matsubara K, Nishida-Umehara C, Kuroiwa A, Tsuchiya graph, 149–156. K, Matsuda Y. 2003. Identification of chromosome rear- Jacobs LL, Flynn LJ, Downs WR. 1989. Neogene rodents of rangements between the laboratory mouse (Mus musculus) southern Asia. In: Black CC, Dawson MR, eds. Papers on fos- and the Indian spiny mouse (Mus platythrix) by comparative sil rodents in honor of Albert Elmer Wood. Los Angeles: Nat- FISH analysis. Chromosome Research 11: 57–64. ural History Museum Los Angeles County, 157–177. Michaux J, Aguilar J-P, Montuire S, Wolff A, Legendre S. Jacobs LL, Pilbeam D. 1980. Of mice and men: fossil-based 1997. Les Murinae (Rodentia, Mammalia) néogènes du Sud divergence dates and molecular ‘Clocks’. Journal of Human de la France: évolution et paléoenvironnements. Geobios 20: Evolution 9: 551–555. 379–385. Jaeger J-J, Tong H, Denys C. 1986. Age de la divergence Michaux JR, Chevret P, Filippucci M-G, Macholan M. Mus–Rattus: comparaison des données paléontologiques et 2002. Phylogeny of the genus Apodemus with a special moléculaires. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences, emphasis to the subgenus Sylvaemus using the nuclear Paris – Série II 302: 917–922. IRBP gene and two mitochondrial markers: cytochrome b Jansa SA, Weksler M. 2004. Phylogeny of muroid rodents: and 12s rRNA. Molecular Phylogenetics and Evolution 23: relationships within and among major lineages as deter- 123–136. mined by IRBP gene sequences. Molecular Phylogenetics and Montgelard C, Bentz S, Tirard C, Verneau O, Catzeflis Evolution 31: 256–276. FM. 2002. Molecular systematics of Sciurognathi (Rodentia): Jotterand M. 1972. Le polymorphisme chromosomique des the mitochondrial cytochrome b and 12S rRNA genes sup- Mus (Leggadas) africains. Cytogénétique, zoogéographie, port the Anomaluroidea (Pedetidae and Anomaluridae). évolution. Revue Suisse de Zoologie 79: 287–359. Molecular Phylogenetics and Evolution 22: 220–233. Jotterand-Bellomo M. 1984. New developments in verte- Musser GG, Carleton MD. 1993. Family Muridae. In: Wilson brate cytotaxonomy. VII. Les chromosomes des rongeurs DE, Reeder DM, eds. Mammal species of the world. A taxo- (ordre Rodentia, Bowdich, 1821). Genetica 64: 3–63. nomic and geographic reference. Washington, DC: Smithso- Kobayashi M, Seki T, Yaginuma K, Koike K. 1981. Nucle- nian Institution Press, 501–755. otide sequences of small ribosomal RNA and adjacent trans- Partridge TC, Wood BA, deMenocal PB. 1995. The influ- fer RNA genes in rat mitochondrial DNA. Gene 16: 297–307. ence of global climatic change and regional uplift on large- Leakey MG, Feibel CS, Bernor RL, Harris JM, Cerling mammalian evolution in East and Southern Africa. In: Vrba TE, Stewart KM, Storrs GW, Walker A, Werdelin L, ES, Denton GH, Partridge TC, Burckle LH, eds. Paleoclimate Winkler AJ. 1996. Lothagam: a record of faunal change in and human evolution, with emphasis on human origins. the Late Miocene of East Africa. Journal of Vertebrate Pale- New-Haven: Yale University Press, 331–355. ontology 16: 556–570. Patnaik R. 2003. Reconstruction of Upper Siwalik palaeoecol- Lecointre G, Philippe H, Vân Lê HL, Le Guyader H. 1993. ogy and palaeoclimatology using microfossil palaeocommu- Species sampling has a major impact on phylogenetic infer- nities. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology ence. Molecular Phylogenetics and Evolution 2: 205–224. 197: 133–150. Lecompte E, Granjon L, Denys C. 2002. The phylogeny of Petter F. 1963. Contribution à la connaissance des souris the Praomys complex (Rodentia: Muridae) and its phyloge- africaines. Mammalia 27: 602–607.

Petter F. 1981. Les souris africaines du groupe sorella Suzuki H, Tsuchiya K, Takezaki N. 2000. A molecular (Rongeurs, Muridés). Mammalia 45: 313–320. phylogenetic framework for the Ryukyu endemic rodents Philippe H. 1993. MUST: a computer package of management Tokudaia osimensis and Diplothrix legata. Molecular Phylo- utilities for sequences and trees. Nucleic Acids Research 21: genetics and Evolution 15: 15–24. 5264–5272. Swofford DL. 1999. PAUP*: phylogenetic analysis using par- Posada D, Crandall KA. 1998. MODELTEST: testing the simony (*and other methods), Version 4.0b. Sunderland, MA: model of DNA substitution. Bioinformatics 14: 817–818. Sinauer Associates. Potter M. 1986. Listing of stocks and strains of mice in the Tchernov E. 1992. The Afro-Arabian component in the levan- genus Mus derived from feral state. Current Topics in Micro- tine mammalian fauna- a short biogeographical review. biology and Immunology 127: 373–379. Israel Journal of Zoology 38: 155–192. Poux C, Douzery EJP. 2004. Primate phylogeny, evolution- Thomas H. 1984. Les Bovidae (Artiodactyla: Mammalia) du ary rate variations, and divergence times: a contribution Miocène du sous-continent indien, de la péninsule Ara- from the nuclear gene IRBP. American Journal of Physical bique et de l’Afrique: Biostratigraphie, biogéographie et Anthropology 124: 1–16. écologie. Paleogeography, Paleoclimatology, Paleoecology 45: Sabatier M. 1982. Les Rongeurs du site Pliocène à hominidés 251–299. de Hadar (Ethiopie). Paleovertebrata 12: 1–56. Tucker PK, Sandstedt SA, Lundrigan BL. 2005. Phyloge- Serizawa K, Suzuki H, Tsuchiya K. 2000. A phylogenetic netic relationships in the subgenus Mus (genus Mus, family view on species radiation in Apodemus inferred from varia- Muridae, subfamily Murinae): examining gene trees and spe- tion of nuclear and mitochondrial genes. Biochemical Genet- cies trees. Biological Journal of the Linnean Society 84: 653– ics 38: 27–40. 662. She J-X, Bonhomme F, Boursot P, Thaler L, Catzeflis F. Verneau O, Catzeflis F, Furano AV. 1997. Determination of 1990. Molecular phylogenies in the genus Mus: comparative the evolutionary relationships in Rattus sensu lato (Roden- analysis of electrophoretic, scnDNA hybridization, and tia: Muridae) using L1 (LINE-1) amplifications events. Jour- mtDNA RFLP data. Biological Journal of the Linnean Soci- nal of Molecular Evolution 45: 424–436. ety 41: 83–103. Verneau O, Catzeflis F, Furano AV. 1998. Determining and Shimodaira H, Hasegawa M. 1999. Multiple comparisons of dating recent rodent speciation events by using L1 (LINE-1) Log-Likelihoods with applications to phylogenetic inference. retrotransposons. Proceedings of the National Academy of Molecular Biology and Evolution 16: 1114–1116. Sciences, USA 95: 11284–11289. Sourrouille P, Hänni C, Ruedi M, Catzeflis FM. 1995. Wesselman HB. 1984. The Omo micromammals. In: Hecht Molecular systematics of Mus crociduroides an endemic MK, Szalay FS, eds. Contribution to vertebrate evolution. mouse of Sumatra (Muridae, Rodentia). Mammalia 59: 91– Basel: S. Karger, 1–219. 102. Winkler AJ. 1994. The middle/upper Miocene dispersal of Springer MS, Douzery E. 1996. Secondary structure and major rodent groups between Asia and Africa. In: Tomida Y, patterns of evolution among mammalian mitochondrial 12S Li CK, Setoguchi T, eds. Rodent and lagomorph families of rRNA molecules. Journal of Molecular Evolution 43: 357– Asian origins and diversification. Tokyo: National Science 373. Museum Monograph, 173–184. Stanhope MJ, Czelusniak J, Si JS, Nickerson J, Good- Winkler AJ. 1997. Systematics, paleobiogeography, and pale- man M. 1992. A molecular perspective on mammalian evo- oenvironmental significance of rodents from the Ibole mem- lution from the gene encoding interphotoreceptor retinoid ber, Manonga valley, Tanzania. In: Harrison T, ed. Neogene binding protein, with convincing evidence for bat monophyly. paleontology of the Manonga Valley, Tanzania. New York: Molecular Phylogenetics and Evolution 1: 148–160. Plenum Press, 311–332. Sullivan J, Holsinger KE, Simon C. 1995. Among-site rate Winkler AJ. 2002. Neogene paleobiogeography and East Afri- variation and phylogenetic analysis of 12S rRNA in Sigmo- can paleoenvironments: contributions from the Tugen Hills dontine rodents. Molecular Biology and Evolution 12: 988– rodents and lagomorphs. Journal of Human Evolution 42: 1001. 237–256.

Article 2 :

Extensive genome repatterning in the genus Mus (Rodentia; Muridae) inferred from multidirectional cross-species chromosome painting. When chromosomes come to the help of molecular phylogeny and vice versa.

Veyrunes F, O’Brien PCM, Dobigny G, Catalan J, Yang F, Robinson TJ, Britton-Davidian J. soumis.

Molecular Biology and Evolution

64 Extensive genome repatterning in the genus Mus (Rodentia; Muridae) inferred from multidirectional cross-species chromosome painting. When chromosomes come to the help of molecular phylogeny and vice versa.

Frédéric Veyrunes (1), Gauthier Dobigny (2, 3), Fengtang Yang (4, 5), Patricia C. M. O’Brien

(4), Josette Catalan (1), Terence J. Robinson (2), Janice Britton-Davidian (1).

(1) Institut des Sciences de l'Evolution (UMR5554), Génétique & Environnement, Université Montpellier II, Montpellier, France (2) Evolutionary Genomics Group, Department of Zoology, University of Stellenbosch, South Africa (3) Centre de Biologie et Génétique des Populations (UMR022), Campus de Baillarguet, Prades-le-Lez, France (4) Centre for Veterinary Science, Cambridge University, Cambridge, UK (5) Current address: Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK

Correspondence and reprint requests: Janice Britton-Davidian

Fax : + 33 4 67 14 36 22

Tel : + 33 4 67 14 39 10 e-mail : [email protected]

The house mouse, which belongs to the genus Mus , is universally adopted as the mammalian laboratory model, and thus, represents an index species for most of large-scale comparative studies, notably in genomics. Paradoxically, within this genus, phylogenetic relationships between the four subgenera (i.e. Mus , Coelomys , Nannomys , Pyromys ) still remained elusive despite numerous previous studies; either genome organization comparison between the four subgenera is absent. Thus, we performed multidirectional chromosome painting by including representatives of three to the four subgenera of the genus Mus . Comparative genome maps between these species were established by fluorescence in situ hybridization (FISH) using house mouse chromosome-specific painting probes and those of Nannomys minutoides derived from flow-sorted chromosomes. We also included in the analyses already published data for the fourth subgenus. The molecular cytogenetic results with the complement of three additional Murinae species as outgroups allowed to perform a phylogenomic study which yielded for the first time to strongly resolved subgeneric relationships, i.e. Coelomys is the first subgenus to diverge, followed by Nannomys , then Mus and Pyromys . In addition, the study revealed an extremely high rate of karyotypic evolution compared to the rest of the mammals, even within the Murinae. This rate is non-constant through the time, since a further important acceleration (ten to thirty times higher) is noted during one million years, which is concomitant with the cladogenesis events. The karyotypic evolution was realized in majority by translocations events. Among these rearrangements, we identified no less than 16 that necessitated new centromere locations. By tracking these rearrangements throughout the phylogeny, the nature of these new centromeres can be ascertained: 14 require neocentromere formation, and two (at least) may involve reactivation of latent centromeres. Hence, by integrating closely related species within Mus , this study allowed (i) to resolve without ambiguity this long-standing controversial phylogeny, (ii) to assess more precisely the chromosome evolution of the house mouse, and (iii) to highlight genomic areas of interest for high resolution studies on neocentromere and synteny breakpoints, and their involvement in restructuring the mouse genome.

Keywords : reciprocal chromosome painting; fluorescence in situ hybridization; Mus ;

Nannomys ; Coelomys ; chromosomal phylogeny; neocentromere

66 Introduction

In the last decade, considerable advances have been made in understanding mammalian genomic architecture through multi-species genome sequencing initiatives, as well as through technical advances in chromosome painting. Large-scale comparative mapping analyses have focused primarily on the three mammalian species for which the most complete genomic data are available: human, mouse and rat. Investigations have shown that

(i) the random breakage model of genome evolution (Nadeau and Taylor, 1984) is flawed, since extensive breakpoint reuse is apparent (Pevzner & Tesler, 2003; Bailey et al., 2004;

Bourque et al., 2004; Zhao et al., 2004), (ii) centromeric shifts and/or neo-centromere formation are relatively common (Ventura et al., 2001, 2003, 2004; Murphy et al., 2005), and

(iii) rates of chromosomal repatterning show considerable variation among lineages (O’Brien et al., 1999; Murphy et al., 2005). However, bio-informatic approaches are limited by the availability of sequenced genomes. In contrast, cross-species chromosome painting comparisons, i.e. ZOO-FISH analyses (flow-sorted chromosomes probes labelled with fluorescence and hydridized in situ to chromosomes of another target species) have provided genomic information, albeit at a far lower resolution, on species spanning most of the twenty modern orders of mammals. The utility of this approach has led to attempts to determine the ancestral karyotype for Placentalia (Chowdhary et al., 1998, Richard et al., 2003a; Yang et al.,

2003a), as well as for Boreoeutheria and the Euarchonta ancestors (Froenicke, 2005; Fronicke et al., in press). In addition, chromosome painting is of significant value in species for which no gene mapping data are available, since it allows for the extrapolation from known genomic maps (e.g. human, mouse) into “gene-poor-mapped” species with good accuracy. Most comparisons of genome organization between mammals have involved human chromosome paints, while those using the house mouse as the index species are relatively scarce despite the biomedical and genomic importance of this species, and have only recently started

67 accumulating (see below). The lack of interest in this rodent is attributed to its highly fragmented and rearranged karyotype compared to that of the human and other mammals

(Stanyon et al., 1999; Nilsson et al., 2001; Gregory et al., 2002). As this feature is shared with the rat genome, it has generally been extended to include to all rodents (e.g. O’Brien et al.,

1999; Bourque et al., 2004). However, recent studies have shown that this does not hold for all rodents, since squirrels exhibit a highly conserved genome organization (Richard et al.,

2003b; Stanyon et al., 2003), narrowing the extensive chromosomal change to the Muridae family within rodents which rats and mice belong to. Several ZOO-FISH comparisons between Mus and other rodent genera have been undertaken: Rattus norvegicus (Guilly et al.,

1999; Grutzner et al., 1999; Stanyon et al., 1999), Rattus rattus (Cavagna et al., 2002),

Cricetulus griseus (Yang et al., 2000), Otomys irroratus (Engelbrecht et al., 2006),

Rhabdomys pumilio (Rambau and Robinson, 2003), Apodemus species (Matsubara et al.,

2004; Stanyon et al., 2004). While these have shed some insight into our understanding of the origin and nature of the extensive repatterning in the house mouse genome the investigations have not been extended to closely related species within the genus Mus . The only exception to this has been M. platythrix which falls within the subgenus Pyromys (Matsubara et al., 2003).

The genus Mus (Rodentia, Muridae, Murinae) is a highly speciose murid genus which exhibits extensive chromosomal evolution (e.g. Marshall, 1977; Capanna, 1982; Hauffe and

Searle, 1993; Britton-Davidian et al., 2000; Veyrunes et al., 2004; Pialek et al., 2005). It comprises several species which are potential reservoirs for human diseases (e.g. Childs et al.,

1992; Matthias and Levett, 2002), and includes M. musculus the cosmopolitan commensal species universally adopted as the mammalian laboratory model (Berry and Scriven, 2005).

This genus encompasses at least 40 species divided into four subgenera: Mus sensu stricto,

Nannomys , Coelomys and Pyromys (Musser and Carleton, 1993). The Palaearctic subgenus

Mus is by far the most extensively studied, and consists of nine species to which three

68 additional ones have recently been added; Mus fragilicauda from Thailand (Auffray et al.,

2003), Mus famulus which was previously included in the subgenus Coelomys (Chevret et al.,

2003), and a new species from the Island of Cyprus currently the subject of formal description

(Bonhomme et al., 2004). The three other subgenera are less well known. The subgenus

Nannomys , the African pygmy mice, has a sub-Saharan distribution and comprises 19 recognized species (Musser and Carleton, 1993). The two last subgenera are restricted to the

Indian subcontinent and South-Eastern Asia: Pyromys, the spiny mice with five species, and

Coelomys or shrew mice with four species (Musser and Carleton, 1993; Chevret et al., 2003).

The Mus genus has been the focus of a plethora of phylogenetic studies (e.g. Bonhomme,

1986, 1992; Jouvin-Marche et al., 1988; She et al., 1990; Catzeflis and Denys, 1992; Boursot et al., 1993; Sourrouille et al., 1995; Lundrigan et al., 2002; Chevret et al., 2003, 2005; Suzuki et al., 2004; Veyrunes et al., 2005). However, whereas the monophyly of the genus and of each of the four subgenera are clearly established, the relationships between them are still unresolved, despite the variety of molecular markers used, including allozymes, DNA RFLPs,

DNA/DNA hybridization, mitochondrial and nuclear DNA sequences (see references cited above). Even the sequencing of no less than six paternally, maternally and biparentally inherited genes failed to provide strong support for the inter-subgeneric relationships

(Lundrigan et al., 2002). This lack of resolution most likely reflects the rapid radiation of these four clades. Thus, new genetic markers are required to resolve these phylogenetic uncertainties. Chromosomal rearrangements appear as the ideal candidates as they are considered to be Rare Genomic Changes sensu Rokas and Holland (2000), and provide cladistic signatures with very low levels of homoplasy (e.g. O’Brien et al., 1999; Wienberg,

2004; Murphy et al., 2004). In effect, ZOO-FISH comparative chromosome painting constitutes a powerful and elegant method for both detecting chromosome homologies

69 between species, and resolving long-standing phylogenetic controversies such as within the

Carnivora or Primate orders (Nie et al., 2002; de Oliveira et al., 2002; Muller et al., 2003).

In the present study, a multidirectional chromosome painting analysis is performed between three subgenera of Mus ( Nannomys , Coelomys and Mus ). By including published data for the fourth subgenus ( Pyromys ; Matsubara et al. 2003), and using available rodent species as outgroups (Cavagna et al., 2002; Rambau and Robinson, 2003; Matsubara et al.,

2004), a chromosomal phylogeny is reconstructed following three aims: i) to test the performance of chromosomal rearrangements in resolving the phylogenetic relationships between the subgenera of Mus ; ii) to infer the ancestral karyotype of the genus Mus for use in future comparisons with other taxa within murids and rodents, and finally, iii) to gain insight into patterns and processes of genome organization and evolution leading to the house mouse karyotype, the index species for much of biomedical research.

Material & Methods

Animals

In order to avoid nomenclatural ambiguities we refer to subgenera to distinguish lineages (i.e Nannomys , Coelomys , Mus , Pyromys ) and not to the genus name ( Mus ).

The female Nannomys mattheyi , male N. minutoides , female Coelomys pahari , and male Mus musculus specimens used in this study were all wild-captured animals, and originated respectively from Samaya in Mali, Stellenbosch in South Africa, India (precise locality unknown), and Clapiers in France.

Chromosome preparation and identification

Chromosome preparations were made either from bone marrow of yeast-stimulated animals (i.e. N. mattheyi , C. pahari and M. musculus ), or fibroblast cell-cultures established

70 from skin biopsy following standard procedures (i.e. N. minutoides ). G-banded karyotypes were obtained after trypsin treatment as described by Seabright (1971). Identification of chromosomes was also accomplished by using DAPI-banding concurrently with in situ hybridization.

Flow sorting and chromosome-specific painting probes preparation

As cell-cultures of N. mattheyi were not available, flow sorting was performed for N. minutoides . Chromosomes of the latter species were prepared for sorting as described previously (Yang et al., 1997). The stained chromosome preparations were sorted on a dual laser cell sorter (FAC-Star Plus, Becton Dickinson). Flow-sorted chromosomes were used as templates for amplification by degenerate oligonucleotide-primed PCR (DOP-PCR; Telenius et al., 1992) using 6-MW primers (Yang et al., 1997). Primary DOP-PCR products were used as a source of template for the incorporation of biotin-16-dUTP (Boehringer).

Fluorescence in situ hybridization (FISH)

The complete sets of commercial chromosome-specific painting probes from the house mouse Mus musculus (Cambio) and those made from Nannomys minutoides were hybridized across species using the chromosome-painting scheme shown in Figure 1. Hybridization and detection were carried out following the procedure described in Yang et al. (1997).

Chromosome-specific probes (50 ng) were made up to 11 µl with hybridization buffer (50% deionized formamide, 10% dextran sulfate, 2 ×SSC, 0.5 mol l -1 phosphate buffer, pH 7.3, and

1×Denhardt’s solution). The probes were pepsinized (HCl 10mM + pepsin 0.01%) at 37°C for

5 min, denaturated at 65°C for 10 min and then preannealed at 37°C for 30 min. Metaphase slides were denaturated by incubation in 70% formamide/30% 2 ×SSC solution at 65°C for 2 min, quenched in ice-cold 70% ethanol, and dehydrated through a 70%, 80%, 90%, 100%

71 ethanol series. The pre-annealed paints were applied to slides, covered with 22 mm 2 cover- slips, sealed with rubber cement, and incubated for 24h at 37°C. Post-hybridization washes involved two 5 min incubations in 50% formamide/50% 2 ×SSC at 45°C followed by two 5 min incubations in 2 ×SSC at 45°C. Biotin-labelled probes were visualized using Cy3-avidin

(1:500 dilution, Amersham). Slides were then mounted in Vectashield mounting medium with

DAPI (Vector Laboratories). Images were captured using the Genus software (Applied

Imaging). Hybridization signals were assigned to specific chromosomal regions identified by

DAPI staining.

Phylogenetic analysis

The phylogenetic analysis was performed using the comparative chromosomal maps of Mus vs. Nannomys and Coelomys generated in the present investigation, and published data on Pyromys (Matsubara et al., 2003). Three additional Murinae species were included as outgroups: Rattus rattus (Cavagna et al., 2002), Rhabdomys pumilio (Rambau and Robinson,

2003) and Apodemus sylvaticus (Matsubara et al., 2004). [A subsequent ZOO-FISH analysis was published for A. sylvaticus by Stanyon et al. (2004) that revealed a few discrepancies between the two studies. We arbitrarily chose the former]. A summary of the species involved in the phylogenetic analysis is provided in Table 1. Contiguous chromosomal segment associations were used as characters to establish a binary data matrix (Table 2) following the procedure for encoding chromosomal data reviewed in Dobigny et al. (2004). We chose to exclude from the matrix the pericentromeric material homologous to Mus chromosome 14 on

Pyromys chromosomes 5, 8, and 12, which may consist of duplications of 18S-28S ribosomal

RNA genes (see Figure 1 in Matsubara et al., 2003; Thomas et al., 2003). In the absence of accurate information, we postulated that all characters had the same weight (i.e. same probability of appearance/fixation). The most parsimonious phylogenetic tree was obtained

72 using an exhaustive search in PAUP 4.0b10 (Swofford, 1999). The robustness of each node was assessed by bootstrap estimates after 1000 iterations.

RESULTS

G-banded karyotypes

The G-banded karyotypes of the Nannomys species have already been described in

Veyrunes et al. (2004): N. mattheyi has an all-acrocentric 2n = 36 karyotype, and N. minutoides has a diploid number of 2n = 18 in which all chromosomes including both sex chromosomes are biarmed. G-banding (Veyrunes et al., 2004) and chromosome painting analyses (data not shown) indicate that the lower diploid number in the latter species resulted exclusively from Robertsonian (Rb) fusions, in particular, sex chromosomes are involved in

Rb fusions with pair 1 to form the chromosomes Rb(X.1) and Rb(Y.1). The G-banded karyotype of Coelomys pahari represents the first ever published for this subgenus, and is composed of 48 acrocentric chromosomes. The size of the chromosomes varies continuously from large (pairs 1 to 5) to small (pairs 20 to 23). The X chromosome is medium-sized.

Flow-sorted karyotype of Nannomys minutoides

Figure 2 shows the flow karyotype of N. minutoides . Hoechst 33258- and

Chromomycin A3-stained chromosome suspensions were sorted on base-pair composition and chromosomal size. This resulted in 10 peaks which represent the eight autosomal pairs, plus

Rb(X.1) and Rb(Y.1). Identification of the different peaks was achieved by hybridizing DOP-

PCR generated probes onto DAPI-banded N. minutoides metaphases.

Reciprocal chromosome painting between Mus and Nannomys

73 All house mouse chromosome-specific probes successfully hybridized to the euchromatic regions of the pygmy mouse chromosomes (see Figure 3 for examples). The 19 autosomal and X paints defined 27 segments of homology between Mus and Nannomys .

Regions of homology are indicated on the G-banded karyotype of N. mattheyi (Figure 4).

Fourteen Mus chromosomes (2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 19, X) were retained as a single conserved block, five Mus probes (1, 9, 13, 17, 18) produced two signals, and finally the Mus chromosome 5 probe hybridized to three regions in the Nannomys karyotype. Nannomys mattheyi chromosomes 7, 10, 11, 12, 14 and X were entirely homologous to Mus chromosomes 3, 10, 11, 12, 16 and X respectively, while the most rearranged Nannomys chromosome was pair 2, formed by regions from four different Mus chromosomes (Figure 4).

Reciprocal chromosome painting ( Nannomys paints onto the Mus karyotype) was used to precisely define the genome-wide homologies that exist between these two subgenera.

Twenty-six homologous segments were detected, and summarized in Figure 6. In addition to confirming the chromosome painting results of the Mus probes, this procedure allowed us to assign subchromosomal segments present in Mus that correspond to multiple Nannomys chromosomes and vice versa. The only exception to this was chromosome 9 of Mus , which is homologous to parts of chromosomes 2 and 13 of Nannomys mattheyi but are present as a single fused chromosome in the Nannomys minutoides derived painting probe, Rb(2.13).

Chromosome painting of Mus and Nannomys probes onto Coelomys chromosomes

The 19 house mouse autosomal probes and the X paint produced hybridization signals that covered the entire euchromatic genome of C. pahari (see Figure 3 for examples) delineating 35 homologous segments (Figure 5). Nine Mus chromosomes (3, 6, 9, 12, 14, 16,

18, 19, X) showed complete synteny (i.e. retained as single sites of hybridization), seven (1, 2,

4, 10, 11, 15, 17) painted two chromosomal regions, and four (5, 7, 8, 13) detected three

74 segments in the Coelomys karyotype. Seven chromosomes were entirely conserved between

Coelomys and Mus , corresponding to 4, 7, 8, 10, 12, 15, X and 3, 12, 14, 9, 16, 18, X, respectively. The most rearranged Coelomys chromosome is pair 19, formed by four regions of two different Mus chromosomes (Figure 5).

The hybridization of Nannomys probes onto Coelomys chromosomes (not shown) revealed 30 homologous segments in perfect concordance with the preceding results and allowed us to assign several subchromosomal homologies between Mus and Coelomys (Figure

6) via the Nannomys karyotype (see painting scheme in Figure 1).

Phylogenetic analysis

The reciprocal painting results, with the complement of G-banding comparisons, allow us to identify most of the sub-regional homologies between the karyotypes of the three subgenera (Figure 6). The homologous adjacent segments (syntenic associations) identified between these species, and those published for Pyromys and the outgroups (see Table 1) were translated into 67 chromosomal characters (Table 2). The maximum parsimony analysis resulted in only one most parsimonious tree (74 steps long, consistensy index = 0.91, retention index = 0.79, homoplasy index = 0.09; Figure 7). The first subgenus to diverge is

Coelomys , followed by Nannomys , then Mus and Pyromys . There is no synapomorphy that supports the monophyly of the genus, resulting in the lowest bootstrap value (= 75) for this node. The two other nodes are more robust (= 97 and 98) and are supported by several chromosomal changes: i.e. four translocations, three fusions, and one inversion all provide strong support for the Nannomys/Mus/Pyromys cluster; and four translocations and one fusion characterize the Mus/Pyromys clade (see below and Figure 7). Semantically, we named translocation, the transfer of a fragment of one chromosome onto another chromosome, and fusion and/or fission, events involving two entire chromosomes.

DISCUSSION

Phylogenetic relationships

Despite the number of studies involved and the variety of molecular markers used (e.g.

Bonhomme, 1986, 1992; Jouvin-Marche et al., 1988; She et al., 1990; Catzeflis and Denys,

1992; Boursot et al., 1993; Sourrouille et al., 1995; Lundrigan et al., 2002; Chevret et al.,

2003, 2005; Suzuki et al., 2004; Veyrunes et al., 2005), an unambiguous phylogenetic tree for the genus Mus has remained elusive. The inability to conclusively resolve the evolutionary relationships most likely stems from the rapid separation of the four subgenera. As a consequence the resolution provided by nuclear gene sequences (which evolve too slowly), or mitochondrial loci (that suffer from high levels of homoplasy, and which lowers the phylogenetic signal in the deepest branches; Lundrigan et al., 2002) remains problematic. In such a context, subgeneric relationships within Mus were investigated using chromosomal rearrangements. They constitute alternative genetic markers with low levels of convergence and thus provide highly informative characters for elucidating phylogenies (Rokas and

Holland, 2000).

Our chromosomal phylogenetic analysis yielded a single most parsimonious tree in which the subgeneric relationships were accurately resolved for the first time (Figure 7).

Nodes were well supported by the standard method of bootstrap, and more importantly, each one was supported by several unique non-ambiguously identified chromosomal rearrangements providing strong confidence to the topology retrieved. The first subgenus to diverge is Coelomys , followed by Nannomys at the base of a Mus -Pyromys clade. This topology has previously been suggested by Lundrigan et al. (2002), using DNA sequences involving no less than six genes, but was not supported by strong bootstrap values (except for one nuclear marker Tcp-1). Other studies have also clustered Mus with Pyromys , although

76 with similarly weak support (Boursot et al., 1993; Catzeflis and Denys, 1992; Chevret et al.,

2005). Curiously, the lowest bootstrap value in our study (= 75) defines the monophyly of the genus, a node consensually supported by a variety of molecular data sets (e.g. Boursot et al.,

1993; Chevret et al., 2003, 2005; Lundrigan et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Veyrunes et al.,

2005).

Palaeontological and molecular data indicate that the genus Mus originated in Asia, with the oldest true-Mus fossil reported from Pakistan at the late Miocene (e.g. Flynn and

Jacobs, 1982; Suzuki et al., 2004; Chevret et al., 2005). The resolved cytogenetically-based phylogenetic tree allowed us to order the dispersal events that occurred during the evolution of the genus into four successive waves of colonization from Asia that occurred approximately 7 Myr ago (Chevret et al., 2005; Veyrunes et al., 2005), the first one to South-

Eastern Asia ( Coelomys ), followed by one to Africa via the Middle East ( Nannomys ), a third to Eurasia ( Mus ), and finally to South-East Asia and the Indian subcontinent ( Pyromys ).

Genome comparison and ancestral Mus karyotype

Although the genus Mus and particularly the house mouse is perhaps the most widely studied mammal in terms of chromosomal evolution (e.g. Capanna, 1982; Hauffe and Searle,

1993; Garagna et al., 1997; Britton-Davidian et al., 2000; Veyrunes et al., 2004; Capanna and

Castiglia, 2004; Pialek et al., 2005), comparisons between subgenera are very scarce. Thus, our cross-species multidirectional chromosome painting involving one representative species belonging to all four subgenera represents the first attempt to establish genome wide comparative chromosome maps in the genus. Moreover, comparison of these data with that for five other murid genera ( Cricetulus griseus : Yang et al., 2000 - Rattus species: Cavagna et al., 2002 - Rhabdomys pumilio : Rambau and Robinson, 2003 - Otomys irroratus : Engelbrecht et al., 2006 - Apodemus species: Matsubara et al., 2004) has shed light on shared primitive

77 and derived chromosomal syntenies in the murid lineage. The results reveal that drastic genome shuffles have occurred in the genus Mus . Several Mus autosomes are retained as complete chromosomes or chromosome blocks (e.g. 3, 12, 16, 19), whereas others have undergone considerable disruption (e.g. 5, 17). Mus chromosomes 3 and 19 are also conserved in toto in all outgroup species, as well as chromosome 12 in O. irroratus , Rattus and

Apodemus species, and 16 in R. pumilio karyotype. Chromosome 4 is also conserved in all species except O. irroratus and the Coelomys subgenus. In contrast, the small-sized chromosome 17 shows extensive fragmentation in all karyotypes, hybridizing to nine regions in the Chinese hamster chromosomes, eight in R. pumilio , four in O. irroratus , five in the black rat, and six in Apodemus . These results suggest that the synteny of mouse chromosome

17 evolved recently. Typically, the X chromosome is conserved across all taxa (Ohno, 1967;

Graves et al., 2002). Although intrachromosomal rearrangements are an important class of chromosome exchanges, they usually escape detection by chromosome painting (e.g. Murphy et al., 2004). However, the pattern shown by several syntenic associations allowed us to detect two inversion events. Thus, the 8/7/8/7 synteny on chromosome 19 of C. pahari provides evidence that a paracentric inversion occurred (see Figure 5). In the same way, the combination 13a/15/13b on chromosome 11 in this same species, which is also present in the

Apodemus karyotype (Matsubara et al., 2004), suggests that it is the ancestral state, and was subsequently modified by an inversion (13a +b/15) in the lineage leading to the three other

Mus subgenera (see Figures 6 and 7). The data allow us to reconstruct the likely ancestral karyotype of the genus Mus . This was done by mapping changes along the phylogenetic tree

(Figure 7) and inferring ancestral character states at the different nodes; i.e. shared syntenies between all ingroup species, or between at least one ingroup and an outgroup. The widespread associations 7/19, 10/17 and 13/15 found in species of all of the investigated genera, as well as the 5/11 synteny which is present in all species except in Rhabdomys and Otomys , suggest

78 that they were all present in the ancestral murid karyotype which is thus in agreement with

Stanyon et al. (2004). Remarkably, the 10/17 combination also exists in several non-rodent species, such as the cow, the cat and the human (HSA 6), which indicates a far more ancient origin for this synteny (Lyons et al., 1997). Interestingly, the widespread 13/15 synteny was expanded to include a second portion of mouse chromosome 13 resulting in the 13/15/13 association present in Apodemus (Matsubara et al., 2004; not detected in Stanyon et al. 2004) and in Coelomys . In addition, synteny 5/6 is also observed in Rattus and Apodemus , and 2/13 in Cricetulus and Rattus . Finally, the subgenera Coelomys and Nannomys share synteny 1/4 suggesting that it was present in the most recent ancestor of the genus Mus . In summary, the ancestral Mus karyotype is thought to consist of 2n = 46 acrocentric chromosomes (Figure 8).

It shares 13 autosomal pairs conserved in toto (block or synteny 7/19, 2, 3, 14, 10, 9, 11/5, 18,

2/13, 15, 8, 8, 17/10) with the 2n=54 ancestral murid karyotype proposed by Stanyon et al.

(2004). The extensive repatterning of the house mouse karyotype compared to that of the human has often led to its exclusion from most interspecific genomic comparisons (e.g.

Stanyon et al., 2003; Richard et al., 2003b). In contrast, the more representative Mus ancestral karyotype may be a helpful substitute for large-scale comparisons of genome organization.

The analysis of comparative synteny maps between these rodents indicates that several chromosomes and/or associations show a high degree of conservation despite the high rate of reorganization in this lineage, suggesting that they may be under selection against disruption of gene syntenies. On the other hand, others tend to be more prone to rearrangements during the course of evolution (see also Murphy et al., 2003). Thus, a survey of the gene content of these chromosomes may contribute to determine the processes that have shaped genome evolution in these rodents, feasible through the sequenced mouse genome (Waterston et al.,

2002).

79 Rates of genome repatterning in the genus Mus

Our analyses provide insight into patterns of chromosomal evolution in the genus Mus .

The 19 autosomal + X Mus probes detected 27 homologous segments in Nannomys (as between Mus and Pyromys ; Matsubara et al., 2003), and 35 in Coelomys . The degree of chromosome repatterning in these subgeneric comparisons is, remarkably, even higher than that between members of different carnivore families (cat and ferret; Cavagna et al., 2000), and is comparable to that between human and the aardvark (Afrotheria) which separated 100-

120 Myr ago (Madsen et al., 2001; Murphy et al., 2001) and for which the 22 human autosomal paints delimit 30 conserved segments (Yang et al., 2003a). These data provide additional support for higher rates of chromosomal reorganization in rodents and particularly murids, compared to other mammalian clades (e.g. Nie et al., 2002; Stanyon et al., 2003;

Yang et al., 2003a; Wienberg, 2004). However, these results further highlight that, even within the murid lineage, the evolution of genome structure in the genus Mus is remarkably extensive. For example, the 20 mouse paints (19 autosomes plus X) revealed 37 homologous segments in both Rattus rattus and Apodemus sylvaticus (Cavagna et al., 2002; Matsubara et al., 2004), which is only slightly higher than in Coelomys (= 35), but the divergence of Mus from both Rattus and Apodemus occurred 11-12 Myr ago, which is twice that estimated between the two subgenera of Mus (Suzuki et al., 2004; Chevret et al., 2005; Veyrunes et al.,

2005). Moreover, a cross-specific chromosome painting survey in Apodemus , the only other

Eurasian murine genus that matches Mus in terms of species diversity and geographic range, reveals the presence of only one translocation plus several inversions among seven species belonging to the four major clades (Matsubara et al., 2004), even though their diversification was estimated to have occurred prior to the radiation within Mus (Michaux et al., 2002).

The chromosomal phylogeny identified 29 rearrangements that have been fixed during the diversification of the genus Mus . The subgenus Coelomys has a conserved karyotype

80 which differs from the ancestral one by only three rearrangements, whereas the others have undergone greater genome shuffles, with 11 rearrangements in Nannomys , 16 in Mus , and 20 in Pyromys (Figure 7). Moreover, this analysis clearly shows that extensive genome repatterning is not unique to the house mouse karyotype since only three rearrangements are autapomorphic, but is in fact a characteristic of the Mus lineage within the Muridae. In addition, the rearrangements are not randomly distributed along the branches, not only between lineages but also through time (Figure 7). The four subgenera of Mus diverged nearly simultaneously within 1 Myr during which nearly half of the rearrangements occurred, representing a rate of 13 mutations per million year. In contrast, as few as three to seven were subsequently fixed in the terminal branches leading to the four subgenera during the last 6-7

Myr (Chevret et al., 2005; Veyrunes et al., 2005), yielding a rate range comprised between

0.4-1.2 / Myr. Thus, the karyotypic evolution exhibits a short phase of intensive diversification followed by a stage with a lower rate of chromosomal change - but still higher than in most mammals. In effect, mammals generally display a low rate of chromosome exchange, on the order of 0.1-0.2 mutations / Myr (O’Brien et al., 1999; Wienberg, 2004), although drastic karyotype reshuffling has also been evidenced in other lineages, such as gibbons (Muller et al., 2003), muntjacs (Yang et al., 1997; Wang and Lan, 2000), or equids

(Yang et al., 2003b). In Mus , this rate acceleration is concomitant with cladogenetic events, i.e. the separation of the four subgenera. Hence, we are tempted to correlate the karyotypic diversification with the speciation events on basis that accumulation of rearrangements may lead to reproductive isolation (e.g. King, 1993; Pialek et al., 2001; Dobigny et al., 2002;

Olmo, 2005). But this scenario does not explain how and why the Mus genome has undergone extreme genome shuffles during a short evolutionary period. Otherwise, some particular conditions, as population dynamic (e.g. demographic bottleneck) or environmental (e.g. geographic fragmentation) may both drive independently specific and karyotypic

81 diversification (Lande, 1979; Hedrick, 1981). Hence, specific and karyotypic events, without being related have, however, a common origin; afterward, the latter processes may accelerate the first ones.

Modes of genome reorganization in the genus Mus

The chromosomal changes that have occurred during the Mus radiation, are mapped onto the branches of the phylogeny (Figure 7), and therefore, are a posteriori polarized (e.g. fusion vs . fission) using the outgroup criterion. Thus, of the 29 rearrangements identified in the genus, the majority are translocations (14), followed by fusions (9), and fissions (4). Very few inversions were identified (2) which is likely due to the painting protocol used

(chromosome specific painting probes are unable to detect most intrachromosomal rearrangements) and would require more refined approaches to be identified (Zhao et al.,

2004). Although we cannot assess the frequency of inversions in these species, the observed preponderance of translocations is in agreement with recent genome sequence comparisons between human, mouse and/or rat, which indicate that interchromosomal vs . intrachromosomal rearrangements are much more frequent in the mouse lineage than in that of the human (Friedman and Hughes, 2004) or even the rat (Zhao et al., 2004). Segmental translocations and particularly fissions necessitate the appearance of centromeres at new locations (Figure 7). The process of emergence of new centromeres remains unclear, and may in fact involve different independent mechanisms, such as reactivation of ancestral latent centromeres, chromosome healing by telomere sequence seeding, or prior segmental duplications of pericentromeric or other sequences (Choo, 1997; du Sart et al., 1997;

Kolnicki, 2000; Ventura et al., 2001, 2003, 2004; Amor and Choo, 2002; Eder et al., 2003;

Amor et al., 2004; Nergadze et al., 2004). By tracking chromosomal segments throughout the phylogeny, the nature of these new centromeres can be ascertained. Thus, none of the

82 rearrangements correspond to centromere shifts, a minimum of two involve previous centromere locations, and 14 require the de novo acquisition of a centromere (i.e. neocentromerization). Thus, neocentromere formation is apparently a recurrent event during the evolution of Mus , mirroring the situation in primates and marsupials (Ventura et al., 2004;

Ferreri et al., 2005). One of the neocentromeres identified appeared following the break of synteny 5/6 (translocation xx), the flanking regions of which have been studied by comparative cytogenomic mapping (Walentinsson et al., 2001; Thomas et al., 2003). Thomas et al. (2003) uncovered pericentromeric duplications at the breakpoint, the sequence divergence of which allowed them to date the event at 3-7 Myr ago. By including close relatives of the house mouse in our phylogenetic framework, we are able to more accurately time the occurrence of this event: it occurred before the split of the subgenera Mus and

Pyromys , ie. at 7 Myr (Chevret et al., 2005; Veyrunes et al., 2005). The two rearrangements involving latent centromere location correspond to characters 55 and 58 (Table 2) which are homoplasies, both involving a fusion followed by a fission further along the tree. These two reversals (fusion then fission) suggest that “fossil” (i.e. latent) centromeres may be a hotspot for breakpoints and centromere reactivation.

For the first time, this study using cross-species chromosome painting allows to resolve without ambiguity the long-standing controversial phylogeny of the genus Mus ; inversely, this phylogenetic analysis allows to assess more precisely the chromosome evolution in the genus. In addition, we offer several new glimpses and promising pathways of investigations by highlighting chromosomal genomic areas of interest for higher resolution studies (as gene-mapping, FISH with BACs, or in silico genome exploration) on sequence composition of neocentromeres and synteny breakpoints and their involvement in restructuring the mouse genome. The advantage of this phylogenetic framework involving closely related species within Mus , is the shorter evolutionary timescale than the human-

83 and/or rat-mouse split, allowing us to trace ancestral sequences at breakpoints, and date the rearrangements and associated segmental duplications more precisely.

ACKNOWLEDGEMENTS

We are grateful to E. Panetto and A.T. Pardini for helpful technical assistance, and F.

Bonhomme, M. Marquine, C.A Matthee, J.A.J. Nel, A. Orth, and B. Sicard, for collecting specimens. This study was supported by a CNRS-NRF collaboration (N° 13293 and 15439,

2002-2004), and CNRS-UM II grants to UMR 5554. This is publication ISEM N° 2006-0xx.

REFERENCES

Amor, D. J., K. Bentley, J. Ryan, J. Perry, L. Wong, H. Slater, and K. H. A. Choo. 2004. Human centromere repositioning "in progress". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6542-6547. Amor, D. J., and K. H. A. Choo. 2002. Neocentromeres: role in human disease, evolution, and centromere study. Am. J. Hum. Genet. 71:695-714. Auffray, J. C., A. Orth, J. Catalan, J. P. Gonzales, E. Desmarais, and F. Bonhomme. 2003. Phylogenetic position and description of a new species of subgenus Mus (Rodentia, Mammalia) from Thailand. Zool. Script. 32:119-127. Bailey, J. A., R. Baertsch, W. James Kent, D. Haussler, and E. E. Eichler. 2004. Hotspots of mammalian chromosomal evolution. Genome Biol. 5:R23. Berry, R. J., and P. N. Scriven. 2005. The house mouse: a model and motor for evolutionary understanding. Biol. J. Linnean Soc. 84:335-347. Bonhomme, F. 1986. Evolutionary relationships in the genus Mus . Curr. Top. Microbiol. Immun. 127:19-34. Bonhomme, F. 1992. Genetic diversity and evolution in the genus Mus . Page 16 in Techniques for the genetic analysis of brain and behavior (D. Goldowitz, W. D., and R. E. Winner, eds.). Elsevier Sciences Publishers BV. Bonhomme, F., A. Orth, T. Cucchi, E. Hadjisterkotis, J. D. Vigne, and J. C. Auffray. 2004. A new species of wild mice on the Island of Cyprus. C. R. Acad. Sci. Biol. 327:501-507. Bourque, G., P. A. Pevzner, and G. Tesler. 2004. Reconstructing the genomic architecture of ancestral mammals: lessons from human, mouse, and rat genomes. Genome Res. 14:507- 516. Boursot, P., J.-C. Auffray, J. Britton-Davidian, and F. Bonhomme. 1993. The evolution of house mice. Annu. Rev. Ecol. Syst. 24:119-152. Britton-Davidian, J., J. Catalan, M. d. G. Ramalhinho, G. Ganem, J.-C. Auffray, R. Capela, M. Biscoito, J. Searle, and M. d. L. Mathias. 2000. Rapid chromosomal evolution in island mice. Nature 403:158. Capanna, E. 1982. Robertsonian numerical variation in animal speciation: Mus musculus , an emblematic model. Pages 155-177 in Mechanisms of speciation Alan R. Liss, Inc., New York.

84 Capanna, E., and R. Castiglia. 2004. Chromosomes and speciation in Mus musculus domesticus . Cytogenet. Genome Res. 105:375-384. Catzeflis, F., and C. Denys. 1992. The African Nannomys (Muridae): an early offshoot from the Mus lineage- Evidence from scnDNA hybridization experiments and compared morphology. Israel J. Zool. 38:219-231. Cavagna, P., A. Menotti, and R. Stanyon. 2000. Genomic homology of the domestic ferret with cats and humans. Mamm. Genome 11:866-870. Cavagna, P., G. Stone, and R. Stanyon. 2002. Black rat ( Rattus rattus ) genomic variability characterized by chromosome painting. Mamm. Genome 13:157-163. Childs, J. E., G. E. Glass, G. W. Korch, T. G. Ksiazek, and J. W. Leduc. 1992. Lymphocytic choriomeningitis virus-infection and house mouse ( Mus musculus ) distribution in urban Baltimore. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47:27-34. Chevret, P., P. Jenkins, and F. Catzeflis. 2003. Evolutionnary systematics of the Indian mouse Mus famulus : molecular (DNA/DNA hybrization and 12S rRNA sequences) and morphological evidence. Zool. J. Linnean Soc. 137:385-401. Chevret, P., F. Veyrunes, and J. Britton-Davidian. 2005. Molecular phylogeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochondrial and nuclear data. Biol. J. Linnean Soc. 84:417-427. Choo, K. H. A. 1997. Centromere DNA dynamics: latent centromeres and neocentromere formation. Am. J. Hum. Genet. 61:1225-1233. Chowdhary, B. P., T. Raudsepp, L. Fronicke, H. Scherthan. 1998. Emerging patterns of comparative genome organization in some mammalian species as revealed by Zoo-FISH. Genome Res. 8 :577-589. de Oliveira, E. H. C., M. Neusser, W. B. Figueiredo, C. Nagamachi, J. C. Pieczarka, I. J. Sbalqueiro, J. Wienberg, and S. Muller. 2002. The phylogeny of howler monkeys (Alouatta , Platyrrhini): Reconstruction by multicolor cross-species chromosome painting. Chromosome Res. 10:669-683. Dobigny, G., V. Aniskin, and V. Volobouev. 2002. Explosive chromosome evolution and speciation in the gerbil genus Taterillus (Rodentia; Gerbillinae): a case of two new cryptic species. Cytogenet. Genome Res. 96:117-124. Dobigny, G., J. F. Ducroz, T. J. Robinson, and V. Volobouev. 2004. Cytogenetics and cladistics. Syst. Biol. 53:470-484. du Sart, D., M. R. Cancilla, E. Earle, J. Mao, R. Saffery, K. M. Tainton, P. Kalitsis, J. Martin, A. E. Barry, and K. H. A. Choo. 1997. A functional neo centromere formed through activation of a latent human centromere and consisting of non-alpha-satellite DNA. Nature Genet. 16:144-153. Eder, V., M. Ventura, M. Ianigro, M. Teti, M. Rocchi, and N. Archidiacono. 2003. Chromosome 6 phylogeny in primates and centromere repositioning. Mol. Biol. Evol. 20:1506-1512. Engelbrecht, A., G. Dobigny, and T. J. Robinson. 2006. Further insights into the ancestral murine karyotype: the contribution of the Otomys - Mus comparison using chromosome painting. Cytogenet. Genome Res. 112:126-130. Ferreri, G. C., D. M. Liscinsky, J. A. Mack, M. D. B. Eldridge, and R. J. O'Neill. 2005. Retention of latent centromeres in the mammalian genome. J. Hered. 96:217-224. Flynn, L. J., and L. L. Jacobs. 1982. Effects of changing environments on Siwalik rodent faunas of northern Pakistan. Palaeogeogr. Palaeocl. Palaeoecol. 38:129-138. Froenicke, L. 2005. Origins of primate chromosomes - as delineated by Zoo-FISH and alignments of human and mouse draft genome sequences. Cytogenet. Genome Res. 108:122-138.

85 Froenicke, L., M. G. Caldes, A. Graphodatsky, S. Müller, L.A. Lyons, T.J. Robinson, M. Volleth, F. Yang, and J. Wienberg. in press. Are molecular cytogenetics and bioinformatics suggesting contradictory models of ancestral mammalian genomes? Genome Res. Friedman, R., and A. L. Hughes. 2004. Two patterns of genome organization in mammals: the chromosomal distribution of duplicate genes in human and mouse. Mol. Biol. Evol. 21:1008-1013. Garagna, S., M. Zuccotti, C. A. Redi, and E. Capanna. 1997. Trapping speciation. Nature 390:241-242. Graves, J. A. M., J. Gecz, and H. Hameister. 2002. Evolution of the human X - a smart and sexy chromosome that controls speciation and development. Cytogenet. Genome Res. 99:141-145. Gregory, S. G., M. Sekhon, J. Schein, S. Y. Zhao, K. Osoegawa, et al. 2002. A physical map of the mouse genome. Nature 418:743-750. Grutzner, F., H. Himmelbauer, M. Paulsen, H. H. Ropers, and T. Haaf. 1999. Comparative mapping of mouse and rat chromosomes by fluorescence in situ hybridization. Genomics 55:306-313. Guilly, M. N., P. Fouchet, P. De Chamisso, A. Schmitz, and B. Dutrillaux. 1999. Comparative karyotype of rat and mouse using bidirectional chromosome painting. Chromosome Res. 7:213-221. Hauffe, H. C., and J. B. Searle. 1993. Extreme karyotypic variation in a Mus musculus domesticus hybrid zone: the Tobacco mouse story revisited. Evolution 47:1374-1395. Hedrick, P. W. 1981. The establishment of chromosomal variants. Evolution 35:322-332. Jouvin-Marche, E., A. Cuddihy, S. Butler, J. N. Hansen, W. M. Fitch, and S. Rudikoff. 1988. Modern evolution of a single-copy gene: the immunoglobulin Ck in wild mice. Mol. Biol. Evol. 5:500-511. King, M. 1993. Species evolution. The role of chromosome change. Cambridge University Press, Cambridge. Kolnicki, R. L. 2000. Kinetochore reproduction in animal evolution: cell biological explanation of karyotypic fission theory. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9493-9497. Lande, R. 1979. Effective deme sizes during long-term evolution estimated from rates of chromosomal rearrangement. Evolution 33:234-251. Lundrigan, B. L., S. A. Jansa, and P. K. Tucker. 2002. Phylogenetic relationships in the genus Mus , based on paternally, maternally, and biparentally inherited characters. Syst. Biol. 51:410-431. Lyons, L. A., T. F. Laughlin, N. G. Copeland, N.A. Jenkins, J. E. Womack, and S. J. O’Brien. 1997. Comparative anchor tagged sequences (CATS) for integrative mapping of mammalian genome. Nature Genet. 15:47-56. Madsen, O., M. Scally, C. J. Douady, D. J. Kao, R. W. DeBry, R. Adkins, H. M. Amrine, M. J. Stanhope, W. W. de Jong, and M. S. Springer. 2001. Parallel adaptive radiations in two major clades of placental mammals. Nature 409:610-614. Marshall, J. T. 1977. A synopsis of Asian species of Mus (Rodentia, Muridae). Bull. Am. Mus. Nat. Hist. 158:173-220. Matsubara, K., C. Nishida-Umehara, A. Kuroiwa, K. Tsuchiya, and Y. Matsuda. 2003. Identification of chromosome rearrangements between the laboratory mouse ( Mus musculus ) and the Indian spiny mouse ( Mus platythrix ) by comparative FISH analysis. Chromosome Res. 11:57-64. Matsubara, K., C. Nishida-Umehara, K. Tsuchiya, D. Nukaya, and Y. Matsuda. 2004. Karyotypic evolution of Apodemus (Muridae, Rodentia) inferred from comparative FISH analyses. Chromosome Res 12:383-395.

86 Matthias, M. A., and P. N. Levett. 2002. Leptospiral carriage by mice and mongooses on the island of Barbados. West Indian Med. J. 51:10-13. Michaux, J. R., P. Chevret, M. G. Filippucci, and M. Macholan. 2002. Phylogeny of the genus Apodemus with a special emphasis on the subgenus Sylvaemus using the nuclear IRBP gene and two mitochondrial markers: cytochrome b and 12S rRNA. Mol. Phylogenet. Evol. 23:123-136. Muller, S., M. Hollatz, and J. Wienberg. 2003. Chromosomal phylogeny and evolution of gibbons (Hylobatidae). Hum. Genet. 113:493-501. Murphy, W. J., E. Eizirik, S. J. O'Brien, O. Madsen, M. Scally, C. J. Douady, E. Teeling, O. A. Ryder, M. J. Stanhope, W. W. de Jong, and M. S. Springer. 2001. Resolution of the early placental mammal radiation using Bayesian phylogenetics. Science 294:2348-2351. Murphy, W. J., L. Fronicke, S. J. O'Brien, and R. Stanyon. 2003. The origin of human chromosome 1 and its homologs in placental mammals. Genome Res. 13:1880-1888. Murphy, W. J., D. M. Larkin, A. Everts-van der Wind, G. Bourque, G. Tesler, et al. 2005. Dynamics of Mammalian chromosome evolution inferred from multispecies comparative maps. Science 309:613-617. Murphy, W. J., P. A. Pevzner, and S. J. O'Brien. 2004. Mammalian phylogenomics comes of age. Trends Genet. 20:631-639. Musser, G. G., and M. D. Carleton. 1993. Family Muridae. Pages 501-755 in Mammal species of the world. A taxonomic and geographic reference (D. E. Wilson, and D. M. Reeder, eds.). Smithsonian Institution Press, Washington and London. Nadeau, J. H., and B. A. Taylor. 1984. Lenghts of chromosomal segments conserved since divergence of man and mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:814-818. Nergadze, S. G., M. Rocchi, C. M. Azzalin, C. Mondello, and E. Giulotto. 2004. Insertion of telomeric repeats at intrachromosomal break sites during Primate evolution. Genome Res. 14:1704-1710. Nie, W., J. Wang, P. C. M. O'Brien, B. Fu, T. Ying, M. A. Ferguson-Smith, and F. Yang. 2002. The genome phylogeny of domestic cat, red panda and five mustelid species revealed by comparative chromosome painting and G-banding. Chromosome Res. 10:209-222. Nilsson, S., K. Helou, A. Walentinsson, C. Szpirer, O. Nerman, and F. Stahl. 2001. Rat- Mouse and Rat-Human comparative maps based on gene homology and high-resolution Zoo-FISH. Genomics 74:287-298. O'Brien, S. J., M. Menotti-Raymond, W. J. Murphy, W. G. Nash, J. Wienberg, R. Stanyon, N. G. Copeland, N. A. Jenkins, J. E. Womack, and J. A. M. Graves. 1999. The promise of comparative genomics in mammals. Science 286:458-481. Ohno, S. 1967. Sex chromosomes and sex linked genes. Springer, Berlin. Olmo, E. 2005. Rate of chromosome changes and speciation in reptiles. Genetica 125:185- 203. Pevzner, P., and G. Tesler. 2003. Human and mouse genomic sequences reveal extensive breakpoint reuse in mammalian evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7672-7677. Pialek, J., H. C. Hauffe, K. M. Rodriguez-Clark, and J. B. Searle. 2001. Raciation and speciation in house mice from the Alps: the role of chromosomes. Mol. Ecol. 10:613-625. Pialek, J., H. C. Hauffe, and J. B. Searle. 2005. Chromosomal variation in the house mouse. Biol. J. Linnean Soc. 84:535-563. Rambau, R. V., and T. J. Robinson. 2003. Chromosome painting in the African four-striped mouse Rhabdomys pumilio : detection of possible murid specific contiguous segment combinations. Chromosome Res. 11:91-8. Richard, F., M. Lombard, and B. Dutrillaux. 2003a. Reconstruction of the ancestral karyotype of eutherian mammals. Chromosome Res. 11:605-618.

87 Richard, F., C. Messaoudi, A. Bonnet-Garnier, M. Lombard, and B. Dutrillaux. 2003b. Highly conserved chromosomes in an Asian squirrel ( Menetes berdmorei , Rodentia: Sciuridae) as demonstrated by ZOO-FISH with human probes. Chromosome Res. 11:597-603. Rokas, A., and P. W. H. Holland. 2000. Rare genomic changes as a tool for phylogenetics. Trends Ecol. Evol. 15:454-459. Seabright, J. 1971. A rapid technique for human chromosomes. Lancet II:971-972. She, J. X., F. Bonhomme, P. Boursot, L. Thaler, and F. Catzeflis. 1990. Molecular phylogenies in the genus Mus : Comparative analysis of electrophoretic, scnDNA hybridization, and mtDNA RFLP data. Biol. J. Linnean Soc. 41:83-103. Sourrouille, P., C. Hanni, M. Ruedi, and F. M. Catzeflis. 1995. Molecular systematics of Mus crociduroides , an endemic mouse of Sumatra (Muridae: Rodentia). Mammalia 59:91-102. Stanyon, R., F. Yang, P.Cavagna, P. C. M. O'Brien, M. Bagga, M. A. Ferguson-Smith, and J. Wienberg. 1999. Reciprocal chromosome painting shows that genomic rearrangement between rat and mouse proceeds ten times faster than between humans and cats. Cytogenet. Cell Genet. 84:150-155. Stanyon, R., G. Stone, M. Garcia, and L. Froenicke. 2003. Reciprocal chromosome painting shows that squirrels, unlike rodents, have a highly conserved genome organization. Genomics 82:245-249. Stanyon, R., F. Yang, A. M. Morescalchi, and L. Galleni. 2004. Chromosome painting in the long-tailed field mouse provides insights into the ancestral murid karyotype. Cytogenet. Genome Res. 105:406-411. Suzuki, H., T. Shimada, M. Terashima, K. Tsuchiya, and K. Aplin. 2004. Temporal, spatial, and ecological modes of evolution of Eurasian Mus based on mitochondrial and nuclear gene sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 33:626-646. Swofford, D. L. 1999. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other Methods), version Version 4. 0b. Sinauer Associates. Telenius, H., A. H. Pelmear, A. Tunnacliffe, N. P. Carter, A. Behmel, M. A. Ferguson-Smith, M. Nordenskjold, R. Pfragner, and B. A. J. Ponder. 1992. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes Chromosomes Cancer 4:257-263. Thomas, J. W., M. G. Schueler, T. J. Summers, R. W. Blakesley, J. C. McDowell et al. 2003. Pericentromeric duplications in the laboratory mouse. Genome Res. 13:55-63. Ventura, M., N. Archidiacono, and M. Rocchi. 2001. Centromere emergence in evolution. Genome Res. 11:595-599. Ventura, M., J. M. Mudge, V. Palumbo, S. Burn, E. Blennow, M. Pierluigi, R. Giorda, O. Zuffardi, N. Archidiacono, M. S. Jackson, and M. Rocchi. 2003. Neocentromeres in 15q24- 26 map to duplicons which flanked an ancestral centromere in 15q25. Genome Res. 13:2059-2068. Ventura, M., S. Weigl, L. Carbone, M. F. Cardone, D. Misceo, M. Teti, P. D'Addabbo, A. Wandall, E. Bjorck, P. J. de Jong, X. W. She, E. E. Eichler, N. Archidiacono, and M. Rocchi. 2004. Recurrent sites for new centromere seeding. Genome Res. 14:1696-1703. Veyrunes, F., J. Britton-Davidian, T.J. Robinson, E. Calvet, C. Denys, and P. Chevret. 2005. Molecular phylogeny of the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Rodentia, Murinae, Mus ): implications for chromosomal evolution. Mol. Phylogenet. Evol. 36:358-369. Veyrunes, F., J. Catalan, B. Sicard, T. J. Robinson, J. M. Duplantier, L. Granjon, G. Dobigny, and J. Britton-Davidian. 2004. Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Muridae; Mus ). Chromosome Res. 12:369-382. Walentinsson, A., K. Helou, and G. Levan. 2001. A dual-color FISH gene map of the proximal region of rat chromosome 4 and comparative analysis in human and mouse. Mamm. Genome 12:900-908.

88 Wang, W., and H. Lan. 2000. Rapid and parallel chromosomal number reductions in muntjac deer inferred from mitochondrial DNA phylogeny. Mol. Biol. Evol. 17:1326-1333. Waterston, R. H., K. Lindblad-Toh, E. Birney, J. Rogers, F. J. Abril et al. 2002. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420:520-562. Wienberg, J. 2004. The evolution of eutherian chromosomes. Curr. Op. Genet. Dev. 14:657- 666. Yang, F., E. Z. Alkalaeva, P. L. Perelman, A. T. Pardini, W. R. Harrison, P. C. O'Brien, B. Fu, A. S. Graphodatsky, M. A. Ferguson-Smith, and T. J. Robinson. 2003a. Reciprocal chromosome painting among human, aardvark, and elephant (superorder Afrotheria) reveals the likely eutherian ancestral karyotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:1062- 1066. Yang, F., B. Fu, P. C. M. O'Brien, T. J. Robinson, O. A. Ryder, and M. A. Ferguson-Smith. 2003b. Karyotypic relationships of horses and zebras: results of cross-species chromosome painting. Cytogenet. Genome Res. 102:235-243. Yang, F., P. C. O'Brien, and M. A. Ferguson-Smith. 2000. Comparative chromosome map of the laboratory mouse and Chinese hamster defined by reciprocal chromosome painting. Chromosome Res. 8:219-27. Yang, F., P. C. M. O'Brien, J. Wienberg, and M. A. Ferguson-Smith. 1997. A reappraisal of the tandem fusion theory of karyotype evolution in the Indian muntjac using chromosome painting. Chromosome Res. 5:109-117. Zhao, S., J. Shetty, L. Hou, A. Delcher, B. Zhu, K. Osoegawa, P. de Jong, W. C. Nierman, R. L. Strausberg, and C. M. Fraser. 2004. Human, Mouse, and Rat genome large-scale rearrangements: stability versus speciation. Genome Res. 14:1851-1860.

Coelomys

Mus Nannomys

Figure 1 : Reciprocal painting scheme used in this study. Arrows indicate directional painting experiments (source species chromosome paints onto target species chromosomes).

Table 1 : List of species investigated for the phylogenetic analysis Species 2n Cross-species FISH Genus Mus : Mus musculus 40 referential Nannomys mattheyi 36 this study Coelomys pahari 48 this study Pyromys platythrix 26 Matsubara et al., 2003 Outgroups: Apodemus sylvaticus 46 Matsubara et al., 2004 Rattus rattus 38 Cavagna et al. 2002 Rhabdomys pumilio 48 Rambau & Robinson, 2003

90 Table 2 : Binary data matrix subjected to PAUP, based on presence (1) absence (0) of the syntenic association of homologous chromosome segments. ? = unknown

No. character (synteny) Rattus Rhabdomys Apodemus Coelomys Nannomys Mus Pyromys 1 MMU 1prox/MMU 1dist 0 0 0 0 0 1 1 2 MMU 2prox/MMU 2dist 0 ? ? 0 1 1 1 3 MMU 4prox/MMU 4dist 1 1 1 0 1 1 1 4 MMU 5prox/MMU 5med 0 0 0 0 0 1 1 5 MMU 5med/MMU 5dist 0 0 0 0 0 1 1 6 MMU 6prox/MMU 6dist 1 ? 1 1 1 1 0 7 7a/7b 1 1 1 0 1 1 1 8 MMU 8prox/MMU 8dist 0 0 0 0 1 1 1 9 9a/9b 1 ? 1 1 0 1 1 10 MMU 10prox/MMU 10dist 0 0 0 0 1 1 1 11 MMU 11prox/MMU 11dist 0 0 0 0 1 1 1 12 MMU 12prox/MMU 12dist 1 0 1 1 1 1 1 13 MMU 13prox/MMU 13med 0 ? 0 0 0 1 1 14 MMU 13med/MMU 13dist 0 ? 0 0 1 1 1 15 14a/14b ? 1 1 1 1 1 0 16 MMU 15prox/MMU 15dist 0 ? 0 0 1 1 1 17 16a/16b ? 1 0 1 1 1 1 18 MMU 17prox/MMU 17dist 0 0 0 0 0 1 0 19 MMU 18prox/ MMU 18dist 1 1 ? 1 0 1 1 20 15/10 1 0 0 0 0 0 0 21 10*MMU 4 1 1 0 0 0 0 0 22 10/13 1 0 0 0 0 0 0 23 13*17 1 0 0 0 0 0 0 24 17/MMU 7 1 0 0 0 0 0 0 25 MMU 7prox/MMU 19 1 1 1 1 1 0 1 26 MMU 13 dist/MMU 15prox 1 0 1 1 1 0 1 27 MMU 15prox/MMU 3 1 0 0 0 0 0 0 28 16*17 1 0 0 0 0 0 0 29 17/1 1 1 1 0 0 0 0 30 1/17 1 1 1 0 0 0 0 31 MMU 5prox/MMU 6 1 0 1 1 1 0 0 32 17/MMU 12prox 1 1 1 0 0 0 0 33 16/MMU 11dist 1 0 0 0 0 0 0 34 MMU 5med/MMU 11prox 1 0 1 1 0 0 0 35 8/14 1 0 0 0 0 0 0 36 MMU 2prox/MMU 13prox 1 0 0 1 0 0 0 37 MMU 14/1 0 1 0 0 0 0 0 38 1*MMU 3 0 1 0 0 0 0 0 39 11/17 0 1 1 0 0 0 0 40 17*MMU 2 0 1 0 0 0 0 0

41 17/10 0 1 0 0 0 0 0 42 10*MMU 7 0 1 0 0 0 0 0 43 MMU 18*9 0 1 0 0 0 0 0 44 9/13 0 1 0 0 0 0 0 45 17/10 0 1 0 0 0 0 0 46 MMU 11prox/MMU 16 0 1 0 0 0 0 0 47 9/17 0 1 0 0 0 0 0 48 10/17 0 1 1 0 0 0 0 49 16/17 0 0 1 0 0 0 0 50 18/13 0 0 1 0 0 0 0 51 MMU 15prox/13 0 0 1 1 0 0 0 52 7/8 0 0 0 1 0 0 0 53 8/7 0 0 0 1 0 0 0 54 MMU 17prox/10 ? ? 1 1 0 0 0 55 MMU 1prox/MMU 4prox 0 0 0 1 1 0 0 56 MMU 18dist/9 0 0 0 0 1 0 0 57 9/MMU 5prox 0 0 0 0 1 0 0 58 MMU 5dist/MMU 8 0 0 0 0 1 0 0 59 MMU 18prox/MMU 14 0 0 0 0 1 0 0 60 MMU 5med/MMU 17prox 0 0 0 0 1 0 0 61 MMU 12/MMU 1 0 0 0 0 0 0 1 62 6/MMU 3 0 0 0 0 0 0 1 63 MMU 10/MMU 9 0 0 0 0 0 0 1 64 14/17 0 0 0 0 0 0 1 65 6/17 0 0 0 0 0 0 1 66 17/MMU 16 0 0 0 0 0 0 1 67 14/MMU 2 0 0 0 0 0 0 1

The identification of characters is based on Mus chromosomes, which the numbers refer to. When the homologous segment is identified precisely on the chromosome, the chromosomal number is preceded by MMU. "dist", "med", "prox" refer to the distal, median and proximal segment of the chromosome respectively. "/" means that the chromosome segments lie together on the same arm "*" means that the association of chromosome segments is interrupted by a centromere

1000

Rb(X.1)

Rb(5.8)

Rb(4.7) Rb(2.13) Rb(10.14) Rb(3.9)

Rb(12.17) Rb(6.11) Hoechst Fluorescence Hoechst 400 600 800 Rb(Y.1)

200 Rb(15.16)

200 400 600 800 1000 Chromomycin Fluorescence

Figure 2 : Flow karyotype of a male Nannomys minutoides from Stellenbosch resolving ten peaks, each containing a Rb fusion.

aMMU 15 b MMU 16

cMMU 18 d MMU 5

eMMU 10 f MMU 18

Figure 3 : Examples of hybridization using mouse chromosome paints (MMU) to (a-c) Nannomys mattheyi and (d-f) Coelomys pahari metaphase spreads which were counterstained with DAPI.

18 dist 9a 5dist 7 5prox 18 prox 6 8 1dist 19 14

NMA 1 NMA 2 NMA 3 NMA 4 NMA 5

1prox 13 dist 3 2 4 10 15

NMA 6 NMA 7 NMA 8 NMA 9 NMA 10

11 12 9b 16 13 prox NMA 11 NMA 12 NMA 13 NMA 14 NMA 15

X 5med 17 dist 17 prox NMA 16 NMA 17 NMA X

Figure 4 : G-banded karyotype of Nannomys mattheyi (NMA) with the assignments of Mus musculus homologous segments (chromosome pair numbers on the right) revealed by the mouse probes.

5prox 7a 6 2dist 3 1dist 19 CPA 1 CPA 2 CPA 3 CPA 4 CPA 5

14 10 a 9 4dist 12

CPA 6 CPA 7 CPA 8 CPA 9 CPA 10

13 dist a 11 prox 16 15 prox 5med 11 dist 18 13 dist b CPA 11 CPA 12 CPA 13 CPA 14 CPA 15

2prox 7b1 15 dist 8a1 13 prox 17 dist 7b2 8b 8a2 CPA 16 CPA 17 CPA 18 CPA 19 CPA 20

17 prox 1prox 5dist X 10 b 4prox CPA 21 CPA 22 CPA 23 CPA X

Figure 5 : G-banded karyotype of Coelomys pahari (CPA) with the assignments of Mus musculus homologous segments (chromosome pair numbers on the right) revealed by the mouse probes.

96 CPA MMU NMA CPA MMU NMA CPA MMU NMA CPA MMU NMA

6 22 16 22

4 7 6 6 5 5 3 8 2 1 3 4

2 2 19

19 16 2 2 13 1 1 3 20 7 23 5 3 6 8

21 2 13 10 10 11 7 9 12 13 14 9 10 11 12

11 16 15 8 4 9 12 14 17 11 9 13 14 15 16

21 16 4 15 X X 18 1 1 17 17 18 19 X 2

Figure 6 : Genome-wide chromosomal comparisons between Mus musculus (centre), Coelomys pahari (left) and Nannomys mattheyi (right) with M. musculus as reference, deduced from reciprocal and cross-species chromosome painting, and G-banded patterns. Hatched lines indicate homologies not fully resolved due to the absence of reciprocal painting between Mus and Coelomys , and between Mus and Nannomys on MMU 9 since chromosomes 2 and 13 of Nannomys are on the same probe.

Mus genus

subgenus subgenus Pyromys Pyromys

23-29 pumilio pumilio Mus Mus

* Rhabdomys Rhabdomys subgenus subgenus

* * subgenus subgenus Nannomys Nannomys **

20-22 * 98 subgenus subgenus Coelomys Coelomys Inversion Neocentromere emergence

12-14 ** * ** 15-19 rattus Rattus *

1-3 96 sylvaticus sylvaticus Apodemus Apodemus

** *

* * 4-11

Mus Fission Translocation Fusion 1 karyotype

ancestral

Figure 7 : Most parsimonious phylogeny using PAUP, based on the 67 chromosomal characters. Bootstrap values supporting each clade are indicated on nodes. The chromosomal rearrangements which have occurred within the genus Mus are mapped onto the tree and refer numbered in grey (see below). Each rearrangement is coded as follows: transl = translocation; inv = inversion; fiss = fission; fus = fusion followed by the character numbers of Table 2. Asterisk indicates a new centromere emergence. Rearrangements 1 to 3 : transl* + inv 52-53; fiss* 3 – rearrangements 4 to 11 : inv 14; fus 16; fus 8; fus 58; transl 11; transl* 60; transl* 10; transl* 2 – rearrangements 12 to 14 : transl* 57; transl* 56; fus 59 - rearrangements 15 to 19 : transl* 1; transl* 18; transl 5; transl* 4; fus 13 – rearrangements 20 to 22 : fiss* 25; fiss* 26; fiss* 58 – rearrangements 23 to 29 : transl* 66; transl* 65; transl* 67; fus 64; fus 62; fus 61; fus 63.

5prox 7 6 2dist 3 1dist 19

ANC 1 ANC 2 ANC 3 ANC 4 ANC 5

1prox

4 12 14 10 a 9

ANC 6 ANC 7 ANC 8 ANC 9 ANC 10

11 prox 13 dist a 16 15 prox 5med 11 dist 18 13 dist b ANC 11 ANC 12 ANC 13 ANC 14 ANC 15

2prox 13 prox 15 dist 17 dist 8a 8b ANC 16 ANC 17 ANC 18 ANC 19 ANC 20

17 prox X 5dist 10b ANC 21 ANC 22 ANC X

Figure 8 : Inferred haploid set of ancestral karyotype of the genus Mus (2n = 46) reconstructed with Coelomys , Nannomys , and Mus G-banded chromosomes. Homology to Mus chromosomes is indicated on the right.

100 résumé article 3 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

2ème partie : HISTOIRE EVOLUTIVE DES NANNOMYS ET

EVOLUTION CHROMOSOMIQUE.

A. Diversité chromosomique.

Une étude cytogénétique par Banding-G (Article 3 : Veyrunes et al., 2004) portant sur 65 souris naines africaines en provenance de deux extrêmes de leur aire de répartition (Afrique de l’Ouest et du Sud) révèle une diversité chromosomique inter- mais aussi intra-spécifique très importante, impliquant notamment des fusions Rb. Ces réarrangements chromosomiques pallient les faibles pouvoirs diagnostics des caractères morphologiques et apparaissent comme de bons critères d’identification spécifique. Ainsi, les spécimens sont assignés à cinq espèces différentes. L’une d’entre-elles (Mus minutoides) représente d’ailleurs très vraisemblablement un complexe d’espèces cryptiques tant la variation caryotypique est grande. Parmi ces cinq espèces, deux sont caractérisées par la présence de fusions Rb sexe-autosome : Rb(X.7) chez Mus musculoides et Rb(X.1) (Y.1) chez M. minutoides. Deux autres fusions de ce type ont été rapportées de la littérature dans ce sous-genre (Jotterand-Bellomo, 1984, 1986, 1988). Ces observations font donc de Nannomys, la lignée de mammifères ayant la plus grande diversité de translocations sexe-autosome connue à ce jour. Les translocations sexe-autosome sont des événements très rares au sein des mammifères car très délétères (voir Introduction : Translocations chromosome sexuel-autosome). Pourtant, elles sont répandues chez les Nannomys, ce qui pose le problème de leur fixation étant donné leur coût élevé. Plusieurs auteurs (e.g. Viegas-Pequignot et al., 1982 ; Jaafar et al., 1993 ; White et al., 1998 ; Dobigny et al., 2004b) ont émis une hypothèse sur l’existence de facteurs limitant le désavantage sélectif de ce type de fusion. Ils suggèrent que la présence d’une quantité importante d’hétérochromatine centromérique pourrait isoler l’autosome du chromosome sexuel, réduisant ainsi l’effet disruptif du remaniement sur la spermatogénèse (par exemple, barrière à la propagation de l’inactivation du X sur le matériel autosomal). Cette hypothèse a été testée par banding-C, coloration différentielle qui révèle spécifiquement l’hétérochromatine constitutive. Alors que M. musculoides suit le patron attendu, M. minutoides ne présente pas de bloc d’hétérochromatine entre le compartiment sexuel et autosomal. D’autres hypothèses sont alors proposées. En outre, dans cette lignée les translocations sexe-autosome sont associées dans certains cas à un important polymorphisme des chromosomes sexuels (voir Chapitre suivant : Déterminisme du sexe).

100

Article 3 :

Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Muridae; Mus).

Veyrunes F, Catalan J, Sicard B, Robinson TJ, Duplantier JM, Granjon L, Dobigny G, Britton-Davidian J. 2004.

Chromosome Research 12: 369-382.

101

102 Chromosome Research 12: 369–382, 2004. 369 # 2004 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands

Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Murinae; Mus)

Fre´de´ric Veyrunes1*, Josette Catalan1, Bruno Sicard2, Terence J. Robinson3, Jean-Marc Duplantier4, Laurent Granjon2,5, Gauthier Dobigny3,5 & Janice Britton-Davidian1 1Institut des Sciences de l’Evolution (UMR5554), Ge´ne´tique & Environnement, Universite´ Montpellier II, Montpellier, France; Tel: þ 33-4-67-14-39-10; Fax: þ 33-4-67-14-36-22; E-mail: [email protected]; 2Laboratoire de Mammalogie (CBGP, UMR022), Institut de Recherche pour le De´veloppement, Bamako, Mali; 3Department of Zoology, University of Stellenbosch, South Africa; 4Laboratoire de Mammalogie (CBGP, UMR022), Institut de Recherche pour le De´veloppement, Dakar, Senegal; 5Muse´um National d’Histoire Naturelle, Laboratoire de Zoologie Mammife`res et Oiseaux, Paris, France *Correspondence

Received 6 January 2004. Received in revised form and accepted for publication by Herbert Macgregor 10 February 2004

Key words: African pygmy mice, cytogenetics, Nannomys, Robertsonian translocations, sex-autosome translocations, sex chromosome

Abstract

The African pygmy mice, subgenus Nannomys, constitute the most speciose lineage of the genus Mus with 19 recognized species. Although morphologically very similar, they exhibit considerable chromosomal diversity which is here confirmed and extended by the G-banding analysis of 65 mice from West and South Africa. On the basis of their karyotype and distribution area, the specimens were assigned to at least five species. Exten- sive differentiation both within and between species was observed that involved almost exclusively Robertsonian translocations, 23 of which are newly described. Two of the rearrangements were sex chromosome-autosome translocations, associated in some cases with partial deletions of the X or Y chromosomes. Several authors have predicted that the highly deleterious effect of this rearrangement would be reduced if the sex and autosomal segments were insulated by a block of centromeric heterochromatin. The C-banding analyses performed showed that among the species carrying X-autosome translocations, one followed the expected pattern, while the other did not. In this case, functional isolation of the sex and autosome compartments must involve other repetitive sequences or genomic traits that require further molecular characterization. Such studies will provide insight into the causes and consequences of the high diversity of sex chromosome rearrangements in this subgenus.

Introduction Anolis lizards in the Caribbean (Losos et al. 1998), the evolutionary success of Murinae has The Murinae, the rats and mice of the Old World, not been accompanied by spectacular morpholo- comprise almost a quarter of rodent species bio- gical modifications, making species identification diversity (Musser & Carleton 1993) and occupy a difficult. Cytogenetic studies exemplified by the diversity of ecological niches. However, contrary pioneering work of Matthey (1952, 1959, 1964, to the famous adaptive radiations of the Galapa- 1965, 1966) have revealed extensive inter- and gos finches (Grant 1981, Sato et al. 1999) or intra-specific karyotypic diversity in rodents 370 F. Veyrunes et al. which, in turn, provides an extremely useful tool (Fredga 1965, 1972), and rodents, e.g. Taterillus for identifying and discriminating sibling species. (Volobouev & Granjon 1996, Dobigny et al. 2002) Indeed, in some instances, the taxonomic status or Gerbillus (Viegas-Pe¤ quignot et al. 1982, Ratom- of karyologically differentiated populations can ponirina et al. 1986). The low frequency of X- be inferred from the level of reproductive isola- autosome translocations in mammals is associated tion predicted by the karyotypes, since chromo- with their highly deleterious e¡ects on gene somal changes may contribute to the rapid expression and gametogenesis due to con£icting development of an efficient reproductive barrier inactivation and replication requirements of the between taxa (e.g. Britton-Davidian et al. 2000, sex chromosome and autosome components (King Dobigny et al. 2002, Delneri et al. 2003, reviews 1993, Ashley 2002, Dobigny et al. submitted). by King 1993, Searle 1993 and Rieseberg 2001). To account for the ¢xation of these unusual The African pygmy mice, Nannomys, an African chromosomal rearrangements, several authors subgenus of Mus sensu lato (Muridae, Murinae), (Viegas-Pe¤ quignot et al. 1982, Ratomponirina constitute a group of small-sized rodents (<12 g) et al. 1986, Jaafar et al. 1993, review in Dobigny that are widespread throughout sub-Saharan et al. submitted) have proposed that the accumula- Africa (Catze£is & Denys 1992). They are a tion of repetitive sequences between the sex and complex of morphologically very similar species autosomal segments may serve to insulate the two (Petter 1963, 1981, Macholan 2001), which has led chromosomal arms, thus reducing the disruptive to the description of 5 to 30 species (see Marshall e¡ects of these types of rearrangements. 1981). Most recently, Musser and Carleton (1993) The aim of this study was to identify the pattern recognized 19 species, making Nannomys the most of chromosomal diversity in Nannomys from two speciose subgenus of Mus. In contrast with the extremes of their distribution range (West and highly conserved morphology, chromosomal stu- South Africa) by G-banding analyses. In addition, dies have uncovered extensive karyotypic diversity the distribution of C-bands was studied to test for within this group that includes Robertsonian (Rb) the presence of intercalary heterochromatic blocks translocations between autosomes, between sex between the sex and autosomal arms in taxa carry- chromosomes and autosomes, tandem fusions, ing sex-autosome translocations. These data are pericentric inversions, heterochromatin additions compared to those previously published on this and even deletion of the sex chromosomes subgenus as well as other Mus species, thus provid- (Matthey 1966, 1970, Jotterand 1970, Jotterand- ing insights into the patterns of chromosomal Bellomo 1984, 1986, 1988). Paradoxically, in spite of evolution within Nannomys. this high chromosomal diversity, few G-banding studies have been performed to determine the patterns of chromosomal evolution within this Material and methods group (Jotterand-Bellomo 1984, 1986, 1988, Aniskin et al. 1998, Castiglia et al. 2002). A total of 65 specimens of Nannomys were Sex chromosome-autosome translocations are karyotyped, all of which were collected by hand of particular interest in Nannomys, since three of after excavation or night drives, or using baited them have so far been identi¢ed that involve either Sherman traps. Sampled localities included agri- the X, the Y or both chromosomes in di¡erent cultural (e.g. bean, rice and potato fields), com- species (Matthey 1966, Jotterand-Bellomo 1986, mensal (e.g. village) or natural savannah and 1988). Such diversity is uncommon in mammals, grassland habitats. The origin, sex, diploid and as when X-autosome tranlocations are present the fundamental numbers, morphology of the sex same one is usually retained by all species within a chromosomes and type of chromosomal analysis lineage. This is the case in ruminants, e.g. genus performed are provided for each individual in Gazella and other Antilopinae (Vassart et al. 1995), Table 1. The geographical distribution of the Muntiacus (Neitzel 1987, Yang et al. 1997), bats of samples are indicated in Figure 1. the Phyllostomidae family (Tucker 1986, Rodri- Metaphase spreads were obtained using the air- gues Noronha et al. 2001), insectivores, e.g. Sorex drying technique (Evans et al. 1964) from either (Pack et al. 1993), carnivores, e.g. Herpestes bone marrow cells of yeast-stimulated individuals Chromosomal diversity in african pygmy mice 371

Table 1. Origin, karyotypic data, chromosomal analysis and species assignment of samples.

Species Country Locality Number and Sex 2n FN Morphology of X Chromosomal analysis

M. mattheyi Burkina Faso Nazinga, 1 4 M 36 36 acro st, GBG, CGB Burkina Faso Nazinon, 2 1 F 36 36 acro st, GBG Burkina Faso Oursi, 3 2 ? 36 36 acro st Mali Balamansala, 4 1 F 36 36 acro st Mali Farabana, 5 5 M, 1 F 36 36 acro st, GBG Mali Kabakoro, 6 1 F 36 36 acro st Mali Kabalabougou, 7 5 M, 1 F 36 36 acro st, GBG Mali Samaya, 8 6 M, 3 F 36 36 acro st, GBG, CBG Mali Sibi Sibi, 9 1 F 36 36 acro st, GBG Senegal Bandia, 10 1 M 36 36 acro st, GBG, CGB M. indutus South Africa Tussen die reviere, 11 2 F 36 36 acro st, GBG, CBG M. haussa Chad Karal, 12 1 F 30 38 acro st Mali Me´naka, 13 5 M, 1 F 32–33 38 acro st, GBG Niger Babangata, 14 1 F 32 38 acro st Niger Guileyni, 15 1 M, 1 F 33–34 38 acro st Niger Kollo, 16 3 M, 2 F 31–33 38 acro st Senegal Thie`s, 17 2 M, 2 F 28 38 acro st, GBG, CGB M. musculoides Mali Diaban, 18 1 F 18 36 (X.7) st Mali Djoliba, 19 1 M 19 36 (X.7) st Mali Samaya, 8 3 M, 3 F 18–19 36 (X.7) st, GBG, CBG M. minutoides South Africa Caledon Reserve, 20 2 M 18 35 (X.1) st, GBG, CBG

South Africa Kuruman, 21 1 F 34 36 (X.1)/(Xd.1) st, GBG, CBG South Africa Stellenbosch, 22 1 F 18 36 (X.1) st, GBG, CBG

Geographic origin of sampled localities numbered according to Figure 1. M ¼ male; F ¼ female; ? ¼ unknown; 2n ¼ diploid number; FN ¼ fundamental number; acro ¼ acrocentric; (X.1) ¼ Rb(X.1) Robertsonian translocation between chromosome X and pair 1; (X.7) ¼ Rb(X.7); Xd ¼ deleted X chromosome; st ¼ standard; GBG ¼ G-banding; CBG ¼ C-banding.

(e.g. specimens from Burkina Faso, Mali and tion area (Matthey 1966, Jotterand 1972, Musser & Senegal; Lee & Elder, 1980) or ¢broblast cultures Carleton 1993). The skulls and skins of all established after skin biopsy (e.g. specimens specimens are deposited at the MNHN, Paris from Chad, Niger and South Africa). The diploid (France), the Institut des Sciences de l’Evolution, (2n) and fundamental number (FN) for each Montpellier (France), the Department of Zoology, specimen was established by analysis of standard Stellenbosch (South Africa) and the IRD stained preparations. Identi¢cation of chromosomes laboratory of Bamako (Mali). and/or chromosomal arms was determined by G-banding (GBG; Seabright 1971), and karyo- Results types constructed following the nomenclature of Jotterand-Bellomo (1986). At least ¢ve G-banded The chromosomal analysis carried out on the metaphases were photographed and karyotyped 65 samples of African pygmy mice revealed con- for each individual using a Zeiss photomicroscope siderable variation in diploid number (18 4 2n 4 equipped with an image analyzer (Cytovision, 36), and less so in fundamental number (35 4 Applied Imaging). Heterochromatic regions of the FN 4 38). Homology of G-banded patterns genome were revealed by C-banding (CBG; between specimens was established for all chromo- Sumner 1972) performed on previously G-banded somes, although identification of autosome pairs slides in one to four individuals per taxon. 16 and 17, when involved in rearrangements, The taxonomic assignation of individuals was requires confirmation by molecular analyses (e.g. performed by comparison of karyotypes with fluorescence in situ hybridization). In all, six published data (Matthey 1966, Jotterand 1972, cytotypes were recognized, four of which are Jotterand-Bellomo 1986) and/or known distribu- newly described. 372 F. Veyrunes et al.

Figure 1. Map showing the geographical origin of the samples studied. Locality numbers are indicated in Table 1.

Thirty-four animals from Burkina Faso (7), The four individuals from Thie' s in Senegal were Mali (24), Senegal (1) and South Africa (2) had a characterized by a fundamental number of 38 and chromosomal formula of 2n ¼ 36, FN ¼ 36, all a diploid number of 28; the karyotype consisted of chromosomes being acrocentric (Figure 2a). The nine pairs of acrocentric chromosomes and ¢ve size of the chromosomes varied continuously from pairs of sub-metacentric or metacentric chromo- large (pairs 1 to 5) to small (pairs 16and 17). The somes. The X and Y chromosomes were medium- X chromosome was medium-sized and the Y was sized acrocentrics (Figure 2c). G-banding revealed approximately two-thirds the size of the X. All the presence of four autosomal Robertsonian (Rb) chromosomes were free of C-positive hetero- translocations: Rb(2.12), Rb(4.6), Rb(5.7) and chromatin even in the centromeric region, except Rb(9.10) and a pericentric inversion on chromo- for the Y which was entirely C-band positive some pair 15 that results in an increase of the FN (Figure 2b). No di¡erences in G- and C-banding from 36to 38. The C-banding performed on two patterns were observed between specimens. The animals revealed moderate blocks of centromeric G-banded karyotype was identical to the one heterochromatin in all of the acrocentric and published by Jotterand-Bellomo (1986) who biarmed chromosomes, including the sex chromo- assigned the West African cytotype to Mus somes (Figure 2d). The pygmy mice from Me¤ naka, (Nannomys) mattheyi. The two individuals from Mali, possessed 32 or 33 chromosomes (two and Tussen die reviere, South Africa, with the same four individuals respectively) and a FN ¼ 38. karyotype, were referred to Mus indutus, a species G-banding (not shown) revealed the presence of described in South Africa which also possesses 36 three rearrangements which were identical to those acrocentric chromosomes according to Matthey in the Senegal specimens: the pericentric inversion of (1966). If con¢rmed, this would be the ¢rst chromosome 15 and the Robertsonian transloca- G-banded karyotype published for M. indutus. tions Rb(2.12) and Rb(4.6), the former translocation Chromosomal diversity in african pygmy mice 373

Figure 2. (a) G-banded karyotype and (b) C-banded metaphase of a male M. mattheyi.(c) G-banded karyotype and (d) C-banded metaphase of a female M. haussa,pi¼ pericentric inversion. (e) G-banded karyotype (insert: sex chromosomes of a male) and (f) C-banded metaphase of a female M. musculoides. Arrows indicate sex chromosomes. Scale bars indicate 10 mm. 374 F. Veyrunes et al. being heterozygous in the 2n ¼ 33 karyotype. The varying numbers of autosomal Rb translocations; samples from Niger and Chad showed a diploid however, they all had in common the same number varying from 30 to 34 due to the presence Rb(X.1) translocation but di¡ered in the morphol- of 6to 2 biarmed chromosomes respectively. All ogy of the sex chromosomes. specimens carried a FN ¼ 38 suggestive of a peri- The two males from Caledon Provincial Nature centric inversion which involved a small biarmed Reserve, South Africa, had 2n ¼ 18 (Figure 3a); all chromosome. No G- or C-banding data were avail- chromosomes were biarmed including both sex able for these mice. All the specimens with a chromosomes due to Robertsonian translocations: FN ¼ 38 from Senegal, Mali, Niger and Chad Rb(2.10), Rb(3.9), Rb(4.7), Rb(5.8), Rb(6.11), were referred to M. haussa, a species restricted to Rb(12.17), Rb(13.16), Rb(14.15) and Rb(X/Y.1). the sahelian region and for which Jotterand (1972) The very small size of chromosome 15 in described a pericentric inversion involving a small Rb(14.15) suggests that an additional unidenti¢ed pair of chromosomes and a variation in diploid rearrangement has occurred. Similarly, the chro- number between 32 and 34. G-banding patterns mosomal segment assigned to the Y was extremely represent the ¢rst data for this species. reduced in size and was not stained by C-banding The karyotype of the six animals from Samaya (Figure 3b). The X chromosome displayed a sharp in Mali (plus one male from Djoliba and one C-positive intercalary band, and several of the female from Diaban, Mali, for which only stan- autosomes possessed weak interstitial heterochro- dard Giemsa stains were available) consisted of 18 matic bands which were only perceptible after and 19 chromosomes in females and males respec- C-banding alone (not shown). tively, with a FN ¼ 36in both sexes (Figure 2e). The female from Stellenbosch, South Africa Except for the Y chromosome which was acro- presented a similar chromosomal con¢guration centric, all chromosomes were biarmed resulting (2n ¼ 18, FN ¼ 36) (Figure 3c). G-banding of this from Robertsonian translocations. Eight of these individual showed that it shared six Rb transloca- involved only autosomes, Rb(1.5), Rb(2.16), tions with the previous specimens: Rb(3.9), Rb(3.11), Rb(4.13), Rb(6.17), Rb(8.15), Rb(9.10), Rb(4.7), Rb(5.8), Rb(6.11), Rb(12.17) and Rb(12.14), and one the X chromosome, Rb(X.7). Rb(X.1), while the remaining three were unique: The absence of a fusion involving the Y chromo- Rb(2.13), Rb(10.14) and Rb(15.16). Pair 15 pre- some led to a XX/XY1Y2 sex-chromosome sys- sented the same reduction in size as in the previous tem, and thus to the odd diploid number in males cytotype. The X chromosome was heteromorphic, (2n ¼ 19). C-banding was performed on a female the two forms di¡ering in length and banding and showed a large heterochromatic block in the pattern. G-banding revealed three main bands on centromeric region of the X chromosome translo- both X chromosomes; however, these bands were cated onto chromosome 7, whereas very small of equal intensity on the smallest form, whereas heterochromatic blocks were observed in the peri- they were spaced wider, with the middle one much centric regions of most autosomes (Figure 2f). A darker than the other two, in the larger X. After similar chromosomal con¢guration (2n ¼ 18^19, C-banding, both X chromosomes presented a FN ¼ 36) was described from Central African well-pronounced intercalary band located near the Republic and Senegal by Jotterand (1972), who telomere, with an additional less distal band attributed it to the minutoides/musculoides species present in the larger form (Figure 3d). Several auto- complex. In the absence of a referential G-banded somes possessed weak interstitial heterochromatic karyotype and considering the distribution area bands that were only perceptible after C-banding currently assigned to these two species (minutoides alone (not shown). in South-Eastern Africa, and musculoides in Finally, the karyotype of a female from Western and Central Africa; Musser & Carleton Kuruman, South Africa, consisted of 2n ¼ 34, 1993), we considered this karyotype as representing FN ¼ 36. It carried a Rb(X.1) translocation, while M. musculoides. the remaining autosomes were all acrocentric The three remaining cytotypes involved speci- (Figure 3e). In addition, the two X chromosomes mens from di¡erent localities in South Africa. The di¡ered in morphology, one being normal-sized, diploid number ranged from 2n ¼ 18 to 34 due to Rb(X.1), while the other was partially deleted, Chromosomal diversity in african pygmy mice 375

Figure 3. M. minutoides:(a) G-banded karyotype and (b) C-banded metaphase of a male from Caledon. (c) G-banded karyotype and (d) C-banded metaphase of a female from Stellenbosch. (e) G-banded karyotype and (f) C-banded metaphase of a female from Kuruman. Arrows indicate sex chromosomes. Scale bars indicate 10 mm. 376 F. Veyrunes et al.

Rb(Xd.1). C-banding revealed that the deleted Xd Bellomo 1986). This karyotype appears widespread arm was entirely C-positive, whereas the normal- throughout Africa, as it is present in species sized X arm was heterochromatin-free. The distributed in West Africa (M. mattheyi), Ethiopia majority of the autosomal acrocentrics showed (M. mahomet), Burundi (M. bufo) and Southern diminutive blocks of centromeric heterochromatin Africa (M. indutus), and has been regarded as (Figure 3f). An identical G-banded karyotype ancestral within the Nannomys (Matthey 1966, (without the partial deletion of one of the X chro- Jotterand-Bellomo 1984, 1986). However, the mosomes) has been described from Ivory Coast phylogenetic relatedness of the 2n ¼ 36all- by Jotterand-Bellomo (1986) who assigned this acrocentric species remains to be determined by cytotype to the minutoides/musculoides complex. molecular analyses. As the last three cytotypes shared the Rb(X.1) The second group comprises specimens with translocation which so far has only been described FN ¼ 38 and is assigned to M. haussa. All indivi- in specimens of the minutoides/musculoides com- duals share a pericentric inversion, while the plex (Jotterand-Bellomo 1986, Castiglia et al. diploid number varies from 2n ¼ 28 to 34, due to 2002), we have tentatively assigned them to M. varying numbers of autosomal Rb fusions among minutoides, on the basis of the South-Eastern localities. Such variation in diploid number has African distribution area provided for this species also been recorded in specimens from Cameroon by Musser & Carleton (1993). (2n ¼ 32^34; Jotterand 1972), and suggests that M. haussa may be characterized by a gradual accumulation of Rb fusions throughout its range. This Discussion hypothesis is supported by the two Rb fusions shared between the samples from Senegal (2n ¼ 28) Chromosomal diversity and Mali (2n ¼ 33^34), but needs to be con¢rmed by G-banding for the specimens from the other The chromosomal analysis of Nannomys speci- localities. The existence of Rb chromosomal poly- mens from West and South Africa confirmed the morphism may represent a transitory phase prior extensive karyotypic diversification detected by to ¢xation of new Rb fusions, or a hybrid karyo- Matthey (1966) within the pygmy mice. The G- type between chromosomally di¡erentiated popula- banding data allowed us to assign the samples to tions. Within Nannomys, pericentric inversions, five taxa (M. mattheyi, M. indutus, M. haussa, although uncommon, have also been reported in M. musculoides and M. minutoides; Table 1) clus- M. oubanguii (Jotterand-Bellomo 1984). tered into three major species groups based on The third group, represented by the minutoides/ their karyotypes and/or type of chromosomal musculoides complex, comprises taxa in which at rearrangements. In addition, comparison of the least one of the sex chromosomes is translocated rearrangements differentiating the karyotypes onto an autosome, and 0^16autosomal Rb fusions within groups allowed us to infer, in some (aRb) are present. Two X-autosome translocations instances, likely levels of reproductive isolation. are found in this group: Rb(X.7) in M. muscu- The ¢rst group is distinguished by a chromoso- loides from Mali, and Rb(X.1) in all M. minutoides mal con¢guration of 2n ¼ 36, FN ¼ 36. This karyo- from South Africa. Moreover, no aRb fusions are type is shared by M. mattheyi and M. indutus, shared between specimens from these two coun- and has been reported in the literature for other tries, suggesting a high level of chromosomal diver- species such as M. setulosus, M. tenellus, M. bufo gence within this morphologically undi¡erentiated and M. mahomet (Matthey 1966, Jotterand- species complex. The Rb(X.1) translocation found Bellomo 1986, Aniskin et al. 1998). The G-band in the South African specimens has also been recor- karyotypes of the specimens which we assign ded in karyotypes of pygmy mice from Central to this group are identical to those published African Republic (CAR), Ivory Coast (Jotterand- previously for M. mattheyi, M. bufo (Jotterand- Bellomo 1984, 1986) and recently from Zambia Bellomo 1986, 1988) and M. mahomet (Aniskin (Castiglia et al. 2002). The geographically wide- et al. 1998), whereas di¡erences in C-banding are spread occurrence of this fusion raises the question present between these and M. setulosus (Jotterand- of their phylogenetic relationship. Sex-autosome Chromosomal diversity in african pygmy mice 377 translocations are highly deleterious chromosomal 1986, Castiglia et al. 2002), at least two highly rearrangements in mammals (King 1993, Ashley reproductively isolated groups are expected, 2002), and are thus not expected to be prone to and may represent cryptic species complexes. convergence (Rokas & Holland 2000). This would Molecular analyses are required to extend these suggest that the Rb(X.1) translocation may result observations and to support the phylogenetic relat- from a unique event, in which case all cytotypes edness of all Rb(X.1)-carrying taxa. In addition, carrying this rearrangement would belong to the extensive geographic sampling, particularly in same phylogenetic lineage, the female from Kuru- South Africa, is needed to determine the distribu- man representing an ancestral form since only this tional boundaries between related cytotypes and fusion is present. Subsequent chromosomal di¡er- their taxonomic assignment. In particular, the entiation within this lineage would have occurred 2n ¼ 18 specimens from Caledon, South Africa through ¢xation of aRb fusions: one in CAR and may represent M. orangiae described from the Ivory Coast (Jotterand-Bellomo 1984, 1986), ¢ve Free State, South Africa (Musser & Carleton in Zambia (Castiglia et al. 2002) and eight in 1993, Bronner et al. 2003), which until recently South Africa (specimens from Caledon and Stellen- was considered as a subspecies of M. minutoides. bosch). Identi¢cation of the chromosomal arms Until further systematics studies are performed, involved in the aRb fusions showed that none of we propose that all samples carrying the Rb(X.1) the latter were shared by mice from these di¡erent translocation should be assigned to a ‘minutoides countries, leading to extensive monobrachial (i.e. species complex’, thereby extending its previous single arm) homology (Table 2). The e¡ects of western and northern distribution limit from south- aRb translocation heterozygosity on fertility have ern Africa to Ivory Coast. been intensively studied in several mammalian spe- If the systematics of Nannomys species is unsa- cies, and have shown that the level of gameto- tisfactory owing to the lack of discriminating mor- genetic disruption in hybrids depended on the phological characters, it is further confounded by nature and number of chromosomes involved. In the sympatric coexistence of similarly-sized species particular, the presence of a large number of triva- (Jotterand-Bellomo 1988). In Samaya (Mali), two lents and/or of meiotic chain con¢gurations invol- species were collected in the same locality, but in ving more than ¢ve chromosomes was found to di¡erent sites. Thus, M. musculoides (2n ¼ 18^19) severely impair gametogenesis leading to complete was trapped in rice-cultivated areas, and M. sterility in some cases (Gropp et al. 1982, Redi & mattheyi (2n ¼ 36) in neighboring sweet potato Garagna et al. 1990, Saı¨d et al. 1993, Hau¡e & ¢elds. No hybrids between the two were found. Searle 1998, Castiglia & Capanna 2000). As this These results stress the diagnostic value of would be the case for hybrids resulting from karyotypic traits in this morphologically homo- crosses between either of the 2n ¼ 18 specimens geneous subgenus. from South Africa and all the other cytotypes (Kuruman, Zambia, CAR and Ivory Coast), these Sex chromosome diversity data strongly suggest that they represent two reproductively isolated groups. However, the extent of In addition to the occurrence of sex-autosome meiotic disruption within each of these groups is translocations, African pygmy mice show further less straightforward, since meiosis would involve a modifications of sex chromosome morphology. A ring of 6chromosomes in the former group, and case in point is the partially deleted and entirely few trivalents (0^5) and/or small chains (4^5 chro- C-positive Xd chromosome arm of the female M. mosomes) in the latter, con¢gurations that lead to minutoides from Kuruman. The occurrence of variable levels of subfertility in house mice and such chromosomes is not unusual among the shrews (Gropp et al. 1982, Redi & Capanna 1988, Nannomys, as similar reports have been described Garagna et al. 1990, Mercer et al. 1992, Hau¡e & in M. minutoides/musculoides from Zambia Searle 1998, Banaszek et al. 2000, Pialek et al. (Castiglia et al. 2002), Ivory Coast (Matthey 2001). In summary, among the six di¡erent 1966), and CAR (Jotterand 1972), and in M. cytotypes that have been described within the triton from Congo (Matthey 1967). In all cases, Rb(X.1) lineage (this study, Jotterand-Bellomo the Xd chromosome is only observed in females 378

Table 2. List of known Rb translocations in Nannomys.

Chromosome number

SpeciesCountry(locality)XY12 345689 1012131415References

M. haussa Senegal (Thie`s) 2.12 4.6 5.7 9.10 this study Mali (Me´naka) 2.12* 4.6 this study M. musculoides Mali (Samaya) X.7 1.5 2.16 3.11 4.13 6.17 8.15 9.10 12.14 this study M. minutoides SA (Caledon) X.1 2.10 3.9 4.7 5.8 6.11 12.17 13.16 14.15 this study SA (Stellenbosch) X.1 ? 2.13 3.9 4.7 5.8 6.11 10.14 12.17 15.16 this study SA (Kuruman) X.1 ? this study Zambia X.1 Y.1 2.7 3.12 4.5 6.8 9.16* Castiglia et al. 2002 Ivory Coast X.1 Y.1 2.17* Jotterand-Bellomo 1986 CAR X.1 Y.1 3.7* Jotterand-Bellomo 1986 M. oubanguii CAR X.15 Y.15 4.10 8.13 Jotterand-Bellomo 1986 M. triton Burundi X.12 2.15* Jotterand-Bellomo 1988

? ¼ unknown event; * ¼ polymorphic Rb translocations. .Vyue tal. et Veyrunes F. Chromosomal diversity in african pygmy mice 379 and is always in a heterozygous form, the pro- common rearrangement in the karyotypic differ- portion of XXd individuals varying from 20% to entiation of the African pygmy mice. Twenty- 60% of the female population. The absence of four Rb fusions were identiﬁed in the present XdXd and XdY individuals suggests that the lat- investigation, 23 of which are newly described, ter combination is likely lethal. The evolutionary raising to 38 the number of known Rb transloca- mechanisms leading to and maintaining this tions within African pygmy mice (Table 2). All apparently selectively disadvantageous X chro- chromosomes were involved in a minimum of mosome form remain unknown. Other rodent two and up to seven (e.g. chromosome 2) distinct species such as Akodon show a comparable sys- Rb fusions. These rearrangements were present tem (females are XX or XY*), and Bianchi in several species, but only one was identical in (2002) has shown that XY* females have a larger two of them: Rb(9.10). These results highlight a ovulation rate or a longer reproductive lifespan particularly proneness for autosomal Rb fusions than XX females, thereby compensating for the in Nannomys, similar to that described in another loss of YY* embryos. Furthermore, it is of note species of a closely related subgenus of Mus, i.e. that partially deleted X chromosomes have so far the well studied Mus musculus domesticus. Sev- only been noted in Nannomys taxa carrying eral authors (Redi et al. 1990, Garagna et al. X-autosome translocations. 2001) have proposed that the recurrence of aRb Variation in length of the Y chromosome fusions in a genome is related to large amounts between species is a common feature in mammals, and high degree of homology of pericentromeric but seems particularly pronounced in African satellite DNA sequences. However, C-banding pygmy mice. The Y chromosome, when acro- analyses revealed contrasting results within Nan- centric, is slightly larger than the smallest auto- nomys. No autosomal pericentromeric C-positive some pair (e.g. M. mattheyi: this study and heterochromatin was observed in M. mattheyi, Jotterand-Bellomo 1986; M. setulosus: Jotterand- M. indutus and M. minutoides from Caledon and Bellomo 1986; Y1 of M. musculoides: this study), Stellenbosch (this study), and from M. minu- but may decrease dramatically, becoming the smal- toides/musculoides from CAR and Zambia lest arm of the karyotype (e.g. M. minutoides/ (Jotterand-Bellomo 1984, Castiglia et al. 2002). musculoides and M. oubanguii: Jotterand-Bellomo Additionally, very small heterochromatic blocks 1986; M. mahomet: Aniskin et al. 1998). An even in the pericentric regions of most autosomes larger decrease is observed in the diminutive Y of in M. haussa, M. musculoides, M. minutoides the M. minutoides males from Caledon (South from Kuruman (this study) and M. oubanguii Africa), although assigning these sequences to a (Jotterand-Bellomo 1984) were observed, whereas functional Y chromosome requires molecular con- large amounts were present in M. setulosus ¢rmation using Y-speci¢c probes, as they showed (Jotterand-Bellomo 1984) and M. mahomet no C þ staining, contrary to the other species. (Aniskin et al. 1998). Thus, the data for Nannomys Such a molecular identi¢cation is essential as total provide only partial support for these Rb-enhan- deletion of the Y chromosome has been observed cing molecular requirements, unless these sequen- in M. triton (Jotterand-Bellomo 1988), resulting in ces were present initially and subsequently lost. a weird sex determination mechanism known for A prominent feature among the Rb fusions iden- only three other species of mammals in which ti¢ed in the pygmy mice studied was the presence males and females are XO: two spiny rats species of two sex-autosome translocations, one of which of the genus Tokudaia (Sutou et al. 2001, Arakawa is newly described (Rb(X.7) in M. musculoides). et al. 2002), and the mole vole Ellobius lutescens Thus, a total of no less than four di¡erent X- (Just et al. 1995, 2002). autosome Rb fusions are now known in the subgenus (Table 2), making Nannomys the lineage of Pattern of autosome and sex chromosome evolution mammals having the greatest diversity of sex- autosome translocations known so far. Such re- The present study supports previous observations arrangements are known to have a highly deleterious that suggest Rb translocations involving both e¡ect on gene expression and gametogenesis in autosomes and sex chromosomes as the most mammals, due to the di¡erential inactivation and 380 F. Veyrunes et al. replication requirements of the X and autosome addition, in the European shrew Sorex araneus,a genomes (King 1993, Ashley 2002, Dobigny et al. heterochromatic C-negative but late-replicating submitted). The existence of several X-autosome block was observed between the sexual and fusions in Nannomys suggests that speci¢c genomic autosomal segments (in Dobigny et al. submitted). traits allowing a higher rate of appearance and/or Therefore, isolation of the sex and autosome ¢xation of this rearrangement may be present genomic compartments in M. minutoides may within this subgenus. Several authors (Viegas- involve other types of repetitive sequences, such as Pe¤ quignot et al. 1982, Ratomponirina et al. 1986, telomeres and rDNA clusters (Parish et al. 2002), Jaafar et al. 1993, Dobigny et al. submitted) have or genomic characteristics speci¢c to chromosome proposed that the presence of a large heterochro- 1 such as a low density of LINE-1 elements, as matic block between the original X and the trans- they appear to act as booster elements of the located autosome may represent such a feature. X-inactivation process (Bailey et al. 2000, Parish This would serve as a boundary preventing X-inac- et al. 2002). This study has revealed a high diver- tivation from spreading to the autosomal segment, sity of rearrangements involving the sex chromo- and would also allow an independent regulation somes in the African pygmy mice, which may be of replication timing on both the sexual and unique among mammals, and undoubtedly makes autosomal arms (reviewed in Dobigny et al. sub- this subgenus a choice model for investigating the mitted). The pathological consequences of such a evolution of sex determination mechanisms. rearrangement will thus be reduced, increasing the viability and fertility of the individuals carrying it. Support for this hypothesis is found in most of the Acknowledgments mammal species known to possess sex-autosome translocations, in which a large amount of cen- We are extremely grateful to S. Ag Atteynine, tromeric heterochromatin located between the K. Ba, C.T. Chiminba, C. Kone´, T. Maddalena, autosomal and sexual segments has been observed V. Nance´, J.A.J. Nel, Y. Papillon, P. Vogel, (Viegas-Pe¤ quignot et al. 1982, Tucker 1986, J. Watson and all the members of the ‘Chad Ratomponirina et al. 1986, Jaafar et al. 1993, operation’ leaded by C. Denys, for their con- Yang et al. 1997, Metcalfe et al. 1998, Rodrigues tribution in collecting specimens. This study was Noronha et al. 2001, Dobigny et al. 2002, supported by a CNRS-NRF collaboration (N submitted). The C-banding analyses performed in 13293 and 15439 2002–2004), CNRS-UM II Nannomys showed that, whereas no centromeric grants to UMR 5554 and IRDfunding to UMR heterochromatin was present on the acrocentric X 022. This is publication ISEM N 2004-004. chromosomes of M. mattheyi and indutus, and only a small amount in M. haussa, a large pericentromeric block was evident on the X chromosome References arm of Rb(X.7) in M. musculoides. However, this was not the case for the M. minutoides taxa carry- Aniskin VM, Lavrenchenko LA, Varshavskii AA, Milishnikov ing Rb(X.1), since no C þ staining was observed AN (1998) Karyotypes and cytogenetic differentiation of two african mouse species of genus Mus (Rodentia, on the ‘‘normal’’ X arm of the sample from Muridae). Russ J Genet 34: 80–85. Kuruman, and only interstitial ones in those from Arakawa Y, Nishida-Umehara C, Matsuda Y, Sutou S, Suzuki Caledon and Stellenbosch. Similar observations H (2002) X-chromosomal localization of mammalian were made in the Rb(X.1)-carrying specimens Y-linked genes in two XO species of the Ryukyu spiny rat. from CAR and Zambia (Jotterand-Bellomo 1984, Cytogenet Genome Res 99: 303–309. Ashley T (2002) X-autosome translocations, meiotic synapsis, Castiglia et al. 2002). So, while results for M. chromosome evolution and speciation. Cytogenet Genome musculoides follow the expected pattern for X- Res 96: 33–39. autosome translocations, those for M. minutoides Bailey JA, Carrel L, Chakravarti A, Eichler EE (2000) clearly do not. However, Castiglia et al. (2002) Molecular evidence for a relationship between LINE-1 reported the presence of centromeric telomeric elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA 97: 6634–6639. sequences on both the Rb(X.1) and Rb(Y.1) Banaszek A, Fedyk S, Szalaj KA, Chetnicki W (2000) A chromosomes of the samples from Zambia. In comparison of spermatogenesis in homozygotes, simple Chromosomal diversity in african pygmy mice 381

Robertsonian heterozygotes and complex heterozygotes Hauffe HC, Searle JB (1998) Chromosomal heterozygosity and of the common shrew (Sorex araneus L.). Heredity 84: fertility in house mice (Mus musculus domesticus) from 570–577. Northern Italy. Genetics 150: 1143–1154. Bianchi NO (2002) Akodon sex reversed females: the never Jaafar H, Gabriel-Robez O, Rumpler Y (1993) Chromosomal ending story. Cytogenet Genome Res 96: 60–65. anomalies and disturbance of transcriptional activity at the Britton-Davidian J, Catalan J, Ramalhinho MDG et al. (2000) pachytene stage of meiosis: relationship to male sterility. Rapid chromosomal evolution in island mice. Nature 403: Cytogenet Cell Genet 64: 273–280. 158. Jotterand M (1970) Un nouveau syste`me polymorphe Bronner GN, Hoffmann M, Taylor PJ et al. (2003) A revised robertsonien chez une nouvelle espe`ce de ‘Leggada’ (Mus systematic checklist of the extant mammals of the southern goundae Petter). Experientia 26: 1360–1361. African subregion. Durban Museum Novitates 28: 56–106. Jotterand M (1972) Le polymorphisme chromosomique des Castiglia R, Capanna E (2000) Contact zone between Mus (Leggadas) africains. Cytogeńe´tique, zoogeógraphie, chromosomal races of Mus musculus domesticus. 2. Fertility e´volution. Rev Suisse Zool 79: 287–359. and segregation in laboratory-reared and wild mice Jotterand-Bellomo M (1984) L’analyse cytogeńe´tique de deux heterozygous for multiple Robertsonian rearrangements. espe`ces de Muridae africains, Mus oubanguii et Mus Hereditas 85: 147–156. minutoides/musculoides: polymorphisme chromosomique et Castiglia R, Gormung E, Corti M (2002) Cytogenetic analyses e´bauche d’une phylogeńie. Cytogenet Cell Genet 38: of chromosomal rearrangements in Mus minutoı¨des/ 182–188. musculoı¨des from North-West Zambia through mapping Jotterand-Bellomo M (1986) Le genre Mus africain, un of the telomeric sequence (TTAGGG)n and banding exemple d’homogeńeíte´ caryotypique: e´tude cytogeńe´tique techniques. Chromosome Res 10: 399–406. de Mus minutoides/musculoides (Coˆte d’Ivoire), de M. Catzeflis F, Denys C (1992) The African Nannomys (Muridae): setulosus (Re´publique Centrafricaine), et de M. mattheyi an early offshoot from the Mus lineage. Evidence from (Burkina Faso). Cytogenet Cell Genet 42: 99–104. scnDNA hybridization experiments and compared mor- Jotterand-Bellomo M (1988) Chromosome analysis of five phology. Israel J Zool 38: 219–231. specimens of Mus bufo-triton (Muridae) from Burundi Delneri D, Colson I, Grammenoudi S, Roberts IN, Louis EJ, (Africa): three cytogenetic entities, a special type of Oliver SG (2003) Engineering evolution to study speciation chromosomal sex determination, taxonomy, and phylogeny. in yeasts. Nature 422: 68–72. Cytogenet Cell Genet 48: 88–91. Dobigny G, Aniskin V, Volobouev V (2002) Explosive Just W, Rau W, Vogel W et al. (1995) Absence of SRY in chromosome evolution and speciation in the gerbil genus species of the vole Ellobius. Nature Genet 11: 117–118. Taterillus (Rodentia; Gerbillinae): a case of two new cryptic Just W, Baumstark A, Hameister H et al. (2002) The sex species. Cytogenet Genome Res 96: 117–124. determination in Ellobius lutescens remains bizarre. Cyto- Dobigny G, Ozouf-Costaz C, Bonillo C, Volobouev V (sub- genet Genome Res 96: 146–153. mitted) Viability of X-autosome translocations in mammals: King M (1993) Species evolution. The role of chromosome an epigenomic hypothesis from a rodent case-study. change. Cambridge: Cambridge University Press. Evans EP, Breckon G, Ford CE (1964) An air-drying Lee MR, Elder FFB (1980) Yeast stimulation of bone marrow method for meiotic preparations from mammalian testes. mitosis for cytogenetic investigations. Cytogenet Cell Genet Cytogenetics 3: 289–294. 26: 36–40. Fredga K (1965) A new sex determining in a mammal. Losos JB, Jackman TR, Larson A, de Queiroz Q, Rodriguez- Chromosomes of Indian mongoose (Herpestes auro- Schettino L (1998) Contingency and determinism in punctatus). Hereditas 52: 411–420. replicated adaptive radiations of island lizards. Science 279: Fredga K (1972) Comparative chromosome studies in 2115–2118. mongooses (Carnivora, Viverridae). I. Idiograms of 12 Macholan M (2001) Multivariate analysis of morphometric species and karyotype evolution in Herpestinae. Hereditas variation in Asian Mus and sub-saharan Nannomys 71: 1–74. (Rodentia: Muridae). Zool Anz 240: 7–14. Garagna S, Redi CA, Zuccoti M, Britton-Davidian J, Winking Marshall JT (1981) Taxonomy. In: Foster HL, Small JD, Fox H (1990) Kinetics of oogenesis in mice heterozygous for JG, eds. The mouse in biomedical research, volume 1. New Robertsonian translocations. Differentiation 42: 167–171. York: Academic Press, pp 17–26. Garagna S, Marziliano N, Zuccotti M, Searle J, Capanna E, Matthey R (1952) Chromosomes de Muridae (Microtinae et Redi CA (2001) Pericentromeric organization at the fusion Cricetinae). Chromosoma 5: 113–138. point of mouse Robertsonian translocation chromosomes. Matthey R (1959) Formules chromosomiques de Muridae et Proc Natl Acad Sci USA 98: 171–175. Spalacidae. La question du polymorphisme chromosomique Grant PR (1981) Speciation and the adaptive radiation of the chez les mammife`res. Rev Suisse Zool 66: 175–209. Darwin’s Finches. Am Sci 69: 653–663. Matthey R (1964) Evolution chromosomique et spećiation Gropp A, Winking H, Redi C (1982) Consequences of chez les Mus du sous-genre Leggada. Experientia 20: Robertsonian heterozygosity: segregational impairment of 657–665. fertility versus male-limited sterility. In: Crosignani PG, Matthey R (1965) Etudes de cytogeńe´tique sur les Rubin BL, eds. Serono Clinical Colloquia on Reproduction Murinae africains appartenant aux genres Arvicanthis, N3. New York: Academic Press/Grune and Stratton 3: Praomys, Acomys et Mastomys (Rodentia). Mammalia 29: 115–134. 228–249. 382 F. Veyrunes et al.

Matthey R (1966) Le polymorphisme chromosomique des Mus Redi CA, Garagna S, Capanna E (1990) Nature’s experiment africains du sous-genre Leggada.Re´vision geńe´rale portant with in situ hybridization? A hypothesis for the mechanism sur l’analyse de 213 individus. Rev Suisse Zool 73: 585–607. of Rb fusion. J Evol Biol 3: 133–137. Matthey R (1967) Cytogeńe´tique des Leggada: (1) la formule Rieseberg LH (2001) Chromosomal rearrangements and chromosomique de Mus (Leggada) bufo, (2) Nouvelles speciation. Trends Ecol Evol 16: 351–358. donneés sur la de´le´tion portant sur le bras court d’un X chez Rodrigues Noronha RC, Nagamachi CY, Pieczarka JC, Mus (Leggada) triton. Experientia 23: 133–134. Marques-Aguiar S, De Souza Barros RM (2001) Matthey R (1970) Nouvelles donneés sur la cytogeńe´tique et la Sex-autosome translocations: meiotic behaviour suggests spećiation des Leggada (Mammalia–Rodentia–Muridae). an inactivation block with permanence of autosomal Experientia 26: 102–103. gene activity in Phyllostomids bats. Caryologia 54: Mercer SJ, Wallace BMN, Searle JB (1992) Male common 267–277. shrews (Sorex araneus) with long chain configurations can be Rokas A, Holland PWH (2000) Rare genomic changes as a fertile: implications for chromosomal models of speciation. tool for phylogenetics. Trends Ecol Evol 15: 454–459. Cytogenet Cell Genet 60: 68–73. Saı¨d K, Saad A, Auffray JC, Britton-Davidian J (1993) Metcalfe CJ, Eldridge MDB, Toder R, Johnston PG (1998) Fertility estimates in the Tunisian all-acrocentric and Mapping the distribution of the telomeric sequence Robertsonian populations of the house mouse and their (T2AG3)n in the Macropodoidea (Marsupialia), by fluor- chromosomal hybrids. Heredity 71: 532–538. escence in situ hybridization. I. The swamp wallaby, Sato A, O’hUigin C, Figueroa F et al. (1999) Phylogeny of Wallabia bicolor. Chromosome Res 6: 603–610. Darwin’s finches as revealed by mtDNA sequences. Proc Musser GG, Carleton MD(1993) Family Muridae. In: Wilson Natl Acad Sci USA 96: 5101–5106. DE, Reeder DM, eds. Mammal species of the world. A Seabright J (1971) A rapid technique for human chromosomes. taxonomic and geographic reference. Washington and Lancet II: 971–972. London: Smithsonian Institution Press, pp 501–755. Searle JB (1993) Chromosomal hybrid zones in eutherian Neitzel H (1987) Chromosome evolution of Cervidae: karyotypic mammals. In: Harrison RG, eds. Hybrid zones and the and molecular aspects. In: Obe G, Basler A, eds. Cytogenetics. evolutionary process. Oxford: Oxford University Press, pp Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, pp 90–112. 309–353. Pack SD, Borodin PM, Serov OL, Searle JB (1993) The X- Sumner AT (1972) A simple technique for demonstrating autosome translocation in the common shrew (Sorex araneus centromeric heterochromatin. Exp Cell Res 75: 304–306. L.): late replication in female somatic cells and pairing in Sutou S, Mitsui Y, Tsuchiya K (2001) Sex determination male meiosis. Chromosoma 102: 355–360. without the Y chromosome in two Japanese rodents Parish DA, Vise P, Wichman HA, Bull JJ, Baker RJ (2002) Tokudaia osimensis osimensis and Tokudaia osimensis spp. Distribution of LINEs and others repetitive elements in the Mamm Genome 12: 17–21. karyotype of the bat Carollia: implications for X-chromosome Tucker PK (1986) Sex chromosome-autosome translocations in inactivation. Cytogenet Genome Res 96: 191–197. the leaf-nosed bats, family Phyllostomidae. I. Mitotic Petter F (1963) Contribution a` la connaissance des souris analyses of the subfamilies Stenodermatinae and Phyllos- africaines. Mammalia 27: 602–607. tominae. Cytogenet Cell Genet 43: 19–27. Petter F (1981) Les souris africaines du groupe sorella Vassart M, Seguela A, Hayes H (1995) Chromosomal (Rongeurs, Muride´s). Mammalia 45: 313–320 evolution in Gazelles. J Hered 86: 216–227. Pialek J, Hauffe HC, Rodriguez-Clark KM, Searle JB (2001) Viegas-Pe´quignot E, Benazzou T, Dutrillaux B, Petter F (1982) Raciation and speciation in house mice from the Alps: the Complex evolution of sex chromosomes in Gerbillidae role of chromosomes. Mol Ecol 10: 613–625. (Rodentia). Cytogenet Cell Genet 34: 158–167.

Ratomponirina C, Viegas-Pe´quignot E, Dutrillaux B, Petter F, Volobouev V, Granjon L (1996) A ﬁnding of the XX/XY1Y2 Rumpler Y (1986) Synaptonemal complexes in Gerbillidae: sex-chromosome system in Taterillus arenarius (Gerbillinae, probable role of intercaled heterochromatin in gonosome- Rodentia) and its phylogenetic implications. Cytogenet Cell autosome translocations. Cytogenet Cell Genet 43: 161–167. Genet 75: 45–48. Redi CA, Capanna E (1988) Robertsonian heterozygotes in the Yang F, O’Brien PCM, Wienberg J, Ferguson-Smith MA house mouse and the fate of their germ cells. In: Daniel A, (1997) A reappraisal of the tandem fusion theory of eds. The cytogenetics of mammalian autosomal rearrange- karyotype evolution in the Indian muntjac using chro- ments. New York: Alan R. Liss, Inc., pp 315–359. mosome painting. Chromosome Res 5: 109–117. Résumé article 4 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

B. Phylogénie moléculaire

Une étude phylogénétique basée sur les séquences du gène mitochondrial cytochrome b et du gène nucléaire IRBP a été réalisée sur un échantillonnage le plus exhaustif possible de souris naines africaines (Article 4 : Veyrunes et al., 2005). Ce travail a pour but de proposer la première phylogénie de Nannomys, afin (i) de clarifier en partie la systématique de ce groupe très diversifié, (ii) de préciser la connaissance des aires de distribution, (iii) d’obtenir un cadre temporel à partir duquel des scénarios biogéographiques seront discutés, (iv) de tester la congruence des données chromosomiques (Veyrunes et al., 2004) et moléculaires, (v) d’étudier dans un cadre phylogénétique et temporel, l’évolution chromosomique de ce groupe, et enfin (vi) d’amorcer une réflexion sur les processus chromosomiques et génomiques associés aux événements de cladogénèse.

Alors que leur morphologie est très conservée, les résultats révèlent que les espèces étudiées sont génétiquement très différenciées (entre 10 et 16% de distance génétique entre deux espèces jumelles), et que les réarrangements chromosomiques offrent de bons critères diagnostics pour distinguer la plupart des espèces. Les aires de répartitions de certaines d’entre elles ont pu être précisées, voire même largement étendues. A titre d’exemple, d’après la littérature, M. minutoides était jusqu’ici restreinte à l’Afrique australe, alors qu’en réalité elle occupe pratiquement toute l’Afrique sub-saharienne. De plus, la validité de la classification systématique basée sur la morphologie des chromosomes sexuels, PR/TR (i.e. non-fusionnés vs. fusionnés à un autosome), a pu être testée ; il apparaît ainsi que les espèces présentant différentes fusions sexe-autosome sont monophylétiques, alors que les espèces PR sont paraphylétiques. Cette classification ne correspond donc pas à une réalité biologique. Ces résultats confirment que les fusions sexe-autosome sont des événements rares (Rokas & Holland, 2000), et sont donc moins sujettes à la convergence que les fusions entre autosomes. Si le clade TR est confirmé par l’addition de nouveaux taxons caractérisés par des fusions Rb sexe- autosome impliquant d’autres autosomes, alors l’origine unique des espèces TR suggère qu'une modification du génome autorisant un taux plus élevé d'occurrence et/ou de fixation de tels événements a eu lieu, menant à l’émergence de cette lignée. De plus, cette étude montre que les fusions sexe-autosome pourraient être à l’origine d’événements rapides de spéciation.

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Article 4 :

Molecular phylogeny of the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Rodentia, Murinae, Mus): implications for chromosomal evolution.

Veyrunes F, Britton-Davidian J, Robinson TJ, Calvet E, Denys C, Chevret P. 2005.

Molecular Phylogenetics and Evolution 36: 358-369

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106 Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 www.elsevier.com/locate/ympev

Molecular phylogeny of the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Rodentia, Murinae, Mus): Implications for chromosomal evolution

Frédéric Veyrunes a,b,¤, Janice Britton-Davidian a, Terence J. Robinson c, Elisabeth Calvet d, Christiane Denys d, Pascale Chevret b

a Institut des Sciences de l’Evolution (UMR5554), Génétique and Environnement, Université Montpellier II, Montpellier, France b Institut des Sciences de l’Evolution (UMR5554), Paléontologie, Paléobiologie and Phylogénie, Université Montpellier II, Montpellier, France c Department of Botany and Zoology, University of Stellenbosch, South Africa d Muséum National d’Histoire Naturelle, Département Systématique et Evolution, Origine, Structure et Evolution de la Biodiversité (FRE 2695 CNRS), Paris, France

Received 12 October 2004; revised 2 February 2005 Available online 23 March 2005

Abstract

Molecular phylogenies based on sequences of mitochondrial cytochrome b and nuclear IRBP genes are assessed on a comprehensive taxonomic sampling of African pygmy mice (subgenus Nannomys of the genus Mus). They represent a taxonomically diversiWed group of morphologically similar species, and exhibit an important chromosomal diversity, particularly involving sex-autosome translocations, one of the rarest and most deleterious chromosomal changes among mammals. The results show that the species sampled are genetically well diVerentiated, and that chromosomal rearrangements oVer accurate diagnostic characters for discriminating most species. Furthermore, the species carrying diVerent sex-autosome translocations appear monophyletic, suggesting that a genome modiWcation allowing a higher rate of occurrence and/or Wxation of such translocations took place, leading to the emergence of this lineage. In addition to taxonomic and biogeographical clariWcations, we provide a temporal framework within which patterns of genic and chromosomal evolution are discussed.  2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: African pygmy mice; Nannomys; Mus; Cytochrome b; Exon IRBP; Molecular systematics; Chromosomal evolution; Sex-autosome translocations

1. Introduction pygmy mice are a complex of morphologically very similar species (Macholan, 2001; Petter, 1963, 1981), which has The African pygmy mice (Rodentia, Muridae) are a led to the description of 5–30 species depending on the group of small-sized rodents (4–12g) widespread through- authors. More recently, Musser and Carleton (1993) rec- out sub-Saharan Africa, occupying a wide range of habi- ognized 19 species, but highlighted the need for a system- tats from deserts to altitudinal forests. They belong to the atic revision using chromosomal and/or molecular subgenus Nannomys, formerly named Leggada (e.g., Mat- markers owing to the low diagnostic resolution of mor- they, 1966; Meester et al., 1986; Rosevear, 1969), and are phological characters in this group. A case in point is the included in the genus Mus with three other subgenera number of specimens described as Mus sp. in the literature (Coelomys, Pyromys, and Mus sensu stricto -ss-; e.g. Mar- or assigned to species complexes such as Mus minutoides/ shall, 1981; Musser and Carleton, 1993). The African musculoides (Aniskin et al., 1998; Castiglia et al., 2002; Jotterand-Bellomo, 1986). In contrast to the species’ * Corresponding author. Fax: + 33 4 67 14 36 22. highly conserved morphology, chromosomal studies have E-mail address: [email protected] (F. Veyrunes). uncovered extensive karyotypic diversity within this group

(Castiglia et al., 2002; Jotterand-Bellomo, 1986, 1988; Wcation is proposed, and the diagnostic value of chro- Matthey, 1966; Veyrunes et al., 2004). The most frequently mosomal characters in discriminating diVerent species encountered rearrangement are Robertsonian (Rb) trans- of African pygmy mice is evaluated. The phylogenetic locations between autosomes, but an unexpectedly large analyses further provide a temporal framework within number of chromosomal changes also involve the sex which the rates and patterns of chromosome evolution chromosomes. In fact, the African pygmy mice are nota- in the subgenus Nannomys are assessed. ble for having the greatest diversity of sex-autosome translocations known in a mammalian lineage (Veyrunes et al., 2004). The widespread occurrence of these translo- 2. Material and methods cations has led several authors (Jotterand, 1972; Matthey, 1966) to cluster the Nannomys species into two groups 2.1. Taxon sampling according to the morphology of the sex chromosomes. The Wrst comprises species having acrocentric sex chro- A total of 28 wild-caught individuals of Nannomys mosomes, considered as the ancestral type, named “PR” collected from 26 localities in 12 countries distributed for “primitive.” The second group clusters species in which throughout sub-Saharan Africa (Fig. 1) have been the X and/or Y chromosomes are (sub)metacentric, due to sequenced for this study. Tentative taxonomic assigna- Rb translocations with autosomes, named “TR” for tion of most pygmy mouse specimens (see Veyrunes et “translocated.” However, the validity of this classiWcation al., 2004) was performed by comparison of karyotypes has never been tested with molecular markers. In addition, with published data and/or known distribution area as sex-autosome translocations are highly deleterious (Jotterand, 1972; Jotterand-Bellomo, 1986; Matthey, events (King, 1993), they will likely generate eYcient bar- 1966; Musser and Carleton, 1993). Others have been riers to gene Xow and lead to reproductive isolation (Del- assigned by morphological analyses (e.g., M. setulosus neri et al., 2003; King, 1993; Rieseberg, 2001; Searle, 1993). individuals from Guinea and Gabon -one of the few spe- Thus, these rearrangements are not only considered as cies easily recognized by morphology), or have not been potential drivers of speciation, but should also provide a speciWcally determined (e.g., one specimen from Chad strong phylogenetic signal since they are not expected to and one from Kenya). Table 1 lists all Nannomys speci- be prone to convergence (Rokas and Holland, 2000). mens involved in the molecular study, with their The aim of the present study was to investigate phy- sequence accession numbers or references, their origin, logenetic relationships among a sample of karyotypi- diploid and fundamental numbers, and sex chromosome cally diVerentiated African pygmy mice widely group (TR/PR) when known. Other Murinae (six species distributed throughout sub-Saharan Africa. This anal- of Mus of the three other subgenera, two species of ysis is based on mitochondrial cytochrome b sequences Apodemus, Rattus, and Leopoldamys) were used respec- and those of the nuclear interphotoreceptor retinoid tively as representatives of the genus, timescale calibra- binding protein (IRBP) gene. Both genetic markers tion point, or outgroups. have been used successfully to resolve systematic relationships in a number of related murid rodents (Chev- ret et al., 2005; Ducroz et al., 1998; Lecompte et al., 2002; Michaux et al., 2002; Suzuki et al., 2003; Tie- mann-Boege et al., 2000; Weksler, 2003). This study comprises the most comprehensive taxonomic sampling analysed so far within the subgenus. Although the Nannomys represent approximatively half of the speciWc richness of the genus Mus, they have always been under-represented in previous molecular phylogenies of the genus, which included only one or two species (Bonhomme, 1992; Boursot et al., 1993; CatzeXis and Denys, 1992; Chevret et al., 2003; Lundrigan et al., 2002; She et al., 1990; Sourrouille et al., 1995; Suzuki et al., 2004) or Wve species at the most (Chevret et al., 2005). In addition, given that most of the specimens sequenced have previously been karyotyped (Veyrunes et al., 2004), the monophyly of the TR and PR chromosomal groups is tested, as well as the multiple versus unique origin of TR species carrying sex chromosomes Fig. 1. Map showing the locality of study sites sampled in this investi- translocated onto diVerent autosomal pairs. From gation. Locality numbers are indicated in Table 1. Crosses indicate these analyses, a taxonomic and biogeographical clari- samples for which the precise locality is unknown. 360 F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369

Table 1 List of Nannomys taxa used in this study with species assignment, origin, karyotypic data and references, and accession number or reference (when published) of gene sequences Species Country Locality Cytochrome b IRBP 2n FN PR/TR References M. mattheyi Burkina Faso Oursi, 1 AJ877114/AJ877115 — 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) Mali Farabana, 2 AJ875066 — 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) Mali Kabalabougou, 3 Chevret et al. (2005) Chevret et al. (2005) 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) Mali Samaya, 4 AJ875067 — 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) Senegal Bandia, 5 AJ875068 — 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) Togo ? 6 AJ875069 — 36 36 PR Nancé, unpublished data M. indutus South Africa Tussen die reviere, 7 AJ875070 — 36 36 PR Veyrunes et al. (2004) South Africa Kgalagadi NP, 8 Chevret et al. (2005) Chevret et al. (2005) M. haussa Chad Karal, 9 AJ875071 — 30 38 PR Veyrunes et al. (2004) Mali Ménaka, 10 Chevret et al. (2005) Chevret et al. (2005) 32–33 38 PR Veyrunes et al. (2004) Niger Guileyni, 11 AJ875072 — 33–34 38 PR Veyrunes et al. (2004) Niger Kollo, 12 AJ875073 — 31–33 38 PR Veyrunes et al. (2004) Senegal Thiès, 13 AJ875074 — 28 38 PR Veyrunes et al. (2004) M. musculoides Mali Djoliba, 14 AJ875075 — 19 36 TR (X.7) Veyrunes et al. (2004) Mali Samaya, 4 Chevret et al. (2005) Chevret et al. (2005) 18–19a 36 TR (X.7) Veyrunes et al. (2004) Mali Bamako, 15 Barome et al. (1998) — M. minutoides Guinea Bantou, 16 AJ875077 — 34 36 TR (X.1) Aniskin, unpublished data Guinea Gbetaya, 17 AJ875076 AJ875086 Kenya ? 18 Lundrigan et al. (2002) — South Africa Caledon Reserve, 19 AJ875078 AJ875087 18 35 TR (X.1) Veyrunes et al. (2004) South Africa Kuruman, 20 AJ875079 — 34 36 TR (X.1) Veyrunes et al. (2004) South Africa Stellenbosch, 21 AJ875080 — 18 36 TR (X.1) Veyrunes et al. (2004) Tanzania Kingu Pira, Selous, 22 AJ875081 — 34–35 36 TR (X.1) Aniskin, unpublished data M. setulosus CAR Ippy-Banguy, 23 AJ875082 — 36 36 PR Jotterand-Bellomo (1986) Gabon ? 24 Chevret et al. (2005) Chevret et al. (2005) Guinea Gbetaya, 17 AJ875083 AJ875088 “Unknown” Chad Zakouma NP, 25 AJ875085 AJ875089 Kenya Nairobi, 26 AJ875084 — Geographic origin of sampled localities are numbered according to Fig. 1. 2n, diploid number; FN, fundamental number, i.e., number of chromosomal arms; PR, species having primitive (i.e., acrocentric) sex chromosomes; TR, species having translocated sex chromosomes, i.e., sex-autosome translocations; (X.1) D Rb(X.1), Robertsonian translocation between chromosome X and pair 1; (X.7) D Rb(X.7). a, females have 18 and males 19 chromosomes.

2.2. DNA sequencing and sequence alignment rectly assigned, but only one was included in the analyses shown here. Sequences were aligned manually using DNA samples were extracted from 95% ethanol pre- the ED editor of the program MUST (Philippe, 1993). served tissues. Complete mitochondrial cytochrome b The 25 new sequences have been deposited in the sequences were ampliWed using primers L7 and H6 EMBL databank under Accession Nos. AJ875066 to (Montgelard et al., 2002), and part of the exon of the AJ875089 and AJ877114/AJ877115 (Table 1). The acces- IRBP gene was ampliWed in two fragments with 300 sion numbers of the non-Nannomys taxa are provided as overlapping base pairs by the PCR primers I1, J2 and I2, follows (cytochrome b; IRBP): Mus cervicolor J1 (Poux and Douzery, 2004). PCR products were puri- (AY057811; AJ698886), M. musculus (V00711; Wed from 1% TAE agarose gels using Amicon Ultra- AF126968), M. spretus (AB033700; AJ698883), M. freeDNA columns (Millipore), and were sequenced and platythrix (AJ698880; AJ698895), M. pahari (AY057814; analysed on an ABI 310 automatic sequencer. Sequenc- AJ698893), M. crociduroides (AJ698878; AJ698894), ing was performed with PCR primers and additional Apodemus mystacinus (AF159394; AJ311158), A. sylvati- internal ones: L2 D 5Ј-TACCATGAGGACAAATATC- cus (AB033695; AB032863), Rattus norvegicus (V01556; 3Ј or L24 D 5Ј-CCATGGGGACARATATCATTYTG AJ429134), Leopoldamys edwarsi (AJ698881; AJ698897). AGG-3Ј (forward), and H8 D 5Ј-CCTCAGAATG ATATTTGTCCTC-3Ј and/or H16 (Michaux et al., 2.3. Saturation analyses 2002) (reverse) for cytochrome b, and by PCR primers plus I5 (Poux and Douzery, 2004) (forward) and J4 D 5Ј- The cytochrome b and IRBP sequences were indepen- CAGTGACGGAGATCWAGCACCA-3Ј (reverse) for dently examined for saturation following the procedure IRBP. Whenever possible, two individuals per locality of Philippe and Forterre (1999). This entails plotting the were sequenced to ascertain that each specimen was cor- number of substitutions inferred by maximum-likeli- F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 361 hood (ML) analysis against the observed distance Kishino, 2002; Thorne et al., 1998) to estimate parame- between each pair of taxa. This was performed using the ters, length branches and datings respectively. Parame- programs TREEPLOT and COMP_MAT as imple- ters used in MULTIDIVTIME model were 1,000,000 mented in MUST. The level of saturation was estimated cycles generated, trees sampled every 100, burnin value by the slope of the linear regression (S) between the D 100,000 generations, number of time unit between tip observed and inferred substitutions. When no saturation and root of the tree a priori given at 12 Myr with a stan- is observed in the dataset, the slope equals one, whereas dard deviation (SD) of 6 Myr, rate of root node D 0.036 the slope tends towards zero as the level of saturation (SD D 0.018), and Brownian motion D 0.080 increases. (SD D 0.080). We chose a palaeontological calibration point based on the fossil records of Murinae in Eurasia: 2.4. Phylogenetic reconstructions and molecular dating the divergence between A. mystacinus and the “small” Sylvaemus species (e.g., A. sylvaticus) estimated at The phylogenetic analyses were initially conducted approximately 7 Myr (Aguilar and Michaux, 1996; using cytochrome b sequences of all Nannomys speci- Michaux et al., 1997). This calibration point has two mens to assess species relationships, and to establish the advantages. First, it has already been successfully correspondence between the molecular phylogeny and employed as a molecular phylogenetic timescale in previ- the species assignment based on chromosomal data. A ous studies focusing on the genus Mus or its close rela- second series of analyses was subsequently performed tive, the genus Apodemus (Chevret et al., 2005; Michaux using the IRBP exon sequences independently, and then et al., 2002), and second, it is relatively recent, corre- on the combined markers (concatenated sequences of sponding to our focus level, i.e., intra-generic diversiWca- cytochrome b and IRBP) on a trimmed dataset compris- tion (around 1–5 Myr). ing one or two individuals per major Nannomys clade as evidenced by the cytochrome b analysis, and the other Murinae referred to above. The combined analysis was 3. Results done to increase the robustness of the phylogeny by including maternally and biparentally inherited genes, 3.1. Gene evolution and saturation analyses and to estimate divergence time between taxa. All phylogenetic reconstructions were performed using two prob- Complete sequences of the cytochrome b gene com- abilistic approaches: ML in PAUP* 4b10 (SwoVord, prise 1140 positions including 459 variable and 393 1999), and Bayesian approaches in MrBayes (Huelsen- informative sites; the slope of saturation (S D 0.25) sug- beck and Ronquist, 2001). The program MODELTEST gests that this gene is highly saturated. However, given (Posada and Crandall, 1998) indicated that the most that our study focuses on low taxonomic levels (intra- appropriate model for all separate analyses was the (sub)genus and even intra-species), we follow the ratio- GTR + 8 +I (see Posada and Crandall, 2001). ML nale of Voelker and Edwards (1998) and Björklund parameters were estimated with PAUP* using a loop (1999) and include all nucleotides in subsequent analyses approach described in Delsuc et al. (2002), whereas (see also Ducroz et al., 1998; Montgelard et al., 2003). Bayesian parameters were estimated with MrBayes for Alignment of the IRBP marker comprises 1222 posi- the three codon positions of each gene. The robustness tions, with 245 variable sites of which 133 are informa- of each node was evaluated by bootstrap percentage tive; graphical saturation analysis indicates that it is (BP) after 500 iterations for ML, and posterior probabil- slightly saturated (S D 0.66). ities (PP) after 1,000,000 generations with trees sampled every 100 generations (burnin value: 20,000 generations) 3.2. Molecular phylogenies for MrBayes. Genetic divergence between Nannomys taxa was cal- The results of the analyses for each gene separately culated on complete cytochrome b sequences using pair- and in combination are presented in Figs. 2 and 3. wise distances estimated from ML parameters. We The molecular phylogenies reXect a perfect agreement extended this to include the Kimura two-parameter with the taxonomic assignations mostly inferred from the model, for comparison with previous studies on other karyotypes of the African pygmy mice. Regarding the two groups of mammals (e.g., Bradley and Baker, 2001; unassigned individuals (Chad and Kenya), the former is Ducroz et al., 1998; Johns and Avise, 1998; Smith and suYciently distinct from all other specimens to merit a Patton, 1993). separate species status (Mus sp.), whereas the latter clus- To assess divergence times, a Bayesian method was ters within the M. minutoides clade, where it is very applied to the combined gene analyses following the pro- closely related to the other Kenyan specimen. cedure of Yoder and Yang (2004), with the programs The three topologies (cytochrome b; IRBP; cyto- BASEML of the PAML package (Yang, 1997), EST- chrome b +IRBP Figs. 2 and 3) are largely congruent; BRANCHES and MULTIDIVTIME (Thorne and the main diVerences concern the relationships among the 362 F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369

Fig. 2. Maximum Likelihood phylogram under the GTR + 8 + I model using cytochrome b sequences of all samples. Robustness of the nodes is indicated when BP > 50% and PP > 0.80 as follows: BP (upper), PP (under). Each specimen is designated by its precise locality (when known) and country of origin (SA, South Africa; CAR, Central African Republic). Asterisks indicate samples of questionable taxonomic origin. Star indicates the monophyletic origin of sex-autosome translocations. Subgenera are abbreviated in parentheses: (N.), Nannomys; (M.), Mus; (C.), Coelomys; and (P.), Pyro- mys. PR, species having primitive (i.e., acrocentric) sex chromosomes; TR, species having translocated sex chromosomes, i.e., sex-autosome translocations. four subgenera, although none of which enjoy meaning- the recognition and monophyly of the four subgenera, ful bootstrap support (BP < 50, PP < 0.80), and the close but fail to resolve clear relationships between them. relationships within Nannomys itself. The two genes pro- Within Mus ss, the Palaearctic M. musculus and M. spr- vide complementary results concerning intra-Nannomys etus are more closely associated to each other than either relationships. Whereas several nodes are unresolved with is to the Asiatic M. cervicolor. Within the subgenus Nan- cytochrome b reconstructions (M. haussa–M. mattheyi nomys, M. setulosus is basal, followed by a clade that is cluster, and the position of Mus sp.; Fig. 2), and others subdivided into two, with M. sp. at the base of M. haussa with IRBP analysis (polytomy of M. musculoides, M. and M. mattheyi on one hand, and M. indutus at the base minutoides, and M. indutus; Fig. 3A), the combined anal- of M. musculoides and M. minutoides on the other (Fig. yses give strong support for most nodes (Fig. 3B). 3B). Thus, while the TR species (M. musculoides and M. All analyses support the monophyly of the genus Mus minutoides) represent a monophyletic group, the PR spe- (BP D 85–100, PP D 1.00) and provide strong support for cies are paraphyletic (Fig. 2). F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 363

Fig. 3. Maximum likelihood phylogram under the GTR + 8 + I model using IRBP sequences of selected samples (A), and concatenated cytochrome b and IRBP sequences from the same samples (B). Statistical support for nodes is indicated when BP > 50% and PP > 0.80 as follows: BP (upper), PP (under). Each specimen is characterized by species name and its country of origin when two conspeciWc individuals are included. The molecular clock calibration point is indicated by a dot. Subgenera are abbreviated in parentheses: (N.), Nannomys; (M.), Mus; (C.), Coelomys; and (P.), Pyromys.

3.3. Genetic distances and divergence time for comparisons between species (e.g., M. setulosus/M. musculoides: 34.05 vs. 16.29%). These diVerences are due Genetic distances estimated on cytochrome b to the assumption of faster nucleotide substitution rates sequences among Nannomys taxa are given in Table 2. in the former model, as it detects with more accuracy the Those inferred from GTR + 8 + I are much higher than occurrence of multiple mutation events on a same site. those using the Kimura two-parameter model, especially However, only the genetic distances calculated with the

Table 2 Mean genetic distances (in percentage) between complete cytochrome b sequences of selected clades and taxa of Nannomys, inferred from the GTR + 8 + I model with ML parameters, and from the Kimura two-parameter model Taxon GTR + 8 + I distance Standard deviation Kimura 2p distance Standard deviation Within M. setulosus 11.97 0.73 8.35 0.28 M. haussa 2.90 1.95 2.63 1.70 Senegal vs. Mali, Niger, Chad 4.95 0.25 4.40 0.20 M. mattheyi 2.81 1.62 2.72 1.46 Senegal, Mali vs. Burkina Faso, Togo 4.05 0.23 3.82 0.21 M. indutus 0.64 0.64 M. musculoides 1.03 0.44 1.00 0.42 M. minutoides 5.84 1.68 4.89 1.63 South Africa 3.19 1.58 2.95 1.41 Between M. setulosus vs. M. musculoides 34.05 6.10 16.29 1.09 M. sp. vs. M. haussa 24.88 1.45 14.80 0.23 M. mattheyi vs. M. haussa 19.08 1.46 12.11 0.52 M. mattheyi vs. M. indutus 25.47 2.94 14.21 0.85 M. indutus vs. M. minutoides 24.30 1.92 14.17 0.70 M. musculoides vs. M. minutoides 14.42 0.48 10.35 0.26 364 F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369

Table 3 Estimated divergence times of each node of the Fig. 3B, using a Bayesian method (see Material and methods) Nodes Estimate of divergence Standard deviation Credibility interval times (Myr) (Myr) at 95% (Myr) Between genera Mus/Apodemus 11.4 1.3 9.1–14.4 Between subgenera Coelomys/Pyromys, Mus ss, Nannomys 7.6 1.1 5.7–10.0 Pyromys/Mus ss, Nannomys 7.1 1.1 5.2–9.4 Mus ss/Nannomys 6.6 1.0 4.8–8.9 Within subgenus Coelomys M. crociduroides/M. pahari 3.4 0.8 2.0–5.2 Within subgenus Mus ss M. cervicolor/M. musculus, M. spretus 4.8 0.9 3.2–6.8 M. musculus/M. spretus 2.3 0.6 1.3–3.6 Within subgenus Nannomys: M. setulosus/other Nannomys 4.0 0.8 2.5–5.9 M. setulosus 1.4 0.4 0.7–2.4 M. indutus, M. musculoides, 3.2 0.7 1.9–4.9 M. minutoides/M. sp., M. mattheyi, M. haussa M. sp./M. mattheyi, M. haussa 2.9 0.7 1.7–4.4 M. mattheyi/M. haussa 2.6 0.6 1.5–3.9 M. indutus/M. musculoides, M. minutoides 2.5 0.6 1.4–4.0 M. musculoides/M. minutoides 1.6 0.5 0.8–2.7 M. minutoides 0.9 0.3 0.4–1.5 Calibration point, split between Apodemus mystacinus and A. sylvaticus estimated at 7 Myr.

Kimura two-parameter model, albeit less realistic, will genus Mus comprising the four subgenera, Mus ss, Pyro- be discussed herein since these values are directly com- mys, Coelomys and Nannomys, is well supported by the parable to those reported in other studies (e.g., Barome two genes (in particular by IRBP), although only three et al., 1998; Bradley and Baker, 2001; Ducroz et al., 1998; other genera (Apodemus, Leopoldamys, Rattus) are Johns and Avise, 1998; Smith and Patton, 1993). Inter- included in our study. However, this is corroborated by speciWc distances are quite high varying between other studies using a variety of datasets and taxa (Bour- 10.35% § 0.26 (M. musculoides vs. M. minutoides) and sot et al., 1993; Chevret et al., 2003, 2005; Lundrigan 16.29% § 1.09 (M. musculoides vs. M. setulosus), while et al., 2002; She et al., 1990; Suzuki et al., 2004). intra-speciWc distances range widely from 0.64% (M. Our analyses provide strong support for the recogni- indutus; two individuals) to 8.35% § 0.28 (M. setulosus; tion of the four subgenera. As expected, the monophyly three individuals). of the subgenus Coelomys (Mus pahari and M. crocid- Based on our calibration point (divergence time uroides) is found with BP D 100, PP D 1.00 with each/ between A. mystacinus and A. sylvaticus estimated at both genes (Chevret et al., 2003, 2005; Sourrouille et al., 7.0 Myr), we obtained a timescale for the diVerent clado- 1995). The monophyly of the subgenus Mus is less genic events which are summarized in Table 3. The split straightforward, as mentioned in previous studies (Chev- between the genus Mus and Apodemus is estimated to ret et al., 2003, 2005; Lundrigan et al., 2002; Suzuki et al., have occurred 11.4 Mya, and the divergence between the 2004). The Mus ss cluster is poorly supported by the four subgenera of Mus took place around 7 Mya. The mitochondrial marker, but the combination with a radiation of Nannomys group started 4.0 Mya, with mul- nuclear gene removes this ambiguity (BP D 95, tiple speciation events between 3.2–1.4 Mya. PP D 1.00). Mus platythrix (subgenus Pyromys) is clearly distinct from the other subgenera. Finally, the widespread sampling of pygmy mice belonging to at least 4. Discussion seven species strongly supports the monophyly of the Nannomys. Whereas the four subgenera are well deWned, 4.1. Phylogenetic relationships and taxonomy the relationships between them are unclear and vary depending on the marker used (Boursot et al., 1993; The speciWc phylogenetic aYnities found in the pres- Chevret et al., 2003, 2005; Jouvin-Marche et al., 1988; ent study are consistent with previous morphological, Lundrigan et al., 2002; She et al., 1990; Suzuki et al., chromosomal and molecular data (Boursot et al., 1993; 2004; this study). The phylogenetic trees (Figs. 2 and 3) CatzeXis and Denys, 1992; Chevret et al., 2003, 2005; provide three diVerent topologies for the subgeneric rela- Lundrigan et al., 2002; Musser and Carleton, 1993; She tionships, and none are robust (BP < 50, PP < 0.80). Nev- et al., 1990; Suzuki et al., 2004). The monophyly of the ertheless, it is noteworthy that the IRBP sequence F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 365 analysis clustered Mus ss and Nannomys with BP D 48, are characterized by morphological traits (Petter, 1969) PP D 0.54 as recorded in Suzuki et al. (2004), in contrast that are considered as diagnostically unreliable by Mus- to other studies showing a Mus ss–Pyromys relationship, ser and Carleton (1993) constitute two valid sister-spe- although with low support (CatzeXis and Denys, 1992; cies. In the same way, M. minutoides and M. musculoides Chevret et al., 2003, 2005; Lundrigan et al., 2002; She which are undistinguishable in morphology and have et al., 1990). According to She et al. (1990) and Bonho- often been lumped into a minutoides/musculoides com- mme (1992), this lack of resolution may reXect the rapid plex, are in fact diVerentiated by a genetic distance of radiation of these clades marked by nearly simultaneous 10.35% § 0.26. The latter two species cluster with a third events of speciation related to the colonization of new one: M. indutus, as was to be expected based on its mor- territories, such as Africa for Nannomys. In order to phological aYnities (Petter, 1963). The individual from improve the subgeneric resolution, Lundrigan et al. Zakouma National Park, Chad, constitutes the seventh (2002) suggested to increase the number of species sam- species, but in the absence of karyotypic data and/or ref- pled in the under-represented subgenera (particularly erential molecular sequences of putative conspeciWcs Nannomys) to subdivide the relatively long terminal (Mus sorella?), it cannot yet be assigned with any conW- branches (Lecointre et al., 1993). Our study clearly dence to a recognised species, and is consequently shows, however, that adding taxa within Nannomys is referred to Mus sp. in the present study. The specimen not suYcient to resolve the phylogeny of the four sub- from Nairobi, Kenya on the other hand nests within the genera (see also Chevret et al., 2005). M. minutoides clade, and is very closely related to the Within the Nannomys, the cytochrome b (Fig. 2) and other Kenyan specimen; as such, it can be convincingly the combined markers phylogenies (Fig. 3B) show that, referred to M. minutoides. Until recently, M. minutoides contrary to their conserved morphology, the pygmy was restricted to southern Africa, the northern limits of mouse species appear genetically well diVerentiated. In its range remaining unknown (Musser and Carleton, fact, the interspeciWc genetic diversity measured from 1993; Skinner and Smithers, 1990). In agreement with cytochrome b sequences is very high, varying between 10 the molecular phylogeny and cytogenetic data (Veyrunes and 16% (Table 2). Our molecular dating suggests, how- et al., 2004), we propose to extend its northern distribu- ever, that these high levels may be more a consequence tion limits to Kenya–Tanzania in Eastern Africa, and of accelerated cytochrome b sequence evolution than of Guinea in North-Western Africa. Similarly, the pygmy ancient divergences, since cladogenesis in the Nannomys mouse from Tussen die Reviere, South Africa, was is recent having occurred in 1–4 Myr (see below; Table assigned to M. indutus on the basis of its karyotype 3). This result is consistent with other observations that (Veyrunes et al., 2004), although the locality of capture is rodents have a higher rate of DNA sequence evolution well to the South of the published distribution range for than many other mammals (Wu and Li, 1985; Johns and this species (Skinner and Smithers, 1990). The present Avise, 1998). Nevertheless, these values do correspond to study conWrms this assignment, as the specimen from the upper range of interspeciWc variability generally Tussen die Reviere strongly clusters with a M. indutus reported for other murid genera (Barome et al., 1998; specimen sampled close to the type locality (genetic Bradley and Baker, 2001; Ducroz et al., 1998; Johns and divergence between the two individuals: 0.64%). So the Avise, 1998; Smith and Patton, 1993). Seven clades are range of M. indutus should be extended further south to delimited by the sequence data corresponding to at least 30° 29Ј S. seven species but probably more since several of these may correspond to species complexes (e.g., M. minuto- 4.2. Molecular phylogeny and chromosomal evolution ides and M. setulosus, see below). The Wrst dichotomy separates a clade of forest-dwelling species, M. setulosus, The present molecular phylogenies are in perfect from one including all the other species living in open agreement with speciWc determinations based for the habitats. Thus, M. setulosus appears as the most basal major part on karyotypes (see Table 1, Fig. 2). The com- species, in agreement with chromosomal (Jotterand-Bel- bination of molecular and chromosomal markers vali- lomo, 1984), and morphological data (CatzeXis and dates for the Wrst time the diagnostic value of Denys, 1992), both of which suggest that it is slightly chromosomal rearrangements in discriminating most more primitive than the other African pygmy mice. The species of African pygmy mice, in contrast with the gen- three specimens are genetically very divergent erally low resolution of morphological traits. Three spe- (8.35% § 0.28; Table 2), a value usually corresponding to cies carry the 2n D 36 all-acrocentric karyotype, M. separate species rather than conspeciWc individuals (e.g., mattheyi, M. indutus, and M. setulosus. However, the lat- Bradley and Baker, 2001). Further systematics studies ter can be distinguished by the addition of large blocks are needed to determine their taxonomic assignments. of centromeric heterochromatin on several autosomes The molecular markers provide unambiguous dis- (Jotterand-Bellomo, 1986), and the range of the two oth- crimination between two groups of morphological very ers does not overlap. Likewise, although M. haussa and similar species. Thus, M. haussa and M. mattheyi which M. mattheyi constitute a pair of West African sibling 366 F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 species, they are easily recognized by their karyotype, as The monophyly of the TR species, if conWrmed by the the former carries a diagnostic pericentric inversion in addition of other taxa such as M. oubanguii which pos- addition to a polymorphic diploid number (2n D 28–34; sesses Rb(X.15), or M. triton that carries Rb(X.12) (Jott- FN D 38). In the same way, G-banded karyotypes dis- erand-Bellomo, 1986, 1988), indicates that this clade criminate M. minutoides from M. musculoides, as the Wrst would share a synapomorphy for one type of rearrange- species is characterized by the sex-autosome transloca- ment (i.e., a predisposition for sex-autosome translocation Rb(X.1), and the second by Rb(X.7). tions) but not for a particular rearrangement, since The chromosomal and molecular data also allow us diVerent autosomes are involved in the translocations. to infer patterns of chromosomal evolution within this This unusual diversity of sex-autosome translocations group of rodents. The phylogenetic analyses clearly among the Nannomys, which are rare and deleterious show that the pygmy mouse species carrying the primi- events within mammals, suggests that a genome modiW- tive acrocentric sex chromosome morphology (PR spe- cation allowing a higher rate of occurrence and/or Wxa- cies) are paraphyletic. In eVect, although M. haussa and tion of these translocations would have occurred within M. mattheyi do occur in the same lineage, they are not the ancestral karyotype leading to the emergence of sister species to either M. indutus or M. setulosus. Con- these TR taxa. versely, the TR species carrying sex-chromosome translocations (M. minutoides and M. musculoides) are 4.3. Biogeographical and temporal implications monophyletic. Thus, the classiWcation of pygmy mouse species based on the morphology of the sex-chromo- The genus Mus originated in Asia during the late somes (TR vs. PR) is invalid regarding those carrying Miocene with the oldest fossil dated 5.7 Mya (Jacobs and primitive sex chromosomes, as this chromosomal char- Downs, 1994; Jacobs et al., 1989). The Asiatic mouse acter does not reXect their phylogenetic relatedness. radiation produced an African oVshoot and the Wrst Moreover, the presence of the 36-acrocentric karyotype true-Nannomys fossils are recorded in Ethiopia at 3.3 in taxa scattered throughout the tree (M. mattheyi, M. and 3.0 Myr (in CatzeXis and Denys, 1992), although an indutus, and M. setulosus) denotes conservation of a older Mus fossil was reported in Kenya at 4.5 Myr (Win- shared ancestral karyotype (Jotterand-Bellomo, 1986), kler, 2002). Our estimated divergence times (Table 3) do whereas other species (M. minutoides, M. musculoides, not contradict the palaeontological data, and are in and to a lesser extent M. haussa) have undergone exten- agreement with previous molecular dating, although sive karyotypic evolution. they are slightly younger (especially within Nannomys) The TR cluster groups two species carrying diVerent than those estimated by Chevret et al. (2005), and older sex-autosome translocations, suggesting that this type than the ones indicated by DNA/DNA hybridization of rearrangement represents a strong synapomorphic and DNA sequencing (CatzeXis and Denys, 1992; Chev- character. This is in agreement with the highly deleteri- ret et al., 2003; She et al., 1990; Suzuki et al., 2004). The ous eVect on gametogenesis of sex-autosome transloca- latter may be partly due to the use of a divergence time tions in mammals related to dysfunction in X-linked between Mus and Rattus calibrated at only 10 Myr in gene expression (Ashley, 2002; Dobigny et al., 2004; She et al. (1990) and CatzeXis and Denys (1992). The King, 1993; White et al., 1998). Such rearrangements are molecular dating suggests that migration from Asia to thus not expected to be prone to convergence (Rokas Africa of the last common ancestor to the extant Nanno- and Holland, 2000). Given the much higher cost of this mys took place between 6.6 and 4.0 Mya. Palaeontologi- type of rearrangement on Wtness than the others cal evidence indicates that this period coincided with the observed within these pygmy mice (pericentric inver- existence of a palaeobiogeographic province extending sion, Rb translocation, heterochromatic addition; King, from India to East Africa, which favoured migrations 1993; Qumsiyeh, 1994), sex-autosome translocations are through the Arabian peninsula of several mammal taxa, considered as an eYcient reproductive isolating mecha- such as murine rodents and Bovidae (Brandy et al., 1980; nism that could generate rapid events of speciation. Flynn and Jacobs, 1999; Thomas, 1984; Winkler, 1994). Thus, Rb(X.1) and Rb(X.7) may be pivotal in the emer- The access to novel ecological niches that followed the gence of M. minutoides and M. musculoides. This is sup- colonization of Africa by the Nannomys ancestor led to ported by the clustering of all Rb(X.1)-carrying taxa extensive diversiWcation during late Pliocene and Pleisto- within the same phylogenetic lineage assigned to M. cene, resulting in a much more speciose subgenus than minutoides. In fact, within this clade, Rb(X.1) is the only the three Eurasian ones. Moreover, contemporaneous translocation common to all specimens that in turn diversiWcation events have been recorded in other diVer by varying numbers of autosomal translocations African Muridae (Denys, 1999; Ducroz et al., 1998; (see Veyrunes et al., 2004), suggesting that this rear- Lecompte et al., 2002), suggesting that additional envi- rangement is likely a unique event that occurred prior ronmental factors may also be involved, such as the rain to the chromosomal diversiWcation presently observed forest contraction and the increase in the savannah vege- in this species. tation that occurred at 3.5 Myr (Cerling, 1992; Maley, F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 367

1996). These modiWcations may have favoured specia- Zakouma National Park, for Weld support and research tion events in the African pygmy mice by spatial frag- permits in Chad. Thanks to Dr L. Koivogui and the mentation of the forest-dwelling species, and isolation PFHG for Weldwork in Guinea. Fieldwork in Tanzania and subsequent dispersal of the savannah-dwelling ones. was possible through the help of Dr Makundi and Dr Such processes are also known to favor the Wxation of Machangu (Morogoro University) and a COSTECH chromosomal rearrangements (e.g., King, 1993; Riese- Permit No. 2003-152-CC-2003-83 and TAWIRI one. berg, 2001; Wang and Lan, 2000), the rate of which is This study was supported by a CNRS-NRF collabora- particularly extensive in M. minutoides. This diminutive tion (No. 13293 and 15439 2002-2004), CNRS-UM II mouse represents the most newly-emerged species in our grants to UMR 5554, a grant from the European Com- phylogenetic analysis, indicating that in about 1 Myr munity, INCO-DEV program (No. ICA4-Ct2002- (Table 3) it not only colonized almost the entire African 10050), the «ACI Informatique-Mathématique-Physique continent, but also diVerentiated into very diverse cyto- en Biologie Moléculaire [ACI IMP-Bio]», and the Sys- types, some of which are most likely reproductively iso- tematics Association (year 2002/2003). This publication lated (Veyrunes et al., 2004). Although with more is the contribution No. EPML-008 of the Equipe-Projet restricted distribution ranges, three of the other species multi-laboratoires CNRS-STIC «Méthodes informa- studied show evidence of genetic diVerentiation along a tiques pour la biologie moléculaire», and ISEM No. geographic axis accompanied or not by chromosomal 2004-046. variation. M. setulosus presents the highest within-species distance values in a three-individual sample, whereas two geographic entities occur within M. mattheyi, indi- References viduals from Senegal and Mali having diverged by 3.82% § 0.21 from those of Burkina Faso and Togo. A Aguilar, J.P., Michaux, J., 1996. The beginning of the age of Murinae similar situation is present in M. haussa in which both (Mammalia: Rodentia) in southern France. Acta Zool. Cracovia 39, 35–45. genetic and chromosomal characters delimit two groups: Aniskin, V.M., Lavrenchenko, L.A., Varshavskii, A.A., Milishnikov, Senegal (2n D 28) vs. Mali, Niger and Chad (2n D 30–34), A.N., 1998. Karyotypes and cytogenetic diVerentiation of two Afri- diVering by a genetic distance of 4.40% § 0.20 (Table 2). can mouse species of genus Mus (Rodentia, Muridae). Russ. J. The East/West distribution of diversity uncovered within Genet. 34, 80–85. M. haussa and M. mattheyi is common to several West- Ashley, T., 2002. X-autosome translocations, meiotic synapsis, chromosome evolution and speciation. Cytogenet. Genome Res. 96, 33– African murid species, such as Taterillus (Dobigny, 39. 2002) and Acomys (Barome et al., 1998), although others Barome, P.O., Monnerot, M., Gautun, J.C., 1998. Intrageneric phylog- (Lemniscomys, Rosevear, 1969; Arvicanthis, Sicard et al., eny of Acomys (Rodentia, Muridae) using mitochondrial gene cyto- 2004) present a North/South gradient of diVerentiation chrome b. Mol. Phylogenet. Evol. 9, 560–566. corresponding to climatic biomes. The diVerent patterns Björklund, M., 1999. Are third positions really that bad? a test using W vertebrate cytochrome b. Cladistics 15, 191–197. evidenced may be related to speci c ecological require- Bonhomme, F., 1992. Genetic diversity and evolution in the genus Mus. ments, historical refuges, and/or to the origin and path- In: Goldowitz, W.D., Winner, R.E. (Eds.), Techniques for the ways of colonization. These results clearly highlight the Genetic Analysis of Brain and Behavior, Elsevier Sciences Publish- need for further investigations involving a multidisci- ers BV, p. 16. V plinary study on a comprehensive sample of Nannomys Boursot, P., Au ray, J.C., Britton-Davidian, J., Bonhomme, F., 1993. The evolution of house mice. Ann. Rev. Ecol. Syst. 24, 119–152. thoughout Africa to provide an accurate assessment of Bradley, R.D., Baker, R.J., 2001. A test of the genetic species concept: speciWc diversity, status, geographical distribution, pat- cytochrome b sequences and mammals. J. Mamm. 82, 960–973. terns of chromosomal evolution and processes of specia- Brandy, L.D., Sabatier, M., Jaeger, J.J., 1980. Implications phylogéné- tion in this highly diversiWed group of cryptic species. tiques et biogéographiques des dernières découvertes de Muridae en Afganistan, au Pakistan et en Ethiopie. Geobios 13, 639–643. Castiglia, R., Gormung, E., Corti, M., 2002. Cytogenetic analyses of chromosomal rearrangements in Mus minutoides/musculoides from Acknowledgments North-West Zambia through mapping of the telomeric sequence (TTAGGG)n and banding techniques. Chromosome Res. 10, 399– We are extremely grateful to M. Angaya, V. Aniskin, 406. X S. Ag Atteynine, K. Ba, C.T. Chimimba, P. Funston, C. Catze is, F., Denys, C., 1992. The African Nannomys (Muridae): an early oVshoot from the Mus lineage- evidence from scnDNA Koné, T. Maddalena, V. Nancé, J.A.J. Nel, A. Orth, F. hybridization experiments and compared morphology, Israel. J. Petter, J. Watson, and all the members of the MNHN Zool. 38, 219–231. Weld trips to Chad, Guinea and Tanzania, for their help Cerling, T.E., 1992. Development of grasslands and savannas in East in collecting specimens. We are especially indebted to G. Africa during the Neogene. Palaeogeogr. Palaeocl. Palaeoecol. 97, Dobigny, J.M. Duplantier, L. Granjon, and B. Sicard for 241–247. Chevret, P., Jenkins, P., CatzeXis, F., 2003. Evolutionnary systematics their unrelenting and enthusiastic contributions to the of the Indian mouse Mus famulus: molecular (DNA/DNA hybriza- Nannomys collections. Special thanks to the Laboratory tion and 12S rRNA sequences) and morphological evidence. Zool. of veterinary studies of Farcha, Wildlife department, J. Linnean Soc. 137, 385–401. 368 F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369

Chevret, P., Veyrunes, F., Britton-Davidian, J., 2005. Molecular phy- Lecompte, E., Granjon, L., Kerbis Peterhans, J., Denys, C., 2002. logeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochon- Cytochrome b-based phylogeny of the Praomys group (Roden- drial and nuclear data. Biol. J. Linnean Soc. 84, 417–427. tia, Murinae): a new african radiation?. C. R. Acad. Sci. 325, 827– Delneri, D., Colson, I., Grammenoudi, S., Roberts, I.N., Louis, E.J., Oli- 840. ver, S.G., 2003. Engineering evolution to study speciation in yeasts. Lundrigan, B.L., Jansa, S.A., Tucker, P.K., 2002. Phylogenetic relation- Nature 422, 68–72. ships in the genus Mus, based on paternally, maternally, and bipa- Delsuc, F., Scally, M., Madsen, O., Stanhope, M.J., de Jong, W.W., Cat- rentally inherited characters. Syst. Biol. 51, 410–431. zeXis, F.M., Springer, M.S., Douzery, E.J.P., 2002. Molecular phy- Macholan, M., 2001. Multivariate analysis of morphometric variation logeny of living Xenarthrans and the impact of character and taxon in Asian Mus and sub-saharan Nannomys (Rodentia: Muridae). Z. sampling on the placental tree rooting. Mol. Biol. Evol. 19, 1656– Anzeiger 240, 7–14. 1671. Maley, J., 1996. The African rain forest—main characteristics of Denys, C., 1999. Of mice and men. Evolution in the East and South changes in vegetation and climate from the Upper Cretaceous to Africa during Plio-Pleistocene times. In: Bromage, T.G., Schrenk, the Quaternary. Proc. R. Soc. Edinb. 104, 31–73. F. (Eds.), African Biogeography, Climate Change, and Human Marshall, J.T., 1981. Taxonomy. In: Foster, H.L., Small, J.D., Fox, J.G. Evolution. Oxford University Press, New York, pp. 226–252. (Eds.), The Mouse in Biomedical Research, 1. Academic Press, New Dobigny, G., 2002. Spéciation chromosomique chez les espèces jum- York, pp. 17–26. elles ouest-africaines du genre Taterillus (Rodentia, Gerbillinae). Matthey, R., 1966. Le polymorphisme chromosomique des Mus afric- PhD. Dissertation, Muséum National d’ Histoire Naturelle, Paris, ains du sous-genre Leggada. Révision générale portant sur l’analyse France. de 213 individus. Rev. Suisse Zool. 73, 585–607. Dobigny, G., Ozouf-Costaz, C., Bonillo, C., Volobouev, V., 2004. Via- Meester, J.A.J., Rautenbach, I.L., Dippenaar, N.J., Baker, C.M., 1986. bility of X-autosome translocations in mammals: an epigenomic ClassiWcation of Southern African Mammals. Transvaal Museum hypothesis from a rodent case-study. Chromosoma 113, 34–41. Monogr. 5, 1–359. Ducroz, J.F., Volobouev, V., Granjon, L., 1998. A molecular perspec- Michaux, J., Aguilar, J.P., Montuire, S., WolV, A., Legendre, S., 1997. tive on the systematics and evolution of the genus Arvicanthis Les Murinae (Rodentia, Mammalia) néogènes du Sud de la France: (Rodentia: Muridae): inferences from complete cytochrome b gene évolution et paléoenvironnements. Geobios 20, 379–385. sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 10, 104–117. Michaux, J.R., Chevret, P., Filippucci, M.G., Macholan, M., 2002. Phy- Flynn, L.J., Jacobs, L.L., 1999. Late Miocene small mammal faunal logeny of the genus Apodemus with a special emphasis on the sub- dynamics: the crossroads of the Arabian peninsula. In: Whybrow, genus Sylvaemus using the nuclear IRBP gene and two P.J., Hill, A. (Eds.), Fossil Vertebrates of Arabia. Yale University mitochondrial markers: cytochrome b and 12S rRNA. Mol. Phylo- Press, New Haven & London, pp. 412–419. genet. Evol. 23, 123–136. Huelsenbeck, J.P., Ronquist, F., 2001. Mrbayes: Bayesian inference of Montgelard, C., Bentz, S., Tirard, C., Verneau, O., CatzeXis, F.M., 2002. phylogenetic trees. Bioinformatics 17, 754–755. Molecular systematics of Sciurognathi (Rodentia): the mitochon- Jacobs, L.L., Downs, W.R., 1994. The evolution of murine rodents in drial cytochrome b and 12S rRNA genes support the Anomaluroi- Asia. In: Tomida, Y., Li, C.K., Setoguschi, T. (Eds.), Rodent and dea (Pedetidae and Anomaluridae). Mol. Phylogenet. Evol. 22, 220– Lagomorph Families of Asian Origins and Their DiversiWcation. 233. National Science Museum Monograph, Tokyo, pp. 149–156. Montgelard, C., Matthee, C.A., Robinson, T.J., 2003. Molecular sys- Jacobs, L.L., Flynn, L.J., Downs, W.R., 1989. Neogene rodents of tematics of dormice (Rodentia: Gliridae) and the radiation of southern Asia. In: Black, C.C., Dawson, M.R. (Eds.), Papers on Graphiurus in Africa. Proc. R. Soc. Lond. B. 270, 1947–1955. Fossil Rodents in Honor of Albert Elmer Wood. Natural History Musser, G.G., Carleton, M.D., 1993. Family Muridae. In: Wilson, D.E., Museum Los Angeles County, Los Angeles, pp. 157–177. Reeder, D.M. (Eds.), Mammal Species of the World. A Taxonomic Johns, G.C., Avise, J.C., 1998. A comparative summary of genetic dis- and Geographic Reference. Smithsonian Institution Press, Wash- tances in the vertebrates from the mitochondrial cytochrome b ington and London, pp. 501–755. gene. Mol. Biol. Evol. 15, 1481–1490. Petter, F., 1963. Contribution à la connaissance des souris africaines. Jotterand, M., 1972. Le polymorphisme chromosomique des Mus Mammalia 27, 602–607. (Leggadas) africains. Cytogénétique, zoogéographie, évolution. Petter, F., 1969. Une souris nouvelle d’Afrique occidentale Mus mat- Rev. Suisse Zool. 79, 287–359. theyi sp. nov. Mammalia 33, 118–123. Jotterand-Bellomo, M., 1984. L’analyse cytogénétique de deux espèces Petter, F., 1981. Les souris africaines du groupe sorella (Rongeurs, de Muridae africains, Mus oubanguii et Mus minutoides/musculo- Muridés). Mammalia 45, 313–320. ides: polymorphisme chromosomique et ébauche d’une phylogénie. Philippe, H., 1993. MUST: a computer package of management utili- Cytogenet. Cell Genet. 38, 182–188. ties for sequences and trees. Nucleic Acids Res. 21, 5264–5272. Jotterand-Bellomo, M., 1986. Le genre Mus africain, un exemple Philippe, H., Forterre, P., 1999. The rooting of the universal tree of life d’homogénéité caryotypique: étude cytogénétique de Mus minuto- is not reliable. J. Mol. Evol. 49, 509–523. ides/musculoides (Côte d’Ivoire), de M. setulosus (République Posada, D., Crandall, K.A., 1998. MODELTEST: testing the model of Centrafricaine), et de M. mattheyi (Burkina Faso). Cytogenet. Cell DNA substitution. Bioinformatics 14, 817–818. Genet. 42, 99–104. Posada, D., Crandall, K.A., 2001. Selecting the best-Wt model of nucleo- Jotterand-Bellomo, M., 1988. Chromosome analysis of Wve specimens tide substitution. Syst. Biol. 50, 580–601. of Mus bufo-triton (Muridae) from Burundi (Africa): three cytoge- Poux, C., Douzery, E.J.P., 2004. Primate phylogeny, evolutionary rate netic entities, a special type of chromosomal sex determination, tax- variations, and divergence times: a contribution from nuclear gene onomy, and phylogeny. Cytogenet. Cell Genet. 48, 88–91. IRBP. Am. J. Phys. Anthropol. 124, 1–16. Jouvin-Marche, E., Cuddihy, A., Butler, S., Hansen, J.N., Fitch, W.M., Qumsiyeh, M.B., 1994. Evolution of number and morphology of mam- RudikoV, S., 1988. Modern evolution of a single-copy gene: the malian chromosomes. J. Hered. 85, 455–465. immunoglobulin Ck in wild mice. Mol. Biol. Evol. 5, 500–511. Rieseberg, L.H., 2001. Chromosomal rearrangements and speciation. King, M., 1993. Species Evolution. The Role of Chromosome Change. Trends Ecol. Evol. 16, 351–358. Cambridge University Press, Cambridge. Rokas, A., Holland, P.W.H., 2000. Rare genomic changes as a tool for Lecointre, G., Philippe, H., Lanh Van Le, H., Le Guyader, H., 1993. phylogenetics. Trends Ecol. Evol. 15, 454–459. Species sampling has a major impact on phylogenetic inference. Rosevear, D.R., 1969. The Rodents of West Africa. British Museum, Mol. Phylogenet. Evol. 2, 205–224. London p. 604. F. Veyrunes et al. / Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (2005) 358–369 369

Searle, J.B., 1993. Chromosomal hybrid zones in eutherian mammals. Tiemann-Boege, I., Kilpatrick, C.W., Schmidly, D.J., Bradley, R.D., In: Harrison, R.G. (Ed.), Hybrid Zones and the Evolutionary Pro- 2000. Molecular phylogenetics of the Peromyscus boylii species cess. Oxford University Press, Oxford, pp. 309–353. group (Rodentia: Muridae) based on mitochondrial cytochrome b She, J.X., Bonhomme, F., Boursot, P., Thaler, L., CatzeXis, F., 1990. sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 16, 366–378. Molecular phylogenies in the genus Mus: comparative analysis of Veyrunes, F., Catalan, J., Sicard, B., Robinson, T.J., Duplantier, J.M., electrophoretic, scnDNA hybridization, and mtDNA RFLP data. Granjon, L., Dobigny, G., Britton-Davidian, J., 2004. Autosome Biol. J. Linnean Soc. 41, 83–103. and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, Sicard, B., Catalan, J., Ag’Atteynine, S., Abdoulaye, D., Britton-Davi- subgenus Nannomys (Muridae; Mus). Chromosome Res. 12, 369– dian, J., 2004. EVects of climate and local aridity on the latitudinal 382. and habitat distribution of Arvicanthis niloticus and Arvicanthis Voelker, G., Edwards, S.V., 1998. Can weighting improve bushy ansorgei (Rodentia, Murinae) in Mali. J. Biogeogr. 31, 5–18. trees? Models of cytochrome b evolution and the molecular sys- Skinner, J.D., Smithers, R.H.N., 1990. In: The Mammals of the South- tematics of pipits and wagtails (Aves: Motacillidae). Syst. Biol. 47, ern African Subregion. University of Pretoria, Pretoria, pp. 264– 589–603. 265. Wang, W., Lan, H., 2000. Rapid and parallel chromosomal number Smith, M.F., Patton, J.L., 1993. The diversiWcation of South American reductions in muntjac deer inferred from mitochondrial DNA phy- murid rodents: evidence from mitochondrial DNA sequence data logeny. Mol. Biol. Evol. 17, 1326–1333. for the Akodontine tribe. Biol. J. Linnean Soc. 50, 149–177. Weksler, M., 2003. Phylogeny of Neotropical oryzomyine rodents Sourrouille, P., Hanni, C., Ruedi, M., CatzeXis, F.M., 1995. Molecular (Muridae: Sigmodontinae) based on the nuclear IRBP exon. Mol. systematics of Mus crociduroides, an endemic mouse of Sumatra Phylogenet. Evol. 29, 331–349. (Muridae: Rodentia). Mammalia 59, 91–102. White, W.M., Willard, H.F., Van Dyke, D.L., WolV, D.J., 1998. The Suzuki, H., Sato, J.J., Tsuchiya, K., Luo, J., Zhang, Y.P., Wang, Y.X., spreading of X inactivation into autosomal materiel of an X; auto- Jiang, X.L., 2003. Molecular phylogeny of wood mice (Apodemus, some translocation: evidence for a diVerence between autosomal Muridae) in East Asia. Biol. J. Linnean Soc. 80, 469–481. and X-chromosomal DNA. Am. J. Hum. Genet. 63, 20–28. Suzuki, H., Shimada, T., Terashima, M., Tsuchiya, K., Aplin, K., 2004. Winkler, A.J., 1994. The middle/upper Miocene dispersal of major Temporal, spatial, and ecological modes of evolution of Eurasian rodents group between Asia and Africa. In: Tomida, Y., Li, C.K., Mus based on mitochondrial and nuclear gene sequences. Mol. Setoguchi, T. (Eds.), Rodent and Lagomorph Families of Asian Phylogenet. Evol. 33, 626–646. Origins and DiversiWcation. National Science Museum Mono- SwoVord, D.L., 1999. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony graph, Tokyo, pp. 173–184. (*and other methods). Sinauer Associates, Sunderland, Massachu- Winkler, A.J., 2002. Neogene paleobiogeography and East African setts. paleoenvironments: contributions from the Tugen Hills rodents Thomas, H., 1984. Les Bovidae (Artiodactyla: Mammalia) du Miocène and lagomorphs. J. Hum. Evol. 42, 237–256. du sous-continent indien, de la péninsule Arabique et de l’Afrique: Wu, C.I., Li, W.H., 1985. Evidence for higher rates of nucleotide substi- Biostratigraphie, biogéographie et écologie. Palaeogeogr. Palaeocl. tution in rodents than in man. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1741– Palaeoecol. 45, 251–299. 1745. Thorne, J.L., Kishino, H., 2002. Divergence time and evolutionary rate Yang, Z., 1997. PAML: a program package for phylogenetic analysis estimation with multilocus data. Syst. Biol. 51, 689–702. by maximum likelihood. Comput. Appl. Biosci. 13, 555–556. Thorne, J.L., Kishino, H., Painter, I.S., 1998. Estimating the rate of Yoder, A.D., Yang, Z., 2004. Divergence dates for Malagasy lemurs evolution of the rate of molecular evolution. Mol. Biol. Evol. 15, estimated from multiple gene loci: geological and evolutionary con- 1647–1657. text. Mol. Ecol. 13, 757–773. 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

C. Localisation des séquences télomériques (TTAGGG)n dans le génome de plusieurs espèces de Nannomys.

Les télomères correspondent à des complexes ADN-protéines qui caractérisent l’extrémité de tous les chromosomes d’Eucaryotes et qui participent de façon essentielle à l’organisation du chromosome. En effet, ils jouent un rôle primordial en maintenant l’intégrité des chromosomes et en les préservant des événements de fusions et/ou de cassures de l’ADN (Blackburn, 1991 ; Zakian, 1995). Les séquences télomériques consistent en des motifs d’ADN hautement répétés (TTAGGG)n et extrêmement conservés dans le génome des vertébrés (Moyzis et al., 1988, Meyne et al., 1990). Chez de nombreux taxa, des séquences télomériques ont également été identifiées ailleurs dans le génome qu’à l’extrémité des chromosomes (signaux interstitiels ou au niveau du centromère de chromosomes métacentriques). Ces signaux correspondent en fait aux traces des structures télomériques de chromosomes ancestraux qui ont subi des réarrangements chromosomiques, notamment des fusions Rb et en tandem (e.g. Meyne et al., 1990, Lee et al., 1993, Fagundes & Yonenaga- Yassuda, 1998, Metcalfe et al., 1998, 2002, Dobigny et al., 2003b). Certains auteurs suggèrent même que les télomères seraient directement impliqués dans l’apparition de fusions Rb (Slijepcevic, 1998). La présence de séquences télomériques au niveau du centromère (= STC Séquences Télomériques Centromériques) de chromosomes fusionnés a été observée dans de nombreux groupes taxonomiques, et leur patron de distribution peut même varier entre espèces proches phylogénétiquement (Meyne et al., 1990).

Les réarrangements les plus fréquemment rencontrés chez les Nannomys sont de loin les fusions Rb, qui concernent majoritairement les autosomes, mais aussi les chromosomes sexuels (Veyrunes et al., 2004). La seule étude d’investigation des distributions des télomères chez les souris naines africaines a été réalisée dans une population de M. musculoides/minutoides de Zambie, et a montré que les STC étaient maintenues chez toutes les fusions Rb, à l’exception d’une (Castiglia et al., 2002). Dès lors, il apparaît opportun d’étudier la distribution des télomères chez d’autres taxa de Nannomys. En effet, la présence de STC pourrait augmenter la probabilité de fissions Rb (des séquences télomériques au niveau du centromère du néo-chromosome acrocentrique étant un pré-requis à sa stabilité ; voir Garagna et al., 1995 ; Nanda et al., 1995), et par là-même augmenter la diversité chromosomique. Cette étude pourrait donc nous renseigner sur la dynamique de mutation et

107

marqueur PCRde taille 1 PCR 2

Figure 12: PCR 1: amplification d’éléments répétés (TTAGGG)n; PCR 2: amplification du produit de PCR 1 par les mêmes amorces

et marquage à la biotine par nick-translation. Programme PCR 1: 3 cycles de: 1’ à 95°C, 1’ à 30°C, 1’ à 72°C. 17 cycles de: 30’’ à 94°C, 1’ à 50°C, 1’ à 72°C. fin. Programme PCR 2: 20 cycles de: 1’ à 94°C, 1’ à 50°C, 1’ à 72°C. fin.

a. b.

Figure13: Localisation des séquences télomériques par hybridation in situ d’une sonde

(TTAGGG)n sur une métaphase de M. mattheyi, 2n = 36 (a) et M. minutoides de Caledon, 2n = 18 (b). Chez ce dernier, noter les amplifications importantes du signal au niveau des centromères de la majorité des fusions Rb.

108 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique donc d’évolution chromosomique dans ce groupe très diversifié. Par ailleurs, la présence de STC au niveau des fusions Rb sexe-autosome pourrait jouer un rôle épigénomique dans leur apparition, en isolant les bras chromosomiques sexuel et autosomal (hypothèse postulée dans Veyrunes et al., 2004).

Ainsi, une sonde télomérique a été entièrement synthétisée à partir d’amorces de PCR pré-définies : TR-A=5'-GGTTAGGGTTAGGGTAG-3', et TR-B=5'-AACCCTAACCCTAACCCT-3' qui servent simultanément d’amorces et de substrat (d’après G. Dobigny, in litt.). Le produit de PCR est ensuite purifié sur gel, puis marqué à la biotine par nick-translation via une seconde PCR avec les mêmes amorces (Figure 12). Les conditions des deux PCR sont données dans la Figure 12. La sonde télomérique ainsi obtenue, est ensuite hybridée sur les métaphases de différents taxa de Nannomys, suivant la procédure légèrement modifiée décrite dans Garagna et al. (1997a).

Après des résultats prometteurs obtenus dans le laboratoire Comparative Genomics Group en Afrique du Sud à la veille de mon retour, je n’ai malheureusement jusqu’à présent jamais pu retrouver de telles conditions optimales à Montpellier. Dans l’effervescence du retour en France, je n’ai pas eu le temps de prendre des photos pour chaque taxon, mais les patrons d’hybridation avaient tout de même été notés. Les résultats présentés sont donc très préliminaires en attendant de régler les problèmes d’expérimentation. Ainsi, chez un mâle M. mattheyi (2n = 36 ; NF = 36) et une femelle M. musculoides (2n = 18 ; NF = 36), des signaux télomériques ont été détectés uniquement aux extrémités de chaque chromosome (Figure 13a) ; il n’y a pas de signal au niveau des centromères des chromosomes métacentriques de M. musculoides (données non fournies). Chez une femelle et un mâle M. minutoides respectivement de Stellenbosch et Caledon (2n = 18 ; NF = 36), toutes les extrémités des chromosomes sont hybridées par la sonde, tandis qu’un signal très fort est observé dans la région péricentromérique de plusieurs métacentriques (Figure 13b). Ces STC sont beaucoup plus forts que les signaux observés au niveau du centromère d’acrocentriques de M. mattheyi (cette étude) ou de M. minutoides de Zambie (Castiglia et al., 2002).

En attendant de prochains résultats plus détaillés, nous pouvons d’ores et déjà discuter de plusieurs points majeurs qui s’en détachent. Ø Il existe une importante hétérogénéité de patterns, puisque aucun STC n’est détecté chez les fusions Rb de M. musculoides et de certaines de M. minutoides, alors que d’importants

109

a. b.

ADN satellite majeur

" " ADN satellite*

ADN satellite mineur "

Télomères ***** ***** "

****** ***

* *

* * * * *

* ** * * * *

* *

* * * * * * * *

* *

* * * * * * * *

* * * * "

" ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

" "

* La structure de l’ADN satellite n’est pas connue chez Nannomys. Figure 14: Représentation schématique de la région péricentromérique et implications des différentes séquences répétées dans les mécanismes de formation d’une fusion Rb chez (a) Mus m. domesticus (d’après Garagna et al., 1995; Nanda et al., 1995) et (b) chez les Nannomys (hypothèse à confirmer).

110 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique clusters STC sont observés sur les autres fusions Rb de cette dernière espèce. A partir de là, deux hypothèses peuvent être formulées sur le mécanisme de formation des fusions Rb chez les Nannomys : (i) le mécanisme est le même chez toutes les espèces ; les séquences télomériques participent à la fusion et forment des STC qui ensuite sont soit éliminées (M. musculoides) ou amplifiées (la plupart des fusions de M. minutoides) ; (ii) le mécanisme est différent selon les espèces, voire même au sein d’un génome, comprenant dans certains cas le schéma précédent et dans d’autres la perte des séquences télomériques lors de la fusion. Ainsi, bien qu’appartenant au même genre, le processus d’apparition des fusions Rb des Nannomys (tout du moins de M. minutoides) s’écarte de celui de la souris domestique. En effet, chez M. m. domesticus, le processus de fusion engendre toujours la perte irréversible des séquences télomériques et d’une grande part de celles d’ADN satellite mineur, seule une petite portion de ces dernières persistent et suffisent à former un centromère actif de chromosome métacentrique (Figure 14 ; Garagna et al., 1995 ; Nanda et al., 1995). L’absence de STC chez les fusions Rb de la souris domestique fait que chez cette dernière la réversion (fission Rb) est très improbable. A l’inverse, la persistance de STC chez M. minutoides pourrait augmenter la flexibilité caryotypique de cette espèce, expliquant en partie son importante diversité chromosomique. Par contre, Le patron d’hybridation de M. minutoides est en tout point comparable à celui observé chez les musaraignes Sorex, où certains métacentriques présentent des STC et d’autres non. Dans ce dernier genre, il a été montré que le mécanisme de fusions Rb conserve les séquences télomériques (Zhdanova et al., 2005). Ayant perdu toute fonction, les STC seraient par la suite éliminés au cours de l’évolution. En effet, il a été montré que la présence ou non de STC pouvait refléter l’âge de formation des fusions Rb considérées : les plus récentes ayant encore leurs STC, les plus anciennes les ayant éliminées (e.g. Zhdanova et al., 2005). Au sein de M. minutoides, même si nous n’avons pas encore pu identifier spécifiquement les fusions Rb qui présentent des STC, il semblerait que les fusions Rb impliquant de grandes paires d’autosomes ont des clusters STC moins importants (voire absents) que celles impliquant de petits autosomes ; Or, les premières sont identiques entre les cytotypes de Caledon et Stellenbosch ce qui implique qu’elles se soient mises en place avant la séparation des deux taxa, alors que les dernières sont différentes s’étant formées après leur séparation. Les fusions Rb ayant les forts signaux STC ont donc bien une origine plus récente. Par extrapolation, ces observations suggèrent que l’absence de STC des fusions chez M. musculoides serait due à leur âge d’apparition plus ancien. Ainsi, à l’avenir, l’identification des fusions Rb et la quantification de l’intensité du signal STC permettra de proposer une

111

a. b. c.

° ° * * ° *

d. e. f.

* ° *

* °

g. h. i.

° * ° * * °

Figure 15: Métaphases I de M. mattheyi montrant 17 bivalents autosomaux et les chromosomes sexuels : ° indique le chromosome X et * le chromosome Y. a-f: chromosomes sexuels dissociés, a-c: complètement séparés, d-f: dissociés, mais proches l’un de l’autre. g-i: chromosomes sexuels associés, dans le prolongement l’un de l’autre.

112 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique séquence d’apparition des fusions Rb au cours de l’évolution des différents cytotypes de M. minutoides.

Ø Enfin, il a été montré qu’une quantité importante d’hétérochromatine entre les segments autosomal et sexuel d’une translocation sexe-autosome permettait d’isoler les segments sexuel et autosomal, et ainsi de réduire le coût associé à ce type d’événements (Viegas-Pequignot et al., 1982 ; Jaafar et al., 1993 ; Ashley , 2002 ; Dobigny et al., 2004b). Comme attendu, un gros bloc d’hétérochromatine au niveau du centromère de la fusion Rb X-autosome est observé chez M. musculoides ; en revanche, aucun n’est noté chez M. minutoides (Veyrunes et al., 2004). Inversement, M. musculoides ne possède pas de STC, alors que M. minutoides présente une nette amplification STC chez certains métacentriques, dont Rb(X.1). Cette différence de patron suggère une convergence épigénomique entre M. musculoides et minutoides ; en effet, des séquences répétées autres que l’hétérochromatine constitutive, tels que les télomères pourraient ainsi servir « d’isolant » entre les segments sexuel et autosomal. Cette observation sera plus amplement détaillée dans le chapitre Evolution chromosomique : les fusions Rb sexe-autosome.

D. Etude de la méiose.

La méiose est un processus se déroulant durant la gamétogénèse, c'est-à-dire durant l'élaboration des gamètes. Elle a pour but de donner des cellules haploïdes à partir de cellules diploïdes. Mais en plus de ce rôle de division, la méiose a un rôle important dans le brassage génétique (crossing-overs). Elle se déroule en deux divisions cellulaires : méiose I ou phase réductionnelle et méiose II ou phase équationnelle. C’est au début du cycle de la méiose I (prophase et métaphase I) qu’a lieu le brassage génétique inter-chromosomique : les chromosomes homologues forment des synapses et échangent du matériel génétique, ce sont les crossing-overs (formation de chiasmas). Chez les placentaires, l’association synaptique des chromosomes sexuels par la région homologue recombinante, la région pseudoautosomale, PAR, semble un pré-requis nécessaire pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes X et Y dans les gamètes (Burgoyne, 1982). En effet, l’absence de chiasmas des chromosomes sexuels entraîne irrémédiablement un arrêt de la méiose et donc la stérilité complète (e.g . Mohandas et al., 1992 ; Burgoyne et al., 1992). Toutefois, des études

113

M. mattheyi 8441 M. mattheyi 8442

*** ***

47 49

15 7

X/Y non-associés X/Y associés X/Y non-associés X/Y associés

Figure 16: Distribution des métaphases I de la méiose en fonction du comportement des chromosomes X et Y (i.e. non-associés vs. associés) chez deux individus de M. mattheyi. Les différences observées sont fortement significatives d’après un Test de Normalité (p< 0.001).

114 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique anciennes ont montré que les chromosomes sexuels de Nannomys étaient de nature asynaptiques (c’est-à-dire qui ne s’apparient pas à la méiose) (Matthey, 1966a, 1966c ; Jotterand-Bellomo, 1981). A ma connaissance, ce caractère n’a été noté que chez trois autres groupes de rongeurs : les gerbilles du genre Gerbillus (Ratomponirina et al., 1989), Psammomys obesus (Ashley & Moses, 1980) et les Arvicolidae chez lesquels ce caractère est apparu deux fois indépendamment, au sein des Microtus et Myopus (Megias-Nogales et al., 2003).

Afin d’une part de confirmer les études de Matthey des années 60’, et d’autre part de comparer le comportement méiotique des chromosomes sexuels de type PR (acrocentriques) et TR (fusions sexe-autosome), nous avons réalisé des analyses méiotiques de deux mâles de M. mattheyi capturés à Samaya, Mali (PR) et de deux mâles de M. minutoides de Caledon, Afrique du Sud (TR). Malheureusement, les préparations des méioses de ces derniers n’ont pu être exploitées dû à une absence d’activité méiotique. Ceci pourrait être relié au fait que ces individus furent échantillonnés en dehors de la période de reproduction. Une soixantaine de métaphases I par individu ont été examinées. Pour chacune d’elles, les chromosomes X et Y (reconnaissables car ils sont colorés moins intensément au DAPI que les autosomes) sont identifiés selon s’ils sont appareillés (formation d’un bivalent) ou non (univalents). Les figures 15 et 16 résument les résultats obtenus. Dans la grande majorité des cas, les chromosomes sexuels apparaissent complètement dissociés, tout en étant souvent proches l’un de l’autre (Figure 15a-f). En revanche, dans 12 (individu 8442) et 24% (individu 8441) des cas, les chromosomes sexuels sont accolés ou situés dans le prolongement l’un de l’autre (Figure 15g-i). La présence d’un nombre significativement plus élevé de chromosomes sexuels non-appariés suggère qu’ils soient asynaptiques (Figure 16). Les chromosomes sexuels de M. mattheyi ont un comportement méiotique en tout point similaire à celui décrit chez M. setulosus (Jotterand-Bellomo, 1981). Ces résultats devraient toutefois être confirmés par une analyse des complexes synaptonémaux au stade zygotène afin de vérifier qu’il ne s’agisse pas d’une dissociation précoce des chromosomes sexuels.

D’après la phylogénie moléculaire de Nannomys (Veyrunes et al., 2005), M. setulosus est l’espèce basale (la première à avoir divergée) ; ceci suggère que le caractère asynaptique serait survenu avant la diversification des espèces, écartant l’hypothèse qu’il soit apparu après la mise en place de changements génomiques impliquant les chromosomes sexuels (notamment inversion, délétion ou translocation sexe-autosome ; voir Veyrunes et al., 2004).

115

WART

Figure 17: Formation d’un WART (Whole arm reciprocal translocation) par échange de bras entre deux métacentriques.

116 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

A l’instar des mécanismes entraînant la perte du comportement synaptique des chromosomes sexuels, les mécanismes assurant une disjonction correcte du X et du Y en l’absence de cet appariement restent inconnus. Toutefois, plusieurs hypothèses permettant une association des chromosomes sexuels ont été émises. Par exemple, chez certaines espèces asynaptiques de Microtus, les régions terminales des chromosomes sexuels sont rattachées à l’enveloppe nucléaire, ce qui pourrait permettre d’assurer une ségrégation correcte (Carnero et al., 1991 ; Jimenez et al., 1991). Un autre mécanisme proposé est la présence de fibrilles constitutives joignant les chromosomes X et Y observée chez Microtus duodecimcostatus (Carnero et al., 1991) et M. cabrerae (Jimenez et al., 1991). Enfin, la vésicule sexuelle (VS) pourrait maintenir associés les chromosomes X et Y (Jimenez et al., 1991). Dans ce dernier cas, nous devrions nous attendre à ce que les espèces asynaptiques présentent des VS plus denses que celles des espèces synaptiques. Cependant, une telle corrélation ne semble pas exister puisque des VS denses sont observées aussi bien chez des espèces asynaptiques (Carnero et al., 1991 ; Jimenez et al., 1991) que synaptiques (e.g. Arvicola sapidus ; Megias- Nogales et al., 2003).

E. Présence d’un WART (Whole Arm Reciprocal

Translocation) à l’état hétérozygote chez deux individus de Mus minutoides de Caledon.

L’échange de bras chromosomiques entre deux chromosomes métacentriques ou entre un métacentrique et un acrocentrique, appelé WART (Whole Arm Reciprocal Translocation) (Figure 17), est un processus souvent énoncé pour tenter d’expliquer l’apparition de différentes fusions Rb dans des populations parapatriques de souris domestique (e.g. Hauffe & Pialek, 1997 ; Garagna et al., 1997b ; Pialek et al., 2005 ; Britton-Davidian et al., sous presse). Cependant, ces études bénéficient uniquement d’approches indirectes par reconstruction cladistique ou phénétique. Ainsi, les théories et modèles prévoient qu’il s’agit d’un événement récurrent dans l’évolution chromosomique des différentes races Rb de la souris domestique ; pourtant les observations directes font cruellement défaut. Le WART a été décrit pour la première fois par Crocker & Cattanach (1981) chez une souris de laboratoire exposée aux rayons X. Par la suite, l’occurrence spontanée (à l’état hétérozygote) de cet

117 M. Minutoides de Caledon, a. M. Minutoides de Caledon, b. femelle sans WART femelle avec WART

2 signaux 3 signaux

Sonde Rb(X.1) Sonde Rb(X.1) de M. minutoides de M. minutoides

M. Minutoides de c. d. Caledon avec WART

sonde X de souris domestique

(2.10) (3.9) (4.7) (5.8) (6.11)

(12.17)

13 13

16 Y 16

(14.15) X 1 1 X (13.16) (Y.1) (X.1) 1 (1.13) (13.16) (X.16)

Figure 18 : Hybridation in situ de la sonde Rb(X.1) sur des métaphases de femelles M. minutoides sans WART révélant 2 signaux (a), et avec WART révélant 3 signaux (b). FISH de la sonde X de souris sur une femelle avec WART (c) ; la même métaphase en DAPI (d) qui a servi à reconstruire le caryotype (e) ; en insert : fusion Rb(13.16) homozygote et chromosomes sexuels Rb(Y.1) et Rb(X.1) chez un mâle sans WART. 118 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

événement n’a été identifiée qu’à trois reprises chez la souris domestique (Capanna & Redi, 1995 ; Castiglia & Capanna, 1999 ; Catalan et al., 2000). Au sein des mammifères, un quatrième cas a été décrit chez un spécimen de tupaïa Tupaia belangeri de l’ordre des Scandentia (Hirai et al., 2002). Nous rapportons ici un nouveau cas de WART hétérozygote chez Mus minutoides.

Au cours d’un suivi caryologique de sept animaux (5 femelles, 2 mâles) capturés à Caledon (Afrique du Sud) en novembre 2003, nous avons identifié deux femelles présentant un caryotype (2n = 18) étrange et similaire. Par des techniques de ZOO-FISH (méthode décrite dans Veyrunes et al. soumis) et de DAPI-banding (pattern de bandes équivalent au banding-G), nous avons identifié les chromosomes qui composent ce caryotype (Figure 18) : - sept fusions Rb homozygotes identiques à celles des autres animaux capturés - un chromosome 1 acrocentrique - et trois métacentriques à l’état hétérozygote, Rb(13.16), Rb(1.13) et Rb(X.16). L’hybridation in situ de la sonde chromosomique Rb(X.1) (produite à partir du caryotype de M. minutoides de Stellenbosch ; Veyrunes et al., soumis) sur des métaphases des femelles de Caledon avec et sans WART est non-équivoque. Les femelles* sans WART présentent deux signaux [Rb(X.1) et 1 acrocentrique], les femelles avec WART, trois signaux [Rb(X.16), Rb(1.13) et 1 acrocentrique] (Figure 18a-b). Les mêmes métaphases sont colorées au DAPI, ce qui a permis d’identifier les chromosomes impliqués (Figure 18c-e). Ainsi, ces deux femelles partagent sept fusions Rb avec les autres individus de la population, sauf deux à l’état hétérozygote qui n’avaient jamais été détectées auparavant : Rb(1.13) et Rb(X.16). En outre, elles possèdent le même haplotype cytochrome b (donnée non montrée) que les autres individus de la population. Elles se retrouvent donc incluses dans le clade M. minutoides ; Or d’après la phylogénie moléculaire la première fusion à s’être fixée dans ce clade est Rb(X.1) (Veyrunes et al., 2005). L’interprétation la plus parcimonieuse est donc que ce caryotype soit issu d’un WART survenu entre les fusions Rb(13.16) et Rb(X.1) chez un parent des deux femelles.

* Note importante : les femelles de Caledon ont un système sexuel particulier, ayant un seul chromosome X (XO) (voir chapitre suivant : Déterminisme du sexe).

119 Ces résultats offrent de nouvelles perspectives pour comprendre l’évolution chromosomique de certains groupes d’espèces et notamment celle des races Rb de la souris domestique ou même de l’ornithorynque.

Ø Cette observation de WART hétérozygote dans une population naturelle témoigne une nouvelle fois de l’existence de ce type de réarrangement in natura et le potentiel de ce dernier à créer rapidement de nouveaux variants chromosomiques. Ceci soutient les études précédentes qui suggèrent que la formation de WART est le mécanisme le plus parcimonieux pour comprendre la diversité chromosomique entre certaines races Rb parapatriques apparentées de souris domestique (Hauffe & Pialek, 1997 ; Garagna et al., 1997b ; Pialek et al., 2005 ; Britton-Davidian et al., sous presse). En effet, ces études proposent un modèle d’évolution chromosomique qui privilégie les apparitions de WART, excluant les fissions Rb (qui, contrairement au WART, nécessitent la néo-formation d’un centromère et de télomères ; Garagna et al., 1995 ; Nanda et al., 1995) et réduisant le nombre de fixations convergentes de fusions Rb.

Ø Pour la première fois décrit, ce type de remaniement implique le chromosome X. Une nouvelle fusion Rb sexe-autosome est ainsi apparue par WART : Rb(X.16). Il s’agit de la cinquième fusion sexe-autosome identifiée au sein des Nannomys, pourtant si rare chez tous les autres mammifères (voir Veyrunes et al., 2004). Cette étude révèle ainsi que cette formidable diversité de fusions sexe-autosome ne s’est pas mise en place uniquement par des fusions Rb indépendantes, mais a pu aussi l’être par l’intermédiaire de WARTs (tout au moins pour le cas présenté ici).

Ø A la méiose, l’appariement des chromosomes issus du WART est complexe. Une chaîne de quatre chromosomes comprenant le X et le Y est formée : - 1(1.13)(13.16)(16.X) chez les femelles - (Y.1)(1.13)(13.16)(16.X) chez les mâles Les chromosomes sexuels étant asynaptiques, la configuration méiotique des mâles est une chaîne et non pas un anneau, avec le X et le Y aux deux extrémités. Le mâle produit deux types de gamètes balancés : [(Y.1) (13.16)] et [(1.13) (16.X)]. Cette configuration est non sans rappeler la chaîne extraordinaire du mâle ornithorynque qui comprend cinq chromosomes X et cinq Y, X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 (Grutzner et al., 2004 ; Rens et al.,

120 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

2004). Seuls les chromosomes X des extrémités (X1 et X5) possèdent des gènes spécifiques aux chromosomes sexuels des mammifères et des oiseaux (!) ; Les huit autres chromosomes sont de nature autosomale (Grutzner et al., 2004). Ces auteurs ont proposé un scénario pour expliquer la mise en place d’un tel système méiotique via des événements rares de translocations non-réciproques entre chromosomes sexuels et autosomes et entre autosomes (Grutzner et al., 2004 ; Rens et al., 2004). Ce scénario est contesté par Ashley (2005) qui en suggère un autre faisant intervenir des fusions Rb à homologie monobrachiale. D’après nos observations concernant les deux individus de M. minutoides, nous proposons une troisième hypothèse où le système sexuel de l’ornithorynque se serait mis en place comme chez M. minutoides par une succession de WARTs. Ce modèle se rapproche de celui proposé par Ashley (2005), mais est plus parcimonieux dans le sens où il ne fait pas intervenir d’événements d’hybridation entre deux cytotypes d’ornithorynque qui aurait aujourd’hui disparus à la faveur du cytotype d’origine hybride.

Ø Enfin, les deux spécimens étudiés possèdent un caryotype extraordinaire avec pas moins de trois remaniements chromosomiques considérés comme très rares et impliquant le X : femelle avec un déterminisme du sexe XO (un seul X) + translocation sexe-autosome + WART hétérozygote. Nous pouvons nous interroger sur la valeur sélective de ces individus. Ils sont a priori fertiles, puisque les deux premiers caractères sont fixés dans la population et le troisième a été transmis par l’un des parents. Par ailleurs, le WART produit une chaîne de quatre chromosomes à la méiose ; Cette configuration confère chez la souris domestique une fertilité très variable (de quasi-normale à stérilité totale) dépendant des chromosomes impliqués ; mais jamais la présence des chromosomes sexuels dans une telle configuration n’a été testée (revue dans Gropp et al., 1982).

F. Evolution chromosomique

a) Les réarrangements chromosomiques, confrontations avec les données moléculaires. Dans notre échantillon de Nannomys, l’évolution chromosomique s’est fait majoritairement par fixation de fusions Rb (orthosélection), à l’exception d’une inversion

121

Groupes externes (Coelomys, Pyromys, Mus ss, Apodemus, Rattus) ?? Zakouma NP, Chad Mus sp. 100 1.00 Kenya autosome 67 Nairobi, Kenya Rb(X.1) 0.97 Kingu Pira, Tanzania sex chrom. Rb(Y.1) 100 Kuruman, SA Mus 1.00 94 minutoides 0.99 Caledon Reserve, SA 2n = 18-34 99 100 Stellenbosch, SA 1.00 95 1.00 1.00 Gbetaya, Guinea 100 Bantou, Guinea 1.00 73 Bamako, Mali 0.97 Mus Samaya, Mali musculoides 100 Caryotype Rb(X.7) 1.00 Djoliba, Mali 2n = 18-19 100 ancestral 1.00 Kgalagadi NP, SA Mus Tussen die Reviere , SA indutus 96 2n = 36 1.00 Togo 100 Oursi, Burkina Faso 98 1.00 1.00 Farabana, Mali Mus

Bandia, Senegal mattheyi 88 2n = 36 1.00 Kabalabougou, Mali 63 - Samaya, Mali 100 Thiès, Senegal 1.00 Karal, Chad Inversion Mus péricentrique Guileyni, Niger haussa + 92 Ménaka, Mali 2n = 28-34 H 0.98 58 Kollo, Niger 0.97 Addition 100 Gbetaya, Guinea d’hétérochromatine 1.00 Mus Gabon setulosus 91 Ippy-Banguy, CAR 2n = 36 0.1 0.80

Figure 19: Figure modifiée d’après Veyrunes et al. (2005). Confrontation des données moléculaires et chromosomiques. Phylogénie moléculaire reconstruite par maximum de vraisemblance à partir des séquences du gène cytochrome b. La robustesse des nœuds est indiquée lorsque le bootstrap est > 50% et la probabilité postérieure bayésienne > 0.80. Les individus sont désignés par leur localité et leur pays de capture. Les valeurs des nombres diploïdes sont résumées

pour chaque espèce. Les réarrangements chromosomiques diagnostics sont représentés pour chaque clade majeur.

122 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique péricentrique notée chez M. haussa et l’addition d’hétérochromatine sur les petites paires du caryotype de M. setulosus. Curieusement, aucune fusion en tandem n’a été identifiée, alors qu’elle est connue de plusieurs autres espèces : M. oubanguii (Jotterand-Bellomo, 1984), M. triton (Jotterand-Bellomo, 1988), M. mahomet (Aniskin et al., 1998) et probablement aussi M. goundae (Jotterand, 1970). Les remaniements chromosomiques nous ont permis d’assigner chaque individu à une espèce (Article 3 : Veyrunes et al., 2004). Nous avons ensuite confronté ces données avec la phylogénie moléculaire (Article 4 : Veyrunes et al., 2005), et observons une parfaite concordance. Les fusions Rb entre autosomes ne sont pas discriminantes tant la diversité inter- et intra-spécifique est importante (e.g. apparition multiple de la fusion Rb(9.10) chez M. haussa et M. musculoides) ; En revanche, les autres remaniements (translocations sexe-autosome, inversion péricentrique et addition d’hétérochromatine) apparaissent comme de bons marqueurs phylogénétiques diagnostics (Figure 19). Contrairement aux modifications d’hétérochromatine et à l’inversion péricentrique, les translocations sexe-autosome sont des changements très délétères, ce qui les fait considérer comme un mécanisme d'isolement reproductif conséquent (King, 1993). Une telle différenciation chromosomique devrait ainsi conduire à un isolement reproductif rapide entre taxa, notamment des populations PR (chromosomes sexuels non-fusionnés), mais également entre populations TR si elles ne partagent pas le même autosome fusionné. D’ailleurs, au sein du clade M. minutoides, la seule fusion en commun à tous les échantillons est Rb(X.1), suggérant que cet événement est le premier à s’être fixé et pourrait donc avoir joué un rôle initiateur dans la divergence de ce clade (Veyrunes et al., 2005).

b) Les fusions Rb entre autosomes Les fusions Rb sont de loin l’événement chromosomique le plus répandu chez les mammifères (King, 1993 ; Qumsiyeh, 1994) ; d’ailleurs, le sous-genre Nannomys et les populations dites « Robertsoniennes » de la souris domestique ont indéniablement une propension à ce type de réarrangement (e.g. Hauffe & Searle, 1993 ; Britton-Davidian et al., 2000 ; Veyrunes et al., 2004 ; Pialek et al., 2005). A titre d’exemple, pas moins de 20 fusions Rb différentes se sont fixées dans les populations de souris domestique de l’île de Madère en moins de 500 ans (Britton-Davidian et al., 2000). Pourtant, la comparaison des génomes par ZOO-FISH des quatre sous-genres de Mus (Article 2 : Veyrunes et al., soumis) montre curieusement qu’au cours de l’évolution du génome du genre, aucune fusion Rb n’a été impliquée, mais uniquement des fusions en tandem (c’est-à-dire fusion centromère-partie

123 a.

Belfast Lydenburg

2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 (X.1)

(2.9) (3.17) (4.7) (5.8) (6.11)

(10.12)

(13.14) (15.16) (X.1) (Y.1)

Figure 20a: Caryotype en banding-G de M. minutoides: () femelle en provenance de Belfast, (b) mâle de Lydenburg. 124 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique distale au lieu de centromère-centromère). Pourtant, les fusions en tandem sont beuacoup plus délétères que les fusions Rb et sont ainsi beaucoup moins sujettes à se fixer dans une population (Baker et al., 1988 ; King, 1993). Comment alors concevoir que la fusion Rb soit actuellement le remaniement le plus répandu, alors qu’elle ne semble pas être intervenue au cours de l’évolution historique des génomes ? Trois hypothèses peuvent être avancées pour appréhender ce paradoxe : mécanistique, épigénétique et sélective. - mécanistique : le chromosome métacentrique est une structure labile, son centromère étant un hotspot de cassure chromosomique, la réversion (fission Rb) serait ainsi un événement courant. Cette hypothèse est en contradiction avec les observations de Garagna et al. (1995) et de Nanda et al. (1995) qui suggèrent que la fission Rb est peu probable chez la souris domestique, car le processus de fusion engendre la perte complète des télomères, mais est en accord avec les analyses de distribution des séquences télomériques chez M. minutoides (cf. précédemment). - épigénétique : la nature du centromère de certaines lignées a changé récemment, devenant plus encline à la fixation de fusions Rb (par exemple augmentation du degré d'homologie des séquences répétées d’ADN péri- et/ou centromériques autorisant un appariement illégitime des différents chromosomes; Redi et al., 1990). - sélective : cette hypothèse, bien que moins réaliste, repose sur le fait que ce paradoxe rappelle le modèle de canalisation énoncé par Bickham & Baker (1979). L'évolution caryotypique est avant tout réalisée par des réarrangements chromosomiques à effets majeurs permettant une intense restructuration du génome (par exemple translocations, fusions en tandem, fissions) jusqu'à l’obtention d’un « caryotype proche de l’optimum adaptatif » ; ensuite les remaniements à effets majeurs sont contre-sélectionnés et ceux à effets mineurs (par exemple fusions Rb) peuvent alors survenir pour affiner le caryotype et ainsi atteindre un « caryotype optimum ». Enfin, la sélection fixe ce caryotype optimal et une période de stase chromosomique s’installe.

Il existe une formidable diversité de fusions Rb au sein des Nannomys. En effet, alors que seules cinq études cytogénétiques en banding-G ont été réalisées sur ce modèle (Jotterand-Bellomo, 1984, 1986, 1988 ; Castiglia et al., 2002 ; Veyrunes et al., 2004), pas moins de 43 fusions Rb ont d’ores et déjà été identifiées sur les 153 combinaisons possibles (soit près d’un tiers), dont 28 nouvellement décrites pendant cette thèse. Depuis la parution de l’article 3 (Veyrunes et al., 2004), de nouvelles données sont venues corroborer et d’autres réévaluer les résultats présentés. En effet, toutes les homologies

125 a. Relations phylogénétiques d’après les données chromosomiques 2n Kuruman 34

Belfast 34

(X.1) (Y.1) (2.9) (3.17) (10.12) (13.14) (15.16) Lydenburg 18

(4.7) (5.8) (6.11) (2.10) (13.16)(14.15) Caledon 18 (3.9) (12.17)

(2.13) (10.14)(15.16) Stellenbosch 18

b. Relations phylogénétiques d’après les données moléculaires Kuruman 34

Belfast 34

(X.1) (Y.1) (12.17) (3.9) (2.13) (10.14) (15.16) Stellenbosch 18

(4.7) (5.8) (6.11) (12.17) (3.9) (2.10) (13.16)(14.15) Caledon 18

(2.9) (3.17) (10.12) (13.14)(15.16) Lydenburg 18

Figure 21: Topologies et scénarios évolutifs d’après les données chromosomiques (a) et moléculaires (b). Les fusions Rb sont indiquées le long des branches, celles en gras sont homoplasiques, i.e. événements de convergence.

126 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique chromosomiques entre espèces de Nannomys, basées sur les profils de bandes G, ont été confirmées par ZOO-FISH : hybridation des sondes chromosomiques de M. minutoides de Stellenbosch sur tous les autres cytotypes (travail non-présenté dans cette thèse). De même, l’obtention de mâles M. minutoides originaires de Stellenbosch et Kuruman ont permis d’affirmer la présence d’une fusion impliquant le chromosome Y avec un autosome de la paire 1. Enfin, de nouveaux échantillons en provenance de deux localités d’Afrique du Sud ont été caryotypés. - Une femelle de Belfast présente un cytotype identique à celui identifié à Kuruman, à savoir 2n = 34 ; tous les autosomes sont acrocentriques excepté la paire 1 qui fusionne avec les chromosomes X (Figure 20a). - Un mâle de Lydenburg possède quant à lui un caryotype de 2n = 18 chromosomes, ce qui signifie que tous les chromosomes sont fusionnés y compris les sexuels : Rb(X.1), Rb(Y.1), Rb(2.9), Rb(3.17), Rb(4.7), Rb(5.8), Rb(6.11), Rb(10.12), Rb(13.14), Rb(15.16). Le segment correspondant au chromosome Y est très petit (Figure 20b). Outre les fusions sexe- autosome, ce nouveau cytotype possède plusieurs autres fusions en commun avec les cytotypes de Caledon et Stellenbosch: Rb(4.7), Rb(5.8), Rb(6.11), tandis que Rb(15.16) n’est partagée qu’avec ce dernier (Veyrunes et al., 2004).

Ces individus originaires de localités proches géographiquement ont pourtant des caryotypes très différents, même s’ils partagent la fusion sexe-autosome Rb(X.1). La présence de ce remaniement signe cependant leur identité spécifique : ils appartiennent à la même espèce ou complexe d’espèces, M. minutoides (Veyrunes et al., 2004, 2005). Les analyses cytogénétique et moléculaire (phylogénie à partir des séquences du cytochrome b -non présentée-) suggère qu’il existe, au sein de cette espèce (complexe d’espèces), au moins deux lignées distinctes en Afrique du Sud : l’une possédant 34 chromosomes, rencontrée à Kuruman et Belfast ; l’autre ayant 18 chromosomes, ce qui signifie que tous les chromosomes participent à des fusions Rb mais n’impliquant pas les mêmes chromosomes, rencontrée à Stellenbosch, Caledon et Lydenburg (Veyrunes et al., 2004). La comparaison des fusions Rb entre les trois cytotypes de la lignée à 2n = 18 permet de proposer un scénario évolutif pour ce groupe (Figure 21a). Le plus parcimonieux est qu’après la séparation d’avec la lignée à 2n = 34, les fusions Rb(4.7), Rb(5.8), Rb(6.11) se sont fixées. Ensuite, le cytotype de Lydenburg est le premier à avoir divergé, les individus de Stellenbosch et Caledon ayant deux autres fusions en commun [Rb(3.9), Rb(12.17)], apparaissant ainsi groupe-frère (taxa les plus proches phylogénétiquement). En revanche

127 Rb(15.16) est commune aux cytotypes de Stellenbosch et Lydenburg, suggérant une apparition multiple ou un événement de fission suivi de fusion ou un WART. Pourtant, la phylogénie moléculaire (non présentée) soutient de façon robuste (bootstrap de 100% à chaque nœud) une autre topologie (moins parcimonieuse) où les cytotypes de Caledon et Lydenburg apparaissent groupe-frère, ce qui implique trois événements de convergence/réversion au lieu d’un seul (Figure 21b). Il s’agit donc ici du premier conflit rapporté entre les données chromosomiques et moléculaires au sein de notre échantillon.

A l’instar des différentes espèces de Nannomys où certaines ont un caryotype de type ancestral et d’autres très remanié, la lignée à 2n = 34 au sein de M. minutoides, semble être en « stase caryotypique » (évolution chromosomique nulle), alors que celle à 2n = 18 subit une évolution chromosomique intense avec pas moins de 15 fusions Rb autosomales fixées. Ces différences chromosomiques sont largement suffisantes pour initier un isolement reproducteur non seulement entre les deux lignées, mais aussi au sein de la lignée à 18 chromosomes. A titre d’exemples, les méioses d’hybrides théoriques entre Belfast et Lydenburg (croisement inter-lignée) ou entre Lydenburg et Stellenbosch (croisement intra-lignée) produiraient respectivement huit trivalents ou un anneau de huit chromosomes ; ces configurations entraînant à coup sûr une baisse drastique de la fertilité, voire une stérilité totale, chez la souris domestique (Gropp et al., 1982 ; Garagna et al., 1990 ; Hauffe & Searle, 1998 ; Castiglia & Capanna, 2000). Cependant, ces interprétations sont à nuancer puisque les études de Matthey (1966a, 1970a) laissent envisager qu’il existe un continuum entre les nombres diploïdes 18 et 34 ; ainsi une continuité du flux génique pourrait être assuré via les caryotypes intermédiaires (d’ailleurs, dans notre échantillonnage, un individu de Guinée à 2n = 32 est assigné à une probable M. minutoides ; V. Aniskin, comm. pers.).

Des facteurs génomiques (par exemple, degré d'homologie des séquences répétées centromériques autorisant un appariement illégitime des différents chromosomes) ou environnementaux (par exemple, taille des populations) sont à rechercher pour expliquer une telle différence de pattern entre ces deux lignées. En outre, cette diversité de fusions Rb localisée à certaines espèces/lignées peut être due (i) à des événements répétés de WARTs (dont l’occurrence au sein de M. minutoides a déjà été prouvée) qui créent de nouvelles combinaisons chromosomiques dans des clades déjà diversifiés et qui expliquerait les incongruences de topologies entre les données chromosomiques et moléculaires ; ou (ii) à la persistance des motifs télomériques lors des fusions Rb qui entraîne une certaine flexibilité

128 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique caryotypique puisque les fissions Rb deviennent alors moins problématiques (voir Garagna et al., 1995 ; Nanda et al., 1995).

Mais cette diversité de fusions Rb est d’autant plus remarquable qu’elle implique également les chromosomes sexuels. c) Les fusions Rb sexe-autosome Les translocations sexe-autosome sont beaucoup plus délétères que celles entre autosomes, provoquant d’importants disfonctionnements de la gamétogenèse, de l’expression génique et du déterminisme du sexe (revues dans King, 1993 ; White et al., 1998 ; Ashley, 2002 ; Dobigny et al., 2004b). Ces perturbations sont liées aux différences de comportement méiotique entre les compartiments sexuel et autosomal. Le phénomène le plus spectaculaire est la compensation de dosage du sexe homogamétique par l’inactivation aléatoire d’un des X chez les mammifères. Dans le cas d’une translocation sexe-autosome, le mécanisme d’inactivation peut alors se propager (au moins partiellement) sur la partie autosomale transloquée rendant ainsi inactifs les gènes portés par l’autosome. L’étude de Schanz & Steinbach (1989) en est la meilleure illustration. Ces auteurs rapportent le cas clinique d’un nourrisson possédant de légères malformations congénitales ; l’observation caryologique révèle une trisomie 14 qui n’est pourtant pas compatible avec une survie postnatale. Cependant, le troisième chromosome 14 est transloqué sur le X inactivé, inactivation qui s’est répandue sur l’autosome, le rendant à son tour inactif. Ainsi, l’association de deux évènements chromosomiques rares très délétères, une trisomie 14 normalement létale chez l’homme et une translocation sexe-autosome, a permis la survie du patient. Etant donné leur coût élevé, les translocations sexe-autosome sont très rares chez les mammifères (cf. Introduction), à l’exception des souris naines africaines qui présentent une diversité unique de translocations sexe-autosome. D’après la littérature, trois paires d’autosomes fusionnent avec les chromosomes sexuels dans ce groupe : Rb(X.1) (Y.1) chez Mus minutoides, Rb(X.15) (Y.15) chez M. oubanguii et Rb(X.12) chez M. triton (Jotterand- Bellomo, 1986, 1988 ; Castiglia et al., 2002 ; Veyrunes et al., 2004) ; A ceux-ci s’ajoutent deux autres fusions Rb sexe-autosome qui ont été identifiées au cours de ma thèse, Rb(X.7) chez M. musculoides (Veyrunes et al., 2004) et Rb(X.16) chez deux individus de M. minutoides en provenance de Caledon, Afrique du sud. Cette incroyable diversité au sein des Nannomys se révèle être riche d’enseignements.

129

B B B B C C D D A

Monophylie des espèces TR

D B B B A A C C A

Monophylie des espèces TR

Figure 22: Scénarios phylogénétiques permettant de discriminer les modes d’apparition des fusions Rb sexe-autosome. Les fusions sexe-autosome (A-D) sont replacées dans un arbre phylogénétique. Hypothèse a: Les fusions sexe-autosome sont mises en place indépendamment grâce à une modification du génome ( ), elles sont alors toutes monophylétiques. Hypothèse b: les fusions sexe-autosome apparaissent par WARTs de fusions existantes ( ), certaines sont alors paraphylétiques (i.e. A et B).

130 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

La phylogénie moléculaire des Nannomys (Veyrunes et al., 2005) a permis de confirmer que les fusions Rb sexe-autosome sont des changements génomiques rares (Rokas & Holland, 2000) et de ce fait, moins sujets à la convergence que les fusions Rb entre autosomes. En effet, malgré des caryotypes très différents (2n = 18-34) et des localités très éloignées (Afrique du Sud, Kenya, Guinée), tous les taxa présentant la fusion Rb(X.1) apparaissent monophylétiques. De plus, les résultats suggèrent que les différentes espèces TR ont une origine unique. Si ce clade est confirmé par l’addition de nouveaux échantillons, ceci suggérerait que les taxa le composant partagent non pas une synapomorphie pour un remaniement particulier, mais pour un type de remaniement (propension à fixer des fusions Rb sexe-autosome). Nous pouvons donc prédire la mise en place d’une modification du génome (ou épigénomique) conduisant à un taux plus élevé d’apparition et/ou de fixation des fusions sexe-autosome que dans les autres clades et qui a mené à l’émergence de cette lignée. Cependant, nous avons vu chez M. minutoides que les fusions Rb sexe-autosome pouvaient aussi apparaître par WART. Un tel mécanisme est compatible avec la monophylie du clade regroupant les espèces TR présentant différentes fusions sexe-autosome. En effet, si la diversité de ces dernières est due à des WARTs, ces événements ne seraient plus considérés comme indépendants, et l’on s’attendrait alors à ce que les espèces TR porteuses de ces fusions aient également une origine unique (voir Veyrunes et al., 2005). De nouvelles études sont donc nécessaires pour appréhender les mécanismes à l’origine de la diversité des fusions sexe-autosome au sein de ce clade. L’incorporation de nouveaux taxa TR dans une phylogénie moléculaire pourrait nous permettre de trancher entre l’hypothèse de la modification génomique et celle du WART, car on s’attend à un schéma phylogénétique différent : les fusions Rb sexe-autosome seraient respectivement monophylétiques vs. paraphylétiques (Figure 22).

L’existence d’une telle diversité de fusions sexe-autosome pose par ailleurs le problème de la fixation de remaniements très délétères. Deux hypothèses ont été émises sur l’existence de facteurs limitant le désavantage sélectif de tels événements. Ainsi, Charlesworth & Charlesworth (1980) ont argumenté en faveur d’un avantage sélectif des fusions sexe-autosome lorsque des gènes possédant des effets antagonistes entre sexes (Partridge & Hurst, 1998 ; Rinn & Snyder, 2005) sont portés par l’autosome. Une seule condition est nécessaire : les allèles au locus autosomal considéré doivent être maintenus par sélection à des fréquences différentes entre les deux sexes. La sélection pour ce type de fusion peut être appréhendée comme un cas spécial de sélection dont l’effet est de réduire la

131 recombinaison entre deux gènes. Par extension, une implication différentielle des autosomes dans les fusions avec les chromosomes sexuels est attendue selon leur contenu génique. Toutefois, le fait que, dans certains cas, la même paire d’autosomes fusionne sur le X et le Y (i.e. M. minutoides et oubanguii) ne semble pas en accord avec cette hypothèse puisque la sélection différentielle entre sexes est alors annulée. La seconde hypothèse est celle postulée par Viegas-Péquignot et al. (1982) et reprise par plusieurs auteurs (Ratomponirina et al., 1986 ; Jaafar et al., 1993 ; Lyon, 1998 ; Rodrigues Noronha et al., 2001 ; Dobigny et al., 2004b). Ces auteurs suggèrent que la présence d’une quantité importante d’hétérochromatine centromérique pourrait isoler l’autosome du chromosome sexuel (le bloc d’hétérochromatine empêcherait la propagation de l’inactivation sur l’autosome), réduisant ainsi l’effet disruptif du remaniement sur la spermatogenèse. Cette hypothèse est d’ailleurs fortement soutenue, puisque toutes les espèces de mammifères qui ont de telles translocations présentent un important bloc d’hétérochromatine entre le compartiment sexuel et autosomal (chez les rongeurs du genre Gerbillus -Ratomponirina et al., 1986-, et Taterillus -Dobigny et al., 2004b-, chez des souches de laboratoire de souris domestique -Jaafar et al., 1993- chez les chauve-souris de la famille des Phyllostomidae - Rodrigues Noronha et al., 2001-, chez les musaraignes du genre Sorex -d’après Dobigny et al., 2004b- chez le cerf élaphode Elaphodus cephalophus -Shi et al., 1991- le cerf muntjac indien -Yang et al., 1997- et chez le marsupial Wallabia bicolor -Metcalfe et al., 1998). Cette hypothèse a alors été testée chez les Nannomys par banding-C. Alors que les autosomes ne possèdent pas ou peu d’hétérochromatine centromérique, les chromosomes Rb(X.7) de M. musculoides ont un important bloc d’hétérochromatine centromérique entre le segment sexuel et autosomal. En revanche, contre toute attente, M. minutoides ne présente pas d’hétérochromatine entre le compartiment sexuel et autosomal (Veyrunes et al., 2004).

Nous proposons aujourd’hui d’autres pistes d’investigation quant au(x) mécanisme(s) acquis indépendamment par M. minutoides permettant de surmonter le coût des fusions Rb sexe-autosome. - D’autres types de séquences répétées pourraient agir « d’isolant » entre les segments sexuel et autosomal, telles que les séquences télomériques ou d’ADN ribosomaux (Parish et al., 2002). Ainsi, nous avons étudié la distribution des télomères (TTAGGG)n dans différents génomes de Nannomys. Alors que M. musculoides ne possède pas de clusters télomériques au niveau du centromère de Rb(X.7), M. minutoides en revanche, présente une importante amplification des séquences télomériques centromériques de Rb(X.1). Ces résultats sont donc

132 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique en accord avec la prédiction, différents types de séquences répétées pourraient agir de barrière à l’inactivation selon les espèces : hétérochromatine constitutive chez M. musculoides et la plupart des autres mammifères, locus d’ADNr 28S chez la chauve-souris Carollia brevicauda (Parish et al., 2002) et séquences télomériques chez M. minutoides. Toutefois, ces résultats pourraient être à nuancer puisque la plupart des fusions Rb de M. minutoides présentent également d’importants clusters de télomères au niveau des centromères, contrairement à M. musculoides ; de surcroît Rb(X.1) n’est pas le chromosome qui en possède le plus. - La paire chromosomique 1 impliquée dans la fusion sexe-autosome de M. minutoides pourrait posséder des caractéristiques génomiques propres, permettant de surmonter le coût d’une telle fusion. Par exemple, une faible densité de rétrotransposons LINE-1, éléments qui semblent jouer un rôle dans la propagation de l’inactivation (Bailey et al., 2000 ; Parish et al., 2002) ; ainsi, l’inactivation serait stoppée et n’affecterait pas l’autosome. D’après le protocole décrit dans Waters et al. (2004), j’ai donc réalisé une sonde marquée à la biotine spécifique des éléments LINE-1 que j’ai ensuite hybridée sur des métaphases de M. minutoides. Les résultats préliminaires semblent réfuter l’hypothèse. En effet, la paire 1 n’apparaît pas moins riche en LINE-1 que les autres autosomes (Figure 23). - Enfin, une autre hypothèse est envisageable : au lieu de « résoudre le problème », M. minutoides se serait « soustrait du problème », n’ayant plus le besoin d’inactiver un X. En effet, au sein de M. minutoides, la fusion Rb(X.1) est parfois associée à des modifications du déterminisme du sexe. Ainsi, les femelles de Caledon ont un système sexuel XO et la femelle de Kuruman est XY (pour plus de détails, voir chapitre suivant : Déterminisme du sexe). Ces femelles ne possèdent donc qu’une seule copie du chromosome X, tout comme les mâles ; dans ce cas, le phénomène de compensation de dosage (inactivation d’un des X) n’a pas lieu d’être. Quant à la femelle décrite de Stellenbosch (Veyrunes et al., 2004), elle possède deux chromosomes X, mais hétéromorphes : l’un des deux X est atypique (X*) avec des patterns de bandes G et C différents et une taille plus courte que le X normal (délétion partielle ?). S’il correspond à un état non-fonctionnel, un seul des chromosomes X est alors actif et la compensation de dosage est là aussi inutile. Cependant, dans toutes les populations de mammifères (y compris les Nannomys) où ont été décrites des femelles de types XY ou XX* comme à Kuruman et Stellenbosch (i.e. Dicrostonyx torquatus, Myopus schisticolor, Nannomys sp., Akodon sp. ; e.g. Matthey, 1967, 1970b ; Fredga, 1983, 1988 ; Bianchi, 2002), une forte proportion de femelles (~50%) ont un caryotype classique XX, chez lequel l’inactivation du X est nécessaire.

133

1 X

Figure 23: A partir des amorces L1R=5’-ATTCTRTTCCATTGGTCTA-3’ et L1F=5’- CCATGCTCATSGATTGG -3’ définies dans Waters et al. (2004), j’ai amplifié par PCR un fragment de 290pb situé dans la région ORF (Open Reading Frame) II de LINE-1

à partir de l’ADN génomique total de M. mattheyi. Le produit de PCR (température d’hybridation = 51°C) a ensuite été purifié sur gel, puis marqué à la biotine par nick- translation via une seconde PCR. La sonde LINE-1 ainsi obtenue a été hybridée sur des métaphases d’un mâle M. minutoides de Caledon en suivant la procédure décrite dans Waters et al. (2004).

134 2ème partie : Histoire évolutive & Evolution chromosomique

Des analyses supplémentaires sur le modèle Nannomys sont donc requises afin de comprendre les pressions de sélection et les processus génomiques sous-jacents à la fixation de translocations sexe-autosome au cours de l’évolution des mammifères.

135

136 3ème partie : Déterminisme du sexe

3ème partie : DETERMINISME DU SEXE.

A. Identification de nouveaux systèmes de déterminisme du sexe.

Le déterminisme du sexe des mammifères est un système extrêmement conservé assuré par une paire de chromosomes dimorphiques, les femelles étant XX et les mâles XY. Toutefois d’après la littérature, une vingtaine d’espèces de mammifères ont évolué vers des systèmes sexuels atypiques. A l’exception du Paresseux à deux doigts Choloepus hoffmanni, il s’agit exclusivement de rongeurs (pour une liste exhaustive, voir Introduction : Modification du déterminisme du sexe). Parmi ces systèmes singuliers, l’un des plus remarquables est celui décrit chez Ellobius lutescens (Arvicollinae) et Tokudaia osimensis (Muridae) où mâles et femelles n’ont qu’un seul chromosome sexuel, le X (i.e. perte du second X chez les femelles et du Y chez les mâles). De plus, la recherche dans leur génome du gène Sry, considéré comme indispensable à la fonction mâle, s’est révélée infructueuse (Just et al., 1995, 2002 ; Soullier et al., 1998 ; Sutou et al., 2001) ! Ce système sexuel XO / XO a été identifié dans une troisième lignée, une espèce de Nannomys du Burundi, Mus triton (Jotterand-Bellomo, 1988). Par ailleurs, au sein des Nannomys, j’ai identifié au cours de ma thèse pas moins de deux nouveaux déterminismes du sexe. a) Femelles XX-XY, Mâles XY Dans une étude précédente (Veyrunes et al., 2004), nous avions déterminé la présence de deux chromosomes sexuels morphologiquement très différents chez une femelle M. minutoides de Kuruman (Afrique du Sud). L’un des deux était de taille normale, le second était deux-tiers plus court. En outre, ce dernier, contrairement au premier, se révélait être entièrement hétérochromatique comme un chromosome Y. A l’époque, nous les avions identifiés comme X « normal » et X « délété » (Xd) d’après la littérature existante. En effet, l’occurrence d’un Xd hétérochromatique n’était pas rare chez les Nannomys, et des cas similaires avaient été rapportés dans des populations de M. musculoides/minutoides de Côte d’Ivoire (Matthey, 1967), République de Centrafrique (Matthey, 1970b ; Jotterand, 1972), Zambie (Castiglia et al., 2002), et dans une population de M. triton du Congo (Matthey,

137 M. Minutoides de a. Kuruman, femelle

X 1

Y 1 Sonde Rb (X.1) de M. minutoides M. Minutoides de b. c. Kuruman, femelle

Y 1 X Sonde Rb(Y.1) 1 de M. minutoides

M. Minutoides de d. M. Minutoides de Caledon, e. Caledon, mâle femelle sans WART

sonde Y de souris sonde X de souris domestique domestique

M. Minutoides de Caledon, f. g. femelle avec WART 16

sonde X de souris domestique

Figure 24 : Hybridation in situ des sondes Rb(X.1) (a) et Rb(Y.1) (b) sur des métaphases de femelle M. minutoides de Kuruman ; (c) coloration au DAPI de la métaphase b. FISH de la sonde Y de souris sur le caryotype d’un mâle M. minutoides de Caledon (d), et de la sonde X de souris sur une femelle M. minutoides de Caledon sans WART (e) et avec WART (f) ; (g) coloration au DAPI de la métaphase e.

138 3ème partie : Déterminisme du sexe

1967). Il est important de noter que dans tous ces cas, le chromosome Xd n’était observé que chez des femelles hétérozygotes XXd, ces individus représentant 20 à 60% des femelles selon les populations. Xd n’a jamais était observé chez un mâle ni même une femelle homozygote pour cette mutation. A la lumière de nouveaux résultats, nous revenons aujourd’hui sur notre interprétation. L’étude cytologique en banding-G et -C d’un mâle capturé dans la même localité de Kuruman a permis de révéler une paire de chromosomes sexuels indistinguable de celle de la femelle. Afin de confirmer la nature de ce bras chromosomique (chromosome X partiellement délété? chromosome Y ? ou bloc de séquences répétées ?), nous avons donc effectué une analyse de ZOO-FISH (méthode décrite dans Veyrunes et al., soumis) en hybridant les sondes chromosomiques de M. minutoides, Rb(X.1) et Rb(Y.1), sur le caryotype de la femelle de Kuruman (Figure 24a-c). L’hybridation de la sonde Rb(X.1) révèle deux signaux: sur la totalité du chromosome Rb(X.1) et sur le bras long du chromosome Rb(Xd.1) correspondant au chromosome 1 (Figure 24a). Le contenu génétique du bras Xd n’a donc pas d’homologie avec du matériel X. En revanche, la sonde Rb(Y.1) hybride le bras long du chromosome

Rb(X.1) correspondant au chromosome 1 et la totalité du chromosome Rb(Xd.1) (Figure 24b).

Le bras chromosomique Xd correspond donc en réalité à un chromosome Y. Ce spécimen de Kuruman est donc de sexe femelle avec un caryotype de type mâle XY. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que toutes les femelles précédemment décrites comme étant XXd dans différentes populations de différentes espèces de Nannomys (Matthey, 1966a, 1967, 1970b ; Jotterand, 1972 ; Castiglia et al., 2002) correspondent en fait à des femelles XY. Le système décrit est équivalent à celui rencontré dans le genre Akodon (Sigmodontinae) chez lequel plusieurs espèces possèdent indépendamment une proportion de femelles XY parmi des femelles XX (Bianchi et al., 1993 ; Hoekstra & Edwards, 2000 ; Bianchi, 2002). Ce système sexuel polymorphe stable où les femelles ont un caryotype XX ou XY est également connu de deux autres espèces de rongeurs, Myopus schisticolor (Fredga et al., 1976 ; Fredga, 1983, 1988 ; Gileva & Fedorov, 1991 ; Liu et al., 1998 ; Marchal et al., 2003) et Dicrostonyx torquatus (Gileva, 1983 ; Fredga, 1983, 1988 ; Marchal et al., 2003).

b) Femelles XO, Mâles XY L’étude chromosomique (Veyrunes et al., 2004) a révélé un autre caryotype particulier, celui de M. minutoides de Caledon (Afrique du sud). Les deux mâles analysés présentaient un bras chromosomique minuscule, assigné au chromosome Y. Toutefois,

139

Stellenbosch Caledon Kuruman

de de de

mattheyi minutoides minutoides minutoides

M. M. M. M. marqueur de taille

Figure 25: PCR d’un fragment de 500 pb du gène Sry d’après les amorces définies par Lundriganet al. (2002). Un signal est noté chez tous les mâles ainsi que chez la femelle XY de M. minutoides de Kuruman.

140 3ème partie : Déterminisme du sexe contrairement aux Y des autres espèces, il ne réagissait pas positivement au banding-C (Veyrunes et al., 2004). Ainsi, sa taille extrêmement réduite et sa structure non- hétérochromatique nous ont amené à identifier la nature de ce fragment par ZOO-FISH, et par-là même attester de la présence ou absence d’un chromosome Y. L’hybridation in situ de la sonde chromosomique Y de souris domestique a confirmé la présence d’un Y puisque le fragment considéré montre un signal non-ambigu (Figure 24d). En revanche, contre toute attente, la surprise est venue de l’étude chromosomique d’individus femelles capturés lors de la seconde mission de piégeage. En effet, les femelles possèdent un NF = 35 au lieu de 36. L’analyse en banding-G a permis de révéler chez les cinq femelles la présence d’un seul chromosome X, résultat confirmé par l’hybridation in situ de la sonde X de la souris domestique (Figure 24e-g). Au cours de l’évolution, le second chromosome X a donc été perdu, les femelles ont un caryotype XO, tandis que les mâles sont XY. Ce système sexuel XO / XY particulier n’est connu que de trois autres espèces de mammifères : Choloepus hoffmanni (Corin-Frédéric, 1969), Acomys selousi (Matthey, 1965) et Microtus oregoni (Fredga, 1983, 1988 ; Charlesworth & Dempsey, 2001 ; Marchal et al., 2003).

B. Recherche du gène Sry dans le génome.

Le sexe des mammifères placentaires et marsupiaux est contrôlé par un seul gène porté par le chromosome Y, Sry. Son activation pré-natale initie le développement des testicules (Sinclair et al., 1990 ; Koopman et al., 1991). Sry est un exon unique en copie unique (sauf exceptions ; Bianchi et al., 1993 ; Nagamine, 1994 ; Lundrigan & Tucker, 1997 ; Bullejos et al., 1997) de la famille génique SOX. Il code pour une protéine ayant un domaine HMG (High-Mobility Group) permettant de reconnaître et de se fixer sur la séquence d’ADN cible. Ce domaine HMG (ou HMG box) est très conservé ; il est constitué de 79 acides aminés, et flanqué de queues N et C terminales de longueurs et compositions inversement très variables (e.g. Whitfield et al., 1993 ; Lovell-Badge & Hacker, 1995 ; O’Neill & O’Neill, 1999 ; Nagamine et al., 1999). L’importance et la fonction de ces régions terminales sont peu connues, la grande majorité des cas pathologiques de réversions du sexe chez l’homme et la souris étant dus à des mutations intervenant dans le domaine HMG (Hawkins, 1993 ; Lovell- Badge & Hacker, 1995 ; O’Neill & O’Neill, 1999 ; Vaiman & Pailhoux, 2000 ; Canning & Lovell-Badge, 2002).

141 L’existence de femelles porteuses d’un chromosome Y, nous a incité à rechercher la présence du gène Sry dans le génome, et vérifier s’il était présent qu’il soit fonctionnel ou non. De même, concernant le système sexuel XO / XY, compte tenu de la taille extrêmement réduite et de la nature non-hétérochromatique du fragment Y, il était indispensable de s’assurer de la fonctionnalité de ce dernier (et notamment du gène Sry). Dans le cas contraire, nous aurions à faire à une étape précoce évoluant vers un système de type XO / XO d‘ores et déjà mis en évidence chez une autre espèce de Nannomys, M. triton (Jotterand-Bellomo, 1988). La présence de Sry a ainsi été testée par PCR à partir de deux couples d’amorces définis sur plusieurs espèces de Mus dont le sous-genre Nannomys par Lundrigan et al. (2002). Ces amorces amplifient 500 pb correspondant à la totalité de la HMG box (237 pb) et 76 et 187 pb situées respectivement de part et d’autre de la HMG dans les queues hyper- variables N et C. Pour chacun des taxa, un mâle et une femelle ont été analysés : M. mattheyi, M. musculoides et M. minutoides de Stellenbosch, Kuruman et Caledon. Un signal positif a été détecté chez tous les individus mâles (y compris celui de Caledon), ainsi que chez la femelle de Kuruman, les autres femelles ayant servi de témoins négatifs (Figure 25). Tous les produits de PCR ont été séquencés. Les résultats soulèvent plusieurs points intéressants :

(i) La séquence Sry du mâle de Caledon ne contient pas de mutation nucléotidique ou d’indel (insertion/délétion) qui induisent des codons-stop lors de la transcription. Le gène Sry est donc a priori fonctionnel. Toutefois on ne peut exclure la possibilité que des mutations délétères soient apparues en dehors de la région HMG séquencée (par exemple dans les séquences du promoteur).

(ii) La séquence Sry de la femelle XY de Kuruman ne possède pas non plus de codon- stop ; elle est en outre identique à celle portée par le mâle de Kuruman. Ces résultats sont similaires à ceux décrits chez Akodon où mâles et femelles XY ont la même séquence Sry (Bianchi et al., 1993). Dans ces deux modèles, l’absence d’expression de ce gène chez les femelles XY peut avoir des causes multiples, telles que la présence de mutations délétères en dehors de la région considérée, l’expression déficiente d’un autre gène intervenant dans la cascade génique du déterminisme du sexe, l’expression d’un gène répresseur de Sry, etc… (pour plus de détails, voir chapitre suivant).

142 3ème partie : Déterminisme du sexe

(iii) Nagamine (1994) a démontré que le chromosome Y de certains Muridae et notamment du genre Mus portaient plusieurs copies du gène Sry, le maximum de copies ayant été identifié chez une Nannomys, M. minutoides : 13 copies. Cependant, les copies intra-spécimen sont toutes monomorphes (i.e. séquences nucléotidiques identiques ; Nagamine, 1994). Notre étude est en accord avec ces observations puisqu’un seul haplotype par individu a été détecté.

(iv) L’existence de plusieurs copies de Sry a été démontrée chez d’autres genres de Muridae africains (i.e. Arvicanthis, Lemniscomys, Rhabdomys, Mastomys ; Lundrigan & Tucker, 1997), ainsi que chez Akodon (Bianchi et al., 1993) et Microtus cabrerae (Bullejos et al., 1997, 1999). En outre, chez ce dernier des copies polymorphes de Sry ont également été localisées sur le chromosome X (Fernandez et al., 2002). Curieusement ces deux derniers genres comportent des espèces au déterminisme du sexe atypique, comme Nannomys.

C. Nouveaux systèmes de déterminisme du sexe : implications évolutives.

a) Système sexuel XX, XY / XY chez M. minutoides de Kuruman. Les réversions du sexe, femelle XY et plus rarement mâle XX sont des mutations délétères provoquant généralement une infertilité/stérilité qui ne sont pas rares et ont été identifiées chez de nombreuses espèces de mammifères, que ce soit chez l’homme (littérature médicale abondante sur ce sujet), ou chez les animaux domestiques et sauvages (revues dans Fredga, 1988 et Vaiman & Pailhoux, 2000). Dans tous ces cas, il s’agit de mutations pathologiques. En revanche, la présence en proportions importantes (20 à 60%) de femelles XY dans plusieurs populations de différentes espèces de Nannomys (dont M. minutoides de Kuruman) est tout à fait exceptionnelle et a seulement été identifiée dans trois autres genres de rongeurs. D’après la littérature, il existe des nuances entre les mécanismes de réversion du sexe chez ces rongeurs. En résumé, chez Myopus schisticolor, le mécanisme est dépendant d’un X* modifié (délétion partielle) qui, par un processus inconnu (Liu et al., 1998) induit le développement d’ovaires fonctionnels chez les individus X*Y (Fredga et al., 1976 ; Fredga, 1983, 1988). De

143 plus, grâce à une double non-disjonction lors de la méiose, les femelles X*Y ne produisent que des oocytes X* engendrant 100% de descendants femelles, et évitent ainsi la perte d’embryons YY (Fredga, 1988 ; Liu et al., 1998). De même, chez Dicrostonyx torquatus, la présence de femelles XY est également due à une mutation sur le X que l’on nomme par convention X*, mais qui est cette fois morphologiquement indistinguable du X classique (Gileva, 1983 ; Fredga, 1983, 1988). En outre, il n’y a pas de double non-disjonction méiotique ; Il en résulte ainsi la formation d’embryons YY non-viables. Enfin, dans le genre Akodon, les femelles XY sont la conséquence d’une déficience fonctionnelle du chromosome Y (Y*) et non d’un X* anormal, puisque les femelles XY* dérivent toutes de femelles XY* et non XX (Hoekstra & Edwards, 2000 ; Bianchi, 2002). Comme pour D. torquatus, les femelles XY* produisent des embryons YY* non-viables.

La mise en place d’un tel système implique normalement la perte d’1/4 des embryons ; toutefois ces coûts peuvent être réduits ou compensés (i) par la mise en place d’une distorsion méiotique (i.e. transmission préférentielle du X dans les gamètes femelles), (ii) par une plus forte capacité reproductive comme chez Akodon où les femelles XY ont des portées équivalentes aux femelles XX grâce à un taux d’ovulation plus important et une durée de vie reproductrice plus longue (Bianchi, 2002) ; (iii) ces coûts peuvent même être annulés par l’apparition d’un mécanisme de double non-disjonction méiotique systématique comme chez M. schisticolor (Fredga et al., 1976). Enfin, (iv) des pressions de sélection peuvent participer au maintien d’un tel système qui produit un sexe-ratio déséquilibré en faveur des femelles : chez M. schisticolor : femelles XX* et X*Y produisent respectivement 75 et 100% de descendants femelles ; chez D. torquatus : femelles XX* et X*Y engendrent respectivement 75 et 66% de femelles ; chez Akodon : les individus XY* produisent 66% de femelles. Au moins concernant les deux lemmings (Myopus et Dicrostonyx), il s’agit d’espèces grégaires fortement polygames qui peuvent parfois générer des explosions démographiques ; ne pourrait-on pas envisager alors la production d’excès de femelles comme une stratégie adaptative ? En outre, une mortalité hivernale plus élevée chez les femelles que chez les mâles a été observée chez M. schisticolor (Gileva & Fedorov, 1991). Cependant, il existe quelques colonies de D. torquatus où paradoxalement le biais du sexe-ratio est en faveur des mâles (Jarrell, 1995) ; Ces stratégies de sexe-ratio pourraient varier dans le temps en fonction du degré de consanguinité, et donc indirectement en fonction du moment par rapport aux phases d’explosion démographique (Gileva, 1998).

144 3ème partie : Déterminisme du sexe

A une échelle moléculaire, le(s) déterminisme(s) génétique(s) et/ou le(s) contexte(s) génomique(s) qui font que la présence du chromosome Y n’induit pas une masculinisation est(sont) encore très obscur(s). Nous l’avons vu, le développement du sexe mâle est un processus complexe qui fait intervenir une cascade d’activités géniques dont Sry est le précurseur. L’identité de ces gènes, la régulation de cet ensemble et dans certains cas leurs fonctions précises restent encore très mal connues, et ce malgré le nombre d’études sur le sujet (e.g. revues dans McElreavey et al., 1993 ; Lovell-Badge & Hacker, 1995 ; Jimenez et al., 1996 ; Werren & Beukeboom, 1998 ; Marshall Graves, 2000 ; Vaiman & Pailhoux, 2000 ; Canning & Lovell-Badge, 2002 ; Knower et al., 2003 ; Koopman, 2005 ; Haag & Doty, 2005). Le manque de connaissance dans ce domaine est de ce fait très limitant pour comprendre le déterminisme génétique des réversions de sexe. Nous connaissons aujourd’hui l’identité de plusieurs de ces gènes intervenant dans la cascade du déterminisme du sexe mâle, tels que WT1, SF-1, SOX-9 et DAX-1 ; nous savons aussi que des mutations intervenant sur l’un de ces gènes peuvent inhiber la cascade génique et entraîner l’arrêt de la différentiation sexuelle (e.g. Vaiman & Pailhoux, 2000 ; Canning & Lovell-Badge, 2002 ; Knower et al., 2003). De nombreux autres gènes restent encore à identifier. Ainsi, chez M. schisticolor, Liu et al. (1998) ont montré qu’une délétion de 1 Mb sur le chromosome X (Xp21-23) empêchait la différentiation des individus XY en mâles ; il y aurait donc dans cette partie du génome délétée un gène encore inconnu indispensable à la cascade du déterminisme du sexe mâle. Chez l’homme, de nombreux cas de réversion de sexe XY sont liés à une mutation dans le domaine HMG du gène Sry, mais il en existe aussi qui sont dus à des mutations sur le X et même sur des autosomes (pour une revue de la diversité des gènes impliqués voir Vaiman & Pailhoux, 2000). Enfin, d’autres auteurs ont proposé des modèles théoriques faisant intervenir d’éventuels gènes répresseurs. Le modèle qui a reçu le plus d’attentions est celui du « gène hypothétique Z » où Sry n’agirait pas directement, mais serait en fait un inhibiteur d’un gène « Z », lui même inhibiteur de la voie mâle (McElreavey et al., 1993). Ainsi, si Sry est absent où s’il n’agit pas sur sa cible, alors celle-ci inhibe le développement mâle et l’individu se féminise. Un candidat possible au gène « Z » a été identifié, il s’agirait de Sox3 (Marshall Graves, 1998).

A terme, pour comprendre la mise en place du système sexuel XX, XY / XY chez les Nannomys, il apparaît donc indispensable d’appréhender les mécanismes génétiques sous- jacents par des analyses moléculaires plus fines et notamment en étudiant l’expression de différents gènes susceptibles d’êtres impliqués dans le déterminisme du sexe.

145

Femelle (XO)

X 0

X a

Y `

Mâle (XY)

Figure 26: Formation des embryons de M. minutoides de Caledon.

146 3ème partie : Déterminisme du sexe b) Système sexuel XO / XY chez M. minutoides de Caledon. En l’absence de distorsion méiotique, la mise en place d’un tel système de déterminisme du sexe implique un énorme coût à la fécondation, puisque la moitié des embryons sont létaux (Figure 26). Par ailleurs, une distorsion méiotique permettant de réduire le coût associé par la transmission préférentielle d’un type de gamète ne peut être retenue dans ce cas-ci, car la formation des deux sexes nécessite l’implication pour moitié de chaque gamète produit par les deux sexes. Pourtant, au cours de l’évolution, un système sexuel XO / XY s’est mis en place indépendamment chez au moins deux autres espèces de mammifères (une troisième, Acomys selousi reste à confirmer, Matthey, 1965). Afin d’appréhender l’origine ou, tout au moins, le processus qui aboutit à un tel système et de mieux comprendre son maintien qui s’oppose aux lois de la sélection naturelle, il est alors utile de comparer notre modèle aux deux autres espèces qui bénéficient d’ores et déjà de plusieurs études.

Le déterminisme du sexe XO / XY du campagnol Microtus oregoni est étudié depuis longtemps (Ohno et al., 1963, 1966 ; Fredga, 1983 ; Charlesworth & Dempsey, 2001). Mâles et femelles sont en fait des individus « mosaïques gonosomaux », ce qui signifie qu’au sein d’un individu, les cellules somatiques et germinales ne possèdent pas le même caryotype. Les femelles sont XO mais XX dans la lignée germinale, les mâles étant XY mais avec des cellules germinales YO. Dans la lignée germinale femelle, lors de la division cellulaire I de la méiose, une non-disjonction se produit systématiquement de telle sorte que deux types d’ovogonies sont produites XX et OO, mais seules les premières survivent produisant à la fin de la méiose un seul type de gamète, X. De même, dans la lignée germinale du mâle, une non- disjonction produit des cellules XXY et YO, parmi lesquelles uniquement les YO se différencient en spermatocytes produisant deux types de gamètes Y et O, qui fécondés à un ovule X produisent respectivement des mâles XY et des femelles XO dans des proportions 1 : 1. Ainsi, dans ce système propre à M. oregoni, il n’y a plus de perte d’embryons.

Le déterminisme du sexe XO / XY du paresseux à deux doigts Choloepus hoffmanni a, quant à lui, été peu étudié (Corin-Frédéric, 1969). Cet auteur émet l’hypothèse que le phénomène d’inactivation du X serait en fait remplacé par l’élimination pure et simple d’un des X (voir aussi Hayman & Martin, 1965 ; Johnston et al., 2002). Il s’agit donc d’un processus normal qui aurait atteint ici une forme extrême. Lors des divisions cellulaires, le X

147 inactivé a une duplication plus tardive que le reste du génome ; nous pouvons donc envisager une accentuation de ce retard, retard devenu tel que la synthèse de l’ADN ne serait pas achevée quand débute la mitose subséquente, ce qui entraînerait l’élimination de ce chromosome. Les cellules germinales, n’étant pas concernées par le processus d’inactivation, conserveraient leurs deux chromosomes X. Dès lors, la gamétogenèse femelle s’effectuerait normalement et la fécondation produirait les combinaisons normales XX et XY. Selon cette hypothèse, les femelles Choloepus hoffmanni seraient, elles aussi, des « mosaïques gonosomales ».

Le scénario proposé pour le paresseux est donc proche de celui décrit chez M. oregoni, faisant intervenir une hétérogénéité du caryotype entre les lignées cellulaires somatiques et germinales. Il serait donc utile d’étudier chez les femelles Mus minutoides de Caledon le processus méiotique pour déterminer la présence d’un ou de deux chromosomes X. Le côté séduisant de l’hypothèse de Corin-Frédéric (1969) est (i) qu’elle ne fait pas intervenir d’événements de non-disjonctions devenus systématiques dans les deux sexes contrairement à M. oregoni, et de surcroît (ii) le mécanisme de ce dernier n’est pas applicable à M. minutoides car chez cette espèce le X et Y sont fusionnés à des autosomes et de ce fait les événements de non-disjonctions génèreraient automatiquement des monosomies autosomales (i.e. aneuploïdie). Cependant, le mécanisme de Choloepus n’est pas non plus entièrement satisfaisant puisque la présence de la fusion X-autosome pose le problème de l’élimination du X sans affecter l’autosome auquel il est fusionné. Même si le mécanisme est semble-t-il plus complexe que chez C. hoffmanni ou M. oregoni, nous devrions toutefois nous attendre à ce que M. minutoides de Caledon ait acquis un système équivalent, où les deux X persistent dans la lignée germinale femelle. En effet, un tel scénario est le plus avantageux, puisque non seulement les coûts à la reproduction sont annulés (pas de perte d’embryons), mais également le chromosome X peut continuer à recombiner avec son homologue pendant la méiose préservant ainsi son intégrité. Dans le cas inverse, le chromosome X serait en copie unique chez la femelle comme chez le mâle, l’arrêt de la recombinaison pourrait entraîner alors sa dégradation progressive à l’instar du chromosome Y (Charlesworth & Charlesworth, 2000 ; Marshall-Graves, 2002a). Des études supplémentaires sont donc requises afin d’appréhender le système XO / XY de la population de Caledon de M. minutoides.

148 3ème partie : Déterminisme du sexe c) Implications évolutives Notre échantillonnage, somme toute restreint, a cependant révélé pas moins de deux nouveaux déterminismes du sexe atypiques dans deux populations de M. minutoides d’Afrique du Sud : XX, XY / XY à Kuruman et XO / XY à Caledon. Ces systèmes sexuels étaient jusqu’alors inconnus au sein des Nannomys, mais d’après la littérature, nous pouvons réinterpréter d’anciennes données et étendre la présence de femelles XY à d’autres populations de M. musculoides/minutoides et M. triton (Matthey, 1967, 1970b ; Jotterand, 1972 ; Castiglia et al., 2002). Enfin, il est important de rappeler que Jotterand-Bellomo (1988) a rapporté le système extraordinaire XO / XO dans une population de M. triton du Burundi. Ainsi, il existe au moins trois systèmes sexuels différents chez M. minutoides (XX/XY - XO/XY - XX, XY/XY) et M. triton (XX/XY - XO/XO - XX, XY/XY).

Au sein des Nannomys, il est surprenant de constater que tous ces nouveaux déterminismes du sexe sont restreints à quelques populations isolées (parfois même d’espèces différentes) et qu’ils ne sont pas fixés à l’ensemble des individus d’une espèce. Ce patron de distribution peut être lié à l’effet délétère intrinsèque de ce genre de mutation qui de ce fait est un obstacle à sa fixation au sein de toute une espèce et reste confiné à des dèmes isolés soumis à une forte dérive génétique. En effet, la formation de nouveaux systèmes est un événement rare très délétère qui bouleverse probablement toute l’organisation du génome. Nous pouvons le voir comme une révolution génomique. Des conditions écologiques particulières, notamment des tailles efficaces de populations très petites sont alors nécessaires pour fixer par dérive un tel événement délétère. D’ailleurs, plusieurs des espèces aux déterminismes du sexe atypiques ont des aires de distribution restreintes, telles que Acomys selousi, Akodon kofordi, A. torques et plus particulièrement Tokudaia osimensis, espèce endémique d’une minuscule île de l’archipel de Ryukyu au Japon où seulement quelques centaines d’individus persistent (Sutou et al., 2001 ; Arakawa et al., 2002). Cependant, à l’inverse, d’autres ont aujourd’hui des répartitions vastes : Akodon azarae, Ellobius lutescens, Choloepus hoffmanni, Myopus schisticolor, mais il est probable que les nouveaux déterminismes du sexe soient apparus et se soient fixés lors de phases drastiques de goulot démographique survenus au cours de l’évolution.

De plus, à l’instar du genre Akodon chez lequel Hoekstra & Edwards (2000) ont montré que la présence de femelles XY dans plusieurs espèces était liée à des événements

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a. Kenya

Nairobi, Kenya

Kingu Pira, Tanzanie Rb(X.1) Kuruman, Afrique Sud Rb(Y.1) Mus

Caledon, Afrique Sud minutoides

Stellenbosch, Afrique Sud Gbetaya, Guinée

Bantou, Guinée

Bamako, Mali Mus Samaya, Mali musculoides Djoliba, Mali Rb(X.7)

b. XX / XY XX / XY Y XY / XY XO / XY inconnu 1 2 XX XX XY XO

` ?

XY XY1Y2 XY XY

Figure 27: a: Figure modifiée d’après Veyrunes et al. (2005) ; Zoom du clade TR d’après la phylogénie moléculaire reconstruite par maximum de vraisemblance à partir des séquences du gè ne cytochrome b. Les individus sont désignés par leur localité et pays de capture. Datation moléculaire estimée par méthode bayésienne: = 1.6MA, = 0.9MA. Les différentes hachures des branches terminales se réfèrent aux systèmes sexuels représentés en b, les barres bleues indiquent le chromosome X, les barres rouges, le chromosome Y.

150 3ème partie : Déterminisme du sexe indépendants, les apparitions multiples de systèmes sexuels atypiques suggèrent une certaine prédisposition du génome de Nannomys à tolérer de tels bouleversements. A noter chez l’espèce proche M. musculus, alors que toutes les monosomies et trisomies autosomales sont létales, les femelles XO, XY et les mâles XYY, XYYY sont viables et parfois même fertiles (e.g. Turner et al., 2000 ; Rodriguez & Burgoyne, 2001 ; Burgoyne et al., 2002).

Quels que soient les forces et processus permettant le maintien de ces systèmes sexuels délétères, ces derniers ont donc pour corollaire un isolement reproductif conséquent (King, 1993). Ainsi, ces changements de déterminisme du sexe pourraient générer de rapides et multiples événements de spéciation chez les Nannomys. En effet, nous pouvons supposer que la population M. minutoides de Caledon, XO / XY, soit isolée reproductivement des autres populations périphériques XX / XY. M. minutoides ainsi que M. triton sont donc à considérer comme des complexes d’espèces cryptiques.

Cependant, ne s’agirait-il pas d’événements de spéciation « éphémères » menant à des événements d’extinction rapides ? Bien que le déterminisme du sexe XX / XY soit extrêmement conservé au sein des mammifères, quelques nouveaux variants ont pu apparaître et se fixer au cours de l’évolution. Ceci démontre que les contraintes évolutives ne sont pas le caractère limitant. Comment alors concevoir une telle homogénéité ? Dans tous les cas recensés, ces nouveaux variants ne concernent qu’une seule espèce, y compris chez Akodon et Nannomys où chaque apparition correspond à un événement indépendant (Hoekstra & Edwards, 2000 ; cette thèse). Il n’y a donc pas de grande lignée ou de clade de mammifères avec un déterminisme du sexe singulier plésiomorphe (caractère dérivé partagé). Ces espèces représentent alors peut-être des culs de sac évolutifs voués à s’éteindre étant sélectivement désavantagées, moins performantes que les espèces XX / XY.

Les changements de déterminisme du sexe chez les Nannomys sont replacés dans le cadre phylogénétique et temporel obtenus précédemment (Figure 27). Il apparaît ainsi que les populations de Kuruman et Caledon de M. minutoides ne sont pas monophylétiques, mais sont toutefois proches phylogénétiquement. En outre, ces nouveaux déterminismes du sexe se sont mis en place très récemment (moins de 0.9 MA). La date de divergence entre les populations de Stellenbosch et Caledon n’a pas été estimée, mais est de l’ordre probablement de 100 à 200 mille ans uniquement !! Ceci correspondrait à un des événements de changement de

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Perte du Y DEGRADATION Y

A B C D 10 µm

Figure 28: Dégénérescence du chromosome Y des Nannomys. Taille du chromosome Y indiquée par une barre verticale. A: Mus mattheyi, B: M. minutoides (population de Kuruman), C: M. minutoides (population de Caledon), D: M. triton du Burundi (Jotterand- Bellomo, 1988).

152 3ème partie : Déterminisme du sexe déterminisme du sexe et par-là même de spéciation parmi les plus récents chez les mammifères. Les systèmes XX, XY / XY et XO / XY identifiés au sein de M. minutoides ont donc vraisemblablement une origine différente. Toutefois, le fait que dans la même lignée il existe des femelles XY et XO pourraient suggérer que ces deux systèmes sexuels aient un processus d’apparition commun. En effet, la formation de femelles XY peut être envisagée comme une étape évolutive précédant la formation de femelles XO. Imaginons une copie Y* déficiente qui n’entraîne pas le développement du sexe mâle ; ce segment de génome mâle-spécifique devient alors femelle-spécifique (ceci constituerait la 1ère étape avec mise en place d’un système XX, XY / XY). Une fois dans le génome femelle, Y* est équivalent à de l’ADN non- codant, il est alors éliminé (2nde étape : mise en place d’un système XO / XY).

Par ailleurs, tous les changements de déterminisme du sexe identifiés jusqu’à présent sont strictement associés à des translocations sexe-autosome. En effet, seules les espèces (ou complexes d’espèces) M. minutoides, M. triton et peut-être M. musculoides* appartenant toutes les trois au groupe TR, possèdent des populations avec des déterminismes du sexe atypiques, alors qu’aucune espèce ayant des chromosomes sexuels acrocentriques (type PR) ne présentent de modification du système de déterminisme sexuel. Y-a-t-il alors un lien de cause à effet entre ces deux événements rares au sein du même génome ou bien soulignent-ils la plasticité génomique des chromosomes sexuels de cette lignée de Nannomys ? Des hypothèses seront présentées dans le chapitre suivant.

De plus, le chromosome Y présente une formidable variation de taille, avec notamment une diminution importante chez les taxa les plus récents, jusqu’à la disparition totale chez M. triton du Burundi (Figure 28). Cette diminution de taille suggère une dégénérescence rapide du chromosome Y chez les Nannomys (e.g. Marshall Graves, 2002a), ce qui signifie une perte de matériel génétique et notamment de gènes fonctionnels. Les gènes portés par le chromosome Y interviennent essentiellement dans le déterminisme du sexe et la spermatogénèse (e.g. Marshall Graves, 2000). Ainsi, la perte de tels gènes entraînent irrémédiablement une perturbation et donc une réorganisation du mécanisme de déterminisme du sexe, qui pourrait expliquer la diversité des systèmes sexuels rencontrée.

* Note : Plusieurs auteurs ont identifié des femelles XY dans des populations assignées au complexe M. minutoides/musculoides ; d’après leur distribution et leur caryotype (au moins pour celles de Zambie ; Castiglia et al., 2002), il s’agirait en fait de M. minutoides. Données à confirmer.

153

Tableau 3: Liste des espèces de mammifères ayant au moins deux des caractères chromosomiques rares qui impliquent les chromosomes sexuels.

Modif. Transloc. X Y système sex. X-autosome asynaptiques

Choloepus hoffmanni [ [ Myopus schisticolor [ [ Dicrostonyx torquatus [ [ ? Microtus thomasi [ [

M. mandarinus [ [ ? [* [ M. cabrerae [ [ Gerbillus sp. [ [ [ Nannomys sp. * = seules deux femelles XY fertiles ont été décrites par Burgos et al. (1988), depuis aucun autre cas n’a été rapporté, en revanche toutes les femelles possèdent des copies de Sry sur le chromosome X (Bullejos et al., 1997)

154 4ème partie : Génome & Chromosomes sexuels

4ème partie : GENOME DE NANNOMYS : UN HOTSPOT

POUR LES REARRANGEMENTS RARES IMPLIQUANT LES

CHROMOSOMES SEXUELS.

Les Nannomys ont donc une évolution chromosomique intense qui touche non seulement les autosomes mais fait plus rare, également les chromosomes sexuels. D’après la littérature (voir Introduction), Ø Seuls cinq genres d’Euthériens ont des chromosomes sexuels asynaptiques : Psammomys, Microtus, Myopus, Gerbillus et Nannomys (sous-genre). Ø Uniquement une vingtaine de genres de mammifères possèdent des translocations sexe- autosome, dont Nannomys, qui en outre en présente la plus grande diversité. Ø Seuls neuf genres de mammifères (pour 21 espèces) possèdent des déterminismes du sexe s’écartant de XX / XY : Choloepus, Akodon, Myopus, Dicrostonyx, Microtus, Ellobius, Tokudaia, Acomys et Nannomys.

Les Nannomys sont uniques au sein des mammifères, puisqu’elles présentent une diversité extraordinaire de remaniements affectant les chromosomes sexuels, que ce soit perte du complexe synaptique, fixations de fusions Rb sexe-autosome, délétions de chromosomes sexuels et/ou modifications du déterminisme du sexe. La présence dans un même génome de ces trois types de remaniements parmi les plus rares car les plus délétères est tout à fait exceptionnelle et n’est probablement pas due au hasard. D’autant plus que d’autres lignées de mammifères sont aussi affectées pas plusieurs de ces remaniements (Tableau 3). Nous proposons alors quatre hypothèses pour expliquer en partie cette diversité des chromosomes sexuels en identifiant notamment les liens de causes à effets qui peuvent exister entre ces trois types d’événements. Ces liens potentiels sont résumés dans la figure 29.

1ère Hypothèse : La nature asynaptique des chromosomes sexuels peut favoriser la fixation de translocations sexe-autosome. L’association synaptique des chromosomes sexuels par la région homologue recombinante, la PAR, semble un pré-requis nécessaire pour assurer une ségrégation correcte

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1. Chromosomes sexuels asynaptiques Plasticité génomique Intrinsèque + 2. Translocations sexe-autosome Réponses physiologiques

3. Modifications du déterminisme du sexe

Figure 29: Représentation des liens de causes à effets qui peuvent exister entre les trois changements génomiques rares affectant les chromosomes sexuels.

156 4ème partie : Génome & Chromosomes sexuels des chromosomes X et Y à la méiose (Burgoyne, 1982). Pourtant au cours de l’évolution, cinq lignées d’Euthériens ont perdu indépendamment ce comportement, chez lesquelles les chromosomes X et Y ne forment pas de bivalent à la méiose. Parmi ces cinq lignées, trois d’entre-elles possèdent des représentants qui ont acquis des translocations sexe-autosome : Microtus, Gerbillus et Nannomys. Cette association récurrente XY asynaptiques – translocations sexe-autosome suggère que les conditions asynaptiques pourraient favoriser la fixation des translocations sexe-autosomes. En effet, ne pourrait-on voir les fusions X- autosome et Y-autosome comme des médiateurs assurant une bonne ségrégation méiotique du X et Y, puisque les autosomes homologues fusionnés continuent eux de s’apparier et ségrègent chacun vers un pôle de la cellule entraînant avec eux le chromosome X ou Y associé. Les chromosomes homologues fusionnés au X et au Y remplaceraient pour ainsi dire le rôle de la PAR des autres mammifères. Cependant, dans ces trois groupes, certaines espèces asynaptiques n’ont pas de translocations sexe-autosome et ne semblent pas pour autant avoir un taux d’aneuploïdie plus élevé, mais les comparaisons statistiques font défauts.

2ième Hypothèse : Les translocations sexe-autosome peuvent entraîner des perturbations et donc des modifications du déterminisme du sexe. D’après King (1993), les translocations sexe-autosome ont un impact direct sur les mécanismes de déterminisme du sexe. Ceci est semble-t-il conforté par les observations réalisées au cours de cette thèse. La phylogénie moléculaire (Veyrunes et al., 2005) a permis d’établir la séquence d’apparition des remaniements : les fusions Rb sexe-autosome ont précédé les changements de déterminisme du sexe (voir aussi Figure 27a). De plus, nous avons vu que la sélection de femelles avec un seul chromosome X (XO ou XY) peut être un moyen de s’abroger du phénomène d’inactivation du X et donc des problèmes inhérents à la propagation de l’inactivation sur la partie autosomale fusionnée ou inversement à la réactivation du chromosome X.

3ième Hypothèse : La dégénérescence et les délétions partielles ou totales de chromosomes sexuels peuvent favoriser l’apparition de translocations sexe-autosome. La dégénérescence du chromosome Y est un phénomène inexorable du fait de l’arrêt de la recombinaison sur une majeure partie du chromosome X et Y qui permet de préserver un cluster de gènes Y-spécifiques responsables du déterminisme du sexe (e.g. Charlesworth & Charlesworth, 2000 ; Marshall Graves, 1998, 2002, 2004). Le X quant à lui continue de recombiner avec son homologue chez la femelle, ainsi son contenu génétique est conservé

157 alors que sur le Y seule une poignée de gènes résistent (voir Introduction). A terme, les prédictions prévoient que le chromosome Y de l’homme va disparaître (Marshall Graves, 2002a) comme ce fut déjà le cas chez quatre mammifères Ellobius lutescens, E. tancrei, Tokudaia osimensis et M. triton, où même chez la drosophile (Carvalho & Clark, 2005 ; Marshall Graves, 2005). Le destin tragique du Y peut alors être évité ou du moins retardé par l’addition de matériel autosomal sur les chromosomes sexuels, comme ce fut le cas il y a 80- 130 MA chez les Euthériens (Waters et al., 2001b ; voir aussi Charlesworth et al., 2005). A noter également qu’une étude récente chez la drosophile D. pseudoobscura a montré que le vrai Y avait été entièrement remplacé par un autosome nommé Y2 dont l’homologue était fusionné au X (Carvalho & Clark, 2005 ; Marshall Graves, 2005 ; Charlesworth & Charlesworth, 2005). Ainsi, ne pourrait-on pas envisager que la dégénérescence et les délétions subies par les chromosomes sexuels favorisent l’apparition et la fixation des translocations sexe-autosome.

4ième Hypothèse : La présence simultanée des conditions asynaptiques + translocations sexe- autosome + modifications du déterminisme du sexe résulte d’une plasticité génomique très importante. Chez les mammifères, les remaniements affectant les chromosomes sexuels sont généralement associés à une forte baisse de al valeur sélective liée entre autres à la règle de Haldane (Turelli & Orr, 1995) et au fait qu’une modification survenue sur le X affecterait le processus d’inactivation (Ohno, 1967 ; Marshall Graves, 2002b). Pourtant la lignée des Nannomys (cette thèse) et à une échelle taxonomique plus vaste celle des Arvicolinae (revue dans Marchal et al., 2003) suggèrent qu’elles aient indépendamment acquis une propension à accumuler les réarrangements impliquant les chromosomes sexuels. Ceci peut être dû à une formidable plasticité génomique intrinsèque des chromosomes sexuels. Le cas rapporté de WART hétérozygote impliquant de surcroît l’unique chromosome X de M. minutoides de Caledon en est d’ailleurs une manifestation remarquable. Finalement, le paradigme selon lequel les chromosomes sexuels sont perçus comme le « Territoire Sacré » du génome, compartiment fragile, isolé, très conservé à l’abri des affres des mutations est peut être à reconsidérer. En effet, des études récentes ont montré que les chromosomes sexuels possédaient une certaine plasticité qui suggère que les mutations ne soient pas forcément si délétères. Ainsi, Canning & Lovell-Badge (2002) ont montré que le gène Sox9 pouvait initier un développement mâle et ce en l’absence de Sry. Concernant l’inactivation génique du X, Carrel & Willard (2005) ont révélé un degré d’hétérogénéité

158 4ème partie : Génome & Chromosomes sexuels largement insoupçonnée, puisque 15% des gènes du X échappent systématiquement à l’inactivation, mais plus remarquable encore, plus de 10% des autres gènes sont inactivés ou non selon les échantillons et sont donc aléatoirement exprimés en une ou deux doses. Ces patrons d’expression variables suggèrent que les effets néfastes des translocations sexe- autosome sur le processus d’inactivation du X et donc d’expression génique sont peut-être à nuancer. Enfin, nous l’avons vu, alors que toutes les monosomies et trisomies autosomales sont létales chez la souris, les femelles XO, XY et les mâles XYY, XYYY sont viables et parfois même fertiles (e.g. Turner et al., 2000 ; Rodriguez & Burgoyne, 2001 ; Burgoyne et al., 2002). Il apparaît ainsi que le génome des chromosomes sexuels subit de nombreux remaniements chromosomiques ou génétiques et ont une résilience pour certains plus importante que les autosomes. Les chromosomes sexuels ne sont donc pas aussi « figés » que prévu, malgré un conservatisme important (i.e. X).

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160 5ème partie : Conclusion

5ème partie : CONCLUSION.

Les souris naines africaines ou Nannomys sont un groupe très peu étudié, dont la systématique reste encore floue et dont les principales analyses cytogénétiques datent des travaux de R. Matthey en collaboration avec F. Petter et M. Jotterand dans les années 60’. Avec les moyens techniques de l’époque, ils avaient su montrer l’intérêt de ce groupe pour l’étude de l’évolution chromosomique et notamment des chromosomes sexuels. Pourtant, ces recherches sont restées longtemps sans lendemain.

Au terme de cette thèse, il apparaît que l’option d’associer approches cytogénétiques (classique et moléculaire) et phylogénétiques (moléculaire et chromosomique) s’est révélée particulièrement propice à l’étude de l’histoire évolutive et de l’évolution chromosomique non seulement des souris naines africaines Nannomys, mais également de l’ensemble du genre Mus. Ainsi, ce travail illustre l’intérêt de considérer les chromosomes comme des marqueurs génétiques performants pour élucider des phylogénies qui ne peuvent être résolues par les marqueurs moléculaires classiques. Inversement, les phylogénies moléculaires sont essentielles et apportent un éclairage riche d’enseignements pour comprendre l’évolution chromosomique.

A l’instar des précédentes études phylogénétiques sur le genre Mus, l’augmentation de l’échantillonnage intra-Nannomys (afin de se soustraire au phénomène d’attraction des longues banches) et l’addition de nouvelles séquences d’ADN nucléaire (pour augmenter le signal phylogénétique) ne nous ont pas permis de résoudre le conflit phylogénétique depuis longtemps débattu des relations de parenté entre les quatre sous-genres de Mus (Article 1 : Chevret et al., 2005). Nous avons alors réalisé une phylogénie chromosomique (phylogénomique) en utilisant les données d’homologie issues du ZOO-FISH. Cette étude a permis d’offrir ainsi pour la première fois une topologie très robuste des relations de parenté entre les quatre sous-genres de Mus, chaque nœud étant soutenu par 5-7 remaniements chromosomiques considérés comme rares (Article 2 : Veyrunes et al., soumis). En outre, cette étude met en exergue une évolution chromosomique intense lors des événements de

161 cladogénèse, qui de surcroît fait intervenir majoritairement des remaniements impliquant l’apparition de nouveaux centromères (« néocentromérisation »). Cette étude a également mis en notre possession les homologies du génome de Nannomys avec celui de Mus musculus qui constitue le quatrième sous-genre (Veyrunes et al., soumis). Il a été établi qu’il existait une correspondance de près de 95% entre les cartes génomiques comparatives inférées à partir de Chromosome Painting vs. Gene Mapping (e.g. O’Brien et al., 1999 ; Cavagna et al., 2000 ; Wienberg, 2004). Il s’agit donc là d’un moyen économique d’extrapoler la carte génomique très bien documentée de la souris domestique (Waterston et al., 2002) à celle des Nannomys pour laquelle nous ne possédions pas de données moléculaires. Ces résultats seront des données de bases indispensables pour appréhender les mécanismes génétiques pouvant intervenir dans les changements de déterminisme du sexe (perte/acquisition/ translocation de gènes) et/ou les formations de translocations sexe-autosome (Charlesworth & Charlesworth, 1980).

L’étude cytogénétique entreprise a révélé (et confirmé) une incroyable diversité chromosomique dans le sous-genre Nannomys qui contraste avec la morphologie très conservée des différentes espèces (Article 3 : Veyrunes et al., 2004). Cette diversité s’est mise en place essentiellement par fixation de fusions Rb ; la comparaison des caryotypes suggère l’existence de plusieurs complexes d’espèces cryptiques, et donc une diversité spécifique largement sous-estimée. En parallèle, une étude de phylogénie moléculaire a été réalisée à partir des mêmes individus précédemment caryotypés (Article 4 : Veyrunes et al., 2005). La phylogénie obtenue a permis, entre autres, de donner un autre estimateur de la biodiversité qu’il est intéressant de comparer à la diversité inférée par les outils morphologiques et cytogénétiques, et de confronter les données moléculaires et chromosomiques. Ainsi, les remaniements chromosomiques apparaissent comme de bons critères diagnostics pour distinguer les différentes espèces, et la plupart de nos hypothèses basées sur l’étude des caryotypes ont été validées. Par ailleurs, la connaissance des aires de distribution spécifiques a été grandement affinée. Mais surtout cette étude offre un cadre phylogénétique et temporel (datations moléculaires) indispensables à l’interprétation évolutive de la différenciation chromosomique chez les Nannomys permettant d’amorcer une réflexion sur les processus chromosomiques et génomiques associés aux événements de cladogénèse. A court terme, il serait évidemment utile d’intégrer dans nos études de nouveaux taxa, dont M. oubanguii (translocations sexe-autosome) ou M. triton du Burundi (XO/XO). L’échantillonnage devrait être également complété notamment en Afrique du Sud pour réaliser une étude de

162 5ème partie : Conclusion phylogéographie du complexe M. minutoides (lignées à 2n = 18 et 34) dans cette région, en y intégrant les données caryologiques. Outre une meilleure estimation de la diversité chromosomique et spécifique, une telle étude aurait pour but de nous renseigner sur la dynamique démographique, les éventuels événements d’introgression entre les deux lignées, et les processus de colonisation et de diversification. Dans ce contexte, les facteurs environnementaux ou intrinsèques (e.g. formation de WARTs, persistance des télomères après une fusion Rb) à l’origine de cette diversité pourraient être identifiés, et permettraient de préciser les scénarios évolutifs ; ces derniers seraient ensuite replacés dans un cadre plus conceptuel de l’évolution chromosomique.

Plus étonnant encore est le polymorphisme découvert associé aux chromosomes sexuels. Alors que les chromosomes X et Y correspondent à la partie du génome la plus conservée au sein des mammifères, ils présentent ici une diversité unique, jusque là insoupçonnée, survenue à la suite de multiples fusions Rb sexe-autosome et de différentes modifications du système de déterminisme du sexe (Veyrunes et al., 2004 ; cette thèse). A tel point que les Nannomys représentent actuellement la lignée de mammifères ayant la plus grande diversité de translocations sexe-autosome et aussi de systèmes sexuels atypiques (XX, XY/XY - XO/XY - XO/XO). D’ores et déjà, la diversité des systèmes sexuels rencontrée dans un seul clade est tout aussi spectaculaire que celle observée chez l’ensemble des mammifères, sinon davantage puisqu’elle est apparue rapidement en quelques millions d’années et parfois seulement 100-200 mille ans (Veyrunes et al., 2005). Par conséquent, les Nannomys apparaissent comme le modèle biologique le plus pertinent pour l’étude de la mise en place de nouveaux mécanismes de déterminisme du sexe, de l’origine de leur plasticité et de leurs conséquences à l’échelle du génome et de l’espèce. J’ai ainsi mis en évidence une diversité exceptionnelle des systèmes sexuels ; à présent, il est primordial de s’intéresser aux processus qui génèrent une telle diversité, en étudiant les gènes eux-mêmes impliqués dans le déterminisme du sexe. En particulier, une approche comparative d’espèces-sœurs (intra- genre) permet la découverte et l’interprétation de modifications des chromosomes sexuels à petites échelles évolutives, ce que ne permet pas les comparaisons entre les trois sous-classes de mammifères (placentaires, marsupiaux et monotrèmes). Ces processus ainsi mis en évidence chez les Nannomys peuvent être ensuite raisonnablement extrapolés à l’ensemble des mammifères.

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III. REFERENCES

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166 Références

III. REFERENCES

Adler ID, Johanisson R, and Winking H. 1989. The influence of the Robertsonian translocation Rb(X.2)2Ad on anaphase I non-disjunction in male laboratory mice. Genet. Res. 53: 77-86. Andersson AC, Narain Y, Tegelström H, and Fredga K. 2004. No apparent reduction of gene flow in a hybrid zone between the West and North European karyotypic groups of the common shrew, Sorex araneus. Mol. Ecol. 13: 1205-1215. Aniskin VM, Lavrenchenko LA, Varshavskii AA, and Milishnikov AN. 1998. Karyotypes and cytogenetic differentition of two African mouse species of genus Mus (Rodentia, Muridae). Russian J. Genet. 34: 80-85. Arakawa Y, Nishida-Umehara C, Matsuda Y, Sutou S, and Suzuki H. 2002. X- chromosomal localization of mammalian Y-linked genes in two XO species of the Ryukyu spiny rat. Cytogenet. Genome Res. 99: 303-309. Arntzen L, Wadee AA, and Isaacson M. 1991. Immune response of two Mastomys sibling species to Yersinia pestis. Infections Immunity 59: 1966-1971. Ashley T. 2002. X-autosome translocations, meiotic synapsis, chromosome evolution and speciation. Cytogenet. Genome Res. 96: 33-39. Ashley T. 2005. Chromosome chains and platypus sex: kinky connections. BioEssays 27: 681-684. Ashley T, and Fredga K. 1994. The curious normality of the synaptic association between the sex chromosomes of two Arvicoline rodents Microtus oeconomus and Clethrionomys glareolus. Hereditas 120: 105-111. Ashley T, and Moses MJ. 1980. End association and segregation of the achiasmatic X and Y chromosomes of the sand rat, Psammomys obesus. Chromosoma 78: 203-210. Auffray JC, Orth A, Catalan J, Gonzales JP, Desmarais E, and Bonhomme F. 2003. Phylogenetic position and description of a new species of subgenus Mus (Rodentia, Mammalia) from Thailand. Zool. Script. 32: 119-127. Auffray JC, Vanlerberghe F, and Britton-Davidian J. 1990. The house mouse progression in Eurasia: a palaeontological and archaeozoological approach. Biol. J. Linnean Soc. 41: 13-25. Ayala FJ, and Coluzzi M. 2005. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 6535-6542. Bailey JA, Carrel L, Chakravarti A, and Eichler EE. 2000. Molecular evidence for a relationships between LINE-1 elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6634-6639. Baker RJ, Bass RA, and Johnson MA. 1979. Evolutionary implications of chromosomal homology in four genera of stenodermine bats (Phyllostomidae: chiroptera). Evolution 33: 220-226. Baker RJ, and Bickham JW. 1986. Speciation by monobrachial centric fusions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8245-8248.

167 Baker RJ, Bickham JW, and Arnold ML. 1985. Chromosomal evolution in Rhogeessa (Chiroptera: Vespertilionidae): possible speciation by centric fusions. Evolution 39: 233- 243. Baker RJ, and Hsu TC. 1970. Further studies on the sex-chromosome systems of the American leaf-nosed bats (Chiroptera, Phyllostomidae). Cytogenetics 9: 131-138. Baker RJ, Qumsiyeh MB, and Rautenbach IL. 1988. Evidence for eight tandem and five centric fusions in the evolution of the karyotype of Aethomys namaquensis (Rodentia: Muridae). Genetica 76: 161-169. Banaszek A, Fedyk S, Fiedorczuk U, Szalaj KA, and Chetnicki W. 2002. Meiotic studies of male common shrews (Sorex araneus L.) from a hybrid zone between chromosome races. Cytogenet. Cell Genet. 96: 40-44. Banaszek A, Fedyk S, Szalaj KA, and Chetnicki W. 2000. A comparison of spermatogenesis in homozygotes, simple Robertsonian heterozygotes and complex heterozygotes of the common shrew (Sorex araneus L.). Heredity 84: 570-577. Barton NH, and Charlesworth B. 1984. Genetic revolutions, founder effects, and speciation. Ann. Rev. Ecol. Syst. 15: 133-164. Barton NH, and Charlesworth B. 1998. Why sex and recombination? Science 281: 1986- 1990. Baumstark A, Akhverdyan M, Schulze A, Reisert I, Vogel W, and Just W. 2001. Exclusion of SOX9 as the testis determining factor in Ellobius lutescens: Evidence for another testis determining gene besides SRY and SOX9. Mol. Genet. Metab. 72: 61-66. Baumstark A, Hameister H, Hakhverdyan M, Baklousshinskaya I, and Just W. 2005. Characterization of Pirst1/Foxl2 in Ellobius lutescens and exclusion as sex-determining genes. Mamm. Genome 16: 281-289. Benzekri K, Britton-Davidian J, and Ganem G. 2002. Sexual preference between two chromosomal races of the house mouse (Rodentia, Muridae): a preliminary study comparing wild caught parents and laboratory-born offspring. Folia Zool. 51: 15-22. Berry RJ, and Scriven PN. 2005. The house mouse: a model and motor for evolutionary understanding. Biol. J. Linnean Soc. 84: 335-347. Bianchi NO. 2002. Akodon sex reversed females: the never ending story. Cytogenet. Genome Res. 96: 60-65. Bianchi NO, Bianchi MS, Bailliet G, and Delachapelle A. 1993. Characterization and Sequencing of the Sex-Determining Region-Y Gene (Sry) in Akodon (Cricetidae) Species With Sex Reversed Females. Chromosoma 102: 389-395. Bickham JW, and Baker RJ. 1979. Canalization model of chromosomal evolution. Bull. Carn. Mus. Nat. Hist. 13: 70-84. Blackburn EH .1991. Structure and function of telomeres. Nature 350: 569-573. Bodrug SE, Holden JJA, Ray PN, and Worton RG. 1991. Molecular analysis of X- autosome translocations in females with Duchenne muscular dystrophy. EMBO Journal 10: 3931-3939. Bonhomme F. 1986. Evolutionary relationships in the genus Mus. Curr. Top. Microbiol. Immun. 127: 19-34.

168 Références

Bonhomme F. 1992. Genetic diversity and evolution in the genus Mus. In: Goldowitz D, D. W and Winner RE, eds. Techniques for the genetic analysis of brain and behavior: Elsevier Sciences Publishers BV. 16. Bonhomme F, Catalan J, Gautun JC, Petter F, and Thaler L. 1982. Caractérisation biochimique de souris africaines référables au sous-genre Nannomys Peters, 1876. Mammalia 46: 110-113. Bonhomme F, Orth A, Cucchi T, Hadjisterkotis E, Vigne JD, and Auffray JC. 2004. A new species of wild mice on the Island of Cyprus. C. R. Acad. Sci. Biol. 327: 501-507. Bonvicino CR, Lemos B, and Seuanez N. 2001. Molecular phylogenetics of howler monkeys (Alouatta, Platyrrhini). A comparison with karyotypic data. Chromosoma 110: 241-246. Borodin PM, Sablina OV, and Rodionova MI. 1995. Pattern of X-Y chromosome pairing in microtine rodents. Hereditas 123: 17-23. Bourque G, Pevzner PA, and Tesler G. 2004. Reconstructing the genomic architecture of ancestral mammals: lessons from human, mouse, and rat genomes. Genome Res. 14: 507- 516. Boursot P, Auffray JC, Britton-Davidian J, and Bonhomme F. 1993. The evolution of house mice. Ann. Rev. Ecol. Syst. 24: 119-152. Bovie C, Holden ST, Schroer A, Smith E, Trump D, and Raymond FL. 2003. Neurofibromatosis 2 in a patient with a de novo balanced reciprocal translocation 46,X,t(X;22)(p11.2;q11.2), J. Med. Genet. 40: 682-684. Britton-Davidian J, Catalan J, Granjon L, and Duplantier JM. 1995. Chromosomal phylogeny and evolution in the genus Mastomys (Mammalia, Rodentia). J. Mammal. 76: 248-262. Britton-Davidian J, Catalan J, Ramalhinho MdG, Ganem G, Auffray JC, Capela R, Biscoito M, Searle J, and Mathias MdL. 2000. Rapid chromosomal evolution in island mice. Nature 403: 158. Britton-Davidian J, Catalan J, Ramalhinho MdG, Ganem G, Auffray JC, Nunes AC, Searle JB, and Mathias MdL. sous presse. Rapid chromosomal differentiation: analysis of chromosomal diversity and phylogeny in the Robertsonian races of the house mouse from the island of Madeira. Genet. Res. sous presse. Brown CJ, and Greally JM. 2003. A stain upon the silence: genes escaping X inactivation. Trends Genet. 19: 432-438. Bull JJ. 1983. Evolution of sex determining mechanisms. Menlo Park, California: Benjamin Cummings. Bullejos M, Sanchez A, Burgos M, Hera C, Jimenez R, and de la Guardia RD. 1997. Multiple, polymorphic copies of SRY in both males and females of the vole Microtus cabrerae. Cytogenet. Cell Genet. 79: 167-171. Bullejos M, Sanchez A, Burgos M, Jimenez R, and de la Guardia RD. 1999. Multiple mono- and polymorphic Y-linked copies of the SRY HMG-box in Microtidae. Cytogenet. Cell Genet. 86: 46-50. Burgos M, Jimenez R, and Diaz de la Guardia R. 1988a. XY females in Microtus cabrerae (Rodentia, Microtidae): a case of possibly Y-linked sex reversal. Cytogenet. Cell Genet. 49: 275-277.

169 Burgos M, Jimenez R, Olmos DM, and Diaz de la Guardia R. 1988b. Heterogeneous heterochromatin and size variation in the sex chromosomes of Microtus cabrerae. Cytogenet. Cell Genet. 47: 75-79. Burgoyne PS. 1982. Genetic homology and crossing-over in the X and Y chromosomes of mammals. Hum. Genet. 61: 85-90. Burgoyne PS, Mahadevaiah SK, Sutcliffe MJ, Palmer SJ. 1992. Fertility in mice requires X-Y pairing and a Y-chromosomal spermiogenesis mapping to the long arm. Cell 71: 391- 398. Burgoyne PS, Ojarikre OA, and Turner JMA. 2002. Evidence that postnatal growth retardation in XO mice is due to haploinsufficiency for a non-PAR gene. Cytogenet. Genome Res. 99: 252-256. Butlin RK. 2005. Recombination and speciation. Mol. Ecol. 14: 2621-2635. Canning CA, and Lovell-Badge R. 2002. Sry and sex determination: how lazy can it be? Trends Genet. 18: 111-113. Capanna E. 1982. Robertsonian numerical variation in animal speciation: Mus musculus, an emblematic model Mechanisms of speciation. New York: Alan R. Liss, Inc. 155-177. Capanna E, and Redi CA. 1995. Whole-arm reciprocal translocation (WART) between Robertsonian chromosomes: finding of a Robertsonian heterozygous mouse with karyotype derived through WARTs. Chromosome Res. 3: 135-137. Carnero A, Jimenez R, Burgos M, Sanchez A, de la Guardia RD. 1991. Achiasmatic sex- chromosomes in Pitymys duodecimcostatus – Mechanisms of association and segregation. Cytogenet. Cell Genet. 56: 78-81. Carrel L, and Willard HF. 2005. X-inactivation profile reveals extensive variability in X- linked gene expression in females. Nature 434: 400-404. Carvalho AB, and Clark AG. 2005. Y chromosome of D. pseudoobscura is not homologous to the ancestral Drosophila Y. Science 307: 108-110. Castiglia R, and Capanna E. 1999. Whole-arm reciprocal translocation (WART) in a feral population of mice. Chromosome Res. 7: 493-495. Castiglia R, and Capanna E. 2000. Contact zone between chromosomal races of Mus musculus domesticus. 2. Fertility and segregation in laboratory-reared and wild mice heterozygous for multiple Robertsonian rearrangements. Heredity 85: 147-156. Castiglia R, Gormung E, and Corti M. 2002. Cytogenetic analyses of chromosomal rearrangements in Mus minutoides/musculoides from North-West Zambia through mapping of the telomeric sequence (TTAGGG)n and banding techniques. Chromosome Res. 10: 399-406. Catalan J, Auffray J-C, Pellestor F, and Britton-Davidian J. 2000. Spontaneous occurrence of a Robertsonian fusion involving chromosome 19 by single whole-arm reciprocal translocation (WART) in wild-derived house mice. Chromosome Res. 8: 593- 601. Catzeflis F, and Denys C. 1992. The African Nannomys (Muridae): an early offshoot from the Mus lineage- Evidence from scnDNA hybridization experiments and compared morphology. Israel J. Zool. 38: 219-231.

170 Références

Cavagna P, Menotti A, and Stanyon R. 2000. Genomic homology of the domestic ferret with cats and humans. Mamm. Genome 11: 866-870. Charlesworth B. 1991. The evolution of sex chromosomes. Science 251: 1030-1033. Charlesworth B. 1996. the evolution of chromosomal sex determination and dosage compensation. Curr. Biol. 6: 149-162. Charlesworth B. 2002. Evolutionary genetics: the evil of abstinence from sex. Curr. Biol. 12: 56-59. Charlesworth B, and Charlesworth D. 2000. The degeneration of Y chromosomes. Phil. Trans. Royal Soc. London 355: 1563-1572. Charlesworth D, and Charlesworth B. 1980. Sex differences in fitness and selection for centric fusions between sex-chromosomes and autosomes. Genet. Res. 35: 205-214. Charlesworth D, and Charlesworth B. 2005. Sex chromosomes: evolution of the weird and wonderful. Curr. Biol. 15: 129-131. Charlesworth D, Charlesworth B, and Marais G. 2005. Steps in the evolution of heteromorphic sex chromosomes. Heredity 95: 118-128. Charlesworth B, and Dempsey ND. 2001. A model of the evolution of the unusual sex chromosome system of Microtus oregoni. Heredity 86: 387-94. Chaumeil J, and Heard E. 2004. L'inactivation du chromosome X chez les mammifères. Biofutur 243: 31-36. Chevret P, Jenkins P, and Catzeflis F. 2003. Evolutionnary systematics of the Indian mouse Mus famulus: molecular (DNA/DNA hybrization and 12S rRNA sequences) and morphological evidence. Zool. J. Linnean Soc. 137: 385-401. Chevret P, Veyrunes F, and Britton-Davidian J. 2005. Molecular phylogeny of the genus Mus (Rodentia: Murinae) based on mitochondrial and nuclear data. Biol. J. Linnean Soc. 84: 417-427. Childs JE, Glass GE, Korch GW, Ksiazek TG, and Leduc JW. 1992. Lymphocytic choriomeningitis virus-infection and house mouse (Mus musculus) distribution in urban Baltimore. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47:27-34. Colombo PC. 1989. Chromosome polymorphisms affecting recombination and exophenotypic traits in Leptysma argentina (Orthoptera): a populational survey. Heredity 62: 289-299. Coluzzi M, Sabatini A, della Torre A, Di Deco MA, and Patrarca V. 2002. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex. Science 298: 1415-1418. Corin-Frédéric J. 1969. Les formules chromosomiques dites aberrantes chez les Mammifères Euthériens. Exemple particulier du paresseux Choloepus hoffmanni (Edente, Xenarthre, famille des Bradypodidae). Chromosoma 27: 268-287. Coyne JA. 1992. Genetics and speciation. Nature 355: 511-515. Coyne JA, and Orr HA. 1989. Patterns of speciation in Drosophila. Evolution 43: 362-381. Crocker M, and Cattanach BM. 1981. X-ray induction of translocations in mice carrying metacentrics (Robertsonian fusions); detection of whole arm chromosome exchanges. Mutation Res. 91: 353-357.

171 Davies TJ, Barraclough TG, Chase MW, Soltis PS, Soltis DE, and Savolainen V. 2004. Darwin's abominable mystery: Insights from a supertree of the angiosperms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1904-1909. Davisson MT, and Akeson EC. 1993. Recombination suppression by heterozygous Robertsonian chromosomes in the mouse. Genetics 133: 649-667. de Oliveira EHC, Neusser M, Figueiredo WB, Nagamachi C, Pieczarka JC, Sbalqueiro IJ, Wienberg J, and Muller S. 2002. The phylogeny of howler monkeys (Alouatta, Platyrrhini): Reconstruction by multicolor cross-species chromosome painting. Chromosome Res. 10: 669-683. de Oliviera EHC, de Lima MCM, Sbalquiero IJ, and Pissinati A. 1998. The karyotype of Alouatta fusca clamitans from Rio de Janeiro, Brazil: evidence for a Y-autosome translocation. Genet. Mol. Biol. 21: 361-364. della Torre A, Costantini C, Besansky NJ, Caccone A, Patrarca V, Powell JR, and Coluzzi M. 2002. Speciation within Anopheles gambiae - the glass is half full. Science 298: 115-117. Delneri D, Colson I, Grammenoudi S, Roberts IN, Louis EJ, and Oliver SG. 2003. Engineering evolution to study speciation in yeasts. Nature 422: 68-72. Delobel B, Djelati R, Gabriel-Robez O, Croquette MF, Rousseaux-Prévost R, Rousseaux J, Rigot JM, and Rumpler Y. 1998. Y-autosome translocation and infertility: usefulness of molecular, cytogenetic and meiotic studies. Hum. Genet. 102: 98-102. Delsuc F, Brinkmann H, and Philippe H. 2005. Phylogenomics and the reconstruction of the tree of life. Nature Rev. Genet. 6: 361-375. Delsuc F, Scally M, Madsen O, Stanhope MJ, de Jong WW, Catzeflis FM, Springer MS, and Douzery EJP. 2002. Molecular Phylogeny of living Xenarthrans and the impact of character and taxon sampling on the placental tree rooting. Mol. Biol. Evol. 19: 1656-1671. Disteche CM. 1995. Escape from X inactivation in human and mouse. Trends Genet. 11: 17- 22. Disteche CM, Filippova GN, and Tsuchiya KD. 2002. Escape from X inactivation. Cytogenet. Genome Res. 99: 36-43. Djalali M, Hameister H, and Vogel W. 1986. Further chromosomal studies on Ellobius lutescens: Heteromorphism of chromosome No. 1 is not associated with sex determination. Experientia 42: 1281-1282. Dobigny G, Aniskin V, and Volobouev V. 2002a. Explosive chromosome evolution and speciation in the gerbil genus Taterillus (Rodentia; Gerbillinae): a case of two new cryptic species. Cytogenet. Genome Res. 96: 117-124. Dobigny G, Baylac M, and Denys C. 2002b. Geometric morphometrics, neural networks and diagnosis of sibling Taterillus species (Rodentia, Gerbillinae). Biol. J. Linnean Soc. 77: 319-327. Dobigny G, Granjon L, Aniskin V, Ba K, and Volobouev V. 2003a. A new sibling species of Taterillus (Muridae, Gerbillinae) from West Africa. Mamm. Biol. 68: 299-316. Dobigny G, Ozouf-Costaz C, Bonillo C, and Volobouev V. 2003b. Evolution of rRNA gene clusters and telomeric repeats during explosive genome repatterning in Taterillus (Rodentia, Gerbillinae). Cytogenet. Genome Res. 103: 94-103.

172 Références

Dobigny G, Ozouf-Costaz C, Bonillo C, and Volobouev V. 2004. Viability of X-autosome translocations in mammals: an epigenomic hypothesis from a rodent case-study. Chromosoma 113: 34-41. Ducroz JF, Granjon L, Chevret P, Duplantier JM, Lombard M, and Volobouev V. 1998. Characterization of two distinct species of Arvicanthis (Rodentia, Muridae) in West Africa: cytogenetic, molecular and reproductive evidence. J. Zool. Lond. 241: 709-723. Ducroz JF, Volobouev V, and Granjon L. 1998. A molecular perspective on the systematics and evolution of the genus Arvicanthis (Rodentia: Muridae): inferences from complete cytochrome b gene sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 10: 104-117. Dumas D, and Britton-Davidian J. 2002. Chromosomal rearrangements and evolution of recombination: comparison of chiasma distribution patterns in standard and Robertsonian populations of the house mouse. Genetics 162: 1355-1366. Dunnum JL, Salazar-Bravo J, and Yates TL. 2001. The bolivian bamboo rat, Dactylomys boliviensis (Rodentia: Echimyidae), a new record for chromosome number in mammal. Mamm. Biol. 66: 121-126. Dutrillaux B, Descailleaux J, Viegas-Pequignot E, and Couturier J. 1981. Y-Autosome Translocation in Cacajao-Calvus-Rubicundus (Platyrrhini). Ann. Genet. 24: 197-201. Dutrillaux B, Lombard M, Carroll JB, and Martin RD. 1988. Chromosomal affinities of Callimico goeldii (Platyrrhini) and characterization of Y-autosome translocation in the male. Folia Primat. 50: 230-236. Dutrillaux B, Webb G, Muleris M, Couturier J, and Butler R. 1984. Chromosome Study of Presbytis cristatus - Presence of a Complex Y-Autosome Rearrangement in the Male. Ann. Genet. 27: 148-153. Ellerman JR. 1941. The families and genera of living rodents. London: British Museum Natural History. Fadda C, and Corti M. 2001. Three-dimensional geometric morphometrics of Arvicanthis: implications for systematics and taxonomy. J. Zool. Syst. Evol. Res. 39: 235-245. Fagundes V, and Yonenaga-Yassuda Y. 1998. Evolutionary conservation of whole homeologous chromosome arms in the Akodont rodents Bolomys and Akodon (Muridae, Sigmodontinae): maintenance of interstitial telomeric segments (ITBs) in recent event of centric fusion. Chromosome Res. 6: 643-648. Fedorov VB, Fredga K, and Jarrell GH. 1999. Mitochondrial DNA variation and the evolutionary history of chromosomes races of collared lemmings (Dicrostonyx) in the Eurasian Arctic. J. Evol. Biol. 12: 134-145. Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J. Mol. Evol. 17: 368-376. Fernandez R, Barragan MJL, Bullejos M, Marchal JA, Martinez S, de la Guardia RD, and Sanchez A. 2002. Mapping the SRY gene in Microtus cabrerae: a vole species with multiple SRY copies in males and females. Genome 45: 600-603. Fredga K. 1970. Unusual sex chromosome inheritance in mammals. Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. 259: 15-36. Fredga K. 1972. Comparative chromosomestudies in mongooses (Carnivora, Viverridae). I. Idiograms of 12 species and karyotype evolution in Herpestinae. Hereditas 71: 1-74.

173 Fredga K. 1983. Aberrant sex chromosome mechanisms in mammals. Differentiation 23: S23-S30. Fredga K. 1988. Aberrant Chromosomal Sex-Determining Mechanisms in Mammals, With Special Reference to Species With XY-Females. Phil. Trans. Royal Soc. London Series B 322: 83-94. Fredga K, Gropp A, Winking H, and Frank F. 1976. Fertile XX- and XY-type females in the wood lemming Myopus schisticolor. Nature 261: 225-227. Freije D, Helms C, Watson MS, and Donis-Keller H. 1992. Identification of a second pseudoautosomal region near the Xq and Yq telomeres. Science 258: 1784-1787. Fritz B, Kunz J, Knudsen GPS, Louwen F, Kennerknecht I, Eiben B, Orstavik KH, Friedrich U, and Rehder H. 2005. Situs ambiguus in a female foetus with balanced (X;21) translocation – evidence for functional nullisomy of the ZIC3 gene?, Eur. J. Hum. Genet. 13: 34–40. Futuyma DJ. 1986. Evolutionary biology. Sinauer Associates, inc, Sunderland. Gallagher DS, Jr., Davis SK, De Donato M, Burzlaff JD, Womack JE, Taylor JF, and Kumamoto AT. 1998. A karyotypic analysis of nilgai, Boselaphus tragocamelus (Artiodactyla: Bovidae). Chromosome Res. 6: 505-513. Gallagher DS, Davis SK, De Donato M, Burzlaff JD, Womack JE, Taylor JF, and Kumamoto AT. 1999. A molecular cytogenetic analysis of the tribe Bovini (Artiodactyla : Bovidae : Bovinae) with an emphasis on sex chromosome morphology and NOR distribution. Chromosome Res. 7: 481-492. Garagna S, Broccoli D, Redi CA, Searle JB, Cooke HJ, and Capanna E. 1995. Robertsonian metacentrics of the house mouse lose telomeric sequences but retain some minor satellite DNA in the pericentromeric area. Chromosoma 103: 685-692. Garagna S, Redi CA, Zuccoti M, Britton-Davidian J, and Winking H. 1990. Kinetics of oogenesis in mice heterozygous for Robertsonian translocations. Differentation 42: 167 - 171. Garagna S, Ronchetti E, Mascheretti S, Crovella S, Formenti D, Rumpler Y, and Romanini MGM. 1997a. Non-telomeric chromosome localization of (TTAGGG)n repeats in the genus Eulemur. Chromosome Res. 5: 487-491. Garagna S, Zuccotti M, Redi CA, and Capanna E. 1997b. Trapping speciation. Nature 390: 241-242. Genest-Villard H. 1973. Données ecologiques sur un "Leggada" des savanes intraforestières du centre africain: Mus oubanguii. Mammalia 37: 218-230. Gileva EA. 1980. Chromosomal diversity and an aberrant genetic system of sex determination in the arctic lemming, Dicrostonyx torquatus. Genetica 52/53: 99-103. Gileva EA. 1983. A contrasted pattern of chromosome evolution in two genera of lemmings, Lemmus and Dicrostonyx (Mammalia, Rodentia). Genetica 60: 173-179. Gileva EA. 1998. Inbreeding and sex ratio in two captive colonies of Dicrostonyx torquatus: a reply to G. H. Jarrell. Hereditas 128: 185-188. Gileva EA, and Fedorov VB. 1991. Sex ratio, XY females and absence of inbreeding in a population of the wood Lemming, Myopus schisticolor. Heredity 66: 351-355.

174 Références

Gora D, Yaya T, Jocelyn T, Didier F, Maoulouth D, Amadou S, Ruel TD, and Gonzalez JP. 2000. The potential role of rodents in the enzootic cycle of Rift Velley Fever virus in Senegal. Microbes Infections 2: 343-346. Goto T, and Monk M. 1998. Regulation of X-chromosome inactivation in development in mice and humans. Microbiol. Molec. Biol. Reviews 62: 362-378. Granjon L, and Dobigny G. 2003. The importance of cytotaxonomy in understanding the biogeography of African rodents: Lake Chad murids as an example. Mammal. Rev. 33: 77- 91. Graves JAM, Gecz J, and Hameister H. 2002. Evolution of the human X - a smart and sexy chromosome that controls speciation and development. Cytogenet. Genome Res. 99: 141- 145. Gropp A, Winking H, Frank F, Noack G, and Fredga K. 1976. Sex chromosome aberrations in wood lemmings (Myopus schisticolor). Cytogenet. Cell Genet. 17: 343-358. Gropp A, Winking H, and Redi C. 1982. Consequences of Robertsonian heterozygosity: segregational impairment of fertility versus male-limited sterility. In Crosignani PGea, ed. Serono Clinical Coll. on Reprod.: Grune and Stratton, 115-134. Grützner F, and Marshall Graves JA. 2004. A platypus' eye view of the mammalian genome. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 642-649. Grützner F, Rens W, Tsend-Ayush E, El-Mogharbel N, O'Brien PCM, Jones RC, Ferguson-Smith MA, and Marshall Graves JA. 2004. In the platypus a meiotic chain of ten sex chromosomes shares genes with the bird Z and mammal X chromosomes. Nature 432: 913-917. Guénet JL, and Bonhomme F. 2003. Wild mice: an ever-increasing contribution to a popular mammalian model. Trends Genet. 19: 24-31. Guindon S, and Gascuel O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst. Biol. 52: 696-704. Haag ES, and Doty AV. 2005. Sex determination across evolution: connecting the dots. PLOS Biol. 3: e21. Hansen RS. 2003. X inactivation-specific methylation of LINE-1 elements by DNMT3B: implications for the Lyon repeat hypothesis. Hum. Mol. Genet. 12: 2559-2567. Hauffe HC, and Pialek J. 1997. Evolution of the chromosomal races of Mus musculus domesticus in the Rhaetian Alps: the roles of whole-arm reciprocal translocation and zonal raciation. Biol. J. Linnean Soc. 62: 255-278. Hauffe HC, and Searle JB. 1993. Extreme karyotypic variation in a Mus musculus domesticus hybrid zone: the Tobacco mouse story revisited. Evolution 47: 1374-1395. Hauffe HC, and Searle JB. 1998. Chromosomal heterozygosity and fertility in house mice (Mus musculus domesticus) from Northern Italy. Genetics 150: 1143-1154. Hawkins JR. 1993. Mutational analysis of SRY in XY females. Hum. Mutat. 2:347-350. Hayman DL, and Martin PG. 1965. Sex chromosome mosaicism in the marsupial genera Isoodon and Perameles. Genetics 52: 1201-1206. Heard E, Clerc P, Avner P. 1997. X-chromosome inactivation in mammals. Ann. Rev. Genet. 31: 571-610.

175 Hedrick PW. 1981. The establishment of chromosomal variants. Evolution 35: 322-332. Hedrick PW, and Levin DA. 1984. Kin-founding anf the fixation of chromosomal variants. Am. Nat. 124: 789-797. Hirai H, Hirai Y, Kawamoto Y, Endo H, Kimura J, and Rerkamnuaychoke W. 2002. Cytogenetic differentiation of two sympatric tree shrew taxa found in the southern part of the Isthmus of Kra. Chromosome Res. 10: 313-327. Hoekstra HE, and Edwards SV. 2000. Multiple origins of XY female mice (genus Akodon): phylogenetic and chromosomal evidence. Proc. R. Soc. Lond. B 267: 1825-1831. Hoekstra HE, and Hoekstra JM. 2001. An unusual sex-determination system in South American field mice (genus Akodon): The role of mutation, selection, and meiotic drive in maintaining XY females. Evolution 55: 190-197. Hoffman SL, Subramanian GM, Collins FH, and Venter JC. 2002. Plasmodium, human and Anopheles genomics and malaria. Nature 415: 702-709. Huelsenbeck JP, and Ronquist F. 2001. MrBayes: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics 17: 754-755. Huynh KD, and Lee JT. 2005. X-chromosome inactivation: a hypothesis linking ontogeny and phylogeny. Nature Rev. Genet. in press. Iannuzzi L, Molteni L, Di Meo GP, De Giovanni A, Perucatti A, Succi G, Incarnato D, Eggen A, and Cribiu EP. 2001. A case of azoospermia in a bull carrying a Y-autosome reciprocal translocation. Cytogenet. Cell Genet. 95: 225-227. Ishak B, Warter S, Dutrillaux B, and Rumpler Y. 1992. Chromosomal rearrangements and speciation in sportive lemurs (Lepilemur species). Folia Primatol. 58: 121-130. Iwase M, Satta Y, Hirai H, Imai H, and Takahata N. 2003. The amelogenin loci span an ancient pseudoautosomal boundary in diverse mammalian species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5258-5263. Jaafar H, Gabriel-Robez O, and Rumpler Y. 1993. Chromosomal anomalies and disturbance of transcriptional activity at the pachytene stage of meiosis: relationship to male sterility. Cytogenet. Cell Genet. 64: 273-280. Jacobs LL, Downs WR. 1994. The evolution of murine rodents in Asia. In: Tomida Y, Li CK and Setoguschi T, eds. Rodent and Lagomorph Families of Asian Origins and their diversification. Tokyo: National Science Museum Monograph. 149-156. Jacobs LL, and Pilbeam D. 1980. Of mice and men: Fossil-based divergence dates and molecular "Clocks". J. Hum. Evol. 9: 551-555. Jaeger JJ. 1996. Les mondes fossiles. Editions Odile Jacob, Paris. Jaeger JJ, Tong H, and Denys C. 1986. Age de la divergence Mus-Rattus: comparaison des données paléontologiques et moléculaires. C. R. Acad. Sci. 302: 917-922. Jarrell GH. 1995. A male-biased natal sex-ratio in inbred collared lemmings, Dicrostonyx groenlandicus. Hereditas 123: 31-37. Jimenez R, Burgos M, Caballero L, and Diaz de la Guardia R. 1988. Sex reversal in a wild population of Talpa occidentalis (Insectivora, mammalia). Genet. Res. 52: 135-140.

176 Références

Jimenez R, Carnero A, Burgos M, Sanchez A, and Diaz de la Guardia R. 1991. Achiasmatic giant sex chromosomes in the vole Microtus cabrerae (Rodentia, Microtidae). Cytogenet. Cell Genet. 57: 56-58. Jimenez R, Sanchez A, Burgos M, and Diaz de la Guardia R. 1996. Puzzling out the genetics of mammalian sex determination. Trends Genet. 12: 164-166. Johannisson R, and Winking H. 1994. Synaptonemal complexes of chains and rings in mice heterozygous for multiple Robertsonian translocations. Chromosome Res. 2: 137-145. Johnston PG, Watson CM, Adams M, and Paull DJ. 2002. Sex chromosome elimination, X chromosome inactivation and reactivation in the southern brown bandicoot Isoodon obesulus (Marsupialia : Peramelidae). Cytogenet. Genome Res. 99: 119-124. Jotterand M. 1970. Un nouveau système polymorphe robertsonien chez une nouvelle espèce de "Leggada" (Mus goundae Petter). Experientia 26: 1360-1361. Jotterand M. 1972. Le polymorphisme chromosomique des Mus (Leggadas) africains. Cytogénétique, zoogéographie, évolution. Rev. Suisse Zool. 79: 287-359. Jotterand M. 1975. The African Mus (pigmy mice): the role of chromosomal polymorphism in speciation. Caryologia 28: 335-344. Jotterand-Bellomo M. 1981. Le caryotype et la spermatogénèse de Mus setulosus (bandes Q, C, G, et coloration argentique). Genetica 56: 217-227. Jotterand-Bellomo M. 1984. L'analyse cytogénétique de deux espèces de Muridae africains, Mus oubanguii et Mus minutoides/musculoides: polymorphisme chromosomique et ébauche d'une phylogénie. Cytogenet. Cell Genet. 38: 182-188. Jotterand-Bellomo M. 1986. Le genre Mus africain, un exemple d'homogénéité caryotypique: étude cytogénétique de Mus minutoides/musculoides (Côte d'Ivoire), de M. setulosus (République Centrafricaine), et de M. mattheyi (Burkina Faso). Cytogenet. Cell Genet. 42: 99-104. Jotterand-Bellomo M. 1988. Chromosome analysis of five specimens of Mus bufo-triton (Muridae) from Burundi (Africa): three cytogenetic entities, a special type of chromosomal sex determination, taxonomy, and phylogeny. Cytogenet. Cell Genet. 48: 88-91. Jouvin-Marche E, Cuddihy A, Butler S, Hansen JN, Fitch WM, and Rudikoff S. 1988. Modern evolution of a single-copy gene: the immunoglobulin Ck in wild mice. Mol. Biol. Evol 5: 500-511. Just W, Baumstark A, Hameister H, Schreiner B, Reisert I, Hakhverdyan M, and Vogel W. 2002. The sex determination in Ellobius lutescens remains bizarre. Cytogenet. Genome Res. 96: 146-153. Just W, Rau W, Vogel W, Akhverdian M, Fredga K, Graves JAM, and Lyapunova E. 1995. Absence of Sry in Species of the Vole Ellobius. Nature Genet. 11: 117-118. Kalz-Fuller B, Sleegers E, Schwanitz G, and Schubert R. 1999. Characterization, phenotypic manifestations and X-inactivation pattern in 14 patients with X-autosome translocations. Clin. Genet. 55: 362-366. Kamali M. 1975. Karyotype ans sex-chromosome polymorphism in Nesokia indica from Iran. Mammal Chrom. Newsletter 16: 165-167. Kasahara S, and Dutrillaux B. 1983. Chromosome-Banding Patterns of 4 Species of Bats, With Special Reference to a Case of X-Autosome Translocation. Ann. Genet. 26: 197-201.

177 Kasangaki A, Kityo R, and Kerbis J. 2003. Diversity of rodents and shrews along an elevational gradient in Bwindi Impenetrable National Park, South-Western Uganda. Afr. J. Ecol. 41: 115-123. Kearney MR. 2003. Why is sex so unpopular in the Australian desert? Trends Ecol. Evol. 18: 605-607. King M. 1993. Species evolution. The role of chromosome change. Cambridge University Press, Cambridge. Knower KC, Kelly S, and Harley VR. 2003. Turning on the male - Sry, Sox9 and sex determination in mammals. Cytogenet. Genome Res. 101: 185-198. Kolnicki RL. 2000. Kinetochore reproduction in animal evolution: cell biological explanation of karyotypic fission theory. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 9493-9497. Koopman P. 2005. Sex determination: a tale of two Sox genes. Trends Genet. 21: 367-370. Koopman P, Gubbay J, Vivian N, Goodfellow P, and Lovell-Badge R. 1991. Male development of chromosomally female mice transgenic for Sry. Nature 351: 117-121. Kornfield I, and Smith PF. 2000. African cichlid fishes: Model systems for evolutionary biology. Ann. Rev. Ecol. Syst. 31: 163-196. Lahn BT, and Page DC. 1999. Four evolutionary strata on the human X chromosome. Science 286: 964-967. Lande R. 1979. Effective deme sizes during long-term evolution estimated from rates of chromosomal rearrangement. Evolution 33: 234-251. Lande R. 1985. The fixation of chromosomal rearrangements in a subdivided population with local extinction and colonization. Heredity 54: 323-332. Lecointre G, Philippe H, Lanh Van Le H, and Le Guyader H. 1993. Species sampling has a major impact on phylogenetic inference. Mol. Phylogenet. Evol. 2: 205-224. Lee C, Sasi R, and Lin CC. 1993. Interstitial localization of telomeric DNA sequences in the Indian muntjac chromosomes: further evidence for tandem chromosome fusions in the karyotypic evolution of the Asian muntjacs. Cytogenet. Cell Genet. 63: 156-159. Lee MR, and Elder FFB. 1980. Yeast stimulation of bone marrow mitosis for cytogenetics investigations. Cytogenet. Cell Genet. 26: 36-40. Lee S, Lee, SH, Chung TG, Kim HJ, Yoon TK, Kwak IP, Park SH, Cha WT, Cho SW, and Cha KY. 2003. Molecular and cytogenetic characterization of two azoospermic patients with X-autosome translocation. J. Assist. Reprod. Genet. 20: 385-389. Li T, O'Brien PCM, Biltueva L, Fu B, Wang J, Nie W, Ferguson-Smith MA, Graphodatsky AS, and Yang F. 2004. Evolution of genome organizations of squirrels (Sciuridae) revealed by cross-species chromosome painting. Chromosome Res. 12: 317- 335. Lima MMC, and Seuanez HN. 1991. Chromosome Studies in the Red Howler Monkey, Alouatta seniculus (Platyrrhini, Primates) - Description of an X1X2Y1Y2/X1X1X2X2 Sex Chromosome System and Karyological comparisons with other Subspecies. Cytogenet. Cell Genet. 57: 151-156. Liu WS, Eriksson L, and Fredga K. 1998. XY sex reversal in the wood lemming is associated with deletion of Xp21- 23 as revealed by chromosome microdissection and fluorescence in situ hybridization. Chromosome Res. 6: 379-83.

178 Références

Lovell-Badge R, and Hacker A. 1995. The molecular genetics of Sry and its role in mammalian sex determination. Phil. Trans. Royal Soc. London B 350: 205-214. Lundrigan BL, Jansa SA, and Tucker PK. 2002. Phylogenetic relationships in the genus Mus, based on paternally, maternally, and biparentally inherited characters. Syst. Biol. 51: 410-431. Lundrigan BL, and Tucker PK. 1997. Evidence for multiple functional copies of the male sex-determining locus, Sry, in African Murine rodents. J. Mol. Evol. 45: 60-65. Lyon MF. 1961. Gene action in the X chromosome of the mouse (Mus musculus). Nature 190: 372-373. Lyon MF. 1998. X-chromosome inactivation spreads itself: effects in autosomes. Am. J. Hum. Genet. 63: 17-19. Ma NSF. 1981. Chromosome Evolution in the Owl Monkey, Aotus. Am. J. Phys. Anthrop. 54: 293-303. Ma NSF, Elliott MW, Morgan L, Miller A, and Jones TC. 1976. Translocation of Y- Chromosome to an Autosome in Bolivian Owl Monkey, Aotus. Am. J. Phys. Anthrop. 45: 191-201. Ma NSF, Jones TC, Thorington RW, Miller A, and Morgan L. 1975. Y-Autosome Translocation in Howler Monkey, Alouatta-Palliata. J. Med. Primat. 4: 299-307. Ma NSF, Page DC, and Harris TS. 1989. Molecular evidence of Y-autosomal translocations in Owl Monkeys. J. Hered. 80: 259-263. Ma NSF, Renquist DM, Hall R, Sehgal PK, Simeone T, and Jones TC. 1980. Xx-Xo Sex Determination System in a Population of Peruvian Owl Monkey, Aotus. J. Hered. 71: 336- 342. Macholan M. 2001. Multivariate analysis of morphometric variation in Asian Mus and sub- saharan Nannomys (Rodentia : Muridae). Zool. Anz. 240: 7-14. Marais G, and Galtier N. 2003. Sex chromosomes: how X-Y recombination stops. Curr. Biol. 13: 641-643. Marchal JA, Acosta MJ, Bullejos M, Diaz de la Guardia R, and Sanchez A. 2003. Sex chromosomes, sex determination, and sex-linked in Microtidae. Cytogenet. Genome Res. 101: 266-273. Marchal JA, Acosta MJ, Nietzel H, Sperling K, Bullejos M, Diaz de la Guardia R, and Sanchez A. 2004. X chromosome painting in Microtus: origin and evolution of the giant sex chromosomes. Chromosome Res. 12: 767-776. Marshall JT. 1981. Taxonomy. In: Foster HL, Small JD, Fox JG, eds. The mouse in biomedical research, volume 1. New York: Academic Press. 17-26. Marshall Graves JA. 1998. Evolution of the mammalian Y chromosome and sex- determining genes. J. Exp. Zool. 281: 472-481. Marshall Graves JA. 2000. Human Y chromosome, sex determination, and spermatogenesis - A feminist view. Biol. Reprod. 63: 667-676. Marshall Graves JA. 2002a. The rise and fall of SRY. Trends Genet. 18: 259-264. Marshall Graves JA. 2002b. Sex chromosomes and sex determination in weird mammals. Cytogenet. Genome Res. 96: 161-168.

179 Marshall Graves JA. 2004. The degenerate Y chromosome - can conversion save it? Reprod. Fertility Dev. 16: 527-534. Marshall Graves JA. 2005. Recycling the Y chromosome. Science 307: 50-51. Matsuda T, Hayashi K, Nonomura M, Yamamoto S, and Yoshida O. 1989. Azoospermic male with balanced Y-autosome translocation. Urol. Int. 44: 43-46. Matthias MA, and Levett PN. 2002. Leptospiral carriage by mice and mongooses on the island of Barbados. West Indian Med. J. 51:10-13. Matthey, R. 1953. La formule chromosomique et le problème de la détermination sexuelle chez Ellobius lutescens (Thomas) (Rodentia-Muridae-Microtinae). Arch. Julius Klaus-Stift Vererb. Forsch 28: 65-73. Matthey R. 1965. The problem of sex determination in Acomys selousi de Winton. Cytogenetics of the genus Acomys (Rodentia – Murinae). Rev. Suisse Zool. 72 : 119-144. Matthey R. 1966a. Le polymorphisme chromosomique des Mus africains du sous-genre Leggada. Révision générale portant sur l'analyse de 213 individus. Rev. Suisse Zool. 73: 585-607. Matthey R. 1966b. Note sur un nouveau caryotype dans le système chromosomique polymorphe de Mus (Leggada) minutoides musculoides. Rev. Suisse Zool. 73: 579-583. Matthey R. 1966c. Nouvelles contributions à la cytogénétique des Mus africains du sous- genre Leggada. Experientia 22: 400-401. Matthey R. 1967. Cytogénétique des Leggada: (1) la formule chromosomique de Mus (Leggada) bufo, (2) Nouvelles données sur la délétion portant sur le bras court d'un X chez Mus (Leggada) triton. Experientia 23: 133-134. Matthey R. 1970a. L'"éventail robertsonien" chez les Mus (Leggada) africains du groupe minutoides-musculoides. Rev. Suisse Zool. 77: 625-629. Matthey R. 1970b. Nouvelles données sur la cytogénétique et la spéciation des Leggada (Mammalia - Rodentia - Muridae). Experientia 26: 102-103. McElreavey KE, Vilain E, Abbas N, Herskowitz I, and Fellous M. 1993. A regulatory cascade hypothesis for mammalian sex determination: SRY represses a negative regulator of male development. Proc Natl Acad Sci USA 90: 3368-3372. Meester JAJ, Rautenbach IL, Dippenaar NJ, and Baker CM. 1986. Classification of Southern African Mammals. Transvaal Museum Monograph 5: 1-359. Megias-Nogales B, Marchal JA, Acosta MJ, Bullejos M, De la Guardia RD, and Sanchez A. 2003. Sex chromosomes pairing in two Arvicolidae species: Microtus nivalis and Arvicola sapidus. Hereditas 138: 114-121. Mercer SJ, Wallace BMN, and Searle JB. 1992. Male common shrews (Sorex araneus) with long chain configurations can be fertile: implications for chromosomal models of speciation. Cytogenet. Cell Genet. 60: 68-73. Metcalfe CJ, Eldridge MDB, and Johnston PG. 2002. Mapping the distribution of the telomeric sequence (T2AG3)n in rock wallabies, Petrogale (Marsupialia: Macropodidae), by fluorescence in situ hybridization. II. The lateralis complex. Cytogenet. Cell Genet. 96: 169-175. Metcalfe CJ, Eldridge MDB, Toder R, and Johnston PG. 1998. Mapping the distribution of the telomeric sequence (T2AG3)n in the Macropodoidea (Marsupialia), by fluorescence

180 Références

in situ hybridization. I. The swamp wallaby, Wallabia bicolor. Chromosome Res. 6: 603- 610. Meyne J, Baker RJ, Hobart HH, Hsu TC, Ryder OA, Ward OG, Wiley JE, Wurster-Hill DH, Yates TL, and Moyzis RK. 1990. Distribution of non-telomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence in vertebrate chromosomes. Chromosoma 99: 3-10. Michalakis Y, and Olivieri I. 1993. The influence of local extinctions on the probability of fixation of chromosomal rearrangements. J. Evol. Biol. 6: 153-170. Michaux, J, Aguilar JP, Montuire S, Wolff A, and Legendre S. 1997. Les Murinae (Rodentia, Mammalia) néogènes du Sud de la France : évolution et paléoenvironnements. Geobios 20: 379-385. Michaux JR, Chevret P, Filippucci MG, and Macholan M. 2002. Phylogeny of the genus Apodemus with a special emphasis on the subgenus Sylvaemus using the nuclear IRBP gene and two mitochondrial markers: cytochrome b and 12S rRNA. Mol. Phylogenet. Evol. 23: 123-136. Migeon BR. 2002. X chromosome inactivation: theme and variations. Cytogenet. Genome Res. 99: 8-16. Mohandas TK, Speed RM, Passage MB, Yen PH, Chandley AC, and Shapiro LJ. 1992. Role of the pseudoautosomal region in sex-chromosome pairing during male meiosis – meiotic studies in a man with a deletion of distal Xp. Am. J. Hum. Genet. 51: 526-533. Montoya-Burgos JI, Boursot P, and Galtier N. 2003. Recombination explains isochores in mammalian genomes. Trends Genet. 19: 128-30. Montgelard C, Bentz S, Tirard C, Verneau O, and Catzeflis FM. 2002. Molecular systematics of Sciurognathi (Rodentia): the mitochondrial cytochrome b and 12S rRNA genes support the Anomaluroidea (Pedetidae and Anomaluridae). Mol. Phylogenet. Evol. 22: 220-233. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, Dani M, Deaven LL, Jones MD, Meyne J, Ratliff RL, and Wu JR. 1988. A highly conserved repetitive DNA sequence (TTAGGG)n present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA 85: 6622-6626. Mudry MD, Rahn M, Gorostiaga M, Hick A, Merani MS, and Solari AJ. 1998. Revised karyotype of Alouatta caraya (Primates: Platyrrhini) based on synaptonemal complex and banding analyses. Hereditas 128: 9-16. Muller S, Hollatz M, and Wienberg J. 2003. Chromosomal phylogeny and evolution of gibbons (Hylobatidae). Hum. Genet. 113: 493-501. Murphy WJ, Pevzner PA, and O'Brien SJ. 2004. Mammalian phylogenomics comes of age. Trends Genet. 20: 631-639. Musser GG, and Carleton MD. 1993. Family Muridae. In: Wilson DE and Reeder DM, eds. Mammal species of the world. A taxonomic and geographic reference. Washington and London: Smithsonian Institution Press. 501-755. Nachman MW, and Myers P. 1989. Exceptional chromosomal mutations in a rodent population are not strongly underdominant. Proc Natl Acad Sci USA 86: 6666-6670. Nachman MW, and Searle JB. 1995. Why is the house mouse karyotype so variable? Trends Ecol. Evol. 10: 397-402.

181 Nagamine CM. 1994. The testis-determining gene, SRY, exists in multiple copies in Old World rodents. Genet. Res. 64: 151-159. Nagamine CM, Morohashi K, Carlisle C, and Chang DK. 1999. Sex reversal caused by Mus musculus domesticus Y chromosomes linked to variant expression of the testis- determining gene Sry. Dev. Biol. 216: 182-194. Nanda I, and Raman R. 1981. Cytological similarity between the heterochromatin of the large X and Y chromosomes of the soft-furred field rat, Millardia meltada (family: Muridae). Cytogenet. Cell Genet. 30: 77-82. Nanda I, Schneider-Rasp S, Winking H, and Schmid M. 1995. Loss of telomeric sites in the chromosomes of Mus musculus domesticus (Rodentia: Muridae) during Robertsonian rearrangements. Chromosome Res. 3: 399-409. Navarro A, and Barton NH. 2003. Chromosomal speciation and molecular divergence - Accelerated evolution in rearranged chromosomes. Science 300: 321-324. Nevo E, Filipucci MG, Redi C, Korol A, and Beiles A. 1994. Chromosomal speciation and adaptive radiation of mole rats in Asia Minor correlated with increased ecological stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8160-8164. Nicolas M, Marais G, Hykelova V, Janousek B, Laporte V, Vyskot B, Mouchiroud D, Negrutiu I, Charlesworth D, and Monéger F. 2005. A gradual process of recombination restriction in the evolutionary history of the sex chromosomes in dioecious plants. PLOS Biology 3: e4. Nie W, Wang J, O'Brien PCM, Fu B, Ying T, Ferguson-Smith MA, and Yang F. 2002. The genome phylogeny of domestic cat, red panda and five mustelid species revealed by comparative chromosome painting and G-banding. Chromosome Res. 10: 209-222. Noor MAF, Grams KL, Bertucci LA, and Reiland J. 2001. Chromosomal inversions and the reproductive isolation of species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 12084-12088. O'Brien SJ, Menotti-Raymond M, Murphy WJ, Nash WG, Wienberg J, Stanyon R, Copeland NG, Jenkins NA, Womack JE, and Graves JAM. 1999. The promise of comparative genomics in mammals. Science 286: 458-481. Ogata M, Ohtani H, Igarashi T, Hasegawa Y, Ichikawa Y, and Miura I. 2003. Change of the heterogametic sex from male to female in the frog. Genetics 164: 613-620. Ohno S. 1967. Sex chromosomes and sex linked genes. Springer, Berlin. Ohno S, Jainchill J, and Stenius C. 1963. The creeping vole (Microtus oregoni) as a gonosomic mosaic. I. The OY/XY constitution of the male. Cytogenetics 2: 232-239. Ohno S, Stenius C, Christian L. 1966. The XO as the normal female of the creeping vole (Microtus oregoni). In: Darlington CD, Lewis KR, eds. Chromosome Today, vol 1. Oliver and Boyd, Edingburgh London, pp 182-187. O'Neill MJ, and O'Neill JW. 1999. Whatever happened to Sry ? Cell. Mol. Life Sci. 56: 883- 893. Orr HA. 1995. The population genetics of speciation: the evolution of hybrid incompatibilities. Genetics 139: 1805-1813. Orr HA. 2001. The genetics of species differences. Trends Ecol. Evol. 16: 343-350. Orr HA, Masly JP, and Presgraves DC. 2004. Speciation genes. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 675-679.

182 Références

Otto SP. 2003. The advantages of segregation and the evolution of sex. Genetics 164: 1099- 1118. Otto SP, and Lenormand T. 2002. Resolving the paradox of sex and recombination. Nature Rev. Genet. 3: 252-261. Otto SP, and Whitton J. 2000. Polyploid incidence and evolution. Ann. Rev. Genet. 34: 401- 437. Page J, Berrios S, Parra MT, Viera A, Suja JA, Prieto I, Barbero JL, Rufas JS, and Fernandez-Donoso R. 2005. The program of sex chromosome pairing in meiosis is highly conserved across marsupial species: implications for sex chromosome evolution. Genetics in press. Page J, Berrios S, Rufas JS, Parra MT, Suja JA, Heytig C, and Fernandez-Donoso R. 2003. The pairing of X and Y chromosomes during meiotic prophase in the marsupial species Thylamys elegans is maintained by a dense plate developed from their axial elements. J. Cell Science 116: 551-560. Palmer MS, Sinclair AH, Berta P, Ellis NA, Goodfellow PN, Abbas NE, and Fellous M. 1989. Genetic evidence that ZFY is not the testis-determining factor. Nature 342: 937-939. Pardo-Manuel de Villena F, and Sapienza C. 2001. Female meiosis drives karyotypic evolution in mammals. Genetics 159: 1179-1189. Parish DA, Vise P, Wichman HA, Bull JJ, and Baker RJ. 2002. Distribution of LINEs and others repetitive elements in the karyotype of the bat Carollia: implications for X- chromosome inactivation. Cytogenet. Genome Res. 96: 191-197. Partridge L, and Hurst LD. 1998. Sex and conflict. Science 281: 2003-2008. Pathak S, and Stock AD. 1976. Giemsa-banding and the identification of the Y/autosome translocation in the African marsh mongoose, Atilax paludinosus (Carnivora, Viverridae). Cytogenet. Cell Genet. 16: 487-494. Patterson BD. 2000. Patterns and trends in the discovery of new Neotropical mammals. Diversity & Distrib. 6: 145-151. Perry J, Palmer S, Gabriel A, and Ashworth A. 2001. A short pseudoautosomal region in laboratory mice. Genome Res. 11: 1826-1832. Petter F. 1963. Contribution à la connaissance des souris africaines. Mammalia 27: 602-607. Petter F. 1969. Une souris nouvelle d'Afrique occidentale Mus mattheyi sp. nov. Mammalia 33: 118-123. Petter F. 1981. Les souris africaines du groupe sorella (Rongeurs, Muridés). Mammalia 45: 313-320. Pialek J, Hauffe HC, Rodriguez-Clark KM, and Searle JB. 2001. Raciation and speciation in house mice from the Alps: the role of chromosomes. Mol. Ecol. 10: 613-625. Pialek J, Hauffe HC, and Searle JB. 2005. Chromosomal variation in the house mouse. Biol. J. Linnean Soc. 84: 535-563. Prueitt RL, Chen H, Barnes RI, and Zinn AR. 2002. Most X-autosome translocations associated with premature ovarian failure do not interrupt X-linked genes. Cytogenet. Genome Res. 97: 32-38.

183 Qumsiyeh MB. 1994. Evolution of number and morphology of mammalian chromosomes. J. Hered. 85: 455-465. Rahn MI, Mudry M, Merani MS, and Solari AJ. 1996. Meiotic behavior of the X1X2Y1Y2 quadrivalent of the primate Alouatta caraya. Chromosome Res. 4: 350-356. Raman R, and Sharma T. 1976. Unique Multiple Sex-Chromosomes of Tree Mouse Vandeleuria o. oleracea - Identification of X1 and X2. Heredity 37: 435-439. Ratomponirina C, Viegas-Péquignot E, Dutrillaux B, Petter F, and Rumpler Y. 1986. Synaptonemal complexes in Gerbillidae : probable role of intercaled heterochromatin in gonosome-autosome translocations. Cytogenet. Cell Genet. 43: 161-167.

Ratomponirina C, Viegas-Péquinot E, Petter F, Dutrillaux B, and Rumpler Y. 1989. Synaptonemal complex study in some species of Gerbillidae without heterochromatin interposition. Cytogenet. Cell Genet. 52: 23-27. Redi CA, and Capanna E. 1988. Robertsonian heterozygotes in the house mouse and the fate of their germ cells. The Cytogenetics of Mammalian Autosomal Rearrangements.: Alan R. Liss, Inc. 315-359. Redi CA, Garagna S, and Capanna E. 1990. Nature's experiment with in situ hybridization? A hypothesis for the mechanism of Rb fusion. J. Evol. Biol. 3: 133-137. Rens W, Grützner F, O'Brien PCM, Fairclough H, Graves JAM, and Ferguson-Smith MA. 2004. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 16257-16261. Rieseberg LH. 1997. Hybrid origins of plant species. Ann. Rev. Ecol. Syst. 28: 359-389. Rieseberg LH. 2001. Chromosomal rearrangements and speciation. Trends Ecol. Evol. 16: 351-358. Rinn JL, and Snyder M. 2005. Sexual dimorphism in mammalian gene expression. Trends Genet. 21: 298-305. Ritchie MG, Butlin RK, and Hewitt GM. 1992. Fitness consequences of potential assortative mating inside and outside of a hybrid zone in Chorthippus parallelus (Orthoptera: Acrididae): implications for reinforcement and sexual selection theory. Biol. J. Linnean Soc. 45: 219-234. Robbins CB, and Van der Straeten E. 1996. Small mammals of Togo and Benin. II. Rodentia. Mammalia 60: 231-242. Robbins LW, and Baker RJ. 1981. An assessment of the nature of chromosomal rearrangements in 18 species of Peromyscus (Rodentia: Cricetidae). Cytogenet. Cell Genet. 31: 194-202. Rodrigues Noronha RC, Nagamachi CY, Pieczarka JC, Marques-Aguiar S, and De Souza Barros RM. 2001. Sex-autosome translocations: meiotic behaviour suggests an inactivation block with permanence of autosomal gene activity in Phyllostomids bats. Caryologia 54: 267-277. Rodriguez TA, and Burgoyne PS. 2001. Spermatogenic failure in male mice with four sex chromosomes. Chromosoma 110: 124-129.

184 Références

Rokas A, and Holland PWH. 2000. Rare genomic changes as a tool for phylogenetics. Trends Ecol. Evol. 15: 454-459. Ruiz-Herrera A, Garcia F, Aguilera M, Garcia M, and Ponsa Fontanals M. 2005. Comparative chromosome painting in Aotus reveals a highly derived evolution. Am. J. Primat. 65: 73-85. Rumpler Y, Couturier J, Warter S, and Dutrillaux B. 1983. Chromosomal evolution in Malagasy lemurs VII. Phylogenetic relationships between Propithecus, Avahi (Indridae), Microcebus (Cheirogaleidae), and Lemur (Lemuridae). Cytogenet. Cell Genet. 36: 542-546. Sabatier M. 1982. Les Rongeurs du site Pliocène à hominidés de Hadar (Ethiopie). Paleovert. 12: 1-56. Saccone G, Pane A, and Polito LC. 2002. Sex determination in flies, fruitflies and butterflies. Genetica 116: 15-23. Saïd K, Saad A, Auffray J-C, and Britton-Davidian J. 1993. Fertility estimates in the Tunisian all-acrocentric and Robertsonian populations of the house mouse and their chromosomal hybrids. Heredity 71: 532-538. Salido EC, Li XM, Yen PH, Martin N, Mohandas TK, and Shapiro LJ. 1996. Cloning and expression of the mouse pseudoautosomal steroid sulphatase gene (Sts). Nature Genet. 13: 83-86. Sandstedt SA, and Tucker PK. 2004. Evolutionary strata on the mouse X chromosome correspond to strata on the human X chromosome. Genome Res. 14: 267-272. Sbalqueiro IJ, Mattevi MS, and Oliveira LFB. 1984. An X1X1X2X2/X1X2Y Mechanism of Sex Determination in a South-American Rodent, Deltamys kempi (Rodentia, Cricetidae). Cytogenet. Cell Genet. 38: 50-55. Schanz S, and Steinbach P. 1989. Investigation of the "variable spreading" of X inactivation into a translocated autosome. Hum. Genet. 82: 244-248. Schartl M. 2004. Sex chromosome evolution in non-mammalian vertebrates. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 634-641. Schluter D. 1996. Ecological causes of adaptive radiation. Am. Nat. 148: 40-64. Schroder W, Poetsch M, Gazda H, Werner W, Reichelt T, Knoll W, Rokicka-Milewska R, Zieleniewska B, and Herrmann FH. 1998. A de novo translocation 46,X,t(X;15) causing haemophilia B in a girl: a case report. Brit. J. Haemat. 100: 750-757. Seabright J. 1971. A rapid technique for human chromosomes. Lancet II: 971-972. Searle JB. 1988. Karyotypic variation and evolution in the common shrew, Sorex araneus. Kew Chromosome Conference III, HMSO, 97-107. Searle JB. 1993. Chromosomal hybrid zones in eutherian mammals. In: Harrison RG, ed. Hybrid zones and the evolutionary process. Oxford: Oxford University Press. 309-353. Sharp P. 1982. Sex chromosomes pairing during meiosis in marsupials. Chromosoma 86: 27- 47. She JX, Bonhomme F, Boursot P, Thaler L, and Catzeflis F. 1990. Molecular phylogenies in the genus Mus: Comparative analysis of electrophoretic, scnDNA hybridization, and mtDNA RFLP data. Biol. J. Linnean Soc. 41: 83-103.

185 Shi L, Yang F, and Kumamoto A. 1991. The chromosomes of tufted deer (Elaphodus cephalophus). Cytogenet. Cell Genet. 56: 189-192. Sinclair AH, Berta P, Palmer MS, Hawkins JR, Griffiths BL, Smith MJ, Foster JW, Frischauf AM, Lovell-Badge R, and Goodfellow PN. 1990. A gene from the human sex- determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif. Nature 346: 240-244. Sinpson E, Chandler P, Goulmy E, Disteche CM, Ferguson-Smith MA, and Page DC. 1987. Separation of the genetic loci for the H-Y antigen and for testis determination on human Y chromosome. Nature 326: 876-878. Sites JWJ. 1995. Chromosomal speciation. Evolution 49: 218-222. Slijepcevic P. 1998. Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion. Chromosoma 107: 136-140. Solari AJ, and Ashley T. 1977. Ultrastructure and behaviour of the achiasmatic, telosynaptic XY pair of the sand rat (Psammomys obesus). Chromosoma 62: 319-336. Solari AJ, and Pigozzi MI. 1994. Fine structure of the XY body in the XY1Y2 trivalent of the bat Artibeus lituratus. Chromosome Res. 2: 53-58. Soullier S, Hanni C, Catzeflis F, Berta P, and Laudet V. 1998. Male sex determination in the spiny rat Tokudaia osimensis (Rodentia: Muridae) is not Sry dependent. Mamm. Genome 9: 590-592. Sourrouille P, Hanni C, Ruedi M, and Catzeflis FM. 1995. Molecular systematics of Mus crociduroides, an endemic mouse of Sumatra (Muridae: Rodentia). Mammalia 59: 91-102. Spirito F. 1998. The role of chromosomal change in speciation. In: Howard DJ and Berlocher SH, eds. Endless forms. Species and speciation. Oxford: Oxford University Press. 320-329. Stanyon R, Yang F, Cavagna P, O'Brien PCM, Bagga M, Ferguson-Smith MA, and Wienberg J. 1999. Reciprocal chromosome painting shows that genomic rearrangement between rat and mouse proceeds ten times faster than between humans and cats. Cytogenet. Cell Genet. 84: 150-155. Stanyon R, Stone G, Garcia M, and Froenicke L. 2003. Reciprocal chromosome painting shows that squirrels, unlike rodents, have a highly conserved genome organization. Genomics 82: 245-249. Stitou S, Jimenez R, Diaz de la Guardia R, and Burgos M. 2000. Sex-chromosome pairing through heterochromatin in the African rodent Lemniscomys barbarus (Rodentia, Muridae). A synaptonemal complex study. Chromosome Res. 8: 277-283. Sumner AT. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Exp. Cell Res. 75: 304-306. Sutou S, Mitsui Y, and Tsuchiya K. 2001. Sex determination without the Y chromosome in two Japanese rodents Tokudaia osimensis osimensis and Tokudaia osimensis spp. Mamm. Genome 12: 17-21. Suzuki H, Shimada T, Terashima M, Tsuchiya K, and Aplin K. 2004. Temporal, spatial, and ecological modes of evolution of Eurasian Mus based on mitochondrial and nuclear gene sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 33: 626-646. Svartman M, Stone G, and Stanyon R. 2005. Molecular cytogenetics discards polyploidy in mammals. Genomics 85: 425-430.

186 Références

Swofford DL. 1999. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. 0b ed. Sunderland, Massachusetts.: Sinauer Associates. Tease C, and Fisher G. 1991. Two new X-autosome Robertsonian translocations in the mouse. I. Meiotic chromosome segregation in male hemizygotes and female heterozygotes. Genet. Res. 58: 115 - 121. Tease C, and Fisher G. 1993. Two new X-autosome Robertsonian translocations in the mouse. II. Sex chromosome configurations in spermatocytes of hemizygous males. Chromosoma 102: 575-582. Telenius H, Pelmear AH, Tunnacliffe A, Carter NP, Behmel A, Ferguson-Smith MA, Nordenskjold M, Pfragner R, and Ponder BAJ. 1992. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes Chromosomes Cancer 4: 257-263. Thanou E, Fraguedakis-Tsolis S, and Chondropoulos B. 2005. mtDNA variation and evaluation of phylogenetic relationships among karyotypically polymorphic populations of Microtus (Terricola) thomasi (Arvicolidae, Rodentia) from Greece. Biol. J. Linnean Soc. 84: 55-68. Thorne JL, and Kishino H. 2002. Divergence time and evolutionary rate estimation with multilocus data. Syst. Biol. 51: 689-702. Toder R, O'Neill RJ, Wienberg J, O'Brien PC, Voullaire L, and Marshall-Graves JA. 1997. Comparative chromosome painting between two marsupials: origins of an XX/XY1Y2 sex chromosome system. Mamm. Genome 8: 418-422. Torres OM, Enciso S, Ruiz F, Silva E, and Yunis I. 1998. Chromosome diversity of the genus Aotus from Colombia. Am. J. Primat. 44: 255-275. Torres OM, and Ramirez C. 2003. Estudio citogenetico de Alouatta palliata. Caldasia 25: 193-198. Tucker PK. 1986. Sex chromosome-autosome translocations in the leaf-nosed bats, family Phyllostomidae. I. Mitotic analyses of the subfamilies Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytogenet. Cell Genet. 43: 19-27. Tucker PK, and Bickham JW. 1986. Sex chromosome-autosome translocations in the leaf- nosed bats, family Phyllostomidae. II. Meiotic analyses of the subfamilies Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytogenet. Cell Genet. 43: 28-37. Tucker PK, and Bickham JW. 1989. Heterochromatin and sex-chromosome variation in bats of the genus Carollia (Chiroptera: Phyllostomidae). J. Mamm. 70: 174-179. Turelli N, and Orr HA. 1995. The dominance theory of Haldane’s rule. Genetics 140: 389- 402. Turner JMA, Mahadevaiah SK, Benavente R, Offenberg HH, Heyting C, and Burgoyne PS. 2000. Analysis of male meiotic "sex body" proteins during XY female meiosis provides new insights into their functions. Chromosoma 109: 426-432. Vaiman D, and Pailhoux E. 2000. Mammalian sex reversal and intersexuality: deciphering the sex-determination cascade. Trends Genet. 16: 488-494. Vasques LR, Klockner MN, and Pereira LV. 2002. X chromosome inactivation: how human are mice? Cytogenet. Genome Res. 99: 30-35.

187 Vassart M, Guédant A, Vié JC, Kéravec J, Séguéla A, and Volobouev VT. 1996. Chromosomes of Alouatta seniculus (Platyrrhini, Primates) from French Guinea. J. Hered. 87: 331-334. Vassart M, Seguela A, and Hayes H. 1995. Chromosomal evolution in Gazelles. J. Hered. 86: 216-227. Veyrunes F, Britton-Davidian J, Robinson TJ, Calvet E, Denys C, and Chevret P. 2005. Molecular phylogeny of the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Rodentia, Murinae, Mus): implications for chromosomal evolution. Mol. Phylogenet. Evol. 36: 358-369. Veyrunes F, Catalan J, Sicard B, Robinson TJ, Duplantier JM, Granjon L, Dobigny G, and Britton-Davidian J. 2004. Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Muridae; Mus). Chromosome Res. 12: 369-382. Veyrunes F, and DCD Happold. sous presse. Genus Mus. In: Happold DCD, ed. Mammals of Africa. Veyrunes F, O’Brien PCM, Dobigny G, Catalan J, Yang F, Robinson TJ, and Britton- Davidian J. soumis. Extensive genome repatterning in genus Mus (Rodentia; Muridae) inferred from multidirectional cross-species chromosome painting. When chromosomes come to the help of molecular phylogeny and vice versa. Mol. Biol. Evol. Via S. 2001. Sympatric speciation in animals: the ugly duckling grows up. Trends Ecol. Evol. 16: 381-389. Viegas-Péquignot E, Benazzou T, Dutrillaux B, and Petter F. 1982. Complex evolution of sex chromosomes in Gerbillidae (Rodentia). Cytogenet. Cell Genet. 34: 158-167. Vogel W, Steinbach P, Djalali M, Mehnert K, Ali S, and Thomas Epplen J. 1988. Chromosome 9 of Ellobius lutescens is the X chromosome. chromosoma 96: 112-118. Volff JN, and Schartl M. 2001. Variability of genetic sex determination in poeciliid fishes. Genetica 111: 101-110. Volobouev V. 1989. Phylogenetic relationships of the Sorex araneus-arcticus species complex (Insectivora, Soricidae) based on high-resolution chromosome analysis. J. Hered. 80: 284-290. Volobouev V, Ducroz JF, Aniskin VM, Britton-Davidian J, Castiglia R, Dobigny G, Granjon L, Lombart M, Corti M, Sicard B, and Capanna E. 2002. Chromosomal characterization of Arvicanthis species (Rodentia, Murinae) from western and central Africa: implications for taxonomy. Cytogenet. Genome Res. 96: 250-260. Vyskot B, and Hobza R. 2004. Gender in plants: sex chromosomes are emerging from the fog. Trends Genet. 20: 432-438. Wang W, and Lan H. 2000. Rapid and parallel chromosomal number reductions in muntjac deer inferred from mitochondrial DNA phylogeny. Mol. Biol. Evol. 17: 1326-1333. Wang JX, Zhao XF, Deng Y, Qi HY, and Wang ZJ. 2003. Chromosomal polymorphism of mandarin vole, Microtus mandarinus (Rodentia). Hereditas 138: 47-53. Waters JJ, Campbell PL, Crocker AJ, and Campbell CM. 2001a. Phenotypic effects of balanced X-autosome translocations in females: a retrospective survey of 104 cases reported from UK laboratories. Hum. Genet. 108: 318-327. Waters PD. 2002. Evolution of the mammalian Y chromosome. PhD thesis, Canberra.

188 Références

Waters PD, Dobigny G, Pardini AT, and Robinson TJ. 2004. LINE-1 distribution in Afrotheria and Xenarthra: implications for understanding the evolution of LINE-1 in eutherian genomes. Chromosoma 113: 137-144. Waters PD, Duffy B, Frost CJ, Deldridge ML, and Marshall Graves JA. 2001b. The human Y chromosome derives largely from a single autosomal region added to the sex chromosomes 80-130 million years ago. Cytogenet. Cell Genet. 92: 74-79. Waterston RH, Lindblad-Toh K, Birney E, Rogers J, Abril FJ et al., 2002. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520-562. Watson JM, Riggs A, Graves JAM. 1992. Gene mapping studies confirm the homology between the platypus X and Echidna X(1) chromosomes and identify a conserved ancestral monotreme X chromosome. Chromosoma 101: 596-601. Weksler M. 2003. Phylogeny of Neotropical oryzomyine rodents (Muridae: Sigmodontinae) based on the nuclear IRBP exon. Mol. Phylogenet. Evol. 29: 331-349. Werren JH, and Beukeboom LW. 1998. Sex determination, sex ratios, and genetic conflict. Annu. Rev. Ecol. Syst. 29: 233-261. Wesselman HB. 1984. The Omo micromammals. In: Hecht MK and Szalay FS, eds. Contribution to vertebrate Evolution. Basel: S. Karger, 1-219. White MJD. 1968. Models of speciation. Science 159: 1065-1070. White MJD. 1973. Animal cytology and evolution, third edition. Cambridge University Press, New York. White MJD. 1975. Chromosomal repatterning – regularities and restrictions. Genetics 79: 63- 72. White MJD. 1978. Chain processes in chromosomal speciation. Syst. Zool. 27: 285-298. White WM, Willard HF, Van Dyke DL, and Wolff DJ. 1998. The spreading of X inactivation into autosomal material of an X;autosome translocation: evidence for a difference between autosomal and X-chromosomal DNA. Am. J. Hum. Genet. 63: 20-28. Whitfield LS, Lovell-Badge R, and Goodfellow PN. 1993. Rapid sequence evolution of the mammalian sex-determining gene Sry. Nature 364: 713-715. Wienberg J. 2004. The evolution of eutherian chromosomes. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 657-666. Wilson DE, and Reeder DM. 1993. Mammal species of the world. A taxonomic and geographic reference. Washington and London: Smithsonian Institution Press. Winking H, Gropp A, and Fredga K. 1981. Sex determination and phenotype in wood lemmings with XXY and related karyotypic anomalies. Hum. Genet. 58: 98-104. Wolf KW. 1994. How meiotic cells deal with non-exchange chromosomes. BioEssays 16: 107-114. Wu CI. 2001. The genic view of the process of speciation. J. Evol. Biol. 14: 851-865. Yang F, Alkalaeva EZ, Perelman PL, Pardini AT, Harrison WR, O'Brien PC, Fu B, Graphodatsky AS, Ferguson-Smith MA, and Robinson TJ. 2003. Reciprocal chromosome painting among human, aardvark, and elephant (superorder Afrotheria) reveals the likely eutherian ancestral karyotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1062- 1066.

189 Yang F, Carter NP, Shi L, and Ferguson-Smith MA. 1995. A comparative study of karyotypes of muntjacs by chromosome painting. Chromosoma 103: 642-652. Yang F, O'Brien PCM, Wienberg J, and Ferguson-Smith MA. 1997. A reappraisal of the tandem fusion theory of karyotype evolution in the Indian muntjac using chromosome painting. Chromosome Res. 5: 109-117. Yoder AD, and Yang Z. 2004. Divergence dates for Malagasy lemurs estimated from multiple gene loci: geological and evolutionary context. Mol. Ecol. 13: 757-773. Zakian VA. 1995. Telomeres: beginning to understand the End. Science 270: 1601-1607. Zhdanova NS, Karamisheva TV, Minina J, Astakhova NM, Lansdorp P, Kammori M, Rubtsov NB, and Searle JB. 2005. Unusual distribution pattern of telomeric repeats in the shrews Sorex araneus and Sorex granarius. Chromosome Res. 13: 617-625. Zhu B, Gao H, Wang H, Gao J, Zhang Y, Dong Y, Hou J, and Nan X. 2003. The origin of the genetical diversity of Microtus mandarinus chromosomes. Hereditas 139: 90-95.

190

IV. ANNEXES

191

192 Annexe 1:

The Genus Mus.

Veyrunes F & Happold DCD. in press.

* in Mammals of Africa (Ed : Happold D.C.D.)

* Cet ouvrage scientifique est une encyclopédie recensant et décrivant toutes les espèces de mammifères présentes sur le continent africain, comprenant pour chacune d’entre-elles leur statut de protection et des données taxonomiques, morphologiques, caryologiques, biologiques, comportementales, etc... Le chapitre présenté est une introduction à la description des 20 espèces de souris du genre Mus vivant en Afrique.

193

194 Annexes

Mus

Mus Linnaeus, 1758. Syst. Nat., 10th ed., 1:59.

In Africa, the genus Mus is represented by about 20 species. Species within the genus occur throughout most of the continent and are recorded from forest, savanna, highland grassland and semi-arid habitats, and from sea-level to ca 2500 m. The only habitats where Mus does not occur are rainforests and arid deserts. Extralimitally, the genus is represented throughout the Old World. One species, Mus musculus, has been introduced into all continents and many islands, and has, in general, proved to be a very successful colonizer.

The genus, as exemplified by African species, is characterised by small size (HB ca 43 - 90 mm, GLS 16-25 mm, weight 3-20 g), delicate build, shortish pelage, and moderate tail without a terminal pencil. Uniquely there is a notch on the posterior face of the upper incisors. Other diagnostic skull characters include pronounced masseteric knob on the zygomatic plate near the lower edge, anterior palatal foramen which extends well posterior to the anterior end of upper M1, laminae of the molar teeth which tilt posteriorly, t1 of upper M1 distorted posteriorly and hence almost in line with t4 and t5, and very small upper M3.

There is great variation in the distribution and abundance of species of Mus in Africa. Some are widepread and numerous (M. minutoides, M. musculoides, M. setulosus), some have very limited distributions (e.g. M. bufo, M. goundae, M. oubanguii), and others are known from only few widely scattered localities and their full geographic range is uncertain (e.g. M callewaerti, M. sorella, M. tenellus). Typically, individuals of many species of Mus are numerous in favoured environments and contribute a relatively large percentage to the total rodent community; they have short life expectancies and high fecundity, and the population turnover is rapid. They form an important source of food for smaller predators, and their remains often contribute a high percentage of total prey in the pellets of owls. Individuals of Mus spp. are mostly gregarious and non-territorial. They are granivorous or omnivorous, their small size necessitating that they eat only high-quality foods.

The genus is divided into four subgenera, two of which are represented in Africa: subgenus Mus (typical Old World Mice) distinguished by larger size, flat anterior face to the zygomatic plate, masseteric knob at the lower anterior corner of the plate, and upper M3 with two (often inconspicous) laminae (2 ssp. - Mus musculus, M. spretus), and the subgenus Nannomys (African Pygmy Mice) distinguished by smaller size, convex anterior face to the zygomatic plate, masseteric knob at the lower centre of the plate, and upper M3 usually without laminae (18 spp.). In the past, Nannomys was referred to as Leggada (e.g. de Graaf 1981, Smithers 1983, Meester et al .1986) and raised to rank of genus by some authorities (e.g. Allen 1939, Roberts 1951, Bonhomme 1992). The distinction between the two subgenera is not always clearcut (Petter 1963), although in West Africa, for example, the two can be easily separated (Rosevear 1969). For Africa, the recognition of Nannomys appears to be warranted (Musser & Carleton 2004).

Because all species of Mus (especially Nannomys) are small and morphologically similar, distinctions between species are often blurred. Geographical variation within widespread species is common and has resulted in the naming of many forms (species or subspecies), many of which are now regarded as synonyms. Within Nannomys, some species have been classified into groups: implying close morphological affinities; for example, the "sorella group" (Petter 1981) comprising M. sorella, M. goundae, M. neavei, and M oubanguii.

195 Research on the karyology and cytogenetics of Nannomys is likely to clarify species boundaries and the phylogenetic relationships of species to a much greater extent than classical morphology. The extensive karyotypic diversity uncovered between species involves centric and tandem translocations, heterochromatin additions, pericentric inversions and chromosomal deletions, and provides useful characteristics for distinguishing species. Using the morphology of the sex chromosomes, Nannomys clusters into two groups (Matthey 1966). The first group (with acrocentric X and Y chromosomes) includes M. bufo, M. indutus, M. mattheyi, and M. mahomet which all have 36 acrocentric chromosomes (diploid number 2n=36, and fundamental number NF=36). Two additional species belong to this group: M. setulosus (2n=36, NF=36) which is distinguished from the others by large heterochromatin additions on several pairs of autosomes, and M. haussa which is discriminated by a pericentric inversion and varying numbers of autosomal centric fusions (2n=28-34, NF=38). The second group (with metacentric X and/or Y chromosomes formed by sex-autosome translocations) includes M. triton, M. oubanguii, M. musculoides, M. minutoides and M. goundae (Matthey 1966, Jotterand 1972, Veyrunes et al. 2004). This group is of special interest because of the large variation in the number and morphology of chromosomes between populations and even within populations (2n=18-34, NF=30-36). This is particularly evident for M. minutoides and probably also for M. triton. Such diversity most likely indicates the occurrence of cryptic species (Veyrunes et al. 2004).

Species in the genus may be distinguished by size, pelage colour, various skull characteristics, and chromosome characteristics.

F. Veyrunes & D.C.D. Happold

References Allen, G. M. 1939. A checklist of African mammals. Bulletin of the American Museum of Natural History 83: 1-763. Bonhomme, F. 1992. Genetic Diversity and evolution in the genus Mus. In: Techniques for the genetic analysis of brain and behaviour (eds G. Goldowitz, D. Wahlsten & R. E. Wimer). Elsevier Science Publishers. pp. 41-56. de Graaff, G. 1981. The Rodents of Southern Africa. Butterworths, Durban. 267 pp. Meester, J. A. J., Rautenbach, I. L., Dippenaar, N. J. & Baker, C. M., 1986. Classification of Southern African Mammals. Transvaal Museum Monograph 5: 1 - 359. Musser, G. & Carleton, M.D. 2004. Family Muridae. In: Mammal Species of the World: a taxonomic and geographic reference. 3rd Edn. (Eds. D. E. Wilson and D. M. Reeder). Smithsonian Institution Press, Washington, D. C. pp. 622-629. Petter, F. 1963. Contribution à la connaissance des souris africaines. Mammalia 27: 602-607. Petter, F. 1981. Les souris africaines du groupe sorella (Rongeurs, Muridés). Mammalia 45: 313-320. Roberts, A. 1951. The Mammals of South Africa. Johannesburg. pp. XX. Rosevear, D. R. 1969. The Rodents of West Africa. British Museum (Natural History), London. 604 pp. Smithers, R. H. N. 1983. The Mammals of the Southern African Subregion. University of Pretoria, Pretoria. 734 pp. Veyrunes, F., Catalan, J., Sicard, B., Robinson, T. J., Duplantier, J. M., Granjon, L., Dobigny, G., & Britton-Davidian, J. 2004. Autosome and sex chromosome diversity among the African pygmy mice, subgenus Nannomys (Murinae: Mus). Chromosome Research 12: 369-382.

196 Annexes

Annexe 2:

Annexe 2: Liste des spécimens étudiés, et détails des analyses moléculaires et cytogénétiques réalisées Espèce N° id Pays Localité sexe 2n NF r12s cyt b IRBP Sry Giemsa G-band C-band télo. Coll./Source ???? L5547 Bénin Tokan F ? ? X LD/MW

???? 2000-082 Tchad PN Zakouma ? ? ? X X CD

???? L5551 Congo Bombo ? ? ? RK/RL

haussa M4332 Mali Ménaka M 33 38 X X SAA/JBD haussa M4333 Mali Ménaka M 33 38 X X SAA/JBD haussa M4334 Mali Ménaka M 33 38 X X SAA/JBD haussa M4335 Mali Ménaka M 32 38 X X X X SAA/JBD haussa M4336 Mali Ménaka M 33 38 X SAA/JBD haussa M4337 Mali Ménaka F 32 38 X X SAA/JBD haussa 3096 Niger Guileyni F 34 38 X GD haussa 3069 Niger Kollo M 31 38 X GD haussa M9092 Sénégal Thiès F 28 38 X X X JMD/AO haussa M9093 Sénégal Thiès ? 28 38 X JMD/AO haussa M9094 Sénégal Thiès F 28 38 X X X X X JMD/AO haussa M9095 Sénégal Thiès ? 28 38 X X JMD/AO haussa 2000-047 Tchad Karal F 30 38 X X GD

indutus L5510 Afrique Sud Kalahari NP ? ? ? X PF/TJR indutus L5511 Afrique Sud Kalahari NP ? ? ? X X X PF/TJR indutus US8 Afrique Sud Tussen reviere F 36 36 X X X X X JW/TJR indutus US10 Afrique Sud Tussen reviere F 36 36 X X X X X JW/TJR

mattheyi M8783 Burkina F. Nazinga M 36 36 X X JBD mattheyi M8785 Burkina F. Nazinga M 36 36 X X JBD mattheyi M8786 Burkina F. Nazinga M 36 36 X X JBD mattheyi 4761 Burkina F. Nazinon F 36 36 X X X YP/BS mattheyi L-4120 Burkina F. Oursi ? 36 36 X X X MV/JBD mattheyi 758 Guinée Bantou M 36 36 X EC mattheyi 606 Guinée Koneya F ? ? X EC mattheyi 812 Guinée Tanganya M 36 36 X EC mattheyi M5074 Mali Balamansala F 36 36 X X X CK/LG mattheyi M4316 Mali Farabana M 36 36 X X CK/JBD mattheyi M4317 Mali Farabana F 36 36 X X X CK/JBD mattheyi M4318 Mali Farabana M 36 36 X CK/JBD mattheyi M4323 Mali Farabana M? 36 36 X CK/JBD mattheyi M4324 Mali Farabana M 36 36 X X X CK/JBD mattheyi M4325 Mali Farabana F 36 36 X X CK/JBD mattheyi M4309 Mali Kabakoro F 36 36 X CK/JBD mattheyi M4310 Mali Kabakoro F 36 36 X X CK/JBD mattheyi M4301 Mali Kabalabougou F 36 36 X X X CK/JBD mattheyi M4302 Mali Kabalabougou M 36 36 X CK/JBD mattheyi M4303 Mali Kabalabougou M 36 36 X CK/JBD mattheyi M4326 Mali Kabalabougou M 36 36 X CK/JBD mattheyi M4327 Mali Kabalabougou M 36 36 X CK/JBD mattheyi M4328 Mali Kabalabougou M 36 36 X CK/JBD mattheyi K8407 Mali Samaya M 36 36 X X X BS/JBD mattheyi K8408 Mali Samaya M 36 36 X X BS/JBD mattheyi K8409 Mali Samaya F 36 36 X X BS/JBD mattheyi K8410 Mali Samaya M 36 36 X X X BS/JBD mattheyi M4306 Mali Samaya M 36 36 X X X BS/JBD mattheyi M4312 Mali Samaya F 36 36 X X BS/JBD mattheyi 8440 Mali Samaya F 36 36 X X X X BS mattheyi 8441 Mali Samaya M 36 36 X X X X X BS mattheyi 8442 Mali Samaya M 36 36 X X X X BS mattheyi M4939 Mali Sibi Sibi F 36 36 X CK/BS mattheyi M9091 Sénégal Bandia M 36 36 X X X X JMD/FC/AO mattheyi L-4116 Togo ? F ? ? X FC mattheyi L-4117 Togo ? M ? ? X FC

197

Espèce N° id Pays Localité sexe 2n NF r12s cyt b IRBP Sry Giemsa G-band C-band télo. Coll./Source minutoides US15 Afrique Sud Belfast F 34 36 X X X CN/TJR minutoides US17 Afrique Sud Caledon NR F 18 35 X X JW/JBD minutoides US18 Afrique Sud Caledon NR M 18 35 X X JW/JBD minutoides US19 Afrique Sud Caledon NR F 18 35 X X X X X JW/JBD minutoides US20 Afrique Sud Caledon NR F 18 35 X X X X JW/JBD minutoides US21 Afrique Sud Caledon NR F 18 35 X X JW/JBD minutoides US22 Afrique Sud Caledon NR M 18 35 X X JW/JBD minutoides US23 Afrique Sud Caledon NR F 18 35 X X X JW/JBD minutoides US2 Afrique Sud Caledon NR M 18 35 X X X X X X X JW/TJR minutoides US3 Afrique Sud Caledon NR M 18 35 X X X X JW/TJR minutoides US1 Afrique Sud Caledon NR F ? ? X X JW/TJR minutoides US4 Afrique Sud Kuruman M 34 36 X X X X X X CC/TJR minutoides US5 Afrique Sud Kuruman F 34 36 X X X X X X CC/TJR minutoides US14 Afrique Sud Lydenburg M 18 36 X X CN/TJR minutoides US24 Afrique Sud Lydenburg M 18 36 X CN/TJR minutoides US16 Afrique Sud Somerset M 18 36 X X CM/TJR minutoides SMW1 Afrique Sud St Lucia M ? ? X SWM/TJR minutoides US11 Afrique Sud Stellenbosch F 18 36 X X X X X JN/TJR minutoides US 12 Afrique Sud Stellenbosch F 18 36 X JN/TJR minutoides US 13 Afrique Sud Stellenbosch M 18 36 X X X X JN/TJR minutoides 216 Guinée Bantou M ? ? X EC minutoides 241 Guinée Gagal F ? ? X EC minutoides 93 Guinée Gayebombo M ? ? X EC minutoides 155 Guinée Gbetaya F ? ? X X EC minutoides 16796 Kenya Nairobi ? ? ? X AO minutoides KP66 Tanzanie Kingu Pira M 34 36 X CD minutoides KP147 Tanzanie Kingu Pira F 34 36 X CD

minutoides? 777 Guinée Tanganya F 32 36 EC

musculoides KD22 Guinée Kodoko ? ? ? X CD/EC musculoides M4999 Mali Diaban F 18 36 X CK/LG musculoides 4734 Mali Djoliba F ? ? X BS musculoides 4743 Mali Djoliba M 19 36 X X BS musculoides M4313 Mali Samaya M 19 36 X X CK/JBD musculoides M4314 Mali Samaya F 18 36 X X X CK/JBD musculoides M4319 Mali Samaya M 19 36 X X X X CK/JBD musculoides M4320 Mali Samaya F 18 36 X CK/JBD musculoides M4321 Mali Samaya M 19 36 X X X X CK/JBD musculoides 8444 Mali Samaya F 18 36 X X X X BS

musculoides? 704 Guinée Bantou M 34 36 EC musculoides? 815 Guinée Tanganya F 34 36 EC

setulosus L-4591 Gabon ? F ? ? X X X FC setulosus BH4 Guinée Boïta ? ? ? X CD/EC setulosus FR6 Guinée Franfina ? ? ? X CD/EC setulosus 158 Guinée Gbetaya M ? ? X X CD/EC setulosus MAC16 Guinée Macenta ? ? ? X CD/EC setulosus MK34 Guinée Maikou ? ? ? X CD/EC setulosus SA41K Guinée Sangassou ? 36 36 X EC setulosus M7567 Rép Centr Afr Ippy-Banguy F 36 36 X X AO G-band = banding-G; C-band = banding-C; télo = FISH d’un sonde télomérique; Coll = collecteur SAA = S. Ag Atteynine ; KB = Khalilou Bâ ; JBD = Janice Britton-Davidian ; EC = Elisabeth Calvet; FC = François Catzeflis ; CC = C. Chimimba ; CD = Christiane Denys ; LD = Luc Djogbenou ; GD = Gauthier Dobigny ; JMD = Jean-Marc Duplantier ; PF = P. Funston ; LG = Laurent Granjon ; RK= Robert Kisasa ; CK = C. Koné ; RL = Roland Libois ; CM = Conrad Matthee ; JN = J. Nel ; CN = C. Newberry ; AO = Annie Orth ; YP = Y. Papillon ; TJR = Terry J. Robinson; BS = Bruno Sicard ; MV = Maddalena Vogel ; JW = Johan Watson ; MW = Mylène Weill ; SWM = Sandy Willows-Munro

J’en profite ici pour remercier chaleureusement Janice Britton-Davidian et Josette Catalan pour leur aide technique dans les études cytogénétiques (banding-G et -C) et plus particulièrement pour les analyses méiotiques ; Pascale Chevret et mon étudiante Elise Cellier-Holzem pour leur coup de main dans le séquençage moléculaire (et notamment Pascale pour le gène Sry); Terry Robinson et Gauthier Dobigny pour s’être occupés de mes cultures cellulaires lorsque je n’étais pas en Afrique du Sud ; Gauthier (à nouveau) pour son aide précieuse dans mon apprentissage du Chromosome Painting ; et enfin et surtout, tous les collecteurs.

198 . Radiation évolutive des souris naines Africaines, Nannomys (Rodentia, Muridae, Mus) : rôle des remaniements chromosomiques dans la spéciation et évolution des systèmes de déterminisme du sexe. - Approches phylogénétiques, cytogénétiques et cytogénomiques - Les souris naines africaines sont assignées au sous-genre Nannomys, inclus dans le genre Mus auquel appartient la souris domestique ; il s’agit d’un groupe de rongeurs de très petite taille, dont la morphologie conservée a rendu la caractérisation des espèces délicate. Au contraire, l’étude chromosomique de ce groupe par des approches variées a révélé une extraordinaire diversité caryologique, mise en place essentiellement par des fusions Robertsoniennes -Rb-. Les chromosomes apparaissent de plus comme de bons marqueurs spécifiques, palliant ainsi le manque de caractères morphologiques diagnostics. En outre, une étude phylogénomique à partir de réarrangements chromosomiques identifiés par ZOO-FISH a confirmé les potentialités de cette méthode en résolvant pour la première fois de façon robuste la phylogénie longtemps débattue du genre Mus. En parallèle, l’obtention d’une phylogénie moléculaire des espèces de Nannomys a permis de clarifier en partie la systématique du groupe, de préciser la connaissance des aires de distribution, mais surtout d’apporter un cadre phylogénétique et temporel précis au sein duquel l’évolution chromosomique et les processus génomiques associés aux événements de spéciation ont pu être interprétés. Ces résultats ont révélé l’existence d’un clade qui présente une importante diversité chromosomique impliquant notamment les chromosomes sexuels. Très conservés chez les mammifères, les chromosomes X et Y présentent ici une diversité unique, survenue à la suite de multiples fusions Rb sexe-autosome associées à différentes modifications du système de déterminisme du sexe, deux types d’événements pourtant extrêmement rares. D’ores et déjà, la diversité des systèmes sexuels rencontrée dans ce clade (XX/XY - XX, XY/XY - XO/XY - XO/XO) est tout aussi spectaculaire que celle observée chez l’ensemble des mammifères, sinon davantage puisqu’elle est apparue rapidement en quelques millions voire centaines de milliers d’années. Par conséquent, les Nannomys apparaissent comme le modèle biologique le plus pertinent pour l’étude de l’évolution des chromosomes sexuels et de la mise en place de nouveaux mécanismes de déterminisme du sexe, de l’origine de leur plasticité et de leurs conséquences à l’échelle du génome et de l’espèce.

Mots clés : évolution chromosomique, fusion Robertsonienne, translocation sexe-autosome, déterminismes du sexe atypiques, femelles XY et XO, chromosomes sexuels, spéciation, phylogénie, souris naines africaines, Nannomys, Mus

Evolutionary radiation of the African pygmy mice, Nannomys (Rodentia, Muridae, Mus) : the role of chromosomal rearrangements in speciation and evolution of sex determination systems. - Phylogenetic, cytogenetic and cytogenomic approaches - The African pygmy mice represent the subgenus Nannomys, and are included in the genus Mus along with the house mouse; they consist of small-sized rodents, with morphologically very similar species. Chromosomal studies of this group by multiple approaches have revealed an incredible karyological diversity, mostly involving Robertsonian -Rb- fusions. In most cases, chromosomes appear as diagnostics markers contrary to the poorly discriminant morphological characters. Moreover, a phylogenomic study using chromosomal homologies identified by ZOO-FISH has confirmed the potential of this method in strongly resolving for the first time the long-debated phylogeny of the genus Mus. A molecular phylogeny of these Nannomys species was performed, and allowed us to partially clarify the systematics of the group, and delimit distribution ranges more precisely. In addition, the tree produced yielded a well-defined phylogenetic and temporal framework to interpret rates of chromosomal evolution and the genomic processes associated with speciation events. These results have revealed a phylogenetic clade showing an important chromosomal diversity which involved sex chromosomes. Although highly conserved within mammals, the X and Y chromosomes present a unique diversity in this clade due to multiple sex-autosome Rb fusions associated in some cases with modifications of the sex determination systems; both of these events are generally extremely rare. So far, the diversity of sex chromosome systems observed (XX/XY - XX, XY/XY - XO/XY - XO/XO) is as spectacular as that reported from the entire mammalian lineage, and even more so since it occurred in only a few million or hundred of thousands years. Therefore, the Nannomys are probably the most relevant biological model to investigate sex chromosome evolution, the formation of new sex determination mechanisms, and the origin of their plasticity, as well as their evolutionary consequences on the genome and the species.

Keywords : chromosomal evolution, Robertsonian fusion, sex-autosome translocation, weird sex determination, XY and XO females, sex chromosomes, speciation, phylogeny, African pygmy mice, Nannomys, Mus